BR112014003477B1 - Composição imunoterapêutica de muc1 de levedura - Google Patents
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Abstract
composições imunoterapêuticas de levedura-muc1 e uso de veículo de levedura expressando proteína de fusão para a preparação das mesmas. a presente invenção refere-se a composições imunoterapêuticas com base em levedura compreendendo mucina-1 (muc1), bem como métodos para a prevenção e/ou tratamento de cânceres caracterizados pela expressão ou superexpressão de mucina-1 (muc1).
Description
[0001] A presente invenção foi criada no desempenho de um Acordo de Pesquisa e Desenvolvimento Cooperativo com o National Institutes of Health, uma agência do Department of Health and Human Services. O Governo dos Estados Unidos tem determinados direitos na presente invenção.
[0002] O presente Pedido reivindica o benefício de prioridade sob 35 USC § 119 (e) ao Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos N° 61/524.407, depositado em 17 de Agosto de 2011. A descrição completa do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos N° 61/524.407 é aqui incorporada por referência.
[0003] A presente invenção foi feita por ou em nome de partes em um Acordo de Pesquisa e Desenvolvimento Cooperativo, executado em 08 de Maio de 2008. As partes no Acordo de Pesquisa e Desenvolvimento Cooperativo são: GlobeImmune, Inc. e U.S. Department of Health and Human Services, representado pelo National Cancer Institute, um Instituto, Centro ou Divisão do National Institutes of Health.
[0004] O presente Pedido contém uma Listagem de Sequência enviada eletronicamente como um arquivo de texto por EFS-Web. O arquivo de texto, denominado "3923-40-PCT_ST25", tem um tamanho em bytes de 89 KB e foi gravado em 16 de Agosto de 2012. A informação contida no arquivo de texto é aqui incorporada por referência na íntegra nos termos do 37 CFR § 1.52 (e), (5).
[0005] A presente invenção se refere, de modo geral, à composições imunoterapêuticas com base em levedura e métodos para a prevenção e/ou tratamento de cânceres caracterizados pela expressão ou superexpressão de mucina-1 (MUC1).
[0006] O câncer é uma das principais causas de morte no mundo e o desenvolvimento de terapias eficazes para o câncer continua a ser uma das áreas mais ativas de pesquisa e desenvolvimento clínico. Embora tenham sido propostas uma variedade de abordagens inovadoras para tratamento e prevenção de cânceres, muitos cânceres continuam a ter uma elevada taxa de mortalidade e podem ser difíceis de tratar ou relativamente insensíveis às terapias convencionais.
[0007] Um grande número de carcinomas humanos e malignidades hematológicas são caracterizados, pelo menos em parte, por superexpressão anormal de uma proteína conhecida como mucina-1 (MUC1) cuja função normal consiste em ajudar a proteger as células epiteliais contra toxinas, micro-organismos e outros tipos de estresses do ambiente externo (Kufe et al., Hybridoma 1984; 3: 223-32). MUC1 é uma proteína heterodimérica formada a partir da interação não covalente de duas subunidades que são codificadas por um único transcrito e, então, processadas em subunidades pós-traducionalmente, conhecidas como MUC1-N e MUC1-C. MUC1 é normalmente encontrada nas bordas apicais de células epiteliais secretoras e, quando as células perdem a polaridade em resposta ao estresse, um processo reversível para células normais, a MUC1 pode interagir com moléculas que normalmente se localizam nas bordas basolaterais. Além disso, em resposta a ambientes de estresse, a subunidade MUC1-N, uma grande proteína que contém um número variável de repetições em cadeia (Variable Number of Tandem Repeat - VNTR) que são extensivamente glicosiladas com glicanas O-ligadas, pode ser extravasada. A outra subunidade de MUC1, conhecida como MUC1-C, tem um domínio extracelular, um domínio transmembrana e uma cauda citoplasmática e pode se ligar a um ligante que é responsável pela associação física de MUC1 com o receptor de fator de crescimento epidérmico (Epidermal Growth Factor Receptor - EGFR) (Li et al., J Biol Chem 2001; 276: 35239-42; Schroeder et al., J Biol Chem 2001; 276: 13057-64), bem como outros receptores de quinases de tirosina, tais como ErbB2-4, FGFR321 e PDGFR (Li et al., Mol Cancer Res 2003; 1: 765-75; Ren et al., Mol Cancer Res 2006; 4: 873-83; Singh et al., Cancer Res 2007; 67: 5201-10). Além disso, a MUC1-C tem sido associada a uma variedade de vias de sinalização que incluem receptores ErbB, c-Src, β-catenina, fatores de transcrição (p53, ERa) e outros efetuadores, tais como Grb2/SOS (Pandey et al., Cancer Res 1995; 55: 4000-3; Kinlough et al., J Biol Chem 2004; 279: 53071-7).
[0008] Em células epiteliais transformadas, a polarização da membrana é irreversível e a expressão de MUC-1 é positivamente regulada sobre toda a superfície das células de carcinoma (Kufe et al., 1984, supra). Superexpressão de MUC1está associada com a O- glicosilação de MUC1-N diminuída e altos níveis de MUC1-N na superfície celular bloqueiam estericamente as interações célula-célula e célula-matriz extracelular, as quais estão associadas ao fenótipo maligno (Ligtenberg et al., Cancer Res 1992; 52: 223-32; van de Wiel- van Kemenade et al., J Immunol 1993; 151: 767-76; Wesseling et al., Mol Biol Cell 1996; 7: 565-77). A subunidade MUC1-C é agora considerada como sendo uma oncoproteína com base em seu envolvimento em diversas vias de sinalização associadas à tumorigênese e foi mostrado que sua superexpressão está envolvida em bloqueio de indução de apoptose em resposta a danos no DNA (Ren et al., Cancer Cell 2004; 5: 163-75; Raina et al., J Biol Chem 2004; 279: 20607-12), estresse oxidativo (Yin e Kufe, J Biol Chem 2003; 278: 35458-64; Yin et al., J Biol Chem 2004; 279: 45721-7) e hipoxia (Yin et al., J Biol Chem 2007; 282: 257-66), bem como confere um crescimento e tumorigenicidade independentes de ancoragem (Li et al., Oncogene 2003; 22: 6107-10; Huang et al., Cancer Biol Ther 2003; 2: 702-6; Huang et al., Cancer Res 2005; 65: 10413-22; Schroeder et al., Oncogene 2004; 23: 5739-47).
[0009] Conforme discutido acima, os dados de vários laboratórios indicam que a MUC1-N (subunidade α) desempenha um papel em câncer, conferindo propriedades celulares que permitam a evasão imune e potencialmente a disseminação metastática. A MUC1-C (subunidade β) se acoplada à vias de sinalização responsáveis pelo início e progressão de tumor. Estas funções duplas da MUC1 podem explicar os diferentes papéis que este antígeno parece exercer em diferentes indicações de câncer. Por exemplo, a MUC1 parece ser um marcador precoce de câncer, tal como câncer de mama e câncer de cólon (por exemplo, vide Kretschmer et al., Mol Cancer. 11 de Fevereiro de 2011; 10(1): 15; Mukhopadhyay et al., Biochim Biophys Acta. Abril de 2011; 1815(2): 224-40; Saeki et al., Gastroenterology. Março de 2011; 140(3): 892-902), enquanto que a MUC1 está associada à vias de transição epitelial-mesenquimal (Epithelial-Mesenchymal Transition - EMT) e disseminação metastática em cânceres tais como câncer de pâncreas e câncer esofageal (por exemplo, vide Xu et al., Life Sci. 6 de Junho de 2011; 88(23-24): 1063-9; Besmer et al., Cancer Res. 1 de Julho de 2011; 71(13): 4432-42; Roy et al., Oncogene, 24 de Março de 2011; 30(12): 1449-59; Ye et al., Lab Invest. 9 de Maio de 2011; 91(5): 778-87) e impede a diferenciação terminal por espécies reativas de oxigênio em leucemia mielóide aguda (Acute Myeloid Leukemia - AML) (por exemplo, vide Yin et al., Blood. 5 de Maio de 2011; 117(18): 486370; Fatrai et al., Exp Hematol. Outubro de 2008; 36(10): 1254-65), deste modo, permitindo a auto-renovação limitada destas células cancerosas.
[0010] Dado o evidente papel de MUC1 no fenótipo maligno de células cancerosas, a MUC1 e, particularmente MUC1-N, tem sido o foco de abordagens terapêuticas anti-câncer. Na verdade, a maioria das abordagens terapêuticas têm como alvo a proteína MUC1-N, a porção extracelular do heterodímero de MUC1. No entanto, tais abordagens que objetivam a MUC1-N não têm sido bem sucedidas na clínica até o momento, possivelmente em virtude de interferência da MUC1-N que é extravasada das células. Estudos mais recentes têm proposto a objetivação da subunidade MUC1-C com anticorpos contra o domínio extracelular, ou com peptídeos, peptídeos conjugados com um polímero de carboidrato, pequenas moléculas, com preparados de células tumorosas que expressam MUC1 e com fusões de células tumorosas/células dendríticas. No entanto, atualmente não há terapia de câncer aprovada que objetive especificamente a MUC1. Consequentemente, continua a haver uma necessidade na técnica por novos produtos que tratam e/ou previnem eficazmente os cânceres associados à expressão ou superexpressão de MUC-1.
[0011] Uma modalidade da invenção se refere a uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura que compreende: (a) um veículo de levedura; e (b) uma proteína de fusão expressa pelo veículo de levedura e compreendendo pelo menos um antígeno MUC-1. Em um aspecto, o antígeno MUC1 consiste, na ordem do N- para o C-término, em um domínio extracelular (Extracellular Domain - ED)/SEA de MUC1 (ED), em que o domínio SEA/ED de MUC1 compreende um ED de MUC1 flanqueado, no N-término, por um ou mais aminoácidos da porção não ED do domínio SEA de MUC1; pelo menos dois números variáveis de domínios com repetições em cadeia (Variable Number of Tandem Repeat - VNTR); um domínio transmembrana (TransMembrane - TM); e um domínio citoplasmático (Cytoplasmic Domain - CD) de MUC1.
[0012] Em um aspecto, o antígeno inclui dois domínios VNTR. Em um aspecto, o domínio VNTR tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica às posições 126-145 de SEQ ID NO: 11; quaisquer 20 aminoácidos consecutivos entre as posições 61 e 1020 de SEQ ID NO: 11; quaisquer 20 aminoácidos consecutivos entre as posições 126 e 965 de SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; quaisquer 20 aminoácidos consecutivos entre as posições 90 e 130 de SEQ ID NO: 14; quaisquer 20 aminoácidos consecutivos entre as posições 60 e 100 de SEQ ID NO: 15; e uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 humana diferente. Em um aspecto, o domínio VNTR tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a quaisquer 20 aminoácidos consecutivos entre as posições 90 e 130 de SEQ ID NO: 14 ou quaisquer 20 aminoácidos consecutivos entre as posições 60 e 100 de SEQ ID NO: 15. Em um aspecto, a proteína de fusão tem dois domínios VNTR e a sequência de aminoácidos dos dois domínios VNTR é as posições 90 e 130 de SEQ ID NO: 14 ou posições 60 e 100 de SEQ ID NO: 15.
[0013] Em um aspecto, o ED de MUC1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 116-173 de SEQ ID NO: 2; posições 107-164 de SEQ ID NO: 4; posições 107-164 de SEQ ID NO: 6; posições 98-155 de SEQ ID NO: 8; posições 1098-1155 de SEQ ID NO: 11; posições 32-89 de SEQ ID NO: 14; posições 2-59 de SEQ ID NO: 15; e uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 humana diferente. Em um aspecto, o ED de MUC1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica às posições 32-89 de SEQ ID NO: 14 ou posições 2 - 59 de SEQ ID NO: 15. Em um aspecto, o ED de MUC1 tem uma sequência de aminoácidos das posições 32-89 de SEQ ID NO: 14 ou posições 2-59 de SEQ ID NO: 15. Em um aspecto, o SEA/ED de MUC1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 115-173 de SEQ ID NO: 2; posições 106-164 de SEQ ID NO: 4; posições 106-164 de SEQ ID NO: 6; posições 97-155 de SEQ ID NO: 8; posições 1097-1155 de SEQ ID NO: 11; posições 31-89 de SEQ ID NO: 14; posições 1-59 de SEQ ID NO: 15 e uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 humana diferente. Em um aspecto, o SEA/ED de MUC1 tem uma sequência de aminoácidos das posições 31-89 de SEQ ID NO: 14 ou posições 1-59 de SEQ ID NO: 15.
[0014] Em um aspecto, o domínio TM de MUC1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 174 - 201 de SEQ ID NO: 2, posições 165-192 de SEQ ID NO: 4, posições 165-192 de SEQ ID NO: 6, posições 156-183 de SEQ ID NO: 8, posições 1156-1183 de SEQ ID NO: 11, posições 131-158 de SEQ ID NO: 14, posições 101-128 de SEQ ID NO: 15 e uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 humana diferente. Em um aspecto, o domínio TM de MUC1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica às posições 131-158 de SEQ ID NO: 14 ou posições 101-128 de SEQ ID NO: 15. Em um aspecto, o domínio TM de MUC1 tem uma sequência de aminoácidos das posições 131-158 de SEQ ID NO: 14 ou posições 101-128 de SEQ ID NO: 15.
[0015] Em um aspecto, o domínio CD de MUC1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 202 - 273 de SEQ ID NO: 2, posições 193-264 de SEQ ID NO: 4, posições 193-264 de SEQ ID NO: 6, posições 184-255 de SEQ ID NO: 8, posições 1184-1255 de SEQ ID NO: 11, posições 159-230 de SEQ ID NO: 14, posições 129-200 de SEQ ID NO: 15, posições 7-78 de SEQ ID NO: 17, posições 79-150 de SEQ ID NO: 17, posições 151-222 de SEQ ID NO: 17, posições 1-72 de SEQ ID NO: 18, posições 73-144 de SEQ ID NO: 18, posições 145-216 de SEQ ID NO: 18 e uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 humana diferente. Em um aspecto, o domínio CD de MUC1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos das posições 159-230 de SEQ ID NO: 14 ou posições 129-200 de SEQ ID NO: 15. Em um aspecto, o domínio CD de MUC1 tem uma sequência de aminoácidos das posições 159-230 de SEQ ID NO: 14 ou posições 129-200 de SEQ ID NO: 15.
[0016] Em um aspecto dessa modalidade da invenção, o antigen MUC1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à SEQ ID NO: 15. Em um aspecto, o antígeno MUC1 compreende SEQ ID NO: 15 ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 15. Em um aspecto, o antígeno MUC1 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
[0017] Em um aspecto dessa modalidade da invenção, a proteína de fusão compreende ainda uma sequência sinalizadora de MUC1 presa ao N-término do SEA/ED de MUC1. Em um aspecto, a sequência sinalizadora de MUC1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 1-27 de SEQ ID NO: 2, posições 1-32 de SEQ ID NO: 4, posições 1-32 de SEQ ID NO: 6, posições 1-27 de SEQ ID NO: 8, posições 1-23 de SEQ ID NO: 11, posições 1-30 de SEQ ID NO: 14 e uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 humana diferente. Em um aspecto, a sequência sinalizadora de MUC1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos das posições 1-30 de SEQ ID NO: 14. Em um aspecto, a sequência sinalizadora de MUC1 tem uma sequência de aminoácidos das posições 1-30 de SEQ ID NO: 14. Em um aspecto, a proteína de fusão tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à SEQ ID NO: 14. Em um aspecto, a proteína de fusão compreende SEQ ID NO: 14 ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 14. Em um aspecto, a proteína de fusão tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
[0018] Em um aspecto dessa modalidade da invenção, o antigen MUC1 compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou mais substituições de aminoácidos, quando comparado com uma sequência de MUC1 de tipo silvestre, para formar entre um e 11 epítopos agonistas dentro do antígeno MUC-1, também referido aqui como um antígeno agonista MUC1. Em um aspecto desta modalidade da invenção, as substituições de aminoácidos são selecionadas de: A96Y, P97L , G104V, S105Y, T106L, A147Y, C161V, T199L, D200F, S215Y e T239L, em relação à porção do antígeno MUC-1 de SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15. Em um aspecto, o antígeno agonista MUC1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à SEQ ID NO: 23. Em um aspecto, o antígeno MUC1 compreende SEQ ID NO: 23 ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 23. Em um aspecto, o antígeno MUC1 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. A composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura de acordo com a Reivindicação 1, em que o antígeno MUC1 compreende entre uma e onze substituições de aminoácidos para criar um antígeno agonista MUC1.
[0019] Uma outra modalidade da invenção se refere a uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura compreendendo: (a) um veículo de levedura e (b) uma proteína de fusão expressa por leveduras e o veículo, compreendendo pelo menos um antígeno de MUC-1. O antígeno MUC1 consiste em dois ou mais domínios citoplasmáticos (Cytoplasmic Domain - CD) de MUC1. Em um aspecto, o antígeno MUC1 consiste em três domínios citoplasmáticos (Cytoplasmic Domain - CD) de MUC1. Em um aspecto, os três CDs são da mesma proteína MUC1. Em um aspecto, cada domínio CD compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 202-273 de SEQ ID NO: 2, posições 193-264 de SEQ ID NO: 4, posições 193-264 de SEQ ID NO: 6, posições 184-255 de SEQ ID NO: 8, posições 1184-1255 de SEQ ID NO: 11, 159 posições 159-230 de SEQ ID NO: 14, posições 129-200 de SEQ ID NO: 15, posições 7-78 de SEQ ID NO: 17, posições 79-150 de SEQ ID NO: 17, posições 151-222 de SEQ ID NO: 17, posições 1-72 de SEQ ID NO: 18, posições 73-144 de SEQ ID NO: 18, posições 145-216 de SEQ ID NO: 18 e uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 humana diferente. Em um aspecto, cada domínio CD compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 129-200 de SEQ ID NO: 15, posições 7-78 de SEQ ID NO: 17, posições 79-150 de SEQ ID NO: 17, posições 151-222 de SEQ ID NO: 17; posições 1-72 de SEQ ID NO: 18, 73 posições -144 de SEQ ID NO: 18 e posições 145-216 de SEQ ID NO: 18.
[0020] Em um aspecto desta modalidade, o antígeno MUC1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à SEQ ID NO: 18. Em um aspecto, o antígeno MUC1 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 18. Em um aspecto, o antígeno MUC1 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Em um aspecto, a proteína de fusão tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à SEQ ID NO: 17. Em um aspecto, a proteína de fusão tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 17. Em um aspecto, a proteína de fusão tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
[0021] Outra modalidade da invenção se refere a uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura compreendendo: (a) um veículo de levedura e (b) uma proteína de fusão expressa pelo veículo de levedura compreendendo pelo menos um antígeno agonista MUC1. Em um aspecto desta modalidade da invenção, o antígeno agonista MUC1 compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou mais substituições de aminoácidos quando comparado com uma sequência de MUC-1 de tipo silvestre, de modo a formar entre um e 11 epítopos agonistas dentro do antígeno MUC-1, também referido aqui como um antígeno agonista MUC1. Em um aspecto, o antígeno agonista MUC1 tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 25. Em um aspecto, o antígeno MUC1 compreende SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 25 ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 25. Em um aspecto, o antígeno MUC1 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 25.
[0022] Ainda outra modalidade da invenção se refere a um método para reduzir a carga de tumor, inibir o crescimento de tumor e/ou aumentar a sobrevivência de um indivíduo que tem um câncer que expressa MUC1. O método inclui a etapa de administração, ao indivíduo, de uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura descrita acima ou em qualquer outra parte aqui. Em um aspecto, a expressão de MUC-1 é detectada no câncer do indivíduo no momento em que a composição é administrada pela primeira vez. Em um aspecto, o indivíduo tem um câncer em estágio I. Em um aspecto, o indivíduo tem um câncer em estágio II. Em um aspecto, o indivíduo tem um câncer em estágio III. Em um aspecto, o indivíduo tem um câncer em fase IV.
[0023] Outra modalidade da invenção se refere com ao uso de qualquer uma das composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura descritas aqui para tratar uma doença. Em um aspecto, a doença é câncer.
[0024] Ainda outra modalidade da invenção se refere com ao uso de qualquer uma das composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura descritas aqui para reduzir, interromper, reverter ou prevenir a progressão de metástases de câncer em um indivíduo que tem câncer.
[0025] Ainda outra modalidade da invenção se refere com ao uso de qualquer uma das composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura descritas aqui para prevenir ou retardar o aparecimento de um câncer que expressa MUC1.
[0026] Outra modalidade da invenção se refere com ao uso de uma combinação de composições imunoterapêuticas para tratar câncer, as composições imunoterapêuticas compreendendo: (a) uma primeira composição que é qualquer uma das composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura descritas aqui e (b) pelo menos uma composição imunoterapêutica adicional compreendendo um veículo de levedura e um antígeno que não é um antígeno MUC1. Em um aspecto, o antígeno que não é um antígeno MUC1 é selecionado de Ras com mutação, antígeno carcinoembriônico (CarcinoEmbryonic Antigen - CEA) e/ou Brachyury.
[0027] Em um aspecto de qualquer uma das modalidades relacionadas a um método ou um uso relacionado com uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura descrita aqui, o indivíduo está sendo tratado ou foi tratado com outra terapia para câncer a qual pode incluir, porém sem limitações, quimioterapia, terapia de câncer objetivada, radioterapia, transferência adotiva de células T, resseção cirúrgica de um tumor do indivíduo e/ou administração de uma ou mais composições imunoterapêuticas. Em um aspecto, as composições imunoterapêuticas adicionais compreendem um segundo antígeno de câncer que é um antígeno MUC-1 ou um antígeno de câncer que não é um antígeno MUC1. Em um aspecto, as composições imunotera- pêuticas adicionais compreendem um veículo de levedura e um segundo antígeno de câncer que não inclui o antígeno MUC1. Em um aspecto, as composições imunoterapêuticas adicionais compreendem um segundo antígeno de câncer que inclui, porém sem limitações, Ras com mutação, antígeno carcinoembriônico (CarcinoEmbryonic Antigen - CEA), Brachyury, EGFR, BCR-Ab1, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GAGE, GP-100, MUC-2, PSMA, tirosinase, TRP-1 (gp75), NY-ESO-1, TRP-2, TAG72, KSA, CA-125, PSA, HER-2/neu/c-erb/B2, hTERT, p73, B-RAF, Adenomatous Polipose Coli (APC), Myc, proteína de von Hippel- Lindau (VHL), Rb-1, Rb-2, receptor de andrógeno (AR), Smad4, MDR1, Flt-3, BRCA-1, BRCA-2, PAX3-FKHR, EWS-FLI-1, HERV-H, HERV-K, TWIST, Mesotelina e/ou NGEP. Em um aspecto, o segundo antígeno de câncer é selecionado do grupo que consiste em: Ras com mutação, antígeno carcinoembriônico (CarcinoEmbryonic Antigen - CEA) e Brachyury. Em um aspecto, a composição imunoterapêutica adicional é uma vacina de vetor viral. Em um aspecto, a composição imunoterapêutica adicional é uma fusão de células dendríticas/células tumorosas.
[0028] Ainda outra modalidade da invenção se refere a um método para prevenir ou retardar o aparecimento de um câncer que expressa MUC1. O método inclui uma etapa de administração, a um indivíduo, de qualquer uma das composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura descritas aqui. Em um aspecto, o câncer não foi detectado no indivíduo. Em um aspecto, o indivíduo está em maior risco de desenvolver câncer. Em um aspecto, o indivíduo tem uma lesão pré-cancerosa. Em um aspecto, o indivíduo tem câncer, mas as células cancerosas que expressam MUC1 não foram detectadas no câncer.
[0029] Em qualquer um dos métodos ou usos relacionados a uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura descrita aqui, em um aspecto, o câncer é de origem epitelial. Em um aspecto, o câncer pode incluir, porém sem limitações: câncer de mama, câncer de intestino, câncer de estômago, câncer pancreático, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer uterino, câncer de ovário, câncer testicular, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer de próstata, melanoma, leucemia mielogênea múltipla (Multiple Myelogenous Leukemia - MML), leucemia linfocítica crônica (Chronic Lymphocytic Leukemia - CLL), leucemia mieloide aguda (Acute Myeloid Leukemia - AML), linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin, cânceres de tecidos secretores e cânceres metastáticos dos mesmos. Em um aspecto, o câncer é selecionado de câncer de mama e câncer de cólon. Em um aspecto, o câncer é selecionado de câncer de mama, câncer de cólon, câncer de pâncreas, câncer de ovário, câncer de esôfago e AML. Em um aspecto, o câncer é AML e a composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura é administrada ao doador e receptor de terapia de transplante de medula óssea (Bone Marrow Transplantation - BMT). Em um aspecto, o câncer é AML e a composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura é administrada ao indivíduo em conjunto com terapia com citarabina e antraciclina.
[0030] Em qualquer uma das modalidades da invenção descritas acima ou qualquer outra parte aqui, em um aspecto, o veículo de levedura é uma levedura inteira. Em um aspecto, o veículo de levedura é termicamente inativado. Em um aspecto, o veículo de levedura é de uma cepa mutante de levedura que produz proteínas sub-glicosiladas quando comparado com uma cepa de levedura de tipo silvestre. Em um aspecto, o antígeno MUC1 é expresso na parede celular do veículo de levedura. Em um aspecto, o antígeno MUC1 é expresso no periplasma ou citoplasma do veículo de levedura. Em um aspecto, o veículo de levedura é Saccharomyces. Em um aspecto, o veículo de levedura é Saccharomyces cerevisiae.
[0031] Em qualquer uma das modalidades da invenção descritas acima ou qualquer outra parte aqui, em um aspecto, a composição imunoterapêutica foi produzida por meio de cultura de uma levedura inteira que expressa o antígeno MUC1 em um meio que foi mantido em um nível de pH entre 5,5 e 8. Em um aspecto, o meio foi tamponado com um agente de tamponamento. Em um aspecto, a levedura foi cultivada em um meio que foi mantido em um nível de pH entre 6 e 8.
[0032] Em qualquer uma das modalidades da invenção descritas acima ou qualquer outra parte aqui, em um aspecto, a composição compreende ainda pelo menos um modificador de resposta biológica.
[0033] Em qualquer uma das modalidades da invenção descritas acima ou qualquer outra parte aqui, em um aspecto, a composição compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0034] Em qualquer uma das modalidades da invenção descritas acima ou qualquer outra parte aqui, em um aspecto, a composição foi formulada para injeção.
[0035] A Fig. 1A é uma representação esquemática que mostra a estrutura da proteína MUC1 de comprimento completo.
[0036] A Fig. 1B é um desenho esquemático que mostra a estrutura da proteína de fusão expressa na composição imunoterapêutica com base em levedura conhecida como GI-6101.
[0037] A Fig. 1C é um desenho esquemático que mostra a estrutura da proteína de fusão expressa na composição imunoterapêutica com base em levedura conhecida como GI-6104.
[0038] A Fig. 2A é uma imagem digitalizada que mostra a expressão de proteína de fusão de MUC1 por GI-6101.
[0039] A Fig. 2B é uma imagem digitalizada que mostra a expressão de proteínas de fusão de MUC1 de GI-6101 e 6104 antes e após desglicosilação.
[0040] A Fig. 2C é uma imagem digitalizada que mostra a expressão de proteína de fusão de MUC1 por GI-6104.
[0041] A Fig. 3 é uma imagem digitalizada que mostra a expressão de proteína de fusão de MUC1 por GI-6105.
[0042] A presente invenção se refere, de modo geral, à composições imunoterapêuticas com base em levedura e métodos para a prevenção e/ou tratamento de cânceres que expressam ou superexpressam mucina-1 (a qual pode ser geralmente referida aqui como "MUC1" e a qual é também conhecida ou tem sido conhecida como "antígeno DF3" ou "HMFG"). A invenção inclui o uso de uma composição imunoterapêutica com base em levedura (também designada por composição ou produto para imunoterapia com base em levedura) que compreende um veículo de levedura e novos antígenos MUC1 (também referida aqui como "composição para imunoterapia com MUC1 de levedura", "produto para imunoterapia com MUC1 de levedura" ou "composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura"). Os inventores descrevem aqui a construção e produção de novos produtos para imunoterapia com MUC1 de levedura e demonstram que a imunoterapia com MUC1 de levedura amadurece células dendríticas (DCs) humanas, aumenta a produção de citocinas por DCs que está associada à respostas imunes que se espera serem úteis no tratamento de tumores e provoca a ativação de linhagens de células T MUC1- específicas. Tomados juntos, os dados apresentados aqui mostram que a imunoterapia com MUC1 de levedura é útil para a estimulação de respostas imunes celulares MUC1-específicas (CD4+ e CD8+) e que a imunoterapia com MUC1 de levedura deverá ser útil para a prevenção e tratamento de tumores que expressam MUC1.
[0043] A imunoterapia com MUC1 de levedura é facilmente adaptável ao uso de antígenos tumorosos adicionais dentro da mesma composição de levedura ou ao uso em combinação com outros produtos imunoterapêuticos com base em levedura que objetivam outros antígenos tumorosos (sequencial ou simultaneamente) ou outros tratamentos imunoterapêuticos e/terapias para o câncer. Consequentemente, a imunoterapia com MUC1 de levedura pode ser adaptada para o tipo de câncer, o estágio do câncer, o grau do câncer, os antígenos expressos pelo tumor e o estado de saúde global do indivíduo (isto é, a terapia é facilmente personalizada) e, para o indivíduo que já tem câncer, seu uso pode ser modificado à medida que o câncer progride em um indivíduo, de modo a conferir uma eficácia máxima sobre uma variedade estágios de tumor. A imunoterapia com MUC1 de levedura oferece a oportunidade para o tratamento profilático e/ou terapêutico em uma base ampliada de uma grande variedade de cânceres.
[0044] Na verdade, a imunoterapia com MUC1 de levedura pode ser usada de modo flexível para o tratamento de vários cânceres MUC1- positivos adaptando a imunoterapia com MUC1 de levedura ao papel particular que este antígeno exerce em cada tipo de indicação de câncer. Por exemplo, uma vez que a MUC1 foi descrita como um marcador precoce de cânceres, tais como câncer de mama ou câncer de cólon, a imunoterapia com base em levedura pode ser usada profilaticamente em pacientes com hiperplasia pré-maligna da mama ou pólipos do cólon MUC1-positivos. Como outro exemplo, uma vez que a MUC1 foi associada às vias de transição epitelial-mesenquimal (Epithelial-Mesenchymal Transition - EMT) e disseminação metastática de cânceres, tais como câncer de pâncreas, câncer de ovário e câncer de esôfago, a imunoterapia com MUC1 de levedura pode ser usada como um produto terapêutico suplementar à terapia padrão de câncer para promover a interrupção de metástase em câncer de pâncreas, ovário e esôfago em estágio 3 MUC1-positivos. Como ainda outro exemplo, uma vez que foi mostrado que a MUC1 impede a diferenciação terminal por espécies reativas de oxigênio em leucemia mieloide aguda (Acute Myeloid Leukemia - AML), deste modo, permitindo a auto- renovação ilimitada destas células cancerosas, a imunoterapia com MUC1 de levedura pode ser usada como um suplemento à terapia padrão em AML MUC1-positiva para promover a apoptose e evitar a auto-renovação ilimitada de células malignas. Um ensaio clínico usando imunoterapia com MUC1 de levedura em pacientes de AML é descrito nos exemplos.
[0045] As composições de MUC1 de levedura descritas aqui induzem à respostas imunes inatas, bem como respostas imunes adaptativas contra o antígeno alvo (MUC1), incluindo respostas de células T TH17 e TH1 dependentes de CD4 e respostas de células T CD8+ antígeno-específicas, as quais incluem linfócitos T citotóxico (Cytotoxic T Lymphocyte - CTL), todos sem o uso de adjuvantes exógenos, citocinas ou outras moléculas imunoestimuladoras, muitos dos quais têm problemas de toxicidade. Além disso, as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura inibem os números e/ou a funcionalidade de células T reguladoras (Treg), deste modo, aumentando as respostas das células T efetuadoras que normalmente poderiam ser suprimidas pela presença do tumor, por exemplo. Além disso quando comparado com composições imunoterapêuticas que imunizam por meio de geração de respostas de anticorpos, acredita-se que as respostas imunes celulares antígeno-específicas, de base ampla e potentes induzidas pela imunoterapia com MUC1 de levedura sejam particularmente eficazes em células tumorosas alvo. Na verdade, vários estudos demonstraram que as abordagens imunoterapêuticas são intensificadas quando as células tumorosas são objetivadas via CTLs CD8+ que reconhecem peptídeos tumorosos no contexto de moléculas da classe I do MHC. A imunoterapia com MUC1 de levedura é altamente hábil em ativar células que apresentam antígeno e tem uma capacidade única de produzir uma resposta imune cruzada, gerando respostas de CTLs CD8+ que normalmente são eficazes contra os tumores, mesmo em face daquilo que, de outra forma, seria um ambiente supressivo. Uma vez que este tipo de imunoterapia utiliza a capacidade natural da célula que apresenta antígeno de apresentar os imunogênios relevantes, não é necessário conhecer a identidade exata de epítopos de CTL ou epítopos da classe II do MHC de MUC1 para produzir um produto imunoterapêutico eficaz de acordo com a presente invenção. Na verdade, diversos epítopos de células T CD4+ e CD8+ podem ser objetivados em uma única composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura e, assim, os produtos imunoterapêuticos de MUC1 de levedura da invenção não se limitam ao uso de peptídeos curtos. Na verdade, o uso de polipeptídeos mais longos e proteínas de fusão que contêm vários domínios do antígeno alvo nestas composições é eficaz. Consequentemente, usando a imunoterapia com MUC1 de levedura, o uso de algoritmos e fórmulas complexas para identificar epítopos de células T putativos é eliminado.
[0046] A MUC1 de levedura pode ser eficazmente usada em um protocolo de imunização (profilático ou terapêutico) sem o uso de adjuvantes, agentes imunoestimulantes ou moléculas exógenas, moléculas coestimuladoras ou citocinas, embora tais agentes possam ser incluídos se desejado. Além disso, a imunoterapia com MUC1 de levedura pode ser administrada várias vezes sem perda de eficácia, uma vez que isto pode ser problemático com outros tipos de imunoterapia.
[0047] Uma modalidade da presente invenção se refere a uma composição imunoterapêutica com base em levedura que pode ser usada para prevenir e/ou tratar cânceres caracterizados por superexpressão ou expressão de MUC-1 (incluindo cânceres que podem não conter células que expressam MUC1 detectável inicialmente, mas que podem ou conterão células que expressam MUC1 em estágios posteriores de desenvolvimento do câncer). A composição é uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura compreendendo: (a) um veículo de levedura e (b) um antígeno de câncer compreendendo um ou mais antígenos MUC1 e/ou o(s) domínio(s) imunogênico(s) dos mesmos. O antígeno MUC1 ou domínio imunogênico do mesmo é, mais tipicamente, expresso como uma proteína recombinante pelo veículo de levedura (por exemplo, por uma levedura intacta ou esferoplastos de levedura, os quais podem opcionalmente ser ainda processados em um citoplasto de levedura, ghost de levedura ou extrato de membrana de levedura ou fração da mesma), embora seja uma modalidade da invenção que um ou mais antígenos MUC1 são carregados em um veículo de levedura ou de outra forma estão em complexo com, ligados a ou misturados com um veículo de levedura administrado, conforme descrito aqui, para formar uma composição da presente invenção.
[0048] Uma "composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura" é um tipo específico de "composição imunoterapêutica com base em levedura" que contém pelo menos um antígeno MUC-1 ou domínio imunogênico do mesmo. A frase "composição imunoterapêutica com base em levedura" pode ser usada alternadamente com "produto para imunoterapia com base em levedura", "composição imunoterapêutica com base em levedura", "composição com base em levedura", "produto imunoterapêutico com base em levedura", "vacina com base em levedura" ou derivados destas frases. Uma "composição imunoterapêutica" é uma composição que desencadeia uma resposta imune suficiente para obter pelo menos um benefício terapêutico em um indivíduo. Conforme usado aqui, a composição imunoterapêutica com base em levedura se refere a uma composição que inclui um componente de veículo de levedura e que provoca uma resposta imune suficiente para obter pelo menos um benefício terapêutico em um indivíduo. Mais particularmente, uma composição imunoterapêutica com base em levedura é uma composição que inclui um componente de veículo de levedura e, tipicamente, um componente de antígeno e pode provocar ou induzir a uma resposta imune, tal como resposta imune celular incluindo, sem limitação, uma resposta imune celular mediada por células T. Em um aspecto, uma composição imunoterapêutica com base em levedura útil na presente invenção é capaz de induzir a uma resposta imune mediada por células T CD8+ e/ou CD4+ e, em um aspecto, uma resposta imune mediada por células T CD4+ e CD8+, especialmente contra um antígeno alvo (por exemplo, um antígeno de câncer). Uma resposta imune CD4+ pode incluir respostas imunes TH1, respostas imunes TH2, respostas imunes TH17 ou qualquer combinação dos precedentes. Produtos imunoterapêuticos com base em levedura são particularmente capazes de gerar respostas TH1 e TH17. A resposta imune CD8+ pode incluir uma resposta de linfócito T citotóxico (CTL) e produtos imunoterapêuticos com base em levedura são capazes de gerar tais respostas. Em um aspecto, uma composição imunoterapêutica com base em levedura modula o número e/ou a funcionalidade das células T reguladoras (Tregs) em um indivíduo. A imunoterapia com base em levedura também pode ser modificada para promover um tipo de resposta em relação a outro, por exemplo, mediante a adição de citocinas, anticorpos e/ou modulação do processo de fabricação da levedura. Opcionalmente, uma composição imunoterapêutica com base em levedura é capaz de induzir a uma resposta imune humoral.
[0049] As composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura da invenção podem ser "profiláticas" ou "terapêuticas". Quando fornecidas profilaticamente, as composições da presente invenção são fornecidas antes de desenvolvimento ou detecção de desenvolvimento de um câncer que expressa MUC1 com o objetivo de prevenir, inibir ou retardar o desenvolvimento de tumores que expressam MUC1; e/ou prevenir, inibir ou retardar metástases de tais tumores e/ou prevenir ou inibir a progressão de câncer em geral em um indivíduo. Conforme discutido aqui, a MUC1 é expressa em vários tipos de câncer. Portanto, as composições profiláticas podem ser administradas a indivíduos que parecem estar sem câncer (indivíduos saudáveis ou normais), a indivíduos com lesões pré-malignas (pré-cancerosas) e também indivíduos que têm câncer, mas nos quais MUC1 ainda não foi detectada (isto é, antes da expressão de MUC-1 por células tumorosas do câncer). Indivíduos que estão em alto risco de desenvolvimento de um câncer, particularmente um câncer no qual expressão de MUC1 e/ou metástases estão tipicamente associadas, podem ser tratados profilaticamente com uma composição da invenção. Quando fornecidas terapeuticamente, as composições imunoterapêuticas são fornecidas a um indivíduo com um câncer que expressa MUC1 com o objetivo de melhorar o câncer, tal como reduzir a carga tumoral no indivíduo; inibir o crescimento de tumor no indivíduo; aumentar a sobrevivência do indivíduo; e/ou prevenir, inibir, retardar ou reverter a progressão de câncer no indivíduo.
[0050] Tipicamente, uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura inclui um veículo de levedura e pelo menos um antígeno de câncer compreendendo um antígeno MUC1 ou domínio imunogênico do mesmo, em que o antígeno de câncer é expresso por, ligado a, carregado em ou misturado com o veículo de levedura. Em algumas modalidades, o antígeno de câncer, antígeno MUC1 ou domínio imunogênico do mesmo é fornecido como uma proteína de fusão. Várias proteínas MUC1 e proteínas de fusão adequadas para uso nas composições e métodos da invenção são descritas abaixo. Em algumas modalidades, o antígeno de câncer e o antígeno MUC-1 são o mesmo elemento. Em algumas modalidades, o antígeno de câncer inclui outros antígenos, incluindo outros antígenos de câncer, além do antígeno MUC1. Em um aspecto da invenção, uma proteína de fusão útil como um antígeno de câncer pode incluir dois ou mais antígenos, por exemplo, um antígeno MUC-1 e outro antígeno de câncer que não é um antígeno MUC1 ou dois antígenos MUC1 diferentes. Em um aspecto, a proteína de fusão pode incluir dois ou mais domínios imunogênicos de um ou mais antígenos, tais como dois ou mais domínios imunogênicos de um antígeno MUC-1 ou dois ou mais epítopos de um ou mais antígenos, tal como dois ou mais epítopos de um antígeno MUC1.
[0051] De acordo com a presente invenção, um veículo de levedura usado em uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura é qualquer célula de levedura (por exemplo, uma célula inteira ou intacta) ou um derivado da mesma (vide abaixo) que pode ser usado em conjunto com um ou mais antígenos, domínios imunogênicos dos mesmos ou epítopos dos mesmos em uma composição da presente invenção (por exemplo, uma composição terapêutica ou profilática). O veículo de levedura pode, portanto, incluir, porém sem limitações, um micro-organismo de levedura intacto (inteiro) vivo (ou seja, uma célula de levedura tendo todos os seus componentes, incluindo uma parede celular), um micro-organismo de levedura morto ou inativado intacto ou derivado de leveduras intactas, incluindo: um esferoplasto de levedura (isto é, uma célula de levedura sem uma parede celular), um citoplasto de levedura (isto é, uma célula de levedura sem uma parede celular e o núcleo), um ghost de levedura (isto é, uma célula de levedura sem uma parede celular, núcleo e citoplasma), um extrato de levedura de membrana subcelular ou fração (também referida como uma partícula de membrana de levedura e anteriormente como uma partícula de levedura subcelular), qualquer outra partícula de levedura ou um preparado de parede celular de levedura.
[0052] Esferoplastos de levedura são, tipicamente, produzidos através de digestão enzimática da parede celular de levedura. Tal método é descrito, por exemplo, em Franzusoff et al., 1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674, aqui incorporado por referência na íntegra.
[0053] Citoplastos de levedura são, tipicamente, produzidos por enucleação de células de levedura. Tal método é descrito, por exemplo, em Coon, 1978, Natl. Cancer Inst. Monogr. 48, 45-55, aqui incorporado por referência na íntegra.
[0054] Ghosts de levedura são, tipicamente, produzidos re-vedando uma célula permeabilizada ou submetida à lise e podem, mas não precisam, conter pelo menos alguns dos organelas desta célula. Tal método é descrito, por exemplo, em Franzusoff et al., 1983, J. Biol. Chem. 258, 3608-3614 e Bussey et al., 1979, Biochim. Biophys. Acta 553, 185-196, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na íntegra.
[0055] Uma partícula de membrana de levedura (extrato de membrana de levedura subcelular ou fração da mesma) se refere a uma membrana de levedura que carece de um núcleo ou citoplasma natural. A partícula pode ser de qualquer tamanho, incluindo tamanhos que vão desde o tamanho de uma membrana de levedura natural a micropartículas produzidas por ultrassom ou outros métodos de ruptura de membrana conhecidos por aqueles versados na técnica, seguido por nova vedação. Um método para a produção de extratos de membrana subcelulares de levedura é descrito, por exemplo, em Franzusoff et al., 1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674. Pode-se também utilizar frações de partículas de membranas de levedura que contêm porções de membrana de levedura e, quando o antígeno ou outra proteína recombinante é expressa pela levedura antes de preparo das partículas de membrana de levedura, o antígeno ou outra proteína de interesse. Antígenos ou outras proteínas de interesse podem ser trazidos dentro da membrana, sobre qualquer superfície da membrana ou uma combinação dos mesmos (isto é, a proteína pode estar tanto no interior quanto no exterior da membrana e/ou abrangendo a membrana da partícula de membrana de levedura). Em uma modalidade, uma partícula de membrana de levedura é uma partícula de membrana de levedura recombinante que pode ser uma membrana de levedura intacta, rompida ou rompida e novamente vedada que inclui pelo menos um antígeno desejado ou outra proteína de interesse sobre a superfície da membrana ou pelo menos parcialmente incorporada dentro da membrana.
[0056] Um exemplo de um preparado de parede celular de levedura é uma preparado de parede celular de levedura isolado que traz um antígeno sobre sua superfície ou pelo menos parcialmente incorporado dentro da parede celular, de tal modo que o preparado de parede celular de levedura, quando administrado a um animal, estimula uma resposta imune desejada contra um alvo de doença.
[0057] Qualquer cepa de levedura pode ser usada para produzir um veículo de levedura da presente invenção. Levedura são microorganismos unicelulares que pertencem a uma de três classes: Ascomycetes, Basidiomycetes e Fungi Imperfecti. Uma consideração para a seleção de um tipo de levedura para uso como um modulador imune é a patogenicidade da levedura. Em uma modalidade, a levedura é uma cepa não patogênica, tal como Saccharomyces cerevisiae. A seleção de uma cepa de levedura não patogênica minimiza quaisquer efeitos adversos para o indivíduo ao qual o veículo de levedura é administrado. No entanto, levedura patogênica pode ser usada se a patogenicidade da levedura pode ser eliminada por quaisquer meios conhecidos por aqueles versados na técnica (por exemplo, mutantes). De acordo com um aspecto da presente invenção, cepas de levedura não patogênicas são usadas.
[0058] Gêneros de leveduras que podem ser usadas na invenção incluem, porém sem limitações, Saccharomyces, Candida (que pode ser patogênica), Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Schizosaccharomyces e Yarrowia. Em um aspecto, gêneros de levedura são selecionados de Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia ou Schizosaccharomyces e, em um aspecto, Saccharomyces é usado. As espécies de leveduras que podem ser usadas na invenção incluem, porém sem limitações Saccharomyces cerevisiae, Saccharo- myces carlsbergensis, Candida albicans, Candida kefyr, Candida tropicalis, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Pichia pastoris, Rhodotorula rubra, Schizosaccharomyces pombe e Yarrowia lipolytica. Será apreciado que uma série destas espécies incluem uma variedade de subespécies, tipos, subtipos, etc., que se destinam a ser incluídos no âmbito das espécies mencionadas acima. Em um aspecto, as cepas de leveduras usadas na invenção incluem S. cerevisiae, C. albicans, H. polymorpha, P. pastoris e S. pombe. S. cerevisiae é útil, pois é relativamente fácil de manipular e é "Geralmente Reconhecido Como Seguro" ou "GRAS" para uso como aditivos alimentícios (GRAS, a FDA propôs a Norma 62FR18938, 17 de Abril de 1997). Uma modalidade da presente invenção é uma cepa de levedura que é capaz de replicar em plasmídeos em um número de cópias particularmente elevado, tal como S. cerevisiae. A cepa de S. cerevisiae é uma cepa que é capaz de suportar vetores de expressão que permitem que um ou mais antígenos alvo e/ou proteínas de fusão de antígeno e/ou outras proteínas sejam expressas em níveis elevados. Outra cepa de levedura útil na presente invenção é Saccharomyces cerevisiae W303α. Além disso, quaisquer cepas de levedura mutantes podem ser usadas na presente invenção, incluindo aquelas que exibem modificações pós-traducionais reduzidas de antigenes alvo expressos ou outras proteínas, tais como mutações em enzimas que estendem a glicosilação N-ligada. Em um aspecto da invenção, uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura é produzida usando uma cepa mutante de levedura que produz o antígeno MUC1 como uma proteína sub-glicosilada quando comparado com o mesmo antígeno produzido pela cepa de tipo selvagem (com glicosilação normal). Tal antígeno MUC1 pode ser mais similar aos antígenos MU1 expressos pelas células tumorais os quais podem, então, ser processados em epítopos de células T únicos por células que apresentam antígeno, assim, aumentando a resposta anti-tumor específica.
[0059] A composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura da invenção inclui pelo menos um antígeno de câncer compreendendo um antígeno MUC1. De acordo com a presente invenção, o uso geral do termo "antígeno" aqui se refere a: qualquer porção de uma proteína (por exemplo, peptídeo, proteína parcial, proteína de comprimento total), em que a proteína é de ocorrência natural ou derivada ou concebida sinteticamente, uma composição celular (células inteiras, lisato celular ou células rompidas), um organismo (organismo inteiro, lisato ou células rompidas) ou um carboidrato ou outra molécula ou uma porção da mesma. Um antígeno pode induzir a uma resposta imune antígeno- específica (por exemplo, uma resposta humoral e/ou uma resposta imune mediada por células) contra os mesmos ou antígenos similares que são encontrados in vitro, in vivo ou ex vivo por um elemento do sistema imune (por exemplo, células T, anticorpos).
[0060] Um antígeno pode ser tão pequeno quanto um único epítopo, um único domínio imunogênico ou maior e pode incluir vários epítopos ou domínios imunogênicos. Como tal, o tamanho do antígeno pode ser tão pequeno quanto cerca de 8-11 aminoácidos (isto é, um peptídeo) e tão grande quanto: um domínio de uma proteína, uma proteína de comprimento completo, um multímero, uma proteína de fusão, um proteína quimérica, uma célula inteira, um micro-organismo inteiro ou quaisquer porções dos mesmos (por exemplo, fragmentos de proteína (polipeptídeos) lisatos de células inteiras ou extratos de microorganismos). Antígenos úteis no produto imunoterapêutico de MUC1 de levedura da presente invenção são peptídeos, polipeptídeos, domínio(s) de proteína, subunidades de proteínas, proteínas de comprimento total, multímeros, proteínas de fusão e proteínas quiméricas. Além disso, os antígenos podem incluir carboidratos, os quais podem ser carregados em um veículo de levedura ou em uma composição da invenção. Será apreciado que, em algumas modalidades (por exemplo, quando o antígeno é expresso pelo veículo de levedura a partir de uma molécula de ácido nucleico recombinante), o antígeno é uma proteína (incluindo fragmentos, subunidades, domínios e proteínas de comprimento completo), proteína de fusão, proteína quimérica ou fragmento dos mesmos, em vez de uma célula ou micro-organismo inteiro. Para expressão em leveduras, em uma modalidade, um antígeno é uma dimensão mínima capaz de ser expressa de forma recombinante em levedura, se o antígeno é toda a proteína a ser expressa pela levedura (em outras palavras, a proteína que é expressa pela levedura, a qual pode incluir ou consistir no antígeno tem, de preferência, pelo menos 25 aminoácidos de comprimento) e tem, tipicamente, pelo menos ou é maior do que 25 aminoácidos de comprimento ou pelo menos ou maior do que 26 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 27 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 28 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 29 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 30 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 31 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 32 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 33 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 34 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 35 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 36 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 37 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 38 aminoácidos ácidos, pelo menos ou maior do que 39 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 40 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 41 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 42 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 43 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 44 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 45 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 46 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 47 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 48 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 49 aminoácidos, pelo menos ou maior do que 50 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 25-50 aminoácidos de comprimento, pelo menos 30-50 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 35-50 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 40-50 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 45-50 aminoácidos de comprimento, embora proteínas menores possam ser expressas e proteínas consideravelmente maiores (por exemplo, centenas de aminoácidos de comprimento ou mesmo alguns milhares de aminoácidos de comprimento) possam ser expressas. Em um aspecto, uma proteína de comprimento total ou um domínio de uma proteína que carece de entre 1 e 20 aminoácidos a partir do N- e/ou C-término pode ser expressa. Proteínas de fusão e as proteínas quiméricas são também antígenos que podem ser expressos na invenção. Um "antígeno alvo" é um antígeno que é especificamente objetivado por uma composição imunoterapêutica da invenção (isto é, um antígeno, usualmente o antígeno nativo, contra o qual a estimulação de uma resposta imune é desejada). Um "antígeno de câncer" é um antígeno que compreende pelo menos um antígeno que está associado a um câncer, tal como um antígeno expresso por uma célula tumorosa, de modo que objetivação do antígeno também objetiva a célula tumorosa e/ou câncer. Um antígeno de câncer pode incluir um ou mais antígenos de uma ou mais proteínas, incluindo uma ou mais proteínas associadas a tumores. Um "antígeno MUC1" é um antígeno derivado, concebido ou produzido a partir de uma proteína MUC1 (incluindo MUC1-N, MUC1- C ou MUC1- N e MUC1-C).
[0061] Quando de referência à estimulação de uma resposta imune, o termo "imunogênio" é um subconjunto do termo "antígeno" e, portanto, em alguns casos, pode ser usado alternadamente com o termo "antígeno". Um imunogênio, conforme usado aqui, descreve um antígeno que induz a uma resposta humoral e/ou uma resposta imune mediada por células (isto é, é imunogênico), de modo que a administração do imunogênio a um indivíduo monta uma resposta imune antígeno-específica contra o mesmo ou antígenos similares que são encontrados pelo sistema imune do indivíduo. Em uma modalidade, o imunogênio induz a uma resposta imune mediada por células, incluindo uma resposta de células T CD4+ (por exemplo, TH1, TH2 e/ou TH17) e/ou uma resposta de células T CD8+ (por exemplo, uma resposta de CTL).
[0062] Um "domínio imunogênico" ou "domínio imunológico" de um determinado antígeno pode ser qualquer parte, fragmento ou epítopo de um antígeno (por exemplo, um fragmento de peptídeo ou uma subunidade ou um epítopo de anticorpo ou outro epítopo conformacional) que contém pelo menos um epítopo que pode agir como um imunogênio quando administrado a um animal. Portanto, um domínio imunogênico é maior do que um único aminoácido e tem pelo menos um tamanho suficiente para conter pelo menos um epítopo que pode agir como um imunogênio. Por exemplo, uma única proteína pode conter vários domínios imunogênicos diferentes. Domínios imunogênicos não precisam de ser sequências lineares dentro de uma proteína, tal como no caso de uma resposta imune humoral, onde domínios conformacionais são considerados.
[0063] Um epítopo é definido aqui como um único sítio imunogênico dentro de um determinado antígeno que é suficiente para induzir a uma resposta imune quando fornecido ao sistema imune no contexto de sinais coestimuladores adequados e/ou células ativadas do sistema imune. Em outras palavras, um epítopo representa a parte de um antígeno que é reconhecida pelos componentes do sistema imune e pode também ser referido como um determinante antigênico. Aqueles versados na técnica reconhecerão que os epítopos de células T são diferentes quanto ao tamanho e composição de células B ou epítopos de anticorpos e que os epítopos apresentados através da via da classe I do MHC são diferentes, quanto ao tamanho e atributos estruturais, de epítopos apresentados pela via da classe II do MHC. Por exemplo, os epítopos de células T apresentados por moléculas da Classe I do MHC têm normalmente entre 8 e 11 aminoácidos de comprimento, enquanto que os epítopos apresentados por moléculas da Classe II do MHC têm um comprimento menos restrito e podem ter até 25 aminoácidos ou mais. Além disso, os epítopos de células T têm características estruturais previstas, dependendo das moléculas específicas do MHC ligadas pelo epítopo. Os epítopos podem ser epítopos de sequência linear ou epítopos conformacionais (regiões de ligação conservadas). A maioria dos anticorpos reconhecem epítopos conformacionais.
[0064] MUC1 (a qual também pode ser referida como "mucina-1" e também "antígeno DF3" ou "HMFG1") é uma glicoproteína grande expressa pela maioria dos tecidos secretores epiteliais em níveis basais e é expressa em níveis elevados por malignidades de origem epitelial. A MUC1 é, mais tipicamente, encontrada como proteína transmembrana de tipo I polimórfica com um grande domínio extracelular (também referido como subunidade MUC1-N) que inclui um número variável de repetições em cadeia (VNTR, normalmente entre 20 e 125 repetições) que são altamente glicosiladas através O-ligações. A proteína MUC1 é codificada como um único transcrito e, então, transformada em subunidades pós-traducionalmente, conhecidas como MUC1-N e MUC1-C ou subunidades α e β, respectivamente, as quais, então, formam uma proteína heterodimérica através de uma forte interação não covalente das duas subunidades. MUC1 é clivada em suas subunidades N- e C- dentro do domínio da "proteína de esperma de ouriço-do-mar, enteroquinase e agrina" (SEA), um domínio de proteínas altamente conservadas que foi denominado com base em sua identificação inicial de uma proteína de esperma, em enteroquinase e em agrina e que é encontrada em uma série de proteínas do tipo mucina fortemente glicosiladas que estão, tipicamente, presas à membrana. A proteína MUC1 é clivada entre glicina e serina presentes na sequência GSVVV (por exemplo, posições 1097-1101 de SEQ ID NO: 11) dentro do domínio SEA (Lillehoj et al., 2003, Biochem. Biophys. Res. Commun. 307: 743-749; Parry et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 283: 715-720; Wreschner et al., 2002, Protein Sci. 11: 698-706).
[0065] A subunidade MUC1-C inclui o domínio extracelular (ED), o qual é glicosilado e se liga ao ligante de galectina-3 o qual, por sua vez, serve como uma ponte para associar fisicamente a MUC1 ao receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e, possivelmente, outros receptores de quinase de tirosina. MUC1-C também compreende um domínio transmembrana (TM) e um domínio citoplasmático (Cytoplasmic Domain - CD) que contém vários resíduos de tirosina os quais, quando fosforilados, poderiam atuar como motivos de ligação para proteínas com domínios SH2 (para uma discussão detalhada da proteína MUC1 e funções conhecidas e putativas, vide Kufe, 2008, Cancer Biol. & Ther. 7: 81-84). Variantes de splicing alternativas de MUC1 (conhecidas como MUC-1/Y e MUC1/X, por exemplo) são versões "curtas" de MUC1 que não carecem principalmente de MUC1- N, incluindo a região VNTR grande, mas que incluem as regiões de ED, TM e CD, bem como o domínio SEA e porções da região de sequência sinalizadora da região N-terminal. Clivagem dentro do domínio SEA pode não ocorrer nestas versões curtas.
[0066] O isolamento e sequenciamento de DNA e cDNA que codifica a MUC1 humana foram reportados (vide, por exemplo, Siddiqui et al., 1998, PNAS 85:2320-2323; Abe and Kufe, 1993, PNAS 90:282286; Hareuveni et al., 1990, Eur.J. Biochem. 189(3) 475-486; Gendler et al., 1990, J. Biol. Chem. 265 (25) 15286-15293; Lan et al., 1990, J. Biol. Chem 265(25) 15294-15299; Tsarfaty et al., 1990, Gene 93(2) 313-318; Lancaster, 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun. 173(3) 1019-1029). Um exemplo de uma proteína MUC1 humana precursora de comprimento total, contendo tanto as regiões MUC1-C e MUC1-N, está descrita no N° de Acesso SwissProt P15941.3 (GI: 296439295) e é aqui representada por SEQ ID NO: 11. 10 isoformas diferentes de MUC1 podem ser criadas a partir do gene que codifica SEQ ID NO: 11 por meio de splicing de transcrito alternativo. Por exemplo, uma isoforma conhecida como MUC-1/Y carece das posições 54-1053 de SEQ ID NO: 11. Várias outras isoformas são descritas na descrição do banco de dados desta proteína.
[0067] Para fins de ilustração da identificação dos domínios dentro da proteína MUC1, a qual pode ser aplicada à qualquer proteína MUC1 humana, bem como outras proteínas MUC1 de mamíferos, os seguintes domínios podem ser facilmente identificados em SEQ ID NO: 11. A sequência sinalizadora da proteína MUC1, também referida aqui como a sequência líder, está localizada em torno das posições 1-23 de SEQ ID NO: 11 (a sequência sinalizadora de MUC1 é identificada como mais longa em algumas variantes de MUC1 e pode incluir aminoácidos adicionais, tais como as posições 1-32). A subunidade MUC1-N ou subunidade α compreende aproximadamente as posições 24-1097 de SEQ ID NO: 11 e a subunidade MUC1-C ou subunidade β compreende aproximadamente as posições 1098-1255 de SEQ ID NO: 11.
[0068] Dentro da subunidade MUC1-N, o domínio VNTR (número variável de repetições em cadeia) pode ser encontrado compreendendo múltiplas repetições nesta proteína particular, incluindo aproximadamente a região da partir da posição 126-965, a qual contém quarenta e dois repetições de 20 aminoácidos da sequência PAPGSTAPPAHGVTSAPDTR (por exemplo, posições 126-145 de SEQ ID NO: 11), a qual é a sequência de VNTR comumente reconhecida (vide também SEQ ID NO: 12 abaixo, a qual designa polimorfismos comuns dentro desta sequência). Uma vez que estas são sequências repetidas, pode-se iniciar a contagem a partir de qualquer um dos 20 aminoácidos de uma VNTR e, então, reiniciar a numeração com a repetição desse primeiro aminoácido. Mais particularmente, uma vez que um único domínio VNTR é uma sequência de cerca de 20 aminoácidos que é precedida por e/ou seguida por outra sequência de 20 aminoácidos idêntica, quase idêntica ou homóloga a qual pode estar dentro de um grande número de tais sequências repetidas, para fins de descrição de um único VNTR dentro de uma região de VNTRs, pode-se considerar a "posição 1" de um determinado VNTR como sendo qualquer um dos 20 aminoácidos do VNTR e, então, os aminoácidos de flanqueamento anteriores e posteriores serão numerados em conformidade, com o aminoácido a montante (antes) da posição 1 sendo o último aminoácido (posição 20) do VNTR do VNTR anterior ou o último aminoácido da sequência associada ao VNTR (se tal sequência anterior não é também um VNTR) e o aminoácido que está a jusante da posição 1 sendo a posição 2 desse VNTR, seguido pela posição 3 e assim por diante, até que a sequência se repita com o próximo VNTR.
[0069] As posições 61-1120 de SEQ ID NO: 11 incluem a região VNTR discutida acima, além de regiões adicionais denotadas como "regiões repetitivas". Por exemplo, as posições 81-100, posições 101120, posições 121-140, posições 141-160, posições 161-180, posições 181-200, posições 201-220, posições 221-240, posições 241-260, 261 posições -180, posições 281-300 e assim por diante, em incrementos de 20 aminoácidos através das posições 1001-1120 de SEQ ID NO: 11, representam regiões repetitivas nesta proteína.
[0070] Na proteína MUC1 de comprimento total, representada por SEQ ID NO: 11 (antes de clivagem em subunidades), o domínio SEA abrange as posições 1034-1152 de SEQ ID NO: 11. A clivagem do domínio SEA entre os aminoácidos 1097 e 1098 de SEQ ID NO: 11 produz o domínio MUC1-C. Dentro do domínio MUC1-C, o domínio extracelular (ED) é encontrado em torno das posições 1098-1155 de SEQ ID NO: 11; o domínio transmembrana (TM) é encontrado em torno das posições 1156-1183 de SEQ ID NO: 11; e o domínio citoplasmático (Cytoplasmic Domain - CD, também denominado de cauda citoplasmática) é encontrado em torno das posições 1184-1255 de SEQ ID NO: 11.
[0071] O número de VNTRs em uma dada subunidade MUC1-N é altamente polimórfico e pode variar, por exemplo, 20-125 repetições. O icosapeptídeo repetido em cadeia normalmente tem um polimorfismo em uma ou mais de três posições (posições 9, 18 e 19 de SEQ ID NO: 12): PAPGSTAP[P/A/Q/T]AHGVTSAP[DT/ES]R (SEQ ID NO: 12, as regiões entre parênteses indicam os polimorfismos comuns), onde o polimorfismo nas posições 18 e 19 de SEQ ID NO: 12 ocorrem com a preferência de DT > ES e onde as substituições únicas na posição 9 ocorrem com a seguinte preferência: P > A, P > Q e P > T. A substituição mais frequente, DT > ES, ocorre em até 50% das repetições.
[0072] Uma variedade de variantes de transcrição de MUC1 sãoconhecidas, mas as subunidades, domínios ou regiões de MUC1 descritas nem SEQ ID NO: 11 exemplificativa acima podem ser facilmente identificados nas variantes, de modo que um antígeno MUC1 útil na invenção pode ser concebido ou produzido com base em uma determinada sequência de MUC1 ou uma sequência correspondente de outra proteína MUC1. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína MUC1 humana é aqui representada por SEQ ID NO: 1, a qual corresponde ao N° de Acesso GENBANK® NM_002456.4 (GI: 65301116). SEQ ID NO: 1 codifica uma proteína MUC1 humana de 273 aminoácidos (variante de transcrição 1, também conhecida como MUC1/ZD), a sequência de aminoácidos da qual é aqui representada como SEQ ID NO: 2 (também encontrada em N° de Acesso GenBank® NP_002447.4; GI: 65301117). Dentro de SEQ ID NO: 2, os seguintes domínios estão presentes: sequência sinalizadora (posições 1-27 de SEQ ID NO: 2); domínio SEA (posições 55-170 de SEQ ID NO: 2); ED (posições 116-173 de SEQ ID NO: 2); domínio TM (posições 174-201 de SEQ ID NO: 2) e CD (posições 202-273 de SEQ ID NO: 2). O sítio de clivagem proteolítica dentro do domínio SEA que cliva o domínio ED da porção N-terminal do domínio SEA está entre as posições 115 e 116 de SEQ ID NO: 2. Esta variante de transcrição não contém a região VNTR, conforme mostrado em SEQ ID NO: 11.
[0073] Uma outra sequência de nucleotídeos que codifica outra proteína MUC1 humana é aqui representada por SEQ ID NO: 3, a qual corresponde ao N° de Acesso GENBANK® NM_001018016.1 (GI: 67189006). SEQ ID NO: 3 codifica uma proteína MUC1 humana de 264 aminoácidos (variante de transcrição 2, também conhecida como "MUC1/Y"), a sequência de aminoácidos da qual é aqui representada como SEQ ID NO: 4 (também encontrada em N° de Acesso GENBANK® NP_001018016.1; GI: 67189007). Dentro de SEQ ID NO: 4, os seguintes domínios estão presentes: sequência sinalizadora (posições 1-32 de SEQ ID NO: 4); domínio SEA (posições 45-161 de SEQ ID NO: 4); ED (107-164 de SEQ ID NO: 4); domínio TM (posições 165-192 de SEQ ID NO: 4) e CD (posições 193-264 de SEQ ID NO: 4). O sítio de clivagem proteolítica dentro do domínio SEA que cliva o domínio ED da porção N-terminal do domínio SEA está entre as posições 106 e 107 de SEQ ID NO: 4. Esta variante de transcrição não contém a região VNTR, conforme mostrado em SEQ ID NO: 11.
[0074] Uma outra sequência de nucleotídeos que codifica outra proteína MUC1 humana é aqui representada por SEQ ID NO: 5, a qual corresponde ao N° de Acesso GENBANK® AY327587.1 (GI: 33150003). SEQ ID NO: 5 codifica uma proteína MUC1 humana de 264 aminoácidos (variante de transcrição 2, também conhecida como "MUC1/Y"), a sequência de aminoácidos da qual é aqui representada como SEQ ID NO: 6 (também encontrada no N° de Acesso GenBank® AAP97018.1 (GI: 33150004). Dentro de SEQ ID NO: 6, os seguintes domínios estão presentes: sequência sinalizadora (posições 1-32 de SEQ ID NO: 6); domínio SEA (posições 45-161 de SEQ ID NO: 6); ED (posições 107-164 de SEQ ID NO: 6); domínio TM (posições 165-192 de SEQ ID NO: 6) e CD (posições 193-264 de SEQ ID NO: 6.) O sítio de clivagem proteolítica dentro do domínio SEA que cliva o domínio ED da porção N-terminal do domínio SEA está entre as posições 106 e 107 de SEQ ID NO: 6. Esta variante de transcrição não contém a região VNTR, conforme mostrado em SEQ ID NO: 11. SEQ ID NO:. 6 é 99% idêntica à SEQ ID NO: 4, o que ilustra o elevado grau de homologia entre sequências de MUC1 de diferentes fontes.
[0075] Uma outra sequência de nucleotídeos que codifica outra proteína MUC1 humana é aqui representada por SEQ ID NO: 7, a qual corresponde ao N° de Acesso GENBANK® NM_001018017 (GI: 324.120.954). SEQ ID NO: 7 codifica uma proteína MUC1 humana de 255 aminoácidos (variante de transcrição 3), a sequência de aminoácidos da qual é aqui representada como SEQ ID NO: 8 (também encontrada em N° de Acesso GenBank® NP_001018017.1; GI: 67189069). Dentro de SEQ ID NO: 8, os seguintes domínios estão presentes: sequência sinalizadora (posições 1-27 de SEQ ID NO: 8); domínio SEA (posições 36-152 de SEQ ID NO: 8); ED (posições 98-155 de SEQ ID NO: 8); domínio TM (posições 156-183 de SEQ ID NO: 8) e CD (posições 184-255 de SEQ ID NO: 8). O sítio de clivagem proteolítica dentro do domínio SEA que cliva o domínio ED da porção N-terminal do domínio SEA está entre as posições 97 e 98 de SEQ ID NO: 6. Esta variante de transcrição não contém a região VNTR, conforme mostrado em SEQ ID NO: 11.
[0076] MUC1 humana tem uma elevada homologia pela proteína MUC1 de outras espécies de animais e, consequentemente, pode-se esperar que seja capaz de identificar os domínios dentro de uma determinada proteína MUC1 com base em comparação de sequências. Além disso, pode-se usar determinadas sequências de MUC1 de outras espécies de animais e espécies de mamíferos em particular no preparo de uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura da invenção, particularmente onde estas sequências são idênticas ou substancialmente homólogas e estas sequências induzem a uma resposta imune eficaz contra o antígeno alvo (por exemplo, MUC1 nativa expressa por uma célula tumorosa). Por exemplo, uma proteína MUC1 de murino é aqui representada pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO: 9 corresponde ao N° de Acesso GENBANK® NM_013605 (GI: 7305292). SEQ ID NO: 9 codifica uma proteína MUC1 de murino de 631 aminoácidos, a sequência de aminoácidos da qual é aqui representada como SEQ ID NO: 10 (também encontrada em N° de Acesso GenBank® NP_038633; GI: 7305293). Dentro de SEQ ID NO: 10, os seguintes domínios estão presentes: sequência sinalizadora (aproximadamente posições 1-20 de SEQ ID NO: 10); VNTR (identificável dentro das posições 21-425 de SEQ ID NO: 10); domínio SEA (posições 426 -528 de SEQ ID NO: 10); ED (posições 475-536 de SEQ ID NO: 10); domínio TM (posições 531559 de SEQ ID NO: 10) e CD (posições 560-631 de SEQ ID NO: 10). O sítio de clivagem proteolítica dentro do domínio SEA que cliva o domínio ED da porção N-terminal do domínio SEA está entre as posições 474 e 475 de SEQ ID NO: 10. Para ilustrar o nível de conservação de sequências de MUC1 dentro dos domínios, o domínio SEA de MUC1 de murino de SEQ ID NO: 10 é 62% idêntico e 68% homólogo ou positivo (conforme definido pelo BLAST) ao domínio SEA de MUC1 humana de SEQ ID NO: 11. O ED de MUC1 de murino de SEQ ID NO: 10 é 56% idêntico e 73% homólogo ao ED de proteína MUC1 humana de SEQ ID NO: 11. O domínio TM de MUC1 de murino de SEQ ID NO: 10 é 89% idêntico e 93% homólogo ao domínio TM de MUC1 humana de SEQ ID NO: 11. O CD de MUC1 de murino de SEQ ID NO: 10 é 88% idêntico e 88% homólogo ao CD de MUC1 humana de SEQ ID NO: 11.
[0077] MUC1 humana, incluindo as proteínas MUC1 humanas e antígenos MUC1 descritos aqui, contém vários epítopos de células T CD4+ e CD8+. Tais epítopos de células T foram descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos N° 6.546.643, Patente dos Estados Unidos N° 7.118.738, Patente dos Estados Unidos N° 7.342.094, Patente dos Estados Unidos N° 7.696.306 e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 2008/0063653.
[0078] Em uma modalidade da invenção, um antígeno MUC1 compreende ou é consiste em uma proteína de fusão compreendendo vários domínios de uma proteína MUC1. Em uma modalidade, o antígeno é derivado de MUC1 ou concebido a partir de porções da subunidade MUC1-C. Em uma modalidade, o antígeno MUC1 é derivado ou concebido a partir de porções da subunidade MUC1-IN. Em uma modalidade, o antígeno é derivado de MUC1 ou concebido a partir de porções de ambas as subunidades MUC1-C e MUC1-N.
[0079] Em uma modalidade da invenção, uma proteína de fusão útil em uma composição imunoterapêutica com base em levedura da invenção inclui pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro ou pelo menos cinco dos seguintes antígenos MUC1, dispostos em qualquer ordem dentro da proteína de fusão e qualquer um dos quais pode ser repetido duas ou mais vezes dentro da proteína de fusão (por exemplo, uma combinação de dois ou mais segmentos de CD): (1) uma sequência sinalizadora de MUC1, (2) pelo menos uma porção de um domínio SEA de MUC1 e/ou pelo menos uma porção do domínio extracelular (ED) de MUC1ou um domínio imunogênico do mesmo o qual pode incluir, em um aspecto, a maior parte ou todo o ED que flanqueia um ou mais aminoácidos de flanqueamento a partir do domínio SEA, (3) pelo menos dois domínios VNTR, (4) pelo menos um domínio transmembrana ou domínio imunogênico de MUC1 e (5) pelo menos um domínio citoplasmático (Cytoplasmic Domain - CD) de proteína MUC1 ou domínio imunogênico do mesmo. Tal proteína de fusão não é e não compreende uma proteína MUC1 de comprimento total (isto é, não inclui uma subunidade MUC1-N completa e uma subunidade MUC1-C completa) e tal proteína de fusão não compreende uma subunidade MUC1-N de comprimento completo. Em um aspecto, tal proteína de fusão não contém uma subunidade MUC1-C completa. Em um aspecto, os segmentos da proteína de fusão (por exemplo, proteínas ou domínios, incluindo domínios imunogênicos de MUC1) estão dispostos em uma ordem diferente da disposição dos segmentos que ocorreria em uma proteína MUC1 de tipo selvagem ou nativa.
[0080] A sequência sinalizadora de MUC-1 (ou sequência líder) útil em uma proteína de fusão descrita acima ou em qualquer outra parte aqui pode ser uma sequência sinalizadora de qualquer proteína MUC1 e, em um aspecto, é de uma proteína MUC1 humana. Em um aspecto da invenção, a sequência sinalizadora de MUC1 usada em uma proteína de fusão da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que inclui ou que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 1-27 de SEQ ID NO: 2, posições 1-32 de SEQ ID NO: 4, posições 1-32 de SEQ ID NO: 6, posições 1-27 de SEQ ID NO: 8, posições 1-23 de SEQ ID NO: 11, posições 1-30 de SEQ ID NO: 14, uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 diferente, tal como outra proteína MUC1 humana ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à qualquer uma destas sequências de aminoácidos. A sequência sinalizadora de MUC1 está, em um aspecto da invenção, colocada na extremidade N-terminal de uma proteína de fusão útil na presente invenção. Em um aspecto da invenção, uma sequência não MUC-1 é usada em lugar de (em vez de) uma sequência sinalizadora de MUC1, tal como qualquer um dos peptídeos sintéticos N-terminais e os peptídeos derivados de levedura descritos a seguir para uso com uma proteína de fusão da invenção.
[0081] Uma proteína MUC1 de esperma de ouriço-do-mar, enteroquinase e agrina (SEA) útil em uma proteína de fusão descrita acima ou em qualquer outra parte aqui pode ser um domínio SEA ou uma porção do mesmo que inclui pelo menos um domínio imunogênico de qualquer proteína MUC1 e, em um aspecto, é de uma proteína MUC1 humana. Em um aspecto da invenção, uma porção de domínio SEA de MUC1 útil em uma proteína de fusão da invenção compreende pelo menos a sequência de aminoácidos do domínio extracelular (ED) de MUC1, mas pode excluir sequência a montante do domínio ED. Em um aspecto da invenção, o domínio SEA de MUC1 usado em uma proteína de fusão da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que inclui ou que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 55-170 ou posições 116-170 de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 45-161 ou posições 107-161 de SEQ ID NO: 4 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 45-161 ou posições 107-161 de SEQ ID NO: 6 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 36-152 ou posições 98-152 de SEQ ID NO: 8 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 1034-1152 ou posições 1098-1152 de SEQ ID NO: 11 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 31-86 de SEQ ID NO: 14 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 1-56 de SEQ ID NO: 15 ou pelo menos um domínio imunogênico, uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 diferente, tal como outra proteína MUC1 humana ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à qualquer uma destas sequências de aminoácidos.
[0082] Um domínio extracelular (ED) de MUC1 útil em uma proteína de fusão descrita acima ou em qualquer outra parte aqui pode ser um ED ou uma porção do mesmo que inclui pelo menos um domínio imunogênico de qualquer proteína MUC1 e, em um aspecto, é de uma proteína MUC1 humana. Em um aspecto da invenção, o ED de proteína MUC1 usado em uma proteína de fusão da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que inclui ou que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 116-173 de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 107-164 de SEQ ID NO: 4 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 107-164 de SEQ ID NO: 6 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 98-155 de SEQ ID NO: 8 ou a pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 1098-1155 de SEQ ID NO: 11 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 32-89 de SEQ ID NO: 14 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 2-59 de SEQ ID NO: 15 ou pelo menos um domínio imunogênico, uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 diferente, tal como outra proteína MUC1 humana ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à qualquer uma destas sequências de aminoácidos.
[0083] Um domínio com número variável de repetições aleatóriasúnica (VNTR) de MUC1 útil em uma proteína de fusão descrita acima ou em qualquer outra parte aqui pode ser um domínio VNTR de qualquer proteína MUC1 e, em um aspecto, é de uma proteína MUC1 humana. Em um aspecto da invenção, o domínio VNTR de MUC1 usado em uma proteína de fusão da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que inclui ou que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 126-145 de SEQ ID NO: 11, 20, qualquer amino consecutivo ácidos entre as posições 61 e 1020 de SEQ ID NO: 11 ou quaisquer 20 aminoácidos consecutivos entre as posições 126 e 965 de SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12 (incluindo qualquer um dos polimorfismos dentro de SEQ ID NO: 12 conforme descrito acima), quaisquer 20 aminoácidos consecutivos entre as posições 90 e 130 de SEQ ID NO: 14, quaisquer 20 aminoácidos consecutivos entre as posições 60 e 100 de SEQ ID NO: 15, uma sequência VNTR correspondente de uma proteína MUC1 diferente, tal como outra proteína MUC1 humana ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à qualquer uma destas sequências de aminoácidos.
[0084] Um domínio transmembrana (TM) de MUC1 útil em uma proteína de fusão descrita acima ou em qualquer outra parte aqui pode ser um domínio TM ou uma porção do mesmo que inclui pelo menos um domínio imunogênico de qualquer proteína MUC1 e, em um aspecto, é de uma proteína MUC1 humana. Em um aspecto da invenção, o domínio TM de MUC1 usado em uma proteína de fusão da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que inclui ou que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 174-201 de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos um imunogênico domínio dos mesmos, posições 165-192 de SEQ ID NO: 4 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 165-192 de SEQ ID NO: 6 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 156-183 de SEQ ID NO: 8 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 1156-1183 de SEQ ID NO: 11 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 131-158 de SEQ ID NO: 14 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 101-128 de SEQ ID NO: 15 ou pelo menos um domínio imunogênico, uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 diferente, tal como outra proteína MUC1 humana ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à qualquer uma destas sequências de aminoácidos.
[0085] Um domínio citoplasmático (Cytoplasmic Domain - CD) de MUC1 útil em uma proteína de fusão descrita acima ou em qualquer outra parte aqui pode ser um CD ou uma porção do mesmo que inclui pelo menos um domínio imunogênico de qualquer proteína MUC1 e, em um aspecto, é de uma proteína MUC-1 humana. Em um aspecto da invenção, o CD de MUC1 usado em uma proteína de fusão da presente invenção tem uma sequência de aminoácidos que inclui ou que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 202-273 de SEQ ID NO: 2 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 193-264 de SEQ ID NO: 4 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 193-264 de SEQ ID NO: 6 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 184-255 de SEQ ID NO: 8 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 1184-1255 de SEQ ID NO: 11 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 159-230 de SEQ ID NO: 14 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 129-200 de SEQ ID NO: 15 ou pelo menos um domínio imunogênico da mesma, posições 7-78 ou posições 79-150 ou posições 151-222 de SEQ ID NO: 17 ou pelo menos um domínio imunogênico, posições 1-72 ou posições 73-144 ou 145 posições -216 de SEQ ID NO: 18 ou um domínio imunogênico, uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 diferente, tal como outra proteína MUC1 humana ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à qualquer uma destas sequências de aminoácidos.
[0086] Em uma modalidade da invenção, uma proteína de fusão útil em uma composição imunoterapêutica com base em levedura da invenção inclui os seguintes antígenos MUC1, na ordem do N- para o C-término: (1) uma porção de um domínio SEA de proteína MUC1 e um domínio extracelular (ED) de MUC1 que inclui a maioria ou todos o ED da proteína MUC1, (2), pelo menos dois domínios VNTR, (3) um domínio transmembrana de MUC1 e (4) um domínio citoplasmático de MUC1 (CD). Em uma modalidade, a proteína de fusão inclui os seguintes antígenos MUC1, na ordem do N- para o C-término: (1) uma sequência sinalizadora de MUC1, (2) uma porção de um domínio SEA de proteína MUC1 e um domínio extracelular (ED) de MUC1 que inclui a maioria ou todo o ED da proteína MUC1, (3) pelo menos dois domínios VNTR, (4) um domínio transmembrana de MUC1 e (5) um domínio citoplasmático de MUC1 (CD). Elementos adicionais ou alternativos a serem incluídos em uma proteína de fusão da invenção podem incluir peptídeos N-terminais e/ou C-terminais que melhoram ou auxiliam na expressão ou estabilidade e/ou permitem a identificação e/ou purificação da proteína de fusão e/ou sequências ligantes intervenientes curtas (por exemplo, peptídeos de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos) entre os segmentos da proteína de fusão que podem ser úteis para a introdução de sítios de enzimas de restrição para facilitar a clonagem, tal como sítios de clivagem para proteases fagossômicas do hospedeiro, para acelerar o processamento de proteínas ou antígeno e a futura manipulação dos construtos. Esses elementos são descritos em detalhes abaixo.
[0087] Um exemplo de tal proteína de fusão que é útil em uma composição imunoterapêutica com base em levedura da invenção compreende ou inclui os seguintes antígenos MUC1, na ordem do N- para o C-término:
[0088] um domínio extracelular (ED) de MUC1 que pode ter, na extremidade N-terminal, um, dois, três, quatro, cinco ou mais aminoácidos que flanqueiam a porção não ED do domínio AAE que reside a montante do ED na proteína de tipo silvestre, na qual o segmento de ED compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 116-173 de SEQ ID NO: 2 ou posições 107-164 de SEQ ID NO: 4; posições 107-164 de SEQ ID NO: 6; posições 98-155 de SEQ ID NO: 8; posições 1098-1155 de SEQ ID NO: 11; posições 32-89 de SEQ ID NO: 14; posições 2-59 de SEQ ID NO: 15; uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 diferente, tal como outra proteína MUC1 humana ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à qualquer uma destas sequências de aminoácidos;
[0089] pelo menos dois domínios VNTR, em que cada um dos domínios VNTR compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 126-145 de SEQ ID NO: 11, todos os 20 aminoácidos consecutivos entre as posições 61 e 1020 de SEQ ID NO: 11 ou quaisquer 20 aminoácidos consecutivos entre as posições 126 e 965 de SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12 (incluindo qualquer um dos polimorfismos dentro de SEQ ID NO: 12 conforme descrito acima), quaisquer 20 aminoácidos consecutivos entre as posições 90 e 130 de SEQ ID NO: 14, todos os 20 aminoácidos consecutivos entre as posições 60 e 100 de SEQ ID NO: 15, uma sequência que corresponde ao VNTR de uma proteína MUC1 diferente, tal como outra proteína MUC1 humana ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à qualquer uma destas sequências de aminoácidos;
[0090] um domínio transmembrana (TM) de proteína MUC1, em que o domínio TM compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 174-201 de SEQ ID NO: 2, posições 165-192 de SEQ ID NO: 4, 165 posições -192 de SEQ ID NO: 6, posições 156-183 de SEQ ID NO: 8, posições 1156-1183 de SEQ ID NO: 11, posições 131-158 de SEQ ID NO: 14, posições 101-128 de SEQ ID NO: 15, de uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 diferente, tal como outra proteína MUC1 humana ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à qualquer uma destas sequências de aminoácidos, e
[0091] um domínio citoplasmático de MUC1 (CD), em que o CD compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 202-273 de SEQ ID NO: 2, posições 193-264 de SEQ ID NO: 4, posições 193 - 264 de SEQ ID NO: 6, posições 184- 255 de SEQ ID NO: 8, posições 1184-1255 de SEQ ID NO: 11, posições 159-230 de SEQ ID NO: 14, posições 129-200 de SEQ ID NO: 15, posições 7-78 ou posições 79-150 ou posições 151-222 de SEQ ID NO: 17; posições 1-72 ou posições 73-144 ou posições 145-216 de SEQ ID NO: 18, uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 diferente, tal como outra proteína MUC1 humana ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à qualquer um estas sequências de aminoácidos.
[0092] Em um aspecto desta variante, uma proteína de fusão que é útil em uma composição imunoterapêutica com base em levedura da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO: 14 inclui os seguintes antígenos MUC1, na ordem do N- para o C-término: (1) uma sequência sinalizadora de MUC1 (posições 1-30 de SEQ ID NO: 14), (2) um segmento SEA/ED de MUC1 (posições 31-89 de SEQ ID NO: 14), (3) um segmento VNTR que compreende dois domínios VNTR (posições 90-130 de SEQ ID NO: 14), (4) um domínio TM de MUC1 (posições 131158 de SEQ ID NO: 14), (5) um CD de MUC1 (posições 159-230 de SEQ ID NO: 14) e (6) um marcador de histidina hexapeptídico (posições 231-236 de SEQ ID NO: 14). SEQ ID NO: 14 é codificada pela sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 13. SEQ ID NO: 15 inclui os seguintes antígenos MUC1, na ordem do N- para o C-término: (1) um segmento de SEA/ED de MUC1 (posições 1-59 de SEQ ID NO: 15), (2) um segmento VNTR que compreende dois domínios VNTR (posições 60-100 de SEQ ID NO: 15), (3) um domínio TM de MUC1 (posições 101128 de SEQ ID NO: 15) e (4) um CD de MUC1 (posições 129-200 de SEQ ID NO: 15). Opcionalmente, a proteína de fusão de SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15 inclui um peptídeo N-terminal que é um peptídeo N-terminal sintético concebido para conferir resistência à degradação proteossômica e estabilizar a expressão representada por SEQ ID NO: 21 ou um peptídeo N-terminal de uma sequência líder de fator alfa de levedura, tal como SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20 ou outro peptídeo N-terminal adequado para uso com um produto imunoterapêutico com base em levedura, conforme descrito aqui. Também opcionalmente, um ou mais peptídeos ligantes de um, dois, três ou mais aminoácidos, tal como o ligante de dois aminoácidos Tre-Ser, podem ser inseridos entre os segmentos da proteína de fusão. O marcador de hexa-histidina na extremidade C-terminal da proteína de fusão também é opcional.
[0093] Em uma modalidade da invenção, uma proteína de fusão útil em uma composição imunoterapêutica com base em levedura da invenção inclui os seguintes antígenos MUC1, na ordem do N- para o C-término: (1) pelo menos dois domínios VNTR e (2) uma porção de um domínio SEA de proteína MUC1 e um domínio extracelular (ED) de MUC1, que inclui a maior parte ou toda a proteína MUC1. Tal proteína de fusão pode incluir porções complementares da região de MUC1-N que flanqueia os domínios VNTR. Tal proteína de fusão não inclui uma subunidade MUC1-N inteira.
[0094] Em outra modalidade da invenção, uma proteína de fusão útil em uma composição imunoterapêutica com base em levedura da invenção inclui os seguintes antígenos MUC1, na ordem do N- para o C-término: (1) um primeiro domínio citoplasmático (CD) de MUC1, (2) um segundo domínio citoplasmático de MUC1 (CD) e (3) um terceiro domínio citoplasmático de MUC1 (CD). Em uma modalidade, domínios citoplásmicos de MUC1 adicionais podem ser incluídos em tal proteína de fusão. Em uma modalidade, pelo menos um dos CDs de MUC1 é proveniente de uma fonte diferente dos outros CDs de MUC1 (por exemplo, um CD de MUC1 é de uma primeira proteína MUC1 humana e um CD de MUC1 é de uma segunda proteína MUC1, em que poderão existir diferenças de sequência entre os primeiro e segundo CDs de MUC1). Em uma modalidade, esta proteína de fusão possui, na extremidade N-terminal, uma sequência sinalizadora de MUC1. Em outra modalidade, esta proteína de fusão pode incluir peptídeos N- terminais e/ou C-terminais que melhoram ou auxiliam na expressão ou estabilidade e/ou para permitem a identificação e/ou purificação da proteína de fusão e/ou sequências ligantes intervenientes curtas (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 peptídeos de aminoácidos) entre os segmentos da proteína de fusão que podem ser úteis para a introdução de sítios de enzimas de restrição para facilitar a clonagem, tais como sítios de clivagem para proteases fagossômicas do hospedeiro, para acelerar o processamento de proteína ou antígeno e para futura manipulação dos construtos.
[0095] Um exemplo de tal proteína de fusão que é útil em uma composição imunoterapêutica com base em levedura da invenção compreende ou inclui os seguintes antígenos MUC1, na ordem do N- para o C-término:
[0096] um primeiro domínio citoplasmático (Cytoplasmic Domain - CD) de MUC1, em que o CD compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 202-273 de SEQ ID NO: 2, posições 193-264 de SEQ ID NO: 4, 193 posições -264 de SEQ ID NO: 6, posições 184-255 de SEQ ID NO: 8, posições 1184-1255 de SEQ ID NO: 11, posições 159-230 de SEQ ID NO: 14, posições 129200 de SEQ ID NO: 15, posições 7-78 ou posições 79-150 ou posições 151-222 de SEQ ID NO: 17; posições 1-72 ou posições 73-144 ou posições 145-216 de SEQ ID NO: 18, uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 diferente, tal como outra proteína MUC1 humana ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à qualquer uma destas sequências de aminoácidos;
[0097] um segundo domínio citoplasmático (Cytoplasmic Domain - CD) de proteína MUC1, em que o CD compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 202-273 de SEQ ID NO: 2, posições 193-264 de SEQ ID NO: 4, 193 posições -264 de SEQ ID NO: 6, posições 184-255 de SEQ ID NO: 8, posições 1184-1255 de SEQ ID NO: 11, posições 159-230 de SEQ ID NO: 14, posições 129200 de SEQ ID NO: 15, posições 7-78 ou posições 79-150 ou posições 151-222 de SEQ ID NO: 17; posições 1-72 ou posições 73-144 ou posições 145-216 de SEQ ID NO: 18, uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 diferente, tal como outra proteína MUC1 humana ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica à qualquer uma destas sequências de aminoácidos;
[0098] um terceiro domínio citoplasmático (Cytoplasmic Domain - CD) de MUC1, em que o CD compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada de: posições 202-273 de SEQ ID NO: 2, posições 193-264 de SEQ ID NO: 4, 193 posições -264 de SEQ ID NO: 6, posições 184-255 de SEQ ID NO: 8, posições 1184-1255 de SEQ ID NO: 11, posições 159-230 de SEQ ID NO: 14, posições 129200 de SEQ ID NO: 15, posições 7-78 ou posições 79-150 ou posições 151-222 de SEQ ID NO: 17; posições 1-72 ou posições 73-144 ou posições 145-216 de SEQ ID NO: 18, uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 diferente, tal como outra proteína MUC1 humana ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica, pelo menos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica a qualquer uma destas sequências de aminoácidos.
[0099] Em um aspecto desta variante, uma proteína de fusão que é útil em uma composição imunoterapêutica com base em levedura da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18. SEQ ID NO: 17 inclui os seguintes antígenos MUC1, na ordem do N- para o C-término: (1) um peptídeo sintético representado por SEQ ID NO: 21 (posições 1-6 de SEQ ID NO: 17); (2) um primeiro CD de MUC1 (posições 7-78 de SEQ ID NO: 17); (3) um segundo CD de MUC1 (posições 79-150 de SEQ ID NO: 17); (4) um terceiro CD de MUC1 (posições 151 - 222 de SEQ ID NO: 17); e (5) um marcador de hexa-histidina (posições 223-228 de SEQ ID NO: 17). SEQ ID NO: 17 é codificada pela sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 16. SEQ ID NO: 18 inclui os seguintes antígenos MUC1, na ordem do N- para o C-término: (1) um primeiro CD de MUC1 (posições 1-72 de SEQ ID NO: 18); (2) um segundo CD de MUC1 (posições 73-144 de SEQ ID NO: 18); (3) um terceiro CD de MUC1 (posições 145-216 de SEQ ID NO: 18). Opcionalmente, a proteína de fusão de SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18 inclui um peptídeo N-terminal que é um peptídeo N-terminal sintético concebido para conferir resistência à degradação proteossômica e estabilizar a expressão representada por SEQ ID NO: 21 ou um peptídeo N-terminal de uma sequência líder de fator alfa de levedura, tal como SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20 ou outro peptídeo N-terminal adequado para uso com um produto imunoterapêutico com base em levedura, conforme descrito. Também opcionalmente, um ou mais peptídeos ligantes de uma a três ou mais sequências de aminoácidos ligantes de um, dois, três ou mais aminoácidos, tal como o ligante de dois aminoácidos Tre- Ser, podem ser inseridos entre os segmentos da proteína de fusão. O marcador de hexa-histidina na extremidade C-terminal da proteína de fusão também é opcional.
[00100] Um antígeno MUC1 útil na presente invenção também inclui proteínas tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de qualquer uma das proteínas MUC1, domínios, proteínas de fusão ou antígenos descritos aqui ao longo do comprimento total da proteína ou em relação a um fragmento definido ou domínio do mesmo (por exemplo, um domínio imunológico ou domínio funcional (domínio com pelo menos uma atividade biológica)) que faz parte da proteína. Por exemplo, um domínio de proteína MUC1 descrito aqui inclui a sequência sinalizadora, um domínio VNTR, um domínio SEA, o domínio extracelular (ED), um domínio TM e/ou um domínio citoplasmático (Cytoplasmic Domain - CD). Um domínio imunológico foi descrito em detalhes acima. As proteínas de fusão MUC1 descritas aqui incluem aquelas representadas por SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18. Consequentemente, um antígeno MUC1 útil no produto imunotera- pêutico com base em levedura da presente invenção inclui um antígeno MUC1 compreendendo ou consistindo em qualquer uma de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18, uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 e/ou uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 diferente (por exemplo, uma proteína de fusão em que um ou mais dos segmentos de fusão são das sequências correspondentes de uma proteína MUC1 diferente ou de uma sequência agonista de proteína MUC1, de modo que diferenças de sequência mínimas podem estar presentes quando comparado com as sequências apresentadas aqui).
[00101] É simples usar as porções correspondentes de qualquer uma das proteínas MUC1 ou domínios derivados ou obtidos a partir da sequência ou diferentes daqueles exemplificados aqui e particularmente sequências ou fontes dentro das mesmas espécies de animais, para criar proteínas de fusão com a mesma ou uma estrutura global similar às proteínas de fusão descritas aqui. A título de exemplo, pode-se identificar facilmente uma sequência correspondente em determinada proteína MUC1 humana de qualquer fonte que corresponde às posições 1034-1152 de SEQ ID NO: 11 usando ferramentas ou processos de alinhamento de sequências simples. Portanto, sequências com diferenças mínimas e/ou conservativas em relação às sequências exemplificadas aqui são expressamente incluídas na presente invenção.
[00102] Em alguns aspectos da invenção, inserções, deleções e/ou substituições de aminoácidos podem ser feitas em um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou mais aminoácidos de uma proteína MUC1 de tipo selvagem ou de referência, contanto que a proteína MUC1 resultante, quando usada como um antígeno em uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura da invenção, induza a uma resposta imune contra uma proteína MUC1 nativa similarmente à proteína MUC1 de tipo selvagem ou de referência, a qual pode incluir uma resposta imune aumentada, uma resposta imune diminuída ou uma resposta imune substancialmente similar. Por exemplo, a invenção inclui o uso de antígenos agonistas MUC1, os quais podem incluir um ou mais epítopos de células T que sofreram mutação para aumentar a resposta de células T contra o agonista MUC1 tal como ao aumentar a avidez ou afinidade do epítopo por uma molécula do MHC ou pelo receptor de células T que reconhece o epítopo no contexto da apresentação ao MHC. Agonistas MUC1 podem, portanto, aprimorar a potência ou a eficiência de uma resposta de células T contra a MUC1 nativa expressa por uma célula tumorosa. Uma variedade de epítopos de células T de MUC-1, incluindo epítopos agonistas, são descritos na Patente dos Estados Unidos N° 6.546.643, Patente dos Estados Unidos N° 7.118.738, Patente dos Estados Unidos N° 7.342.094, Patente dos Estados Unidos N° 7.696.306 e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 2008/ 0063653 e qualquer um ou mais destes epítopos podem ser usados em um antígeno MUC1 da presente invenção, incluindo através de adição, supressão ou substituição de um ou mais aminoácidos dentro de uma sequência descrita aqui para conformar a sequência à sequência de epítopo publicada nesta(s) posição(ões).
[00103] Exemplos de antígenos agonistas MUC1 são fornecidos aqui (vide Exemplos 3 e 4). Em uma modalidade, um antígeno agonista MUC1 adequado para uso na presente invenção compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou todas as seguintes substituições, onde as posições das substituições são fornecidas em relação a uma proteína MUC1 de tipo selvagem representada pelo N° de Acesso NP_001191214 (embora as mesmas ou posições equivalentes possam ser prontamente identificadas em qualquer outra sequência de MUC-1 de tipo selvagem): T93, A161, P162, G169, S170, T171, A392, C406, T444, D445 ou S460. Em uma monômero, um antígeno agonista MUC1 que é útil para uma composição imunoterapêutica com base em levedura da invenção compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 25. SEQ ID NO: 23 inclui os seguintes antígenos MUC1, na ordem do N- para o C-término: (1) sequência sinalizadora de MUC1 (posições 1-30 de SEQ ID NO: 23); (2) um segmento SEA/ED de MUC1 (posições 31-89 de SEQ ID NO: 23); (3) um segmento VNTR que compreende dois domínios VNTR (posições 90-130 de SEQ ID NO: 23); (4) um domínio TM de MUC1 (posições 131-158 de SEQ ID NO: 23); (5) um CD de MUC1 (posições 159-230 de SEQ ID NO: 23); (6) um epítopo agonista de MUC1 (posições 231-246 de SEQ ID NO: 23); e (7) um marcador de histidina hexapeptídico (posições 247-252 de SEQ ID NO: 23). SEQ ID NO: 23 é codificada pela sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 22 (códons otimizados para expressão em leveduras). A sequência sinalizadora de MUC1 (posições 1-30 de SEQ ID NO: 23) pode ser substituída por uma sequência N-terminal diferente concebida para conferir resistência à degradação proteossômica e/ou estabilizar a expressão, tal como o peptídeo representado por SEQ ID NO: 21 ou um peptídeo N-terminal de uma sequência líder de fator alfa de levedura, tal como SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20. O marcador de hexa- histidina C-terminal é opcional e facilita a identificação e/ou purificação da proteína. Quando comparado com o antígeno MUC1 em SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15, a SEQ ID NO: 23 contém as seguintes substituições de aminoácidos para criar uma variedade de epítopos agonistas (posições de substituição fornecidas com referência à SEQ ID NO: 23, com referência adicional à localização da substituição em uma MUC-1 de tipo selvagem representada pelo N° de Acesso NP_001191214): A96Y (posição 161 na MUC1 de tipo selvagem), P97L (posição 162 na MUC1 de tipo selvagem), G104V (posição 169 na MUC1 de tipo selvagem), S105Y (posição 170 na MUC1 de tipo selvagem), T106L (posição 171 na MUC1 de tipo selvagem), A147Y (posição 392 na MUC1 de tipo selvagem), C161V (posição 406 na MUC1 de tipo selvagem), T199L (posição 444 na MUC1 de tipo selvagem), D200F (posição 445 na MUC1 de tipo selvagem), S215Y (posição 460 na MUC1 de tipo selvagem) e T239L (posição 93 na MUC1 de tipo selvagem).
[00104] SEQ ID NO: 25 inclui os seguintes antígenos MUC1, na ordem do N- para o C-término: (1) uma sequência líder do fator alfa descrita em outra parte aqui por SEQ ID NO: 19 (posições 1-89 de SEQ ID NO: 25); (2) uma sequência ligante de Tre-Ser (posições 90-91 de SEQ ID NO: 25); (3) uma proteína agonista MUC1 de comprimento total correspondendo a uma proteína de tipo selvagem, exceto quanto à introdução de 11 epítopos agonistas (posições 92-566 de SEQ ID NO: 25); e (7) um marcador de histidina hexapeptídico (posições 567-572 de SEQ ID NO: 25). SEQ ID NO: 25 é codificada pela sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 24 (códons otimizados para expressão em leveduras). A sequência líder de fator alfa (posições 1-89 de SEQ ID NO: 25) pode ser substituída por uma sequência N-terminal diferente concebida para conferir resistência à degradação proteossômica e/ou estabilizar a expressão, tal como o peptídeo representado por SEQ ID NO: 21 ou um peptídeo N-terminal de uma sequência líder de fator alfa de levedura diferente, tal como SEQ ID NO: 20 ou uma sequência sinalizadora de MUC1. O marcador de hexa- histidina C-terminal é opcional e facilita a identificação e/ou purificação da proteína. Quando comparado com a proteína MUC1 de tipo selvagem usada como um modelo, a sequência de GI-6106 contém as seguintes substituições de aminoácidos para criar uma variedade de epítopos agonistas (posições de substituição fornecidas com referência à SEQ ID NO: 25, com referência ainda à localização da substituição em uma MUC-1 de tipo selvagem representada pelo N° de Acesso NP_001191214): T184L (posição 93 na MUC1 de tipo selvagem), A232Y (posição 161 na MUC1 de tipo selvagem), P233L (posição 162 na MUC1 de tipo selvagem), G240V (posição 169 na MUC1 de tipo selvagem), S241Y (posição 170 na MUC1 de tipo selvagem), T242L (posição 171 na MUC1 de tipo selvagem), A483Y (posição 392 na MUC1 de tipo selvagem), C497V (posição 406 na MUC1 de tipo selvagem), T535L (posição 444 na MUC1 de tipo selvagem), D536F (posição 445 na MUC1 de tipo selvagem) e S551Y (posição 460 na MUC1 de tipo selvagem).
[00105] Consequentemente, um antígeno agonista MUC1 útil no produto imunoterapêutico com base em levedura da presente invenção inclui um antígeno MUC1 que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 25 ou as sequências MUC1-específicas dentro destas proteínas de fusão maiores ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 ou sequências MUC1- específicas dentro destas proteínas de fusão maiores e/ou uma sequência correspondente de uma proteína MUC1 diferente (por exemplo, uma proteína de fusão em que um ou mais dos segmentos de fusão são de sequências correspondentes de uma proteína MUC1 diferente, de tal modo que diferenças mínimas de sequência podem estar presentes quando comparado com as sequências apresentadas aqui).
[00106] Conforme discutido acima, sequências de expressão N- terminais e os marcadores C-terminais, tais como aqueles descritos acima em relação às proteínas de fusão de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 25, são opcionais, mas podem ser selecionados de várias sequências diferentes descritas aqui em outra parte para aprimorar ou auxiliar na expressão, estabilidade e/ou permitir a identificação e/ou purificação da proteína. Além disso, muitos promotores diferentes adequados para uso em leveduras são conhecidos na técnica. Além disso, sequências intervenientes ligantes curtas (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 peptídeos de aminoácidos) podem ser introduzidas entre as porções de uma proteína de fusão que compreendem um antígeno MUC-1 por uma variedade de razões, incluindo a introdução de sítios de enzimas de restrição para facilitar a clonagem, tais como sítios de clivagem para proteases fagossômicas do hospedeiro, para acelerar o processamento de proteínas ou antígeno e para futura manipulação de construtos.
[00107] Opcionalmente, as proteínas, incluindo as proteínas de fusão, que são usadas como um componente da composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura da invenção são produzidas usando construtos de antígeno que são particularmente úteis para melhorar ou estabilizar a expressão de antígenos heterólogos em levedura. Em uma modalidade, a(s) proteína(s) antigênica(s) ou peptídeo(s) desejado(s) é/são fundido(s) em suas extremidades amino terminais a: (a) um peptídeo sintético específicoque estabiliza a expressão da proteína de fusão no veículo de levedura ou impede a modificação pós-traducional da proteína de fusão expressa (tais peptídeos são descritos em detalhes, por exemplo, na Publicação de Patente dos Estados Unidos N° 2004-0156858 A1, publicada em 12 de Agosto de 2004, aqui incorporada por referência na íntegra); (b) pelo menos uma porção de um proteína endógena de levedura, em que um dos parceiros de fusão confere uma melhor estabilidade de expressão à proteína em levedura e/ou impede a modificação pós-traducional das proteínas pelas células de levedura (tais proteínas são também descritas em detalhes, por exemplo, na Publicação de Patente dos Estados Unidos N° 2004-0156858 A1, supra); e/ou (c) pelo menos uma porção de uma proteína da levedura que faz com que a proteína de fusão seja expressa na superfície da levedura (por exemplo, uma proteína Aga, descrita em maiores detalhes aqui). Além disso, a presente invenção inclui, opcionalmente, o uso de peptídeos que estão fundidos com o C-término do construto de codificação de antígeno, particularmente para uso na seleção e identificação de proteína. Tais peptídeos incluem, porém sem limitações, qualquer peptídeo sintético ou natural, tal como um marcador peptídico (por exemplo, 6X His ou hexapeptídeo) ou qualquer outro marcador de epítopo curto. Os peptídeos ligados ao C-término de um antígeno de acordo com a invenção podem ser usados com ou sem a adição de peptídeos N- terminais discutidos acima e vice-versa.
[00108] Em uma modalidade, um peptídeo sintético útil para uma proteína de fusão a ser expressa em uma levedura está ligado ao N- término do antígeno, o peptídeo consistindo em pelo menos duas posições de aminoácidos que são heterólogas ao antígeno, em que o peptídeo estabiliza a expressão da proteína de fusão no veículo de levedura ou impede a modificação pós-traducional da proteína de fusão expressa. O peptídeo sintético e a porção N-terminal do antígeno juntos formam uma proteína de fusão que tem os seguintes requisitos: (1) o resíduo de aminoácido na posição um da proteína de fusão é uma metionina (por exemplo, o primeiro aminoácido no peptídeo sintético é uma metionina); (2) o resíduo de aminoácido na posição dois da proteína de fusão não é uma glicina ou uma prolina (isto é, o segundo aminoácido no peptídeo sintético não é uma glicina ou uma prolina); (3) nenhuma das posições de aminoácidos nas posições 2-6 da proteína de fusão é uma metionina (por exemplo, os aminoácidos nas posições 2-6, quer uma parte do peptídeo sintético ou proteína, quer o peptídeo sintético seja mais curto do que seis aminoácidos, não incluem uma metionina); e (4) nenhum dos aminoácidos nas posições 2-6 da proteína de fusão é uma lisina ou uma arginina (ou seja, os aminoácidos nas posições 2-6, quer uma parte do peptídeo sintético ou a proteína, quer o peptídeo sintético seja mais curto do que 5 aminoácidos, não incluem uma lisina ou uma arginina). O peptídeo sintético pode ser tão curto quanto dois aminoácidos porém, em um aspecto, tem de 2-6 aminoácidos (incluindo 3, 4, 5 aminoácidos) e pode ter mais de 6 aminoácidos, em números inteiros, até cerca de 200 aminoácidos, 300 aminoácidos, 400 aminoácidos e 500 aminoácidos ou mais.
[00109] Em uma modalidade, uma proteína de fusão compreende uma sequência de aminoácidos de M-X2-X3-X4-X5-X6, em que M é metionina; em que X2 é qualquer aminoácido exceto glicina, prolina, lisina ou arginina; em que X3 é qualquer aminoácido exceto metionina,lisina ou arginina; em que X4 é qualquer aminoácido exceto metionina,lisina ou arginina; em que X5 é qualquer aminoácido exceto metionina,lisina ou arginina; e em que X6 é qualquer aminoácido exceto metionina,lisina ou arginina. Em uma modalidade, o resíduo X6 é uma prolina. Uma sequência sintética exemplificativa que melhora a estabilidade de expressão de um antígeno em uma célula de levedura e/ou impede a modificação pós-traducional da proteína na levedura inclui a sequência M-A-D-E-A-P (representada aqui por SEQ ID NO: 21). Além do aumento de estabilidade do produto de expressão, este parceiro de fusão não parece ter um impacto negativo sobre a resposta imune contra o antígeno de imunização no construto. Além disso, os peptídeos de fusão sintéticos podem ser concebidos para proporcionar um epítopo que pode ser reconhecido por um agente de seleção, tal como um anticorpo.
[00110] Em uma modalidade, o antígeno MUC1 está ligado ao N- término de uma proteína de levedura, tal como uma sequência pré-pró do fator alfa (também referida como sequência líder sinalizadora de fator alfa, a sequência de aminoácidos da qual é aqui exemplificada por SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20). Outras sequências de sequência pré-pró de fator alfa de levedura são conhecidas na técnica e abrangidas para uso na presente invenção.
[00111] Em um aspecto da invenção, o veículo de levedura é manipulado de modo que o antígeno seja expresso ou fornecido pela distribuição ou translocação de um produto de proteína expresso, parcial ou totalmente, sobre a superfície do veículo de levedura (expressão extracelular). Um método para realização deste aspecto da invenção é o uso de um braço espaçador para o posicionamento de uma ou mais proteínas sobre a superfície do veículo de levedura. Por exemplo, pode-se usar um braço espaçador para criar uma proteína de fusão de antígeno(s) ou outra proteína de interesse com uma proteína que tem como alvo o(s) antígeno(s) ou outra proteína de interesse à parede celular da levedura. Por exemplo, tal proteína que pode ser usada para objetivação de outras proteínas é uma proteína de levedura (por exemplo, a proteína da parede celular 2 (cwp2), Aga2, Pir4 ou proteína FLO1) que permite que o(s) antígeno(s) ou outra proteína seja objetivada à parede celular de levedura, de tal modo que o antígeno ou outra proteína esteja localizada na superfície da levedura. Outras proteínas que não proteínas de levedura podem ser usadas para o braço espaçador, no entanto, para qualquer proteína de braço espaçador, é altamente desejável que a resposta imune seja objetivada contra o antígeno alvo, em vez da proteína de braço espaçador. Como tal, se outras proteínas são usadas para o braço espaçador, então, a proteína de braço espaçador que é usada não deverá gerar uma grande resposta imune à proteína de braço espaçador em si, de tal modo que a resposta imune ao(s) antígeno(s) alvo seja sobrecarregada. Aqueles versados na técnica deverão objetivar uma pequena resposta imune à proteína do braço espaçador em relação à resposta imune ao(s) antígeno(s) alvo. Braços espaçadores podem ser construídos de modo a terem sítios de clivagem (por exemplo, sítios de clivagem de protease) que permitem que o antígeno seja prontamente removido ou processado da levedura, se desejado. Qualquer método conhecido para determinar a magnitude das respostas imunes pode ser usado (por exemplo, produção de anticorpos, ensaios de lise, etc,) e são facilmente conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00112] Outro método para posicionamento do(s) antígeno(s) alvo(s) ou outras proteínas a serem expostas sobre a superfície da levedura é usar sequências sinalizadoras, tal como glicosilfosfatidil inositol (GPI) para ancorar o alvo à parede celular da levedura. Alternativamente, o posicionamento pode ser realizado conectando sequências sinalizadoras que têm como alvo o(s) antígeno(s) ou outras proteínas de interesse para a via secretora através de translocação para o retículo endoplasmático (ER), de modo que o antígeno se liga a uma proteína que está ligada à parede celular (por exemplo, cwp).
[00113] Em um aspecto, a proteína de braço espaçador é uma proteína de levedura. A proteína de levedura pode consistir entre cerca de dois e cerca de 800 aminoácidos de uma proteína de levedura. Em uma modalidade, a proteína de levedura tem de cerca de 10 a 700 aminoácidos. Em uma outra modalidade, a proteína de levedura tem de cerca de 40-600 aminoácidos. Outras modalidades da invenção incluem a proteína de levedura tendo pelo menos 250 aminoácidos, pelo menos 300 aminoácidos, pelo menos 350 aminoácidos, pelo menos 400 aminoácidos, pelo menos 450 aminoácidos, pelo menos 500 aminoácidos, pelo menos 550 aminoácidos ácidos, pelo menos 600 aminoácidos ou pelo menos cerca de 650 aminoácidos. Em uma modalidade, a proteína de levedura tem pelo menos 450 aminoácidos de comprimento. Outra consideração para otimização de expressão do antígeno sobre a superfície, se isso for desejado, é se a combinação de antígeno e braço espaçador for expressa como um monômero ou como dímero ou trímero ou mesmo mais unidades conectadas juntas. Este uso de monômeros, dímeros, trímeros, etc. permite espaçamento ou duplicação apropriada do antígeno de modo que uma parte, se não todo, o antígeno é apresentado sobre a superfície do veículo de levedura de uma maneira que o torna mais imunogênico.
[00114] Uso de proteínas de levedura pode estabilizar a expressão de proteínas de fusão no veículo de levedura, impedir a modificação pós-traducional da proteína de fusão expressa e/ou objetivar a proteína de fusão a um compartimento particular na levedura (por exemplo, para ser expressa sobre a superfície da célula de levedura). Para distribuição à via de secreção de levedura, proteínas de levedura exemplificativas a utilizar incluem, porém sem limitações: Aga (incluindo, porém sem limitações, Aga1 e/ou Aga2); SUC2 (invertase de levedura); sequência líder sinalizadora de fator alfa; CPY; Cwp2p por sua localização e retenção na parede celular; genes BUD para localização no broto de células de levedura durante a fase inicial de formação de célula filha; Flo1p; Pir2p e Pir4p.
[00115] Outras sequências podem ser usadas para objetivar, reter e/ou estabilizar a proteína a outras partes do veículo de levedura, por exemplo, no citosol ou mitocôndrias ou retículo endoplasmático ou núcleo. Exemplos de proteínas de levedura adequadas que podem ser usadas para qualquer uma das modalidades acima incluem, porém sem limitações, TK, AF, SEC7; produtos dos genes de carbóxi quinase de fosfoenolpiruvato PCK1, fosfogliceroquinase PGK e isomerase de triose de fosfato TPI por sua expressão reprimível em glicose e localização citosólica; as proteínas de choque térmico SSA1, SSA3, SSA4, SSC1, cuja expressão é induzida e cujas proteínas são mais termoestáveis após exposição das células a tratamento térmico; a proteína mitocondrial CYC1 para importação em mitocôndrias; ACT1.
[00116] Métodos de produção de veículos de levedura e expressão, combinação e/ou associação de veículos de levedura com os antígenos e/ou outras proteínas e/ou agentes de interesse para a produção de composições imunoterapêuticas com base em levedura são considerados pela invenção.
[00117] De acordo com a presente invenção, o termo "complexo de veículo de levedura-antígeno" ou "complexo de levedura-antígeno" é usado genericamente para descrever qualquer associação de um veículo de levedura com um antígeno e pode ser usado alternadamente com "composição imunoterapêuticas com base em levedura" quando essa composição é usada para induzir a uma resposta imune, conforme descrito acima. Esta associação inclui expressão do antígeno pela levedura (uma levedura recombinante), introdução de um antígeno em uma levedura, ligação física do antígeno à levedura e a mistura da levedura e antígeno em conjunto, tal como em um tampão ou outra solução ou formulação. Estes tipos de complexos são descritos em detalhes abaixo.
[00118] Em uma modalidade, uma célula de levedura usada para preparar o veículo de levedura é transfectada com uma molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica uma proteína (por exemplo, o antígeno) de modo que a proteína é expressa pela célula de levedura. Tal levedura é também referida aqui como uma levedura recombinante ou um veículo de levedura recombinante. A célula de levedura pode, então, ser formulada com um excipiente farmaceuticamente aceitável e administrada diretamente a um paciente, armazenada para posterior administração ou carregada em uma célula dendrítica como uma célula intacta. A célula de levedura também pode ser morta ou pode ser derivatizada, tal como por meio de formação de esferoplastos de levedura, citoplastos, ghosts ou partículas subcelulares, qualquer um dos quais pode ser seguido por armazenamento, administração ou carregamento do derivado dentro da célula dendrítica. Esferoplastos de levedura também podem ser diretamente transfectados com a molécula de ácido nucleico recombinante (por exemplo, o esferoplasto é produzido a partir de uma levedura inteira e, então, transfectado) a fim de produzir um esferoplasto recombinante que expressa o antígeno. As células de levedura ou esferoplastos de levedura recombinantes que expressam o(s) antígeno(s) podem ser usados para produzir um veículo de levedura compreendendo um citoplasto de levedura, um ghost de levedura ou uma partícula de membrana de levedura ou partículas de parede celular de levedura ou frações dos mesmos.
[00119] Em geral, o veículo de levedura e antígeno(s) e/ou outros agentes podem estar associados através de uma técnica descrita aqui. Em um aspecto, o veículo de levedura foi carregado intracelularmente com o(s) antígeno(s) e/ou agente(s). Em um outro aspecto, o(s) antígeno(s) e/ou agente(s) foram covalentemente ou não covalentemente ligados ao veículo de levedura. Em ainda outro aspecto, o veículo de levedura e o(s) antígeno(s) e/ou agente(s) foram associados através de mistura. Em outro aspecto e, em uma modalidade, o(s) antígeno(s) e/ou agente(s) são expressos de forma recombinante pelo veículo de levedura ou pela célula de levedura ou esferoplastos de levedura dos quais o veículo de levedura foi derivado.
[00120] Uma série de antígenos e/ou outras proteínas a serem produzidos por um veículo de levedura da presente invenção é qualquer número de antígenos e/ou outras proteínas que podem ser razoavelmente produzidos por um veículo de levedura e geralmente varia de pelo menos um a pelo menos cerca de 6 ou mais, incluindo de cerca de 2 a cerca de 6 antígenos ou outras proteínas.
[00121] A expressão de um antígeno ou outra proteína em um veículo de levedura da presente invenção é realizada usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Resumidamente, uma molécula de ácido nucleico que codifica pelo menos um antígeno desejado ou outra proteína é inserida em um vetor de expressão, de modo que a molécula de ácido nucleico esteja operativamente ligada a uma sequência de controle de transcrição de forma a ser capaz de realizar expressão constitutiva ou regulada da molécula de ácido nucleico quando transformada em uma célula hospedeira de levedura. Moléculas de ácido nucleico que codificam um ou mais antígenos e/ou outras proteínas podem estar em um ou mais vetores de expressão operativamente ligados a uma ou mais sequências de controle de expressão. Sequências de controle de expressão particularmente importantes são aquelas que controlam o início de transcrição, tais como sequências promotoras e de ativação a montante. Qualquer promotor de levedura adequado pode ser usado na presente invenção e uma variedade de tais promotores são conhecidos por aqueles versados na técnica. Promotores para expressão em Saccharomyces cerevisiae incluem, porém sem limitações, promotores de genes que codificam as seguintes proteínas de levedura: desidrogenase de álcool I (ADH1) ou II (ADH2), CUP1, quinase de fosfoglicerato (PGK), isomerase de triose de fosfato (TPI), fator EF-1 alfa de alongamento de tradução (TEF2), desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH; também referida como TDH3 para desidrogenase de triose de fosfato), galactoquinase (GAL1), uridil-transferase de galactose-1-fosfato (GAL7), epimerase de UDP-galactose (GAL10), citocromo c1 (CYC1), proteína Sec7 (SEC7) e fosfatase ácida (PHO5), incluindo promotores híbridos, tais como os promotores ADH2/GAPDH e CYC1/GAL10, incluindo o promotor ADH2/GAPDH, o qual é induzido quando as concentrações de glicose na célula são baixas (por exemplo, cerca de 0,1 a cerca de 0,2 por cento), bem como o promotor CUP1 e o promotor TEF2. Similarmente, uma série de sequências de ativação a montante (UASs), também referidas como intensificadores, são conhecidas. Sequências de ativação a montante para expressão em Saccharomyces cerevisiae incluem, porém sem limitações, as UAS de genes que codificam as seguintes proteínas: PCK1, TPI, TDH3, CYC1, ADH1, ADH2, SUC2, GAL1, GAL7 e GAL10, bem como outras UASs ativadas pelo produto do gene GAL4, com a UAS de ADH2 sendo usada em um aspecto. Uma vez que a UAS de ADH2 é ativada pelo produto do gene ADR1, pode ser preferível superexpressar o gene ADR1 quando um gene heterólogo está operativamente ligado à UAS de ADH2. Sequências de término de transcrição para expressão em Saccharomyces cerevisiae incluem as sequências de término dos genes de fator-α, GAPDH e CYC1.
[00122] Sequências de controle de transcrição para expressar genes em levedura metiltrópicas incluem as regiões de controle de transcrição dos genes que codificam uma oxidase de álcool e desidrogenase de formato.
[00123] A transfecção de uma molécula de ácido nucleico em uma célula de levedura de acordo com a presente invenção pode ser realizada por meio de qualquer método através do qual uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida dentro da célula e inclui, porém sem limitações, difusão, transporte ativo, sonicação em banho, eletroporação, microinjeção, lipofecção, adsorção e fusão de protoplastos. As moléculas de ácido nucleico transfectadas podem ser integradas em um cromossomo de levedura ou mantidas em vetores extracromossômicos usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Exemplos de veículos de levedura que trazem tais moléculas de ácido nucleico são descritos em detalhes aqui. Conforme discutido acima, citoplasto de levedura, ghost de levedura e partículas de membrana de levedura ou preparados da parede celular também podem ser produzidos de forma recombinante através de transfecção de microorganismos de levedura intactos ou esferoplastos de levedura com moléculas de ácido nucleico desejadas, produzindo o antígeno nas mesmas e, então, manipulando adicionalmente os micro-organismos ou esferoplastos usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica para a produção de citoplasto, ghost ou extrato de membrana de levedura subcelular ou frações dos mesmos contendo antígenos desejados ou outras proteínas.
[00124] Condições eficazes para a produção de veículos de levedura recombinantes e expressão do antígeno e/ou outra proteína pelo veículo de levedura incluem um meio eficaz no qual uma cepa de levedura pode ser cultivada. Um meio eficaz é, tipicamente, um meio aquoso que compreende fontes assimiláveis de carboidrato, nitrogênio e fosfato, bem como sais, minerais, metais e outros nutrientes apropriados, tais como vitaminas e fatores de crescimento. O meio pode compreender nutrientes complexos ou pode ser um meio mínimo definido. As cepas de levedura da presente invenção podem ser cultivadas em uma variedade de recipientes incluindo, porém sem limitações, biorreatores, frascos de Erlenmeyer, tubos de ensaio, placas de microtitulação e placas de Petri. A cultura é realizada em uma temperatura, pH e teor de oxigênio adequados para a cepa de levedura. Tais condições de cultura estão bem dentro da perícia daqueles versados na técnica (vide, por exemplo, Guthrie et al. (eds.), 1991, Methods in Enzymology, vol. 194, Academic Press, San Diego). Por exemplo, sob um protocolo, culturas líquidas contendo um meio adequado podem ser inoculadas usando culturas obtidas a partir de placas iniciais e/ou culturas iniciais de composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura e são cultivadas durante cerca de 20 horas a 30 °C com agitação a 250 rpm. As culturas primárias podem ser expandidas em culturas maiores conforme desejado. A expressão de proteínas a partir de vetores nos quais a levedura foi transformada (por exemplo, expressão de MUC-1) pode ser constitutiva se o promotor usado é um promotor constitutivo ou pode ser induzida pela adição das condições de indução adequadas para o promotor, se o promotor usado é um promotor indutível (por exemplo, sulfato de cobre no caso do promotor CUP1). No caso de um promotor indutível, indução de expressão da proteína pode ser iniciada após a cultura crescer até uma densidade de células apropriada, a qual pode ser cerca de 0,2 Y.U./ml ou densidades maiores.
[00125] Um exemplo não limitativo de um meio adequado para a cultura de uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura da invenção é o meio U2. O meio U2 compreende os seguintes componentes: 15 g/L de glicose, 6,7 g/L de base de nitrogênio para levedura contendo sulfato de amônio e 0,04 mg/mL de cada um de histidina, triptofano e adenina e 0,06 mg/ml de leucina. Outro exemplo não limitativo de um meio adequado para a cultura da composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura da invenção é o meio UL2. O meio UL2 compreende os seguintes componentes: 15 g/L de glicose, 6,7 g/L de base de nitrogênio para levedura contendo sulfato de amônio e 0,04 mg/mL de cada um de histidina, triptofano e adenina.
[00126] Em algumas modalidades da invenção, a levedura é cultivada sob condições de pH neutro. Conforme usado aqui, o uso geral do termo "pH neutro" se refere a uma faixa de pH entre um pH de cerca de 5,5 e um pH de cerca de 8 e, em um aspecto, um pH entre cerca de 6 e cerca de 8. Aqueles versados na técnica apreciarão que flutuações mínimas (por exemplo, dezenas ou centenas) podem ocorrer durante medição com um medidor de pH. Como tal, o uso de um pH neutro para crescimento de células de levedura significa que as células de levedura são crescidas em pH neutro a maioria do tempo em que estão em cultura. Em uma modalidade, a levedura é cultivada em meio mantido em um nível de pH de pelo menos 5,5 (ou seja, o pH do meio de cultura não é deixado cair abaixo de um pH de 5,5). Em outro aspecto, a levedura é cultivada em um nível de pH mantido em cerca de 6, 6,5, 7, 7,5 ou 8. Em um aspecto, o pH neutro é mantido usando um tampão adequado para criar uma cultura ou meio de crescimento tamponado. O uso de um pH neutro no processo de cultura de levedura promove vários efeitos biológicos, os quais são características desejáveis para uso de levedura como veículos para imunomodulação. Por exemplo, cultura da levedura em pH neutro permite um bom crescimento da levedura sem efeito negativo sobre o tempo de geração de células (por exemplo, retardo do tempo de duplicação). A levedura pode continuar a crescer em altas densidades sem perder a elasticidade de sua parede celular. O uso de um pH neutro permite a produção de levedura com paredes celulares flexíveis e/ou leveduras que são mais sensíveis à enzimas de digestão da parede celular (por exemplo, glucanases) em todas as densidades de coleta. Esta característica é desejável porque leveduras com paredes celulares flexíveis podem induzir à respostas imunes diferentes ou aprimoradas quando comparado com leveduras cultivadas sob condições mais ácidas, por exemplo, ao promover a secreção de citocinas por células que apresentam antígeno que realizaram fagocitose da levedura (por exemplo, citocinas de tipo TH1 incluindo, porém sem limitações, IFN-Y, interleucina-12 (IL-12) e IL-2, bem como citocinas pró-inflamatórias, tal como IL-6). Além disso, uma maior acessibilidade aos antígenos localizados na parede celular é proporcionada por tais métodos de cultura. Em um outro aspecto, o uso de um pH neutro para alguns antígenos permite a liberação do antígeno ligado por dissulfureto através de tratamento com ditiotreitol (DTT), o que não é possível quando tal levedura que expressa o antígeno é cultivada em meio com um pH mais baixo (por exemplo, pH de 5). Em um exemplo não limitativo do uso de condições de pH neutro para cultura de levedura para uso na presente invenção, o meio UL2 descrito acima é tamponado usando, por exemplo, 4,2 g/L de Bis-Tris.
[00127] Os inventores demonstram aqui que as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura da invenção cultivadas usando condições de pH neutro são ativadores mais potentes de células dendríticas e ativam células T MUC1-específicas para produzir níveis elevados de IFN-Y do que as mesmas composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura cultivadas sob condições normais (onde um pH neutro não é mantido) (vide Exemplos).
[00128] Em uma modalidade, controle da quantidade de glicosilação de levedura é usado para controlar a expressão de antígenos pela levedura, em particular sobre a superfície. A quantidade de glicosilação de levedura pode afetar a imunogenicidade e antigenicidade, particularmente uma expressa sobre a superfície, uma vez que porções de açúcar tendem a ser volumosas. Como tal, a existência de porções de açúcar sobre a superfície da levedura e seu impacto sobre o espaço tridimensional em torno do(s) antígeno(s) alvo devem ser considerados na modulação da levedura de acordo com a invenção. Qualquer método pode ser usado para reduzir ou aumentar a quantidade de glicosilação da levedura, se desejado. Por exemplo, pode-se usar uma cepa mutante de levedura que tenha sido selecionada para ter baixa glicosilação (por exemplo, mutantes mnn1, och1 e mnn9) ou pode-se eliminar, através de mutação, as sequências aceitadoras de glicosilação no antígeno alvo. Alternativamente, pode-se usar uma levedura com padrões de glicosilação abreviados, por exemplo, Pichia. Pode-se também tratar a levedura usando métodos que reduzem ou alteram a glicosilação.
[00129] Em uma modalidade da presente invenção, como uma alternativa à expressão de um antígeno ou outra proteína recombinante no veículo de levedura, um veículo de levedura é carregado intracelularmente com a proteína ou peptídeo ou com carboidratos ou outras moléculas que servem como um antígeno e/ou são úteis como agentes imunomoduladores ou modificadores de resposta biológica de acordo com a invenção. Subsequentemente, o veículo de levedura, que agora contém o antígeno e/ou outras proteínas intracelulares, pode ser administrado a um indivíduo ou carregado em um veículo, tal como uma célula dendrítica. Os peptídeos e as proteínas podem ser inseridos diretamente nos veículos de levedura da presente invenção por meio de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, tal como por difusão, transporte ativo, fusão de lipossomas, eletroporação, fagocitose, ciclos de congelamento-descongelamento e sonicação. Veículos de levedura que podem ser diretamente carregados com peptídeos, proteínas, carboidratos ou outras moléculas incluem levedura intactas, bem como esferoplastos, ghosts ou citoplastos que podem ser carregados com antígenos e outros agentes após produção. Alternativamente, a levedura intacta pode ser carregada com o antígeno e/ou agente e, então, esferoplastos, ghosts, citoplastos ou partículas subcelulares podem ser preparados a partir dos mesmos. Qualquer número de antígenos e/ou outros agentes pode ser carregado em um veículo de levedura nesta modalidade, de pelo menos 1, 2, 3, 4 ou qualquer número inteiro até centenas ou milhares de antígenos e/ou outros agentes, tal como através de carregamento de um micro-organismo ou partes do mesmo, por exemplo.
[00130] Em uma outra modalidade da presente invenção, um antígeno e/ou outro agente é fisicamente preso ao veículo de levedura. Ligação física do antígeno e/ou outro agente ao veículo de levedura pode ser obtida por meio de qualquer método adequado na técnica, incluindo métodos de associação covalente e não covalente os quais incluem, porém sem limitações, reticulação química do antígeno e/ou outro agente à superfície externa do veículo de levedura ou ligação biológica do antígeno e/ou outro agente à superfície externa do veículo de levedura, tal como mediante uso de um anticorpo ou outro parceiro de ligação. Reticulação química pode ser conseguida, por exemplo, por meio de métodos que incluem ligação de glutaraldeído, marcação por fotoafinidade, tratamento com carbodi-imidas, tratamento com produtos químicos capazes de formação de ligações de dissulfureto e tratamento com outros produtos químicos de reticulação padrões na técnica. Alternativamente, um produto químico pode ser contatado com o veículo de levedura o qual altera a carga da bicamada lipídica da membrana de levedura ou a composição da parede celular, de modo que a superfície externa da levedura esteja mais suscetível à fusão ou ligação aos antígenos e/ou outros agente tendo características de carga particulares. Agentes de objetivação, tais como anticorpos, peptídeos de ligação, receptores solúveis e outros ligantes, também podem ser incorporados em um antígeno como uma proteína de fusão ou de outro modo associados com um antígeno para ligação do antígeno ao veículo de levedura.
[00131] Quando o antígeno ou outra proteína é expressa em ou fisicamente ligada à superfície da levedura, braços espaçadores podem, em um aspecto, ser cuidadosamente selecionados para otimizar o antígeno ou outra expressão ou teor de proteína sobre a superfície. O tamanho do(s) braço(s) espaçador(es) pode afetar quanto do antígeno ou outra proteína está exposto para ligação sobre a superfície da levedura. Assim, dependendo de qual(is) antígeno(s) ou outra(s) proteína(s) são usados, aqueles versados na técnica selecionarão um braço espaçador que realiza o espaçamento adequado para o antígeno ou outras proteínas sobre a superfície da levedura. Em uma modalidade, o braço espaçador é uma proteína de levedura de pelo menos 450 aminoácidos. Braços espaçadores foram discutidos em detalhes acima.
[00132] Em ainda outra modalidade, o veículo de levedura e o antígeno ou outras proteínas estão associados uns aos outros por meio de um mecanismo de ligação mais passivo, não específica ou não covalente, tal como misturando suavemente o veículo de levedura e o antígeno ou outra proteína juntos em um tampão ou outra formulação apropriada (por exemplo, mistura).
[00133] Em uma modalidade, a levedura intacta (com ou sem expressão de antígenos heterólogos ou outras proteínas) pode ser triturada ou transformada de modo a produzir preparados de parede celular de levedura, partículas de membrana de levedura ou fragmentos de levedura (ou seja, não intactos) e os fragmentos de levedura podem, em algumas modalidades, ser fornecidos com ou administrados com outras composições que incluem antígenos (por exemplo, vacinas de DNA, vacinas de subunidades de proteína, patógenos mortos ou inativados, vacinas de vetores virais) para reforçar as respostas imunes. Por exemplo, tratamento enzimático, tratamento químico ou força físico (por exemplo, desagregação mecânica ou sonicação) pode ser usado para quebrar a levedura em partes que são usadas como um adjuvante.
[00134] Em uma modalidade da invenção, veículos de levedura úteis na presente invenção incluem veículos de levedura que foram mortos ou inativados. Morte ou inativação de levedura pode ser obtida por meio de qualquer um de uma variedade de métodos adequados conhecidos na técnica. Por exemplo, inativação térmica de levedura é um método padrão de inativação de levedura e aqueles versados na técnica podem acompanhar as alterações estruturais do antígeno alvo, se desejado, através de métodos padrões conhecidos na técnica. Alternativamente, outros métodos de inativação de levedura podem ser usados, tais como métodos químicos, elétricos, radioativos ou UV. Vide, por exemplo, a metodologia descrita em livros texto de cultura de levedura padrões, tal como Methods of Enzymology, Vol. 194, Cold Spring Harbor Publishing (1990). Qualquer uma das estratégias de inativação usadas deve levar a estrutura secundária, terciária ou quaternária do antígeno alvo em consideração e preservar a estrutura de forma a otimizar sua imunogenicidade.
[00135] Veículos de levedura podem ser formulados em composições imunoterapêuticas com base em levedura e produtos da presente invenção usando uma série de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, veículos de levedura podem ser secos por liofilização. Formulações que compreendem veículos de levedura também podem ser preparadas empacotando a levedura em um bolo ou em um comprimido, tal como feito para a levedura usada em operações de cozimento ou cervejaria. Além disso, os veículos de levedura podem ser misturados com um excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como um tampão isotônico que é tolerado por um hospedeiro ou célula hospedeira. Exemplos de tais excipientes incluem água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose, solução de Hank e outras soluções salinas aquosas fisiologicamente equilibradas. Veículos não aquosos, tais como óleos fixos, óleo de gergelim, oleato de etila ou triglicerídeos, podem também ser usados. Outras formulações úteis incluem suspensões contendo agentes para aumento de viscosidade, tais como carbóxi metil celulose de sódio, sorbitol, glicerol ou dextrana. Excipientes também pode conter quantidades menores de aditivos, tais como substâncias que aumentam a isotonicidade e estabilidade química. Exemplos de tampões incluem tampão de fosfato, tampão de bicarbonato e tampão Tris, enquanto que exemplos de conservantes incluem timerosal, m- ou o-cresol, formalina e álcool benzílico. Formulações convencionais podem ser injetáveis líquidos ou sólidos os quais podem ser absorvidos em um líquido apropriado, tal como uma suspensão ou solução injetável. Assim, em uma formulação não líquida, o excipiente pode compreender, por exemplo, dextrose, albumina de soro humano e/ou conservantes aos quais água estéril ou solução salina pode ser adicionada antes de administração.
[00136] Em uma modalidade da presente invenção, uma composição pode incluir agentes adicionais, os quais podem também ser referidos como compostos modificadores de resposta biológica ou com capacidade de produzir tais agentes/modificadores. Por exemplo, um veículo de levedura pode ser transfectado com ou carregado com pelo menos um antígeno e um composto/agente modificador de pelo menos uma resposta biológica ou uma composição da invenção pode ser administrada em conjunto com pelo menos um agente/modificador de resposta biológica. Modificadores de resposta biológica incluem adjuvantes e outros compostos que podem modular respostas imunes, os quais podem ser referidos como compostos imunomoduladores, bem como compostos que alteram a atividade biológica de outro composto ou agente, tais como um produto imunoterapêutico com base em levedura, tal atividade biológica não estando limitada aos efeitos sobre o sistema imune. Determinados compostos imunomoduladores podem estimular uma resposta imune protetora, enquanto que outros podem suprimir uma resposta imune prejudicial e, se um imunomodulador é útil em combinação com um determinado produto imunoterapêutico com base em levedura pode depender, pelo menos em parte, do estado da doença ou condição a ser tratada ou prevenida e/ou do indivíduo que está sendo tratado. Determinados modificadores da resposta biológica intensificam, de preferência, uma resposta imune mediada por células, enquanto que outros intensificam, de preferência, uma resposta imune humoral (isto é, podem estimular uma resposta imune onde há um nível aumentado de imunidade célula-mediada quando comparado com a imunidade humoral ou vice-versa). Determinados modificadores de resposta biológica têm uma ou mais propriedades em comum com as propriedades biológicas de produto imunoterapêuticos com base em levedura ou aumentam ou complementam as propriedades biológicas de produtos imunoterapêuticos com base em levedura. Há uma série de técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica para medir a estimulação ou supressão de respostas imunes, bem como diferenciar as respostas imunes mediadas por células de respostas imunes humorais e diferenciar um tipo de resposta mediada por células de outro (por exemplo, uma resposta TH17 versus uma resposta TH1).
[00137] Agentes/modificadores de resposta biológica úteis na presente invenção podem incluir, porém sem limitações, citocinas, quimiocinas, hormônios, derivados lipídicos, peptídeos, proteínas, polissacarídeos, fármacos de pequenas moléculas, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno (incluindo, porém sem limitações, anticorpos anti-citocina, anticorpos anti-receptores de citocinas, anticorpos anti-quimiocinas), vitaminas, polinucleotídeos, porções de ligação de ácido nucleico, aptâmeros e moduladores de crescimento. Alguns agentes adequados incluem, porém sem limitações, IL-1 ou agonistas de IL-1 ou IL-1R, anti-IL-1 ou outros antagonistas de IL-1; IL- 6 ou agonistas de IL-6 ou IL-6R, anti-IL-6 ou outros antagonistas de IL- 6; IL-12 ou agonistas de IL-12 ou IL-12R, anti-IL-12 ou outrosantagonistas de IL-12; IL-17 ou agonistas de IL-17 ou IL-17R, anti-IL-17 ou outros antagonistas de IL-17; IL-21 ou agonistas de IL-21 ou IL-21R, anti-IL-21 ou outros antagonistas de IL-21; IL-22 ou agonistas de IL-22 ou IL-22R, anti-IL-22 ou outros antagonistas de IL-22; IL-23 ou agonistas de IL-23 ou IL-23R, anti-IL-23 ou outros antagonistas de IL-23; IL-25 ou agonistas de IL-25 ou IL-25R, anti-IL-25 ou outros antagonistas de IL- 25; IL-27 ou agonistas de IL-27 ou IL-27R, anti-IL-27 ou outros antagonistas de IL-27; interferon de Tipo I (incluindo IFN-α) ou agonistas ou antagonistas de interferon de Tipo I ou um receptor do mesmo; interferon de Tipo II (incluindo IFN-Y) ou agonistas ou antagonistas de interferon de Tipo II ou um receptor do mesmo; anti-CD40, CD40L, proteína 3 do gene de ativação de linfócitos (LAG3) e/ou IMP321 (fator imunoestimulante de células T derivadas da forma solúvel de LAG3), anti-CTLA-4 (por exemplo, para liberar células T anérgicas); coestimuladores de células T (por exemplo, anti-CD137, anti-CD28, anti-CD40); alemtuzumab (por exemplo, Campath®), denileucina diftitox (por exemplo, Ontak®), anti-CD4; anti-CD25; anti-PD-1, anti-PD-L1, anti- PD-L2; agentes que bloqueiam FOXP3 (por exemplo, para eliminar a atividade/matar células T reguladoras CD4+/CD25+); ligante Flt3, imiquimod (AldaraTM), fator de estimulação de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fator de estimulação de colônias de granulócitos (G-CSF), estimulante sargramostim (Leukine®); hormônios incluindo, sem limitação, prolactina e hormônio do crescimento; agonistas de receptores do tipo Toll (TLR) incluindo, porém sem limitações, agonistas de TLR-2, agonistas de TLR-4, agonistas de TLR-7 e agonistas de TLR- 9; antagonistas de TLR incluindo, porém sem limitações, antagonistas de TLR-2, antagonistas de TLR-4, antagonistas de TLR-7 e antagonistas de TLR-9; agentes anti-inflamatórios e imunomoduladores incluindo, porém sem limitações, inibidores de COX-2 (por exemplo, celecoxib, NSAIDs), glucocorticóides, estatinas e talidomida e análogos dos mesmos, incluindo IMiD™ (os quais são análogos estruturais e funcionais de talidomida (por exemplo, Revlimid® (lenalidomida), Actimid® (pomalidomida)); agentes pró-inflamatórios, tais como fungos ou componentes bacterianos ou qualquer citocina ou quimiocina pró- inflamatória; vacinas imunoterapêuticas incluindo, porém sem limitações, vacinas com base em vírus, vacinas com base em bactérias ou vacinas com base em anticorpos e quaisquer outros imunomoduladores, imuno-intensificadores, agentes anti-inflamatórios, agentes pró-nflamatórios e quaisquer agentes que modulam a quantidade, modulam o estado de ativação e/ou modulam a sobrevivência de células que apresentam antígeno ou células TH17, TH1 e/ou Treg. Qualquer combinação de tais agentes é considerada pela invenção e qualquer um de tais agentes combinado com ou administrado em um protocolo (por exemplo, simultânea, sequencialmente ou em outros formatos) com um produto imunoterapêutico com base em levedura é uma composição abrangida pela invenção. Tais agentes são bem conhecidos na técnica. Estes agentes podem ser usados isoladamente ou em combinação com outros agentes descritos aqui.
[00138] Agentes podem incluir agonistas e antagonistas de um determinado peptídeo ou proteína ou domínio dos mesmos. Conforme usado aqui, um "agonista" é qualquer composto ou agente incluindo, sem limitação, pequenas moléculas, proteínas, peptídeos, anticorpos, agentes de ligação de ácido nucleico, etc., que se ligam a um receptor ou ligante e produzem ou provocam uma resposta, os quais podem incluir agentes que imitam ou aumentam a ação de uma substância que ocorre naturalmente que se liga ao receptor ou ligante. Um "antagonista" é qualquer composto ou agente incluindo, sem limitação, pequenas moléculas, proteínas, peptídeos, anticorpos, agentes de ligação de ácido nucleico, etc. que bloqueiam ou inibem ou reduzem a ação de um agonista.
[00139] As composições da invenção podem ainda incluir ou podem ser administradas com (concorrente, sequencial ou intermitentemente com) quaisquer outros agentes ou composições e protocolos que são úteis para a prevenção ou o tratamento de câncer ou qualquer um dos compostos que trata ou melhora qualquer um dos sintomas de câncer e, particularmente, cânceres associados à expressão ou superex- pressão de MUC1. Além disso, as composições da invenção podem ser usadas em conjunto com outras composições imunoterapêuticas, incluindo imunoterapia profilática e/ou terapêutica. Agentes, composições ou protocolos adicionais (por exemplo, protocolos terapêuticos) que são úteis para o tratamento de câncer incluem, porém sem limitações, quimioterapia, resseção cirúrgica de um tumor, radioterapia, transplante de células tronco autólogas ou alogeneicas, transferência adotiva de células T, outros tipos de imunoterapia, incluindo imunoterapia com base em vetor viral e imunoterapia de fusão de células dendríticas/tumorosas e/ou terapias de objetivação de câncer (por exemplo, medicamentos de pequenas moléculas, produtos biológicos ou terapêuticos de anticorpos monoclonais que têm especificamente como alvo moléculas envolvidas em crescimento e progressão de tumor incluindo, porém sem limitações, moduladores seletivos do receptor de estrogênio (Selective Estrogen Receptor Modulators - SERM), inibidores de aromatase, inibidores de quinase de tirosina, inibidores de quinase de treonina/serina, inibidores de deacetilase de histona (Histone DeACetylase - HDAC), ativadores de receptores retinoides, estimuladores de apoptose, inibidores de angiogênese, inibidores de polimerase de (poli)ADP-ribose (PARP) ou imunoestimuladores). Qualquer um destes agentes terapêuticos e/ou protocolos terapêuticos adicionais pode ser administrado antes, simultaneamente com, alternadamente com ou após as composições imunoterapêuticas da invenção ou em diferentes pontos de tempo. Por exemplo, quando administradas a um indivíduo em conjunto com quimioterapia ou terapia de objetivação de câncer, pode ser desejável administrar as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura durante o "intervalo" entre as doses de quimioterapia ou terapia de objetivação de câncer, a fim de maximizar a eficácia das composições imunoterapêuticas. Resseção cirúrgica de um tumor pode frequentemente preceder a administração de uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura, mas cirurgia adicional ou primária pode ocorrer durante ou após a administração de uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura.
[00140] A invenção também inclui um kit que compreende qualquer uma das composições descritas aqui ou qualquer um dos componentes individuais das composições descritas aqui. Os kits podem incluir reagentes adicionais e instruções por escrito ou instruções para ao uso de qualquer uma das composições da invenção para prevenir ou tratar cânceres associados com ou caracterizados pela expressão ou superexpressão de MUC-1.
[00141] As composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura da invenção são concebidas para uso para prevenir ou tratar cânceres que estão associados com ou caracterizados pela expressão ou superexpressão de MUC1, incluindo ao impedir a emergência de tais tipos de câncer, interromper a progressão de tais tipos de câncer ou eliminar esses tipos de câncer. Mais particularmente, as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura podem ser usadas para prevenir, inibir ou retardar o desenvolvimento de tumores que expressam MUC1 e/ou para prevenir, inibir ou retardar a migração do tumor e/ou invasão de tumores de outros tecidos (metástases) e/ou para prevenir ou inibir a progressão de câncer em geral em um indivíduo. Composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura também podem ser usadas para melhorar pelo menos um sintoma do câncer, tal como reduzir a carga tumoral no indivíduo; inibir o crescimento de tumor no indivíduo; aumentar a sobrevivência do indivíduo e/ou impedir, inibir, reverter ou retardar a progressão do câncer no indivíduo.
[00142] Cânceres que são relevantes para as composições e métodos da invenção são qualquer tipo de câncer que expressa ou pode expressar MUC1 ou cânceres em proximidade de cânceres que expressam ou podem expressar MUC1, incluindo cânceres de tecidos epiteliais e incluem, porém sem limitações, câncer de mama, intestino delgado, estômago, rim, bexiga, útero, ovário, testículo, pulmão, cólon, pâncreas, próstata, testículos e cânceres metastáticos dos mesmos. Além disso, a MUC1 é ou pode ser expressa em cânceres hematológicos, tais como linfomas, mielomas e leucemias incluindo, porém sem limitações, leucemia linfocítica crônica (Chronic Lymphocytic Leukemia - CLL), linfoma mielóide múltipla (MML), leucemia mieloide aguda (Acute Myeloid Leukemia - AML), células B transformadas por vírus de Epstein-Barr (EBV), linfomas de Hodgkin e Burkitt.
[00143] Em um aspecto, a MUC1 não é detectada no câncer do indivíduo no momento em que a composição é administrada pela primeira vez. Quando MUC1 não é detectada no câncer do indivíduo, o indivíduo pode ter um câncer em estágio inicial no qual a expressão de MUC-1 ainda não se manifestou (por exemplo, estágio I ou estágio II) ou no qual a expressão de MUC-1 ainda não é detectável em qualquer caso (isto é, MUC1 pode ou não ser expressa em níveis baixos ou em um pequeno número de células tumorosas, mas ainda não é facilmente detectável usando métodos de detecção convencionais). Alternativamente, o indivíduo pode ter lesões ou tumores pré-cancerosos ou pode ser conhecido por estar predisposto a desenvolver câncer (por exemplo, conhecendo a história familiar, marcadores genéticos, etc.). Nestes aspectos da invenção, o desenvolvimento de células tumorosas que expressam MUC1 é impedido, retardado ou inibido mediante uso da composição de imunoterapêutica de MUC1 de levedura.
[00144] Em outro aspecto, a expressão de MUC-1 é ou pode ser detectada no câncer do indivíduo no momento em que a composição é administrada pela primeira vez. O indivíduo pode ter um câncer em estágio I, estágio II, estágio III ou estágio IV neste aspecto da invenção. Neste aspecto, o uso da composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura reduz, elimina ou diminui ou interrompe o crescimento de tumores que expressam MUC-1, o que pode resultar em redução na carga de tumor no indivíduo, inibição de crescimento de tumores que expressam MUC-1 e/ou aumento de sobrevivência do indivíduo.
[00145] Uma outra modalidade da invenção se refere a um método para tratar câncer e, particularmente, um câncer que expressa MUC1. O método inclui a administração, a um indivíduo que tem um câncer que expressa MUC-1, de uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura descrita aqui, a qual pode incluir uma composição compreendendo: (a) um veículo de levedura e (b) um antígeno de câncer compreendendo pelo menos um antígeno MUC1. Em um aspecto, o método reduz a carga tumoral no paciente. Em um aspecto, o método aumenta a sobrevivência do paciente. Em um aspecto, o método inibe o crescimento de tumor no indivíduo.
[00146] Em um aspecto, o indivíduo é adicionalmente tratado com pelo menos um outro composto terapêutico ou protocolo terapêutico útil para o tratamento de câncer. Tais agentes e protocolos terapêuticos foram discutidos em detalhes em outra parte aqui. Por exemplo, em qualquer uma das modalidades referentes aos métodos da invenção descritos aqui, em um aspecto, quando o indivíduo tem câncer (independentemente do estado de expressão detectável de MUC1 em células tumorosas), o indivíduo está sendo tratado ou foi tratado com outra terapia para o câncer. Tal terapia pode incluir qualquer um dos protocolos terapêuticos ou o uso de qualquer composto terapêutico ou agente aqui descrito anteriormente incluindo, porém sem limitações, quimioterapia, radioterapia, terapia objetivada de câncer, resseção cirúrgica de um tumor, transferência de células tronco, terapia com citocinas, transferência adotiva de células T e/ou administração de uma segunda composição imunoterapêutica. No caso de administração de uma segunda composição imunoterapêutica, tais composições podem incluir, porém sem limitações, imunoterapia suplementar com base em levedura, imunoterapia com base em vírus recombinantes (vetores virais, por exemplo, vide Publicação PCT WO/00/34494), terapia com citocinas, terapia imunoestimulante (incluindo quimioterapia com propriedades imunoestimulantes), vacinas de DNA, imunoterapia com fusão de células dendríticas/tumorosas (por exemplo, vide Publicação PCT N° WO/2009/062001) e outras composições imunoterapêuticas.
[00147] Em um aspecto, a segunda composição imunoterapêutica inclui um segundo antígeno de câncer que não é um antígeno MUC1. Por exemplo, uma segunda composição imunoterapêutica útil em combinação com uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura é uma composição imunoterapêutica de levedura compreendendo um outro antígeno de câncer que é expresso pelo mesmo tipo de tumor ou por outros tumores que o indivíduo a ser tratado tem ou possa ter desenvolvido. Tais antígenos de câncer incluem, porém sem limitações, qualquer um ou mais de antígeno carcinoembriônico (CarcinoEmbryonic Antigen - CEA), oncoproteína Ras com mutação de ponto, Brachyury, EGFR, BCR-Ab1, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GAGE, GP -100, MUC-2, oncoproteínas p53 com mutação de ponto e normais, PSMA, tirosinase, TRP-1 (gp75), NY-ESO-1, TRP-2, TAG72, KSA, CA-125, PSA, HER-2/neu/c-erb/B2, hTERT, p73, B-RAF, Adenomatous Polipose Coli (APC), Myc, proteína de von Hippel-Lindau (VHL), Rb-1, Rb-2, receptor de androgênio (RA), Smad4, MDR1, Flt-3, BRCA-1, BRCA-2, PAX3-FKHR, EWS-FLI-1, HERV-H, HERV-K, TWIST, Mesotelina, NGEP, modificações de tais antígenos, variantes de splicing de tais antígenos e epítopos agonistas de tais antígenos, bem como combinações de tais antígenos e/ou domínios imunogênicos dos mesmos, modificações dos mesmos, variantes dos mesmos e/ou agonistas de epítopo dos mesmos.
[00148] Conforme usado aqui, "tratar" um câncer ou qualquer permutação do mesmo (por exemplo, "tratado do câncer", etc.) se refere, em geral, à administração de uma composição da invenção uma vez que o câncer tenha ocorrido (por exemplo, uma vez que o câncer tenha sido diagnosticado ou detectado em um indivíduo), com pelo menos um objetivo terapêutico do tratamento (quando comparado com a ausência deste tratamento) incluindo: redução no peso do tumor; inibição de crescimento do tumor; aumento da sobrevivência do indivíduo; atraso, inibição, interrupção ou prevenção do aparecimento ou o desenvolvimento de câncer metastático (tal como ao retardar, inibir, interromper ou prevenir o início do desenvolvimento de migração do tumor e/ou invasão de tumores de tecidos para fora do tumor primário e/ou outros processos associados à progressão metastática do câncer); atraso ou interrupção da progressão do câncer primário, melhora das respostas imunes contra o tumor, melhora das respostas imunes de memória de longo prazo contra antígenos tumorosos e/ou melhora do estado geral de saúde do indivíduo. Por "impedir" ou "proteger" contra um câncer ou qualquer permutação dos mesmos (por exemplo, "prevenção de câncer", etc.) entenda-se, em geral, a administração de uma composição da invenção antes que um câncer tenha ocorrido, quando as células pré-cancerosas são detectadas ou antes que um estágio específico de câncer ou expressão do antígeno tumoroso em um câncer tenha ocorrido (por exemplo, antes que expressão de MUC- 1 seja detectada no câncer), com pelo menos um objetivo do tratamento (quando comparado com a ausência deste tratamento) incluindo: prevenir ou retardar o aparecimento ou desenvolvimento de um câncer ou, no caso do câncer ocorrer após o tratamento, pelo menos reduzir a gravidade do câncer (por exemplo, reduzir o nível de crescimento de tumor, interromper a progressão do câncer, melhorar a resposta imune contra o câncer, inibir processos metastáticos, etc.) ou melhorar os resultados para o indivíduo (por exemplo, melhorar a sobrevivência).
[00149] A presente invenção inclui a distribuição (administração, imunização, vacinação) de uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura da invenção a uma pessoa ou indivíduo. O processo de administração pode ser realizado ex vivo ou in vivo mas é, tipicamente, realizado in vivo. Administração ex vivo se refere à realização de parte da etapa reguladora fora do paciente, tal como a administração de uma composição da presente invenção a uma população de células (células dendríticas) removida de um paciente sob condições tais que um veículo de levedura, antígeno(s) e quaisquer outros agentes ou composições são carregados dentro da célula e as células retornadas para o paciente. A composição terapêutica da presente invenção pode, então, ser devolvida a um paciente ou administrada a um paciente através de qualquer modo de administração adequado.
[00150] A administração de uma composição pode ser sistêmica, mucosal e/ou proximal ao local alvo (por exemplo, próximo de um local de um tumor). Vias adequadas de administração serão evidentes para aqueles versados na técnica, dependendo do tipo de câncer a ser prevenido ou tratado e/ou da população de células ou tecido alvo. Vários métodos aceitáveis de administração incluem, porém sem limitações, administração intravenosa, administração intraperitoneal, administração intramuscular, administração intranodal, administração intracoronária, administração intra-arterial (por exemplo, na artéria carótida), administração subcutânea, administração transdérmica, administração intratraqueal, administração intra-articular, administração intraventricular, por inalação (por exemplo, por aerossol), administração intracraniana, intra-espinal, intra-ocular, oral, intranasal, bucal, pulmonar, impregnação de um cateter e injeção direta em um tecido. Em um aspecto, as vias de administração incluem: intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intradérmica, intranodal, as vias intramuscular, transdérmica, inalação, intranasal, oral, intra-ocular, intra-articular, intracraniana e intra-espinal. Distribuição parenteral pode incluir as vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrapleural, intrapulmonar, intravenosa, subcutânea, cateter atrial e cateter venoso. Distribuição aural pode incluir gotas para os ouvidos, distribuição intranasal pode incluir gotas nasais ou injeção intranasal e distribuição intraocular pode incluir colírios. Distribuição por aerossol (inalação) também pode ser realizada usando métodos padrões na técnica (vide, por exemplo, Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189: 1127711281, 1992). Em um aspecto, uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura da invenção é administrada por via subcutânea. Em um aspecto, a composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura é administrada diretamente em um ambiente de tumor.
[00151] Em geral, uma dose simples apropriada de uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura é uma dose que é capaz de fornecer efetivamente um veículo de levedura e o antígeno MUC1 a um determinado tipo de célula, tecido ou região do corpo do paciente em uma quantidade eficaz para induzir a uma resposta imune antígeno- específica contra um ou mais antígenos ou epítopos de MUC1 quando administrada uma ou mais vezes ao longo de um período de tempo adequado. Por exemplo, em uma modalidade, uma dose única de uma MUC1 de levedura da presente invenção é de cerca de 1 x 105 a cerca de 5 x 107 equivalentes de células de levedura por quilograma de peso corporal do organismo ao qual a composição tem de ser administrada. Uma Unidade de Levedura (Yeast Unity - YU) é 1 x 107 células de levedura ou equivalentes de células de levedura. Em um aspecto, uma dose única de um veículo de levedura da presente invenção é de cerca de 0,1 YU (1 x 106 células de levedura ou equivalentes de células de levedura) a cerca de 100 YU (1 x 109 células) por dose (ou seja, por organismo), incluindo qualquer dose intercalada, em incrementos de 0,1 x 106 células (ou seja, 1,1 x 106, 1,2 x 106, 1,3 x 106...). Em uma modalidade, uma dose adequada inclui doses entre 1 Y.U. e 40 Y.U. e, em um aspecto, entre 10 Y.U. e 40 Y.U. ou entre 10 Y.U. e 80 Y.U. Em uma modalidade, as doses são administradas em diferentes locais sobre o indivíduo, mas durante o mesmo período de dosagem. Por exemplo, uma dose de 40 Y.U. pode ser administrada injetando de doses de 10 Y.U. em quatro locais diferentes no indivíduo durante um período de dosagem. A invenção inclui a administração de uma quantidade da composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20 Y.U. ou mais) em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais locais diferentes em um indivíduo para formar uma única dose.
[00152] "Agentes de reforços" ou "reforços" de uma composição terapêutica são administrados, por exemplo, quando a resposta imune contra o antígeno tenha diminuído ou conforme necessário, para fornecer uma resposta imune ou induz a uma resposta de memória contra um determinado antígeno ou antígeno(s). Agentes de reforço podem ser administrados com um intervalo de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 semanas ou mensalmente, bimensalmente, trimestralmente, anualmente e/ou em incrementos de alguns ou vários anos após a administração inicial, dependendo do estado do indivíduo a ser tratado e do objetivo da terapia no momento da administração (por exemplo, profilática, tratamento ativo, manutenção). Em uma modalidade, um esquema de administração é aquele no qual as doses de composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura são administradas pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais vezes ao longo de um período de tempo de semanas ou meses ou anos. Em uma modalidade, as doses são administradas semanalmente ou quinzenalmente para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais doses, seguido de doses bi-semanais ou mensais, conforme necessário para atingir o tratamento preventivo ou terapêutico desejado para o câncer. Agentes de reforço adicionais podem, então, ser fornecidos em intervalos similares ou mais longos (meses ou anos) como uma terapia de manutenção ou remissão, se desejado.
[00153] Em um aspecto da invenção, um ou mais agentes terapêuticos adicionais ou protocolos terapêuticos são administrados ou realizados sequencial e/ou simultaneamente com a administração da composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura, por exemplo, resseção cirúrgica do tumor, administração de quimioterapia, administração de radioterapia, administração de uma outra composição imunoterapêutica ou protocolo incluindo terapia de vetor viral e terapia de fusão de células dendríticas/tumorosas, terapia com citocinas, transferência adotiva de células T (incluindo transferência adotiva de células T que tenham sido estimuladas ex vivo por um antígeno e/ou composição imunoterapêutica) ou transplante de células tronco. Em um exemplo, a imunoterapia com MUC1 de levedura é administrada em conjunto com uma terapia viral usando imunoterapia com base em vetor, tal como descrito na Publicação PCT N° WO/00/34494. Em outro exemplo, a imunoterapia com MUC1 de levedura é administrada em conjunção com terapia de fusão com células dendríticas/tumorosas ou células do sistema imune (por exemplo, células T) estimuladas com tais fusões de células dendríticas/tumorosas, tal como descrito na Publicação PCT N° WO/2009062001. Em tais modalidades, a imunoterapia não baseada em levedura pode ter como alvo a MUC1 ou um antígeno de tumor diferente e tais terapias podem incluir a administração adicional de outros agentes, tais como citocinas, anticorpos ou outros agentes.
[00154] Em um aspecto, uma ou mais terapias para o câncer (incluindo todas as terapias descritas aqui ou de outro modo conhecidas na técnica) podem ser administradas ou realizadas antes da primeira dose da composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura ou após a primeira dose ser administrada. Em uma modalidade, uma ou mais terapias podem ser administradas ou realizadas alternadamente com a dosagem de composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura, tal como em um protocolo no qual a composição de MUC1 de levedura é administrada em intervalos prescritos entre uma ou mais doses consecutivas de quimioterapia ou outras terapias. Em uma modalidade, a composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura é administrada em uma ou mais doses durante um período de tempo antes do início de terapias adicionais. Em outras palavras, a composição imunotera- pêutica de MUC1 de levedura é administrada como uma monoterapia durante um período de tempo e, então, uma terapia adicional é adicionada (por exemplo, quimioterapia), simultaneamente com novas doses de imunoterapia com MUC1 de levedura ou alternadamente com imunoterapia com MUC1 de levedura. Alternativa ou adicionalmente, outra terapia pode ser administrada durante um período de tempo antes da administração inicial da composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura e os conceitos podem ser combinados (por exemplo, remoção cirúrgica de um tumor, seguido de uma monoterapia usando a imunoterapia com MUC1 de levedura durante várias semanas, seguido por doses de quimioterapia e imunoterapia com MUC1 de levedura durante semanas ou meses, opcionalmente seguido por monoterapia usando imunoterapia com MUC1 de levedura e/ou outra terapia ou um novo protocolo de combinações de terapia fornecidas sequencial, simultânea ou alternadamente). Vários protocolos para o tratamento de câncer usando imunoterapia com MUC1 de levedura são considerados pela invenção e esses exemplos devem ser considerados como exemplos não limitativos de vários protocolos possíveis.
[00155] Uma composição imunoterapêutica com base em vírus compreende, tipicamente, um vetor viral que compreende um genoma do vírus ou porções do mesmo (por exemplo, um vírus recombinante) e uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos (um) antígeno(s) de um agente causador de doença ou estado doentio (por exemplo, (um) antígeno(s) de câncer, antígeno(s) de doenças infecciosas e/ou pelo menos um domínio imunogênico dos mesmos). Em algumas modalidades, uma composição imunoterapêutica com base em vírus inclui ainda pelo menos um vetor viral compreendendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais moléculas imunoestimulatórias. Em algumas modalidades, os genes que codificam as moléculas imunoestimulatórias e antígenos são inseridos no mesmo vetor viral (o mesmo vírus recombinante).
[00156] As composições imunoterapêuticas de fusão de células dendríticas/células tumorosas são, tipicamente, células híbridas geradas pela fusão entre células dendríticas e células não dendríticas que expressam antígenos tumorais, incluindo células tumorosas, usando métodos de fusão que são conhecidos na técnica. As células fundidas têm características de células dendríticas e também expressam e apresentam antígenos tumorosos a partir da célula tumorosa. As composições podem ser administradas a um indivíduo ou usadas para estimular células T ex vivo para métodos de transferência de células T.
[00157] Em um aspecto da invenção, outros antígenos adicionais que não MUC1 são também objetivados usando imunoterapia com base em levedura, além de objetivação de MUC1. Tais antígenos alvo adicionais podem estar incluídos dentro do mesmo veículo de levedura que os antígenos MUC1 ou composições imunoterapêuticas com base em levedura adicionais que objetivam antígenos diferentes podem ser produzidas e, então, combinadas conforme desejado, dependendo do indivíduo a ser tratado, dos antígenos expressos pelo tipo de câncer ou do tumor particular de um indivíduo e/ou dependendo da fase do câncer no indivíduo ou da fase de tratamento do indivíduo. Por exemplo, pode ser selecionada uma combinação de antígenos compreendendo: (1) antígenos envolvidos em eventos seminais no desenvolvimento de câncer, tal como Ras com mutação; (2) antígenos envolvidos em ou associados à desregulação de processos celulares, tais como CEA e MUC1; e (3) Brachyury, o qual está envolvido em processos metastáticos. Por exemplo, uma ou mais outras composições imunoterapêuticas com base em levedura podem expressar um ou mais antígenos incluindo, porém sem limitações, antígeno carcinoembriônico (CarcinoEmbryonic Antigen - CEA), oncoproteína Ras com mutação de ponto, Brachyury, EGFR, BCR-Ab1, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, GAGE, GP-100, MUC-2, oncoproteínas p53 com mutação de ponto e normais, PSMA, tirosinase, TRP-1 (gp75), NY-ESO-1, TRP-2, TAG72, KSA, CA-125, PSA, HER-2/neu/c-erb/B2, hTERT, p73, B-RAF, Adenomatous Polipose Coli (APC), Myc, proteína de von Hippel-Lindau (VHL), Rb-1, Rb-2, receptor de androgênio (RA), Smad4, MDR1, Flt-3, BRCA-1, BRCA-2, PAX3-FKHR, EWS-FLI-1, HERV-H, HERV-K, TWIST, Mesotelina, NGEP, modificações de tais antígenos, variantes de splicing de tais antígenos e agonistas de epítopo de tais antígenos, bem como combinações de tais antígenos e/ou domínios imunogênicos, modificações dos mesmos, variantes dos mesmos e/ou agonistas de epítopo dos mesmos. Uma, duas, três ou mais destas composições imunoterapêuticas com base em levedura podem ser administradas a um indivíduo antes de, concorrente ou alternadamente com e/ou após a administração de uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura a fim de otimizar a objetivação de antígenos no tumor do indivíduo. Conforme referido acima, terapias adicionais também podem ser usadas em tais protocolos (por exemplo, remoção cirúrgica de tumor, quimioterapia, terapia de câncer objetivada, radioterapia, etc.).
[00158] Em uma modalidade da invenção, um método para tratar câncer é fornecido. O método inclui as etapas de: (a) administração, a um indivíduo que tem câncer ou tumor pré-canceroso, de uma primeira composição imunoterapêutica compreendendo um veículo de levedura e um antígeno MUC1, conforme descrito aqui e (b) administração ao indivíduo, antes de, simultaneamente com ou subsequentemente a, a administração da primeira composição imunoterapêutica ou uma ou mais composições imunoterapêuticas adicionais, cada uma compreendendo um veículo de levedura e cada uma compreendendo um antígeno de câncer diferente que não é um antígeno MUC1. O antígeno de câncer adicional pode ser qualquer um daqueles conhecidos na técnica ou descritos aqui incluindo, porém sem limitações, Ras com mutação, antígeno carcinoembriônico (CarcinoEmbryonic Antigen - CEA), Brachyury, EGFR, etc. As etapas podem ser repetidas conforme necessário para tratar um câncer de um indivíduo em particular e os antígenos de câncer podem ser modificados antes ou durante o tratamento para tratar especificamente o câncer do indivíduo em particular.
[00159] No método da presente invenção, as composições e as composições terapêuticas podem ser administradas a qualquer animal, incluindo vertebrados e, particularmente, a qualquer membro da classe dos vertebrados, Mammalia incluindo, sem limitação, primatas, roedores, animais de criação e animais de estimação. Animais de criação incluem mamíferos a serem consumidos ou que produzem produtos úteis (por exemplo, ovelhas para produção de lã). Mamíferos para tratar ou proteger usando a invenção incluem seres humanos, primatas não humanos, cães, gatos, camundongos, ratos, cabras, ovelhas, gado, cavalos e porcos.
[00160] Um "indivíduo" é um vertebrado, tal como um mamífero incluindo, sem limitação, um ser humano. Mamíferos incluem, porém sem limitações, animais de fazenda, animais desportivos, animais de estimação, primatas, camundongos e ratos. O termo "indivíduo" pode ser usado alternadamente com o termo "animal", "pessoa" ou "paciente".
[00161] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado em contrário, métodos convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica, química de ácidos nucleicos e imunologia, os quais são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura, tais como Methods of Enzymology, Vol. 194, Guthrie et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Biology and activities of yeasts, Skinner et al., eds., Academic Press (1980); Methods in yeast genetics : a laboratory course manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); The Yeast Saccharomyces: Cell Cycle and Cell Biology, Pringle et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997); The Yeast Saccharomyces: Gene Expression, Jones et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993); The Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesis and Energetics, Broach et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segundo edição (Sambrook et al., 1989) e Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição (Sambrook e Russel, 2001), (conjuntamente referidos aqui como "Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, incluindo suplementos até 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Harlow e Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York; Harlow e Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (conjuntamente referidos aqui como "Harlow e Lane"), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000); Casarett e Doull’s Toxicology The Basic Science of Poisons, C. Klaassen, ed., 6a edição (2001) e Vaccines, S. Plotkin, W. Orenstein e P. Offit, eds., Quinta Edição (2008).
[00162] Um "TARMOGEN®" (GlobeImmune, Inc., Louisville, Colorado) se refere, em geral, a um veículo de levedura que expressa um ou mais antígenos heterólogos extracelularmente (sobre sua superfície), intracelularmente (interna ou citosolicamente) ou extracelular e intracelularmente. TARMOGEN®s foram descritos de modo geral (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 5.830.463). Determinadas composições imunoterapêuticas com base em levedura e métodos para produção e uso geral das mesmas são também descritos em detalhes, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos N° 5.830.463, Patente dos Estados Unidos N° 7.083.787, Patente dos Estados Unidos N° 7.736.642, Stubbs et al., Nat. Med. 7: 625-629 (2001), Lu et al., Cancer Research 64: 5084-5088 (2004) e em Bernstein et al., Vaccine, 24 de Janeiro de 2008; 26(4): 509-21, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na íntegra.
[00163] Conforme usado aqui, o termo "análogo" se refere a um composto químico que é estruturalmente similar a outro composto, mas difere ligeiramente quanto à composição (como na substituição de um átomo por um átomo de um elemento diferente ou presença de um grupo funcional em particular ou a substituição de um grupo funcional por outro grupo funcional). Assim, um análogo é um composto que tem função e aparência similar ou comparável, mas tem uma estrutura ou origem diferente em relação ao composto de referência.
[00164] Os termos "substituído", "derivado substituído" e "derivado", quando usados para descrever um composto, significam que pelo menos um átomo de hidrogênio ligado ao composto não substituído é substituído por um átomo ou uma porção química diferente.
[00165] Embora um derivado tenha uma estrutura física similar àquela do composto original, o derivado pode ter propriedades biológicas e/ou químicas diferentes do composto original. Tais propriedades podem incluir, porém sem limitações, um aumento ou diminuição de atividade do composto parental, nova atividade quando comparado com o composto parental, biodisponibilidade aumentada ou diminuída, eficácia aumentada ou diminuída, estabilidade aumentada ou diminuída in vitro e/ou in vivo e/ou propriedades de absorção aumentadas ou diminuídas.
[00166] Em geral, o termo "biologicamente ativo" indica que um composto (incluindo uma proteína ou peptídeo) tem pelo menos uma atividade detectável que tem um efeito sobre os processos metabólicos, fisiológicos, químicos ou outros de uma célula, um tecido ou um organismo, conforme medido ou observado in vivo (isto é, em um ambiente fisiológico natural) ou in vitro (isto é, sob condições de laboratório).
[00167] De acordo com a presente invenção, o termo "modulam" pode ser usado alternadamente com "regulam" e se refere, em geral, à regulação positiva ou regulação negativa de uma atividade em particular. Conforme usado aqui, o termo "regular positivamente" pode ser usado em geral para descrever qualquer um de: estimulação, início, aumento, reforço, melhora, intensificação, amplificação, promoção ou fornecimento, em relação a uma atividade particular. Da mesma forma, o termo "regular negativamente" pode ser usado em geral para descrever qualquer um de: diminuição, redução, inibição, alívio, bloqueio ou prevenção em relação a uma atividade particular.
[00168] Em uma modalidade da presente invenção, qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas aqui pode ser produzida a partir de pelo menos um e até cerca de 20 aminoácidos heterólogos adicionais que flanqueiam cada uma das extremidades C- e/ou N- terminais da sequência de aminoácidos especificada. A proteína ou polipeptídeo resultante pode ser referido como "consistindo essencialmente" da sequência de aminoácidos especificada. De acordo com a presente invenção, aminoácidos heterólogos são uma sequência de aminoácidos que não é naturalmente encontrada (isto é, não se encontra na natureza in vivo) flanqueando a sequência de aminoácidos especificada ou que não está relacionada à função da sequência de aminoácidos especificada ou que não seria codificada pelos nucleotídeos que flanqueiam a sequência de ácido nucleico de ocorrência natural que codifica a sequência de aminoácidos especificada conforme ela ocorre no gene, se tais nucleotídeos na sequência de ocorrência natural foram traduzidos utilizando o uso de códons padrão para organismo do qual a dada sequência de aminoácidos é derivada. Da mesma forma, a frase "consistindo essencialmente em", quando usada com referência a uma sequência de ácido nucleico aqui, se refere a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos especificada que pode ser flanqueada por pelo menos um e até tantos quanto cerca 60 nucleotídeos heterólogos adicionais em cada uma das extremidades 5' e/ou 3' da sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos especificada. Os nucleotídeos heterólogos não são naturalmente encontrados (isto é, não encontrados na natureza in vivo) flanqueando a sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos especificada conforme ocorre no gene natural ou não codificam uma proteína que confere uma função adicional à proteína ou altera a função da proteína tendo a sequência de aminoácidos especificada.
[00169] De acordo com a presente invenção, a frase "se liga seletivamente a" se refere à capacidade de um anticorpo, fragmento de ligação a antígeno ou parceiro de ligação da presente invenção de se ligar preferencialmente às proteínas específicas. Mais especificamente, a frase "se liga seletivamente" se refere à ligação específica de uma proteína à outra (por exemplo, um anticorpo, fragmento do mesmo ou parceiro de ligação para um antígeno), em que o nível de ligação, conforme medido por meio de qualquer ensaio padrão (por exemplo, um imunoensaio), é significativamente maior do que o controle de base para o ensaio. Por exemplo, quando de realização de um imunoensaio, controles incluem, tipicamente, um tubo/cavidade de reação que contém o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno apenas (isto é, na ausência de antígeno), em que uma quantidade de reatividade (por exemplo, ligação não específica à cavidade) pelo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno na ausência de antígeno é considerada para ser a base. A ligação pode ser medida usando uma variedade de métodos padrões na técnica, incluindo imunoensaios enzimáticos (por exemplo, ELISA, ensaios immunoblot, etc.).
[00170] Referência geral a uma proteína ou polipeptídeo usado na presente invenção inclui proteínas de comprimento total ou qualquer fragmento, domínio (estrutural, funcional ou imunogênico), epítopo conformacional ou um homólogo ou variante de uma determinada proteína. Uma proteína de fusão também pode ser geralmente referida como uma proteína ou um polipeptídeo. Uma proteína isolada de acordo com a presente invenção é uma proteína (incluindo um polipeptídeo ou peptídeo) que foi removida de seu meio natural (isto é, que tenha sido submetida à manipulação humana) e pode incluir proteínas purificadas, proteínas parcialmente purificadas, proteínas recombinantemente produzidas e proteínas sinteticamente produzidas por exemplo. Como tal, "isolada" não reflete a extensão até a qual a proteína foi purificada. De preferência, uma proteína isolada da presente invenção é produzida recombinantemente. De acordo com a presente invenção, os termos "modificação" e "mutação" podem ser usados alternadamente, particularmente em relação às modificações/mutações na sequência de aminoácidos de proteínas ou porções da mesma (ou sequências de ácidos nucleicos descritas aqui).
[00171] Conforme usado aqui, o termo "homólogo" ou "variante" é usado para se referir a uma proteína ou um peptídeo que difere de uma proteína ou peptídeo de referência (isto é, a proteína "protótipo" ou "de tipo selvagem") por modificações em relação à proteína ou peptídeo de referência, mas o qual mantém a estrutura básica da proteína e a cadeia lateral da forma que ocorre naturalmente. Tais alterações incluem, porém sem limitações: alterações em uma ou algumas das cadeias laterais de aminoácidos; alteração em um ou alguns dos aminoácidos, incluindo deleções (por exemplo, uma versão truncada da proteína ou peptídeo), inserções e/ou substituições; alterações na estereoquímica de um ou alguns dos átomos; e/ou pequenas derivatizações incluindo, porém sem limitações: metilação, glicosilação, fosforilação, acetilação, miristoilação, prenilação, palmitação, amidação e/ou adição de glicosil fosfatidil inositol. Um homólogo ou variante pode ter propriedades aumentadas, diminuídas ou substancialmente similares quando comparado com a proteína ou peptídeo de referência. Um homólogo ou variante pode incluir um agonista de uma proteína ou um antagonista de uma proteína. Homólogos ou variantes podem ser produzidos usando métodos conhecidos na técnica para a produção de proteínas incluindo, porém sem limitações, alterações diretas na proteína de referência isolada, síntese direta de proteínas ou modificações na sequência de ácido nucleico que codifica a proteína usando, por exemplo, técnicas clássicas ou de DNA recombinante para realizar mutagênese aleatória ou dirigida, resultando na codificação de uma variante de proteína. Além disso, podem existir variantes de ocorrência natural de uma proteína de referência (por exemplo, isoformas, variantes alélicas ou outras variantes naturais que podem ocorrer de indivíduo para indivíduo) e podem ser isoladas, produzidas e/ou usadas na invenção.
[00172] Um homólogo ou variante de uma determinada proteína pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 45% ou pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 55% ou pelo menos cerca de 60% ou pelo menos cerca de 65% ou pelo menos cerca de 70% ou pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 85% ou pelo menos cerca de 86% idênticas ou pelo menos cerca de 87% idêntica ou pelo menos cerca de 88% idêntica ou pelo menos cerca de 89% idêntica ou pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 91% idêntica ou pelo menos cerca de 92% idêntica ou pelo menos cerca de 93% idêntica ou pelo menos cerca de 94% idêntica ou pelo menos cerca de 95% idêntica ou pelo menos cerca de 96% idêntica ou pelo menos cerca de 97% idêntica ou pelo menos cerca de 98% idêntica ou pelo menos cerca de 99% idêntica (ou qualquer percentagem de identidade entre 45% e 99%, em incrementos de números inteiros) à sequência de aminoácidos da proteína de referência (por exemplo, uma sequência de aminoácidos especificada aqui ou a sequência de aminoácidos de uma proteína especificada). Em uma modalidade, o homólogo ou variante compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos que é menos de 100% idêntica, menos de cerca de 99% idêntica, menos do que cerca de 98% idêntica, menos de cerca de 97% idêntica, menos de cerca de 96% idêntica, menos de cerca de 95% idêntica e assim por diante, em incrementos de 1%, até menos de cerca de 70% idêntica à sequência de aminoácidos da proteína de referência.
[00173] Conforme aqui usado, a menos que especificado em contrário, referência a um percentual (%) de identidade se refere a uma avaliação de homologia que é realizada usando: (1) uma pesquisa de homologia local básica pelo Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) usando blastp para pesquisas de aminoácido e blastn para pesquisas de ácido nucleico com parâmetros padrões de default, em que a sequência de consulta é filtrada para regiões de baixa complexidade pelo default (tal como descrito em Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, aqui incorporado por referência na íntegra); (2) um alinhamento de duas sequências pelo BLAST (por exemplo, usando os parâmetros descritos abaixo); e/ou (3) PSI-BLAST com os parâmetros padrões de default (Position-Specific Iterated BLAST). Note que, em virtude de algumas diferenças nos parâmetros padrões entre o Basic BLAST e o BLAST para duas sequências, duas sequências específicas podem ser reconhecidas como tendo homologia significativa usando o programa BLAST, enquanto que uma pesquisa realizada no Basic BLAST usando uma das sequências como a sequência de consulta pode não identificar a segunda sequência nas compatibilidades principais. Além disso, o PSI-BLAST fornece uma versão de uso fácil automatizada de uma busca por "perfil", a qual é uma maneira sensível de procurar homólogos de sequências. O programa primeiro realiza uma pesquisa no banco de dados BLAST com lacunas. O programa PSI-BLAST usa a informação de quaisquer alinhamentos significativos retornada para a construção de uma matriz de escore posição-específica, a qual substitui a sequência de consulta para o próximo ciclo de pesquisa no banco de dados. Portanto, deve ser entendido que a percentagem de identidade pode ser determinada usando qualquer um desses programas.
[00174] Duas sequências específicas podem ser alinhadas uma com a outra usando o BLAST, conforme descrito em Tatusova e Madden, (1999), "Blast 2 Sequences - A New Tool For Comparing Protein and Nucleotide Sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250, aqui incorporado por referência na íntegra. Tal alinhamento da sequência é realizado no blastp ou blastn usando o algoritmo BLAST 2.0 para realizar uma pesquisa BLAST Gapped (BLAST 2.0) entre as duas sequências que permite a introdução de lacunas (deleções e inserções) no alinhamento resultante. Para fins de clareza aqui, um alinhamento de sequências pelo BLAST para duas sequências é feito usando os parâmetros padrões de default como segue.
[00175] Para blastn, usando a matriz 0 BLOSUM62:
[00176] Recompensa por compatibilidade = 1
[00177] Multa por incompatibilidade = -2
[00178] Penalidades por abertura de lacuna (5) e extensão de lacuna (2)
[00179] lacuna x_ausência (50) expectativa (10) tamanho de palavra (11) filtro (ligado)
[00180] Para blastp, usando a matriz 0 BLOSUM62:
[00181] Penalidades por abertura de lacuna (11) e extensão de lacuna (1)
[00182] lacuna x_ausência (50) expectativa (10) tamanho de palavra (3) filtro (ligado).
[00183] Uma molécula de ácido nucleico isolada é uma molécula de ácido nucleico que foi removida de seu meio natural (isto é, que tenha sido submetida à manipulação humana), seu ambiente natural sendo o genoma ou cromossomo no qual a molécula de ácido nucleico se encontra na natureza. Como tal, "isolada" não reflete necessariamente a extensão até a qual a molécula de ácido nucleico foi purificada, mas indica que a molécula não inclui um genoma ou um cromossomo inteiro ou um segmento do genoma que contém mais de um gene, no qual a molécula de ácido nucleico se encontra na natureza. Uma molécula de ácido nucleico isolada pode incluir um gene completo. Uma molécula de ácido nucleico isolada que inclui um gene não é um fragmento de um cromossomo que inclui tal gene, mas inclui a região de codificação e as regiões reguladoras associadas ao gene, mas não genes adicionais que são naturalmente encontrados no mesmo cromossomo. Uma molécula de ácido nucleico isolada também podem incluir porções de um gene. Uma molécula de ácido nucleico isolada pode também incluir uma sequência de ácido nucleico específica flanqueada (isto é, na extremidade 5' e/ou extremidade 3' da sequência) por ácidos nucleicos adicionais que normalmente não flanqueiam a sequência de ácido nucleico especificada na natureza (isto é, sequências heterólogas). Moléculas isoladas de ácido nucleico podem incluir DNA, RNA (por exemplo, mRNA) ou derivados de DNA ou RNA (por exemplo, cDNA). Embora a frase "molécula de ácido nucleico" se refira primariamente à molécula de ácido nucleico física e a frase "sequência de ácido nucleico" se refira primariamente à sequência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico, as duas frases podem ser usadas alternadamente, especialmente em relação a uma molécula de ácido nucleico ou uma sequência de ácido nucleico que são capazes de codificar uma proteína ou um domínio de uma proteína.
[00184] Uma molécula de ácido nucleico recombinante é uma molécula que pode incluir pelo menos uma de qualquer sequência de ácido nucleico que codifica qualquer uma ou mais das proteínas descritas aqui operativamente ligadas a pelo menos uma de qualquer sequência de controle de transcrição capaz de regular eficazmente a expressão da(s) molécula(s) de ácido nucleico na célula a ser transfectada. Embora a frase "molécula de ácido nucleico" se refira primariamente à molécula de ácido nucleico física e a frase "sequência de ácido nucleico" se refira primariamente à sequência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico, as duas frases podem ser usadas alternadamente, especialmente em relação a uma molécula de ácido nucleico ou uma sequência de ácido nucleico que são capazes de codificar uma proteína. Além disso, a frase "molécula recombinante" se refere primariamente a uma molécula de ácido nucleico operativamente ligada a uma sequência de controle de transcrição, mas pode ser usada alternadamente com o termo "molécula de ácido nucleico" a qual é administrada a um animal.
[00185] Uma molécula de ácido nucleico recombinante inclui um vetor recombinante, o qual é qualquer sequência de ácido nucleico, normalmente uma sequência heteróloga, a qual está operativamente ligada à molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma proteína de fusão da presente invenção, a qual é capaz de permitir a produção recombinante da proteína de fusão e capaz de distribuir a molécula de ácido nucleico a uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção. Tal vetor pode conter sequências de ácidos nucleicos que não são naturalmente encontradas adjacentes às moléculas de ácidos nucleicos isoladas a serem inseridas no vetor. O vetor pode ser RNA ou DNA, quer procariota ou eucariota e, de preferência, na presente invenção, é um plasmídeo útil para a transfecção de levedura. Vetores recombinantes podem ser usados na clonagem, sequenciamento e/ou manipulação de moléculas de ácido nucleico e podem ser usados na distribuição de tais moléculas (por exemplo, tal como em uma composição de DNA ou uma composição com base em vetor viral). Vetores recombinantes são, de preferência, usados na expressão de moléculas de ácido nucleico e também podem ser referidos como vetores de expressão. Vetores recombinantes preferidos são capazes de ser expressos em uma célula hospedeira transfectada, tal como uma levedura.
[00186] Em uma molécula recombinante da presente invenção, as moléculas de ácido nucleico são operativamente ligada a vetores de expressão que contêm sequências reguladoras, tais como sequências de controle de transcrição, sequências de controle de tradução, origens de replicação e outras sequências reguladoras que sejam compatíveis com a célula hospedeira e que controlam a expressão de moléculas de ácido nucleico da presente invenção. Em particular, as moléculas recombinantes da presente invenção incluem moléculas de ácido nucleico que estão operativamente ligadas a uma ou mais sequências de controle de expressão. A frase "operativamente ligada" se refere à ligação de uma molécula de ácido nucleico a uma sequência de controle de expressão de uma forma tal que a molécula é expressa quando transfectada (isto é, transformada, transduzida ou transfectada) em uma célula hospedeira.
[00187] De acordo com a presente invenção, o termo "transfecção" é usado para se referir a qualquer método através do qual uma molécula de ácido nucleico exógena (isto é, uma molécula de ácido nucleico recombinante) pode ser inserida dentro de uma célula. O termo "transformação" pode ser usado alternadamente com o termo "transfecção" quando esse termo é usado para se referir à introdução de moléculas de ácido nucleico em células microbianas, tais como algas, bactérias e leveduras. Em sistemas microbianos, o termo "transformação" é usado para descrever uma mudança herdada em virtude da aquisição de ácidos nucleicos exógenos pelo microorganismo e é essencialmente sinônimo do termo "transfecção". Portanto, técnicas de transfecção incluem, porém sem limitações, transformação, tratamento químico de células, bombardeamento de partículas, eletroporação, microinjeção, lipofecção, adsorção, infecção e fusão de protoplastos.
[00188] Os resultados experimentais a seguir são fornecidos para fins de ilustração e não se destinam a limitar o âmbito da invenção.
[00189] O exemplo a seguir descreve a produção de uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura conhecida como GI-6101.
[00190] Neste experimento, a levedura (Saccharomyces cerevisiae) foi modificada para expressar um antígeno MUC1 humano sob o controle do promotor indutível por cobre CUP1 ou o promotor constitutivo TEF2 para a produção de composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura. Em cada caso, uma proteína de fusão que compreende um antígeno MUC-1 foi produzida como um polipeptídeo único com os seguintes elementos de sequência fundidos em-rede do N- para o C-término, representada por SEQ ID NO: 15: (1) um segmento de SEA/ED de MUC1 (posições 1-59 de SEQ ID NO: 15); (2) um segmento VNTR que compreende dois domínios VNTR (posições 60100 de SEQ ID NO: 15); (3) um domínio TM de MUC1 (posições 101128 de SEQ ID NO: 15); e (4) um CD de MUC1 (posições 129-200 de SEQ ID NO: 15). Esta proteína de fusão inclui ainda uma sequência sinalizadora de MUC1 (posições 1-30 de SEQ ID NO: 14) que pode ser substituída por uma sequência N-terminal diferente concebida para conferir resistência à degradação proteossômica e/ou estabilizar a expressão, tal como o peptídeo representado por SEQ ID NO: 21 ou um peptídeo N-terminal de uma sequência líder de alfa de levedura, tal como SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20. A proteína de fusão completa, incluindo sequência sinalizadora de MUC1 N-terminal e um marcador de hexa-histidina C-terminal para facilitar a identificação e/ou purificação da proteína, é um polipeptídeo único com os seguintes elementos de sequência fundidos em-rede do N- para o C-término (representada por SEQ ID NO: 14: (1) sequência sinalizadora de MUC1 (posições 1-30 de SEQ ID NO: 14), (2) um segmento SEA/ED de MUC1 (posições 31-89 de SEQ ID NO: 14), (3) um segmento VNTR que compreende dois domínios VNTR (posições 90-130 de SEQ ID NO: 14), (4) um domínio TM de MUC1 (posições 131-158 de SEQ ID NO: 14), ( 5) um CD de MUC1 (posições 159 -230 de SEQ ID NO: 14) e (6) um marcador de histidina hexa-peptídico (posições 231-236 de SEQ ID NO: 14). SEQ ID NO: 14 é codificada pela sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 13 (códons otimizados para expressão em leveduras).
[00191] Resumidamente, o DNA que codifica os antígenos MUC1 foi sintetizado e, então, inserido nos sítios de clonagem EcoRI e NotI atrás do promotor CUP1 (vetor pGI-100) ou o promotor TEF2 (vetores plu011) em vetores de expressão de levedura de 2 μm. As sequências de nucleotídeos que codificam um peptídeo de hexa-histidina C-terminal foram adicionadas ao vetor de plasmídeo para codificar a proteína de fusão completa, representada por SEQ ID NO: 14. Os plasmídeos resultantes foram transformados em DH5a para armazenamento em plasmídeo e em Saccharomyces cerevisiae W303α para a produção das composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura
[00192] A transformação em Saccharomyces cerevisiae foi realizada por transfecção de acetato de lítio/polietileno glicol e os transfectantes primários foram selecionados sobre placas mínimas sólidas carecendo de uracila (meio sem uridina; Uridine Dropout Medium - UDM). Colônias foram selecionadas através de crescimento em U2 (meio sem uridina) ou UL2 (meio sem uridina e leucina) a 30 °C.
[00193] A composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura que compreende um polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão de MUC1 humana representada por SEQ ID NO: 14, sob o controle do promotor TEF2, é também referida aqui como GI-6101.
[00194] Culturas líquidas que carecem de uridina (U2) ou carecem de uridina e leucina (UL2) foram inoculadas com as placas e culturas iniciais descritas acima e foram cultivadas durante cerca de 24 horas a 30 °C, 250 rpm. Meio UL2 com pH tamponado contendo 4,2 g/L de BisTris (BT-UL2) também foi inoculado a partir de bancos de levedura congelada para avaliar os produtos imunoterapêuticos de MUC1 de levedura produzidos sob condições de pH neutro (dados não mostrados). A cultura em meio UL2 com pH tamponado expõe β- glicanas na parede celular da levedura e acredita-se que modifica as respostas imunes celulares induzidas pela levedura como um resultado de modificação das interações com os receptores de dectina sobre células que apresentam antígeno. As condições de cultura restantes foram as mesmas, quer U2, UL2 ou BT-UL2 seja usado. As culturas primárias foram usadas para inocular culturas finais da mesma formulação
[00195] Receita para o meio líquido U2:
[00196] 15 g/L de glicose
[00197] 6,7 g/L de base de nitrogênio para levedura contendo sulfato de amônio
[00198] 0,04 g/L de cada um de histidina, triptofano, adenina
[00199] 0,06 g/l de leucina
[00200] Receita para UL2 meios líquidos:
[00201] 15g/L de glicose
[00202] 6,7 g/L de base de nitrogênio para levedura contendo sulfato de amônio
[00203] 0,04 g/L de cada um de histidina, triptofano e adenina
[00204] Em experimentos iniciais que comparavam composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura sob o controle de diferentes promotores, a expressão de MUC1 de levedura estimulada por CUP1 (expressão indutível) foi produzido em uma cultura em 2 etapas ou 3 etapas; após a cultura inicial ou intermédia atingir o log mediano (1,5-4 YU/ml), a expressão de antígeno foi iniciada mediante a adição de sulfato de cobre a 0,375 mM à cultura final diluída para 0,1 ou 0,2 YU/ml a partir da cultura intermédia e foi continuada até que a cultura atingisse uma densidade de 1,5-3 Y.U. A expressão de MUC1 de levedura estimulada por TEF2 é constitutiva e o crescimento destas células foi continuado até que as culturas atingissem uma densidade entre 1,1 e 4,0 Y.U./ml. As células de cada cultura foram, então, coletadas, lavadas e termicamente inativadas a 56 °C durante 1 hora em PBS.
[00205] Após inativar termicamente as culturas, as células foram lavadas três vezes em PBS. Expressão de proteína total foi medida por um ensaio de precipitação/ligação de nitrocelulose TCA e por Western blot usando um anticorpo monoclonal anti-marcador His e um anticorpo anti-MUC-1 (VNTR) (sc-7313, Santa Cruz). O teor de proteína foi quantificado usando métodos de imagiologia digital semi-quantitativos. Esperava-se que GI-6101 expressasse a proteína de fusão MUC1 como uma proteína associada à membrana de cerca de 25 kDa
[00206] A Fig. 2A mostra a expressão do antígeno MUC1 em GI-6101 usando anticorpos anti-MUC1 (VNTR) e anti-His para detecção. Estes resultados mostraram boa expressão da proteína de fusão de MUC1. A Fig. 2B mostra o antígeno MUC1 de GI-6101 após desglicosilação com EdoH ou PNGaseF. Esta figura mostra que a proteína de fusão GI-6101 é um produto glicosilado, uma vez que o tamanho da proteína de fusão é maior do que aqueles estimado antes de desglicosilação, mas o tamanho esperado (25 kDa) é reduzido após desglicosilação com EdoH ou PNGaseF.
[00207] A quantificação da expressão de antígeno em GI-6101, que foi cultivada sob condições de cultura padrões, foi comparada com GI- 6101 cultivada sob condições de pH neutro, conforme descrito acima. Os níveis de expressão de antígeno foram aproximadamente os mesmos usando qualquer um dos processos (dados não mostrados), demonstrando que o processo em pH neutro não altera o nível de expressão do antígeno MUC1 pela levedura
[00208] O exemplo a seguir descreve a produção de uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura conhecida como GI-6104.
[00209] Neste experimento, a levedura (Saccharomyces cerevisiae) foi modificada para expressar um antígeno MUC1 humano sob o controle do promotor indutível por cobre CUP1 ou o promotor constitutivo TEF2 para a produção de composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura. Em cada caso, uma proteína de fusão que compreende um antígeno MUC-1 foi produzida como um polipeptídeo único com os seguintes elementos de sequência fundidos em-rede do N- para o C-término, representada por SEQ ID NO: 18: (1) um primeiro CD de MUC1 (posições 1-72 de SEQ ID NO: 18); (2) um segundo CD de MUC1 (posições 73-144 de SEQ ID NO: 18); e (3) um terceiro CD de MUC1 (posições 145-216 de SEQ ID NO: 18). Esta proteína de fusão inclui ainda uma sequência N-terminal concebida para conferir resistência à degradação proteossômica e/ou estabilizar a expressão (representada nesta proteína de fusão por SEQ ID NO: 21). A proteína de fusão poderia, alternativamente, ser concebida usando uma sequência sinalizadora de MUC1 (por exemplo, posições 1-30 de SEQ ID NO: 14), um peptídeo N-terminal sintético diferente conforme descrito aqui ou um peptídeo N-terminal de uma sequência líder alfa de levedura, tal como SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20. A proteína de fusão completa, incluindo o peptídeo N-terminal e um marcador de hexa- histidina C-terminal para facilitar a identificação e/ou purificação da proteína, é um polipeptídeo único com os seguintes elementos de sequência fundidos em-rede do N- para o C-término (representada por SEQ ID NO: 17): (1) um peptídeo sintético representado por SEQ ID NO: 21 (posições 1-6 de SEQ ID NO: 17), (2) um primeiro CD de MUC1 (posições 7-78 de SEQ ID NO: 17), (3) um segundo CD de MUC1 (posições 79-150 de SEQ ID NO: 17), (4) um terceiro CD de MUC1 (posições 151-222 de SEQ ID NO: 17) e (5) um marcador de hexa- histidina (posições 223-228 de SEQ ID NO: 17). SEQ ID NO: 17 é codificada pela sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 16 (códons otimizados para expressão em leveduras).
[00210] Resumidamente, o DNA que codifica os antígenos MUC1 foi sintetizado e, então, inserido nos sítios de clonagem EcoRI e NotI atrás do promotor CUP1 (vetor pGI-100) ou o promotor TEF2 (vetores plu011) em vetores de expressão de levedura de 2 μm. As sequências de nucleotídeos que codificam um peptídeo de hexa-histidina C-terminal foram adicionadas ao vetor de plasmídeo para codificar a proteína de fusão completa, representada por SEQ ID NO: 17. Os plasmídeos resultantes foram transformados em DH5a para armazenamento em plasmídeo e em Saccharomyces cerevisiae W303α para a produção das composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura.
[00211] A transformação em Saccharomyces cerevisiae foi realizada por transfecção de acetato de lítio/polietileno glicol e os transfectantes primários foram selecionados sobre placas mínimas sólidas carecendo de uracila (meio sem uridina; Uridine Dropout Medium - UDM). Colônias foram selecionadas através de crescimento em U2 (meio sem uridina) ou UL2 (meio sem uridina e leucina) a 30 °C.
[00212] A composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura que compreende um polinucleotídeo que codifica a proteína de fusão de MUC1 humana representada por SEQ ID NO: 17, sob o controle do promotor CUP1, é também referida aqui como GI-6104.
[00213] Culturas líquidas que carecem de uridina (U2) ou carecem de uridina e leucina (UL2) (receitas de meios são fornecidas no Exemplo 1) foram inoculadas com as placas e culturas iniciais descritas acima e foram cultivadas durante cerca de 24 horas a 30 °C, 250 rpm. Meio UL2 com pH tamponado contendo 4,2 g/L de Bis-Tris (BT-UL2) também foi inoculado a partir de bancos de levedura congelada para avaliar os produtos imunoterapêuticos de MUC1 de levedura produzidos sob condições de pH neutro (dados não mostrados). A cultura em meio UL2 com pH tamponado expõe β-glicanas na parede celular da levedura e acredita-se que modifica as respostas imunes celulares induzidas pela levedura como um resultado de modificação das interações com os receptores de dectina sobre células que apresentam antígeno. As condições de cultura restantes foram as mesmas, quer UL2 ou BT-UL2 seja usado. As culturas primárias foram usadas para inocular culturas finais da mesma formulação.
[00214] Em experimentos iniciais que comparavam composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura sob o controle de diferentes promotores, a expressão de MUC1 de levedura estimulada por CUP1 (expressão indutível) foi produzido em uma cultura em 2 etapas ou 3 etapas; após a cultura inicial ou intermédia atingir o log mediano (1,5-4 YU/ml), a expressão de antígeno foi iniciada mediante a adição de sulfato de cobre a 0,375 mM à cultura final diluída para 0,1 ou 0,2 YU/ml a partir da cultura intermédia e foi continuada até que a cultura atingisse uma densidade de 1,5-3 Y.U. A expressão de levedura- MUC1 estimulada por CUP1 (expressão indutível) também foi iniciada mediante a adição de sulfato de cobre a 0,375 mM após a cultura final de MUC1 de levedura atingir uma densidade de aproximadamente 2 Y.U./ml e foi induzida durante 4-6 horas. A expressão de MUC1 de levedura estimulada por TEF2 é constitutiva e o crescimento destas células foi continuado até que as culturas atingissem uma densidade entre 1,1 e 4,0 Y.U./ml. As células de cada cultura foram, então, coletadas, lavadas e termicamente inativadas a 56 °C durante 1 hora em PBS.
[00215] Após inativar termicamente as culturas, as células foram lavadas três vezes em PBS. Expressão de proteína total foi medida por um ensaio de precipitação/ligação de nitrocelulose TCA e por Western blot usando um anticorpo monoclonal anti-marcador His e um anticorpo anti-MUC-1 (C-término) (sc-6827, Santa Cruz). O teor de proteína foi quantificado usando métodos de imagiologia digital semi-quantitativos. Esperava-se que GI-6104 expressasse a proteína de fusão MUC1 como uma proteína citosólica de cerca de 25 kDa.
[00216] A Fig. 2C mostra a expressão do antígeno MUC1 em GI- 6104 usando anticorpos anti-MUC1 (C-término) e anti-His para detecção. Estes resultados mostraram boa expressão da proteína de fusão de MUC1. A Fig. 2B mostra o antígeno MUC1 de GI-6104 após desglicosilação com EdoH. Esta figura mostra que a proteína de fusão GI-6104 não é expressa como um produto glicosilado, uma vez que o tamanho da proteína de fusão é o mesmo antes e após desglicosilação com EdoH.
[00217] A quantificação da expressão de antígeno em GI-6104, que foi cultivada sob condições de cultura padrões, foi comparada com GI- 6104 cultivada sob condições de pH neutro, conforme descrito acima. Os níveis de expressão de antígeno foram aproximadamente os mesmos usando qualquer um dos processos (dados não mostrados), demonstrando que o processo em pH neutro não altera o nível de expressão do antígeno MUC1 pela levedura.
[00218] O exemplo a seguir descreve a produção de uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura agonista conhecida como GI-6105.
[00219] Neste experimento, levedura (Saccharomyces cerevisiae) foi modificada para expressar um antígeno agonista MUC1 humano sob o controle do promotor de induzível por cobre CUP1, produzindo uma composição imunoterapêuticas de MUC1 de levedura agonista. O antígeno agonista MUC1 foi concebido usando o antígeno da composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura GI-6101 (vide Exemplo 1) como um modelo. Resumidamente, uma proteína de fusão que compreende um antígeno agonista MUC1 foi produzida como um polipeptídeo único com os seguintes elementos de sequência fundidos em-rede do N- para o C-término, representada por SEQ ID NO: 23: (1) sequência sinalizadora de MUC1 (posições 1-30 de SEQ ID NO: 23); (2) um segmento SEA/ED de MUC1 (posições 31-89 de SEQ ID NO: 23); (3) um segmento VNTR que compreende dois domínios VNTR (posições 90-130 de SEQ ID NO: 23); (4) um domínio TM de MUC1 (posições 131-158 de SEQ ID NO: 23); (5) um CD de MUC1 (posições 159-230 de SEQ ID NO: 23); (6) um epítopo agonista de MUC1 (posições 231-246 de SEQ ID NO: 23); e (7) um marcador de histidina hexapeptídico (posições 247-252 de SEQ ID NO: 23). SEQ ID NO: 23 é codificada pela sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 22 (códons otimizados para expressão em leveduras). A sequência sinalizadora de MUC1 (posições 1-30 de SEQ ID NO: 23) pode ser substituída por uma sequência N-terminal diferente concebida para conferir resistência à degradação proteossômica e/ou estabilizar a expressão, tal como o peptídeo representado por SEQ ID NO: 21 ou um peptídeo N-terminal de uma sequência líder alfa de levedura, tal como SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20. O marcador de hexa-histidina C- terminal é opcional e facilita a identificação e/ou purificação da proteína. Quando comparado com o antígeno em GI-6101 (por exemplo, SEQ ID NO: 14 ou 15), a sequência em GI-6105 contém as seguintes substituições de aminoácidos para criar uma variedade de epítopos agonistas (posições de substituição fornecidas em referência à SEQ ID NO: 23, com referência ainda à localização da substituição em uma MUC-1 de tipo selvagem representada pelo N° de Acesso NP_001191214): A96Y (posição 161 na MUC1 de tipo selvagem), P97L (posição 162 na MUC1 de tipo selvagem), G104V (posição 169 na MUC1 de tipo selvagem), S105Y (posição 170 na MUC1 de tipo selvagem), T106L (posição 171 na MUC1 de tipo selvagem), A147Y (posição 392 na MUC1 de tipo selvagem), C161V (posição 406 na MUC1 de tipo selvagem), T199L (posição 444 na MUC1 de tipo selvagem), D200F (posição 445 na MUC1 de tipo selvagem), S215Y (posição 460 na MUC1 de tipo selvagem) e T239L (posição 93 na MUC1 de tipo selvagem).
[00220] Um plasmídeo contendo antígeno agonista MUC1 para GI- 6105 (SEQ ID NO: 23) foi transfectado em levedura W303α e os transformantes foram selecionados após 3 dias de crescimento a 30 °C em agar sem de uridina (Uridine Dropout Agar - UDA). Colônias isoladas foram novamente cultivadas em placas de agar sem de uridina e leucina (Uridine and Leucine Dropout Agar - ULDA) e incubadas a 30 °C durante mais 4 dias para selecionar células com elevado número de cópias do plasmídeo.
[00221] Uma única colônia de GI-6105 foi retirada da placa ULDA e usada para inocular 25 mL de meio líquido UL2 (cultura inicial). A cultura inicial foi incubada com agitação a 30 °C em uma densidade de ~ 3 YU/ml e, então, usada para inocular uma cultura intermédia de 0,3 YU/mL. A cultura intermediária foi crescida em uma densidade de 3 YU/ml e, então, usada para inocular uma cultura final em uma densidade de 0,04 YU/mL. A cultura final foi cultivada em uma densidade de 3,6 YU/mL, então, tratada com sulfato de cobre a 0,5 mM durante 3h a 30 °C para induzir à expressão de antígeno agonista Muc1 v1.0.
[00222] As células induzidas foram lavadas uma vez com PBS, termicamente inativadas a 56 °C durante 1 hora, então, lavadas três vezes em PBS. O teor total de proteína das células termicamente inativadas foi medido por meio do ensaio Amidoschwarz e o teor de antígeno agonista foi medido por Western blot com um anticorpo monoclonal que reconhece um marcador de epítopo de hexa-histidina C-terminal. A quantidade de antígeno foi determinada por meio de interpolação contra uma curva padrão compreendida da proteína NS3 de HCV marcada com His. Conforme mostrado na Fig. 3, o antígeno foi expresso pela levedura e o teor de antígeno para GI-6105 foi estimado como sendo de aproximadamente 2801 Ng/YU.
[00223] O exemplo a seguir descreve a produção de uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura agonista conhecida como GI-6106.
[00224] Neste experimento, levedura (Saccharomyces cerevisiae) foi modificada para expressar um antígeno agonista MUC1 humano sob o controle do promotor de induzível por cobre CUP1, produzindo uma composição imunoterapêuticas de MUC1 de levedura agonista. O antígeno agonista MUC1 foi concebido usando um antígeno MUC1 de tipo selvagem de comprimento completo tendo o N° de Acesso NP_001191214, embora outras proteínas MUC1 de tipo selvagem poderiam ser utilizadas para conceber agonistas similares. Resumidamente, uma proteína de fusão que compreende um antígeno agonista MUC1 foi produzida como um polipeptídeo único com os seguintes elementos de sequência fundidos em-rede do N- para o C- término, representada por SEQ ID NO: 25: (1) uma sequência líder de fator alfa descrita aqui em outra parte por SEQ ID NO: 19 (posições 189 de SEQ ID NO: 25); (2) uma sequência ligante de Tre-Ser (posições 90-91 de SEQ ID NO: 25); (3) uma proteína agonista MUC1 de comprimento completo correspondendo a uma proteína de tipo selvagem, exceto quanto à introdução de 11 epítopos agonistas (posições 92-566 de SEQ ID NO: 25); e (7) um marcador de histidina hexapeptídico (posições 567-572 de SEQ ID NO: 25). SEQ ID NO: 25 é codificada pela sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 24 (códons otimizados para expressão em leveduras). A sequência líder de fator alfa (posições 1-89 de SEQ ID NO: 25) pode ser substituída por uma sequência N-terminal diferente concebida para conferir resistência à degradação proteossômica e/ou estabilizar a expressão, talcomo o peptídeo representado por SEQ ID NO: 21 ou um peptídeo N- terminal de uma sequência líder alfa de levedura diferentes, tal como SEQ ID NO: 20, ou uma sequência sinalizadora de MUC1. O marcador de hexa-histidina C-terminal é opcional e facilita a identificação e/ou purificação da proteína. Quando comparado com a proteína MUC1 de tipo selvagem usada como modelo, a sequência de GI-6106 contém as seguintes substituições de aminoácidos para criar uma variedade de epítopos agonistas (posições de substituição fornecidas em referência à SEQ ID NO: 25, com referência ainda à localização da substituição em MUC-1 de tipo selvagem representada pelo N° de Acesso NP_001191214): T184L (posição 93 na MUC1 de tipo selvagem), A232Y (posição 161 na MUC1 de tipo selvagem), P233L (posição 162 na MUC1 de tipo selvagem), G240V (posição 169 na MUC1 de tipo selvagem), S241Y (posição 170 na MUC1 de tipo selvagem), T242L (posição 171 na MUC1 de tipo selvagem), A483Y (posição 392 na MUC1 de tipo selvagem), C497V (posição 406 na MUC1 de tipo selvagem), T535L (posição 444 na MUC1 de tipo selvagem), D536F (posição 445 na MUC1 de tipo selvagem) e S551Y (posição 460 na MUC1 de tipo selvagem).
[00225] Um plasmídeo contendo antígeno agonista MUC1 para GI- 6106 foi transfectado em levedura W303α e transformantes foram selecionados após 3 dias de crescimento a 30 °C em agar sem de uridina (Uridine Dropout Agar - UDA). Colônias isoladas foram novamente cultivadas em placas de agar sem de uridina e leucina (Uridine and Leucine Dropout Agar - ULDA) e incubadas a 30 °C durante mais 4 dias para selecionar células com elevado número de cópias do plasmídeo.
[00226] Uma única colônia de GI-6106 foi retirada da placa ULDA e usada para inocular 25 mL de meio líquido UL2 (cultura inicial). A cultura inicial foi incubada com agitação a 30 °C em uma densidade de ~ 3 YU/ml e, então, usada para inocular uma cultura intermédia de 0,3 YU/mL. A cultura intermediária foi crescida em uma densidade de 3 YU/ml e, então, usada para inocular uma cultura final em uma densidade de 0,04 YU/mL. A cultura final foi cultivada em uma densidade de 3 YU/mL, então, tratada com sulfato de cobre a 0,5 mM durante 3h a 30 °C para induzir à expressão de antígeno agonista Muc1 v2.0.
[00227] As células induzidas foram lavadas uma vez com PBS, termicamente inativadas a 56 °C durante 1 hora, então, lavadas três vezes em PBS. O teor total de proteína das células termicamente inativadas foi medido por meio do ensaio Amidoschwarz e o teor de antígeno agonista foi medido por Western blot com um anticorpo monoclonal que reconhece um marcador de epítopo de hexa-histidina C-terminal. A quantidade de antígeno foi determinada por meio de interpolação contra uma curva padrão compreendida da proteína NS3 de HCV marcada com His. Os resultados mostraram que a levedura GI- 6106 expressava o antígeno (dados não mostrados); o teor de antígeno para GI-6106 foi estimado como sendo de aproximadamente 2940 Ng/YU.
[00228] Os exemplos a seguir descrevem a análise fenotípica e funcional dos efeitos das composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura sobre células dendríticas humanas.
[00229] A fim de avaliar o efeito das composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura descritas nos Exemplos 1 e 2 sobre o fenótipo e função de células dendríticas, os experimentos a seguir foram realizados.
[00230] Em um primeiro experimento, células dendríticas (Dendritic Cells - DCs) humanas foram cultivadas durante 48 horas com: (1) meio isolado (não tratado); (2) CD40L (1 μg/ml) mais intensificador de ligante (1 μg/ml) como um controle positivo; (3) levedura de controle (Levedura de Controle; levedura compreendendo um vetor vazio (sem inserto de antígeno MUC1)); (4) a composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura conhecida como GI-6101, cultivada sob condições de crescimento normais, conforme descrito no Exemplo 1 (GI-6101); (5) a composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura conhecida como GI-6101, cultivada sob condições de crescimento em pH neutro, conforme descrito no Exemplo 1 (GI-6101 (DEC)); (6) a composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura conhecida como GI-6104 (GI- 6104), cultivada sob condições de crescimento normais, conforme descrito no Exemplo 2; ou (7) a composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura conhecida como GI-6104, cultivada sob condições de crescimento em pH neutro, conforme descrito no Exemplo 2 (GI-6104 (DEC)). As células dendríticas e as leveduras foram combinadas em uma proporção de 1:10 (DC:levedura). As DCs foram coletadas e analisadas por citometria de fluxo quanto à expressão de marcador na superfície de DCs. Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo como a percentagem de células positivas e MFI (parênteses).Tabela 1
[00231] Os resultados mostram que a levedura (levedura de controle e levedura que expressa antígenos MUC1), independentemente do método de crescimento, regulou positivamente a expressão de CD80 e CD83 em células dendríticas quando comparado com células não tratadas. CD80, ou B7.1, é uma molécula coestimulatória necessária para ativação de células T e a sobrevida é regulada positivamente sobre células dendríticas ativadas. CD83 é um marcador de maturação de células dendríticas. Consequentemente, este experimento mostra que as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura podem regular positivamente marcadores de maturação de DC.
[00232] Em um segundo experimento, a produção de citocinas e quimiocinas por células dendríticas foi avaliada após cultura com os produtos imunoterapêuticos de MUC1 de levedura. Resumidamente, DCs humanas de um doador normal (um doador que se acreditava estar sem câncer) foram cultivadas durante 5 dias com fator de estimulação de colônia de macrófagos-granulócitos (Granulocyte MacrophageColony Stimulating Factor - GM-CSF) e interleucina-4 (IL-4) ou tratadas com CD40L (1 μg/ml, Enzo Life Sciences) mais intensificador para ligantes (1 μg/ml, Enzo Life Sciences) durante 24 horas ou com levedura de controle (vetor vazio), GI-6101 cultivada sob condições de crescimento padrões (GI-6101), GI-6101 cultivada sob condições de pH neutro (GI-6101 (DEC)), GI-6104 cultivada sob condições de crescimento normais (GI-6104) ou GI-6104 cultivada sob condições de pH neutro (GI-6104 (DEC)) durante 48 horas (proporção de DC:levedura = 1:10). Sobrenadantes de cultura foram coletados e pesquisados quanto à produção de citocinas e quimiocinas com um kit de citocinas/quimiocinas multiplex. Os resultados são expressos em pg/ml e mostrados na Tabela 2. Tabela 2
[00233] Os resultados da Tabela 2 mostram que o tratamento de células dendríticas de um doador normal com composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura descritas nos Exemplos 1 e 2 aumenta a produção de citocina e quimiocina por estas células. Notavelmente, a produção de interferon-Y (IFN-Y) foi aumentada após exposição às composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura cultivadas sob condições de pH neutro, o que espera-se que melhore as respostas de células CD8+ e TH1. Além disso, as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura cultivadas sob condições de pH neutro induzem a uma maior produção de citocinas e quimiocinas por DCs, com a composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura conhecida como GI-6101 (pH neutro) mostrando a maior estimulação de produção de citocinas e quimiocinas por DCs. Os números destacados em negrito mostram a indução de citocinas/quimiocinas que é estatisticamente aprimorada de modo significativo quando comparado com o controle não tratado (dados não mostrados).
[00234] O experimento mostrado na Tabela 2 foi repetido usando células dendríticas isoladas de um doador normal diferente. Os resultados (dados não mostrados) são comparáveis àqueles mostrados na Tabela 2 e confirmam que as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura induzem à produção de citocina e quimiocina por células dendríticas e que a composição de MUC1 de levedura conhecida como GI-6101, cultivada sob condições de crescimento em pH neutro, induz a maiores níveis de produção de citocina e quimiocina por células dendríticas, dentre as duas composições de MUC1 de levedura cultivadas sob cada condição.
[00235] Tomados juntos, estes resultados mostram que as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura podem ativar células dendríticas e induzir à produção de citocina e quimiocina que está associada a uma resposta imune produtiva.
[00236] O exemplo a seguir mostra que as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura da invenção podem ativar células T MUC1-específicas.
[00237] T-3-P93L é uma linhagem de células T MUC1-específica que reconhece especificamente o peptídeo agonista de MUC1, denotado P93L, no contexto do HLA-A2. P93L é um peptídeo que abrange as posições 92-101 de uma proteína MUC1 de comprimento completo (por exemplo, ATWGQDVTSV; posições 92-101 de SEQ ID NO: 11), exceto que a treonina na posição 2 deste peptídeo (posição 93 nas posições 92-101 de SEQ ID NO: 11) é substituído por uma leucina, criando um peptídeo agonista. P93L se liga ao HLA-A2 em maiores níveis do que o peptídeo nativo (tipo selvagem) e é um melhor indutor de células T MUC1-específicas do que o peptídeo nativo (maior produção de citocinas Th1 (vide Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos N ° 2008/0063653). A linhagem de células T-3-P93L pode realizar lise especificamente de alvos tumorais MUC1-positivos, HLA- A2-positivos in vitro (dados não mostrados). Esta linhagem de células T é específica para uma porção da proteína MUC1 que está dentro da subunidade MUC1-N.
[00238] Neste experimento, DCs de um doador normal, preparadas conforme descrito no Exemplo 5, foram tratadas com as composições imunoterapêuticas de levedura descritas nos Exemplos 1 e 2 ou com levedura de controle (vetor vazio), CD40L (controle positivo) ou não tratadas (controle negativo), usando as condições descritas acima no Exemplo 5. DCs tratadas com controle de levedura ou com CD40L receberam um pulso com ou sem o peptídeo P93L (P93L foi usado a 10 μg/ml). DCs tratadas foram, então, usadas como células que apresentam antígeno (Antigen Presenting Cells - APCs) para avaliar sua capacidade de estimular a linhagem de células T MUC1-específica T-3-P93L (proporção de células T:DC = 10:1). Os sobrenadantes de cultura de 24 horas foram coletados e pesquisados quanto à secreção de interferon-Y (IFN-Y). Os resultados são mostrados na Tabela 3, expressos como a quantidade de IFN-Y produzida pelas células T em pg/ml. Tabela 3
[00239] Os resultados mostram que células dendríticas tratadas com GI-6101, produzida sob condições de pH neutro e padrões, e as quais expressam domínios VNTR da subunidade MUC1-N, foram capazes de estimular células T MUC1-N-específicas para produzir quantidades significativas de IFN-Y. GI-6104, a qual não expressa o antígeno da proteína MUC1-N (GI-6104 expressa apenas o antígeno MUC1 a partir do domínio citoplasmático (Cytoplasmic Domain - CD)), não estimulou células T MUC-1-N-específicas.
[00240] Em um segundo experimento, a linhagem de células T MUC1-C-específica, designada T-15-P1240(1Y), foi estimulada com DCs que foram tratadas conforme no experimento acima, para determinar se as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura da invenção podem estimular estas células T. A linhagem de células T- 15-P1240(1Y) é uma linhagem de células T MUC1-específica que reconhece especificamente o peptídeo agonista de MUC1, denotado P1240(1Y), o qual é um peptídeo de MUC1-C, no contexto de HLA-A2. P1240(1Y) é um peptídeo que abrange posições 1240-1248 de uma proteína MUC1 de comprimento completo (por exemplo, SLSYTNPAV; posições 1240-1248 de SEQ ID NO: 11), exceto que a serina na posição 1 do presente peptídeo (posição 1240 nas posições 1240-1248 de SEQ ID NO: 11) é substituída por uma lisina, criando um peptídeo agonista. P1240(1Y) se liga ao HLA-A2 bem ou melhor do que o peptídeo nativo (tipo selvagem) e é uma melhor indutor de células T MUC1-específicas do que o peptídeo nativo (maior produção de citocinas Th1. A linhagem de células T-15-P1240(1Y) pode realizar lise especificamente de alvos tumorais MUC1-positivos, HLA-A2-positivos in vitro (dados não mostrados). Esta linhagem de células T é específica para uma porção de MUC1 que está dentro da subunidade MUC1-C e especificamente o domínio citoplasmático (Cytoplasmic Domain - CD).
[00241] Neste experimento, DCs foram geradas a partir de PBMCs de um doador HLA-A2 positivo saudável e preparadas conforme descrito no Exemplo 5. As DCs foram tratadas com as composições imunoterapêuticas de levedura descritas nos Exemplos 1 e 2 ou com CD40L (controle positivo) ou não tratadas (controle negativo), usando as condições descritas acima no Exemplo 5. DCs tratadas com CD40L receberam um pulso com ou sem peptídeo P1240(1Y) (peptídeo foi usado a 10 μg/ml). DCs tratadas foram, então, usadas como células que apresentam antígeno (Antigen Presenting Cells - APCs) para avaliar sua capacidade de estimular a linhagem de células T MUC1-específicas T- 15-P1240(1Y) (proporção de células T:DC = 10:1). Os sobrenadantes de cultura de 24 horas foram coletados e pesquisados quanto à secreção de interferon-Y (IFN-Y). Os resultados são mostrados na Tabela 4, expressos como a quantidade de IFN-Y produzida pelas células T em pg/ml. Tabela 4
[00242] Os resultados mostram que tanto GI-6101 quanto GI-6104, cultivadas sob condições de pH neutro ou padrões, foram capazes de estimular células T MUC1-C-específicas para produzir quantidades significativas de IFN-Y. As composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura cultivadas sob condições de pH neutro (GI-6101 e GI-6104) estimularam maiores níveis de produção de IFN-Y pelas células T do que composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura cultivadas sob condições padrões.
[00243] Em um terceiro experimento, o experimento descrito na Tabela 4 acima foi repetido, mas usando diferentes proporções de DC:células T para DCs tratadas com as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura GI-6101 e GI-6104. Os resultados são apresentados abaixo na Tabela 5. Tabela 5
[00244] Os resultados mostram mais uma vez que tanto GI-6101 quanto GI-6104, cultivadas sob condições de pH neutro ou padrões, foram capazes de estimular células T MUC1-específicas para produzir quantidades significativas de IFN-Y e que as composições cultivadas sob condições de pH neutro estimularam níveis mais elevados de produção de IFN-y pelas células T do que composições imunotera- pêuticas de MUC1 de levedura cultivadas sob condições padrões. Os resultados mostram ainda uma resposta à dose, uma vez que o número de DCs aumenta em relação ao número de células T.
[00245] Tomados juntos, estes resultados mostram que as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura podem ativar células T MUC1-específicas de uma maneira antígeno-específica, conforme ilustrado pela liberação de IFN-y a partir de células T estimuladas por DCs tratadas com as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura. Estes resultados mostram também uma vantagem para a produção de IFN-y por células T como um resultado do uso de composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura cultivadas sob condições de pH neutro.
[00246] O exemplo que segue demonstra que composições de MUC1 de levedura da invenção podem expandir e estimular células T MUC1-específicas de pacientes com câncer.
[00247] Neste experimento, DCs são preparadas a partir de PBMC de pacientes com câncer (após tratamento com uma terapia de câncer, a qual pode incluir quimioterapia ou tratamento e/ou pré-tratamento com vacinas virais). DCs são preparados de uma cultura de 5 dias na presença de GM-CSF e IL-4, seguido por incubação na presença de leveduras (GI-6101 e/ou GI-6104, cultivadas sob condições de pH neutro ou padrões). Após 48 horas de cocultura, as DCs são usadas como APCs para estimulação de células T autólogas medindo-se a produção de citocinas e/ou proliferação de células T CD4+. Espera-se que composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura expandam e ativem as células T de pacientes com câncer.
[00248] Em um segundo experimento, DCs são preparadas a partir de PBMCs de pacientes com câncer (pós-tratamento com uma terapia de câncer, o qual pode incluir quimioterapia ou tratamento e/ou pré- tratamento com vacinas virais). As DCs são preparadas em uma cultura de 5 dias na presença de GM-CSF e IL-4, seguido de incubação na presença de leveduras (GI-6101 e/ou GI-6104, cultivadas sob condições de pH neutro ou padrão). Após 48 horas de cocultura, as DCs são usadas como APCs para estimulação de células T autólogas. Cada ciclo de IVS consiste em três dias na ausência de IL-2, seguido por mais quatro dias na presença de 20 U/ml de IL-2 recombinante. Tetrâmeros específicos para um peptídeo de MUC1 são usados para detectar a percentagem de células T CD8+ que são expandidas por meio de tratamento com as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura. Espera-se que composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura expandam e ativem as células T de pacientes com câncer.
[00249] Em um terceiro experimento, as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura são usadas para gerar CTLs MUC1-específicos a partir de PBMCs que realizam a lise de alvos que expressam MUC1. Neste experimento, células T MUC1-específicas de doadores normais e/ou de pacientes com câncer (após tratamento com uma terapia de câncer, a qual pode incluir quimioterapia ou tratamento e/ou pré-tratamento com vacina viral), são expandidas in vitro usando DCs incubadas com composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura (GI-6101 ou GI-6104) durante 2 ciclos de estimulação in vitro (In Vitro Stimulation - IVS). No dia 5, células T CD8+ são isoladas e usadas em um ensaio de CTL durante a noite contra células tumorosas que expressam MUC1. Espera-se que estes experimentos demonstrem que as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura podem gerar CTLs MUC1-específicos que são capazes de matar células tumorosas que expressam MUC1.
[00250] O exemplo a seguir demonstra que a imunização com uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura reduz tumores que expressam MUC1 in vivo.
[00251] Neste experimento, camundongos receberam células tumorosas que expressam uma proteína MUC1 humana recombinante por meio da veia da cauda (dia 0). Quatro dias após implante do tumor, os animais recebem vacinações semanais com controle de levedura (YVEC ou vetor de levedura vazio) versus MUC1 de levedura (GI-6101 ou GI-6104), administrada na dose de 1 YU por local em quatro locais diferentes (4YU no total por dose). No dia 40 pós-implante do tumor, os animais são sacrificados e o número de nódulos tumorosos pulmonares é avaliado. Espera-se que as composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura sejam capazes de reduzir os tumores que expressam MUC1 em camundongos quando comparado com camundongos que receberam levedura apenas (sem antígeno MUC1).
[00252] O exemplo a seguir descreve um ensaio clínico de fase 1 em indivíduos com câncer MUC1-positivo.
[00253] Um ensaio clínico aberto de fase 1, de escalonamento de dose é realizado usando uma composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura conhecida como GI-6101 descrita no Exemplo 1 ou GI-6104 descrita no Exemplo 2 (produzidas sob condições de crescimento normais ou sob condições de pH neutro). A composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura é administrada a 12-24 indivíduos com um tumor MUC1-positivo em um protocolo de escalonamento de dose por grupo sequencial utilizando faixas de dose de 4 Y.U. (1 Y.U. x 4 locais), 16 Y.U. (4 Y.U. x 4 locais) e 40 Y.U. (10 Y.U. x 4 locais), administrada por via subcutânea. A imunoterapia com MUC1 de levedura é administrada em intervalos de 2 semanas, durante 3 meses e depois mensalmente. Um grupo de expansão de pacientes (n = 10) na dose máxima tolerada (Maximum Tolerated Dose - MTD) ou a melhor dose observada é selecionado para estudo adicional. Os resultados monitoram a segurança como um endpoint primário e, como parâmetros secundários, respostas das células T antígeno-específicas (por exemplo, células T CD8+ MUC1-específicas que emergem ou expandem quando de tratamento), bem como a atividade clínica.
[00254] Espera-se que GI-6101 e GI-6104 sejam seguras e bem toleradas, sem efeitos tóxicos significativos. Além disso, espera-se que GI-6101 ou GI-6104 produza respostas de células T MUC1-específicas emergentes do tratamento ou uma melhora nas respostas de células T de linha de base MUC1-específicas pré-existentes em um número estatisticamente significativo de pacientes. Espera-se também que alguns pacientes tenham a doença estabilizada.
[00255] O exemplo a seguir descreve um ensaio clínico (P1/P2) usando composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura.
[00256] Aumento de expressão de MUC-1 foi observada em ~ 70% dos casos de leucemia mieloide aguda (Acute Myeloid Leukemia - AML), o que sugere que níveis elevados de MUC1 podem estar envolvidos na regulação do potencial proliferativo do compartimento leucêmico imaturo.
[00257] Em um primeiro ensaio clínico, o uso de um produto para imunoterapia de primeira linha com base em levedura conhecido como GI-6101 (vide Exemplo 1) é implementado no ambiente de AML MUC1- positiva (este design experimental é também aplicável à outras composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura, tal como GI- 6104). O uso de GI-6101 é concebido para complementar o padrão citotóxico existente de regimes de tratamento, citarabina e uma antraciclina (por exemplo, daunorubicina), em uma abordagem complementar ao promover a destruição imune de células leucêmicas MUC1-positivas, bem como a eliminação de células leucêmicas MUC1 as quais possam escapar de vias de diferenciação (apoptose) terminais. Os endpoints incluem melhora da indução de remissão, bem como a sobrevivência global (pré- e pós-transplante).
[00258] Em um segundo ensaio, GI-6101 é usada no ambiente de transplante de medula óssea (Bone Marrow Transplantation - BMT)) para prevenir a recaída de AML em pacientes com doença MUC1- positiva (este design experimental é também aplicável à outras composições imunoterapêuticas de MUC1 de levedura, tal como GI- 6104). Estratégias clínicas as quais avaliam a vacinação de doadores de medula óssea (transferência adotiva) e/ou vacinação de receptores de medula óssea no período pós-transplante são usadas para reduzir a taxa de recidiva após BMT.(A) Design de estudo clínico para terapia de primeira linha de pacientes com AML MUC1-positiva com GI-6101, mais citarabina e daunorubicina versus padrão de atendimento individualmente
[00259] Os pacientes recebem quimioterapia de indução com infusão intravenosa continua de citarabina (arabinosídeo de citosina) a 100-200 mg/m2 por dia x 7 dias mais daunorubicina intravenosa (ou daunomicina (daunomicina cerubidina)) 45 mg/m2 nos dias 1, 2 e 3 de terapia com citarabina ou uma variação aceitável deste regime, seguido por administração de GI-6101 (ou placebo) 14 dias após a conclusão do ciclo de indução com quimioterapia. GI-6101 (ou placebo) são, então, administrados 14 dias após a terapia de re-indução ou 14 dias após cada ciclo de consolidação de quimioterapia subsequente. Após indução, re-indução, consolidação e terapia, GI-6101 (ou placebo) são administrados a cada mês durante até 3 anos com o objetivo principal de prevenir a recaída de remissão.
[00260] Espera-se que o uso de GI-6101 aumente a recidiva de remissão em pacientes quando comparado com aqueles que receberam placebo.(B) Design de estudo clínico para terapia pós-BMT da AML MUC1- positiva com GI-6101 versus placebo
[00261] Para pacientes com AML MUC1-positiva que requerem terapia mielo-ablativa seguido de transplante de medula óssea, GI-6101 (ou placebo) são administrados ao doador de medula óssea 7-14 dias antes de doação da medula óssea e GI-6101 (ou placebo) são administrados ao receptor da medula óssea em uma base mensal durante até 3 anos após o enxerto de medula óssea ocorrer. O objetivo principal é reduzir a taxa de recaída de AML.
[00262] Espera-se que o uso de GI-6101 reduza a taxa de recaída em pacientes com AML quando comparado com pacientes que receberam placebo.
[00263] Embora várias modalidades da presente invenção tenham sido descritas em detalhes, é evidente que modificações e adaptações das modalidades ocorrerão para aqueles versados na técnica. Deverá ser expressamente entendido, contudo, que tais modificações e adaptações estão dentro do âmbito da presente invenção, conforme definido nas reivindicações exemplificativas a seguir.
Claims (5)
1. Composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura, caracterizada pelo fato de que compreende:a) um veículo de levedura; eb) um antígeno MUC1 expresso pelo veículo de levedura, em que o antígeno MUC1 consiste na SEQ ID NO: 25 ou nas posições 92-566 da SEQ ID NO: 25.
2. Composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o veículo de levedura é uma levedura inteira.
3. Composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que em que a levedura inteira é inativada pelo calor.
4. Composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o veículo de levedura é de uma cepa de levedura mutante que produz proteínas subglicosiladas, em comparação com uma cepa de levedura do tipo selvagem.
5. Composição imunoterapêutica de MUC1 de levedura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o veículo de levedura é de Saccharomyces cerevisiae.
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