CN105228646B - 基于酵母的脊索瘤免疫疗法 - Google Patents

基于酵母的脊索瘤免疫疗法 Download PDF

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Abstract

本发明的一个实施方案涉及治疗具有脊索瘤的个体中的脊索瘤的方法。该方法包括对具有脊索瘤的个体施用免疫治疗性组合物的步骤，所述免疫治疗性组合物包含：(a)酵母媒介物；和(b)包含至少一种畸形短尾抗原的癌症抗原。本发明的另一个实施方案涉及免疫治疗性组合物用于具有脊索瘤的个体中的脊索瘤的方法，所述免疫治疗性组合物包含酵母媒介物和包含至少一种畸形短尾抗原的癌症抗原。本发明的又一个实施方案涉及包含酵母媒介物的免疫治疗性组合物的用途。

Description

基于酵母的脊索瘤免疫疗法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月19日提交的美国临时申请流水号61/803,332的35U.S.C.119(e)下的优先权权益。通过提及并入2013年3月19日提交的美国临时申请流水号61/803,332的全部公开内容。
政府权利
本发明在履行国家健康研究所(健康和人类服务部的机构)的合作研究和开发协议中产生。政府具有本发明的某些权利。
关于联合研究协议的声明
本发明由2008年5月8日执行的合作研究和开发协议的各方或代表所述各方完成。合作研究和开发协议的各方：GlobeImmune,Inc.和美国健康和人类服务部，如以国家癌症研究所(国家健康研究所的一个研究所、中心或部分)代表。
引用序列表
本申请含有通过EFS-Web作为文本文件电子提交的序列表。命名为“7797-2-PCT_ST25”的文本文件具有76KB的以字节计的大小，并且在2014年3月14日记录。按照37CFR§1.52(e)(5)，文本文件中含有的信息通过提及完整收入本文。
发明领域
一般而言，本发明涉及基于酵母的免疫治疗性组合物和用于预防和/或治疗脊索瘤的方法。
发明背景
脊索瘤是一种主要为源自脊索的胚胎剩余部分的脊柱的罕见骨癌，其是攻击性的，局部侵入性的，并且具有不良预后(Chugh et al.,2007,The Oncologist 12:1344-1350)。它在男性中比在女性中更频繁发生(60％对40％)，诊断时的中值年龄为59岁，发生率随年龄逐渐渐进增加(McMaster et al.,2001,Cancer Causes Control 12:1–11)。尽管在文献中经常错误引用为具有骶尾部的倾向，但是来自SEER数据库的400例病例的最全面群体分析指示脊索瘤在骶骨(29.2％)、颅底(32％)和移动脊柱(mobile spine)(32.8％)间几乎同等分布(McMaster et al.,同上；Walcott et al.(2012)Lancet Oncol 13:e69-76)。在此研究中，在所有人种和性别间，中值总体存活是6.29年，其中5年、10年和20年存活分别陡然下降到68％、40％和13％(McMaster et al.,见上文)。然而，重要的是，注意到作者鉴定诊断并且后来在22年调查中治疗的患者具有显著改善的存活，并且假设这是改善的手术和放射技术的结果。4项后来的(较小)研究支持此假设，其中总共230名受试者具有82％和57％的5年和10年总体存活(Ferraresi et al.(2010),BMC Cancer 10:22.(Table4)；Stacchiotti et al.(2010),Ann Surg Oncol 17(1):211-9)。
美国的脊索瘤发病率是每100,000之0.08，每年产生约250例新美国病例(McMaster et al.,见上文；截止2013年1月1日的美国人口调查局的美国人口估值(315,091,138))。欧洲-27(EU)的发病率类似于美国，每年产生约400例新美国病例(脊索瘤基金网站，2013；截止2012年1月1日的欧洲委员会EuroStat数据库EU-27人口(503,700,000))。在约10年的平均总体存活的情况下，脊索瘤的患病率(prevalence)是每百万之约8，或者在美国为约2500及在欧洲为4000。其它地区的脊索瘤的发病率和患病率是未知的。
脊索瘤是无痛的并且缓慢生长，因此它们经常是临床上沉默的，直到疾病的晚期阶段。脊索瘤通常在表象上不是转移的，在初始表象时仅5％显示转移到肺、骨、皮肤和脑。比起受到疾病的局部进展影响，患者存活似乎不太受到远端转移影响。局部进展已经作为死亡率的最重要预测者出现，并且初始切除的程度在为治愈提供机会中已经变为最重要的因素(Walcott et al.,见上文)。
强调神经学保护的攻击性手术切除(aggressive surgical resection)及后续的辅助放射疗法是此疾病的护理标准。具有宽手术边缘的攻击性全块手术切除(Aggressiveen-bloc surgical resection)已经实质性改善疾病复发的局部控制(Hsieh et al.(2009),Spine 34:2233-39；Stacchiotti et al.,见上文；Tzortzidis et al.(2006),Neurosurgery 59(2):230-7)。然而，肿瘤自身的复合除去不是令人满意的治疗目的；在评估手术结果时患者神经学功能的保存和生命质量也必须取得优先。用放射疗法管理手术后仍然存在的任何肿瘤，特别是在体积小时。目前，在约50％骶骨脊索瘤中可获得完全切除，脊椎和颅底脊索瘤的比率低得多(Walcott et al.,见上文)。虽然独立的放射疗法已经证明是无效的，但是似乎有如下的共识，即基于Hadron的(不是光子)辅助放射疗法比单独的手术提供添加的优点，5年局部控制率是50-60％(Walcott et al.,见上文)。
脊索瘤一般对常规的化学疗法不敏感，如根据其缓慢的生长性质预期的(Azzarelli et al.(1988),J Surg Oncol 37(3):185-91)。然而，有限的病例报告已经提出了去分化的脊索瘤能对攻击性化学疗法敏感(Fleming et al.(1993),Cancer 72:714-18)。脊索瘤的分子序型分析(profiling)已经揭示了这些肿瘤过表达PDGF受体A和B及KIT受体。因此，已经在脊索瘤患者中尝试了几种酪氨酸激酶抑制剂诸如伊马替尼(imatinib)和舒尼替尼(sunitinib)。至今获得的最佳结果是用舒尼替尼，其中44％的脊索瘤患者(4/9)具有稳定疾病达16周(Merriam et al.(2009),J Clin Oncol 27:3154-60)。
脊柱和颅底的肿瘤的准确诊断是重要的。短尾畸形(Brachyury)已经变为一种针对脊索瘤的区别性生物标志物。在与细胞角蛋白染色组合时，用于检测脊索瘤的敏感性和特异性分别是98％和100％(Oakley et al.(2008),Mod Path 21,1461–1469)。短尾畸形(又称为“T”)是一种中胚层转录因子和基因的T框复合物的成员，在脊椎动物中在早期发育及后中胚层的形成和分化和轴形成(axial development)中发挥作用(参见例如Wilkinsonet al.,1990,Nature343(6259):657–659)；Beddington et al.,1992,Development(Suppl.):157-165；Schulte-Merker et al.,1994,Development 120:1009-1015；Kispertand Herrmann,1994,Dev.Biol.161:179-193；Showell et al.,2004,Dev Dyn229:201-218)。新近，Palena及同事已经证明了短尾畸形在多种人肿瘤组织和癌细胞系中表达(Palena et al.,2007,Clin.Cancer Res.13(8):2471-2478)。Fernando等的研究已经显示了短尾畸形促进人肿瘤细胞中的表皮-间充质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)，对肿瘤细胞赋予间充质表型，以及迁移和侵入性能力，同时减弱肿瘤细胞周期进展(Fernando et al.,2010,J.Clin.Invest.120(2):533-544)。因而，短尾畸形参与癌症的转移进展。然而，在脊索瘤中，短尾畸形在所有疾病阶段更广泛牵涉。在家族性和散发性脊索瘤患者中，研究已经鉴定出短尾畸形的常见基因重复(Yang et al.,NatGenet2009；41:1176–78)。
尽管在最初治疗时最佳努力，但是大多数脊索瘤会复发或进展。虽然许多患者选择经历复杂的再手术，尽管所有损伤位置的死亡率较高，但是存在有非常少的治疗方案的报告和复发损伤的后果。先前的放射治疗经常限制安全再放射的能力，以及引起后续手术的增加的死亡率。因而，本领域中需要用于治疗脊索瘤的改善的治疗办法。另外，鉴于家族性脊索瘤的发生，本领域中需要用于预防脊索瘤的选项，或者延迟家族性脊索瘤发作的选项，或者改善家族性脊索瘤的后果。
发明概述
本发明的一个实施方案涉及治疗具有脊索瘤的个体中的脊索瘤的方法。所述方法包括对具有脊索瘤的个体施用免疫治疗性组合物的步骤，所述免疫治疗性组合物包含：(a)酵母媒介物；和(b)包含至少一种短尾畸形抗原的癌症抗原。本发明的另一个实施方案涉及免疫治疗性组合物用于具有脊索瘤的个体中的脊索瘤的用途，所述免疫治疗性组合物包含酵母媒介物和包含至少一种短尾畸形抗原的癌症抗原。本发明的又一个实施方案涉及免疫治疗性组合物用于预防脊索瘤或延迟脊索瘤发作的用途，所述免疫治疗性组合物包含酵母媒介物和包含至少一种短尾畸形抗原的癌症抗原。
在本发明的这些实施方案的一个方面中，个体是具有不能切除的、局部复发性损伤的个体。在一个方面，所述损伤的局部复发在施用所述免疫治疗性组合物前3-9个月发生。在一个方面中，个体是具有寡转移性疾病的个体。在又一个方面中，个体是具有不能切除的损伤或能切除的损伤的第一次复发的个体。在又一个方面，个体是具有转移性疾病的个体。
在任何前述方面中，个体在治疗或者已经用另一种癌症疗法治疗。在任何前述方面中，疗法是放射疗法。可以在施用免疫治疗性组合物前，与施用免疫治疗性组合物同时和/或与施用免疫治疗性组合物序贯施用放射疗法。仍在任何前述方面中，疗法还可以包括肿瘤切除。仍在任何前述方面中，疗法还可以包括化学疗法。仍在任何前述方面中，疗法可以包括药物靶向疗法。在一个方面中，药物靶向疗法选自酪氨酸激酶抑制剂、EGFR抑制剂和STAT3抑制剂。仍在任何前述方面中，疗法可以包括施用一种或多种别的免疫治疗性组合物。在一个方面中，别的免疫治疗性组合物是酵母媒介物和与短尾畸形抗原不同的抗原。在又一个方面中，别的免疫治疗性组合物是酵母媒介物和选自下组的抗原：表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生的生长因子(PDGF)受体、kit受体、CD24、II和X型胶原、纤连蛋白、matrillin 3(MATN3)、高分子量黑素瘤关联抗原(HMW-MAA)、基质金属蛋白酶MMP-9和MMP-19。
本发明的另一个实施方案涉及在具有家族性脊索瘤史的个体中预防脊索瘤、延迟脊索瘤发作、或者改善脊索瘤后果的方法，其包括对所述个体施用免疫治疗性组合物。所述方法包括对具有家族性脊索瘤史的个体施用免疫治疗性组合物的步骤，所述免疫治疗性组合物包含：(a)酵母媒介物；和(b)包含至少一种短尾畸形抗原的癌症抗原；其中在施用时，个体尚未诊断出脊索瘤。
在任何实施方案的一个方面或上文或本文中别处描述的发明的各方面中，短尾畸形抗原是全长人短尾畸形。在一个方面中，短尾畸形抗原不是全长短尾畸形。在一个方面中，所述短尾畸形抗原具有以SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2至少95％相同的氨基酸序列。在一个方面中，所述短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2的至少1或2位至介于255位和C端之间。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18或SEQID NO:2的至少1或2位至介于430位和C端之间。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:2的246-254位。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:6的2-435位或与SEQ ID NO:6至少95％相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:18的2-435位或与SEQ ID NO:18至少95％相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2的2-435位或与SEQ ID NO:2至少95％相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:6的2-435位或与SEQ ID NO:6至少99％相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:18的2-435位或与SEQ ID NO:18至少99％相同的氨基酸序列。在一个方面中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2的2-435位或与SEQ ID NO:2至少99％相同的氨基酸序列。
在任何实施方案的一个方面或上文或本文中别处描述的发明的各方面中，癌症抗原是融合蛋白。在一个方面中，融合蛋白具有以SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8至少95％相同的氨基酸序列所示的氨基酸序列。在一个方面中，融合蛋白具有以SEQ ID NO:20或与SEQID NO:20至少95％相同的氨基酸序列所示的氨基酸序列。
在任何实施方案的一个方面或上文或本文中别处描述的发明的各方面中，酵母媒介物是完整的酵母。在任何前述方面中，完整的酵母是杀死的。在任一个前述方面中，完整的酵母是热灭活的。在任一个前述方面中，酵母表达抗原。在任一个前述方面中，酵母来自选自下组的属：酵母属、假丝酵母属、隐球菌属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母、红酵母属、裂殖酵母属和耶氏酵母属。在一个方面中，酵母来自酵母属。在一个方面中，酵母来自酿酒酵母。
在上文或本文中别处描述的发明的任何实施方案的任何前述方面中，所述组合物在适合于通过注射受试者施用的药学可接受赋形剂中配制。在任何前述方面中，以约0.1Y.U.-约100Y.U的剂量对所述受试者施用所述免疫治疗性组合物。在任何前述方面中，以约10Y.U.-约80Y.U的剂量对所述受试者施用所述免疫治疗性组合物。在任何前述方面中，以2Y.U.、40Y.U.或80Y.U的剂量对所述受试者施用所述免疫治疗性组合物。
在上文或本文中别处描述的发明的任何实施方案的任何前述方面中，每周施用所述免疫治疗性组合物。在任何前述方面中，每隔一周施用所述免疫治疗性组合物。在任何前述方面中，每月施用所述免疫治疗性组合物。在任何前述方面中，所述免疫治疗性组合物每周施用持续5周，接着每月施用。仍在任何前述方面中，所述免疫治疗性组合物以2周时间间隔施用持续7轮治疗，接着每月施用。在任何前述方面中，在所述个体上的超过一个部位处施用所述免疫治疗性组合物以形成单剂。
在上文或本文中别处描述的发明的任何实施方案的任何前述方面中，与另一种癌症疗法同时施用免疫治疗性组合物，如上文或别处描述的。
附图简述
图1显示了I期扩展研究中的个体受试者的肿瘤测量变化，其中对7名患者施用40Y.U.本文中公开的免疫治疗性组合物，特别是GI-6301。第0天的左侧的x-轴尺度与第0天的右侧的尺度不同。
发明详述
一般地，本发明涉及基于酵母的免疫治疗性组合物及基于酵母的免疫治疗性组合物用于预防和/或治疗脊索瘤的用途。本发明包括使用基于酵母的免疫治疗性组合物(又称为基于酵母的免疫疗法)，包括但不限于基于酵母的免疫疗法组合物，其包含酵母媒介物和短尾畸形抗原或其免疫原性域(在本文中又称为“酵母-短尾畸形免疫疗法”或“酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物”)。靶向短尾畸形的基于酵母的免疫疗法组合物已经详细记载于PCT公开文本No.WO 2012/125998，2012年9月30日公布，并且通过提及完整收入本文。发明人在本文中描述了基于酵母的免疫疗法，以及在本发明的一个方面中，基于酵母的短尾畸形免疫疗法用于治疗脊索瘤(例如经典(或常规)、软骨样(chondroid)或去分化脊索瘤)，和/或用于预防脊索瘤(例如家族性脊索瘤)或延迟脊索瘤(例如家族性脊索瘤)的发作的特定用途。
常规脊索瘤是最常见的脊索瘤类型。它们以软骨或别的间充质组分的缺乏为特征。软骨样脊索瘤含有脊索瘤和软骨特征两者，并且具有在颅底的蝶枕区形成的趋势。截止2007年，此变体占所有脊索瘤的5％-15％，并且颅脊索瘤的多达35％。在2％-8％脊索瘤中发生去分化或肉瘤转化(Chugh et al.,2007,The Oncologist 12:1344-1350)。软骨样脊索瘤比常规脊索瘤趋于具有更小的侵入性，而去分化的脊索瘤更具攻击性，更快速生长并且更可能转移(www.chordomafoundation.org)。
本发明的方法也容易适合于在相同酵母组合物中使用别的肿瘤抗原，或者与靶向脊索瘤肿瘤(在本文中又称为损伤)中存在的其它抗原的其它基于酵母的免疫治疗剂组合使用(序贯或同时)，或者与其它用于脊索瘤的治疗/疗法组合使用。可用于治疗或预防脊索瘤的别的肿瘤抗原和别的治疗/疗法在下文详细描述。
在本发明的方法中使用的描述的基于酵母的免疫疗法组合物诱导先天性免疫应答，及针对靶抗原(例如短尾畸形)的适应性免疫应答，包括CD4依赖性TH17和TH1T细胞应答和抗原特异性CD8+T细胞应答，其包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，都不使用外源佐剂、细胞因子或其它免疫刺激性分子，这些中的许多具有毒性问题。另外，基于酵母的免疫治疗性组合物抑制调节T细胞(Treg)数目和/或功能性，由此增强效应T细胞应答，其通常可以通过例如肿瘤的存在而受到抑制。此外，与通过产生抗体应答免疫的免疫治疗性组合物相比，认为由基于酵母的免疫疗法引发的抗原特异性、宽基础的且有力的免疫应答在靶向肿瘤细胞中特别有效。的确，许多研究已经显示了免疫治疗方法在肿瘤细胞经由在MHC I类分子的背景中识别肿瘤肽的CD8+CTL靶向时得到增强。
基于酵母的免疫疗法高度善于活化抗原呈递细胞，并且具有交叉引发免疫应答的独特能力，从而产生通常有效针对肿瘤的CD8+CTL应答，即使是面对在其它情况下可能为抑制环境的情形。由于此类免疫疗法利用抗原呈递细胞呈递相关免疫原的天然能力，没有必要知道产生依照本发明的有效免疫治疗剂的靶抗原(例如短尾畸形)的CTL表位或MHC II类表位的精确身份，尽管激动性表位可以包括在基于酵母的免疫治疗性组合物中以进一步增强免疫应答，如下文详细描述的。实际上，可以在单一基于酵母的免疫治疗性组合物中靶向多个CD4+和CD8+T细胞表位，因此本发明的基于酵母的免疫治疗剂不限于使用短肽，并且事实上，在这些组合物中使用较长的多肽和融合蛋白是有效的。因而，通过使用基于酵母的免疫疗法，消除了使用算法和复杂的公式鉴定推定的T细胞表位。
此外，基于酵母的免疫疗法可以在免疫方案(预防性或治疗性)中有效利用，而不使用外源佐剂、免疫刺激剂或分子、共刺激分子、或细胞因子，尽管若想要的话，此类药剂也可以包括在内。此外，可以在不损失效力的情况下重复施用基于酵母的免疫疗法，其在其它类型的免疫疗法中可能是有问题的。
用于治疗或预防脊索瘤的方法
本发明的一个实施方案涉及治疗脊索瘤的方法，其通过对具有脊索瘤的个体(受试者)施用本发明的基于酵母的免疫疗法组合物进行。用于脊索瘤的基于酵母的免疫疗法组合物在下文详细描述。如本文中使用的，“治疗”脊索瘤或其任何排列(例如“脊索瘤的治疗”等)一般指一旦发生了脊索瘤(例如一旦已经在个体中诊断或检测出脊索瘤)，或者一旦脊索瘤已经复发，以治疗的至少一种治疗目的(与缺乏此治疗的情况下相比)施用本发明的组合物，所述目的包括：改善脊索瘤的至少一种症状，诸如通过减低个体中的肿瘤负荷；抑制，降低，减少，或消除个体中的肿瘤生长或肿瘤生长速率(肿瘤生长动力学)；增加或延长个体的存活，其可以包括总体存活和/或无进展存活；改善肿瘤响应率(即如通过RECIST和/或Choi测量，下文定义)；延迟，抑制，停滞或预防肿瘤的复发；预防，抑制，逆转或延迟肿瘤迁移的形成和/或其它组织的肿瘤侵入(转移性癌症)；停滞，预防，抑制，逆转或延迟个体中的癌症进展；改善针对由脊索瘤表达的肿瘤抗原的长期记忆免疫应答；提高损伤对放射疗法、化学疗法和/或靶向药物疗法的敏感性；和/或改善个体的一般健康。如本文中使用的，术语“肿瘤”就脊索瘤而言可以与术语“损伤”互换使用。
本发明的另一个实施方案涉及预防脊索瘤，抑制或延迟脊索瘤的发作，或者改善脊索瘤的后果的方法(例如通过延长存活，通过抑制癌症进展，通过随时间降低或控制肿瘤负荷和/或提高肿瘤对化学疗法或放射疗法的敏感性)。此方法包括对个体施用基于酵母的免疫疗法组合物的步骤，所述个体目前没有脊索瘤，但是有或可能有形成脊索瘤的素因。例如，有形成脊索瘤的素因的个体可以包括具有脊索瘤的家族史(在本文中称为家族性脊索瘤)的个体，并且因此与整体的群体相比有更高的形成脊索瘤的风险。可能有形成脊索瘤的素因的个体也可以经由遗传筛选或者良性脊索肿瘤的存在来鉴定。家族性脊索瘤通常鉴定为在家族中发生的脊索瘤，其中两位以上的血亲亲戚具有脊索瘤史(Yang,X.,etal.Int.J.Cancer.116:487-491；2005)。在家族性脊索瘤的一些病例中，已经发现了独特的短尾畸形基因重复(Yang,X.,et al.Nat Gen.2009,41(11):1176-1178)。
“预防”或“防止”脊索瘤或其任何排列(例如“脊索瘤的预防”等)一般指以治疗的至少一种目的(与缺乏此治疗的情况下相比)在脊索瘤已经发生或形成前使用本发明的组合物，所述目的包括：预防脊索瘤或延迟脊索瘤的发作或形成，或者如果脊索瘤在治疗后仍然发生，那么与缺乏治疗的情况下相比至少改善个体中的后果，包括但不限于降低个体中的肿瘤负荷；抑制(降低，减少，消除)个体中的肿瘤生长或者肿瘤生长的速率；增加(延长)个体的存活，其可以包括总体存活和/或无进展存活；改善肿瘤响应率(即如通过RECIST和/或Choi测量，下文定义)；延迟，抑制，停滞或预防肿瘤的复发；预防，抑制，逆转或延迟肿瘤迁移的形成和/或其它组织的肿瘤侵入(转移性癌症)；停滞，预防，抑制，逆转或延迟个体中的癌症进展；改善针对由脊索瘤表达的肿瘤抗原的长期记忆免疫应答；提高肿瘤对放射疗法、化学疗法和/或靶向药物疗法的敏感性；和/或改善个体的一般健康。
如上文描述的，在本发明的一个实施方案中，用本发明的基于酵母的免疫疗法组合物治疗改善治疗受试者中的无进展存活(PFS)和/或总体存活(OS)。癌症中的无进展存活一般定义为癌症治疗期间和之后患者在具有癌症的情况下生存，但是癌症没有恶化(如由治疗临床医生和合适的癌症评估标准测定)的时间长度。癌症中的总体存活一般定义为从诊断日或开始治疗起患者仍然活着的时间长度，无论癌症是否已经进展(恶化)。
在本发明的一个实施方案中，用本发明的基于酵母的免疫疗法组合物治疗降低肿瘤生长率(肿瘤生长率动力学)。可以使用各种模型来计算肿瘤生长率，包括基于指数生长的模型(Yorke et al.,1993,Cancer Research 53,2987-2993)，Universal Law模型(Westet al.,2001,Nature 413,628-631)和/或“倍增时间”(细胞群体达到其大小两倍花费的时间；Spratt et al.,1964,Annals of surgery 159,161-171；Steele et al.,1973,TheJournal of thoracic and cardiovascular surgery 65,140-151；Collins et al.,1956,The American journal of roentgenology,radium therapy,and nuclearmedicine 76,988-1000。
在本发明的一个实施方案中，用本发明的基于酵母的免疫疗法组合物治疗改善受试者中的响应率，即如通过RECIST或Choi标准测量。“RECIST”指实体瘤响应评估标准，并且是限定癌症患者中的肿瘤何时改善、稳定化或进展的一组发布指南。RECIST定义的响应依赖于靶损伤的大小的变化，如通过非侵入性成像评估测定。RECIST标准最初在2000年2月通过国际合作发布，包括欧洲癌症研究和治疗组织(European Organization for Researchand Treatment of Cancer,EORTC)，美国国立癌症研究所(NCI)和加拿大临床试验组的国立癌症研究所(National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group)。(Therasse et al.,J.Natl.Cancer Inst.2000,92:205-216))，并且在2009年修订，如记载于Eisenhauer et al.,Eur.J.Cancer,2009,45:228-247的。如记载于Eisenhauer et al.,见上文，“完全响应”或CR目前定义为所有靶损伤的消失，任何病理学淋巴结(靶标或非靶标)的短轴下降到<10mm。“部分响应”或“PR”目前定义为靶损伤的直径的总和的至少30％降低，采用基线总和直径作为参照。“稳定疾病”或“SD”定义为既不是足以符合PR的皱缩，又不是足以符合PD的增加，采用研究期间的最小总和直径作为参照。“进行性疾病”或“PD”定义为靶损伤的直径总和的至少20％增加，采用研究时的最小总和作为参照。另外，总和还必须证明至少5mm的绝对增加。认为一个或多个新损伤的出现也是进展。别的标准适用于非靶损伤，如记载于Eisenhauer et al.见上文。
“Choi”标准指最初由Choi等(J.Clin.Oncol.2007,25(13):1753-1759)描述的计算断层摄影术响应标准集，并且评估靶损伤的大小或密度的变化，如通过CT测量。Choi标准还使用CR、PR、SD和PD分组分类患者。CR定义为所有损伤消失，没有新的损伤。PR定义为尺寸缩小>10％或在CT上肿瘤减弱降低(decrease in tumor attenuation)>15％，没有新的损伤并且没有明显的测量不到的疾病的进展。SD定义为不满足CR、PR或PD的标准，并且没有归因于肿瘤进展的症状性恶化。PD定义为肿瘤尺寸增加>10％，并且根据CT上的肿瘤减弱，不满足PR标准，和/或具有新的损伤。
在本发明的一个实施方案中，用本发明的基于酵母的免疫疗法组合物治疗改善针对由脊索瘤表达的肿瘤抗原的长期记忆免疫应答。可以如下评估针对脊索瘤和脊索瘤肿瘤抗原的免疫应答：检测治疗后的CD4+和/或CD8+T细胞出现或扩充，并且测量一般免疫活化的参数，包括外周血中的免疫细胞子集的频率(CD8+记忆/效应T细胞、CD4+记忆/效应T细胞、Tregs、NK细胞、DC)和细胞因子的血液水平的变化(例如IFN-γ,IL-10,IL-12,IL-2,IL-4,TGF-β等)。可以使用本领域中已知的各种免疫学测定法检测并评估免疫应答，包括但不限于ELISpot响应、流式细胞测定方法、和淋巴细胞增殖测定法(LPA)。
如上文讨论，脊索瘤以短尾畸形的表达为特征，并且实际上短尾畸形是此癌症的区别性生物标志物，即短尾畸形表达是所有脊索瘤共同的且特异性的生物标志物。因此，在一个实施方案中，如上文或本文中别处描述的本发明的任何方法中施用的酵母免疫疗法组合物是酵母-短尾畸形免疫疗法组合物(下文详细描述)。因此，本发明的方法包括如下的步骤：对具有脊索瘤的个体或有风险形成脊索瘤，但是目前没有检出短尾畸形表达癌细胞的个体施用如本文中描述的酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物，其包含但不限于：(a)酵母媒介物；和(b)包含至少一种短尾畸形抗原的癌症抗原。本发明包括对受试者或个体投递(施用，免疫)本发明的基于酵母的免疫治疗性组合物，其包含但不限于酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物。施用过程可以离体或在体内实施，但是通常在体内实施。离体施用指在患者外部实施调节步骤的一部分，诸如在一定条件下对从患者取出的细胞(树突细胞)群体施用本发明的组合物，从而将酵母媒介物、抗原和任何其它药剂或组合物加载到细胞中，并且将细胞返回到患者。可以通过任何合适的施用模式将本发明的治疗性组合物返回到患者，或对患者施用。
组合物的施用可以是系统性的、粘膜的和/或靶位点位置附近的(例如，肿瘤部位附近)。合适的施用途径对本领域技术人员而言是显然的。各种可接受的施用方法包括，但不限于静脉内施用、腹膜内施用、肌肉内施用、结内施用、冠状动脉内施用、动脉内施用(例如到颈动脉中)、皮下施用、经皮递送、气管内施用、关节内施用、脑室内(intraventricular)施用、吸入(例如气溶胶)、颅内、脊柱内、眼内、耳、鼻内、口服、肺施用、导管浸渍(impregnation)及直接注射入组织。在一个方面中，施用途径包括：静脉内、腹膜内、皮下、皮内、结内、肌肉内、经皮、吸入、鼻内、口服、眼内、关节内、颅内和脊柱内。胃肠外递送可包括皮内、肌肉内、腹膜内、胸膜内、肺内、静脉内、皮下、心房导管和静脉导管途径。耳递送可包括滴耳剂，鼻内递送可包括滴鼻剂或鼻内注射，眼内递送可包括滴眼剂。也可以利用本领域的标准方法进行气溶胶(吸入)递送(参见例如Stribling et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA189:11277-11281,1992)进行。在一个方面中，皮下施用本发明的基于酵母的免疫治疗性组合物。对肿瘤环境直接施用在一个方面中，the基于酵母的免疫治疗性组合物。在一个方面中，鞘内施用本发明的基于酵母的免疫治疗性组合物。
一般地，基于酵母的免疫治疗性组合物(包括酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物)的合适的单剂是在合适的时间段里施用一次或多次时能够以有效引发针对一种或多种肿瘤抗原或表位(例如,短尾畸形)的抗原特异性免疫应答的量对患者身体的给定细胞类型、组织或区域有效提供酵母媒介物和抗原的剂量。例如，在一个实施方案中，本发明的基于酵母的组合物的单剂是施用组合物的生物体的每千克体重的约1 x 105至约5 x 107个酵母细胞等同物。在一个方面中，本发明的酵母媒介物的单剂是每剂(即每个生物体)约0.1酵母单位(Y.U.，其是1 x 106个酵母细胞或酵母等同物)至约100Y.U.(1 x 109个细胞)，包括任何中间剂量，增量为0.1 x 106个细胞(即1.1 x 106,1.2 x 106,1.3 x 106...)。在一个实施方案中，剂量包括1Y.U-40Y.U.的剂量、1Y.U.-50Y.U.的剂量、1Y.U.-60Y.U.的剂量、1Y.U.-70Y.U.的剂量、或1Y.U.-80Y.U.的剂量，并且在一个方面中，10Y.U.-40Y.U.、50Y.U.、60Y.U.、70Y.U.或80Y.U.的剂量。在一个实施方案中，在个体上的不同部位，但是在相同给药期期间施用剂量。例如，可以通过在一个给药期期间对个体上的4个不同部位注射10Y.U.剂量施用40Y.U.剂量，或者可以在相同给药期期间通过对个体上的4个不同部位注射5Y.U.剂量，或者通过在个体上的2个不同部位注射10Y.U.剂量施用20Y.U.剂量。本发明包括在个体上的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多个部位施用一定量的基于酵母的免疫疗法组合物(例如1,2,3,4,5,6,7,8,910,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20Y.U.或更多)以形成单剂。1个酵母单位(Y.U.)是1 x 107个酵母细胞或酵母细胞等同物。
例如，在针对抗原的免疫应答已经减弱或者根据需要为了针对特定的一种或多种抗原提供免疫应答或诱导记忆应答时，施用本发明的免疫治疗性组合物的“加强剂”或“加强”。根据治疗的个体的状态和施用时的疗法目的(例如预防、活性治疗、维持)，可以在初始施用后相隔约1,2,3,4,5,6,7,或8周，或者每月，每两个月，每季，每年，和/或在几年或数年增量中施用加强剂。在一个实施方案中，施用日程表是如下的：其中在数周至数月，至数年的时间段里将基于酵母的免疫治疗性组合物的剂量施用至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多次。在一个实施方案中，剂量每周或每两周施用1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多剂，接着根据需要是每两周或每月剂量，以实现用于脊索瘤的期望的预防性或治疗性处理。在一个实施方案中，每两周施用剂量，持续1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多剂，接着是额外的每月剂量，直到实现期望的预防或治疗结果。在一个实施方案中，每月施用剂量，持续1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多剂，接着是额外的每月剂量或接着是根据需要以不同频率投递的剂量，以实现用于脊索瘤的期望的预防性或治疗性处理。在本文中描述的所有给药方案中，然后可以以相似或更长的时间间隔(例如数月或数年)给予额外的加强剂作为维持或消退疗法(若想要的话)。在一个方面中，施用加强剂用于长期维持疗法(即，在完成疗法的主要过程后，意图是阻止或延迟疾病的复发，或者意图是维持疾病稳定性)。在一个方面中，施用加强剂用于具有家族性脊索瘤的个体的预防性处理。
在治疗脊索瘤的方法的一个方面中，另外用至少一种可用于治疗脊索瘤的其它治疗性化合物或治疗性方案治疗个体。此类疗法可以包括任何治疗性方案或或使用任何治疗性化合物或药剂，其对于治疗脊索瘤有用或者对于治疗脊索瘤可能有用，包括但不限于手术切除、放射疗法(包括但不限于独立的放射疗法和辅助放射疗法，特别是基于强子的放射疗法)、化学疗法或靶向癌症或药物疗法(例如酪氨酸激酶抑制剂，包括但不限于伊马替尼、舒尼替尼、西妥昔单抗(cetuximab)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、尼洛替尼(nilotinib)、达沙替尼(dasatinib)、拉帕替尼(lapatinib)和依维莫司(everolimus)；STAT3抑制剂、蒽环类抗生素(anthracyclines)；顺铂；烷化剂；喜树碱类似物)、干细胞转移、细胞因子疗法、过继T细胞转移、和/或施用第二种免疫治疗性组合物。在施用第二种免疫治疗性组合物的情况中，此类组合物可以包含但不限于别的基于酵母的免疫疗法、基于重组病毒的免疫疗法(病毒载体)、免疫刺激剂疗法(包括具有免疫刺激特性的化学疗法)、DNA疫苗和其它免疫疗法组合物。
在一个方面中，可以在施用本发明的免疫治疗性组合物之前、同时和/或序贯施用放射疗法。另外，可以与手术切除组合施用放射疗法。放射技术和治疗的进展已经产生用较高剂量的放射对损伤的更要害性(strategic)的靶向。另外，诸如引入强子(即高剂量质子或带电颗粒，包括碳离子、氦或氖)等的进展已经导致在对周围组织的最小损害的情况下对靶标投递的更高剂量(会永久损伤正常组织的剂量)的放射，并且改善放射生物学效果(Walcott,B.The Lacent Oncology,Vol 13 Feb 2012,p.e69-e79)。例如，对碳离子放射疗法用于骶骨脊索瘤的用途的回顾分析报告了52.8-73.6 GyE的剂量(Imai et al.,2011,J.Radiol.,84:S048-S054)。称作质子束疗法的另一类放射(其利用质子(获自氢原子的带电颗粒)最常推荐用于脊索瘤患者，因为它容许对肿瘤投递非常高剂量的放射，同时使对仅离几毫米的组织的剂量最小化(参见例如Wilson,Radiology,1946,47:487-491；及Hug etal.,1999,J.Neurosurgery 91,432-439(1999))。对个体肿瘤定制质子束投递，从而在组织中最大的质子穿透点处沉积放射能量，对超出靶标的正常组织的放射较小。通常通过由外部束放射投递的质子放射(例如电磁放射)也用于治疗脊索瘤。脊索瘤治疗中使用的高剂量的质子放射可以是约45-80Gy，而用常规放射疗法的质粒通常为约40-60 Gy的剂量量(Walcott,B.The Lacent Onccology,Vol 13 Feb 2012,p.e69-e79)。某些其它类型的适形放射(conformal radiation)，诸如放射外科手术(包括伽马刀和CyberKnife)和强度调节性放射疗法(IMRT)也用于治疗脊索瘤，并且其使用通常依赖于肿瘤的大小和位置(Di Maioet al.,2011,J Neurosurg.Dec；115(6):1094-105)。若损伤在初始照射后复发，则有可能或不可能再次具有放射疗法。这是因为身体中的每种组织具有放射的某个终生最大耐受，超出该终生最大耐受会发生严重损伤。然而，在本发明的方法中，如果治疗临床医生和目前的最佳实践认为它可能并且或许对脊索瘤患者有益，那么可以在方案中包括额外的损伤放射。
在一个方面中，在受试者接受本发明的免疫治疗性组合物的施用前约18个月、约17个月、约16个月、约15个月、约14个月、约13个月、约12个月、约11个月、约10个月、约9个月、约8个月、约7个月、约6个月、约5个月、约4个月、约3个月、约2个月、或约1个月内对一个或多个损伤施用放射疗法。在放射疗法期间，受试者可以接受至少1剂、至少2剂、至少3剂、至少4剂、至少5剂、至少6剂、至少7剂、至少8剂、至少9剂或至少10剂放射疗法。另外，在第一次施用免疫治疗性组合物后，受试者可以接受一剂或多剂放射疗法。
在另一个方面，受试者可以接受单独的靶向药物疗法或者在放射疗法之前、同时或序贯施用。此类靶向药物疗法可以包括施用一种或多种酪氨酸激酶(TKI)抑制剂药物、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂药物和/或信号转导物物和转录活化物3(STAT3)抑制剂药物(Walcott,B.The Lacent Onccology,Vol13 Feb 2012,p.e69-e79)。例如，可以对受试者施用400mg/天-800mg/天的甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)
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(一种对血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)的激酶域具有特异性的小分子TKI抑制剂药物)，通常为口服剂量。可以监测总体肿瘤响应率(如通过RECIST定义)以测定受试者是否在响应疗法。可以从几天至几年对受试者施用甲磺酸伊马替尼(Stacchiotti,S.,et al.Curr Oncol Rep,May 2011 online；Casali,P.G.,J Clinical Oncology,2005 ASCO Annual MeetingProceedings,Vol.23.No.16S)。靶向药物疗法的另一个例子包括对受试者施用150mg/天剂量的厄洛替尼
Figure BDA0000848106730000152
(一种EGFR抑制剂药物)，通常为口服剂量(Lauay et al.BMCCancer,2011,11:423)。可以从几天至几年施用厄洛替尼，监测总体肿瘤。靶向药物疗法可以单独或与另一种靶向药物疗法组合施用，或者在施用另一种药物疗法之前、同时或序贯施用。
在一个方面中，第二种免疫治疗性组合物包括不包含短尾畸形抗原的第二种癌症抗原。例如，可用于组合酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物的第二种免疫治疗性组合物是包含另一种癌症抗原的酵母-免疫治疗性组合物。已经与脊索瘤肿瘤联系起来或者在脊索瘤肿瘤中观察到的癌症抗原作为本发明中的抗原靶物是特别感兴趣的。此类癌症抗原可以包含但不限于表皮生长因子受体(EGFR)(参见例如Harris et al.,Breast CancerRes.Treat,29:1-2(1994)；血小板衍生的生长因子(PDGF)受体(参见例如
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登录号GI:129890和Gronwald et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85(10),3435-3439；及
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登录号GI:129892和Claesson-Welsh et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(13),4917-4921)；kit受体(参见例如登录号GI:125472和Yarden et al.,1987,EMBO J.6(11),3341-3351)；CD24(参见例如GI:143811372和Kay etal.,1991,J.Immunol.147(4),1412-1416)；聚集蛋白聚糖(aggrecan)(参见例如登录号GI:22209083和Strausberg et al.,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26),16899-16903)；II&X型胶原(参见例如登录号GI:124056489和Su et al.,1989,Nucleic AcidsRes.17(22),9473；及登录号GI:1405723和Beier et al.,1996,Matrix Biol.15(6),415-422)；纤连蛋白(参见例如登录号GI:384872704和Labeit and Kolmerer,1995,Science270(5234),293-296(1995))；,matrillin 3(MATN3)(参见例如登录号GI:14548113和Belluoccio et al.,1998,Genomics 53(3),391-394)；,高分子量黑素瘤关联抗原(HMW-MAA)(参见例如登录号GI:47419930和Campoli et al.,2004,Crit Rev Immunol.24(4):267-96)；,基质金属蛋白酶MMP-9(参见例如登录号GI:269849668和Huhtala et al.,1991,J.Biol.Chem.266(25),16485-16490)；,及MMP-19(参见例如登录号GI:442535505和Sedlacek et al.,1998,Immunobiology 198(4):408–23)；及此类抗原的修饰、此类抗原的剪接变体、和此类抗原的表位激动剂、及此类抗原的组合、和/或其免疫原性域、其修饰、及其变体。其它癌症抗原是本领域中已知的，并且也可以是适合于脊索瘤的免疫疗法的靶抗原。本发明不限于上文或本文中别处明确描述的抗原。
在本发明的一个方面中，与施用基于酵母的免疫疗法组合物序贯和/或同时实施一种或多种别的治疗剂或治疗方案(例如手术切除肿瘤、施用放射疗法、施用化学疗法或靶向癌症疗法、施用另一种免疫疗法组合物或方案、细胞因子疗法、过继T细胞转移、可用于组合基于酵母的免疫疗法或干细胞移植的药剂)。可用于组合根据本发明的基于酵母的免疫疗法组合物的药剂包括但不限于：抗-CD40、CD40L、淋巴细胞活化基因3(LAG3)蛋白和/或IMP321(源自LAG3的可溶性形式的T细胞免疫刺激因子)、抗-CTLA-4抗体(例如以释放无变应性T细胞)；T细胞共刺激物(例如，抗CD137、抗CD28、抗CD40)；阿仑珠单抗(alemtuzumab)(例如
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)、denileukin diftitox(例如
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)；抗-CD4；抗-CD25；抗-PD-1、抗-PD-L1、抗-PD-L2；阻断FOXP3的药剂(例如以消除活性/杀伤CD4+/CD25+T调节细胞)；Flt3配体，咪喹莫特(imiquimod)(AldaraTM)，Toll样受体(TLR)激动剂，包括但不限于TLR-2激动剂，TLR-4激动剂，TLR-7激动剂，和TLR-9激动剂；TLR拮抗剂，包括但不限于TLR-2拮抗剂，TLR-4拮抗剂，TLR-7拮抗剂，和TLR-9拮抗剂；抗炎剂和免疫调控剂，包括但不限于COX-2抑制剂(例如Celecoxib，NSAIDS)、糖皮质激素、他汀(statins)、和沙立度胺(thalidomide)及其类似物，包括
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(其是沙立度胺的结构和功能类似物(例如
Figure BDA0000848106730000174
(来那度胺(lenalidomide))，
Figure BDA0000848106730000173
(pomalidomide))和任何下述药剂，该药剂调控抗原呈递细胞或TH17、TH1、和/或Treg细胞的数目，调控抗原呈递细胞或TH17、TH1、和/或Treg细胞的活化状态，和/或调控抗原呈递细胞或TH17、TH1、和/或Treg细胞的存活。本发明涵盖此类药剂的任何组合，并且与基于酵母的免疫治疗剂组合或在方案中与基于酵母的免疫治疗剂一起(例如，同时，序贯或以其它形式)施用的任何此类药剂是本发明涵盖的组合物。此类药剂是本领域中公知的。这些药剂可以单独或与本文中描述的其它药剂组合使用。另外，一种或多种疗法可以在第一剂基于酵母的免疫疗法组合物前或在施用第一剂后施用或实施。作为一个例子，对于具有可以切除的脊索瘤的个体，手术切除，任选地接着是放射疗法，然后是基于酵母的免疫疗法可以代表疗法过程。在一个实施方案中，可以与基于酵母的免疫疗法组合物的给药以交替的方式施用或实施一种或多种疗法，诸如在下述方案中，其中基于酵母的组合物在一剂或连续几剂的化学疗法或其它靶向疗法之间以规定的时间间隔施用。作为另一个例子，对于具有局部复发的脊索瘤或者具有转移性疾病的个体(其中肿瘤进展已经在先前的12个月内，或者在开始治疗前的最后3-9个月内发生)，基于酵母的免疫疗法可以代表主要的疗法过程。在开始用基于酵母的免疫疗法治疗前，个体还可以接受手术、放射疗法或另一种脊索瘤疗法。在启动基于酵母的免疫疗法后约6个月(或者在如治疗内科医生确定的适当时间点时)，任选地，如果确定受试者具有可以照射的损伤，那么可以给予放射疗法，接着监测，直到确定肿瘤进展，或者对疗法的部分或完全响应。如果没有给予额外的放射疗法，那么可以监测受试者，直到确定肿瘤进展，或对疗法的部分或完全响应。
在一个实施方案中，在开始别的疗法前的一段时间里在一剂或多剂中施用基于酵母的免疫疗法组合物。换言之，基于酵母的免疫治疗性组合物作为单一疗法施用一段时间，然后与新剂量的基于酵母的免疫疗法同时，或者与基于酵母的免疫疗法以交替方式添加别的疗法(例如化学疗法)。或者/另外，可以在开始基于酵母的免疫疗法组合物施用前施用另一种疗法达一段时间，并且可以组合构思(例如肿瘤的手术切除，接着用基于酵母的免疫疗法进行单一疗法达几周，接着是交替剂量的化学疗法或靶向疗法和基于酵母的免疫疗法达几周或几个月，任选地接着是使用基于酵母的免疫疗法的单一疗法或另一种疗法，或者接着是序贯、同时或以交替方式提供的疗法组合的新方案)。本发明涵盖使用基于酵母的免疫疗法治疗脊索瘤的各种方案，并且应当认为这些例子是各个可能方案的非限制性例子。
在本发明的方法中，要用本发明的免疫治疗性组合物治疗的受试者可以是具有不能切除的损伤的第一次发生(即不能完全手术除去)或者能切除的损伤的脊索瘤受试者；具有不能切除的局部复发性损伤的受试者(即局部复发是在与已经除去的初始或原发性损伤的相同位置附近(处于或接近该位置)再出现的损伤)，无论第一次复发与否；具有如下文描述的寡转移性疾病的受试者；或具有如下文描述的转移性疾病的受试者。在一个方面中，受试者可以已经或尚未具有先前的放射疗法、手术和/或靶向药物疗法。在另一个方面，先前可以已经或尚未照射损伤。
在本发明的方法中，要用本发明的免疫治疗性组合物治疗的脊索瘤受试者的一个例子是具有不能切除的(即不能被完全手术除去)、局部复发性损伤(即局部复发是在与已经除去的初始或原发性损伤的相同位置附近(处于或接近该位置)再出现的损伤)的受试者。在一个方面中，先前尚未照射不能切除的损伤，然而，在用本发明的免疫治疗性组合物治疗前，可以已经或尚未将受试者在其它位置处暴露于放射疗法。在又一个方面，在用本发明的免疫治疗性组合物治疗前先前已经照射不能切除的损伤。在另一个实施方案中，受试者具有由于损伤位置而不能切除的的损伤，但是可以已经接受用于脊索瘤的一种或多种别的治疗性处理。
在本发明的方法中，要用本发明的免疫治疗性组合物治疗的脊索瘤受试者的另一个例子是具有寡转移性疾病和不能切除的损伤的受试者。如本文中使用的，“寡转移性疾病”定义为受限的肿瘤转移能力，或更具体地，转移性癌症(已经从起源的原发性部位扩散到其它部位的癌症)，其中转移(转移性损伤或转移性肿瘤)在数目和位置上受限(参见例如Hellman and Weichselbaum,1995,J.Clin.Oncol.13(1):8-10；Weichselbaum andHellman,2011,S.Nat.Rev.Clin.Oncol.8,378–382)。就脊索瘤而言，一般认为寡转移性疾病构成原发性损伤部位附近发生的5或更少，4或更少，3或更少，2或更少，或1个损伤。在一个方面中，先前尚未照射不能切除的损伤，然而，在用本发明的免疫治疗性组合物治疗前，可以已经或尚未将受试者在其它位置处暴露于放射疗法。在又一个方面，在用本发明的免疫治疗性组合物治疗前先前已经照射不能切除的损伤。
在本发明的方法中，要用本发明的免疫治疗性组合物治疗的脊索瘤受试者的另一个例子是具有寡转移性疾病和切除后损伤(即监测的损伤的手术除去)的受试者。在一个方面中，受试者先前尚未接受放射疗法。在另一个方面，受试者已经接受先前的放射疗法。
在本发明的方法中，要用本发明的免疫治疗性组合物治疗的脊索瘤受试者的又一个例子是具有不能切除的损伤的第一次发生的受试者。在一个方面中，先前尚未照射不能切除的损伤，然而，在用本发明的免疫治疗性组合物治疗前，可以已经或尚未将受试者在其它位置处暴露于放射疗法。在又一个方面，在用本发明的免疫治疗性组合物治疗前先前已经照射不能切除的损伤。
在本发明的方法中，要用本发明的免疫治疗性组合物治疗的脊索瘤受试者的另一个例子是具有转移性疾病(即，癌症已经从其首先开始的地方或原发性部位扩散到身体中的另一个位置，其特征在于癌症含有源自初始或原发性肿瘤的细胞)和先前尚未照射的损伤的受试者。在另一个方面，先前已经照射损伤。
在本发明的方法中，要用本发明的免疫治疗性组合物治疗的脊索瘤受试者的另一个例子是具有局部复发性或转移性疾病的受试者，肿瘤进展在用本发明的免疫治疗性组合物开始治疗前3-9个月发生。在一个方面中，受试者可以已经接受用于脊索瘤的任何可接受疗法线，包括但不限于手术、放射、化学疗法或用靶向药物疗法治疗。受试者接受如本文中描述的基于酵母的免疫治疗性组合物。在启动免疫治疗性组合物后6个月时，护理提供者可以评估受试者以确定他们是否具有可以照射的损伤。若可以照射损伤，则会用放射疗法治疗损伤，并且会监测并评估受试者，直到认为受试者响应下文讨论的免疫治疗性组合物。若不能照射损伤，则受试者不会接受放射疗法，并且会监测和评估受试者，直到认为受试者响应免疫治疗性组合物。通过测定如通过RECIST限定的无进展存活(PFS)，以及通过肿瘤响应率(通过RECIST和Choi限定，并且在照射和非照射损伤中评估以进行比较)和/或肿瘤生长速率动力学(在免疫治疗处理之前6个月对免疫治疗处理之后6个月时评估)，认为患者响应免疫治疗性组合物。对于PFS，与非治疗对照受试者(预期5个月)相比，预期中值是9个月。可以与以相同方式治疗，但是没有添加免疫治疗性组合物或与二线疗法(诸如放射疗法、手术切除、靶向药物疗法或其组合)组合的免疫治疗性组合物的受试者比较受试者对免疫治疗性组合物的响应。
可以用本发明的免疫治疗性组合物治疗的受试者可以包括具有下列一项或多项的受试者：实体瘤的存在、可测量疾病(疾病必须可评估)或测量不到的疾病、根据高灵敏性方法(诸如用于循环肿瘤细胞的基于PCR的测定法或其它类似的方法)的疾病阳性、东部协作肿瘤学组(ECOG)状态等级0-1(其中0级指示完全活性，能够在没有限制的情况下继续所有疾病前行为，并且1级指示身体费力活动受限但能走动，并且能够进行轻或静坐性质的工作)、肌酸酐水平</-1.5xULN(正常的上限)、ALT水平(丙氨酸氨基转移酶)</-2.5xULN、AST水平(天冬氨酸氨基转移酶)</-2.5xULN、胆红素(Bili)水平</-1.5xULN、绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)>1500、血小板计数>100,000、从在先化学疗法治疗、先前免疫疗法或其组合起最小值2周。
在本发明的方法中，可以对任何动物施用组合物和治疗性组合物，包括任何脊椎动物，特别是脊椎动物纲、哺乳纲的任何成员，包括但不限于灵长类、啮齿动物、家畜和家庭宠物。家畜包括被食用或能产生有用产品的哺乳动物(例如，用于生产羊毛的绵羊)。可以利用发明治疗或保护的哺乳动物包括人、非人灵长类、犬、猫、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、马和猪。
“个体”是脊椎动物，比如哺乳动物，包括但不限于人。哺乳动物包括，但不限于农场动物、体育运动动物、宠物、灵长类、小鼠和大鼠。术语“个体”可以与术语“动物”、“受试者”或“患者”交换使用。
在本发明的方法中使用的组合物
本发明的方法利用基于酵母的免疫疗法组合物，并且在一个实施方案中为酵母-短尾畸形免疫疗法组合物。根据本发明，可用于本发明的基于酵母的免疫疗法组合物是组合物，其包含：(a)酵母媒介物(下文详细描述)；和(b)至少一种癌症抗原。癌症抗原是由脊索瘤表达的抗原，包括但不限于短尾畸形、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板衍生的生长因子(PDGF)受体(A或B)、kit受体、CD24、聚集蛋白聚糖、II&X型胶原、纤连蛋白、matrillin 3、高分子量黑素瘤关联抗原(HMW-MAA)、基质金属蛋白酶MMP-9和MMP-19。在酵母-短尾畸形免疫疗法组合物的情况中，组合物包含：(a)酵母媒介物；和(b)癌症抗原，其包含一种或多种短尾畸形抗原和/或其免疫原性域。癌症抗原(其可以包括短尾畸形抗原和/或其它脊索瘤表达抗原)最通常是由酵母媒介物表达为重组蛋白(例如，由完整酵母或者酵母原生质球，任选进一步加工为酵母胞质体、酵母空胞，或者酵母膜提取物或其组分)，虽然本发明的实施方案也包括将一或多个癌症抗原装载到酵母媒介物中，或者象文中描述的以其他方式与酵母媒介物复合、附着或混合或共同施用，从而形成本发明的组合物。
“酵母-短尾畸形免疫治疗组合物”是含有至少一个短尾畸形抗原或其免疫原性域的特定类型的“基于酵母的免疫治疗组合物”。短语“基于酵母的免疫治疗组合物”可以与“基于酵母的免疫治疗产物”、“基于酵母的免疫治疗组合物”、“基于酵母的组合物”、“基于酵母的免疫治疗剂”、“基于酵母的疫苗”或者这些短语的派生形式交换使用。“免疫治疗组合物”是能够在受试对象中引发免疫反应，实现至少一个治疗好处的组合物。用于本文，基于酵母的免疫治疗组合物是指包含酵母媒介物成分并且在受试对象中引发能实现至少一个治疗好处的免疫反应的组合物。更具体地说，基于酵母的免疫治疗组合物是这样的组合物，所述组合物包含酵母媒介物成分，通常还有抗原成分，可以引发或诱发免疫反应，比如细胞免疫反应，包括但不限于T细胞介导的细胞免疫反应。在一个方面中，可以用于发明的基于酵母的免疫治疗组合物能够诱发CD8+和/或CD4+T细胞介导的免疫反应，并且在一个方面中，特别是抗目标抗原(例如癌抗原)的CD8+和CD4+T细胞介导的免疫反应。CD4+免疫反应可以包括TH1免疫反应、TH2免疫反应、TH17免疫反应或者以上的任意组合。基于酵母的免疫治疗剂尤其能够生成TH1和TH17反应。CD8+免疫反应可以包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，基于酵母的没有治疗剂能够生成这样的反应。在一个方面中，基于酵母的免疫治疗组合物调理受试对象中调节性T细胞(Tregs)的数量和/或功能。还可以通过例如添加细胞因子、抗体和/或调理酵母的生产过程来改造基于酵母的免疫疗法，从而促进一类反应超过另一类。任选地，基于酵母的免疫治疗组合物能够引发体液免疫反应。当抗原呈递在酵母外部，诸如在酵母表面上附着或者作为混合物时，基于酵母的免疫治疗性组合物可以引发体液免疫应答。
本发明的基于酵母的免疫治疗性组合物可以是“预防性”或“治疗性”。在预防性提供时，在脊索瘤的形成进展或检测到脊索瘤的形成中提供本发明的组合物，其目的是预防、抑制或延迟脊索瘤的形成或发作；和/或预防、抑制或延迟肿瘤迁移和/或其它组织的肿瘤侵入(转移)和/或一般阻止或抑制给中的脊索瘤进展。如本文中讨论的，短尾畸形在所有脊索瘤中表达，并且是脊索瘤的标志，因此酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物特别可用作可能形成脊索瘤的个体中的预防性疗法。可以对个体施用预防性组合物，所述个体表现为无癌症(健康的，或正常的个体)，但是有或可能有风险形成脊索瘤，诸如具有家族性脊索瘤史或在其它情况下具有至少一名具有脊索瘤的紧密家族成员的个体。在治疗性提供时，对具有脊索瘤的个体提供免疫疗法组合物，其目的是改善癌症，诸如通过降低个体中的肿瘤负荷；抑制个体中的肿瘤生长；延长个体的存活；预防、抑制、逆转或延迟肿瘤迁移和/或其它组织的肿瘤侵入(转移)的形成和/或预防、抑制、逆转或延迟个体中的癌症进展。
通常，基于酵母的免疫疗法组合物包含酵母媒介物和至少一种包含脊索瘤抗原(与脊索瘤有关或由脊索瘤表达的癌症抗原)的癌症抗原，其中脊索瘤抗原由酵母媒介物表达，附着于酵母媒介物，加载到酵母媒介物中，或者与酵母媒介物混合。在一些实施方案中，脊索瘤抗体作为融合蛋白提供。如本文中讨论的，脊索瘤抗原可以包括但不限于短尾畸形、EGFR、PDGF受体、kit受体、CD24、聚集蛋白聚糖、II&X型胶原、纤连蛋白、matrillin 3、高分子量黑素瘤关联抗原(HMW-MAA)、基质金属蛋白酶MMP-9和MMP-19。下文描述了适合用于本发明的组合物和方法的几种短尾畸形蛋白和融合蛋白。在本发明的一个方面中，可用作脊索瘤的癌症抗原的融合蛋白可以包含两种或更多种抗原，例如短尾畸形抗原和不是短尾畸形抗原的另一种癌症抗原，其在一个实施方案中可以在单一融合蛋白内，或者两种不同短尾畸形抗原提供。
根据本发明，用于治疗或预防脊索瘤的基于酵母的免疫治疗组合物的酵母媒介物是任何酵母细胞(例如整个或完整细胞)或其衍生物(见下文)，可以与一或多个抗原、期免疫原性域或其表位在发明的组合物(例如治疗或预防性组合物)中联用。因此酵母媒介物可以包括，但不限于活的完整(整个)酵母微生物(即具有包括细胞壁在内的所有成分的酵母细胞)、被杀死(死的)或者灭活的完整酵母微生物，或者完整酵母的衍生物，包括:原生质球(即缺少细胞壁的酵母细胞)、酵母胞质体(即缺少细胞壁和细胞核的酵母细胞)、酵母空胞(即缺少细胞壁、细胞核和细胞质的酵母细胞)、亚细胞酵母膜提取物或其组分(又被称为酵母膜颗粒，以前被称为亚细胞酵母颗粒)、任何其他酵母颗粒或者酵母细胞壁制备物。
酵母原生质球通常是通过对酵母细胞壁进行酶解产生的。这类方法在例如Franzusoff et al.,1991,Meth.Enzymol.194,662-674中有描述，该文献通过引用全部并入本文。
酵母胞质体通常是通过酵母细胞去核仁产生的。这类方法在例如Coon,1978,Natl.Cancer Inst.Monogr.48,45-55中有描述，该文献通过引用全部并入本文。
酵母空胞(ghosts)通常是通过将发生通透化或者裂解的细胞重新密封产生的，可以但不必须含有该细胞的至少部分细胞器。这类方法在例如Franzusoff et al.,1983,J.Biol.Chem.258,3608-3614和Bussey et al.,1979,Biochim.Biophys.Acta 553,185-196中有描述，每个文献都通过引用全部并入本文。
酵母膜颗粒(亚细胞酵母膜提取物或其组分)是指缺少天然细胞核或细胞质的酵母膜。颗粒可以是任何大小，大小的范围包括从天然酵母膜到通过超声处理或其他本领域技术人员已知的膜破碎方法产生的微颗粒，然后重新密封。产生亚细胞酵母膜提取物的方法在例如Franzusoff et al.,1991,Meth.Enzymol.194,662-674中有描述。还可以使用含有酵母膜部分的酵母膜颗粒组分，以及如果抗原或其他蛋白是在制备酵母膜颗粒之前由酵母重组表达的，可以使用抗原或其他目标蛋白。抗原或其他目标蛋白可以被运送到膜内，或者膜表面或者它们的组合(即，蛋白可以是膜内或者膜外的，和/或跨酵母膜颗粒的膜)。在一个实施方案中，酵母膜颗粒是重组酵母膜颗粒，所述重组酵母膜颗粒可以是完整的、破碎的或者破碎并重新密封的酵母膜，所述酵母膜包含位于膜表面或者至少部分镶嵌在膜内的至少一个所需抗原或其他目标蛋白。
酵母细胞壁制备物的一个例子是带有抗原的分离酵母细胞壁制品，所述抗原在细胞壁表面或者至少部分嵌在细胞壁内，这样将所述酵母细胞壁制备物给予动物时，会刺激抗疾病目标的所需免疫反应。
可以使用任何酵母株来产生用于本发明的酵母媒介物。酵母是单细胞微生物，属于以下三类之一：子囊菌纲、担子菌纲或半知菌纲。选择作为免疫调节剂的酵母的类型时一个考虑是酵母的病原性。在一个实施方案中，酵母是诸如酿酒酵母的非致病菌株。选择非致病酵母菌株最小化了带给被给予酵母媒介物的个体的任何不良效应。但是，如果酵母的致病性可以通过本领域技术人员已知的任何手段(例如突变菌株)抵消，则可以使用致病酵母。根据本发明的一个方面，使用的是非致病性酵母株。
可以用于本发明的酵母菌株的属包括，但不限于糖酵母属、假丝酵母属(有可能是病原性的)、隐球菌属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、裂殖酵母属和耶氏酵母属。在一个方面中，酵母的属选自糖酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属或裂殖酵母属；并且在一个方面中，使用了糖酵母属。可以用于本发明的酵母株的种包括，但不限于酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、白色假丝酵母、克菲假丝酵母(Candida kefyr)、热带假丝酵母、罗伦特隐球菌(Cryptococcus laurentii)、新型隐球菌、异常汉逊酵母、多形汉逊酵母、脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母马克斯变种、巴斯德毕赤酵母、深红酵母、粟酒裂殖酵母和解脂耶氏酵母。应当理解，这些种中有许多包括多种亚种、型、亚型等，它们都是意图包括在以上提到的种中的。在一个方面中，用于发明的酵母种包括酿酒酵母、白色假丝酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母和粟酒裂殖酵母。酿酒酵母很有用因为它相对容易操作，并且对于作为食品添加剂被“通常认为是安全的”或"GRAS"(GRAS,FDA proposed Rule 62FR18938,April 17,1997)。本发明的一个实施方案是能够将质粒复制到特别高拷贝数的酵母株，比如酿酒酵母cir°株。该酿酒酵母株是这样的菌株，所述菌株能够支持高水平表达一或多个目标抗原和/或抗原融合蛋白和/或其他蛋白的表达载体。可以用于本发明的另一个酵母株是酿酒酵母W303α。此外，本发明中可以使用任何突变酵母株，包括那些表现出对所表达的目标抗原或其他蛋白的翻译后修饰减少(比如延伸N端连接糖基化的酶发生突变)的菌株。
发明的基于酵母的免疫治疗组合物包含至少一个由脊索瘤表达或与脊索瘤有关的抗原。根据本发明，本文中术语“抗原”的一般使用是指蛋白的任何部分(例如，肽、部分蛋白、全长蛋白)，其中所述蛋白对于细胞组成(完整细胞、细胞裂解物或破碎的细胞)、生物体(完整生物体、裂解物或破碎的细胞)、或者碳水化合物或者其他分子或者它们的部分来说是自然存在的或者合成来源或设计的。抗原可以引发针对与免疫系统组成成分(例如，T细胞、抗体)遇到的相同或相似的抗原的抗原特异性免疫反应(例如，体液和/或细胞介导的免疫反应)。
抗原可以小到单个表位、单个免疫原性域，或者更大一些，包括多个表位或免疫原性域。因此抗原的大小可以只有大约8-11个氨基酸(即，肽)，也可以达到全长蛋白、多聚体、融合蛋白、嵌合蛋白、完整细胞、完整微生物或其任何部分(例如，完整细胞的蛋白片段(多肽)裂解物或者微生物的提取物)。可以用于本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗剂的抗原是肽、多肽、全长蛋白、聚合物、融合蛋白和嵌合蛋白。此外，抗原可以包含碳水化合物，可以被载入酵母媒介物或者本发明的组合物中。可以理解在一些实施方案(例如，当抗原是由酵母媒介物从重组核酸分子表达的)中，抗原是蛋白、融合蛋白、嵌合蛋白、或者它们的片段，而不是完整的细胞或微生物。在酵母中表达时，如果抗原是要被酵母表达的整个蛋白，抗原处于能在酵母中重组表达的最小体积，通常长度是至少或大于25个氨基酸、或至少或大于26、至少或大于27、至少或大于28、至少或大于29、至少或大于30、至少或大于31、至少或大于32、至少或大于33、至少或大于34、至少或大于35、至少或大于36、至少或大于37、至少或大于38、至少或大于39、至少或大于40、至少或大于41、至少或大于42、至少或大于43、至少或大于44、至少或大于45、至少或大于46、至少或大于47、至少或大于48、至少或大于49或者至少或大于50个氨基酸，或者至少或大于25-50个氨基酸长、至少或大于30-50个氨基酸长、或者至少或大于35-50个氨基酸长、或者至少或大于40-50个氨基酸长、或者至少或大于45-50个氨基酸长，虽然可以表达较小的蛋白，也可以表达颇大的蛋白(例如，长几百个氨基酸，甚至几千个氨基酸)。在一个方面中，可以表达全长蛋白或者N和/或C端缺少1到20个氨基酸的蛋白。融合蛋白和嵌合蛋白也是本发明可以表达的抗原。“靶抗原”是被本发明的免疫治疗组合物特异靶向的抗原(即，希望引起针对它的免疫反应的抗原)。“癌抗原”是包含至少一个与癌症(例如脊索瘤)相关或由癌症(例如脊索瘤)表达的抗原，比如肿瘤细胞表达的抗原，从而靶向所述抗原即可靶向癌症。癌抗原可以包含来自一或多个蛋白(包括一或多个肿瘤相关蛋白)的一或多个抗原。“短尾畸形抗原”是由短尾畸形蛋白衍生、设计或生成的抗原。
提到免疫反应的刺激时，术语“免疫原”是术语“抗原”的子集，因此在一些情况中，可以与术语“抗原”交换使用。用于本文的免疫原描述了能够引发体液和/或细胞介导的免疫反应(即是免疫原性的)的抗原，因此将免疫原给予个体会发动抗原特异性免疫反应，针对与个体免疫系统遭遇的相同或相似的抗原。在一个实施方案中，免疫原引发细胞介导的免疫反应，包括CD4+T细胞反应(例如，TH1,TH2和/或TH17)和/或CD8+T细胞反应(例如，CTL反应)。
给定抗原的“免疫原性域”可以是抗原中含有至少一个在给予动物时能够作为免疫原的表位的任何部分、片段或表位(例如，肽片段或亚基或抗体表位或其他构象表位)。因此，免疫原性域大于单个氨基酸，大小要至少足够含有可以作为免疫原的至少一个表位。例如，单个蛋白可以含有多个不同的免疫原性域。免疫原性域不需要是蛋白内的线性序列，比如在体液免疫反应的情况中，考虑了构象结构域。
表位在本文定义为给定抗原中的单个免疫原性位点，所述免疫原性位点在被提供给免疫系统(对于合适的共刺激信号的情况)和/或免疫系统的活化细胞时足以引发免疫反应。换句话说，表位是抗原中被免疫系统成分识别的部分，还可以被称为抗原决定簇。本领域技术人员可以认识到T细胞表位与B细胞或者抗体表位的大小和组成不同，通过I型MHC途径呈递的表位与通过II型MHC途径呈递的表位在大小和结构特性上不同。例如，通过I型MHC分子呈递的T细胞表位通常长度在8-11氨基酸，而通过II型MHC分子呈递的表位的长度没有太多限制，可以达到25个氨基酸或更长。此外，根据表位结合的特定MHC分子，T细胞表位有预测得到的结构特点。表位可以是线性序列表位或者构象表位(保守结合区)。多数抗体识别构象表位。
在本发明的一个实施方案中，用于本发明的基于酵母的免疫疗法组合物是酵母-短尾畸形免疫疗法组合物。短尾畸形(还可以被称为“T”)蛋白在多种不同动物物种之间高度保守，是含有“T-box”结构域或“T域”的转录因子，所述“T-box”结构域或“T域”是几种不同蛋白中共有的DNA结合结构域基元，统称为T-box蛋白家族。人短尾畸形在1996年首次被克隆(Edwards et al.，同前)。编码人短尾畸形的一个核苷酸序列在文中以SEQ ID NO:1代表，该序列是从
Figure BDA0000848106730000271
Accession No.NM_003181(GI:19743811)获得的mRNA序列。SEQ ID NO:1编码435个氨基酸的人短尾畸形蛋白,其氨基酸序列在此以SEQ ID NO:2表示(还可见于
Figure BDA0000848106730000272
Accession No.NP_003172；GI:4507339)。
本文公开的另一个人短尾畸形蛋白是SEQ ID NO:2所代表的人短尾畸形蛋白的变体，具有氨基酸序列SEQ ID NO:6。同样是435个氨基酸的蛋白SEQ ID NO:6由SEQ ID NO:5所代表的核苷酸序列编码。SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:2在蛋白全长上大概99％相同。SEQID NO:6与SEQ ID NO:2的不同在位点177(分别是Asp vs.Gly)、位点368(分别是Thrvs.Ser)和位点409(分别是Asn vs.Asp)。
例如，本文公开的另一个人短尾畸形蛋白是SEQ NO:2或SEQ ID NO:6所代表的人短尾畸形蛋白的激动剂。作为一般性的用法，“激动剂”是包含但不限于小分子、蛋白、肽、抗体、核酸结合剂等的任何化合物或药剂，它们能够结合受体或配体并产生或引发反应，激动剂可以包括模拟或增强那些与受体或配体结合的天然物质的作用的药剂。用于本发明的短尾畸形抗原的语境时，“激动性”抗原或蛋白是指包含至少一个T细胞激动性表位的抗原或蛋白，又被称为“模拟表位(mimotope)”。模拟表位肽是模拟野生型表位的结构的肽，并且作为激动剂，模拟表位可以模拟或增强天然表位的作用(生物学功能)。例如，氨基酸序列SEQID NO:12(WLLPGTSTL)是野生型短尾畸形蛋白的T细胞表位。氨基酸序列SEQ ID NO:13(WLLPGTSTV)是T细胞表位SEQ ID NO:12的模拟表位或激动剂，其中SEQ ID NO:12的第9位的亮氨酸用SEQ ID NO:13中的缬氨酸取代。
一个人短尾畸形激动性抗原在此以SEQ ID NO:18代表。SEQ ID NO:18是由SEQ IDNO:17所代表的核苷酸序列编码的435个氨基酸的蛋白。除了(SEQ ID NO:6)位点254的亮氨酸被取代为SEQ ID NO:18中的缬氨酸，SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:6相同。这一取代在SEQID NO:18的位点246-254形成一个T细胞激动性表位，不希望受到理论的束缚，但相信该表位与野生型表位(SEQ ID NO:6的位点246-254)相比，能够诱导增强的抗短尾畸形的T细胞反应。
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18中的任何一个的位点41-223代表人短尾畸形的T-box DNA结合结构域，通过与这些序列的比较，可以容易地鉴定到其他短尾畸形序列，包括来自其他物种的短尾畸形序列中的T-box结构域。用于本文，提到本文描述的或者本领域已知并且用于本发明的任何短尾畸形蛋白的T-box结构域，可以在限定的T-box结构域的N末端和/或C末端(例如在SEQ ID NOs:2、6或18的位点41-223的任何一端)包含短尾畸形序列的另外1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39or 40个连续氨基酸。人短尾畸形(包括这里描述的两个人短尾畸形蛋白)还含有各种CD4+和CD8+T细胞表位。这类表位在例如WO2008/106551中已有描述，包含位于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的位点246-254的CD8+CTL表位WLLPGTSTL(文中又被称为Tp2，SEQ ID NO:12)。正如以上讨论的，SEQ ID NO:18包含SEQ ID NO:12的激动性表位，在文中以SEQ ID NO:13代表。
人短尾畸形与来自其他动物物种的短尾畸形有非常高的特异性，因此在制备本发明的酵母-短尾畸形免疫治疗组合物时可以使用来自其他生物的短尾畸形序列，特别是当这些序列是相同的、基本同源的并且能引发抗目标抗原(例如由肿瘤细胞表达的天然短尾畸形)的有效免疫反应时。例如，小鼠短尾畸形首次由Hermann及其同事在1990年克隆(Hermann et al.,同前)与人短尾畸形在核苷酸水平上大概85％相同，在氨基酸水平上大概91％相同。就来自其他动物的短尾畸形来说，在氨基酸水平上，人短尾畸形与来自黑猩猩(Pan troglodytes)的短尾畸形99.5％相同，与来自家犬(Canis lupus familiaris)的短尾畸形90.1％相同，与来自野牛(Bos Taurus)的短尾畸形88.5％相同，与来自褐鼠(Rattusnorvegicus)的短尾畸形92.2％相同，与来自原鸡(Gallus gallus)的短尾畸形80.9％相同。在短尾畸形中含有T-box结构域的氨基酸1-223中，小鼠和人短尾畸形只有两个氨基酸不同(位点26和96)。编码小鼠短尾畸形的核苷酸序列在文中以SEQ ID NO:3代表，它是从
Figure BDA0000848106730000281
Accession No.NM_009309(GI:118130357)获得的mRNA序列。SEQ ID NO:3编码一个436个氨基酸的小鼠短尾畸形蛋白，其氨基酸序列在此以SEQ ID NO:4代表。SEQ IDNO:4的位点41-223代表小鼠短尾畸形的T-box DNA结合结构域。
在发明的一个实施方案中，短尾畸形抗原包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:18或者它们的至少一个免疫原性域所代表的氨基酸序列，或者由它们构成。在一个实施方案中，短尾畸形抗原包含两个、三个、四个、五个或更多个短尾畸形免疫原性域，或者由它们构成。在发明的一个实施方案中，短尾畸形抗原包含以SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的氨基酸位点1或2到C端最后25个氨基酸中的一个(即，到SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的位点441-435中的任何一个，或者到SEQ ID NO:4的位点442-436中的任何一个)为代表的氨基酸序列，或者由它们构成。另一个可以用于发明的短尾畸形抗原还包括短尾畸形的至少氨基酸位点1-223(例如，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的位点1-223)或者短尾畸形的位点41-223(例如，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的位点41-223)。另一个可用于发明的短尾畸形抗原包含从至少SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:18的氨基酸位点1到85到位点255和C端之间。另一个可用于发明的短尾畸形抗原包含从至少SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的氨基酸位点1到85到位点430和C端之间。另一个可用于发明的短尾畸形抗原包含从至少SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18的氨基酸位点1、2、3、4、5、6、7、8、9或10到位点255和C端之间。
根据本发明的任何实施方案，提到“全长”蛋白(或者全长功能结构域或全长免疫结构域)包括象本文描述的或者其他方式已知的或者在已公开序列中描述的所述蛋白或功能结构域或免疫结构域的全长氨基酸序列。“接近全长的”的蛋白或结构域也是蛋白的一种同源物，与全长蛋白或结构域的不同在于在所述全长蛋白或全长结构域的N和/或C端有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的添加或缺失或省略。作为一个例子，文中描述的几个融合蛋白包含“接近全长的”短尾畸形抗原，因为抗原省略了位点1的甲硫氨酸并取代了N端肽。一般性提及蛋白或结构域或抗原可以包括全长和接近全长的蛋白，以及它们的其他同源物。
在任何涉及用于治疗或预防脊索瘤的方法中使用的抗原的实施方案的一个方面中，癌抗原(脊索瘤抗原)处于使得抗原能被酵母表达的最小大小。为了在酵母中表达，蛋白通常长度是至少约25个氨基酸，虽然更小的蛋白可以被表达，大得多的蛋白也可以被酵母表达。例如，可以用于本发明的短尾畸形抗原是可以被酵母重组表达的短尾畸形蛋白片段，含有短尾畸形的至少一个免疫原性域，可以包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18中任何一个的至少一个免疫原性域。在一个方面中，这样的抗原至少25个氨基酸长，并且含有脊索瘤抗原，诸如短尾畸形的至少一个免疫原性域。在一个方面中，这样的抗原至少30个氨基酸长，并且含有脊索瘤抗原，诸如短尾畸形的至少一个免疫原性域。。在一个方面中，这样的抗原至少25-50个氨基酸长，并且含有癌抗原的至少一个免疫原性域。在一个方面中，这样的抗原至少30-50个氨基酸长，并且含有癌抗原的至少一个免疫原性域。在一个方面中，这样的抗原至少35-50个氨基酸长，并且含有癌抗原的至少一个免疫原性域。在一个方面中，这样的抗原至少40-50个氨基酸长，并且含有癌抗原的至少一个免疫原性域。在一个方面中，这样的抗原至少45-50个氨基酸长，并且含有癌抗原的至少一个免疫原性域。在一个实施方案中，可以用于本发明的癌抗原长度是至少25个氨基酸，或者长度是至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175,180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425或者430个氨基酸，其就短尾畸形抗原而言可以包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:18中至少任何这些长度的任何片段。
在一个方面中，可用于本发明的方法的抗原包含一或多个CTL表位，可能包括文中描述的CTL表位中的任何一个、两个、三个或更多个的两个或以上拷贝。在一个方面中，抗原包含一或多个CD4+T细胞表位。T细胞在一个方面中，抗原包含一或多个CTL表位和一或多个CD4+T细胞表位。在一个方面中，T细胞表位是激动性表位。
在一个方面中，短尾畸形抗原包含氨基酸序列WLLPGTSTL(SEQ ID NO:12，还被SEQID NO:2或SEQ ID NO:6的位点245-254代表)。在一个方面中，短尾畸形抗原包含氨基酸序列WLLPGTSTV(SEQ ID NO:13,还被SEQ ID NO:18的位点245-254代表)。在一个方面中，SEQID NO：12或SEQ ID NO:13位点4的氨基酸(在这些序列中是脯氨酸或P)被丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)取代。
在一个方面中，短尾畸形抗原包含氨基酸序列SQYPSLWSV(SEQ ID NO:14)。在一个方面中，SEQ ID NO:14位点2的氨基酸(在该序列中是谷氨酰胺或Q)被亮氨酸(L)取代。在一个方面中，SEQ ID NO:14位点4的氨基酸(在该序列中是脯氨酸或P)被丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、亮氨酸(L)或缬氨酸(V)取代。在一个方面中，SEQ ID NO:14位点7的氨基酸(在该序列中是色氨酸或W)被缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)取代。在一个方面中，SEQ ID NO:14位点9的氨基酸(在该序列中是缬氨酸或V)被亮氨酸(L)取代。发明考虑了这样的抗原，所述抗原包含具有SEQ ID NO:14中这些取代的一或多个的任意组合的序列。
在一个方面中，短尾畸形抗原包含氨基酸序列RLIASWTPV(SEQ ID NO:15)。在一个方面中，SEQ ID NO:15位点1的氨基酸(在该序列中是精氨酸或R)被酪氨酸(Y)或色氨酸(W)取代。在一个方面中，SEQ ID NO:15位点6的氨基酸(在该序列中是色氨酸或W)被缬氨酸(V)、赖氨酸(L)、异亮氨酸(I)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)取代。发明考虑了这样的抗原，所述抗原包含具有SEQ ID NO:15中这些取代的一或多个的任意组合的序列。
在一个方面中，短尾畸形抗原包含氨基酸序列AMYSFLLDFV(SEQ ID NO:16)。在一个方面中，SEQ ID NO:16位点2的氨基酸(在该序列中是甲硫氨酸或M)被取代为亮氨酸(L)。
在发明的一个实施方案中，短尾畸形抗原包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的融合蛋白，基本由其构成，或者由其构成。SEQ ID NO:8的融合蛋白是一个单一多肽，含有从N到C端符合读框地融合的以下序列：(1)N端肽，赋予对在酵母中的蛋白酶体降解抗性和表达稳定性(SEQ ID NO:8的位点1-6)；(2)由SEQ ID NO:6的氨基酸2-435构成的人短尾畸形抗原(SEQ ID NO:8的位点7-440)；和(3)六组氨酸标签(SEQ ID NO:8的位点441-446)。氨基酸序列SEQ ID NO:8由多核苷酸序列SEQ ID NO:7编码。在此融合蛋白中使用的氨基酸序列可以通过使用在短尾畸形抗原的任一端侧翼的额外或交替氨基酸修饰(若想要的话)，并且也可以使用短尾畸形的较短部分。
在发明的另一个实施方案中，短尾畸形抗原包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的融合蛋白，基本由其构成，或者由其构成。SEQ ID NO:10的融合蛋白是一个单一多肽，含有从N到C端符合读框地融合的以下序列：(1)N端肽，赋予对在酵母中的蛋白酶体降解抗性和表达稳定性(SEQ ID NO:10的位点1-6)；(2)由SEQ ID NO:4的位点2-435构成的小鼠短尾畸形抗原(SEQ ID NO:10的位点7-441)；和(3)六组氨酸标签(SEQ ID NO:10的位点442-447)。氨基酸序列SEQ ID NO:10由多核苷酸序列SEQ ID NO:9编码。
在发明的另一个实施方案中，短尾畸形抗原包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:20的融合蛋白，基本由其构成，或者由其构成。SEQ ID NO:20的融合蛋白是一个单一多肽，含有从N到C端符合读框地融合的以下序列：(1)N端肽，赋予对在酵母中的蛋白酶体降解抗性和表达稳定性(SEQ ID NO:20的位点1-6，该肽序列在文中还被SEQ ID NO:11所代表)；(2)SEQID NO:18的氨基酸2-435(SEQ ID NO:20的位点7-440)，SEQ ID NO:18代表全长人短尾畸形激动剂蛋白；和(3)六组氨酸标签(SEQ ID NO:20的位点441-446)。激动性表位(SEQ ID NO:13)位于SEQ ID NO：20的位点251-259(SEQ ID NO:18的位点246-254)。氨基酸序列SEQ IDNO:20由多核苷酸序列SEQ ID NO:19编码。
可用于在根据本发明的方法中使用的组合物的抗原还包括这样的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列与文中描述的任何癌症蛋白或癌症抗原的氨基酸序列在蛋白全长上，或者对于形成蛋白的一部分的限定片段或其结构域(例如，免疫学结构域或者功能结构域(具有至少一个生物活性的结构域))来说，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。例如，文中描述的短尾畸形蛋白的结构域包括T-box结构域。以上已经详细描述了免疫结构域。
在发明的一些方面中，可以对野生型或参照蛋白的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多个氨基酸进行氨基酸插入、缺失和/或取代，只要得到的蛋白在作为本发明的基于酵母的免疫治疗组合物中的抗原时能够象野生型或参照蛋白一样引发抗天然蛋白的免疫反应，所述免疫反应可以包括增强的免疫反应、减弱的免疫反应或者基本类似的免疫反应。例如，发明包括使用激动性抗原，包括短尾畸形激动性抗原，所述抗原可以包括一或多个这样的T细胞表位，所述T细胞表位经过突变能够增强抗激动剂的T细胞反应，比如通过提高表位对MHC分子或者对就MHC递呈来说的识别表位的T细胞受体的亲合力或亲和力。因此抗原激动剂可以提高抗肿瘤细胞表达的天然抗原的T细胞反应的效力或效率。具有SEQID NO:18的氨基酸序列的短尾畸形抗原是短尾畸形激动剂(或包含激动性表位的短尾畸形抗原)的一个非限制性例子。
此外，对于SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:20的融合蛋白来说，诸如以上描述的N端表达序列和C端标签是任选的，但可以从文中其他地方描述的几个不同序列中选择从而提高或协助蛋白的表达、稳定性和/或鉴定和/或纯化。还有许多适合在酵母中使用的不同启动子是本领域已知的。而且，可以为了多种原因在包含癌症抗原的融合蛋白部分之间引入短的间隔连接序列(例如，1、2、3、4或5个氨基酸肽)，包括引入限制酶切位点以便有助于克隆、作为宿主吞噬体蛋白酶的切割位点、加快蛋白或抗原加工，以及将来对构建体的操作。
任选地，作为本发明的基于酵母的免疫治疗组合物的成分使用的蛋白(包括融合蛋白)是利用抗原构建体产生的，所述抗原构建体特别适用于提高或稳定酵母中的异源抗原的表达。在一个实施方案中，需要的抗原蛋白或肽在N端与下述融合:(a)特定的合成肽，能够稳定融合蛋白在酵母媒介物中的表达或者防止所表达的融合蛋白的翻译后修饰(这类肽在例如2004年8月12日公开的美国专利公开2004-0156858 A1中有详细描述，该文献通过引用全部并入本文)；(b)内源酵母蛋白的至少一部分，包括但不限于酵母α因子前导序列，其中融合伙伴中的任意一个提供提高的蛋白在酵母中表达的稳定性和/或防止酵母细胞对蛋白的翻译后修饰(这类蛋白在美国专利公开2004-0156858 A1中也有详细描述，同前)；和/或(c)酵母蛋白的至少一部分，所述蛋白导致融合蛋白表达在酵母表面(例如，文中更详细描述的Aga蛋白)。此外，本发明任选包括抗原编码构建体C端融合的肽的使用，抗原编码构建体，特别是用于蛋白的选择和鉴定。这类肽包括，但不限于任何合成的或天然肽，比如肽标签(例如，6X His或六肽)或者任何其他短表位肽。根据发明，附着在抗原C端的肽可以和或者不和以上讨论的N端肽一起使用，反之亦然。
在一个实施方案中，融合蛋白包含氨基酸序列M-X2-X3-X4-X5-X6，其中M是甲硫氨酸；其中X2是除了甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸或精氨酸的任何氨基酸；其中X3是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸的任何氨基酸；其中X4是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸的任何氨基酸；其中X5是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸的任何氨基酸；其中X6是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸的任何氨基酸。在一个实施方案中，X6残基是脯氨酸。能够提高抗原在酵母细胞中表达稳定性和/或防止蛋白在酵母中的翻译后修饰的一个示范性合成序列包括序列M-A-D-E-A-P(文中以SEQ ID NO:11代表)。除了更高的表达产物稳定性，该融合伙伴似乎不会负面影响抗构建体中免疫抗原的免疫反应。此外，可以设计合成融合肽来提供能被选择剂(比如抗体)识别的表位。
发明考虑了制备酵母媒介物和用酵母媒介物表达并与抗原和/或其他蛋白和/或目标药剂组合和/或结合从而产生基于酵母的免疫治疗组合物的方法。
根据本发明，术语“酵母媒介物-抗原复合体”或“酵母-抗原复合体”用于一般性描述酵母媒介物与抗原的任何结合，并且可以与“基于酵母的免疫治疗组合物”在所述组合物被用于如上所述引发免疫反应的情况下交换使用。这种结合包括由酵母(重组酵母)表达抗原、将抗原引入酵母、抗原与酵母的物理附着，和酵母与抗原在比如缓冲液或其他溶液或制剂中的混合。以下详细描述了这些类型的复合体。
在一个实施方案中，用于制备酵母媒介物的酵母细胞与编码蛋白(例如抗原)的异源核酸分子一起转染，从而由酵母细胞表达蛋白。这样的酵母在本文又被称为重组酵母或重组酵母媒介物。然后可以将酵母细胞与药学可接受的赋形剂成剂并直接给予患者、保持用于以后给药，或者装载到树突细胞中作为完整细胞。还可以将酵母细胞杀死，或者通过形成酵母原生质球、胞质、空胞或亚细胞颗粒进行衍生化，之后将上述衍生物中的任何一种保存、给药或者装载到树突细胞中。为了产生能够表达抗原或其他蛋白的重组原生质球，还可以直接用重组核酸分子转染酵母原生质球(例如，由整个酵母产生原生质球，然后转染)。能够重组表达抗原的酵母细胞或酵母原生质球可以用于制备包含酵母胞质、酵母空胞或酵母膜颗粒或酵母细胞壁颗粒或者它们的部分的酵母媒介物。
一般来说，酵母媒介物或抗原和/或其他药剂可以通过本文描述的任何技术进行结合。在一个方面中，用抗原和/或药剂胞内装载酵母媒介物。在另一个方面中，抗原和/或药剂共价地或者非共价地附着酵母媒介物。在再一个方面中，酵母媒介物和抗原和/或药剂通过混合来结合。另一个方面中，在一个实施方案中，抗原和/或药剂是由酵母媒介物或酵母细胞或者衍生酵母媒介物的酵母原生质球重组表达。
由本发明的酵母媒介物产生的抗原和/或其他蛋白的数量是可以通过酵母媒介物合理产生的任何抗原和/或其他蛋白数量，通常在至少一个到至少大约6个或更多个，包括大约2个到大约6个异源抗原和/或其他蛋白。
抗原或其他蛋白在本发明的酵母媒介物中的表达是利用本领域技术人员已知的技术实现的。简单来说，将编码至少一个所需抗原或其他蛋白的核酸分子插入表达载体，其方式使得核酸分子与转录调控序列可操纵地连接，从而在转化到宿主酵母细胞中时，能够影响核酸分子的组成性表达或调控表达。编码一或多个抗原和/或其他蛋白的核酸分子可以在一或多个表达载体上与一或多个表达调控序列可操纵地连接。特别重要的表达调控序列是那些控制转录起始的序列，比如启动子和上游激活序列。任何合适的酵母启动子都可以用于本发明，许多这样的启动子是本领域技术人员已知的。用于酿酒酵母表达的启动子包括，但不限于编码以下酵母蛋白的基因的启动子：乙醇脱氢酶I(ADH1)或II(ADH2)、CUP1、磷酸甘油酸激酶(PGK)、磷酸丙酮异构酶(TPI)、翻译延伸因子EF-1α(TEF2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH；又被称为TDH3，代表磷酸丙酮脱氢酶)、半乳糖激酶(GAL1)、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GAL7),UDP-半乳糖表异构酶(GAL10)、细胞色素c1(CYC1)、Sec7蛋白(SEC7)和酸性磷酸酶(PHO5)，包括诸如ADH2/GAPDH和CYC1/GAL10启动子的杂合启动子，包括细胞内的葡萄糖浓度低(例如，大约百分之0.1到大约百分之0.2)时被诱导的ADH2/GAPDH启动子，以及CUP1启动子和TEF2启动子。同样的，多个上游激活序列(UASs)，又被称为增强子是已知的。用于酿酒酵母表达的上游激活序列包括，但不限于编码以下蛋白的基因的UASs：PCK1、TPI、TDH3、CYC1、ADH1、ADH2、SUC2、GAL1、GAL7和GAL10，以及被GAL4基因产物活化的其他UASs，一个方面中使用的是ADH2UAS。因为ADH2UAS被ADR1基因产物所激活，当异源基因与ADH21UAS可操纵地连接时，优选用ADH2UAS来过表达ADR1基因。用于酿酒酵母表达的转录终止序列包括α因子、GAPDH或CYC1基因的终止序列。
用于在甲基营养型酵母中表达基因的转录调控序列包括编码乙醇氧化酶和甲酸脱氢酶的基因的转录调控区。
根据本发明，核酸分子转染酵母细胞可以通过任何核酸分子导入细胞的方法来实现，包括但不限于扩散、主动运输、浴超声处理、电穿孔、微量注射、脂质转染、吸附和原生质体融合。被转染的核酸分子可以利用本领域技术人员已知的技术整合到酵母染色体中或者维持在染色体外的载体中。带有这样的核酸分子的酵母媒介物的例子在文中有详细公开。正如以上讨论的，还可以通过用所需核酸分子转染完整的酵母微生物或酵母原生质球从而重组产生酵母胞质体、酵母空胞和酵母膜颗粒或者细胞壁制品，在其中产生抗原，然后利用本领域技术人员已知的技术进一步操纵微生物或原生质球，产生含有所需抗原或其他蛋白的胞质、空胞或亚细胞酵母膜提取物或其部分。
产生重组酵母媒介物并由酵母媒介物表达抗原和/或其他蛋白的有效条件包括可以培养酵母菌株的有效培养基。有效培养基通常是包含可同化的碳水化合物、氮和磷源，以及合适的盐、矿物质、金属和其他营养(比如维生素和生长因子)的水样培养基。培养基可以包含复杂营养或者是限定的基础培养基。本发明的酵母株可以培养在多种容器内，包括但不限于生物反应器、锥形瓶、试管、微量滴定板和培养皿。培养在适合酵母菌株的温度、pH和氧气含量下进行。这些培养条件是本领域技术人员的专业知识范围内的(参见例如，Guthrie et al.(eds.),1991,Methods in Enzymology,vol.194,Academic Press,SanDiego)。例如，在一个方案中，可以用从酵母-短尾畸形免疫治疗组合物的起始培养板和/或起始培养物获得的培养物接种含有合适培养基的液体培养物，在30℃，250rpm搅拌培养约20小时。然后将原生培养物按照需要扩增到更大的培养物。蛋白从酵母所转化的载体的表达(例如，短尾畸形表达)可以是组成型的，如果使用的是组成型启动子；或者可以通过加入对启动子适合的诱导条件来诱导，如果所用启动子是诱导型启动子(例如，对CUP1启动子的情况，硫酸铜)。在诱导型启动子的情况中，蛋白表达的诱导可以在培养物生长到合适的细胞密度后开始，所述合适的细胞密度可以是大约0.2Y.U./ml或更高。
在本发明的一个方面，可用于本发明的酵母-短尾畸形免疫疗法组合物酵母-短尾畸形免疫疗法组合物，其包含在CUP1启动子的控制下表达以SEQ ID NO:8所示的人短尾畸形融合蛋白的多核苷酸的酵母酿酒酵母，在本文中称为GI-6301。在另一个方面，可用于本发明的酵母-短尾畸形免疫疗法组合物是酵母-短尾畸形免疫疗法组合物，其包含在TEF2启动子的控制下表达以SEQ ID NO:8所示的人短尾畸形融合蛋白的多核苷酸(在载体plu011中)的酵母酿酒酵母，在本文中称为GI-6302。在另一个方面，可用于本发明的酵母-短尾畸形免疫疗法组合物是酵母-短尾畸形免疫疗法组合物，其包含在TEF2启动子的控制下表达以SEQ ID NO:8所示的人短尾畸形融合蛋白的多核苷酸(在载体pGI-172中)的酵母酿酒酵母，在本文中称为GI-6303。在又一个方面，可用于本发明的酵母-短尾畸形免疫疗法组合物是酵母-短尾畸形免疫疗法组合物，其包含在CUP1启动子的控制下表达以SEQ ID NO:20所示的人短尾畸形激动剂融合蛋白的多核苷酸的酵母酿酒酵母，在本文中称为GI-6305。
在本发明的一个实施方案中，作为在酵母媒介物中重组表达抗原或其他蛋白的一个替代方法，将酵母媒介物胞内装载蛋白或肽，或者碳水化合物或其他分子，这些装载的分子可以作为本发明的抗原和/或作为免疫调节剂或生物反应调节剂。随后可以将现在胞内含有抗原和/或其他蛋白的酵母媒介物给予个体或装载到载体(比如树突细胞)中。肽和蛋白可以通过本领域技术人员已知的技术直接插入到酵母媒介物中，比如通过扩散、主动运输、脂质体融合、电穿孔、胞吞、冻融循环和浴超声处理。可以直接装载肽、蛋白、碳水化合物或其他分子的酵母媒介物包括完整酵母，以及原生质球、空胞或胞质，它们可以在生产后装载抗原和其他药剂。替代地，可以给完整酵母装载抗原和/或药剂，然后由它制备原生质球、空胞、胞质或亚细胞颗粒。在这个实施方案中，可以将任何数量的抗原和/或其他药剂装载到酵母媒介物中，从至少1、2、3、4或任何整数到几百或几千抗原和/或其他药剂，比如通过装载例如微生物或某些部分可以提供的数量。
在本发明的另一个实施方案中，抗原和/或其他药剂物理附着于酵母媒介物。抗原和/或其他药剂与酵母媒介物的物理附着可以通过本领域的任何合适方法来实现，包括共价和非共价结合方法，包括但不限于将抗原和/或其他药剂化学交联到酵母媒介物的外表面；或者比如通过利用抗体或其他结合伙伴，将抗原和/或其他药剂生物连接到酵母媒介物的外表面。化学交联的实现可以通过例如包括戊二醛连接、光亲和标记的方法、用二亚胺碳进行处理、用能够连接二硫键的化学物质进行处理，以及用其他本领域标准的交联化学剂进行处理。替代地，可以将化学剂与酵母媒介物进行接触，所述化学剂会改变酵母细胞膜脂双层的电荷或细胞壁的成分，从而使酵母外表面更可能与具有特定电荷特性的抗原和/或其他药剂发生融合或结合。还可以将诸如抗体、结合肽、可溶性受体和其他配体的靶向药剂并入抗原作为融合蛋白，或者以其他方式与抗原关联从而使抗原结合酵母媒介物。
当抗原或其他蛋白被表达或者物理附着在酵母表面上时，在一个方面中可以仔细挑选间隔臂来优化抗原或其他蛋白的表达或者表面的成分。间隔臂的大小会影响抗原或其他蛋白有多少暴露在酵母表面发生结合。因此，根据所使用的抗原或其他蛋白，本领域技术人员可以挑选能够在酵母表面上的抗原或其他蛋白之间形成合适间隔的间隔臂。在一个实施方案中，间隔臂是至少有450个氨基酸的酵母蛋白。上文已经详细讨论了间隔臂。
在再一个实施方案中，酵母媒介物和抗原或其他蛋白通过更被动、非特异性的或者非共价的结合机制相互结合，比如通过将酵母媒介物与抗原或其他蛋白在缓冲液或其他合适的制剂(例如混合液)中轻轻混合。
在一个实施方案中，可以将(有或没有异源抗原或其他蛋白表达的)完整酵母以能够产生酵母细胞壁制品、酵母膜颗粒或酵母片段(即不是完整的)的方式磨碎或加工，在一些实施方案中，可以将酵母片段与包含抗原的其他组合物(例如DNA疫苗、蛋白亚基疫苗、杀死或灭活的病原体、病毒载体疫苗)一起提供或给予从而加强免疫反应。例如，可以利用酶处理、化学处理或物理力(例如，机械剪切或超声处理)将酵母破碎成可以作为佐剂的部分。
在发明的一个实施方案中，可用于发明的酵母媒介物包括已经被杀死或灭活的酵母媒介物。杀死或灭活酵母可以通过本领域已知的多种合适方法中的任何一种来完成。例如，酵母热灭活是灭活酵母的一种标准途径，如果需要，本领域技术人员可以通过本领域已知的常规方法来监测目标抗原的结构变化。替代地，可以使用其他酵母灭活方法，比如化学、电学、放射性或UV方法。参见例如标准酵母培养参考书，比如Methods of Enzymology,Vol.194,Cold Spring Harbor Publishing(1990)中公开的方法。任何使用的灭活策略都应当考虑到目标抗原的二级、三级或四级结构，并且保存这些结构以便优化抗原的免疫原性。
酵母媒介物可以利用本领域技术人员已知的多种技术配制成本发明的基于酵母的免疫治疗组合物或产品。例如，可以通过冻干对酵母媒介物进行干燥。包含酵母媒介物的制剂还可以通过将酵母制成饼或片剂，比如象用于烘培或酿造工艺中的酵母。此外，可以将酵母媒介物与药学上可接受的赋形剂混合，比如宿主或宿主细胞能够耐受的等渗缓冲液。这类赋形剂的例子包括水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液、Hank's溶液，和其他水性生理平衡盐溶液。还可以使用非水性的媒介物，比如固定油类、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。其他有用的制剂包括含有增稠剂(比如羧甲基纤维素钠、山梨醇、甘油或葡聚糖)的悬浮液。赋形剂还可以含有微量的添加剂，比如能增强等渗性和化学稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，防腐剂的例子包括噻汞撒(thimerosal)、m-或o-甲苯酚、福尔马林和苯甲醇。标准的制剂可以是液态注射剂，或者能够加入合适液体成为用于注射的悬浮液或溶液的固体。因此，在非液体制剂中，赋形剂可以包含例如葡萄糖、人血清白蛋白和/或防腐剂，然后在给药前可以加入无菌水或盐水。
在本发明的一个实施方案中，组合物可以包含其他药剂，这些药剂也可以被称为生物反应调节剂化合物，或者产生这些药剂/改造剂的能力。例如，可以用至少一种抗原和至少一种抗原/生物反应调节剂化合物转染或装载酵母媒介物，或者可以将本发明的组合物与至少一种药剂/生物反应调节剂一起给予。生物反应调节剂包括能调节免疫应答的佐剂和其他化合物，它们可以被称为免疫调节性化合物；还包括能改造另一种化合物或药剂的生物活性的化合物，比如基于酵母的免疫治疗剂，所述生物活性不限于免疫系统的效应。某些免疫调节化合物能刺激保护性免疫反应，而其它的能抑制有害的免疫反应，免疫调节与给定基于酵母的免疫治疗剂的组合是否有用可能至少部分取决于要治疗或防止的疾病状态或状况，和/或待治疗的个体。某些生物反应调节剂优先增强细胞介导型免疫反应，而其它的优先增强体液免疫反应(即，刺激的免疫反应中，与体液免疫相比，细胞介导的免疫反应水平提高，或者反过来)。某些生物反应调节剂与基于酵母的免疫治疗剂有一或多个共同的特性，或者对基于酵母的免疫治疗剂的生物特性能够增强或互补。本领域技术人员知道多种测量免疫反应的激发或抑制的方法，以及区分细胞介导的免疫反应和体液介导的免疫反应的方法，和区分一类细胞介导的反应与另一类反应(例如，TH17反应对TH1反应)。
可用于发明的药剂/生物反应调节剂可以包括，但不限于细胞因子、趋化因子、激素、脂类衍生物、肽、蛋白、多糖、小分子药物、抗体及其抗原结合片段(包括，但不限于抗细胞因子抗体、抗细胞因子受体抗体、抗趋化因子抗体)、维生素、多核苷酸、核酸结合部分、适配体和生长调节剂。本发明涵盖此类药剂的任何组合，并且与基于酵母的免疫治疗剂组合或在方案中与基于酵母的免疫治疗剂一起施用(例如同时，序贯或以其它形式)的任何此类药剂是本发明涵盖的组合物。这类药剂是本领域公知的。这些药剂可以单独使用或者与文中描述的其他药剂组合使用。
药剂可以包括给定蛋白或肽或其结构域的激动剂和拮抗剂。用于本文，“激动剂”是能够与受体或配体结合并产生或引发反应的任何化合物或药剂，包括但不限于小分子、蛋白、肽、抗体、核酸结合剂等，其中可能包括那些模拟天然物质结合受体或配体的作用的药剂。“拮抗剂”是能够阻断或抑制或减少激动剂的作用的任何化合物或药剂，包括但不限于小分子、蛋白、肽、抗体、核酸结合剂等。
可用于本发明的一般技术
本发明的实施会应用(除非另有说明)到本领域技术人员熟知的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。这类技术在文献中有充分解释，比如Methods of Enzymology,Vol.194,Guthrie et al.,eds.,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1990)；Biology and activities of yeasts,Skinner,et al.,eds.,Academic Press(1980)；Methods in yeast genetics:a laboratory course manual,Rose et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)；The Yeast Saccharomyces：Cell Cycle and Cell Biology,Pringle et al.,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1997)；The Yeast Saccharomyces:Gene Expression,Jones et al.,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1993)；The Yeast Saccharomyces:Genome Dynamics,Protein Synthesis,and Energetics,Broachet al.,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1992)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook et al.,1989)和Molecular Cloning:A Laboratory Manual,third edition(Sambrook and Russel,2001)(文中统称为“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987，包括至2001年的补充材料)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis etal.,eds.,1994)；Harlow and Lane(1988),Antibodies，A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Publications,New York；Harlow and Lane(1999)Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(文中统称为“Harlow and Lane”)；Beaucage et al.eds.,Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,John Wiley&Sons,Inc.,New York,2000)；Casarett andDoull’s Toxicology The Basic Science of Poisons,C.Klaassen,ed.,6th edition(2001)以及Vaccines,S.Plotkin and W.Orenstein,eds.,Fifth Edition(2008).
一般定义
Figure BDA0000848106730000401
(GlobeImmune,Inc.,Louisville,Colorado)通常是指胞外(在表面)、胞内(内部或者胞质)或者既有胞外也有胞内地表达一或多个异源抗原的酵母媒介物。
Figure BDA0000848106730000402
产品已有概括描述(参见例如美国专利5,830,463)。某些基于酵母的免疫治疗组合物以及它们的制备方法和一般使用方法也有详细描述，例如美国专利5,830,463、美国专利7,083,787、美国专利7,736,642、Stubbs et al.,Nat.Med.7:625-629(2001)、Lu et al.,Cancer Research 64:5084-5088(2004)和Bernstein et al.,Vaccine2008Jan24；26(4):509-21，这些文献中的每一个都通过引用全部并入本文。
一般来说，术语“生物活性的”表明化合物(包括蛋白或肽)通过体内(即在天然生理环境中)或体外(即在实验室条件下)测量或观察，具有至少一种对细胞、组织或生物的代谢、生理、化学或其他过程有影响的可检测活性。
根据本发明，术语“调整(modulate)”可以与调节(regulate)交换使用，通常是指对特定活性的上调或下调。用于本文，术语“上调”可以一般性地描述：相对特定活性来说的引发、启动、增加、增多、加强、提高、增强、扩大、促进或提供。类似地，术语“下调”可以一般性地描述：相对特定活性来说的下降、减少(reducing)、抑制、减轻、消除、减少(lessening)、阻断或防止。
在本发明的一个实施方案中，文中描述的任何氨基酸序列可以制备为在限定的氨基酸序列的C和/或N端各自侧接了至少一个到最多大约20个额外的异源氨基酸。这样得到的蛋白或多肽可以被称为“基本由(所述限定氨基酸序列)构成”。根据本发明，异源氨基酸是这样的氨基酸序列，所述序列不是天然(即自然界、体内没有)侧接着限定的氨基酸序列的；或者与限定的氨基酸序列的功能无关；或者如果使用给定氨基酸序列所来源的生物的标准密码子对天然序列中的核苷酸进行翻译，则编码所述限定的氨基酸序列的基因中的天然核酸序列的侧翼核苷酸不编码所述序列(即异源序列)。类似地，短语“基本由…构成”在提到本文的核酸序列时使用是指编码限定氨基酸序列的核酸序列，可以在编码该限定氨基酸序列的核酸序列的5’和/或3’端各自侧接从至少一个到最多大约60个额外的异源核苷酸。异源核苷酸不象在天然基因中那样，天然侧接编码限定氨基酸序列的核酸序列(即自然界、体内没有)；或者不编码能够给具有限定氨基酸序列的蛋白带来任何额外功能或者改变蛋白的功能的蛋白。
根据本发明，短语“选择性结合”是指本发明的抗体、抗原结合片段或结合伙伴优先结合特定蛋白的能力。更具体地说，短语“选择性结合”是指一个蛋白与另一个(例如，针对某抗原的抗体、抗体片段或结合伙伴)的特异结合，其中通过任何标准检验(例如免疫学分析)测量到它们的结合水平比检验中的背景对照在统计学上显著更高。例如，在进行免疫学分析时，对照一般包括只含有抗体或抗原结合片段的反应孔/管(即没有抗原)，其中在没有抗原情况下，抗体或其抗原结合片段产生的反应量(例如，与孔的非特异性结合)被认为是背景。结合可以利用本领域的多种标准方法，包括酶免疫分析(例如ELISA、免疫印迹分析等)来测量。
一般提到的本发明中使用的蛋白或多肽包括给定蛋白的全长蛋白、接近全长的蛋白(上文定义的)、或者这些蛋白的任何片段、结构域(结构的、功能的或者免疫原性的)、构象表位或同源物或变体。融合蛋白也可以统称为蛋白或多肽。根据本发明分离的蛋白是已经被从其自然环境移出(即已经经过人的操作)的蛋白(包括多肽或肽)，并且可以包括例如纯化蛋白、部分纯化的蛋白、重组产生的蛋白和合成产生的蛋白。因此“分离的”不反映蛋白的纯化程度。优选地，本发明的分离的蛋白是重组产生的。根据本发明，术语“修饰”和“突变”可以交换使用，特别是就对本文描述的蛋白或其部分的氨基酸序列(或核酸序列)进行的修饰/突变来说。
用于本文，术语“同源物”或“变体”用来指这样的蛋白或肽，所述蛋白或肽由于对参照蛋白或肽(即“原型”或“野生型”蛋白)的次要修饰而不同于参照蛋白或肽，但维持了所述天然形式的基本蛋白和侧链结构。这样的变化包括，但不限于，一个或数个氨基酸侧链的变化；一个或数个氨基酸的变化，包括缺失(例如，蛋白或肽的截短形式)、插入和/或取代；一个或数个原子的立体化学的变化；和/或次要的衍生化，包括但不限于甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、棕榈酰化、酰胺化和/或糖基磷脂酰肌醇的添加。同源物或变体与参照蛋白或肽相比可具有加强的、降低的，或基本相似的性能。同源物或变体可以包括蛋白质的激动剂或蛋白质的拮抗剂。同源物或变体可以用本领域已知的制备蛋白的方法来制备，包括，但不限于直接对分离的参照蛋白进行修饰、直接合成蛋白，或者使用例如经典或重组DNA技术对编码该蛋白的核酸序列进行修饰以产生随机或定向突变，从而得到蛋白变体的编码。此外，可能存在参照蛋白的天然变体(例如异构体、等位基因变体或其他可能从个体到个体发生的天然变体)，可以分离、产生和/或用于发明。
给定蛋白的同源物或变体可能包含这样的氨基酸序列、基本由其构成，或者由其构成，所述氨基酸序列与参照蛋白的氨基酸序列(例如文中限定的氨基酸序列或者限定蛋白的氨基酸序列)至少约45％、或至少约50％、或至少约55％、或至少约60％、或至少约65％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约91％相同、或至少约92％相同、或至少约93％相同、或至少约94％相同、或至少约95％相同、或至少约96％相同、或至少约97％相同、或至少约98％相同、或至少约99％相同(或者45％和99％之间的按整数增加的任何百分比同一性)。在一个实施方案中，同源物或变体包含这样的氨基酸序列、基本由其构成，或者由其构成，所述氨基酸序列与参照蛋白的氨基酸序列小于100％相同、小于约99％相同、小于约98％相同、小于约97％相同、小于约96％相同、小于约95％相同等等，按1％递减到小于约70％相同。
用于本文，除非另有说明，提到百分比(％)同一性是指利用下述程序进行的同源性评估：(1)Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)基本同源性检索，以标准缺省参数，使用blastp进行氨基酸检索，使用blastn进行核酸检索，其中缺省将查询序列进行低复杂度区域的过滤(比如在Altschul,S.F.,Madden,T.L.,
Figure BDA0000848106730000431
A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.&Lipman,D.J.(1997)"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation ofprotein database search programs."Nucleic Acids Res.25:3389-3402中有描述，该文献通过引用并入全部本文)；(2)两个序列的BLAST比对(使用以下描述的参数)；(3)和/或PSI-BLAST，使用标准缺省参数(Position-Specific Iterated BLAST)。应当注意，由于两个序列的Basic BLAST和BLAST之间的标准参数存在一些差异，两个特定序列在使用BLAST程序时可能被识别为有显著的同源性，而在Basic BLAST中使用序列之一作为查询序列进行的检索可能最佳匹配中没有鉴定到第二个序列。此外，PSI-BLAST提供了“profile”检索的自动化的使用简便版本，是一种寻找同源序列的敏感方式。程序首先进行空位BLAST数据库检索。PSI-BLAST程序利用来自返回的任何明显比对的信息构建位点特异性打分矩阵，以此在下一轮数据库检索中替代查询序列。因此，可以理解通过使用这些程序中的任意一种能够确定百分比同一性。
使用BLAST，按照Tatusova and Madden,(1999),"Blast 2 sequences-a newtool for comparing protein and nucleotide sequences"(FEMS Microbiol Lett.174:247-250，通过引用全部并入本文)中描述的那样，将两个特定序列进行相互比对。BLAST 2序列比对在blastp或blastn中进行，使用BLAST 2.0算法在两个序列间进行空位BLAST检索(BLAST 2.0)，以便在最后得到的比对中引入空位(缺失和插入)。为了清楚起见，利用如下标准缺省参数进行了BLAST序列比对。
对于blastn，使用0 BLOSUM62矩阵:
匹配得分＝1
错配罚分＝-2
开放空位(5)和延伸空位(2)罚分
gap x_dropoff(50)期望值(10)字长(11)滤器(开)
对于blastp，使用0BLOSUM62矩阵:
开放空位(11)和延伸空位(1)罚分
gap x_dropoff(50)期望值(10)字长(3)滤器(开).
分离的核酸分子是已经被从其自然环境移出(即，已经经过人的操作)的核酸分子，其自然环境是自然界中发现该核酸分子的基因组或染色体。因此，“分离的”并不一定反映该核酸分子的纯化程度，而是表明所述分子未包含自然界中发现该核酸分子所处的整个基因组或整个染色体或含有一个以上基因的基因组区段。分离的核酸分子可包括完整基因。包含某基因的分离的核酸分子并不是包含该基因的染色体片段，而是包含与该基因相关的编码区和调控区，但没有天然存在于同一染色体上的其它基因。分离的核酸分子还可包含基因的一部分。分离的核酸分子还可包含(在序列的5’和/或3’端)侧接有其他核酸的限定的核酸序列，所述其他核酸在自然界中通常不位于该限定的核酸序列的侧翼(即为异源序列)。分离的核酸分子包括DNA、RNA(例如mRNA)、或者DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。尽管短语“核酸分子”主要指物理的核酸分子，短语“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，这两个短语可以互换使用，尤其是对于能编码蛋白或蛋白结构域的核酸分子或核酸序列而言。
重组核酸分子是这样的分子，所述分子包含的编码本文描述的任何一或多个蛋白的任何一个核酸序列可操纵地连接着至少一个任意转录调控序列，其中所述转录调控序列能有效地调控该核酸分子在要转染的细胞中的表达。虽然短语“核酸分子”主要指物理的核酸分子，短语“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，这两个短语可以互换使用，尤其是对于能编码蛋白的核酸分子或核酸序列而言。此外，短语“重组分子”主要指可操纵地连接转录控制序列的核酸分子，但可以与给予动物的短语“核酸分子”互换使用。
重组核酸分子包括重组载体，所述重组载体是与编码本发明融合蛋白的分离的核酸分子可操纵地连接的任何核酸序列，一般是异源序列，其能使所述融合蛋白得以重组产生，并能将所述核酸分子递送到本发明的宿主细胞中。这样的载体可以含有天然状态下与待插入该载体的分离的核酸分子不相邻的核酸序列。载体可以是RNA或DNA，原核的或真核的，而且在本发明中优选是可用于转染酵母的质粒。重组载体可用在克隆、测序和/或其它对核酸分子的操作中，并可以用于递送这样的分子(例如，象在DNA组合物或基于病毒载体的组合物中那样)。重组载体优选用于核酸分子的表达，还可称为表达载体。优选的重组载体能在所转染的宿主细胞，比如酵母中表达。
在本发明的重组分子中，核酸分子可操纵地与表达载体连接，其中所述表达载体含有调控序列，比如转录控制序列、翻译控制序列、复制原点，以及其它与宿主细胞相容并控制本发明的核酸分子的表达的调控序列。特别地，本发明的重组分子包括与一或多个表达控制序列可操纵地连接的核酸分子。短语“可操纵地连接”是指核酸分子与表达控制序列的连接方式使得该分子在转染(即，转化、转导或转染)到宿主细胞中后被表达。
根据本发明，术语“转染”用来指可将外源核酸分子(即重组核酸分子)插入细胞中的任何方法。当用来指将核酸分子导入微生物细胞，例如藻类、细菌和酵母时，术语“转化”可与术语“转染”互换使用。在微生物系统中，术语“转化”用于描述由于微生物获取了外源核酸而继承的变化，并且基本上与术语“转染”同义。因此，转染技术包括但不限于，转化、细胞的化学处理、粒子轰击、电穿孔、显微注射、脂质转染、吸附、感染和原生质体融合。
以下实验结果是为说明目的而提供的，并不意在限制发明的范围。
实施例
实施例1
下述实施例描述了具有脊索瘤的受试者中的1期或2期临床试验。
使用如本文中描述的酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(例如酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物，其包含完整的、热杀死的已经表达SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:20的酵母属酵母)运行具有脊索瘤的患者中的随机化1期或2期临床试验。登记至少20名或更多名具有脊索瘤的受试者。
试验作为双盲或开放标签、以安慰剂为对照、多中心试验运行。所有患者接受标准护理疗法，其包括肿瘤切除和放射疗法，治疗分组患者在治疗期间接受酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物的几次连续注射。主要端点是短尾畸形阳性肿瘤细胞的减少、改善的症状性和放射学响应、肿瘤生长的非进展、无复发存活或总体存活。别的端点可以包括抗原特异性T细胞应答(例如治疗后的短尾畸形特异性CD8+T细胞出现或扩充)。
预期基于酵母的免疫治疗性组合物是安全且完全耐受的，没有重大毒性。另外，预期酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物在至少一些或大多数患者中产生治疗紧急短尾畸形特异性T细胞应答和/或先前存在的短尾畸形特异性基线T细胞应答的改善。还预期一些或大多数患者具有稳定化的疾病和/或具有延长的无复发存活(无进展存活)和/或总体存活。
实施例2
下述实施例描述了具有家族性脊索瘤史的健康受试者中的2期临床试验。
使用如本文中描述的酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(例如酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物，其包含完整的、热杀死的已经表达SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:20的酵母属酵母)运行在具有家族性脊索瘤史的健康受试者(即来自具有两位以上具有脊索瘤史的血亲亲戚的家族的受试者)中的随机化2期临床试验。登记至少40名或更多名受试者。
试验作为双盲或开放标签、以安慰剂为对照、多中心试验运行。所有患者接受常规监测，治疗分组患者接受酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物的几次连续注射。对受试者监测脊索瘤的发生。端点可以包括抗原特异性T细胞应答(例如治疗后的短尾畸形特异性CD8+T细胞出现或扩充)、脊索瘤负性的维持、和延迟的进展脊索瘤。
预期基于酵母的免疫治疗性组合物是安全且完全耐受的，没有重大毒性。另外，预期酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物在至少一些或大多数患者中产生治疗紧急短尾畸形特异性T细胞应答。与接受安慰剂的受试者相比或者与具有脊索瘤史(即家族性脊索瘤)且尚未接受基于酵母的免疫疗法的受试者群体相比，预期受试者的治疗组具有更低的脊索瘤发生率，或者延迟的脊索瘤发作。为了比较以确定治疗的效率，对照可以包括家族性脊索瘤发生的有效/参照历史对照率，诸如可以通过随时间追踪来自家族性脊索瘤家族的家族成员测定以提供疾病发生的基线参照。
实施例3
下述实施例描述了在具有已知表达短尾畸形的癌症的受试者中进行的1期临床试验。
使用称为GI-6301的酵母-短尾畸形免疫疗法组合物启动开放标签、序贯剂量放大、1期临床试验。在此临床试验方案下，关键的纳入标准包括实体瘤、可测量疾病(疾病必须可评估)或非可测量疾病的存在、东部协作肿瘤学组(Eastern Cooperative OncologyGroup,ECOG)状态等级0-1(其中0级指示完全活动性，能够在没有限制的情况下继续所有疾病前行为，并且1级指示身体费力活动受限但能走动，并且能够进行轻或静坐性质的工作)、肌酸酐水平</-1.5xULN(正常的上限)、ALT水平(丙氨酸氨基转移酶)</-2.5xULN、AST水平(天冬氨酸氨基转移酶)</-2.5xULN、胆红素(Bili)水平</-1.5xULN、绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)>1500、血小板计数>100,000、从在先化学疗法治疗起最小值2周。另外，容许具有在先免疫疗法的患者。
关键的纳入标准包括具有HIV或肝炎的患者；妊娠女性，哺乳期女性(breastfeeding women)、具有活动性自身免疫性疾病的患者、一些系统性类固醇使用、对基于酵母的产物的变态反应、CNS疾病、心包块>2cm、EBV病毒血症(virmia)(通过PCR限定，log10值>3.0)、甲状腺疾病(块或自身免疫性)和使用三环抗忧郁药的患者。
登记27名具有晚期癌症的患者(每个剂量分组3-16名患者)，并且在序贯剂量分组放大方案中对所述患者施用称为GI-6301的酵母-短尾畸形免疫疗法组合物。方案利用剂量范围4Y.U.(1Y.U.x 4个部位，意味着在每次访视时在患者身体上的4个不同部位施用1Y.U.GI-6301)、16Y.U.(4Y.U x 4个部位)和40Y.U.(10Y.U.x 4个部位)，皮下施用。以2周时间间隔施用GI-6301，总共7次访视(约3个月)，然后此后每月施用，在研究期间每2个月进行再分期(restaging)扫描。主要端点是安全的。次要端点包括分析肿瘤关联抗原免疫应答，即无论T细胞前体的显著变化是否可检测，如通过ELISpot测定法中的短尾畸形特异性T细胞的增加和响应短尾畸形蛋白的增殖(例如治疗后短尾畸形特异性CD8+或CD4+T细胞出现或扩充)测量。别的次要端点包括临床益处，诸如无进展存活、肿瘤标志物或变化速率的变化、以及一般免疫活化的参数，包括外周血中的免疫细胞子集的频率(CD8+记忆/效应T细胞、CD4+记忆/效应T细胞、Tregs、NK细胞、DC)和细胞因子(例如IFN-γ,IL-10,IL-12,IL-2,IL-4,TGF-β等)的血清水平变化。例如，通过在细胞因子干扰素gamma(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)和白介素2(IL-2)方面对CD4和CD8T淋巴细胞的流式细胞术胞内染色(ICS)测量免疫应答。
治疗是完全耐受的，对27名患者给予191个疫苗周期。2名患者经历3级注射部位反应(短暂的)。没有与疫苗相关的其它3级和4级毒性。仅9个周期与2级毒性(一般是流感样症状)有关。
21份样品可用于免疫应答分析，其中7份样品表明短尾畸形特异性应答，如通过ICS测量。研究的中值时间是74天(范围)。具有转移性结肠癌的患者具有稳定疾病达15个月。
总体上，发现免疫治疗性组合物GI-6301是安全且完全耐受的，没有重大毒性。用GI-6301免疫疗法组合物的此1期研究在一些患者中证明了安全性和增强的免疫应答。这些结果在人中第一次证明可以经由疫苗接种免疫学靶向转录因子。
实施例4
下述实施例描述了实施例3中描述的1期研究的扩展，其显示了来自使用本发明的酵母-短尾畸形组合物免疫具有脊索瘤的受试者的结果。
启动实施例3中描述的1期研究的扩展期。扩展期的目的是以最高耐受剂量对另一分组的患者施用GI-6301，以及在研究中包括晚期脊索瘤患者。为了登记扩展期，与实施例3中描述的初始研究相比除去下述当选标准：排除CNS疾病(特别是容许登记脊索瘤患者)、甲状腺疾病(以及监测)和埃巴病毒(Epstein-Barr virus,EBV)PCR要求。
将7名具有复发性(晚期)脊索瘤的患者登记到40Y.U.剂量水平扩展期上，并且最初已经评估了这些患者的临床和免疫学后果。所有7名患者已经经历了先前的放射(从放射起中值470天：范围111-1883)。中值年龄是59(41-66)。全部每2周接受40Y.U.疫苗达7次，第8天第一次再分期。如果稳定，那么患者接着每月剂量给药，每2个月再分期扫描。主要端点是安全性，但是也追踪临床后果。还通过在细胞因子IFN-γ、TNF和IL-2方面对CD4和CD8T淋巴细胞的流式细胞术胞内染色(ICS)分析短尾畸形特异性T细胞应答。
如上文讨论的，所有7名患者已经经历了广泛的先前治疗。开始研究，2名患者分别具有相对稳定的疾病达6和12个月，并且两人在第141天和第197天再分期时仍然是稳定的。剩下的5名患者在登记时具有进行性疾病。那5人中，1名在第141天时具有指数损伤降低>30％，并且在4周后的重复扫描上具有经确认的部分响应(PR)。到第141天再分期，1名患者具有稳定疾病。其他3名在第141天再分期时进展。不利事件是最小的，注射部位反应是最常见的(63剂中的13例事件(21％)，7名患者中的6名(86％))。根据ICS，7名患者中的2名具有短尾畸形特异性T细胞应答。
在40Y.U.扩展组中，记录了肿瘤测量变化，如图4中看到的。第0天左侧的x-轴尺度不同于第0天右侧的尺度。
至今，在用GI-6301疫苗的I期研究中的此分组的具有晚期脊索瘤的患者表明安全性和增强的免疫应答及经确认的部分响应(PR)。
已经安排4-5名具有复发性脊索瘤的患者进入80Y.U.剂量水平扩展期。
实施例5
下述实施例描述了具有局部复发性或转移性疾病的脊索瘤受试者中的2期临床试验，肿瘤进展在试验中登记前3-9个月发生。
此临床研究在具有局部复发性或转移性疾病的脊索瘤受试者中评估酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物。将已经接受了任何在先疗法线的受试者接受到研究中。另外，为了被纳入研究中，受试者必须具有在研究中登记前3-9个月发生的肿瘤进展。受试者接受如本文中描述的基于酵母的免疫治疗性组合物，例如GI-6301。例如，方案可以利用剂量范围4Y.U.(1Y.U.x 4个部位，意味着在每次访视时在患者身体上的4个不同部位施用1Y.U.GI-6301)、16Y.U.(4Y.U x 4个部位)、40Y.U.(10Y.U.x 4个部位)及80Y.U.(皮下施用)。
在启动免疫治疗性组合物免疫后约6个月时，护理提供者会评估受试者以确定他们是否具有可以照射的损伤。若可以照射损伤，则会用放射疗法治疗损伤，并且会监测并评估受试者，直到达到试验的主要和次要端点。若不能照射损伤，则受试者不会接受放射疗法，并且会监测和评估受试者，直到达到试验的主要和次要端点。在此时间期间继续施用基于酵母的免疫治疗性组合物，直到达到试验的主要和次要端点。
主要端点会是测定无进展存活(PFS)，如通过RECIST定义。次要端点包括肿瘤响应率(通过RECIST和Choi定义，并且在照射和非照射损伤中评估以进行比较)和肿瘤生长速率动力学(在免疫治疗性处理前6个月对免疫治疗性处理后6个月时评估)。对于PFS，与非处理对照受试者(预期5个月)相比，预期中值是9个月。可以比较受试者对免疫治疗性组合物的响应与在以相同方式治疗，但是没有添加免疫治疗性组合物或与二线疗法(诸如放射疗法、手术切除、靶向药物疗法或其组合)组合的免疫治疗性组合物的受试者。
施用酵母-短尾畸形组合物在此研究中是安全且完全耐受的，没有重大毒性。另外，与接受护理标准的此类受试者的标准中值PFS相比，施用酵母-短尾畸形组合物改善无进展存活，并且PFS的改善通过疫苗后额外的放射治疗增强。另外，施用酵母-短尾畸形组合物改善响应率，并且有利改变肿瘤生长速率动力学。最后，施用酵母-短尾畸形组合物在至少一些或大多数患者中产生治疗紧急短尾畸形特异性T细胞应答。
实施例6
下述实施例描述了具有不能切除的、局部复发性损伤的脊索瘤受试者中的2期临床试验，其中先前尚未照射损伤。
使用如本文中描述的酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(例如酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物，其包含完整的、热杀死的已经表达SEQ ID NO:8(GI-6301)或SEQ ID NO:20(GI-6305)的酵母属酵母)运行这些脊索瘤受试者中的随机化2期临床试验。试验会是统计学有力的，以登记合适数目的患者来使用下文描述的标准评估临床效力。
试验以双盲或开放标签、多中心试验运行。所有患者接受常规监测和/或护理标准放射疗法治疗、系统性药物疗法或其组合，治疗分组患者接受酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(即GI-6301或其它酵母-短尾畸形免疫治疗剂)的几次连续注射。例如，方案可以利用剂量范围4Y.U.(1Y.U.x 4个部位，意味着在每次访视时在患者身体上的4个不同部位施用1Y.U.GI-6301)、16Y.U.(4Y.U x 4个部位)、40Y.U.(10Y.U.x 4个部位)及80Y.U.(皮下施用)。可以例如如实施例3中描述或每月施用剂量。纳入标准可以包括实体瘤和可测量疾病的存在。主要和/或次要端点可以包括无进展存活(可以通过RECIST限定，或者可以通过针对RECIST修改的免疫相关响应标准或者通过Choi标准限定)、延迟的进展前时间、肿瘤响应率(即到登记前6-12个月通过在该时间段期间对未治疗肿瘤成像限定的放射摄影响应(radiographic response)，稳定性或进展，如通过RECIST和/或Choi标准测量和/或与受试者中的非照射损伤相比)、肿瘤生长速率动力学的变化(诸如治疗前6个月对治疗后6个月)、抗原特异性T细胞应答(例如治疗后短尾畸形特异性CD8+和/或CD4+T细胞出现或扩充)、总体存活或其组合。
可以比较受试者对基于酵母的免疫治疗性组合物的响应与在以相同方式治疗，但是没有添加免疫治疗性组合物或与二线疗法(诸如放射疗法、手术切除、靶向药物疗法或其组合)组合的免疫治疗性组合物的受试者。
基于酵母的免疫治疗性组合物是安全且完全耐受的，没有重大毒性。另外，酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物改善无进展存活，在至少一些或大多数患者中产生治疗紧急短尾畸形特异性T细胞应答和/或降低肿瘤生长速率。与尚未接受基于酵母的免疫疗法的对照受试者相比，受试者的治疗组具有延迟的进展前时间。研究的目的是实现趋向，并且优选相对于本实施例中公开的脊索瘤群体的预期中值PFS的中值PFS的统计学显著增加。举例而言，可以实现中值PFS为9个月的统计学目标，其中对于所研究的相关脊索瘤群体，预期中值PFS通常可以是约5个月。
实施例7
下述实施例描述了具有不能切除的、局部复发性损伤的脊索瘤受试者中的2期临床试验，其中先前已经照射损伤。
使用如本文中描述的酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(例如酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物，其包含完整的、热杀死的已经表达SEQ ID NO:8(GI-6301)或SEQ ID NO:20(GI-6305)的酵母属酵母)运行这些脊索瘤受试者中的随机化2期临床试验。试验会是统计学有力的，以登记合适数目的患者来使用下文描述的标准评估临床效力。
试验以双盲或开放标签、多中心试验运行。所有患者接受常规监测和/或护理标准放射疗法治疗、系统性药物疗法或其组合，治疗分组患者接受酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(即GI-6301或其它酵母-短尾畸形免疫治疗剂)的几次连续注射。例如，方案可以利用剂量范围4Y.U.(1Y.U.x 4个部位，意味着在每次访视时在患者身体上的4个不同部位施用1Y.U.GI-6301)、16Y.U.(4Y.U x 4个部位)、40Y.U.(10Y.U.x 4个部位)及80Y.U.(皮下施用)。可以例如如实施例3中描述或每月施用剂量。纳入标准可以包括实体瘤和可测量疾病的存在。主要和/或次要端点可以包括无进展存活(可以通过RECIST限定，或者可以通过针对RECIST修改的免疫相关响应标准或者通过Choi标准限定)、延迟的进展前时间、肿瘤响应率(即到登记前6-12个月通过在该时间段期间对未治疗肿瘤成像限定的放射摄影响应(radiographic response)，稳定性或进展，如通过RECIST和/或Choi标准测量和/或与受试者中的非照射损伤相比)、肿瘤生长速率动力学的变化(诸如治疗前6个月对治疗后6个月)、抗原特异性T细胞应答(例如治疗后短尾畸形特异性CD8+和/或CD4+T细胞出现或扩充)、总体存活或其组合。
可以比较受试者对基于酵母的免疫治疗性组合物的响应与在以相同方式治疗，但是没有添加免疫治疗性组合物或与二线疗法(诸如放射疗法、手术切除、靶向药物疗法或其组合)组合的免疫治疗性组合物的受试者。
基于酵母的免疫治疗性组合物是安全且完全耐受的，没有重大毒性。另外，酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物改善无进展存活，在至少一些或大多数患者中产生治疗紧急短尾畸形特异性T细胞应答和/或降低肿瘤生长速率。与尚未接受基于酵母的免疫疗法的对照受试者相比，受试者的治疗组具有延迟的进展前时间。研究的目的是实现趋向，并且优选相对于本实施例中公开的脊索瘤群体的预期中值PFS的中值PFS的统计学显著增加。举例而言，可以实现中值PFS为9个月的统计学目标，其中对于所研究的相关脊索瘤群体，预期中值PFS通常可以是约5个月。
实施例8
下述实施例描述了具有寡转移性疾病和不能切除的损伤的脊索瘤受试者中的2期临床试验，其中先前尚未照射损伤。
使用如本文中描述的酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(例如酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物，其包含完整的、热杀死的已经表达SEQ ID NO:8(GI-6301)或SEQ ID NO:20(GI-6305)的酵母属酵母)运行这些脊索瘤受试者中的随机化2期临床试验。试验会是统计学有力的，以登记合适数目的患者来使用下文描述的标准评估临床效力。
试验以双盲或开放标签、多中心试验运行。所有患者接受常规监测和/或护理标准放射疗法治疗、系统性药物疗法或其组合，治疗分组患者接受酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(即GI-6301或其它酵母-短尾畸形免疫治疗剂)的几次连续注射。例如，方案可以利用剂量范围4Y.U.(1Y.U.x 4个部位，意味着在每次访视时在患者身体上的4个不同部位施用1Y.U.GI-6301)、16Y.U.(4Y.U x 4个部位)、40Y.U.(10Y.U.x 4个部位)及80Y.U.(皮下施用)。可以例如如实施例3中描述或每月施用剂量。纳入标准可以包括实体瘤和可测量疾病的存在。主要和/或次要端点可以包括无进展存活(可以通过RECIST限定，或者可以通过针对RECIST修改的免疫相关响应标准或者通过Choi标准限定)、延迟的进展前时间、肿瘤响应率(即到登记前6-12个月通过在该时间段期间对未治疗肿瘤成像限定的放射摄影响应(radiographic response)，稳定性或进展，如通过RECIST和/或Choi标准测量和/或与受试者中的非照射损伤相比)、肿瘤生长速率动力学的变化(诸如治疗前6个月对治疗后6个月)、抗原特异性T细胞应答(例如治疗后短尾畸形特异性CD8+和/或CD4+T细胞出现或扩充)、总体存活或其组合。
可以比较受试者对基于酵母的免疫治疗性组合物的响应与在以相同方式治疗，但是没有添加免疫治疗性组合物或与二线疗法(诸如放射疗法、手术切除、靶向药物疗法或其组合)组合的免疫治疗性组合物的受试者。
基于酵母的免疫治疗性组合物是安全且完全耐受的，没有重大毒性。另外，酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物改善无进展存活，在至少一些或大多数患者中产生治疗紧急短尾畸形特异性T细胞应答和/或降低肿瘤生长速率。与尚未接受基于酵母的免疫疗法的对照受试者相比，受试者的治疗组具有延迟的进展前时间。研究的目的是实现趋向，并且优选相对于本实施例中公开的脊索瘤群体的预期中值PFS的中值PFS的统计学显著增加。举例而言，可以实现中值PFS为9个月的统计学目标，其中对于所研究的相关脊索瘤群体，预期中值PFS通常可以是约5个月。
实施例9
下述实施例描述了具有寡转移性疾病和不能切除的损伤的脊索瘤受试者中的2期临床试验，其中先前已经照射损伤。
使用如本文中描述的酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(例如酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物，其包含完整的、热杀死的已经表达SEQ ID NO:8(GI-6301)或SEQ ID NO:20(GI-6305)的酵母属酵母)运行这些脊索瘤受试者中的随机化2期临床试验。试验会是统计学有力的，以登记合适数目的患者来使用下文描述的标准评估临床效力。
试验以双盲或开放标签、多中心试验运行。所有患者接受常规监测和/或护理标准放射疗法治疗、系统性药物疗法或其组合，治疗分组患者接受酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(即GI-6301或其它酵母-短尾畸形免疫治疗剂)的几次连续注射。例如，方案可以利用剂量范围4Y.U.(1Y.U.x 4个部位，意味着在每次访视时在患者身体上的4个不同部位施用1Y.U.GI-6301)、16Y.U.(4Y.U x 4个部位)、40Y.U.(10Y.U.x 4个部位)及80Y.U.(皮下施用)。可以例如如实施例3中描述或每月施用剂量。纳入标准可以包括实体瘤和可测量疾病的存在。主要和/或次要端点可以包括无进展存活(可以通过RECIST限定，或者可以通过针对RECIST修改的免疫相关响应标准或者通过Choi标准限定)、延迟的进展前时间、肿瘤响应率(即到登记前6-12个月通过在该时间段期间对未治疗肿瘤成像限定的放射摄影响应(radiographic response)，稳定性或进展，如通过RECIST和/或Choi标准测量和/或与受试者中的非照射损伤相比)、肿瘤生长速率动力学的变化(诸如治疗前6个月对治疗后6个月)、抗原特异性T细胞应答(例如治疗后短尾畸形特异性CD8+和/或CD4+T细胞出现或扩充)、总体存活或其组合。
可以比较受试者对基于酵母的免疫治疗性组合物的响应与在以相同方式治疗，但是没有添加免疫治疗性组合物或与二线疗法(诸如放射疗法、手术切除、靶向药物疗法或其组合)组合的免疫治疗性组合物的受试者。
基于酵母的免疫治疗性组合物是安全且完全耐受的，没有重大毒性。另外，酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物改善无进展存活，在至少一些或大多数患者中产生治疗紧急短尾畸形特异性T细胞应答和/或降低肿瘤生长速率。与尚未接受基于酵母的免疫疗法的对照受试者相比，受试者的治疗组具有延迟的进展前时间。研究的目的是实现趋向，并且优选相对于本实施例中公开的脊索瘤群体的预期中值PFS的中值PFS的统计学显著增加。举例而言，可以实现中值PFS为9个月的统计学目标，其中对于所研究的相关脊索瘤群体，预期中值PFS通常可以是约5个月。
实施例10
下述实施例描述了具有寡转移性疾病和能后切除的损伤(post-resectablelesion)的脊索瘤受试者中的2期临床试验，其中受试者先前尚未接收针对脊索瘤的放射疗法。
使用如本文中描述的酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(例如酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物，其包含完整的、热杀死的已经表达SEQ ID NO:8(GI-6301)或SEQ ID NO:20(GI-6305)的酵母属酵母)运行这些脊索瘤受试者中的随机化2期临床试验。试验会是统计学有力的，以登记合适数目的患者来使用下文描述的标准评估临床效力。
试验以双盲或开放标签、多中心试验运行。所有患者接受常规监测和/或护理标准放射疗法治疗、系统性药物疗法或其组合，治疗分组患者接受酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(即GI-6301或其它酵母-短尾畸形免疫治疗剂)的几次连续注射。例如，方案可以利用剂量范围4Y.U.(1Y.U.x 4个部位，意味着在每次访视时在患者身体上的4个不同部位施用1Y.U.GI-6301)、16Y.U.(4Y.U x 4个部位)、40Y.U.(10Y.U.x 4个部位)及80Y.U.(皮下施用)。可以例如如实施例3中描述或每月施用剂量。纳入标准可以包括实体瘤和可测量疾病的存在。主要和/或次要端点可以包括无进展存活(可以通过RECIST限定，或者可以通过针对RECIST修改的免疫相关响应标准或者通过Choi标准限定)、延迟的进展前时间、肿瘤响应率(即到登记前6-12个月通过在该时间段期间对未治疗肿瘤成像限定的放射摄影响应(radiographic response)，稳定性或进展，如通过RECIST和/或Choi标准测量和/或与受试者中的非照射损伤相比)、肿瘤生长速率动力学的变化(诸如治疗前6个月对治疗后6个月)、抗原特异性T细胞应答(例如治疗后短尾畸形特异性CD8+和/或CD4+T细胞出现或扩充)、总体存活或其组合。
可以比较受试者对基于酵母的免疫治疗性组合物的响应与在以相同方式治疗，但是没有添加免疫治疗性组合物或与二线疗法(诸如放射疗法、手术切除、靶向药物疗法或其组合)组合的免疫治疗性组合物的受试者。
基于酵母的免疫治疗性组合物是安全且完全耐受的，没有重大毒性。另外，酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物改善无进展存活，在至少一些或大多数患者中产生治疗紧急短尾畸形特异性T细胞应答和/或降低肿瘤生长速率。与尚未接受基于酵母的免疫疗法的对照受试者相比，受试者的治疗组具有延迟的进展前时间。研究的目的是实现趋向，并且优选相对于本实施例中公开的脊索瘤群体的预期中值PFS的中值PFS的统计学显著增加。举例而言，可以实现中值PFS为9个月的统计学目标，其中对于所研究的相关脊索瘤群体，预期中值PFS通常可以是约5个月。
实施例11
下述实施例描述了具有寡转移性疾病和能后切除的损伤(post-resectablelesion)的脊索瘤受试者中的2期临床试验，其中受试者先前已经接收放射疗法。
使用如本文中描述的酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(例如酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物，其包含完整的、热杀死的已经表达SEQ ID NO:8(GI-6301)或SEQ ID NO:20(GI-6305)的酵母属酵母)运行这些脊索瘤受试者中的随机化2期临床试验。试验会是统计学有力的，以登记合适数目的患者来使用下文描述的标准评估临床效力。
试验以双盲或开放标签、多中心试验运行。所有患者接受常规监测和/或护理标准放射疗法治疗、系统性药物疗法或其组合，治疗分组患者接受酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(即GI-6301或其它酵母-短尾畸形免疫治疗剂)的几次连续注射。例如，方案可以利用剂量范围4Y.U.(1Y.U.x 4个部位，意味着在每次访视时在患者身体上的4个不同部位施用1Y.U.GI-6301)、16Y.U.(4Y.U x 4个部位)、40Y.U.(10Y.U.x 4个部位)及80Y.U.(皮下施用)。可以例如如实施例3中描述或每月施用剂量。纳入标准可以包括实体瘤和可测量疾病的存在。主要和/或次要端点可以包括无进展存活(可以通过RECIST限定，或者可以通过针对RECIST修改的免疫相关响应标准或者通过Choi标准限定)、延迟的进展前时间、肿瘤响应率(即到登记前6-12个月通过在该时间段期间对未治疗肿瘤成像限定的放射摄影响应(radiographic response)，稳定性或进展，如通过RECIST和/或Choi标准测量和/或与受试者中的非照射损伤相比)、肿瘤生长速率动力学的变化(诸如治疗前6个月对治疗后6个月)、抗原特异性T细胞应答(例如治疗后短尾畸形特异性CD8+和/或CD4+T细胞出现或扩充)、总体存活或其组合。
可以比较受试者对基于酵母的免疫治疗性组合物的响应与在以相同方式治疗，但是没有添加免疫治疗性组合物或与二线疗法(诸如放射疗法、手术切除、靶向药物疗法或其组合)组合的免疫治疗性组合物的受试者。
基于酵母的免疫治疗性组合物是安全且完全耐受的，没有重大毒性。另外，酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物改善无进展存活，在至少一些或大多数患者中产生治疗紧急短尾畸形特异性T细胞应答和/或降低肿瘤生长速率。与尚未接受基于酵母的免疫疗法的对照受试者相比，受试者的治疗组具有延迟的进展前时间。研究的目的是实现趋向，并且优选相对于本实施例中公开的脊索瘤群体的预期中值PFS的中值PFS的统计学显著增加。举例而言，可以实现中值PFS为9个月的统计学目标，其中对于所研究的相关脊索瘤群体，预期中值PFS通常可以是约5个月。
实施例12
下述实施例描述了具有不能切除的损伤的第一次复发的脊索瘤受试者中的2期临床试验，其中先前尚未照射所述损伤。
使用如本文中描述的酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(例如酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物，其包含完整的、热杀死的已经表达SEQ ID NO:8(GI-6301)或SEQ ID NO:20(GI-6305)的酵母属酵母)运行这些脊索瘤受试者中的随机化2期临床试验。试验会是统计学有力的，以登记合适数目的患者来使用下文描述的标准评估临床效力。
试验以双盲或开放标签、多中心试验运行。所有患者接受常规监测和/或护理标准放射疗法治疗、系统性药物疗法或其组合，治疗分组患者接受酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(即GI-6301或其它酵母-短尾畸形免疫治疗剂)的几次连续注射。例如，方案可以利用剂量范围4Y.U.(1Y.U.x 4个部位，意味着在每次访视时在患者身体上的4个不同部位施用1Y.U.GI-6301)、16Y.U.(4Y.U x 4个部位)、40Y.U.(10Y.U.x 4个部位)及80Y.U.(皮下施用)。可以例如如实施例3中描述或每月施用剂量。纳入标准可以包括实体瘤和可测量疾病的存在。主要和/或次要端点可以包括无进展存活(可以通过RECIST限定，或者可以通过针对RECIST修改的免疫相关响应标准或者通过Choi标准限定)、延迟的进展前时间、肿瘤响应率(即到登记前6-12个月通过在该时间段期间对未治疗肿瘤成像限定的放射摄影响应(radiographic response)，稳定性或进展，如通过RECIST和/或Choi标准测量和/或与受试者中的非照射损伤相比)、肿瘤生长速率动力学的变化(诸如治疗前6个月对治疗后6个月)、抗原特异性T细胞应答(例如治疗后短尾畸形特异性CD8+和/或CD4+T细胞出现或扩充)、总体存活或其组合。
可以比较受试者对基于酵母的免疫治疗性组合物的响应与在以相同方式治疗，但是没有添加免疫治疗性组合物或与二线疗法(诸如放射疗法、手术切除、靶向药物疗法或其组合)组合的免疫治疗性组合物的受试者。
基于酵母的免疫治疗性组合物是安全且完全耐受的，没有重大毒性。另外，酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物改善无进展存活，在至少一些或大多数患者中产生治疗紧急短尾畸形特异性T细胞应答和/或降低肿瘤生长速率。与尚未接受基于酵母的免疫疗法的对照受试者相比，受试者的治疗组具有延迟的进展前时间。研究的目的是实现趋向，并且优选相对于本实施例中公开的脊索瘤群体的预期中值PFS的中值PFS的统计学显著增加。举例而言，可以实现中值PFS为9个月的统计学目标，其中对于所研究的相关脊索瘤群体，预期中值PFS通常可以是约5个月。
实施例13
下述实施例描述了具有不能切除的损伤的第一次复发的脊索瘤受试者中的2期临床试验，其中先前已经照射所述损伤。
使用如本文中描述的酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(例如酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物，其包含完整的、热杀死的已经表达SEQ ID NO:8(GI-6301)或SEQ ID NO:20(GI-6305)的酵母属酵母)运行这些脊索瘤受试者中的随机化2期临床试验。试验会是统计学有力的，以登记合适数目的患者来使用下文描述的标准评估临床效力。
试验以双盲或开放标签、多中心试验运行。所有患者接受常规监测和/或护理标准放射疗法治疗、系统性药物疗法或其组合，治疗分组患者接受酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(即GI-6301或其它酵母-短尾畸形免疫治疗剂)的几次连续注射。例如，方案可以利用剂量范围4Y.U.(1Y.U.x 4个部位，意味着在每次访视时在患者身体上的4个不同部位施用1Y.U.GI-6301)、16Y.U.(4Y.U x 4个部位)、40Y.U.(10Y.U.x 4个部位)及80Y.U.(皮下施用)。可以例如如实施例3中描述或每月施用剂量。纳入标准可以包括实体瘤和可测量疾病的存在。主要和/或次要端点可以包括无进展存活(可以通过RECIST限定，或者可以通过针对RECIST修改的免疫相关响应标准或者通过Choi标准限定)、延迟的进展前时间、肿瘤响应率(即到登记前6-12个月通过在该时间段期间对未治疗肿瘤成像限定的放射摄影响应(radiographic response)，稳定性或进展，如通过RECIST和/或Choi标准测量和/或与受试者中的非照射损伤相比)、肿瘤生长速率动力学的变化(诸如治疗前6个月对治疗后6个月)、抗原特异性T细胞应答(例如治疗后短尾畸形特异性CD8+和/或CD4+T细胞出现或扩充)、总体存活或其组合。
可以比较受试者对基于酵母的免疫治疗性组合物的响应与在以相同方式治疗，但是没有添加免疫治疗性组合物或与二线疗法(诸如放射疗法、手术切除、靶向药物疗法或其组合)组合的免疫治疗性组合物的受试者。
基于酵母的免疫治疗性组合物是安全且完全耐受的，没有重大毒性。另外，酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物改善无进展存活，在至少一些或大多数患者中产生治疗紧急短尾畸形特异性T细胞应答和/或降低肿瘤生长速率。与尚未接受基于酵母的免疫疗法的对照受试者相比，受试者的治疗组具有延迟的进展前时间。研究的目的是实现趋向，并且优选相对于本实施例中公开的脊索瘤群体的预期中值PFS的中值PFS的统计学显著增加。举例而言，可以实现中值PFS为9个月的统计学目标，其中对于所研究的相关脊索瘤群体，预期中值PFS通常可以是约5个月。
实施例14
下述实施例描述了具有转移性疾病和先前尚未照射的损伤的脊索瘤受试者中的2期临床试验。
使用如本文中描述的酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(例如酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物，其包含完整的、热杀死的已经表达SEQ ID NO:8(GI-6301)或SEQ ID NO:20(GI-6305)的酵母属酵母)运行这些脊索瘤受试者中的随机化2期临床试验。试验会是统计学有力的，以登记合适数目的患者来使用下文描述的标准评估临床效力。
试验以双盲或开放标签、多中心试验运行。所有患者接受常规监测和/或护理标准放射疗法治疗、系统性药物疗法或其组合，治疗分组患者接受酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(即GI-6301或其它酵母-短尾畸形免疫治疗剂)的几次连续注射。例如，方案可以利用剂量范围4Y.U.(1Y.U.x 4个部位，意味着在每次访视时在患者身体上的4个不同部位施用1Y.U.GI-6301)、16Y.U.(4Y.U x 4个部位)、40Y.U.(10Y.U.x 4个部位)及80Y.U.(皮下施用)。可以例如如实施例3中描述或每月施用剂量。纳入标准可以包括实体瘤和可测量疾病的存在。主要和/或次要端点可以包括无进展存活(可以通过RECIST限定，或者可以通过针对RECIST修改的免疫相关响应标准或者通过Choi标准限定)、延迟的进展前时间、肿瘤响应率(即到登记前6-12个月通过在该时间段期间对未治疗肿瘤成像限定的放射摄影响应(radiographic response)，稳定性或进展，如通过RECIST和/或Choi标准测量和/或与受试者中的非照射损伤相比)、肿瘤生长速率动力学的变化(诸如治疗前6个月对治疗后6个月)、抗原特异性T细胞应答(例如治疗后短尾畸形特异性CD8+和/或CD4+T细胞出现或扩充)、总体存活或其组合。
可以比较受试者对基于酵母的免疫治疗性组合物的响应与在以相同方式治疗，但是没有添加免疫治疗性组合物或与二线疗法(诸如放射疗法、手术切除、靶向药物疗法或其组合)组合的免疫治疗性组合物的受试者。
基于酵母的免疫治疗性组合物是安全且完全耐受的，没有重大毒性。另外，酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物改善无进展存活，在至少一些或大多数患者中产生治疗紧急短尾畸形特异性T细胞应答和/或降低肿瘤生长速率。与尚未接受基于酵母的免疫疗法的对照受试者相比，受试者的治疗组具有延迟的进展前时间。研究的目的是实现趋向，并且优选相对于本实施例中公开的脊索瘤群体的预期中值PFS的中值PFS的统计学显著增加。举例而言，可以实现中值PFS为9个月的统计学目标，其中对于所研究的相关脊索瘤群体，预期中值PFS通常可以是约5个月。
实施例15
下述实施例描述了具有转移性疾病和先前已经照射的损伤的脊索瘤受试者中的2期临床试验。
使用如本文中描述的酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(例如酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物，其包含完整的、热杀死的已经表达SEQ ID NO:8(GI-6301)或SEQ ID NO:20(GI-6305)的酵母属酵母)运行这些脊索瘤受试者中的随机化2期临床试验。试验会是统计学有力的，以登记合适数目的患者来使用下文描述的标准评估临床效力。
试验以双盲或开放标签、多中心试验运行。所有患者接受常规监测和/或护理标准放射疗法治疗、系统性药物疗法或其组合，治疗分组患者接受酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物(即GI-6301或其它酵母-短尾畸形免疫治疗剂)的几次连续注射。例如，方案可以利用剂量范围4Y.U.(1Y.U.x 4个部位，意味着在每次访视时在患者身体上的4个不同部位施用1Y.U.GI-6301)、16Y.U.(4Y.U x 4个部位)、40Y.U.(10Y.U.x 4个部位)及80Y.U.(皮下施用)。可以例如如实施例3中描述或每月施用剂量。纳入标准可以包括实体瘤和可测量疾病的存在。主要和/或次要端点可以包括无进展存活(可以通过RECIST限定，或者可以通过针对RECIST修改的免疫相关响应标准或者通过Choi标准限定)、延迟的进展前时间、肿瘤响应率(即到登记前6-12个月通过在该时间段期间对未治疗肿瘤成像限定的放射摄影响应(radiographic response)，稳定性或进展，如通过RECIST和/或Choi标准测量和/或与受试者中的非照射损伤相比)、肿瘤生长速率动力学的变化(诸如治疗前6个月对治疗后6个月)、抗原特异性T细胞应答(例如治疗后短尾畸形特异性CD8+和/或CD4+T细胞出现或扩充)、总体存活或其组合。
可以比较受试者对基于酵母的免疫治疗性组合物的响应与在以相同方式治疗，但是没有添加免疫治疗性组合物或与二线疗法(诸如放射疗法、手术切除、靶向药物疗法或其组合)组合的免疫治疗性组合物的受试者。
基于酵母的免疫治疗性组合物是安全且完全耐受的，没有重大毒性。另外，酵母-短尾畸形免疫治疗性组合物改善无进展存活，在至少一些或大多数患者中产生治疗紧急短尾畸形特异性T细胞应答和/或降低肿瘤生长速率。与尚未接受基于酵母的免疫疗法的对照受试者相比，受试者的治疗组具有延迟的进展前时间。研究的目的是实现趋向，并且优选相对于本实施例中公开的脊索瘤群体的预期中值PFS的中值PFS的统计学显著增加。举例而言，可以实现中值PFS为9个月的统计学目标，其中对于所研究的相关脊索瘤群体，预期中值PFS通常可以是约5个月。
虽然已经详细描述了本发明的各个实施方案，但是明显的是对于本领域技术人员会发生那些实施方案的修改和改编。然而，应当明确理解，此类修改和改编在本发明的范围内，如所附例示的权利要求书中列出。
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Claims (40)

1.免疫治疗性组合物用于制备用于治疗脊索瘤的药物的用途，其包括对具有脊索瘤的个体施用免疫治疗性组合物，该免疫治疗性组合物包含：
a)酵母媒介物；和
b)癌症抗原，其包含至少一种短尾畸形(Brachyury)抗原，其中所述短尾畸形抗原由以SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成。
2.权利要求1的用途，其中所述个体是具有不能切除的、局部复发性损伤的个体。
3.权利要求2的用途，其中所述损伤的局部复发在施用所述免疫治疗性组合物前3至9个月发生。
4.权利要求1的用途，其中所述个体是具有寡转移性疾病的个体。
5.权利要求1的用途，其中所述个体是具有不能切除的损伤或能切除的损伤的第一次复发的个体。
6.权利要求1的用途，其中所述个体是具有转移性疾病的个体。
7.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述个体正在或者已经用另一种癌症疗法治疗。
8.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述个体正在或已经用放射疗法治疗。
9.权利要求8的用途，其中在施用所述免疫治疗性组合物前施用所述放射疗法。
10.权利要求8或权利要求9的用途，其中与施用所述免疫治疗性组合物同时施用所述放射疗法。
11.权利要求8或权利要求9的用途，其中与施用所述免疫治疗性组合物序贯施用所述放射疗法。
12.权利要求1-11中任一项的用途，其中所述个体正在或者已经用肿瘤切除治疗。
13.权利要求1-12中任一项的用途，其中所述个体正在或者已经用化学疗法治疗。
14.权利要求1-13中任一项的用途，其中所述个体正在或者已经用选自下组的药物靶向疗法治疗：酪氨酸激酶抑制剂、EGFR抑制剂、和STAT3抑制剂。
15.权利要求1-14中任一项的用途，其中所述个体正在或者已经通过施用一种或多种别的免疫治疗性组合物治疗。
16.权利要求15的用途，其中所述别的免疫治疗性组合物是酵母媒介物和与短尾畸形抗原不同的抗原。
17.权利要求15的用途，其中所述别的免疫治疗性组合物是酵母媒介物和表皮生长因子受体(EGFR)抗原。
18.免疫治疗性组合物用于制备用于在具有家族性脊索瘤史的个体中延迟脊索瘤发作、或者改善脊索瘤后果的药物的用途，其包括对所述个体施用免疫治疗性组合物，所述免疫治疗性组合物包含：
a)酵母媒介物；和
b)癌症抗原，其包含至少一种短尾畸形抗原，其中所述短尾畸形抗原由以SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成；
其中在施用时，所述个体尚未诊断出脊索瘤。
19.权利要求1-18中任一项的用途，其中所述短尾畸形抗原由以SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成。
20.权利要求1-18中任一项的用途，其中所述短尾畸形抗原由以SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成。
21.权利要求1-20中任一项的用途，其中所述酵母媒介物是完整的酵母。
22.权利要求21的用途，其中所述完整的酵母是杀死的。
23.权利要求21的用途，其中所述完整的酵母是热灭活的。
24.权利要求1-23中任一项的用途，其中所述酵母媒介物表达所述抗原。
25.权利要求1-24中任一项的用途，其中所述酵母来自选自下组的属：酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母(Pichia)、红酵母属(Rhodotorula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)和耶氏酵母属(Yarrowia)。
26.权利要求1-25中任一项的用途，其中所述酵母来自酵母属。
27.权利要求1-25中任一项的用途，其中所述酵母来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
28.权利要求1-27中任一项的用途，其中所述组合物在适合于通过注射对个体施用的药学可接受赋形剂中配制。
29.权利要求1-28中任一项的用途，其中以0.1Y.U.至100Y.U.的剂量对所述个体施用所述免疫治疗性组合物。
30.权利要求1-28中任一项的用途，其中以10Y.U.至80Y.U.的剂量对所述个体施用所述免疫治疗性组合物。
31.权利要求1-28中任一项的用途，其中以2Y.U.、40Y.U.或80Y.U.的剂量对所述个体施用所述免疫治疗性组合物。
32.权利要求1-31中任一项的用途，其中每周施用所述免疫治疗性组合物。
33.权利要求1-31中任一项的用途，其中每隔一周施用所述免疫治疗性组合物。
34.权利要求1-31中任一项的用途，其中每月施用所述免疫治疗性组合物。
35.权利要求1-31中任一项的用途，其中所述免疫治疗性组合物每周施用持续5周，接着每月施用。
36.权利要求1-31中任一项的用途，其中所述免疫治疗性组合物以2周时间间隔施用持续7轮治疗，接着每月施用。
37.权利要求1-31中任一项的用途，其中在所述个体上的超过一个部位处施用所述免疫治疗性组合物以形成单剂。
38.权利要求1-31中任一项的用途，其中与另一种癌症疗法同时施用所述免疫治疗性组合物。
39.免疫治疗性组合物用于制备用于治疗脊索瘤的药物的用途，所述免疫治疗性组合物包含酵母媒介物和癌症抗原，所述癌症抗原包含至少一种短尾畸形抗原，其中所述短尾畸形抗原由以SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成。
40.免疫治疗性组合物用于制备用于延迟脊索瘤发作的药物的用途，所述免疫治疗性组合物包含酵母媒介物和癌症抗原，所述癌症抗原包含至少一种短尾畸形抗原，其中所述短尾畸形抗原由以SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列组成。
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Revisiting chordoma with brachyury, a "new age" marker: analysis of a validation study on 51 cases;Jambhekar NA et al.;《Arch Pathol Lab Med》;20100831;第134卷(第8期);1181-1187 *

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