TWI748957B

TWI748957B - 經修飾之酵母-短尾畸型（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）免疫治療組合物

Info

Publication number: TWI748957B
Application number: TW105124349A
Authority: TW
Inventors: 湯瑪士Ｈ金; 郭志敏; 傑弗瑞史庫倫; 克勞蒂雅潘拉娜
Original assignee: 美商環球免疫公司; 美國衛生與公眾服務部
Priority date: 2015-08-03
Filing date: 2016-08-01
Publication date: 2021-12-11
Also published as: WO2017023840A1; IL257208A; JP6789283B2; CA2994272C; HK1249431A1; US11065313B2; CA2994272A1; KR20180054587A; EP3331552A1; IL257208B; TW201716574A; EP3331552B1; AU2016303525B2; AU2016303525A1; CN108348586B; JP2018522041A; US20180214525A1; CN108348586A

Abstract

本發明揭示包含經修飾之短尾畸型(Brachyury)抗原的基於經改良之酵母之免疫治療組合物，及用於預防及/或治療特徵為短尾畸型之表現或過度表現之癌症的方法。

Description

經修飾之酵母-短尾畸型(Brachyury)免疫治療組合物

相關申請案之交叉參考

本申請案主張2015年8月3日申請之美國臨時申請案第62/200,497號中35 U.S.C.119(e)下之優先權的權益。2015年8月3日申請之美國臨時申請案第62/200,497號之全部揭示內容以引用之方式併入本文中。

政府權利

由美國國家衛生研究院(衛生及人類服務部門之機構)在執行合作研究及開發協議中創建本發明。美國政府具有本發明之某些權利。

關於聯合研究協議之說明

由各方或代表各方按2008年5月8日執行之合作研究及開發協議製作本發明。合作研究及開發協議之各方為：GlobeImmune Inc.及如由美國國家癌症研究院(美國國家衛生研究院之研究所、中心或分部)代表之美國衛生及人類服務部門。

對序列表之參考

本申請案含有藉由EFS-Web以文本檔案形式以電子方式提交之序列表。名為「7797-3-PCT_ST25」之文本檔案具有以字節計50KB之大小且於2016年7月26日記錄。文本檔案中所含資訊遵循37 CFR§1.52(e)(5)以全文引用的方式併入本文中。

本發明大體上係關於經改良之酵母-短尾畸型(Brachyury)免疫治療組合物，及用於預防及/或治療特徵為短尾畸型之表現或過度表現之癌症的方法以及改良酵母-短尾畸型免疫治療組合物之製造及用途的方法。

亦稱為「T」之短尾畸型為基因之T-box複合物之中胚層轉錄因子及成員。編碼短尾畸型之基因(表示為人類中之T基因或短尾畸型基因)最初於1927年由Nadine Dobrovolskaïa-Zavadskaïa經由在感染異型接合動物中之尾長及骶椎的小鼠中之突變識別。短尾畸型基因係於1990年由Hermann及同事(Herrmann等人，1990，Nature 343：617-622)在小鼠中選殖且於1996年由Edwards及同事(Edwards等人，1996，Genome Res.6：226-223)在人體中選殖，其亦描述經推論之人類短尾畸型的胺基酸序列。

作為轉錄因子之T-box族之成員，短尾畸型含有稱為「T-box」或T-域之高度保守之DNA-結合域基序(motif)，其結合至具有迴文結構的共有序列(palindromic consensus sequence)。類似其他T-box蛋白質之短尾畸型已展示在早期發展中起一定作用且對脊椎動物之尾部中胚層之形成及分化及軸向發展至關重要(參見，例如Wilkinson等人，1990,Nature 343(6259)：657-659)；Beddington等人，1992,Development(Suppl.)：157-165；Schulte-Merker等人，1994,Development 120：1009-1015；Kispert及Herrmann,1994,Dev.Biol.161：179-193；Showell等人，2004,Dev Dyn 229：201-218)。最近，Palena及同事已證實短尾畸型會在各種人類腫瘤組織及癌細胞系中表現且已展示短尾畸型之肽可用以在正常供體及癌症患者中產生短尾畸型-特定T細胞系(Palena等人，2007,Cancer Res.13(8)：2471-2478)。Fernando等人之研究已展示短尾畸型促進人類腫瘤細胞中上皮間葉細胞轉化(EMT)，賦予腫瘤細胞間葉細胞表型以及遷移性及侵襲性能力，同時使腫瘤細胞週期進程衰減(Fernando等人，2010,J.Clin.Invest.120(2)：533-544)。因此，短尾畸型參與癌症之轉移性進程。

癌症為世界死亡之主要原因，且對癌症之有效治療劑的研發繼續是研究及臨床研發之最活躍的領域之一。儘管已提出治療及防礙癌症之各種創新方法，但許多癌症仍具有較高死亡率且可能難以治療或對習知療法相對無反應。可在各種組織(包括乳房、小腸、胃、腎臟、膀胱、子宮、卵巢、睾丸、肺、結腸、骨骼(包括索脊瘤)及前列腺)中發現與短尾畸型表現相關之癌症，且該癌症包括轉移性及晚期癌症。另外，短尾畸型在B細胞原發腫瘤中表現，該等腫瘤諸如慢性淋巴球性白血病(CLL)、經埃-巴二氏病毒(Epstein Barr Virus)轉型之B細胞、伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤及霍奇金氏(Hodgkin's)淋巴瘤。因此，短尾畸型似乎在大量人類癌症中起一定作用。儘管已提出短尾畸型為癌症免疫療法之靶向物(參見，例如Palena等人，同前文獻，Fernando等人，同前文獻及WO 2008/106551)，由於此為相對新的癌症靶向物，所以在此項技術中仍需要有效治療及/或預防與短尾畸型表現或過度表現相關聯之癌症的新的免疫治療產品。

本發明之一個實施例係關於酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其包含：a)酵母；及b)由酵母表現之至少一個經修飾之短尾畸型抗原，其中該經修飾之短尾畸型抗原具有因至少一個修飾而不同於野生型短尾畸型胺基酸序列的胺基酸序列，該至少一個修飾選自野生型短尾畸型之位點42至229中之任何一或多處之胺基酸之缺失或取代，其中該短尾畸型抗原與該野生型短尾畸型相比具有經破壞之DNA結合位點。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原與野生型短尾畸型相比具有經破壞之DNA結合活性。在再一態樣中，該酵母與表現野生型短尾畸型之酵母相比具有降低之絮凝表型。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原具有因至少一個修飾而不同於野生型短尾畸型胺基酸序列的胺基酸序列，該至少一個修飾選自野生型短尾畸型之位點66至217中之任何一或多處之胺基酸之缺失或取代。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原具有因至少一個修飾而不同於野生型短尾畸型胺基酸序列的胺基酸序列，該至少一個修飾選自野生型短尾畸型之位點198至222中之任何一或多處之胺基酸之缺失或取代。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原具有因至少一個修飾而不同於野生型短尾畸型胺基酸序列的胺基酸序列，該至少一個修飾選自野生型短尾畸型之至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個胺基酸殘基之缺失或取代，該等胺基酸殘基選自：Lys66、Arg69、Arg70、Arg101、Lys103、Lys147、Asn150、Lys151、Ser162、Thr196、Ala197、Tyr198、Ile208、Asn211、Pro212、Phe213、Ala214、Lys215、Ala216及/或Phe217。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原具有因而不同於野生型短尾畸型胺基酸序列的胺基酸序列，該至少一個修飾選自野生型短尾畸型之至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個胺基酸殘基之缺失或取代，該等胺基酸殘基選自：Met87、Pro127、Asp128、Ser129、Pro130、Asn131、Phe132及/或Val175。在再一態樣中，該修飾為缺失。在又一態樣中，經修飾之短尾畸型抗原因修飾中之1者、2者、3者、4者、5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者、16者、17者、18者、19者、20者、21者、22者、23者或24者而不同於野生型短尾畸型胺基酸序列。在再一態樣中，經修飾之短尾畸型抗原具有因缺失野生型短尾畸型之位點66與217之間的至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個連續胺基酸而不同於野生型短尾畸型胺基酸序列的胺基酸序列。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原具有因缺失野生型短尾畸型之位點198與222之間的至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個連續胺基酸而不同於野生型短尾畸型胺基酸序列的胺基酸序列。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原具有因缺失野生型短尾畸型之位點198至222而不同於野生型短尾畸型胺基酸序列的胺基酸序列。

在上文或本文其他處所描述之本發明之實施例或態樣中的任一者之一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原具有進一步包含至少一個促效劑T細胞抗原決定基之胺基酸序列。在一個態樣中，促效劑抗原決定基具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列。

在上文或本文其他處所描述之本發明之實施例或態樣中的任一者之一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原具有與SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：13至少80%相同之胺基酸序列。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原具有與SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：13至少90%相同之胺基酸序列。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原具有與SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：13至少95%相同之胺基酸序列。在再一態樣中，經修飾之短尾畸型抗原具有包含SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：10之位點2至410之胺基酸序列。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原具有包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：13之位點2至410之胺基酸序列。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原為具有與SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：15至少95%相同之胺基酸序列的融合蛋白質。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原為具有SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：15之胺基酸序列的融合蛋白質。

在上文或本文其他處所描述之本發明之實施例中的之前述態樣中之任一者中，酵母來自酵母菌屬(Saccharomyces)。在一個態樣中，酵母來自釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。在一個態樣中，酵母為整個酵母。在一個態樣中，整個酵母經殺滅。在一個態樣中，整個酵母為經熱滅活。

在上文或本文其他處所描述之本發明實施例中之任一者的一個態樣中，組合物係於適於投與受試者之醫藥學上可接受之賦形劑中調配。

本發明之又一實施例係關於酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其包含：a)整個滅活之酵母；及b)短尾畸型融合蛋白質，其包含SEQ ID NO：10之位點2至415之胺基酸序列，其中該短尾畸型融合蛋白質由酵母表現；且其中該組合物引發短尾畸型特異性T細胞反應。在一個態樣中，融合蛋白質具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列。本發明之再一實施例係關於酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其包含：a)整個滅活之酵母；及(b)短尾畸型融合蛋白質，其包含SEQ ID NO：13之位點2至415之胺基酸序列；其中該短尾畸型融合蛋白質由酵母表現；且其中該組合物引發短尾畸型特異性T細胞反應。在一個態樣中，融合蛋白質具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列。

在上文或本文其他處所描述之本發明之實施例或態樣中的任一者中，短尾畸型融合蛋白質之表現受到啟動子CUP1之控制。在一個態樣中，酵母來自酵母菌屬。在一個態樣中，酵母來自釀酒酵母菌。在一個態樣中，組合物係於適於投與受試者之醫藥學上可接受之賦形劑中調配。

本發明之又一實施例係關於治療表現短尾畸型之癌症的方法。在一個態樣中，該方法包含向患有表現短尾畸型之癌症的受試者投與如上文或本文其他處所描述之酵母-短尾畸型免疫治療組合物。

本發明之又一實施例係關於降低、阻止、逆轉、延緩或預防患有癌症之個體中之癌症的轉移性進展的方法，該方法包含向患有正經歷轉移性進展、處於經歷轉移性進展之風險下或經預測開始經歷轉移性進展之癌症的個體投與如上文或本文其他處所描述之免疫治療組合物。

本發明之再一實施例係關於預防或延緩表現短尾畸型之癌症之發病的方法，該方法包含向個體投與如上文或本文其他處所描述之免疫治療組合物。

本發明之另一實施例係關於治療脊索瘤之方法，該方法包含向患有脊索瘤之受試者投與如上文或本文其他處所描述之免疫治療組合物。

在上文或本文其他處所描述之本發明之實施例或態樣中的任一者之一個態樣中，正藉由或已藉由用於癌症之另一療法治療個體。在一個態樣中，療法係選自放射療法、手術切除腫瘤、化學療法、靶向癌症療法、過繼性T細胞轉移或投與一或多種額外免疫治療組合物。

本發明之另一實施例係關於降低或預防患有癌症之患者中之腫瘤細胞的化學療法抗性或放射抗性的方法，該方法包含向患有癌症且正接受化學療法及/或放射療法之個體投與如上文或本文其他處所描述之免疫治療組合物。

在上文或本文其他處所描述之本發明之實施例或態樣中的任一者之一個態樣中，該方法降低個體中之腫瘤負荷、延長個體之存活期及/或抑制個體中之腫瘤生長。在一個態樣中，癌症為乳癌、骨癌、脊索瘤、小腸癌、胃癌、胰臟癌、腎臟癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睾丸癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、慢性淋巴球性白血病(CLL)、伯基特氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤及其轉移性癌症。

本發明之另一實施例係關於治療或預防與埃-巴二氏病毒(EBV)感染相關聯之疾病或病狀的方法，該方法包含向個體投與如上文或本文其他處所描述之酵母-短尾畸型免疫治療組合物。

本發明之又一實施例係關於本文所述之免疫治療組合物中之任一者治療表現短尾畸型之癌症；降低、阻止、逆轉或預防患有癌症之個體中癌症之轉移性進展；預防或延緩表現短尾畸型之癌症的發病或降低或預防患有癌症之患者中之腫瘤細胞的化學療法抗性或放射抗性的用途。

本發明之再一實施例係關於本文所述之免疫治療組合物中之任一者在製備用於治療表現短尾畸型之癌症之藥物中的用途。

圖1為展示被稱為GI-6306(或6306)之酵母-短尾畸型免疫治療組合物之抗原表現與表示為GI-6301(或6301)及GI-6305(或6305)之酵母-短尾畸型免疫治療組合物中之抗原表現比較的蛋白質印跡之數位影像。(「ug」為微克)。「YVEC」為空載體酵母。

圖2為展示被稱為GI-6306之酵母-短尾畸型免疫治療組合物與酵母-短尾畸型免疫治療組合物GI-6301及GI-6305相比呈現降低之絮凝表型的數位影像。

本發明大體上係關於經改良之酵母-短尾畸型免疫治療組合物、用於生產此類組合物之方法及用於使用此類組合物預防及/或治療表現或過度表現短尾畸型之癌症的方法。本發明包括產生具有降低或經破壞之DNA結合活性之新穎短尾畸型抗原以供免疫療法使用的短尾畸型抗原之特定修飾。本發明人已完成驚人且出人意料的發現，短尾畸型抗原之此類修飾亦改良酵母-短尾畸型免疫治療組合物之製備及用途兩者。本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物不僅缺乏結合DNA之能力且因此充當轉錄因子，原生短尾畸型同樣如此，但其亦驚人地且出人意料地更容易製備、更容易投與，且即使當引入其他修飾(例如，促效劑突變)時，仍以高位準表現短尾畸型抗原。

更特定言之，本發明包括基於經改良之酵母之免疫治療組合物(在本文中亦稱為「基於酵母之免疫療法」、「酵母-短尾畸型免疫療法」、「酵母-短尾畸型免疫治療組合物」、「基於酵母之免疫治療產物」、「基於酵母之疫苗」或此等片語之派生詞)，其中該組合物包含酵母媒劑及至少一中經修飾之短尾畸型抗原(包括短尾畸型促效劑抗原)，其中該短尾畸型抗原之DNA結合活性(例如，與野生型短尾畸型蛋白質相比)已藉由突變(例如，藉由在短尾畸型DNA結合區內之足以降低或消除短尾畸型蛋白質之固有DNA結合活性之缺失、取代、插入或其他修飾)降低或消除。本發明進一步包括此等經修飾之酵母-短尾畸型免疫治療組合物治療或預防癌症之用途，以及生產此等經修飾之酵母-短尾畸型免疫治療組合物之方法。本發明人在本文中描述此等新穎酵母-短尾畸型免疫治療產物之建構及生產，其經設計以擴展來自正常個體及來自癌症患者之短尾畸型特異性T細胞(包括CD4⁺ T細胞及CD8⁺ CTL)。使用本發明之新穎組合物之酵母-短尾畸型免疫療法適用於誘發短尾畸型特異性細胞免疫反應(CD4⁺及CD8⁺)且適用於向患有表現短尾畸型腫瘤之受試者投與，從而提供用於預防及/或治療表現短尾畸型之癌症(包括(但不限於)索脊瘤、轉移性癌症及相關病況)的新穎療法。

因為短尾畸型不由大部分正常(非腫瘤)組織表現且通常在腫瘤細胞中過度表現，所以截至本發明之時間未涉及且未觀測到與正常組織相關之任何「偏離靶向」效應，其中保留其DNA結合序列之短尾畸型抗原已在活體內使用。然而，本發明之經修飾之酵母-短尾畸型免疫治療組合物含有消除原生短尾畸型之DNA結合功能之修飾，由此消除短尾畸型抗原充當轉錄因子之能力且因此消除此活性之任何後階段效應。在本發明中，短尾畸型僅需要充當免疫原，且因此不難解決其在 mRNA轉錄中之滅活天然作用。

本發明人已完成出人意料且不可預測的發現，當具有經消除之DNA結合活性的短尾畸型在酵母中表現時，該酵母與無此修飾之表現短尾畸型的酵母相比具有不同結構特性。更特定言之，由本發明描述之無修飾之酵母-短尾畸型組合物在製造製程期間呈現穩定的「絮凝」表型，意謂隨著酵母細胞生長且表現短尾畸型抗原，細胞聚集成較大的多細胞結構，該結構比在生長培養基或PBS中之非聚集細胞更稠密(下文更具體地描述)。相比之下，本發明之表現經修飾之短尾畸型抗原的酵母不呈現絮凝表型，或呈現大體上降低之絮凝表型。因此，消除短尾畸型之DNA結合功能不僅提供不具有天然短尾畸型生物活性同時保持抗原之免疫原性的基於酵母之免疫治療產物，而且新抗原之驚人且出人意料的性質為表現經修飾之抗原的酵母中絮凝表型之缺失。絮凝表型之缺失使得能夠減少製造製程中之步驟及/或修飾步驟的數量，該製造製程用以適應酵母-短尾畸型中之此特徵。

另外，含有本發明之修飾之例示性短尾畸型抗原(參見實例)與除新穎修飾之外為相同序列之短尾畸型抗原的表現位準相比以實質上較高位準在酵母中表現。此結果指示根據本發明之短尾畸型抗原之修飾亦可增強短尾畸型抗原在酵母中之表現。穩定的抗原表現為酵母-短尾畸型免疫治療組合物之高度正向特徵。

適用於本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物在其開始獲取活動力並侵入其他組織期間之前或之時靶向腫瘤細胞，從而預防、抑制、阻止、逆轉或延緩轉移性癌症之發病及/或癌症(且尤其轉移性癌症)之進展。另外，本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物可用於預防或延緩患有早期癌症或具有癌前期(惡化前)病變或腫瘤之個體、處於罹患癌症之高風險下之個體、尤其具有高速轉移之個體中之轉移性癌症或癌症之進展，且甚至在正常個體中用作預防癌症之預防劑，其可與用於癌症(諸如本文所描述)之其他預防性免疫療法結合使用。

本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物亦向經歷用於癌症之其他療法(包括化學療法及放射療法)的個體提供益處。已知轉移性癌症在某些情況下對化學療法及/或放射療法比對原發性癌症更具抗性。因此，本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物可用於藉由抑制癌症中之短尾畸型表現腫瘤(且從而抑制抗增值性影響)來抑制或降低或消除可出現於轉移性癌症中之化學療法抗性或放射抗性，且本發明之組合物可增強個體中化學療法或放射療法之效能。

近年來，短尾畸型已成為被稱為脊索瘤之罕見骨癌的區別生物標記。當與細胞角蛋白染色組合時，使用短尾畸型檢測索脊瘤之靈敏度及特異性分別為98%及100%(Oakley等人，(2008),Mod Path 21,1461-1469)。因此，本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物適用於預防及/或治療索脊瘤。

本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物亦可用於治療與短尾畸型表現相關之病狀或疾病，該等病狀或疾病可為本質上非腫瘤的或可在惡性轉化之前的。舉例而言，短尾畸型在經以感染原(例如，諸如埃-巴二氏病毒(EBV)之病毒)感染的細胞中會被上調。因此，本發明之酵母-短尾畸型免疫療法可用於治療或預防與短尾畸型表現相關聯之任何疾病或病狀，包括(但不限於)諸如病毒感染之感染性疾病，包括(但不限於)與EBV相聯關之病狀(例如，單核白血球增多症)。

本文所描述之酵母-短尾畸型組合物均在未使用多數具有毒性問題之外源性佐劑、細胞激素或其他免疫刺激分子的情況下誘發針對靶抗原(短尾畸型)之先天性免疫反應以及適應性免疫反應，包括CD4依賴性TH17及TH1 T細胞反應及抗原特異性CD8⁺ T細胞反應，其包括細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應。另外，酵母-短尾畸型免疫治療組合物抑制調節T細胞(Treg)數目及/或功能性，從而(例如)增強可通常受腫瘤之存在抑制之效應T細胞反應。此外，與藉由產生抗體反應而免疫之免疫治療組合物相比，認為藉由酵母-短尾畸型免疫療法引發之抗原特異性、廣泛式及有效細胞免疫反應在靶向腫瘤細胞中尤其有效。實際上，大量研究已展示當腫瘤細胞經由識別MHC I類分子情形下之腫瘤肽之CD8⁺ CTL靶向時，增強免疫治療方法。

即使在面對另外可為抑制環境的情況下，酵母-短尾畸型免疫療法仍高度適於活化抗原呈現細胞且具有跨素免疫反應之獨特能力，產生通常有效抗腫瘤之CD8⁺ CTL反應。因為此類免疫療法利用抗原呈現細胞之天然能力呈現相關免疫原，因此不必瞭解短尾畸型之CTL抗原決定基或MHC II類抗原決定基產生根據本發明之有效免疫治療的確切標識。實際上，多種CD4⁺及CD8⁺ T細胞抗原決定基可靶向單個酵母-短尾畸型免疫治療組合物，且因此本發明之酵母-短尾畸型免疫治療劑不限於使用短肽，且實際上在此等組合物中使用較長多肽及融合蛋白質為有效的。因此，藉由使用酵母-短尾畸型免疫療法，消除使用算法及複雜工式以識別假定的T細胞抗原決定基。

在未使用外源性佐劑、免疫刺激劑或免疫刺激分子、協同刺激分子或細胞激素之情況下(但若需要時可包括此等製劑)，可在免疫方案(預防性或治療性)有效利用酵母-短尾畸型。此外，可在不損失療效的情況下重複投與酵母-短尾畸型免疫療法，其可為其他類型之免疫療法存在的問題。

本發明之組合物

本發明之一個實施例係關於可用於預防及/或治療特徵為短尾畸型表現或過度表現之癌症或其他疾病(包括在起初可不含有表現可檢測的短尾畸型之細胞的癌症，但其在癌症之發展的後期可或將含有表現短尾畸型之細胞)的基於酵母之免疫治療組合物。該組合物為酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其包含：(a)酵母媒劑；及(b)包含一或多種短尾畸型抗原之癌症抗原，其中短尾畸型抗原為經修飾之短尾畸型抗原(例如，與野生型短尾畸型蛋白質相比)。特定言之，經修飾之短尾畸型抗原最低限度地包含其中已藉由突變(例如，藉由足以降低或消除短尾畸型蛋白質之天然DNA結合活性的短尾畸型DNA結合區之缺失、取代、插入或其他修飾)降低或消除短尾畸型蛋白質之DNA結合活性的修飾。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原最低限度地包含導致表現經修飾之短尾畸型抗原之酵母與表現野生型短尾畸型蛋白質之酵母相比具有降低之絮凝表型(酵母展示減少聚集成較大多細胞結構)的修飾。經修飾之短尾畸型抗原可包括額外修飾(亦即，不同於野生型短尾畸型蛋白質)，諸如取代蛋白質中之一或多個胺基酸殘基以在短尾畸型抗原中產生一或多個促效劑抗原決定基(下文更詳細地描述)。最後，經修飾之短尾畸型抗原(即使經修飾)仍保持誘發免疫反應之能力，且較佳為針對原生短尾畸型蛋白質(諸如由腫瘤細胞表現之短尾畸型蛋白質)之細胞介導之免疫反應(T細胞反應)。經修飾之短尾畸型抗原最典型地由酵母媒劑(例如，由完整(整個)酵母或酵母球形質體，其可視情況進一步經處理成酵母胞質體、酵母殘骸或酵母細胞膜提取物或其碎片)表現為重組蛋白質，儘管其為本發明之一實施例，一或多種經修飾之短尾畸型抗原可裝載至酵母媒劑或以其他方式與如本文所描述之酵母媒劑複合、連接、混合或投與以形成本發明之組合物。

根據本發明，「酵母-短尾畸型免疫治療組合物」為含有酵母媒劑及至少一種短尾畸型抗原或其免疫原性結構域之特定類型之「基於酵母之免疫治療組合物」，且在本發明中，含有如上文及本文其他處所描述之至少一種經修飾之短尾畸型抗原。「免疫治療組合物」為誘發足以在受試者中達成至少一種治療效益之免疫反應的組合物。如本文所使用，基於酵母之免疫治療組合物係指包括酵母媒劑組分且誘發足以在受試者中達成至少一種治療效益之免疫反應的組合物。更特定言之，基於酵母之免疫治療組合物為包括酵母媒劑組分且通常包括抗原組分，且可誘發或誘導諸如細胞免疫反應(包括(但不限於)T細胞介導之細胞免疫反應)之免疫反應的組合物。在一個態樣中，適用於本發明之基於酵母之免疫治療組合物能夠誘導CD8⁺及/或CD4⁺ T細胞介導之免疫反應，且在一個態樣中，尤其針對靶抗原(例如，癌症抗原)誘導CD8⁺及CD4⁺ T細胞介導之免疫反應。CD4⁺免疫反應可包括TH1免疫反應、TH2免疫反應、TH17免疫反應或以上之任何組合。基於酵母之免疫療法尤其能夠產生TH1及TH17反應。CD8⁺免疫反應可包括細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應，且基於酵母之免疫療法能夠產生該等反應。在一個態樣中，基於酵母之免疫治療組合物調整受試者中之調節T細胞(Treg)之數目及/或功能性。基於酵母之免疫療法亦可經修飾以例如藉由添加細胞激素、抗體及/或調整酵母之製造製程來促進一種類型之反應超過另一種。基於酵母之免疫治療組合物視情況能夠誘發體液免疫反應。

本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物可為「預防性」或「治療性」。當預防性地提供時，在表現短尾畸型之癌症之發展或發展之檢測之前提供本發明之組合物，從而預防、抑制或延緩表現短尾畸型之腫瘤的發展；及/或預防、抑制或延緩腫瘤轉移及/或腫瘤侵入其他組織(轉移瘤)及/或通常預防或抑制個體中之癌症之進展。如本文所論述，短尾畸型在若干癌症(包括晚期癌症)中表現，且已展示涉及EMT過程，該EMT過程為與諸如轉移性癌症中之腫瘤侵襲性及轉移相關之過程。因此，可向呈現無癌之個體(健康或正常個體)、向癌前(惡化前病變)個體及亦向患有癌症但其中未檢測到短尾畸型之個體(亦即，在表現短尾畸型之前由癌症中之腫瘤細胞檢測)投與預防性組合物。可使用本發明之組合物預防性地治療處於高風險罹患癌症(尤其通常與短尾畸型表現及/或轉移相關聯之癌症)之高風險的個體。當治療性地提供時，向患有表現短尾畸型之癌症的個體提供免疫治療組合物，從而諸如藉由降低個體中之腫瘤負荷來改善癌症；抑制個體中之腫瘤生長；增加個體存活期；預防、抑制、逆轉或延緩腫瘤遷移及/或腫瘤侵入其他組織(轉移性癌症)之發展及/或預防、抑制、逆轉或延緩個體中癌症之進展。在一個態樣中，治療性地使用酵母-短尾畸型免疫療法以藉由抑制癌症中之短尾畸型表現來抑制、降低或消除可在轉移性癌症中出現之化學療法抗性或放射抗性，且本發明之組合物可增強個體中化學療法或放射療法之效能。

通常，酵母-短尾畸型免疫治療組合物包括酵母媒劑及包含本發明之經修飾之短尾畸型抗原的至少一種癌症抗原，其中該癌症抗原由酵母媒劑表現、與酵母媒劑連接、裝載至酵母媒劑中或與酵母媒劑混合。在一些實施例中，癌症抗原經提供為融合蛋白質。以下描述適合用於本發明之該等組合物及方法的若干經修飾之短尾畸型蛋白質及融合蛋白質。在一些實施例中，癌症抗原及經修飾之短尾畸型抗原為相同成分。在一些實施例中，癌症抗原包括其他抗原，該等其他抗原包括除經修飾之短尾畸型抗原之外的其他癌症抗原。在本發明之一個態樣中，適合用作癌症抗原之融合蛋白質可包括兩種或更多種抗原，例如，經修飾之短尾畸型抗原及非短尾畸型抗原之另一癌症抗原，或兩個不同的短尾畸型抗原(例如，具有不同促效劑抗原決定基的兩種經修飾之短尾畸型抗原)。在一個態樣中，融合蛋白質可包括一或多種抗原之兩個或更多個免疫原性結構域，諸如經修飾之短尾畸型抗原之兩個或更多個免疫原性結構域(其中該免疫原性結構域包含本發明之修飾)。

根據本發明，本文術語「抗原」之一般用途係指：蛋白質之任何部分(例如肽、部分蛋白質、全長蛋白質)，其中該蛋白質為天然產生的或經合成方式衍生或設計的；細胞組合物(整個細胞、細胞裂解物或經破壞之細胞)；生物體(整個生物體、裂解物或經破壞之細胞)；或碳水化合物或其他分子或其部分。抗原可針對由免疫系統之成分(例如T細胞，抗體)遇到之相同或相似抗原誘發抗原特異性免疫反應(例如，體液及/或細胞介導之免疫反應)。抗原可如單個抗原決定基、單個免疫原性結構域一樣小或更大，且可包括多個抗原決定基或免疫原性結構域。因此，抗原之大小可與約8個至11個胺基酸(亦即，肽)一樣小及與全長蛋白質、多聚體、融合蛋白質、嵌合蛋白質、整個細胞、整個微生物或其任何部分(例如，整個細胞之蛋白質片段(多肽)分解物或微生物之提取物)一樣大。另外，抗原可包括可裝載入酵母媒劑或本發明之組合物中之碳水化合物。

適用於本發明之酵母-短尾畸型免疫治療之抗原為多肽、全長蛋白質、多聚體、融合蛋白質及嵌合蛋白質，其中在此等態樣中之任一者中，抗原包括如本文所描述之至少一種經修飾之短尾畸型抗原。為在酵母中表現，為蛋白質之抗原(諸如經修飾之短尾畸型抗原)具有能夠以重組方式在酵母中表現之最小大小，且通常至少或大於25個胺基酸長度、或至少或大於26個、至少或大於27個、至少或大於28個、至少或大於29個、至少或大於30個、至少或大於31個、至少或大於32個、至少或大於33個、至少或大於34個、至少或大於35個、至少或大於36個、至少或大於37個、至少或大於38個、至少或大於39個、至少或大於40個、至少或大於41個、至少或大於42個、至少或大於43個、至少或大於44個、至少或大於45個、至少或大於46個、至少或大於47個、至少或大於48個、至少或大於49個或至少或大於50個胺基酸長度，或至少或大於25個至50個胺基酸長度，或至少或大於30個至50個胺基酸長度，或至少或大於35個至50個胺基酸長度，或至少或大於40個至50個胺基酸長度，或至少或大於45個至50個胺基酸長度，儘管可表現較小蛋白質，且可表現相當大之蛋白質(例如，數百個胺基酸長度或甚至幾千個胺基酸長度)。在一個態樣中，可表現全長蛋白質或自N端及/或C端缺失1個與20個胺基酸之間的蛋白質。融合蛋白質及嵌合蛋白質亦為可在本發明中表現之抗原。「靶抗原」為由本發明之免疫治療組合物特定靶向之抗原(亦即，對其誘發免疫反應之所需抗原，例如本發明中之短尾畸型)。「癌症抗原」為包含至少一種與癌症相關聯之抗原的抗原，諸如由腫瘤細胞表現之抗原，使得靶向該抗原亦靶向該癌症。癌症抗原可包括來自一或多種蛋白質(包括一或多種與腫瘤相關聯之蛋白質)的一或多種抗原。「短尾畸型抗原」為自短尾畸型蛋白質衍生、設計或產生之抗原。根據本發明之「經修飾之短尾畸型抗原」為包含因至少一個修飾(例如，缺失，取代，插入或其他修飾)而不同於對應野生型短尾畸型胺基酸序列的胺基酸序列之短尾畸型抗原，該至少一個修飾足以降低或消除短尾畸型蛋白質之天然DNA結合活性(與野生型短尾畸型蛋白質相比)及/或降低或消除表現經修飾之短尾畸型抗原之酵母之絮凝表型(例如，與表現野生型蛋白質之酵母相比，表現經修飾之抗原之酵母具有降低之聚集成較大多細胞結構之傾向)。經修飾之短尾畸型抗原可包含額外修飾，諸如形成促效劑抗原決定基之一或多個胺基酸取代。

當涉及刺激免疫反應時，術語「免疫原」為術語「抗原」之子集，且因此在一些情況下可與術語「抗原」互換使用。如本文所使用之免疫原描述誘發體液及/或細胞介導之免疫反應(亦即為免疫原性)之抗原，使得將免疫原投與個體增大針對由個體之免疫系統遇到之相同或相似抗原之抗原特異性免疫反應。在一個實施例中，免疫原誘發細胞介導之免疫反應，包括CD4⁺ T細胞反應(例如，TH1、TH2及/或TH17)及/或CD8⁺ T細胞反應(例如，CTL反應)。

給定抗原之「免疫原性結構域」可為含有至少一種可充當免疫原(當向動物投與時)之抗原決定基的抗原的任何部分、片段或抗原決定基(例如，肽片段或次單元或抗體抗原決定基或其他構形抗原決定基)。因此，免疫原結構域大於單個胺基酸且至少為足以含有可充當免疫原之至少一種抗原決定基之大小。舉例而言，單個蛋白質可含有多個不同的免疫原性結構域。免疫原結構域在蛋白質內無需為線性序列，諸如在體液免疫反應之情況下，其中涵蓋構形結構域。

抗原決定基在本文中經定義為當在免疫系統之適當協同刺激訊號及/或活化細胞之情形下提供至免疫系統時，足以誘發免疫反應之給定抗原內之單個免疫原位點。換言之，抗原決定基為藉由免疫系統之組分識別之抗原的一部分且亦可稱為抗原決定子。熟習此項技術者將認識到T細胞抗原決定基在大小及組成上不同於B細胞或抗體抗原決定基，且經由I類MHC路徑呈現之抗原決定基在大小及結構屬性上不同於經由II類MHC路徑呈現之抗原決定基。舉例而言，藉由I類MHC分子呈現之T細胞抗原決定基長度通常在8個與11個胺基酸之間，而藉由H類MHC分子呈現之抗原決定基在長度上限制較少且可至多為25個胺基酸或更長。另外，T細胞抗原決定基已預測取決於由抗原決定基結合之特定MHC分子之結構特徵。抗原決定基可為線性序列抗原決定基或構形抗原決定基(保守結合區)。大部分抗體識別構形抗原決定基。

短尾畸型(其亦可稱為「T」)在多個不同動物物種中為高度保守之蛋白質，且為含有「T-box」結構域或「T-結構域」，若干不同蛋白質中共享之DNA結合域基序(統稱為蛋白質之T-box家族)之轉錄因子。人類短尾畸型初次於1996年選殖(Edwards等人，同前文獻)。編碼例示性野生型人類短尾畸型之一種核苷酸序列在本文藉由SEQ ID NO：1表示，其為自GENBANK^®寄存號NM_003181(GI：19743811)獲得之mRNA序列。SEQ ID NO：1編碼435個胺基酸的野生型人類短尾畸型蛋白質，在本文中其胺基酸序列表示為SEQ ID NO：2(亦見於GENBANK®寄存號NP_003172；GI：4507339中)。在SEQ ID NO：2內，位點42至223表示為T-box區(T-box結構域)，且尤其與DNA結合相關聯之位點表示為SEQ ID NO：2之以下位點：63、65、66、67、68、69、70、72、101、162、196、197、198、204、208、211、212、213、214、215、216、217、218及219。

另一例示性野生型人類短尾畸型蛋白質為SEQ ID NO：2之人類短尾畸型蛋白質之變異體，且具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列。SEQ ID NO：4(亦為435個胺基酸蛋白質)藉由本文中表示為SEQ ID NO：3之核苷酸序列編碼。SEQ ID NO：4在蛋白質之全長上與SEQ ID NO：2大致99%相同。SEQ ID NO：4與SEQ ID NO：2在位點177(分別為Asp與Gly)、位點368(分別為Thr與Ser)及位點409(分別為Asn與Asp)上不同。T-box區(T-box結構域)位於位點42至223處，且尤其與DNA結合相關聯之位點表示為SEQ ID NO：4之以下位點：63、65、66、67、68、69、70、72、101、162、196、197、198、204、208、211、212、213、214、215、216、217、218及219。

T-box結構域(或T-box區)通常為在所有「T-box蛋白質」內定義為T-box蛋白質內之必需且足以用於序列特異性DNA結合之最小區域。T-box族之成員(具有此結構域之蛋白質)結合至DNA共有序列TCACACCT(Wilson及Conlon,Genome Biology 2002,3(6)：reviews3008)。在短尾畸型中，T-box族之精液成份，鼠類蛋白質之位點1至229(例如，位點1至229)起初描述為包含整個T-box DNA結合結構域域(Kispert等人，The EMBO Journal 1993,12(8)3211-3220；Kispert等人，The EMBO Journal 1996,14(19)：4763-4772)，且鼠類蛋白質之少至N端17個胺基酸的缺失明顯減弱蛋白質之DNA結合能力(Kispert等人，1993，同前文獻)。基於不同T-box蛋白質中之殘基之保守性，後續出版物及公開資料庫已更明確地將DNA結合結構域描述為通常自約位點41或42橫跨至約位點223(例如，參見GENBANK^®寄存號NP_003172)，對應於大約180個胺基酸結構域，儘管亦可在科學文獻中發現在位點1至229內具有額外或較少胺基酸的結構域。已經由晶體結構識別為直接涉及DNA結合的短尾畸型之胺基酸殘基包括(關於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4之給定位點)：Lys66、Arg69、Arg70、Arg101、Lys103、Lys147、Asn150、Lys151、Ser162、Thr196、Ala197、Tyr198、Ile208、Asn211、Pro212、Phe213、Ala214、Lys215、Ala216及Phe217(參見，例如，Müller及Herrmann,1997,Nature 389：884-888，圖1)。已經由晶體結構識別為直接涉及短尾畸型蛋白質之二聚合反應(其為蛋白質結合至DNA之形式，且因此，此等殘基亦可影響DNA結合)的短尾畸型之胺基酸殘基包括(關於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4之給定位點)：Met87、Pro127、Asp128、Ser129、Pro130、Asn131、Phe132及Val175(參見，例如，Müller及Herrmann,1997,Nature 389：884-888，圖1)。

藉由與此等序列相比可易於識別來自其他短尾畸型序列(包括來自其他物種之短尾畸型序列)之對於活性至關重要的T-box結構域及特定DNA結合殘基、蛋白質二聚合反應殘基或其他殘基。如本文所使用，提及本文所描述之或此項技術中已知之且在本發明中利用之任何短尾畸型蛋白質之「T-box結構域」或「DNA結合域」通常係指人類短尾畸型蛋白質之至少位點41至223(藉由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之此等位點例示)，且可包括人類短尾畸型蛋白質之至多位點1至229，或該結構域之N端上的短尾畸型序列之額外1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、 35個、36個、37個、38個、39個或40個連續胺基酸，或經定義之T-box結構域(例如，在SEQ ID NO：2或4位點41至223之任一側上)之C端上的短尾畸型序列之額外1個、2個、3個、4個、5個或6個連續胺基酸。參考人類短尾畸型序列(藉由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4例示)，尤其與DNA結合相關聯之殘基包括：位點66、69、70、101、103、147、150、151、162、196、197、198、208、211、212、213、214、215、216及217。參考人類短尾畸型序列(藉由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4例示)，尤其與蛋白質之二聚合反應相關聯且其可影響短尾畸型之DNA結合活性之殘基包括：位點87、127、128、129、130、131、132及175。

根據本發明，具有「降低或經破壞之DNA結合活性」之經修飾之短尾畸型抗原通常係指經修飾之短尾畸型蛋白質，與野生型(天然產生、未經修飾)短尾畸型蛋白質相比，該經修飾之短尾畸型蛋白質在標準實驗室或生理學條件下具有可觀測或可檢測(藉由任何合適的檢測方法)及較佳地顯著，且更佳地統計顯著的降低之結合至DNA或已知短尾畸型T-box區結合至序列的能力。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原不具有可檢測之結合其天然DNA靶向物之能力。可藉由此項技術中已知之各種分析檢測DNA結合活性，包括藉由使經修飾之短尾畸型蛋白質與DNA活體內或活體外接觸或藉由檢測由DNA結合產生之轉錄因子活性。舉例而言，經修飾之短尾畸型可在合適之條件下與寡核苷酸培育，原生短尾畸型結合該等寡核苷酸，且可免疫沈澱及評估結合複合物。作為另一實例，細胞可與編碼經修飾之短尾畸型之核苷酸構築體及與通報質體共轉染，且通報基因活性(例如，酶活性)可經量測為短尾畸型結合至DNA或充當轉錄因子(其需要短尾畸型結合至DNA之能力)之能力的讀數。對於此等類型分析之實例，參見(例如)Kispert等人，1993，同前文獻，或Kispert等人，1996，同前文獻。其他量測蛋白質-DNA結合之分析為此項技術中已知的。

根據本發明，與「降低之酵母絮凝表型」相關聯之經修飾之短尾畸型抗原係指具有修飾之短尾畸型蛋白質，該等修飾導致表現經修飾之短尾畸型抗原之酵母具有降低之絮凝表型，亦即，表現該抗原之酵母具有降低之聚集成較大多細胞結構或叢集在一起的傾向。如上文所論述，表現野生型(未經修飾)短尾畸型抗原之酵母在培養期間具有穩定的絮凝表型。酵母「絮凝」已描述於此項技術中，且通常定義為酵母細胞之非性聚集體，其使得酵母細胞自培養酵母之培養基中分離。具有絮凝表型之酵母在生長培養基或緩衝液(其容納於其中且可能不易於保持在懸浮液中)比無此表型之酵母中更密集。存在關於引起絮凝之生物機理的若干理論，其評述於(例如)Domingues等人，Biotechnol.Bioprocess Eng.2000,5：288-305中。不管產生酵母絮凝所藉由之機理，本發明藉由描述可對在酵母中產生此性質之抗原進行之修飾來降低表現短尾畸型抗原之酵母的絮凝表型。可使用任何合適之檢測方法量測酵母中之絮凝表型，方法包括(但不限於)結合強度量測、絮凝物大小量測、酵母沈降速率之測定、沈積試驗、原子力顯微法(AFM)、赫爾姆(Helm's)分析法及經修改之赫爾姆分析法(參見，例如van Hamersveld等人，J.Inst.Brew.1996,102：333-342；Soares等人，J.Inst.Brew.,1997,103：93-98；D'Hautcourt及Smart，J Am Soc Brew Chem.,1999,57：123-128；Vidgren及Londesborough，J Inst Brew.2011,117：475-487)。

在本發明之一個實施例中，經修飾之短尾畸型抗原(亦即，與野生型蛋白質相比，其中DNA結合活性已降低或破壞之短尾畸型抗原及/或其中表現抗原之酵母具有降低之絮凝表型之短尾畸型抗原)具有足以降低或破壞短尾畸型之DNA結合活性及/或降低表現經修飾之短尾畸型蛋白質之酵母之絮凝表型的因至少1個、2個、3個、4個、5個、6 個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或更多個胺基酸修飾(亦即，胺基酸殘基之缺失、取代、插入或其他修飾)而不同於野生型短尾畸型胺基酸序列的胺基酸序列。較佳地，短尾畸型序列之修飾之數目經降至最低至達成降低或破壞之DNA結合及/或降低之酵母之絮凝表型的目標所必需之彼等數目，同時將短尾畸型抗原內之T細胞抗原決定基之保持力增至最大(亦即，保存含有T細胞抗原決定基之短尾畸型胺基酸序列為較佳的)。在本發明之一個態樣中，在短尾畸型之位點1至229(位點對應於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之位點)內作出此等修飾。在本發明之一個態樣中，在短尾畸型之位點18至229(位點對應於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之位點)內作出此等修飾。在本發明之一個態樣中，在短尾畸型之位點66與217(位點對應於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之位點)內作出此等修飾。在一個態樣中，在短尾畸型之位點198至222(位點對應於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之位點)內作出此等修飾。在一個態樣中，此等修飾導致至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個胺基酸殘基之缺失或取代，該等胺基酸殘基選自：Lys66、Arg69、Arg70、Arg101、Lys103、Lys147、Asn150、Lys151、Ser162、Thr196、Ala197、Tyr198、Ile208、Asn211、Pro212、Phe213、Ala214、Lys215、Ala216、Phe217(位點對應於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之位點)。在一個態樣中，此等修飾替代地或另外導致至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個或8個胺基酸殘基之缺失或取代，該等胺基酸殘基選自：Met87、Pro127、Asp128、Ser129、Pro130、Asn131、Phe132及/或Val175(位點對應於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之位點)。在一個態樣中，此等修飾為取代或缺失短尾畸型之位點66與217之間或(在一個態樣中)短尾畸型之位點198與222(位點對應於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之位點)之間的至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或更多個連續胺基酸。在所有情況下，該等修飾達成降低或破壞DNA結合及/或降低表現抗原之酵母之絮凝表型的目標。

如上文所論述，適用於本發明之短尾畸型抗原除上述修飾之外，可包括會導致抗原內促效劑抗原決定基之形成的一或多個其他修飾。如本文通常所使用，「促效劑」為與受體或配位體結合且會產生或觸發反應之任何化合物或試劑，包括(但不限於)小分子、蛋白質、肽、抗體、核酸結合劑等，其可包括模擬或增強與受體或配位體結合之天然存在物質之作用的試劑。當在本發明之短尾畸型抗原(包括經修飾之短尾畸型抗原)之上下文中使用時，「促效劑」抗原或蛋白質係指包含至少一個T細胞促效劑抗原決定基之抗原或蛋白質，其亦可稱為「模擬抗原決定基」。模擬抗原決定基肽為模擬野生型抗原決定基之結構且作為促效劑之肽，模擬抗原決定基會模擬或增強天然抗原決定基之作用(生物功能)。

舉例而言，SEQ ID NO：5之胺基酸序列(WLLPGTSTL)為野生型短尾畸型蛋白質之T細胞抗原決定基。SEQ ID NO：5位於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4之位點246至254處。SEQ ID NO：6之胺基酸序列(WLLPGTSTV)為SEQ ID NO：5之T細胞抗原決定基之模擬抗原決定基或促效劑。因此，在本發明之一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原包含WLLPGTSTV(SEQ ID NO：6)之胺基酸序列。在一個態樣中，SEQ ID NO：6之位點4處之胺基酸(脯胺酸或P)係經絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、異白胺酸(I)或纈胺酸(V)取代。

在一個態樣中，短尾畸型抗原包含SQYPSLWSV(SEQ ID NO：7) 之胺基酸序列。在一個態樣中，SEQ ID NO：7之位點2處之胺基酸(此序列中之麩醯胺酸或Q)係經白胺酸(L)取代。在一個態樣中，SEQ ID NO：7之位點4處之胺基酸(此序列中之脯胺酸或P)係經絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、白胺酸(L)或纈胺酸(V)取代。在一個態樣中，SEQ ID NO：7之位點7處之胺基酸(此序列中之色胺酸或W)係經纈胺酸(V)、白胺酸(L)、異白胺酸(I)、絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)取代。在一個態樣中，SEQ ID NO：7之位點9處之胺基酸(此序列中之纈胺酸或V)係經白胺酸(L)取代。本發明涵蓋包含具有SEQ ID NO：7中之此等取代中的一或多者之任何組合的序列的抗原。

在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原包含RLIASWTPV(SEQ ID NO：8)之胺基酸序列。在一個態樣中，SEQ ID NO：8之位點1處之胺基酸(此序列中之精胺酸或R)係經酪胺酸(Y)或色胺酸(W)取代。在一個態樣中，SEQ ID NO：8之位點6處之胺基酸(此序列中之色胺酸或W)係經纈胺酸(V)、離胺酸(L)、異白胺酸(I)、絲胺酸(S)或蘇胺酸(T)取代。本發明涵蓋包含具有SEQ ID NO：8中之此等取代中的一或多者之任何組合之序列的抗原。

在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原包含AMYSFLLDFV(SEQ ID NO：9)之胺基酸序列。在一個態樣中，SEQ ID NO：9之位點2處之胺基酸(此序列中之甲硫胺酸或M)係經白胺酸(L)取代。

在本發明之一個實施例中，經修飾之短尾畸型抗原為包含、基本由或由SEQ ID NO：10之胺基酸序列組成的蛋白質。SEQ ID NO：10之蛋白質為根據本發明之經修飾之短尾畸型抗原的一個實例，其中該胺基酸序列因位點198至222之缺失(亦即，SEQ ID NO：4之位點198至222未出現在SEQ ID NO：10中)而不同於由SEQ ID NO：4表示之人類短尾畸型蛋白質的胺基酸序列。換言之，SEQ ID NO：10為由直接融合至SEQ ID NO：4之位點223至435之位點1至197組成的單個多肽。此經修飾之短尾畸型抗原與SEQ ID NO：4之短尾畸型蛋白質相比具有破壞之DNA結合能力且表現抗原之酵母具有降低之絮凝表型。SEQ ID NO：12為包含SEQ ID NO：10(實際上為SEQ ID NO：10之位點2至410，此係因為移除SEQ ID NO：10之N端甲硫胺酸以適應添加以下所描述之N端肽)之經修飾之短尾畸型蛋白質的融合蛋白質。SEQ ID NO：12為具有以下融合於自N端至C端之框中之序列元件的單個多肽：(1)賦予酵母中之蛋白酶體降解及穩定化表現抗性之N端肽(SEQ ID NO：12之位點1至6，具有亦由本文SEQ ID NO：16表示之Met-Ala-Asp-Glu-Ala-Pro之胺基酸序列)；(2)由SEQ ID NO：4之位點2至197及223至435組成之人類短尾畸型抗原，其亦可描述為SEQ ID NO：10之位點2至410(SEQ ID NO：12之位點7至415)；及(3)六聚組胺酸標記(SEQ ID NO：12之位點416至421)。SEQ ID NO：12之胺基酸序列及SEQ ID NO：10之位點2至410之胺基酸序列由SEQ ID NO：11之多核苷酸序列編碼。

在本發明之另一實施例中，經修飾之短尾畸型抗原為包括、基本上由或由SEQ ID NO：13之胺基酸序列組成之蛋白質。SEQ ID NO：13之蛋白質為根據本發明之經修飾之短尾畸型抗原的另一實例，其中該胺基酸序列因以下者而不同於由SEQ ID NO：4表示之人類短尾畸型蛋白質之胺基酸序列：(1)缺失位點198至222(亦即，SEQ ID NO：4之位點198至222未出現於SEQ ID NO：13中)；及(2)位於SEQ ID NO：4之位點254處(及位於SEQ ID NO：13之位點229處)之胺基酸(白胺酸)經纈胺酸取代。換言之，SEQ ID NO：13為由直接融合至SEQ ID NO：4之位點位點223至435之位點1至197組成且包括使得將促效劑抗原決定基引入至SEQ ID NO：13中之胺基酸修飾的單個多肽。位點254處(相對於SEQ ID NO：4)之纈胺酸至白胺酸取代在SEQ ID NO：13之位點221至229處產生SEQ ID NO：13中之T細胞促效劑抗原決定基，在不受理論限制之情況下，認為該抗原決定基與野生型抗原決定基(SEQ ID NO：4 之位點246至254)相比誘導針對短尾畸型之增強T細胞反應。此促效劑抗原決定基在本文亦由SEQ ID NO：6表示。由SEQ ID NO：13表示之此經修飾之短尾畸型抗原具有經破壞DNA結合能力且與SEQ ID NO：4之短尾畸型蛋白質相比，表現抗原之酵母具有降低之絮凝表型，且當此構築體在酵母-短尾畸型免疫治療劑中向受試者投與時額外含有增強針對原生短尾畸型之T細胞反應的促效劑抗原決定基。SEQ ID NO：15為包含SEQ ID NO：13(實際上為SEQ ID NO：13之位點2至410，此係因為移除SEQ ID NO：13之N端甲硫胺酸以適應添加以下所描述之N端肽)之經修飾之短尾畸型蛋白質的融合蛋白質。SEQ ID NO：15為具有以下融合於自N端至C端之框中之序列元件的單個多肽：(1)賦予酵母中之蛋白酶體降解及穩定化表現抗性之N端肽(SEQ ID NO：15之位點1至6，其胺基酸序列在本文亦由SEQ ID NO：16表示)；(2)人類短尾畸型抗原，其由SEQ ID NO：4之位點2至197及223至435組成且進一步含有纈胺酸對在SEQ ID NO：4之位點254處之白胺酸的取代，其亦可描述為SEQ ID NO：13之位點2至410(SEQ ID NO：15之位點7至415)；及(3)六聚組胺酸標記(SEQ ID NO：15之位點416至421)。SEQ ID NO：15之胺基酸序列及SEQ ID NO：13之位點2至410之胺基酸序列由SEQ ID NO：14之多核苷酸序列編碼。表現此融合蛋白質之基於酵母之免疫治療組合物在本文中亦稱為GI-6306。

在本發明之另一實施例中，經修飾之短尾畸型抗原為包含、基本上由或由一種胺基酸序列組成的蛋白質，該胺基酸序列因缺失至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少十一個、至少十二個、至少十三個、至少十四個、至少十五個、至少十六個、至少十七個、至少十八個、至少十九個、至少二十個、至少二十一個、至少二十二個、至少二十三個或至少二十四個胺基酸而不同於野生型短尾畸型蛋白質之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或不同人類短尾畸型蛋白質之對應序列)，其中可缺失之胺基酸殘基係選自：(1)一或多種胺基酸，其選自(相對於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所給定之位點)：Lys66、Arg69、Arg70、Arg101、Lys103、Lys147、Asn150、Lys151、Ser162、Thr196、Ala197、Tyr198、Ile208、Asn211、Pro212、Phe213、Ala214、Lys215、Ala216、Phe217、Met87、Pro127、Asp128、Ser129、Pro130、Asn131、Phe132及/或Val175，其中位點Lys66、Arg69、Arg70、Arg101、Lys103、Lys147、Asn150、Lys151、Ser162、Thr196、Ala197、Tyr198、Ile208、Asn211、Pro212、Phe213、Ala214、Lys215、Ala216、Phe217中之一或多者處的缺失係更佳的(位點對應於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之位點)；(2)位於野生型短尾畸型蛋白質之位點1至229(位點對應於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之位點)內之一或多種胺基酸；(3)位於野生型短尾畸型蛋白質之位點66至217(位點對應於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之位點)內之一或多種胺基酸；或(4)位於野生型短尾畸型蛋白質之位點198至222(位點對應於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之位點)內之一或多種胺基酸。在所有情況下，經修飾之短尾畸型抗原具有降低或經破壞之DNA結合活性及/或表現抗原之酵母具有降低之絮凝表型。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原可為如下所定義之「接近全長」短尾畸型蛋白質，意謂該蛋白質與野生型序列相比可自N端及/或C端缺少1個與10個之間的胺基酸。

在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原進一步包含至少一種促效劑抗原決定基(例如，SEQ ID NO：6或任何其他促效劑抗原決定基，諸如如上文所描述之SEQ ID NO：5、7、8或9之序列的促效劑)。

在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原為融合蛋白質之一部分，該融合蛋白質除上文所描述之經修飾之短尾畸型抗原之外，可視情況亦包括：(1)N端肽，其為經設計以賦予由SEQ ID NO：16表示之蛋白酶體降解及穩定化表現抗性的合成N端肽，其可經諸如酵母α因子序列之N端肽或適合與本文所描述之基於酵母之免疫治療劑使用之另一N端肽取代；(2)適用於融合蛋白質之離析或識別的C端肽，諸如六聚組胺酸標記；(3)用以接合融合蛋白質內之片段的一個、兩個、三個或大於三個胺基酸的連接肽；及/或(4)另一抗原，其可為另一短尾畸型抗原或不同(非短尾畸型)抗原且較佳為癌症抗原。

在本發明之另一實施例中，經修飾之短尾畸型抗原為包含、基本上由或由一種胺基酸序列組成的蛋白質，該胺基酸序列因不同胺基酸殘基而非在所述位點天然存在之胺基酸取代至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少十一個、至少十二個、至少十三個、至少十四個、至少十五個、至少十六個、至少十七個、至少十八個、至少十九個、至少二十個、至少二十一個、至少二十二個、至少二十三個或至少二十四個胺基酸經不同於在彼位點處天然存在之胺基酸殘基的胺基酸殘基取代而不同於野生型短尾畸型蛋白質之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或不同人類短尾畸型蛋白質之對於序列)。可經取代之胺基酸殘基係選自：(1)一或多種胺基酸，其選自(相對於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4給定之位點)：Lys66、Arg69、Arg70、Arg101、Lys103、Lys147、Asn150、Lys151、Ser162、Thr196、Ala197、Tyr198、Ile208、Asn211、Pro212、Phe213、Ala214、Lys215、Ala216、Phe217、Met87、Pro127、Asp128、Ser129、Pro130、Asn131、Phe132及/或Val175，其中位點Lys66、Arg69、Arg70、Arg101、Lys103、Lys147、Asn150、Lys151、Ser162、Thr196、Ala197、Tyr198、Ile208、Asn211、Pro212、 Phe213、Ala214、Lys215、Ala216、Phe217中之一或多者處的係較佳的(位點對應於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之位點)；(2)位於野生型短尾畸型蛋白質之位點1至229(位點對應於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之位點)內之一或多種胺基酸；(3)位於野生型短尾畸型蛋白質之位點66至217(位點對應於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之位點)內之一或多個胺基酸；或(4)位於野生型短尾畸型蛋白質之位點198至222(位點對應於SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中之位點)內之一或多種胺基酸。在所有情況下，該等取代導致經修飾之短尾畸型抗原具有降低或經破壞之DNA結合活性及/或表現抗原之酵母具有降低之絮凝表型。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原可為如下所定義之「接近全長」短尾畸型蛋白質，意謂該蛋白質與野生型序列相比可自N端及/或C端缺少1個與10個之間的胺基酸。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原進一步包含至少一種促效劑抗原決定基(例如，SEQ ID NO：6或任何其他促效劑抗原決定基，諸如如上文所描述之SEQ ID NO：5、7、8或9之序列的促效劑)。在一個態樣中，經修飾之短尾畸型抗原為融合蛋白質之一部分，該融合蛋白質除上文所描述之經修飾之短尾畸型抗原之外，可視情況亦包括：(1)N端肽，其為經設計以賦予由SEQ ID NO：16表示之蛋白酶體降解及穩定化表現抗性的合成N端肽，其可經諸如酵母α因子序列之N端肽或適合與本文所描述之基於酵母之免疫治療劑使用之另一N端肽取代；(2)適用於融合蛋白質之離析或識別的C端肽，諸如六聚組胺酸標記；(3)用以接合融合蛋白質內之片段的一個、兩個、三個或大於三個胺基酸的連接肽；及/或(4)另一抗原，其可為另一短尾畸型抗原或不同(非短尾畸型)抗原且較佳為癌症抗原。

人類短尾畸型與來自其他動物種類之短尾畸型具有極高同源性，且因此能夠利用來自其他生物體之短尾畸型之序列或不同於本文所描述之例示性人類序列之人類短尾畸型序列來製備本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，尤其其中此等序列相同、大體上同源的，且誘發針對靶抗原(例如，由腫瘤細胞表現之原生短尾畸型)之有效免疫反應。舉例而言，鼠類短尾畸型(藉由Hermann及同事於1990年初次選殖(Hermann等人，同前文獻))與人類短尾畸型在核苷酸位準上大約85%相同，在胺基酸位準上大約91%相同。相對於來自其他動物之短尾畸型，在胺基酸位準上，人類短尾畸型與來自黑猩猩之短尾畸型99.5%相同，與來自家犬之短尾畸型90.1%相同，與來自溫帶牛之短尾畸型88.5%相同，與來自褐鼠之短尾畸型92.2%相同且與來自原雞之短尾畸型80.9%相同。在含有T-box結構域之短尾畸型之胺基酸1至223內，小鼠與人類短尾畸型僅相差兩個胺基酸(在位點26及96處)。

根據本發明之任何實施例，提及「全長」蛋白質(或全長功能域或全長免疫域)包括如本文所述或以其他方式已知或描述於公開可獲得之序列中之蛋白質的全長胺基酸序列或功能結構域或免疫結構域。「接近全長」之蛋白質或結構域(亦為同系物類型之蛋白質)因自此類全長蛋白質或全長域之N端及/或C端缺失或省略1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸而不同於全長蛋白質或結構域。舉例而言，本文所述之若干融合蛋白質由於抗原省略位點1處甲硫胺酸且取代N端肽而包含「接近全長」之短尾畸型抗原。通常提及蛋白質或結構域或抗原可包括全長及接近全長之蛋白質兩者以及其其他同系物。

在與短尾畸型抗原或癌症抗原有關之任何實施例之一個態樣中，抗原具有足以使抗原由酵母表現之最小大小。為在酵母中表現，蛋白質通常為至少約25個胺基酸長度，儘管可表現較小蛋白質，但可由酵母表現相當大的蛋白質。舉例而言，適用於本發明之癌症抗原為可以重組方式由酵母表現且含有至少一種免疫原性結構域之癌症蛋白質之片段。在一個實施例中，適用於本發明之癌症抗原為至少25個胺基酸長度，或至少：30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、105個、110個、115個、120個、125個、130個、135個、140個、145個、150個、155個、160個、165個、170個、175個、180個、185個、190個、195個、200個、205個、210個、215個、220個、225個、230個、235個、240個、245個、250個、255個、260個、265個、270個、275個、280個、285個、290個、295個、300個、305個、310個、315個、320個、325個、330個、335個、340個、345個、350個、355個、360個、365個、370個、375個、380個、385個、390個、395個、400個、405個或410個、415個、420個、425個或430個胺基酸長度。

適用於本發明之短尾畸型抗原(包括經修飾之短尾畸型抗原)亦包括在蛋白質之全長內具有與本文所描述之經修飾之短尾畸型抗原中的任一者之胺基酸序列(例如，SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15)至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列的蛋白質，其中短尾畸型抗原保留本發明之經修飾之短尾畸型抗原之特性(亦即，降低或經破壞之DNA結合活性及/或表現抗原之酵母具有降低之絮凝表型)。

如上所簡要論述，相對於本文所述之融合蛋白質之N端表現序列及C端標記(諸如上文所述之彼等)為視情況選用的，但可選自本文其他處所描述之若干不同序列以改良或輔助表現、穩定性及/或使得識別及/或純化蛋白質。同樣，適用於酵母之許多不同啟動子為此項技術中已知。此外，出於各種原因，可在包含短尾畸型抗原之融合蛋白質的部分之間引入較短插入連接序列(例如，1個、2個、3個、4個或5個胺基酸肽)，包括引入限制酶部位以促進選殖，隨宿主吞噬體蛋白酶之裂解部位以促進蛋白質或抗原處理及用於將來操縱構築體。

視情況，使用特別適用於改良或穩定異源抗原在酵母中之表現的抗原構築體產生用作本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物之組分的蛋白質(包括融合蛋白質)。在一個實施例中，所需之一或多種抗原蛋白質或肽在其胺基末端處融合至：(a)特異性合成肽，其使融合蛋白質在酵母媒劑中之表現穩定或防止表現之融合蛋白質之轉譯後修飾(此等肽詳細地描述於(例如)2004年8月12日公開之美國專利公開案第2004-0156858 A1號中，該公開案以全文引用的方式併入本文中)；(b)內源性酵母蛋白質之至少一部分，包含但不限於酵母α因子前導序列，其中融合搭配物提供蛋白質在酵母中表現的經改良之穩定性及/或藉由該等酵母細胞防止該等蛋白質之轉譯後修飾(此等蛋白質亦詳細地描述於(例如)美國專利公開案第2004-0156858 A1號，同前文獻)；及/或(c)酵母蛋白質之至少一部分，其使融合蛋白質在酵母之表面上表現(例如，本文更詳細地描述之Aga蛋白質)。增強抗原在酵母細胞中表現之穩定性及/或防止蛋白質在酵母中之轉譯後修飾的例示性合成序列包括序列M-A-D-E-A-P(本文藉由SEQ ID NO：16表示)。另外，本發明視情況包括與抗原編碼構築體之C端融合之肽的用途，尤其用於選擇及識別蛋白質。此等肽包括(但不限於)任何合成或天然肽，諸如肽標記(例如6×His或六肽)或任何其他短抗原決定基標記。與根據本發明之抗原之C端連接的肽可在添加或不添加上文所論述之N端肽之情況下使用，且反之亦然。

根據本發明，用於酵母-短尾畸型免疫治療組合物中之酵母媒劑為任何可與一或多種抗原、其免疫原性結構域或其抗原決定基結合用於本發明之組合物(例如，治療性或預防性組合物)中之酵母細胞(例如，整個或完整細胞)或其衍生物(參見下文)。因此酵母媒劑可包括(但不限於)活的完整(整個)酵母微生物(亦即，具有包括細胞壁之所有其組分之酵母細胞)、經殺死(死的)或滅活之完整酵母微生物或完整酵母之衍生物，其包括：酵母球形質體(亦即，缺少細胞壁之酵母細胞)、酵母胞質體(亦即，缺少細胞壁及細胞核之酵母細胞)、酵母殘骸(亦即缺少細胞壁、細胞核及細胞質之酵母細胞)、亞細胞酵母膜提取物或其碎片(亦稱為酵母膜粒子且以前稱為亞細胞酵母粒子)、任何其他酵母粒子或酵母細胞壁製劑。

通常藉由酵母細胞壁之酶分解製備酵母球形質體。此方法描述於(例如)Franzusoff等人，1991,Meth.Enzymol.194,662-674中，其以全文引用之方式併入本文中。

通常藉由酵母細胞之去核製備酵母胞質體。此方法描述於(例如)Coon,1978,Natl.Cancer Inst.Monogr.48,45-55中，其以全文引用之方式併入本文中。

酵母殘骸通常藉由重新密封經滲透或經裂解之細胞來製備且可(但不需要)含有彼細胞之至少一些細胞器。此方法描述於(例如)Franzusoff等人，1983,J.Biol.Chem.258,3608-3614及Bussey等人，1979,Biochim.Biophys.Acta 553,185-196中，上述文獻中之每一者以全文引用之方式併入本文中。

酵母細胞膜粒子(亞細胞酵母細胞膜提取物或其碎片)係指缺少天然細胞核或細胞質之酵母細胞膜。該粒子可具有任何大小，包括自天然酵母細胞膜之大小至藉由熟習此項技術者已知之音波處理或其他細胞膜破裂方法製備，隨後重新密封之微米粒子的大小範圍。用於製備亞細胞酵母膜提取物之方法描述於(例如)Franzusoff等人，1991,Meth.Enzymol.194,662-674中。當在製備酵母細胞膜粒子之前抗原或其他蛋白質由酵母以重組方式表現時，亦可使用含有酵母細胞膜部分之酵母細胞膜粒子之碎片及抗原或其他相關蛋白質。抗原或其他相關蛋白質可經載運至細胞膜內部、細胞膜之任一表面上或其組合(亦即，蛋白質可位於細胞膜內部及外部及/或跨越酵母細胞膜粒子之細胞膜)。在一個實施例中，酵母細胞膜粒子為重組型酵母細胞膜粒子，其可為包括細胞膜表面上或至少部分嵌入細胞膜內之至少一種所需抗原或其他所關注之蛋白質的完整、經破壞或經破壞且重新密封之酵母細胞膜。

酵母細胞壁製劑之實例為攜有其表面上或至少部分嵌入細胞壁內之抗原的經分離之酵母細胞壁製劑，以使得當向動物投與時酵母細胞壁製劑刺激產生抗疾病靶向物之所需免疫反應。

可使用任何酵母菌株來產生用於本發明之酵母媒劑。酵母為屬於以下三個類別中之一者的單細胞微生物：子囊菌、擔子菌及半知菌。選擇適用作免疫調節劑之酵母的類之考慮因素為酵母之致病性。在一個實施例中，酵母為諸如釀酒酵母菌之非致病性菌株。選擇非致病性酵母菌株使投與酵母媒劑之個體之任何不良作用降至最低。然而，若酵母之致病性可藉由熟習此項技術者已知之任何方法中和，則可使用致病性酵母。根據本發明之一個態樣，使用非致病性酵母菌株。

可用於本發明之酵母菌株屬包括(但不限於)酵母菌屬、假絲酵母菌屬(Candida)(其可為致病性)、隱球酵母菌屬(Cryptococcus)、漢森酵母菌屬(Hansenula)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母菌屬(Pichia)、紅酵母菌屬(Rhodotorula)、裂殖酵母菌屬(Schizosaccharomyces)及耶氏酵母菌屬(Yarrowia)。在一個態樣中，酵母屬係選自酵母菌屬、假絲酵母菌屬、漢森酵母菌屬、畢赤酵母菌屬或裂殖酵母菌屬，且在一個態樣中，使用酵母菌屬。可用於本發明中之酵母菌株的種類包括(但不限於)釀酒酵母菌、卡爾斯伯酵母菌(Saccharomyces carlsbergensis)、白假絲酵母(Candida albicans)、乳酒假絲酵母(Candida kefyr)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)、新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)、異常漢森酵母(Hansenula anomala)、多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、馬克斯變種乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus var.lactis)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、魯布拉紅酵母(Rhodotorula rubra)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)及解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。應瞭解，多個此等種類包括既定包括於前述種類內之各種亞種、類型、亞型等。在一個態樣中，用於本發明中之酵母種類包括釀酒酵母菌、白假絲酵母、多形漢森酵母、巴斯德畢赤酵母及粟酒裂殖酵母。釀酒酵母菌係有用的，因為其相對易於操作且為「普遍認為安全」或「GRAS」以用作食品添加劑(GRAS，1997年4月17日FDA提出之規則62FR18938)。本發明之一個實施例為能夠將質粒複製至特定較高拷貝數目之酵母菌株，諸如釀酒酵母菌cir°菌株。釀酒酵母菌株為能夠支援使得一或多個靶抗原及/或抗原融合蛋白質及/或其他蛋白質以高位準表現之表現載體的如此之菌株。適用於本發明之另一酵母菌株為釀酒酵母菌W303α。另外，任何突變酵母菌株可用於本發明中，包括展示靶抗原或其他蛋白質表現之降低之轉譯後修飾之彼等，諸如延長N鏈接糖基化之酶類突變。

本發明涵蓋生產酵母媒劑及使酵母媒劑表現抗原及/或其他所關注之蛋白質及/或相關試劑、與其組合及/或締合以產生基於酵母之免疫治療組合物的方法。

根據本發明，術語「酵母媒劑-抗原複合物」或「酵母-抗原複合物」通常用於描述酵母媒劑與抗原之任何締合，且當此組合物用於誘發如上文所述之免疫反應時，可與「基於酵母之免疫治療組合物」互換地使用。此締合包括藉由酵母(重組型酵母)表現抗原、將抗原引入至酵母中、將抗原實體附接至酵母及使酵母與抗原混合在一起(諸如在緩衝液或其他溶液或調配物中)。下文詳細地描述此等類型複合物。

一般而言，酵母媒劑及一或多種抗原(及/或其他試劑)可藉由本文所述之任何技術與彼此締合。在一個態樣中，酵母媒劑細胞裝載有一或多種抗原。在另一態樣中，該(該等)抗原以共價或非共價方式連接至酵母媒劑。在又一態樣中，酵母媒劑及該(該等)抗原藉由混合而締合。在為較佳實施例之另一態樣中，抗原藉由酵母媒劑或藉由自其衍生酵母媒劑之酵母細胞或酵母球形質以重組方式表現。

在本發明之一個實施例中，作為在酵母媒劑中以重組方式表現抗原或其他蛋白質之替代方案，使酵母媒劑細胞內裝載有蛋白質或肽，或充當抗原及/或適用作本發明之免疫調節劑或生物反應調節劑之碳水化合物或其他分子。隨後可將目前細胞內含有抗原及/或其他蛋白質之酵母媒劑向個體投與或裝載入諸如樹突狀細胞之載體中。可藉由熟習此項技術者已知之技術(諸如藉由擴散、主動輸送、脂質體融合、電穿孔、噬菌作用、凍融循環及水浴音波處理)將肽及蛋白質直接插入至本發明之酵母媒劑中。可直接裝載肽、蛋白質、碳水化合物或其他分子之酵母媒劑包括完整酵母以及球形質體、殘骸或胞質體，在產生之後其可裝載抗原及其他試劑。替代地，完整酵母可裝載抗原及/或試劑，且接著可自其製備球形質體、殘骸、胞質體或亞細胞粒子。

在本發明之另一實施例中，抗原及/或其他藥劑與酵母媒劑實體連接。抗原及/或其他試劑與酵母媒劑之實體連接可藉由適合於此項技術中之任何方法實現，包括共價及非共價締合方法，其包括(但不限於)抗原及/或其他試劑與酵母媒劑之外表面化學交聯或抗原及/或其他試劑與酵母媒劑之外表面生物連接(諸如藉由使用抗體或其他結合搭配物)。化學交聯可(例如)藉由包括戊二醛鍵、光親和標記、經碳化二亞胺處理、經能夠連接雙硫鍵之化學物質處理及經此項技術中其他交聯化學標準物處理之方法實現。替代地，化學物質可與改變酵母細胞膜之脂質雙層或細胞壁之組合物之電荷的酵母媒劑接觸，以使得酵母外表面較可能與具有特定電荷特徵之抗原及/或其他試劑融合或結合。諸如抗體、結合肽、可溶性受體之靶向劑及其他配位體亦可併入至作為融合蛋白質之抗原中或以其他方式與抗原結合以使抗原與酵母媒劑結合。

當抗原或其他蛋白質在酵母表面上表現或與酵母表面實體連接時，在一個態樣中，可謹慎地選擇間隔臂以使抗原或其他蛋白質在表面上之表現或含量最佳化。該(該等)間隔臂之大小可影響暴露多少抗原或其他蛋白質以在酵母之表面上結合。因此，取決於使用之一或多種抗原或其他蛋白質，熟習此項技術者將選擇實現酵母表面上之抗原或其他蛋白質合適間距的間隔臂。在一個實施例中，間隔臂為至少450個胺基酸之酵母蛋白質。

在又一實施例中，酵母媒劑及抗原或其他蛋白質藉由更加被動、非特異性或非共價結合機制彼此締合，諸如藉由緩慢地使酵母媒劑及抗原或其他蛋白質在緩衝液或其他合適之調配物(例如混雜物)中混合在一起。

在一個實施例中，用以製備酵母媒劑之酵母細胞經編碼蛋白質(例如，抗原)之異源核酸分子轉染使得蛋白質由酵母細胞表現。此酵母在本文中亦稱為重組型酵母。酵母細胞可隨後與醫藥學上可接受之賦形劑調配且直接向患者投與，儲存用於稍後投與或裝載入如完整細胞之樹突狀細胞中。亦可殺死酵母細胞或其可(諸如)藉由形成酵母球形質體、胞質體、殘骸或亞細胞粒子而衍生化，其中任一者可接著儲存、投與或將衍生物裝載入樹突狀細胞中。酵母球形質體亦可直接經重組型核酸分子(例如，球形質體自完整酵母產生，且接著經轉染)轉染以產生表現抗原之重組型球形質體。以重組方式表現抗原之酵母細胞或酵母球形質體可用於產生包含酵母胞質體、酵母殘骸或酵母膜粒子或酵母細胞壁粒子或其部分之酵母媒劑。

使用熟習此項技術者已知之技術實現抗原或其他蛋白質在本發明之酵母媒劑中之表現。簡言之，將編碼至少一種所需抗原或其他蛋白質之核酸分子插入至表現載體中(係以核酸分子可操作性連接至轉錄控制序列的方式)，以便當轉型至宿主酵母細胞中時，能夠實現核酸分子之組成性或經調節之表現。編碼一或多種抗原及/或其他蛋白質之核酸分子可位於可操作連接至一或多個表現控制序列之一或多個表現載體上。尤其重要之表現控制序列為其控制轉錄起始之彼等，諸如啟動子及上游活化序列。在本發明中可使用任何合適之酵母啟動子且多種該等啟動子為熟習此項技術者已知。用於在釀酒酵母菌中表現之啟動子包括(但不限於)編碼以下酵母蛋白質之基因的啟動子：乙醇脫氫酶I(ADH1)或II(ADH2)、CUP1、磷酸甘油酸激酶(PGK)、丙醣磷酸異構酶(TPI)、轉譯伸長因子EF-1α(TEF2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH；亦稱為TDH3，用於丙醣磷酸脫氫酶)、半乳糖激酶(GAL1)、半乳糖-1-磷酸轉尿苷醯酶(GAL7)、UDP-半乳糖表異構酶(GAL10)、細胞色素c1(CYC1)、Sec7蛋白質(SEC7)及酸磷酸酶(PHO5)，包括諸如ADH2/GAPDH及CYC1/GAL10啟動子之雜合啟動子，且包括當細胞中之葡萄糖濃度較低(例如，約0.1%至約0.2%)時誘導之ADH2/GAPDH啟動子，以及CUP1啟動子及TEF2啟動子。同樣，上游活化序列(UAS)(亦稱為強化子)之數目為已知的。用於在釀酒酵母菌中表現之上游活化序列包括(但不限於)編碼以下蛋白質之基因之UAS：PCK1、TPI、TDH3、CYC1、ADH1、ADH2、SUC2、GAL1、GAL7及GAL10，以及其他藉由GAL4基因產物活化之UAS，其中在一個態樣中使用ADH2 UAS。因為ADH2 UAS藉由ADR1基因產物活化，所以當異源基因以可操作性方式連接至ADH2 UAS時，其可較佳過度表現ADR1基因。用於在釀酒酵母菌中表現之轉錄終止序列包括α因子、GAPDH及CYC1基因之終止序列。

待在甲基營養型酵母中表現基因之轉錄控制序列包括編碼乙醇氧化酶及甲酸脫氫酶之基因的轉錄控制區域。

可藉由將核酸分子引入至細胞中之任何方法實現將核酸分子轉染至本發明之酵母細胞中，且其包括(但不限於)擴散、主動輸送、水浴音波處理、電穿孔、顯微注射、脂質體轉染、吸收及原生質體融合。經轉染之核酸分子可使用熟習此項技術者已知之技術整合至酵母染色體中或維持在染色體外之載體上。攜帶此等核酸分子之酵母媒劑之實例詳細揭示於本文中。如上文所論述，亦可藉由用所需核酸分子轉染完整酵母微生物或酵母球形質體以重組方式產生酵母胞質體、酵母殘骸及酵母細胞膜粒子或細胞壁製劑，從而產生抗原且接著進一步使用熟習此項技術者已知之技術操控微生物或球形質體以產生胞質體、殘骸或亞細胞酵母細胞膜提取物或其含有所需抗原或其他蛋白質之碎片。

用於生產重組酵母媒劑及藉由酵母媒劑表現抗原及/或其他蛋白質之有效條件包括可在其中培養酵母菌株之有效培養基。有效培養基通常為包含可吸收的碳水化合物、氮及磷酸源以及合適的鹽類、礦物質、金屬及其他養分(諸如維生素及生長因子)之水性培養基。培養基可包含複合物養分或可為定義之基本培養基。本發明之酵母菌株可培育在各種容器中，包括(但不限於)生物反應器、愛倫美氏燒瓶(Erlenmeyer flask)、試管、微量滴定培養皿及皮氏培養盤(Petri plate)。在適合於酵母菌株之溫度、pH及含氧量下進行培養。該等培養條件較佳地在一般熟習此項技術者之專長內(參見，例如Guthrie等人(編寫),1991,Methods in Enzymology，第194卷，Academic Press，聖地亞哥)。舉例而言，在一個方案下，含有合適之培養基之液體培養物可使用由酵母-短尾畸型免疫治療組合物之起子培養盤及/或起子培養物獲得的培養物接種，且在30℃下以250rpm攪拌下生長約20小時。接著按需要，可將初代培養擴增成較大培養。若所利用之啟動子為組成型啟動子，則該酵母經以來自載體轉型之蛋白質表現就是組成性方式(例如，短尾畸型表現)，或若所使用之啟動子為誘導性啟動子(例如，在CUP1啟動子之情況下，硫酸銅)，則藉由添加用於啟動子之合適誘導條件即可加以誘導。在誘導性啟動子之情況下，蛋白質表現之誘導可在培養物已生長至合適之細胞密度(可為約0.2Y.U./ml或更高密度)之後引發。

適合針對培養本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物之培養基之一個非限制性實例為U2培養基。U2培養基包含以下組分：20g/L之葡萄糖、6.7g/L之含有硫酸銨之酵母氮鹼及組胺酸、各0.04mg/mL之白胺酸、色胺酸及腺嘌呤。適合於培養本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物之培養基之另一非限制性實例為UL2培養基。UL2培養基包含以下組分：20g/L之葡萄糖6.7g/L之含有硫酸銨之酵母氮鹼及各0.04mg/mL之組胺酸、色胺酸及腺嘌呤。

當使用誘導性啟動子(例如CUP1啟動子)表現本發明之酵母媒劑中的經修飾之短尾畸型抗原時，與適合於由酵母表現之大部分蛋白質之細胞密度相比，使用此啟動子在較高細胞密度開始誘導蛋白質表現。當使得表現短尾畸型抗原之酵母生長至至少0.5Y.U/ml與大約2.0Y.U./ml之間，且在一個態樣中，生長至至0.5Y.U./ml與大約1.5Y.U./ml之間，且在一個態樣中，生長至至1.0Y.U./ml與約2.0Y.U./ml之間且在另一態樣中，生長至至大約1.0Y.U./ml的細胞密度時，在誘導表現酵母中之短尾畸型抗原之前產生由CUP1啟動子驅動之最佳短尾畸型抗原表現。在本發明之一個實施例中，具有在誘導性啟動子(諸如CUP1啟動子)之控制下的抗原表現之酵母-短尾畸型免疫治療組合物在誘導抗原表現之前生長至對數中期。在一個態樣中，該等細胞在誘導抗原表現之前生長至大約1Y.U./ml與2Y.U./ml之間。在一個態樣中，抗原表現(例如，藉由添加硫酸銅)經誘導並持續至多6小時、6.5小時、7小時、7.5小時或8小時。在一個態樣中，在約30℃之溫度及250rpm之攪拌速率下進行誘導。

在本發明之一些實施例中，酵母在中性pH條件下培養。如本文所用，術語「中性pH」之一般用途係指在約pH 5.5與約pH 8之間的pH範圍，且在一個態樣中在約pH 6與約8之間。熟悉此項技術者將瞭解，當用pH測定計量測時可能出現較小波動(例如，十分之一或百分之一)。因此，使用中性pH培養酵母細胞意謂該等酵母細胞在中性pH下培養其在培養基中之大部分時間。在一個實施例中，酵母在pH值保持為至少5.5之培養基(亦即，使培養基之pH不降至低於pH 5.5)中生長。在另一態樣中，酵母在pH值保持約6、6.5、7、7.5或8下生長。在培養酵母中使用之中性pH促進若干使用酵母作為免疫調節之媒劑之適宜特徵的生物效應。舉例而言，在中性pH中培養酵母使得酵母良好生長而對細胞產生時間無不良作用(例如減緩倍增時間)。酵母可在不失去其細胞壁柔軟性之情況下持續生長至高密度。使用中性pH可以使所產生之酵母具有柔軟的細胞壁及/或使所產生之酵母在所有採集密度下對細胞壁消化酶(例如，葡聚糖酶)更敏感。需要此特點，因為與在較酸性條件下生長的酵母相比，具有可撓性細胞壁之酵母可誘發不同的或經改良之免疫反應，例如促進吞噬酵母之抗原呈現細胞分泌細胞激素(例如TH1型細胞激素，包括(但不限於)IFN-γ、白細胞介素-12(IL-12)及IL-2以及促炎性細胞激素，諸如IL-6)。另外，藉由此培養方法，可以更容易接近位於細胞壁中之抗原。在另一態樣中，有些抗原使用中性pH時，可以藉由經二硫蘇糖醇(DTT)處理而釋放以二硫化物鍵結之抗原，亦即當在較低pH(例如，pH 5)之培養基中培養此表現抗原之酵母時其係不可能的。

在本發明之一個實施例中，完整酵母(具有或不具有異源抗原或其他蛋白質之表現)可以採用可產生酵母細胞壁製劑、酵母膜粒子或酵母片段(亦即，非完整)之方式磨碎或加工，且在一些實施例中，酵母片段可利用包括本發明之經修飾之短尾畸型抗原之其他組合物(例如，作為蛋白質亞單元或含於不同媒劑內)提供或一起投與，以增強免疫反應。舉例而言，可採用酶處理、化學處理或物理力(例如，機械剪切或音波處理)將酵母分解成用作佐劑之部分。

在本發明之一個實施例中，適用於本發明之酵母媒劑包括已經殺死或滅活之酵母媒劑。酵母之殺死或滅活法可藉由此項技術中已知之多種合適之方法中的任一者實現。舉例而言，酵母之熱滅活法為酵母之標準滅活方式，且熟習此項技術者可視需要藉由此項技術中已知之標準方法監測靶抗原之結構變化。或者，可使用其他滅活酵母之方法，諸如化學法、電法、放射法或UV法。參見，(例如)揭示於標準酵母培養教科書(諸如Methods of Enzymology，第194卷，Cold Spring Harbor Publishing(1990))中之方法。所使用之任何滅活策略均應考慮靶抗原之二級、三級或四級結構且保留該結構以使其免疫原性最佳化。

可使用熟習此項技術者已知之許多技術將酵母媒劑調配成本發明之基於酵母之免疫治療組合物或產物。舉例而言，酵母媒劑可藉由凍乾來乾燥。包含酵母媒劑之調配物亦可藉由將酵母填充在餅狀物或錠劑中來製備，諸如完成用於焙烤或釀造操作之酵母。另外，酵母媒劑可與醫藥學上可接受之賦形劑混合，諸如宿主或宿主細胞所耐受之等滲緩衝液。此賦形劑之實例包括水、生理鹽水、林格氏溶液 (Ringer's solution)、葡萄糖溶液、漢克氏溶液(Hank's solution)及其他含水的生理上平衡之鹽溶液。亦可使用非水媒劑，諸如非揮發性油、芝麻油、油酸乙酯或三酸甘油酯。其他適用之調配物包括含有黏度增強劑(諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、甘油或聚葡萄糖)之懸浮液。賦形劑亦可含有少量添加劑，諸如增強等滲性及化學穩定性之物質。緩衝劑之實例包括磷酸緩衝液、碳酸氫鹽緩衝液及三羥甲基胺基甲烷緩衝液，而防腐劑之實例包括硫柳汞、間甲酚或鄰甲酚、福馬林及苯甲醇。標準調配物可為液體可注射劑或可溶於作為用於注射之懸浮液或溶液之合適之液體中的固體。因此，在非液體調配物下，賦形劑可包含(例如)葡萄糖、人類血清白蛋白及/或在投與之前可加入至無菌水或生理鹽水之防腐劑。

在本發明之一個實施例中，組合物可包括額外試劑(亦可稱為生物反應修飾劑化合物)或產生該等試劑/修飾劑之能力。舉例而言，酵母媒劑可經至少一種抗原及至少一種試劑/生物反應修飾劑化合物轉染或裝載有至少一種抗原及至少一種試劑/生物反應修飾劑化合物，或本發明之組合物可與至少一種試劑/生物反應修飾劑一起投與。生物反應修飾劑包括佐劑及其他可調節免疫反應之化合物(可稱為免疫調節化合物)以及改變另一化合物或試劑之生物活性的化合物(諸如基於酵母之免疫治療劑)，該生物活性並非限於免疫系統效應。某些免疫調節化合物可刺激保護性免疫反應，而其他則可抑制有害免疫反應，且免疫調節是否適用於與給定基於酵母之免疫治療劑組合，至少部分可取決於待治療或預防之疾病病況或病狀及/或待治療在個體。某些生物反應修飾劑優先增強細胞介導之免疫反應，而其他則優先增強體液性免疫反應(亦即，與體液免疫相比可刺激其中細胞介導之位準增強的免疫反應，或反之亦然)。某些生物反應修飾劑具有與基於酵母之免疫療法之生物特性相同的一或多個特性或增強或補充基於酵母之免疫療法之生物特性。存在許多熟習此項技術者已知之技術用於量測免疫反應之刺激或抑制以及用於自體液免疫反應區分細胞介導免疫反應，及用於區分一種類型之細胞介導反應與另一種(例如TH17反應相對於TH1反應)。

適用於本發明之試劑/生物反應修飾劑可包括(但不限於)細胞激素、趨化因子、激素、脂質衍生物、肽、蛋白質、多醣、小分子藥物、抗體及其抗原結合片段(包括(但不限於)抗細胞因子抗體、抗細胞因子受體抗體、抗趨化因子抗體)、維生素、聚核苷酸、結合核酸之部分、適體及生長調節劑。某些合適之試劑包括(但不限於)：IL-1或IL-1之促效劑或IL-1R之促效劑、抗IL-1或其他IL-1拮抗劑；IL-6或IL-6之促效劑或IL-6R之促效劑、抗IL-6或其他IL-6拮抗劑；IL-12或IL-12之促效劑或IL-12R之促效劑、抗IL-12或其他IL-12拮抗劑；IL-17或IL-17之促效劑或IL-17R之促效劑、抗IL-17或其他IL-17拮抗劑；IL-21或IL-21之促效劑或IL-21R之促效劑、抗IL-21或其他IL-21拮抗劑；IL-22或IL-22之促效劑或IL-22R之促效劑、抗IL-22或其他IL-22拮抗劑；IL-23或IL-23之促效劑或IL-23R之促效劑、抗IL-23或其他IL-23拮抗劑；IL-25或IL-25之促效劑或IL-25R之促效劑、抗IL-25或其他IL-25拮抗劑；IL-27或IL-27之促效劑或IL-27R之促效劑、抗IL-27或其他IL-27拮抗劑；I型干擾素(包括IFN-α)或I型干擾素之促效劑或拮抗劑或其受體；II型干擾素(包括IFN-γ)或II型干擾素之促效劑或拮抗劑或其受體；抗CD40、CD40L、淋巴細胞活化基因3(LAG3)蛋白質及/或IMP321(自可溶性形式之LAG3衍生之T細胞免疫刺激因子)、抗CTLA-4抗體(例如，釋放無變應性T細胞)；T細胞供刺激劑(例如，抗CD137、抗CD28、抗CD40)；阿侖單抗(alemtuzumab)(例如，CamPath®)、地尼白介素迪夫托斯(denileukin diftitox)(例如，ONTAK®)；抗CD4；抗CD25；免疫查核點抑制劑(例如，「免疫查核點」之抑制劑為維持自身耐受度及調節生理免疫反應之持續時間及幅度之免疫系統之抑制性路徑，此免疫查核點抑制劑包括(但不限於)：抗CTLA-4抗體(諸如伊派利單抗(ipilimumab)(Bristol-Myers Squibb,Princeton,NJ)或曲美單抗(tremelimumab)(MedImmune/AstraZeneca,Wilmington,DE))、程式性細胞死亡蛋白質1(PD-1)、程式性細胞死亡蛋白質1配位體(PD-L1)、程式性細胞死亡蛋白質2配位體(PD-L2，諸如被稱為AMP-224(Amplimmune,Gaithersburg,MD/GlaxoSmithKline,Philadelphia,PA)之PD-L2融合蛋白質)、抗PD-1抗體(諸如納武單抗(nivolumab)(Bristol-Myers Squibb)、派姆單抗(pembrolizumanb)(Merck,Whitehouse Station,NJ)或皮立珠單抗(pidilizumab)(CureTech,Yavne,Israel))、抗PD-L1抗體(諸如MPDL3280A(Genentech,South San Francisco,CA)、MEDI4736(MedImmune/AstraZeneca)、BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)、MSB0010718C(EMD Serono,Rockland,MD)或抗PD-L2抗體)；吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO)抑制劑(諸如INCB24360)；阻斷FOXP3之試劑(例如，消除活性/殺滅CD4+/CD25+T調節細胞)；Flt3配位體、咪喹莫特(imiquimod)(Aldara^TM)、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)；顆粒球-群落刺激因子(G-CSF)、沙格司亭(sargramostim)(Leukine®)；包括(但不限於)促乳素及生長激素之激素；鐸樣受體(TLR)促效劑，包括(但不限於)TLR-2促效劑、TLR-4促效劑、TLR-7促效劑及TLR-9促效劑；TLR拮抗劑，包括(但不限於)TLR-2拮抗劑、TLR-4拮抗劑、TLR-7拮抗劑及TLR-9拮抗劑；抗發炎劑及免疫調節劑，包括(但不限於)COX-2抑制劑(例如，塞來昔布(Celecoxib),NSAIDS)、糖皮質激素、斯達汀(statin)及撒利多胺(thalidomide)及其包括IMiD^TMs(其為撒利多胺(例如，REVLIMID^®(來那度胺(lenalidomide))、ACTIMID^®(泊利度胺(pomalidomide)))之結構性及官能性類似物)之類似物；促炎性試劑，諸如真菌或細菌組分或任何促炎性細胞激素或趨化因子；免疫治療疫苗包括(但不限於)基於病毒之疫苗、基於細菌之疫苗或基於抗體之疫苗；及任何其他免疫調節劑、免疫增強劑、抗發炎劑、促炎性劑，及任何調節抗原呈遞細胞之或TH17、TH1及/或Treg細胞之數量、調節該等物質之活化狀態及/或調節該等物質在存活期的試劑。本發明涵蓋該等試劑之任何組合，且與基於酵母之免疫治療劑組合或以一種方案(例如同時、依序或以其他形式)與其一起投與之該等試劑中之任一者為本發明所包涵之組合物。該等試劑已為此項技術中所熟知的。此等試劑可單獨使用或與本文所述之其他試劑組合使用。

本發明之組合物可進一步包括或可與適用於預防或治療癌症之任何其他試劑或組合物或方案或任何治療或改善癌症(及尤其與短尾畸型表現或過度表現相關之癌症)之任何症狀的化合物(同時、依序或間歇地)投與。另外，本發明之組合物可與其他免疫治療組合物(包括預防性及/或治療性免疫療法)一起使用。實際上，本發明之組合物可用於藉由抑制癌症中之短尾畸型表現(且從而抑制抗增生影響)來抑制或降低在轉移性癌症中可能出現之化學療法抗性或放射抗性或本發明之組合物可增強個體中化學療法或放射療法之效能。適用於治療癌症之其他試劑、組合物或方案(例如，治療性方案)包括(但不限於)化學療法、手術切除腫瘤、放射療法、同種異體或自體幹細胞移植及/或靶向癌症療法(例如，尤其靶向與腫瘤生長及進展相關之分子之小分子藥物、生物製劑或單株抗體治療劑，包括(但不限於)選擇性雌激素受體調節劑(SERM)、芳香酶抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑、組蛋白脫乙醯基酶(HDAC)抑制劑、類視黃素受體活化劑、細胞凋亡刺激劑、血管生成抑制劑、聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)抑制劑或免疫刺激劑)。此等額外治療劑及/或治療性方案中之任一者可在本發明之免疫治療組合物之前、同時、交替或之後投與，或在不同時間點投與。舉例而言，在與化學療法或靶向癌症療法結合給與個體時，可能需要在化學療法或靶向癌症療法之給藥之間的「停藥」期間投與酵母-短尾畸型免疫治療組合物，以便最大化免疫治療組合物之療效。手術切除腫瘤可常常先於酵母-短尾畸型免疫治療組合物之投與，但額外或主要手術可在投與酵母-短尾畸型免疫治療組合物期間或之後進行。

本發明亦包括一種套組，其包含本文中所描述之組合物中之任一者或本文中所描述之組合物之個別組分中之任一者。套組可包括使用本發明之組合物中之任一者以預防或治療與短尾畸型表現或過度表現相關之癌症的額外試劑及書面說明或指示。

投與或使用本發明之組合物之方法

本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物經設計用以預防或治療與短尾畸型表現或過度表現相關或由其表現之癌症，包括預防此等癌症之出現、阻止此等癌症之進展或改善或消除此等癌症。更特定言之酵母-短尾畸型免疫治療組合物可用於預防、抑制或延緩表現短尾畸型之腫瘤之發展，及/或預防、抑制或延緩腫瘤遷移及/或腫瘤侵入其他組織(轉移)及/或通常預防或抑制個體中癌症之進展。酵母-短尾畸型免疫治療組合物亦可用以改善癌症之至少一個症狀，諸如藉由減輕個體中之腫瘤負荷；抑制個體中之腫瘤生長；延長個體之存活期；預防、抑制逆轉或延緩腫瘤遷移之發展及/或腫瘤侵入其他組織(轉移性癌症)及/或預防、抑制逆轉或延緩個體中癌症之進展。酵母-短尾畸型免疫療法藉由抑制癌症中之短尾畸型表現在治療學上用以抑制、降低或消除可在轉移性癌症中出現之化學療法抗性或放射抗性，且本發明之組合物可增強個體中化學療法或放射療法之效能。

與本發明之組合物及方法相關之癌症為表現，或可表現短尾畸型之任何癌症或接近表現或可表現短尾畸型之癌症地癌症，且包括 (但不限於)乳房、骨骼(包括(但不限於)索脊瘤)、小腸、胃、腎臟、膀胱、子宮、卵巢、睾丸、肺、結腸、胰腺或前列腺之癌症且包括轉移性及晚期癌症。另外，短尾畸型會在B細胞病因之腫瘤中表現，諸如慢性淋巴球性白血病(CLL)、經埃-巴二氏病毒轉型之B細胞、伯基特氏淋巴瘤及霍奇金氏淋巴瘤以及其轉移性癌症。

因此，本發明之一個實施例係關於治療癌症，且尤其表現短尾畸型之癌症的方法。該方法包括向患有表現短尾畸型之癌症投與本文所述之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，該組合物包括包含以下之組合物：(a)酵母媒劑；及(b)包含本發明之至少一種經修飾之短尾畸型抗原的癌症抗原。在一個態樣中，該方法降低患者中之腫瘤負荷。在一個態樣中，該方法延長患者之存活期。在一個態樣中，該方法抑制個體中之腫瘤生長。在一個態樣中，該方法預防、阻止或逆轉腫瘤之轉移性進展。

由於認為短尾畸型表現會隨癌症發展或進展至愈高階段(例如，取決於特定癌症，自階段I至階段II至階段III至階段IV)而愈普遍且與轉移性過程相關，所以本發明之實施例提供預防或延緩表現短尾畸型之癌症之發病，或將癌症阻止在轉移前或惡化前階段，或預防或延緩此癌症之進展(例如，使癌症穩定化)的方法。此方法包括向未檢測到表現短尾畸型之癌症之個體投與本文所述之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其可包括包含以下之組合物：(a)酵母媒劑；及(b)包含本發明之至少一種經修飾之短尾畸型抗原的癌症抗原。在此實施例之一個態樣中，在患有癌症個體之至少一群體子集中，在癌症之某些階段下已知癌症會表現短尾畸型或認為其易受表現短尾畸型之影響。在此實施例之一個態樣中，在第一次投與組合物時，個體已患有癌症，但此時未在癌症中檢測到短尾畸型，意謂該個體具有其中尚未顯現短尾畸型表現或在任何情況下其中尚未檢測到短尾畸型表現(亦即，雖然短尾畸型可或可不以低位準或少數腫瘤細胞表現，但使用標準檢測方法尚不易檢測)之更早階段的癌症。在一些情況下，已知該類癌症具有高速轉移性進展，在此態樣中，酵母-短尾畸型免疫治療組合物之投與可預防、延緩或抑制患者之癌症中表現短尾畸型之腫瘤細胞之發展，且因此預防、阻止、延緩或抑制伴隨短尾畸型表現之轉移性過程。在另一態樣中，當投與組合物時個體未患有癌症。可能因為家族病史或遺傳標記，或因為個體已展示癌前期細胞或病變之跡象或具有癌前期(惡化前)細胞或病變，此個體會「傾向於」或有可能產生癌症。

本發明之一個實施例係關於抑制腫瘤遷移及/或降低、停止(阻止)、逆轉或預防患有癌症之個體中癌症之轉移性進展，或逆轉癌症中轉移性現象之發展的方法。如上文所論述，短尾畸型促進人類腫瘤細胞中之上皮-間質轉化(EMT)，賦予腫瘤細胞間質表型以及遷移性及侵入性能力，同時緩解腫瘤細胞循環進展。因此，短尾畸型參與轉移性過程使其為預防或抑制轉移性過程(包括將癌症阻止在轉移前階段)之理想靶向物。面對癌症逃脫(或嘗試逃脫)傳統療法(諸如化學療法及放射法)，使用本發明之酵母短尾畸型免疫治療組合物可有效預防或治療轉移性癌症，包括阻止癌症之進展。該方法包括向患有癌症之個體投與如本文所描述之本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，該組合物包括(但不限於)：(a)酵母媒劑；及(b)包含本發明之至少一種經修飾之短尾畸型抗原的癌症抗原。

在一個態樣中，在第一次投與組合物時，尚未在個體之癌症中檢測到短尾畸型。一般而言，當在個體之癌症中未檢測到短尾畸型時，該個體具有其中尚未顯現短尾畸型表現(例如，階段I或階段II)，或在任何情況下其中尚未檢測到短尾畸型表現(亦即，雖然短尾畸型可或可不以低位準或少數腫瘤細胞表現，但使用標準檢測方法尚不易檢測)之更早階段的癌症。在下本發明之此態樣中，藉由使用酵母-短尾畸型免疫治療組合物可預防、延緩或抑制表現短尾畸型之腫瘤細胞之發展。其結果係可預防、延緩或抑制會導致腫瘤之轉移性進展的腫瘤遷移及/或其他轉移性過程及/或普遍性阻止個體中出現腫瘤進展。

在另一態樣中，在第一次投與組合物時，個體之癌症中存在或可檢測到短尾畸型表現。在本發明之此態樣中，個體患有階段I、階段II、階段III或階段IV癌症。在此態樣中，酵母-短尾畸型免疫治療組合物之使用可降低、消除或減緩或阻止表現短尾畸型之腫瘤之生長，其可導致降低個體中之腫瘤負荷、抑制表現短尾畸型之腫瘤生長及/或延長個體之存活期。個體可經歷轉移性過程中阻止、減緩或逆轉，改良患者之存活期及健康狀況，且此外，允許其他治療性方案治療癌症。

實際上，轉移性癌症可與對諸如化學療法、放射之癌症療法或靶向癌症療法之抗性，或提高之抗性相關，從而癌症自療法「逃脫」或僅少量受到療法及進展影響。因此，需要降低或消除對此等療法之抗性以改良或增強療法之療效及改良患者健康狀況及存活期。因此，本發明之一個實施例係關於降低或預防患有癌症之患者中之化學療法抗性、靶向癌症療法抗性或放射抗性的方法。該方法包含向患有癌症且接受對癌症之化學療法及/或放射療法的個體投與如本文所描述之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其可包括包含以下之組合物：(a)酵母媒劑；及(b)包含本發明之至少一種經修飾之短尾畸型抗原的癌症抗原。本發明之此方法亦可用以治療與其他對癌症之治療性治療(包括(但不限於)靶向癌症療法)相關的抗性。

在此實施例之一個態樣中，在第一次投與組合物時未在個體之癌症中檢測到短尾畸型。在此態樣中，酵母-短尾畸型免疫治療組合物之投與藉由抑制癌症中表現短尾畸型之腫瘤細胞之發展來預防或抑制對化學療法或放射療法之抗性的發病。在另一態樣中，在第一次投與組合物時未在個體之癌症中檢測到短尾畸型表現。在此態樣中，個體可已經歷或可未經歷對化學療法或放射之抗性。在任一情況下，本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物之投與藉由降低或消除患者中之表現短尾畸型之腫瘤細胞來預防或抑制對化學療法或放射療法之抗性或增強化學療法或放射療法治療個體之能力。

本發明之另一實施例係關於藉由向患有脊索瘤之個體(受試者投與本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物來治療脊索瘤的方法如上文所論述，索脊瘤其特徵在於短尾畸型之表現且實際上短尾畸型為辨別此癌症之生物標記，亦即對於所有索脊瘤短尾畸型表現為共同的且為特異性生物標記。因此，本發明之此方法包括向患有脊索瘤之個體，或處於罹患脊索瘤之風險下但目前尚未檢測到表現短尾畸型之癌症的個體投與如本文所描述之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其包括(但不限於)：(a)酵母媒劑；及(b)包含本發明之至少一種經修飾之短尾畸型抗原的癌症抗原。待用本發明之免疫治療組合物治療之受試者可為患有不可切除病變(亦即，不能以手術方式澈底移除)或可切除病變之原發性索脊瘤受試者；不論是否初次復發，患有不可切除，局部復發病變(亦即，局部復發為在已移除之初始或原發性病變之相同位置附近(在或靠近)再現之病變)之受試者；患有如下所述之寡轉移性疾病之受試者或患有如下所述轉移性疾病之受試者。在一個態樣中，受試者可已進行或可尚未進行前期放射療法、手術及/或靶向藥物療法。在另一態樣中，受試者患有已先前經輻射之癌症病變。在一個態樣中，受試者患有先前尚未經輻射之癌症病變。在一個態樣中，向受試者投與酵母-短尾畸型免疫療法，且另外，在投與酵母-短尾畸型免疫療法之前、期間及/或之後輻射癌症病變。

在上文所述之方法中之任一者之一個態樣中，該個體除經投與本發明之酵母-短尾畸型組合物之外，另外經適用於治療癌症、在投與本發明之基於酵母之免疫治療組合物之前、依序、同時及/或之後投與或執行之至少一個其他治療性化合物或治療性方案來治療。舉例而言，在關於本文所述之本發明之方法的實施例中之任一者中，在一個態樣中，當個體患有癌症(不管腫瘤細胞中可檢測短尾畸型表現之狀態)時，該個體將經用於癌症之另一療法治療或已經該療法治療。該治療可包括前文所描述之治療方案或任何治療化合物或試劑之用途中的任一者，包括(但不限於)化學療法或靶向癌症療法或藥物療法(例如，酪胺酸激酶抑制劑，包括(但不限於)伊馬替尼(imatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、尼羅替尼(nilotinib)、達沙替尼(dasatinib)、拉帕替尼(lapatinib)及依維莫司(everolimus)；STAT3抑制劑、蒽環黴素(anthracycline)；順鉑(cisplatin)；烷基化劑；喜樹鹼類似物)、放射療法(包括(但不限於)單機放射療法及輔助放射療法，尤其基於強子之放射療法)、手術切除腫瘤、幹細胞轉移、細胞因子療法、過繼性T細胞轉移及/或投與第二免疫治療組合物。就投與第二免疫治療組合物而言，此等組合物可包括(但不限於)額外基於酵母之免疫療法、以重組型病毒為基礎之免疫療法(病毒載體)、細胞激素療法、免疫刺激劑療法(包括具有免疫刺激屬性之化學療法)、DNA疫苗及其他免疫治療組合物。

此等額外試劑或治療劑中之任一者可在酵母-短尾畸型免疫治療組合物之第一次給藥之前或在投與第一次劑量之後投與或執行。在一個實施例中，可以與酵母-短尾畸型免疫治療組合物之給藥交替的方式投與或執行一或多種療法，諸如在一種方案中，酵母-短尾畸型組合物在一或多個連續劑量之化學療法或其他治療之間按規定間隔投與。在一個實施例中，在開始額外治療之前歷經一段時間以一或多個劑量投與酵母-短尾畸型免疫治療組合物。換言之，酵母-短尾畸型免疫治療組合物作為單一療法投與一段時間，且接著與酵母-短尾畸型免疫治療同時或以與酵母-短尾畸型免疫治療之交替方式加入額外治療(例如，化學療法或放射療法)。替代地或另外地，在開始投與酵母-短尾畸型免疫治療組合物之前可投與另一治療一段時間，且可合併概念(例如手術切除腫瘤，隨後使用以酵母-短尾畸型免疫治療作為單一療法持續數週，隨後投與交替劑量之化學療法或放射療法及酵母-短尾畸型免疫治療持續數週或數月，視情況可隨後使用酵母-短尾畸型免疫治療或另一療法作為單一療法，或藉由與所提供之療法依序、同時或以交替方式組合之新方案)。本發明涵蓋使用酵母-短尾畸型免疫治療治療癌症之各種方案，且此等實例應視為各種可能方案之非限制性實例。

在一個態樣中，第二免疫治療組合物包括第二癌抗原，其不包括短尾畸型抗原。舉例而言，適用於與酵母-短尾畸型免疫治療組合物組合之第二免疫治療組合物為包含另一癌抗原之酵母-免疫治療組合物。此等癌症抗原可包括(但不限於)癌胚抗原(CEA)、點突變Ras癌蛋白、MUC-1、EGFR、BCR-Abl、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、GAGE、GP-100、MUC-2、正常及點突變p53腫瘤蛋白、PSMA、酪胺酸酶、TRP-1(gp75)、NY-ESO-1、TRP-2、TAG72、KSA、CA-125、PSA、HER-2/neu/c-erb/B2、hTERT、p73、B-RAF、結腸腺瘤息肉病(APC)、Myc、逢希伯-林道蛋白質(von Hippel-Lindau protein)(VHL)、Rb-1、Rb-2、雄激素受體(AR)、Smad4、MDR1、Flt-3、BRCA-1、BRCA-2、pax3-fkhr、ews-fli-1、HERV-H、HERV-K、TWIST、間皮素、NGEP、此等抗原之修飾、此等抗原之剪接變異體及此等抗原之促效劑以及此等抗原之組合，及/或其免疫原性結構域、其修飾、其變異體及/或其抗原決定基促效劑。

如本文所使用，「治療」癌症或其任何置換(例如，「癌症之治療」等)通常係指在出現癌症(例如，在個體中已診斷或檢測到癌症)之後投與本發明之組合物，實現包括治療之以下之至少一個治療性目標(與無此治療之情況相比)：諸如藉由降低個體中之腫瘤負荷來改善癌症之至少一個症狀；抑制、降低、減少或消除腫瘤生長或個體中之腫瘤生長速率(腫瘤生長動力學)；延長或擴展個體之存活期，其可包括整體存活期及/或無進展生存期；改良腫瘤反應速率(亦即，如藉由下文定義之RECIST及/或Choi所量測)；延緩、抑制、阻止或預防腫瘤之復發；預防、抑制、逆轉或延緩腫瘤遷移及/或腫瘤侵入其他組織(轉移性癌症)之發展；阻止、預防、抑制、逆轉或延緩個體中癌症之進展；改良抗由癌症表現之一或多種腫瘤抗原的長期記憶體免疫反應；提高病變對放射療法、化學療法及/或靶向藥物療法之靈敏度；及/或改良個體之普遍性健康狀況。

「預防」或「防止」癌症或其任何置換(例如「癌症之預防」等)通常係指在出現癌症之前或癌症之特異性階段或在癌症中出現腫瘤抗原表現之前(例如，在癌症中檢測到短尾畸型表現之前)投與本發明之組合物，實現包括以下之至少一個治療目標(與無此治療之情況相比)：預防或延緩癌症或在治療之後仍然出現之癌症的發病或發展、與無此治療之情況相比至少改良個體之最終結果，包括(但不限於)降低個體之腫瘤負荷；抑制(降低、減少、消除)腫瘤生長或個體中腫瘤生長之速率；延長(擴展)個體之存活期，其可包括整體存活期及/或無進展生存期；改良腫瘤反應速率(亦即，如藉由下文定義之RECIST及/或Choi所量測)；延緩、抑制、阻止或預防腫瘤之復發；預防、抑制、逆轉或延緩腫瘤遷移及/或腫瘤侵入其他組織(轉移性癌症)之發展；阻止、預防、抑制、逆轉或延緩個體中癌症之進展；改良抗由癌症表現之一或多種腫瘤抗原的長期記憶體免疫反應；提高病變對放射療法、化學療法及/或靶向藥物療法之靈敏度；及/或改良個體之普遍性健康狀況。

在本發明之一個實施例中，經本發明之基於酵母之免疫治療組合物治療改良受試者中之反應率，亦即，如藉由RECIST或Choi標準量測。「RECIST」係指實體腫瘤之療效評價標準且為一套定義癌症患者中之腫瘤何時改良、穩定或發展之公開指南。經RECIST定義之療效取決於靶向病變之大小變化，如藉由非侵入性成像評估測定。RECIST標準最初由包括歐洲癌症研究及治療組織(EORTC)、美國國家癌症研究院(NCI)及加拿大國家癌症研究院臨床試驗組之國際合作於2000年2月公開(Therasse等人，J.Natl.Cancer Inst.2000,92：205-216)且於2009年經修訂，如Eisenhauer等人，Eur.J.Cancer,2009,45：228-247中所描述。同前文獻中描述之「完全有效」或CR目前定義為所有靶向病變與以<10mm之短軸線降低之任何病理淋巴結(靶向物或非靶向物)之消失。「部分有效」或「PR」目前定義為以基線直徑總和作為參照，靶向病變之直徑總和至少減少30%。「穩定疾病」或「SD」定義為以同時處於研究之最小直徑總和作為參照，既不充分縮小以符合PR亦不充分增加以符合PD。「進行性疾病」或「PD」定義為以研究之最小總和作為參照，靶向病變之直徑總和至少增加20%。另外，總和必須亦顯示至少5mm之絕對增量。一或多種新病變之出現亦視為進展。適用於非靶向病變之額外標準如Eisenhauer等人(同前文獻)所描述。

「Choi」標準係指最初由Choi等人(J.Clin.Oncol.2007,25(13)：1753-1759)所描述之一組計算之斷層攝影術療效標準，且如藉由CT量測評估靶向病變之大小或密度變化。Choi標準亦使用CR、PR、SD及PD分組將患者分類。CR定義為所有病變消失而無新病變。PR定義為在CT上大小減少>10%或腫瘤衰減降低>15%，而無新病變及無非可量測疾病之明顯的進展。SD定義為未滿足CR、PR或PD標準且無歸因於腫瘤進展之症狀性惡化。PD定義為腫瘤大小增加>10%且在CT上腫瘤衰減並不滿足PR標準且/或具有新病變。

本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物向受試者或個體之遞送(投與、免疫)可離體或活體內進行，但通常在活體內進行。離體投與係指在患者之外部進行部分調節步驟，諸如在使酵母媒劑、經修飾之短尾畸型抗原及任何其他抗原、試劑或組合物裝載至細胞中之條件下向自患者移除之細胞群(樹突狀細胞)投與本發明之組合物，並將該等細胞返回至患者中。本發明之治療性組合物可藉由任何合適之投與方式返回至患者或投與患者。

投與組合物可為全身性、經黏膜及/或接近靶位點(例如靠近腫瘤部位)之位置。投與之合適途徑對熟習此項技術者將係清楚的，其取決於待預防或治療之癌症類型及/或靶細胞數或組織。投藥之各種可接受方法包括(但不限於)靜脈內投藥、腹膜內投藥、肌肉內投藥、節點內投藥、冠狀動脈內投藥、動脈內投藥(例如至頸動脈中)、皮下投藥、經皮傳遞、氣管內投藥、關節內投藥、心室內投藥、吸入(例如氣溶膠)、顱內、脊柱內、眼內、耳、鼻內、口服、經肺投藥、導管浸漬及直接注射至組織中。在一個態樣中，投與途徑包括：靜脈內、腹膜內、皮下、鞘內、皮內、結節內、肌內、經皮、吸入、鼻內、口服、眼內、關節內、顱內及脊柱內。不經腸傳送可包括鞘內、結節內、腹膜內、胸膜內、肺內、靜脈內、皮下、心房導管及腎導管途徑。耳遞送可包括滴耳劑，鼻內遞送可包括滴鼻劑或鼻內注射劑，且眼內遞送可包括滴眼劑。氣溶膠(吸入劑)遞送亦可使用此項技術中之標準方法進行(參見，(例如)Stribling等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 189：11277-11281,1992)。在一個態樣中，本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物經皮下投與。在一個態樣中，酵母-短尾畸型免疫治療組合物直接經投與至腫瘤環境中。在一個態樣中，本發明之基於酵母之免疫治療組合物經鞘內投與。

在本發明之一個態樣中酵母-短尾畸型免疫治療組合物經調配用於注射且藉由注射(例如藉由皮下注)射投與。在一個態樣中，酵母-短尾畸型免疫治療組合物以小瓶懸浮液提供，具備對受試者之恰當操作、劑量及投與之說明。在一個態樣中，酵母-短尾畸型免疫治療組合物以小瓶冷凍之調配物提供，具備對受試者之恰當操作、再懸浮、劑量及投與之說明。本發明之經修飾之短尾畸型抗原及隨後降低表現抗原之酵母之絮凝表型之一個優勢為對醫療從業者而言，投與酵母-短尾畸型免疫治療組合物需要較少投入以確保組合物恰當地懸浮或再懸浮於小瓶中且在裝載至注油器及投與受試者期間保持恰當地懸浮。

一般而言，本發明之酵母-短尾畸型免疫治療組合物之合適單次劑量為能夠向患者體內之給定細胞類型、組織或區域有效提供酵母媒劑及經修飾之短尾畸型抗原的劑量，當歷經合適之時間段投與一或多次時，呈誘發抗一或多種腫瘤抗原或抗原決定基(例如短尾畸型)之抗原特異性免疫反應之有效量。舉例而言，在一個實施例中，本發明之基於酵母之組合物的單次劑量為投與該組合物之生物體之每公斤體重約1×10⁵至約5×10⁷個酵母細胞等效物。在一個態樣中，本發明之酵母媒劑之單次劑量為每劑量(亦即每個生物體)約0.1酵母單位(Y.U.，其為1×10⁶個酵母細胞或酵母細胞等效物)至約100Y.U.(1×10⁹個細胞)，包括以0.1×10⁶個細胞之增量的任何中間劑量(亦即1.1×10⁶、1.2×10⁶、1.3×10⁶...)。在一個實施例中，劑量包括1Y.U與40Y.U.之間的劑量、1Y.U.與50Y.U.之間的劑量、1Y.U.與60Y.U.之間的劑量、1Y.U.與70Y.U.之間的劑量或1Y.U.與80Y.U.之間的劑量，且在一個態樣中，在10Y.U與40Y.U.、50Y.U.、60YU.、70Y.U.或80Y.U.之間。在一個實施例中，在個體之不同部位上但在相同給藥階段期間投與該等劑量。舉例而言，在一個給藥時間段期間可藉由注射10Y.U.劑量將40Y.U.劑量投與個體上之四個不同部位，或在相同給藥時間段期間，可藉由注射5Y.U.劑量將20Y.U.劑量投與個體上之四個不同部位或藉由注射10Y.U.劑量投與個體上之兩個不同部位。本發明包括在個體之1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個不同部位投與一定量的基於酵母之免疫治療組合物(例如，1Y.U.、2Y.U.、3Y.U.、4Y.U.、5Y.U.、6Y.U.、7Y.U.、8Y.U.、9Y.U.、10Y.U.、11Y.U.、12Y.U.、13Y.U.、14Y.U.、15Y.U.、16Y.U.、17Y.U.、18Y.U.、19Y.U.、20Y.U.或更多)形成單次劑量。一個酵母單位(Y.U.)為1×10⁷個酵母細胞或酵母細胞等效物。

舉例而言，當抗抗原之免疫反應已衰減或按需要提供免疫反應或誘發抗特定抗原之記憶反應時，投與本發明之免疫治療組合物之「輔助劑(booster)」或「增強免疫(boost)」。輔助劑可在初始投藥之後約隔1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週或8週或每月、每兩月、每季、每年及/或以數年或若干年增量投與，取決於經治療之個體及在投藥時之治療目標(例如預防、主動治療、維持)之情況。在一個實施例中，投藥時間表為歷經數週至數月、至數年之時間段投與基於酵母之免疫治療組合物之劑量至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。在一個實施例中，劑量係每週或每兩週投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多劑量，按需要隨後每兩週或每月投與劑量以實現索脊瘤之所需預防性或治療性治療。在一個實施例中，劑量係每兩週投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多劑量，隨後每月投與額外劑量直至實現所需預防性或治療性結果。在一個實施例中，劑量係每月投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多劑量。隨後每月投與額外劑量或隨後按需要以不同頻率(例如每季)遞送劑量以實現癌症之所需預防性或治療性治療。在本文所述之所有給藥方案中，視需要可接著按類似或較長間隔(例如數月或數年)提供額外輔助劑作為維持或緩解療法。在一個態樣中，投與輔助劑用於長期維持療法(亦即在主要治療時程完成之後，意欲預防或延緩疾病復發或意欲維持疾病穩定)。

在本發明之方法中，組合物及治療性組合物可投與動物，包括任何脊椎動物，及尤其投與脊椎動物類(哺乳綱)之任何成員，包括(但不限於)靈長類動物、嚙齒動物、家畜及家養寵物。家畜包括待消費或生產適用產品之哺乳動物(例如用於羊毛生產之綿羊)。待使用本發明治療或保護之哺乳動物包括人類、非人類靈長類動物、狗、貓、小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬及豬。

「個體」為包括(但不限於)人類之脊椎動物(諸如哺乳動物)。哺乳動物包括(但不限於)農畜、體育動物、寵物、靈長類動物、小鼠及大鼠。術語「個體」可與術語「動物」、「受試者」或「患者」互換使用。

適用於本發明之通用技術

除非另外指明，否則本發明之實踐將採用已為熟習此項技術者所熟知之習知分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、核酸化學及免疫學技術。此等技術充分解釋於文獻中，諸如Methods of Enzymology，第194卷，Guthrie等人編，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)；Biology and activities of yeasts,Skinner等人編，Academic Press(1980)；Methods in yeast genetics：a laboratory course manual,Rose等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)；The Yeast Saccharomyces：Cell Cycle and Cell Biology,Pringle等人編，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1997)；The Yeast Saccharomyces：Gene Expression,Jones等人編，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1993)；The Yeast Saccharomyces： Genome Dynamics,Protein Synthesis,and Energetics,Broach等人編，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1992)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)及Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版(Sambrook及Russel,2001)(在本文中聯合稱為「Sambrook」)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編，1987，包括增刊2001)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人編，1994)；Harlow及Lane(1988),Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York；Harlow及Lane(1999)Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(在本文中聯合稱為「Harlow及Lane」),Beaucage等人編，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,John Wiley & Sons公司，New York,2000)；Casarett及Doull之Toxicology The Basic Science of Poisons,C.Klaassen編，第6版(2001)，及Vaccines,S.Plotkin,W.Orenstein，及P.Offit編，第五版(2008)。

通用定義

「TARMOGEN^®」(GlobeImmune公司，Louisville,Colorado)一般係指在細胞外(在其表面上)、細胞內(內部或細胞溶質)或細胞外及細胞內兩者表現一或多種異源抗原之酵母媒劑。TARMOGEN^®產品已經大體描述(參見例如美國專利第5,830,463號)。某些基於酵母之免疫治療組合物及產生及通常使用同一組合物之方法亦詳細描述於(例如)美國專利第5,830,463號、美國專利第7,083,787號、美國專利第7,736,642號、Stubbs等人，Nat.Med.7：625-629(2001)，Lu等人，Cancer Research 64：5084-5088(2004)及Bernstein等人，Vaccine 2008年1月24日；26(4)：509-21中，該等專利之每一者均以全文引用之方式併入本文中。

如本文所用，術語「類似物」係指在結構上類似於另一化合物但組成略有不同(如由於一個原子經一個不同元素之原子置換或由於存在特定官能基，或一個官能基經另一官能基置換)之化合物。因此，類似物為相對於參考化合物在功能及外觀上類似或相當，但具有不同結構或起源之化合物。

當用於描述化合物時，術語「經取代」、「經取代之衍生物」及「衍生物」意謂至少一個結合至未經取代之化合物之氫經不同的原子或化學部分置換。

儘管衍生物具有與母化合物類似之物理結構，但衍生物可具有與母化合物相比不同的化學及/或生物特性。該等特性可包括(但不限於)：增加或降低之母化合物活性、與母化合物相比新穎之活性、增強或降低之生物可用性、增強或降低之功效、增強或降低之活體外及/或活體內穩定性、及/或增強或降低之吸收特性。

一般而言，術語「生物反應性」表示如活體內(亦即，在天然生理環境下)或活體外(亦即，在實驗室條件下)所量測或觀測，化合物(包括蛋白質或肽)具有影響細胞、組織或生物體之代謝、生理、化學或其他過程之至少一種可檢測活性。

根據本發明，術語「調控(modulate)」可與「調節(regulate)」互換使用且通常係指上調或下調特定活性。如本文所用，就特定活性而言，術語「上調」通常可用於描述：誘發、起始、增加、加強、強化、改良、增強、放大、促進或提供中之任一者。類似地，就特定活性而言，術語「下調」通常可用於描述：降低、減少、抑制、減輕、下降、減低、阻斷或阻止中之任一者。

在本發明之一個實施例中，可製得本文所述之任何胺基酸序列，使其具有至少一個且至多約20個側接指定胺基酸序列之各C端及/或N端的另外的異源胺基酸。所得蛋白質或多肽可稱為「主要由指定胺基酸序列組成」。根據本發明，異源胺基酸為側接指定胺基酸序列之非天然存在(亦即，非存在於天然、活體內)之胺基酸序列，或與指定胺基酸序列之功能不相關之胺基酸序列，或若衍生該指定胺基酸序列之生物體使用標準密碼子轉譯該天然存在序列中編碼指定胺基酸序列之天然存在核酸序列(當其出現在基因中時)所側接之核苷酸時，則無法由此等核苷酸編碼之胺基酸序列。類似地，當參照本文之核酸序列使用詞組「主要由...組成」時，係指編碼指定胺基酸序列之核酸序列可在編碼指定胺基酸序列之核酸序列之各5'端及/或3'端側接至少一個，且至多約60個額外異源核苷酸。異源核苷酸不會天然發現(亦即不會在天然、活體內發現)側接編碼指定胺基酸序列之核酸序列，因為其係出現在天然基因中或不會編碼賦予蛋白質任何額外功能或改變該具有指定胺基酸序列之蛋白質之功能的蛋白質。

根據本發明，詞組「選擇性結合至」係指本發明之抗體、抗原結合片段或結合搭配物優先結合至指定蛋白質之能力。更特定言之，詞組「選擇性結合」係指一種蛋白質與另一種(例如，抗體、其片段或搭配物與抗原結合)之特異性結合，其中如藉由任何分析法(例如，免疫測定)量測之結合位準在統計上顯著高於用於分析之背景技術對照。舉例而言，當進行免疫測定時，控制裝置通常包括含有抗體或單獨抗原結合片段(亦即，在無抗原之情況下)之反應槽/試管，其中在無抗原之情況下將抗體或其抗原結合片段之活性量(例如，結合至槽之非特異性)視為背景技術。可使用此項技術中包括酶免疫分析法之各種方法標準(例如，ELISA，免疫印跡分析法等)量測結合。

本發明中所使用之蛋白質或多肽之一般參照包括全長蛋白質、接近全長蛋白質(上文所定義)或任何片段、區域(結構、功能或免疫原)、構形抗原決定基或給定蛋白質之同系物或變異體。融合蛋白質亦可通常稱為蛋白質或多肽。根據本發明之經分離之蛋白質為已自其天然環境移除(亦即，已經受人類處理)且可包括純蛋白質、部分純蛋白質、以重組方式製得之蛋白質及以合成方式製得之蛋白質(例如)的蛋白質(包括或肽)。因此，「經分離」未反映蛋白質已純化之程度。較佳地，本發明之經分離蛋白質係重組製得。根據本發明，術語「修飾」及「突變」可互換使用，尤其對於本文所述之蛋白質或其部分之胺基酸序列(或核酸序列)的修飾/突變。

如本文所用，術語「同系物」或「變異體」用以指不同於參考蛋白質或肽(亦即，「原型」或「野生型」蛋白質)之蛋白質或肽，藉由稍微對參考蛋白質或肽進行修飾，但維持天然存在形式之基本蛋白質及側鏈結構。該等變化包括但不限於：一或少數個胺基酸側鏈之變化；一或少數個胺基酸之變化，包括缺失(例如截短型蛋白質或肽)、插入及/或取代；一或少數個原子之立體化學之變化；及/或包括(但不限於)甲基化、糖基化、磷酸化、乙醯化、豆蔻醯化、異戊烯化、棕櫚酸化、醯胺化及/或添加糖基磷脂醯肌醇之微量衍生化。同系物或變異體可具有相比於參考蛋白質或肽之增強、降低或大體上類似特性。同系物或變異體可包括蛋白質之促效劑或蛋白質之拮抗劑。可使用此項技術中已知用於產生蛋白質之技術產生同系物或變異體，包括(但不限於)直接修飾經分離之參考蛋白質、直接蛋白質合成或使用(例如)典型或重組DNA技術實現隨機效應或靶向突變誘發，從而導致蛋白質變異體之編碼以修飾編碼蛋白質之核酸序列。另外，可存在參考蛋白質之天然存在變異體(例如同功異型物、對偶基因變異體或其他可自個體至個體發生之天然變異體)且在本發明中可經分離、產生及/或使用。

給定蛋白質之同系物或變異體可包含與參考蛋白質(例如，本文中特定胺基酸序列或特定蛋白質之胺基酸序列)之胺基酸序列至少約45%、或至少約50%、或至少約55%、或至少約60%、或至少約65%、或至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約86%相同、或至少約87%相同、或至少約88%相同、或至少約89%相同、或至少約90%、或至少約91%相同、或至少約92%相同、或至少約93%相同、或至少約94%相同、或至少約95%相同、或至少約96%相同、或至少約97%相同、或至少約98%相同或至少約99%相同(或以全整數遞增之介於45%與99%之間的任何相同度百分比)之胺基酸序列、基本上由該等胺基酸序列組成或由該等胺基酸序列組成。在一個實施例中，同系物或變異體包含與參考蛋白質之胺基酸序列低於100%相同、低於約99%相同、低於約98%相同低於約97%相同低於約96%相同、低於約95%相同等等，以1%遞增至低於約70%相同之胺基酸序列，基本上由該等胺基酸序列組成或由該等胺基酸序列組成。

如本文所用，除非另外規定，否則提及相同度百分比(%)係指使用以下工具進行同源性評價：(1)使用具有標準預設參數之用於胺基酸檢索之blastp及用於核酸檢索之blastn的鹼基局部比對檢索工具(BLAST)基本同源性檢索，其中針對低複雜度區域藉由預設值過濾查詢序列(諸如描述於Altschul,S.F.,Madden,T.L.,Schääffer,A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.& Lipman,D.J.(1997)「Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs.」Nucleic Acids Res.25：3389-3402中，該文獻以全文引用的方式併入本文中)；(2)BLAST比對兩個序列(例如使用以下所述之參數)；(3)及/或具有標準預設參數之PSI-BLAST(位置特異性疊代BLAST)。應注意由於針對兩個序列在基本BLAST與BLAST之間的標準參數存在一些差異，因此使用BLAST程式可識別兩個特異性序列具有顯著同源性，然而採用基本BLAST進行檢索，使用該等序列中之一者作為查詢序列可並未將第二序列識別為高度匹配。另外，PSI-BLAST提供自動化、易於使用版之「特徵」檢索，其為查詢序列同系物之靈敏方式。該程式第一次進行有缺口之BLAST資料庫檢索。PSI-BLAST程式使用從返回至構築體位置特異性得分矩陣之任何顯著比對之資訊，其代替查詢序列用於接下來資料庫檢索之捨入。因此，應理解可藉由使用此等程式中之任一者來測定相同度百分比。

兩個特異性序列可使用如Tatusova及Madden,(1999),「Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences」,FEMS Microbiol Lett.174：247-250(該文獻以全文引用的方式併入本文中)中所述之BLAST彼此比對。使用BLAST 2.0算法以blastp或blastn進行此序列比對以執行兩個序列之間的有缺口之BLAST檢索(BLAST 2.0)，從而使得在所得比對中引入缺口(缺失及插入)。出於本文清晰性之目的，使用如下標準預設參數執行兩個序列之BLAST序列比對。

對於blastn，使用0 BLOSUM62矩陣：

匹配之獎勵=1

不匹配之懲罰值=-2

打開缺口(5)及延伸缺口(2)懲罰值

缺口x_下降(50)預期(10)字尺寸(11)過濾(打開)

對於blastp，使用0 BLOSUM62矩陣：

開放缺口(11)及延伸缺口(1)罰分

缺口x_下降(50)預期(10)字大小(3)過濾(打開)

經分離之核酸分子為已自其天然環境移除之核酸分子(亦即，已經受人類處理)，其天然環境為其中在天然中發現核酸分子之基因體或染色體。同樣，「經分離」未必反映核酸分子已經純化之程度，但指示分子不包括整個基因組或整個染色體或含有超過一個基因之基因組之區段，其中在天然中發現核酸分子。經分離核酸分子可包括完整基因。包括基因之經分離之核酸分子不係包括此基因之染色體之片段，而係包括與該基因相關之編碼區及調節區，而在相同染色體上未天然發現額外基因。經分離核酸分子亦可包括基因之一部分。經分離之核酸分子亦可包括由額外核酸(亦即，異源序列)側接(亦即，在序列之5'端及/或3'端)之指定核酸序列，該額外核酸通常在本質上未側接指定核酸序列。經分離之核酸分子可包括DNA、RNA(例如，mRNA)或DNA或RNA(例如，cDNA)之衍生物。儘管詞組「核酸分子」主要係指實體核酸分子且詞組「核酸序列」主要係指核酸分子上之核苷酸序列，但兩個短語可互換使用，尤其就能夠編碼蛋白質或蛋白質域之核酸分子或核酸序列而言。

重組型核酸分子為可包括編碼本文所描述之任何一或多種蛋白質之任何核酸序列中之至少一者的分子，本文所描述之任何一或多種蛋白質係以可操作方式與能夠有效調節細胞中待轉染之核酸分子表現之任何轉錄控制序列中之至少一者連接。儘管詞組「核酸分子」主要係指實體核酸分子且詞組「核酸序列」主要係指核酸分子上之核苷酸序列，但兩個短語可互換使用，尤其就能夠編碼蛋白質之核酸分子或核酸序列而言。另外，詞組「重組型分子」主要係指以可操作方式與轉錄控制序列連接之核酸分子，但該詞組可與詞組「核酸分子」(投與動物)互換使用。

重組型核酸分子包括重組載體，該重組載體為以可操作方式與編碼本發明之融合蛋白質之經分離核酸分子連接的任何核酸序列，通常為異源序列，該重組型載體能夠實現融合蛋白質之重組產生且能夠將核酸分子遞送至根據本發明之宿主細胞中。此類載體可含有非天然發現與待插入至載體中之經分離核酸分子相鄰之核酸序列。載體可為RNA或DNA、原核或真核，且在本發明中較佳為適用於轉染酵母之質粒。重組型載體可用於選殖、定序及/或以其他方式操縱核酸分子，且可用於遞送該等分子(例如，以DNA組合物或基於病毒載體之組合物之形式)。重組型載體較佳用於核酸分子之表現，且亦可稱為表現載體。重組型載體較佳能夠在經轉染之宿主細胞(諸如酵母)中表現。

在本發明之重組型分子中，核酸分子係操作連接至含有與宿主細胞相容及控制本發明之核酸分子之表現的調節序列(諸如轉錄控制序列、轉譯控制序列、複製起點及其他調節序列)之表現載體。特定言之，本發明之重組型分子包括經操作連接至一或多個表現控制序列之核酸分子。詞組「操作連接至」係指將核酸分子連接至表現控制序列，連接方式是當轉染(亦即，轉型、轉導或轉染)至宿主細胞中時，該分子得以表現之方式。

根據本發明，所用術語「轉染」係指可使外源性核酸分子(亦即，重組型核酸分子)插入至細胞中之任何方法。當所用術語「轉型」係指將核酸分子引入至微生物細胞(諸如海藻、細菌及酵母)中時，此術語「轉型」可與術語「轉染」互換使用。在微生物系統中，術語「轉型」用以描述因獲得微生物之外源性核酸所致之遺傳變化且基本上與術語「轉染」同義。因此，轉染技術包括(但不限於)轉型、化學處理細胞、粒子轟擊、電穿孔、顯微注射、脂質體轉染、吸附、侵染及原生質體融合。

以下實驗結果係因應說明之目的而提供且不意欲限制本發明之範疇。

實例 實例1

以下實例描述經修飾之酵母-短尾畸型免疫治療組合物之產生。

在此實驗中，酵母(釀酒酵母菌)經工程改造以表現人類短尾畸型抗原，其為包含T細胞抗原決定基WLLPGTSTV(SEQ ID NO：9)(其為促效劑抗原決定基)且進一步包含T box DNA結合域之缺失之接近全長的短尾畸型蛋白質。以例如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6存在之原生短尾畸型T細胞抗原決定基為WLLPGTSTL(SEQ ID NO：8)。在銅-誘導性啟動子(CUP1)之控制下表現人類短尾畸型促效劑抗原以生產酵母-短尾畸型免疫治療組合物。更特定言之，亦為根據本發明之經修飾之短尾畸型抗原的短尾畸型促效劑抗原以由SEQ ID NO：13表示之單個多肽形式產生。SEQ ID NO：13之胺基酸序列與由SEQ ID NO：4表示之人類短尾畸型蛋白質(未經修飾之短尾畸型抗原)之胺基酸序列之不同之處在於：(1)缺失位點198至222(亦即，SEQ ID NO：4之位點198至222不存在於SEQ ID NO：13中)；及(2)用纈胺酸取代位於SEQ ID NO：4中之位點254上(及位於SEQ ID NO：13之位點229上)的胺基酸(白胺酸)。換言之，SEQ ID NO：13為由直接融合至SEQ ID NO：4之位點223至435之位點1至197組成之單個多肽，且其包括使得將促效劑抗原決定基引入至SEQ ID NO：13中之胺基酸修飾(在與SEQ ID NO：4之位點254對應之SEQ ID NO：13之位點229處)。在位點254處(相對於SEQ ID NO：4)纈胺酸至白胺酸之取代在SEQ ID NO：13之位點221至229處產生SEQ ID NO：13中之T細胞促效劑抗原決定基，不受理論束縛，咸信該抗原決定基與野生型抗原決定基(SEQ ID NO：4之位點246至254)相比會誘導針對短尾畸型之增強T細胞反應。此促效劑抗原決定基在本文亦由SEQ ID NO：6表示。與SEQ ID NO：4之短尾畸型蛋白質相比，由SEQ ID NO：13表示之經修飾之短尾畸型抗原具有經破壞DNA結合能力且表現抗原之酵母具有降低之絮凝表型，且當此構築體以酵母-短尾畸型免疫治療劑投與受試者時額外含有增強對原生短尾畸型之T細胞反應的促效劑抗原決定基。

SEQ ID NO：15為包含SEQ ID NO：13(實際上為SEQ ID NO：13之位點2至410，此係因為移除SEQ ID NO：13之N端甲硫胺酸以適應添加以下所描述之N端肽)之經修飾之短尾畸型蛋白質的融合蛋白質。SEQ ID NO：15為具有以下融合於自N端至C端之框內之序列元素的單個多肽：(1)賦予酵母中蛋白酶體降解及穩定化表現抗性之N端肽(SEQ ID NO：15之位點1至6，其胺基酸序列在本文亦由SEQ ID NO：16表示)；(2)人類短尾畸型抗原，其由SEQ ID NO：4之位點2至197及223至435組成且進一步含有纈胺酸對在SEQ ID NO：4之位點254處之白胺酸的取代，其亦可描述為SEQ ID NO：13之位點2至410(SEQ ID NO：15之位點7至415)；及(3)六聚組胺酸標記(SEQ ID NO：15之位點416至421)。SEQ ID NO：15之胺基酸序列及SEQ ID NO：13之位點2至410之胺基酸序列由SEQ ID NO：14之多核苷酸序列編碼。表現此融合蛋白質之基於酵母之免疫治療組合物在本文中亦稱為GI-6306。

製備GI-6306酵母免疫治療組合物，簡言之，使用PCR合成、擴增編碼具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列之人類短尾畸型蛋白質的DNA序列，且接著在酵母2μm表現載體中CUP1啟動子(載體pGI-100)之後的EcoRI及SpeI選殖部位處插入。亦將編碼N端穩定肽MADEAP(SEQ ID NO：16)之核苷酸序列及C端六聚組胺酸肽添加至質粒載體以編碼由SEQ ID NO：15表示之完整融合蛋白質。將所得質粒轉型至DH5α中以便質粒儲存，及轉型至釀酒酵母菌W303α中以便產生酵母-短尾畸型免疫治療組合物。

藉由鋰乙酸/聚乙二醇轉染作用，進行轉型至釀酒酵母菌，且在缺少尿嘧啶(UDA；無瓊脂之尿苷)之固體瓊脂基本培養盤上選擇主要轉染物。藉由在缺少尿苷及白胺酸(ULDA)兩者之瓊脂培養盤上重新劃分各別群落來選擇此等主要轉型的菌株群落；接著在30℃下生長4天以確保純系純度且以在該等酵母細胞內建立較高短尾畸型質粒拷貝數之穩定狀態。

使用來自ULDA培養盤之群落接種於缺少尿苷及白胺酸(UL4aa)之液體起始培養基上且在30℃下在250rpm之旋轉振盪下生長20小時。接著將此等主要培養物用以接種相同UL4aa調配物之最終培養基。

UL4aa液體培養基之配方(每公升)：

25公克(g)葡萄糖

10g含有硫酸銨之酵母氮基體

0.08g腺嘌呤

0.16g色胺酸

0.16g組胺酸

在CUP1-驅動銅-誘導性啟動子之控制下評估酵母-短尾畸型免疫治療組合物的初步實驗中，藉由在酵母-短尾畸型培養物達到大致2Y.U./ml之密度之後添加0.375mM硫酸銅至最終培養物中來引醱酵母-短尾畸型表現，且在30℃下持續引發3小時。隨後採集來自各培養物之細胞，將其在PBS中洗滌且於56℃下在PBS中加熱殺滅1小時。

在熱殺滅培養物之後，將該等細胞在PBS中洗滌三次。藉由TCA沈積/硝化纖維結合分析量測總蛋白質成分且使用抗his標記單株抗體及抗短尾畸型抗體(Abcam,Cambridge,MA)之蛋白質印跡評估短尾畸型抗原表現。使用蛋白質印跡之半定量數位成像，將來自酵母分解物之短尾畸型抗原波段強度/訊號內插至含有已知量之重組純化his-標記抗原的標準曲面上來定量該等酵母細胞之短尾畸型抗原成分。

初步表現實驗之結果展示於圖1中且證實表現GI-6306之融合蛋白質(SEQ ID NO：15)包含高位準(16,438ng/YU)之經修飾之短尾畸型促效劑抗原(SEQ ID NO：13之位點2至410)。此表現位準與包含由稱為GI-6301(16,787ng/YU；參見圖1)之酵母免疫治療組合物表現在未經修飾之短尾畸型抗原(SEQ ID NO：4之位點2至435)多融合蛋白質之表現類似。藉由GI-6306表現經修飾之短尾畸型促效劑抗原尤其高於短尾畸型促效劑抗原之表現，該短尾畸型促效劑抗原含有與SEQ ID NO：13相同之促效劑點突變，但不含有存在於SEQ ID NO：13中之 DNA結合域的缺失(稱為GI-6305之酵母免疫治療組合物表現SEQ ID NO：4之位點2至435的胺基酸序列，除纈胺酸對SEQ ID NO：4之位置254處之白胺酸的取代之外)(參見圖1，10,862ng/YU)。因此，消除短尾畸型之DNA結合活性(例如，經由DNA結合殘基之缺失)呈現顯著增強短尾畸型促效劑抗原之表現。

亦根據目視檢查沈降來評估上文所述之酵母-短尾畸型免疫治療產物之培養物(GI-6301、GI-6305及GI-6306)之絮凝特徵。如圖2中展示，酵母-短尾畸型組合物GI-6306顯著比GI-6301或GI-6305中之任一者較少凝聚。

實例2

以下實例描述患有短尾畸型-陽性癌症之受試者中之1期臨床試驗。

使用被稱為GI-6306之酵母-短尾畸型免疫治療組合物或如本文所描述之酵母-短尾畸型免疫治療組合物進行開放標記、連續劑量升級之1期臨床試驗。在此臨床試驗方案下，以使用4Y.U.(1Y.U.×4個部位，意謂在各就診患者身體之4個不同部位投與1Y.U.之免疫治療組合物)16Y.U.(4Y.U.×4個部位)、40Y.U.(10Y.U.×4個部位)或80Y.U.(20Y.U.×4個部位)之劑量變化的連續劑量組升級方案向9個至18個癌症患者(每劑量組3個至6個患者)投與、經皮下投與酵母-短尾畸型免疫治療組合物。以2週間隔對總共7次就診(約3個月)投與免疫治療組合物，且接著之後每月投與直至患者符合停止研究之標準。選擇處於最大耐受劑量(MTD)或最佳觀測劑量之擴展患者組(n=10)用於額外研究。監測結果之安全及可容忍性作為主要終點，且在該擴展組中，如藉由以ELISpot分析法提高短尾畸型特異性T細胞及增殖回應短尾畸型蛋白質(例如，短尾畸型特異性CD8⁺或CD4⁺ T細胞在治療中出現或擴充)量測在T細胞前驅體中之顯著變化是否可檢測。作為二級終點，量測臨床益處(諸如無進展存活期、臨床放射反應)、漿液標記物之降低及/或循環腫瘤細胞之減少，以及包括末梢血液(CD8⁺記憶體/效應T細胞、CD4⁺記憶體/效應T細胞、Tregs、NK細胞、DC)中免疫細胞亞群之頻率及在細胞激素(例如、IFN-γ、IL-10、IL-12、IL-2、IL-4、TGF-β等等)之漿液位準上之改變的一般免疫活化參數。

預期包括GI-6306之免疫治療組合物為安全及耐受良好而無顯著毒性的。另外，預期免疫治療組合物在至少一些或大部分患者中產生治療出現之短尾畸型特異性T細胞反應或預先存在短尾畸型特異性基線T細胞反應之改良。亦預期一些患者具有穩定之疾病。

在額外研究或此研究之擴展中，使用以上測定之最大耐受劑量或最佳觀測劑量及所量測之相同主要終點及二級終點向額外患者組投與本文所揭示之酵母-短尾畸型免疫治療組合物。

實例3

以下實例描述使用本文所述之酵母-短尾畸型免疫治療組合物的2期臨床試驗。

使用如描述於實例1中之酵母-短尾畸型免疫治療組合物對患有乳癌之患者進行隨機2期臨床試驗。至少100個或更多個患有階段I、II或III短尾畸型陽性乳癌之受試者參加。受試者入選標準可包括患有1級、2級或3級癌症之受試者。包括標準之受試者亦可包括患有「三陰性」乳癌(對雌激素受體(ER)、孕酮受體(PR)及HER2各者呈陰性之癌症)之受試者。受試者入選標準亦包括患有淋巴結陰性癌症之患者。

試驗按雙盲或開放標籤，安慰劑對照，多中心試驗進行。在治療期間，所有患者與接受若干系列之酵母-短尾畸型免疫治療組合物注射的治療組患者接受標準照護療法。主要終點為無復發存活期或整體存活期。額外終點可包括腫瘤細胞中之抗原特異性T細胞反應(例如，在治療中出現或擴充短尾畸型特異性CD8⁺ T細胞)、保存淋巴結陰性、轉移進展及短尾畸型表現。

預期酵母-短尾畸型免疫治療組合物為安全及耐受良好而無顯著毒性的。另外，預期酵母-短尾畸型免疫治療組合物在至少一些或大多數患者中產生治療出現之特異性T細胞反應及/或預先存在短尾畸型特異性基線T細胞反應中之改良。亦預期一些或大部分患者具有穩定之疾病、維持淋巴結陰性及/或預防、降低或阻止轉移性進展。

雖然已對本發明之各種實施例進行詳細描述，但顯而易見，熟習此項技術者將會想到彼等實施例之改良及修改。但是應明確瞭解該等改良及修改係在本發明範疇內，如以下例示性申請專利範圍中所闡述。

<110> 美商環球免疫公司(GlobeImmune,Inc.) 美國衛生與公眾服務部(The USA, as represented by the Secretary, Dept. of Health and Human Services)

<120> 經修飾之酵母-短尾畸型免疫治療組合物

<130> 7797-3-PCT

<140> TW105124349

<141> 2016-08-01

<150> 62/200,497

<151> 2015-08-03

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2518

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (494)..(1801)

<400> 1

<210> 2

<211> 435

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 1305

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1305)

<400> 3

<210> 4

<211> 435

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 促效劑肽

<400> 6

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

<210> 10

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成構築體

<400> 10

<210> 11

<211> 1295

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> CDS

<222> (10)..(1275)

<400> 11

<210> 12

<211> 421

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成構築體

<400> 12

<210> 13

<211> 410

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成構築體

<400> 13

<210> 14

<211> 1295

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 合成構築體

<220>

<221> CDS

<222> (10)..(1275)

<400> 14

<210> 15

<211> 421

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 合成構築體

<400> 15

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 16

Claims

一種酵母-短尾畸型(Brachyury)免疫治療組合物，其包含：a)酵母；b)由酵母表現之至少一種經修飾之短尾畸型抗原，其中該經修飾之短尾畸型抗原具有包含SEQ ID NO：10之位點2至410的胺基酸序列，或SEQ ID NO：13之位點2至410的胺基酸序列。
如請求項1之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該經修飾之短尾畸型抗原與該野生型短尾畸型相比具有經破壞之DNA結合活性。
如請求項1之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該酵母與表現野生型短尾畸型之酵母相比具有降低之絮凝表型(flocculation phenotype)。
如請求項1至3中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該經修飾之短尾畸型抗原具有進一步包含至少一個促效劑T細胞抗原決定基之胺基酸序列。
如請求項4之酵母短尾畸型免疫治療組合物，其中該促效劑抗原決定基具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
如請求項1至3中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該經修飾之短尾畸型抗原為具有SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：15之胺基酸序列的融合蛋白質。
如請求項1至3中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該酵母來自酵母菌屬(Saccharomyces)。
如請求項1至3中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該酵母來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
如請求項1至3中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該酵母為整個酵母。
如請求項9之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該整個酵母係經殺滅。
如請求項9之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該整個酵母係經熱滅活。
如請求項1至3中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該組合物係於適於投與受試者之醫藥學上可接受之賦形劑中調配。
如請求項1至3中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該經修飾之短尾畸型抗具有與SEQ ID NO：4之野生型短尾畸型胺基酸序列差別在該野生型短尾畸型序列之位點198至222之缺失。
一種酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其包含：a)整個滅活之酵母；及b)短尾畸型融合蛋白質，其包含SEQ ID NO：10之位點2至410之胺基酸序列；其中該短尾畸型融合蛋白質由該酵母表現；且其中該組合物引發短尾畸型特異性T細胞反應。
如請求項14之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該融合蛋白質具有SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
一種酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其包含：a)整個滅活之酵母；及a)短尾畸型融合蛋白質，其包含SEQ ID NO：13之位點2至410之胺基酸序列；其中該短尾畸型融合蛋白質由該酵母表現；且其中該組合物引發短尾畸型特異性T細胞反應。
如請求項16之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該融合蛋白質具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列。
如請求項14至17中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該短尾畸型融合蛋白質之表現受到啟動子CUP1之控制。
如請求項14至17中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該酵母來自酵母菌屬。
如請求項14至17中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該酵母來自釀酒酵母菌。
如請求項14至17中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物，其中該組合物係於適於投與受試者之醫藥學上可接受之賦形劑中調配。
一種如請求項1至21中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物之用途，其係用以製備用於治療個體中表現短尾畸型之之癌症的藥物。
一種如請求項1至21中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物之用途，其係用以製備用於降低、阻止、逆轉、延緩或預防個體中癌症之轉移性進展的藥物，其中該個體正經歷轉移性進展、處於經歷轉移性進展之風險下或經預測開始經歷轉移性進展之癌症。
一種如請求項1至21中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物之用途，其係用以製備用於預防或延緩個體中表現短尾畸型之癌症之發病的藥物。
一種如請求項1至21中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物之用途，其係用以製備用於治療個體中脊索瘤之藥物。
如請求項22至25中任一項之用途，其中該個體正藉由或已藉由另一癌症療法治療。
如請求項26之用途，其中該療法係選自：放射療法、手術切除腫瘤、化學療法、靶向癌症療法、過繼性T細胞轉移或投與一或多種額外免疫治療組合物。
一種如請求項1至21中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物之用途，其係用以製備用於降低或預防正接受化學療法及/或放射療法之個體中的腫瘤細胞之化學療法抗性或放射抗性的藥物。
如請求項22至25及28中任一項之用途，其中該藥物降低該個體中之腫瘤負荷、延長該個體之存活期及/或抑制該個體中之腫瘤生長。
如請求項22至25及28中任一項之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：乳癌、骨癌、脊索瘤、小腸癌、胃癌、胰臟癌、腎臟癌、膀胱癌、子宮癌、卵巢癌、睾丸癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、慢性淋巴球性白血病(chronic lymphocytic leukemia；CLL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及其轉移性癌症。
一種如請求項1至21中任一項之酵母-短尾畸型免疫治療組合物之用途，其係用以製備用於治療或預防個體中與埃-巴二氏病毒(Epstein Barr Virus；EBV)感染相關聯之疾病或病狀的藥物。