EA030381B1 - Иммунотерапевтическая композиция, ее применения и способы лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита дельта - Google Patents

Иммунотерапевтическая композиция, ее применения и способы лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита дельта Download PDF

Info

Publication number
EA030381B1
EA030381B1 EA201490015A EA201490015A EA030381B1 EA 030381 B1 EA030381 B1 EA 030381B1 EA 201490015 A EA201490015 A EA 201490015A EA 201490015 A EA201490015 A EA 201490015A EA 030381 B1 EA030381 B1 EA 030381B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
yeast
ηόν
antigen
patient
protein
Prior art date
Application number
EA201490015A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201490015A1 (ru
Inventor
Томас Х. Кинг
Дэвид Эйпелиан
Original Assignee
Глоубиммьюн, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Глоубиммьюн, Инк. filed Critical Глоубиммьюн, Инк.
Publication of EA201490015A1 publication Critical patent/EA201490015A1/ru
Publication of EA030381B1 publication Critical patent/EA030381B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
    • A61K2039/645—Dendrimers; Multiple antigen peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/10011—Arenaviridae
    • C12N2760/10111—Deltavirus, e.g. hepatitis delta virus
    • C12N2760/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/10011—Arenaviridae
    • C12N2760/10111—Deltavirus, e.g. hepatitis delta virus
    • C12N2760/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к иммунотерапевтическим композициям против HDV на основе дрожжей, применениям заявленных композиций для профилактики и/или лечения инфекции HDV, а также соответствующим способам лечения, профилактики инфекции HDV и устранения ее симптомов, включающим введение заявленных композиций.

Description

Изобретение относится к иммунотерапевтическим композициям против НИУ на основе дрожжей, применениям заявленных композиций для профилактики и/или лечения инфекции НЭУ. а также соответствующим способам лечения, профилактики инфекции НИУ и устранения ее симптомов, включающим введение заявленных композиций.
030381 Β1
Перекрестная ссылка на родственные заявки
По заявке на данный патент испрашивается приоритет на основании 35 и.8.С. §119(е) временной заявки на патент США № 61/497039, поданной 14 июня 2011 г. Полное раскрытие временной заявки на патент США № 61/497039 включено в описание посредством ссылки.
Ссылка на список последовательностей
Это изобретение содержит список последовательностей, представленных в электронном виде в виде текстового файла с помощью ЕР8-^еЬ. Текстовый файл под названием 3923-39-РСТ 8Т25 имеет размер в байтах 66 КВ, и был записан 12 июня 2012 г. Информация, содержащаяся в текстовом файле, включена в описание посредством ссылки во всей полноте в соответствии с 37 СРК § 1.52(е) (5).
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение в целом относится к иммунотерапевтическим композициям и способам профилактики и/или лечения инфекции, вызываемой вирусом гепатита дельта (НОУ).
Уровень техники
Гепатит И представляет собой заболевание, вызываемое инфекцией небольшим оболочечным вирусом, содержащим кольцевую РНК, известным как вирус гепатита дельта (НОУ). НОУ был открыт в 1977 году (Ρίζ/еио е! а1., Си! 1977; 18: 997-1003), и позднее было показано, что он является инфекционным агентом новой формы гепатита (Ρίζ/еио е! а1., 1. 1пГес1 ϋί8 1980; 141:590-602; Κίζ/ейо е! а1., Ргос Νηΐ1 Асаб 8с1 И8А 1980; 77: 6124-8; \7апд е! а1., №1иге 1986; 323: 508-14; Мазоп е! а1., 1п: Раицие! СМ, Мауо МА, МапбоГГ 1. Оеззе1Ьегдег и, Ва11 ЬА, ебз. Είβΐιΐ Керой оГ (Не 1п!ета!юпа1 СоттШее оп Тахопоту оГ Упизез. Ьопбоп: Е1зеу1ег/Асабетю Ргезз, 20 05 ; 735-8). Недавно установлено, что 15-20 миллионов людей инфицированы НОУ, для жизненного цикла которого необходима ассоциированная инфекция с вирусом гепатита В (НВУ), хотя указанные данные могут быть неполными, в частности из-за отсутствия систематического скрининга инфекции НОУ у НВУ-инфицированных пациентов (Разсаге11а апб №дго, Ыуег 1п!егпабопа1 2011, 31: 7-21).
Вирусы гепатита О представляют собой сферические частицы, которые содержат ядерную структуру, образованную из геномной РНК НОУ, которая состоит приблизительно из 70 молекул НОАд (в малой и большой формах) (Куи е! а1., 1. Уио1. 1993; 67:3281-7). Считают, что НОУ проникает в клетку за счет того же рецептора, что и НВУ, с использованием оболочечных белков НВУ в качестве своей наружной оболочки. Оболочка состоит приблизительно из 100 копий поверхностных антигенных белков НВУ (малый, средний и большой НВзАд). Большая форма НОАд и НВзАд достаточны для образования вирусных частиц, которые не инфекционны, если также не содержат РНК НОУ, и малая форма НОАд увеличивает эффективность упаковки вируса (СНеп е! а1., 1. Уио1. 1992; 66: 2853-9; \7апд е! а1., 1. У1го1. 1994; 68: 636371).
После проникновения внутрь клетки НОУ использует клеточные РНК-полимеразы хозяина. Три РНК накапливаются во время процессов вирусной репликации. Геном НОУ представляет собой кольцевую отрицательную одноцепочечную РНК, состоящую приблизительно из 1672-1697 нуклеотидов (Каб|еГе! а1., 1. Уйо1. 2004; 78:2537-44) и содержит рибозимный домен, охватывающий нуклеотиды 680-780, и предполагаемый промоторный участок для РНК НОАд (Веагб е! а1., 1. Уио1. 1996; 70: 4986-95). Антигеном, который содержит окрытую рамку считывания, кодирующую НОАд, и рибозимный домен (8Нагтееп е! а1., 1. Уио1. 1988; 62: 2674-9; Регге-О'атаге е! а1., №Ниге 1998; 395:567-74) является прекрасным дополнением генома и его репликация происходит с помощью РНК-направленного синтеза РНК без каких-либо ДНК-интермедиатов (СНеп е! а1., Ргос Ν;·ιΐ1 Асаб 8с1 И8А 1986; 83: 8774-8). мРНК направляет синтез НОАд.
Известен только один белок, кодируемый геномом НОУ, и он включает две формы, 27 кОа большой (Ь) НОАд (НОАд-Ь или Ь-НОАд) (214 аминокислот) и 24 кОа малый (8) НОАд (НОАд-8 или 8НОАд) (195 аминокислот). Белки отличаются приблизительно на 19 аминокислот, расположенных на Сконце большого НОАд. Ν-конец антигена НОУ ответственен за передачу сигнала внутриядерной локализации, средний домен антигена НОУ ответственен за связывание РНК, и С-конец участвует в сборке вирионов и ингибирование сборки РНК. НОАд-8 продуцируется на ранних стадиях вирусной инфекции и поддерживает вирусную репликацию. НОАд-Ь продуцируется позднее в ходе вирусной инфекции, ингибирует вирусную инфекцию и является необходимым для сборки вирусных частиц.
Инфекция НОУ встречается только у пациентов, которые коинфицированы другим вирусом, вирусом гепатита В (НВУ), и конкретнее, только у пациентов с положительным результатом теста на НВУ поверхностный антиген (НВзАд). Как обсуждалось выше, для НОУ необходим НВзАд НВУ, для образования частиц и передачи, и, таким образом, НВУ нужен для сборки вириона НОУ и высвобождения. Известны два основных типа инфицирования пациента НОУ. При первом типе, называемом коинфекцией, НОУ и НВУ могут одновременно коинфицировать пациента в виде активной инфекции, и указанный тип инфекции заканчивается приблизительно в 95% восстановлением большинства пациентов, аналогично значениям показателя восстановления при острой инфекции НВУ. Второй тип инфекции НОУ, который является наиболее распространенным, представляет собой суперинфекцию, при которой происходит острое инфицирование НОУ у пациента, который уже имеет хроническую инфекцию НВУ. В таком случае инфекция НОУ прогрессирует до хронической инфекции НОУ приблизительно у 80-90% пациентов,
- 1 030381 и она является хронической инфекцией ΗΌν, которая представляет собой наиболее тяжелую форму заболевания. Поэтому суперинфекцию можно классифицировать, как раннюю острую суперинфекцию ΗΌν у носителя хронического ΗΒν или позднюю хроническую инфекцию ΗΌν. О третьей, но спорной форме потенциальной инфекции ΗΌν, называемой хелпер-независимой латентной инфекцией, впервые сообщалось в 1991, и она была описана, как имеющая место при трансплантации печени (ОйоЪгеШ е! а1., Са5!гоеп!его1оду 1991; 101: 1649-55). При данной форме инфекции гепатоциты пациента могут быть инфицированы только ΗΌν (например, при трансплантации печени, когда передача ΗΒν устраняется путем введения иммуноглобулинов против гепатита Β), но если ΗΒν в остаточном количестве избегает нейтрализации, или в дальнейшем пациент подвергается воздействию ΗΒν другим путем, клетки, инфицированные ΗΌν, могут спастись. Указанная форма была продемонстрирована на животных моделях, но такое заражение человеческих гепатоцитов остается спорным.
Хронический гепатит Ό в настоящее время считается наиболее тяжелой формой вирусного гепатита человека (для подробного обзора заболевания и ассоциированного с ним ΗΌν, см. СгаЪо\У5к1 апб \Уебетеуег, 2010, Όί§. П15еа5е 28: 133-138; или Ра5саге11а апб Ыедго, Муст 1п!егпайопа1 2011, 31: 7-21). Пациенты, хронически инфицированные ΗΌν, характеризуются ускоренным прогрессированием заболевания до фиброза, повышенным риском гепатоцеллюлярной карциномы, и ранней декомпенсацией на фоне цирроза. Заболевание может протекать бессимптомно или может быть представлено неспецифическими симптомами, и диагноз может быть установлен только после появления осложнений заболевания на стадии цирроза. Уровни аланинаминотрансферазы (АЬТ) и аспартатаминотрансферазы (АЗТ) постоянно увеличиваются у большинства пациентов и могут быть использованы для наблюдения за заболеванием. В течение 5-10 лет у 70-80% пациентов с хронических гепатитом Ό может развиться цирроз (Ρίζ/еЦо е! а1., Апп 1п!егп Меб 1983; 98: 437-41; Соутбагфап е! а1., ЫераЮоду 1986; 6: 640-4) и у 15% пациентов в течение 1-2 лет (Загассо е! а1., 1. Ыера1о1 1987; 5: 274-81). Инфекция ΗΌν также может ускорить развитие гепатоцеллюлярной карциномы (ЯСС).
Инфекция ΗΌν наиболее распространена в Средиземноморском бассейне, на Среднем Востоке, в Центральной и Северной Африке, в бассейне Амазонки, в Венесуэле, Колумбии и на определенных островах Тихого океана, вирус представлен и/или появляется по всему миру (например, Россия, Северная Индия, Южная Албания, Континентальный Китай и некоторые острова в Тихом океане). Инфекция ΗΌν передается парентерально, наиболее часто в результате употребления наркотиков или в результате применения крови или препаратов крови. Передача ΗΌν половым путем встречается реже, и перинатальная передача вируса является редкой.
Независимо от вида инфекции ΗΌν, в настоящее время не существует надлежащего метода лечения или профилактики инфекции ΗΌν. Противовирусные препараты, применяемые для лечения других вирусов, которые инфицируют гепатоциты (например, противовирусные препараты в случае ΗΒν или ΗΠν), не эффективны против ΗΌν. Иммуномодуляторные препараты, такие как кортикостероиды или лемивазол, не оказали эффекта (К^ейо е! а1., Апп 1п!егп Меб 1983; 98: 437-41; Апгдош е! а1., Апп 1п!егп Меб 1983; 98: 1024), как и тимусные пептиды (Ко5ша е! а1., Όί§ Муст Όΐ5 2002; 34: 285-9; ХауадПа е! а1., 1. Сйп Са5!гоеп!его1 1996; 23: 162-3). Это оставляет лечение интерфероном (например, пегилированным интерфероном-а; редГРЫ-а) в качестве единственного апробированного в настоящее время лечения инфекции ΗΌν. Однако известно, что ΗΌν может нарушать активацию сигнального пути ΙΡΝ-а ш уйто, и в действительности лечение ΗΌν с помощью ред1РЫ-а имеет терапевтические неудачи и низкие показатели эффективности. В одном проспективном исследовании только у 21% пациентов получали отрицательный результат тестов РНК ΗΌν и только у 26% пациентов наблюдали биохимический ответ (ΝίΐΌ е! а1., Ыера1о1оду 2006; 44:713-20), и сходные результаты были получены в других исследованиях, где стойкий ответ на терапию (лекарство) остается очень низким. Таким образом, в данной области существует потребность в новых профилактических и терапевтических подходах к инфекции ΗΌν.
Сущность изобретения
Один вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, включающей: (а) дрожжевой носитель; и (Ъ) гибридный белок, содержащий антигены ΗΌν, причем антигены ΗΌν состоят по меньшей мере из одного иммуногенного домена большого антигена ΗΌν (ГОАд-Ь) или малого антигена ΗΌν (ПОАд-З), где сигнал внутриядерной локализации (ЫЪ§) инактивирован с помощью замены или делеции одной или более аминокислот ΝΕ-З. Композиция вызывает ΗΌνспецифический иммунный ответ при введении пациенту.
В одном аспекте этого варианта осуществления изобретения антиген ΗΌν содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из ЗЕО ГО ΝΟ: 34, ЗЕО ГО ΝΟ: 28. В одном аспекте антиген ΗΌν содержит аминокислотную последовательность, которая идентична по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% аминокислотной последовательности, выбранной из ЗЕО ГО ΝΟ: 34, ЗЕО ГО ΝΟ: 28. В одном аспекте антиген ΗΌν выбирают из ЗЕО ГО ΝΟ: 34, ЗЕО ГО ΝΟ: 28.
В одном аспекте этого варианта осуществления изобретения гибридный белок имеет аминокислот- 2 030381 ную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО N0: 36 или §ЕЦ ГО N0: 30, или аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична 8ЕЦ ГО N0: 36 или §ЕЦ ГО N0: 30 соответственно.
В любом из описанных выше вариантов осуществления изобретения, в одном аспекте НОЛд-Ь имеет аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО N0: 2, §ЕЦ ГО N0: 5, §ЕЦ ГО N0: 8, или соответствующей аминокислотной последовательности другого штамма ΗΌν. В одном аспекте ИОЛд-З имеет аминокислотную последовательность, выбранную из 8ЕЦ ГО N0: 3, §ЕЦ ГО N0: 6, §ЕЦ ГО N0: 9, или соответствующую последовательность другого штамма ΗΌν. В одном аспекте антиген ΗΌν содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из 8ЕЦ ГО N0: 2, §ЕЦ ГО N0: 5, §ЕЦ ГО N0: 8, или соответствующей аминокислотной последовательности другого штамма ΗΌν.
В любом из описанных выше вариантов осуществления, относящихся к иммунотерапевтической композиции по изобретению, в одном аспекте антиген ΗΌν экспрессируется дрожжевым носителем. В одном аспекте дрожжевой носитель представляет собой цельные дрожжевые клетки. В одном аспекте цельные дрожжевые клетки инактивируют. В одном аспекте цельные дрожжевые клетки инактивируют нагреванием. В одном аспекте дрожжевой носитель происходит из 8ассйаготусс8 ссгсуыас.
В любом из описанных выше вариантов осуществления, относящихся к иммунотерапевтической композиции по изобретению, в одном аспекте композиция включена в фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, подходящее для введения пациенту.
В любом из описанных выше вариантов осуществления, относящихся к иммунотерапевтической композиции по изобретению, в одном аспекте композиция содержит более 90% дрожжевого белка.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу лечения инфекции, вызываемой вирусом гепатита Ό (ΗΌν), или по меньшей мере одного симптома, обусловленного инфекцией ΗΌν, у пациента, или улучшения выживаемости пациента, который инфицирован ΗΌν. Способ включает стадию введения пациенту, который инфицирован ΗΌν, по меньшей мере одной иммунотерапевтической композиции, как описано выше или в другом месте настоящего описания, где введение композиции пациенту уменьшает инфекцию ΗΌν или по меньшей мере один симптом, обусловленный инфекцией ΗΌν у пациента. В одном аспекте способ дополнительно включает введение пациенту одного или более дополнительных веществ, используемых для лечения или уменьшения симптома инфекции ΗΌν. Например, такое вещество может включать, но без ограничения интерферон. Интерфероны включают, но без ограничения интерферон-α, включая, но не ограничиваясь пегилированным интерфероном-а2а. В одном аспекте интерферон представляет собой интерферон-λ.
В одном аспекте этого варианта осуществления изобретения пациент хронически инфицирован вирусом гепатита В (ΗΒν). В одном аспекте способ также включает стадию введения пациенту противовирусного препарата для лечения инфекции ΗΒν. Такой противовирусный препарат может включать, но без ограничения: тенофовир, ламивудин, адефовир, телбивудин, энтекавир, и их комбинации.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу индукции антигенспецифического, клеточно-опосредованного иммунного ответа против антигена ΗΌν, включающему введение пациенту по меньшей мере одной иммунотерапевтической композиции, как описано выше или в другом месте настоящего описания.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу профилактики инфекции ΗΌν у пациента, включающему введение пациенту, который не инфицирован ΗΌν, по меньшей мере одной иммунотерапевтической композиции, как описано выше или в другом месте настоящего описания. В одном аспекте настоящего изобретения пациент хронически инфицирован вирусом гепатита В (ΗΒν). В одном аспекте способ дополнительно включает введение пациенту противовирусного препарата для лечения инфекции ΗΒν.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу иммунизации популяции пациентов против ΗΌν, включающему введение популяции пациентов по меньшей мере одной иммунотерапевтической композиции, как описано выше или в другом месте настоящего описания. В одном аспекте этого варианта осуществления изобретения популяция пациентов хронически инфицирована ΗΒν.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, как описано выше или в другом месте настоящего описания, для применения в лечении инфекции ΗΌν.
Другой вариант осуществления изобретения относится к иммунотерапевтической композиции, как описано выше или в другом месте настоящего описания, для применения в профилактике инфекции ΗΌν у пациента. В одном аспекте пациент хронически инфицирован ΗΒν.
Другой вариант осуществления изобретения относится к применению по меньшей мере одной иммунотерапевтической композиции, как описано выше или в другом месте настоящего описания, в получении лекарственного средства для лечения инфекции ΗΌν.
Другой вариант осуществления изобретения относится к применению по меньшей мере одной иммунотерапевтической композиции, как описано выше или в другом месте настоящего описания, в получении лекарственного средства для профилактики инфекции ΗΌν.
- 3 030381
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой выравнивание последовательностей, в котором показаны части ΗΌΑ§, использованные в конструкции, представленной 8ЕЦ ГО N0: 16 выровненной, для иллюстрации гомологии генотипов, использованных в данном гибридном белке (последовательность генотип 1 на строке 1 представляет собой положения 1-140 8ЕЦ ГО N0: 16; последовательность генотип 2 на строке 2 представляет собой положения 141-280 8ЕЦ ГО N0: 16; последовательность генотип 3 на строке 3 представляет собой положения 281-420 8ЕЦ ГО N0: 16).
Фиг. 2 представляет собой оцифрованное изображение, на котором показана экспрессия иммунотерапевтических средств на основе дрожжей, известных как ΗΌν1 (экспрессирующая 8ЕЦ ГО N0: 30) и ΗΌν2 (экспрессирующая 8ЕЦ ГО N0: 33), выращенных на средах И2 и ИЬ2, в сравнении с одним набором стандартов N83-415.
Фиг. 3 представляет собой оцифрованное изображение, на котором показана экспрессия иммунотерапевтических средств на основе дрожжей, известных как ΗΌν1 (экспрессирующая 8ЕЦ ГО N0: 30) и ΗΌν2 (экспрессирующая 8ЕЦ ГО N0: 33), выращенных на средах И2 и ИЬ2, в сравнении со вторым набором стандартов N83-418.
Фиг. 4 представляет собой оцифрованное изображение, на котором показана экспрессия иммунотерапевтического средства на основе дрожжей, известного как ΗΌν3 (экспрессирующая 8ЕЦ ГО N0: 36), выращенного на средах И2 и ИЬ2.
Фиг. 5А представляет собой график, на котором показаны результаты анализа ЕЫ8ро1 по определению интерферона-γ (ШЫу) у мышей С57ВЬ/6, вакцинированных ΗΌν-иммунотерапевтическими композициями на основе дрожжей ΗΌν1 и ΗΌν3 с применением пептида ΗΌν-Ρ2 (0νΑΧ = контрольные дрожжевые клетки, экспрессирующие нецелевой антиген).
Фиг. 5В представляет собой график, на котором показаны те же результаты анализа ЕЫ8ро1, как и на фиг. 5А, с вычитанием средового фона.
Фиг. 6А представляет собой график, на котором показаны результаты анализа ЕЫ8ро1 по определению интерлейкина-2 (ГО-2) у мышей С57ВЬ/6, вакцинированных ΗΌν-иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей ΗΌν-1 с применением пептида ΗΌν-Ρ1 (0νΑΧ = контрольные дрожжевые клетки, экспрессирующие нецелевой антиген).
Фиг. 6В представляет собой график, на котором показаны те же самые результаты анализа ЕЫ8ро1, как и на фиг. 6А, с вычитанием средового фона.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение в целом относится к композициям и способам профилактики и/или лечения инфекции, вызываемой вирусом гепатита дельта (ΗΌν). Изобретение включает иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей (также обозначаемую как ΗΌν-иммунотерапия на основе дрожжей), содержащую дрожжевой носитель и антиген(ы) ΗΌν, которые разработаны для вызывания профилактического и/или терапевтического иммунного ответа против инфекции ΗΌν у пациента, и применение таких композиций для профилактики и/или лечения инфекции ΗΌν. Изобретение также включает молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, применяемые в композиции на основе дрожжей изобретения, а также белки, кодируемые ими, для применения в какой-либо иммунотерапевтической композиции и/или в каком-либо терапевтическом или профилактическом протоколе для ΗΌν, включая какой-либо терапевтический или профилактический протокол, который включает ΗΌν-специфические композиции по изобретению на основе дрожжей наряду с каким-либо одним или более другими терапевтическими или профилактическими композициями, веществами, лекарствами, соединениями и/или протоколами в случае инфекции ΗΌν и/или связанной коинфекции.
Иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей вводят в виде биологически или фармацевтически приемлемых композиций. Поэтому, в отличие от применения дрожжей в качестве системы для производства антигена с последующей очисткой антигена от дрожжей, полный дрожжевой носитель, как описано здесь, должен быть пригодным и созданным для введения пациенту. Данное применение отличается от применения дрожжей с целью получения рекомбинантных белков для субъединичных вакцин, при котором белки, после того, как они экспрессированы, затем выделяют из дрожжей путем разрушения дрожжевых клеток и очищают, так что конечная вакцина в сочетании с адъювантом не содержит ДНК дрожжей в детектируемых количествах и включает не более 1-5% дрожжевого белка. ΗΌνиммунотерапевтические композиции по изобретению на основе дрожжей, с другой стороны, включают легко детектируемую ДНК дрожжей и содержат значительно больше чем 5% дрожжевого белка (т.е. свыше 5% общего белка в вакцине представлено белком, который является частью дрожжей или производится дрожжами); в целом иммунотерапевтические препараты изобретения на основе дрожжей содержат более 70%, более 80%, или, как правило, более 90% дрожжевого белка.
Иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей вводят пациенту, чтобы иммунизировать пациента в терапевтических и/или профилактических целях. В одном варианте осуществления изобретения композиции на основе дрожжей включают для введения в фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество или препарат. В одном аспекте следует создать композицию, которая подходит для введения человеческому пациенту (например, условия получения должны быть подходящими для при- 4 030381 менения у человека, и любые вспомогательные вещества или препараты, применяемые для окончательной обработки композиции и/или получения дозы иммунотерапевтического препарата для введения, должны быть подходящими для применения у человека). В одном аспекте изобретения иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей создают для введения с помощью инъекции пациенту или пациенту, например, парентеральным путем (например, с помощью подкожной, интраперитонеальной, внутримышечной или внутрикожной инъекции, или другим подходящим парентеральным путем).
В одном варианте осуществления дрожжевые клетки экспрессируют антиген (например, обнаруживаемый с помощью вестерн-блоттинга), и антиген не агрегирует в дрожжах, не образует тельца включений в дрожжах и/или не образует вирусоподобных частиц (УЪР) или других крупных антигенных частиц в дрожжевых клетках. В одном варианте осуществления антиген продуцируется в виде растворимого белка в дрожжах, и/или не секретируется дрожжами или по существу или главным образом не секретируется дрожжами. Иммунотерапевтические препараты на основе дрожжей должны легко фагоцитироваться дендритными клетками иммунной системы, и дрожжи и антигены должны легко процессироваться указанными дендритными клетками, чтобы вызвать эффективный иммунный ответ против НОУ.
Антигены вируса гепатита И, конструкции и композиции по изобретению.
Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей, которую можно использовать для предотвращения и/или лечения инфекции НОУ и/или для облегчения по меньшей мере одного симптома, обусловленного инфекцией НОУ. Композиция включает: (а) дрожжевой носитель и (Ь) один или более антигенов НОУ, содержащих белок (белки)) и/или их иммуногенный домен(ы), как подробно описано здесь. Связанные с дрожжевым носителем антигены НОУ наиболее часто экспрессируются дрожжевым носителем в виде рекомбинантных белков (например, интактными дрожжами или дрожжевым сферопластом, который в некоторых случаях может быть превращен в дрожжевой цитопласт, в тень дрожжевой клетки, или в экстракт дрожжевых мембран или его фракции), хотя существует вариант осуществления изобретения, в котором один или более таких антигенов НОУ помещают в дрожжевой носитель или другим путем собирают в одно целое с дрожжевым носителем, присоединяют к дрожжевому носителю, смешивают или вводят с дрожжевым носителем, как описано здесь, для создания композиции настоящего изобретения. Согласно настоящему изобретению, ссылка на гетерологичный белок или гетерологичный антиген, включая гетерологичный гибридный белок, вместе с дрожжевым носителем изобретения, означает, что белок или антиген представляет собой белок или антиген, который не экспрессируется дрожжами в природе, хотя гибридный белок, который включает гетерологичный антиген или гетерологичный белок, также может включать дрожжевые последовательности или белки или их части, которые также экспрессируются дрожжами в природе (например, препропоследовательность альфа-фактора, как описано здесь).
Один вариант осуществления изобретения относится к антигенам НОУ, используемым в иммунотерапевтической композиции по изобретению, и в одном аспекте в иммунотерапевтической композиции по изобретению на основе дрожжей. Как обсуждалось выше, существует только один известный белок, кодируемый геномом НОУ, и он включает две формы, 27 кОа большой (Ь) НОАд (ИОАд-Ь или Ь-ИОАд) (214 аминокислот) и 24 кОа малый (8) НОАд (НОАд-8 или 8-НОАд) (195 аминокислот). Белки отличаются приблизительно на 19 аминокислот, расположенных на С-конце большой формы НОАд.
Хотя в настоящее время известны по меньшей мере восемь различных генотипов НОУ (Ье Са1 е! а1., Етегд 1пГее1 ϋίδ 2006; 12: 1447-50), три генотипа являются наиболее распространенными, так называемые генотипы 1 (или I), 2 (или II) и 3 (или III). Генотип(ы) можно определить у пациента стандартными методами (например, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (КРЬР) продуктов полимеразной цепной реакции (РСК), секвенирование и/или иммуногистохимическое окрашивание). Высококонсервативные домены в генотипах НОУ расположены вокруг участков аутокаталитического расщепления геномной и антигеномной РНК и РНК-связывающего домена НОАд (СЬао е! а1., У1го1оду 1990; 178: 384-92; Аи е! а1., НераЮ1оду 1995; 22: 1656-60).
Генотип 1 в настоящее время является преобладающим генотипом НОУ и обнаруживается по всему миру, но в особенности в Европе, Северной Америке, Африке и в некоторых регионах Азии. Пример генотипа 1 генома НОУ представлен в базе данных под учетным номером АР104263 или СР11022740, также представлен здесь 8Еф ГО N0: 1. 8 ЕС ГО N0: 1 кодирует НОАд-Ь, представленный 8Еф ГО N0: 2 (также под учетным номером ААС26087.1 или СТ: 11022742) и НОАд-8, представленный 8Еф ГО N0: 3. Генотип 2 встречается в Японии, на Тайване и в России. Пример генотипа 2 неполного генома НОУ представлен в базе данных с учетным номером А1309880 или СЕ 15212076, также представлен здесь 8Еф ГО N0: 4. 8Е0 ГО N0: 4 кодирует НОАд-Ь, представленный 8Еф ГО N0: 5 (также под учетным номером САС51366.1 или СЕ15212077) и НОАд-8, представленный 8Еф ГО N0: 6. Генотип 3 встречается в Южной Америке (например, Перу, Колумбия, Венесуэла). Пример генотипа 3 генома НОУ представлен в базе данных учетным номером Ь22063.1 или СЬ410182, также представлен здесь 8Еф ГО N0: 7. 8Еф ГО N0: 7 кодирует НОАд-Ь, представленный 8Еф ГО N0: 8 (также под учетным номером Р0С6М3.1 или СЬ226737601) и НОАд-8, представленный 8Еф ГО N0: 9. Генотип 4 обнаружен в Японии и на Тайване, и генотипы 5-8 обнаружены в Африке. Различные последовательности НОАд описаны для указанных генотипов и могут быть найдены в общедоступных базах данных. Один пациент может быть инфицирован
- 5 030381 разнообразными генотипами, хотя обычно преобладает один генотип.
Последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность для многих геномов НОУ и кодируемых ими белков НОАд (больших и малых) известны в данной области для каждого из известных генотипов. Описанные выше последовательности являются показательными (типичными).
Отмечается, что небольшие вариации могут иметь место в аминокислотной последовательности между различными вирусными изолятами одного и того же белка или домена из одного генотипа НОУ. Однако антиген НОАд имеет по существу одинаковую общую структуру в различных штаммах и генотипах, так что специалист в данной области может легко отличить одну определенную последовательность НОАд от соответствующей последовательности НОАд из другого штамма/изолята НОУ или генотипа. Таким образом, используя методические принципы, приводимые в данном документе, и ссылку на типичные последовательности НОУ, специалист в данной области сможет легко создать ряд белков на основе НОУ, включая гибридные белки, из любого штамма (изолята) НОУ или генотипа, для использования в композициях и способах настоящего изобретения, и соответственно, изобретение не ограничивается конкретными последовательностями, раскрытыми в описании. Ссылка на белок НОУ или антиген НОУ в любом месте настоящего раскрытия, или на его любой функциональный, структурный или иммуногенный домен, соответственно, может быть осуществлена с помощью ссылки на конкретную последовательность из одной или более последовательностей, представленных в настоящем раскрытии, или с помощью ссылки на ту же самую, сходную или соответствующую последовательность из другого изолята (штамма) НОУ, включая последовательность из другого генотипа генотип или подгенотипа, чем референсный изолят/штамм.
Хотя применение любого из полноразмерных или почти полноразмерных антигенов НОУ (НОАд-Ь или НОАд-8), описанных здесь, входит в объем изобретения, рассматриваются дополнительные антигены НОУ, в особенности в целях оптимизации или увеличения применимости антигенов НОУ в качестве клинических продуктов, в том числе и в контексте иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей. Антигены НОУ, которые используют в настоящем изобретении, разработаны для получения НЭУиммунотерапевтического продукта на основе дрожжей, который позволяет достичь одну или более из следующих целей: (1) включение максимального числа известных Т-клеточных эпитопов (класса I МНС и класса II МНС); (2) максимальное включение или предпочтительное включение иммуногенных доменов, и конкретнее Т-клеточных эпитопов (эпитопы СО4+ и/или СО8+, и доминантные и/или субдоминантные эпитопы), которые являются наиболее консервативными среди генотипов и/или подгенотипов НОУ, или которые можно легко модифицировать с получением консенсусной последовательности или можно включить в две или более формы, чтобы преодолеть наиболее важные различия в последовательностях целевых геномов; (3) уменьшения числа ненатуральных соединений в последовательности антигена НОУ в продукте; (4) уменьшение до минимума или устранение последовательностей, которые могут препятствовать экспрессии белка дрожжами (например, гидрофобные домены); и/или (5) уменьшение до минимума или устранение последовательностей, которые могут быть важны для действия вируса (сигнал внутриядерной локализации), например, модификации с целью деактивации вируса. В одном варианте осуществления можно создать антигены НОУ, которые соответствуют положениям Консультативного комитета по рекомбинантным ДНК (КАС) Национальных институтов здравоохранения (МН).
В одном варианте осуществления изобретения антиген НОУ, используемый в изобретении включает НОАд, которые кодируются менее чем приблизительно: 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75, 70 или 66,67% генома НОУ, хотя несколько копий одного НОАд, соответствующих указанному параметру, или двух или более различных НОАд, соответствующих указанному параметру, но происходящих из различных генотипов, подгенотипов, или штаммов/изолятов НОУ, могут быть предоставлены в форме гибридного белка в настоящем изобретении.
В одном варианте осуществления изобретения антиген НОУ, применяемый в изобретении, включает НОАд, содержащий мутацию, достаточную для деактивации или удаления сигнала внутриядерной локализации (М-8; представленного, например, опубликованной последовательностью АОАРРАККАК (8ЕО ГО N0: 27) или ЕОАРРАККАК, которая соответствует положениям 66-75 8Е0 ГО N0: 2, или соответствующей последовательностью из другого генома НОУ или штамма/изолята НОУ). Такая мутация может включать делецию или замену одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или всех десяти аминокислотных остатков, включающих ΝΕ8. Дополнительные аминокислоты, фланкирующие ΝΣ8 также могут быть удалены или заменены, хотя обычно этого не требуется, и более предпочтительно сохранять аминокислотные остатки естественных Т-клеточных эпитопов в антигене НОУ. Удаление ΝΣ8 полезно по меньшей мере по двум причинам. Во-первых, устраняются вопросы, вызывающие озабоченность в связи с возможной биологической активностью антигена НОУ, применяемого в изобретении (вирус инактивируют) и, во-вторых, авторы изобретения установили, что делеция указанного функционального сайта увеличивает экспрессию получаемого белка или гибридного белка в дрожжах, с одновременным увеличением скорости роста и устранением измененной комкообразной морфологии дрожжей, обнаруживаемой, когда экспрессирующийся антиген НОУ содержит последовательность ΝΣ8.
В табл. 1 представлены некоторые опубликованные Т-клеточные эпитопы из НОУ (положения даны применительно к белку НОАд-Ь), один или более из которых можно использовать в антигене НОУ со- 6 030381 гласно настоящему изобретению. В одном аспекте изобретения антиген ΗΌν включает по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или более указанных эпитопов или других Т-клеточных эпитопов.
Таблица 1
Эпитоп Номер последовательности Позиция ΗϋΑ§ Предпочтение по классу НЬА
КЬГГ)Е\Р\¥б δ ТО ГО N0:19 43-51 Класс I А2
1къё5ъёк5ъ δΕζ) ГО N0:20 26-34 Класс I А2
2КЪЕОЪЕКОЪКК1ККК1 δΕζ) ГО N0:21 26-41 Класс II
г^люшкбгобкк5к5о δΕζ) ГО N0:22 50-65 Класс II
2ΑΟΑΡΡΑΚΚΑΚΤϋζ)ΜΕΙ δΕζ) ГО N0:23 66-81 Класс II
2АКТОЭМЕШ8ОРОККР δΕζ) ГО N0:24 74-89 Класс II
2ΚΑΕΕΝΚΚΚζ)ΕΑΑΟΟΚΗ δΕζ) ГО N0:25 106-121 Класс II
ΑδΚΕΕΕΕΕΕΚΚΕΤΕΕϋΕΚΚΕΚΚΤΑΟΡδνΟΟνΝ δΕζ) ГО N0:26 122-153 (122- 137, 130-145, и 138153) Класс II (3 перекрывающихся эпитопа)
1 Ниапд е! а1., 2004, I. Оеп νΐΓοΙ 85:3089-3098.
2 Νΐδΐηΐ е! а1., 1997, I. νΐΓοΙ. 71 (3):2241-2251.
Антигены ΗΌν и гибридные белки изобретения можно использовать в иммунотерапевтической композиции по изобретению, включая иммунотерапевтическую композицию изобретения на основе дрожжей. Такие антигены, гибридные белки и/или молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующие такие белки, также можно использовать в комбинации с иммунотерапевтической композицией или для получения иммунотерапевтической композиции не на основе дрожжей, которая может включать без ограничения ДНК-вакцину, субъединичную белковую вакцину, рекомбинантную вирусную иммунотерапевтическую композицию, вакцину из инактивированных или убитых клеток патогенов и/или вакцину на основе дендритных клеток. В другом варианте осуществления такие гибридные белки могут быть использованы в диагностическом тесте для определения ΗΌν и/или для создания антител против ΗΌν.
Один вариант осуществления изобретения относится к новым антигенам ΗΌν и гибридным белкам и молекулам рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующим указанные антигены и белки. Здесь описаны несколько различных новых антигенов ΗΌν для применения в иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей или в другой композиции (например, другие иммунотерапевтические или диагностические композиции).
Согласно настоящему изобретению, основное применение в описании термина антиген относится к любой части белка, (пептида, неполноценного белка, непроцессированного белка), где белок встречается в природе или получен синтетическим методом, к клеточной композиции (целая клетка, клеточный лизат или разрушенные клетки), к организму (целый организм, лизат или разрушенные клетки) или к углеводу, или к другим молекуле или к их частям. Антиген может вызывать антиген-специфический иммунный ответ (например, гуморальный и/или клеточно-опосредованный иммунный ответ) против того же самого или сходных антигенов, с которыми встречается элемент иммунной системы (например, Тклетки, антитела).
Антиген может быть небольшим, как один эпитоп, один иммуногенный домен или более крупным, и может включать несколько эпитопов или иммуногенных доменов. По размеру антиген фактически может быть настолько маленьким как приблизительно 8-12 аминокислот (т.е. пептид) и таким крупным как мультимер, гибридный белок, химерный белок, целая клетка, целый микроорганизм или любые их части (например, лизаты целых клеток или экстракты микроорганизмов). Кроме того, антигены могут включать углеводы, которые могут быть введены в дрожжевой носитель или в композицию изобретения. Следует понимать, что в некоторых вариантах осуществления (например, когда антиген экспрессируется дрожжевым носителем за счет рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты), антиген представляет собой белок, гибридный белок, химерный белок, или его фрагмент, а не целую клетку или микроорганизм.
Если антиген представляет собой антиген, который должен экспрессироваться в дрожжах, антиген имеет минимальный размер, экспрессируемый рекомбинантно в дрожжах, и обычно имеет в длину по меньшей мере или больше чем 25 аминокислот или по меньшей мере или больше чем 26, по меньшей мере или больше чем 27, по меньшей мере или больше чем 28, по меньшей мере или больше чем 29, по меньшей мере или больше чем 30, по меньшей мере или больше чем 31, по меньшей мере или больше чем 32, по меньшей мере или больше чем 33, по меньшей мере или больше чем 34, по меньшей мере или больше чем 35, по меньшей мере или больше чем 36, по меньшей мере или больше чем 37, по меньшей
- 7 030381 мере или больше чем 38, по меньшей мере или больше чем 39, по меньшей мере или больше чем 40, по меньшей мере или больше чем 41, по меньшей мере или больше чем 42, по меньшей мере или больше чем 43, по меньшей мере или больше чем 44, по меньшей мере или больше чем 45, по меньшей мере или больше чем 46, по меньшей мере или больше чем 47, по меньшей мере или больше чем 48, по меньшей мере или больше чем 49, или по меньшей мере или больше чем 50 аминокислот, или его длина составляет по меньшей мере 25-50 аминокислот, по меньшей мере 30-50 аминокислот, или по меньшей мере 3550 аминокислот, или по меньшей мере 40-50 аминокислот, или по меньшей мере 45-50 аминокислот. Могут быть экспрессированы белки меньшего размера, и значительно более крупные белки (например, длиной в сотни аминокислот или даже в тысячи аминокислот) могут быть экспрессированы. В одном аспекте может экспрессироваться полноразмерный белок или его структурный или функциональный домен или его иммуногенный домен, который лишен одной или более аминокислот на Ν- и/или С-конце, (например, отсутствует приблизительно от 1 до 20 аминокислот на Ν- и/или С-конце). Гибридные белки и химерные белки также представляют собой антигены, которые могут быть экспрессированы в изобретении. Целевой антиген представляет собой антиген, который специфически выявляется иммунотерапевтической композицией изобретения (т.е. требуется антиген, против которого вызывается иммунный ответ). Антиген ΗΌν представляет собой антиген, извлеченный, сконструированный или изготовленный из одного или более белков ΗΌν, так чтобы воздействие на антиген также оказывало воздействие на вирус гепатита Ό.
При ссылке на стимуляцию иммунного ответа, термин иммуноген является разновидностью термина антиген, и таким образом, в отдельных случаях может использоваться взаимозаменяемо с термином антиген. Иммуноген в данном контексте описывает антиген, который вызывает гуморальный и/или клеточно-опосредованный иммунный ответ (т.е. является иммуногенным), так что введение иммуногена пациенту повышает антигенспецифический иммунный ответ против тех же самых или сходных антигенов, которые обнаруживаются иммунной системой пациента. В одном варианте осуществления иммуноген вызывает клеточно-опосредованный иммунный ответ, включая СИ4+ Т-клеточный ответ (например, ТН1, ТН2 и/или ТН17) и/или СИ8+ Т-клеточный ответ (например, ответ СТЬ).
Иммуногенный домен данного антигена может представлять собой любую часть, фрагмент или эпитоп антигена (например, пептидный фрагмент или субъединицу или эпитоп, с которым связываются антитела, или другой конформационный эпитоп), который содержит по меньшей мере один эпитоп, который действует, как иммуноген, при введении животному. Таким образом, иммуногенный домен включает больше чем одну аминокислоту и, по меньшей мере, обладает размером, достаточным для включения по меньшей мере одного эпитопа, который может действовать, как иммуноген. Например, один белок может содержать несколько различных иммуногенных доменов.
Иммуногенные домены не обязательно должны представлять собой линейные последовательности в пределах белка, как например, в случае гуморального иммунного ответа, где предусматриваются конформационные домены.
Функциональный домен данного белка представляет собой часть или функциональную единицу белка, которая включает последовательность или структуру, которая прямо или косвенно ответственна по меньшей мере за одну биологическую или химическую функцию, ассоциированную с белком, приписываемую белку, или осуществляемую белком. Например, функциональный домен может включать активный участок для ферментативной активности, лигандсвязывающий участок, рецепторсвязывающий участок, участок связывания молекулы или ее части, такой как ион кальция, участок фосфорилирования, или трансактивационный домен. Примеры функциональных доменов ΗΌν включают, но без ограничения сигнал внутриядерной локализации (Ν68). РНК-связывающий домен, и домены, вовлеченные в сборку вириона и ингибирование сборки РНК.
Структурный домен данного белка представляет собой часть белка или элемент в общей структуре белка, который обладает определяемой структурой (например, он может представлять собой первичную или четвертичную структуру, принадлежащую нескольким белкам и свойственную для нескольких белков в пределах класса или семейства белков), является самостабилизирующимся и/или может сворачиваться независимо от остальной части белка. Структурный домен часто ассоциируется с биологической функцией белка или в значительной мере определяет биологическую функцию белка, к которому он принадлежит.
Эпитоп определяют в описании как один иммуногенный участок в данном антигене, который является достаточным, чтобы вызвать иммунный ответ, когда он предоставляется иммунной системе в контексте соответствующих костимулирующих сигналов и/или активированных клеток иммунной системы. Другими словами, эпитоп является частью антигена, которая обычно распознается компонентами иммуннной системы, и также может обозначаться как антигенная детерминанта. Специалисту в данной области понятно, что Т-клеточные эпитопы отличаются по размеру и составу от В-клеточных эпитопов или эпитопов, распознаваемых антителами, и что эпитопы, предоставляемые за счет использования пути МНС класса I, отличаются по размеру и структурным свойствам от эпитопов, предоставляемые за счет использования пути МНС класса II. Например, Т-клеточные эпитопы, представляемые с помощью молекул класса I МНС, обычно составляют в длину от 8 до 11 аминокислот, в то время как эпитопы, пред- 8 030381 ставленные с помощью молекул класса II МНС, менее ограничены по длине и могут составлять от 8 аминокислот до 25 аминокислот или больше. Кроме того, Т-клеточные эпитопы имеют предсказанные структурные характеристики, зависящие от специфических молекул МНС, связанных эпитопом. Некоторые Т-клеточные эпитопы установлены в штаммах ΗΌν и представлены в табл. 1. Эпитопы могут представлять собой эпитопы с линейной последовательностью или конформационные эпитопы (консервативные связывающие участки). Большинство антител распознает конформационные эпитопы.
Для любого из описанных здесь антигенов ΗΌν, включая любой из гибридных белков, можно применить следующие дополнительные варианты осуществления. Во-первых, Ν-концевая последовательность, обеспечивающая экспрессию, и С-концевой маркер, включенные в некоторые антигенные конструкции, являются необязательными, и в случае использования могут быть выбраны из нескольких различных последовательностей, описанных здесь, для придания устойчивости к протеосомной деградации и/или стабилизации или улучшения экспрессии, устойчивости и/или создания возможности для идентификации и/или очистки белка. Альтернативно одна или обе Ν- или С-концевые последовательности вообще не включаются. Кроме того, многочисленные различные промоторы, подходящие для применения в дрожжах, известны в данной области и они включены для использования, чтобы экспрессировать антигены ΗΌν согласно настоящему изобретению. Подходящие промоторы включают, но без ограничения СиР1 и ТЕР2. Кроме того, короткие промежуточные линкерные последовательности (например, пептиды, включающие 1, 2, 3, 4, или 5, или более аминокислот) можно ввести между частями гибридного белка по разным причинам, включая 1Пс введение сайтов рестрикции для облегчения клонирования и дальнейшей обработки конструкций. В заключение, как подробно обсуждалось в описании, последовательности, описанные здесь, являются типичными, и могут быть модифицированы как подробно описано в изобретении, для замены, добавления или удаления последовательностей в целях предоставления преимуществ для генотипа, штамма или изолята ΗΌν, или консенсусных последовательностей и введения предпочтительных Т-клеточных эпитопов, включая доминантные и/или субдоминантные Т-клеточные эпитопы. Описание некоторых различных типичных антигенов ΗΌν, используемых в изобретении, приводится ниже.
В одном варианте осуществления изобретения антиген(ы) ΗΌν для применения в композиции или в способе изобретения представляет собой белок или гибридный белок, содержащий антигены ΗΌν, где антигены ΗΌν включают в себя или состоят по меньшей мере из одного белка ΗΌΆ§-Ό или ΗΌΆ§-8, и/или по меньшей мере из одного их иммуногенного домена. В одном аспекте белок ΗΌΆ§-Ό или ΗΌΆ§8 является полноразмерным или почти полноразмерным. Согласно любому варианту осуществления настоящего изобретения ссылка на полноразмерный белок (или полноразмерный функциональный домен или полноразмерный иммуногенный домен) включает полноразмерную аминокислотную последовательность белка или функционального домена или иммуногенного домена, как описано здесь или как известно из другого источника или описано для общедоступной последовательности. Белок или домен, который является почти полноразмерным, который также является типом гомолога белка, отличается от полноразмерного белка или домена, добавлением или удалением или пропуском 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот на Ν- и/или С-конце такого полноразмерного белка или полноразмерного домена. Общая ссылка на белок или домен может включать как полноразмерные белки, так и почти полноразмерные белки, а также другие их гомологи.
Последовательности ΗΌν, применяемые для создания указанных конструкций и других конструкций, описанных и/или приведенных в качестве примера в описании, основаны на изолятах или штаммах определенного генотипа ΗΌν. Однако вариант осуществления изобретения позволяет добавить к или заменить в любой части антигена ΗΌν, описанного здесь, который основан на или получен из определенного генотипа, подгенотипа, или штамма/изолята, соответствующую последовательность, или даже одну или небольшую замену, вставку или делецию аминокислоты, которая встречается в соответствующей последовательности, из любого другого генотипа(ов), подгенотипа (ов), или штамма(ов) ΗΌν. В одном варианте осуществления антиген ΗΌν можно получить путем замены полной последовательности(стей) антигена ΗΌν, описанного здесь соответствующей последовательностью(стями) из одного или более различных генотипов, подгенотипов или штаммов/изолятов ΗΌν. Добавление или замена последовательности из одного генотипа или подгенотипа ΗΌν последовательности из другого генотипа или подгенотипа ΗΌν позволяет, например, адаптировать иммунотерапевтическую композицию для конкретного пациента или популяции пациентов (например, популяции пациентов в данной области страны, чтобы воздействовать на генотип(ы) ΗΌν, который наиболее распространен в данной стране или области страны). Аналогично, в варианте осуществления изобретения также используют всю консенсусную последовательность или части консенсусной последовательности, полученные из, установленные из, или опубликованные для данного штамма, генотипа или подтипа ΗΌν, чтобы внести изменения в последовательность данного антигена ΗΌν для более точного или полного соответствия консенсусной последовательности. Согласно настоящему изобретению и как обычно понимают в данной области, консенсусная последовательность представляет собой последовательность, выведенную на основании наиболее часто встречающегося нуклеотида или аминокислоты в определенном положении данной последовательности, после проведения выравнивания нескольких последовательностей.
- 9 030381
В качестве конкретного примера упомянутых выше типов модификаций, антиген ΗΌν можно модифицировать для изменения Т-клеточного эпитопа в данной последовательности из одного изолята, чтобы он более точно или полностью соответствовал Т-клеточному эпитопу из другого изолята или чтобы он более точно или полностью соответствовал консенсусной последовательности Т-клеточного эпитопа. В действительности, согласно изобретению, можно создать антигены ΗΌν, которые включают консенсусные последовательности из различных генотипов и/или подтипов ΗΌν, или комбинации последовательностей из различных генотипов и/или подтипов ΗΌν. Выравнивание ΗΌΆ§ ΗΌν среди типичных последовательностей каждого из главных известных генотипов можно легко осуществить с использованием общедоступного программного обеспечения, которое будет информировать, например, о получении консенсусных последовательностей. Примеры таких модификаций проиллюстрированы и представлены в качестве примера в описании.
Один пример осуществления изобретения относится к антигену ΗΌν, который имеет аминокислотную последовательность, представленную 8ΕΟ ΙΌ N0: 10, которая представляет собой укороченный (меньше чем полноразмерный) ΗΌΑ§-Ό ΗΌν генотипа 1. Указанный антиген включает последовательность ΚΕΕΌΕΕΚΌΕ или 8Ε0 ΙΌ N0: 20 (положения 5-13 8Ε0 ΙΌ N0: 10), которая представляет собой Тклеточный эпитоп для класса I ΜΗ0; и последовательность ΚΕΕΌΕΝΡ\νΕ или 8Е0 ΙΌ N0: 19 (положения 22-30) которая представляет собой другой Т-клеточный эпитоп для класса I ΜΗ0 (см. табл. 1 выше). Положения 22-140 8Ε0 ΙΌ N0: 10 представляют собой участки, богатые эпитопами, связывающими молекулы класса ΙΙ МНС (см. табл. 2). Указанный антиген может быть получен с использованием соответствующей последовательности любого генотипа, подгенотипа или штамма ΗΌν (т.е. можно использовать аминокислоты в аналогичных положениях ΗΟΆ^-Ό из другого штамма ΗΌν, вместо штамма, выбранного для 8Ε0 ΙΌ N0: 10). Для использования в получении иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей, создают дрожжи (например, 8ассйаготусе8 сегеуыае) для экспрессии антигена ΗΌν под контролем подходящего промотора. Конструирование и получение иммунотерапевтических продуктов на основе дрожжей более подробно описано ниже.
Как обсуждалось в общих чертах выше и также подробно описано далее, антиген, представленный 8Ε0 ΙΌ N0: 10, и любой другой антиген ΗΌν, описанный здесь, также можно присоединить к Шконцу для добавления последовательности, которая придает устойчивость к протеосомной деградации и/или стабилизирует экспрессию белка, такого как следующий белок: ΜΆΌΕΑΡ (8Ε0 ΙΌ N0: 11). Дополнительные подходящие Шконцевые последовательности обсуждаются ниже. Необязательно указанный антиген и любой антиген ΗΌν, описанный здесь, можно модифицировать для включения С-концевой последовательности, которая может способствовать стабилизации, идентификации и/или выделению белка, такой как гексагистидиновая последовательность, которая используется для идентификации белка. В качестве примера, гибридный белок, содержащий Шконцевую последовательность 8Ε0 ΙΌ N0: 11 и гексагистидиновый С-конец представлен 8Ε0 ΙΌ N0: 12, где положения 1-6 8Ε0 ΙΌ N0: 12 соответствуют 8Ε0 ΙΌ N0: 11, положения 7-146 8Ε0 ΙΌ N0: 12 соответствуют 8Ε0 ΙΌ N0: 10, и положения 147-152 8Ε0 ΙΌ N0: 12 представляют собой гексагистидиновый маркер.
Антиген 8Ε0 ΙΌ N0: 10, который может быть заменен соответствующей последовательностью из другого генотипа, подгенотипа или штамма ΗΌν, также может быть присоединен к Шконцу для добавления препропоследовательности альфа-фактора, чтобы стабилизировать экспрессию (представлен здесь 8Ε0 ΙΌ N0: 13 или 8Ε0 ΙΌ N0: 14, которые являются типичными препропоследовательностями альфафактора), и в свою очередь, необязательно может быть присоединен к С-концу для добавления гексагистидиновой последовательности, если желательно. Один такой гибридный белок представлен 8Ε0 ΙΌ N0: 15, который может быть заменен соответствующей последовательностью из другого штамма ΗΌν (включая 8Ε0 ΙΌ N0: 10 и 8Ε0 ΙΌ N0: 13, а также гексагистидиновый маркер). Положения 1-89 8Ε0 ΙΌ N0: 15 соответствуют 8Ε0 ΙΌ N0: 13, положения 90-229 8Ε0 ΙΌ N0: 15 соответствуют 8Ε0 ΙΌ N0: 10 и положения 230-235 8Ε0 ΙΌ N0: 15 представляют собой гексагистидиновый маркер.
Другой антиген ΗΌν, используемый в изобретении, представлен аминокислотной последовательностью 8Ε0 ΙΌ N0: 16. В данном антигене одна копия укороченного ΗΌΑ§ (выбранного для максимального увеличения Т-клеточных эпитопов), полученная из штамма, принадлежащего к каждому из трех различных генотипов, известных как генотипы 1, 2 и 3, предоставлена в виде одного гибридного белка для получения более универсальной конструкции. Указанный антиген может быть получен с использованием соответствующей последовательности любого генотипа(ов) ΗΌν или штамма(ов), и кроме того, любая часть ΗΌΑ§ может быть использована для создания такого гибридного белка (т.е. части ΗΌΑ§, использованные в 8Ε0 ΙΌ N0: 16, являются типичными, но можно использовать более мелкие или более крупные части, вплоть до полноразмерных ΗΌΑ§). В данной конструкции часть ΗΌΑ§ из штамма ΗΌν генотипа 1 (далее генотип 1) соответствует положениям 1-140 в 8Ε0 ΙΌ N0: 16; часть ΗΌΑ§ из штамма ΗΌν генотипа 2 (далее генотип 2) соответствует положениям 141-280 в 8Ε0 ΙΌ N0: 16; и часть ΗΌΑ§ из штамма ΗΌν генотипа 3 (далее генотип 3) соответствует положениям 281-420 в 8Ε0 ΙΌ N0: 16.
Другая сходная конструкция, которую можно создать, которая относится к последовательности, представленной 8Ε0 ΙΌ N0: 16, представляет собой слияние трех или более полноразмерных белков ΗΌΑ^-Ό, где каждый из белков ΗΌΑ§-Ε происходит из различного генотипа ΗΌν (например, генотипы
- 10 030381
1, 2 и 3, или различные комбинации генотипов), за исключением того, что, по сравнению с полноразмерными последовательностями каждый из белков НОЛд-Ь модифицировали для инактивации области ΝΣ8, как описано выше (например, с помощью замены и/или делеции остатков в пределах указанного сайта). В одном примере такой конструкции полноразмерную последовательность НОЛд-Ь генотипа 1, представленную 8ЕЦ ГО N0: 2 (или соответствующую последовательность из другого штамма ГОР) с делецией в положениях 66-75 (ΝΣδ) связывают с полноразмерной последовательностью НОЛд-Ь генотипа 2, представленной δΕΟ ГО N0: 5 (или с соответствующей последовательностью из другого штамма ΗΌν) с делецией в положениях 66-75 (ΝΌδ), которая связана с полноразмерной последовательностью НОЛд-Ь генотипа 3, представленной δΕΟ ГО N0: 8 (или с соответствующей последовательностью из другого штамма НОН с делецией положений 66-75 (ΝΌδ). Указанные последовательности также можно объединить в другом порядке, или можно использовать для объединения другие или дополнительные генотипы или подгенотипы Н0\;' для получения универсальной иммунотерапевтической композиции. Кроме того, различные остатки любой из последовательностей индивидуального генотипа можно модифицировать (например, с помощью аминокислотной замены) для более точного соответствия консенсусной последовательности для данного генотипа, и/или различные остатки можно модифицировать (например, с помощью аминокислотной замены) для более точного соответствия известным консенсусным Тклеточным эпитопам, которые ассоциированы с иммунными ответами против НЭ\/
На фиг. 1 показано выравнивание частей НОЛд. использованных в конструкции δΕΟ ГО N0: 16, для иллюстрации гомологии среди генотипов, используемых в данном гибридном белке δΕΟ ГО N0: 16. Выравнивание также иллюстрирует, что идентификация соответствующей последовательности из различных генотипов, подгенотипов или штаммов/изолятов Н0\;' не вызывает затруднений, поскольку каждая из последовательностей в δΕΟ ГО N0: 16 представляет собой укороченную часть полноразмерного НОЛд-Ь I ιυν.
Как и в случае с антигенами №ν, обсуждаемыми в другом месте в описании, N и/или С-концы δΕΟ ГО N0: 16 или сходный гибридный белок можно присоединить, чтобы включить различные последовательности (например, δΕΟ ГО N0: 11, 13 или 14). Например, при использовании Нконцевого пептида δΕΟ ГО N0: 11 и С-концевой гексагистидиновой последовательности вместе с δΕΟ ГО N0: 16, получают гибридный белок, представленный δΕΟ ГО N0: 17. Положения 1-6 δΕΟ ГО N0: 17 соответствуют δΕΟ ГО N0: 11; положения 7-426 δΕΟ ГО N0: 17 соответствуют δΕΟ ГО N0: 16 и положения 427-432 δΕΟ ГО N0: 17 соответствуют гексагистидиновому маркеру. При использовании Нконцевой последовательности δΕΟ ГО N0: 13 вместе с δΕΟ ГО N0: 16 и присоединении С-конца, как указано выше, получают гибридный белок, представленный δΕΟ ГО N0: 18, в котором положения 1-89 δΕΟ ГО N0: 18 соответствуют δΕΟ ГО N0: 13, положения 90-509 δΕΟ ГО N0: 18 соответствуют δΕΟ ГО N0: 16, и положения 510-515 δΕΟ ГО N0: 18 соответствуют гексагистидиновому маркеру.
Дополнительные антигены Ю V, включая гибридные белки и композиции, содержащие антигены НОУ описаны в примере 1. В одной конструкции создают дрожжи (например, δαοοΙιαίΌΐηγοοδ сетеу181ае), которые экспрессируют антиген ^ν под контролем промотора, индуцируемого ионами меди, СИР1 (произвольный промотор может включать, но без ограничения промотор ΊΈΡ2). Указанный антиген №ν включает одну копию НОЛд-Ь ^ν генотипа 1. Антиген создавали с использованием одной копии НОЛд, представленной здесь в виде δΕΟ ГО N0: 2, в качестве матрицы основной цепи, хотя соответствующую последовательность из любого другого штамма/изолята ^ν, или любого другого генотипа или подгенотипа ^ν, можно использовать вместо последовательности, включенной в данную конструкцию. В указанной конструкции антиген ^ν, представленный δΕΟ ГО N0: 2, модифицировали с удалением 10 аминокислотных остатков сигнала внутриядерной локализации (т.е. ΕΟΆΡΡΆΚΚ.ΆΚ, или положения 66-75 δΕΟ ГО N0: 2) для улучшения потенциального профиля безопасности полученной конструкции и иммунотерапевтического препарата на основе дрожжей, экспрессирующего данный антиген, и для возможного улучшения экспрессии указанной конструкции в дрожжах. Указанный изолят ^ν (δΕΟ ГО N0: 2) содержит несколько Т-клеточных эпитопов, которые предположительно вызывают иммунный ответ против ^ν. Полученный белок не содержит известных трансмембранных доменов и не включает чрезвычайно гидрофобных элементов, и, следовательно, дополнительную модификацию с учетом гидрофобности не рассматривают в качестве важного фактора при создании указанного антигена ^ν. Аминокислотная последовательность полученного антигена представлена здесь δΕΟ ГО N0: 28, которая может быть заменена соответствующей последовательностью из другого штамма, генотипа или подгенотипа №ν. ТОконцевую последовательность, соответствующую δΕΟ ГО N0: 11, и С-концевую последовательность гексагистидинового маркера добавляли к δΕΟ ГО N0: 28 для улучшения экспрессии антигена в дрожжах Щ-концевая последовательность) и для упрощения идентификации антигена (С-концевая последовательность). Линкер из двух аминокислот (ТЪт^ет), который позволяет ввести участок узнавания рестриктазой δρе1, вставляли между δΕΟ ГО N0: 11 и δΕΟ ГО N0: 28 для облегчения клонирования конструкции. Полученный гибридный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную δΕΟ ГО N0: 30, где положения 1-6 δΕΟ ГО N0: 30 представляют собой ТОконцевой пептид δΕΟ ГО N0: 11; положения 7-8 δΕΟ ГО N0: 30 представляют собой линкер из двух аминокислот; положения 9-212 δΕΟ ГО N0: 30 представляют собой антиген ®ν δΕΟ ГО N0: 28; и положения 213-218 δΕΟ ГО N0: 30
- 11 030381 представляют собой гексагистидиновый маркер. 8 ЕС ГО N0: 30 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной здесь 8Е0 ГО N0: 29, которая оптимизирована для экспрессии в дрожжах.
Во второй конструкции, основанной на ΗΌΆ§ ΗΌν 8Е0 ΙΌ N0: 2 и описанной в примере 1, оставляли последовательность ИЪ8, чтобы оценить полученный антиген в отношении биологии дрожжей и экспрессии антигена дрожжами. Аминокислотная последовательность полученного антигена представлена здесь 8Е0 ГО N0: 31, которая может быть заменена соответствующей последовательностью из другого штамма, генотипа или подгенотипа ΗΌν. Ц-концевую последовательность, соответствующую 8Е0 ГО N0: 11, и С-концевую последовательность гексагистидинового маркера добавляли к 8Е0 ГО N0: 31 с целью улучшения экспрессии антигена в дрожжах (Л-концевая последовательность) и облегчения идентификации антигена (С-концевая последовательность). Линкер из двух аминокислот (ТЬг-8ег) помещали между 8Е0 ГО N0: 11 и 8Е0 ГО N0: 31 для облегчения клонирования конструкции. Полученный гибридный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0: 33, где положения 1-6 8Е0 ГО N0: 33 представляют собой ^концевой пептид 8Е0 ГО N0: 11; положения 7-8 8Е0 ГО N0: 33 представляют собой линкер из двух аминокислот; положения 9-222 8Е0 ГО N0: 33 представляют собой антиген ΗΌν 8Е0 ΙΌ N0: 31; и положения 223-228 8Е0 ГО N0: 33 представляют собой гексагистидиновый маркер. 8Е0 ГО N0: 33 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной здесь 8Е0 ГО N0: 32, которую оптимизируют для экспрессии в дрожжах.
В третье конструкции, описанной в примере 1, создавали дрожжи (например, 8ассйаготусе8 сегеУ181ае) для экспрессии антигена ΗΌν под контролем промотора, индуцируемого ионами меди, СИР I. Данный антиген считается более универсальным иммунотерапевтическим препаратом или вакциной, и представляет собой один гибридный белок, содержащий модифицированный ΗΌΑ§-Ό из двух различных генотипов ΗΌν, в данном случае генотипов 1 и 2. Указанный антиген ΗΌν создавали с использованием одной копии ΗΌΑ§, представленной здесь в виде 8Е0 ГО N0: 2 (генотип 1) в качестве первой матрицы основной цепи, и одной копии ΗΌΑ§, представленной здесь в виде 8Е0 ГО N0: 5 (генотип 2), в качестве второй матрицы основной цепи. Соответствующую последовательность из любого другого штамма/изолята ΗΌν, или любого другого генотипа или подгенотипа ΗΌν, можно использовать вместо одной или обеих последовательностей, включенных в данную конструкцию, и аналогичные слияния можно осуществить с использованием третьего, четвертого, пятого или дополнительного генотипа, подгенотипа или штамма. В данном гибридном белке антиген ΗΌν, представленный 8Е0 ГО N0: 2, модифицировали с удалением 10 остатков сигнала внутриядерной локализации (т.е. ЕОАРРАККАК, или положения 66-75 в 8Е0 ГО N0: 2) в целях улучшения потенциального профиля безопасности полученной конструкции и иммунотерапевтического препарата на основе дрожжей, экспрессирующего данный антиген. Аналогично, антиген ΗΌν, представленный 8Е0 ГО N0: 5, модифицировали с удалением 10 остатков сигнала внутриядерной локализации (ЕОАРРАККАК, или положения 66-75 в 8Е0 ГО N0: 5), также в целях улучшения потенциального профиля безопасности полученной конструкции и иммунотерапевтического препарата на основе дрожжей, экспрессирующего данный антиген. Указанный гибридный белок включает несколько Т-клеточных эпитопов в каждой из последовательностей выделенных матриц ΗΌν (8Е0 ΙΌ N0: 2 и 8Е0 ΙΌ N0: 5), которые предположительно вызывают иммунный ответ против ΗΌν. Аминокислотная последовательность полученного антигена представлена 8Е0 ГО N0: 34, которую можно заменить соответствующей последовательностью из другого штамма(ов), генотип(ов) или подгенотип(ов) ΗΌν. В 8Е0 ГО N0: 34 последовательность антигена с генотипом 1 ΗΌν представлена положениями 1204 8Е0 ГО N0: 34 и последовательность антигена с генотипом 2 ΗΌν представлена положениями 205408 8ЕС ГО N0: 34.
^концевую последовательность, соответствующую 8Е0 ГО N0: 11 и С-концевую последовательность гексагистидинового маркера добавляли к 8Е0 ГО N0: 34 с целью улучшения экспрессии антигена в дрожжах Щ-концевая последовательность) и облегчения идентификации антигена (С-концевая последовательность). Линкер из двух аминокислот (ТЬг-8ег) помещали между 8Е0 ГО N0: 11 и 8Е0 ГО N0: 34 для облегчения клонирования конструкции. Полученный гибридный белок имеет аминокислотную последовательность, представленную 8Е0 ГО N0: 36, где положения 1-6 8Е0 ГО N0: 36 представляют собой ^концевой пептид 8Е0 ГО N0: 11; положения 7-8 8Е0 ГО N0: 36 представляют собой линкер из двух аминокислот; положения 9-212 8Е0 ГО N0: 36 представляют собой антиген генотипа 1 ΗΌν из 8Е0 ГО N0: 34; положения 213-416 8Е0 ГО N0: 36 представляют собой антиген генотипа 2 из 8Е0 ГО N0: 34, и положения 417-422 8Е0 ГО N0: 36 представляют собой гексагистидиновый маркер. 8ЕС ГО N0: 36 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной здесь 8Е0 ГО N0: 35, которую оптимизируют для экспрессии в дрожжах.
Изобретение также включает гомологи любого из описанных выше антигенов ΗΌν и гибридные белки, а также применение гомологов, вариантов или мутантов отдельных белков ΗΌν или их частей (включая любые функциональные и/или иммуногенные домены), которые являются частью таких гибридных белков. В одном аспекте антиген ΗΌν, применяемый в настоящем изобретении (включая любую из 8ЕС ГО N0: 2, 8ЕС ГО N0: 3, 8ЕС ГО N0: 5, 8ЕС ГО N0: 6, 8ЕС ГО N0: 8, 8ЕС ГО N0: 9, 8ЕС ГО N0: 10, 8ЕС ГО N0: 12, 8ЕС ГО N0: 15, 8ЕС ГО N0: 16, 8ЕС ГО N0: 17, 8ЕС ГО N0: 18, 8ЕС ГО N0: 28, 8ЕС
- 12 030381
ΙΌ N0: 30, 8Εφ ΙΌ N0: 31, 8ΙΤ) ΙΌ N0: 33, 8ΙΤ) ΙΌ N0: 34 или 8ΙΤ) ΙΌ N0: 36), содержит по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% линейной последовательности полноразмерного антигена ΗΌν (НОЛд-Ь или НЭАд-8). или антигена НОУ, который был модифицирован с удалением или заменой от 1 до 10 аминокислот домена ИЕ8, или части белка НЭАд-Ь или ΗΌΑ§-8, которая включает по меньшей мере один иммуногенный домен ΗΌΑ§-Ε или ΗΌΑ§-8. В одном аспекте антиген ΗΌν (включая любую из 8Ι+) ΙΌ N0: 2, 8ΙΤ) ΙΌ N0: 3, 8ΙΤ) ΙΌ N0: 5, 8Ι+) ΙΌ N0: 6, 8Ι+) ΙΌ N0: 8, 8ΙΤ) ΙΌ N0: 9, 8Ι+) ΙΌ N0: 10, 8ΙΤ) ΙΌ N0: 12, 8Ι+) ΙΌ N0: 15, 8Ι+) ΙΌ N0: 16, 8ΙΤ) ΙΌ N0: 17, 8Ι+) ΙΌ N0: 18, 8Ι+) ΙΌ N0: 28, 8Ι+) ΙΌ N0: 30, 8Ι+) ΙΌ N0: 31, 8Ι+) ΙΌ N0: 33, 8ΙΤ) ΙΌ N0: 34 или 8ΙΤ) ΙΌ N0: 36) идентичен по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% полноразмерному антигену ΗΌν (ΗΌΑ§-Ε или ΗΌΑ§-8), или антигену ΗΌν, который модифицировали с удалением или заменой от 1 до 10 аминокислот домена ИЪ8, или части белка ΗΌΑ§-Ε или ΗΌΑ§-8, которая включает по меньшей мере один иммуногенный домен ΗΌΑ§-Ε или ΗΌΑ§-8. Добавление И-концевой последовательности, обеспечивающей экспрессию, и С-концевого маркера является необязательным, и указанные последовательности можно выбрать из нескольких различных последовательностей, описанных здесь для улучшения экспрессии, стабильности и/или обеспечения возможности идентификации и/или очистки белка, или одна или обе N или С-концевые последовательности вообще не включаются. Вместе с тем, многочисленные промоторы, подходящие для применения в дрожжах, известны в данной области. Более того, короткие промежуточные линкерные последовательности (например, пептиды, состоящие из 1, 2, 3, 4 или 5, или более аминокислот) могут быть помещены между частями гибридного белка по ряду причин, включая введение участков рестрикции для облегчения клонирования и последующей обработки конструкций.
В некоторых аспектах изобретения аминокислотные вставки, делеции и/или замены могут быть осуществлены в отношении одной, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти или более аминокислот белка дикого типа или эталонного белка ΗΌν или его иммуногенного домена, при условии, что полученный белок ΗΌν при использовании в качестве антигена в дрожжевой ΗΌνиммунотерапевтической композиции по изобретению вызывает иммунный ответ против белка-мишени или белка дикого типа или эталонного белка ΗΌν, который может предусматривать усиленный иммунный ответ, сниженный иммунный ответ, или по существу одинаковый иммунный ответ. Например, изобретение включает применение агонистов антигенов ΗΌν, которые могут включать один или более Тклеточных эпитопов, которые были изменены для усиления Т-клеточного ответа против агониста ΗΌν, например, путем увеличения авидности или аффинности эпитопа для молекулы МНС или для для Тклеточного рецептора, который распознает эпитоп в контексте представления МНС. Белковые агонисты ΗΌν, соответственно, могут увеличивать силу или эффективность Т-клеточного ответа против нативных белков ΗΌν, которые инфицируют хозяина.
Рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты и кодируемые ими белки, включая любые антигены ΗΌν, описанные здесь, в качестве одного варианта осуществления изобретения, можно использовать в иммунотерапевтических композициях на основе дрожжей, или в других вариантах осуществления с любой другой целью, для которой подходит антиген (антигены) ΗΌν, включая применение в анализе ίη νίίΓΟ, в получении антител, или в другой иммунотерапевтической композиции, включая другую вакцину, не на основе иммунотерапии, описанную здесь (например, вакцина на основе вирусного вектора, вакцина на основе дендритных клеток, или в качестве компонента для слияния или соединения с другим иммунотерапевтическим веществом). Экспрессия белков с помощью дрожжей является одним предпочтительным вариантом осуществления, хотя можно использовать другие системы экспрессии для получения белков для применений, отличающихся от иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей.
Иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей.
В различных вариантах осуществления изобретение включает применение по меньшей мере одной иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей (фразу можно использовать взаимозаменяемо с фразами иммунотерапевтический продукт на основе дрожжей, композиция для иммунотерапии на основе дрожжей, композиция на основе дрожжей, иммунотерапевтический препарат на основе дрожжей, вакцина на основе дрожжей, или производными указанных фраз).
Иммунотерапевтическая композиция является композицией, которая вызывает иммунный ответ, достаточный для достижения по меньшей мере одного терапевтического преимущества у пациента. В данном контексте иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей относится к композиции, которая включает компонент дрожжевого носителя и которая вызывает иммунный ответ, достаточный для достижения по меньшей мере одного терапевтического преимущества у пациента. Более подробно, иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей является композицией, которая включает компонент дрожжевого носителя и может вызывать или индуцировать иммунный ответ, например клеточный иммунный ответ, включая без ограничения клеточный иммунный ответ, опосредованный Т-клетками. В одном аспекте иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, используемая в изобретении, способна индуцировать ΟΌ8+ и/или ΟΌ4+ Т-клеточно-опосредованный иммунный ответ и в другом аспекте, ΟΌ8+ и ΟΌ4+ Т-клеточно-опосредованный иммунный ответ. Необязательно, иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей способна вызывать гуморальный иммунный ответ. Иммунотерапев- 13 030381 тическая композиция на основе дрожжей, используемая в настоящем изобретении, может, например, вызвать иммунный ответ у пациента, благодаря чему пациент защищен от инфекции ΗΌν и/или получает лечение от инфекции ΗΌν или от симптомов, возникающих в результате инфекции ΗΌν.
Иммунотерапевтические композиции по изобретению на основе дрожжей могут быть либо профилактическими либо терапевтическими. При профилактическом применении композиции настоящего изобретения предоставляются до выявления или наблюдения какого-либо идентификатора или симптома инфекции ΗΌν. Такую композицию можно вводить при рождении, в раннем детстве или взрослым, или она может быть полезна в одном варианте осуществления для иммунизации популяции пациентов, у которых существует риск инфицирования ΗΌν или инфекция ΗΒν. Профилактическое введение иммунотерапевтических композиций используют для предотвращения последующей инфекции ΗΌν, для более быстрого или более полного устранения инфекции, если инфицирование ΗΌν происходит позже, и/или для уменьшения симптомов инфекции ΗΌν, если инфицирование происходит позже. При терапевтическом применении иммунотерапевтические композиции предоставляются во время или после появления инфекции ΗΌν, с целью облегчения по меньшей мере одного симптома инфекции и предпочтительно, с целью устранения инфекции, обеспечения длительной ремиссии инфекции, и/или обеспечения стойкого иммунитета против последующих инфекций или реактиваций вируса.
Обычно иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей включает дрожжевой носитель и по меньшей мере один антиген или его иммуногенный домен, экспрессируемый дрожжевым носителем, прикрепленный к дрожжевому носителю, или смешанный с дрожжевом носителем, где антиген гетерологичен для дрожжей, и где антиген включает один или более антигенов ΗΌν. В некоторых вариантах осуществления антиген ΗΌν предоставляется в виде гибридного белка. Некоторые гибридные белки ΗΌν, подходящие для применения в композициях и способах изобретения, описаны выше. В одном аспекте изобретения гибридный белок может включать два или более антигенов, например, повтор одного и того же антигена или два или более ΗΌΑ§, где каждый антиген происходит из другого генотипа, подгенотипа или штамма. В одном аспекте гибридный белок может включать два или более имммуногенных домена одного или более антигенов, или два или более эпитопов одного или более антигенов.
В любой из иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, используемых в настоящем изобретении, следующие аспекты, связанные с дрожжевым носителем, включены в изобретение. Согласно настоящему изобретению, дрожжевой носитель представляет собой какую-либо дрожжевую клетку (например, целую или интактную клетку) или ее производное (см. ниже), которое можно использовать в сочетании с одним или более антигенами, их иммуногенными доменами или эпитопами в терапевтической композиции по изобретению, или в одном аспекте дрожжевой носитель можно использовать отдельно или в качестве адъюванта. Дрожжевой носитель соответственно может включать, но без ограничения, живой, интактный (целый) дрожжевой микроорганизм (т.е. дрожжевая клетка, имеющая все компоненты, включая клеточную стенку), убитый (мертвый) или инактивированный интактный (целый) дрожжевой микроорганизм, или производные интактный (целых) дрожжей, включающие: дрожжевой сферопласт (т.е. дрожжевая клетка, лишенная клеточной стенки), дрожжевой цитопласт (т.е. дрожжевая клетка, лишенная клеточной стенки и ядра), тень дрожжевой клетки (т.е. дрожжевая клетка, лишенная клеточной стенки, ядра и цитоплазмы), субклеточный экстракт дрожжевых мембран или его фракцию (также обозначаемую как дрожжевая мембранная частица и ранее как субклеточная дрожжевая частица), любую другую дрожжевую частицу, или препарат клеточной стенки дрожжей.
Дрожжевые сферопласты обычно получают с помощью разрушения ферментами клеточной стенки дрожжей. Такой метод описан, например, Егап/июГГ е! а1., 1991, МеЫ. Εηζνιηοΐ. 194, 662-674, и включен в описание посредством ссылки во всей полноте.
Дрожжевые цитопласты обычно получают путем удаления ядра дрожжевых клеток. Такой метод описан, например, Сооп, 1978, Ναΐΐ. Сапсег 1пз!. Моподг. 48, 45-55 и включен в описание посредством ссылки во всей полноте.
Тени дрожжевых клеток обычно получают путем повторного закрытия клетки с нарушенной проницаемостью мембраны или лизированной клетки и они могут, но не должны содержать, по меньшей мере, некоторые из органелл такой клетки. Такой метод описан, например, Рга^изоГГ е! а1., 1983, 1. Вю1. СЬет. 258, 3608-3614 и Виззеу е! а1., 1979, ВюсЫт. ВюрЬуз. Ас!а 553, 185-196, и каждый из которых включен в описание посредством ссылки во всей полноте.
Частица дрожжевой мембраны (субклеточный экстракт мембран дрожжей или его фракция) обозначает мембрану дрожжевой клетки, которая лишена природного ядра или цитоплазмы. Частица может быть любого размера, в диапазоне от размера природной дрожжевой мембраны до микрочастиц, получаемых с помощью обработки ультразвуком или других методов разрушения мембран, известных специалисту в данной области, с последующим повторным закрытием мембраны. Способ получения субклеточных экстрактов мембран дрожжей описан, например, в Рга^изоГГ е! а1., 1991, Ме!Ь. Εηζуто1. 194, 662674. Также можно использовать фракции частиц дрожжевых мембран, которые содержат части дрожжевых мембран и антиген или другой интересующий белок, если такой антиген или другой белок экспрессировался рекомбинантно дрожжами перед получением частиц мембран дрожжей. Антигены или другие интересующие белки могут быть перенесены внутри мембраны, на любой поверхности мембраны, или с
- 14 030381 помощью комбинаций указанных методов (т.е. белок может находиться внутри и снаружи мембраны и/или располагаться трансмембранно в частице мембраны дрожжей). В одном варианте осуществления частица дрожжевой мембраны является частицей мембраны рекомбинантных дрожжей, которая может быть интактной, разрушенной или разрушенной и повторно закрытой дрожжевой мембраной, которая несет по меньшей мере один желаемый антиген или другой интересующий белок на поверхности мембраны или, по меньшей мере, частично встроенным в мембрану.
Примером препарата клеточных стенок дрожжей является препарат клеточных стенок дрожжей, несущих на своей поверхности антиген, или, по меньшей мере, частично внедренный в клеточную стенку, такой что препарат клеточной стенки дрожжей, при введении животному, стимулирует желаемый иммунный ответ против заданного заболевания.
Любой штамм дрожжей можно использовать для получения дрожжевого носителя настоящего изобретения. Дрожжи представляют собой одноклеточные микроорганизмы, которые принадлежат к одному из трех классов: А8сотусе1е8, ВаЧйютусеЮк, и Риид1 1трегГесЫ Одним фактором выбора типа дрожжей для применения в качестве иммунного модулятора является патогенность дрожжей. В одном варианте осуществления дрожжи представляют собой непатогенный штамм, такой как 8ассйаготусе8 сегеуыае. Выбор непатогенного штамма дрожжей сокращает до минимума появление каких-либо нежелательных явлений у пациента, которому вводят дрожжевой носитель. Однако патогенные дрожжи можно использовать, если патогенность дрожжей можно устранить каким-либо способом, известным специалисту в данной области (например, мутантные штаммы). Согласно одному аспекту настоящего изобретения используют непатогенные дрожжевые штаммы.
Роды штаммов дрожжей, которые можно использовать в изобретении включают, но без ограничения 8асскаготусе8, СапЫйа, Сгур1ососси8, Еаи8епи1а, К1иууеготусе8, РюЫа, Р1юйо1оги1а. 8с1й/о касскаготусек и Уагго\\аа. В одном аспекте роды дрожжей выбирают из 8асскаготусе8, СаиЫйа, Наи8епи1а, РюЫа или ЗсШ/окассйаготусек, и в одном аспекте, роды дрожжей выбирают из 8ассйаготусе8, Наи8епи1а и РюЫа, и в одном аспекте, используют 8ассйаготусе8. Виды штаммов дрожжей, которые можно использовать в изобретении включают, но без ограничения 8ассйаготусе8 сегеу181ае, 8ассйаготусе8 сагкЬегдепкк, СапЫйа а1Ысап8, СапйЫа кеГуг, СапйЫа йорюшк, Сгур1ососси8 1аигепЫ, Сгур1ососси8 пеоГогтапк, Наи8епи1а апота1а, Наи8епи1а ро1утогрка, К1иууеготусе8 Ггадйк, КЫууеготусек 1ас1к, К1иууеготусек тагх1апи8 уаг. 1ас1к, РюЫа райогк, Р1юйо1оги1а гиЬга, 8сН|/о5ассНаготусе5 ротЬе и Уагго\\аа Прокиса. Следует понимать, что некоторое количество указанных видов включает ряд подвидов, типов, подтипов и т.д., которые включены в вышеупомянутые виды. В одном аспекте, виды дрожжей, используемые в изобретении, включают 8. сегеук1ае, С. аЫюапк, Н. роктогрПа, Р. райогк и 8. ротЬе. Вид 8. сегеук1ае является полезным, поскольку он довольно удобен в работе и общепризнан безопасным или ОКА.8 для применения в качестве пищевых добавок (СКЛ8, Правило, предлагаемое ΡΌΆ, 62РК18938, 17 апреля 1997 г.). Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой штамм дрожжей, который обеспечивает репликацию плазмид с получением очень большого числа копий, например, штамм 8. сегеук1ае аг°. Штамм 8. сегеук1ае является таким штаммом, который способен обеспечить экспрессию векторов, которые предусматривают высокий уровень экспрессии одного или более целевого антигена (нов) и/или антигенного гибридного белка(ов) и/или других белков. Кроме того, любые мутантные штаммы дрожжей можно использовать в настоящем изобретении, включая штаммы, которые демонстрируют сниженные посттрансляционные модификации экспрессированных антигеновмишеней или других белков, такие как мутации ферментов, которые увеличивают Ν-связанное гликозилирование.
В большинстве вариантов осуществления изобретения иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей включает по меньшей мере один антиген, его иммуногенный домен или эпитоп. Антигены, предлагаемые для применения в изобретении, включают любой антиген НОУ или его иммуногенный домен, включая мутанты, варианты и агонисты белков НОУ или их доменов, против которого желательно вызвать иммунный ответ в целях профилактической или терапевтической иммунизации хозяина против инфекции НОУ.
Антигены НОУ, которые применимы в различных вариантах осуществления изобретения, подробно описаны выше.
Как обсуждалось выше, композиции по изобретению включают по меньшей мере один антиген НОУ и/или по меньшей мере один иммуногенный домен по меньшей мере одного антигена НОУ для иммунизации пациента. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой гибридный белок, некоторые примеры которого описаны выше.
Необязательно, белки, включая гибридные белки, которые используют в качестве компонента иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей изобретения, получают с использованием конструкций, которые особенно полезны для улучшения или усиления экспрессии или стабильности экспрессии рекомбинантных антигенов в дрожжах. Обычно желаемый антигенный белок(ки) или пептид(ы) соединяют по его аминоконцевому остатку: (а) с определенным синтетическим пептидом, который стабилизирует экспрессию гибридного белка в дрожжевом носителе или предотвращает посттрансляционную модификацию экспрессированного гибридного белка (такие пептиды подробно описаны, например, в
- 15 030381 патентной публикации США № 2004-0156858 А1, опубликованной 12 августа 2004 г. и включенной в описание посредством ссылки во всей полноте); (Ь) по меньшей мере, с частью эндогенного дрожжевого белка, включая, но без ограничения альфа-фактор, где партнер по гибридизации обеспечивает повышенную стабильность экспрессии белка в дрожжах и/или предотвращает посттрансляционную модификацию белков дрожжевыми клетками (такие белки также подробно описаны, например, в патентной публикации США № 2004-0156858 А1, выше); и/или (с) по меньшей мере с частью дрожжевого белка, которая обуславливает экспрессию гибридного белка на поверхности дрожжевых клеток (например, белок Ада, описанный здесь более подробно). Кроме того, настоящее изобретение включает в некоторых случаях применение пептидов, которые присоединяют к С-концу конструкции, кодирующей антиген, в особенности для использования в отборе и идентификации белка. Такие пептиды включают, но без ограничения любой синтетический или природный пептид, такой как пептидный маркер (например, 6Х Ηίδ) или любую другую короткий эпитопный маркер. Пептиды, присоединенные к С-концу антигена, согласно изобретению можно использовать с присоединением или без присоединения Ν-концевых пептидов, рассмотренных выше.
В одном варианте осуществления синтетический пептид, используемый в гибридном белке, соединяют с Ν-концом антигена, пептид состоит по меньшей мере из двух аминокислотных остатков, которые гетерологичны антигену, где пептид стабилизирует экспрессию гибридного белка в дрожжевом носителе или предотвращает посттрансляционную модификацию экспрессированного гибридного белка. Синтетический пептид и Ν-концевая часть антигена вместе образуют гибридный белок, который должен соответствовать следующим требованиям: (1) аминокислотный остаток в положении один гибридного белка представляет собой метионин (т. е. первая аминокислота в синтетическом пептиде является метионином); (2) аминокислотный остаток в положении два гибридного белка не является глицином или пролином (т.е. вторая аминокислота в синтетическом пептиде не является глицином или пролином); (3) аминокислотные остатки в положениях 2-6 гибридного белка не являются метионином (т.е. аминокислоты в положениях 2-6, или в части синтетического пептида или в белке, если синтетический пептид короче 6 аминокислот, не содержат метионин); и (4) аминокислоты в положениях 2-6 гибридного белка не являются лизином или аргинином (т.е. аминокислоты в положениях 2-6, или в части синтетического пептида или в белке, если синтетический пептид короче 5 аминокислот, не содержат лизин или аргинин). Синтетический пептид может быть настолько коротким, что состоит из двух аминокислот, но в одном аспекте, он состоит из 2-6 аминокислот (включая 3, 4, 5 аминокислот), и может быть длиннее чем 6 аминокислот, в целых числах, вплоть до приблизительно 200 аминокислот, 300 аминокислот, 400 аминокислот, 500 аминокислот или больше.
В одном варианте осуществления гибридный белок содержит аминокислотную последовательность М-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6, где М представляет собой метионин; Х2 представляет собой любую аминокислоту, кроме глицина, пролина, лизина или аргинина; Х3 представляет собой любую аминокислоту, кроме метионина, лизина или аргинина; Х4 представляет собой любую аминокислоту, кроме метионина, лизина или аргинина; Х5 представляет собой любую аминокислоту, кроме метионина, лизина или аргинина; и Х6 представляет собой любую аминокислоту, кроме метионина, лизина или аргинина. В одном варианте осуществления остаток Х6 представляет собой пролин. Типичная синтетическая последовательность, которая повышает стабильность экспрессии антигена в дрожжевой клетке и/или предотвращает посттрансляционную модификацию белка в дрожжах, включает последовательность М-А-Э-Е-А-Р (8Еф ГО N0: 11). Другой типичной последовательностью с такими же свойствами является последовательность М-У. Помимо повышенной стабильности продукта экспрессии, указанные партнеры, участвующие в слиянии, не оказывают отрицательного влияния на иммунный ответ против иммунизирующего антигена в конструкции. Кроме того, можно создать синтетические гибридные пептиды для предоставления эпитопа, который может распознаваться селектирующим агентом, например антителом.
В одном варианте осуществления антиген НОУ присоединен по Ν-концу к дрожжевому белку, такому как препропоследовательность альфа-фактора (также обозначаемая как сигнальная лидерная последовательность альфа-фактора, аминокислотная последовательность которой представлена здесь в качестве примера 5>ЕС ГО N0: 13 или 8Еф ГО N0: 14). Другие последовательности для препропоследовательности альфа-фактора дрожжей известны в данной области и включены для применения в настоящем изобретении.
В одном аспекте изобретения дрожжевой носитель обрабатывают таким образом, что антиген экспрессируется или предоставляется с помощью доставки или транслокации экспрессированного белкового продукта, частично или полностью, на поверхности дрожжевого носителя (внеклеточная экспрессия). Один способ осуществления данного аспекта изобретения заключается в применении спейсерной ножки для размещения одного или более белка(ов) на поверхности дрожжевого носителя. Например, можно использовать спейсерную ножку для создания гибридного белка антигена(ов) или другого белка, представляющего интерес, с белком, который направляет антиген(ы) или другой белок, представляющий интерес, к клеточной стенке дрожжей. Например, один такой белок, который можно использовать, для нацеливания других белков представляет собой дрожжевой белок (например, белок клеточной стенки 2 (с\\р2). Ада2, Ри4 или белок Р1о1), который позволяет направить антиген(ы) или другой белок к клеточ- 16 030381 ной стенке дрожжей, так что антиген или другой белок локализуется на поверхности дрожжей. Белки, отличающиеся от дрожжевых белков, можно использовать в спейсерной ножке; однако, в случае любого белка спейсерной ножки, наиболее предпочтительным является, чтобы иммунный ответ был направлен против антигена-мишени, а не белка спейсерной ножки. По существу, если в спейсерной ножке используют другие белки, то белок спейсерной ножки, который используют, не должен вызывать такой сильный иммунный ответ на сам белок спейсерной ножки, чтобы он не перекрывал иммунный ответ на антиген-мишень (антигены-мишени). Специалисту в данной области следует добиваться низкого иммунного ответа против белка спейсерной ножки, по сравнению с иммунным ответом против антигена-мишени (антигенов-мишеней). Можно сконструировать спейсерные ножки, которые включают участки расщепления (например, участки расщепления протеазами), что позволяет легко удалить антиген из дрожжей или процессировать, если желательно. Можно использовать любой известный метод определения величины иммунных ответов (например, образование антител, литические тесты и т.д.), и такие методы хорошо известны специалисту в данной области.
Другой способ позиционирования антигена-мишени (антигенов-мишеней) или других белков, которые должны быть представлены на поверхности дрожжевой клетки, заключается в применении сигнальных последовательностей, таких как гликозилфосфатидилинозитол (СР1), чтобы прикрепить мишень к клеточной стенке дрожжей. Альтернативно позиционирование можно осуществить путем присоединения сигнальных последовательностей, которые направляют антиген(ы) или другие интересующие белки по секреторному пути с помощью транслокации в эндоплазматический ретикулум (ЕК), так что антиген связывается с белком, который соединен с клеточной стенкой (например, сир).
В одном аспекте белок спейсерной ножки представляет собой дрожжевой белок. Дрожжевой белок может включать приблизительно от двух до 800 аминокислот дрожжевого белка. В одном варианте осуществления дрожжевой белок включает приблизительно от 10 до 700 аминокислот. В другом варианте осуществления дрожжевой белок включает приблизительно от 40 до 600 аминокислот. Другие варианты осуществления изобретения охватывают дрожжевой белок, включающий по меньшей мере 250 аминокислот, по меньшей мере 300 аминокислот, по меньшей мере 350 аминокислот, по меньшей мере 400 аминокислот, по меньшей мере 450 аминокислот, по меньшей мере 500 аминокислот, по меньшей мере 550 аминокислот, по меньшей мере 600 аминокислот, или по меньшей мере 650 аминокислот. В одном варианте осуществления длина дрожжевого белка составляет по меньшей мере 450 аминокислот. Другой фактор, который следует учитывать при оптимизации экспрессии антигена, если это требуется, заключается в том, нужно экспрессировать комбинацию антигена и спейсерной ножки в виде мономера, или димера, или тримера или большего числа единиц, соединенных вместе. Такое применение мономеров, димеров, тримеров, и т. д. обеспечивает соответствующее пространственное размещение или фолдинг антигена, при котором часть антигена или даже весь антиген представлены на поверхности дрожжевого носителя, что делает его более иммуногенным.
Применение дрожжевых белков позволяет стабилизировать экспрессию гибридных белков в дрожжевом носителе, предотвратить посттрансляционную модификацию экспрессированного гибридного белка, и/или направить гибридный белок в определенный компартмент в дрожжевых клетках (например, чтобы белок экспрессировался на поверхности дрожжевой клетки). Для доставки в секреторный путь дрожжей типичные дрожжевые белки, которые используют, включают, но без ограничения: Ада (включая, но без ограничения, Ада1 и/или Ада2); продукт гена 8ИС2 (инвертаза дрожжей); сигнальную лидерную последовательность альфа-фактора; продукт гена СРУ; Сир2р для локализации и удержания в клеточной стенке; продукты генов ΒυΌ для локализации в почке дрожжевой стенки во время начальной фазы образования дочерней клетки; Р1о1р; Рп2р; и Рп4р.
Можно использовать другие последовательности для нацеливания белка, удержания и/или стабилизации белка в других частях дрожжевого носителя, например, в цитозоле или в митохондриях или в эндоплазматическом ретикулуме или в ядре. Примеры подходящего дрожжевого белка, который можно использовать для любого из приведенных выше вариантов осуществления включают, но без ограничения продукты генов ТК, АР, §ЕС7;,фосфоенолпируваткарбоксикиназу, кодируемую геном РСК1, фосфоглицерокиназу, кодируемую геном РСК, и триозофосфатизомеразу, кодируемую геном ТР1, для обеспечения экспрессии, репрессируемой в присутствии глюкозы, и цитозольной локализации белка; белки теплового шока, кодируемые генами §§А1, §§А3, §§А4, §§С1, экспрессия которых индуцируется и белки которых более термостабильны при тепловой обработке клеток; митохондриальный белок, кодируемый геном СУС1, для импорта в митохондрии; продукт гена АСТ1.
В изобретении рассматривают способы продуцирования дрожжевых носителей и экспрессирования, комбинирования и/или соединения дрожжевых носителей с антигенами и/или другими белками и/или веществами, представляющими интерес, для получения иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей.
Согласно настоящему изобретению термин комплекс дрожжевой носитель - антиген или комплекс дрожжи - антиген используют в целом для описания любого объединения дрожжевого носителя с антигеном, и его можно использовать взаимозаменяемо с термином иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, если композицию используют, чтобы вызвать иммунный ответ, как описано
- 17 030381 выше. Такое объединение включает экспрессию антигена дрожжами (рекомбинантные дрожжи), введение антигена в дрожжи, физическое прикрепление антигена к дрожжам, и смешивание дрожжей и антигена друг с другом, например в буфере или в другом растворе или в препарате. Указанные типы комплексов подробно описаны ниже.
В одном варианте осуществления дрожжевую клетку, используемую для получения дрожжевого носителя трансфицируют гетерологичной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей белок (например, антиген), так что белок экспрессируется дрожжевой клеткой. Такие дрожжи обозначены в описании как рекомбинантные дрожжи или рекомбинантный дрожжевой носитель. Затем дрожжевую клетку можно поместить внутрь дендритной клетки в виде интактной клетки, или дрожжевую клетку можно убить, или из нее можно получить производные, например, путем создания дрожжевых сферопластов, цитопластов, клеточных теней, или субклеточных частиц, с последующим введением производного в дендритную клетку. Дрожжевые сферопласты также могут быть непосредственно трансфицированы рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты (например, сферопласт получают из целой дрожжевой клетки и затем трансфицируют) для того, чтобы получить рекомбинантный сферопласт, который экспрессирует антиген или другой белок.
В целом дрожжевой носитель и антиген(ы) и/или другие вещества можно объединить с помощью описанных здесь методик. В одном аспекте дрожжевой носитель нагружали внутриклеточно антигеном(ми) и/или веществом(ми). В другом аспекте антиген(ы) и/или вещество(ва) присоединяли ковалентно или нековалентно к дрожжевому носителю. В другом аспекте дрожжевой носитель и антиген(ы) и/или агент(ы) соединяли с помощью смешивания. В другом аспекте и в одном варианте осуществления антиген(ы) и/или вещество(ва) экспрессируются рекомбинантно дрожжевым носителем или дрожжевой клеткой или дрожжевом сферопластом, из которого получали дрожжевой носитель.
Число антигенов и/или других белков, которые могут продуцироваться дрожжевым носителем настоящего изобретения, составляет любое число антигенов и/или других белков, которое может обоснованно продуцироваться дрожжевым носителем, и обычно изменяется в пределах по меньшей мере приблизительно от одного до 6 или больше, включая от 2 до 6 гетерологичных антигенов и/или других белков.
Экспрессия антигена или другого белка в дрожжевом носителе настоящего изобретения осуществляется с применением методик, известных специалистам в данной области. Вкратце, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один целевой мутантный полипептид, встраивают в экспрессионный вектор таким способом, чтобы молекула нуклеиновой кислоты была функционально связана с последовательностью регуляции транскрипции, что дает возможность осуществления конститутивной или регулируемой экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты при трансформации дрожжевой клетки-хозяина. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие один или более антигенов и/или других белков, могут находиться в одном или более векторах экспрессии, функционально связанных с одной или более последовательностями, управляющими экспрессией. Особенно важными последовательностями, управляющими экспрессией, являются последовательности, которые контролируют инициацию транскрипции, такие как промоторная последовательность и активирующие последовательности. Любой подходящий дрожжевой промотор можно использовать в настоящем изобретении, и ряд таких промоторов известен специалисту в данной области. Промоторы экспрессии в ЗассЬаготусек ссгсуыас включают, но без ограничения промоторы генов, кодирующих такие дрожжевые белки как: алкогольдегидрогеназа I (ΛΌΗ1) или II (ΆΌΗ2), СИР1, фосфоглицераткиназа (РОК), триозофосфатизомераза (ТР^, фактор элонгации трансляции ЕР-1 альфа (ТЕР2), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ΟΑΡΌΗ; также обозначаемая как ΊΌΗ3, в случае триозофосфатдегидрогеназы), галактокиназа (ОАЬ1), галактозо-1фосфатуридилтрансфераза (ОАЬ7), υΌΡ-галактозоэпимераза (ОАЬ 10), цитохром с1 (СУС1), белок 8сс7 (8ЕС7) и кислая фосфатаза (ΡΗ05), включая гибридные промоторы, такие как промоторы ΑΌΗ2/ΟΑΡΌΗ и СУС1/ОАР10, и включая промотор ΑΌΗ2/ΟΑΡΌΗ, промотор, который индуцируется при низких значениях глюкозы в клетке (например, приблизительно от 0,1 до 0,2%), а также промотор СиР1 и промотор ТЕР2. Аналогично, известен ряд активирующих последовательностей (υΑδ), также называемых энхансерами. Активирующие последовательности для экспрессии в δ;κΟι;·ιΐΌΐη\·^5 ссгсуыас включают, но без ограничения υΑδ следующих генов, кодирующих соответствующие белки: РСК1, ТРЕ ТЭИ3. СУС1, ΑΌΗ1, ΑΌΗ2, 5^2, ΟΑΣ1, ΟΑΣ7 и ΟΑΣ10, а также другие υΑδ, активируемые продуктом гена ΟΑΣ4, при этом ΑΌΗ2 υΑδ используют в одном аспекте. Поскольку υΑδ ΑΌΗ2 активируется продуктом гена ΑΌΚ1, предпочтительно сверхэкспрессировать ген ΑΌΚ1, если гетерологичный ген функционально связан с υΑδ ΑΌΗ2. Последовательности терминации транскрипции при экспрессии в δассЬа^отусс8 ссгсУ181ас включают терминирующие последовательности генов α-фактора, ΟΑΕΌΗ и СУСЕ
Последовательности регуляции транскрипции для экспрессии генов в метилотрофных дрожжах, включают участки, контролирующие транскрипцию генов, кодирующих алкогольоксидазу и формиатдегидрогеназу.
Трансфекцию молекулы нуклеиновой кислоты в дрожжевую клетку согласно настоящему изобретению можно осуществить любым способом, с помощью которого молекулу нуклеиновой кислоты можно ввести в клетку, и способ включает, но без ограничения диффузию, активный транспорт, обработку
- 18 030381 ультразвуком в ванне, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, адсорбцию и слияние протопластов. Трансфицированные молекулы нуклеиновой кислоты можно интегрировать в хромосому дрожжей или можно поддерживать на внехромосомных векторах с использованием способов, известных специалисту в данной области. Примеры дрожжевых носителей, содержащих такие молекулы нуклеиновой кислоты, подробно раскрываются в описании. Как обсуждалось выше, дрожжевой цитопласт, тень дрожжевой клетки, и частицы мембран дрожжей или препараты клеточной стенки также можно получить рекомбинантно путем трансфекции интактных дрожжевых микроорганизмов или дрожжевых сферопластов желаемыми молекулами нуклеиновой кислоты, продукции клетками антигена, и последующей обработки микроорганизмов или сферопластов с использованием способов, известных специалисту в данной области для получения цитопласта, клеточной тени или субклеточного экстракта мембран дрожжей или его фракций, содержащих желаемые антигены или другие белки.
Эффективные условия получения рекомбинантных дрожжевых носителей и экспрессии антигена и/или другого белка дрожжевым носителем включают эффективную среду, в которой можно культивировать штамм дрожжей. Эффективная среда обычно представляет собой водную среду, содержащую усвояемые углеводы, источники азота и фосфатов, а также подходящие соли, микроэлементы, металлы и другие питательные вещества, такие как витамины и факторы роста. Среда может содержать комплекс питательных веществ или может представлять собой определенную минимальную среду. Дрожжевые штаммы настоящего изобретения можно культивировать в различных емкостях, включая, но без ограничения, биореакторы, колбы Эрленмейера, пробирки, микротитрационные планшеты и чашки Петри. Культивирование осуществляют при значениях температуры, рН и содержания кислорода, подходящих для дрожжевого штамма. Такие условия культивирования хорошо известны специалистам среднего звена в данной области (см., например, СшНпе е! а1. (еб8.), 1991, Мебюбз ίη Еп/уто1оду. уо1. 194, Асабетю Рге88, 8ап ЭГедо).
В некоторых вариантах осуществления изобретения дрожжи выращивают в условиях нейтральных значений рН. В данном контексте общее применение термина нейтральное значение рН относится к диапазону значений рН приблизительно от рН 5,5 до 8, в одном аспекте, приблизительно от рН 6 до 8. Специалисту в данной области понятно, что небольшие колебания (например, на десятые или тысячные доли) могут иметь место при измерении с помощью рН-метра. По существу, использование нейтрального значения рН при выращивании дрожжевых клеток означает, что дрожжевые клетки выращивают при нейтральном рН большую часть времени, когда они находятся в культуре. В одном варианте осуществления дрожжи выращивают в среде, с поддерживаемым уровнем рН по меньшей мере 5,5 (т.е. значению рН культуральной среды не позволяют опуститься ниже значения рН 5,5). В другом аспекте дрожжи выращивают при рН, поддерживаемом приблизительно на уровне 6, 6,5, 7, 7,5 или 8. Применение нейтрального значения рН при культивировании дрожжей способствует развитию некоторых биологических эффектов, которые являются желательными характеристиками при использовании дрожжей в качестве носителей при иммуномодуляции. Например, культивирование дрожжей при нейтральном рН обеспечивает хороший рост дрожжей без негативного воздействия в отношении времени клеточной генерации (например, замедление времени удвоения). Дрожжи могут продолжать расти до достижения высоких значений плотности без потери эластичности клеточной стенки. Применение нейтрального рН обеспечивает получение дрожжей с эластичными клеточными стенками и/или дрожжей, которые более чувствительны к ферментам, разрушающим клеточную стенку (например, к глюканазе) при всех значениях плотности урожая клеток. Указанный признак является желательным, поскольку дрожжи с эластичными клеточными стенками могут индуцировать другие или улучшенные иммунные ответы по сравнению с дрожжами, выращенными в более кислых условиях, например, путем активации секреции цитокинов антигенпрезентирующими клетками, которые фагоцитировали дрожжи (например, цитокины типа ТН1, включая, но без ограничения ШИ-У, интерлейкин-12 (Ш-12), и ГЕ-2, а также провоспалительные цитокины, такие как ΣΕ-6). Вместе с тем, с помощью таких методов культивирования обеспечивается повышенная доступность антигенов, расположенных в клеточной стенке. В другом аспекте применение нейтрального значения рН в случае некоторых антигенов обеспечивает высвобождение антигена, связанного дисульфидными связями, при обработке дитиотреитолом (ЭТТ), что является невозможным, если такие дрожжи, экспрессирующие антиген, культивируют в среде при более низком значении рН (например, рН 5).
В одном варианте осуществления контроль степени гликозилирования дрожжевых клеток используют для контроля экспрессии антигенов дрожжами, в особенности на поверхности клеток. Степень гликозилирования дрожжей может влиять на иммуногенность и антигенные свойства антигена, экспрессированного на поверхности, поскольку сахарные группировки обычно бывают объемными. По существу, наличие сахарных группировок на поверхности дрожжей и их влияние на трехмерное пространство вокруг антигена(ов) следует принимать во внимание при изменении дрожжей согласно изобретению. Можно использовать любой способ, чтобы уменьшить степень гликозилирования дрожжей (или увеличить, если желательно). Например, можно использовать мутантный штамм дрожжей, который выбирают так, чтобы он характеризовался низкой степенью гликозилирования (например, мутанты тпп1, осН1 и тпп9), или можно с помощью мутации удалить акцепторные последовательности, участвующие в гликозилиро- 19 030381 вании антигена-мишени. Альтернативно можно использовать дрожжи со сниженными профилями гликозилирования, например, РюЫа. Также можно использовать методы обработки дрожжей, которые уменьшают или изменяют гликозилирование.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, в качестве альтернативы рекомбинантной экспрессии антигена или белка в дрожжевом носителе, дрожжевой носитель нагружают внутриклеточно белком или пептидом, или углеводами или другими молекулами, которые служат антигеном и/или являются полезными в качестве иммуномодулирующих веществ или модификаторов биологического ответа согласно изобретению. Следовательно, дрожжевой носитель, который теперь содержит антиген и/или другие белки внутриклеточно, можно ввести пациенту или поместить в носитель, такой как дендритная клетка. Пептиды и белки можно вставить непосредственно в дрожжевые носители настоящего изобретения с помощью методик, известных специалисту в данной области, таких как диффузия, активный транспорт, слияние липосом, электропорация, фагоцитоз, циклы замерзания-оттаивания и ультразвуковая ванна. Дрожжевые носители, в которые можно непосредственно поместить пептиды, белки, углеводы или другие молекулы, включают интактные дрожжевые клетки, а также сферопласты, тени клеток или цитопласты, в которые после получения можно поместить антигены и другие вещества. Альтернативно в интактные дрожжевые клетки можно ввести антиген и/или агент, и затем из них можно получить сферопласты, тени клеток, цитопласты, или субклеточные частицы.
Любое число антигенов и/или других веществ можно поместить в дрожжевой носитель в данном варианте осуществления, по меньшей мере от 1, 2, 3, 4 или любого целого числа вплоть до сотен или тысяч антигенов и/или других веществ, в таком количестве, которое обеспечивалось бы, например, загрузкой микроорганизма или его частей.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антиген и/или другое вещество присоединяют физически к дрожжевому носителю. Физическое присоединение антигена и/или другого вещества к дрожжевому носителю можно осуществить любым способом, применимым в данной области, включая методы ковалентного и нековалентного связывания, которые включают, но без ограничения образование химических поперечных связей антигена и/или другого вещества с внешней поверхностью дрожжевого носителя или биологическое связывание антигена и/или другого вещества на внешней мембране дрожжевого носителя, например, с применением антитела или другого связывающего партнера. Образование химических поперечных связей можно осуществить, например, с помощью методов, включающих глутаральдегидное связывание, фотоаффинное мечение, обработку карбодиимидами, обработку реагентами, образующими дисульфидные связи, а также обработки другими стандартными сшивающими реагентами. Альтернативно реагент может контактировать с дрожжевым носителем, изменяя заряд липидного бислоя дрожжевой мембраны или состав клеточной стенки, в результате чего внешняя поверхность дрожжей легче присоединяет или связывает антигены, имеющие определенные зарядные характеристики. Направляющие агенты, такие как антитела, связывающие пептиды, растворимые рецепторы и другие лиганды также могут быть включены в антиген в виде гибридного белка или другим способом связаны с антигеном для связывания антигена с дрожжевым носителем.
Если антиген или другой белок экспрессируется на поверхности дрожжей или физически прикреплен к ней, в одном аспекте спейсерные ножки могут быть тщательно выбраны для оптимизации экспрессии антигена или другого белка или их содержания на поверхности. Размер спейсерной ножки (ножек) может влиять на количество антигена или другого белка, которое представлено для связывания на поверхности дрожжей. Таким образом, в зависимости от того, какой антиген(ы) или другой белок(белки) используются, специалист в данной области будет выбирать спейсерную ножку, которая обеспечит соответствующее расположение антигена или другого белка на поверхности дрожжей. В одном варианте осуществления спейсерная ножка представляет собой дрожжевой белок, состоящий по меньшей мере из 450 аминокислот. Спейсерные ножки подробно обсуждались выше.
В другом варианте осуществления дрожжевой носитель и антиген или другой белок соединяют друг с другом с помощью более пассивного, неспецифического или нековалентного механизма связывания, например, с помощью осторожного смешивания дрожжевого носителя и антигена или другого белка друг с другом в буфере или в другом подходящем препарате (например, в смеси).
В одном варианте осуществления изобретения дрожжевой носитель и антиген или другой белок помещают внутриклеточно в носитель, такой как дендритная клетка или макрофаг для создания терапевтической композиции или вакцины настоящего изобретения. Альтернативно антиген или другой белок можно поместить в дендритную клетку в отсутствие дрожжевого носителя.
В одном варианте осуществления интактные дрожжи (с экспрессией гетерологичных антигенов или других белков или без нее) можно измельчить или обработать каким-либо способом для получения препаратов клеточной стенки дрожжей, частиц дрожжевых мембран или фрагментов дрожжей (т.е. не интактных), и в некоторых вариантах осуществления фрагменты дрожжей можно предоставить или ввести вместе с другими композициями, которые включают антигены (например, ДНК-вакцины, вакцины на основе белковых субъединиц, убитых или инактивированных патогенов), для усиления иммунных ответов. Например, обработку ферментами, химическую обработку или физическую силу (например, механическое разделение или обработку ультразвуком) можно использовать для разрушения дрожжевой
- 20 030381 клетки на фрагменты, которые используют в качестве адъюванта.
В одном варианте осуществления изобретения дрожжевые носители, применяемые в изобретении, включают дрожжевые носители, которые были убиты или инактивированы. Лизис или инактивацию дрожжей можно осуществить с помощью любого из многочисленных подходящих методов, известных в данной области. Например, инактивация нагреванием является стандартным способом инактивации дрожжей, и специалист в данной области может контролировать структурные изменения целевого антигена, если желательно, с помощью стандартных способов, известных в данной области. Альтернативно можно использовать другие способы инактивации дрожжей, например, химический, электрический, радиоактивный способы или способ УФ-инактивации. См., например, способы, раскрытые в стандартных руководствах по культивированию дрожжей, например в МсФоЕ о£ Еп/уто1оду. Уо1. 194, Со1й 8ргтд НагЬог РиЫЫнпд (1990). При использовании любой из стратегий инактивации следует учитывать вторичную, третичную или четвертичную структуру целевого антигена и сохранять такую структуру, чтобы оптимизировать его иммуногенность.
Дрожжевые носители могут быть включены в иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей или в продукты настоящего изобретения, включая препараты, которые вводят непосредственно пациенту или вначале помещают в носитель, такой как дендритная клетка, с использованием ряда методик, известных специалисту в данной области. Например, дрожжевые носители можно высушить с помощью лиофилизации. Препараты, содержащие дрожжевые носители, также могут быть изготовлены с помощью упаковки дрожжей в виде плитки или таблетки, как это делают в случае дрожжей, используемых в процессах хлебопечения или пивоварения. Кроме того, дрожжевые носители можно смешать с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, таким как изотонический буфер, который подходит для организма-хозяина или клетки-хозяина. Примеры таких вспомогательных веществ включают воду, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, раствор Хэнкса и другие водные физиологически сбалансированные солевые растворы. Также можно использовать неводные носители, такие как нелетучие масла, кунжутное масло, этилолеат или триглицериды. Другие полезные препараты включают суспензии, содержащие вещества, увеличивающие вязкость, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, сорбит, глицерин или декстран. Вспомогательные вещества также могут содержать в незначительных количествах добавки, такие как вещества, которые увеличивают изотоничность и химическую стабильность. Примеры буферов включают фосфатный буфер, бикарбонат буфер и Трис-буфер, кроме того примеры консервантов включают тимеросал, м- или о-крезол, формалин и бензиловый спирт. Стандартные препараты могут представлять собой либо жидкие препараты для инъекций либо твердые вещества, которые принимать в подходящей жидкости в виде суспензии или раствора для инъекции. Таким образом, в нежидком препарате, вспомогательное вещество может включать, например, декстрозу, человеческий сывороточный альбумин, и/или консерванты, к которому можно добавить перед стерильную воду или физиологический раствор перед введением.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция может включать дополнительные вещества, которые также можно обозначить как соединения, модифицирующие биологический ответ, или обладающие способностью продуцировать такие вещества/модификаторы. Например, дрожжевой носитель можно трансфицировать или нагрузить по меньшей мере одним антигеном и по меньшей мере одним веществом/соединением, модифицирующим биологический ответ, или композицию изобретения можно ввести совместно по меньшей мере с одним веществом/модификатором биологического ответа. Модификаторы биологического ответа включают адъюванты и другие соединения, которые могут модулировать иммунные ответы, которые также могут быть обозначены как иммуномодуляторные соединения, а также соединения, которые изменяют биологическую активность другого соединения или агента, например, иммунотерапевтического препарата на основе дрожжей, указанная биологическая активность не ограничивается эффектами иммунной системы. Определенные иммуномодуляторные соединения могут стимулировать протективный иммунный ответ, тогда как другие соединения могут подавлять неблагоприятный иммунный ответ, и является ли иммуномодулятор полезным в комбинации с определенным иммунотерапевтическим препаратом на основе дрожжей, может зависеть, по меньшей мере отчасти, от стадии заболевания или состояния, которое лечат или предотвращают, и/или от пациента, который получает лечение. Определенные модификаторы биологического ответа предпочтительно усиливают клеточно-опосредованный иммунный ответ, тогда как другие модификаторы предпочтительно усиливают гуморальный иммунный ответ (т.е. могут стимулировать иммунный ответ, при котором наблюдается повышенный уровень клеточно-опосредованного иммунитета, по сравнению с гуморальным иммунитетом, или наоборот). Определенные модификаторы биологического ответа обладают одним или более свойствами наряду с биологическими свойствами иммунотерапевтических препаратов на основе дрожжей, которые усиливают или дополняют биологические свойства иммунотерапевтических препаратов на основе дрожжей. Существует ряд способов, известных специалисту в данной области, позволяющих оценить стимуляцию или супрессию иммунных ответов, а также отличить клеточноопосредованные иммунные ответы от гуморальных иммунных ответов, и отличить один тип клеточноопосредованного ответа от другого (например, ТН17-ответ и ТН1-ответ).
Вещества/модификаторы биологического ответа, используемые в изобретении, могут включать, но
- 21 030381 без ограничения цитокины, хемокины, гормоны, производные липидов, пептиды, белки, полисахариды, низкомолекулярные лекарственные препараты, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты (включая, но без ограничения антицитокиновые антитела, антитела против рецепторов цитокинов, антихемокиновые антитела), витамины, полинуклеотиды, вещества, связывающие нуклеиновые кислоты, аптамеры и модификаторы роста. Некоторые подходящие вещества включают, но без ограничения, ГЬ-1 или агонисты ГЬ-1 или ГЬ-1К, анти-ГЬ-1 или антагонисты ГЬ-1; ГЬ-6 или агонисты ГЬ-6 или ГЬ-6К, анти-ГЬ-6 или другие антагонисты ГЬ-6; ГЬ-12 или агонисты ГЬ-12 или ГЬ-12К, анти-ГЬ-12 или другие антагонисты ГЬ12; ГЬ-17 или агонисты ГЬ-17 или ГЬ-17К, анти-ГЬ-17 или другие антагонисты ГЬ-17; ГЬ-21 или агонисты ГЬ-21 или ГЬ-21К, анти-ГЬ-21 или другие антагонисты ГЬ-21; ГЬ-22 или агонисты ГЬ-22 или ГЬ-22К, антиГЬ-22 или другие антагонисты ГЬ-22; ГЬ-23 или агонисты ГЬ-23 или ГЬ-23К, анти-ГЬ-23 или другие антагонисты ГЬ-23; ГЬ-25 или агонисты ГЬ-25 или ГЬ-25К, анти-ГЬ-25 или другие антагонисты ГЬ-25; ГЬ-27 или агонисты ГЬ-27 или ГЬ-27К, анти-ГЬ-27 или другие антагонисты ГЬ-27; интерферон I типа (включая ΙΡΝа) или агонисты или антагонисты интерферона I типа или его рецептора; интерферон II типа (включая ΙΡΝ-γ) или агонисты или антагонисты интерферона II типа или его рецептора; анти-СО40, СО40Ь, антитело анти-СТЬА-4 (например, для высвобождения анергических Т-клеток); Т-клеточные костимуляторы (например, анти-СО137, анти-СО28, анти-СЭ40); алемтузумаб (например, СатРаГЬ®), денилейкин дифтитокс (например, ΘΝΓΆΚ®); анти-СЭ4; анти-СЭ25; анти-РО-1, анти-РО-Ь1, анти-РО-Ь2; вещества, которые блокируют РОХР3 (например, для отмены активации/уничтожения СЭ4+/СЭ25+ Т-регуляторных клеток); лиганд Р1!3, имиквимод (А1бага(™)), гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор (СМ-С8Р); гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Р), сарграмостим (Ьеикше®); гормоны, включая, но без ограничения пролактин и гормон роста; агонисты То11-подобного рецептора (ТЬК), включая, но без ограничения агонисты ТЬК-2, агонисты ТЬК-4, агонисты ТЬК-7, и агонисты ТЬК-9; антагонисты ТЬК, включая, но без ограничения антагонисты ТЬК-2, антагонисты ТЬК-4, антагонисты ТЬК-7, и антагонисты ТЬК-9; противовоспалительные средства и иммуномодуляторы, включая, но без ограничения ингибиторы СОХ-2 (например, Се1есохЛ, ЖАЮ8), глюкокортикоиды, статины и талидомид и его аналоги, включая ГМГО™ (которые являются структурными и функциональными аналогами талидомида (например, КЕУЫМГО® (леналидомид), АСТIМI^®(помалидомид)); средства, вызывающее воспаление, такие как фунгальные или бактериальные компоненты или любой провоспалительный цитокин или хемокин; иммунотерапевтические вакцины, включая, но без ограничения вирусные вакцины, бактериальные вакцины, или вакцины на основе антител; и любые другие иммуномодуляторы, иммуностимуляторы, антивоспалительные вещества, и/или провоспалительные вещества. Любая комбинация таких веществ предусматривается в изобретении, и любое из указанных веществ в сочетании или введении в протокол с иммунотерапевтическим препаратом на основе дрожжей (например, одновременно, последовательно, или в других форматах), является композицией, включенной в изобретение. Такие вещества хорошо известны в данной области. Указанные вещества можно использовать отдельно или в комбинации с другими веществами, описанными здесь.
Вещества могут включать агонисты и антагонисты данного белка или его пептид или домен. В данном контексте агонист представляет собой любое соединение или вещество, включая без ограничения небольшие молекулы, белки, пептиды, антитела, вещества, связывающие нуклеиновые кислоты, и т.д., которое связывается с рецептором или лигандом и осуществляет или запускает ответ, которое может включать вещества, которые имитируют действие вещества, встречающегося в природе, которое связывается с рецептором или лигандом. Антагонист представляет собой любое соединение или вещество, включая без ограничения небольшие молекулы, белки, пептиды, антитела, вещества, связывающие нуклеиновые кислоты, и т.д., которое блокирует или ингибирует или уменьшает действие агониста.
Композиции по изобретению также могут включать или могут вводиться (одновременно, последовательно или периодически) вместе с любыми другими соединениями или композициями, которые полезны для предотвращения или лечения инфекции НОУ или с любыми другими соединениями, которые лечат или уменьшают любой симптом инфекции НОУ. Такие препараты включают, но без ограничения низкомолекулярные лекарственные вещества против НОАд, или интерфероны, такие как интерферона2а или пегилированный интерферон-а2а (РЕСА8У8®). Кроме того, композиции по изобретению можно использовать вместе с другими иммунотерапевтическими композициями, включая профилактическую и/или терапевтическую иммунотерапию. Хотя иммунотерапевтические композиции не одобрены в США для лечения НОУ, такие композиции могут включать вакцины на основе белка или субъединицы эпитопа НОУ, вакцины на основе вирусных векторов НОУ, цитокины, и/или другие иммуномодуляторные вещества (например, агонисты ТЬК, иммуномодуляторные препараты).
Изобретение также включает набор, содержащий любую композицию, описанную здесь, или любой отдельный компонент композиций, описанных здесь.
Способы введения или использования композиций изобретения.
Композиции по изобретению, которые могут включать одну или более (например, комбинации двух, трех, четырех, пяти или более) иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей, описанных здесь, антигены НОУ, включая белки НОУ и гибридные белки, и/или рекомбинантные молекулы
- 22 030381 нуклеиновой кислоты, кодирующие такие белки ΗΌν или гибридные белки, описанные выше, и другие композиции, содержащие такие композиции на основе дрожжей, антигены, белки, гибридные белки, или рекомбинантные молекулы, описанные здесь, можно использовать в различных методах ш У1уо и ш уйго, включая, но без ограничения лечение и/или предотвращение инфекции ΗΌν и ее осложнений, диагностические тесты ΗΌν, или получение антител против ΗΌν.
Инфекцию ΗΌν выявляют чаще всего путем измерения РНК ΗΌν, выявления антигена ΗΌν (ГОАд). и/или обнаружения анти-ΗΌν (антител против ΗΌν). Измерение РНК ΗΌν можно осуществить, например, с помощью тестов на основе гибридизации нуклеотидных последовательностей (которые могут включать гибридизацию ш 5Йи) или на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (КТ-РСК). КТ-РСК является наиболее чувствительным из таких тестов, и позволяет обнаружить 10 геномов/мл. Сывороточный ЬОАд или анти-ΗΌν 1дМ или 1дС обычно выявляют с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫЗА) или радиоиммуноанализа (КГА), и ЬОАд также можно выявить с помощью иммунофлуоресценции или иммуногистохимического окрашивания образцов биопсии печени. Поскольку инфекция ΗΒν необходима для инфекции ΗΌν, присутствие поверхностного антигена ΗΒν (ΗΒ5Αд) обычно предшествует выявлению ΗΌν.
Острая ΗΌν коинфекция (ΗΌν/ΗΒν) характеризуется высокими титрами 1дМ анти-ΗΒс (антитела против ядерного антигена ΗΒν), которые являются антителами, которые исчезают при хронической инфекции ΗΒν. ЬОАд также является ранним маркером острой инфекции ΗΌν (как при коинфекции, так и при суперинфекции). Антитела анти-ΗΌ являются более поздними маркерами, но также могут быть использованы для постановки диагноза, если ранние маркеры уже не представлены, и являются индикатором прогрессирования хронической инфекции. При хронической инфекции ΗΌν образуются иммунные комплексы между ЬОАд и анти-ΗΌ, представленными в высоких титрах. На данной стадии сложно обнаружить ЬОАд в печени, но обычно можно выявить РНК ΗΌν в сыворотке, и высокий титр анти-ΗΌ является главным биомаркером, используемым при постановке диагноза хронической инфекции ΗΌν.
Считается, что произошла элиминация вируса ΗΌν, если значения РНК ΗΌν в сыворотке и ЬОАд в печени устойчиво не определяются (Ра5саге11а е! а1., выше), хотя излечение считают полным только при условии одновременного или последующего клиренса ΗΒ5Αд (поверхностный антиген ΗΒν). Считают, что образование антител анти-ΗΌ защищает против реинфекции ΗΌν, и клиренс вируса обычно характеризуется нормализацией уровней АЬТ, уменьшение некротического воспаление печени, и остановка прогрессирования фиброза печени.
Один вариант осуществления изобретения относится к способу лечения хронической инфекции, вызываемой вирусом гепатита Ό (ΗΌν), и/или для предотвращения, уменьшения или лечения по меньшей мере одного симптома хронической инфекции ΗΌν у пациента или популяции пациентов. Способ включает стадию введения пациенту или популяции пациентов, которые хронически инфицированы ΗΌν, одной или более иммунотерапевтических композиций изобретения. В одном аспекте композиция представляет собой иммунотерапевтическую композицию, включающую один или более антигенов ΗΌν, как описано здесь, которая может содержать одну или более иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей. В одном аспекте композиция включает белок или гибридный белок, содержащий антигены ΗΌν, как описано здесь, и/или рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую такой белок или гибридный белок. В одном аспекте пациента или популяцию пациентов дополнительно лечат по меньшей мере одним другим терапевтическим соединением, используемым для лечения инфекции ΗΌν, например, интерфероном I типа (например, ΙΡΝ-α).
В указанном варианте осуществления изобретения пациент, которого лечат, страдающий хронической инфекцией ΗΌν, также инфицирован вирусом гепатита Β (ΗΒν). Поэтому, другой аспект указанного способа изобретения относится к одновременному или последовательному (до или после) лечению пациента по поводу инфекции ΗΒν. Известно много препаратов, которые полезны для предотвращения и/или лечения или ослабления инфекции ΗΒν. Такие препараты включают, но без ограничения противовирусные соединения, включая, но без ограничения нуклеотидный аналог ингибитора обратной транскриптазы (пКТ15). В одном аспекте изобретения подходящие противовирусные соединения включают, но без ограничения: тенофовир (УГКЕАО®), ламивудин (ЕР1У1К®), адефовир (ЫЕРЗЕКА®), телбивудин (ТУ2ЕКА®), энтекавир ^АКАСЬНОЕ®), и их комбинации, и/или интерфероны, такие как интерферона2а или пегилированный интерферон-а2а (РЕСАЗУЗ®) или интерферон-λ. При лечении ΗΒν указанные препараты обычно вводят в течение длительных периодов времени (например, ежедневно или еженедельно в течение от одного года до пяти лет или больше).
Кроме того, другие композиции для лечения ΗΒν можно совмещать с композициями изобретения для лечения ΗΌν, например, различные профилактические и/или иммунотерапевтические композиции для лечения ΗΒν. Профилактические вакцины против ΗΒν коммерчески доступны с начала 1980-х гг., и они не являются инфекционными, вакцины на основе вирусных субъединиц, содержащие очищенный поверхностный антиген рекомбинантного вируса гепатита Β (ΗΒ5Αд), и их можно вводить, начиная с рождения. В настоящее время не существует одобренных терапевтических вакцин против ΗΒν.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу иммунизации пациента или попу- 23 030381 ляции пациентов против ΗΌν для предотвращения инфекции ΗΌν, предотвращения хронической инфекции ΗΌν, и/или уменьшения тяжести инфекции ΗΌν у пациента или популяции пациентов. Способ включает стадию введения пациенту или популяции пациентов, которые не инфицированы ΗΌν (или считаются не инфицированными ΗΌν), композиции по изобретению. В одном аспекте композиция представляет собой иммунотерапевтическую композицию, содержащую один или более антигенов ΗΌν, как описано здесь, включая одну или более иммунотерапевтических композиций на основе дрожжей. В одном аспекте композиция включает гибридный белок, содержащий антигены ΗΌν как описано здесь, или рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую такой гибридный белок.
В одном аспекте этого варианта осуществления изобретения пациент или популяция, которых иммунизируют против инфекции ΗΌν с применением композиции по изобретению, уже хронически инфицированы ΗВV. В данном аспекте изобретения пациент, который уже хронически инфицирован ΗВV, может быть пациентом с впервые выявленным ΗВV, с выявленной, но нелеченой инфекцией ΗВV, независимо от времени, когда был диагностирован ΗВV, или может быть пациентом, получающим лечение по поводу хронической инфекции ΗВV, и может включать пациентов, которые получали лечение по поводу инфекции ΗВV в течение продолжительного периода времени (например, года). Такие пациенты также могут включать пациентов, которые ранее получали лечение по поводу ΗВV и в настоящее время считаются излеченными от инфекции ΗВV. ΗΌν-иммунотерапевтическую композицию изобретения также можно использовать для иммунизации пациентов или популяции пациентов, которые могут иметь повышенный риск ΗВV и ΗΌν независимо от статуса инфекции ΗВV (например, пациенты могут быть иммунизированы, даже если являются ΗВV-негативными, или если статус ΗВV пациента неизвестен), например, вследствие присутствия в части мира, где ΗΌν является эндемическим или очень распространенным заболеванием. Пациенты или популяции пациентов с повышенным риском заражения инфекцией ΗВV по сравнению с общей популяцией (например, вследствие местонахождения, профессии, и/или рискованных процедур, ассоциированных с передачей ΗВV) также могут быть иммунизированы против ΗΌν (одновременно), в особенности, если указанные пациенты находятся в регионе, где ΗΌν является эндемичным или распространенным.
В данном контексте термин лечить инфекцию ΗΌν, или любое его изменение (например, получающий лечение по поводу инфекции ΗΌν и т.д.) обычно относится к применению или введению композиции по изобретению после того, как проявилась инфекция (острая или хроническая), с целью уменьшения или устранения определяемого вирусного титра (например, снижение количества вирусной РНК), уменьшения по меньшей мере одного симптома, обусловленного инфекцией, у пациента, замедления или предотвращения начала болезни и/или тяжести симптомов и/или последующих осложнений, вызванных инфекцией, уменьшения повреждения органа или физиологической системы (например, цирроза), обусловленного инфекцией (например, снижение аномальных уровней АЬТ, уменьшение воспаления печени, снижение фиброза печени), предотвращения и/или уменьшения частоты возникновения и распространенности гепатоцеллюлярной карциномы (ЯСС), улучшения функции органа или системы, находящихся под негативным влиянием инфекции (нормализация сывороточных уровней АЬТ, положительная динамика воспаления печени и фиброза печени), улучшения иммунных ответов против инфекции, улучшения иммунных ответов на основе иммунологической памяти против инфекции, снижения реактивации вируса ΗΌν, улучшения общего состояния здоровья пациента или популяции пациентов, и/или улучшения общей выживаемости пациента или популяции пациентов. Все указанные параметры представлены в сравнении со статусом пациента или популяции пациентов в условиях отсутствия применения ΗΌν-иммунотерапевтических композиций изобретения.
В одном аспекте целью лечения является достижение устойчивого клиренса вируса в течение по меньшей мере 6 месяцев после завершения терапии. В одном аспекте целью лечения является отсутствие детектируемых уровней РНК ΗΌν в сыворотке и ЫОАд в печени, с последующим клиренсом МВхАд (поверхностный антиген ΗВV), которого можно достичь, если лечение соответствующей инфекции ΗВV проводят одновременно или последовательно с лечением ΗΌν, описанным здесь, например, с помощью одновременного или последовательного введения противовирусных лекарств для ΗВV, или других видов терапии ΗВV, включая, но без ограничения интерфероны, ΗВV-иммунотерапевтические средства, или другие терапевтические препараты ΗВV. В одном аспекте целью лечения является образование антител (сероконверсия) против ЫОАд (анти-ΗΌ). Сероконверсию можно выявить с помощью радиоиммунного анализа, иммуноферментного анализа. Дополнительные результаты успешного лечения инфекции ΗΌν включают нормализацию уровней АЬТ, уменьшение некротического воспаления печени и прекращение прогрессирования фиброза печени.
Термин предотвратить инфекцию ΗΌν или любое его изменение (например, предотвращение инфекции ΗΌν и т.д.) обычно относится к применению или введению композиции по изобретению до того, как произошло инфицирование ΗΌν, с целью предотвращения инфекции ΗΌν, предотвращения хронической инфекции ΗΌν (т.е. предоставление возможности пациенту для устранения острой инфекции ΗΌν без дальнейшего вмешательства) или, по меньшей мере, уменьшения тяжести, и/или продолжительности инфекции и/или физиологического повреждения, вызванного хронической инфекцией, включая улучшение выживаемости у пациента или популяции пациентов, у которых инфекция может
- 24 030381 возникнуть позже. В одном аспекте настоящее изобретение можно использовать для предотвращения хронической инфекции ΗΌν, например, путем введения пациенту с острой инфекцией ΗΌν композиции по изобретению для устранения инфекции и предотвращения развития хронической инфекции. В одном аспекте настоящее изобретение используют для предотвращения или уменьшения наличия или тяжести инфекции ΗΌν у пациента, хронически инфицированного НВУ, даже если сама инфекция НВУ не излечена.
Настоящее изобретение включает доставку (введение, иммунизацию) одной или более иммунотерапевтических композиций изобретения, включая ΗΌν-иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей, пациенту. Процесс введения может проводиться ех νΐνο или ίη νΐνο, но обычно осуществляется ίη νΐνο. Введение ех νΐνο относится к осуществлению части регуляторной стадии вне организма пациента, например, введение композиции настоящего изобретения популяции клеток (дендритных клеток), полученных от пациента в таких условиях, что дрожжевой носитель, антиген(ы) и любые другие вещества или композиции помещают в клетку, и возвращение клеток в организм пациента. Терапевтическая композиция настоящего изобретения может быть дана пациенту или введена пациенту любым подходящим способом введения.
Введение композиции может быть системным, мукозальным и/или проксимальным по отношению к расположению целевого участка (например, рядом с участком инфекции). Подходящие пути введения будут очевидны специалистам в данной области в зависимости от типа состояния, которое нужно предотвратить или вылечить, используемого антигена, и/или намеченной клеточной популяции или ткани. Различные подходящие способы введения включают, но без ограничения внутривенное введение, интраперитонеальное введение, внутримышечное введение, интранодальное введение, внутрикоронарное введение, внутриартериальное введение (например, в сонную артерию), подкожное введение, трансдермальное введение, внутритрахеальное введение, внутрисуставное введение, внутрижелудочковое введение, ингаляция (например, аэрозоль), интракраниальное, интраспинальное, внутриглазное, ауральное, интраназальное, пероральное, легочное введение, пропитывание катетера, и прямую инъекцию в ткань. В одном аспекте пути введения включают: внутривенный, интраперитонеальный, подкожный, интрадермальный, интранодальный, внутримышечный, трансдермальный, ингаляционный, интраназальный, пероральный, внутриглазной, внутрисуставной, внутричерепной и интраспинальный. Парентеральное введение может включать интрадермальный, внутримышечный, интраперитонеальный, интраплевральный, внутрилегочный, внутривенный, подкожный пути и введение через артериальный или венозный катетер. Ауральное введение может включать ушные капли, интраназальное введение может включать назальные капли или интраназальную инъекцию, и внутриглазное введение может включать глазные капли. Аэрозольное (ингаляционное) введение также может быть осуществлено с помощью методов, стандартных для данной области (см., например, 81пЬ1тд е! а1., Ргос. №И1. Асай. δα. υδΛ 189: 11277-11281, 1992). Другие пути введения, с помощью которых модулируют иммунные свойства слизистых оболочек, могут быть полезны при лечении вирусных инфекций. Такие пути включают бронхиальный, внутрикожный, внутримышечный, интраназальный, другой ингаляционный, ректальный, подкожный, топический, трансдермальный, вагинальный и уретральный пути. В одном аспекте иммунотерапевтическую композицию изобретения вводят подкожно.
Что касается иммунотерапевтических композиций изобретения на основе дрожжей, обычно, подходящая разовая доза соответствует дозе, которая обеспечивает эффективное поступление дрожжевого носителя в данный тип клетки, ткани или области организма пациента в количестве, эффективно индуцирующем антиген-специфический иммунный ответ против одного или более антигенов ΗΌν или эпитопов, при введении один или более раз в течение подходящего периода времени. Например, в одном варианте осуществления разовая доза дрожжевого носителя настоящего изобретения составляет приблизительно от 1х105 до 5х107 эквивалентов дрожжевых клеток на килограмм массы тела организма, которому нужно ввести композицию. В одном аспекте разовая доза дрожжевого носителя настоящего изобретения составляет приблизительно от 0,1 Υ.υ. (1х106 клеток) до 100 Υ.υ. (1х109 клеток) на дозу (т.е. на организм), включая любую промежуточную дозу с шагом, 0,1х106 клеток (т.е. 1,1х106, 1,2х106, 1,3х106). В одном варианте осуществления дозировки включают дозы от 1 до 40 Υ.υ., от 1 до 50 Υ.υ., дозы от 1 до 60 Υ.υ., от 1 до 70 Υ.υ. или дозы от 1 до 80 Υ.υ. и в одном аспекте от 10 до 40, 50, 60, 70 или 80 Υ.υ. В одном варианте осуществления дозы вводят в различные участки тела пациента, но во время одного и того же периода дозирования. Например, дозу 40 Υ.υ. можно ввести с помощью инъекций доз 10 Υ.υ. в четыре различных участка тела пациента во время одного периода дозирования, или дозу 20 Υ.υ. можно ввести с помощью инъекций 5 доз Υ.υ. в четыре различных участка тела пациента, или с помощью инъекций 10 доз Υ.υ. в два различных участка тела пациента, во время одного и того же периода дозирования. Изобретение включает введение количества иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20 Υ.υ. или больше) в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, или больше различных участков тела пациента при формировании разовой дозы.
Ревакцинирующие дозы или бустерные дозы терапевтической композиции вводят, например, если иммунный ответ против антигена уменьшился, или по мере необходимости для обеспечения им- 25 030381 мунного ответа или для индукции вторичного иммунного ответа против определенного антигена или антигенов. Бустерные дозы можно вводить приблизительно с интервалом от 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 недель, до одного раза в месяц, в два месяца, в три месяца, одного раза в год, в несколько лет после исходного введения. В одном варианте осуществления график введения представляет собой график, по которому приблизительно от 1х105 до 5х107 эквивалентов дрожжевых клеток композиции на килограмм массы тела организма вводят по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или большее число раз в течение периода времени продолжительностью от недель до месяцев или лет. В одном варианте осуществления дозы вводят еженедельно для обеспечения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доз, с последующим ежемесячным введением доз по необходимости для достижения желаемого ингибирования или удаления вируса ΗΌν. Например, дозы можно вводить до достижения у пациента сероконверсии, до устойчивого исчезновения детектируемых титров РНК ΗΌν, до отсутствия ИОАд в печени, до достижения недетектируемых значений ΗΒδАд ΗΒν, и/или до нормализиции уровней АЬТ. В одном варианте осуществления дозы вводят по 4-недельному протоколу (каждые 4 недели, или в день 1, неделю 4, неделю 8, неделю 12 и т.д., для предоставления от 2 до 10 доз или больше, как определяет врач). Дополнительные дозы можно вводить даже после достижения у пациента сероконверсии, если желательно, хотя введение доз может и не быть необходимым.
ΗΌν-иммунотерапевтические композиции по изобретению, включая ΗΌν-иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей, можно вводить с одним или более дополнительным терапевтическим или профилактическим средством. Такие терапевтические или профилактические средства могут включать средства, которые полезны для предотвращения и/или лечения ΗΌν, и дополнительно могут включать средства, полезны для предотвращения и/или лечения ΗΒν. В одном аспекте изобретения одно или более дополнительные терапевтические или профилактические средства вводят последовательно с иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей. В другом варианте осуществления одно или более дополнительные терапевтические или профилактические средства вводят перед введением иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей. В другом варианте осуществления одно или более дополнительные терапевтические или профилактические средства вводят после введения ΗΌνиммунотерапевтической композиции на основе дрожжей. В одном варианте осуществления одно или более дополнительные терапевтические или профилактические средства вводят в чередующихся дозах с иммунотерапевтической композицией на основе дрожжей, или по протоколу, в котором дрожжевую композицию ΗΌν вводят в предписанные интервалы между введением или с введением одной или более последовательных доз дополнительного препарата или наоборот. В одном варианте осуществления ΗΌν-иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей вводят в одной или более дозах в течение некоторого периода времени перед началом введения дополнительных средств. Другими словами, ΗΌν-иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей вводят в виде монотерапии в течение определенного периода времени, и затем добавляют введение терапевтического или профилактического средства, либо одновременно с новыми дозами ΗΌν-иммунотерапии на основе дрожжей, либо попеременно с иммунотерапией на основе дрожжей. Альтернативно средство можно вводить в течение некоторого периода времени, предшествующего началу введения ΗΌν-иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей.
В одном варианте осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство, которое используют в сочетании с ΗΌν-иммунотерапевтической композицией изобретения на основе дрожжей, представляет собой интерферон. В одном аспекте интерферон представляет собой интерферон-α, и в одном аспекте интерферон-а2Ь (вводимый с помощью подкожной инъекции 3 раза в неделю); или пегилированный интерферон-а2а (например РЕСА8У8). В данном контексте термин интерферон относится к цитокину, который обычно продуцируется клетками иммуннной системы и широким спектром клеток в ответ на присутствие двухцепочечный РНК. Интерфероны способствуют иммунному ответу путем ингибирования вирусной репликации в клетках хозяина, активации естественных киллеров и макрофагов, увеличения антигенной презентации лимфоцитам, и индуцирования резистентности клеток хозяина к вирусной инфекции. Интерфероны I типа включают интерферон-α. Интерфероны III типа включают интерферон-λ. Интерфероны, используемые в способах настоящего изобретения включают любой интерферон типа I или типа III, включая интерферон-α, интерферон-а2, и в одном аспекте, пролонгированные формы интерферона, включая, но без ограничения, пегилированные интерфероны, гибридные белки интерферона (интерферон, слитый с альбумином), и препараты с контролируемым высвобождением, содержащие интерферон (например, интерферон в микросферах или интерферон с наночастицами, содержащими полиаминокислоты). Один интерферон, РЕСА8У8®, пегилированный интерферон-а2а, представляет собой ковалентный конъюгат рекомбинантного интерферона-а2а (приблизительный молекулярный вес [ΜΨ] 20000 Дальтон (Да)) с отдельной разветвленной цепью бисмонометоксиполиэтиленгликоля (РЕС) (приблизительный ΜXV 40000 Да). Молекулу РЕС связывают с одним участком молекулы интерферона-α посредством стабильной амидной связи с лизином. Пегилированный интерферон-а2а имеет приблизительный молекулярный вес 60000 Да.
При лечении ΗΌν интерферон обычно вводят с помощью внутримышечной или подкожной инъек- 26 030381 ции, и обычно вводят в высокой дозе в течение продолжительного периода времени. В одном варианте осуществления стандартный ШИ-а вводят приблизительно в дозе 9 миллионов единиц три раза в неделю или 5 миллионов единиц ежедневно в течение 12 месяцев, и срок введения может быть продлен, если НВ8Ад не устранен. Пегилированный ШН-а можно вводить еженедельно в дозе от 3 до 10 миллионов единиц, при этом доза 3 миллиона единиц является предпочтительной в одном варианте осуществления, и более высокие дозы являются предпочтительными в других вариантах осуществления (например, 4 миллиона единиц, 5 миллионов единиц, 6 миллионов единиц, 7 миллионов единиц, 8 миллионов единиц, 9 миллионов единиц, или 10 миллионов единиц. В целом дозы интерферона вводят по стандартному графику, согласно которому число введений может варьировать от 1, 2, 3, 4, 5, или 6 раз в неделю, до одного раза в неделю, одного раза в две недели, одного раза в три недели, или в месяц, и зависит от типа вводимого интерферона, его переносимости пациентом, и регрессии инфекции. Типичная доза интерферона, который имеется в настоящее время, предоставляется еженедельно (пегилированный ШМ-а), что является предпочтительным режимом дозирования интерферона, согласно настоящему изобретению.
В одном аспекте изобретения, когда начинают курс лечения интерфероном, то вводят дополнительные дозы иммунотерапевтической композиции по изобретению на протяжении того же самого периода времени, или в течение, по меньшей мере, части указанного времени, и могут продолжать введение после окончания курса лечения интерфероном. Однако режим дозирования иммунотерапии в течение всего периода может быть и предполагается, что обычно будет другим, чем для интерферона. Например, иммунотерапевтическую композицию можно вводить в те же дни или по меньшей мере через 3-4 дня после последней введенной (самой последней) дозы интерферона (или любое подходящее количество дней после введения последней дозы), и можно вводить ежедневно, еженедельно, один раз в две недели, раз в месяц, раз в два месяца, или каждые 3-6 месяца, или с более продолжительными интервалами, которые устанавливает врач. Во время начального периода монотерапии, что касается введения иммунотерапевтической композиции, если ее используют, то иммунотерапевтическую композицию предпочтительно вводят еженедельно в течение от 4 до 12 недель, с последующим ежемесячным введением (независимо от того, когда интерферон дополнительно добавляют в протокол). В одном аспекте иммунотерапевтическую композицию вводят еженедельно в течение четырех или пяти недель, с последующим ежемесячным введением в дальнейшем, до завершения полного протокола лечения. В одном аспекте изобретения НОУ-иммунотерапевтическую композицию изобретения применяют в безинтерфероновом протоколе (т.е. в виде монотерапии или в комбинации с один или более средствами, которые не являются интерфероном).
В одном аспекте изобретения дополнительное терапевтическое средство, которое вводят совместно с НОУ-иммунотерапевтической композицией изобретения на основе дрожжей, представляет собой противовирусное соединение, которое эффективно для лечения сопутствующей инфекции НВУ у пациента. В данном контексте термин противовирусный относится к любому соединению или лекарству, обычно низкомолекулярному ингибитору или антителу, которое воздействует на одну или более стадии жизненного цикла вируса с оказанием прямых противовирусных эффектов. Подходящие противовирусные средства включают, но без ограничения: тенофовир (УШЕАО®), ламивудин (ЕРIVIК®), адефовир (НЕР8ЕКА®), телбивудин (ТУ2ЕКА®), энтекавир (ВАКАСЕиОЕ®), и их комбинации.
Тенофовир (тенофовира дизопроксил фумарат или ТОР), или ({[(2К)-1-(6-амино-9Н-пурин-9ил)пропан-2-ил]окси}метил)фосфоновая кислота, представляет собой нуклеотидный аналог ингибитора обратной транскриптазы (пКТН). Для лечения инфекции НВУ, тенофовир обычно вводят взрослым в виде таблетки в дозе 300 мг (тенофовира дизопроксил фумарат) один раз в день. Дозировка для педиатрических пациентов основана на массе тела пациента (8 мг на кг массы тела, до 300 мг один раз в день) и может предоставляться в виде таблетки или порошка для перорального введения.
Ламивудин, или 2',3'-дидеокси-3'-триацилтимидин, обычно называемый 3ТС, представляет собой мощный нуклеозидный аналог ингибитора обратной транскриптазы (пКЛ). Для лечения инфекции НВУ, ламивудин вводят в виде таблетки или перорального раствора в дозе 100 мг один раз в день (3,1-4,4 мг/кг, два раза в день для детей в возрасте от 3 месяцев до 12 лет).
Адефовир (адефовира дипивоксил), или 9-[2-[бис-[(пивалойлокси)метокси]фосфинил]метокси]этил] аденин, представляет собой нуклеотидный аналог ингибитора обратной транскиптазы (йКП) для перорального введения. При лечении инфекции НВУ, адефовир вводят в виде таблетки в дозе 10 мг один раз в день.
Телбивудин или 1-(2-деокси-Р-^-эритро-пентофураносизил)-5-метилпиридин-2,4(1И,3И)-дион представляет собой синтетический тимидиновый аналог нуклеозида (Ь-изомер тимидина). При лечении инфекции НВУ телбивудин вводят в виде таблетки или перорального раствора в дозе 600 мг один раз в день.
Энтекавир, или 2-амино-9-[(18,3К,48)-4-гидрокси-3-(гидроксиметил)-2-митилиденециклопентил]6,9-дигидро-3Н-пурин-6-он, представляет собой нуклеозидный аналог (аналог гуанина), который ингибирует обратную транскрипцию, репликацию ДНК и транскрипцию вируса. При лечении инфекции НВУ энтекавир вводят в виде таблетки или перорального раствора в дозе 0,5 мг один раз в день (1 мг еже- 27 030381 дневно для ламивудин-рефрактерных мутаций или мутаций, устойчивых к телбивудину).
В аспектах изобретения иммунотерапевтическую композицию и другие средства можно вводить вместе (одновременно). В данном контексте одновременное использование не обязательно означает, что все дозы всех соединений вводят в один и тот же день в одно и тоже время. Скорее, одновременное использование означает, что каждый из компонентов терапии (например, иммунотерапия и терапия интерфероном) начинают использовать приблизительно в один и тот же период (в пределах часов, до 1-7 дней относительно друг друга, или даже больше (недели или месяцы), но вводят в виде части одного протокола) и вводят на протяжении того же общего периода времени, отмечая, что каждый компонент может иметь другой режим дозирования (например, интерферон вводят еженедельно, иммунотерапию проводят раз в месяц). Кроме того, до или после периода одновременного введения, любое из средств или иммунотерапевтические композиции можно вводить без другого средства (средств).
В настоящем изобретении предполагается, что применение иммунотерапевтической композиции по изобретению с интерфероном, таким как ΙΡΝ-α, позволит обеспечить краткосрочный курс применения интерферона, или позволит исключить применение интерферона. Требования к дозировкам интерферона также могут быть снижены или изменены благодаря комбинации с иммунотерапевтическим препаратом изобретения, для улучшения в целом переносимости лекарства пациентом. Кроме того, предполагается, что иммунотерапевтическая композиция по изобретению позволит обеспечить сероконверсию или устойчивые вирусологические ответы у пациентов, у которых монотерапия интерфероном не привела к ожидаемым результатам. Иначе говоря, если иммунотерапевтическая композиция по изобретению используют в комбинации с интерфероном, то у большего числа пациентов будут достигнуты отрицательные результаты вирусологических анализов или сероконверсия, чем при использовании интерферона в чистом виде.
По способу настоящего изобретения, композиции и терапевтические композиции можно вводить животному, включая любое позвоночное, и в особенности любого члена класса УеПеЬга1е, МатшаНа, включая, без ограничения, приматов, грызунов, сельскохозяйственных и домашних животных.
Сельскохозяйственные животные включают млекопитающих, которых употребляют в пищу, или которые производят полезные продукты (например, овцы для получения шерсти). Млекопитающие, которых лечат или проводят профилактику, включают человека, собак, кошек, мышей, крыс, коз, овец, крупный рогатый скот, лошадей и свиней.
Индивид представляет собой позвоночное, например млекопитающее, включая без ограничения человека. Млекопитающие включают, но без ограничения сельскохозяйственных животных, спортивных животных, домашних животных, приматов, мышей и крыс. Термин индивид можно использовать взаимозаменяемо с терминами животное, субъект или пациент.
Общие методики, используемые в изобретении.
При осуществлении настоящего изобретения применяют, если не указано особо, методики, общепринятые в таких областях, как молекулярная биология (включая рекомбинантные технологии), микробиология, клеточная биология, биохимия, химия нуклеиновых кислот, и иммунология, которые хорошо известны специалисту в данной области. Указанные методики полностью изложены в литературе, наПрИМер В °5 Епгуто1оду, Υοΐ. 194,
- 28 030381
6иЬЬг1е еЬ а1. , ебз., Со1б Зрг1пд НагЬог ЬаЬогаЬогу Ргезз (1990); В1о1оду апб асЫуШез оЬ уеазЬз, ЗЫппег, еЬ а1., ебз., АсабетЬс Ргезз (1980); МеЬЬобз ίη уеазЬ депеЫсз : а ЬаЬогаЬогу соигзе тапиа!, Козе еЬ а1. , Со1б ЗргЬпд НагЬог ЬаЬогаЬогу Ргезз (1990); ТЬе УеазЬ ЗассЬаготусез: Се11 Сус1е апб Се11 ВЬоЬоду, РгЬпд1е еЬ а1. , ебз., Со1б ЗргЬпд НагЬог ЪаЬогаЬогу Ргезз (1997); ТЬе УеазЬ ЗассЬаготусез: Сепе
ЕхргеззЬоп, бопез еЬ а1. , ебз., Со1б ЗргЬпд НагЬог ЪаЬогаЬогу Ргезз (1993); ТЬе УеазЬ ЗассЬаготусез: Сепоте РупатЬсз, РгоЬеЬп ЗупЬЬезЬз, апб ЕпегдеЫсз, ВгоасЬ еЬ а1. , ебз., Со1б ЗргЬпд
НагЬог ЬаЬогаЬогу Ргезз (1992); Мо1еси1аг С1оп1пд: А ЬаЬогаЬогу
Мапиа!, зесопб ебЬЫоп (ЗатЬгоок еЬ а1., 1989) и Мо1еси1аг
С1оп1пд: А ЬаЬогаЬогу Мапиа!, ЬЫгб ебЬЫоп (ЗатЬгоок апб
Киззе1, 2001), фоЬпЫу геЬеггеб Ьо Ьеге1п аз ЗатЬгоок);
СиггепЬ РгоЬосо1з ίη Мо1еси1аг В1о1оду (Е.М. АизиЬе1 ек а1. , ебз., 1987, 1пс1иб1пд зирр1етепкз ЬЬгоидЬ 2001); РСК: ТЬе РоТутегазе СЬаЬп КеасЫоп, (Ми1Из ек а1. , ебз., 1994); Наг1ом апб Ьапе (1988), АпЫЬобЬез, А ЬаЬогаЬогу Мапиа!, Со1б ЗргЬпд НагЬог РиЬИсаЫопз, Ыем Уогк; Наг1ом апб Ьапе (1999) Цзгпд АпЫЬоЫез: А ЬаЬогаЬогу Мапиа!, Со1б ЗргЬпд НагЬог ЬаЬогаЬогу Ргезз, Со1б ЗргЬпд НагЬог, ΝΥ фоЬпЫу геЬеггеб Ьо ЬегеЬп аз Наг1ом апб Ьапе), Веаисаде еЬ а1. ебз., СиггепЬ РгоЬосо1з ίη Ыис1е1с Αοίά СЬетгзЬгу, боЬп ИПеу & Зопз, 1пс., Ыем Уогк,
2000); СазагеЬЬ апб ОоиП'з Тох1со1оду ТЬе Вазгс Зсгепсе оЬ Рогзопз, С. К1ааззеп, еб., 6ЬЬ еб1Ыоп (2001), и Уассгпез, 3.
Р1оЬк1п апб И. 0гепзЬе1п, ебз., Згб еб1Ыоп (1999) .
Основные определения.
ΤΑΚΜΟΘΕΝ® (О1оЬе1ттипе, 1пс., ЬошзуШе, Со1огайо) в целом обозначает дрожжевой носитель, экспрессирующий один или более гетерологичных антигенов внеклеточно (на своей поверхности), внутриклеточно (с внутренней стороны или в цитозоле) или как внеклеточно, так и внутриклеточно. Продукты ΤΆΚΜΘΘΕΝ® в целом описаны (см., например, патент США № 5830463). Определенные иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей, и способы получения и в целом применение таких композиций, также подробно описаны, например, в патенте США № 5830463, патенте США № 7083787, патенте США № 7736642, в публикациях 8!иЪЪ§ е! а1., Ναι. Мей. 7:625-629 (2001), Ьи е! а1., Сапсег Кезеагсй 64:5084-5088 (2004), и в Вегп§!е1п е! а1., Уассте 2008 .1а п 24; 26(4):509-21, которые включены в описание посредством ссылки во всей полноте.
В данном контексте термин аналог относится к химическому соединению, которое структурно похоже на другое соединение, но несколько отличается по составу (т.е. замещение одного атома атомом другого элемента или наличие определенной функциональной группы, или замещение одной функциональной группы другой функциональной группой). Таким образом, аналог представляет собой соединение, которое сходно или сравнимо по функции и виду, но имеет другую структуру или происхождение по сравнению с исходным соединением.
Термины замещенный, замещенное производное и производное, когда их используют для описания соединения, означают, что по меньшей мере одна водородная связь в незамещенном соединении замещена другим атомом или химической функциональной группой.
Хотя производное обладает сходной физической структурой с исходным соединением, производное может иметь другие химические и/или биологические свойства, чем исходное соединение. Такие свойства могут включать, но без ограничения повышение или снижение активности исходного соединения, новую активность, по сравнению с исходным соединением, увеличение или уменьшение биодоступности, повышенную или пониженную эффективность, повышенную или пониженную стабильность ш уйго и/или ш у1уо, и/или увеличение или уменьшение абсорбционных свойств.
В целом термин биологически активный показывает, что соединение (включая белок или пептид) обладает по меньшей мере одной детектируемой активностью, которая оказывает эффект на метаболические или другие процессы клетки или организма, которые измеряют или наблюдают ш у1уо (т.е. в естественной физиологической среде) или ш уйго (т.е. в лабораторных условиях).
Согласно настоящему изобретению термин модулировать можно использовать взаимозаменяемо с регулировать, и он относится к повышающей регуляции или к понижающей регуляции определенной активности. В данном контексте термин повышающая регуляция можно использовать в целом для опи- 29 030381 сания любого из перечисленного: элиситация, инициация, возрастание, расширение, стимулирование, улучшение, увеличение, усиление, продвижение, или обеспечение применительно к определенной активности. Аналогичным образом, термин понижающая регуляция в целом можно использовать для описания любого из перечисленного: снижение, ослабление, ингибирование смягчение, сокращение, уменьшение, блокирование или предотвращение, применительно к определенной активности.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, любая из аминокислотных последовательностей, описанных здесь, может быть получена с помощью по меньшей мере от одной, и приблизительно до 20 дополнительных гетерологичных аминокислот, фланкирующих каждый из С- и/или Νконцов определенной аминокислотной последовательности. Полученный белок или полипептид может обозначаться как состоящий по существу из определенной аминокислотной последовательности. Согласно настоящему изобретению, гетерологичные аминокислоты представляют собой последовательность аминокислот, которые не встречаются в природе (т.е. не найдены в природе, ш νί\Ό). фланкирующих определенную аминокислотную последовательность, или которые не связаны с функцией определенной аминокислотной последовательности, или которые не кодировались бы нуклеотидами, которые фланкируют встречающуюся в природе последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую определенную аминокислотную последовательность, как происходит в гене, если бы такие нуклеотиды в природной последовательности транслировались на основании стандартной для организма частоты использования кодона, из которого данная аминокислотная последовательность получена. Аналогично, фраза состоящий по существу из, когда она используется здесь со ссылкой на последовательность нуклеиновой кислоты, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей определенную аминокислотную последовательность, которая может быть фланкирована дополнительными гетерологичными нуклеотидами, по меньшей мере от одного нуклеотида и до приблизительно 60 нуклеотидов, по 5'- и/или 3'-концу нуклеотидной последовательности, кодирующей определенную аминокислотную последовательность. Гетерологичные нуклеотиды не встречаются в природе (т.е. не обнаружены в природе, ш У1уо), фланкируют последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую определенную аминокислотную последовательность, как происходит в природном гене, или не кодируют белок, который придает дополнительную функцию белку, или изменяет функцию белка, имеющего определенную аминокислотную последовательность.
Согласно настоящему изобретению фраза селективно связывается с относится к способности антитела, антигенсвязывающего фрагмента или связывающего партнера настоящего изобретения предпочтительно связываться с установленными белками. Более подробно, фраза селективно связывается относится к специфическому связыванию одного белка с другим белком (например, антитела, его фрагмента, или связывающего партнера с антигеном), где показатель связывания, который измеряют с помощью любого стандартного теста (например, иммунологического теста), статистически значительно выше, чем фоновое контрольное значение в тесте. Например, при выполнении иммунологического теста, контроли обычно включают реакционную лунку/пробирку, которая содержит только антитело или антигенсвязывающий фрагмент (т.е. в отсутствие антигена), где величину реактивности (например, неспецифическое связывание с лункой) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в отсутствие антигена принимают за фоновое значение. Связывание можно измерить с помощью различных методов, стандартных в данной области, включая иммуноферментные анализы (например, ЕЫ§Л, анализ методом иммуноблоттинга и т. д.).
Ссылка не белок или полипептид, используемый в настоящем изобретении, включает полноразмерные белки, гибридные белки, или любой фрагмент, домен, конформационный эпитоп, или гомологи таких белков, включая функциональные домены и иммуногенные домены белков. Более подробно, выделенный белок, согласно настоящему изобретению, представляет собой белок (включая полипептид или пептид), который выделен из его природного окружения (т.е. который подвергался воздействию человека) и может включать очищенные белки, частично очищенные белки, рекомбинантно полученные белки, и, например, синтетически произведенные белки. По существу, выделенный не отражает, в какой степени был очищен белок. Предпочтительно, выделенный белок настоящего изобретения получают рекомбинантно. Согласно настоящему изобретению, термины модификация и мутация можно использовать взаимозаменяемо, особенно в отношении модификаций/мутаций аминокислотной последовательности белков или их частей (или последовательностей нуклеиновой кислоты), описанных здесь.
В данном контексте термин гомолог используют для обозначения белка или пептида, который отличается от природного белка или пептида (т.е. прототипа или белка дикого типа) небольшими модификациями природного белка или пептида, но который сохраняет основную структуру белка и боковых цепей природной формы. Такие изменения включают, но без ограничения: изменения в одной или в нескольких боковых цепях аминокислот; изменения одной или нескольких аминокислот, включая делеции (например, усеченная версия белка или пептида), вставки и/или замены; изменения в стереохимии одного или нескольких атомов; и/или небольшие дериватизации, включая, но без ограничения: метилирование, гликозилирование, фосфорилирование, ацетилирование, миристоилирование, пренилирование, пальмитирование, амидирование и/или добавление гликозилфосфатидилинозитола. Гомолог может иметь усиленные, сниженные или по существу одинаковые свойства по сравнению с природным белком
- 30 030381 или пептидом. Гомолог может включать агонист белка или антагонист белка. Гомологи можно получить с применением методик, известных в данной области, для получения белков, включая, но без ограничения, прямые модификации выделенного, природного белка, прямой синтез белка, или модификации последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок с применением, например, классические или рекомбинантные ДНК-технологии для воздействия на случайный или направленный мутагенез.
Гомолог данного белка может включать аминокислотную последовательность, преимущественно состоять из, состоять из аминокислотной последовательности, которая приблизительно по меньшей мере на 45%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 55%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 65%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 75%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 85%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 91% идентична, или по меньшей мере на 92% идентична, или по меньшей мере на 93% идентична, или по меньшей мере на 94% идентична, или по меньшей мере на 95% идентична, или по меньшей мере на 96% идентична, или по меньшей мере на 97% идентична, или по меньшей мере на 98% идентична, или по меньшей мере на 99% (или любой процент идентичности от 45 до 99%, по возрастанию в целых числах), идентична аминокислотной последовательности эталонного белка. В одном варианте осуществления гомолог включает аминокислотную последовательность, преимущественно состоит из, состоит из аминокислотной последовательности, которая идентична природной аминокислотной последовательности эталонного белка менее чем на 100%, приблизительно менее чем на 99%, менее чем на 98%, менее чем на 97%, менее чем на 96%, менее чем на 95% и т.д., с интервалами, равными 1%, до менее чем на 70%.
Гомолог может включать белки или домены белков, которые являются почти полноразмерными, что означает, что такой гомолог отличается от полноразмерного белка, функционального домена или иммуногенного домена (такого как белок, функциональный домен или иммуногенного домена, которые описаны здесь или известны другим образом или описаны в общедоступных источниках) добавлением или делецией 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот на Ν- и/или С-конце, такого полноразмерного белка или полноразмерного функционального домена или полноразмерного иммуногенного домена.
В данном контексте, если не указано иначе, ссылка на процентную (%) идентичность относится к оценке гомологии, которую осуществляют с использованием: (1) пакета программ ВЬА8Т 2.0 Вакю ВЬА8Т йото1о§у кеатсй с использованием программы Ъ1ак1р при поиске аминокислот и программы Ъ1ак1п при поиске нуклеиновых кислот со стандартными используемыми по умолчанию значениями параметров, где для изучаемой последовательности устанавливают фильтр на области низкой сложности (описано в публикации А11кс1шк 8.Р., Маббеп, Т.Ь., БсНааГГег. А.А., Ζΐιαηβ. 1., Ζΐκπίβ. Ζ., МШет, & Ыршап, Ό.Γ (1997), Сарреб ВЬА8Т апб Р§1-ВЬА§Т: а пе\у депетайоп оГ рто1еш ба1аЪаке кеатсй ргодгатк. №ю1ею Аабк Кек. 25:3389-3402, включенной в описание посредством ссылки во всей полноте); (2) ВЬА8Т 2 аПдптеШ (с использованием параметров, описанных ниже); (3) и/или Р§1-ВЬА§Т со стандартными параметрами, принимаемыми по умолчанию (Рокбюп-§ресбтс ПегаЮб ВЬА8Т). Следует отметить, что вследствие некоторых различий в стандартных параметрах между ВЬА8Т 2.0 Вакю ВЬА8Т и ВЬА8Т 2, две специфические последовательности могут быть распознаны, как обладающие существенной гомологией, при использовании программы ВЬА8Т 2, тогда как поиск, выполненный в ВЬА8Т 2.0 Вакю ВЬА8Т с использованием одной из последовательностей в качестве изучаемой последовательности, может не идентифицировать вторую последовательность среди лучших соответствий. Кроме того, программа Р81ВЬА8Т предоставляет автоматизированную, простую в использовании версию поиска профайла, которая является чувствительным методом поиска гомологов последовательности. Программа сначала выполняет поиск с пропусками в базе данных ВЬА8Т. Программа Р81-ВЬА§Т использует информацию, получаемую в результате любых существенных выравниваний, возвращается для построения матрицы со специфической оценкой в зависимости от позиций, в которой происходит замещение в искомой последовательности для следующего раунда поиска в базе данных. Поэтому, следует понимать, что процент идентичности можно определить с помощью любой из указанных программ.
Выравнивание двух определенных последовательностей между собой можно выполнить с использованием пакета программ ВЬА8Т 2 кедиепсе, как описано в публикации ТаШкоуа апб Маббеп (1999), В1ак1 2 кесщепсек - а пе\у 1оо1 Гог со трап пд рто!ет апб пис1еойбе кедиепсек, РЕМ8 МютоЪю1 Ьей. 174:247-250, включенной в описание посредством ссылки во всей полноте. Выравнивание с применением пакета программ ВЬА8Т 2 кесщепсе выполняют в программах Ъ1ак1р или Ъ1ак1п с использованием алгоритма ВЬА8Т 2.0 для осуществления поиска Сарреб ВЬА8Т (ВЬА8Т 2.0) между двумя последовательностями, предусматривающего введение пропусков (делеции и вставки) в результирующее выравнивание. Для ясности, выравнивание с помощью ВЬА8Т 2 кесщепсе осуществляют с использованием стандартных значений, принимаемых по умолчанию, как указано ниже.
Для программы ЫакОт с использованием матрицы 0 ВЬО8иМ62:
- 31 030381
Вознаграждение за совпадение = 1 Штраф за несовпадение = -2
Штрафы за внесение пропуска (5) и продолжение пропуска (2) пропуск х_возврат (50) ожидание (10) длина сегмента (11) фильтр (вкл)
Для программы Ыаз1р, с использованием матрицы 0 ΒΕΘδυΜ62:
Штрафы за внесение пропуска (11) и продолжение пропуска (1) пропуск х_возврат (50) ожидание (10) длина сегмента (3) фильтр (вкл).
Выделенная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которую получили (т.е. которая подвергалась воздействию человека) из естественного окружения, представляющего собой геном или хромосому, в которой молекула нуклеиновой кислоты находится в природе. По существу выделенный не обязательно отражает степень очистки молекулы нуклеиновой кислоты, но показывает, что молекула не содержит полный геном или полную хромосому, в которой молекула нуклеиновой кислоты находится в природе. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты может включать ген. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая включает ген, не является фрагментом хромосомы, которая содержит указанный ген, но, скорее, включает кодирующий участок и регуляторные участки, ассоциированные с геном, но не дополнительные гены, которые в природных условиях находятся в той же самой хромосоме. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты также может включать определенную последовательность нуклеиновой кислоты, фланкированную (т.е. по 5'- и/или 3'-концу последовательности) дополнительными нуклеиновыми кислотами, которые обычно не фланкируют определенную последовательность нуклеиновой кислоты в природе (т.е. гетерологичные последовательности). Выделенная молекула нуклеиновой кислоты может включать ДНК, РНК (например, мРНК), или производные ДНК или РНК (например, кДНК). Хотя фраза молекула нуклеиновой кислоты, прежде всего, относится к физической молекуле нуклеиновой кислоты, и фраза последовательность нуклеиновой кислоты, прежде всего, относится к последовательности нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты, указанные две фразы можно использовать взаимозаменяемо, особенно в отношении молекулы нуклеиновой кислоты или последовательности нуклеиновой кислоты, способной кодировать белок или домен или белок.
Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу, которая включает по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, описанных здесь, которая функционально связана по меньшей мере с одной последовательностью, управляющей транскрипцией, способной эффективно регулировать экспрессию молекулы (молекул) нуклеиновой кислоты в клетке, которую трансфицируют. Хотя фраза молекула нуклеиновой кислоты, прежде всего, относится к физической молекуле нуклеиновой кислоты и фраза последовательность нуклеиновой кислоты, прежде всего, относится к последовательности нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты, указанные две фразы можно использовать взаимозаменяемо, особенно в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, или последовательности нуклеиновой кислоты, способной кодировать белок. Кроме того, фраза рекомбинантная молекула относится, главным образом, к молекуле нуклеиновой кислоты, функционально связанной с последовательностью, управляющей транскрипцией, но может использоваться взаимозаменяемо с фразой молекула нуклеиновой кислоты, которую вводят животному.
Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты включает рекомбинантный вектор, который представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, обычно гетерологичную последовательность, которая функционально связана с выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок настоящего изобретения, который способен обеспечить рекомбинантную продукцию гибридного белка, и который способен доставить молекулу нуклеиновой кислоты в клетку-хозяин согласно настоящему изобретению. Такой вектор может содержать последовательности нуклеиновой кислоты, которые в природе не располагаются рядом с выделенными молекулами нуклеиновой кислоты, помещаемыми в вектор. Вектор может быть РНК- или ДНК-содержащим, прокариотическим или эукариотическим, и предпочтительно в настоящем изобретении, представляет собой вирус или плазмиду. Рекомбинантные векторы можно использовать при клонировании, секвенировании и/или других манипуляциях с молекулами нуклеиновой кислоты, и можно использовать для доставки таких молекул (например, в виде ДНКкомпозиции или композиции на основе вирусного вектора). Рекомбинантные векторы предпочтительно используют для экспрессии молекул нуклеиновой кислоты, и также обозначают как экспрессионные векторы. Предпочтительные рекомбинантные векторы способны экспрессироваться в трансфицированной клетке-хозяине.
В рекомбинантной молекуле настоящего изобретения молекулы нуклеиновой кислоты функционально связаны с экспрессионными векторами, содержащими регуляторные последовательности, такие как последовательности, управляющие транскрипцией, последовательности, управляющие трансляцией, точки начала репликации, и другие регуляторные последовательности, которые совместимы с клеткойхозяином и которые контролируют экспрессию молекул нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.
- 32 030381
В том числе, рекомбинантные молекулы настоящего изобретения включают молекулы нуклеиновой кислоты, которые функционально связаны с одной или более последовательностями, управляющими экспрессией. Фраза функционально связанный относится к соединению молекулы нуклеиновой кислоты с последовательностью, управляющей экспрессией, таким способом, что молекула способна экспрессироваться при трансфекции (т.е. трансформации, трансдукции или трансфекции) в клетке-хозяине.
Согласно настоящему изобретению термин трансфекция используют для обозначения любого метода, с помощью которого экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты (т.е. рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты) можно ввести в клетку. Термин трансформация можно использовать взаимозаменяемо с термином трансфекция, когда такой термин используют в отношении введения молекул нуклеиновой кислоты в клетки микроорганизмов, таких как водоросли, бактерии и дрожжи. В системах микроорганизмов термин трансформация используют для описания наследственного изменения вследствие получения экзогенных нуклеиновых кислот микроорганизмом, и по существу он является синонимом термина трансфекция. Соответственно, методы трансфекции включают, но без ограничения трансформацию, химическую обработку клеток, бомбардировку частицами, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, адсорбцию, инфицирование и слияние протопластов.
Следующие экспериментальные результаты приводятся в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения объема изобретения.
Примеры
Пример 1.
Следующий пример описывает создание иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей для лечения или предотвращения инфекции, вызываемой вирусом гепатита Ό (НОУ).
В данном эксперименте конструировали дрожжи (например, 8ассЬаготусс8 ссгсуыас) для экспрессии антигена НОУ под контролем промотора, индуцируемого ионами меди, СИР I. Антиген НОУ представлял собой один полипептид, состоящий приблизительно из 218 аминокислот, со следующей последовательностью элементов, лигированных в рамке считывания от N к С-концу, представленных с помощью 8ЕО 10 N0: 30: 1) Ν-концевой пептид для придания устойчивости к протеосомной деградации и стабилизации экспрессии (положения 1-6 в 8Еф ГО N0: 30); 2) спейсер, состоящий из двух аминокислот (Тйг-8сг), для введения участка узнавания рестриктазы 8рс1 (положения 7-8 в 8Еф ГО N0: 30); 3) аминокислотная последовательность большого (Ь) антигена (НОЛд-Ь) НОУ генотипа 1, которую модифицировали с удалением сигнала внутриядерной локализации (положения 9-212 в 8Еф ГО N0: 30, также представлены здесь с помощью 8Еф ГО N0: 28); и 4) гексагистидиновый маркер (положения 213-218 в 8Еф ГО N0: 30). Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок 8Еф ГО N0: 30 (кодон оптимизирован для экспрессии в дрожжах) представлена здесь 8Еф ГО N0: 29. 8Еф ГО N0: 30 (и 8Е0 ГО N0: 28) содержит многочисленные эпитопы или домены, которые, как считают, усиливают иммуногенность антигена НОУ. Например, положения 34-42 и положения 51-59 в 8Еф ГО N0: 30 включают известные Т-клеточные эпитопы МНС класса I, и положения 34-49, положения 58-73, положения 74-87, положения 104-119, и положения 120-151 включают известные Т-клеточные эпитопы МНС класса II. Дрожжевая иммунотерапевтическая композиция, экспрессирующая 8Еф ГО N0: 30, также обозначается здесь как НОУ1.
Второй продукт, экспрессирующий такой же антиген НОУ, как описано выше, но с сохраненным N08, получали следующим образом. Конструировали дрожжи (например, 8ассйаготусс5 ссгсуыас) для экспрессии антигена НОУ под контролем промотора, индуцируемого ионами меди, СИР I. Антиген НОУ представлял собой отдельный полипептид, состоящий приблизительно из 228 аминокислот, со следующей последовательностью элементов, лигированных в рамке считывания от N к С-концу, представленных с помощью 8Еф ГО N0: 33: 1) ^концевой пептид для придания устойчивости к протеосомной деградации и стабилизации экспрессии (положения 1- 6 в 8Еф ГО N0: 33); 2) спейсер, состоящий из двух аминокислот (Тйг-8сг), для введения участка узнавания рестриктазы 8рс1 (положения 7-8 в 8Еф ГО N0: 33); 3) аминокислотная последовательность большого (Ь) антигена (НОЛд-Ь) НОУ генотипа 1, соответствующая 8Еф ГО N0: 2, за исключением замены глутамина аланином в положении 66 в 8Еф ГО N0: 2 (положения 9-222 в 8Еф ГО N0: 33, также представленные здесь с помощью 8Еф ГО N0: 31); и 4) гексагистидиновый маркер (положения 223-228 в 8Еф ГО N0: 33). Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок 8Еф ГО N0: 33 (кодон оптимизирован для экспрессии в дрожжах), представлена здесь с помощью 8Еф ГО N0: 32. 8Еф ГО N0: 33 (и 8Еф ГО N0: 31) содержит многочисленные эпитопы или домены, которые, как считают, усиливает иммуногенность антигена НОУ. Например, положения 34-42 и положения 51-59 в 8Еф ГО N0: 33 включают известные Т-клеточные эпитопы МНС класса I, и положения 34-49, положения 58-73, положения 74-89, положения 82-97, положения 114-129 и положения 130-161 включают известные Т-клеточные эпитопы МНС класса II. Дрожжевая иммунотерапевтическая композиция, экспрессирующая 8Еф ГО N0: 33, также обозначается здесь как Н0У2.
При создании дрожжевых иммунотерапевтических композиций Н0У1 и НОУ2, вкратце, проводили оптимизацию кодонов ДНК, кодирующей антигены НОУ, описанные выше, для экспрессии в дрожжах, и затем расщепляли ДНК с помощью ЕсоК1 и ШЙ и помещали после промотора СИР1 (р0Н100) в 2 мкм дрожжевых экспрессионных вектора. Нуклеотидная последовательность 8Еф ГО N0: 29 кодирует гиб- 33 030381 ридный белок, представленный 8ЕЦ ГО N0: 30, и нуклеотидная последовательность 8ЕЦ ГО N0: 32 кодирует гибридный белок, представленный 8ЕЦ ГО N0: 33. Полученные плазмиды вводили в дрожжи штамма ^303 8ассЬаготусс8 ссгсуыас путем трансфекции с помощью ацетата лития/полиэтиленгликоля, и проводили отбор первичных трансфектантов на планшетах с твердой минимальной средой, не содержащей урацила (ИОМ; среда, не содержащая уридин). Колонии пересевали штриховым методом на среду ИОМ или ИЬОМ (среда, не содержащая уридин и лейцин) и выращивали в течение 3 дней при 30°С. Жидкие культуры, не содержащие уридина (среда И2: 20г/л глюкозы; 6,7 г/л основы азотного агара для дрожжей, содержащей сульфат аммония; гистидин, лейцин, триптофан и аденин в количестве 0,04 мг/мл) или не содержащие уридина и лейцина (среда ИЬ2: 20г/л глюкозы; 6,7 г/л основы азотного агара для дрожжей, содержащей сульфат аммония; и гистидин, триптофан, и аденин в количестве 0,04 мг/мл), инокулировали колониями, полученными на планшетах, и стартовые культуры выращивали в течение 20 ч при 30°С, 250 об/мин. Первичные культуры использовали для инокуляции конечных культур такого же состава и поддерживали рост до достижения плотности 1,1-4,0 УИ/мл. Культуры стимулировали 400 мкМ сульфата меди при исходной плотности 1-4 УИ/мл в течение 3 ч при 30°С. Затем клетки из каждой культуры собирали, отмывали буфером РВ8 и убивали нагреванием при 56°С в течение 1 ч в буфере РВ8.
После тепловой инактивации культур клетки трижды отмывали в буфере РВ8 и общий белок выделяли путем разрушения клеток с помощью стеклянных шариков с кипением в лизирующем буфере 808. Общее количество белка определяли в тесте с реагентом апийо5с11\уаг//связывание на нитроцеллюлозе, и содержание антигена НОУ измеряли с помощью вестерн-блоттинга с использованием зонда, маркерного моноклонального антитела анти-НЕ 1ад, с последующей интерполяцией по стандартной кривой, полученной с использованием НЕ-меченого белка N83 НСУ.
Результаты представлены на фиг. 2 и 3. На фиг. 2 представлена индуцируемая ионами меди экспрессия НОУ 1 и НИУ2: и2 и ИЬ2 с использованием одного набора внутренних стандартов (НИУ1 и НИУ2 использовали в количестве 4 мкг белка/дорожку), и на фиг. 3 представлена индуцируемая ионами меди экспрессия НОУ 1 и НИУ2: И2 и ИЬ2 с использованием второго набора внутренних стандартов (НИУ1 и НИУ2 использовали в количестве 4 мкг белка/дорожку). Указанные фигуры показывают, что каждая из НИУ-иммунотерапевтических композиций изобретения на основе дрожжей, описанных выше, экспрессирует белок НОУ, и может быть идентифицирована с помощью вестерн-блоттинга. Наилучшую экспрессию антигена получали при использовании среды ИЬ2. Расчетное значение экспрессии антигена составляло ~7171 нг белка на У.И. для дрожжей, экспрессирующих 8ЕЦ ГО N0: 30 (НИУ1), и ~6600 нг белка на У.И. для дрожжей, экспрессирующих 8ЕЦ ГО N0: 33 (НИУ2) (единица количества дрожжей; одна единица количества дрожжей (У.И.) составляет 1х107 дрожжевых клеток или эквивалентов дрожжевых клеток) или 76 пмоль белка на У.И.). Однако обнаружили, что НИУ2 образует агглютинаты и имеет значительно более длительное время удвоения, чем НИУ1. Образование клеточных агглютинатов и крайне медленный рост являются нежелательными свойствами для дрожжевых препаратов-кандидатов, и поэтому для дальнейших экспериментов выбрали НИУ1.
Пример 2.
Следующий пример описывает получение другой иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей для лечения или профилактики инфекции, вызываемой вирусом гепатита Ό (НОУ).
В данном эксперименте создавали дрожжи (например, 8ассЬаготусс8 ссгсуыас) для экспрессии антигена НОУ под контролем промотора, индуцируемого ионами меди, СИР I. Антиген НОУ представлял собой отдельный полипептид, состоящий приблизительно из 422 аминокислот, со следующей последовательностью элементов лигированных в рамке считывания от N к С-концу, представленных с помощью 8ЕЦ ГО N0: 36: 1) Мконцевой пептид для придания устойчивости к протеосомной деградации и стабилизации экспрессии (положения 1-6 в 8ЕЦ ГО N0: 36); 2) спейсер, состоящий из двух аминокислот (ТЬг8сг) для введения участка узнавания рестриктазы 8рс1 (положения 7-8 в 8ЕЦ ГО N0: 36); 3) аминокислотная последовательность большого (Ь) антигена (НОАд-Ь) НОУ генотипа 1, которую модифицировали с удалением сигнала внутриядерной локализации (положения 9-212 в 8ЕЦ ГО N0: 36); 4) аминокислотная последовательность большого (Ь) антигена (НОАд-Ь) НОУ генотипа 2, которую модифицировали с удалением сигнала внутриядерной локализации (положения 213-416 в 8ЕЦ ГО N0: 36); и 5) гексагистидиновый маркер (положения 417-422 в 8ЕЦ ГО N0: 36). Аминокислотная последовательность, соответствующая только последовательностям НОУ в данном гибридном белке, представляет собой 8ЕЦ ГО N0: 34. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок 8ЕЦ ГО N0: 36 (кодон оптимизирован для экспрессии в дрожжах), представлена здесь 8ЕЦ ГО N0: 35. 8ЕЦ ГО N0: 36 (и 8ЕЦ ГО N0: 34) содержит многочисленные эпитопы или домены, которые, как предполагают, усиливают иммуногенность антигена НОУ. Например, в пределах последовательности антигена НОУ генотипа 1 положения 34-42 и положения 51-59 в 8ЕЦ ГО N0: 36 включают известные Т-клеточные эпитопы МНС класса I, и положения 34-49, положения 58-73, положения 74-89, положения 82-97, положения 114-129 и положения 130-161 включают известные Т-клеточные эпитопы МНС класса II. Соответствующие последовательности можно идентифицировать в последовательности антигена НОУ генотипа 2. Дрожжевая иммунотерапевтическая композиция, экспрессирующая 8ЕЦ ГО N0: 36, также обозначается здесь как НОУ3.
- 34 030381
Для получения иммунотерапевтической композиции дрожжей ΗΌν3, кратко, проводили оптимизацию кодонов ДНК, кодирующей антиген ΗΌν, описанный выше, для экспрессии в дрожжевых клетках, и затем и затем расщепляли ДНК с помощью ΙοοΚΙ и М и помещали после промотора СИР1 (ρΘΙ-100) в 2 мкм дрожжевых экспрессионных вектора. Нуклеотидная последовательность 8Ε^ ΙΌ N0: 35 кодирует гибридный белок, представленный 8Ε^ ΙΌ N0: 36. Полученные плазмиды вводили в дрожжи штамма ^303 8ассЬагошусе§ сегеуыае путем трансфекции с помощью ацетата лития/полиэтиленгликоля, и проводили отбор первичных трансфектантов на планшетах с твердой минимальной средой, не содержащей урацила (ΌΌΜ; среда, не содержащая уридин). Колонии пересевали штриховым методом на среду ΌΌΜ или иЬБМ (среда, не содержащая уридин и лейцин) и выращивали в течение 3 дней при 30°С. Жидкие культуры, не содержащие уридина (среда И2: 20 г/л глюкозы; 6,7 г/л основы азотного агара для дрожжей, содержащей сульфат аммония; гистидин, лейцин, триптофан и аденин в количестве 0,04 мг/мл) или не содержащие уридина и лейцина (среда иЬ2: 20 г/л глюкозы; 6,7 г/л основы азотного агара для дрожжей, содержащей сульфат аммония; и гистидин, триптофан, и аденин в количестве 0,04 мг/мл), инокулировали колониями, полученными на планшетах, и стартовые культуры выращивали в течение 20 ч при 30°С, 250 об/мин. Первичные культуры использовали для инокуляции конечных культур такого же состава и поддерживали рост до достижения плотности 1,1-4,0 Υυ/мл. Культуры стимулировали 400 мкМ сульфата меди при исходной плотности 1-4 Υυ/мл в течение 3 ч при 30°С. Затем клетки из каждой культуры собирали, отмывали буфером РВ8 и убивали нагреванием при 56°С в течение 1 ч в буфере РВ8.
После тепловой инактивации культур клетки трижды отмывали в буфере РВ8 и общий белок выделяли путем разрушения клеток с помощью стеклянных шариков с кипением в лизирующем буфере 8Ό8. Общее количество белка определяли в тесте с реагентом ат10озсИмаг//связывание на нитроцеллюлозе, и содержание антигена ΗΌν измеряли с помощью вестерн-блоттинга с использованием зонда, маркерного моноклонального антитела анти-Ηΐδ 1а§, с последующей интерполяцией по стандартной кривой, полученной с применением Ηΐδ-меченного белка N83 ΗСV. Результаты представлены на фиг. 4. На фиг. 4 представлена индуцируемая ионами меди экспрессия ΗΌν3 в среде и2 и иЬ2, с использованием двух различных наборов внутренних стандартов. Результаты показывают, что ΗΌΫ3 экспрессирует высокие уровни антигена ΗΌν, которые могут быть идентифицированы с помощью вестерн-блоттинга. Наилучшую экспрессию антигена наблюдали при использовании среды иЬ2. Расчетный показатель экспрессии антигена составлял ~23861 нг белка на Υ.υ. для дрожжей, экспрессирующих 8Ε^ ΙΌ N0: 36 (ΗΌν3). Для проведения дальнейших экспериментов выбирали ΗΌν3.
Пример 3.
Следующий пример описывает преклинические эксперименты на мышах, чтобы продемонстрировать иммуногенность ΗΌν-иммунотерапевтических композиций изобретения на основе дрожжей при введении ΐη νίνο.
В экспериментах три группы мышей С57ВЬ/6 иммунизировали подкожно, как показано в табл. 2. Мышей иммунизировали ΗΌΫ1 (8Ε^ ΙΌ N0: 30, см. пример 1) и ΗΌν3 (8Ε^ ΙΌ N0: 36, см. пример 2), и контрольной композицией дрожжей, известной как 0νΑΧ2010 (указанные дрожжи экспрессируют овальбумин куриного яйца, содержащий ^концевой лидерный пептид альфа-фактора, экспрессия запускается промотором СиР Ι).
Таблица 2
Группы иммунизации: мыши С57ВГ/6
Группа Мыши Вакцина Схема течение введения ( : 3 недель) Еженедельно в
А С57ВЪ/б п=5 Ολ/ΑΧ2 010 2,5 Υϋ в загривок, 2,5 Υυ в бок
В С57ВЪ/б п=5 Ηϋνΐ 2,5 Υϋ в загривок, 2,5 Υυ в бок
С С57ВЪ/б п=5 Ηϋν3 2,5 Υϋ в загривок, 2,5 Υυ в бок
Мышей иммунизировали всего 5 Υ.υ. (в два места по 2,5 Υ.υ. на участок инъекции) указанной иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей один раз в неделю всего в течение 3 недель. Через восемь дней после третьей иммунизации мышей подвергали эвтаназии и выделяли селезенку и лимфоузлы, измельчали их до получения одноклеточных суспензий и подсчитывали клетки. Клетки наносили на 96-луночные планшеты с υ-образным дном в количестве 200000 клеток/лунку (106 клеток/мл) и добавляли ΗΌν-специфические пептидные антигены в количестве 30 мкг/мл. Через 4 дня инкубации при 37°С/5% С02 в инкубаторе с увлажняющей системой, 150 мкл (150000 клеток) переносили в планшеты Ε^I8ροΐ для одновременного измерения двух параметров, интерлейкин-2/интерферон-у (Ш^ЛГЛу) (Κ&Ό 8у81еш§), на 24 ч. Планшеты обрабатывали согласно инструкциям производителя и подсчитывали пятна с применением утвержденного оборудования и программного обеспечения (СТЦ Ыс.). При проведении теста использовали следующие пептиды ΗΌν:
- 35 030381
ΗΌν 26-34 (связывающий ΗΌΑ-Α2): К1.К1)1.К1ГО1.; δΕΟ ΙΌ N0: 20;
ΗΌν 43-51 (связывающий ΗΌΑ-Α2): 141.14)1^1^1/ δΕΟ ΙΌ N0: 19.
Результаты эксперимента представлены на фиг. 5Α, 5В, 6Α и 6В. На фиг. 5Α показано, что вакцинация ΗΌν1 или ΗΌν3 вызывает в анализе ΕΕΙδροΐ ΗΌν-специфический ответ ΙΡ^, который специфически выявляется при добавлении ех νΐνο известного пептида Т-клеточного эпитопа ΗΌν (Ρ2: ΗΌν 43-51 или δΕΟ ΙΌ N0: 19; ρ=0,0008 ΗΌν3 в сравнении с 0νΑΧ). Указанный результат является существенным, поскольку ΙΡ^ является ключевым компонентом функционального адаптивного иммунного ответа; он продуцируется СО4+ТЫ и СО8+ цитотоксическими Т-лимфоцитарными (СТЬ) эффекторными Тклетками при развитии функционального иммунитета. Хотя наблюдали значительный уровень фоновых значений ΕΕΙδροΐ в лунках, содержащих только среду роста, антигенная специфичность иммунного ответа очевидна даже после вычитания указанного фонового значения из значений ΕΕΙδροΐ, полученных при обработке пептидом (фиг. 5В). Примечательно, что ΗΌν3 вызывала в 3,5 раза более высокий ответ в ΕΕΙδροΐ, чем ΗΌν1 (фиг. 5В; 42 пятен в случае ΗΌν3 и 12 пятен в случае ΗΌν1) и что обладала приблизительно в 3,3 раза более высоким содержанием антигена ΗΌν, чем ΗΌν1 (23861 ^/Уи в случае ΗΌν3 и 7171 ^/Υυ в случае ΗΌν1). Данный результат иллюстрирует, что более высокий показатель содержания антигена на дрожжевую клетку коррелирует с более высокой частотой встречаемости антигенспецифических Т-клеток, вызванных иммунотерапией на основе дрожжевых клеток.
Результаты анализа ΕΕΙδροΐ для ΙΌ-2 также выявили индукцию антиген-специфического иммунного ответа при вакцинации ΗΌν-1. На фиг. 6Α показано, что вакцинация ΗΌν1 вызывает ответ ΙΌ-2 в ΕΕΙδροΐ, который специфически развивается при добавлении ех νΐνο другого пептида ΗΌν (ΡΙ: ΗΌν-26-34 или δΕΟ ΙΌ N0: 20; ρ=0,02 ΗΌν1 в сравнении с 0νΑΧ). Результат подтверждает качество иммунного ответа, индуцированного дрожжевой ΗΌν-иммунотерапевтической вакцинацией, поскольку ΙΌ-2 стимулирует рост, дифференцировку и выживаемость антиген-специфических цитотоксических Т-клеток. Хотя существует а значительный уровень фоновых значений ΙΌ-2 ΕΕΙδροΐ в образцах, инкубированных только в присутствии среды роста (Отс. стимуляции на фиг. 6Α), антигенная специфичность иммунного ответа очевидна даже после вычитания фонового значения из значений ΕΕΙδροΐ. полученных при обработке пептидом (фиг. 6В). Число скорректированных по фону пятен в тесте определения ΙΌ-2 ΕΕΙδροΐ для Η^V1-вакцинированных мышей вдвое выше, по сравнению со значениями, полученными для 0νΑΧвакцинированных мышей.
Результаты анализов ΕΕΙδροΐ для ГР^ и ΙΌ-2 в совокупности показывают, что ΗΌνиммунотерапевтические композиции по изобретению на основе дрожжей в результате введения ίη νΐνο вызывают образование антиген-специфических Т-клеток, продуцирующих цитокины, которые являются известными маркерами индукции СТЬ, и иллюстрируют полезность указанных композиций для индукции функциональных анти-ΗΌν ответов.
Пример 4.
Следующий пример описывает фазу 1 клинического испытания с участием здоровых добровольцев.
12-недельное, открытое, с увеличением дозы клиническое исследование 1-й фазы осуществляют с применением ΗΌν-иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей, описанной здесь (например, ΗΌν-иммунотерапевтической композиции, описанной в примерах 1 или 2). Пациенты являются здоровыми добровольцами с активным иммунитетом без предшествующих или текущих признаков или записей, свидетельствующих инфекции ΗΌν или инфекции ΗВV.
Приблизительно 48 пациентам (6 групп, по 8 пациентов в группе), отвечающим указанным критериям, вводят ΗΌν-иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей в условиях последовательного увеличения дозы в группе испытуемых с использованием одного из двух различных протоколов введения, как указано ниже:
Протокол Α: режим введения прайм-буст (4 еженедельных дозы начиная со дня 1, с последующими 2 ежемесячными дозами в неделю 4 и неделю 8).
Группа 1Α: 20 единиц количества дрожжей (Υ.υ.) (вводили в дозах 10 Υ.υ. в 2 различных участка); группа 2Α: 40 Υ.υ. (вводили в дозах 10 Υ.υ. в 4 различных участка); группа 3Α: 80 Υ.υ. (вводили в дозах 20 Υ.υ. в 4 различных участка).
4-недельный режим введения (три общие дозы вводили в день 1, неделю 4 и неделю 8).
Группа 1В: 20 Υ.υ. (вводили в дозах 10 Υ.υ. в 2 различных участка); группа 2В: 40 Υ.υ. (вводили в дозах 10 Υ.υ. в 4 различных участка); группа 3В: 80 Υ.υ. (вводили в дозах 2 0 Υ.υ. в 4 различных участка)
Все дозы вводят подкожно и дозу делят на два или четыре участка введения в организм (в каждый визит), как указано выше. Проводят оценку безопасности и иммуногенности (например, антигенспецифические Т-клеточные ответы, измеренные с помощью теста ΕΕΙδροΐ, и Т-клеточная пролиферация). Конкретно, алгоритм на основе ΕΕΙδροΐ разрабатывается для категориальных пациентов с лечебным эффектом. Также оценивают результаты тестов ΕΕΙδροΐ по количественному определению регуляторных Тклеток (Тгед) и оценивают СО4+ Т-клеточную пролиферацию в ответ на антигены ΗΌν и сопоставляют с образованием антител анти^ассйаготусек сегеуыае (ΑδСΑ).
- 36 030381
Предполагается, что ΗΌν иммунотерапевтический препарат на основе дрожжей будет хорошо переноситься и проявлять иммуногенность, которую измеряют с помощью одного или более тестов ЕЫ8ροΐ, анализ пролиферации лимфоцитов (ЬРА), Т-клеточная стимуляция ех νίνο антигенами ΗΒν и/или А8СА.
Пример 5.
Следующий пример описывает фазу 1Ь/2а клинического исследования у пациентов, хронически инфицированных вирусом гепатита Ό и вирусом гепатита Β (терапевтическая группа), или моноинфицированных вирусом гепатита Β (профилактическая группа).
Открытое, с увеличением дозы клиническое исследование фазы 1Ь/2а проводят с использованием ΗΌν-иммунотерапевтической композиции на основе дрожжей, описанной здесь, (например, ΗΌνиммунотерапевтическая композиция, описанная в примерах 1 или 2). В группе 1 (группа терапевтического лечения ΗΌν) пациенты имеют активный иммунитет и хронически инфицированы вирусом гепатита Β (ΗΒν) и вирусом гепатита Ό (ΗΌν). В группе 2 (группа профилактики ΗΌν), пациенты имеют активный иммунитет и хронически инфицированы ΗΒν без явлений коинфекции ΗΌν (т.е. моноинфекция ΗΒν). В этой группе хроническая инфекция ΗΒν хорошо контролируется с помощью общепринятой ΗΒν-противовирусной терапии (например, тенофовира дизопроксил фумарат, или ΊΌΡ (ΥΙΚΕΛΌ®)). что определяют по уровням ДНК ΗΒν.
На первой стадии исследования пациентам в обеих группах, соответствующим указанным критериям, вводят ΗΌν-иммунотерапевтическую композицию на основе дрожжей по протоколу, предусматривающему последовательное увеличение доз в когорте в диапазоне доз от 0,05 до 80 Υ.υ. Необязательно, один пациент, составляющий отдельную когорту, будет получать подкожные инъекции плацебо ^Β8) по схеме, аналогичной иммунотерапии, плюс продолженную противовирусную терапию. Правила прекращения исследования включают внезапное увеличение значений АЬТ и появление признаков декомпенсации.
На второй стадии исследования пациентов каждой группы рандомизируют в две одинаковые когорты для продолжения антивирусного протокола в чистом виде или антивирусного протокола с добавлением ΗΌν-иммунотерапии на основе дрожжей (доза 1 и доза 2) в течение 48 недель. Пациенты в группе 2 необязательно могут наблюдаться в течение более длительного срока (свыше 48 недель) для мониторинга показателей инфекции ΗΌν. В группе 2 один пациент, составляющий отдельную когорту, будет получать подкожные инъекции плацебо ^Β8) по схеме, аналогичной иммунотерапии, плюс продолженную противовирусную терапию ΗΒν.
В группе 1 оценивают безопасность, ΗΌν-вирусную кинетику, сероконверсию ИОАд, и ΗΌνспецифическую иммуногенность (например, антигенспецифические Т-клеточные ответы, измеряемые с помощью ΕΌΙ8ροΐ), а также одновременно сероконверсию ΗΒδΑд для измерения эффектов лечения ΗΒν. Кроме того, проводят мониторинг изменения биохимического показателя (АЬТ) в зависимости от дозы.
В группе 2 оценивают безопасность и ΗΌν-специфическую иммуногенность (например, антигенспецифические Т-клеточные ответы, измеряемые с помощью ΕΌΙ8ροΐ), а также одновременно сероконверсию ΗΒ8Αд, и регулярно проводят мониторинг показателей инфекции ΗΌν, включая определение РНК ΗΌν, определение антигена ΗΌν ЩОАд), и/или определение анти-ΗΌν (антитела против ΗΌν).
В группе 1 (терапевтическая группа), предполагается, что ΗΌν-иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей, обеспечивает терапевтический эффект у пациентов, хронически инфицированных ΗΌν. Предполагается, что иммунотерапия является безопасной и хорошо переносится во всех вводимых дозах. Предполагается, что, по меньшей мере, пациенты, получающие ΗΌν-иммунотерапию на основе дрожжей в самой высокой дозе, продемонстрируют возникающие во время лечения, ΗΌνспецифические Т-клеточные ответы, которые обнаруживают с помощью ЕЫ8Р0Т, и у пациентов с предшествующими минимальными ΗΌν-специфическими Т-клеточными ответами ожидается улучшение ΗΌν-специфических Т-клеточных ответов, возникающее во время лечения. У пациентов, получающих ΗΌν-иммунотерапию на основе дрожжей, ожидается уменьшение значений РНК ΗΌν и/или улучшение индексов сероконверсии ΗΌν по сравнению с группой, получающей противовирусное лечение, и/или по сравнению с контрольной группой, получающей плацебо, если применимо. Предполагается положительная динамика в нормализации значений АЬТ у пациентов, получающих ΗΌν-иммунотерапию на основе дрожжей.
В группе 2 (профилактика), предполагается, что ΗΌν-иммунотерапевтическая композиция на основе дрожжей обеспечивает защиту против коинфекции ΗΌν у ΗΒν-моноинфицированных пациентов, включая признак снижения индексов коинфекции ΗΌν, снижение тяжести симптомов и осложнений, ассоциированных с инфекцией ΗΌν, увеличение общей выживаемости, и/или повышение клиренса инфекции ΗΌν в виде строго заболевания, по сравнению с контролем (группа плацебо). Кроме того, предполагается, что, по меньшей мере, пациенты, получающие ΗΌν-иммунотерапию на основе дрожжей в самой высокой дозе, продемонстрируют появившиеся за время лечения, ΗΌν-специфические Тклеточные ответы, которые обнаруживают с помощью ЕЫ8Р0Т.
Хотя различные варианты осуществления настоящего изобретения подробно описаны, очевидно, что модификации и адаптации указанных вариантов осуществления будут разработаны специалистами в
- 37 030381 данной области. При этом однозначно понимается, что такие модификации и адаптации входят в объем настоящего изобретения, как описано в нижеследующей формуле изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> С1оЬе1штипе, 1пс.
Кйпд, ТЪотаз Н.
БачЩ, АреИап Н.
<120> ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА ДЕЛЬТА <130> 3923-39-РСТ <150> 61/497,039 <151> 2011-06-14 <160> 36 <170> Рабепб1п чегзйоп 3.5 <210> 1 <211> 1676 <212> ДНК <213> Вирус гепатита Ό
<400> 1 сабдддссаб сбссдадсда адддддсдсд сбддаадддб сддсбсссда дадддабааа 60
асддбааада дсдббддабс бсбдадддба даасссссаа даадаааааа ададааадса 120
ададасддас дабббсссса бдасбсбдда дасабссбдд ааддддааад ааддааддбд 180
даааадаадд адсбдддссб сссдабссда ддддсссаас бдссаадббб ддададсасб 240
ссддссдааа ддбсдаддба сссадаадда ддаабсбсас ддадаааадс адасааабса 300
ссбссададд ассссббсад сдаасадада дсбсбдасдс дсдаддадба адсссабадс 360
дабадддада дабдсбадда дббададдад ассдаадсда ддаддааадс ааадададса 420
асддддсбад бсддбдддбд ббссдссссс сдададддда сдадбдаддс ббабсссддд 480
даасбсддсд аабсдбсссс асабадсадс бсссддадсс ссббссаааа бдассдаддд 540
дддбддсбад даасдсдддд дассадбдда дссабдддаб дсссббсссд абдбссдабс 600
абсбсссбсс сссссдадбд бсдсссадда абддсдддас сссасбсаас бддддбссдс 660
дббссабссб ббсббассбд абддссддса бддбсссадс сбссссддбд дсдссддсбд 720
ддсаасаббс сдааддддас сдбсссбсдд баабддсдаа бдддасссад аадбсбсбсб 780
адаббсссад ададаабсда дадаааасбд дсбсбсссбб адссабссда дбддасдсбс 840
дбссбссббс ддабдсссад дбсддассдс даддаддбдд адабдссабд ссдасссдаа 900
даддааадаа ддасдсдада сасдаасссд бдадбддааа сссдсбббаб бсасбддддб 960
сдасаасбсб ддддадаааа дддаддабсд дсбдддаада дбабабссба бдддаабссс 1020
бддбббсссс бсасдбссад ссссбссссд дбссбддада адддддасбс сдддасдсбб 1080
- 38 030381
адса+д++дд ддасдаадсс дсссссдддс дс+сссс+сд а+ссасс++с даддддд++с 1140
асасссссаа ссдасдддсс ддс+д++с++ С+++ССС++С +с+сд+с++с с+сдд+саас 1200
с+с++аад++ СС+С++С++С ++сс++дс+д адд+дс++сс с+сссдсддс садс+дс+++ 1260
с+с++д++с+ сдадддсс++ сс++сд+сдд +да+сс+дсс +с+сс++д+с ддадаассс+ 1320
сссс+дадад дсс+с++ссс аддсссддад +с+а+с+сса +с+дд+ссд+ +сдддссс+с 1380
++сдссдддд дадссссс+с +сса+сс++а +с+++с+++с сдадаа++сс +++да+д+++ 1440
сссадссадд да++++сд+с с+саад+++с ++да++++с+ +с++аа+с++ ссддадд+сс 1500
с+с+сдада+ сс+с+аас++ с+++с++ссд +++асссас+ дс+сдадда+ сссс+с+с++ 1560
ссд+сдсда+ +сс+с++сда с+сддаасдд с+са+с+сда саададдсда сдд+сс+сад 1620
+ас+с++ас+ с++++с+д+а аададдадас +дс+ддас+с дасдсссдад ++сдад 1676
<210> 2 <211> 214 <212> Белок <213> Вирус гепатита Б <400> 2
Ме+ 1 Бег Агд Бег О1и 5 Бег Буз Агд Азп Агд Азр О1у Агд О1и О1у 11е
10 15
Беи О1и О1п Тгр Уа1 Азп О1у Агд Буз Буз Беи О1и Азр Беи О1и Агд
20 25 30
Азр Беи Агд Буз 11е Буз Буз Буз 11е Буз Буз Беи О1и Азр О1и Азп
35 40 45
Рго Тгр Беи О1у Азп 11е Буз О1у 11е Беи О1у Буз Буз Азр Буз Азр
50 55 60
О1у О1и О1у А1а Рго Рго А1а Буз Агд А1а Агд ТЪг Азр О1п Ме+ О1и
65 70 75 80
11е Азр Бег О1у Рго О1у Буз Агд Рго Беи Агд О1у О1у РЪе Бег Азр
85 90 95
Буз О1и Агд О1п Азр Н1з Агд Агд Агд Буз А1а Беи О1и Азп Буз Агд
100 105 110
Буз О1п Беи А1а А1а О1у О1у Буз Н1з Беи Бег Буз О1и О1и О1и О1и
115 120 125
О1и Беи Буз Агд Беи ТЪг О1и О1и Азр О1и Агд Агд О1и Агд Агд ТЪг
130 135 140
- 39 030381
А1а 145 О1у Рго Бег Уа1 О1у О1у 150 Уа1 Азп Рго Ьеи О1и О1у О1у Бег Агд
155 160
О1у А1а Рго О1у О1у О1у РЬе Уа1 Рго Азп МеЬ Ьеи Бег Уа1 Рго О1и
165 170 175
Бег Рго РЬе Бег Агд ТЬг О1у О1и О1у Ьеи Азр Уа1 Агд О1у Азп О1п
180 185 190
О1у РЬе Рго Тгр Азр 11е Ьеи РЬе Рго А1а Азр Рго Рго РЬе Бег Рго
195 200 205
О1п Бег Суз Агд Рго О1п
210
<210> 3
<211> 195
<212> Белок
<213> Вирус гепатита Ό
<400> 3
МеЬ Бег Агд Бег О1и Бег Ьуз Агд Азп Агд Азр О1у Агд О1и О1у 11е
1 5 10 15
Ьеи О1и О1п Тгр Уа1 Азп О1у Агд Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр Ьеи О1и Агд
20 25 30
Азр Ьеи Агд Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр О1и Азп
35 40 45
Рго Тгр Ьеи О1у Азп 11е Ьуз О1у 11е Ьеи О1у Ьуз Ьуз Азр Ьуз Азр
50 55 60
О1у О1и О1у А1а Рго Рго А1а Ьуз Агд А1а Агд ТЬг Азр О1п МеЬ О1и
65 70 75 80
11е Азр Бег О1у Рго О1у Ьуз Агд Рго Ьеи Агд О1у О1у РЬе Бег Азр
85 90 95
Ьуз О1и Агд О1п Азр Н1з Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1и Азп Ьуз Агд
100 105 110
Ьуз О1п Ьеи А1а А1а О1у О1у Ьуз Н1з Ьеи Бег Ьуз О1и О1и О1и О1и
115 120 125
О1и Ьеи Ьуз Агд Ьеи ТЬг О1и О1и Азр О1и Агд Агд О1и Агд Агд ТЬг
130 135 140
- 40 030381
А1а 145 О1у Рго Зег Уа1 О1у О1у 150 Уа1 Азп Рго Ьеи 155 О1и О1у О1у Зег Агд 160
О1у А1а Рго О1у О1у О1у РЬе Уа1 Рго Азп Меб Ьеи Зег Уа1 Рго О1и
165 170 175
Зег Рго РЬе Зег Агд ТЬг О1у О1и О1у Ьеи Азр Уа1 Агд О1у Азп О1п
180 185 190
О1у РЬе Рго 195 <210> 4 <211> 1688 <212> ДНК <213> Вирус гепатита Ό
<400> 4 абдддссдса адссдаасда аддаббссдд бааддддада ддаадаабсс сдааддддбб 60
ссссасбааа дадбддаада аббсбсддда адсббсбссс аадаадаасс адаабссссс 120
аадададада абддабсссс абдасдсбдд аададасбсс дддбаассаа дбсааддада 180
аддаасддба даааададсд адссбсбсда басдаааддд ссдсдассба бсаадбббдд 240
адбсабссдд дссааадддб бдааааабсс сасадасддд адссассадд адддабсбад 300
дадаабссас сбссададда ссссссбсаа бдаасадаад асбсбсбасс бсддаддааа 360
аадассабад сдабаддаад адабдсбадд адбаддсддс дассааадсд аддаадааад 420
бааадааадс аасддддсба дсдадбддаб дббссдсссс ааддддадсс дадбдаддсб 480
бабсссдддд аасбсддсдб абсдбсссда аабдаддадс ссддабсссс ббссааааад 540
асддададдд ддбдасбадд аабсдддсбс сддбддабсс дбдддассад сссдсбссас 600
сбссдсддса сасбссббсс ссссбдсддд сссссссаба адабддсадд аасссасбса 660
ббддддбссд сбдббссабб сбббсббасс ббдбддссдд сабддбссса дссбссбсдс 720
бддсдссддс бдддсаасаб бссдадддда ссдбсссбсд дбаабддсда абдддассса 780
даасбсбсбс бадаббссса дададаабсд ададаааасб ддсбсбсссб бадссабссд 840
адбаддасдб сбдбссбссб асддабдссс аддбсддасс дсдаддаддб ддадабдсса 900
бдссдасссд аададдааад аадаасасдд асдсдаассс дбаадбддаа сссбдабссб 960
ббаббддддд дбасасбсда ддадбддаад дсдсбдсссд дддддадссд даббдассба 1020
сдддаабссс сддбсдссбс бдабдбссад бсссбссссс дбссдадада адддадаббс 1080
сддаасбсса дбсабббдад ддасдаадсс дсссссдддс дсбссссбсд дасббссбсс 1140
аддадддббс асабссссаа сссдсдддсс ддсбасбсбб сбббдбсббб сдбсдбсббс 1200
- 41 030381
ааБддБсаас сБссБдадББ ссБсББсББс ББссББдсБд аддсБсБББс сссссдсдда 1260
дадББддББс ББсББдББсБ ддадддссББ ссББсБдсдд БддБссБдсс БсБссББдБс 1320
ддБдаасссд сБсББдБдад дБББсББссБ аддБссддад БсдассБсса БсБдаБсБдБ 1380
БсдддсссБс ББсдссдддд дадсБсссБс сссдБссББс ссББББсББа БдаББсссад 1440
даБдББсссс адссадддаБ БдБсаБссБс дадБсБсББд аБддБсБББс БддссББссд 1500
даддБсБсБс БсдадсБсББ ссдссБББББ БсББдБддаБ асссасББББ сдаддаБаБс 1560
ББсссББссБ ссссБссддс ББББссБсда ББсддаББдд сБсаБссБсд асдадддсда 1620
сддБссБсад ББсБсБсБаБ БсБББссБББ Бдааададда дасБдсБддБ ссааасдссс 1680
дадБсддд 1688
<210> 5 <211> 214 <212> Белок <213> Вирус гепатита Ό <400> 5
МеБ 1 Бег О1п Бег О1и 5 Бег Агд Ьуз Бег Агд Агд О1у О1у Агд О1и Азр
10 15
11е Ьеи О1и Ьуз Тгр Уа1 Бег ТЪг Агд Ьуз Ьуз А1а О1и О1и Ьеи О1и
20 25 30
Агд Азр Ьеи Агд Ьуз А1а Агд Ьуз ТЪг 11е Ьуз Агд Ьеи О1и Азр Азр
35 40 45
Азп Рго Тгр Ьеи О1у Азп 11е Ьеи О1у 11е 11е Агд Ьуз О1у Ьуз Азр
50 55 60
О1у О1и О1у А1а Рго Рго А1а Ьуз Агд А1а Агд ТЪг Азр О1п МеБ О1и
65 70 75 80
Уа1 Азр Бег О1у Рго Агд Ьуз Ьуз Рго Н1з Ьуз Бег О1у РЪе ТЪг Азр
85 90 95
Ьуз О1и Агд О1п Азр Н1з Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1п Азп Ьуз Ьуз
100 105 110
Азп О1п Ьеи Бег А1а О1у О1у Ьуз Бег Ьеи Бег Ьуз О1и О1и О1и О1и
115 120 125
О1и Ьеи Агд Агд Ьеи ТЪг 11е О1и Азр Азр О1и Агд О1п Агд Агд Уа1
130 135 140
А1а О1у Рго Агд Уа1 О1у Азр Уа1 Азп Рго Рго О1у О1у Бег Рго Агд
- 42 030381
145 150 155 160
О1у А1а Рго О1у О1у О1у РЪе Уа1 Рго О1п 165 170 МеЬ ТЪг О1у Уа1 Рго О1и 175
Зег Рго РНе Зег 180 Агд ТЪг О1у О1и О1у Ьеи 185 Азр 11е Агд О1у Азр Агд 190
О1у РНе Рго Тгр Уа1 Азп Рго А1а Рго Рго 195 200 Ьеи О1и Суз ТЪг Рго О1п 210 <210> 6 <211> 195 <212> Белок <213> Вирус гепатита Б <400> 6 О1у С1п Агд 205 Ьеи Рго Ьеи
МеЬ Зег О1п Зег 1 О1и Зег Агд Ьуз Зег Агд 5 10 Агд О1у О1у Агд О1и Азр 15
11е Ьеи О1и Ьуз 20 Тгр Уа1 Зег ТЪг Агд Ьуз 25 Ьуз А1а О1и О1и Ьеи О1и 30
Агд Азр Ьеи Агд 35 Ьуз А1а Агд Ьуз ТЪг 11е 40 Ьуз Агд Ьеи 45 О1и Азр Азр
Азп Рго Тгр Ьеи 50 О1у Азп 11е Ьеи О1у 11е 55 11е Агд Ьуз 60 О1у Ьуз Азр
О1у О1и О1у А1а 65 Рго Рго А1а Ьуз Агд А1а 70 Агд ТЪг Азр 75 С1п МеЬ О1и 80
Уа1 Азр Зег О1у Рго Агд Ьуз Ьуз Рго Н1з 85 90 Ьуз Зег О1у РЪе ТЪг Азр 95
Ьуз О1и Агд О1п 100 Азр Н1з Агд Агд Агд Ьуз 105 А1а Ьеи О1п Азп Ьуз Ьуз 110
Азп О1п Ьеи Зег 115 А1а О1у О1у Ьуз Зег Ьеи 120 Зег Ьуз О1и 125 О1и О1и С1и
О1и Ьеи Агд Агд 130 Ьеи ТЪг 11е О1и Азр Азр 135 О1и Агд С1п 140 Агд Агд Уа1
А1а О1у Рго Агд Уа1 О1у Азр Уа1 Азп Рго Рго О1у О1у Зег Рго Агд
- 43 030381
145 150 155 160
О1у А1а Рго О1у О1у О1у РЬе Уа1 Рго О1п Меб ТЬг О1у Уа1 Рго О1и
165 170 175
Зег Рго РЬе Зег Агд ТЬг О1у О1и О1у Ьеи Азр 11е Агд О1у Азр Агд
180 185 190
О1у РЬе Рго 195 <210> 7 <211> 1677 <212> ДНК <213> Вирус гепатита Ό
<400> 7 бдддссдсбб ссддсааддд ддбссдаааб сдададсддд ддадаасбсс сдададббдд 60
дадаадааад адддсдаааа ббсбсддасд дабсссссаа дсбсссааса даддаадада 120
асаадабада ддадссссса сдасдсбадс ааассдбсдс дсасбдддад аддадбдддс 180
ддаадабада аасддадасс ссддбссдаа бдссаабсдд садсааасбс сбсбддадбс 240
сбссдддссд аааддадааа асбассддсд дадддбдабс сасссддадб бдаасддаса 300
адссасабсс ададдасссс ббсддсдаас адаадасссб ддбассддда дддаабадсс 360
сабадбасаа ддддадабдс баддадбсдд аддаадссад аасдасбдад ааадсааада 420
дадсаасддд дсбадссасс дддбдббсса бссабдддаб сддбдссдад бдаддсббаб 480
сссдддддбд асдссбсддс ссббссббад сабсддаабс ссдддссссс бсссаддааб 540
дддаасаддд ддадабсдас сддддсссдс аддасссдаб ддадббсссс сассабсссб 600
бссддасдаа аасбддбссс дабаддддса сссасаабад дабддсаааа ддддасбсбс 660
дддбссдбсд ббссабссбб ббсббассбс дбддссддса бддссссадс сбссбсдсбд 720
дсдссддсбд ддсаасдабс сдадддадсб асбссбсбсд адаабсддса аабддддссс 780
сбсдсбсдба бсбссдадад дадасдадаа ддаддбддаб сбсссбббдс сабссдаддд 840
адсбасдсбс бссббасдда бдсссаддбс ддассдсдад даддбддада бсссабдссд 900
асссдаадад даааддадда сасддасдас ааассдбдад ббсбаббдсс сбббаббдбб 960
дддбдсассс бдддасссад баабасссдд ддддаддсдд ддбааассса басбабддда 1020
асбдсбдддб бссбсддабд бсдабссссб сбсссдббсд ддаааадддд дасбссддаа 1080
сбсссбдсад дсбдддсасд аадсссссас сдддсдсбсс ссбсддсддд ссдбссаббд 1140
ддббсасасс сссаддбсдс дддссддсбд ббсббсбббс бсбббсдбсд бсабсссбдд 1200
ссадссбссд дадббссбсб бсббссбсбб ддсбдаддбд сбббсссссб ссддссадбб 1260
- 44 030381
дсббсббсбб дббсбссадд дссббссббс ббсбдбддбс ссдссбсбсс бддбсддбда 1320
асссссбддс сббдддбббс сбсссаддбс сддаабсаас сбссабддбб бссбдссбсд 1380
дссбсббсдс сдддддсдсб ссдбсббсдб ссббсббссб бсбсаасадб ссаасдасдб 1440
бсссбадсса ддддббсбса бссбсаадбб бсббдабсбб сббдббддсб сдссддадаб 1500
ссббсбсдад сбббсдссбд ббсббссббб ссбсбассса сбдббсдадд абсбссбсбс 1560
бсбссббсда ддбсадссбб дсдасддббб ддсбсабссб дадассдддд адсббсдасд 1620
абсбсббабс бсбссбаадд аддааддадс бсбсдаасдс ссссссддсб ссбсдда 1677
<210> 8 <211> 214 <212> Белок <213> Вирус гепатита Б <400> 8
Меб 1 Бег О1п ТЪг Уа1 5 А1а Агд Беи ТЪг Бег 10 Буз О1и Агд О1и О1и 15 11е
Беи О1и О1п Тгр Уа1 О1и О1и Агд Буз Азп Агд Агд Буз Беи О1и Буз
20 25 30
Азр Беи Агд Агд А1а Азп Буз Буз 11е Буз Буз Беи О1и Азр О1и Азп
35 40 45
Рго Тгр Беи О1у Азп Уа1 Уа1 О1у Беи Беи Агд Агд Буз Буз Азр О1и
50 55 60
Азр О1у А1а Рго Рго А1а Буз Агд Рго Агд О1п О1и ТЪг Меб О1и Уа1
65 70 75 80
Азр Бег О1у Рго О1у Агд Буз Рго Буз А1а Агд О1у РЪе ТЪг Азр О1п
85 90 95
О1и Агд Агд Азр Ηΐ3 Агд Агд Агд Буз А1а Беи О1и Азп Буз Буз Буз
100 105 110
О1п Беи А1а О1у О1у О1у Буз Н1з Беи Бег О1п О1и О1и О1и О1и О1и
115 120 125
Беи Агд Агд Беи А1а Агд Азр Азр Азр О1и Агд О1и Агд Агд ТЪг А1а
130 135 140
О1у Рго Агд Рго О1у О1у Уа1 Азп Рго Меб Азр О1у Рго Рго Агд О1у
145 150 155 160
А1а Рго О1у О1у О1у РЪе Уа1 Рго Бег Беи О1п О1у Уа1 Рго О1и Бег
- 45 030381
165 170 175
Рго РЬе Зег Агд ТЬг О1у О1и О1у 11е Азр 11е Агд О1у ТЬг О1п О1п 180 185 190
РЬе Рго Тгр Туг О1у РЬе ТЬг Рго Рго Рго Рго О1у Туг Туг Тгр Уа1 195 200 205
Рго О1у Суз ТЬг О1п О1п 210 <210> 9 <211> 195 <212> Белок <213> Вирус гепатита Ό <400> 9
МеЬ 1 Зег О1п ТЬг Уа1 5 А1а Агд Ьеи ТЬг Зег 10 Ьуз О1и Агд О1и О1и 15 11е
Ьеи О1и О1п Тгр Уа1 О1и О1и Агд Ьуз Азп Агд Агд Ьуз Ьеи О1и Ьуз
20 25 30
Азр Ьеи Агд Агд А1а Азп Ьуз Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр О1и Азп
35 40 45
Рго Тгр Ьеи О1у Азп Уа1 Уа1 О1у Ьеи Ьеи Агд Агд Ьуз Ьуз Азр О1и
50 55 60
Азр О1у А1а Рго Рго А1а Ьуз Агд Рго Агд О1п О1и ТЬг МеЬ О1и Уа1
65 70 75 80
Азр Зег О1у Рго О1у Агд Ьуз Рго Ьуз А1а Агд О1у РЬе ТЬг Азр О1п
85 90 95
О1и Агд Агд Азр Ηΐ3 Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1и Азп Ьуз Ьуз Ьуз
100 105 110
О1п Ьеи А1а О1у О1у О1у Ьуз Н1з Ьеи Зег О1п О1и О1и О1и О1и О1и
115 120 125
Ьеи Агд Агд Ьеи А1а Агд Азр Азр Азр О1и Агд О1и Агд Агд ТЬг А1а
130 135 140
О1у Рго Агд Рго О1у О1у Уа1 Азп Рго МеЬ Азр О1у Рго Рго Агд О1у
145 150 155 160
А1а Рго О1у О1у О1у РЬе Уа1 Рго Зег Ьеи О1п О1у Уа1 Рго О1и Зег
- 46 030381
165 170 175
Рго РЬе Зег Агд ТЬг О1у О1и О1у 11е Азр 11е Агд О1у ТЬг О1п О1п 180 185 190
РНе Рго Тгр 195 <210> 10 <211> 140 <212> Белок <213> Искуственный <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 10
Азп 1 О1у Агд Ьуз Ьуз 5 Ьеи О1и Азр
Ьуз Ьуз Ьуз 11е 20 Ьуз Ьуз Ьеи О1и
11е Ьуз О1у 35 11е Ьеи О1у Ьуз Ьуз 40
Рго А1а 50 Ьуз Агд А1а Агд ТЬг 55 Азр
О1у 65 Ьуз Агд Рго Ьеи Агд 70 О1у О1у
Нчз Агд Агд Агд Ьуз 85 А1а Ьеи О1и
О1у О1у Ьуз Нчз 100 Ьеи Зег Ьуз О1и
ТЬг О1и О1и 115 Азр О1и Агд Агд О1и 120
О1у О1у 130 Уа1 Азп Рго Ьеи О1и 135 О1у
Ьеи О1и 10 Агд Азр Ьеи Агд Ьуз 15 11е
Азр 25 О1и Азп Рго Тгр Ьеи 30 О1у Азп
Азр Ьуз Азр О1у О1и 45 О1у А1а Рго
О1п Меб О1и 11е 60 Азр Зег О1у Рго
РЬе Зег Азр 75 Ьуз О1и Агд О1п Азр 80
Азп Ьуз 90 Агд Ьуз О1п Ьеи А1а 95 А1а
О1и 105 О1и О1и О1и Ьеи Ьуз 110 Агд Ьеи
Агд Агд ТЬг А1а О1у 125 Рго Зег Уа1
О1у Зег Агд О1у
<210> 11
<211> 6
<212> Белок
<213> Искуственный
<220>
140
- 47 030381 <223> Синтетическая конструкция <400> 11
МеЕ А1а Азр О1и А1а Рго
5 <210> 12 <211> 152 <212> Белок <213> Искуственный <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 12
МеЕ 1 А1а Азр О1и А1а 5 Рго Азп О1у
Агд Азр Ьей Агд 20 Ьуз 11е Ьуз Ьуз
Азп Рго Тгр 35 Ьей О1у Азп 11е Ьуз 40
Азр О1у 50 О1и О1у А1а Рго Рго 55 А1а
О1и 65 11е Азр Бег О1у Рго 70 О1у Ьуз
Азр Ьуз О1и Агд О1п 85 Азр Нчз Агд
Агд Ьуз О1п Ьей 100 А1а А1а О1у О1у
О1и О1и Ьей 115 Ьуз Агд Ьей Тйг О1и 120
Тйг А1а 130 О1у Рго Бег Уа1 О1у 135 О1у
Агд Ьуз 10 Ьуз Ьей О1и Азр Ьей 15 О1и
Ьуз 25 11е Ьуз Ьуз Ьей О1и 30 Азр О1и
О1у 11е Ьей О1у Ьуз 45 Ьуз Азр Ьуз
Ьуз Агд А1а Агд 60 Тйг Азр О1п МеЕ
Агд Рго Ьей 75 Агд О1у О1у Рйе Бег 80
Агд Агд 90 Ьуз А1а Ьей О1и Азп 95 Ьуз
Ьуз 105 Нчз Ьей Бег Ьуз О1и 110 О1и О1и
О1и Азр О1и Агд Агд 125 О1и Агд Агд
Уа1 Азп Рго Ьей О1и О1у О1у Бег
140
Агд О1у Нчз Нчз 145
Нтз Нтз Нтз
Нтз <210> 13 <211> 89 <212> Белок <213> Бассйаготусез сегеччзтае
150
- 48 030381 <400> 13
Меб 1 Агд РДе Рго Зег 5 11е РДе ТДг А1а Уа1 10 Ьеи РДе А1а А1а Зег 15 Зег
А1а Зег А1а А1а Рго Уа1 Азп ТДг ТДг ТДг О1и Азр О1и ТДг А1а О1п
20 25 30
11е Рго А1а О1и А1а Уа1 11е О1у Туг Ьеи Азр Ьеи О1и О1у Азр РДе
35 40 45
Азр Уа1 А1а Уа1 Ьеи Рго РДе Зег Азп Зег ТДг Азп Азп О1у Ьеи Ьеи
50 55 60
РДе 11е Азп ТДг ТДг 11е А1а Зег 11е А1а А1а Ьуз О1и О1и О1у Уа1
65 70 75 80
Зег Ьеи Азр Ьуз Агд О1и А1а О1и А1а
85
<210> 14
<211> 89
<212> Белок
<213> ЗассДаготусез сегечизтае
<400> 14
Меб Агд РДе Рго Зег 11е РДе ТДг А1а Уа1 Ьеи РДе А1а А1а Зег Зег
1 5 10 15
А1а Ьеи А1а А1а Рго Уа1 Азп ТДг ТДг ТДг О1и Азр О1и ТДг А1а О1п
20 25 30
11е Рго А1а О1и А1а Уа1 11е О1у Туг Ьеи Азр Ьеи О1и О1у Азр РДе
35 40 45
Азр Уа1 А1а Уа1 Ьеи Рго РДе Зег Азп Зег ТДг Азп Азп О1у Ьеи Ьеи
50 55 60
РДе 11е Азп ТДг ТДг 11е А1а Зег 11е А1а А1а Ьуз О1и О1и О1у Уа1
65 70 75 80
Зег Ьеи Азр Ьуз Агд О1и А1а О1и А1а
<210> 15 85
<211> 235
<212> Белок
<213> Искусственный
<220>
- 49 030381 <223> Синтетическая конструкция <400> 15
Меб 1 Агд РЪе Рго Зег 5 11е РЪе ТЪг А1а Уа1 10 Ьеи РЪе А1а А1а Зег 15 Зег
А1а Зег А1а А1а Рго Уа1 Азп ТЪг ТЪг ТЪг О1и Азр О1и ТЪг А1а О1п
20 25 30
11е Рго А1а О1и А1а Уа1 11е О1у Туг Ьеи Азр Ьеи О1и О1у Азр РЪе
35 40 45
Азр Уа1 А1а Уа1 Ьеи Рго РЪе Зег Азп Зег ТЪг Азп Азп О1у Ьеи Ьеи
50 55 60
РЪе 11е Азп ТЪг ТЪг 11е А1а Зег 11е А1а А1а Ьуз О1и О1и О1у Уа1
65 70 75 80
Зег Ьеи Азр Ьуз Агд О1и А1а О1и А1а Азп О1у Агд Ьуз Ьуз Ьеи О1и
85 90 95
Азр Ьеи О1и Агд Азр Ьеи Агд Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьеи
100 105 110
О1и Азр О1и Азп Рго Тгр Ьеи О1у Азп 11е Ьуз О1у 11е Ьеи О1у Ьуз
115 120 125
Ьуз Азр Ьуз Азр О1у О1и О1у А1а Рго Рго А1а Ьуз Агд А1а Агд ТЪг
130 135 140
Азр О1п Меб О1и 11е Азр Зег О1у Рго О1у Ьуз Агд Рго Ьеи Агд О1у
145 150 155 160
О1у РЪе Зег Азр Ьуз О1и Агд О1п Азр Нбз Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи
165 170 175
О1и Азп Ьуз Агд Ьуз О1п Ьеи А1а А1а О1у О1у Ьуз Нбз Ьеи Зег Ьуз
180 185 190
О1и О1и О1и О1и О1и Ьеи Ьуз Агд Ьеи ТЪг О1и О1и Азр О1и Агд Агд
195 200 205
О1и Агд Агд ТЪг А1а О1у Рго Зег Уа1 О1у О1у Уа1 Азп Рго Ьеи О1и
210 215 220
О1у О1у Зег Агд О1у Нбз Нтз Нтз Нтз Нтз Нбз
225 230 235
- 50 030381 <210> 16 <211> 420 <212> Белок <213> Искусственный <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 16
Азп 1 О1у Агд Ьуз Ьуз 5 Ьеи О1и Азр
Ьуз Ьуз Ьуз 11е 20 Ьуз Ьуз Ьеи О1и
11е Ьуз О1у 35 11е Ьеи О1у Ьуз Ьуз 40
Рго А1а 50 Ьуз Агд А1а Агд ТЬг 55 Азр
О1у 65 Ьуз Агд Рго Ьеи Агд 70 О1у О1у
Нчз Агд Агд Агд Ьуз 85 А1а Ьеи О1и
О1у О1у Ьуз Нчз 100 Ьеи Зег Ьуз О1и
ТЬг О1и О1и 115 Азр О1и Агд Агд О1и 120
О1у О1у 130 Уа1 Азп Рго Ьеи О1и 135 О1у
Ьуз 145 Ьуз А1а О1и О1и Ьеи 150 О1и Агд
11е Ьуз Агд Ьеи О1и 165 Азр Азр Азп
11е 11е Агд Ьуз 180 О1у Ьуз Азр О1у
А1а Агд ТЬг 195 Азр О1п Ме5 О1и Уа1 200
Ьеи О1и 10 Агд Азр Ьеи Агд Ьуз 15 11е
Азр 25 О1и Азп Рго Тгр Ьеи 30 О1у Азп
Азр Ьуз Азр О1у О1и 45 О1у А1а Рго
О1п Ме5 О1и 11е 60 Азр Зег О1у Рго
РЬе Зег Азр 75 Ьуз О1и Агд О1п Азр 80
Азп Ьуз 90 Агд Ьуз О1п Ьеи А1а 95 А1а
О1и 105 О1и О1и О1и Ьеи Ьуз 110 Агд Ьеи
Агд Агд ТЬг А1а О1у 125 Рго Зег Уа1
О1у Зег Агд О1у 140 Уа1 Зег ТЬг Агд
Азр Ьеи Агд 155 Ьуз А1а Агд Ьуз ТЬг 160
Рго Тгр 170 Ьеи О1у Азп 11е Ьеи 175 О1у
О1и 185 О1у А1а Рго Рго А1а 190 Ьуз Агд
Азр Зег О1у Рго Агд 205 Ьуз Ьуз Рго
- 51 030381
Няз Ьуз 210 Зег О1у РЬе ТЬг Азр 215 Ьуз О1и Агд О1п Азр 220 Няз Агд Агд Агд
Ьуз А1а Ьеи О1п Азп Ьуз Ьуз Азп О1п Ьеи Зег А1а О1у О1у Ьуз Зег
225 230 235 240
Ьеи Зег Ьуз О1и О1и О1и О1и О1и Ьеи Агд Агд Ьеи ТЬг 11е О1и Азр
245 250 255
Азр О1и Агд О1п Агд Агд Уа1 А1а О1у Рго Агд Уа1 О1у Азр Уа1 Азп
260 265 270
Рго Рго О1у О1у Зег Рго Агд О1у Уа1 О1и О1и Агд Ьуз Азп Агд Агд
275 280 285
Ьуз Ьеи О1и Ьуз Азр Ьеи Агд Агд А1а Азп Ьуз Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьеи
290 295 300
О1и Азр О1и Азп Рго Тгр Ьеи О1у Азп Уа1 Уа1 О1у Ьеи Ьеи Агд Агд
305 310 315 320
Ьуз Ьуз Азр О1и Азр О1у А1а Рго Рго А1а Ьуз Агд Рго Агд О1п О1и
325 330 335
ТЬг Ме+ О1и Уа1 Азр Зег О1у Рго О1у Агд Ьуз Рго Ьуз А1а Агд О1у
340 345 350
РЬе ТЬг Азр О1п О1и Агд Агд Азр Няз Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1и
355 360 365
Азп Ьуз Ьуз Ьуз О1п Ьеи А1а О1у О1у О1у Ьуз Няз Ьеи Зег О1п О1и
370 375 380
О1и О1и О1и О1и Ьеи Агд Агд Ьеи А1а Агд Азр Азр Азр О1и Агд О1и
385 390 395 400
Агд Агд ТЬг А1а О1у Рго Агд Рго О1у О1у Уа1 Азп Рго Ме+ Азр О1у
405 410 415
Рго Рго ι Агд О1у 420
<210> 17
<211> 432
<212> Белок
<213> Искуственный
<220>
<223> Синтетическая конструкция
- 52 030381 <400> 17
Меб 1 А1а Азр О1и А1а 5 Рго Азп О1у Агд Ьуз 10 Ьуз Ьеи О1и Азр Ьеи 15 О1и
Агд Азр Ьеи Агд Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр О1и
20 25 30
Азп Рго Тгр Ьеи О1у Азп 11е Ьуз О1у 11е Ьеи О1у Ьуз Ьуз Азр Ьуз
35 40 45
Азр О1у О1и О1у А1а Рго Рго А1а Ьуз Агд А1а Агд ТЬг Азр О1п Меб
50 55 60
О1и 11е Азр Зег О1у Рго О1у Ьуз Агд Рго Ьеи Агд О1у О1у РЬе Зег
65 70 75 80
Азр Ьуз О1и Агд О1п Азр Н1з Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1и Азп Ьуз
85 90 95
Агд Ьуз О1п Ьеи А1а А1а О1у О1у Ьуз Н1з Ьеи Зег Ьуз О1и О1и О1и
100 105 110
О1и О1и Ьеи Ьуз Агд Ьеи ТЬг О1и О1и Азр О1и Агд Агд О1и Агд Агд
115 120 125
ТЬг А1а О1у Рго Зег Уа1 О1у О1у Уа1 Азп Рго Ьеи О1и О1у О1у Зег
130 135 140
Агд О1у Уа1 Зег ТЬг Агд Ьуз Ьуз А1а О1и О1и Ьеи О1и Агд Азр Ьеи
145 150 155 160
Агд Ьуз А1а Агд Ьуз ТЬг 11е Ьуз Агд Ьеи О1и Азр Азр Азп Рго Тгр
165 170 175
Ьеи О1у Азп 11е Ьеи О1у 11е 11е Агд Ьуз О1у Ьуз Азр О1у О1и О1у
180 185 190
А1а Рго Рго А1а Ьуз Агд А1а Агд ТЬг Азр О1п Меб О1и Уа1 Азр Зег
195 200 205
О1у Рго Агд Ьуз Ьуз Рго Н1з Ьуз Зег О1у РЬе ТЬг Азр Ьуз О1и Агд
210 215 220
О1п Азр Нгз Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1п Азп Ьуз Ьуз Азп О1п Ьеи
225 230 235 240
- 53 030381
Зег А1а О1у О1у Ьуз 245 Зег Ьеи Зег Ьуз О1и О1и О1и О1и О1и Ьеи Агд
250 255
Агд Ьеи ТЬг 11е О1и Азр Азр О1и Агд О1п Агд Агд Уа1 А1а О1у Рго
260 265 270
Агд Уа1 О1у Азр Уа1 Азп Рго Рго О1у О1у Зег Рго Агд О1у Уа1 О1и
275 280 285
О1и Агд Ьуз Азп Агд Агд Ьуз Ьеи О1и Ьуз Азр Ьеи Агд Агд А1а Азп
290 295 300
Ьуз Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр О1и Азп Рго Тгр Ьеи О1у Азп Уа1
305 310 315 320
Уа1 О1у Ьеи Ьеи Агд Агд Ьуз Ьуз Азр О1и Азр О1у А1а Рго Рго А1а
325 330 335
Ьуз Агд Рго Агд О1п О1и ТЬг Меб О1и Уа1 Азр Зег О1у Рго О1у Агд
340 345 350
Ьуз Рго Ьуз А1а Агд О1у РЬе ТЬг Азр О1п О1и Агд Агд Азр Шз Агд
355 360 365
Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1и Азп Ьуз Ьуз Ьуз О1п Ьеи А1а О1у О1у О1у
370 375 380
Ьуз Ηίδ Ьеи Зег О1п О1и О1и О1и О1и О1и Ьеи Агд Агд Ьеи А1а Агд
385 390 395 400
А3р Азр Азр О1и Агд О1и Агд Агд ТЬг А1а О1у Рго Агд Рго О1у О1у
405 410 415
Уа1 Азп Рго Меб Азр О1у Рго Рго Агд 425 О1у Шз
420
<210> 18
<211> 515
<212> Белок
<213> Искуственный
<220>
<223> Синтетическая : конструкция
<400> 18
Меб Агд РЬе Рго Зег 11е РЬе ТЬг А1а Уа1 Ьеи
1 5 10
Ηίδ Ηίδ Ηίδ
430
РЬе А1а А1а
Ηίδ
Ηίδ
Зег
Зег
А1а Зег А1а А1а Рго Уа1 Азп ТЬг ТЬг ТЬг О1и Азр О1и ТЬг А1а О1п
- 54 030381
25 30
11е Рго А1а О1и 35 А1а Уа1 11е О1у Туг 40 Ьеи Азр Ьеи О1и 45 О1у Азр РЬе
Азр Уа1 А1а Уа1 Ьеи Рго РЬе Зег Азп Зег ТЬг Азп Азп О1у Ьеи Ьеи
50 55 60
РЬе 11е Азп ТЬг ТЬг 11е А1а Зег 11е А1а А1а Ьуз О1и О1и О1у Уа1
65 70 75 80
Зег Ьеи Азр Ьуз Агд О1и А1а О1и А1а Азп О1у Агд Ьуз Ьуз Ьеи О1и
85 90 95
Азр Ьеи О1и Агд Азр Ьеи Агд Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьеи
100 105 110
О1и Азр О1и Азп Рго Тгр Ьеи О1у Азп 11е Ьуз О1у 11е Ьеи О1у Ьуз
115 120 125
Ьуз Азр Ьуз Азр О1у О1и О1у А1а Рго Рго А1а Ьуз Агд А1а Агд ТЬг
130 135 140
Азр О1п Меб О1и 11е Азр Зег О1у Рго О1у Ьуз Агд Рго Ьеи Агд О1у
145 150 155 160
О1у РЬе Зег Азр Ьуз О1и Агд О1п Азр Нйз Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи
165 170 175
О1и Азп Ьуз Агд Ьуз О1п Ьеи А1а А1а О1у О1у Ьуз Нйз Ьеи Зег Ьуз
180 185 190
О1и О1и О1и О1и О1и Ьеи Ьуз Агд Ьеи ТЬг О1и О1и Азр О1и Агд Агд
195 200 205
О1и Агд Агд ТЬг А1а О1у Рго Зег Уа1 О1у О1у Уа1 Азп Рго Ьеи О1и
210 215 220
О1у О1у Зег Агд О1у Уа1 Зег ТЬг Агд Ьуз Ьуз А1а О1и О1и Ьеи О1и
225 230 235 240
Агд Азр Ьеи Агд Ьуз А1а Агд Ьуз ТЬг 11е Ьуз Агд Ьеи О1и Азр Азр
245 250 255
Азп Рго Тгр Ьеи О1у Азп 11е Ьеи О1у 11е 11е Агд Ьуз О1у Ьуз Азр
260 265 270
- 55 030381
О1у О1и О1у А1а 275 Рго Рго А1а Ьуз 280 Агд А1а Агд ТЪг Азр 285 О1п МеЬ О1и
Уа1 Азр Зег О1у Рго Агд Ьуз Ьуз Рго Нгз Ьуз Зег О1у РЪе ТЪг Азр
290 295 300
Ьуз О1и Агд О1п Азр Нгз Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1п Азп Ьуз Ьуз
305 310 315 320
Азп О1п Ьеи Зег А1а О1у О1у Ьуз Зег Ьеи Зег Ьуз О1и О1и О1и О1и
325 330 335
О1и Ьеи Агд Агд Ьеи ТЪг 11е О1и Азр Азр О1и Агд О1п Агд Агд Уа1
340 345 350
А1а О1у Рго Агд Уа1 О1у Азр Уа1 Азп Рго Рго О1у О1у Зег Рго Агд
355 360 365
О1у Уа1 О1и О1и Агд Ьуз Азп Агд Агд Ьуз Ьеи О1и Ьуз Азр Ьеи Агд
370 375 380
Агд А1а Азп Ьуз Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр О1и Азп Рго Тгр Ьеи
385 390 395 400
О1у Азп Уа1 Уа1 О1у Ьеи Ьеи Агд Агд Ьуз Ьуз Азр О1и Азр О1у А1а
405 410 415
Рго Рго А1а Ьуз Агд Рго Агд О1п О1и ТЪг МеЬ О1и Уа1 Азр Зег О1у
420 425 430
Рго О1у Агд Ьуз Рго Ьуз А1а Агд О1у РЪе ТЪг Азр О1п О1и Агд Агд
435 440 445
Азр Нгз Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1и Азп Ьуз Ьуз Ьуз О1п Ьеи А1а
450 455 460
О1у О1у О1у Ьуз Нгз Ьеи Зег О1п О1и О1и О1и О1и О1и Ьеи Агд Агд
465 470 475 480
Ьеи А1а Агд Азр Азр Азр О1и Агд О1и Агд Агд ТЪг А1а О1у Рго Агд
485 490 495
Рго О1у О1у Уа1 Азп Рго МеЬ Азр О1у Рго Рго Агд О1у Нгз Нгз Нгз
500 505 510
Нгз Нгз Нгз
515
- 56 030381
<210> <211> <212> <213> <400> Ьуз Ьеи 1 19 9 Белок Вирус гепатита Ό
19 Азп
ί О1и Азр О1и 5
<210> 20
<211> 9
<212> Белок
<213> Вирус гепатита Ό
<400> 20
Ьуз Ьеи О1и Азр Ьеи О1и
1 5
<210> 21
<211> 16
<212> Белок
<213> Вирус гепатита Ό
<400> 21
Ьуз Ьеи О1и Азр Ьеи О1и
1 5
<210> 22
<211> 16
<212> Белок
<213> Вирус гепатита Ό
<400> 22
Тгр Ьеи О1у Азп 11е Ьуз
1 5
<210> 23
<211> 16
<212> Белок
<213> Вирус гепатита Ό
<400> 23
А1а О1у А1а Рго Рго А1а
1 5
<210> 24
<211> 16
<212> Белок
<213> Вирус гепатита Ό
<400> 24
Рго
Агд
Агд
О1у
Ьуз
Тгр
Азр
Азр
11е
Агд
Ьеи
Ьеи
Ьеи Агд Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьуз 11е 10 15
Ьеи О1у Ьуз Ьуз Азр Ьуз Азр О1у 10 15
А1а Агд ТЬг Азр О1п МеЬ О1и 11е 10 15
- 57 030381
А1а Агд ТЬг Азр О1п Меб О1и 11е Азр Зег О1у Рго О1у Ьуз Агд Рго
1 5 10 15
<210> 25
<211> 16
<212> Белок
<213> Вирус гепатита Ό
<400> 25
Ьуз А1а . Ьеи О1и Азп Ьуз Агд Ьуз О1п Ьеи А1а А1а О1у О1у Ьуз Нбз
1 5 10 15
<210> 26
<211> 32
<212> Белок
<213> Вирус гепатита Ό
<400> 26
Ьеи Зег Ьуз О1и О1и О1и О1и О1и Ьеи Ьуз Агд Ьеи ТЬг О1и О1и Азр
1 5 10 15
О1и Агд Агд О1и Агд Агд ТЬг А1а О1у Рго Зег Уа1 О1у О1у Уа1 Азп
20 25 30
<210> 27
<211> 10
<212> Белок
<213> Вирус гепатита Ό
<400> 27
А1а О1у А1а Рго Рго А1а Ьуз Агд А1а Агд
5 10 <210> 28 <211> 204 <212> Белок <213> Искуственный <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 28
Меб 1 Зег Агд Зег О1и 5 Зег Ьуз Агд Азп Агд Азр 10 О1у Агд О1и О1у 15 11е
Ьеи О1и О1п Тгр Уа1 Азп О1у Агд Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр Ьеи О1и Агд
20 25 30
Азр Ьеи Агд Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр О1и Азп
35 40 45
- 58 030381
Рго Тгр 50 Ьеи О1у Азп 11е Ьуз 55 О1у 11е Ьеи О1у Ьуз 60 Ьуз Азр Ьуз Азр
О1у ТЬг Азр О1п МеС О1и 11е Азр Бег О1у Рго О1у Ьуз Агд Рго Ьеи
65 70 75 80
Агд О1у О1у РЬе Бег Азр Ьуз О1и Агд О1п Азр Нчз Агд Агд Агд Ьуз
85 90 95
А1а Ьеи О1и Азп Ьуз Агд Ьуз О1п Ьеи А1а А1а О1у О1у Ьуз Нчз Ьеи
100 105 110
Бег Ьуз О1и О1и О1и О1и О1и Ьеи Ьуз Агд Ьеи ТЬг О1и О1и Азр О1и
115 120 125
Агд Агд О1и Агд Агд ТЬг А1а О1у Рго Бег Уа1 О1у О1у Уа1 Азп Рго
130 135 140
Ьеи О1и О1у О1у Бег Агд О1у А1а Рго О1у О1у О1у РЬе Уа1 Рго Азп
145 150 155 160
МеС Ьеи Бег Уа1 Рго О1и Бег Рго РЬе Бег Агд ТЬг О1у О1и О1у Ьеи
165 170 175
Азр Уа1 Агд О1у Азп О1п О1у РЬе Рго Тгр Азр 11е Ьеи РЬе Рго А1а
180 185 190
Азр Рго Рго РЬе Бег Рго О1п Бег Суз Агд Рго О1п
195 200
<210> 29 <211> 677 <212> ДНК <213> Искуственный <220>
<223> Синтетическая конструкция <220>
<221> Кодирующая последовательность <222> (13)..(669) <400> 29 дааССсдсса сс аСд дсС дас даа дсС ссС асС адС аСд адС ада СсС даа 51
МеС А1а Азр О1и А1а Рго ТЬг Бег МеС Бег Агд Бег О1и 1 5 10
Сса Бег аад Ьуз 15 ада Агд ааС Азп ада Агд даС Азр ддс О1у 20 ада Агд дад О1и ддС О1у аСС 11е сСа Ьеи 25 даа О1и саа О1п Сдд Тгр дСд Уа1 99
ааС ддС ада аад ааа ССа дад дас сСс даа сдС дас сСС ада аад аСС 147
- 59 030381
Азп О1у 30 Агд Ьуз Ьуз Ьеи 35 О1и Азр Ьеи О1и Агд Азр 40 Ьеи Агд Ьуз 11е 45
аад аад ааа а+с ааа аад с+с даа да+ даа аас сса +дд с+а ддс аа+ 195
Ьуз Ьуз Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр О1и Азп Рго Тгр Ьеи О1у Азп
50 55 60
а+с ааа дд+ а+с ++а дд+ ааа аад да+ ааа дас дд+ аса да+ саа а+д 243
11е Ьуз О1у 11е Ьеи О1у Ьуз Ьуз Азр Ьуз Азр О1у ТЪг Азр О1п Ме+
65 70 75
даа а++ да+ +с+ ддс сса ддс ааа ада сс+ ++а ада дд+ дда ++с +с+ 291
О1и 11е Азр Бег О1у Рго О1у Ьуз Агд Рго Ьеи Агд О1у О1у РЪе Бег
80 85 90
да+ ааа дад ада саа да+ са+ адд сда сд+ ааа дсс с+а даа аа+ аад 339
Азр Ьуз О1и Агд О1п Азр Нчз Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1и Азп Ьуз
95 100 105
ада ааа сад ++д дс+ дса ддд ддс аад са+ ++д +са аад дад дад даа 387
Агд Ьуз О1п Ьеи А1а А1а О1у О1у Ьуз Нчз Ьеи Бег Ьуз О1и О1и О1и
110 115 120 125
дад даа ++д ааа ада ++д ас+ даа дад да+ даа сд+ ада даа ада сд+ 435
О1и О1и Ьеи Ьуз Агд Ьеи ТЪг О1и О1и Азр О1и Агд Агд О1и Агд Агд
130 135 140
аса дсд дд+ сс+ +са д+с ддс дд+ д++ аас сса ++а даа дд+ дд+ +са 483
ТЪг А1а О1у Рго Бег Уа1 О1у О1у Уа1 Азп Рго Ьеи О1и О1у О1у Бег
145 150 155
ада дда дса сс+ дда дда дда ++с д+а сса аас а+д ++д +сс д++ сса 531
Агд О1у А1а Рго О1у О1у О1у РЪе Уа1 Рго Азп Ме+ Беи Бег Уа1 Рго
160 165 170
даа адс сса +++ +сс ада асс ддд даа ддд с+д дас д++ ада дд+ аа+ 579
О1и Бег Рго РЪе Бег Агд ТЪг О1у О1и О1у Ьеи Азр Уа1 Агд О1у Азп
175 180 185
саа дда +++ сса +дд да+ а+а с++ +++ сса дса да+ сса сса +++ +с+ 627
О1п О1у РЪе Рго Тгр Азр 11е Ьеи РЪе Рго А1а Азр Рго Рго РЪе Бег
190 195 200 205
сс+ саа +с+ +д+ адд сс+ сад сас са+ са+ сас са+ сас +ад дсддссдс 677
Рго О1п Бег Суз Агд Рго О1п Нчз Нчз Нчз Нчз Нчз Нчз
210 215 <210> 30 <211> 218 <212> Белок <213> Искуственный <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 30
Ме+ А1а Азр О1и А1а Рго ТЪг Бег Ме+ Бег Агд Бег О1и Бег Ьуз Агд
1 5 10 15
Азп Агд Азр О1у Агд О1и О1у 11е Ьеи О1и О1п Тгр Уа1 Азп О1у Агд
- 60 030381
20 25 30
Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр Ьеи О1и Агд Азр Ьеи Агд Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьуз
35 40 45
11е Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр О1и Азп Рго Тгр Ьеи О1у Азп 11е Ьуз О1у
50 55 60
11е Ьеи О1у Ьуз Ьуз Азр Ьуз Азр О1у ТЬг Азр О1п МеЬ О1и 11е Азр
65 70 75 80
Зег О1у Рго О1у Ьуз Агд Рго Ьеи Агд О1у О1у РЬе Зег Азр Ьуз О1и
85 90 95
Агд О1п Азр Нчз Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1и Азп Ьуз Агд Ьуз О1п
100 105 110
Ьеи А1а А1а О1у О1у Ьуз Нчз Ьеи Зег Ьуз О1и О1и О1и О1и О1и Ьеи
115 120 125
Ьуз Агд Ьеи ТЬг О1и О1и Азр О1и Агд Агд О1и Агд Агд ТЬг А1а О1у
130 135 140
Рго Зег Уа1 О1у О1у Уа1 Азп Рго Ьеи О1и О1у О1у Зег Агд О1у А1а
145 150 155 160
Рго О1у О1у О1у РЬе Уа1 Рго Азп МеЬ Ьеи Зег Уа1 Рго О1и Зег Рго
165 170 175
РЬе Зег Агд ТЬг О1у О1и О1у Ьеи Азр Уа1 Агд О1у Азп О1п О1у РЬе
180 185 190
Рго Тгр Азр 11е Ьеи РЬе Рго А1а Азр Рго Рго РЬе Зег Рго О1п Зег
195 200 205
Суз Агд Рго О1п Нчз Нчз Нчз Нчз Нчз Нчз
210 215 <210> 31 <211> 214 <212> Белок <213> Искуственный <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 31
МеЬ Зег Агд Зег О1и Зег Ьуз Агд Азп Агд Азр О1у Агд О1и О1у 11е
1 5 10 15
- 61 030381
Ьеи О1и О1п Тгр Уа1 Азп О1у Агд Ьуз 25 Ьуз Ьеи О1и Азр Ьеи 30 О1и Агд
20
Азр Ьеи Агд Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр О1и Азп
35 40 45
Рго Тгр Ьеи О1у Азп 11е Ьуз О1у 11е Ьеи О1у Ьуз Ьуз Азр Ьуз Азр
50 55 60
О1у А1а О1у А1а Рго Рго А1а Ьуз Агд А1а Агд ТДг Азр О1п Меб О1и
65 70 75 80
11е Азр Зег О1у Рго О1у Ьуз Агд Рго Ьеи Агд О1у О1у РДе Зег Азр
85 90 95
Ьуз О1и Агд О1п Азр Няз Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1и Азп Ьуз Агд
100 105 110
Ьуз О1п Ьеи А1а А1а О1у О1у Ьуз Няз Ьеи Зег Ьуз О1и О1и О1и О1и
115 120 125
О1и Ьеи Ьуз Агд Ьеи ТДг О1и О1и Азр О1и Агд Агд О1и Агд Агд ТДг
130 135 140
А1а О1у Рго Зег Уа1 О1у О1у Уа1 Азп Рго Ьеи О1и О1у О1у Зег Агд
145 150 155 160
О1у А1а Рго О1у О1у О1у РДе Уа1 Рго Азп Меб Ьеи Зег Уа1 Рго О1и
165 170 175
Зег Рго РДе Зег Агд ТДг О1у О1и О1у Ьеи Азр Уа1 Агд О1у Азп О1п
180 185 190
О1у РДе Рго Тгр Азр 11е Ьеи РДе Рго А1а Азр Рго Рго РДе Зег Рго
195 200 205
О1п Зег Суз Агд Рго О1п
210 <210> 32 <211> 707 <212> ДНК <213> Искуственный <220>
<223> Синтетическая конструкция
- 62 030381 <220>
<221> Кодирующая последовательность <222> (13)..(699) <400> 32 дааббсдсса сс абд дсб дас даа дсб ссб асб адб абд адб ада бсб даа 51
Меб А1а Азр О1и А1а Рго ТЬг Зег Меб Зег Агд Зег О1и 1 5 10
бса Зег аад Ьуз 15 ада Агд ааб Азп ада Агд даб Азр ддс О1у 20 ада Агд дад О1и ддб О1у абб 11е сба Ьеи 25 даа О1и саа О1п бдд Тгр дбд Уа1 99
ааб ддб ада аад ааа бба дад дас сбс даа сдб дас сбб ада аад абб 147
Азп О1у Агд Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр Ьеи О1и Агд Азр Ьеи Агд Ьуз 11е
30 35 40 45
аад аад ааа абс ааа аад сбс даа даб даа аас сса бдд сба ддс ааб 195
Ьуз Ьуз Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр О1и Азп Рго Тгр Ьеи О1у Азп
50 55 60
абс ааа ддб абс бба ддб ааа аад даб ааа дас ддб дсс ддб дсс сса 243
11е Ьуз О1у 11е Ьеи О1у Ьуз Ьуз Азр Ьуз Азр О1у А1а О1у А1а Рго
65 70 75
ссб дсб ааа ада дсб ада аса даб саа абд даа абб даб бсб ддс сса 291
Рго А1а Ьуз Агд А1а Агд ТЬг Азр О1п Меб О1и 11е Азр Зег О1у Рго
80 85 90
ддс ааа ада ссб бба ада ддб дда ббс бсб даб ааа дад ада саа даб 339
О1у Ьуз Агд Рго Ьеи Агд О1у О1у РЬе Зег Азр Ьуз О1и Агд О1п Азр
95 100 105
саб адд сда сдб ааа дсс сба даа ааб аад ада ааа сад ббд дсб дса 387
Нгз Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1и Азп Ьуз Агд Ьуз О1п Ьеи А1а А1а
110 115 120 125
ддд ддс аад саб ббд бса аад дад дад даа дад даа ббд ааа ада ббд 435
О1у О1у Ьуз Нгз Ьеи Зег Ьуз О1и О1и О1и О1и О1и Ьеи Ьуз Агд Ьеи
130 135 140
асб даа дад даб даа сдб ада даа ада сдб аса дсд ддб ссб бса дбс 483
ТЬг О1и О1и Азр О1и Агд Агд О1и Агд Агд ТЬг А1а О1у Рго Зег Уа1
145 150 155
ддс ддб дбб аас сса бба даа ддб ддб бса ада дда дса ссб дда дда 531
О1у О1у Уа1 Азп Рго Ьеи О1и О1у О1у Зег Агд О1у А1а Рго О1у О1у
160 165 170
дда ббс дба сса аас абд ббд бсс дбб сса даа адс сса ббб бсс ада 579
О1у РЬе Уа1 Рго Азп Меб Ьеи Зег Уа1 Рго О1и Зег Рго РЬе Зег Агд
175 180 185
асс ддд даа ддд сбд дас дбб ада ддб ааб саа дда ббб сса бдд даб 627
ТЬг О1у О1и О1у Ьеи Азр Уа1 Агд О1у Азп О1п О1у РЬе Рго Тгр Азр
190 195 200 205
аба сбб ббб сса дса даб сса сса ббб бсб ссб саа бсб бдб адд ссб 675
11е Ьеи РЬе Рго А1а Азр Рго Рго РЬе Зег Рго О1п Зег Суз Агд Рго
210 215 220
сад сас саб саб сас саб сас бад дсддссдс 707
О1п Нгз Нгз Нгз Нгз Нгз Нгз
- 63 030381
225 <210> 33 <211> 228 <212> Белок <213> Искуственный <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 33
МеЬ 1 А1а Азр О1и А1а 5 Рго ТЬг Зег
Азп Агд Азр О1у 20 Агд О1и О1у 11е
Ьуз Ьуз Ьеи 35 О1и Азр Ьеи О1и Агд 40
11е Ьуз 50 Ьуз Ьеи О1и Азр О1и 55 Азп
11е 65 Ьеи О1у Ьуз Ьуз Азр 70 Ьуз Азр
Агд А1а Агд ТЬг Азр 85 О1п МеЬ О1и
Рго Ьеи Агд О1у 100 О1у РЬе Зег Азр
Агд Ьуз А1а 115 Ьеи О1и Азп Ьуз Агд 120
Няз Ьеи 130 Зег Ьуз О1и О1и О1и 135 О1и
Азр 145 О1и Агд Агд О1и Агд 150 Агд ТЬг
Азп Рго Ьеи О1и О1у 165 О1у Зег Агд
Рго Азп МеЬ Ьеи 180 Зег Уа1 Рго О1и
О1у Ьеи Азр 195 Уа1 Агд О1у Азп О1п 200
МеЬ Зег 10 Агд Зег О1и Зег Ьуз 15 Агд
Ьеи 25 О1и О1п Тгр Уа1 Азп 30 О1у Агд
Азр Ьеи Агд Ьуз 11е 45 Ьуз Ьуз Ьуз
Рго Тгр Ьеи О1у 60 Азп 11е Ьуз О1у
О1у А1а О1у 75 А1а Рго Рго А1а Ьуз 80
11е Азр 90 Зег О1у Рго О1у Ьуз 95 Агд
Ьуз 105 О1и Агд О1п Азр Няз 110 Агд Агд
Ьуз О1п Ьеи А1а А1а 125 О1у О1у Ьуз
О1и Ьеи Ьуз Агд 140 Ьеи ТЬг О1и О1и
А1а О1у Рго 155 Зег Уа1 О1у О1у Уа1 160
О1у А1а 170 Рго О1у О1у О1у РЬе 175 Уа1
Зег 185 Рго РЬе Зег Агд ТЬг 190 О1у О1и
О1у РЬе Рго Тгр Азр 205 11е Ьеи РЬе
- 64 030381
Рго А1а Азр Рго Рго РЪе Бег Рго О1п Бег Суз Агд Рго О1п Нчз Нчз 210 215 220
Нчз Нчз Нчз Нчз 225 <210> 34 <211> 408 <212> Белок <213> Искуственный <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 34
МеБ 1 Бег Агд Бег О1и 5 Бег Ьуз Агд
Ьеи О1и С1п Тгр 20 Уа1 Азп О1у Агд
Азр Ьеи Агд 35 Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьуз 40
Рго Тгр 50 Ьеи О1у Азп 11е Ьуз 55 О1у
О1у 65 ТЪг Азр С1п МеБ О1и 70 11е Азр
Агд О1у О1у РЪе Бег 85 Азр Ьуз О1и
А1а Ьеи О1и Азп 100 Ьуз Агд Ьуз С1п
Бег Ьуз О1и 115 О1и О1и О1и О1и Ьеи 120
Агд Агд 130 О1и Агд Агд ТЪг А1а 135 О1у
Ьеи 145 О1и О1у О1у Бег Агд 150 О1у А1а
МеБ Ьеи Бег Уа1 Рго О1и Бег Рго
Азп Агд 10 Азр О1у Агд О1и О1у 15 11е
Ьуз 25 Ьуз Ьеи О1и Азр Ьеи 30 О1и Агд
11е Ьуз Ьуз Ьеи О1и 45 Азр О1и Азп
11е Ьеи О1у Ьуз 60 Ьуз Азр Ьуз Азр
Бег О1у Рго 75 О1у Ьуз Агд Рго Ьеи 80
Агд С1п 90 Азр Нчз Агд Агд Агд 95 Ьуз
Ьеи 105 А1а А1а О1у О1у Ьуз 110 Нчз Ьеи
Ьуз Агд Ьеи ТЪг О1и 125 О1и Азр О1и
Рго Бег Уа1 О1у 140 О1у Уа1 Азп Рго
Рго О1у О1у 155 О1у РЪе Уа1 Рго Азп 160
РЪе Бег 170 Агд ТЪг О1у О1и О1у 175 Ьеи
165
- 65 030381
Азр Уа1 Агд О1у 180 Азп О1п О1у РЬе Рго 185 Тгр Азр 11е Ьеи РЬе 190 Рго А1а
Азр Рго Рго РЬе Зег Рго О1п Зег Суз Агд Рго О1п Меб Зег О1п Зег
195 200 205
О1и Зег Агд Ьуз Зег Агд Агд О1у О1у Агд О1и Азр 11е Ьеи О1и Ьуз
210 215 220
Тгр Уа1 Зег ТЬг Агд Ьуз Ьуз А1а О1и О1и Ьеи О1и Агд Азр Ьеи Агд
225 230 235 240
Ьуз А1а Агд Ьуз ТЬг 11е Ьуз Агд Ьеи О1и Азр Азр Азп Рго Тгр Ьеи
245 250 255
О1у Азп 11е Ьеи О1у 11е 11е Агд Ьуз О1у Ьуз Азр О1у ТЬг Азр О1п
260 265 270
Меб О1и Уа1 Азр Зег О1у Рго Агд Ьуз Ьуз Рго Нчз Ьуз Зег О1у РЬе
275 280 285
ТЬг Азр Ьуз О1и Агд О1п Азр Нчз Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1п Азп
290 295 300
Ьуз Ьуз Азп О1п Ьеи Зег А1а О1у О1у Ьуз Зег Ьеи Зег Ьуз О1и О1и
305 310 315 320
О1и О1и О1и Ьеи Агд Агд Ьеи ТЬг 11е О1и Азр Азр О1и Агд О1п Агд
325 330 335
Агд Уа1 А1а О1у Рго Агд Уа1 О1у Азр Уа1 Азп Рго Рго О1у О1у Зег
340 345 350
Рго Агд О1у А1а Рго О1у О1у О1у РЬе Уа1 Рго О1п Меб ТЬг О1у Уа1
355 360 365
Рго О1и Зег Рго РЬе Зег Агд ТЬг О1у О1и О1у Ьеи Азр 11е Агд О1у
370 375 380
Азр Агд О1у РЬе Рго Тгр Уа1 Азп Рго А1а Рго Рго О1у О1п Агд Ьеи
385 390 395 400
Рго Ьеи Ьеи О1и Суз ТЬг Рго О1п
<210> 35 <211> 1292
405
- 66 030381 <212> ДНК <213> Искуственный <220>
<223> Синтетическая конструкция <220>
<221> Кодирующая последовательность <222> (13)..(1284) <400> 35 дааЕЕсдсса сс аЕд дсЕ дас даа дсЕ ссЕ асЕ адЕ аЕд адЕ ада ЕсЕ даа 51
МеЕ А1а Азр О1и А1а Рго ТНг Бег МеЕ Бег Агд Бег О1и 1 5 10
Еса Бег аад Ьуз 15 ада Агд ааЕ Азп ада Агд даЕ Азр ддс О1у 20 ада Агд дад О1и ддЕ О1у аЕЕ 11е сЕа Ьей 25 даа О1и саа О1п Едд Тгр дЕд Уа1 99
ааЕ ддЕ ада аад ааа ЕЕа дад дас сЕс даа сдЕ дас сЕЕ ада аад аЕЕ 147
Азп О1у Агд Ьуз Ьуз Ьей О1и Азр Ьей О1и Агд Азр Ьей Агд Ьуз 11е
30 35 40 45
аад аад ааа аЕс ааа аад сЕс даа даЕ даа аас сса Едд сЕа ддс ааЕ 195
Ьуз Ьуз Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьей О1и Азр О1и Азп Рго Тгр Ьей О1у Азп
50 55 60
аЕс ааа ддЕ аЕс ЕЕа ддЕ ааа аад даЕ ааа дас ддЕ аса даЕ саа аЕд 243
11е Ьуз О1у 11е Ьей О1у Ьуз Ьуз Азр Ьуз Азр О1у ТНг Азр О1п МеЕ
65 70 75
даа аЕЕ даЕ ЕсЕ ддс сса ддс ааа ада ссЕ ЕЕа ада ддЕ дда ЕЕс ЕсЕ 291
О1и 11е Азр Бег О1у Рго О1у Ьуз Агд Рго Ьей Агд О1у О1у РНе Бег
80 85 90
даЕ ааа дад ада саа даЕ саЕ адд сда сдЕ ааа дсс сЕа даа ааЕ аад 339
Азр Ьуз О1и Агд О1п Азр Нчз Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьей О1и Азп Ьуз
95 100 105
ада ааа сад ЕЕд дсЕ дса ддд ддс аад саЕ ЕЕд Еса аад дад дад даа 387
Агд Ьуз О1п Ьей А1а А1а О1у О1у Ьуз Нчз Ьей Бег Ьуз О1и О1и О1и
110 115 120 125
дад даа ЕЕд ааа ада ЕЕд асЕ даа дад даЕ даа сдЕ ада даа ада сдЕ 435
О1и О1и Ьей Ьуз Агд Ьей ТНг О1и О1и Азр О1и Агд Агд О1и Агд Агд
130 135 140
аса дсд ддЕ ссЕ Еса дЕс ддс ддЕ дЕЕ аас сса ЕЕа даа ддЕ ддЕ Еса 483
ТНг А1а О1у Рго Бег Уа1 О1у О1у Уа1 Азп Рго Ьей О1и О1у О1у Бег
145 150 155
ада ддд дда дса ссЕ дда дда дда ЕЕс дЕа сса аас аЕд ЕЕд Есс дЕЕ 531
Агд О1у О1у А1а Рго О1у О1у О1у РНе Уа1 Рго Азп МеЕ Ьей Бег Уа1
160 165 170
сса даа адс сса ЕЕЕ Есс ада асс ддд даа ддд сЕд дас дЕЕ ада ддЕ 579
Рго О1и Бег Рго РНе Бег Агд ТНг О1у О1и О1у Ьей Азр Уа1 Агд О1у
175 180 185
ааЕ саа дда ЕЕЕ сса Едд даЕ аЕа сЕЕ ЕЕЕ сса дса даЕ сса сса ЕЕЕ 627
Азп О1п О1у РНе Рго Тгр Азр 11е Ьей РНе Рго А1а Азр Рго Рго РНе
190 195 200 205
- 67 030381
бсб Зег ссб Рго саа О1п бсб Зег бдб Суз 210 адд Агд сса Рго сад О1п абд Меб бсб Зег 215 сад О1п бса Зег даа О1и бсс Зег ада Агд 220 ааа Буз 675
аде ада ада ддс дда ада дад даб абб ббд даа ааа бдд дбд бсб асб 723
Зег Агд Агд О1у О1у Агд О1и Азр 11е Беи О1и Буз Тгр Уа1 Зег ТЬг
225 230 235
ада аад ааа дсб дад даа бба даа адд даб сбб ада ааа дсд ада ааа 771
Агд Буз Буз А1а О1и О1и Беи О1и Агд Азр Беи Агд Буз А1а Агд Буз
240 245 250
асе абб ааа ада сбд даа даб даб ааб сса бдд ббд ддс аас абс сба 819
ТЬг 11е Буз Агд Беи О1и Азр Азр Азп Рго Тгр Беи О1у Азп 11е Беи
255 260 265
ддб аба абс ада ааа дда ааа даб ддд аса дас саа абд даа дба даб 867
О1у 11е 11е Агд Буз О1у Буз Азр О1у ТЬг Азр О1п Меб О1и Уа1 Азр
270 275 280 285
бсб дда ссб адд ааа аад ссб саб аад бса ддб ббс асд даб аад даа 915
Зег О1у Рго Агд Буз Буз Рго Нгз Буз Зег О1у РЬе ТЬг Азр Буз О1и
290 295 300
ада саа дас сас ада сдб ада ааа дсб ббд саа аас аад аад аас саа 963
Агд О1п Азр Нгз Агд Агд Агд Буз А1а Беи О1п Азп Буз Буз Азп О1п
305 310 315
сбд бсс дса дда ддс ааа бсб сбс бса ааа дад даа даа даа дад сбд 1011
Беи Зег А1а О1у О1у Буз Зег Беи Зег Буз О1и О1и О1и О1и О1и Беи
320 325 330
адд ада сбб асб аба даа даб дас дад ада саа ада сда дбб дсс ддб 1059
Агд Агд Беи ТЬг 11е О1и Азр Азр О1и Агд О1п Агд Агд Уа1 А1а О1у
335 340 345
сса ада дбб ддб дас дбс ааб сса ссб ддс ддб адб ссб ада дда дсс 1107
Рго Агд Уа1 О1у Азр Уа1 Азп Рго Рго О1у О1у Зег Рго Агд О1у А1а
350 355 360 365
ссб дда ддд ддс ббб дба сса саа абд аса ддб дбс ссб даа бса сса 1155
Рго О1у О1у О1у РЬе Уа1 Рго О1п Меб ТЬг О1у Уа1 Рго О1и Зег Рго
370 375 380
ббс бсб ада асб ддб даа ддб ббд даб абс ада ддб дас ада ддб ббб 1203
РЬе Зег Агд ТЬг О1у О1и О1у Беи Азр 11е Агд О1у Азр Агд О1у РЬе
385 390 395
сса бдд дбд ааб ссб дсб сса сса ддб сад сда бба сса бба ббд даа 1251
Рго Тгр Уа1 Азп Рго А1а Рго Рго О1у О1п Агд Беи Рго Беи Беи О1и
400 405 410
бдс аса ссб саа саб сас саб сас сас саб бад дсддссдс 1292
Суз ТЬг Рго О1п Нгз Нгз Нгз Нгз Нтз Нгз
415 420
<210> 36 <211> 423 <212> Белок <213> Искуственный
- 68 030381 <220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 36
Ме+ 1 А1а Азр О1и А1а 5 Рго ТЬг Зег Ме+ Зег Агд 10 Зег О1и Зег Ьуз 15 Агд
Азп Агд Азр О1у Агд О1и О1у 11е Ьеи О1и О1п Тгр Уа1 Азп О1у Агд
20 25 30
Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр Ьеи О1и Агд Азр Ьеи Агд Ьуз 11е Ьуз Ьуз Ьуз
35 40 45
11е Ьуз Ьуз Ьеи О1и Азр О1и Азп Рго Тгр Ьеи О1у Азп 11е Ьуз О1у
50 55 60
11е Ьеи О1у Ьуз Ьуз Азр Ьуз Азр О1у ТЬг Азр О1п Ме+ О1и 11е Азр
65 70 75 80
Зег О1у Рго О1у Ьуз Агд Рго Ьеи Агд О1у О1у РЬе Зег Азр Ьуз О1и
85 90 95
Агд О1п Азр Нчз Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1и Азп Ьуз Агд Ьуз О1п
100 105 110
Ьеи А1а А1а О1у О1у Ьуз Нчз Ьеи Зег Ьуз О1и О1и О1и О1и О1и Ьеи
115 120 125
Ьуз Агд Ьеи ТЬг О1и О1и Азр О1и Агд Агд О1и Агд Агд ТЬг А1а О1у
130 135 140
Рго Зег Уа1 О1у О1у Уа1 Азп Рго Ьеи О1и О1у О1у Зег Агд О1у О1у
145 150 155 160
А1а Рго О1у О1у О1у РЬе Уа1 Рго Азп Ме+ Ьеи Зег Уа1 Рго О1и Зег
165 170 175
Рго РЬе Зег Агд ТЬг О1у О1и О1у Ьеи Азр Уа1 Агд О1у Азп О1п О1у
180 185 190
РЬе Рго Тгр Азр 11е Ьеи РЬе Рго А1а Азр Рго Рго РЬе Зег Рго О1п
195 200 205
Зег Суз Агд Рго О1п Ме+ Зег О1п Зег О1и Зег Агд Ьуз Зег Агд Агд
210 215 220
О1у О1у Агд О1и Азр 11е Ьеи О1и Ьуз Тгр Уа1 Зег ТЬг Агд Ьуз Ьуз
225 230 235 240
- 69 030381
А1а О1и О1и Ьеи О1и Агд Азр Ьеи Агд Ьуз 250 А1а Агд Ьуз ТЪг 11е 255 Ьуз
245
Агд Ьеи О1и Азр Азр Азп Рго Тгр Ьеи О1у Азп 11е Ьеи О1у 11е 11е
260 265 270
Агд Ьуз О1у Ьуз Азр О1у ТЪг Азр О1п Меб О1и Уа1 Азр Зег О1у Рго
275 280 285
Агд Ьуз Ьуз Рго Нбз Ьуз Зег О1у РЪе ТЪг Азр Ьуз О1и Агд О1п Азр
290 295 300
Нбз Агд Агд Агд Ьуз А1а Ьеи О1п Азп Ьуз Ьуз Азп О1п Ьеи Зег А1а
305 310 315 320
О1у О1у Ьуз Зег Ьеи Зег Ьуз О1и О1и О1и О1и О1и Ьеи Агд Агд Ьеи
325 330 335
ТЪг 11е О1и Азр Азр О1и Агд О1п Агд Агд Уа1 А1а О1у Рго Агд Уа1
340 345 350
О1у Азр Уа1 Азп Рго Рго О1у О1у Зег Рго Агд О1у А1а Рго О1у О1у
355 360 365
О1у РЪе Уа1 Рго О1п Меб ТЪг О1у Уа1 Рго О1и Зег Рго РЪе Зег Агд
370 375 380
ТЪг О1у О1и О1у Ьеи Азр 11е Агд О1у Азр Агд О1у РЪе Рго Тгр Уа1
385 390 395 400
Азп Рго А1а Рго Рго О1у О1п Агд Ьеи Рго Ьеи Ьеи О1и Суз ТЪг Рго
405 410 415
О1п Нбз Нбз Нбз Нбз Нбз Нбз
420

Claims (17)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Иммунотерапевтическая композиция, включающая:
    a) дрожжевой носитель и
    b) гибридный белок, содержащий антигены ΗΌν, которые состоят по меньшей мере из одного иммуногенного домена большого антигена ΗΌν (ΗΌΑ§-Ε) или малого антигена ΗΌν (ΗΌΑ§-8), у которых сигнал внутриядерной локализации (^8) инактивирован с помощью замены или делеции одной или более аминокислот МЬ8;
    причем композиция вызывает ΗΌν-специфический иммунный ответ против инфекции ΗΌν при введении пациенту.
  2. 2. Иммунотерапевтическая композиция по п.1, в которой антигены ΗΌν включают аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% аминокислотной последовательности 8Ι+) ΙΌ N0: 34 или 8Ι+) ΙΌ N0: 28.
    - 70 030381
  3. 3. Иммунотерапевтическая композиция по п.1 или 2, в которой гибридный белок имеет аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% последовательности 8ЕР ГО N0: 36 или 8Ер ГО N0: 30.
  4. 4. Иммунотерапевтическая композиция по любому из пп.1-3, в которой дрожжевой носитель представляет собой цельные дрожжевые клетки.
  5. 5. Иммунотерапевтическая композиция по п.4, в которой антигены НОУ экспрессированы цельными дрожжевыми клетками.
  6. 6. Иммунотерапевтическая композиция по п.5, в которой цельные дрожжевые клетки инактивированы нагреванием.
  7. 7. Иммунотерапевтическая композиция по любому из пп.1-6, в которой дрожжевой носитель происходит из 8ассНаготуссз ссгсу151ас.
  8. 8. Способ лечения пациента, который инфицирован НИУ, включающий введение пациенту композиции по любому из пп.1-7.
  9. 9. Способ устранения у пациента, который инфицирован НИУ, по меньшей мере одного симптома, обусловленного инфекцией НИУ, включающий введение пациенту композиции по любому из пп.1-7.
  10. 10. Способ улучшения выживаемости пациента, который инфицирован НИУ, включающий введение пациенту композиции по любому из пп.1-7, причем введение композиции пациенту ослабляет инфекцию НОУ или по меньшей мере один симптом, обусловленный инфекцией НОУ.
  11. 11. Способ профилактики инфекции НОУ у пациента, который не инфицирован НОУ, включающий введение пациенту композиции по любому из пп.1-7.
  12. 12. Способ по любому из пп.8-10, отличающийся тем, что пациент хронически инфицирован НВУ.
  13. 13. Способ по п.12, дополнительно включающий введение пациенту противовирусного соединения для лечения инфекции НВУ.
  14. 14. Способ иммунизации пациента против НОУ, включающий введение пациенту композиции по любому из пп.1-7.
  15. 15. Применение композиции по любому из пп.1-7 для лечения инфекции НОУ у пациента.
  16. 16. Применение композиции по любому из пп.1-7 для профилактики НОУ инфекции у пациента.
  17. 17. Применение по п.15 или 16, отличающееся тем, что пациент хронически инфицирован НВУ.
    генотип 1 генотип 2 генотип 3 генотип 1 генотип 2 генотип 3
    -НСЕККЬЕВ ЬЕЕВ ЬЕК1ККК1ККЬЕВЕЫРЫЬ ССТ1КС1Ь СККВКВ СЕ САР РАКЕАЕТВ ОМЕ 5 9 УЗТЕККАЕЕ ЬЕЕВ ЬЕКАЕКПКЕЬЕВВЫРНЬ СЕЛ Ь С1ΙΕΚ- СКВ СЕ САР РАКЕАЕТВ ПНЕ 5 9 УЕЕЕКНЕЕКЬЕКВ ЬЕЕАЫКК1ККЬЕВЕЫРНЬ СНУУСЬ ЬЕЕ-ККВЕВ САР РАКЕРЕОЕТНЕ 5 9 ΐΐ· ΐΐ·ΐΐΐ· * ΐ- ΐ-ΐ-* ΐ-ΐ-ΐ- ΐΐ ΐΐΐΐΐΐΐ ΐ-
    ΙΒ 3 СР СКЕР ЬЕССЕЗВКЕЕОВНЕЕЕКАЬЕНКЕКО ЬААССКНЬ ЗКЕЕЕЕЕ ЬКЕЬТЕЕВЕЕЕ 119 УВ 3 СРЕККРНКЗ СГТВКЕЕОВНЕЕЕКАЬ 0ΝΚΚΗ0 Ь 3АССКЗ Ь ЗКЕЕЕЕЕ ЬЕКЬТ1ЕВВЕЕ 119 УВ 3 СР СЕКРКАЕСГГВ ОЕЕЕВНЕЕЕКАЬЕНКККО ЬАСССКНЬ 3 ОЕЕЕЕЕ ЬЕЕЬ АЕВВВЕЕ 119 ΐΐΐΐ - ΐ ΐΐ- ΐ· ΐΐ- ΐΐΐΐΐΐΐΐ- ΐΐ- ΐΐ- ΐΐΐ ΐΐ- ΐΐΐΐΐΐ- ΐΐ- --λ-- ± генотип 1 генотип 2 генотип 3
EA201490015A 2011-06-14 2012-06-14 Иммунотерапевтическая композиция, ее применения и способы лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита дельта EA030381B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161497039P 2011-06-14 2011-06-14
PCT/US2012/042426 WO2012174220A1 (en) 2011-06-14 2012-06-14 Yeast-based compositions and methods for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201490015A1 EA201490015A1 (ru) 2014-12-30
EA030381B1 true EA030381B1 (ru) 2018-07-31

Family

ID=47357462

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201490015A EA030381B1 (ru) 2011-06-14 2012-06-14 Иммунотерапевтическая композиция, ее применения и способы лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита дельта

Country Status (13)

Country Link
US (2) US9579377B2 (ru)
EP (1) EP2720716B1 (ru)
JP (1) JP2014523878A (ru)
CN (1) CN103732250A (ru)
AU (1) AU2012271625B2 (ru)
BR (1) BR112013032381B1 (ru)
CA (1) CA2838950C (ru)
EA (1) EA030381B1 (ru)
ES (1) ES2671381T3 (ru)
HK (1) HK1197026A1 (ru)
IL (1) IL229902B (ru)
SG (2) SG195383A1 (ru)
WO (1) WO2012174220A1 (ru)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2696551T3 (es) 2010-12-17 2019-01-16 Globeimmune Inc Composiciones y métodos para el tratamiento o la prevención de la infección por adenovirus-36 humano
EA028659B1 (ru) 2011-02-12 2017-12-29 Глоубиммьюн, Инк. Терапевтическое средство на основе дрожжей для лечения хронического гепатита b
EP2685995B1 (en) 2011-03-17 2017-05-03 Globeimmune, Inc. Yeast-brachyury immunotherapeutic compositions
AU2012271625B2 (en) 2011-06-14 2017-05-18 Globeimmune, Inc. Yeast-based compositions and methods for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection
WO2013025972A1 (en) 2011-08-17 2013-02-21 Globeimmune, Inc. Yeast-muc1 immunotherapeutic compositions and uses thereof
EP2864792A1 (en) 2012-06-26 2015-04-29 Biodesix, Inc. Mass-spectral method for selection, and de-selection, of cancer patients for treatment with immune response generating therapies
TWI674108B (zh) 2013-03-19 2019-10-11 美商環球免疫公司 索脊瘤之以酵母菌爲基礎之免疫療法
EP2978449B1 (en) 2013-03-26 2021-09-08 Globeimmune, Inc. Compositions and methods for the treatment or prevention of human immunodeficiency virus infection
US10226522B2 (en) 2013-08-30 2019-03-12 Globeimmune, Inc. Compositions and methods for the treatment or prevention of tuberculosis
CN106456677A (zh) * 2014-04-11 2017-02-22 全球免疫股份有限公司 基于酵母的免疫疗法和i型干扰素敏感性
US11311519B2 (en) 2014-05-01 2022-04-26 Eiger Biopharmaceuticals, Inc. Treatment of hepatitis delta virus infection
US10076512B2 (en) 2014-05-01 2018-09-18 Eiger Biopharmaceuticals, Inc. Treatment of hepatitis delta virus infection
WO2016090107A2 (en) * 2014-12-04 2016-06-09 Eiger Biopharmaceuticals, Inc. Treatment of hepatitis delta virus infection
KR20170102002A (ko) 2015-01-09 2017-09-06 이투빅스 코포레이션 에볼라 바이러스 백신접종을 위한 방법 및 조성물
CN107530338B (zh) 2015-04-21 2020-12-01 艾格尔峰生物制药有限公司 包含洛那法尼和利托那韦的药物组合物
EP3331552B1 (en) 2015-08-03 2021-01-27 Globeimmune, Inc. Modified yeast-brachyury immunotherapeutic compositions
PT3416675T (pt) * 2016-02-19 2021-06-14 Eiger Biopharmaceuticals Inc Tratamento de infeção pelo vírus da hepatite delta com interferão lambda
CN107653342A (zh) * 2016-12-28 2018-02-02 成都百泰赛维生物科技有限公司 一种pcr法检测汉族人hdv病毒的方法
CN107641661A (zh) * 2016-12-28 2018-01-30 成都百泰赛维生物科技有限公司 一种用于检测汉族人hdv病毒的试剂盒
US20210154250A1 (en) * 2018-05-15 2021-05-27 Globeimmune, Inc. Lysates of recombinant yeast for inducing cellular immune responses
CN115968291A (zh) * 2020-04-22 2023-04-14 南湖制药公司 聚乙二醇化干扰素tau及其组合物和方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998028004A1 (en) * 1996-12-24 1998-07-02 The Crown In The Right Of The Queensland Department Of Health (Sir Albert Sakzewski Virus Research Centre) Hepatitis delta particle containing a fusion protein immunogen
WO2010033841A1 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Globeimmune, Inc. Immunotherapy for chronic hepatitis c virus infection
WO2010121180A1 (en) * 2009-04-17 2010-10-21 Globeimmune, Inc. Combination immunotherapy compositions against cancer and methods

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2486400B1 (fr) 1980-07-09 1986-05-30 Univablot Medicaments a base de levures ou de leurs extraits insolubles
NZ199722A (en) 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
US4775622A (en) 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
US5310654A (en) 1985-07-31 1994-05-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for determining virulence of Yersinia
US5234830A (en) 1988-02-03 1993-08-10 Suntory Limited DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region
IL95019A0 (en) 1989-08-09 1991-06-10 Mycogen Corp Process for encapsulation of biologicals
US5830463A (en) 1993-07-07 1998-11-03 University Technology Corporation Yeast-based delivery vehicles
US5413914A (en) 1993-07-07 1995-05-09 The Regents Of The University Of Colorado Yeast assay to identify inhibitors of dibasic amino acid processing endoproteases
ATE325875T1 (de) * 1994-10-07 2006-06-15 Univ Loyola Chicago Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung
US5858378A (en) 1996-05-02 1999-01-12 Galagen, Inc. Pharmaceutical composition comprising cryptosporidium parvum oocysts antigen and whole cell candida species antigen
US6844171B1 (en) 1998-07-02 2005-01-18 President And Fellows Of Harvard College Oligomerization of hepatitis delta antigen
US20020044948A1 (en) 2000-03-15 2002-04-18 Samir Khleif Methods and compositions for co-stimulation of immunological responses to peptide antigens
DK1272213T3 (da) 2000-04-06 2006-07-10 Seer Pharmaceuticals Llc Mikrobielt afgivelsessystem
AU2002225681A1 (en) 2000-11-15 2002-05-27 Globe Immune, Inc. Yeast-dentritic cell vaccines and uses thereof
FR2830019B1 (fr) 2001-09-24 2005-01-07 Assist Publ Hopitaux De Paris Molecules d'acides nucleiques d'hdv, leurs fragments et leurs apllications
JP2005516939A (ja) * 2001-12-18 2005-06-09 イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 診断及び治療用途の精製ｃ型肝炎ウイルス外被タンパク質
US7439042B2 (en) 2002-12-16 2008-10-21 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis C infection
AU2003301021C1 (en) 2002-12-16 2010-02-18 Globelmmune, Inc. Yeast-based vaccines as immunotherapy
CN101437964B (zh) * 2004-10-18 2012-06-13 全球免疫股份有限公司 基于酵母的对慢性丙型肝炎感染的治疗
KR100996105B1 (ko) * 2005-02-25 2010-11-22 화이자 프로덕츠 인크. 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스의 ｎ 단백질돌연변이체
AU2006268333B2 (en) * 2005-07-11 2012-06-14 Globeimmune, Inc. Compositions and methods for eliciting an immune response to escape mutants of targeted therapies
US20070172503A1 (en) 2005-12-13 2007-07-26 Mycologics,Inc. Compositions and Methods to Elicit Immune Responses Against Pathogenic Organisms Using Yeast Based Vaccines
EP1988919A4 (en) * 2006-02-02 2009-06-10 Globeimmune Inc VAKZINE ON YEAST BASE FOR TRIGGERING AN IMMUNE RESPONSE
TW200806789A (en) 2006-03-27 2008-02-01 Globeimmune Inc RAS mutation and compositions and methods related thereto
US20080138354A1 (en) * 2006-07-21 2008-06-12 City Of Hope Cytomegalovirus vaccine
AU2008214029B2 (en) 2007-02-02 2014-01-30 Globelmmune, Inc. Methods for producing yeast-based vaccines
BRPI0809247A2 (pt) 2007-03-19 2014-09-09 Globeimmune Inc Composições e métodos para a ablação do escape mutacional de terapias marcadas para câncer.
WO2010065626A1 (en) 2008-12-02 2010-06-10 Globeimmune, Inc. Genotyping tools, methods and kits
ITTO20080964A1 (it) 2008-12-22 2010-06-23 Natimab Therapeutics S R L Anticorpo monoclonale anti-hcv come medicamento per il trattamento terapeutico e la prevenzione di infezioni da hcv
WO2011015656A2 (en) 2009-08-07 2011-02-10 Transgene Sa Composition for treating hbv infection
EP2477647B1 (en) * 2009-09-14 2016-01-13 The Regents of the University of Colorado Modulation of yeast-based immunotherapy products and responses
JP2013522302A (ja) 2010-03-14 2013-06-13 グローブイミューン，インコーポレイテッド 酵母系免疫療法を使用した感染症の薬理ゲノミクス及び治療反応性ガイド治療
WO2012019127A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 The Regents Of The University Of Colorado Combination yeast-based immunotherapy and arginine therapy for the treatment of myeloid-derived supressor cell-associated diseases
ES2696551T3 (es) 2010-12-17 2019-01-16 Globeimmune Inc Composiciones y métodos para el tratamiento o la prevención de la infección por adenovirus-36 humano
EA028659B1 (ru) 2011-02-12 2017-12-29 Глоубиммьюн, Инк. Терапевтическое средство на основе дрожжей для лечения хронического гепатита b
EP2685995B1 (en) 2011-03-17 2017-05-03 Globeimmune, Inc. Yeast-brachyury immunotherapeutic compositions
AU2012271625B2 (en) 2011-06-14 2017-05-18 Globeimmune, Inc. Yeast-based compositions and methods for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection
WO2013025972A1 (en) 2011-08-17 2013-02-21 Globeimmune, Inc. Yeast-muc1 immunotherapeutic compositions and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998028004A1 (en) * 1996-12-24 1998-07-02 The Crown In The Right Of The Queensland Department Of Health (Sir Albert Sakzewski Virus Research Centre) Hepatitis delta particle containing a fusion protein immunogen
WO2010033841A1 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Globeimmune, Inc. Immunotherapy for chronic hepatitis c virus infection
WO2010121180A1 (en) * 2009-04-17 2010-10-21 Globeimmune, Inc. Combination immunotherapy compositions against cancer and methods

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANG, Y.-H. et al.: "Varied Immunity Generated in Mice by DNA Vaccines with Large and Small Hepatitis Delta Antigens". Journal of Virology. 2003. 77(24): 12980-12985, page 12981 *

Also Published As

Publication number Publication date
BR112013032381B1 (pt) 2021-01-12
EP2720716B1 (en) 2018-03-21
CA2838950C (en) 2020-10-27
SG10201605265TA (en) 2016-08-30
US9987352B2 (en) 2018-06-05
EP2720716A4 (en) 2015-03-11
US9579377B2 (en) 2017-02-28
SG195383A1 (en) 2013-12-30
US20140193362A1 (en) 2014-07-10
CA2838950A1 (en) 2012-12-20
WO2012174220A1 (en) 2012-12-20
ES2671381T3 (es) 2018-06-06
HK1197026A1 (en) 2015-01-02
EA201490015A1 (ru) 2014-12-30
NZ619761A (en) 2015-08-28
AU2012271625A1 (en) 2014-01-30
EP2720716A1 (en) 2014-04-23
JP2014523878A (ja) 2014-09-18
IL229902B (en) 2019-07-31
AU2012271625B2 (en) 2017-05-18
US20170182153A1 (en) 2017-06-29
CN103732250A (zh) 2014-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA030381B1 (ru) Иммунотерапевтическая композиция, ее применения и способы лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита дельта
KR20220154121A (ko) 코로나바이러스 면역원성 조성물 및 이의 용도
EA028659B1 (ru) Терапевтическое средство на основе дрожжей для лечения хронического гепатита b
JP6613399B2 (ja) Ｈｂｖに対する免疫応答を生じさせるために用いられるウイルス様粒子
WO2020063370A2 (zh) 免疫组合物及其制备方法与应用
US11801299B2 (en) Compositions and methods for generating an immune response to hepatitis B virus
US20220305116A1 (en) Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and capsid assembly modulators being sulfonamide derivatives
CN113666990A (zh) 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用
US20230330214A1 (en) Improved dna vaccine for sars-cov-2
JP2018516926A (ja) ブタ生殖器呼吸器症候群及びブタサーコウイルス関連疾患に対するワクチン組成物
JP2019013229A (ja) 異種ポリペプチドを含むＣｙａＡベースのキメラタンパク質及び免疫応答の誘導におけるその使用
Yan et al. CCL19 and CCL28 assist herpes simplex virus 2 glycoprotein D to induce protective systemic immunity against genital viral challenge
WO2023023940A1 (zh) 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用
JP2023523423A (ja) ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン及びその調製物
WO2020255015A1 (en) Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and dihydropyrimidine derivatives as capsid assembly modulators
Neeli et al. Comparison of DNA vaccines with AS03 as an adjuvant and an mRNA vaccine against SARS-CoV-2
US20210277077A1 (en) Recombinant transmembrane domain-deficient sting as biomimetic protein carrier for cgamp enhanced cancer immunotherapy
Gholami Parizad et al. Immune Response in Mice Immunized with Recombinant PreS2/S-C18-27 Protein from Hepatitis B Virus Compared with Commercial Vaccine
Robles et al. Recombinant MBP-pσ1 expressed in soybean seeds delays onset and reduces developing disease in an animal model of multiple sclerosis
Gao et al. Saccharomyces cerevisiae oral immunization in mice using multi-antigen of the African swine fever virus elicits a robust immune response
Parizad et al. Comparison of Immune Response in Mice Immunized with Recombinant PreS2/S-C18-27 Protein Derived from Hepatitis B Virus with Commercial Vaccine
CN104762269A (zh) 一种增强肿瘤抗原免疫原性的新策略及其在肺癌免疫治疗中的应用
WO2023161649A1 (en) Rhinovirus vaccine
AU2022400924A1 (en) Nant covid vaccine cross reactivity
CN117442712A (zh) 用于实现冠状病毒初免-加强免疫的试剂盒及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM