JP2014523878A - Ｄ型肝炎ウイルス感染の治療又は予防のための酵母ベースの組成物及び方法 - Google Patents

Ｄ型肝炎ウイルス感染の治療又は予防のための酵母ベースの組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）感染の予防及び治療の少なくとも一方のための免疫治療組成物及び方法、例えば、ＨＤＶ感染並びにその症状及び続発症の予防及び治療の少なくとも一方のための酵母ベースのＨＤＶ免疫治療組成物、並びにこのような組成物の使用方法などが開示される。

Description

本発明は、概して、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｌｔａ ｖｉｒｕｓ）感染の予防及び／又は治療のための免疫治療組成物及び方法に関する。
Ｄ型肝炎は、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）として知られる、小さな環状のエンベロープ化ＲＮＡウイルスへの感染によって起こる疾患である。ＨＤＶは、１９７７年に初めて発見され（非特許文献１）、後に、肝炎の新型の感染因子であることが明らかにされた（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。近年、１，５００万〜２，０００万人の人が、ＨＤＶ（その生活環の間に、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）への同時感染を必要とする）に感染したが、この数は、一部には、ＨＢＶに感染した個体におけるＨＤＶ感染の系統的スクリーニングがないために、過少に発表されている場合がある（非特許文献６）。
Ｄ型肝炎ウイルスは、ＨＤＶゲノムＲＮＡから形成されるコア構造を含む球形の粒子であり、ＨＤＶゲノムＲＮＡは、約７０分子のＨＤＡｇ（スモール及びラージ型の両方）と複合体化している（非特許文献７）。ＨＤＶは、ＨＢＶと同じ受容体を用い、その外皮としてＨＢＶエンベロープタンパク質を使って、細胞に進入すると考えられている。このエンベロープは、約１００コピーのＨＢＶ表面抗原タンパク質（スモール、ミドル及びラージＨＢｓＡｇ）から成る。ラージＨＤＡｇ及びＨＢｓＡｇは、ウイルス粒子を形成するのに十分であり、ＨＤＶ ＲＮＡも含まれない限り感染性ではなく、スモールＨＤＡｇは、ウイルスのパッケージング効率を高める（非特許文献８；非特許文献９）。
いったん細胞内部に入ると、ＨＤＶは宿主の細胞ＲＮＡポリメラーゼを使う。ウイルス複製過程中に、３つのＲＮＡが蓄積する。ＨＤＶゲノムは、約１６７２〜１６９７個のヌクレオチドからなる環状マイナス一本鎖ＲＮＡであり（非特許文献１０）、ヌクレオチド６８０〜７８０に及ぶリボザイムドメインと、ＨＤＡｇＲＮＡの推定プロモータ部位を含む（非特許文献１１）。ＨＤＡｇをコードするオープンリーディングフレームとリボザイムドメインとを含むアンチゲノム（非特許文献１２；非特許文献１３）は、ゲノムの完全な補体であり、その複製は、一切のＤＮＡ中間体なしに、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成によって行われる（非特許文献１４）。ｍＲＮＡは、ＨＤＡｇの合成を指令する。
ＨＤＶゲノムによってコードされる既知のタンパク質は、ただ１つしかなく、これは、２つの形態、すなわち、２７ｋＤａのラージ（Ｌ）ＨＤＡｇ（ＨＤＡｇ−Ｌ又はＬ−ＨＤＡｇ）（２１４アミノ酸）と、２４ｋＤａのスモール（Ｓ）ＨＤＡｇ（ＨＤＡｇ−Ｓ又はＳ−ＨＤＡｇ）（１９５アミノ酸）から構成される。これらのタンパク質は、ラージＨＤＡｇのＣ末端の約１９アミノ酸が異なる。ＨＤＶ抗原のＮ末端は、核局在化シグナル伝達を担当し、ＨＤＶ抗原の中央ドメインは、ＲＮＡ結合を担当し、また、Ｃ末端は、ビリオン集合と、ＲＮＡ集合の阻害に関与する。ＨＤＡｇ−Ｓは、ウイルス感染の早期に生産されて、ウイルスの複製を支持する。ＨＤＡｇ−Ｌは、ウイルス感染の後期に生産されて、ウイルス感染を阻害し、ウイルス粒子の集合に必要である。
ＨＤＶ感染は、別のウイルスである、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に共感染した個体、より具体的には、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）陽性の個体にしか起こらない。前述したように、ＨＤＶは、粒子形成及び伝播のために、ＨＢＶ ＨＢｓＡｇを必要とする。従って、ＨＢＶは、ＨＤＶビリオンの集合及び放出のために必須である。ＨＤＶが個体に感染
する２つの主要な形態が知られている。第１の場合、共感染と呼ばれ、ＨＤＶとＨＢＶが、急性感染として個体に同時に共感染しうるが、このタイプの感染は、急性ＨＢＶ感染単独の回復率と同様に、ほとんどの人で約９５％の回復をもたらす。より一般的な第２のタイプのＨＤＶ感染は、「重感染」であり、この場合、すでに慢性ＨＢＶ感染を有する個体にＨＤＶが急性感染する。この場合、ＨＤＶ感染は、個体の約８０〜９０％で、慢性ＨＤＶ感染に進行し、これが、この疾患のより重症の病態である慢性ＨＤＶ感染である。従って、重感染は、慢性ＨＢＶ保有者の早期急性ＨＤＶ重感染又は後期ＨＤＶ慢性感染として分類することができる。異論はあるが、潜在性ＨＤＶ感染の第３の形態は、ヘルパー非依存性潜伏感染と呼ばれ、１９９１年に初めて報告され、肝移植時に起こるものとして記載されている（非特許文献１５）。この形態の感染では、患者の肝細胞は、ＨＤＶだけに感染している可能性がある（例えば、ＨＢＶ伝播が、Ｂ型肝炎免疫グロブリンの投与によって予防される肝移植中に）が、残留するＨＢＶが中和を逃れるか、又は患者が後にＨＢＶに暴露されると、ＨＤＶに感染した細胞は「レスキュー」されうる。この形態は、動物モデルで実証されているが、ヒト肝細胞のこうした感染については、まだ議論の余地がある。
慢性Ｄ型肝炎は、現在、ヒトにおけるウイルス性肝炎の最も重篤な形態と考えられている（この疾患及び関連ＨＤＶについてさらに詳しくは、以下を参照：非特許文献１６；又は非特許文献６）。ＨＤＶに慢性感染した個体は、線維症の進行の加速、肝細胞癌の危険性の増大、及び硬変の状態での早期代償不全を有する。この疾患は、無症状性であるか、又は特有の症状もなく存在しうるため、疾患の硬変期に合併症が現れて初めて診断される場合がある。ほとんどの患者で、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ：ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ：ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）レベルが持続的に上昇することから、これを用いて、疾患をモニターすることができる。５〜１０年以内に、７０〜８０％もの慢性Ｄ型肝炎患者が、硬変を発現する可能性があり（非特許文献１７；非特許文献１８）、１５％が１〜２年以内に発現する（非特許文献１９）。ＨＤＶ感染はまた、肝細胞癌（ＨＣＣ：ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の発現も加速しうる。
ＨＤＶ感染は、地中海盆地、中東地域、中央及び北アジア、西及び中央アフリカ、アマゾン盆地、ベネズエラ、コロンビア及び太平洋の特定の島々で最も有病率が高いが、このウイルスは、世界中に存在及び／又は出現する（例えば、ロシア、北インド、南アルバニア、中国本土、及びいくつかの太平洋諸島）。ＨＤＶ感染は、非経口的に伝播し、最も典型的には、薬物使用又は血液若しくは血液製剤への暴露によって伝播する。ＨＤＶの性交による感染は一般的ではなく、ウイルスの母子感染は稀である。
ＨＤＶ感染の形態にかかわらず、現在のところ、ＨＤＶ感染の治療又は予防のための優れた選択肢はない。肝細胞に感染する他のウイルスを治療するのに用いられている抗ウイルス剤（例えば、ＨＢＶ又はＨＣＶ用の抗ウイルス薬）は、ＨＤＶに対して有効ではない。コルチコステロイド又はレミバゾールなどの免疫調節薬は、有効ではなく（非特許文献１７；非特許文献２０）、胸腺由来のペプチドも有効ではなかった（非特許文献２１；非特許文献２２）。これによって、ＨＤＶ感染について現在唯一承認されている療法として、インターフェロン療法（例えば、ペギル化インターフェロンα；ｐｅｇＩＦＮ−α）が残っている。しかし、ＨＤＶは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−αシグナル伝達を妨害しうることがわかっており、実際、ｐｅｇＩＦＮ−αによるＨＤＶの治療は、治療の失敗及び低い応答率を被っている。１つのプロスペクティブ臨床試験では、患者の２１％しかＨＤＶ ＲＮＡ陰性を達成せず、２６％しか生化学的応答を示さなかった（非特許文献２３）が、同様の結果が別の試験でも得られており、その場合、治療（治癒）に対する持続的応答は非常に低いままである。従って、当分野では、ＨＤＶ感染についての新しい予防及び
治療のアプローチが求められている。
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構築物に用いられるＨＤＡｇの部分を示す配列アラインメントであって、アラインメントした配列番号１６により表され、この融合タンパク質に用いられる遺伝子型同士の相同性を示している（ライン１の「遺伝子型１」配列は、配列番号１６の１〜１４０位であり；ライン２の「遺伝子型２」配列は、配列番号１６の１４１〜２８０位であり；ライン３の「遺伝子型３」配列は、配列番号１６の２８１〜４２０位である）。 Ｕ２及びＵＬ２培地で増殖され、ＨＤＶ１（配列番号３０を発現）及びＨＤＶ２（配列番号３３を発現）として知られる酵母ベースの免疫治療薬の発現を、１組のＮＳ３−Ｈｉｓ標準と比較して示すデジタル化画像。 Ｕ２及びＵＬ２培地で増殖され、ＨＤＶ１（配列番号３０を発現）及びＨＤＶ２（配列番号３３を発現）として知られる酵母ベースの免疫治療薬の発現を、第２組のＮＳ３−Ｈｉｓ標準と比較して示すデジタル化画像。 Ｕ２及びＵＬ２培地で増殖され、ＨＤＶ３（配列番号３６を発現）として知られる酵母ベースの免疫治療薬の発現を示すデジタル化画像。 ＨＤＶ−Ｐ２ペプチドを用いた、酵母ベースのＨＤＶ免疫治療組成物ＨＤＶ１及びＨＤＶ３のワクチン接種Ｃ５７ＢＬ／６マウスのインターフェロンγ（ＩＦＮγ：ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）ＥＬＩＳｐｏｔを示すグラフ（ＯＶＡＸ＝無関係の抗原を発現する対照酵母）。 培地バックグラウンドを差し引いた、図５Ａに示したのと同じＥＬＩＳｐｏｔ結果を示すグラフ。 ＨＤＶ−Ｐ１ペプチドを用いた、酵母ベースのＨＤＶ免疫治療組成物ＨＤＶ−１のワクチン接種Ｃ５７ＢＬ／６マウスのインターロイキン２（ＩＬ−２：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）ＥＬＩＳｐｏｔを示すグラフ（ＯＶＡＸ＝無関係の抗原を発現する対照酵母）。 培地バックグラウンドを差し引いた、図６Ａに示したのと同じＥＬＩＳｐｏｔ結果を示すグラフ。
本発明の一実施形態は、（ａ）酵母ビヒクル；及び（ｂ）ＨＤＶ抗原を含有する融合タンパク質を含む免疫治療組成物に関する。本組成物は、対象に投与されると、ＨＤＶ特異的免疫応答を誘発する。
本発明のこの実施形態の一態様では、ＨＤＶ抗原は、ＨＤＶラージ抗原（ＨＤＡｇ−Ｌ）又はＨＤＶスモール抗原（ＨＤＡｇ−Ｓ）の少なくとも１つの免疫原性ドメインから構成され、ここで、核局在化配列（ＮＬＳ：ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、ＮＬＳの１つ又は複数のアミノ酸の置換若しくは欠失によって不活性化されている。例えば、ＮＬＳは、全ＮＬＳの欠失によって不活性化することができ
るが、本発明がこの例に限定されるわけではない。
本発明のこの実施形態の一態様では、ＨＤＶ抗原は、ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓの核局在化配列（ＮＬＳ）が、ＮＬＳの１つ又は複数のアミノ酸の置換若しくは欠失によって不活性化されている以外は、少なくとも１つの完全長ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓから構成される。
本発明のこの実施形態の別の態様では、ＨＤＶ抗原は、ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓの各々の核局在化配列（ＮＬＳ）が、ＮＬＳの１つ又は複数のアミノ酸の置換若しくは欠失によって不活性化されている以外は、２つ以上の完全長ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓの融合物から構成される。例えば、一態様では、ＮＬＳが欠失している。本発明のこの実施形態の一態様では、ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓの各々は、異なるＨＤＶ遺伝子型に由来する。
本発明のこの実施形態のさらに別の態様では、ＨＤＶ抗原は、ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓの各々の核局在化配列（ＮＬＳ）が、ＮＬＳの１つ又は複数のアミノ酸の置換若しくは欠失によって不活性化されている以外は、３つの完全長ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓの融合物から構成される。この実施形態の一態様では、ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓの各々は、異なるＨＤＶ遺伝子型に由来する。このようなＨＤＶ抗原の一例では、６６〜７５位（ＮＬＳ）が欠失した配列番号２によって表される完全長遺伝子型１ＨＤＡｇ−Ｌ配列（又は別のＨＤＶ株由来の対応配列）を、６６〜７５位（ＮＬＳ）が欠失した配列番号５によって表される完全長遺伝子型２ＨＤＡｇ−Ｌ配列（又は別のＨＤＶ株由来の対応配列）に連結して、これを、６６〜７５位（ＮＬＳ）が欠失した配列番号８によって表される完全長遺伝子型３ＨＤＡｇ−Ｌ配列（又は別のＨＤＶ株由来の対応配列）に連結する。融合タンパク質におけるこれら３つのＨＤＡｇの配置は、上記以外のどんな順序に変更してもよい。一態様では、３つのＨＤＡｇは、前述したのとは異なる遺伝子型又は遺伝子亜型のＨＤＶに由来する。
本発明のこの実施形態の一態様では、ＨＤＶ抗原は、配列番号３４、配列番号２８、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＨＤＶ抗原は、配列番号３４、配列番号２８、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列に少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＨＤＶ抗原は、配列番号３４、配列番号２８、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択される。
本発明のこの実施形態の一態様では、融合タンパク質は、配列番号３６若しくは配列番号３０から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号３６若しくは配列番号３０にそれぞれ少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明の免疫治療組成物に関するさらに別の実施形態では、ＨＤＶ抗原は、ＨＤＶラージ抗原（ＨＤＡｇ−Ｌ）又はＨＤＶスモール抗原（ＨＤＡｇ−Ｓ）の少なくとも１つの免疫原性ドメインから構成され、ここで、ＨＤＶ抗原は、完全長ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓタンパク質に満たない。一態様では、ＨＤＶ抗原は、少なくとも２つ以上の完全長ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓタンパク質の融合物から構成されるが、ここで、ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓタンパク質の少なくとも１つは、完全長ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓタンパク質に満たない。一態様では、ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓタンパク質の各々は、異なるＨＤＶ遺伝子型に由来する。一態様では、ＨＤＶ抗原は、配列番号１０、配列番号１６、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＨＤＶ抗原は、配列番号１０
、配列番号１６、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、若しくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ＨＤＶ抗原は、配列番号１０、配列番号１６、又は別のＨＤＶ株由来の対応配列から選択される。
本発明のこの実施形態の一態様では、融合タンパク質は、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１７、若しくは配列番号１８から選択される。
本発明の前述した実施形態のいずれかにおいて、一態様では、ＨＤＡｇ−Ｌは、配列番号２、配列番号５、配列番号８、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＨＤＡｇ−Ｓは、配列番号３、配列番号６、配列番号９、又は別のＨＤＶ株由来の対応配列から選択されるアミノ酸配列を有する。一態様では、ＨＤＶ抗原は、配列番号２、配列番号５、配列番号８、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
本発明の免疫治療組成物に関する前述の実施形態のいずれかにおいて、一態様では、ＨＤＶ抗原は、酵母ビヒクルによって発現される。一態様では、酵母ビヒクルは、全酵母である。一態様では、全酵母は死滅している。一態様では、全酵母は熱不活性化されている。一態様では、酵母ビヒクルは、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、及びヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からなる群から選択される酵母属由来のものである。一態様では、酵母ビヒクルは、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）由来のものである。一態様では、酵母ビヒクルは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のものである。
本発明の免疫治療組成物に関する前述の実施形態のいずれかにおいて、一態様では、本組成物は、対象への投与に好適な薬学的に許容される賦形剤で製剤化される。
本発明の免疫治療組成物に関する前述の実施形態のいずれかにおいて、一態様では、本組成物は、９０％超の酵母タンパク質を含有する。
本発明の別の実施形態は、対象におけるＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）感染又はＨＤＶ感染による少なくとも１つの症状を治療するか、又はＨＤＶに感染した対象の生存を改善する方法に関する。本方法は、前述の、又は本明細書の他所に記載する少なくとも１つの免疫治療組成物を、ＨＤＶに感染した対象に投与するステップを含み、対象への組成物の投与によって、対象におけるＨＤＶ感染又はＨＤＶ感染による少なくとも１つの症状を軽減する。一態様では、本方法は、さらに、ＨＤＶ感染の症状を治療又は軽減するのに有用な１種以上の別の薬剤を対象に投与することも含む。例えば、このような薬剤は、限定するものではないが、インターフェロンを含んでよい。インターフェロンとしては、限定するものではないが、ペギル化インターフェロンα２ａなどのインターフェロンαがあるが、これに限定されるわけではない。一態様では、インターフェロンは、インターフェロンγである。
本発明のこの実施形態の一態様では、対象は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に慢性感染している。一態様では、本方法は、さらに、ＨＢＶ感染を治療するための抗ウイルス化合物を対象に投与するステップを含む。このような抗ウイルス化合物は、限定するものではないが、テノフォビル、ラミブジン、アデフォビル、テルビブジン、エンテカビル、及びこれらの組合せを含むことができる。
本発明のさらに別の実施形態は、ＨＤＶ抗原に対する抗原特異的細胞性免疫応答を誘発する方法に関し、この方法は、前述の、又は本明細書の他所に記載する少なくとも１つの免疫治療組成物を、対象に投与するステップを含む。
本発明の別の実施形態は、対象におけるＨＤＶ感染を予防する方法に関し、この方法は、前述の、又は本明細書の他所に記載する少なくとも１つの免疫治療組成物を、ＨＤＶに感染していない対象に投与するステップを含む。この実施形態の一態様では、対象は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に慢性感染している。一態様では、本方法は、ＨＢＶ感染を治療するための抗ウイルス化合物を対象に投与するステップをさらに含む。
本発明のさらに別の実施形態は、個体の集団をＨＤＶに対して免疫する方法に関し、この方法は、前述の、又は本明細書の他所に記載する少なくとも１つの免疫治療組成物を、個体の集団に投与するステップを含む。本発明のこの実施形態の一態様では、個体の集団は、ＨＢＶに慢性感染している。
本発明の別の実施形態は、ＨＤＶ感染を治療する目的で使用するための、前述の、又は本明細書の他所に記載する免疫治療組成物に関する。
本発明のさらに別の実施形態は、対象におけるＨＤＶ感染を予防する目的で使用するための、前述の、又は本明細書の他所に記載する免疫治療組成物に関する。一態様では、対象は、ＨＢＶに慢性感染している。
本発明の別の実施形態は、ＨＤＶ感染を治療するための薬剤の製造における、前述の、又は本明細書の他所に記載する少なくとも１つの免疫治療組成物の使用に関する。
本発明のまた別の実施形態は、ＨＤＶ感染を予防するための薬剤の製造における、前述の、又は本明細書の他所に記載する少なくとも１つの免疫治療組成物の使用に関する。
発明の詳細な説明
本発明は、概して、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）感染の予防及び治療の少なくとも一方のための組成物及び方法に関する。本発明は、対象においてＨＤＶ感染に対する予防的免疫応答及び治療的免疫応答の少なくとも一方を誘発するように設計された酵母ビヒクル及びＨＤＶ抗原を含む酵母ベースの免疫治療組成物（また、酵母ベースのＨＤＶ免疫治療薬とも呼ぶ）、並びにＨＤＶ感染の予防及び治療の少なくとも一方のための上記組成物の使用を包含する。本発明はまた、ＨＤＶの任意の免疫治療組成物、及び任意の治療的又は予防的プロトコルの少なくとも一方に使用するための、本発明の酵母ベースの組成物に用いられる組換え核酸分子、並びにそれによってコードされるタンパク質も包含する。上記プロトコルは、本発明のＨＤＶ特異的酵母ベース組成物を、ＨＤＶ感染及び関連する共感染の少なくとも一方のための他の治療的又は予防的な、組成物、薬剤、薬物、化合物、及び／又はプロトコルのいずれか１つ又は複数と組み合わせる、任意の治療的又は予防的プロトコルを含む。
酵母ベースの免疫治療組成物は、生物製剤又は薬学的に許容される組成物として投与される。従って、抗原生産系として酵母を用いた後に酵母から抗原を精製するよりは、本明細書に記載するような全酵母ビヒクルの方が、患者への投与に好適であるに相違なく、患者への投与のために製剤化されるべきである。これは、酵母を用いて、サブユニットワクチン用の組換えタンパク質を生産するのとは対照的であり、このような場合、タンパク質は、発現させた後、破砕によって酵母から放出させ、酵母から精製するため、アジュバントを添加した最終ワクチンは、検出可能な酵母ＤＮＡを含んでおらず、含有する酵母タンパク質は、１〜５％以下にすぎない。これに対し、本発明のＨＤＶ酵母ベース免疫治療組成物は、容易に検出可能な酵母ＤＮＡを含み、実質的に５％超の酵母タンパク質を含有し
ており（すなわち、ワクチン中の全タンパク質の５％超が、酵母に属するものであるか、又は酵母によって産生されるものである）；一般に、本発明の酵母ベースの免疫治療薬は、７０％超、８０％超、又は一般に９０％超の酵母タンパク質を含有する。
酵母ベースの免疫治療組成物は、治療及び予防の少なくとも一方の目的で、患者を免疫するために、患者に投与される。本発明の一実施形態では、酵母ベースの組成物は、薬学的に許容される賦形剤又は製剤での投与のために製剤化される。組成物は、一態様では、ヒト対象への投与に好適であるように製剤化されるべきである（例えば、製造条件は、ヒトへの使用に適しているべきであり、また、組成物を完成させるため、又は、投与用に免疫治療薬の用量を調製するため、あるいはそれら両方のために用いられる任意の賦形剤若しくは製剤は、ヒトへの使用に適しているべきである）。本発明の一態様では、酵母ベースの免疫治療組成物は、非経口経路（例えば、皮下、腹腔内、筋内若しくは皮膚内注射、又は他の好適な非経口経路）などの、患者又は対象の注射による投与のために製剤化される。
一実施形態では、酵母は、抗原（例えば、ウェスタンブロットによって検出可能）を発現する。抗原は、酵母内で凝集せず、抗原は、酵母内に封入体を形成せず、及び／又はウイルス様粒子（ＶＬＰ：ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）又はその他の大きな抗原粒子を形成しない。一実施形態では、抗原は、酵母内で可溶性タンパク質として産生され、及び／又は、酵母から分泌されないか実質的に若しくは主に酵母から分泌されない。ＨＤＶに対する有効な免疫応答を誘発するためには、酵母ベースの免疫治療薬が、免疫系の樹状細胞によって容易に貪食され、しかも、酵母及び抗原が、このような樹状細胞によって容易に処理される必要がある。
Ｄ型肝炎ウイルス抗原、構築物、及び本発明の組成物
本発明の一実施形態は、ＨＤＶ感染の予防及び治療の少なくとも一方、及び／又はＨＤＶ感染による少なくとも１つの症状の改善のために用いることができる酵母ベースの免疫治療組成物に関する。本発明は、本明細書に詳しく記載するように、（ａ）酵母ビヒクルと；（ｂ）ＨＤＶタンパク質及びその免疫原性ドメインの少なくとも一方を含有する１種又は複数種のＨＤＶ抗原とを含む。酵母ビヒクルと一緒に、ＨＤＶ抗原は、最も典型的には、酵母ビヒクルによって（例えば、インタクトな酵母若しくは酵母スフェロプラストにより；尚、これらは、任意選択で、酵母サイトプラスト、酵母ゴースト、若しくは酵母膜抽出物又はその画分にさらに処理することができる）、組換えタンパク質として発現されるが、本明細書に記載するように、１つ又は複数のこうしたＨＤＶ抗原を、酵母ビヒクルにロードするか、又は酵母ビヒクルとの複合体形成、結合、混合、若しくは一緒の投与を行って、本発明の組成物を形成することは、本発明の一実施形態である。本発明によれば、本発明の酵母ビヒクルに関して、異種融合タンパク質を含め、「異種」タンパク質又は「異種」抗原と言うとき、タンパク質又は抗原が、酵母によって自然に発現されるタンパク質又は抗原ではないことを意味するが、異種抗原又は異種タンパク質を含む融合タンパク質はまた、酵母によって自然に発現される酵母配列又はタンパク質若しくはその部分（例えば、本明細書に記載するようなα因子プレプロ配列）も含みうる。
本発明の一実施形態は、本発明の免疫治療組成物において、また、一態様では、本発明の酵母ベースの免疫治療組成物において有用なＨＤＶ抗原に関する。前述したように、ＨＤＶゲノムによりコードされる既知のタンパク質は、ただ１つしかなく、これは、２つの形態、すなわち、２７ｋＤａのラージ（Ｌ）ＨＤＡｇ（ＨＤＡｇ−Ｌ又はＬ−ＨＤＡｇ）（２１４アミノ酸）及び２４ｋＤａのスモール（Ｓ）ＨＤＡｇ（ＨＤＡｇ−Ｓ又はＳ−ＨＤＡｇ）（１９５アミノ酸）から構成される。このタンパク質は、ラージＨＤＡｇのＣ末端で約１９アミノ酸異なっている。
現在、少なくとも８つの個別のＨＤＶの遺伝子型があることがわかっている（ル・ガル（Ｌｅ Ｇａｌ）ら著、新興感染症（Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ）、２００６年、第１２巻、ｐ．１４４７〜１４５０）が、１（又はＩ）、２（又はＩＩ）、及び３（又はＩＩＩ）として知られる３つの遺伝子型が最も有病率が高い。遺伝子型は、常用の方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）産物の制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ：ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析、配列決定、及び／又は免疫組織化学的染色）により、個体において決定することができる。ＨＤＶ遺伝子型の間で高度に保存されているドメインは、ＨＤＡｇのゲノム及びアンチゲノムＲＮＡ自触的切断部位並びにＲＮＡ結合ドメインの周辺に位置する（チャオ（Ｃｈａｏ）ら著、ウイルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１９９０年、第１７８巻、ｐ．３８４〜３９２；ウー（Ｗｕ）ら著、肝臓学（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、１９９５年、第２２巻、ｐ．１６５６〜１６６０）。
遺伝子型１は、現在、最も優性のＨＤＶ遺伝子型であり、世界中に存在するが、特に、欧州、北米、アフリカ及びいくつかのアジア地域でみとめられる。遺伝子型１ＨＤＶゲノムの一例は、データベースアクセッション番号ＡＦ１０４２６３又はＧＩ：１１０２２７４０によって示されるが、本明細書では、配列番号１でも表す。配列番号１は、配列番号２（また、データベースアクセッション番号ＡＡＧ２６０８７．１又はＧＩ：１１０２２７４２）で表されるＨＤＡｇ−Ｌ及び配列番号３で表されるＨＤＡｇ−Ｓをコードする。遺伝子型２は、日本、台湾及びロシアでみとめられる。遺伝子型２ＨＤＶ部分ゲノムの一例は、データベースアクセッション番号ＡＪ３０９８８０又はＧＩ：１５２１２０７６によって示されるが、本明細書では、配列番号４でも表す。配列番号４は、配列番号５（また、データベースアクセッション番号ＣＡＣ５１３６６．１又はＧＩ：１５２１２０７７）で表されるＨＤＡｇ−Ｌ及び配列番号６で表されるＨＤＡｇ−Ｓをコードする。遺伝子型３は、南米（例えば、ペルー、コロンビア、ベネズエラ）でみとめられる。遺伝子型３ＨＤＶゲノムの一例は、データベースアクセッション番号Ｌ２２０６３．１又はＧＩ：４１０１８２によって示されるが、本明細書では、配列番号７でも表す。配列番号７は、配列番号８（また、アクセッション番号Ｐ０Ｃ６Ｍ３．１又はＧＩ：２２６７３７６０１）で表されるＨＤＡｇ−Ｌ及び配列番号９で表されるＨＤＡｇ−Ｓをコードする。遺伝子型４は、日本及び台湾で、また遺伝子型５〜８はアフリカでみとめられる。ＨＤＡｇの様々な配列がこれら遺伝子型について記載されており、公用データベースでみいだすことができる。複数の遺伝子型が、１人の患者に感染する可能性はあるが、典型的には、１つの遺伝子型が優性である。
既知の遺伝子型各々について、多数のＨＤＶゲノムの核酸及びアミノ酸配列、並びにそれによってコードされるＨＤＡｇタンパク質（ラージ及びスモール）が、当分野では公知である。前述した配列は、例示的（代表的）なものである。同じＨＤＶ遺伝子型由来の同じタンパク質若しくはドメインの様々なウイルス単離物の間で、アミノ酸配列に若干の変化が起こりうることは留意されたい。しかし、ＨＤＡｇ抗原は、様々な株及び遺伝子型間で本質的に同じ全体構造をしており、当業者であれば、ＨＤＡｇの所与の一配列から、別のＨＤＶ株／単離物若しくは遺伝子型由来のＨＤＡｇの対応配列を容易に決定することができる。従って、本明細書に記載するガイダンス及びＨＤＶ配列例の参照を用いて、当業者であれば、本発明の組成物及び方法で用いるために、任意のＨＤＶ株（単離物）又は遺伝子型から、様々なＨＤＶベースのタンパク質（融合タンパク質を含む）を容易に生産することができよう。このように、本発明は、本明細書に開示する特定の配列に限定されるわけではない。従って、本明細書に示す配列の１つ又は複数に由来する特定の配列、又は別のＨＤＶ単離物（株）（参照単離物／株とは異なる遺伝子型若しくは遺伝子亜型など）由来の同一、類似若しくは対応配列を参照することにより、本明細書の任意の箇所に記載するＨＤＶタンパク質若しくはＨＤＶ抗原、又はその任意の機能ドメイン、構造ドメイン
若しくは免疫原性ドメインを参照することができる。
本明細書に記載する完全長若しくはほぼ完全長ＨＤＶ抗原（ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓ）のいずれの使用も本発明の範囲に含まれるが、特に、酵母ベースの免疫治療組成物に関してなど、臨床用製剤としてのＨＤＶ抗原の有用性を最適化又は増強するために、別のＨＤＶ抗原も考慮される。本発明に有用なＨＤＶ抗原は、以下の目標の１つ又は複数を達成するＨＤＶ酵母ベースの免疫治療製剤を製造するように設計されている：（１）最大数の既知Ｔ細胞エピトープ（ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ）の含有；（２）免疫原性ドメイン、より具体的には、Ｔ細胞エピトープ（ＣＤ４＋エピトープ及びＣＤ８＋エピトープの少なくとも一方、及び、優性エピトープ及び低優性エピトープの少なくとも一方）の含有の最大化又は優先化（これらは、ＨＤＶ遺伝子型及び遺伝子亜型の少なくとも一方の中で最も保存的であるか、又は、共通配列に容易に改変されることができ、若しくは、標的遺伝子型同士の最も重要な配列差を補うために２つ以上の形態に含有されることができる）；（３）製剤におけるＨＤＶ抗原の配列内の非天然結合の数の最小化；（４）酵母によるタンパク質の発現を妨害しうる配列（例えば、疎水性ドメイン）の最小化若しくは排除；及び／又は（５）ウイルスの機能に必須となりうる配列（核局在化配列）の最小化若しくは排除、例えば、ウイルスを不活性化する改変。一実施形態では、ＨＤＶ抗原は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の組換えＤＮＡ諮問委員会（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＲＡＣ）のガイドラインを満たすように設計してよい。
本発明の一実施形態では、本発明で有用なＨＤＶ抗原は、ＨＤＶゲノムの約９９％未満、約９８％未満、約９７％未満、約９６％未満、約９５％未満、約９４％未満、約９３％未満、約９２％未満、約９１％未満、約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、若しくは約６６．６７％未満によってコードされるＨＤＡｇから構成されるが、このパラメータを満たす同じＨＤＡｇの数個のコピー、又は、上記パラメータを満たすが異なる遺伝子型、遺伝子亜型、若しくはＨＤＶ株／単離物に各々が由来する２つ以上の異なるＨＤＡｇを、本発明において融合タンパク質の形態で提供することができる。
本発明の一実施形態では、本発明で有用なＨＤＶ抗原は、核局在化配列（ＮＬＳ；例えば、公開配列：ＡＧＡＰＰＡＫＲＡＲ（配列番号２７）又は配列番号２の６６〜７５位に対応するＥＧＡＰＰＡＫＲＡＲ、あるいは、異なるＨＤＶ遺伝子型若しくはＨＤＶの株／単離物に由来する対応配列によって表される）を不活性化又は除去するのに十分な突然変異を含むＨＤＡｇから構成される。このような突然変異は、ＮＬＳを含むアミノ酸残基の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、若しくは１０個全部の欠失又は置換から構成しうる。また、ＮＬＳとフランキングする別のアミノ酸を欠失又は置換してもよいが、これは一般に必要なく、ＨＤＶ抗原中に天然のＴ細胞エピトープ由来のアミノ酸残基を保持する方が好ましい。ＮＬＳの除去は、少なくとも２つの理由から有用である。第１に、本発明で用いるＨＤＶ抗原の潜在的生物活性に関する懸念が取り除かれる（ウイルスが不活性化される）ためであり、第２に、本発明者らが、この機能部位の欠失によって、酵母において得られるタンパク質若しくは融合タンパク質の発現が改善されると同時に、増殖速度が改善し、また、ＮＳＬ配列を含むＨＤＶ抗原を発現する際に酵母が獲得した異常な凝集形態が排除されることをみいだしたためである。
表１は、ＨＤＶ由来の複数の公開Ｔ細胞エピトープ（位置は、ＨＤＡｇ−Ｌタンパク質に関して表示）を示すが、そのいずれか１つ又は複数を本発明のＨＤＶ抗原に用いてよい。本発明の一態様では、ＨＤＶ抗原は、これらのエピトープ又は他のＴ細胞エピトープの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくはそれを超える数を含む。
本発明のＨＤＶ抗原及び融合タンパク質は、本発明の酵母ベースの免疫治療組成物を含む、本発明の免疫治療組成物において有用である。こうした抗原、融合タンパク質、及び／又は、こうしたタンパク質をコードする組換え核酸分子は、非酵母ベースの免疫治療組成物と併用して、又はこれを製造するために用いられることもできる。こうした非酵母ベースの免疫治療組成物として、限定するものではないが、ＤＮＡワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、組換えウイルスベースの免疫治療組成物、死滅若しくは不活性化病原体ワクチン及び／又は樹状細胞ワクチンが挙げられる。別の実施形態では、このような融合タンパク質は、ＨＤＶの診断アッセイ、及びＨＤＶに対する抗体作製の少なくとも一方に用いられうる。
本発明の一実施形態は、新規のＨＤＶ抗原及び融合タンパク質、並びにこれら抗原及びタンパク質をコードする組換え核酸分子に関する。本明細書には、酵母ベースの免疫治療組成物又は他の組成物（例えば、他の免疫治療組成物若しくは診断組成物）に用いるための複数の様々な新規のＨＤＶ抗原が記載される。
本発明によれば、本明細書で一般に用いる「抗原」という用語は、以下のものを指す：天然に存在するか、又は合成により誘導されるタンパク質（ペプチド、部分的タンパク質、完全長タンパク質）、細胞組成物（全細胞、細胞溶解物若しくは破砕細胞）、生物（全生物、溶解物若しくは破砕細胞）、又は炭水化物、又はその他の分子、あるいはそれらの一部。抗原は、免疫系のエレメント（例えば、Ｔ細胞、抗体）が遭遇する同じ若しくは類似の抗原に対する抗原特異的免疫応答（例えば、液性及び／又は細胞性免疫応答）を誘発しうる。
抗原は、単一エピトープ、単一免疫原性ドメインのように小さくすることも、これより大きくすることもでき、複数のエピトープ若しくは免疫原性ドメインを含みうる。このように、抗原の大きさは、約８〜１２アミノ酸のように小さくすることも（すなわち、ペプチド）、完全長タンパク質、多量体、融合タンパク質、キメラタンパク質、全細胞、全微生物のように大きくすることもでき、又はこれらのいずれかの部分（例えば、全細胞の溶解物若しくは微生物の抽出物）とすることもできる。さらに、抗原は、炭化水素を含むこ
とができ、これは、酵母ビヒクル、又は本発明の組成物にロードすることができる。いくつかの実施形態（例えば、酵母ビヒクルによって組換え核酸分子から抗原を発現させる場合）では、抗原は、全細胞若しくは微生物であるよりも、むしろタンパク質、融合タンパク質、キメラタンパク質、又はこれらの断片である。
抗原を酵母において発現させようとする場合、抗原は、酵母において組換えにより発現させることができる最小サイズのものであり、典型的に、少なくとも２５アミノ酸以上、又は少なくとも２６アミノ酸以上、少なくとも２７アミノ酸以上、少なくとも２８アミノ酸以上、少なくとも２９アミノ酸以上、少なくとも３０アミノ酸以上、少なくとも３１アミノ酸以上、少なくとも３２アミノ酸以上、少なくとも３３アミノ酸以上、少なくとも３４アミノ酸以上、少なくとも３５アミノ酸以上、少なくとも３６アミノ酸以上、少なくとも３７アミノ酸以上、少なくとも３８アミノ酸以上、少なくとも３９アミノ酸以上、少なくとも４０アミノ酸以上、少なくとも４１アミノ酸以上、少なくとも４２アミノ酸以上、少なくとも４３アミノ酸以上、少なくとも４４アミノ酸以上、少なくとも４５アミノ酸以上、少なくとも４６アミノ酸以上、少なくとも４７アミノ酸以上、少なくとも４８アミノ酸以上、少なくとも４９アミノ酸以上、又は少なくとも５０アミノ酸以上の長さであるか、あるいは、少なくとも２５〜５０アミノ酸の長さ、少なくとも３０〜５０アミノ酸の長さ、又は少なくとも３５〜５０アミノ酸の長さ、又は少なくとも４０〜５０アミノ酸の長さ、又は少なくとも４５〜５０アミノ酸の長さである。より小さいタンパク質を発現させてもよく、かなり大きいタンパク質（例えば、数百アミノ酸の長さ、あるいは、数千アミノ酸の長さ）を発現させることもできる。一態様では、完全長タンパク質を発現させてもよい。あるいは、その構造ドメイン若しくは機能ドメイン又はその免疫原性ドメインであって、Ｎ末端及びＣ末端の少なくとも一方から１以上のアミノ酸が欠失したものを発現させてもよい（例えば、Ｎ末端及びＣ末端の少なくとも一方から約１〜約２０アミノ酸を欠失）。融合タンパク質及びキメラタンパク質も、本発明で発現させることができる抗原である。「標的抗原」は、本発明の免疫治療組成物によって特異的にターゲティングされる抗原（すなわち、免疫応答の誘発が望まれる抗原）である。「ＨＤＶ抗原」は、抗原のターゲティングが、Ｄ型肝炎ウイルスもターゲティングするように、１つ又は複数のＨＤＶタンパク質から誘導、設計、若しくは産生される抗原である。
免疫応答の刺激に関する場合、用語「免疫原」は、用語「抗原」のサブセットであり、従って、場合によっては、用語「抗原」と置換え可能に用いることができる。本明細書で用いる場合、免疫原とは、個体への免疫原の投与が、個体の免疫系に遭遇した同一抗原又は類似抗原に対する抗原特異的免疫応答を開始するように、液性免疫応答及び細胞性免疫応答の少なくとも一方を誘発する（すなわち、免疫原性）抗原を意味する。一実施形態では、免疫原は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答（例えば、ＴＨ１、ＴＨ２及びＴＨ１７の少なくとも一方）及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答（例えば、ＣＴＬ応答）などの細胞性免疫応答を誘発する。
所与の抗原の「免疫原性ドメイン」は、動物に投与されると、免疫原として作用する少なくとも１つのエピトープを含む抗原の任意の部分、断片若しくはエピトープ（例えば、ペプチド断片若しくはサブユニット又は抗体エピトープ又は他の構造エピトープ）とすることができる。従って、免疫原性ドメインは、単一のアミノ酸より大きく、少なくとも、免疫原として作用することができる少なくとも１つのエピトープを含有するのに十分な大きさである。例えば、単一タンパク質は、複数の異なる免疫原性ドメインを含みうる。免疫原性ドメインは、液性免疫応答の場合（この場合、構造ドメインが考慮される）のように、タンパク質内で線状配列である必要はない。
所与のタンパク質の「機能ドメイン」は、当該タンパク質に関連する、タンパク質に帰する、又はタンパク質によって実施される少なくとも１つの生物学的若しくは化学的機能
を、直接若しくは間接的に担当する配列又は構造を含むタンパク質の部分又は機能単位である。例えば、機能ドメインは、酵素活性、リガンド結合部位、受容体結合部位、カルシウムなどの分子若しくは部分に対する結合部位、リン酸化部位、又は相互活性化ドメインを含みうる。ＨＤＶ機能ドメインの例としては、限定するものではないが、核局在化配列（ＮＬＳ）、ＲＮＡ結合ドメイン、及び、ビリオン集合とＲＮＡ集合の阻害とに関与するドメインが挙げられる。
所与のタンパク質の「構造ドメイン」は、タンパク質の部分、又は識別可能な構造（例えば、タンパク質の１クラス若しくはファミリーに属し、その中の数種のタンパク質を示す一次若しくは三次構造であってよい）を有するタンパク質の全体構造内のエレメントであり、自己安定性であって、及び／又は残りのタンパク質とは独立にフォールディングしうる。構造ドメインは、往々にして、それが属するタンパク質の生物学的機能に関連するか、又はその機能において顕著に重要な役割を果たす。
本明細書において、エピトープは、免疫系に付与されると、適切な共刺激シグナル及び／又は免疫系の活性化細胞に関して、免疫応答を誘発するのに十分な所与の抗原内の単一免疫原性部位として定義される。言い換えれば、エピトープは、免疫系の成分によって実際に認識される抗原の部分であり、抗原決定基と呼ばれることもある。当業者は、Ｔ細胞エピトープは、Ｂ細胞又は抗体エピトープとは、その大きさ及び組成が異なること、また、クラスＩ ＭＨＣ経路を介して提示されるエピトープは、クラスＩＩ ＭＨＣ経路を介して提示されるエピトープとは、その大きさ及び構造属性が異なることを認識されよう。例えば、クラスＩ ＭＨＣ分子によって提示されるＴ細胞エピトープは、典型的に、長さが８〜１１アミノ酸であるが、クラスＩＩ ＭＨＣ分子によって提示されるエピトープは、長さがそれほど限定的ではなく、８アミノ酸〜２５アミノ酸であっても、それより長くてもよい。さらに、Ｔ細胞エピトープは、エピトープが結合する特定のＭＨＣ分子に応じて異なる推定構造特徴を有する。いくつかのＴ細胞エピトープが、ＨＤＶ株において同定されており、これらを表１に示す。エピトープは、線状配列エピトープ又は構造エピトープ（保存結合領域）であってよい。ほとんどの抗体は、構造エピトープを認識する。
融合タンパク質の全てを含む本明細書に記載するＨＤＶ抗原のいずれにおいても、以下に示す別の実施形態を適用することができる。第１に、抗原構築物のいくつかに含まれるＮ末端発現配列及びＣ末端タグは、任意選択であり、使用する場合、プロテアソーム分解に対する耐性を付与する、及び／又は発現、安定性を安定化若しくは改善する、及び／又はタンパク質の同定及び／若しくは精製を可能にするように、本明細書の他所に記載の複数の異なる配列から選択してよい。あるいは、Ｎ末端又はＣ末端配列の一方若しくは両方を完全に省略する。さらに、酵母での使用に好適な多数の異なるプロモータが当分野では公知であり、本発明のＨＤＶ抗原を発現させる目的での使用についてこれらも含まれる。好適なプロモータとしては、限定するものではないが、ＣＵＰ１及びＴＥＦ２がある。さらに、短い介在リンカー配列（例えば、１、２、３、４、若しくは５、又はそれを超えるアミノ酸ペプチド）を、様々な理由から融合タンパク質の部分同士の間に導入してもよく、例えば、クローン化及び構築物の将来の操作を容易にするための制限酵素部位の導入などがある。最後に、本明細書の他所で詳細に述べるように、本明細書に記載する配列は例示的なものであり、本明細書の他所で詳細に述べるように、ＨＤＶ遺伝子型、ＨＤＶ株若しくは単離物、又は共通配列の優先、並びに好ましいＴ細胞エピトープ（優性及び／又は低優性Ｔ細胞エピトープなど）の含有に適合させる目的で、改変して配列を置換、付加若しくは欠失させてもよい。本発明で有用な複数の異なるＨＤＶ抗原例の説明を以下に行う。
本発明の一実施形態では、本発明の組成物又は方法に用いるためのＨＤＶ抗原は、ＨＤＶ抗原を含むタンパク質若しくは融合タンパク質であり、ここで、ＨＤＶ抗原は、少なく
とも１つのＨＤＡｇ−Ｌ若しくはＨＤＡｇ−Ｓタンパク質の全部、及び／又は少なくとも１つのその免疫原性ドメインを含むか、これらから構成される。一態様では、ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓタンパク質は、完全長若しくはほぼ完全長である。本発明のいずれかの実施形態によれば、「完全長」タンパク質（又は完全長機能ドメイン若しくは完全長免疫ドメイン）と言うとき、前述したように、又は一般に公開されている配列において公知の、若しくは記載されているタンパク質又は機能ドメイン若しくは免疫ドメインの完全長アミノ酸配列を包含する。「ほぼ完全長」であるタンパク質又はドメインは、タンパク質の１種の相同体でもあり、完全長タンパク質又はドメインとの相違は、このような完全長タンパク質又はドメインのＮ末端及び／又はＣ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０アミノ酸の付加又は欠失又は省略があることである。タンパク質又はドメインと一般に言うとき、これは、完全長タンパク質及びほぼ完全長タンパク質の両方、並びにその他の相同体を包含することができる。
これらの構築物及び本明細書に記載及び／若しくは例示する他の構築物を設計するのに用いられるＨＤＶ配列は、特定のＨＤＶ遺伝子型の単離物又は株に基づく。しかし、１つの特定の遺伝子型、遺伝子亜型、若しくは株／単離物に基づく又は由来する、本明細書に記載のＨＤＶ抗原のいずれかの部分に、いずれか他のＨＤＶ遺伝子型、遺伝子亜型、若しくは株由来の対応配列を付加又は置換すること、あるいは、対応配列に起こる単一の、若しくは小さなアミノ酸置換、挿入又は欠失であっても、本明細書の一実施形態である。一実施形態では、本明細書に記載するＨＤＶ抗原の全配列を、１つ又は複数の異なるＨＤＶ遺伝子型、遺伝子亜型、若しくは株／単離物由来の対応配列で置換することによって、ＨＤＶ抗原を作製することができる。例えば、１つのＨＤＶ遺伝子型又は遺伝子亜型由来の配列に別の配列を付加、又は別の配列で置換することにより、特定の個体又は個体の集団（例えば、所与の国又は国の地域内での個体の集団；その国又は国の地域内で最も優勢なＨＤＶ遺伝子型をターゲティングする目的で）のために、免疫治療組成物をカスタマイズすることが可能になる。同様に、所与のＨＤＶ株、遺伝子型若しくは遺伝子亜型に由来する、これから決定された、若しくはそれについて公開されている共通配列の全部又は一部を用いて、共通配列と、より近似して又は厳密に一致するように、所与のＨＤＶ抗原の配列に変更を加えることも、本発明の一実施形態である。本発明に従い、また当分野で一般に理解されるように、「共通配列」は、典型的に、複数の配列をアラインメントした後、所与の配列の特定の位置で最も共通するヌクレオチド又はアミノ酸に基づく配列である。
前述したタイプの改変の具体例として、ＨＤＶ抗原を改変することにより、異なる単離物からのＴ細胞エピトープとより近似して、若しくは厳密に一致するように、又は、Ｔ細胞エピトープの共通配列とより近似して、若しくは厳密に一致するように、１つの単離物由来の所与の配列におけるＴ細胞エピトープを変更することができる。実際、本発明によれば、様々なＨＤＶ遺伝子型及び／若しくは亜型由来の共通配列、又は異なるＨＤＶ遺伝子型及び／若しくは亜型由来の配列の混合物を含むＨＤＶ抗原を設計することができる。主な既知の遺伝子型の各々に由来する配列例に対するＨＤＶ ＨＤＡｇのアラインメントは、一般に入手可能なソフトウエアを用いて、容易に実施することができ、これによって、例えば、共通配列の作製を知らせることができる。このような改変の例を本明細書で説明及び例示する。
本発明の一実施形態例は、切断型（完全長より短い）ＨＤＶ遺伝子型１ＨＤＡｇ−Ｌである、配列番号１０によって表されるアミノ酸配列を有するＨＤＶ抗原に関する。この抗原は、ＭＨＣクラスＩ Ｔ細胞エピトープである配列：ＫＬＥＤＬＥＲＤＬ又は配列番号２０（配列番号１０の５〜１３位）；及び別のＭＨＣクラスＩ Ｔ細胞エピトープである配列：ＫＬＥＤＥＮＰＷＬ又は配列番号１９（２２〜３０位）である（上の表１を参照）。配列番号１０の２２〜１４０位は、ＭＨＣクラスＩＩ結合エピトープが豊富な領域である（表２を参照）。この抗原は、いずれかのＨＤＶ遺伝子型、遺伝子亜型、若しくは株の
対応配列を用いて作製することができる（すなわち、配列番号１０について選択したものの代わりに、別のＨＤＶ株由来のＨＤＡｇ−Ｌの同じアミノ酸位置を用いることができる）。酵母ベースの免疫治療組成物の製造に用いるために、好適なプロモータの制御下でＨＤＶ抗原を発現するように、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を操作する。酵母ベースの免疫治療組成物の構築及び製造について、以下にさらに詳しく説明する。
以上概説し、また、以下にさらに詳しく説明するように、配列番号１０で表される抗原、本明細書に記載するいずれか他のＨＤＶ抗原が付加されて、プロテアソーム分解に対する耐性を付与する、及び／又は、タンパク質の発現を安定化する配列（例えば、以下のタンパク質：ＭＡＤＥＡＰ（配列番号１１））が、そのＮ末端に追加される。別の好適なＮ末端配列については以下に述べる。任意選択で、この抗原、及び本明細書に記載するいずれかのＨＤＶ抗原は、タンパク質の安定化、同定及び単離の少なくとも一方に役立ちうるＣ末端配列を含有するように改変されうる。例えば、こうしたＣ末端配列は、ヘキサ−ヒスチジン配列であり、これは、タンパク質を同定するのに有用である。一例として、配列番号１１のＮ末端配列とヘキサヒスチジンＣ末端とを含む融合タンパク質は、配列番号１２によって表され、ここで、配列番号１２の１〜６位は、配列番号１１と一致し、配列番号１２の７〜１４６位は、配列番号１０に一致し、また、配列番号１２の１４７〜１５２は、ヘキサヒスチジンタグである。
また、配列番号１０の抗原（これは、別のＨＤＶ遺伝子型、遺伝子亜型又は株の対応配列で置換可能である）について、発現を安定化するためのα因子プレプロ配列（本明細書では、配列番号１３又は配列番号１４で表される；いずれも、α因子プレプロ配列例である）を、Ｎ末端に付加して追加することもできるし、所望であれば、任意選択で、ヘキサ−ヒスチジン配列を、Ｃ末端に付加して追加することもできる。このような融合タンパク質の１つは、本明細書では配列番号１５によって表され、これは、別のＨＤＶ株の対応配列で置換することができる（配列番号１０及び配列番号１３、さらにはヘキサ−ヒスチジンタグを含む）。配列番号１５の１〜８９位は、配列番号１３に一致し、配列番号１５の９０〜２２９位は、配列番号１０に一致し、また、配列番号１５の２３０〜２３５位は、ヘキサヒスチジンタグである。
本発明で有用な別のＨＤＶ抗原は、配列番号１６のアミノ酸配列で表される。この抗原では、遺伝子型１、２及び３として知られる３つの異なる遺伝子型の各々からの株に由来する切断型ＨＤＡｇの１コピー（Ｔ細胞エピトープを最大化するように選択される）が、より普遍的な構築物を作製するための単一融合タンパク質として提供される。この抗原は、いずれかのＨＤＶ遺伝子型若しくは株の対応配列を用いて作製することができ、さらに、ＨＤＡｇの任意の部分を用いて、このような融合タンパク質を形成することができる（すなわち、配列番号１６に用いられるＨＤＡｇの部分は例示的なものであって、より小さい部分若しくは、完全長ＨＤＡｇまでの、より大きい部分を用いることもできる）。この構築物において、遺伝子型１ＨＤＶ株（以下「遺伝子型１」）由来のＨＤＡｇの部分は、配列番号１６の１〜１４０位と一致し；遺伝子型２株（以下「遺伝子型２」）由来のＨＤＡｇの部分は、配列番号１６の１４１〜２８０位と一致し；遺伝子型３株（以下「遺伝子型３」）由来のＨＤＡｇの部分は、配列番号１６の２８１〜４２０位と一致する。
配列番号１６で表される配列に関するもので、作製することができる別の類似構築物は、３つ以上の完全長ＨＤＡｇ−Ｌタンパク質の融合物であり、ＨＤＡｇ−Ｌタンパク質の各々は、異なるＨＤＶ遺伝子型（例えば、遺伝子型１、遺伝子型２及び３、若しくは異なる遺伝子型の組合せ）に由来するが、完全長配列と比較して、ＨＤＡｇ−Ｌタンパク質の各々は、前述したように（例えば、この部位内の残基の置換及び／又は欠失により）、ＮＬＳ領域を不活性化するように改変されている。このような構築物の一例では、６６〜７
５位（ＮＬＳ）の欠失を含む配列番号２（又は別のＨＤＶ株由来の対応配列）で表される完全長遺伝子型１ＨＤＡｇ−Ｌ配列を、６６〜７５位（ＮＬＳ）の欠失を含む配列番号５（又は別のＨＤＶ株由来の対応配列）で表される完全長遺伝子型２ＨＤＡｇ−Ｌ配列と連結し、これを、６６〜７５位（ＮＬＳ）の欠失を含む配列番号８（又は別のＨＤＶ株由来の対応配列）で表される完全長遺伝子型３ＨＤＡｇ−Ｌ配列と連結する。これらの配列は、別の順序で互いに融合することもでき、あるいは、異なる、若しくは追加のＨＤＶ遺伝子型又は遺伝子亜型を融合物に付加することにより、「普遍的」免疫治療組成物を作製することも可能である。さらに、個別の遺伝子型配列のいずれかの様々な残基を改変して（例えば、アミノ酸置換により）、所与の遺伝子型の共通配列と、より近似して一致するようにすることもできるし、及び／又は様々な残基を改変して（例えば、アミノ酸置換により）、ＨＤＶに対する免疫応答に関連した既知の共通Ｔ細胞エピトープと、より近似して一致するようにすることもできる。
図１は、配列番号１６の融合タンパク質に用いられる遺伝子型同士の相同性を表すために、配列番号１６の構築物に用いられるＨＤＡｇの部分のアラインメントを示す。配列番号１６における配列の各々が、完全長ＨＤＶ ＨＤＡｇ−Ｌの切断型部分であることから、このアラインメントは、様々なＨＤＶ遺伝子型、遺伝子亜型若しくは株／単離物の間の対応配列を同定するのが簡単明瞭であることも示している。
本明細書の他所で述べるＨＤＶ抗原の場合と同様に、配列番号１６のＮ末端及びＣ末端の少なくとも一方又は類似の融合タンパク質は、様々な配列（例えば、配列番号１１、１３若しくは１４）を含有するために付加されうる。例えば、配列番号１１のＮ末端ペプチド及びＣ末端ヘキサヒスチジン配列を配列番号１６と共に用いて、配列番号１７で表される融合タンパク質が作製される。配列番号１７の１〜６位は、配列番号１１と一致し；配列番号１７の７〜４２６位は、配列番号１６と一致し、また、配列番号１７の４２７〜４３２位は、ヘキサヒスチジンタグと一致する。配列番号１３のＮ末端配列を配列番号１６と共に用い、前述のようにＣ末端を付加して、配列番号１８で表される融合タンパク質が作製され、この場合、配列番号１８の１〜８９位は、配列番号１３と一致し；配列番号１８の９０〜５０９位は、配列番号１６と一致し、また、配列番号１８の５１０〜５１５位は、ヘキサヒスチジンタグと一致する。
別のＨＤＶ抗原（融合タンパク質など）及びＨＤＶ抗原含有組成物を実施例１で説明する。一構築物では、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を銅誘導性プロモータ、ＣＵＰ１（任意選択のプロモータとして、限定するものではないが、ＴＥＦ２プロモータを含んでもよい）の制御下でＨＤＶ抗原を発現するように操作した。このＨＤＶ抗原は、遺伝子型１ＨＤＶ ＨＤＡｇ−Ｌの単コピーを含む。この抗原は、骨格鋳型として、本明細書では配列番号２で表されるＨＤＡｇの単コピーを用いて構築したが、この構築物に含まれるものの代わりに、いずれか他のＨＤＶ株／単離物、又はいずれか他のＨＤＶ遺伝子型若しくは遺伝子亜型に由来する対応配列を用いることもできる。この構築物では、得られる構築物、並びにこの抗原を発現する酵母ベースの免疫治療薬の潜在的安全性プロフィールを高め、また、酵母における上記構築物の発現を潜在的に増大するために、配列番号２で表されるＨＤＶ抗原を改変して、１０アミノ酸残基の核局在化配列（すなわち、ＥＧＡＰＰＡＫＲＡＲ、若しくは配列番号２の６６〜７５位）を欠失させた。このＨＤＶ単離物（配列番号２）は、ＨＤＶに対する免疫応答を誘発すると推定される複数のＴ細胞エピトープを含有する。得られたタンパク質は、既知の膜貫通ドメインを含有しておらず、極めて疎水性のエレメントを含まないため、疎水性に関するそれ以上の改変は、このＨＤＶ抗原の設計において重要な要素ではないと考えられた。得られた抗原のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号２８で表されるが、これは、別のＨＤＶ株、遺伝子型若しくは遺伝子亜型由来の対応配列で置換することができる。酵母における抗原の発現を改善する（Ｎ末端配列）と共に、抗原の同
定を容易にする（Ｃ末端配列）ために、配列番号１１に一致するＮ末端配列及びヘキサ−ヒスチジンタグのＣ末端配列を配列番号２８に付加した。Ｓｐｅ１制限酵素部位を導入する２アミノ酸リンカー（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）を、配列番号１１と配列番号２８との間に挿入して、上記構築物のクローニングを促進した。得られた融合タンパク質は、配列番号３０で表されるアミノ酸配列を有し、ここで、配列番号３０の１〜６位は、配列番号１１のＮ末端ペプチドであり；配列番号３０の７〜８位は、２アミノ酸リンカーであり；配列番号３０の９〜２１２位は、配列番号２８のＨＤＶ抗原であり；配列番号３０の２１３〜２１８位は、ヘキサ−ヒスチジンタグである。配列番号３０は、本明細書において配列番号２９で表される核酸配列によってコードされ、これは、酵母における発現のために最適化される。
配列番号２のＨＤＶ ＨＤＡｇに基づくもので、実施例１で説明する第２の構築物では、酵母生物学及び酵母による抗原の発現に関して、得られる抗原を評価するために、ＮＬＳ配列を保持した。得られる抗原のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号３１で表され、これは、別のＨＤＶ株、遺伝子型若しくは遺伝子亜型由来の対応配列で置換することができる。酵母における抗原の発現を改善する（Ｎ末端配列）と共に、抗原の同定を容易にする（Ｃ末端配列）ために、配列番号１１に一致するＮ末端配列及びヘキサ−ヒスチジンタグのＣ末端配列を配列番号３１に付加した。２アミノ酸リンカー（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）を、配列番号１１と配列番号３１との間に挿入して、上記構築物のクローニングを促進した。得られた融合タンパク質は、配列番号３３で表されるアミノ酸配列を有し、ここで、配列番号３３の１〜６位は、配列番号１１のＮ末端ペプチドであり；配列番号３３の７〜８位は、２アミノ酸リンカーであり；配列番号３３の９〜２２２位は、配列番号３１のＨＤＶ抗原であり；配列番号３３の２２３〜２２８位は、ヘキサ−ヒスチジンタグである。配列番号３３は、本明細書において配列番号３２で表される核酸配列によってコードされ、これは、酵母における発現のために最適化される。
実施例１に記載する第３の構築物では、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を銅誘導性プロモータ、ＣＵＰ１の制御下でＨＤＶ抗原を発現するように操作した。この抗原は、より「普遍的な」免疫治療薬若しくはワクチンであると考えられ、２つの異なるＨＤＶ遺伝子型、この場合、遺伝子型１及び２由来の改変されたＨＤＡｇ−Ｌを含む単一の融合タンパク質である。このＨＤＶ抗原は、１つの骨格鋳型として、本明細書では配列番号２で表されるＨＤＡｇの単コピー（遺伝子型１）、並びに第２の骨格鋳型として、本明細書では配列番号５で表されるＨＤＡｇの単コピー（遺伝子型２）を用いて構築した。この構築物に含まれる２つの配列の一方若しくは両方の代わりに、いずれか他のＨＤＶ株／単離物、又はいずれか他のＨＤＶ遺伝子型若しくは遺伝子亜型に由来する対応配列を用いることもでき、また、第３、第４、第５、又は別の遺伝子型、遺伝子亜型若しくは株を用いて、類似の融合物を作製することができる。この構築物では、得られる構築物、並びにこの抗原を発現する酵母ベースの免疫治療薬の潜在的安全性プロフィールを高めるために、配列番号２で表されるＨＤＶ抗原を改変して、１０残基の核局在化配列（すなわち、ＥＧＡＰＰＡＫＲＡＲ、若しくは配列番号２の６６〜７５位）を欠失させた。同様に、得られる構築物、並びにこの抗原を発現する酵母ベースの免疫治療薬の潜在的安全性プロフィールを高めるために、配列番号５で表されるＨＤＶ抗原を改変して、１０残基の核局在化配列（すなわち、ＥＧＡＰＰＡＫＲＡＲ、若しくは配列番号５の６６〜７５位）を欠失させた。この融合タンパク質は、このＨＤＶ単離物（配列番号２）は、ＨＤＶに対する免疫応答を誘発すると推定されるＨＤＶ単離物鋳型の配列（配列番号２及び配列番号５）の各々において複数のＴ細胞エピトープを含有する。得られた抗原のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号３４で表されるが、これは、別のＨＤＶ株、遺伝子型若しくは遺伝子亜型由来の対応配列で置換することができる。配列番号３４では、遺伝子型１ＨＤＶ抗原の配列は、配列番号３４の１〜２０４位で表され、遺伝子型２ＨＤＶ抗原の配列は、配列番号３４の２０５〜４０８位で表
される。
酵母での抗原の発現を改善する（Ｎ末端配列）と共に、抗原の同定を容易にする（Ｃ末端配列）ために、配列番号１１と一致するＮ末端配列及びヘキサ−ヒスチジンタグのＣ末端配列を配列番号３４に付加した。構築物のクローニングを促進するために、２アミノ酸リンカー（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）を、配列番号１１と配列番号３４との間に挿入した。得られた融合タンパク質は、配列番号３６で表されるアミノ酸配列を有し、ここで、配列番号３６の１〜６位は、配列番号１１のＮ末端ペプチドであり；配列番号３６の７〜８位は、２アミノ酸リンカーであり；配列番号３６の９〜２１２位は、配列番号３４由来の遺伝子型１ＨＤＶ抗原であり；配列番号３６の２１３〜４１６位は、配列番号３４由来の遺伝子型２抗原であり；配列番号３６の４１７〜４２２位は、ヘキサ−ヒスチジンタグである。配列番号３６は、本明細書において配列番号３５で表される核酸配列によってコードされ、これは、酵母における発現のために最適化される。
本発明はまた、前述のＨＤＶ抗原及び融合タンパク質のいずれかの相同体、並びにこうした融合タンパク質の一部である個別のＨＤＶタンパク質又はその部分（いずれかの機能及び／若しくは免疫原性ドメイン）の相同体、変異体、若しくは突然変異体の使用も包含する。一態様では、本発明で有用なＨＤＶ抗原（配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４若しくは配列番号３６のいずれかを含む）は、完全長ＨＤＶ抗原（ＨＤＡｇ−Ｌ若しくはＨＤＡｇ−Ｓ）の直鎖状配列、又はＮＬＳドメインの１〜１０アミノ酸を欠失若しくは置換するように、改変されたＨＤＶ抗原、又はＨＤＡｇ−Ｌ若しくはＨＤＡｇ−Ｓタンパク質の少なくとも１つの免疫原性ドメインを含有するＨＤＡｇ−Ｌ若しくはＨＤＡｇ−Ｓタンパク質の１部分の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％を含む。一態様では、ＨＤＶ抗原（配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４若しくは配列番号３６のいずれかを含む）は、完全長ＨＤＶ抗原（ＨＤＡｇ−Ｌ若しくはＨＤＡｇ−Ｓ）、又はＮＬＳドメインの１〜１０アミノ酸を欠失若しくは置換するように、改変されたＨＤＶ抗原、又はＨＤＡｇ−Ｌ若しくはＨＤＡｇ−Ｓの少なくとも１つの免疫原性ドメインを含有するＨＤＡｇ−Ｌ若しくはＨＤＡｇ−Ｓの１部分と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である。Ｎ末端発現配列及びＣ末端タグの付加は任意選択であり、発現、安定性を改善する、及び／又は、タンパク質の同定及び精製の少なくとも一方を可能にするように、本明細書の他所に記載する複数の異なる配列から選択してもよく、あるいは、Ｎ末端若しくはＣ末端配列の一方又は両方を完全に省略する。さらに、酵母に用いるのに好適な多数の様々なプロモータが当分野では公知である。さらにまた、短い介在リンカー配列（例えば、１、２、３、４、若しくは５、又はそれを超えるアミノ酸ペプチド）を、様々な理由から、融合タンパク質の部分同士の間に導入してもよく、例えば、クローン化及び構築物の将来の操作を容易にするための制限酵素部位の導入などがある。
いくつかの態様では、アミノ酸挿入、欠失、及び／又は置換を、野生型又は基準ＨＤＶタンパク質又はその免疫原性ドメインの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくはそれを超えるアミノ酸について実施することができるが、得られるＨＤＶタンパク質は、本発明の酵母−ＨＤＶ免疫治療組成物において抗原として用いられる場合、標的若しくは野生型若しくは基準ＨＤＶタンパク質に対して免疫応答を誘発するものとし、これは、免疫応答の増大、免疫応答の低減、又は実質的に同様の免疫応答を含みうる。例えば
、本発明は、ＨＤＶアゴニスト抗原の使用を含み、この抗原は、例えば、ＭＨＣ分子について、又はＭＨＣ提示に関し、エピトープを認識するＴ細胞受容体について、エピトープの結合活性又は親和性を改善することにより、ＨＤＶアゴニストに対するＴ細胞応答を増大するように、突然変異されている１つ又は複数のＴ細胞エピトープを含んでいてもよい。従って、ＨＤＶタンパク質アゴニストは、宿主に感染するネイティブＨＤＶタンパク質に対するＴ細胞応答の効力又は効率を改善しうる。
本発明の一実施形態として、組換え核酸分子及びこれによってコードされるタンパク質（本明細書に記載する任意のＨＤＶ抗原など）は、酵母ベースの免疫治療組成物に用いてもよく、又は別の実施形態では、ＨＤＶ抗原のいずれかの他の好適な目的（ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおけるものなど）、抗体の生産、又は別の免疫治療組成物、例えば、本明細書に記載する酵母ベースの免疫治療薬に基づくものではない別のワクチン（例えば、ウイルスベクターワクチン、樹状細胞、又は別の免疫治療部分との融合物若しくは結合物の成分として）のために用いてもよい。酵母によるタンパク質の発現は、好ましい実施形態の１つであるが、酵母ベースの免疫治療組成物以外の用途のためのタンパク質を生産するのに、他の発現系を用いてもよい。
酵母ベースの免疫治療組成物。本発明の様々な実施形態において、本発明は、少なくとも１つの「酵母ベースの免疫治療組成物」（この表現は、「酵母ベースの免疫治療製剤」、「酵母ベースの免疫療法組成物」、「酵母ベースの組成物」、「酵母ベースの免疫治療薬」、「酵母ベースのワクチン」、又はこれら表現の誘導体と置換え可能に用いられうる）の使用を含む。「免疫治療組成物」は、対象に少なくとも１つの治療利益を達成するのに十分な免疫応答を誘発する組成物である。本明細書で用いる場合、酵母ベースの免疫治療組成物は、酵母ビヒクル成分を含み、かつ、対象に少なくとも１つの治療利益を達成するのに十分な免疫応答を誘発する組成物を指す。より具体的には、酵母ベースの免疫治療組成物は、酵母ビヒクル成分を含み、かつ、免疫応答、例えば、限定するものではないが、Ｔ細胞媒介性細胞性免疫応答などの細胞性免疫応答を誘発若しくは誘導することができる組成物である。一態様では、本発明で有用な酵母ベースの免疫治療組成物は、ＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導することができ、また、一態様では、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘導することができる。任意選択で、酵母ベースの免疫治療組成物は、液性免疫応答を誘発することができる。本発明で有用な酵母ベースの免疫治療組成物は、例えば、ＨＤＶ感染から個体を防御する、及び／又はＨＤＶ感染について、若しくはＨＤＶによって起こる症状について、個体を治療するように、個体において免疫応答を誘発することができる。
本発明の酵母ベースの免疫治療組成物は、「予防用」又は「治療用」のいずれであってもよい。予防用として投与する場合、本発明の組成物は、ＨＤＶ感染の何らかの識別子又は症状の検出若しくは観察に先立って提供される。このような組成物は、生後間もなく、乳幼児、又は成人に投与されることができ、また、一実施形態では、ＨＤＶ感染の危険性がある、又はＨＢＶ感染の危険性がある個体の集団を免疫する上でも有用でありうる。免疫治療組成物の予防的投与は、後のＨＤＶ感染を予防する上で、後にＨＤＶ感染が起こる場合により速く若しくはより完全に感染を解消する上で、及び／又は、後にＨＤＶ感染が起こった場合にＨＤＶ感染の症状を改善する上で役立つ。治療用に投与する場合、免疫治療組成物は、感染の少なくとも１つの症状を改善する目的で、好ましくは、感染を排除し、感染の長期持続的寛解をもたらし、及び／又はウイルスのその後の感染若しくは再活性化に対する長期免疫をもたらすことを目的として、ＨＤＶ感染の発症時、又は発症後に提供される。
典型的に、酵母ベースの免疫治療組成物は、酵母ビヒクルと、酵母ビヒクルによって発現される、これと結合した、若しくは混合された少なくとも１種の抗原若しくは免疫原性
ドメインとを含む。抗原は、酵母に対して非相同であり、１種又は複数種のＨＤＶ抗原を含む。いくつかの実施形態では、ＨＤＶ抗原は、融合タンパク質として提供される。本発明の組成物及び方法での使用に好適な複数のＨＤＶ融合タンパク質について上に説明してきた。本発明の一態様では、融合タンパク質は、２種以上の抗原、例えば、同じ抗原の反復配列、又は各抗原が異なる遺伝子型、遺伝子亜型若しくは株に由来する２種以上のＨＤＡｇを含むことができる。一態様では、融合タンパク質は、１種又は複数種の抗原の２つ以上の免疫原性ドメイン、又は１種又は複数種の抗原の２つ以上のエピトープを含んでよい。
本発明で用いられる酵母ベースの免疫治療組成物のいずれかにおいて、酵母ビヒクルに関連する以下の態様が本発明に含まれる。本発明によれば、酵母ビヒクルは、任意の酵母細胞（例えば、全細胞若しくはインタクトな細胞）又はその誘導体（派生物）（以下を参照）であり、これらは、本発明の治療組成物において、１種又は複数種の抗原、その免疫原性ドメイン、又はそのエピトープと一緒に用いられることができるし、あるいは、一態様では、酵母ビヒクルは、単独で、又はアジュバントとして用いられることができる。従って、酵母ビヒクルとして、限定するものではないが、以下のものを挙げることができる：生存しているインタクトな（全）酵母微生物（すなわち、細胞壁などのその成分をすべて有する酵母細胞）、死滅（死んだ）若しくは不活性化されたインタクトな（全）酵母微生物、又はインタクトな（全）酵母の誘導体、例えば、酵母スフェロプロスト（すなわち、細胞壁のない酵母細胞）、酵母サイトプラスト（すなわち、細胞壁及び核のない酵母細胞）、酵母ゴースト（すなわち、細胞壁、核及び細胞質のない酵母細胞）、細胞下酵母膜抽出物又はその画分（酵母膜粒子とも呼ばれ、以前は細胞下酵母粒子と呼ばれる）、その他任意の酵母粒子、又は酵母細胞壁調製物。
酵母スフェロプラストは、典型的に、酵母細胞壁の酵素消化によって製造される。このような方法は、例えば、フランズソフ（Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ）ら著、１９９１年、酵素学の方法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、第１９４巻、ｐ．６６２〜６７４に記載されている。尚、この文献は、その全文を参照として本明細書に組み込むものとする。
酵母サイトプラストは、典型的に、酵母細胞の除核によって製造される。このような方法は、例えば、クーン（Ｃｏｏｎ）著、１９７８年、国立ＨＤＶ感染研究所研究論文（Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．）、第４８巻、ｐ．４５〜５５に記載されており、この文献は、その全文を参照として本明細書に組み込むものとする。
酵母ゴーストは、典型的に、透過処理又は溶解した細胞を再封入することによって製造され、その細胞の細胞小器官の少なくとも一部を含んでもよいが、必ずしも含む必要はない。このような方法は、例えば、フランズソフ（Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ）ら著、１９８３年、米国生化学会誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２５８巻、ｐ．３６０８〜３６１４及びブッセイ（Ｂｕｓｓｅｙ）ら著、１９７９年、生化学・生物物理学誌（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、第５５３巻、ｐ．１８５〜１９６に記載されている。尚、これらの文献は各々、その全文を参照として本明細書に組み込むものとする。
酵母膜粒子（細胞下酵母膜抽出物又はその画分）とは、天然の核又は細胞質が欠失した酵母膜を指す。粒子は、どんな大きさであってもよく、天然酵母膜の大きさから、音波破砕又は当業者には公知の他の膜破砕方法に続く再封入によって製造される微粒子までの大きさを含む。細胞下酵母膜抽出物を製造する方法は、例えば、フランズソフ（Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ）ら著、１９９１年、酵素学の方法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、第１９４巻、ｐ．６６２〜６７４に記載されている。また、酵母膜部分を含む酵母膜粒子の画分、さらには、酵母膜粒子の製造前に、抗原又は他のタンパク質を酵母により組換え法で発現させた場合には、目的の抗原又は他のタンパク質も含む酵母膜粒子の画分を用いてもよ
い。目的の抗原又は他のタンパク質は、膜の内側、膜のいずれかの表面、又はそれらの組合せに担持させることができる（すなわち、タンパク質は、膜の内側及び外側の両方にあってもよく、及び／又は酵母膜粒子の膜を貫通していてもよい）。一実施形態では、酵母膜粒子は、組換え酵母膜粒子であり、これは、膜の表面に、又は膜内に少なくとも部分的に埋め込まれた状態で、少なくとも１つの所望の抗原若しくは目的とする他のタンパク質を含む、インタクトな、破砕された、若しくは破砕され、かつ再封入された酵母膜であってよい。
酵母細胞壁調製物の一例は、この酵母細胞壁調製物が、動物に投与されると、疾患標的に対して所望の免疫応答を刺激するように、その表面に、又は細胞壁内に少なくとも部分的に埋め込まれた状態で、抗原を担持する、単離された酵母細胞壁の調製物である。
本発明の酵母ビヒクルを製造するのに、任意の酵母株を用いることができる。酵母は、次の３つの綱：子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、担子菌（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）及び不完全菌（Ｆｕｎｇｉ Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）の１つに属する単細胞微生物である。免疫調節成分として用いる酵母の種類の選択に考慮すべきことの１つは、酵母の病原性である。一実施形態では、酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの非病原性株である。非病原性酵母株を選択することによって、酵母ビヒクルを投与する個体への任意の有害な作用を最小限にする。しかし、当業者には公知のいずれかの手段（例えば、突然変異株）によって、酵母の病原性を無効にすることができれば、病原性酵母を用いてもよい。本発明の一態様では、非病原性酵母株を用いる。
本発明で用いることができる酵母株の属としては、限定するものではないが、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）が挙げられる。一態様では、酵母属は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）又はシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択され、一態様では、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、及びピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）から選択され、一態様では、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が用いられる。本発明で用いることができる酵母株の種として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ケフィア（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコッカス・ラウレンティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ハンセヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス・バー・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ ｖａｒ．ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ロドトルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、及びヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗ
ｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）。これらの種の多くが、様々な亜種、タイプ、サブタイプなどを含み、これらは、前述した種に含まれることが意図されることを理解すべきである。一態様では、本発明で用いられる酵母種として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）がある。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、操作するのが比較的容易であり、食品添加物としての使用に「一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ
Ａｓ Ｓａｆｅ）」又は「ＧＲＡＳ」（ＧＲＡＳ；ＦＤＡによる提案規定（ＦＤＡ ｐｒｏｐｓｅｄ Ｒｕｌｅ）６２ＦＲ１８９３８、１９９７年４月１７日）であることから、有用である。本発明の一実施形態は、プラスミドを特に高いコピー数に複製することができる酵母株、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｃｉｒＯ株である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、１種又は複数種の標的抗原及び／又は抗原融合タンパク質及び／又は他のタンパク質を高レベルで発現させることを可能にする発現ベクターを支持することができるような株である。さらに、任意の突然変異酵母株を本発明で用いることができ、こうした株として、発現した標的抗原又は他のタンパク質の翻訳後修飾低減を呈示するもの、例えば、Ｎ連結グルコシル化を伸長する酵素の突然変異などがある。
本発明のほとんどの実施形態において、酵母ベースの免疫療法組成物は、少なくとも１種の抗原、その免疫原性ドメイン、若しくはそのエピトープを含む。本発明に用いるのに考慮される抗原は、ＨＤＶ感染から宿主を予防若しくは治療的に免疫する目的で、免疫応答を誘発しようとする、任意のＨＤＶ抗原若しくはその免疫原性ドメイン（ＨＤＶタンパク質の突然変異体、変異体及びアゴニスト若しくはそのドメインを含む）を包含する。本発明の様々な実施形態において有用なＨＤＶ抗原については、上に詳しく記載した。
前述したように、本発明の組成物は、対象を免疫するために少なくとも１種のＨＤＶ抗原の少なくとも１種のＨＤＶ抗原及び／又は少なくとも１種の免疫原性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、融合タンパク質であり、そのいくつかの例を上に記載している。
任意選択で、本発明の酵母ベースの免疫治療組成物の成分として用いられるタンパク質（融合タンパク質など）は、酵母において組換え抗原の発現、又は発現の安定性を改善若しくは増強するのに特に有用な構築物を用いて作製される。典型的に、所望の抗原タンパク質又はペプチドは、それらのアミノ末端で、以下の（ａ）〜（ｃ）のうちの少なくとも一つと融合される：（ａ）酵母ビヒクルにおける融合タンパク質の発現を安定化するか、又は発現した融合タンパク質の翻訳後修飾を阻止する特定の合成ペプチド（このようなペプチドは、例えば、２００４年８月１２日に公開された米国特許出願公開第２００４−０１５６８５８Ａ１号明細書に詳しく記載されている；尚、この文献は、参照としてその全文を本明細書に組み込む）；（ｂ）内在性酵母タンパク質の少なくとも一部であって、例えば、限定するものではないがα因子であり、いずれかの融合相手が、酵母内でのタンパク質の発現の安定性改善をもたらし、及び／又は酵母細胞によるタンパク質の翻訳後修飾を阻止する（このようなタンパク質も、米国特許出願公開第２００４−０１５６８５８Ａ１号明細書（前掲）に詳しく記載されている）；及び（ｃ）酵母の表面に融合タンパク質を発現させる酵母タンパク質の少なくとも一部（例えば、本明細書にさらに詳しく記載されるＡｇａタンパク質）。さらに、本発明は、任意選択で、特に、タンパク質の選択及び同定に用いるための、抗原コード構築物のＣ末端に融合したペプチドの使用を含む。このようなペプチドとして、限定するものではないが、ペプチドタグ（例えば、６ＸＨｉｓ）又は他のいずれかの短いエピトープタグなどの任意の合成若しくは天然ペプチドが挙げられる。本発明の抗原のＣ末端に結合したペプチドは、前述したＮ末端ペプチドを付加して
、又は付加せずに用いることができる。
一実施形態では、融合タンパク質に有用な合成ペプチドを抗原のＮ末端に結合させるが、このペプチドは、抗原に対し異種である少なくとも２つのアミノ酸残基から構成され、このペプチドは、酵母ビヒクルにおける融合タンパク質の発現を安定化するか、又は発現した融合タンパク質の翻訳後修飾を阻止する。合成ペプチドと、抗原のＮ末端部分は一緒に、以下の要件を有する融合タンパク質を形成する：（１）融合タンパク質の１位のアミノ酸残基は、メチオニンである（すなわち、合成ペプチドの最初のアミノ酸は、メチオニンである）；（２）融合タンパク質の２位のアミノ酸残基は、グリシン又はプロリンではない（すなわち、合成ペプチドの２番目のアミノ酸は、グリシン又はプロリンではない）；（３）融合タンパク質の２〜６位のアミノ酸残基のいずれも、メチオニンではない（すなわち、合成ペプチドが６アミノ酸より短い場合、合成ペプチド又はタンパク質の部分のいずれであっても、２〜６位のアミノ酸は、メチオニンを含まない）；並びに（４）融合タンパク質の２〜６位のアミノ酸のいずれも、リシン又はアルギニンではない（すなわち、合成ペプチドが５アミノ酸より短い場合、合成ペプチド又はタンパク質の部分のいずれであっても、２〜６位のアミノ酸は、リシン又はアルギニンを含まない）。合成ペプチドは、２アミノ酸のように短くてもよいが、一態様では、２〜６アミノ酸（３、４、５アミノ酸を含む）であり、整数で、６アミノ酸より長く、最長で約２００アミノ酸、３００アミノ酸、４００アミノ酸、５００アミノ酸、又はそれを超えるアミノ酸であってもよい。
一実施形態では、融合タンパク質は、Ｍ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｍは、メチオニンであり；Ｘ２は、グリシン、プロリン、リシン若しくはアルギニン以外のいずれかのアミノ酸であり；Ｘ３は、メチオニン、リシン若しくはアルギニン以外のいずれかのアミノ酸であり；Ｘ４は、メチオニン、リシン若しくはアルギニン以外のいずれかのアミノ酸であり；Ｘ５は、メチオニン、リシン若しくはアルギニン以外のいずれかのアミノ酸であり；Ｘ６は、メチオニン、リシン若しくはアルギニン以外のいずれかのアミノ酸である。一実施形態では、Ｘ６残基は、プロリンである。酵母細胞における抗原の発現の安定性を高める、及び／又は酵母におけるタンパク質の翻訳後修飾を阻止する合成配列の１例としては、配列：Ｍ−Ａ−Ｄ−Ｅ−Ａ−Ｐ（配列番号１１）がある。同じ特性を備える別の合成配列の例として、Ｍ−Ｖがある。発現産物の安定性増加に加えて、この融合相手は、構築物における免疫抗原に対する免疫応答にマイナスの影響を与えないようである。さらに、合成融合ペプチドは、抗体などの選択因子によって認識されうるエピトープを付与するように設計することもできる。
本発明の一態様では、ＨＤＶ抗原をＮ末端で酵母タンパク質、例えば、α因子プレプロ配列（α因子シグナルリーダー配列とも呼ぶ）に結合させるが、このアミノ酸配列は、本明細書では、配列番号１３若しくは配列番号１４によって例示される。酵母α因子プレプロ配列の他の配列は、当分野において公知であり、本発明での使用に包含される。
本発明の一態様では、酵母ビヒクルは、酵母ビヒクルの表面上で（細胞外発現）、部分的若しくは全体的に、発現タンパク質産物の輸送若しくは転位によって抗原が発現され又は提供されるように操作される。本発明のこの態様を達成する一方法は、酵母ビヒクルの表面に１つ又は複数のタンパク質を配置するためのスペーサアームを用いることである。例えば、スペーサアームを用いて、目的の抗原又は他のタンパク質と、目的の抗原又は他のタンパク質を酵母細胞壁にターゲティングするタンパク質との融合タンパク質を形成することができる。例えば、他のタンパク質をターゲティングするのに用いることができるこのようなタンパク質の１つは、抗原又は他のタンパク質が、酵母の表面に位置するように、抗原又は他のタンパク質を酵母細胞壁にターゲティングすることを可能にする酵母タンパク質（例えば、細胞壁タンパク質２（ｃｗｐ２）、Ａｇａ２、Ｐｉｒ４若しくはＦｌｏ１タンパク質）である。酵母タンパク質以外のタンパク質をスペーサアームに用いても
よいが、いずれのスペーサアームの場合も、スペーサアームタンパク質ではなく、標的抗原に対して免疫原性応答を向かわせることが最も望ましい。従って、スペーサアームに他のタンパク質を用いる場合には、用いられるスペーサアームタンパク質は、スペーサアームタンパク質自体に対してはそうした大きな免疫応答を引き起こさず、標的抗原に対する免疫応答が優るようにしなければならない。当業者は、標的抗原の免疫応答と比較して、スペーサアームタンパク質に対しては小さな免疫応答を目標とすべきである。スペーサアームは、必要に応じて、抗原を酵母から容易に除去、若しくはプロセシングすることを可能にする切断部位（例えば、プロテアーゼ切断部位）を有するように構築することができる。免疫応答の大きさを決定する任意の公知の方法（例えば、抗体生産、溶菌アッセイなど）を用いることができ、これらは当業者には周知である。
酵母表面に露出するように標的抗原又は他のタンパク質を配置する別の方法は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ：ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）などのシグナル配列を用いて、酵母細胞壁に標的を固定するものである。あるいは、抗原が、細胞壁に結合したタンパク質（例えば、ｃｗｐ）と結合するように、小胞体（ＥＲ：ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）への転位を介して分泌経路へと目的の抗原又は他のタンパク質をターゲティングするシグナル配列を付加することによって、配置を達成することもできる。
一態様では、スペーサアームタンパク質は、酵母タンパク質である。酵母タンパク質は、酵母タンパク質の約２〜約８００アミノ酸から成るものでよい。一実施形態では、酵母タンパク質は、約１０〜７００アミノ酸である。別の実施形態では、酵母タンパク質は、約４０〜６００アミノ酸である。本発明の別の実施形態は、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも４５０アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも５５０アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、又は少なくとも６５０アミノ酸である酵母タンパク質を含む。一実施形態では、酵母タンパク質は、少なくとも４５０アミノ酸の長さである。必要に応じて、抗原表面発現を最適化するための別の考慮事項は、抗原とスペーサアームの組合せを、モノマー若しくは二量体若しくは三量体、又は互いに結合したそれより大きいユニットとして発現させるべきか否かである。単量体、二量体、三量体などの使用によって、全部ではないにしろ、抗原の一部が、それをより免疫原性にするような様式で、酵母ビヒクルの表面に提示されるように、抗原の適切なスペーシング又はフォールディングが可能になる。
酵母タンパク質の使用により、酵母ビヒクルにおける融合タンパク質の発現を安定化することができ、発現した融合タンパク質の翻訳後修飾を阻止し、及び／又は融合タンパク質を酵母内の特定のコンパートメントにターゲティングする（例えば、酵母細胞壁表面に発現させる目的で）。酵母分泌経路への送達のために、用いるべき酵母タンパク質の例として、限定するものではないが、Ａｇａ（限定しないが、Ａｇａ１及び／又はＡｇａ２）；ＳＵＣ２（酵母インベルターゼ）；α因子シグナルリーダー配列；ＣＰＹ；細胞壁における局在化及び保持のためのＣｗｐ２ｐ；娘細胞形成の初期段階での酵母細胞芽への局在化のためのＢＵＤ遺伝子；Ｆｌｏ１ｐ；Ｐｉｒ２ｐ；及びＰｉｒ４ｐが挙げられる。
他の配列を用いて、タンパク質を酵母ビヒクルの他の部分、例えば、細胞質ゾル又はミトコンドリア又は小胞体又は核内に、ターゲティング、保持及び／若しくは安定化することができる。前述した実施形態のいずれにも用いることができる好適な酵母タンパク質の例として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：ＴＫ、ＡＦ、ＳＥＣ７；グルコース及び細胞質ゾル局在化における抑制性発現を目的とする、ホスホエノールピルビン酸カルボキシナーゼＰＣＫ１、ホスホグリセロキナーゼＰＧＫ及びトリオースリン酸イソメラーゼＴＰＩ遺伝子産物；熱ショックタンパク質ＳＳＡ１、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、
ＳＳＣ１（その発現は誘導され、そのタンパク質は、熱処理に細胞を暴露する際、より熱安定的である）；ミトコンドリアへの移入のためのミトコンドリアタンパク質ＣＹＣ１；ＡＣＴ１。
酵母ビヒクルを作製し、且つ、目的の抗原、他のタンパク質及び他の物質の少なくとも一つを発現させ、これらと酵母ビヒクルを組み合わせ、及び／又は結合させて、酵母ベースの免疫治療組成物を製造する方法が、本発明によって考慮される。
本発明によれば、「酵母ビヒクル−抗原複合体」又は「酵母−抗原複合体」という用語は、酵母ビヒクルと抗原との任意の結合を表すために一般的に用いられ、このような組成物が、前述したように、免疫応答を誘発するために用いられる場合、「酵母ベースの免疫療法組成物」と置換え可能に用いることができる。このような結合は、例えば、バッファ又はその他の溶液若しくは製剤中での、酵母（組換え酵母）による抗原の発現、酵母への抗原の導入、抗原と酵母との物理的結合、並びに酵母と抗原との混合を含む。これらのタイプの複合体については、以下に詳しく記載する。
一実施形態では、酵母ビヒクルを作製するのに用いられる酵母細胞は、タンパク質が酵母細胞によって発現されるように、タンパク質（例えば、抗原）をコードする異種核酸分子でトランスフェクトされる。このような酵母は、本明細書において、組換え酵母又は組換え酵母ビヒクルとも呼ばれる。次に、酵母細胞をインタクトな細胞として樹状細胞にロードしてもよく、又は、酵母細胞を死滅させるか、あるいは、例えば、酵母スフェロプラスト、サイトプラスト、ゴースト、又は細胞下粒子の形成などにより、誘導体化してもよく、これらのいずれかに続いて、誘導体を樹状細胞にロードすることができる。酵母スフェロプラストはまた、抗原又は他のタンパク質を発現する組換えスフェロプラストを生産するために、組換え核酸分子で直接トランスフェクトされることができる（例えば、全酵母からスフェロプラストを生産した後、これらをトランスフェクトする）。
一般に、酵母ビヒクルと抗原及び／又は他の物質とは、本明細書に記載する任意の技術によって結合させることができる。一態様では、酵母ビヒクルに、抗原及び／又は物質を細胞内ロードする。別の態様では、抗原及び／又は物質を、酵母ビヒクルと共有又は非共有結合させる。また別の態様では、酵母ビヒクルと抗原及び／又は物質とを混合によって結合させる。別の態様では、また一実施形態において、酵母ビヒクル、又は酵母ビヒクルを誘導した酵母細胞若しくは酵母スフェロプラストによって、抗原及び／又は物質を組換えにより発現させる。
本発明の酵母ビヒクルによって産生させようとする抗原及び／又は他のタンパク質の数は、酵母ビヒクルが妥当に産生することができる任意の数の抗原及び／又は他のタンパク質であり、典型的には、少なくとも１から少なくとも約６又はそれを超える範囲であり、約２〜約６の異種抗原及び／又は他のタンパク質を含む。
本発明の酵母ビヒクルにおける抗原又は他のタンパク質の発現は、当業者には公知の技術を用いて達成される。手短には、少なくとも１種の所望の抗原又は他のタンパク質をコードする核酸分子を発現ベクターに挿入することにより、核酸分子が、転写制御配列と機能的に連結して、宿主酵母細胞に形質転換されると、核酸分子の構成的又は調節された発現のいずれかを実施することができるようにする。１種又は複数種の抗原及び／又は他のタンパク質をコードする核酸分子は、１種又は複数種の発現制御配列と機能的に連結した１つ又は複数の発現ベクター上にあってよい。特に重要な発現制御配列は、転写開始を制御するもの、例えば、プロモータ及び上流活性化配列である。任意の好適な酵母プロモータを本発明で用いることができ、このようなプロモータは多種が当業者には公知である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で
の発現用のプロモータとして、限定するものではないが、以下の酵母タンパク質：アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ１）又はＩＩ（ＡＤＨ２）、ＣＵＰ１、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ：ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ：ｔｒｉｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、翻訳伸長因子ＥＦ−１α（ＴＥＦ２：ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＥＦ−１ ａｌｐｈａ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）；トリオースリン酸デヒドロゲナーゼについては、ＴＤＨ３とも呼ばれる）、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１：ｇａｌａｃｔｏｋｉｎａｓｅ）、ガラクトース−１−リン酸ウリジル−トランスフェラーゼ（ＧＡＬ７：ｇａｌａｃｔｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｕｒｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＧＡＬ１０：ＵＤＰ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）、シトクロムｃ１（ＣＹＣ１：ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ１）、Ｓｅｃ７タンパク質（ＳＥＣ７：Ｓｅｃ７ ｐｒｏｔｅｉｎ）及び酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５：ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）をコードする遺伝子のプロモータが挙げられ、このようなものとして、例えば、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨ及びＣＹＣ１／ＧＡＬ１０プロモータなどのハイブリッドプロモータがあり、これは、細胞中のグルコース濃度が低い時（例えば、約０．１〜約０．２％）に誘導されるＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモータを含み、また、ＣＵＰ１プロモータ及びＴＥＦ２プロモータも挙げられる。同様に、いくつかの上流活性化配列（ＵＡＳ：ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（エンハンサーとも呼ばれる）が公知である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現用の上流活性化配列として、限定するものではないが、以下のタンパク質：ＰＣＫ１、ＴＰＩ、ＴＤＨ３、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＳＵＣ２、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０をコードする遺伝子のＵＡＳ、並びにＧＡＬ４遺伝子産物によって活性化される他のＵＳＡが挙げられ、一態様では、ＡＤＨ２ ＵＡＳが用いられる。ＡＤＨ２ ＵＡＳは、ＡＤＲ１遺伝子産物によって活性化されることから、異種遺伝子がＡＤＨ２ ＵＡＳに機能的に連結されると、ＡＤＲ１遺伝子を過剰発現するのが好ましいであろう。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のための転写終結配列には、α因子、ＧＡＰＤＨ、及びＣＹＣ１遺伝子の終結配列がある。
メチルトローフ酵母において遺伝子を発現する転写制御配列として、アルコールオキシダーゼ及びギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写制御領域がある。
本発明の酵母細胞への核酸分子のトランスフェクションは、核酸分子を細胞に導入することができるいずれの方法によっても達成することができ、そのような方法として、限定するものではないが、拡散、能動輸送、音波破砕浴、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、及び原形質体融合などがある。トランスフェクトされた核酸分子は、当業者には公知の技術を用いて、酵母染色体に組み込まれ、又は染色体外ベクター上で維持されることができる。このような核酸分子を担持する酵母ビヒクルの例は、本明細書に詳しく開示されている。前述したように、酵母細胞質体、酵母ゴースト、及び酵母膜粒子若しくは細胞壁調製物はまた、組換えにより作製されうる。すなわち、インタクトな酵母微生物又は酵母スフェロプラストを所望の核酸分子でトランスフェクトし、そこで抗原を産生させた後、当業者に公知の技術を用いて上記微生物又はスフェロプラストをさらに操作することにより、所望の抗原又は他のタンパク質を含有する細胞質体、ゴースト、又は細胞下酵母膜抽出物又はこれらの画分を生産する。
組換え酵母ビヒクルの作製並びに酵母ビヒクルによる抗原及び／又は他のタンパク質の発現のために効果的な条件として、酵母株を培養することができる有効培地が挙げられる。有効培地は、典型的に、同化可能な炭水化物、窒素及びリン酸供給源、並びに適切な塩、ミネラル類、金属及びその他の栄養素、例えば、ビタミン及び増殖因子などを含む水性
培地である。培地は、複合栄養素を含んでも、限定最小培地であってもよい。本発明の酵母株は、様々な容器内で培養することができ、こうした容器として、限定するものではないが、バイオリアクター、三角フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ ｆｌａｓｋ）、試験管、マイクロタイタープレート、及びペトリプレートなどがある。培養は、酵母株に適した温度、ｐＨ及び酸素量で実施する。こうした培養条件は、当業者には周知のものである（例えば、以下を参照：グスリー（Ｇｕｔｈｒｉｅ）ら（編）、１９９１年、「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、第１９４巻、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ）。
本発明のいくつかの実施形態では、酵母は、中性ｐＨ条件下で増殖させる。本明細書で用いる場合、用語「中性ｐＨ」を一般的に用いる場合、ｐＨ約５．５〜ｐＨ約８のｐＨ範囲、一態様では、ｐＨ約６〜ｐＨ約８のｐＨ範囲を指す。当業者であれば、ｐＨメータで測定する際、微細な変動（例えば、１／１０又は１／１００単位で）が起こりうることは理解されよう。従って、酵母細胞を増殖させるための中性ｐＨの使用とは、酵母細胞を培養している大部分の時間にわたって、これら酵母細胞を中性ｐＨで増殖させることを意味する。一実施形態では、少なくとも５．５のｐＨレベルに維持した培地（すなわち、培地のｐＨは、ｐＨ５．５を下回らないようにする）中で酵母を増殖させる。別の態様では、約６、６．５、７、７．５、又は８に維持したｐＨレベルで酵母を増殖させる。酵母を培養する中性ｐＨの使用は、免疫調節用のビヒクルとして酵母を用いるのに望ましい特性である複数の生物学的効果を促進する。例えば、中性ｐＨでの酵母の培養により、細胞産生時間にマイナスの作用（例えば、倍加時間の減速）をもたらすことなく、酵母の良好な増殖を可能にする。酵母は、その細胞壁柔軟性を失うことなく、高い密度まで増殖し続けることができる。中性ｐＨの使用により、柔軟な細胞壁を有する酵母及び／又は細胞壁消化酵素（例えば、グルカナーゼ）に対してより感受性の高い酵母の生産が、すべての回収密度で可能になる。柔軟な細胞壁を有する酵母は、より酸性の条件下で増殖させた酵母と比較して、例えば、酵母を貪食した抗原提示細胞によるサイトカイン（例えば、限定するものではないが、ＩＦＮ−γ、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、及びＩＬ−２などのＴＨ１型サイトカイン、並びにＩＬ−６のような炎症誘発性サイトカイン）の分泌を促進することにより、異なる又は改善された免疫応答を誘導することができるため、上記の特徴は望ましい。さらに、このような培養方法により、細胞壁内に位置する抗原との高い接触性がもたらされる。別の態様では、いくつかの抗原についての中性ｐＨの使用は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ：ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）での処理により、ジスルフィド結合抗原の放出を可能にするが、これは、このような抗原−発現酵母をより低いｐＨ（例えば、ｐＨ５）の培地で培養した場合には、不可能である。
一実施形態では、酵母グリコシル化の量の制御を用いて、特に表面での、酵母による抗原の発現を制御する。酵母グリコシル化の量は、糖部分が嵩高になりやすいため、表面に発現した、抗原の免疫原性及び抗原性に影響を及ぼしうる。従って、酵母表面上の糖部分の存在、及び標的抗原周辺の３次元空間へのその影響を本発明の酵母の調節において考慮すべきである。任意の方法を用いて、酵母のグリコシル化の量を低減（又は、所望であれば、増加）することができる。例えば、低グリコシル化をもたらすように選択された酵母突然変異株（例えば、ｍｎｎ１、ｏｃｈ１及びｍｎｎ９突然変異体）を用いることも、標的抗原へのグリコシル化アクセプター配列を突然変異により排除することもできる。あるいは、短縮グリコシル化パターンを有する酵母、例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）を用いることもできる。また、グリコシル化を低減又は改変する方法を用いて、酵母を処理することも可能である。
本発明の一実施形態では、酵母ビヒクルでの組換えによる抗原又は他のタンパク質の発現に代わるものとして、タンパク質若しくはペプチド、又は炭水化物若しくは他の分子を、酵母ビヒクルに細胞内ロードする。この炭水化物若しくは他の分子は、抗原として作用
し、及び／又は、本発明の免疫調節物質若しくは生体応答調節物質として有用である。続いて、ここで、抗原及び／又は他のタンパク質を細胞内に含有する酵母ビヒクルを個体に投与するか、あるいは、樹状細胞などの担体にロードすることができる。ペプチド及びタンパク質を、拡散、能動輸送、リポソーム融合、エレクトロポレーション、食作用、凍結解凍サイクル及び音波破砕浴など、当業者には公知の技術によって、本発明の酵母ビヒクルに直接挿入することができる。ペプチド、タンパク質、炭水化物、又は他の分子を直接ロードすることができる酵母ビヒクルとして、インタクトな酵母、並びにスフェロプラスト、ゴースト若しくは細胞質体などがあり、作製後、これらに、抗原及び他の物質をロードすることができる。あるいは、インタクトな酵母に、抗原及び／又は物質をロードした後、これらから、スフェロプラスト、ゴースト、細胞質体、又は細胞下粒子を調製することもできる。この実施形態では、いくつの抗原及び／又は他の物質を酵母ビヒクルにロードしてもよく、例えば、微生物又はその一部のローディングによって提供されるように、少なくとも１、２、３、４、又は数百若しくは数千までの任意の整数の抗原及び／又は他の物質をロードすることができる。
本発明の別の実施形態では、抗原及び／又は他の物質を酵母ビヒクルに物理的に結合させる。酵母ビヒクルへの抗原及び／又は他の物質の物理的結合は、当分野において好適な任意の方法によって達成することができ、共有及び非共有結合方法を含む。こうした方法は、限定するものではないが、酵母ビヒクルの外側表面への抗原及び／又は他の物質の化学的架橋、又は酵母ビヒクルの外側表面への抗原及び／又は他の物質の生物学的連結（例えば、抗体若しくは他の結合相手を用いて）などを含む。化学的架橋は、例えば、グルタルアルデヒド結合、光親和性標識、カルボジイミドによる処理、ジスルフィド結合が可能な化学物質による処理、並びに当分野で標準的な他の架橋化学物質による処理などの方法によって達成することができる。あるいは、酵母の外側表面が、特定の電荷特性を有する抗原及び／又は他の物質と融合若しくは結合しやすくなるように、酵母膜の脂質二層の電荷又は細胞壁の組成を改変する化学物質を酵母ビヒクルと接触させることができる。抗体、結合ペプチド、可溶性受容体、及び他のリガンドなどのターゲティング物質を、融合タンパク質として抗原に組み込んでも、抗原と酵母ビヒクルとの結合のために抗原と結合させてもよい。
抗原又は他のタンパク質を酵母の表面に発現させるか、又は物理的に結合させる場合、一態様では、表面上の抗原若しくは他のタンパク質発現又は含量を最適化するように、スペーサアームを注意深く選択することができる。スペーサアームの大きさは、どのくらいの量の抗原又は他のタンパク質を、酵母の表面への結合のために露出させるかに影響を及ぼしうる。従って、どの抗原又は他のタンパク質が用いられているかに応じて、当業者は、酵母表面上の抗原又は他のタンパク質の適切なスペーシングを達成するスペーサアームを選択する。一実施形態では、スペーサアームは、少なくとも４５０アミノ酸の酵母タンパク質である。スペーサアームについては、上に詳しく述べている。
また別の実施形態では、酵母ビヒクルと抗原又は他のタンパク質とは、より受動的、非特異的、又は非共有的な結合機構により結合され、例えば、バッファ又は他の好適な製剤（例えば、混合物）中で、酵母ビヒクルと抗原又は他のタンパク質とを穏やかに混合することなどによって互いに結合される。
本発明の一実施形態では、酵母ビヒクルと抗原又は他のタンパク質とを、樹状細胞又はマクロファージのような担体に共に細胞内ロードすることにより、本発明の治療組成物又はワクチンを形成する。あるいは、酵母ビヒクルの非存在下で、抗原又は他のタンパク質を樹状細胞にロードさせることができる。
一実施形態では、酵母細胞壁調製物、酵母膜粒子若しくは酵母断片（すなわち、インタ
クトではない）を製造するように、インタクトな酵母（異種抗原又は他のタンパク質の発現を含む、又は含まない）を粉砕するか、又は処理することができる。酵母断片は、いくつかの実施形態では、免疫応答を増強するための抗原（例えば、ＤＮＡワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、死滅若しくは不活性化病原体）を含む他の組成物と共に、提供若しくは投与されうる。例えば、酵素処理、化学処理又は物理的力（例えば、機械的せん断若しくは音波破砕）は、酵母を粉砕してアジュバントとして用いられる小片にするために用いられうる。
本発明の一実施形態では、本発明において有用な酵母ビヒクルには、死滅又は不活性化した酵母ビヒクルが含まれる。酵母の死滅又は不活性化は、当分野では公知の様々な好適な方法のどれを用いても達成することができる。例えば、酵母の熱不活性化は、酵母を不活性化する標準的方法であり、当業者は、必要に応じて、当分野では公知の標準的方法により、標的抗原の構造変化をモニターすることができる。あるいは、酵素を不活性化する別の方法、例えば、化学、電気、放射性若しくはＵＶ方法などを用いることもできる。例えば、「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、第１９４巻、コールド・スプリング・ハーバ出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）（１９９０年）のような標準的酵母培養テキストに開示されている方法を参照されたい。用いられる不活性化方法のいずれも、標的抗原の二次、三次、若しくは四次構造を考慮に入れて、その免疫原性を最適化するような構造を保存すべきである。
当業者に公知のいくつかの方法を用いて、酵母ビヒクルを本発明の酵母ベース免疫治療組成物又は製剤（例えば、対象に直接投与する製剤）に製剤化するか、又は樹状細胞のような担体に最初にロードすることができる。例えば、酵母ビヒクルを凍結乾燥により乾燥させることができる。酵母ビヒクルを含む製剤は、ベーキング又は醸造処理に用いられる酵母についてなされるように、ケーク若しくは錠剤に酵母を充填することによっても製造されることができる。さらに、酵母ビヒクルを薬学的に許容される賦形剤、例えば、宿主若しくは宿主細胞に許容される等張バッファなどと混合してもよい。このような賦形剤の例として、水、塩水、リンガー液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、デキストロース溶液、ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、及びその他の水性生理的平衡食塩水が挙げられる。また、不揮発性油、ゴマ油、オレイン酸エチル、若しくはトリグリセリドなどの非水性ビヒクルを用いてもよい。他の有用な製剤として、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、グリセロール若しくはデキストランなどの増粘剤を含有する懸濁液がある。賦形剤はまた、等張性及び化学的安定性を高める物質のような添加剤を少量含んでもよい。バッファの例として、リン酸バッファ、重炭酸バッファ及びトリス（Ｔｒｉｓ）バッファがあり、防腐剤の例としては、チメロサール、ｍ−又はｏ−クレゾール、ホルマリン及びベンジルアルコールが挙げられる。標準的製剤は、注射液、又は注射用の懸濁液若しくは溶液として好適な液体に溶解させることができる固体のいずれであってもよい。従って、非液体製剤の場合、賦形剤は、例えば、デキストロース、ヒト血清アルブミン、及び／又は防腐剤を含んでよく、投与前に、これらに滅菌水又は塩水を添加することができる。
本発明の一実施形態では、組成物は、別の物質（これらは、生体応答調節化合物とも呼ぶこともできる）、又はこのような物質／調節剤を生成する能力を含んでもよい。例えば、酵母ビヒクルを少なくとも１種の抗原及び少なくとも１種の物質／生体応答調節化合物でトランスフェクトするか、又はこれらを酵母ビヒクルにロードしても、本発明の組成物を少なくとも１種の物質／生体応答調節剤と一緒に投与してもよい。生体応答調節剤としては、免疫応答を調節することができるアジュバント及び他の化合物（免疫調節化合物と呼ばれる）、並びに酵母ベース免疫治療薬などの別の化合物若しくは物質の生物活性を改変する化合物（生物活性は、免疫系作用に限定されない）を挙げられる。防御免疫応答を刺激することができる免疫調節化合物もあれば、有害な免疫応答を抑制することができる
ものもあり、免疫調節剤が、所与の酵母ベース免疫治療薬と併用して有用であるか否かは、少なくとも部分的に、治療若しくは予防しようとする病態若しくは状態、及び／又は治療しようとする個体に左右されうる。特定の生体応答調節剤は、細胞性免疫応答を優先的に増強する一方、他のものは、液性免疫応答を優先的に増強する（すなわち、液性免疫に比べて、高いレベルの細胞性免疫が存在する免疫応答を刺激することができ、その逆も可能である）。特定の生体応答調節剤は、酵母ベース免疫治療薬の生物学的特性と共通する１つ又は複数の特性を有するか、又は酵母ベースの免疫治療薬の生物学的特性を増強又は補足する。免疫応答の刺激又は抑制を測定するために、並びに液性免疫応答から細胞性免疫応答を識別するために、さらには、あるタイプの細胞性免疫応答を別のタイプから識別する（例えば、ＴＨ１７応答とＴＨ１応答）ために、当業者に公知の多数の方法がある。
本発明で有用な物質／生体応答調節剤としては、限定するものではないが、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、脂質誘導体、ペプチド、タンパク質、多糖、小分子薬剤、抗体及びその抗原結合断片（限定するものではないが、抗サイトカイン抗体、抗サイトカイン受容体抗体、抗ケモカイン抗体）、ビタミン、ポリヌクレオチド、核酸結合部分、アプタマー、及び増殖調節剤などが挙げられる。いくつかの好適な物質として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：ＩＬ−１、ＩＬ−１のアゴニスト、若しくはＩＬ−１Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ−１若しくは他のＩＬ−１アンタゴニスト；ＩＬ−６、ＩＬ−６のアゴニスト、若しくはＩＬ−６Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ−６若しくは他のＩＬ−６アンタゴニスト；ＩＬ−１２、ＩＬ−１２のアゴニスト、若しくはＩＬ−１２Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ−１２若しくは他のＩＬ−１２アンタゴニスト；ＩＬ−１７、ＩＬ−１７のアゴニスト、若しくはＩＬ−１７Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ−１７若しくは他のＩＬ−１７アンタゴニスト；ＩＬ−２１、ＩＬ−２１のアゴニスト、若しくはＩＬ−２１Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ−２１若しくは他のＩＬ−２１アンタゴニスト；ＩＬ−２２、ＩＬ−２２のアゴニスト、若しくはＩＬ−２２Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ−２２若しくは他のＩＬ−２２アンタゴニスト；ＩＬ−２３、ＩＬ−２３のアゴニスト、若しくはＩＬ−２３Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ−２３若しくは他のＩＬ−２３アンタゴニスト；ＩＬ−２５、ＩＬ−２５のアゴニスト、若しくはＩＬ−２５Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ−２５若しくは他のＩＬ−２５アンタゴニスト；ＩＬ−２７、ＩＬ−２７のアゴニスト、若しくはＩＬ−２７Ｒのアゴニスト、抗ＩＬ−２７若しくは他のＩＬ−２７アンタゴニスト；Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−αなど）又はＩ型インターフェロンのアゴニスト若しくはアンタゴニスト又はその受容体；ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−γ）又はＩＩ型インターフェロンのアゴニスト若しくはアンタゴニスト又はその受容体；抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、抗原Ｔ細胞を放出する目的で）；Ｔ細胞共刺激因子（例えば、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４０）；アレムツマブ（例えば、ＣａｍＰａｔｈ（登録商標））、デニロイキン・ディフティトックス（例えば、ＯＮＴＡＫ（登録商標））；抗ＣＤ４；抗ＣＤ２５；抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤ−Ｌ２；ＦＯＸＰ３をブロックする物質（例えば、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ調節細胞の活性を無効にする／これらを死滅させる目的で）；Ｆｌｔ３リガンド、イミキモド（アルダラ（Ａｌｄａｒａ）（商標））、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、サルグラモスチム（ロイキン（Ｌｅｕｋｉｎｅ）（登録商標））；限定するものではないが、プロラクチン及び成長ホルモンなどのホルモン；Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、例えば、限定するものではないが、ＴＬＲ−２アゴニスト、ＴＬＲ−４アゴニスト、ＴＬＲ−７アゴニスト、及びＴＬＲ−９アゴニスト；ＴＬＲアンタゴニスト、例えば、限定するものではないが、ＴＬＲ−２アンタゴニスト、ＴＬＲ−４アンタゴニスト、ＴＬＲ−７アンタゴニスト、及びＴＬＲ−９アンタゴニスト；抗炎症剤及び免疫調節剤、例えば、限定するものではないが、ＣＯＸ−２阻害剤（例：セレコキシブ、ＮＳＡＩＤＳ）、グルココルチコイド、スタチン、並びにタリドミド及びその類似体、例えば、ＩＭｉＤ（商標）（これらは、タリドミド（例：ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）（レナリドミド）、ＡＣＴＩＭＩＤ（登録商標）（ポマリドミド）の構造的かつ機能的類似体である
）；真菌若しくは細菌成分などの炎症誘発性物質、又は任意の炎症誘発性サイトカイン若しくはケモカイン；免疫治療ワクチン、例えば、限定するものではないが、ウイルスベースのワクチン、細菌ベースのワクチン、又は抗体ベースのワクチン；並びにその他いずれかの免疫調節剤、免疫増強剤、抗炎症剤、及び／又は炎症誘発性物質。このような物質の任意の組合せが本発明によって考慮され、酵母ベースの免疫治療薬と併用される上記物質、又は酵母ベースの免疫治療薬を含む（例えば、これと同時に、逐次、若しくはその他のフォーマットで）プロトコルで投与される上記物質のいずれも、本発明に包含される組成物である。このような物質は当分野では公知である。これらの物質は、単独で用いても、本明細書に記載の他の物質と併用してもよい。
薬剤は、所与のタンパク質若しくはペプチド又はそのドメインのアゴニスト及びアンタゴニストを含んでよい。本明細書で用いる場合、「アゴニスト」は、受容体又はリガンドに結合して、応答を発生若しくはトリガーする、任意の化合物若しくは物質であり、例えば、限定するものではないが、小分子、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸結合物質などが挙げられ、受容体又はリガンドに結合する天然に存在する物質の作用を模倣する物質を含みうる。「アンタゴニスト」は、アゴニストの作用をブロック又は阻害又は抑制する、任意の化合物若しくは物質であり、限定するものではないが、小分子、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸結合物質などが挙げられる。
本発明の組成物は、ＨＤＶ感染を予防若しくは治療するのに有用ないずれか他の化合物若しくは組成物、又はＨＤＶ感染の任意の症状を治療若しくは軽減する任意の化合物をさらに含んでも、これらと一緒に（同時に、逐次、若しくは断続的に）投与されてもよい。このような薬剤として、限定するものではないが、ＨＤＡｇに対する小分子薬物、又はインターフェロンα２ａ若しくはペギル化インターフェロンα２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））などのインターフェロンがある。さらに、本発明の組成物は、予防的及び／又は治療的免疫治療薬などの他の免疫治療組成物と一緒に用いられることができる。ＨＤＶの治療に関して、米国で承認されている免疫療法組成物はないが、このような組成物としては、ＨＤＶタンパク質若しくはエピトープサブユニットワクチン、ＨＤＶウイルスベクターワクチン、サイトカイン、及び／又は他の免疫調節剤（例えば、ＴＬＲアゴニスト、免疫調節薬）を挙げることができる。
本発明はまた、本明細書に記載する組成物のいずれか、又は本明細書に記載する組成物の個々の成分のいずれかを含むキットも含む。
本発明の組成物の投与又は使用方法
本発明の組成物は、本明細書に記載のいずれか１種又は複数種の（例えば、２種、３種、４種、５種又はそれを超える種の組合せ）酵母ベースの免疫治療組成物、及び、ＨＤＶタンパク質及び融合タンパク質を含むＨＤＶ抗原、及び、前述したこのようなＨＤＶタンパク質若しくは融合タンパク質をコードする組換え核酸分子、の少なくとも一つと、上記酵母ベースの組成物、抗原、タンパク質、融合タンパク質、又は本明細書に記載の組換え分子を含む他の組成物と、を含むことができ、様々なｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏ方法で用いられることができる。こうした方法としては、限定するものではないが、ＨＤＶの診断アッセイにおいて、ＨＤＶ感染及びその続発症を治療及び／又は予防すること、あるいは、ＨＤＶに対する抗体を生産することを目的とするものがある。
ＨＤＶ感染は、最も典型的には、ＨＤＶ ＲＮＡの測定、ＨＤＶ抗原（ＨＤＡｇ）の検出、及び／又は抗ＨＤＶ（ＨＤＶに対する抗体）の検出によって検出される。ＨＤＶ ＲＮＡの検出は、例えば、ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含んでもよい）又は逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって実施することができる。ＲＴ−ＰＣＲは、これらアッセイの中で最も感度が高く、１０ゲノム／ｍｌを検出する。血清ＨＤＡｇ又は抗ＨＤＶ ＩｇＭ若しくは
ＩｇＧは、典型的に、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ ａｓｓａｙ）又は放射線免疫検定法（ＲＩＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）によって検出されるが、ＨＤＡｇはまた、肝生検の免疫蛍光若しくは免疫組織化学染色によっても検出されることができる。ＨＢＶ感染は、ＨＤＶ感染に不可欠であるため、通常、ＨＤＶが検出される前に、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）が存在する。
急性ＨＤＶ共感染（ＨＤＶ／ＨＢＶ）は、高力価のＩｇＭ抗ＨＢｃ（ＨＢＶコア抗原に対する抗体）を特徴とするが、これらは、慢性ＨＢＶ感染で消失する抗体である。ＨＤＡｇはまた、急性ＨＤＶ感染の早期マーカ（共感染及び重感染のいずれの場合も）でもある。抗ＨＤ抗体は、後期マーカであるが、早期マーカがもはや存在しない場合には、診断を確立するのに用いることができ、慢性感染への進行の指標である。慢性ＨＤＶ感染では、ＨＤＡｇが、高力価の抗ＨＤと複合体化する。この段階では、肝臓内でＨＤＡｇを検出するのは難しいが、ＨＤＶ ＲＮＡは、典型的に、血清中に検出することができ、高力価の抗ＨＤは、慢性ＨＤＶ感染を診断するのに用いられる主要バイオマーカである。
血清中のＨＤＶ ＲＮＡ及び肝臓中のＨＤＡｇ両方が、持続的に検出限界以下であるとき、ＨＤＶが排除されたと考えられる（パスカレラ（Ｐａｓｃａｒｅｌｌａ）ら著、前掲）が、ＨＢｓＡｇ（ＨＢＶ表面抗原）のクリアランスを伴う、又はこれが続いて起こる場合にのみ、治癒が決定的であると考えられる。抗ＨＤ抗体が発生すると、ＨＤＶの再感染からの防御が行われると考えられ、ウイルスのクリアランスは、典型的に、ＡＬＴレベルの正常化、肝壊死性炎症の軽減、及び肝線維症進行の停止を特徴とする。
本発明の本実施形態は、個体又は個体の集団における、慢性Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｄ ｖｉｒｕｓ）感染を治療する、及び／又は慢性ＨＤＶ感染の少なくとも１つの症状を予防、軽減若しくは治療するための方法に関する。本発明は、ＨＤＶに慢性感染している個体若しくは個体の集団に、本発明の１種又は複数種の免疫治療組成物を投与するステップを含む。一態様では、本組成物は、本明細書に記載する１種又は複数種のＨＤＶ抗原を含む免疫治療組成物であり、これは、１種又は複数種の酵母ベースの免疫治療組成物を含んでよい。一態様では、本組成物は、本明細書に記載するＨＤＶ抗原を含有するタンパク質若しくは融合タンパク質、及び／又はこのようなタンパク質若しくは融合タンパク質をコードする組換え核酸分子を含む。一態様では、個体若しくは個体の集団は、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α）などのＨＤＶ感染の治療に有用な少なくとも１種の他の治療化合物で、さらに治療される。
本発明の本実施形態では、慢性ＨＤＶ感染を有した治療される対象は、従って、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ： ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）にも感染しうる。従って、ＨＢＶ感染について対象を同時に若しくは逐次（前又は後に）治療することは、本発明の方法のさらに別の態様である。様々な薬剤が、ＨＢＶ感染を予防及び／若しくは治療又は改善するのに有用であることがわかっている。このような薬剤として、限定するものではないが、抗ウイルス化合物があり、例えば、限定しないが、ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤（ｎＲＴＩ）が挙げられる。本発明の一態様では、好適な抗ウイルス化合物として、限定するものではないが、以下のものがある：テノフォビル（ＶＩＲＥＡＤ（登録商標））、ラミブジン（ＥＰＩＶＩＲ（登録商標））、アデフォビル（ＨＥＰＳＥＲＡ（登録商標））、テルビブジン（ＴＹＺＥＫＡ（登録商標））、エンテカビル（ＢＡＲＡＣＬＵＤＥ（登録商標））、並びにこれらの組合せ、及び／又はインターフェロン、例えば、インターフェロン−α２ａ若しくはペギル化インターフェロン−α２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））若しくはインターフェロン−λ。ＨＢＶの治療の場合、これらの薬剤は、典型的に、長期間にわたって投与される（例えば、１〜５年又はそれを超える期間にわたり毎日若しくは毎週）。
さらに、ＨＤＶを治療するための本発明の組成物と一緒に、ＨＢＶ治療のための他の組成物、例えば、ＨＢＶのための様々な予防及び／又は治療組成物を併用してもよい。ＨＢＶの予防ワクチンは、１９８０年代初期から市販されており、これは非感染性のサブユニットウイルスワクチンであり、精製組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を提供するもので、生後から投与することができる。現在のところ、承認されているＨＢＶの治療ワクチンはない。
本発明の別の実施形態は、個体若しくは個体の集団において、ＨＤＶ感染を予防する、慢性ＨＤＶ感染を予防する、及び／又はＨＤＶ感染の重症度を軽減する目的で、個体若しくは個体の集団をＨＤＶに対して免疫する方法に関する。本方法は、ＨＤＶに感染していない（又はＨＤＶに感染していないと思われる）個体若しくは個体の集団に、本発明の組成物を投与するステップを含む。一態様では、組成物は、本明細書に記載するように、１種又は複数種のＨＤＶ抗原を含有する免疫治療組成物であり、これは、１種又は複数種の酵母ベースの免疫治療組成物を含む。一態様では、本組成物は、本明細書に記載するように、ＨＤＶ抗原を含有する融合タンパク質、又はこのような融合タンパク質をコードする組換え核酸分子を含む。
本発明のこの実施形態の一態様では、本発明の組成物を用いて、ＨＤＶ感染に対して免疫される対象若しくは集団は、すでにＨＢＶに慢性感染している。本発明のこの態様では、すでにＨＢＶに慢性感染している対象は、新たに診断されてもよく、診断されたが、ＨＢＶの診断から経過した時間とは関係なく、その時点でＨＢＶ感染の治療を受けていなくてもよく、あるいは、目下、慢性ＨＢＶ感染の治療中であってもよく、長期（例えば、数年）にわたってＨＢＶ感染の治療を受けてきた対象を含んでもよい。このような対象は、以前ＨＢＶについて治療を受けたことがあり、現時点でＨＢＶ感染が治癒したと思われる対象を含んでもよい。本発明のＨＤＶ免疫治療組成物は、ＨＢＶ感染状態とは関係なく（例えば、これらの個体は、ＨＢＶ陰性であっても、又は個体のＨＢＶ状態が未知であっても免疫されうる）、例えば、ＨＤＶが風土病であるか又は非常に流行している世界の地域である場所に起因して、ＨＢＶ及びＨＤＶに感染する危険性がより高い可能性のある個体若しくは個体の集団を免疫するために用いられうる。一般の集団と比較して、ＨＢＶ感染への暴露の危険性が高い（例えば、場所、職業、及び／又はＨＢＶ伝播に関連する高リスクの常習行為）個体又は個体の集団も、特に、これらの個体が、ＨＤＶが風土病であるか、又は流行している地域に位置している場合には、ＨＤＶに対して（同時に）免疫されてもよい。
本明細書で用いる場合、ＨＤＶ感染を「治療する」、又はその任意の変化形（例えば、「ＨＤＶ感染について治療した」など）という表現は、一般に、以下のことを目標として、感染（急性若しくは慢性）が起こった場合に、本発明の組成物を適用又は投与することを指す。目標とは、検出可能なウイルス力価の低減若しくは排除（例えば、ウイルスＲＮＡの減少）、個体において感染によって起こる少なくとも１つの症状の軽減、感染が引き起こす発症及び／又は症状の重症度及び／又は下流続発症の遅延若しくは予防、感染による臓器若しくは生理系損傷（例えば、硬変）の軽減（例えば、異常ＡＬＴレベルの低下、肝炎症の軽減、肝線維症の軽減）、肝細胞癌（ＨＣＣ：ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の予防及び／又はその頻度及び出現率の低減、感染によって悪影響を被った臓器若しくは全身機能の改善（血清ＡＬＴレベルの正常化、肝炎症の改善、肝線維症の改善）、感染に対する免疫応答の改善、感染に対する長期記憶免疫応答の改善、ＨＤＶウイルスの再活性化の低下、個体若しくは個体の集団の健康状態の改善、及び／又は、個体若しくは個体の集団の全体的生存の改善である。このようなパラメータはすべて、本発明のＨＤＶ免疫治療組成物の使用の非存在下での個体若しくは個体の集団の状態と比較したものである。
一態様では、治療の目標は、治療の終了から少なくとも６ヵ月にわたる持続的なウイルスのクリアランスである。一態様では、治療の目標は、血清中の検出可能なＨＤＶ ＲＮＡの消失及び肝臓中のＨＤＡｇの消失と、これに続くＨＢｓＡｇ（ＨＢＶ表面抗原）のクリアランスであり、後者は、対応するＨＢＶ感染が、本明細書に記載するＨＤＶ治療と、同時に又は逐次治療される場合に達成されうる。治療は、例えば、ＨＢＶ用の抗ウイルス薬、あるいは、他のＨＢＶ治療薬、例えば、限定するものではないが、インターフェロン、ＨＢＶ免疫治療薬、又はその他のＨＢＶの治療薬の同時若しくは逐次投与による。一態様では、治療の目標は、ＨＤＡｇ（抗ＨＤ）に対する抗体の発生（セロコンバージョン）である。セロコンバージョンは、放射性免疫検定法、酵素免疫検定法によって決定されてよい。ＨＤＶ感染の治療成功の別の結果として、ＡＬＴレベルの正常化、肝壊死性炎症の軽減、及び肝線維症進行の停止が挙げられる。
ＨＤＶ感染を「予防する」、又はその任意の変化形（例えば、「ＨＤＶ感染の予防」など）は、一般に、以下のことを目標として、ＨＤＶ感染が起こる前に、本発明の組成物を適用又は投与することを指す。目標とは、万一後に感染が起こる場合、個体若しくは個体の集団において、ＨＤＶによる感染を予防すること、ＨＤＶによる慢性感染を予防すること（すなわち、それ以上の介入なしに、個体が急性ＨＤＶ感染を排除することを可能にする）、又は少なくとも、慢性感染が引き起こす感染及び生理的損傷の少なくとも一方の重症度及び／又は期間を低減することであり、生存を改善することを含む。一態様では、本発明を用いて、例えば、本発明の組成物の投与後にＨＤＶに急性感染した個体が、感染を排除することができ、また、慢性感染にならないようにすることによって、慢性ＨＤＶ感染を予防することができる。一態様では、ＨＢＶ感染自体が治癒していなくても、ＨＢＶに慢性感染した個体におけるＨＤＶ感染を予防するか、又はその出現率若しくは重症度を低減するために、本発明を用いる。
本発明は、本発明の１種又は複数種の免疫治療組成物（酵母ベースのＨＤＶ免疫療法組成物など）の対象への送達（投与、免疫）を含む。投与プロセスは、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで実施することができるが、典型的には、ｉｎ ｖｉｖｏで実施する。ｅｘ ｖｉｖｏ投与とは、調節ステップの一部を患者の外部で行うことを指し、例えば、酵母ビヒクル、抗原及び任意の他の物質若しくは組成物が細胞にロードされるような条件下で、患者から採取した細胞（樹状細胞）の集団に本発明の組成物を投与した後、これらの細胞を患者に戻すことを意味する。本発明の治療組成物は、任意の好適な投与方法によって、患者に戻す、又は投与することができる。
組成物の投与は、全身、粘膜及び／又は標的部位の位置の近位（例えば、感染部位付近）に行うことができる。投与の好適な経路は、当業者には明らかであり、予防若しくは治療しようとする病態のタイプ、用いる抗原、及び／又は標的細胞集団若しくは組織に応じて異なる。許容される多様な投与方法として、限定するものではないが、静脈内投与、腹腔内投与、筋内投与、結節内投与、冠内投与、動脈内投与（例えば、頚動脈内）、皮下投与、経皮送達、気管内投与、関節内投与、脳室内投与、吸入（例えば、エアロゾル）、頭蓋内、脊髄内、眼内、耳、鼻内、経口、肺投与、カテーテルの含浸、並びに組織への直接注射が挙げられる。一態様では、投与経路には、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、結節内、筋内、経皮、吸入、鼻内、経口、眼内、関節内、頭蓋内及び脊髄内がある。非経口的送達としては、皮内、筋内、腹腔内、胸膜内、肺内、静脈内、皮下、動脈カテーテル及び静脈カテーテル経路を挙げることができる。耳送達としては、点耳薬があり、鼻内送達としては、点鼻薬若しくは鼻内注射があり、また眼内送達としては、点眼薬が挙げられる。エアロゾル（吸入）送達は、当分野では標準的な方法（例えば、ストリブリング（Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１８９巻、１１２７７〜１１２８１、１９９２年を参照）を用いて実施するこ
とができる。粘膜免疫を調節する他の投与経路が、ウイルス感染の治療に有用となりうる。このような経路としては、気管支、皮内、筋内、鼻内、他の吸入、直腸、皮下、局所、経皮、膣及び尿道経路が挙げられる。一態様では、本発明の免疫治療組成物を皮下投与する。
本発明の酵母ベースの免疫療法組成物に関して、一般に、好適な単一用量は、好適な期間にわたって１回又は複数回投与すると、１種又は複数種のＨＤＶ抗原若しくはエピトープに対する抗原特異的免疫応答を誘発するのに有効な量で、患者身体の所与の細胞型、組織、若しくは領域に、酵母ビヒクル及び抗原（含有されている場合）を有効にもたらすことができる用量である。例えば、一実施形態では、本発明の酵母ビヒクルの単一用量は、組成物が投与される生物の体重１ｋｇ当たり約１×１０５〜約５×１０７酵母細胞当量である。一態様では、本発明の酵母ビヒクルの単一用量は、用量当たり（すなわち１生物につき）、約０．１Ｙ．Ｕ．（１×１０６細胞）〜約１００Ｙ．Ｕ．（１×１０９細胞）であり、０．１×１０６細胞の増分（すなわち、１．１×１０６、１．２×１０６、１．３×１０６・・・）毎に、上記範囲内の用量を含む。一実施形態では、用量は、１Ｙ．Ｕ．〜４０Ｙ．Ｕ．の用量、１Ｙ．Ｕ．〜５０Ｙ．Ｕ．の用量、１Ｙ．Ｕ．〜６０Ｙ．Ｕ．の用量、１Ｙ．Ｕ．〜７０Ｙ．Ｕ．の用量、又は１Ｙ．Ｕ．〜８０Ｙ．Ｕ．の用量を含み、一態様では、１０Ｙ．Ｕ．〜４０Ｙ．Ｕ．、５０Ｙ．Ｕ．、６０Ｙ．Ｕ．、７０Ｙ．Ｕ．、又は８０Ｙ．Ｕ．の用量を含む。一実施形態では、個体の様々な部位に用量を投与するが、同じ投薬期間中に行う。例えば、１つの投薬期間中、個体の４つの異なる部位に１０Ｙ．Ｕ．の用量を注射することにより、４０Ｙ．Ｕ．の用量を投与してもよく、同じ投与期間中に、個体の４つの異なる部位に５Ｙ．Ｕ．の用量を注射することにより、又は個体の２つの異なる部位に１０Ｙ．Ｕ．の用量を注射することにより、２０Ｙ．Ｕ．の用量を投与してもよい。本発明は、個体の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なる部位に、単一用量を形成する量（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０Ｙ．Ｕ．以上）の酵母ベースの免疫療法組成物を投与することを含む。
治療組成物の「ブースター」又は「ブースト」は、例えば、抗原に対する免疫応答が衰えたとき、又は特定の１以上の抗原に対する免疫応答の提供や記憶応答の誘導のための必要に応じて、投与される。ブースターは、初回投与から、約１、２、３、４、５、６、７、若しくは８週間から、又は毎月、２ヵ月毎、４ヵ月毎、毎年、数年までの間隔で投与されうる。一実施形態では、投与スケジュールは、数週間から、数ヵ月、数年の期間にわたり、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回又はそれを上回る回数、生物の体重１ｋｇ当たり約１×１０５〜約５×１０７酵母細胞当量の組成物を投与するものである。一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを上回る用量を毎週投与した後、所望するＨＤＶウイルスの阻害若しくは排除を達成する必要に応じて、毎月投与する。例えば、個体が、セロコンバージョンを達成するまで、ＨＤＶ ＲＮＡ力価が持続的に検出限界以下となるまで、ＨＤＡｇが肝臓中に検出されなくなるまで、ＨＢＶ ＨＢｓＡｇが検出されなくなるまで、及び／又はＡＬＴレベルが正常化するまで、上記の用量を投与することができる。一実施形態では、上記の用量を４週間毎のプロトコルで（臨床医が決定するように、２〜１０用量以上を、４週間毎、すなわち第１日、第４週、第８週、第１２週等に）投与する。個体がセロコンバージョンを達成した後であっても、必要に応じて、追加用量を投与することもできるが、そのような投与は必ずしも必要ではない。
本発明のＨＤＶ免疫治療組成物（酵母ベースのＨＤＶ免疫治療組成物など）は、１種又は複数種の別の治療若しくは予防薬と一緒に投与されることができる。このような治療若しくは予防薬は、ＨＤＶの予防及び／又は治療に有用な薬剤を含んでよく、また、ＨＢＶの予防及び／又は治療に有用な薬剤をさらに含んでもよい。本発明の一態様では、１種又
は複数種の別の治療若しくは予防薬が、酵母ベースの免疫治療組成物と一緒に逐次投与される。別の実施形態では、１種又は複数種の別の治療若しくは予防薬は、酵母ベースの免疫治療組成物の投与前に投与される。別の実施形態では、１種又は複数種の追加の治療若しくは予防薬は、酵母ベースのＨＤＶ免疫治療組成物の投与後に投与される。一実施形態では、１種又は複数種の別の治療若しくは予防薬は、酵母ベースの免疫療法組成物と交互に、あるいは、別の薬剤の１用量以上の連続投与の間に規定の間隔で、若しくはそれと一緒に、又はその逆に、酵母ベースのＨＤＶ組成物を投与するプロトコルで、投与される。一実施形態では、酵母ベースのＨＤＶ免疫療法組成物は、別の薬剤の投与の開始前に、所定の期間にわたって１又は複数の用量で投与される。言い換えれば、酵母ベースのＨＤＶ免疫治療組成物が、所定の期間にわたり単剤療法として投与された後、治療若しくは予防薬投与が、新たな用量の酵母ベースのＨＤＶ免疫治療薬と一緒に投与されるか、又は酵母ベースの免疫治療薬と交互に投与されるかのいずれで追加される。あるいは、酵母ベースの免疫療法組成物の投与開始前に、上記の薬剤が所定の期間にわたって投与されてもよい。
本発明の一実施形態では、本発明の酵母ベースのＨＤＶ免疫治療組成物と一緒に用いようとする追加の治療薬は、インターフェロンである。一態様では、インターフェロンは、インターフェロン−αであり、一態様では、インターフェロン−α２ｂ（毎週３回の皮下注射により投与）；又はペギル化インターフェロン−α２ｂ（例えば、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））である。本明細書で用いる場合、「インターフェロン」という用語は、典型的に、免疫系の細胞によって、また、二本鎖ＲＮＡの存在に応答して非常に多様な細胞によって産生されるサイトカインを指す。インターフェロンは、宿主細胞内のウイルス複製を阻害し、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージを活性化し、リンパ球に対する抗原提示を増加して、ウイルス感染に対する宿主細胞の抵抗を誘導することにより、免疫応答を促進する。Ｉ型インターフェロンとしては、インターフェロン−αがある。ＩＩＩ型インターフェロンとしては、インターフェロン−λがある。本発明の方法に有用なインターフェロンとして、任意のＩ型又はＩＩＩ型インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−α２があり、一態様では、持続型のインターフェロン、例えば、限定するものではないが、ペギル化インターフェロン、インターフェロン融合タンパク質（アルブミンと融合したインターフェロン）、及びインターフェロンを含有する制御放出製剤（例えば、ミクロスフィア中のインターフェロン又はポリアミノ酸ナノ粒子を含むインターフェロン）がある。インターフェロンの１種である、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）、すなわちペギル化インターフェロン−α２ａは、単一の分枝状ビス−モノメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）鎖（近似ＭＷ４０，０００ダルトン）と、組換えインターフェロン−α２ａ（近似分子量［ＭＷ］２０，０００ダルトン）との共有結合コンジュゲートである。ＰＥＧ部分は、リシンとの安定したアミド結合を介してインターフェロン−α部分に単一部位で結合される。ペギル化インターフェロン−α２ａは、近似分子量６０，０００ダルトンを有する。
ＨＤＶの治療の場合、インターフェロンを典型的には、筋内若しくは皮下注射によって投与し、通常、高い用量で長期間にわたり投与する。一実施形態では、標準的ＩＦＮ−αは、毎週３回約９百万単位で、又は毎日５百万単位で１２ヵ月間投与され、この期間は、ＨＢｓＡｇが排除されなければ、延長されてもよい。ペギル化ＩＦＮ−αは、毎週３百万〜１千万単位の用量で投与されることができ、一実施形態では、３百万単位が好ましく、他の実施形態では、より高い用量（例えば、４百万単位、５百万単位、６百万単位、７百万単位、８百万単位、９百万単位、若しくは１千万単位が好ましい。一般に、インターフェロンの用量は、規則的スケジュールで投与されることができ、週に１、２、３、４、５、若しくは６回から、毎週、隔週、３週間置き、若しくは毎月まで変わりうるが、これは、投与されるインターフェロンの種類、患者の耐容性、及び感染の分利に応じて異なる。現在入手可能なインターフェロンの典型的用量は、毎週投与される（ペギル化インターフ
ェロン−α）が、これは、本発明によれば、インターフェロンの好ましい投与スケジュールである。
本発明の一態様では、インターフェロン療法の治療コースの開始時に、本発明の免疫治療組成物の追加用量が、同じ期間にわたって、又は少なくともその期間の一部にわたって、投与されるが、インターフェロンの治療コースが終了した後、投与され続けてもよい。しかし、全期間にわたる免疫療法の投与スケジュールは、インターフェロンのスケジュールとは異なっていてもよく、一般的には異なることが予想される。例えば、免疫治療組成物は、インターフェロンの最後（最近）の投与と同じ日、又は少なくとも３〜４日後（若しくは最後の投与から任意の好適な日数の経過後）に投与されても、毎日、毎週、隔週、毎月、隔月、若しくは３〜６ヵ月毎、又は医師の決定に従い、より長い間隔で、投与されてもよい。単剤療法、すなわち、使用されている場合、免疫治療組成物の投与の初期において、免疫治療組成物は、好ましくは４〜１２週間毎週投与された後、毎月投与する（さらにインターフェロンをプロトコルに追加する場合にかかわらず）。一態様では、免疫治療組成物は、４〜５週間毎週投与された後、完全な治療プロトコルの終了まで、毎月投与される。本発明の一態様では、本発明のＨＤＶの免疫治療組成物の使用は、インターフェロンを含まないプロトコルで（すなわち、単剤療法として、又はインターフェロンではない１種又は複数種の薬剤と併用して）用いられる。
本発明の一態様では、本発明の酵母ベースのＨＤＶ免疫治療組成物と一緒に投与しようとする別の治療薬は、対象に共存するＨＢＶ感染の治療に有効な抗ウイルス化合物である。本明細書で用いる場合、「抗ウイルス薬」という用語は、化合物若しくは薬物、典型的には、小分子阻害剤若しくは抗体を指し、これは、直接抗ウイルス治療効果によって、ウイルス生活環の１つ又は複数のステップをターゲティングする。好適なウイルス化合物として、限定するものではないが、テノフォビル（ＶＩＲＥＡＤ（登録商標））、ラミブジン（ＥＰＩＶＩＲ（登録商標））、アデフォビル（ＨＥＰＳＥＲＡ（登録商標））、テルビブジン（ＴＹＺＥＫＡ（登録商標））、エンテカビル（ＢＡＲＡＣＬＵＤＥ（登録商標））、及びこれらの組合せが挙げられる。
テノフォビル（テノフォビルジソプロキシルフマル酸塩若しくはＴＤＦ）、又は（｛［（２Ｒ）−１−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−２−イル］オキシ｝メチル）リン酸は、ヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤（ｎＲＴＩ）である。ＨＢＶ感染の治療の場合、テノフォビルは、一般に、１日１回３００ｍｇ（テノフォビルジソプロキシルフマル酸塩）の用量で摂取される丸薬として成人に投与する。小児患者への投与は、患者の体重に基づき（体重１ｋｇ当たり８ｍｇ、１日１回３００ｍｇまで）、錠剤若しくは経口用粉末として提供してよい。
ラミブジン、若しくは２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（一般に３ＴＣと呼ばれる）は、強力なヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤（ｎＲＴＩ）である。ＨＢＶ感染の治療の場合、ラミブジンは、１日１回１００ｍｇの用量で摂取される丸薬若しくは経口用溶液として投与する（生後３ヵ月〜１２歳の小児には、１日２回１．４〜２ｍｇ／ｌｂ．）。
アデフォビル（アデフォビルジピボキシル）、若しくは９−［２−［［ビス（ピバロイルオキシ）メトキシ］−ホスフィニル］−メトキシ］エチル］アデニンは、経口投与されるヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤（ｎｔＲＴＩ）である。ＨＢＶ感染の治療の場合、アデフォビルは、１日１回１０ｍｇの用量で摂取される丸薬として投与する。
テルビブジン、若しくは１−（２−デオキシ−β−Ｌ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンは、合成チミジンヌクレオシド
類似体（チミジンのＬ異性体）である。ＨＢＶ感染の治療の場合、テルビブジンは、１日１回６００ｍｇの用量で摂取される丸薬若しくは経口用溶液として投与する。
エンテカビル、若しくは２−アミノ−９−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−４−ヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）−２−メチリデンシクロペンチル］−６，９−ジヒドロ−３Ｈ−プリン−６−オンは、ウイルスの逆転写、ＤＮＡ複製及び転写を阻害するヌクレオシド類似体（グアニン類似体）である。ＨＢＶ感染の治療の場合、エンテカビルは、１日１回０．５ｍｇの用量で摂取される丸薬若しくは経口用溶液として投与する（ラミブジン不応性若しくはテルビブジン耐性突然変異の場合には、１日１ｍｇ）。
本発明の形態では、免疫治療組成物と他の薬剤を一緒に（同時に）投与することができる。本明細書で用いる場合、同時使用は、必ずしも、全ての化合物の全ての用量を同じ日に同時に投与することを意味するわけではない。むしろ、同時使用は、治療構成要素（例えば、免疫療法及びインターフェロン療法）の各々をほぼ同時期に（数時間以内、互いに１〜７日まで、又はそれより長い（数週間若しくは数ヵ月）間隔を置くが、同じプロトコルの一環として投与する）開始し、ほぼ同じ期間にわたって投与することを意味するが、各要素が、異なる投与スケジュール（例えば、インターフェロンを毎週、免疫療法を毎月）であってもよいことに留意されたい。さらに、同時投与期間の前若しくは後に、薬剤又は免疫治療組成物のいずれか一方を、他方の薬剤なしで投与することができる。
本発明では、ＩＦＮ−αのようなインターフェロンと一緒に本発明の免疫治療組成物を使用すると、インターフェロン使用の時間単位を短くすることが可能になるか、あるいは、インターフェロンの排除を可能にする場合もある。また、薬物に対する患者の耐容性を全般に改善するような本発明の免疫治療薬との併用の結果、インターフェロンの投薬要件も軽減、若しくは変更されうる。さらに、本発明の免疫治療組成物は、インターフェロン療法単独で、これらのエンドポイントの達成に失敗した患者のセロコンバージョン又は持続的ウイルス応答を可能にすると考えられる。言い換えれば、インターフェロンを単独で用いることによってウイルス陰性又はセロコンバージョンを達成するのと比較して、本発明の免疫治療組成物をインターフェロンと併用する場合に、より多くの患者が、ウイルス陰性又はセロコンバージョンを達成する。
本発明の方法において、組成物及び治療組成物は、任意の脊椎動物を含む動物、特に、脊椎動物種、哺乳動物の任意のメンバー（限定するものではないが、霊長類、げっ歯類、家畜及び家庭用ペットなど）に投与することができる。家畜には、消費用の哺乳動物又は有用な製品を生産する哺乳動物（例えば、羊毛生産のためのヒツジ）が含まれる。治療又は保護する哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、畜牛、ウマ及びブタが挙げられる。
「個体」は、哺乳動物などの脊椎動物であり、限定するものではないが、ヒトが挙げられる。哺乳動物としては、限定するものではないが、酪農動物、スポーツ用動物、ペット、霊長類、マウス及びラットが挙げられる。用語「個体」は、用語「動物」、「対象」又は「患者」と置換え可能に用いることができる。
本発明に有用な一般的方法
本発明の実施には、別途記載のない限り、当業者には公知の分子生物学（組換え技術など）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の従来の技術を使用する。こうした技術は、例えば、以下に挙げるような文献に詳細に説明されている：「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、第１９４巻、グスリー（Ｇｕｔｈｒｉｅ）ら編、コールド・スプリング・ハーバ研究所プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９９０年；「酵母の生物学
及び活性（Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｙｅａｓｔｓ）」、スキナー（Ｓｋｉｎｎｅｒ）ら編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８０年；「酵母遺伝学の方法：実験手順マニュアル（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｃｏｕｒｓｅ ｍａｎｕａｌ）」、ローズ（Ｒｏｓｅ）ら著、コールド・スプリング・ハーバ研究所プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９９０年；「酵母サッカロミセス：細胞周期と細胞生物学（Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、プリングル（Ｐｒｉｎｇｌｅ）ら編、コールド・スプリング・ハーバ研究所プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９９７年；「酵母サッカロミセス：遺伝子発現（Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら編、コールド・スプリング・ハーバ研究所プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９９３年；「酵母サッカロミセス：ゲノムダイナミクス、タンパク質合成、及びエネルギー論（Ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ Ｅｎｅｒｇｉｔｉｃｓ）」、ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）ら編、コールド・スプリング・ハーバ研究所プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９９２年；「分子クローン化：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、１９８９年）及び「分子クローン化：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第３版（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）著、２００１年）、（本明細書では、これらを合わせて「サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）」として示す）；「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｆ．Ｍ．オースベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、１９８７年、２００１年までの増補版を含む）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」（ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら著、１９９４年）；ハーロ（Ｈａｒｌｏｗ）及びレーン（Ｌａｎｅ）、１９８８年、「抗体、実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバ出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ニューヨーク；ハーロ（Ｈａｒｌｏｗ）及びレーン（Ｌａｎｅ）著、１９９９年、「抗体の使用：実験マニュアル（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバ研究所プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（本明細書では、これらを合わせて「ハーロ（Ｈａｒｌｏｗ）及びレーン（Ｌａｎｅ）」として示す）、ボーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）ら編、「核酸化学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、ジョン・ウィリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、２０００年）；カサレット（Ｃａｓａｒｅｔｔ）及びドウル（Ｄｏｕｌｌ）の「毒物学、毒物の基礎化学（Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｏｉｓｏｎｓ）」、Ｃ．クラーセン（Ｋｌａａｓｓｅｎ）編、第６版、２００１年、並びに「ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」、Ｓ．プロトキン（Ｓ．Ｐｌｏｔｋｉｎ）及びＷ．オレンステイン（Ｗ．Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ）編、第３版（１９９９年）。
一般的定義
「タルモゲン（ＴＡＲＭＯＧＥＮ）（登録商標）」（グローブイミューン社（ＧｌｏｂｅＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．）、ルイスビル、コロラド）は、一般に、細胞外（その表面）
に、細胞内（内部若しくは細胞質体）に、又は細胞外及び細胞内の両方に、１種又は複数種の異種抗原を発現する酵母ビヒクルを指す。タルモゲン（ＴＡＲＭＯＧＥＮ）（登録商標）製品については、一般に記載されている（例えば、米国特許第５，８３０，４６３号明細書を参照）。いくつかの酵母ベース免疫療法組成物、並びにその製造方法及び一般的使用方法についても、例えば、米国特許第５，８３０，４６３号明細書、米国特許第７，０８３，７８７号明細書、米国特許第７，７３６，６４２号明細書、スタッブス（Ｓｔｕｂｂｓ）ら著、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）、第７巻、ｐ．６２５〜６２９、２００１年、ルー（Ｌｕ）ら著、「癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、第６４巻、ｐ．５０８４〜５０８８、２００４年、並びにバーンステイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）ら著、「ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）」、２００８年、１月２４日、第２６巻（４）、ｐ．５０９〜５２１（これらの各々は、その全文を参照として本明細書に組み込むものとする）に詳しく記載されている。
本明細書で用いる場合、用語「類似体」とは、別の化合物と構造的に類似しているが、組成が若干異なる（例えば、異なる元素の原子による１原子の置換、又は特定の官能基の存在、又は別の官能基による１官能基の置換など）化学化合物を指す。従って、類似体は、機能及び外観が類似、若しくは同等の化合物であるが、基準化合物に対して、異なる構造若しくは由来を有する。
化合物を表すのに用いる場合、用語「置換された」、「置換誘導体」及び「誘導体」とは、非置換化合物に結合した少なくとも１つの水素が、別の原子若しくは化学部分で置換されていることを意味する。
誘導体は、親化合物と類似した物理的構造を有するが、誘導体は、親化合物とは異なる化学的及び／又は生物学的特性を有していてもよい。このような特性として、限定するものではないが、親化合物の活性増大若しくは低減、親化合物と比較して新しい活性、生物利用能の増大若しくは低減、効力の増強若しくは低減、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／若しくはｉｎ ｖｉｖｏでの安定性の増大若しくは低下、並びに／又は吸収性の増大若しくは低下が挙げられる。
一般に、用語「生物学的に活性の」とは、化合物（タンパク質若しくはペプチドなど）が、ｉｎ ｖｉｖｏ（すなわち、天然の生理学的環境）又はｉｎ ｖｉｔｒｏ（すなわち、実験室条件下）で測定若しくは観察される、細胞若しくは生物の代謝若しくはその他のプロセスに対する作用を有する少なくとも１つの検出可能な活性を有することを意味する。
本発明によれば、用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は、「調節する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）」と置換え可能に用いることができ、一般に、特定の活性の上方制御若しくは下方制御を指す。本明細書で用いる場合、用語「上方制御する」は、一般に、特定の活性に対して、誘発、開始、増加、増大、ブースト、改善、増強、増幅、促進、若しくは付与のいずれかを表すのに用いることができる。同様に、用語「下方制御する」は、一般に、特定の活性に対して、減少、抑制、阻害、緩和、縮小、低下、ブロッキング、若しくは阻止のいずれかを表すのに用いることができる。
本発明の一実施形態では、本明細書に記載するアミノ酸配列のいずれも、指定アミノ酸配列のＣ末端及び／又はＮ末端の各々にフランキングする少なくとも１個〜約２０個までの別の異種アミノ酸から作製することができる。得られたタンパク質若しくはポリペプチドは、指定アミノ酸配列から「ほぼ構成される」と言うことができる。本発明によれば、異種アミノ酸は、指定アミノ酸配列にフランキングする、天然に存在しない（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏでは、本来存在しない）、又は指定アミノ酸配列の機能とは関連しない、
又は、天然に存在する配列中のこのようなヌクレオチドが、所与のアミノ酸配列が由来する生物の標準コドン使用頻度を用いて翻訳された場合に、遺伝子で起こるように、指定アミノ酸配列をコードする天然に存在する核酸配列にフランキングするヌクレオチドによってコードされないアミノ酸の配列である。同様に、本明細書で核酸配列に関して用いる場合、「〜からほぼ構成される」という表現は、指定アミノ酸配列をコードする核酸配列の５’及び／又は３’末端の各々で、少なくとも１個〜多くとも約６０個までの別の異種ヌクレオチドによってフランキングされうる、指定アミノ酸配列をコードする核酸配列を指す。異種ヌクレオチドは、天然の遺伝子で起こるように、指定アミノ酸をコードする核酸配列にフランキングした状態で天然に存在しない（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏでは、本来存在しない）か、又はタンパク質にいずれか別の機能を付与する、若しくは指定アミノ酸配列を有するタンパク質の機能を変更するタンパク質をコードしない。
本発明によれば、「〜に選択的に結合する」という表現は、指定タンパク質に優先的に結合する、本発明の抗体、抗原結合フラグメント若しくは結合相手の能力を指す。より具体的には、「〜に選択的に結合する」という表現は、１つのタンパク質と別のタンパク質（例えば、抗体、そのフラグメント、若しくは抗原との結合相手）の特異的結合を指し、ここで、任意の標準的アッセイ（例えば、免疫検定）によって測定される結合のレベルは、アッセイのバックグラウンド対照より統計的に有意に高い。例えば、免疫検定を実施する場合、対照は、典型的に、抗体若しくは抗原結合フラグメントのみを含む（すなわち、抗原の非存在下で）反応ウェル／管を包含し、この場合、抗原の非存在下での、抗体若しくはその抗原結合フラグメントによる反応性の量（例えば、ウェルとの非特異的結合）が、バックグラウンドであるとみなされる。結合は、酵素免疫検定（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロットアッセイなど）などの、当分野では標準的な様々な方法を用いて、測定することができる。
本発明で用いるタンパク質若しくはポリペプチドへの言及は、完全長タンパク質、融合タンパク質、又はいずれかの断片、ドメイン、構造エピトープ、又はこのようなタンパク質の相同体（タンパク質の機能ドメイン及び免疫ドメインを含む）を包含する。より具体的には、本発明の単離されたタンパク質は、天然の環境から取り出された（すなわち、人為的操作を受けた）タンパク質（ポリペプチド若しくはペプチドを含む）であり、例えば、精製タンパク質、部分的精製タンパク質、組換えにより作製されたタンパク質、並びに合成により作製されたタンパク質などを挙げることができる。従って、「単離された」は、タンパク質が精製された程度を表すわけではない。好ましくは、本発明の単離されたタンパク質は、組換えにより作製される。本発明によれば、「修飾」及び「突然変異」という用語は、特に、本明細書に記載するタンパク質若しくはその部分のアミノ酸配列（又は核酸配列）に対する修飾／突然変異に関して、置換え可能に用いることができる。
本明細書で用いる場合、用語「相同体」は、天然に存在するタンパク質又はペプチドに対する軽微な修飾によって、天然に存在するタンパク質又はペプチド（すなわち、「始原型」若しくは「野生型」タンパク質）とは異なるが、天然に存在する形態の基本的なタンパク質及び側鎖構造を維持しているタンパク質又はペプチドを指すために用いられる。このような変化として、限定するものではないが、以下のものが挙げられる：１個又は数個のアミノ酸側鎖の変化；欠失（例えば、タンパク質若しくはペプチドの切断型）、挿入及び／若しくは置換などの、１個又は数個のアミノ酸側鎖を変化させること；１個又は数個の原子の立体配位の変化；並びに／又は限定するものではないが、メチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化、アミド化、及び／若しくはグリコシルホスファチジルイノシトールの付加など、軽微な誘導体化などがある。相同体は、天然に存在するタンパク質又はペプチドと比較して、増強、低減した特性、若しくは実質的に同等の特性を有しうる。相同体は、タンパク質のアゴニスト又はタンパク質のアンタゴニストを含んでもよい。相同体は、タンパク質を作製するための当
分野では公知の技術を用いて作製することができ、こうした方法として、限定するものではないが、単離された天然に存在するタンパク質の直接修飾、タンパク質の直接合成、又は、例えば、ランダム若しくは標的型突然変異誘発を実施するための伝統的技術若しくは組換えＤＮＡ技術を用いた、タンパク質をコードする核酸配列の修飾が含まれる。
所与のタンパク質の相同体は、基準タンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも約４５％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約５５％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９１％同一、又は少なくとも約９２％同一、又は少なくとも約９３％同一、又は少なくとも約９４％同一、又は少なくとも約９５％同一、又は少なくとも約９６％同一、又は少なくとも約９７％同一、又は少なくとも約９８％同一、又は少なくとも約９９％同一（すなわち、４５％から９９％までの任意の整数増加のパーセントで同一）であるアミノ酸配列を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。一実施形態では、相同体は、基準タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列に対して、１００％未満同一、約９９％未満同一、約９８％未満同一、約９７％未満同一、約９６％未満同一、約９５％未満同一であり、同様に、１％の増分毎に約７０％未満まで同一である、アミノ酸配列を含む、このアミノ酸配列からほぼ構成される、若しくは構成される。
相同体は、「ほぼ完全長」であるタンパク質又はタンパク質のドメインを含んでもよく、これは、このような相同体が、完全長タンパク質、機能ドメイン若しくは免疫ドメイン（こうしたタンパク質、機能ドメイン若しくは免疫ドメインが、本明細書に記載されているか、又は一般公開されている配列において公知若しくは記載されているように）が、完全長タンパク質又は完全長機能ドメイン若しくは完全長免疫ドメインのＮ及び／又はＣ末端からの１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０アミノ酸の付加又は欠失によって異なることを意味する。
本明細書で用いる場合、別途記載のない限り、パーセント（％）同一性と言うとき、これは、以下を用いて実施される相同性の評価を指す：（１）標準デフォルトパラメータと共に、アミノ酸検索にはｂｌａｓｔｐを、また核酸検索にはｂｌａｓｔｎを用いた、ＢＬＡＳＴ ２．０ベーシックＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴ）相同性検索、ここで、問合せ配列は、デフォルトにより低複雑性領域についてフィルタリングされる（アルシュール，Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）、マッデン，Ｔ．Ｌ．（Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．）、シェーファ，Ａ．Ａ．（Ｓｈａｅａｅｆｆｅｒ，Ａ．Ａ．）、チャン，Ｊ．（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．）、チャン，Ｚ．（Ｚｈａｎｇ，Ｚ．）、ミラー，Ｗ．（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．）及びリップマン，Ｄ．Ｊ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．）著、１９９７年、「ギャップ有りＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース検索プログラム（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ）」、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、第２５巻、ｐ．３３８９〜３４０２に記載、尚、これらの文献は、その全文を参照として本明細書に組み込むものとする））；（２）ＢＬＡＳＴ２アラインメント（以下に記載するパラメータを用いて）；及び／又は（３）標準デフォルトパラメータを有するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（部位特異的反復ＢＬＡＳＴ（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｔｅｒａｔｅｄ ＢＬＡＳＴ）。ＢＬＡＳＴ ２．０ベーシックＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ＢＬＡＳＴ）とＢＬＡＳＴ２との間の標準パラメータのいくつかの相違のために、ＢＬＡＳＴ２プログラムを用いると、２つの特定の配列は、有意な相同性を有するものとして認識されうるが、配列の一方を問合せ配列として用いるＢＬＡＳＴ ２．０ベーシックＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ
ＢＬＡＳＴ）で実施される検索は、第２の配列を上位マッチで識別しない可能性があることに留意されたい。さらに、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは、「プロフィール」検索の自動化さ
れた、使用しやすいバージョンを提供し、これは、配列相同体を検索する上で高感度の方法である。プログラムは初めにギャップ有りＢＬＡＳＴデータベース検索を実施する。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、戻ってくる任意の有意なアラインメントからの情報を用いて、部位特異的スコアマトリックスを構築し、これが、データベース検索の次のラウンドの問合せ配列に代わって用いられる。従って、これらのプログラムのどれを用いても、同一性（％）を決定できることを理解すべきである。
タツソバ（Ｔａｔｕｓｏｖａ）及びマッデン（Ｍａｄｄｅｎ）著、１９９９年、「Ｂｌａｓｔ２配列−タンパク質及びヌクレオチド配列を比較する新たなツール（Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ − ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、ＦＥＭＳ微生物学ジャーナル（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．）、第１７４巻、ｐ．２４７〜２５０（この文献は、その全文を参照として本明細書に組み込むものとする）に記載されているように、ＢＬＡＳＴ２配列を用いて、２つの特定の配列を互いにアラインメントすることができる。ＢＬＡＳＴ２配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを用いて、ｂｌａｓｔｐ又はｂｌａｓｔｎで実施することにより、２つの配列同士のギャップ有りＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）検索（ＢＬＡＳＴ２．０）を実施し、得られるアラインメントにギャップ（欠失及び挿入）の導入を可能にする。本明細書では、明瞭にする目的で、ＢＬＡＳＴ２配列アラインメントは、以下のような標準デフォルトパラメータを用いて実施する。
ｂｌａｓｔｎの場合、０ ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いて：
マッチについての報酬＝１
ミスマッチについてのペナルティ＝−２
オープンギャップ（５）及び延長ギャップ（２）ペナルティ
（１０）語長（１１）フィルター（適用）を除き、ギャップｘ＿ドロップオフ（５０）
ｂｌａｓｔｐの場合、０ ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いて：
オープンギャップ（１１）及び延長ギャップ（１）ペナルティ
（１０）語長（３）フィルター（適用）を除き、ギャップｘ＿ドロップオフ（５０）
単離された核酸分子は、その天然の環境（すなわち、人為的操作を受けている）から取り出された核酸分子であり、その天然の環境は、核酸分子が天然に存在するゲノム若しくは染色体である。従って、「単離された」とは、核酸分子が精製された程度を必ずしも表すわけではなく、この分子が、当該核酸分子が天然に存在する全ゲノム又は全染色体を含まないことを意味する。単離された核酸分子は、１遺伝子を含んでもよい。１遺伝子を含む単離された核酸分子は、このような遺伝子を含む染色体の断片ではなく、むしろ、この遺伝子に関連するコード領域及び調節領域を含むが、同じ染色体に天然に存在する別の遺伝子に関連するものは含まない。また、単離された核酸分子は、天然では指定核酸配列に通常フランキングしない別の核酸分子によってフランキングされる（すなわち、配列の５’及び／又は３’末端で）指定核酸配列（すなわち、異種配列）を含んでもよい。単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡのいずれかの誘導体（例えば、ｃＤＮＡ）を含んでよい。「核酸分子」という表現は、主として物理的核酸分子を指し、また「核酸配列」という表現は、主として核酸分子のヌクレオチドの配列を指すが、２つの表現は、特に、タンパク質若しくはタンパク質のドメインをコードすることができる核酸分子、又は核酸配列に関して、置換え可能に用いることができる。
組換え核酸分子は、トランスフェクトしようとする細胞において核酸分子の発現を有効に調節することができる任意の転写制御配列の少なくとも１つと機能的に連結した、本明細書に記載するいずれか１つ又は複数のタンパク質をコードする任意の核酸配列の少なくとも１つを含みうる分子である。「核酸分子」という表現は、主として物理的核酸分子を
指し、また、「核酸配列」という表現は、主として核酸分子のヌクレオチドの配列を指すが、２つの表現は、特に、タンパク質をコードすることができる核酸分子、又は核酸配列に関して、置換え可能に用いることができる。さらに、「組換え核酸分子」という表現は、主として転写制御配列と機能的に連結した核酸分子を指すが、動物に投与される「核酸分子」という表現と置換え可能に用いることができる。
組換え核酸分子は、組換えベクターを含むが、これは、本発明の融合タンパク質をコードする単離された核酸分子に機能的に連結され、融合タンパク質の組換え生産を可能にすることができ、また、本発明に従い、核酸分子を宿主細胞に送達することができる、いずれかの核酸配列、典型的には異種配列である。このようなベクターは、ベクターに挿入しようとする単離された核酸分子に隣接して天然に存在する核酸配列を含んでよい。このベクターは、原核若しくは真核いずれのＲＮＡ若しくはＤＮＡのいずれであってもよく、本発明において好ましくは、ウイルス又はプラスミドである。組換えベクターは、クローン化、配列決定、及び／又は核酸分子の操作に用いることができ、このような分子の送達（例えば、ＤＮＡ組成物若しくはウイルスベクターベースの組成物として）にも用いることができる。組換えベクターは、好ましくは、核酸分子の発現に用いられ、発現ベクターとも呼ぶことができる。好ましい組換えベクターは、トランスフェクトされた宿主細胞に発現させることができる。
本発明の組換え分子において、核酸分子は、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、並びに宿主細胞と適合性で、しかも本発明の核酸分子の発現を制御する他の調節配列などの調節配列を含む発現ベクターと機能的に連結している。特に、本発明の組換え分子は、１つ又は複数の発現制御配列と機能的に連結した核酸分子を含む。「機能的に連結した」という表現は、宿主細胞にトランスフェクトされた（すなわち、形質転換、形質導入、若しくはトランスフェクトされた）とき、核酸分子が発現されるように、核酸分子を発現制御配列に連結することを意味する。
本発明によれば、用語「トランスフェクション」は、外来性の核酸分子（すなわち、組換え核酸分子）を細胞に挿入することができる任意の方法を指すのに用いられる。用語「形質転換」は、藻類、細菌及び酵母などの微生物細胞への核酸分子の導入を指すのに用いられる場合、用語「トランスフェクション」と置換え可能に用いることができる。微生物系では、用語「形質転換」は、微生物による外来性核酸の獲得による遺伝的変化を表すのに用いられ、用語「トランスフェクション」とほぼ同義である。従って、トランスフェクション技術には、限定するものではないが、形質転換、細胞の化学処理、パーティクル・ガン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、感染及び原形質体融合などが含まれる。
以下の実験結果は、例示の目的で提供されるものであり、本発明の範囲を限定する意図はない。
（実施例）
実施例１
以下の実施例により、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）感染の治療又は予防のための酵母ベースの免疫治療組成物の作製について説明する。
本実験では、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を銅誘導性プロモータ、ＣＵＰ１の制御下で、ＨＤＶ抗原を発現するように操作した。ＨＤＶ抗原は、配列番号３０で表される、Ｎ末端からＣ末端までのフレーム内で融合した以下の配列要素を含む、約２１８アミノ酸の単一ポリペプチドであった：（１）プロテアソーム分解に対する耐性を付与して、発現を安定化するためのＮ末端ペプチド（配列番号３０の１〜６位）；２）ＳｐｅＩ制限酵素部位を導入するた
めの２つのアミノ酸スペーサ（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）（配列番号３０の７〜８位）；３）核局在化配列を欠失させるために改変されたＨＤＶ遺伝子型１ラージ（Ｌ）抗原（ＨＤＡｇ−Ｌ）のアミノ酸配列（配列番号３０の９〜２１２位、本明細書では、配列番号２８でも表される）；並びに４）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号３０の２１３〜２１８位）。配列番号３０の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母発現のために最適化されたコドン）は、本明細書では配列番号２９で表される。配列番号３０（及び配列番号２８）は、ＨＤＶ抗原の免疫原性を増強すると考えられる複数のエピトープ若しくはドメインを含む。例えば、配列番号３０の３４〜４２位及び５１〜５９位は、既知のＭＨＣクラスＩＴ細胞エピトープを含み、３４〜４９位、５８〜７３位、７４〜８７位、１０４〜１１９位、及び１２０〜１５１位は、既知のＭＨＣクラスＩＩＴ細胞エピトープを含む。配列番号３０を発現する酵母免疫治療組成物は、本明細書においてＨＤＶ１とも呼ばれる。
前述と同じＨＤＶ抗原を発現するが、ＮＬＳを保持する第２の生成物を以下のように作製した。酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を銅誘導性プロモータ、ＣＵＰ１の制御下で、ＨＤＶ抗原を発現するように操作した。ＨＤＶ抗原は、配列番号３３で表される、Ｎ末端からＣ末端までのフレーム内で融合した以下の配列要素を含む、約２２８アミノ酸の単一ポリペプチドであった：（１）プロテアソーム分解に対する耐性を付与して、発現を安定化するためのＮ末端ペプチド（配列番号３３の１〜６位）；２）ＳｐｅＩ制限酵素部位を導入するための２つのアミノ酸スペーサ（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）（配列番号３３の７〜８位）；３）配列番号２の６６位のグルタミンをアラニンに置換した以外は、配列番号２と一致するＨＤＶ遺伝子型１ラージ（Ｌ）抗原（ＨＤＡｇ−Ｌ）のアミノ酸配列（配列番号３３の９〜２２２位、本明細書では、配列番号３１でも表される）；並びに４）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号３３の２２３〜２２８位）。配列番号３３の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母発現のために最適化されたコドン）は、本明細書では配列番号３２で表される。配列番号３３（及び配列番号３１）は、ＨＤＶ抗原の免疫原性を増強すると考えられる複数のエピトープ若しくはドメインを含む。例えば、配列番号３３の３４〜４２位及び５１〜５９位は、既知のＭＨＣクラスＩＴ細胞エピトープを含み、３４〜４９位、５８〜７３位、７４〜８９位、８２〜９７位、１１４〜１２９位、及び１３０〜１６１位は、既知のＭＨＣクラスＩＩＴ細胞エピトープを含む。配列番号３３を発現する酵母免疫治療組成物は、本明細書においてＨＤＶ２とも呼ばれる。
ＨＤＶ１及びＨＤＶ２酵母免疫治療組成物を作製するために、手短には、前述したＨＤＶ抗原をコードするＤＮＡを、酵母での発現のためにコドン最適化した後、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化し、酵母２μｍ発現ベクター内のＣＵＰ１プロモータ（ｐＧＩ−１００）の後ろに挿入した。配列番号２９のヌクレオチド配列が、配列番号３０によって表される融合タンパク質をコードし、配列番号３２のヌクレオチド配列が、配列番号３３によって表される融合タンパク質をコードする。得られたプラスミドを、酢酸リチウム／ポリエチレングリコールトランスフェクションによって、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３α酵母に導入し、一次トランスフェクタントをウラシル欠失固形最小プレート（ＵＤＭ；ウリジンドロップアウト培地（ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｒｏｐｏｕｔ ｍｅｄｉｕｍ））上で選択した。コロニーをＵＤＭ又はＵＬＤＭ（ウリジン及びロイシンドロップアウト培地）上に再度線状に接種し、３０℃で３日間増殖させた。ウリジン欠失の液体培養物（Ｕ２培地：２０ｇ／Ｌのグルコース；６．７ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム含有酵母窒素ベース；各々、０．０４ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、及びアデニン）又はウリジン及びロイシン欠失の液体培養物（ＵＬ２培地：２０ｇ／Ｌのグルコース；６．７ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム含有酵母窒素ベース；各々、０．０４ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、トリプトファン、及びアデニン）にプレートから接種し、出発培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間増殖させた。一次培養物を用いて、同じ配合の最終培養物に接種し、所定の密度、すなわち１．１〜４
．０ＹＵ／ｍＬの密度に達するまで、増殖を継続した。１〜４ＹＵ／ｍＬの出発密度で、４００μＭ硫酸銅を用いて、培養を３０℃で３時間誘導した。各培養物からの細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中、５６℃で１時間熱により死滅させた。
培養物の加熱処理後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、全タンパク質をガラスビーズ破砕により単離した後、ＳＤＳ溶解バッファ中で煮沸した。全タンパク質の定量をアミドシュバルツ／ニトロセルロース結合アッセイによって実施し、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体プローブを用いたウェスタンブロットによりＨＤＶ抗原の含量を測定した後、Ｈｉｓタグ付きＨＣＶ ＮＳ３タンパク質標準曲線に補間した。
結果を図２及び図３に示す。図２は、１組の内標準（４μｇタンパク質／レーンでロードしたＨＤＶ１及びＨＤＶ２）を用いた、Ｕ２対ＵＬ２のＨＤＶ１及びＨＤＶ２の銅誘導発現を示し、図３は、第２組の内標準（４μｇタンパク質／レーンでロードしたＨＤＶ１及びＨＤＶ２）を用いた、Ｕ２対ＵＬ２のＨＤＶ１及びＨＤＶ２の銅誘導発現を示す。これらの図は、前述したＨＤＶ酵母ベースの免疫治療組成物の各々が、ＨＤＶタンパク質を発現し、これらはウェスタンブロットによって識別することができることを示している。抗原の発現は、ＵＬ２培地を用いた場合に最も優れていた。計算した抗原発現は、配列番号３０（ＨＤＶ１）を発現する酵母の場合、Ｙ．Ｕ．当たり約７１７１ｎｇのタンパク質であり、配列番号３３（ＨＤＶ２）を発現する酵母の場合、Ｙ．Ｕ．当たり約６６００ｎｇのタンパク質（酵母単位；１酵母単位（Ｙ．Ｕ．）は、１×１０７酵母細胞又は酵母細胞当量である）又はＹ．Ｕ．当たり７６ｐモルのタンパク質であった）。しかし、ＨＤＶ２は、凝集し、ＨＤＶ１よりはるかに長い倍加時間を有することが観察された。細胞凝集及び極めて遅い増殖は、酵母ベースの免疫治療薬候補には望ましくない特徴であり、従って、ＨＤＶ１を追加の実験のために選択した。
実施例２
以下の実施例により、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）感染の治療又は予防のための別の酵母ベースの免疫治療組成物の作製について説明する。
本実験では、酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を銅誘導性プロモータ、ＣＵＰ１の制御下で、ＨＤＶ抗原を発現するように操作した。ＨＤＶ抗原は、配列番号３６で表される、Ｎ末端からＣ末端までのフレーム内で融合した以下の配列要素を含む、約４２２アミノ酸の単一ポリペプチドであった：（１）プロテアソーム分解に対する耐性を付与して、発現を安定化するためのＮ末端ペプチド（配列番号３６の１〜６位）；２）ＳｐｅＩ制限酵素部位を導入するための２つのアミノ酸スペーサ（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ）（配列番号３６の７〜８位）；３）核局在化配列を欠失させるために改変されたＨＤＶ遺伝子型１ラージ（Ｌ）抗原（ＨＤＡｇ−Ｌ）のアミノ酸配列（配列番号３６の９〜２１２位）；４）核局在化配列を欠失させるために改変されたＨＤＶ遺伝子型２ラージ（Ｌ）抗原（ＨＤＡｇ−Ｌ）のアミノ酸配列（配列番号３６の２１３〜４１６位）；並びに５）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号３６の４１７〜４２２位）。この融合タンパク質においてＨＤＶ配列のみを表すアミノ酸配列は、配列番号３４である。配列番号３６の融合タンパク質をコードする核酸配列（酵母発現のために最適化されたコドン）は、本明細書では配列番号３５で表される。配列番号３６（及び配列番号３４）は、ＨＤＶ抗原の免疫原性を増強すると考えられる複数のエピトープ若しくはドメインを含む。例えば、配列番号３６のＨＤＶ遺伝子型１抗体内の３４〜４２位及び５１〜５９位は、既知のＭＨＣクラスＩＴ細胞エピトープを含み、３４〜４９位、５８〜７３位、７４〜８９位、８２〜９７位、１１４〜１２９位及び１３０〜１６１位は、既知のＭＨＣクラスＩＩＴ細胞エピトープを含む。対応する配列は、ＨＤＶ遺伝子型２抗原由来の配列において識別することができる。配列番号３６を発現する酵母免疫治療組成物は、本明細書においてＨＤＶ３とも呼ばれる。
ＨＤＶ３酵母免疫治療組成物を作製するために、手短には、前述したＨＤＶ抗原をコードするＤＮＡを、酵母での発現のためにコドン最適化した後、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで消化し、酵母２μｍ発現ベクター内のＣＵＰ１プロモータ（ｐＧＩ−１００）の後ろに挿入した。配列番号３５のヌクレオチド配列が、配列番号３６によって表される融合タンパク質をコードする。得られたプラスミドを、酢酸リチウム／ポリエチレングリコールトランスフェクションによって、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３α酵母に導入し、一次トランスフェクタントをウラシル欠失の固形最小プレート（ＵＤＭ；ウリジンドロップアウト培地）上で選択した。コロニーをＵＤＭ又はＵＬＤＭ（ｕｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ ｌｅｕｃｉｎｅ ｄｒｏｐｏｕｔ
ｍｅｄｉｕｍ）（ウリジン及びロイシンドロップアウト培地）上に再度線状に接種し、３０℃で３日間増殖させた。ウリジン欠失の液体培養物（Ｕ２培地：２０ｇ／Ｌのグルコース；６．７ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム含有酵母窒素ベース；各々、０．０４ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、及びアデニン）又はウリジン及びロイシン欠失の液体培養物（ＵＬ２培地：２０ｇ／Ｌのグルコース；６．７ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム含有酵母窒素ベース；各々、０．０４ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、トリプトファン、及びアデニン）にプレートから接種し、出発培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間増殖させた。一次培養物を用いて、同じ配合の最終培養物に接種し、所定の密度、すなわち１．１〜４．０ＹＵ／ｍＬの密度に達するまで、増殖を継続した。１〜４ＹＵ／ｍＬの出発密度で、４００μＭ硫酸銅を用いて、培養を３０℃で３時間誘導した。各培養物からの細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ中、５６℃で１時間、熱により死滅させた。
培養物の加熱処理後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、全タンパク質をガラスビーズ破砕により単離した後、ＳＤＳ溶解バッファ中で煮沸した。全タンパク質の定量をアミドシュバルツ／ニトロセルロース結合アッセイによって実施し、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体プローブを用いたウェスタンブロットにより、ＨＤＶ抗原の含量を測定した後、Ｈｉｓタグ付きＨＣＶ ＮＳ３タンパク質標準曲線に補間した。結果を図４に示す。図４は、異なる２組の内標準を用いた、Ｕ２及びＵＬ２培地の各々におけるＨＤＶ３の銅誘導発現を示す。これらの結果は、ＨＤＶ３が、高レベルのＨＤＶ抗原を発現し、これらはウェスタンブロットによって識別することができることを示している。抗原の発現は、ＵＬ２培地を用いた場合に最も優れていた。計算した抗原発現は、配列番号３６（ＨＤＶ３）を発現する酵母の場合、Ｙ．Ｕ．当たり約２３８６１ｎｇのタンパク質であった。ＨＤＶ３を追加の実験のために選択した。
実施例３
以下の実施例には、ｉｎ ｖｉｖｏで投与した場合、本発明の酵母ベースのＨＤＶ免疫療法組成物の免疫原性を実証するためのマウスにおける前臨床実験を記載する。
これらの実験では、３つのグループのＣ５７ＢＬ／６マウスを表２に示すように皮下免疫した。マウスは、ＨＤＶ１（配列番号３０、実施例１を参照）及びＨＤＶ３（配列番号３６、実施例２を参照）、並びにＯＶＡＸ２０１０として知られる対照酵母組成物（この酵母は、Ｎ末端α因子リーダペプチドを含むニワトリオボアルブミンを発現するが、この発現は、ＣＵＰ１プロモータによって駆動される）で免疫した。
毎週１回、合計５Ｙ．Ｕ．（１注射部位につき、２．５Ｙ．Ｕ．で２か所）の表示した酵母ベースの免疫療法組成物で、合計３週間にわたりマウスを免疫した。３回目の免疫から８日後、マウスを安楽死させ、膵臓及びリンパ節を摘出し、浸軟して単細胞懸濁液とした後、カウントした。細胞を２００，０００細胞／ウェル（１０６細胞／ｍＬ）で、Ｕ底９６ウェルプレートに導入し、ＨＤＶ特異的ペプチド抗原を３０μｇ／ｍＬで添加した。３７℃／５％ＣＯ２加湿インキュベータでの４日のインキュベーションの後、１５０μｌ（１５０，０００細胞）を二重インターロイキン−２／インターフェロン−γ（ＩＬ−２／ＩＦＮγ）ＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））に２４時間かけて移した。製造業者の指示に従い、プレートを展開させ、有効スポットカウント装置及びソフトウエア（ＣＴＬ社（ＣＴＬ，Ｉｎｃ．）を用いてスポットをカウントした。このアッセイに用いたＨＤＶペプチドは、以下の通りであった：
・ＨＤＶ２６−３４（ＨＬＡ−Ａ２バインダー）：ＫＬＥＤＬＥＲＤＬ；配列番号２０
・ＨＤＶ４３−５１（ＨＬＡ−Ａ２バインダー）：ＫＬＥＤＥＮＰＷＬ；配列番号１９
この実験の結果を図５Ａ、５Ｂ、６Ａ及び６Ｂに示す。図５Ａは、ＨＤＶ１又はＨＤＶ３のワクチン接種が、既知ＨＤＶ Ｔ細胞エピトープペプチド（Ｐ２：ＨＤＶ４３−５１若しくは配列番号１９；ｐ＝０．０００８ＨＤＶ３対ＯＶＡＸ）のｅｘ ｖｉｖｏ添加により特異的に発生するＨＤＶ特異的ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答を誘発することを示している。この結果は、ＩＦＮγが、機能適応免疫応答の基本的要素であることから、意味がある；これは、機能免疫の発達に際し、ＣＤ４＋Ｔｈ１及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）エフェクターＴ細胞によって産生される。増殖培地のみを含むウェル中に顕著なレベルのバックグラウンドＥＬＩＳｐｏｔが存在したが、ペプチド処理ＥＬＩＳｐｏｔカウント数からこのバックグラウンドを差し引いた後であっても、免疫応答の抗原特異性は明らかである（図５Ｂ）。特に、ＨＤＶ３は、ＨＤＶ１より３．５倍高いＥＬＩＳｐｏｔ応答を誘発し（図５Ｂ；ＨＤＶ１の１２スポットに対して、ＨＤＶ３は、４２スポット）、ＨＤＶ１より約３．３倍高いＨＤＶ抗原量を含む（ＨＤＶ１の７１７１Ｎｇ／ＹＵに対して、ＨＤＶ３は、２３８６１Ｎｇ／ＹＵ）。この知見は、１酵母細胞につき、より高い抗原含量が、酵母免疫療法によって誘発される抗原特異的Ｔ細胞のより高い頻度と相関することを示している。
ＩＬ−２ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果から、ＨＤＶ−１ワクチン接種に対する抗原特異的免疫応答の誘発も明らかになった。図６Ａは、ＨＤＶ１のワクチン接種が、別のＨＤＶペプチド（Ｐ１：ＨＤＶ−２６−３４若しくは配列番号２０；ｐ＝０．０２ＨＤＶ１対ＯＶＡＸ）のｅｘ ｖｉｖｏ添加によって特異的に発生するＩＬ−２ＥＬＩＳｐｏｔ応答を誘発することを示している。この結果は、ＩＬ−２が、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の増殖、分化及び生存を刺激するために、酵母ＨＤＶ免疫治療ワクチン接種によって誘導される免疫応答の質を証明するものである。増殖培地のみ（図６Ａの「刺激なし」）でインキュベートしたサンプルについて顕著なレベルのバックグラウンドＩＬ−２ＥＬＩＳｐｏｔが存在するが、ペプチド処理ＥＬＩＳｐｏｔカウント数からこのバックグラウンドを差
し引いた後であっても、免疫応答の抗原特異性は明らかである（図６Ｂ）。ＨＤＶ１ワクチン接種マウスのバックグラウンド補正ＩＬ−２ＥＬＩＳｐｏｔの数は、ＯＶＡＸワクチン接種マウスの二倍である。
これらを全て考え合わせると、ＩＦＮγ及びＩＬ−２ＥＬＩＳｐｏｔデータから、本発明のＨＤＶ酵母ベースの免疫治療組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与の結果、抗原特異的Ｔ細胞を誘発し、ＣＴＬ誘導の既知マーカであるサイトカインを産生することがわかり、これは、機能抗ＨＤＶ応答の誘導について、これら組成物の有用性を示している。
実施例４
以下の実施例には、健康なボランティアにおける第１相臨床試験を記載する。
本明細書に記載の酵母ベースの免疫療法組成物（例えば、実施例１又は２に記載のＨＤＶ免疫療法組成物）を用いて、１２週間の非盲検用量漸増第１相臨床試験を実施する。被験者は、ＨＤＶ感染又はＨＢＶ感染の過去若しくは現在の適応又は記録がない、免疫活性かつ健康なボランティアである。
これらの基準を満たす約４８人の対象（６グループ、グループ当たり８人）に、以下に示す２つの異なる投与プロトコルの１つを用いた逐次用量コホート漸増プロトコルで、酵母ベースのＨＤＶ免疫治療組成物を投与する：
プロトコルＡ：初回−追加投与（４つの毎週用量を第１日に開始した後、第４週及び第８週に、２回の毎月用量）
グループ１Ａ：２０酵母単位（Ｙ．Ｕ．）（２つの異なる部位に１０Ｙ．Ｕ．投与）；
グループ２Ａ：４０Ｙ．Ｕ．（４つの異なる部位に１０Ｙ．Ｕ．投与）；
グループ３Ａ：８０Ｙ．Ｕ．（４つの異なる部位に２０Ｙ．Ｕ．投与）
４週毎の投与（第１日、第４週及び第８週に、合計３用量）
グループ１Ｂ：２０Ｙ．Ｕ．（２つの異なる部位に１０Ｙ．Ｕ．投与）；
グループ２Ｂ：４０Ｙ．Ｕ．（４つの異なる部位に１０Ｙ．Ｕ．投与）；
グループ３Ｂ：８０Ｙ．Ｕ．（４つの異なる部位に２０Ｙ．Ｕ．投与）
用量はすべて、皮下投与し、上に示したように、この用量を身体の２つ又は４つの部位に配分する（来院毎に）。安全性及び免疫原性（例えば、ＥＬＩＳｐｏｔ及びＴ細胞増殖によって測定される抗原特異的Ｔ細胞応答）を評価する。特に、分類別応答個体についてＥＬＩＳｐｏｔアルゴリズムを作成する。調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ
Ｔ ｃｅｌｌｓ）を測定するＥＬＩＳｐｏｔアッセイも評価し、ＨＤＶ抗原に応答するＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を評価した後、抗サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）抗体（ＡＳＣＡ：ａｎｔｉ−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の発生と相関させる。
酵母ベースの免疫治療薬が、良好な耐容性を示し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ、リンパ球増殖アッセイ（ＬＰＡ：ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ＨＢＶ抗原によるｅｘ ｖｉｖｏＴ細胞刺激、及び／又はＡＳＣＡのうち１つ又は複数によって測定される免疫原性を示すであろうと予想される。
実施例５
以下の実施例には、Ｄ型肝炎ウイルス及びＢ型肝炎ウイルスの両方に慢性感染した対象（治療グループ）、又はＢ型肝炎ウイルスに単独感染した対象（予防グループ）における第１ｂ／２ａ相臨床試験を記載する。
本明細書に記載の酵母ベースのＨＤＶ免疫治療組成物（例えば、実施例１又は２に記載のＨＤＶ免疫療法組成物）を用いて、非盲検用量漸増第１ｂ／２ａ相臨床試験を実施する。グループ１（ＨＤＶ療法治療グループ）では、対象は、免疫活性であり、かつ、Ｂ型肝
炎ウイルス（ＨＢＶ）及びＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）の両方に慢性感染している。グループ２（ＨＤＶ予防グループ）では、対象は、免疫活性であり、かつ、ＨＢＶに慢性感染しているが、ＨＤＶの共感染のエビデンスはみとめられない（すなわち、ＨＢＶ単独感染）。各グループにおいて、慢性ＨＢＶ感染は、ＨＢＶＤＮＡレベルによって測定されるように、従来のＨＢＶ抗ウイルス療法（例えば、テノフォビルジソプロキシルフマル酸塩、若しくはＴＤＦ（ＶＩＲＥＡＤ（登録商標））で良好に制御されている。
この試験の第１段階では、関連基準を満たす両グループの対象に０．０５Ｙ．Ｕ．〜８０Ｙ．Ｕ．の用量範囲を用いた逐次用量コホート漸増プロトコルで、酵母ベースのＨＤＶ免疫治療組成物を投与する。任意選択で、単一の患者コホートは、継続抗ウイルス療法を加えた免疫療法と同じスケジュールで、プラセボ（ＰＢＳ）の皮下注射を受ける。ＡＬＴ発赤及び減圧の徴候の場合には、伝統的な停止規則を適用する。
この試験の各グループの第２段階では、対象を同数のコホートにランダムに分けて、抗ウイルス剤単独か、又は抗ウイルス剤と酵母ベースのＨＤＶ免疫治療プロトコル（用量１及び用量２）を４８週間までの期間にわたって継続する。グループ２の患者は、任意選択で、より長期（４８週間超）にわたり、ＨＤＶ感染率について追跡してもよい。グループ２では、単一の患者コホートは、ＨＢＶの継続抗ウイルス療法を加えたＨＤＶ免疫療法と同じスケジュールで、プラセボ（ＰＢＳ）の皮下注射を受ける。
グループ１では、安全性、ＨＤＶウイルス動態、ＨＤＡｇセロコンバージョン、及びＨＤＶ特異的免疫原性（例えば、ＥＬＩＳｐｏｔによる抗原特異的Ｔ細胞応答）、並びにＨＢｓＡｇセロコンバージョンを評価して、ＨＢＶ治療の作用を同時に測定する。さらに、用量依存性生化学（ＡＬＴ）をモニターする。
グループ２では、安全性及びＨＤＶ特異的免疫原性（例えば、ＥＬＩＳｐｏｔにより測定する抗原特異的Ｔ細胞応答）、並びにＨＢｓＡｇセロコンバージョンを同時に評価して、ＨＤＶ感染の指標（例えば、ＨＤＶ ＲＮＡの検出、ＨＤＶ抗原（ＨＤＡｇ）の検出、及び／又は抗ＨＤＶの検出により）について常用の方法で対象をモニターする。
グループ１（治療）においては、酵母ベースのＨＤＶ免疫治療組成物は、慢性感染のＨＤＶ患者に治療利益をもたらすと予想される。免疫療法は、送達される全ての用量が安全であり、かつ耐容性が良好であると予想される。少なくとも最も高い用量の酵母ベースのＨＤＶ免疫治療を受ける患者は、治療で発現するＨＤＶ特異的Ｔ細胞応答（ＥＬＩＳＰＯＴで決定される）を示すと考えられ、事前のベースラインＨＤＶ特異的Ｔ細胞応答を有する患者は、治療中に、ＨＤＶ特異的Ｔ細胞応答の改善を示すと予想される。酵母ベースのＨＤＶ免疫療法を受ける患者は、抗ウイルス薬グループ及び／又はプラセボ対照グループ（使用している場合）と比較して、ＨＤＶ ＲＮＡの低減及び／又はＨＤＶセロコンバージョン速度の改善を示すと予想される。酵母ベースの免疫療法を受ける患者においては、ＡＬＴ正常化の改善が予想される。
グループ２（予防）においては、酵母ベースのＨＤＶ免疫療法組成物は、対照（プラセボグループ）と比較して、ＨＢＶ単独感染患者のＨＤＶへの共感染に対する防御、例えば、ＨＤＶ共感染率の低下、ＨＤＶ感染に関連する症状及び続発症の重症度の軽減、全体的生存の上昇、及び／又は急性疾患としてのＨＤＶ感染のクリアランスの増加のエビデンスなどをもたらすと予想される。さらに、少なくとも最高用量の酵母ベースのＨＤＶ免疫治療薬を受ける患者は、治療で発現するＨＤＶ特異的Ｔ細胞応答（ＥＬＩＳＰＯＴで決定される）を示すと予想される。
本発明の様々な実施形態を詳細に説明してきたが、これらの実施形態の変更形態及び改
変形態が、当業者には容易に想到されることは明らかである。しかし、このような変更形態及び改変形態が、以下の特許請求の範囲に記載するように、本発明の範囲内であることは、明確に理解されるべきである。

Claims (52)

  1. （ａ）酵母ビヒクル；及び
    （ｂ）ＨＤＶ抗原を含有する融合タンパク質
    を含む免疫治療組成物であって、
    前記ＨＤＶ抗原は、ＨＤＶラージ抗原（ＨＤＡｇ−Ｌ）又はＨＤＶスモール抗原（ＨＤＡｇ−Ｓ）の少なくとも１つの免疫原性ドメインから構成され、核局在化配列（ＮＬＳ）は、前記ＮＬＳの１つ又は複数のアミノ酸の置換若しくは欠失によって不活性化されており；
    前記組成物は、対象に投与されると、ＨＤＶ特異的免疫応答を誘発する、免疫治療組成物。
  2. 前記ＨＤＶ抗原は、少なくとも１つの完全長ＨＤＡｇ−Ｌから構成され、ただし、該ＨＤＡｇ−Ｌの核局在化配列（ＮＬＳ）は、該ＮＬＳの１つ又は複数のアミノ酸の置換若しくは欠失によって不活性化されている、請求項１に記載の免疫治療組成物。
  3. 前記ＮＬＳが欠失している、請求項２に記載の免疫治療組成物。
  4. 前記ＨＤＶ抗原は、２つ以上の完全長ＨＤＡｇ−Ｌの融合物から構成され、ただし、該ＨＤＡｇ−Ｌの各々の前記核局在化配列（ＮＬＳ）は、該ＮＬＳの１つ又は複数のアミノ酸の置換若しくは欠失によって不活性化されている、請求項１に記載の免疫治療組成物。
  5. 前記ＮＬＳが欠失している、請求項４に記載の免疫治療組成物。
  6. 前記ＨＤＡｇ−Ｌの各々が、異なるＨＤＶ遺伝子型に由来する、請求項４に記載の免疫治療組成物。
  7. 前記ＨＤＶ抗原は、３つの完全長ＨＤＡｇ−Ｌの融合物から構成され、ただし、該ＨＤＡｇ−Ｌの各々の前記核局在化配列（ＮＬＳ）は、該ＮＬＳの１つ又は複数のアミノ酸の置換若しくは欠失によって不活性化されており、前記ＨＤＡｇ−Ｌの各々は、異なるＨＤＶ遺伝子型に由来する、請求項１に記載の免疫治療組成物。
  8. 前記ＨＤＶ抗原が、配列番号３４、配列番号２８、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫治療組成物。
  9. 前記ＨＤＶ抗原が、配列番号３４、配列番号２８、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫治療組成物。
  10. 前記ＨＤＶ抗原が、配列番号３４、配列番号２８、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択される、請求項１に記載の免疫治療組成物。
  11. 前記ＨＤＡｇ−Ｌが、配列番号２、配列番号５、配列番号８、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の免疫治療組成物。
  12. 前記ＨＤＡｇ−Ｓが、配列番号３、配列番号６、配列番号９、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の免疫治療組成物。
  13. 前記ＨＤＶ抗原が、配列番号２、配列番号５、配列番号８、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の免疫治療組成物。
  14. 前記融合タンパク質が、配列番号３６若しくは配列番号３０から選択されるアミノ酸配列、又は、配列番号３６若しくは配列番号３０にそれぞれ少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の免疫治療組成物。
  15. ａ）酵母ビヒクル；及び
    ｂ）ＨＤＶ抗原を含有する融合タンパク質
    を含む免疫治療組成物であって、
    前記ＨＤＶ抗原が、ＨＤＶラージ抗原（ＨＤＡｇ−Ｌ）又はＨＤＶスモール抗原（ＨＤＡｇ−Ｓ）の少なくとも１つの免疫原性ドメインから構成され、前記ＨＤＶ抗原は、完全長ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓタンパク質より短く；
    前記組成物は、対象に投与されると、ＨＤＶ特異的免疫応答を誘発する、免疫治療組成物。
  16. 前記ＨＤＶ抗原が、少なくとも２つ以上のＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓタンパク質の融合物から構成され、前記ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓタンパク質の少なくとも１つは、完全長ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓタンパク質に満たない、請求項１５に記載の免疫治療組成物。
  17. 前記ＨＤＡｇ−Ｌ又はＨＤＡｇ−Ｓタンパク質の各々が、異なるＨＤＶ遺伝子型に由来する、請求項１６に記載の免疫治療組成物。
  18. 前記ＨＤＶ抗原が、配列番号１０、配列番号１６、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の免疫治療組成物。
  19. 前記ＨＤＶ抗原が、配列番号１０、配列番号１６、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の免疫治療組成物。
  20. 前記ＨＤＶ抗原が、配列番号１０、配列番号１６、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択される、請求項１５に記載の免疫治療組成物。
  21. 前記ＨＤＡｇ−Ｌが、配列番号２、配列番号５、配列番号８、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の免疫治療組成物。
  22. 前記ＨＤＡｇ−Ｓが、配列番号３、配列番号６、配列番号９、又は別のＨＤＶ株由来の対応アミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の免疫治療組成物。
  23. 前記融合タンパク質が、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１７、又は配列番号１８から選択される、請求項１に記載の免疫治療組成物。
  24. 前記ＨＤＶ抗原が、前記酵母ビヒクルによって発現される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の免疫治療組成物。
  25. 前記酵母ビヒクルが、全酵母である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の免疫治療組成物。
  26. 前記全酵母は死滅している、請求項２５に記載の免疫治療組成物。
  27. 前記全酵母は熱により不活性化されている、請求項２５に記載の免疫治療組成物。
  28. 前記酵母ビヒクルが、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、及びヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）からなる群から選択される酵母属由来のものである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の免疫治療組成物。
  29. 前記酵母ビヒクルが、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）由来のものである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の免疫治療組成物。
  30. 前記酵母ビヒクルが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のものである、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の免疫治療組成物。
  31. 前記組成物が、対象への投与に好適な薬学的に許容される賦形剤で製剤化される、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の免疫治療組成物。
  32. 前記組成物が、９０％超の酵母タンパク質を含有する、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の免疫治療組成物。
  33. 対象におけるＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）感染若しくはＨＤＶ感染による少なくとも１つの症状を治療する、又はＨＤＶに感染している対象の生存を改善する方法であって、
    請求項１〜３２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組成物を、ＨＤＶに感染した対象に投与するステップを含み、前記対象への前記組成物の投与によって、対象におけるＨＤＶ感染又はＨＤＶ感染による少なくとも１つの症状を軽減する、方法。
  34. ＨＤＶ感染の症状を治療又は改善するのに有用な１種以上の別の薬剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記化合物が、インターフェロンである、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記インターフェロンが、インターフェロンαである、請求項２４に記載の方法。
  37. 前記インターフェロンが、ペギル化インターフェロンα２ａである、請求項２４に記載の方法。
  38. 前記インターフェロンが、インターフェロンλである、請求項２４に記載の方法。
  39. 前記対象が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に慢性感染している、請求項３３に記載の方法。
  40. 前記ＨＢＶ感染を治療するための抗ウイルス化合物を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記抗ウイルス化合物が、テノフォビル、ラミブジン、アデフォビル、テルビブジン、エンテカビル、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
  42. ＨＤＶ抗原に対する抗原特異的細胞性免疫応答を誘発する方法であって、
    請求項１〜３２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組成物を、対象に投与するステップを含む、方法。
  43. 対象におけるＨＤＶ感染を予防する方法であって、
    請求項１〜３２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組成物を、ＨＤＶに感染していない対象に投与するステップを含む、方法。
  44. 前記対象が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に慢性感染している、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ＨＢＶ感染を治療するための抗ウイルス化合物を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 個体の集団をＨＤＶに対して免疫する方法であって、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組成物を、前記個体の集団に投与するステップを含む、方法。
  47. 前記個体の集団が、ＨＢＶに慢性感染している、請求項４６に記載の方法。
  48. ＨＤＶ感染を治療する目的で使用するための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
  49. 対象におけるＨＤＶ感染を予防する目的で使用するための、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
  50. 前記対象が、ＨＢＶに慢性感染している、請求項４９に記載の組成物。
  51. ＨＤＶ感染を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  52. ＨＤＶ感染を予防するための薬剤の製造における、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
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