CN108348586A - 经修饰的酵母-Brachyury免疫治疗组合物 - Google Patents

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Abstract

公开了改进的基于酵母的免疫治疗组合物，其包含经修饰的Brachyury抗原，以及预防和/或治疗以Brachyury的表达或过表达为特征的癌症的方法。

Description

经修饰的酵母-Brachyury免疫治疗组合物
对相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2015年8月3日提交的美国临时申请流水号62/200,497的优先权权益。所述2015年8月3日提交的美国临时申请流水号62/200,497的全部公开内容通过引用并入本文。
政府的权利
本发明是在执行与卫生与人类服务部的机构国立卫生研究院之间的合作研究和开发协议产生的。美国政府对本发明具有某些权利。
关于联合研究协议的声明
本发明是由2008年5月8日执行的合作研究和开发协议的缔约方作出的。合作研究和开发协议的缔约方为全球免疫股份有限公司(GlobeImmune,Inc.)和美国卫生与人类服务部，其由国家癌症研究所，国立卫生研究院的研究所，中心或分部代表。
对序列表的引用
本申请含有通过EFS-Web以文本文件电子提交的序列表。命名为“7797-3-PCT_ST25”的文本文件具有50KB的大小，于2016年7月26日记录。该文本文件包含的信息根据37CFR§1.52(e)(5)通过引用全部并入本文。
发明领域
本发明一般地涉及改进的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，和用于预防和/或治疗以Brachyury的表达或过表达为特征的癌症的方法，以及用于改进酵母-Brachyury免疫治疗组合物的制造和使用的方法。
发明背景
Brachyury，又称为“T”，是一种中胚层转录因子和T-box基因复合体的成员。编码Brachyury的基因(在人中表示为T基因或Brachyury基因)最初是由Nadine在1927年通过小鼠中影响杂合动物中尾长度和骶椎的突变鉴定到的。Brachyury基因在1990年由Hermann及其同事在小鼠中克隆(Herrmann et al.,1990,Nature 343:617-622)，在1996年由Edwards及其同事在人中克隆(Edwards et al.,1996,Genome Res.6:226-223)，他们还描述了推断的人Brachyury氨基酸序列。
作为T-box家族转录因子的成员，Brachyury含有高度保守的DNA结合结构域基序，被称为“T-box”或T-结构域，其结合回文共有序列。与其它T-box蛋白一样，Brachyury被证实在早期发育中发挥作用，且对于脊椎动物中后部中胚层的形成和分化以及中轴发育非常关键(参见例如，Wilkinson et al.,1990,Nature 343(6259):657–659)；Beddington etal.,1992,Development(Suppl.):157-165；Schulte-Merker et al.,1994,Development120:1009-1015；Kispert and Herrmann,1994,Dev.Biol.161:179-193；Showell et al.,2004,Dev Dyn 229:201-218)。近年，Palena和同事已经证明了Brachyury在多种人类肿瘤组织和癌细胞系中表达，并且显示了Brachyury的肽可以用于在正常供体和癌症患者中生成Brachyury特异性T细胞系(Palena et al.,2007,Clin.Cancer Res.13(8):2471-2478)。Fernando等人的研究显示，Brachyury促进人肿瘤细胞中的上皮细胞-间充质转化(EMT)，赋予肿瘤细胞以间充质表型，以及迁移和侵袭能力，同时减弱肿瘤细胞周期进展(Fernandoet al.,2010,J.Clin.Invest.120(2):533-544)。因此，Brachyury参与癌症的转移性进展。
癌症在全世界是领先的致死原因，开发有效的癌症疗法一直是最活跃的研究和临床开发领域之一。虽然已提出了各种癌症治疗和预防的创新方法，但许多癌症仍然有高的死亡率，并且可以难以治疗或者对传统疗法相对不响应。与Brachyury表达相关的癌症可见于包括乳房、小肠、胃、肾、膀胱、子宫、卵巢、睾丸、肺、结肠、骨(包括脊索瘤)和前列腺的多种组织，且包括转移性和晚期癌症。此外，Brachyury在B细胞起源的肿瘤中表达，如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、Epstein-Barr病毒转化的B细胞、伯基特氏(Burkitt’s)和霍奇金淋巴瘤。因此，Brachyury似乎在许多人类癌症中有作用。虽然Brachyury曾被提议作为癌症免疫疗法的靶标(参见例如，Palena et al.,同前，Fernando et al.，同前和WO 2008/106551)，由于其是一种相对较新的癌症靶标，本领域仍然需要能够有效地治疗和/或预防与Brachyury表达或过表达关联的癌症的新的免疫治疗产品。
发明概述
本发明的一个实施方案涉及酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其包含：a)酵母；和b)由所述酵母表达的至少一种经修饰的Brachyury抗原，其中所述经修饰的Brachyury抗原具有通过至少一个修饰与野生型Brachyury氨基酸序列不同的氨基酸序列，所述修饰选自野生型Brachyury的位置42至229的任意一个或多个处的氨基酸的缺失或取代，其中所述Brachyury抗原相比于所述野生型Brachyury具有被破坏的DNA结合位点。在一方面，所述经修饰的Brachyury抗原相比于野生型Brachyury具有被破坏的DNA结合活性。在另一方面，所述酵母相比于表达野生型Brachyury的酵母具有降低的絮凝表型。在一方面，所述经修饰的Brachyury抗原具有通过至少一个修饰与野生型Brachyury氨基酸序列不同的氨基酸序列，所述修饰选自野生型Brachyury的位置66至217的任意一个或多个处的氨基酸缺失或取代。在一方面，所述经修饰的Brachyury抗原具有通过至少一个修饰与野生型Brachyury氨基酸序列不同的氨基酸序列，所述修饰选自野生型Brachyury的位置198至222的任意一个或多个处的氨基酸缺失或取代。在一方面，所述经修饰的Brachyury抗原具有通过至少一个修饰与野生型Brachyury氨基酸序列不同的氨基酸序列，所述修饰选自野生型Brachyury的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基的缺失或取代，所述氨基酸残基选自Lys66、Arg69、Arg70、Arg101、Lys103、Lys147、Asn150、Lys151、Ser162、Thr196、Ala197、Tyr198、Ile208、Asn211、Pro212、Phe213、Ala214、Lys215、Ala216和/或Phe217。在一方面，所述经修饰的Brachyury抗原具有通过至少一个修饰与野生型Brachyury氨基酸序列不同的氨基酸序列，所述修饰选自野生型Brachyury的至少1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸残基的缺失或取代，所述氨基酸残基选自Met87、Pro127、Asp128、Ser129、Pro130、Asn131、Phe132和/或Val175。在另一方面，所述修饰是缺失。在再一方面，所述经修饰的Brachyury抗原通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个所述修饰与野生型Brachyury氨基酸序列不同。在另一方面，所述经修饰的Brachyury抗原具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列通过野生型Brachyury的位置66和217之间的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续氨基酸的缺失与野生型Brachyury氨基酸序列不同。在一方面，所述经修饰的Brachyury抗原具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列通过野生型Brachyury的位置198和222之间的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续氨基酸的缺失与野生型Brachyury氨基酸序列不同。在一方面，所述经修饰的Brachyury抗原具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列通过野生型Brachyury的位置198-222的缺失与野生型Brachyury氨基酸序列不同。
在以上或本文其它地方所述的本发明的任意实施方案或方面的一方面，所述经修饰的Brachyury抗原具有还包含至少一个激动性T细胞表位的氨基酸序列。在一方面，所述激动性T细胞表位具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在以上或本文其它地方所述的本发明的任意实施方案或方面的一方面，所述经修饰的Brachyury抗原具有与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13至少80％相同的氨基酸序列。在一方面，所述经修饰的Brachyury抗原具有与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13至少90％相同的氨基酸序列。在一方面，所述经修饰的Brachyury抗原具有与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13至少95％相同的氨基酸序列。在另一方面，所述经修饰的Brachyury抗原具有包含SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:10的位置2-410的氨基酸序列。在一方面，所述经修饰的Brachyury抗原具有包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:13的位置2-410的氨基酸序列。在一方面，所述经修饰的Brachyury抗原是融合蛋白，其具有与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:15至少95％相同的氨基酸序列。在一方面，所述经修饰的Brachyury抗原是融合蛋白，其具有SEQ ID NO:12或SEQID NO:15的氨基酸序列。
在以上或本文其它地方所述的本发明的任意实施方案的任意前述方面，所述酵母来自酵母属。在一方面，所述酵母来自酿酒酵母。在一方面，所述酵母是完整酵母。在一方面，所述完整酵母被杀死。在一方面，所述完整酵母被热灭活。
在以上或本文其它地方所述的本发明的任意实施方案的一方面，所述组合物在适合于施用至受试者的药学上可接受的赋形剂中配制。
本发明的再一实施方案涉及酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其包含：a)完整的灭活酵母；和b)Brachyury融合蛋白，其包含SEQ ID NO:10的位置2-415的氨基酸序列；其中所述Brachyury融合蛋白由所述酵母表达；且其中所述组合物引发Brachyury特异性T细胞应答。在一方面，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列。本发明的另一实施方案涉及酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其包含：a)完整的灭活酵母；和Brachyury融合蛋白，其包含SEQ ID NO:13的位置2-415的氨基酸序列；其中所述Brachyury融合蛋白由所述酵母表达；且其中所述组合物引发Brachyury特异性T细胞应答。在一方面，所述融合蛋白具有SEQID NO:15的氨基酸序列。
在以上或本文其它地方所述的本发明的任意实施方案或方面中，所述Brachyury融合蛋白的表达受到启动子CUP1的控制。在一方面，所述酵母来自酵母属。在一方面，所述酵母来自酿酒酵母。在一方面，所述组合物在适合于施用至受试者的药学上可接受的赋形剂中配制。
本发明的另一实施方案涉及治疗表达Brachyury的癌症的方法。在一方面，所述方法包括将以上或本文其它地方所述的酵母-Brachyury免疫治疗组合物施用至患有表达Brachyury的癌症的受试者。
本发明的另一实施方案涉及在患有癌症的个体中减少、遏制、逆转、延迟或防止癌症转移性进展的方法，包括将以上或本文其它地方所述的免疫治疗组合物施用至患有癌症的个体，所述癌症正在转移性进展、有转移性进展的风险或者预测要开始转移性进展。
本发明的另一实施方案涉及预防或延迟表达Brachyury的癌症发作的方法，包括将以上或本文其它地方所述的免疫治疗组合物施用至个体。
本发明的另一实施方案涉及治疗脊索瘤的方法，包括将以上或本文其它地方所述的免疫治疗组合物施用至患有脊索瘤的受试者。
在以上或本文其它地方所述的本发明的任意实施方案或方面的一方面，所述个体正使用或者已经使用另一种癌症疗法治疗。在一方面。所述疗法选自放射疗法，肿瘤的手术切除，化疗，靶向癌症疗法，过继性T细胞转移或一种或多种另外的免疫治疗组合物的施用。
本发明的另一实施方案涉及减少或防止癌症患者中肿瘤细胞的化疗抗性或放射抗性的方法，包括将以上或本文其它地方所述的免疫治疗组合物施用至患有癌症且正接受化疗和/或放射疗法的个体。
在以上或本文其它地方所述的本发明的任意实施方案或方面的一方面，所述方法减少个体中的肿瘤负荷、提高个体存活率和/或抑制个体中的肿瘤生长。在一方面，所述癌症是乳腺癌，骨癌，脊索瘤，小肠癌，胃癌，胰腺癌，肾癌，膀胱癌，子宫癌，卵巢癌，睾丸癌，肺癌，结肠癌，前列腺癌，慢性淋巴细胞白血病(CLL)、伯基特氏淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和它们的转移癌症。
本发明的另一实施方案涉及治疗或预防与埃巴病毒(Epstein Barr virus,EBV)感染相关的疾病或状况的方法，包括将以上或本文其它地方所述的酵母-Brachyury免疫治疗组合物施用至个体。
本发明的另一实施方案涉及本文所述的任何免疫治疗组合物治疗表达Brachyury的癌症；减少、遏制、逆转或防止患有癌症的个体中的癌症的转移性进展；防止或延迟表达Brachyury的癌症的发病；减少或防止癌症患者中的肿瘤细胞的化疗抗性或放射抗性的用途。
本发明的再一实施方案涉及本文所述的任何免疫治疗组合物在制备用于治疗表达Brachyury的癌症的药物中的用途。
附图简述
图1是Western印迹数字图像，其显示了与命名为GI-6301(或6301)和GI-6305(或6305)的酵母-Brachyury免疫治疗组合物中的抗原表达相比，称为GI-6306(或6306)的酵母-Brachyury免疫治疗组合物的抗原表达。(“ug”是微克)。“YVEC”是空载体酵母。
图2的数字图像显示了与酵母-Brachyury免疫治疗组合物GI-6301和GI-6305相比，称为GI-6306的酵母-Brachyury免疫治疗组合物表现出降低的絮凝表型。
发明详述
本发明一般地涉及改进的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，产生此类组合物的方法，和使用此类组合物预防和/或治疗表达或过表达Brachyury的癌症的方法。本发明包括对Brachyury抗原的特定修饰，其产生具有降低或破坏的DNA结合活性的新的Brachyury抗原用于免疫治疗。本发明人已经做出令人惊讶和出乎意料的发现，即对Brachyury抗原的此类修饰也改善了酵母-Brachyury免疫治疗组合物的制造和使用。本发明的酵母-brachyury免疫治疗组合物不仅缺乏结合DNA且从而与天然Brachyury一样起转录因子的作用的能力，但是它们令人惊讶地并且出乎意料地更容易制造，更容易施用，并且以高水平表达Brachyury抗原，甚至当引入其它修饰(例如激动性突变)时也是如此。
更具体的，本发明包括改进的基于酵母的免疫治疗组合物(在本文中也称为“基于酵母的免疫疗法”，“酵母-Brachyury免疫疗法”，“酵母-Brachyury免疫治疗组合物”，“基于酵母的免疫治疗产品”，“基于酵母的疫苗”或这些短语的衍生词)，其中所述组合物包含酵母媒介物和至少一种经修饰的Brachyury抗原(包括Brachyury激动剂抗原)，其中Brachyury抗原的DNA结合活性(例如与野生型Brachyury蛋白相比)已经通过突变(例如，通过在Brachyury DNA结合区内缺失，取代，插入或其它修饰，其足以降低或消除Brachyury蛋白的天然DNA结合活性)而减少或消除。本发明进一步包括这些改进的酵母-Brachyury免疫治疗组合物治疗或预防癌症的用途，以及生产这些改进的酵母-Brachyury免疫治疗组合物的方法。发明人在本文中描述了这些新的酵母-Brachyury免疫治疗产品的构建和产生，其设计为扩增来自正常个体和来自癌症患者的Brachyury特异性T细胞，包括CD4+T细胞和CD8+CTL。使用本发明的新的组合物的酵母-Brachyury免疫疗法对于引发Brachyury特异性细胞免疫应答(CD4+和CD8+)和施用至具有表达Brachyury的肿瘤的患者是有用的，提供了预防和/或治疗表达Brachyury的癌症的新的疗法，所述表达Brachyury的癌症包括但不限于脊索瘤，转移性癌症，和相关状况。
因为Brachyury在大多数正常(非肿瘤)组织中不表达，而通常在肿瘤细胞中过表达，不需要担心与正常组织有关的任何“脱靶”效应，且在截至本发明时尚未观察到，其中保留了其DNA结合序列的Brachyury抗原已经用于体内。然而，本发明的改进的酵母-Brachyury免疫治疗组合物含有修饰，其消除天然Brachyury的DNA结合功能，从而消除Brachyury抗原作为转录因子起作用的能力和因此此类活性的任意下游效应。在本发明中，Brachyury仅需要作为免疫原作用，因此其在mRNA转录中的天然作用的失活没有问题。
发明人已经做出了预料不到且无法预期的发现，即当在酵母中表达消除了DNA结合活性的Brachyury时，该酵母与表达没有该修饰的Brachyury的酵母相比具有不同的结构特征。更具体地说，没有本发明所述的修饰的酵母-Brachyury组合物在制造过程中显示出稳健的“絮凝”表型，意味着随着酵母细胞生长并表达Brachyury抗原，细胞聚集成大的多细胞结构，其比生长培养基或PBS中的非聚集细胞更密集(下文更具体地描述)。相反，表达本发明的经修饰的Brachyury抗原的酵母不表现出絮凝表型，或表现出显著降低的絮凝表型。因此，消除Brachyury的DNA结合功能不仅提供了在维持该抗原的免疫原性的情况下缺乏天然Brachyury生物学活性的基于酵母的免疫治疗产品，而且新抗原的令人惊讶和出乎意料的性质是在表达经修饰的抗原的酵母中丧失了絮凝表型。絮凝表型的丧失使得能够在制造过程中减少步骤的数量和/或修饰步骤，所述步骤用于调适酵母-Brachyury中该特征。
另外，与除新的修饰外序列相同的Brachyury抗原的表达水平相比，含有本发明的修饰的示例性Brachyury抗原(参见实施例)在酵母中以显著较高的水平表达。该结果表明根据本发明的对Brachyury抗原的修饰还能够提高酵母中的Brachyury抗原表达。稳健的抗原表达是酵母-Brachyury免疫治疗组合物的高度积极的特征。
可用于本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物在肿瘤细胞开始获得活动性和侵袭其它组织之前或者过程中有效地靶向肿瘤细胞，从而防止、抑制、遏制、逆转或延迟转移性癌症的发病和/或癌症(特别是转移性癌症)的进展。另外，本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物可以用于在患有早期癌症的个体，或者患有癌前(precancerous)或恶性前(premalignant)病变或肿瘤的个体，有高风险形成癌症(特别是具有高转移率的癌症)的个体，甚至是在正常个体中作为预防性药剂用于癌症预防，以预防或延迟转移性癌症或癌症的进展，其可以与其它的预防性癌症免疫疗法(例如本文中所述)结合使用。
本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物还为正在进行其它癌症疗法(包括化疗和放射疗法)的个体提供好处。已知在一些病例中转移性癌症比原发性癌症对化疗和/或放射疗法更具抗性。因此，本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物可以用于消除在转移性癌症中可以发生的化疗抗性或放射抗性，其通过抑制癌症中的表达Brachyury的肿瘤(并从而抑制抗增殖效应)进行，且本发明的组合物可以提高个体中化疗或放射疗法的表现。
近年来，Brachyury已成为称为脊索瘤的罕见骨癌的区别性生物标志物。当与细胞角蛋白染色结合时，使用Brachyury检测脊索瘤的灵敏度和特异性分别为98％和100％(Oakley et al.(2008),Mod Path 21,1461–1469)。因此，本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物可用于脊索瘤的预防和/或治疗。
本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物还可以用于治疗与Brachyury表达相关的状况或疾病，这些状况或疾病本身可以是非肿瘤性的，或者可以在恶性转化之前发生。例如，在感染了传染原(例如病毒，例如埃巴病毒(EBV))的细胞中Brachyury可以上调。因此，本发明的酵母-Brachyury免疫疗法可以用于治疗或预防与Brachyury表达相关的任何疾病或状况，包括但不限于感染性疾病，例如病毒感染，包括但不限于EBV相关的状况(例如，单核细胞增多)。
本文所述的酵母-Brachyury组合物诱导针对靶抗原(Brachyury)的先天免疫应答，以及适应性免疫应答，包括CD4依赖性TH17和TH1T细胞应答和抗原特异性CD8+T细胞应答，其包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，其都不需要使用其中许多会带来毒性问题的外源佐剂、细胞因子或其它免疫刺激分子。另外，酵母-Brachyury免疫治疗组合物抑制调节性T细胞(Treg)的数量和/或功能，从而例如增强正常情况下会被肿瘤的存在所抑制的效应性T细胞应答。此外，与通过生成抗体应答来免疫的免疫治疗组合物相比，认为酵母-Brachyury免疫疗法所引发的抗原特异性、广泛的强力细胞免疫应答在靶向肿瘤细胞方面特别有效。的确，大量研究显示当经由CD8+CTLs(在I型MHC分子的情况下识别肿瘤肽)靶向肿瘤细胞时，免疫治疗方法增强。
酵母-Brachyury免疫疗法在活化抗原呈递细胞方面是高度有效，且具有独特的交叉引发免疫应答的能力，生成通常可以有效针对肿瘤的CD8+CTL应答，即使在面临其它情况下可以是抑制性的环境时。因为此类免疫疗法利用了抗原呈递细胞的天然能力来呈递相关免疫原，不需要知道Brachyury的CTL表位或者MHC II型表位的确切身份来产生根据本发明的有效的免疫治疗剂。事实上，单个酵母-Brachyury免疫治疗组合物中可以靶向多种CD4+和CD8+T细胞表位，且因此本发明的酵母-Brachyury免疫治疗剂不限于使用短肽，事实上，在这些组合物中使用较长的多肽和融合蛋白是有效的。因此，通过使用酵母-Brachyury免疫疗法，可以取消使用算法和复杂的公式来鉴定推断的T细胞表位。
可以在免疫方案(预防性或治疗性)中有效利用酵母-Brachyury，而不使用外源佐剂、免疫刺激剂或分子、共刺激分子或者细胞因子的，尽管如果需要可以包含这些试剂。此外，酵母-Brachyury免疫疗法可以反复施用而不失去效力，而这对其它类型的免疫疗法可以是有问题的。
本发明的组合物
本发明的一个实施方案涉及基于酵母的免疫治疗组合物，所述组合物可以用于预防和/或治疗以Brachyury表达或过表达为特征的癌症或其它疾病(包括下述癌症，其开始可以不含有表达可检测Brachyury的细胞，但在癌症发展后期可以或者将含有表达Brachyury的细胞)。所述组合物是酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其包含:(a)酵母媒介物；和(b)癌症抗原，其包含一种或多种Brachyury抗原，其中所述Brachyury抗原是经修饰的Brachyury抗原(例如相比于野生型Brachyury蛋白)。特别地，所述经修饰的Brachyury抗原最低限度包含修饰，其中通过突变(例如通过Brachyury DNA结合区的缺失、取代、插入或其它修饰，其足以降低或消除Brachyury蛋白的天然DNA结合活性)降低或消除Brachyury蛋白的DNA结合活性。在一方面，所述经修饰Brachyury抗原最低限度包含修饰，其导致表达经修饰的Brachyury抗原的酵母相比于表达野生型Brachyury蛋白的酵母具有降低的絮凝表型(酵母表现出减少的聚集为大的多细胞结构)。经修饰的Brachyury抗原可以包括另外的修饰(例如与野生型Brachyury蛋白的差异)，例如蛋白中的一个或多个氨基酸残基的取代，以在Brachyury抗原中产生一个或多个激动性表位(如下文更详细地讨论)。最后，经修饰的Brachyury抗原尽管被修饰，保留了引发针对天然Brachyury蛋白例如由肿瘤细胞表达的Brachyury蛋白的免疫应答且优选细胞介导的免疫应答(T细胞应答)的能力。经修饰的Brachyury抗原最典型地作为重组蛋白由酵母媒介物表达(例如由完全(完整)酵母或酵母原生质球表达，其可以任选地进一步处理成酵母细胞质、酵母空胞，或酵母膜提取物或其级分)，尽管如本文所述一种或多种，经修饰的Brachyury抗原可以装载到酵母媒介物中或以其它方式与酵母媒介物复合、附着于酵母媒介物，或与酵母媒介物混合以形成本发明的组合物也是本发明的实施方案。
根据本发明，“酵母-Brachyury免疫治疗组合物”是含有酵母媒介物和至少一种Brachyury抗原或其免疫原性结构域，且在本发明中，含有至少一种如上文或本文其它地方所述的经修饰的Brachyury抗原的特定类型的“基于酵母的免疫治疗组合物。“免疫治疗组合物”是能够在受试者中引发足以实现至少一种治疗益处的免疫应答的组合物。如本文所用，基于酵母的免疫治疗组合物是指包含酵母媒介物组分并且在受试者中引发足以实现至少一种治疗益处的免疫应答的组合物。更具体地说，基于酵母的免疫治疗组合物是以下组合物，所述组合物包含酵母媒介物组分，且通常还有抗原组分，并可以引发或诱发免疫应答，例如细胞免疫应答，包括但不限于T细胞介导的细胞免疫应答。在一方面，可以用于发明的基于酵母的免疫治疗组合物能够诱导CD8+和/或CD4+T细胞介导的免疫应答，并且在一方面，特别是针对目标抗原(例如癌症抗原)的CD8+和CD4+T细胞介导的免疫应答。CD4+免疫应答可以包括TH1免疫应答、TH2免疫应答、TH17免疫应答或者以上的任意组合。基于酵母的免疫治疗剂尤其能够生成TH1和TH17应答。CD8+免疫应答可以包括细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答，而基于酵母的免疫治疗剂能够生成此类应答。在一方面，基于酵母的免疫治疗组合物调节受试者中调节性T细胞(Tregs)的数量和/或功能。还可以通过例如添加细胞因子、抗体和/或调节酵母的制造过程来修饰基于酵母的免疫疗法，从而促进一类应答超过另一类。任选地，基于酵母的免疫治疗组合物能够引发体液免疫应答。
本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物可以是“预防性的”或者“治疗性的”。当预防性提供时，本发明的组合物是在表达Brachyury的癌症形成或者检测到形成之前提供的，目的是防止、抑制或延迟表达Brachyury的肿瘤的形成；和/或防止、抑制或延迟肿瘤迁移和/或肿瘤侵袭其它组织(转移)和/或整体防止或抑制个体中的癌症进展。正如文中讨论的，Brachyury在几种癌症中表达，包括晚期癌症，并且已被证实参与EMT过程，其是与例如转移癌中肿瘤的侵袭和迁移有关的过程。因此，可以将预防性组合物施用于似乎未患癌症的个体(健康或正常的个体)、癌前(pre-cancerous)(恶性前病变)的个体，以及患有癌症但还没有检测到Brachyury(即在癌症中的肿瘤细胞表达Brachyury之前)的个体。可以用本发明的组合物预防性治疗有高风险形成癌症，尤其是通常与Brachyury表达和/或转移关联的癌症的个体。当治疗性提供时，将免疫治疗组合物提供给患有表达Brachyury的癌症的个体，目的是通过例如减少个体中的肿瘤负荷缓解癌症；抑制个体中的肿瘤生长；提高个体的存活率；防止、抑制、逆转或延迟肿瘤迁移和/或肿瘤侵袭其它组织(转移性癌症)和/或防止、抑制、逆转或延迟个体中的癌症的进展。在一方面，酵母-Brachyury免疫疗法用于治疗性用途，通过抑制癌症中的Brachyury表达从而抑制、减少或消除转移性癌症中可以发生的化疗抗性或放射疗法抗性，且本发明的组合物可以提高化疗或放射疗法在个体中的表现。
典型地，酵母-Brachyury免疫治疗组合物包含酵母媒介物和包含本发明的经修饰的Brachyury抗原的至少一种癌症抗原，其中癌症抗原由酵母媒介物表达、附着在酵母媒介物上或者与酵母媒介物混合。在一些实施方案中，癌症抗原作为融合蛋白提供。以下描述了适合在本发明的组合物和方法中使用的几种经修饰的Brachyury蛋白和融合蛋白。在一些实施方案中，癌症抗原和经修饰的Brachyury抗原是相同的组成成分。在一些实施方案中，除Brachyury抗原外，癌症抗原还包含其它抗原，包括其它癌抗原。在本发明的一方面，作为癌症抗原使用的融合蛋白可以包含两种或更多种抗原，例如经修饰的Brachyury抗原和非Brachyury抗原的另一种癌症抗原，或者两种不同的Brachyury抗原(例如具有不同激动性表位的两种经修饰的Brachyury抗原)。在一方面，融合蛋白可以包括一个或多个抗原的两个或更多个免疫原性结构域，例如经修饰的Brachyury抗原的两个或更多个免疫原性结构域(其中所述免疫原性结构域包含本发明的修饰)。
根据本发明，本文中术语“抗原”的一般使用是指蛋白的任何部分(例如，肽、部分蛋白、全长蛋白)，其中所述蛋白对于细胞组成(完整细胞、细胞裂解物或破碎的细胞)、生物体(完整生物体、裂解物或破碎的细胞)、或者碳水化合物或者其它分子或者它们的部分来说是天然存在的或者合成来源或设计的。抗原可以引发针对与免疫系统的元件(例如，T细胞、抗体)遇到的相同或相似的抗原的抗原特异性免疫应答(例如，体液和/或细胞介导的免疫应答)。抗原可以小到单个表位、单个免疫原性结构域或者更大，并可以包括多个表位或免疫原性结构域。因此抗原的大小可以小到约8-11个氨基酸(即，肽)，也可以大到全长蛋白、多聚体、融合蛋白、嵌合蛋白、完整细胞、完整微生物或其任何部分(例如，完整细胞的蛋白片段(多肽)裂解物或者微生物的提取物)。另外，抗原可以包括碳水化合物，其可以装载到酵母媒介物或本发明的组合物中。
可以用于本发明的酵母-Brachyury免疫治疗剂的抗原是多肽、全长蛋白、多聚体、融合蛋白和嵌合蛋白，其中在任何这些方面，抗原包括如本文所述的至少一种经修饰的Brachyury抗原。对于在酵母中表达，抗原是蛋白，例如经修饰的Brachyury抗原，其处于能在酵母中重组表达的最小大小，且通常是至少或大于25个氨基酸长、或至少或大于26、至少或大于27、至少或大于28、至少或大于29、至少或大于30、至少或大于31、至少或大于32、至少或大于33、至少或大于34、至少或大于35、至少或大于36、至少或大于37、至少或大于38、至少或大于39、至少或大于40、至少或大于41、至少或大于42、至少或大于43、至少或大于44、至少或大于45、至少或大于46、至少或大于47、至少或大于48、至少或大于49或者至少或大于50个氨基酸长，或者至少或大于25-50个氨基酸长、至少或大于30-50个氨基酸长、或者至少或大于35-50个氨基酸长、或者至少或大于40-50个氨基酸长、或者至少或大于45-50个氨基酸长，虽然可以表达较小的蛋白，也可以表达相当大的蛋白(例如，长几百个氨基酸，或者甚至几千个氨基酸)。在一方面，可以表达全长蛋白或者N和/或C末端缺少1到20个氨基酸的蛋白。融合蛋白和嵌合蛋白也是本发明可以表达的抗原。“靶抗原”是被本发明的免疫治疗组合物特异性靶向的抗原(即，希望引起针对它的免疫应答的抗原，例如本发明中的Brachyury)。“癌症抗原”是包含至少一个与癌症相关的抗原的抗原，例如肿瘤细胞表达的抗原，使得靶向所述抗原也靶向癌症。癌症抗原可以包含来自一或多个蛋白(包括一或多个肿瘤相关蛋白)的一或多个抗原。“Brachyury抗原”是从Brachyury蛋白衍生、设计或生成的抗原。根据本发明，“经修饰的Brachyury抗原”是包含以下氨基酸序列的Brachyury抗原，所述氨基酸序列通过至少一个修饰(例如缺失、取代、插入或其它修饰)与相应野生型Brachyury氨基酸序列不同，相比于野生型Brachyury蛋白，所述修饰足以降低或消除Brachyury蛋白的DNA结合能力，和/或降低或消除表达经修饰的Brachyury抗原的酵母的絮凝表型(例如，相比于表达野生型蛋白的酵母，表达经修饰的抗原的酵母具有降低的聚集成大的多细胞结构的倾向)。经修饰的Brachyury抗原可以包含另外的修饰，例如一个或多个氨基酸取代，其形成激动性表位。
当提及免疫应答的刺激时，术语“免疫原”是术语“抗原”的子集，因此在一些情况中，可以与术语“抗原”互换使用。如本文使用的免疫原描述了引发体液和/或细胞介导的免疫应答的抗原(即是免疫原性的)，使得将免疫原施用于个体会发动抗原特异性免疫应答，其针对与个体免疫系统遭遇的相同或相似的抗原。在一个实施方案中，免疫原引发细胞介导的免疫应答，包括CD4+T细胞应答(例如，TH1,TH2和/或TH17)和/或CD8+T细胞应答(例如，CTL应答)。
给定抗原的“免疫原性结构域”可以是抗原的任何部分、片段或表位(例如肽片段或亚基或抗体表位或其它构象表位)，其含有当施用于动物时能够作为免疫原作用的至少一个表位。因此，免疫原性结构域大于单个氨基酸，且大小至少足以含有可以作为免疫原的至少一个表位。例如，单个蛋白可以含有多个不同的免疫原性结构域。免疫原性结构域不需要是蛋白内的线性序列，例如在体液免疫应答的情况中，其中考虑构象结构域。
表位在本文中定义为给定抗原中的单个免疫原性位点，其在合适的共刺激信号和/或免疫系统的活化细胞的情况下当提供给免疫系统时足以引发免疫应答。换句话说，表位是抗原中被免疫系统组分识别的部分，也可以称为抗原决定簇。本领域技术人员可以认识到T细胞表位与B细胞或者抗体表位的大小和组成不同，通过I型MHC途径呈递的表位与通过II型MHC途径呈递的表位在大小和结构特性上不同。例如，通过I型MHC分子呈递的T细胞表位通常长度在8-11个氨基酸，而通过II型MHC分子呈递的表位的长度没有太多限制，可以高达25个氨基酸或更长。此外，根据表位结合的特定MHC分子，T细胞表位具有预测的结构特点。表位可以是线性序列表位或者构象表位(保守结合区)。大多数抗体识别构象表位。
Brachyury(其也可以称为“T”)在多种不同动物物种之间高度保守，是含有“T-box”结构域或“T-结构域”的转录因子，所述“T-box”结构域或“T-结构域”是几种不同蛋白中共有的DNA结合结构域基序，统称为T-box蛋白家族。人Brachyury在1996年首次被克隆(Edwards et al.，同前)。编码人Brachyury的一个核苷酸序列在文中以SEQ ID NO:1表示，该序列是从Accession No.NM_003181(GI:19743811)获得的mRNA序列。SEQID NO:1编码435个氨基酸的人Brachyury蛋白,其氨基酸序列在此以SEQ ID NO:2表示(还可见于Accession No.NP_003172；GI:4507339)。在SEQ ID NO:2中，位置42-223指定为T-box区(T-box结构域)，且与DNA结合特异性相关的位置指定为SEQ ID NO:2的以下位置：63、65、66、67、68、69、70、72、101、162、196、197、198、204、208、211、212、213、214、215、216、217、218和219。
另一个示例性野生型人Brachyury蛋白是SEQ ID NO:2的人Brachyury蛋白的变体，且具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。同样是435个氨基酸的蛋白的SEQ ID NO:4由SEQ IDNO:3所表示的核苷酸序列编码。SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:2在蛋白全长上约99％相同。SEQID NO:4与SEQ ID NO:2在位置177(分别是Asp vs.Gly)、位置368(分别是Thr vs.Ser)和位置409(分别是Asn vs.Asp)不同。T-box区(T-box结构域)位于位置42-223，且与DNA结合特异性相关的位置指定为SEQ ID NO:4的以下位置：63、65、66、67、68、69、70、72、101、162、196、197、198、204、208、211、212、213、214、215、216、217、218和219。
T-box结构域(或T-box区)通常在所有“T-box蛋白”内定义为对于序列特异性DNA结合既是必需又足够的T-box蛋白内的最小区域。T-box家族成员(具有该结构域的蛋白质)与DNA共有序列TCACACCT结合(Wilson and Conlon,Genome Biology 2002,3(6):reviews3008)。在Brachyury(T-box家族的种子(seminal)成员)中，鼠蛋白的位置1-229(例如位置1-229)最初被描述为包含整个T-box DNA结合结构域(Kispert et al.,The EMBOJournal 1993,12(8)3211-3220；Kispert et al.,The EMBO Journal1996,14(19):4763-4772)，并且鼠蛋白的仅N末端17个氨基酸的缺失显著减弱蛋白的DNA结合能力(Kispert etal.,1993，同上)。基于不同T盒蛋白质之间残基的保守性，随后的出版物和公共数据库已经更具体地将DNA结合结构域描述为通常跨越约位置41或42位至约位置223(例如参见Accession No.NP_003172)，对应于大概180个氨基酸的结构域，尽管在科学文献中也可以找到具有位置1至229内的另外的或较少的氨基酸的结构域。已经通过晶体结构鉴定为直接参与DNA结合的Brachyury的氨基酸残基包括(参照SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4给出的位置)：Lys66，Arg69，Arg70，Arg101，Lys103，Lys147，Asn 150，Lys 151，Ser162，Thr 196，Ala 197，Tyr 198，Ile 208，Asn 211，Pro212，Phe213，Ala214，Lys215，Ala216和Phe217。已经通过晶体结构鉴定的直接参与Brachyury蛋白的二聚化(其是蛋白与DNA结合的形式，因此这些残基也可以影响DNA结合)的Brachyury的氨基酸残基包括(参照SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4给出的位置)：Met87，Pro127，Asp128，Ser129，Pro130，Asn131，Phe132和Val175(参见例如Müller and Herrmann,1997,Nature 389:884-888，图1)。
通过与这些序列比较，可以容易地从其它Brachyury序列(包括来自其它物种的Brachyury序列)鉴定T-box结构域和特定的DNA结合残基，蛋白质二聚化残基或对活性重要的其它残基。如本文所用，本文所述或本领域已知且用于本发明的任何Brachyury蛋白的“T-box结构域”或“DNA结合结构域”通常是指人Brachyury蛋白的至少位置41位至223(通过SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中的这些位置例示)，并且可以包括多达人Brachyury蛋白的位置1至229，或该结构域的N末端的Brachyury序列的另外1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39或40个连续氨基酸，或确定的T-box结构域的C末端的Brachyury序列的另外1,2,3,4,5或6个连续氨基酸(例如，在SEQ ID NO:2或4的位置41-223的任一侧)。参考人Brachyury序列(由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4例示)，与DNA结合特别相关的残基包括：位置66,69,70,101,103,147,150,151,162,196,197,198,208,211,212,213,214,215,216和217。与蛋白二聚化特别相关并且可以影响Brachyury的DNA结合活性的残基包括参照人Brachyury序列(由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4例示)：位置87,127,128,129,130,131,132,和175。
根据本发明，具有“降低的或破坏的DNA结合活性”的经修饰的Brachyury抗原通常是指经修饰的Brachyury蛋白质，与野生型(天然存在的，未修饰的)Brachyury蛋白相比，经修饰的Brachyury蛋白质在标准实验室或生理条件下具有可观察或可检测的(通过任何合适的检测手段)并且优选显著且更优选统计学显著的降低的与DNA或与已知与BrachyuryT-box区域结合的序列的结合能力。在一方面，经修饰的Brachyury抗原不具有可检测的结合其天然DNA靶标的能力。DNA结合活性可通过本领域已知的多种测定来检测，包括通过体外或离体使经修饰的Brachyury蛋白与DNA接触或通过检测由DNA结合产生的转录因子活性。例如，经修饰的Brachyury可以在合适的条件下与天然Brachyury结合的寡核苷酸孵育，并且可以免疫沉淀和评估结合的复合物。作为另一个例子，可以用编码经修饰的Brachyury的核苷酸构建体和报告质粒共转染细胞，并且可以测量报告子活性(例如酶活性)作为Brachyury结合DNA或充当转录因子的能力(其需要Brachyury与DNA结合的能力)的读数。关于这些类型的测定的例子，参见例如Kispert et al.,1993，同上或Kispert et al.,1996，同上。测量蛋白-DNA结合的其它测定法是本领域已知的。
根据本发明，与“降低的酵母絮凝表型”相关的经修饰的Brachyury抗原是指具有修饰的Brachyury蛋白，所述修饰导致表达经修饰的Brachyury抗原的酵母具有降低的絮凝表型，即表达抗原的酵母具有降低的聚集成大的多细胞结构或聚集在一起的倾向。如上所述，表达野生型(未修饰的)Brachyury抗原的酵母在培养期间具有稳健的絮凝表型。本领域已经描述了酵母“絮凝”，并且通常将其定义为酵母细胞的非有性聚集，其允许酵母细胞从培养酵母的培养基中分离。在含有它们的生长培养基或缓冲液中，具有絮凝表型的酵母比没有这种表型的酵母更稠密，并且可能不容易保持悬浮。关于负责絮凝作用的生物学机制有几种理论，其在例如Domingues et al.,Biotechnol.Bioprocess Eng.2000,5:288-305中综述。无论发生酵母絮凝的机制如何，本发明通过描述可以对抗原进行修饰(其在酵母中产生该性质)，从而降低表达Brachyury抗原的酵母的絮凝表型。酵母中的絮凝表型可使用任何合适的检测方法测量，包括但不限于粘结强度测量，絮状物尺寸测量，酵母沉降速率的测定，沉淀测试，原子力显微镜(AFM)，Helm's测定和改进的Helm's测定(参见例如vanHamersveld et al.,J.Inst.Brew.1996,102:333-342；Soares et al.,J.Inst.Brew.,1997,103:93-98；D’Hautcourt and Smart,J Am Soc Brew Chem.,1999,57:123-128；Vidgren and Londesborough,J Inst Brew.2011,117:475–487)。
在本发明的一个实施方案中，经修饰的Brachyury抗原(即其中与野生型蛋白相比DNA结合活性已经降低或破坏的Brachyury抗原，和/或其中表达该抗原的酵母具有降低的絮凝表型的Brachyury抗原)具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列通过至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或更多个氨基酸修饰(即缺失、取代、插入或对氨基酸残基的其它修饰)与野生型Brachyury序列不同，所述修饰足以降低或破坏Brachyury的DNA结合活性和/或降低表达经修饰的Brachyury蛋白的酵母的絮凝表型。优选地，对Brachyury序列的修饰的数量最小化到实现降低或破坏的DNA结合和/或减少酵母的絮凝表型的目的，同时最大化T细胞表位在Brachyury抗原内的保留(即维持含有T细胞表位的Brachyury氨基酸序列是优选的)的数量。在本发明的一个方面，此类修饰在Brachury的位置1-229(位置对应于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中的位置)内进行。在本发明的一个方面，此类修饰在Brachury的18-229位(位置对应于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中的位置)内进行。在本发明的一个方面，此类修饰在Brachury的66-217位(位置对应于SEQID NO：2或SEQ ID NO：4中的位置)内进行。在本发明的一个方面，此类修饰在Brachury的198-222位(位置对应于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中的位置)内进行。在一方面，此类修饰导致选自以下的至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20个氨基酸的缺失或取代：Lys66,Arg69,Arg70,Arg101,Lys103,Lys147,Asn150,Lys151,Ser162,Thr196,Ala197,Tyr198,Ile208,Asn211,Pro212,Phe213,Ala214,Lys215,Ala216,Phe217(位置对应于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中的位置)。在一方面，此类修饰可选地或另外地导致选自以下的至少1,2,3,4,5,6,7,或8个氨基酸残基的缺失或取代：Met87,Pro127,Asp128,Ser129,Pro130,Asn131,Phe132,和/或Val175(位置对应于SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4中的位置)。在一方面，此类修饰是Brachyury的位置66和217之间，或者在一方面Brachyury的位置198和222(位置对应于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中的位置)之间的至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或更多个连续氨基酸的取代或缺失。在所有情况下，该修饰实现降低或破坏DNA结合和/或降低表达该抗原的酵母的絮凝表型的目的。
如上文所讨论的，可用于本发明的Brachyury抗原除上述修饰外可以包括一个或多个进一步的修饰，其导致所述抗原内的激动性表位的形成。如本文一般性使用的，“激动剂”是包含但不限于小分子、蛋白、肽、抗体、核酸结合剂等的任何化合物或试剂，它们能够结合受体或配体并产生或引发反应，其可以包括模拟或增强那些与受体或配体结合的天然物质的作用的试剂。用于本发明的Brachyury抗原的语境时，“激动性/激动剂”抗原或蛋白是指包含至少一个T细胞激动性表位的抗原或蛋白，又可以称为“模拟表位(mimotope)”。模拟表位肽是模拟野生型表位的结构的肽，并且作为激动剂，模拟表位模拟或增强天然表位的作用(生物学功能)。
例如，SEQ ID NO:5的氨基酸序列(WLLPGTSTL)是野生型Brachyury蛋白的T细胞表位。SEQ ID NO:5位于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO:4的位置246-254处。SEQ ID NO:6的氨基酸序列(WLLPGTSTV)是SEQ ID NO:5的T细胞表位的模拟表位或激动剂。因此，在本发明的一个方面，经修饰的Brachyury抗原包含WLLPGTSTV的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。在一个方面，SEQ ID NO:6的位置4处的氨基酸(脯氨酸或P)被丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)取代。
在一方面，经修饰的Brachyury抗原包含SQYPSLWSV的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。在一方面，SEQ ID NO:7的位置2处的氨基酸(该序列中的谷氨酰胺或Q)被亮氨酸(L)取代。在一方面，SEQ ID NO:7的位置4处氨基酸(该序列中的脯氨酸或P)被丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，亮氨酸(L)或缬氨酸(V)取代。在一方面，SEQ ID NO:7的位置7处的氨基酸(该序列中的色氨酸或W)被缬氨酸(V)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，丝氨酸(S)或苏氨酸(T)取代。在一方面，SEQ ID NO:7的位置9处的氨基酸(该序列中的缬氨酸或V)被亮氨酸(L)取代。本发明涵盖包含具有SEQ ID NO:7中的这些取代中的一个或多个的任何组合的序列的抗原。
在一方面，经修饰的Brachyury抗原包含RLIASWTPV的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。在一方面，SEQ ID NO:8的位置1处的氨基酸(该序列中的精氨酸或R)被酪氨酸(Y)或色氨酸(W)取代。在一方面，SEQ ID NO:8的位置6处的氨基酸(该序列中的色氨酸或W)被缬氨酸(V)，赖氨酸(L)，异亮氨酸(I)，丝氨酸(S)或苏氨酸(T)取代。本发明涵盖包含具有SEQ IDNO:8中的这些取代中的一个或两个的任何组合的序列的抗原。
一方面，经修饰的Brachyury抗原包含AMYSFLLDFV的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。在一方面，SEQ ID NO:9的位置2处的氨基酸(该序列中的甲硫氨酸或M)被亮氨酸(L)取代。
在本发明的一个实施方案中，经修饰的Brachyury抗原是包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成的蛋白质。SEQ ID NO:10的蛋白是根据本发明的经修饰的Brachyury抗原的一个实例，其中氨基酸序列通过位置198-222的缺失与SEQ ID NO:4所示的人Brachyury蛋白质的氨基酸序列不同(即，SEQ ID NO:4的198-222位不存在于SEQID NO:10中)。换言之，SEQ ID NO:10是由SEQ ID NO:4的位置1-197与位置223-435直接融合组成的单一多肽。与SEQ ID NO:4的Brachyury蛋白相比，该经修饰的Brachyury抗原已经破坏了DNA结合能力，并且表达该抗原的酵母具有降低的絮凝表型。SEQ ID NO:12是包含SEQ ID NO:10的经修饰的Brachyury蛋白的融合蛋白(实际上是SEQ ID NO:10的位置2-410，因为去除了SEQ ID NO:10的N末端甲硫氨酸以适于添加下述N末端肽)。SEQ ID NO:12是单个多肽，其从N到C末端具有符合读框地融合的以下序列元件：(1)N末端肽，其赋予蛋白酶体降解抗性并稳定酵母中的表达(SEQ ID NO:12的位置1-6，具有Met-Ala-Asp-Glu-Ala-Pro的氨基酸序列，其在本文中也由SEQ ID NO:16表示)；(2)由SEQ ID NO:4的位置2-197和223-435组成的人Brachyury抗原，其也可以描述为SEQ ID NO:10的位置2-410(SEQ ID NO:12的位置7-415)；和(3)六聚组氨酸标签(SEQ ID NO:12的位置416-421)。SEQ ID NO:12的氨基酸序列和SEQ ID NO:10的位置2-410的氨基酸序列由SEQ ID NO:11的多核苷酸序列编码。
在本发明的另一个实施方案中，经修饰的Brachyury抗原是包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成的蛋白。SEQ ID NO:13的蛋白是根据本发明的经修饰的Brachyury抗原的另一个实例，其中氨基酸序列通过以下与SEQ ID NO:4表示的人Brachyury蛋白的氨基酸序列不同：(1)198-222位的缺失(即SEQ ID NO:4的198-222位不存在于SEQ ID NO：13中)；和(2)用缬氨酸取代SEQ ID NO：4的位置254(且位于SEQ ID NO：13的229位)的氨基酸(亮氨酸)。换言之，SEQ ID NO:13是单个多肽，其由SEQ ID NO:4的位置1-197与位置223-435直接融合组成，并包括导致向SEQ ID NO:13引入激动性表位的氨基酸修饰。在位置254(相对于SEQ ID NO:4)的亮氨酸取代为缬氨酸在SEQ ID NO:13中产生T细胞激动性表位，其位于SEQ ID NO:13的位置221-229，其不受理论的束缚，认为与野生型表位(SEQ ID NO:4的位置246至254)相比诱导增强的针对Brachyury的T细胞应答。该激动性表位在本文中也由SEQ ID NO：6表示。与SEQ ID NO:4的Brachyury蛋白相比，由SEQ ID NO:13表示的该经修饰的Brachyury抗原具有破坏的DNA结合能力，并且表达该抗原的酵母具有降低的絮凝表型，并且另外含有激动性表位以当该构建体在酵母-Brachyury免疫治疗剂中施用于受试者时，增强针对天然Brachyury的T细胞应答。SEQ ID NO:15是包含SEQ ID NO:13的经修饰的Brachyury蛋白(实际上为SEQ ID NO:13的位置2-410，因为去除了SEQ IDNO:13的N末端甲硫氨酸以适于添加下述N末端肽)。SEQ ID NO:15是单个多肽，其从N末端到C末端具有符合读框地融合的以下序列元件：(1)N末端末肽，其赋予对蛋白酶体降解的抗性和稳定酵母中的表达(SEQ ID NO:15的位置1-6，其氨基酸序列在本文中也由SEQ ID NO:16表示)；(2)由SEQ ID NO:4的位置2-197和223-435组成的人Brachyury抗原，并且在SEQ IDNO:4的位置254处还包含缬氨酸取代亮氨酸的取代，其也可以描述为SEQ ID NO:13的位置2-410(SEQ ID NO:15的位置7-415)；和(3)六聚组氨酸标签(SEQ ID NO:15的位置416-421)。SEQ ID NO:15的氨基酸序列和SEQ ID NO:13的位置2-410的氨基酸序列由SEQ IDNO:14的多核苷酸序列编码。表达该融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在本文中也称为GI-6306。
在本发明的另一个实施方案中，经修饰的Brachyury抗原是包含以下氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成的蛋白，所述氨基酸序列通过至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，至少十个，至少十一个，至少十二个，至少十三个，至少十四个，至少十五个，至少十六个，至少十七个，至少十八个，至少十九个，至少至少二十个，至少二十一个，至少二十二个，至少二十三个或至少二十四个氨基酸的缺失与野生型Brachyury蛋白质的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4或不同的人Brachyury蛋白的相应序列)不同，其中可以缺失的氨基酸残基选自：(1)选自(位置相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4给出)：Lys66,Arg69,Arg70,Arg101,Lys103,Lys147,Asn150,Lys151,Ser162,Thr196,Ala197,Tyr198,Ile208,Asn211,Pro212,Phe213,Ala214,Lys215,Ala216,Phe217,Met87,Pro127,Asp128,Ser129,Pro130,Asn131,Phe132,和/或Val175的一个或多个氨基酸，其中更优选位置Lys66,Arg69,Arg70,Arg101,Lys103,Lys147,Asn150,Lys151,Ser162,Thr196,Ala197,Tyr198,Ile208,Asn211,Pro212,Phe213,Ala214,Lys215,Ala216,Phe217的一个或多个的缺失(位置相对于SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4给出)；(2)野生型Brachyury蛋白的位置1-229位的一个或多个氨基酸(位置对应于SEQID NO:2或SEQ ID NO:4中的位置)；(3)野生型Brachyury蛋白的位置66-217中的一个或多个氨基酸(位置对应于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中的位置)；或(4)野生型Brachyury蛋白的位置198-222内的一个或多个氨基酸(位置对应于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中的位置)。在所有情况下，经修饰的Brachyury抗原具有降低的或破坏的DNA结合活性和/或表达该抗原的酵母具有降低的絮凝表型。在一方面，经修饰的Brachyury抗原可以是如下文定义的“近全长”Brachyury蛋白，这意味着该蛋白相比于野生型序列在N末端和/或C末端可以缺乏1-10个氨基酸。
在一方面，经修饰的Brachyury抗原进一步包含至少一个激动性表位(例如SEQ IDNO:6或任何其它激动性表位，例如SEQ ID NO:5、7、8或9的序列的激动剂，如上文所述)。
在一方面，经修饰的Brachyury抗原是融合蛋白的一部分，其除了上述经修饰的Brachyury抗原之外，还可以任选地包括：(1)由SEQ ID NO:16表示的N末端肽，其是合成的N末端肽，设计为赋予对蛋白酶体降解的抗性并稳定表达，其可以被N末端肽如酵母α因子序列或适合用于本文所述的基于酵母的免疫治疗剂的另一N末端肽替换；(2)可用于分离或鉴定融合蛋白的C末端肽，如六聚组氨酸标签；(3)用于连接融合蛋白内的片段的一个，两个，三个或更多个氨基酸的接头肽；和/或(4)另一抗原，其可以是另一Brachyury抗原或不同的(非Brachyury)抗原，并且优选是癌症抗原。
在本发明的另一个实施方案中，经修饰的Brachyury抗原是包含以下氨基酸序列，基本上由其组成或由其组成的蛋白，所述氨基酸序列通过至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，至少十个，至少十一个，至少十二个，至少十三个，至少十四个，至少十五个，至少十六个，至少十七个，至少十八个，至少十九个，至少至少二十个，至少二十一个，至少二十二个，至少二十三个或至少二十四个氨基酸的取代与野生型Brachyury蛋白质的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4或不同的人Brachyury蛋白的相应序列)不同，所述取代为使用不同于该位置处的天然发生的氨基酸残基的氨基酸残基取代。可以取代的氨基酸残基选自：(1)选自Lys66,Arg69,Arg70,Arg101,Lys103,Lys147,Asn150,Lys151,Ser162,Thr196,Ala197,Tyr198,Ile208,Asn211,Pro212,Phe213,Ala214,Lys215,Ala216,Phe217,Met87,Pro127,Asp128,Ser129,Pro130,Asn131,Phe132,和/或Val175的一个或多个氨基酸(位置相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4给出)，其中更优选位置Lys66,Arg69,Arg70,Arg101,Lys103,Lys147,Asn150,Lys151,Ser162,Thr196,Ala197,Tyr198,Ile208,Asn211,Pro212,Phe213,Ala214,Lys215,Ala216,Phe217的一个或多个处的取代(位置相对于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4给出)；(2)野生型Brachyury蛋白的位置1-229位的一个或多个氨基酸(位置对应于SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4中的位置)；(3)野生型Brachyury蛋白的位置66-217中的一个或多个氨基酸(位置对应于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中的位置)；或(4)野生型Brachyury蛋白的位置198-222内的一个或多个氨基酸(位置对应于SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中的位置)。在所有情况下，取代导致经修饰的Brachyury抗原具有降低的或破坏的DNA结合活性和/或表达该抗原的酵母具有降低的絮凝表型。在一方面，经修饰的Brachyury抗原可以是如下文定义的“近全长”Brachyury蛋白，这意味着该蛋白相比于野生型序列在N末端和/或C末端可以缺乏1-10个氨基酸。在一方面，经修饰的Brachyury抗原进一步包含至少一个激动性表位(例如SEQ IDNO:6或任何其它激动性表位，例如SEQ ID NO:5、7、8或9的序列的激动剂，如上文所述)。在一方面，经修饰的Brachyury抗原是融合蛋白的一部分，其除了上述经修饰的Brachyury抗原之外，还可以任选地包括：(1)由SEQ ID NO:16表示的N末端肽，其是合成的N末端肽，设计为赋予对蛋白酶体降解的抗性并稳定表达，其可以被N末端肽如酵母α因子序列或适合用于本文所述的基于酵母的免疫治疗剂的另一N末端肽替换；(2)可用于分离或鉴定融合蛋白的C末端肽，如六聚组氨酸标签；(3)用于连接融合蛋白内的片段的一个，两个，三个或更多个氨基酸的接头肽；和/或(4)另一抗原，其可以是另一Brachyury抗原或不同的(非Brachyury)抗原，并且优选是癌症抗原。
人Brachyury与来自其它动物物种的Brachyury有非常高的同源性，因此在制备本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物时可以使用来自其它生物的Brachyury的序列，或与本文中所述的示例性人序列不同的人Brachyury序列，特别是当这些序列是相同的、基本同源的并且能引发抗目标抗原(例如由肿瘤细胞表达的天然Brachyury)的有效免疫应答时。例如，首次由Hermann及其同事在1990年克隆的小鼠Brachyury(Hermann et al.,同前)与人Brachyury在核苷酸水平上大约85％相同，在氨基酸水平上大约91％相同。就来自其它动物的Brachyury来说，在氨基酸水平上，人Brachyury与来自黑猩猩(Pan troglodytes)的Brachyury 99.5％相同，与来自家犬(Canis lupus familiaris)的Brachyury 90.1％相同，与来自野牛(Bos Taurus)的Brachyury88.5％相同，与来自褐鼠(Rattus norvegicus)的Brachyury 92.2％相同，与来自原鸡(Gallus gallus)的Brachyury 80.9％相同。在Brachyury中含有T-box结构域的氨基酸1-223中，小鼠和人Brachyury只有两个氨基酸不同(位置26和96)。
根据本发明的任何实施方案，提及“全长”蛋白(或者全长功能结构域或全长免疫结构域)包括如本文描述的或者其它方式已知的或者在已公开序列中描述的所述蛋白或功能结构域或免疫结构域的全长氨基酸序列。“近全长的”的蛋白或结构域也是蛋白的同源物类型，与全长蛋白或结构域的不同在于在所述全长蛋白或全长结构域的N和/或C末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的缺失或省略。作为例子，文中描述的几种融合蛋白包含“近全长的”Brachyury抗原，因为抗原省略了位置1处的甲硫氨酸并取代了N末端肽。一般性提及蛋白或结构域或抗原可以包括全长和近全长的蛋白，以及它们的其它同源物。
在涉及Brachyury抗原或癌症抗原的任意实施方案的一个方面，该抗原以足以允许抗原被酵母表达的最小大小。对于在酵母中表达，蛋白通常为至少约25个氨基酸长，虽然更小的蛋白可以表达，大得多的蛋白也可以由酵母表达。例如，可用于本发明的癌症抗原是可以由酵母重组表达的癌症蛋白的片段，且其含有至少一个免疫原性结构域。在一个实施方案中，可用于本发明的癌症抗原为至少25个氨基酸长，或至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175,180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425或者430个氨基酸长。
可用于本发明的Brachyury抗原(包括经修饰的Brachyury抗原)还包括具有以下氨基酸序列的蛋白，所述氨基酸序列与文中描述的任何经修饰的Brachyury抗原的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15)在蛋白全长上至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，其中所述Brachyury抗原保留了本发明的经修饰的Brachyury抗原的特征(即降低或破坏的DNA结合活性和/或表达该抗原的酵母具有降低的絮凝表型)。
如上文简短讨论的，N末端表达序列和C末端标签，例如以上关于本文所述的融合蛋白描述的那些是任选的，但是可以从本文中其它地方描述的几个不同序列中选择从而改善或协助蛋白的表达、稳定性和/或允许蛋白的鉴定和/或纯化。另外，适合在酵母中使用的许多不同启动子是本领域已知的。此外，为了多种原因可以在包含Brachyury抗原的融合蛋白部分之间引入短的间隔连接序列(例如，1、2、3、4或5个氨基酸肽)，包括引入限制酶切位点以便有助于克隆、作为宿主吞噬体蛋白酶的切割位点、加快蛋白或抗原加工，以及将来对构建体的操作。
任选地，作为本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物的成分使用的蛋白(包括融合蛋白)是使用抗原构建体产生的，所述抗原构建体特别适用于改善或稳定酵母中的异源抗原的表达。在一个实施方案中，需要的抗原蛋白或肽在其N末端与下述融合:(a)特定的合成肽，其能够稳定融合蛋白在酵母媒介物中的表达或者防止所表达的融合蛋白的翻译后修饰(此类肽在例如2004年8月12日公开的美国专利公开2004-0156858A1中有详细描述，该文献通过引用全部并入本文)；(b)内源酵母蛋白的至少一部分，包括但不限于酵母α因子前导序列，其中融合配偶体中的任意一个提供蛋白在酵母中表达的改善的稳定性和/或防止酵母细胞对蛋白的翻译后修饰(此类蛋白在美国专利公开2004-0156858A1中也有详细描述，同前)；和/或(c)酵母蛋白的至少一部分，其导致融合蛋白在酵母表面表达(例如，本文中更详细描述的Aga蛋白)。提高酵母细胞中表达的抗原的稳定性和/或防止酵母细胞中的蛋白的翻译后修饰的示例性合成序列包括序列M-A-D-E-A-P(由SEQ ID NO:16表示)。此外，本发明任选包括使用与编码抗原的构建体的C末端融合的肽，特别是用于蛋白的选择和鉴定。此类肽包括但不限于任何合成的或天然的肽，例如肽标签(例如，6X His或六肽)或者任何其它短表位肽。附着于根据本发明的抗原的C末端的肽可以具有或者不具有以上讨论的N末端肽的添加，反之亦然。
根据本发明，用于酵母-Brachyury免疫治疗组合物的酵母媒介物是任何酵母细胞(例如整个或完整细胞)或其衍生物(见下文)，其在本发明的组合物(例如治疗性或预防性组合物)中可以与一或多个抗原、其免疫原性结构域或其表位联用。因此酵母媒介物可以包括，但不限于活的完整(整个)酵母微生物(即具有包括细胞壁在内的所有成分的酵母细胞)、被杀死(死的)或者灭活的完整酵母微生物，或者完整酵母的衍生物，包括:酵母原生质球(即缺少细胞壁的酵母细胞)、酵母胞质体(即缺少细胞壁和细胞核的酵母细胞)、酵母空胞(即缺少细胞壁、细胞核和细胞质的酵母细胞)、亚细胞酵母膜提取物或其组分(又被称为酵母膜颗粒，且以前被称为亚细胞酵母颗粒)、任何其它酵母颗粒或者酵母细胞壁制备物。
酵母原生质球通常是通过对酵母细胞壁进行酶解产生的。此类方法在例如Franzusoff et al.,1991,Meth.Enzymol.194,662-674中有描述，该文献通过引用全部并入本文。
酵母胞质体通常是通过酵母细胞去核仁产生的。此类方法在例如Coon,1978,Natl.Cancer Inst.Monogr.48,45-55中有描述，该文献通过引用全部并入本文。
酵母空胞通常是通过将发生通透化或者裂解的细胞重新密封产生的，可以但不必须含有该细胞的至少部分细胞器。此类方法在例如Franzusoff et al.,1983,J.Biol.Chem.258,3608-3614和Bussey et al.,1979,Biochim.Biophys.Acta 553,185-196中有描述，其各自通过引用全部并入本文。
酵母膜颗粒(亚细胞酵母膜提取物或其组分)是指缺少天然细胞核或细胞质的酵母膜。颗粒可以是任何大小，大小的范围包括从天然酵母膜到通过超声处理或其它本领域技术人员已知的膜破碎方法产生的微颗粒，然后重新密封。产生亚细胞酵母膜提取物的方法在例如Franzusoff et al.,1991,Meth.Enzymol.194,662-674中有描述。还可以使用酵母膜颗粒组分，其含有酵母膜部分和(当在制备酵母膜颗粒之前由酵母重组表达抗原或其它蛋白时)感兴趣的抗原或其它蛋白。抗原或其它感兴趣的蛋白可以被运送到膜内，在膜表面的任一表面，或者其组合(即，蛋白可以在膜内或者膜外，和/或跨酵母膜颗粒的膜)。在一个实施方案中，酵母膜颗粒是重组酵母膜颗粒，其可以是完整的、破碎的或者破碎并重新密封的酵母膜，所述酵母膜包括位于膜表面或者至少部分镶嵌在膜内的至少一种所需抗原或其它感兴趣的蛋白。
酵母细胞壁制备物的一个例子是在携带抗原的分离酵母细胞壁制备物，所述抗原在细胞壁表面或者至少部分嵌在细胞壁内，使得当将所述酵母细胞壁制备物施用于动物时刺激针对疾病靶标的所需免疫应答。
可以使用任何酵母株来产生本发明的酵母媒介物。酵母是单细胞微生物，属于以下三类之一：子囊菌纲(Ascomycetes)、担子菌纲(Basidiomycetes)或半知菌纲(FungiImperfecti)。选择用作免疫调节剂的酵母的类型时一个考虑是酵母的病原性。在一个实施方案中，酵母是诸如酿酒酵母的非致病菌株。选择非致病酵母菌株最小化了带给被施用酵母媒介物的个体的任何不良效应。但是，如果酵母的致病性可以通过本领域技术人员已知的任何手段(例如突变菌株)抵消，则可以使用致病酵母。根据本发明的一个方面，使用的是非致病性酵母株。
可以用于本发明的酵母菌株的属包括，但不限于酵母属、假丝酵母属(其可以是病原性的)、隐球菌属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、裂殖酵母属和耶氏酵母属(Yarrowia)。在一个方面，酵母的属选自酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属或裂殖酵母属；并且在一个方面，使用了酵母属。可以用于本发明的酵母株的种包括，但不限于酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、白色假丝酵母(Candida albicans)、克菲假丝酵母(Candida kefyr)、热带假丝酵母(Candidatropicali)、罗伦特隐球菌(Cryptococcus laurentii)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母乳酸变种(Kluyveromyces marxianusvar.lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、深红酵母(Rhodotorula rubra)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。应当理解，这些种中有许多包括多种亚种、型、亚型等，它们都是意图包括在以上提到的种中的。在一个方面中，用于发明的酵母种包括酿酒酵母、白色假丝酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母和粟酒裂殖酵母。酿酒酵母很有用因为它相对容易操作，并且对于作为食品添加剂被“通常认为是安全的”或"GRAS"(GRAS,FDA proposed Rule 62FR18938,April 17,1997)。本发明的一个实施方案是能够将质粒复制到特别高拷贝数的酵母株，例如酿酒酵母cir°株。该酿酒酵母株是这样的菌株，所述菌株能够支持高水平表达一或多个目标抗原和/或抗原融合蛋白和/或其它蛋白的表达载体。可以用于本发明的另一个酵母株是酿酒酵母W303α。此外，本发明中可以使用任何突变酵母株，包括那些表现出对所表达的目标抗原或其它蛋白的翻译后修饰减少的菌株，例如延伸N末端连接糖基化的酶中发生突变。
本发明考虑了产生酵母媒介物和表达、组合和/或联合酵母媒介物和抗原和/或其它蛋白和/或感兴趣的试剂以产生基于酵母的免疫治疗组合物的方法。
根据本发明，术语“酵母媒介物-抗原复合体”或“酵母-抗原复合体”用于一般性描述酵母媒介物与抗原的任何结合，并且当此类组合物用于如上所述引发免疫应答的情况下，可以与“基于酵母的免疫治疗组合物”互换使用。此类结合包括由酵母(重组酵母)表达抗原、将抗原引入酵母、抗原对酵母的物理附着，和酵母与抗原在例如缓冲液或其它溶液或制剂中的混合。以下详细描述了这些类型的复合体。
一般来说，酵母媒介物和抗原(和/或其它试剂)可以通过本文描述的任何技术彼此结合。在一个方面，用抗原和/或试剂胞内装载酵母媒介物。在另一个方面，抗原和/或试剂共价地或者非共价地附着酵母媒介物。在再一个方面，酵母媒介物和抗原和/或试剂通过混合来结合。另一个方面，其是优选的实施方案，抗原由酵母媒介物或酵母细胞或者衍生酵母媒介物的酵母原生质球重组表达。
在本发明的一个实施方案中，作为在酵母媒介物中重组表达抗原或其它蛋白的替代方法，将酵母媒介物胞内装载蛋白或肽，或者碳水化合物或其它分子，这些装载的分子可以作为根据本发明的抗原和/或用作免疫调节剂或生物反应调节剂。随后可以将现在胞内含有抗原和/或其它蛋白的酵母媒介物施用于个体或装载到载体例如树突细胞中。肽和蛋白可以通过本领域技术人员已知的技术直接插入到酵母媒介物中，例如通过扩散、主动运输、脂质体融合、电穿孔、胞吞、冻融循环和浴超声处理。可以直接装载肽、蛋白、碳水化合物或其它分子的酵母媒介物包括完整酵母，以及原生质球、空胞或胞质，它们可以在生产后装载抗原和其它试剂。替代地，可以给完整酵母装载抗原和/或试剂，然后从其制备原生质球、空胞、胞质或亚细胞颗粒。
在本发明的另一个实施方案中，抗原和/或其它试剂物理附着于酵母媒介物。抗原和/或其它试剂与酵母媒介物的物理附着可以通过本领域的任何合适方法来实现，包括共价和非共价结合方法，包括但不限于将抗原和/或其它试剂化学交联到酵母媒介物的外表面，或者例如通过利用抗体或其它结合配偶体，将抗原和/或其它试剂生物连接到酵母媒介物的外表面。化学交联的实现可以通过例如包括戊二醛连接、光亲和标记的方法、用二亚胺碳进行处理、用能够连接二硫键的化学物质进行处理，以及用其它本领域标准的交联化学剂进行处理。替代地，可以将化学剂与酵母媒介物接触，其改变酵母细胞膜脂双层的电荷或细胞壁的组分，从而使酵母外表面更可能与具有特定电荷特性的抗原和/或其它试剂发生融合或结合。还可以将诸如抗体、结合肽、可溶性受体和其它配体的靶向试剂并入抗原作为融合蛋白，或者以其它方式与抗原关联从而使抗原结合酵母媒介物。
当抗原或其它蛋白被表达或者物理附着在酵母表面上时，在一个方面中可以仔细挑选间隔臂来优化表面上抗原或其它蛋白的表达或者含量。间隔臂的大小可以影响抗原或其它蛋白有多少暴露，用于酵母表面上的结合。因此，根据所使用的抗原或其它蛋白，本领域技术人员可以挑选能够在酵母表面上的抗原或其它蛋白之间形成合适间隔的间隔臂。在一个实施方案中，间隔臂是至少有450个氨基酸的酵母蛋白。
在再一个实施方案中，酵母媒介物和抗原或其它蛋白通过更被动、非特异性的或者非共价的结合机制相互结合，例如通过将酵母媒介物与抗原或其它蛋白在缓冲液或其它合适的制剂(例如混合液)中轻轻混合。
在一个实施方案中，用于制备酵母媒介物的酵母细胞用编码蛋白(例如抗原)的异源核酸分子转染，使得由酵母细胞表达蛋白。此类酵母在本文又被称为重组酵母。然后可以将酵母细胞与药学可接受的赋形剂配制并直接施用于患者、储存用于以后施用，或者装载到树突细胞中作为完整细胞。还可以将酵母细胞杀死，或者通过形成酵母原生质球、胞质、空胞或亚细胞颗粒进行衍生化，随后将上述任意衍生物保存、施用或者装载到树突细胞中。为了产生能够表达抗原的重组原生质球，还可以直接用重组核酸分子直接转染酵母原生质球(例如，由整个酵母产生原生质球，然后转染)。重组表达抗原的酵母细胞或酵母原生质球可以用于产生包含酵母胞质、酵母空胞或酵母膜颗粒或酵母细胞壁颗粒或者它们的部分的酵母媒介物。
抗原或其它蛋白在本发明的酵母媒介物中的表达是利用本领域技术人员已知的技术实现的。简单来说，将编码至少一个所需抗原或其它蛋白的核酸分子插入表达载体，其方式使得核酸分子与转录调控序列可操纵地连接，从而在转化到宿主酵母细胞中时，能够实现核酸分子的组成性表达或调控表达。编码一或多个抗原和/或其它蛋白的核酸分子可以在一或多个表达载体上与一或多个表达调控序列可操纵地连接。特别重要的表达调控序列是那些控制转录起始的序列，例如启动子和上游活化序列。任何合适的酵母启动子都可以用于本发明，许多这样的启动子是本领域技术人员已知的。用于酿酒酵母表达的启动子包括，但不限于编码以下酵母蛋白的基因的启动子：乙醇脱氢酶I(ADH1)或II(ADH2)、CUP1、磷酸甘油酸激酶(PGK)、磷酸丙酮异构酶(TPI)、翻译延伸因子EF-1α(TEF2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH；又称为TDH3，对于磷酸丙酮脱氢酶)、半乳糖激酶(GAL1)、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GAL7),UDP-半乳糖表异构酶(GAL10)、细胞色素c1(CYC1)、Sec7蛋白(SEC7)和酸性磷酸酶(PHO5)，包括诸如ADH2/GAPDH和CYC1/GAL10启动子的杂合启动子，并包括细胞内的葡萄糖浓度低(例如，约百分之0.1到约百分之0.2)时被诱导的ADH2/GAPDH启动子，以及CUP1启动子和TEF2启动子。同样的，多个上游激活序列(UAS)，又被称为增强子是已知的。用于酿酒酵母表达的上游激活序列包括，但不限于编码以下蛋白的基因的UAS：PCK1、TPI、TDH3、CYC1、ADH1、ADH2、SUC2、GAL1、GAL7和GAL10，以及被GAL4基因产物活化的其它UAS，一个方面中使用的是ADH2UAS。因为ADH2UAS被ADR1基因产物所激活，当异源基因与ADH21UAS可操纵地连接时，优选用ADH2UAS来过表达ADR1基因。用于酿酒酵母表达的转录终止序列包括α因子、GAPDH或CYC1基因的终止序列。
用于在甲基营养型酵母中表达基因的转录调控序列包括编码乙醇氧化酶和甲酸脱氢酶的基因的转录调控区。
根据本发明，核酸分子转染到酵母细胞中可以通过任何核酸分子导入细胞的方法来实现，包括但不限于扩散、主动运输、浴超声处理、电穿孔、微量注射、脂质转染、吸附和原生质体融合。转染的核酸分子可以利用本领域技术人员已知的技术整合到酵母染色体中或者维持在染色体外的载体中。携带此类核酸分子的酵母媒介物的例子在本文中有详细公开。正如以上讨论的，还可以如下重组产生酵母胞质体、酵母空胞和酵母膜颗粒或者细胞壁制品，通过用所需核酸分子转染完整的酵母微生物或酵母原生质球，从而，在其中产生抗原，然后利用本领域技术人员已知的技术进一步操纵微生物或原生质球，以产生含有所需抗原或其它蛋白的胞质、空胞或亚细胞酵母膜提取物或其部分。
产生重组酵母媒介物并由酵母媒介物表达抗原和/或其它蛋白的有效条件包括可以培养酵母菌株的有效培养基。有效培养基通常是包含可同化的碳水化合物、氮和磷源，以及合适的盐、矿物质、金属和其它营养(例如维生素和生长因子)的水样培养基。培养基可以包含复杂营养或者是限定的基础培养基。本发明的酵母株可以培养在多种容器内，包括但不限于生物反应器、锥形瓶、试管、微量滴定板和培养皿。培养在适合酵母菌株的温度、pH和氧气含量下进行。这些培养条件是本领域技术人员的专业知识范围内的(参见例如，Guthrie et al.(eds.),1991,Methods in Enzymology,vol.194,Academic Press,SanDiego)。例如，在一个方案中，可以用从酵母-Brachyury免疫治疗组合物的起始培养板和/或起始培养物获得的培养物接种含有合适培养基的液体培养物，在30℃，250rpm搅拌培养约20小时。然后将原生培养物按照需要扩增到更大的培养物。蛋白从转化酵母的载体的表达(例如，Brachyury表达)可以是组成型的，如果使用的是组成型启动子；或者可以通过加入对启动子适合的诱导条件来诱导，如果所用启动子是诱导型启动子(例如，对CUP1启动子的情况，硫酸铜)。在诱导型启动子的情况中，蛋白表达的诱导可以在培养物生长到合适的细胞密度后开始，所述合适的细胞密度可以是大约0.2Y.U./ml或更高密度。
适合培养本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物的培养基的一个非限制性例子是U2培养基。U2培养基包含以下成分:20g/L葡萄糖、6.7g/L含有硫酸铵的酵母氮源，和各0.04mg/mL的组氨酸、亮氨酸、色氨酸和腺嘌呤。适合培养本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物的培养基的另一个非限制性例子是UL2培养基。UL2培养基包含以下成分:20g/L葡萄糖、6.7g/L含有硫酸铵的酵母氮源，和各0.04mg/mL的组氨酸、色氨酸和腺嘌呤。
当使用诱导型启动子(例如CUP1启动子)在根据发明的酵母媒介物中表达经修饰的Brachyury蛋白时，与对用该启动子的酵母表达的多数蛋白来说合适的细胞密度相比，蛋白表达的诱导在更高的细胞密度开始。在诱导酵母中的Brachyury抗原表达之前，CUP1启动子引导的最佳Brachyury抗原表达发生在表达Brachyury抗原的酵母生长到至少0.5Y.U/ml和约2.0Y.U./ml之间的细胞密度，在一个方面，生长到0.5Y.U./ml和约1.5Y.U./ml之间，在一个方面，生长到至少1.0Y.U./ml和约2.0Y.U./ml之间，在另一个方面，生长到至少约1.0Y.U./ml。在本发明的一个实施方案中，在诱导抗原表达之前，将具有处于诱导型启动子(例如CUP1启动子)控制的抗原表达的酵母-Brachyury免疫治疗组合物生长到对数生长中期。在一个方面中，在诱导抗原表达之前，细胞生长到约1至2Y.U./ml。在一个方面中，抗原表达被诱导(例如，通过添加硫酸铜)并持续达到6、6.5、7、7.5或8个小时。在一个方面，诱导发生在约30℃的温度和250rpm的搅拌速度。
在本发明的一些实施方案中，酵母在中性pH条件下生长。用于本文，术语“中性pH”的一般用法是指在大约pH 5.5和大约pH 8之间的pH范围，在一个方面中，在大约pH 6和大约8之间。本领域技术人员可以理解，用pH计测量时会发生小的浮动(例如，十分之几或百分之几)。因此，使用中性pH来培养酵母细胞意味着酵母细胞在培养过程中的多数时间在中性pH生长。在一个实施方案中，酵母生长的培养基维持在至少5.5的pH水平(即不允许培养基的pH降到pH 5.5以下)。在另一个方面中，酵母生长在维持在大约6、6.5、7、7.5或8的pH水平。培养酵母中使用中性pH促进了对于使用酵母作为免疫调节媒介物来说是有益特性的几个生物效应。例如，在中性pH培养酵母允许酵母有良好的生长，同时对细胞传代时间没有负面影响(例如，加倍时间变慢)。酵母可以在不丧失细胞壁柔性的情况下继续生长到高密度。使用中性pH可以在所有收集密度产生具有柔性细胞壁的酵母和/或对细胞壁消化酶(例如葡聚糖酶)更敏感的酵母。这个特点是合意的，因为具有柔性细胞壁的酵母与在更酸性条件下生长的酵母相比，可以诱导不同的或者改善的免疫应答，例如通过促进胞吞了酵母的抗原递呈细胞分泌细胞因子(例如，TH1型细胞因子，包括但不限于IFN-γ、白介素12(IL-12)和IL-2，以及促炎细胞因子，例如IL-6)。此外，此类培养方法可以提供对位于细胞壁内的抗原的更高的可接触性。在另一个方面中，对于一些抗原使用中性pH可以利用二硫苏糖醇(DTT)处理来释放二硫键结合的抗原，而这对于培养在较低pH(例如pH5)的培养基中的抗原表达酵母是不可能的。
在本发明的一个实施方案中，可以将完整酵母(有或没有异源抗原或其它蛋白表达的)以能够产生酵母细胞壁制品、酵母膜颗粒或酵母片段(即不是完整的)的方式磨碎或加工，并且在一些实施方案中，可以将酵母片段与包含本发明的Brachyury抗原的其它组合物(例如作为蛋白质亚基或包含在不同媒介物内)一起提供或施用从而加强免疫应答。例如，可以利用酶处理、化学处理或物理力(例如，机械剪切或超声处理)将酵母破碎成可以用作佐剂的部分。
在本发明的一个实施方案中，可用于发明的酵母媒介物包括已经被杀死或灭活的酵母媒介物。杀死或灭活酵母可以通过本领域已知的多种合适方法中的任何一种来完成。例如，酵母热灭活是灭活酵母的一种标准途径，如果需要，本领域技术人员可以通过本领域已知的常规方法来监测目标抗原的结构变化。替代地，可以使用其它酵母灭活方法，例如化学、电学、放射性或UV方法。参见例如标准酵母培养参考书，例如Methods of Enzymology,Vol.194,Cold Spring Harbor Publishing(1990)中公开的方法。任何使用的灭活策略都应当考虑到目标抗原的二级、三级或四级结构，并且保存这些结构以便优化抗原的免疫原性。
酵母媒介物可以利用本领域技术人员已知的多种技术配制成本发明的基于酵母的免疫治疗组合物或产品。例如，可以通过冻干对酵母媒介物进行干燥。包含酵母媒介物的制剂还可以通过将酵母制成饼或片剂，例如象用于烘培或酿造工艺中的酵母。此外，可以将酵母媒介物与药学上可接受的赋形剂混合，例如宿主或宿主细胞能够耐受的等渗缓冲液。此类赋形剂的例子包括水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液、Hank's溶液，和其它水性生理平衡盐溶液。还可以使用非水性的媒介物，例如固定油类、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。其它有用的制剂包括含有增稠剂(例如羧甲基纤维素钠、山梨醇、甘油或葡聚糖)的悬浮液。赋形剂还可以含有微量的添加剂，例如能增强等渗性和化学稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，防腐剂的例子包括硫柳汞(thimerosal)、m-或o-甲苯酚、福尔马林和苯甲醇。标准的制剂可以是液态注射剂，或者能够加入合适液体成为用于注射的悬浮液或溶液的固体。因此，在非液体制剂中，赋形剂可以包含例如葡萄糖、人血清白蛋白和/或防腐剂，其在施用前可以加入无菌水或盐水。
在本发明的一个实施方案中，组合物可以包含另外的试剂，其也可以被称为生物反应调节剂化合物，或者产生此类试剂/调节剂的能力。例如，可以用至少一种抗原和至少一种试剂/生物反应调节剂化合物转染或装载酵母媒介物，或者可以将本发明的组合物与至少一种试剂/生物反应调节剂一起施用。生物反应调节剂包括能调节免疫应答的佐剂和其它化合物，它们可以被称为免疫调节性化合物；还包括能修饰另一种化合物或试剂的生物活性的化合物，例如基于酵母的免疫治疗剂，此类生物活性不限于免疫系统的效应。某些免疫调节化合物能刺激保护性免疫应答，而其它的能抑制有害的免疫应答，免疫调节与给定基于酵母的免疫治疗剂的组合是否有用可以至少部分取决于要治疗或防止的疾病状态或状况，和/或待治疗的个体。某些生物反应调节剂优先增强细胞介导型免疫应答，而其它的优先增强体液免疫应答(即能够刺激免疫应答，其中与体液免疫相比，细胞介导的免疫应答水平提高，或者反之亦然)。某些生物反应调节剂与基于酵母的免疫治疗剂有一或多个共同的特性，或者对基于酵母的免疫治疗剂的生物特性能够增强或互补。本领域技术人员知道多种测量免疫应答的激发或抑制的方法，以及区分细胞介导的免疫应答和体液介导的免疫应答的方法，和区分一类细胞介导的应答与另一类应答(例如，TH17应答对TH1应答)。
可用于本发明的试剂/生物反应调节剂可以包括，但不限于细胞因子、趋化因子、激素、脂类衍生物、肽、蛋白、多糖、小分子药物、抗体及其抗原结合片段(包括，但不限于抗细胞因子抗体、抗细胞因子受体抗体、抗趋化因子抗体)、维生素、多核苷酸、核酸结合部分、适配体和生长调节剂。一些合适的试剂包括，但不限于IL-1，或者IL-1或IL-1R的激动剂，抗IL-1或其它IL-1拮抗剂；IL-6或者IL-6或IL-6R的激动剂，抗IL-6或其它IL-6拮抗剂；IL-12，或者IL-12或IL-12R的激动剂，抗IL-12或其它IL-12拮抗剂；IL-17，或者IL-17或IL-17R的激动剂，抗IL-17或其它IL-17拮抗剂；IL-21，或者IL-21或IL-21R的激动剂，抗IL-21或其它IL-21拮抗剂；IL-22，或者IL-22或IL-22R的激动剂，抗IL-22或其它IL-22拮抗剂；IL-23，或者IL-23或IL-23R的激动剂，抗IL-23或其它IL-23拮抗剂；IL-25，或者IL-25或IL-25R的激动剂，抗IL-25或其它IL-25拮抗剂；IL-27，或者IL-27或IL-27R的激动剂，抗IL-27或其它IL-27拮抗剂；I型干扰素(包括IFN-α)，或者I型干扰素或其受体的激动剂或拮抗剂；II型干扰素(包括IFN-γ)，或者II型干扰素或其受体的激动剂或拮抗剂；抗CD40、CD40L、淋巴细胞激活基因3(LAG3)蛋白和/或IMP321(由可溶形式LAG3衍生的T细胞免疫刺激因子)；抗CTLA-4抗体(例如，为了释放无反应性T细胞)；T细胞共刺激剂(例如，抗CD137、抗CD28、抗CD40)；阿来组单抗(alemtuzumab)(例如)、地尼白介素2(denileukin diftitox，例如)；抗CD4；抗CD25；免疫检查点抑制剂(例如“免疫检查点”的抑制剂，其是免疫系统的抑制途径，并维持自我耐受和调节生理性免疫应答的持续时间和幅度，此类免疫检查点抑制剂包括但不限于：抗CTLA-4抗体，例如易普利姆玛(Bristol-Myers Squibb，Princeton，NJ)或tremelimumab(MedImmune/AstraZeneca，Wilmington，DE)，程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，程序性细胞死亡蛋白1配体(PD-L1)，程序性细胞死亡蛋白2配体(PD-L2，例如称为AMP-224的PD-L2融合蛋白(Amplimmune，Gaithersburg，MD/GlaxoSmithKline，Philadelphia，PA)，抗PD-1抗体(例如Nivolumab(Bristol-Myers Squibb)，pembrolizumanb(Merck，Whitehouse Station，NJ)或pidilizumab(CureTech，Yavne，Israel))，抗PD-L1抗体(例如MPDL3280A(Genentech，South San Francisco，CA)，MEDI4736(MedImmune/AstraZeneca)，BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)，MSB0010718C(EMDSerono，Rockland，MD))或抗PD-L2抗体。吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂(如INCB24360)；阻断FOXP3的药剂(例如以消除活性/杀死CD4+/CD25+T调节细胞)；Flt3配体、咪喹莫特(imiquimod，AldaraTM)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、沙格司亭(sargramostim，)；激素，包括但不限于催乳素和生长激素；Toll样受体(TLR)激动剂，包括但不限于TLR-2激动剂、TLR-4激动剂、TLR-7激动剂和TLR-9激动剂；TLR拮抗剂，包括但不限于TLR-2拮抗剂、TLR-4拮抗剂、TLR-7拮抗剂和TLR-9拮抗剂；抗炎剂和免疫调节剂，包括但不限于COX-2抑制剂(例如，赛来昔布(Celecoxib)、NSAIDS)、糖皮质激素、他汀类(statins)和沙利度胺(thalidomide)以及它们的类似物，包括IMiDTMs(它是沙利度胺(例如(来那度胺(lenalidomide))、(泊马度胺(pomalidomide))的结构和功能类似物；促炎剂，例如真菌或细菌成分或任何促炎细胞因子或趋化因子；免疫治疗疫苗，包括但不限于基于病毒的疫苗、基于细菌的疫苗，或者基于抗体的疫苗；和任何其它免疫调节剂、免疫增强剂、抗炎剂、促炎剂和能够调节抗原呈递细胞或TH17、TH1和/或Treg细胞的数量、活化状态和/或存活情况的任何试剂。发明考虑了这些试剂的任何组合，并且任何此类试剂与基于酵母的免疫治疗剂的组合或者与基于酵母的免疫治疗剂一起的(例如同时、顺序或者其它格式)给药方案都是发明涵盖的组合物。此类试剂是本领域公知的。这些试剂可以单独使用或者与文中描述的其它试剂组合使用。
本发明的组合物还可以包含任何其它试剂或组合物或方案，或者与它们一起(同时、顺序或间歇地)给药，所述试剂或组合物或方案可以用于防止或治疗癌症，或者治疗或缓解癌症的任何症状(特别是与Brachyury表达或过表达相关的癌症)的任何化合物。此外，本发明的组合物可以与其它免疫治疗组合物一起使用，包括预防性和/或治疗性免疫疗法。的确，本发明的组合物可以用于通过抑制癌症中的Brachyury表达来抑制或减少转移癌中可以发生的化疗抗性或放射疗法抗性(并从而抑制抗增殖影响)，或者本发明的组合物可以增强化疗或放射疗法在个体中的表现。可以用于癌症治疗的其它试剂、组合物或方案(例如治疗性方案)包括，但不限于化疗、手术切除肿瘤、放射疗法、同种异体或自体干细胞移植，和/或靶向癌症疗法(例如小分子药物；生物剂；或者特异靶向那些参与肿瘤生长和进展的分子的单克隆抗体疗法，所述分子包括但不限于选择性雌激素受体调节剂(SERMs)、芳香酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、视黄素受体激动剂、凋亡刺激剂、血管生成抑制剂、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂或者免疫刺激剂)。这些其它治疗剂和/或治疗方案可以在本发明的免疫治疗组合物之前、同时、交替或之后施用，或者在不同时间点施用。例如，当与化疗或靶向癌症疗法联合施用于个体时，可能希望在化疗或靶向癌症疗法剂量之间的“假期”施用酵母-Brachyury免疫治疗组合物，以便最大化免疫治疗组合物的效力。肿瘤的手术切除往往是在施用酵母-Brachyury免疫治疗组合物之前，但在施用酵母-Brachyury免疫治疗组合物过程中或者之后可以进行另外的或者初次手术。
本发明还包括含有本文描述的任何组合物或本文描述的组合物的任何个别组分的试剂盒。试剂盒可以包括其它试剂和使用本发明的任何组合物来预防或治疗与Brachyury表达或过表达相关的癌症的书面说明或指导。
发明组合物的施用或使用方法
本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物被设计用于预防或治疗与Brachyury表达或过表达有关的或者以Brachyury表达或过表达为特征的癌症，包括通过预防此类癌症的出现、遏制此类癌症的进展，或者缓解或消除此类癌症。更具体地说，酵母-Brachyury免疫治疗组合物可以用于防止、抑制或延迟表达Brachyury的肿瘤的发展，和/或防止、抑制或延迟肿瘤迁移和/或肿瘤对其它组织的侵袭(转移)，和/或整体防止或抑制个体中癌症的进展。酵母-Brachyury免疫治疗组合物还可以用于减轻癌症的至少一个症状，例如通过减少个体中的肿瘤负荷；抑制个体中的肿瘤生长；提高个体存活率；防止、抑制、逆转或延迟肿瘤迁移和/或肿瘤侵袭其它组织(转移癌症)的发展；和/或防止、抑制、逆转或延迟个体中癌症的进展。酵母-Brachyury免疫疗法还可以用于通过抑制癌症中的Brachyury表达来抑制、减少或消除转移癌中可以发生的化疗抗性或放射疗法抗性，并且本发明的组合物可以增强化疗或放射疗法在个体中的表现。
与本发明的组合物和方法有关的癌症是任何表达或可以表达Brachyury的癌症，或者与表达或可以表达Brachyury的癌症接近的癌症，包括但不限于乳腺、骨(包括但不限于脊索瘤)、小肠、胃、肾、膀胱、子宫、卵巢、睾丸、肺、结肠、胰或前列腺的癌症，且包括转移和晚期癌症。此外，B细胞来源的肿瘤，例如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、埃巴病毒转化的B细胞、伯基特氏和霍奇金氏淋巴瘤，以及其转移癌症中表达Brachyury。
因此，本发明的一个实施方案涉及治疗癌症，特别是表达Brachyury的癌症的方法。所述方法包括将本文描述的酵母-Brachyury免疫治疗组合物施用于患有表达Brachyury的癌症的个体，所述组合物包括：(a)酵母媒介物；和(b)包含至少一种经修饰的Brachyury抗原的癌症抗原。在一方面，方法减少了患者中的肿瘤负荷。在一方面，方法提高了患者的存活率。在一方面，方法抑制了个体中的肿瘤生长。在一方面，方法防止、遏制或逆转了肿瘤的转移性进展。
由于Brachyury表达据信随着癌症进展到更高阶段(例如，根据具体癌症，从I期到II期到III期到IV期)会更普遍，并且与转移过程相关，本发明的实施方案提供了防止或延迟表达Brachyury的癌症发病，或者将癌症遏制在转移前或恶性前阶段，或者防止或延迟此类癌症的进展(例如稳定化癌症)的方法。此类方法包括将本文描述的酵母-Brachyury免疫治疗组合物施用于没有检测到Brachyury表达的癌细胞的个体，所述组合物包括的组合物含有：(a)酵母媒介物；和(b)包含至少一种经修饰的Brachyury抗原的癌症抗原。在该实施方案的一个方面，患有癌症的个体中有至少一部分已知表达Brachyury，或者相信在癌症的某个阶段倾向表达Brachyury。在该实施方案的一个方面，个体已经患有癌症，但在第一次施用组合物时癌症中没有检测到Brachyury，意味着个体可以患有较早期癌症，其中Brachyury表达还没有发生，或者其中Brachyury表达还无法检测到(即Brachyury可以有或没有以低水平表达，或者只在少数肿瘤细胞中表达，但使用标准检测方法还不能容易地检测到)。在一些情况中，癌症类型可以是已知有高转移进展率的类型，在这方面，施用酵母-Brachyury免疫治疗组合物防止、延迟或抑制患者的癌症中表达Brachyury的肿瘤细胞的发展，并从而防止、遏制、延迟或抑制伴随Brachyury表达的转移过程。在另一个方面，个体在施用组合物时没有癌症。此类个体是“有倾向”或可能发展成癌症的，或许是由于家族史或者遗传标记，或者因为个体已经表现出癌前细胞或病变或者具有癌前(恶性前)细胞或病变。
本发明的一个实施方案涉及抑制肿瘤迁移和/或减少、停止(遏制)、逆转或防止患有癌症的个体中的癌症的转移性进展，或者逆转癌症中转移事件的发展的方法。正如以上讨论的，Brachyury促进了人肿瘤细胞中的上皮细胞-间充质转化(EMT)、赋予肿瘤细胞以间充质表型，以及迁移和侵袭能力，而减弱肿瘤细胞周期进展。因此，Brachyury对转移过程的参与使它成为理想的防止或抑制转移过程(包括将癌症遏制在转移前阶段)的靶标。使用本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物可以在面临癌症逃逸(或试图逃逸)传统疗法(例如化疗和放射疗法)时，有效地防止或治疗转移性癌症，包括遏制癌症的进展。所述方法包括将本文中描述的本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物施用于患有癌症的个体的步骤，所述组合物包括但不限于:(a)酵母媒介物；和(b)包含本发明的至少一种经修饰的Brachyury抗原的癌症抗原。
在一方面，第一次施用组合物时在个体的癌症中没有检测到Brachyury。通常，当个体的癌症中检测不到Brachyury时，该个体可以患有较早期癌症，其中Brachyury表达还没有显现(例如I期或II期)，或者其中Brachyury表达无论如何还是无法检测到的(即Brachyury可以有或没有以低水平表达，或者只在少数肿瘤细胞中表达，但使用常规检测方法还不能容易地检测到)。就本发明的这个方面来说，通过使用酵母-Brachyury免疫治疗组合物可以防止、延迟或抑制表达Brachyury的肿瘤细胞的发展。因此，导致肿瘤转移性进展的肿瘤迁移和/或其它转移过程被防止、延迟或抑制，和/或个体中发生肿瘤进展的整体遏制。
在另一方面，第一次施用组合物时在个体的癌症中检测到了或者可以检测Brachyury表达。在本发明的这个方面中个体可以患有I期、II期、III期或IV期癌症。在这个方面，使用酵母-Brachyury免疫治疗组合物减少、消除或减慢或遏制了表达Brachyury的肿瘤的生长，这可以导致个体中肿瘤负荷的减少、抑制表达Brachyury的肿瘤的生长，和/或提高个体存活率。该个体可以经历转移过程的遏制、减慢或逆转，改善患者的存活率和健康；并且此外允许其它治疗方案对癌症进行治疗。
的确，转移性癌症可以和对癌症疗法例如化疗、放射疗法或靶向癌症疗法的抗性或者对癌症疗法的抗性提高有关，由此癌症因此可以“逃逸”这些疗法或者被疗法和过程更少地影响。因此，需要减少或消除对此类疗法的抗性，从而提高或增强疗法的效率，改善患者的健康和存活率。因此，本发明的一个实施方案涉及减少或防止患有癌症的个体的化疗抗性、靶向癌症疗法抗性或放射疗法抗性的方法。所述方法包括将本文描述的酵母-Brachyury免疫治疗组合物施用于患有癌症并正在接受针对癌症的化疗和/或放射疗法的个体，其可以包括的组合物包含:(a)酵母媒介物；和(b)包含至少一种本发明的经修饰的Brachyury抗原的癌症抗原。本发明的该方法还可以用于治疗与其它癌症疗法治疗相关的抗性，包括但不限于靶向癌症疗法。
在该实施方案的一个方面，在第一次施用所述组合物时，个体的癌症中没有检测到Brachyury。在这个方面，施用酵母-Brachyury免疫治疗组合物通过抑制癌症中表达Brachyury的肿瘤细胞的发展，防止或抑制对化疗或放射疗法的抗性的出现。在另一方面，在第一次施用所述组合物时，个体的癌症中检测到了Brachyury表达。在这个方面，个体可以已经或者还没有经历对化疗或放射疗法的抗性。任一种情况中，施用本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物通过减少或消除患者中的表达Brachyury的肿瘤细胞，防止或抑制对化疗或放射疗法的抗性，或者增强化疗或放射疗法治疗个体的能力。
本发明的又一个实施方案涉及通过向具有脊索瘤的个体(受试者)施用本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物来治疗脊索瘤的方法。脊索瘤的特征在于Brachyury的表达，且事实上Brachyury是这种癌症的区别性生物标志物，即Brachyury表达是所有脊索瘤常见的并且是特定生物标志物。因此，本发明的该方法包括向具有脊索瘤的个体或有发展脊索瘤的风险但目前未检测到表达Brachyury的癌细胞的个体施用如本文所述的酵母-Brachyury免疫治疗组合物的步骤，所述酵母-Brachyury免疫治疗组合物包括但不限于：(a)酵母媒介物；和(b)包含本发明的至少一种经修饰的Brachyury抗原的癌症抗原。用本发明的免疫治疗组合物治疗的受试者可以是脊索瘤受试者，其具有首次出现的不可切除的病变(即，不能被完全手术切除)或可切除的病变；具有不可切除的局部复发病变(即，局部复发是在与已被移除的原始病变或原发病灶相同的地方附近(在该地方或接近该地方)再现的病变)，无论是首次复发或不是首次复发的受试者；具有如下所述的寡转移(oligometastatic)疾病的受试者；或具有如下所述的转移性疾病的受试者。在一个方面，受试者可以有或者没有进行先前的放射疗法，手术和/或靶向药物疗法。在另一方面，受试者具有先前已经照射过的癌症病变。在一个方面，受试者具有先前未被照射的癌症病变。在一个方面，对受试者施用酵母-Brachyury免疫疗法，并且另外在施用酵母-Brachyury免疫疗法之前，期间和/或之后照射癌症病变。
在上述任意方法的一方面，除施用本发明的酵母-Brachyury组合物外，对个体另外地使用对于癌症的治疗有用的至少一种其它的治疗性化合物或治疗方案治疗，其在本发明的基于酵母的免疫治疗组合物的施用之前，相继地，同时和/或之后施用或进行。例如，在关于本文所述的本发明的方法的任意实施方案中，在一方面，当个体患有癌症时(不论肿瘤细胞中可检测的Brachyury表达的状态如何)，该个体正使用或已经使用另一种癌症疗法治疗。此类疗法可以包括任意治疗方案或本文先前所述的任意治疗性化合物或试剂的使用，包括但不限于化疗或靶向癌症疗法或药物疗法(例如酪氨酸激酶抑制剂，包括但不限于伊马替尼，舒尼替尼西妥昔单抗，吉非替尼，厄洛替尼，尼洛替尼，达沙替尼，拉帕替尼和依维莫司；STAT3抑制剂，蒽环类药物；顺铂(cisplatins)；烷化剂；喜树碱类似物)，放射疗法(包括但不限于独立放射疗法和辅助放射疗法，特别是基于强子的放射疗法)，肿瘤的手术切除，干细胞转移，细胞因子疗法，过继性T细胞转移和/或施用第二免疫治疗组合物。在施用第二免疫治疗组合物的情况下，此类组合物可以包括但不限于另外的基于酵母的免疫疗法，基于重组病毒的免疫疗法(病毒载体)，细胞因子疗法，免疫刺激疗法(包括具有免疫刺激性质的化疗)，DNA疫苗和其他免疫治疗组合物。
任意这些另外的药剂或疗法可以在第一剂量的酵母-Brachyury免疫治疗组合物之前或在第一剂量施用之后施用或进行。在一个实施方案中，一种或多种疗法可以以交替方式与酵母-Brachyury免疫疗法组合物的给药一起施用或进行，例如在其中以规定间隔在一次或多次连续剂量的化疗或其他疗法之间施用酵母-Brachyury组合物的方案中。在一个实施方案中，在开始另外的治疗之前，在一段时间内以一个或多个剂量施用酵母-Brachyury免疫治疗组合物。换句话说，酵母-Brachyury免疫治疗组合物作为单一疗法施用一段时间，然后添加另外的疗法(例如化疗或放射疗法)，其与新的酵母-Brachyury免疫疗法剂量同时施用，或者与酵母-Brachyury免疫疗法交替的方式施用。可替代地或另外地，在开始施用酵母-Brachyury免疫治疗组合物之前可以施用另一种疗法一段时间，并且可以将这些概念组合(例如肿瘤的手术切除，随后用酵母-Brachyury免疫疗法的单一疗法数周，随后用交替剂量的化疗或放射疗法和酵母-Brachyury免疫治疗数周或数月，任选地随后使用用酵母-Brachyury免疫疗法或其他疗法的单一疗法，或序贯、同时，或以交替方式提供的疗法的组合的新方案)。本发明设想了使用酵母-Brachyury免疫疗法治疗癌症的各种方案，并且这些实例应该被认为是各种可能方案的非限制性实例。
在一方面，第二免疫治疗组合物包含不包括Brachyury抗原的第二癌症抗原。例如，可用于与酵母-brachyury免疫治疗组合物组合的第二免疫治疗组合物是包含另一癌症抗原的酵母免疫治疗组合物。此类癌症抗原可以包括但不限于癌胚抗原(CEA)，点突变Ras癌蛋白，MUC-1，EGFR，BCR-Abl，MART-1，MAGE-1，MAGE-3，GAGE，GP-100，MUC-2，正常和点突变的p53癌蛋白，PSMA，酪氨酸酶，TRP-1(gp75)，NY-ESO-1，TRP-2，TAG72，KSA，CA-125，PSA，HER-2/neu/c-erb/B2，hTERT，p73，B-RAF，腺瘤性息肉病(APC)，Myc，von Hippel-Lindau蛋白(VHL)，Rb-1，Rb-2，雄激素受体(AR)，Smad4，MDR1，Flt-3，BRCA-1，BRCA-2，pax3-fkhr，ews-fli-1，HERV-H，HERV-K，TWIST，Mesothelin，NGEP，此类抗原的修饰，此类抗原的剪接变体，此类抗原的表位激动剂，以及此类抗原的组合，和/或其免疫原性部分，其修饰，其变体，和/或其表位激动剂。
如本文所使用的，“治疗”癌症，或者它的任何排列方式(例如“对癌症的治疗”等)通常是指癌症一旦已经发生施用本发明的组合物(例如一旦在个体中诊断或检测到癌症)，处理的至少一个治疗性目的(与没有此类处理相比)包括：缓解癌症的至少一个症状，例如通过减少个体中的肿瘤负荷；抑制、减少、降低，或削弱个体中的肿瘤生长或肿瘤生长速率(肿瘤生长动力学)；增加或延长个体的存货，其可以包括总体存活和/或无进展存活；改善肿瘤反应率(即如通过以下限定的RECIST和/或Choi测量)；延迟、抑制、遏制或防止肿瘤的复发；防止、抑制、逆转或延迟肿瘤迁移和/或肿瘤侵袭原发癌症之外的组织(转移癌)；遏制、防止、抑制、逆转或延迟个体中的癌症进展；改善针对癌症表达的肿瘤抗原的长期记忆免疫应答；增加病变对放射疗法、化疗和/或靶向药物疗法的敏感性；和/或改善个体的总体健康。
“预防”、“防止”或“提供保护而免于”癌症，或者其任何排列方式(例如“癌症的防止”等)通常是指在癌症发生前，或者在癌症的特定阶段或者癌症中肿瘤抗原表达发生之前(例如，在癌症中检测到Brachyury表达之前)施用本发明的组合物，其至少一个处理目的(与没有此类处理相比)包括：防止或延迟癌症的发作或发展，或者如果癌症在处理后发生，则与不存在处理时相比，至少改善个体的结果，包括但不限于减少个体的肿瘤负担；抑制(减少，降低，削弱)个体中的肿瘤生长或肿瘤生长速率；增加(延长)个体的存活，其可以包括总体存活和/或无进展存活；改善肿瘤反应率(即如通过以下限定的RECIST和/或Choi测量)；延迟，抑制，遏制或防止肿瘤的复发；防止、抑制、逆转或延迟肿瘤迁移和/或肿瘤侵袭原发癌症之外的组织(转移癌)；遏制、防止、抑制、逆转或延迟个体中的癌症进展；改善针对癌症表达的肿瘤抗原的长期记忆免疫应答；增加肿瘤对放射疗法、化疗和/或靶向药物疗法的敏感性；和/或改善个体的总体健康。
在本发明的一个实施方案中，使用本发明的基于酵母的免疫治疗组合物改善受试者中的反应率，即如通过RECIST或Choi标准测量。“RECIST”是指实体瘤中的反应评估标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)，是一组已发表的指南，用于确定癌症患者中的肿瘤何时改善，稳定或进展。RECIST定义的反应取决于目标病灶的大小变化，如通过非侵入性成像评估所确定的。RECIST标准最初由包括欧洲癌症研究与治疗组织(European Organization for Research and Treatment of Cancer，EORTC)，美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)和加拿大国家癌症研究所临床试验组织(National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group)的国际合作于2000年2月发布(Therasse et al.,J.Natl.Cancer Inst.2000,92:205-216)，并在2009年进行了修订，如Eisenhauer et al.,Eur.J.Cancer,2009,45:228-247中所述。如以上Eisenhaueret al.,中所述，目前将“完全反应”或CR定义为所有目标病灶的消失，其中任何病理性淋巴结(靶或非靶)短轴减少至<10mm。目前将“部分反应”或“PR”定义为参照基线总和直径，目标病灶直径总和减少至少30％。“稳定疾病”或“SD”定义为既没有足够的收缩率以符合PR，也没有足够的增加以符合PD，以研究时的最小直径总和为参照。“进行性疾病”或“PD”定义为目标病灶直径总和增加至少20％，以研究时的最小直径总和为参照。此外，总和还必须显示至少5毫米的绝对增量。一个或多个新病灶的出现也认为是进展。适用于非靶标病灶的另外的标准描述于以上Eisenhauer et al.中。
“Choi”标准是指最初由Choi et al.,(J.Clin.Oncol.2007,25(13):1753-1759)描述的一组计算机断层摄影反应标准，并评估通过CT测量的目标病灶的大小或密度的变化。Choi标准也使用CR，PR，SD和PD分组对患者分类。CR定义为所有病灶消失，没有新的病灶。PR定义为CT大小减少>10％或肿瘤衰减减少>15％，没有新的病灶且没有明显的不可测量的疾病进展。SD定义为不符合CR，PR或PD的标准，且没有归因于肿瘤进展的症状恶化。PD定义为肿瘤大小增加>10％，并且不符合CT上肿瘤衰减的PR标准，和/或具有新的病灶。
本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物对受试者或个体的递送(施用、免疫)可以离体或体内进行，但通常体内进行。离体施用是指在患者体外进行部分调节步骤，例如在一定条件下将本发明的组合物施用于从患者分离的细胞(树突细胞)群，使得酵母媒介物、经修饰的Brachyury抗原和任何其它试剂或组合物装载到细胞中，并将这些细胞返回给患者。本发明的治疗性组合物可以用任何合适的施用模式返回给患者，或施用于患者。
组合物的施用可以是系统性的、粘膜的和/或目标位点位置附近的(例如，肿瘤部位附近)。合适的施用途径对本领域技术人员而言是显而易见的，取决于要预防或治疗的癌症的类型和/或目标细胞群或组织的类型。各种可接受的施用方法包括，但不限于静脉内施用、腹膜内施用、肌肉内施用、结内施用、冠状动脉内施用、动脉内施用(例如到颈动脉中)、皮下施用、经皮递送、气管内施用、关节内施用、脑室内(intraventricular)施用、吸入(例如气溶胶)、颅内、脊柱内、眼内、耳、鼻内、口服、肺部施用、导管浸渍(impregnation)及直接注射入组织。在一个方面中，施用途径包括：静脉内、腹膜内、皮下、皮内、结内、肌肉内、经皮、吸入、鼻内、口服、眼内、关节内、颅内和脊柱内。胃肠外递送可包括皮内、肌肉内、腹膜内、胸膜内、肺内、静脉内、皮下、心房导管和静脉导管途径。耳递送可包括滴耳剂，鼻内递送可包括滴鼻剂或鼻内注射，而眼内递送可包括滴眼剂。也可以利用本领域的标准方法进行气溶胶(吸入)递送进行(参见例如Stribling et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 189:11277-11281,1992)。在一方面，皮下施用本发明的酵母-Brachyury免疫治疗组合物。在一方面，酵母-Brachyury免疫治疗组合物直接施用于肿瘤周围环境的。在一方面，鞘内施用本发明的基于酵母的免疫治疗组合物
在本发明的一个方面，配制酵母-Brachyury免疫治疗组合物用于通过注射，例如通过皮下注射施用。在一个方面，酵母-Brachyury免疫治疗组合物在装入小瓶的悬浮液中提供，与用于适当处理，给药和对受试者施用的说明一起。在一方面，酵母-Brachyury免疫治疗组合物作为装入小瓶的冻干制剂提供，与用于适当处理，重悬，剂量和对受试者施用的说明一起。本发明的经修饰的Brachyury抗原，以及后续的在表达该抗原的酵母中的絮凝表型降低的一个优势是酵母-Brachyury免疫治疗组合物的施用需要医师更少的努力来确保将组合物适当地悬浮或重悬在小瓶中，并在装入注射器和施用给受试者期间保持适当悬浮。
一般来说，酵母-Brachyury免疫治疗组合物的合适单个剂量是在合适的时间段内施用一次或多次时，能够有效地给患者身体的特定细胞类型、组织或区域提供有效量的酵母媒介物和Brachyury抗原，从而引发抗一或多个Brachyury抗原或表位的抗原特异性免疫应答的剂量。例如，在一个实施方案中，本发明的酵母-Brachyury的单个剂量是被施用该组合物的每千克生物体重约1x 105到约5x 107个酵母细胞等同量。在一个方面，本发明的酵母媒介物的单个剂量是每剂(即每个生物)约0.1酵母单位(Y.U.，即1x 106个酵母细胞或酵母细胞等同物)到约100Y.U.(1x 109个细胞)，包括按0.1x 106个细胞的增量递增的任何中间剂量(即，1.1x 106、1.2x 106、1.3x 106...)。在一个实施方案中，剂量包括1Y.U和40Y.U.之间的剂量，1Y.U和50Y.U.之间的剂量，1Y.U和60Y.U.之间的剂量，1Y.U和70Y.U.之间的剂量，或1Y.U和80Y.U.之间的剂量，且在一个方面中，在10Y.U.和40Y.U.，50Y.U.，60Y.U.，70Y.U.，或90Y.U.之间。在一个实施方案中，在相同的给剂时期内剂量施用到个体的不同部位。例如，在一个给剂时期内40Y.U.的剂量可以通过在个体的四个不同部位注射10Y.U.剂量来施用，或者在一个给剂时期内20Y.U.的剂量可以通过在个体的四个不同部位注射5Y.U.剂量，或者在个体的两个不同部位注射10Y.U.剂量来施用。本发明包括将一定量酵母-Brachyury免疫治疗组合物(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20Y.U.或更多)施用于个体的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同部位以形成单个剂量。一个酵母单位(Y.U.)是1x 107酵母细胞或酵母细胞等同物。
免疫治疗组合物的“增强剂”(booster或boosts)在针对抗原的免疫应答已减弱时施用或按需要施用，以提供针对特定抗原的免疫应答或诱导记忆应答。根据被治疗的个体的状态以及施用时的疗法目的(例如，预防、积极治疗、维持)，可以在初始施用后约1、2、3、4、5、6、7、或8周，或者每月、每两月、每季度、每年和/或几年或多年后施用加强剂。在一个实施方案中，施用计划包括在几周到几个月到几年的时间段内，施用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次基于酵母的免疫治疗组合物的剂量。在一个实施方案中，剂量每周或每两周施用，达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量，然后根据需要每两周或每月施用以达到对脊索瘤的预防性或治疗性处理。在一个实施方案中，剂量每两周施用达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量，然后另外地每月施用直到达到所需的预防性或治疗性结果。在一个实施方案中，剂量每月施用达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量，然后另外地每月施用或者然后根据需要以不同的频率递送剂量(例如每季度)以实现所需的癌症的预防性或治疗性处理。在本文所述的所有剂量方案中，如果需要，可以以相似或更长的时间间隔(例如，数月或数年)施用另外的增强剂作为维持或缓解疗法。在一方面，施用增强剂用于长期维持治疗(即在完成治疗的主要过程之后，旨在预防或延迟疾病的复发，或旨在维持疾病稳定)。
在本发明的方法中，组合物和治疗组合物可以施用于动物，包括任何脊椎动物，并且特别是脊椎动物类，哺乳动物的任何成员，包括但不限于灵长类，啮齿动物，家畜和家养宠物。家畜包括消耗的哺乳动物或产生有用的产品的哺乳动物(例如用于羊毛生产的绵羊)。利用本发明治疗或保护的哺乳动物包括人类，非人灵长类动物，狗，猫，小鼠，大鼠，山羊，绵羊，牛，马和猪。
“个体”是脊椎动物，例如哺乳动物，包括但不限于人类。哺乳动物包括但不限于农场动物，运动动物，宠物，灵长类，小鼠和大鼠。术语“个体”可以与术语“动物”、“受试者”或“患者”互换使用。
可用于本发明的一般技术
本发明的实施会应用(除非另有说明)到本领域技术人员熟知的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。此类技术在文献中有充分解释，例如Methods of Enzymology,Vol.194,Guthrie et al.,eds.,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1990)；Biology and activities of yeasts,Skinner,et al.,eds.,Academic Press(1980)；Methods in yeast genetics:a laboratory course manual,Rose et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)；The Yeast Saccharomyces:Cell Cycle and Cell Biology,Pringle et al.,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1997)；The Yeast Saccharomyces:Gene Expression,Jones et al.,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1993)；The Yeast Saccharomyces:Genome Dynamics,Protein Synthesis,and Energetics,Broachet al.,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1992)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook et al.,1989)和Molecular Cloning: A Laboratory Manual,third edition(Sambrook and Russel,2001)(文中统称为“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987，包括至2001年的补充材料)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis etal.,eds.,1994)；Harlow and Lane(1988),Antibodies,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Publications,New York；Harlow and Lane(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(文中统称为“Harlow and Lane”)；Beaucage et al.eds.,Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,John Wiley&Sons,Inc.,New York,2000)；Casarett andDoull’s Toxicology The Basic Science of Poisons,C.Klaassen,ed.,6th edition(2001)以及Vaccines,S.Plotkin and W.Orenstein,eds.,Fifth Edition(2008).
一般定义
(GlobeImmune,Inc.,Louisville,Colorado)通常是指胞外(在表面)、胞内(内部或者胞质)或者既有胞外也有胞内地表达一或多个异源抗原的酵母媒介物。产品已有概括描述(参见例如美国专利5,830,463)。某些基于酵母的免疫治疗组合物以及它们的制备方法和一般使用方法也有详细描述，例如美国专利5,830,463、美国专利7,083,787、美国专利7,736,642、Stubbs et al.,Nat.Med.7:625-629(2001)、Lu et al.,Cancer Research 64:5084-5088(2004)和Bernstein et al.,Vaccine2008Jan24；26(4):509-21，这些文献中的每一个都通过引用全部并入本文。
如用于本文，术语“类似物”是指与另一种化合物结构上相似但组成上略有不同(象用不同元素的原子替代一个原子，或者在有特定功能团存在时，一个功能团被另一个功能团代替)的化学化合物。因此，类似物是功能和外表上相似或相当的化合物，但相对参照化合物具有不同的结构或来源。
术语“取代的”、“取代衍生物”和“衍生物”在用于描述化合物时，意味着结合在未取代化合物上的至少一个氢被不同原子或化学部分所代替。
尽管衍生物具有和亲本化合物相似的物理结构，但衍生物可能有和亲本化合物不同的化学和/或生物学性能。此类性能可能包括，但不限于与亲本化合物相比提高或下降的活性、与亲本化合物相比的新活性、提高或下降的生物可用性、提高或下降的效力、提高或下降的体外和/或体内稳定性，和/或提高或下降的吸附性能。
一般来说，术语“生物活性的”表明化合物(包括蛋白或肽)通过体内(即在天然生理环境中)或体外(即在实验室条件下)测量或观察，具有至少一种对细胞、组织或生物体的代谢、生理、化学或其它过程有影响的可检测活性。
根据本发明，术语“调整(modulate)”可以与调节(regulate)交换使用，通常是指对特定活性的上调或下调。用于本文，术语“上调”可以一般性地描述：相对特定活性来说的引发、启动、增加、增多、加强、提高、增强、扩大、促进或提供。类似地，术语“下调”可以一般性地描述任意以下项：相对特定活性来说的下降、减少(reducing)、抑制、减轻、消除、减少(lessening)、阻断或防止。
在本发明的一个实施方案中，本文中描述的任何氨基酸序列可以制备为在限定的氨基酸序列的C和/或N末端各自侧翼的至少一个到最多大约20个另外的异源氨基酸。得到的蛋白或多肽可以被称为“基本由所述限定氨基酸序列构成”。根据本发明，异源氨基酸是这样的氨基酸序列，所述序列在天然发现时不在限定的氨基酸序列侧翼(即在自然界中，在体内找不到)；或者与限定的氨基酸序列的功能无关；或者如果使用给定氨基酸序列所来源的生物的标准密码子选择对天然存在的序列中的核苷酸进行翻译，则不会由在编码限定的氨基酸序列的天然存在核酸序列侧翼的核苷酸编码(就像它在基因中存在)。类似地，短语“基本由…构成”在提到本文的核酸序列时使用是指编码限定氨基酸序列的核酸序列，其侧翼可以有在编码该限定氨基酸序列的核酸序列的5’和/或3’端的每端的从至少一个到最多大约60个额外的异源核苷酸。异源核苷酸不象在天然基因中那样天然侧接编码限定氨基酸序列的核酸序列(即自然界、体内找不到)，或者不编码能够给具有限定氨基酸序列的蛋白带来任何额外功能或者改变蛋白的功能的蛋白。
根据本发明，短语“选择性结合”是指本发明的抗体、抗原结合片段或结合配偶体优先结合特定蛋白的能力。更具体地说，短语“选择性结合”是指一个蛋白与另一个(例如，针对某抗原的抗体、抗体片段或结合配偶体)的特异结合，其中通过任何标准检验(例如免疫学分析)测量到它们的结合水平比检验中的背景对照在统计学上显著更高。例如，在进行免疫学分析时，对照一般包括只含有抗体或抗原结合片段的反应孔/管(即没有抗原)，其中在没有抗原情况下，抗体或其抗原结合片段产生的反应量(例如，与孔的非特异性结合)被认为是背景。结合可以利用本领域的多种标准方法，包括酶免疫分析(例如ELISA、免疫印迹分析等)来测量。
一般提到的本发明中使用的蛋白或多肽包括给定蛋白的全长蛋白、接近全长的蛋白(上文定义的)、或者这些蛋白的任何片段、结构域(结构的、功能的或者免疫原性的)、构象表位或同源物或变体。融合蛋白也可以统称为蛋白或多肽。根据本发明分离的蛋白是已经被从其自然环境移出(即已经经过人的操作)的蛋白(包括多肽或肽)，并且可以包括例如纯化蛋白、部分纯化的蛋白、重组产生的蛋白和合成产生的蛋白。因此“分离的”不反映蛋白的纯化程度。优选地，本发明的分离的蛋白是重组产生的。根据本发明，术语“修饰”和“突变”可以交换使用，特别是就对本文描述的蛋白或其部分的氨基酸序列(或核酸序列)进行的修饰/突变来说。
如用于本文，术语“同源物”或“变体”用来指这样的蛋白或肽，所述蛋白或肽由于对参照蛋白或肽(即“原型”或“野生型”蛋白)的次要修饰而不同于参照蛋白或肽，但维持了所述天然形式的基本蛋白和侧链结构。这样的变化包括，但不限于，一个或数个氨基酸侧链的变化；一个或数个氨基酸的变化，包括缺失(例如，蛋白或肽的截短形式)、插入和/或取代；一个或数个原子的立体化学的变化；和/或次要的衍生化，包括但不限于甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、棕榈酰化、酰胺化和/或糖基磷脂酰肌醇的添加。同源物或变体与参照蛋白或肽相比可具有加强的、降低的，或基本相似的性能。同源物或变体可以包括蛋白质的激动剂或蛋白质的拮抗剂。同源物或变体可以用本领域已知的制备蛋白的方法来制备，包括，但不限于直接对分离的参照蛋白进行修饰、直接合成蛋白，或者使用例如经典或重组DNA技术对编码该蛋白的核酸序列进行修饰以产生随机或定向突变，从而得到蛋白变体的编码。此外，可能存在参照蛋白的天然变体(例如异构体、等位基因变体或其它可能从个体到个体发生的天然变体)，可以分离、产生和/或用于发明。
给定蛋白的同源物或变体可能包含这样的氨基酸序列、基本由其构成，或者由其构成，所述氨基酸序列与参照蛋白的氨基酸序列(例如文中限定的氨基酸序列或者限定蛋白的氨基酸序列)至少约45％、或至少约50％、或至少约55％、或至少约60％、或至少约65％、或至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约91％相同、或至少约92％相同、或至少约93％相同、或至少约94％相同、或至少约95％相同、或至少约96％相同、或至少约97％相同、或至少约98％相同、或至少约99％相同(或者45％和99％之间的按整数增加的任何百分比同一性)。在一个实施方案中，同源物或变体包含以下氨基酸序列、基本由其组成，或者由其组成，所述氨基酸序列与参照蛋白的氨基酸序列小于100％相同、小于约99％相同、小于约98％相同、小于约97％相同、小于约96％相同、小于约95％相同等等，按1％递减到小于约70％相同。
如用于本文，除非另有说明，提到百分比(％)同一性是指利用下述程序进行的同源性评估：(1)Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)基本同源性检索，以标准缺省参数，使用blastp进行氨基酸检索，使用blastn进行核酸检索，其中缺省将查询序列进行低复杂度区域的过滤(例如在Altschul,S.F.,Madden,T.L.,A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.&Lipman,D.J.(1997)"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a newgeneration of protein database search programs."Nucleic Acids Res.25:3389-3402中有描述，该文献通过引用并入全部本文)；(2)两个序列的BLAST比对(使用以下描述的参数)；(3)和/或PSI-BLAST，使用标准缺省参数(Position-Specific Iterated BLAST)。应当注意，由于两个序列的Basic BLAST和BLAST之间的标准参数存在一些差异，两个特定序列在使用BLAST程序时可能被识别为有显著的同源性，而在Basic BLAST中使用序列之一作为查询序列进行的检索可能最佳匹配中没有鉴定到第二个序列。此外，PSI-BLAST提供了“profile”检索的自动化的使用简便版本，是一种寻找同源序列的敏感方式。程序首先进行空位BLAST数据库检索。PSI-BLAST程序利用来自返回的任何明显比对的信息构建位点特异性打分矩阵，以此在下一轮数据库检索中替代查询序列。因此，可以理解通过使用这些程序中的任意一种能够确定百分比同一性。
使用BLAST，按照Tatusova and Madden,(1999),"Blast 2sequences-a new toolfor comparing protein and nucleotide sequences"(FEMS Microbiol Lett.174:247-250，通过引用全部并入本文)中描述的那样，将两个特定序列进行相互比对。此类序列比对在blastp或blastn中进行，使用BLAST 2.0算法在两个序列间进行空位BLAST检索(BLAST2.0)，以便在最后得到的比对中引入空位(缺失和插入)。为了清楚起见，利用如下标准缺省参数进行了BLAST序列比对。
对于blastn，使用0BLOSUM62矩阵:
匹配得分＝1
错配罚分＝-2
开放空位(5)和延伸空位(2)罚分
gap x_dropoff(50)期望值(10)字长(11)滤器(开)
对于blastp，使用0BLOSUM62矩阵:
开放空位(11)和延伸空位(1)罚分
gap x_dropoff(50)期望值(10)字长(3)滤器(开).
分离的核酸分子是已经被从其自然环境移出(即，已经经过人的操作)的核酸分子，其自然环境是自然界中发现该核酸分子的基因组或染色体。因此，“分离的”并不一定反映该核酸分子的纯化程度，而是表明所述分子未包含自然界中发现该核酸分子所处的整个基因组或整个染色体或含有一个以上基因的基因组区段。分离的核酸分子可包括完整基因。包含某基因的分离的核酸分子并不是包含该基因的染色体片段，而是包含与该基因相关的编码区和调控区，但没有天然存在于同一染色体上的其它基因。分离的核酸分子还可包含基因的一部分。分离的核酸分子还可包含(在序列的5’和/或3’端)侧接有其它核酸的限定的核酸序列，所述其它核酸在自然界中通常不位于该限定的核酸序列的侧翼(即为异源序列)。分离的核酸分子包括DNA、RNA(例如mRNA)、或者DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。尽管短语“核酸分子”主要指物理的核酸分子，短语“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，这两个短语可以互换使用，尤其是对于能编码蛋白或蛋白结构域的核酸分子或核酸序列而言。
重组核酸分子是这样的分子，所述分子可以包含编码本文描述的任何一或多个蛋白的任何一个核酸序列以及可操纵地连接的至少一个任意转录调控序列，所述转录调控序列能有效地调控该核酸分子在要转染的细胞中的表达。虽然短语“核酸分子”主要指物理的核酸分子，短语“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，这两个短语可以互换使用，尤其是对于能编码蛋白的核酸分子或核酸序列而言。此外，短语“重组分子”主要指可操纵地连接转录控制序列的核酸分子，但可以与施用动物的短语“核酸分子”互换使用。
重组核酸分子包括重组载体，所述重组载体是与编码本发明融合蛋白的分离的核酸分子可操纵地连接的任何核酸序列，一般是异源序列，其能使所述融合蛋白得以重组产生，并能将所述核酸分子递送到本发明的宿主细胞中。这样的载体可以含有天然状态下与待插入该载体的分离的核酸分子不相邻的核酸序列。载体可以是RNA或DNA，原核的或真核的，而且在本发明中优选是可用于转染酵母的质粒。重组载体可用在克隆、测序和/或其它对核酸分子的操作中，并可以用于递送这样的分子(例如，象在DNA组合物或基于病毒载体的组合物中那样)。重组载体优选用于核酸分子的表达，还可称为表达载体。优选的重组载体能在所转染的宿主细胞，例如酵母中表达。
在本发明的重组分子中，核酸分子可操纵地与表达载体连接，其中所述表达载体含有调控序列，例如转录控制序列、翻译控制序列、复制原点，以及其它与宿主细胞相容并控制本发明的核酸分子的表达的调控序列。特别地，本发明的重组分子包括与一或多个表达控制序列可操纵地连接的核酸分子。短语“可操纵地连接”是指核酸分子与表达控制序列的连接方式使得该分子在转染(即，转化、转导或转染)到宿主细胞中后被表达。
根据本发明，术语“转染”用来指可将外源核酸分子(即重组核酸分子)插入细胞中的任何方法。当用来指将核酸分子导入微生物细胞，例如藻类、细菌和酵母时，术语“转化”可与术语“转染”互换使用。在微生物系统中，术语“转化”用于描述由于微生物获取了外源核酸而继承的变化，并且基本上与术语“转染”同义。因此，转染技术包括但不限于，转化、细胞的化学处理、粒子轰击、电穿孔、显微注射、脂质转染、吸附、感染和原生质体融合。
以下实验结果是为说明目的而提供的，并不意在限制发明的范围。
实施例
实施例1
以下实施例描述了改进的酵母-Brachyury免疫治疗组合物的制备。
在该实验中，将酵母(酿酒酵母)工程化改造以表达人Brachyury抗原，该Brachyury抗原是包含作为激动性表位的T细胞表位WLLPGTSTV(SEQ ID NO:9)且进一步包含T box DNA结合结构域的缺失的近全长Brachyury蛋白。例如存在于SEQ ID NO:4或6中的天然Brachyury T细胞表位是WLLPGTSTL(SEQ ID NO:8)。在铜诱导型启动子CUP1的控制下表达人Brachyury激动剂抗原，产生酵母-Brachyury免疫治疗组合物。更具体地说，将根据本发明的Brachyury激动剂抗原(其也是一种经修饰的Brachyury抗原)作为由SEQ ID NO:13表示的单个多肽生成。SEQ ID NO:13的氨基酸序列与由SEQ ID NO:4表示的人Brachyury蛋白(未修饰的Brachyury抗原)不同在于：(1)位置198-222的缺失(即SEQ ID NO:4的198-222位不存在于SEQ ID NO:13中)；和(2)用缬氨酸取代SEQ ID NO:4的位置254(并位于SEQID NO:13的位置229)的氨基酸(亮氨酸)。换句话说，SEQ ID NO:13是由直接融合的SEQ IDNO:4的位置1-197与SEQ ID NO:4的位置223-435组成并且包括导致将激动性表位引入SEQID NO:13的氨基酸修饰(在SEQ ID NO：13的位置229处，其对应SEQ ID NO:4的位置254)的单一多肽。在位置254(相对于SEQ ID NO:4)的亮氨酸取代为缬氨酸在SEQ ID NO：13中产生了位于SEQ ID NO:13的位置221-229处的T细胞激动性表位，不受理论的束缚，认为其相比于野生型表位(SEQ ID NO:4的位置246至254)诱导增强的针对Brachyury的T细胞应答。该激动性表位在本文中也由SEQ ID NO:6表示。与SEQ ID NO:4的Brachyury蛋白质相比，由SEQ ID NO:13表示的经修饰的Brachyury抗原具有破坏的DNA结合能力，并且表达该抗原的酵母具有降低的絮凝表型，并且另外含有激动性表位以在该构建体在酵母-Brachyury免疫治疗剂中施用于受试者时，增强针对天然Brachyury的T细胞应答。
SEQ ID NO:15是融合蛋白，其包含SEQ ID NO:13的经修饰的Brachyury蛋白(实际上是SEQ ID NO:13的位置2-410，因为SEQ ID NO:13的N-末端甲硫氨酸被去除以适应添加下文所述的N末端肽)。SEQ ID NO:15是单个多肽，其从N末端到C末端具有符合读码框地融合的以下序列元件：(1)N末端肽，其赋予对蛋白酶体降解的抗性并稳定酵母中的表达(SEQID NO:15的位置1-6，该氨基酸序列在本文中也由SEQ ID NO:16表示)；(2)由SEQ ID NO:4的位置2-197和223-435组成，并且在SEQ ID NO:4的位置254处还包含缬氨酸取代亮氨酸的取代的人Brachyury抗原，其也可以描述为SEQ ID NO:13的位置2-410(SEQ ID NO:15的位置7-415)；和(3)六聚组氨酸标签(SEQ ID NO:15的第416-421位)。SEQ ID NO:15的氨基酸序列和SEQ ID NO:13的位置2-410的氨基酸序列由SEQ ID NO:14的多核苷酸序列编码。表达该融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在本文中也称为GI-6306。
为了产生GI-6306酵母免疫治疗组合物，简单地说，合成编码具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的人Brachyury蛋白的DNA序列，使用PCR扩增，然后插入酵母2μm表达载体(载体pGI-100)中的CUP1启动子后面的EcoRI和SpeI克隆位点。编码N末端稳定化肽MADEAP(SEQID NO:16)和C末端六聚组氨酸肽的核苷酸序列也添加至质粒载体以编码由SEQ ID NO:15表示的完整融合蛋白。将所得质粒转化到DH5α中用于质粒储存，并转化到酿酒酵母W303α中以产生酵母-Brachyury免疫治疗组合物。
通过醋酸锂/聚乙二醇转染进行酿酒酵母转化，并且在缺乏尿嘧啶的固体琼脂基板(UDA；尿苷缺失琼脂)上选择初级转染子。通过在缺乏尿苷和亮氨酸(ULDA)的琼脂平板上重新划线单个菌落来选择这些初级转化体菌落；随后在30℃下生长4天以确保克隆纯度并在酵母细胞内建立稳定状态的高Brachyury质粒拷贝数。
使用来自ULDA平板的菌落接种缺乏尿苷和亮氨酸的液体起始培养物(UL4aa)，并在30℃以250rpm旋转振荡生长20小时。然后将这些原代培养物用于接种相同的UL4aa配制的最终培养物。
UL4aa液体培养基配方(每升)：
25克(g)葡萄糖
10g含有硫酸铵的酵母氮碱
0.08g腺嘌呤
0.16g色氨酸
0.16g组氨酸
在初步实验中，为了评估在CUP1驱动的铜诱导型启动子控制下的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，在酵母-Brachyury培养物达到约2Y.U./ml的密度后，通过加入0.375mM硫酸铜在最终培养物中起始酵母-Brachyury表达，并在30℃下继续诱导3h。然后收获来自每种培养物的细胞，用PBS洗涤，并在PBS中在56℃下热灭活1小时。
在培养物加热杀死之后，将细胞在PBS中洗涤三次。通过TCA沉淀/硝化纤维素结合测定法测量总蛋白质含量，并使用抗his标签单克隆抗体和抗Brachyury抗体(Abcam，Cambridge，MA)通过Western印迹评估Brachyury抗原表达。将酵母细胞的Brachyury抗原含量使用Western印迹的半定量数字成像定量，其中将来自酵母裂解物的Brachury抗原条带强度/信号插入含有已知量的重组纯化的his标记的抗原的标准曲线上。
初始表达实验的结果显示在图1中，并证明了GI-6306以高水平(16,438ng/YU)表达包含经修饰的Brachyury激动剂抗原(SEQ ID NO:13的位置2-410)的融合蛋白(SEQ IDNO:15)。该表达水平与由称为GI-6301的酵母免疫治疗组合物表达的包含未修饰的Brachyury抗原(SEQ ID NO:4的位置2-435)的融合蛋白的表达相当(16,787ng/YU；参见图1)。GI-6306的经修饰的Brachyury激动剂抗原的表达显著高于含有与SEQ ID NO:13相同的激动性点突变，但不含有SEQ ID NO:13中存在的DNA结合结构域的缺失的Brachyury激动剂抗原(称为GI-6305的酵母免疫治疗组合物，其表达SEQ ID NO:4的位置2-435的氨基酸序列，除了在相对于SEQ ID NO:4的位置254处的缬氨酸对亮氨酸的取代)的表达(参见图1，10,862ng/YU)。因此，消除Brachyury的DNA结合活性(例如，通过DNA结合残基的缺失)似乎显著增强了Brachyury激动剂抗原的表达。
还基于沉降的视觉检查评估上述酵母-Brachyury免疫治疗产品(GI-6301，GI-6305和GI-6306)的培养物的絮凝特性。如图2所示，酵母-Brachyury组合物GI-6306比GI-6301或GI-6305中的任一种明显更少地絮凝。
实施例2
以下实施例描述了患有Brachyury阳性癌症的受试者的1期临床试验。
已经使用如本文所述的称为GI-6306的酵母-Brachyury免疫治疗组合物或另一种酵母-Brachyury免疫治疗组合物开始了开放标签的，顺序的剂量递增的1期临床试验。在该临床试验方案中，9-18个癌症患者(每个剂量组群3-6个患者)以序贯剂量群组递增方案施用所述酵母-Brachyury免疫治疗组合物，利用剂量范围为4Y.U.(1个Y.U.x 4个位点，意味着在每次访视的患者身体上的4个不同位点施用1个Y.U.的免疫治疗组合物)，16Y.U.(4Y.Ux 4个位点)，40Y.U.(10Y.U.x 4个位点)或80个Y.U.(20Y.U.x 4个位点)，皮下施用。免疫治疗组合物以2周的间隔施用，总共7次访视(约3个月)，然后每月一次，直到患者符合离线研究(off-study)标准。选择最大耐受剂量(MTD)的患者(n＝10)的扩展组群或观察到的最佳剂量进行另外的研究。结果监测作为主要终点的安全性和耐受性，并且在扩展组群中，通过ELISpot测定和响应Brachyury蛋白的增殖测量Brachyury特异性T细胞的增加来测量是否可检测到T细胞前体的显著变化(例如，治疗中出现或扩增的Brachyury特异性CD8+或CD4+T细胞)。作为次要终点，测量临床益处，例如无进展存活，临床放射响应，血清标志物减少和/或循环肿瘤细胞减少，以及一般性免疫活性的参数，包括外周血中免疫细胞亚群(CD8+记忆/效应T细胞，CD4+记忆/效应T细胞，Tregs，NK细胞，DC)的频率和细胞因子(例如IFN-γ，IL-10，IL-12，IL-2，IL-4，TGF-β等)血清水平的变化。
包括GI-6306在内的免疫治疗组合物是安全的并且耐受性良好，没有显著的毒性。另外，免疫治疗组合物在至少一些或大部分患者中产生治疗中出现的Brachyury特异性T细胞应答或预先存在的Brachyury特异性基线T细胞应答的改善。有些患者也会有稳定的疾病。
在另外的研究或该研究的扩展中，利用上文确定的最大耐受剂量或观察到的最佳剂量，将本文公开的酵母-Brachyury免疫治疗组合物施用于另外的患者群组，并且测量相同的主要和次要终点。
实施例3
以下实施例描述了使用本文所述的酵母-Brachyury免疫治疗组合物的2期临床试验。
使用如实施例1中所述的酵母-Brachyury免疫治疗组合物进行乳腺癌患者的随机化2期临床试验。登记至少100名或更多具有I期，II期或III期Brachyury阳性乳腺癌的受试者。受试者招募标准可以包括患有1级，2级或3级癌症的受试者。受试者纳入标准还可以包括患有“三阴性”乳腺癌(对于雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)和HER2各自都是阴性的癌症)的受试者。受试者纳入标准还可以包括淋巴结阴性癌症患者。
该试验作为双盲或开放标签，安慰剂对照，多中心试验进行。在治疗期间，所有患者接受标准护理疗法，其中治疗组患者接受酵母-Brachyury免疫治疗组合物的几次连续注射。主要终点是无复发存活或总体存活。另外的终点可包括抗原特异性T细胞应答(例如，治疗中Brachyury特异性CD8+T细胞出现或扩增)，维持淋巴结阴性，进展为转移，和肿瘤细胞中的Brachyury表达。
酵母-Brachyury免疫治疗组合物是安全的并且耐受性良好，没有显著的毒性。另外，酵母-Brachyury免疫治疗组合物在至少一些或大部分患者中产生治疗出现的Brachyury特异性T细胞应答和/或预先存在的Brachyury特异性基线T细胞应答的改善。一些或大部分患者还具有稳定的疾病，维持淋巴结阴性，和/或预防，减少或遏制转移性进展。
虽然已经详细描述了本发明的各种实施方案，但显然本领域技术人员会想到这些实施方案的修改和适应。然而，应当明确理解，此类修改和适应是如以下示范性权利要求给出的发明范围内的。
序列表
<110> 全球免疫股份有限公司
美利坚合众国, 由健康及人类服务部部长代表
King, Thomas H.
Guo, Zhimin
Schlom, Jeffrey
Palena, Claudia
<120> 经修饰的酵母- Brachyury免疫治疗组合物
<130> 7797-3-PCT
<140> 尚未分配
<141> 2016-07-26
<150> 62/200,497
<151> 2015-08-03
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2518
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (494)..(1801)
<400> 1
tttgcttttg cttatttccg tccatttccc tctctgcgcg cggaccttcc ttttccagat 60
ggtgagagcc gcggggacac ccgacgccgg ggcaggctga tccacgatcc tgggtgtgcg 120
taacgccgcc tggggctccg tgggcgaggg acgtgtgggg acaggtgcac cggaaactgc 180
cagactggag agttgaggca tcggaggcgc gagaacagca ctactactgc ggcgagacga 240
gcgcggcgca tcccaaagcc cggccaaatg cgctcgtccc tgggagggga gggaggcgcg 300
cctggagcgg ggacagtctt ggtccgcgcc ctcctcccgg gtctgtgccg ggacccggga 360
cccgggagcc gtcgcaggtc tcggtccaag gggccccttt tctcggaagg gcggcggcca 420
agagcaggga aggtggatct caggtagcga gtctgggctt cggggacggc ggggagggga 480
gccggacggg agg atg agc tcc cct ggc acc gag agc gcg gga aag agc 529
Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser
1 5 10
ctg cag tac cga gtg gac cac ctg ctg agc gcc gtg gag aat gag ctg 577
Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu
15 20 25
cag gcg ggc agc gag aag ggc gac ccc aca gag cgc gaa ctg cgc gtg 625
Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val
30 35 40
ggc ctg gag gag agc gag ctg tgg ctg cgc ttc aag gag ctc acc aat 673
Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn
45 50 55 60
gag atg atc gtg acc aag aac ggc agg agg atg ttt ccg gtg ctg aag 721
Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys
65 70 75
gtg aac gtg tct ggc ctg gac ccc aac gcc atg tac tcc ttc ctg ctg 769
Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu
80 85 90
gac ttc gtg gcg gcg gac aac cac cgc tgg aag tac gtg aac ggg gaa 817
Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu
95 100 105
tgg gtg ccg ggg ggc aag ccg gag ccg cag gcg ccc agc tgc gtc tac 865
Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr
110 115 120
atc cac ccc gac tcg ccc aac ttc ggg gcc cac tgg atg aag gct ccc 913
Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro
125 130 135 140
gtc tcc ttc agc aaa gtc aag ctc acc aac aag ctc aac gga ggg ggc 961
Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly
145 150 155
cag atc atg ctg aac tcc ttg cat aag tat gag cct cga atc cac ata 1009
Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile
160 165 170
gtg aga gtt ggg ggt cca cag cgc atg atc acc agc cac tgc ttc cct 1057
Val Arg Val Gly Gly Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro
175 180 185
gag acc cag ttc ata gcg gtg act gct tat cag aac gag gag atc aca 1105
Glu Thr Gln Phe Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr
190 195 200
gct ctt aaa att aag tac aat cca ttt gca aaa gct ttc ctt gat gca 1153
Ala Leu Lys Ile Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala
205 210 215 220
aag gaa aga agt gat cac aaa gag atg atg gag gaa ccc gga gac agc 1201
Lys Glu Arg Ser Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser
225 230 235
cag caa cct ggg tac tcc caa tgg ggg tgg ctt ctt cct gga acc agc 1249
Gln Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser
240 245 250
acc ctg tgt cca cct gca aat cct cat cct cag ttt gga ggt gcc ctc 1297
Thr Leu Cys Pro Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu
255 260 265
tcc ctc ccc tcc acg cac agc tgt gac agg tac cca acc ctg agg agc 1345
Ser Leu Pro Ser Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser
270 275 280
cac cgg tcc tca ccc tac ccc agc ccc tat gct cat cgg aac aat tct 1393
His Arg Ser Ser Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser
285 290 295 300
cca acc tat tct gac aac tca cct gca tgt tta tcc atg ctg caa tcc 1441
Pro Thr Tyr Ser Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser
305 310 315
cat gac aat tgg tcc agc ctt gga atg cct gcc cat ccc agc atg ctc 1489
His Asp Asn Trp Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu
320 325 330
ccc gtg agc cac aat gcc agc cca cct acc agc tcc agt cag tac ccc 1537
Pro Val Ser His Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro
335 340 345
agc ctg tgg tct gtg agc aac ggc gcc gtc acc ccg ggc tcc cag gca 1585
Ser Leu Trp Ser Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala
350 355 360
gca gcc gtg tcc aac ggg ctg ggg gcc cag ttc ttc cgg ggc tcc ccc 1633
Ala Ala Val Ser Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro
365 370 375 380
gcg cac tac aca ccc ctc acc cat ccg gtc tcg gcg ccc tct tcc tcg 1681
Ala His Tyr Thr Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser
385 390 395
gga tcc cca ctg tac gaa ggg gcg gcc gcg gcc aca gac atc gtg gac 1729
Gly Ser Pro Leu Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asp Ile Val Asp
400 405 410
agc cag tac gac gcc gca gcc caa ggc cgc ctc ata gcc tca tgg aca 1777
Ser Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr
415 420 425
cct gtg tcg cca cct tcc atg tga agcagcaagg cccaggtccc gaaagatgca 1831
Pro Val Ser Pro Pro Ser Met
430 435
gtgacttttt gtcgtggcag ccagtggtga ctggattgac ctactaggta cccagtggca 1891
gtctcaggtt aagaaggaaa tgcagcctca gtaacttcct tttcaaagca gtggaggagc 1951
acacggcacc tttccccaga gccccagcat cccttgctca cacctgcagt agcggtgctg 2011
tcccaggtgg cttacagatg aacccaactg tggagatgat gcagttggcc caacctcact 2071
gacggtgaaa aaatgtttgc cagggtccag aaactttttt tggtttattt ctcatacagt 2131
gtattggcaa ctttggcaca ccagaatttg taaactccac cagtcctact ttagtgagat 2191
aaaaagcaca ctcttaatct tcttccttgt tgctttcaag tagttagagt tgagctgtta 2251
aggacagaat aaaatcatag ttgaggacag caggttttag ttgaattgaa aatttgactg 2311
ctctgccccc tagaatgtgt gtattttaag catatgtagc taatctcttg tgttgttaaa 2371
ctataactgt ttcatatttt tcttttgaca aagtagccaa agacaatcag cagaaagcat 2431
tttctgcaaa ataaacgcaa tatgcaaaat gtgattcgtc cagttattag tgaagcccct 2491
ccttttgtga gtatttactg tttattg 2518
<210> 2
<211> 435
<212> PRT
<213> 人类
<400> 2
Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg
1 5 10 15
Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser
20 25 30
Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu
35 40 45
Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val
50 55 60
Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser
65 70 75 80
Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala
85 90 95
Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly
100 105 110
Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp
115 120 125
Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser
130 135 140
Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu
145 150 155 160
Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly
165 170 175
Gly Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe
180 185 190
Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr Ala Leu Lys Ile
195 200 205
Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala Lys Glu Arg Ser
210 215 220
Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly
225 230 235 240
Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Leu Cys Pro
245 250 255
Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser
260 265 270
Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser
275 280 285
Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser
290 295 300
Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp
305 310 315 320
Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His
325 330 335
Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser
340 345 350
Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Ser
355 360 365
Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr
370 375 380
Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu
385 390 395 400
Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asp Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp
405 410 415
Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro
420 425 430
Pro Ser Met
435
<210> 3
<211> 1305
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1305)
<400> 3
atg agc tcc cct ggc acc gag agc gcg gga aag agc ctg cag tac cga 48
Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg
1 5 10 15
gtg gac cac ctg ctg agc gcc gtg gag aat gag ctg cag gcg ggc agc 96
Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser
20 25 30
gag aag ggc gac ccc aca gag cgc gaa ctg cgc gtg ggc ctg gag gag 144
Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu
35 40 45
agc gag ctg tgg ctg cgc ttc aag gag ctc acc aat gag atg atc gtg 192
Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val
50 55 60
acc aag aac ggc agg agg atg ttt ccg gtg ctg aag gtg aac gtg tct 240
Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser
65 70 75 80
ggc ctg gac ccc aac gcc atg tac tcc ttc ctg ctg gac ttc gtg gcg 288
Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala
85 90 95
gcg gac aac cac cgc tgg aag tac gtg aac ggg gaa tgg gtg ccg ggg 336
Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly
100 105 110
ggc aag ccg gag ccg cag gcg ccc agc tgc gtc tac atc cac ccc gac 384
Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp
115 120 125
tcg ccc aac ttc ggg gcc cac tgg atg aag gct ccc gtc tcc ttc agc 432
Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser
130 135 140
aaa gtc aag ctc acc aac aag ctc aac gga ggg ggc cag atc atg ctg 480
Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu
145 150 155 160
aac tcc ttg cat aag tat gag cct cga atc cac ata gtg aga gtt ggg 528
Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly
165 170 175
gat cca cag cgc atg atc acc agc cac tgc ttc cct gag acc cag ttc 576
Asp Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe
180 185 190
ata gcg gtg act gct tat cag aac gag gag atc aca gct ctt aaa att 624
Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr Ala Leu Lys Ile
195 200 205
aag tac aat cca ttt gca aaa gct ttc ctt gat gca aag gaa aga agt 672
Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala Lys Glu Arg Ser
210 215 220
gat cac aaa gag atg atg gag gaa ccc gga gac agc cag caa cct ggg 720
Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly
225 230 235 240
tac tcc caa tgg ggg tgg ctt ctt cct gga acc agc acc ctg tgt cca 768
Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Leu Cys Pro
245 250 255
cct gca aat cct cat cct cag ttt gga ggt gcc ctc tcc ctc ccc tcc 816
Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser
260 265 270
acg cac agc tgt gac agg tac cca acc ctg agg agc cac cgg tcc tca 864
Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser
275 280 285
ccc tac ccc agc ccc tat gct cat cgg aac aat tct cca acc tat tct 912
Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser
290 295 300
gac aac tca cct gca tgt tta tcc atg ctg caa tcc cat gac aat tgg 960
Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp
305 310 315 320
tcc agc ctt gga atg cct gcc cat ccc agc atg ctc ccc gtg agc cac 1008
Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His
325 330 335
aat gcc agc cca cct acc agc tcc agt cag tac ccc agc ctg tgg tct 1056
Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser
340 345 350
gtg agc aac ggc gcc gtc acc ccg ggc tcc cag gca gca gcc gtg acc 1104
Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Thr
355 360 365
aac ggg ctg ggg gcc cag ttc ttc cgg ggc tcc ccc gcg cac tac aca 1152
Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr
370 375 380
ccc ctc acc cat ccg gtc tcg gca ccc tct tcc tcg gga tcc cca ctg 1200
Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu
385 390 395 400
tac gaa ggg gcg gcc gcg gcc aca aac atc gtg gac agc cag tac gac 1248
Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asn Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp
405 410 415
gcc gca gcc caa ggc cgc ctc ata gcc tca tgg aca cct gtg tcg cca 1296
Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro
420 425 430
cct tcc atg 1305
Pro Ser Met
435
<210> 4
<211> 435
<212> PRT
<213> 人类
<400> 4
Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg
1 5 10 15
Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser
20 25 30
Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu
35 40 45
Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val
50 55 60
Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser
65 70 75 80
Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala
85 90 95
Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly
100 105 110
Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp
115 120 125
Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser
130 135 140
Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu
145 150 155 160
Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly
165 170 175
Asp Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe
180 185 190
Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr Ala Leu Lys Ile
195 200 205
Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala Lys Glu Arg Ser
210 215 220
Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly
225 230 235 240
Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Leu Cys Pro
245 250 255
Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser
260 265 270
Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser
275 280 285
Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser
290 295 300
Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp
305 310 315 320
Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His
325 330 335
Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser
340 345 350
Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Thr
355 360 365
Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr
370 375 380
Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu
385 390 395 400
Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asn Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp
405 410 415
Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro
420 425 430
Pro Ser Met
435
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类
<400> 5
Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Leu
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Agonist Peptide
<400> 6
Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Val
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类
<400> 7
Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser Val
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人类
<400> 8
Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类
<400> 9
Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val
1 5 10
<210> 10
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg
1 5 10 15
Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser
20 25 30
Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu
35 40 45
Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val
50 55 60
Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser
65 70 75 80
Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala
85 90 95
Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly
100 105 110
Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp
115 120 125
Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser
130 135 140
Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu
145 150 155 160
Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly
165 170 175
Asp Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe
180 185 190
Ile Ala Val Thr Ala Arg Ser Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro
195 200 205
Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro
210 215 220
Gly Thr Ser Thr Leu Cys Pro Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly
225 230 235 240
Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr
245 250 255
Leu Arg Ser His Arg Ser Ser Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg
260 265 270
Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met
275 280 285
Leu Gln Ser His Asp Asn Trp Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro
290 295 300
Ser Met Leu Pro Val Ser His Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser
305 310 315 320
Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly
325 330 335
Ser Gln Ala Ala Ala Val Thr Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg
340 345 350
Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro
355 360 365
Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asn
370 375 380
Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala
385 390 395 400
Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro Pro Ser Met
405 410
<210> 11
<211> 1295
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> CDS
<222> (10)..(1275)
<400> 11
gaattccgc atg gcc gat gaa gct ccg agc tcc cct ggc acc gag agc gcg 51
Met Ala Asp Glu Ala Pro Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala
1 5 10
gga aag agc ctg cag tac cga gtg gac cac ctg ctg agc gcc gtg gag 99
Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu
15 20 25 30
aat gag ctg cag gcg ggc agc gag aag ggc gac ccc aca gag cgc gaa 147
Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu
35 40 45
ctg cgc gtg ggc ctg gag gag agc gag ctg tgg ctg cgc ttc aag gag 195
Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu
50 55 60
ctc acc aat gag atg atc gtg acc aag aac ggc agg agg atg ttt ccg 243
Leu Thr Asn Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro
65 70 75
gtg ctg aag gtg aac gtg tct ggc ctg gac ccc aac gcc atg tac tcc 291
Val Leu Lys Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser
80 85 90
ttc ctg ctg gac ttc gtg gcg gcg gac aac cac cgc tgg aag tac gtg 339
Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val
95 100 105 110
aac ggg gaa tgg gtg ccg ggg ggc aag ccg gag ccg cag gcg ccc agc 387
Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser
115 120 125
tgc gtc tac atc cac ccc gac tcg ccc aac ttc ggg gcc cac tgg atg 435
Cys Val Tyr Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met
130 135 140
aag gct ccc gtc tcc ttc agc aaa gtc aag ctc acc aac aag ctc aac 483
Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn
145 150 155
gga ggg ggc cag atc atg ctg aac tcc ttg cat aag tat gag cct cga 531
Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg
160 165 170
atc cac ata gtg aga gtt ggg gat cca cag cgc atg atc acc agc cac 579
Ile His Ile Val Arg Val Gly Asp Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His
175 180 185 190
tgc ttc cct gag acc cag ttc ata gcg gtg act gct aga agt gat cac 627
Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe Ile Ala Val Thr Ala Arg Ser Asp His
195 200 205
aaa gag atg atg gag gaa ccc gga gac agc cag caa cct ggg tac tcc 675
Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly Tyr Ser
210 215 220
caa tgg ggg tgg ctt ctt cct gga acc agc acc ctg tgt cca cct gca 723
Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Leu Cys Pro Pro Ala
225 230 235
aat cct cat cct cag ttt gga ggt gcc ctc tcc ctc ccc tcc acg cac 771
Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser Thr His
240 245 250
agc tgt gac agg tac cca acc ctg agg agc cac cgg tcc tca ccc tac 819
Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser Pro Tyr
255 260 265 270
ccc agc ccc tat gct cat cgg aac aat tct cca acc tat tct gac aac 867
Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser Asp Asn
275 280 285
tca cct gca tgt tta tcc atg ctg caa tcc cat gac aat tgg tcc agc 915
Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp Ser Ser
290 295 300
ctt gga atg cct gcc cat ccc agc atg ctc ccc gtg agc cac aat gcc 963
Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His Asn Ala
305 310 315
agc cca cct acc agc tcc agt cag tac ccc agc ctg tgg tct gtg agc 1011
Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser Val Ser
320 325 330
aac ggc gcc gtc acc ccg ggc tcc cag gca gca gcc gtg acc aac ggg 1059
Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Thr Asn Gly
335 340 345 350
ctg ggg gcc cag ttc ttc cgg ggc tcc ccc gcg cac tac aca ccc ctc 1107
Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr Pro Leu
355 360 365
acc cat ccg gtc tcg gca ccc tct tcc tcg gga tcc cca ctg tac gaa 1155
Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu Tyr Glu
370 375 380
ggg gcg gcc gcg gcc aca aac atc gtg gac agc cag tac gac gcc gca 1203
Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asn Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp Ala Ala
385 390 395
gcc caa ggc cgc ctc ata gcc tca tgg aca cct gtg tcg cca cct tcc 1251
Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro Pro Ser
400 405 410
atg cat cac cat cac cat cac tga gactagtccc gggcggccgc 1295
Met His His His His His His
415 420
<210> 12
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Met Ala Asp Glu Ala Pro Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu
20 25 30
Leu Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg
35 40 45
Val Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr
50 55 60
Asn Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu
65 70 75 80
Lys Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu
85 90 95
Leu Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly
100 105 110
Glu Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val
115 120 125
Tyr Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala
130 135 140
Pro Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His
165 170 175
Ile Val Arg Val Gly Asp Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe
180 185 190
Pro Glu Thr Gln Phe Ile Ala Val Thr Ala Arg Ser Asp His Lys Glu
195 200 205
Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Trp
210 215 220
Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Leu Cys Pro Pro Ala Asn Pro
225 230 235 240
His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser Thr His Ser Cys
245 250 255
Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser Pro Tyr Pro Ser
260 265 270
Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser Asp Asn Ser Pro
275 280 285
Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp Ser Ser Leu Gly
290 295 300
Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His Asn Ala Ser Pro
305 310 315 320
Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser Val Ser Asn Gly
325 330 335
Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Thr Asn Gly Leu Gly
340 345 350
Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr Pro Leu Thr His
355 360 365
Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu Tyr Glu Gly Ala
370 375 380
Ala Ala Ala Thr Asn Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln
385 390 395 400
Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro Pro Ser Met His
405 410 415
His His His His His
420
<210> 13
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg
1 5 10 15
Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser
20 25 30
Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu
35 40 45
Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val
50 55 60
Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser
65 70 75 80
Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala
85 90 95
Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly
100 105 110
Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp
115 120 125
Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser
130 135 140
Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu
145 150 155 160
Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly
165 170 175
Asp Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe
180 185 190
Ile Ala Val Thr Ala Arg Ser Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro
195 200 205
Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro
210 215 220
Gly Thr Ser Thr Val Cys Pro Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly
225 230 235 240
Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr
245 250 255
Leu Arg Ser His Arg Ser Ser Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg
260 265 270
Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met
275 280 285
Leu Gln Ser His Asp Asn Trp Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro
290 295 300
Ser Met Leu Pro Val Ser His Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser
305 310 315 320
Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly
325 330 335
Ser Gln Ala Ala Ala Val Thr Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg
340 345 350
Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro
355 360 365
Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asn
370 375 380
Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala
385 390 395 400
Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro Pro Ser Met
405 410
<210> 14
<211> 1295
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> CDS
<222> (10)..(1275)
<400> 14
gaattccgc atg gcc gat gaa gct ccg agc tcc cct ggc acc gag agc gcg 51
Met Ala Asp Glu Ala Pro Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala
1 5 10
gga aag agc ctg cag tac cga gtg gac cac ctg ctg agc gcc gtg gag 99
Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu
15 20 25 30
aat gag ctg cag gcg ggc agc gag aag ggc gac ccc aca gag cgc gaa 147
Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu
35 40 45
ctg cgc gtg ggc ctg gag gag agc gag ctg tgg ctg cgc ttc aag gag 195
Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu
50 55 60
ctc acc aat gag atg atc gtg acc aag aac ggc agg agg atg ttt ccg 243
Leu Thr Asn Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro
65 70 75
gtg ctg aag gtg aac gtg tct ggc ctg gac ccc aac gcc atg tac tcc 291
Val Leu Lys Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser
80 85 90
ttc ctg ctg gac ttc gtg gcg gcg gac aac cac cgc tgg aag tac gtg 339
Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val
95 100 105 110
aac ggg gaa tgg gtg ccg ggg ggc aag ccg gag ccg cag gcg ccc agc 387
Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser
115 120 125
tgc gtc tac atc cac ccc gac tcg ccc aac ttc ggg gcc cac tgg atg 435
Cys Val Tyr Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met
130 135 140
aag gct ccc gtc tcc ttc agc aaa gtc aag ctc acc aac aag ctc aac 483
Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn
145 150 155
gga ggg ggc cag atc atg ctg aac tcc ttg cat aag tat gag cct cga 531
Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg
160 165 170
atc cac ata gtg aga gtt ggg gat cca cag cgc atg atc acc agc cac 579
Ile His Ile Val Arg Val Gly Asp Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His
175 180 185 190
tgc ttc cct gag acc cag ttc ata gcg gtg act gct aga agt gat cac 627
Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe Ile Ala Val Thr Ala Arg Ser Asp His
195 200 205
aaa gag atg atg gag gaa ccc gga gac agc cag caa cct ggg tac tcc 675
Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly Tyr Ser
210 215 220
caa tgg ggg tgg ctt ctt cct gga acc agc acc gtg tgt cca cct gca 723
Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Val Cys Pro Pro Ala
225 230 235
aat cct cat cct cag ttt gga ggt gcc ctc tcc ctc ccc tcc acg cac 771
Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser Thr His
240 245 250
agc tgt gac agg tac cca acc ctg agg agc cac cgg tcc tca ccc tac 819
Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser Pro Tyr
255 260 265 270
ccc agc ccc tat gct cat cgg aac aat tct cca acc tat tct gac aac 867
Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser Asp Asn
275 280 285
tca cct gca tgt tta tcc atg ctg caa tcc cat gac aat tgg tcc agc 915
Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp Ser Ser
290 295 300
ctt gga atg cct gcc cat ccc agc atg ctc ccc gtg agc cac aat gcc 963
Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His Asn Ala
305 310 315
agc cca cct acc agc tcc agt cag tac ccc agc ctg tgg tct gtg agc 1011
Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser Val Ser
320 325 330
aac ggc gcc gtc acc ccg ggc tcc cag gca gca gcc gtg acc aac ggg 1059
Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Thr Asn Gly
335 340 345 350
ctg ggg gcc cag ttc ttc cgg ggc tcc ccc gcg cac tac aca ccc ctc 1107
Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr Pro Leu
355 360 365
acc cat ccg gtc tcg gca ccc tct tcc tcg gga tcc cca ctg tac gaa 1155
Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu Tyr Glu
370 375 380
ggg gcg gcc gcg gcc aca aac atc gtg gac agc cag tac gac gcc gca 1203
Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asn Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp Ala Ala
385 390 395
gcc caa ggc cgc ctc ata gcc tca tgg aca cct gtg tcg cca cct tcc 1251
Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro Pro Ser
400 405 410
atg cat cac cat cac cat cac tga gactagtccc gggcggccgc 1295
Met His His His His His His
415 420
<210> 15
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
Met Ala Asp Glu Ala Pro Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu
20 25 30
Leu Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg
35 40 45
Val Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr
50 55 60
Asn Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu
65 70 75 80
Lys Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu
85 90 95
Leu Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly
100 105 110
Glu Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val
115 120 125
Tyr Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala
130 135 140
Pro Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His
165 170 175
Ile Val Arg Val Gly Asp Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe
180 185 190
Pro Glu Thr Gln Phe Ile Ala Val Thr Ala Arg Ser Asp His Lys Glu
195 200 205
Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Trp
210 215 220
Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Val Cys Pro Pro Ala Asn Pro
225 230 235 240
His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser Thr His Ser Cys
245 250 255
Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser Pro Tyr Pro Ser
260 265 270
Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser Asp Asn Ser Pro
275 280 285
Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp Ser Ser Leu Gly
290 295 300
Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His Asn Ala Ser Pro
305 310 315 320
Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser Val Ser Asn Gly
325 330 335
Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Thr Asn Gly Leu Gly
340 345 350
Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr Pro Leu Thr His
355 360 365
Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu Tyr Glu Gly Ala
370 375 380
Ala Ala Ala Thr Asn Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln
385 390 395 400
Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro Pro Ser Met His
405 410 415
His His His His His
420
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
Met Ala Asp Glu Ala Pro
1 5

Claims (50)

1.酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述免疫治疗组合物包含:
a)酵母；
b)由所述酵母表达的至少一种经修饰的Brachyury抗原，其中所述经修饰的Brachyury抗原具有通过至少一个修饰与野生型Brachyury氨基酸序列不同的氨基酸序列，所述修饰选自野生型Brachyury的位置42至229的任意一个或多个处的氨基酸缺失或取代，其中所述Brachyury抗原相比于所述野生型Brachyury具有被破坏的DNA结合位点。
2.权利要求1的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原相比于所述野生型Brachyury具有被破坏的DNA结合活性。
3.权利要求1的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述酵母相比于表达野生型Brachyury的酵母具有降低的絮凝表型。
4.权利要求1-3中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原具有通过至少一个修饰与野生型Brachyury氨基酸序列不同的氨基酸序列，所述修饰选自野生型Brachyury的位置66至217的任意一个或多个处的氨基酸缺失或取代。
5.权利要求1-3中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原具有通过至少一个修饰与野生型Brachyury氨基酸序列不同的氨基酸序列，所述修饰选自野生型Brachyury的位置198至222的任意一个或多个处的氨基酸缺失或取代。
6.权利要求1-3中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原具有通过至少一个修饰与野生型Brachyury氨基酸序列不同的氨基酸序列，所述修饰选自野生型Brachyury的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基的缺失或取代，所述氨基酸残基选自Lys66、Arg69、Arg70、Arg101、Lys103、Lys147、Asn150、Lys151、Ser162、Thr196、Ala197、Tyr198、Ile208、Asn211、Pro212、Phe213、Ala214、Lys215、Ala216和/或Phe217。
7.权利要求1-3中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原具有通过至少一个修饰与野生型Brachyury氨基酸序列不同的氨基酸序列，所述修饰选自野生型Brachyury的至少1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸残基的缺失或取代，所述氨基酸残基选自Met87、Pro127、Asp128、Ser129、Pro130、Asn131、Phe132和/或Val175。
8.权利要求1-7中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述修饰是缺失。
9.权利要求1-7中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个所述修饰与野生型Brachyury氨基酸序列不同。
10.权利要求1-7中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列通过野生型Brachyury的位置66和217之间的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续氨基酸的缺失与野生型Brachyury氨基酸序列不同。
11.权利要求1-7中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列通过野生型Brachyury的位置198和222之间的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续氨基酸的缺失与野生型Brachyury氨基酸序列不同。
12.权利要求1-7中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原具有以下氨基酸序列，所述氨基酸序列通过野生型Brachyury的位置198-222的缺失与野生型Brachyury氨基酸序列不同。
13.权利要求1-7中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原具有还包含至少一个激动性T细胞表位的氨基酸序列。
14.权利要求13的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述激动性表位具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列。
15.权利要求1-14中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原具有与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13至少80％相同的氨基酸序列。
16.权利要求1-14中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原具有与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13至少90％相同的氨基酸序列。
17.权利要求1-14中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原具有与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13至少95％相同的氨基酸序列。
18.权利要求1-14中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原具有包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:10的位置2-410的氨基酸序列。
19.权利要求1-14中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原具有包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:13的位置2-410的氨基酸序列。
20.权利要求1-14中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原是融合蛋白，其具有与SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:15至少95％相同的氨基酸序列。
21.权利要求1-14中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述经修饰的Brachyury抗原是融合蛋白，其具有SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
22.权利要求1-21中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述酵母来自酵母属。
23.权利要求1-22中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述酵母来自酿酒酵母。
24.权利要求1-23中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述酵母是完整酵母。
25.权利要求24的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述完整酵母被杀死。
26.权利要求24的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述完整酵母被热灭活。
27.权利要求1-26中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述组合物在适合于施用至受试者的药学上可接受的赋形剂中配制。
28.酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其包含：
a)完整的灭活酵母；和
b)Brachyury融合蛋白，其包含SEQ ID NO:10的位置2-415的氨基酸序列；
其中所述Brachyury融合蛋白由所述酵母表达；和
其中所述组合物引发Brachyury特异性T细胞应答。
29.权利要求28的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述融合蛋白具有SEQ IDNO:12的氨基酸序列。
30.酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其包含：
a)完整的灭活酵母；和
b)Brachyury融合蛋白，其包含SEQ ID NO:13的位置2-415的氨基酸序列；
其中所述Brachyury融合蛋白由所述酵母表达；和
其中所述组合物引发Brachyury特异性T细胞应答。
31.权利要求30的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述融合蛋白具有SEQ IDNO:15的氨基酸序列。
32.权利要求28-31中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述Brachyury融合蛋白的表达受到启动子CUP1的控制。
33.权利要求28-32中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述酵母来自酵母属。
34.权利要求28-33中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述酵母来自酿酒酵母。
35.权利要求28-34中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物，其中所述组合物在适合于施用至受试者的药学上可接受的赋形剂中配制。
36.治疗表达Brachyury的癌症的方法，其包括将权利要求1-35中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物施用至患有表达Brachyury的癌症的受试者。
37.在患有癌症的个体中减少、遏制、逆转、延迟或防止癌症转移性进展的方法，其包括将权利要求1-35中任一项的免疫治疗组合物施用至患有癌症的个体，所述癌症正在转移性进展、有转移性进展的风险或者预测要开始转移性进展。
38.预防或延迟表达Brachyury的癌症发作的方法，其包括将权利要求1-35中任一项的免疫治疗组合物施用至个体。
39.治疗脊索瘤的方法，其包括将权利要求1-35中任一项的免疫治疗组合物施用至患有脊索瘤的受试者。
40.权利要求36至39中任一项的方法，其中所述个体正使用或者已经使用另一种癌症疗法治疗。
41.权利要求40的方法，其中所述疗法选自：放射疗法、肿瘤的手术切除、化疗、靶向癌症疗法、过继性T细胞转移或一种或多种另外的免疫治疗组合物的施用。
42.减少或防止癌症患者中肿瘤细胞的化疗抗性或放射抗性的方法，其包括将权利要求1-35中任一项的免疫治疗组合物施用至患有癌症且正接受化疗和/或放射疗法的个体。
43.权利要求36至42中任一项的方法，其中所述方法减少个体中的肿瘤负荷、提高个体存活率和/或抑制个体中的肿瘤生长。
44.权利要求36至42中任一项的方法，其中所述癌症选自下组：乳腺癌、骨癌、脊索瘤、小肠癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、伯基特氏淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和它们的转移癌症。
45.治疗或预防与埃巴病毒(EBV)感染相关的疾病或状况的方法，包括将权利要求1-35中任一项的酵母-Brachyury免疫治疗组合物施用至个体。
46.权利要求1-35中任一项的免疫治疗组合物，其用于治疗表达Brachyury的癌症。
47.权利要求1-35中任一项的免疫治疗组合物，其用于减少、遏制、逆转或防止患有癌症的个体中的癌症的转移性进展。
48.权利要求1-35中任一项的免疫治疗组合物，其用于防止或延迟表达Brachyury的癌症的发病。
49.权利要求1-35中任一项的免疫治疗组合物，其用于减少或防止癌症患者中的肿瘤细胞的化疗抗性或放射抗性。
50.权利要求1-35中任一项的免疫治疗组合物在制备用于治疗表达Brachyury的癌症的药物中的用途。
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