ES2696551T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento o la prevención de la infección por adenovirus-36 humano - Google Patents

Composiciones y métodos para el tratamiento o la prevención de la infección por adenovirus-36 humano Download PDF

Info

Publication number
ES2696551T3
ES2696551T3 ES11848223T ES11848223T ES2696551T3 ES 2696551 T3 ES2696551 T3 ES 2696551T3 ES 11848223 T ES11848223 T ES 11848223T ES 11848223 T ES11848223 T ES 11848223T ES 2696551 T3 ES2696551 T3 ES 2696551T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
yeast
positions
protein
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11848223T
Other languages
English (en)
Inventor
David Apelian
Thomas King
Claire Coeshott
Yingnian Lu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlobeImmune Inc
Original Assignee
GlobeImmune Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GlobeImmune Inc filed Critical GlobeImmune Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2696551T3 publication Critical patent/ES2696551T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/235—Adenoviridae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Una composición inmunoterapéutica que comprende: a) un vehículo de levadura; y b) una proteína de fusión que comprende un antígeno de adenovirus-36 (Ad-36) que comprende al menos un dominio inmunogénico de CR1α y al menos un dominio inmunogénico de CR1γ.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para el tratamiento o la prevención de la infección por adenovirus-36 humano
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a composiciones inmunoterapéuticas para su uso en la prevención y/o el tratamiento de la infección por adenovirus-36 humano, así como la prevención y/o el tratamiento de la obesidad y/o trastornos asociados con la obesidad u otras secuelas relacionadas con la infección por adenovirus-36 humano.
Antecedentes de la invención
Los términos "obesidad" y "sobrepeso" o "preobeso" definen intervalos de pesos que son mayores que los pesos que se consideran en general sanos para una persona de una altura dada. Según un informe de agosto de 2010 de los Centros para el Control de Enfermedades (CDC), "ningún estado cumplió el objetivo de obesidad de Healthy people 2010 del 15 % y la prevalencia indicada por los participantes de obesidad entre adultos de los Estados Unidos había aumentado 1,1 puntos porcentuales desde 2007" (Sherry et al., Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR), 59; 1-5; 3 de agosto de 2010). En niños y adolescentes, el exceso de peso representa un problema de salud muy grave. El Estudio de Examen de Salud y Nutrición Nacional (NHANES) de 2007-2008 estimó que el 17 % de individuos de 2-19 años de edad son obesos (CDC). De hecho, el CDC y la OMS han hecho referencia a una "epidemia de obesidad" en muchas poblaciones en todo el mundo. Los individuos con sobrepeso y obesos tiene una mayor probabilidad de desarrollar una diversidad de problemas de salud incluyendo, pero sin limitación, enfermedades cardiovasculares y afecciones asociadas (por ejemplo, tensión arterial alta, colesterol alto), diabetes de tipo 2, trastornos respiratorios, cáncer, trastornos reproductivos, disfunción hepática y osteoartritis.
Varios factores diferentes pueden contribuir a la obesidad o al sobrepeso, y la afección puede ser un problema de salud complejo para muchos individuos. Los factores conductuales, factores ambientales, la genética, la enfermedad y/o los agentes infecciosos pueden desempeñar un papel en la afección. La falta de suficiente actividad física y exceso de consumo calórico en la dieta, es decir, desequilibrio calórico, son las causas más evidentes y habituales de sobrepeso u obesidad. Sin embargo, parece haber varios factores genéticos que pueden predisponer a determinados individuos al aumento de peso, incluyendo mutaciones en genes relacionados con el control del comportamiento alimentario y diversas mutaciones genéticas o correlaciones de genotipo con obesidad en individuos y poblaciones. Además de estos factores, diversas enfermedades y fármacos también pueden influir en el peso de un individuo. Más recientemente, se ha identificado que algunos agentes infecciosos contribuyen a algunos casos de obesidad.
Varios agentes infecciosos se han asociado con la obesidad en animales no humanos, y uno en particular se ha asociado con la obesidad humana. El adenovirus-36 humano (también denominado Ad-36, Adv-36 o hAdv-36) se describió por primera vez en un niño con diabetes en 1980 (Wigand et al., 1980, Arch. Viol. 64(3):225-233). Desde el principio de la década de 1990, experimentos de Dhurandhar y colaboradores mostraron por primera vez que Ad-36 aumentaba la adiposidad en pollos y en ratones ((Dhurandhar et al., 1990, J. Bombay Vet. College 2:131-132; Dhurandhar et al., 1992, Vet. Microbiol., 31:101-107; Dhurandhar et al., 2000, Int J Obes Relat Metab Disord 24:989-996; Dhurandhar et al., 2001, Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 25(7):990-996), así como en monos (Dhurandhar, et al., 2002, J. Nutr. 132(10):3155-3160). En ratones y pollos, la infección con Ad-36 dio como resultado viremia, infección de tejido adiposo, aumento de la grasa visceral, la grasa corporal total y/o el peso corporal, y reducción del colesterol y los triglicéridos en suero. En monos, Ad-36 promovió el aumento de peso y redujo el colesterol en suero. Pasarica y colaboradores han mostrado que el Ad-36 humano induce adiposidad, aumenta la sensibilidad a insulina y altera las monoaminas hipotalámicas en ratas (Pasarica et al., 2006, Obesity 14(11):1905-1913).
En los seres humanos, se ha mostrado que Ad-36 tiene una alta probabilidad de estar asociado con obesidad, donde un fenotipo único de bajos niveles de colesterol y triglicéridos en suero estaba presente en aproximadamente 30 % de sujetos humanos obesos que tenían anticuerpos anti Ad-36, mientras que solamente 5 % de los seres humanos no obesos examinados tenían anticuerpos para Ad-36 (Dhurandhar et al., 1997, FASEB J, 3:A230; Atkinson et al., 1998, Int J Obes Relat Metab Disord 22(Supl): S57). Un estudio epidemiológico mostró que 30 % de las personas obesas estaban infectadas con Ad-36 en comparación con solamente 11 % de las personas delgadas en el estudio (Atkinson et al., 2005, Int J Obes (Lond), 29(3):281-286). Estos investigadores mostraron que Ad-36 está asociado con aumento del peso corporal y la reducción de lípidos en suero en seres humanos. Investigadores adicionales han indicado una asociación entre Ad-36 humano y trastornos lipídicos o tasas de obesidad en niños y adolescentes en todo el mundo (Na et al., 2010, Int. J. Obes. 34:89-93; Gabbert et al., 2010, Pediatrics 2010;126:721-726; y Atkinson et al., 2010, Int. J. Ped. Obes. 5:157-160). Trabajo adicional de Pasarica y Dhurandhar y colaboradores ha mostrado que Ad-36 induce determinación, diferenciación y acumulación de lípidos en células madre procedentes de tejido adiposo humano (Pasarica et al., 2008, Stem Cells 26:969-978). Por otra parte, se ha mostrado que la adipogénesis in vitro es acelerada por la infección de preadipocitos con Ad-36 humano (Vangipuram et al., 2004, Obes. Res.
12(5):770-777) y también se ha mostrado que la infección aumenta la sensibilidad a insulina y suprime la expresión de ARNm de leptina (Vangipuram et al., 2007, Int. J. Obes. (Lond.) 31(1):87-96. Se ha sugerido que la actividad del gen E4 orfl de Ad-36 es responsable de esta adipogénesis (Rogers et al., 2008, International Journal of Obesity 32:397-406). El documento WO2010/011440 describe adenovirus lipógenos y su uso como biomarcadores para la hipertrofia de tejido adiposo anómalo. El documento WO2006/044923 describe composiciones de vacuna que comprenden un vehículo de levadura y antígenos del virus de la hepatitis C (VHC) para su uso en la vacunación de un animal contra el VHC. El documento WO2009/073104 describe el uso de adenovirus de la subfamilia E de simios como vectores víricos para suministrar moléculas heterólogas como antígenos. Toth et al (Virus Research 108 (2005) págs. 149-159) describe un vector de adenovirus que comprende proteínas E3 y sugiere que la infección de ratones con el vector protege células A549 humanas trasplantadas del rechazo en ratones infectados.
En 2010, Arnold y colaboradores informaron de la caracterización completa del genoma de Ad-36 humano (Arnold et al., 2010, Virus Res. 149:152-161). Se han descrito ensayos de diagnóstico para la identificación de infección por Ad-36 en tejidos humanos, mediante la identificación o el uso de anticuerpos anti Ad-36 (véase, por ejemplo, documentos WO 98/44946, WO 2007/120362) y se está desarrollando comercialmente un ensayo de diagnóstico de Ad-36 (Scandivir AB). Sin embargo, no existe un tratamiento para la infección vírica, una vez identificada; no está disponible en el mercado en la actualidad ningún tratamiento preventivo o terapéutico que se dirija directamente a infección por Ad-36. En consecuencia, sigue existiendo la necesidad en la técnica de un tratamiento profiláctico y/o terapéutico eficaz para la infección por adenovirus-36, para reducir o eliminar condiciones de obesidad y sobrepeso asociadas con Ad-36.
Sumario de la invención
La invención proporciona una composición inmunoterapéutica que comprende:
a. un vehículo de levadura; y
b. una proteína de fusión que comprende un antígeno de adenovirus-36 (Ad-36) que comprende al menos un dominio inmunogénico de CR1a y al menos un dominio inmunogénico de CR1y.
En la composición inmunoterapéutica de la invención el antígeno de Ad-36 de la proteína de fusión puede comprender una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36.
En la composición inmunoterapéutica de la invención el antígeno de Ad-36 de la proteína de fusión puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de: la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 54 o la SEQ ID NO: 47.
En la composición inmunoterapéutica de la invención el antígeno de Ad-36 de la proteína de fusión puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de: la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 54 o la SEQ ID NO: 47.
En la composición inmunoterapéutica de la invención el antígeno de Ad-36 de la proteína de fusión puede comprender secuencias de Ad-36, en donde las secuencias de Ad-36 pueden consistir en: las posiciones 19-60 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 83-116 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 18-60 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; o las posiciones 123-157 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36.
En la composición inmunoterapéutica de la invención:
el antígeno de Ad-36 puede ser expresado por el vehículo de levadura;
el vehículo de levadura de levadura puede ser una levadura completa, termoinactivada; y/o
el vehículo de levadura puede ser de Saccharomyces cerevisiae.
La invención también proporciona una proteína de fusión que comprende al menos un dominio inmunogénico de CR1a de Ad-36 y al menos un dominio inmunogénico de CR1y de Ad-36.
La proteína de fusión de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de: la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 54 o la SEQ ID NO: 47.
La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la proteína de fusión de la invención.
La invención también proporciona una célula aislada transfectada con la molécula de ácido nucleico recombinante de la invención.
La invención también proporciona una composición que comprende la proteína de fusión de la invención, la molécula de ácido nucleico recombinante de la invención o la célula aislada de la invención.
La invención también proporciona cualquiera de las composiciones anteriormente descritas de la invención para su uso para tratar la infección por Ad-36, para su uso para prevenir la infección por Ad-36, para su uso para reducir la tasa de aumento de peso en un individuo infectado con Ad-36 y/o para su uso para provocar una respuesta inmunitaria de Ad-36 en un individuo.
Una realización de la invención se refiere a una composición inmunoterapéutica que comprende: (a) un vehículo de levadura; y (b) un antígeno de adenovirus-36 (Ad-36) que comprende una o más proteínas de Ad-36 y/o dominios inmunogénicos de dichas proteínas. En un aspecto, las proteínas de Ad-36 incluyen al menos una proteína seleccionada de, pero sin limitación: hexón, fibra, CR1 a y CR1y, y/o al menos un dominio inmunogénico de al menos una de las proteínas. En un aspecto, las proteínas de Ad-36 incluyen al menos un dominio inmunogénico de CR1a y al menos un dominio inmunogénico de CR1y.
En un aspecto, el antígeno de Ad-36 comprende secuencias de Ad-36, en donde las secuencias de Ad-36 consisten en: las posiciones 71-136 de Ad-36 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 145-169 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 290-313 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; y las posiciones 334-363 de Ad-36 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36. Por ejemplo, dicho antígeno de Ad-36 puede incluir, pero sin limitación, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: la SEQ ID NO: 42 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36, la SEQ ID NO: 48 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36 y la SEQ ID NO: 49 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36.
En un aspecto, el antígeno de Ad-36 comprende secuencias de Ad-36, en donde las secuencias de Ad-36 consisten en: las posiciones 136-218 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 235-285 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 297-308 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; y las posiciones 410-450 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36. Por ejemplo, dicho antígeno de Ad-36 puede incluir, pero sin limitación, la SEQ ID NO: 43 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36, la SEQ ID NO: 50 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36 y la SEQ ID NO: 51 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36.
En otro aspecto, el antígeno de Ad-36 comprende secuencias de Ad-36, en donde las secuencias de Ad-36 consisten en las posiciones 2-944 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36. Por ejemplo, dicho antígeno de Ad-36 puede incluir, pero sin limitación, la SEQ ID NO: 44 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36, la SEQ ID NO: 52 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36 y la SEQ ID NO: 53 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36.
En otro aspecto más, el antígeno de Ad-36 comprende secuencias de Ad-36, en donde las secuencias de Ad-36 consisten en: las posiciones 71-136 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 145-169 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 290-313 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 334-363 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 136-218 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 235-285 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 297-308 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; y las posiciones 410-450 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36. Por ejemplo, dicho antígeno de Ad-36 puede incluir, pero sin limitación, la SEQ ID NO: 45 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36 y las posiciones 7 a 418 de la SEQ ID NO: 45 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36.
En otro aspecto, el antígeno de Ad-36 comprende secuencias de Ad-36, en donde las secuencias de Ad-36 consisten en: las posiciones 136-218 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 235-285 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 297-308 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 410-450 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 71-136 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 145-169 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 290-313 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; y las posiciones 334-363 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36. Por ejemplo, dicho antígeno de Ad-36 puede incluir, pero sin limitación, la SEQ ID NO: 46 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36 y las posiciones 7 a 418 de la SEQ ID NO: 46 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36.
En otro aspecto, el antígeno de Ad-36 comprende secuencias de Ad-36, en donde las secuencias de Ad-36 consisten en: las posiciones 18-60 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 123-157 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 19­ 60 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; y las posiciones 83-116 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36. Por ejemplo, dicho antígeno de Ad-36 puede incluir, pero sin limitación, la SEQ ID NO: 47 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36, la SEQ ID NO: 54 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36 y la SEQ ID NO: 55 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36.
En cualquiera de los aspectos o realizaciones de la invención descritos anteriormente o en otra parte del presente documento, en un aspecto, el antígeno de Ad-36 se expresa por el vehículo de levadura. En un aspecto, el vehículo de levadura es una levadura completa. En un aspecto, la levadura está inactivada. En un aspecto, la levadura está termoinactivada. En un aspecto, el vehículo de levadura es de un género de levadura seleccionado de: Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Schizosaccharomyces y Yarrowia. En un aspecto, el vehículo de levadura es de Saccharomyces. En un aspecto, el vehículo de levadura es de Saccharomyces cerevisiae.
En cualquiera de los aspectos o realizaciones de la invención descritos anteriormente o en otra parte del presente documento, en un aspecto, una composición de la invención se formula en un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para administración a un individuo.
Otra realización de la invención se refiere a una proteína de fusión que comprende al menos un dominio inmunogénico de CR1a y al menos un dominio inmunogénico de CR1y.
Las composiciones pueden comprender dos o más proteínas de Ad-36 y/o dominios inmunogénicos de una o más proteínas de Ad-36, en donde las proteínas de Ad-36 incluyen al menos una proteína seleccionada de: hexón, fibra, CR1a y CR1y, y/o al menos un dominio inmunogénico de al menos una de las proteínas.
En un aspecto, las proteínas de Ad-36 incluyen E4, o al menos un dominio inmunogénico de la misma. En un aspecto, las proteínas de Ad-36 incluyen al menos un dominio inmunogénico de CR1a y al menos un dominio inmunogénico de CR1y. En un aspecto, la proteína de fusión comprende: (a) secuencias de Ad-36 que consisten en: las posiciones 71-136 de Ad-36 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 145-169 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 290-313 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; y las posiciones 334-363 de Ad-36 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; (b) secuencias de Ad-36 que consisten en: las posiciones 136-218 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 235-285 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 297-308 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; y las posiciones 410-450 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; (c) secuencias de Ad-36 que consisten en: las posiciones 2-944 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; (d) secuencias de Ad-36 que consisten en: las posiciones 71-136 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 145-169 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 290-313 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 334-363 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 136-218 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 235-285 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 297-308 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; y las posiciones 410-450 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; (e) secuencias de Ad-36 que consisten en: las posiciones 136-218 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 235-285 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 297-308 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 410-450 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 71-136 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 145-169 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 290-313 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; y las posiciones 334-363 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; o (f) secuencias de Ad-36 que consisten en: las posiciones 18-60 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 123-157 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 19-60 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; y las posiciones 83-116 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36. En un aspecto, la proteína de fusión se selecciona del grupo de: SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 55.
Otra realización más de la divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica cualquiera de las proteínas de fusión descritas anteriormente o en otra parte del presente documento.
Otra realización de la divulgación se refiere a una célula aislada transfectada con la molécula de ácido nucleico recombinante anterior. En un aspecto, la célula es una célula de levadura.
Realizaciones adicionales de la divulgación se refieren a una composición que comprende cualquiera de las proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico recombinantes o células aisladas, descritas anteriormente o en otra parte del presente documento. En cualquiera de estas realizaciones, en un aspecto, la composición comprende además al menos un modificador de respuesta biológica.
Otra realización de la divulgación se refiere a un método para tratar la infección por adenovirus-36 (Ad-36) en un sujeto. El método incluye la etapa de administrar a un sujeto que se ha infectado con Ad-36 cualquiera de las composiciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento, en donde la administración de la composición al sujeto reduce la infección por Ad-36 en el sujeto. En un aspecto, la administración de la composición al sujeto reduce la carga vírica de Ad-36 en el sujeto.
Otra realización más de la divulgación se refiere a un método para tratar la infección por adenovirus-36 (Ad-36) en un sujeto. El método incluye la etapa de administrar a un sujeto que se ha infectado con Ad-36 cualquiera de las composiciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento, en donde la administración de la composición al sujeto reduce la tasa de aumento de peso en el sujeto.
Otra realización de la divulgación se refiere a un método para tratar la obesidad o el exceso de peso asociado con adenovirus-36 (Ad-36) en un sujeto. El método incluye la etapa de administrar a un sujeto que se ha infectado con Ad-36 y tiene un índice de masa corporal (IMC) de al menos 25, cualquiera de las composiciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento, en donde la administración de la composición al sujeto reduce la IMC en el sujeto.
Otra realización más de la divulgación se refiere a un método para tratar la obesidad o el exceso de peso asociado con adenovirus-36 (Ad-36) en un sujeto. El método incluye la etapa de administrar a un sujeto que se ha infectado con Ad-36 y tiene un índice de masa corporal (IMC) de menos de 25, cualquiera de las composiciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento, en donde la administración de la composición al sujeto reduce el IMC en el sujeto o reduce la tasa de aumento de peso en el sujeto.
Otra realización de la divulgación se refiere a un método para provocar una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T, específica de antígeno, contra un antígeno de Ad-36. El método incluye la etapa de administrar a un sujeto cualquiera de las composiciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento.
Otra realización más de la divulgación se refiere a un método para prevenir la infección por Ad-36 en un sujeto o para reducir la tasa de aumento de peso en un sujeto. El método incluye la etapa de administrar a un sujeto que no se ha infectado con Ad-36 cualquiera de las composiciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento. En un aspecto, el sujeto tiene un IMC de menos de 25. En un aspecto, el sujeto tiene un IMC de 25 o más. En un aspecto, el sujeto es de entre 2 y 19 años de edad. En un aspecto, el sujeto es un adulto.
Otra realización de la divulgación se refiere a un método para inmunizar una población de individuos contra infección por Ad-36, que comprende administrar a la población de individuos cualquiera de las composiciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento. En un aspecto, los individuos son adultos. En un aspecto, los individuos son de 2 a 19 años de edad. En un aspecto, los individuos tienen un IMC de 25 o más. En un aspecto, los individuos tienen un IMC de menos de 25.
Otra realización de la divulgación se refiere a cualquiera de las composiciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento para su uso para tratar la infección por Ad-36.
Otra realización más de la divulgación se refiere a cualquiera de las composiciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento para su uso para prevenir la infección por Ad-36.
Otra realización de la divulgación se refiere a cualquiera de las composiciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento para su uso para reducir la tasa de aumento de peso en un individuo infectado con Ad-36.
Otra realización de la divulgación se refiere a cualquiera de las composiciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento para su uso para provocar una respuesta inmunitaria a Ad-36 en un individuo.
Otra realización más de la divulgación se refiere al uso de cualquiera de las composiciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento en la preparación de un medicamento para tratar la infección por Ad-36. Otra realización de la divulgación se refiere al uso de cualquiera de las composiciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento en la preparación de un medicamento para prevenir infección por Ad-36.
Otra realización de la divulgación se refiere al uso de cualquiera de las composiciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento en la preparación de un medicamento para reducir la tasa de aumento de peso en un individuo infectado con Ad-36.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es una imagen digitalizada de una transferencia de western que muestra la expresión de: (1) una composición de inmunoterapia basada en levadura que expresa una proteína de fusión de Ad-36 que comprende fibra (FIB) (SEQ ID NO: 42) bajo el control de un promotor de TEF2; (2) una composición de inmunoterapia basada en levadura que expresa una proteína de fusión de Ad-36 que comprende hexón (HEX) (SEQ ID NO: 43) bajo el control de un promotor de TEF2; y (3) una composición de inmunoterapia basada en levadura que expresa una proteína de fusión de Ad-36 que comprende CR1a y CR1y (CRAG) (SEQ ID NO: 47) bajo el control de un promotor de TEF2. La Fig. 2 es una imagen digitalizada de una transferencia de western que muestra la expresión de: (1) una composición de inmunoterapia basada en levadura que expresa una proteína de fusión de Ad-36 que comprende fibra (Ad-aFL-FIB) (SEQ ID NO: 48) bajo el control de un promotor de Cup1; (2) una composición de inmunoterapia basada en levadura que expresa una proteína de fusión de Ad-36 que comprende hexón (Ad-aFL-HEX) (SEQ ID NO: 50) bajo el control de un promotor de Cup1; (3) una composición de inmunoterapia basada en levadura que expresa una proteína de fusión de Ad-36 que comprende CR1a y CRIy (Ad-aFL-CRAG) (SEQ ID NO: 54) bajo el control de un promotor de Cup1; y (4) una composición de inmunoterapia basada en levadura que expresa una proteína de fusión de Ad-36 que comprende hexón de longitud completa (Ad-aFL-Hexón-Completo) (SEQ ID NO: 52) bajo el control de un promotor de TEF2.
La Fig. 3 es un gráfico de barras que muestra la expresión de genes que codifican Ad-36 E1A, Ad-36 E4orf1 y hexón de Ad-36 en células madre procedentes de tejido adiposo de rata (ADS) 15 horas después de la infección por Ad-36 in vitro.
La Fig. 4 es un gráfico de barras que muestra la expresión de genes que codifican Ad-36 E1A, Ad-36 E4orfl y hexón de Ad-36 en células A549 (célula hospedadora natural para adenovirus humanos) 15 horas después de infección por Ad-36 in vitro.
La Fig. 5 es un gráfico que muestra el control de simulación para el estudio de cinética de partículas víricas (P.V.) tempranas.
La Fig. 6 es un gráfico que muestra cinética de partículas víricas (P.V.) tempranas después de exposición a 107 UFP de Ad-36. 8 La Fig. 7 es un gráfico que muestra cinética de partículas víricas (P.V.) tempranas después de exposición a 108 UFP de Ad-36. 9 La Fig. 8 es un gráfico que muestra cinética de partículas víricas (P.V.) tempranas después de exposición a 109 UFP de Ad-36.
La Fig. 9 es una imagen digitalizada de PCR anidado que detecta ADN de Ad-36 en tejido adiposo visceral de ratas dos semanas después de infección con diversas dosis del virus in vivo.
La Fig. 10 es un gráfico de dispersión que muestra aumento de peso corporal 18 semanas después de infección por Ad-36 en ratas a las que se inyectó PBS (PBS), levadura de control (YVEC), una composición de inmunoterapia basada en levadura que expresa una proteína de fusión que comprende CR1 a de Ad-36 y CR1y de Ad-36 (aFL-Crag), y una composición de inmunoterapia basada en levadura que expresa una proteína de fusión que comprende hexón de Ad-36 (aFL-Hex).
La Fig. 11 es un gráfico lineal que representa la evolución temporal de la mediana de aumento de peso con respecto al valor basal en ratas infectadas por Ad-36 en las que se inyectó PBS (PBS), levadura de control (YVEC), una composición de inmunoterapia basada en levadura que expresa una proteína de fusión que comprende CR1a de Ad-36 y CR1y de Ad-36 (aFL-Crag), y una composición de inmunoterapia basada en levadura que expresa una proteína de fusión que comprende hexón de Ad-36 (aFL-Hex).
La Fig. 12 es un gráfico de barras que compara la mediana del aumento de peso corporal en la semana 4 y la semana 12 después de infección por Ad-36 en ratas a las que se inyectó PBS (PBS, barras blancas), levadura de control (YVEc , barras grises), una composición de inmunoterapia basada en levadura que expresa una proteína de fusión que comprende CR1a de Ad-36 y CR1y de Ad-36 (aFL-CRAG, barras negras), y una composición de inmunoterapia basada en levadura que expresa una proteína de fusión que comprende hexón de Ad-36 (aFL-HEX, barras a cuadros).
La Fig. 13 es un gráfico lineal que muestra la cinética vírica de Ad-36 en la sangre para ratas estaban infectadas con Ad-36 y se les inyectó PBS (PBS), levadura de control (YVEC), una composición de inmunoterapia basada en levadura que expresa una proteína de fusión que comprende CR1a de Ad-36 y CR1y de Ad-36 (aFL-Crag), y una composición de inmunoterapia basada en levadura que expresa una proteína de fusión que comprende hexón de Ad-36 (aFL-Hex).
La Fig. 14 es un gráfico de barras que compara el consumo dietético total (en peso) durante 12 semanas de ratas no infectadas por Ad-36 a las que se inyectó un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa una proteína de fibra de Ad-36 y ratas a las que se inyectó de forma simulada (sin producto inmunoterapéutico).
La Fig. 15 es un gráfico lineal que compara el aumento de peso durante 12 semanas de ratas no infectadas con Ad-36 a las que se inyectó un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa una proteína de fibra de Ad-36 y ratas a las que se inyectó de forma simulada (sin producto inmunoterapéutico).
La Fig. 16 es una imagen digitalizada de PCR que muestra ADN de Ad-36 en órganos y tejidos de una rata 15 semanas después de inoculación intraperitoneal con el virus Ad-36.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere en general a composiciones inmunoterapéuticas y métodos para la prevención y/o el tratamiento de la infección por adenovirus-36 (Ad-36), así como la prevención y/o el tratamiento de obesidad, trastornos relacionados con obesidad relacionados con infección por adenovirus-36 e hipertrofia del tejido adiposo relacionada con infección por Ad-36. La invención incluye una composición inmunoterapéutica basada en levadura (también denominada inmunoterapia basada en levadura) que comprende un vehículo de levadura y una proteína de fusión que comprende uno o más antígenos de Ad-36 que se han diseñado para provocar una respuesta inmunitaria profiláctica y/o terapéutica contra infección por Ad-36 en un sujeto. La invención incluye dichas composiciones para su uso en la prevención y/o el tratamiento de infección por Ad-36. La invención también incluye las moléculas de ácido nucleico recombinante usadas en las composiciones basadas en levadura de la invención, así como las proteínas codificadas por las mismas, para su uso en cualquier composición inmunoterapéutica y/o protocolo terapéutico para infección por Ad-36.
Las composiciones inmunoterapéuticas específicas de Ad-36, basadas en levadura, de la invención inducen respuestas inmunitarias innatas, así como respuestas inmunitarias adaptativas que se dirigen específicamente a Ad-36, incluyendo respuestas de linfocitos T t H17 y TH1 dependientes de CD4 y respuestas de linfocitos T CD8+ específicas de antígeno, que incluyen respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL). Además, las composiciones inmunoterapéuticas específicas de Ad-36, basadas en levadura, de la invención modulan números y/o funcionalidad de linfocitos T reguladores (Treg). La amplitud de la respuesta inmunitaria provocada por inmunoterapia basada en levadura específica de Ad-36 puede modularse hacia el tipo deseado de respuesta inmunitaria (por ejemplo, TH1 frente a TH17 frente a Treg), y es muy adecuada para dirigirse a Ad-36. A diferencia de vacunas que se inmunizan generando respuestas de anticuerpo neutralizantes, las composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura que se dirigen a Ad-36 provocan respuestas inmunitarias celulares específicas de antígeno, de base amplia y potentes, incluyendo respuestas de linfocitos T CD4+ T que se cree que son particularmente eficaces para proporcionar inmunidad contra adenovirus, ya que la infección por adenovirus temprano puede inhibir la expresión del MHC de clase I. También se cree que la capacidad de la inmunoterapia basada en levadura para potenciar respuestas de linfocitos T TH17 es útil, ya que IL-17 bloquea la diferenciación de células adiposas precursoras a verdaderos adipocitos y también promueve la lipólisis (Shin et al., 2009).
La inmunoterapia basada en levadura también es muy capaz de activar células presentadoras de antígenos y tiene una capacidad única de sensibilizar de forma cruzada la respuesta inmunitaria, generando respuestas de CTL CD8+ que son típicamente eficaces contra infecciones víricas, incluso frente a lo que de otro modo puede ser un ambiente supresor. La inmunoterapia basada en levadura puede diseñarse para dirigirse a regiones de Ad-36 que son específicas para este virus, o para dirigirse a regiones que están conservada entre muchos serotipos de adenovirus y/o para dirigirse a una mezcla de estas regiones, haciendo la vacuna muy adaptable a las necesidades del individuo infectado, y para dirigirse a la inmunidad tanto protectora como terapéutica. Ya que este tipo de inmunoterapia utiliza la capacidad natural de la célula presentadora de antígeno para presentar inmunógenos relevantes, no es necesario conocer la identidad precisa de epítopos de CTL o epítopos del MHC de clase II para producir un producto inmunoterapéutico eficaz y, de hecho, múltiples epítopos de linfocitos T CD4 y CD8 pueden ser diana en una única composición. Por lo tanto, se espera que la inmunoterapia de Ad-36 basada en levadura, activando la respuesta inmunitaria tanto innata como adaptativa, se dirija eficazmente a células infectadas por Ad-36 para eliminación no citopática, destrucción, o ambas. Además de ser eficaces en el tratamiento del exceso de peso o combatir la tasa de aumento de peso, así como en el tratamiento de afecciones relacionadas con el exceso de peso o el aumento de peso que se asocian con la infección por Ad-36, se espera que las composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura de la invención sean eficaces en casos en los que el tejido adiposo presenta crecimiento anómalo o hipertrofia que se asocia con la presencia de Ad-36, como sucede en pacientes infectados con VIH. De hecho, antes del desarrollo de SIDA avanzado, los pacientes infectados por VIH y pacientes que experimentan adiposidad anómala asociada con Ad-36 que puede desarrollarse en el contexto de función inmunitaria normal reducida o alterada, administración de la inmunoterapia basada en levadura descrita en el presente documento puede ser eficaz para tratar dichos pacientes proporcionando una respuesta inmunitaria de base amplia suficiente para reducir la carga vírica de Ad-36 y de este modo resolver la hipertrofia del tejido adiposo anómala. La inmunoterapia basada en levadura activa múltiples rutas del sistema inmunitario y se espera que sea eficaz cuando otros enfoques terapéuticos, incluyendo otros enfoques inmunoterapéuticos, carecen de eficacia.
Las composiciones, los métodos y los usos de la invención se dirigen a la prevención y/o el tratamiento de infección por Ad-36, lo que puede reducir o prevenir uno o más síntomas o afecciones asociados con infección por Ad-36, incluyendo, pero sin limitación, obesidad, sobrepeso, aumento de peso indeseable o anómalo y/o hipertrofia de tejido adiposo anómala. Abordando estas afecciones, las secuelas corriente abajo de la obesidad y el sobrepeso, o afecciones asociadas con obesidad, exceso de peso, aumento de peso indeseable o anómalo o hipertrofia de tejido adiposo anómala, también pueden reducirse. Dichas afecciones incluyen, pero sin limitación, colesterol en suero alto, triglicéridos altos, tensión arterial alta, afecciones respiratorias, resistencia a la insulina y diabetes de tipo II.
Composiciones de la invención
Una realización de la presente invención se refiere a una composición inmunoterapéutica basada en levadura que puede usarse para prevenir y/o tratar la infección por Ad-36 o para aliviar al menos un síntoma resultante de la infección por Ad-36, incluyendo, pero sin limitación, obesidad, sobrepeso, aumento de peso indeseado o anómalo, o la propensión a los mismos. La composición comprende: (a) un vehículo de levadura; y (b) una o más proteínas de Ad-36 y/o uno o más dominios inmunogénicos de las mismas (colectivamente, "antígenos de Ad-36"). Junto con el vehículo de levadura, las proteínas de Ad-36 se expresan más típicamente como proteínas recombinantes por el vehículo de levadura (por ejemplo, por una levadura intacta o esferoplasto de levadura, que opcionalmente pueden procesarse además a un citoplasto de levadura, célula vacía de levadura o extracto de membrana de levadura o fracción de la misma), aunque es una realización de la invención que se carguen una o más de dichas proteínas de Ad-36 en un vehículo de levadura o formen complejos de otra manera con, se adhieran a, se mezclen con o se administren con un vehículo de levadura como se describe en el presente documento para formar una composición de la presente invención. Según la presente invención, la referencia a una proteína "heteróloga" o antígeno "heterólogo", incluyendo una proteína de fusión heteróloga, en relación a un vehículo de levadura de la invención, significa que la proteína o el antígeno no es una proteína o un antígeno que son expresadas de forma natural por la levadura, aunque una proteína de fusión puede incluir secuencias de levadura o proteínas o partes de las mismas que también son expresadas de forma natural por la levadura. Las proteínas de Ad-36 son heterólogas con respecto a levadura. Los antígenos diana útiles en la presente invención son normalmente proteínas de Ad-36 y/o dominios inmunogénicos de las mismas.
Otra realización de la invención se refiere a proteínas de fusión de Ad-36 novedosas descritas en la presente memoria. En un aspecto, dichas proteínas de fusión de Ad-36 son útiles en una composición inmunoterapéutica de la invención, incluyendo una composición inmunoterapéutica basada en levadura de la invención. Dichas proteínas de fusión, y/o las moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican dichas proteínas, se pueden usar también en, en combinación con o para producir, una composición inmunoterapéutica basada en levadura, que puede incluir, sin limitación, una vacuna de ADN, una vacuna de subunidad de proteína, una composición inmunoterapéutica basada en virus recombinante y una vacuna de patógeno destruido o inactivado. En otra realización, dichas proteínas de fusión pueden usarse en un ensayo de diagnóstico para Ad-36 y/o para generar anticuerpos contra Ad-36. Se describen en el presente documento proteínas de fusión de Ad-36 ejemplares que proporcionan partes seleccionadas de Ad-36 que son particularmente útiles en composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura de la invención.
Adenovirus-36
Adenovirus-36 (también denominado en el presente documento Ad-36, Adv-36, hAdv-36 o HAdV-D36, o serotipo de adenovirus 36, todos los cuales pueden usarse indistintamente) es uno de 52 serotipos conocidos en la actualidad de adenovirus que infectan seres humanos, de la familia Adenoviridae, género Mastadenovirus, especie Adenovirus humano D (HAdV-D). El virus fue identificado por primera vez en un niño con diabetes y enteritis (Wigand et al., 1980, mencionado anteriormente) y se depositó en la ATCC como ATCC® número VR-1610™ de Wigand. En 2010, Arnold y colaboradores secuenciaron el genoma de Ad-36 completo (Arnold et al., 2010, mencionado anteriormente), que está depositado con el n.° de referencia de GenBank® GQ384080.1 (GI:261875889). La secuencia de nucleótidos de esta secuencia genómica de adenovirus-36 representativa se representa en el presente documento por SEQ ID NO: 1.
Ad-36 es un virus de ADN bicatenario con un genoma de 35.152 pb, organizado en 39 fases abiertas de lectura (ORF) predichas. Las secuencias codificantes que son más divergentes de otros adenovirus se encuentran en el hexón, CR1p, CR1y y regiones codificantes de fibras. La Tabla 1 indica las secuencias proteicas individuales codificadas por el genoma de Ad-36 (SEQ ID NO: 1). Se observa que pueden producirse variaciones pequeñas en la secuencia de aminoácidos entre diferentes aislados víricos de la misma proteína de Ad-36. Sin embargo, usando las directrices proporcionadas en el presente documento y la referencia a las secuencias de Ad-36 ejemplares, un experto en la materia podrá fácilmente producir una diversidad de proteínas basadas en Ad-36, incluyendo proteínas de fusión, de cualquier cepa (aislado) o genotipo de Ad-36, para su uso en las composiciones y métodos de la presente invención y, por lo tanto, la invención no está limitada a las secuencias específicas divulgadas en el presente documento. La referencia a una proteína o antígeno de Ad-36 en cualquier parte de esta divulgación, o a cualquier dominio funcional, estructural o inmunogénico de la misma, puede en consecuencia hacerse por referencia a una secuencia particular de una o más de las secuencias presentadas en esta divulgación, o por referencia a la misma secuencia, una similar o correspondiente de un aislado (cepa) de Ad-36 diferente. Un experto en la materia podrá identificar fácilmente la posición de la secuencia correspondiente para cada proteína en la Tabla 1 en una secuencia de Ad-36 dada de cualquier cepa/aislado de Ad-36, dadas las directrices proporcionadas posteriormente, incluso aunque algunos aminoácidos pueden diferir de las secuencias en la Tabla 1.
T l 1. n i r i n vir -
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
Antígenos y construcciones diana de adenovirus-36.
Una realización de la invención se refiere a nuevas proteínas de Ad-36 y proteínas de fusión que pueden usarse como antígenos diana en una composición inmunoterapéutica de la invención y moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican estas proteínas o antígenos. Se describen en el presente documento varias proteínas de Ad-36 y proteínas de fusión nuevas diferentes para su uso como antígenos diana en una composición inmunoterapéutico basado en levadura u otra composición (por ejemplo, otra composición inmunoterapéutica o de diagnóstico) que proporcionan una, dos, o múltiples (tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más) y/o uno, dos o múltiples dominios inmunogénicos de una o más proteínas, todos contenidos en el mismo polipéptido y codificado por la misma construcción de ácido nucleico recombinante. Las proteínas usadas en las composiciones de la invención incluyen al menos un antígeno de Ad-36 para inmunizar un animal (de forma profiláctica o terapéutica). La composición puede incluir, una, dos, algunas, varias o una pluralidad de antígenos de Ad-36, incluyendo uno o más dominios inmunogénicos de una o más proteínas de Ad-36, según se desee.
Según la presente invención, el uso general en el presente documento del término "antígeno" se refiere: a cualquier parte de una proteína (péptido, proteína parcial, proteína de longitud completa), en donde la proteína es de origen natural o se ha obtenido sintéticamente, a una composición celular (célula completa, lisado celular o células alteradas), a un organismo (organismo completo, lisado o células alteradas) o a un carbohidrato, u otra molécula o una parte de la misma. Un antígeno puede provocar una respuesta inmunitaria específica de antígeno (por ejemplo, una respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por células) contra antígenos iguales o similares que encuentran un elemento del sistema inmunitario (por ejemplo, linfocitos T, anticuerpos).
Un antígeno puede ser tan pequeño como un único epítopo, o mayor, y puede incluir múltiples epítopos. Por tanto, el tamaño de un antígeno puede ser tan pequeño como de aproximadamente 5-12 aminoácidos (es decir, un péptido) y tan grande como: una proteína de longitud completa, un multímero, una proteína de fusión, una proteína quimérica, una célula completa, un microorganismo completo o cualquier parte de los mismos (por ejemplo, lisados de células completas o extractos de microorganismos. Además, los antígenos pueden incluir carbohidratos, que pueden cargarse en un vehículo de levadura o en una composición de la invención. Se apreciará que en algunas realizaciones (es decir, cuando el antígeno es expresado por el vehículo de levadura a partir de una molécula de ácido nucleico recombinante), el antígeno es una proteína, proteína de fusión, proteína quimérica o fragmento de la misma, en lugar de una célula o microorganismo completo.
Cuando el antígeno tiene va a expresarse en levadura, un antígeno es de un tamaño mínimo que puede expresarse de forma recombinante en levadura, y es típicamente de al menos o mayor de 25 aminoácidos de longitud, o de al menos o mayor de 26, al menos o mayor de 27, al menos o mayor de 28, al menos o mayor de 29, al menos o mayor de 30, al menos o mayor de 31, al menos o mayor de 32, al menos o mayor de 33, al menos o mayor de 34, al menos o mayor de 35, al menos o mayor de 36, al menos o mayor de 37, al menos o mayor de 38, al menos o mayor de 39, al menos o mayor de 40, al menos o mayor de 41, al menos o mayor de 42, al menos o mayor de 43, al menos o mayor de 44, al menos o mayor de 45, al menos o mayor de 46, al menos o mayor de 47, al menos o mayor de 48, al menos o mayor de 49, o de al menos o mayor de 50 aminoácidos de longitud, o es de al menos 25­ 50 aminoácidos de longitud, al menos 30-50 aminoácidos de longitud, o al menos 35-50 aminoácidos de longitud, o de al menos 40-50 aminoácidos de longitud, o al menos 45-50 aminoácidos de longitud. Pueden expresarse proteínas más pequeñas, y pueden expresarse proteínas considerablemente más grandes (por ejemplo, cientos de aminoácidos de longitud o incluso varios miles de aminoácidos de longitud). En un aspecto, puede expresarse una proteína de longitud completa o un dominio estructural o funcional de la misma o un dominio inmunogénico de la misma que carece de uno o más aminoácidos del extremo N y/o C (por ejemplo, que carece entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 aminoácidos del extremo N y/o C). Las proteínas de fusión y proteínas quiméricas también son antígenos que pueden expresarse en la invención. Un "antígeno diana" es un antígeno al que se dirige específicamente una composición inmunoterapéutica de la invención (es decir, un antígeno contra el que se desea provocar una respuesta inmunitaria). Un "antígeno de Ad-36" es un antígeno obtenido, diseñado o producido a partir de una o más proteínas de Ad-36 de modo que la dirección al antígeno también dirija al adenovirus-36.
Cuando se hace referencia a la estimulación de una respuesta inmunitaria, el término "inmunógeno" es un subconjunto del término "antígeno" y, por lo tanto, en algunos casos, puede usarse indistintamente con el término "antígeno". Un inmunógeno, como se usa en el presente documento, describe un antígeno que provoca una respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por células (es decir, es inmunogénico), de modo que la administración del inmunógeno a un individuo genera una respuesta inmunitaria específica de antígeno contra antígenos iguales o similares con los que se encuentra el sistema inmunitario del individuo. En una realización, el inmunógeno provoca una respuesta inmunitaria mediada por células, incluyendo una respuesta de linfocitos T CD4+ (TH1 y/o t H17) y/o una respuesta de linfocitos T CD8+ (por ejemplo una respuesta de CTL).
Un "dominio inmunogénico" de un antígeno dado puede ser cualquier parte, fragmento o epítopo de un antígeno (por ejemplo, un fragmento peptídico o subunidad o un epítopo de anticuerpo u otro epítopo conformacional) que contiene al menos un epítopo que puede actuar como un inmunógeno cuando se administra a un animal. Por lo tanto, un dominio inmunogénico es más grande que un único aminoácido y es de al menos un tamaño suficiente para contener al menos un epítopo. Por ejemplo, una única proteína puede contener múltiples dominios inmunogénicos diferentes. No es necesario que los dominios inmunogénicos sean secuencias lineales dentro de una proteína, tal como en el caso de una respuesta inmunitaria humoral, donde se contemplan dominios conformacionales.
Un epítopo se define en este documento como un único sitio inmunogénico dentro de un antígeno dado que es suficiente para provocar una respuesta inmunitaria cuando se proporciona al sistema inmunitario en el contexto de señales coestimuladoras apropiadas y/o células activadas del sistema inmunitario. En otras palabras, un epítopo es la parte de un antígeno que es reconocida por componentes del sistema inmunitario, y también puede denominarse determinante antigénico. Los expertos en la materia reconocerán que los epítopos de linfocitos T son de tamaño y composición diferentes de los epítopos de linfocitos B o anticuerpos, y que los epítopos presentados a través de la ruta del MHC de clase I difieren en tamaño y atributos estructurales de los epítopos presentados a través de la ruta del MHC de clase II. Por ejemplo, los epítopos de linfocitos T presentados por moléculas del MHC de clase I típicamente son de una longitud de entre 8 y 11 aminoácidos, mientras que los epítopos presentados por moléculas del MHC de clase II están menos restringidos en su longitud y pueden ser de hasta 25 aminoácidos o más largos. Además, los epítopos de linfocitos T tienen características estructurales predichas que dependen de las moléculas del MHC específicas con las que se une el epítopo. Los epítopos pueden ser epítopos de secuencia lineal o epítopos conformacionales (regiones de unión conservadas). La mayoría de los anticuerpos reconocen epítopos conformacionales.
Un "dominio funcional" de una proteína dada es una parte o unidad funcional de la proteína que incluye secuencia o estructura que es directa o indirectamente responsable de al menos una función biológica o química asociada con, atribuida a o realizada por la proteína. Por ejemplo, un dominio funcional puede incluir un sitio activo para actividad enzimática, un sitio de unión a ligando, un sitio de unión a receptor, un sitio de unión para una molécula o resto tal como calcio, un sitio de fosforilación o un dominio de transactivación.
Un "dominio estructural" de una proteína dada es una parte de la proteína o un elemento en la estructura global de la proteína que tiene una estructura identificable (por ejemplo, puede ser una estructura primaria o terciaria que pertenece a y es indicativa de varias proteínas dentro de una clase o familia de proteínas), es autoestabilizante y/o puede plegarse independientemente del resto de la proteína. Un dominio estructural está frecuentemente asociado con o tiene un papel prominente en la función biológica de la proteína a la que pertenece.
Un antígeno de Ad-36 de la presente invención es una proteína de fusión. En un aspecto de la invención, dicha proteína de fusión puede incluir dos o más antígenos. En un aspecto, la proteína de fusión puede incluir dos o más dominios inmunogénicos y/o dos o más epítopos de una o más proteínas de Ad-36. Una composición inmunoterapéutica que contiene dichos antígenos puede proporcionar inmunización específica de antígeno en una amplia serie de pacientes. Por ejemplo, una proteína o proteína de fusión abarcada por la invención puede incluir al menos una parte o la longitud completa de una cualquiera o más proteínas de Ad-36 representadas en la Tabla 1 (secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 2 a 41) y/o uno o más dominios inmunogénicos cualesquiera de una cualquiera o más de estas proteínas de Ad-36, proporcionadas en cualquier combinación. En una realización, una proteína útil en la presente invención comprende una o más de las siguientes proteínas de Ad-36 y/o uno o más dominios inmunogénicos de una cualquiera o más de las siguientes proteínas: hexón, fibra, CR1a, CR1y y/o E4. En una realización, un antígeno útil en una composición inmunoterapéutica de la invención es una única proteína de Ad-36 (longitud completa, longitud casi completa o parte de la misma que comprende, al menos, uno, dos, tres, cuatro o más dominios inmunogénicos de una proteína de longitud completa). En una realización de la invención, una composición inmunoterapéutica incluye uno, dos, tres, cuatro, cinco o más vehículos de levadura individuales, expresando o conteniendo cada uno un antígeno de Ad-36 diferente.
En una realización de la invención, el o los antígenos de Ad-36 para su uso en una composición de la invención es un antígeno de Ad-36 que comprende o consiste en hexón, fibra, CR1 a, CR1y y/o E4 y/o uno o más dominios (estructurales, funcionales o inmunogénicos) de los mismos, o cualquier combinación de los mismos. En un aspecto, uno cualquiera o más de estas proteínas o dominios son de longitud completa o longitud casi completa. Según la presente invención, la referencia a una proteína "de longitud completa" (o un dominio funcional de longitud completa o dominio inmunológico de longitud completa) incluye la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína o dominio funcional o dominio inmunológico, como se describe en el presente documento o se conoce de otro modo o se describe en una secuencia públicamente disponible. Una proteína o dominio que es "de longitud casi completa", que también es un tipo de homólogo de una proteína, difiere de una proteína o dominio de longitud completa, por la adición o supresión de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos del extremo N y/o C de dicha proteína de longitud completa o dominio de longitud completa. La referencia general a una proteína o dominio puede incluir proteínas de longitud completa y de longitud casi completa, así como otros homólogos de las mismas. En un aspecto, una o más de estas proteínas o dominios comprenden o consisten en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más dominios inmunogénicos. En un aspecto, uno cualquiera o más de estas proteínas o dominios comprenden al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la secuencia lineal de la secuencia de longitud completa correspondiente o de un dominio o parte específico de la secuencia de longitud completa. Una secuencia de expresión N-terminal y/o un marcador C-terminal son opcionales para su uso con los antígenos de Ad-36, y puede seleccionarse de varias secuencias diferentes descritas en otra parte del presente documento para mejorar la expresión, estabilidad y/o permitir la identificación y/o purificación de la proteína, o una o ambas de las secuencias N o C-terminales se omiten completamente. Además, se conocen en la técnica muchos promotores diferentes adecuados para su uso en levadura.
Además si dos o más proteínas de Ad-36 o dominios de las mismas se incluyen en un antígeno de Ad-36, pueden introducirse opcionalmente secuencias conectoras intermedias cortas (por ejemplo, péptidos de 1, 2, 3, 4 o 5 o más aminoácidos) entre partes de la proteína o entre las proteínas y otros elementos (por ejemplo, péptidos N-terminales) por una diversidad de razones, incluyendo la introducción de sitios de enzimas de restricción para facilitar la clonación y la futura manipulación de las construcciones. Por último, como se analiza en otra parte del presente documento, las secuencias descritas en el presente documento son ejemplares y pueden modificarse como se ha descrito anteriormente para sustituir, añadir o suprimir secuencias para acomodar preferencias para la cepa o el aislado de Ad-36, o secuencias consenso e inclusión de epítopos de linfocitos T preferidos, incluyendo epítopos de linfocitos T dominantes y/o subdominantes.
En un aspecto de la invención, los antígenos de Ad-36 útiles en la invención son antígenos que son divergentes, o están menos conservados, con respecto a otros adenovirus (por ejemplo, tienen homología o identidad de secuencia relativamente baja con las mismas proteínas o proteínas equivalentes de otros serotipos/genotipos de adenovirus). En una realización de la invención, una región divergente de una proteína, o referencia a una proteína o región de una proteína que es divergente con respecto a otras proteínas de estructura y/o función similar (por ejemplo, una región de una proteína de Ad-36 en comparación con aproximadamente la misma región o una región similar de la misma proteína o una proteína equivalente de otro serotipo/genotipo de adenovirus), se define como una región proteica para la que hay menos de aproximadamente 60 % de identidad de aminoácidos promedio entre la secuencia de referencia y al menos otras cinco secuencias de otras fuentes que son equivalentes en estructura y/o función, determinada, por ejemplo, usando un algoritmo de BLAST (descrito posteriormente). En consecuencia, se incluyen proteínas o dominios o partes de proteínas de Ad-36 que no están altamente conservados (están relativamente o muy poco conservados) con otros serotipos/genotipos de adenovirus en antígenos y proteínas de fusión útiles en la invención, en una realización de la invención. La inclusión de antígenos de Ad-36 que son divergentes de otros antígenos de adenovirus (por ejemplo, antígenos similares o equivalentes, con respecto a la estructura y/o función, de otros serotipos o genotipos de adenovirus) tiene la ventaja de crear una composición inmunoterapéutica que es específica de Ad-36 y potencialmente minimiza los efectos fuera de diana del producto inmunoterapéutico o dilución de la especificidad del producto inmunoterapéutico. En otro aspecto de la invención, pueden incluirse antígenos de regiones conservadas de Ad-36 (por ejemplo, regiones con mayor homología de secuencia con otros antígenos similares o equivalentes de otros serotipos/genotipos de adenovirus) en una proteína de fusión o composición de la invención, que tiene la ventaja, por ejemplo, de proporcionar un producto inmunoterapéutico de amplio espectro con aplicaciones potenciales más allá del tratamiento o la prevención de obesidad y afecciones relacionadas con tejido adiposo.
En una realización ejemplar de la invención, el o los antígenos de Ad-36 para su uso en una composición de la invención,. es una proteína que comprende secuencias de Ad-36, en donde las secuencias de Ad-36 comprenden o consisten en proteína de fibra de Ad-36 y/o uno o más dominios inmunogénicos de proteína de fibra de Ad-36. En un aspecto, el antígeno de fibra de Ad-36 es proteína de fibra de longitud completa o proteína de fibra de longitud casi completa. En un aspecto, el antígeno de fibra de Ad-36 comprende al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la secuencia lineal de un antígeno de fibra de Ad-36 de longitud completa o un dominio inmunogénico o parte del mismo. En un aspecto, el antígeno de fibra de Ad-36 es de al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a un antígeno de fibra de Ad-36 de longitud completa o un dominio inmunogénico o parte del mismo. En una realización, una proteína útil en una composición de la invención comprende o consiste en dominios o partes divergentes, es decir, dominios o partes relativamente no conservados, con respecto a otros adenovirus, de proteína de fibra de Ad-36. Por ejemplo, una construcción de proteína de fibra de Ad-36 según esta realización puede estar comprendida por una fusión de una, dos, tres, cuatro o más regiones diferentes de proteína de fibra de Ad-36 que están poco conservadas entre genotipos adenovíricos humanos.
Se describen ejemplos de dichas proteínas de fusión en el Ejemplo 1. Un antígeno de Ad-36 que comprende secuencia de proteína de fibra descrita en el Ejemplo 1 es una proteína de fusión expresada como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representado por la SEQ ID NO: 42: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar la expresión (posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO: 42); (2) las posiciones 71-136 de fibra de Ad-36 (posiciones 71-136 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 7-72 de la SEQ ID NO: 42; (3) las posiciones 145-169 de fibra de Ad-36 (posiciones 145-169 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 73­ 97 de la SEQ ID NO: 42; (4) las posiciones 290-313 de fibra de Ad-36 (posiciones 290-313 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 98-194 de la SEQ ID NO: 42; (5) las posiciones 334-363 de fibra de Ad-36 (posiciones 334-363 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 195-224 de la SEQ ID NO: 42; y (6) un marcador de hexahistidina (posiciones 225-230 de la SEQ ID NO: 42). Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 42 (codones optimizados para la expresión en levadura) también está incluida en la presente divulgación.
Otro antígeno de Ad-36 que comprende secuencia de proteína de fibra descrita en el Ejemplo 1 es una proteína de fusión expresada como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representado por la SEQ ID NO: 48: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar o potenciar la expresión (SEQ ID NO: 56 o posiciones 1 a 89 de la SEQ ID NO: 48); (2) un espaciador/conector de dos aminoácidos (Thr-Ser) para facilitar la clonación y manipulación de las secuencias (posiciones 90 a 91 de la SEQ ID NO: 48); (3) las posiciones 71-136 de fibra de Ad-36 (posiciones 71­ 136 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 92-157 de la SEQ ID NO: 48; (4) las posiciones 145-169 de fibra de Ad-36 (posiciones 145-169 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 158-182 de la SEQ ID NO: 48; (5) las posiciones 290-313 de fibra de Ad-36 (posiciones 290-313 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 183-279 de la SEQ ID NO: 48; (6) las posiciones 334-363 de fibra de Ad-36 (posiciones 334-363 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 280-309 de la SEQ ID NO: 48; y (7) un marcador de hexahistidina (posiciones 310-315 de la SEQ ID NO: 48). Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 48 (codones optimizados para la expresión en levadura) también está incluida en la presente divulgación.
Los segmentos de aminoácidos usados en estas proteínas de fusión pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio; los ejemplos proporcionados en el presente documento son solamente ejemplares. Además, la secuencia de expresión N-terminal (por ejemplo, las posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO:42 o las posiciones 1-89 de la SEQ ID nO:48) y el marcador C-terminal (por ejemplo, las posiciones 225-230 de la SEQ ID NO:42 o las posiciones 310-315 de la SEQ ID NO:48) son opcionales y pueden seleccionarse en lugar de otras secuencias diferentes descritas en otra parte en el presente documento o que se conoce en la técnica que mejoran la expresión, estabilidad y/o permiten la identificación y/o purificación de la proteína, o una o ambas se pueden omitir completamente. Asimismo, pueden introducirse secuencias conectoras intermedias cortas tales como la ejemplificada en la SEQ ID NO: 48 (por ejemplo, péptidos de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos o más grandes) entre partes de la proteína de fusión por una diversidad de razones, incluyendo la introducción de sitios de enzimas de restricción para facilitar la clonación como sitios de escisión para proteasas fagosómicas del hospedador, para acelerar el procesamiento de proteínas o antígenos, y para la futura manipulación de las construcciones. La secuencia de aminoácidos que consiste solamente en las proteínas de fibra de Ad-36 en las proteínas de fusión descritas anteriormente se representa en el presente documento por SEQ ID NO: 49. La SEQ ID NO: 49 es una proteína de fusión expresada como un único polipéptido: (1) las posiciones 71-136 de fibra de Ad-36 (posiciones 71-136 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 1-66 de la SEQ ID NO: 49; (2) las posiciones 145-169 de fibra de Ad-36 (posiciones 145-169 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 67-91 de la SEQ ID NO: 49; (3) las posiciones 290-313 de fibra de Ad-36 (posiciones 290-313 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 92-188 de la SEQ ID NO: 49; y (4) las posiciones 334-363 de fibra de Ad-36 (posiciones 334-363 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 189-218 de la SEQ ID NO: 49. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 49 (codones optimizados para la expresión en levadura) también está incluida en la presente divulgación.
En otra realización ejemplar de la invención, el o los antígenos de Ad-36 para su uso en una composición de la invención, es una proteína que comprende secuencias de Ad-36, en donde las secuencias de Ad-36 comprenden o consisten en proteína de hexón de Ad-36 y/o uno o más dominios inmunogénicos de proteína de hexón de Ad-36. En un aspecto, el antígeno de hexón de Ad-36 es proteína de hexón de longitud completa o proteína de hexón de longitud casi completa (longitud completa y longitud casi completa se han definido anteriormente). En un aspecto, el antígeno de hexón de Ad-36 comprende al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la secuencia lineal de un proteína de hexón de Ad-36 de longitud completa o un dominio inmunogénico o parte del mismo. En un aspecto, el antígeno de hexón de Ad-36 es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a un proteína de hexón de Ad-36 de longitud completa o un dominio inmunogénico o parte del mismo. En una realización, una proteína útil en una composición de la invención comprende o consiste en dominios o partes divergentes, es decir, dominios o partes relativamente no conservados, con respecto a otros adenovirus, de proteína de hexón de Ad-36. Por ejemplo, una construcción de proteína de hexón de Ad-36 según esta realización puede estar comprendida por una fusión de una, dos, tres, cuatro, cinco o más regiones diferentes de proteína de hexón de Ad-36 que están poco conservadas entre genotipos adenovíricos humanos.
Se describen ejemplos de dichas proteínas de fusión que comprenden proteínas de hexón en el Ejemplo 1. Uno de dichos antígenos de Ad-36 que comprende secuencias de proteínas de hexón procedentes de partes divergentes de hexón de Ad-36 es una proteína de fusión expresada como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representado por la SEQ ID NO: 43: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar la expresión (posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO: 43); (2) las posiciones 136-218 de hexón de Ad-36 (posiciones 136-218 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 7-89 de la SEQ ID NO: 43; (3) las posiciones 235-285 de hexón de Ad-36 (posiciones 235-285 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 90-141 de la SEQ ID NO: 43; (4) las posiciones 297-308 de hexón de Ad-36 (posiciones 297-308 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 142-153 de la SEQ ID NO: 43; (5) las posiciones 410-450 de hexón de Ad-36 (posiciones 410-450 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 154-194 de la SEQ ID NO: 43; y (6) un marcador de hexahistidina (posiciones 195-200 de la SEQ ID NO: 43). Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 43 (codones optimizados para la expresión en levadura) también está incluida en la presente divulgación.
Otro antígeno de Ad-36 que comprende secuencia de proteína de hexón procedente de partes divergentes de secuencia de Ad-36 es una proteína de fusión expresada como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representado por la SEQ ID NO: 50: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar o potenciar la expresión (SEQ ID NO: 56 o posiciones 1 a 89 de la SEQ ID NO: 50); (2) un espaciador/conector de dos aminoácidos (Thr-Ser) para facilitar la clonación y manipulación de las secuencias (posiciones 90 a 91 de la SEQ ID NO: 50); (3) las posiciones 136-218 de hexón de Ad-36 (posiciones 136-218 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 92-174 de la SEQ ID NO: 50; (4) las posiciones 235-285 de hexón de Ad-36 (posiciones 235-285 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 175-226 de la SEQ ID NO: 50; (5) las posiciones 297-308 de hexón de Ad-36 (posiciones 297-308 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 227-238 de la SEQ ID NO: 50; (6) las posiciones 410-450 de hexón de Ad-36 (posiciones 410-450 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 239-279 de la SEQ ID NO: 50; y (7) un marcador de hexahistidina (posiciones 280-285 de la SEQ ID NO: 50). Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 50 (codones optimizados para la expresión en levadura) también está incluida en la presente divulgación.
Los segmentos de aminoácidos usados en estas proteínas de fusión basadas en hexón descritas anteriormente pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio; los ejemplos proporcionados en el presente documento son solamente ejemplares. Además, la secuencia de expresión N-terminal (por ejemplo, las posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO: 43 o las posiciones 1-89 de la SEQ ID NO: 50) y el marcador C-terminal (por ejemplo, las posiciones 195-200 de la SEQ ID NO: 43 o las posiciones 280­ 285 de la SEQ ID NO: 50) son opcionales y pueden seleccionarse en lugar de otras secuencias diferentes descritas en otra parte en el presente documento o que se conoce en la técnica que mejoran la expresión, estabilidad y/o permiten la identificación y/o purificación de la proteína, o una o ambas se pueden omitir completamente. Asimismo, pueden introducirse secuencias conectoras intermedias cortas tales como la ejemplificada en la SEQ ID NO: 48 (por ejemplo, péptidos de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos o más grandes) entre partes de la proteína de fusión por una diversidad de razones, incluyendo la introducción de sitios de enzimas de restricción para facilitar la clonación como sitios de escisión para proteasas fagosómicas del hospedador, para acelerar el procesamiento de proteínas o antígenos, y para la futura manipulación de las construcciones. La secuencia de aminoácidos que consiste solamente en las proteínas de hexón de Ad-36 en las proteínas de fusión descritas anteriormente se representa en el presente documento por SEQ ID NO: 51. La SEQ ID NO: 51 es una proteína de fusión expresada como un único polipéptido: (1) las posiciones 136-218 de hexón de Ad-36 (posiciones 136-218 de la SeQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 1-83 de la SEQ ID NO: 51; (2) las posiciones 235-285 de hexón de Ad-36 (posiciones 235-285 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 84-135 de la SEQ ID NO: 51; (3) las posiciones 297-308 de hexón de Ad-36 (posiciones 297-308 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 136-147 de la SEQ ID NO: 51; y (4) las posiciones 410-450 de hexón de Ad-36 (posiciones 410-450 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 148-188 de la SEQ ID NO: 51. Puede adjuntarse cualquier secuencia N-terminal y/o C-terminal adecuada a esta secuencia, como se ha descrito anteriormente para SEQ ID NO: 43 y 50, o pueden omitirse una o ambas. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 51 (codones optimizados para la expresión en levadura) también está incluida en la presente divulgación.
Un antígeno de Ad-36 que comprende secuencia de proteína de hexón de longitud completa o longitud casi completa descrita en el Ejemplo 1 es una proteína de fusión expresada como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representado por la SEQ ID NO: 44: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar la expresión (posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO: 44); (2) las posiciones 2-944 de hexón de Ad-36 (posiciones 2-944 de la SeQ ID No : 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 7-949 de la SEQ ID NO: 44; y (3) un marcador de hexahistidina (posiciones 950-955 de la SEQ ID NO: 44). Esta construcción contiene epítopos del MHC de clase I demostrados o potenciales (por ejemplo, las posiciones 119-129 de la SEQ ID NO:44; posiciones 319-327 de la SEQ ID NO: 44; posiciones 710-718 de la SEQ ID NO: 44; posiciones 843-851 de la SEQ ID NO: 44; o posiciones 909-915 de la SEQ ID NO: 44) y epítopos del MHC de clase II demostrados o potenciales (por ejemplo, las posiciones 15-25 de la SEQ ID NO:44; posiciones 31-41 de la SEQ ID NO: 44; 321-335 de la SEQ ID NO: 44; posiciones 373-383 de la SEQ ID NO: 44; posiciones 707-718 de la SEQ ID NO: 44; o posiciones 862­ 872 de la SEQ ID NO: 44). Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 44 (codones optimizados para la expresión en levadura) también está incluida en la presente divulgación.
Otro antígeno de Ad-36 que comprende secuencia de proteína de hexón de longitud completa o longitud casi completa descrita en el Ejemplo 1 es una proteína de fusión expresada como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representado por la SEQ ID NO: 52: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar o potenciar la expresión (SEQ ID NO: 56 o posiciones 1 a 89 de la SEQ ID NO: 52); (2) un espaciador/conector de dos aminoácidos (Thr-Ser) para facilitar la clonación y manipulación de las secuencias (posiciones 90 a 91 de la SEQ ID NO: 52); (3) las posiciones 2-944 de hexón de Ad-36 (posiciones 2-944 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 92-1034 de la SEQ ID NO: 52; y (3) un marcador de hexahistidina (posiciones 1035-1040 de la SEQ ID NO: 52). Esta construcción contiene epítopos del MHC de clase I demostrados o potenciales (por ejemplo, las posiciones 204-214 de la SEQ ID NO:52; posiciones 404-412 de la SEQ ID NO: 52; posiciones 795-803 de la SEQ ID NO: 52; posiciones 928-936 de la SEQ ID NO: 52; o posiciones 994-1000 de la s Eq ID NO: 52) y epítopos del MHC de clase II demostrados o potenciales (por ejemplo, las posiciones 100-110 de la SEQ ID NO:52; posiciones 116-126 de la SEQ ID NO: 52; 406-420 de la SEQ ID NO: 52; posiciones 458-468 de la SEQ ID NO: 52; posiciones 792-803 de la SEQ ID NO: 52; o posiciones 947-957 de la SEQ ID NO: 52). Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 52 (codones optimizados para la expresión en levadura) también está incluida en la presente divulgación.
Los segmentos de aminoácidos usados en estas proteínas de fusión basadas en hexón descritas anteriormente pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio; los ejemplos proporcionados en el presente documento son solamente ejemplares. Además, la secuencia de expresión N-terminal (por ejemplo, las posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO: 44 o las posiciones 1-89 de la SEQ ID NO: 52) y el marcador C-terminal (por ejemplo, las posiciones 950-955 de la SEQ ID NO: 44 o las posiciones 1035­ 1040 de la SEQ ID NO: 52) son opcionales y pueden seleccionarse en lugar de otras secuencias diferentes descritas en otra parte en el presente documento o que se conoce en la técnica que mejoran la expresión, estabilidad y/o permiten la identificación y/o purificación de la proteína, o una o ambas se pueden omitir completamente. Asimismo, pueden introducirse secuencias conectoras intermedias cortas tales como la ejemplificada en la SEQ ID NO: 48 (por ejemplo, péptidos de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos o más grandes) entre partes de la proteína de fusión por una diversidad de razones, incluyendo la introducción de sitios de enzimas de restricción para facilitar la clonación como sitios de escisión para proteasas fagosómicas del hospedador, para acelerar el procesamiento de proteínas o antígenos, y para la futura manipulación de las construcciones. La secuencia de aminoácidos que consiste solamente en la proteína de hexón de Ad-36 en las proteínas de fusión descritas anteriormente se representa en el presente documento por SEQ ID NO: 53. SEQ ID NO: 53 es una proteína de fusión expresada como un único polipéptido y comprende las posiciones 2-944 de hexón de Ad-36 (posiciones 2-944 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 1-943 de la SEQ ID NO: 53. Esta construcción contiene epítopos del MHC de clase I demostrados o potenciales (por ejemplo, las posiciones 113-123 de la SEQ ID NO:53; posiciones 313-321 de la SEQ ID NO: 53; posiciones 704-712 de la SEQ ID NO: 53; posiciones 837-845 de la SEQ ID NO: 53; o posiciones 903-909 de la SEQ ID NO: 53) y epítopos del MHC de clase II demostrados o potenciales (por ejemplo, las posiciones 9-19 de la SEQ ID NO:53; posiciones 25-35 de la SEQ ID NO: 53; 315-329 de la SEQ ID NO: 53; posiciones 367-377 de la SEQ ID NO: 53; posiciones 701-712 de la SEQ ID NO: 53; o posiciones 856-866 de la SEQ ID NO: 53). Puede adjuntarse cualquier secuencia N-terminal y/o C-terminal adecuada a esta secuencia, como se ha descrito anteriormente para SEQ ID NO: 44 y 52, o pueden omitirse una o ambas. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 53 (codones optimizados para la expresión en levadura) también está incluida en la presente divulgación.
En otra realización ejemplar de la invención, el o los antígenos de Ad-36 para su uso en una composición de la invención es una proteína que comprende secuencias de Ad-36, en donde las secuencias de Ad-36 comprenden o consisten en proteína de hexón y proteína de fibra de Ad-36 y/o uno o más dominios inmunogénicos de proteína de hexón y proteína de fibra. En un aspecto, el antígeno de hexón de Ad-36 y/o de fibra de Ad-36 son proteínas de longitud completa o proteínas de longitud casi completa (longitud completa y longitud casi completa se han definido anteriormente). En un aspecto, el antígeno de hexón y de fibra de Ad-36 comprende al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la secuencia lineal de un proteína de Ad-36 de longitud completa o dominio inmunogénico o parte del mismo. En un aspecto, el antígeno de hexón de Ad-36 y/o de fibra de Ad-36 es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a un proteína de Ad-36 de longitud completa o dominio inmunogénico o parte del mismo. En una realización, una proteína útil en una composición de la invención comprende o consiste en dominios o partes divergentes, es decir, dominios o partes relativamente no conservados, con respecto a otros adenovirus, de proteína de hexón de Ad-36 y proteína de fibra de Ad-36. Por ejemplo, una construcción de proteína de hexón-fibra o fibra-hexón de Ad-36 según esta realización puede estar comprendida por una fusión de una, dos, tres, cuatro, cinco o más regiones diferentes de proteína de hexón de Ad-36 que están poco conservadas entre genotipos adenovíricos humanos, y una, dos, tres, cuatro, cinco o más regiones diferentes de proteína de fibra de Ad-36 que están poco conservadas entre genotipos adenovíricos humanos.
Se describen ejemplos de dichas proteínas de fusión que comprenden proteínas tanto de hexón como de fibra en el Ejemplo 1. Uno de dichos antígenos de Ad-36 que comprende secuencias de proteínas de hexón y fibra procedentes de partes divergentes de hexón y fibra de Ad-36 es una proteína de fusión expresada como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representado por la SEQ ID NO: 45: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar la expresión (posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO: 45); (2) las posiciones 71-136 de fibra de Ad-36 (posiciones 71-136 de la SeQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 7-72 de la SEQ ID NO: 45; (3) las posiciones 145-169 de fibra de Ad-36 (posiciones 145-169 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 73-97 de la SEQ ID NO: 45; (4) las posiciones 290-313 de fibra de Ad-36 (posiciones 290-313 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 98-194 de la SEQ ID NO: 45; (5) las posiciones 334-363 de fibra de Ad-36 (posiciones 334-363 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 195-224 de la SEQ ID NO: 45; (6) las posiciones 136-218 de hexón de Ad-36 (posiciones 136-218 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 225-307 de la SEQ ID NO: 45; (7) las posiciones 235-285 de hexón de Ad-36 (posiciones 235-285 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 308-359 de la SEQ ID NO: 45; (8) las posiciones 297-308 de hexón de Ad-36 (posiciones 297-308 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 360-371 de la SEQ ID NO: 45; (9) las posiciones 410-450 de hexón de Ad-36 (posiciones 410-450 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 372-412 de la SEQ ID NO: 45; y (10) un marcador de hexahistidina (posiciones 413-418 de la SEQ ID NO: 45).
Otro antígeno de Ad-36 que comprende secuencias de proteínas de hexón y fibra procedentes de partes divergentes de hexón y fibra de Ad-36 es una proteína de fusión expresada como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representado por la SEQ ID NO: 46: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar la expresión (posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO: 46); (2) las posiciones 136-218 de hexón de Ad-36 (posiciones 136-218 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 7-89 de la SEQ ID NO: 46; (3) las posiciones 235-285 de hexón de Ad-36 (posiciones 235-285 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 90-141 de la SEQ ID NO: 46; (4) las posiciones 297-308 de hexón de Ad-36 (posiciones 297-308 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 142-153 de la SEQ ID NO: 46; (5) las posiciones 410-450 de hexón de Ad-36 (posiciones 410-450 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 154-194 de la SEQ ID NO: 46; (6) las posiciones 71-136 de fibra de Ad-36 (posiciones 71-136 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 195-260 de la SEQ ID NO: 46; (7) las posiciones 145-169 de fibra de Ad-36 (posiciones 145-169 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 261-285 de la SEQ ID NO: 46; (8) las posiciones 290-313 de fibra de Ad-36 (posiciones 290-313 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 286-382 de la SEQ ID NO: 46; (9) las posiciones 334-363 de fibra de Ad-36 (posiciones 334-363 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 383-412 de la SEQ ID NO: 46; y (10) un marcador de hexahistidina (posiciones 413-418 de la SEQ ID NO: 46). Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 46 (codones optimizados para la expresión en levadura) también está incluida en la presente divulgación.
Los segmentos de aminoácidos usados en cualquiera de las proteínas de fusión descritas anteriormente pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio; los ejemplos proporcionados en el presente documento son solamente ejemplares. La secuencia de expresión N-terminal (las posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO: 45 o 46) y el marcador C-terminal (las posiciones 413-418 de la SEQ ID NO: 45 o 46) son opcionales y pueden seleccionarse en lugar de otras secuencias diferentes descritas en otra parte en el presente documento o que se conoce en la técnica que mejoran la expresión, estabilidad y/o permiten la identificación y/o purificación de la proteína, o una o ambas se pueden omitir completamente. Asimismo, pueden introducirse secuencias conectoras intermedias cortas tales como la ejemplificada en la SEQ ID NO: 48 (por ejemplo, péptidos de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos o más grandes) entre partes de la proteína de fusión por una diversidad de razones, incluyendo la introducción de sitios de enzimas de restricción para facilitar la clonación como sitios de escisión para proteasas fagosómicas del hospedador, para acelerar el procesamiento de proteínas o antígenos, y para la futura manipulación de las construcciones. Por ejemplo, una proteína de fusión que omite las secuencias tanto N como C-terminales de la SEQ ID NO: 45 está representada por las posiciones 7-412 de la SEQ ID NO: 45 y una proteína de fusión que omite las secuencias tanto N como C-terminales de la SEQ ID NO: 46 está representada por las posiciones 7-412 de la SEQ ID NO: 46.
En otra realización ejemplar más de la invención, el o los antígenos de Ad-36 para su uso en una composición de la invención es una proteína que comprende secuencias de Ad-36, en donde las secuencias de Ad-36 comprenden o consisten en proteína CR1a de Ad-36 y/o CR1y de Ad-36 y/o uno o más dominios inmunogénicos de CR1a y/o CR1y. En un aspecto, el antígeno de c R1 tt de Ad-36 y/o de CR1y de Ad-36 son proteínas de longitud completa o proteínas de longitud casi completa (longitud completa y longitud casi completa se han definido anteriormente). En un aspecto, el antígeno de CR1a de Ad-36 y/o de CR1y de Ad-36 comprende al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la secuencia lineal de un proteína de Ad-36 de longitud completa o dominio inmunogénico o parte del mismo. En un aspecto, el antígeno de CR1a de Ad-36 y/o de CR1y de Ad-36 es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a un proteína de Ad-36 de longitud completa o dominio inmunogénico o parte del mismo. En una realización, una proteína útil en una composición de la invención comprende o consiste en dominios o partes divergentes, es decir, dominios o partes relativamente no conservados, con respecto a otros adenovirus, de CR1 a y/o CR1y de Ad-36. Por ejemplo, una construcción de proteína de CR1a y/o CR1y de Ad-36 según esta realización puede estar comprendida por una fusión de una, dos, tres, cuatro, cinco o más regiones diferentes de proteína de cR1a y/o CR1y de Ad-36 que están poco conservadas entre genotipos adenovíricos humanos. En una realización, una región N-terminal notablemente hidrófoba se omite de CR1a en una proteína de la invención (por ejemplo, aproximadamente las posiciones 1-17 de la proteína madura) para minimizar el riesgo de agregación y/o insolubilidad cuando esa proteína se exprese en levadura. En una realización, un segmento C-terminal de CR1a madura se omite de proteínas usadas en la invención debido a la notable hidrofobicidad (posiciones 158-177) más alta conservación de secuencia con otros serotipos/genotipos de adenovirus (posiciones 158 a extremo C). En otra realización, las posiciones N-terminales 1­ 18 de CR1y se omiten de proteínas usadas en la invención ya que contienen ambas posiciones de aminoácidos altamente conservadas con otros serotipos/genotipos de adenovirus y también contienen un elemento muy hidrófobo.
Se describen ejemplos de dichas proteínas de fusión que comprenden proteínas tanto de CR1a como de CR1y en el Ejemplo 1. Uno de dichos antígenos de Ad-36 que comprende secuencias de proteínas de CR1a y CR1y procedentes de partes divergentes y/o seleccionadas de CR1 a y CR1y de Ad-36 es una proteína de fusión expresada como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representado por la SEQ ID NO: 47: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar la expresión (posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO: 47); (2) las posiciones 18-60 de CR1a (posiciones 18-60 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 7-49 de la SEQ ID NO: 47; (3) las posiciones 123-157 de CR1a de Ad-36 (posiciones 123-157 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 50-84 de la SEQ ID NO: 47; (4) las posiciones 19-60 de CR1y de Ad-36 (posiciones 19-60 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 85-126 de la SEQ ID NO: 47; (5) las posiciones 83-116 de CR1y de Ad-36 (posiciones 83-116 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 127-160 de la SEQ ID NO: 47; y (6) un marcador de hexahistidina (posiciones 161-166 de la SEQ ID NO: 47). Los segmentos de aminoácidos usados en cualquiera de las proteínas de fusión descritas anteriormente pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio; los ejemplos proporcionados en el presente documento son solamente ejemplares. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 47 (codones optimizados para la expresión en levadura) también está incluida en la presente invención.
Otro antígeno de Ad-36 que comprende secuencias de proteínas de CR1a y CR1y descritas en el Ejemplo 1 es una proteína de fusión expresada como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representado por la s Eq ID NO: 54: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar o potenciar la expresión (SEQ ID NO: 56 o posiciones 1 a 89 de la SEQ ID NO: 54); (2) un espaciador/conector de dos aminoácidos (Thr-Ser) para facilitar la clonación y manipulación de las secuencias (posiciones 90 a 91 de la SEQ ID NO: 54); (3) las posiciones 18-60 de CR1 a (posiciones 18-60 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 92-134 de la SEQ ID NO: 54; (4) las posiciones 123-157 de CR1a de Ad-36 (posiciones 123-157 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 135-169 de la SEQ ID NO: 54; (5) las posiciones 19-60 de CR1y de Ad-36 (posiciones 19-60 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 170-211 de la SEQ ID NO: 54; (6) las posiciones 83-116 de CR1 y de Ad-36 (posiciones 83-116 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 212-245 de la SEQ ID NO: 54; y (7) un marcador de hexahistidina (posiciones 246-251 de la SEQ ID nO: 54). Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 54 (codones optimizados para la expresión en levadura) también está incluida en la presente invención.
Los segmentos de aminoácidos usados en estas proteínas de fusión basadas en CR1a y CR1y descritas anteriormente pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio; los ejemplos proporcionados en el presente documento son solamente ejemplares. Además, la secuencia de expresión N-terminal (por ejemplo, las posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO: 47 o las posiciones 1-89 de la SEQ ID NO: 54) y el marcador C-terminal (por ejemplo, las posiciones 161-166 de la SeQ ID NO: 47 o las posiciones 246-251 de la SEQ ID NO: 54) son opcionales y pueden seleccionarse en lugar de otras secuencias diferentes descritas en otra parte en el presente documento o que se conoce en la técnica que mejoran la expresión, estabilidad y/o permiten la identificación y/o purificación de la proteína, o una o ambas se pueden omitir completamente. Asimismo, pueden introducirse secuencias conectoras intermedias cortas tales como la ejemplificada en la SEQ ID NO: 48 (por ejemplo, péptidos de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos o más grandes) entre partes de la proteína de fusión por una diversidad de razones, incluyendo la introducción de sitios de enzimas de restricción para facilitar la clonación como sitios de escisión para proteasas fagosómicas del hospedador, para acelerar el procesamiento de proteínas o antígenos, y para la futura manipulación de las construcciones. La secuencia de aminoácidos que consiste solamente en las proteínas de CR1a y CR1y de Ad-36 en las proteínas de fusión descritas anteriormente se representa en el presente documento por SEQ ID NO: 55. La SEQ ID NO: 55 es una proteína de fusión expresada como un único polipéptido: (1) las posiciones 18-60 de CR1 a (posiciones 18-60 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 1-43 de la SEQ ID NO: 55; (2) las posiciones 123-157 de CR1a de Ad-36 (posiciones 123-157 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 44-78 de la SEQ ID NO: 55; (3) las posiciones 19-60 de CR1y de Ad-36 (posiciones 19-60 de la SeQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 79-120 de la SEQ ID NO: 55; y (4) las posiciones 83-116 de CR1y de Ad-36 (posiciones 83-116 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 121-154 de la SEQ ID NO: 55. Puede adjuntarse cualquier secuencia N-terminal y/o C-terminal adecuada a esta secuencia, como se ha descrito anteriormente para SEQ ID NO: 47 y 54, o pueden omitirse una o ambas. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 55 (codones optimizados para la expresión en levadura) también está incluida en la presente invención.
La invención también incluye homólogos de cualquiera de las proteínas de fusión descritas anteriormente, así como el uso de homólogos, variantes o mutantes de las proteínas de Ad-36 individuales o partes de las mismas que son parte de dichas proteínas de fusión. En un aspecto, la invención incluye el uso de proteínas de fusión que tienen secuencias de aminoácidos que son al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a la secuencia de aminoácidos de las proteínas de fusión descritas en el presente documento sobre la longitud completa de la proteína de fusión o con respecto a una proteína definida o dominio de la misma (dominio inmunológico o dominio funcional (dominio con al menos una actividad biológica)) que forma parte de la proteína de fusión.
Las moléculas de ácido nucleico recombinantes útiles en una composición basada en levadura de la invención no incluyen el genoma de longitud completa de Ad-36, sino que incluyen en su lugar menos que la longitud completa de Ad-36. Normalmente, las moléculas de ácido nucleico recombinantes útiles en una composición basada en levadura de la invención incluyen una o más secuencias codificantes de longitud completa y/o una o más secuencias codificantes de dominios (inmunogénico o funcional) para proteínas de Ad-36. Las proteínas incluidas en una única composición basada en levadura de la invención no incluyen todas las proteínas codificadas por Ad-36. Preferentemente, una composición basada en levadura comprende una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más proteínas codificadas por Ad-36 y/o uno o más dominios inmunogénicos de una cualquiera o más proteínas de Ad-36.
Las moléculas de ácido nucleico recombinantes y las proteínas codificadas por las mismas, incluyendo proteínas de fusión, como una realización de la invención, pueden usarse en composiciones de inmunoterapia basadas en levadura o para cualquier otro fin adecuado para un antígeno o antígenos de Ad-36, incluyendo en un ensayo in vitro, para la producción de anticuerpos, o en otra composición de inmunoterapia, incluyendo otra vacuna, que no se basa en la inmunoterapia basada en levadura descrita en el presente documento. La expresión de las proteínas/antígenos por levadura es una realización preferida, aunque pueden usarse otros sistemas de expresión para producir las proteínas/antígenos para aplicaciones diferentes a una composición de inmunoterapia basada en levadura.
Composiciones de inmunoterapia basadas en levadura. En diversas realizaciones de la invención, la invención incluye el uso de al menos una "composición inmunoterapéutica basada en levadura" (expresión que puede usarse indistintamente con "producto de inmunoterapia basado en levadura", "composición de inmunoterapia basada en levadura", "composición basada en levadura", "producto inmunoterapéutico basado en levadura", "vacuna basada en levadura" o derivados de estas expresiones). Una "composición inmunoterapéutica" es una composición que provoca una respuesta inmunitaria suficiente para conseguir al menos un beneficio terapéutico en un sujeto. Como se usa en el presente documento, la composición inmunoterapéutica basada en levadura se refiere a una composición que incluye un componente de vehículo de levadura y que provoca una respuesta inmunitaria suficiente para conseguir al menos un beneficio terapéutico en un sujeto. Más particularmente, una composición inmunoterapéutica basada en levadura es una composición que incluye un componente de vehículo de levadura y puede provocar o inducir una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta inmunitaria celular, incluyendo, sin limitación, una respuesta inmunitaria celular mediada por linfocitos T. En un aspecto, una composición inmunoterapéutica basada en levadura útil en la invención puede inducir una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos-T CD8+ y/o CD4+ y, en un aspecto, una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos-T CD8+ y CD4+. Una respuesta inmunitaria de CD4+ puede incluir repuestas inmunitarias de TH1, respuestas inmunitarias de TH17, o ambas, ya que los productos inmunoterapéuticos basados en levadura son capaces de generar ambos tipos de respuesta. Una respuesta inmunitaria de CD8+ puede incluir una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL), ya que los productos inmunoterapéuticos basados en levadura son capaces de generar dichas respuestas. En un aspecto, una composición inmunoterapéutica basada en levadura modula el número y/o la funcionalidad de linfocitos T reguladores (Treg) en un sujeto. La inmunoterapia basada en levadura también puede modificarse para promover un tipo de respuesta por encima de otra, por ejemplo, mediante la adición de citocinas, anticuerpos y/o modulación del proceso de fabricación para la levadura. Opcionalmente, una composición inmunoterapéutica basada en levadura puede provocar una respuesta inmunitaria humoral. Una composición inmunoterapéutica basada en levadura útil en la presente invención puede provocar, por ejemplo, una respuesta inmunitaria en un individuo de modo que el individuo esté protegido de infección por Ad-36 y/o se trate para infección por Ad-36 o para los síntomas resultantes de infección por Ad-36.
Las composiciones de inmunoterapia basadas en levadura de la invención pueden ser "profilácticas" o "terapéuticas". Cuando se proporcionan de manera profiláctica, las composiciones de la presente invención se proporcionan por anticipado a cualquier síntoma de infección por Ad-36. Dicha composición podría administrarse al nacimiento, en la infancia temprana o a adultos, y pueden incluir sujetos obesos, con sobrepeso, no obesos o sin sobrepeso. La administración profiláctica de las composiciones de inmunoterapia sirve para prevenir la posterior infección por Ad-36, para resolver una infección más rápidamente o más completamente si sobreviene posteriormente infección por Ad-36 y/o para mejorar o aliviar los síntomas de infección por Ad-36 si posteriormente sobreviene la infección. Cuando se proporcionan de manera terapéutica, las composiciones de inmunoterapia se proporcionan en o después de la aparición de la infección por Ad-36, con el objetivo de prevenir o aliviar al menos un síntoma de la infección (por ejemplo, prevenir la obesidad en sujetos infectados por Ad-36, no obesos, o reducir el peso en sujetos infectados por Ad-36, obesos) y, preferentemente, con el objetivo de eliminar la infección, proporcionando una remisión de larga duración de la infección, y/o proporcionando inmunidad a largo plazo contra posteriores infecciones o reactivaciones del virus.
Normalmente, una composición de inmunoterapia basada en levadura incluye un vehículo de levadura y al menos un antígeno (por ejemplo, una proteína de Ad-36) o dominio inmunogénico del mismo expresado por, adherido a o mezclado con el vehículo de levadura, en donde el antígeno es heterólogo con respecto a la levadura, y en donde el antígeno comprende una o más proteínas de Ad-36 o dominios inmunogénicos de las mismas. En algunas realizaciones, el antígeno o dominio inmunogénico del mismo se proporciona como una proteína de fusión. Se han descrito anteriormente varias proteínas de fusión de Ad-36 adecuadas para su uso en las composiciones y métodos de la invención. En un aspecto de la invención, la proteína de fusión puede incluir dos o más antígenos. En un aspecto, la proteína de fusión puede incluir dos o más dominios inmunogénicos de uno o más antígenos, o dos o más epítopos de uno o más antígenos.
Un TARMOGEN® es un ejemplo no limitante de una composición de inmunoterapia basada en levadura que es útil en la presente invención. Un TARMOGEN® (TARgeted MOlecular immunoGEN, GlobeImmune, Inc., Louisville, Colorado) se refiere en general a un vehículo de levadura que expresa uno o más antígenos heterólogos de forma extracelular (en su superficie), de forma intracelular (internamente o citosólicamente) o tanto extracelularmente como intracelularmente. Los TARMOGEN® se han descrito en general en la técnica. Véase, por ejemplo, patente de los Estados Unidos n.° 5.830.463.
Se describen en detalle composiciones de inmunoterapia basadas en levadura y métodos para preparar y usarlos en general, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n.° 5.830.463, patente de los Estados Unidos n.° 7.083.787, patente de los Estados Unidos n.° 7.736.642, Stubbs et al., Nat. Med. 7:625-629 (2001), Lu et al., Cancer Research 64:5084-5088 (2004), y en Bernstein et al., Vaccine 24 ene 2008;26(4):509-21. Se ha mostrado que estos productos inmunoterapéuticos basados en levadura provocan respuestas inmunitarias, incluyendo respuestas inmunitarias celulares y humorales. Los productos inmunoterapéuticos basados en levadura son capaces de destruir células diana que expresan una diversidad de antígenos in vivo, en una diversidad de especies animales, y hacerlo mediante respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T CD4+ y CD8+, específicas de antígeno. Estudios adicionales han mostrado que la levadura es fagocitada de forma ávida por y activa directamente células dendríticas que después presentan proteínas asociadas a levadura a linfocitos T c D4+ y CD8+ de una manera altamente eficaz. Véase, por ejemplo, Stubbs et al. Nature Med. 5:625-629 (2001) y Patente de los Estados Unidos n.° 7.083.787.
En cualquiera de las composiciones de inmunoterapia basadas en levadura usadas en la presente invención, se incluyen en la invención los siguientes aspectos relacionados con el vehículo de levadura. Según la presente invención, un vehículo de levadura es cualquier célula de levadura (por ejemplo, una célula completa o intacta) o un derivado de la misma (véase posteriormente) que puede usarse junto con uno o más antígenos, dominios inmunogénicos de los mismos o epítopos de los mismos en una composición terapéutica de la invención, o en un aspecto, el vehículo de levadura puede usarse en solitario o como un adyuvante. El vehículo de levadura, por lo tanto, puede incluir, pero sin limitación, un microorganismo de levadura intacto (completo) vivo (es decir, una célula de levadura que tiene todos sus componentes incluyendo una pared celular), un microorganismo de levadura destruido (muerto) o inactivado intacto, o derivados de levadura intacta incluyendo: un esferoplasto de levadura (es decir, una célula de levadura que carece de una pared celular), un citoplasto de levadura (es decir, una célula de levadura que carece de una pared celular y núcleo), una célula vacía de levadura (es decir, una célula de levadura que carece de una pared celular, núcleo y citoplasma), un extracto de membrana de levadura subcelular o fracción del mismo (también denominado partícula de membrana de levadura y previamente partícula de levadura subcelular), cualquier otra partícula de levadura o una preparación de pared celular de levadura.
Los esferoplastos de levadura típicamente se producen por digestión enzimática de la pared celular de la levadura. Dicho método se describe, por ejemplo, en Franzusoff et al., 1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674.
Los citoplastos de levadura se producen típicamente por enucleación de células de levadura. Dicho método se describe, por ejemplo, en Coon, 1978, Natl. Cancer Inst. Monogr. 48, 45-55.
Las células vacías de levadura se producen típicamente resellando una célula permeabilizada o lisada y pueden contener, pero no necesariamente, al menos algunos de los orgánulos de esa célula. Dicho método se describe, por ejemplo, en Franzusoff et al., 1983, J. Biol. Chem. 258, 3608-3614 y Bussey et al., 1979, Biochim. Biophys. Acta 553, 185-196.
Una partícula de membrana de levadura (extracto de membrana de levadura subcelular o fracción del mismo) se refiere a una membrana de levadura que carece de un núcleo o citoplasma natural. La partícula puede ser de cualquier tamaño, incluyendo tamaños que varían desde el tamaño de una membrana de levadura natural a micropartículas producidas por sonicación u otros métodos de alteración de membrana conocidos por los expertos en la materia, seguido por resellado. Un método para producir extractos de membrana de levadura subcelular se describe, por ejemplo, en Franzusoff et al., 1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674. También se pueden usar fracciones de partículas de membrana de levadura que contienen partes de membrana de levadura y, cuando el antígeno u otra proteína se expresó de forma recombinante por la levadura antes de la preparación de las partículas de membrana de levadura, el antígeno u otra proteína de interés. Los antígenos u otras proteínas de interés pueden transportarse dentro de la membrana, sobre cualquier superficie de la membrana o combinaciones de las mismas (es decir, la proteína puede estar tanto dentro como fuera de la membrana y/o ser transmembrana de la partícula de membrana de levadura). En una realización, una partícula de membrana de levadura es una partícula de membrana de levadura recombinante que puede ser una membrana de levadura intacta, alterada o interrumpida y resellada que incluye al menos un antígeno deseado u otra proteína de interés sobre la superficie de la membrana o al menos incluida parcialmente dentro de la membrana.
Un ejemplo de una preparación de pared celular de levadura es una preparación de paredes celulares de levadura aisladas que transportan un antígeno sobre su superficie o al menos parcialmente incluido dentro de la pared celular de modo que la preparación de pared celular de levadura, cuando se administra a un animal, estimula una respuesta inmunitaria deseada contra una diana de enfermedad.
Puede usarse cualquier cepa de levadura para producir un vehículo de levadura de la presente invención. Las levaduras son microorganismos unicelulares que pertenecen a una de tres clases: ascomicetos, basidiomicetos y hongos imperfectos. Una consideración para la selección de un tipo de levadura para su uso en un modulador inmunitario es la patogenia de la levadura. En una realización, la levadura es una cepa no patógena tal como Saccharomyces cerevisiae. La selección de una cepa de levadura no patógena minimiza cualquier efecto adverso al individuo al que se administra el vehículo de levadura. Sin embargo, puede usarse levadura patógena si puede anularse la patogenia de la levadura por cualquier medio conocido por un experto en la materia (por ejemplo, cepas mutantes). De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se usan cepas de levadura no patógenas.
Los géneros de cepas de levadura que pueden usarse en la invención incluyen, pero sin limitación, Saccharomyces, Candida (que puede ser patógena), Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Schizosaccharomyces y Yarrowia. En un aspecto, los géneros de levadura se seleccionan de Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia o Schizosaccharomyces y, en un aspecto, se usa Saccharomyces. Las especies de cepas de levadura que pueden usarse en la invención incluyen, pero sin limitación, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Candida albicans, Candida kefyr, Candida tropicalis, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Pichia pastoris, Rhodotorula rubra, Schizosaccharomyces pombe, y Yarrowia lipolytica. Debe apreciarse que varias de estas especies incluyen una diversidad de subespecies, tipos, subtipos, etc. que se pretende que estén incluidos dentro de las especies mencionadas anteriormente. En un aspecto, las especies de levadura usadas en la invención incluye S. cerevisiae, C. albicans, H. polymorpha, P. pastoris y S. pombe. S. cerevisiae es útil ya que es relativamente fácil de manipular y es "generalmente reconocida como segura" o "GRAS" para su uso como aditivos alimenticios (GRAS, norma 62FR18938 propuesta por la FDA, 17 de abril de 1997). Una realización de la presente invención es una cepa de levadura que puede replicar plásmidos a un número de copias particularmente alto, tal como una cepa cir° de S. cerevisiae. La cepa de S. cerevisiae es una de dichas cepas que puede mantener vectores de expresión que permiten expresar uno o más antígenos diana y/o una o más proteínas de fusión de antígeno y/u otras proteínas a altos niveles. Además, puede usarse cualquier cepa de levadura mutante en la presente invención, incluyendo las que muestran modificaciones postraduccionales reducidas de antígenos diana expresados u otras proteínas, tales como mutaciones en las enzimas que amplían la glucosilación ligada a N.
En una realización, un vehículo de levadura de la presente invención puede fusionarse con el tipo celular al que se suministra el vehículo de levadura y antígeno/agente, tal como una célula dendrítica o macrófago, efectuando de este modo suministro particularmente eficaz del vehículo de levadura y, en muchas realizaciones, el o los antígenos u otro agente, al tipo celular. Como se usa en el presente documento, la fusión de un vehículo de levadura con un tipo celular diana se refiere a la capacidad de la membrana celular de levadura, o partícula de la misma, para fusionarse con la membrana del tipo celular diana (por ejemplo, célula dendrítica o macrófago), lo que conduce a la formación de sincicios. Como se usa en el presente documento, un sincicio es una masa multinucleada de protoplasma producida por la fusión de células. Se ha mostrado que varias proteínas de superficie vírica (incluyendo las de virus de la inmunodeficiencia tales como VIH, virus de la gripe, poliovirus y adenovirus) y otros fusógenos (tales como los implicados en fusiones entre óvulos y espermatozoides) son capaces de efectuar fusión entre dos membranas (es decir, entre membranas celulares víricas y de mamíferos o entre membranas celulares de mamífero). Debe observarse, sin embargo, que la incorporación de un resto de dirección en el vehículo de levadura, aunque puede ser deseable en algunas circunstancias, no es necesaria. En el caso de vehículos de levadura que expresan antígenos de forma extracelular, esto puede ser una ventaja adicional de los vehículos de levadura de la presente invención. En general, los vehículos de levadura útiles en la presente invención son captados fácilmente por células dendríticas (así como otras células, tales como macrófagos).
En la mayoría de las realizaciones de la invención, la composición de inmunoterapia basada en levadura incluye al menos un antígeno, dominio inmunogénico del mismo o epítopo del mismo. Los antígenos contemplados para su uso en esta invención incluyen cualquier antígeno de Ad-36 o dominio inmunogénico del mismo, incluyendo mutantes, variantes y agonistas de proteínas de Ad-36 o dominios de las mismas, contra las que se desea provocar una respuesta inmunitaria con el fin de inmunizar profiláctica o terapéuticamente un hospedador contra infección por Ad-36.
Como se ha analizado anteriormente, las composiciones de la invención incluyen al menos un antígeno de Ad-36 y/o al menos un dominio inmunogénico de al menos un antígeno de Ad-36 para inmunizar a un sujeto. En algunas realizaciones, el antígeno es una proteína de fusión, varios ejemplos de la cual se han descrito anteriormente.
Opcionalmente, se producen proteínas, incluyendo proteínas de fusión, que se usan como un componente de la composición inmunoterapéutica basada en levadura de la invención usando construcciones que son particularmente útiles para mejorar la expresión de antígenos heterólogos en levadura. Normalmente, la o las proteínas o el o los péptidos antigénicos deseados se fusionan en su extremo amino terminal a: (a) un péptido sintético específico que estabiliza la expresión de la proteína de fusión en el vehículo de levadura o evita la modificación postraduccional de la proteína de fusión expresada (dichos péptidos se describen en detalle, por ejemplo, en la publicación de patente de los Estados Unidos n.° 2004-0156858 A l, publicada el 12 de agosto de 2004); (b) al menos una parte de una proteína de levadura endógena, en donde cualquier compañero de fusión proporciona estabilidad mejorada de la expresión de la proteína en la levadura y/o evita la modificación postraduccional de las proteínas por las células de levadura (dichas proteínas también se describen en detalle, por ejemplo, en la publicación de patente de los Estados Unidos n.° 2004-0156858 A1, mencionado anteriormente); y/o (c) al menos una parte de una proteína de levadura que provoca que la proteína de fusión se exprese sobre la superficie de la levadura (por ejemplo, una proteína Aga, descrita en más detalle en el presente documento). Además, la presente invención incluye opcionalmente el uso de péptidos que se fusionan al extremo C de la construcción que codifica el antígeno, particularmente para su uso en la selección e identificación de la proteína. Dichos péptidos incluyen, pero sin limitación, cualquier péptido sintético o natural, tal como un marcador peptídico (por ejemplo, 6X His) o cualquier otro marcador epitópico corto. Los péptidos adheridos al extremo C de un antígeno según la invención pueden usarse con o sin la adición de los péptidos N-terminales analizados anteriormente.
En una realización, un péptido sintético útil en una proteína de fusión se une al extremo N del antígeno, consistiendo el péptido en al menos dos posiciones de aminoácido que son heterólogas para el antígeno, en donde el péptido estabiliza la expresión de la proteína de fusión en el vehículo de levadura o evita la modificación postraduccional de la proteína de fusión expresada. El péptido sintético y la parte N-terminal del antígeno juntos forman una proteína de fusión que tiene los siguientes requisitos: (1) el resto de aminoácido en la posición uno de la proteína de fusión es una metionina (es decir, el primer aminoácido en el péptido sintético es una metionina); (2) el resto de aminoácido en la posición dos de la proteína de fusión no es una glicina o una prolina (es decir, el segundo aminoácido en el péptido sintético no es una glicina o una prolina); (3) ninguna de las posiciones de aminoácidos en las posiciones 2-6 de la proteína de fusión es una metionina (es decir, los aminoácidos en las posiciones 2-6, sean parte del péptido sintético o de la proteína, si el péptido sintético es de menos de 6 aminoácidos, no incluyen una metionina); y (4) ninguno de los aminoácidos en las posiciones 2-6 de la proteína de fusión es una lisina o una arginina (es decir, los aminoácidos en las posiciones 2-6, sean parte del péptido sintético o de la proteína, si el péptido sintético es de menos de 5 aminoácidos, no incluyen una lisina o una arginina). El péptido sintético puede ser tan corto como de dos aminoácidos, pero en un aspecto, es de 2-6 aminoácidos (incluyendo 3, 4, 5 aminoácidos), y puede ser de más de 6 aminoácidos, en números enteros, hasta aproximadamente 200 aminoácidos, 300 aminoácidos, 400 aminoácidos, 500 aminoácidos o más.
En una realización, una proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de M-X2-X3-X4-X5-X6, en donde M es metionina; en donde X2 es cualquier aminoácido excepto glicina, prolina, lisina o arginina; en donde X3 es cualquier aminoácido excepto metionina, lisina o arginina; en donde X4 es cualquier aminoácido excepto metionina, lisina o arginina; en donde X5 es cualquier aminoácido excepto metionina, lisina o arginina; y en donde X6 es cualquier aminoácido excepto metionina, lisina o arginina. En una realización, el resto X6 es una prolina. Una secuencia sintética ejemplar que potencia la estabilidad de expresión de un antígeno en una célula de levadura y/o evita la modificación postraduccional de la proteína en la levadura incluye la secuencia M-A-D-E-A-P (por ejemplo, SEQ ID NO: 58). Otra secuencia sintética ejemplar con las mismas propiedades es MV. Además de la estabilidad potenciada del producto de expresión, este compañero de fusión no parece afectar de forma negativa a la respuesta inmunitaria contra el antígeno inmunizante de la construcción. Además, los péptidos de fusión sintéticos pueden diseñarse para proporcionar un epítopo que pueda ser reconocido por un agente de selección, tal como un anticuerpo.
En un aspecto de la invención, el vehículo de levadura se manipula de modo que el antígeno se exprese o se proporcione por suministro o translocación de un producto proteínico expresado, parcial o completamente, sobre la superficie del vehículo de levadura (expresión extracelular). Un método para conseguir este aspecto de la invención es usar un brazo espaciador para colocar una o más proteínas sobre la superficie del vehículo de levadura. Por ejemplo, se puede usar un brazo espaciador para crear una proteína de fusión del antígeno o antígenos u otra proteína de interés con una proteína que dirija el antígeno o antígenos u otra proteína de interés a la pared celular de levadura. Por ejemplo, una de dichas proteínas que puede usarse para dirigir otras proteínas es una proteína de levadura (por ejemplo, la proteína 2 de pared celular (cwp2), Aga2, Pir4 o la proteína Flo1) que posibilita que el antígeno o antígenos u otra proteína se dirija a la pared celular de levadura de modo que el antígeno u otra proteína esté ubicado sobre la superficie de la levadura. Pueden usarse proteínas diferentes de proteínas de levadura para el brazo espaciador; sin embargo, para cualquier proteína del brazo espaciador, es mucho más deseable que la respuesta inmunogénica se dirija contra el antígeno diana en lugar de la proteína del brazo espaciador. Por tanto, si se usan otras proteínas para el brazo espaciador, entonces la proteína del bazo espaciador que se usa no debe generar una gran respuesta inmunitaria contra la propia proteína del brazo espaciador de modo que la respuesta inmunitaria contra el antígeno o antígenos diana se sobrepase. Un experto en la materia debe enfocarse a una respuesta inmunitaria pequeña contra la proteína del brazo espaciador respecto a la respuesta inmunitaria para el antígeno o antígenos diana. Los brazos espaciadores pueden construirse para que tengan sitios de escisión (por ejemplo, sitios de escisión por proteasa) que permitan que el antígeno se elimine fácilmente o se retire por procesado de la levadura, si se desea. Puede usarse cualquier método conocido de determinación de la magnitud de las respuestas inmunitarias (por ejemplo, producción de anticuerpos, ensayos líticos, etc.) y son fácilmente conocidos por los expertos en la materia.
Otro método para ubicar el antígeno o antígenos diana u otras proteínas a exponer sobre la superficie de la levadura es usar secuencias señal tales como glucosilfosfatidil inositol (GPI) para anclar la diana a la pared celular de levadura. Como alternativa, la ubicación puede conseguirse anexando secuencias señal que dirijan el antígeno o antígenos u otras proteínas de interés a la ruta de secreción mediante translocación al retículo endoplásmico (RE) de modo que el antígeno se una a una proteína que se une a la pared celular (por ejemplo, cwp).
En un aspecto, la proteína del brazo espaciador es una proteína de levadura. La proteína de levadura puede consistir en entre aproximadamente dos y aproximadamente 800 aminoácidos de una proteína de levadura. En una realización, la proteína de levadura es de aproximadamente 10 a 700 aminoácidos. En otra realización, la proteína de levadura es de aproximadamente 40 a 600 aminoácidos. Otras realizaciones de la invención incluyen la proteína de levadura que es de al menos 250 aminoácidos, al menos 300 aminoácidos, al menos 350 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos, al menos 450 aminoácidos, al menos 500 aminoácidos, al menos 550 aminoácidos, al menos 600 aminoácidos o al menos 650 aminoácidos. En una realización, la proteína de levadura es de al menos 450 aminoácidos de longitud. Otra consideración para optimizar la expresión en superficie del antígeno, si se desea, es si la combinación del antígeno y el brazo espaciador debe expresarse como un monómero o como dímero o como trímero, o incluso más unidades conectadas entre sí. Este uso de monómeros, dímeros, trímeros, etc. permite un espaciado o plegamiento apropiado del antígeno de modo que alguna parte, si no todo, del antígeno se presenta sobre la superficie del vehículo de levadura de una manera que lo hace más inmunogénico.
El uso de proteínas de levadura puede estabilizar la expresión de las proteínas de fusión en el vehículo de levadura, evita la modificación postraduccional de la proteína de fusión expresada y/o dirige la proteína de fusión a un compartimento particular en la levadura (por ejemplo, a expresarse sobre la superficie celular de la levadura). Para el suministro en la ruta de secreción de la levadura, las proteínas de levadura ejemplares para su uso incluyen, pero sin limitación: Aga (incluyendo, pero sin limitación, Agal y/o Aga2); SUC2 (invertasa de levadura); secuencia líder señal de factor alfa; c PY; CWp2p para su localización y retención en la pared celular; genes BUD para la localización en la gema celular de levadura durante la fase inicial de la formación de células descendientes; Flolp; Pir2p; y Pir4p.
Pueden usarse otras secuencias para dirigir, retener y/o estabilizar la proteína a otras partes del vehículo de levadura, por ejemplo, en el citosol o la mitocondria o el retículo endoplásmico o el núcleo. Los ejemplos de proteína de levadura adecuada que pueden usarse para cualquiera de las realizaciones anteriores incluyen, pero sin limitación, productos génicos de TK, AF, SEC7; fosfoenolpiruvato carboxiquinasa PCK1, fosfogliceroquinasa PGK y triosa fosfato isomerasa TPI para su expresión reprimible en glucosa y localización citosólica; las proteínas de choque térmico SSA1, SSA3, SSA4, SSC1, cuya expresión se induce y cuyas proteínas son más termoestables tras exposición de las células a tratamiento por calor; la proteína mitocondrial CYC1 para su importación a la mitocondria; ACT1.
En una realización, el antígeno de Ad-36 se une en el extremo N a una proteína de levadura, tal como una secuencia prepro de factor alfa (también denominada secuencia líder señal del factor alfa, cuya secuencia de aminoácidos se ejemplifica en el presente documento por la SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO: 57. Otras secuencias para la secuencia prepro de factor alfa de levadura son conocidas en la técnica y están abarcadas para su uso en la presente invención. Sin quedar ligado a teoría alguna, los inventores creen que una ventaja de utilizar secuencia prepro de factor alfa en una proteína de fusión basada en levadura es la minimización de proteólisis de la proteína, ya que la proteína se inmoviliza separada de proteasomas citosólicos.
Los métodos de producción de vehículos de levadura y expresión, combinación y/o asociación de vehículos de levadura con antígenos y/u otras proteínas y/o agentes de interés para producir composiciones de inmunoterapia basadas en levadura están contemplados por la invención.
Según la presente invención, la expresión "complejo de vehículo de levadura-antígeno" o "complejo de levaduraantígeno" se usa de forma genérica para describir cualquier asociación de un vehículo de levadura con un antígeno, y puede usarse indistintamente con "composición de inmunoterapia basada en levadura" cuando dicha composición se usa para provocar una respuesta inmunitaria como se ha descrito anteriormente. Dicha asociación incluye la expresión del antígeno por la levadura (una levadura recombinante), la introducción de un antígeno en una levadura, la adhesión física del antígeno a la levadura, y mezcla de la levadura y el antígeno juntos, tal como en un tampón u otra solución o formulación. Estos tipos de complejos se describen en detalle a continuación.
En una realización, una célula de levadura usada para preparar el vehículo de levadura se transfecta con una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica una proteína (por ejemplo, el antígeno) de modo que la proteína sea expresada por la célula de levadura. Dicha levadura también se denomina en el presente documento levadura recombinante o vehículo de levadura recombinante. La célula de levadura entonces puede cargarse en la célula dendrítica como una célula intacta, o la célula de levadura puede inactivarse, o puede derivatizarse tal como por formación de esferoplastos, citoplastos, células vacías o partículas subcelulares de levadura, cualquiera de las cuales va seguida por carga del derivado en la célula dendrítica. Los esferoplastos de levadura también pueden transfectarse directamente con una molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, el esferoplasto se produce a partir de una levadura completa y después se transfecta) para producir una esferoplasto recombinante que expresa un antígeno u otra proteína.
En un aspecto, una célula de levadura o esferoplasto de levadura usado para preparar el vehículo de levadura se transfecta con una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica el o los antígenos u otra proteína de modo que el antígeno u otra proteína sea expresada de forma recombinante por la célula de levadura o esferoplasto de levadura. En este aspecto, la célula de levadura o esferoplasto de levadura que expresa de forma recombinante el o los antígenos u otra proteína se usa para producir un vehículo de levadura que comprende un citoplasto de levadura, una célula vacía de levadura o una partícula de membrana de levadura o partícula de pared celular de levadura, o fracción de la misma.
En general, el vehículo de levadura y el antígeno o antígenos y/u otros agentes pueden asociarse por cualquier técnica descrita en el presente documento. En un aspecto, el vehículo de levadura se cargó de forma intracelular con el antígeno o antígenos y/o agente o agentes. En otro aspecto, el antígeno o antígenos y/o el agente o agentes se adhirieron covalente o no covalentemente al vehículo de levadura. En otro aspecto más, el vehículo de levadura y el antígeno o antígenos y/o el agente o agentes se asociaron por mezcla. En otro aspecto, y en una realización, el antígeno o antígenos y/o el agente o agentes se expresan de forma recombinante por el vehículo de levadura o por la célula de levadura o esferoplasto de levadura del que se obtuvo el vehículo de levadura.
Varios antígenos y/u otras proteínas para producir por un vehículo de levadura de la presente invención es cualquiera de varios antígenos y/u otras proteínas que pueden producirse de forma razonable por un vehículo de levadura, y típicamente varía de al menos uno a al menos aproximadamente 6 o más, incluyendo de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 antígenos heterólogos y/u otras proteínas.
La expresión de un antígeno u otra proteína en un vehículo de levadura de la presente invención se consigue usando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Brevemente, una molécula de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno deseado u otra proteína se inserta en un vector de expresión de tal manera que la molécula de ácido nucleico se une de forma operativa a una secuencia de control de la transcripción para que pueda lograr la expresión constitutiva o regulada de la molécula de ácido nucleico cuando se transforme en una célula de levadura hospedadora. Las moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más antígenos y/u otras proteínas pueden ser uno o más vectores de expresión unidos de forma operativa a una o más secuencias de control de la expresión. Son secuencias de control de la expresión particularmente importantes las que controlan el inicio de la transcripción, tales como secuencias promotoras y de activación cadena arriba. Cualquier promotor de levadura adecuado puede usarse en la presente invención y los expertos en la materia conocen una diversidad de dichos promotores. Los promotores para la expresión en Saccharomyces cerevisiae incluyen, pero sin limitación, promotores de genes que codifican las siguientes proteínas de levadura: alcohol deshidrogenasa I (ADH1) o II (ADH2), CUP1, fosfoglicerato quinasa (PGK), triosa fosfato isomerasa (TPI), factor de elongación traduccional EF-1 alfa (TEF2), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, (GAPDH; también denominada TDH3, para triosa fosfato deshidrogenasa), galactoquinasa (GAL1), galactosa-1-fosfato uridil-transferasa (GAL7), UDP-galactosa epimerasa (GAL10), citocromo c1 (CYC1), proteína Sec7 (SEC7) y fosfatasa ácida (PHO5), incluyendo promotores híbridos tales como los promotores ADH2/GAPDH y CYC1/GAL10, e incluyendo el promotor ADH2/GAPDH, que se induce cuando las concentraciones de glucosa en la célula son bajas (por ejemplo, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,2 por ciento), así como el promotor de CUP1 y el promotor de TEF2. Análogamente, se conocen varias secuencias de activación cadena arriba (UAS), también denominadas potenciadores. Las secuencias de activación cadena arriba para la expresión en Saccharomyces cerevisiae incluyen, pero sin limitación, las UAS de genes que codifican las siguientes proteínas: PCK1, TPI, TDH3, CYC1, ADH1, ADH2, SUC2, GAL1, GAL7 y GAL10, así como otras UAS activadas por el producto génico de GAL4, usándose la UAS de ADH2 en un aspecto. Ya que la UAS de ADH2 se activa por el producto génico de ADR1, puede ser preferible sobreexpresar el gen de ADR1 cuando un gen heterólogo se une de forma operativa a la UAS de ADH2. Las secuencias de terminación de la transcripción para la expresión en Saccharomyces cerevisiae incluyen las secuencias de terminación de los genes de factor-a, GAPDH y CYC1.
Las secuencias de control de la transcripción para expresar genes en levaduras metiltróficas incluyen las regiones de control de la transcripción de los genes que codifican la alcohol oxidasa y la formiato deshidrogenasa.
La transfección de una molécula de ácido nucleico en una célula de levadura según la presente invención puede conseguirse por cualquier método por el que pueda introducirse una molécula de ácido nucleico en la célula e incluye, pero sin limitación, difusión, transporte activo, sonicación en baño, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción y fusión de protoplastos. Las moléculas de ácido nucleico transfectadas pueden integrarse en un cromosoma de levadura o mantenerse en vectores extracromosómicos usando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Los ejemplos de vehículos de levadura que portan dichas moléculas de ácido nucleico se divulgan en detalle en el presente documento. Como se ha analizado anteriormente, también pueden producirse citoplastos de levadura, células vacías de levadura y partículas de membrana de levadura o preparaciones de pared celular de forma recombinante transfectando microorganismos de levadura intactos o esferoplastos de levadura con moléculas de ácido nucleico deseadas, que producen el antígeno en los mismos, y después manipulan adicionalmente los microorganismos o esferoplastos usando técnicas conocidas por los expertos en la materia para producir citoplastos, células vacías o extracto de membrana de levadura subcelular o fracciones de los mismos que contienen antígenos deseados u otras proteínas.
Las condiciones eficaces para la producción de vehículos de levadura recombinantes y la expresión del antígeno y/u otra proteína por el vehículo de levadura incluyen un medio eficaz en que puede cultivarse una cepa de levadura. Un medio eficaz es típicamente un medio acuoso que comprende fuentes asimilables de carbohidrato, nitrógeno y fosfato, así como sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas y factores de crecimiento. El medio puede comprender nutrientes complejos o puede ser un medio mínimo definido. Las cepas de levadura de la presente invención pueden cultivarse en una diversidad de recipientes, incluyendo, pero sin limitación, biorreactores, matraces de Erlenmeyer, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas de Petri. El cultivo se realiza a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para la cepa de levadura. Dichas condiciones de cultivo pertenecen a la experiencia de los expertos habituales en la materia (véase, por ejemplo, Guthrie et al. (eds.), 1991, Methods in Enzymology, vol. 194, Academic Press, San Diego).
En algunos aspectos de la invención, las levaduras se cultivan en condiciones de pH neutro y, particularmente, en un medio mantenido a un nivel de pH de al menos 5,5, concretamente no se permite que el pH del medio de cultivo descienda por debajo de pH 5,5. En otros aspectos, la levadura se cultiva a un nivel de pH mantenido a aproximadamente 5,5. En otros aspectos, la levadura se cultiva a un nivel de pH mantenido a aproximadamente 5,6, 5.7, 5,8, o 5,9. En otro aspecto, la levadura se cultiva a un nivel de pH mantenido a aproximadamente 6. En otro aspecto, la levadura se cultiva a un nivel de pH mantenido a aproximadamente 6,5. En otros aspectos, la levadura se cultiva a un nivel de pH mantenido a aproximadamente 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 o 7,0. En otros aspectos, la levadura se cultiva a un nivel de pH mantenido a aproximadamente 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7.8, 7,9 u 8,0. El nivel de pH es importante en el cultivo de levadura. Un experto en la materia apreciará que el proceso de cultivo incluye no solamente el inicio del cultivo de levadura sino también el mantenimiento del cultivo. Como se sabe que el cultivo de levadura se vuelve ácido (es decir, reduce el pH) a lo largo del tiempo, debe tenerse cuidado de supervisar el nivel de pH durante el proceso de cultivo. Aún se contemplan cultivos celulares de levadura por los que el nivel de pH del medio desciendo por debajo de 6 en el alcance de la invención siempre que el pH del medio se lleve hasta al menos 5,5 en algún momento durante el proceso de cultivo. Por tanto, cuanto más tiempo se cultive la levadura en un medio que esté a pH 5,5 o más, mejores serán los resultados con respecto a obtener levadura con características deseables.
Como se usa en el presente documento, el uso general de la expresión "pH neutro" se refiere a un intervalo de pH entre aproximadamente pH 5,5 y aproximadamente pH 8 y, en un aspecto, entre aproximadamente pH 6 y aproximadamente pH 8. Un experto en la materia apreciará que pueden producirse fluctuaciones mínimas (por ejemplo, décimas o centésimas) cuando se mide con un pehachímetro. Por tanto, el uso de pH neutro para cultivar células de levadura significa que las células de levadura se cultivan en pH neutro durante la mayoría del tiempo que están en cultivo. El uso de un pH neutro en el cultivo de levaduras promueve varios efectos biológicos que son características deseables para usar la levadura como vehículos para inmunomodulación. En un aspecto, el cultivo de la levadura en pH neutro permite un buen crecimiento de la levadura sin ningún efecto negativo sobre el tiempo de generación celular (por ejemplo, ralentización del tiempo de duplicación). La levadura puede continuar creciendo hasta altas densidades sin perder su elasticidad de pared celular. En otro aspecto, el uso de un pH neutro permite la producción de levadura con paredes celulares elásticas y/o levaduras que son sensibles a enzimas de digestión de la pared celular (por ejemplo, glucanasa) a todas las densidades de recolección. Este rasgo es deseable porque la levadura con paredes celulares flexibles puede inducir respuestas inmunitarias poco habituales, tal como promoviendo la secreción de citocinas (por ejemplo, interferón-Y (IFN-y)) en las células que albergan la levadura. Además, se produce mayor accesibilidad a los antígenos localizados en la pared celular por dichos métodos de cultivo. En otro aspecto, el uso de pH neutro para algunos antígenos permite liberar el antígeno unido por disulfuro por tratamiento con ditiotreitol (DTT) que no es posible cuando dicha levadura que expresa antígeno se cultiva en medio a pH inferior (por ejemplo, pH 5). Por último, en otro aspecto, la levadura cultivada usando las metodologías de pH neutro, provoca aumento de la producción de al menos citocinas de tipo TH1 incluyendo, pero sin limitación, IFN-y, interleucina-12 (IL-12) e IL-2 y también pueden inducir aumento de la producción de otras citocinas, tales como citocinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-6).
En una realización, el control de la cantidad de glucosilación de la levadura se usa para controlar la expresión de antígenos por la levadura, particularmente en la superficie. La cantidad de glucosilación de la levadura puede afectar a la inmunogenicidad y antigenicidad del antígeno expresado en la superficie, ya que los restos de azúcar tienden a ser voluminosos. Por tanto, la existencia de restos de azúcar sobre la superficie de levadura y su influencia sobre el espacio tridimensional alrededor del antígeno o antígenos diana debe considerarse en la modulación de la levadura según la invención. Puede usarse cualquier método para reducir la cantidad de glucosilación de la levadura (o aumentarla, si se desea). Por ejemplo, se podría usar una cepa mutante de levadura que se ha seleccionado para tener baja glucosilación (por ejemplo mutantes mnn1, och1 y mnn9), o se podría eliminar por mutación las secuencias aceptoras de glucosilación en el antígeno diana. Como alternativa, se podría usar una levadura con patrones de glucosilación abreviados, por ejemplo, Pichia. También se puede tratar la levadura usando métodos para reducir o alterar la glucosilación.
En una realización de la presente invención, como alternativa a la expresión de un antígeno u otra proteína de forma recombinante en el vehículo de levadura, se carga el vehículo de levadura de forma intracelular con la proteína o péptido, o con carbohidratos u otras moléculas que sirven como antígeno y/o son útiles como agentes inmunomoduladores o modificadores de la respuesta biológica según la invención. Posteriormente, el vehículo de levadura, que ahora contiene el antígeno y/u otras proteínas de forma intracelular, puede administrarse a un individuo o cargarse en un vehículo tal como una célula dendrítica. Los péptidos y proteínas pueden insertarse directamente en vehículos de levadura de la presente invención por técnicas conocidas por los expertos en la materia, tales como por difusión, transporte activo, fusión de liposomas, electroporación, fagocitosis, ciclos de congelación-descongelación y sonicación en baño. Los vehículos de levadura que pueden cargarse directamente con péptidos, proteínas, carbohidratos u otras moléculas incluyen levaduras intactas, así como esferoplastos, células vacías o citoplastos, que pueden cargarse con antígenos y otros agentes después de la producción. Como alternativa, la levadura intacta puede cargarse con el antígeno y/o agente, y después pueden prepararse a partir de la misma esferoplastos, células vacías, citoplastos o partículas subcelulares. Cualquiera de varios agentes y/u otros agentes puede cargarse en un vehículo de levadura en esta realización, de al menos 1, 2, 3, 4 o cualquier número entero hasta cientos o miles de antígenos y/u otros agentes, tal como se proporcionaría por la carga de un microorganismo o partes del mismo, por ejemplo.
En otra realización de la presente invención, un antígeno y/u otro agente se adhiere físicamente al vehículo de levadura. La adhesión física del antígeno y/u otro agente al vehículo de levadura puede conseguirse por cualquier método adecuado en la técnica, incluyendo métodos de asociación covalente y no covalente que incluyen, pero sin limitación, reticulación química del antígeno y/u otro agente a la superficie exterior del vehículo de levadura o unión biológica del antígeno y/u otro agente a la superficie exterior del vehículo de levadura, tal como usando un anticuerpo u otro compañero de unión. La reticulación química puede conseguirse, por ejemplo, por métodos que incluyen unión de glutaraldehído, marcaje de fotoafinidad, tratamiento con carbodiimidas, tratamiento con productos químicos que pueden unir enlaces disulfuro y tratamiento con otros productos químicos reticulantes convencionales en la técnica. Como alternativa, un producto químico puede ponerse en contacto con el vehículo de levadura que altera la carga de la bicapa lipídica de la membrana de levadura o la composición de la pared celular de modo que la superficie exterior de la levadura tiene mayor probabilidad de fusionarse o unirse a antígenos y/u otro agente que tenga características de carga particulares. También pueden incorporarse agentes de dirección tales como anticuerpos, péptidos de unión, receptores solubles y otros ligandos a un antígeno como una proteína de fusión o asociarse de otro modo con un antígeno para la unión del antígeno al vehículo de levadura.
Cuando el antígeno u otra proteína se expresa en o se adhiere físicamente a la superficie de la levadura, pueden seleccionarse cuidadosamente brazos espaciadores, en un aspecto, para optimizar u otra expresión de antígeno u otra proteína o contenido sobre la superficie. El tamaño del brazo o brazos espaciadores puede afectar a la cantidad de antígeno u otra proteína que se expone para la unión en la superficie de la levadura. Por tanto, dependiendo del antígeno o antígenos u otra proteína o proteínas que se estén usando, un experto en la materia seleccionará un brazo espaciador que logre el espaciado apropiado para el antígeno u otra proteína en la superficie de levadura. En una realización, el brazo espaciador es una proteína de levadura de al menos 450 aminoácidos. Los brazos espaciadores se han analizado en detalle anteriormente.
En otra realización más, el vehículo de levadura y el antígeno u otra proteína se asocian entre sí por un mecanismo de unión no específico o no covalente más pasivo, tal como por mezcla suave del vehículo de levadura y el antígeno u otra proteína juntos en un tampón u otra formulación adecuada (por ejemplo, mezcla).
En una realización de la invención, el vehículo de levadura y el antígeno u otra proteína se cargan ambos de forma intracelular en un vehículo tal como una célula dendrítica o macrófago para formar la composición terapéutica o vacuna de la presente invención. Como alternativa, puede cargarse un antígeno u otra proteína en una célula dendrítica en ausencia del vehículo de levadura.
En una realización, la levadura intacta (con o sin expresión de antígenos heterólogos u otras proteínas) puede molerse o procesarse de una manera que produzca preparaciones de pared celular de levadura, partículas de membrana de levadura o fragmentos de levadura (es decir, no intactos) y los fragmentos de levadura pueden, en algunas realizaciones, proporcionarse o administrarse con otras composiciones que incluyen antígenos (por ejemplo, vacunas de ADN, vacunas de subunidad de proteína, patógenos muertos o inactivados) para potenciar las respuestas inmunitarias. Por ejemplo, puede usarse tratamiento enzimático, tratamiento químico o fuerza física (por ejemplo, corte mecánico o sonicación) para descomponer la levadura en partes que se usan como adyuvante.
En una realización de la invención, los vehículos de levadura útiles en la invención incluyen vehículos de levadura que se han eliminado o inactivado. La eliminación o inactivación de la levadura puede conseguirse por cualquiera de una diversidad de métodos adecuados conocidos en la técnica. Por ejemplo, la inactivación por calor de una levadura es una manera convencional de inactivar la levadura, y un experto en la materia puede controlar los cambios estructurales del antígeno diana, si se desea, por métodos convencionales conocidos en la técnica. Como alternativa, pueden usarse otros métodos de inactivación de la levadura, tales como métodos químicos, eléctricos, radiactivos o de UV. Véase, por ejemplo, la metodología analizada en libros de texto convencionales de cultivo de levadura tales como Methods of Enzymology, Vol. 194, Cold Spring Harbor Publishing (1990). Cualquiera de las estrategias de inactivación usadas debe tener en cuenta la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria del antígeno diana y conservar dicha estructura para optimizar su inmunogenicidad.
Los vehículos de levadura pueden formularse en composiciones de inmunoterapia basados en levadura o productos de la presente invención, incluyendo preparaciones para administrar a un sujeto directamente o cargados en primer lugar en un vehículo tal como una célula dendrítica, usando varias técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, los vehículos de levadura pueden secarse por liofilización. Las formulaciones que comprenden vehículos de levadura también pueden presentarse empaquetando la levadura en una pastilla o un comprimido, tal como se hace para la levadura usada en operaciones de panadería o cervecería. Además, los vehículos de levadura pueden mezclarse con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como un tampón isotónico que se tolera por un hospedador o célula hospedadora. Los ejemplos de dichos excipientes incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, solución de Hank y otras soluciones salinas acuosas fisiológicamente equilibradas. También pueden usarse vehículos no acuosos, tales como aceites fijos, aceite de sésamo, oleato de etilo o triglicéridos. Otras formulaciones útiles incluyen suspensiones que contienen agentes potenciadores de la viscosidad, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, glicerol o dextrano. Los excipientes también pueden contener cantidades mínimas de aditivos, tales como sustancias que potencian la isotonicidad y la estabilidad química. Los ejemplos de tampones incluyen tampón de fosfato, tampón de bicarbonato y tampón Tris, mientras que los ejemplos de conservantes incluyen timerosal, m- u o-cresol, formalina y alcohol bencílico. Las formulaciones convencionales pueden ser soluciones inyectables líquidas o sólidos que pueden recogerse en un líquido adecuado como una suspensión o solución para inyección. Por tanto, en una formulación que no es líquida, el excipiente puede comprender, por ejemplo, dextrosa, albúmina de suero humano y/o conservantes a los que puede añadirse agua o solución salina estéril antes de la administración.
En una realización de la presente invención, una composición puede incluir agentes adicionales, que también pueden denominarse compuestos modificadores de la respuesta biológica, o la capacidad para producir dichos agentes/modificadores. Por ejemplo, un vehículo de levadura puede transfectarse o cargarse con al menos un antígeno y al menos un agente/compuesto modificador de la respuesta biológica, o una composición de la invención puede administrase junto con al menos un agente/modificador de la respuesta biológica. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen adyuvantes y otros compuestos que pueden modular las respuestas inmunitarias, que pueden denominarse compuestos inmunomoduladores, así como compuestos que modifican la actividad biológica de otro compuesto o agente, tal como un agente inmunoterapéutico basado en levadura, sin estar limitada dicha actividad biológica a los efectos del sistema inmunitario. Determinados compuestos inmunomoduladores pueden estimular una respuesta inmunitaria protectora mientras que otros pueden suprimir una respuesta inmunitaria perjudicial, y si un inmunomodulador es útil en combinación con un producto inmunoterapéutico basado en levadura dado puede depender, al menos en parte, de la patología o afección para tratar o prevenir, y/o del individuo que se vaya a tratar. Determinados modificadores de la respuesta biológica potencian preferentemente una respuesta inmunitaria mediada por células mientras que otros potencian preferentemente una respuesta inmunitaria humoral (es decir, pueden estimular una respuesta inmunitaria en la que hay un nivel aumentado de inmunidad mediada por células en comparación con la inmunidad humoral, o viceversa). Determinados modificadores de la respuesta biológica tienen una o más propiedades en común con las propiedades biológicas de productos inmunoterapéuticos basados en levadura o potencian o complementan las propiedades biológicas de productos inmunoterapéuticos basados en levadura. Hay varias técnicas conocidas por los expertos en la materia para medir la estimulación o supresión de las respuestas inmunitarias, así como para diferenciar las respuestas inmunitarias mediadas por células de las respuestas inmunitarias humorales, y para diferenciar un tipo de respuesta mediada por células de otra (por ejemplo, una respuesta TH17 frente a una respuesta TH1).
Los agentes/modificadores de la respuesta biológica útiles en la invención pueden incluir, pero sin limitación, citocinas, quimiocinas, hormonas, derivados lipídicos, péptidos, proteínas, polisacáridos, fármacos de molécula pequeña, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos (incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos anticitocina, anticuerpos antirreceptor de citocina, anticuerpos antiquimiocina), vitaminas, polinucleótidos, restos de unión a ácido nucleico, aptámeros y modulares del crecimiento. Algunos agentes adecuados incluyen, pero sin limitación, IL-1 o agonistas de IL-1 o de IL-1R, anti-IL-1 u otros antagonistas de IL-1; IL-6 o agonistas de IL-6 o de IL-6R, anti-IL-6 u otros antagonistas de IL-6; IL-12 o agonistas de IL-12 o de IL-12R, anti-IL-12 u otros antagonistas de IL-12; IL-17 o agonistas de IL-17 o de IL-17R, anti-IL-17 u otros antagonistas de IL-17; IL-21 o agonistas de IL-21 o de IL-21R, anti-IL-21 u otros antagonistas de IL-21; IL-22 o agonistas de IL-22 o de IL-22R, anti-IL-22 u otros antagonistas de IL-22; IL-23 o agonistas de IL-23 o de IL-23R, anti-IL-23 u otros antagonistas de IL-23; IL-25 o agonistas de IL-25 o de IL-25R, anti-IL-25 u otros antagonistas de IL-25; IL-27 o agonistas de IL-27 o de IL-27R, anti-IL-27 u otros antagonistas de IL-27; interferón de tipo I (incluyendo IFN-a) o agonistas o antagonistas de interferón de tipo I o un receptor del mismo; interferón de tipo II (incluyendo IFN-y) o agonistas o antagonistas de interferón de tipo II o un receptor del mismo; anti-CD40, CD40L, anticuerpo anti-CTLA-4 (por ejemplo, para liberar linfocitos T anérgicos); coestimuladores de linfocitos T (por ejemplo, anti-CD137, anti-CD28, anti-CD40); alemtuzumab (por ejemplo CAMPATH®), denileuquina diftitox (por ejemplo, ONTAK®); anti-CD4; anti-CD25; anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-PD-L2; agentes que bloquean FOXP3 (por ejemplo, para anular la actividad/eliminar linfocitos T reguladores CD4+/CD25+); ligando Flt3, imiquimod (ALDARA™), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF); factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), sargramostim (Leukine®); hormonas incluyendo, sin limitación, prolactina y hormona del crecimiento; agonistas del receptor de tipo Toll (TLR), incluyendo pero sin limitación agonistas de t LR-2, agonistas de TLR-4, agonistas de TLR-7 y agonistas de TLR-9; antagonistas de TLR, incluyendo pero sin limitación antagonistas de TLR-2, antagonistas de TLR-4, antagonistas de TLR-7 y antagonistas de TLR-9; agentes antiinflamatorios e inmunomoduladores, incluyendo, pero sin limitación, inhibidores de COX-2 (por ejemplo, Celecoxib, AINE), glucocorticoides, estatinas y talidomida y análogos de la misma incluyendo IMiD™ (que son análogos estructurales y funcionales de talidomida (por ejemplo, REVLIMID® (lenalidomida), ACTIMID® (pomalidomida)); agentes proinflamatorios, tales como componentes fúngicos o bacterianos o cualquier citocina o quimiocina proinflamatoria; vacunas inmunoterapéuticas incluyendo, pero sin limitación, vacunas basadas en virus, vacunas basadas en bacterias o vacunas basadas en anticuerpos; y cualquier otro inmunomodulador, inmunopotenciador, agente antiinflamatorio y/o agente proinflamatorio. Se contempla cualquier combinación de dichos agentes por la invención, y cualquiera de dichos agentes combinado con o administrado en un protocolo con (por ejemplo, simultáneamente, secuencialmente o en otros formatos con) un producto inmunoterapéutico basado en levadura es una composición abarcada por la invención. Dichos agentes son bien conocidos en la técnica. Estos agentes pueden usarse en solitario o en combinación con otros agentes descritos en el presente documento.
Los agentes pueden incluir agonistas o antagonistas de una proteína o péptido dado o dominio del mismo. Como se usa en el presente documento, un "agonista" es cualquier compuesto o agente, incluyendo sin limitación moléculas pequeñas, proteínas, péptidos, anticuerpos, agentes de unión a ácido nucleico, etc., que se une a un receptor o ligando y produce o desencadena una respuesta, que puede incluir agentes que imitan la acción de una sustancia de origen natural que se une al receptor o ligando. Un "antagonista" es cualquier compuesto o agente, incluyendo sin limitación moléculas pequeñas, proteínas, péptidos, anticuerpos, agentes de unión a ácido nucleico, etc., que bloquea o inhibe o reduce la acción de un agonista.
Las composiciones de la invención pueden incluir además o pueden administrarse con (simultáneamente, secuencialmente o intermitentemente con) cualquier otro compuesto o composición que sea útil para prevenir o tratar una infección por Ad-36 o cualquier compuesto que trate o mejore cualquier síntoma de infección por Ad-36. Además, las composiciones de la invención pueden usarse junto con otras composiciones inmunoterapéuticas, incluyendo inmunoterapia profiláctica y/o terapéutica.
La divulgación también incluye un kit que comprende cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento, o cualquiera de los componentes individuales de las composiciones descritas en el presente documento. Los kits pueden incluir reactivos adicionales e instrucciones o indicaciones escritas para usar cualquiera de las composiciones de la invención para prevenir o tratar la infección por Ad-36 y/u obesidad o sobrepeso que está o puede asociarse con dicha infección.
Métodos para administración o uso de composiciones de la invención
Las composiciones de la invención, que, en una realización, incluyen composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura descritas anteriormente, así como proteínas de fusión de Ad-36 descritas en el presente documento y moléculas de ácido nucleico recombinante tales como proteínas de fusión de Ad-36 y otras composiciones que comprenden dichas composiciones basadas en levadura, proteínas de fusión o moléculas recombinantes descritas en el presente documento, pueden usarse en una diversidad de métodos in vivo e in vitro, incluyendo, pero sin limitación, métodos y usos para tratar y/o prevenir la infección por Ad-36 y/u obesidad, exceso de peso (por ejemplo, sobrepeso clínico) o hipertrofia de tejido adiposo anómala asociada con infección por Ad-36, otros síntomas y afecciones asociados con infección por Ad-36 y/o exceso de peso o hipertrofia de tejido adiposo anómala, en ensayos de diagnóstico para Ad-36 o para producir anticuerpos contra Ad-36.
Un aspecto de la divulgación se refiere a un método para tratar la infección por Ad-36 y/o para prevenir, mejorar o tratar al menos un síntoma o secuelas de infección crónica por Ad-36, en un individuo o población de individuos. En un aspecto, la divulgación se refiere a un método para reducir o prevenir la obesidad, el exceso de peso o la hipertrofia del tejido adiposo anómala que se asocia con la infección por Ad-36, reduciendo, deteniendo o previniendo, la infección por Ad-36. El método incluye la etapa de administrar a un individuo o una población de individuos que están, pueden estar o pueden llegar a estar, infectados con Ad-36, una composición inmunoterapéutica de la invención. En un aspecto, la composición es una composición inmunoterapéutica que comprende uno o más antígenos de Ad-36 (proteínas de Ad-36 y/o dominios inmunogénicos de las mismas), incluyendo cualquiera de los antígenos de Ad-36 (incluyendo cualquier proteína de fusión) como se describe en el presente documento. En un aspecto, la composición inmunoterapéutica es una composición inmunoterapéutica basada en levadura. En un aspecto, la composición incluye una proteína de fusión que comprende antígenos de Ad-36 como se describe en el presente documento, o molécula de ácido nucleico recombinante que codifica dichos antígenos. En una realización, el individuo o la población de individuos tiene infección por Ad-36 (está infectado actualmente con Ad-36 o al menos tiene pruebas de estar infectado). En una realización, el individuo o la población de individuos tiene sobrepeso o está obeso y, en otra realización, el individuo o la población de individuos no tiene sobrepeso o no está obeso. En un aspecto, el individuo o la población de individuos se trata adicionalmente con al menos un compuesto terapéutico o protocolo terapéutico para el tratamiento de infección por Ad-36 o útil para el tratamiento de una afección asociada con infección por Ad-36, incluyendo, pero sin limitación, obesidad, sobrepeso, hipertrofia de tejido adiposo anómala, diabetes de tipo II o síntomas de estas afecciones. Los compuestos terapéuticos adicionales adecuados incluyen, pero sin limitación, fármacos antivíricos de acción directa y/o interferones y/u otros agentes inmunoterapéuticos o inmunomoduladores y/o insulina. Los protocolos terapéuticos adicionales adecuados incluyen, pero sin limitación, la administración de dichos agentes, programas de dieta y programas de ejercicio.
Otra realización de la divulgación se refiere a un método para inmunizar a un individuo o población de individuos contra Ad-36 para prevenir la infección por Ad-36, prevenir la infección crónica por Ad-36 y/o reducir la gravedad de la infección por Ad-36 en el individuo o población de individuos. El método incluye la etapa de administrar a un individuo o población de individuos que no está infectado con Ad-36 (o que se cree que no está infectado con Ad-36 o no se sabe que esté o haya estado infectado con Ad-36) una composición de la invención. En un aspecto, la composición es una composición inmunoterapéutica que comprende uno o más antígenos de Ad-36 como se describe en el presente documento, incluyendo una composición inmunoterapéutica basada en levadura. En un aspecto, la composición incluye una proteína de fusión que comprende antígenos de Ad-36 como se describe en el presente documento, o molécula de ácido nucleico recombinante que codifica dicha proteína de fusión.
Como se usa en el presente documento, la expresión "tratar" una infección por Ad-36, o cualquier permutación de la misma (por ejemplo, "tratado para infección por Ad-36", etc.) se refiere en general a aplicar o administrar una composición de la invención una vez se ha producido la infección (aguda o crónica), con el objetivo de reducir o eliminar el título vírico detectable, conseguir seroconversión como se mide por el desarrollo de anticuerpos con Ad-36 que reflejan una eliminación del virus, reducción en al menos un síntoma producido por la infección en el individuo (por ejemplo, reducción del IMC, reducción del peso corporal, reducción de la tasa de aumento de peso, reducción de la adiposidad, etc.), retardo o prevención de la aparición y/o gravedad de los síntomas y/o secuelas posteriores causadas por la infección, reducción del daño orgánico o fisiológico sistémico resultante de la infección, mejora de la función orgánica o sistémica que se vio influida negativamente por la infección, mejora de las respuestas inmunitarias contra el virus, mejora de las respuestas inmunitarias a largo plazo contra el virus y/o mejora de la salud general del individuo o población de individuos. "Prevenir" una infección por Ad-36 o cualquier permutación de la misma (por ejemplo, "prevención de infección por Ad-36", etc.), se refiere en general a aplicar o administrar una composición de la invención antes de que se haya producido una infección con Ad-36, con el objetivo de prevenir la infección por Ad-36, prevenir la infección crónica por Ad-36 (es decir, posibilitar que un individuo elimine una infección aguda por Ad-36 sin intervención adicional) o al menos reducir la gravedad y/o duración de la infección y/o el daño fisiológico causado por la infección crónica, y/o reducir la tasa de aumento de peso, en un individuo o población de individuos si la infección se produce posteriormente.
Según la presente invención, el índice de masa corporal, o IMC, se usa habitualmente para determinar un grado exceso de peso (por ejemplo, sobrepeso) y obesidad, aunque no es una medida directa de la grasa corporal. Es una medida del peso en relación con la altura de un individuo y puede calcularse en unidades inglesas o del sistema métrico. Según los centros de control y prevención de enfermedades (CDC), se considera que un adulto que tiene un índice de masa corporal (IMC) entre 25 y 29,9 tiene sobrepeso. Se considera que un adulto que tiene un IMC de 30 o más es obeso. Para niños y adolescentes, los intervalos de IMC por encima de un peso normal tienen diferentes marcadores y tienen en cuenta diferencias normales en la grasa corporal entre niños y niñas y diferencias en la grasa corporal a diversas edades. El "sobrepeso" en niños y adolescentes de 2-19 años de edad se define como un IMC en o por encima del 85o percentil y menor del 95o percentil para niños de la misma edad y sexo. La obesidad de niños y adolescentes de 2-19 años de edad se define como un IMC a o por encima del 95o percentil para niños de la misma edad y sexo. Como se usa en el presente documento, la expresión "exceso de peso" se usa en general para hacer referencia a un peso que es mayor que el que se considera sano para un individuo de una edad, sexo y/o altura dados, que tiene típicamente al menos "sobrepeso" como ha definido el CDC u otra institución de salud público y como se expone en el presente documento. En consecuencia, la referencia a "exceso de peso" puede usarse indistintamente en referencia a "sobrepeso" o "tener sobrepeso". Están disponibles calculadoras del IMC para niños y adolescentes, así como adultos, a través de los centros para el control y la prevención de enfermedades, por ejemplo, y puede usarse para determinar el IMC para una edad, altura y pesos específicos (para niños y adolescentes, para adultos, se consideran la altura y el peso) y recomiendan el percentil de peso para el individuo si es un niño o adolescente, y recomiendan además si el individuo se considera potencialmente con sobrepeso u obeso según los patrones actuales para niños, adolescentes y adultos.
Según la invención, la referencia a "tejido adiposo anómalo", "tejido adiposo hipertrófico" o "hipertrofia de tejido adiposo anómala", se refiere a un aumento de tejido adiposo (adiposidad) o crecimiento de adipocitos que es anómalo y típicamente se presenta como un lipoma benigno o un depósito de tejido adiposo en una localización anatómica poco habitual. El tejido adiposo anómalo se distingue por lo tanto de la obesidad, ya que un individuo puede no ser clínicamente obeso, pero tener áreas de tejido adiposo anómalo o hipertrofia de tejido adiposo. El tejido adiposo anómalo es, por ejemplo, una afección asociada con la infección por VIH.
Preferentemente, el uso de una composición inmunoterapéutica de la invención da como resultado la prevención de obesidad o exceso de aumento de peso, en una reducción del peso aumentado o una tasa reducida de aumento de peso en individuos que están infectados o se infectan con Ad-36 y/o en una reducción de la probabilidad de ser obeso o tener sobrepeso, en un individuo que está infectado o se infecta con el virus pero en la actualidad no tiene sobrepeso ni es obeso. En un individuo adulto con un IMC de 30 o más, o en un niño o adolescente de 2-19 años de edad con un IMC a o aproximadamente el 95o percentil para niños/adolescentes de la misma edad y sexo, en un aspecto de la invención, el uso de una composición inmunoterapéutica de la invención da como resultado una reducción de IMC en el individuo hasta menos de 30 para dichos adultos o menos del 95o percentil para dichos niños o adolescentes. En un individuo adulto con un IMC de entre 25 y 29,9, o en un niño o adolescente de 2-19 años de edad con un IMC a o aproximadamente el 85o percentil para niños/adolescentes de la misma edad y sexo, en un aspecto de la invención, el uso de una composición inmunoterapéutica de la invención da como resultado una reducción de IMC hasta menos de 25 para dichos adultos o hasta menos del 85o percentil para dichos niños o adolescentes.
La eficacia, o efectividad, de una composición inmunoterapéutica de la invención también puede definirse como un cambio estadísticamente significativo, o tendencia estadística, hacia el beneficio del paciente en uno cualquiera o más parámetros medibles o detectables asociado con infección por Ad-36 o afecciones ligadas a dicha infección, en un individuo que recibe la composición inmunoterapéutica, en comparación con un valor de control para el parámetro que se evalúa. En un aspecto de la invención, un cambio clínicamente relevante puede medirse como un cambio de porcentaje hacia el beneficio del paciente en comparación con una evaluación previa, y puede ser 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 % o mayor. El beneficio también puede medirse como un cambio en la pendiente de una curva a lo largo del tiempo en comparación con un control (por ejemplo, un cambio en la pendiente de peso corporal o la tasa de aumento de peso representada a lo largo del tiempo antes, durante o después del tratamiento).
Los parámetros para evaluar para la determinación de la eficacia de una composición de la invención incluyen, pero sin limitación, carga vírica, eliminación vírica, hipertrofia de tejido adiposo, peso corporal, IMC, tasa de aumento de peso, grasa corporal total, colesterol en suero, triglicéridos, tensión arterial, tolerancia a la glucosa, sensibilidad a la insulina y respuestas inmunitarias, incluyendo respuestas de linfocitos T específicas de Ad-36 y respuestas de anticuerpos neutralizantes. El valor de control puede seleccionarse de cualquier valor de control adecuado, incluyendo, pero sin limitación, una o más mediciones previas del parámetro en el mismo individuo; una medición del parámetro como un promedio o una media en una población de individuos que cumplen criterios similares para sexo, edad, peso y/u otros estados clínicos; o un valor de referencia proporcionado en forma de información almacenada con respecto a un nivel basal previamente determinado para el parámetro dado. Dicha forma de información almacenada puede incluir, por ejemplo, pero sin limitación, un diagrama de referencia, listado o archivo electrónico de datos poblaciones o individuales con respecto a individuos "sanos" (control negativo) o individuos obesos o con sobrepeso o individuos infectados con Ad-36 que no se han curado o tratado (control positivo); un diagrama médico para los datos de registro individuales de evaluaciones previas; o cualquier otra fuente de datos con respecto a niveles basales que son útiles para la evaluación de la eficacia del tratamiento.
Según la invención, un "nivel basal" es un nivel de control, y en algunas realizaciones (pero no todas las realizaciones, dependiendo del método), un nivel normal, de un criterio de valoración o parámetro clínico dado con el que puede compararse un nivel de ensayo del criterio de valoración o parámetro clínico dado. La expresión "control negativo" usada en referencia a un nivel basal de dicho criterio de valoración o parámetro clínico se refiere típicamente a un nivel basal establecido en una muestra del paciente o de una población de individuos que se cree que son normales (es decir, no infectados con Ad-36, sin sobrepeso, no obesos, no anómalos con respecto al criterio de valoración que se ensaye). En una realización, puede establecerse un nivel basal o control a partir de un individuo al inicio del tratamiento terapéutico o preventivo de modo que el estado del individuo pueda supervisarse a lo largo del tiempo y/o de modo que la eficacia de un protocolo terapéutico o profiláctico dado pueda evaluarse a lo largo del tiempo (de forma continua o intermitente). Un "control positivo" puede incluir cualquier control que confirme la detección positiva del parámetro o criterio de valoración clínico que se asocie con infección por Ad-36 y/u obesidad o exceso de peso, u otro criterio de valoración asociado.
Se conocen en la técnica métodos para la detección de virus Ad-36 y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 2007/120362, WO 2010 011440, WO 2007/064836 y WO 98/44946. La presencia de ADN vírico puede determinarse mediante métodos convencionales incluyendo, pero sin limitación, secuenciación de ADN, hibridación de oligonucleótidos o amplificación por PCR. También se ha descrito la detección de anticuerpos o proteínas de Ad-36 que se unen con anticuerpos de Ad-36 y dichos métodos están abarcados por la divulgación. La unión puede medirse usando una diversidad de métodos convencionales en la técnica, incluyendo, pero sin limitación: transferencia Western, inmunotransferencia, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoprecipitación, resonancia de plasmón superficial, quimioluminiscencia, polarización fluorescente, fosforescencia, análisis inmunohistoquímica, espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF), microcitometría, micromatriz, microscopia, separación de células activadas por fluorescencia (FACS) y citometría de flujo.
La presente divulgación incluye el suministro (administración, inmunización) de una composición inmunoterapéutica de la invención, incluyendo una composición de inmunoterapia basada en levadura, a un sujeto. El proceso de administración puede realizarse ex vivo o in vivo, pero típicamente se realiza in vivo. La administración ex vivo se refiere a realizar parte de la etapa reguladora fuera del paciente, tal como administrando una composición de la presente invención a una población de células (células dendríticas) retiradas de un paciente en condiciones tales que un vehículo de levadura, uno o más antígenos y cualquier otro agente o composición se carguen en la célula, y devolviendo las células al paciente. La composición terapéutica de la presente invención puede devolverse a un paciente, o administrarse a un paciente, por cualquier modo adecuado de administración.
La administración de una composición puede ser sistémica, a la mucosa y/o proximal a la ubicación del sitio diana (por ejemplo, cerca de un sitio de infección o tejido diana, tal como tejido adiposo). Las vías adecuadas de administración serán evidentes para los expertos en la materia, dependiendo del tipo de afección para prevenir o tratar, el antígeno usado y/o la población celular o tejido diana. Diversos métodos aceptables de administración incluyen, pero sin limitación, administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración intramuscular, administración intraganglionar, administración intracoronaria, administración intraarterial (por ejemplo, en una arteria carótida), administración subcutánea, suministro transdérmico, administración intratraqueal, administración intraarticular, administración intraventricular, inhalación (por ejemplo, aerosol), administración intracraneal, intraespinal, intraocular, ótica, intranasal, oral, pulmonar, impregnación de un catéter e inyección directa en un tejido. En un aspecto, las vías de administración incluyen: intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intradérmica, intraganglionar, intramuscular, transdérmica, inhalada, intranasal, oral, intraocular, intraarticular, intracraneal e intravertebral. El suministro parenteral puede incluir vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrapleural, intrapulmonar, intravenosa, subcutánea, por catéter auricular y catéter venoso. El suministro ótico puede incluir gotas para el oído, el suministro intranasal puede incluir gotas para la nariz o inyección intranasal y el suministro intraocular puede incluir colirios. El suministro por aerosol (inhalación) también puede realizarse usando métodos convencionales en la técnica, (véase, por ejemplo, Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281,1992). Otras vías de administración que modulan la inmunidad de la mucosa pueden ser útiles en el tratamiento de infecciones víricas. Dichas vías incluyen vías bronquial, intradérmica, intramuscular, intranasal, otra vía de inhalación, rectal, subcutánea, tópica, transdérmica, vaginal y uretral. En un aspecto, una composición inmunoterapéutica de la invención se administra por vía subcutánea. En un aspecto, la composición inmunoterapéutica se administra directamente al tejido adiposo.
Con respecto a las composiciones de inmunoterapia basadas en levadura de la invención, en general, una única dosis adecuada es una dosis que puede proporcionar de forma eficaz un vehículo de levadura y un antígeno (si se incluye) a un tipo celular, tejido o región dados del cuerpo del paciente en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria específica de antígeno contra uno o más antígenos o epítopos de Ad-36, cuando se administra una o más veces durante un periodo de tiempo adecuado. Por ejemplo, en una realización, una dosis única de un vehículo de levadura de la presente invención es de aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 5 x 107 equivalentes de células de levadura por kilogramo de peso corporal del organismo al que se está administrando la composición. En un aspecto, una dosis única de un vehículo de levadura de la presente invención es de aproximadamente 0,1 U.L. (1 x 106 células) a aproximadamente 100 U.L. (1 x 109 células) por dosis (es decir, por organismo), incluyendo cualquier dosis intermedia, en incrementos de 0,1 x 106 células (es decir 1,1 x 106, 1,2 x 106, 1,3 x 106...). En una realización, las dosis incluyen dosis entre 1 U.L. y 40 U.L. u 80 U.L. y en un aspecto, entre 10 U.L. y 40 U.L. u 80 U.L. En una realización, las dosis se administran en diferentes sitios en el individuo, pero durante el mismo periodo de dosificación. Por ejemplo, puede administrase una dosis de 40 U.L. mediante inyección de dosis de 10 U.L. a cuatro sitios diferentes en el individuo durante un periodo de dosificación, o puede administrarse una dosis de 20 U.L. inyectando dosis de 5 U.L. a cuatro sitios diferentes en el individuo, o inyectando dosis de 10 U.L. a dos sitios diferentes en el individuo, durante el mismo periodo de dosificación. La invención incluye la administración de una cantidad de la composición de inmunoterapia basada en levadura (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 910, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 U.L. o más) a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, o más sitios diferentes en un individuo para formar una única dosis. Una unidad de levadura (U.L.) es 1 x 107 células de levadura.
Se administran "reforzadores" o "refuerzos" de una composición terapéutica, por ejemplo, cuando la respuesta inmunitaria contra el antígeno ha menguado o según lo necesario para proporcionar una respuesta inmunitaria o inducir una respuesta de memoria contra un antígeno o antígenos particulares. Los reforzadores pueden administrarse con un intervalo desde aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas, hasta mensualmente, hasta bimensualmente, hasta trimestralmente, hasta anualmente, hasta varios años después de la administración original. En una realización, una p7auta de administración es una en que se administran de aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 5 x 107 equivalentes de células de levadura de una composición por kg de peso corporal del organismo al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces durante un periodo de tiempo desde semanas, hasta meses, hasta años. En una realización, las dosis se administran semanalmente para 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dosis, seguidas por dosis mensuales según lo necesario para conseguir la inhibición o eliminación deseada del virus Ad-36.
En un aspecto de la divulgación, se administran uno o más agentes terapéuticos adicionales de forma secuencial con la composición de inmunoterapia basada en levadura (por ejemplo, un antivírico de acción directa, una composición nutracéutica, o similares). En otra realización, se administran uno o más agentes terapéuticos adicionales antes de administrar la composición de inmunoterapia basada en levadura. En otra realización, se administra uno o más agentes terapéuticos adicionales después de administrar la composición de inmunoterapia basada en levadura. En una realización, se administran uno o más agentes terapéuticos adicionales en dosis alternas con la composición de inmunoterapia basada en levadura, o en un protocolo en que la composición basada en levadura se administra a intervalos prescritos entre o con una o más dosis consecutivas de los agentes adicionales, o viceversa. En una realización, la composición de inmunoterapia basada en levadura se administra en una o más dosis durante un periodo de tiempo antes de comenzar la administración de los agentes adicionales. En otras palabras, la composición inmunoterapéutica basada en levadura se administra como una monoterapia durante un periodo de tiempo, y después se añade la administración del agente, de forma simultánea con nuevas dosis de inmunoterapia basada en levadura, o de un modo alterno con la inmunoterapia basada en levadura. Como alternativa, el agente puede administrarse durante un periodo de tiempo antes de empezar la administración de la composición de inmunoterapia basada en levadura. En un aspecto, la levadura se modifica técnicamente para expresar o portar el agente, o una levadura diferente se modifica técnicamente o se produce para expresar o portar el agente.
En el método de la presente divulgación, las composiciones y composiciones terapéuticas pueden administrarse a un animal, incluyendo cualquier vertebrado, y particularmente cualquier miembro de la clase de vertebrados, mamíferos, incluyendo, sin limitación, primates, roedores, ganado y mascotas domésticas. El ganado incluye mamíferos para consumir o que producen productos útiles (por ejemplo, ovejas para producción de lana). Los mamíferos para tratar o proteger incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas, cabras, ovejas, ganado bovino, caballos y cerdos.
Un "individuo" es un vertebrado, tal como un mamífero, incluyendo sin limitación un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, animales de granja, animales para el deporte, mascotas, primates, ratones y ratas. El término "individuo" puede usarse indistintamente con el término "animal", "sujeto" o "paciente".
Técnicas generales útiles en la invención
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica, química de ácidos nucleicos e inmunología, que son bien conocidas por los expertos en la materia. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía, tal como, Methods of Enzymology, Vol. 194, Guthrie et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Biology and activities of yeasts, Skinner, et al., eds., Academic Press (1980); Methods in yeast genetics: a laboratory course manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); The Yeast Saccharomyces: Cell Cycle and Cell Biology, Pringle et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997); The Yeast Saccharomyces: Gene Expression, Jones et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993); The Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics, Broach et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989) y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición (Sambrook y Russel, 2001), (conjuntamente denominado en este documento "Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, incluyendo los suplementos hasta 2001); RCP: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Harlow y Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (conjuntamente denominado en este documento "Harlow y Lane"), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 2000); Casarett and Doull's Toxicology The Basic Science of Poisons, C. Klaassen, ed., 6.a edición (2001), y Vaccines, S. Plotkin, W. Orenstein y P. Offit, eds., Quinta Edición (2008).
Definiciones generales
Como se usa en el presente documento, el término "análogo" se refiere a un compuesto químico que es estructuralmente similar a otro compuesto, pero difiere ligeramente en la composición (como en el remplazo de un átomo por un átomo de un elemento diferente o en la presencia de un grupo funcional particular, o el remplazo de un grupo funcional por otro grupo funcional). Por tanto, un análogo es un compuesto que es similar o comparable en su función y aspecto, pero tiene una estructura u origen diferente con respecto al compuesto de referencia.
Las expresiones "sustituido", "derivado sustituido" y "derivado", cuando se usan para describir un compuesto, significan que al menos un hidrógeno unido al compuesto sin sustituir está remplazado con un átomo o un resto químico diferente.
Aunque un derivado tiene una estructura física similar al compuesto precursor, el derivado puede tener diferentes propiedades químicas y/o biológicas que el compuesto precursor. Dichas propiedades pueden incluir, pero sin limitación, actividad aumentada o disminuida del compuesto precursor, nueva actividad en comparación con el compuesto precursor, biodisponibilidad potenciada o disminuida, eficacia potenciada o disminuida, estabilidad potenciada o disminuida in vitro y/o in vivo, y/o propiedades de absorción potenciadas o disminuidas.
En general, la expresión "biológicamente activo" indica que un compuesto (incluyendo una proteína o péptido) tiene al menos una actividad detectable que tiene un efecto sobre los procesos metabólicos u otros procesos de una célula u organismo, medidos u observados in vivo (es decir, en un entorno fisiológico natural) o in vitro (es decir, en condiciones de laboratorio).
Según la presente invención, el término "modular" puede usarse indistintamente con "regular" y se refiere en general a regulación positiva o regulación negativa de una actividad particular. Como se usa en el presente documento, la expresión "regular positivamente" puede usarse en general para describir cualquiera de: provocar, iniciar, incrementar, aumentar, reforzar, mejorar, potenciar, amplificar, promover o proporcionar, con respecto a una actividad particular. De manera similar, la expresión "regular negativamente" puede usarse en general para describir cualquiera de: disminuir, reducir, inhibir, mejorar, menguar, minimizar, bloquear o prevenir, con respecto a una actividad particular.
En una realización de la presente invención, cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento puede producirse con al menos uno, y hasta aproximadamente 20, aminoácidos heterólogos adicionales que flanquean cada uno de los extremos C y/o N-terminales de la secuencia de aminoácidos especificada. Puede indicarse que la proteína o polipéptido resultante "consiste esencialmente en" la secuencia de aminoácidos especificada. Según la presente invención, los aminoácidos heterólogos son una secuencia de aminoácidos que no se encuentran de forma natural (es decir, no se encuentran en la naturaleza, in vivo) flanqueando la secuencia de aminoácidos especificada, o que no están relacionados con la función de la secuencia de aminoácidos especificada, o que no estarían codificados por los nucleótidos que flanquean la secuencia de ácido nucleico de origen natural que codifica la secuencia de aminoácidos específica según se produce en el gen, si dichos nucleótidos en la secuencia de origen natural se tradujeran usando el uso convencional de codones para el organismo del que se obtiene la secuencia de aminoácidos dada. De manera similar, la expresión "que consiste esencialmente en", cuando se usa con referencia a una secuencia de ácido nucleico en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos especificada que puede estar flanqueada por al menos uno y hasta aproximadamente 60, nucleótidos heterólogos adicionales en cada uno del extremo 5' y/o 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos especificada. Los nucleótidos heterólogos no se encuentran de forma natural (es decir, no se encuentran en la naturaleza, in vivo) flanqueando la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos especificada según se produce en el gen natural o no codifican una proteína que confiere ninguna función adicional a la proteína o cambia la función de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos especificada.
Según la presente invención, la expresión "se une selectivamente a" se refiere a la capacidad de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o compañero de unión de la presente invención de unirse preferentemente a proteínas especificadas. Más específicamente, la expresión "se une selectivamente" se refiere a la unión específica de una proteína a otra (por ejemplo, un anticuerpo, fragmento del mismo o compañero de unión para un antígeno), en donde el nivel de unión, medido por cualquier ensayo convencional (por ejemplo, un inmunoensayo), es estadísticamente significativamente mayor que el control de fondo para el ensayo. Por ejemplo, cuando se realiza un inmunoensayo, los controles típicamente incluyen un pocillo/tubo de reacción que contiene anticuerpo o fragmento de unión a antígeno solo (es decir, en ausencia de antígeno), en donde una cantidad de reactividad (por ejemplo, unión no específica al pocillo) por el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en ausencia del antígeno se considera el fondo. La unión puede medirse usando una diversidad de métodos convencionales en la técnica incluyendo inmunoensayos enzimáticos (por ejemplo, ELISA, ensayos de inmunotransferencia, etc.).
La referencia a una proteína o polipéptido usado en la presente invención incluye proteínas de longitud completa, proteínas de fusión o cualquier fragmento, dominio (estructural, funcional o inmunogénico), epítopo conformacional u homólogo de dichas proteínas. Una proteína aislada, según la presente invención, es una proteína (incluyendo un polipéptido o péptido) que se ha retirado de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulación humana) y puede incluir proteínas purificadas, proteínas parcialmente purificadas, proteínas producidas de forma recombinante y proteínas producidas de forma sintética, por ejemplo. Por tanto, "aislado" no refleja el grado en que se ha purificado la proteína. Preferentemente, una proteína aislada de la presente invención se produce de forma recombinante. Según la presente invención, los términos "modificación" y "mutación" pueden usarse indistintamente, particularmente con respecto a las modificaciones/mutaciones de la secuencia de aminoácidos de las proteínas o partes de las mismas (o secuencias de ácido nucleico) descritas en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término "homólogo" se usa para hacer referencia a una proteína o péptido que difiere de una proteína o péptido de origen natural (es decir, la proteína "prototipo" o "de tipo silvestre") por modificaciones menores de la proteína o péptido de origen natural, pero que mantiene la proteína básica y la estructura de cadena lateral de la forma de origen natural. Dichos cambios incluyen, pero sin limitación: cambios en una o varias cadenas laterales de aminoácidos; cambios en uno o varios aminoácidos, incluyendo supresiones (por ejemplo, una versión truncada de la proteína o péptido), inserciones y/o sustituciones; cambios en la estequiometría de uno o varios átomos; y/o derivatizaciones menores, incluyendo, pero sin limitación: metilación, glucosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palmitación, amidación y/o adición de glucosilfosfatidil inositol. Un homólogo puede tener propiedades potenciadas, disminuidas o sustancialmente similares en comparación con la proteína o péptido de origen natural. Un homólogo puede incluir un agonista de una proteína o un antagonista de una proteína. Pueden producirse homólogos usando técnicas conocidas en este campo para la producción de proteínas incluyendo, pero sin limitación, modificaciones directas de la proteína de origen natural aislada, síntesis directa de proteínas o modificaciones de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína usando, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante o clásicas para efectuar mutagénesis aleatoria o dirigida.
Un homólogo de una proteína dada puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en, una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 45 %, o al menos aproximadamente 50 %, o al menos aproximadamente 55 %, o al menos aproximadamente 60 %, o al menos aproximadamente 65 %, o al menos aproximadamente 70 %, o al menos aproximadamente 75 %, o al menos aproximadamente 80 %, o al menos aproximadamente 85 %, o al menos aproximadamente 90 %, o al menos aproximadamente 95 % idéntica, o al menos aproximadamente 95 % idéntica, o al menos aproximadamente 96 % idéntica, o al menos aproximadamente 97 % idéntica, o al menos aproximadamente 98 % idéntica, o al menos aproximadamente 99 % idéntica (o cualquier porcentaje de identidad entre 45 % y 99 %, en incrementos de números enteros), a la secuencia de aminoácidos de la proteína de referencia. En una realización, el homólogo comprende, consiste esencialmente en o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es menos de 100 % idéntica, menos de aproximadamente 99 % idéntica, menos de aproximadamente 98 % idéntica, menos de aproximadamente 97 % idéntica, menos de aproximadamente 96 % idéntica, menos de aproximadamente 95 % idéntica y así sucesivamente, en incrementos de 1 %, hasta menos de aproximadamente 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de origen natural de la proteína de referencia.
Como se usa en el presente documento, a menos que se especifique otra cosa, una referencia a un porcentaje (%) de identidad se refiere a una evaluación de la homología que se realiza usando: (1) una búsqueda de homología BLAST 2.0 Basic BLAST usando blastp para búsquedas de aminoácidos y blastn para búsquedas de ácido nucleico con parámetros por defecto convencionales, en donde la secuencia de consulta se filtra para regiones de baja complejidad por defecto (descrito en Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. y Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402); (2) una alineación BLAST 2 (usando los parámetros descritos posteriormente); (3) y/o PSI-BLAST con los parámetros por defecto convencionales (BLAST por iteraciones de posición específica). Se aprecia que debido a algunas diferencias en los parámetros convencionales entre BLAST 2.0 Basic BLAST y BLAST 2, podría reconocerse que dos secuencias específicas tienen homología significativa usando el programa BLAST 2, mientras que una búsqueda realizada en BLAST 2.0 Basic BLAST usando una de las secuencias como secuencia de consulta puede no identificar la segunda secuencia en las mejores coincidencias. Además, PSI-BLAST proporciona una versión automatizada, fácil de usar, de una búsqueda "de perfil", que es una manera sensible de buscar homólogos de secuencia. El programa en primer lugar realiza una búsqueda en base de datos de BLAST con huecos. El programa PSI-BLAST usa la información de cualquier alineación significativa devuelta para construir una matriz de valores específica de posición, que remplaza la secuencia de consulta para la siguiente ronda de búsqueda en base de datos. Por lo tanto, debe entenderse que el porcentaje de identidad puede determinarse usando uno cualquiera de estos programas.
Las secuencias específicas pueden alinearse entre sí usando la secuencia BLAST 2 como se describe en Tatusova y Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250. La alineación de secuencias BLAST 2 se realiza en blastp o blastn usando el algoritmo BLAST 2.0 para realizar una búsqueda de BLAST con huecos (BLAST 2.0) entre las dos secuencias permitiendo la introducción de huecos (supresiones e inserciones) en la alineación resultante. Por razones de claridad en este documento, se realiza una alineación de secuencia BLAST 2 usando los siguientes parámetros por defecto convencionales.
Para blastn, usando la matriz 0 BLOSUM62:
Recompensa por coincidencia = 1
Penalización por falta de coincidencia = -2
Penalizaciones por abertura de hueco (5) y extensión de hueco (2)
disminución por hueco x (50) expectativa (10) tamaño de palabra (11) filtro (activo)
Para blastp, usando la matriz 0 BLOSUM62:
Penalizaciones por abertura de hueco (11) y extensión de hueco (1)
disminución por hueco x (50) expectativa (10) tamaño de palabra (3) filtro (activo).
Una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico que se ha retirado de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulación humana), siendo su medio natural el genoma o cromosoma en que se encuentra la molécula de ácido nucleico en la naturaleza. Por tanto, "aislada" no refleja necesariamente el grado en que se ha purificado la molécula de ácido nucleico, sino que indica que la molécula no incluye un genoma completo o un cromosoma completo en que se encuentra la molécula de ácido nucleico en la naturaleza. Una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir un gen. Una molécula de ácido nucleico aislada que incluye un gen no es un fragmento de un cromosoma que incluye dicho gen, sino que en su lugar incluye la región codificante y regiones reguladoras asociadas con el gen, pero no genes adicionales que se encuentran de forma natural en el mismo cromosoma. Una molécula de ácido nucleico aislada también puede incluir partes de un gen. Una molécula de ácido nucleico aislada también puede incluir una secuencia de ácido nucleico específica flanqueada por (es decir, en el extremo 5' y/o 3' de la secuencia) ácidos nucleicos adicionales que no flanquean normalmente la secuencia de ácido nucleico específica en la naturaleza (es decir, secuencias heterólogas). La molécula de ácido nucleico aislada puede incluir ADN, ARN (por ejemplo, ARNm) o derivados de ADN o ARN (por ejemplo, ADNc). Aunque la expresión "molécula de ácido nucleico" se refiere principalmente a la molécula de ácido nucleico física y la expresión "secuencia de ácido nucleico" se refiere principalmente a la secuencia de nucleótidos en la molécula de ácido nucleico, las dos expresiones pueden usarse indistintamente, especialmente con respecto a una molécula de ácido nucleico, o una secuencia de ácido nucleico, que puede codificar una proteína o dominio de una proteína.
Una molécula de ácido nucleico recombinante es una molécula que puede incluir al menos una de cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique una cualquiera o más proteínas descritas en este documento unida de forma operativa a al menos una de cualquier secuencia de control de la transcripción que pueda regular de forma eficaz la expresión de la molécula o moléculas de ácido nucleico en la célula para transfectar. Aunque la expresión "molécula de ácido nucleico" se refiere principalmente a la molécula de ácido nucleico física y la expresión "secuencia de ácido nucleico" se refiere principalmente a la secuencia de nucleótidos en la molécula de ácido nucleico, las dos expresiones pueden usarse indistintamente, especialmente con respecto a una molécula de ácido nucleico, o una secuencia de ácido nucleico, que puede codificar una proteína. Además, la expresión "molécula recombinante" se refiere principalmente a una molécula de ácido nucleico unida de forma operativa a una secuencia de control de la transcripción, pero puede usarse indistintamente con la expresión "molécula de ácido nucleico" que se administra a un animal.
Una molécula de ácido nucleico recombinante incluye un vector recombinante, que es cualquier secuencia de ácido nucleico, típicamente una secuencia heteróloga, que esté unida de forma operativa a la molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de fusión de la presente invención, que puede posibilitar la producción recombinante de la proteína de fusión, y que puede suministrar la molécula de ácido nucleico a la célula hospedadora según la presente invención. Dicho vector puede contener secuencias de ácido nucleico que no se encuentran de forma natural adyacentes a las moléculas de ácido nucleico aisladas para insertar en el vector. El vector puede ser de ARN o ADN, procariota o eucariota, y preferiblemente en la presente invención, es un virus o un plásmido. Los vectores recombinantes pueden usarse en la clonación, secuenciación y/o manipulación de otra manera de moléculas de ácido nucleico, y pueden usarse en el suministro de dichas moléculas (por ejemplo, como en una composición de ADN o una composición basada en vector vírico). Los vectores recombinantes se usan preferiblemente en la expresión de moléculas de ácido nucleico, y también pueden denominarse vectores de expresión. Los vectores recombinantes preferidos pueden expresarse en una célula hospedadora transfectada.
En una molécula recombinante de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico se unen de forma operativa a vectores de expresión que contienen secuencias reguladoras tales como secuencias de control de la transcripción, secuencias de control de la traducción, orígenes de replicación y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula hospedadora y que controlan la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. En particular, las moléculas recombinantes de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico que están unidas de forma operativa a una o más secuencias de control de la expresión. La expresión "unida de forma operativa" se refiere a unir una molécula de ácido nucleico a una secuencia de control de la expresión de una manera tal que la molécula se expresa cuando se transfecta (es decir, se transforma, transduce o transfecta) en una célula hospedadora.
Según la presente invención, el término "transfección" se usa para hacer referencia a cualquier método por el que pueda insertarse una molécula de ácido nucleico exógena (es decir, una molécula de ácido nucleico recombinante) en una célula. El término "transformación" puede usarse indistintamente con el término "transfección" cuando dicho término se usa para hacer referencia a la introducción de moléculas de ácido nucleico en células microbianas, tales como algas, bacterias y levaduras. En sistemas microbianos, el término "transformación" se usa para describir un cambio hereditario debido a la adquisición de ácidos nucleicos exógenos por el microorganismo y es esencialmente sinónimo del término "transfección." Por lo tanto, las técnicas de transfección incluyen, pero sin limitación, transformación, tratamiento químico de células, bombardeo de partículas, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, infección y fusión de protoplastos.
Los siguientes resultados experimentales se proporcionan con fines de ilustración y no se pretende que limiten el alcance de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1
Diseño y producción de producto inmunoterapéutico basado en levadura
El siguiente ejemplo describe el diseño y producción de varias composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura diferentes para el tratamiento o prevención de la infección por adenovirus-36 (Ad-36).
En estos experimentos, se modificaron técnicamente levaduras (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para que expresaran diversas proteínas de fusión de Ad-36 bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1, o el promotor TEF2. Brevemente, para producir cada uno de los productos inmunoterapéuticos basados en levadura en este Ejemplo, se preparó ADN que codificaba antígeno de Ad-36 como se expone para cada proteína de fusión posteriormente, se optimizaron sus codones para expresión en levadura y después se digirió con Spel y Notl y se insertó detrás del promotor CUP1 (pGI-100) o el promotor TEF2 (pTK57-1), como se indica para cada construcción posteriormente, en vectores de expresión de 2 pm de levadura. Los plásmidos resultantes se introdujeron en la levadura Saccharomyces cerevisiae W303a por transfección con acetato de litio/polietilenglicol, y se seleccionaron los transfectantes primarios en placas mínimas sólidas que carecían de uracilo (UDM; medio de retirada de uridina). Otras cepas de levadura, especies de levadura o géneros de levadura pueden usarse en productos inmunoterapéuticos basados en levadura de la invención; Saccharomyces cerevisiae W303a es una cepa ejemplar. Las colonias se volvieron a sembrar en estrías en UDM o ULDM (medio de retirada de uridina y leucina) y se dejaron crecer durante 3 días a 30° C. Se inocularon cultivos líquidos que carecían de uridina (U2) o que carecían de uridina y leucina (UL2) desde placas y se dejaron crecer cultivos de inicio durante 20 h a 30 °C, 250 rpm. Si se desea, aunque no se ha usado para estos experimentos, puede inocularse medio de pH tamponado que contiene 4,2 g/l de Bis-Tris (BT-U2; BT-UL2). Los cultivos primarios se usaron para inocular cultivos finales de la misma formulación y se continuó el crecimiento hasta que se alcanzó una densidad de 1,1 a 4,0 U.L./ml.
Para cepas de TEF2 (expresión constitutiva), después se recogieron células, se lavaron y se termoinactivaron a 56 °C durante 1 h en PBS. Para cepas de CUP1 (expresión inducible), se indujo expresión en el mismo medio con sulfato de cobre 0,375 mM durante 5 h a 30 °C, 250 rpm. Se recogieron células, se lavaron y se termoinactivaron a 56 °C durante 1 h en PBS.
Después de la termoinactivación de cultivos de TEF2 y CUP1, las células se lavaron tres veces con PBS. La expresión total de proteínas se midió mediante un ensayo de precipitación de TCA/unión de nitrocelulosa y se midió la expresión de proteínas de fusión de Ad-36 mediante transferencia Western usando un anticuerpo monoclonal antimarcador his (véase Figs. 1 y 2). Como se describe a continuación, las Figs. 1 y 2 mostraron que la composición de inmunoterapia basada en levadura de la invención expresó la proteína de fusión de Ad-36 bien usando ambos promotores, y usando dos secuencias N-terminales en las proteínas de fusión (SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO: 58) y se identificaron fácilmente mediante transferencia Western.
Receta para medio líquido U2:
• 20 g/l de glucosa
• 6,7 g/l de base nitrogenada de levadura que contiene sulfato de amonio
• 0,04 mg/ml de cada uno de histidina, leucina, triptófano y adenina
Receta para medio líquido UL2:
• 20 g/l de glucosa
• 6,7 g/l de base nitrogenada de levadura que contiene sulfato de amonio
• 0,04 mg/ml de cada uno de histidina, triptófano y adenina
Se produjeron varios productos inmunoterapéuticos basados en levadura que expresaban proteínas de fusión de Ad-36 en este experimento. Un producto inmunoterapéutico basado en levadura, indicado en la Fig. 1 como "FIB", se diseñó para expresar una proteína de fusión de Ad-36 como un único polipéptido que comprende partes seleccionadas de la proteína de fibra de Ad-36 (la proteína de fibra de Ad-36 completa está representada por la SEQ ID NO: 34), fusionada en su extremo N con un péptido sintético representado por la SEQ ID NO: 58. Se modificaron técnicamente Saccharomyces cerevisiae para que expresaran esta proteína bajo el control del promotor TEF2. La proteína de fusión tiene los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representados por la SEQ ID NO: 42: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar la expresión (posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO: 42); (2) las posiciones 71-136 de fibra de Ad-36 (posiciones 71-136 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 7-72 de la SEQ ID NO: 42; (3) las posiciones 145-169 de fibra de Ad-36 (posiciones 145-169 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 73-97 de la SEQ ID NO: 42; (4) las posiciones 290-313 de fibra de Ad-36 (posiciones 290-313 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 98-194 de la SEQ ID NO: 42; (5) las posiciones 334-363 de fibra de Ad-36 (posiciones 334-363 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 195-224 de la SEQ ID NO: 42; y (6) un marcador de hexahistidina (posiciones 225-230 de la SEQ ID NO: 42). Los segmentos de aminoácidos usados en esta proteína de fusión pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio. Se optimizaron los codones de la secuencia de ácido nucleico que codificaba la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 42 para expresión en levadura, y el producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresaba esta proteína de fusión se produjo como se ha descrito anteriormente.
La expresión de esta proteína de fusión de fibra de Ad-36 en levadura se muestra en la Fig. 1 (FIB). El nivel de expresión estimado de la proteína de fusión fue de 1704 ng/U.L.
Otro producto inmunoterapéutico basado en levadura, indicado en la Fig. 2 como "aFL-Fib" se diseñó para expresar una proteína de fusión de Ad-36 como un único polipéptido que comprende partes de la proteína de fibra de Ad-36 (la proteína de fibra de Ad-36 completa está representada por la SEQ ID NO: 34) fusionada en su extremo N con un líder de señal de factor alfa de levadura (SEQ ID NO: 56). Se modificaron técnicamente Saccharomyces cerevisiae para que expresaran esta proteína bajo el control del promotor CUP1. Esta proteína de fusión tiene los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representados por la SEQ ID NO: 48: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar o potenciar la expresión (SEQ ID NO: 56 o posiciones 1 a 89 de la SEQ ID NO: 48); (2) un espaciador/conector de dos aminoácidos (Thr-Ser) para facilitar la clonación y manipulación de las secuencias (posiciones 90 a 91 de la SEQ ID NO: 48); (3) las posiciones 71-136 de fibra de Ad-36 (posiciones 71-136 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 92-157 de la SEQ ID NO: 48; (4) las posiciones 145-169 de fibra de Ad-36 (posiciones 145-169 de la s Eq ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 158-182 de la SEQ ID NO: 48; (5) las posiciones 290-313 de fibra de Ad-36 (posiciones 290-313 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 183-279 de la SEQ ID NO: 48; (6) las posiciones 334-363 de fibra de Ad-36 (posiciones 334-363 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 280-309 de la SEQ ID NO: 48; y (7) un marcador de hexahistidina (posiciones 310-315 de la SEQ ID NO: 48). Los segmentos de aminoácidos usados en esta proteína de fusión pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio; el ejemplo proporcionado en el presente documento es ejemplar. Se optimizaron los codones de la secuencia de ácido nucleico que codificaba la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 48 para expresión en levadura, y el producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresaba esta proteína de fusión se produjo como se ha descrito anteriormente.
La expresión de esta proteína de fusión de fibra de Ad-36 en levadura se muestra en la Fig. 2 (aFL-FIB). El nivel de expresión estimado de la proteína de fusión fue de 14.854 ng/U.L.
Otro producto inmunoterapéutico basado en levadura, indicado en la Fig. 1 como "HEX", se diseñó para expresar una proteína de fusión de Ad-36 como un único polipéptido que comprende partes de la proteína de hexón de Ad-36 (la proteína de hexón de Ad-36 completa está representada por la SEQ ID NO: 18) fusionada en su extremo N con un péptido sintético representado por la SEQ ID NO: 58. Se modificaron técnicamente Saccharomyces cerevisiae para que expresaran esta proteína bajo el control del promotor TEF2. Esta proteína de fusión tiene los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representados por la SEQ ID NO: 43: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar la expresión (posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO: 43); (2) las posiciones 136-218 de hexón de Ad-36 (posiciones 136-218 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 7-89 de la SEQ ID NO: 43; (3) las posiciones 235-285 de hexón de Ad-36 (posiciones 235-285 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 90-141 de la SEQ ID NO: 43; (4) las posiciones 297-308 de hexón de Ad-36 (posiciones 297-308 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 142-153 de la SEQ ID NO: 43; (5) las posiciones 410-450 de hexón de Ad-36 (posiciones 410-450 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 154-194 de la SEQ ID NO: 43; y (6) un marcador de hexahistidina (posiciones 195-200 de la SEQ ID NO: 43). Los segmentos de aminoácidos usados en esta proteína de fusión pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio. Se optimizaron los codones de la secuencia de ácido nucleico que codificaba la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 43 para expresión en levadura, y el producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresaba esta proteína de fusión se produjo como se ha descrito anteriormente.
La expresión de esta proteína de fusión de hexón de Ad-36 en levadura se muestra en la Fig. 1 (HEX). El nivel de expresión estimado de esta proteína fue de 1981 ng/U.L.
Otro producto inmunoterapéutico basado en levadura, indicado en la Fig. 2 como "aFL-Hexón" se diseñó para expresar una proteína de fusión de Ad-36 como un único polipéptido que comprende partes de la proteína de hexón de Ad-36 (la proteína de hexón de Ad-36 completa está representada por la SEQ ID NO: 18) fusionada con una secuencia señal líder de factor alfa de levadura (SEQ ID NO: 56). Se modificaron técnicamente Saccharomyces cerevisiae para que expresaran esta proteína bajo el control del promotor CUP1. Esta proteína de fusión tiene los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representados por la SEQ ID NO: 50: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar o potenciar la expresión (SEQ ID NO: 56 o posiciones 1 a 89 de la SEQ ID NO: 50); (2) un espaciador/conector de dos aminoácidos (Thr-Ser) para facilitar la clonación y manipulación de las secuencias (posiciones 90 a 91 de la SEQ ID NO: 50); (3) las posiciones 136-218 de hexón de Ad-36 (posiciones 136-218 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 92-174 de la SEQ ID NO: 50; (4) las posiciones 235-285 de hexón de Ad-36 (posiciones 235-285 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 175-226 de la SEQ ID NO: 50; (5) las posiciones 297-308 de hexón de Ad-36 (posiciones 297-308 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 227-238 de la SEQ ID NO: 50; (6) las posiciones 410-450 de hexón de Ad-36 (posiciones 410-450 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 239-279 de la SEQ ID NO: 50; y (7) un marcador de hexahistidina (posiciones 280-285 de la SEQ ID NO: 50). Los segmentos de aminoácidos usados en esta proteína de fusión pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio. Se optimizaron los codones de la secuencia de ácido nucleico que codificaba la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 50 para expresión en levadura, y el producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresaba esta proteína de fusión se produjo como se ha descrito anteriormente.
La expresión de esta proteína de fusión de hexón de Ad-36 en levadura se muestra en la Fig. 2 (aFL-Hexón). El nivel de expresión estimado de esta proteína fue de 19.695 ng/U.L.
Otro producto inmunoterapéutico basado en levadura, indicado en la Fig. 2 como "aFL-Hexón-F", se diseñó para expresar una proteína de fusión de Ad-36 como un único polipéptido que comprende la proteína de hexón de Ad-36 de longitud completa (la proteína de hexón completa está representada por la SEQ ID NO: 18) fusionada en su extremo N con secuencia líder de factor alfa de levadura (SEQ ID NO: 56). Se modificaron técnicamente Saccharomyces cerevisiae para que expresaran esta proteína bajo el control del promotor TEF2. Esta proteína de fusión tiene los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representados por la SEQ ID NO: 52: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar o potenciar la expresión (SEQ ID NO: 56 o posiciones 1 a 89 de la SEQ ID NO: 52); (2) un espaciador/conector de dos aminoácidos (Thr-Ser) para facilitar la clonación y manipulación de las secuencias (posiciones 90 a 91 de la SEQ ID NO: 52); (3) las posiciones 2-944 de hexón de Ad-36 (posiciones 2-944 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 92-1034 de la SEQ ID NO: 52; y (3) un marcador de hexahistidina (posiciones 1035-1040 de la SEQ ID NO: 52). Esta construcción contiene epítopos del MHC de clase I demostrados o potenciales (por ejemplo, las posiciones 204-214 de la SEQ ID NO:52; posiciones 404-412 de la SEQ ID NO: 52; posiciones 795-803 de la SEQ ID NO: 52; posiciones 928-936 de la SEQ ID NO: 52; o posiciones 994-1000 de la s Eq ID NO: 52) y epítopos del MHC de clase II demostrados o potenciales (por ejemplo, las posiciones 100-110 de la SEQ ID NO:52; posiciones 116-126 de la SEQ ID NO: 52; 406-420 de la SeQ ID NO: 52; posiciones 458-468 de la SEQ ID NO: 52; posiciones 792-803 de la SEQ ID NO: 52; o posiciones 947-957 de la SEQ ID NO: 52). Los segmentos de aminoácidos usados en esta proteína de fusión pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio. Se optimizaron los codones de la secuencia de ácido nucleico que codificaba la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 44 para expresión en levadura, y el producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresaba esta proteína de fusión se produjo como se ha descrito anteriormente.
La expresión de esta proteína de fusión de hexón de Ad-36 en levadura se muestra en la Fig. 2 (aFL-Hexón-F). El nivel de expresión estimado de esta proteína fue de 25.315 ng/U.L.
Otro producto inmunoterapéutico basado en levadura, indicado en la Fig. 1 como "CRAG", se diseñó para expresar una proteína de fusión de Ad-36 como un único polipéptido que comprende partes de las proteínas CR1a y CR1y de Ad-36 (la proteína CR1a completa está representada por la SEQ ID NO: 26 y la proteína CR1y completa está representada por la SEQ ID NO: 29), fusionada en su extremo N con un péptido sintético representado por la SEQ ID NO: 58. Se modificaron técnicamente Saccharomyces cerevisiae para que expresaran esta proteína bajo el control del promotor TEF2. Esta proteína de fusión tiene los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representados por la SEQ ID NO: 47: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar la expresión (posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO: 47); (2) las posiciones 18-60 de CR1a (posiciones 18-60 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 7-49 de la SEQ ID NO: 47; (3) las posiciones 123-157 de CR1a de Ad-36 (posiciones 123-157 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 50-84 de la SEQ ID NO: 47; (4) las posiciones 19-60 de CR1y de Ad-36 (posiciones 19-60 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 85-126 de la SEQ ID NO: 47; (5) las posiciones 83-116 de CR1y de Ad-36 (posiciones 83-116 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 127-160 de la SEQ ID NO: 47; y (6) un marcador de hexahistidina (posiciones 161-166 de la SEQ ID NO: 47). Los segmentos de aminoácidos usados en esta proteína de fusión pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio. Se optimizaron los codones de la secuencia de ácido nucleico que codificaba la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 43 para expresión en levadura, y el producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresaba esta proteína de fusión se produjo como se ha descrito anteriormente.
La expresión de esta proteína de fusión de CR1a-CR1Y de Ad-36 se muestra en la Fig. 1 (CRAG). El nivel de expresión estimado de esta proteína fue de 3341 ng/U.L.
Otro producto inmunoterapéutico basado en levadura, indicado como "aFL-CRAG" en la Fig. 2, se diseñó para expresar una proteína de fusión de Ad-36 como un único polipéptido que comprende partes de las proteínas CR1a y CR1y de Ad-36 (la proteína CR1a completa está representada por la SEQ ID NO: 26 y la proteína CR1y completa está representada por la SEQ ID NO: 29), fusionada en su extremo N con secuencia líder de factor alfa de levadura (SEQ ID NO: 56). Se modificaron técnicamente Saccharomyces cerevisiae para que expresaran esta proteína bajo el control del promotor CUP1. Esta proteína de fusión tiene los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representados por la SEQ ID NO: 54: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar o potenciar la expresión (SEQ ID NO: 56 o posiciones 1 a 89 de la SEQ ID NO: 54); (2) un espaciador/conector de dos aminoácidos (Thr-Ser) para facilitar la clonación y manipulación de las secuencias (posiciones 90 a 91 de la SEQ ID NO: 54); (3) las posiciones 18-60 de CR1a (posiciones 18-60 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 92-134 de la SEQ ID NO: 54; (4) las posiciones 123-157 de CR1a de Ad-36 (posiciones 123-157 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 135-169 de la SEQ ID NO: 54; (5) las posiciones 19-60 de CR1y de Ad-36 (posiciones 19-60 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 170-211 de la SEQ ID NO: 54; (6) las posiciones 83-116 de CR1 y de Ad-36 (posiciones 83-116 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 212-245 de la SEQ ID NO: 54; y (7) un marcador de hexahistidina (posiciones 246-251 de la SEQ ID NO: 54). Los segmentos de aminoácidos usados en esta proteína de fusión pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio. Se optimizaron los codones de la secuencia de ácido nucleico que codificaba la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 54 para expresión en levadura, y el producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresaba esta proteína de fusión se produjo como se ha descrito anteriormente. La expresión de esta proteína de fusión de CR1a-CR1Y de Ad-36 se muestra en la Fig. 2 (aFL-CRAG). El nivel de expresión estimado de esta proteína fue de 16.154 ng/U.L.
Los inventores han diseñado composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura adicionales y estas se producen usando los mismos protocolos descritos anteriormente. Por ejemplo, se diseña otro producto inmunoterapéutico basado en levadura para expresar una proteína de fusión de Ad-36 como un único polipéptido que comprende la proteína de hexón de Ad-36 de longitud completa (la proteína de hexón completa está representada por la SEQ ID NO: 18), fusionada en su extremo N con un péptido sintético representado por la SEQ ID NO: 58. Se modifican técnicamente Saccharomyces cerevisiae para que expresen esta proteína bajo el control del promotor TEF2 o CUP1. Esta proteína de fusión tiene los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representados por la SEQ ID NO: 44: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar la expresión (posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO: 44); (2) las posiciones 2-944 de hexón de Ad-36 (posiciones 2-944 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 7-949 de la SEQ ID NO: 44; y (3) un marcador de hexahistidina (posiciones 950-955 de la SEQ ID NO: 44). Esta construcción contiene epítopos del MHC de clase I demostrados o potenciales (por ejemplo, las posiciones 119-129 de la SEQ ID NO:44; posiciones 319-327 de la SEQ ID NO: 44; posiciones 710-718 de la SEQ ID NO: 44; posiciones 843-851 de la SEQ ID NO: 44; o posiciones 909-915 de la SEQ ID NO: 44) y epítopos del MHC de clase II demostrados o potenciales (por ejemplo, las posiciones 15-25 de la SEQ ID NO:44; posiciones 31-41 de la SEQ ID NO: 44; 321-335 de la SEQ ID NO: 44; posiciones 373-383 de la SEQ ID NO: 44; posiciones 707-718 de la SEQ ID NO: 44; o posiciones 862-872 de la SEQ ID NO: 44). Los segmentos de aminoácidos usados en esta proteína de fusión pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio; el ejemplo proporcionado en el presente documento es ejemplar. Se optimizan los codones de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 44 para expresión en levadura, y un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa esta proteína de fusión se produce como se ha descrito anteriormente.
Se diseña otro producto inmunoterapéutico basado en levadura para expresar una proteína de fusión de Ad-36 como un único polipéptido que comprende partes de las proteínas de fibra y hexón de Ad-36 (proteína completa representada por la SEQ ID NO: 34 (fibra) y la SEQ ID NO: 18 (hexón)), fusionado en su extremo N con un péptido sintético representado por la SEQ ID NO: 58. Se modifican técnicamente Saccharomyces cerevisiae para que expresen esta proteína bajo el control del promotor TEF2 o CUP1. Esta proteína de fusión tiene los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representados por la SEQ ID NO: 45: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar la expresión (posiciones 1 a 6 de la SEQ ID No : 45); (2) las posiciones 71-136 de fibra de Ad-36 (posiciones 71-136 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 7-72 de la SEQ ID NO: 45; (3) las posiciones 145-169 de fibra de Ad-36 (posiciones 145-169 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 73-97 de la SEQ ID NO: 45; (4) las posiciones 290-313 de fibra de Ad-36 (posiciones 290-313 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 98-194 de la SEQ ID NO: 45; (5) las posiciones 334-363 de fibra de Ad-36 (posiciones 334-363 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 195-224 de la SEQ ID NO: 45; (6) las posiciones 136-218 de hexón de Ad-36 (posiciones 136-218 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 225-307 de la SEQ ID NO: 45; (7) las posiciones 235-285 de hexón de Ad-36 (posiciones 235-285 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 308-359 de la SEQ ID NO: 45; (8) las posiciones 297-308 de hexón de Ad-36 (posiciones 297-308 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 360-371 de la SEQ ID NO: 45; (9) las posiciones 410-450 de hexón de Ad-36 (posiciones 410-450 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 372-412 de la SEQ ID NO: 45; y (10) un marcador de hexahistidina (posiciones 413-418 de la SEQ ID NO: 45). Los segmentos de aminoácidos usados en esta proteína de fusión pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio; el ejemplo proporcionado en el presente documento es ejemplar. Se optimizan los codones de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 45 para expresión en levadura, y el producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa esta proteína de fusión se produce como se ha descrito anteriormente.
Se diseña otro producto inmunoterapéutico basado en levadura para expresar una proteína de fusión de Ad-36 como un único polipéptido que comprende partes de las proteínas de hexón y fibra de Ad-36 (proteína completa representada por la SEQ ID NO: 18 (hexón) y la SEQ ID NO: 34 (fibra)) fusionada en su extremo N con un péptido sintético representado por la SEQ ID NO: 58. Se modifican técnicamente Saccharomyces cerevisiae para que expresen esta proteína bajo el control del promotor TEF2 o CUP1. Esta proteína de fusión tiene los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase desde el extremo N al C, representados por la SEQ ID NO: 46: (1) un péptido N-terminal para conferir resistencia a degradación por el proteasoma y estabilizar la expresión (posiciones 1 a 6 de la SEQ ID NO: 46); (2) las posiciones 136-218 de hexón de Ad-36 (posiciones 136-218 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 7-89 de la SEQ ID NO: 46; (3) las posiciones 235-285 de hexón de Ad-36 (posiciones 235-285 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 90-141 de la SEQ ID NO: 46; (4) las posiciones 297-308 de hexón de Ad-36 (posiciones 297-308 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 142-153 de la SEQ ID NO: 46; (5) las posiciones 410-450 de hexón de Ad-36 (posiciones 410-450 de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 154-194 de la SEQ ID NO: 46; (6) las posiciones 71-136 de fibra de Ad-36 (posiciones 71-136 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 195-260 de la SEQ ID NO: 46; (7) las posiciones 145-169 de fibra de Ad-36 (posiciones 145-169 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 261-285 de la SEQ ID NO: 46; (8) las posiciones 290-313 de fibra de Ad-36 (posiciones 290-313 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 286-382 de la SEQ ID NO: 46; (9) las posiciones 334-363 de fibra de Ad-36 (posiciones 334-363 de la SEQ ID NO: 34 o una secuencia correspondiente de otra cepa o aislado de Ad-36), correspondientes a las posiciones 383-412 de la SEQ ID NO: 46; y (10) un marcador de hexahistidina (posiciones 413-418 de la SEQ ID NO: 46). Los segmentos de aminoácidos usados en esta proteína de fusión pueden modificarse mediante el uso de aminoácidos adicionales que flanquean uno de los extremos de cualquier dominio; el ejemplo proporcionado en el presente documento es ejemplar. Se optimizan los codones de una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la SEQ ID NO: 46 para expresión en levadura, y el producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa esta proteína de fusión se produce como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 2
Infección/replicación de Ad-36 en células madre de rata y células A549
El siguiente ejemplo describe la capacidad de Ad-36 para infectar preadipocitos primarios y células A549. Este experimento demuestra que la reserva vírica que se pretende usar en experimentos in vivo descritos en los ejemplos posteriores es biológicamente activa y puede infectar células diana de relevancia in vitro. Ad-36 es un virus de ADN y carece de ARNm. No se produce transcripción de genes de Ad-36 en ARNm a no ser que el virus haya infectado una célula hospedadora de mamífero. La presencia de ARNm de Ad-36 en las células diana es por lo tanto una prueba directa de infección y replicación vírica.
Se añadió reserva vírica de Ad-36 purificada a células madre procedentes de tejido adiposo de rata (ASC) y a células A549 (línea celular de carcinoma de pulmón humano que es una célula hospedadora natural para adenovirus humanos) en cultivo a una multiplicidad de infección (MOI) de 5. Quince horas después de la adición vírica, se aisló ARN total de las células diana y se sometió a PCR de transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR) con SYBR green fluorescente diseñado para medir específicamente la tasa de amplificación por PCR de E1A, E4 orf1 y ARNm de Hexón. La expresión relativa de estos genes se determinó para dianas infectadas con simulación o infectadas por Ad-36. Los resultados, mostrados en la Fig. 3 (ASC) y la Fig. 4 (A549) muestran que los genes de E1A y Hexón se expresaron en ambas dianas celulares y que E4 Orf1 se expresó específicamente en células A549. La expresión génica requirió la adición de Ad-36, ya que las células infectadas con simulación solamente mostraron niveles de fondo de señal en todas las reacciones.
Ejemplo 3
Estudio piloto de ratas-cinética de Ad36 e infección de tejidos adiposos viscerales
El siguiente ejemplo describe la capacidad de la reserva de Ad-36 para infectar ratas in vivo y evalúa: i) la dosis óptima de Ad-36 que da lugar a inoculación vírica con éxito, conocida de otro modo como 'toma vírica'; ii) la cinética de la fase virémica sanguínea de infección; iii) la capacidad del virus para infectar el tejido adiposo visceral.
Antes de la presente invención, hasta donde alcanza el conocimiento de los inventores, no ha habido ningún experimento de cinética o dosificación o estudios de localización de grasas disponibles que fuera suficientemente robusto para establecer un modelo animal óptimo de infección por Ad-36 que fuera útil para evaluar la eficacia de la vacuna profiláctica y terapéutica. En consecuencia, los siguientes experimentos se diseñaron para proporcionar esta información y para establecer un modelo relevante y útil para estudiar la infección por Ad-36 (aguda y crónica). Brevemente, las ratas se inyectaron de forma intraperitoneal con PBS solamente o partículas víricas de Ad-36 purificadas a 3 dosis (107, 108 o 109 unidades formadoras de placas (UFP)), según el protocolo mostrado en la Tabla 2. Se tomaron muestras de sangre de ratas los días 0 (antes de la exposición) y los días 1 después de la exposición (20 h) y los días 2 y 4 después de la exposición. Se preparó ADN de virus de 100 ml de plasma usando el kit de virus QIAAMP® MINElUt E® (Qiagen), y el nivel de Ad N vírico se estimó mediante PCR cuantitativa (qPCR) en tiempo real que presentaba una sonda específica de ADN de hexón de Ad-36. Se obtuvieron estimaciones del número de copias víricas mediante interpolación frente a una curva patrón producida con plásmido de hexón purificado de número de copias conocido. A las dos semanas después de la exposición, las ratas se sacrificaron, se disecó la grasa visceral y se aisló ADN total del tejido graso usando un método de precipitación de proteinasa K/isopropanol. El ADN se sometió a PCR de dos ciclos anidada que presenta cebadores de PCR específicos de ADN de hexón.
Tabla 2
Figure imgf000041_0001
Se proporcionan resultados que muestran las copias de partículas víricas (P.V.)por ml de sangre a cada nivel de infección vírica en la Fig. 5 (Grupo A; control de simulación); Fig. 6 (Grupo B; 107 UFP de Ad-36); Fig. 7 (Grupo C; 108 UFP de Ad-36); y Fig. 8 (Grupo D; 109 UFP de Ad-36). La Fig. 9 muestra los resultados de Pc R para detectar hexón de Ad-36 en grasa visceral. En conjunto, los resultados de estos experimentos demuestran que: 1) el nivel de virus Ad-36 en la sangre determinado por qPCR de hexón es máximo a la dosis de 109UFP, y a las 20 h después de la exposición; y 2) el virus Ad-36 está presente en el tejido adiposo visceral de todas las ratas a las 2 semanas después de la exposición a las dosis de 108 y 109 UFP, mientras que a la dosis de 107 UFP, el virus fue detectable de forma robusta en el tejido adiposo de solamente una de las dos ratas. Estos datos muestran que la reserva de Ad-36 purificado que se ha mostrado que infecta preadipocitos primarios en cultivo en el Ejemplo 2 también es infecciosa in vivo y confirman informes publicados (por ejemplo, Pasarica et al, 2008) de que Ad-36 infecta tejidos adiposos viscerales. Ya que los niveles máximos de viremia se produjeron con inyección de 109 UFP (véase Fig. 8), esta dosis se seleccionó para exposición de ratas en los experimentos de vacunación de inmunoterapia basada en levadura descritos en los siguientes ejemplos. En consecuencia, estos datos se usaron para establecer un sistema modelo de rata optimizado de infección por Ad-36 para el ensayo de vacunas profilácticas y terapéuticas (inmunoterapia).
Ejemplo 4
Efecto de la administración profiláctica de Tarmogens de Ad-36 en el modelo de rata de infección por Ad-36 El siguiente ejemplo describe el uso de productos inmunoterapéuticos de adenovirus 36 (Ad-36) basados en levadura en modelo profiláctico de rata de obesidad relacionada con adenovirus.
En la bibliografía se ha estudiado un modelo de rata (Dhurandhar et al, Obesity 11:1905, 2006) en el que ratas infectadas por Ad36 obtuvieron un peso corporal y peso de panículos adiposos significativamente mayores a las 30 semanas después de la inoculación que ratas de control infectadas con simulación. Los pesos de los panículos adiposos epidídimo-inguinal, retroperitoneal y visceral del grupo infectado fueron mayores que los de las ratas de control de PBS en 60 %, 46 % y 86 %, respectivamente (p < 0,00001). Los presentes inventores han mejorado este modelo de rata para los fines de evaluar vacunas profilácticas y terapéuticas, como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3.
El siguiente experimento describe un estudio para determinar si la administración profiláctica de las composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura descrita en el Ejemplo 1 previene o reduce el grado o la tasa de aumento de peso inducido por Ad-36.
Se inmunizaron cohortes de ratas (n=18/grupo) por vía subcutánea (s.c.) con composiciones inmunoterapéuticas de Ad-36 basadas en levadura (vacunas), administradas en cuatro sitios diferentes con 20 millones de células de levadura (2 U.L.) en 0,1 ml por sitio. En estos experimentos, se usaron dos composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura diferentes. "Ad-aFL-CRAG" es el producto inmunoterapéutico basado en levadura descrito en el Ejemplo 1 anterior que expresa una proteína de fusión de Ad-36 que comprende antígenos de CR1a y CR1y de Ad-36, teniendo estos antígenos una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55, que se une en el extremo N con una secuencia líder de factor alfa, para formar una proteína de fusión completa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54. "Ad-aFL-HEX-Completo" es el producto inmunoterapéutico basado en levadura descrito en el Ejemplo 1 anterior que expresa una proteína de fusión de Ad-36 que comprende un antígeno de hexón de longitud casi completa, teniendo el antígeno una secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 53, que se une en el extremo N con una secuencia líder de factor alfa, para formar una proteína de fusión completa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 52. La dosificación fue una vez por semana durante 3 semanas y después, tras un descanso de dos semanas, las ratas se expusieron por vía intraperitoneal a Ad-36 (109 UFP), que se estableció en el Ejemplo 3 que es una dosis vírica óptima para evaluar la infección por Ad-36. Después se realizó inmunización una vez a la semana durante hasta 30 semanas después de la exposición. Las cohortes experimentales se muestran en la Tabla 3. Los grupos de control adicionales incluyen un grupo de ratas que reciben solamente PBS (sin tratamiento previo o "PBS") y un grupo de ratas inmunizadas con composiciones de levadura de control (levadura de "vector vacío" o "YVEC", que son levaduras transfectadas con un vector que no contiene un inserto de antígeno; es decir, estas levaduras no expresan un antígeno o antígenos de Ad-36).
Tabla 3
Figure imgf000042_0001
Los animales se pesaron antes de la inmunización, antes de la exposición vírica y después bisemanalmente durante aproximadamente 30 semanas después de inoculación con virus. A lo largo del estudio se supervisaron el consumo de alimento y agua. Se recogió sangre en el momento basal, antes de la exposición vírica y semanalmente después de la exposición vírica para supervisar el ADN de Ad-36, colesterol, niveles de triglicéridos, corticosterona, anticuerpos neutralizantes para Ad-36 y otros parámetros (véase Ejemplo 5). Se realiza ensayo de tolerancia a la glucosa a intervalos seleccionados y también se miden los niveles de glucosa en orina. Se obtuvo sangre (500 pl por punto temporal) con anestesia de isofluroano de la vena de la cola. Al final del estudio, los animales se sacrificaron y se recoge tejido adiposo para medir los niveles víricos mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). También puede realizarse PCR en biopsias obtenidas durante el transcurso del estudio.
Este experimento se realizó en ratas Wistar exogámicas. Si, como se esperaba, el aumento de peso se previene o se reduce (o la tasa de aumento de peso se reduce) en ratas inmunizadas con inmunoterapia de Ad-36 basada en levadura en comparación con ratas de control, se evaluarán ratas Wistar Furth endogámicas según el mismo protocolo o uno similar, ya que se esperaba que la rata fuera más susceptible a evaluación de la inmunidad de linfocitos T. También pueden realizarse experimentos adicionales para determinar el efecto de la dieta u otros factores junto con inmunoterapia (por ejemplo, administrando una dieta alta en grasa frente a una dieta normal).
La inmunización con una composición de inmunoterapia de Ad-36 basada en levadura se considera activa en este estudio si provoca, en comparación con controles de levadura de vector vacío o PBS, tendencias notables hacia la normalización de o resultado beneficioso (más sano, menos característico de obesidad o de tener o llegar a sobrepeso) en uno cualquiera o más de los siguientes parámetros para ratas infectadas por Ad-36: i) peso corporal o tasa de aumento de peso corporal; ii) porcentaje de grasa corporal o índice de masa corporal); iii) frecuencia o título de anticuerpos neutralizantes; iv) niveles de colesterol; v) triglicéridos en suero vi) corticosterona en suero; vii) niveles de glucosa en sangre y/u orina; viii) tolerancia a la glucosa; ix) título vírico de Ad-36 en sangre. Algunos de estos parámetros ya se han observado como indicadores positivos de la eficacia de inmunoterapia basada en levadura dirigida a Ad-36 en ratas inmunizadas (véase el siguiente análisis) a las 18 semanas después de la exposición, y se cree que muestran que la inmunoterapia basada en levadura que se dirige a Ad-36 es eficaz para reducir la tasa de aumento de peso de una manera específica de antígeno. Se espera que al final del estudio a las 30 semanas cuando el fenotipo inducido por Ad-36 surja completamente, los resultados demostrarán que la inmunización con una composición de inmunoterapia de Ad-36 basada en levadura es eficaz para reducir y/o prevenir el aumento de peso, reducir la tasa de aumento de peso y/o reducir o prevenir la adiposidad en ratas infectadas con Ad-36 de una manera específica de antígeno o específica de Ad-36, y esto puede estar acompañado de cambios en los parámetros bioquímicos mencionados, dada su asociación conocida con el fenotipo de obesidad.
Como se ha analizado anteriormente, el presente estudio está actualmente en la semana 18 después de la exposición vírica. No se anticipa que el aumento de peso inducido por virus en ratas de control sea medible en este punto temporal temprano basándose en el trabajo de Dhurandhar (Dhurandhar et al 2006). De acuerdo con esta expectativa, los datos de aumento de peso hasta la semana 18 muestran que la exposición a Ad-36 aún no ha provocado aumento de peso por encima de las ratas de control a las que se ha inyectado PBS. Sin embargo, el grupo de inmunización de aFL-CRAG Tarmogen ya tiene un aumento de peso general menor que ratas en los otros grupos, como se muestra en las Figs. 10, 11 y 12. Específicamente, la Fig. 10 es un diagrama de dispersión que muestra ratas individuales en cada uno de los grupos de inmunización, y que revela una clara tendencia en los grupos de inmunoterapia basados en levadura, y particularmente en las ratas inmunizadas con un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa CR1 a y CR1y de Ad-36, hacia una menor tasa de aumento de peso en comparación con ratas inmunizadas solamente con PBS (PBS) o con el control de levadura de "vector vacío" (YVEC). La Fig. 11 muestra la mediana del aumento de peso para cada grupo de animales a lo largo del tiempo. De nuevo, la tasa de aumento de peso reducida en comparación con controles en las ratas inmunizadas con producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa CR1a y CR1y Ad-36 es evidente. La Fig. 12 ilustra dos puntos temporales individuales (4 semanas después de la exposición vírica y 12 semanas después de la exposición vírica) y, de nuevo, la tasa de aumento de peso reducida en ratas inmunizadas con inmunoterapia de Ad-36 de levadura en comparación con el control de PBS es evidente (los valores de p son relativos al control de PBS). Las barras de error en la Fig. 12 se generan basándose en la comparación con el grupo de control, inmunizado con PBS, expuesto al virus, y la significación estadística se mide también en comparación con este grupo.
En conjunto, Estos datos demuestran un efecto específico de Ad-36 y, particularmente, un efecto específico de antígeno CR1a-CR1Y de Ad-36, del producto inmunoterapéutico basado en levadura en el aumento de peso corporal, y uno que ha surgido antes de que sea siquiera aparente un fenotipo de obesidad emergente por Ad-36. Un diagrama del peso corporal en las semanas 4 y 12 muestra que este aumento de peso de ratas inmunizadas con aFL-CRAG es estadísticamente significativamente menor que el aumento de peso de YVEC (levadura de control) o ratas sin tratamiento previo (PBS) en estos puntos temporales (Fig. 12). Las ratas inmunizadas con la levadura que expresan una proteína de fusión basada en hexón muestran una tendencia hacia un fenotipo similar, aunque, en este punto temporal, la diferencia con respecto a los controles no es tan sustancial como para la levadura que expresa el antígeno CR1a-CR1Y. Por lo tanto, la inmunoterapia basada en levadura que se dirige a Ad-36 reduce la tasa de aumento de peso en un modelo animal de infección por Ad-36 crónica, y se espera que muestre aumento de peso reducido y beneficios adicionales, en comparación con los controles, con respecto a los otros parámetros analizados anteriormente a las 30 semanas después de la exposición.
Ejemplo 5
Cinética vírica en el estudio de inmunoterapia profiláctica basada en levadura de Ad-36 (rata)
El siguiente experimento demuestra el uso del método descrito en el Ejemplo 4 para ensayar cinética vírica de Ad-36 en el torrente sanguíneo después de exposición vírica a Ad-36.
Brevemente, se extrajo ADN genómico sanguíneo de 100 pl de sangre de rata usando kit QlAamp de Qiagen. Se detectó ADN de Ad-36 mediante reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), que presenta una sonda específica de gen de hexón único diseñado por los inventores. Los resultados, ilustrados en la Fig. 13, muestran que está presente ADN de Ad-36 de 106 a 109 copias por ml durante hasta 9 semanas después de la exposición y se eliminó de la sangre completamente a las 13 semanas después de exposición. Curiosamente, la variabilidad entre ratas de la carga de ADN vírico se reduce a lo largo del tiempo, alcanzando un mínimo justo antes de la eliminación. Sin quedar ligado a teoría alguna, los inventores creen que estos datos podrían reflejar la respuesta inmunitaria natural al virus, la respuesta inmunitaria inducida por inmunoterapia basada en levadura al virus, o alguna combinación de estos efectos.
Ejemplo 6
Experimento terapéutico de rata
El siguiente ejemplo describe el uso de productos inmunoterapéuticos de Ad-36 basados en levadura en modelo terapéutico de rata de obesidad relacionada con adenovirus.
En el siguiente experimento, se evaluaron composiciones inmunoterapéuticas de Ad-36 basadas en levadura (vacunas) para determinar si la inmunización contra este virus usando inmunoterapia basada en levadura puede invertir la obesidad o al menos reducir el aumento de peso o la tasa de aumento de peso y adiposidad en ratas cuando la inmunización con composiciones de Ad-36 basadas en levadura se inicia después de infección por Ad-36 y posterior aumento de peso.
Las ratas se infectaron con Ad-36 (aproximadamente 1x 109 UFP en 1 ml) mediante administración intraperitoneal, como se describe en el estudio profiláctico en el Ejemplo 4. Después de haberse establecido un fenotipo de obesidad emergente por Ad-36, se inmunizan grupos de ratas por vía subcutánea (s.c) con una de las dos composiciones inmunoterapéuticas de Ad-36 basadas en levadura (vacunas) descritas en el Ejemplo 4 anterior y en la Tabla 4 posterior, administrada en cuatro sitios diferentes, con 20 millones de células (2,0 U.L) s.c. en 0,1 ml por sitio. Se realizan vacunaciones una vez a la semana durante 2 semanas después de la exposición y después mensualmente durante hasta 30 semanas. Grupos de control adicionales incluyen un grupo de ratas inmunizadas con composiciones de levadura de control (levadura de "vector vacío", o YVEC, que no expresan el antígeno o los antígenos de Ad-36) y un grupo de ratas que recibió solamente PBS (sin tratamiento previo o PBS). En el presente ejemplo el grupo de control (B) es PBS.
Tabla 4
Figure imgf000044_0001
Los animales se pesan antes de la infección vírica y después hasta bisemanalmente durante la duración de hasta 30 semanas del estudio. Además, se supervisan el consumo de alimento y agua. Se recoge sangre antes de la infección vírica y bisemanalmente para supervisar la carga vírica en suero, colesterol, niveles de triglicéridos, corticosterona, anticuerpos neutralizantes y los otros parámetros bioquímicos como se describe en el Ejemplo 5. Se realiza ensayo de tolerancia a la glucosa y se miden los niveles de glucosa en la orina. Se obtiene sangre (500 pl por punto temporal) con anestesia de isofluroano de la vena de la cola.
Al final del estudio, los animales se sacrificaron y se recoge tejido adiposo para medir los niveles víricos mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). También puede realizarse PCR en biopsias obtenidas durante el transcurso del estudio.
Este experimento se realizó en ratas Wistar exogámicas. Si, como se esperaba, el aumento de peso adicional se previene o se reduce en ratas inmunizadas con inmunoterapia de Ad-36 basada en levadura en comparación con ratas de control, se evaluarán ratas Wistar Furth endogámicas según el mismo protocolo o uno similar, ya que se espera que estas ratas endogámicas sean más susceptibles a evaluación de la inmunidad de linfocitos T. Experimentos adicionales también pueden determinar el efecto de la dieta u otros factores junto con inmunoterapia (por ejemplo, administrando una dieta alta en grasa frente a una dieta normal).
La inmunización con una composición de inmunoterapia de Ad-36 basada en levadura se considera activa si provoca, en comparación con controles de levadura de vector vacío o PBS, tendencias notables hacia la normalización de cualquiera de los siguientes parámetros para ratas infectadas por Ad-36: i) peso corporal o tasa de aumento de peso corporal reducida; ii) porcentaje de grasa corporal o índice de masa corporal; iii) frecuencia o título de anticuerpos neutralizantes; iv) niveles de colesterol; v) corticosterona en suero; vi) triglicéridos en suero; vii) niveles de glucosa en sangre y/u orina; viii) tolerancia a la glucosa; ix) título vírico de Ad-36 en sangre. En resumen, se espera que la inmunización con una composición de inmunoterapia de Ad-36 basada en levadura sea eficaz para reducir o prevenir el aumento de peso y la adiposidad en ratas y esto puede acompañarse de cambios en los parámetros bioquímicos mencionados, dada su asociación conocida con el fenotipo de obesidad.
Ejemplo 7
Efecto de vector de levadura en el apetito y el aumento de peso corporal de la rata
El siguiente ejemplo describe un experimento diseñado para determinar si la inmunización de ratas con composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura de la invención afecta a la tasa de aumento de peso de ratas no infectadas (no infectadas con Ad-36) sin tratamiento previo. Este experimentó se diseñó para identificar si hay un efecto basado en vector de levadura de vacunación de Tarmogen en el apetito o aumento de peso corporal que es independiente de la exposición a Ad-36. Dichos efectos en el apetito o el peso corporal, si se observan, no se considerarían específicos de antígeno, ya que no hay ningún antígeno vírico en el hospedador, y sería importante determinar antes de interpretar el efecto de la inmunización de Tarmogen de Ad-36 en el aumento de peso inducido por Ad-36.
Las ratas se inmunizaron con una de las composiciones de inmunoterapia basadas en levadura descritas en el Ejemplo 1 (Ad-Fib, cuya proteína de fusión está representada por la SEQ ID NO: 42) una vez a la semana, las semanas 1, 2, 7, 9 y 11. La vacunación fue en 4 sitios s.c. con 2 U.L. por sitio. Los animales se pesaron antes de la inmunización y bisemanalmente después de la vacunación. El consumo de dieta y peso corporal de las ratas se supervisaron durante este periodo. Los resultados, mostrados en la Fig. 14, muestran que no hubo ninguna diferencia en el consumo de alimentos entre el grupo inmunizado con levadura y el grupo de control. Además, la vacunación con levadura de fibra de Ad no cambió la tasa de aumento de peso corporal en comparación con ratas de control sin tratamiento previo, como se muestra en la Fig. 15. Estos datos demuestran que las vacunaciones de inmunoterapia basadas en levadura por sí solas (en ausencia del antígeno diana) no alteran el apetito o aumento de peso corporal de ratas. Estos resultados son coherentes con la observación de que no se cree que los efectos de inmunoterapia basada en levadura de Ad-36 en el peso corporal, cuando se observan en los experimentos de exposición a Ad-36 descritos anteriormente, sean atribuibles a un efecto generalizado de la levadura o el vector de levadura en el apetito o el metabolismo de las ratas.
Ejemplo 8
Distribución orgánica de Ad-36 después de inoculación intraperitoneal
El siguiente experimento demuestra la distribución de Ad-36 en órganos y tejidos importantes después de la infección vírica.
Este experimento es relevante para la especificidad/tropismo del virus y, hasta donde alcanza el conocimiento de los inventores, dichos análisis no se han realizado en ningún estudio tan tarde después de la exposición vírica. Por lo tanto, los siguientes experimentos se diseñaron para confirmar que los restos de Ad-36 en compartimentos grasos después del virus ya no son detectables en la sangre, y para indicar además tejidos u órganos donde la inmunoterapia basada en levadura puede ser activa. En un estudio publicado (Pasaricia et al, 2008), realizado a los 4 días después de la exposición, se encontró Ad-36 en casi todos los tejidos ensayados incluyendo el sistema nervioso central (SNC), el corazón, el pulmón, el hígado, el bazo, el riñón, la grasa visceral y otros órganos. En el presente estudio, la distribución por todo el órgano/cuerpo de Ad-36 se evaluó a las 15 semanas después de exposición al virus en una rata no inmunizada. Brevemente, se retiraron y aislaron órganos y tejidos importantes (incluyen sangre y células mononucleares de sangre periférica (PBMC)). Se extrajo ADN genómico de órgano y tejido de todas las muestras usando el kit QIAamp y se detectó ADN de Ad-36 con un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada muy sensible. Los resultados, mostrados en la Fig. 16, indicaron que 15 semanas después de inoculación de virus, es detectable ADN de Ad-36 en los tejidos adiposos viscerales del epidídimo, retroperitoneal, omental y también en el bazo y el riñón. Sin embargo, estaba ausente ADN de Ad-36 del corazón, el hígado, el pulmón, el cerebro y la grasa subcutánea, así como los otros órganos/tejidos ensayados. Estos resultados, considerados en conjunto con los resultados anteriores de Pasarica et al., muestran que Ad-36, aunque está ampliamente distribuido en la mayoría de órganos importantes pronto después de la exposición, se localiza más en compartimentos grasos, así como riñón y bazo, a las 15 semanas después de exposición vírica.
Ejemplo 9
Modelo de ratón-profiláctico
El siguiente ejemplo describe el uso de productos inmunoterapéuticos de adenovirus 36 (Ad-36) basados en levadura en un modelo animal de obesidad relacionada con adenovirus.
Se ha descrito en la bibliografía un modelo de ratón por el que la infección de animales con Ad-36 humano ha provocado aumento de peso y aumento de la adiposidad (Dhurandhar et al. Int. J. Obesity 24:989, 2000). En esos estudios, se indujo un aumento estadísticamente significativo del peso de grasa corporal (p<0,02) en ratones infectados por Ad36 en comparación con el grupo de control. Adicionalmente, 60 % de los ratones a los que se inyectó Ad-36 frente a 22 % de los controles se consideraron obesos cuando la obesidad se definió como > percentil 85 del grupo de control.
En el siguiente experimento, se evalúan composiciones inmunoterapéuticas de Ad-36 basadas en levadura (vacunas) para determinar si la inmunización contra este virus usado inmunoterapia basada en levadura puede prevenir la obesidad o al menos reducir el aumento de peso y la adiposidad asociados con infección por Ad-36. Se inmunizan grupos de ratones por vía subcutánea (s.c.) con una composición inmunoterapéutica de Ad-36 basada en levadura (vacuna) administrada en de dos a cuatro sitios diferentes (de 1 a 20 millones de células (o 0,1-2,0 U.L.) s.c. en 0,1 ml por sitio), entre tres y seis veces a intervalos semanales. Después de la administración final, los ratones se expusieron a Ad-36 (aproximadamente 2 X 107 UFP en 0,1-0,2 ml) mediante administración intraperitoneal. Se inmunizan grupos experimentales de ratones (10-20 ratones por grupo) con una composición inmunoterapéutica de Ad-36 basada en levadura, por ejemplo, una de las composiciones de inmunoterapia basadas en levadura descritas en el Ejemplo 1. Los grupos de control adicionales incluyen un grupo de ratones inmunizados con composiciones de levadura de control (levadura de "vector vacío" que no expresa el antígeno o antígenos de Ad-36) y un grupo de ratones que reciben solamente PBS (sin tratamiento previo).
Los animales se pesaron antes del tratamiento, antes de la exposición vírica y después hasta dos veces por semana durante aproximadamente 22 semanas después de inoculación con virus. Además, se supervisan el consumo de alimento y agua. Se recoge sangre en el momento basal, antes de la exposición vírica y bisemanalmente después de la exposición para supervisar los niveles de colesterol, triglicéridos y para anticuerpos neutralizantes para Ad-36 en el suero. Se realiza ensayo de tolerancia a la glucosa y se miden los niveles de glucosa en la orina. Se obtiene sangre (200 pl por punto temporal) con anestesia de isofluroano del plexo retroorbital. Al final del estudio, los animales se sacrificaron y se recoge tejido adiposo para medir los niveles víricos mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). También puede realizarse PCR en biopsias obtenidas durante el transcurso del estudio.
El experimento se realiza inicialmente en ratones exogámicos (por ejemplo, ratones ICR o CD-1®). Si, como se esperaba, el aumento de peso se previene o se reduce en ratones inmunizados con inmunoterapia de Ad-36 basada en levadura en comparación con ratones de control, se evalúan adicionalmente cepas endogámicas según el mismo protocolo o uno similar (por ejemplo, C57BL/6, BALB/c o C3H), ya que se espera que estos ratones sean más susceptibles a evaluación de la inmunidad de linfocitos T. Experimentos adicionales también pueden determinar el efecto de la dieta u otros factores junto con inmunoterapia (por ejemplo, administrando una dieta alta en grasa frente a una dieta normal).
La inmunización con una composición de inmunoterapia de Ad-36 basada en levadura es eficaz si la inmunización da como resultado una diferencia estadísticamente significativa en el peso corporal o aumento de peso corporal entre ratones inmunizados con Ad-36 de levadura y ratones de control (inmunizados con levadura de vector vacío o PBS) y/o al menos una diferencia doble de niveles de anticuerpos neutralizantes, y/o una reducción de más del 5 % en el porcentaje de grasa corporal, colesterol, triglicéridos, reducción de glucosa en la orina o niveles de glucosa reducidos mediante ensayo de tolerancia a la glucosa y/o reducción de títulos víricos de Ad-36, entre el grupo experimental y uno de los grupos de control (inmunizado con levadura de vector vacío o PBS). Se espera que la inmunización con una composición de inmunoterapia de Ad-36 basada en levadura sea eficaz para reducir o prevenir el aumento de peso y la adiposidad en ratones.
Ejemplo 10
Modelo de ratón-terapéutico
El siguiente ejemplo describe el uso de productos inmunoterapéuticos de Ad-36 basados en levadura en un modelo animal de obesidad relacionada con adenovirus.
En el siguiente experimento, se evalúan composiciones inmunoterapéuticas de Ad-36 basadas en levadura (vacunas) para determinar si la inmunización contra este virus usando inmunoterapia basada en levadura puede invertir la obesidad o al menos reducir el aumento de peso y adiposidad en ratones cuando la inmunización con composiciones de Ad-36 basadas en levadura se inicia después de infección por Ad-36 y posterior aumento de peso.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Una composición inmunoterapéutica que comprende:
a) un vehículo de levadura; y
b) una proteína de fusión que comprende un antígeno de adenovirus-36 (Ad-36) que comprende al menos un dominio inmunogénico de CR1a y al menos un dominio inmunogénico de CR1y.
2. La composición inmunoterapéutica de la reivindicación 1, en donde el antígeno de Ad-36 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36.
3. La composición inmunoterapéutica de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el antígeno de Ad-36 comprende una secuencia de aminoácidos que al menos 80 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de: la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 54 o la SEQ ID NO: 47.
4. La composición inmunoterapéutica de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el antígeno de Ad-36 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de: la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 54 o la SEQ ID NO: 47.
5. La composición inmunoterapéutica de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde el antígeno de Ad-36 comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de: la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 54 o la SEQ ID NO: 47.
6. La composición inmunoterapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el antígeno de Ad-36 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 54 o la SEQ ID NO: 47.
7. La composición inmunoterapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el antígeno de Ad-36 comprende secuencias de Ad-36, en donde las secuencias de Ad-36 consisten en: las posiciones 19-60 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 83-116 de la SEQ ID NO: 29 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; las posiciones 18-60 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36; o las posiciones 123-157 de la SEQ ID NO: 26 o una secuencia correspondiente de otra cepa de Ad-36.
8. La composición inmunoterapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:
el antígeno de Ad-36 se expresa por el vehículo de levadura;
el vehículo de levadura es una levadura completa, termoinactivada; y/o
el vehículo de levadura es de Saccharomyces cerevisiae.
9. Una proteína de fusión que comprende al menos un dominio inmunogénico de CR1a de Ad-36 y al menos un dominio inmunogénico de CR1y de Ad-36.
10. La proteína de fusión de la reivindicación 9, en donde la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: la SEQ ID NO: 55, la SEQ ID NO: 54 o la SEQ ID NO: 47.
11. Una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 9 o la reivindicación 10.
12. Una célula aislada transfectada con la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 11.
13. Una composición que comprende la proteína de fusión de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 11 o la célula aislada de la reivindicación 12.
14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o 13, para su uso para tratar la infección por Ad-36.
15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o 13, para su uso para prevenir la infección por Ad-36.
16. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o 13, para su uso para reducir la tasa de aumento de peso en un individuo infectado con Ad-36.
17. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o 13, para su uso para provocar una respuesta inmunitaria de Ad-36 en un individuo.
ES11848223T 2010-12-17 2011-12-19 Composiciones y métodos para el tratamiento o la prevención de la infección por adenovirus-36 humano Active ES2696551T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201061424472P 2010-12-17 2010-12-17
PCT/US2011/065868 WO2012083302A2 (en) 2010-12-17 2011-12-19 Compositions and methods for the treatment or prevention of human adenovirus-36 infection

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2696551T3 true ES2696551T3 (es) 2019-01-16

Family

ID=46245416

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11848223T Active ES2696551T3 (es) 2010-12-17 2011-12-19 Composiciones y métodos para el tratamiento o la prevención de la infección por adenovirus-36 humano

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9254320B2 (es)
EP (1) EP2651439B1 (es)
ES (1) ES2696551T3 (es)
WO (1) WO2012083302A2 (es)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011032119A1 (en) 2009-09-14 2011-03-17 The Regents Of The University Of Colorado Modulation of yeast-based immunotherapy products and responses
EP2651439B1 (en) 2010-12-17 2018-09-19 Globeimmune, Inc. Compositions and methods for the treatment or prevention of human adenovirus-36 infection
EP3266464A3 (en) 2011-02-12 2018-03-14 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis b infection
KR102046449B1 (ko) 2011-03-17 2019-11-19 글로브이뮨 효모-브라큐리 면역요법 조성물
EA030381B1 (ru) 2011-06-14 2018-07-31 Глоубиммьюн, Инк. Иммунотерапевтическая композиция, ее применения и способы лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита дельта
CA2844500C (en) 2011-08-17 2022-05-10 Globeimmune, Inc. Yeast-muc1 immunotherapeutic compositions and uses thereof
US9653272B2 (en) 2012-06-26 2017-05-16 Biodesix, Inc. Mass-spectral method for selection, and de-selection, of cancer patients for treatment with immune response generating therapies
MX374829B (es) 2013-03-19 2025-03-06 Globeimmune Inc Composición a base de levadura para usarse para tratar cordoma.
US9782473B2 (en) 2013-03-26 2017-10-10 Globeimmune, Inc. Compositions and methods for the treatment or prevention of human immunodeficiency virus infection
WO2015031778A2 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Globeimmune, Inc. Compositions and methods for the treatment or prevention of tuberculosis
CN113419058B (zh) 2014-04-11 2025-04-01 全球免疫股份有限公司 基于酵母的免疫疗法和i型干扰素敏感性
WO2017023840A1 (en) 2015-08-03 2017-02-09 Globeimmune, Inc. Modified yeast-brachyury immunotherapeutic compositions
EP3793576A4 (en) 2018-05-15 2022-04-06 Globeimmune, Inc. Lysates of recombinant yeast for inducing cellular immune responses
JP2024538854A (ja) * 2021-10-15 2024-10-23 ザ トラスティーズ オブ コロンビア ユニバーシティ イン ザ シティ オブ ニューヨーク 皮膚状態を治療するための組成物及び方法

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2486400B1 (fr) 1980-07-09 1986-05-30 Univablot Medicaments a base de levures ou de leurs extraits insolubles
NZ199722A (en) 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
US4775622A (en) 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
US5310654A (en) 1985-07-31 1994-05-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for determining virulence of Yersinia
US5234830A (en) 1988-02-03 1993-08-10 Suntory Limited DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region
IL95019A0 (en) 1989-08-09 1991-06-10 Mycogen Corp Process for encapsulation of biologicals
US5413914A (en) 1993-07-07 1995-05-09 The Regents Of The University Of Colorado Yeast assay to identify inhibitors of dibasic amino acid processing endoproteases
US5830463A (en) 1993-07-07 1998-11-03 University Technology Corporation Yeast-based delivery vehicles
US5858378A (en) 1996-05-02 1999-01-12 Galagen, Inc. Pharmaceutical composition comprising cryptosporidium parvum oocysts antigen and whole cell candida species antigen
US6127113A (en) 1997-04-04 2000-10-03 Obetech, Llc Viral obesity methods and compositions
CA2799545A1 (en) * 2000-03-07 2001-09-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Adenovirus formulations
US20020044948A1 (en) 2000-03-15 2002-04-18 Samir Khleif Methods and compositions for co-stimulation of immunological responses to peptide antigens
US8153414B2 (en) 2000-04-06 2012-04-10 Allertein Therapeutics, Llc Microbial delivery system
WO2002039951A2 (en) 2000-11-15 2002-05-23 Globe Immune, Inc. Yeast-dentritic cell vaccines and uses thereof
US7439042B2 (en) 2002-12-16 2008-10-21 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis C infection
KR101241272B1 (ko) 2002-12-16 2013-03-15 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코포레이트 면역 요법으로서의 효모계 백신
JP2008516610A (ja) 2004-10-18 2008-05-22 グローブイミューン，インコーポレイテッド 酵母を用いた慢性ｃ型肝炎感染の治療
SG163572A1 (en) 2005-07-11 2010-08-30 Globeimmune Inc Compositions and methods for eliciting an immune response to escape mutants of targeted therapies
CA2632013C (en) 2005-11-30 2013-02-26 Wayne State University Adenovirus 36 e4 orf 1 gene and protein and their uses
US20070172503A1 (en) 2005-12-13 2007-07-26 Mycologics,Inc. Compositions and Methods to Elicit Immune Responses Against Pathogenic Organisms Using Yeast Based Vaccines
WO2007120362A2 (en) 2005-12-27 2007-10-25 Obetech, Llc Adipogenic adenoviruses as a biomarker for disease
CA2638815A1 (en) 2006-02-02 2007-08-16 Globeimmune, Inc. Yeast-based vaccine for inducing an immune response
CA2647102A1 (en) 2006-03-27 2007-11-22 Globeimmune, Inc. Ras mutation and compositions and methods related thereto
CA2676783C (en) 2007-02-02 2016-04-05 Globeimmune, Inc. Improved methods for producing yeast-based vaccines
BRPI0809247A2 (pt) 2007-03-19 2014-09-09 Globeimmune Inc Composições e métodos para a ablação do escape mutacional de terapias marcadas para câncer.
EP3128010A1 (en) 2007-11-28 2017-02-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian subfamily e adenoviruses sadv-30 and uses thereof
EP2325298B1 (en) * 2008-03-04 2016-10-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania SIMIAN ADENOVIRUSES SAdV-36, -42.1, -42.2, AND -44 AND USES THEREOF
WO2010011440A2 (en) 2008-06-16 2010-01-28 Obetech Llc Diagnosis and treatment of lipogenic adenovirus infection associated with adipose tissue hypertrophy
WO2010033841A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Globeimmune, Inc. Immunotherapy for chronic hepatitis c virus infection
WO2010065626A1 (en) 2008-12-02 2010-06-10 Globeimmune, Inc. Genotyping tools, methods and kits
WO2011032119A1 (en) 2009-09-14 2011-03-17 The Regents Of The University Of Colorado Modulation of yeast-based immunotherapy products and responses
JP2013522302A (ja) 2010-03-14 2013-06-13 グローブイミューン，インコーポレイテッド 酵母系免疫療法を使用した感染症の薬理ゲノミクス及び治療反応性ガイド治療
WO2012019127A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 The Regents Of The University Of Colorado Combination yeast-based immunotherapy and arginine therapy for the treatment of myeloid-derived supressor cell-associated diseases
EP2651439B1 (en) 2010-12-17 2018-09-19 Globeimmune, Inc. Compositions and methods for the treatment or prevention of human adenovirus-36 infection
EP3266464A3 (en) 2011-02-12 2018-03-14 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis b infection
KR102046449B1 (ko) 2011-03-17 2019-11-19 글로브이뮨 효모-브라큐리 면역요법 조성물
EA030381B1 (ru) 2011-06-14 2018-07-31 Глоубиммьюн, Инк. Иммунотерапевтическая композиция, ее применения и способы лечения или профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита дельта
CA2844500C (en) 2011-08-17 2022-05-10 Globeimmune, Inc. Yeast-muc1 immunotherapeutic compositions and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012083302A2 (en) 2012-06-21
EP2651439B1 (en) 2018-09-19
US9254320B2 (en) 2016-02-09
EP2651439A2 (en) 2013-10-23
US20140072590A1 (en) 2014-03-13
WO2012083302A3 (en) 2013-01-24
EP2651439A4 (en) 2014-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2696551T3 (es) Composiciones y métodos para el tratamiento o la prevención de la infección por adenovirus-36 humano
ES2671381T3 (es) Composiciones inmunoterapéuticas para el tratamiento o prevención de infección por virus de hepatitis delta
ES2643389T3 (es) Producto terapéutico basado en levadura para infección por hepatitis B crónica
RU2690180C2 (ru) Иммунотерапевтические композиции на основе дрожжей с brachyury
US10265393B2 (en) Compositions and methods for the treatment or prevention of human immunodeficiency virus infection
TWI748957B (zh) 經修飾之酵母-短尾畸型（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）免疫治療組合物
TW201936206A (zh) 索脊瘤之以酵母菌為基礎之免疫療法
HK1190616A (en) Compositions and methods for the treatment or prevention of human adenovirus-36 infection
HK1190616B (en) Compositions and methods for the treatment or prevention of human adenovirus-36 infection
HK1197026B (en) Immunotherapeutic compositions for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection
OA16792A (en) Yeast-based compositions and methods for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection.