ES2643389T3 - Producto terapéutico basado en levadura para infección por hepatitis B crónica - Google Patents

Producto terapéutico basado en levadura para infección por hepatitis B crónica Download PDF

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Description

Producto terapéutico basado en levadura para infección por hepatitis B crónica
5 Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a composiciones inmunoterapéuticas y su uso en métodos para prevenir y/o tratar la infección por virus de la hepatitis B (VHB).
Antecedentes de la invención
El virus de la hepatitis B (VHB) es un miembro de la familia de hepadnavirus y es un agente causante de hepatitisaguda y crónica en todo el mundo. La epidemia de VHB ha sido prevalente en Asia y África, y la infección por VHB es endémica en China (Williams, R. (2006), “Global challenges in liver disease”, Hepatology (Baltimore, Md.) 44 (3):
15 521-526). Más de 2 mil millones de personas han sido infectadas por el virus y se estima que hay 350 millones de individuos infectados por el VHB de forma crónica en todo el mundo (“Hepatitis B”, World Health Organization, 2009; “FAQ About Hepatitis B”, Stanford School of Medicine. ). Las vías de infección son mediante contacto sanguíneo y de fluidos corporales, incluyendo transfusiones de sangre y uso de fármacos IV, transmisión sexual, mordeduras y lesiones, y transmisión vertical (por ejemplo, en el parto).
El VHB se encuentra como uno de cuatro serotipos principales (adr, adw, ayr, ayw) que se determina basándose en epítopos antigénicos dentro sus proteínas de envoltura. Hay ocho genotipos diferentes (A-H) basándose en las variaciones de secuencia de nucleótidos en el genoma. Las diferencias genotípicas influyen en la gravedad de la enfermedad, la evolución de la enfermedad y la probabilidad de complicaciones, la respuesta al tratamiento y
25 posiblemente la respuesta a la vacunación (Kramvis et al., (2005), Vaccine 23 (19): 2409-2423; Magnius y Norder, (1995), Intervirology 38 (1-2): 24-34).
El periodo de incubación clínico para VHB es habitualmente de 2-3 meses; aproximadamente dos tercios de los que tienen infección aguda son asintomáticos o tienen síntomas leves, subclínicos. El tercio restante de individuos infectados de forma aguda pueden experimentar ictericia, inflamación del hígado, vómitos, dolores y/o fiebre suave, pero la enfermedad se resuelve con el tiempo en la mayoría de los adultos y pocas veces conduce a insuficiencia hepática. De hecho, aproximadamente el 95 % de los adultos se recuperan completamente de la infección por VHB y no se infectan de forma crónica. Sin embargo, aproximadamente el 90 % de los bebés y 25 %-50 % de los niños de 1-5 años de edad permanecerán crónicamente infectados con VHB (Centros para el Control y la Prevención de
35 Enfermedades en septiembre de 2010). Aproximadamente el 25 % de los que se infectan de forma crónica durante la infancia y el 15 % de los que se infectan de forma crónica después de la infancia mueren prematuramente de cirrosis o carcinoma hepatocelular, y la mayoría de los individuos infectados de forma crónica permanecen asintomáticos hasta la aparición de cirrosis o enfermedad hepática de estadio final (CDC en septiembre de 2010). Se producen 1 millón de muertes al año en todo el mundo (aproximadamente 2000-4000 muertes al año en Estados Unidos) por infección por VHB crónica. Los individuos infectados de forma crónica tienen niveles elevados en suero de alanina aminotransferasa (ALT) (un marcador de daño hepático), inflamación hepática y/o fibrosis tras biopsia del hígado. Para los pacientes que desarrollan cirrosis, la tasa de supervivencia a los 5 años es de aproximadamente el 50 %.
45 La infección por VHB y su tratamiento se supervisa típicamente por la detección de antígenos víricos y/o anticuerpos contra los antígenos. Tras la infección con VHB, el primer antígeno detectable es el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), seguido del antígeno “e” de la hepatitis B (HBeAg). La eliminación del virus está indicada por la variación de anticuerpos IgG en el suero contra HBsAg y/o contra el antígeno principal (HBcAg), también conocido como seroconversión. Numerosos estudios indican que la replicación vírica, el nivel de viremia y la progresión al estado crónico en individuos infectados por VHB están influidos directamente e indirectamente por la inmunidad celular específica de VHB mediada por linfocitos T CD4+ auxiliares (TH) y CD8+ citotóxicos (CTL). Los pacientes que progresan a enfermedad crónica tienden a tener respuestas de células T específicas de VHB ausentes, más débiles
o estrechamente centradas en comparación con pacientes que superan la infección aguda. Véase, por ejemplo, Chisari, 1997, J Clin Invest 99: 1472-1477; Maini et al., 1999, Gastroenterology 117: 1386-1396; Rehermann et al.,
55 2005, Nat Rev Immunol 2005; 5: 215-229; Thimme et al., 2001, J Virol 75: 3984-3987; Urbani et al., 2002, J Virol 76: 12423-12434; Wieland and Chisari, 2005, J Virol 79: 9369-9380; Webster et al., 2000, Hepatology 32: 1117-1124; Penna et al., 1996, J Clin Invest 98: 1185-1194; Sprengers et al., 2006, J Hepatol 2006; 45: 182-189.
Las vacunas para la prevención del VHB han estado disponibles en el mercado desde principios de los años 80. Las vacunas comerciales actuales no son infecciosas, proporcionando las vacunas víricas subunitarias antígeno de superficie de virus de la hepatitis B recombinante purificado (HBsAg), y pueden administrarse desde el nacimiento. Las vacunas han sido eficaces en la reducción de la incidencia de infección en países donde la vacuna se administra habitualmente. Aunque se están desarrollando algunos productos inmunoterapéuticos, incluyendo diversas vacunas epitópicas o proteicas de VHB y citocinas, en la actualidad no hay ningún producto inmunoterapéutico aprobado para
65 el tratamiento de infección por VHB activa en los Estados Unidos.
La terapia de tratamiento de referencia (SOC) actual para infección por VHB incluye principalmente fármacos antivíricos, tales como tenofovir (VIREAD®), lamivudina (EPIVIR®), adefovir (HEPSERA®), telbivudina (TYZEKA®) y entecavir (BARACLUDE®), así como interferón-α2a e interferón-α2a pegilado (PEGASYS®). Estos fármacos, y en particular los fármacos antivíricos, se administran típicamente durante periodos de tiempo largos (por ejemplo, 5 diariamente o semanalmente durante uno a cinco años o más), y aunque ralentizan o detienen la replicación vírica, típicamente no proporcionan una “cura” completa o erradicación del virus. Los enfoques basados en interferón son tóxicos y tienen tasas de remisión modestas. Las terapias antivíricas inhiben la replicación vírica y se toleran mejor que el interferón, pero como se ha mencionado anteriormente, estos fármacos típicamente no proporcionan una cura vírica completa, y en algunos casos no se consiguen tasas de remisión a largo plazo. Además, en algunos casos, se produce a continuación desarrollo de resistencia farmacológica. Por ejemplo, la lamivudina es un antivírico oral potente que inhibe la transcriptasa inversa del VHB (Pol). Como la lamivudina se tolera bien, y debido a que es ahora un fármaco genérico, la lamivudina es una opción para la terapia antivírica del VHB en países en desarrollo. Sin embargo, una tasa de resistencia vírica anual del 20 % por mutaciones puntuales en la secuencia de Pol limita la utilidad de lamivudina para VHB. Además, la respuesta al tratamiento antivírico y de interferón actual es eficaz de
15 forma diferente entre genotipos del VHB (Cao, World Journal of Gastroenterology 2009; 15(46): 5761-9) y en algunos pacientes, debido a que el ADN del virus de la hepatitis B puede persistir en el cuerpo incluso después de eliminarse la infección, puede producirse reactivación del virus a lo largo del tiempo.
En consecuencia, aunque la terapia de tratamiento de referencia (SOC) proporciona el mejor tratamiento aprobado en la actualidad para pacientes que padecen VHB crónico, el periodo de tiempo para la terapia y los efectos adversos significativos de los regímenes pueden conducir a falta de observancia, reducción de la dosis y detención del tratamiento, combinado con escape vírico, reactivación del virus y pacientes que no responden o no mantienen la respuesta a la terapia. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de la técnica de tratamientos terapéuticos mejorados para infección por VHB.
25 D1 desvela levadura que expresa antígeno de superficie del VHB en una proteína de fusión, en la que la proteína de fusión se expresa en la superficie de la levadura (Schreuder et al, Vaccine, Vol. 14, N.º 5, 1996).
D2 desvela una cepa de Salmonella atenuada que puede expresar una proteína de fusión que comprende un antígeno de núcleo y antígenos de superficie del VHB, y su uso como una vacuna (Tacket et al, Infection and Immunity, Vol. 65, N.º 8, 1997).
Sumario de la invención
35 En una realización, la presente invención proporciona una composición inmunoterapéutica que comprende:
a) un vehículo de levadura; y
b) una proteína de fusión que comprende antígenos del VHB, en la que los antígenos del VHB consisten en:
i) un antígeno X del VHB; ii) un antígeno de superficie del VHB, y; iii) un antígeno de núcleo del VHB,
en la que la proteína de fusión es expresada por el vehículo de levadura.
45 También se proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 % o 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 150 o SEQ ID NO: 122 que tiene SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 121. También se proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 150 o SEQ ID NO: 122 que tiene SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 121.
La invención también proporciona una célula de levadura aislada transfectada con la molécula de ácido nucleico recombinante descrita anteriormente. También se proporciona una célula de levadura aislada transfectada con una
55 molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 %, 85 %, 90 % o 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 150 o SEQ ID NO: 122 o un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 150 o SEQ ID NO: 122.
La invención también proporciona composiciones que comprenden las moléculas de ácido nucleico recombinantes y células de levadura aisladas descritas anteriormente.
También se proporcionan las composiciones inmunoterapéuticas y composiciones descritas para su uso para tratar
65 o prevenir infección por VHB o un síntoma de la misma. También se proporcionan las composiciones inmunoterapéuticas y composiciones descritas para su uso para inmunizar una población de individuos contra el
VHB.
En cualquiera de los casos de la divulgación descrita en el presente documento, incluyendo cualquier realización relacionada con una composición inmunoterapéutica, antígeno del VHB, proteína de fusión o uso de dicha
5 composición, el antígeno o la proteína de fusión del VHB, en un aspecto, la secuencia de aminoácidos del antígeno de superficie grande (L) del VHB puede incluir, pero sin limitación, una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ DI NO: 27 o SEQ ID NO: 31, o una secuencia correspondiente de otra cepa/aislado del VHB. La secuencia de aminoácidos de un antígeno X del VHB puede incluir, pero sin limitación, una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 32, o una secuencia correspondiente de otra cepa/aislado del VHB.
Un aminoácido de un antígeno de superficie del VHB útil como un antígeno del VHB o en una proteína de fusión o una composición inmunoterapéutica puede incluir, pero sin limitación, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11,
15 posiciones 21-47 de SEQ ID NO: 11, posiciones 176-400 de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, posiciones 9-407 de SEQ ID NO: 34, posiciones 6-257 de SEQ ID NO: 36, posiciones 6-257 de SEQ ID NO: 41, posiciones 92-343 de SEQ ID NO: 92, posiciones 90-488 de SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, posiciones 90-338 de SEQ ID NO: 101, posiciones 7-254 de SEQ ID NO: 102 posiciones 1-249 de SEQ ID NO: 107, posiciones 1-249 de SEQ ID NO: 108, posiciones 1-249 de SEQ ID NO: 109, posiciones 1-249 de SEQ ID NO: 110, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 112, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 114, o posiciones 1399 de SEQ ID NO: 116, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 118, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 120, posiciones 1399 de SEQ ID NO: 122, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 124, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 126, posiciones 231-629 de SEQ ID NO: 128, posiciones 63-461 de SEQ ID NO: 130, posiciones 289-687 de SEQ ID NO: 132, posiciones 289-687 de SEQ ID NO: 134, o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente.
25 Un aminoácido de un antígeno de núcleo del VHB útil como un antígeno del VHB o en una proteína de fusión o una composición inmunoterapéutica de la invención puede incluir, pero sin limitación, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 1, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 5, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 9, posiciones 37 a 188 de SEQ ID NO: 9, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 13, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 17, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 21, posiciones 14-194 de SEQ ID NO: 25, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 29, posiciones 408-589 de SEQ ID NO: 34, posiciones 605 a 786 de SEQ ID NO: 36, posiciones 352-533 de SEQ ID NO: 38, posiciones 160-341 de SEQ ID NO: 39, posiciones 605-786 de SEQ ID NO: 41, posiciones 691-872 de SEQ ID NO: 92, posiciones 90-271 de SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, posiciones 567 a 718 de SEQ ID NO: 101, posiciones 483 a 634 de SEQ ID NO: 102, posiciones 2-183 de SEQ ID NO: 105, posiciones 184-395 de SEQ ID NO: 105, posiciones 396-578 de SEQ ID NO:
35 105, posiciones 579-761 de SEQ ID NO: 105, posiciones 2-183 de SEQ ID NO: 106, 338-520 de SEQ ID NO: 106, posiciones 478-629 de SEQ ID NO: 107, posiciones 478-629 de SEQ ID NO: 108, posiciones 478-629 de SEQ ID NO: 109, posiciones 478-629 de SEQ ID NO: 110, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 112, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 114, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 116, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 118, posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 120, posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 122, posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 124, posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 126, posiciones 630 a 811 de SEQ ID NO: 128, posiciones 462 a 643 de SEQ ID NO: 130, posiciones 688 a 869 de SEQ ID NO: 132, posiciones 688 a 869 de SEQ ID NO: 134, o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente.
Un aminoácido de un antígeno X del VHB útil como un antígeno del VHB o en una proteína de fusión o una
45 composición inmunoterapéutica de la invención puede incluir, pero sin limitación, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, posiciones 2 a 154 de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 4, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 8, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 12, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 16, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84126 de SEQ ID NO: 20, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 24, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 28, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 32, posiciones 787 a 939 de SEQ ID NO: 36, posiciones 7-159 de SEQ ID NO: 39, posiciones 873-1025 de SEQ ID NO: 92, posiciones 90-242 de SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, posiciones 719-778 de SEQ ID NO: 101, posiciones 635-694 de SEQ ID NO: 102 posiciones 184-337 de SEQ ID NO: 106, posiciones 521-674 de SEQ ID NO: 106,
55 posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 107, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 108, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 109, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 110, posiciones 582-641 de SEQ ID NO: 122, posiciones 810-869 de SEQ ID NO: 124, posiciones 582-641 de SEQ ID NO: 126, posiciones 1-60 de SEQ ID NO: 130, posiciones 229 a 288 de SEQ ID NO: 132, posiciones 1 a 60 de SEQ ID NO: 134, o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente.
En una realización, la presente invención incluye una composición inmunoterapéutica que comprende: (a) un vehículo de levadura; y (b) una proteína de fusión que comprende antígenos del VHB, en la que los antígenos del VHB consisten en: (i) un antígeno X del VHB que comprende al menos un dominio inmunogénico de un antígeno X del VHB de longitud completa; (ii) un antígeno de superficie del VHB que comprende al menos un dominio 65 inmunogénico de un antígeno de superficie grande (L) del VHB de longitud completa, y (iii) un antígeno del núcleo del VHB que comprende al menos un dominio inmunogénico de una proteína del núcleo del VHB de longitud
completa, en el que la proteína de fusión es expresada por el vehículo de levadura. En un aspecto de esta realización, la composición inmunoterapéutica comprende: (a) un vehículo de levadura; y (b) una proteína de fusión que comprende antígenos del VHB, en la que los antígenos del VHB consisten en: (i) un antígeno X del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a las posiciones 52 a 126 de un antígeno X del
5 VHB de longitud completa; (ii) un antígeno de superficie del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de un antígeno de superficie grande (L) del VHB de longitud completa y (iii) un antígeno del núcleo del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de una proteína del núcleo del VHB de longitud completa. La composición induce una respuesta inmunitaria específica del VHB.
En un aspecto de esta realización de la invención, la secuencia de aminoácidos del antígeno X del VHB es al menos 95 % idéntica, o al menos 96 % idéntica, o al menos 97 % idéntica, o al menos 98 % idéntica, o al menos 99 % idéntica o es idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de: posiciones 1-60 de SEQ ID NO: 130, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 110, posiciones 582-641 de SEQ ID NO: 122, posiciones 630-689 de SEQ ID 15 NO: 107, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 108, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 109, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 4, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 8, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 12, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84126 de SEQ ID NO: 16, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 20, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 24, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 28, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 100, posiciones 719-778 de SEQ ID NO: 101, posiciones 635-694 de SEQ ID NO: 102 posiciones 810-869 de SEQ ID NO: 124, posiciones 582641 de SEQ ID NO: 126, posiciones 229 a 288 de SEQ ID NO: 132, posiciones 1 a 60 de SEQ ID NO: 134 o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del antígeno X del VHB se selecciona de: posiciones 1-60 de SEQ ID NO: 130, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 110,
25 posiciones 582-641 de SEQ ID NO: 122, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 109, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 108, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 100, o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente.
En un aspecto de esta realización de la invención, la secuencia de aminoácidos del antígeno de superficie del VHB es al menos 95 % idéntica, o al menos 96 %, o al menos 97 % idéntica, o al menos 98 % idéntica, o al menos 99 % idéntica o es idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de: posiciones 63-461 de SEQ ID NO: 130, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 118, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 122, posiciones 9-407 de SEQ ID NO: 34, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 112, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 114, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27,
35 SEQ ID NO: 31, posiciones 90-488 de SEQ ID NO: 93, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 120, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 124, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 126, posiciones 231-629 de SEQ ID NO: 128, posiciones 289687 de SEQ ID NO: 132, posiciones 289-687 de SEQ ID NO: 134, o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del antígeno de superficie del VHB se selecciona de: posiciones 63-461 de SEQ ID NO: 130, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 118, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 122, posiciones 9-407 de SEQ ID NO: 34, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 112, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 114, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 116, o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente.
En un aspecto de esta realización de la invención, la secuencia de aminoácidos del antígeno de núcleo del VHB es al menos 95 % idéntica, o al menos 96 % idéntica, o al menos 97 % idéntica, o al menos 98 % idéntica, o al menos 45 99 % idéntica o es idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de: posiciones 462 a 643 de SEQ ID NO: 130, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 118, posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 122, posiciones 408-589 de SEQ ID NO: 34, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 112, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 114, posiciones 400581 de SEQ ID NO: 116, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 1, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 5, posiciones 31212 de SEQ ID NO: 9, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 13, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 17, posiciones 31212 de SEQ ID NO: 21, posiciones 14-194 de SEQ ID NO: 25, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 29, posiciones 605 a 786 de SEQ ID NO: 36, posiciones 352-533 de SEQ ID NO: 38, posiciones 160-341 de SEQ ID NO: 39, posiciones 605-786 de SEQ ID NO: 41, posiciones 691-872 de SEQ ID NO: 92, posiciones 90-271 de SEQ ID NO: 95, posiciones 2-183 de SEQ ID NO: 105, posiciones 184-395 de SEQ ID NO: 105, posiciones 396-578 de SEQ ID NO: 105, posiciones 579-761 de SEQ ID NO: 105, posiciones 2-183 de SEQ ID NO: 106, 338-520 de SEQ ID NO: 106,
55 posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 120, posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 124, posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 126, posiciones 630 a 811 de SEQ ID NO: 128, posiciones 688 a 869 de SEQ ID NO: 132, posiciones 688 a 869 de SEQ ID NO: 134, o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos del antígeno de núcleo del VHB se selecciona de: posiciones 462 a 643 de SEQ ID NO: 130, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 118, posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 122, posiciones 408-589 de SEQ ID NO: 34, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 116, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 112, posiciones 400581 de SEQ ID NO: 114, o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente.
En un aspecto de esta realización de la invención, los antígenos del VHB se disponen en el siguiente orden, del extremo N al C terminal, en la proteína de fusión: antígeno X del VHB, antígeno de superficie del VHB, antígeno del 65 núcleo del VHB. En un aspecto de esta realización de la invención, los antígenos del VHB se disponen en el siguiente orden, del extremo N al C terminal, en la proteína de fusión: antígeno de superficie del VHB, antígeno del
núcleo del VHB, antígeno X del VHB.
En un aspecto de esta realización de la invención, la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica, o al menos 96 % idéntica, o al menos 97 % idéntica, o al menos 98 % idéntica, o al 5 menos 99 % idéntica o es idéntica, a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 122 o SEQ ID NO: 150.
Otra realización más de la invención se refiere a una composición inmunoterapéutica que comprende: (a) una levadura completa, inactivada por calor de Saccharomyces cerevisiae; y (b) una proteína de fusión del VHB expresada por la levadura, en la que la proteína de fusión comprende SEQ ID NO: 130.
Otra realización de la invención se refiere a una composición inmunoterapéutica que comprende: (a) una levadura completa, inactivada por calor de Saccharomyces cerevisiae; y (b) una proteína de fusión del VHB expresada por la levadura, en la que la proteína de fusión comprende SEQ ID NO: 150.
15 Otra realización más de la invención se refiere a una composición inmunoterapéutica que comprende: (a) una levadura completa, inactivada por calor de Saccharomyces cerevisiae; y (b) una proteína de fusión del VHB expresada por la levadura, en la que la proteína de fusión comprende SEQ ID NO: 122. En un aspecto, la proteína de fusión es un único polipéptido con las siguientes secuencias fusionadas en fase del extremo N al C terminal: (1) una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; (2) un péptido enlazador de dos aminoácidos de treonina-serina;
(3) una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 122; y (4) un péptido de hexahistidina.
Cualquiera de las proteínas de fusión puede comprender, en un aspecto, una secuencia N terminal seleccionada de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 90.
25 En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, incluyendo anteriormente y posteriormente, relacionadas con una proteína de fusión, antígenos del VHB o composición inmunoterapéutica que comprende dicha proteína de fusión o antígenos del VHB, en una realización adicional, la proteína de fusión puede agregarse en su extremo N terminal para añadir una secuencia adicional. En un aspecto, la secuencia N terminal se selecciona de una secuencia de aminoácidos que es 95 % idéntica a SEQ ID NO: 37, una secuencia de aminoácidos que es 95 % idéntica a SEQ ID NO: 89 o una secuencia de aminoácidos que es 95 % idéntica a SEQ ID NO: 90. En un aspecto, la secuencia N terminal se selecciona de SEQ ID NO: 37, posiciones 1 a 5 de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 90, o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente.
35 En un aspecto de cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento, la proteína de fusión es expresada por el vehículo de levadura. En otro aspecto de cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente o en otra parte del presente documento, el vehículo de levadura es una levadura completa. La levadura completa se destruye en un aspecto. En un aspecto, la levadura completa está inactivada por calor.
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones de la invención descritas anteriormente o en otra parte del presente documento, el vehículo de levadura puede ser de un género de levadura seleccionado de: Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Schizosaccharomyces y Yarrowia. En un aspecto, el vehículo de levadura es de Saccharomyces. En un aspecto, el vehículo de levadura es de Saccharomyces cerevisiae.
45 En un aspecto de cualquiera de las realizaciones de la invención descritas anteriormente o en otra parte del presente documento, la composición se formula para administración a un sujeto o a un paciente. En un aspecto, la composición se formula para administración mediante inyección de un sujeto o un paciente (por ejemplo, por una vía parenteral, tal como inyección subcutánea o intraperitoneal o intramuscular). En un aspecto, la composición se formula en un excipiente farmacéuticamente aceptable que es adecuado para administración a un ser humano. En un aspecto, la composición contiene más de 90 % de proteína de levadura. En un aspecto, la composición contiene más del 90 % de proteína de levadura y se formula para administración a un paciente.
En un aspecto de cualquiera de las realizaciones de la invención descritas anteriormente o en otra parte del
55 presente documento, la proteína de fusión no se agrega en la levadura. En un aspecto, la proteína de fusión no forma cuerpos de inclusión en la levadura. En un aspecto, la proteína de fusión no forma VLP u otras partículas antigénicas grandes en la levadura. En un aspecto, la proteína de fusión forma VLP u otras partículas antigénicas grandes en la levadura.
En un aspecto de cualquier realización de la invención descrita anteriormente o en otra parte del presente documento, en un aspecto, las secuencias del VHB son del genotipo A de VHB. En otro aspecto, las secuencias del VHB son del genotipo B de VHB. En otro aspecto, las secuencias del VHB son del genotipo C de VHB. En otro aspecto, las secuencias del VHB son del genotipo D de VHB. En otro aspecto, las secuencias del VHB son del genotipo E de VHB. En otro aspecto, las secuencias del VHB son del genotipo F de VHB. En otro aspecto, las
65 secuencias del VHB son del genotipo H de VHB. En un aspecto, las secuencias del VHB son de una combinación de cualquiera de los genotipos del VHB a los que se ha hecho referencia anteriormente o de cualquier genotipo o
subgenotipo de VHB conocido.
Breve descripción de los dibujos
5 La Fig. 1 es un dibujo esquemático que muestra la disposición genómica del virus de la hepatitis B. La Fig. 2 es un dibujo esquemático que muestra la estructura básica de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión del núcleo/antígeno de superficie del VHB útil en una composición inmunoterapéutica basada en levadura de la divulgación. La Fig. 3 es un dibujo esquemático que muestra la estructura básica de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión de X/núcleo/polimerasa/antígeno de superficie del VHB útil en una composición inmunoterapéutica basada en levadura de la divulgación. La Fig. 4 es un dibujo esquemático que muestra la estructura básica de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión del núcleo/polimerasa del VHB útil en una composición inmunoterapéutica basada en levadura de la divulgación.
15 La Fig. 5 es un dibujo esquemático que muestra la estructura básica de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión del núcleo/X del VHB útil en una composición inmunoterapéutica basada en levadura de la divulgación. La Fig. 6 es un dibujo esquemático que muestra la estructura básica de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión de polimerasa del VHB útil en una composición inmunoterapéutica basada en levadura de la divulgación. La Fig. 7 es un dibujo esquemático que muestra la estructura básica de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión del núcleo/polimerasa/antígeno de superficie del VHB útil en una composición inmunoterapéutica basada en levadura de la divulgación. La Fig. 8 es un dibujo esquemático que muestra la estructura básica de una molécula de ácido nucleico
25 recombinante que codifica una proteína de fusión de polimerasa/núcleo/antígeno de superficie del VHB útil en una composición inmunoterapéutica basada en levadura de la divulgación. La Fig. 9 es un dibujo esquemático que muestra la estructura básica de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión de X/núcleo/antígeno de superficie del VHB útil en una composición inmunoterapéutica basada en levadura de la invención. La Fig. 10 es un dibujo esquemático que muestra la estructura básica de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión de X/polimerasa/núcleo/antígeno de superficie del VHB útil en una composición inmunoterapéutica basada en levadura de la divulgación. La Fig. 11 es un dibujo esquemático que muestra la estructura básica de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión de polimerasa/X/núcleo/antígeno de superficie del VHB útil en
35 una composición inmunoterapéutica basada en levadura de la divulgación. La Fig. 12 es un dibujo esquemático que muestra la estructura básica de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión de núcleo/antígeno de superficie/polimerasa del VHB útil en una composición inmunoterapéutica basada en levadura de la divulgación. La Fig. 13 es un dibujo esquemático que muestra la estructura básica de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión de núcleo/antígeno de superficie/X del VHB útil en una composición inmunoterapéutica basada en levadura de la divulgación. La Fig. 14 es un dibujo esquemático que muestra la estructura básica de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión de núcleo/antígeno de superficie/X/polimerasa del VHB útil en una composición inmunoterapéutica basada en levadura de la divulgación.
45 La Fig. 15 es un dibujo esquemático que muestra la estructura básica de una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteína de fusión de núcleo/antígeno de superficie/polimerasa/X del VHB útil en una composición inmunoterapéutica basada en levadura de la divulgación. La Fig. 16 es una imagen digital de una transferencia de Western que muestra la expresión de varias composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura que expresan una proteína de fusión del Núcleo/antígeno de Superficie del VHB (levadura completa, destruida por calor). La Fig. 17 es una imagen digital de una transferencia de Western que muestra la expresión de varias composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura que expresan una proteína de fusión del Núcleo/antígeno de Superficie del VHB (levadura completa, viva). La Fig. 18 es una imagen digital de una transferencia de Western que muestra la expresión de varias
55 composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura que expresan una proteína de fusión de X/núcleo/polimerasa/antígeno de superficie del VHB. La Fig. 19 es una imagen digital de una transferencia de Western que muestra la expresión de varias composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura que expresan una proteína de fusión de X/núcleo/polimerasa/antígeno de superficie del VHB. La Fig. 20 es una imagen digital de una transferencia de Western que muestra la expresión de varias composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura que expresan antígenos del VHB que comprenden proteínas de fusión del núcleo-superficie (Sc) o proteínas de fusión de X-núcleo-polimerasa-superficie (Sp). La Fig. 21 es una imagen digital de una transferencia de Western que muestra la expresión de antígenos del VHB de varias composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura cultivadas en medio UL2.
65 La Fig. 22 es un gráfico de barras que muestra la expresión promedio de antígenos del VHB de varias composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura cultivadas en medio UL2 o medio U2 (las
barras de error son Desviación Típica). La Fig. 23 es un gráfico que muestra la proliferación de células T CD4+ esplénicas de ratones inmunizados con un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa un antígeno de Superficie-Núcleo del VHB (SCORE) a una mezcla de antígeno S/Núcleo o a un péptido mimótopo de SAg de MHC de clase II (las barras de error son Desviación Típica). La Fig. 24 es un gráfico que muestra la proliferación de células T de ganglios linfáticos de ratones inmunizados con un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa un antígeno de Superficie-Núcleo del VHB (SCORE) a una mezcla de antígeno S/Núcleo o a un péptido mimótopo de SAg de MHC de clase II (las barras de error son Desviación Típica). La Fig. 25 es un gráfico que muestra la respuesta de ELISpot de interferón-γ (IFN-γ) de células T de ganglios linfáticos de ratones inmunizados con un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa un antígeno de Superficie-Núcleo del VHB (SCORE) a una mezcla de antígeno de S/Núcleo o a un péptido mimótopo de SAg de MHC de Clase II. La Fig. 26 es un gráfico que muestra la proliferación de células T CD4+ esplénicas de ratones inmunizados con un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa un antígeno de Superficie-Pol-Núcleo-X del VHB (indicado como α-Spex) a una mezcla de antígenos de S/Núcleo o a un péptido mimótopo de SAg de MHC de Clase II (las barras de error son Desviación Típica). La Fig. 27 es un gráfico que muestra la producción de IL-1β en esplenocitos de ratones inmunizados con: (a) un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa un antígeno de Superficie-Pol-E/Núcleo-X del VHB (indicado como Sp), columnas izquierdas; o (b) un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa un antígeno de Superficie-Núcleo del VHB (indicado como Sc) (las barras de error son Desviación Típica). La Fig. 28 es un gráfico que muestra la producción de IL-12p70 en esplenocitos de ratones inmunizados con: (a) un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa un antígeno de Superficie-Pol-Núcleo-X del VHB (indicado como Sp), columnas izquierdas; o (b) un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa un antígeno de Superficie-Núcleo del VHB (indicado como Sc) (las barras de error son Desviación Típica). La Fig. 29A y 29B son gráficos que muestran la producción de interferón-γ (IFN-γ) en esplenocitos de ratones inmunizados con: (Fig. 29A) un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa un antígeno de Superficie-Núcleo del VHB (indicado como Sc) o (Fig. 29B) un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa un antígeno de Superficie-Pol-Núcleo-X del VHB (indicado como Sp) (las barras de error son Desviación Típica). Las Figs. 30A-D son gráficos que muestran la producción de IL-1β (Fig. 30A), IL-6 (Fig. 30B), IL-13 (Fig. 30C) e IL-12p70 (Fig. 30D) en esplenocitos de ratones inmunizados con: (a) un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa un antígeno de Superficie-Pol-Núcleo-X del VHB (indicado como Sp), columnas izquierdas;
o (b) un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa un antígeno de Superficie-Núcleo del VHB (indicado como Sc). La Fig. 31 es un gráfico de barras que muestra que ratones inmunizados con GI-13002 o GI-13002 + anticuerpo anti-CD40, pero no YVEC, indujeron protección comparable de la exposición con tumores EL4 que expresan el antígeno diana del VHB (las barras de error son Desviación Típica). La Fig. 32 es un gráfico de barras que muestra los resultados de un ensayo de ELISpot de IFN-γ que compara las respuestas de células T de ratones inmunizados con GI-13008 (SCORE-C) y GI-13013 (SPEXv2) en comparación con YVEC usando una diversidad de péptidos y antígenos del VHB (las barras de error son Desviación Típica). La Fig. 33 es un gráfico de barras que muestra respuestas de ELISpot de IFN-γ a estimulación con GI-13002 de un sujeto humano antes y después de la inmunización, y después del refuerzo, con una vacuna del VHB profiláctica. La Fig. 34 es un gráfico de barras que muestra respuestas de ELISpot de IFN-γ específicas de antígeno del VHB de células de ganglios linfáticos aisladas de ratones transgénicos de HLA-A2 inmunizados con GI-13009 (SCORE-D) o GI-13020 (X-SCORE) en comparación con ratones inmunizados con un control de levadura (YVEC) (las barras de error son Desviación Típica). La Fig. 35 es un gráfico de barras que muestra respuestas de ELISpot de IFN-γ específicas de antígeno del VHB de células del bazo aisladas de ratones transgénicos para HLA-A2 inmunizados con GI-13009 (SCORE-D) en comparación con ratones inmunizados con un control de levadura (YVEC) (las barras de error son Error Típico). La Fig. 36 es un gráfico de barras que muestra respuestas de ELISpot de IFN-γ específicas de antígeno del VHB de células del ganglio linfático aisladas de ratones C57BL/6 inmunizados con GI-13009 (SCORE-D) o GI-13020 (X-SCORE) en comparación con ratones inmunizados con un control de levadura (YVEC) o ratones sin tratamiento previo (las barras de error son Desviación Típica). La Fig. 37 es un gráfico lineal que muestra respuestas de células T CD8+ específicas de antígeno del VHB a un péptido del VHB restringido a MHC de Clase I en ratones C57BL/6 inmunizados con GI-13009 (SCORE-D) o GI13020 (X-SCORE) en comparación con ratones inmunizados con un control de levadura (YVEC) o un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa ovoalbúmina (OVAX). La Fig. 38 es un gráfico de barras que muestra respuestas de células T CD8+ específicas de antígeno del VHB a un péptido del VHB restringido a MHC de Clase II en ratones C57BL/6 inmunizados con GI-13009 (SCORE-D) o GI-13020 (X-SCORE) en comparación con ratones inmunizados con un control de levadura (YVEC) o un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa ovoalbúmina (OVAX).
Descripción detallada de la invención
Se describen composiciones y su uso en métodos para prevenir y/o tratar infección por virus de la hepatitis B (VHB). Se describen composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura (también denominadas “inmunoterapia de
5 VHB basada en levadura”) que comprenden un vehículo de levadura y antígeno o antígenos del VHB que se han diseñado para inducir una respuesta inmunitaria profiláctica y/o terapéutica contra infección por VHB en un individuo, y el uso de dichas composiciones para prevenir y/o tratar infección por VHB y síntomas relacionados de los mismos. También se describen moléculas de ácido nucleico recombinantes usadas en las composiciones basadas en levadura, así como las proteínas y proteínas de fusión codificadas por las mismas, para uso en cualquier composición inmunoterapéutica y/o cualquier protocolo terapéutico o profiláctico para infección por VHB, incluyendo cualquier protocolo terapéutico o profiláctico que combine las composiciones basadas en levaduras específicas del VHB descritas con uno cualquiera o más de otras composiciones, agentes, fármacos, compuestos y/o protocolos terapéuticos o profilácticos para infección por VHB.
15 Las composiciones inmunoterapéuticas específicas de VHB, basadas en levadura, son únicas entre diversos tipos de inmunoterapia, porque estas composiciones de la invención inducen respuestas inmunitarias innatas, así como respuestas inmunitarias adaptativas que se dirigen específicamente al VHB, incluyendo respuestas de células T TH17 y TH1 dependientes de CD4 y respuestas de células T CD8+ específicas de antígeno. La amplitud de la respuesta inmunitaria inducida por inmunoterapia basada en levadura específica del VHB es apropiada para dirigirse a VHB. En primer lugar, se cree que el VHB evita la respuesta inmunitaria innata pronto en la infección “ocultándose” de la respuesta innata y por lo tanto no induciéndola, en lugar de contrarrestar directamente la inmunidad innata (Wieland y Chisari, 2005, J. Virol. 15: 9369-9380; Wieland, et al., 2004, PNAS USA 101: 6669-6674). En consecuencia, se puede esperar que el VHB sea sensible a respuestas inmunitarias innatas si se activan por otro mecanismo, es decir, las composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura de la invención. En segundo
25 lugar, el VHB produce expresión de antígenos de alto nivel en células hospedadoras infectadas que se espera que sea visible a la respuesta inmunitaria adaptativa (Guidotti, et al., 1999, Science 284: 825-829; Thimme et al., 2003, J. Virol. 77: 68-76), y la eliminación de infección aguda se ha asociado con respuestas de células T CD4+ y CD8+ robustas (Maini et al., 1999, Gastroenterol. 117: 1386-1396; Rehermann et al., 1995, J. Exp. Med. 181: 1047-1058; Thimme et al., 2003, J. Virol. 77: 68-76; Wieland y Chisari, 2005, J. Virol. 15: 9369-9380). Por lo tanto, se espera que la inmunoterapia del VHB basada en levadura, activando la respuesta inmunitaria adaptativa, se dirija eficazmente a células infectadas por VHB para destrucción y/o se espera que potencien eficazmente la eliminación vírica. Además, se cree que la respuesta inmunitaria generada por inmunoterapia basada en levadura es independiente de interferón y dependiente de interferón (Tamburini et al., 2012, J. Immunother. 35(1): 14-22); en consecuencia, la capacidad, o falta de la misma, de un individuo para responder a terapia basada en interferón, que es un tratamiento de referencia
35 para VHB, no se cree que influya directamente en la capacidad del sujeto para responder a inmunoterapia basada en levadura de la invención. Además, las composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levaduras descritas en el presente documento se diseñan para dirigirse a regiones inmunogénicas y conservadas del VHB, múltiples epítopos de CTL e incluyen regiones de VHB que pueden ser diana de escape (permitiendo modificaciones de las composiciones según sea necesario para dirigir dichas mutaciones de escape), haciéndola una terapia altamente adaptable para VHB que optimiza la oportunidad de respuestas inmunitarias eficaces contra este virus.
Además, y sin quedar ligada a la teoría, se cree que la inmunoterapia basada en levadura para VHB induce una respuesta inmunitaria que no está dirigida solamente de forma específica contra el antígeno diana portado por el producto inmunoterapéutico basado en levadura, sino que también evoluciona para dirigirse contra otros epítopos 45 inmunológicos del virus (es decir, distintos de los portados por la composición de antígeno-levadura). En otras palabras, una respuesta inmunitaria celular primaria al antígeno o los antígenos y/o el epítopo o los epítopos contenidos en el producto inmunoterapéutico basado en levadura puede conducir a respuestas inmunitarias celulares secundarias a antígeno o antígenos y/o epítopo o epítopos que están presentes en las células infectadas en el sujeto tratado pero que no están presentes en el producto inmunoterapéutico basado en levadura, lo que conduce de este modo a la evolución de perfiles de respuestas inmunitarias complejos e impredecibles que son únicos para cada sujeto tratado. Estas respuestas inmunitarias secundarias son específicas para el perfil molecular de la infección por VHB en cada sujeto tratado, y el producto inmunoterapéutico basado en levadura puede conducir estos efectos corriente abajo de una manera única en comparación con otras modalidades de tratamiento, incluyendo otras plataformas de inmunoterapia. Este fenómeno también puede denominarse en general
55 “propagación epitópica” y representa una ventaja del uso de inmunoterapia del VHB basada en levadura, debido a que la inducción de una respuesta inmunitaria contra un antígeno del VHB particular o incluso contra un genotipo de VHB particular (por ejemplo, proporcionando ese antígeno en el contexto del producto inmunoterapéutico de levadura), se espera que dé como resultado la dirección en cascada del sistema inmunitario contra una diversidad de antígenos del VHB adicionales, que puede dar como resultado respuestas inmunitarias eficaces contra antígenos de genotipos o cepas del VHB diferentes a los representados en la composición inmunoterapéutica basada en levadura.
Como se ha analizado anteriormente, los pacientes que se infectan de forma crónica con VHB tienden a tener inmunidad mediada por células T, específica del VHB, más débil (o ausente) y más estrecha. En consecuencia, las 65 composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas de levadura de la invención, aborda la necesidad de composiciones terapéuticas para tratar pacientes que estén infectados de forma activa con VHB, incluyendo
pacientes con infección crónica, y proporcionan además una vacuna adicional para la prevención de infección por VHB que puede tener ventajas con respecto a la producción de respuestas inmunitarias de memoria duraderas. De hecho, se espera que las composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura de la invención promuevan las respuestas de células T de memoria duraderas contra VHB, que pueden prevenir la infección, así 5 como proporcionar beneficios a largo plazo que pueden proteger a un paciente infectado de forma crónica de la reactivación vírica. Se espera que las composiciones inmunoterapéuticas de VHB basadas en levadura como inmunoterapia o en combinación con otros enfoques terapéuticos para el tratamiento de VHB (por ejemplo, en combinación con compuestos antivíricos) aumenten el porcentaje de pacientes con infección crónica que consiguen eliminación de HBsAg y HBeAg, que consiguen seroconversión completa y/o que consiguen eliminación vírica
10 sostenida durante al menos 6 meses después de completar la terapia.
En consecuencia, la inmunoterapia del VHB basada en levadura puede combinarse con fármacos antivíricos y/o terapia de interferón, y/o con otras terapias para VHB, para reducir la carga vírica en un individuo hasta un nivel que el sistema inmunitario pueda manejar de forma más eficaz. Los títulos víricos de VHB son típicamente muy altos 15 (pueden infectarse hasta 1011 hepatocitos) y por lo tanto pueden superar la capacidad de un individuo para montar una respuesta de CTL eficaz; en consecuencia, se espera que la reducción de carga vírica usando fármacos antivíricos en combinación con inducción de actividad CTL específica de VHB usando inmunoterapia basada en levadura sea beneficiosa para el individuo infectado. Además, la reducción de la carga vírica mediante el uso de fármacos antivíricos también puede reducir los efectos negativos, si los hubiera, de la activación inmunitaria en el 20 contexto de un alto número de hepatocitos infectados que son diana de destrucción. También se espera que la inmunoterapia del VHB basada en levadura desempeñe un papel en la reducción y/o eliminación de compartimentos de infección vírica latente. Por ejemplo, existen muchos tejidos que se han mostrado que son VHB positivos mediante PCR, y que se consideran santuarios potenciales para la reactivación del VHB. El ADN del VHB puede integrarse en el genoma del hospedador, lo que proporciona una persistencia quiescente del VHB, y ADNccc es una
25 forma latente, superenrollada, del genoma del VHB que también contribuye a la quiescencia. Sin quedar ligado a la teoría, los inventores creen que la inmunoterapia del VHB basada en levadura descrita en el presente documento desempeñará un papel en la eliminación de todos estos tipos de “santuarios” del VHB que probablemente contribuyan a la tasa de curación sin enfermedad baja observada con los enfoques antivíricos actuales.
30 En otro escenario, el uso de un producto inmunoterapéutico de VHB basado en levadura de la invención, solo o en combinación con un antivírico u otro producto terapéutico de VHB, es suficiente para conseguir eliminación completa de HBsAg, pero no suficiente para conseguir producción anti-HB, puede seguirse de, o combinarse adicionalmente con, vacunas de subunidades profilácticas existentes para conseguir seroconversión completa. Como alternativa, cualquiera de las proteínas de fusión descritas en el presente documento también puede usarse como vacunas
35 subunitarias para conseguir seroconversión completa, o para proteger a un sujeto de infección por VHB, solas o en combinación con un producto inmunoterapéutico de VHB basado en levadura de la invención. Finalmente, la composición inmunoterapéutica de la invención es adecuada para la modificación y/o combinación con composiciones inmunoterapéuticas adicionales, incluyendo cualquiera de la descrita en el presente documento, para tratar mutaciones de escape del VHB que se inducen por tratamiento con fármacos antivíricos.
40 Se administran composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura como productos biológicos o composiciones farmacéuticamente aceptables. En consecuencia, en lugar de usar levadura como un sistema de producción de antígenos seguido de purificación del antígeno de la levadura, el vehículo de levadura completa como se describe en el presente documento debe ser adecuado para, y se formula para, administración a un paciente. Por
45 el contrario, las vacunas de VHB comerciales existentes, así como muchas en desarrollo, comprenden proteínas del VHB recombinantes (por ejemplo, proteínas HBsAg) que se producen en Saccharomyces cerevisiae, pero posteriormente se liberan de la levadura por rotura y se purifican de la levadura de modo que la vacuna final, combinada con un adyuvante (por ejemplo, hidroxifosfato sulfato de aluminio o hidróxido de aluminio), no contenga ADN de levadura detectable y contenga no más de 1-5 % de proteína de levadura. Las composiciones
50 inmunoterapéuticas basadas en levadura de VHB de la invención, por otro lado, contienen ADN de levadura fácilmente detectable y contienen sustancialmente más del 5 % de proteína de levadura; en general, los productos inmunoterapéuticos basados en levadura de la invención contienen más del 70 %, más del 80 % o generalmente más del 90 % de proteína de levadura.
55 Se administran composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura a un paciente para inmunizar al paciente para fines terapéuticos y/o profilácticos. En una realización de la invención, las composiciones basadas en levadura se formulan para administración en un excipiente o una formulación farmacéuticamente aceptable. La composición debería formularse, en un aspecto, para ser adecuada para administración a un sujeto humano (por ejemplo, las condiciones de fabricación deberían ser adecuadas para uso en seres humanos, y cualquier excipiente o
60 formulación usada para finalizar la composición y/o preparar la dosis del producto inmunoterapéutico para administración debería ser adecuado para uso en seres humanos). En un aspecto de la invención, se formulan composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura para administración por inyección del paciente o sujeto, tal como por vía parenteral (por ejemplo, por inyección subcutánea, intraperitoneal, intramuscular o intradérmica, u otra vía parenteral adecuada).
En una realización, la levadura expresa el antígeno (por ejemplo, detectable por una transferencia de Western) y el antígeno no se agrega a la levadura, el antígeno no forma cuerpos de inclusión en levadura y/o no forma partículas muy grandes (VLP) u otras partículas antigénicas grandes en la levadura. En una realización, el antígeno se produce como una proteína soluble en la levadura y/o no se secreta de la levadura o no se secreta sustancial o 5 principalmente de la levadura. En otra realización, sin quedar ligado a la teoría, los presentes inventores creen que combinaciones particulares y quizás disposiciones, de antígenos en una proteína de fusión del VHB que incluye antígeno de superficie y antígeno de núcleo, descrito en detalle en el presente documento, pueden formar VLP o agregarse en algún grado dentro de la levadura que expresa los antígenos. Como resultado, el antígeno expresado por la levadura tiene propiedades inmunogénicas que parecen estar relacionadas con su estructura y forma general, 10 como una característica separada de las propiedades inmunogénicas de los epítopos inmunitarios (por ejemplo, epítopos de células T) portados dentro del antígeno. Cuando la levadura que expresa dichas proteínas de fusión se proporciona en un producto inmunoterapéutico del VHB basado en levadura de la invención, la composición inmunoterapéutica genera propiedades que activan el sistema inmunitario innato no solamente del vehículo de levadura como se ha analizado anteriormente (como con todos los productos inmunoterapéuticos basados en 15 levadura descritos en el presente documento), sino también en parte de la estructura de antígeno de proteína de fusión (por ejemplo, la proteína de fusión de superficie-núcleo como se expresa en la levadura también tiene propiedades de tipo adyuvante); además, la composición inmunoterapéutica genera propiedades que activan el sistema inmunitario adaptativo de una manera específica de antígeno de la proteína de fusión (mediante la aportación de diversos epítopos de células T), como con todos los productos inmunoterapéuticos basados en 20 levadura descritos en el presente documento. Esta combinación específica de propiedades parece ser única para los productos inmunoterapéuticos basados en levadura que expresan proteínas de fusión de superficie-núcleo particulares del VHB descrito en el presente documento. Sin embargo, en todas las realizaciones de la invención descritas en el presente documento, el producto inmunoterapéutico basado en levadura debería fagocitarse fácilmente por células dendríticas del sistema inmunitario, y la levadura y los antígenos procesarse fácilmente por
25 dichas células dendríticas, para inducir una respuesta inmunitaria eficaz contra VHB.
Composiciones de la invención
Un caso de la presente divulgación se refiere a una composición inmunoterapéutica basada en levadura que puede
30 usarse para prevenir y/o tratar la infección por VHB y/o para aliviar al menos un síntoma que resulte de la infección por VHB. La composición comprende: (a) un vehículo de levadura; y (b) uno o más antígenos que comprenden proteína o proteínas del VHB y/o dominio o dominios inmunogénicos de las mismas. Junto con el vehículo de levadura, las proteínas del VHB se expresan más típicamente como proteínas recombinantes por el vehículo de levadura (por ejemplo, por una levadura intacta o esferoplasto de levadura, que puede procesarse adicionalmente de
35 forma opcional a un citoplasto de levadura, fantasma de levadura o extracto de membrana de levadura o fracción de los mismos), aunque en un caso, una o más de dichas proteínas del VHB se cargan en un vehículo de levadura o forman complejo de otro modo, se unen, se mezclan o se administran con un vehículo de levadura como se describe en el presente documento para formar una composición de la presente divulgación. De acuerdo con la presente divulgación, la referencia a una proteína “heteróloga” o un antígeno “heterólogo”, incluyendo una proteína de fusión
40 heteróloga, en relación con un vehículo de levadura de la divulgación, significa que la proteína o el antígeno no es una proteína o antígeno que la levadura expresa de forma natural, aunque una proteína de fusión que incluye antígeno heterólogo o proteína heteróloga también puede incluir secuencias de levadura o proteínas o partes de las mismas que también se expresan de forma natural por levadura (por ejemplo, una secuencia prepro de factor alfa como se describe en el presente documento).
45 Un caso de la divulgación se refiere a diversas proteínas de fusión del VHB. En un aspecto, dichas proteínas de fusión del VHB son útiles en una composición inmunoterapéutica basada en levadura descrita. Dichas proteínas de fusión y/o las moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican dichas proteínas también pueden usarse en, en combinación con, o para producir, una composición inmunoterapéutica no basada en levadura, que puede incluir,
50 sin limitación, una vacuna de ADN, una vacuna de subunidad proteica, una composición inmunoterapéutica basada en virus recombinante, una vacuna de patógeno muerto o inactivado y/o una vacuna de células dendríticas. En otra realización, dichas proteínas de fusión pueden usarse en un ensayo de diagnóstico para VHB y/o para generar anticuerpos contra VHB. Se describen en el presente documento proteínas de fusión del VHB ejemplares que proporcionan partes seleccionadas de antígenos del VHB, incluyendo, por ejemplo, partes seleccionadas de y/o
55 polimerasa modificada; partes seleccionadas de y/o antígeno de superficie modificado; partes seleccionadas de y/o núcleo modificado (incluyendo al menos partes de o la mayoría del antígeno e); partes seleccionadas de y/o antígeno X modificado; así como partes seleccionadas de y/o disposiciones de uno, dos, tres cualesquiera o los cuatro antígenos (antígeno de superficie, núcleo, X y polimerasa), tales como, pero sin limitación, partes seleccionadas y/o disposiciones de antígeno de superficie y núcleo (incluyendo al menos partes de o la mayoría del
60 antígeno e); partes seleccionadas y/o disposiciones de antígeno de superficie, núcleo (incluyendo al menos partes de o la mayoría del antígeno e), polimerasa y antígeno X; partes seleccionadas y/o disposiciones de antígeno de superficie, núcleo (incluyendo al menos partes o la mayoría del antígeno e) y polimerasa; y partes seleccionadas y/o disposiciones de antígeno de superficie, núcleo (incluyendo al menos partes o la mayoría del antígeno e) y antígeno
X. 65
En una realización, se fusionan antígenos del VHB, incluyendo dominios inmunogénicos de proteínas de longitud completa, como se describe en el presente documento, con proteínas hospedadoras que se sobreexpresan en células hospedadoras infectadas por VHB, pero no en células no infectadas. En una realización, se fusionan antígenos del VHB, incluyendo dominios inmunogénicos de proteínas de longitud completa, como se describe en el
5 presente documento con proteína R2, un factor hospedador requerido para replicación del VHB, que en una realización se expresa en hepatocitos. R2 es un componente proteico de la ribonucleótido reductasa (RNR) y es crítico para el ciclo de vida del VHB (véase, por ejemplo, Cohen et al., 2010, Hepatol. 51(5): 1538-1546).
Virus de la Hepatitis B, Genes y Proteínas. El virus de la hepatitis B (VHB) es un miembro de la familia de virus
10 Hepadnaviridae (hepadnavirus) y provoca infecciones transitorias y crónicas del hígado en seres humanos y los grandes simios. Los hepadnavirus que infectan a mamíferos tienen secuencias de ADN y organización genómica similares, y se agrupan en el género Orthohepadnavirus. La partícula del virus de la hepatitis B tiene una envoltura externa que contiene lípidos y partículas antigénicas de superficie conocidas como HBsAg. Un núcleo de nucleocápsida que contiene proteína de núcleo (HBcAg) rodea al ADN vírico y una ADN polimerasa con actividad de
15 transcriptasa inversa. Como se revisa en Seeger y Mason, 2000, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64(1): 51-68, el VHB tiene un genoma de ADN relajado circular (ADNrc) parcialmente bicatenario de 3,2 kb se convierte en una molécula de ADN bicatenaria circular cerrada de forma covalente (ADNccc) tras el suministro del genoma vírico al núcleo de un hepatocito infectado. La ARN polimerasa II de la célula hospedadora transcribe cuatro ARN víricos del molde de ADNccc que se transportan al citoplasma de la célula hospedadora. Los ARN víricos incluyen ARNm que se
20 transcriben para producir el núcleo vírico y proteínas estructurales de la envoltura y el prenúcleo, polimerasa y proteínas víricas no estructurales X. El ARN que se traduce para producir el núcleo y la polimerasa también actúa como el ARN pregenómico (ARNpg) que es el molde para transcripción inversa. ARNpg y la polimerasa se encapsulan por la proteína de núcleo, que produce la nucleocápsida vírica en la que el ARNpg se transcribe de forma inversa a ADNrc. Estas nucleocápsidas que contienen ADNrc se incluyen después por proteínas de la
25 envoltura y se secretan de la célula hospedadora como viriones maduros o se transportan al núcleo para amplificar el ADNccc vírico.
Las proteínas estructurales y no estructurales producidas por el genoma del VHB se muestran en la Tabla 1. El genoma del VHB parcialmente bicatenario contiene cuatro genes conocidos como C, X, P y S (véase también Fig.
30 1).
Tabla 1. Genes y productos génicos del VHB
Gen
Proteína Función o funciones
C
Proteína del núcleo (HBcAg) Forma la cápsida vírica que rodea al ARNpg vírico y la polimerasa
Antígeno e (HBeAg)
Función desconocida; puede ser un factor inmunosupresor específico del VHB para respuesta inmunitaria adaptativa
P
Polimerasa Polimerasa para replicación de ADN vírico -Dominio 1: el dominio de proteína terminal (PT) empaqueta el ARNpg y ceba la cadena de ADN menos -Dominio 2: dominio de transcriptasa inversa (RT), RNasa H; degrada ARNpg
S HBsAg (antígeno de superficie; pequeño)
Proteína de envoltura y forma partículas antigénicas de superficie; puede suprimir la función inmunitaria
S
M HBsAg (antígeno de superficie; mediado = Pre-S2 + S) Proteína de envoltura y forma partículas antigénicas de superficie junto con S; puede suprimir la función inmunitaria
L HBsAg (antígeno de superficie; grande = Pre-S1 + pre-S2 + S
Proteína de envoltura y forma partículas antigénicas de superficie; el domino pre-S1 proporciona un ligando para partículas del núcleo durante el ensamblaje de la envoltura vírica; receptor de hepatocitos; puede suprimir la función inmunitaria
X
Antígeno X (Hbx) Transactivación transcripcional; regulación de las rutas de reparación de ADN; elevación de los niveles de calcio citosólico; modulación de las rutas de degradación de proteínas; modulación de la progresión de ciclo celular y rutas de proliferación celular en células hospedadoras; estimulación de la replicación del VHB
El gen C codifica dos antígenos estrechamente relacionados: una proteína de 21 kDa denominada “proteína del
35 núcleo” o “antígeno del núcleo” (HBcAg) que forma la cápsida vírica, y una proteína de 17 kDa denominada antígeno e (HBeAg) que forma dímeros pero que no se ensambla en una cápsida. La proteína de núcleo de longitud completa es una proteína de aproximadamente 183 aminoácidos, que comprende todos los aminoácidos excepto los 10 N terminales del antígeno e y que comprende aproximadamente 34 aminoácidos adicionales en el extremo C terminal que se escinden proteolíticamente en la producción de antígeno e. En otras palabras, la proteína del núcleo y el
40 antígeno e tienen 149 restos de aminoácidos en común (esta sección se denomina en ocasiones el antígeno de
núcleo de la hepatitis), pero difieren en las regiones N terminal y C terminal. La proteína prenúcleo es una proteína precursora que comprende una secuencia de aminoácidos que incluye secuencia tanto del núcleo como de antígeno e, a partir de la que se produce antígeno e mediante procesamiento proteolítico. HBeAg intracelular incluye los restos de prenúcleo -29 a -1 (la numeración de restos en esta descripción particular se proporciona con el primer 5 resto de aminoácido de la proteína de núcleo dentro de la proteína de prenúcleo que se indica como la posición “1”), que contiene una secuencia señal que dirige la proteína al retículo endoplásmico, momento en el cual se escinden los aminoácidos -29 a -11; otra escisión proteolítica entre los aminoácidos 149 y 150 retira la parte del extremo C terminal del prenúcleo (que está presente en la proteína del núcleo de longitud completa) y el HBeAg restante (que consiste en los aminoácidos -10 a -1 de prenúcleo más aminoácidos 1-149 de HBcAg o núcleo) se secreta después 10 como antígeno e (Standing et al., 1988, PNAS USA 85: 8405-8409; Ou et al., 1986, PNAS USA 83: 1578-1582; Bruss y Gerlich, 1988, Virology 163: 268-275; Takahashi et al., 1983, J. Immunol. 130: 2903-2907). También se ha encontrado HBeAg que consiste en la región de prenúcleo completa en sueros humanos (Takahashi et al., 1992, J. Immunol. 147: 3156-3160). Como se ha mencionado, HBcAg (núcleo) forma dímeros que se ensamblan en la cápsida vírica y contienen la polimerasa y ADN vírico o ARNpg. La función de HBeAg (antígeno e) se desconoce, 15 pero no se requiere para replicación de VHB o infección por VHB, y se cree que es un factor inmunosupresor que protege el VHB contra el ataque por el sistema inmunitario (Milich et al., 1990, PNAS USA 87: 6599-6603; Che et al., 2004, PNAS USA 101: 14913-14918; Wieland y Chisari, 2005, J. Virol. 79: 9369-9380). Para mayor claridad, en las secuencias del VHB descritas en el presente documento (por ejemplo, véase Tabla 3), se proporciona la secuencia para prenúcleo de genotipos de VHB representativos, y las posiciones de proteína de núcleo y antígeno e se indican
20 dentro de la secuencia prenúcleo, con el primer aminoácido de prenúcleo designado como posición 1.
El gen P codifica la ADN polimerasa (Pol) del VHB que consiste en dos dominios principales unidos por un espaciador. El dominio N terminal de la polimerasa (también denominado “proteína terminal” o PT) está implicado en el empaquetamiento de ARNpg y en el cebado del ADN de cadena sin sentido. El dominio C terminal es una
25 transcriptasa inversa (RT) que tiene actividad de RNasa H (RH).
El gen S tiene múltiples codones de inicio y codifica tres proteínas de envoltura (también denominadas en el presente documento generalmente “proteína de superficie” o “antígeno de superficie”) denominadas S, M y L, que son todas componentes de las partículas víricas infecciosas, también conocidas como partículas Dane. S, por sí sola 30 y junto con M y L, también forma partículas de antígeno de superficie (HBsAg) que pueden secretarse de células infectadas en grandes cantidades (Seeger y Mason, 2000, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64(1): 51-68; Beck, (2007), “Hepatitis B virus replication”, World Journal of Gastroenterology: WJG 13(1): 48-64). Los codones para M y L están localizados aproximadamente 165 (M) y 489 (L) nucleótidos, respectivamente, cadena arriba del codón de inicio para
S. S o el antígeno de superficie “pequeño” es el más pequeño y más abundante de los antígenos de superficie. Los
35 anticuerpos producidos contra este antígeno representan seroconversión en individuos infectados. M o el antígeno de superficie “mediano” tiene un dominio proteico extra, en comparación con S, conocido como pre S2, y el dominio proteico que es único de L o antígeno de superficie “grande” se conoce como pre S1 (L por lo tanto también contiene pre S2 y la secuencia adicional que pertenece a M y S). Pre S1 contiene el dominio de receptor de hepatocitos vírico (sitio de unión al receptor de hepatocitos), que se localiza aproximadamente entre las posiciones de aminoácidos 21
40 y 47 de Pre S1. Los epítopos en pre S1 pueden inducir anticuerpos neutralizantes de virus. Además, el dominio pre S1 proporciona el ligando para partículas de núcleo durante el ensamblaje de la envoltura vírica. Las partículas de antígeno de superficie (HBsAg) también pueden suprimir la eliminación inmunitaria de células infectadas actuando como un tolerágeno de alta dosis (Reignat et al., 2002, J. Exp. Med. 195: 1089-1101; Webster et al., 2004, J. Virol. 78:5707-5719).
45 El gen X codifica el antígeno X (HBx) (que también puede denominarse “proteína X”) que está implicado en la transactivación transcripcional, la regulación de las rutas de reparación de ADN, la elevación de los niveles citosólicos de calcio, la modulación de las rutas de degradación proteica y la modulación de la progresión del ciclo celular y rutas de proliferación celular en la célula hospedadora (Gearhart et al., 2010, J. Virol.), que potencia la
50 estimulación de la replicación del VHB. HBx también está asociado con el desarrollo de cáncer de hígado (Kim et al., Mature 1991, 351: 317-320; Terradillos et al., Oncogene 1997, 14: 395-404).
VHB se encuentra como uno de cuatro serotipos principales (adr, adw, ayr, ayw) que se determinan basándose en epítopos antigénicos dentro de sus proteínas de la envoltura. Existen ocho genotipos de VHB diferentes (A-H)
55 basándose en las variaciones de secuencia de nucleótidos en el genoma. La distribución geográfica de los genotipos se muestra en la Tabla 2 (Kramvis et al., 2005, Vaccine 23(19): 2409-2423; Magnius y Norder, 1995, Intervirology 38(1-2): 24-34; Sakamoto et al., 2006, J. Gen. Virol. 87: 1873-1882; Lim et al., 2006, Int. J. Med. Sci. 3: 14-20).
Tabla 2
Genotipo del VHB
Distribución Geográfica Prevalente
VHB/A
América, Europa, África, Sureste Asiático
VHB/B
Asia (China, Japón, Sureste Asiático), Estados Unidos
VHB/C
Asia (China, Japón, Sureste Asiático), Estados Unidos
VHB/D
Estados Unidos, Mediterráneo, Oriente Medio e India
VHB/E
Sub Sáhara y África Occidental
VHB/F
América Central y Sudamérica
VHB/G
Francia, Alemania, Estados Unidos
VHB/H
América Central, Estados Unidos (California)
La secuencia de ácido nucleico y aminoácidos para genes del VHB y las proteínas codificadas por los mismos se conocen en la técnica para cada uno de los genotipos conocidos. La Tabla 3 proporciona referencia a identificadores de secuencia para secuencias de aminoácidos ejemplares (representativas) de todas las proteínas estructurales y 5 no estructurales del VHB en cada uno de los ocho genotipos conocidos del VHB, e indica además la posición de ciertos dominios estructurales. Se observa que pueden producirse variaciones pequeñas en la secuencia de aminoácidos entre diferentes aislados víricos de la misma proteína o dominio del mismo genotipo de VHB. Sin embargo, como se ha analizado anteriormente, las cepas y los serotipos de VHB y genotipos de VHB presentan alta identidad de aminoácidos incluso entre serotipos y genotipos (por ejemplo, véase Tabla 4). Por lo tanto, usando la 10 orientación proporcionada en el presente documento y la referencia a las secuencias del VHB ejemplares, un experto en la materia podrá fácilmente producir una diversidad de proteínas basadas en VHB, incluyendo proteínas de fusión, a partir de cualquier cepa (aislado), serotipo o genotipo del VHB, para uso en las composiciones y métodos de la presente invención, y como tal, la invención no se limita a las secuencias específicas desveladas en el presente documento. La referencia a una proteína del VHB o antígeno del VHB en cualquier parte de la presente
15 divulgación, o a cualquier dominio funcional, estructural o inmunogénico del mismo, puede realizarse en consecuencia por referencia a una secuencia particular de una o más de las secuencias presentadas en la presente divulgación, o por referencia a la misma secuencia, a una similar o a una correspondiente de un aislado (cepa) de VHB diferente.
20 Tabla 3
Organismo, Genotipo, Gen
Proteína Identificador de Secuencia (N.º de Referencia de Base de Datos)
VHB, Genotipo A, C
Prenúcleo SEQ ID NO: 1 (n.º de Referencia AAX83988.1)
• Núcleo (HBcAg)
*Posiciones 30/31-212 de SEQ ID NO: 1
• antígeno e (HBeAg)
*Posiciones 20-178 de SEQ ID NO: 1
VHB, Genotipo A, P
Polimerasa SEQ ID NO: 2 (n.º de Referencia BAI81985)
• transcriptasa inversa
*Posiciones 383-602 de SEQ ID NO: 2
VHB, Genotipo A, S
HBsAg (L) de Superficie SEQ ID NO: 3 (n.º de Referencia BAD91280.1)
HBsAg (M) de Superficie
*Posiciones 120-400 de SEQ ID NO: 3
HBsAg (S) de Superficie
*Posiciones 175-400 de SEQ ID NO: 3
VHB, Genotipo A, X
X (HBx) SEQ ID NO: 4 (n.º de Referencia AAK97189.1)
VHB, Genotipo B, C
Prenúcleo SEQ ID NO: 5 (n.º de Referencia BAD90067)
• Núcleo (HBcAg)
*Posiciones 30/31-212 de SEQ ID NO: 5
• antígeno e (HBeAg)
*Posiciones 20-178 de SEQ ID NO: 5
VHB, Genotipo B, P
Polimerasa SEQ ID NO: 6 (n.º de Referencia BAD90068.1)
• transcriptasa inversa
*Posiciones 381-600 de SEQ ID NO: 6
VHB, Genotipo B, S
HBsAg (L) de Superficie SEQ ID NO: 7 (n.º de Referencia BAJ06634.1)
HBsAg (M) de Superficie
*Posiciones 120-400 de SEQ ID NO: 7
HBsAg (S) de Superficie
*Posiciones 175-400 de SEQ ID NO: 7
VHB, Genotipo B, X
X (HBx) SEQ ID NO: 8 (n.º de Referencia BAD90066.1)
VHB, Genotipo C, C
Prenúcleo SEQ ID NO: 9 (n.º de Referencia YP_355335)
• Núcleo (HBcAg)
*Posiciones 30/31-212 de SEQ ID NO: 9
• antígeno e (HBeAg)
*Posiciones 20-178 de SEQ ID NO: 9
VHB, Genotipo C, P
Polimerasa SEQ ID NO: 10 (n.º de Referencia ACH57822)
• transcriptasa inversa
*Posiciones 381-600 de SEQ ID NO: 10
VHB, Genotipo C, S
HBsAg (L) de Superficie SEQ ID NO: 11 (n.º de Referencia BAJ06646.1)
HBsAg (M) de Superficie
*Posiciones 120-400 de SEQ ID NO: 11
HBsAg (S) de Superficie
*Posiciones 175-400 de SEQ ID NO: 11
VHB, Genotipo C, X
X (HBx) SEQ ID NO: 12 (n.º de Referencia BAJ06639.1)
VHB, Genotipo D, C
Prenúcleo SEQ ID NO: 13 (n.º de Referencia ADF29260.1)
• Núcleo (HBcAg)
*Posiciones 30/31-212 de SEQ ID NO: 13
• antígeno e (HBeAg)
*Posiciones 20-178 de SEQ ID NO: 13
VHB, Genotipo D, P
Polimerasa SEQ ID NO: 14 (n.º de Referencia ADD12642.1)
• transcriptasa inversa
*Posiciones 370-589 de SEQ ID NO: 14
VHB, Genotipo D, S
HBsAg (L) de Superficie SEQ ID NO: 15 (n.º de Referencia ACP20363.1)
HBsAg (M) de Superficie
*Posiciones 109-389 de SEQ ID NO: 15
HBsAg (S) de Superficie
*Posiciones 164-389 de SEQ ID NO: 15
VHB, Genotipo D, X
X(HBx) SEQ ID NO: 16 (n.º de Referencia BAF47226.1)
VHB, Genotipo E, C
Prenúcleo SEQ ID NO: 17 (n.º de Referencia ACU25047.1)
• Núcleo (HBcAg)
*Posiciones 30/31-212 de SEQ ID NO: 17
• antígeno e (HBeAg)
*Posiciones 20-178 de SEQ ID NO: 17
VHB, Genotipo E, P
Polimerasa SEQ ID NO: 18 (n.º de Referencia AC089764.1)
• transcriptasa inversa
*Posiciones 380-599 de SEQ ID NO: 18
VHB, Genotipo E, S
HBsAg (L) de Superficie SEQ ID NO: 19 (n.º de Referencia BAD91274.1)
HBsAg (M) de Superficie
*Posiciones 119-399 de SEQ ID NO: 19
HBsAg (S) de Superficie
*Posiciones 174-399 de SEQ ID NO: 19
VHB, Genotipo E, X
X (HBx) SEQ ID NO: 20 (n.º de Referencia ACU24870.1)
VHB, Genotipo F, C
Prenúcleo SEQ ID NO: 21 (n.º de Referencia BAB17946.1)
• Núcleo (HBcAg)
*Posiciones 30/31-212 de SEQ ID NO: 21
• antígeno e (HBeAg)
*Posiciones 20-178 de SEQ ID NO: 21
VHB, Genotipo F, P
Polimerasa SEQ ID NO: 22 (n.º de Referencia ACD03788.2)
• transcriptasa inversa
*Posiciones 381-600 de SEQ ID NO: 22
VHB, Genotipo F, S
HBsAg (L) de Superficie SEQ ID NO: 23 (n.º de Referencia BAD98933.1)
HBsAg (M) de Superficie
*Posiciones 120-400 de SEQ ID NO: 23
HBsAg (S) de Superficie
*Posiciones 175-400 de SEQ ID NO: 23
VHB, Genotipo F, X
X (HBx) SEQ ID NO: 24 (n.º de Referencia AAM09054.1)
VHB, Genotipo G, C
Prenúcleo SEQ ID NO: 25 (n.º de Referencia ADD62622.1)
• Núcleo (HBcAg)
*Posiciones 14-194 de SEQ ID NO: 25
• antígeno e (HBeAg)
*Posiciones 4-161 de SEQ ID NO: 25
VHB, Genotipo G, P
Polimerasa SEQ ID NO: 26 (n.º de Referencia ADD62619.1)
• transcriptasa inversa
*Posiciones 380-599 de SEQ ID NO: 26
VHB, Genotipo G, S
(HBsAg) (L) de Superficie SEQ ID NO: 27 (n.º de Referencia ADD62620.1)
HBsAg (M) de Superficie
*Posiciones 119-399 de SEQ ID NO: 27
HBsAg (S) de Superficie
*Posiciones 174-399 de SEQ ID NO: 27
VHB, Genotipo G, X
X (HBx) SEQ ID NO: 28 (n.º de Referencia BAB82400.1)
VHB, Genotipo H, C
Prenúcleo SEQ ID NO: 29 (n.º de Referencia BAD91265.1)
• Núcleo (HBcAg)
*Posiciones 30/31-212 de SEQ ID NO: 29
• antígeno e (HBeAg)
*Posiciones 20-178 de SEQ ID NO: 29
VHB, Genotipo H, P
Polimerasa SEQ ID NO: 30 (n.º de Referencia BAF49208.1)
• transcriptasa inversa
*Posiciones 381-600 de SEQ ID NO: 30
VHB, Genotipo H, S
HBsAg (L) de Superficie SEQ ID NO: 31 (n.º de Referencia BAE20065.1)
HBsAg (M) de Superficie
*Posiciones 120-400 de SEQ ID NO: 31
HBsAg (S) de Superficie
*Posiciones 175-400 de SEQ ID NO: 31
VHB, Genotipo H, X
X (HBx) SEQ ID NO: 32 (n.º de Referencia BAF49206.1)
*La numeración de posiciones es aproximada y puede incluir aminoácidos adicionales que flanquean uno de los lados de la posición indicada
Antígenos y construcciones del virus de la hepatitis B. Un caso de la divulgación se refiere a nuevos antígenos del VHB y proteínas de fusión y moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican estos antígenos y proteínas. Se describen en el presente documento diferentes antígenos del VHB novedosos para su uso en una composición 5 inmunoterapéutica basada en levadura que proporciona tres antígenos o dominios inmunogénicos de los mismos, todos contenidos dentro de la misma proteína de fusión y codificados por la misma construcción de ácido nucleico recombinante (molécula de ácido nucleico recombinante). Los antígenos usados en las composiciones descritas incluyen al menos una proteína del VHB o dominio inmunogénico de la misma para inmunizar a un animal (profiláctica o terapéuticamente). La composición incluye tres antígenos del VHB o dominios inmunogénicos de los 10 mismos. En algunas realizaciones de la divulgación, el antígeno es una proteína de fusión. En un caso, la proteína de fusión puede incluir dos o más proteínas. En un aspecto, la proteína de fusión puede incluir dos o más dominios inmunogénicos y/o dos o más epítopos de una o más proteínas. Una composición inmunoterapéutica que contiene dichos antígenos puede proporcionar inmunización específica de antígeno en una amplia serie de pacientes. Por ejemplo, un antígeno o una proteína de fusión descritos pueden incluir al menos una parte de, o la longitud completa 15 de, cualquier proteína del VHB seleccionada de: proteína de superficie del VHB (también denominada antígeno de superficie o proteína de envoltura o HBsAg), incluyendo las formas grande (L), mediana (M) y/o pequeña (S) de la proteína de superficie y/o los dominios pre S1 y/o pre S2 de la misma; proteína de núcleo del VHB (también denominada antígeno de núcleo o HBcAg); antígeno X del VHB (también denominado X, antígeno X o HBx); y/o uno cualquiera o más dominios inmunogénicos de una cualquiera o más de estas proteínas del VHB. En una realización,
un antígeno útil en una composición terapéutica es de una única proteína del VHB (de longitud completa, de longitud casi completa o parte de la misma que comprende al menos uno, dos, tres, cuatro o más dominios inmunogénicos de una proteína de longitud completa). En una realización, una composición inmunoterapéutica incluye uno, dos, tres, cuatro, cinco o más vehículos individuales de levadura, que expresan o contienen cada uno un antígeno o
5 antígenos del VHB diferentes.
Las moléculas de ácido nucleico recombinantes y las proteínas codificadas por las mismas, incluyendo proteínas de fusión, pueden usarse en composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura, o para cualquier otro fin adecuado para antígeno o antígenos del VHB, incluyendo en un ensayo in vitro, para la producción de anticuerpos, o en otra composición inmunoterapéutica, incluyendo otra vacuna, que no esté basada en la inmunoterapia basada en levadura descrita en el presente documento. La expresión de las proteínas por levadura es una realización preferida, aunque pueden usarse otros sistemas de expresión para producir las proteínas para aplicaciones distintas de una composición inmunoterapéutica basada en levadura.
15 El uso general en el presente documento del término “antígeno” se refiere: a cualquier parte de una proteína (péptido, proteína parcial, proteína de longitud completa), en la que la proteína es de origen natural o se obtiene de forma sintética, a una composición celular (célula completa, lisado celular o células rotas), a un organismo (organismo completo, lisado o células rotas) o a un carbohidrato, u otra molécula, o una parte de la misma. Un antígeno puede inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno (por ejemplo, una respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por células) contra el mismo antígeno o antígenos similares que se encuentran con un elemento del sistema inmunitario (por ejemplo, células T, anticuerpos).
Un antígeno puede ser tan pequeño como un único epítopo, un único dominio inmunogénico o mayor, y puede incluir múltiples epítopos o dominios inmunogénicos. Como tal, el tamaño de un antígeno puede ser tan pequeño como
25 aproximadamente 8-12 aminoácidos (es decir, un péptido) y tan grande como: una proteína de longitud completa, un multímero, una proteína de fusión, una proteína quimérica, una célula completa, un microorganismo completo o cualquier parte de los mismos (por ejemplo, lisados de células completas o extractos de microorganismos). Además, los antígenos pueden incluir carbohidratos, que pueden cargarse en un vehículo de levadura o en una composición de la invención. Se apreciará que en algunas realizaciones (por ejemplo, cuando el antígeno es expresado por el vehículo de levadura de una molécula de ácido nucleico recombinante), el antígeno es una proteína, proteína de fusión, proteína quimérica o fragmento de las mismas, en lugar de una célula o un microorganismo completa.
Cuando el antígeno va a expresarse en levadura, un antígeno es de un tamaño mínimo capaz de expresarse de forma recombinante en levadura, y es típicamente de al menos o más de 25 aminoácidos de longitud, o al menos o 35 más de 26, al menos o más de 27, al menos o más de 28, al menos o más de 29, al menos o más de 30, al menos o más de 31, al menos o más de 32, al menos o más de 33, al menos o más de 34, al menos o más de 35, al menos o más de 36, al menos o más de 37, al menos o más de 38, al menos o más de 39, al menos o más de 40, al menos o más de 41, al menos o más de 42, al menos o más de 43, al menos o más de 44, al menos o más de 45, al menos o más de 46, al menos o más de 47, al menos o más de 48, al menos o más de 49 o al menos o más de 50 aminoácidos de longitud, o es de al menos 25-50 aminoácidos de longitud, al menos 30-50 aminoácidos de longitud, al menos 35-50 aminoácidos de longitud, al menos 40-50 aminoácidos de longitud o al menos 45-50 aminoácidos de longitud. Pueden expresarse proteínas más pequeñas, y pueden expresare proteínas considerablemente mayores (por ejemplo, de cientos de aminoácidos de longitud o incluso algunos miles de aminoácidos de longitud). En un aspecto, puede expresarse una proteína de longitud completa, o un dominio estructural o funcional de la misma, o
45 un dominio inmunogénico de la misma, que carece de uno o más aminoácidos del extremo N y/o el C terminal (por ejemplo, que carece de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20 aminoácidos del extremo N y/o el C terminal). Las proteínas de fusión y proteínas quiméricas también son antígenos que pueden expresarse. Un “antígeno diana” es un antígeno que es diana específica de una composición inmunoterapéutica de la divulgación (es decir, un antígeno contra el que se desea la inducción de una respuesta inmunitaria). Un “antígeno del VHB” es un antígeno obtenido, diseñado o producido a partir de una o más proteínas del VHB de modo que la dirección al antígeno también dirige al virus de la hepatitis B.
Cuando se hace referencia a la estimulación de una respuesta inmunitaria, el término “inmunógeno” es un subconjunto del término “antígeno” y, por lo tanto, en algunos casos, puede usarse indistintamente con el término
55 “antígeno”. Un inmunógeno, como se usa en el presente documento, describe un antígeno que induce una respuesta inmunitaria humoral y/o mediada por células (es decir, es inmunogénico), de modo que la administración del inmunógeno a un individuo monta una respuesta inmunitaria específica de antígeno contra el mismo antígeno o antígenos similares que se encuentran con el sistema inmunitario del individuo. En una realización, un inmunógeno induce una respuesta inmunitaria mediada por células, incluyendo una respuesta de células T CD4+ (por ejemplo, TH1, TH2 y/o TH17) y/o una respuesta de células T CD8+ (por ejemplo, una respuesta de CTL).
Un “dominio inmunogénico” de un antígeno dado puede ser cualquier parte, fragmento o epítopo de un antígeno (por ejemplo, un fragmento o una subunidad de un péptido o un epítopo de anticuerpo u otro epítopo conformacional) que contiene al menos un epítopo que actúa como un inmunógeno cuando se administra a un animal. Por lo tanto, un 65 dominio inmunogénico es mayor de un único aminoácido y es de un tamaño al menos suficiente para contener al menos un epítopo que puede actuar como un inmunógeno. Por ejemplo, una única proteína puede contener
múltiples dominios inmunogénicos diferentes. No es necesario que los dominios inmunogénicos sean secuencias lineales dentro de una proteína, tal como en el caso de una respuesta inmunitaria humoral, donde se contemplan dominios conformacionales.
5 Un “dominio funcional” de una proteína dada es una parte o un dominio funcional de la proteína que incluye secuencia o estructura que es directa o indirectamente responsable de al menos una función biológica o química asociada con, atribuida a o realizada por la proteína. Por ejemplo, un dominio funcional puede incluir un sitio activo para actividad enzimática, un sitio de unión a ligando, un sitio de unión a receptor, un sitio de unión para una molécula o un resto tal como calcio, un sitio de fosforilación o un dominio de transactivación. Los ejemplos de dominios funcionales del VHB incluyen, pero sin limitación, el dominio receptor de hepatocito vírico en pre S1, o el dominio de transcriptasa inversa o dominio de RNasa H de la polimerasa.
Un “dominio estructural” de una proteína dada es una parte de la proteína o un elemento en la estructura general de la proteína que tiene una estructura identificable (por ejemplo, puede ser una estructura primaria o terciaria que
15 pertenece a y es indicativa de varias proteínas dentro de una clase o familia de proteínas) es autoestabilizante y/o puede plegarse independientemente del resto de la proteína. Un dominio estructural se asocia con frecuencia con o se presenta prominentemente en la función biológica de la proteína a la que pertenece.
Un epítopo se define en el presente documento como un único sitio inmunogénico dentro de un antígeno dado que es suficiente para inducir una respuesta inmunitaria cuando se proporciona al sistema inmunitario en el contexto de señales coestimulantes apropiadas y/o células activadas del sistema inmunitario. En otras palabras, un epítopo es la parte de un antígeno que es reconocida de hecho por componentes del sistema inmunitario, y también puede denominarse determinante antigénico. Los expertos en la materia reconocerán que los epítopos de células T son de diferente tamaño y composición de los epítopos de células B o anticuerpos, y que los epítopos presentados a través 25 de la ruta del MHC de Clase I difieren en su tamaño y atributos estructurales de los epítopos presentados a través de la ruta del MHC de Clase II. Por ejemplo, los epítopos de células T presentados por moléculas del MHC de Clase I son típicamente de entre 8 y 11 aminoácidos de longitud, mientras que los epítopos presentados por las moléculas del MHC de Clase II están menos restringidos en su longitud y pueden ser de 8 aminoácidos hasta 25 aminoácidos o más largos. Además, los epítopos de células T tienen características estructurales predichas dependiendo de las moléculas del MHC específicas que se unen con el epítopo. Se han identificado múltiples epítopos de células T diferentes en diversas cepas del VHB y para muchos tipos de HLA humanos, varios de los cuales se identifican en la Tabla 5. Además, se han descubierto en el presente documento nuevos epítopos para ciertos haplotipos de MHC murino y también se presentan en la Tabla 5 o en los Ejemplos. Los epítopos pueden ser epítopos de secuencia lineal o epítopos conformacionales (regiones de unión conservadas). La mayoría de los anticuerpos reconocen
35 epítopos conformacionales.
Un ejemplo de la divulgación se refiere a una proteína de fusión que comprende un antígeno del VHB que es un antígeno del VHB multiproteico, y en este ejemplo, una fusión comprendida por antígeno de superficie grande (L) del VHB, incluyendo todos los dominios transmembrana hidrófobos y antígeno del núcleo (HBcAg), descrito en detalle posteriormente. Se expresan abundantemente antígenos de superficie y núcleo en células infectadas, se requieren para replicación vírica y contienen múltiples epítopos de células T CD4+ y CD8+. Además, estos antígenos, particularmente antígeno de superficie, contienen sitios de mutación conocidos que pueden inducirse por terapia antivírica; estas regiones pueden por lo tanto modificarse, según sea necesario, para proporcionar composiciones inmunoterapéuticas adicionales para dirigirse a las mutaciones “de escape”. Una ventaja adicional de la dirección de
45 estas proteínas, y particularmente ambas proteínas en una única composición inmunoterapéutica, es el alto grado de conservación al nivel de aminoácidos entre diferentes genotipos del VHB. Las proteínas tanto del núcleo como de superficie (L) están altamente conservadas entre genotipos A y C del VHB o entre A y H, por ejemplo (véase Tabla 4), que son genotipos prevalentes en América y Asia (Tabla 2). La proteína del núcleo presenta una identidad de aminoácidos del 95 % entre los genotipos A y C y entre los genotipos A y H. La proteína de superficie grande (L) también está altamente conservada entre los diferentes genotipos del VHB; existe una identidad de aminoácidos del 90 % entre los genotipos A y C, y existe una identidad de aminoácidos del 82 % entre los genotipos A y H.
Tabla 4
Comparación
Núcleo Superficie (L) X Polimerasa
Genotipo A del VHB frente a Genotipo C del VHB
95 90 89 90
Genotipo A del VHB frente a Genotipo H del VHB
95 82 79 82
55 Por lo tanto, puede esperarse que una composición inmunoterapéutica diseñada usando un genotipo del VHB induzca una respuesta inmunitaria eficaz contra un genotipo del VHB altamente similar, bien mediante dirección directa de epítopos conservados o mediante propagación de epítopos como resultado de la dirección inicial a epítopos que están conservados entre genotipos. Como alternativa, debido a la facilidad de producción de composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura de la invención, es sencillo modificar una secuencia para codificar una proteína, dominio o epítopo de un genotipo diferente, o para incluir en la misma construcción diferentes epítopos de células T o dominios y/o proteínas completos de dos o más genotipos del VHB diferentes, para aumentar la amplia aplicabilidad de la inmunoterapia. Se describen ejemplos de dichos antígenos del VHB en detalle
y se ejemplifican posteriormente. Aunque una composición inmunoterapéutica de la presente divulgación se diseñó para dirigirse a dos antígenos del VHB, proteína de superficie y de núcleo, en un único producto, este enfoque puede expandirse fácilmente para incorporar las secuencias proteicas de otras proteínas víricas del VHB esenciales, conservadas e inmunogénicas para dar como resultado respuestas inmunitarias celulares aún más amplias. Dichas
5 proteínas de fusión adicionales y composiciones inmunoterapéuticas se describen y se ejemplifican en el presente documento.
En un caso de la divulgación, el antígeno o los antígenos del VHB para uso en una composición o método descrito se seleccionan de antígenos del VHB que se han diseñado para optimizar o potenciar su utilidad como productos clínicos, incluyendo en el contexto de una composición inmunoterapéutica basada en levadura. Dichos antígenos del VHB se han diseñado para producir un producto inmunoterapéutico basado en levadura del VHB que consigue uno o más de los siguientes objetivos: (1) cumplimiento de las directrices del Comité Consultivo de ADN Recombinante (RAC) del Instituto Nacional de Salud (NIH), en las que no pueden usarse más de dos tercios (2/3) del genoma de un agente infeccioso en un producto terapéutico o vacuna recombinante; (2) inclusión de un número maximizado de
15 epítopos de células T conocidos asociados con respuestas inmunitarias a infecciones por VHB agudas/autolimitantes y/o infecciones por VHB crónicas (con prioridad en un aspecto basado en el repertorio de epítopos agudos/autolimitantes, como se analiza posteriormente); (3) maximización o priorización de la inclusión de dominios inmunogénicos y más particularmente epítopos de células T (epítopos CD4+ y/o CD8+ y epítopos dominantes y/o subdominantes) que están más conservados entre genotipos y/o subgenotipos del VHB, o que puede modificarse fácilmente a una secuencia consenso o incluirse en dos o más formas para abarcar las diferencias de secuencia más importantes entre genotipos diana; y/o (4) minimizar el número de puntos de unión no naturales dentro de la secuencia del antígeno del VHB en el producto.
En consecuencia, la divulgación describe modificación de antígenos del VHB de sus secuencias de origen natural o
25 de tipo silvestre en una cepa dada para cumplir uno o más de los criterios descritos anteriormente, así como para incluir elementos de diseño y/o criterios de diseño de antígeno descritos en otra parte del presente documento. Dichos criterios y dicha orientación de diseño de antígenos son aplicables a productos inmunoterapéuticos basados en levadura que comprenden antígenos del VHB que son proteínas o dominios del VHB individuales, así como antígenos del VHB que incluyen combinaciones de proteínas o dominios del VHB y particularmente antígenos multiproteicos/proteínas de fusión (por ejemplo, antígenos del VHB de dos o más proteínas del VHB diferentes y/o dominios de los mismos, tales como combinaciones de antígenos de proteína de superficie, polimerasa, núcleo, antígeno e y/o antígeno X del VHB). Se apreciará que a medida que aumenta la complejidad del antígeno del VHB, se implementará utilización de más de estos criterios en la construcción del antígeno.
35 Por lo tanto, en un caso de la divulgación, un antígeno del VHB útil en la presente divulgación como una proteína o proteína de fusión para expresar por una levadura incluye secuencias del VHB codificadas por secuencias de nucleótidos que representan menos de dos tercios (2/3) del genoma del VHB (es decir, los antígenos están codificados por secuencias de ácido nucleico que en total componen menos de dos tercios (2/3) del genoma del VHB o cumplen los requisitos de RAC para productos profilácticos y terapéuticos recombinantes). En un aspecto, esto puede conseguirse seleccionando antígenos del VHB para expresión en un producto inmunoterapéutico basado en levadura que cumple los requisitos de RAC en su forma de longitud completa o longitud casi completa (por ejemplo, el antígeno X es pequeño y cuando se usa solo cumpliría los requisitos de RAC). En otro aspecto, esto se consigue modificando la estructura de la proteína o las proteínas y/o el dominio o los dominios para incluir en el antígeno del VHB, tal como por supresión de secuencia para truncar proteínas o retirar secuencias internas de
45 proteínas, incluyendo solamente dominios funcionales, estructurales o inmunogénicos seleccionados de una proteína, o eligiendo eliminar la inclusión de una proteína particular en la construcción antigénica totalmente. Además, los productos inmunoterapéuticos basados en levadura del VHB pueden producirse, en una realización, como construcciones de antígenos individuales, y después usarse en combinación de manera que no se opongan a ninguna restricción relacionada con el genoma vírico.
En otro caso de la divulgación, como se ha analizado anteriormente, la inclusión de epítopos de células T en una construcción de antígeno del VHB (proteína o proteína de fusión) se maximiza, por ejemplo, si el antígeno del VHB incluido en el producto inmunoterapéutico se ha modificado para cumplir otra consideración de diseño, tal como el requisito de RAC analizado anteriormente. En esta realización, se modifican antígenos del VHB útiles en un producto
55 inmunoterapéutico basado en levadura con el objetivo de maximizar el número de dominios inmunogénicos, y, en un aspecto, el número de epítopos de células T, que están conservados en el antígeno del VHB. En un aspecto, la inclusión de epítopos de células T en un antígeno del VHB se prioriza de la siguiente manera:
Epítopos identificados en respuestas inmunitarias tanto a infecciones por VHB agudas/autolimitantes como a infecciones por VHB crónicas > Epítopos identificados en respuestas inmunitarias a infecciones por VHB agudas/autolimitantes > Epítopos identificados en respuestas inmunitarias a infecciones por VHB crónicas.
En esta realización, sin quedar ligado a la teoría, los inventores creen que las respuestas inmunitarias de individuos que han tenido infecciones por VHB agudas o autolimitantes pueden ser más productivas en la eliminación de la 65 infección vírica que las respuestas inmunitarias de individuos que tienen infecciones por VHB crónicas. Por lo tanto, la inclusión de epítopos de células T que parecen estar asociados con la eliminación del virus en estas infecciones
agudas o autolimitantes (bien dominantes o bien subdominantes) se prioriza por ser más probable que induzcan una
respuesta inmunitaria beneficiosa en un individuo inmunizado. Además, y de nuevo sin quedar ligado a la teoría, los
inventores creen que la generación de una respuesta inmunitaria contra uno o más antígenos diana del VHB usando
inmunoterapia basada en levadura dará como resultado una respuesta inmunitaria en el individuo inmunizado no
5 solamente contra los epítopos incluidos en el producto inmunoterapéutico basado en levadura, sino también contra
otros epítopos del VHB presentes en el individuo. Este fenómeno, denominado “propagación epitópica” permite el
diseño de antígenos del VHB que se centran en epítopos que parecen ser más relevantes para el beneficio
terapéutico, y el mecanismo de acción de un producto inmunoterapéutico basado en levadura que permite que el
sistema inmunitario expanda la respuesta inmunitaria para abarcar epítopos diana adicionales, potenciando de este 10 modo una respuesta inmunitaria terapéuticamente productiva o beneficiosa contra el VHB.
En consecuencia, un antígeno del VHB en una realización comprende uno o más epítopos de CTL (por ejemplo,
epítopos que son reconocidos por un receptor de células T de un linfocito T citotóxico (CTL), cuando se presentan
en el contexto de una molécula del MHC de Clase I apropiada). En un aspecto, el antígeno del VHB comprende uno 15 o más epítopos de células T CD4+ (por ejemplo, epítopos que son reconocidos por un receptor de células T de una
célula T CD4+, en el contexto de una molécula del MHC de Clase II apropiada). En un aspecto, el antígeno del VHB
comprende uno o más epítopos de CTL y uno o más epítopos de células T CD4+. En un aspecto, un antígeno del
VHB útil en una composición inmunoterapéutica de la invención comprende uno o más de los epítopos de CTL del
VHB ejemplares descritos en la Tabla 5. Un experto en la materia será capaz de identificar fácilmente la posición de 20 la secuencia correspondiente para cada epítopo en la Tabla 5 en una secuencia de VHB dada de cualquier genotipo,
subgenotipo o cepa/aislado, dada la orientación proporcionada posteriormente, incluso aunque algunos aminoácidos
pueden diferir de los de la Tabla 5. Se ilustran ejemplos de dichas diferencias en la Tabla 5. La divulgación no se
limita a antígenos que comprenden estos epítopos ya que se conocerán otros en la técnica y se contemplan para su
uso en la divulgación. En una realización, el epítopo puede modificarse para corresponder con la secuencia del 25 epítopo dentro de un genotipo, subgenotipo o cepa/aislado del VHB dado, ya que puede haber una o más
diferencias de aminoácidos en estos epítopos entre genotipos, subgenotipos o cepas/aislados.
Tabla 5
Epítopo
Identificador de Secuencia Antígeno del VHB Preferencia de HLA
FLLTRILTI1,2,3
SEQ ID NO: 42 Superficie (por ejemplo posiciones 20-28 de S; por ejemplo correspondientes a las posiciones 194-202 de SEQ ID NO: 11, posiciones 201-209 de SEQ ID NO: 34, o posiciones 51-59 de SEQ ID NO: 36) A*0201
GLSPTVWLSV5
SEQ ID NO: 43 Superficie (por ejemplo posiciones 185-194 de S; por ejemplo correspondientes a las posiciones 359-368 de SEQ ID NO: 11, posiciones 366-375 de SEQ ID NO: 34, o posiciones 216-225** de SEQ ID NO: 36) A*0201
FLPSDFFPSI2,3,4
SEQ ID NO: 44 Núcleo (por ejemplo posiciones 47-56 de Precore; por ejemplo correspondientes a las posiciones 47-56 de SEQ ID NO: 9, posiciones 424-433 de SEQ ID NO: 34, o posiciones 621-630 de SEQ ID NO: 36) A*0201
FLLSLGIHL1
SEQ ID NO: 45 Polimerasa (por ejemplo posiciones 575-583 de Pol; por ejemplo correspondientes a las posiciones 573-581 de SEQ ID NO: 10, o posiciones 486-494 de SEQ ID NO: 36) A*0201
WLSLLVPFV1,3,5
SEQ ID NO: 46 Superficie (por ejemplo posiciones 172-180 de S; por ejemplo correspondientes a las posiciones 346-354 de SEQ ID NO: 11, posiciones 353-361† de SEQ ID NO: 34, o posiciones 203-211 de SEQ ID NO: 36) A*0201
KYTSFPWLL
SEQ ID NO: 47 Polimerasa (por ejemplo posiciones 756-764 de Pol; por ejemplo correspondientes a las posiciones 756-764 de SEQ ID NO: 10) A*2402
YVNVNMGLK4
SEQ ID NO: 48 Núcleo (por ejemplo posiciones 117-125 de Precore; por ejemplo correspondientes a las posiciones 117-125 de SEQ ID NO: 9, posiciones 494-502 de SEQ ID NO: 34, o posiciones 691-699 de SEQ ID NO: 36) A*1101
EYLVSFGVW
SEQ ID NO: 49 Núcleo (por ejemplo posiciones 146-154 de Precore; por ejemplo correspondientes a las posiciones 146-154 de SEQ ID NO: 9, posiciones 523-531 de SEQ ID NO: 34, o posiciones 720-728 de SEQ ID NO: 36) A*2402
GLSRYVARL3
SEQ ID NO: 50 Polimerasa (por ejemplo posiciones 455-463 de Pol; por ejemplo correspondientes a las posiciones 453-461‡ de SEQ ID NO: 10, o posiciones 366-374 de SEQ ID NO: 36) A*0201
CLFKDWEEL5
SEQ ID NO: 51 X (por ejemplo posiciones 115-123 de X; por ejemplo correspondientes a las posiciones 115-123§ de SEQ ID NO: 12, o posiciones 900-908§ de SEQ ID NO: 36) A*02
PLGFFPDH5
SEQ ID NO: 52 Superficie (por ejemplo posiciones 21-28 de Pre-S1; por ejemplo correspondientes a las posiciones 21-28 de SEQ ID NO: 11, posiciones 28-35 de SEQ ID NO: 34, o posiciones 6-13 de SEQ ID NO: 36) A*11
IPIPSSWAF5
SEQ ID NO: 53 Superficie (por ejemplo posiciones 150-158 de S; por ejemplo correspondientes a las posiciones 324-332 de SEQ ID NO: 11, posiciones 331-339 de SEQ ID NO: 34, o posiciones 181-189 de SEQ ID NO: 36) B*07
LPSDFFPSV5
SEQ ID NO: 54 Núcleo (por ejemplo posiciones 48-56 de Precore; por ejemplo correspondientes a las posiciones 48-56II de SEQ ID NO: 9, posiciones 425-433II de SEQ ID NO: 34, o posiciones 619-630II de SEQ ID NO: 36) B*51
MQWNSTALHQALQDP5
SEQ ID NO: 55 Superficie (por ejemplo posiciones 1-15 de pre-S2; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 120-134 de SEQ ID NO: 3) A*3
LLDPRVRGL5
SEQ ID NO: 56 Superficie (por ejemplo posiciones 12-20 de pre-S2; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 131-139 de SEQ ID NO: 3) A*2
SILSKTGDPV5
SEQ ID NO: 57 Superficie (por ejemplo posiciones 44-53 de un pre-S2; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 163-172 de SEQ ID NO: 3) A*2
VLQAGFFLL5
SEQ ID NO: 58 Superficie (por ejemplo posiciones 14-22 de S; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 188-196 de SEQ ID NO: 3) A*2
FLLTRILTI5
SEQ ID NO: 59 Superficie (por ejemplo posiciones 20-28 de S; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 194-202 de SEQ ID NO: 3) A*2
FLGGTPVCL5
SEQ ID NO: 60 Superficie (por ejemplo posiciones 41-49 de S; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 215-223 de SEQ ID NO: 3) A*2
LLCLIFLLV5
SEQ ID NO: 61 Superficie (por ejemplo posiciones 88-96 de S; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 262-270 de SEQ ID NO: 3) A*2
LVLLDYQGML5
SEQ ID NO: 62 Superficie (por ejemplo posiciones 95-104 de S; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 269-278 de SEQ ID NO: 3) A*2
LLDYQGMLPV5
SEQ ID NO: 63 Superficie (por ejemplo posiciones 97-106 de S; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 271-280 de SEQ ID NO: 3) A*2
SIVSPFIPLL5
SEQ ID NO: 64 Superficie (por ejemplo posiciones 207-216 de S; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 381-390 de SEQ ID NO: 3) A*2
ILSPFLPLL5
SEQ ID NO: 65 Superficie (por ejemplo posiciones 208-216 de S; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 382-390 de SEQ ID NO: 3) A*2
TPARVTGGVF5
SEQ ID NO: 66 Polimerasa (por ejemplo posiciones 367-376 de Pol; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 367-376 de SEQ ID NO: 2) B*7
LWDFSQFSR5
SEQ ID NO: 67 Polimerasa (por ejemplo posiciones 390-399 de Pol; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 390-399 de SEQ ID NO: 2) A*3
SAICSVVRR5
SEQ ID NO: 68 Polimerasa (por ejemplo posiciones 533-541 de Pol; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 533-541 de SEQ ID NO: 2) A*3
YMDDWLGA5
SEQ ID NO: 69 Polimerasa (por ejemplo posiciones 551-559 de Pol; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 551-559 de SEQ ID NO: 2) A*2
ALMPLYACI5
SEQ ID NO: 70 Polimerasa (por ejemplo posiciones 655-663 de Pol; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 655-663 de SEQ ID NO: 2) A*2
QAFTFSPTYK5
SEQ ID NO: 71 Polimerasa (por ejemplo posiciones 667-676 de Pol; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 667-676 de SEQ ID NO: 2) A*3
ATVELLSFLPSDFFPSV5
SEQ ID NO: 72 Núcleo (por ejemplo posiciones 40-56 de Precore; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 40-56 de SEQ ID NO: 1) A*2
LPSDFFPSV5
SEQ ID NO: 73 Núcleo (por ejemplo posiciones 48-56 de Precore; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 48-56 de SEQ ID NO: 1) B*51
CLTFGRETV5
SEQ ID NO: 74 Núcleo (por ejemplo posiciones 136-144 de Precore; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 136-144 de SEQ ID NO: 1) A*2
VLEYLVSFGV5
SEQ ID NO: 75 Núcleo (por ejemplo posiciones 144-153 de Precore; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 144-153 de SEQ ID NO: 1) A*2
ILSTLPETTV5
SEQ ID NO: 76 Núcleo (por ejemplo posiciones 168-177 de Precore; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 168-177 de SEQ ID NO: 1) A*2
STLPETTWRR5
SEQ ID NO: 77 Núcleo (por ejemplo posiciones 170-180 de Precore; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 170-180 de SEQ ID NO: 1) A*3
HLSLRGLFV5
SEQ ID NO: 78 X (por ejemplo posiciones 52-60 de X; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 52-60 de SEQ ID NO: 4) A*2
VLHKRTLGL5
SEQ ID NO: 79 X (por ejemplo posiciones 92-100 de X; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 92-100 de SEQ ID NO: 4) A*2
GLSAMSTTDL5
SEQ ID NO: 80 X (por ejemplo posiciones 99-108 de X; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 99-108 de SEQ ID NO: 4) A*2
VLGGCRHKL5
SEQ ID NO: 81 X (por ejemplo posiciones 133-141 de X; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones de 133-141 SEQ ID NO: 4) A*2
NVSIWTHK5
SEQ ID NO: 82 Polimerasa (por ejemplo posiciones 49-57 de Pol; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 49-57 de SEQ ID NO: 2) A*3
KVGNFTGLY5
SEQ ID NO: 83 Polimerasa (por ejemplo posiciones 57-65 de Pol; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 57-65 de SEQ ID NO: 2) A*3
GLYSSTVPV5
SEQ ID NO: 84 Polimerasa (por ejemplo posiciones 63-71 de Pol; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 63-71 de SEQ ID NO: 2) A*2
TLWKAGILYK5
SEQ ID NO: 85 Polimerasa (por ejemplo posiciones 152-161 de Pol; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones de SEQ ID NO: 2) A*3
KYTSFPWLL5
SEQ ID NO: 86 Polimerasa (por ejemplo posiciones 756-764 de Pol; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 758-766 de SEQ ID NO: 2) A*24
ILRGTSFVYV5
SEQ ID NO: 87 Polimerasa (por ejemplo posiciones 773-782 de Pol; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 773-782 de SEQ ID NO: 2) A*2
SLYADSPSV5
SEQ ID NO: 88 Polimerasa (por ejemplo posiciones 816-824 de Pol; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 816-824 de SEQ ID NO: 2) A*2
KLHLYSHPI6
SEQ ID NO: 135 Polimerasa (por ejemplo posiciones 502-510 de Pol; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 502-510 de SEQ ID NO: 2) A*2
LLVPFVQWFV6,7
SEQ ID NO: 136 Superficie (por ejemplo posiciones 349-358 de S; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 349-358 de SEQ ID NO: 3) A*2
HLYSHPIIL8
SEQ ID NO: 137 Polimerasa (por ejemplo posiciones 504-512 de Pol; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 504-512 de SEQ ID NO: 2) A*2
WSPQAQGIL9
SEQ ID NO: 138 Superficie (por ejemplo posiciones 77-84 de S; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 77-84 de SEQ ID NO: 3) H-2Db
VLLDYQGM10
SEQ ID NO: 139 Superficie (por ejemplo posiciones 270-277 de S; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 270-277 de SEQ ID NO: 3) H-2Kb
ASVRFSWL10
SEQ ID NO: 140 Superficie (por ejemplo posiciones 340-347 de S; por ejemplo ***correspondientes a las posiciones 340-347 de SEQ ID NO: 3) H-2Kb
**Sustitución de una Val por Ala en la posición 9 de SEQ ID NO: 43; en la posición 225 en SEQ ID NO: 36.
†Sustitución de Leu-Val por Gln-Ala en las posiciones 5 y 6 de SEQ ID NO: 46; en las posiciones 357 y 358 en SEQ ID NO: 34.
‡Sustitución de Ser por Pro en la posición 3 de SEQ ID NO: 50; en la posición 455 en SEQ ID NO: 10. §Sustitución de Leu por Val en la posición 2 de SEQ ID NO: 51; en la posición 116 en SEQ ID NO: 12 y en la posición 901 en SEQ ID NO: 36. IISustitución de Val por IIe en la posición 9 de SEQ ID NO: 54; en la posición 56 en SEQ ID NO: 9, posición 433 de SEQ ID NO: 34 y posición 630 de SEQ ID NO: 36. ***Una o más diferencias de aminoácidos entre la secuencia de epítopo y la secuencia real de la proteína o del dominio mayor correspondiente pueden existir debido a las diferencias de genotipo, subgenotipo o cepa, aunque la posición del epítopo dentro de la proteína o el dominio mayor puede determinarse fácilmente. 1Zhang et al., Journal of Hepatology 50: 1163-1173 (2009) 2Lopes et al., J. Clin. Invest. 118: 1835-1845 (2008) 3Boettler et al., J Virol 80(7): 3532-3540 (2006) 4Peng et al., Mol. Immunol. 45: 963-970 (2008) 5
Desmond 2008; www.allelefrequencies.net o Desmond et al., Antiviral Ther. 13: 16-175 (2008) 6Webster et al., 2004, J. Virol. 78(11)5707-5719 7Vitiello, 1997, Eur. J. Immunol. 27(3): 671-678 8Sette et al., 1994, J. Immunol. 153(12): 5586-5592 9Epítopo de H-2Db murino, no presentado previamente 10Epítopo de H-2Kb murino, no presentado previamente
En un caso de la divulgación, los antígenos del VHB útiles pueden incluir en una o más composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura un antígeno que comprende uno o más epítopos de células T que se ha descrito como o se determina que es un epítopo “dominante” (es decir, un epítopo de células T que contribuye al 5 desarrollo de una respuesta de células T contra la proteína completa y/o que está entre el número relativamente pequeño de epítopos de células T dentro del grupo grande de posibles epítopos que más probablemente o más fácilmente induzcan respuestas de células T CD4+ y CD8+, también denominado “epítopo inmunodominante”). En otra realización, los antígenos del VHB útiles pueden incluir en las mismas composiciones basadas en levadura o una diferente o adicional, un antígeno del VHB que comprende uno o más epítopos de células T que se han descrito 10 como o se ha determinado que son un epítopo “subdominante” (es decir, un epítopo de células T que es inmunogénico, pero en menor grado que un epítopo inmunodominante; la respuesta inmunitaria generada por un epítopo subdominante puede suprimirse o superarse por competición por la respuesta inmunitaria a un epítopo inmunodominante). Para un ejemplo de este efecto con respuestas de células T a epítopos de células T del VHB en ratones, véase Schirmbeck R., et al. J. immunology 168: 6253-6262, 2010; o Sette et al. J Immunology 166: 138915 1397, 2001. En un aspecto de la divulgación, podrían administrarse diferentes composiciones que comprenden epítopos inmunodominantes o subdominantes en el mismo sitio de un individuo, o en una realización, en diferentes sitios en un individuo (es decir, la composición que comprende epítopos dominantes que se administra a un sitio y la composición que comprende epítopos subdominantes que se administran a un sitio diferente). En algunos casos, un epítopo subdominante puede inducir una respuesta inmunitaria más beneficiosa terapéuticamente que un epítopo 20 dominante. Por lo tanto, si se administra a sitios separados, puede reducir la probabilidad de que una respuesta inmunitaria a un epítopo dominante suprima o supere por competición una respuesta inmunitaria a un epítopo subdominante, maximizando de este modo la respuesta inmunitaria en su conjunto y maximizando el beneficio protector o terapéutico en un individuo. Este enfoque para proporcionar diferentes antígenos en diferentes composiciones administradas a diferentes sitios en el individuo también puede utilizarse incluso si todos los epítopos
25 son dominantes o subdominantes. Se ha reconocido que los epítopos inmunodominantes y los epítopos subdominantes desempeñan un papel en la infección por VHB y las respuestas inmunitarias (véase, por ejemplo, Sette et al., 2001, mencionado anteriormente y Schirmbeck et al., 2002, mencionado anteriormente).
En un caso de la divulgación, un antígeno del VHB útil en un producto inmunoterapéutico basado en levadura
30 maximiza la inclusión de dominios inmunogénicos, y, particularmente, epítopos de células T, que están conservados entre genotipos y/o subgenotipos y/o incluye dominios inmunogénicos de varios genotipos diferentes y/o subgenotipos diferentes y/o incluye dominios inmunogénicos que pueden modificarse fácilmente para producir múltiples productos inmunoterapéuticos basados en levadura que difieren en algunos aspectos menores, pero están adaptados para tratar a diferentes individuos o poblaciones de individuos basándose en el genotipo o los genotipos o
35 subgenotipo o subgenotipos del VHB que infectan a dichos individuos o poblaciones de individuos. Por ejemplo, el antígeno del VHB puede producirse basándose en un genotipo o subgenotipo que es más prevalente entre individuos o poblaciones de individuos para proteger o tratar, y el antígeno del VHB incluye los dominios inmunogénicos más conservados de esos genotipos. Como alternativa o además, los dominios inmunogénicos pueden modificarse para corresponder a una secuencia consenso para ese dominio o epítopo, o puede incluirse
40 más de una versión del epítopo en la construcción.
En cualquier caso de la divulgación relacionada con el diseño de un antígeno del VHB para una composición inmunoterapéutica basada en levadura, en un aspecto, las uniones artificiales entre segmentos de una proteína de fusión que comprende antígenos del VHB se minimizan (es decir, la inclusión de secuencias no naturales se limita o 45 minimiza en la medida de lo posible). Sin quedar ligado a la teoría, se cree que la evolución natural ha dado como
resultado: i) secuencias contiguas en el virus que es más probable que se expresen bien en otra célula, tal como una levadura; y ii) un inmunoproteasoma en células presentadoras de antígenos que pueden digerir apropiadamente y presentar las secuencias al sistema inmunitario. El producto inmunoterapéutico basado en levadura de la divulgación permite que el sistema inmunitario hospedador procese y presente antígenos diana; en consecuencia, una proteína
5 de fusión con muchos puntos de unión no naturales puede ser menos útil en un producto inmunoterapéutico basado en levadura en comparación con uno que conserve más de las secuencias de proteínas del VHB naturales.
En cualquiera de los antígenos del VHB descritos en el presente documento, incluyendo cualquiera de las proteínas de fusión, se pueden aplicar las siguientes realizaciones adicionales. En primer lugar, la secuencia de expresión N terminal y el marcador C terminal incluido en algunas de las proteínas de fusión son opcionales y, si se usan, pueden seleccionarse de varias secuencias diferentes descritas en otra parte del presente documento para mejorar la expresión, estabilidad y/o permitir la identificación y/o purificación de la proteína. Como alternativa, se omiten totalmente una o ambas de las secuencias N o C terminales. Además, se conocen en la técnica muchos promotores diferentes adecuados para su uso en levadura y están incluidos para su uso para expresar antígenos del VHB de
15 acuerdo con la presente invención. Además, pueden introducirse secuencias enlazadoras intermedias cortas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5, o más, péptidos de aminoácidos) entre partes de la proteína de fusión por una diversidad de razones, incluyendo la introducción de sitios de enzimas de restricción para facilitar la clonación y futura manipulación de las construcciones. Finalmente, como se analiza en detalle en otra parte del presente documento, las secuencias descritas en el presente documento son ejemplares y pueden modificarse como se describe en detalle en otra parte del presente documento para sustituir, añadir o suprimir secuencias para acomodar las preferencias para el genotipo del VHB, subgenotipo del VHB, cepa o aislado del VHB, o secuencias consenso e inclusión de epítopos de células T preferidos, incluyendo epítopos de células T dominantes y/o subdominantes. Se describe a continuación una descripción de varios antígenos del VHB ejemplares diferentes útiles en la divulgación.
25 En cualquiera de las realizaciones de la invención descritas en el presente documento, incluyendo cualquier realización relacionada con una composición inmunoterapéutica, antígeno del VHB, proteína de fusión o uso de dicha composición, antígeno del VHB o proteína de fusión, en un aspecto, un aminoácido de un antígeno de superficie del VHB útil como un antígeno del VHB o en una proteína de fusión o una composición inmunoterapéutica de la invención puede incluir, pero sin limitación, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, posiciones 21-47 de SEQ ID NO: 11, posiciones 176-400 de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, posiciones 9-407 de SEQ ID NO: 34, posiciones 6-257 de SEQ ID NO: 36, posiciones 6-257 de SEQ ID NO: 41, posiciones 92-343 de SEQ ID NO: 92, posiciones 90-488 de SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 97, posiciones 90-338 de SEQ ID NO: 101, posiciones 7-254 de SEQ ID NO: 102, posiciones 1-249 de SEQ ID NO: 107, posiciones 1-249 de SEQ ID NO: 108, posiciones 1-249 de SEQ ID NO: 109, posiciones 1-249 de SEQ ID NO: 110,
35 posiciones 1-399 de la SEQ ID NO: 112, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 114, o posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 116, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 118, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 120, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 122, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 124, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 126, posiciones 231-629 de SEQ ID NO: 128, posiciones 63-461 de SEQ ID NO: 130, posiciones 289-687 de SEQ ID NO: 132, posiciones 289-687 de SEQ ID NO: 134, o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente.
En cualquiera de las realizaciones de la invención descrita en el presente documento, incluyendo cualquier realización relacionada con una composición inmunoterapéutica, antígeno del VHB, proteína de fusión o uso de dicha composición, antígeno del VHB o proteína de fusión, en un aspecto, un aminoácido de un antígeno de núcleo del VHB útil como un antígeno del VHB o en una proteína de fusión o una composición inmunoterapéutica de la 45 invención puede incluir, pero sin limitación, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 1, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 5, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 9, posiciones 37 a 188 de SEQ ID NO: 9, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 13, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 17, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 21, posiciones 14-194 de SEQ ID NO: 25, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 29, posiciones 408-589 de SEQ ID NO: 34, posiciones 605 a 786 de SEQ ID NO: 36, posiciones 352-533 de SEQ ID NO: 38, posiciones 160-341 de SEQ ID NO: 39, posiciones 605-786 de SEQ ID NO: 41, posiciones 691-872 de SEQ ID NO: 92, posiciones 90-271 de SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 99, posiciones 567 a 718 de SEQ ID NO: 101, posiciones 483 a 634 de SEQ ID NO: 102, posiciones 2-183 de SEQ ID NO: 105, posiciones 184-395 de SEQ ID NO: 105, posiciones 396-578 de SEQ ID NO: 105, posiciones 579-761 de SEQ ID NO: 105, posiciones 2-183 de SEQ ID NO: 106, 338-520 de SEQ ID NO: 106, posiciones 478-629 de SEQ ID NO: 107, posiciones 478-629 de SEQ ID NO: 108, posiciones 478-629 de SEQ ID NO: 109, posiciones 478-629
55 de SEQ ID NO: 110, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 112, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 114, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 116, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 118, posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 120, posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 122, posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: ID NO: 124, posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 126, posiciones 630 a 811 de SEQ ID NO: 128, posiciones 462 a 643 de SEQ ID NO: 130, posiciones 688 a 869 de SEQ ID NO: 132, posiciones 688 a 869 de SEQ ID NO: 134, o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente.
En cualquiera de las realizaciones de la invención descritas en el presente documento, incluyendo cualquier realización relacionada con una composición inmunoterapéutica, antígeno del VHB, proteína de fusión o uso de dicha composición, antígeno del VHB o proteína de fusión, en un aspecto, un aminoácido de un antígeno X del VHB 65 útil como un antígeno del VHB o en una proteína de fusión o una composición inmunoterapéutica de la invención puede incluir, pero sin limitación, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, posiciones 2 a 154 de SEQ ID NO:
12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 4, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 8, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 12, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 16, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 20, posiciones 52-68 seguidas de
5 posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 24, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 28, posiciones 52-68 seguidas de posiciones 84-126 de SEQ ID NO: 32, posiciones 787 a 939 de SEQ ID NO: 36, posiciones 7-159 de SEQ ID NO: 39, posiciones 873-1025 de SEQ ID NO: 92, posiciones 90-242 de SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 100, posiciones 719-778 de SEQ ID NO: 101, posiciones 635-694 de SEQ ID NO: 102, posiciones 184337 de SEQ ID NO: 106, posiciones 521-674 de SEQ ID NO: 106, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 107, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 108, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 109, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 110, posiciones 582-641 de SEQ ID NO: 122, posiciones 810-869 de SEQ ID NO: 124, posiciones 582-641 de SEQ ID NO: 126, posiciones 1-60 de SEQ ID NO: 130, posiciones 229 a 288 de SEQ ID NO: 132, posiciones 1 a 60 de SEQ ID NO: 134, o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente.
15 Antígenos del VHB que Comprenden Antígeno de Superficie, Proteína de Núcleo y Antígeno X. En una realización de la invención, el antígeno o los antígenos del VHB para su uso en una composición o composición para su uso para tratar o prevenir infección por VHB o un síntoma de la misma de la invención es una proteína de fusión que comprende los antígenos del VHB, en la que los antígenos del VHB comprenden o consisten en: el antígeno de superficie del VHB (grande (L), mediano (M) o pequeño (S)) o al menos un dominio estructural, funcional o inmunogénico del mismo), la proteína de núcleo del VHB (HBcAg) o al menos un dominio estructural, funcional o inmunogénico de la misma y el antígeno X del VHB (HBx) o al menos un dominio estructural, funcional o inmunogénico del mismo. En un aspecto, uno cualquiera o más del antígeno de superficie del VHB, proteína del núcleo del VHB, antígeno X del VHB o dominio de los mismos es de longitud completa o de longitud casi completa. En un aspecto, uno cualquiera o más del antígeno de superficie del VHB, proteína de núcleo del VHB, antígeno X
25 del VHB o dominio de los mismos comprende al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la secuencia lineal de un antígeno de superficie del VHB, proteína del núcleo del VHB, antígeno X del VHB de longitud completa, o dominio de los mismos, respectivamente, o de las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 97 (antígeno de superficie del VHB optimizado), SEQ ID NO: 99 (proteína del núcleo optimizada), SEQ ID NO: 100 (antígeno X optimizado) o una secuencia correspondiente de otra cepa del VHB, según sea aplicable. En un aspecto, uno cualquiera o más del antígeno de superficie del VHB, proteína del núcleo del VHB, antígeno X del VHB o dominio de los mismos es al menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico a un antígeno de superficie del VHB, proteína del núcleo del VHB, antígeno X del VHB de longitud completa, o dominio de los mismos, respectivamente, o de las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 97 (antígeno de superficie del VHB optimizado), SEQ ID NO: 99
35 (proteína del núcleo optimizada), SEQ ID NO: 100 (antígeno X optimizado) o una secuencia correspondiente de otra cepa del VHB, según sea aplicable. Se describen en el presente documento una diversidad de secuencias adecuadas y ejemplares para antígenos de superficie del VHB adicionales, antígenos de núcleo del VHB y antígenos X del VHB útiles en esta construcción.
El Ejemplo 8 describe una proteína de fusión que contiene secuencias de antígeno de superficie, proteína de núcleo y antígeno X del VHB, en la que las secuencias se obtuvieron de segmentos de las proteínas de fusión representadas por SEQ ID NO: 110 y SEQ ID NO: 118. Este antígeno se basa en una secuencia consenso para el genotipo D del VHB; sin embargo, sería sencillo producir una proteína de fusión que tuviera una estructura general similar usando los segmentos de fusión correspondientes de las proteínas de fusión representadas por SEQ ID NO: 45 107 o SEQ ID NO: 112 (genotipo A), SEQ ID NO: 108 o SEQ ID NO: 114 (genotipo B), SEQ ID NO: 109 o SEQ ID NO: 116 (genotipo C) o usando las secuencias correspondientes de un genotipo, subgenotipo, secuencia de consenso o cepa del VHB diferente. En este ejemplo, se modificó técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar esta proteína de fusión bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1, y la composición inmunoterapéutica del VHB de levadura resultante puede denominarse en el presente documento GI-13016, ilustrada esquemáticamente en la Fig. 9. La proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 122 comprende, en orden, secuencias de antígeno de superficie, núcleo y antígeno X, como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal, representados por SEQ ID NO: 122 (secuencias opcionales que no son secuencias del VHB no están incluidas en la secuencia base de SEQ ID NO: 122, pero pueden añadirse a esta secuencia como en la construcción descrita en el Ejemplo 8): (1) 55 opcionalmente, un péptido N terminal que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a degradación proteasómica y estabilizar la expresión representada por SEQ ID NO: 37 (en la construcción descrita en el Ejemplo 8), que puede sustituirse por un péptido N terminal representado por SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 u otro péptido N terminal adecuado para su uso con un producto inmunoterapéutico basado en levadura como se describe en el presente documento; (2) opcionalmente, un péptido enlazador de uno a tres o más aminoácidos, tal como el enlazador de dos aminoácidos de Thr-Ser (en la construcción descrita en el Ejemplo 8); (3) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso de longitud casi completa (menos la posición 1) para antígeno de superficie grande (L) del genotipo D del VHB representado por las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 122 (correspondientes a las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 118); 4) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso para antígeno del núcleo del genotipo D de VHB representada por las posiciones 400 a 581 de SEQ ID 65 NO: 122 (correspondientes a las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 118); (5) una parte optimizada del antígeno X del VHB usando una secuencia consenso para el genotipo D de VHB, representada por las posiciones 582 a 641 de
SEQ ID NO: 122 (correspondientes a las posiciones 630 a 689 de SEQ ID NO: 110); y (6) opcionalmente, un marcador de hexahistidina (en la construcción descrita en el Ejemplo 8). La SEQ ID NO: 122 contiene múltiples epítopos de células T (humanos y murinos), que pueden encontrarse en la Tabla 5. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de SEQ ID NO: 122 (con codones optimizados para la expresión en levadura) está
5 representada en el presente documento por SEQ ID NO: 121.
El Ejemplo 8 también describe una proteína de fusión que contiene secuencias del antígeno de superficie, la proteína del núcleo y el antígeno X del VHB, en la que, como en la proteína de fusión que comprende SEQ ID NO: 122, las secuencias se obtuvieron de segmentos de las proteínas de fusión representadas por SEQ ID NO: 110 y SEQ ID NO: 118. Esta proteína de fusión difiere de la proteína de fusión que comprende SEQ ID NO: 122, sin embargo, en la disposición de los segmentos de fusión dentro de la proteína de fusión. Este antígeno se basa en una secuencia consenso para el genotipo D de VHB; sin embargo, sería sencillo producir una proteína de fusión que tuviera una estructura general similar usando los segmentos de fusión correspondientes de las proteínas de fusión representadas por SEQ ID NO: 107 o SEQ ID NO: 112 (genotipo A), SEQ ID NO: 108 o SEQ ID NO: 1114 (genotipo 15 B), SEQ ID NO: 109 o SEQ ID NO: 116 (genotipo C), o usando las secuencias correspondientes de un genotipo, subgenotipo, secuencia consenso o cepa del VHB diferente. En este ejemplo, se modificó técnicamente la levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar esta proteína de fusión bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1, y la composición inmunoterapéutica del VHB de levadura resultante puede denominarse en el presente documento GI-13020, ilustrada esquemáticamente en la Fig. 13. La proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 130 comprende, en orden, secuencias de antígeno X, antígeno de superficie y antígeno de núcleo, como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal, representados por SEQ ID NO: 130 (no se incluyen secuencias opcionales que no sean secuencias del VHB en la secuencia básica de SEQ ID NO: 130, con la excepción del enlazador Leu-Glu entre el segmento del antígeno X y el segmento de antígeno de superficie en la construcción ejemplificada en el presente documento, pero 25 puede añadirse a esta secuencia como en la construcción descrita en el Ejemplo 8): (1) opcionalmente, un péptido N terminal que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a la degradación proteasómica y estabilizar la expresión representado por la SEQ ID NO: 37 (en la construcción descrita en el Ejemplo 8), que puede sustituirse por un péptido N terminal representado por la SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 u otro péptido N terminal adecuado para su uso con un producto inmunoterapéutico basado en levadura como se describe en el presente documento; (2) opcionalmente, un péptido enlazador de uno a tres o más aminoácidos, tal como el enlazador de dos aminoácidos de Thr-Ser (en la construcción descrita en el Ejemplo 8); (3) una parte optimizada de antígeno X del VHB que usa una secuencia consenso para el genotipo D de VHB, representada por las posiciones 1 a 60 de SEQ ID NO: 130 (correspondientes a las posiciones 630 a 689 de SEQ ID NO: 110); (4) opcionalmente, un péptido enlazador de uno a tres o más aminoácidos, tal como el enlazador de dos aminoácidos de Leu-Glu (en la 35 construcción descrita en el Ejemplo 8), representado por las posiciones 61 a 62 de SEQ ID NO: 130; (5) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso de longitud casi completa (menos la posición 1) para antígeno de superficie grande (L) del genotipo D de VHB representado por las posiciones 63 a 461 de SEQ ID NO: 130 (correspondientes a las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 118); (6) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso para antígeno de núcleo del genotipo D de VHB representada por las posiciones 462 a 643 de SEQ ID NO: 130 (correspondientes a las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 118); y (7) opcionalmente, un marcador de hexahistidina (en la construcción descrita en el Ejemplo 8). La SEQ ID NO: 130 contiene múltiples epítopos de células T (humanos y murinos), que pueden encontrarse en la Tabla 5. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión completa descrita en el Ejemplo 8 que comprende SEQ ID NO: 130 y que incluye los péptidos N y C terminales y todos los enlazadores se representan en el presente documento por SEQ ID NO: 150. Se representa
45 una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de SEQ ID NO: 130 o SEQ ID NO: 150 (con codones optimizados para expresión en levadura) en el presente documento por SEQ ID NO: 129.
Antígenos del VHB que Comprenden Proteínas del VHB de Dos o Más Genotipos. Otro caso de la divulgación se refiere a antígenos del VHB para su uso en una composición inmunoterapéutica de la divulgación que maximiza la dirección de genotipos y/o subgenotipos del VHB para proporcionar composiciones con el potencial de tratar a un gran número de individuos o poblaciones de individuos usando una composición. Dichas composiciones se producen en general de forma más eficaz (es decir, tienen una ventaja de producción por incluir múltiples antígenos y/o un enfoque consenso para dirigirse a genotipos) y son más eficaces para utilizar en una amplia diversidad de situaciones clínicas (por ejemplo, una composición puede servir a muchos tipos diferentes de poblaciones de
55 pacientes en muchos entornos geográficos diferentes). Como se ha analizado anteriormente, para producir dichos antígenos del VHB, pueden seleccionarse antígenos conservados y/o dominios conservados (entre genotipos del VHB), y los antígenos pueden diseñarse para maximizar la inclusión de dominios inmunológicos conservados.
Realizaciones Adicionales con Respecto a Antígenos del VHB. En algunos aspectos de la divulgación, pueden realizarse inserciones, supresiones y/o sustituciones de aminoácidos para uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más aminoácidos de una proteína del VHB de tipo silvestre o de referencia, siempre que la proteína del VHB resultante, cuando se use como un antígeno en una composición inmunoterapéutica del VHB de levadura de la divulgación, induzca una respuesta inmunitaria contra la proteína del VHB diana o de tipo silvestre o de referencia, que puede incluir una respuesta inmunitaria potenciada, una respuesta inmunitaria reducida o una 65 respuesta inmunitaria sustancialmente similar. Por ejemplo, la divulgación describe el uso de antígenos agonistas del VHB, que pueden incluir uno o más epítopos de células T que se han mutado para potenciar la respuesta de
células T contra el agonista del VHB, tal como mejorando la avidez o afinidad del epítopo por una molécula del MHC
o por el receptor de células T que reconoce el epítopo en el contexto de presentación del MHC. Los agonistas de proteínas del VHB pueden por lo tanto mejorar la potencia o eficacia de una respuesta de células T contra proteínas del VHB nativas que infectan un hospedador.
5 En referencia a cualquiera de los antígenos y proteínas de fusión del VHB descritos anteriormente, es un aspecto de la invención usar los antígenos del VHB de proteínas del VHB individuales dentro de la proteína de fusión (del antígeno de superficie del VHB, el núcleo del VHB y antígeno X del VHB) para construir antígenos de “proteínas individuales” (por ejemplo, antígenos de solamente una de estas proteínas del VHB), o para construir proteínas de fusión usando solamente dos o tres de los segmentos de proteínas del VHB, si es aplicable a la proteína de fusión de referencia dada. También es un aspecto de la invención cambiar el orden de segmentos de proteínas del VHB dentro de la proteína de fusión. Como otro diseño alternativo, pueden combinarse genotipos y/o secuencias consenso del VHB en los que dos, tres, cuatro o más genotipos y/o secuencias consenso se usan para construir la proteína de fusión.
15 También se describen en el presente documento homólogos de cualquiera de las proteínas de fusión anteriormente descritas, así como el uso de homólogos, variantes o mutantes de las proteínas del VHB individuales o partes de las mismas (incluyendo cualquier dominio funcional y/o inmunogénico) que son parte de dichas proteínas de fusión o se describen también de otro modo en el presente documento. En un aspecto, el uso de proteínas de fusión o proteínas del VHB individuales (sencillas) o antígenos del VHB, que tienen secuencias de aminoácidos que son al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las proteínas de fusión o proteínas del VHB individuales o antígenos del VHB, respectivamente, se describe en el presente documento, incluyendo cualquiera de las proteínas del VHB, antígenos del VHB y proteínas de fusión a las que se hace referencia por un identificador de secuencia
25 específico en el presente documento, sobre la longitud completa de la proteína de fusión, o con respecto a un segmento definido en la proteína de fusión o una proteína definida o un dominio de la misma (dominio inmunogénico
o dominio funcional (es decir, un dominio con al menos una actividad biológica)) que forma parte de la proteína de fusión. Se conocen en la técnica muchos epítopos de CTL (epítopos que son reconocidos por linfocitos T citotóxicos de pacientes infectados con VHB) y mutaciones de escape (mutaciones que surgen en una proteína del VHB debido a presión selectiva de un fármaco antivírico) y esta información también puede usarse para realizar sustituciones o crear variantes u homólogos de los antígenos del VHB descritos en el presente documento para proporcionar una secuencia específica en el antígeno del VHB de la invención.
Composiciones Inmunoterapéuticas Basadas en Levadura. En diversos casos de la divulgación, la divulgación
35 incluye el uso de al menos una “composición inmunoterapéutica basada en levadura” (expresión que puede usarse indistintamente con “producto inmunoterapéutico basado en levadura”, “composición inmunoterapéutica basada en levadura”, “composición basada en levadura”, “inmunoterapia basada en levadura”, “vacuna basada en levadura” o derivados de estas expresiones). Una “composición inmunoterapéutica” es una composición que induce una respuesta inmunitaria suficiente para conseguir al menos un beneficio terapéutico en un sujeto. Como se usa en el presente documento, la composición inmunoterapéutica basada en levadura se refiere a una composición que incluye un componente de vehículo de levadura y que induce una respuesta inmunitaria suficiente para conseguir al menos un beneficio terapéutico en un sujeto. Más particularmente, una composición inmunoterapéutica basada en levadura es una composición que incluye un componente de vehículo de levadura y puede inducir o provocar una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta inmunitaria celular, incluyendo sin limitación una respuesta
45 inmunitaria celular mediada por células T. En un aspecto, una composición inmunoterapéutica basada en levadura útil en la invención es capaz de inducir una respuesta inmunitaria mediada por células T CD8+ y/o CD4+ y en un aspecto, una respuesta inmunitaria mediada por células T CD8+ y CD4+. Opcionalmente, una composición inmunoterapéutica basada en levadura es capaz de inducir una respuesta inmunitaria humoral. Una composición inmunoterapéutica basada en levadura útil en la presente invención puede provocar, por ejemplo, una respuesta inmunitaria en un individuo de modo que el individuo esté protegido de la infección por VHB y/o se trate para infección por VHB o para síntomas resultantes de infección por VHB.
Las composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura de la invención pueden ser “profilácticas” o “terapéuticas”. Cuando se proporcionan profilácticamente, las composiciones de la presente invención se
55 proporcionan antes de cualquier síntoma de infección por VHB. Dicha composición podría administrarse al nacer, en la infancia temprana o a adultos. La administración profiláctica de las composiciones inmunoterapéuticas sirve para prevenir la infección por VHB posterior, para resolver una infección más rápidamente o más completamente si se produce posteriormente infección por VHB y/o para aliviar los síntomas de infección por VHB si se produce posteriormente infección. Cuando se proporcionan terapéuticamente, las composiciones inmunoterapéuticas se proporcionan en o después de la aparición de infección por VHB, con el objetivo de aliviar al menos un síntoma de la infección y preferentemente con el objetivo de eliminar la infección, proporcionando una remisión de larga duración de la infección y/o proporcionando inmunidad a largo plazo contra infecciones posteriores o reactivaciones del virus. En un aspecto, un objetivo del tratamiento es la pérdida de carga vírica de VHB detectable o reducción de la carga vírica de VHB (por ejemplo, niveles por debajo de lo detectable por PCR o <2000 UI/ml). En un aspecto, un objetivo
65 del tratamiento es la eliminación vírica sostenida durante al menos 6 meses después de completar la terapia. En un aspecto, un objetivo del tratamiento es la pérdida de proteínas HBeAg y/o HBsAg en suero detectables. En un
aspecto, un objetivo del tratamiento es el desarrollo de anticuerpos contra el antígeno de superficie de la hepatitis B (anti-HBs) y/o anticuerpos contra HBeAg. En un aspecto, el objetivo del tratamiento es la seroconversión, que puede definirse por: (a) 10 o más unidades de relación de muestra (URM) como se determina por radioinmunoensayo; (b) un resultado positivo como se determina por inmunoensayo enzimático; o (c) detección de una concentración de
5 anticuerpos de ≥10 mUI/ml (10 URM es comparable a 10 mUI/ml de anticuerpo). En un aspecto, un objetivo del tratamiento es la normalización de los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) en suero, mejora de la inflamación del hígado y/o mejora de la fibrosis hepática.
En cualquiera de las composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura usadas en la presente invención, se incluyen en la invención los siguientes aspectos relacionados con el vehículo de levadura. De acuerdo con la presente invención, un vehículo de levadura es cualquier célula de levadura (por ejemplo, una célula completa o intacta) o un derivado de la misma (véase posteriormente) que puede usarse junto con uno o más antígenos, dominios inmunogénicos de los mismos o epítopos de los mismos en una composición terapéutica de la invención, o en un aspecto, el vehículo de levadura puede usarse solo o como un adyuvante. El vehículo de levadura puede
15 incluir por lo tanto, pero sin limitación, un microorganismo de levadura intacto (completo) vivo (es decir, una célula de levadura que tiene todos sus componentes incluyendo una pared celular), un microorganismo de levadura intacto destruido (muerto) o inactivado o derivados de levadura intacta/completa incluyendo: un esferoplasto de levadura (es decir, una célula de levadura que carece de pared celular), un citoplasto de levadura (es decir, una célula de levadura que carece de pared celular y núcleo), un fantasma de levadura (es decir una célula de levadura que carece de pared celular, núcleo y citoplasma), un extracto de membrana de levadura subcelular o fracción del mismo (también denominado partícula de membrana de levadura y previamente partícula de levadura subcelular), cualquier otra partícula de levadura o una preparación de pared celular de levadura.
Se producen típicamente esferoplastos de levadura por digestión enzimática de la pared celular de levadura. Dicho 25 método se describe, por ejemplo, en Franzusoff et al., 1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674.
Se producen típicamente citoplastos de levadura por enucleación de células de levadura. Dicho método se describe, por ejemplo, en Coon, 1978, Natl. Cáncer Inst. Monogr. 48, 45-55.
Los fantasmas de levadura se producen típicamente volviendo a sellar una célula permeabilizada o lisada y pueden contener, aunque no es necesario, al menos algunos de los órganos de esa célula. Dicho método se describe, por ejemplo, en Franzusoff et al., 1983, J. Biol. Chem. 258, 3608-3614 y Bussey et al., 1979, Biochim. Biophys. Acta 553, 185-196.
35 Una partícula de membrana de levadura (extracto de membrana de levadura subcelular o fracción del mismo) se refiere a una membrana de levadura que carece de un núcleo natural o citoplasma. La partícula puede ser de cualquier tamaño, incluyendo tamaños que varían del tamaño de una membrana de levadura natural a micropartículas producidas por ultrasonidos u otros métodos de rotura de membrana conocidos por los expertos en la materia, seguidos de resellado. Se describe un método para producir extractos de membrana de levadura subcelular, por ejemplo, en Franzusoff et al., 1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674. También se pueden usar fracciones de partículas de membrana de levadura que contienen partes de membranas de levadura y, cuando el antígeno u otra proteína se expresó de forma recombinante por la levadura antes de la preparación de las partículas de membrana de levadura, el antígeno u otra proteína de interés. Pueden portarse antígenos u otras proteínas de interés dentro de la membrana, en la superficie de la membrana, o combinaciones de las mismas (es decir, la
45 proteína puede estar tanto dentro como fuera de la membrana y/o atravesar la membrana de la partícula de membrana de levadura). En una realización, una partícula de membrana de levadura es una partícula de membrana de levadura recombinante que puede ser una membrana de levadura intacta, rota o rota y resellada que incluye al menos un antígeno deseado u otra proteína de interés en la superficie de la membrana o al menos parcialmente incluido dentro de la membrana.
Un ejemplo de una preparación de pared celular de levadura es una preparación de paredes celulares de levadura aisladas que portan un antígeno en su superficie o al menos parcialmente incluido dentro de la pared celular de modo que la preparación de pared celular de levadura, cuando se administre a un animal, estimula una respuesta inmunitaria deseada contra una diana de enfermedad.
55 Puede usarse cualquier cepa de levadura para producir un vehículo de levadura de la presente invención. La levadura es un microorganismo unicelular que pertenece a una de tres clases: Ascomicetos, Basidiomicetos y Hongos Imperfectos. Una consideración para la selección de un tipo de levadura para uso como un modulador inmunitario es la patogenia de la levadura. En una realización, la levadura es una cepa no patógena tal como Saccharomyces cerevisiae. La selección de una cepa de levadura no patógena minimiza cualquier efecto adverso para el individuo al que se administra el vehículo de levadura. Sin embargo, puede usarse levadura patógena si la patogenia de la levadura puede neutralizarse por cualquier medio conocido por un experto en la materia (por ejemplo, cepas mutantes).
65 Los géneros de cepas de levadura que pueden usarse en la invención incluyen pero sin limitación Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Schizosaccharomyces y Yarrowia. En un
aspecto, los géneros de levadura se seleccionan de Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia o Schizosaccharomyces, y en un aspecto, los géneros de levadura se seleccionan de Saccharomyces, Hansenula y Pichia, y en un aspecto, se usa Saccharomyces. Las especies de cepas de levadura que pueden usarse en la invención incluyen pero sin limitación Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Candida albicans, 5 Candida kefyr, Candida tropicalis, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Hansenula anomala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Pichia pastoris, Rhodotorula rubra, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Se apreciará que varias de estas especies incluyen una diversidad de subespecies, tipos, subtipos, etc. que se pretende incluir dentro de la especie anteriormente mencionada. En un aspecto, las especies de levaduras usadas en la invención incluyen S. cerevisiae,
C. albicans, H. polymorpha, P. pastoris y S. pombe. S. cerevisiae es útil ya que es relativamente fácil de manipular y a que es “reconocida en general como segura” o “GRAS” para su uso como aditivo alimentario (GRAS, Norma propuesta por la FDA 62FR18938, 17 de abril de 1997). Una realización de la presente invención es una cepa de levadura que es capaz de replicar plásmidos a un número de copias particularmente alto, tal como la cepa cir0 de S. cerevisiae. La cepa de S. cerevisiae es tal cepa que sea capaz de soportar los vectores de expresión que permiten
15 que se expresen uno o más antígenos diana y/o proteína o proteínas de fusión y/u otras proteínas a altos niveles. Además, puede usarse cualquier cepa de levadura mutante en la presente invención, incluyendo las que muestran modificaciones postraduccionales reducidas de antígenos diana u otras proteínas expresados, tales como mutaciones en las enzimas que extienden la glucosilación ligada a N.
Se producen proteínas de fusión que se usan como componente de la composición inmunoterapéutica basada en levadura de la invención usando construcciones que son particularmente útiles para mejorar o potenciar la expresión, o la estabilidad de expresión, de antígenos recombinantes en levadura. Típicamente, la proteína o las proteínas o el péptido o los péptidos antigénicos deseados se fusionan en su extremo amino terminal con: (a) un péptido sintético específico que estabiliza la expresión de la proteína de fusión en el vehículo de levadura o evita la 25 modificación postraduccional de la proteína de fusión expresada (dichos péptidos se describen en detalle, por ejemplo, en la Publicación de Patente de Estados Unidos n.º 2004-0156858 A1, publicada el 12 de agosto de 2004, incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad); (b) al menos una parte de una proteína de levadura endógena, incluyendo pero sin limitación factor alfa, en la que un compañero de fusión proporciona estabilidad mejorada de expresión de la proteína en la levadura y/o evita la modificación postraduccional de las proteínas por las células de levadura (dichas proteínas también se describen en detalle, por ejemplo, en la Publicación de Patente de Estados Unidos n.º 2004-0156858 A1, mencionado anteriormente); y/o (c) al menos una parte de una proteína de levadura que provoca que la proteína de fusión se exprese en la superficie de la levadura (por ejemplo, una proteína Aga descrita en más detalle en el presente documento). Además, la presente invención incluye opcionalmente el uso de péptidos que se fusionan con el extremo C terminal de la construcción que codifica
35 el antígeno, particularmente para uso en la selección e identificación de la proteína. Dichos péptidos incluyen, pero sin limitación, cualquier péptido sintético o natural, tal como un marcador peptídico (por ejemplo, hexahistidina) o cualquier otro marcador epitópico corto. Los péptidos unidos al extremo C terminal de un antígeno de acuerdo con la invención pueden usarse con o sin la adición de los péptidos N terminales analizados anteriormente.
En una realización, se une un péptido sintético útil en una proteína de fusión con el extremo N terminal del antígeno, consistiendo el péptido en al menos dos restos de aminoácidos que son heterólogos para el antígeno, en el que el péptido estabiliza la expresión de la proteína de fusión en el vehículo de levadura o evita la modificación postraduccional de la proteína de fusión expresada. El péptido sintético y la parte N terminal del antígeno forman juntos una proteína de fusión que tiene los siguientes requisitos: (1) el resto de aminoácido en la posición uno de la 45 proteína de fusión es una metionina (es decir, el primer aminoácido en el péptido sintético es una metionina); (2) el resto de aminoácido en la posición dos de la proteína de fusión no es una glicina o una prolina (es decir, el segundo aminoácido en el péptido sintético no es una glicina o una prolina); (3) ninguno de los restos de aminoácidos en las posiciones 2-6 de la proteína de fusión es una metionina (es decir, los aminoácidos en las posiciones 2-6, bien parte del péptido sintético o de la proteína, si el péptido sintético es de menos de 6 aminoácidos, no incluyen una metionina); y (4) ninguno de los aminoácidos en las posiciones 2-6 de la proteína de fusión es una lisina o una arginina (es decir, los aminoácidos en las posiciones 2-6, bien parte del péptido sintético o de la proteína, si el péptido sintético es de menos de 5 aminoácidos, no incluyen una lisina o una arginina). El péptido sintético puede ser tan corto como de dos aminoácidos, pero en un aspecto, es de 2-6 aminoácidos (incluyendo 3, 4, 5 aminoácidos) y puede ser de más de 6 aminoácidos, en números enteros, hasta aproximadamente 200 aminoácidos, 300
55 aminoácidos, 400 aminoácidos, 500 aminoácidos o más.
En una realización, una proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de M-X2-X3-X4-X5-X6, en la que M es metionina; en la que X2 es cualquier aminoácido excepto glicina, prolina, lisina o arginina; en la que X3 es cualquier aminoácido excepto metionina, lisina o arginina; en la que X4 es cualquier aminoácido excepto metionina, lisina o arginina; en la que X5 es cualquier aminoácido excepto metionina, lisina o arginina; y en la que X6 es cualquier aminoácido excepto metionina, lisina o arginina. En una realización, el resto X6 es una prolina. Una secuencia sintética ejemplar que potencia la estabilidad de la expresión de un antígeno en una célula de levadura y/o evita la modificación postraduccional de la proteína en la levadura incluye la secuencia M-A-D-E-A-P (SEQ ID NO: 37). Otra secuencia sintética ejemplar con las mismas propiedades es M-V. Además de la estabilidad 65 potenciada del producto de expresión, estos compañeros de fusión no parecen influir negativamente en la respuesta inmunitaria contra el antígeno inmunizador en la construcción. Además, los péptidos de fusión sintéticos pueden
diseñarse para proporcionar un epítopo que puede ser reconocido por un agente de selección, tal como un anticuerpo.
En una realización, el antígeno del VHB está unido en el extremo N terminal con una proteína de levadura, tal como
5 una secuencia prepro de factor alfa (también denominada la secuencia líder de señal de factor alfa), cuya secuencia de aminoácidos se ejemplifica en el presente documento por SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 90. Se conocen en la técnica otras secuencias para secuencia prepro de factor alfa de levadura y están incluidas para su uso en la presente invención.
En un aspecto de la invención, el vehículo de levadura se manipula de modo que el antígeno se exprese o proporcione por suministro o translocación de un producto proteico expresado, parcial o completamente, en la superficie del vehículo de levadura (expresión extracelular). Un método para conseguir este aspecto de la invención es usar una rama espaciadora para situar una o más proteínas en la superficie del vehículo de levadura. Por ejemplo, se puede usar una rama espaciadora para crear una proteína de fusión del antígeno o los antígenos u otra 15 proteína de interés con una proteína que dirija el antígeno o los antígenos u otra proteína de interés a la pared celular de levadura. Por ejemplo, una de dichas proteínas que puede usarse para dirigir otras proteínas es una proteína de levadura (por ejemplo, proteína de la pared celular 2 (cwp2), proteína Aga2, Pir4 o Flo1) que permite que el antígeno o los antígenos u otra proteína se dirija a la pared celular de levadura de modo que el antígeno u otra proteína se localice en la superficie de la levadura. Pueden usarse proteínas distintas de proteínas de levadura para la rama espaciadora; sin embargo, para cualquier proteína de la rama espaciadora, es más deseable tener la respuesta inmunogénica dirigida contra el antígeno diana en lugar de la proteína de la rama espaciadora. Como tal, si se usan otras proteínas para la rama espaciadora, entonces la proteína de rama espaciadora que se usa no debería generar una respuesta inmunitaria tan grande para la proteína de la rama espaciadora en sí misma de modo que la respuesta inmunitaria al antígeno o los antígenos diana se supere. Un experto en la materia debería buscar
25 una respuesta inmunitaria pequeña a la proteína de la rama espaciadora en relación con la respuesta inmunitaria para el antígeno o los antígenos diana. Pueden construirse ramas espaciadoras para que tengan sitios de escisión (por ejemplo, sitios de escisión por proteasa) que permitan que el antígeno se retire o se separe por procesamiento fácilmente de la levadura, si se desea. Puede usarse cualquier método conocido para determinar la magnitud de las respuestas inmunitarias (por ejemplo, producción de anticuerpos, ensayos líticos, etc.) y los expertos en la materia los conocen fácilmente.
Otro método para situar el antígeno o los antígenos diana u otras proteínas para exponer en la superficie de levadura es usar secuencias señales tales como glucosilfosfatidil inositol (GPI) para anclar la diana a la pared de la célula de levadura. Como alternativa, puede conseguirse la colocación adjuntando secuencias señal que dirigen el
35 antígeno o los antígenos u otras proteínas de interés a la ruta secretora mediante translocación al retículo endoplásmico (RE) de modo que el antígeno se une con una proteína que está unida a la pared celular (por ejemplo, cwp).
En un aspecto, la proteína de rama espaciadora es una proteína de levadura. La proteína de levadura puede consistir en entre aproximadamente dos y aproximadamente 800 aminoácidos de una proteína de levadura. En una realización, la proteína de levadura es de aproximadamente 10 a 700 aminoácidos. En otra realización, la proteína de levadura es de aproximadamente 40 a 600 aminoácidos. Otras realizaciones de la invención incluyen la proteína de levadura que es de al menos 250 aminoácidos, al menos 300 aminoácidos, al menos 350 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos, al menos 450 aminoácidos, al menos 500 aminoácidos, al menos 550 aminoácidos ácidos, al
45 menos 600 aminoácidos o al menos 650 aminoácidos. En una realización, la proteína de levadura es de al menos 450 aminoácidos de longitud. Otra consideración para optimizar la expresión de antígeno de superficie, si se desea, es si la combinación de antígeno y rama espaciadora debería expresarse como un monómero o como dímero o como un trímero, o incluso más unidades conectadas entre sí. Este uso de monómeros, dímeros, trímeros, etc. permiten la separación o el plegamiento apropiado del antígeno de modo que alguna parte, si no todo, del antígeno se presenta en la superficie del vehículo de levadura de manera que lo haga más inmunogénico.
El uso de proteínas de levadura puede estabilizar la expresión de proteínas de fusión en el vehículo de levadura, evita la modificación postraduccional de la proteína de fusión expresada y/o dirige la proteína de fusión a un compartimento particular en la levadura (por ejemplo, para expresar en la superficie de célula de levadura). Para
55 suministro a la ruta secretora de levadura, las proteínas de levadura ejemplares para usar incluyen, pero sin limitación: Aga (incluyendo, pero sin limitación, Aga1 y/o Aga2); SUC2 (invertasa de levadura); secuencia líder señal de factor alfa; CPY; Cwp2p para su localización y retención en la pared celular; genes de BUD para su localización en la yema de célula de levadura durante la fase inicial de la formación de células descendientes; Flo1p; Pir2p; y Pir4p.
Otras secuencias pueden usarse para dirigir, retener y/o estabilizar la proteína en otras partes del vehículo de levadura, por ejemplo, en el citosol o las mitocondrias o el retículo endoplasmático o el núcleo. Los ejemplos de proteína de levadura adecuada que pueden usarse para cualquiera de las realizaciones anteriores incluyen, pero sin limitación, TK, AF, SEC7; fosfoenolpiruvato carboxiquinasa PCK1, fosfogliceroquinasa PGK y productos génicos de 65 triosa fosfato isomerasa TPI para su expresión reprimible en glucosa y localización citosólica; las proteínas de choque térmico SSA1, SSA3, SSA4, SSC1, cuya expresión se induce y cuyas proteínas son más termoestables tras
exposición de células al tratamiento por calor; la proteína mitocondrial CYC1 para importar en mitocondrias; ACT 1.
Se describen métodos para producir vehículos de levadura y expresar, combinar y/o asociar vehículos de levadura con antígenos y/u otras proteínas y/o agentes de interés para producir composiciones inmunoterapéuticas basadas 5 en levadura.
La expresión “complejo de antígeno-vehículo de levadura” o “complejo de antígeno-levadura” se usa de forma genérica para describir cualquier asociación de un vehículo de levadura con un antígeno, y puede usarse indistintamente con “composición inmunoterapéutica basada en levadura” cuando dicha composición se usa para
10 provocar una respuesta inmunitaria como se ha descrito anteriormente. Dicha asociación incluye expresión del antígeno por la levadura (una levadura recombinante), introducción de un antígeno en una levadura, unión física del antígeno a la levadura y mezcla de la levadura y el antígeno entre sí, tal como en un tampón u otra solución o formulación. Estos tipos de complejos se describen en detalle posteriormente.
15 En una realización, una célula de levadura usada para preparar el vehículo de levadura se transfecta con una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica una proteína (por ejemplo, el antígeno) de modo que la proteína es expresada por la célula de levadura. Dicha levadura también se denomina en el presente documento levadura recombinante o un vehículo de levadura recombinante. La célula de levadura puede después cargarse en la célula dendrítica como una célula intacta, o la célula de levadura puede destruirse, o puede derivatizarse tal como por
20 formación de esferoplastos, citoplastos, fantasmas o partículas subcelulares de levadura, cualquiera de los cuales se sigue de carga del derivado en la célula dendrítica. Los esferoplastos de levadura también pueden transfectarse directamente con una molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, el esferoplasto se produce a partir de una levadura completa y después se transfecta) para producir un esferoplasto recombinante que expresa un antígeno u otra proteína.
25 En general, el vehículo y el antígeno o los antígenos de levadura y/u otros agentes pueden asociarse por cualquier técnica descrita en el presente documento. En un aspecto, el vehículo de levadura se cargó intracelularmente con el antígeno o los antígenos y/o agente o agentes. En otro aspecto, el antígeno o antígenos y/o agente o agentes se unieron covalentemente o no covalentemente con el vehículo de levadura. En otro aspecto más, el vehículo de
30 levadura y el antígeno o los antígenos y/o agente o agentes se asociaron mezclando. En otro aspecto, y en una realización, el antígeno o antígenos y/o agente o agentes se expresan de forma recombinante por el vehículo de levadura o por la célula de levadura o esferoplasto de levadura del que se obtuvo el vehículo de levadura.
Varios antígenos y/u otras proteínas para producir por un vehículo de levadura de la presente invención es cualquier
35 variedad de antígenos y/u otras proteínas que puedan producirse de forma razonable por un vehículo de levadura, y típicamente varía de al menos uno a al menos aproximadamente 6 o más, incluyendo de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 antígenos heterólogos y/u otras proteínas.
Se consigue expresión de un antígeno u otra proteína en un vehículo de levadura de la presente invención usando
40 técnicas conocidas por los expertos en la materia. Brevemente, una molécula de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno deseado u otra proteína se inserta en un vector de expresión de tal manera que la molécula de ácido nucleico se una operativamente con una secuencia de control de la transcripción para poder efectuar expresión constitutiva o regulada de la molécula de ácido nucleico cuando se transforma en una célula de levadura hospedadora. Las moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más antígenos y/u otras proteínas pueden estar
45 en uno o más vectores de expresión unidas operativamente con una o más secuencias de control de la expresión. Son secuencias de control de la expresión particularmente importantes las que controlan el inicio de la transcripción, tal como secuencias promotoras y de activación cadena arriba. Puede usarse cualquier promotor de levadura adecuado en la presente invención y los expertos en la materia conocen una diversidad de dichos promotores. Los promotores para expresión en Saccharomyces cerevisiae incluyen, pero sin limitación, promotores de genes que
50 codifican las siguientes proteínas de levadura: alcohol deshidrogenasa I (ADH1) o II (ADH2), CUP1, fosfoglicerato quinasa (PGK), triosa fosfato isomerasa (TPI), factor de elongación de la traducción EF-1 alfa (TEF2), gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; también denominado TDH3, para triosa fosfato deshidrogenasa), galactoquinasa (GAL1), galactosa-1-fosfato uridil transferasa (GAL7), UDP-galactosa epimerasa (GAL10), citocromo c1 (CYC1), proteína Sec7 (SEC7) y fosfatasa ácida (PHO5), incluyendo promotores híbridos tales como promotores
55 ADH2/GAPDH y CYC1/GAL10, e incluyendo el promotor ADH2/GAPDH, que se induce cuando las concentraciones de glucosa en la célula son bajas (por ejemplo, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,2 por ciento), así como el promotor CUP1 y el promotor TEF2. De forma similar, se conocen varias secuencias de activación cadena arriba (UAS) también denominadas potenciadores. Las secuencias de activación cadena arriba para expresión en Saccharomyces cerevisiae incluyen, pero sin limitación, las UAS de genes que codifican las siguientes proteínas:
60 PCK1, TPI, TDH3, CYC1, ADH1, ADH2, SUC2, GAL1, GAL7 y GAL10, así como otras UAS activadas por el producto génico de GAL4, usándose la UAS ADH2 en un aspecto. Ya que la UAS ADH2 se activa por el producto génico de ADR1, puede ser preferible sobreexpresar el gen de ADR1 cuando un gen heterólogo está unido operativamente con la UAS ADH2. Las secuencias de terminación de la transcripción para expresión en Saccharomyces cerevisiae incluyen las secuencias de terminación de los genes del factor α, GAPDH y CYC1.
Las secuencias de control de la transcripción para expresar genes en levadura metiltrópica incluyen las regiones de control de la transcripción de los genes que codifican alcohol oxidasa y formiato deshidrogenasa.
Puede conseguirse transfección de una molécula de ácido nucleico en una célula de levadura de acuerdo con la
5 presente invención por cualquier método por el que puede introducirse una molécula de ácido nucleico en la célula e incluye, pero sin limitación, difusión, transporte activo, ultrasonidos en baño, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción y fusión de protoplastos. Las moléculas de ácido nucleico transfectadas pueden integrarse en un cromosoma de levadura o mantenerse en vectores extracromosómicos usando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Se desvelan en detalle en el presente documento ejemplos de vehículos de levadura que portan dichas moléculas de ácido nucleico. Como se ha analizado anteriormente, también pueden producirse citoplasto de levadura, fantasma de levadura y partículas de membrana de levadura o preparaciones de pared celular de forma recombinantemente transfectando microorganismos de levadura intactos o esferoplastos de levadura con moléculas de ácido nucleico deseadas, produciendo el antígeno en las mismas y manipulando después adicionalmente los microorganismos o esferoplastos usando técnicas conocidas por los expertos en la materia para
15 producir citoplasto, fantasma o extracto de membrana de levadura subcelular o fracciones de los mismos que contienen antígenos deseados u otras proteínas.
Las condiciones eficaces para la producción de vehículos de levadura recombinantes y expresión del antígeno y/u otra proteína por el vehículo de levadura incluyen un medio eficaz en el que puede cultivarse una cepa de levadura. Un medio eficaz es típicamente un medio acuoso que comprende fuentes asimilables de carbohidratos, nitrógeno y fosfato, así como sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas y factores de crecimiento. El medio puede comprender nutrientes complejos o puede ser un medio mínimo definido. Pueden cultivarse cepas de levadura de la presente invención en una diversidad de recipientes, incluyendo, pero sin limitación, biorreactores, matraces de Erlenmeyer, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas de Petri. El
25 cultivo se lleva a cabo a una temperatura, un pH y un contenido de oxígeno apropiados para la cepa de levadura. Dichas condiciones de cultivo están dentro del conocimiento de un experto habitual en la materia (véase, por ejemplo, Guthrie et al. (eds.), 1991, Methods in Enzymology, vol. 194, Academic Press, San Diego).
En algunas realizaciones de la invención, la levadura se cultiva en condiciones de pH neutro. Como se usa en el presente documento, el uso general de la expresión “pH neutro” se refiere a un intervalo de pH entre aproximadamente pH 5,5 y aproximadamente pH 8, y en un aspecto, entre aproximadamente pH 6 y aproximadamente 8. Un experto en la materia apreciará que pueden producirse fluctuaciones menores (por ejemplo, decenas o cientos) cuando se mide con un pehachímetro. Como tal, el uso de pH neutro para cultivar células de levadura significa que las células de levadura se cultivan en pH neutro durante la mayor parte del tiempo en que 35 están en cultivo. En una realización, la levadura se cultiva en un medio mantenido a un nivel de pH de al menos 5,5 (es decir, no se permite que el pH del medio de cultivo descienda por debajo de pH 5,5). En otro aspecto, se cultiva levadura a un nivel de pH mantenido a aproximadamente 6, 6,5, 7, 7,5 u 8. El uso de un pH neutro en cultivo de levadura promueve varios efectos biológicos que son características deseables para usar la levadura como vehículos para inmunomodulación. Por ejemplo, el cultivo de levadura en pH neutro permite un buen crecimiento de la levadura sin efecto negativo en el tiempo de generación celular (por ejemplo, ralentización del tiempo de duplicación). La levadura puede continuar creciendo hasta altas densidades sin perder la flexibilidad de su pared celular. El uso de un pH neutro permite la producción de levadura con paredes celulares flexibles y/o levadura que son más sensibles a enzimas de digestión de la pared celular (por ejemplo, glucanasa) a todas las densidades de recogida. Este rasgo es deseable porque la levadura con paredes celulares flexibles puede inducir respuestas
45 inmunitarias diferentes o mejoradas en comparación con levadura cultivada en condiciones más ácidas, por ejemplo, promoviendo la secreción de citocinas mediante células presentadoras de antígenos que han fagocitado la levadura (por ejemplo, citocinas de tipo TH1 incluyendo, pero sin limitación, IFN-γ, interleucina-12 (IL-12) e IL-2, así como citocinas proinflamatorias tales como IL-6). Además, dichos métodos de cultivo proporcionan mayor accesibilidad a los antígenos localizados en la pared celular. En otro aspecto, el uso de pH neutro para algunos antígenos permite la liberación del antígeno con enlaces disulfuro por tratamiento con ditiotreitol (DTT) que no es posible cuando dicha levadura que expresa antígenos se cultiva en medio a pH menor (por ejemplo, pH 5).
En una realización, se usa control de la cantidad de glucosilación de levadura para controlar la expresión de antígenos por la levadura, particularmente en la superficie. La cantidad de glucosilación de levadura puede afectar a
55 la inmunogenicidad y antigenicidad del antígeno expresado en la superficie, ya que los restos de azúcar tienden a ser voluminosos. Como tal, debería tenerse en cuenta existencia de restos de azúcares en la superficie de levadura y su influencia en el espacio tridimensional alrededor del antígeno o los antígenos diana en la modulación de levadura de acuerdo con la invención. Puede usarse cualquier método para reducir la cantidad de glucosilación de la levadura (o aumentarla, si se desea). Por ejemplo, se podría usar una cepa mutante de levadura que se ha seleccionado para tener baja glucosilación (por ejemplo, mutantes mnn1, och1 y mnn9), o se podría eliminar por mutación las secuencias aceptoras de glucosilación en el antígeno diana. Como alternativa, se podría usar una levadura con patrones de glucosilación abreviados, por ejemplo, Pichia. También se puede tratar la levadura usando métodos que reduzcan o alteren la glucosilación.
65 En un caso de la presente divulgación, como alternativa a la expresión de un antígeno u otra proteína de forma recombinante en el vehículo de levadura, se carga un vehículo de levadura de forma intracelular con la proteína o
péptido, o con carbohidratos u otras moléculas que actúan como un antígeno y/o son útiles como agentes inmunomoduladores o modificadores de respuesta biológica de acuerdo con la divulgación. Posteriormente, el vehículo de levadura, que contiene ahora el antígeno y/u otras proteínas intracelularmente, puede administrarse a un individuo o cargarse en un vehículo tal como una célula dendrítica. Los péptidos y proteínas pueden insertarse
5 directamente en vehículos de levadura de la presente divulgación por técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como por difusión, transporte activo, fusión de liposomas, electroporación, fagocitosis, ciclos de congelación-descongelación y ultrasonidos en baño. Los vehículos de levadura que pueden cargarse directamente con péptidos, proteínas, carbohidratos u otras moléculas incluyen levadura intacta, así como esferoplastos, fantasmas o citoplastos, que pueden cargarse con antígenos y otros agentes después de la producción. Como alternativa, la levadura intacta puede cargarse con el antígeno y/o agente, y después pueden prepararse a partir de la misma esferoplastos, fantasmas, citoplastos o partículas subcelulares. Puede cargarse cualquier variedad de antígenos y/u otros agentes en un vehículo de levadura en esta realización, de al menos 1, 2, 3, 4 o cualquier número entero hasta cientos o miles de antígenos y/u otros agentes, tal como se proporcionaría por la carga de un microorganismo o partes del mismo, por ejemplo.
15 En otro caso de la presente divulgación, un antígeno y/u otro agente está unido físicamente al vehículo de levadura. Puede conseguirse unión física del antígeno y/u otro agente al vehículo de levadura por cualquier método adecuado en la técnica, incluyendo métodos de asociación covalentes y no covalentes que incluyen, pero sin limitación, reticulación química del antígeno y/u otro agente con la superficie externa del vehículo de levadura o unión biológica del antígeno y/u otro agente con la superficie externa del vehículo de levadura, tal como usando un anticuerpo u otro compañero de unión. Puede conseguirse reticulación química, por ejemplo, por métodos que incluyen enlace de glutaraldehído, marcaje de fotoafinidad, tratamiento con carbodiimidas, tratamiento con productos químicos capaces de unir enlaces disulfuro y tratamiento con otros productos químicos de reticulación convencionales en la técnica. Como alternativa, puede ponerse en contacto un producto químico con el vehículo de levadura que altera la carga
25 de la bicapa lipídica de membrana de levadura o la composición de la pared celular de modo que la superficie externa de la levadura tenga más probabilidades de fusionarse o unirse con antígenos y/u otro agente que tenga características de carga particulares. También pueden incorporarse agentes diana tales como anticuerpos, péptidos de unión, receptores solubles y otros ligandos en un antígeno como una proteína de fusión o asociarse de otro modo con un antígeno para unión del antígeno con el vehículo de levadura.
Cuando el antígeno u otra proteína se expresa en o se une físicamente a la superficie de la levadura, pueden seleccionarse cuidadosamente ramas espaciadoras, en un aspecto, para optimizar la expresión o el contenido de antígeno u otra proteína en la superficie. El tamaño de la rama o las ramas espaciadoras puede afectar a cuánto del antígeno u otra proteína se expone para unión en la superficie de la levadura. Por lo tanto, dependiendo de qué
35 antígeno o antígenos u otra proteína o proteínas se usen, un experto en la materia seleccionará una rama espaciadora que efectúe separación apropiada del antígeno u otra proteína en la superficie de levadura. En una realización, la rama espaciadora es una proteína de levadura de al menos 450 aminoácidos. Se han analizado en detalle anteriormente ramas espaciadoras.
En otra realización más, el vehículo de levadura y el antígeno u otra proteína se asocian entre sí por un mecanismo de unión no específico o no covalente, más pasivo, tal como por mezclado suave del vehículo de levadura y el antígeno u otra proteína juntos en un tampón u otra formulación adecuada (por ejemplo, mezcla).
En un caso de la divulgación, el vehículo de levadura y el antígeno u otra proteína se cargan ambos 45 intracelularmente en un vehículo tal como una célula dendrítica o macrófago para formar la composición terapéutica
o vacuna de la presente divulgación. Como alternativa, un antígeno u otra proteína puede cargarse en una célula dendrítica en ausencia del vehículo de levadura.
En una realización, la levadura intacta (con o sin expresión de antígenos heterólogos u otras proteínas) puede molerse o procesarse de manera que produzca preparaciones de pared celular de levadura, partículas de membrana de levadura o fragmentos de levadura (es decir, no intactos) y los fragmentos de levadura pueden, en algunas realizaciones, proporcionarse con o administrarse con otras composiciones que incluyen antígenos (por ejemplo, vacunas de ADN, vacunas de subunidades proteicas, patógenos muertos o inactivados) para potenciar respuestas inmunitarias. Por ejemplo, puede usarse tratamiento enzimático, tratamiento químico o fuerza física (por ejemplo,
55 cizalla mecánica o ultrasonidos) para romper la levadura en partes que se usen como un adyuvante.
En una realización de la invención, los vehículos de levadura útiles en la invención incluyen vehículos de levadura que se han destruido e inactivado. La destrucción o inactivación de levadura puede conseguirse por cualquiera de una diversidad de métodos adecuados conocidos en la técnica. Por ejemplo, la inactivación por calor de levadura es un modo convencional de inactivar levadura, y un experto en la materia puede supervisar los cambios estructurales del antígeno diana, si se desea, por métodos convencionales conocidos en la técnica. Como alternativa, pueden usarse otros métodos de inactivación de la levadura, tales como métodos químicos, eléctricos, radiactivos o UV. Véase, por ejemplo, la metodología desvelada en libros de texto de cultivo de levadura convencionales tales como Methods of Enzymology, Vol. 194, Cold Spring Harbor Publishing (1990). Cualquiera de las estrategias de
65 inactivación usadas debería tomar la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria del antígeno diana en consideración y conservar dicha estructura para optimizar su inmunogenicidad.
Los vehículos de levadura pueden formularse en composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura de la presente invención, incluyendo preparaciones para administrar a un sujeto directamente o cargar en primer lugar en un vehículo tal como una célula dendrítica, usando varias técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, los vehículos de levadura pueden secarse por liofilización. También pueden prepararse formulaciones que 5 comprenden vehículos de levadura empaquetando levadura en una pastilla o un comprimido, tal como se realiza para levadura usada en operaciones de horneado o elaboración de cervezas. Además, los vehículos de levadura pueden mezclarse con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como un tampón isotónico que es tolerado por un hospedador o una célula hospedadora. Los ejemplos de dichos excipientes incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, solución de Hank y otras soluciones salinas equilibradas fisiológicamente acuosas. También pueden usarse vehículos no acuosos, tales como aceites fijos, aceite de sésamo, etil oleato o triglicéridos. Otras formulaciones útiles incluyen suspensiones que contienen agentes potenciadores de la viscosidad, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, glicerol o dextrano. Los excipientes también pueden contener cantidades menores de aditivos, tales como sustancias que potencian la isotonicidad y la estabilidad química. Los ejemplos de tampones incluyen tampón de fosfato, tampón de bicarbonato y tampón de Tris, mientras
15 que los ejemplos de conservantes incluyen timerosal, m u o-cresol, formalina y alcohol bencílico. Las formulaciones convencionales pueden ser inyectables líquidos o sólidos que pueden tratarse en un líquido adecuado como una suspensión o solución para inyección. Por lo tanto, en una formulación no líquida, el excipiente puede comprender, por ejemplo, dextrosa, albúmina de suero humano y/o conservantes a los que puede añadirse agua o solución salina estéril antes de la administración.
En una realización de la presente invención, una composición puede incluir agentes adicionales, que también pueden denominarse compuestos modificadores de la respuesta biológica, o la capacidad para producir dichos agentes/modificadores. Por ejemplo, un vehículo de levadura puede transfectarse con o cargarse con al menos un antígeno y al menos un compuesto modificador de respuesta biológica/agente, o una composición de la invención 25 puede administrarse junto con al menos un modificador de respuesta biológica/agente. Los modificadores de respuesta biológica incluyen adyuvantes y otros compuestos que pueden modular respuestas inmunitarias, que pueden denominarse compuestos inmunomoduladores, así como compuestos que modifican la actividad biológica de otro compuesto o agente, tal como un producto inmunoterapéutico basado en levadura, no estando dicha actividad biológica limitada a efectos del sistema inmunitario. Ciertos compuestos inmunomoduladores pueden estimular una respuesta inmunitaria protectora mientras que otros pueden suprimir una respuesta inmunitaria perjudicial, y si un inmunomodulador es útil en combinación con un producto inmunoterapéutico basado en levadura dado puede depender, al menos en parte, de la patología o afección para tratar o prevenir y/o del individuo que va a tratarse. Ciertos modificadores de la respuesta biológica potencian preferentemente una respuesta inmunitaria mediada por células mientras que otros potencian preferentemente una respuesta inmunitaria humoral (es decir,
35 pueden estimular una respuesta inmunitaria en la que hay un nivel aumentado de inmunidad mediada por células en comparación con inmunidad humoral o viceversa). Ciertos modificadores de respuesta biológica tienen una o más propiedades en común con las propiedades biológicas de productos inmunoterapéuticos basados en levadura o potencian o complementan las propiedades biológicas de productos inmunoterapéuticos basados en levadura. Existen varias técnicas conocidas por los expertos en la materia para medir la estimulación o supresión de respuestas inmunitarias, así como para diferenciar respuestas inmunitarias mediadas por células de respuestas inmunitarias humorales, y diferenciar un tipo de respuesta mediada por células de otro (por ejemplo, una respuesta de TH17 frente a una respuesta de TH1).
Los modificadores de respuestas biológicas/agentes útiles en la invención pueden incluir, pero sin limitación,
45 citocinas, quimiocinas, hormonas, derivados lipídicos, péptidos, proteínas, polisacáridos, fármacos de moléculas pequeñas, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos (incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos anticitocina, anticuerpos anti receptores de citocina, anticuerpos antiquimiocinas), vitaminas, polinucleótidos, restos de unión a ácido nucleico, aptámeros y moduladores del crecimiento. Algunos agentes adecuados incluyen, pero sin limitación, IL-1 o agonistas de IL-1 o de IL-1R, anti IL-1 u otros antagonistas de IL-1; IL-6 o agonistas de IL-6 o de IL6R, anti IL-6 u otros antagonistas de IL-6; IL-12 o agonistas de IL-12 o de IL-12R, anti IL-12 u otros antagonistas de IL-12; IL-17 o agonistas de IL-17 o de IL-17R, anti IL-17 u otros antagonistas de IL-17; IL-21 o agonistas de IL-21 o de IL-21R, anti IL-21 u otros antagonistas de IL-21; IL-22 o agonistas de IL-22 o de IL-22R, anti IL-22 u otros antagonistas de IL-22; IL-23 o agonistas de IL-23 o de IL-23R, anti IL-23 u otros antagonistas de IL-23; IL-25 o agonistas de IL-25 o de IL-25R, anti IL-25 u otros antagonistas de IL-25; IL-27 o agonistas de IL-27 o de IL-27R, anti
55 IL-27 u otros antagonistas de IL-27; interferón de tipo I (incluyendo IFN-α) o agonistas o antagonistas de interferón de tipo I o un receptor del mismo; interferón de tipo II (incluyendo IFN-γ) o agonistas o antagonistas de interferón de tipo II o un receptor del mismo; anticuerpo anti CD40, CD40L, anticuerpo anti CTLA-4 (por ejemplo, para liberar células T anérgicas); coestimulantes de células T (por ejemplo, anti CD137, anti CD28, anti CD40); alemtuzumab (por ejemplo, CamPath®), diftitox de denileucina (por ejemplo, ONTAK®); anti CD4; anti CD25; anti PD-1, anti PD-L1, anti PD-L2; agentes que bloquean FOXP3 (por ejemplo, para anular la actividad/destruir células T reguladoras CD4+/CD25+); ligando de Flt3, imiquimod (Aldara™), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF); factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), sargramostim (Leukine®); hormonas que incluyen sin limitación prolactina y hormona del crecimiento; agonistas del receptor de tipo Toll (TLR), incluyendo pero sin limitación agonistas de TLR-2, agonistas de TLR-4, agonistas de TLR-7 y agonistas de TLR-9; antagonistas
65 de TLR, incluyendo pero sin limitación antagonistas de TLR-2, antagonistas de TLR-4, antagonistas de TLR-7 y antagonistas de TLR-9; agentes antiinflamatorios e inmunomoduladores, incluyendo pero sin limitación, inhibidores
de COX-2 (por ejemplo Celecoxib, AINE), glucocorticoides, estatinas y talidomida y análogos de los mismos incluyendo IMiD™ (que son análogos estructurales y funcionales de talidomida (por ejemplo, REVLIMID® (lenalidomida), ACTIMID® (pomalidomida)); agentes proinflamatorios, tales como componentes fúngicos o bacterianos o cualquier citocina o quimiocina proinflamatoria; vacunas inmunoterapéuticas incluyendo, pero sin
5 limitación, vacunas basadas en virus, vacunas basadas en bacterias o vacunas basadas en anticuerpos; y cualquier otro inmunomodulador, inmunopotenciador, agente antiinflamatorio y/o agente proinflamatorio. Se desvela cualquier combinación de dichos agentes, y cualquiera de dichos agentes combinados con o administrados en un protocolo con (por ejemplo, simultáneamente, secuencialmente o en otros formatos con) un producto inmunoterapéutico basado en levadura es una composición abarcada por la invención. Dichos agentes se conocen bien en la técnica. Estos agentes pueden usarse solos o en combinación con otros agentes descritos en el presente documento.
Los agentes pueden incluir agonistas y antagonistas de una proteína o un péptido dado o dominio de los mismos. Como se usa en el presente documento, un “agonista” es cualquier compuesto o agente, incluyendo sin limitación moléculas pequeñas, proteínas, péptidos, anticuerpos, agentes de unión a ácido nucleico, etc., que se unen con un
15 receptor o ligando y produce o desencadena una respuesta, que puede incluir agentes que imitan la acción de una sustancia de origen natural que se une con el receptor o el ligando. Un “antagonista” es cualquier compuesto o agente, incluyendo, sin limitación, moléculas pequeñas, proteínas, péptidos, anticuerpos, agentes de unión a ácido nucleico, etc., que bloquea o inhibe o reduce la acción de un agonista.
Las composiciones de la invención pueden incluir además o pueden administrarse con (simultáneamente, secuencialmente o intermitentemente con) cualquier otro compuesto o composición que sea útil para prevenir o tratar infección por VHB o cualquier compuesto que trate o alivie cualquier síntoma de infección por VHB. Se conoce una diversidad de agentes que son útiles para prevenir y/o tratar o aliviar infección por VHB. Dichos agentes incluyen, pero sin limitación, compuestos antivíricos, incluyendo, pero sin limitación, inhibidor de transcriptasa 25 inversa análogo de nucleótido (nRTI). En un aspecto de la invención, los compuestos antivíricos adecuados incluyen, pero sin limitación: tenofovir (VIREAD®), lamivudina (EPIVIR®), adefovir (HEP-SERA®), telbivudina (TYZEKA®), entecavir (BAPACLUDE®), y combinaciones de los mismos, y/o interferones, tales como interferón-α2a
o interferón-α2a pegilado (PEGASYS®) o interferón λ. Estos agentes se administran típicamente durante periodos de tiempo largos (por ejemplo, diariamente o semanalmente durante hasta uno a cinco años o más). Además, las composiciones de la invención pueden usarse junto con otras composiciones inmunoterapéuticas, incluyendo inmunoterapia profiláctica y/o terapéutica. Por ejemplo, han estado disponibles en el mercado vacunas profilácticas para el VHB desde principios de los años 80. Estas vacunas comerciales son vacunas víricas subunitarias, no infecciosas, que proporcionan antígeno de superficie de virus de la hepatitis B (HBsAg) recombinante purificado y pueden administrarse desde el nacimiento. Aunque no se han aprobado composiciones inmunoterapéuticas
35 terapéuticas en los Estados Unidos para el tratamiento del VHB, dichas composiciones pueden incluir vacunas subunitarias proteicas o epitópicas del VHB, vacunas de vectores víricos del VHB, citocinas y/u otros agentes inmunomoduladores (por ejemplo, agonistas de TLR, fármacos inmunomoduladores).
La divulgación también describe un kit que comprende cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento, o cualquiera de los componentes individuales de las composiciones descritas en el presente documento.
Métodos para administración o uso de composiciones de la invención
Las composiciones de la divulgación, que pueden incluir una cualquiera o más (por ejemplo, combinaciones de dos,
45 tres, cuatro, cinco o más) composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura descritas en el presente documento, antígenos del VHB incluyendo proteínas del VHB y proteínas de fusión y/o moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican dichas proteínas del VHB o proteínas de fusión descritas anteriormente, y otras composiciones que comprenden dichas composiciones, antígenos, proteínas, proteínas de fusión o moléculas recombinantes basados en levadura descritos en el presente documento, pueden usarse en una diversidad de métodos in vivo e in vitro, incluyendo, pero sin limitación, para tratar y/o prevenir la infección por VHB y sus secuelas, en ensayos de diagnóstico para VHB o para producir anticuerpos contra VHB.
Una realización de la invención se refiere a la composición para uso en un método para tratar infección por virus de la hepatitis B (VHB) crónica y/o para prevenir, aliviar o tratar al menos un síntoma de infección por VHB crónica, en 55 un individuo o en una población de individuos. La composición para uso en el método incluye la etapa de administrar a un individuo o una población de individuos que están infectados de forma crónica con el VHB las composiciones inmunoterapéuticas de la invención. En un aspecto, la composición es una composición inmunoterapéutica que comprende los antígenos del VHB como se describe en el presente documento, que pueden incluir una composición inmunoterapéutica basada en levadura. En un aspecto, la composición incluye una proteína de fusión que comprende antígenos del VHB como se describe en el presente documento y/o una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica dicha proteína o proteína de fusión. En una realización, el individuo o la población de individuos tiene infección por VHB crónica. En un aspecto, el individuo o la población de individuos se trata adicionalmente con al menos otro compuesto terapéutico útil para el tratamiento de infección por VHB. Dichos compuestos terapéuticos incluyen, pero sin limitación, fármacos antivíricos de acción directa (por ejemplo, los 65 descritos anteriormente o en otra parte del presente documento) y/o interferones y/u otros agentes inmunomoduladores o inmunoterapéuticos. En un aspecto, dichos compuestos terapéuticos incluyen productos
terapéuticos dirigidos a hospedador (por ejemplo, inhibidores de ciclofilina que pueden interferir con la replicación vírica o inhibidores de la reentrada que pueden interferir con el ciclo vital vírico (reinfección)).
El “Tratamiento de Referencia” o “SOC” se refiere en general al tratamiento de referencia aprobado en la actualidad
5 para el tratamiento de una enfermedad específica. En infección por VHB crónica, el SOC puede ser uno de varios protocolos terapéuticos aprobados diferentes e incluir, pero sin limitación, terapia de interferón y/o terapia antivírica. Los fármacos antivíricos aprobados en la actualidad para el tratamiento de infección por VHB incluyen tenofovir (VIREAD®), lamivudina (EPIVIR®), adefovir (HEPSERA®), telbivudina (TYZEKA®) y entecavir (BARACLUDE®). Los fármacos antivíricos recetados con más frecuencia para infección por VHB crónica son en la actualidad tenofovir y entecavir. El interferón útil para el tratamiento de infección por VHB crónica incluye un interferón de tipo I tal como interferón-α, incluyendo, pero sin limitación, interferón α2 o interferón α2 pegilado (por ejemplo, PEGASYS®). En una realización, el interferón es un interferón de tipo III, incluyendo, sin limitación, interferón λ1, interferón λ2 y/o interferón λ3. La composición inmunoterapéutica de la invención puede administrarse antes de, simultáneamente con, intermitentemente con y/o después de uno o más antivíricos y/o interferón y/u otros agentes inmunoterapéuticos
15 o inmunomoduladores. Los otros compuestos terapéuticos también pueden administrarse antes de o después del tratamiento con las composiciones inmunoterapéuticas de la invención.
La infección por VHB se diagnostica típicamente en un individuo por detección de HBsAg (antígeno de superficie del virus de la hepatitis B) y/o HBeAg (antígeno e) en la sangre del individuo infectado. La detección de HBeAg en el suero refleja la replicación vírica activa y el resultado clínico de la infección puede correlacionarse con el estado del antígeno e, aunque la remisión a largo plazo (o cura) se predice mejor usando seroconversión de HBsAg cuando se usan terapias actuales (véase posteriormente). También puede usarse la detección del anticuerpo del núcleo IgM para detectar infección por VHB aguda durante los primeros 6-12 meses de infección. La persistencia de HBsAg en la sangre durante más de 6 meses identifica típicamente infección por VHB crónica. Además, la infección por VHB
25 crónica puede diagnosticarse identificando ADN del VHB (> 2000 UI/ml), que puede combinarse con la detección o identificación de niveles elevados de alanina aminotransferasa (ALT) y/o aspartato aminotransferasa (AST) en suero (por ejemplo, más de dos veces el límite superior de lo normal).
La recuperación de la infección vírica (respuesta completa, o el punto final para un tratamiento de VHB) se determina por seroconversión de HBeAg/HBsAg, que es pérdida de HBeAg y HBsAg, respectivamente, y el desarrollo de anticuerpos contra el antígeno de superficie de la hepatitis B (anti HBs) y/o anticuerpos contra HBeAg. Los estudios clínicos han definido la seroconversión, o un nivel de anticuerpo protector (anti HBs) como: (a) 10 o más unidades de relación de muestra (URM) como se determina por radioinmunoensayo; (b) un resultado positivo como se determina por inmunoensayo enzimático; o (c) detección de una concentración de anticuerpo de ≥
35 10 mUI/ml (10 URM es comparable a anticuerpo 10 mUI/ml). La seroconversión puede tardar años en desarrollarse en un paciente con infección crónica con tratamiento de referencia actual (es decir, fármacos antivíricos o interferón). Los pacientes también pueden supervisarse con respecto a pérdida o reducción notable de ADN vírico (por debajo de niveles detectables por PCR o <2000 UI/ml), normalización de los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) en suero y mejora en la inflamación y fibrosis hepática. “ALT” es una medida bien validada de la lesión hepática y sirve como un sustituto para la inflamación hepática. En ensayos de hepatitis grandes anteriores, se ha mostrado que las reducciones y/o la normalización de los niveles de ALT (normalización de ALT) se correlacionan con función hepática mejorada y fibrosis hepática reducida como se determina por biopsia en serie.
Otra realización de la invención se refiere a la composición para su uso en un método para inmunizar a un individuo
45 o una población de individuos contra el VHB para prevenir la infección por VHB, evitar la infección por VHB crónica y/o reducir la gravedad de infección por VHB en el individuo o la población de individuos. El uso de la composición en el método incluye la etapa de administrar a un individuo o a una población de individuos que no están infectados con VHB (o que se cree que no están infectados con VHB), una composición de la invención. En un aspecto, la composición es una composición inmunoterapéutica que comprende los antígenos del VHB como se describe en el presente documento, incluyendo una o más composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura. En un aspecto, la composición incluye una proteína de fusión que comprende antígenos del VHB como se describe en el presente documento, o una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica dicha proteína de fusión.
Como se usa en el presente documento, la expresión “tratar” infección por VHB, o cualquier permutación de la
55 misma (por ejemplo, “tratado para infección por VHB”, etc.) se refiere en general a aplicar o administrar una composición de la invención una vez que se ha producido la infección (aguda o crónica), con el objetivo de reducir o eliminar el título vírico detectable (por ejemplo, reducción del ADN vírico (por debajo de niveles detectables por PCR o > 2000 UI/ml)), alcanzar la seroconversión (desarrollo de anticuerpos contra HBsAg y/o HBeAg) y pérdida o reducción simultánea de estas proteínas del suero), reducción en al menos un síntoma resultante de la infección en el individuo, retardo o prevención de la aparición y/o gravedad de síntomas y/o secuelas corriente abajo provocadas por la infección, reducción de daño al órgano o al sistema fisiológico (por ejemplo, cirrosis) resultante de la infección (por ejemplo, reducción de los niveles de ALT anómalos, reducción de la inflamación hepática, reducción de la fibrosis hepática), prevención y/o reducción de la frecuencia e incidencia del carcinoma hepatocelular (HCC), mejora de la función orgánica o sistémica que se vio influida negativamente por la infección (normalización de los niveles de
65 ALT en suero, mejora de la inflamación hepática, mejora de la fibrosis hepática), mejora de las respuestas inmunitarias contra la infección, mejora de las respuestas inmunitarias de memoria a largo plazo contra la infección,
reducción de la reactivación del virus VHB y/o mejora de la salud general del individuo o la población de individuos.
En un aspecto, un objetivo del tratamiento es la eliminación vírica sostenida durante al menos 6 meses después de completar la terapia. En un aspecto, un objetivo del tratamiento es la pérdida de proteínas HBeAg y/o HBsAg en
5 suero detectables. En un aspecto, un objetivo del tratamiento es el desarrollo de anticuerpos contra el antígeno de superficie de la hepatitis B (anti HB) y/o anticuerpos contra HBeAg. En un aspecto, el objetivo del tratamiento es la seroconversión, que puede definirse por: (a) 10 o más unidades de relación de muestra (URM) como se determina por radioinmunoensayo; (b) un resultado positivo como se determina por inmunoensayo enzimático; o (c) detección de una concentración de anticuerpo de ≥ 10 mUI/ml (10 URM es comparable a 10 mUI/ml del anticuerpo).
“Prevenir” la infección por VHB, o cualquier permutación de la misma (por ejemplo, “prevención de la infección por VHB”, etc.), se refiere en general a aplicar o administrar una composición de la invención antes de que se haya producido una infección con VHB, con el objetivo de prevenir la infección por VHB, prevenir la infección crónica por VHB (es decir, permitir que un individuo elimine una infección por VHB aguda sin intervención adicional) o, si se
15 produjera la infección posteriormente, al menos reducir la gravedad y/o la duración de la infección y/o el daño fisiológico provocado por la infección crónica, incluyendo prevenir o reducir la gravedad o la incidencia de al menos un síntoma resultante de la infección del individuo y/o retardar o prevenir la aparición y/o gravedad de síntomas y/o secuelas corriente abajo provocadas por la infección en un individuo o una población de individuos. En un aspecto, la presente invención puede usarse para prevenir la infección por VHB crónica, tal como permitiendo que un individuo que se infecte de forma aguda con VHB después de la administración de una composición de la invención para eliminar la infección y no se infecte de forma crónica.
La presente invención incluye el suministro (administración, inmunización) de la composición inmunoterapéutica de la invención, incluyendo una composición inmunoterapéutica basada en levadura, a un sujeto. El proceso de
25 administración puede realizarse ex vivo o in vivo, pero se realiza típicamente in vivo. La administración ex vivo se refiere a realizar parte de la etapa reguladora fuera del paciente, tal como administrar una composición de la presente invención a una población de células (células dendríticas) retirada de un paciente en condiciones tales que se carguen en la célula un vehículo de levadura, antígeno o antígenos y cualquier otro agente o composición, y se devuelvan las células al paciente. La composición terapéutica de la presente invención puede devolverse a un paciente, o administrarse a un paciente, por cualquier modo adecuado de administración.
La administración de una composición puede ser sistémica, mucosa y/o próxima a la localización del sitio diana (por ejemplo, cerca de un sitio de infección). Las vías adecuadas de administración serán evidentes para los expertos en la materia, dependiendo del tipo de afección para prevenir o tratar, el antígeno usado y/o la población celular o el 35 tejido diana. Diversos métodos de administración aceptables incluyen, pero sin limitación, administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración intramuscular, administración intranodal, administración intracoronaria, administración intraarterial (por ejemplo, en una arteria carótida), administración subcutánea, suministro transdérmico, administración intratraqueal, administración intraarticular, administración intraventricular, inhalación (por ejemplo, aerosol), administración intracraneal, intrarraquídea, intraocular, ótica, intranasal, oral, pulmonar, impregnación de un catéter e inyección directa en un tejido. En un aspecto, las vías de administración incluyen: intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intradérmica, intranodal, intramuscular, transdérmica, inhalada, intranasal, oral, intraocular, intraarticular, intracraneal e intrarraquídea. El suministro parenteral puede incluir vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrapleural, intrapulmonar, intravenosa, subcutánea, catéter auricular y catéter venoso. El suministro ótico puede incluir gotas óticas, el suministro intranasal puede incluir gotas nasales o
45 inyección intranasal, y el suministro intraocular puede incluir colirios. También puede realizar suministro por aerosol (inhalación) usando métodos convencionales en la técnica (véase, por ejemplo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189: 11277-11281, 1992). Otras vías de administración que modulan la inmunidad mucosa pueden ser útiles en el tratamiento de infecciones víricas. Dichas vías incluyen las vías bronquial, intradérmica, intramuscular, intranasal, otras vías inhaladoras, rectal, subcutánea, tópica, transdérmica, vaginal y uretral. En un aspecto, una composición inmunoterapéutica de la invención se administra por vía subcutánea.
Con respecto a las composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura de la invención, en general, una única dosis adecuada es una dosis que es capaz de proporcionar eficazmente un vehículo de levadura y un antígeno (si se incluye) a un tipo celular, tejido o región dados del cuerpo del paciente en una cantidad eficaz para inducir una 55 respuesta inmunitaria específica de antígeno contra uno o más antígenos o epítopos del VHB, cuando se administran una o más veces durante un periodo de tiempo adecuado. Por ejemplo, en una realización, una dosis individual de un vehículo de levadura de la presente invención es de aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 5 x 107 equivalentes de células de levadura por kilogramo de peso corporal del organismo al que se administra la composición. En un aspecto, una dosis individual de un vehículo de levadura de la presente invención es de aproximadamente 0,1 U.L. (1 x 106 células) a aproximadamente 100 U.L. (1 x 109 células) por dosis (es decir, por organismo), incluyendo cualquier dosis intermedia, en incrementos de 0,1 x 106 células (es decir, 1,1 x 106, 1,2 x 106, 1,3 x 106...). En una realización, las dosis incluyen dosis entre 1 U.L. y 40 U.L., dosis entre 1 U.L. y 50 U.L., dosis entre 1 U.L. y 60 U.L., dosis entre 1 U.L. y 70 U.L., o dosis entre 1 U.L. y 80 U.L. y, en un aspecto, entre 10
U.L. y 40 U.L., 50 U.L., 60 U.L., 70 U.L. u 80 U.L. En una realización, las dosis se administran en sitios diferentes del
65 individuo pero durante el mismo periodo de dosificación. Por ejemplo, una dosis de 40 U.L. puede administrarse mediante inyección de dosis de 10 U.L. a cuatro sitios diferentes en un individuo durante un periodo de dosificación,
o puede administrarse una dosis de 20 U.L. inyectando dosis de 5 U.L. a cuatro sitios diferentes del individuo, o inyectando dosis de 10 U.L. a dos sitios diferentes del individuo, durante el mismo periodo de dosificación. La invención incluye administración de una cantidad de la composición de inmunoterapia basada en levadura (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 U.L. o más) en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o
5 más sitios diferentes en un individuo para formar una única dosis.
Se administran “reforzadores” o “refuerzos” de una composición terapéutica, por ejemplo, cuando la respuesta inmunitaria contra el antígeno ha disminuido o según sea necesario para proporcionar una respuesta inmunitaria o inducir una respuesta de memoria contra un antígeno o antígenos particulares. Pueden administrarse reforzadores en un intervalo de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas, a mensualmente, bimensualmente, trimestralmente, anualmente, hasta varios años después de la administración original. En una realización, un programa de administración es uno en el que se administran de aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 5 x 107 equivalentes de células de levadura de una composición por kg de peso corporal del organismo al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces durante un periodo de tiempo de semanas, a meses, a años. En una realización, las
15 dosis se administran semanalmente durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dosis, seguido de dosis mensuales según sea necesario para conseguir la inhibición o eliminación deseadas del virus VHB. Por ejemplo, las dosis pueden administrarse hasta que el individuo consigue seroconservación, hasta que los títulos de ADN del VHB caen por debajo de 2000 UI/ml y/o hasta que los niveles de ALT se normalizan. En una realización, las dosis se administran en un protocolo de 4 semanas (cada 4 semanas, o el día 1, la semana 4, la semana 8, la semana 12, etc. durante entre 2 y 10 dosis o más según determine el especialista clínico). Pueden administrarse dosis adicionales incluso después de que el individuo consiga la seroconversión, si se desea, aunque dicha dosificación puede no ser necesaria.
Con respecto a la administración de composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura descritas en el
25 presente documento, puede administrarse una única composición a un individuo o a una población de individuos o puede administrarse una combinación de dichas composiciones. Por ejemplo, la invención proporciona varias composiciones “de proteínas individuales” o composiciones dirigidas contra un genotipo particular, así como composiciones multiproteicas y composiciones que se dirigen a múltiples genotipos o subgenotipos. En consecuencia, pueden seleccionarse dos o más composiciones en un enfoque de “estante de especias” para prevenir o tratar más eficazmente la infección por VHB en un individuo o una población de individuos dados.
En un aspecto de la invención, se administran secuencialmente uno o más agentes terapéuticos adicionales con la composición inmunoterapéutica basada en levadura. En otra realización, se administran uno o más agentes terapéuticos adicionales antes de administrarse la composición inmunoterapéutica basada en levadura. En otra 35 realización, se administran uno o más agentes terapéuticos adicionales después de administrarse la composición inmunoterapéutica basada en levadura. En una realización, se administran uno o más agentes terapéuticos adicionales en dosis alternantes con la composición inmunoterapéutica basada en levadura, o en un protocolo en el que la composición inmunoterapéutica basada en levadura se administra a intervalos prescritos entre o con una o más dosis consecutivas de los agentes adicionales, o viceversa. En una realización, la composición inmunoterapéutica basada en levadura se administra en una o más dosis durante un periodo de tiempo antes de comenzar la administración de los agentes adicionales. En otras palabras, la composición inmunoterapéutica basada en levadura se administra como una monoterapia durante un periodo de tiempo, y después se añade la administración de agente, bien simultáneamente con nuevas dosis de inmunoterapia basada en levadura, o bien de forma alternante con inmunoterapia basada en levadura. Como alternativa, el agente puede administrarse durante
45 un periodo de tiempo antes de comenzar la administración de la composición inmunoterapéutica basada en levadura. En un aspecto, la levadura se modifica técnicamente para expresar o portar el agente, o se modifica técnicamente o se produce una levadura diferente para expresar o portar el agente.
En un aspecto de la invención, cuando comienza un ciclo de tratamiento de interferón o terapia de compuesto antivírico, se administran dosis adicionales de la composición inmunoterapéutica durante el mismo periodo de tiempo, o durante al menos una parte de ese tiempo, y pueden continuar administrándose una vez que ha terminado el ciclo de interferón o compuesto antivírico. Sin embargo, el programa de dosificación para la inmunoterapia durante el periodo completo puede ser, y se espera típicamente que sea, diferente del de interferón o el compuesto antivírico. Por ejemplo, la composición inmunoterapéutica puede administrarse los mismos días o al menos 3-4 días
55 después de la última dosis dada (más reciente) de interferón o antivírico (o cualquier número adecuado de días después de la última dosis) y puede administrarse diariamente, semanalmente, bisemanalmente, mensualmente, bimensualmente o cada 3-6 meses, o a intervalos mayores según determine el médico. Durante un periodo inicial de administración monoterapéutica de la composición inmunoterapéutica, si se utiliza, la composición inmunoterapéutica se administra preferentemente semanalmente durante entre 4 y 12 semanas, seguido de administración mensual (independientemente de cuándo se añade el interferón adicional o la terapia antivírica al protocolo). En un aspecto, la composición inmunoterapéutica se administra semanalmente durante cuatro o cinco semanas, seguido de administración mensual a continuación, hasta la conclusión del protocolo de tratamiento completo.
65 En aspectos de la invención, una composición inmunoterapéutica y otros agentes pueden administrarse juntos (simultáneamente). Como se usa en el presente documento, el uso simultáneo no significa necesariamente que
todas las dosis de todos los compuestos se administren el mismo día al mismo tiempo. En su lugar, el uso simultáneo significa que cada uno de los componentes de terapia (por ejemplo, inmunoterapia y terapia de interferón, o inmunoterapia y terapia antivírica) se inician aproximadamente en el mismo periodo (en un periodo de horas, o hasta 1-7 días entre sí) y se administran durante el mismo periodo general de tiempo, observando que cada
5 componente puede tener un programa de dosificación diferente (por ejemplo, interferón semanalmente, inmunoterapia mensualmente, antivírico diariamente o semanalmente). Además, antes o después del periodo de administración simultáneo, uno cualquiera de los agentes o las composiciones inmunoterapéuticas puede administrarse sin el otro agente o los otros agentes.
La presente invención contempla que el uso de una composición inmunoterapéutica de la invención con un antivírico tal como tenofovir o entecavir permitirá un ciclo temporal más corto para el uso del fármaco antivírico. Se esperan resultados similares cuando se combina un inmunoterapéutico de la invención con interferón. Los requisitos de dosificación para el antivírico o interferón también pueden reducirse o modificarse como resultado de la combinación con el compuesto inmunoterapéutico de la invención para mejorar en general la tolerancia del paciente por el 15 fármaco. Además, se contempla que la composición inmunoterapéutica permitirá la seroconversión o respuestas víricas sostenidas para pacientes en los que la terapia antivírica sola no consigue alcanzar estos puntos finales. En otras palabras, más pacientes conseguirán seroconversión cuando una composición inmunoterapéutica de la invención se combina con un antivírico o interferón que conseguirá seroconversión usando antivíricos o interferón solamente. Con el SOC actual para infección por VHB, pueden administrarse antivíricos durante 6 meses a un año, dos años, tres años, cuatro años, cinco años o más (por ejemplo, indefinidamente). Combinando dicha terapia con una composición inmunoterapéutica de la invención, el tiempo para la administración del antivírico puede reducirse en varios meses o años. Se contempla que el uso de las composiciones inmunoterapéuticas de la presente invención, como una monoterapia o en combinación con enfoques antivíricos y/o inmunomoduladores será eficaz para conseguir pérdida de HBsAg y/o HBeAg; seroconversión de HBeAg, seroconversión de HBsAg o
25 seroconversión completa; y en muchos individuos, eliminación vírica sostenida durante al menos 6 meses después de completar la terapia. En algunos pacientes, la inmunoterapia de acuerdo con la presente invención, cuando se usa como una monoterapia o en combinación con enfoques antivíricos y/o inmunomoduladores, puede conseguir pérdida de HBsAg y/o HBeAg, pero no conseguir seroconversión (desarrollo de anti-HBs o anti-HBeAg). En este escenario, es una realización de la invención usar adicionalmente, solos o en combinación con la inmunoterapia basada en levadura de la invención y/o antivíricos u otros agentes inmunomoduladores, un agente tal como una vacuna subunitaria del VHB recombinante profiláctica actual, para conseguir respuesta completa en el paciente.
Como se usa en el presente documento, el término “antivírico” se refiere a cualquier compuesto o fármaco, típicamente una molécula pequeña inhibidora o anticuerpo, que se dirige a una o más etapas en el ciclo de vida del
35 virus con efectos terapéuticos antivíricos directos. En una realización de la invención, el compuesto antivírico o fármaco para administrar el mismo protocolo terapéutico con una composición inmunoterapéutica de la invención se selecciona de (VIREAD®), lamivudina (EPIVIR®), adefovir (HEPSERA ®), telbivudina (TYZEKA®) y entecavir (BARACLUDE®), o cualquier análogo o derivado de los mismos, o cualquier composición que comprenda o contenga dicho compuesto, fármaco, análogo o derivado.
El tenofovir (disoproxil fumarato de tenofovir o TDF), o ácido ({[(2R)-1-(6-amino-9H-purin-9-il)propan-2il]oxi}metil)fosfónico es un inhibidor de transcriptasa inversa análogo de nucleótido (nRTI). Para el tratamiento de infección por VHB, tenofovir se administra típicamente a adultos como una píldora tomada a una dosis de 300 mg (disoproxil fumarato de tenofovir) una vez al día. La dosificación para pacientes pediátricos se basa en el peso
45 corporal del paciente (8 mg por kg de peso corporal, hasta 300 mg una vez al día) y puede proporcionarse como un comprimido o un polvo oral.
La lamivudina, o 2’,3’-didesoxy-3’-tiacitidina, habitualmente denominada 3TC, es un potente inhibidor de transcriptasa inversa análogo de nucleósido (nRTI). Para el tratamiento de infección por VHB, la lamivudina se administra como una píldora o solución oral tomada a una dosis de 100 mg una vez al día (3,16-4,44 mg/kg, dos veces al día para niños de 3 meses a 12 años de edad).
Adefovir (adefovir dipivoxilo) o 9-[2-[[bis[(pivaloiloxi)metoxi]-fosfinil]-metoxi]etil]adenina es un inhibidor de transcriptasa inversa análogo de nucleótido (ntRTI) administrado por vía oral. Para el tratamiento de infección por
55 VHB, adefovir se administra como una píldora tomada a una dosis de 10 mg una vez al día.
Telbivudina o 1-(2-desoxi-L-eritro-pentofuranosil)-5-metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona es un análogo de nucleósido timidina sintético (el isómero L de timidina). Para el tratamiento de infección por VHB, se administra telbivudina como una píldora o solución oral tomada a una dosis de 600 mg una vez al día.
Entecavir o 2-amino-9-[(1S,3R,4S)-4-hidroxi-3-(hidroximetil)-2-metilidenciclopentil]-6,9-dihidro-3Hpurin-6-ona, es un análogo de nucleósido (análogo de guanina) que inhibe la transcripción inversa, replicación de ADN y transcripción del virus. Para el tratamiento de infección por VHB, entecavir se administra como una píldora o solución oral tomada a una dosis de 0,5 mg una vez al día (1 mg diario para mutaciones de resistencia a telbivudina o refractarias para
65 lamivudina).
En una realización de la invención, el interferón para administrar en un protocolo terapéutico con una composición inmunoterapéutica de la invención es un interferón, y en un aspecto, interferón-α, y en un aspecto, interferón-α2b (administrado por inyección subcutánea 3 veces por semana); o interferón-α2a pegilado (por ejemplo PEGASYS®). Como se usa en el presente documento, el término “interferón” se refiere a una citocina que es producida 5 típicamente por células del sistema inmunitario y por una amplia diversidad de células en respuesta a la presencia de ARN bicatenario. Los interferones ayudan a la respuesta inmunitaria inhibiendo la replicación vírica dentro de células hospedadoras, activando células citolíticas naturales y macrófagos, aumentando la presentación de antígenos a linfocitos e induciendo la resistencia de células hospedadoras a infección vírica. Los interferones de tipo I incluyen interferón-α. Los interferones de tipo III incluyen interferón-λ. Los interferones útiles en los métodos de la 10 presente invención incluyen cualquier interferón de tipo I o tipo III, incluyendo interferón-α, interferón-α2, y en un aspecto, formas de más larga duración de interferón, incluyendo, pero sin limitación, interferones pegilados, proteínas de fusión de interferón (interferón fusionado con albúmina) y formulaciones de liberación controlada que comprenden interferón (por ejemplo, interferón en microesferas o interferón con nanopartículas de poliaminoácidos). Un interferón, PEGASYS®, interferón-α2a pegilado, es un conjugado covalente de interferón-α2a recombinante
15 (peso molecular [PM] aproximado de 20.000 daltons) con una única cadena ramificada de bis-monometoxi polietilenglicol (PEG) (PM aproximado de 40.000 daltons). El resto de PEG se une en un único sitio con el resto de interferón-α mediante un enlace de amida estable a lisina. El interferón-α2a pegilado tiene un peso molecular aproximado de 60.000 daltons.
20 El interferón se administra típicamente por inyección intramuscular o subcutánea, y puede administrarse en una dosis de entre 3 y 10 millones de unidades, prefiriéndose 3 millones de unidades en una realización. Las dosis de interferón se administran en un programa regular, que puede variar de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 veces por semana a semanalmente, bisemanalmente, cada tres semanas o mensualmente. Una dosis típica de interferón que está disponible en la actualidad se proporciona semanalmente, y es un programa de dosificación preferido para
25 interferón, de acuerdo con la presente invención. Para el tratamiento de VHB, se administra simultáneamente interferón-α2a pegilado por vía subcutánea una vez a la semana a una dosis de 180 mg (1,0 ml vírico o 0,5 ml de jeringa precargada), durante un total de 48 semanas. La cantidad de dosis y el momento de administración pueden variarse de acuerdo con las preferencias y recomendaciones del médico, así como de acuerdo con las recomendaciones para el interferón particular que se use, y está dentro de las capacidades de los expertos en la
30 materia determinar la dosis apropiada. Se contempla que usando terapia de interferón junto con una composición inmunoterapéutica de la invención, la concentración de dosis y/o el número de dosis de interferón (el periodo de tiempo con interferón y/o intervalos entre dosis de interferón) puede reducirse.
Las composiciones y composiciones terapéuticas para uso en los métodos de la presente divulgación pueden
35 administrarse a un animal, incluyendo cualquier vertebrado, y particularmente a cualquier miembro de la clase de vertebrados, mamíferos, incluyendo sin limitación, primates, roedores, ganado y mascotas domésticas. El ganado incluye mamíferos para consumir o que producen productos útiles (por ejemplo, ovejas para producción de lana). Los mamíferos para tratar o proteger incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas, cabras, ovejas, vacas, cabellos y cerdos.
40 Un “individuo” es un vertebrado, tal como un mamífero, incluyendo sin limitación un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, animales de granja, animales deportivos, mascotas, primates, ratones y ratas. El término “individuo” puede usarse indistintamente con el término “animal”, “sujeto” o “paciente”.
45 Técnicas generales útiles en la invención
La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica, química de ácidos nucleicos e inmunología, que son bien conocidas por los expertos en la materia. Dichas técnicas se explican 50 completamente en la bibliografía, tal como, Methods of Enzymology, Vol. 194, Guthrie et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Biology and activities of yeast, Skinner, et al., eds., Academic Press (1980); Methods in yeast genetics: a laboratory course manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); The Yeast Saccharomyces: Cell Cycle and Cell Biology, Pringle et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997); The Yeast Saccharomyces: Gene Expression, Jones et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press 55 (1993); The Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics, Broach et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989) y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición (Sambrook y Russel, 2001), (denominados en su conjunto en el presente documento “Sambrook”); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, incluyendo suplementos hasta 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Harlow 60 y Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (denominados en su conjunto en el presente documento “Harlow y Lane”), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 2000); Casarett and Doull’s Toxicology The Basic Science of Poisons, C. Klaassen, ed., 6ª edición (2001), y Vaccines, S. Plotkin y W. Orenstein, eds., 3ª edición
65 (1999).
Definiciones generales
Un “TARMOGEN®” (Globelmmune, Inc., Louisville, Colorado) se refiere en general a un vehículo de levadura que expresa uno o más antígenos heterólogos de forma extracelular (en su superficie), intracelular (de forma interna o
5 citosólica) o tanto extracelular como intracelular. Los productos TARMOGEN se han descrito en general (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.º 5.830.463). Ciertas composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura y métodos para prepararlas y uso general de las mismas también se describen en detalle, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.º 5.830.463, Patente de Estados Unidos N.º 7.083.787, Patente de Estados Unidos N.º 7.736.642, Stubbs et al., Nat. Med. 7: 625-629 (2001), Lu et al., Cancer Research 64: 5084-5088 (2004), y en Bernstein et al., Vaccine 2008 ene 24; 26(4): 509-21.
Como se usa en el presente documento, el término “análogo” se refiere a un compuesto químico que es estructuralmente similar a otro compuesto pero difiere ligeramente en su composición (como en el reemplazo de un átomo por un átomo de un elemento diferente o en presencia de un grupo funcional particular, o el reemplazo de un
15 grupo funcional por otro grupo funcional). Por lo tanto, un análogo es un compuesto que es similar o comparable en función o apariencia, pero tiene una estructura o un origen diferente con respecto al compuesto de referencia.
Las expresiones “sustituido”, “derivado sustituido” y “derivado”, cuando se usan para describir un compuesto, significan que al menos un hidrógeno unido al compuesto no sustituido se reemplaza con un átomo o un resto químico diferente.
Aunque un derivado tiene una estructura física similar al compuesto parental, el derivado puede tener propiedades químicas y/o biológicas diferentes al del compuesto parental. Dichas propiedades puede incluir, pero sin limitación, actividad aumentada o reducida del compuesto parental, nueva actividad en comparación con el compuesto
25 parental, biodisponibilidad potenciada o reducida, eficacia potenciada o reducida, estabilidad potenciada o reducida in vitro y/o in vivo y/o propiedades de absorción potenciadas o reducidas.
En general, la expresión “biológicamente activo” indica que un compuesto (incluyendo una proteína o un péptido) tiene al menos una actividad detectable que tiene un efecto en los procesos metabólicos u otros de una célula o un organismo, como se mide o se observa in vivo (es decir, en un ambiente fisiológico natural) o in vitro (es decir, en condiciones de laboratorio).
De acuerdo con la presente invención, el término “modular” puede usarse indistintamente con “regular” y se refiere en general a la regulación positiva o regulación negativa de una actividad particular. Como se usa en el presente
35 documento, la expresión “regular positivamente” puede usarse en general para describir cualquiera de: inducción, inicio, elevación, aumento, refuerzo, mejora, potenciación, amplificación, promoción o provisión, con respecto a una actividad particular. De forma similar, la expresión “regular negativamente” puede usarse en general para describir cualquier de: bajar, reducir, inhibir, mejorar, disminuir, aliviar, bloquear o prevenir, con respecto a una actividad particular.
En una realización de la presente invención, puede producirse cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento con al menos uno, y hasta aproximadamente 20, aminoácidos heterólogos adicionales que flanquean cada uno de los extremos C y/o N terminales de la secuencia de aminoácidos especificada. Puede indicarse que la proteína o el polipéptido resultante “consiste esencialmente en” la secuencia de 45 aminoácidos especificada. De acuerdo con la presente invención, los aminoácidos heterólogos son una secuencia de aminoácidos que no se encuentran de forma natural (es decir, no se encuentran en la naturaleza, in vivo) flanqueando la secuencia de aminoácidos especificada o que no están relacionados con la función de la secuencia de aminoácidos especificada, o que no estarían codificados por los nucleótidos que flanquean la secuencia de ácido nucleico de origen natural que codifica la secuencia de aminoácidos especificada como aparece en el gen, si dichos nucleótidos en la secuencia de origen natural se tradujeran usando uso codónico convencional para el organismo del que deriva la secuencia de aminoácidos dada. De forma similar, la expresión “que consiste esencialmente en”, cuando se usa en referencia a una secuencia de ácido nucleico en el presente documento se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos especificada que puede flanquearse por de al menos uno, y hasta aproximadamente 60, nucleótidos heterólogos adicionales en cada uno del extremo 5’ y/o el
55 extremo 3’ de la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos especificada. Los nucleótidos heterólogos no se encuentran de forma natural (es decir, no se encuentran en la naturaleza, in vivo) flanqueando la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos especificada como aparece en el gen natural o no codifican una proteína que transmita ninguna función adicional a la proteína o cambie la función de la proteína que tenga la secuencia de aminoácidos especificada.
De acuerdo con la presente invención, la expresión “se une selectivamente con” se refiere a la capacidad de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o compañero de unión de la presente invención para unirse preferentemente con proteínas especificadas. Más específicamente, la expresión “se unen selectivamente” se refiere a la unión específica de una proteína con otra (por ejemplo, un anticuerpo, fragmento del mismo, o compañero de 65 unión a un antígeno), en la que el nivel de unión, como se mide por cualquier ensayo convencional (por ejemplo, un inmunoensayo) es estadísticamente significativamente mayor que el control de fondo para el ensayo. Por ejemplo,
cuando se realiza un inmunoensayo, los controles incluyen típicamente un pocillo/tubo de reacción que contiene un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno solo (es decir, en ausencia de antígeno, en el que se considera que una cantidad de reactividad (por ejemplo, unión no específica con el pocillo) por el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en ausencia del antígeno es fondo. La unión puede medirse usando una diversidad de métodos
5 convencionales en la técnica incluyendo inmunoensayos enzimáticos (por ejemplo, ELISA, ensayos de inmunotransferencia, etc.).
La referencia a una proteína o a un polipéptido usado en la presente invención incluye proteínas de longitud completa, proteínas de fusión o cualquier fragmento, dominio, epítopo conformacional u homólogo de dichas proteínas, incluyendo dominios funcionales y dominios inmunológicos de proteínas. Más específicamente, una proteína aislada, de acuerdo con la presente invención, es una proteína (incluyendo un polipéptido o péptido) que se ha retirado de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulación humana) y puede incluir proteínas purificadas, proteínas parcialmente purificadas, proteínas producidas de forma recombinante y proteínas producidas de forma sintética, por ejemplo. Como tal, “aislado” no refleja la medida en que se ha purificado la proteína.
15 Preferentemente, una proteína aislada de la presente invención se produce de forma recombinante. De acuerdo con la presente invención, los términos “modificación” y “mutación” pueden usarse indistintamente, particularmente con respecto a las modificaciones/mutaciones de la secuencia de aminoácidos de proteínas o partes de las mismas (o secuencias de ácido nucleico) descritas en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “homólogo” se usa para hacer referencia a una proteína o a un péptido que difiere de una proteína o un péptido de origen natural (es decir, la proteína “prototípica” o “de tipo silvestre”) por modificaciones menores de la proteína o el péptido de origen natural, pero que mantiene la proteína básica y la estructura de cadena lateral de la forma de origen natural. Dichos cambios incluyen, pero sin limitación: cambios en una o varias cadenas laterales de aminoácidos; cambios en uno o varios aminoácidos, incluyendo
25 supresiones (por ejemplo, una versión truncada de la proteína o el péptido) inserciones y/o sustituciones; cambios en la estereoquímica de uno o varios átomos; y/o derivatizaciones menores, incluyendo pero sin limitación: metilación, glucosilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palmitación, amidación y/o adición de glucosilfosfatidil inositol. Un homólogo puede tener propiedades potenciadas, reducidas o sustancialmente similares en comparación con la proteína o el péptido de origen natural. Un homólogo puede incluir un agonista de una proteína o un antagonista de una proteína. Pueden producirse homólogos usando técnicas conocidas en este campo para la producción de proteínas incluyendo, pero sin limitación, modificaciones directas de la proteína de origen natural, aislada, síntesis proteica directa o modificaciones de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína usando, por ejemplo, técnicas de ADN clásicas o recombinantes para efectuar mutagénesis aleatoria o dirigida.
35 Un homólogo de una proteína dada puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 45 %, o al menos aproximadamente 50 %, o al menos aproximadamente 55 %, o al menos aproximadamente 60 %, o al menos aproximadamente 65 %, o al menos aproximadamente 70 %, o al menos aproximadamente 75 %, o al menos aproximadamente 80 %, o al menos aproximadamente 85 %, o al menos aproximadamente 90 %, o al menos aproximadamente 91 % idéntica, o al menos aproximadamente 92 % idéntica, o al menos aproximadamente 93 % idéntica, o al menos aproximadamente 94 % idéntica, o al menos aproximadamente 95 % idéntica, o al menos aproximadamente 96 % idéntica, o al menos aproximadamente 97 % idéntica, o al menos aproximadamente 98 % idéntica, o al menos aproximadamente 99 % idéntica (o cualquier porcentaje de identidad entre 45 % y 99 %, en incrementos de números enteros), a la secuencia de aminoácidos de la proteína de referencia. En una realización, el homólogo comprende, consiste esencialmente en
45 o consiste en una secuencia de aminoácidos que es menos de 100 % idéntica, menos de aproximadamente 99 % idéntica, menos de aproximadamente 98 % idéntica, menos de aproximadamente 97 % idéntica, menos de aproximadamente 96 % idéntica, menos de aproximadamente 95 % idéntica, y así sucesivamente, en incrementos del 1 % a menos de aproximadamente 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de origen natural de la proteína de referencia.
Un homólogo puede incluir proteínas o dominios de proteínas que son “de longitud casi completa”, lo que significa que dicho homólogo difiere de la proteína de longitud completa, el dominio funcional o el dominio inmunológico (como dicha proteína, dominio funcional o dominio inmunológico se describe en el presente documento o se conoce
o describe de otro modo en una secuencia disponible públicamente) mediante la adición o supresión de 1, 2, 3, 4, 5,
55 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos del extremo N y/o C terminal de dicha proteína de longitud completa o dominio funcional de longitud completa o dominio inmunológico de longitud completa.
Como se usa en el presente documento, a no ser que se especifique de otro modo, la referencia a un porcentaje (%) de identidad se refiere a una evaluación de homología que se realiza usando: (1) una búsqueda homología de BLAST 2.0 basic BLAST usando blastp para búsquedas de aminoácidos y blastn para búsquedas de ácidos nucleicos con parámetros por defecto convencionales, en la que la secuencia de consulta se filtra con respecto a regiones de baja complejidad por defecto (descrito en Altschul, S.F., Madden, T.L., Schääffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. y Lipman, D.J. (1997) “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.” Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402); (2) un alineamiento de BLAST 2 (usando los parámetros 65 descritos posteriormente); (3) y/o PSI-BLAST con los parámetros por defecto convencionales (BLAST por iteraciones específico de posición). Se observa que debido a algunas diferencias en los parámetros convencionales entre
BLAST 2.0 Basic BLAST y BLAST 2, podría reconocerse que dos secuencias específicas tienen homología significativa usando el programa BLAST 2, mientras que una búsqueda realizada en BLAST 2.0 Basic BLAST usando una de las secuencias como la secuencia de consulta puede no identificar la segunda secuencia en las mejores coincidencias. Además, PSI-BLAST proporciona una versión automática, fácil de usar, de una búsqueda de
5 “perfil”, que es un modo sensible de buscar homólogos de secuencia. El programa realiza en primer lugar una búsqueda de bases de datos BLAST con huecos. El programa PSI-BLAST usa información de cualquier elemento significativo producida para construir una matriz de puntuación específica de posición, que reemplaza la secuencia de consulta para el siguiente ciclo de búsqueda de base de datos. Por lo tanto, debe entenderse que el porcentaje de identidad puede determinarse usando uno cualquiera de estos programas.
Pueden alinearse dos secuencias específicas entre sí usando secuencia BLAST 2 como se describe en Tatusova y Madden, (1999), “Blast 2 sequences -a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250. Se realiza alineamiento de secuencias BLAST 2 en blastp o blastn en usando el algoritmo BLAST
2.0 para realizar una búsqueda de BLAST con huecos (BLAST 2.0) entre las dos secuencias permitiendo la
15 introducción de huecos (supresiones e inserciones) en el alineamiento resultante. Para fines de claridad en el presente documento, se realiza un alineamiento de secuencias BLAST 2 usando los parámetros por defecto convencionales de la siguiente manera.
Para blastn, usando matriz 0 BLOSUM62:
Recompensa por coincidencia = 1 Penalización por desapareamiento = -2 Penalizaciones por hueco abierto (5) y extensión de hueco (2) Disminución de hueco x (50) expectativa (10) tamaño de palabra (11) filtro (activado)
25 Para blastp, usando matriz 0 BLOSUM62:
Penalizaciones de hueco abierto (11) y extensión de hueco (1)
Disminución de hueco x (50) expectativa (10) tamaño de palabra (3) filtro (activado)
Una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico que se ha retirado de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulación humana), siendo su medio natural el genoma o el cromosoma en el que se encuentra la molécula de ácido nucleico en la naturaleza. Como tal, “aislado” no refleja necesariamente la medida en que la molécula de ácido nucleico se ha purificado, pero indica que la molécula no incluye un genoma 35 completo o un cromosoma completo en el que la molécula de ácido nucleico se encuentra en la naturaleza. Una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir un gen. Una molécula de ácido nucleico aislada que incluye un gen no es un fragmento de un cromosoma que incluye dicho gen, sino que en su lugar incluye la región codificante y regiones reguladoras asociadas con el gen, pero no genes adicionales que se encuentren de forma natural en el mismo cromosoma. Una molécula de ácido nucleico aislada también puede incluir una secuencia de ácido nucleico especificada flanqueada por (es decir, en el extremo 5’ y/o el 3’ de la secuencia) ácidos nucleicos adicionales que no flaquean normalmente la secuencia de ácido nucleico especificada en la naturaleza (es decir, secuencias heterólogas). La molécula de ácido nucleico aislada puede incluir ADN, ARN (por ejemplo, ARNm) o derivados de ADN o ARN (por ejemplo, ADNc). Aunque la expresión “molécula de ácido nucleico” se refiere principalmente a la molécula de ácido nucleico física y la expresión “secuencia de ácido nucleico” se refiere principalmente a la
45 secuencia de nucleótidos en la molécula de ácido nucleico, las dos expresiones pueden usarse indistintamente, especialmente con respecto a una molécula de ácido nucleico, o una secuencia de ácido nucleico, que es capaz de codificar una proteína o un dominio de una proteína.
Una molécula de ácido nucleico recombinante es una molécula que puede incluir al menos una de cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique una cualquiera o más proteínas descritas en el presente documento unidas operativamente con al menos una de cualquier secuencia de control de la transcripción capaz de regular eficazmente la expresión de la molécula o las moléculas de ácido nucleico en la célula para transfectar. Aunque la expresión “molécula de ácido nucleico” se refiere principalmente a la molécula de ácido nucleico física y la expresión “secuencia de ácido nucleico” se refiere principalmente a la secuencia de nucleótidos en la molécula de ácido
55 nucleico, las dos expresiones pueden usarse indistintamente, especialmente con respecto a una molécula de ácido nucleico, o una secuencia de ácido nucleico, que es capaz de codificar una proteína. Además, la expresión “molécula recombinante” se refiere principalmente a una molécula de ácido nucleico unida operativamente con una secuencia de control de la transcripción, pero que puede usarse indistintamente con la expresión “molécula de ácido nucleico” que se administra a un animal.
Una molécula de ácido nucleico recombinante incluye un vector recombinante, que es cualquier secuencia de ácido nucleico, típicamente una secuencia heteróloga, que se une operativamente con la molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de fusión de la presente invención, que es capaz de permitir la producción recombinante de la proteína de fusión, y que es capaz de suministrar la molécula de ácido nucleico a una célula 65 hospedadora de acuerdo con la presente invención. Dicho vector puede contener secuencias de ácido nucleico que no se encuentran de forma natural adyacentes a las moléculas de ácido nucleico aisladas para insertar en el vector.
El vector puede ser ARN o ADN, bien procariota o bien eucariota, y preferentemente en la presente invención es un virus o un plásmido. Pueden usarse vectores recombinantes en la clonación, secuenciación y/o manipulación de otro modo de moléculas de ácido nucleico, y pueden usarse en el suministro de dichas moléculas (por ejemplo, como en una composición de ADN o una composición basada en vector vírico). Se usan preferentemente vectores
5 recombinantes en la expresión de moléculas de ácido nucleico, y también pueden denominarse vectores de expresión. Los vectores recombinantes preferidos pueden expresarse en una célula hospedadora transfectada.
En una molécula recombinante de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico se unen operativamente con vectores de expresión que contiene secuencias reguladoras tales como secuencias de control de la transcripción, secuencias de control de la traducción, orígenes de replicación y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula hospedadora y que controlan la expresión de moléculas de ácido nucleico de la presente invención. En particular, las moléculas recombinantes de la presente invención incluyen moléculas de ácido nucleico que se unen operativamente con una o más secuencias de control de la expresión. La expresión “unido operativamente” se refiere a unir una molécula de ácido nucleico con una secuencia de control de la expresión de tal
15 manera que la molécula se exprese cuando se transfecta (decir, se transforma, se transduce o se transfecta) en una célula hospedadora.
De acuerdo con la presente invención, el término “transfección” se usa para hacer referencia a cualquier método por el que una molécula de ácido nucleico exógena (es decir, una molécula de ácido nucleico recombinante) puede insertarse en una célula. El término “transformación” puede usarse indistintamente con el término “transfección” cuando dicho término se usa para hacer referencia a la introducción de moléculas de ácido nucleico en células microbianas, tales como algas, bacterias y levadura. En sistemas microbianos, el término “transformación” se usa para describir un cambio heredado debido a la adquisición de ácidos nucleicos exógenos por el microorganismo y es esencialmente sinónimo con el término “transfección”. Por lo tanto, las técnicas de transfección incluyen, pero sin
25 limitación, transformación, tratamiento químico de células, bombardeo de partículas, electroporación, microinyección, lipofección, absorción, infección y fusión de protoplastos.
Los siguientes resultados experimentales se proporcionan para fines de ilustración.
Ejemplos
Ejemplo 1
El siguiente ejemplo describe la producción de una composición inmunoterapéutica basada en levadura para el 35 tratamiento o la prevención de la invención por el virus de la hepatitis B (VHB).
En este experimento, se modificó técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar diversas proteínas de fusión de superficie-núcleo del VHB, que tienen cada una la estructura básica mostrada en la Fig. 2, bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1, o el promotor TEF2. En cada caso, la proteína de fusión del VHB fue un único polipéptido de aproximadamente 595 aminoácidos, con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N al C terminal, representados por SEQ ID NO: 34 (1) un péptido N terminal para transmitir resistencia a la degradación proteasómica y estabilizar la expresión (posiciones 1 a 6 de SEQ ID NO: 34); 2) un espaciador de dos aminoácidos (Thr-Ser) para introducir un sitio de enzimas de restricción SpeI; 3) la secuencia de aminoácidos de un antígeno de superficie grande (L) del genotipo C de VHB de longitud 45 casi completa (menos la posición 1) (por ejemplo, posiciones 9 a 407 de SEQ ID NO: 34, correspondientes a las posiciones 2-400 de SEQ ID NO: 11, que difieren de SEQ ID NO: 34 en las posiciones 350-351 de SEQ ID NO: 11, donde una secuencia Leu-Val en SEQ ID NO: 11 se reemplaza con una secuencia Gln-Ala en las posiciones 357358 de SEQ ID NO: 34); 4) la secuencia de aminoácidos de un antígeno de núcleo del VHB (por ejemplo, las posiciones 408 a 589 de SEQ ID NO: 34 o las posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 9); y 5) un marcador de hexahistidina (posiciones 590-595 de SEQ ID NO: 34). Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de SEQ ID NO: 34 (con codones optimizados para la expresión en levadura) está representada en el presente documento por SEQ ID NO: 33. Las posiciones 28-54 de SEQ ID NO: 34 comprenden la parte receptora de hepatocitos de la proteína de superficie grande (L). SEQ ID NO: 34 contiene múltiples epítopos o dominios que se cree que potencian la inmunogenicidad de la proteína de fusión. Por ejemplo, en las posiciones 209-220, las
55 posiciones 389-397, las posiciones 360-367 y las posiciones 499-506, con respecto a SEQ ID NO: 34, comprenden epítopos de CTL y/o de unión a MHC de Clase I conocidos. Las posiciones 305-328 de SEQ ID NO: 34 comprenden un epítopo de anticuerpo. Esta proteína de fusión y producto inmunoterapéutico basado en levadura correspondiente que comprende esta proteína pueden denominarse en general en el presente documento “Score”, “MADEAP-Score”, “M-Score” o “GI-13002”.
Brevemente, se optimizaron los codones del ADN que codificaba el antígeno de superficie grande (L) de longitud casi completa fusionada con el antígeno de núcleo de longitud completa para la expresión en levadura, y después se digirió con EcoRI y NotI y se insertó detrás del promotor CUP1 (pGI-100) o el promotor TEF2 (pTK57-1), en vectores de expresión de 2 um de levadura. La proteína de fusión codificada por estas construcciones está representada en 65 el presente documento por SEQ ID NO: 34 (codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 33) y tiene un peso molecular aproximado esperado de 66 kDa. Los plásmidos resultantes se introdujeron en levadura
Saccharomyces cerevisiae W303α por transfección con acetato de litio/polietilenglicol, y se seleccionaron transfectantes primarios en placas mínimas sólidas que carecían de uracilo (UDM; medio sin uridina). Las colonias se volvieron a sembrar en estrías en UDM o ULDM (medio sin uridina y leucina) y se permitió que crecieran durante 3 días a 30 ºC. Se inocularon cultivos líquidos que carecían de uridina (medio U2: glucosa 20 g/l; 6,7 g/l de base
5 nitrogenada de levadura que contiene sulfato de amonio; 0,04 mg/ml de cada uno de histidina, leucina, triptófano y adenina) o que carece de uridina y leucina (medio UL2; glucosa 20 g/l; 6,7 g/l de base nitrogenada de levadura que contiene sulfato de amonio; y 0,04 mg/ml de cada uno de his, triptófano y adenina) de placas y cultivos de partida durante 20 h a 30 ºC, 250 rpm. También se inoculó medio con pH tamponado que contenía 4,2 g/l de Bis-Tris (BT-U2; BT-UL2) para evaluar el crecimiento de la levadura en condiciones de pH neutro. Se usaron cultivos primarios para inocular cultivos finales de la misma formulación y se continuó el crecimiento hasta que se alcanzó una densidad de 1,1 a 4,0 UL/ml.
Para cepas TEF2 (expresión constitutiva), las células se recogieron, se lavaron y se destruyeron por calor a 56 ºC durante 1 h en PBS. Las células vivas también se procesaron para comparación. Para cepas CUP1 (expresión
15 inducible) se indujo expresión en el mismo medio con sulfato de cobre 0,5 mM durante 5 h a 30 ºC, 250 rpm. Las células se recogieron, se lavaron y se destruyeron por calor a 56 ºC durante 1 h en PBS. Las células vivas también se procesaron para comparación.
Después de destruir por calor cultivos de TEF2 y CPU1, las células se lavaron tres veces en PBS. La expresión proteica total se midió por un ensayo de unión de nitrocelulosa/precipitación de TCA y se midió la expresión de antígenos por transferencia de western usando un anticuerpo monoclonal anti-marcador de his. El antígeno se cuantificó por interpolación a partir de una curva patrón de proteína NS3 recombinante, marcada con hexa-histidina que se procesó en la misma transferencia de western. Los resultados se muestran en la Fig. 16 (destruidos por calor) y Fig. 17 (levadura viva). Estas figuras muestran que la composición inmunoterapéutica basada en levadura
25 de la divulgación expresa la proteína de fusión de superficie-núcleo del VHB bien usando ambos promotores, y puede identificarse por transferencia de Western en células de levadura tanto destruidas por calor como vivas. La expresión de antígeno calculada por este producto inmunoterapéutico basado en levadura fue de ∼5000 ng de proteína por U.L. (Unidad de Levadura; Una Unidad de Levadura (U.L.) es 1 x 107 células de levadura o equivalentes de células de levadura) o 76 pmoles de proteína por U.L.
Ejemplo 2
El siguiente ejemplo describe la producción de otra composición inmunoterapéutica basada en levadura para el tratamiento o la prevención de la infección por virus de la hepatitis B (VHB).
35 Se modificó técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar diversas proteínas de fusión del VHB, que tienen cada una la estructura mostrada esquemáticamente en la Fig. 3, bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1 o el promotor TEF2. En cada caso, la proteína de fusión fue un único polipéptido de aproximadamente 945 aminoácidos, con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal, representados por SEQ ID NO: 36: (1) un péptido N terminal para transmitir resistencia a degradación proteasómica y estabilizar la expresión (posiciones 1 a 5 de SEQ ID NO: 36); 2) la secuencia de aminoácidos de un dominio receptor de hepatocitos de genotipo C del VHB de la parte pre-S1 de la proteína de superficie grande (L) del VHB (única de L) (por ejemplo, posiciones 21-47 de SEQ ID NO: 11 o posiciones 6 a 32 de SEQ ID NO: 36); 3) la secuencia de aminoácidos de un antígeno de superficie pequeño (S) del genotipo C de VHB
45 de longitud completa (por ejemplo, posiciones 176 a 400 de SEQ ID NO: 11 o posiciones 33 a 257 de SEQ ID NO: 36); 4) un espaciador/enlazador de dos aminoácidos (Leu-Glu) para facilitar la clonación y manipulación de las secuencias (posiciones 258 y 259 de SEQ ID NO: 36); 5) la secuencia de aminoácidos de una parte de la polimerasa del genotipo C de VHB que incluye el dominio de transcriptasa inversa (por ejemplo, las posiciones 247 a 691 de SEQ ID NO: 10 o las posiciones 260 a 604 de SEQ ID NO: 36); 6) una proteína del núcleo del genotipo C de VHB (por ejemplo, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 9 o posiciones 605 a 786 de SEQ ID NO: 36); 7) la secuencia de aminoácidos de un antígeno X del genotipo C de VHB (por ejemplo, posiciones 2 a 154 de SEQ ID NO: 12 o posiciones 787 a 939 de SEQ ID NO: 36); y 8) un marcador de hexahistidina (posiciones 940 a 945 de SEQ ID NO: 36). La proteína de fusión y el producto inmunoterapéutico basado en levadura correspondiente que comprenden esta proteína pueden denominarse en general en el presente documento “MADEAP-Spex”, “M-Spex” o “GI-13005”.
55 Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de SEQ ID NO: 36 (con codones optimizados para expresión en levaduras) está representada en el presente documento por SEQ ID NO: 35. SEQ ID NO: 36 tiene un peso molecular aproximado esperado de 106-107 kDa. SEQ ID NO: 36 contiene múltiples epítopos o dominios que se cree que potencian la inmunogenicidad de la proteína de fusión, incluyendo varios descritos anteriormente para SEQ ID NO: 34. Además, el dominio de transcriptasa inversa usado en esta proteína de fusión contiene varias posiciones de aminoácidos que se sabe que se mutan como una respuesta de resistencia farmacológica al tratamiento con fármacos antivíricos, y por lo tanto pueden mutarse en esta proteína de fusión para proporcionar un producto inmunoterapéutico terapéutico o profiláctico que dirige las mutaciones de resistencia a fármaco específicas (de escape). Estas posiciones de aminoácidos están, con respecto a la SEQ ID NO: 36, en la posición de
65 aminoácido: 432 (Val, que se sabe que muta a una Leu después de terapia de lamivudina); posición 439 (Leu, que se sabe que muta a una Met después terapia de lamivudina); posición 453 (Ala, que se sabe que muta a una Thr
después de terapia de tenofovir); posición 463 (Met, que se sabe que muta a una Ile o Val después de terapia de lamivudina); y posición 495 (Asn, que se sabe que muta a Thr después de terapia de adefovir).
Para crear un segundo producto inmunoterapéutico basado en levadura utilizando un péptido N terminal diferente en
5 el antígeno, se modificó técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar diversas proteínas de fusión del VHB, que también tienen la estructura básica mostrada esquemáticamente en la Fig. 3, bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1 o el promotor TEF2. En este segundo caso, se usó una secuencia prepro de factor alfa (representada por SEQ ID NO: 89) en lugar del péptido N terminal sintético descrito anteriormente en la fusión representada por SEQ ID NO: 36. Brevemente, la nueva proteína de fusión fue un polipéptido individual con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal, representados por SEQ ID NO: 92: (1) un péptido N terminal para transmitir resistencia a degradación proteasómica y estabilizar o potenciar la expresión (SEQ ID NO: 89, posiciones 1 a 89 de SEQ ID NO: 92); 2) un espaciador/enlazador de dos aminoácidos (Thr-Ser) para facilitar la clonación y manipulación de las secuencias (posiciones 90 a 91 de SEQ ID NO: 92); 3) la secuencia de aminoácidos de un dominio del receptor de hepatocitos
15 de genotipo C del VHB de la parte pre-S1 de la proteína de superficie grande (L) del VHB (única de L) (por ejemplo, posiciones 21-47 de SEQ ID NO: 11 o posiciones 92 a 118 de SEQ ID NO: 92); 4) la secuencia de aminoácidos de un antígeno de superficie pequeño (S) del genotipo C de VHB de longitud completa (por ejemplo, posiciones 176 a 400 de SEQ ID NO: 11 o posiciones 119 a 343 de SEQ ID NO: 92); 5) un espaciador/enlazador de dos aminoácidos (Leu-Glu) para facilitar la clonación y manipulación de las secuencias (por ejemplo, posiciones 344 a 345 de SEQ ID NO: 92); 6) la secuencia de aminoácidos de una parte de la polimerasa del genotipo C de VHB que incluye el dominio de transcriptasa inversa (por ejemplo, posiciones 247 a 691 de SEQ ID NO: 10 o posiciones 346 a 690 de SEQ ID NO: 92); 7) una proteína del núcleo del genotipo C de VHB (por ejemplo, posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 9 o posiciones 691 a 872 de SEQ ID NO: 92); 8) la secuencia de aminoácidos de un antígeno X del genotipo C del VHB (por ejemplo, posiciones 2 a 154 de SEQ ID NO: 12 o posiciones 873 a 1025 de SEQ ID NO: 92); y 9) un
25 marcador de hexahistidina (por ejemplo, posiciones 1026 a 1031 de SEQ ID NO: 92). Esta proteína de fusión y producto inmunoterapéutico basado en levadura correspondiente que comprende esta proteína puede denominarse en general en el presente documento “alfa-Spex”, “a-Spex” o “GI-13004”.
Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de SEQ ID NO: 92 (con codones optimizados para expresión en levadura) está representada en el presente documento por SEQ ID NO: 91. SEQ ID NO: 92 tiene un peso molecular aproximado esperado de 123 kDa. SEQ ID NO: 92 contiene múltiples epítopos o dominios que se cree que potencian la inmunogenicidad de la proteína de fusión, incluyendo varios descritos anteriormente para SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 36. Además, el dominio de transcriptasa inversa usada en esta proteína de fusión contiene varias posiciones de aminoácidos que se sabe que se mutan como una respuesta a la resistencia a fármaco al
35 tratamiento con fármacos antivíricos, y por lo tanto, pueden mutarse en esta proteína de fusión para proporcionar un producto inmunoterapéutico terapéutico o profiláctico que se dirige a mutaciones de resistencia a fármaco específicas (escape). Estas posiciones de aminoácidos están, con respecto a SEQ ID NO: 82, en la posición de aminoácido: 518 (Val, que se sabe que muta a una Leu después de terapia de lamivudina); posición 525 (Leu, que se sabe que muta a una Met después de terapia de lamivudina); posición 539 (Ala, que se sabe que muta a Thr después de terapia de tenofovir); posición 549 (Met, que se sabe que muta a una Ile o Val después de terapia de lamivudina); y posición 581 (Asn, que se sabe que muta a Thr después de terapia de adefovir).
Para crear estas composiciones inmunoterapéuticas que comprenden las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 92, se fusionaron ADN que codifica las regiones conservadas anteriormente
45 descritas del antígeno de superficie (región receptora de hepatocitos de pre-S1 o antígeno de superficie grande, y antígeno de superficie pequeño de longitud completa) y la región de transcriptasa inversa de polimerasa con el núcleo de longitud completa y el antígeno X de longitud completa. Se optimizaron los codones del ADN para expresión en levadura y después se digirió con EcoRI y Notl y se insertó detrás del promotor CUP1 (pGI-100) o el promotor TEF2 (pTK57-1) en vectores de expresión de 2 um de levadura. Los plásmidos resultantes se introdujeron en levadura Saccharomyces cerevisiae W303α mediante transfección con acetato de litio/polietilenglicol y se seleccionaron transfectantes primarios en placas mínimas sólidas sin Uracilo (UDM; medio sin uridina). Las colonias se volvieron a sembrar en estrías en UDM o ULDM (medio sin uridina y leucina) y se permitió que crecieran durante 3 días a 30 ºC.
55 Se inocularon cultivos líquidos que carecían de uridina (U2) o que carecían de uridina y leucina (UL2) de placas y se dejaron crecer cultivos de partida durante 20 h a 30 ºC, 250 rpm. También se inocularon medios con pH tamponado que contenían 4,2 g/l de Bis-Tris (BT-U2; BT-UL2) para evaluar el crecimiento de la levadura en condiciones de pH neutro (datos no mostrados). Se usaron cultivos primarios para inocular cultivos finales de la misma formulación y se continuó el crecimiento hasta que se alcanzó una densidad de 1,1 a 4,0 UL/ml. Para cepas de TEF2 (expresión constitutiva), las células se recogieron, se lavaron y se destruyeron por calor a 56 ºC durante 1 h en PBS. Para cepas CUP1 (expresión inducible), se indujo expresión en el mismo medio con sulfato de cobre 0,5 mM durante 5 h a 30 ºC, 250 rpm. Las células se recogieron, se lavaron y se destruyeron por calor a 56 ºC durante 1 h en PBS. También se procesaron células vivas para comparación (datos no mostrados).
65 Después de destruir por calor cultivos de TEF2 y CUP1, las células se lavaron tres veces en PBS. Se midió la expresión proteica total por un ensayo de unión a nitrocelulosa/precipitación con TCA y se midió la expresión de
antígeno por transferencia de western usando un anticuerpo monoclonal antimarcador his. El antígeno se cuantificó por interpolación de una curva patrón de proteína NS3 marcada con hexa-histidina, recombinante, que se procesó en la misma transferencia de western.
5 Para el producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa la proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 36 (GI-13005), los resultados se muestran en la Fig. 18. La Fig. 18 muestra que la composición inmunoterapéutica basada en levadura de la divulgación expresa la proteína de fusión bien usando ambos promotores, y puede identificarse por transferencia de Western en células de levadura destruidas por calor (también se consiguió expresión de levaduras vivas, datos no mostrados). La expresión de antígeno calculada por este producto inmunoterapéutico basado en levadura fue ∼1200 ng de proteína por U.L. u 11 pmoles de proteína por U.L., para cultivo en UL2.
Para el producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa la proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 92 (GI-13004), los resultados se muestran en la Fig. 19. La Fig. 19 muestra la expresión de esta composición
15 inmunoterapéutica basada en levadura bajo el control CUP1 (identificado en la Fig. 19 como Alfa-SPEX) en comparación con un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa un antígeno no relacionado (Levadura de Control) y con la composición inmunoterapéutica basada en levadura que expresa una proteína de fusión del VHB representada por SEQ ID NO: 36 (SPEX). La Fig. 19 muestra que los productos inmunoterapéuticos basados en levadura expresan las proteínas de fusión relevantes bien, y pueden identificarse por transferencia de Western en células de levadura destruidas por calor. La expresión de antígeno calculada por este producto inmunoterapéutico basado en levadura (Alfa-SPEX) fue de ∼5000 ng de proteína por U.L. o 41 pmoles de proteína por U.L. para cultivo en UL2.
Ejemplo 3
25 El siguiente ejemplo describe la producción de composición inmunoterapéutica basada en levadura adicional para el tratamiento o la prevención de infección por virus de la hepatitis B (VHB).
En este experimento, se modifica levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar diversas proteínas de fusión de polimerasa-núcleo del VHB, como se muestra esquemáticamente en la Fig. 4, bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1, o el promotor TEF2. En cada caso, la proteína de fusión es un único polipéptido de aproximadamente 527 aminoácidos, con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal, representados por SEQ ID NO: 38: (1) un péptido N terminal para transmitir resistencia a degradación proteasómica y estabilizar la expresión (SEQ ID NO: 37; posiciones 1 a 6 de SEQ ID NO: 38); 2) la 35 secuencia de aminoácidos de una parte de la polimerasa del genotipo C de VHB que incluye el dominio de transcriptasa inversa (por ejemplo, las posiciones 347 a 691 de SEQ ID NO: 10 o las posiciones 7 a 351 de SEQ ID NO: 38); 3) una proteína de núcleo del genotipo C de VHB (por ejemplo, posiciones 31 a 212 de SEQ ID NO: 9 o posiciones 352 a 533 de SEQ ID NO: 38); y 4) un marcador de hexahistidina (por ejemplo, posiciones 534 a 539 de SEQ ID NO: 38). SEQ ID NO: 38 tiene un peso molecular predicho de aproximadamente 58 kDa. La secuencia también contiene epítopos o dominios que se cree que potencian la inmunogenicidad de la proteína de fusión. En construcciones adicionales, el péptido N terminal de SEQ ID NO: 37 se reemplaza con un péptido N terminal sintético diferente representado por un homólogo de SEQ ID NO: 37 que cumple los mismos requisitos estructurales básicos de SEQ ID NO: 37 como se describe en detalle en la memoria descriptiva, o el péptido N terminal de SEQ ID NO: 37 se reemplaza con el péptido de N terminal de SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 90, y en otra construcción, el
45 péptido N terminal se omite y se incluye una metionina en la posición uno.
En otro experimento, se modifica técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar diversas proteínas de fusión X-núcleo del VHB como se muestra esquemáticamente en la Fig. 5 bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1, o el promotor TEF2. En cada caso, la proteína de fusión es un único polipéptido de aproximadamente 337 aminoácidos con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal, representados por SEQ ID NO: 39 (1) un péptido N terminal para transmitir resistencia a degradación proteasómica y estabilizar la expresión (SEQ ID NO: 37; posiciones 1 a 6 de SEQ ID NO: 39); 2) la secuencia de aminoácidos de un antígeno X del genotipo C de VHB de longitud casi completa (menos la posición 1) (por ejemplo, posiciones 2 a 154 de SEQ ID NO: 12 o posiciones 7 a 159 de SEQ ID NO: 39); 3) una proteína de núcleo del
55 genotipo C de VHB (por ejemplo, posiciones 31 a 212 de SEQ ID NO: 9 o posiciones 160 a 341 de SEQ ID NO: 39); y 4) un marcador de hexahistidina (posiciones 342 a 347 de SEQ ID NO: 39). SEQ ID NO: 39 tiene un peso molecular aproximado predicho de 37 kDa. La secuencia también contiene epítopos o dominios que se cree que potencian la inmunogenicidad de la proteína de fusión. En construcciones adicionales, el péptido N terminal de SEQ ID NO: 37 se reemplaza con un péptido N terminal sintético diferente representado por un homólogo de SEQ ID NO: 37 que cumple los mismos requisitos estructurales básicos de SEQ ID NO: 37 como se describe en detalle en la memoria descriptiva o el péptido N terminal de SEQ ID NO: 37 se reemplaza con el péptido N terminal de SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 90, y en otra construcción, el péptido N terminal se omite y se incluye una metionina en la posición uno.
65 En otro experimento, se modifica técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar diversas proteínas polimerasa de VHB como se muestra esquemáticamente en la Fig. 6 bajo el control del promotor
inducible por cobre, CUP1 o el promotor TEF2. En cada caso, la proteína de fusión es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal, representados por SEQ ID NO: 40 (1) un péptido N terminal para transmitir resistencia a degradación proteasómica y estabilizar la expresión (SEQ ID NO: 37; o las posiciones 1 a 6 de SEQ ID NO: 40); 2) la secuencia de aminoácidos de una parte de la polimerasa 5 del genotipo C de VHB que incluye el dominio de transcriptasa inversa (por ejemplo, posiciones 347 a 691 de SEQ ID NO: 10 o posiciones 7 a 351 de SEQ ID NO: 40; y 3) un marcador de hexahistidina (posiciones 352 a 357 de SEQ ID NO: 40). La secuencia también contiene epítopos o dominios que se cree que potencian la inmunogenicidad de la proteína de fusión. Además, en una realización, la secuencia de esta construcción puede modificarse para introducir una o más de todas las siguientes mutaciones de resistencia antivírica: rtM204l, rtL180M, rtM204V, rtV173L, rtN236T, rtA194T (posiciones dadas con respecto a la secuencia de aminoácidos de longitud completa para polimerasa del VHB). En una realización, se crean seis composiciones inmunoterapéuticas diferentes, conteniendo cada una una de estas mutaciones. En otras realizaciones, se incluyen todas o algunas de las mutaciones en una única proteína de fusión. En construcciones adicionales, el péptido N terminal de SEQ ID NO: 37 se reemplaza con un péptido N terminal sintético diferente representado por un homólogo de SEQ ID NO: 37 que cumple los mismos
15 requisitos estructurales básicos de SEQ ID NO: 37 como se describe en detalle en la memoria descriptiva, o el péptido N terminal de SEQ ID NO: 37 se reemplaza con el péptido N terminal de SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 90, y en otra construcción, el péptido N terminal se omite y se incluye una metionina en la posición uno.
En otro experimento, se modifica técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar diversas proteínas de fusión-superficie-núcleo del VHB como se muestra esquemáticamente en la Fig. 7 bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1 o el promotor TEF2. En cada caso, la proteína de fusión es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal, representados por SEQ ID NO: 41: (1) un péptido N terminal para transmitir resistencia a degradación proteasómica y estabilizar la expresión (por ejemplo, posiciones 1 a 5 de SEQ ID NO: 41); 2) una secuencia de aminoácidos del dominio de 25 receptor de hepatocitos del VHB amino de la parte pre-S1 de la proteína de superficie grande (L) del VHB (única de L) (por ejemplo, posiciones 21 a 47 de SEQ ID NO: 11 o posiciones 6 a 32 de SEQ ID NO: 41; 3) la secuencia de aminoácidos de una proteína de superficie pequeña (S) del VHB (por ejemplo, posiciones 176 a 400 de SEQ ID NO: 11 o posiciones 33 a 257 de SEQ ID NO: 41); 4) un espaciador/enlazador de dos aminoácidos para facilitar la clonación y manipulación de las secuencias (por ejemplo, posiciones 258 y 259 de SEQ ID NO: 41); 5) la secuencia de aminoácidos de una polimerasa del VHB que comprende el dominio de transcriptasa inversa (por ejemplo, posiciones 247 a 691 de SEQ ID NO: 10 o posiciones 260 a 604 de SEQ ID NO: 41); 6) la secuencia de aminoácidos de una proteína de núcleo del VHB (por ejemplo, 31-312 de SEQ ID NO: 9 o posiciones 605 a 786 de SEQ ID NO: 41); y 7) un marcador de hexahistidina (por ejemplo, posiciones 787 a 792 de SEQ ID NO: 41). La secuencia también contiene epítopos o dominios que se cree que potencian la inmunogenicidad de la proteína de fusión. 35 Además, en una realización, la secuencia de esta construcción puede modificarse para introducir una o más o todas las siguientes mutaciones de resistencia antivírica: rtM2041, rtL180M, rtM204V, rtV173L, rtN236T, rtA194T (posiciones dadas con respecto a la secuencia de aminoácidos de longitud completa para polimerasa del VHB). En una realización se crean seis composiciones inmunoterapéuticas diferentes, que contienen cada una una de estas mutaciones. En otras realizaciones, se incluyen todas o algunas de las mutaciones en una única proteína de fusión. En una realización, esta construcción también contiene una o más mutaciones de resistencia antivírica en el antígeno de superficie. En construcciones adicionales, el péptido N terminal representado por las posiciones 1 a 5 de SEQ ID NO: 41 se reemplaza con un péptido N terminal sintético diferente representado por un homólogo de las posiciones 1 a 5 de SEQ ID NO: 41 que cumple los mismos requisitos estructurales básicos de las posiciones 1 a 5 de SEQ ID NO: 41 (o de SEQ ID NO: 37) como se describe en detalle en la memoria descriptiva, o el péptido N
45 terminal de las posiciones 1 a 5 de SEQ ID NO: 41 se reemplaza con el péptido N terminal de SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 90, y en otra construcción, el péptido N terminal se omite y se incluye una metionina en la posición uno.
Para producir cualquiera de las proteínas de fusión descritas anteriormente y composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura que expresan dichas proteínas, brevemente se optimizan los codones del ADN que codifica la proteína de fusión para expresión en levadura y después se digiere con EcoRI y NotI y se inserta detrás del promotor CUP1 (pGI-100) o el promotor TEF2 (pTK57-1) en vectores de expresión de 2 um de levadura. Los plásmidos resultantes se introducen en levadura Saccharomyces cerevisiae W303α por transfección con acetato de litio/polietilenglicol y se seleccionan transfectantes primarios en placas mínimas sólidas que carecen de Uracilo (UDM; medio sin uridina). Las colonias se vuelven a sembrar en estrías en UDM o ULDM (medio sin uridina y
55 leucina) y se permite que crezcan durante 3 días a 30 ºC.
Se inoculan cultivos líquidos que carecen de uridina (U2) o que carecen de uridina y leucina (UL2) de placas y se dejan crecer cultivos de partida durante 20 h a 30 ºC, 250 rpm. También pueden inocularse medios con pH tamponado que contienen 4,2 g/l de Bis-Tris (BT-U2; BT-UL2) para evaluar el crecimiento de la levadura en condiciones de pH neutro. Se usan cultivos primarios para inocular cultivos finales de la misma formulación y se continúa el crecimiento hasta que se alcanza una densidad de 1,1 a 4,0 UL/ml. Para cepas TEF2 (expresión constitutiva), las células se recogen, se lavan y se destruyen por calor a 56 ºC durante 1 h en PBS. Para cepas CUP1 (expresión inducible), la expresión se induce en el mismo medio con sulfato de cobre 0,5 mM durante 5 h a 30 ºC, 250 rpm. Las células se recogen, se lavan y se destruyen por calor a 56 ºC durante 1 h en PBS. Las células
65 vivas también se procesan para comparación.
Después de destruir por calor cultivos de TEF2 y CUP1, las células se lavan tres veces en PBS. La expresión de proteínas total se mide por un ensayo de unión a nitrocelulosa/precipitación de TCA y se mide la expresión de proteínas por transferencia de western usando un anticuerpo monoclonal antimarcador his. La proteína de fusión se cuantifica por interpolación de una curva patrón de proteína NS3 marcada con hexa-histidina recombinante que se
5 procesó en la misma transferencia de western.
Ejemplo 4
El siguiente ejemplo describe la producción de composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura adicionales para el tratamiento o la prevención de infección por virus de la hepatitis B (VHB).
Este ejemplo describe la producción de cuatro composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura diferentes, cada una diseñada para expresar una proteína del VHB. Estos “productos inmunoterapéuticos de levadura de proteína del VHB individual” pueden usarse en combinación o en secuencia entre sí y/o en combinación o en
15 secuencia con otros productos inmunoterapéuticos basados en levadura, tales como los descritos en cualquiera de los Ejemplos 1-3 y 5-8, incluyendo productos inmunoterapéuticos basados en levadura de múltiples proteínas del VHB descritos en el presente documento. Además, un “producto inmunoterapéutico de levadura de proteína del VHB individual”, tal como los descritos en este ejemplo, puede producirse usando la secuencia del VHB para cualquier genotipo o subgenotipo dado y pueden producirse productos inmunoterapéuticos basados en levadura de antígeno de superficie del VHB adicionales usando las secuencias del VHB para uno o más genotipos o subgenotipos adicionales cualesquiera, para proporcionar un “estante de especias” de diferentes antígenos del VHB y genotipos y/o subgenotipos, cada uno de los cuales se proporciona en el contexto de un producto inmunoterapéutico basado en levadura de la divulgación, o en una estrategia de inmunización/administración que incluye al menos un producto inmunoterapéutico basado en levadura de la divulgación.
25 En este ejemplo, se producen los siguientes cuatro productos inmunoterapéuticos basados en levadura:
Antígeno de superficie del VHB. Se modifican técnicamente Saccharomyces cerevisiae para expresar una proteína de superficie del VHB bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1 o el promotor TEF2. En cada caso, la proteína de fusión es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal, representados por SEQ ID NO: 93: 1) un péptido N terminal de SEQ ID NO: 89 (posiciones 1-89 de SEQ ID NO: 93); 2) la secuencia de aminoácidos de un antígeno de superficie grande (L) del genotipo C de VHB de longitud casi completa (menos la posición 1) (por ejemplo, posiciones 2-400 de SEQ ID NO: 11 o posiciones 90 a 488 de SEQ ID NO: 93); y 3) un marcador de hexahistidina (por ejemplo, posiciones
35 489 a 494 de SEQ ID NO: 93). Como alternativa, el péptido N terminal puede reemplazarse con SEQ ID NO: 37 o un homólogo del mismo u otro péptido N terminal descrito en el presente documento. Antígeno de polimerasa del VHB. Se modifican técnicamente Saccharomyces cerevisiae para expresar la siguiente proteína de Polimerasa del VHB bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1 o el promotor TEF2. En cada caso, la proteína de fusión es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal, representados por SEQ ID NO: 94: 1) un péptido N terminal de SEQ ID NO: 89 (posiciones 1-89 de SEQ ID NO: 94); 2) la secuencia de aminoácidos de una parte de la polimerasa del genotipo C de VHB que incluye el dominio de transcriptasa inversa (por ejemplo, posiciones 347 a 691 de SEQ ID NO: 10 o posiciones 90 a 434 de SEQ ID NO: 94); y 3) un marcador de hexahistidina (por ejemplo, posiciones 435 a 440 de SEQ ID NO: 94). Como alternativa, el péptido N terminal puede reemplazarse
45 con SEQ ID NO: 37 o un homólogo del mismo u otro péptido N terminal descrito en el presente documento. Antígeno de núcleo del VHB. Se modifican técnicamente Saccharomyces cerevisiae para expresar la siguiente proteína de núcleo del VHB bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1, o el promotor TEF2. En cada caso, la proteína de fusión es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal, representados por SEQ ID NO: 95: 1) un péptido N terminal de SEQ ID NO: 89 (posiciones 1-89 de SEQ ID NO: 95); 2) la secuencia de aminoácidos de una parte de la proteína del núcleo del genotipo C de VHB (por ejemplo, posiciones 31 a 212 de SEQ ID NO: 9 o posiciones 90 a 271 de SEQ ID NO: 95); y 3) un marcador de hexahistidina (por ejemplo, posiciones 272 a 277 de SEQ ID NO: 95). Como alternativa, el péptido N terminal puede reemplazarse con SEQ ID NO: 37 o un homólogo del mismo u otro péptido N terminal descrito en el presente documento.
55 Antígeno X del VHB. Se modifican técnicamente Saccharomyces cerevisiae para expresar el siguiente antígeno X del VHB bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1, o el promotor TEF2. En cada, la proteína de fusión es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal, representados por SEQ ID NO: 96: 1) un péptido N terminal de SEQ ID NO: 89 (posiciones 1-89 de SEQ ID NO: 96); 2) la secuencia de aminoácidos de una parte del antígeno X del genotipo C de VHB (por ejemplo, posiciones 2 a 154 de SEQ ID NO: 12 o posiciones 90 a 242 de SEQ ID NO: 96); y 3) un marcador de hexahistidina (por ejemplo, posiciones 243 a 248 de SEQ ID NO: 96). Como alternativa, el péptido N terminal puede reemplazarse con SEQ ID NO: 37 o un homólogo del mismo u otro péptido N terminal descrito en el presente documento.
65 Para crear estas composiciones inmunoterapéuticos, brevemente, se optimizan los codones de ADN que codifican la proteína de fusión para expresión en levadura y después se digieren con EcoRI y NotI y se insertan detrás del
promotor CUP1 (pGI-100) o el promotor TEF2 (pTK57-1) en vectores de expresión de 2 um de levadura. Los plásmidos resultantes se introducen en levadura Saccharomyces cerevisiae W303α por transfección de acetato de litio/polietilenglicol y se seleccionan transfectantes primarios en placas mínimas sólidas que carecen de Uracilo (UDM; medio sin uridina). Se vuelven a sembrar en estrías colonias en UDM o ULDM (medio sin uridina y leucina) y
5 se permite que crezcan durante 3 días a 30 ºC.
Los cultivos líquidos que carecen de uridina (U2) o que carecen de uridina y leucina (UL2) se inoculan de placas y se dejan crecer cultivos de partida durante 20 h a 30 ºC, 250 rpm. También puede inocularse medio con pH tamponado que contienen 4,2 g/l de Bis-Tris (BT-U2; BT-UL2) para evaluar el crecimiento de la levadura en condiciones de pH neutro. Se usan cultivos primarios para inocular cultivos finales de la misma formulación y se continúa el crecimiento hasta que se alcanza una densidad de 1,1 a 4,0 UL/ml. Para cepas de TEF2 (expresión constitutiva), las células se recogen, se lavan y se destruyen por calor a 56 ºC durante 1 h en PBS. Para cepas de CUP1 (expresión inducible), se induce expresión en el mismo medio con sulfato de cobre 0,5 mM durante 5 h a 30 ºC, 250 rpm. Las células se recogen, se lavan y se destruyen por calor a 56 ºC durante 1 h en PBS. Las células vivas también se procesan para
15 comparación.
Después de destruir por calor cultivos de TEF2 y CUP1, las células se lavan tres veces en PBS. La expresión de proteínas total se mide por un ensayo de unión a nitrocelulosa/precipitación de TCA y la expresión de proteínas se mide por transferencia de western usando un anticuerpo monoclonal antimarcador de his. La proteína de fusión se cuantifica por interpolación de una curva patrón de proteína NS3 marcada con hexa-histidina recombinante que se procesó en la misma transferencia de western.
Ejemplo 5
25 El siguiente ejemplo describe la producción de varias composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura diferentes para el tratamiento o la prevención de la infección por virus de la hepatitis B (VHB).
Este ejemplo describe la producción de productos inmunoterapéuticos basados en levadura que expresan proteínas que se han diseñado para alcanzar uno o más de los siguientes objetivos: (1) producir una construcción de VHB multi-antígeno que comprende menos de aproximadamente 690 aminoácidos (correspondiente a menos de dos tercios del genoma del VHB), para producir un producto clínico inmunoterapéutico basado en levadura que cumple las directrices del Comité Consultivo de ADN Recombinante (RAC), si es necesario; (2) producir una construcción del VHB multi-antígeno que contiene un número maximizado de epítopos de células T conocidos asociados con respuestas inmunitarias a infecciones por VHB autolimitantes/agudas y/o infecciones por VHB crónicas; (3) producir
35 una construcción de VHB multi-antígeno que contiene epítopos de células T que están más conservados entre genotipos; y/o (4) producir una construcción de VHB multi-antígeno modificada para corresponderse más estrechamente a una o más secuencias consenso, epítopos consenso y/o epítopo o epítopos de genotipos particulares. Las modificaciones demostradas en este ejemplo pueden aplicarse individualmente o junto con cualquier otro producto inmunoterapéutico basado en levadura descrito o contemplado en el presente documento.
En un experimento, se diseñó una composición inmunoterapéutica basada en levadura que comprende una levadura que expresa una proteína de fusión que cumple los requisitos de los objetivos especificados anteriormente y que comprende partes de cada una de las proteínas principales del VHB: antígeno de superficie, polimerasa, núcleo y antígeno X del VHB. Para diseñar esta proteína de fusión, se redujo el tamaño de los antígenos del VHB individuales
45 dentro de la fusión (en comparación con la longitud completa), y los segmentos de fusión se modificaron individualmente para maximizar la inclusión de epítopos de células T conocidos correspondientes a los identificados en la Tabla 5. La inclusión de epítopos de células T en esta proteína de fusión se priorizó de la siguiente manera:
Epítopos identificados en respuestas inmunitarias tanto a infecciones por VHB agudas/auto-limitantes como a infecciones por VHB crónicas > Epítopos identificados en respuestas inmunitarias a infecciones por VHB agudas/auto-limitantes > Epítopos identificados en respuestas inmunitarias a infecciones por VHB crónicas.
También se minimizaron los puntos de unión artificiales en el diseño de cada segmento de esta proteína de fusión debido a que, sin quedar ligado a la teoría, se cree que la evolución natural ha dado como resultado: i) secuencias
55 contiguas en el virus que se expresan bien; y ii) un inmunoproteasoma en células presentadoras de antígenos que pueden digerir apropiadamente y presentar esas secuencias al sistema inmunitario. En consecuencia, una proteína de fusión con muchos puntos de unión no naturales puede ser menos útil en un producto inmunoterapéutico basado en levadura en comparación con uno que conserva más de las secuencias de proteínas del VHB naturales.
Para construir un segmento que comprende antígeno de superficie del VHB para su uso en una proteína de fusión, se redujo una proteína de antígeno de superficie grande (L) de longitud completa del genotipo C de VHB en su tamaño por truncamiento de las secuencias N y C terminales (las posiciones 1 a 119 y posiciones 360 a 400 del antígeno grande se retiraron, en comparación con una proteína de antígeno de superficie L de longitud completa, tal como la representada por SEQ ID NO: 11). La parte restante se seleccionó, en parte, para maximizar la inclusión de 65 epítopos de células T del MHC de clase I conocidos correspondientes a los identificados en la Tabla 5, usando la priorización para inclusión de epítopos de células T descritos anteriormente. El segmento de antígeno de superficie
resultante está representado por la SEQ ID NO: 97.
Para construir el segmento que comprende polimerasa del VHB para su uso en una proteína de fusión, se eliminaron partes sustanciales de una polimerasa de longitud completa del genotipo C de VHB, que es una proteína muy 5 grande de aproximadamente 842 aminoácidos, centrándose en la inclusión del dominio del sitio activo (del dominio RT), que es la región más conservada de la proteína entre genotipos y aislados del VHB. El dominio RT también incluye varios sitios donde se sabe que se han producido mutaciones de resistencia a fármacos; por lo tanto, esta parte de la construcción puede modificarse adicionalmente en otras versiones, según sea necesario, para dirigirse a mutaciones de escape de terapia dirigida. En proteínas de fusión que incluyen menos proteínas del VHB, el tamaño 10 del segmento de polimerasa puede expandirse, si se desea. La parte seleccionada de la polimerasa del VHB se incluyó para maximizar los epítopos de células T conocidos, usando la estrategia de priorización analizada anteriormente. La secuencia de polimerasa de longitud completa que se eliminó por lo tanto incluía una secuencia fuera del dominio RT y secuencias dentro del dominio RT que no contenían ningún epítopo de células T conocido, o que incluían dos epítopos identificados en menos del 17 % o el 5 %, respectivamente, de pacientes de genotipo A en
15 los que se identificaron estos epítopos (véase Desmond et al., 2008 y Tabla 5). Todos los epítopos de células T restantes excepto uno en el segmento del genotipo C de polimerasa del VHB fueron coincidencias perfectas con los epítopos publicados del análisis del genotipo A y el único epítopo con un desapareamiento de un único aminoácido se modificó para corresponder al epítopo publicado. El segmento de antígeno de polimerasa del VHB resultante está representado por la SEQ ID NO: 98.
20 Para construir el segmento que comprende antígeno de núcleo del VHB para su uso en una proteína de fusión, una proteína de núcleo de longitud completa (por ejemplo, similar a las posiciones 31-212 de SEQ ID NO: 9) del genotipo C de VHB se modificó de la siguiente manera: i) un único aminoácido dentro de un epítopo de células T de la proteína derivada del genotipo C se modificó para crear una coincidencia perfecta con un epítopo de células T
25 conocido descrito en la Tabla 5; ii) siete aminoácidos del extremo N terminal, que no contenían un epítopo de células T, se retiraron, conservando algunos aminoácidos flanqueantes N terminales del primer epítopo de células T conocido en la proteína; y iii) los 24 aminoácidos C terminales del núcleo se retiraron, lo que no suprime epítopos conocidos, pero que sí retira un extremo C terminal con carga excepcionalmente positiva. Un extremo C terminal con carga positiva es un buen candidato para retirada de un antígeno para expresar en levadura, ya que dichas
30 secuencias pueden, en algunas construcciones, ser tóxicas para levadura por interferencia competitiva con las proteínas de unión a ARN de levadura naturales que con frecuencia son ricas en arginina (tienen carga positiva). En consecuencia, la retirada de esta parte del Núcleo es aceptable. El segmento de antígeno de Núcleo del VHB resultante está representado por la SEQ ID NO: 99.
35 Para construir un segmento que comprende antígeno X del VHB para su uso en una proteína de fusión, se truncó un antígeno X de longitud completa del genotipo C de VHB (por ejemplo, similar a SEQ ID NO: 12) en el extremo N y C terminal para producir un segmento de antígeno X que incluye la mayoría de los epítopos de células T conocidos de la Tabla 5, que se agrupan en el antígeno X. Dos de los epítopos se modificaron por cambios de aminoácidos individuales para corresponderse con las secuencias de epítopos de células T publicadas, y se conservaron
40 secuencias que flanqueaban los epítopos de células T en los extremos del segmento para facilitar el procesamiento eficaz y la presentación de los epítopos correctos por una célula presentadora de antígenos. El segmento de antígeno X del VHB resultante está representado por la SEQ ID NO: 100.
Para construir una proteína de fusión completa que contiene los cuatro segmentos de proteínas del VHB, los cuatro
45 segmentos del VHB descritos anteriormente se unieron (superficie-pol-núcleo-X) para formar una única proteína que optimiza la inclusión de epítopos de células T que abarcan todas las proteínas codificadas por el genoma del VHB, y que se espera que cumplan criterios para proteínas víricas para uso clínico anticipado.
Se crearon en última instancia dos proteínas de fusión diferentes, cada una con un péptido N terminal diferente
50 añadido para potenciar y/o estabilizar la expresión de la proteína de fusión en levadura. Además, se incluyó un péptido de hexahistidina en el extremo C terminal para ayudar con la identificación de la proteína. Como para todas las otras proteínas usadas en las composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura descritas en el presente documento, en construcciones adicionales, el péptido N terminal de SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 89 utilizado en este ejemplo puede reemplazarse con un péptido N terminal sintético diferente (por ejemplo, un homólogo de SEQ
55 ID NO: 37 que cumple los mismos requisitos estructurales básicos de SEQ ID NO: 37 como se describe en detalle en la memoria descriptiva), o con un homólogo del péptido N terminal de SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 90, y en otra construcción, el péptido N terminal se omite y se incluye una metionina en la posición uno. Además, pueden añadirse secuencias enlazadoras de uno, dos, tres o más aminoácidos entre segmentos de la proteína de fusión, si se desea. Además, aunque estas construcciones se diseñaron usando proteínas del VHB del genotipo C como la
60 cadena principal, puede usarse cualquier otro genotipo del VHB, subgenotipo o proteínas del VHB de diferentes cepas o aislados para diseñar estos segmentos de proteínas, como se ejemplifica en el Ejemplo 7. Finalmente, si se excluyen uno o más segmentos de la proteína de fusión como se describe en el presente documento, entonces la secuencia de los segmentos restantes puede expandirse para incluir epítopos de células T adicionales y regiones flanqueantes de las proteínas (por ejemplo, véase Ejemplo 8).
Para producir composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura que comprenden una proteína de fusión construida de los segmentos del VHB descritos anteriormente, se modificó técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar diversas proteínas de fusión de superficie-polimerasa-núcleo-X del VHB, optimizadas como se ha analizado anteriormente, bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1, o el
5 promotor TEF2.
En una construcción, la proteína de fusión es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N al C terminal, representados por SEQ ID NO: 101: (1) un péptido N terminal que es una secuencia prepro de factor alfa, para transmitir resistencia a la degradación proteasómica y estabilizar la expresión representada por SEQ ID NO: 89 (posiciones 1-89 de SEQ ID NO: 101); (2) una parte optimizada de un antígeno de superficie grande (L) del VHB representado por SEQ ID NO: 97 (posiciones 90 a 338 de SEQ ID NO: 101); (3) una parte optimizada del dominio de transcriptasa inversa (RT) de la polimerasa del VHB representada por la SEQ ID NO: 98 (posiciones 339 a 566 de SEQ ID NO: 101); (4) una parte optimizada de proteína de núcleo del VHB representada por SEQ ID NO: 99 (posiciones 567 a 718 de SEQ ID NO: 101); (5) una parte optimizada del
15 antígeno X del VHB representada por la SEQ ID NO: 100 (posiciones 719 a 778 de SEQ ID NO: 101); y (6) un marcador de hexahistidina (por ejemplo, posiciones 779 a 784 de SEQ ID NO: 101).
En una segunda construcción, la proteína de fusión es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N al C terminal, representados por la SEQ ID NO: 102: (1) un péptido N terminal que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a degradación proteasómica y estabilizar la expresión representada por la SEQ ID NO: 37 (posiciones 1-6 de SEQ ID NO: 102); (2) una parte optimizada de un antígeno de superficie grande (L) del VHB representado por las posiciones 2 a 248 de SEQ ID NO: 97 (posiciones 7 a 254 de SEQ ID NO: 102); (3) una parte optimizada del dominio de transcriptasa inversa (RT) de polimerasa del VHB representada por la SEQ ID NO: 98 (posiciones 255 a 482 de SEQ ID NO: 102); (4) una parte
25 optimizada de proteína de núcleo del VHB representada por la SEQ ID NO: 99 (posiciones 483 a 634 de SEQ ID NO: 102); (5) una parte optimizada de antígeno X del VHB representada por la SEQ ID NO: 100 (posiciones 635 a 694 de SEQ ID NO: 102); y (6) un marcador de hexahistidina (por ejemplo, posiciones 695 a 700 de SEQ ID NO: 102).
Se producen composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura que expresan estas proteínas de fusión usando el mismo protocolo descrito en detalle en el Ejemplo 1-4.
Ejemplo 6
35 El siguiente ejemplo describe la producción de composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura adicionales que maximizan la dirección a genotipos y/o subgenotipos del VHB junto con inclusión de antígeno y/o epítopo conservada dentro de una única composición, para proporcionar composiciones individuales con el potencial de tratar un gran número de individuos o poblaciones de individuos.
Para preparar una construcción que comprende múltiples genotipos diferentes dentro del mismo producto inmunoterapéutico basado en levadura, se modifica técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar una proteína de fusión del VHB bajo el control de un promotor adecuado, tal como el promotor inducible por cobre, CUP1, o el promotor TEF2. La proteína es un único polipéptido que comprende cuatro antígenos de núcleo, cada uno de un genotipo diferente (genotipos A, B, C y D del VHB), representado por la SEQ ID NO: 105: 45 1) una metionina N terminal en la posición 1 de SEQ ID NO: 105; 2) la secuencia de aminoácidos de una proteína de Núcleo de longitud completa cercana del genotipo A de VHB (por ejemplo, posiciones 31 a 212 de SEQ ID NO: 1 o posiciones 2 a 183 de SEQ ID NO: 105); 3) la secuencia de aminoácidos de una proteína de Núcleo de longitud casi completa del genotipo B de VHB (por ejemplo, posiciones 30 a 212 de SEQ ID NO: 5 o posiciones 184 a 395 de SEQ ID NO: 105); 4) la secuencia de aminoácidos de una proteína de Núcleo de longitud casi completa del genotipo C de VHB (por ejemplo, posiciones 30 a 212 de SEQ ID NO: 9 o posiciones 396 a 578 de SEQ ID NO: 105); 5) la secuencia de aminoácidos de una proteína de Núcleo de longitud casi completa del genotipo D de VHB (por ejemplo, posiciones 30 a 212 de SEQ ID NO: 13 o posiciones 579 a 761 de SEQ ID NO: 105); y 5) un marcador de hexahistidina (por ejemplo, posiciones 762 a 767 de SEQ ID NO: 105). La secuencia también contiene epítopos o dominios que se cree que potencian la inmunogenicidad de la proteína de fusión. La metionina N terminal en la
55 posición 1 puede estar sustituida con SEQ ID NO: 37 o un homólogo de la misma, o con una secuencia prepro alfa de SEQ ID NO: 89 o SEQ ID NO: 90, o un homólogo de la misma, o cualquier otra secuencia N terminal adecuada si se desea. Además, pueden insertarse secuencias enlazadoras entre proteínas del VHB para facilitar la clonación y manipulación de la construcción, si se desea. Esta es una construcción ejemplar, ya que puede sustituirse cualquier otra combinación de genotipos y/o subgenotipos del VHB en este diseño según se desee para construir un producto inmunoterapéutico del VHB basado en levadura de un único antígeno con amplia aplicabilidad clínica y diseño eficaz para fabricación. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 también contiene varios epítopos de células T conocidos, y ciertos epítopos se han modificado para corresponder a la secuencia publicada para el epítopo dado, que puede identificarse por comparación de la secuencia con los epítopos mostrados en la Tabla 5, por ejemplo.
65 Para preparar una construcción que comprende más de un antígeno del VHB y más de un genotipo dentro del mismo producto inmunoterapéutico basado en levadura, se modifica técnicamente levadura (por ejemplo,
Saccharomyces cerevisiae) para expresar una proteína de fusión del VHB bajo el control de un promotor adecuado, tal como el promotor inducible por cobre, CUP1, o el promotor TEF2. La proteína es un único polipéptido que comprende dos antígenos de núcleo y dos antígenos X, cada uno del par de un genotipo diferente (genotipos A y C del VHB), representado por la SEQ ID NO: 106: 1) una metionina N terminal en la posición 1 de SEQ ID NO: 106; 2) 5 la secuencia de aminoácidos de una proteína de Núcleo de longitud casi completa del genotipo A de VHB (por ejemplo, posiciones 31 a 212 de SEQ ID NO: 1 o posiciones 2 a 183 de SEQ ID NO: 106); 3) la secuencia de aminoácidos de un antígeno X de longitud completa del genotipo A de VHB (por ejemplo, posiciones SEQ ID NO: 4 o posiciones 184 a 337 de SEQ ID NO: 106); 4) la secuencia de aminoácidos de una proteína de Núcleo de longitud casi completa del genotipo C de VHB (por ejemplo, posiciones 30 a 212 de SEQ ID NO: 9 o posiciones 338 a 520 de SEQ ID NO: 106); 5) la secuencia de aminoácidos de un antígeno X de longitud completa del genotipo C de VHB (por ejemplo, SEQ ID NO: 8 o las posiciones 521 a 674 de SEQ ID NO: 106); y 5) un marcador de hexahistidina (por ejemplo, posiciones 675 a 680 de SEQ ID NO: 106). La secuencia también contiene epítopos o dominios que se cree que potencian la inmunogenicidad de la proteína de fusión. La metionina N terminal en la posición 1 puede sustituirse con SEQ ID NO: 37 o un homólogo de la misma, o con una secuencia prepro alfa de SEQ ID NO: 89 o
15 SEQ ID NO: 90, o un homólogo de la misma. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 también contiene varios epítopos de células T conocidos, y se han modificado ciertos epítopos para corresponder a la secuencia publicada para el epítopo dado, que puede identificarse por comparación de la secuencia con los epítopos mostrados en la Tabla 5, por ejemplo.
Se producen composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura que expresan estas proteínas de fusión usando el mismo protocolo descrito con detalle en el Ejemplo 1-4.
Ejemplo 7
25 El siguiente ejemplo describe la producción de composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura adicionales que utilizan secuencias consenso para genotipos del VHB, maximizando adicionalmente la dirección a genotipos y/o subgenotipos del VHB junto con inclusión de antígeno y/o epítopo conservada, para proporcionar composiciones con el potencial de tratar un gran número de individuos o poblaciones de individuos usando una composición.
Para diseñar varias construcciones que incluyen segmentos del VHB de cada uno de proteína, núcleo, polimerasa y antígeno X de superficie, la estructura de proteína de fusión descrita en el Ejemplo 5 para SEQ ID NO: 101 y SEQ ID NO: 102 (y por lo tanto las subpartes de estas proteínas de fusión representadas por SEQ ID NO: 97 (antígeno de superficie), SEQ ID NO: 98 (polimerasa), SEQ ID NO: 99 (antígeno de núcleo) y SEQ ID NO: 100 (antígeno X)) se
35 usó como un molde. En referencia a las secuencias de consenso para cada uno del genotipo A, B, C y D del VHB que se construyeron a partir de múltiples fuentes de secuencias del VHB (por ejemplo, Yu y Yuan et al, 2010, para S, Núcleo y X, en las que las secuencias consenso se generaron a partir de 322 secuencias del VHB o para Pol (RT) de la Base de Datos de Resistencia Farmacológica del VIH de la Universidad de Stanford, VHBseq and VHB Site Release Notes), se reemplazaron secuencias en la estructura molde con secuencias consenso correspondientes a las mismas posiciones, a no ser que el uso de la secuencia consenso altere uno de los epítopos de células T autolimitantes agudos o uno de los sitios de mutación de escape de polimerasa conocidos, en cuyo caso, estas posiciones se situaron detrás de la secuencia publicada para estos epítopos o sitios de mutación. Podrían construirse antígenos adicionales basándose solamente en secuencias consenso o usando otros epítopos publicados a medida que se conozcan.
45 Se diseñó una primera construcción basada en una secuencia consenso para el genotipo A de VHB de la siguiente manera. Usando SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 100, que se diseñaron para reducir el tamaño de los segmentos de fusión (en comparación con la longitud completa), para maximizar la inclusión de epítopos de células T conocidos correspondientes a los identificados en la Tabla 5 (prioridad como se ha analizado anteriormente), y para minimizar puntos de unión artificiales, se crearon nuevos segmentos de fusión basándose en una secuencia consenso para el genotipo A de VHB. El nuevo segmento de antígeno de superficie está representado por las posiciones 1-249 de la SEQ ID NO: 107. El nuevo segmento de polimerasa (RT) está representado por las posiciones 250-477 de SEQ ID NO: 107. El nuevo segmento de Núcleo está representado por las posiciones 478-629 de SEQ ID NO: 107. El nuevo segmento de antígeno X está representado por las posiciones
55 630-689 de SEQ ID NO: 107. Esta proteína de fusión completa es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N al C terminal, en el que las secuencias del VHB están representadas por la SEQ ID NO: 107 (las secuencias que no son del VHB indicadas como “opcionales” no se incluyeron en la secuencia base de SEQ ID NO: 107, pero se añadieron en realidad a la proteína de fusión descrita en este ejemplo):
(1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a degradación proteasómica y estabilizar la expresión representada por la SEQ ID NO: 37; (2) un péptido enlazador opcional de Thr-Ser; (3) una parte optimizada de un antígeno de superficie grande (L) del VHB representado por las posiciones 1 a 249 de SEQ ID NO: 107, que es una secuencia consenso para el genotipo A de VHB utilizando la estrategia de diseño analizada anteriormente; (4) una parte optimizada del dominio de transcriptasa inversa (RT) de polimerasa del VHB representada por las posiciones 250 a 477 de SEQ ID NO: 107, que es una secuencia consenso
65 para el genotipo A de VHB utilizando la estrategia de diseño analizada anteriormente; (5) una parte optimizada de la proteína de núcleo del VHB representada por las posiciones 478 a 629 de SEQ ID NO: 107, que es una secuencia
consenso para el genotipo A del VHB que utiliza la estrategia de diseño analizada anteriormente; (6) una parte optimizada del antígeno X del VHB representada por las posiciones 630 a 689 de SEQ ID NO: 107, que es una secuencia consenso para el genotipo A del VHB que utiliza la estrategia de diseño analizada anteriormente; y (7) un marcador de hexahistidina opcional (seis restos de histidina detrás de la posición 689 de SEQ ID NO: 107). Una
5 composición inmunoterapéutica basada en levadura que expresa esta proteína de fusión completa también se denomina en el presente documento GI-13010. La proteína de fusión y producto inmunoterapéutico basado en levadura correspondiente también puede denominarse en el presente documento “SPEXv2-A” o “Spex-A”.
Se diseñó una segunda construcción basada en una secuencia consenso para el genotipo B de VHB de la siguiente
10 manera. Usando SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 100, que se diseñaron para reducir el tamaño de los segmentos de fusión (en comparación con la longitud completa), para maximizar la inclusión de epítopos de células T conocidos correspondientes a los identificados en la Tabla 5 (prioridad como se ha analizado anteriormente), y para minimizar los puntos de unión artificiales, se crearon nuevos segmentos de fusión basándose en una secuencia consenso para el genotipo B de VHB. El nuevo segmento de antígeno de superficie está
15 representado por las posiciones 1-249 de la SEQ ID NO: 108. El nuevo segmento de polimerasa (RT) está representado por las posiciones 250-477 de SEQ ID NO: 108. El nuevo segmento de Núcleo está representado por las posiciones 478-629 de SEQ ID NO: 108. El nuevo segmento de antígeno X está representado por las posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 108. Esta proteína de fusión es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal, representados por la SEQ ID NO: 108 (no se incluyeron
20 secuencias que no eran de VHB indicadas como “opcionales” en la secuencia básica de SEQ ID NO: 108, pero se añadieron de hecho a la proteína de fusión descrita en este ejemplo): (1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a degradación proteasómica y estabilizar la expresión representado por la SEQ ID NO: 37; (2) un péptido enlazador opcional de Thr-Ser; (3) una parte optimizada de un antígeno de superficie grande (L) del VHB representado por las posiciones 1 a 249 de la SEQ ID
25 NO: 108, que es una secuencia consenso para el genotipo B de VHB que utiliza la estrategia de diseño analizada anteriormente; (4) una parte optimizada del dominio de transcriptasa inversa (RT) de la polimerasa del VHB representada por las posiciones 250 a 477 de SEQ ID NO: 108, que es una secuencia consenso para el genotipo B de VHB que utiliza la estrategia de diseño analizada anteriormente; (5) una parte optimizada de proteína de núcleo del VHB representada por las posiciones 478 a 629 de SEQ ID NO: 108, que es una secuencia consenso para el
30 genotipo B de VHB que utiliza la estrategia de diseño analizada anteriormente; (6) una parte optimizada del antígeno X del VHB representada por las posiciones 630 a 689 de SEQ ID NO: 108, que es una secuencia consenso para el genotipo B de VHB que utiliza la estrategia de diseño analizada anteriormente; y (7) un marcador de hexahistidina opcional. Una composición inmunoterapéutica basada en levadura que expresa esta proteína de fusión completa también se denomina en el presente documento GI-13011. La proteína de fusión y el producto inmunoterapéutico
35 basado en levadura correspondiente también pueden denominarse en el presente documento “SPEXv2-B” o “Spex-B”.
Se diseñó una tercera construcción basada en una secuencia consenso para el genotipo C de VHB de la siguiente manera. Usando SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 100, que se diseñaron para reducir 40 el tamaño de los segmentos de fusión (en comparación con la longitud completa), para maximizar la inclusión de epítopos de células T conocidos correspondientes a los identificados en la Tabla 5 (prioridad como se ha analizado anteriormente), y para minimizar los puntos de unión artificiales, se crearon nuevos segmentos de fusión basándose en una secuencia consenso para el genotipo C de VHB. El nuevo segmento de antígeno de superficie está representado por las posiciones 1-249 de la SEQ ID NO: 109. El nuevo segmento de polimerasa (RT) está 45 representado por las posiciones 250-477 de SEQ ID NO: 109. El nuevo segmento de Núcleo está representado por las posiciones 478-629 de SEQ ID NO: 109. El nuevo segmento de antígeno X está representado por las posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 109. Esta proteína de fusión es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal, representados por la SEQ ID NO: 109 (no se incluyeron secuencias que no eran de VHB indicadas como “opcionales” en la secuencia básica de SEQ ID NO: 109, pero se 50 añadieron de hecho a la proteína de fusión descrita en este ejemplo): (1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a degradación proteasómica y estabilizar la expresión representado por la SEQ ID NO: 37; (2) un péptido enlazador opcional de Thr-Ser; (3) una parte optimizada de un antígeno de superficie grande (L) del VHB representado por las posiciones 1 a 249 de SEQ ID NO: 109, que es una secuencia consenso para el genotipo C de VHB que utiliza la estrategia de diseño analizada 55 anteriormente; (4) una parte optimizada del dominio de transcriptasa inversa (RT) de la polimerasa del VHB representada por las posiciones 250 a 477 de SEQ ID NO: 109, que es una secuencia consenso para el genotipo C de VHB que utiliza la estrategia de diseño analizada anteriormente; (5) una parte optimizada de proteína de núcleo del VHB representada por las posiciones 478 a 629 de SEQ ID NO: 109, que es una secuencia consenso para el genotipo C de VHB que utiliza la estrategia de diseño analizada anteriormente; (6) una parte optimizada del antígeno 60 X de VHB representada por las posiciones 630 a 689 de SEQ ID NO: 109, que es una secuencia consenso para el genotipo C de VHB que utiliza la estrategia de diseño analizada anteriormente; y (7) un marcador de hexahistidina opcional. Una composición inmunoterapéutica basada en levadura que expresa esta proteína de fusión completa también se denomina en el presente documento GI-13011. La proteína de fusión y producto inmunoterapéutico basado en levadura correspondiente también pueden denominarse en el presente documento “SPEXv2-C” o “Spex
65 C”.
Se diseñó una cuarta construcción basada en una secuencia consenso para el genotipo D del VHB de la siguiente manera. Usando SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 y SEQ ID NO: 100, que se diseñaron para reducir el tamaño de los segmentos de fusión (en comparación con la longitud completa), para maximizar la inclusión de epítopos de células T conocidos correspondientes a los identificados en la Tabla 5 (prioridad como se ha analizado 5 anteriormente), y para minimizar los puntos de unión artificiales, se crearon nuevos segmentos de fusión basándose en una secuencia consenso para el genotipo D de VHB. El nuevo segmento de antígeno de superficie está representado por las posiciones 1-249 de la SEQ ID NO: 110. El nuevo segmento de polimerasa (RT) está representado por las posiciones 250-477 de SEQ ID NO: 110. El nuevo segmento de Núcleo está representado por las posiciones 478-629 de SEQ ID NO: 110. El nuevo segmento de antígeno X está representado por las posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 110. Esta proteína de fusión es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal, representados por la SEQ ID NO: 110 (no se incluyeron secuencias que no eran de VHB indicadas como “opcionales” en la secuencia básica de SEQ ID NO: 110, pero se añadieron de hecho a la proteína de fusión descrita en este ejemplo): (1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a degradación proteasómica y estabilizar la 15 expresión representado por la SEQ ID NO: 37; (2) un péptido enlazador opcional de Thr-Ser; (3) una parte optimizada de un antígeno de superficie grande (L) del VHB representado por las posiciones 1 a 249 de la SEQ ID NO: 110, que es una secuencia consenso para el genotipo D de VHB que utiliza la estrategia de diseño analizada anteriormente; (4) una parte optimizada del dominio de transcriptasa inversa (RT) de la polimerasa del VHB representada por las posiciones 250 a 477 de SEQ ID NO: 110, que es una secuencia consenso para el genotipo D de VHB que utiliza la estrategia de diseño analizada anteriormente; (5) una parte optimizada de proteína de núcleo del VHB representada por las posiciones 478 a 629 de SEQ ID NO: 110, que es una secuencia consenso para el genotipo D de VHB que utiliza la estrategia de diseño analizada anteriormente; (6) una parte optimizada del antígeno X de VHB representada por las posiciones 630 a 689 de SEQ ID NO: 110, que es una secuencia consenso para el genotipo D de VHB que utiliza la estrategia de diseño analizada anteriormente; y (7) un marcador de hexahistidina
25 opcional. Una composición inmunoterapéutica basada en levadura que expresa esta proteína de fusión completa también se denomina en el presente documento GI-13013. Una composición inmunoterapéutica basada en levadura que expresa una proteína de fusión similar (que contiene SEQ ID NO: 110), excepto que el péptido N terminal de SEQ ID NO: 37 se sustituye con la secuencia del factor alfa de SEQ ID NO: 89, se denomina en el presente documento GI-13014. La proteína de fusión y el producto inmunoterapéutico basado en levadura correspondiente también pueden denominarse en el presente documento “SPEXv2-D”, “Spex-D”, o “M-SPEXv2-D” (para GI-13013) o “a-SPEXv2-D” para (GI-13014).
Se diseñaron proteínas de fusión del VHB adicionales para su uso en un producto inmunoterapéutico basado en levadura usando la aplicación de secuencias consenso para cuatro genotipos del VHB para demostrar cómo 35 alteraciones similares a las realizadas en las proteínas de fusión descritas anteriormente (SEQ ID NO: 107-110) puede realizarse en una proteína de fusión del VHB diferente, tal como la descrita por SEQ ID NO: 34, que contiene proteínas de superficie del VHB y proteínas de núcleo del VHB. Para diseñar estos antígenos del VHB adicionales y composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura correspondientes, la estructura de proteína de fusión descrita anteriormente para SEQ ID NO: 34 (y por lo tanto las subpartes de estas proteínas de fusión (antígeno de superficie y núcleo)) se usó como un molde. Como anteriormente para las construcciones descritas anteriormente, se construyeron secuencias consenso para cada uno del genotipo A, B, C y D del VHB a partir de múltiples fuentes de secuencias del VHB (por ejemplo, Yu y Yuan et al, 2010, para S y Core) y se reemplazaron secuencias en la estructura molde con secuencias consenso correspondientes a las mismas posiciones, a no ser que el uso de la secuencia consenso alterara uno de los epítopos de células T autolimitantes agudos conocidos o uno de los sitios de
45 mutación de escape de polimerasa conocidos, en cuyo caso estas posiciones se pusieron a continuación de la secuencia publicada para estos epítopos o sitios de mutación.
Se diseñó una primera construcción basada en una secuencia consenso para el genotipo A de VHB de la siguiente manera. Usando SEQ ID NO: 34 como un molde, se creó una nueva proteína de fusión basada en una secuencia consenso para el genotipo A de VHB, representada en el presente documento por la SEQ ID NO: 112. Esta proteína de fusión es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N al C terminal, representado por la SEQ ID NO: 112 (no se incluyen secuencias que no son del VHB indicadas como “opcionales” en la secuencia básica de SEQ ID NO: 112, pero se añadieron de hecho a la proteína de fusión descrita en este ejemplo): (1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir
55 resistencia a la degradación proteasómica y estabilizar la expresión representada por SEQ ID NO: 37; (2) un péptido enlazador opcional de Thr-Ser; (3) una secuencia consenso para el antígeno de superficie grande (L) del genotipo A de VHB representado por las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 112; 4) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso para el antígeno de núcleo del genotipo A de VHB representado por las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 112; y (5) un marcador de hexahistidina opcional. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión que comprende SEQ ID NO: 112 (con codones optimizados para expresión en levadura) está representada en el presente documento por SEQ ID NO: 111. Una composición inmunoterapéutica basada en levadura que expresa esta proteína de fusión también se denomina en el presente documento GI-13006. La proteína de fusión y el producto inmunoterapéutico basado en levadura correspondiente también pueden denominarse en el presente documento “Score-A”
65 Se diseñó una segunda construcción basada en una secuencia consenso para el genotipo B de VHB de la siguiente
manera. Usando SEQ ID NO: 34 como un molde, se creó una nueva proteína de fusión basada en una secuencia consenso para el genotipo B de VHB, representada en el presente documento por la SEQ ID NO: 114. Esta proteína de fusión es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N al C terminal, representado por la SEQ ID NO: 114 (no se incluyen secuencias que no son del VHB indicadas como 5 “opcionales” en la secuencia básica de SEQ ID NO: 114, pero se añadieron de hecho a la proteína de fusión descrita en este ejemplo): (1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a la degradación proteasómica y estabilizar la expresión representada por SEQ ID NO: 37; (2) un péptido enlazador opcional de Thr-Ser; (3) una secuencia consenso para el antígeno de superficie grande (L) del genotipo B de VHB representado por las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 114; 4) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso para el antígeno de núcleo del genotipo B de VHB representado por las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 114; y (5) un marcador de hexahistidina opcional. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión que comprende SEQ ID NO: 114 (con codones optimizados para expresión en levadura) está representada en el presente documento por SEQ ID NO: 113. Una composición inmunoterapéutica basada en levadura que expresa esta proteína de fusión también se denomina en el presente documento GI-13007. La proteína
15 de fusión y el producto inmunoterapéutico basado en levadura correspondiente también pueden denominarse en el presente documento “Score-B”
Se diseñó una tercera construcción basada en una secuencia consenso para el genotipo C de VHB de la siguiente manera. Usando SEQ ID NO: 34 como un molde, se creó una nueva proteína de fusión basada en una secuencia consenso para el genotipo C de VHB, representada en el presente documento por la SEQ ID NO: 116. Esta proteína de fusión es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N al C terminal, representado por la SEQ ID NO: 116 (no se incluyen secuencias que no son del VHB indicadas como “opcionales” en la secuencia básica de SEQ ID NO: 116, pero se añadieron de hecho a la proteína de fusión descrita en este ejemplo): (1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir
25 resistencia a la degradación proteasómica y estabilizar la expresión representada por SEQ ID NO: 37; (2) un péptido enlazador opcional de Thr-Ser; (3) una secuencia consenso para el antígeno de superficie grande (L) del genotipo C de VHB representado por las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 116; 4) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso para el antígeno de núcleo del genotipo C de VHB representado por las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 116; y (5) un marcador de hexahistidina opcional. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión que comprende SEQ ID NO: 116 (con codones optimizados para expresión en levadura) está representada en el presente documento por SEQ ID NO: 115. Una composición inmunoterapéutica basada en levadura que expresa esta proteína de fusión también se denomina en el presente documento GI-13006. La proteína de fusión y el producto inmunoterapéutico basado en levadura correspondiente también pueden denominarse en el presente documento “Score-C”
35 Se diseñó una cuarta construcción basada en una secuencia consenso para el genotipo D de VHB de la siguiente manera. Usando SEQ ID NO: 34 como un molde, se creó una nueva proteína de fusión basada en una secuencia consenso para el genotipo D de VHB, representada en el presente documento por la SEQ ID NO: 118. Esta proteína de fusión es un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N al C terminal, representado por la SEQ ID NO: 118 (no se incluyen secuencias que no son del VHB indicadas como “opcionales” en la secuencia básica de SEQ ID NO: 118, pero se añadieron de hecho a la proteína de fusión descrita en este ejemplo): (1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a la degradación proteasómica y estabilizar la expresión representada por SEQ ID NO: 37; (2) un péptido enlazador opcional de Thr-Ser; (3) una secuencia consenso para el antígeno de superficie grande (L) del genotipo D
45 de VHB representado por las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 118; 4) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso para el antígeno de núcleo del genotipo D de VHB representado por las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 118; y (5) un marcador de hexahistidina opcional. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión completa que comprende SEQ ID NO: 118 y los péptidos N y C terminal y el péptido enlazador está representado en el presente documento por SEQ ID NO: 151. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión que comprende SEQ ID NO: 118 o SEQ ID NO: 151 (con codones optimizados para expresión en levadura) está representada en el presente documento por SEQ ID NO: 117. Una composición inmunoterapéutica basada en levadura que expresa esta proteína de fusión también se denomina en el presente documento GI-13009. La proteína de fusión y el producto inmunoterapéutico basado en levadura correspondiente también pueden denominarse en el presente documento “Score-D”
55 Las composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura de GI-13010 (que comprenden SEQ ID NO: 107), GI13011 (que comprende SEQ ID NO: 108), GI-13012 (que comprende SEQ ID NO: 109), GI-13013 (que comprende SEQ ID NO: 110), GI-13006 (que comprende SEQ ID NO: 112), GI-13007 (que comprende SEQ ID NO: 114), GI13008 (que comprende SEQ ID NO: 116) y GI-13009 (que comprende SEQ ID NO: 118) se produjeron como se ha descrito para otras composiciones anteriormente. Brevemente, se optimizaron los codones del ADN que codificaba la proteína de fusión para expresión en levadura y después se insertó detrás del promotor CUP1 (pGI-100) en vectores de expresión de 2 um de levadura. Los plásmidos resultantes se introdujeron en levadura Saccharomyces cerevisiae W303α por transfección con acetato de litio/polietilenglicol. Se aislaron transformantes de levadura de cada plásmido en placas mínimas sólidas que carecían de uracilo (UDM; medio sin uridina). Las colonias se
65 volvieron a sembrar en estrías en ULDM (medio sin uridina y leucina) y se permitió que crecieran durante 3 días a 30 ºC. Se inocularon cultivos de partida líquidos que carecían de uridina y leucina (UL2; formulación proporcionada
en el Ejemplo 1) a partir de placas y se dejaron crecer los cultivos de partida durante 18 h a 30 ºC, 250 rpm. Se usaron cultivos primarios para inocular cultivos finales de UL2 y se continuó el crecimiento hasta que se alcanzó una densidad de 2 UL/ml. Los cultivos se indujeron con sulfato de cobre 0,5 mM durante 3 h y después las células se lavaron en PBS, se destruyeron por calor a 56 ºC durante 1 h y se lavaron tres veces en PBS. El contenido de
5 proteína total se midió por un ensayo de unión a nitrocelulosa/precipitación de TCA y se midió la expresión de antígeno del VHB por transferencia de Western usando un anticuerpo monoclonal anti marcador his.
Los resultados se muestran en la Fig. 20. Los carriles en la mancha mostrada en la Fig. 20 contienen proteína de los siguientes productos inmunoterapéuticos basados en levadura: carril 1 (v1.0; Score) = GI-13002 (que expresa SEQ ID NO: 34); Carril 2 (v2.0; ScA) = GI-13006 (que expresa SEQ ID NO: 112); Carril 3 (v2.0; ScB) = GI-13007 (que expresa SEQ ID NO: 114); Carril 4 (v2.0; ScC) = GI-13008 (que expresa SEQ ID NO: 116); Carril 5 (v2.0; ScD) = GI13009 (que expresa SEQ ID NO: 118); Carril 6 (v1.0; Sp) = GI-13005 (que expresa SEQ ID NO: 36); Carril 7 (v1.0; a-Sp) = GI-13004 (que expresa SEQ ID NO: 92); Carril 8 (v2.0; SpA) = GI-13010 (que expresa SEQ ID NO: 107); Carril 9 (v2.0; SpB) = GI-13011 (que expresa SEQ ID NO: 108); Carril 10 (v2.0; SpC) = GI-13012 (que expresa SEQ ID
15 NO: 109); Carril 11 (v2.0; SpD) = GI-13013 (que expresa SEQ ID NO: 110).
Los resultados muestran que cada uno de los antígenos del VHB que comprenden la combinación de antígeno de superficie y núcleo (antígenos “Score”), es decir, GI-13002 (Score), GI-13006 (ScA; Score-A), GI-13007 (ScB; Score-B), GI-13008 (ScC; Score-C) y GI-13009 (ScD; Score-D) se expresaban de forma robusta en la levadura. Los niveles de expresión típicos de Score v2.0 en estos experimentos y otros similares estuvieron en el intervalo de aproximadamente 90 a 140 pmol/UL (es decir, 5940 ng/UL a 9240 ng/UL). Los niveles de expresión de los antígenos del VHB que comprenden las cuatro proteínas del VHB (superficie, polimerasa, núcleo y X, o “Spex”) fueron variables. Específicamente, la expresión de los antígenos de GI-13010 (SpA, Spex-A), GI-13011 (SpB, Spex-B), GI13012 (SpC, Spex-D) y GI-13013 (SpD, Spex-D) fue sustancialmente menor que la expresión de los antígenos
25 “Score”, así como los antígenos de GI-13005 (Sp; Spex) y GI-13004 (a-Sp. a-Spex). La expresión del antígeno en GI-13012 (SpC, Spex-C) fue escasamente detectable. Tomados juntos, estos resultados indican que como grupo, los antígenos del VHB que comprenden antígeno de superficie y núcleo se expresan muy bien en levadura, mientras que los antígenos del VHB que comprenden todo el antígeno de superficie, polimerasa, núcleo y X tienen expresión variable en levadura, y generalmente se expresan peor que los antígenos “Score”.
Ejemplo 8
El siguiente ejemplo describe la producción de composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura adicionales que utilizan secuencias consenso para genotipos del VHB, y adicionalmente demuestran el uso de
35 configuraciones/disposiciones alternativas de segmentos de proteínas del VHB dentro de una proteína de fusión para modificar o mejorar la expresión de un antígeno del VHB en levadura y/o mejorar o modificar la inmunogenicidad u otro atributo funcional del antígeno del VHB.
En este ejemplo, se diseñaron nuevas proteínas de fusión que adjuntaron antígeno X y/o antígenos de polimerasa al extremo N o C terminal de la combinación de antígeno de superficie fusionado con el núcleo. Estas construcciones se diseñaron en parte basándose en el razonamiento de que debido a que las proteínas de fusión dispuestas en la configuración denominadas en general en el presente documento “Score” (por ejemplo, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 118) se expresan muy bien en levadura, puede ser ventajoso utilizar esta configuración básica (es decir, antígeno de superficie fusionado con proteína del núcleo) para producir
45 antígenos del VHB que comprenden componentes proteicos del VHB adicionales. Dichas estrategias pueden mejorar la expresión de antígenos multiproteicos y/o mejorar o modificar la funcionalidad de dichos antígenos en el contexto de la inmunoterapia. Por ejemplo, sin quedar ligado a la teoría, los inventores han propuesto que la expresión de un antígeno del VHB que usa tres o las cuatro proteínas del VHB podría mejorarse construyendo la proteína de fusión usando superficie-núcleo (en orden) como una base, y después adjuntando los otros antígenos a esta construcción.
En consecuencia, para ejemplificar esta realización de la divulgación, se diseñaron y se construyeron ocho nuevas proteínas de fusión y se produjeron productos inmunoterapéuticos basados en levadura que expresan estas proteínas. En cada caso, la proteína de fusión usó una proteína de fusión de superficie-núcleo como una base que 55 se obtuvo de segmentos de la proteína de fusión representada por la SEQ ID NO: 118, que es una proteína de fusión de superficie-núcleo descrita en el Ejemplo 7 que utiliza una secuencia consenso para el genotipo D de VHB y optimizada para maximizar el uso de epítopos inmunológicos conservados. Todas las disposiciones posibles de un segmento de polimerasa y/o un segmento de antígeno X se adjuntaron a esta configuración básica, utilizando segmentos derivados de la proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 110, que es una proteína de fusión del VHB multiproteica descrita en el Ejemplo 7 que se construyó para reducir el tamaño de los segmentos proteicos, maximizar el uso de epítopos inmunológicos conservados y utilizar una secuencia consenso para el genotipo D de VHB. Aunque estos ocho antígenos resultantes se basan en una secuencia consenso para el genotipo D de VHB, sería sencillo producir una proteína de fusión que tuviera una estructura general similar usando los segmentos de fusión correspondientes de las proteínas de fusión representadas por SEQ ID NO: 107 y/o SEQ ID NO: 112 65 (genotipo A), SEQ ID NO: 108 y/o SEQ ID NO: 114 (genotipo B), SEQ ID NO: 109 y/o SEQ ID NO: 116 (genotipo C),
o usando las secuencias correspondientes de un genotipo, subgenotipo, secuencia consenso o cepa de VHB
diferente.
Para producir la primera composición, se modificó técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar una nueva proteína de fusión del VHB, ilustrada esquemáticamente en la Fig. 8, bajo el control del 5 promotor inducible por cobre, CUP1. La composición inmunoterapéutica del VHB de levadura resultante puede denominarse en el presente documento GI-13015. Esta proteína de fusión, también denominada en el presente documento “Score-Pol” y representada por la SEQ ID NO: 120, comprende, en orden, secuencias de antígeno de superficie, proteína de núcleo y polimerasa, como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal (no se incluyeron secuencias que no son del VHB indicadas como “opcionales” en la secuencia básica de SEQ ID NO: 120, pero se añadieron de hecho a la proteína de fusión descrita en este ejemplo): (1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a la degradación proteasómica y estabilizar la expresión representado por la SEQ ID NO: 37; (2) un péptido enlazador opcional de Thr-Ser; (3) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso de longitud casi completa (menos la posición 1) para el antígeno de superficie grande (L) del genotipo D de VHB representado por 15 las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 120 (correspondientes a las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 118); (4) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso para el antígeno de núcleo del genotipo D de VHB representado por las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 120 (correspondientes a las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 118); (5) una parte optimizada del dominio de transcriptasa inversa (RT) de polimerasa del VHB usando una secuencia consenso para el genotipo D de VHB, representado por las posiciones 582 a 809 de SEQ ID NO: 120 (correspondientes a las posiciones 250 a 477 de SEQ ID NO: 110); y (6) un marcador de hexahistidina opcional. SEQ ID NO: 120 contiene múltiples epítopos de células T (humanos y murinos), que pueden encontrarse en la Tabla
5. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de SEQ ID NO: 120 (con codones optimizados para expresión en levadura) está representada en el presente documento por SEQ ID NO: 119.
25 Para producir la segunda composición, se modificó técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar una nueva proteína de fusión del VHB, ilustrada esquemáticamente en la Fig. 9, bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1. La composición inmunoterapéutica del VHB de levadura resultante puede denominarse en el presente documento GI-13016. Esta proteína de fusión, también denominada en el presente documento “Score-X” y representada por la SEQ ID NO: 122, comprende, en orden, secuencias de antígeno de superficie, núcleo y antígeno X, como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal (no se incluyeron secuencias que no son del VHB indicadas como “opcionales” en la secuencia básica de SEQ ID NO: 122, pero se añadieron de hecho a la proteína de fusión descrita en este ejemplo):
(1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a la degradación proteasómica y estabilizar la expresión representado por la SEQ ID NO: 37; (2) un péptido enlazador 35 opcional de Thr-Ser; (3) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso de longitud casi completa (menos la posición 1) para el antígeno de superficie grande (L) del genotipo D de VHB representado por las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 122 (correspondientes a las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 118); (4) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso para el antígeno de núcleo del genotipo D de VHB representado por las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 122 (correspondientes a las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 118); (5) una parte optimizada de antígeno X del VHB usando una secuencia consenso para el genotipo D de VHB, representado por las posiciones 582 a 641 de SEQ ID NO: 122 (correspondientes a las posiciones 630 a 689 de SEQ ID NO: 110); y (6) un marcador de hexahistidina opcional. SEQ ID NO: 122 contiene múltiples epítopos de células T (humanos y murinos), que pueden encontrarse en la Tabla 5. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de SEQ ID NO: 122 (con codones optimizados para expresión en levadura) está representada
45 en el presente documento por SEQ ID NO: 121.
Para producir la tercera composición, se modificó técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar una nueva proteína de fusión del VHB, ilustrada esquemáticamente en la Fig. 10, bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1. La composición inmunoterapéutica del VHB de levadura resultante puede denominarse en el presente documento GI-13017. Esta proteína de fusión, también denominada en el presente documento “Score-Pol-X” y representada por la SEQ ID NO: 124, comprende, en orden, secuencias de antígeno de superficie, núcleo y polimerasa y antígeno X, como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal (no se incluyeron secuencias que no son del VHB indicadas como “opcionales” en la secuencia básica de SEQ ID NO: 124, pero se añadieron de hecho a la proteína de fusión descrita 55 en este ejemplo): (1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a la degradación proteasómica y estabilizar la expresión representado por la SEQ ID NO: 37; (2) un péptido enlazador opcional de Thr-Ser; (3) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso de longitud casi completa (menos la posición 1) para el antígeno de superficie grande (L) del genotipo D de VHB representado por las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 124 (correspondientes a las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 118); (4) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso para el antígeno de núcleo del genotipo D de VHB representado por las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 124 (correspondientes a las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 118); (5) una parte optimizada del dominio de transcriptasa inversa (RT) de polimerasa del VHB usando una secuencia consenso para el genotipo D de VHB, representado por las posiciones 582 a 809 de SEQ ID NO: 124 (correspondientes a las posiciones 250 a 477 de SEQ ID NO: 110); (6) una parte optimizada de antígeno X del VHB 65 usando una secuencia consenso para el genotipo D de VHB, representado por las posiciones 810 a 869 de SEQ ID NO: 124 (correspondientes a las posiciones 630 a 689 de SEQ ID NO: 110); y (7) un marcador de hexahistidina
opcional. SEQ ID NO: 124 contiene múltiples epítopos de células T (humanos y murinos), que pueden encontrarse en la Tabla 5. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de SEQ ID NO: 124 (con codones optimizados para expresión en levadura) está representada en el presente documento por SEQ ID NO: 123.
5 Para producir la cuarta composición, se modificó técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar una nueva proteína de fusión del VHB, ilustrada esquemáticamente en la Fig. 11, bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1. La composición inmunoterapéutica del VHB de levadura resultante puede denominarse en el presente documento GI-13018. Esta proteína de fusión, también denominada en el presente documento “Score-X-Pol” y representada por la SEQ ID NO: 126, comprende, en orden, secuencias de antígeno de superficie, núcleo, antígeno X y polimerasa, como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal (no se incluyeron secuencias que no son del VHB indicadas como “opcionales” en la secuencia básica de SEQ ID NO: 126, pero se añadieron de hecho a la proteína de fusión descrita en este ejemplo): (1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a la degradación proteasómica y estabilizar la expresión representado por la SEQ ID NO: 37; (2) un
15 péptido enlazador opcional de Thr-Ser; (3) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso de longitud casi completa (menos la posición 1) para el antígeno de superficie grande (L) del genotipo D de VHB representado por las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 126 (correspondientes a las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 118); (4) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso para el antígeno de núcleo del genotipo D de VHB representado por las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 126 (correspondientes a las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 118); (5) una parte optimizada de antígeno X del VHB usando una secuencia consenso para el genotipo D de VHB, representado por las posiciones 582 a 641 de SEQ ID NO: 126 (correspondientes a las posiciones 630 a 689 de SEQ ID NO: 110); (5) una parte optimizada del dominio de transcriptasa inversa (RT) de polimerasa del VHB usando una secuencia consenso para el genotipo D de VHB, representado por las posiciones 642 a 869 de SEQ ID NO: 126 (correspondientes a las posiciones 250 a 477 de SEQ ID NO: 110); y (7) un marcador de hexahistidina
25 opcional. SEQ ID NO: 126 contiene múltiples epítopos de células T (humanos y murinos), que pueden encontrarse en la Tabla 5. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión que comprende SEQ ID NO: 126 (con codones optimizados para expresión en levadura) está representada en el presente documento por SEQ ID NO: 125.
Para producir la quinta composición, se modificó técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar una nueva proteína de fusión del VHB, ilustrada esquemáticamente en la Fig. 12, bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1. La composición inmunoterapéutica del VHB de levadura resultante puede denominarse en el presente documento GI-13019. Esta proteína de fusión, también denominada en el presente documento “Pol-Score” y representada por la SEQ ID NO: 128, comprende, en orden, secuencias de polimerasa, 35 antígeno de superficie y núcleo, como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal (no se incluyeron secuencias que no son del VHB indicadas como “opcionales” en la secuencia básica de SEQ ID NO: 128, con la excepción del enlazador Leu-Glu entre el segmento de polimerasa y el segmento de antígeno de superficie en la construcción ejemplificada aquí, pero se añadieron de hecho a la proteína de fusión descrita en este ejemplo): (1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a la degradación proteasómica y estabilizar la expresión representado por la SEQ ID NO: 37; (2) un péptido enlazador opcional de Thr-Ser; (3) una parte optimizada del dominio de transcriptasa inversa (RT) de polimerasa del VHB usando una secuencia consenso para el genotipo D de VHB, representado por las posiciones 1 a 228 de SEQ ID NO: 120 (correspondientes a las posiciones 250 a 477 de SEQ ID NO: 110); (4) un péptido enlazador (opcional) de Leu-Glu, representado por las posiciones 229 a 230 de SEQ ID NO: 128; (5) la
45 secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso de longitud casi completa (menos la posición 1) para el antígeno de superficie grande (L) del genotipo D de VHB representado por las posiciones 231 a 629 de SEQ ID NO: 128 (correspondientes a las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 118); (6) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso para el antígeno de núcleo del genotipo D de VHB representado por las posiciones 630 a 811 de SEQ ID NO: 128 (correspondientes a las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 118); y (7) un marcador de hexahistidina opcional. SEQ ID NO: 128 contiene múltiples epítopos de células T (humanos y murinos), que pueden encontrarse en la Tabla 5. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión que comprende SEQ ID NO: 128 (con codones optimizados para expresión en levadura) está representada en el presente documento por SEQ ID NO: 127.
55 Para producir la sexta composición, se modificó técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar una nueva proteína de fusión del VHB, ilustrada esquemáticamente en la Fig. 13, bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1. La composición inmunoterapéutica del VHB de levadura resultante puede denominarse en el presente documento GI-13020. Esta proteína de fusión, también denominada en el presente documento “X-Score” y representada por la SEQ ID NO: 130, comprende, en orden, secuencias de antígeno X, antígeno de superficie y núcleo, como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal (no se incluyeron secuencias que no son del VHB indicadas como “opcionales” en la secuencia básica de SEQ ID NO: 130, con la excepción del enlazador Leu-Glu entre el segmento X y el segmento de antígeno de superficie en la construcción ejemplificada aquí, pero se añadieron de hecho a la proteína de fusión descrita en este ejemplo): (1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para
65 transmitir resistencia a la degradación proteasómica y estabilizar la expresión representado por la SEQ ID NO: 37;
(2) un péptido enlazador opcional de Thr-Ser; (3) una parte optimizada de antígeno X del VHB usando una
secuencia consenso para el genotipo D de VHB, representado por las posiciones 1 a 60 de SEQ ID NO: 130 (correspondientes a las posiciones 630 a 689 de SEQ ID NO: 110); (4) un péptido enlazador (opcional) de Leu-Glu, representado por las posiciones 61 a 62 de SEQ ID NO: 130; (5) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso de longitud casi completa (menos la posición 1) para el antígeno de superficie grande (L) del genotipo D
5 de VHB representado por las posiciones 63 a 461 de SEQ ID NO: 130 (correspondientes a las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 118); (6) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso para el antígeno de núcleo del genotipo D de VHB representado por las posiciones 462 a 643 de SEQ ID NO: 130 (correspondientes a las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 118); y (7) un marcador de hexahistidina opcional. SEQ ID NO: 130 contiene múltiples epítopos de células T (humanos y murinos), que pueden encontrarse en la Tabla 5. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión completa que comprende SEQ ID NO: 130 y los péptidos y enlazadores N y C terminales está representada en el presente documento por SEQ ID NO: 150. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión que comprende SEQ ID NO: 130 o SEQ ID NO: 150 (con codones optimizados para expresión en levadura) está representada en el presente documento por SEQ ID NO: 129.
15 Para producir la séptima composición, se modificó técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar una nueva proteína de fusión del VHB, ilustrada esquemáticamente en la Fig. 14, bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1. La composición inmunoterapéutica del VHB de levadura resultante puede denominarse en el presente documento GI-13021. Esta proteína de fusión, también denominada en el presente documento “Pol-X-Score” y representada por la SEQ ID NO: 132, comprende, en orden, polimerasa, antígeno X, antígeno de superficie y núcleo, como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal (no se incluyeron secuencias que no son del VHB indicadas como “opcionales” en la secuencia básica de SEQ ID NO: 132, pero se añadieron de hecho a la proteína de fusión descrita en este ejemplo):
(1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a la degradación proteasómica y estabilizar la expresión representado por la SEQ ID NO: 37; (2) un péptido enlazador 25 opcional de Thr-Ser; (3) una parte optimizada del dominio de transcriptasa inversa (RT) de polimerasa del VHB usando una secuencia consenso para el genotipo D de VHB, representado por las posiciones 1 a 228 de SEQ ID NO: 132 (correspondientes a las posiciones 250 a 477 de SEQ ID NO: 110); (4) una parte optimizada de antígeno X del VHB usando una secuencia consenso para el genotipo D de VHB, representado por las posiciones 229 a 288 de SEQ ID NO: 132 (correspondientes a las posiciones 630 a 689 de SEQ ID NO: 110); (5) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso de longitud casi completa (menos la posición 1) para el antígeno de superficie grande (L) del genotipo D de VHB representado por las posiciones 289 a 687 de SEQ ID NO: 132 (correspondientes a las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 118); (6) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso para el antígeno de núcleo del genotipo D de VHB representado por las posiciones 688 a 869 de SEQ ID NO: 132 (correspondientes a las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 118); y (7) un marcador de hexahistidina
35 opcional. SEQ ID NO: 132 contiene múltiples epítopos de células T (humanos y murinos), que pueden encontrarse en la Tabla 5. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión que comprende SEQ ID NO: 132 (con codones optimizados para expresión en levadura) está representada en el presente documento por SEQ ID NO: 127.
Para producir la octava composición, se modificó técnicamente levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) para expresar una nueva proteína de fusión del VHB, ilustrada esquemáticamente en la Fig. 15, bajo el control del promotor inducible por cobre, CUP1. La composición inmunoterapéutica del VHB de levadura resultante puede denominarse en el presente documento GI-13022. Esta proteína de fusión, también denominada en el presente documento “X-Pol-Score” y representada por la SEQ ID NO: 134, comprende, en orden, antígeno X, polimerasa, 45 antígeno de superficie y proteína de núcleo, como un único polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en fase del extremo N a C terminal (no se incluyeron secuencias que no son del VHB indicadas como “opcionales” en la secuencia básica de SEQ ID NO: 134, pero se añadieron de hecho a la proteína de fusión descrita en este ejemplo): (1) un péptido N terminal opcional que es un péptido N terminal sintético diseñado para transmitir resistencia a la degradación proteasómica y estabilizar la expresión representado por la SEQ ID NO: 37; (2) un péptido enlazador opcional de Thr-Ser; (3) una parte optimizada de antígeno X del VHB usando una secuencia consenso para el genotipo D de VHB, representado por las posiciones 1 a 60 de SEQ ID NO: 134 (correspondientes a las posiciones 630 a 689 de SEQ ID NO: 110); (4) una parte optimizada del dominio de transcriptasa inversa (RT) de polimerasa del VHB usando una secuencia consenso para el genotipo D de VHB, representado por las posiciones 61 a 288 de SEQ ID NO: 134 (correspondientes a las posiciones 250 a 477 de SEQ ID NO: 110); (5) la
55 secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso de longitud casi completa (menos la posición 1) para el antígeno de superficie grande (L) del genotipo D de VHB representado por las posiciones 289 a 687 de SEQ ID NO: 134 (correspondientes a las posiciones 1 a 399 de SEQ ID NO: 118); (6) la secuencia de aminoácidos de una secuencia consenso para el antígeno de núcleo del genotipo D de VHB representado por las posiciones 688 a 869 de SEQ ID NO: 132 (correspondientes a las posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 118); y (7) un marcador de hexahistidina opcional. SEQ ID NO: 132 contiene múltiples epítopos de células T (humanos y murinos), que pueden encontrarse en la Tabla 5. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión que comprende SEQ ID NO: 134 (con codones optimizados para expresión en levadura) está representada en el presente documento por SEQ ID NO: 133.
65 Para producir cada una de las composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura descritas anteriormente, se aislaron transformantes de levadura de cada plásmido en placas mínimas sólidas que carecían de uracilo (UDM;
medio sin uridina). Se volvieron a sembrar en estrías colonias en placas ULDM y UDM y se permitió que crecieran durante 3 días a 30 ºC. Se inocularon cultivos de partida líquidos que carecían de uridina y leucina (UL2) o que carecían de uridina (U2) de placas y se dejaron crecer cultivos de partida durante 18 horas a 30 ºC, 250 rpm. Se usaron cultivos primarios para inocular cultivos intermedios de U2 o UL2 y se continuó el crecimiento hasta que se
5 alcanzó una densidad de aproximadamente 2 UL/ml. Se usaron cultivos intermedios para inocular cultivos finales hasta una densidad de 0,05 UL/ml y estos se incubaron hasta que la densidad celular alcanzó 1-3 UL/ml. Después se indujeron cultivos finales con sulfato de cobre 0,5 mM durante 3 h y las células se lavaron en PBS, se destruyeron por calor a 56 ºC durante 1 h y se lavaron tres veces en PBS. Se midió el contenido total de proteínas con un ensayo de unión a nitrocelulosa/precipitación de TCA y se midió la expresión del antígeno del VHB por transferencia de Western usando un anticuerpo monoclonal anti marcador his. Se usaron lisados de dos composiciones inmunoterapéuticas de levadura descritas en el Ejemplo 7 como GI-13008 (SEQ ID NO: 116; “Score-C”) o GI-13009 (SEQ ID NO: 118; “Score-D”) como la base de comparación con una levadura que expresa el producto de antígeno de superficie-núcleo básico.
15 La Fig. 21 es una mancha de transferencia que muestra la expresión de las ocho construcciones en levadura cultivada en medio UL2 (1 μg de proteína cargada) en comparación con la expresión de la construcción en el producto inmunoterapéutico de levadura descrito en el Ejemplo 7 como GI-13009 (SEQ ID NO: 118; “Score-D”). En referencia a la Fig. 21, los carriles 1 y 2 contienen marcadores de peso molecular y los carriles 4-6 contienen proteína NS3 marcada con hexahistidina recombinante que se procesó en la misma transferencia para cuantificar el antígeno por interpolación de una curva patrón generada a partir de estos carriles. Los carriles 7-14 contienen lisados de cada producto inmunoterapéutico basado en levadura indicado por un número (por ejemplo, GI-13015) cultivados en medio UL2, y el carril 15 contiene el lisado de la comparación con GI-13009. No se muestran aquí transferencias de Western adicionales de levadura cultivada en medio U2, así como transferencias adicionales que evalúen diferentes cantidades de carga de proteínas en el gel, pero en general, los resultados indican que los ocho
25 antígenos se expresaron hasta niveles detectables en al menos un medio de cultivo.
Los resultados de expresión generales se resumen en la Fig. 22 como un gráfico de barras para los cultivos que tenían expresión detectable de antígeno diana en medio U2 o UL2 en comparación con la expresión de antígenos en GI-13008 (Score-C) y GI-13009 (Puntuación-D). En referencia a la Fig. 22, los antígenos del VHB se indican debajo de cada barra usando la referencia a la disposición de antígenos en la proteína de fusión como se ha descrito para cada construcción anterior, junto con el medio usado para cultivar la levadura correspondiente que expresaba el antígeno (es decir, “Pol-Score-U2” se refiere al antígeno del VHB que es una proteína de fusión de polimerasa– superficie-núcleo, representada por la SEQ ID NO: 128 y expresada por GI-13019 en medio U2). Los resultados indicaron que la expresión del antígeno indicado “X-Score” (expresado por GI-13020; SEQ ID NO: 130) fue 35 particularmente robusta, a ~122 pmol/UL, que era aproximadamente 79-80 % del nivel de expresión obtenido para Score-C (GI-13008) o Score-D (GI-13009) en moles (cualquiera de los medios). La expresión de los antígenos expresados por GI-13015 (Score-Pol; SEQ ID NO: 120), GI-13016 (Score-X; SEQ ID NO: 122), GI-13017 (Score-Pol-X; 124) y GI-13018 (Score-X-Pol; SEQ ID NO: 126) en el medio U2 estuvo por debajo del nivel de cuantificación de este experimento, aunque cada uno de estos antígenos se expresó cuando se cultivó el mismo producto inmunoterapéutico basado en levadura en medio UL2 (véase Fig. 22). En general, las configuraciones de antígenos que contenían el dominio de transcriptasa inversa (RT) de la polimerasa se acumularon a niveles menores que los que contenían solamente S-núcleo con o sin la adición de antígeno X. Tomando los datos mostrados en este ejemplo y otros anteriores en su conjunto, las configuraciones de antígenos de superficie-núcleo (“Score” o “SCORE”; todas construcciones similares) y X-superficie-núcleo (“X-Score” o “X-SCORE GI-13020) fueron las
45 configuraciones de antígeno de mayor expresión entre todos los productos inmunoterapéuticos del VHB basados en levadura ensayados.
Ejemplo 9
El siguiente ejemplo describe experimentos preclínicos en ratones para demostrar la seguridad, inmunogenicidad, y eficacia in vivo de composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura de la divulgación.
Para evaluar las composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura en estudios preclínicos, se empleó una diversidad de ensayos in vitro e in vivo que detectan la inducción de linfocitos específicos de antígeno
55 por composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura de la divulgación, incluyendo proliferación de linfocitos, citotoxicidad mediada por células, secreción de citocinas y protección de exposición tumoral (por ejemplo, destrucción de tumores modificados técnicamente para expresar proteínas del VHB in vivo).
Para apoyar estos estudios, se usaron inicialmente composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura descritas en los Ejemplos 1 y 2, con estudios adicionales realizados usando composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura descritas en 7 y 8 o en otra parte del presente documento. Sin embargo, estos estudios pueden aplicarse fácilmente a cualquier composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura de la divulgación, y los resultados proporcionados en el presente documento pueden extrapolarse a otras composiciones del VHB que comprenden la misma base de antígenos o construcciones de antígenos
65 similares. Los resultados de estos experimentos iniciales se describen posteriormente.
Como protocolo general que puede adaptarse para cualquier composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura, se inyecta a los ratones (por ejemplo, ratones hembra BALB/c y/o C57BL/6) una cantidad adecuada de una composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura, por ejemplo, 4-5 UL (administradas por vía subcutánea en inyecciones de 2-2,5 UL en 2 sitios de inyección diferentes). Opcionalmente, se administra una inyección de anticuerpo anti CD40 al día siguiente de las composiciones de levadura. Los ratones se inmunizan semanalmente o bisemanalmente, durante 1, 2 o 3 dosis, y se administra opcionalmente una dosis de refuerzo final 3-4 semanas después de la última dosis semanal o bisemanal. Los ratones se sacrifican 7-9 días después de la inyección final. Se preparan suspensiones de células del bazo y/o suspensiones del ganglio linfático, agrupadas de cada grupo, y se someten a condiciones de estimulación in vitro (IVS) utilizando estímulos específicos del VHB en forma de péptidos del VHB y/o antígenos del VHB, que pueden incluir levadura que expresa antígenos del VHB. Se estimulan cultivos de control con péptidos que no son del VHB, que pueden incluir un péptido de ovoalbúmina o un péptido vírico no relevante (por ejemplo, un péptido del VIH). Se emplean ensayos convencionales para evaluar respuestas inmunitarias inducidas por la administración de composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura e incluyen proliferación de linfocitos como se evalúa mediante incorporación de 3H-timidina, ensayos de citotoxicidad mediada por células (ensayos de CTL) que emplean células diana marcadas con 51Cr (u otras dianas marcadas para CTL durante una noche), cuantificación de la secreción de citocinas por ensayo de citocinas o ELISPOT (por ejemplo, IFN-γ, IL-12, TNF-α, IL-6 y/o IL-2, etc.) y protección de la exposición tumoral (por ejemplo, exposición in vivo con células tumorales modificadas técnicamente de forma recombinante para expresar antígenos del VHB).
Se espera que las composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura sean inmunogénicas como ha demostrado su capacidad para inducir respuestas de células T específicas de antígeno del VHB como se mide por los ensayos descritos anteriormente.
En experimentos iniciales, se ensayaron dos de los productos inmunoterapéuticos del VHB basados en levadura descritos en los Ejemplos 1 y 2 en ensayos de proliferación de linfocitos (LPA) para determinar si la inmunización con estos productos induce proliferación de células T CD4+ específicas de antígeno. Más específicamente, el producto inmunoterapéutico basado en levadura (GI-13002) que expresa una proteína de fusión representada por la SEQ ID NO: 34 bajo el control del promotor CUP1, también conocida como “SCORE” y más específicamente descrita en el Ejemplo 1 anterior, y el producto inmunoterapéutico basado en levadura (GI-13004) que expresa una proteína de fusión representada por la SEQ ID NO: 92 bajo el control del promotor CUP1 y también conocida como “a-SPEX” y más específicamente descrita en el Ejemplo 2, se usaron cada una para inmunizar ratones y evaluar células T CD4+ específicas para los antígenos de superficie y/o núcleo que son dianas en ambos productos usando ensayos de proliferación de linfocitos (LPA).
Se inmunizaron ratones hembra BALB/c tres veces por semana con 5 UL de “SCORE” o a-SPEX por vía subcutánea en 2 sitios diferentes en el ratón (2,5 UL/flanco). Los ratones de control se vacunaron con vector vacío de levadura (indicado como “YVEC”) o nada (indicado como “no tratado”). Una semana después de la tercera inmunización, los ratones se sacrificaron de forma humanitaria y se retiraron los bazos y los ganglios linfáticos (LN) de drenaje periaórtico e inguinal y se procesaron a suspensiones celulares individuales. Se agruparon células del LN de los dos tipos de ganglios y se estimularon in vitro (IVS) con una mezcla de antígeno de núcleo y superficie recombinantes (“mezcla S/Núcleo”) o un péptido mimótopo restringido a clase II (GYHGSSLY, SEQ ID NO: 103, indicado como “péptido mimótopo de SAg de Clase II”), que se ha indicado previamente que induce proliferación de células T de ratones BALB/c inmunizados con SAg (Rajadhyaksha et al., 1995) PNAS 92: 1575-1579).
Se sometieron células del bazo a enriquecimiento de células T CD4+ por Clasificación de Células Activadas Magnéticas (MACS) y se incubaron con los mismos antígenos que se ha descrito para LN. Después de 4 días de incubación, los cultivos IVS se sometieron a pulsos con timidina tritiada (3H) durante 18 h, y se recogió ADN celular en microfiltros de fibra de vidrio. El nivel de 3H-timidina incorporada se midió por recuento de centelleo. Se ensayaron en paralelo cultivos de LN repetidos de ratones inmunizados con SCORE. Se usó producción de interferón gamma (IFN-γ) por ELISpot como un medio adicional para evaluar la activación de células T.
Como se muestra en la Fig. 23, Fig. 24 y Fig. 26, las células T CD4+ de ratones inmunizados por SCORE o a-SPEX proliferaron en respuesta a la mezcla de antígenos S y de núcleo recombinante. Las células T esplénicas de ratones inmunizados por SCORE (Fig. 23) mostraron un nivel de proliferación > 5 veces mayor que las células T de ratones inmunizados con YVEC (control de vector vacío) o no tratados, lo que indica que el efecto es específico para la proteína de fusión de Superficie-Núcleo (es decir, respuesta de células T específica de antígeno). Las células T de ratones inmunizados con SCORE incubados con el péptido mimótopo del VHB también proliferaron hasta niveles mayores que los controles YVEC o no tratados con pulsos de péptidos, lo que proporciona pruebas adicionales de la especificidad de antígeno de la respuesta al producto inmunoterapéutico basado en levadura. Estos efectos también dependen de la cantidad de antígeno añadido a IVS, produciéndose actividad óptima a 3 μg/ml (antígeno recombinante) o 30 μg/ml (péptido).
Como se muestra en la Fig. 24, las células del LN de ratones inmunizados con SCORE también proliferaron en respuesta a IVS con estos mismos antígenos, aunque la diferencia en la proliferación entre animales inmunizados con SCORE frente a no tratados o inmunizados con YVEC fue menor que para células T CD4+ esplénicas aisladas.
Los datos de ELISpot (Fig. 25) indican que las preparaciones de LN de ratones inmunizados con SCORE reestimulados con mezcla de S+C contienen > 10 veces más células secretoras de IFN-γ que LN de animales no tratados previamente. IVS con péptido del VHB (SEQ ID NO: 103) también indujo una respuesta de IFN-γ. Específicamente, las preparaciones de LN SCORE contenían más de 3,5 veces más células productoras de IFN-γ que preparaciones de LN no tratados (Fig. 25). Estos datos muestran colectivamente que SCORE (inmunoterapia basada en levadura que expresa la proteína de fusión que comprende antígeno de superficie y núcleo) induce respuestas de células T específicas de antígeno del VHB tanto en bazo como en LN, y que estas respuestas pueden amplificarse mediante IVS con antígenos purificados de una manera dependiente de dosis.
Análisis similares con a-SPEX (Fig. 26) mostraron que este producto inmunoterapéutico del VHB basado en levadura también induce respuestas proliferativas de células T, a-SPEX indujo aproximadamente un 30 % de aumento en comparación con YVEC en IVS realizado con la mezcla de antígeno recombinante. En general, las respuestas observadas con a-SPEX fueron menores que las observadas con SCORE. La diferencia en la magnitud de la respuesta puede reflejar el hecho de que la expresión de antígeno en a-SPEX es menos de la mitad de la de SCORE en moles. Como alternativa, sin quedar ligado a la teoría, estos resultados pueden indicar que la configuración de los antígenos expresados por la levadura influye en el nivel de expresión, la eficacia de procesamiento a través del endosoma/proteasoma u otros parámetros de la respuesta inmunitaria. La proliferación de células T de ratones a-SPEX usando el péptido de 100 μg/ml fue al menos dos veces mayor que la proliferación en ratones vacunados por YVEC (Fig. 26, tres columnas de la derecha).
Ejemplo 10
El siguiente ejemplo describe la evaluación inmunológica de dos productos inmunoterapéuticos del VHB basados en levadura de la divulgación usando perfiles de citocinas.
Un modo de caracterizar la respuesta inmunitaria celular inducida como resultado de inmunización con productos inmunoterapéuticos del VHB basados en levadura de la divulgación es evaluar los perfiles de citocinas producidos tras estimulación ex vivo de preparaciones del bazo de los animales inmunizados.
En estos experimentos, se inmunizaron ratones hembra C57B1/6 con GI-13002 (“SCORE”, un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa la proteína de fusión de superficie-núcleo del VHB representada por SEQ ID NO: 34, Ejemplo 1) y GI-13005 (“M-SPEX”, un producto inmunoterapéutico basado en levadura que expresa la proteína de fusión de superficie-pol-núcleo-X del VHB representada por SEQ ID NO: 36 bajo el control del promotor CUP1, Ejemplo 2), YVEC (levadura de control de vector vacío) o nada (no tratado) de la siguiente manera: se inyectaron 2 UL de producto inmunoterapéutico basado en levadura o levadura de control por vía subcutánea en 2 sitios diferentes en el animal los días 0, 7 y 28. Se administró anticuerpo anti CD40 por inyección intraperitoneal (IP) el día 1 para proporcionar activación adicional de células dendríticas (CD) más allá del nivel de activación proporcionado por producto terapéutico basado en levadura. El tratamiento con anticuerpos anti CD40 es opcional, pero el uso del anticuerpo puede reforzar el nivel de células T CD8+ específicas de antígeno cuando se intenta detectar estas células por tinción con pentámero directa (dichos datos no se muestran en este experimento). Nueve días después de la última inmunización, se retiraron los bazos y se procesaron en suspensiones celulares individuales. Las células se pusieron en cultivos de estimulación in vitro (IVS) durante 48 horas con una mezcla de 2 grupos de péptidos del VHB (indicados “P” en la Fig. 27 y Fig. 28 y “HBVP” en las Figuras 29A y 29B) o con esplenocitos singénicos sin tratamiento previo tratados con mitomicina C pulsados con los 2 péptidos (indicados “PPS” en la Fig. 27 y Fig. 28 y “HPPS” en las Figuras 29A y 29B). Los péptidos están restringidos a H-2Kb y tienen las siguientes secuencias: ILSPFLPLL (SEQ ID NO: 65, véase Tabla 5) y MGLKFRQL (SEQ ID NO: 104). Los cultivos se sometieron a análisis repetidos de Luminex de IL1β, IL-12 e IFN-γ.
Estas citocinas se evaluaron porque se asocian con los tipos de respuestas inmunitarias que se cree que están asociadas con una respuesta inmunitaria productora o eficaz contra VHB. IL-1β es una citocina pro-inflamatoria producida por células presentadoras de antígenos, y es una citocina que se sabe que está inducida por inmunización con composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura. IL-12 también es producida por células presentadoras de antígeno y promueve la actividad de linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+. IFN-γ es producido por linfocitos T citotóxicos CD8+ en el desarrollo de la respuesta inmunitaria adaptativa y también promueve la diferenciación de células T CD4+ Th1.
Los resultados, mostrados en la Fig. 27 (IL-1β), Fig. 28 (IL-12), Fig. 29A (IFN-γ; inmunizado por SCORE) y Fig. 29B (IFN-γ; inmunizado por M-SPEX) muestran que las tres citocinas son producidas por esplenocitos de ratones inmunizadores con Score (indicados como “Sc” en la Fig. 27, Fig. 28 y Fig. 29A) en respuesta a IVS directa con el grupo de péptidos solamente, y que la respuesta es mayor para ratones inmunizados con SCORE que para YVEC (indicados como “Y” en la Fig. 27, Fig. 28 y Figs. 29A y 29B) o no tratados (indicados como “N” en la Fig. 27, Fig. 28 y Figs. 29A y 29B), lo que demuestra que la inmunización con SCORE induce una respuesta inmunitaria específica de antígeno que da como resultado la producción de esas tres citocinas. IVS con esplenocitos singénicos con pulsos de péptidos también indujo una respuesta específica de antígeno aunque de menor magnitud. Los esplenocitos de ratones vacunados con M-SPEX (indicados como “Sp” en la Fig. 27, Fig. 28 y Fig. 29B) produjeron un nivel general menor de las citocinas que las de ratones vacunados con SCORE. No obstante, la cantidad de IL12p70 producida en respuesta a M-SPEX es mayor que la cantidad producida por YVEC o no tratados, lo que indica una respuesta inmunitaria específica de antígeno inducida por esta composición inmunoterapéutica basada en levadura. Se espera que a-SPEX (GI-13004; Ejemplo 2), que expresó mayores niveles de antígeno e indujo una respuesta proliferativa CD4+ en los ensayos descritos en el Ejemplo 9, induzca mayores niveles de producción de citocinas.
Se realizaron ensayos de citocinas adicionales usando ratones hembras BALB/c inmunizados con uno de los mismos dos productos inmunoterapéuticos basados en levadura. En estos experimentos, se inmunizaron ratones hembra BALB/c con SCORE (GI-13002; indicado como “Sc” en las Figs. 30A-30D), M-SPEX (GI-13005; indicado como “Sp” en las Figs. 30A-30D), YVEC (indicado como “Y” en las Figs. 30A-30D), o nada (no tratado, indicado como “N” en las Figs. 30A-30D) de la siguiente manera: se administraron 2 UL de producto de levadura en 2 sitios en los días 0, 11, 39, 46, 60 y 67. Como en el experimento anterior, se administró anticuerpo anti-CD40 i.p. Nueve días después de la última inmunización (día 76) se retiraron los bazos, se procesaron en suspensiones celulares individuales y se sometieron a IVS durante 48 h con una mezcla de proteínas de Superficie y Núcleo del VHB recombinantes (indicadas como “Sag+ de Núcleo de VHB” en las Figs. 30A-30D). Los sobrenadantes se recogieron y se evaluaron por Luminex con respecto a la producción de IL1β, IL-6, IL-13 e IL12p70. IL-6 es una citocina proinflamatoria producida por células presentadoras de antígeno y células T y se cree que es una citocina importante en el mecanismo de acción de productos inmunoterapéuticos basados en levadura. IL-13 también es una citocina proinflamatoria producida por células T y está estrechamente relacionada con IL-4 y la promoción de una respuesta inmunitaria Th2 CD4+.
Los resultados, mostrados en las Fig. 30A (IL-1β), Fig. 30B (IL-6), Fig. 30C (IL-13) y Fig. 30D (IL-12) muestran que los esplenocitos de ratones inmunizados con SCORE produjeron IL-1β, IL-6, IL12p70 e IL-13 en respuesta a la mezcla de antígeno de superficie y de núcleo y que la magnitud de la respuesta fue mayor que para esplenocitos de ratones inmunizados con YVEC o no tratados. Esta especificidad de antígeno es coherente con los resultados obtenidos para LPA en ratones BALB/c (véase Ejemplo 9) y para ensayos de liberación de citocinas en ratones C57B1/6 (véase anteriormente).
Los esplenocitos de ratones inmunizados con M-SPEX produjeron señales específicas de antígeno para IL-1β (Fig. 30A) pero no para las otras citocinas. Como con los hallazgos en C57B1/6, esta aparente diferencia en la potencia entre SCORE y M-SPEX puede explicarse por el menor contenido de antígenos de este último. Se espera que a-SPEX (que expresa una proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 92, descrita en el Ejemplo 2), que expresa mayores niveles de antígeno, induzca producción de citocinas específicas de antígeno mejorada, y además, se espera que los ensayos de IVS que presentan los antígenos adicionales expresados por este producto u otros que incorporan otros antígenos del VHB (antígenos X y Polimerasa del VHB) revelen inmunogenicidad adicional.
Ejemplo 11
El siguiente ejemplo describe ensayos de inmunogenicidad in vivo de una composición inmunoterapéutica basada en levadura para VHB.
En este experimento, el producto inmunoterapéutico basado en levadura (GI-13002) que expresa una proteína de fusión representada por SEQ ID NO: 34 bajo el control del promotor CUP1, también conocido como “SCORE” y más específicamente descrito en el Ejemplo 1 se usó en un método de transferencia adoptivo en el que se transfirieron las células T de ratones inmunizados con SCORE a ratones receptores Deficientes Inmunitarios Combinados Graves (SCID) antes de la implantación tumoral en los ratones SCID.
Brevemente, se inmunizaron por vía subcutánea ratones hembra C57BL/6 (edad 4-6 semanas) con GI-13002 (SCORE), YVEC (levadura que contiene vector vacío) o nada (no tratado) en 2 sitios (2,5 UL en el flanco, 2,5 UL en el pescuezo) los días 0, 7 y 14. En una cohorte de ratones inmunizados con SCORE se inyectaron adicionalmente por vía intraperitoneal (i.p.) 50 µg de anticuerpo anti-CD40 un día después de cada inmunización. El día 24, los ratones se sacrificaron y se prepararon y contaron los esplenocitos totales. Se inyectaron veinticinco millones de esplenocitos en 200 µl de PBS i.p. en ratones SCID hembras de 4-6 semanas de edad no tratados receptores. Veinticuatro horas después de la transferencia, los receptores se expusieron por vía subcutánea (s.c.) en el área de la caja torácica a 300.000 células tumorales EL4 que expresaban antígeno SCORE (indicadas como “EL-4-Score”),
o células tumorales que expresaban antígeno de ovoalbúmina irrelevante. El crecimiento tumoral se supervisó por medición con calibrador digital a intervalos de 1 a 2 días comenzando el día 10 después de la exposición tumoral.
Los resultados a los 10 días después de la exposición tumoral mostrados en la Fig. 31, demostraron que los esplenocitos de ratones inmunizados con GI-13002 (SCORE) o GI-13002 + anticuerpo anti-CD40, pero no de ratones YVEC o no tratados, indujeron protección comparable de la exposición a tumores EL4 que expresaban el antígeno SCORE (Fig. 31, primera y segunda barras desde la izquierda). El número de ratones con tumores 10 días después de la exposición se indica encima de cada barra en la Fig. 31. Las células T de ratones inmunizados con GI-13002 no tuvieron ningún efecto en el crecimiento de tumores EL4 que expresaron un antígeno no relacionado (no mostrado). Los esplenocitos de ratones inmunizados con YVEC (Fig. 31, barra media) no afectaron al crecimiento tumoral, ya que el tamaño y el número de tumores en este grupo fue comparable al de los ratones que no recibieron esplenocitos (Fig. 31, barra del extremo derecho) o los ratones que recibieron esplenocitos de ratones sin tratamiento previo (Fig. 31, segunda barra desde la derecha). Estos resultados indican que la inmunización con una composición inmunoterapéutica basada en levadura que expresan una proteína de fusión de núcleo-antígeno de superficie genera una respuesta inmunitaria específica de antígeno que protege a los ratones SCID de la exposición
5 tumoral. La co-administración del anticuerpo anti-CD40 que activa células dendríticas (CD) no influyó en el grado de protección.
Ejemplo 12
10 El siguiente ejemplo describe el ensayo de inmunogenicidad de dos composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura para VHBm, usando ensayos de ELISpot de interferón-γ (IFN-γ).
Este experimento se diseñó para evaluar dos composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura optimizadas descritas en el Ejemplo 7 con respecto a la capacidad para inducir células T específicas de antígeno del VHB en 15 ratones inmunizados con estas composiciones. El experimento también ensayó si pueden usarse nuevas secuencias peptídicas del VHB diseñadas con algoritmos computacionales y secuencias obtenidas de la bibliografía publicada para volver a estimular respuestas de células T que fueron generadas por estas composiciones inmunoterapéuticas.
En este experimento, la composición inmunoterapéutica basada en levadura descrita en el Ejemplo 7 como GI
20 13008 (“Score-C”, que comprende SEQ ID NO: 116) y la composición inmunoterapéutica basada en levadura descrita en el Ejemplo 7 como GI-13013 (“Spex-D”, que comprende SEQ ID NO: 110) se evaluaron con respecto a inmunogenicidad. Las secuencias peptídicas usadas en este experimento se muestran en la Tabla 7. Las secuencias indicadas como ZGP-5 y ZGP-7 son de la bibliografía publicada mientras que los péptidos restantes se identificaron computacionalmente con algoritmos predictivos BIMAS o SYFPEITHI. Los prefijos “Db” o “Kb” se
25 refieren al haplotipo de ratones C57BL/6: H-2Db y H2-Kb, respectivamente.
Tabla 7
Nombre del Secuencia de aminoácidos Identificador de Clase de Antígeno del péptido Secuencia MHC VHB
Db9-84 WSPQAQGIL SEQ ID NO: 138 I Sag Db9-94 TVPANPPPA SEQ ID NO: 141 I Sag Db9-283 GMLPVCPLL SEQ ID NO: 142 I Sag Db9-499 MGLKIRQLL SEQ ID NO: 143 I Núcleo Kb8-249 ICPGYRWM SEQ ID NO: 144 I Sag Kb8-262 IIFLFILL SEQ ID NO: 145 I Sag Kb8-277 VLLDYQGM SEQ ID NO: 139 I Sag Kb8-347 ASVRFSWL SEQ ID NO: 140 I Sag Kb8-360 FVQWFVGL SEQ ID NO: 146 I Sag Kb8-396 LLPIFFCL SEQ ID NO: 147 I Sag ZGP-5 VSFGVWIRTPPAYRPPNAPIL SEQ ID NO: 148 II Núcleo ZGP-7 ILSPFLPL SEQ ID NO: 149 I Sag
Se inmunizó por vía subcutánea a ratones hembra C57BL/6 (edad 4-6 semanas) por vía subcutánea con GI-13008
30 (Score-C), GI-13013 (Spex-D), YVEC (control de levadura de vector vacío) o nada (no tratados) en 2 sitios (2,5 UL en el flanco, 2,5 UL en el pescuezo) los días 0, 7 y 14. El día 20, los ratones se sacrificaron y se prepararon esplenocitos totales, se agotaron los glóbulos rojos, se contaron y se incubaron a 200.000 células/pocillos durante cuatro días en RPMI completo que contenía suero de ternero fetal al 5 % más los estimulantes peptídicos enumerados en la Tabla 7 (10 µM para péptidos Db y Kb; 30 µg/ml para péptidos ZGP) o una mezcla de antígeno
35 SAg y del Núcleo del VHB recombinante (3 µg/ml total). Se añadió concanavalina A como un estimulante de control positivo.
Los resultados (Fig. 32) muestran que la inmunización de ratones C57BL/6 con GI-13008 (Score-C) induce respuestas de ELISpot de IFNγ dirigidas contra antígenos de superficie (S) y núcleo de VHB con especificidad
40 particular por los siguientes péptidos: Db9-84, Kb8-277 y/o Kb8-347, ZGP-5 y ZGP-7. Estos péptidos indujeron respuestas de IFNγ mayores que las de pocillos que contenían solamente medio, o de pocillos que contenían esplenocitos de ratones inmunizados con GI-13013 (Spex-D), YVEC o no tratados. La mezcla de antígenos S+Núcleo recombinante también indujo una respuesta de IFNγ, aunque las células de control YVEC en ese grupo estimulante particular produjeron señal de fondo que evitaba la evaluación de una contribución específica de
45 antígeno para la mezcla de antígenos S+Núcleo. Estos datos indican que GI-13008 (Score-C), que expresa una proteína de fusión de superficie-núcleo, induce respuestas inmunitarias específicas de antígeno del VHB que pueden volver a estimularse con péptidos seleccionados ex vivo, y que estas respuestas son más fácilmente detectables que las inducidas por GI-13013 (Spex-D).
Ejemplo 13
El siguiente ejemplo describe un experimento en el que una composición inmunoterapéutica basada en levadura para VHB se ensayó con respecto a la capacidad de estimular la producción de IFNγ de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un sujeto vacunado con una vacuna profiláctica de VHB comercial.
En este experimento, el producto inmunoterapéutico basado en levadura conocido como GI-13002 (“Score”, que comprende SEQ ID NO: 34, Ejemplo 1) se ensayó con respecto a su capacidad para estimular la producción de IFNγ de PBMC aisladas de un sujeto que se vacunó con vacuna profiláctica de VHB comercial (ENGERIX-B , GlaxoSmithKline), que es una vacuna profiláctica que contiene un antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) purificado recombinante adsorbido en un adyuvante basado en aluminio.
Brevemente, se recogió sangre y se aislaron PBMC de un sujeto humano no expuesto a VHB sano que expresaba el alelo HLA-A*0201. Las PBMC se congelaron para análisis posterior. El sujeto se vacunó después con ENGERIX-B (inyección 1), se recogió sangre los días 12 y 29 después de la inyección y se aislaron y congelaron PBMC. El sujeto se vacunó una segunda vez con ENGERIX-B (inyección 2, “refuerzo”) y se recogió sangre los días 10, 21 y 32 después del refuerzo. Se aislaron y congelaron PBMC para cada punto temporal.
Después de adquirirse y congelarse la serie de muestras de PBMC, las células de todos los puntos temporales se descongelaron, se lavaron y se incubaron con el control de levadura de vector vacío (YVEC) o con GI-13002 a una relación de levadura:PBMC de 5:1 durante 3 días en un incubador de CO2 5 %/37 ºC. Las células se transfirieron después a una placa de ELISpot de IFNγ, se incubaron durante 18 h y se procesaron para desarrollar ELISpot de acuerdo con procedimientos normalizados.
Como se muestra en la Fig. 33 (las columnas indican periodos de tiempo antes y después de la inmunización por sensibilización o después del refuerzo), se observó una respuesta de ELISpot sustancial para PBMC tratadas con GI-13002 que fue mayor que la de PBMC tratadas con YVEC el día 21 después del punto temporal del refuerzo (ELISpots de GI-13002 – ELISpots de YVEC ∼230 puntos por cada millón de PBMC). El nivel de ELISpots de Score sin YVEC estuvo por encima del número observado para otros puntos temporales y 2,8 veces por encima de la señal obtenida para la muestra pre-vacunación. La única diferencia estructural sustancial entre las composiciones basadas en levadura de GI-13002 e YVEC es la presencia de la proteína de fusión de superficie-núcleo (el antígeno del VHB) dentro del vector portado por GI-13002 (es decir, YVEC tiene un vector “vacío”). Por lo tanto, el resultado indica que GI-13002 indujo estimulación específica de antígeno de células T en las PBMC del sujeto. Debido a que la vacuna ENGERIX-B contiene antígeno de superficie recombinante, pero no antígeno de núcleo, y debido a que el sujeto fue negativo para virus VHB (no se había infectado con VHB), este resultado también indica que la producción de IFNγ observada derivó de células T específicas de HBsAg (específicas de antígeno de superficie) en lugar de específicas de antígeno de núcleo.
Ejemplo 14
El siguiente ejemplo describe la evaluación de composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura para VHB in vivo en modelos de inmunización murinos.
En este experimento, el producto inmunoterapéutico basado en levadura conocido como GI-13009 (“SCORE-D”, que comprende SEQ ID NO: 118, Ejemplo 7), y el producto inmunoterapéutico basado en levadura conocido como GI13020 (“X-SCORE”, que comprende SEQ ID NO: 130, Ejemplo 8) se administraron a ratones C57BL/6, ratones BALB/c y ratones transgénicos para HLA-A2 (B6.Cg-Tg(HLA-A/H2-D)2Enge/J; The Jackson Laboratory, proporcionado bajo una licencia de la Fundación de Patentes de la Universidad de Virginia). Los ratones transgénicos para HLA-A2 usados en estos experimentos expresan un gen de MHC de clase I híbrido entre especies, AAD, que contiene los dominios alfa-1 y alfa-2 del gen HLA-A2.1 humano y los dominios alfa-3 transmembrana y citoplasmático del gen H-2Dd de ratón, bajo la dirección del promotor de HLA-A2.1 humano. La molécula de MHC de Clase I quimérica HLA-A2.1/H2-Dd media en la selección positiva eficaz de células T de ratón para proporcionar un repertorio de células T más completo capaz de reconocer péptidos presentados por moléculas de HLA-A2.1 de Clase 1. Los epítopos peptídicos presentados y reconocidos por células T de ratón en el contexto de la molécula de HLA-A2.1/H2-Dd de clase I son iguales que los presentados en seres humanos HLA-A2.1+. En consecuencia, esta cepa transgénica permite la modelización de respuestas inmunitarias de células T humanas a antígenos presentados por HLA-A2.
El objetivo de estos experimentos fue evaluar la amplitud y magnitud de las respuestas inmunitarias específicas de antígeno del VHB que son generadas por inmunización con los productos inmunoterapéuticos de VHB basados en levadura en ratones con alelos del MHC variados, incluyendo uno que expresa una molécula del MHC humano (HLA). Se realizó ensayo de inmunogenicidad después de inmunización por estimulación ex vivo de células del bazo
o ganglios linfáticos con antígenos del VHB relevantes, seguido de evaluación de respuesta de células T mediante: ELISpot de color doble IFN-γ/IL-2, ensayo de proliferación de linfocitos (LPA), análisis de multi-citocinas de Luminex, y/o tinción de citocinas intracelulares (ICCS). Se usó ICCS para determinar la contribución de células T CD4+ y CD8+ a la producción específica de antígeno de IFN-γ y TNF-α.
En cada uno de los experimentos descritos posteriormente, los ratones se vacunaron por vía subcutánea con productos inmunoterapéuticos del VHB basados en levadura o control basado en levadura (descrito posteriormente) 5 de acuerdo con el mismo régimen: inyección en 2 sitios (flanco, pescuezo) con 2,5 UL de la composición de levadura por sitio, una vez a la semana durante 3 semanas. Los controles incluyeron YVEC (levadura de control que contiene un vector vacío, es decir, sin antígeno), OVAX2010 (una composición inmunoterapéutica de levadura de control que expresa el antígeno que no es de VHB, ovoalbúmina) y la combinación de YVEC con antígenos recombinantes solubles (ovoalbúmina o antígenos del VHB) y anticuerpo anti-CD40. Los experimentos y las cohortes de tratamiento específicos se muestran en las Tablas 8 y 9 posteriores. Los ratones se sacrificaron 8 días (transgénicos para HLA-A2, Experimento 1) o 14 días (C57BL/6 y BALB/c, Experimento 2) después de la tercera inmunización, y se diseccionaron el bazo y los ganglios linfáticos inguinales y se incubaron con diversos estímulos antigénicos (péptidos restringidos al MHC de clase I y clase II del VHB, proteínas recombinantes y líneas celulares tumorales que expresan antígeno del VHB) durante 5 días, como se ha indicado anteriormente. Para análisis de Luminex, se 15 recogieron sobrenadantes de cultivo y se evaluaron con respecto a la producción de 10 citocinas diferentes (tipo Th1 y Th2) a las 48 h después de la adición de antígenos. Para ensayos ELISpot, se incubaron células en placas recubiertas con anticuerpos de IFN-γ durante las últimas 24 h de la estimulación in vitro (IVS) de 5 días, seguido de detección y recuento de puntos normalizado. Para LPA, las células se sometieron a pulsos con 3H-timidina durante las últimas 18 h de IVC de 5 días, y se midió después la cantidad de isótopo incorporado en ADN de nueva síntesis por recuento de centelleo. Para ICCS, después de 7 días enteros de estimulación, se sometieron a centrifugación de gradiente de Ficoll para eliminar las células muertas y se incubaron después 1 millón de células viables por pocillo (placas de fondo en U de 96 pocillos) durante 5 horas con los mismos estímulos antigénicos a una serie de concentraciones (valoración) y después se permeabilizaron, y se sometieron a tinción con anticuerpos acoplados a fluorocromo que reconocían IFN-γ y TNF-α intracelulares más marcadores de superficie celular CD4 y CD8. El
25 porcentaje de células T CD4+ o CD8+ que expresan las citocinas se determinó por citometría de flujo.
La Tabla 8 describe las cohortes experimentales y el protocolo para el Experimento 1. En este experimento, las cohortes de HLA-A2 de ratones se inmunizaron usando el protocolo descrito anteriormente, y los ratones se sacrificaron para análisis inmunitario 8 días después de la tercera inmunización. El Grupo A (“YVEC”) recibió el control de YVEC de levadura de acuerdo con el programa de inmunización descrito anteriormente; el Grupo B (“SCORE-D (GI-13009-UL2)”) recibió GI-13009 cultivado en medio UL2 (véase Ejemplo 7) de acuerdo con el programa de inmunización descrito anteriormente; y el Grupo C (“X-SCORE (GI-13020-U2)”) recibió GI-13020 cultivado en medio U2 (véase Ejemplo 8) de acuerdo con el programa de inmunización descrito anteriormente.
35 Tabla 8
Grupo
Ratones HLA-A2 (n.º, tratamiento)
A
3, YVEC
B
3, SCORE-D/GI-13009-UL2
C
3, X-SCORE/GI-13020-U2
Los resultados del ensayo de ELISpot de IFN-γ de las células de ganglios linfáticos recogidas de ratones en el Experimento 1 se muestran en la Fig. 34. Esta figura muestra los resultados de reestimulación de células de ganglios linfáticos de los ratones inmunizados con diversos péptidos del VHB en comparación con un control de medio (obsérvese que el péptido indicado como “TKO20” es un péptido del antígeno X (X52-60) que está contenido dentro del producto inmunoterapéutico X-SCORE, pero no está presente en SCORE-D). Los resultados indicaron que las células de ganglios linfáticos de ratones tanto inmunizados con SCORE-D (GI-13009) como inmunizados con X-SCORE (GI-13020) poseen células T que producen IFN-γ en respuesta a estimulación in vitro con una mezcla de 3 µg/ml cada uno de antígenos de superficie y núcleo del VHB recombinantes (Fig. 34; indicado como “SyC3”).
45 Esta respuesta de ELISpot fue mayor que la observada para ratones inmunizados con YVEC (controles de levadura) tratados con el mismo estimulante, lo que indica que los antígenos de superficie y/o núcleo del VHC dentro de las composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura (SCORE-D y X-SCORE) se requieren para la inducción de la respuesta de IFN-γ. Además, los resultados indican que la reestimulación usando antígeno del VHB en la IVS da como resultado la producción de IFN-γ eficaz, ya que los pocillos que contienen solamente medio mostraron una respuesta de ELISpot mucho menor.
La Fig. 34 también muestra que un epítopo restringido a HLA-A2 seleccionado de núcleo del VHB (TKP16; Núcleo: 115-124 VLEYL-VLEYLVSFGV; SEQ ID NO: 75) que se sabe en el campo que es importante en pacientes con exposición a VHB aguda y eliminación, induce una respuesta en ratones inmunizados con X-SCORE que es mayor
55 que la observada para pocillos solamente con medio. Se espera que el refinamiento adicional de la concentración de péptido y los tiempos de incubación para el ensayo de ELISpot aumente la magnitud y reduzcan la variabilidad en la respuesta observada para estos antígenos.
La Fig. 35 muestra los resultados de ensayo de ELISpot de IFN-γ de las células del bazo recogidas de ratones inmunizados con SCORE-D en el Experimento 1. El péptido del núcleo del VHB indicado “Núcleo 11-27” (ATVELLSFLPSDFFPSV (SEQ ID NO: 72)) está contenido dentro del antígeno expresado por SCORE-D, mientras que el péptido X del VHB indicado como “X92-100” no está contenido dentro del antígeno expresado por SCORE-D y es por lo tanto un péptido de control en este experimento. Como se muestra en la Fig. 35, las células del bazo de los ratones transgénicos para HLA-A2 inmunizados con SCORE-D produjeron una respuesta de ELISpot de IFN-γ tras la estimulación in vitro con el epítopo del núcleo del VHB restringido a HLA-A2 conocido, indicado como “Núcleo
5 11-27”. Esta respuesta fue mayor que la observada a partir de células del bazo que se estimularon in vitro con un péptido irrelevante (indicado como “X92-100”), solamente medio o para cualquier pocillo de tratamiento de IVS para esplenocitos de ratones inmunizados con YVEC.
Por lo tanto, los resultados iniciales del Experimento 1 muestran que tanto SCORE-D como X-SCORE inducen respuestas de células T específicas de antígeno del VHB en ratones transgénicos para HLA-A2 inmunizados con estas composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura.
La Tabla 9 describe las cohortes experimentales y el protocolo para el Experimento 2. En este experimento, se inmunizaron cohortes C57BL/6 y BALB/c de ratones usando el protocolo descrito anteriormente, y los ratones se
15 sacrificaron para análisis inmunitario dos semanas después de la tercera inmunización. El Grupo A (“no tratado”) no recibió tratamiento; el Grupo B (“YVEC”) recibió el control de YVEC de levadura de acuerdo con el programa de inmunización descrito anteriormente; el Grupo C (“X-SCORE (GI-13020-U2)”) recibió GI-13020 cultivado en medio U2 (véase Ejemplo 8) de acuerdo con el programa de inmunización descrito anteriormente; el Grupo D (“SCORE-D (GI-13009-UL2)”) recibió GI-13009 cultivado en medio UL2 (véase Ejemplo 7) de acuerdo con el programa de inmunización descrito anteriormente; y el Grupo E (“OVAX2010”) recibió el control de levadura que expresa ovoalbúmina de acuerdo con el programa de inmunización descrito anteriormente.
Tabla 9
Grupo
Ratones C57BL/6 (n.º, tratamiento) Ratones BALB/c (n.º, tratamiento)
A
8, no tratado 8, no tratado
B
8, YVEC 8, YVEC
C
8, X-SCORE (GI-13020-U2) 8, X-SCORE (GI-13020-U2)
D
8, SCORE-D (GI-13009-UL2) 8, SCORE-D (GI-13009-UL2)
E
8,OVAX2010 7,OVAX2010
25 La Fig. 36 muestra los resultados de los ensayos de ELISpot para células de ganglios linfáticos aisladas de ratones C57BL/6 inmunizados como se ha indicado en el Experimento 2 (Tabla 9). Estos resultados han demostrado que tanto X-SCORE como SCORE-D indujeron respuestas de IFN-γ en ratones C57BL/6 de tipo silvestre. Las células de ganglios linfáticos de ratones inmunizados con X-SCORE estimulados in vitro con antígenos de superficie y núcleo expresados en Pichia pastoris, purificados (indicados como yS&C; IVS con mezcla 1:1 de antígenos de superficie y núcleo expresados en Pichia, 3 μg/ml cada uno) produjeron una respuesta inmunitaria de IFN-γ significativa. Las mismas preparaciones de células de ganglios linfáticos de ratones inmunizados tanto con X-SCORE como con SCORE-D, cuando se estimularon con antígenos de superficie y núcleo expresados en E. coli (indicados como cS&D; IVS con mezcla 1:1 de antígeno de superficie y núcleo expresados en E. coli, 3 μg/ml cada uno), produjeron respuestas de ELISpot generales mayores que las observadas para los antígenos recombinantes expresados en
35 Pichia. La columna marcada “sin estim” en la Fig. 36 indica condiciones de IVS en las que se proporcionó medio cRPMI solamente (sin antígeno). En general, la inmunización con X-SCORE indujo un mayor efecto que SCORE-D, y ambas composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura del VHB indujeron una respuesta mayor que la observada para ratones inmunizados con YVEC (control de levadura) o no tratados. Estos datos indican que tanto SCORE-D como X-SCORE producen respuestas inmunitarias específicas de antígeno del VHB que son detectables en preparaciones de células de ganglios linfáticos ex vivo de ratones C57BL/6.
La Fig. 37 muestra los resultados del ensayo de tinción de citocinas intracelular (ICCS) para ratones C57BL/6 realizados en el Experimento 2 (Tabla 9). Los resultados mostraron que la inmunización de ratones C57BL/6 con X-SCORE o SCORE-D induce células T CD8+ productoras de IFN-γ que son específicas para el péptido restringido a
45 H-2Kb del MHC de Clase I, del antígeno de superficie, indicado como “VWL” (VWLSVIWM; SEQ ID NO: 152). Este efecto dependió de la concentración del péptido añadido a las células durante la incubación de 5 horas del procedimiento de ICCS; mayores concentraciones de péptido dieron como resultado una diferencia creciente en el nivel de células T CD8+ productoras de IFN-γ para productos inmunoterapéuticos basados en levadura del VHB (SCORE-D y X-SCORE) frente a los controles de levadura irrelevantes (Ovax e Yvec), produciéndose separación máxima a 10 μg/ml del péptido.
Los ensayos de ICCS del Experimento 2 también han mostrado que la inmunización de ratones C57BL/6 con X-SCORE y SCORE-D indujo células T CD4+ productoras de IFN-γ específicas para el péptido del VHB restringido al MHC de clase II de la proteína del núcleo indicada como “ZGP-5” (VSFGVWIRTPPAYRPPNAPIL; SEQ ID NO: 148),
55 con 0,5 μg/ml de péptido añadido durante el periodo de incubación de 5 horas del procedimiento de ICCS (Fig. 38).
Tomados junto con los resultados de ELISpot descritos anteriormente, estos datos indican que las composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura tanto SCORE-D como X-SCORE inducen células T CD4+ y CD8+ efectoras, específicas de antígeno del VHB que se detectan por estimulación ex vivo de células de ganglios linfáticos y del bazo con antígenos del VHB recombinantes y péptidos del VHB. Las respuestas de células T se producen tanto en ratones C57BL/6 de tipo silvestre (H2-Kb) como en ratones transgénicos para HLA-A2, lo que indica el potencial de estas vacunas para inducir respuestas inmunitarias en el contexto de diversos tipos de complejo mayor de histocompatibilidad.
Basándose en los resultados descritos en este Ejemplo anterior para ratones HLA-A2 y ratones C57BL/6, así como los resultados de los experimentos descritos en los Ejemplos 9, 10, 11 y 12, se espera que los resultados con ratones BALB/c inmunizados con SCORE-D o X-SCORE también demuestren que las composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura induzcan células T CD4+ y CD8+ efectoras específicas de antígeno del VHB en estos ratones. De hecho, los resultados iniciales de las cohortes de BALB/c fueron positivos para respuestas de células T CD8+ (datos no mostrados). Se espera además que los ensayos de proliferación de linfocitos y análisis de liberación de citocinas Luminex muestren que tanto SCORE-D como X-SCORE inducen respuestas inmunitarias que se dirigen específicamente a las secuencias de antígeno del VHB en el producto inmunoterapéutico de levadura y que estas respuestas se observan en las tres cepas de ratón (HLA-A2 transgénico, C57BL/6 y BALB/c).
Ejemplo 15
El siguiente ejemplo describe un experimento en el que las composiciones inmunoterapéuticas basadas en levadura para VHB se evalúan con respecto a la capacidad para estimular la producción de IFNγ a partir de PBMC aisladas de donantes de exposición a antígeno del VHB variada.
En este experimento, el producto inmunoterapéutico basado en levadura conocido como GI-13009 (“Score-D”, que comprende SEQ ID NO: 118, Ejemplo 7), y el producto inmunoterapéutico basado en levadura conocido como GI13020 (“X-Score”, que comprende SEQ ID NO: 130, Ejemplo 8) se ensayan con respecto a su capacidad para
estimular la producción de IFNγ de PBMC aisladas de donantes de exposición a antígeno del VHB variada. En este
experimento, un grupo de donantes se ha vacunado previamente con ENGERIX-B® (GlaxoSmithKline) o con RECOMBIVAX HB® (Merck & Co., Inc.), un grupo de donantes no se ha expuesto previamente a antígenos del VHB (“normal”), y un grupo de donantes es un paciente de VHB crónico (un sujeto que se ha infectado de forma crónica con VHB). ENGERIX-B® es una vacuna de subunidad recombinante profiláctica que contiene un antígeno de superficie del virus de la hepatitis B purificado recombinante (HBsAg) producido en células de levadura, purificado y después adsorbido en un adyuvante basado en aluminio. RECOMBIVAX HB® es una vacuna subunitaria recombinante profiláctica derivada del antígeno de superficie del VHB (HBsAg) producido en células de levadura y purificado para contener menos del 1 % de proteína de levadura. Todos los donantes expresan el alelo HLA-A* 0201.
Las PBMC donantes se incuban en placas de cultivo tisular de fondo plano de 6 pocillos (107 PBMC por pocillo) durante 3 h en un incubador de CO2 al 5 % en medio RPMI completo que contiene suero bovino fetal al 10 %. Se retiran las células no adherentes y se descartan y las células adherentes se tratan con interleucina-4 (IL-4) humana recombinante y factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) humanos recombinantes (20 y 50 ng/ml, respectivamente) durante 5 días para generar células dendríticas inmaduras (CDi). Las CDi se incuban después con anticuerpo anti CD40 (1 μg/ml), YVEC (control de levadura que comprende un vector vacío) o los productos basados en levadura GI-13020 o GI-13009, durante 48 horas en un incubador de CO2 al 5 % a 37 ºC, para generar CD maduras. Para CD tratadas con anticuerpos anti CD40, las células se someten a pulsos adicionalmente con péptidos del VHB restringidos a HLA-A* 0201 usando métodos convencionales. Todos los grupos de CD se lavan con PBS y después se retiran de placas con un recolector celular en PBS. Las células se irradian (30 Gy) y se usan para estimular las PBMC donantes autólogas a una relación de CD:PBMC de 1:10. Se realiza estimulación durante 7 días (ciclo 1) de los que los últimos 4 días se realizan en medio que contiene IL-2 humana recombinante. Las PBMC estimuladas se someten después a centrifugación en gradiente de Ficoll, y las células viables aisladas se someten a un segundo ciclo de IVS con CD con pulsos de péptidos o pulsos de levadura preparadas como se ha descrito anteriormente. Las PBMC estimuladas se incuban después con péptido o péptidos del VHB o controles en presencia de rhIL-2 20 U/ml en placas de 96 pocillos recubiertas con anticuerpo específico para IFN-γ, y se realiza detección por ELISpot usando procedimientos de fabricación convencionales. Se espera que las PBMC estimuladas con CD a las que se ha administrado SCORE-D o X-SCORE autólogas, o con CD con pulsos de péptidos del VHB, respondan a péptidos del VHB exógenos en un mayor grado que las PBMC estimuladas con CD a las que se ha administrado YVEC o sin pulsos, y que este efecto será más pronunciado para receptores de vacuna ENGERIX® o RECOMBIVAX HB® del VHB que para donantes que no se han expuesto previamente al antígeno del VHB.
Ejemplo 16
El siguiente ejemplo describe experimentos preclínicos usando PBMC humanas para demostrar la inmunogenicidad de composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura de la divulgación en seres humanos.
Específicamente, estos experimentos se diseñan para determinar si pueden detectarse células T CD8+ específicas de antígeno de superficie del VHB y/o específicas de antígeno de núcleo del VHB en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de vehículos de VHB después de 2 ciclos de estimulación in vitro (IVS) con composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura que contienen antígeno de superficie del VHB y núcleo de VHB.
Las PBMC se obtienen de donantes humanos que se ha confirmado que son positivos para VHB (basándose en el estado de HBsAg en suero). Se aísla ADN total de 0,5 ml de sangre completa y se tipifica con respecto a HLA para identificar el pentámero de VHB correcto para ensayar (véase la tabla posterior).
Tabla 10
Tipo de HLA
Secuencia Peptídica Pentamérica Antígeno
A*0201
FLLTRILTI (SEQ ID NO:42) Superficie
A*0201
GLSPTVWLSV (SEQ ID NO:43) Superficie
A*0201
FLPSDFFPSI (SEQ ID NO:44) Núcleo
A*1101
YVNVNMGLK (SEQ ID NO:48) Núcleo
A*2402
EYLVSFGVW (SEQ ID NO:49) Núcleo
10 Se preparan células dendríticas (CD) a partir de las PBMC aisladas de los donantes descritos anteriormente cultivando las PBMC durante 5 días en presencia de GM-CSF e IL-4. Las CD se incuban posteriormente con composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura (por ejemplo, las descritas en cualquiera de los ejemplos 1-8 o en otra parte del presente documento) o levadura de control (por ejemplo, “YVEC”, que es levadura Saccharomyces cerevisiae que se transforma con un vector vacío, o vector que no contiene un inserto que codifica
15 antígeno) a una relación de 1:1 (levadura:CD). Los cultivos de CD de control también incluyen CD incubadas con péptidos del VHB, péptidos de control (péptidos que no son de VHB), o nada.
Después de 48 horas en cocultivo, las CD se usan como células presentadoras de antígenos (APC) para estimulación de células T autólogas (es decir, células T de los donantes). Cada ciclo de estimulación, designado
20 como IVS (estimulación in vitro), consiste en un cultivo 3 días en ausencia de IL-2, seguido de 4 días adicionales en presencia de IL-2 recombinante (20 U/ml). Al final de IVS 2, las células T se tiñen con un tetrámero o pentámero de control o un tetrámero o pentámero específico para un epítopo peptídico del VHB identificado anteriormente. El porcentaje de células T CD8+ que dan tinción positiva con el tetrámero o pentámero se cuantifica por citometría de flujo.
25 Se espera que la estimulación de células T donantes de donantes positivos para el VHB con un producto inmunoterapéutico del VHB de levadura de la divulgación aumente el porcentaje de células T CD8+ positivas para tetrámeros/pentámeros en al menos parte o una mayoría de los donantes, en comparación con los controles, lo que indica que las células T humanas de individuos infectados por VHB tienen la capacidad de reconocer proteínas del
30 VHB portadas por la inmunoterapia basada en levadura como inmunógenos.
Se realizan experimentos adicionales similares a los anteriores usando PBMC donantes de individuos normales (no infectados por VHB). Se espera que la estimulación de células T donantes de donantes normales con un producto inmunoterapéutico del VHB basado en levadura de la divulgación aumente el porcentaje de células T CD8+ positivas
35 para tetrámeros/pentámeros en al menos algunos o una mayoría de los donantes, en comparación con controles, lo que indica que las células T humanas de individuos no infectados también tienen la capacidad de reconocer proteínas del VHB portadas por la inmunoterapia basada en levadura como inmunógenos.
En un experimento adicional, se expanden células T específicas del VHB de tres de los donantes de los
40 experimentos descritos anteriormente in vitro usando CD incubadas con productos inmunoterapéuticos basados en levadura del VHB (por ejemplo, los descritos en cualquiera de los Ejemplos 1-8 o en otra parte del presente documento) durante dos ciclos de IVS (como se ha descrito anteriormente). Se lleva a cabo una tercera IVS con CD maduradas en presencia de CD40L y con pulsos del péptido o los péptidos del VHB. El día 5, se aíslan células T CD8+ y se usan en un ensayo de linfocitos T citotóxicos (CTL) de una noche contra dianas celulares tumorales que
45 expresan antígenos del VHB, a diversas relaciones de efector:diana (ET). Se mide el porcentaje de células T CD8+ que tienen tinción positiva con un tetrámero/pentámero de control frente a un tetrámero/pentámero específico del VHB.
Se espera que las células T de algunos o todos los donantes sean capaces de generar CTL CD8+ que puedan
50 destruir las dianas que expresan antígenos del VHB. Estos datos demostrarán que las composiciones inmunoterapéuticas del VHB de levadura pueden generar CTL específicos de VHB que son capaces de destruir una célula tumoral que expresa antígeno del VHB.
Ejemplo 17
55 El siguiente ejemplo describe un ensayo clínico de fase 1 en voluntarios sanos.
Se realiza un estudio clínico de fase 1 con aumento de dosis abierto, de 12 semanas, usando una composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura descrita en el presente documento como GI-13009 (“SCORE-D”, que comprende SEQ ID NO: 118, Ejemplo 7) o como alternativa se usa la composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura descrita en el presente documento como GI-13020 (“X-SCORE”, que comprende SEQ ID NO: 130, Ejemplo 8). Pueden utilizarse composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura descritas en el presente documento (por ejemplo, cualquiera de las descritas en los Ejemplos 1-8) en un ensayo clínico de fase 1
5 similar. El producto inmunoterapéutico del VHB basado en levadura para el ensayo clínico de fase 1 se selecciona de estudios preclínicos (por ejemplo, los descritos en uno cualquiera de los Ejemplos 9-17) basándose en consideraciones que incluyen el perfil de respuesta inmunitaria neto más fuerte (por ejemplo, amplitud de respuesta para epítopos de células T que son más predictivos de resultado positivo, y/o amplitud de respuesta inmunitaria por toda la serie de epítopos).
10 Los sujetos son voluntarios sanos inmunoactivos sin ninguna indicación previa o actual o registro de infección por VHB.
Se administra a aproximadamente 48 sujetos (6 ramas, 8 sujetos por rama) que cumplen estos criterios la
15 composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura en un protocolo de aumento de cohorte de dosis secuencial que utiliza uno de dos protocolos de dosificación diferentes de la siguiente manera:
Protocolo A: dosificación de Sensibilización-Refuerzo (4 dosis semanales comenzando el Día 1, seguido de 2 dosis mensuales en la Semana 4 y Semana 8) 20 Rama 1A: 20 U.L. (administrado en dosis de 10 U.L. a 2 sitios diferentes);
Rama 2A: 40 U.L. (administrado en dosis de 10 U.L. a 4 sitios diferentes);
Rama 3A: 80 U.L. (administrado en dosis de 20 U.L. a 4 sitios diferentes)
Dosificación Cada 4 Semanas (tres dosis totales administradas el Día 1, la Semana 4 y la Semana 8
Rama 1B: 20 U.L. (administrado en dosis de 10 U.L. a 2 sitios diferentes);
Rama 2B: 40 U.L. (administrado en dosis de 10 U.L. a 4 sitios diferentes);
Rama 3B: 80 U.L. (administrado en dosis de 20 U.L. a 4 sitios diferentes)
25 Todas las dosis se administran por vía subcutánea y la dosis se divide entre dos o cuatro sitios en el cuerpo (en cada visita) como se ha indicado anteriormente. Se evalúan la seguridad e inmunogenicidad (por ejemplo, respuestas de células T específicas de antígeno medidas por ELISpot y proliferación de células T). Específicamente, se desarrolla un algoritmo basado en ELISpot para individuos que responden categóricamente. Los ensayos de ELISpot que miden las células T reguladoras (Treg) también se evalúan y se evalúa la proliferación de células T
30 CD4+ en respuesta a antígenos del VHB y se correlaciona con el desarrollo de anticuerpos anti Saccharomyces cerevisiae (ASCA).
Se espera que el producto inmunoterapéutico del VHB basado en levadura esté bien tolerado y muestre inmunogenicidad como se mide por uno o más de ensayo de ELISpot, ensayo de proliferación de linfocitos (LPA),
35 estimulación de células T ex vivo por antígenos del VHB y/o ASCA.
Ejemplo 18
El siguiente ejemplo describe un ensayo clínico de fase 1b/2a en sujetos infectados de forma crónica con virus de la 40 hepatitis B.
Debido a una tendencia de los pacientes infectados por VHB a experimentar agravamientos desestabilizantes de hepatitis como parte del historial natural de la enfermedad, la inmunoterapia del VHB basada en levadura se inicia después de algún período de control virológico parcial o completo usando terapia basada en antivíricos, con un
45 objetivo de eficacia primario de mejorar las tasas de seroconversión. En este primer enfoque de consolidación, se usa inmunoterapia del VHB en pacientes después de conseguir negatividad de ADN del VHB por PCR para determinar si pueden mejorarse las tasas de seroconversión en combinación con terapia antivírica continuada.
Se realiza un ensayo clínico de fase 1b/2a de aumento de dosis abierto usando una composición inmunoterapéutica
50 del VHB basada en levadura descrita en el presente documento como GI-13009 (“SCORE-D”, que comprende SEQ ID NO: 118, Ejemplo 7), o, como alternativa, se usa la composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura descrita en el presente documento como GI-13020 (“X-SCORE”, que comprende SEQ ID NO: 130, Ejemplo 8). Otras composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura descritas en el presente documento (por ejemplo, cualquiera de las descritas en los Ejemplos 1-8) pueden utilizarse en un ensayo clínico de fase 1 similar. Los sujetos son inmunoactivos e infectados crónicamente con virus de la hepatitis B (VHB) que está bien controlado por terapia antivírica (es decir, disoproxil fumarato de tenofovir o TDF (VIRE-AD®)), como se mide por los niveles de ADN del VHB. Los sujetos son negativos para ADN del VHB (por debajo de niveles detectables por PCR o <2000 UI/ml), pero para clasificarse para este estudio, los sujetos deben ser HBeAg positivos y no tener pruebas de cirrosis o descompensación.
En el estadio uno de este estudio, se administra a aproximadamente 40 sujetos (~5 sujetos por rama) que cumplen estos criterios la composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura en un protocolo de aumento de cohorte de dosis secuencial utilizando intervalos de dosis de 0,05 U.L. a 80 U.L. (por ejemplo, 0,05 U.L., 10 U.L., 20 U.L. y 40-80 U.L.). En un protocolo, se administrarán por vía subcutánea 5 dosis semanalmente (dosificación semanal durante 4 semanas), seguido de 2-4 dosis mensuales también administradas por vía subcutánea, con terapia antivírica continuada durante el tratamiento con la inmunoterapia del VHB basada en levadura (protocolo de sensibilización-refuerzo). En un segundo protocolo, se sigue un protocolo de dosificación de 4 semanas, en el que los sujetos reciben un total de tres dosis administradas el día 1, la semana 4 y la semana 8, usando la misma estrategia de aumento de dosis como se ha expuesto anteriormente. Opcionalmente, en un estudio, una única cohorte de pacientes (5-6 pacientes) recibirá inyecciones subcutáneas de placebo (PBS) en el mismo programa que la inmunoterapia más terapia anti vírica continuada. Se utilizan normas de detención conservativas para brotes de ALT y señales de descompresión.
En el segundo estadio de este ensayo, los sujetos (n = 60) se clasifican aleatoriamente a 30 por rama para continuar solamente con antivírico (TDF) o antivírico más el protocolo inmunoterapéutico del VHB basado en levadura (dosis 1 y dosis 2) durante hasta 48 semanas.
Se evalúan la seguridad, la cinética de antígenos del VHB, la seroconversión de HBeAg y HBsAg, y la inmunogenicidad (por ejemplo, respuestas de células T específicas de antígeno medidas por ELISpot). Además, se supervisa la carga vírica y bioquímica dependiente de dosis (ALT). Específicamente, se realiza medición de la reducción de HBsAg en suero durante el tratamiento entre las 3 ramas de tratamiento en las semanas 12, 24, 48, y se mide la pérdida/seroconversión de HBsAg en la semana 48.
Un aumento en las tasas de pérdida y/o seroconversión de HBsAg hasta > 20 % a las 48 semanas en sujetos que reciben la inmunoterapia basada en levadura y TDF, en comparación con sujetos que reciben solamente TDF, se considera un avance clínicamente significativo. Se espera que la composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura proporcione un beneficio terapéutico a pacientes infectados crónicamente con VHB. Se espera que la inmunoterapia sea segura y se tolere bien a todas las dosis suministradas. Se espera que los pacientes que reciben al menos la mayor dosis de inmunoterapia del VHB basada en levadura muestren respuestas de células T específicas de VHB, que surjan por tratamiento, como se determina por ELISPOT, y se espera que los pacientes con respuestas de células T específicas de VHB de línea basal previas muestren respuesta de células T específicas de VHB mejoradas mientras estén realizando el tratamiento. Se espera que los pacientes que reciben inmunoterapia del VHB basada en levadura muestren mejora en sus tasas de seroconversión en comparación con el grupo antivírico y/o en comparación con el grupo controlado por placebo, si se utiliza. Se esperan mejoras en la normalización de ALT en pacientes que reciben inmunoterapia del VHB basada en levadura.
En un ensayo alternativo, los pacientes negativos para HBeAg que cumplen los otros criterios (inmunoactivos, infectados por VHB de forma crónica, bien controlados con antivíricos, sin señales de descompensación) se tratan en un ensayo de aumento de dosis similar al descrito anteriormente (o a la dosis tolerada máxima o la mejor dosis identificada en el ensayo descrito anteriormente). Los pacientes se supervisan con respecto a seguridad inmunogenicidad y seroconversión de HBsAg.
Ejemplo 19
El siguiente ejemplo describe un ensayo clínico de fase 1b/2a en sujetos infectados de forma crónica con virus de la hepatitis B.
Se realiza un ensayo clínico de fase 1b/2a de aumento de dosis abierto usando una composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura descrita en el presente documento como GI-13009 (“SCORE-D”, que comprende SEQ ID NO: 118, Ejemplo 7) o, como alternativa, se usa la composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura descrita en el presente documento como GI-13020 (“X-SCORE”, que comprende SEQ ID NO: 130, Ejemplo 8). Pueden utilizarse otras composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura descritas en el presente documento (por ejemplo, cualquiera de las descritas en los Ejemplos 1-8) en un ensayo clínico de fase 1b/2a similar. Los sujetos son inmunoactivos y están infectados de forma crónica con virus de la hepatitis B (VHB) que se ha controlado por terapia antivírica (por ejemplo tenofovir (VIREAD®)) durante al menos 3 meses. No se requiere que los sujetos hayan eliminado completamente el virus para incluirse en el estudio, es decir, los pacientes pueden ser positivos o negativos para ADN del VHB (la negatividad se determina como niveles por debajo de lo detectable por PCR o <2000 UI/ml); sin embargo, para clasificarse para este estudio, los sujetos no tienen pruebas de cirrosis o descompensación. Los pacientes pueden ser positivos para HBeAg, aunque pueden incluirse en el estudio pacientes negativos para HBeAg.
Se administra a 30-40 sujetos (6-10 pacientes por cohorte) que cumplen estos criterios la composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura en un protocolo de aumento de cohorte de dosis secuencial utilizando intervalos de dosis de 0,05 U.L. a 40 U.L. (por ejemplo, 0,05 U.L., 0,5 U.L., 4 U.L., 40 U.L.), o utilizando intervalos de dosis de 0,05 U.L. a 80 U.L. (por ejemplo, 0,05 U.L., 10 U.L., 20 U.L., 40/80 U.L.). En un protocolo, se administrarán 5 dosis semanales por vía subcutánea (dosificación semanal durante 4 semanas), seguido de 2-4 dosis mensuales también administradas por vía subcutánea, con terapia antivírica continuada durante el tratamiento con la inmunoterapia del VHB basada en levadura (protocolo de sensibilización-refuerzo). En un segundo protocolo, se sigue un protocolo de dosificación cada 4 semanas, en el que los sujetos reciben un total de tres dosis administradas el día 1, la semana 4 y la semana 8, usando la misma estrategia de aumento de dosis que se ha expuesto anteriormente. En un estudio, una única cohorte de pacientes (5-6 pacientes) recibirá inyecciones subcutáneas de placebo (PBS) con el mismo programa que la inmunoterapia más terapia antivírica continuada. Se utilizan normas de detención conservativas para brotes de ALT y señales de descompresión.
Se evalúan la seguridad, la seroconversión de HBeAg y HBsAg, el control vírico (por ejemplo, desarrollo de negatividad vírica o tendencia hacia negatividad vírica) e inmunogenicidad (por ejemplo, respuestas de células T específicas de antígeno medidas por ELISpot). Además, se supervisa la bioquímica dependiente de dosis (ALT) y la carga vírica.
Una reducción > 1log10 en HB-SAg a las 24 semanas o reducción > 1log10 en HB-eAg a las 12 semanas se consideran puntos finales para la fase 2a. Para seroconversión de VHB, una seroconversión de SAg de 10 % a las 24 semanas y 15 % a las 48 semanas, y/o una tasa de seroconversión de eAg del 25 % a las 24 semanas o el 50 % a las 48 semanas son criterios de éxito.
Se espera que la composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura proporcione un beneficio terapéutico a pacientes de VHB con infección crónica. Se espera que la inmunoterapia sea segura y esté bien tolerada a todas las dosis suministradas. Se espera que los pacientes que reciben al menos la mayor dosis de inmunoterapia del VHB basada en levadura muestren respuestas de células T específicas del VHB, que surgen por tratamiento como se determina por ELISPOT y pacientes con respuestas de células T específicas del VHB de línea basal previas muestren respuestas de células T específicas del VHB mejoradas mientras tomen el tratamiento. Los pacientes que reciben inmunoterapia del VHB basada en levadura mostrarán mejora de las tasas de seroconversión en comparación con datos comparativos disponibles para el antivírico proporcionado y/o en comparación con el grupo controlado por placebo. Los pacientes que reciben inmunoterapia del VHB basada en levadura mostrarán mejora en la pérdida vírica (por ejemplo, negatividad vírica como se mide por PCR). Se esperan mejoras en la normalización de ALT en pacientes que reciben inmunoterapia del VHB basada en levadura.
Ejemplo 20
El siguiente ejemplo describe un ensayo clínico de fase 2 en sujetos infectados de forma crónica con virus de la hepatitis B.
Un ensayo clínico de fase 2 aleatorio en pacientes infectados de forma crónica con VHB trata sujetos positivos para HBeAg, sin tratamiento previo (y posiblemente negativos para HBeAg) con ALT > 2x ULN y cargas víricas > 1 millón de copias. Los sujetos (~60 sujetos por rama ajustados basándose en la señal del estudio de fase 1) deben tener al menos 6 meses de terapia antivírica previa, y tener negatividad vírica durante 2 visitas consecutivas con al menos un mes de diferencia. Los sujetos se asignan aleatoriamente a dos ramas. Los pacientes de rama 1 reciben 24-48 semanas de inmunoterapia del VHB basada en levadura (por ejemplo, composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura descrita en el presente documento como GI-13009 (“SCORE-D”, que comprende SEQ ID NO: 118, Ejemplo 7) o, como alternativa, la composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura descrita en el presente documento como GI-13020 (“X-SCORE”, que comprende SEQ ID NO: 130, Ejemplo 8). Todos los pacientes que reciben inmunoterapia continúan la terapia antivírica (por ejemplo, tenofovir (VIREAD®)). Los pacientes de la rama 2 reciben un placebo (inyección de control de PBS) con terapia anti vírica continuada. El criterio de valoración primario es la seroconversión y la negatividad vírica. También pueden utilizarse composiciones inmunoterapéuticas del VHB basadas en levadura adicionales descritas en el presente documento (por ejemplo, cualquiera de las descritas en los Ejemplos 1-8) en un ensayo de fase 2 con diseño similar.
Los pacientes que consiguen seroconversión reciben terapia de consolidación de 6-12 meses con inmunoterapia de levadura y antivíricos (Rama 1) o solamente antivíricos (Rama 2), seguido de un descanso del tratamiento de 6 meses. El número de pacientes que permanecen en remisión después de completar el descanso de 6 meses representa el criterio de valoración secundario del estudio. Los criterios de valoración adicionales incluyen la seguridad, la inmunogenicidad y la normalización de ALT, como se ha analizado en los ejemplos que describen los ensayos clínicos humanos anteriores.
Se espera que la composición inmunoterapéutica del VHB basada en levadura proporcione un beneficio terapéutico a pacientes con VHB infectados de forma crónica. Se espera que la inmunoterapia sea segura y esté bien tolerada. Se espera que los pacientes que reciben inmunoterapia del VHB basada en levadura muestren respuestas de células T específicas del VHB, que surgen por tratamiento, como se determina por ELISPOT y pacientes con respuestas de células T específicas del VHB de línea basal previas muestran respuestas de células T específicas del VHB mejoradas mientras tomen el tratamiento. Se espera que los pacientes que reciben inmunoterapia del VHB basada en levadura muestren una mejora en las tasas de seroconversión en comparación con el grupo controlado por placebo. Se espera que los pacientes que reciben inmunoterapia del VHB basada en levadura muestren una mejora en la pérdida vírica (por ejemplo, negatividad vírica como se mide por PCR). Se esperan mejoras en la normalización de ALT en pacientes que reciben inmunoterapia del VHB basada en levadura.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> GlobeImmune, Inc. Apelian, David King, Thomas H. Guo, Zhimin Coeshott, Claire M.
<120> Composiciones y métodos para el tratamiento o la prevención de infección por virus de la hepatitis B
<130> 3923-32-PCT
<150> 61/507.361
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<150> 61/496.945
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<150> 61/442.204
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<170> PatentIn versión 3.5
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Construcción sintética 10
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<400> 103
15 <210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
20 <220>
<223> Péptido sintético
<400> 104
<210> 105
<211> 767
<212> PRT 30 <213> Artificial
<220>
<223> Construcción sintética
35 <400> 105
<210> 106
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<400> 106
<210> 107
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<400> 107
<210> 108
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<400> 108
<210> 109
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<400> 109
<210> 110
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<400> 110
<210> 111
<211> 1808 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Construcción sintética 10
<220>
<221> CDS
<222> (37)..(1779)
15 <400> 111
<210> 112
<211> 581
<212> PRT
<213> Artificial
5
<220>
<223> Construcción sintética
<400> 112
10
<210> 113
<211> 1808 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<220>
<221> CDS
<222> (37)..(1779)
<210> 114
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
15 <400> 113
<400> 114
<210> 115
<211> 1808 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<220>
<221> CDS
<222> (37)..(1779)
<210> 116
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
15 <400> 115
<400> 116
<210> 117
<211> 1808 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<220>
<221> CDS
<222> (37)..(1779)
<400> 117
<210> 118
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<400> 118
<210> 119
<211> 2492 <212> ADN
<213> Artificial
<220> 5 <223> Construcción sintética
<220>
<221> CDS
<222> (37)..(2463) 10
<400> 119
<210> 120
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<400> 120
<210> 121
<211> 1988
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Construcción sintética
<220>
<221> CDS
<222> (37)..(1959)
<400> 121
<210> 122
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<400> 122
<210> 123
<211> 2672 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<220>
<221> CDS
<222> (37)..(2643)
<210> 124
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<400> 124
<210> 125
<211> 2672
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 5
<220>
<221> CDS
<222> (37)..(2643)
<210> 126
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
15 <400> 123
10 <400> 125
<400> 126
<210> 127
<211> 2498 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<220>
<221> CDS
<222> (37)..(2469)
<210> 128
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
15 <400> 127
<400> 128
<210> 129
<211> 1994 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<220>
<221> CDS
<222> (37)..(1965)
<210> 130
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
<400> 130
<210> 131
<211> 2672
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Construcción sintética
<220>
<221> CDS
<222> (37)..(2643)
<400> 131
<210> 132
<213> Artificial
<220>
<223>
Construcción sintética 10
15 <400> 129
<400> 132
<210> 133
<211> 2672 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Construcción sintética 10
<220>
<221> CDS
<222> (37)..(2643)
15 <400> 133
<210> 134
<211> 869
<212> PRT
<213> Artificial
5
<220>
<223> Construcción sintética
<400> 134
10
<210> 135
<211> 9
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis B
<400> 135
<210> 136
<211> 10
<212> PRT 15 <213> Virus de la hepatitis B
<400> 136
5 <210> 137
<211> 9
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis B
10 <400> 137
<210> 138 15 <211> 9
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis B
<400> 138
<210> 139
<211> 8
<212> PRT 25 <213> Virus de la hepatitis B
<400> 139
30 <210> 140
<211> 8
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis B
35 <400> 140
<210> 141
<211> 9
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis B
<400> 141
<210> 142
<211> 9
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis B
<400> 142
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis B 15
<400> 143
20 <210> 144
<211> 8
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis B
25 <400> 144
<210> 145 30 <211> 8
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis B
<400> 145 35
<210> 146
<211> 8
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis B
<400> 146
<210> 147
<211> 8
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis B
<400> 147
<210> 148 10 <211> 21
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis B
<400> 148 15
<210> 149
<211> 8
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis B
<400> 149
<210> 150
<211> 657
<212> PRT 30 <213> Artificial
<220>
<223> Construcción sintética
35 <400> 150
<210> 151
<213> Artificial
<220>
<223> Construcción sintética 10
<400> 151
<210> 152
<211> 8
<212> PRT
<213> Virus de la hepatitis B
<400> 152

Claims (39)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composición inmunoterapéutica que comprende:
    a) un vehículo de levadura; y b) una proteína de fusión que comprende antígenos del VHB, en la que los antígenos del VHB consisten en:
    i) un antígeno X del VHB; ii) un antígeno de superficie del VHB; y iii) un antígeno de núcleo del VHB,
    en la que la proteína de fusión está expresada por el vehículo de levadura.
  2. 2. La composición inmunoterapéutica de la reivindicación 1 que comprende:
    a) un vehículo de levadura; y b) una proteína de fusión que comprende antígenos del VHB, en la que los antígenos del VHB consisten en:
    i) un antígeno X del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a las posiciones 1-60 de SEQ ID NO: 130 o una secuencia correspondiente de otra cepa de VHB; ii) un antígeno de superficie del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a las posiciones 63-461 de SEQ ID NO: 130 o una secuencia correspondiente de otra cepa de VHB; y iii) un antígeno de núcleo del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a las posiciones 462-643 de SEQ ID NO: 130 o una secuencia correspondiente de otra cepa de VHB.
  3. 3. La composición inmunoterapéutica de la reivindicación 1 que comprende:
    a) un vehículo de levadura; y b) una proteína de fusión que comprende antígenos del VHB, en la que los antígenos del VHB consisten en:
    i) un antígeno X del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a las posiciones 1-60 de SEQ ID NO: 130 o una secuencia correspondiente de otra cepa de VHB; ii) un antígeno de superficie del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a las posiciones 63-461 de SEQ ID NO: 130 o una secuencia correspondiente de otra cepa de VHB; y iii) un antígeno de núcleo del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a las posiciones 462-643 de SEQ ID NO: 130 o una secuencia correspondiente de otra cepa de VHB.
  4. 4. La composición inmunoterapéutica de la reivindicación 1 que comprende:
    a) un vehículo de levadura; y b) una proteína de fusión que comprende antígenos del VHB, en la que los antígenos del VHB consisten en:
    i) un antígeno X del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a las posiciones 1-60 de SEQ ID NO: 130 o una secuencia correspondiente de otra cepa de VHB; ii) un antígeno de superficie del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a las posiciones 63-461 de SEQ ID NO: 130 o una secuencia correspondiente de otra cepa de VHB; y iii) un antígeno de núcleo del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a las posiciones 462-643 de SEQ ID NO: 130 o una secuencia correspondiente de otra cepa de VHB.
  5. 5. La composición inmunoterapéutica de la reivindicación 1 que comprende:
    a) un vehículo de levadura; y b) una proteína de fusión que comprende antígenos del VHB, en la que los antígenos del VHB consisten en:
    i) un antígeno X del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos de las posiciones 1-60 de SEQ ID NO: 130
    o una secuencia correspondiente de otra cepa de VHB; ii) un antígeno de superficie del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos de las posiciones 63-461 de SEQ ID NO: 130 o una secuencia correspondiente de otra cepa de VHB; y iii) un antígeno de núcleo del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos de las posiciones 462-643 de SEQ ID NO: 130 o una secuencia correspondiente de otra cepa de VHB.
  6. 6. La composición inmunoterapéutica de acuerdo con la reivindicación 1 en la que:
    i) el antígeno X del VHB tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a las posiciones 52 a 126 de un antígeno X del VHB de longitud completa; ii) el antígeno de superficie del VHB tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de un antígeno de superficie grande (L) del VHB de longitud completa; y iii) el antígeno de núcleo del VHB tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos de una proteína de núcleo del VHB de longitud completa;
    en la que la composición induce una respuesta inmunitaria específica del VHB.
  7. 7.
    La composición inmunoterapéutica de las reivindicaciones 1 o 6, en la que la secuencia de aminoácidos del antígeno de X del VHB se selecciona de: posiciones 1-60 de SEQ ID NO: 130, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 110, posiciones 582-641 de SEQ ID NO: 122, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 109, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 108, posiciones 630-689 de SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 100, o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente.
  8. 8.
    La composición inmunoterapéutica de las reivindicaciones 1 o 6, en la que la secuencia de aminoácidos del antígeno de superficie del VHB se selecciona de: posiciones 63-461 de SEQ ID NO: 130, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 118, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 122, posiciones 9-407 de SEQ ID NO: 34, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 112, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 114, posiciones 1-399 de SEQ ID NO: 116, o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente.
  9. 9.
    La composición inmunoterapéutica de las reivindicaciones 1 o 6, en la que la secuencia de aminoácidos del antígeno de núcleo del VHB se selecciona de: posiciones 462 a 643 de SEQ ID NO: 130, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 118, posiciones 400 a 581 de SEQ ID NO: 122, posiciones 408-589 de SEQ ID NO: 34, posiciones 400581 de SEQ ID NO: 116, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 112, posiciones 400-581 de SEQ ID NO: 114, o una secuencia correspondiente de una cepa de VHB diferente.
  10. 10.
    La composición inmunoterapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que comprende:
    a) un vehículo de levadura; y b) una proteína de fusión que comprende antígenos del VHB, en la que los antígenos del VHB consisten en:
    i) un antígeno X del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos de las posiciones 1-60 de SEQ ID NO: 130; ii) un antígeno de superficie del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos de las posiciones 63-461 de SEQ ID NO: 130; y iii) un antígeno de núcleo del VHB que tiene una secuencia de aminoácidos de las posiciones 462-643 de SEQ ID NO: 130.
  11. 11.
    La composición inmunoterapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos N terminal de SEQ ID NO: 37.
  12. 12.
    La composición inmunoterapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que los antígenos del VHB están dispuestos en el siguiente orden, del extremo N al C terminal, en la proteína de fusión: antígeno X del VHB, antígeno de superficie del VHB, antígeno de núcleo del VHB.
  13. 13.
    La composición inmunoterapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 150 o SEQ ID NO: 122.
  14. 14.
    La composición inmunoterapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 85 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 150 o SEQ ID NO: 122.
  15. 15.
    La composición inmunoterapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 150 o SEQ ID NO: 122.
  16. 16.
    La composición inmunoterapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 150 o SEQ ID NO: 122.
  17. 17.
    La composición inmunoterapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 150 o SEQ ID NO:
  18. 122.
  19. 18.
    La composición inmunoterapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que el vehículo de levadura es una levadura completa.
  20. 19.
    La composición inmunoterapéutica de la reivindicación 18, en la que la levadura completa está muerta.
  21. 20.
    La composición inmunoterapéutica de la reivindicación 18, en la que la levadura completa está inactivada por calor.
  22. 21.
    La composición inmunoterapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en la que el vehículo de levadura es de Saccharomyces cerevisiae.
  23. 22.
    La composición inmunoterapéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en la que la composición contiene más del 90 % de proteína de levadura y se formula para administración por inyección de un paciente.
  24. 23.
    La composición inmunoterapéutica de la reivindicación 1 que comprende:
    a) una levadura completa, inactivada por calor de Saccharomyces cerevisiae; y b) una proteína de fusión del VHB expresada por la levadura, en la que la proteína de fusión comprende SEQ ID NO: 130 o SEQ ID NO: 150.
  25. 24.
    Una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 que tiene SEQ ID NO: 129 o SEQ ID NO: 121.
  26. 25.
    Una célula de levadura aislada transfectada con la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación
  27. 24.
  28. 26.
    Una célula de levadura aislada transfectada con una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17.
  29. 27.
    Una composición que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 24.
  30. 28.
    Una composición que comprende la célula de levadura aislada de la reivindicación 25 o 26.
  31. 29.
    La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, 27 o 28 para uso para tratar la infección por VHB o un síntoma de la misma.
  32. 30.
    La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, 27 o 28 para uso para prevenir la infección por VHB o un síntoma de la misma.
  33. 31.
    La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, 27 o 28 para uso para inmunizar una población de individuos contra VHB.
  34. 32.
    La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30 que comprende además administrar al sujeto uno o más compuestos adicionales útiles para tratar o aliviar un síntoma de infección por VHB.
  35. 33.
    La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 32, en la que el o los compuestos adicionales son un compuesto antivírico.
  36. 34.
    La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 33, en la que el compuesto antivírico es un inhibidor de transcriptasa inversa análogo de nucleótido.
  37. 35.
    La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 33, en la que el compuesto antivírico se selecciona del grupo que consiste en: tenofovir, lamivudina, adefovir, telbivudina, entecavir y combinaciones de los mismos.
  38. 36.
    La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 33, en la que el compuesto antivírico es tenofovir.
  39. 37.
    La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 33, en la que el compuesto antivírico es disoproxil fumarato de tenofovir (TDF).
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