KR20150132867A

KR20150132867A - 척색종에 대한 효모-기반의 면역치료

Info

Publication number: KR20150132867A
Application number: KR1020157030048A
Authority: KR
Inventors: 티모시 씨. 로델; 데이비드 아펠리언; 클라우디아 팔레나; 제프리 슈롬
Original assignee: 글로브이뮨; 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈
Priority date: 2013-03-19
Filing date: 2014-03-19
Publication date: 2015-11-26
Also published as: EP2976100A1; AU2014265873A1; TWI674108B; CN105228646A; US10507235B2; SG10201707608QA; CA2907560A1; JP2016516081A; AU2014265873B2; IL241384B; CN105228646B; EP2976100B1; SG11201507328RA; TW201936206A; CA2907560C; JP6509808B2; EP2976100A4; MX2015013380A; IL241384A0; HK1216861A1

Abstract

본 발명의 일 구현예는 척색종을 가진 개체에서 척색종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은, (a) 효모 비히클; 및 (b) 하나 이상의 브라큐리 (Brachyury) 항원을 포함하는 암 항원을 포함하는 면역치료 조성물을, 척색종을 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예는 척색종을 개체에서 척색종에 대한 효모 비히클 및 1종 이상의 브라큐리 항원을 포함하는 암 항원을 포함하는 면역치료 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 구현예는 효모 비히클을 포함하는 면역치료 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

척색종에 대한 효모-기반의 면역치료 {YEAST-BASED IMMUNOTHERAPY FOR CHORDOMA}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 35 U.S.C. 119(e)에 준거하여 2013년 3월 19일자 미국 가출원번호 61/803,332에 대해 우선권을 주장한다. 2013년 3월 19일자 미국 가출원번호 61/803,332의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

정부의 권리

본 발명은 보건 복지부의 산하 기관인 국립 보건원과의 공동 연구 개발 협정에 따라 창출되었다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 가진다.

공동 연구개발 협정에 대한 진술

본 발명은 2008년 5월 8일자로 서명된 공동 연구 개발 협정의 당사자에 의하여 또는 이를 대신하여 행하여졌다. 상기 공동 연구 개발 협정의 당사자들은 GlobeImmune, Inc. 및 국립 보건원의 기관, 센터 또는 분과인 국립 암 연구소를 대표하는 미국 보건 복지부이다.

서열목록에 대한 언급

본 출원은 EFS-Web에 텍스트 파일로서 전자 제출된 서열목록을 포함하고 있다. 파일명 "7797-2-PCT_ST25"으로 지칭되는 텍스트 파일은 76KB 크기이며, 2014년 3월 14일자로 등록되었다. 텍스트 파일에 포함된 정보는 37 CFR § 1.52(e)(5)에 준하여 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 전체적으로 척색종을 예방 및/또는 치료하기 위한 효모-기반의 면역치료 조성물 및 방법에 관한 것이다.

척색종은, 척색의 배아성 잔류물로부터 발생하는 척추의 원발성 희귀 골암으로서, 공격적이며, 국소 침습적이며, 예후가 좋지 않다 (Chugh et al., 2007, The Oncologist 12:1344-1350). 척색종은 여성 (40%) 보다는 남성 (60%)에서 발생 빈도가 더 높으며, 평균 진단 연령은 59세이며, 일반적으로 노화에 따라 점진적으로 증가한다 (McMaster et al., 2001, Cancer Causes Control 12: 1-11). 문헌들에 천미골 병변 성향을 가진 것으로 종종 잘못 언급되기도 하지만, SEER 데이타베이스의 400건에 대한 광범위한 집단 분석에서 척색종은 천골 (29.2%), 두개저 (32%) 및 이동성 척추 (mobile spine) (32.8%)에 거의 비슷하게 분포하는 것으로 나타났다 (McMaster et al., ibid.; Walcott et al. (2012) Lancet Oncol 13:e69-76). 이 연구에서, 전체 생존 중앙값은 6.29년이며, 5년, 10년 및 20년 생존율은 모든 인종과 성별에서 각각 68%, 40% 및 13%로 급락한다 (McMaster et al., supra). 그러나, 저자들은 22년 간의 조사에서 진단받은 후 치유된 환자의 생존성이 현저하게 개선되었음을 확인하였으며, 이는 외과적 및 방사성 기법이 개선된 결과인 것으로 추정하였다. 이후 (소규모) 4차례의 연구들에서도 이러한 추정이 뒷받침되었으며, 총 230명에서 5년 생존율과 10년 생존율이 각각 82% 및 57%이었다 (Ferraresi et al. (2010), BMC Cancer 10:22. (Table 4); Stacchiotti et al. (2010), Ann Surg Oncol 17(1):211-9).

미국의 척색종 발병률은 100,000명 당 0.08로, 미국의 매년 신생 발병 건수는 약 250건이다 (McMaster et al., supra; U.S. Census Bureau estimate of U.S. population (315,091,138) as of January 1, 2013). 유럽-27 (EU)의 발병률도 미국과 비슷하며, 유럽에서의 매년 신생 발병 건수는 약 400건이다 (Chordoma Foundation website, 2013; European Commission EuroStat database EU-27 population as of January 1, 2012 (503,700,000)). 평균 전체 생존 기간은 약 10년이며, 척색종의 유병률은 약 100만 분의 8이며, 미국은 약 2500건, 유럽은 4000건이다. 다른 지역에서는 척색종의 발병률과 유병률이 알려져 있지 않다.

척색종은 통증이 거의 없고 서서히 진행되기 때문에, 병기의 후기가 될 때까지 거의 대부분 임상적으로 징후가 나타나지 않는다. 척색종은 발현시 전형적으로 전이성이 아니며, 초기 발현시 폐, 뼈, 피부 및 뇌로의 전이율은 5%에 불과하다. 환자 생존율은 질환의 국소 진행에 의한 영향 보다 원거리 전이에 의한 영향을 적게 받는 것으로 보인다. 국소 진행이 사망을 예측하는 가장 중요한 예측인자인 것으로 드러나고 있으며, 일차 절제 정도가 치유 기회를 줄 수 있는 가장 중요한 인자가 되고 있다 (Walcott et al., supra).

신경 보존에 중점을 둔 공격적인 외과적 절제와 후속적인 보조적 방사선 치료가 이 질환의 표준 치료법이다. 수술 절제면이 넓은 공격적인 일괄 외과적 절제는 질환 재발의 국소 방제를 실질적으로 향상시킨다 (Hsieh et al. (2009), Spine 34:2233-39; Stacchiotti et al., supra; Tzortzidis et al. (2006), Neurosurgery 59(2):230-7). 그러나, 복합적인 종양 제거 자체는 만족스러운 치료 목표가 아니며; 수술 결과를 평가하는데 있어 환자의 신경 기능과 삶의 질을 보존하는데 우선하여야 한다. 수술 후 남아있는 종양은, 특히 종양의 크기가 작은 경우, 방사선 치료로 조치된다. 현재, 완전 절제는 천골 척색종의 약 50%에서 달성가능하며, 척추 및 두개저 척색종에서는 그 비율이 훨씬 더 낮다 (Walcott et al., supra). 표준-단독 방사선 치료는 효과가 없는 것으로 입증되고 있고, 하드론을 이용한 (광자가 아님) 보조적 방사선 치료가 5년 국소 방제율이 50-60%이어서, 수술만을 수행하는 것 보다는 추가적인 이점을 제공한다는 결론이 모아지고 있다 (Walcott et al., supra).

척색종은 이의 느린 증식 특성을 감안하여 예상되는 바와 같이 일반적으로 통례적인 화학요법에는 둔감하다 (Azzarelli et al. (1988), J Surg Oncol 37(3):185-91). 그러나, 한정된 사례의 보고들에서는 탈분화된 척색종이 공격적인 화학요법에 민감할 수도 있는 것으로 제시되었다 (Fleming et al. (1993), Cancer 72:714-18). 척색종의 분자 프로파일링을 통해, 이들 종양이 PDGF 수용체 A와 B, 뿐 아니라 KIT 수용체를 과다 발현하는 것으로 밝혀졌다. 그 결과, 이마티닙 및 서니티닙 등의 수종의 티로신 키나제 저해제가 척색종 환자들에서 시도되어 왔다. 지금까지 수득된 최상의 결과는 서니티닙에서 였으며, 척색종 환자의 44% (4/9)가 16주간 안정적인 질환 상태를 나타내었다 (Merriam et al. (2009), J Clin Oncol 27: 3154-60).

척추와 두개저 종양을 정확하게 진단하는 것이 중요하다. 브라큐리 (Brachyury)는 척색종을 식별하는 바이오마커가 되고 있다. 사이토케라틴 염색과 함께 사용하였을 때, 척색종 검출의 민감성 및 특이성은 각각 98% 및 100%이다 (Oakley et al. (2008), Mod Path 21, 1461-1469). 브라큐리는, "T"라고도 하며, 중배엽 전사인자로서, 초기 발생에서 그리고 후방 중배엽의 형성 및 분화와 척추동물에서의 축 발생에 중요한 역할을 하는, 유전자들의 T-박스 복합체의 일원이다 (예, Wilkinson et al., 1990, Nature 343(6259):657-659); Beddington et al., 1992, Development (Suppl.):157-165; Schulte-Merker et al., 1994, Development 120: 1009-1015; Kispert and Herrmann, 1994, Dev. Biol. 161:179-193; Showell et al., 2004, Dev Dyn 229:201-218). 최근 들어, 팔레나와 동료들이, 브라큐리가 다양한 인간 종양 조직들과 암 세포주들에서 발현됨을 입증하였다 (Palena et al., 2007, Clin. Cancer Res. 13(8):2471-2478). 페르난도 등의 연구에 따르면, 브라큐리가 인간 종양 세포에서 상피-간엽 이행 (EMT)을 촉진시켜, 종양 세포에 간엽 표현형 뿐 아니라 이주성 및 침습성 능력들을 부여해주며, 동시에 종양의 세포 주기 진행을 약화시킨다 (Fernando et al., 2010, J. Clin. Invest. 120(2):533-544). 즉, 브라큐리는 암이 전이성으로 진행되는데 관여한다. 그러나, 척색종에서, 브라큐리는 질환의 모든 단계들에서 보다 광범위하게 관여하는 것으로 보인다. 가족성 및 산발성 척색종을 가진 환자들에서, 연구를 통해 브라큐리의 공통 유전자 중복 (common gene duplication)이 동정되었다 (Yang et al., Nat Genet 2009; 41: 1176-78).

초기 치료에서 최선의 노력에도 불구하고, 대부분의 척색종은 재발하거나 또는 진행될 것이다. 모든 병변 위치들에서 사망율이 매우 높음에도 불구하고, 많은 환자들은 복합 재수술 (complex reoperation)을 선택하지만, 재발 병변에 대한 치료 프로토콜과 성과에 대한 보고는 거의 없다. 사전 방사선 치료는 종종 추후 안전한 방사선 치료의 가능성을 제한할 뿐만 아니라 후속적인 수술시 사망율을 높일 수 있다. 이에, 척색종을 치료하는데 적절한 개선된 치료제가 당해 기술 분야에 요구되고 있다. 또한, 가족성 척색종의 발병을 감안하면, 척색종을 예방하는 방법, 또는 가족성 척색종의 발병을 지연 또는 예후를 개선하는 방법이 당해 기술 분야에 요구되고 있다.

본 발명의 일 구현예는 척색종을 가진 개체에서 척색종의 치료 방법에 관한 것이다. 본 방법은, (a) 효모 비히클; 및 (b) 하나 이상의 브라큐리 항원을 포함하는 암 항원을 포함하는 면역치료 조성물을, 척색종을 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예는 척색종을 가진 개체의 척색종에 대한 효모 비히클 및 하나 이상의 브라큐리 항원을 포함하는 암 항원을 포함하는 면역치료 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 구현예는 척색종의 예방 또는 발병을 지연하기 위한, 효모 비히클 및 하나 이상의 브라큐리 항원을 포함하는 암 항원을 포함하는 면역치료 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에서, 개체는 절제불가한 국소 재발성 병변을 가진 개체이다. 일 측면에서, 병변의 국소 재발은 면역치료 조성물을 투여하기 전 3 내지 9개월 사이에 발생한다. 일 측면에서, 개체는 올리고-전이성 (oligometastatic) 질환을 가진 개체이다. 또 다른 측면에서, 개체는 절제불가 병변 또는 절제가능 병변이 1차 재발한 개체이다. 또 다른 측면에서, 개체는 전이성 질환을 가진 개체이다.

전술한 측면들 중 임의의 측면에서, 개체는 다른 암 치료요법으로 치료 중이거나 치료를 받은 적 있는 개체이다. 전술한 임의의 측면들에서, 치료요법은 방사선 요법이다. 방사선 요법은, 면역치료 조성물을 투여하기 전, 면역치료 조성물의 투여와 병용하여, 및/또는 면역치료 조성물의 투여와 순차적으로 투여될 수 있다. 전술한 임의의 측면들에서, 치료요법은 종양 절제를 포함할 수 있다. 전술한 임의의 측면들에서, 치료요법은 화학요법을 포함할 수 있다. 전술한 임의의 측면들에서, 치료요법은 약물 표적 요법을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 약물 표적 요법은 티로신 키나제 저해제, EGFR 저해제 및 STAT3 저해제로부터 선택된다. 전술한 임의의 측면들에서, 치료요법은 한가지 이상의 추가적인 면역치료 조성물의 투여를 포함한다. 일 측면에서, 추가적인 면역치료 조성물은 효모 비히클, 및 브라큐리 항원 이외의 항원을 포함한다. 또 다른 측면에서, 추가적인 면역치료 조성물은 효모 비히클, 및 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), 혈소판 유래 성장인자 (PDGF) 수용체, kit 수용체, CD24, II형 & X형 콜라겐, 파이브로넥틴, matrillin 3 (MATN3), 고분자량-흑색종 관련 항원 (HMW-MAA), 매트릭스 메탈로프로테나제 MMP-9 및 MMP-19로부터 선택되는 항원을 포함한다.

본 발명의 다른 측면은 가족성 척색종 병력을 가진 개체에서 척색종 예방, 척색종 발병 지연 또는 척색종 예후 개선 방법에 관한 것이다. 본 방법은 (a) 효모 비히클; 및 (b) 하나 이상의 브라큐리 항원을 포함하는 암 항원을 포함하는 면역치료 조성물을, 가족성 척색종 병력을 가진 개체에게, 투여하는 단계를 포함하며, 투여시 개체는 척색종으로 진단받지 않은 상태이다.

전술한 또는 본원의 도처에 기술된 본 발명의 임의의 구현예들의 일 측면 또는 측면들에서, 브라큐리 항원은 전장 인간 브라큐리 (full-length human Brachyury)이다. 일 측면에서, 브라큐리 항원은 전장 브라큐리가 아니다. 일 측면에서, 브라큐리 항원은 서열번호 6, 서열번호 18, 서열번호 2으로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 6, 서열번호 18 또는 서열번호 2와 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진다. 일 측면에서, 브라큐리 항원은 서열번호 6, 서열번호 18 또는 서열번호 2의 적어도 위치 1 또는 2번에서부터 255번 위치에서 C-말단 사이까지를 포함한다. 일 측면에서, 브라큐리 항원은 서열번호 6, 서열번호 18 또는 서열번호 2의 적어도 위치 1 또는 2번에서부터 430번 위치에서 C-말단 사이까지를 포함한다. 일 측면에서, 브라큐리 항원은 서열번호 6, 서열번호 18 또는 서열번호 2의 246번에서 254번까지를 포함한다. 일 측면에서, 브라큐리 항원은 서열번호 6, 서열번호 6의 2-435번 위치들 또는 서열번호 6과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 측면에서, 브라큐리 항원은 서열번호 18, 서열번호 18의 2-435번 위치들 또는 서열번호 18과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 측면에서, 브라큐리 항원은 서열번호 2, 서열번호 2의 2-435번 위치들 또는 서열번호 2와 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 측면에서, 브라큐리 항원은 서열번호 6, 서열번호 6의 2-435번 위치들 또는 서열번호 6과 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 측면에서, 브라큐리 항원은 서열번호 18, 서열번호 18의 2-435번 위치들 또는 서열번호 18과 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일 측면에서, 브라큐리 항원은 서열번호 2, 서열번호 2의 2-435번 위치들 또는 서열번호 2와 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

전술한 또는 본원의 도처에 기술된 본 발명의 임의의 구현예들의 일 측면 또는 측면들에서, 암 항원은 융합 단백질이다. 일 측면에서, 융합 단백질은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진다. 일 측면에서, 융합 단백질은 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 20과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진다.

전술한 또는 본원의 도처에 기술된 본 발명의 임의의 구현예들 또는 측면들에 대한 임의의 상기한 측면들에 있어서, 효모 비히클은 전효모 (whole yeast)이다. 임의의 전술한 측면들에서, 전효모는 사멸된 것이다. 전술한 측면들 중 임의의 한가지 측면에서, 전효모는 열에 의해 불활화된다. 전술한 측면들 중 임의의 한가지 측면에서, 효모는 항원을 발현한다. 전술한 측면들 중 임의의 한가지 측면에서, 효모는 사카로마이세스 (Saccharomyces), 칸디다 (Candida), 크립토코커스 (Cryptococcus), 한세눌라 (Hansenula), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아 (Pichia), 로도토룰라 (Rhodotorula), 시조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 및 야로이와 (Yarrowia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속으로부터 유래된다. 일 측면에서, 효모는 사카로마이세스로부터 유래된다. 일 측면에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된다.

전술한 또는 본원의 도처에 기술된 본 발명의 임의의 구현예들에 대한 임의의 상기한 측면들에 있어서, 조성물은 개체로의 주입에 의해 투여하기 적합한 약제학적으로 허용가능한 부형제 중에 제형화된다. 임의의 전술한 측면들에서, 개체는 면역치료 조성물을 약 0.1 Y.U. - 약 100. Y.U의 투여량으로 투여받는다. 임의의 전술한 측면들에서, 개체는 면역치료 조성물을 약 10 Y.U. - 약 80. Y.U의 투여량으로 투여받는다. 임의의 전술한 측면들에서, 개체는 면역치료 조성물을 2 Y.U., 40 Y.U. 또는 80 Y.U.의 투여량으로 투여받는다.

전술한 또는 본원의 도처에 기술된 본 발명의 임의의 구현예들에 대한 임의의 상기한 측면들에 있어서, 면역치료 조성물은 매주 투여된다. 임의의 전술한 측면들에서, 면역치료 조성물은 2주 간격으로 투여된다. 임의의 전술한 측면들에서, 면역치료 조성물은 매달 투여된다. 임의의 전술한 다른 측면들에서, 면역치료 조성물은 5주간 매주 투여된 후 매달로 투여된다. 전술한 임의의 측면들에서, 면역치료 조성물은 7회차 치료까지 2주 간격으로 투여된 후 매달 투여된다. 임의의 전술한 측면들에서, 면역치료 조성물은 개체에 2곳 이상에 투여되어 1회 투여량이 된다.

전술한 또는 본원의 도처에 기술된 본 발명의 임의의 구현예들에 대한 임의의 상기한 측면들에 있어서, 면역치료 조성물은 전술한 또는 도처에 기술된 바와 같이 다른 암 치료요법과 병용하여 투여된다.

도 1은 환자 7명에게 본원의 면역치료 조성물, 특히 GI-6301을 40 Y.U.로 투여하는 I상 확대 실험에서 개별 개체에서의 종양 측정값 변화를 나타낸 것이다. 0일 좌측 X 축 스케일은 0일 우측의 스케일과 상이하다.

본 발명은 일반적으로 효모-기반의 면역치료 조성물 및 효모-기반의 면역치료 조성물의 척색종 예방 및/또는 치료 용도에 관한 것이다. 본 발명은, 비제한적으로, 효모 비히클 및 브라큐리 항원 또는 이의 면역원성 도메인을 포함하는 효모-기반의 면역치료 조성물 (본원에서 "효모-브라큐리 면역치료제제" 또는 "효모-브라큐리면역치료 조성물"이라고도 함)을 비롯한, 효모-기반의 면역치료 조성물 (효모-기반의 면역치료제라고도 함)의 용도에 관한 것이다. 브리큐리를 표적하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 2012년 9월 30일에 공개된 PCT 공개 번호 WO 2012/125998에 상세히 기술되어 있으며, 이 문헌의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 발명자들은 본원에서 효모-기반의 면역치료제의 특수 용도를 기술하며, 본 발명의 일 측면에서, 척색종 (예, 고전적인 (또는 관례성), 연골형 또는 탈분화된 척색종)의 치료, 및/또는 척색종 (예, 가족성 척색종)의 예방 또는 발병 지연을 위한, 효모-기반의 브라큐리 면역치료제의 용도를 기술한다.

관례성 척색종이 가장 일반적인 타입의 척색종이다. 이는 연골성 또는 추가적인 간엽성 요소의 부재로 특정된다. 연골성 척색종은 척색종성 및 연골종성 특징들을 가지고 있으며, 두개저의 접형후두 (spheno-occipital) 영역에서 형성되는 경향이 있다. 2007년 현재, 이러한 변형은 전체 척색종의 5% - 15%를 차지하며, 두개 척색종의 최대 35%에 이른다. 탈분화 또는 육종 전환도 척색종의 2% - 8%에서 발생한다 (Chugh et al., 2007, The Oncologist 12:1344-1350). 연골종성 척색종은 관례성 척색종 보다 공격성이 약한 경향이 있으며, 탈분화된 척색종은 공격성이 보다 높으며, 신속하게 증식하며, 전이 가능성이 보다 높다 (www.chordomafoundation.org).

또한, 본 발명의 방법은 동일 효모 조성물에 추가적인 종양 항원의 사용, 척색종 종양 (본원에서는 병변으로도 언급됨)에 존재하는 다른 항원을 (순차적으로 또는 동시에) 표적하는 다른 효모-기반의 면역치료제와의 조합 사용, 또는 척색종의 다른 치료제/치료법과의 조합 사용을 위해 쉽게 변형가능하다. 척색종을 치료 또는 예방하는데 사용가능한 추가적인 종양 항원 및 추가적인 치료제/치료법은 아래에 상세히 기술된다.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 것으로 기술된 효모-기반의 면역치료 조성물은 선천적인 면역 반응 뿐만 아니라 CD4-의존성 TH17 및 TH1 T 세포 반응 및 항원-특이적인 CD8⁺ T 세포 반응 등의 타겟 항원 (예, 브라큐리)에 대한 후천적인 면역 반응을 유도하며, 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 포함하며, 독성 문제가 많은 외인성 보강제, 사이토카인 또는 기타 면역자극성 분자들을 사용하지 않는다. 아울러, 효모-기반의 면역치료 조성물은 조절성 T 세포 (Treg)의 수 및/또는 기능성을 저해함으로써, 예를 들어 종양 존재에 의해 통상적으로 억제될 수 있는 작동자 T 세포 반응을 강화한다. 또한, 항체 반응을 형성함으로써 면역화하는 면역치료 조성물과 비교해, 효모-기반의 면역치료에 의해 유발되는 항원-특이적, 포괄적 및 강력한 세포성 면역 반응이 종양 세포를 표적하는데 특히 효과적인 것으로 생각된다. 실제, 다수의 연구들에서, 종양 세포를 MHC 클래스 I 분자 측면에서 종양 펩타이드를 인지하는 CD8⁺ CTL을 통해 표적화하는 경우에, 면역치료 방식이 강화되는 것으로 밝혀지고 있다.

효모-기반의 면역치료는 항원 제시 세포를 활성화하는데 고도로 능숙하며, 면역 반응을 교차-촉매하는 독특한 능력을 가지고 있어, 억제 조건일 수 있는 상황에서도 전형적으로 종양에 효과적인 CD8⁺ CTL 반응을 구축한다. 이러한 타입의 면역치료는 항원 제시 세포가 관련 면역원을 제시하는 천연적인 능력을 활용하기 때문에, 작용제 에피토프가 후술한 면역 반응을 추가로 강화하기 위해 효모-기반의 면역치료 조성물에 포함될 수 있지만, 본 발명에 따른 효과적인 면역치료제를 만들기 위해 표적 항원 (예, 브라큐리)의 CTL 에피토프 또는 MHC 클래스 II 에피토프의 정확한 실체를 알아야 할 필요가 없다. 실제, 복수의 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 에피토프가 하나의 효모-기반의 면역치료 조성물에서 표적화될 수 있어, 본 발명의 효모-기반의 면역치료제는 짧은 펩타이드의 사용으로 한정되지 않으며, 실제 이들 조성물에 보다 긴 폴리펩타이드 및 융합 단백질을 사용하는 것이 효과적이다. 이에, 효모-기반의 면역치료제를 이용함으로써, 추정의 T 세포 에피토프를 동정하기 위한 알고리즘 및 복잡한 식의 사용이 생략된다.

아울러, 효모-기반의 면역치료는, 외인성 보강제, 면역자극성 물질 또는 분자, 공-자극성 분자 또는 사이토카인을 필요에 따라 포함시킬 수도 있지만, 이를 사용하지 않고도, 면역화 프로토콜 (예방 또는 치료)에 효과적으로 활용될 수 있다. 또한, 효모-기반의 면역치료는, 다른 타입의 면역치료에서 문제가 될 수 있는 효능 상실 없이, 반복적으로 투여할 수 있다.

척색종 치료 또는 예방 방법

본 발명의 일 구현예는 척색종을 가진 개인 (개체)에 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물을 투여함으로써 척색종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 척색종을 위한 효모-기반의 면역치료 조성물은 아래에 상세히 기술된다. 본원에서, 척색종을 "치료한다" 또는 이의 임의의 다른 배치 (예, "척색종 치료" 등)는, 일반적으로 척색종이 발병하면 (예, 일단 척색종이 개체에서 진단되거나 또는 검출되면) 또는 척색종이 재발하면, (치료 부재시와 비교하여) 개체에서 종양 크기 (tumor burden) 축소에 의해서와 같은 척색종의 한가지 이상의 증상 완화; 개체에서 종양 증식 또는 종양 증식 속도 (종양 증식 카이네틱스) 저해, 경감, 감소 또는 저하; 전체적인 생존율 및/또는 무진행성 생존율을 포함할 수 있는, 개체의 생존율 증가 또는 연장; (즉, RECIST 및/또는 하기에 정의된 Choi에 의한 측정시) 종양 반응 비율 (tumor response rate) 개선; 종양의 재발 지연, 저해, 정지 또는 방지; 다른 조직으로의 종양 이동 및/또는 종양 침습 (전이암) 발생 방지, 저해, 후퇴 또는 지연; 개체에서 암의 진행 정지, 방지, 저해, 후퇴 또는 지연; 척색종에 의해 발현되는 종양 항원(들)에 대한 장기간의 기억 면역 반응의 개선; 방사선 요법, 화학요법 및/또는 표적 약물 요법에 대한 병변의 민감성 증가; 및/또는 개체의 전반적인 건강 개선 등의, 한가지 이상의 치료 목표를 가지고, 본 발명의 조성물을 투여하는 8것을 의미한다. 본원에서, 척색종과 관련된 용어 "종양"은 용어 "병변"과 상호 호환적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 (예로, 생존율 증가, 암 진행 저해, 경시적인 종양 크기 축소 또는 통제 및/또는 화학요법 또는 방사선 치료에 대한 종양의 민감성 증가에 의해) 척색종을 예방, 척색종 발병을 저해 또는 지연, 또는 척색종의 예후 (outcome)를 개선시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 현재 척색종을 가지고 있지 않지만, 척색종 발병 소인이 있거나 있을 수 있는 개체에게 효모-기반의 면역치료 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 척색종 발병 소인이 있는 개체는 가족성 척색종 병력 (본원에서 가족성 척색종이라 함)을 가진, 따라서 전체 인구와 비교해 척색종 발병 위험성이 더 높은 개체를 포함할 수 있다. 또한, 척색종 발병 소인이 있을 수 있는 개체는 양성 척삭 종양의 유전자 스크리닝을 통해 동정하거나 또는 양성 척상 종양의 존재를 통해 동정할 수 있다. 가족성 척색종은 전형적으로 혈연 관계 2명 이상이 척색종 병력을 가지고 있는 가족에서 발생하는 척색종으로 동정된다 (Yang, X., et al. Int. J. Cancer. 116:487-491; 2005). 가족성 척색종의 일부 사례들에서, 독특한 브라큐리 유전자 중복이 발견되고 있다 (Yang, X., et al. Nat Gen. 2009, 41(11):1176-1178).

척색종을 "예방" 또는 척색종으로부터 "보호" 또는 임의 임의의 다른 배치 (예, "척색종의 예방" 등)는, 일반적으로, 척색종의 개시 또는 발병의 예방 또는 지연 또는 치료받은 이후에 척색종이 발생하더라도 비제한적인 예로 개체에서 종양 크기 축소 등의 치료 부재시와 비교해 개체에서 적어도 예후 개선; 개체에서 종양 증식 또는 종양 증식율의 저해 (경감, 감소, 저하); 전체 생존율 및/또는 무진행성 생존을 포함할 수 있는, 개체의 생존 증가 (연장); (즉, RECIST 및/또는 하기에 정의된 Choi에 의한 측정시) 종양 반응 비율 개선; 종양의 재발 지연, 저해, 정지 또는 예방; 다른 조직으로의 종양 이동 및/또는 종양 침습 (전이암) 발생 예방, 저해, 후퇴 또는 지연; 개체에서 암의 진행 정지, 예방, 저해, 후퇴 또는 지연; 척색종에 의해 발현되는 종양 항원에 대한 장기간의 기억 면역 반응의 개선; 방사선 요법, 화학요법 및/또는 표적 약물 요법에 대한 종양의 민감성 증가; 및/또는 개체의 전반적인 건강 개선 등의, 한가지 이상의 치료 목표를 가지고, 척색종이 발생 또는 발병되기 전에, 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 일반적으로 지칭한다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물을 이용한 치료는 치료받는 개체의 무진행성 생존 (PFS) 및/또는 전체적인 생존 (OS)을 개선시킨다. 암의 무진행성 생존은 일반적으로 암 치료 중 또는 암 치료 후, 치료 임상의와 암의 적정 평가 척도에 따른 평가시, 환자가 암을 가지고 있으며 생존하지만 암이 악화되지 않는 기간으로서 정의된다. 암의 전체적인 생존은 일반적으로 암이 진행 (악화) 여부와 상관없이, 진단일 또는 치료 개시일에서 시작해 환자가 여전히 생존하는 시간의 길이로서 정의된다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물을 이용한 치료는 종양 증식율 (종양 증식율 카이네틱스)을 낮춘다. 지수기 증식을 토대로 한 모델 (Yorke et al., 1993, Cancer Research　53, 2987-2993), 보편 법칙 모델 (the Universal Law model) (West et al., 2001, Nature　413, 628-631) 및/또는 "배가 시간 (doubling time)" (세포의 집단의 크기가 2배가 되는데 걸리는 시간; Spratt et al., 1964, Annals of surgery　159, 161-171; Steele et al., 1973, The Journal of thoracic and cardiovascular surgery　65, 140-151; Collins et al., 1956, The American journal of roentgenology, radium therapy, and nuclear medicine　76, 988-1000) 등의 다양한 모델을 이용해, 종양 증식율을 계산할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물을 이용한 치료는 즉, RECIST 또는 Choi 척도에 따른 측정시, 개체에서 반응 비율을 개선시킨다. "RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumor)"는 고형 종양의 반응 평가 척도로서, 암 환자에서 종양이 개선, 안정 또는 진행되는 경우를 정의하는 공개된 가이드라인 세트이다. RECIST-의거한 반응은 비-침습적인 이미징 평가에 의해 측정되는 표적 병변의 크기 변화에 따라 결정된다. RECIST 척도는 EORTC (European Organization for Research and Treatment of Cancer), 미국 국립 암 센터 (NCI) 및 캐나다 임상 실험 그룹의 국립 암 센터 등의 국제 협력에 의해 2000년 2월에 최초로 발표되었으며 (Therasse et al., J. Natl. Cancer Inst. 2000, 92:205-216)), Eisenhauer et al., Eur. J. Cancer, 2009, 45:228-247에 기술된 바와 같이 2009년에 개정되었다. 상기 Eisenhauer 문헌에 기술된 바와 같이, "완전 관해" 또는 CR은 현재 모든 표적 병변들이 소실되고 단축이 < 10 mm까지 감소된 임의의 (표적 또는 비-표적) 병리학적 림프절을 가지는 것으로 정의된다. "부분 관해" 또는 "PR"은 현재 베이스라인 직경 합을 기준으로 하여 표적 병변의 직경들의 합이 30% 이상 감소된 것으로 정의된다. "안정 질환" 또는 "SD"는 실험 중에 직경의 최저 합을 기준으로 하여, PR 상태까지의 충분한 퇴화도 아니고 PD 상태까지의 충분한 증가도 아닌 것으로 정의된다. "진행 질환" 또는 "PD"는 실험 중에 직경의 최저 합을 기준으로 하여, 표적 병변의 직경들의 합이 적어도 20% 증가로서 정의된다. 아울러, 합은 또한 5 mm 이상의 절대 증가를 나타내어야 한다. 하나 이상의 새로운 병변의 출현 역시 진행으로 간주된다. 상기 Eisenhauer 문헌에 기술된 바와 같이, 추가적인 척도는 비-표적 병변에 적용된다.

"Choi" 척도는 최초 Choi et al. (J. Clin. Oncol. 2007, 25(13):1753-1759)에 기술된 컴퓨터 단층촬영 반응 척도 (computed tomography response criteria) 세트를 의미하며, CT에 의해 측정되는 표적 병변의 크기 또는 밀도 변화를 평가한다. 또한, Choi 척도는 환자를 CR, PR, SD 및 PD 그룹으로 분류한다. CR은 모든 병변이 없어지고 새로운 병변이 없는 것으로 정의된다. PR은 CT에서 종양 크기의 >10% 감소 또는 종양 약화 (tumor attenuation)의 > 15% 감소가 발생되며, 새로운 병변이 없고 측정불가한 질환의 명백한 진행이 없는 것으로서 정의된다. SD는 CR, PR 또는 PD의 척도에 해당되지 않으며, 종양 진행으로 인한 증상 악화가 없는 것으로서 정의된다. PD는 CT에서 종양 크기의 >10% 증가 존재, 종양 약화에 의한 PR 척도에 부합되지 않으며, 및/또는 새로운 병변이 있는 것으로서 정의된다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물을 이용한 치료는 척색종에 의해 발현되는 종양 항원에 대해 장기 기억 면역 반응을 개선시킨다. 척색종 및 척색종 종양 항원에 대한 면역 반응은, 치료 시 CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포 출현 또는 확대의 검출, 및 말초혈 (CD8⁺ 기억/작동자 T 세포, CD4⁺ 기억/작동자 T 세포, Tregs, NK 세포, DC)에서 면역 세포 아종의 빈도 및 혈청내 사이토카인 (예, IFN-γ, IL-10, IL-12, IL-2, IL-4, TGF-β, 등) 수준 변화 등의, 전체적인 면역 활성화의 파라미터 측정에 의해, 평가할 수 있다. 면역 반응은, 비제한적인 예로, ELISpot 반응, 유세포 측정법 및 림프구 증식 분석 (LPA) 등의 당해 기술 분야에 공지된 다양한 면역 분석들을 이용해, 검출 및 평가할 수 있다.

전술한 바와 같이, 척색종은 브라큐리의 발현이 특징이며, 실제, 브라큐리는 이러한 암을 구별하는 바이오마커이며, 즉, 브라큐리 발현은 모든 척색종에서 공통적이며, 특이적인 바이오마커이다. 따라서, 일 구현예에서, 전술한 또는 도처에 기술된 본 발명의 임의 방법에 투여되는 효모 면역치료 조성물은 (본원에 아래에서 상세히 기술된) 효모-브라큐리 면역치료 조성물이다. 본 발명의 방법은, 척색종을 가진 개체 또는 현재 브라큐리-발현성 암 세포는 검출되지 않지만 척색종 발병 위험성이 있는 개체에게, 비제한적으로, (a) 효모 비히클; 및 (b) 하나 이상의 브라큐리 항원을 포함하는 암 항원을 포함하는, 본원에 기술된 효모-브라큐리 면역치료 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은, 비제한적으로 효모-브라큐리 면역치료 조성물 등의 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물을 개체 또는 개인에게 전달 (투여, 면역화)하는 것을 포함한다. 투여 과정은 생체외, 생체내에서 수행될 수 있으며, 전형적으로 생체내로 수행된다. 생체외 투여는, 조절 단계의 일부분을 환자의 외부에서 수행하는 것, 예를 들어, 본 발명의 조성물을 효모 비히클, 항원(들) 및 임의의 다른 제제 또는 조성물을 세포에 주입하는 조건 하에 환자에서 취한 세포 집단 (수지상 세포)에 본 발명의 조성물을 투여하고 이 세포를 환자로 회귀시키는 것을 의미한다. 본 발명의 치료 조성물은 임의의 적절한 투여 방식을 통해 환자에게 회귀시키거나 또는 환자에게 투여할 수 있다.

조성물의 투여는 전신, 점막 및/또는 타겟 부위의 근처 (예, 종양 부위 근처)일 수 있다. 적합한 투여 경로는 당해 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 다양한 허용가능한 투여 방법으로는, 정맥내 투여, 복막내 투여, 근육내 투여, 결절내 (intranodal) 투여, 관상내 (intracoronary) 투여, 동맥내 투여 (예, 경동맥내), 피하 투여, 경피 전달, 기관내 (intratracheal) 투여, 관절내 (intraventricular) 투여, 심실내 투여, 흡입 (예, 에어로졸), 두개강내, 척수내, 안내, 귀내, 비강내, 경구, 폐내 투여, 카테터 삽입 및 조직에로의 직접 주입을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 일 측면에서, 투여 경로는 정맥내, 복막내, 피하, 척수강재, 진피내, 결절내, 근육내, 경피, 흡입, 비강내, 경구, 안내, 관절내, 두개강내 및 척수내를 포함한다. 비경구 전달은 진피내, 근육내, 복막내, 늑막내, 폐내, 정맥내, 피하, 심방 카테터 및 정맥 카테터 경로를 포함할 수 있다. 귀내 전달은 점이제 (ear drop)를 포함할 수 있으며, 비강내 전달은 점비제 또는 비강내 주입을 포함할 수 있으며, 안내 전달은 점안제 (eye drop)를 포함할 수 있다. 에어로졸 (흡입) 전달은 또한 당해 기술 분야의 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다 (예, Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281, 1992). 일 측면에서, 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물은 피하 투여된다. 일 측면에서, 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물은 종양 환경 (tumor milieu)으로 직접 투여된다. 일 측면에서, 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물은 척수강내로 투여된다.

일반적으로, 효모-브리큐리 면역치료 조성물 등의 효모-기반의 면역치료 조성물의 적정 1회 투여량은, 적정 기간 동안 1회 이상 투여하였을 때, 한가지 이상의 항원 또는 에피토프 (예, 브라큐리)에 대한 항원-특이 면역 반응을 유발하는데 효과적인 양으로 환자 신체의 소정의 세포 타입, 조직 또는 영역에 효모 비히클 및 항원을 효과적으로 제공할 수 있는 투여량이다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명의 효모-기반의 조성물의 1회 투여량은 조성물이 투여되는 유기체의 체중 1 킬로그램 당 약 1 x 10⁵ 내지 약 5 x 10⁷의 효모 세포 당량 (yeast cell equivalent)이다. 일 측면에서, 본 발명의 효모 비히클의 1회 투여량은, 투여 당 (즉, 유기체 당) 약 0.1 효모 단위 (Y.U., 이는 효모 세포 1 x 10⁶개 또는 효모 세포 당량) 내지 약 100 Y.U. (세포 1 x 10⁹개), 예컨대, 세포 0.1 x 10⁶개 단위로 증가하는 상기한 범위내 임의 용량 (즉, 1.1 x 10⁶, 1.2 x 10⁶, 1.3 x 10⁶...)이다. 일 구현예에서, 투여량은 1 Y.U - 40 Y.U., 1 Y.U. - 50 Y.U., 1 Y.U. - 60 Y.U., 1 Y.U. - 70 Y.U., 또는 1 Y.U. - 80 Y.U.의 투여량이며, 일 측면에서, 10 Y.U. 내지 40 Y.U., 50 Y.U., 60 Y.U., 70 Y.U. 또는 80 Y.U.의 투여량이다. 일 구현예에서, 상기한 투여량은 개체의 여러 부위에 동일한 투약 기간 동안 투여된다. 예를 들어, 투여량 40 Y.U.은, 한번의 투약 기간 동안 개체의 4가지 부위에 각각 투여량 10 Y.U.를 주입함으로써 투여할 수 있거나, 투여량 20 Y.U.은, 동일한 투약 기간 동안, 개체의 4가지 부위에 각각 5 Y.U. 투여량씩 주입하거나 또는 개체의 2가지 부위에 각각 10 Y.U. 투여량씩 주입함으로써 투여할 수 있다. 본 발명은 개체의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10곳 이상의 여러 부위에 효모-기반의 면역치료 조성물의 양 (예, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 Y.U. 또는 그 이상)의 투여를 포함하여, 1회 투여량이 된다. 1 효모 단위 (Y.U.)는 1 x 10⁷ 효모 세포 또는 효모 세포 당량이다.

본 발명의 면역치료 조성물의 "부스터 (booster)" 또는 "부스트 (boost)"는, 예를 들어, 항원에 대한 면역 반응이 특정 항원 또는 항원(들)에 대한 면역 반응을 제공하거나 기억 반응(memory response)을 유도하는 것이 요구되거나 필요한 경우에 투여된다. 부스터는, 치료받는 개체의 상태와 투여시의 치료요법의 목표 (예, 예방, 활성 치료, 유지)에 따라, 최초 투여 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주 간격으로, 매달, 2달에 한번, 분기별로, 매년 또는 수년간 투여할 수 있다. 일 구현예에서, 투여 스케줄은, 효모-기반의 면역치료 조성물의 투여량들이 수주, 수개월 또는 수년의 기간 동안 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 횟수로 투여되는, 스케줄이다. 일 구현예에서, 투여량은, 매주 또는 2주 마다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 횟수로 투여되며, 이후 척색종의 원하는 예방적 또는 치료적 치료를 달성하기 위한 필요에 따라, 2주 또는 매주로 투여된다. 일 구현예에서, 투여량은, 2주 간격으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 횟수로 투여하며, 바람직한 예방 또는 치료 결과가 달성될 때까지 추가적으로 매주 투여로 투여된다. 일 구현예에서, 투여량은, 매달 마다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 횟수로 투여되며, 이후 척색종의 원하는 예방적 또는 치료적 치료를 달성하기 위한 필요에 따라, 추가적으로 매달 투여하거나 또는 여러가진 빈도로 투여량 전달이 이행된다. 본원에 언급된 모든 투약 프로토콜들에서, 이후 추가적인 부스터가 필요에 따라 유지 또는 관해 요법과 유사한 또는 보다 긴 간격 (예, 수개월 또는 수년)으로 제공될 수 있다. 일 측면에서, 부스터는 장기간의 유지 요법을 위해 (즉, 주 치료 코스가 완료된 후, 질환 재발 방지 또는 지연 의도로 또는 질환 안정화를 유지하고자 하는 의도로) 투여된다. 일 측면에서, 부스터는 가족성 척색종을 가진 개체에서 예방학적 치료를 위해 투여된다.

척색종 치료 방법에 대한 일 측면에서, 개체는 척색종 치료에 이용가능한 하나 이상의 다른 치료 화합물 또는 치료 프로토콜을 이용하여 추가적으로 치료된다. 이러한 치료요법은, 척색종 치료에 사용가능하거나 또는 척색종 치료에 사용가능할 수 있는 임의의 치료 프로토콜 또는 임의의 치료 화합물 또는 물질을 포함할 수 있으며, 그 예로는, 비제한적으로 수술 절제, 방사선 요법 (비제한적으로, 독립형 방사선 요법 및 보조적 방사산 요법, 특히 하드론을 이용한 방사선 요법), 화학 요법 또는 표적 암 또는 약물 요법 (예, 티로신 키나제 저해제, 비제한적인 예로, 이마티닙, 서니티닙 (Sunitinib), 세투시맵 (cetuximab), 게피티닙 (gefitinib), 에를로티닙 (Erlotinib), 닐로티닙 (nilotinib), 다사티닙 (dasatinib), 라파티닙 (lapatinib) 및 에베롤리무스 (everolimus); STAT3 저해제, 안트라사이클린 (anthracycline); 시스플라틴 (cisplatin); 알킬화제; 캄프토테신 유사체 (camptothecin analogues)), 줄기 세포 트랜스퍼, 사이토카인 요법, 입양 T 세포 트랜스퍼 및/또는 제2 면역치료 조성물의 투여를 포함한다. 제2 면역치료 조성물의 투여 경우에, 이러한 조성물은, 비제한적으로, 추가적인 효모-기반의 면역치료, 재조합 바이러스-기반의 면역치료 (바이러스 벡터), 면역자극 요법 (면역자극 특성을 가진 화학요법이 포함됨), DNA 백신 및 그외 면역치료 조성물을 포함할 수 있다.

일 측면에서, 방사선 요법은 본 발명의 면역치료 조성물의 투여 전, 투여와 동시에 및/또는 투여와 순차적으로 투여될 수 있다. 또한, 방사선 요법은 외과적 절제와 조합하여 투여될 수 있다. 방사선 기술 및 치료의 진보로, 방사선을 보다 높은 조사량으로 사용하여 병변을 보다 전략적으로 표적화할 수 있다. 아울러, 하드론 도입 (즉, 고-용량 프로톤 또는 하전된 입자, 예로, 탄소 이온, 헬륨 또는 네온)과 같은 진보로, 주변 조직에 대한 손상은 최소화하고 방사선에 의해 생물학적 효과를 개선시키면서, 방사선이 보다 고용량 (정상 조직을 영구적으로 손상시킬 수 있는 용량)으로 표적부에 전달된다 (Walcott, B. The Lacent Oncology, Vol 13 Feb 2012, p. e69-e79). 예를 들어, 천골 척색종에 대한 탄소 이온 방사선요법을 이용한 후향적 분석에서는 52.8 - 73.6 GyE의 용량이 보고되었다 (Imai et al., 2011, J. Radiol., 84:S048-S054). 척색종 환자에게는 프로톤 (수소 원자로부터 수득되는 하전된 입자)을 이용하는 프로톤 빔 요법으로 지칭되는 다른 타입의 방사선이 가장 많이 권고되는데, 그 이유는 불과 mm 떨어진 조직으로의 조사는 최소화하면서 종양에 매우 높은 조사량의 방사선을 전달할 수 있기 때문이다 (Wilson, Radiology, 1946, 47:487-491; 및 Hug et al., 1999, J. Neurosurgery　91, 432-439 (1999)). 프로톤 빔 전달은, 방사선 에너지가 조직내 최대 프로톤 침투 포지션에 증착되도록 개별 종양에 맞춤 설계되며, 표적부 이외의 정상 조직으로의 방사선 조사는 거의 이루어지지 않는다. 전형적으로 외부 방사선 치료에 의해 전달되는 프로톤 방사선, 예를 들어, 전자기 방사선이 척색종 치료에 사용된다. 척색종 치료에 사용되는 고용량의 프로톤 방사선은 약 45-80 Gy일 수 있으며, 반면 통상적인 방사선 치료를 이용한 치료에서는 용량이 전형적으로 약 40-60 Gy이다 (Walcott, B. The Lacent Onccology, Vol 13 Feb 2012, p. e69-e79). (감마 나이프 및 사이버나이프 등의) 방사선 수술 등의 다른 특정 타입의 공초점 방사선과 세기조절 방사선 치료 (intensity modulated radiotherapy, IMRT)도 척색종 치료에 사용되며, 이의 사용은 전형적으로 종양의 크기와 위치에 좌우된다 (Di Maio et al., 2011, J Neurosurg.　 Dec;115(6):1094-105). 만일 1차 방사선 치료 후 병변이 회복되면, 방사선 치료를 다시 수행하는 것이 가능할 수 있거나 가능하지 않을 수 있다. 이는, 체내 모든 조직이 방사선에 대해 일정한 생애 최고 허용치가 있어, 그 수준을 넘어서게 되면 심각한 손상이 발생할 것이기 때문이다. 그러나, 치료 임상의와 현행 최적 실무 (best practices)에 따라 가능하며 척색종 환자에 유익할 가능성이 높다고 간주되는 경우에는, 병변에 대한 추가적인 방사선 치료가 프로토콜에 포함될 수 있다.

일 측면에서, 방사선 치료는, 본 발명의 면역치료 조성물을 개체에게 투여하기 전, 약 18개월, 약 17개월, 약 16개월, 약 15개월, 약 14개월, 약 13개월, 약 12개월, 약 11개월, 약 10개월, 약 9개월, 약 8개월, 약 7개월, 약 6개월, 약 5개월, 약 4개월, 약 3개월, 약 2개월 또는 약 1개월 이내에 하나 이상의 병변에 실시된다. 방사선 치료하는 동안에, 개체는 방사선 치료를 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상, 6회 이상, 7회 이상, 8회 이상, 9회 이상 또는 10회 이상 받을 수 있다. 또한, 면역치료 조성물을 1차 투여한 후, 개체에게 방사선 치료를 1회 이상 실시할 수 있다.

다른 측면에서, 개체는 표적 약물 요법을 단독으로 제공받거나 또는 방사선 치료의 실시 전에, 동시에 또는 순차적으로 함께 제공받을 수 있다. 이러한 표적 약물 요법은 한가지 이상의 티로신 키나제 (TKI) 저해 약물, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 저해 약물 및/또는 STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3) 저해 약물의 투여를 포함한다 (Walcott, B. The Lacent Onccology, Vol 13 Feb 2012, p. e69-e79). 예를 들어, 혈소판 유래 성장인자 수용체 (PDGFR)의 키나제 도메인에 대해 특이성을 가진 소분자 TKI 저해 약물인 이마티닙 메실레이트 (Gleevec^®)을 400 mg/day - 800 mg/day으로 개체에게, 전형적으로 경구 투여로서 투여할 수 있다. RECIST에 의해 정의되는 전체적인 종양 반응 비율을 모니터링하여, 개체가 치료요법에 반응성인지를 확인할 수 있다. 이마티닙 메실레이트는 수일에서 수년간 개체에게 투여될 수 있다 (Stacchiotti, S., et al. Curr Oncol Rep, May 2011 online; Casali, P.G., J Clinical Oncology, 2005 ASCO Annual Meeting Proceedings, Vol. 23. No. 16S). 표적 약물 요법의 다른 예로는, EGFR 저해 약물인 에를로티닙 (Erlotinib) (Tarceva^®)을 전형적으로 경구 투여로서 150 mg/day의 투여량으로 투여하는 것을 포함한다 (Lauay et al. BMC Cancer, 2011, 11:423). 에를로티닙은 전체적인 종양 비율을 모니터링하면서 수일 내지 수년간 투여될 수 있다. 표적 약물 요법은 단독으로 수행하거나 또는 다른 표적 약물 요법과 조합하여 수행될 수 있으며, 또는 다른 약물 요법을 투여하기 전, 투여와 동시에 또는 투여와 순차적으로 행해질 수 있다.

일 측면에서, 제2 면역치료 조성물은 브라큐리 항원을 포함하지 않는 제2 암 항원을 포함한다. 예를 들어, 효모-브라큐리 면역치료 조성물과 조합 사용가능한 제2 면역치료 조성물은 다른 암 항원을 포함하는 효모-면역치료 조성물이다. 척색종 종양과 관련있거나 척색종 종양에서 관찰되는 암 항원이 특히 본 발명에서 항원 표적으로서 흥미롭다. 이러한 암 항원으로는, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) (예, Harris et al., Breast Cancer Res. Treat, 29:1-2 (1994); 혈소판 유래 성장인자 (PDGF) 수용체 (예, GenBank^® 등재번호 GI:129890 및 Gronwald et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (10), 3435-3439; 및 GenBank^® 등재번호 GI:129892 및 Claesson-Welsh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (13), 4917-4921); kit 수용체 (예, 등재번호 GI:125472 및 Yarden et al., 1987, EMBO J. 6 (11), 3341-3351); CD24 (예, GI:143811372 및 Kay et al., 1991, J. Immunol. 147 (4), 1412-1416 ); 어그레칸 (aggrecan) (예, 등재번호 GI:22209083 및 Strausberg et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903); II형 & X형 콜라겐 (예, 등재번호 GI:124056489 및 Su et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17 (22), 9473; 등재번호 GI:1405723 및 Beier et al., 1996, Matrix Biol. 15 (6), 415-422); 파이브로넥틴 (fibronectin) (예, 등재번호 GI:384872704 및 Labeit and Kolmerer, 1995, Science 270 (5234), 293-296 (1995)); 마트릴린 (matrillin) 3 (MATN3) (예, 등재번호 GI:14548113 및 Belluoccio et al., 1998, Genomics 53 (3), 391-394); 고분자량-흑색종 관련 항원 (HMW-MAA) (예, 등재번호 GI:47419930 및 Campoli et al., 2004, Crit Rev Immunol. 24(4):267-96); 매트릭스 메탈로프로테나제 MMP-9 (예, 등재번호 GI:269849668 및 Huhtala et al., 1991, J. Biol. Chem. 266 (25), 16485-16490); 및 MMP-19 (예, 등재번호 GI:442535505 및 Sedlacek et al., 1998, Immunobiology 198 (4): 408-23); 뿐 아니라 이들 항원의 변형체, 이들 항원의 스플라이스 변형체 및 이들 항원의 에피토프 작용제, 및 이들 항원의 조합 및/또는 이의 면역원성 도메인, 이의 변형체 및 이의 변이체를 포함할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 다른 암 항원들은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 또한 척색종 면역치료에 적절한 표적 항원일 수 있다. 본 발명은 상기에 기술되거나 본원 도처에 기술된 항원들로 한정되지 않는다.

본 발명의 일 측면에서, 하나 이상의 추가적인 치료제 또는 치료 프로토콜이 수행되거나, 또는 효모-기반의 면역치료 조성물의 투여와 순차적으로 및/또는 동시에 수행된다 (예, 종양의 외과적 절제, 방사선 치료의 실시, 화학치료제 또는 표적 암 치료 실시, 다른 면역치료 조성물 또는 프로토콜의 실시, 사이토카인 요법, 입양 T 세포 트랜스퍼, 효모-기반의 면역치료와 조합 사용가능한 물질 또는 줄기 세포 이식). 본 발명에 따른 효모-기반의 면역치료 조성물과 조합하여 사용가능한 물질로는, anti-CD40, CD40L, 림프구-활성화 유전자 3 (LAG3) 단백질 및/또는 IMP321 (LAG3의 용해성 형태로부터 유래된 T-세포 면역자극성 인자), anti-CTLA-4 항체 (예, 아네르기 T 세포를 방출하기 위함); T 세포 공-자극인자 (예, anti-CD137, anti-CD28, anti-CD40); 알렘투주맵 (alemtuzumab) (예로, CamPath®), 데니루킨 디프티톡스 (Denileukin diftitox) (예로, ONTAK®); anti-CD4; anti-CD25; anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-PD-L2; FOXP3를 차단하는 물질 (예로, CD4+/CD25+ T 조절성 세포의 활성을 없애거나/사멸시키기 위함); Flt3 리간드, 이미퀴모드 (imiquimod) (Aldara^TM), Toll-유사 수용체 (TLR) 작용제, 비제한적인 예로, TLR-2 작용제, TLR-4 작용제, TLR-7 작용제 및 TLR-9 작용제; TLR 길항제, 비제한적인 예로, TLR-2 길항제, TLR-4 길항제, TLR-7 길항제 및 TLR-9 길항제; 항염증제 및 면역조절제, 비제한적인 예로, COX-2 저해제 (예, 셀레콕십 (celecoxib), NSAIDS), 글루코코르티코이드, 스타틴, 탈리도마이드 및 이들의 유사체, 예, IMiDs^® (탈리도마이드의 구조 및 기능 유사체임 (예, REVLIMID^® (lenalidomide), POMALYST^® (pomalidomide)) 및 항원-제시 세포 또는 TH17, TH1 및/또는 Treg 세포의 수를 조절하거나, 활성화 상태를 조절하거나, 및/또는 생존을 조절하는 임의의 물질이 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 이들 물질들의 임의 조합이 본 발명에 포함되며, 효모-기반의 면역치료와 조합되거나 또는 프로토콜에서 함께 (예, 동시에, 순차적으로, 또는 다른 형태로) 투여되는 상기한 임의의 물질은 본 발명에 포함되는 조성물이다. 이러한 물질들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이들 물질은 단독으로 사용할 수 있거나 또는 본원에 기술된 다른 물질과 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 한가지 이상의 치료가 효모-기반의 면역치료 조성물의 1차 투여 전에 또는 1차 투여 이후에 투여되거나 수행될 수 있다. 일 예로서, 절제가능한 척색종을 가진 개체의 경우, 외과적으로 절제하고, 선택적으로 방사선 치료한 다음 효모-기반의 면역 치료를 수행하는 것이 치료요법의 코스일 수 있다. 일 구현예에서, 하나 이상의 치료는 효모-기반의 면역치료 조성물의 투여와 교차하는 방식으로 투여 또는 수행될 수 있으며, 예를 들어, 효모-기반의 조성물이 규정된 주기로 투여되고, 그 사이에 화학요법 또는 다른 표적 치료가 1회 이상 연속 투여된다. 다른 예로서, 국소 재발성 척색종을 가지고 있거나 또는 전이성 질환을 가지고 있으며, 종양 진행이 앞서 12개월 이내에 발생하거나 또는 치료 개시 전 3-9개월 이내에 진행된 개체의 경우, 효모-기반의 면역치료가 치료요법의 1차 코스일 수 있다. 효모-기반의 면역치료를 이용한 치료를 개시하기 전에, 또한 개체는 수술, 방사선 치료 또는 다른 척색종 치료요법을 받을 수 있다. 효모-기반의 면역치료를 개시한 후 약 6개월 이후에 (또는 치료 의사에 의해 결정된 적정 시기에), 선택적으로, 개체가 방사선 치료 가능한 병변을 가지고 있는 것으로 결정된다면 방사선 치료가 행해질 수 있으며, 그런 후 치료에 대한 종양 진행, 또는 부분 또는 완전 관해가 확인될 때까지 모니터링할 수 있다. 추가적인 방사선 치료가 행해지지 않는 경우, 개체는 치료에 대한 종양 진행, 또는 부분 또는 완전 관해가 확인될 때까지 모니터링될 수 있다.

일 구현예에서, 효모-기반의 면역치료 조성물은 추가적인 치료요법을 착수하기 전 일정 기간 동안 1회 이상 투여된다. 즉, 효모-기반의 면역치료 조성물이 단일요법으로서 일정 기간 투여된 후, 추가적인 치료요법 (예, 화학요법)이 효모-기반의 면역치료제의 새로운 투여와 동시에 또는 효모-기반의 면역치료제와 교대로 제공되는 방식으로 추가된다. 다른 예로 또는 추가적으로, 다른 치료요법이 효모-기반의 면역치료 조성물의 투여를 개시하기 전에 일정 기간 동안 수행될 수 있으며, 컨셉들이 조합될 수 있다 (예, 종양을 외과적으로 적출한 다음 수 주간 효모-기반의 면역치료를 이용한 단일요법을 수행하고, 이후 수개월 또는 수주간 화학요법 또는 표적 요법과 효모-기반의 면역치료를 교대로 행하며, 선택적으로 이후 효모-기반의 면역치료 또는 다른 치료요법을 단일 요법으로 행하거나 또는 순차적, 동시 또는 교대로 행하는 방식으로 제공되는 치료 요법의 새로운 조합 프로토콜이 행해짐). 효모-기반의 면역치료를 이용하여 척색종을 치료하는 다양한 프로토콜들은 본 발명에 포함되며, 이들 예들은 다양한 가능한 프로토콜의 비제한적인 예로서 간주되어야 한다.

본 발명의 방법에서, 본 발명의 면역치료 조성물로 치료받을 개체는 절제불가한 병변 (즉, 외과적으로 완전히 제거할 수 없음) 또는 절제가능한 병변이 1차 발생한 척색종 개체; 1차 재발 여부에 상관없이, 절제불가하며 국소 재발된 병변 (즉, 국소 재발은 제거된 오리지날 또는 1차 병변과 동일한 장소 (또는 그 근처) 주변에 다시 발생한 병변임)을 가진 개체; 후술한 올리고-전이성 질환을 가진 개체; 또는 후술한 전이성 질환을 가진 개체일 수 있다. 일 측면에서, 개체는 앞서 방사선 치료, 수술 및/또는 표적 약물 요법을 받은 적이 있거나, 없을 수 있다. 다른 측면에서, 병변은 이전에 방사선 치료를 받은 적이 있거나, 없을 수 있다.

본 발명의 방법에서, 본 발명의 면역치료 조성물로 치료받을 척색종 개체의 일 예는, 절제불가한 (즉, 외과적으로 완전히 제거할 수 없음) 국소 재발 병변 (즉, 국소 재발은 제거된 오리지날 또는 1차 병변과 동일한 장소 (또는 그 근처) 주변에 다시 발생한 병변임)을 가진 개체이다. 일 측면에서, 절제불가한 병변은 기존에 방사선 치료 받지 않은 병변이지만, 개체는 본 발명의 면역치료 조성물로 치료받기 전에 다른 병변에 대한 방사선 치료에 노출된 적 있거나 또는 없을 수 있다. 또 다른 측면에서, 절제불가한 병변은 본 발명의 면역치료 조성물로 치료받기 전에 앞서 방사선 치료를 받은 적이 있다. 다른 구현예에서, 개체는 병변의 위치로 인해 절제는 불가능하지만, 척색종에 대한 한가지 이상의 추가적인 치료학적 치료를 받을 수 있는, 병변을 가진 개체이다.

본 발명의 방법에서, 본 발명의 면역치료 조성물로 치료받을 척색종 개체의 다른 예는, 올리고-전이성 질환을 가지고 있으며 절제불가한 병변을 가진, 개체이다. 본원에서, "올리고-전이성 질환"은 종양의 제한적인 전이 능력으로서 정의되며, 또는 보다 구체적으로, 전이가 수 및 위치 측면에서 제한적인 전이암 (최초 원발성 부위에서 다른 부위로 전파된 암)으로서 정의된다 (예, Hellman and Weichselbaum, 1995, J. Clin. Oncol. 13(1):8-10; Weichselbaum and Hellman, 2011, S. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 378-382). 척색종과 관련하여, 올리고-전이성 질환은 일반적으로, 원발성 병변 부위 근처에 발생한 병변이 5곳 이하, 4곳 이하, 3곳 이하, 2곳 또는 1곳인 것으로 간주된다. 일 측면에서, 절제불가한 병변은 앞서 방사선 치료를 받진 않았지만, 개체는 본 발명의 면역치료 조성물로 치료하기 전에 다른 위치에서 방사선 치료에 노출된 적 있거나 또는 없을 수 있다. 또 다른 측면에서, 절제불가한 병변은 본 발명의 면역치료 조성물을 이용한 치료 전에 이미 방사선 치료를 받은 적 있는 병변이다.

본 발명의 방법에서, 본 발명의 면역치료 조성물을 이용하여 치료할 척색종 개체의 다른 예는, 올리고-전이성 질환을 가지고 있으며, 병변을 절제받은 (즉, 병변을 외과적으로 제거한 후 모니터링 중임) 개체이다. 일 측면에서, 개체는 기존에 방사선 치료를 받지 않은 개체이다. 다른 측면에서, 개체는 앞서 방사선 치료를 받은 개체이다.

본 발명의 방법에서, 본 발명의 면역치료 조성물을 이용하여 치료할 척색종 개체의 다른 예는, 절제불가한 병변이 1차 발생한 개체이다. 일 측면에서, 절제불가한 병변은 앞서 방사선 치료를 받은 적 없지만, 개체는 본 발명의 면역치료 조성물을 이용한 치료 이전에 다른 위치에서 방사선 치료를 받은 적 있거나 받은 적 없을 수 있다. 또 다른 측면에서, 절제불가한 병변은 본 발명의 면역치료 조성물을 이용한 치료 이전에 이미 방사선 치료를 받은 적 있는 병변이다.

본 발명의 방법에서, 본 발명의 면역치료 조성물을 이용하여 치료할 척색종 개체의 다른 예는, 전이성 질환 (즉, 암이 최초 발생한 장소 또는 원발성 부위에서 신체의 다른 부위로 퍼짐, 이는 오리지날 또는 원발성 종양으로부터 유래되는 세포를 암이 함유하는 특징을 가짐)을 가지고 있으며, 앞서 방사선 치료를 받은 적 없는 병변을 가진, 개체이다. 다른 측면에서, 병변은 기존에 방사선 치료를 받은 적 있다.

본 발명의 방법에서, 본 발명의 면역치료 조성물을 이용하여 치료할 척색종 개체의 다른 예는, 본 발명의 면역치료 조성물을 이용한 치료를 개시하기 전 3개월 - 9개월 사이에 종양이 진행된 국소 재발성 또는 전이성 질환을 가진 개체이다. 일 측면에서, 개체는, 비제한적인 예로, 수술, 방사선 치료, 화학요법 또는 표적 약물 요법을 이용한 치료 등의, 척색종에 대한 임의의 허용가능한 치료 코스를 받은 적이 있을 수 있다. 개체는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료 조성물을 제공받는다. 면역치료 조성물의 투여 개시 후 6개월째에, 개체는 방사선 치료가능한 병변이 있는지를 확인하기 위해 케어 제공자로부터 평가를 받는다. 만일 병변이 방사선 치료가 가능하다면, 병변에 방사선 치료가 행해질 것이며, 개체는 개체가 후술한 면역치료 조성물에 반응하는 것으로 간주될 때까지 모니터링되고 평가받게 될 것이다. 만일, 병변에 대한 방사선 치료가 불가능하다면, 개체는 방사선 치료를 받지 않으며, 개체가 면역치료 조성물에 반응하는 것으로 간주될 때까지 모니터링되고 평가받게 될 것이다. 개체는, RECIST에 의해 정의되는 무진행성 생존 (PFS) 판단 뿐 아니라 종양 반응 비율 (RECIST 및 Choi에 의해 정의됨, 비교를 위해 방사선 치료받은 병변과 치료받지 않은 병변에서 조사함) 및/또는 종양 증식 속도 카이네틱스 (면역치료하기 6개월 전 평가 대 면역치료 후 6개월 이후 평가)에 의해, 면역치료 조성물에 대한 반응을 검토받는다. PFS의 경우, 무처리 대조군 개체와 비교하여 (5개월 예상됨) 중앙값이 9개월일 것으로 예상된다. 면역치료 조성물에 대한 개체의 반응은, 동일한 방식으로 치료 중이지만 면역치료 조성물이 추가되지 않거나 또는 방사선 치료, 수술 절제, 표적 약물 요법 또는 이들의 조합과 같은 제2선 치료와 면역치료 조성물이 조합되지 않은, 개체에서와 비교될 수 있다.

본 발명의 면역치료 조성물로 치료받을 수 있는 개체는, 다음 중 한가지 이상을 가진 개체를 포함할 수 있다: 고형 종양, 측정가능한 질환 (질환은 평가가능하여야 함) 또는 비-측정가능한 질환의 존재, 고도로 민감한 방법 (예, 순환성 종양 세포에 대한 PCR 기반의 분석 또는 다른 유사 방법), ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) 상태 등급 0-1 (0 등급은 제한없이 병에 걸리기 전의 활동을 모두 수행할 수 있는 모든 활동 가능인 것을 의미하며, 1 등급은 육체적으로 힘든 활동에는 제한적이지만 걸을 수 있으며 경미하거나 앉아서 하는 일은 가능한 상태를 의미함), 크레아티닌 수준 </- 1.5xULN (정상치의 상한), ALT 수준 (알라닌-아미노트랜스퍼라제) </- 2.5xULN, AST 수준 (아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제) </- 2.5xULN, 빌리루빈 (Bili) 수준 </- 1.5xULN, 절대 호중구 카운트 (ANC) > 1500, 혈소판 카운트 > 100,000, 사전 화학요법 치료로부터 최소 2주, 사전 면역요법으로부터 최소 2주 또는 이들의 조합.

본 발명의 방법에서, 조성물 및 치료 조성물은 임의의 척추동물 등의 임의의 동물, 특히 척추동물 강, 포유류에 속하는 임의 구성원, 비제한적인 예로서, 영장류, 설치류, 가축 및 애완 동물에 투여할 수 있다. 가축은 소비되거나 유용한 생산물을 생산하는 동물 (예, 울 제품을 생산하는 양)을 포함한다. 치료 또는 예방할 포유류는 인간, 인간을 제외한 영장류, 개, 고양이, 마우스, 랫, 염소, 양, 소, 말 및 돼지를 포함한다.

"개체"는 척추동물, 예컨대, 포유류, 비제한적인 예로서 인간이다. 포유류는, 비제한적인 예로서, 농장 동물, 스포츠 동물, 애완 동물, 영장류, 마우스 및 랫을 포함한다. 용어 "개체"는 용어 "동물", "대상" 또는 "환자"와 상호 호환적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 조성물

본 발명의 방법은 효모-기반의 면역치료 조성물, 일 구현예에서, 효모-브라큐리 면역치료 조성물을 이용한다. 본 발명에서, 본 발명에 사용가능한 효모-기반의 면역치료 조성물은, (a) (후술한) 효모 비히클; 및 (b) 하나 이상의 암 항원을 포함하는 조성물이다. 암 항원은 척색종에 의해 발현되는 항원이며, 비제한적인 예로, 브라큐리, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), 혈소판 유래 성장인자 (PDGF) 수용체 (A or B), kit 수용체, CD24, 어그레칸 (aggrecan), II형 & X형 콜라겐, 파이브로넥틴, matrillin 3, 고분자량-흑색종 관련 항원 (HMW-MAA), 매트릭스 메탈로프로테나제 MMP-9 및 MMP-19이다. 효모-브라큐리 면역치료 조성물의 경우, 조성물은 (a) 효모 비히클; 및 (b) 하나 이상의 브라큐리 항원(들)을 포함하는 암 항원 및/또는 이의 면역원성 도메인(들)을 포함한다. 브라큐리 항원 및/또는 다른 척색종-발현 항원을 포함할 수 있는 암 항원은, 본 발명의 일 구현예에서, 하나 이상의 암 항원을 효모 비히클에 부하하거나 또는 본원에 기술된 바와 같이 효모 비히클과 복합체를 형성하거나, 여기에 부착시키거나, 혼합하거나 또는 함께 투여하여 본 발명의 조성물을 형성할 수 있지만, 가장 전형적으로는 효모 비히클에 의해 (예, 선택적으로 효모 사이토플라스트, 효모 고스트, 효모 막 추출물 또는 이의 분획으로 추가로 가공될 수 있는, 온전한 효모, 효모 스페로플라스트에 의해) 재조합 단백질로서 발현된다.

"효모-브라큐리 면역치료 조성물"은 하나 이상의 브라큐리 항원 또는 이의 면역원성 도메인을 포함하는, 특정 타입의 "효모-기반의 면역치료 조성물"이다. "효모-기반의 면역치료 조성물"이라는 표현은 "효모-기반의 면역치료 제품", "효모-기반의 면역치료 조성물", "효모-기반의 조성물", "효모-기반의 면역치료제", "효모-기반의 백신", 또는 이들 표현의 파생어와 상호 호환적으로 사용될 수 있다. "면역치료 조성물"은 개체에서 한가지 이상의 치료학적 이점을 달성하기에 충분한 면역 반응을 유발하는 조성물이다. 본원에 사용되는 효모-기반의 면역치료 조성물은 효모 비히클 성분을 포함하며 개체에서 한가지 이상의 치료학적 이점을 달성하기에 충분한 면역 반응을 유발하는 조성물을 의미한다. 보다 구체적으로, 효모-기반의 면역치료 조성물은 효모 비히클 성분 및 전형적으로 항원 성분을 포함하고, 비제한적으로 T 세포-매개 세포성 면역 반응을 포함하는 세포성 면역 반응과 같은 면역 반응을 유발 또는 유도할 수 있는 조성물이다. 일 측면에서, 본 발명에 사용가능한 효모-기반의 면역치료 조성물은 CD8⁺ 및/또는 CD4⁺ T 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있으며, 일 측면에서, 특히 표적 항원 (예를 들어, 암 항원)에 대한 CD8⁺ 및 CD4⁺ T 세포-매개 면역 반응을 유도할 수 있다. CD4⁺ 면역 반응은 TH1 면역 반응, TH2 면역 반응, TH17 면역 반응 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 효모-기반의 면역치료는 특히 TH1 및 TH17 반응을 형성할 수 있다. CD8⁺ 면역 반응은 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 포함할 수 있으며, 효모-기반의 면역치료는 이러한 반응을 형성할 수 있다. 일 측면에서, 효모-기반의 면역치료 조성물은 개체 내에 조절 T 세포 (Tregs)의 수와 기능성을 조절한다. 효모-기반의 면역치료는 또한 예를 들어 사이토카인의 부가, 항체 및/또는 효모에 대한 제조 과정의 조절에 의해, 다른 것에 비해 한가지 유형의 반응을 촉진하도록 변경될 수 있다. 선택적으로, 효모-기반의 면역치료 조성물은 체액성 면역 반응을 유발할 수 있다. 효모-기반의 면역치료 조성물은, 항원이 효모의 표면에 부착되어 있거나 또는 혼합물로서와 같이 효모의 외부에 제시된 경우, 체액성 면역 반응을 유발할 수 있다.

본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물은 "예방적" 또는 "치료적"일 수 있다. 예방학적으로 제공되는 경우, 본 발명의 조성물은 척색종의 진행 또는 발병의 예방, 저해 또는 지연; 및/또는 다른 조직으로의 종양 이동 및/또는 종양 침습 (전이)의 예방, 저해 또는 지연, 및/또는 일반적으로 개체에서 척색종의 진행을 예방 또는 저해하기 위한 목적으로, 척색종의 발생 또는 발생의 검출 전에 제공된다. 본원에 논의되는 바와 같이, 브리큐리는 모든 척색종들에서 발현되며, 척색종의 홀마크이므로, 효모-브라큐리 면역치료 조성물은 특히 척색종이 발생할 수 있는 개체에서 예방학적 치료로서 사용가능하다. 예방학적 조성물은 암을 가지지 않는 것으로 보이(건강한, 또는 정상인 개체)지만, 가족성 척색종 병력을 가지고 있는 개체 등의 척색종 발병 위험성이 있거나 있을 수 있거나, 또는 직계 가족 중에 한명 이상의 척색종 환자가 있는 개체에 투여될 수 있다. 치료학적으로 제공되는 경우, 상기 면역치료 조성물은 개체에서 종양 크기를 감소시키고; 개체의 종양 증식을 저해하고; 개체의 생존율을 높이고; 다른 조직으로의 종양 이동 및/또는 종양 침습 (전이) 발생을 예방, 저해, 반전 또는 지연시키고, 및/또는 개체에서 암의 진행을 예방, 저해, 반전 또는 지연시킴으로써와 같이, 암을 완화시킬 목적으로, 척색종을 가지는 개체에게 제공된다.

전형적으로, 효모-기반의 면역치료 조성물은 효모 비히클 및 척색종 항원 (척색종과 관련있거나 척색종에 의해 발현되는 암 항원)을 포함하는 하나 이상의 암 항원을 포함하며, 상기 척색종 항원은 상기 효모 비히클에 의하여 발현되거나, 이에 부착되거나, 그 안에 탑재(loading)되거나, 그와 혼합된다. 일부 구현예에서, 상기 척색종 항원은 융합 단백질로서 제공된다. 본원에 기술된 바와 같이, 척색종 항원으로는 브리큐리, EGFR, PDGF 수용체, kit 수용체, CD24, aggrecan, II형 & X형 콜라겐, 파이브로넥틴, matrillin 3, 고분자량-흑색종 관련 항원 (HMW-MAA), 매트릭스 메탈로프로테나제 MMP-9 및 MMP-19를 포함할 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 몇몇 브라큐리 단백질 및 융합 단백질은 아래에 기재한다. 본 발명의 일 측면에서, 척색종의 암 항원으로서 사용가능한 융합 단백질은, 일 구현예에서 하나의 융합 단백질로 제공될 수 있는, 2 이상의 항원, 예를 들어, 브라큐리 항원 및 브라큐리 항원이 아닌 다른 암 항원, 또는 2종의 다른 브라큐리 항원을 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 척색종의 치료 또는 예방용 효모-기반의 면역치료 조성물에 사용되는 효모 비히클은, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 치료적 또는 예방적 조성물) 내에 하나 이상의 항원, 그의 면역원성 도메인 또는 에피토프와 함께 사용될 수 있는, 임의의 효모 세포 (예를 들어, 전체 또는 무손상 세포) 또는 이의 유도체 (이하 참조)이다. 효모 비히클은 따라서, 살아 있는 무손상 (전) 효모 미생물 (즉, 세포벽을 비롯한 그것의 모든 성분들을 가지는 효모 세포), 사멸된(죽은) 또는 불활화된 무손상 효모 미생물, 또는 효모 스페로플라스트 (즉, 세포벽이 없는 효모 세포), 효모 사이토플라스트 (즉, 세포벽 및 핵이 없는 효모 세포), 효모 고스트 (즉, 세포벽, 핵 및 세포질이 없는 효모 세포), 준세포 효모막 추출물 (subcellular yeast membrane extract) 또는 이의 분획 (효모 막 입자 및 이전에는 준세포 효모 입자로도 불리움), 임의의 기타 효모 입자, 또는 효모 세포벽 조제물 등의 무손상 효모의 파생물을 포함할 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

효모 스페로플라스트는 전형적으로 효모 세포벽의 효소 분해에 의하여 제조된다. 이러한 방법은 예를 들어 Franzusoff et al., 1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

효모 사이토플라스트는 전형적으로 효모 세포의 탈핵에 의해 제조된다. 이러한 방법은 예를 들어 Coon, 1978, Natl. Cancer Inst. Monogr. 48, 45-55에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

효모 고스트는 전형적으로 투과화 또는 세포용혈된 세포의 재밀봉에 의하여 제조되며, 세포의 세포소기관을 적어도 일부를 함유할 수 있으나 반드시 그런 것은 아니다. 이러한 방법은 예를 들어 Franzusoff et al., 1983, J. Biol. Chem. 258, 3608-3614 및 Bussey et al., 1979, Biochim. Biophys. Acta 553, 185-196에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

효모 막 입자 (준세포 효모 막 추출물 또는 그의 분획)는 천연 핵 또는 세포질이 제거된 효모 막을 의미한다. 이 입자는 천연 효모 막의 크기에서부터 초음파 처리 또는 당업계에 공지된 기타 막 파괴 방법과 후속적인 재밀봉에 의하여 제조되는 미세입자 범위의 크기를 포함하는, 임의의 크기일 수 있다. 준세포 효모 막 추출물의 제조 방법은 예를 들어 Franzusoff et al., 1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674에 기재되어 있다. 효모 막 일부를 함유하는 효모 막 입자의 분획 또한 사용할 수 있으며, 효모 막 입자 제조 전에 효모에 의해 항원 또는 기타 단백질이 재조합에 의하여 발현되는 경우, 해당 항원 또는 기타 단백질을 사용할 수 있다. 해당 항원 또는 기타 단백질은 막 내부에, 막 표면 상에 또는 이들 조합으로 (즉, 단백질이 막 내부 및 외부 모두에 및/또는 효모 막 입자의 막에 걸쳐 있을 수 있음) 탑재될 수 있다. 일 구현예에서, 효모 막 입자는, 막 표면 상에 또는 막 내에 적어도 부분적으로 매립되는 하나 이상의 원하는 항원 또는 기타 해당 단백질을 포함하는, 무손상, 파괴된 또는 파괴 및 재밀봉된 효모 막일 수 있는, 재조합 효모 막 입자이다.

효모 세포벽 조제물의 예는, 효모 세포벽 조제물이 동물에 투여되었을 때 질환 표적에 대하여 원하는 면역 반응을 자극하도록, 그 표면 상에 탑재되거나 또는 세포벽 내에 적어도 부분적으로 매립된 항원을 수반하는 분리된 효모 세포벽 조제물이다.

임의의 효모 균주를 이용하여 본 발명의 효모 비히클을 제조할 수 있다. 효모는 세 가지 강(class): 자낭균류(Ascomycetes), 담자균류(Basidiomycetes) 및 불완전 균류(Fungi Imperfecti) 중 하나에 속하는 단세포성 미생물이다. 면역 조절제로서 사용하기 위한 효모 유형을 선택하는데 있어 한가지 고려 사항은 효모의 병원성이다. 일 구현에예에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지애와 같은 비-병원성 균주이다. 비-병원성 효모 균주의 선택은 효모 비히클이 투여되는 개체에 대한 부작용을 최소화한다. 그러나, 효모의 병원성이 당업계에 공지된 임의의 수단 (예를 들어, 돌연변이 균주)에 의해 없앨 수 있다면, 병원성 효모를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따르면, 비-병원성 효모 균주가 사용된다.

본 발명에 사용될 수 있는 효모 균주의 속은, 사카로마이세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida: 병원성일 수 있음), 크립토코커스(Cryptococcus), 한세뉼라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 로도토룰라(Rhodotorula), 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 및 야로이야(Yarrowia)를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 일 측면에서, 효모 속은 사카로마이세스, 칸디다, 한세뉼라, 피키아 또는 시조사카로마이세스로부터 선택되고, 일 측면에서, 사카로마이세스가 사용된다. 본 발명에 사용될 수 있는 효모 균주의 종은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 케피르(Candida kefyr), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 크립토코커스 라우렌티(Cryptococcus laurentii), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 한세뉼라 아노말라(Hansenula anomala), 한세뉼라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스 var. 락티스 (Kluyveromyces marxianus var. lactis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 로도토룰라 루브라(Rhodotorula rubra), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 야로이야 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 다수의 이들 종들은 상기 종들에 포함되는 것으로 의도되는 다양한 아종, 타입, 아형 등을 포괄하는 것으로 이해될 것이다. 일 측면에서, 본 발명에 사용되는 효모 종은 S. 세레비지애(S. cerevisiae), C. 알비칸스(C. albicans), H. 폴리모르파(H. polymorpha), P. 파스토리스(P. pastoris) 및 S. 폼베(S. pombe)를 포함한다. S. 세레비지애(S. cerevisiae)가 비교적 조작이 용이하고 "일반적으로 안전한 것으로 인식되고" 있거나 또는 식품 첨가제로서 사용하기 위한 "GRAS" (GRAS, FDA proposed Rule 62FR18938, April 17, 1997)로 인식되고 있으므로 유용하다. 본 발명의 일 구현예는 S. 세레비지애 cir^O 균주와 같은, 특히 고 카피수로 플라스미드를 복제할 수 있는 효모 균주이다. S. 세레비지애 균주는 하나 이상의 표적 항원(들) 및/또는 항원 융합 단백질(들) 및/또는 기타 단백질이 높은 수준으로 발현되도록 하는 발현 벡터를 지원할 수 있는 균주이다. 본 발명에 유용한 다른 효모 균주는 사카로마이세스 세레비지애 W303α이다. 또한, N-연결성 당화를 연장하는 효소 내 돌연변이와 같이, 발현된 표적 항원 또는 기타 단백질의 번역후 수정을 나타내는 것 등의, 임의의 돌연변이 효모 균주가 본 발명에 사용될 수 있다.

본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물은 척색종에 의해 발현되거나 이와 관련된 하나 이상의 암 항원을 포함한다. 본 발명에 따르면, 본원에 사용되는 용어 "항원"은 자연 발생 또는 합성에 의해 유도 또는 설계된 단백질의 임의의 일부 (예를 들어, 펩타이드, 부분 단백질, 전장 단백질), 세포성 조성물 (전체 세포, 세포 용혈물 또는 파괴된 세포), 유기체 (전체 유기체, 세포 용혈물 또는 파괴된 세포) 또는 탄수화물 또는 기타 분자 또는 그의 일부를 의미한다. 항원은 면역계의 인자 (예를 들어, T 세포, 항체)가 대면하는 동일 또는 유사 항원에 대하여 항원-특이적인 면역 반응 (예를 들어, 체액성 및/또는 세포-매재 면역 반응)을 유발할 수 있다.

항원은 단일 에피토프, 단일 면역원성 도메인과 같이 작거나 더 클 수 있으며, 복수의 에피토프 또는 면역원성 도메인을 포함할 수 있다. 이와 같이, 항원의 크기는 아미노산 약 8-11개 (즉, 펩타이드)와 같이 작을 수 있고, 전장 단백질, 다량체, 융합 단백질, 키메라 단백질, 전체 세포, 전체 미생물, 또는 이의 일부 (예를 들어, 미생물 추출물 또는 전체 세포의 단백질 단편 (폴리펩타이드) 용혈물)와 같이 클 수 있다. 본 발명의 효모-기반의 면역치료에 유용한 항원은 펩타이드, 폴리펩타이드, 전장 단백질, 다량체, 융합 단백질 및 키메라 단백질이다. 또한, 항원은 탄수화물을 포함할 수 있으며, 이것은 효모 비히클 내로 또는 본 발명의 조성물 내로 탑재될 수 있다. 일부 구현예에서 (예를 들어, 항원이 효모 비히클에 의하여 재조합 핵산 분자로부터 발현되는 경우), 항원은 전체 세포 또는 미생물이기보다는 단백질, 융합 단백질, 키메라 단백질 또는 이의 단편인 것으로 이해될 것이다. 효모에서 발현하는 경우, 항원이 효모에 의해 발현시킬 전체 단백질이라면, 항원은 재조합에 의하여 발현시킬 수 있는 최소 크기이고, 전형적으로 아미노산 25개 이상, 또는 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상, 30개 이상, 31개 이상, 32개 이상, 33개 이상, 34개 이상, 35개 이상, 36개 이상, 37개 이상, 38개 이상, 39개 이상, 40개 이상, 41개 이상, 42개 이상, 43개 이상, 44개 이상, 45개 이상, 46개 이상, 47개 이상, 48개 이상, 49개 이상, 또는 아미노산 50개 이상의 길이, 또는 아미노산 25-50개 이상의 길이, 또는 아미노산 30-50개 이상의 길이 또는 아미노산 35-50개 이상의 길이, 또는 아미노산 40-50 아미노산개 이상의 길이, 또는 아미노산 45-50 아미노산개 이상의 길이이나, 더 작은 단백질이 발현될 수도 있으며, 현저히 더 큰 단백질 (예를 들어, 수백개의 아미노산 길이 또는 심지어 수천개의 아미노산 길이)이 발현될 수 있다. 일 측면에서, 전장 단백질 또는 N- 및/또는 C-말단으로부터 아미노산 1 내지 20개가 결손된 단백질이 발현될 수 있다. 융합 단백질 및 키메라 단백질 또한 본 발명에서 발현될 수 있는 항원이다. "표적 항원"은 본 발명의 면역치료 조성물에 의하여 특이적으로 표적화되는 항원이다 (즉, 이에 대한 면역 반응 유발이 요구되는 항원). "암 항원"은 그 항원의 표적화가 또한 암을 표적화하도록, 종양 세포에 의하여 발현되는 항원과 같은 암 (예, 척색종)과 관련있거나 암에 의해 발현되는 하나 이상의 항원을 포함하는 항원이다. 암 항원은 하나 이상의 종양-관련 단백질을 포함하는, 하나 이상의 단백질로부터 유래되는 하나 이상의 항원을 포함할 수 있다. "브라큐리 항원"은 브라큐리 단백질로부터 유래, 설계 또는 제조되는 항원이다.

면역 반응의 자극을 언급할 때, 용어 "면역원"은 용어 "항원"의 서브세트이며, 따라서, 일부 경우, 용어 "항원"과 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 면역원은, 그 면역원의 개체에의 투여가, 그 개체의 면역계가 접촉한 동일 또는 유사 항원에 대한 항원-특이 면역 반응을 탑재하도록, 체액성 및/또는 세포-매개 면역 반응을 유발하는 (즉, 면역원성인) 항원을 가르킨다. 일 구현예에서, 면역원은 CD4⁺ T 세포 반응 (예를 들어, TH1, TH2 및/또는 TH17) 및/또는 CD8⁺ T 세포 반응 (예를 들어, CTL 반응)을 포함하는, 세포-매개 면역 반응을 유발한다.

소정의 항원의 "면역원성 도메인"은 동물에 투여되었을 때 면역원으로 작용할 수 있는 적어도 하나의 에피토프를 함유하는 항원의 단편 또는 에피토프 (예를 들어, 펩타이드 단편 또는 서브유닛 또는 항체 에피토프 또는 기타 구조적 에피토프)일 수 있다. 따라서, 면역원성 도메인은 단일 아미노산보다 크고, 적어도 면역원으로 작용할 수 있는 적어도 하나의 에피토프를 함유하기에 충분한 크기이다. 예를 들어, 단일 단백질은 복수의 여러가지 면역원성 도메인들을 함유할 수 있다. 면역원성 도메인은 구조적 도메인이 고려되는 경우, 체액성 면역 반응의 경우와 같이, 단백질 내 선형 서열일 필요는 없다.

본원에서 에피토프는 면역계의 적절한 공자극 신호 및/또는 활성화된 세포의 맥락에서 면역계에 제공될 때 면역 반응을 유발하기에 충분한 소정의 항원 내 단일 면역원성 부위로서 정의된다. 즉, 에피토프는 면역계의 구성 요소에 의하여 인지되는 항원의 일부이며, 또한 항원 결정인자로도 언급될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자는 T 세포 에피토프가 B 세포 또는 항체 에피토프와 크기 및 조성에 있어서 다르며, Class I MHC 경로를 통하여 제시되는 에피토프는 Class II MHC 경로를 통하여 제시되는 에피토프와 크기 및 구조적 특성에서 다름을 인지할 것이다. 예를 들어, Class I MHC 분자에 의하여 제시되는 T 세포 에피토프는 전형적으로 아미노산 8 내지 11개 길이인 반면, Class II MHC 분자에 의하여 제시되는 에피토프는 길이 제한이 거의 없고 아미노산 25개 이하 또는 그보다 길 수 있다. 또한, T 세포 에피토프는 그 에피토프에 결합된 특정 MHC 분자에 따라 예측되는 구조적 특성을 가진다. 에피토프는 선형 서열 에피토프 또는 구조적 에피토프 (보존된 결합 영역)일 수 있다. 대부분의 항체는 구조적 에피토프 (conformational epitope)를 인지한다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 사용되는 효모-기반의 면역치료 조성물은 효모-브라큐리 면역치료 조성물이다. 브라큐리 (이는 또한 "T"로도 지칭될 수 있음)는 복수의 여러 동물 종들에서 고도로 보존된 단백질이며, "T-박스" 도메인 또는 "T-도메인", 수종의 여러 단백질들에서 공유된 DNA-결합 도메인 - 총괄하여 T-박스 패밀리 단백질로 지칭됨 -을 포함하는, 전사 인자이다. 인간 브라큐리는 1996년에 최초로 클로닝되었다 (Edwards et al., supra). 인간 브라큐리를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 하나는 서열번호 1로 표시되며, 서열번호 1은 GENBANK^® 등재번호 NM_003181 (GI:19743811)로부터 입수된 mRNA 서열이다. 서열번호 1은 아미노산 435개 길이의 인간 브라큐리 단백질을 코딩하며, 이의 아미노산 서열은 서열번호 2로 본원에 제공된다 (GENBANK^® 등재번호 NP_003172; GI:4507339).

본원에 언급되는 다른 인간 브라큐리 단백질은 서열번호 2로 표시되는 인간 브라큐리 단백질의 변이체이며, 서열번호 6의 아미노산 서열을 가진다. 서열번호 6 역시 아미노산 435개 길이의 단백질이며, 서열번호 5로 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 서열번호 6은 단백질 전장에서 서열번호 2와 약 99% 동일하다. 서열번호 6은 서열번호 2와 177번 (Asp vs. Gly), 368번 (Thr vs. Ser) 및 409번 (Asn vs. Asp)이 다르다.

본원에 언급되는 다른 인간 브라큐리 단백질은, 예를 들어, 서열번호 2 또는 서열번호 6으로 제시되는 인간 브라큐리 단백질의 작용제이다. 본원에서 일반적으로 사용되는 "작용제"는 수용체 또는 리간드에 결합하여 반응을 발생 또는 촉발시키는 소분자, 단백질, 펩타이드, 항체, 핵산 결합 물질 등의, 임의의 화합물 또는 물질이며, 수용체 또는 리간드에 결합하는 천연 물질의 작용을 모방 또는 강화하는 물질을 포함할 수도 있다. 본 발명의 브라큐리 항원에 대해 사용되는 경우, "작용제" 항원 또는 단백질은, "미모토프 (mimotope)"로도 지칭될 수 있는, 에피토프에 대한 하나 이상의 T 세포 작용제 에피토프를 포함하는 항원 또는 단백질을 지칭한다. 미모토프 펩타이드는 야생형 에피토프의 구조를 모방하는 펩타이드로서, 미모토프는 작용제로서 천연 에피토프의 작용 (생물 기능)을 모방 또는 강화한다. 예를 들어, 서열번호 12의 아미노산 서열 (WLLPGTSTL)은 야생형 브라큐리 단백질의 T 세포 에피토프이다. 서열번호 13의 아미노산 서열 (WLLPGTSTV)은 서열번호 12의 T 세포 에피토프의 미모토프 또는 작용제이며, 이때 서열번호 13에서 9번 위치는 서열번호 12의 루신에서 발린으로 치환된다.

한가지 브라큐리 작용제 항원은 본원에서 서열번호 18로 제시된다. 서열번호 18은 435개의 아미노산으로 구성된 단백질이며, 이는 서열번호 17에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 서열번호 18은, 254번 위치의 루신(서열번호 6)이 서열번호 18에서 발린으로 치환된 것을 제외하고는, 서열번호 6과 동일하다. 이런 치환은 서열번호 18의 246번 - 254번 위치에서 T 세포 작용제 에피토프를 구축하며, 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이 위치는 야생형 에피토프 (서열번호 6의 246-254 위치)와 비교해 브라큐리에 대한 강화된 T 세포 반응을 유도할 것으로 생각된다.

서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 18 중 임의의 것의 41 - 223번 위치는 인간 브라큐리의 T-박스 DNA 결합 도메인이며, 다른 종 유래 브라큐리 서열을 비롯한 다른 브라큐리 서열들에서의 T-박스 도메인은 이들 서열과 비교하여 쉽게 식별할 수 있다. 본원에서, 본원에 언급되거나 당해 기술 분야에 공지되며 본원에서 이용되는 임의의 브라큐리 단백질의 T-박스 도메인에 대한 언급은, 규정된 T-박스 도메인의 N-말단 및/또는 C-말단 상에 (예, 서열번호 2, 6 또는 18의 41-223번 위치의 양쪽 상에) 브라큐리 서열의 추가적인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 연속되는 아미노산을 포함할 수 있다. 본원에 언급된 2종의 인간 브라큐리 단백질을 비롯한, 인간 브라큐리는, 또한 다양한 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 에피토프를 포함한다. 이들 에피토프는, 예를 들어, WO 2008/106551에 기술되어 있으며, 서열번호 2 또는 서열번호 6의 246-254 위치에 CD8⁺ CTL 에피토프, WLLPGTSTL (본원에서는 Tp2로 언급됨, 서열번호 12)을 포함한다. 전술한 바와 같이, 서열번호 18은, 본원에서 서열번호 13으로 제시된, 서열번호 12의 작용제 에피토프를 포함한다.

인간 브라큐리는 다른 동물 종으로부터 유래된 브라큐리와 상동성이 매우 높으며, 따라서 본 발명의 효모-브라큐리 면역치료 조성물의 제조시, 특히 서열이 동일하고, 실질적으로 상동하며, 표적 항원 (예, 종양 세포에 의해 발현되는 천연 브라큐리)에 대한 효과적인 면역 반응을 유발한다면, 다른 유기체 유래 브라큐리 서열을 이용할 수 있다. 예를 들어, 허만 및 동료들(Hermann et al., supra)에 의해 1990년에 최초 클로닝된 설치류 브라큐리는, 뉴클레오티드 수준에서는 인간 브라큐리와 약 85% 동일하며, 아미노산 수준에서는 약 91% 동일하다. 다른 동물 유래 브라큐리의 경우, 아미노산 수준에서, 인간 브라큐리는 판 트로글로디테스 (Pan troglodytes) 유래 브리큐리와 99.5% 동일하고, 카니스 루푸스 패닐리어리스 (Canis lupus familiaris) 유래 브라큐리와 90.1% 동일하고, 보스 타우루스 (Bos Taurus) 유래 브라큐리와 88.5% 동일하고, 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus) 유래 브라큐리와 92.2% 동일하고, 갈루스 갈루스 (Gallus gallus) 유래 브라큐리와 80.9% 동일하다. T-박스 도메인을 포함하는 브라큐리의 아미노산 1-223의 경우, 마우스와 인간 브라큐리는 아미노산 차이는 2개에 불과하다 (26번 위치와 96번 위치). 설치류 브라큐리를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3으로 본원에 제시되는데, 이것은 GENBANK^® 등재번호 NM_009309 (GI:118130357)로부터 입수된 mRNA 서열이다. 서열번호 3은 아미노산 436개 길이의 설치류 브라큐리 단백질을 코딩하며, 이의 아미노산 서열은 서열번호 4로 본원에 제시된다. 서열번호 41번 위치 - 223번 위치는 설치류 브라큐리의 T-박스 DNA 결합 도메인이다.

본 발명의 일 구현예에서, 브라큐리 항원은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 18로 제시된 아미노산 서열 또는 이의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함하거나, 이로 구성된다. 일 구현예에서, 브라큐리 항원은 브라큐리의 2, 3, 4, 5 또는 그 이상 수의 면역원성 도메인을 포함하거나, 또는 이로 구성된다. 본 발명의 일 구현예에서, 브라큐리 항원은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 18의, 1번 또는 2번 위치에서부터 C-말단의 마지막 25개의 아미노산들 중 하나의 아미노산 (즉, 서열번호 2, 서열번호 6 또는 서열번호 18의 441번 - 435번 위치들 중 임의의 한 위치, 또는 서열번호 4의 441번 - 435번 위치들 중 임의의 한 위치)까지에 이르는, 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다. 본 발명에 사용가능한 다른 브라큐리 항원은, 또한, 적어도 브라큐리의 1-223번 아미노산 위치 (예, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 18의 1-223번 위치), 또는 브라큐리의 41-223번 위치 (예, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 18의 41-223번 위치)를 포함한다. 본 발명에 사용가능한 다른 브라큐리 항원은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 18의 적어도 아미노산 1-85번 위치에서부터 255번 위치에서 C-말단 사이까지를 포함한다. 본 발명에 사용가능한 다른 브라큐리 항원은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 18의, 적어도 아미노산 1-85번 위치에서부터 430번 위치에서 C-말단 사이까지를 포함한다. 본 발명에 사용가능한 다른 브라큐리 항원은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 18의 적어도 아미노산 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10번에서부터 255번 위치에서 C-말단 사이까지를 포함한다.

본 발명의 임의의 구현예에서, "전장" 단백질 (또는 전장 기능성 도메인 또는 전장 면역 도메인)에 대한 언급은, 본원에 기술되거나 또는 공개적으로 이용가능한 서열에 공지 또는 기술된 바와 같이, 단백질, 기능성 도메인 또는 면역 도메인의 전장 아미노산 서열을 포함한다. 또한 단백질의 상동체 타입인 "거의 전장"인 단백질 또는 도메인은, 상기한 전장 단백질 또는 전장 도메인의 N- 및/또는 C-말단으로부터 아미노산 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 부가, 결손 또는 생략에 의해, 전장 단백질 또는 도메인과 차이를 가진다. 예를 들어, 본원에 언급되는 융합 단백질 수종은, 항원이 1번 위치의 메티오닌이 생략되고 N-말단 펩타이드가 치환되기 때문에, "거의 전장" 브라큐리 항원을 포함한다. 단백질, 도메인 또는 항원에 대한 일반적인 언급은 전장 및 거의 전장 단백질 뿐만 아니라 이들의 다른 상동체 모두를 포함할 수 있다.

척색종 치료 또는 예방하기 위한 방법에 사용하기 위한 항원과 관련된 임의의 구현예들에 대한 일 측면에서, 암 항원 (척색종 항원)은 항원이 효모에 의해 발현될 수 있는 충분한 최소 크기이다. 효모에서 발현시키기 위해서는, 단백질은 전형적으로 아미노산 약 25개 이상의 길이이지만, 더 작은 단백질로서 발현시킬 수 있으며, 상당히 큰 단백질로서 효모에 의해 발현시킬 수도 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용가능한 브라큐리 항원은, 효모에 의해 재조합으로 발현가능하며 브라큐리의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함하는, 브라큐리 단백질의 단편이며, 이는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 18 중 임의의 것의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 이러한 항원은 적어도 아미노산 25개 이상의 길이이며, 브라큐리와 같은 척색종 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함한다. 일 측면에서, 이러한 항원은 아미노산 길이가 30개 이상이며, 암 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함한다. 일 측면에서, 이러한 항원은 적어도 아미노산 25-50개 길이이며, 암 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함한다. 일 측면에서, 이러한 항원은 적어도 아미노산 30-50개 길이이며, 암 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함한다. 일 측면에서, 이러한 항원은 적어도 아미노산 35-50개 길이이며, 암 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함한다. 일 측면에서, 이러한 항원은 적어도 아미노산 40-50개 길이이며, 암 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함한다. 일 측면에서, 이러한 항원은 적어도 아미노산 45-50개 길이이며, 암 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명에 사용가능한 암 항원은 적어도 아미노산 25개 길이이거나, 또는 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425 또는 430개 길이이며, 브라큐리 항원의 경우, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 18의 적어도 임의의 것의 임의의 단편을 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명의 방법에 사용가능한 항원은 하나 이상의 CTL 에피토프를 포함하며, 본원에 언급된 임의의 1, 2, 3개 이상의 CTL 에피토프들을 2 카피 이상으로 포함할 수 있다. 일 측면에서, 항원은 하나 이상의 CD4⁺ T 세포 에피토프를 포함한다. 일 측면에서, 항원은 하나 이상의 CTL 에피토프와 하나 이상의 CD4⁺ T 세포 에피토프를 포함한다. 일 측면에서, T 세포 에피토프는 작용제 에피토프이다.

일 측면에서, 브라큐리 항원은 아미노산 서열 WLLPGTSTL (서열번호 12, 이는 또한 서열번호 2 또는 서열번호 6의 245번 - 254번 위치에 제시됨)을 포함한다. 일 측면에서, 브라큐리 항원은 아미노산 서열 WLLPGTSTV (서열번호 13, 이는 또한 서열번호 18의 245번 - 254번 위치에 제시됨)를 포함한다. 일 측면에서, 서열번호 12 또는 서열번호 13의 4번 위치의 아미노산 (이들 서열에서 프롤린 또는 P)은 세린 (S), 트레오닌 (T), 이소루신 (I) 또는 발린 (V)으로 치환된다.

일 측면에서, 브라큐리 항원은 아미노산 서열 SQYPSLWSV (서열번호 14)를 포함한다. 일 측면에서, 서열번호 14의 2번 위치의 아미노산 (이 서열에서 글루타민 또는 Q)은 루신 (L)으로 치환된다. 일 측면에서, 서열번호 14의 4번 위치의 아미노산 (이 서열에서 프롤린 또는 P)은 세린 (S), 트레오닌 (T), 루신 (L) 또는 발린 (V)으로 치환된다. 일 측면에서, 서열번호 14의 7번 위치의 아미노산 (이 서열에서 트립토판 또는 W)은 발린 (V), 루신 (L), 이소루신 (I), 세린 (S) 또는 트레오닌 (T)으로 치환된다. 일 측면에서, 서열번호 14의 9번 위치의 아미노산 (이 서열에서 발린 또는 V)은 루신 (L)으로 치환된다. 서열번호 14에서 이들 치환 2 이상의 임의 조합을 가진 서열을 포함하는 항원은 본 발명에 포함된다.

일 측면에서, 브라큐리 항원은 아미노산 서열 RLIASWTPV (서열번호 15)를 포함한다. 일 측면에서, 서열번호 15의 1번 위치의 아미노산 (이 서열에서 아르기닌 또는 R)은 티로신 (Y) 또는 트립토판 (W)으로 치환된다. 일 측면에서, 서열번호 15의 6번 위치의 아미노산 (이 서열에서 트립토판 또는 W)은 발린 (V), 라이신 (L), 이소루신 (I), 세린 (S) 또는 트레오닌 (T)으로 치환된다. 서열번호 15에서 이들 치환 2 이상의 임의 조합을 가진 서열을 포함하는 항원은 본 발명에 포함된다.

일 측면에서, 브라큐리 항원은 아미노산 서열 AMYSFLLDFV (서열번호 16)를 포함한다. 일 측면에서, 서열번호 16의 2번 위치의 아미노산 (이 서열에서 메티오닌 또는 M)은 루신 (L)으로 치환된다.

본 발명의 일 구현예에서, 브라큐리 항원은 서열번호 8의 아미노산 서열을 가진 융합 단백질을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 서열번호 8의 융합 단백질은, N-에서 C-말단으로의 인 프래임으로 하기 서열 인자들이 융합된 하나의 폴리펩타이드이다: (1) 효모내에서, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고, 발현을 안정화하는, N-말단 펩타이드 (서열번호 8의 1-6번 위치들); (2) 서열번호 6의 2-435번 위치로 구성된 인간 브라큐리 항원 (서열번호 8의 7-440번 위치들); 및 (3) 헥사히스티딘 테그 (서열번호 8의 441-446번 위치들). 서열번호 8의 아미노산 서열은 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 이 융합 단백질에 사용되는 아미노산 서열은 필요에 따라 브라큐리 항원의 양쪽 끝 측면에 추가적인 또는 대안적인 아미노산을 배치하여 사용함으로써 변형시킬 수 있으며, 브라큐리의 보다 짧은 영역을 사용할 수도 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 브라큐리 항원은 서열번호 10의 아미노산 서열을 가진 융합 단백질을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 서열번호 10의 융합 단백질은, N-에서 C-말단으로의 인 프래임으로 하기 서열 인자들이 융합된 하나의 폴리펩타이드이다: (1) 효모에서, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고, 발현을 안정화하는, N-말단 펩타이드 (서열번호 10의 1-6번 위치들); (2) 서열번호 4의 2-436번 위치로 구성된 설치류 브라큐리 항원 (서열번호 10의 7-441번 위치들); 및 (3) 헥사히스티딘 테그 (서열번호 10의 442-447번 위치들). 서열번호 10의 아미노산 서열은 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.

본 발명의 다른 측면에서, 브라큐리 항원은 서열번호 20의 아미노산 서열을 가진 융합 단백질을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 서열번호 20의 융합 단백질은, N-에서 C-말단으로의 인 프래임으로 하기 서열 인자들이 융합된 하나의 폴리펩타이드이다: (1) 효모에서, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고, 발현을 안정화하는, N-말단 펩타이드 (서열번호 20의 1-6번 위치들, 펩타이드 서열은 또한 서열번호 11로 본원에 제시됨); (2) 서열번호 18의 아미노산 2-435번 위치 (서열번호 20의 7-440번 위치들), 서열번호 18은 전장의 인간 브라큐리 작용제 단백질임; 및 (3) 헥사히스티딘 테그 (서열번호 20의 441-446번 위치들). 작용제 에피토프 (서열번호 13)는 서열번호 20의 251-259번 위치들에 위치한다 (서열번호 18의 246-254번 위치들). 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.

본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 조성물에 유용한 항원은, 또한, 단백질의 전장에 대해 또는 단백질의 일부를 형성하는 이의 규정된 단편 또는 도메인 (예, 면역 도메인 또는 기능 도메인 (한가지 이상의 생물 활성을 가진 도메인))에 대해, 본원에 언급된 암 단백질 또는 암 항원들 중 임의의 것의 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 가진 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본원에 언급된 브라큐리 단백질의 도메인은 T-박스 도메인을 포함한다. 면역 도메인은 앞에서 상세히 기술하였다.

본 발명의 일부 측면들에서, 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물에 항원으로서 사용되었을 때, 제조되는 단백질이, 야생형 또는 기준 단백질로서 천연 단백질에 대해, 면역 반응 강화, 면역 반응 감소 또는 실질적으로 유사한 면역 반응을 포함할 수 있는, 면역 반응을 형성하는 한, 야생형 또는 기준 단백질의 아미노산 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 아미노산에서 아미노산 삽입, 결손 및/또는 치환이 행해질 수 있다. 예컨대, 본 발명은 브라큐리 작용제 항원 등의 작용제 항원의 사용을 포함하며, MHC 제시 상황에서 에피토프를 인지하는 T 세포 수용체나 MHC 분자에 대한 에피토프의 결합성 또는 친화성 개선에 의해서와 같이, 작용제에 대한 T 세포 반응을 강화하도록 돌연변이된 T 세포 에피토프를 하나 이상 포함할 수 있다. 따라서, 항원 작용제는 종양 세포에 의해 발현되는 천연 항원에 대해 T 세포 반응의 강도 또는 효과를 개선시킬 수 있다. 서열번호 18의 아미노산 서열을 가진 브라큐리 항원은 브라큐리 작용제 (또는 작용제 에피토프를 포함하는 브라큐리 항원)의 비제한적인 일 예이다.

아울러, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 20의 융합 단백질과 관련하여 상기에 기술된 등의, N-말단 발현 서열 및 C-말단 테그는 선택적이지만, 단백질의 발현, 안정성을 개선 또는 보조하거나 및/또는 동정 및/또는 정제를 허용하기 위해, 본원의 도처에 언급된 수종의 여러 서열들로부터 선택될 수 있다. 또한, 효모에 사용하기 적합한 다수의 여러가지 프로모터들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 더욱이, 짧은 개재 링커 서열 (intervening linker sequence) (예, 아미노산 1, 2, 3, 4 또는 5개 길이의 펩타이드)은, 숙주 식균성 프로테아제 (host phagosomal protease)의 절단 부위로서 클로닝을 용이화하기 위해, 단백질 또는 항원 프로세싱을 가속화하기 위해, 구조체의 향후 조작을 위한 제한 효소 부위의 도입을 위해서 등의 다양한 이유로, 암 항원을 포함하는 융합 단백질의 부분들의 사이에 도입될 수 있다.

선택적으로, 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물의 성분으로서 사용되는 융합 단백질 등의 단백질은, 효모에서 이종 항원의 발현을 개선 또는 안정화하는데 특히 유용한 항원 구조체를 이용하여 제조된다. 일 구현예에서, 바람직한 항원 단백질(들) 또는 펩타이드(들)는, 이의 아미노-말단에, (a) 효모 비히클에서 융합 단백질의 발현을 안정화하거나 발현된 융합 단백질의 번역후 수정을 방지하는, 특정 합성 펩타이드 (이들 펩타이드는, 예를 들어, 2004. 8. 12 공개된 미국 특허 공보 제 2004-0156858 A1호에 상세히 기술되어 있음, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨); (b) 비제한적인 예로, 효모 알파 인자 리더 서열 등의, 내인성 효모 단백질의 적어도 일부 (각 융합 파트너는 효모에서 단백질 발현 안전성 개선을 제공하고 및/또는 효모 세포에 의한 단백질의 번역후 수정을 방지함) (이러한 단백질은 상세하게는, 예를 들어, 위의 미국 특허 공보 제 2004-0156858 A1에 기재됨); 및/또는 (c) 융합 단백질이 효모 표면 상으로 발현되도록 야기하는 효모 단백질의 적어도 일부 (예를 들어, 본원에 더욱 상세히 기재되는 Aga 단백질)를 융합한다. 또한, 본 발명은 특히 단백질 선별 및 동정에 사용하기 위해, 항원-코딩 구조체의 C-말단에 융합되는 펩타이드의 사용을 임의로 포함한다. 이러한 펩타이드로는 펩타이드 태그 (예를 들어, 6X His 또는 헥사펩타이드) 또는 임의의 다른 짧은 에피토프 태그와 같은, 임의의 합성 또는 천연 펩타이드를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 항원의 C-말단에 부착되는 펩타이드는 상기 논의된 N-말단 펩타이드를 부가하여/부가없이 사용될 수 있으며, 그 반대 또한 마찬가지이다.

일 구현예에서, 융합 단백질은 아미노산 서열 M-X2-X3-X4-X5-X6를 포함하며, 여기서 M은 메티오닌이고; X2는 글리신, 프롤린, 라이신 또는 아르기닌을 제외한 모든 아미노산이고; X3는 메티오닌, 라이신 또는 아르기닌을 제외한 모든 아미노산이고; X4는 메티오닌, 라이신 또는 아르기닌을 제외한 모든 아미노산이고; X5는 메티오닌, 라이신 또는 아르기닌을 제외한 모든 아미노산이고; X6는 메티오닌, 라이신 또는 아르기닌을 제외한 모든 아미노산이다. 일 구현예에서, X6 잔기는 프롤린이다. 효모 세포에서 항원의 발현 안정성을 증가시키거나 및/또는 효모에서 단백질의 번역 후 수정을 방지하는, 합성 서열의 예로는, 서열 M-A-D-E-A-P (본원에서는 서열번호 11로 제시됨)를 포함한다. 발현 산물의 안정성 증가 외에는, 이 융합 파트너는 구조체의 면역 항원에 대한 면역 반응에 부정적으로 작용하는 것으로 보이지 않는다. 또한, 합성 융합 펩타이드는 항체와 같은 선별 물질에 의해 인지될 수 있는 에피토프를 제공하도록 설계될 수 있다.

효모 비히클의 제조 방법과, 효모 비히클을 해당 항원 및/또는 기타 단백질 및/또는 물질과 함께 발현, 조합 및/또는 결합시켜 효모-기반의 면역치료 조성물을 제조하는 방법들은 본 발명에 포함된다.

본 발명에 따르면, 용어 "효모 비히클-항원 복합체" 또는 "효모-항원 복합체"는 효모 비히클과 항원의 모든 결합을 기술하고자 일반적으로 사용되며, 조성물이 상기한 바와 같이 면역 반응을 도출하기 위해 사용되는 경우에는, "효모-기반의 면역치료 조성물"과 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 이러한 결합은 효모 (재조합 효모)에 의한 항원의 발현, 항원의 효모 내로의 도입, 항원의 효모에의 물리적 부착, 및 완충액 또는 기타 용액 또는 제형 내에서와 같은, 효모와 항원의 혼합을 포함한다. 이러한 유형의 복합체들은 아래에 상세히 기술된다.

일 구현예에서, 효모 비히클 제조에 사용되는 효모 세포는, 단백질 (예, 항원)을 코딩하는 이종 핵산 분자로, 그 단백질이 상기 효모 세포에 의해 발현되도록, 형질감염된다. 이러한 효모는 또한 본원에서 재조합 효모 또는 재조합 효모 비히클로도 언급된다. 그런 후, 효모 세포는 약제학적으로 허용가능한 부형제를 사용해 제형화되어, 환자에 직접 투여되거나, 추후 투여를 위하여 저장되거나, 또는 무손상 세포로서 수지상 세포 내로 주입될 수 있다. 효모 세포는 또한 사멸되거나, 또는 효모 스페로플라스트, 사이토플라스트, 고스트 또는 준세포 입자의 형성에 의해서와 같이 파생될 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 이후 저장, 투여 또는 수지상 세포 내로 주입될 수 있다. 효모 스페로플라스트는 또한 항원을 발현하는 재조합 스페로플라스트를 제조하기 위해, 재조합 핵산 분자로 직접 형질전환될 수 있다 (예를 들어, 전효모로부터 스페로플라스트를 만든 후 형질감염시킨다). 항원(들)을 재조합에 의하여 발현하는 효모 세포 또는 효모 스페로플라스트를 사용하여, 효모 사이토플라스트, 효모 고스트 또는 효모 막 입자 또는 효모 세포벽 입자, 또는 이의 분획을 포함하는 효모 비히클을 제조할 수 있다.

일반적으로, 효모 비히클 및 항원(들) 및/또는 기타 물질들은 본원에 기재된 임의의 기법을 통해 결합시킬 수 있다. 일 측면에서, 효모 비히클은 항원(들) 및/또는 물질(들)과 함께 세포내로 탑재된다. 다른 측면에서, 항원(들) 및/또는 물질(들)은 효모 비히클에 공유 결합 또는 비-공유 결합에 의해 부착된다. 또 다른 측면에서, 효모 비히클 및 항원(들) 및/또는 물질(들)이 혼합에 의해 결합된다. 다른 측면에서 및 일 구현예에서, 항원(들) 및/또는 물질(들)은, 효모 비히클에 의해, 또는 효모 비히클이 유래되는 효모 세포 또는 효모 스페로플라스트에 의해, 재조합으로 발현된다.

본 발명의 효모 비히클에 의해 제조할 항원 및/또는 기타 단백질의 수는 효모 비히클에 의해 합리적으로 제조할 수 있는 항원 및/또는 기타 단백질의 수이며, 전형적으로, 1개 이상 내지 약 6개 이상, 예로, 항원 및/또는 기타 단백질 약 2 - 약 6개의 범위이다.

본 발명의 효모 비히클내에서의 항원 또는 기타 단백질의 발현은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기법을 이용하여 달성된다. 간략하게는, 하나 이상의 원하는 항원 또는 기타 단백질을 코딩하는 핵산 분자를, 숙주 효모 세포에 형질전환되었을 때 핵산 분자의 구성적 또는 조절성 발현을 구현할 수 있도록 하기 위해, 핵산 분자가 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 방식으로, 발현 벡터에 삽입한다. 하나 이상의 항원 및/또는 기타 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 하나 이상의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 발현 벡터 상에 있을 수 있다. 특히 중요한 발현 조절 서열은 프로모터 및 상류 활성화 서열 등의, 전사 개시를 조절하는 것이다. 임의의 적합한 효모 프로모터가 본 발명에 사용될 수 있으며, 다양한 그러한 프로모터들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 알려져 있다. 사카로마이세스 세레비지애에서 발현시키기 위한 프로모터로는, ADH2/GAPDH 및 CYC1/GAL10 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터, 세포 내 글루코스 농도가 낮을 때 (예를 들어, 약 0.1 내지 약 0.2%) 유도되는 ADH2/GAPDH 프로모터, 및 CUP1 프로모터 및 TEF2 프로모터를 비롯하여, 다음과 같은 효모 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다: 알코올 데하이드로게나제 I (ADH1) 또는 II (ADH2), CUP1, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK), 트리오스 포스페이트 이소머라제 (TPI), 번역 연장 인자 EF-1 알파 (TFE2), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나아제 (GAPDH: 트리오스 포스페이트 디하이드로게나아제에 대하여, TDH3으로도 언급됨), 갈락토키나제 (GAL1), 갈락토오스-1-포스페이트 우리딜-트랜스퍼라제 (GAL7), UDP-갈락토오스 에피머라제 (GAL10), 시토크롬 c1 (CYC1), Sec7 단백질 (SEC7) 및 액시드 포스파타제 (PHO5). 마찬가지로, 인핸서로도 언급되는 다수의 상류 활성화 서열 (UAS)들이 공지되어 있다. 사카로마이세스 세레비지애에서의 발현에 대한한 상류 활성화 서열로는 다음과 같은 단백질을 코딩하는 유전자의 UAS 뿐만 아니라 GAL4 유전자 산물에 의해 활성화되는 기타 UAS를 포함하나, 이들로 한정되지 않으며, ADH2 UAS가 일 측면에서 사용된다: PCK1, TPI, TDH3, CYC1, ADH1, ADH2, SUC2, GAL1, GAL7 및 GAL10. ADH2 UAS는 ADR1 유전자 산물에 의해 활성화되므로, 이종 유전자가 ADH2 UAS에 작동가능하게 연결되었을 때 ADR1을 과발현시키는 것이 바람직할 것이다. 사카로마이세스 세레비지애에서 발현시키기 위한 전사 종결 서열은 α-인자, GAPDH 및 CYC1 유전자의 종결 서열들을 포함한다.

메탄영양성 효모에서 유전자를 발현시키기 위한 전사 조절 서열은 알코올 옥시다제 및 포르메이트 데하이드로게나제를 코딩하는 유전자들의 전사 조절 영역들을 포함한다.

본 발명에 따른 효모 세포에 핵산 분자를 형질감염시키는 것은 핵산 분자가 세포 내로 도입될 수 있는 임의의 방법에 의하여 달성될 수 있으며, 비제한적으로, 확산, 능동 수송, 조 초음파처리 (bath sonication), 전기천공, 미세주입, 리포펙션, 흡착 및 프로토플라스트 융합을 포함한다. 형질감염된 핵산 분자는 당해 기술 분야의 업자에 공지된 기술을 이용하여 효모 염색체에 통합되거나 또는 염색체외 벡터 상에 유지될 수 있다. 그러한 핵산 분자를 운반하는 효모 비히클의 예는 본원에 상세히 개시되어 있다. 전술한 바와 같이, 효모 사이토플라스트, 효모 고스트 및 효모 막 입자 또는 세포벽 조제물 역시, 무손상 효모 미생물 또는 효모 스페로플라스트를 원하는 핵산 분자로 형질감염시키고, 그 안에서 항원을 생산한 다음, 상기 미생물 또는 스페로플라스트를 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 추가로 조작하여 원하는 항원 또는 기타 단백질을 함유하는 사이토플라스트, 고스트 또는 준세포 효모 막 추출물 또는 그의 분획을 생산함으로써, 재조합에 의하여 제조할 수 있다.

재조합 효모 비히클의 제조 및 효모 비히클에 의한 항원 및/또는 기타 단백질의 발현에 효과적인 조건은 효모 균주가 배양될 수 있는 효과적인 배지를 포함한다. 효과적인 배지는, 전형적으로, 동화가능한 탄수화물, 질소 및 인산 소스, 뿐만 아니라 적절한 염, 미네랄, 금속 및 비타민 및 성장 인자와 같은 기타 영양분을 포함하는, 수성 배지이다. 배지는 복합 영양분을 포함할 수 있거나, 또는 소정의 최소 배지일 수 있다. 본 발명의 효모 균주는, 비제한적으로, 생물반응기, 에를렌마이어 플라스크, 시험관, 마이크로타이터 디쉬 및 페트리 플레이트 등의, 다양한 용기에서 배양할 수 있다. 배양은 효모 균주에 적절한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행된다. 그러한 배양 조건은 당업자의 전문 지식 범위 내이다 (예, Guthrie et al. (eds.), 1991, Methods in Enzymology, vol. 194, Academic Press, San Diego 참조). 예를 들어, 하나의 프로토콜 하에, 적정 배지를 함유하는 배양액을 효모-브라큐리 면역치료 조성물의 스타터 플레이트로부터 수득되는 배양물 및/또는 스타터 배양액을 이용하여 접종할 수 있으며, 250 rpm에서 교반하면서 30℃에서 대략 20시간 동안 증식시킨다. 그런 후, 1차 배양을 원하는 더 큰 규모의 배양으로 확대시킬 수 있다. 효모에 형질전환되는 벡터로부터의 단백질 발현 (예를 들어, 브라큐리 발현)은, 사용되는 프로모터가 구성적 프로모터인 경우, 구성적일 수 있거나, 또는 사용되는 프로모터가 유도성 프로모터인 경우 그 프로모터에 대한 적합한 유도 조건 (예를 들어, CUP1 프로모터의 경우 황산구리)의 부여에 의해 유도할 수 있다. 유도성 프로모터의 경우, 단백질 발현의 유도는 배양액이 약 0.2 Y.U./ml 또는 그 이상의 밀도일 수 있는 적정 세포 밀도로 증식된 이후에, 착수할 수 있다.

본 발명의 일 측면에서, 본 발명에 사용가능한 효모-브라큐리 면역치료 조성물은, CUP1 프로모터의 통제 하에 서열번호 8로 제시되는 인간 브라큐리 융합 단백질을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는, 본원에서 또한 GI-6301로 지칭되는 사카로마이세스 세레비지애 효모를 포함하는, 효모-브라큐리 면역치료 조성물이다. 다른 측면에서, 본 발명에 사용가능한 효모-브라큐리 면역치료 조성물은, TEF2 프로모터 (벡터 plu011에서)의 통제 하에 서열번호 8로 제시되는 인간 브라큐리 융합 단백질을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는, 본원에서 또한 GI-6302로 지칭되는 사카로마이세스 세레비지애 효모를 포함하는, 효모-브라큐리 면역치료 조성물이다. 다른 측면에서, 본 발명에 사용가능한 효모-브라큐리 면역치료 조성물은, TEF2 프로모터 (벡터 pGI-172에서)의 통제 하에 서열번호 8로 제시되는 인간 브라큐리 융합 단백질을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는, 본원에서 또한 GI-6303으로 지칭되는 사카로마이세스 세레비지애 효모를 포함하는, 효모-브라큐리 면역치료 조성물이다. 또 다른 측면에서, 본 발명에 사용가능한 효모-브라큐리 면역치료 조성물은, CUP1 프로모터의 통제 하에 서열번호 20으로 제시되는 인간 브라큐리 융합 단백질을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는, 본원에서 또한 GI-6305로 지칭되는 사카로마이세스 세레비지애 효모를 포함하는, 효모-브라큐리 면역치료 조성물이다.

본 발명의 일 구현예에서, 효모 비히클에서 항원 또는 기타 단백질을 재조합 발현하는 방법의 대안으로서, 효모 비히클에, 단백질 또는 펩타이드, 또는 항원으로서 이용되거나 및/또는 본 발명에 따른 면역조절제 또는 생물학적 반응 변형제로서 유용한 탄수화물 또는 기타 분자를, 세포내로 탑재한다. 이어서, 항원 및/또는 기타 단백질을 현재 세포내 함유하는 효모 비히클을 개체에게 투여하거나, 또는 수지상 세포와 같은 담체 내로 주입할 수 있다. 펩타이드 및 단백질을, 확산, 능동 수송, 리포솜 융합, 전기천공, 식세포 작용, 동결-해동 사이클 및 조내 초음파 처리와 같은, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기술에 의해, 본 발명의 효모 비히클 내로 직접 삽입할 수 있다. 펩타이드, 단백질, 탄수화물 또는 기타 분자를 직접 탑재시킬 수 있는 효모 비히클은 무손상 효모 뿐만 아니라, 제조 후 항원 및 기타 물질을 탑재할 수 있는, 스페로플라스트, 고스트 또는 사이토플라스트를 포함한다. 다른 예로, 무손상 효모에 항원 및/또는 물질을 탑재한 다음, 스페로플라스트, 고스트, 사이토플라스트 또는 준세포 입자를 이로부터 제조할 수 있다. 이러한 구현예에서, 항원 및/또는 기타 물질을 임의의 수로, 예를 들어, 미생물 또는 이의 일부의 탑재에 의하여 제공될 수 있는 것과 같은, 항원 및/또는 기타 물질을, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 수백 또는 수천개 이하의 모든 정수 범위로 효모 비히클 내에 탑재할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 항원 및/또는 기타 물질이 효모 비히클에 물리적으로 부착된다. 항원 및/또는 기타 물질의 효모 비히클에의 물리적 부착은, 비제한적으로, 항체 또는 기타 결합 파트너의 사용에 의해서와 같이, 항원 및/또는 기타 물질의 효모 비히클 외표면에의 화학적 가교결합 또는 항원 및/또는 기타 물질의 효모 비히클의 외표면에의 생물학적 결합을 포함하는, 공유 및 비-공유 결합 방법 등의, 당업계에 적합한 임의의 방법에 의하여 달성될 수 있다. 화학적 가교는, 예를 들어, 글루타르알데히드 결합, 광친화성 표지, 카보디이미드 처리, 다이-설파이드 결합을 연결할 수 있는 화학제 처리 및 기타 당업계에 표준인 기타 가교 화학제 처리를 비롯한 방법들에 의해 달성될 수 있다. 다른 예로, 효모의 외표면이 특정 전하 특성을 가지는 항원 및/또는 기타 물질에 융합 또는 결합할 가능성이 높도록 세포벽의 조성 또는 효모막의 지질 이중층의 전하를 변경시키는 화학제에, 효모 비히클을 접촉시킬 수 있다. 항체, 결합 펩타이드, 가용성 수용체 및 기타 리간드와 같은 표적화 제제들 또한 항원에 융합 단백질로서 삽입하거나 또는 효모 비히클에 항원을 결합시키기 위해 항원과 결합시킬 수 있다.

항원 또는 기타 단백질이 효모의 표면 상에 발현되거나 이에 물리적으로 부착되는 경우, 일 측면에서, 스페이서 암 (spacer arm)이 상기 표면 상에서의 항원 또는 기타 단백질의 발현 또는 함유를 최적화하도록 조심스럽게 선택될 수 있다. 스페이서 암(들)의 크기는 항원 또는 기타 단백질이 효모 표면 상에 결합되기 위해 노출되는 양에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 어떤 항원(들) 또는 기타 단백질(들)이 사용되고 있는지에 따라, 당해 기술 분야의 당업자는 효모 표면 상에 항원 또는 기타 단백질에 대한 적절한 공간 형성을 유발하는 스페이서 암을 선택할 것이다. 일 구현예에서, 상기 스페이서 암은 적어제시된 아미50개의 아미노산으로 된 효모 단백질이다. 스페이서 암은 상기에 상세히 논의되어 있다.

또 다른 구현예에서, 효모 비히클 및 항원 또는 기타 단백질은, 효모 비히클과 항원 또는 기타 단백질을 완충액 또는 기타 적합한 제형 내에서 가볍게 혼합함에 의해서와 같이 (예를 들어, 혼합물), 보다 수동적인, 비-특이적 또는 비-공유결합 메커니즘에 의하여 서로 결합된다.

일 구현예에서, 무손상 효모 (이종 항원 또는 기타 단백질을 발현하거나 또는 발현하지 않는)는, 효모 세포벽 조제물, 효소 막 입자 또는 효모 단편 (즉, 무손상이 아닌)을 제조하는 방식으로 그라인딩하거나 가공 처리할 수 있으며, 일부 구현예에서, 면역 반응을 강화하기 위해, 상기 효모 단편은, 항원 (예를 들어, DNA 백신, 단백질 서브유닛 백신, 사멸되거나 불활화된 병원균, 바이러스 벡터 백신)을 포함하는 기타 조성물과 함께 제공 또는 투여할 수 있다. 예를 들어, 효소 처리, 화학적 처리 또는 물리적 힘 (예, 기계적 전단 또는 초음파 처리)을 사용하여 효모를 보강제로서 사용되는 성분들로 분해할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 사용가능한 효모 비히클은 사멸되거나 불활화된 효모 비히클을 포함한다. 효모의 사멸 또는 불활화는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 적합한 방법들을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 효모의 열 불활화는 효모를 불활화시키는 표준 방식으로서, 당해 기술 분야의 당업자는 원한다면 당업계에 공지된 표준 방법에 의하여 표적 항원의 구조적 변화를 모니터링할 수 있다. 다른 예로, 화학적, 전기적, 방사선 또는 UV 방법 등의, 효모를 불활화하는 다른 방법들을 이용할 수 있다. 예를 들어, Methods of Enzymology, Vol. 194, Cold Spring Harbor Publishing (1990)와 같은 표준 효모 배양 텍스트북에 개시된 방법을 참조한다. 사용되는 임의의 불활화 전략은 표적 항원의 2차, 3차 또는 4차 구조를 고려하여야 하며, 이의 면역원성을 최적화하도록 그러한 구조를 보존하여야 한다.

효모 비히클은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 많은 기법들을 이용하여 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물 또는 생성물로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 효모 비히클은 동결건조에 의해 건조될 수 있다. 효모 비히클을 포함하는 제형은, 또한, 베이킹 또는 양조 작업에 사용되는 효모에 대하여 행하여지는 것과 같이, 효모를 케이크 또는 정제로 패킹함으로써 제조될 수 있다. 또한, 효모 비히클은 숙주 또는 숙주 세포에 허용되는 등장 완충액과 같은 약제학적으로 허용가능한 부형제와 혼합될 수 있다. 그러한 부형제의 예는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로오스 용액, 행크 용액 및 기타 생리학적으로 밸런스된 수성 염 용액들을 포함한다. 비휘발유, 참기름, 에틸 올레이트, 또는 트리글리세라이드와 같은 비수성 비히클도 또한 사용할 수 있다. 기타 유용한 제형들은 소듐 카복시메틸셀룰로오스, 소르비톨, 글리세롤 또는 덱스트란과 같은, 증점제를 함유하는 현탁액을 포함한다. 부형제는 또한 등장성 및 화학적 안정성을 강화하는 물질과 같은, 첨가제를 소량 함유할 수 있다. 완충액의 예는 인산 완충액, 중탄산 완충액, Tris 완충액을 포함하며, 방부제의 예는 티메로살, m- 또는 o-크레졸, 포르말린 및 벤질 알코올을 포함한다. 표준 제형은 주사용 현탁액 또는 용액으로서 적합한 액체 중에 취해질 수 있는 주사가능한 액체 또는 고체일 수 있다. 따라서, 비-액체 제형의 경우, 부형제는 예를 들어 덱트로스, 인간 혈청 알부민 및/또는 방부제를 포함할 수 있으며, 투여 전에 멸균수 또는 식염수가 첨가된다.

본 발명의 일 구현예에서, 조성물은 생물학적 반응 변형 화합물로도 언급될 수 있는 부가적 물질, 또는 그러한 물질/변형제의 형성력을 포함할 수 있다. 예를 들어, 효모 비히클이 적어도 하나의 항원 및 적어도 하나의 물질/생물학적 반응 변형 화합물로 형질감염되거나 또는 이것을 탑재할 수 있으며, 또는 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 물질/생물학적 반응 변형제와 함께 투여될 수 있다. 생물학적 반응 변형제는 보강제와 면역조절 화합물로 언급될 수 있는 면역 반응을 조절할 수 있는 기타 화합물, 뿐만 아니라 효모-기반의 면역치료제와 같이, 다른 화합물 또는 물질의 생물학적 활성을 변형시키는 화합물을 포함하며, 이러한 생물학적 활성은 면역계의 작용으로 한정되지 않는다. 특정 면역조절 화합물은 보호성 면역 반응을 자극할 수 있으며, 그외의 것은 유해한 면역 반응을 억제할 수 있으며, 면역조절제가 소정의 효모-기반의 면역치료제와 함께 사용가능한지 여부는 적어도 부분적으로 치료 또는 예방할 질병 상태 또는 병태, 및/또는 치료할 개체에 따라 결정될 수 있다. 특정 생물학적 반응 변형제는 세포-매개 면역 반응을 우선적으로 강화하는 반면, 다른 것들은 체액성 면역 반응을 우선적으로 강화한다 (즉, 체액성 면역에 비하여 세포-매개의 수준이 증가되는 면역 반응을 자극시킬 수 있거나, 그 반대임). 특정 생물학적 반응 변형제는 효모-기반의 면역치료제의 생물학적 특성과 공통되는 하나 이상의 특성을 가지거나, 또는 효모-기반의 면역치료제의 생물학적 특성을 강화 또는 보완한다. 면역 반응의 자극 또는 억제를 측정하고, 세포-매개 면역 반응을 체액성 면역 반응과 구분하고, 한가지 유형의 세포-매개 반응을 다른 것과 구분 (예를 들어, TH17 반응 대 TH1 반응)하기 위한, 다수의 기법들이 당해 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명에 사용가능한 물질/생물학적 반응 변형제는, 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 지질 유도체, 펩타이드, 단백질, 다당류, 소분자 약물, 항체 및 이의 항원 결합 단편 (비제한적으로, 항-사이토카인, 항-사이토카인 수용체 항체, 항-케모카인 항체), 비타민, 폴리뉴클레오티드, 핵산 결합 모이어티, 앱타머 및 증식 모듈레이터를 포함할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이들 물질들의 임의 조합이 본 발명에 포함되며, 효모-기반의 면역치료제와 함께 한 프로토콜로 투여 또는 함께 조합되는 임의의 이러한 물질들은 본 발명에 포함되는 조성물이다. 이들 물질은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이들 물질은 단독으로 또는 본원에 기술된 다른 물질과 조합하여 사용될 수 있다.

물질들은 소정의 단백질 또는 펩타이드 또는 그의 도메인에 대한 작용제 및 길항제를 포함할 수 있다. 본원에서 "작용제"는, 비제한적으로, 수용체 또는 리간드에 결합하여 반응을 형성 또는 촉발시키는 소분자, 단백질, 펩타이드, 항체, 핵산 결합 물질 등의, 임의의 화합물 또는 물질이며, 수용체 또는 리간드에 결합하는 천연 물질의 작용을 모방 또는 강화하는 물질을 포함할 수 있다. "길항제"는, 비제한적으로, 작용제의 작용을 차단, 억제 또는 감소시키는, 소분자, 단백질, 펩타이드, 항체, 핵산 결합제 등의, 임의의 화합물 또는 물질이다.

본 발명에 사용가능한 일반 기법들

본 발명의 실시는, 달리 기재되지 않은 한, 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있는 분자생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학 및 면역학의 통상적인 기법들을 사용할 것이다. 이러한 기법들은, 예를 들어, Methods of Enzymology, Vol. 194, Guthrie et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Biology and activities of yeasts, Skinner, et al., eds., Academic Press (1980); Methods in yeast genetics : a laboratory course manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); The Yeast Saccharomyces: Cell Cycle and Cell Biology, Pringle et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997); The Yeast Saccharomyces: Gene Expression, Jones et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993); The Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics, Broach et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), (본원에서 "Sambrook"으로 공동으로 언급됨); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ("Harlow and Lane"으로 본원에서 공동으로 언급됨), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000); Casarett and Doull's Toxicology The Basic Science of Poisons, C. Klaassen, ed., 6th edition (2001), and Vaccines, S. Plotkin, W. Orenstein, and P. Offit, eds., Fifth Edition (2008) 등의 문헌에 충분히 설명되어 있다.

일반 정의

"TARMOGEN^®" (GlobeImmune, Inc., Louisville, Colorado)은 일반적으로 하나 이상의 이종 항원을 세포 외 (표면 상에), 세포 내 (내부 또는 세포질) 또는 세포 외 및 세포 내 모두에 발현하는 효모 비히클을 의미한다. TARMOGEN^®은 일반적으로 개시되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,830,463호 참조). 특정 효모-기반의 면역치료 조성물 및 이의 제조 및 일반적인 이의 이용 방법 또한 미국 특허 제 5,830,463호, 미국 특허 제 7,083,787호, 미국 특허 제 7,736,642호, Stubbs et al., Nat. Med. 7:625-629 (2001), Lu et al., Cancer Research 64:5084-5088 (2004), 및 Bernstein et al., Vaccine 2008 Jan 24;26(4):509-21에 기재되어 있으며, 이들 문헌들은 각각 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다.

일반적으로, 용어 "생물학적으로 활성"은 화합물 (단백질 또는 펩타이드 포함)이 생체내 (즉, 천연 생리학적 환경에서) 또는 시험관내 (즉, 실험실 조건 하에) 측정 또는 관찰하였을 때, 대사 과정, 생리 과정, 화학적 과정, 또는 세포, 조직 또는 유기체의 기타 과정에 영향을 미치는, 한가지 이상의 검출가능한 활성을 가지는 것을 의미한다.

본 발명에서, 용어 "조정하다"는 "조절한다"와 상호 호환적으로 사용될 수 있으며, 일반적으로 특정 활성의 상향 조절 또는 하향 조절을 의미한다. 본원에서 용어 "상향 조절하다"는 일반적으로 특정 활성에 대하여 유발, 개시, 증가, 증대, 부스팅, 개선, 강화, 증폭, 촉진 또는 제공 중 임의의 현상을 기술하기 위해 사용될 수 있다. 유사하게, 용어 "하향 조절한다"는 일반적으로 특정 활성에 대하여 감소, 저하, 저해, 완화, 약화, 줄임, 차단 또는 예방 중 임의의 현상을 기술하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본원에 언급된 임의의 아미노산 서열은, 명시된 아미노산 서열의 C- 및/또는 N-말단이 각각 측면에 위치하는, 하나 이상 내지 약 20개 이하의 부가적인 이종 아미노산들로, 제조될 수 있다. 제조되는 단백질 또는 폴리펩타이드는 명시된 아미노산 서열로 "필수적으로 구성되는" 것으로 언급될 수 있다. 본 발명에서, 이종의 아미노산 서열은 자연적으로는 명시된 아미노산 서열 측면에서 발견되지 않는 (즉, 생체 내에서 자연적으로 발견되지 않는), 또는 명시된 아미노산 서열의 기능과 관련없는, 또는 천연 서열에서 상기한 뉴클레오티드가 소정의 아미노산 서열이 유래되는 유기체에 대한 표준 코돈 사용법을 이용하여 번역된다면, 유전자에서 발생되는 바와 같이 명시된 아미노산 서열을 코딩하는 천연 핵산 서열의 측면에 위치한 뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 없는, 아미노산 서열이다. 유사하게, "필수적으로 구성되는"이라는 표현은 본원에서 핵산 서열에 대해 사용되는 경우, 명시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 5' 및/또는 3' 말단 각각에, 하나 이상 내지 많게는 약 60개 이하의 부가적 이종의 뉴클레오티드가 측면에 위치될 수 있는, 명시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 이종의 뉴클레오티드는, 천연 유전자에서 만들어지는 바와 같이 명시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 측면에서 천연적으로 발견되지 않거나 (즉, 생체내에서 천연적으로 발견되지 않음), 또는 명시된 아미노산 서열을 가진 단백질의 기능을 바꾸거나 단백질에 임의의 추가적인 기능을 부여하는 단백질을 코딩하지 않는다.

본원에서, "에 선택적으로 결합하다"라는 표현은, 본 발명의 항체, 항원-결합 단편 또는 결합 파트너가 명시된 단백질에 우선적으로 결합하는 능력을 의미한다. 보다 구체적으로, "선택적으로 결합하다"라는 표현은 하나의 단백질의 다른 것 (예를 들어, 항체, 그의 단편, 또는 항원에의 결합 파트너)에의 특이적인 결합을 의미하며, 임의의 표준 분석 (예를 들어, 면역분석)에 의하여 측정시, 결합 수준이 그 분석에 대한 백그라운드 대조군보다 통계학적으로 유의하게 높은 것을 의미한다. 예를 들어, 면역분석 수행시, 대조군은 전형적으로 항체 또는 항원 결합 단편만을 함유하는 (즉, 항원 부재) 반응 웰/튜브를 포함하며, 항원 부재시 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 의한 반응성 (예를 들어, 웰에의 비특이적 결합)의 양은 백그라운드로 간주된다. 결합은 효소 면역분석 (예를 들어, ELISA, 면역블롯 분석 등) 등의 당업계에 표준인 다양한 방법들을 이용하여 측정할 수 있다.

본 발명에 사용되는 단백질 또는 폴리펩타이드에 대한 일반적인 언급은 전장 단백질, 거의 전장 단백질 (상기한 바와 같은), 또는 임의의 단편, 도메인 (구조적, 기능적 또는 면역원성), 구조적 에피토프, 또는 소정의 단백질의 상동체 또는 변이체를 포함한다. 융합 단백질은 또한 일반적으로 단백질 또는 폴리펩타이드로 언급될 수 있다. 본 발명에 따른 분리된 단백질은 그 천연 환경으로부터 취해진 (즉, 인간 조작이 가해진) 단백질 (폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함)이며, 예를 들어, 정제된 단백질, 부분적으로 정제된 단백질, 재조합에 의하여 생산된 단백질, 및 합성에 의하여 생산된 단백질을 포함할 수 있다. 이와 같이, "분리된"은 단백질이 정제된 정도를 반영하는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 분리된 단백질은 재조합에 의해 생산된다. 본 발명에서, 용어 "변형" 및 "돌연변이"는 특히 본원에 언급된 단백질 또는 그의 일부의 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)에 대한 변형/돌연변이에 대하여 상호 호환적으로 사용될 수 있다.

본원에서, 용어 "상동체" 또는 "변이체"는 기준 단백질 또는 펩타이드에 대한 최소한의 변형에 의해 기준 단백질 또는 펩타이드 (즉, "프로토타입" 또는 야생형" 단백질)와는 차이가 있지만, 천연 형태의 기본적인 단백질 및 측쇄 구조를 유지하는, 단백질 또는 펩타이드를 의미한다. 이러한 변화로는, 하나 또는 수개 아미노산 측쇄의 변화; 결손 (예를 들어, 단백질 또는 펩타이드의 절단된 버젼), 삽입 및/또는 치환 등의, 하나 또는 몇몇 아미노산의 변화; 하나 또는 몇몇 원자의 입체 화학적 변화; 및/또는 비제한적으로, 메틸화, 당화, 인산화, 아세틸화, 미리스토일화, 프레닐화, 팔미트화, 아미드화 및/또는 글리코실포스파티딜 이노시톨의 부가 등의 최소한의 유도체화를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상동체 또는 변이체는 기준 단백질 또는 펩타이드와 비교해, 강화된, 감소된 또는 실질적으로 유사한 특성을 가질 수 있다. 상동체 또는 변이체는 단백질의 작용제 또는 단백질의 길항제를 포함할 수 있다. 상동체 또는 변이체는, 비제한적으로, 분리된 기준 단백질에 대한 직접 변형, 직접 단백질 합성, 또는 예를 들어 무작위 또는 표적화 돌연변이 유발을 실행하여 단백질 변이체를 코딩하는 고전적인 또는 재조합 DNA 기법을 이용하여, 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 대한 변형 등의, 당해 기술 분야에 공지된 단백질 제조 기법을 이용하여 만들 수 있다. 또한, 기준 단백질의 천연 변이체도 존재할 수 있으며 (예를 들어, 이소형, 대립유전자 변이체 또는 개체별로 발생할 수 있는 기타 자연적 변이체), 본 발명에서 분리, 생산 및 또는 이용될 수 있다.

소정의 단백질의 상동체 또는 변이체는, 기준 단백질의 아미노산 서열 (예를 들어, 본원에 명시된 아미노산 서열, 또는 명시된 단백질의 아미노산 서열)에 대해, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상 동일하거나, 또는 약 87% 이상 동일한, 약 88% 이상 동일한, 약 89% 이상 동일한, 약 90% 이상, 약 91% 이상 동일한, 약 92% 이상 동일한, 약 93% 이상 동일한, 약 94% 이상 동일한, 약 95% 이상 동일한, 약 96% 이상 동일한, 약 97% 이상 동일한, 약 98% 이상 동일한, 약 99% 동일한 (또는 45% - 99% 사이의 모든 정수 증가분의 모든 % 동일성) 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 또는 이로 구성될 수 있다.

본원에서, 달리 명시되지 않은 한, 퍼센트(%)에 대한 언급은 다음을 사용하여 수행되는 상동성 평가를 지칭한다: (1) 표준 디폴트 파라미터로 아미노산 검색용 blastp 및 핵산 검색용 blastn을 이용한 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 베이직 상동성 검색, 여기서 쿼리 서열은 (예, 원용에 의해 본 명세서에 그 전체가 포함되는, Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에 기재된 바와 같이) 디폴트에 의해 낮은 복합성 영역에서 필터링됨; (2) 두 서열간의 BLAST 정렬 (예를 들어, 후술한 파라미터가 이용됨); 및/또는 (3) 표준 디폴트 파라미터를 이용한 PSI-BLAST (포지션-특이적 반복 BLAST). 2가지 서열에 대한 베이직 BLAST와 BLAST 간의 표준 파라미터의 일부 차이로 인해, BLAST 프로그램을 이용하여 두 개의 특정 서열이 상당한 상동성을 가지는 것을 인식될 수 있는 반면, 쿼리 서열로서 서열 중 하나를 이용하는 베이직 BLAST에서 수행되는 검색은 탑 매치에서 두번째 서열을 동정할 수 없음에 유념하여야 한다. 또한, PSI-BLAST는 자동화된, 사용하기 쉬운 "프로필" 검색 버젼을 제공하며, 이는 서열 상동체를 검색하는 민감한 방식이다. 이 프로그램은 먼저 gapped BLAST 데이터베이스 검색을 수행한다. PSI-BLAST 프로그램은 포지션-특이적 스코어 매트릭스를 구축하기 위해 회귀된 임의의 상당한 정렬로부터 유래된 정보를 이용하며, 이는 다음 라운드의 데이터베이스 검색에서 쿼리 서열을 대체한다. 따라서, 퍼센트 확인은 이들 프로그램 중 임의의 하나를 이용하여 정해질 수 있는 것으로 이해될 것이다.

두 개의 특정 서열들을, Tatusova and Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250에 기재된 바와 같이, BLAST를 이용하여 서로 정렬할 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 원용에 의해 포함된다. 이러한 서열 정렬은 2가지 서열들 간에 Gapped BLAST 검색 (BLAST 2.0)을 수행하여 제조되는 정렬에 갭 (결손 및 삽입) 도입을 허용하기 위해, BLAST 2.0 알고리즘을 이용하여 blastp 또는 blastn으로 수행된다. 본원에서 명확하게 할 목적으로, 두 서열에 대한 BLAST 서열 정렬은 다음과 같은 표준 디폴트 파라미터를 이용하여 수행된다.

blastn의 경우, 0 BLOSUM62 매트릭스 사용:

매치에 대한 보상 = 1

미스매치에 대한 페널티 = -2

오픈 갭 (5) 및 연장 갭 (2) 페널티

갭 x_드롭오프 (50) 예상 (10) 워드 사이즈 (11) 필터 (온)

blastp의 경우, 0 BLOSUM62 매트릭스 사용:

오픈 갭 (11) 및 연장 갭 (1) 페널티

갭 x_드롭오프 (50) 예상 (10) 워드 사이즈 (3) 필터 (온)

분리된 핵산 분자는, 천연 환경으로부터 취해진 (즉, 인간 조작이 가하여진) 핵산 분자이며, 천연 환경은 핵산 분자가 본래 발견되는 게놈 또는 염색체이다. 이와 같이, "분리된"은 핵산 분자가 정제된 정도를 반드시 반영하는 것은 아니지만, 분자가, 핵산 분자가 본래 발견되는, 전체 게놈 또는 전체 염색체 또는 2 이상의 유전자를 포함하는 게놈의 세그먼트를, 포함하지 않는 것을 의미한다. 분리된 핵산 분자는 완전한 유전자를 포함할 수 있다. 유전자를 포함하는 분리된 핵산 분자는 이와 같은 유전자를 포함하는 염색체의 단편이 아니라, 그 유전자와 관련되는 코딩 영역 및 조절 영역은 포함하나, 동일 염색체에서 자연적으로 발견되는 부가적인 유전자는 포함하지 않는다. 분리된 핵산 분자는 또한 유전자 일부를 포함할 수도 있다. 분리된 핵산 분자는, 또한, 본래 정상적으로는 명시된 핵산 서열의 측면에 위치하지 않는 추가적인 핵산 (즉, 이종 서열)이 명시된 핵산 서열의 측면에 위치하는 (예, 서열의 5' 및/또는 3' 말단) 것을 포함할 수 있다. 분리된 핵산 분자는 DNA, RNA (예, mRNA), 또는 DNA 또는 RNA의 유도체 (예, cDNA)를 포함할 수 있다. "핵산 분자"라는 표현이 주로 물리적 핵산 분자를 의미하고, "핵산 서열"이라는 표현은 주로 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 의미하지만, 이들 표현은 특히 단백질 또는 단백질의 도메인을 코딩할 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 서열에 대해서는 상호 호환적으로 사용될 수 있다.

재조합 핵산 분자는, 형질감염시킬 세포에서 핵산 분자(들)의 발현을 효과적으로 조절할 수 있는, 임의의 전사 조절 서열들 중 적어도 하나에 작동가능하게 연결되는, 본원에 언급된 임의의 하나 이상의 단백질을 코딩하는 임의의 핵산 서열 하나 이상을 포함할 수 있는 분자이다. "핵산 분자"라는 표현이 주로 물리적 핵산 분자를 의미하고 "핵산 서열"이라는 표현은 주로 핵산 분자 상의 뉴클레오티드 서열을 의미하지만, 이들 표현은 특히 단백질을 코딩할 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 서열에 대해서는 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 또한, "재조합 분자"라는 표현은 주로 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 핵산 분자를 의미하지만, 동물에 투여되는 "핵산 분자"라는 표현과 상호 호환적으로 사용될 수 있다.

재조합 핵산 분자는, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자에 작동가능하게 연결되고; 융합 단백질의 재조합 생산을 구현할 수 있으며; 본 발명에 따른 숙주 세포로 핵산 분자를 전달할 수 있는, 임의의 핵산 서열, 특히 이종의 서열인, 재조합 벡터를 포함한다. 이러한 벡터는, 상기 벡터 내로 삽입시킬 분리된 핵산 분자에 천연적으로는 인접하게 발견되지 않는, 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 원핵 또는 진핵동물의 RNA 또는 DNA일 수 있으며, 바람직하게 본 발명에서는, 효모의 형질감염에 유용한 플라스미드이다. 재조합 벡터는 핵산 분자의 클로닝, 서열분석 및/또는 그렇지 않으면 조작에 사용될 수 있으며, 상기 분자의 전달에 사용될 수 있다 (예를 들어, DNA 조성물 또는 바이러스 벡터-기재-조성물 내에서와 같이). 재조합 벡터는 바람직하게 핵산 분자의 발현에 사용되며, 또한 발현 벡터로서 언급될 수 있다. 바람직한 재조합 벡터는 효모 등의 형질감염된 숙주 세포에서 발현되어질 수 있다.

본 발명의 재조합 분자에서, 핵산 분자는 전사 조절 서열, 번역 조절 서열, 복제 오리진 및 숙주 세포에 적합하며 본 발명의 핵산 분자의 발현을 조절하는 기타 조절 서열 등의, 조절 서열을 포함하는 발현 벡터에 작동가능하게 연결된다. 특히, 본 발명의 재조합 분자는 하나 이상의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 핵산 분자를 포함한다. "작동가능하게 연결되는"이라는 표현은 핵산 분자가 숙주 세포 내로 형질감염되었을 때 (즉, 형질전환, 형질도입 또는 형질감염) 발현되는 방식으로, 핵산 분자가 발현 조절 서열에 연결되는 것을 의미한다.

본 발명에서, 용어 "형질감염"은 외인성 핵산 분자 (즉, 재조합 핵산 분자)를 세포로 삽입할 수 있는 임의의 방법을 의미한다. 용어 "형질전환"은 이 용어가 조류, 박테리아 및 효모 등의 미생물 세포 내로의 핵산 분자 도입을 의미하는데 사용되는 경우에는, 용어 "형질감염"과 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 미생물 시스템에서, 용어 "형질전환"은 미생물의 외인성 핵산의 획득으로 인한 유전적인 변화를 기술하는데 사용되며, 용어 "형질감염"과 실질적으로 동의어이다. 따라서, 형질감염 기법으로는 형질전환, 세포의 화학적 처리, 유전자총 (particle bombardment), 전기천공, 미세주입, 리포펙션, 흡착, 감염 및 프로토플라스트 융합을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

이하 실험 결과들은 예시 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

아래 실시예는 척색종 개체에서 1상 또는 2상 임상 실험을 기술한다.

척색종 환자에서 무작위 1상 또는 2상 임상 실험을 본원에 언급된 효모-브라큐리 면역치료 조성물 (예, 서열번호 8 또는 서열번호 20을 발현하는 열-사멸된 사카로마이세스 전효모를 포함하는, 효모-브라큐리 면역치료 조성물)을 이용하여 수행한다. 척색종 개체 20명 이상이 참여한다.

실험은 이중 맹검 또는 오픈-라벨의 위약-대조군, 다기관 실험으로서 수행한다. 모든 환자들에게는 종양 절제 및 방사선 치료를 포함한 표준 관리 요법이 제공되며, 치료 그룹 환자에게는 치료하는 동안 효모-브라큐리 면역치료 조성물을 수회 연속 주사한다. 1차 목표는 브라큐리-양성 종양 세포 감소, 증상에 의한 및 방사선에 의한 반응 개선, 종양 증식의 무-진행, 재발없는 생존 또는 전체 생존이다. 추가적인 목표는 항원-특이적인 T 세포 반응 (예, 치료 중에 브라큐리-특이적인 CD8⁺ T 세포 출현 또는 확대)을 포함할 수 있다.

효모-기반의 면역치료 조성물은 안전하며 허용성이 우수하며, 유의한 독성이 없을 것으로 예상된다. 또한, 효모-브라큐리 면역치료 조성물은 치료-출현성 브라큐리-특이적인 T 세포 반응 및/또는 환자의 적어도 일부 또는 대부분에서 기존 브라큐리-특이적인 베이스라인 T 세포 반응의 개선을 유발할 것으로 예상된다. 환자 일부 또는 대부분은 질환이 안정적이거나, 및/또는 재발없는 생존 (무진행성 생존) 및/또는 전체 생존을 연장시킬 것으로 예상된다.

실시예 2

아래 실시예는 가족성 척색종 병력이 있는 건강한 개체에서의 2상 임상 실험을 기술한다.

가족성 척색종 병력을 가진 건강한 개체 (즉, 척색종 병력을 가진 혈족이 2 이상의 가족을 가진 개체)를 대상으로 하는 무작위 2상 임상 실험은 본원에 언급된 효모-브라큐리 면역치료 조성물 (예, 서열번호 8 또는 서열번호 20을 발현하는 열-사멸된 사카로마이세스 전효모를 포함하는, 효모-브라큐리 면역치료 조성물)을 이용하여 수행한다. 개체 40명 이상이 참여한다.

실험은 이중 맹검 또는 오픈-라벨의 위약-대조군, 다기관 실험으로서 수행한다. 모든 환자들에게는 일반적인 모니터링을 제공되며, 치료 그룹 환자에게는 효모-브라큐리 면역치료 조성물을 수회 연속 주사한다. 개체는 척색종 발병에 대해 모니터링된다. 목표는 항원-특이적인 T 세포 반응 (예, 치료 중에 브라큐리-특이적인 CD8⁺ T 세포 출현 또는 확대), 척색종 음성 유지 및 척색종 진행 지연을 포함할 수 있다.

효모-기반의 면역치료 조성물은 안전하며 허용성이 우수하며, 유의한 독성이 없을 것으로 예상된다. 또한, 효모-브라큐리 면역치료 조성물은 환자의 적어도 일부 또는 대부분에서 치료-출현성 브라큐리-특이적인 T 세포 반응을 유발할 것으로 예상된다. 개체의 치료 그룹은, 위약을 제공받는 개체 또는 효모-기반의 면역치료제를 제공받지 않은 척색종 병력 (즉, 가족성 척색종)을 가진 개체 집단과 비교하여, 척색종 발병률이 낮거나 또는 척색종 개시가 지연될 것으로 예상된다. 치료 효능 판단을 위한 비교를 위해, 질환 발생의 베이스라인 기준을 제공하기 위해 가족성 척색종을 가진 가족에 속하는 가족 구성원들을 경시적으로 추적함으로써 결정될 수 있는 바와 같이, 대조군은 가족성 척색종 발생에 있어 유효한/표준화된 과거 방제율 (historical control rate)을 포함할 수 있다.

실시예 3

아래 실시예는 브라큐리를 발현하는 것으로 알려진 암을 가진 개체에서 수행된 1상 임상 실험을 기술한다.

오픈-라벨의 순차적인 용량-증가식의 1상 임상 실험은 GI-6301으로 언급되는 효모-브라큐리 면역치료 조성물을 이용하여 착수하였다. 본 임상 실험 프로토콜에서, 핵심적인 포함 기준은 하기를 포함한다: 고형암, 측정가능한 질환 (질환은 평가가능하여야 함) 또는 측정불가한 질환, ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group) 상태 등급 0-1 (0 등급은 제한없이 병에 걸리기 전의 활동을 모두 수행할 수 있는 모든 활동 가능인 것을 의미하며, 1 등급은 육체적으로 힘든 활동에는 제한적이지만 걸을 수 있으며 경미하거나 앉아서 하는 일은 가능한 상태를 의미함), 크레아티닌 수준 </- 1.5xULN (정상치의 상한), ALT 수준 (알라닌-아미노트랜스퍼라제) </- 2.5xULN, AST 수준 (아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제) </- 2.5xULN, 빌리루빈 (Bili) 수준 </- 1.5xULN, 절대 호중구 카운트 (ANC) > 1500, 혈소판 카운트 > 100,000, 사전 화학요법 치료로부터 최소 2주. 또한, 기존에 면역치료를 시술받은 환자도 허용하였다.

핵심적인 제외 기준은 하기를 포함함다: HIV 또는 간염 환자; 임신부, 수유기 여성, 활성형의 자가면역 질환자, 일부 전신성 스테로이드 사용자, 효모 기반의 제품에 대해 알레르기를 가진 자, CNS 질환을 가진 자, 심막 크기 (pericardial mass) > 2 cm, EBV 바이러스 혈증 (PCR에 의해 규명됨, log10 >3.0), 갑상선 질환 (매스 (mass) 또는 자가면역) 및 삼환식 항우울제를 이용하는 환자.

진행성 암을 가진 환자 27명 (용량 코호트 당 환자 3-16명)이 참여하였으며, GI-6301으로 공지된 효모-브라큐리 면역치료 조성물을 순차적으로 용량 코호트를 증가시키는 프로토콜로 투여하였다. 프로토콜에서는 피하 투여되는 4 Y.U. (1 Y.U. x 4곳, GI-6301 1 Y.U.를 각 방문시 환자의 신체 다른 4곳에 투여하는 것을 의미함), 16 Y.U. (4 Y.U x 4곳) 및 40 Y.U. (10 Y.U. x 4곳)의 용량 범위를 사용하였다. GI-6301은 2주 간격으로 총 7회 (약 3개월) 투여한 다음, 매달 투여하고, 실험하는 동안 2개월마다 스캔을 재평가하였다. 1차 목표는 안전성이었다. 2차 목표는, 종양-관련 항원 면역 반응의 분석, 즉, ELISpot 분석에서 브라큐리-특이 T 세포 증가 및 브라큐리 단백질에 대한 반응으로 인한 증식 (예, 치료 중에 브리큐리-특이적인 CD8⁺ 또는 CD4⁺ T 세포 출현 또는 확대)에 의해 측정되는 바와 같이, T 세포 전구체에서의 유의한 변화가 검출가능한지를 포함하였다. 추가적인 2차 목표는, 무진행성 생존, 종양 마커의 변화 또는 변화율, 뿐만 아니라 말초혈에서의 면역 세포 아종 (CD8⁺ 기억/작동자 T 세포, CD4⁺ 기억/작동자 T 세포, Treg, NK 세포, DC)의 빈도 및 사이토카인 (예, IFN-γ, IL-10, IL-12, IL-2, IL-4, TGF-β 등)의 혈청내 수준 변화 등의, 전체 면역 활성화의 파라미터와 같은, 임상적인 이점을 포함하였다. 예를 들어, 면역 반응은, 사이토카인, 즉 인터페론 γ (IFN-γ), 종양 괴사 인자 (TNF) 및 인터루킨 2 (IL-2)에 대한 CD4 및 CD8 T 림프구의 세포내 염색 (ICS)의 유세포 측정에 의해 측정하였다.

환자 27명에게 제공된 191번의 백신을 이용한 치료는 허용성이 우수하였다. 환자 2명은 3등급의 주사 부위 반응 (일시적)을 경험하였다. 백신과 관련된 다른 3등급 및 4등급 독성은 없었다. 오직 9번의 사이클에서만 2등급 독성 (일반적으로 플루-유사 증상)이 나타났다.

샘플 21종은 면역 반응 분석에 이용가능하였으며, 7종은 ICS에 의한 측정시 브라큐리-특이 반응을 나타내었다. 실험의 시간 중앙값은 74일 (범위)이었다. 전이성 대장암을 가진 환자는 15개월간 질환이 안정적이었다.

전반적으로, 면역치료 조성물, GI-6301은 안전하며 허용성이 높으며, 유의한 독성이 없는 것으로 확인되었다. GI-6301 면역치료 조성물을 이용한 상기한 1상 실험에서, 일부 환자들에서 안전성과 면역 반응 강화가 나타났다. 이들 결과는, 인간에서 최초로 백신화를 통해 전사 인자를 면역학적으로 표적화할 수 있음을 보여준다.

실시예 4

아래 실시예는 실시예 3에 기술된 1상 실험을 확장한 것으로, 본 발명의 효모-브라리 조성물을 이용한 척색종 개체의 면역화 결과를 보여준다.

실시예 3에 기술한 1상 실험의 확대 단계를 착수하였다. 확대 단계의 목표는 추가적인 환자 코호트에 최고 허용 용량으로 GI-6301을 투여하고, 실험에 진행된 척색종 환자를 포함시키는 것이었다. 확대 단계를 등록하기 위해, 실시예 3에 기술된 최초 실험과 비교하여, 다음과 같은 적격 기준은 제외시켰다: CNS 질환 (특히 척색종 환자에게 등록을 허가함), 갑상성 질환 (및 모니터링) 및 엡스타인-바르 바이러스 (EBV) PCR 요건 제외.

재발 (진행성) 척색종을 가진 환자 7명은 40 Y.U. 용량 수준의 확대 단계로 등록시켰으며, 이들 환자의 임상 및 면역학적 결과를 우선 평가하였다. 환자 7명 모두 앞서 방사선 치료를 제공받았다 (방사선 치료 후 중앙값 470일; 범위 111-1883). 연령 중앙값은 59 (41-66)년이었다. 모두에게 백신 40 Y.U.를 2주 간격으로 7번 투여하였고, 8일에 1차 리스테이징 (restaging) 되었다. 안정적인 경우, 환자에게는 2달마다 리스테이징 스캔하면서, 매달 투여를 계속하였다. 1차 목표는 안전성이며, 임상 결과도 물론 추적하였다. 또한, 브라큐리-특이 T 세포 반응도 사이토카인 IFN-γ, TNF 및 IL-2에 대한 CD4 및 CD8 T 림프구에 대한 유세포 측정 세포내 염색 (ICS)으로 분석하였다.

전술한 바와 같이, 환자 7명 모두 대규모의 예비 치료를 시술받았다. 환자 2명은 실험하는 동안 진행되는 각각 6개월 및 12개월간 비교적 질환 상태가 안정적이었으며, 둘다 각각 141일 및 197일째에 안정적으로 유지되었다. 나머지 환자 5명은 등록시 진행성 질환을 가지고 있었다. 이들 5명 중 1명은 141일째에 병변이 >30%로 인덱스 감소하였으며, 4주 후 반복 스캔에서 확증된 부분 관해 (PR)가 확인되었다. 환자 1명은 141 리스테이징하는 동안에 질환이 안정적이었다. 나머지 3명은 141일 리스테이징 시기로 진행되었다. 부작용은 최소였으며, 주사 부위 반응이 가장 일반적이었다 (63회 투여시 부작용 13건 (21%), 6/7 pts (86%)). 2/7 (Two of 7) pts는 ICS으로 측정시 브라큐리-특이 T 세포 반응을 나타내었다.

40 Y.U. 확대 그룹의 경우, 종양 치수 변화를 도 1에 나타낸 바와 같이 기록하였다. 0일 좌측 X 축 스케일은 0일 우측 스케일과 다르다.

지금까지, GI-6301 백신을 이용한 1상 실험에서 진행성 척색종을 가진 이러한 환자 코호트는 안전성과 면역 반응 강화 및 확증된 부분 관해 (PR)를 나타내었다.

재발성 척색종을 가진 환자 4-5명에게 80 Y.U. 용량 수준 확대 단계를 실시하고자 하는 계획을 세웠다.

실시예 5

아래 실시예는, 국소 재발성 또는 전이성 질환을 가지고 있으며 실험 등록 전 3-9개월 사이에 종양이 진행된, 척색종 개체를 대상으로 수행된 2상 임상 실험을 기술한다.

본 임상 실험에서는 국소 재발성 또는 전이성 질환을 가진 척색종 개체에서 효모-브라큐리 면역치료 조성물을 평가한다. 임의의 이전 치료요법을 제공받은 개체도 본 실험에 허용된다. 아울러, 실험에 참여하기 위해서는, 개체는 본 실험에 등록하기 전 3-9개월 사이에 종양 진행이 진행되었어야 한다. 개체에게 효모-기반의 면역치료 조성물, 예컨대, 본원에 언급된 GI-6301을 투여한다. 예를 들어, 프로토콜은 4 Y.U. (1 Y.U. x 4곳, GI-6301 1 Y.U.를 각 방문시 환자의 신체 다른 4곳에 투여하는 것을 의미함), 16 Y.U. (4 Y.U x 4곳), 40 Y.U. (10 Y.U. x 4곳) 및 (피하로 투여되는) 80 Y.U.의 용량 범위를 사용할 수 있다

면역치료 조성물을 이용한 면역화를 개시한 후 약 6개월째에, 방사선 치료할 수 있는 병변이 있는지를 확인하기 위해 개체를 케어 제공자로부터 평가받게 한다. 병변에 방사선 치료가 가능할 경우, 병변을 방사선 치료로 치료하고, 실험의 1차 및 2차 목표가 달성될 때까지 개체를 모니터링하고 평가한다. 병변의 방사선 치료가 가능하지 않을 경우에는, 개체에게 방사선 치료를 수행하지 않고, 실험의 1차 및 2차 목표가 달성될 때까지 개체를 모니터링하고 평가한다. 효모-기반의 면역치료 조성물의 투여는, 실험의 1차 및 2차 목표가 달성될 때까지 계속 진행한다.

1차 목표는 RECIST에 의해 규정되는 무진행성 생존 (PFS) 확인일 것이다. 2차 목표는 종양 반응율 (RECIST 및 Choi에 의해 결정됨, 비교를 위해 방사선 치료한 병변과 방사선 치료하지 않은 병변을 조사함) 및 종양 증식 속도 카이네틱스 (면역치료제의 치료 전 6개월 대 면역치료제 치료 후 6개월째의 평가 비교)를 포함한다. PFS에서, 중앙값은 무-처리 대조군 개체 (5개월 예상됨)과 비교해 9개월일 것으로 예상된다. 면역치료 조성물에 대한 개체의 반응을, 동일한 방식으로 치료하지만 면역치료 조성물은 투여하지 않거나 또는 면역치료 조성물을 방사선 치료, 외과적 절제, 표적화된 약물 요법 또는 이의 조합들과 조합하여 투여하지 않은, 개체의 반응과 비교할 수 있다.

효모-브라큐리 조성물의 투여는 본 실험에서 안전하며 허용성이 우수하며, 유의한 독성이 없을 것으로 예상된다. 아울러, 효모-브라큐리 조성물의 투여는, 표준 케어를 제공받은 개체 범주들에서의 PFS 표준 중앙값과 비교하여, 무진행성 생존을 개선시킬 것으로 예상되며, PFS 개선은 백신 투여 후 방사선 치료의 시술시 증가될 것으로 예상된다. 아울러, 효모-브라큐리 조성물의 투여는 반응율을 개선시키고, 종양 증식 속도 카이네틱스를 우호적으로 변화시킬 것으로 예상된다. 마지막으로, 효모-브라큐리의 투여는 환자의 적어도 일부 또는 대부분에서 치료-출현성 브라큐리-특이 T 세포 반응을 형성할 것으로 예상된다.

실시예 6

아래 실시예는, 절제불가하며 국소 재발성 병변을 가지고 있으며, 병변에 대한 방사선 치료를 받은 적 없는, 척색종 개체에 대한 2상 임상 실험을 기술한다.

이들 척색종 개체에 대한 무작위 2상 임상 실험을 본원의 효모-브라큐리 면역치료 조성물 (예, 서열번호 8 (GI-6301) 또는 서열번호 20 (GI-6305)을 발현하는 열-사멸된 사카로마이세스 전효모를 포함하는 효모-브라큐리 면역치료 조성물)을 이용하여 수행한다. 실험은 후술한 기준을 이용하여 임상 효능을 평가하도록 충분한 수의 환자를 참여시켜, 통계학적으로 유효할 것이다.

본 실험은 이중 맹검 또는 오픈-라벨, 다기관 실험으로 수행한다. 모든 환자에게는 일반적인 모니터링, 및/또는 표준 케어 조치들, 방사선 요법, 전신 약물 요법 또는 이들의 조합을 실시하며, 환자 치료 그룹에는 효모-브라큐리 면역치료 조성물 (즉, GI-6301 또는 기타 효모-브라큐리 면역치료제)을 수차례 연속 주사한다. 예를 들어, 프로토콜은 4 Y.U. (1 Y.U. x 4곳, GI-6301 1 Y.U.를 각 방문시 환자의 신체 다른 4곳에 투여하는 것을 의미함), 16 Y.U. (4 Y.U x 4곳), 40 Y.U. (10 Y.U. x 4곳) 및 (피하로 투여되는) 80 Y.U.의 용량 범위를 사용할 수 있다. 용량은 예를 들어 실시예 3에 기술된 바와 같이 또는 매달 투여할 수 있다. 포함 기준은 고형 종양 및 측정가능한 질환의 존재를 포함할 수 있다. 1차 및/또는 2차 목표는 무진행성 생존 (RECIST에 의해 규정될 수 있거나, 또는 RECIST의 변형된 면역관련 반응 기준 또는 Choi 기준에 의해 규정될 수 있음), 진행 경과 시간 지연, 종양 반응율 (즉, RECIST 및/또는 Choi 기준에 의해 측정되거나 및/또는 개체의 방사선 치료하지 않은 병변과의 비교를 통한, 일정 기간 동안의 무처리 종양의 화상 진찰에 의한 참여하기 6-12개월 전에 확인된 방사선 촬영으로 관찰된 반응, 안정성 또는 진행), 종양 증식 속도 카이네틱스 (예, 치료 전 6개월 대 치료 후 6개월), 항원-특이 T 세포 반응 (예로, 치료 중의 브라큐리-특이 CD8⁺ 및/또는 CD4⁺T 세포의 출현 또는 증폭), 전체 생존 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

효모-기반의 면역치료 조성물에 대한 개체의 반응을, 동일한 방식으로 치료되지만 면역치료 조성물을 투여하지 않거나 또는 면역치료 조성물을 방사선 치료, 외과적 절제, 표적화된 약물 요법 또는 이의 조합 등의 2선 치료법과 조합하여 투여하지 않은, 개체의 반응과 비교할 수 있다.

효모-기반의 면역치료 조성물은 안전하며 허용성이 우수하며, 유의한 독성이 없을 것으로 예상된다. 아울러, 효모-브라큐리 면역치료 조성물은, 무진행성 생존을 개선시키거나, 치료-출현성 브라큐리-특이 T 세포 반응을 일부 환자 또는 대부분의 환자에서 형성시키거나, 및/또는 종양 증식 속도를 저하시킬 것으로 예상된다. 치료 그룹의 개체는 효모-기반의 면역치료제를 투여받지 않은 대조군 개체에 비해, 진행되는 시간을 지연시킬 것으로 예상된다. 본 실험의 목표는 본 실시예에 언급된 척색종 집단의 예상되는 PFS 중앙값으로부터의 증가 경향, 바람직하게는 통계학적으로 유의한 증가 경향을 달성하는 것이다. 예를 들어, 통계학적인 목표인 PFS 중앙값 9개월이 달성될 수 있으며, 이때 실험 중인 관련 척색종 집단의 경우 예상되는 PFS 중앙값은 전형적으로 약 5개월일 수 있다.

실시예 7

아래 실시예는, 절제불가하며 국소 재발성 병변을 가지고 있으며, 병변에 대한 방사선 치료를 받은 적 있는, 척색종 개체에 대한 2상 임상 실험을 기술한다.

실시예 8

아래 실시예는, 올리고-전이성 질환 및 절제불가한 병변을 가지고 있으며, 병변에 대한 방사선 치료를 받은 적 없는, 척색종 개체에 대한 2상 임상 실험을 기술한다.

본 실험은 이중 맹검 또는 오픈-라벨, 다기관 실험으로 수행한다. 모든 환자에게는 일반적인 모니터링, 및/또는 표준 케어 조치들, 방사선 요법, 전신 약물 요법 또는 이들의 조합을 실시하며, 환자 치료 그룹에는 효모-브라큐리 면역치료 조성물 (즉, GI-6301 또는 기타 효모-브라큐리 면역치료제)을 수차례 연속 주사한다. 예를 들어, 프로토콜은 4 Y.U. (1 Y.U. x 4곳, GI-6301 1 Y.U.를 각 방문시 환자의 신체 다른 4곳에 투여하는 것을 의미함), 16 Y.U. (4 Y.U x 4곳), 40 Y.U. (10 Y.U. x 4곳) 및 (피하로 투여되는) 80 Y.U.의 용량 범위를 사용할 수 있다. 용량은 예를 들어 실시예 3에 기술된 바와 같이 또는 매달 투여할 수 있다. 포함 기준은 고형 종양 및 측정가능한 질환의 존재를 포함할 수 있다. 1차 및/또는 2차 목표는 무진행성 생존 (RECIST에 의해 규정될 수 있거나, 또는 RECIST의 변형된 면역관련 반응 기준 또는 Choi 기준에 의해 규정될 수 있음), 진행 경과 시간 지연, 종양 반응율 (즉, 일정 기간 동안 무처리 종양의 화상 진찰에 의한 Choi 기준에 의해 규정될 수 있음), 진행 경과 시간 지연, 종양 반응율 (즉, RECIST 및/또는 Choi 기준에 의해 측정되거나 및/또는 개체의 방사선 치료하지 않은 병변과의 비교를 통한, 일정 기간 동안의 무처리 종양의 화상 진찰에 의한 참여하기 6-12개월 전에 확인된 방사선 촬영으로 관찰된 반응, 안정성 또는 진행), 종양 증식 속도 카이네틱스 (예, 치료 전 6개월 대 치료 후 6개월), 항원-특이 T 세포 반응 (예로, 치료 중의 브라큐리-특이 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포의 출현 또는 증폭), 전체 생존 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

실시예 9

아래 실시예는, 올리고-전이성 질환 및 절제불가한 병변을 가지고 있으며, 그 병변에 대한 방사선 치료를 받은 적 있는, 척색종 개체에 대한 2상 임상 실험을 기술한다.

실시예 10

아래 실시예는, 올리고-전이성 질환 및 post-절제가능 병변을 가지고 있으며, 개체가 척색종에 대한 방사선 치료를 받은 적 없는, 척색종 개체에 대한 2상 임상 실험을 기술한다.

실시예 11

아래 실시예는, 올리고-전이성 질환 및 post-절제가능 병변을 가지고 있으며, 개체가 방사선 치료를 받은 적 있는, 척색종 개체에 대한 2상 임상 실험을 기술한다.

실시예 12

아래 실시예는, 절제불가한 병변이 1차 재발되었으며 그 병변에 대해 방사선 치료가 행해진 적 없는, 척색종 개체에 대한 2상 임상 실험을 기술한다.

실시예 13

아래 실시예는, 절제불가한 병변이 1차 재발되었으며 그 병변에 대해 방사선 치료가 행해진 적 있는, 척색종 개체에 대한 2상 임상 실험을 기술한다.

실시예 14

아래 실시예는, 전이성 질환과 기존에 방사선 치료 받은 적 없는 병변을 가지고 있는, 척색종 개체에 대한 2상 임상 실험을 기술한다.

실시예 15

아래 실시예는, 전이성 질환과 기존에 방사선 치료 받은 적 있는 병변을 가지고 있는, 척색종 개체에 대한 2상 임상 실험을 기술한다.

본 발명의 다양한 구현예들이 상세하게 기술되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 이들 구현예들에 대한 수정 및 조정을 가할 수 있음은 자명한 사실이다. 그러나, 이러한 수정 및 조정은 첨부된 청구항에 기술된 본 발명의 범위 내임을 분명히 인지하여야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> GlobeImmune, Inc. The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Rodell, Timothy C. Apelian, David Palena, Claudia Schlom, Jeffrey <120> Yeast-Based Immunotherapy for Chordoma <130> 7797-2-PCT <140> Not Yet Assigned <141> 2014-03-14 <150> 61/803,332 <151> 2013-03-19 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2518 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (494)..(1801) <400> 1 tttgcttttg cttatttccg tccatttccc tctctgcgcg cggaccttcc ttttccagat 60 ggtgagagcc gcggggacac ccgacgccgg ggcaggctga tccacgatcc tgggtgtgcg 120 taacgccgcc tggggctccg tgggcgaggg acgtgtgggg acaggtgcac cggaaactgc 180 cagactggag agttgaggca tcggaggcgc gagaacagca ctactactgc ggcgagacga 240 gcgcggcgca tcccaaagcc cggccaaatg cgctcgtccc tgggagggga gggaggcgcg 300 cctggagcgg ggacagtctt ggtccgcgcc ctcctcccgg gtctgtgccg ggacccggga 360 cccgggagcc gtcgcaggtc tcggtccaag gggccccttt tctcggaagg gcggcggcca 420 agagcaggga aggtggatct caggtagcga gtctgggctt cggggacggc ggggagggga 480 gccggacggg agg atg agc tcc cct ggc acc gag agc gcg gga aag agc 529 Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser 1 5 10 ctg cag tac cga gtg gac cac ctg ctg agc gcc gtg gag aat gag ctg 577 Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu 15 20 25 cag gcg ggc agc gag aag ggc gac ccc aca gag cgc gaa ctg cgc gtg 625 Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val 30 35 40 ggc ctg gag gag agc gag ctg tgg ctg cgc ttc aag gag ctc acc aat 673 Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn 45 50 55 60 gag atg atc gtg acc aag aac ggc agg agg atg ttt ccg gtg ctg aag 721 Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys 65 70 75 gtg aac gtg tct ggc ctg gac ccc aac gcc atg tac tcc ttc ctg ctg 769 Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu 80 85 90 gac ttc gtg gcg gcg gac aac cac cgc tgg aag tac gtg aac ggg gaa 817 Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu 95 100 105 tgg gtg ccg ggg ggc aag ccg gag ccg cag gcg ccc agc tgc gtc tac 865 Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr 110 115 120 atc cac ccc gac tcg ccc aac ttc ggg gcc cac tgg atg aag gct ccc 913 Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro 125 130 135 140 gtc tcc ttc agc aaa gtc aag ctc acc aac aag ctc aac gga ggg ggc 961 Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly 145 150 155 cag atc atg ctg aac tcc ttg cat aag tat gag cct cga atc cac ata 1009 Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile 160 165 170 gtg aga gtt ggg ggt cca cag cgc atg atc acc agc cac tgc ttc cct 1057 Val Arg Val Gly Gly Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro 175 180 185 gag acc cag ttc ata gcg gtg act gct tat cag aac gag gag atc aca 1105 Glu Thr Gln Phe Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr 190 195 200 gct ctt aaa att aag tac aat cca ttt gca aaa gct ttc ctt gat gca 1153 Ala Leu Lys Ile Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala 205 210 215 220 aag gaa aga agt gat cac aaa gag atg atg gag gaa ccc gga gac agc 1201 Lys Glu Arg Ser Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser 225 230 235 cag caa cct ggg tac tcc caa tgg ggg tgg ctt ctt cct gga acc agc 1249 Gln Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser 240 245 250 acc ctg tgt cca cct gca aat cct cat cct cag ttt gga ggt gcc ctc 1297 Thr Leu Cys Pro Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu 255 260 265 tcc ctc ccc tcc acg cac agc tgt gac agg tac cca acc ctg agg agc 1345 Ser Leu Pro Ser Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser 270 275 280 cac cgg tcc tca ccc tac ccc agc ccc tat gct cat cgg aac aat tct 1393 His Arg Ser Ser Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser 285 290 295 300 cca acc tat tct gac aac tca cct gca tgt tta tcc atg ctg caa tcc 1441 Pro Thr Tyr Ser Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser 305 310 315 cat gac aat tgg tcc agc ctt gga atg cct gcc cat ccc agc atg ctc 1489 His Asp Asn Trp Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu 320 325 330 ccc gtg agc cac aat gcc agc cca cct acc agc tcc agt cag tac ccc 1537 Pro Val Ser His Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro 335 340 345 agc ctg tgg tct gtg agc aac ggc gcc gtc acc ccg ggc tcc cag gca 1585 Ser Leu Trp Ser Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala 350 355 360 gca gcc gtg tcc aac ggg ctg ggg gcc cag ttc ttc cgg ggc tcc ccc 1633 Ala Ala Val Ser Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro 365 370 375 380 gcg cac tac aca ccc ctc acc cat ccg gtc tcg gcg ccc tct tcc tcg 1681 Ala His Tyr Thr Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser 385 390 395 gga tcc cca ctg tac gaa ggg gcg gcc gcg gcc aca gac atc gtg gac 1729 Gly Ser Pro Leu Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asp Ile Val Asp 400 405 410 agc cag tac gac gcc gca gcc caa ggc cgc ctc ata gcc tca tgg aca 1777 Ser Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr 415 420 425 cct gtg tcg cca cct tcc atg tga agcagcaagg cccaggtccc gaaagatgca 1831 Pro Val Ser Pro Pro Ser Met 430 435 gtgacttttt gtcgtggcag ccagtggtga ctggattgac ctactaggta cccagtggca 1891 gtctcaggtt aagaaggaaa tgcagcctca gtaacttcct tttcaaagca gtggaggagc 1951 acacggcacc tttccccaga gccccagcat cccttgctca cacctgcagt agcggtgctg 2011 tcccaggtgg cttacagatg aacccaactg tggagatgat gcagttggcc caacctcact 2071 gacggtgaaa aaatgtttgc cagggtccag aaactttttt tggtttattt ctcatacagt 2131 gtattggcaa ctttggcaca ccagaatttg taaactccac cagtcctact ttagtgagat 2191 aaaaagcaca ctcttaatct tcttccttgt tgctttcaag tagttagagt tgagctgtta 2251 aggacagaat aaaatcatag ttgaggacag caggttttag ttgaattgaa aatttgactg 2311 ctctgccccc tagaatgtgt gtattttaag catatgtagc taatctcttg tgttgttaaa 2371 ctataactgt ttcatatttt tcttttgaca aagtagccaa agacaatcag cagaaagcat 2431 tttctgcaaa ataaacgcaa tatgcaaaat gtgattcgtc cagttattag tgaagcccct 2491 ccttttgtga gtatttactg tttattg 2518 <210> 2 <211> 435 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg 1 5 10 15 Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser 20 25 30 Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu 35 40 45 Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val 50 55 60 Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser 65 70 75 80 Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala 85 90 95 Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly 100 105 110 Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp 115 120 125 Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser 130 135 140 Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu 145 150 155 160 Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly 165 170 175 Gly Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe 180 185 190 Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr Ala Leu Lys Ile 195 200 205 Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala Lys Glu Arg Ser 210 215 220 Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly 225 230 235 240 Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Leu Cys Pro 245 250 255 Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser 260 265 270 Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser 275 280 285 Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser 290 295 300 Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp 305 310 315 320 Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His 325 330 335 Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser 340 345 350 Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Ser 355 360 365 Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr 370 375 380 Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu 385 390 395 400 Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asp Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp 405 410 415 Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro 420 425 430 Pro Ser Met 435 <210> 3 <211> 2046 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (109)..(1419) <400> 3 ggctccgcag agtgaccctt tttcttggaa aagcggtggc gagagaagtg aaggtggctg 60 ttgggtaggg agtcaagact cctggaaggt ggagagggtg gcgggagg atg agc tcg 117 Met Ser Ser 1 ccg ggc aca gag agc gca ggg aag agc ctg cag tac cga gtg gac cac 165 Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg Val Asp His 5 10 15 ctg ctc agc gcc gtg gag agc gag ctg cag gcg ggc agc gag aag gga 213 Leu Leu Ser Ala Val Glu Ser Glu Leu Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly 20 25 30 35 gac ccc acc gaa cgc gaa ctg cga gtg ggc ctg gag gag agc gag ctg 261 Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu 40 45 50 tgg ctg cgc ttc aag gag cta act aac gag atg att gtg acc aag aac 309 Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val Thr Lys Asn 55 60 65 ggc agg agg atg ttc ccg gtg ctg aag gta aat gtg tca ggc ctg gac 357 Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser Gly Leu Asp 70 75 80 ccc aat gcc atg tac tct ttc ttg ctg gac ttc gtg acg gct gac aac 405 Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Thr Ala Asp Asn 85 90 95 cac cgc tgg aaa tat gtg aac ggg gag tgg gta cct ggg ggc aaa cca 453 His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro 100 105 110 115 gag cct cag gcg ccc agc tgc gtc tac atc cac cca gac tcg ccc aat 501 Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp Ser Pro Asn 120 125 130 ttt ggg gcc cac tgg atg aag gcg cct gtg tct ttc agc aaa gtc aaa 549 Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser Lys Val Lys 135 140 145 ctc acc aac aag ctc aat gga ggg gga cag atc atg tta aac tcc ttg 597 Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu 150 155 160 cat aag tat gaa cct cgg att cac atc gtg aga gtt ggg ggc ccg caa 645 His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly Gly Pro Gln 165 170 175 cgc atg atc acc agc cac tgc ttt ccc gag acc cag ttc ata gct gtg 693 Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe Ile Ala Val 180 185 190 195 act gcc tac cag aat gag gag att aca gcc ctt aaa att aaa tac aac 741 Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr Ala Leu Lys Ile Lys Tyr Asn 200 205 210 cca ttt gct aaa gcc ttc ctt gat gcc aaa gaa aga aac gac cac aaa 789 Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala Lys Glu Arg Asn Asp His Lys 215 220 225 gat gta atg gag gaa ccg ggg gac tgc cag cag ccg ggg tat tcc caa 837 Asp Val Met Glu Glu Pro Gly Asp Cys Gln Gln Pro Gly Tyr Ser Gln 230 235 240 tgg ggg tgg ctt gtt cct ggt gct ggc acc ctc tgc ccg cct gcc agc 885 Trp Gly Trp Leu Val Pro Gly Ala Gly Thr Leu Cys Pro Pro Ala Ser 245 250 255 tcc cac cct cag ttt gga ggc tcg ctc tct ctc ccc tcc aca cac ggc 933 Ser His Pro Gln Phe Gly Gly Ser Leu Ser Leu Pro Ser Thr His Gly 260 265 270 275 tgt gag agg tac cca gct cta agg aac cac cgg tca tcg ccc tac ccc 981 Cys Glu Arg Tyr Pro Ala Leu Arg Asn His Arg Ser Ser Pro Tyr Pro 280 285 290 agc ccc tat gct cat cgg aac agc tct cca acc tat gcg gac aat tca 1029 Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Ser Ser Pro Thr Tyr Ala Asp Asn Ser 295 300 305 tct gct tgt ctg tcc atg ctg cag tcc cat gat aac tgg tct agc ctc 1077 Ser Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp Ser Ser Leu 310 315 320 gga gtg cct ggc cac acc agc atg ctg cct gtg agt cat aac gcc agc 1125 Gly Val Pro Gly His Thr Ser Met Leu Pro Val Ser His Asn Ala Ser 325 330 335 cca cct act ggc tct agc cag tat ccc agt ctc tgg tct gtg agc aat 1173 Pro Pro Thr Gly Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser Val Ser Asn 340 345 350 355 ggt acc atc acc cca ggc tcc cag aca gct ggg gtg tcc aac ggg ctg 1221 Gly Thr Ile Thr Pro Gly Ser Gln Thr Ala Gly Val Ser Asn Gly Leu 360 365 370 gga gct cag ttc ttt cga ggc tcc cct gca cat tac aca cca ctg acg 1269 Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr Pro Leu Thr 375 380 385 cac acg gtc tca gct gcc acg tcc tcg tct tct ggt tct ccg atg tat 1317 His Thr Val Ser Ala Ala Thr Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Met Tyr 390 395 400 gaa ggg gct gct aca gtc aca gac att tct gac agc cag tat gac acg 1365 Glu Gly Ala Ala Thr Val Thr Asp Ile Ser Asp Ser Gln Tyr Asp Thr 405 410 415 gcc caa agc ctc ctc ata gcc tcg tgg aca cct gtg tca ccc cca tct 1413 Ala Gln Ser Leu Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro Pro Ser 420 425 430 435 atg tga attgaacttt cctccatgtg ctgagacttg taacaaccgg tgtcaactgg 1469 Met atcttctagg ctcaaagtgg caggctcttg ggacaaggga aaaataaata aataaaagct 1529 agatactaac aactccattt tcaaataaga gcaataatac atgtcctata atcatgttct 1589 acagcctctt gtttgatacc tacagtagtg atatgtgtcc tacattatga agccaaggac 1649 agagagacgg ctgtggtcca gttttttgtg actggcagtt aatcagagtc ctttgctagg 1709 tagggtccta tatcttgtgt ttctctacaa catatatgtg actttgaaat cctggaattc 1769 gtccaccccc tgtcctactt tagtgagaca caaggtacac ctctaatgtc ctcccttgtt 1829 gccttagagt agttaacttt gaggacagaa aaaagcatag ccagaagatt gtaactgaac 1889 cgtcaactgt tctgcccttg gaacatgcct actttaagca cacgtagctt tttgtgttgg 1949 gaagtcaact gtatggatac ttttctgttg acaaagtagc caaagacaat ctgcagaaag 2009 tgttttctgc acaataaagg caatatatag cacctgg 2046 <210> 4 <211> 436 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg 1 5 10 15 Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Ser Glu Leu Gln Ala Gly Ser 20 25 30 Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu 35 40 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Ser Ser His Pro Gln Phe Gly Gly Ser Leu Ser Leu Pro Ser 260 265 270 Thr His Gly Cys Glu Arg Tyr Pro Ala Leu Arg Asn His Arg Ser Ser 275 280 285 Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Ser Ser Pro Thr Tyr Ala 290 295 300 Asp Asn Ser Ser Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp 305 310 315 320 Ser Ser Leu Gly Val Pro Gly His Thr Ser Met Leu Pro Val Ser His 325 330 335 Asn Ala Ser Pro Pro Thr Gly Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser 340 345 350 Val Ser Asn Gly Thr Ile Thr Pro Gly Ser Gln Thr Ala Gly Val Ser 355 360 365 Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr 370 375 380 Pro Leu Thr His Thr Val Ser Ala Ala Thr Ser Ser Ser Ser Gly Ser 385 390 395 400 Pro Met Tyr Glu Gly Ala Ala Thr Val Thr Asp Ile Ser Asp Ser Gln 405 410 415 Tyr Asp Thr Ala Gln Ser Leu Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser 420 425 430 Pro Pro Ser Met 435 <210> 5 <211> 1305 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1305) <400> 5 atg agc tcc cct ggc acc gag agc gcg gga aag agc ctg cag tac cga 48 Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg 1 5 10 15 gtg gac cac ctg ctg agc gcc gtg gag aat gag ctg cag gcg ggc agc 96 Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser 20 25 30 gag aag ggc gac ccc aca gag cgc gaa ctg cgc gtg ggc ctg gag gag 144 Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu 35 40 45 agc gag ctg tgg ctg cgc ttc aag gag ctc acc aat gag atg atc gtg 192 Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val 50 55 60 acc aag aac ggc agg agg atg ttt ccg gtg ctg aag gtg aac gtg tct 240 Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser 65 70 75 80 ggc ctg gac ccc aac gcc atg tac tcc ttc ctg ctg gac ttc gtg gcg 288 Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala 85 90 95 gcg gac aac cac cgc tgg aag tac gtg aac ggg gaa tgg gtg ccg ggg 336 Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly 100 105 110 ggc aag ccg gag ccg cag gcg ccc agc tgc gtc tac atc cac ccc gac 384 Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp 115 120 125 tcg ccc aac ttc ggg gcc cac tgg atg aag gct ccc gtc tcc ttc agc 432 Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser 130 135 140 aaa gtc aag ctc acc aac aag ctc aac gga ggg ggc cag atc atg ctg 480 Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu 145 150 155 160 aac tcc ttg cat aag tat gag cct cga atc cac ata gtg aga gtt ggg 528 Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly 165 170 175 gat cca cag cgc atg atc acc agc cac tgc ttc cct gag acc cag ttc 576 Asp Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe 180 185 190 ata gcg gtg act gct tat cag aac gag gag atc aca gct ctt aaa att 624 Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr Ala Leu Lys Ile 195 200 205 aag tac aat cca ttt gca aaa gct ttc ctt gat gca aag gaa aga agt 672 Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala Lys Glu Arg Ser 210 215 220 gat cac aaa gag atg atg gag gaa ccc gga gac agc cag caa cct ggg 720 Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly 225 230 235 240 tac tcc caa tgg ggg tgg ctt ctt cct gga acc agc acc ctg tgt cca 768 Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Leu Cys Pro 245 250 255 cct gca aat cct cat cct cag ttt gga ggt gcc ctc tcc ctc ccc tcc 816 Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser 260 265 270 acg cac agc tgt gac agg tac cca acc ctg agg agc cac cgg tcc tca 864 Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser 275 280 285 ccc tac ccc agc ccc tat gct cat cgg aac aat tct cca acc tat tct 912 Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser 290 295 300 gac aac tca cct gca tgt tta tcc atg ctg caa tcc cat gac aat tgg 960 Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp 305 310 315 320 tcc agc ctt gga atg cct gcc cat ccc agc atg ctc ccc gtg agc cac 1008 Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His 325 330 335 aat gcc agc cca cct acc agc tcc agt cag tac ccc agc ctg tgg tct 1056 Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser 340 345 350 gtg agc aac ggc gcc gtc acc ccg ggc tcc cag gca gca gcc gtg acc 1104 Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Thr 355 360 365 aac ggg ctg ggg gcc cag ttc ttc cgg ggc tcc ccc gcg cac tac aca 1152 Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr 370 375 380 ccc ctc acc cat ccg gtc tcg gca ccc tct tcc tcg gga tcc cca ctg 1200 Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu 385 390 395 400 tac gaa ggg gcg gcc gcg gcc aca aac atc gtg gac agc cag tac gac 1248 Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asn Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp 405 410 415 gcc gca gcc caa ggc cgc ctc ata gcc tca tgg aca cct gtg tcg cca 1296 Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro 420 425 430 cct tcc atg 1305 Pro Ser Met 435 <210> 6 <211> 435 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg 1 5 10 15 Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser 20 25 30 Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu 35 40 45 Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val 50 55 60 Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser 65 70 75 80 Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala 85 90 95 Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly 100 105 110 Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp 115 120 125 Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser 130 135 140 Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu 145 150 155 160 Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly 165 170 175 Asp Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe 180 185 190 Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr Ala Leu Lys Ile 195 200 205 Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala Lys Glu Arg Ser 210 215 220 Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly 225 230 235 240 Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Leu Cys Pro 245 250 255 Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser 260 265 270 Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser 275 280 285 Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser 290 295 300 Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp 305 310 315 320 Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His 325 330 335 Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser 340 345 350 Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Thr 355 360 365 Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr 370 375 380 Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu 385 390 395 400 Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asn Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp 405 410 415 Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro 420 425 430 Pro Ser Met 435 <210> 7 <211> 1357 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> CDS <222> (10)..(1347) <400> 7 gaattccgc atg gcc gat gaa gct ccg agc tcc cct ggc acc gag agc gcg 51 Met Ala Asp Glu Ala Pro Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala 1 5 10 gga aag agc ctg cag tac cga gtg gac cac ctg ctg agc gcc gtg gag 99 Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu 15 20 25 30 aat gag ctg cag gcg ggc agc gag aag ggc gac ccc aca gag cgc gaa 147 Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu 35 40 45 ctg cgc gtg ggc ctg gag gag agc gag ctg tgg ctg cgc ttc aag gag 195 Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu 50 55 60 ctc acc aat gag atg atc gtg acc aag aac ggc agg agg atg ttt ccg 243 Leu Thr Asn Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro 65 70 75 gtg ctg aag gtg aac gtg tct ggc ctg gac ccc aac gcc atg tac tcc 291 Val Leu Lys Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser 80 85 90 ttc ctg ctg gac ttc gtg gcg gcg gac aac cac cgc tgg aag tac gtg 339 Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val 95 100 105 110 aac ggg gaa tgg gtg ccg ggg ggc aag ccg gag ccg cag gcg ccc agc 387 Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser 115 120 125 tgc gtc tac atc cac ccc gac tcg ccc aac ttc ggg gcc cac tgg atg 435 Cys Val Tyr Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met 130 135 140 aag gct ccc gtc tcc ttc agc aaa gtc aag ctc acc aac aag ctc aac 483 Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn 145 150 155 gga ggg ggc cag atc atg ctg aac tcc ttg cat aag tat gag cct cga 531 Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg 160 165 170 atc cac ata gtg aga gtt ggg gat cca cag cgc atg atc acc agc cac 579 Ile His Ile Val Arg Val Gly Asp Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His 175 180 185 190 tgc ttc cct gag acc cag ttc ata gcg gtg act gct tat cag aac gag 627 Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu 195 200 205 gag atc aca gct ctt aaa att aag tac aat cca ttt gca aaa gct ttc 675 Glu Ile Thr Ala Leu Lys Ile Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe 210 215 220 ctt gat gca aag gaa aga agt gat cac aaa gag atg atg gag gaa ccc 723 Leu Asp Ala Lys Glu Arg Ser Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro 225 230 235 gga gac agc cag caa cct ggg tac tcc caa tgg ggg tgg ctt ctt cct 771 Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro 240 245 250 gga acc agc acc ctg tgt cca cct gca aat cct cat cct cag ttt gga 819 Gly Thr Ser Thr Leu Cys Pro Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly 255 260 265 270 ggt gcc ctc tcc ctc ccc tcc acg cac agc tgt gac agg tac cca acc 867 Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr 275 280 285 ctg agg agc cac cgg tcc tca ccc tac ccc agc ccc tat gct cat cgg 915 Leu Arg Ser His Arg Ser Ser Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg 290 295 300 aac aat tct cca acc tat tct gac aac tca cct gca tgt tta tcc atg 963 Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met 305 310 315 ctg caa tcc cat gac aat tgg tcc agc ctt gga atg cct gcc cat ccc 1011 Leu Gln Ser His Asp Asn Trp Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro 320 325 330 agc atg ctc ccc gtg agc cac aat gcc agc cca cct acc agc tcc agt 1059 Ser Met Leu Pro Val Ser His Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser 335 340 345 350 cag tac ccc agc ctg tgg tct gtg agc aac ggc gcc gtc acc ccg ggc 1107 Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly 355 360 365 tcc cag gca gca gcc gtg acc aac ggg ctg ggg gcc cag ttc ttc cgg 1155 Ser Gln Ala Ala Ala Val Thr Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg 370 375 380 ggc tcc ccc gcg cac tac aca ccc ctc acc cat ccg gtc tcg gca ccc 1203 Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro 385 390 395 tct tcc tcg gga tcc cca ctg tac gaa ggg gcg gcc gcg gcc aca aac 1251 Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asn 400 405 410 atc gtg gac agc cag tac gac gcc gca gcc caa ggc cgc ctc ata gcc 1299 Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala 415 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Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu 50 55 60 cta act aac gag atg att gtg acc aag aac ggc agg agg atg ttc ccg 243 Leu Thr Asn Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro 65 70 75 gtg ctg aag gta aat gtg tca ggc ctg gac ccc aat gcc atg tac tct 291 Val Leu Lys Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser 80 85 90 ttc ttg ctg gac ttc gtg acg gct gac aac cac cgc tgg aaa tat gtg 339 Phe Leu Leu Asp Phe Val Thr Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val 95 100 105 110 aac ggg gag tgg gta cct ggg ggc aaa cca gag cct cag gcg ccc agc 387 Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser 115 120 125 tgc gtc tac atc cac cca gac tcg ccc aat ttt ggg gcc cac tgg atg 435 Cys Val Tyr Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met 130 135 140 aag gcg cct gtg tct ttc agc aaa gtc aaa ctc acc aac aag ctc aat 483 Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn 145 150 155 gga ggg gga cag atc atg tta aac tcc ttg cat aag tat gaa cct cgg 531 Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg 160 165 170 att cac atc gtg aga gtt ggg ggc ccg caa cgc atg atc acc agc cac 579 Ile His Ile Val Arg Val Gly Gly Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His 175 180 185 190 tgc ttt ccc gag acc cag ttc ata gct gtg act gcc tac cag aat gag 627 Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu 195 200 205 gag att aca gcc ctt aaa att aaa tac aac cca ttt gct aaa gcc ttc 675 Glu Ile Thr Ala Leu Lys Ile Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe 210 215 220 ctt gat gcc aaa gaa aga aac gac cac aaa gat gta atg gag gaa ccg 723 Leu Asp Ala Lys Glu Arg Asn Asp His Lys Asp Val Met Glu Glu Pro 225 230 235 ggg gac tgc cag cag ccg ggg tat tcc caa tgg ggg tgg ctt gtt cct 771 Gly Asp Cys Gln Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Val Pro 240 245 250 ggt gct ggc acc ctc tgc ccg cct gcc agc tcc cac cct cag ttt gga 819 Gly Ala Gly Thr Leu Cys Pro Pro Ala Ser Ser His Pro Gln Phe Gly 255 260 265 270 ggc tcg ctc tct ctc ccc tcc aca cac ggc tgt gag agg tac cca gct 867 Gly Ser Leu Ser Leu Pro Ser Thr His Gly Cys Glu Arg Tyr Pro Ala 275 280 285 cta agg aac cac cgg tca tcg ccc tac ccc agc ccc tat gct cat cgg 915 Leu Arg Asn His Arg Ser Ser Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg 290 295 300 aac agc tct cca acc tac gcg gac aat tca tct gct tgt ctg tcc atg 963 Asn Ser Ser Pro Thr Tyr Ala Asp Asn Ser Ser Ala Cys Leu Ser Met 305 310 315 ctg cag tcc cat gat aac tgg tct agc ctc gga gtg cct ggc cac acc 1011 Leu Gln Ser His Asp Asn Trp Ser Ser Leu Gly Val Pro Gly His Thr 320 325 330 agc atg ctg cct gtg agt cat aac gcc agc cca cct act ggc tct agc 1059 Ser Met Leu Pro Val Ser His Asn Ala Ser Pro Pro Thr Gly Ser Ser 335 340 345 350 cag tat ccc agt ctc tgg tct gtg agc aat ggt acc atc acc cca ggc 1107 Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser Val Ser Asn Gly Thr Ile Thr Pro Gly 355 360 365 tcc cag aca gct ggg gtg tcc aac ggg ctg gga gct cag ttc ttt cga 1155 Ser Gln Thr Ala Gly Val Ser Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg 370 375 380 ggc tcc cct gca cat tac aca cca ctg aca cac acg gtc tca gct gcc 1203 Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr Pro Leu Thr His Thr Val Ser Ala Ala 385 390 395 acg tcc tcg tct tct ggt tct ccg atg tat gaa ggg gct gct aca gtc 1251 Thr Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Met Tyr Glu Gly Ala Ala Thr Val 400 405 410 aca gac att tct gac agc cag tat gac acg gcc caa agc ctc ctc ata 1299 Thr Asp Ile Ser Asp Ser Gln Tyr Asp Thr Ala Gln Ser Leu Leu Ile 415 420 425 430 gcc tcg tgg aca cct gtg tca ccc cca tct atg cat cac cat cac cat 1347 Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro Pro Ser Met His His His His His 435 440 445 cac tga gactagt 1360 His <210> 10 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Met Ala Asp Glu Ala Pro Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys 1 5 10 15 Ser Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Ser Glu 20 25 30 Leu Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg 35 40 45 Val Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr 50 55 60 Asn Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val 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Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val 50 55 60 acc aag aac ggc agg agg atg ttt ccg gtg ctg aag gtg aac gtg tct 240 Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser 65 70 75 80 ggc ctg gac ccc aac gcc atg tac tcc ttc ctg ctg gac ttc gtg gcg 288 Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala 85 90 95 gcg gac aac cac cgc tgg aag tac gtg aac ggg gaa tgg gtg ccg ggg 336 Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly 100 105 110 ggc aag ccg gag ccg cag gcg ccc agc tgc gtc tac atc cac ccc gac 384 Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp 115 120 125 tcg ccc aac ttc ggg gcc cac tgg atg aag gct ccc gtc tcc ttc agc 432 Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser 130 135 140 aaa gtc aag ctc acc aac aag ctc aac gga ggg ggc cag atc atg ctg 480 Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu 145 150 155 160 aac tcc ttg cat aag tat gag cct cga atc cac ata gtg aga gtt ggg 528 Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly 165 170 175 gat cca cag cgc atg atc acc agc cac tgc ttc cct gag acc cag ttc 576 Asp Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe 180 185 190 ata gcg gtg act gct tat cag aac gag gag atc aca gct ctt aaa att 624 Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr Ala Leu Lys Ile 195 200 205 aag tac aat cca ttt gca aaa gct ttc ctt gat gca aag gaa aga agt 672 Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala Lys Glu Arg Ser 210 215 220 gat cac aaa gag atg atg gag gaa ccc gga gac agc cag caa cct ggg 720 Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly 225 230 235 240 tac tcc caa tgg ggg tgg ctt ctt cct gga acc agc acc gtg tgt cca 768 Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Val Cys Pro 245 250 255 cct gca aat cct cat cct cag ttt gga ggt gcc ctc tcc ctc ccc tcc 816 Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser 260 265 270 acg cac agc tgt gac agg tac cca acc ctg agg agc cac cgg tcc tca 864 Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser 275 280 285 ccc tac ccc agc ccc tat gct cat cgg aac aat tct cca acc tat tct 912 Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser 290 295 300 gac aac tca cct gca tgt tta tcc atg ctg caa tcc cat gac aat tgg 960 Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp 305 310 315 320 tcc agc ctt gga atg cct gcc cat ccc agc atg ctc ccc gtg agc cac 1008 Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His 325 330 335 aat gcc agc cca cct acc agc tcc agt cag tac ccc agc ctg tgg tct 1056 Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser 340 345 350 gtg agc aac ggc gcc gtc acc ccg ggc tcc cag gca gca gcc gtg acc 1104 Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Thr 355 360 365 aac ggg ctg ggg gcc cag ttc ttc cgg ggc tcc ccc gcg cac tac aca 1152 Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr 370 375 380 ccc ctc acc cat ccg gtc tcg gca ccc tct tcc tcg gga tcc cca ctg 1200 Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu 385 390 395 400 tac gaa ggg gcg gcc gcg gcc aca aac atc gtg gac agc cag tac gac 1248 Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asn Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp 405 410 415 gcc gca gcc caa ggc cgc ctc ata gcc tca tgg aca cct gtg tcg cca 1296 Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro 420 425 430 cct tcc atg 1305 Pro Ser Met 435 <210> 18 <211> 435 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Met Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg 1 5 10 15 Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser 20 25 30 Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu 35 40 45 Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr Asn Glu Met Ile Val 50 55 60 Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu Lys Val Asn Val Ser 65 70 75 80 Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala 85 90 95 Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly 100 105 110 Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val Tyr Ile His Pro Asp 115 120 125 Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser 130 135 140 Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu 145 150 155 160 Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His Ile Val Arg Val Gly 165 170 175 Asp Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe 180 185 190 Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile Thr Ala Leu Lys Ile 195 200 205 Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp Ala Lys Glu Arg Ser 210 215 220 Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly 225 230 235 240 Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Val Cys Pro 245 250 255 Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser 260 265 270 Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg Ser His Arg Ser Ser 275 280 285 Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser 290 295 300 Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln Ser His Asp Asn Trp 305 310 315 320 Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met Leu Pro Val Ser His 325 330 335 Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser 340 345 350 Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln Ala Ala Ala Val Thr 355 360 365 Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr 370 375 380 Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu 385 390 395 400 Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asn Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp 405 410 415 Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro 420 425 430 Pro Ser Met 435 <210> 19 <211> 1370 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> CDS <222> (10)..(1350) <400> 19 gaattccgc atg gcc gat gaa gct ccg agc tcc cct ggc acc gag agc gcg 51 Met Ala Asp Glu Ala Pro Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala 1 5 10 gga aag agc ctg cag tac cga gtg gac cac ctg ctg agc gcc gtg gag 99 Gly Lys Ser Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu 15 20 25 30 aat gag ctg cag gcg ggc agc gag aag ggc gac ccc aca gag cgc gaa 147 Asn Glu Leu Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu 35 40 45 ctg cgc gtg ggc ctg gag gag agc gag ctg tgg ctg cgc ttc aag gag 195 Leu Arg Val Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu 50 55 60 ctc acc aat gag atg atc gtg acc aag aac ggc agg agg atg ttt ccg 243 Leu Thr Asn Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro 65 70 75 gtg ctg aag gtg aac gtg tct ggc ctg gac ccc aac gcc atg tac tcc 291 Val Leu Lys Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser 80 85 90 ttc ctg ctg gac ttc gtg gcg gcg gac aac cac cgc tgg aag tac gtg 339 Phe Leu Leu Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val 95 100 105 110 aac ggg gaa tgg gtg ccg ggg ggc aag ccg gag ccg cag gcg ccc agc 387 Asn Gly Glu Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser 115 120 125 tgc gtc tac atc cac ccc gac tcg ccc aac ttc ggg gcc cac tgg atg 435 Cys Val Tyr Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met 130 135 140 aag gct ccc gtc tcc ttc agc aaa gtc aag ctc acc aac aag ctc aac 483 Lys Ala Pro Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn 145 150 155 gga ggg ggc cag atc atg ctg aac tcc ttg cat aag tat gag cct cga 531 Gly Gly Gly Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg 160 165 170 atc cac ata gtg aga gtt ggg gat cca cag cgc atg atc acc agc cac 579 Ile His Ile Val Arg Val Gly Asp Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His 175 180 185 190 tgc ttc cct gag acc cag ttc ata gcg gtg act gct tat cag aac gag 627 Cys Phe Pro Glu Thr Gln Phe Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu 195 200 205 gag atc aca gct ctt aaa att aag tac aat cca ttt gca aaa gct ttc 675 Glu Ile Thr Ala Leu Lys Ile Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe 210 215 220 ctt gat gca aag gaa aga agt gat cac aaa gag atg atg gag gaa ccc 723 Leu Asp Ala Lys Glu Arg Ser Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro 225 230 235 gga gac agc cag caa cct ggg tac tcc caa tgg ggg tgg ctt ctt cct 771 Gly Asp Ser Gln Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro 240 245 250 gga acc agc acc gtg tgt cca cct gca aat cct cat cct cag ttt gga 819 Gly Thr Ser Thr Val Cys Pro Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly 255 260 265 270 ggt gcc ctc tcc ctc ccc tcc acg cac agc tgt gac agg tac cca acc 867 Gly Ala Leu Ser Leu Pro Ser Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr 275 280 285 ctg agg agc cac cgg tcc tca ccc tac ccc agc ccc tat gct cat cgg 915 Leu Arg Ser His Arg Ser Ser Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg 290 295 300 aac aat tct cca acc tat tct gac aac tca cct gca tgt tta tcc atg 963 Asn Asn Ser Pro Thr Tyr Ser Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met 305 310 315 ctg caa tcc cat gac aat tgg tcc agc ctt gga atg cct gcc cat ccc 1011 Leu Gln Ser His Asp Asn Trp Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro 320 325 330 agc atg ctc ccc gtg agc cac aat gcc agc cca cct acc agc tcc agt 1059 Ser Met Leu Pro Val Ser His Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser 335 340 345 350 cag tac ccc agc ctg tgg tct gtg agc aac ggc gcc gtc acc ccg ggc 1107 Gln Tyr Pro Ser Leu Trp Ser Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly 355 360 365 tcc cag gca gca gcc gtg acc aac ggg ctg ggg gcc cag ttc ttc cgg 1155 Ser Gln Ala Ala Ala Val Thr Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg 370 375 380 ggc tcc ccc gcg cac tac aca ccc ctc acc cat ccg gtc tcg gca ccc 1203 Gly Ser Pro Ala His Tyr Thr Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro 385 390 395 tct tcc tcg gga tcc cca ctg tac gaa ggg gcg gcc gcg gcc aca aac 1251 Ser Ser Ser Gly Ser Pro Leu Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asn 400 405 410 atc gtg gac agc cag tac gac gcc gca gcc caa ggc cgc ctc ata gcc 1299 Ile Val Asp Ser Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala 415 420 425 430 tca tgg aca cct gtg tcg cca cct tcc atg cat cac cat cac cat cac 1347 Ser Trp Thr Pro Val Ser Pro Pro Ser Met His His His His His His 435 440 445 tga gactagtccc gggcggccgc 1370 <210> 20 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Met Ala Asp Glu Ala Pro Ser Ser Pro Gly Thr Glu Ser Ala Gly Lys 1 5 10 15 Ser Leu Gln Tyr Arg Val Asp His Leu Leu Ser Ala Val Glu Asn Glu 20 25 30 Leu Gln Ala Gly Ser Glu Lys Gly Asp Pro Thr Glu Arg Glu Leu Arg 35 40 45 Val Gly Leu Glu Glu Ser Glu Leu Trp Leu Arg Phe Lys Glu Leu Thr 50 55 60 Asn Glu Met Ile Val Thr Lys Asn Gly Arg Arg Met Phe Pro Val Leu 65 70 75 80 Lys Val Asn Val Ser Gly Leu Asp Pro Asn Ala Met Tyr Ser Phe Leu 85 90 95 Leu Asp Phe Val Ala Ala Asp Asn His Arg Trp Lys Tyr Val Asn Gly 100 105 110 Glu Trp Val Pro Gly Gly Lys Pro Glu Pro Gln Ala Pro Ser Cys Val 115 120 125 Tyr Ile His Pro Asp Ser Pro Asn Phe Gly Ala His Trp Met Lys Ala 130 135 140 Pro Val Ser Phe Ser Lys Val Lys Leu Thr Asn Lys Leu Asn Gly Gly 145 150 155 160 Gly Gln Ile Met Leu Asn Ser Leu His Lys Tyr Glu Pro Arg Ile His 165 170 175 Ile Val Arg Val Gly Asp Pro Gln Arg Met Ile Thr Ser His Cys Phe 180 185 190 Pro Glu Thr Gln Phe Ile Ala Val Thr Ala Tyr Gln Asn Glu Glu Ile 195 200 205 Thr Ala Leu Lys Ile Lys Tyr Asn Pro Phe Ala Lys Ala Phe Leu Asp 210 215 220 Ala Lys Glu Arg Ser Asp His Lys Glu Met Met Glu Glu Pro Gly Asp 225 230 235 240 Ser Gln Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Trp Gly Trp Leu Leu Pro Gly Thr 245 250 255 Ser Thr Val Cys Pro Pro Ala Asn Pro His Pro Gln Phe Gly Gly Ala 260 265 270 Leu Ser Leu Pro Ser Thr His Ser Cys Asp Arg Tyr Pro Thr Leu Arg 275 280 285 Ser His Arg Ser Ser Pro Tyr Pro Ser Pro Tyr Ala His Arg Asn Asn 290 295 300 Ser Pro Thr Tyr Ser Asp Asn Ser Pro Ala Cys Leu Ser Met Leu Gln 305 310 315 320 Ser His Asp Asn Trp Ser Ser Leu Gly Met Pro Ala His Pro Ser Met 325 330 335 Leu Pro Val Ser His Asn Ala Ser Pro Pro Thr Ser Ser Ser Gln Tyr 340 345 350 Pro Ser Leu Trp Ser Val Ser Asn Gly Ala Val Thr Pro Gly Ser Gln 355 360 365 Ala Ala Ala Val Thr Asn Gly Leu Gly Ala Gln Phe Phe Arg Gly Ser 370 375 380 Pro Ala His Tyr Thr Pro Leu Thr His Pro Val Ser Ala Pro Ser Ser 385 390 395 400 Ser Gly Ser Pro Leu Tyr Glu Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asn Ile Val 405 410 415 Asp Ser Gln Tyr Asp Ala Ala Ala Gln Gly Arg Leu Ile Ala Ser Trp 420 425 430 Thr Pro Val Ser Pro Pro Ser Met His His His His His His 435 440 445

Claims

척색종 치료 방법으로서,
a) 효모 비히클; 및
b) 하나 이상의 브라큐리 (Brachyury) 항원을 포함하는 암 항원을 포함하는 면역치료 조성물을, 척색종을 가진 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 척색종 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 개체가 절제불가한 국소 재발성 병변을 가진 개체인, 척색종 치료 방법.
제2항에 있어서, 상기 병변의 국소 재발이 상기 면역조성물을 투여하기 전 3 내지 9개월 사이에 발생한, 척색종 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 개체가 올리고-전이성 (oligometastatic) 질환을 가진 개체인, 척색종 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 개체가 절제불가한 병변 또는 절제가능한 병변이 1차 재발된 개체인, 척색종 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 개체가 전이성 질환을 가진 개체인, 척색종 치료 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 상기 개체가 다른 암 치료법으로 치료 중이거나 또는 치료받은 적 있는 개체인, 척색종 치료 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 상기 개체는 방사선 요법으로 치료 중이거나 또는 치료받은 적 있는 개체인, 척색종 치료 방법.
제8항에 있어서, 상기 방사선 요법이 상기 면역치료 조성물의 투여 전에 수행되는, 척색종 치료 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 방사선 요법이 상기 면역치료 조성물의 투여와 병용하여 수행되는, 척색종 치료 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 방사선 요법이 상기 면역치료 조성물의 투여와 순차적으로 수행되는, 척색종 치료 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서, 상기 개체가 종양 절제로 치료 중이거나 또는 종양 절제로 치료받은 적 있는 개체인, 척색종 치료 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한항에 있어서, 상기 개체가 화학요법으로 치료 중이거나 또는 화학요법으로 치료받은 적 있는 개체인, 척색종 치료 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한항에 있어서, 상기 개체가 티로신 키나제 저해제, EGFR 저해제 및 STAT3 저해제로 이루어진 군으로부터 선택되는 약물 표적 요법 (drug targeted therapy)으로 치료 중이거나 또는 치료받은 적 있는 개체인, 척색종 치료 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한항에 있어서, 상기 개체가 한가지 이상의 추가적인 면역치료 조성물의 투여로 치료 중이이거나 또는 치료받은 적 있는 개체인, 척색종 치료 방법.
제15항에 있어서, 상기 추가적인 면역치료 조성물이 효모 비히클과 브라큐리 항원 이외의 항원을 포함하는, 척색종 치료 방법.
제15항에 있어서, 상기 추가적인 면역치료 조성물이 효모 비히클 및 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 항원을 포함하는, 척색종 치료 방법.
가족성 척색종 병력을 가진 개체에서 척색종 예방, 척색종 발병 지연 또는 척색종 예후 (outcome) 개선 방법으로서,
a) 효모 비히클; 및
b) 하나 이상의 브라큐리 (Brachyury) 항원을 포함하는 암 항원을 포함하는 면역치료 조성물을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하며,
투여시, 상기 개체는 척색종으로 진단받지 않은 상태인, 방법
제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 브라큐리 항원이 전장 인간 브라큐리 (full-length human Brachyury)인, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 브라큐리 항원이 전장 인간 브라쿠리가 아닌, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 브라큐리 항원이 서열번호 6, 서열번호 18 또는 서열번호 2로 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호 6, 서열번호 18 또는 서열번호 2와 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 브라큐리 항원이 서열번호 6, 서열번호 18 또는 서열번호 2의 적어도 위치 1 또는 2번에서부터 255번 위치에서 C-말단 사이까지를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 브라큐리 항원이 서열번호 6, 서열번호 18 또는 서열번호 2의 적어도 위치 1 또는 2번에서부터 430번 위치에서 C-말단 사이까지를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 브라큐리 항원이 서열번호 6, 서열번호 18 또는 서열번호 2의 246번 - 254번을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 브라큐리 항원이 서열번호 6, 서열번호 6의 2-435번 위치 또는 서열번호 6과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 브라큐리 항원이 서열번호 18, 서열번호 18의 2-435번 위치 또는 서열번호 18과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 브라큐리 항원이 서열번호 2, 서열번호 2의 2-435번 위치 또는 서열번호 2와 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 브라큐리 항원이 서열번호 6, 서열번호 6의 2-435번 위치 또는 서열번호 6과 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 브라큐리 항원이 서열번호 18, 서열번호 18의 2-435번 위치 또는 서열번호 18과 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 브라큐리 항원이 서열번호 2, 서열번호 2의 2-435번 위치 또는 서열번호 2와 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 브라큐리 항원이 서열번호 8로 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 8과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한항에 있어서, 상기 브라큐리 항원이 서열번호 20으로 제시된 아미노산 서열 또는 서열번호 20과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한항에 있어서, 상기 효모 비히클이 전효모 (whole yeast)인, 방법.
제33항에 있어서, 상기 전효모가 사멸된 것인, 방법.
제33항에 있어서, 상기 전효모가 열-불활화된 것인, 방법.
제1항 내지 제35항 중 어느 한항에 있어서, 상기 효모 비히클이 상기 항원을 발현하는 것인, 방법.
제1항 내지 제36항 중 어느 한항에 있어서, 상기 효모가 사카로마이세스 (Saccharomyces), 칸디다 (Candida), 크립토코커스 (Cryptococcus), 한세눌라 (Hansenula), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아 (Pichia), 로도토룰라 (Rhodotorula), 시조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 및 야로이와 (Yarrowia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속으로부터 유래되는, 방법.
제1항 내지 제37항 중 어느 한항에 있어서, 상기 효모가 사카로마이세스 (Saccharomyces)에 속하는, 방법.
제1항 내지 제37항 중 어느 한항에 있어서, 상기 효모가 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)인, 방법.
제1항 내지 제39항 중 어느 한항에 있어서, 상기 조성물이 주입에 의해 개체에게 투여하기 적합한 약제학적으로 허용가능한 부형제 중에 제형화된, 방법.
제1항 내지 제40중 어느 한항에 있어서, 상기 면역치료 조성물이 상기 개체에게 약 0.1 Y.U. - 약 100 Y.U.의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제40중 어느 한항에 있어서, 상기 면역치료 조성물이 상기 개체에게 약 10 Y.U. - 약 80 Y.U.의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제40중 어느 한항에 있어서, 상기 면역치료 조성물이 상기 개체에게 2 Y.U., 40 Y.U. 또는 80 Y.U.의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제43중 어느 한항에 있어서, 상기 면역치료 조성물이 매주 투여되는, 방법.
제1항 내지 제43중 어느 한항에 있어서, 상기 면역치료 조성물이 격주로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제43중 어느 한항에 있어서, 상기 면역치료 조성물이 매달 투여되는, 방법.
제1항 내지 제43중 어느 한항에 있어서, 상기 면역치료 조성물이 5주간 매주 투여된 후 매달 투여되는, 방법.
제1항 내지 제43중 어느 한항에 있어서, 상기 면역치료 조성물이 2주 간격으로 7회 투여된 후 매달 투여되는, 방법.
제1항 내지 제43중 어느 한항에 있어서, 상기 면역치료 조성물이 상기 개체의 2개 이상의 부위에 나누어 투여되어 1회 투여량 (single dose)이 되는, 방법.
제1항 내지 제43중 어느 한항에 있어서, 상기 면역치료 조성물이 다른 암 치료요법과 병용하여 투여되는, 방법.
효모 비히클 및 1종 이상의 브라큐리 항원을 포함하는 암 항원을 포함하는 면역치료 조성물의, 척색종 치료 용도.
효모 비히클 및 1종 이상의 브라큐리 항원을 포함하는 암 항원을 포함하는 면역치료 조성물의, 척색종 예방 또는 발병 지연을 위한 용도.