KR102026840B1 - 만성적인 b형 간염에 대한 효모-기반의 치료제 - Google Patents

만성적인 b형 간염에 대한 효모-기반의 치료제 Download PDF

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Abstract

HBV 감염 및 이의 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한, 효모-기반의 면역치료 조성물, B형 간염 바이러스 (HBV) 항원 및 융합 단백질 뿐만 아니라 HBV 및/또는 이의 증상의 치료학적 및/또는 예방학적 치료를 위한 효모-기반의 면역치료 조성물, HBV 항원 및 융합 단백질의 이용 방법을 개시한다.

Description

만성적인 B형 간염에 대한 효모-기반의 치료제 {YEAST-BASED THERAPEUTIC FOR CHRONIC HEPATITIS B INFECTION}
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 미국 특허법 제119(e)조에 의거하여 2011년 2월 12일자 미국 가출원번호 61/442,204, 2011년 6월 14일자 미국 가출원번호 61/496,945 및 2011년 7월 13일자 미국 가출원번호 61/507,361에 대해 우선권을 주장한다. 미국 가출원번호 61/442,204, 미국 가출원번호 61/496,945 및 미국 가출원번호 61/507,361은 각각 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
서열목록에 대한 내용
본 출원은 EFS-Web을 통해 텍스트 파일로서 전자 제출된 서열목록을 포함한다. "3923-32-PCT_ST25"로 명명된 텍스트 파일은 476 KB 크기이며, 2012년 2월 7일자로 기록되었다. 텍스트 파일에 포함된 정보는 37 CFR §1.52(e)(5)에 준하여 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 일반적으로 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 면역치료 조성물 및 방법에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스 (HBV)는 헤파드나바이러스(hepadnavirus) 과에 속하며, 전세계적으로 급성 및 만성 간염의 원인이 되는 물질이다. HBV 유행병은 아시아와 아프리카에 만연해 있으며, HBV 감염은 중국 풍토병이다 (Williams, R. (2006), "Global challenges in liver disease", Hepatology (Baltimore, Md.) 44 (3): 521-526). 20억명 이상이 이 바이러스에 감염되었고, 전세계적으로 HBV에 만성적으로 감염된 인구는 3억 5천명인 것으로 추산된다 ("Hepatitis B", World Health Organization, 2009; "FAQ About Hepatitis B", Stanford School of Medicine. 2008-07-10). 감염 경로는 수혈 및 IV 약물 사용, 성 접촉을 통한 전염, 물린 상처와 병변, 및 모자감염 (예, 출산) 등의, 혈액 및 체액 접촉을 통해서이다.
HBV는 외막 단백질내 항원성 에피토프에 따라 정해지는 4가지 주 혈청형 (adr, adw, ayr, ayw)들 중 하나로 확인된다. 게놈의 뉴클레오티드 서열 차이를 토대로 하면 8종의 유전자형 (A-H)이 존재한다. 유전자형 차이는 질병의 중증도, 질환 진행 과정 및 합병증 가능성, 치료 반응성 및 잠재적으로는 백신 접종에 대한 반응성에 영향을 준다 (Kramvis et al., (2005), Vaccine 23 (19): 2409-2423; Magnius and Norder, (1995), Intervirology 38 (1-2): 24-34).
HBV의 임상 인큐베이션 기간은 통상 2-3개월이며, 급성 감염된 환자들 중 약 ⅔는 증상이 없거나 또는 준임상적인 경미한 증상을 나타낸다. 나머지 급성 감염 환자들 중 ⅓은 황달, 간 염증, 구토, 통증 및/또는 가벼운 열 증상을 나타낼 수 있지만, 대부분의 성인들에서는 병증이 결국 해소되어, 간 부전으로 진행되는 경우는 드물다. 실제, 성인의 약 95%가 HBV 감염으로부터 완전히 회복되어, 만성적인 감염으로 되지는 않는다. 그러나, 유아의 약 90%와 1-5세 어린이들 중 25%-50%는 HBV에 만성 감염된 상태로 남을 것이다 (Centers for Disease Control and Prevention as of September 2010). 유년기에 만성 감염된 개체들 중 약 25%와 유년기 이후에 만성 감염된 개체들 중 15%가 간경변 또는 간세포성 암종으로 인해 일찍 사망하며, 만성 감염된 개체 대다수는 간경변이 발생될 때까지 또는 간 질환 말기가 될 때까지는 증상이 나타나지 않는다 (CDC as of September 2010). 전세계적으로 만성적인 HBV 감염으로 인한 사망이 연간 백만명에 달한다 (미국의 경우, 연간 약 2000 - 4000건). 만성적으로 감염된 개체들은 혈청내 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 수준 (간 손상 마커)이 높고, 간 염증이 있으며, 및/또는 간 생검시 섬유증이 확인된다. 간경변으로 발전된 이러한 환자의 경우, 5년 생존율이 약 50%이다.
HBV 감염과 이의 치료는 전형적으로 바이러스 항원 및/또는 상기 항원에 대한 항체의 검출을 통해 모니터링한다. HBV 감염시, 첫번째로 검출할 수 있는 항원은 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg)이고, 그 다음으로 B형 간염 바이러스 "e" 항원 (HBeAg)이다. 바이러스 소멸은 혈청전환 (seroconversion)이라고도 하는 HBsAg 및/또는 코어 항원 (HBcAg)에 대한 혈청내 IgG 항체의 출현으로 확인된다. 많은 연구들에 의하면, HBV-감염 개체에서의 바이러스 복제, 바이러스 혈증(viremia) 수준 및 만성 상태로의 진행이 직간접적으로 CD4+ 헬퍼 (TH) 및 CD8+ 세포독성 T 림프구 (CTL)에 의해 매개되는 HBV-특이적인 세포 면역에 의해 영향을 받는다고 한다. 만성 질환으로 진행 중인 환자는, 급성 감염이 해소된 환자와 비교하여, HBV-특이적인 T 세포 반응이, 없거나, 경미하거나 또는 좁은 범위에서 집중되는 경향을 보인다. 예로, Chisari, 1997, J Clin Invest 99: 1472-1477; Maini et al., 1999, Gastroenterology 117:1386-1396; Rehermann et al., 2005, Nat Rev Immunol 2005; 5:215-229; Thimme et al., 2001, J Virol 75: 3984-3987; Urbani et al., 2002, J Virol 76: 12423-12434; Wieland and Chisari, 2005, J Virol 79: 9369-9380; Webster et al., 2000, Hepatology 32:1117-1124; Penna et al., 1996, J Clin Invest 98: 1185-1194; Sprengers et al., 2006, J Hepatol 2006; 45: 182-189를 참조한다.
HBV 예방 백신은 1980년대 초반 이래로 상업적으로 시판되고 있다. 현행 시판 백신들은 정제된 재조합 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAg)을 제공하는 비-감염성의 서브유닛 바이러스 백신이며, 출생시부터 투여할 수 있다. 백신은, 백신이 일상적으로 투여되는 국가들에서 감염 발생을 낮추는데 유효하다. 다양한 HBV 단백질 또는 에피토프 백신 및 사이토카인 등의 몇몇 면역치료제들이 개발 중에 있지만, 현재 미국에서 활성형 HBV 감염을 치료하기 위해 승인된 면역치료제는 없다.
HBV 감염에 대한 현행 표준 관리 (SOC: current standard of care) 요법은 일차적으로 테노포비르(tenofovir) (VIREAD®), 라미부딘(lamivudine) (EPIVIR®), 아데포비르(adefovir) (HEPSERA®), 텔비부딘(telbivudine) (TYZEKA®) 및 엔테카비르(entecavir) (BARACLUDE®) 등의 항-바이러스 약제들 뿐만 아니라 인터페론-α2a 및 페길화된(pegylated) 인터페론-α2a (PEGASYS®)를 포함한다. 이들 약제들과, 특히 항-바이러스 약제들은, 전형적으로, 장기간 투여되며 (예, 1-5년간 또는 그 이상의 기간 동안 매일 또는 매주), 약제가 바이러스 복제를 서행시키거나 정지시키기는 하지만, 이들 약제는 전형적으로 바이러스의 완전한 "치유" 또는 근절을 제공하지는 못한다. 인터페론에 기반한 방식은 독성이 있으며, 보통 수준의 관해율을 나타낸다. 항-바이러스 치료법들은 바이러스 복제를 저해하고, 인터페론 보다 허용성이 우수하지만, 전술한 바와 같이, 전형적으로 완전한 바이러스 치유를 제공하지 못하며, 어떤 경우에는 장기 관해율을 달성하지 못한다. 아울러, 어떤 경우에는, 약물 내성이 발생하기도 한다. 예를 들어, 라미부딘은 HBV 역전사효소 (Pol)를 저해하는 강력한 경구 항-바이러스제이다. 라미부딘은 허용성이 우수하고, 현재 제네릭 약물(generic drug)이기 때문에, 라미부딘은 개발도상국의 HBV 항-바이러스 요법의 한가지 옵션이다. 그러나, Pol 서열의 점 돌연변이로 인한 연간 바이러스 내성 발생율 20%가 HBV에 대한 라미부딘의 적용을 제한한다. 또한, 현행 항-바이러스 및 인터페론 치료에 대한 반응은 HBV 유전자형들간에 차별적으로 유효하며 (Cao, World Journal of Gastroenterology 2009;15(46):5761-9), 일부 환자들에서는, B형 간염 바이러스 DNA가 감염이 해소된 후에도 체내에 남아있을 수 있기 때문에, 시간 경과에 따라 바이러스의 재활성화가 이루어질 수 있다.
이에, 표준 관리 (SOC) 요법이 만성 HBV를 앓고 있는 환자에 대한 현재 승인된 최상의 치료법을 제공하지만, 긴 치료 기간과 용법의 심각한 부작용으로 인해 불순응, 용량 감소, 및 바이러스 탈출(viral escape), 바이러스의 재활성화와 연계된 치료 불연속이 발생할 수 있으며, 환자는 여전히 치료에 반응하지 못하거나 또는 반응을 지속하지 못할 수 있다. 따라서, HBV 감염에 대한 개선된 치료학적 치료제가 당해 기술 분야에 필요한 실정이다.
본 발명의 일 구현예는 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염 및/또는 HBV 감염의 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 면역치료 조성물에 관한 것이다. 면역치료 조성물은, (a) 효소 비히클; 및 (b) 하나 이상의 HBV 항원을 포함한다. 일 측면에서, HBV 항원은, 단일 단백질 HBV 항원들로 제공될 수 있지만, 하나 이상의 융합 단백질로서 제공된다. HBV 항원들은, (i) 전장 HBV 대형 (L), 중형 (M) 및/또는 소형 (S) 표면 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함하는, HBV 표면 항원; (ii) 전장 HBV 중합효소의 하나 이상의 면역원성 도메인 또는 이의 도메인 (예, 역전사효소 (RT) 도메인)을 포함하는 HBV 중합효소 항원; (iii) 전장 HBV 코어 단백질 및/또는 전장 HBV e-항원 각각의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함하는 HBV 코어 항원 또는 HBV e-항원; 및/또는 (iv) 전장 HBV X 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함하는 HBV X 항원으로 구성된다. 상기 조성물은 조성물내 하나 이상의 HBV 항원에 대해 및/또는 개체에 감염되었거나 감염될 수 있는 B형 간염 바이러스의 하나 이상의 항원에 대해 HBV 특이적인 면역 반응을 일으킨다.
면역치료 조성물, HBV 항원, 융합 단백질, 또는 상기한 조성물, HBV 항원 또는 융합 단백질의 용도와 관련된 임의 구현예를 비롯하여, 본원에 기술된 본 발명의 임의 구현예들에 있어서, 일 측면에서, HBV 대형 표면 항원 (L)의 아미노산 서열은, 비제한적인 예로서, 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 23, 서열번호 27 또는 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열, 또는 다른 HBV 균주/분리주 유래의 대응되는 서열을 포함할 수 있다. HBV 중합효소의 아미노산 서열은, 비제한적인 예로서, 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 10, 서열번호 14, 서열번호 18, 서열번호 22, 서열번호 26 또는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열, 이들 서열의 도메인, 예컨대 역전사효소 (RT) 도메인, 또는 다른 HBV 균주/분리주 유래의 대응되는 서열을 포함할 수 있다. HBV 코어 단백질 서열과 HBV e-항원 서열 둘다를 포함하는 HBV 프리코어(precore) 단백질의 아미노산 서열은, 비제한적인 예로서, 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 13, 서열번호 17, 서열번호 21, 서열번호 25, 또는 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열, 또는 다른 HBV 균주/분리주 유래의 대응되는 서열을 포함할 수 있다. HBV X 항원의 아미노산 서열은, 비제한적인 예로서, 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 16, 서열번호 20, 서열번호 24, 서열번호 28, 또는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열, 또는 다른 HBV 균주/분리주 유래의 대응되는 서열을 포함할 수 있다.
면역치료 조성물, HBV 항원, 융합 단백질, 또는 상기 조성물, HBV 항원 또는 융합 단백질의 사용에 관한 임의 구현예를 비롯하여, 본원에 기술된 본 발명에 대한 임의의 구현예들에 있어서, 일 측면에서, HBV 항원으로서, 또는 융합 단백질에, 또는 본 발명의 면역치료 조성물에 유용한 HBV 표면 항원의 아미노산은, 비제한적인 예로서, 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 11의 21-47번 위치, 서열번호 11의 176-400번 위치, 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 31, 서열번호 34의 9-407번 위치, 서열번호 36의 6-257번 위치, 서열번호 41의 6-257번 위치, 서열번호 92의 92-343번 위치, 서열번호 93의 90-488번 위치, 서열번호 97, 서열번호 101의 90-338번 위치, 서열번호 102의 7-254번 위치, 서열번호 107의 1-249번 위치, 서열번호 108의 1-249번 위치, 서열번호 109의 1-249번 위치, 서열번호 110의 1-249번 위치, 서열번호 112의 1-399번 위치, 서열번호 114의 1-399번 위치, 서열번호 116의 1-399번 위치, 서열번호 118의 1-399번 위치, 서열번호 120의 1-399번 위치, 서열번호 122의 1-399번 위치, 서열번호 124의 1-399번 위치, 서열번호 126의 1-399번 위치, 서열번호 128의 231-629번 위치, 서열번호 130의 63-461번 위치, 서열번호 132의 289-687번 위치, 서열번호 134의 289-687번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열을 포함할 수 있다.
면역치료 조성물, HBV 항원, 융합 단백질, 또는 상기 조성물, HBV 항원 또는 융합 단백질의 사용에 관한 임의 구현예를 비롯하여, 본원에 기술된 본 발명에 대한 임의의 구현예들에 있어서, 일 측면에서, HBV 항원으로서, 또는 융합 단백질에, 또는 본 발명의 면역치료 조성물에 유용한 HBV 중합효소 항원의 아미노산은, 비제한적인 예로서, 서열번호 2의 383-602번 위치, 서열번호 6의 381-600번 위치, 서열번호 10의 381-600번 위치, 서열번호 10의 453-680번 위치, 서열번호 14의 370-589번 위치, 서열번호 18의 380-599번 위치, 서열번호 22의 381-600번 위치, 서열번호 26의 380-599번 위치, 서열번호 30의 381-600번 위치, 서열번호 36의 260-604번 위치, 서열번호 38의 7-351번 위치, 서열번호 40의 7-351번 위치, 서열번호 41의 260-604번 위치, 서열번호 92의 346-690번 위치, 서열번호 94의 90-434번 위치, 서열번호 98, 서열번호 101의 339-566번 위치, 서열번호 102의 255-482번 위치, 서열번호 107의 250-477번 위치, 서열번호 108의 250-477번 위치, 서열번호 109의 250-477번 위치, 서열번호 110의 250-477번 위치, 서열번호 120의 582-809번 위치, 서열번호 124의 582-809번 위치, 서열번호 126의 642-869번 위치, 서열번호 128의 1-228번 위치, 서열번호 132의 1-228번 위치, 서열번호 134의 61-288번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열을 포함할 수 있다.
면역치료 조성물, HBV 항원, 융합 단백질, 또는 상기 조성물, HBV 항원 또는 융합 단백질의 사용에 관한 임의 구현예를 비롯하여, 본원에 기술된 본 발명에 대한 임의의 구현예들에 있어서, 일 측면에서, HBV 항원으로서, 또는 융합 단백질에, 또는 본 발명의 면역치료 조성물에 유용한 HBV 코어 항원의 아미노산은, 비제한적인 예로서, 서열번호 1의 31-212번 위치, 서열번호 5의 31-212번 위치, 서열번호 9의 31-212번 위치, 서열번호 9의 37-188번 위치, 서열번호 13의 31-212번 위치, 서열번호 17의 31-212번 위치, 서열번호 21의 31-212번 위치, 서열번호 25의 14-194번 위치, 서열번호 29의 31-212번 위치, 서열번호 34의 408-589번 위치, 서열번호 36의 605-786번 위치, 서열번호 38의 352-533번 위치, 서열번호 39의 160-341번 위치, 서열번호 41의 605-786번 위치, 서열번호 92의 691-872번 위치, 서열번호 95의 90-271번 위치, 서열번호 99, 서열번호 101의 567-718번 위치, 서열번호 102의 483-634번 위치, 서열번호 105의 2-183번 위치, 서열번호 105의 184-395번 위치, 서열번호 105의 396-578번 위치, 서열번호 105의 579-761번 위치, 서열번호 106의 2-183번 위치, 서열번호 106의 338-520번 위치, 서열번호 107의 478-629번 위치, 서열번호 108의 478-629번 위치, 서열번호 109의 478-629번 위치, 서열번호 110의 478-629번 위치, 서열번호 112의 400-581번 위치, 서열번호 114의 400-581번 위치, 서열번호 116의 400-581번 위치, 서열번호 118의 400-581번 위치, 서열번호 120의 400-581번 위치, 서열번호 122의 400-581번 위치, 서열번호 124의 400-581번 위치, 서열번호 126의 400-581번 위치, 서열번호 128의 630-811번 위치, 서열번호 130의 462-643번 위치, 서열번호 132의 688-869번 위치, 서열번호 134의 688-869번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열을 포함할 수 있다.
면역치료 조성물, HBV 항원, 융합 단백질, 또는 상기 조성물, HBV 항원 또는 융합 단백질의 사용에 관한 임의 구현예를 비롯하여, 본원에 기술된 본 발명에 대한 임의의 구현예들에 있어서, 일 측면에서, HBV 항원으로서, 또는 융합 단백질에, 또는 본 발명의 면역치료 조성물에 유용한 HBV X 항원의 아미노산은, 비제한적인 예로서, 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 12의 2-154번 위치, 서열번호 16, 서열번호 20, 서열번호 24, 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 4의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 8의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 12의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 16의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 20의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 24의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 28의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 32의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 36의 787-939번 위치, 서열번호 39의 7-159번 위치, 서열번호 92의 873-1025번 위치, 서열번호 96의 90-242번 위치, 서열번호 100, 서열번호 101의 719-778번 위치, 서열번호 102의 635-694번 위치, 서열번호 106의 184-337번 위치, 서열번호 106의 521-674번 위치, 서열번호 107의 630-689번 위치, 서열번호 108의 630-689번 위치, 서열번호 109의 630-689번 위치, 서열번호 110의 630-689번 위치, 서열번호 122의 582-641번 위치, 서열번호 124의 810-869번 위치, 서열번호 126의 582-641번 위치, 서열번호 130의 1-60번 위치, 서열번호 132의 229-288번 위치, 서열번호 134의 1-60번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은, (a) 효모 비히클; 및 (b) (i) 전장 HBV X 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함하는 HBV X 항원; (ii) 전장 HBV 대형 표면 항원 (L)의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함하는 HBV 표면 항원; 및 (iii) 전장 HBV 코어 단백질의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함하는 HBV 코어 항원으로 구성된, HBV 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물을 포함한다. 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, 면역치료 조성물은, (a) 효모 비히클; 및 (b) (i) 전장 HBV X 항원의 52-126번 위치와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 HBV X 항원; (ii) 전장 HBV 대형 표면 항원 (L)의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 HBV 표면 항원; 및 (iii) 전장 HBV 코어 단백질의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 HBV 코어 항원으로 구성된, HBV 항원을 포함하는, 융합 단백질을 포함한다. 상기 조성물은 HBV 특이적인 면역 반응을 일으킨다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV X 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 130의 1-60번 위치, 서열번호 110의 630-689번 위치, 서열번호 122의 582-641번 위치, 서열번호 107의 630-689번 위치, 서열번호 108의 630-689번 위치, 서열번호 109의 630-689번 위치, 서열번호 4의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 8의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 12의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 16의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 20의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 24의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 28의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 32의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 100, 서열번호 101의 719-778번 위치, 서열번호 102의 635-694번 위치, 서열번호 124의 810-869번 위치, 서열번호 126의 582-641번 위치, 서열번호 132의 229-288번 위치, 서열번호 134의 1-60번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 또는 이와 일치한다. 일 측면에서, HBV X 항원의 아미노산 서열은 서열번호 130의 1-60번 위치, 서열번호 110의 630-689번 위치, 서열번호 122의 582-641번 위치, 서열번호 109의 630-689번 위치, 서열번호 108의 630-689번 위치, 서열번호 107의 630-689번 위치, 서열번호 100, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택된다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 표면 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 130의 63-461번 위치, 서열번호 118의 1-399번 위치, 서열번호 122의 1-399번 위치, 서열번호 34의 9-407번 위치, 서열번호 112의 1-399번 위치, 서열번호 114의 1-399번 위치, 서열번호 116의 1-399번 위치, 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 31, 서열번호 93의 90-488번 위치, 서열번호 120의 1-399번 위치, 서열번호 124의 1-399번 위치, 서열번호 126의 1-399번 위치, 서열번호 128의 231-629번 위치, 서열번호 132의 289-687번 위치, 서열번호 134의 289-687번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 또는 이와 일치한다. 일 측면에서, HBV 표면 항원의 아미노산 서열은 서열번호 130의 63-461번 위치, 서열번호 118의 1-399번 위치, 서열번호 122의 1-399번 위치, 서열번호 34의 9-407번 위치, 서열번호 112의 1-399번 위치, 서열번호 114의 1-399번 위치, 서열번호 116의 1-399번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택된다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 코어 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 130의 462-643번 위치, 서열번호 118의 400-581번 위치, 서열번호 122의 400-581번 위치, 서열번호 34의 408-589번 위치, 서열번호 112의 400-581번 위치, 서열번호 114의 400-581번 위치, 서열번호 116의 400-581번 위치, 서열번호 1의 31-212번 위치, 서열번호 5의 31-212번 위치, 서열번호 9의 31-212번 위치, 서열번호 13의 31-212번 위치, 서열번호 17의 31-212번 위치, 서열번호 21의 31-212번 위치, 서열번호 25의 14-194번 위치, 서열번호 29의 31-212번 위치, 서열번호 36의 605-786번 위치, 서열번호 38의 352-533번 위치, 서열번호 39의 160-341번 위치, 서열번호 41의 605-786번 위치, 서열번호 92의 691-872번 위치, 서열번호 95의 90-271번 위치, 서열번호 105의 2-183번 위치, 서열번호 105의 184-395번 위치, 서열번호 105의 396-578번 위치, 서열번호 105의 579-761번 위치, 서열번호 106의 2-183번 위치, 서열번호 106의 338-520번 위치, 서열번호 120의 400-581번 위치, 서열번호 124의 400-581번 위치, 서열번호 126의 400-581번 위치, 서열번호 128의 630-811번 위치, 서열번호 132의 688-869번 위치, 서열번호 134의 688-869번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 또는 이와 일치한다. 일 측면에서, HBV 코어 항원의 아미노산 서열은 서열번호 130의 462-643번 위치, 서열번호 118의 400-581번 위치, 서열번호 122의 400-581번 위치, 서열번호 34의 408-589번 위치, 서열번호 116의 400-581번 위치, 서열번호 112의 400-581번 위치, 서열번호 114의 400-581번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택된다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 항원은 융합 단백질에 N-말단에서 C-말단 방향으로, HBV X 항원, HBV 표면 항원, HBV 코어 항원 순서로 배치된다. 본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 항원은 융합 단백질 형태로 N-말단에서 C-말단 방향으로, HBV 표면 항원, HBV 코어 항원, HBV X 항원 순서로 배치된다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, 융합 단백질은 서열번호 130, 서열번호 122, 또는 서열번호 150으로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 또는 이와 일치하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예는, (a) 열-불활성화된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 전효모 (whole yeast); 및 (b) 상기 효모에서 발현되는 서열번호 130을 포함하는 HBV 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예는, (a) 열-불활성화된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 전효모; 및 (b) 상기 효모에서 발현되는 서열번호 150을 포함하는 HBV 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는, (a) 열-불활성화된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 전효모; 및 (b) 상기 효모에서 발현되는 서열번호 122를 포함하는 HBV 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것이다. 일 측면에서, 융합 단백질은, (1) 서열번호 37의 아미노산 서열; (2) 트레오닌-세린으로 구성된 2개의 아미노산 링커 펩타이드; (3) 서열번호 122의 아미노산 서열; 및 (4) 헥사히스티딘 펩타이드가 N-말단에서 C-말단 방향의 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 면역치료 조성물은, (a) 효모 비히클; 및 (b) (i) HBV 대형 표면 항원 (L)의 하나 이상의 면역원성 도메인과 (ii) HBV 코어 단백질 또는 HBV e-항원의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된 HBV 항원을 포함하는, 융합 단백질을 포함한다. 상기 조성물은, HBV 대형 표면 항원 (L) 및/또는 HBV 코어 단백질 또는 HBV e-항원에 대한 면역 반응 등의, HBV-특이적인 면역 반응을 일으킨다.
일 구현예에서, 본 발명은, (a) 효모 비히클; 및 (b) (i) 전장 HBV 대형 표면 항원 (L)의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 HBV 표면 항원과 (ii) 전장 HBV 코어 단백질의 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 HBV 코어 항원으로 구성된 HBV 항원을 포함하는, 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물을 포함한다. 상기 조성물은 HBV-특이적인 면역 반응을 일으킨다. 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 항원은 전장 HBV 코어 단백질 또는 HBV e-항원의 95% 이상을 포함하는 아미노산 서열과 이에 융합된 전장 HBV 대형 표면 항원 (L)의 95% 이상을 포함하는 아미노산 서열로 구성되는다. 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 항원은 전장 HBV 코어 단백질의 95% 이상을 포함하는 아미노산 서열과 이의 N-말단에 융합된 전장 HBV 대형 표면 항원 (L)의 95% 이상을 포함하는 아미노산 서열로 구성되는다. 일 측면에서, HBV 항원은 HBV 대형 표면 항원 (L)의 2 - 400번 아미노산; 및 HBV 코어 단백질과 일부의 HBV e-항원을 포함하는 HBV 프리코어 단백질의 31-212번 아미노산으로 구성된다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 표면 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 118의 1-399번 위치, 서열번호 34의 9-407번 위치, 서열번호 116의 1-399번 위치, 서열번호 112의 1-399번 위치, 서열번호 114의 1-399번 위치, 서열번호 3 또는 서열번호 3의 2-400번 위치, 서열번호 7 또는 서열번호 7의 2-400번 위치, 서열번호 11 또는 서열번호 11의 2-400번 위치, 서열번호 15 또는 서열번호 15의 2-389번 위치, 서열번호 19 또는 서열번호 19의 2-399번 위치, 서열번호 23 또는 서열번호 23의 2-400번 위치, 서열번호 27 또는 서열번호 27의 2-399번 위치, 서열번호 31 또는 서열번호 31의 2-400번 위치, 서열번호 93의 90-488번 위치, 서열번호 120의 1-399번 위치, 서열번호 122의 1-399번 위치, 서열번호 124의 1-399번 위치, 서열번호 126의 1-399번 위치, 서열번호 128의 231-629번 위치, 서열번호 130의 63-461번 위치, 서열번호 132의 289-687번 위치, 서열번호 134의 289-687번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다. 일 측면에서, HBV 표면 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 118의 1-399번 위치, 서열번호 34의 9-407번 위치, 서열번호 112의 1-399번 위치, 서열번호 114의 1-399번 위치, 서열번호 116의 1-399번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택된다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 코어 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 118의 400-581번 위치, 서열번호 34의 408-589번 위치, 서열번호 116의 400-581번 위치, 서열번호 112의 400-581번 위치, 서열번호 114의 400-581번 위치, 서열번호 1의 31-212번 위치, 서열번호 5의 31-212번 위치, 서열번호 9의 31-212번 위치, 서열번호 13의 31-212번 위치, 서열번호 17의 31-212번 위치, 서열번호 21의 31-212번 위치, 서열번호 25의 14-194번 위치, 서열번호 29의 31-212번 위치, 서열번호 36의 605-786번 위치, 서열번호 38의 352-533번 위치, 서열번호 39의 160-341번 위치, 서열번호 41의 605-786번 위치, 서열번호 92의 691-872번 위치, 서열번호 95의 90-271번 위치, 서열번호 105의 2-183번 위치, 서열번호 105의 184-395번 위치, 서열번호 105의 396-578번 위치, 서열번호 105의 579-761번 위치, 서열번호 106의 2-183번 위치, 서열번호 106의 338-520번 위치, 서열번호 120의 400-581번 위치, 서열번호 122의 400-581번 위치, 서열번호 124의 400-581번 위치, 서열번호 126의 400-581번 위치, 서열번호 128의 630-811번 위치, 서열번호 130의 462-643번 위치, 서열번호 132의 688-869번 위치, 서열번호 134의 688-869번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다. 일 측면에서, HBV 코어 항원의 아미노산 서열은 서열번호 118의 400-581번 위치, 서열번호 34의 408-589번 위치, 서열번호 116의 400-581번 위치, 서열번호 112의 400-581번 위치, 서열번호 114의 400-581번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택된다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 항원은 서열번호 34의 9-589번 아미노산 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로 구성되는다. 일 측면에서, HBV 항원은, 서열번호 118, 서열번호 116, 서열번호 34의 9-589번 위치, 서열번호 112, 서열번호 114, 또는 다른 HBV 균주에서의 해당 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 또는 이와 일치한다. 일 측면에서, HBV 항원은 전장 또는 거의 전장 HBV 대형 표면 항원 (L)과 전장 또는 거의 전장 HBV 코어 단백질로 구성된다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, 임의의 융합 단백질은 서열번호 37의 N-말단 아미노산 서열 (융합 단백질의 N-말단에 연결됨)을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 임의의 융합 단백질은 서열번호 89 또는 서열번호 90으로부터 선택되는 N-말단 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 융합 단백질은 서열번호 151의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예는, (a) 사카로마이세스 세레비지애 유래의 열-불활성화된 전효모; 및 (b) 상기 효모에 의해 발현되는 서열번호 118을 포함하는 HBV 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예는, (a) 사카로마이세스 세레비지애 유래의 열-불활성화된 전효모; 및 (b) 상기 효모에 의해 발현되는 서열번호 151을 포함하는 HBV 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는, (a) 사카로마이세스 세레비지애 유래의 열-불활성화된 전효모; 및 (b) 상기 효모에 의해 발현되는 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HBV 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은, (a) 효모 비히클; 및 (b) HBV 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물을 포함한다. HBV 항원은, (i) 전장 HBV 대형 (L), 중형 (M) 및/또는 소형 (S) 표면 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된 HBV 표면 항원; (ii) 전장 HBV 중합효소의 하나 이상의 면역원성 도메인 또는 HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인으로 구성된 HBV 중합효소 항원; (iii) 전장 HBV 코어 단백질 또는 전장 HBV e-항원의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된 HBV 코어 항원; 및 (iv) 전장 HBV X 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된 HBV X 항원으로 구성된다. 상기 조성물은 HBV-특이적인 면역 반응을 일으킨다. 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 표면 항원은 HBV 대형 표면 항원 (L)의 Pre-S1의 간세포 수용체 영역의 하나 이상의 면역원성 도메인과 HBV 소형 표면 항원 (S)의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함한다.
이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 항원은, HBV 대형 표면 항원 (L)의 Pre-S1의 전장 간세포 수용체의 95% 이상, 전장 HBV 소형 표면 항원 (S)의 95% 이상, HBV 중합효소의 역전사효소 도메인의 95% 이상, 전장 HBV 코어 단백질 또는 HBV e-항원의 95% 이상, 및 전장 X 항원의 95% 이상으로 구성된다. 일 측면에서, HBV 항원은, HBV 대형 표면 항원 (L)의 120-368번 아미노산의 95% 이상을 포함하는 HBV 대형 표면 항원 (L); HBV 중합효소의 RT 도메인의 453-680번 아미노산의 95% 이상을 포함하는 HBV 중합효소의 RT 도메인; HBV 코어 단백질의 37-188번 아미노산의 95% 이상을 포함하는 HBV 코어 단백질; 및 HBV X 항원의 52-127번 아미노산의 80% 이상을 포함하는 HBV X 항원으로 구성된다. 일 측면에서, HBV 항원은, Pre-S1의 간세포 수용체 도메인을 포함하는 HBV 대형 표면 항원 (L)의 21-47번 아미노산; HBV 소형 표면 항원 (S)을 포함하는 HBV 대형 표면 항원 (L)의 176-400번 아미노산; 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 중합효소의 247-691번 아미노산; HBV 코어 단백질과 일부의 HBV e-항원을 포함하는 HBV 프리코어 단백질의 31-212번 아미노산; 및 HBV X 항원의 2-154번 아미노산으로 구성된다. 일 측면에서, HBV 항원은, HBV 대형 표면 항원 (L)의 120-368번 아미노산과 95% 이상 동일한 아미노산 서열; HBV 중합효소의 RT 도메인의 453-680 아미노산과 95% 이상 동일한 아미노산 서열; HBV 코어 단백질의 37-188번 아미노산과 95% 이상 동일한 아미노산 서열; 및 HBV X 항원의 52-127번 아미노산과 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 구성되는다. 일 측면에서, HBV 항원은 표 5에 기술된 하나 이상의 T 세포 에피토프 세트를 병합하도록 변형된 것이며, 본원에서 서열번호 42 내지 88 또는 서열번호 135-140으로 표시된다. 일 측면에서, HBV 대형 표면 항원 (L)은 서열번호 97의 아미노산 서열 또는 서열번호 97과 95% 동일한 서열을 포함한다. 일 측면에서, HBV 중합효소의 RT 도메인은 서열번호 98의 아미노산 서열 또는 서열번호 98과 95% 동일한 서열을 포함한다. 일 측면에서, HBV 코어 단백질은 서열번호 99의 아미노산 서열 또는 서열번호 99와 95% 동일한 서열을 포함한다. 일 측면에서, HBV X 항원은 서열번호 100의 아미노산 서열 또는 서열번호 100과 95% 동일한 서열을 포함한다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 표면 항원의 아미노산 서열은 전장 HBV 대형 표면 항원 (L)의 아미노산 서열과 95% 이상 동일하다. 일 측면에서, HBV 표면 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 124의 1-399번 위치, 서열번호 126의 1-399번 위치, 서열번호 132의 289-687번 위치, 서열번호 134의 289-687번 위치, 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 31, 서열번호 34의 9-407번 위치, 서열번호 93의 90-488번 위치, 서열번호 112의 1-399번 위치, 서열번호 114의 1-399번 위치, 서열번호 116의 1-399번 위치, 서열번호 118의 1-399번 위치, 서열번호 120의 1-399번 위치, 서열번호 122의 1-399번 위치, 서열번호 128의 231-629번 위치, 서열번호 130의 63-461번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 표면 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 97, 서열번호 107의 1-249번 위치, 서열번호 108의 1-249번 위치, 서열번호 109의 1-249번 위치, 서열번호 110의 1-249번 위치, 서열번호 11의 21-47번 위치, 서열번호 11의 176-400번 위치, 서열번호 36의 6-257번 위치, 서열번호 41의 6-257번 위치, 서열번호 92의 92-343번 위치, 서열번호 101의 90-338번 위치, 서열번호 102의 7-254번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 중합효소 항원은, HBV 중합효소의 RT 도메인의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된다. 일 측면에서, 상기 HBV 중합효소 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 98, 서열번호 124의 582-809번 위치, 서열번호 126의 642-869번 위치, 서열번호 132의 1-228번 위치, 서열번호 134의 61-288번 위치, 서열번호 107의 250-477번 위치, 서열번호 108의 250-477번 위치, 서열번호 109의 250-477번 위치, 서열번호 110의 250-477번 위치, 서열번호 2의 383-602번 위치, 서열번호 6의 381-600번 위치, 서열번호 10의 381-600번 위치, 서열번호 10의 453-680번 위치, 서열번호 14의 370-589번 위치, 서열번호 18의 380-599번 위치, 서열번호 22의 381-600번 위치, 서열번호 26의 380-599번 위치, 서열번호 30의 381-600번 위치, 서열번호 36의 260-604번 위치, 서열번호 38의 7-351번 위치, 서열번호 40의 7-351번 위치, 서열번호 41의 260-604번 위치, 서열번호 92의 346-690번 위치, 서열번호 94의 90-434번 위치, 서열번호 101의 339-566번 위치, 서열번호 102의 255-482번 위치, 서열번호 120의 582-809번 위치, 서열번호 128의 1-228번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 코어 항원의 아미노산 서열은 전장 HBV 코어 단백질의 아미노산 서열과 95% 이상 동일하다. 일 측면에서, HBV 코어 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 124의 400-581번 위치, 서열번호 126의 400-581번 위치, 서열번호 132의 688-869번 위치, 서열번호 134의 688-869번 위치, 서열번호 34의 408-589번 위치, 서열번호 112의 400-581번 위치, 서열번호 114의 400-581번 위치, 서열번호 116의 400-581번 위치, 서열번호 118의 400-581번 위치, 서열번호 1의 31-212번 위치, 서열번호 5의 31-212번 위치, 서열번호 9의 31-212번 위치, 서열번호 13의 31-212번 위치, 서열번호 17의 31-212번 위치, 서열번호 21의 31-212번 위치, 서열번호 25의 14-194번 위치, 서열번호 29의 31-212번 위치, 서열번호 36의 605-786번 위치, 서열번호 38의 352-533번 위치, 서열번호 39의 160-341번 위치, 서열번호 41의 605-786번 위치, 서열번호 92의 691-872번 위치, 서열번호 95의 90-271번 위치, 서열번호 105의 2-183번 위치, 서열번호 105의 184-395번 위치, 서열번호 105의 396-578번 위치, 서열번호 105의 579-761번 위치, 서열번호 106의 2-183번 위치, 서열번호 106의 338-520번 위치, 서열번호 120의 400-581번 위치, 서열번호 122의 400-581번 위치, 서열번호 128의 630-811번 위치, 서열번호 130의 462-643번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 코어 항원의 아미노산 서열은 서열번호 99, 서열번호 9의 37-188번 위치, 서열번호 101의 567-718번 위치, 서열번호 102의 483-634번 위치, 서열번호 107의 478-629번 위치, 서열번호 108의 478-629번 위치, 서열번호 109의 478-629번 위치, 서열번호 110의 478-629번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV X 항원은 전장 HBV X 항원과 95% 이상 동일한 아미노산 서열로 구성되는다. 일 측면에서, HBV X 항원은 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 12의 2-154번 위치, 서열번호 16, 서열번호 20, 서열번호 24, 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 36의 787-939번 위치, 서열번호 39의 7-159번 위치, 서열번호 92의 873-1025번 위치, 서열번호 96의 90-242번 위치, 서열번호 106의 184-337번 위치, 서열번호 106의 521-674번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
일 측면에서, HBV X 항원은 전장 HBV X 항원의 52-126번 위치와 80% 이상 동일한 아미노산 서열로 구성되는다. 일 측면에서, HBV X 항원의 아미노산 서열은 서열번호 100, 서열번호 124의 810-869번 위치, 서열번호 126의 582-641번 위치, 서열번호 132의 229-288번 위치, 서열번호 134의 1-60번 위치, 서열번호 107의 630-689번 위치, 서열번호 108의 630-689번 위치, 서열번호 109의 630-689번 위치, 서열번호 110의 630-689번 위치, 서열번호 4의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 8의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 12의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 16의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 20의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 24의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 28의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 32의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 101의 719-778번 위치, 서열번호 102의 635-694번 위치, 서열번호 122의 582-641번 위치, 서열번호 130의 1-60번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 항원은 서열번호 36의 6-939번 위치, 서열번호 92의 92-1025번 위치, 서열번호 101의 90-778번 위치, 서열번호 102의 7-694번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 또는 이와 일치하는 아미노산 서열을 가진다.
이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, 융합 단백질은 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 124, 서열번호 126, 서열번호 132 또는 서열번호 134로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 또는 이와 일치하는 아미노산 서열을 포함하다.
임의의 융합 단백질은, 일 측면에서, 서열번호 37, 서열번호 89, 또는 서열번호 90으로부터 선택되는 N-말단 서열을 포함할 수 있다.
이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, 융합 단백질은 서열번호 36, 서열번호 92, 서열번호 101, 또는 서열번호 102로부터 선택되는 아미노산 서열과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 또는 이와 일치하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는, (a) 효모 비히클; 및 (b) (i) HBV 대형 표면 항원 (L)의 Pre-S1의 간세포 수용체 영역의 하나 이상의 면역원성 도메인과 HBV 소형 표면 항원 (S)의 하나 이상의 면역원성 도메인 (S)으로 구성된 HBV 표면 항원; (ii) HBV 중합효소의 역전사효소 도메인의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된 HBV 중합효소 항원; 및 (iii) HBV 코어 단백질의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된 HBV 코어 항원으로 구성된, HBV 항원을 포함하는, 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 HBV-특이적인 면역 반응을 일으킨다. 일 측면에서, HBV 항원은 HBV 대형 표면 항원 (L)의 Pre-S1의 전장 간세포 수용체의 95% 이상, 전장 HBV 소형 표면 항원의 95% 이상, HBV 중합효소의 전장 역전사효소 도메인의 95% 이상, 및 전장 HBV 코어 단백질의 95% 이상으로 구성된다. 일 측면에서, HBV 항원은 전장 HBV 대형 표면 항원 (L)의 95% 이상, HBV 중합효소의 전장 역전사효소 도메인의 95% 이상 및 전장 HBV 코어 단백질의 95% 이상으로 구성된다.
이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 표면 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 120의 1-399번 위치, 서열번호 128의 231-629번 위치, 서열번호 112의 1-399번 위치, 서열번호 114의 1-399번 위치, 서열번호 116의 1-399번 위치, 서열번호 118의 1-399번 위치, 서열번호 41의 6-257번 위치, 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 11의 21-47번 위치, 서열번호 11의 176-400번 위치, 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 31, 서열번호 34의 9-407번 위치, 서열번호 36의 6-257번 위치, 서열번호 92의 92-343번 위치, 서열번호 93의 90-488번 위치, 서열번호 97, 서열번호 101의 90-338번 위치, 서열번호 102의 7-254번 위치, 서열번호 107의 1-249번 위치, 서열번호 108의 1-249번 위치, 서열번호 109의 1-249번 위치, 서열번호 110의 1-249번 위치, 서열번호 122의 1-399번 위치, 서열번호 124의 1-399번 위치, 서열번호 126의 1-399번 위치, 서열번호 130의 63-461번 위치, 서열번호 132의 289-687번 위치, 서열번호 134의 289-687번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 중합효소 항원의 아미노산 서열은 서열번호 120의 582-809번 위치, 서열번호 128의 1-228번 위치, 서열번호 107의 250-477번 위치, 서열번호 108의 250-477번 위치, 서열번호 109의 250-477번 위치, 서열번호 110의 250-477번 위치, 서열번호 41의 260-604번 위치, 서열번호 2의 383-602번 위치, 서열번호 6의 381-600번 위치, 서열번호 10의 381-600번 위치, 서열번호 10의 453-680번 위치, 서열번호 14의 370-589번 위치, 서열번호 18의 380-599번 위치, 서열번호 22의 381-600번 위치, 서열번호 26의 380-599번 위치, 서열번호 30의 381-600번 위치, 서열번호 36의 260-604번 위치, 서열번호 38의 7-351번 위치, 서열번호 40의 7-351번 위치, 서열번호 92의 346-690번 위치, 서열번호 94의 90-434번 위치, 서열번호 98, 서열번호 101의 339-566번 위치, 서열번호 102의 255-482번 위치, 서열번호 124의 582-809번 위치, 서열번호 126의 642-869번 위치, 서열번호 132의 1-228번 위치, 서열번호 134의 61-288번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 코어 항원의 아미노산 서열은 서열번호 120의 400-581번 위치, 서열번호 128의 630-811번 위치, 서열번호 112의 400-581번 위치, 서열번호 114의 400-581번 위치, 서열번호 116의 400-581번 위치, 서열번호 118의 400-581번 위치, 서열번호 41의 605-786번 위치, 서열번호 1의 31-212번 위치, 서열번호 5의 31-212번 위치, 서열번호 9의 31-212번 위치, 서열번호 9의 37-188번 위치, 서열번호 13의 31-212번 위치, 서열번호 17의 31-212번 위치, 서열번호 21의 31-212번 위치, 서열번호 25의 14-194번 위치, 서열번호 29의 31-212번 위치, 서열번호 34의 408-589번 위치, 서열번호 36의 605-786번 위치, 서열번호 38의 352-533번 위치, 서열번호 39의 160-341번 위치, 서열번호 92의 691-872번 위치, 서열번호 95의 90-271번 위치, 서열번호 99, 서열번호 101의 567-718번 위치, 서열번호 102의 483-634번 위치, 서열번호 105의 2-183번 위치, 서열번호 105의 184-395번 위치, 서열번호 105의 396-578번 위치, 서열번호 105의 579-761번 위치, 서열번호 106의 2-183번 위치, 서열번호 106의 338-520번 위치, 서열번호 107의 478-629번 위치, 서열번호 108의 478-629번 위치, 서열번호 109의 478-629번 위치, 서열번호 110의 478-629번 위치, 서열번호 122의 400-581번 위치, 서열번호 124의 400-581번 위치, 서열번호 126의 400-581번 위치, 서열번호 130의 462-643번 위치, 서열번호 132의 688-869번 위치, 서열번호 134의 688-869번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, 융합 단백질은 서열번호 120, 서열번호 128, 서열번호 41의 6-786번 위치, 또는 서열번호 41, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 또는 이와 일치하는 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 다른 구현예는, (a) 효모 비히클; 및 (b) (i) HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된 HBV 중합효소 항원과 (ii) HBV 코어 단백질의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된 HBV 코어 항원으로 구성된, HBV 항원을 포함하는, 융합 단백질에 관한 것이다. 상기 조성물은 HBV-특이적인 면역 반응을 일으킨다. 본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 항원은 HBV 중합효소의 전장 RT 도메인과 95% 이상 동일한 아미노산 서열과 전장 HBV 코어 단백질과 95% 이상 동일한 아미노산 서열로 구성되는다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 중합효소 항원의 아미노산 서열은 서열번호 38의 7-351번 위치, 서열번호 2의 383-602번 위치, 서열번호 6의 381-600번 위치, 서열번호 10의 381-600번 위치, 서열번호 10의 453-680번 위치, 서열번호 14의 370-589번 위치, 서열번호 18의 380-599번 위치, 서열번호 22의 381-600번 위치, 서열번호 26의 380-599번 위치, 서열번호 30의 381-600번 위치, 서열번호 36의 260-604번 위치, 서열번호 40의 7-351번 위치, 서열번호 41의 260-604번 위치, 서열번호 92의 346-690번 위치, 서열번호 94의 90-434번 위치, 서열번호 98, 서열번호 101의 339-566번 위치, 서열번호 102의 255-482번 위치, 서열번호 107의 250-477번 위치, 서열번호 108의 250-477번 위치, 서열번호 109의 250-477번 위치, 서열번호 110의 250-477번 위치, 서열번호 120의 582-809번 위치, 서열번호 124의 582-809번 위치, 서열번호 126의 642-869번 위치, 서열번호 128의 1-228번 위치, 서열번호 132의 1-228번 위치, 서열번호 134의 61-288번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 코어 항원의 아미노산 서열은 서열번호 38의 352-533번 위치, 서열번호 1의 31-212번 위치, 서열번호 5의 31-212번 위치, 서열번호 9의 31-212번 위치, 서열번호 9의 37-188번 위치, 서열번호 13의 31-212번 위치, 서열번호 17의 31-212번 위치, 서열번호 21의 31-212번 위치, 서열번호 25의 14-194번 위치, 서열번호 29의 31-212번 위치, 서열번호 34의 408-589번 위치, 서열번호 36의 605-786번 위치, 서열번호 39의 160-341번 위치, 서열번호 41의 605-786번 위치, 서열번호 92의 691-872번 위치, 서열번호 95의 90-271번 위치, 서열번호 99, 서열번호 101의 567-718번 위치, 서열번호 102의 483-634번 위치, 서열번호 105의 2-183번 위치, 서열번호 105의 184-395번 위치, 서열번호 105의 396-578번 위치, 서열번호 105의 579-761번 위치, 서열번호 106의 2-183번 위치, 서열번호 106의 338-520번 위치, 서열번호 107의 478-629번 위치, 서열번호 108의 478-629번 위치, 서열번호 109의 478-629번 위치, 서열번호 110의 478-629번 위치, 서열번호 112의 400-581번 위치, 서열번호 114의 400-581번 위치, 서열번호 116의 400-581번 위치, 서열번호 118의 400-581번 위치, 서열번호 120의 400-581번 위치, 서열번호 122의 400-581번 위치, 서열번호 124의 400-581번 위치, 서열번호 126의 400-581번 위치, 서열번호 128의 630-811번 위치, 서열번호 130의 462-643번 위치, 서열번호 132의 688-869번 위치, 서열번호 134의 688-869번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, 융합 단백질은, 서열번호 38의 아미노산 서열, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 또는 이와 일치한 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 또 다른 구현예는, (a) 효모 비히클; 및 (b) HBV 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 면역치료 조성물로서, 상기 HBV 항원이 (i) HBV X 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된 HBV X 항원과 (ii) HBV 코어 단백질의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된 HBV 코어 항원으로 구성된 것인, 면역치료 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 HBV-특이적인 면역 반응을 일으킨다. 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 항원은 전장 HBV X 항원과 95% 이상 동일한 아미노산 서열과 전장 HBV 코어 단백질과 95% 이상 동일한 아미노산 서열로 구성되는다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 코어 항원의 아미노산 서열은 서열번호 39의 160-341번 위치, 서열번호 1의 31-212번 위치, 서열번호 5의 31-212번 위치, 서열번호 9의 31-212번 위치, 서열번호 9의 37-188번 위치, 서열번호 13의 31-212번 위치, 서열번호 17의 31-212번 위치, 서열번호 21의 31-212번 위치, 서열번호 25의 14-194번 위치, 서열번호 29의 31-212번 위치, 서열번호 34의 408-589번 위치, 서열번호 36의 605-786번 위치, 서열번호 38의 352-533번 위치, 서열번호 41의 605-786번 위치, 서열번호 92의 691-872번 위치, 서열번호 95의 90-271번 위치, 서열번호 99, 서열번호 101의 567-718번 위치, 서열번호 102의 483-634번 위치, 서열번호 105의 2-183번 위치, 서열번호 105의 184-395번 위치, 서열번호 105의 396-578번 위치, 서열번호 105의 579-761번 위치, 서열번호 106의 2-183번 위치, 서열번호 106의 338-520번 위치, 서열번호 107의 478-629번 위치, 서열번호 108의 478-629번 위치, 서열번호 109의 478-629번 위치, 서열번호 110의 478-629번 위치, 서열번호 112의 400-581번 위치, 서열번호 114의 400-581번 위치, 서열번호 116의 400-581번 위치, 서열번호 118의 400-581번 위치, 서열번호 120의 400-581번 위치, 서열번호 122의 400-581번 위치, 서열번호 124의 400-581번 위치, 서열번호 126의 400-581번 위치, 서열번호 128의 630-811번 위치, 서열번호 130의 462-643번 위치, 서열번호 132의 688-869번 위치, 서열번호 134의 688-869번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV X 항원의 아미노산 서열은 서열번호 39의 7-159번 위치, 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 12의 2-154번 위치, 서열번호 16, 서열번호 20, 서열번호 24, 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 4의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 8의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 12의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 16의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 20의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 24의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 28의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 32의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 36의 787-939번 위치, 서열번호 92의 873-1025번 위치, 서열번호 96의 90-242번 위치, 서열번호 100, 서열번호 101의 719-778번 위치, 서열번호 102의 635-694번 위치, 서열번호 106의 184-337번 위치, 서열번호 106의 521-674번 위치, 서열번호 107의 630-689번 위치, 서열번호 108의 630-689번 위치, 서열번호 109의 630-689번 위치, 서열번호 110의 630-689번 위치, 서열번호 122의 582-641번 위치, 서열번호 124의 810-869번 위치, 서열번호 126의 582-641번 위치, 서열번호 130의 1-60번 위치, 서열번호 132의 229-288번 위치, 서열번호 134의 1-60번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, 융합 단백질은, 서열번호 39의 아미노산 서열, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치하는 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 다른 구현예는, (a) 효모 비히클; 및 (b) HBV 대형 표면 항원 (L)의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된 HBV 표면 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 HBV-특이적인 면역 반응을 일으킨다. 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 표면 항원은 전장 HBV 대형 표면 항원 (L)의 95% 이상으로 구성된다. 일 측면에서, HBV 표면 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 93의 90-488번 위치, 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 11의 21-47번 위치, 서열번호 11의 176-400번 위치, 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 31, 서열번호 34의 9-407번 위치, 서열번호 36의 6-257번 위치, 서열번호 41의 6-257번 위치, 서열번호 92의 92-343번 위치, 서열번호 93의 90-488번 위치, 서열번호 97, 서열번호 101의 90-338번 위치, 서열번호 102의 7-254번 위치, 서열번호 107의 1-249번 위치, 서열번호 108의 1-249번 위치, 서열번호 109의 1-249번 위치, 서열번호 110의 1-249번 위치, 서열번호 112의 1-399번 위치, 서열번호 114의 1-399번 위치, 서열번호 116의 1-399번 위치, 서열번호 118의 1-399번 위치, 서열번호 120의 1-399번 위치, 서열번호 122의 1-399번 위치, 서열번호 124의 1-399번 위치, 서열번호 126의 1-399번 위치, 서열번호 128의 231-629번 위치, 서열번호 130의 63-461번 위치, 서열번호 132의 289-687번 위치, 서열번호 134의 289-687번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다. 일 측면에서, 융합 단백질은, 서열번호 93의 아미노산 서열 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치하는 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 또 다른 구현예는, (a) 효모 비히클; 및 (b) HBV 중합효소의 역전사효소 도메인의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된 HBV 중합효소 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 HBV-특이적인 면역 반응을 일으킨다. 본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 중합효소 항원은 HBV 중합효소의 전장 역전사효소 도메인의 95% 이상으로 구성된다. 일 측면에서, HBV 중합효소 항원의 아미노산 서열은 서열번호 40의 7-351번 위치, 서열번호 94의 90-434번 위치, 서열번호 2의 383-602번 위치, 서열번호 6의 381-600번 위치, 서열번호 10의 381-600번 위치, 서열번호 10의 453-680번 위치, 서열번호 14의 370-589번 위치, 서열번호 18의 380-599번 위치, 서열번호 22의 381-600번 위치, 서열번호 26의 380-599번 위치, 서열번호 30의 381-600번 위치, 서열번호 36의 260-604번 위치, 서열번호 38의 7-351번 위치, 서열번호 41의 260-604번 위치, 서열번호 92의 346-690번 위치, 서열번호 98, 서열번호 101의 339-566번 위치, 서열번호 102의 255-482번 위치, 서열번호 107의 250-477번 위치, 서열번호 108의 250-477번 위치, 서열번호 109의 250-477번 위치, 서열번호 110의 250-477번 위치, 서열번호 120의 582-809번 위치, 서열번호 124의 582-809번 위치, 서열번호 126의 642-869번 위치, 서열번호 128의 1-228번 위치, 서열번호 132의 1-228번 위치, 서열번호 134의 61-288번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다. 일 측면에서, 융합 단백질은 서열번호 40 또는 서열번호 94의 아미노산 서열 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치하는 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 다른 구현예는, (a) 효모 비히클; 및 (b) HBV 코어 단백질의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된 HBV 코어 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 면역치료 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 HBV-특이적인 면역 반응을 일으킨다. 본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, HBV 항원은 전장 HBV 코어 단백질의 95% 이상으로 구성된다. 일 측면에서, HBV 코어 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 95의 90-271번 위치, 서열번호 1의 31-212번 위치, 서열번호 5의 31-212번 위치, 서열번호 9의 31-212번 위치, 서열번호 9의 37-188번 위치, 서열번호 13의 31-212번 위치, 서열번호 17의 31-212번 위치, 서열번호 21의 31-212번 위치, 서열번호 25의 14-194번 위치, 서열번호 29의 31-212번 위치, 서열번호 34의 408-589번 위치, 서열번호 36의 605-786번 위치, 서열번호 38의 352-533번 위치, 서열번호 39의 160-341번 위치, 서열번호 41의 605-786번 위치, 서열번호 92의 691-872번 위치, 서열번호 99, 서열번호 101의 567-718번 위치, 서열번호 102의 483-634번 위치, 서열번호 105의 2-183번 위치, 서열번호 105의 184-395번 위치, 서열번호 105의 396-578번 위치, 서열번호 105의 579-761번 위치, 서열번호 106의 2-183번 위치, 서열번호 106의 338-520번 위치, 서열번호 107의 478-629번 위치, 서열번호 108의 478-629번 위치, 서열번호 109의 478-629번 위치, 서열번호 110의 478-629번 위치, 서열번호 112의 400-581번 위치, 서열번호 114의 400-581번 위치, 서열번호 116의 400-581번 위치, 서열번호 118의 400-581번 위치, 서열번호 120의 400-581번 위치, 서열번호 122의 400-581번 위치, 서열번호 124의 400-581번 위치, 서열번호 126의 400-581번 위치, 서열번호 128의 630-811번 위치, 서열번호 130의 462-643번 위치, 서열번호 132의 688-869번 위치, 서열번호 134의 688-869번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다. 일 측면에서, 상기 단백질은 서열번호 95의 아미노산 서열 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치하는 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 다른 구현예는, (a) 효모 비히클; 및 (b) 전장 HBV X 항원의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된 HBV X 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 HBV-특이적인 면역 반응을 일으킨다. 일 측면에서, HBV 항원은 전장 HBV X 항원의 95% 이상으로 구성된다. 일 측면에서, HBV X 항원의 아미노산 서열은 서열번호 96의 90-242번 위치, 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 12의 2-154번 위치, 서열번호 16, 서열번호 20, 서열번호 24, 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 4의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 8의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 12의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 16의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 20의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 24의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 28의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 32의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 36의 787-939번 위치, 서열번호 39의 7-159번 위치, 서열번호 92의 873-1025번 위치, 서열번호 100, 서열번호 101의 719-778번 위치, 서열번호 102의 635-694번 위치, 서열번호 106의 184-337번 위치, 서열번호 106의 521-674번 위치, 서열번호 107의 630-689번 위치, 서열번호 108의 630-689번 위치, 서열번호 109의 630-689번 위치, 서열번호 110의 630-689번 위치, 서열번호 122의 582-641번 위치, 서열번호 124의 810-869번 위치, 서열번호 126의 582-641번 위치, 서열번호 130의 1-60번 위치, 서열번호 132의 229-288번 위치, 서열번호 134의 1-60번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다. 일 측면에서, 상기 단백질은, 서열번호 96의 아미노산 서열 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열과 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치하는, 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 다른 구현예는 전술한 또는 본원의 도처에 기술된 임의의 1, 2, 3 또는 4종의 면역치료 조성물, 특히 단일 HBV 단백질에 대한 전술한 임의의 1, 2, 3 또는 4종의 면역치료 조성물을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는, (a) 효모 비히클; 및 (b) HBV 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것으로서, 상기 HBV 항원은 2, 3 또는 4종의 HBV 표면 항원 단백질들의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성되며, 상기 각각의 HBV 표면 항원 단백질은 상이한 HBV 유전자형으로부터 유래한다. 상기 조성물은 HBV-특이적인 면역 반응을 일으킨다.
본 발명의 또 다른 구현예는, (a) 효모 비히클; 및 (b) HBV 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것으로서, 상기 HBV 항원은 2, 3 또는 4종의 HBV 중합효소 단백질들의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성되며, 상기 각각의 HBV 중합효소 단백질은 상이한 HBV 유전자형으로부터 유래한다. 상기 조성물은 HBV-특이적인 면역 반응을 일으킨다.
본 발명의 또 다른 구현예는, (a) 효모 비히클; 및 (b) HBV 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것으로서, 상기 HBV 항원은 2, 3 또는 4종의 HBV X 항원들의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성되며, 상기 각각의 HBV X 항원은 상이한 HBV 유전자형으로부터 유래한다. 상기 조성물은 HBV-특이적인 면역 반응을 일으킨다.
본 발명의 또 다른 구현예는, (a) 효모 비히클; 및 (b) HBV 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것으로서, 상기 HBV 항원은 2, 3 또는 4종의 HBV 코어 단백질들의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성되며, 상기 각각의 HBV 코어 단백질은 상이한 HBV 유전자형으로부터 유래한다. 상기 조성물은 HBV-특이적인 면역 반응을 일으킨다. 일 측면에서, 각각의 HBV 코어 단백질은 전장 HBV 코어 단백질의 95% 이상으로 구성된다. 일 측면에서, 각각의 HBV 코어 단백질은 HBV 코어 단백질의 31-212번 아미노산으로 구성된다. 일 측면에서, HBV 유전자형은 유전자형 C를 포함하며, 일 측면에서, HBV 유전자형은 유전자형 D를 포함하며, 일 측면에서, HBV 유전자형은 유전자형 A를 포함하며, 일 측면에서, HBV 유전자형은 유전자형 B이다. 일 측면에서, 각각의 HBV 코어 단백질은 HBV 코어 단백질의 37-188번 아미노산으로 구성된다. 일 측면에서, 융합 단백질은 유전자형 A, 유전자형 B, 유전자형 C 및 유전자형 D로부터 유래된 4가지 HBV 코어 단백질을 포함한다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, 임의의 하나 이상의 HBV 코어 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 95의 90-271번 위치, 서열번호 1의 31-212번 위치, 서열번호 5의 31-212번 위치, 서열번호 9의 31-212번 위치, 서열번호 9의 37-188번 위치, 서열번호 13의 31-212번 위치, 서열번호 17의 31-212번 위치, 서열번호 21의 31-212번 위치, 서열번호 25의 14-194번 위치, 서열번호 29의 31-212번 위치, 서열번호 34의 408-589번 위치, 서열번호 36의 605-786번 위치, 서열번호 38의 352-533번 위치, 서열번호 39의 160-341번 위치, 서열번호 41의 605-786번 위치, 서열번호 92의 691-872번 위치, 서열번호 99, 서열번호 101의 567-718번 위치, 서열번호 102의 483-634번 위치, 서열번호 105의 2-183번 위치, 서열번호 105의 184-395번 위치, 서열번호 105의 396-578번 위치, 서열번호 105의 579-761번 위치, 서열번호 106의 2-183번 위치, 서열번호 106의 338-520번 위치, 서열번호 107의 478-629번 위치, 서열번호 108의 478-629번 위치, 서열번호 109의 478-629번 위치, 서열번호 110의 478-629번 위치, 서열번호 112의 400-581번 위치, 서열번호 114의 400-581번 위치, 서열번호 116의 400-581번 위치, 서열번호 118의 400-581번 위치, 서열번호 120의 400-581번 위치, 서열번호 122의 400-581번 위치, 서열번호 124의 400-581번 위치, 서열번호 126의 400-581번 위치, 서열번호 128의 630-811번 위치, 서열번호 130의 462-643번 위치, 서열번호 132의 688-869번 위치, 서열번호 134의 688-869번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다. 일 측면에서, HBV 항원은, 서열번호 105의 아미노산 서열 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 또는 이와 일치한 아미노산 서열을 가진다.
본 발명의 또 다른 구현예는, (a) 효모 비히클; 및 (b) 2 이상의 HBV 코어 단백질들과 2 이상의 HBV X 항원들을 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 면역치료 조성물에 관한 것으로서, 상기 각각의 HBV 코어 단백질은 상이한 HBV 유전자형으로부터 유래하며, 상기 각각의 HBV X 항원은 상이한 HBV 유전자형으로부터 유래한다. 상기 조성물은 HBV-특이적인 면역 반응을 일으킨다. 일 측면에서, HBV 유전자형은 유전자형 C를 포함하며; 일 측면에서, HBV 유전자형은 유전자형 D를 포함하며; 일 측면에서, HBV 유전자형은 유전자형 A를 포함하며; 일 측면에서, HBV 유전자형은 유전자형 B를 포함한다. 일 측면에서, 각각의 HBV 코어 단백질은 전장 HBV 코어 단백질의 95% 이상으로 구성된다. 일 측면에서, 각각의 HBV 코어 단백질은 HBV 코어 단백질의 31-212번 아미노산을 포함한다. 일 측면에서, 각각의 HBV 코어 단백질은 HBV 코어 단백질의 37-188번 아미노산을 포함한다. 일 측면에서, 각각의 HBV X 항원은 전장 HBV X 항원의 95% 이상을 포함한다. 일 측면에서, 각각의 HBV X 항원은 HBV X 항원의 52-127번 아미노산을 포함한다.
일 측면에서, HBV 코어 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 95의 90-271번 위치, 서열번호 1의 31-212번 위치, 서열번호 5의 31-212번 위치, 서열번호 9의 31-212번 위치, 서열번호 9의 37-188번 위치, 서열번호 13의 31-212번 위치, 서열번호 17의 31-212번 위치, 서열번호 21의 31-212번 위치, 서열번호 25의 14-194번 위치, 서열번호 29의 31-212번 위치, 서열번호 34의 408-589번 위치, 서열번호 36의 605-786번 위치, 서열번호 38의 352-533번 위치, 서열번호 39의 160-341번 위치, 서열번호 41의 605-786번 위치, 서열번호 92의 691-872번 위치, 서열번호 99, 서열번호 101의 567-718번 위치, 서열번호 102의 483-634번 위치, 서열번호 105의 2-183번 위치, 서열번호 105의 184-395번 위치, 서열번호 105의 396-578번 위치, 서열번호 105의 579-761번 위치, 서열번호 106의 2-183번 위치, 서열번호 106의 338-520번 위치, 서열번호 107의 478-629번 위치, 서열번호 108의 478-629번 위치, 서열번호 109의 478-629번 위치, 서열번호 110의 478-629번 위치, 서열번호 112의 400-581번 위치, 서열번호 114의 400-581번 위치, 서열번호 116의 400-581번 위치, 서열번호 118의 400-581번 위치, 서열번호 120의 400-581번 위치, 서열번호 122의 400-581번 위치, 서열번호 124의 400-581번 위치, 서열번호 126의 400-581번 위치, 서열번호 128의 630-811번 위치, 서열번호 130의 462-643번 위치, 서열번호 132의 688-869번 위치, 서열번호 134의 688-869번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
일 측면에서, HBV X 항원의 아미노산 서열은, 서열번호 96의 90-242번 위치, 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 12의 2-154번 위치, 서열번호 16, 서열번호 20, 서열번호 24, 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 4의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 8의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 12의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 16의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 20의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 24의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 28의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 32의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 36의 787-939번 위치, 서열번호 39의 7-159번 위치, 서열번호 92의 873-1025번 위치, 서열번호 100, 서열번호 101의 719-778번 위치, 서열번호 102의 635-694번 위치, 서열번호 106의 184-337번 위치, 서열번호 106의 521-674번 위치, 서열번호 107의 630-689번 위치, 서열번호 108의 630-689번 위치, 서열번호 109의 630-689번 위치, 서열번호 110의 630-689번 위치, 서열번호 122의 582-641번 위치, 서열번호 124의 810-869번 위치, 서열번호 126의 582-641번 위치, 서열번호 130의 1-60번 위치, 서열번호 132의 229-288번 위치, 서열번호 134의 1-60번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 이와 일치한다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, 융합 단백질은, 서열번호 106의 아미노산 서열 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 또는 이와 일치한 아미노산 서열을 가진다.
융합 단백질, HBV 항원, 또는 상기한 융합 단백질 또는 HBV 항원을 포함하는 면역치료 조성물에 관한, 전술한, 그리고 후술한 본원에 기술된 임의 구현예들에 있어서, 다른 일 구현예에서, 융합 단백질은 추가적인 서열을 추가하도록 N-말단에서 부가될 수 있다. 일 측면에서, N-말단 서열은 서열번호 37과 95% 동일한 아미노산 서열, 서열번호 89와 95% 동일한 아미노산 서열 또는 서열번호 90과 95% 동일한 아미노산 서열로부터 선택된다. 일 측면에서, N-말단 서열은 서열번호 37, 서열번호 37의 1-5번 위치, 서열번호 89, 또는 서열번호 90, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열로부터 선택된다.
전술한 또는 본원의 도처에 기술된 본 발명의 임의 구현예에 대한 일 측면에서, 융합 단백질은 효모 비히클에 의해 발현된다. 전술한 또는 본원의 도처에 기술된 본 발명의 임의 구현예에 대한 다른 측면에서, 상기 효모 비히클은 전효모 (whole yeast)이다. 상기 전효모는, 일 측면에서, 사멸된다. 일 측면에서, 상기 전효모는 열-불활성화된다.
전술한 또는 본원의 도처에 기술된 본 발명의 임의 구현예에 대한 일측면에서, 효모 비히클은 사카로마이세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 크립토코커스(Cryptococcus), 산세뉼라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 로도토룰라(Rhodotorula), 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 및 야로이와(Yarrowia)로부터 선택되는 효모 속 유래일 수 있다. 일 측면에서, 효모 비히클은 사카로마이세스로부터 유래된다. 일 측면에서, 효모 비히클은 사카로마이세스 세레비지애 유래이다.
전술한 또는 본원의 도처에 기술된 본 발명의 임의 구현예에 대한 일 측면에서, 상기 조성물은 개체 또는 환자에게 투여하기 위해 제형화된다. 일 측면에서, 상기 조성물은 (예, 피하 또는 복막내 또는 근육내 주입 등의 비경구 경로에 의한) 개체 또는 환자의 주입에 의해 투여하기 위해 제형화된다. 일 측면에서, 상기 조성물은 인간에게 투여하기 적합한 약제학적으로 허용가능한 부형제 중에 제형화된다. 일 측면에서, 상기 조성물은 효모 단백질을 90% 이상으로 포함한다. 일 측면에서, 상기 조성물은 효모 단백질을 90% 이상으로 포함하며, 환자에게 투여하기 위해 제형화된다.
전술한 또는 본원의 도처에 기술된 본 발명의 임의 구현예에 대한 일 측면에서, 융합 단백질은 효모에서 응집(aggregate)되지 않는다. 일 측면에서, 융합 단백질은 효모에서 봉입체(inclusion body)를 형성하지 않는다. 일 측면에서, 융합 단백질은 효모에서 VLP 또는 기타 대형 항원 입자를 형성하지 않는다. 일 측면에서, 융합 단백질은 효모에서 VLP 또는 기타 대형 항원 입자를 형성한다.
전술한 또는 본원의 도처에 기술된 본 발명의 임의 구현예에 대한 일 측면에서, 일 측면에서, HBV 서열은 HBV 유전자형 A로부터 유래된다. 다른 측면에서, HBV 서열은 HBV 유전자형 B로부터 유래된다. 다른 측면에서, HBV 서열은 HBV 유전자형 C로부터 유래된다. 다른 측면에서, HBV 서열은 HBV 유전자형 D로부터 유래된다. 다른 측면에서, HBV 서열은 HBV 유전자형 E로부터 유래된다. 다른 측면에서, HBV 서열은 HBV 유전자형 F로부터 유래된다. 다른 측면에서, HBV 서열은 HBV 유전자형 G로부터 유래된다. 다른 측면에서, HBV 서열은 HBV 유전자형 H로부터 유래된다. 일 측면에서, HBV 서열은 전술한 HBV 유전자형, 또는 임의의 공지된 HBV 유전자형 또는 서브-유전자형 중 임의의 유전자형들의 조합으로부터 유래된다.
본 발명의 다른 구현예는 본 발명의 면역치료 조성물의 일부로서 전술한 또는 본원의 도처에 기술된 임의의 융합 단백질에 관한 것이다. 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, 융합 단백질은, 비제한적인 예로서, (a) HBV 대형 표면 항원 (L), HBV 코어 단백질 및 HBV X 항원으로 구성된 HBV 항원; (b) HBV 대형 표면 항원 (L) 및 HBV 코어 단백질로 구성된 HBV 항원; (c) HBV 대형 표면 항원 (L)의 Pre-S1의 간세포 수용체, HBV 소형 표면 항원 (S), HBV 중합효소의 역전사효소 도메인, HBV 코어 단백질 또는 HBV e-항원 및 HBV X 항원으로 구성된 HBV 항원; (d) HBV 대형 표면 항원 (L), HBV 중합효소의 역전사효소 도메인, HBV 코어 단백질 또는 HBV e-항원 및 HBV X 항원으로 구성된, HBV 항원; (e) HBV 대형 표면 항원 (L), HBV 중합효소의 역전사효소 도메인 및 HBV 코어 단백질로 구성된, HBV 항원; (f) HBV 중합효소 (RT 도메인) 및 HBV 코어 단백질로 구성된, HBV 항원; (g) HBV X 항원 및 HBV 코어 단백질로 구성된, HBV 항원; (h) HBV 대형 표면 항원 (L)의 Pre-S1의 간세포 수용체, HBV 소형 표면 항원 (S), HBV 중합효소의 역전사효소 도메인 및 HBV 코어 단백질 또는 HBV e-항원으로 구성된, HBV 항원; (i) HBV 대형 표면 항원 (L)으로 구성된 HBV 항원; (j) HBV 코어 항원으로 구성된 HBV 항원; (k) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 중합효소로 구성된 HBV 항원; (l) HBV X 항원으로 구성된 HBV 항원; (m) 각각 상이한 HBV 유전자형으로부터 유래된 2-4종의 HBV 표면 항원, HBV 중합효소 항원, HBV 코어 항원 또는 HBV X 항원으로 구성된, HBV 항원; 및 (n) 2종의 HBV 코어 항원과 2종의 HBV X 항원으로 구성되되, 상기 2종의 HBV 코어 항원 각각과 상기 2종의 HBV X 항원 각각이 상이한 HBV 유전자형으로부터 유래된 것인, HBV 항원으로부터 선택되는, HBV 항원을 포함한다. 이들 항원에 유용한 다양한 서열들을 비롯하여, 각각의 HBV 항원에 대한 본 발명의 측면들은, 상기에서 기술된 바 있다.
본 발명의 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, 융합 단백질은, 서열번호 130, 서열번호 150, 서열번호 118, 서열번호 151, 서열번호 34, 서열번호 120, 서열번호 122, 서열번호 124, 서열번호 126, 서열번호 128, 서열번호 132, 서열번호 134, 서열번호 112, 서열번호 114, 서열번호 116, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95, 서열번호 96, 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109 및 서열번호 110으로부터 선택되는 아미노산 서열과, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하거나, 또는 이와 일치한 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는 본원에 기술된 융합 단백질들 중 임의의 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다. 일 측면에서, 상기 재조합 핵산 분자는, 비제한적인 예로서, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 91, 서열번호 111, 서열번호 113, 서열번호 115, 서열번호 117, 서열번호 119, 서열번호 121, 서열번호 123, 서열번호 125, 서열번호 127, 서열번호 129, 서열번호 131 또는 서열번호 133으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 본원에 기술된 재조합 핵산 분자들 중 임의의 것으로 형질전환된 분리된 세포에 관한 것이다. 일 측면에서, 상기 세포는 효모 세포이다.
본 발명의 다른 구현예는 본원에 기술된 임의의 융합 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 구현예는 본원에 기술된 임의의 재조합 핵산 분자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 다른 구현예는 본원에 기술된 임의의 분리된 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는, 본원에 기술된, 임의의 HBV 항원, 융합 단백질 또는 효모 기반의 면역치료 조성물을 비롯한, 한가지 이상의 임의의 면역치료 조성물을 HBV로 감염된 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염 바이러스 (HBV) 감염 또는 HBV 감염으로 인한 한가지 이상의 증상을 개체에서 치료하는 방법에 관한 것이다. 개체로의 조성물의 투여는 개체에서 HBV 감염 또는 HBV 감염으로 인한 한가지 이상의 증상을 경감시킨다.
본 발명의 또 다른 구현예는, 본원에 기술된, 임의의 HBV 항원, 융합 단백질 또는 효모 기반의 면역치료 조성물을 비롯한, 한가지 이상의 임의의 면역치료 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, HBV 항원에 대한 항원-특이적인 세포-매개의 면역 반응을 발생시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는, 본원에 기술된, 임의의 HBV 항원, 융합 단백질 또는 효모 기반의 면역치료 조성물을 비롯한, 한가지 이상의 임의의 면역치료 조성물을 HBV로 감염된 적 없는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 HBV 감염을 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예는, 본원에 기술된, 임의의 HBV 항원, 융합 단백질 또는 효모 기반의 면역치료 조성물을 비롯한, 한가지 이상의 임의의 면역치료 조성물을 개체 집단(population of individuals)에 투여하는 단계를 포함하는, HBV에 대해 개체 집단을 면역화하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예는, HBV 감염 또는 이의 증상을 치료하는데 사용하기 위한, 본원에 기술된, 임의의 HBV 항원, 융합 단백질 또는 효모 기반의 면역치료 조성물을 비롯한, 한가지 이상의 임의의 면역치료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예는, HBV 감염 또는 이의 증상을 예방하기 위해 사용하기 위한, 본원에 기술된, 임의의 HBV 항원, 융합 단백질 또는 효모 기반의 면역치료 조성물을 비롯한, 한가지 이상의 임의의 면역치료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는, HBV 감염 또는 이의 증상을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 본원에 기술된, 임의의 HBV 항원, 융합 단백질 또는 효모 기반의 면역치료 조성물을 비롯한, 한가지 이상의 임의의 면역치료 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예는, HBV 감염 또는 이의 증상을 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 본원에 기술된, 임의의 HBV 항원, 융합 단백질 또는 효모 기반의 면역치료 조성물을 비롯한, 한가지 이상의 임의의 면역치료 조성물의 용도에 관한 것이다.
전술한 또는 본원의 도처에 기술된 본 발명의 방법 또는 용도와 관련된 임의의 구현예에 대한 일 측면에서, 상기 방법은 본원에 기술된 임의의 HBV 항원, 융합 단백질 또는 효소 기반의 면역치료 조성물 등의, 적어도 2, 3, 4종 이상의 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 일 측면에서, HBV 예방 또는 치료에 유용한 부가적인 조성물 또는 화합물 (예, 항-바이러스 화합물, 인터페론, 그외 면역치료 조성물 또는 이들의 조합)이 투여될 수 있다. 일 측면에서, 다양한 조성물 또는 화합물이 개체에게 동시에 투여된다. 일 측면에서, 다양한 조성물 또는 화합물이 개체에게 순차적으로 투여된다. 일 측면에서, 각각의 다양한 조성물이 개체의 여러 부위에 주입에 의해 투여된다. 일 측면에서, 본 발명의 효모 기반의 HBV 면역치료 조성물의 단회 투여량(single dose)은 40 Y.U. total 내지 80 Y.U. total이고, 투여 당, 개체의 다른 2 부위, 3 부위 또는 4 부위에 등분(equal part)으로 투여된다.
전술한 또는 본원의 도처에 기술된 본 발명의 방법 또는 용도와 관련된 임의의 구현예에 대한 일 측면에서, 상기 조성물의 개체로의 투여는 개체 집단에서 혈청전환을 야기하거나 또는 개체 집단에 혈청전환율을 향상시킨다. 일 측면에서, 상기 조성물의 개체로의 투여는 혈청 HBsAg를 감소시키거나, 개체에서 혈청 HBsAg의 소거를 발생시키거나, 또는 개체 집단에서 혈청 HBsAg의 소거율을 향상시킨다. 일 측면에서, 상기 조성물의 개체로의 투여는 혈청 HBeAg를 감소시키거나, 개체에서 혈청 HBeAg의 소거를 발생시키거나, 또는 개체 집단에서 혈청 HBeAg의 소거율을 향상시킨다. 일 측면에서, 상기 조성물의 개체로의 투여는 개체에서 HBV 바이러스 부하(viral load)를 낮추거나, 또는 개체 집단에서의 HBV 바이러스 부하 감소율을 향상시킨다. 일 측면에서, 상기 조성물의 개체로의 투여는 개체의 감염된 세포에서의 HBV DNA 검출불가를 야기하거나 또는 개체 집단에서 높은 수준의 HBV DNA 음성율을 야기한다. 일 측면에서, 상기 조성물의 개체로의 투여는 간 손상을 경감시키거나, 개체에서 간 기능을 개선시키거나, 간 손상율을 낮추거나, 또는 개체 집단에서 개선된 간 기능 개선율을 높인다. 일 측면에서, 상기 조성물의 개체로의 투여는 개체 또는 개체 집단에서 ALT 정상화(normalization)를 향상시킨다.
본원에 기술된 HBV 항원, 융합 단백질, 면역치료 조성물, 또는 HBV 항원, 융합 단백질 또는 면역치료 조성물의 임의의 이용 방법과 관련된 임의의 구현예들에서, 일 측면에서, 상기 조성물은 하나 이상의 생물 반응 변형제(biological response modifier)를 더 포함하거나 또는 이와 함께 사용된다. 일 측면에서, 상기 조성물은 HBV 감염 증상을 치료 또는 완화하는데 유용한 한가지 이상의 부가적인 화합물을 더 포함하거나 또는 이와 함께 사용된다. 일 측면에서, 상기 조성물은 하나 이상의 항-바이러스성 화합물을 더 포함하거나 또는 이와 함께 사용된다. 일 측면에서, 상기 항-바이러스성 화합물은 뉴클레오티드 유사체 역전사효소 저해제이다. 항-바이러스성 화합물은, 비제한적인 예로서, 테노포비르, 라미부딘, 아데포비르, 텔비부딘, 엔테카비르 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 상기 항-바이러스성 화합물은 테노포비르이다. 일 측면에서, 상기 항-바이러스성 화합물은 엔테카비르이다. 일 측면에서, 상기 조성물은 하나 이상의 인터페론을 더 포함하거나 또는 이와 함께 사용된다. 일 측면에서, 상기 인터페론은 인터페론-α이다. 일 측면에서, 상기 인터페론은 페길화된 인터페론-α2a이다. 일 측면에서, 상기 인터페론은 인터페론-λ이다.
도 1은 B형 간염 바이러스 게놈 배열을 나타낸 개략도이다.
도 2는 본 발명의 효모 기반의 면역치료 조성물에 유용한 HBV 표면 항원/코어 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자의 기본 구조를 나타낸 개략도이다.
도 3은 본 발명의 효모 기반의 면역치료 조성물에 유용한 HBV 표면 항원/중합효소/코어/X 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자의 기본 구조를 나타낸 개략도이다.
도 4는 본 발명의 효모 기반의 면역치료 조성물에 유용한 HBV 중합효소/코어 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자의 기본 구조를 나타낸 개략도이다.
도 5는 본 발명의 효모 기반의 면역치료 조성물에 유용한 HBV X/코어 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자의 기본 구조를 나타낸 개략도이다.
도 6은 본 발명의 효모 기반의 면역치료 조성물에 유용한 HBV 중합효소 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자의 기본 구조를 나타낸 개략도이다.
도 7은 본 발명의 효모 기반의 면역치료 조성물에 유용한 HBV 표면 항원/중합효소/코어 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자의 기본 구조를 나타낸 개략도이다.
도 8은 본 발명의 효모 기반의 면역치료 조성물에 유용한 HBV 표면 항원/코어/중합효소 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자의 기본 구조를 나타낸 개략도이다.
도 9는 본 발명의 효모 기반의 면역치료 조성물에 유용한 HBV 표면 항원/코어/X 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자의 기본 구조를 나타낸 개략도이다.
도 10은 본 발명의 효모 기반의 면역치료 조성물에 유용한 HBV 표면 항원/코어/중합효소/X 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자의 기본 구조를 나타낸 개략도이다.
도 11은 본 발명의 효모 기반의 면역치료 조성물에 유용한 HBV 표면 항원/코어/X/중합효소 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자의 기본 구조를 나타낸 개략도이다.
도 12는 본 발명의 효모 기반의 면역치료 조성물에 유용한 HBV 중합효소/표면 항원/코어 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자의 기본 구조를 나타낸 개략도이다.
도 13은 본 발명의 효모 기반의 면역치료 조성물에 유용한 HBV X/표면 항원/코어 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자의 기본 구조를 나타낸 개략도이다.
도 14는 본 발명의 효모 기반의 면역치료 조성물에 유용한 HBV 중합효소/X/표면 항원/코어 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자의 기본 구조를 나타낸 개략도이다.
도 15는 본 발명의 효모 기반의 면역치료 조성물에 유용한 HBV X/중합효소/표면 항원/코어 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자의 기본 구조를 나타낸 개략도이다.
도 16은 HBV 표면 항원/코어 융합 단백질을 발현하는 몇가지 효모 기반의 면역치료 조성물의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯에 대한 디지탈 사진이다 (열-사멸된, 전효모).
도 17은 HBV 표면 항원/코어 융합 단백질을 발현하는 몇가지 효모 기반의 면역치료 조성물의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯에 대한 디지탈 사진이다 (살아있는, 전효모).
도 18은 HBV 표면 항원/중합효소/코어/X 융합 단백질을 발현하는 몇가지 효모 기반의 면역치료 조성물의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯에 대한 디지탈 사진이다.
도 19은 HBV 표면 항원/중합효소/코어/X 융합 단백질을 발현하는 몇가지 효모 기반의 면역치료 조성물의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯에 대한 디지탈 사진이다.
도 20은 표면-코어 융합 단백질 (Sc) 또는 표면-중합효소-코어-X 융합 단백질 (Sp)을 포함하는 HBV 항원을 발현하는 몇가지 효모 기반의 면역치료 조성물의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯에 대한 디지탈 사진이다.
도 21은 UL2 배지에서 배양한 몇가지 효모 기반의 면역치료 조성물로부터 HBV 항원의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯에 대한 디지탈 사진이다.
도 22는 UL2 배지 또는 U2 배지에서 배양한 몇가지 효모 기반의 면역치료 조성물로부터 HBV 항원의 평균 발현을 보여주는 막대 그래프이다 (웨스턴 블롯에 대한 디지탈 사진이다 (오차 막대는 표준 편차임).
도 23은 HBV 표면-코어 항원 (SCORE)을 발현하는 효모-기반의 면역치료 산물로 면역화된 마우스 유래 비장 CD4+ T 세포의, S/코어 항원 믹스 또는 MHC Class II SAg 미메토프 펩타이드(mimetope peptide)에 대한 증식을 나타낸 그래프이다 (오차 막대는 표준 편차임).
도 24는 HBV 표면-코어 항원 (SCORE)을 발현하는 효모-기반의 면역치료 산물로 면역화된 마우스 유래 림프절 T 세포의, S/코어 항원 믹스 또는 MHC Class II SAg 미메토프 펩타이드에 대한 증식을 나타낸 그래프이다 (오차 막대는 표준 편차임).
도 25는 HBV 표면-코어 항원 (SCORE)을 발현하는 효모-기반의 면역치료 산물로 면역화된 마우스 유래 림프절 T 세포의, S/코어 항원 믹스 또는 MHC Class II SAg 미메토프 펩타이드에 대한 인터페론-γ (IFN-γ) ELISpot 반응을 나타낸 그래프이다.
도 26은 HBV 표면-중합효소-코어-X 항원 (a-Spex로 표시됨)을 발현하는 효모-기반의 면역치료 산물로 면역화된 마우스 유래 비장 CD4+ T 세포의, S/코어 항원 믹스 또는 MHC Class II SAg 미메토프 펩타이드에 대한 증식을 나타낸 그래프이다 (오차 막대는 표준 편차임).
도 27은, (a) HBV 표면-중합효소-E/코어-X 항원 (Sp로 표시됨)을 발현하는 효모-기반의 면역치료 산물 (Sp로 표시됨), 좌측 열; 또는 (b) HBV 표면-코어 항원을 발현하는 효모-기반의 면역치료 산물 (Sc로 표시됨)로 면역화된 마우스 유래 비장세포에서의 IL-1β 생산성을 나타낸 그래프이다 (오차 막대는 표준 편차임).
도 28은, (a) HBV 표면-중합효소-코어-X 항원을 발현하는 효모-기반의 면역치료 산물 (Sp로 표시됨), 좌측 열; 또는 (b) HBV 표면-코어 항원을 발현하는 효모-기반의 면역치료 산물 (Sc로 표시됨)로 면역화된 마우스 유래 비장세포에서의 IL-12p70 생산성을 나타낸 그래프이다 (오차 막대는 표준 편차임).
도 29A 및 29B는 (도 29A) HBV 표면-코어 항원을 발현하는 효모-기반의 면역치료 산물 (Sc로 표시됨) 또는 (도 29B) HBV 표면-중합효소-코어-X 항원을 발현하는 효모-기반의 면역치료 산물(Sp로 표시됨)로 면역화된 마우스 유래 비장세포에서의 인터페론-γ (IFN-γ) 생산성을 나타낸 그래프이다.
도 30A-D는 (a) HBV 표면-중합효소-코어-X 항원을 발현하는 효모-기반의 면역치료 산물(Sp로 표시됨), 좌측 열; 또는 (b) HBV 표면-코어 항원을 발현하는 효모-기반의 면역치료 산물 (Sc로 표시됨)로 면역화된 마우스 유래 비장세포에서의, IL-1β (도 30A), IL-6 (도 30B), IL-13 (도 30C) 및 IL-12p70 (도 30D) 생산성을 나타낸 그래프이다.
도 31은 YVEC가 아닌 GI-13002 또는 GI-13002 + 항-CD40 항체로 면역화된 마우스에서 타겟 HBV 항원을 발현하는 EL4 종양의 시험 접종에 대해 비슷한 수준의 방어가 유도됨을 보여주는 막대 그래프이다 (오차 막대는 표준 편차임).
도 32는 GI-13008 (SCORE-C) 및 GI-13013 (SPEXv2)로 면역화된 마우스의 T 세포 반응을 다양한 HBV 펩타이드 및 항원을 이용하여 YVEC와 비교하여 나타낸 IFN-γ ELISpot 분석 결과를 보여주는 막대 그래프이다 (오차 막대는 표준 편차임).
도 33은 HBV 예방 백신으로 면역 전, 면역 후 및 부스트 접종 후, 인간 개체로부터 GI-13002를 이용한 자극에 대한 IFN-γ ELISpot 반응을 나타낸 막대 그래프이다.
도 34는 GI-13009 (SCORE-D) 또는 GI-13020 (X-SCORE)으로 면역화된 HLA-A2 형질전환 마우스로부터 분리한 림프절 세포에서의 HBV 항원-특이적인 IFN-γ ELISpot 반응을, 효모 대조군(YVEC)으로 면역화된 마우스와 비교하여 나타낸, 막대 그래프이다 (오차 막대는 표준 편차임).
도 35는 GI-13009 (SCORE-D)로 면역화된 HLA-A2 형질전환 마우스로부터 분리한 비장 세포에서의 HBV 항원-특이적인 IFN-γ ELISpot 반응을, 효모 대조군(YVEC)으로 면역화된 마우스와 비교하여 나타낸, 막대 그래프이다 (오차 막대는 표준 편차임).
도 36은 GI-13009 (SCORE-D) 또는 GI-13020 (X-SCORE)으로 면역화된 C57BL/6 마우스로부터 분리한 림프절 세포에서의 HBV 항원-특이적인 IFN-γ ELISpot 반응을, 효모 대조군 (YVEC)으로 면역화된 마우스 또는 나이브 마우스와 비교하여 나타낸, 막대 그래프이다 (오차 막대는 표준 편차임).
도 37은 GI-13009 (SCORE-D) 또는 GI-13020 (X-SCORE)으로 면역화된 C57BL/6 마우스에서, MHC 클래스 I-제한적인 HBV 펩타이드에 대한 HBV 항원-특이적인 CD8+ T 세포 반응을, 효모 대조군 (YVEC) 또는 오발부민 (OVAX)을 발현하는 효모-기반의 면역치료제로 면역화된 마우스와 비교하여 나타낸, 선 그래프이다.
도 38은 GI-13009 (SCORE-D) 또는 GI-13020 (X-SCORE)으로 면역화된 C57BL/6 마우스에서, MHC 클래스 II-제한적인 HBV 펩타이드에 대한 HBV 항원-특이적인 CD4+ T 세포 반응을, 효모 대조군 (YVEC) 또는 오발부민 (OVAX)을 발현하는 효모-기반의 면역치료제로 면역화된 마우스와 비교하여 나타낸, 막대 그래프이다.
본 발명은 일반적으로 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염을 예방 및/또는 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 개체에서 HBV 감염에 대한 예방학적 및/또는 치료학적 면역 반응을 발생시키도록 설계된 효모 비히클과 HBV 항원(들)을 포함하는, 효모-기반의 면역치료 조성물 (또한, "효모-기반의 HBV 면역요법"로서 언급됨), 및 HBV 감염 및 이의 관련 증상을 예방 및/또는 치료하기 위한 상기 조성물의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명은, 임의의 면역치료 조성물에 사용하기 위한, 본 발명의 효모-기반의 조성물에 사용되는 재조합 핵산 분자, 뿐만 아니라 이로부터 코딩되는 단백질 및 융합 단백질, 및/또는 본 발명의 HBV-특이적인 효모-기반의 조성물을 HBV 감염에 대한 임의의 한가지 이상의 다른 치료학적 또는 예방학적 조성물, 제제, 약제, 화합물 및/또는 프로토콜을 조합한, 임의의 치료학적 또는 예방학적 프로토콜을 비롯하여, HBV 감염에 대한 임의의 치료학적 또는 예방학적 프로토콜을 포함한다.
효모-기반의 HBV-특이적인 면역치료 조성물은, 본 발명의 조성물이 선천적인 면역 반응 뿐만 아니라 CD4-의존적인 TH17 및 TH1 T 세포 반응과 항원-특이적인 CD8+ T 세포 반응 등의, HBV를 특이적으로 타겟팅하는 후천적인 면역 반응을 유도한다는 점에서, 다양한 타입의 면역치료제들 중에서 특별하다. HBV-특이적인 효모-기반의 면역치료제에 의해 발생되는 면역 반응의 범위는 HBV를 타겟팅하는데 적합하다. 먼저, HBV는, 선천적인 면역을 직접 중화시키기 보다는, 선천적인 반응으로부터 "숨기(hiding)"에 의해 감염 초기에 선천적인 반응을 피함으로써, 반응을 유도하지 않는 것으로 여겨진다 (Wieland and Chisari, 2005, J. Virol. 15:9369-9380; Wieland, et al., 2004, PNAS USA 101:6669-6674). 이에, HBV가, 다른 기전, 즉 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물에 의해 활성화된다면, 선천적인 면역 반응에 감지될 것으로 예상할 수 있다. 두번째로, HBV는 후천적인 면역 반응에서 관찰될 것으로 예상되는 감염된 숙주 세포에서 항원을 고수준으로 발현하며 (Guidotti, et al., 1999, Science 284:825-829; Thimme et al., 2003, J. Virol. 77:68-76), 급성 감염의 소멸은 왕성한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응과 관련있다 (Maini et al., 1999, Gastroenterol. 117:1386-1396; Rehermann et al., 1995, J. Exp. Med. 181:1047-1058; Thimme et al., 2003, J. Virol. 77:68-76; Wieland and Chisari, 2005, J. Virol. 15:9369-9380). 따라서, 효모-기반의 HBV 면역요법은, 후천적인 면역 반응의 활성화에 의해, HBV-감염된 세포를 파괴에 대해 효과적으로 타겟팅할 것으로 예상되며, 및/또는 바이러스 소멸 (viral clearance)을 효과적으로 강화할 것으로 예상된다. 아울러, 효모-기반의 면역치료에 의해 발생되는 면역 반응은 인터페론-비의존적인 반응 및 인터페론-의존적인 반응인 것으로 생각되므로 (Tamburini et al., 2012, J. Immunother. 35(1):14-22); 이에, HBV에 대한 한가지 관리 처치인 인터페론을 이용한 치료법(interferon-based therapy)에 대한 개체의 반응성 또는 이의 반응 결핍은, 본 발명의 효모-기반의 면역치료에 대한 개체의 반응성에 직접 영향을 미치는 것으로 여겨지지 않는다. 또한, 본원에 기술된 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물은, HBV의 면역원성이며 보존된 영역, 다중 CTL 에피토프(multiple CTL epitope)를 타겟팅하도록 설계되며, 탈출을 타겟팅할 수 있는 (상기한 탈출 돌연변이를 타겟팅하기 위해, 필요에 따라, 조성물의 변형을 허용하는) HBV의 영역들을 포함하므로, 이 조성물은 상기 바이러스에 대한 유효한 면역 반응 기회를 최적화하는 매우 적용가능한 HBV 요법이다.
또한, 이론에 결부되지 않으나, HBV에 대한 효모-기반의 면역요법은, 효모-기반의 면역치료 산물에 의해 운반되는 타겟 항원을 특이적으로 겨냥할 뿐만 아니라 바이러스의 다른 면역 에피토프 (즉, 효모-항원 조성물에 의해 운반되는 것 이외의 것)도 겨냥하여 발생하는 면역 반응을 유도하는 것으로 여겨진다. 다시 말해, 효모-기반의 면역치료제에 함유된 항원(들) 및/또는 에피토프(들)에 대한 일차적인 세포성 면역 반응이, 상기 효모-기반의 면역치료제에 존재하지 않지만 치료받은 개체의 감염 세포에 존재하는 항원(들) 및/또는 에피토프(들)에 대한 이차적인 세포성 면역 반응을 유도하여, 따라서 각 치료받은 개체에 대한 고유한 복잡하고 예측할 수 없는 면역 반응 프로파일의 전개 (evolution)를 유도할 수 있다. 이러한 이차적인 면역 반응들은 각 치료받은 개체의 HBV 감염에 대한 분자적인 프로파일에 따라 특이적이며, 효모-기반의 면역치료제는, 그외 면역요법 플랫폼 등의 기타 치료 용법들과 비교하여, 고유한 방식으로 이들 하류 효과들을 유발할 수 있다. 또한, 이러한 현상은, (예, 효모 면역치료제 측면에서 항원을 제공함으로써) 특정 HBV 항원 또는 심지어 특정한 HBV 유전자형에 대한 면역 반응의 유도가 다양한 추가적인 HBV 항원들에 대한 면역계의 케스케이드 타겟팅을 발생시켜, 효모-기반의 면역치료 조성물에 제시된 것 이외의 다른 HBV 유전자형 또는 균주 유래의 항원에 대한 유효한 면역 반응을 형성할 수 있기 때문에, 일반적으로 "에피토프 확산(epitope spreading)"으로 지칭될 수 있으며, 효모-기반의 HBV 면역치료를 이용하는 이점을 제공할 수 있다.
전술한 바와 같이, HBV에 만성 감염으로 진행되는 환자는 약한 (또는 생략된), 보다 협소한 HBV-특이적인 T 세포-매개 면역성을 나타내는 경향이 있다. 이에, 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물은, 만성 감염 환자 등의 HBV에 활성형으로 감염된 환자에 대한 치료 조성물의 치료 요구를 해결하며, 지속가능한 기억 면역 반응 형성과 관련하여 이점이 있을 수 있는 HBV 감염을 예방하기 위한 부가적인 백신을 또한 제공한다. 실제, 본 발명의 효소-기반의 HBV 면역치료 조성물은, 감염을 예방할 수 있는 HBV에 대한 지속가능한 기억 T 세포 반응을 촉매할 뿐만 아니라 바이러스 재활성화로부터 만성 감염 환자를 보호할 수 있는 장기적인 효과를 제공할 것으로 예상된다. HBV를 치료 하기 위한 단일 요법으로서 또는 다른 치료적 접근법과 조합한 (예, 항-바이러스성 화합물과 조합한) 효소-기반의 HBV 면역치료 조성물은, HBsAg와 HBeAg의 소거가 달성되거나, 완전한 혈청전환이 이루어지거나, 및/또는 치료 종료 후 적어도 6개월간 지속적인 바이러스 소거가 이루어진, 만성 감염 환자의 퍼센트를 높일 것으로 예상된다.
이에, 효모-기반의 HBV 면역요법은, 면역계에 의해 보다 효과적으로 처리될 수 있는 수준으로 개체내 바이러스 부하를 줄이기 위해, 항-바이러스 약제 및/또는 인터페론 요법과, 및/또는 다른 HBV 요법들과 조합될 수 있다. HBV 바이러스 역가는 전형적으로 매우 높으며 (높게는 간 세포 1011가 감염될 수 있음), 따라서, 개체의 유효한 CTL 반응을 탑재하는 능력을 압도할 수 있으며; 이에, 효모-기반의 면역요법을 이용한 HBV-특이적인 CTL 활성 유도를 항-바이러스 약제와 조합 사용함으로써 바이러스 부하를 낮추는 것이 감염 개체에게 유익할 것으로 예상된다. 아울러, 항-바이러스 약제 사용을 통한 바이러스 부하 감소는, 파괴시키도록 타겟팅된 다수의 감염된 간 세포에 대해, 면역 활성화의 부정적인 효과를 있다 하더라도 낮출 수 있다. 또한, 효모-기반의 HBV 면역요법은 잠복성 바이러스 감염 구획을 줄이거나 및/또는 없애는데 역할을 하는 것으로 예상된다. 예를 들어, PCR로 HBV-양성으로 판명되었고 HBV의 재활성화를 위한 잠재적인 피난처로 간주되는 조직들이 다수 있다. HBV DNA는 숙주 게놈에 병합되어 HBV를 무활성인 상태로 존속될 수 있으며, cccDNA는 또한 무활성이게 기여하는 휴면 형태인 슈퍼코일드형 HBV 게놈이다. 이론으로 결부되지 않으나, 본 발명자들은 본원에 기술된 효모-기반의 HBV 면역요법이 현행 항-바이러스 방식에서 확인되는 낮은 질병-관해율에 기여할 것으로 보이는 이러한 HBV "피난처" 타입들을 모두 제거하는데 작용할 것으로 생각된다.
다른 시나리오로, 본 발명의 효모-기반의 HBV 면역치료를 단독으로 또는 항-바이러스 또는 기타 HBV 치료와 병용하여 이용하는 것은, HBsAg의 완전한 소거를 달성하는데에는 충분하지만 항-HB 생산을 달성하는데에는 충분하지 못하다면, 완전한 혈청전환을 달성하기 위해 기존 예방학적 서브유닛 백신들이 후속되거나, 또는 이들과 추가로 조합될 수 있다. 다른 예로, 본원에 기술된 임의의 융합 단백질은 또한 완전한 혈청전환을 달성하기 위해 또는 HBV 감염으로부터 개체를 보호하기 위해 단독으로 또는 본 발명의 효모-기반의 HBV 면역치료와 조합하여 서브유닛 백신으로서 사용될 수 있다. 마지막으로, 본 발명의 면역치료 조성물은, 항-바이러스 약제를 이용한 치료에 의해 유발되는 HBV 탈출 돌연변이를 치료하기 위해, 본원에 기술된 임의의 조성물 등의 부가적인 면역치료 조성물을 이용한 수정 및/또는 조합에 매우 적합하다.
효모-기반의 면역치료 조성물은 생물제제 또는 약제학적으로 허용가능한 조성물로서 투여된다. 이에, 항원 생산 시스템으로서 효모를 이용한 다음 효모로부터 항원을 정제하기 보다는, 본원에 기술된 바와 같은 전효모 비히클은 환자에게 투여하는데 적합하여야 하며 제형화되어야 한다. 대조적으로, 기존 시판 HBV 백신 뿐만 아니라 개발 중인 다수의 제품들은, 사카로마이세스 세레비지애에서 생산된 다음 효모의 파괴 및 정제에 의해 효모로부터 후속적으로 분리하는 재조합 HBV 단백질 (예, HBsAg 단백질)을 포함하므로, 보강제(adjuvant) (예, 알루미늄 하이드록시포스페이트 설페이트 또는 알루미늄 하이드록사이드)와 조합된 최종 백신에는 검출가능한 효모 DNA가 함유되지 않으며, 효모 단백질이 1-5% 이상으로 함유되지 않는다. 한편, 본 발명의 HBV 효모-기반의 면역치료 조성물은 용이하게 검출가능한 효모 DNA를 포함하며, 효모 단백질을 실질적으로 5% 이상으로 포함하며; 통상적으로, 본 발명의 효모-기반의 면역치료제는 효모 단백질을 70% 이상, 80% 이상, 또는 통상 90% 이상으로 포함한다.
효모-기반의 면역치료 조성물은 치료학적 및/또는 예방학적 목적으로 환자를 면역화하기 위해 환자에게 투여된다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 효모-기반의 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 제형 중에서 투여하도록 제형화된다. 상기 조성물은, 일 측면에서, 인간 환자에게 투여하는데 적합하도록 제형화되어야 한다 (예, 제조 조건은 인간에게 사용하는데 적합하여야 하며, 조성물을 완성하거나 및/또는 상기 면역치료제의 투여 용량을 준비하기 위해 사용되는 임의의 부형제 또는 제형이 인간에게 사용하는데 적합하여야 함). 본 발명의 일 측면에서, 효모-기반의 면역치료 조성물은 비경구 경로 (예, 피하, 복막내, 근육내, 진피내 주입, 또는 다른 적합한 비경구 경로) 등과 같이, 환자 또는 개체의 주입에 의한 투여용으로 제형화된다.
일 구현예에서, 효모는 (예, 웨스턴 블롯으로 검출가능한) 항원을 발현하며, 항원은 효모 안에서 응집되지 않거나, 항원은 효모에서 봉입체를 형성하지 않거나, 및/또는 효모에서 매우 큰 입자 (VLP) 또는 기타 큰 항원 입자를 형성하지 않는다. 일 구현예에서, 항원은 효모에서 가용성 단백질로서 생산되거나, 및/또는 효모로부터 방출되지 않거나 또는 효모로부터 실질적으로 또는 본질적으로 방출되지 않는다. 다른 구현예에서, 이론으로 결부시키지 않으나, 본 발명의 발명자들은, 본원에 상세하게 기술된, 표면 항원 및 코어 항원을 포함하는 HBV 융합 단백질에서의 항원들의 특정 조합과 어쩌면 배치(arrangement)가 VLP를 형성할 수 있거나 또는 항원을 발현하는 효모 내부에서 어느 정도 응집될 수 있다. 그 결과, 효모에 의해 발현되는 항원은 그 전체 구조와 관련된 것으로 보이며 항원 내부에 보유된 면역 에피토프 (예, T 세포 에피토프)의 면역원성 특징과는 별개의 특징으로서 형성되는, 면역원성 특징을 가진다. 이러한 융합 단백질을 발현하는 효모가 본 발명의 효모-기반의 HBV 면역치료제에 제공되는 경우, 면역치료 조성물은, 전술한 바와 같이 (본원에 기술된 모든 효모-기반의 면역치료제가 그런한 바와 같이) 효모 비히클 뿐만 아니라 일부는 융합 단백질 항원 구조 (예, 효모에서 발현되는 표면-코어 융합 단백질은 또한 보강제-유사 특징을 가짐)로부터, 선천적인 면역 시스템을 활성화하는 특성이 유래되며; 아울러, 면역치료 조성물은, 본원에 기술된 모든 효모-기반의 면역치료제가 그런한 바와 같이, (다양한 T 세포 에피토프의 제공을 통해) 융합 단백질로부터 항원-특이적인 방식으로 후천적인 면역 시스템을 활성화하는 특성이 유래된다. 이러한 특성들의 특이적인 조합이, 본원에 기술된 HBV 유래 특정 표면-코어 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료제에 독창적인 것으로 보인다. 그러나, 본원에 기술된 본 발명의 모든 구현예들에서, 효모-기반의 면역치료제는 면역 시스템의 수지상 세포에 의해 쉽게 식균되어야 하며, HBV에 대한 효과적인 면역 반응을 도출하기 위해 이러한 수지상 세포에 의해 상기 효모와 항원이 쉽게 처리되어야 한다.
본 발명의 조성물
본 발명의 일 구현예는 HBV 감염으로 기인한 한가지 이상의 증상을 완화시키거나, 및/또는 HBV 감염을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있는 효모-기반의 면역치료 조성물에 관한 것이다. 본 조성물은, (a) 효모 비히클; 및 (b) HBV 단백질(들) 및/또는 이의 면역원성 도메인(들)을 포함하는 하나 이상의 항원을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이 HBV 단백질 하나 이상이 효모 비히클에 적재(load)되거나, 이와 복합체를 형성하거나, 부착되거나, 혼합되거나, 효모 비히클과 함께 투여되어, 본 발명의 조성물을 형성하는 것은 본 발명의 일 구현예이지만, HBV 단백질은, 효모 비히클과 연대하여, 효모 비히클에 의해 (예, 선택적으로 효모 사이토플라스트(yeast cytoplast), 효모 고스트(yeast ghost) 또는 효모 막 추출물 또는 이의 분획으로 추가적으로 가공될 수 있는, 무손상 효모 또는 효모 스페로플라스트(yeast spheroplast)에 의해) 재조합 단백질로서 대부분 발현된다. 본 발명에 있어, 본 발명의 효모 비히클과 관련하여, 이종의 융합 단백질 등의 "이종의(heterologous)" 단백질 또는 "이종의" 항원에 대한 언급은, 이종의 항원 또는 이종의 단백질을 포함하는 융합 단백질이 효모에서 선천적으로 발현되는 효모 서열, 단백질 또는 이의 일부 (예, 본원에 기술된 알파 팹터 프리프로 서열)를 포함할 수도 있지만, 상기 단백질 또는 항원이 효모에서 선천적으로 발현되는 단백질 또는 항원이 아니라는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예는 다양한 HBV 융합 단백질에 관한 것이다. 일 측면에서, 그러한 HBV 융합 단백질은 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물에 사용가능하다. 이러한 융합 단백질, 및/또는 상기 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자는, 또한, 비제한적인 예로서, DNA 백신, 단백질 서브유닛 백신, 재조합 바이러스-기반의 면역치료 조성물, 병원체 사 백신, 병원체 불활성화 백신 및/또는 수지상 세포 백신을 포함할 수 있는, 비-효모-기반의 면역치료 조성물과, 조합하여 사용되거나, 또는 이를 제조하는데 이용될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 융합 단백질은 HBV의 진단 분석에 사용되거나 및/또는 HBV에 대한 항체 제조에 사용될 수 있다. 본원에는, 예를 들어, 중합효소의 선택된 일부분 및/또는 변형된 중합효소; 표면 항원의 선택된 일부분 및/또는 변형된 표면 항원; 코어의 선택된 일부분 및/또는 변형된 코어 (e-항원 전체 또는 적어도 일부를 포함함); X 항원의 선택된 일부분 및/또는 변형된 X 항원; 뿐만 아니라, 임의의 1, 2, 3 또는 4가지 항원들의 배열 및/또는 이의 선택된 일부분, 예를 들어, 비제한적인 예로서, 표면 항원과 코어 (e-항원 전체 또는 적어도 일부 포함)의 선택된 일부분 및/또는 배열 (arrangement); 표면 항원, 코어 (e-항원 전체 또는 적어도 일부 포함), 중합효소 및 X 항원의 선택된 일부분 및/또는 배열; 표면 항원, 코어 (e-항원 전체 또는 적어도 일부 포함) 및 중합효소의 선택된 일부분 및/또는 배열; 및 표면 항원, 코어 (e-항원 전체 또는 적어도 일부 포함) 및 X 항원의 선택된 일부분 및/또는 배열 등의, HBV 항원의 선택된 일부분을 구비한 HBV 융합 단백질의 예가 기술되어 있다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이, 전장 단백질의 면역원성 도메인을 비롯한, HBV 항원은 HBV로 감염된 숙주 세포에서 과다 발현되는 숙주 단백질과 융합되지만 감염되지 않은 숙주 세포에서는 그렇지 않다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이, 전장 단백질의 면역원성 도메인을 비롯한, HBV 항원은, 일 구현예에서 간 세포에서 발현되는, HBV 복제에 필요한 숙주 인자인 단백질 R2에 융합된다. R2는 리보뉴클레오티드 리덕타제 (RNR)의 단백질 요소로서, HBV 생활주기에 중요한 인자이다 (예, Cohen et al., 2010, Hepatol. 51(5):1538-1546). 본 발명의 그외 구현예들은 본원에 제공된 내용에 비추어 명확해 질 것이다.
B형 간염 바이러스 유전자 및 단백질. B형 간염 바이러스 (HBV)는 헤파드나바이러스(hepadnavirus) 과에 속하는 바이러스로서, 인간과 유인원의 간에 대해 일시적인 감염과 만성적인 감염을 야기한다. 포유류에 감염하는 헤파드나바이러스들은 비슷한 DNA 서열과 게놈 조직체계를 가지고 있으며, 오르토헤파드나바이러스(Orthohepadnavirus) 속으로 분류된다. B형 간염 바이러스 입자는 지질과 HBsAg라고 하는 표면 항원 입자가 함유된 외막을 가지고 있다. 코어 단백질 (HBcAg)를 포함한 뉴클레오캡시드 코어는 바이러스 DNA와 역전사효소 활성을 가진 DNA 중합효소를 둘러싸고 있다. Seeger and Mason, 2000, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64(1):51-68에서 리뷰된 바와 같이, HBV는 바이러스 게놈이 감염된 간 세포의 핵으로 운반되었을 때 공유결합으로 닫힌 원형의 2중 가닥 DNA (cccDNA) 분자로 변환되는, 3.2 kb의 부분 이중-가닥의 풀린(relaxed)-원형 DNA (rcDNA) 게놈을 가지고 있다. 숙주 세포의 RNA 중합효소 II는 숙주 세포 세포질로 이송된 cccDNA로부터 4종의 바이러스 RNA를 전사한다. 바이러스 RNA로는, 전사되어 바이러스 코어 및 막 구조 단백질들, 그리고 프리코어, 중합효소 및 X 비구조성 바이러스 단백질을 형성하는, mRNA들을 포함한다. 전사되어 코어 및 중합효소를 만드는 RNA는 또한 역전사의 주형인 프리게놈 RNA (pgRNA)로서 제공된다. pgRNA와 중합효소는 코어 단백질에 의해 둘러싸여, pgRNA가 rcDNA로 역전사되는 바이러스 뉴클레오캡시드를 형성한다. 그 후, 이들 rcDNA-함유 뉴클레오캡시드는 막 단백질에 의해 둘러싸이게 되며, 성숙형 비리온으로서 숙주 세포에서 배출되거나 또는 바이러스 cccDNA를 증폭하기 위해 핵으로 셔틀로서 이동된다.
HBV 게놈에 의해 생성되는 구조 단백질과 비-구조 단백질들을 표 1에 나타낸다. 부분 이중-가닥의 HBV 게놈은 C, X, P 및 S로 알려진 유전자 4종을 포함한다 (도 1 참조).
표 1. HBV 유전자 및 유전자 산물
유전자 단백질 기능(들)
C 코어 단백질 (HBcAg) 바이러스 pgRNA와 중합효소를 둘러싼 바이러스 캡시드 형성
e 항원 (HBeAg) 기능 미확인: 후천적인 면역 반응을 위한 HBV-특이적인 면역 억제 인자일 수 있음
P 중합효소 바이러스 DNA 복제용 중합효소
- 도메인 1: 말단 단백질(TP) 도메인은 pgRNA를 패키징하며, (-) 가닥 DNA를 프라이밍함
- 도메인 2: 역전사효소 (RT) 도메인, RNase H; pgRNA 분해
S S HBsAg (표면 항원; 소형) 막 단백질임, 표면 항원 입자를 형성함; 면역 기능을 억제할 수 있음
M HBsAg (표면 항원; 중형 = Pre-S2 + S) 막 단백질임, S와 함께 표면 항원 입자를 형성함; 면역 기능을 억제할 수 있음
L HBsAg (표면 항원; 대형 = Pre-S1 + pre-S2 + S) 막 단백질임, S와 함께 표면 항원 입자를 형성함; 프로-S1 도메인은 바이러스 막이 조립되는 동안에 코어 입자에 대한 리간드를 제공함; 간세포 수용체; 면역 기능을 억제할 수 있음
X X 항원 (HBx) 전사에 대한 트랜스 활성화(transactivation); DNA 복구 경로 조절; 사이토졸 칼슘 수준 상승; 단백질 분해 경로 조절; 숙주 세포에서의 세포 주기 진행과 세포 증식 경로 조절; HBV 복제 자극
유전자 C는 매우 밀접한 항원 2종을 코딩한다: 바이러스 캡시드를 형성하는 "코어 단백질" 또는 "코어 항원"으로 지칭되는 21-kDa 단백질 (HBcAg)과 캡시드로 조립되지 않지만 이량체를 형성하는 e-항원으로 지칭되는 17-kDa 단백질 (HBeAg). 전장 코어 단백질은 대략 183개의 아미노산으로 구성된 단백질로서, e-항원의 N-말단 아미노산 10개와 e-항원 생성시 단백질 분해에 의해 절단되는 C-말단의 부가적인 아미노산 대략 34개를 모두 포함한다. 다시 말해, 코어 단백질과 e-항원은 공통적으로 아미노산 잔기 149개를 가지나 (이 부분은 때때로 간염 코어 항원으로도 지칭됨), N-말단부와 C-말단부에 차이가 있다. 프리코어 단백질은 코어 및 e-항원 둘다로부터 유래된 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 전구체 단백질로서, 단백질 분해 공정에 의해 e-항원이 생성된다. 세포내 HBeAg는 -29번에서 -1번까지의 프리코어 잔기들을 포함하며 (이 상세한 설명에서 잔기의 번호 매김은 프리코어 단백질내 코어 단백질의 첫번째 아미노산 잔기를 "1"번 위치로 함), 이는 아미노산 -29번에서 -11번까지가 절단되는 지점에 단백질을 소포체 (endoplasmic reticulum)로 향하게 하는 신호 서열을 포함하고 있으며; 아미노산 149번과 150번 사이에 다른 단백질 분해에 의한 절단으로 프로코어의 (전장 코어 단백질에 존재하는) C-말단부가 제거되며, 그런 다음, (프리코어 -10번에서 1-번까지의 아미노산들 + HBcAg 또는 코어의 1-149번 아미노산들로 구성된) 남아있는 HBeAg가 e-항원으로서 방출된다 (Standing et al., 1988, PNAS USA 85: 8405-8409; Ou et al., 1986, PNAS USA 83:1578-1582; Bruss and Gerlich, 1988, Virology 163:268-275; Takahashi et al., 1983, J. Immunol. 130:2903-2907). 전체 프리코어 영역으로 구성된 HBeAg는 또한 인간의 혈청에서도 발견되었다 (Takahashi et al., 1992, J. Immunol. 147:3156-3160). 언급한 바와 같이, HBcAg (코어)는 바이러스 캡시드로 조립되어, 중합효소와 바이러스 DNA 또는 pgRNA를 함유하는 이량체를 형성한다. HBeAg (e-항원)의 기능은 확인되지 않았지만, HBV 복제 또는 감염에는 필요하지 않으며, 면역계에 의한 공격으로부터 HBV를 보호하는 면역 억제 인자인 것으로 생각된다 (Milich et al., 1990, PNAS USA 87:6599-6603; Che et al., 2004, PNAS USA 101:14913-14918; Wieland and Chisari, 2005, J. Virol. 79:9369-9380). 명확하게 하기 위해, 본원에 기술된 HBV 서열 (예, 표 3 참조)에서, 대표적인 HBV 유전자형으로부터 유래된 프리코어의 서열이 제시되며, 코어 단백질과 e-항원의 위치들이 상기 프리코어 서열에 표시되며, 프리코어의 첫번째 아미노산이 1번 위치로 표시된다.
유전자 P는 2개의 주 도메인이 스페이서에 의해 연결된 HBV DNA 중합효소 (Pol)를 코딩한다. 중합효소의 N-말단 도메인 ("말단 단백질" 또는 TP로도 지칭됨)은 pgRNA의 패키징과 비-센스 가닥 DNA를 프라이밍하는데 관여한다. C-말단 도메인은 RNase H(RH) 활성을 가진 역전사효소 (RT)이다.
유전자 S는 복수의 개시 코돈들을 가지고 있으며, S, M 및 L로 표시되는 막 단백질 (일반적으로 "표면 단백질" 또는 "표면 항원"으로도 언급됨) 3종을 코딩하는데, 이들 모두 단(Dane) 입자로도 알려져 있는 감염성 바이러스 입자의 전체 구성 성분들이다. S는 그 자체로, 그리고 M과 L과 함께, 또한, 감염된 세포로부터 대량으로 방출될 수 있는 표면 항원 입자 (HBsAg)를 형성한다 (Seeger and Mason, 2000, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64(1):51-68; Beck, (2007), "Hepatitis B virus replication", World Journal of Gastroenterology　: WJG 13(1):48-64). M 및 L에 대한 코돈들은 각각 S의 개시 코돈의 상류 약 165 (M) 및 489 (L)개의 뉴클레오티드 위치에 위치한다. S 또는 "소형" 표면 항원은 가장 작지만 가장 많이 존재하는 표면 항원이다. 항원에 대해 생성된 항체는 감염된 개체에서의 혈청전환을 의미한다. M 또는 "중형" 표면 항원은 S와는 달리 pre-S2라고 하는 여분의 단백질 도메인을 가지고 있으며, L 또는 "대형" 표면 항원에 고유한 단백질 도메인은 pre-S1으로 알려져 있다 (따라서, L은 pre-S2와 M 및 S에 속하는 부가적인 서열도 포함함). pre-S1은 pre-S1의 아미노산 21번과 47번 사이에 위치한 바이러스 간세포 수용체 도메인 (간세포 수용체 결합부)을 포함한다. pre-S1의 에피토프들은 바이러스-중화 항체의 생성을 유도할 수 있다. 아울러, pre-S1 도메인은 바이러스 막이 조립되는 동안에 코어 입자들에 대한 리간드를 제공한다. 표면 항원 입자 (HBsAg)는 또한 고-용량 용인제(high-dose toleragen)로서 기능함으로써 감염 세포의 면역 소멸(immune elimination)을 억제할 수 있다 (Reignat et al., 2002, J. Exp. Med. 195:1089-1101; Webster et al., 2004, J. Virol. 78:5707-5719).
유전자 X는 전사 트랜스 활성화, DNA 복구 경로 조절, 사이토졸 칼슘 농도 상승, 단백질 분해 경로 조절, 및 HBV 복제 자극을 강화하는 숙주 세포에서의 세포주기 진행과 세포 증식 경로의 조절에 관여하는, X 항원 (HBx) ("X 단백질"로서 언급될 수 있음)을 코딩한다 (Gearhart et al., 2010, J. Virol.). 또한, HBx는 간암 발병과 관련있다 (Kim et al., Nature 1991, 351:317-320; Terradillos et al., Oncogene 1997, 14:395-404).
HBV는 막 단백질의 항원성 에피토프를 토대로 결정되는 4가지 주 혈청형 (adr, adw, ayr, ayw) 중 한가지로 확인된다. 게놈의 뉴클레오티드 서열 차이를 토대로 8가지의 HBV 유전자형 (A-H)이 존재한다. 유전자형의 지리학적 분포는 표 2에 나타낸다 (Kramvis et al., 2005, Vaccine 23(19):2409-2423; Magnius and Norder, 1995, Intervirology 38(1-2):24-34; Sakamoto et al., 2006, J. Gen. Virol. 87:1873-1882; Lim et al., 2006, Int. J. Med. Sci. 3:14-20).
표 2
HBV 유전자형 지리학적 유행 분포
HBV/A 아메리카, 유럽, 아프리카, 동남 아시아
HBV/B 아시아 (중국, 일본, 동남 아시아), 미국
HBV/C 아시아 (중국, 일본, 동남 아시아), 미국
HBV/D 미국, 지중해, 중동 및 인도
HBV/E 사하라 이남 및 서아프리카
HBV/F 중앙 아메리카 및 남아메리카
HBV/G 프랑스, 독일, 미국
HBV/H 중앙 아메리카, 미국 (캘리포니아)
당해 기술 분야에서는 HBV 유전자의 핵산 및 아미노산 서열과 이로부터 코딩되는 단백질이 공지 유전자형 각각에 대해 공지되어 있다. 표 3은 HBV 구조 단백질과 비-구조 단백질 전체에 대한 예시 (대표적인) 아미노산 서열을 공지된 8종의 HBV 유전자형 각각에 대해 서열식별자를 참조하여 제공하며, 아울러 일부 구조 도메인의 위치도 나타낸다. 동일한 HBV 유전자형의 동일 단백질 또는 도메인에 대한 아미노산 서열 상의 소폭 차이가 여러가지 바이러스 분리주들 간에 발생한다는 것이 언급되어 있다. 그러나, 전술한 바와 같이, HBV의 균주들과 혈청형, 그리고 HBV의 유전자형은 심지어 혈청형들 및 유전자형들 간에 높은 아미노산 동일성을 나타낸다 (예, 표 4 참조). 따라서, 본원에 제시된 지침을 이용하고 예시적인 HBV 서열을 참조함으로써, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 조성물 및 방법에 이용하기 위해, 임의 HBV 균주 (분리주), 혈청형 또는 유전자형으로부터, 융합 단백질을 비롯한 다양한 HBV-기반의 단백질들을 쉽게 생산할 수 있을 것이며, 이와 같이, 본 발명은 본원에 개시된 특정 서열로 한정되지 않는다. 본 명세서의 도처에 기재된 HBV 단백질 또는 HBV 항원, 또는 이의 임의의 기능, 구조 또는 면역원성 도메인에 대한 언급은, 그에 따라, 본 명세서에 제시된 한가지 이상의 서열로부터 유래되는 특정한 서열을 참조함으로써 이루어지거나, 또는 다른 HBV 분리주 (균주)로부터 유래된 동일한, 유사한 또는 대응되는 서열을 참조참으로써, 이루어질 수 있다.
표 3
유기체, 유전자형, 유전자 단백질 서열 식별자
(데이타베이스 입수번호)
HBV, 유전자형 A, C 프리코어 서열번호 1
(입수번호 AAX83988.1)
● 코어 (HBcAg) * 서열번호 1의 30/31-212번 위치
● e-항원 (HBeAg) * 서열번호 20-178번 위치
HBV, 유전자형 A, P 중합효소 서열번호 2
(입수번호 BAI81985)
● 역전사효소 *서열번호 2의 383-602번 위치
HBV, 유전자형 A, S 표면 HBsAg (L) 서열번호 3
(입수번호 BAD91280.1)
표면 HBsAg (M) * 서열번호 3의 120-400번 위치
표면 HBsAg (S) * 서열번호 3의 175-400번 위치
HBV, 유전자형 A, X X (HBx) 서열번호 4
(입수번호 AAK97189.1)
HBV, 유전자형 B, C 프리코어 서열번호 5
(입수번호 BAD90067)
● 코어 (HBcAg) * 서열번호 5의 30/31-212번 위치
● e-항원 (HBeAg) * 서열번호 5의 20-178번 위치
HBV, 유전자형 B, P 중합효소 서열번호 6
(입수번호 BAD90068.1)
● 역전사효소 *서열번호 6의 381-600번 위치
HBV, 유전자형 B, S 표면 HBsAg (L) 서열번호 7
(입수번호 BAJ06634.1)
표면 HBsAg (M) * 서열번호 7의 120-400번 위치
표면 HBsAg (S) * 서열번호 7의 175-400번 위치
HBV, 유전자형 B, X X (HBx) 서열번호 8
(입수번호 BAD90066.1)
HBV, 유전자형 C, C 프리코어 서열번호 9
(입수번호 YP_355335)
● 코어 (HBcAg) * 서열번호 9의 30/31-212번 위치
● e-항원 (HBeAg) * 서열번호 9의 20-178번 위치
HBV, 유전자형 C, P 중합효소 서열번호 10
(입수번호 ACH57822)
● 역전사효소 *서열번호 10의 381-600번 위치
HBV, 유전자형 C, S 표면 HBsAg (L) 서열번호 11
(입수번호 BAJ06646.1)
표면 HBsAg (M) * 서열번호 11의 120-400번 위치
표면 HBsAg (S) * 서열번호 11의 175-400번 위치
HBV, 유전자형 C, X X (HBx) 서열번호 12
(입수번호 BAJ06639.1)
HBV, 유전자형 D, C 프리코어 서열번호 13
(입수번호 ADF29260.1)
● 코어 (HBcAg) * 서열번호 13의 30/31-212번 위치
● e-항원 (HBeAg) * 서열번호 13의 20-178번 위치
HBV, 유전자형 D, P 중합효소 서열번호 14
(입수번호 ADD12642.1)
● 역전사효소 *서열번호 14의 370-589번 위치
HBV, 유전자형 D, S 표면 HBsAg (L) 서열번호 15
(입수번호 ACP20363.1)
표면 HBsAg (M) * 서열번호 15의 109-389번 위치
표면 HBsAg (S) * 서열번호 15의 164-389번 위치
HBV, 유전자형 D, X X (HBx) 서열번호 16
(입수번호 BAF47226.1)
HBV, 유전자형 E, C 프리코어 서열번호 17
(입수번호 ACU25047.1)
● 코어 (HBcAg) * 서열번호 17의 30/31-212번 위치
● e-항원 (HBeAg) * 서열번호 17의 20-178번 위치
HBV, 유전자형 E, P 중합효소 서열번호 18
(입수번호 ACO89764.1)
● 역전사효소 *서열번호 18의 380-599번 위치
HBV, 유전자형 E, S 표면 HBsAg (L) 서열번호 19
(입수번호 BAD91274.1)
표면 HBsAg (M) * 서열번호 19의 119-399번 위치
표면 HBsAg (S) * 서열번호 19의 174-399번 위치
HBV, 유전자형 E, X X (HBx) 서열번호 20
(입수번호 ACU24870.1)
HBV, 유전자형 F, C 프리코어 서열번호 21
(입수번호 BAB17946.1)
● 코어 (HBcAg) * 서열번호 21의 30/31-212번 위치
● e-항원 (HBeAg) * 서열번호 21의 20-178번 위치
HBV, 유전자형 F, P 중합효소 서열번호 22
(입수번호 ACD03788.2)
● 역전사효소 *서열번호 22의 381-600번 위치
HBV, 유전자형 F, S 표면 HBsAg (L) 서열번호 23
(입수번호 BAD98933.1)
표면 HBsAg (M) * 서열번호 23의 120-400번 위치
표면 HBsAg (S) * 서열번호 23의 175-400번 위치
HBV, 유전자형 F, X X (HBx) 서열번호 24
(입수번호 AAM09054.1)
HBV, 유전자형 G, C 프리코어 서열번호 25
(입수번호 ADD62622.1)
● 코어 (HBcAg) *서열번호 25의 14-194번 위치
● e-항원 (HBeAg) * 서열번호 25의 4-161번 위치
HBV, 유전자형 G, P 중합효소 서열번호 26
(입수번호 ADD62619.1)
● 역전사효소 *서열번호 26의 380-599번 위치
HBV, 유전자형 G, S 표면 (HBsAg) (L) 서열번호 27
(입수번호 ADD62620.1)
표면 HBsAg (M) * 서열번호 27의 119-399번 위치
표면 HBsAg (S) * 서열번호 27의 174-399번 위치
HBV, 유전자형 G, X X (HBx) 서열번호 28
(입수번호 BAB82400.1)
HBV, 유전자형 H, C 프리코어 서열번호 29
(입수번호 BAD91265.1)
● 코어 (HBcAg) * 서열번호 29의 30/31-212번 위치
● e-항원 (HBeAg) * 서열번호 29의 20-178번 위치
HBV, 유전자형 H, P 중합효소 서열번호 30
(입수번호 BAF49208.1)
● 역전사효소 *서열번호 30의 381-600번 위치
HBV, 유전자형 H, S 표면 HBsAg (L) 서열번호 31
(입수번호 BAE20065.1)
표면 HBsAg (M) * 서열번호 31의 120-400번 위치
표면 HBsAg (S) * 서열번호 31의 175-400번 위치
HBV, 유전자형 H, X X (HBx) 서열번호 32
(입수번호 BAF49206.1)
*위치 번호는 대략적인 것이며, 지정된 위치의 양쪽에 부가적인 아미노산이 포함될 수 있음.
B형 간염 바이러스 항원과 구조체들. 본 발명의 일 구현예는 신규한 HBV 항원과 융합 단백질, 및 상기 항원과 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에는, 모두 동일한 융합 단백질에 포함되며 동일한 재조합 핵산 구조체 (재조합 핵산 분자)에 의해 코딩된, 하나 또는 복수의 (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 그 이상) 항원 및/또는 하나 이상의 단백질로부터 유래된 면역원성 도메인을 제공하는, 효모 기반의 면역치료 조성물 또는 기타 조성물 (예, 기타 면역치료 또는 진단 조성물)에 사용하기 위한 수종의 여러가지 신규한 HBV 항원들이 기술되어 있다. 본 발명의 조성물에 사용되는 항원들은 동물을 (예방학적으로 또는 치료학적으로) 면역화하기 위해 하나 이상의 HBV 단백질 또는 이의 면역원성 도메인을 포함한다. 상기 조성물은, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상의 수의 HBV 단백질들의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 면역원성 도메인 비롯하여, 1, 2, 3, 4, 수개, 여러개 또는 복수의 HBV 항원들을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 항원은 융합 단백질이다. 본 발명의 일 측면에서, 상기 융합 단백질은 2 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 융합 단백질은 하나 이상의 단백질의 2 이상의 면역원성 도메인 및/또는 2 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 이러한 항원을 포함하는 면역치료 조성물은 광범위한 환자에게 항원-특이적인 면역화를 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 항원 또는 융합 단백질은, 표면 단백질의 대형(L), 중형 (M) 및/또는 소형 (S) 형태를 비롯한 HBV 표면 단백질 (표면 항원, 막 단백질 또는 HBsAg이라고도 함) 및/또는 이의 pre-S1 및/또는 pre-S2 도메인들; HBV 프리코어 단백질; HBV 코어 단백질 (코어 항원 또는 HBcAg라고도 함); HBV e-항원 (HBeAg라고도 함); HBV 중합효소 (중합효소의 RT 도메인 및 TP 도메인으로 지칭되는 하나 또는 2개의 도메인을 포함함); HBV X 항원 (X, X 항원, 또는 HBx로도 지칭됨); 및/또는 이들 HBV 단백질들 중 임의의 한가지 이상의 임의의 하나 이상의 면역원성 도메인으로부터 선택되는 임의의 한가지 이상의 HBV 단백질의 전장 또는 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 면역치료 조성물에 사용가능한 항원은 단일 HBV 단백질로부터 유래된다 (전장, 거의 전장, 또는 전장 단백질의 적어도 1, 2, 3 또는 4개 이상의 면역원성 도메인을 포함하는 일부분). 본 발명의 일 구현예에서, 면역치료 조성물은, 각각 상이한 HBV 항원(들)을 발현 또는 포함하는, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 개별 효모 비히클들을 포함한다.
본 발명에 사용가능한 HBV 항원들의 조합으로는 (융합 단백질내 임의 순서로) 다음과 같은 것을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다:
(1) (a) 프리코어/코어/e (프리코어, 코어, e-항원, 및/또는 이들의 기능성 도메인 및/또는 면역학적 도메인 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합); (b) 중합효소 (전장, RT 도메인, TP 도메인 및/또는 이들의 기능성 도메인 및/또는 면역학적 도메인 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합); 및/또는 (c) X 항원 (또는 이들의 기능성 도메인 및/또는 면역학적 도메인 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합) 중 임의의 한가지 이상과 조합된, 표면 단백질 (L, M 및/또는 S, 및/또는 비제한적인 예로서 pre-S1 및/또는 pre-S2 및/또는 pre-S1의 간세포 수용체 도메인을 비롯한, 이들의 기능성 및/또는 면역원성 도메인들 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합);
(2) (a) 표면 단백질 (L, M 및/또는 S, 및/또는 비제한적인 예로서 pre-S1 및/또는 pre-S2 및/또는 pre-S1의 간세포 수용체 도메인을 비롯한, 이들의 기능성 및/또는 면역원성 도메인들 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합; (b) 중합효소 (전장, RT 도메인, TP 도메인 및/또는 이들의 기능성 도메인 및/또는 면역학적 도메인 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합); 및/또는 (c) X 항원 (또는 이들의 기능성 도메인 및/또는 면역학적 도메인 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합) 중 임의의 한가지 이상과 조합된, 프리코어/코어/e (프리코어, 코어, e-항원, 및/또는 이들의 기능성 도메인 및/또는 면역학적 도메인 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합);
(3) (a) 표면 단백질 (L, M 및/또는 S, 및/또는 비제한적인 예로서 pre-S1 및/또는 pre-S2 및/또는 pre-S1의 간세포 수용체 도메인을 비롯한, 이들의 기능성 및/또는 면역원성 도메인들 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합; (b) 프리코어/코어/e (프리코어, 코어, e-항원, 및/또는 이들의 기능성 도메인 및/또는 면역학적 도메인 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합); 및/또는 (c) X 항원 (또는 이들의 기능성 도메인 및/또는 면역학적 도메인 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합) 중 임의의 한가지 이상과 조합된, 중합효소 (전장, RT 도메인, TP 도메인 및/또는 이들의 기능성 도메인 및/또는 면역학적 도메인 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합); 또는
(4) (a) 표면 단백질 (L, M 및/또는 S, 및/또는 비제한적인 예로서 pre-S1 및/또는 pre-S2 및/또는 pre-S1의 간세포 수용체 도메인을 비롯한, 이들의 기능성 및/또는 면역원성 도메인들 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합; (b) 중합효소 (전장, RT 도메인, TP 도메인 및/또는 이들의 기능성 도메인 및/또는 면역학적 도메인 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합); 및/또는 (c) 프리코어/코어/e (프리코어, 코어, e-항원, 및/또는 이들의 기능성 도메인 및/또는 면역학적 도메인 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합) 중 임의의 한가지 이상과 조합된, X 항원 (또는 이들의 기능성 도메인 및/또는 면역학적 도메인 중 임의의 한가지 또는 이들의 조합).
재조합 핵산 분자와 이로부터 코딩되는 단백질, 예컨대 융합 단백질은, 본 발명의 일 구현예로서, 효모-기반의 면역치료 조성물에 사용되거나, 또는 시험관내 분석, 항체 생산 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역요법을 토대로 하지 않는 다른 백신 등의 다른 면역치료 조성물을 비롯하여, HBV 항원(들)에 대한 임의의 다른 적합한 목적으로 사용될 수 있다. 효모-기반의 면역치료 조성물 이외의 용도를 위해 다른 발현 시스템을 사용하여 단백질을 생산할 수도 있지만, 효모에 의한 단백질 발현이 바람직한 일 구현예이다.
본 발명에서, 본원에서 일반적으로 사용되는 용어 "항원"은 천연적으로 형성되거나 또는 합성에 의해 파생된 단백질의 임의 영역 (펩타이드, 부분 단백질, 전장 단백질), 세포 조성물 (전세포, 세포 용혈물(lysate) 또는 파괴된 세포), 유기체 (유기체 전체, 용혈물 또는 파괴된 세포), 탄수화물, 기타 분자 또는 이의 일부분을 지칭한다. 항원은 면역 시스템의 요소 (예, T 세포, 항체)가 직면하는 동일 항원 또는 유사 항원에 대해 항원-특이적인 면역 반응 (예, 체액성 및/또는 세포-매개 면역 반응)을 일으킬 수 있다.
항원은 작게는 단일 에피토프, 단일 면역원성 도메인이거나 또는 더 클 수 있으며, 복수의 에피토프 또는 면역원성 도메인을 포함할 수 있다. 이처럼, 항원의 크기는 작게는 아미노산 약 8-12개 (즉, 펩타이드)이고, 크게는 전장 단백질, 다량체, 융합 단백질, 키메라 단백질, 전체 세포, 전체 미생물(whole microorganism) 또는 이들의 임의 일부분 (예, 전체 세포의 용혈물 또는 미생물 추출물)일 수 있다. 아울러, 항원은 본 발명의 효모 비히클 또는 조성물에 적재될 수 있는 탄수화물을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서 (예, 항원이 재조합 핵산 분자로부터 효모 비히클에 의해 발현되는 경우), 항원은 전체 세포 또는 미생물이 아니라, 단백질, 융합 단백질, 키메라 단백질 또는 이의 단편이다.
항원이 효모에서 발현되는 경우, 항원은 효모에서 재조합에 의해 발현가능한 최소 크기이며, 전형적으로 길이는 아미노산 25개 이상, 아미노산 26개 이상, 아미노산 27개 이상, 아미노산 28개 이상, 아미노산 29개 이상, 아미노산 30개 이상, 아미노산 31개 이상, 아미노산 32개 이상, 아미노산 33개 이상, 아미노산 34개 이상, 아미노산 35개 이상, 아미노산 36개 이상, 아미노산 37개 이상 아미노산 38개 이상, 아미노산 39개 이상, 아미노산 40개 이상, 아미노산 41개 이상, 아미노산 42개 이상, 아미노산 43개 이상, 아미노산 44개 이상, 아미노산 45개 이상, 아미노산 46개 이상 아미노산 47개 이상, 아미노산 48개 이상, 아미노산 49개 이상 또는 아미노산 50개 이상이거나, 또는 길이는 적어도 아미노산 25-50개, 적어도 아미노산 30-50개, 적어도 아미노산 35-50, 적어도 아미노산 40-50, 또는 적어도 아미노산 45-50개 길이이다. 더 작은 단백질도 발현될 수 있으며, 상당히 큰 단백질 (예, 길이가 아미노산 수백개 또는 심지어 수천개임)도 발현될 수 있다. 일 측면에서, 전장 단백질, 또는 N-말단 및/또는 C-말단에 아미노산 1개 이상이 결여된, 이의 구조 도메인, 이의 기능성 도메인, 또는 이들의 면역원성 도메인이 발현될 수 있다 (예, N-말단 및/또는 C-말단으로부터 아미노산 약 1 내지 20개가 결여됨). 융합 단백질 및 키메라 단백질 역시 본 발명에서 발현가능한 항원이다. "타겟 항원"은 본 발명의 면역치료 조성물에 의해 특이적으로 타겟이 되는 항원이다 (즉, 면역 반응의 도출이 바람직한 항원). "HBV" 항원은 항원 타겟팅이 B형 간염 바이러스도 타겟팅하도록 하나 이상의 HBV 단백질로부터 유래, 설계 또는 생산되는 항원이다.
면역 반응 자극을 언급할 때, 용어 "면역원"은 용어 "항원"의 서브세트로서, 일부 경우들에서는, 용어 "항원"과 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 면역원은, 본원에서, 체액성 및/또는 세포-매개 면역 반응을 일으키는 (즉, 면역원성인) 항원을 지칭하며, 개체에 면역원의 투여시 개체의 면역 시스템과 직면하는 동일 또는 유사 항원에 대해 항원-특이적인 면역 반응이 개시된다. 일 구현예에서, 면역원은 CD4+ T 세포 반응 (예, TH1, TH2 및/또는 TH17) 및/또는 CD8+ T 세포 반응 (예, CTL 반응) 등의 세포-매개 면역 반응을 일으킨다.
소정의 항원의 "면역원성 도메인"은, 동물에게 투여시, 면역원으로서 작용하는 하나 이상의 에피토프를 포함하는, 항원의 임의의 일부분, 단편 또는 에피토프 (예, 펩타이드 단편 또는 서브유닛, 또는 항체 에피토프 또는 그외 구조 에피토프)일 수 있다. 따라서, 면역원성 도메인은 단일 아미노산 보다는 크며, 면역원으로서 작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 함유할 만큼 적어도 충분한 크기이다. 예를 들어, 단일 단백질은 복수의 여러가지 면역원성 도메인들을 포함할 수 있다. 면역원성 도메인은, 체액성 면역 반응의 경우에서와 같이, 단백질의 선형 서열일 필요는 없으며, 구조 도메인(conformational domain)이 고려된다.
소정의 단백질의 "기능성 도메인"은 단백질과 관련된, 단백질에 의해 부여되는 또는 단백질에 의해 수행되는 한가지 이상의 생물학적 또는 화학적 기능을 직접 또는 간접적으로 담당하는 서열 또는 구조를 포함하는, 단백질의 일부 또는 기능성 유닛이다. 예를 들어, 기능성 도메인은 효소 활성을 위한 활성부, 리간드 결합부, 수용체 결합부, 칼슘 등의 분자 또는 모이어티의 결합부, 인산화 부위 또는 트랜스활성화 도메인을 포함할 수 있다. HBV 기능성 도메인의 예로는, 비제한적인 예로서, pre-S1의 바이러스 간 세포 수용체 도메인 또는 중합효소의 역전사효소 도메인 또는 RNase H 도메인이 있다.
소정의 단백질의 "구조 도메인"은, 식별가능한 구조를 가지거나, 자가-안정적이거나, 및/또는 단백질의 나머지 부분과는 독립적으로 폴딩될 수 있는, 단백질의 일부분 또는 단백질의 전체 구조 (예, 이는 단백질의 클래스 또는 패밀리 범위에 속하는 수종의 단백질들에 속하며 이를 나타내는 일차 또는 삼처 구조일 수 있음)의 한 요소이다. 구조 도메인은 대개 이것이 속하는 단백질의 생물학적 기능과 조합되어 있거나, 상기한 기능에서 주로 특징적이다.
에피토프는 적절한 공동자극 신호 및/또는 면역 시스템의 활성화된 세포 상황에서 면역 시스템에 제공되었을 때 면역 반응을 유도하기에 충분한 소정의 항원의 단일 면역원성 부위(immunogenic site)로서 본원에서 정의된다. 다시 말해, 에피토프는 실제 면역 시스템을 구성하는 성분들에 의해 인지되는 항원의 일부분이며, 또한 항원성 결정기(antigenic determinant)로도 지칭될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, T 세포 에피토프가 B 세포 또는 항체 에피토프들과 크기 및 조성 측면에서 상이하며, 클래스 I MHC 경로를 통하여 제시되는 에피토프가 클래스 II MHC 경로를 통하여 제시되는 에피토프와 다르다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 클래스 I MHC 분자에 의해 제시되는 T 세포 에피토프는 전형적으로 그 길이가 아미노산 8-11개인 반면, 클래스 II MHC 분자에 의해 제시되는 에피토프는 길이 제한성이 거의 없으며, 아미노산 8 내지 최대 25개 또는 그 이상일 수 있다. 아울러, T 세포 에피토프는 에피토프가 결합된 구체적인 MHC 분자에 따라 예상되는 구조 특징들을 가진다. 여러가지 다중 T 세포 에피토프들이 다양한 HBV 균주들과 다수의 인간 HLA 타입들에서 동정되었으며, 몇가지는 표 5에서 확인된다. 또한, 특정 뮤라인 MHC 하플로타입(haplotype)에 대한 에피토프들이 본원에서 새롭게 발견되었으며, 표 5 또는 실시예들에 제시된다. 에피토프는 선형 서열 에피토프 또는 구조형 에피토프(conformational epitope) (보존된 결합 영역)일 수 있다. 대부분의 항체들은 구조형 에피토프를 인지한다.
본 발명의 예시적인 일 구현예는 멀티-단백질 HBV 항원인 HBV 항원을 포함하는 융합 단백질, 이러한 예로서, 소수성 막관통 도메인들 모두를 포함하는 HBV 대형 (L) 표면 항원 및 아래에서 상세히 기술된 코어 항원 (HBcAg)으로 구성된 융합 단백질에 관한 것이다. 표면 항원 및 코어는 감염된 세포에서 다량 발현되며, 바이러스 복제에 필요하며, 복수의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 에피토프들을 포함한다. 또한, 이들 항원, 특히 표면 항원은 항-바이러스 요법에 의해 유도될 수 있는 공지의 돌연변이 부위를 포함하며; 이들 부위는 필요에 따라 "탈출" 돌연변이를 타겟팅하는 부가적인 면역치료 조성물을 제공하도록 변형될 수 있다. 이들 단백질, 구체적으로 단일 면역치료 조성물에서 단백질 양쪽을 타겟팅하는에 있어 부가적인 이점은, 여러가지 HBV 유전자형들에서 아미노산 수준에서의 높은 수준의 보존성이다. 코어 및 표면 (L) 단백질 둘다, 예를 들어 아메리카와 아시아에서 우위를 차지하는 유전자형인 (표 2), HBV 유전자형 A와 C 또는 A와 H에서 고도로 보존되어 있다 (표 4). 코어 단백질은 유전자형 A와 C, 그리고 유전자형 A와 H 간의 아미노산 동일성이 95%이다. 또한, 대형 (L) 표면 단백질은 여러가지 HBV 유전자형들에 고도로 보존되어 있으며; 유전자형 A와 C 간의 아미노산 동일성은 90%이고, 유전자형 A와 H 간의 아미노산 동일성은 82%이다.
표 4
비교 코어 표면 (L) X 중합효소
HBV 유전자형 A vs. HBV 유전자형 C 95 90 89 90
HBV 유전자형 A vs. HBV 유전자형 H 95 82 79 82
따라서, HBV 유전자형을 이용하여 설계된 한가지 면역치료 조성물이, 보존된 에피토프들에 대한 직접 타겟팅을 통해, 또는 유전자형들 간에 보존된 에피토프에 대한 처음 타겟팅의 결과로서 에피토프 확산을 통해, 유사성이 높은 HBV 유전자형에 대해 효과적인 면역 반응을 유도하는 것으로 예측할 수 있다. 다른 예로, 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물의 제조 용이성으로 인해, 면역요법의 광범위한 활용성을 높이기 위해, 다른 유전자형 유래의 단백질, 도메인 또는 에피토프를 코딩하도록 서열을 변형시키거나, 또는 2종 이상의 다른 HBV 유전자형으로부터 유래된 여러가지 T 세포 에피토프들 또는 전체 도메인 및/또는 단백질들을 동일한 구조체에 포함시키는 것은 간단한 일이다. 이들 HBV 항원의 예들은 아래에 자세하게 기술되고 예시된다. 본 발명의 한가지 면역치료 조성물이 하나의 산물 형태로 2개의 HBV 항원들, 표면 및 코어 단백질을 타겟팅하도록 설계되면, 이러한 방식은 다른 필수적인, 보존된, 면역원성 HBV 바이러스 단백질들의 단백질 서열을 병합하여, 심지어 보다 광범위한 세포성 면역 반응을 형성하도록, 용이하게 확장시킬 수 있다. 이러한 부가적인 융합 단백질 및 면역치료 조성물들이 본원에 기술되고 예시된다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 방법에 사용하기 위한 HBV 항원(들)은, 효모-기반의 면역치료 조성물의 맥락에서 등의 임상 제품으로서의 그 유용성을 최적화 또는 강화하도록 설계된 HBV 항원들로부터 선택된다. 이러한 HBV 항원들은 다음과 같은 한가지 이상의 목표를 달성하는 HBV 효모-기반의 면역치료 산물이 제조되도록 설계된다: (1) 국립보건원 (NIH)의 재조합 DNA 자문위원회 (RAC)의 지침 준수에 따라, 감염성 물질의 게놈의 2/3 이상은 재조합 치료제 또는 백신에 사용될 수 없음; (2) 급성/자기-제한성 HBV 감염 및/또는 만성 HBV 감염에 대한 면역 반응과 연관된 공지 T 세포 에피토프를 최대 수로 포함함 (후술되는 바와 같이, 일 측면에서 급성/자기-제한성 에피토프 레페토리에 입각한 우선 순위); (3) HBV 유전자형 및/또는 서브-유전자형들에서 가장 잘 보존되어 있거나, 또는 컨센서스 서열로 쉽게 변형가능하거나 타겟 유전자형들에서 가장 중요한 서열 차이를 커버하기 위해 2가지 이상의 형태로 포함될 수 있는, 면역원성 도메인, 보다 구체적으로 T 세포 에피토프 (CD4+ 및/또는 CD8+ 에피토프, 및 우성 및/또는 준-우성 에피토프)를 최대로 또는 우선적으로 포함함; 및/또는 (4) 산물내 HBV 항원의 서열내 비-천연 정션의 수 최소화.
이에, 본 발명은, 일부 구현예들에서, 전술한 한가지 이상의 항목을 충족시킬 뿐만 아니라 본원의 도처에 기술된 설계 인자 및/또는 항원 설계 기준을 포함시키기 위한, 소정의 균주에서의 천연 또는 야생형 서열 유래 HBV 항원들의 변형을 포함한다. 이러한 기준 및 항원 설계 지침은 개별 HBV 단백질 또는 도메인인 HBV 항원 뿐만 아니라 HBV 단백질들 또는 도메인들의 조합, 구체적으로 멀티-단백질 항원/융합 단백질 (예, 2종 이상의 상이한 HBV 단백질 및/또는 이의 도메인 유래 HBV 항원, 예를 들어, HBV 표면 단백질, 중합효소, 코어, e-항원 및/또는 X 항원 유래 항원들의 조합)을 포함하는 HBV 항원을 포함하는, 효모-기반의 면역치료 조성물에 적용가능하다. HBV 항원의 복잡성이 증가됨에 따라, 더 많은 수의 이들 기준 적용이 항원 구축에 이행되는 것으로 이해될 것이다.
따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 효모에 의해 발현시킬 단백질 또는 융합 단백질로서 본 발명에서 이용가능한 HBV 항원은 HBV 게놈이 2/3 미만인 뉴클레오티드 서열로 코딩되는 HBV 서열을 포함한다. (즉, 항원은 전체에서 HBV 게놈이 전체에서 차지하는 비중이 2/3 미만인 핵산 서열 또는 재조합 치료제 및 예방제에 대한 RAC 요건을 충족시키는 핵산 서열로 코딩됨). 일 측면에서, 본 구현예는, 전장 또는 거의-전장 형태에서 RAC 요건을 충족시키는 효모-기반의 면역치료제에서 발현시키기 위한 HBV 항원 (예, X 항원은 작아, 단독 사용시 RAC 요건을 충족시키게 됨)을 선택함으로써, 달성될 수 있다. 다른 측면에서, 본 구현예는, 단백질 크기를 줄이거나(truncation), 단백질에서 내부 서열을 제거하기 위한 서열을 결손(deletion)시키거나, 단백질의 선택한 기능성 도메인, 구조 도메인 또는 면역원성 도메인만을 포함시키거나, 또는 항원 구조체내 특정 단백질의 함유를 제외하도록 선택함으로써와 같이, HBV 항원에 포함시킬 단백질(들) 및/또는 도메인(들)의 구조를 변형시킴으로써 달성된다. 아울러, HBV 효모-기반의 면역치료제는, 일 구현예에서, 개별 항원 구조체들로서 제조할 수 있으며, 그런 후 바이러스 게놈과 관련된 어떠한 제약도 위반하지 않는 방식으로 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 전술한 바와 같이, 예컨대 면역치료제에 함유되는 HBV 항원이 다른 설계 요건, 예컨대 전술한 RAC 요건을 충족시키도록 변형되었다면, HBV 항원 구조체 (단백질 또는 융합 단백질)내 T 세포 에피토프의 함유가 극대화된다. 이러한 구현예에서, 효모-기반의 면역치료제에 사용가능한 HBV 항원은 면역원성 도메인의 수, 일 측면에서, HBV 항원에 보유되는 T 세포 에피토프의 수를 최대화하기 위한 목적으로 변형된다. 일 측면에서, HBV 항원내 T 세포 에피토프의 함유는 다음과 같이 우선 순위를 가진다:
급성/ 자가-제한성 HBV 감염 및 만성 HBV 감염 둘다에 대한 면역 반응이 확인되는 에피토프 > 급성/ 자가-제한성 HBV 감염에 대한 면역 반응이 확인되는 에피토프 > 만성 HBV 감염에 대한 면역 반응이 확인되는 에피토프.
이러한 구현예에서, 이론으로 결부되지 않으나, 본 발명자들은 급성 또는 자가-제한성 HBV 감염에 걸린 개체의 면역 반응이 만성 HBV 감염에 걸린 개체의 면역 반응에 비해 바이러스 감염을 소멸하는데 훨씬 생산적일 수 있다고 생각한다. 따라서, (우성 또는 준-우성이든 상관없이) 급성 또는 자가-제한성 감염에서 바이러스 소멸과 연관된 것으로 보이는 T 세포 에피토프를 함유하는 것이, 면역화된 개체에서 유익한 면역 반응을 도출할 가능성이 더 높기 때문에, 우선시된다. 또한, 이론으로 결부되지 않지만, 본 발명의 발명자들은, 효모-기반의 면역치료제를 이용하여 한가지 이상의 HBV 타겟 항원에 대해 면역 반응을 발생시키면, 면역화된 개체에서는 효모-기반의 면역치료제에 포함되는 에피토프 뿐만 아니라 개체에 존재하는 다른 HBV 에피토프들에 대해서도 면역 반응이 형성될 것으로 생각한다. 이러한 현상을 "에피토프 확장"이라고 하며, 치료학적 효과와 가장 관련성이 높은 것으로 보이는 에피토프에 초점을 맞춘 HBV 항원 설계를 가능하게 하며, 그래서 효모-기반의 면역치료 산물의 작동 기전은 면역 시스템이 부가적인 타겟 에피토프를 커버하도록 면역 반응을 확장시킬 수 있으며, 그에 따라 HBV에 대한 치료학적으로 생산적이거나 유익한 면역 반응을 강화할 수 있다.
이에, HBV 항원은, 일 구현예에서, 하나 이상의 CTL 에피토프 (예, 적절한 클래스 I MCH 분자에 제시되는 경우, 세포독성 T 림프구 (CTL)의 T 세포 수용체에 의해 인지되는 에피토프)를 포함한다. 일 측면에서, HBV 항원은 하나 이상의 CD4+ T 세포 에피토프 (예, 적절한 클래스 II MCH 분자에 제시되는 경우, CD4+ T 세포의 T 세포 수용체에 의해 인지되는 에피토프)를 포함한다. 일 측면에서, HBV 항원은 하나 이상의 CTL 에피토프와 하나 이상의 CD4+ T 세포 에피토프를 포함한다. 일 측면에서, 본 발명의 면역치료 조성물에 사용가능한 HBV 항원은 표 5에 기술된 HBV CTL 에피토프의 예들 중 하나 이상을 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자는, 하기 제시된 지침을 고려하여, 심지어 일부 아미노산이 표 5의 서열과 상이할 수 있더라도, 임의의 유전자형, 서브-유전자형 또는 균주/분리주의 소정의 HBV 서열에서 표 5의 각 에피토프에 대한 해당 서열의 위치를 쉽게 파악할 수 있을 것이다. 이러한 차이의 예는 표 5에 예시된다. 본 발명은 다른 것들이 당해 기술 분야에 공지될 수 있으며 본 발명에서의 사용이 고려되므로, 상기한 에피토프를 포함하는 항원으로 한정되지 않는다. 일 구현예에서, 유전자형, 서브-유전자형 또는 균주/분리주들간에 에피토프에 하나 이상의 아미노산 차이가 있을 수 있기 때문에, 에피토프는 HBV의 소정의 유전자형, 서브-유전자형 또는 균주/분리주 범위내의 에피토프 서열과 일치하도록 변형될 수 있다.
표 5
에피토프 서열 식별자 HBV 항원 HLA 선호도
FLLTRILTI 1,2,3 서열번호 42 표면
(예, S의 20-28번 위치; 예, 서열번호 34의 194-202번 위치, 서열번호 34의 201-209번 위치, 서열번호 36의 51-59번 위치에 해당됨)		 A*0201
GLSPTVWLSV 5 서열번호 43 표면
(예, S의 185-194번 위치; 예, 서열번호 11의 359-368번 위치, 서열번호 34의 366-375번 위치, 서열번호 36의216-225**번 위치에 해당됨)		 A*0201
FLPSDFFPSI 2,3,4 서열번호 44 코어
(예, 프리코어의 47-56번 위치; 예, 서열번호 9의 47-56번 위치, 서열번호 34의 424-433번 위치, 또는 서열번호 36의 621-630번 위치에 해당됨)		 A*0201
FLLSLGIHL 1 서열번호 45 중합효소
(예, Pol의 575-583번 위치; 예, 서열번호 10의 573-581번 위치, 또는 서열번호 36의 486-494번 위치에 해당됨)		 A*0201
WLSLLVPFV 1,3,5 서열번호 46 표면
(예, S의 172-180번 위치; 예, 서열번호 11의 346-354번 위치, 서열번호 34의 353-361†번 위치, 또는 서열번호 36의 203-211번 위치에 해당됨)		 A*0201
KYTSFPWLL 서열번호 47 중합효소
(예, Pol의 756-764번 위치; 예, 서열번호 10의 756-764번 위치에 해당됨)		 A*2402
YVNVNMGLK 4 서열번호 48 코어
(예, 프리코어의 117-125번 위치; 예, 서열번호 9의 117-125번 위치, 서열번호 34의 494-502번 위치, 또는 서열번호 36의 691-699번 위치에 해당됨)		 A*1101
EYLVSFGVW 서열번호 49 코어
(예, 프리코어의 146-154번 위치; 예, 서열번호 9의 146-154번 위치, 서열번호 34의 523-531번 위치, 또는 서열번호 36의 720-728번 위치에 해당됨)		 A*2402
GLSRYVARL 3 서열번호 50 중합효소
(예, Pol의 455-463번 위치; 예, 서열번호 10의 453-461‡번 위치, 서열번호 36의 366-374번 위치에 해당됨)		 A*0201
CLFKDWEEL 5 서열번호 51 X
(예, X의 115-123번 위치; 예, 서열번호 12의 115-123§번 위치, 서열번호 36의 900-908§번 위치에 해당됨)		 A*02
PLGFFPDH 5 서열번호 52 표면
(예, Pre-S1의 21-28번 위치; 예, 서열번호 11의 21-28번 위치, 서열번호 34의 28-35번 위치, 또는 서열번호 36의 6-13번 위치에 해당됨)		 A*11
IPIPSSWAF 5 서열번호 53 표면
(예, S의 150-158번 위치; 예, 서열번호 11의 324-332번 위치, 서열번호 34의 331-339번 위치, 또는 서열번호 36의 181-189번 위치에 해당됨)		 B*07
LPSDFFPSV 5 서열번호 54 코어
(예, 프리코어의 48-56번 위치; 예, 서열번호 9의 48-56∥번 위치, 서열번호 34의 425-433∥번 위치, 또는 서열번호 619-630∥번 위치에 해당됨)		 B*51
MQWNSTALHQALQDP 5 서열번호 55 표면
(예, pre-S2의 1-15번 위치; 예, ***서열번호 3의 120-134번 위치에 해당됨)		 A*3
LLDPRVRGL 5 서열번호 56 표면
(예, pre-S2의 12-20번 위치; 예, ***서열번호 3의 131-139번 위치에 해당됨)		 A*2
SILSKTGDPV 5 서열번호 57 표면
(예, pre-S2의 44-53번 위치; 예, ***서열번호 3의 163-172번 위치에 해당됨)		 A*2
VLQAGFFLL 5 서열번호 58 표면
(예, S의 14-22번 위치; 예, ***서열번호 3의 188-196번 위치에 해당됨)		 A*2
FLLTRILTI 5 서열번호 59 표면
(예, S의 20-28번 위치; 예, ***서열번호 3의 194-202번 위치에 해당됨)		 A*2
FLGGTPVCL 5 서열번호 60 표면
(예, S의 41-49번 위치; 예, ***서열번호 3의 215-223번 위치에 해당됨)		 A*2
LLCLIFLLV 5 서열번호 61 표면
(예, S의 88-96번 위치; 예, ***서열번호 3의 262-270번 위치에 해당됨)		 A*2
LVLLDYQGML 5 서열번호 62 표면
(예, S의 95-104번 위치; 예, ***서열번호 3의 269-278번 위치에 해당됨)		 A*2
LLDYQGMLPV 5 서열번호 63 표면
(예, S의 97-106번 위치; 예, ***서열번호 3의 271-280번 위치에 해당됨)		 A*2
SIVSPFIPLL 5 서열번호 64 표면
(예, S의 207-216번 위치; 예, ***서열번호 3의 381-390번 위치에 해당됨)		 A*2
ILSPFLPLL 5 서열번호 65 표면
(예, S의 208-216번 위치; 예, ***서열번호 3의 382-390번 위치에 해당됨)		 A*2
TPARVTGGVF 5 서열번호 66 중합효소
(예, Pol의 367-376번 위치; 예, ***서열번호 2의 367-376 of 서열번호 3)		 B*7
LVVDFSQFSR 5 서열번호 67 중합효소
(예, Pol의 390-399번 위치; 예, ***서열번호 2의 390-399번 위치에 해당됨)		 A*3
SAICSVVRR 5 서열번호 68 중합효소
(예, Pol의 533-541번 위치; 예, ***서열번호 2의 533-541번 위치에 해당됨)		 A*3
YMDDVVLGA 5 서열번호 69 중합효소
(예, Pol의 551-559번 위치; 예, ***서열번호 2의 551-559번 위치에 해당됨)		 A*2
ALMPLYACI 5 서열번호 70 중합효소
(예, Pol의 655-663번 위치; 예, ***서열번호 2의 655-663번 위치에 해당됨)		 A*2
QAFTFSPTYK 5 서열번호 71 중합효소
(예, Pol의 667-676번 위치; 예, ***서열번호 2의 667-676번 위치에 해당됨)		 A*3
ATVELLSFLPSDFFPSV 5 서열번호 72 코어
(예, 프리코어의 40-56번 위치; 예, ***서열번호 1의 40-56번 위치에 해당됨)		 A*2
LPSDFFPSV 5 서열번호 73 코어
(예, 프리코어의 48-56번 위치; 예, ***서열번호 1의 48-56번 위치에 해당됨)		 B*51
CLTFGRETV 5 서열번호 74 코어
(예, 프리코어의 136-144번 위치; 예, ***서열번호 1의 136-144번 위치에 해당됨)		 A*2
VLEYLVSFGV 5 서열번호 75 코어
(예, 프리코어의 144-153번 위치; 예, ***서열번호 1의 144-153번 위치에 해당됨)		 A*2
ILSTLPETTV 5 서열번호 76 코어
(예, 프리코어의 168-177번 위치; 예, ***서열번호 1의 168-177번 위치에 해당됨)		 A*2
STLPETTVVRR 5 서열번호 77 코어
(예, 프리코어의 170-180번 위치; 예, ***서열번호 1의 170-180번 위치에 해당됨)		 A*3
HLSLRGLFV 5 서열번호 78 X
(예, X의 52-60번 위치; 예, ***서열번호 4의 52-60번 위치에 해당됨)		 A*2
VLHKRTLGL 5 서열번호 79 X
(예, X의 92-100번 위치; 예, ***서열번호 4의 92-100번 위치에 해당됨)		 A*2
GLSAMSTTDL 5 서열번호 80 X
(예, X의 99-108번 위치; 예, ***서열번호 4의 99-108번 위치에 해당됨)		 A*2
VLGGCRHKL 5 서열번호 81 X
(예, X의 133-141번 위치; 예, ***서열번호 4의 133-141번 위치에 해당됨)		 A*2
NVSIWTHK 5 서열번호 82 중합효소
(예, Pol의 49-57번 위치; 예, ***서열번호 2의 49-57번 위치에 해당됨)		 A*3
KVGNFTGLY 5 서열번호 83 중합효소
(예,Pol의 57-65번 위치; 예, ***서열번호 2의 57-65번 위치에 해당됨)		 A*3
GLYSSTVPV 5 서열번호 84 중합효소
(예, Pol의 63-71번 위치; 예, ***서열번호 2의 63-71번 위치에 해당됨)		 A*2
TLWKAGILYK 5 서열번호 85 중합효소
(예, Pol의 152-161번 위치; 예, ***서열번호 2의번 위치에 해당됨)		 A*3
KYTSFPWLL 5 서열번호 86 중합효소
(예, Pol의 756-764번 위치; 예, ***서열번호 2의 758-766번 위치에 해당됨)		 A*24
ILRGTSFVYV 5 서열번호 87 중합효소
(예, Pol의 773-782번 위치; 예, ***서열번호 2의 773-782번 위치에 해당됨)		 A*2
SLYADSPSV 5 서열번호 88 중합효소
(예, Pol의 816-824번 위치; 예, ***서열번호 2의 816-824번 위치에 해당됨)		 A*2
KLHLYSHPI 6 서열번호 135 중합효소
(예, Pol의 502-510번 위치; 예, ***서열번호 2의 502-510번 위치에 해당됨)		 A*2
LLVPFVQWFV 6,7 서열번호 136 표면
(예, S의 349-358번 위치; 예, ***서열번호 3의 349-358번 위치에 해당됨)		 A*2
HLYSHPIIL 8 서열번호 137 중합효소
(예, Pol의 504-512번 위치; 예, ***서열번호 2의 504-512번 위치에 해당됨)		 A*2
WSPQAQGIL 9 서열번호 138 표면
(예, S의 77-84번 위치; 예, ***서열번호 3의 77-84번 위치에 해당됨)		 H-2Db
VLLDYQGM 10 서열번호 139 표면
(예, S의 270-277번 위치; 예, ***서열번호 3의 270-277번 위치에 해당됨)		 H-2Kb
ASVRFSWL 10 서열번호 140 표면
(예, S의 340-347번 위치; 예, ***서열번호 3의 340-347번 위치에 해당됨)		 H-2Kb
** 서열번호 43의 9번 위치; 서열번호 36의 225번 위치에서, Val가 Ala으로 치환.
† 서열번호 46의 5번 및 6번 위치; 서열번호 34의 357번 및 358번 위치에서, Leu-Val가 Gln-Ala으로 치환.
‡ 서열번호 50의 3번 위치; 서열번호 10의 455번 위치에서, Ser가 Pro으로 치환.
§ 서열번호 51의 2번 위치; 서열번호 12의 116번 위치와 서열번호 36의 901번 위치에서, Leu가 Val로 치환.
∥ 서열번호 54의 9번 위치; 서열번호 9의 56번 위치, 서열번호 34의 433번 위치, 및 서열번호 36의 630번 위치에서, Val가 Ile으로 치환.
*** 더 큰 단백질 또는 도메인내 에피토프의 위치는 쉽게 확인할 수 있지만, 유전자형, 서브-유전자형 또는 균주 차이로 인해, 대응되는 더 큰 단백질 또는 도메인의 에피토프 서열과 실제 서열 간에 하나 이상의 아미노산 차이가 존재할 수 있음.
1Zhang et al., Journal of Hepatology 50:1163-1173 (2009)
2Lopes et al., J. Clin. Invest. 118:1835-1845 (2008)
3Boettler et al., J Virol 80(7):3532-3540 (2006)
4Peng et al., Mol. Immunol. 45:963-970 (2008)
5Desmond 2008; www.allelefrequencies.net or Desmond et al., Antiviral Ther. 13:16-175 (2008)
6Webster et al., 2004, J. Virol. 78(11)5707-5719
7Vitiello, 1997, Eur. J. Immunol. 27(3): 671-678
8Sette et al., 1994, J. Immunol. 153(12): 5586-5592
9Murine H-2Db 에피토프, 기존에 보고되지 않음
10Murine H-2Kb 에피토프, 기존에 보고되지 않음
본 발명의 일 구현예에서, 사용가능한 HBV 항원은 "우성" 에피토프 (즉, 전체 단백질에 대한 T 세포 반응 발현에 기여하거나, 및/또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응들을 발생시킬 가능성이 가장 높거나 가장 쉽게 발생시키는, 거대한 잠재적인 에피토프 그룹내 상대적으로 적은 수의 T 세포 에피토프 중 하나인 T 세포 에피토프, 또한 "면역우성 에피토프(immunodominant epitope)"로도 지칭됨)로 언급되었거나 결정된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 항원으로서 한가지 이상의 효모-기반의 면역치료 조성물에 포함될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명에서 사용가능한 HBV 항원은, "준우성" 에피토프 (즉, 면역원성이지만 면역우성 에피토프 보다 중요성이 낮은 T 세포 에피토프; 준우성 에피토프에 의해 형성되는 면역 반응은 면역우성 에피토프에 대한 면역 반응에 의해 억제되거나 뒤쳐질 수 있음)로 언급되었거나 결정된 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 HBV 항원으로서, 동일하거나, 상이하거나, 또는 부가적인 효모-기반의 조성물에 포함될 수 있다. 마우스에서의 HBV T 세포 에피토프에 대한 CTL 반응을 통한 이러한 효과에 대한 일예로, Schirmbeck R., et al. J. immunology 168: 6253-6262, 2010; 또는 Sette et al. J Immunology 166:1389-1397, 2001을 참조한다. 본 발명의 일 측면에서, 면역우성 또는 준-우성 에피토프를 포함하는 여러가지 조성물들은 개체에 동일 부위에 투여될 수 있거나, 또는 일 구현예에서, 개체에서 다른 부위에 투여될 수 있다 (즉, 우성 에피토프를 포함하는 조성물은 어떤 부위에 투여되고, 준-우성 에피토프를 포함하는 조성물은 다른 부위에 투여됨). 일부 경우들에서, 준-우성 에피토프가 우성 에피토프와 비교하여 치료학적으로 보다 유익한 면역 반응을 발생시킬 수 있다. 따라서, 개별 부위에 투여된다면, 우성 에피토프에 대한 면역 반응이 준-우성 에피토프에 대한 면역 반응을 억제 또는 앞설 수 있는 기회를 줄여, 면역 반응을 전체적으로 극대화하고, 개체에서 예방적 또는 치료적 효과를 극대화할 수 있다. 또한, 개체의 다른 부위들에 투여되는 상이한 조성물에 상이한 항원을 제공하는 이러한 방식은, 모든 에피토프들이 우성이거나 준-우성인 경우에도 적용할 수 있다. 면역우성 에피토프 및 준-우성 에피토프들이 HBV 감염과 면역 반응에 역할을 하는 것으로 인식되고 있다 (예, Sette et al., 2001, supra. and Schirmbeck et al., 2002, supra).
본 발명의 일 구현예에서, 효모-기반의 면역치료제에 사용가능한 HBV 항원은, 유전자형 및/또는 서브-유전자형들간에 보존되어 있거나, 및/또는 수종의 여러가지 유전자형 및/또는 서브-유전자형으로부터 유래된 면역원성 도메인을 포함하거나, 및/또는 일부 사소한 측면에서 차이가 있는 복수의 효모-기반의 면역치료 산물을 제조하도록 쉽게 변형시킬 수 있으나, 개체 또는 개체 집단을 감염시키는 HBV 유전자형(들) 또는 서브-유전자형(들)을 토대로 여러가지 개체 또는 개체 집단을 치료하도록 맞춤 제작된 면역원성 도메인을 포함하는, 면역원성 도메인, 특히 T 세포 에피토프의 함유를 최대화한다. 예를 들어, HBV 항원은 치료 또는 예방할 개체 또는 개체 집단들에서 가장 우세한 유전자형 또는 서브-유전자형을 토대로 제조될 수 있으며, HBV 항원은 이들 유전자형들로부터 유래된 가장 보존된 면역원성 도메인을 포함한다. 다른 예로, 또는 아울러, 면역원성 도메인은, 그 도메인 또는 에피토프, 또는 한가지 버전 이상의 에피토프가 구조체 포함될 수 있기 때문에, 컨센서스 서열에 일치되게 변형시킬 수 있다.
효모-기반의 면역치료 조성물에 대한 HBV 항원 설계와 관련된 본 발명의 임의의 구현예에 있어서, 일 측면에서, HBV 항원을 포함하는 융합 단백질을 구성하는 세그먼트 사이의 인공 정션이 최소화된다 (즉, 비-천연 서열들의 함유는 가능한 수준으로 제한 또는 최소화됨). 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 자연적인 진화를 통해, i) 효모 등의 다른 세포에서도 잘 발현될 가능성이 가장 높은, 바이러스내 인접한 서열들(contiguous sequence); 및 ii) 적절하게 소화되어 면역계에 그 서열을 제시할 수 있는 항원 제시 세포내 면역프로테아좀(immunoproteasome)이 형성된 것으로 여겨진다. 본 발명의 효모-기반의 면역치료 산물은 숙주 면역 시스템이 타겟 항원을 처리 및 제시할 수 있게 하며; 따라서, 다수의 비천연 정션을 가진 융합 단백질은 천연 HBV 단백질 서열을 더 많이 보유한 것에 비해 효모-기반의 면역치료제에서의 유용성이 낮을 수 있다.
임의의 융합 단백질을 비롯한 본원에 기술된 임의의 HBV 항원에 있어서, 다음과 같은 부가적인 구현예이 적용될 수 있다. 먼저, 일부의 융합 단백질들에 포함된 N-말단 발현 서열과 C-말단 텍은 선택사항이며, 이를 사용하는 경우, 단백질의 발현, 안정성을 개선시키거나 및/또는 동정 및/또는 정제가 가능하도록, 본원의 도처에 기술된 수종의 여러가지 서열들로부터 선택될 수 있다. 다른 예로, N-말단 또는 C-말단 서열 중 하나 또는 둘다가 모두 생략된다. 또한, 효모에 사용하기에 적합한 다수의 여러가지 프로모터들이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 본 발명에 따른 HBV 항원의 발현에 사용하기 위한 것으로 포함된다. 아울러, 클로닝과 이후의 구조체의 조작을 용이하게 하기 위한 제한효소 도입 등의 여러가지 이유로 융합 단백질을 구성하는 파트들 사이에 더 짧은 개입 링커 (intervening linker) 서열 (예, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 아미노산 펩타이드)이 도입될 수 있다. 마지막으로, 본원의 도처에서 상세히 기술된 바와 같이, 본원에 기술된 서열들은 예일 뿐이며, 우성 및/또는 준-우성 T 세포 에피토프 등의, 바람직한 T 세포 에피토프의 함유, HBV 유전자형, HBV 서브유전자형, HBV 균주 또는 분리주에 대한 선호성 또는 컨센서스 서열을 수용하기 위해, 서열이 치환, 부가 또는 결손되도록 변형될 수 있다. 본 발명에서 이용가능한 수종의 여러가지 예시적인 HBV 항원에 대한 설명은 아래에 제공된다.
면역치료 조성물, HBV 항원, 융합 단백질, 또는 상기 조성물, HBV 항원 또는 융합 단백질의 사용에 관한 임의 구현예를 비롯하여, 본원에 기술된 본 발명에 대한 임의의 구현예들에 있어서, 일 측면에서, HBV 항원으로서, 또는 융합 단백질에, 또는 본 발명의 면역치료 조성물에 유용한, HBV 표면 항원의 아미노산은, 비제한적인 예로서, 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 11의 21-47번 위치, 서열번호 11의 176-400번 위치, 서열번호 15, 서열번호 19, 서열번호 23, 서열번호 27, 서열번호 31, 서열번호 34의 9-407번 위치, 서열번호 36의 6-257번 위치, 서열번호 41의 6-257번 위치, 서열번호 92의 92-343번 위치, 서열번호 93의 90-488번 위치, 서열번호 97, 서열번호 101의 90-338번 위치, 서열번호 102의 7-254번 위치, 서열번호 107의 1-249번 위치, 서열번호 108의 1-249번 위치, 서열번호 109의 1-249번 위치, 서열번호 110의 1-249번 위치, 서열번호 112의 1-399번 위치, 서열번호 114의 1-399번 위치, 또는 서열번호 116의 1-399번 위치, 서열번호 118의 1-399번 위치, 서열번호 120의 1-399번 위치, 서열번호 122의 1-399번 위치, 서열번호 124의 1-399번 위치, 서열번호 126의 1-399번 위치, 서열번호 128의 231-629번 위치, 서열번호 130의 63-461번 위치, 서열번호 132의 289-687번 위치, 서열번호 134의 289-687번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열을 포함할 수 있다.
면역치료 조성물, HBV 항원, 융합 단백질, 또는 상기 조성물, HBV 항원 또는 융합 단백질의 사용에 관한 임의 구현예를 비롯하여, 본원에 기술된 본 발명에 대한 임의의 구현예들에 있어서, 일 측면에서, HBV 항원으로서, 또는 융합 단백질에, 또는 본 발명의 면역치료 조성물에 유용한, HBV 중합효소의 아미노산은, 비제한적인 예로서, 서열번호 2의 383-602번 위치, 서열번호 6의 381-600번 위치, 서열번호 10의 381-600번 위치, 서열번호 10의 453-680번 위치, 서열번호 14의 370-589번 위치, 서열번호 18의 380-599번 위치, 서열번호 22의 381-600번 위치, 서열번호 26의 380-599번 위치, 서열번호 30의 381-600번 위치, 서열번호 36의 260-604번 위치, 서열번호 38의 7-351번 위치, 서열번호 40의 7-351번 위치, 서열번호 41의 260-604번 위치, 서열번호 92의 346-690번 위치, 서열번호 94의 90-434번 위치, 서열번호 98, 서열번호 101의 339-566번 위치, 서열번호 102의 255-482번 위치, 서열번호 107의 250-477번 위치, 서열번호 108의 250-477번 위치, 서열번호 109의 250-477번 위치, 서열번호 110의 250-477번 위치, 서열번호 120의 582-809번 위치, 서열번호 124의 582-809번 위치, 서열번호 126의 642-869번 위치, 서열번호 128의 1-228번 위치, 서열번호 132의 1-228번 위치, 서열번호 134의 61-288번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열을 포함할 수 있다.
면역치료 조성물, HBV 항원, 융합 단백질, 또는 상기 조성물, HBV 항원 또는 융합 단백질의 사용에 관한 임의 구현예를 비롯하여, 본원에 기술된 본 발명에 대한 임의의 구현예들에 있어서, 일 측면에서, HBV 항원으로서, 또는 융합 단백질에, 또는 본 발명의 면역치료 조성물에 유용한, HBV 코어 항원의 아미노산은, 비제한적인 예로서, 서열번호 1의 31-212번 위치, 서열번호 5의 31-212번 위치, 서열번호 9의 31-212번 위치, 서열번호 9의 37-188번 위치, 서열번호 13의 31-212번 위치, 서열번호 17의 31-212번 위치, 서열번호 21의 31-212번 위치, 서열번호 25의 14-194번 위치, 서열번호 29의 31-212번 위치, 서열번호 34의 408-589번 위치, 서열번호 36의 605-786번 위치, 서열번호 38의 352-533번 위치, 서열번호 39의 160-341번 위치, 서열번호 41의 605-786번 위치, 서열번호 92의 691-872번 위치, 서열번호 95의 90-271번 위치, 서열번호 99, 서열번호 101의 567-718번 위치, 서열번호 102의 483-634번 위치, 서열번호 105의 2-183번 위치, 서열번호 105의 184-395번 위치, 서열번호 105의 396-578번 위치, 서열번호 105의 579-761번 위치, 서열번호 106의 2-183번 위치, 서열번호 106의 338-520번 위치, 서열번호 107의 478-629번 위치, 서열번호 108의 478-629번 위치, 서열번호 109의 478-629번 위치, 서열번호 110의 478-629번 위치, 서열번호 112의 400-581번 위치, 서열번호 114의 400-581번 위치, 서열번호 116의 400-581번 위치, 서열번호 118의 400-581번 위치, 서열번호 120의 400-581번 위치, 서열번호 122의 400-581번 위치, 서열번호 124의 400-581번 위치, 서열번호 126의 400-581번 위치, 서열번호 128의 630-811번 위치, 서열번호 130의 462-643번 위치, 서열번호 132의 688-869번 위치, 서열번호 134의 688-869번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열을 포함할 수 있다.
면역치료 조성물, HBV 항원, 융합 단백질, 또는 상기 조성물, HBV 항원 또는 융합 단백질의 사용에 관한 임의 구현예를 비롯하여, 본원에 기술된 본 발명에 대한 임의의 구현예들에 있어서, 일 측면에서, HBV 항원으로서, 또는 융합 단백질에, 또는 본 발명의 면역치료 조성물에 유용한, HBV X 항원의 아미노산은, 비제한적인 예로서, 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 12의 2-154번 위치, 서열번호 16, 서열번호 20, 서열번호 24, 서열번호 28, 서열번호 32, 서열번호 4의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 8의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 12의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 16의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 20의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 24의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 28의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 32의 52-68번 위치 + 84-126번 위치, 서열번호 36의 787-939번 위치, 서열번호 39의 7-159번 위치, 서열번호 92의 873-1025번 위치, 서열번호 96의 90-242번 위치, 서열번호 100, 서열번호 101의 719-778번 위치, 서열번호 102의 635-694번 위치, 서열번호 106의 184-337번 위치, 서열번호 106의 521-674번 위치, 서열번호 107의 630-689번 위치, 서열번호 108의 630-689번 위치, 서열번호 109의 630-689번 위치, 서열번호 110의 630-689번 위치, 서열번호 122의 582-641번 위치, 서열번호 124의 810-869번 위치, 서열번호 126의 582-641번 위치, 서열번호 130의 1-60번 위치, 서열번호 132의 229-288번 위치, 서열번호 134의 1-60번 위치, 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열을 포함할 수 있다.
표면 항원 및 코어 단백질을 포함하는 HBV 항원. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 방법에 사용하기 위한 HBV 항원(들)은, HBV 대형 (L) 표면 항원 또는 이의 하나 이상의 면역원성 도메인 및 HBV 코어 단백질 (HBcAg) 또는 이의 하나 이상의 면역원성 도메인으로 구성된 또는 이를 포함하는, HBV 항원을 포함하는, 융합 단백질이다. 일 측면에서, HBV 대형 (L) 표면 항원 및/또는 HBV 코어 단백질은 전장 또는 거의 전장이다. 본 발명의 임의의 구현예에 있어서, "전장" 단백질 (또는 전장 기능성 도메인 또는 전장 면역학적 도메인)에 대한 언급은, 본원에 기술된 바와 같이, 또는 공공의 이용가능한 서열에 공지되거나 언급된 바와 같이, 단백질의 전장 아미노산 서열, 또는 기능성 도메인 또는 면역학적 도메인을 포함한다. 또한, 단백질의 상동체 타입인 "거의 전장"인 단백질 또는 도메인은, 전장 단백질 또는 전장 도메인의 N-말단 및/또는 C-말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 19 또는 10개의 아미노산이 부가, 결손 또는 생략됨으로써, 상기한 전장 단백질 또는 도메인과 차이가 있다. 단백질 또는 도메인에 대한 일반적인 언급은 전장 단백질과 거의 전장 단백질 둘다 뿐만 아니라 이의 다른 상동체를 포함할 수 있다.
일 측면에서, HBV 대형 (L) 표면 항원 또는 HBV 코어 단백질은, 적용가능한 바와 같이, 각각의 전장 HBV 대형 (L) 표면 항원 또는 HBV 코어 단백질의 선형 서열의, 또는 pre-S1의 간세포 수용체 결합부와 HBV 소형(S) 표면 항원의 전체 또는 일부를 포함하는, HBV 대형 표면 항원의 일부분의 선형 서열의, 서열번호 97 (최적화된 HBV 표면 항원, 하기에 기술됨), 서열번호 99 (최적화된 코어 단백질, 하기에 기술됨)로 표시되는 선형 아미노산 서열의, 또는 다른 HBV 균주로부터 유래된 해당 서열의, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 본 발명에 유용한 적정 HBV 표면 항원과 HBV 코어 항원에 대한 다른 다양한 서열들이 본원에 기술되어 있다. 일 측면에서, HBV 대형 (L) 표면 항원 또는 HBV 코어 단백질은, 적용가능한 경우, 각각 전장 HBV 대형 (L) 표면 항원 또는 HBV 코어 단백질, 본원에 기술된 다른 HBV 표면 항원 또는 HBV 코어 항원, 예컨대 서열번호 97 (최적화된 HBV 표면 항원, 하기에 기술됨), 서열번호 99 (최적화된 코어 단백질, 하기에 기술됨)로 표시되는 아미노산 서열, 또는 다른 HBV 균주로부터 유래된 대응되는 서열과, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.
이러한 융합 단백질은 도 2에 개략적으로 예시된다. 이러한 융합 단백질을 포함하는 조성물의 일 예는 실시예 1에서 설명된다. 이러한 구현예에서, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를, 도 2에 표시된 다양한 HBV 표면-코어 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1, 또는 TEF2 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작하였다. 각 경우에, HBV 융합 단백질은, 서열번호 34로 표시되는, N-말단에서 C-말단 방향의 골격으로 융합된 하기 서열을 가진 단일 폴리펩타이드이다: (1) 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정화하기 위한 N-말단 펩타이드 (예, 서열번호 34의 1번 위치에서 6번 위치); 2) SpeI 제한효소 부위를 도입하기 위한 2개의 아미노산 스페이서; 3) 거의 전장 (위치 1번 생략) HBV 유전자형 C 대형 (L) 표면 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 34의 9-407번 위치 또는 서열번호 11의 2-400번 위치 (서열번호 11의 350-351번 위치에서 서열번호 34와 차이가 있으며, 서열번호 11의 Leu-Val 서열이 서열번호 34의 357-358번 위치에서 Gln-Ala로 치환됨)); 4) HBV 코어 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 34의 408-589번 위치); 및 5) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 34의 590-595번 위치). 서열번호 34의 28-54번 위치는 대형 (L) 표면 단백질의 간세포 수용체 영역을 포함한다. 서열번호 34는 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 여러개의 에피토프와 도메인을 포함한다. 예를 들어, 서열번호 34에서, 209-220번 위치, 389-397번 위치, 360-367번 위치 및 499-506번 위치는 공지된 MHC 클래스 I 결합성 에피토프 및/또는 CTL 에피토프들을 포함한다. 서열번호 34의 305-328번 위치는 항체 에피토프를 포함한다. 서열번호 34의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모 발현용으로 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 33으로 표시된다. 또한, 이 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 본원에서 GI-13002로 언급된다.
본원에 기술된 임의의 융합 단백질에 사용되는 아미노산 세그먼트들은 임의의 도메인의 한쪽 말단의 측면에 위치한 부가적인 아미노산을 사용함으로써 변형시킬 수 있으며; 본원에 제공되는 설명은 예에 불과하다. 예컨대, 이러한 구현예에 따른 융합 단백질은, 1) 거의 전장 (위치 1번이 생략됨) HBV 유전자형 C 대형 (L) 표면 항원 (예, 서열번호 11의 2-400번 위치 또는 서열번호 34의 9-407번 위치)의 아미노산 서열; 및 2) HBV 코어 항원 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 34의 408-589번 위치)의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, N- 또는 C-말단 서열을 활용하지 않거나 여러가지 N- 또는 C-말단 서열을 활용하거나, 또는 HBV 서열들 사이에 링커를 이용하지 않는다. 일 구현예에서, 서열번호 34의 1-6번 위치로 표시되는 N-말단 펩타이드 대신, 서열번호 89 또는 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드가 이용되며, 헥사히스티딘 C-말단 텍을 포함하거나 포함하지 않는 융합 단백질의 나머지 부분이 이어진다. 또한, 융합 단백질은 HBV 단백질들과 도메인들 사이에 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 링커 (스페이서) 아미노산을 포함할 수도 있다. 동일한 대안적인 구현예들은 본원에 기술된 바와 같이 본 발명에 사용되는 임의의 융합 단백질 또는 HBV 항원 구조체에 적용된다.
융합 단백질과 본원에 기술 및/또는 예시된 다수의 그외의 것을 설계하기 위해 사용되는 HBV 서열은 특정 HBV 유전자형 (예, 유전자형 A, B, C, 또는 D)의 분리주들을 토대로 한다. 그러나, 한가지 특정 유전자형, 서브-유전자형 또는 균주를 토대로 하거나 이로부터 유래된 본원에 기술된 HBV 항원의 임의 일부에 해당 서열을 부가 또는 치환하는 것, 또는 심지어 임의의 다른 HBV 유전자형(들), 서브-유전자형(들) 또는 균주(들)로부터 유래된, 해당 서열에서 발생하는 한개 또는 작은 범위의 아미노산 치환, 삽입 또는 결손은 본 발명의 일 예이다. 일 구현예에서, HBV 항원은 본원에 기술된 HBV 항원의 전체 서열(들)을 하나 이상의 다른 HBV 유전자형, 서브-유전자형 또는 균주/분리주로부터 유래된 대응되는 서열(들)로 치환함으로써, 제조할 수 있다. 한가지 HBV 유전자형 또는 서브-유전자형 유래 서열을 다른 것으로 치환하거나 부가하는 것은, 예를 들어, 특정 개체 또는 개체 집단 (예, 국가 또는 국가의 한 지역에서 가장 유행하는 HBV 유전자형(들)을 타겟팅하기 위해, 소정의 국가 또는 국가의 지역의 개체 집단)에 대한 면역치료 조성물의 맞춤 제작을 가능하게 한다. 마찬가지로, 컨센서스 서열과 가장 근접하거나 실제 동일하게 소정의 HBV 항원 서열에 변화를 가하기 위해, 소정의 HBV 균주, 유전자형 또는 서브타입들로부터 유래된, 이들로부터 확인된, 또는 이들로부터 공개된, 컨센서스 서열 전체 또는 일부를 이용하는 것도 본 발명의 일 구현예이다. 본 발명에 따라, 그리고 당해 기술 분야에서 통상적으로 이해되는 바와 같이, "컨센서스 서열"은 전형적으로 복수의 서열들을 정렬한 후, 소정의 서열의 특정 위치에 가장 공통된 뉴클레오티드나 아미노산을 기반으로 한 서열이다.
전술한 변형 타입들에 대한 구체적인 예로서, HBV 항원은 다른 분리주로부터 유래된 T 세포 에피토프와 가장 또는 실제 동일하도록, 또는 상기 T 세포 에피토프에 대한 컨센서스 서열과 가장 또는 실제 동일하도록, 한가지 분리주로부터 유래된 소정의 서열내에서 T 세포 에피토프가 바뀌게 변형시킬 수 있다. 이러한 T 세포 에피토프는 우성 에피토프 및/또는 준-우성 에피토프를 포함할 수 있다. 실제, 본 발명에 따라, 다양한 HBV 유전자형 및/또는 서브타입들로부터 유래된 컨센서스 서열, 또는 상이한 HBV 유전자형 및/또는 서브타입들로부터 유래된 서열들의 혼합을 통합하는 HBV 항원을 설계할 수 있다. 주요 공지 유전자형들 각각으로부터 유래된 예시적인 서열 전체에서 주요 HBV 단백질들의 정렬을, 예를 들어, 컨센서스 서열들의 형성을 알려주는, 공공의 이용가능한 소프트웨어를 이용하여 쉽게 수행할 수 있다. 아울러, 다수의 HBV 단백질들에서 컨센서스 서열들이 공개되어 있다. 여러가지 HBV 유전자형, 서브-유전자형 및 균주들간에 아미노산 수준에서의 보존성이 높기 때문에, 본원에 예시된 것 이외의 유전자형, 서브-유전자형 또는 균주로부터 유래된 HBV 단백질의 해당 영역을 이용하여, 본원에 기술된 바와 동일하거나 유사한 전체 구조를 가진 HBV 항원을 창출하는 것이 용이하다. 이러한 변형의 예들은 본원에 기술 및 예시되어 있다.
예를 들어, 서열 동일성에서의 차이는 전형적으로 비교 중인 서열 전장에 대해 20% 미만 (즉, 서열이 적어도 80% 동일함)일 것이고, 보다 전형적으로, 서열이 비교하는 서열의 전장에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 것임에도 불구하고, (즉, 균주 또는 분리주 변형으로 인해) 동일한 혈청형 및 유전자형에 속하는 동일한 단백질의 서열들 간에도 사소한 차이가 있을 수 있다. 예를 들어, 전술한 융합 단백질 (서열번호 34)에서, 융합 단백질에 사용되는 대형 (L) 표면 항원의 서열 (서열번호 34의 9-407번 위치)은 HBV 유전자형 C 분리주로부터 유래되며, 이는 HBV 유전자형 C 분리주의 대형 (L) 표면 항원으로부터 유래된 서열번호 11의 2-400번 위치와의 동일성이 약 99%이다 (즉, 서열번호 11의 350-351번 위치 (Gln-Ala)가 서열번호 34의 357-358번 위치 (Leu-Val)와 아미노산 2개 차이가 있음). 그러나, 어느 쪽 서열도, 다른 HBV 균주 유래 서열이 그러한 바와 같이, 본원에 기술된 융합 단백질에 사용하는데 적합하다. 따라서, 일 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 융합 단백질 등의, 본원에 기술된 임의의 HBV 항원에 이용되는 서열은, 한가지 이상의 다른 HBV 유전자형, 서브-유전자형 또는 균주로부터 유래된 해당 서열을 포함할 수 있다.
컨센서스 서열과 개별 HBV 유전자형에 대한 전술한 이용은 본원에 언급된 다양한 HBV 항원들에 적용된다. 예를 들어, 컨센서스 서열 설계는 HBV 표면 단백질과 HBV 코어 단백질을 포함하는, 서열번호 34를 들어 상기에서 언급된 융합 단백질에 적용된다. 실시예 7은 서열번호 34로 표시되는 융합 단백질과 유사하게 설계되지만, HBV 유전자형 A, B, C 및 D 각각의 컨센서스 서열을 토대로 하는 부가적인 융합 단백질을 기술한다. 도 2에 개략적으로 예시된, HBV 유전자형 A의 컨센서스 서열을 토대로 하는 HBV 표면 단백질과 코어 단백질을 포함하는 융합 단백질은, 서열번호 112로 표시되는 N-말단에서 C-말단 방향의 골격으로 융합된 하기 서열 인자들을 가진 단일 폴리펩타이드이다 (HBV 서열이 아닌 선택 서열은 서열번호 112의 기본 서열에 포함되진 않지만, 실시예 7에 기술된 구조체에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 이용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있는, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정화하도록 설계된, 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 아미노산 1, 2, 3개 이상으로 구성된 1-3개 이상의 아미노산 링커로 구성된 링커 펩타이드; (3) 서열번호 112의 1-399번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 A 대형 (L) 표면 항원의 거의 전장 (위치 1번 생략됨) 컨센서스 서열의 아미노산 서열; (4) 서열번호 112의 400-581번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 A 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열; 및 (5) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍. 서열번호 112의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서 발현을 위해 코돈 최적화됨)은 서열번호 111로 본 명세서에 표시된다. 이러한 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 또한 본원에서 GI-13006으로 지칭된다.
또한, 실시예 7은 서열번호 34로 표시되는 융합 단백질과 유사하게 설계되지만, HBV 유전자형 B의 컨센서스 서열을 토대로 하는 융합 단백질을 기술한다. 이 융합 단백질 역시 도 2에 개략적으로 예시되어 있으며, 이는 서열번호 114로 표시되는 N-말단에서 C-말단 방향의 골격으로 융합된 하기 서열 인자들을 가진 단일 폴리펩타이드이다 (HBV 서열이 아닌 선택 서열은 서열번호 114의 기본 서열에 포함되진 않지만, 실시예 7에 기술된 구조체에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 이용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있는, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정화하도록 설계된, 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 아미노산 1, 2, 3개 이상으로 구성된 1-3개 이상의 아미노산 링커로 구성된 링커 펩타이드; (3) 서열번호 114의 1-399번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 B 대형 (L) 표면 항원의 거의 전장 (위치 1번 생략됨) 컨센서스 서열의 아미노산 서열; (4) 서열번호 114의 400-581번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 B 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열; 및 (5) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍. 서열번호 114의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서 발현을 위해 코돈 최적화됨)은 서열번호 113으로 본 명세서에 표시된다. 이러한 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 또한 본원에서 GI-13007로 지칭된다.
실시예 7은 서열번호 34로 표시되는 융합 단백질과 유사하게 설계되지만, HBV 유전자형 C의 컨센서스 서열을 토대로 하는 융합 단백질을 기술한다. 이 융합 단백질 역시 도 2에 개략적으로 예시되어 있으며, 이는 서열번호 116으로 표시되는 N-말단에서 C-말단 방향의 골격으로 융합된 하기 서열 인자들을 가진 단일 폴리펩타이드이다 (HBV 서열이 아닌 선택 서열은 서열번호 116의 기본 서열에 포함되진 않지만, 실시예 7에 기술된 구조체에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 이용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있는, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정화하도록 설계된, 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 아미노산 1, 2, 3개 이상으로 구성된 1-3개 이상의 아미노산 링커로 구성된 링커 펩타이드; (3) 서열번호 116의 1-399번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 C 대형 (L) 표면 항원의 거의 전장 (위치 1번 생략됨) 컨센서스 서열의 아미노산 서열; (4) 서열번호 116의 400-581번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 C 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열; 및 (5) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍. 서열번호 116의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서 발현을 위해 코돈 최적화됨)은 서열번호 115로 본 명세서에 표시된다. 이러한 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 또한 본원에서 GI-13008로 지칭된다.
실시예 7은 서열번호 34로 표시되는 융합 단백질과 유사하게 설계되지만, HBV 유전자형 D의 컨센서스 서열을 토대로 하는 융합 단백질을 기술한다. 이 융합 단백질 역시 도 2에 개략적으로 예시되어 있으며, 이는 서열번호 118로 표시되는 N-말단에서 C-말단 방향의 골격으로 융합된 하기 서열 인자들을 가진 단일 폴리펩타이드이다 (HBV 서열이 아닌 선택 서열은 서열번호 118의 기본 서열에 포함되진 않지만, 실시예 7에 기술된 구조체에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 이용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있는, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정화하도록 설계된, 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 아미노산 1, 2, 3개 이상으로 구성된 1-3개 이상의 아미노산 링커로 구성된 링커 펩타이드; (3) 서열번호 118의 1-399번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원의 거의 전장 (위치 1번 생략됨) 컨센서스 서열의 아미노산 서열; (4) 서열번호 118의 400-581번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열; 및 (5) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍. 서열번호 118을 포함하며 N- 및 C-말단 펩타이드와 링커를 포함하는, 실시예 7에 기술된 완전한 융합 단백질의 핵산 서열은 서열번호 151로 표시된다. 서열번호 118 또는 서열번호 151의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서 발현을 위해 코돈 최적화됨)은 서열번호 117로 본 명세서에 표시된다. 이러한 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 또한 본원에서 GI-13009로 지칭된다.
표면 항원, 코어 단백질, 중합효소 및 X 항원을 포함하는 HBV 항원. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 방법에 사용하기 위한 HBV 항원(들)은, HBV 항원이 HBV 표면 항원 (대형 (L), 중형 (M) 또는 소형 (S)) 또는 이의 하나 이상의 구조 도메인, 기능성 도메인 또는 면역원성 도메인), HBV 중합효소 또는 이의 하나 이상의 구조 도메인, 기능성 도메인 또는 면역원성 도메인, HBV 코어 단백질 (HBcAg) 또는 HBV e-항원 (HBeAg) 또는 이의 하나 이상의 구조 도메인, 기능성 도메인 또는 면역원성 도메인, 및 HBV X 항원 (HBx) 또는 이의 하나 이상의 구조 도메인, 기능성 도메인 또는 면역원성 도메인을 포함하거나, 또는 이들로 구성된 것인, HBV 항원을 포함하는 융합 단백질이다. 일 측면에서, HBV 표면 항원, HBV 중합효소, HBV 코어 단백질, HBV e-항원, HBV X 항원 또는 이의 도메인 중 임의의 하나 이상은 전장 또는 거의 전장이다. 일 측면에서, HBV 표면 항원, HBV 중합효소, HBV 코어 단백질, HBV e-항원, HBV X 항원 또는 이의 도메인 중 임의의 하나 이상은, 각각 전장 HBV 표면 항원, HBV 중합효소, HBV 코어 단백질, HBV e-항원, HBV X 항원 또는 이의 도메인의 선형 서열; 또는 서열번호 97 (최적화된 HBV 표면 항원, 하기에 기술됨), 서열번호 98 (최적화된 HBV 중합효소, 하기에 기술됨), 서열번호 99 (최적화된 코어 단백질, 하기에 기술됨), 서열번호 100 (최적화된 X 항원, 하기에 기술됨)으로 표시되는 선형 아미노산 서열; 또는 적용가능한 경우, 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열의, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 일 측면에서, HBV 표면 항원, HBV 중합효소, HBV 코어 단백질, HBV e-항원, HBV X 항원 또는 이의 도메인 중 임의의 하나 이상은, 각각 전장 HBV 표면 항원, HBV 중합효소, HBV 코어 단백질, HBV e-항원, HBV X 항원 또는 이의 도메인과; 또는 서열번호 97 (최적화된 HBV 표면 항원, 하기에 기술됨), 서열번호 98 (최적화된 HBV 중합효소, 하기에 기술됨), 서열번호 99 (최적화된 코어 단백질, 하기에 기술됨), 또는 서열번호 100 (최적화된 X 항원, 하기에 기술됨)으로 표시되는 아미노산 서열과; 또는 적용가능한 경우, 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열과, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. HBV 표면 항원, HBV 중합효소 항원, HBV 코어 항원 및 HBV X 항원에 대한 다양한 적합하고 예시적인 서열들이 본원에 개시되어 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 방법에 사용하기 위한 HBV 항원(들)은, HBV 항원이 HBV 대형 (L) 표면 항원의 Pre-S1의 간세포 수용체 영역 또는 이의 하나 이상의 면역원성 도메인, HBV 소형 (S) 표면 항원 (HBsAg) 또는 이의 하나 이상의 면역원성 도메인, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인 또는 이의 하나 이상의 면역원성 도메인, HBV 코어 단백질 (HBcAg) 또는 이의 하나 이상의 면역원성 도메인 및 HBV X 항원 (HBx) 또는 이의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함하거나, 또는 이로 구성된 것인, HBV 항원을 포함하는 융합 단백질이다. 일 측면에서, HBV 대형 (L) 표면 항원의 Pre-S1의 간세포 수용체 영역, HBV 소형 (S) 표면 항원, HBV 중합효소의 RT 도메인, HBV 코어 단백질, X 항원 또는 이의 도메인 중 임의의 하나 이상은 전장 또는 거의 전장이다. 일 측면에서, HBV 대형 (L) 표면 항원의 Pre-S1의 간세포 수용체 영역, HBV 소형 (S) 표면 항원, HBV 중합효소의 RT 도메인, HBV 코어 단백질, X 항원 또는 이의 도메인 중 임의의 하나 이상은, 각각 HBV 대형 (L) 표면 항원의 전장 Pre-S1, HBV 소형 (S) 표면 항원, HBV 중합효소의 RT 도메인, HBV 코어 단백질, X 항원 또는 이의 도메인의 선형 서열 중 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 일 측면에서, HBV 대형 (L) 표면 항원의 Pre-S1의 간세포 수용체 영역, HBV 소형 (S) 표면 항원, HBV 중합효소의 RT 도메인, HBV 코어 단백질, X 항원 또는 이의 도메인 중 임의의 하나 이상은, 각각 전장 HBV 대형 (L) 표면 항원의 Pre-S1의 전장 간세포 수용체 영역, HBV 소형 (S) 표면 항원, HBV 중합효소의 RT 도메인, HBV 코어 단백질, X 항원 또는 이의 도메인과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.
이러한 융합 단백질을 도 3에 개략적으로 나타낸다. 이 융합 단백질을 포함하는 조성물의 일 예는 실시예 2에서 기술된다. 이러한 구현예에서, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 도 3에 개략적으로 표시된 바와 같이 다양한 HBV 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1, 또는 TEF2 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작하였다. 일 예로, 융합 단백질은, 서열번호 36으로 표시되는, N-말단에서 C-말단 방향의 골격으로 융합된 하기 서열을 가진 단일 폴리펩타이드이다: (1) 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정화하기 위한 N-말단 펩타이드 (예, 서열번호 36의 1번 위치에서 5번 위치); 2) HBV 대형 (L) 표면 단백질의 pre-S1 영역의 HBV 유전자형 C 간세포 수용체 도메인의 아미노산 서열 (L에 고유함) (예, 서열번호 11의 21-47번 위치 또는 서열번호 36의 6-32번 위치); 3) 전장 HBV 유전자형 C 소형 (S) 표면 항원의 아미노산 (예, 서열번호 11의 176-400번 위치 또는 서열번호 36의 33-257번 위치); 4) 서열 클로닝과 조작을 용이하게 하기 위한 2개의 아미노산 스페이서/링커 (예, 서열번호 36의 258-259번 위치); 5) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 유전자형 C 중합효소의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 247-691번 위치 또는 서열번호 36의 260-604번 위치); 6) HBV 유전자형 C 코어 단백질 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 36의 605-786번 위치); 7) HBV 유전자형 C X 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 12의 2-154번 위치 또는 서열번호 36의 787-939번 위치); 및 8) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 36의 940-945번 위치). 서열번호 36의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 35로 표시된다. 이러한 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 본원에서 GI-13005로 지칭된다.
이 구현예에 대한 한가지 대안적인 예에 있어서, 전술한 또는 후술되는 구현예에 따른 융합 단백질은, 1) HBV 대형 (L) 표면 단백질의 pre-S1 영역의 HBV 유전자형 C 수용체 도메인의 아미노산 서열 (L에 고유함) (예, 서열번호 11의 21-47번 위치 또는 서열번호 36의 6-32번 위치); 2) 전장 HBV 유전자형 C 소형 (S) 표면 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 11의 176-400번 위치 또는 서열번호 36의 33-257번 위치); 3) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 유전자형 C 중합효소의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 247-691번 위치 또는 서열번호 36의 260-604번 위치); 4) HBV 유전자형 C 코어 단백질 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 36의 605-786번 위치); 및 5) HBV 유전자형 C X 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 12의 2-154번 위치 또는 서열번호 36의 787-939번 위치)를 포함할 수 있으며, N- 또는 C-말단 서열을 이용하지 않거나, 또는 다른 N- 또는 C-말단 서열 및/또는 HBV 서열들 간에 링커를 사용하거나 사용하지 않는다.
일 구현예에서, 서열번호 36의 1-5번 위치로 표시되는 N-말단 펩타이드 대신, 서열번호 89 또는 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드 (또는 이의 상동체)가 이용되며, 기술된 융합 단백질의 나머지 부분이 다음으로 이어진다. 실시예 2는 도 3에서 구조체의 개략적인 도시로 예시된 상기한 융합 단백질을 기술한다. 본 구현예에서, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 다시 도 3에 개략적으로 표시된 바와 같이 다양한 HBV 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1, 또는 TEF2 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작하였다. 이러한 두번째 예로, 융합 단백질은, 서열번호 92로 표시되는, N-말단에서 C-말단 방향의 골격으로 융합된 하기 서열을 가진 단일 폴리펩타이드이다: (1)프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정화 또는 강화하기 위한 N-말단 펩타이드 (서열번호 89, 서열번호 92의 1-89번 위치); 2) 서열 클로닝과 조작을 용이하게 하기 위한 2개의 아미노산 스페이서/링커 (Thr-Ser) (서열번호 92의 90-91번 위치); 3) HBV 대형 (L) 표면 단백질의 pre-S1 영역의 HBV 유전자형 C 수용체 도메인의 아미노산 서열 (L에 고유함) (예, 서열번호 11의 21-47번 위치 또는 서열번호 92의 92-118번 위치); 4) 전장 HBV 유전자형 C 소형 (S) 표면 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 11의 176-400번 위치 또는 서열번호 92의 119-343번 위치); 5) 서열 클로닝과 조작을 용이하게 하기 위한 2개의 아미노산 스페이서/링커 (Leu-Glu) (예, 서열번호 92의 344-345번 위치); 6) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 유전자형 C 중합효소의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 247-691번 위치 또는 서열번호 92의 346-690번 위치); 7) HBV 유전자형 C 코어 단백질 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 92의 691-872번 위치); 8) HBV 유전자형 C X 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 12의 2-154번 위치 또는 서열번호 92의 873-1025번 위치); 및 9) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 92의 1026-1031번 위치). 서열번호 92의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 91로 표시된다. 이 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 본원에서 GI-13004로 지칭된다.
서열번호 36 및 서열번호 92는, 서열번호 34에 대한 전술한 수종을 비롯하여, 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 여겨지는 복수의 에피토프들과 도메인들을 포함한다. 또한, 본 융합 단백질에 사용되는 역전사효소 도메인은 다양한 항-바이러스 약제를 이용한 치료에 대해 약물-내성 반응으로서 돌연변이되는 것으로 알려져 있는 몇몇 아미노산 위치들을 포함하며, 따라서, 이들 중 임의의 하나 이상은, 특정 약물 내성 (탈출) 돌연변이를 타겟팅하는 치료학적 또는 예방학적 면역치료제를 제공하기 위해, 이 융합 단백질에서 변이될 수 있다. 이들 아미노산 위치는, 서열번호 36의 경우, 아미노산 432번 위치 (라미부딘 치료 후 Leu로 변이되는 것으로 알려진 Val); 아미노산 439번 위치 (라미부딘 치료 후 Met로 변이되는 것으로 알려진 Leu); 아미노산 453번 위치 (테노포비르 치료 후 Thr로 변이되는 것으로 알려진 Ala); 아미노산 463번 위치 (라미부딘 치료 후 Ile 또는 Val으로 변이되는 것으로 알려진 Met); 및 아미노산 495번 위치 (아데포비르 치료 후 Thr로 변이되는 것으로 알려진 Asn)이다. 이들 아미노산 위치들은, 서열번호 92의 경우, 아미노산 518번 위치 (라미부딘 치료 후 Leu로 변이되는 것으로 알려진 Val); 아미노산 525번 위치 (라미부딘 치료 후 Met로 변이되는 것으로 알려진 Leu); 아미노산 539번 위치 (테노포비르 치료 후 Thr로 변이되는 것으로 알려진 Ala); 아미노산 549번 위치 (라미부딘 치료 후 Ile 또는 Val으로 변이되는 것으로 알려진 Met); 및 아미노산 581번 위치 (아데포비르 치료 후 Thr로 변이되는 것으로 알려진 Asn)이다. 본원에 제공된 지침을 이용하여, 이러한 돌연변이를 타겟팅하는 추가적인 면역치료제를 만들기 위해, 필요에 따라, 동정되거나 동정된 부가적인 약물 내성 돌연변이를 부가할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 서열번호 36에서 901번 위치의 발린 또는 서열번호 92에서 987번 위치의 발린 (또는 서열번호 12에서 116번 위치의 발린 또는 이 대응되는 위치를 포함하는 임의의 X 항원 또는 이의 도메인)을 루신으로 치환하여, 서열번호 51로서 확인되는 T 세포 에피토프를 만든다 (표 5 참조).
전술한 바와 같이, 본 발명은, 감염성 물질과 관련된 치료제 또는 예방제에 대한 필수 기준을 충족시키거나 또는 효모-기반의 면역치료제내 함유를 위해 이의 천연형 또는 야생형 서열 유래의 HBV 항원의 변형을 포함한다. 예를 들어, 하기 설명과 실시예 5-8에서는, RAC의 한가지 이상의 기준 요건, 가장 유익한 면역 반응과 관련된 면역원성 도메인의 최대화, 보존된 T 세포 에피토프의 최대화, 특정 HBV 유전자형에 대한 컨센서스 서열의 활용 및/또는 HBV 항원내 인공 정션의 최소화를 고려한, 효모-기반의 면역치료제의 설계 및 구축을 기술하고 있다. 예컨대, 하기 효모-기반의 면역치료 조성물은 전술한 목표들의 요건을 충족시키고, 각각의 HBV 주요 단백질들의 영역들: HBV 표면 항원, 중합효소, 코어 및 X 항원을 포함하는, HBV 융합 단백질을 예시한다. 이 융합 단백질을 설계하기 위해, 융합 단백질내 각각의 HBV 항원들을, (예, 단백질이 HBV 게놈의 2/3 미만으로 구성되도록 하기 위해) 단백질의 세그멘트 크기를 줄일 뿐만 아니라 급성/자가-제한성 HBV 감염 및/또는 만성 HBV 감염의 면역 반응과 관련되었던 T 세포의 포함을 최대화하고, 보존된 에피토프를 최대화하고, 비-천연 서열의 최소화하기 위해 최적화 또는 변형시켰다. 이러한 지침을 이용하여, 당해 기술 분야의 당업자는 본 발명의 HBV 항원에 이용하기 위한 대안적인 최적화된 HBV 단백질을 제조할 수 있다.
실시예 5에서 보다 상세하게 기술된 바와 같이, HBV 표면 항원 세그먼트를 구축하기 위해, HBV 유전자형 C로부터 유래된 전장 대형 (L) 표면 항원 단백질은, N- 및 C-말단 서열을 잘라 크기를 줄였으며, 동시에 급성/자가-제한성 감염과 관련된 T 세포 에피토프의 함유를 우선적으로 수행함으로써 공지된 MHC T 세포 에피토프의 함유를 극대화하였다. 제조되는 표면 항원 세그먼트는 서열번호 97로 표시된다.
HBV 중합효소를 포함하는 융합 단백질의 세그먼트를 구축하기 위해 (실시예 5 참조), HBV 유전자형들과 분리주들에서 가장 잘 보존된 단백질 영역이며 약물 내성 돌연변이가 발생하는 곳으로 알려져 있는 수개의 부위를 포함하는, (RT 도메인 유래) 활성부 도메인을 포함시키는 것에 집중함으로써, HBV 유전자형 C로부터 유래된 전장 중합효소의 상당 영역을 제거하였다. HBV 중합효소 세그먼트를, 전술한 우선화 전략을 이용하여 공지된 T 세포 에피토프의 함유를 최대화하고, 하나의 아미노산 차이가 있으나 공지된 T 세포 에피토프와 정확하게 일치하는 T 세포 에피토프들 중 하나를 변형시키도록, 설계하였다. 제조되는 HBV 중합효소 항원 세그먼트는 서열번호 98로 표시된다.
HBV 코어 항원을 포함하는 융합 단백질의 세그먼트를 구축하기 위해 (실시예 5 참조), HBV 유전자형 C 유래 전장 코어 단백질을, 특정한 공지된 T 세포 에피토프에 대해 제조된 완벽한 매칭 서열의 포함 및 변형을 통해 T 세포 에피토프의 수를 최대화하면서, 단백질의 크기를 줄이도록 변형시켰다. 아울러, 대개 아르기닌이 다량 존재하는 천연적인 효모 RNA 결합 단백질 (양으로 하전됨)에 의한 경쟁적인 간섭으로 인해 효모에 유해할 수 있는 비정상적으로 양전하를 띄는 C-말단이 포함된 서열도 제거하였다. 제조되는 HBV 코어 항원 세그먼트는 서열번호 99로 표시된다.
HBV X 항원을 포함하는 융합 단백질의 세그먼트를 구축하기 위해 (실시예 5 참조), HBV 유전자형 C 유래 전장 X 항원을, 공지된 T 세포 에피토프 대부분의 보유를 최대화하면서, 단백질의 크기를 줄이도록 절단하였다. 또한, 공개된 T 세포 에피토프 서열과 일치되게 하나의 아미노산 변화를 도입하고, 세그먼트 말단들에 T 세포 에피토프 측면 서열을 유지시켜, 항원 제시 세포에 의한 올바른 에피토프의 효율적인 가공 및 제시가 용이하게 이루어지게 하였다. 제조되는 HBV X 항원 세그먼트는 서열번호 100으로 표시된다.
마지막으로, 실시예 5에 기술된 바와 같이, 전술한 4개의 HBV 세그먼트들을 연결하여 임상적으로 사용하도록 최적화된 단일 단백질을 제조함으로써, 완전한 융합 단백질을 구축하였다. 융합 단백질의 예로 2종을 제작하였으며, 그 각각은 효모에서의 융합 단백질의 발현을 강화 및/또는 안정화하기 위해 추가된 상이한 N-말단 펩타이드를 가진다. 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료 조성물에 사용되는 다른 단백질들 모두에 대해 앞서 설명한 바와 같이, N-말단 펩타이드는 여러가지 합성 또는 천연 N-말단 펩타이드 또는 이의 상동체로 치환될 수 있거나, 또는 N-말단 펩타이드는 한 위치에서 생략되고 메티오닌이 포함될 수 있다. 아울러, 1, 2 또는 3개 이상의 아미노산으로 구성된 링커 서열을 필요에 따라 융합 단백질을 구성하는 세그먼트들 사이에 부가할 수 있다. 예를 들어, Thr-Ser 등의 2개의 아미노산 링커 서열이 융합 단백질에서 N-말단 펩타이드와 제1 HBV 항원 사이에, 및/또는 융합 단백질에서 2개의 HBV 항원들 사이에 부가될 수 있다. 또한, 이들 구조체들은 벡본으로서 유전자형 C 유래 HBV 단백질들을 이용하여 설계하고, 단백질 세그먼트 설계에는 모두 다른 HBV 유전자형, 서브-유전자형 또는 다른 균주 또는 분리주 유래 HBV 단백질들을 사용하였다. 일 측면에서, 소정의 HBV 유전자형 유래 컨센서스 서열을 이용하여 하기 부가적인 융합 단백질에 대해 기술된 바와 같이 단백질 세그먼트들을 설계 및 제조할 수 있다. 마지막으로, 본원에 기술된 바와 같이 융합 단백질로부터 하나 이상의 세그먼트를 제외시킬 수 있다면, 나머지 세그먼트의 서열을 길이 상 연장시켜, 남아있는 단백질의 측면 영역들 및/또는 부가적인 T 세포 에피토프를 포함시킬 수 있다.
실시예 5는, 도 3에 구조에 대한 개략적인 도식을 예시하고 있으며, N-에서 C-말단으로 서열번호 101로 표시되는 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드인, HBV 융합 단백질을 기술한다: (1) 서열번호 89로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위한, 알파 팩터 프리프로 서열인, N-말단 펩타이드 (서열번호 101의 1-89번 위치); (2) 서열번호 97로 표시되는, HBV 대형 (L) 표면 항원의 최적화된 영역 (서열번호 101의 90-338번 위치, 예, 서열번호 11의 120-368번 위치 + 에피토프의 최적화); (3) 서열번호 98로 표시되는, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역 (서열번호 101의 339-566번 위치, 예, 서열번호 10의 453-680번 위치 + 에피토프의 최적화에 해당됨); (4) 서열번호 99로 표시되는, HBV 코어 단백질의 최적화된 영역 (서열번호 101의 567-718번 위치, 예, 서열번호 9의 37-188번 위치 + 에피토프의 최적화에 해당됨); (5) 서열번호 100으로 표시되는, HBV X 항원의 최적화된 영역 (서열번호 101의 719-778번 위치, 예, 서열번호 12의 52-127번 위치 + 에피토프의 최적화에 해당됨); 및 (6) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 101의 779-784번 위치). 일 구현예에서, 서열번호 89의 N-말단 펩타이드와 첫번째 HBV 단백질 (HBV 대형 표면 항원의 최적화된 영역) 사이에 트레오닌 (Thr 또는 T)-세린 (Ser 또는 S) 링커 서열이 사용됨으로써, 서열번호 101의 총 길이는 아미노산 2개만큼 길어진다.
실시예 5는, 도 3에 구조에 대한 개략적인 도식이 예시되어 있으며, N-에서 C-말단으로 서열번호 102로 표시되는 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드인, HBV 융합 단백질을 또한 기술한다: (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드 (서열번호 102 의 1-6번 위치); (2) 서열번호 97의 2-248번 위치로 표시되는, HBV 대형 (L) 표면 항원의 최적화된 영역 (서열번호 102의 7-254번 위치, 예, 서열번호 11의 120-368번 위치 + 에피토프의 최적화에 해당됨); (3) 서열번호 98로 표시되는, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역 (서열번호 102의 255-482번 위치, 예, 서열번호 10의 453-680번 위치 + 에피토프의 최적화에 해당됨); (4) 서열번호 99로 표시되는, HBV 코어 단백질의 최적화된 영역 (서열번호 102의 483-634번 위치, 예, 서열번호 9의 37-188번 위치 + 에피토프의 최적화에 해당됨); (5) 서열번호 100으로 표시되는, HBV X 항원의 최적화된 영역(서열번호 102의 635-694번 위치, 예, 서열번호 12의 52-127번 위치 + 에피토프의 최적화에 해당됨); 및 (6) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 102 의 695-700번 위치). 일 구현예에서, 서열번호 37의 N-말단 펩타이드와 첫번째 HBV 단백질 (HBV 대형 표면 항원의 최적화된 영역) 사이에 트레오닌 (Thr 또는 T)-세린 (Ser 또는 S) 링커 서열이 사용됨으로써, 서열번호 102의 총 길이가 아미노산 2개 만큼 길어진다. 일 구현예에서, 전술한 융합 단백질에 사용되는 HBV 대형 (L) 표면 항원의 최적화된 영역은 서열번호 97의 1-248번 위치로 표시된다 (따라서, 서열번호 102의 총 길이가 아미노산 1개로 길어짐). 일 구현예에서, T-S 링커와 서열번호 97의 1-248번 위치 둘다 서열번호 102에 사용된다.
전술한 바와 같이, 본 발명은, 단백질 세그먼트를 설계 또는 제작하는데 소정의 HBV 유전자형 유래 컨센서스 서열을 이용하는, 임상적인 유용성을 개선시키거나 또는 감염성 물질과 관련된 치료제 또는 예방제의 필수 기준을 충족시키는 효모-기반의 면역치료제에 포함시키기 위한 이의 천연 또는 야생형 서열로부터 유래된 HBV 항원들의 변형을 포함한다. 예를 들어, 이러한 타입의 변형을 예시하기 위해, 본 발명의 효모-기반의 면역치료제에 사용하기 위한 부가적인 HBV 항원을 설계하였다. 전술한 HBV 융합 단백질의 설계에서와 같이, 이들 부가적인 융합 단백질을 제조하기 위해, 융합 단백질내 개별 HBV 항원들을, (예, 단백질이 HBV 게놈의 2/3 미만으로 구성되도록 하기 위해) 단백질의 세그먼트들의 크기를 줄일 뿐만 아니라 급성/자가-제한성 HBV 감염 및/또는 만성 HBV 감염의 면역 반응과 관련되었던 T 세포의 포함을 최대화하고, 보존된 에피토프를 최대화하고, 비-천연 서열의 최소화하기 위해, 그리고 또한 HBV 서열들의 복수 소스로부터 확립된 유전자형 A-D 각각의 컨센서스 서열을 활용하도록, 최적화 또는 변형시켰다 (예, Yu and Yuan et al, 2010, S, Core 및 X의 경우, 322 HBV 서열로부터 유래된, Pol (RT)의 경우에는 스탠포드 대학 HIV 약물 내성 데이타베이스, HBVseq 및 HBV Site Release Notes로부터 유래된 컨센서스 서열를 수득하였음). HBV 항원을 포함하는 아래 예시적인 4종의 융합 단백질을 설계함에 있어, 공지된 급성 자가-제한성 T 세포 에피토프들 중 컨센서스 서열 변이된 한가지 또는 공지된 중합효소 탈출 돌연변이 사이트들 중 컨센서스 서열 변이된 한가지를 이용하지 않는다면, 소정의 HBV 유전자형에 대한 컨센서스 서열을 사용하였으며, 이 경우 이들 위치들은 이들 에피토프 또는 돌연변이 사이트에 대한 공개된 서열을 따른다. 부가적인 항원은 오직 컨센서스 서열을 기초로 구축하거나 또는 알려지게 됨에 따라 다른 공개된 에피토프를 이용하여 구축할 수 있다.
실시예 7은 (도 3에 개략적으로 도시된) 서열번호 101 또는 서열번호 102로 표시되는 융합 단백질에 대한 설계와 비슷하지만, HBV 유전자형 A의 컨센서스 서열을 토대로 한 융합 단백질을 기술한다. 이 융합 단백질은 서열번호 107로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다 (HBV 서열이 아닌 선택 서열은 서열번호 107의 기본 서열에 포함되진 않지만, 실시예 7에 기술된 구조에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드, 이는 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 사용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있음; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 아미노산 1, 2 또는 3개 이상으로 구성된 1-3개 이상의 아미노산 링커 서열들로 구성된 링커 펩타이드; (3) 서열번호 107의 1-249번 위치로 표시되는, HBV 대형 (L) 표면 항원의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 A에 대한 컨센서스 서열임; (4) 서열번호 107의 250-477번 위치로 표시되는, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 A에 대한 컨센서스 서열임; (5) 서열번호 107의 478-629번 위치로 표시되는, HBV 코어 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 A에 대한 컨센서스 서열임; (6) 서열번호 107의 630-689번 위치로 표시되는, HBV X 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 A에 대한 컨센서스 서열임; 및 (7) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍. 이 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 본원에서 또한 GI-13010으로 지칭된다.
또한, 실시예 7은 (도 3에 개략적으로 도시된) 서열번호 101 또는 서열번호 102로 표시되는 융합 단백질에 대한 설계와 비슷하지만, HBV 유전자형 B의 컨센서스 서열을 토대로 한 융합 단백질을 기술한다. 이 융합 단백질은 서열번호 108로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다 (HBV 서열이 아닌 선택 서열은 서열번호 108의 기본 서열에 포함되진 않지만, 실시예 7에 기술된 구조에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드, 이는 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 사용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있음; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 아미노산 1, 2 또는 3개 이상으로 구성된 1-3개 이상의 아미노산 링커 서열들로 구성된 링커 펩타이드; (3) 서열번호 108의 1-249번 위치로 표시되는, HBV 대형 (L) 표면 항원의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 B에 대한 컨센서스 서열임; (4) 서열번호 108의 250-477번 위치로 표시되는, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 B에 대한 컨센서스 서열임; (5) 서열번호 108의 478-629번 위치로 표시되는, HBV 코어 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 B에 대한 컨센서스 서열임; (6) 서열번호 108의 630-689번 위치로 표시되는, HBV X 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 B에 대한 컨센서스 서열임; 및 (7) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍. 이 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 본원에서 또한 GI-13011로 지칭된다.
또한, 실시예 7은 (도 3에 개략적으로 도시된) 서열번호 101 또는 서열번호 102로 표시되는 융합 단백질에 대한 설계와 비슷하지만, HBV 유전자형 C의 컨센서스 서열을 토대로 한 융합 단백질을 기술한다. 이 융합 단백질은 서열번호 109로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다 (HBV 서열이 아닌 선택 서열은 서열번호 109의 기본 서열에 포함되진 않지만, 실시예 7에 기술된 구조에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드, 이는 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 사용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있음; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 아미노산 1, 2 또는 3개 이상으로 구성된 1-3개 이상의 아미노산 링커 서열들로 구성된 링커 펩타이드; (3) 서열번호 109의 1-249번 위치로 표시되는, HBV 대형 (L) 표면 항원의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 C에 대한 컨센서스 서열임; (4) 서열번호 109의 250-477번 위치로 표시되는, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 C에 대한 컨센서스 서열임; (5) 서열번호 109의 478-629번 위치로 표시되는, HBV 코어 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 C에 대한 컨센서스 서열임; (6) 서열번호 109의 630-689번 위치로 표시되는, HBV X 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 C에 대한 컨센서스 서열임; 및 (7) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍. 이 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 본원에서 또한 GI-13012로 지칭된다.
또한, 실시예 7은 (도 3에 개략적으로 도시된) 서열번호 101 또는 서열번호 102로 표시되는 융합 단백질에 대한 설계와 비슷하지만, HBV 유전자형 D의 컨센서스 서열을 토대로 한 융합 단백질을 기술한다. 이 융합 단백질은 서열번호 110으로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다 (HBV 서열이 아닌 선택 서열은 서열번호 110의 기본 서열에 포함되진 않지만, 실시예 7에 기술된 구조에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드, 이는 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 사용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있음; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 아미노산 1, 2 또는 3개 이상으로 구성된 1-3개 이상의 아미노산 링커 서열들로 구성된 링커 펩타이드; (3) 서열번호 110의 1-249번 위치로 표시되는, HBV 대형 (L) 표면 항원의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열임; (4) 서열번호 110의 250-477번 위치로 표시되는, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열임; (5) 서열번호 110의 478-629번 위치로 표시되는, HBV 코어 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열임; (6) 서열번호 110의 630-689번 위치로 표시되는, HBV X 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열임; 및 (7) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍. 서열번호 37로 표시되는 N-말단 서열을 포함하는 상기한 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 본원에서 GI-13013으로 지칭된다. 서열번호 89로 표시되는 N-말단 서열을 포함하는 상기한 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 본원에서 GI-13014로 지칭된다.
전술한 바와 같이, 본원에 기술된 융합 단백질에서 HBV 단백질 세그먼트들의 순서를 바꾸는 것도 본 발명의 일 구현예이다. 이에, 전술한 HBV 단백질 4종을 이용한 구조체는 표면 항원, 이에 융합된 중합효소 항원, 이에 융합된 코어 항원, 이에 융합된 X 항원 순서로 제공되지만, 본 발명은 구조체내 단백질에 대한 상기한 순서로 제한되지 않으며, 실제, 융합 세그먼트들의 다른 배열로 사용할 수 있으며, 일부 측면들에서, 제조되는 면역치료 조성물을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질내의 세그먼트들의 재배열은 효모에서 HBV 항원의 발현을 향상 또는 변형시킬 수 있거나, 또는 HBV 항원의 면역원성 또는 다른 기능성 속성을 향상 또는 변형시킬 수 있다. 이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, 본 발명은 효모에서 잘 발현하거나 및/또는 긍정적인 기능성 데이타 (예, 면역원성임)를 제공하는 한가지 HBV 항원으로 시작하며, HBV 항원에 포함된 잠재적인 항원 또는 에피토프를 확장시키기 위해 HBV 항원에 부가적인 HBV 단백질 또는 도메인을 부가하는 것을 포괄한다. 실시예 8은 전술한 4종의 HBV 단백질들의 추가적인 배열의 일 예를 제시한다.
실시예 8은 HBV 표면 항원, 코어 단백질, 중합효소 및 X 항원의 서열을 포함하는 융합 단백질을 기술하는데, 상기 서열은 서열번호 110 및 서열번호 118로 표시되는 융합 단백질의 세그먼트들로부터 유래되며, 융합 단백질은 서열번호 110과 비교하여 융합 세그먼트들을 다른 순서로 이용한다. 이 항원은 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 토대로 하지만; 서열번호 107 또는 서열번호 112 (유전자형 A), 서열번호 108 또는 서열번호 114 (유전자형 B), 서열번호 109 또는 서열번호 116 (유전자형 C)로 표시되는 융합 단백질로부터 유래되는 대응되는 융합 세그먼트들을 이용하거나, 또는 다른 HBV 유전자형, 서브-유전자형, 컨센서스 서열 또는 균주 유래의 대응되는 서열을 이용하여, 유사한 전체 구조를 구비한 융합 단백질을 제조하는 것은, 쉬운 일일 것이다. 이러한 예, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터, CUP1의 통제 하에 이 융합 단백질을 발현하도록 조작하였고, 제조되는 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 도 10에 개락적으로 도시된 GI-13017로 지칭할 수 있다. 서열번호 124로 표시되는 융합 단백질은, 표면 항원, 코어, 중합효소 및 X 항원 서열의 순으로, 서열번호 124로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드로서 포함한다 (HBV 서열이 아닌 선택 서열은 서열번호 124의 기본 서열에 포함되진 않지만, 실시예 8에 기술된 구조에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서), 이는 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 사용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있음; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 1-3개 이상의 아미노산들로 구성된 링커 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서); (3) 서열번호 124의 1-399번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); 4) 서열번호 124의 400-581번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); (5) 서열번호 124의 582-809번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역 (서열번호 110의 250-477번 위치에 해당됨); (6) 서열번호 124의 810-869번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV X 항원의 최적화된 영역 (서열번호 110의 630-689번 위치에 해당됨); 및 (7) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍 (실시예 8에 기술된 구조체에서). 서열번호 124는 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 124의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 123으로 표시된다.
또한, 실시예 8은 HBV 표면 항원, 코어 단백질, X 항원 및 중합효소 유래 서열을 포함하는 다른 융합 단백질을 기술하며, 이때 상기 서열은 서열번호 110 및 서열번호 118로 표시되는 융합 단백질의 세그먼트들로부터 유래되나, 융합 단백질은 서열번호 110과 비교하여 융합 세그먼트들을 다른 순서로 이용한다. 또한, 이 항원은 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 토대로 하지만; 서열번호 107 또는 서열번호 112 (유전자형 A), 서열번호 108 또는 서열번호 114 (유전자형 B), 서열번호 109 또는 서열번호 116 (유전자형 C)로 표시되는 융합 단백질로부터 유래되는 대응되는 융합 세그먼트들을 이용하거나, 또는 다른 HBV 유전자형, 서브-유전자형, 컨센서스 서열 또는 균주 유래의 대응되는 서열을 이용하여, 유사한 전체 구조를 구비한 융합 단백질을 제조하는 것은, 쉬운 일일 것이다. 이러한 예로, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터, CUP1의 통제 하에 이 융합 단백질을 발현하도록 조작하였고, 제조되는 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 도 11에 개락적으로 도시된 GI-13018로 지칭할 수 있다. 서열번호 126으로 표시되는 융합 단백질은, 표면 항원, 코어, X 항원 및 중합효소 서열의 순으로, 서열번호 126으로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드로서 포함한다 (HBV 서열이 아닌 선택 서열은 서열번호 126의 기본 서열에 포함되진 않지만, 실시예 8에 기술된 구조에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서), 이는 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 사용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있음; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 1-3개 이상의 아미노산들로 구성된 링커 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서); (3) 서열번호 126의 1-399번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); 4) 서열번호 126의 400-581번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); (5) 서열번호 126의 582-641번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV X 항원의 최적화된 영역 (서열번호 110의 630-689번 위치에 해당됨); (5) 서열번호 126의 642-869번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역 (서열번호 110의 250-477번 위치에 해당됨); 및 (7) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍 (실시예 8에 기술된 구조체에서). 서열번호 126은 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 126의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 125로 표시된다.
실시예 8은 HBV 중합효소, X 항원, 표면 항원, 코어 단백질의 서열을 포함하는 융합 단백질을 기술하며, 이때 상기 서열은 서열번호 110 및 서열번호 118로 표시되는 융합 단백질의 세그먼트들로부터 유래되나, 융합 단백질은 서열번호 110과 비교하여 융합 세그먼트들을 다른 순서로 이용한다. 이 항원은 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 토대로 하지만; 서열번호 107 또는 서열번호 112 (유전자형 A), 서열번호 108 또는 서열번호 114 (유전자형 B), 서열번호 109 또는 서열번호 116 (유전자형 C)로 표시되는 융합 단백질로부터 유래되는 대응되는 융합 세그먼트들을 이용하거나, 또는 다른 HBV 유전자형, 서브-유전자형, 컨센서스 서열 또는 균주 유래의 대응되는 서열을 이용하여, 유사한 전체 구조를 구비한 융합 단백질을 제조하는 것은, 쉬운 일일 것이다. 이러한 예로, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터, CUP1의 통제 하에 이 융합 단백질을 발현하도록 조작하였고, 제조되는 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 도 14에 개락적으로 도시된 GI-13021로 지칭할 수 있다. 서열번호 132로 표시되는 융합 단백질은, 중합효소, X 항원, 표면 항원 및 코어 순으로, 서열번호 132로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드로서 포함한다 (HBV 서열이 아닌 선택 서열은 서열번호 132의 기본 서열에 포함되진 않지만, 실시예 8에 기술된 구조에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서), 이는 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 사용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있음; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 1-3개 이상의 아미노산들로 구성된 링커 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서); (3) 서열번호 132의 1-228번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역 (서열번호 110의 250-477번 위치에 해당됨); (4) 서열번호 132의 229-288번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV X 항원의 최적화된 영역 (서열번호 110의 630-689번 위치에 해당됨); (5) 서열번호 132의 289-687번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); (6) 서열번호 132의 688-869번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); 및 (7) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍 (실시예 8에 기술된 구조체에서). 서열번호 132는 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 132의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 131로 표시된다.
또한, 실시예 8은 HBV X 항원, 중합효소, 표면 항원 및 코어 단백질의 서열을 포함하는 융합 단백질을 기술하며, 이때 상기 서열은 서열번호 110 및 서열번호 118로 표시되는 융합 단백질의 세그먼트들로부터 유래되나, 융합 단백질은 서열번호 110과 비교하여 융합 세그먼트들을 다른 순서로 이용한다. 이 항원은 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 토대로 하지만; 서열번호 107 또는 서열번호 112 (유전자형 A), 서열번호 108 또는 서열번호 114 (유전자형 B), 서열번호 109 또는 서열번호 116 (유전자형 C)로 표시되는 융합 단백질로부터 유래되는 대응되는 융합 세그먼트들을 이용하거나, 또는 다른 HBV 유전자형, 서브-유전자형, 컨센서스 서열 또는 균주 유래의 대응되는 서열을 이용하여, 유사한 전체 구조를 구비한 융합 단백질을 제조하는 것은, 쉬운 일일 것이다. 이러한 예로, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터, CUP1의 통제 하에 이 융합 단백질을 발현하도록 조작하였고, 제조되는 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 도 15에 개락적으로 도시된 GI-13022로 지칭할 수 있다. 서열번호 134로 표시되는 융합 단백질은 X 항원, 중합효소, 표면 항원 및 코어 단백질의 순서로, 서열번호 134로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드를 포함한다 (HBV 서열이 아닌 선택 서열은 서열번호 134의 기본 서열에 포함되진 않지만, 실시예 8에 기술된 구조에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서), 이는 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 사용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있음; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 1-3개 이상의 아미노산들로 구성된 링커 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서); (3) 서열번호 134의 1-60번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV X 항원의 최적화된 영역 (서열번호 110의 630-689번 위치에 해당됨); (4) 서열번호 134의 61-288번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역 (서열번호 110의 250-477번 위치에 해당됨); (5) 서열번호 134의 289-687번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); (6) 서열번호 134의 688-869번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); 및 (7) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍 (실시예 8에 기술된 구조체에서). 서열번호 134는 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 134의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 133으로 표시된다.
표면 항원, 코어 단백질 및 X 항원을 포함하는 HBV 항원. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 방법에 사용하기 위한 HBV 항원(들)은, HBV 항원이, HBV 표면 항원 (대형 (L), 중형 (M) 또는 소형 (S)) 또는 이의 하나 이상의 구조 도메인, 기능성 도메인 또는 면역원성 도메인), HBV 코어 단백질 (HBcAg) 또는 HBV e-항원 (HBeAg) 또는 이의 하나 이상의 구조 도메인, 기능성 도메인 또는 면역원성 도메인, 및 HBV X 항원 (HBx) 또는 이의 하나 이상의 구조 도메인, 기능성 도메인 또는 면역원성 도메인으로 구성되거나 이들을 포함하는 것인, HBV 항원을 포함하는 융합 단백질이다. 일 측면에서, HBV 표면 항원, HBV 코어 단백질, HBV e-항원, HBV X 항원 또는 이의 도메인 중 임의의 하나 이상은 전장 또는 거의 전장이다. 일 측면에서, HBV 표면 항원, HBV 코어 단백질, HBV e-항원, HBV X 항원 또는 이의 도메인 중 임의의 하나 이상은, 각각 전장 HBV 표면 항원, HBV 코어 단백질, HBV e-항원, HBV X 항원 또는 이의 도메인의 선형 서열의, 또는 서열번호 97 (최적화된 HBV 표면 항원), 서열번호 99 (최적화된 코어 단백질), 서열번호 100 (최적화된 X 항원)로 표시되는 아미노산 서열의, 또는 적용가능한 경우, 다른 HBV 균주로부터 유래된 해당 서열의, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 일 측면에서, HBV 표면 항원, HBV 코어 단백질, HBV e-항원, HBV X 항원 또는 이의 도메인 중 임의의 하나 이상은, 각각 전장 HBV 표면 항원, HBV 코어 단백질, HBV e-항원, HBV X 항원 또는 이의 도메인과, 서열번호 97 (최적화된 HBV 표면 항원), 서열번호 99 (최적화된 코어 단백질), 서열번호 100 (최적화된 X 항원)으로 표시되는 아미노산 서열과, 또는 적용가능한 경우, 다른 HBV 균주로부터 유래된 해당 서열과, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 구조체에 사용가능한 부가적인 HBV 표면 항원, HBV 코어 항원 및 HBV X 항원에 대한 적합하고, 예시적인 다양한 서열들이 본원에서 언급된다.
실시예 8은 HBV 표면 항원, 코어 단백질 및 X 항원의 서열을 포함하는 융합 단백질을 기술하며, 이때 상기 서열은 서열번호 110 및 서열번호 118로 표시되는 융합 단백질의 세그먼트들로부터 유래된다. 이 항원은 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 토대로 하지만; 서열번호 107 또는 서열번호 112 (유전자형 A), 서열번호 108 또는 서열번호 114 (유전자형 B), 서열번호 109 또는 서열번호 116 (유전자형 C)로 표시되는 융합 단백질로부터 유래되는 대응되는 융합 세그먼트들을 이용하거나, 또는 다른 HBV 유전자형, 서브-유전자형, 컨센서스 서열 또는 균주 유래의 대응되는 서열을 이용하여, 유사한 전체 구조를 구비한 융합 단백질을 제조하는 것은, 쉬운 일일 것이다. 이러한 예로, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터, CUP1의 통제 하에 이 융합 단백질을 발현하도록 조작하였고, 제조되는 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 도 9에 개락적으로 도시된 GI-13016로 지칭할 수 있다. 서열번호 122로 표시되는 융합 단백질은, 표면 항원, 코어 및 X 항원 서열의 순서로, 서열번호 122로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다 (HBV 서열이 아닌 선택 서열은 서열번호 122의 기본 서열에 포함되진 않지만, 실시예 8에 기술된 구조에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서), 이는 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 사용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있음; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 1-3개 이상의 아미노산들로 구성된 링커 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서); (3) 서열번호 122의 1-399번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); 4) 서열번호 122의 400-581번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); (5) 서열번호 122의 582-641번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV X 항원의 최적화된 영역 (서열번호 110의 630-689번 위치에 해당됨); 및 (6) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍 (실시예 8에 기술된 구조체에서). 서열번호 122는 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 122의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 121로 표시된다.
또한, 실시예 8은 HBV 표면 항원, 코어 단백질 및 X 항원의 서열을 포함하는 융합 단백질을 기술하며, 이때 서열번호 122를 포함하는 융합 단백질에서와 같이, 상기 서열은 서열번호 110 및 서열번호 118로 표시되는 융합 단백질의 세그먼트들로부터 유래된다. 그러나, 이 융합 단백질은 융합 단백질내 융합 세그먼트들의 배열 측면에서, 서열번호 122를 포함하는 융합 단백질과 다르다. 이 항원은 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 토대로 하지만; 서열번호 107 또는 서열번호 112 (유전자형 A), 서열번호 108 또는 서열번호 114 (유전자형 B), 서열번호 109 또는 서열번호 116 (유전자형 C)로 표시되는 융합 단백질로부터 유래되는 대응되는 융합 세그먼트들을 이용하거나, 또는 다른 HBV 유전자형, 서브-유전자형, 컨센서스 서열 또는 균주 유래의 대응되는 서열을 이용하여, 유사한 전체 구조를 구비한 융합 단백질을 제조하는 것은, 쉬운 일일 것이다. 이러한 예로, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터, CUP1의 통제 하에 이 융합 단백질을 발현하도록 조작하였고, 제조되는 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 도 13에 개락적으로 도시된 GI-13020으로 지칭할 수 있다. 서열번호 130으로 표시되는 융합 단백질은, X 항원, 표면 항원 및 코어 항원 서열의 순서로, 서열번호 130으로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드로서 포함한다 (HBV 서열이 아닌 선택 서열은, 본원에 예시된 구조체에서 X 항원 세그먼트와 표면 항원 세그먼트 사이의 Leu-Glu 링커를 제외하고는, 서열번호 130의 기본 서열에 포함되진 않지만, 실시예 8에 기술된 구조에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서), 이는 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 사용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있음; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 1-3개 이상의 아미노산들로 구성된 링커 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서); (3) 서열번호 130의 1-60번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV X 항원의 최적화된 영역 (서열번호 110의 630-689번 위치에 해당됨); (4) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Leu-Glu 등의, 1-3개 이상의 아미노산들로 구성된 링커 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서), 서열번호 130의 61-62번 위치로 표시됨; (5) 서열번호 130의 63-461번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); (6) 서열번호 130의 462-643번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); 및 (7) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍 (실시예 8에 기술된 구조체에서). 서열번호 130는 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 130을 포함하며 N-말단과 C-말단 펩타이드와 모든 링커를 포함하는, 실시예 8에 언급된 완전한 융합 단백질의 아미노산 서열은, 본원에서 서열번호 150으로 표시된다. 서열번호 130 또는 서열번호 150의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 129로 표시된다.
표면 항원, 코어 단백질 및 중합효소를 포함하는 HBV 항원. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 방법에 사용하기 위한 HBV 항원(들)은, HBV 항원이 HBV 표면 항원 (대형 (L), 중형 (M) 또는 소형 (S)) 또는 이의 하나 이상의 구조 도메인, 기능성 도메인 또는 면역원성 도메인), HBV 코어 단백질 (HBcAg) 또는 HBV e-항원 (HBeAg) 또는 이의 하나 이상의 구조 도메인, 기능성 도메인 또는 면역원성 도메인, 및 HBV 중합효소 또는 이의 하나 이상의 구조 도메인, 기능성 도메인 또는 면역원성 도메인 (예, 역전사효소 (RT) 도메인)를 포함하거나 또는 이들로 구성된 것인, HBV 항원을 포함하는 융합 단백질이다. 일 측면에서, HBV 표면 항원, HBV 코어 단백질, HBV e-항원, HBV 중합효소 또는 이의 도메인 중 임의의 하나 이상은 전장 또는 거의 전장이다. 일 측면에서, HBV 표면 항원, HBV 코어 단백질, HBV e-항원, HBV 중합효소 또는 이의 도메인 중 임의의 하나 이상은, 각각 전장 HBV 표면 항원, HBV 코어 단백질, HBV e-항원, HBV 중합효소 또는 이의 도메인의 선형 서열의, 또는 서열번호 97 (최적화된 HBV 표면 항원), 서열번호 99 (최적화된 코어 단백질), 서열번호 98 (최적화된 중합효소)로 표시되는 아미노산 서열의, 또는 적용가능한 경우, 다른 HBV 균주로부터 유래된 해당 서열의, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 일 측면에서, HBV 표면 항원, HBV 코어 단백질, HBV e-항원, HBV 중합효소 또는 이의 도메인 중 임의의 하나 이상은, 각각 전장 HBV 표면 항원, HBV 코어 단백질, HBV e-항원, HBV 중합효소 또는 이의 도메인과, 또는 서열번호 97 (최적화된 HBV 표면 항원), 서열번호 99 (최적화된 코어 단백질), 서열번호 98 (최적화된 중합효소)로 표시되는 아미노산 서열과, 또는 적용가능한 경우, 다른 HBV 균주로부터 유래된 해당 서열과, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. HBV 표면 항원, HBV 중합효소 항원 및 HBV 코어 항원에 대한 적합하고, 예시적인 다양한 서열들이 본원에서 언급된다.
이러한 융합 단백질의 일 예는 도 7에 개략적으로 도시된다. 이 융합 단백질을 포함하는 조성물의 일 예는 실시예 3에 기술된다. 이러한 구현예에서, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를, HBV 표면-중합효소-코어 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작한다. 각 경우에, 융합 단백질은 서열번호 41로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다: (1) 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위한 N-말단 펩타이드 (예, 서열번호 41의 1-5번 위치); 2) HBV 대형 (L) 표면 단백질의 pre-S1 영역의 HBV 간세포 수용체 도메인의 아미노산 서열 (L에 고유함) (예, 서열번호 11의 21-47번 위치 또는 서열번호 41의 6-32번 위치); 3) HBV 소형 (S) 표면 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 11의 176-400번 위치 또는 서열번호 41의 33-257번 위치); 4) 서열의 클로닝 및 조작을 용이하게 하기 위한 2개의 아미노산 스페이서/링커 (예, 서열번호 41의 258-259번 위치); 5) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 중합효소의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 247-691번 위치 또는 서열번호 41의 260-604번 위치); 6) HBV 코어 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 41의 605-786번 위치); 및 7) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 41의 787-792번 위치). 또한, 상기 서열은 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 아울러, 일 구현예에서, 이 구조체의 서열은 다음과 같은 항-바이러스 내성 돌연변이를 하나 이상 또는 모두를 도입하도록 변형시킬 수 있다: rtM204l, rtL180M, rtM204V, rtV173L, rtN236T, rtA194T (HBV 중합효소의 전장 아미노산 서열에 대해 위치가 지정됨). 일 구현예에서, 이들 돌연변이들 중 하나를 각각 포함하는 6종의 면역치료 조성물을 제조한다. 다른 구현예에서, 상기 돌연변이들 전체 또는 몇가지가 하나의 융합 단백질에 포함된다. 일 구현예에서, 이 구조체는 표면 항원에 하나 이상의 항-바이러스 내성 돌연변이도 포함한다. 본원에 기술된 임의의 융합 단백질에 사용되는 아미노산 세그먼트를, 임의의 도메인의 양 말단의 옆에 위치한 부가적인 아미노산을 사용함으로써, 변형시킬 수 있으며; 본 발명에 제공되는 구현예는 예시적인 것이다. 예를 들어, 이러한 구현예에 따른 융합 단백질은, 1) HBV 대형 (L) 표면 단백질의 pre-S1 영역의 HBV 간세포 수용체 도메인의 아미노산 서열 (L에 고유함) (예, 서열번호 11의 21-47번 위치 또는 서열번호 41의 6-32번 위치); 2) HBV 소형 (S) 표면 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 11의 176-400번 위치 또는 서열번호 41의 33-257번 위치); 3) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 중합효소의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 247-691번 위치 또는 서열번호 41의 260-604번 위치); 및 4) HBV 코어 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 41의 605-786번 위치)을 포함할 수 있으며, N- 또는 C-말단 서열을 이용하지 않거나 또는 다른 N- 또는 C-말단 서열을 이용하거나, 및/또는 HBV 서열들 사이에 링커를 이용하거나 이용하지 않을 수 있다. 일 구현예에서, 서열번호 41의 1-5번 위치에 표시되는 N-말단 펩타이드 대신, 서열번호 89 또는 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드가 이용되며, 기술된 바와 같이 융합 단백질의 나머지 부분이 다음 순서로 이어진다.
상기한 융합 단백질에 대한 다른 예가 실시예 8에서 기술된다. 실시예 8은 HBV 표면 항원, 코어 단백질 및 중합효소의 서열을 포함하는 융합 단백질을 예시하는데, 이때 상기 서열은 서열번호 110 및 서열번호 118로 표시되는 융합 단백질의 세그먼트들로부터 유래된다. 이 항원은 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 토대로 하지만; 서열번호 107 또는 서열번호 112 (유전자형 A), 서열번호 108 또는 서열번호 114 (유전자형 B), 서열번호 109 또는 서열번호 116 (유전자형 C)로 표시되는 융합 단백질로부터 유래되는 대응되는 융합 세그먼트들을 이용하거나, 또는 다른 HBV 유전자형, 서브-유전자형, 컨센서스 서열 또는 균주 유래의 대응되는 서열을 이용하여, 유사한 전체 구조를 구비한 융합 단백질을 제조하는 것은, 쉬운 일일 것이다. 이러한 예로, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터, CUP1의 통제 하에 이 융합 단백질을 발현하도록 조작하였고, 제조되는 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 도 8에 개락적으로 도시된 GI-13015로 지칭할 수 있다. 서열번호 120으로 표시되는 융합 단백질은, 표면 항원, 코어 단백질 및 중합효소 서열을 이러한 순서로, 서열번호 120으로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드로서 포함한다 (HBV 서열이 아닌 선택 서열은 서열번호 120의 기본 서열에 포함되진 않지만, 실시예 8에 기술된 구조에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서), 이는 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 사용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있음; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 1-3개 이상의 아미노산들로 구성된 링커 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서); (3) 서열번호 120의 1-399번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); (4) 서열번호 120의 400-581번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); (5) 서열번호 120의 582-809번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역 (서열번호 110의 250-477번 위치에 해당됨); 및 (6) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍 (실시예 8에 기술된 구조체에서). 서열번호 120는 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 120의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 119로 표시된다.
상기한 융합 단백질에 대한 또 다른 예는 실시예 8에서 설명된다. 실시예 8은 HBV 중합효소, 표면 항원 및 코어 단백질의 서열을 포함하는 융합 단백질을 예시하는데, 여기서 상기 서열은 서열번호 110 및 서열번호 118로 표시되는 융합 단백질의 세그먼트들로부터 유래된다. 이 융합 단백질은 융합 단백질내에서의 융합 세그먼트들의 배열 측면에서 서열번호 120을 포함하는 융합 단백질과 상이하다. 이 항원은 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 토대로 하지만; 서열번호 107 또는 서열번호 112 (유전자형 A), 서열번호 108 또는 서열번호 114 (유전자형 B), 서열번호 109 또는 서열번호 116 (유전자형 C)로 표시되는 융합 단백질로부터 유래되는 대응되는 융합 세그먼트들을 이용하거나, 또는 다른 HBV 유전자형, 서브-유전자형, 컨센서스 서열 또는 균주 유래의 대응되는 서열을 이용하여, 유사한 전체 구조를 구비한 융합 단백질을 제조하는 것은, 쉬운 일일 것이다. 이러한 예로, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터, CUP1의 통제 하에 이 융합 단백질을 발현하도록 조작하였고, 제조되는 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 도 12에 개락적으로 도시된 GI-13019로 지칭할 수 있다. 서열번호 128로 표시되는 융합 단백질은, 중합효소, 표면 항원 및 코어 서열을, 이러한 순서로, 서열번호 128로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드로서 포함한다 (본원에 예시된 구조체에서 중합효소 세그먼트와 표면 항원 세그먼트 사이의 Leu-Glu 링커를 제외하고는, HBV 서열이 아닌 선택 서열은 서열번호 128의 기본 서열에 포함되진 않음, 실시예 8에 기술된 구조에서와 같이 이 서열에 부가될 수 있음): (1) 선택적으로, 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서), 이는 서열번호 89, 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드, 또는 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료제와 함께 사용하는데 적합한 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있음; (2) 선택적으로, 2개의 아미노산 링커 Thr-Ser 등의, 1-3개 이상의 아미노산들로 구성된 링커 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서); (3) 서열번호 128의 1-228번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역 (서열번호 110의 250-477번 위치에 해당됨); (4) 선택적으로, 서열번호 128의 229-230번 위치로 표시되는 2개의, 아미노산 링커 Leu-Glu 등의, 1-3개 이상의 아미노산들로 구성된 링커 펩타이드 (실시예 8에 기술된 구조체에서); (5) 서열번호 128의 231-629번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); (6) 서열번호 128의 630-811번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); 및 (7) 선택적으로, 헥사히스티딘 텍 (실시예 8에 기술된 구조체에서). 서열번호 128는 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 128의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 127로 표시된다.
중합효소 및 코어 단백질을 포함하는 HBV 항원. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 방법에 사용하기 위한 HBV 항원(들)은, HBV 항원이 HBV 중합효소 (RT 도메인) 또는 이의 하나 이상의 면역원성 도메인, 및 HBV 코어 단백질 (HBcAg) 또는 이의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함하거나 또는 이들로 구성된 것인, HBV 항원을 포함하는 융합 단백질이다. 일 측면에서, HBV 중합효소의 RT 도메인 또는 HBV 코어 단백질은 이중 하나 또는 둘다가 전장 또는 거의 전장이다. 일 측면에서, HBV 중합효소의 RT 도메인 또는 HBV 코어 단백질 또는 이의 도메인 중 하나 또는 둘다는, 각각 전장 HBV 중합효소의 RT 도메인 또는 HBV 코어 단백질 또는 이의 도메인의 선형 서열의, 또는 서열번호 98 (최적화된 HBV 중합효소), 서열번호 99 (최적화된 코어 단백질)로 표시되는 아미노산 서열의, 또는 적용가능한 경우, 다른 HBV 균주로부터 유래된 해당 서열의, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 일 측면에서, HBV 중합효소의 RT 도메인, 또는 HBV 코어 단백질 또는 이의 도메인 중 하나 또는 둘다는, 각각 HBV 중합효소의 전장 RT 도메인 또는 HBV 코어 단백질 또는 이의 도메인과, 또는 서열번호 98 (최적화된 HBV 중합효소), 서열번호 99 (최적화된 코어 단백질)로 표시되는 아미노산 서열과, 또는 적용가능한 경우, 다른 HBV 균주로부터 유래된 해당 서열과, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%로 동일하다. HBV 중합효소 항원과 HBV 코어 항원에 대한 적합하고 예시적인 다양한 서열들이 본원에 기술되어 있다.
이 항원에 대한 일 예를 도 4에 개략적으로 도시한다. 이 융합 단백질을 포함하는 조성물의 일 예를 실시예 3에서 설명한다. 이러한 구현예에서, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)는, 다양한 HBV 중합효소-코어 융합 단백질을 도 4에 개략적으로 도시된 바와 같이 구리-유도성 프로모터 CUP1, 또는 TEF2 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작된다. 각 경우에, 융합 단백질은 서열번호 37로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다: (1) 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위한 N-말단 펩타이드 (예, 서열번호 37 또는 서열번호 38의 1-6번 위치); 2) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 유전자형 C 중합효소의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 347-691번 위치 또는 서열번호 38의 7-351번 위치); 3) HBV 유전자형 C 코어 단백질 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 38의 352-533번 위치); 및 4) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 38의 534-539번 위치). 상기 서열은, 또한, 상기 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 본원에 기술된 임의의 융합 단백질에 사용되는 아미노산 세그먼트들을, 임의의 도메인의 양 말단 측면에 위치한 부가적인 아미노산을 이용함으로써 변형시킬 수 있으며; 본원에 제공된 예들은 예시적인 것이다. 예컨대, 본 구현예에 따른 융합 단백질은, 1) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 유전자형 C 중합효소의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 347-691번 위치 또는 서열번호 38의 7-351번 위치); 및 2) HBV 유전자형 C 코어 단백질 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 38의 352-533번 위치)을 포함할 수 있으며, N- 또는 C-말단 서열을 이용하지 않거나 또는 다른 N- 또는 C-말단 서열을 이용하거나, 및/또는 HBV 서열들 사이에 링커를 이용하거나 이용하지 않을 수 있다. 일 구현예에서, 서열번호 37로 표시되는 N-말단 펩타이드 대신, 서열번호 89 또는 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드가 사용되며, 융합 단백질의 나머지 부분이 다음으로 이어진다.
X 항원과 코어 단백질을 포함하는 HBV 항원. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 방법에 사용하기 위한 HBV 항원(들)은, HBV 항원이 HBV X 항원 또는 이의 하나 이상의 면역원성 도메인, 및 HBV 코어 단백질 (HBcAg) 또는 이의 하나 이상의 면역원성 도메인을 포함하거나 또는 이들로 구성된 것인, HBV 항원을 포함하는 융합 단백질이다. 일 측면에서, 상기 HBV X 항원 또는 HBV 코어 단백질 중 하나 또는 둘다가 전장 또는 거의 전장이다. 일 측면에서, 상기 HBV X 항원 또는 HBV 코어 단백질 또는 이의 도메인 중 하나 또는 모두, 각각 전장 HBV X 항원 또는 HBV 코어 단백질 또는 이의 도메인의 선형 서열의, 서열번호 99 (최적화된 코어 단백질), 서열번호 100 (최적화된 X 항원)으로 표시되는 아미노산 서열의, 또는 적용가능한 경우, 다른 HBV 균주로부터 유래된 해당 서열의 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 일 측면에서, 상기 HBV X 항원 또는 HBV 코어 단백질 또는 이의 도메인 중 하나 또는 모두는, 각각 전장 HBV X 항원 또는 HBV 코어 단백질 또는 이의 도메인과, 서열번호 99 (최적화된 코어 단백질), 서열번호 100 (최적화된 X 항원)으로 표시되는 아미노산 서열과, 또는 적용가능한 경우, 다른 HBV 균주로부터 유래된 해당 서열과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%로 동일하다. HBV 코어 항원 및 HBV X 항원에 대한 적합하고 예시적인 다양한 서열들이 본원에 기술되어 있다.
이 융합 단백질을 도 5에 개략적으로 도시한다. 이 용합 단백질을 포함하는 조성물의 일 예를 실시예 3에서 설명한다. 이러한 구현예에서, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)는, 다양한 HBV X-코어 융합 단백질을 도 5에 개략적으로 도시된 바와 같이 구리-유도성 프로모터 CUP1, 또는 TEF2 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작된다. 각 경우에, 융합 단백질은 서열번호 39로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다: (1) 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위한 N-말단 펩타이드 (예, 서열번호 37 또는 서열번호 39의 1-6번 위치); 2) 거의 전장 (위치 1번 생략) HBV 유전자형 C X 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 12의 2-154번 위치 또는 서열번호 39의 7-159번 위치); 3) HBV 유전자형 C 코어 단백질 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 39의 160-341번 위치); 및 4) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 39의 342-347번 위치). 상기 서열은, 또한, 상기 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 본원에 기술된 임의의 융합 단백질에 사용되는 아미노산 세그먼트들을, 임의의 도메인의 양 말단 측면에 위치한 부가적인 아미노산을 이용함으로써 변형시킬 수 있으며; 본원에 제공된 예들은 예시적인 것이다. 예컨대, 본 구현예에 따른 융합 단백질은, 1) 거의 전장 (위치 1번 생략) HBV 유전자형 C X 항원 (예, 서열번호 12의 2-154번 위치 또는 서열번호 39의 7-159번 위치)의 아미노산 서열; 및 2) HBV 유전자형 C 코어 단백질 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 39의 160-341번 위치)을 포함할 수 있으며, N- 또는 C-말단 서열을 이용하지 않거나 또는 다른 N- 또는 C-말단 서열을 이용하거나, 및/또는 HBV 서열들 사이에 링커를 이용하거나 이용하지 않을 수 있다. 일 구현예에서, 서열번호 37로 표시되는 N-말단 펩타이드 대신, 서열번호 89 또는 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드가 이용되며, 기술된 바와 같이 융합 단백질의 나머지 부분이 다음 순서로 이어진다.
단일 HBV 단백질을 포함하는 HBV 항원. 본 발명의 일 구현예에서, HBV 항원은 단일 HBV 단백질 (예, 표면, 코어, e-항원, 중합효소 또는 X 항원으로부터 선택되는 HBV 단백질 하나) 또는 상기 단일 HBV 단백질로부터 유래된 하나 이상의 도메인 (구조 도메인, 기능성 도메인 및/또는 면역학적 도메인)으로 구성된다. 본 발명의 이 구현예는, 예를 들어 HBV의 치료 또는 예방을 위한 하나 이상의 다른 효모-기반의 면역치료 조성물과 조합하여, 또는 HBV의 치료 또는 예방을 위한 하나 이상의 다른 효모-기반의 면역치료 조성물과 순차적으로, 또는 환자가 감염되기 시작한다면 치료학적 방식으로 예방학적 접근에 후속하여, 사용할 수 있는 효모-기반의 면역치료 조성물을 제작하는데 특히 유용하다. 예를 들어, 본 구현예의 HBV 표면 항원을 포함하는 효모-기반의 면역치료 조성물은, (후술된) HBV X 항원와 같은 다른 HBV 단백질/항원을 포함하는 제2 효모-기반의 면역치료 조성물과, 추가적으로는, 적절한 경우 부가적인 "단일 HBV 단백질" 효모-기반의 면역치료제 (예, HBV 프리코어, 코어 또는 e-항원을 포함하는 효모-기반의 면역치료 조성물 및/또는 HBV 중합효소 항원 또는 이의 도메인을 포함하는 효모-기반의 면역치료 조성물)와 조합할 수 있다. 이들 "단일 HBV 단백질 효모 면역치료제들"은 조합하여, 서로 순차적으로, 및/또는 실시예들 또는 본원의 도처에서 언급된 것 등의 다른 멀티-HBV 단백질 효모-기반의 면역치료제와 조합하거나 순차적으로 사용할 수 있다. 다른 예로, 또는 추가적으로, 이러한 HBV 표면 항원 효모-기반의 면역치료 조성제 등의 "단일 HBV 효모 면역치료제"를, 임의의 소정의 유전자형 또는 서브-유전자형에 대한 HBV 서열을 이용하여 제조할 수 있으며, 부가적인 HBV 표면 항원 효모-기반의 면역치료제를 임의의 한가지 이상의 추가적인 유전자형 또는 서브-유전자형의 HBV 서열을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 전략은, 본 발명의 하나 이상의 효모-기반의 면역치료제를 포함하는 전략에서, 또는 본 발명의 효모-기반의 면역치료제 측면에서, 각각 제공되는 것과는 상이한 HBV 항원 및 유전자형 및/또는 서브-유전자형의 "스파이스 랙(spice rack)"을 효율적으로 구축한다. 이에, HBV로 감염된 개별 환자 또는 환자의 집단을 치료하는데 사용하기 위해, 이들 효모-기반의 면역치료제들의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 종 이상의 임의 조합을 선택할 수 있으며, 이는 개별 환자, 환자의 집단, 인구통계 또는 기타 환자 그룹핑의 요구를 만족시키도록 주문 제작 또는 맞춤 제작하는 본 발명의 유연성을 설명해준다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 방법에 사용하기 위한 HBV 항원(들)은 하기를 포함하거나 또는 이들로 구성된 HBV 항원이다: (a) HBV 대형 (L) 표면 항원의 Pre-S1의 간세포 수용체 영역, HBV 대형 (L) 표면 항원, HBV 중형 (M) 표면 항원, HBV 소형 (S) 표면 항원 (HBsAg), 또는 이들의 임의 도메인 또는 임의 조합을 포함할 수 있는, HBV 표면 항원 단백질 및/또는 이의 하나 이상의 도메인 (구조 도메인, 기능성 도메인 또는 면역원성 도메인); (b) HBV 중합효소의 하나 이상의 도메인 (구조 도메인, 기능성 도메인 또는 면역원성 도메인, 예컨대 HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인 (기능성 도메인)을 포함할 수 있는, HBV 중합효소 항원; (c) HBV 코어 및 HBV e-항원 둘다, 또는 이들 단백질들 중 하나 또는 다른 하나로부터 유래된 서열을 포함하는 HBV 프리코어의 하나 이상의 도메인 또는 영역들을 포함할 수 있는, HBV 프리코어 항원, HBV 코어 항원 및/또는 HBV e-항원, 또는 이의 하나 이상의 도메인 (구조 도메인, 기능성 도메인 또는 면역원성 도메인); 또는 (d) HBV X 항원의 하나 이상의 도메인 (구조 도메인, 기능성 도메인 또는 면역원성 도메인)을 포함할 수 있는, HBV X 항원. 일 측면에서, 상기 단백질 또는 도메인들 중 임의의 하나 이상은 전장 또는 거의 전장이다. 일 측면에서, 이들 단백질 또는 도메인들 중 하나 이상은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 면역원성 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 측면에서, 이들 단백질 또는 도메인들 중 임의의 하나 이상은 대응되는 전장 서열 또는 이의 도메인의 선형 서열의 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 일 측면에서, 이들 단백질 또는 도메인들 중 임의의 하나 이상은 대응되는 전장 서열 또는 이의 도메인과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%로 동일하다. HBV 표면 항원, HBV 중합효소 항원, HBV 코어 항원 및 HBV X 항원에 대한 적합하고 예시적인 다양한 서열들이 본원에 기술되어 있다.
표면 항원 단백질을 포함하는 조성물의 일 예를 실시예 5에 기술한다. 이 구현예에서, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 HBV 표면 단백질을 발현하도록 조작한다. 상기 단백질은, 서열번호 93으로 표시되는, HBV 거의-전장 HBV 대형 (L) 표면 항원 (항원의 발현을 강화하거나 안정화하기 위해 선택된 N-말단 서열의 존재를 수반하기 위함)을 포함하는 단일 폴리펩타이드이다: (1) 서열번호 89의 N-말단 펩타이드 (서열번호 93의 1-89번 위치); 2) 거의 전장 (위치 1번 생략) HBV 유전자형 C 대형 (L) 표면 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 11의 2-400번 위치 또는 서열번호 93의 90-488번 위치); 및 3) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 93의 489-494번 위치). 다른 예로, 상기 N-말단 펩타이드는 서열번호 37 또는 이의 상동체, 또는 본원에 기술된 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있다. 일 구현예에서, 이 구조체는 표면 항원에 한가지 이상의 항-바이러스 내성을 또한 포함한다. 이 구현예는 면역 시스템에 의해 이루어지는 면역원성 에피토프의 노출을 극대화할 수 있는 HBV 항원으로서 대형 (L) 표면 항원을 이용하지만, 표면 항원의 임의 도메인 또는 도메인들의 조합을 포함하는, 표면 항원의 작은 영역을 본원에 제공된 지침을 이용하여 제조할 수 있다. 아울러, 상기 예시적인 면역치료제가 유전자형 C 서열을 이용하여 표시되지만, HBV의 다른 유전자형, 서브-유전자형 및/또는 균주 또는 분리주로부터 유래된 서열을 대신 사용할 수 있다.
HBV 중합효소 항원을 포함하는 조성물의 일 예를 실시예 3과 실시예 5에 기술한다. 실시예 5에서 언급된 HBV 항원은 도 6에 개략적으로 나타나있다. 본 구현예에서, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 다양한 HBV 중합효소 단백질을 발현하도록 조작한다. 각각의 경우에, 융합 단백질은 서열번호 40으로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다: (1) 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위한 N-말단 펩타이드 (서열번호 37, 또는 서열번호 40의 1-6번 위치); 2) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 유전자형 C 중합효소의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 347-691번 위치 또는 서열번호 40의 7-351번 위치); 및 3) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 40의 352-357번 위치). 상기 서열은, 또한, 상기 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 아울러, 일 구현예에서, 이 구조체의 서열을 다음과 같은 항-바이러스 내성 돌연변이들 중 하나 이상 또는 전체를 도입하도록 변형시킬 수 있다: rtM204l, rtL180M, rtM204V, rtV173L, rtN236T, rtA194T (HBV 중합효소의 전장 아미노산 서열에 대해 제시된 위치들). 일 구현예에서, 각각 이들 돌연변이들 중 각 하나를 포함하는 6종의 다른 면역치료 조성물을 제조한다. 다른 구현예에서, 이들 돌연변이들 중 일부 또는 전체가 단일 융합 단백질에 포함된다. 본원에 기술된 임의의 융합 단백질에 사용되는 아미노산 세그먼트들을, 임의의 도메인의 양 말단 측면에 위치한 부가적인 아미노산을 이용함으로써 변형시킬 수 있으며; 본원에 제공된 예들은 예시적인 것이다. 예컨대, 본 구현예에 따른 융합 단백질은, 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 유전자형 C 중합효소의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 347-691번 위치 또는 서열번호 의 7-351번 위치40)을 포함할 수 있으며, N- 또는 C-말단 서열을 이용하지 않거나 또는 다른 N- 또는 C-말단 서열을 이용하거나, 및/또는 HBV 서열들 사이에 링커를 이용하거나 이용하지 않을 수 있다. 일 구현예에서, 서열번호 37로 표시되는 N-말단 펩타이드 대신, 서열번호 89 또는 서열번호 90으로 표시되는 N-말단 펩타이드가 이용되며, 기술된 바와 같이 융합 단백질의 나머지 부분이 다음 순서로 이어진다.
실시예 5에 나타낸 구현예에서, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 HBV 중합효소 단백질을 발현하도록 조작한다. 상기 단백질은, 서열번호 94로 표시되는, 중합효소 (Pol)의 HBV 역전사효소 (RT) 도메인을 포함하는 단일 폴리펩타이드이다: (1) 서열번호 89의 N-말단 펩타이드 (서열번호 94의 1-89번 위치); 2) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 유전자형 C 중합효소의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 347-691번 위치 또는 서열번호 94의 90-434번 위치); 및 3) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 94의 435-440번 위치). 상기 서열은, 또한, 상기 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 아울러, 일 구현예에서, 이 구조체의 서열을 다음과 같은 항-바이러스 내성 돌연변이들 중 하나 이상 또는 전체를 도입하도록 변형시킬 수 있다: rtM204l, rtL180M, rtM204V, rtV173L, rtN236T, rtA194T (HBV 중합효소의 전장 아미노산 서열에 대해 제시된 위치들). 다른 구현예로, 상기 N-말단 펩타이드는 서열번호 37 또는 이의 상동체, 또는 본원에 기술된 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있다.
HBV 프리코어, 코어 또는 e-항원을 포함하는 조성물의 일 예를 실시예 5에 기술한다. 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 HBV 코어 단백질을 발현하도록 조작한다. 상기 단백질은, 서열번호 95로 표시되는, 거의 전장 HBV 코어 단백질을 포함하는 단일 폴리펩타이드이다: (1) 서열번호 89의 N-말단 펩타이드 (서열번호 95의 1-89번 위치); 2) HBV 유전자형 C 코어 단백질의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 95의 90-271번 위치); 및 3) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 95의 272-277번 위치). 상기 서열은, 또한, 상기 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 다른 구현예로, 상기 N-말단 펩타이드는 서열번호 37 또는 이의 상동체, 또는 본원에 기술된 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있다.
HBV X 항원을 포함하는 효모-기반의 면역치료 조성물의 일 예를 실시예 5에 기술한다. 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 HBV X 항원을 발현하도록 조작한다. 상기 단백질은, 서열번호 96으로 표시되는, 거의 전장 HBV X 항원을 포함하는 단일 폴리펩타이드이다: (1) 서열번호 89의 N-말단 펩타이드 (서열번호 96의 1-89번 위치); 2) HBV 유전자형 C X 항원의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 12의 2-154번 위치 또는 서열번호 96의 90-242번 위치); 및 3) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 96의 243-248번 위치). 상기 서열은, 또한, 상기 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 다른 구현예로, 상기 N-말단 펩타이드는 서열번호 37 또는 이의 상동체, 또는 본원에 기술된 다른 N-말단 펩타이드로 치환될 수 있다.
2종 이상의 유전자형으로부터 유래된 HBV 단백질들을 포함하는 HBV 항원들. 본 발명의 다른 구현예는 한가지 조성물을 이용하여 다수의 개체 또는 개체 집단을 치료할 수 있는 잠재력을 갖춘 조성물을 제공하기 위해, HBV 유전자형 및/또는 서브-유전자형의 치료를 극대화하는 본 발명의 면역치료 조성물에 사용하기 위한 HBV 항원에 관한 것이다. 이러한 조성물은 일반적으로 제조하기 보다 효율적이며 (즉, 다중 항원을 포함함으로 인한 제조 이점 및/또는 유전자형을 타겟팅하는 컨센서스 방식을 가짐), 매우 다양한 임상 상황에 활용하기 보다 효과적이다 (예, 하나의 조성물이 여러가지 다른 지리학적 상황에 있는 여러 타입의 환자 집단들에게 제공될 수 있음). 전술한 바와 같이, 이러한 HBV 항원을 수득하기 위해서는, (HBV 유전자형들 간에) 보존된 항원 및/또는 보존된 도메인을 선정하고, 보존된 면역학적 도메인의 포함을 최대화하도록 항원을 설계할 수 있다.
이러한 구현예에 대한 일 측면에 있어서, 항원 구조체에 2, 3, 4, 5번 이상 반복되되, 각 반복시 다른 HBV 유전자형 또는 서브유전자형으로부터 유래된 서열을 이용하는, 단일 효모-기반의 면역치료성 단일 HBV 단백질 또는 이의 도메인 (예, 표면, 중합효소, 코어/e 또는 X)에 포함하는, HBV 항원을 제공한다. 이러한 측면에서, 복수의 우성 또는 일반적인 유전자형을 하나의 효모-기반의 면역치료제에서 타겟팅하여 임상적 및 제조 효율을 높일 수 있다. 이러한 항원은, 적절한 경우, 서브-유전자형, 균주 또는 분리주 차이로 인한 사소한 차이를 포함할 수 있는, 항원내 컨센서스 T 세포 에피토프를 포함하는 컨센서스 서열의 포함을 최대화하도록 변형시킬 수 있다.
이에, 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 방법에 사용하기 위한 HBV 항원(들)은, 다른 HBV 유전자형들의 동일 단백질 또는 도메인의 HBV 항원들이 2번 이상 반복된 것 (예, HBV 코어 또는 e-항원의 하나 이상의 도메인 (구조 도메인, 기능성 도메인 또는 면역원성 도메인)을 포함할 수 있는, 2개 이상의 HBV 코어 또는 e-항원으로서, 여기서 항원은 HBV 유전자형 C 및 HBV 유전자형 D 각각으로부터 유래된 동일한 또는 유사한 항원을 포함하며, 각 코어 단백질이 다른 유전자형인 코어-코어 융합체를 형성함)을 포함하거나 또는 이로 구성된 HBV 항원이다. 일 측면에서, 이러한 구조체에 사용되는 HBV 단백질은 전장 또는 거의 전장의 단백질 또는 도메인이다. 일 측면에서, HBV 항원은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 면역원성 도메인을 포함하거나 이들로 구성된다. 일 측면에서, 상기 단백질 또는 도메인들 중 임의의 하나 이상은 대응되는 전장 서열의 선형 서열의 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 일 측면에서, 상기 단백질 또는 도메인들 중 임의의 하나 이상은 대응되는 전장 서열의 선형 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.
그러한 항원은 실시예 6에서 예시된다. 이 구현예에서, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 HBV 융합 단백질을 발현하도록 조작한다. 상기 단백질은, 서열번호 105로 표시되는, 각 하나가 다른 유전자형 (HBV 유전자형 A, B, C 및 D)으로 부터 유래된 4개의 코어 항원을 포함하는 단일 폴리펩타이드이다: 1) 서열번호 105의 1번 위치에 N-말단 메티오닌; 2) HBV 유전자형 A 유래 거의 전장 코어 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 1의 31-212번 위치 또는 서열번호 105의 2-183번 위치); 3) HBV 유전자형 B 유래 거의 전장 코어 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 5의 30-212번 위치 또는 서열번호 105의 184-395번 위치); 4) HBV 유전자형 C 유래 거의 전장 코어 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 9의 30-212번 위치 또는 서열번호 105의 396-578번 위치); 5) HBV 유전자형 D 유래 거의 전장 코어 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 13의 30-212번 위치 또는 서열번호 105의 579-761번 위치); 및 5) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 105의 762-767번 위치). 상기 서열은, 또한, 상기 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 1번 위치에서의 N-말단 메티오닌은 서열번호 37 또는 이의 상동체, 또는 서열번호 89 또는 서열번호 90의 알파 프리프로 서열 또는 이의 상동체, 또는 적절한 경우 임의의 다른 적합한 N-말단 서열로 치환될 수 있다. 아울러, 필요에 따라 구조체의 클로닝 및 조작을 용이하게 하기 위해 HBV 단백질들 사이에 링커 서열을 삽입할 수 있다. 이는, HBV 유전자형들 및/또는 서브-유전자형들의 임의의 다른 조합들을 필요에 따라 이러한 설계로 치환하여, 임상적인 유용성이 광범위하고 제조 설계가 효율적인 단일 항원 효모-기반의 HBV 면역치료 산물을 구축할 수 있으므로, 이는 구조체의 예이다. 또한, 서열번호 105의 아미노산 서열은 몇가지 공지된 T 세포 에피토프를 포함하며, 특정 에피토프를 임의의 에피토프에 대해 공개된 서열과 일치되도록 변형된다 (표 5 참조).
본 발명의 다른 측면에서, 단일 HBV 유전자형으로부터 유래된 2종 이상의 단백질 또는 도메인은, HBV 게놈으로 코딩되는 가장 잘 보존된 단백질 서열을 최대화하거나, 또는 항원내 치료학적 또는 예방학적으로 유용한 면역원성 도메인의 포함을 최대화하기 위해 선택될 수 있는, 본 발명에서 사용가능한 HBV 항원에 포함된다. 그래서, 이들 항원은, 다른 HBV 유전자형 또는 서브유전자형으로부터 유래된 동일한 또는 유사한 서열을 이용하여, 동일 융합 단백질에 반복된다. 이러한 측면에서, 복수의 우성 또는 일반적인 유전자형이 한가지 효모-기반의 면역치료제에서 타겟팅될 수 있어, 임상적인 효율과 제조 효율을 높일 수 있다. 또한, 이들 항원은, 필요에 따라, 서브-유전자형, 균주 또는 분리주 차이로 인한 사소한 차이를 포함할 수 있는, 항원내 컨센서스 T 세포 에피토프의 포함을 최대화하도록 변형시킬 수 있다.
이에, 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 방법에 사용하기 위한 HBV 항원(들)은, 각각 2번 이상 반복되되, 반복된 서열들이 다른 HBV 유전자형들로부터 유래된, 2가지 이상의 상이한 HBV 단백질 또는 이의 도메인을 포함하거나, 또는 이로 구성된 HBV 항원이다 (예, 2개 이상의 HBV 코어 및 2개 이상의 X 항원, 또는 이의 도메인, 이때, 상기 항원은 각각 HBV 유전자형 C와 HBV 유전자형 D로부터 유래된 동일한 또는 유사한 항원을 포함하며, 코어-X-코어-X 융합 (또는 융합에서 세그먼트들의 임의의 다른 순서)을 형성하며, 각 코어 단백질은 다른 유전자형이고, 각 X 항원은 다른 유전자형임). 일 측면에서, 이러한 구조체에 사용되는 HBV 단백질은 전장 또는 거의 전장의 단백질 또는 도메인이다. 일 측면에서, HBV 항원은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 면역원성 도메인을 포함하거나 이로 구성된다. 일 측면에서, 상기 단백질 또는 도메인들 중 임의의 하나 이상은 대응되는 전장 서열의 선형 서열의 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 일 측면에서, 상기 단백질 또는 도메인들 중 임의의 하나 이상은 대응되는 전장 서열의 선형 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.
상기한 항원은 실시예 6에서 예시된다. 이 구현예에서, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 HBV 융합 단백질을 발현하도록 조작한다. 상기 단백질은, 서열번호 106으로 표시되는, 쌍의 각 한쪽이 다른 유전자형 (HBV 유전자형 A 및 C)으로부터 유래된 2개의 코어 항원과 2개의 X 항원을 포함하는 단일 폴리펩타이드이다: 1) 서열번호 106의 1번 위치에 N-말단 메티오닌; 2) HBV 유전자형 A 유래 거의 전장 코어 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 1의 31-212번 위치 또는 서열번호 106의 2-183번 위치); 3) HBV 유전자형 A 유래 거의 전장 X 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 4 또는 서열번호 106의 184-337번 위치); 4) HBV 유전자형 C 유래 거의 전장 코어 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 9의 30-212번 위치 또는 서열번호 106의 338-520번 위치); 5) HBV 유전자형 C 유래 거의 전장 X 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 8 또는 서열번호 106의 521-674번 위치); 및 5) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 106의 675-680번 위치). 상기 서열은, 또한, 상기 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 1번 위치에서의 N-말단 메티오닌은 서열번호 37 또는 이의 상동체, 또는 서열번호 89 또는 서열번호 90의 알파 프리프로 서열 또는 이의 상동체, 또는 적절한 경우 임의의 다른 적합한 N-말단 서열로 치환될 수 있다. 또한, 서열번호 106의 아미노산 서열은 몇가지 공지된 T 세포 에피토프를 포함하며, 특정 에피토프를 소정의 에피토프에 대해 공개된 서열과 일치되도록 변형된다 (표 5 참조).
HBV 항원에 대한 부가적인 구현예들. 본 발명의 일부 측면들에서, 야생형 또는 참조(reference) HBV 단백질의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 아미노산에 아미노산 삽입, 결손 및/또는 치환할 수 있으며, 단, 제조되는 HBV 단백질은, 본 발명의 효모-HBV 면역치료 조성물에 항원으로서 사용되는 경우, 강화된 면역 반응, 감소된 면역 반응 또는 실질적으로 유사한 면역 반응을 포함할 수 있는, 타겟 또는 야생형 또는 참조 HBV 단백질에 대해 면역 반응을 도출한다. 예를 들어, 본 발명은, MHC 분자에 대한 또는 MHC 제시 상황에서 에피토프를 인지하는 T 세포 수용체에 대한 에피토프의 결합능(avidity) 또는 친화성을 개선시킴으로써와 같이, HBV 작용제에 대해 T 세포 반응을 강화하도록 변형된, 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함할 수 있는, HBV 작용제 항원의 사용을 포함한다. 따라서, HBV 단백질 작용제들은 숙주를 감염시키는 천연 HBV 단백질에 대한 T 세포 반응 세기 또는 효능을 개선시킬 수 있다.
서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 92, 서열번호 101, 서열번호 102, 서열번호 107, 서열번호 108, 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 112, 서열번호 114, 서열번호 116, 서열번호 118, 서열번호 120, 서열번호 122, 서열번호 124, 서열번호 126, 서열번호 128, 서열번호 130, 서열번호 132, 서열번호 134, 서열번호 150 또는 서열번호 151을 포함하거나 또는 이로 표시되는 아미노산 서열을 가진 융합 단백질 등의, 전술한 HBV 항원들 중 임의의 HBV 항원을 참조하여, "단일 단백질" 항원 (예, 이들 HBV 단백질들 중 오직 한가지로부터 유래된 항원)을 구축하기 위해, 또는 소정의 참조 융합 단백질에 적용가능한 경우, HBV 단백질 세그먼트들 중 오직 2 또는 3개만을 이용하여 융합 단백질을 구축하기 위해, 융합 단백질에 각각의 HBV 단백질들로부터 유래된 하나 이상의 HBV 항원 (예, HBV 표면 항원, HBV 중합효소, HBV 코어/e-항원, 및/또는 HBV X 항원)을 이용하는 것은 본 발명의 일 측면이다. 또한, 융합 단백질내에서 HBV 단백질 세그먼트들의 순서를 바꾸는 것도 본 발명의 일 측면이다. 다른 대안적인 설계, HBV 유전자형 및/또는 컨센서스 서열들이 조합될 수 있으며, 이때 2, 3 또는 4가지 이상의 유전자형 및/또는 컨센서스 서열을 사용하여 융합 단백질을 구축한다.
또한, 본 발명은 임의의 전술한 융합 단백질의 상동체, 뿐만 아니라 상기한 융합 단백질의 일부분이거나 또는 본원에 기술된, 개별 HBV 단백질 또는 (임의의 기능성 도메인 및/또는 면역원성 도메인을 포함하는) 이의 일부분의 상동체, 변이체 또는 돌연변이의 사용을 포함한다. 일 측면에서, 본 발명은, 본원의 특정 서열 식별자로 표시되는 임의의 HBV 단백질, HBV 항원 및 융합 단백질 등의, 본원에 기술된, 각각의 융합 단백질, 또는 개별 HBV 단백질 또는 HBV 항원들 중 임의의 한가지에 대한 아미노산 서열과, 상기 융합 단백질의 전체 길이에 대해, 또는 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질의 일부를 형성하는 정해진 단백질내 정해진 세그먼트 또는 이의 도메인 (면역원성 도메인 또는 기능성 도메인 (즉, 한가지 이상의 생물학적 활성을 가진 도메인))에 대해, 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 가진, 융합 단백질 또는 개별 (단일) HBV 단백질 또는 HBV 항원의 사용을 포함한다. 당해 기술 분야에 다수의 CTL 에피토프 (HBV로 감염된 환자로부터 유래된 세포독성 T 림프구에 의해 인지되는 에피토프) 및 탈출 돌연변이 (항-바이러스 약물로부터의 선택압(selective pressure)으로 인해 HBV 단백질에서 발생하는 돌연변이)들이 공지되어 있으며, 이러한 정보는 또한 본 발명의 HBV 항원에서 특이 서열을 제공하기 위해 본원에 기술된 HBV 항원의 변이체 또는 상동체를 창출하거나 치환을 만드는데 이용할 수 있다.
효모-기반의 면역치료 조성물. 본 발명의 다양한 구현예에서, 본 발명은 한가지 이상의 "효모-기반의 면역치료 조성물" (이 표현은 "효모-기반의 면역치료 산물", "효모-기반의 면역치료 조성물", "효모-기반의 조성물", "효모-기반의 면역치료제", "효모-기반의 백신" 또는 이들 표현의 변형 형태과 상호 호환적으로 사용될 수 있음)의 사용을 포함한다. "면역치료 조성물"은 개체에서 한가지 이상의 치료학적 효과를 달성하는데 충분한 면역 반응을 도출하는 조성물이다. 본원에서, 효모-기반의 면역치료 조성물은 개체에서 한가지 이상의 치료학적 효과를 달성하는데 충분한 면역 반응을 도출하며, 효모 비히클 성분을 포함하는 조성물을 지칭한다. 보다 구체적으로, 효모-기반의 면역치료 조성물은, 비제한적인 예로서 T 세포-매개 세포성 면역 반응 등의, 세포성 면역 반응과 같은, 면역 반응을 도출 또는 유도할 수 있으며, 효모 비히클 성분을 포함하는 조성물이다. 일 측면에서, 본 발명에 유용한 효모-기반의 면역치료 조성물은 CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포-매개의 면역 반응을, 일 측면에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포-매개의 면역 반응을 유도할 수 있다. 선택적으로, 효모-기반의 면역치료 조성물은 인간 면역 반응을 도출할 수 있다. 본 발명에 유용한 효모-기반의 면역치료 조성물은, 예를 들어, 개체가 HBV 감염으로부터 보호되도록 개체에서 면역 반응을 도출할 수 있거나, 및/또는 HBV 감염으로 인한 증상 또는 HBV 감염을 치료한다.
본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물은 "예방제" 또는 "치료제"일 수 있다. 본 발명의 조성물은, 예방학적으로 제공되는 경우, HBV 감염의 임의 증상의 앞서 제공된다. 이러한 조성물은 출생시, 영유아기 또는 성인에게 투여할 수 있다. 면역치료 조성물의 예방학적 투여는 이후의 HBV 감염을 예방하거나, HBV 감염이 이후에 발생한다면 감염을 보다 신속하게 또는 보다 완전하게 해소시키거나, 및/또는 감염이 이후에 발생한다면 HBV 감염의 증상들을 완화시키기 위해 제공된다. 면역치료 조성물은, 치료학적으로 제공되는 경우, 감염의 한가지 이상의 증상을 완화시키기 위한 목적으로, 바람직하게는 감염 소멸, 감염의 장기간의 진정, 및/또는 이후의 바이러스 감염 또는 재활성화에 대비한 장기 면역성을 제공하기 위한 목적으로, HBV 감염시 또는 감염 후에 제공된다. 일 측면에서, 치료 목적은 HBV 바이러스 부하(load)의 감소 또는 검출가능한 HBV 바이러스 부하의 소거이다 (예, PCR로 검출가능한 수준 미만 또는 <2000 IU/ml). 일 측면에서, 치료 목적은 치료 종료 후 적어도 6달간 지속적인 바이러스 소멸(viral clearance)이다. 일 측면에서, 치료 목적은 검출가능한 혈청 HBeAg 및/또는 HBsAg 단백질의 소실이다. 일 측면에서, 치료 목적은 B형 간염 바이러스 표면 항원 (항-HB)에 대한 항체 및/또는 HBeAg에 대한 항체의 발생이다. 일 측면에서, 치료 목적은, (a) 방사면역분석으로 측정 시 ≥ 10 SRU (sample ratio unit); (b) 효소 면역 분석시 양성 결과; 또는 (c) 항체 농도 검출 >10 mIU/ml (10 SRU는 항체 10 mIU/mL에 상응함)로 정의될 수 있는, 혈청전환이다. 일 측면에서, 치료 목적은 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 수준의 정상화, 간 염증 개선 및/또는 간 섬유증 개선이다.
전형적으로, 효모-기반의 면역치료 조성물은, 효모 비히클, 및 상기 효모 비히클에 의해 발현되거나, 접촉되거나 또는 혼합된, 하나 이상의 항원 또는 이의 면역원성 도메인을 포함하되, 상기 항원은 효소에 이종이며, 상기 항원은 하나 이상의 HBV 항원 또는 이의 면역원성 도메인을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 항원 또는 이의 면역원성 도메인은 융합 단백질로서 제공된다. 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기에 적합한 수종의 HBV 융합 단백질은 상기에 기술한 바 있다. 본 발명의 일 측면에서, 융합 단백질은 2 이상의 항원을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 융합 단백질은 하나 이상의 항원의 2 이상의 면역원성 도메인, 또는 하나 이상의 항원의 2 이상의 에피토프를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용되는 임의의 효모-기반의 면역치료 조성물에 있어서, 효모 비히클에 관한 하기 측면들은 본 발명에 포함된다. 본 발명에서, 효모 비히클은 본 발명의 치료 조성물에서 하나 이상의 항원, 면역원성 도메인 또는 에피토프와 조합하여 사용할 수 있는, 임의의 효모 세포 (예, 전효모 또는 온전한 세포) 또는 이의 유도체이거나, 일 측면에서, 효모 비히클은 단독 사용되거나 또는 보강제로서 사용될 수 있다. 따라서, 효모 비히클은, 비제한적인 예로서, 살아있는 온전한 (전체) 효모 미생물 (즉, 세포 벽을 비롯한 효모의 모든 성분들을 구비한 효모 세포), 사멸(죽은) 또는 불활성화된 온전한 효모 미생물, 또는 효모 스페로플라스트 (즉, 세포벽이 없는 효모 세포), 효모 사이토플라스트 (즉, 세포벽과 핵이 없는 효모 세포), 효모 고스트 (즉, 세포 벽, 핵 및 사이토플라즘이 없는 효모 세포), 세포내 효모막 추출물 (subcellular yeast membrane extract) 또는 이의 분획 (효모막 입자로도 지칭되며, 종래에는 세포내 효모 입자로 지칭됨), 임의의 다른 효모 입자 또는 효모 세포 벽 제조물 등의 온전한/전효모의 파생물을 포함할 수 있다.
효모 스페로플라스트는 전형적으로 효모 세포 벽의 효소적 분해를 통해 만들어진다. 이러한 방법은, 예를 들어 Franzusoff et al., 1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674에 기재되어 있으며, 이 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
효모 사이토플라스트는 전형적으로 효모 세포의 탈핵에 의해 만들어진다. 이러한 방법은, 예를 들어 Coon, 1978, Natl. Cancer Inst. Monogr. 48, 45-55에 기재되어 있으며, 이 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
효모 고스트는 전형적으로 투과화된 (permeabilized) 세포 또는 세포용혈된 세포 (lysed cell)를 재밀봉함으로써 만들어지지만, 세포의 일정 부분 이상의 기관들을 포함할 필요는 없다. 이러한 방법은, 예컨대, Franzusoff et al., 1983, J. Biol. Chem. 258, 3608-3614 and Bussey et al., 1979, Biochim. Biophys. Acta 553, 185-196에 기재되어 있으며, 각 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
효모 막 입자 (세포내 효모 막 추출물 또는 이의 분획)는 천연 핵 또는 사이토플라즘이 없는 효모 막을 지칭한다. 이 입자는 천연 효모 막 크기에서부터 당해 기술 분야에 공지된 초음파처리 또는 기타 막 파괴 방법을 통해 제조한 후 재밀봉하여 만드는 마이크로입자에 이르는 범위 등의 임의의 크기일 수 있다. 세포내 효모 막 추출물의 제조 방법은, 예를 들어 Franzusoff et al., 1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674에 기술되어 있다. 또한, 효모 막 일부분을 포함하는 효모 막 입자의 분획을 이용할 수도 있으며, 효모 막 입자를 제조하기 전에 항원 또는 기타 단백질을 효소에 의해 재조합에 의해 발현하는 경우, 상기 대상 항원 또는 기타 단백질을 이용할 수 있다. 대상 항원 또는 기타 단백질은 막 내측에서 막의 표면 상에 또는 이의 조합으로 보유될 수 있다 (즉, 단백질은 막의 내측 및 외측 둘다일 수 있으며, 및/또는 효모 막 입자의 막을 가로지를 수 있음). 일 구현예에서, 효모 막 입자는 막의 표면 상에 또는 막내에 일정부분 이상 함입된, 하나 이상의 바람직한 대상 항원 또는 기타 단백질을 포함하는, 온전한, 파괴된 또는 파괴되고 재밀봉된 효모 막일 수 있는, 재조합 효모 막 입자이다.
효모 세포 벽 조제물의 일 예는, 동물에 투여하였을 때, 효모 세포 벽 조제물이 질병 타겟에 대한 바람직한 면역 반응을 자극하도록, 세포 벽내 일정부분 이상 함입된 또는 이의 표면 상에 항원을 보유하고 있는 분리된 효모 세포의 조제물이다.
임의의 효모 균주를 본 발명의 효모 비히클 제조에 사용할 수 있다. 효모는 3가지 강 중 하나에 속하는 단세포성 미생물이다: 자낭균류 (Ascomycetes), 담자균류 (Basidiomycetes) 및 불완전 균류 (Fungi Imperfecti). 면역 조절제(immune modulator)로서 사용하기 위한 효모 타입을 선택함에 있어 한가지 고려사항은 효모의 병원성(pathogenicity)이다. 일 구현예에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지애 등의 비-병원성 균주이다. 비-병원성 효모 균주의 선택은 효모 비히클을 투여받는 개체에 대한 모든 부작용들을 최소화한다. 그러나, 효모의 병원성이 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 임의 수단에 의해 무효화될 수 있다면, 병원성 효모가 사용될 수 있다 (예, 돌연변이 균주).
본 발명에 사용될 수 있는 효모 균주의 속으로는, 비제한적인 예로서, 사카로마이세스, 칸디다, 크립토코커스, 한세뉼라, 클루이베로마이세스, 피키아, 로도토룰라, 시조사카로마이세스 및 야로위아를 포함한다. 일 측면에서, 효모 속은 사카로마이세스, 칸디다, 한세뉼라, 피키아 또는 시조사카로마이세스로부터 선택되며, 일 측면에서, 효모 속은 사카로마이세스, 한세뉼라 및 피키아로부터 선택되며, 일 측면에서, 사카로마이세스가 사용된다. 본 발명에 사용될 수 있는 효모 균주의 종으로는, 비제한적인 예로서, 사카로마이세스 세레비지야, 사카로마이세스 칼스버젠시스(Saccharomyces carlsbergensis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 케피르(Candida kefyr), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 크립토코커스 라우렌티이(Cryptococcus laurentii), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 한세뉼라 아노말라(Hansenula anomala), 한세뉼라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 막시아누스 바르, 락티스(Kluyveromyces marxianus var. lactis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 로도토률라 루브라(Rhodotorula rubra), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함한다. 이들 다수의 속들이 전술한 속에 포함되는 것으로 의도된 다양한 아속(subspecies), 타입 및 서브타입 등을 포함하는 것으로 이해된다. 일 측면에서, 본 발명에 사용되는 효모 종으로는 사카로마이세스 세레비지애, 칸디다 알비칸스, 한세뉼라 폴리모르파, 피키아 파스토리스 및 시조사카로마이세스 폼베를 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애는, 조작이 상대적으로 용이하고, 식품 첨가제로서 사용하는데 "일반적으로 안전한 것으로 인정됨" 또는 "GRAS"이므로, 유용하다 (GRAS, FDA proposed Rule 62FR18938, April 17, 1997). 본 발명의 일 구현예는 사카로마이세스 세레비지애 구상 균주 등의 특히 고카피수로 플라스미드가 복제할 수 있는 효모 균주이다. 사카로마이세스 세레비지애 균주는 하나 이상의 타겟 항원(들) 및/또는 항원 융합 단백질(들) 및/또는 기타 단백질을 고수준으로 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 지지할 수 있는 그러한 한가지 균주이다. 아울러, N-연결된 당화를 연장하는 효소내 돌연변이와 같이 발현된 타겟 항원 또는 기타 단백질의 번역 후 수정 감소를 나타내는 것 등의, 임의의 돌연변이 효모 균주를 본 발명에 이용할 수 있다.
본 발명의 대부분의 구현예들에서, 효모-기반의 면역치료 조성물은 하나 이상의 항원, 이의 면역원성 도메인 또는 에피토프를 포함한다. 본 발명에서의 이용이 고려된 항원은, HBV 감염에 대해 숙주를 예방학적으로 또는 치료학적으로 면역화할 목적으로 이에 면역 반응을 도출하는 것이 바람직한, 돌연변이, 변이체 및 HBV 단백질의 작용제 또는 이의 도메인을 비롯한, 임의의 HBV 항원 또는 이의 면역원성 도메인을 포함한다. 본 발명의 다양한 구현예들에서 사용가능한 HBV 항원들은 상기에 상세하게 기술되어 있다.
선택적으로, 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물의 구성 성분으로서 사용되는, 융합 단백질을 비롯한, 단백질들은, 효모에서 재조합 항원의 발현 또는 발현 안정성을 개선 또는 강화하기 위해 특히 사용가능한 구조체를 이용하여 생산한다. 전형적으로, 바람직한 항원성 단백질(들) 또는 펩타이드(들)은 이의 아미노-말단에서, (a) 효모 비히클에서 융합 단백질의 발현을 안정시키거나 또는 발현된 융합 단백질의 번역후 수정을 방지하는 특이적인 합성 펩타이드 (이러한 펩타이드는 2004년 8월 12일에 공개된 예컨대 미국 특허 공개번호 2004-0156858 A1에 상세히 기술되어 있으며, 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨); (b) 비제한적인 예로서 알파 팩터를 비롯하여, 내인성 효모 단백질의 적어도 일부분으로서, 융합 파트너는 효모에서 단백질의 발현에 안정성 개선을 제공하거나, 및/또는 효모 세포에 의한 단백질의 번역후 수정을 예방함 (이러한 단백질은 또한 전술한 미국 특허 공개번호 2004-0156858 A1에 상세히 기술되어 있음); 및/또는 (c) 효모의 효면에 융합 단백질이 발현되게 하는 효모 단백질의 적어도 일부분 (예, 본원에 보다 상세하게 기술된, Aga 단백질)과 융합된다. 아울러, 본 발명은 선택적으로 단백질의 선별 및 동정에 특히 사용하기 위한, 항원-코딩 구조체의 C-말단과 융합된 펩타이드의 사용을 선택적으로 포함한다. 이러한 펩타이드로는 임의의 합성 펩타이드 또는 천연 펩타이드, 예컨대 펩타이드 텍 (예, 헥사히스티딘) 또는 임의의 다른 짧은 에피토프 텍을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 항원의 C-말단에 부착되는 펩타이드는 전술한 N-말단 펩타이드의 부가와 더불어 또는 부가없이 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 융합 단백질에 사용가능한 합성 펩타이드가 항원의 N-말단에 연결되며, 상기 펩타이드는 항원에 이종인 2개 이상의 아미노산 잔기로 구성되며, 상기 펩타이드는 효모 비히클에서의 융합 단백질의 발현을 안정시키거나 또는 발현되는 융합 단백질의 번역 후 수정을 방지한다. 항원의 합성 헵타이드 및 N-말단 영역이 함께 하기 요건을 구비한 융합 단백질을 형성한다: (1) 융합 단백질의 1번 위치의 아미노산 잔기는 메티오닌임 (즉, 합성 펩타이드에서 첫번째 아미노산이 메티오닌임); (2) 융합 단백질의 2번의 아미노산 잔기는 글리신 또는 프롤린이 아님 (즉, 합성 펩타이드에서 2번째 아미노산은 글리신 또는 프롤린이 아님); (3) 융합 단백질의 2-6번 위치의 아미노산들은 모두 메티오닌이 아님 (즉, 2-6번 위치의 아미노산은, 합성 펩타이드 또는 단백질의 일부이든 간에, 합성 펩타이드가 아미노산 6개 보다 짧다면, 메티오닌을 포함하지 않음); 및 (4) 융합 단백질의 2-6번 위치의 아미노산들은 라이신 또는 아르기닌이 아님 (즉, 2-6번 위치의 아미노산들은, 합성 펩타이드 또는 단백질의 일부이던 간에, 합성 펩타이드가 아미노산 5개 보다 짧다면, 라이신 또는 아르기닌을 포함하지 않음). 합성 펩타이드는 아미노산 2개 길이로 짧을 수 있지만, 일 측면에서 아미노산 2-6개 (아미노산 3, 4, 5개 포함)이며, 아미노산 6개 이상 최대 약 아미노산 200개, 300개, 400개, 500개 또는 그 이상의 모든 정수일 수 있다.
일 구현예에서, 융합 단백질은 M-X2-X3-X4-X5-X6의 아미노산 서열을 포함하되, M은 메티오닌이고; X2는 글리신, 프롤린, 라이신 또는 아르기닌을 제외한 모든 아미노산이고; X3는 메티오닌, 라이신 또는 아르기닌을 제외한 모든 아미노산이고; X4는 메티오닌, 라이신 또는 아르기닌을 제외한 모든 아미노산이고; X5는 메티오닌, 라이신 또는 아르기닌을 제외한 모든 아미노산이고; X6는 메티오닌, 라이신 또는 아르기닌을 제외한 모든 아미노산이다. 일 구현예에서, X6 잔기는 프롤린이다. 효모 세포에서 항원의 발현 안정성을 강화하거나 및/또는 효모에서 단백질의 번역 후 수정을 방지하는 합성 서열의 예는 서열 M-A-D-E-A-P (서열번호 37)를 포함한다. 동일한 특성을 가진 다른 합성 서열의 예는 M-V이다. 발현 산물의 안정성 강화 외에도, 이들 융합 파트너들은 구조체에서 면역화 항원에 대한 면역 반응에 부정적으로 작용하지 않는 것으로 보인다. 아울러, 합성 융합 펩타이드는 항체와 같이 선별 물질에 의해 인지될 수 있는 에피토프를 제공하도록 설계될 수 있다.
일 구현예에서, HBV 항원은 서열번호 89 및 90으로 본원에 아미노산 서열이 예시된, 알파 팩터 프리프로 서열 (알파 팩터 신호 리더 서열이라고도 함) 등의 효모 단백질에 N-말단에서 연결된다. 효모 알파 팩터 프리프로 서열에 대한 다른 서열도 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 본 발명에서의 사용이 포괄된다.
본 발명의 일 측면에서, 효모 비히클은, 항원이 효모 비히클의 표면 상에 (세포외 발현) 일부 또는 전체적으로 발현된 단백질 산물의 전달 또는 전위(translocation)에 의해 발현 또는 제공되도록 조작된다. 본 발명의 이러한 측면을 달성하는 한가지 방법은 효모 비히클의 표면 상에 하나 이상의 단백질(들)를 위치시키기 위해 스페이서 암(spacer arm)을 사용하는 것이다. 예를 들어, 한가지 방법으로, 대상 항원(들) 또는 기타 단백질을 효모 세포 벽으로 타겟팅하는 단백질과 대상 항원(들) 또는 기타 단백질의 융합 단백질을 제작하기 위해 스페이서 암을 이용할 수 있다. 예컨대, 기타 단백질을 타겟팅하는데 사용될 수 있는 상기한 한가지 단백질은, 항원 또는 기타 단백질이 효모의 표면 상에 타겟팅되도록 항원(들) 또는 기타 단백질을 효모 세포 벽으로 타겟팅할 수 있는 효모 단백질 (예, 세포 벽 단백질 2 (cwp2), Aga2, Pir4 또는 Flo1 단백질)이다. 효모 단백질 이외의 단백질들이 스페이서 암에 사용될 수 있지만, 임의의 스페이서 암 단백질의 경우, 스페이서 암 단백질 보다는 타겟 항원에 대해 유도되는 면역원성 반응을 가지는 것이 가장 바람직하다. 이와 같이, 다른 단백질이 스페이서 암에 사용된다면, 사용되는 스페이서 암 단백질은, 타겟 항원(들)에 대한 면역 반응을 압도할 만큼, 스페이서 암 단백질 자체에 대해 대규모의 상기한 면역 반응을 발생시키지 않아야 한다. 당해 기술 분야의 당업자는, 스페이서 암 단백질에 대한 면역 반응이 타겟 항원(들)에 대한 면역 반응에 비해 약하도록 하여야 한다. 스페이서 암들은 적절한 경우 효모로부터 항원을 쉽게 제거하거나 또는 처리할 수 있는 절단부 (예, 프로테아제 절단부)를 가지도록 구축할 수 있다. 면역 반응의 크기를 결정하는 임의의 공지 방법 (예, 항체 생산, 세포용혈성 분석 등)들을 이용할 수 있으며, 당해 기술 분야의 당업자들에게 쉽게 공지되어 있다.
타겟 항원(들) 또는 기타 단백질을 효모 표면 상에 노출되게 위치시키기 위한 다른 방법은, 효모 세포 벽에 타겟을 고정하기 위한 글리코실포스파티딜 이노시톨 (GPI) 등의 신호 서열을 이용하는 것이다. 다른 구현예에서, 위치화는, 항원이 세포 벽에 결합된 단백질 (예, cwp)에 결합하도록, 소포체 (ER: endoplasmic reticulum)로의 전위를 통해 대상 항원(들) 또는 기타 단백질을 분비 경로로 타겟팅하는 신호 서열을 덧붙임으로써, 달성할 수 있다.
일 측면에서, 상기 스페이서 암 단백질은 효모 단백질이다. 효모 단백질은 효모 단백질을 구성하는 아미노산 약 2개 내지 약 800개로 구성될 수 있다. 일 구현예에서, 효모 단백질은 아미노산 약 10개 내지 700개이다. 다른 구현예에서, 효모 단백질은 아미노산 약 40개 내지 600개이다. 본 발명의 다른 구현예는 아미노산이 250개 이상인, 아미노산이 300개 이상인, 아미노산이 350개 이상인, 아미노산이 400개 이상인, 아미노산이 450개 이상인, 아미노산이 500개 이상인, 아미노산이 550개 이상인, 아미노산이 600개 이상인 또는 아미노산이 650개 이상인 효모 단백질을 포함한다. 일 구현예에서, 효모 단백질은 아미노산 450개 이상의 길이이다. 항원 표면 발현을 최적화하기 위한 다른 고려 사항은, 적절한 경우, 항원 및 스페이서 암 조합을 단량체, 이량체 또는 삼량체로서, 또는 심지어 함께 연결된 더 많은 유닛들로서 발현시켜야 하는 지이다. 이러한 단량체, 이량체, 삼량체 등의 사용은, 이의 면역원성을 높이는 방식으로 효모 비히클의 표면 상에 항원의 전체는 아니더라도 일부가 나열되도록, 항원의 적절한 스페이싱 (spacing) 또는 폴딩 (folding)을 가능하게 한다.
효모 단백질의 사용은 효모 비히클에서의 융합 단백질의 발현을 안정시키거나, 발현된 융합 단백질의 번역 후 수정을 방지하거나, 및/또는 효모에서 (예, 효모 세포 표면 상에 발현시킨) 융합 단백질을 개별 구획으로 타겟팅할 수 있다. 효모 분비 경로로 전달하기 위해, 사용할 효모 단백질의 예로는, 비제한적인 예로서, 하기를 포함한다: Aga (비제한적인 예로서, Agal 및/또는 Aga2); SUC2 (효모 인버타제(yeast invertase)); 알파 팩터 신호 리더 서열; CPY; 세포 벽내로의 위치화 및 체류를 위한 Cwp2p; 딸 세포 생성의 첫 단계에서 효모 세포 돌기 (cell bud)에 위치하는 BUD 유전자; Flo1p; Pir2p; 및 Pir4p.
효모 비히클의 다른 파트에, 예컨대 사이토졸, 미토콘드리아, 소포체 또는 핵내로 단백질을 타겟팅, 체류 및/또는 안정시키기 위해, 다른 서열을 사용할 수 있다. 전술한 임의의 구현예들에서 사용될 수 있는 적정 효모 단백질의 예로는, 비제한적인 예로서, TK, AF, SEC7; 글루코스에서의 억제성 발현 및 사이토졸 국지화를 위한, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 PCK1, 포스포글리세로키나제 PGK 및 트리오스 포스페이트 이소머라제 TPI 유전자 산물; 열 충격 단백질 SSA1, SSA3, SSA4, SSC1, 이의 발현은 유도성이며, 이들 단백질은 열 처리에 세포 노출시 열 안정성이 보다 우수함; 미토콘드리아로 유입하기 위한 미토콘드리아 단백질 CYC1; ACT1을 포함한다.
효모-기반의 면역치료 조성물을 제조하기 위한, 효모 비히클의 제조 방법 및 효모 비히클과 대상 항원 및/또는 기타 단백질 및/또는 물질과의 발현, 조합 및/또는 회합(association) 방법들은 본 발명에 포함된다.
본 발명에서, 용어 "효모 비히클-항원 복합체" 또는 "효모-항원 복합체"는 일반적으로 효모와 항원의 모든 회합을 묘사하는데 사용되며, 이러한 조성물은 전술한 면역 반응을 도출하는데 사용되는 경우에는 "효모-기반의 면역치료 조성물"과 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 상기한 회합은 효모 (재조합 효모)에 의한 항원의 발현, 효모로의 항원의 도입, 항원의 효모로의 물리적 부착 및 예를 들어 완충제 또는 기타 용액 또는 제형에서와 같이 효모와 항원을 함께 혼합하는 것을 포함한다. 이러한 타입의 복합체들은 아래에서 상세히 설명된다.
일 구현예에서, 효모 비히클의 제조에 이용되는 효모 세포는 단백질 (예, 항원)을 코딩하는 이종의 핵산 분자로 형질감염되어, 상기 단백질은 상기 효모 세포에 의해 발현된다. 그러한 효모는 본 발명에서 재조합 효모 또는 재조합 효모 비히클로서 지칭된다. 그런 다음, 상기 효모 세포는 온전한 세포로서 수지상 세포로 로딩되거나, 사멸되거나, 효모 스페로플라스트, 사이토플라스트, 고스트 또는 아세포 입자의 형성과 같은 방법에 의해 유도체화되고, 이어서 상기 유도체는 수지상 세포로 로딩될 수 있다. 항원 또는 기타 단백질을 발현하는 재조합 스페로플라스트를 생산하기 위하여, 효모 스페로플라스트를 재조합 핵산 분자로 직접 형질감염시킬 수 있다 (예, 스페로플라스트를 전효모로부터 제조한 다음 형질감염시킴).
일반적으로, 효모 비히클 및 항원(들) 및/또는 기타 물질들은 본원에 기술된 임의의 기법에 의해 회합될 수 있다. 일 측면에서, 효모 비히클은 항원(들) 및/또는 물질(들)과 함께 세포내로 로딩된다. 다른 측면에서, 항원(들) 및/또는 물질(들)은 효모 비히클과 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된다. 또 다른 측면에서, 효모 비히클 및 항원(들) 및/또는 물질(들)은 혼합에 의해 회합된다. 다른 측면에서, 그리고 일 구현예에서, 항원(들) 및/또는 물질(들)은 효모 비히클 또는 효모 비히클이 유래된 효모 세포 또는 효모 스페로플라스트에 의해 재조합적으로 발현된다.
본 발명의 효모 비히클에 의해 생산되는 항원 및/또는 기타 단백질의 수는 효모 비히클에 의해 합리적으로 생산가능한 항원 및/또는 기타 단백질의 임의의 수이며, 전형적으로 이종성 항원 및/또는 기타 단백질 1개 이상 내지 적어도 약 6개 이상의 범위이고, 예컨대 약 2 내지 약 6개이다.
본 발명의 효모 비히클에서의 항원 또는 기타 단백질의 발현은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 달성된다. 간략하게는, 하나 이상의 원하는 항원 또는 기타 단백질을 코딩하는 핵산 분자를, 숙주 효모 세포에 형질감염시켰을 때 핵산 분자의 구성적인(constitutive) 또는 조절된 발현에 영향을 줄 수 있도록, 핵산 분자가 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 방식으로, 발현 벡터에 삽입한다. 하나 이상의 항원 및/또는 기타 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 하나 이상의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 발현 벡터 상에 있을 수 있다. 특히 중요한 발현 조절 서열은, 프로모터 및상류 활성화 서열과 같은 전사 개시를 조절하는 서열들이다. 임의의 적합한 효모 프로모터를 본 발명에서 사용할 수 있으며, 다양한 그러한 프로모터가 당업계에 공지되어 있다. 사카로마이세스 세레비지애에서의 발현을 위한 프로모터로는, 비제한적인 예로서, 하기 효모 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터를 포함한다: 알코올 데하이드로게나제I (ADH1) 또는 II (ADH2), CUP1, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK), 트리오스 포스페이트 아이소머라제 (TPI), 번역 연장 인자 EF-1 alpha (TEF2), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 (GAPDH; 트리오스 포스페이트 데하이드로게나제의 경우, TDH3로도 언급됨), 갈락토키나제 (GAL1), 갈락토스-1-포스페이트 우리딜-트랜스퍼라제 (GAL7), UDP-갈락토스 에피머라제 (GAL10), 사이토크롬 c1 (CYC1), Sec7 단백질 (SEC7) 및 산 포스파타제 (PHO5), 예를 들어, 세포내에서 글루코스 농도가 낮을 때 (예컨대, 약 0.1 내지 약 0.2 퍼센트) 유도되는 프로모터인 ADH2/GAPDH 프로모터, 뿐만 아니라 CUP1 프로모터 및 TEF2 프로모터를 포함하는, ADH2/GAPDH 및 CYC1/GAL10 프로모터 등의 하이브리드 프로모터. 마찬가지로, 인핸서로도 언급되는, 다수의 업스트림 활성화 서열(UAS)들도 공지되어 있다. 사카로마이세스 세레비지애에서의 발현을 위한 상류 활성화 서열로는, 비제한적인 예로서, 다음과 같은 단백질을 코딩하는 유전자의 UAS를 포함한다: PCK1, TPI, TDH3, CYC1, ADH1, ADH2, SUC2, GAL1, GAL7 및 GAL10, 뿐만 아니라 GAL4 유전자 산물에 의해 활성화되는 그외 UAS, 일 측면에서 ADH2 UAS가 사용됨. ADH2 UAS는 ADR1 유전자 산물에 의해 활성화되므로, 이종성 유전자가 ADH2 UAS에 작동가능하게 연결되었을 때 ADR1 유전자를 과발현하는 것이 바람직하다. 사카로마이세스 세레비지애에서의 발현을 위한 바람직한 전사 종결인자 서열은 α-팩터(α-factor), GAPDH, 및 CYC1 유전자의 종결인자 서열을 포함한다.
메틸트로픽 효모(methyltrophic yeast)에서 유전자를 발현시키기 위한 전사 조절 서열은 알코올 옥시다제 및 포르메이트 데하이드로게나제를 코딩하는 유전자의 전사 조절 영역을 포함한다.
본 발명에 따른 효모 세포의 핵산 분자로의 형질감염은 핵산 분자를 세포에 도입할 수 있는 임의의 방법에 의해 달성할 수 있으며, 비제한적인 예로서, 확산, 능동 운반 (active transport), 초음파 처리, 전기천공, 미세 주입, 리포펙션, 흡착 및 프로토플라스트 융합을 포함한다. 형질감염된 핵산 분자는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 효모 염색체에 통합시키거나 또는 염색체외 벡터로서 유지시킬 수 있다. 그러한 핵산 분자를 보유하는 효모 비히클의 예들은 본 발명에서 상세히 설명된다. 전술한 바와 같이, 효모 사이토플라스트, 효모 고스트 및 효모 막 입자 또는 세포 벽 조제물은, 온전한 효모 미생물 또는 효모 스페로플라스트에 원하는 핵산 분자를 형질감염시키고, 항원을 생산한 후, 당업계에 공지된 기술로 상기 미생물 또는 스페로플라스트를 추가로 조작하여 상기 원하는 항원 또는 기타 단백질을 포함하는 사이토플라스트, 고스트 또는 아세포 효모 막 추출물 또는 이의 분획물을 제조함으로써, 재조합에 의해 생산할 수 있다.
재조합 효모 비히클의 제조 및 상기 효모 비히클에 의한 항원 및/또는 기타 단백질의 발현에 효과적인 조건은 효모 균주를 배양할 수 있는 유효 배지를 포함한다. 유효 배지는 전형적으로 동화가능한 탄수화물원, 질소원 및 인원 뿐만 아니라 적합한 염, 미네랄, 금속 및 비타민과 생장 인자와 같은 기타 영양분을 포함하는 수성 배지이다. 배지는 복합 영양분을 포함하거나 제한된 최소 배지일 수도 있다. 본 발명의 효모 균주는, 비제한적인 예로, 생물 반응기, 엘렌메이어(Erlenmeyer) 플라스크, 시험관, 마이크로타이터 디쉬 및 페트리 플레이트 등의 다양한 용기에서 배양할 수 있다. 배양은 효모 균주에 적합한 온도, pH 및 산소 농도에서 수행한다. 그러한 배양 조건은 당해 기술 분야의 당업자의 전문적인 지식에 속한다 (예, Guthrie et al. (eds.), 1991, Methods in Enzymology, vol. 194, Academic Press, San Diego).
본 발명의 일부 구현예들에서, 효모는 중성 pH 조건 하에 배양한다. 본원에서, 용어 "중성 pH"의 일반적인 사용은 약 pH 5.5 내지 약 pH 8의 pH 범위를 지칭하며, 일 측면에서, 약 pH 6 내지 약 pH 8을 지칭한다. 당해 기술 분야의 당업자라면, pH 측정기를 측정할 때 약간의 변동 (예, 1/10 또는 1/100)이 있을 수 있음을 알 것이다. 이처럼, 효모 세포를 배양하기 위해 중성 pH를 사용한다는 것은, 효모 세포가 이들이 배양되는 대부분이 시긴에 중성 pH에서 생장한다는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 효모는 적어도 5.5의 pH 수준이 유지된 배지에서 생장한다 (즉, 배양 배지의 pH는 pH 5.5 밑으로 떨어지는 것이 허용되지 않음). 다른 측면에서, 효모는 약 6, 6.5, 7, 7.5 또는 8로 유지되는 pH 수준에서 생장한다. 효모를 배양하는데 있어서 중성 pH의 사용은 면역조절을 위한 비히클로서 효모의 사용에 바람직한 특징들인 여러가지 생물학적 효과를 촉진한다. 예를 들어, 중성 pH에서의 효모 배양은 세포 세대 기간에 어떠한 부정적인 영향 (예컨대, 더블링 타임을 늦춤)이 없는 양호한 효모 생장을 가능하게 한다. 효모는 그 세포벽의 유연성을 잃지 않으면서 고밀도로 계속 배양할 수 있다. 중성 pH의 사용은 모든 수확 밀도에서 유연한 세포벽을 갖는 효모 및/또는 세포 벽 소화 효소 (예컨대, 글루카나제)에 보다 민감한 효모를 생산할 수 있게 한다. 이러한 속성은, 유연한 세포 벽을 갖춘 효모가, 예를 들어, 효모를 식균한 항원 제시 세포에 의한 사이토카인 (예, TH1-타입의 사이토키인, 비제한적인 예로, IFN-γ, 인터루킨-12 (IL-12) 및 IL-2, 뿐만 아니라 IL-6 등의 전염증성 사이토카인)의 분비를 촉진함으로써, 보다 산성인 조건 하에 배양한 효모에 비해, 상이한 또는 개선된 면역 반응을 유도할 수 있기 때문에, 바람직하다. 또한, 세포벽에 위치한 항원에 대한 우수한 접근성이 상기한 배양 방법에 의해 제공된다. 다른 측면에서, 일부 항원에 대한 중성 pH의 사용은 항원-발현 효모를 낮은 pH (예, pH 5)의 배지에서 배양하는 경우에는 불가능한 디티오트레이톨 (dithiothreitol (DTT))의 처리에 의한 이황화 결합된 항원의 방출을 가능하게 한다.
일 구현예에서, 효모에 의한 특히 표면 상의 항원의 발현을 조절하기 위해, 효모의 당화(glycosylation)의 양 조절이 이용된다. 효모 당화의 양은 당 모이어티 (sugar moieties)들이 큰 부피를 갖는 경향으로 인해, 표면 상에 발현된 항원의 면역원성과 항원성에 영향을 미칠 수 있다. 그러한 것으로서, 본 발명에 따른 효모의 변형에서, 효모 표면 상의 당 모이어티의 존재 및 타겟 항원(들)을 둘러싼 삼차원 공간에 미치는 이의 영향을 고려하여야 한다. 효모의 당화의 양을 줄이기 (적절한 경우, 또는 증가시키기) 위한 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 당화가 낮도록 선택된 효모 돌연변이 균주 (예, mnn1, och1 및 mnn9 돌연변이)를 사용하거나, 타겟 항원의 당화 어셉터 서열의 돌연변이에 의해 제거하는 방법을 사용할 수 있다. 다른 예로, 단축된 당화 패턴을 가진 효모, 예컨대 Pichia를 사용할 수 있다. 당화를 줄이거나 변형시키는 방법으로 효모를 처리할 수도 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 효모 비히클에서의 항원 또는 기타 단백질을 재조합에 의해 발현시키기 위한 대안적인 방법으로서, 효모 비히클에 단백질 또는 펩타이드를 세포내에 로딩하거나 또는 본 발명에 따른 면역조절 물질 또는 생물학적 반응 변형제로서 유용하거나 및/또는 항원으로서 제공되는 기타 분자 또는 탄수화물을 세포내에 로딩한다. 그런 후, 항원 및/또는 기타 단백질을 세포내에 포함하고 있는 효모 비히클을 수지상 세포와 같은 캐리어에 로딩하거나 개체에게 투여할 수 있다. 펩타이드 및 단백질은 확산, 능동 수송, 리포좀 융합, 전기 천공, 식균작용, 냉동-해동 사이클 및 초음파처리와 같은 당해 기술 분야의 당업자에 공지된 기법으로 본 발명의 효모 비히클에 직접 삽입할 수 있다. 펩타이드, 단백질, 탄수화물 또는 기타 분자들을 직접 로딩할 수 있는 효모 비히클은 온전한 효모 뿐만 아니라 제조 항원 및 기타 물질이 로딩될 수 있는 스페로플라스트, 고스트 또는 사이토플라스트를 포함한다. 다른 예로, 온전한 효모에 항원 및/또는 기타 물질을 로딩한 다음, 이로부터 스페로플라스트, 고스트, 사이토플라스트 또는 아세포 입자를 제조할 수 있다. 이러한 구현예에서, 효모 비히클에 로딩될 수 있는 항원 및/또는 기타 물질의 임의 수는, 예를 들면 이는 미생물 또는 이의 일부의 로딩에 의해 제공되는 바와 같이, 항원 및/또는 기타 물질이 적어도 1, 2, 3, 4 또는 임의의 전체 정수, 최대 수백 또는 수천개이다.
본 발명의 다른 구현예에서, 항원 및/또는 기타 물질은 효모 비히클에 물리적으로 부착된다. 효모 비히클에 대한 항원 및/또는 기타 물질의 물리적인 부착은, 항원 및/또는 기타 물질과 효모 비히클 외표면의 화학적인 가교화, 또는 항체 또는 다른 결합 파트너를 이용하는 바와 같이 항원 및/또는 기타 물질의 효모 비히클 외표면과의 생물학적 연결을 비제한적으로 포함하는, 공유적 및 비공유적 조합 방법 등의, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 적정 방법에 의해 달성할 수 있다. 화학적 가교는, 예를 들면, 글루타르알데하이드 연결, 광친화성 라벨링 (photoaffinity labelling), 카르보디이미드의 처리, 이황화 결합을 연결할 수 있는 화학 물질의 처리, 및 당해 기술 분야의 기타 표준적인 가교 화학제의 처리를 비롯한 방법으로 달성할 수 있다. 다른 예로, 효모 막의 지질 이중층 또는 세포벽 조성의 전하를 바꿀 수 있는 화학 물질을 효모 비히클과 접촉시켜, 효모의 외표면이 항원 및/또는 특정 전하 특징을 가진 기타 물질에 융합하거나 결합할 가능성을 높일 수 있다. 항체, 결합성 펩타이드, 가용성 수용체 등의 표적 물질과 기타 리간드들도 융합 단백질로서 항원에 통합시키거나, 또는 효모 비히클에 항원을 결합시키기 위해 항원과 조합할 수 있다.
항원 또는 기타 단백질을 효모의 표면에 물리적으로 부착시키거나 또는 표면 상에 발현시키는 경우, 일 측면에서, 표면 상의 항원 또는 기타 단백질의 발현 또는 함유를 최적화하기 위해, 스페이스 암을 신중하게 선택할 수 있다. 스페이서 암(들)의 크기는 항원 또는 기타 단백질이 효모의 표면 상에서의 결합에 노출되는 양에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 어떤 항원(들) 또는 기타 단백질(들)이 사용되는 지에 따라, 당해 기술 분야의 당업자라면 효모 표면 상에서 항원 또는 기타 단백질에 대한 적절한 간격 두기(spacing)를 수행하는 스페이서 암을 선택할 것이다. 일 구현예에서, 스페이서 암은 아미노산 450개 이상으로 구성된 효모 단백질이다. 스페이서 암은 상기에서 상세히 기술된 바 있다.
또 다른 구현예에서, 효모 비히클과, 항원 또는 기타 단백질은, 효모와 항원 또는 기타 단백질을 완충제 중에서 또는 기타 적합한 제형 (예, 혼합물)에서 함께 조심스럽게 혼합함으로써와 같이, 보다 수동적이며, 비-특이적이거나 또는 비-공유적인 결합 기전을 통해 서로 조합한다.
본 발명의 일 구현예에서, 효모 비히클과 항원 또는 기타 단백질을 모두 수지상 세포 또는 대식 세포와 같은 캐리어에 세포내로 로딩하여, 본 발명의 치료 조성물 또는 백신을 제조한다. 다른 예로, 항원 또는 기타 단백질을 효모 비히클의 부재 하에 수지상 세포에 로딩할 수 있다.
일 구현예에서, (이종의 항원 또는 기타 단백질을 발현하거나 발현하지 않는) 온전한 효모는 효모 세포 벽 조제물, 효모 막 입자 또는 효모 분획들 (즉, 온전하지 않음)을 제조하는 방식으로 분쇄 또는 가공할 수 있으며, 상기 효모 분획들은, 일부 구현예들에서, 면역 반응성을 강화하기 위해 항원을 포함하는 다른 조성물 (예, DNA 백신, 단백질 서브유닛 백신, 사멸된 병원체 또는 불활성화된 병원체)와 함께 제공되거나 투여될 수 있다. 예를 들어, 효모를 보강제로서 사용되는 파트로 분할하기 위해, 효소적 처리, 화학적 처리 또는 물리적 힘 (예, 기계 전단 또는 초음파처리)을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 사용가능한 효모 비히클은 사멸되었거나 불활성화된 효모 비히클을 포함한다. 효모의 사멸 또는 불활성화는 당해 기술 분야에 공지된 적합한 다양한 임의의 방법으로 달성할 수 있다. 예를 들어, 효모의 열에 의한 불활성화가 효모를 불활성화하는 표준 방식이며, 당해 기술 분야의 당업자는 적절한 경우 당해 기술 분야에 공지된 표준 방법을 통해 타겟 항원의 구조적 변화를 모니터링할 수 있다. 다른 예로, 효모를 불활성화하는 다른 방법, 예컨대 화학적, 전기적, 방사성 또는 UV 방법이 사용될 수 있다. 예컨대, Methods of Enzymology, Vol. 194, Cold Spring Harbor Publishing (1990) 등의 표준 표모 배양 교본에 기술된 방법을 참조한다. 사용되는 임의의 불활성화 전략들은, 표적 항원의 이차, 삼차, 또는 사차 구조를 고려하여야 하며, 면역원성을 최적화하기 위해 그러한 구조들을 유지하여야 한다.
효모 비히클은, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 다수의 기법들을 사용하여, 수지상 세포 등의 캐리어에 직접 또는 일차적으로 로딩되는 개체에게 투여할 조제물 등의, 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물 또는 제품으로 제형화할 수 있다. 예를 들어, 효모 비히클은 동결건조에 의해 건조할 수 있다. 또한, 효모 비히클을 포함하는 제형은, 베이킹 또는 양조(brewing) 조작에 사용되는 효모에 대해 행해지는 바와 같이, 케이크 또는 정제로 효모를 패킹함으로써 제조할 수 있다. 아울러, 효모 비히클은 숙주 또는 숙주 세포에게 허용되는 등장성 완충제 등의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 혼합할 수 있다. 이러한 부형제의 예로는 물, 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 한스 용액 및 그외 수계 생리학적인 밸런스 염 용액(aqueous physiologically balanced salt solution)을 포함한다. 고정유, 참깨유, 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드 등의 비-수성 비히클도 사용할 수 있다. 다른 사용가능한 제형으로는 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨, 글리세롤 또는 덱스트란 등의 점성-강화제를 포함하는 현탁제를 포함한다. 또한, 부형제는 등장성 및 화학적 안정성을 강화하는 물질 등의 첨가제를 미량 포함할 수 있다. 완충제의 예로는 포스페이트 완충제, 바이카보네이트 완충제 및 트리스 완충제가 있지만, 보존제의 예로는 티메로살, m-크레졸, o-크레졸, 포르밀린 및 벤질 알코올을 포함한다. 표준 제형은 액체 주사제이거나, 또는 주사용 현탁제 또는 용액으로서 적정 액체로서 취할 수 있는 고체일 수 있다. 따라서, 비-액체 제형에서는, 부형제는, 투여하기 전에 멸균수 또는 식염수를 첨가할 수 있는, 예를 들어 덱스트로스, 인간 혈청 알부민 및/또는 보존제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 조성물은 생물학적 반응 변형제 화합물로 지칭될 수 있는 부가적인 제제 또는 상기한 제제/변형제를 제조할 수 있는 능력을 포함할 수 있다. 예를 들어, 효모 비히클을 하나 이상의 항원 및 하나 이상의 제제/생물학적 반응 변형제 화합물로 형질감염시키거나 로딩할 수 있거나, 또는 본 발명의 조성물은 하나 이상의 제제/생물학적 반응 변형제와 함께 투여할 수 있다. 생물학적 반응 변형제는 보강제 및 면역조절 화합물 뿐만 아니라 효모-기반의 면역치료제 등의 다른 화합물 또는 제제의 생물학적 활성을 변형시키는 화합물로 지칭될 수 있는, 면역 반응을 조정할 수 있는 기타 화합물들을 포함하며, 상기 생물학적 활성은 면역 시스템 작용으로 한정되지 않는다. 일부 면역조절 화합물들은 방어적인 면역 반응을 자극할 수 있는 반면, 다른 화합물들은 유해한 면역 반응을 억제할 수 있으며, 면역조절이 소정의 효모-기반의 면역치료제와 조합하여 사용가능한지는 적어도 부분적으로 치료 또는 예방할 질병 상태나 병태 및/또는 치료할 개체에 따라 결정될 수 있다. 특정 생물학적 반응 변형제는 세포-매개의 면역 반응을 선호적으로 강화시키는 반면, 다른 것은 체액성 면역 반응을 선호적으로 강화한다 (즉, 체액성 면역에 비해 세포-매개 비율이 높은 또는 반대되는 면역 반응을 자극할 수 있음). 특정한 생물학적 반응 변형제는 효모-기반의 면역치료제의 생물학적 특성과 공통된 한가지 이상의 특성을 가지거나, 또는 효모-기반의 면역치료제의 생물학적 특성을 강화 또는 보완한다. 면역 반응의 자극 또는 억제를 측정하기 위한, 아울러 세포-매개 면역 반응을 체액성 면역 반응과 구별하기 위한, 그리고 세포-매개 반응의 한가지 유형을 다른 유형과 구별하기 위한 (예, TH17 반응 대 TH1 반응), 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 다수의 기법들이 존재한다.
본 발명에 유용한 제제/생물학적 반응 변형제는 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 지질 유도체, 펩타이드, 단백질, 다당류, 소분자 약물, 항체 및 이의 항원 결합 단편 (비제한적인 예로서, 항-사이토카인 항체, 항-사이토카인 수용체 항체, 항-케모카인 항체), 비타민, 폴리뉴클레오티드, 핵산 결합 모이어티, 앱타머 및 성장 조절제를 포함할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 일부 적합한 제제로는, IL-1, IL-1의 작용제 또는 IL-1R의 작용제, 항-IL-1 또는 기타 IL-1 길항제; IL-6, IL-6의 작용제 또는 IL-6R의 작용제, 항-IL-6 또는 기타 IL-6 길항제; IL-12, IL-12의 작용제 또는 IL-12R의 작용제, 항-IL-12 또는 기타 IL-12 길항제 IL-17, IL-17의 작용제 또는 IL-17R의 작용제, 항-IL-17 또는 기타 IL-17 길항제 IL-21, IL-21의 작용제 또는 IL-21R의 작용제, 항-IL-21 또는 기타 IL-21 길항제; IL-22, IL-22의 작용제 또는 IL-22R의 작용제, 항-IL-22 또는 기타 IL-22 길항제; IL-23, IL232의 작용제 또는 IL-23R의 작용제, 항-IL-23 또는 기타 IL-23 길항제; IL-25, IL-25의 작용제 또는 IL-25R의 작용제, 항-IL-25 또는 기타 IL-25 길항제; IL-27, IL-27의 작용제 또는 IL-27R의 작용제, 항-IL-27 또는 기타 IL-27 길항제; I형 인퍼테론 (IFN-α 포함), I형 인퍼테론의 길항제 또는 작용제 또는 이의 수용체; II형 인퍼테론 (IFN-γ 포함), II형 인퍼테론의 길항제 또는 작용제 또는 이의 수용체; 항-CD40 항체, CD40L, 항-CTLA-4 항체 (예, 아네르기 T 세포를 분비하기 위함); T 세포 공-자극제 (예, 항-CD137, 항-CD28, 항-CD40); 알렘투주맵(alemtuzumab) (예, CamPath®), 데니루킨 디프티톡스(denileukin diftitox) (예, ONTAK®); 항-CD4; 항-CD25; 항-PD-1, 항-PD-L1, 항-PD-L2; FOXP3 차단제 (예, CD4+/CD25+ T 조절 세포의 활성을 없애거나 사멸시키기 위함); Flt3 리간드, 이미퀴모드(imiquimod) (AldaraTM), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF); 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF), 사르그라모스팀(sargramostim) (Leukine®); 비제한적인 예로서 프로락틴(prolactin) 및 성장 호르몬 등의 호르몬; Toll-유사 수용체 (TLR) 작용제, 비제한적인 예로서, TLR-2 작용제, TLR-4 작용제, TLR-7 작용제, 및 TLR-9 작용제; TLR 길항제, 비제한적인 예로서, TLR-2 길항제, TLR-4 길항제, TLR-7 길항제, 및 TLR-9 길항제; 항-염증제 및 면역조절제, 비제한적인 예로서, COX-2 저해제 (예, Celecoxib, NSAIDS), 글루코코르티코이드, 스타틴 및 탈리도마이드 및 이들의 유사체, 예컨대 IMiD™s (탈리도마이드와 구조 및 기능적 유사체임 (예, REVLIMID® (lenalidomide), ACTIMID® (pomalidomide)); 전염증제, 예컨대 진균성 또는 세균성 성분들 또한 임의의 전염증성 사이토카인 또는 케모카인; 면역치료 백신, 비제한적인 예로서, 바이러스 백신, 세균 백신 또는 항체 백신; 및 임의의 그외 면역조절제, 면역효력제(immunopotentiator), 항염증제 및/또는 전-염증제를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 이러한 제제들의 임의 조합은 본 발명에 포함되며, 효모-기반의 면역치료제와 조합하거나 또는 이와 프로토콜로 (예, 동시에, 순차적으로 또는 다른 포맷으로) 투여하는 상기 임의의 제제들도 본 발명에 포함되는 조성물이다. 이러한 제제들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이들 제제들은 단독으로 사용되거나 또는 본원에 기술된 다른 제제와 조합하여 사용될 수 있다.
제제는 소정의 단백질, 펩타이드 또는 이의 도메인의, 작용제 및 길항제를 포함할 수 있다. 본원에서, "작용제"는, 수용체나 리간드에 결합하여, 수용체 또는 리간드에 결합하는 천연 물질의 행태를 모방하는 제제를 포함할 수 있는 반응을 발현 또는 촉발시키는, 비제한적인 예로서, 소형 분자, 단백질, 펩타이드, 항체, 핵산 결합제 등의, 임의의 화합물 또는 제제이다. "길항제"는 작용제의 행태를 차단, 저해 또는 감소시키는, 비제한적인 예로서 소형 분자, 단백질, 펩타이드, 항체, 핵산 결합제 등의, 임의의 화합물 또는 제제이다.
본 발명의 조성물은, HBV 감염을 예방 또는 치료하는데 유용합 임의의 다른 화합물 또는 조성물, 또는 HBV 감염의 임의 증상을 치료 또는 완화하는 임의의 화합물을, 추가로 포함하거나, 또는 이와 함께 (동시에, 순차적으로 또는 간헐적으로) 투여할 수 있다. 다양한 제제들이 HBV 감염을 예방 및/또는 치료 또는 완화하는데 유용한 것으로 알려져 있다. 이러한 제제로는, 비제한적인 예로서, 항-바이러스 화합물, 비제한적인 예로서, 뉴클레오티드 유사체 역전사효소 저해제 (nRTIs)를 포함한다. 본 발명의 일 측면에서, 적합한 항-바이러스 화합물로는, 네토포비르(tenofovir) (VIREAD®), 라미부딘(lamivudine) (EPIVIR®), 아데포비르(adefovir) (HEPSERA®), 텔비부딘(telbivudine) (TYZEKA®), 엔테카비르(entecavir) (BARACLUDE®), 및 이들의 조합, 및/또는 인터페론, 예컨대 인터페론-α2a 또는 페길화된 인터페론-α2a (PEGASYS®) 또는 인터페론-λ를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 이들 제제는 전형적으로 장기간 (예, 최대 1-5년간 또는 그 이상의 기간 동안 매일 또는 매주) 투여한다. 아울러, 본 발명의 조성물은 예방학적 및/또는 치료학적 면역치료제 등의 다른 면역치료 조성물과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, HBV 예방 백신은 1980년대 초반부터 상용화되어왔다. 이들 시판 백신들은 정제된 재조합 B형 간염 표면 항원 (HBsAg)을 제공하는 비-감염성의 서브유닛 바이러스 백신으로서, 출생에서부터 투여할 수 있다. 미국에서는 HBV를 치료하기 위한 치료학적 면역치료 조성물이 승인된 바 없지만, 이러한 조성물은 HBV 단백질 또는 에피토프 서브유닛 백신, HBV 바이러스 벡터 백신, 사이토카인 및/또는 기타 면역조절제 (예, TLR 작용제, 면역조절 약제)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 조성물을 포함하믐 키트 또는 본원에 기술된 조성물들의 임의의 개별 성분을 포함하는 키트를 포함한다.
본 발명의 조성물의 투여 방법 및 이용 방법
임의의 하나 이상의 (예, 2, 3, 4, 5 종 이상의 조합), 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료 조성물, HBV 단백질 및 융합 단백질을 비롯한 HBV 항원, 및/또는 전술한 상기한 HBV 단백질 또는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자, 및 상기한 효모-기반의 조성물, 항원, 단백질, 융합 단백질 또는 본원에 기술된 재조합 분자를 포함하는 기타 조성물을 포함할 수 있는, 본 발명의 조성물들은, 비제한적인 예로서, HBV 감염 및 이의 결과를 치료 및/또는 예방하기 위한 등의, 다양한 생체내 및 시험관내 방법, HBV에 대한 진단 분석 또는 HBV에 대한 항체를 제작하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예는, 개체 또는 개체 집단에서, 만성적인 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염을 치료하기 위해, 및/또는 만성적인 HBV 감염의 한가지 이상의 증상을 예방, 완화 또는 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 HBV로 만성적으로 감염된 개체 또는 개체의 집단에 본 발명의 하나 이상의 면역치료 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일 측면에서, 상기 조성물은 효모-기반의 면역치료 조성물을 포함할 수 있는, 본원에 기술된 하나 이상의 HBV 항원을 포함하는 면역치료 조성물이다. 일 측면에서, 상기 조성물은 본원에 기술된 HBV 항원을 포함하는 단백질 또는 융합 단백질 및/또는 상기한 단백질 또는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 개체 또는 개체 집단은 만성 HBV 감염을 앓고 있다. 일 측면에서, 상기 개체 또는 개체 집단은 HBV 감염 치료에 유용한 하나 이상의 다른 치료 화합물을 이용하여 추가적으로 치료한다. 이러한 치료 화합물로는, 특이-작용성 항-바이러스 약물 (예, 전술한 또는 본원의 도처에 기술된 화합물) 및/또는 인터페론 및/또는 다른 면역치료제 또는 면역조절제를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 일 측면에서, 상기한 치료 화합물은 숙주-타겟화된 치료제를 포함한다 (예, 바이러스 복제를 간섭할 수 있는 사이클로필린 저해제 또는 (재-감염) 바이러스 생활 주기를 방해할 수 있는 재-도입 저해제).
"표준 관리" 또는 "SOC"는 일반적으로 특정 질환의 치료에 대해 승인받은 현행 표준 관리를 지칭한다. 만성적인 HBV 감염에서, SOC는 몇가지 승인받은 다른 치료 프로토콜들 중 하나일 수 있으며, 비제한적인 예로서 인터페론 요법 및/또는 항-바이러스 요법일 수 있다. HBV 감염을 치료하기 위한 현행 승인받은 항-바이러스 약물로는 테노포비르(tenofovir) (VIREAD®), 라미부딘(lamivudine) (EPIVIR®), 아데포비르(adefovir) (HEPSERA®), 텔비부딘(telbivudine) (TYZEKA®) 및 엔테카비르(entecavir) (BARACLUDE®)가 있다. 현재 만성 HBV 치료에 가장 많이 처방되는 항-바이러스 약물은 테노포비르와 엔테카비르이다. 만성적인 HBV 감염 치료에 사용가능한 인터페론은 인터페론-α, 비제한적인 예로서 인터페론-α2 또는 페길화된 인터페론-α2 (예, PEGASYS®) 등의 I형 인터페론을 포함한다. 일 구현예에서, 인터페론은 III형 인터페론, 비제한적인 예로서, 인터페론-λ1, 인터페론-λ2, 및/또는 인터페론-λ3이다. 본 발명의 면역치료 조성물은 하나 이상의 항-바이러스제(들) 및/또는 인터페론 및/또는 기타 면역치료제 또는 면역조절제 투여 전에, 동시에, 간혈적으로, 및/또는 투여 이후에 투여할 수 있다. 또한, 다른 치료 화합물도 본 발명의 면역치료 조성물 투여 전에 또는 투여 후에 투여할 수 있다.
HBV 감염은, 전형적으로, 감염된 개체의 혈중에 HBsAg (B형 간염 바이러스 표면 항원) 및/또는 HBeAg (e-항원)를 검출함으로써 개체에서 진단한다. 혈청에서의 HBeAg의 검출은 활발한 바이러스 복제를 반영하며, 감염의 임상적인 결과는, 현행 치료법을 이용하는 경우 장기간의 회복 (또는 치유)은 HBsAg 혈청전환으로 더 잘 예측되지만, e-항원 상태와 연관시킬 수 있다 (하기 참조). IgM 코어 항체의 검출을 이용하여 감염된지 처음 6-12개월간 급성 HBV 감염을 검출할 수 있다. 6개월 이상의 기간 동안 혈중 HBsAg의 지속은 전형적으로 만성적인 HBV 감염으로 식별한다. 아울러, 만성적인 HBV 감염은 HBV DNA (>2000 IU/ml)를 동정함으로써 진단할 수 있으며, 이는 혈청내 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및/또는 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) 수준 증가 (예, 정상 상한치의 2배 이상)의 검출 또는 동정과 조합될 수 있다.
바이러스 감염으로부터의 회복 (완전 반응 또는 HBV 치료의 결말)은 각각 HBeAg 및 HBsAg의 감소인 HBeAg/HBsAg 혈청전환, 및 B형 간염 표면 항원에 대한 항체 (항-HB) 및/또는 HBeAg에 대한 항체의 발생으로 확인된다. 임상적인 연구에서는 (a) 방사면역분석으로 측정 시 ≥ 10 SRU (sample ratio unit); (b) 효소 면역 분석시 양성 결과; 또는 (c) 항체 농도 검출 >10 mIU/ml (10 SRU는 항체 10 mIU/mL에 상응함)로서 혈청전환, 또는 예방 항체 (항-HB) 수준을 규정한다. 혈청전환은 현행 표준 관리 치료 (즉, 항-바이러스 약물 또는 인터페론) 하에 만성적으로 감염된 환자에서 나타나는데 수년 걸릴 수 있다. 또한, 환자는, 바이러스 DNA의 소실 또는 현격한 감소 (PCR에 의한 검출 한계 미만 또는 <2000 IU/ml), 혈청 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 수준의 정상화 및 간 염증 및 섬유증의 개선에 대해 모니터링할 수 있다. "ALT"는 간 손상에 대한 매우 유효한 척도이며, 간 염증에 대한 서로게이트로서 사용된다. 종래의 대규모 간염 실험들에서, ALT 수준 감소 및/또는 정상화 (ALT 정상화)는 시리얼 생검으로 확인되는 간 기능 향상 및 간 섬유증 저하와 연관되어 있는 것으로 확인된 바 있다.
본 발명의 다른 구현예는, 개체 또는 개체 집단에서, HBV 감염을 예방하기 위해, 만성적인 HBV 감염을 예방하기 위해, 및/또는 HBV 감염 중증도를 낮추기 위해, HBV에 대해 개체 또는 개체 집단을 면역화하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 HBV로 감염되지 않은 (HBV로 감염되지 않은 것으로 여겨지는) 개체 또는 개체 집단에게 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일 측면에서, 상기 조성물은 하나 이상의 효모-기반의 면역치료 조성물을 비롯하여, 본원에 기술된 하나 이상의 HBV 항원을 포함하는, 면역치료 조성물이다. 일 측면에서, 상기 조성물은 본원에 기술된 HBV 항원을 포함하는 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함한다.
본원에서, HBV 감염을 "치료한다"라는 표현 또는 이의 모든 변형적인 표현 (예, "HBV 감염에 대해 치료받은" 등)은 일반적으로 검출가능한 바이러스 타이터의 감소 또는 소거 (예, 바이러스 DNA 감소 (PCR로 검출가능한 수준 미만 또는 <2000 IU/ml)), 혈청전환 달성 (HBsAg 및/또는 HBeAg에 대한 항체 발생 및 이와 동시에 혈청에서 이들 단백질의 소거 또는 감소), 개체에서 감염으로 인한 한가지 이상의 증상 경감, 감염으로 인한 증상 및/또는 이후 후유증의 발병 및/또는 중증도의 지연 또는 예방, 감염으로 인한 장기 또는 생리학적 시스템의 손상 (예, 간경변) 경감 (예, 비정상적인 ALT 농도 감소, 간 염증 감소, 간 섬유증증 감소), 간세포성 암종 (HCC)의 빈도 및 발생 예방 및/또는 경감, 감염으로 인해 부정적으로 영향으로 받은 장기 또는 시스템의 기능 개선 (혈청내 ALT 농도 정상화, 간 염증 개선, 간 섬유증 개선), 감염에 대한 면역 반응 개선, 감염에 대한 장기 기억 면역 반응 개선, HBv 바이러스의 재활성화 감소 및/또는 개체 또는 개체 집단의 전반적인 건강 상태 개선을 목표로, 감염이 발생되었을 때 본 발명의 조성물을 적용 또는 투여하는 것을 지칭한다.
일 측면에서, 치료 목표는 치료 종료 후 적어도 6개월간의 지속적인 바이러스 소멸이다. 일 측면에서, 치료 목표는 검출가능한 혈청 HBeAg 및/또는 HBsAg 단백질의 소멸이다. 일 측면에서, 치료 목표는 B형 간염 바이러스 표면 항원에 대한 항체 (항-HB) 및/또는 HBeAg에 대한 항체의 발생이다. 일 측면에서, 치료 목적은 다음과 같이 정의될 수 있는 혈청전환이다: (a) 방사면역분석으로 측정 시 ≥ 10 SRU (sample ratio unit); (b) 효소 면역 분석시 양성 결과; 또는 (c) 항체 농도 검출 >10 mIU/ml (10 SRU는 항체 10 mIU/mL에 상응함).
HBV 감염을 "예방"하기 위해 또는 이의 모든 변형적인 표현 (예, "HBV 감염의 예방" 등)은, 일반적으로, 개체 또는 개체 집단에서, HBV에 의한 감염 예방, HBV에 의한 만성적인 감염 예방 (즉, 개체가 추가적인 개입없이도 급성 HBV 감염을 해소시킬 수 있음) 또는 향후 감염 발생의 예방, 적어도 만성 감염으로 인한 중증도 및/또는 감염 기간 및/또는 생리학적 손상의 감소, 예컨대 개체에서 감염으로 인한 한가지 이상의 증상의 중증도 또는 발병 예방 또는 경감, 및/또는 감염으로 인한 증상 및/또는 하위 후유증의 발생 및/또는 중증도 지연 또는 예방을 목표로, HBV 감염이 발생되기 전에 본 발명의 조성물을 적용 또는 투여하는 것을 의미한다. 일 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 조성물을 투여받은 후 HBV로 급성 감염되는 개체를 감염으로부터 해소시켜 만성적으로 감염되지 않게 함으로써 등과 같이 만성적인 HBV 감염을 예방하는데 사용할 수 있다.
본 발명은, 효모-기반의 면역치료 조성물 등의 본 발명의 하나 이상의 면역치료 조성물을 개체에게 전달 (투여, 면역화)하는 것을 포함한다. 투여 프로세스는 생체외 또는 생체내에서 수행될 수 있지만, 전형적으로 생체내에서 이루어진다. 생체외 투여는, 효모 비히클, 항원(들) 및 임의의 다른 제제 또는 조성물이 세포에 로딩되어, 세포가 환자에게 귀환되는 조건 하에, 환자로부터 적출한 세포 (수지상 세포) 집단에 본 발명의 조성물을 투여하는 등의, 환자의 외부에서 조절 단계의 일부를 수행하는 것을 지칭한다. 본 발명의 치료학적 조성물은 환자에게 임의의 적합한 투여 방식으로 귀환 또는 투여될 수 있다.
조성물의 투여는 전신, 점막 및/또는 타겟 부위의 근처 (예, 감염 부위 근처)일 수 있다. 적합한 투여 경로가 예방 또는 치료한 병태의 타입, 사용되는 항원 및/또는 타겟 세포 집단 또는 조직에 따라 결정됨은 당해 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 다양한 허용가능한 투여 방법으로는, 정맥내 투여, 복막내 투여, 근육내 투여, 결절내(intranodal) 투여, 관상내(intracoronary) 투여, 동맥내 투여 (예, 경동맥내), 피하 투여, 경피 전달, 기관내(intratracheal) 투여, 관절내 투여, 심실내r 투여, 흡입 (예, 에어로졸), 두개강내, 척수내, 안내, 귀내, 비강내, 경구, 폐내 투여, 카테터 삽입 및 조직에 직접 주입을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 일 측면에서, 투여 경로는 정맥내, 복막내, 피하, 진피내, 결절내, 근육내, 경피, 흡입, 비강내, 경구, 안내, 관절내, 두개강내, 및 척수내를 포함한다. 비경구 전달은 진피내, 근육내, 복막내, 늑막내, 폐내, 정맥내, 피하, 심방 카테터 및 정맥 카테터 경로를 포함할 수 있다. 귀내 전달은 점이제(ear drop)를 포함할 수 있으며, 비강내 전달은 점비제 또는 비강내 주입을 포함할 수 있으며, 안내 전달은 점안제(eye drop)를 포함할 수 있다. 에어로졸 (흡입) 전달은 또한 당해 기술 분야의 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다 (예, Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281, 1992). 점액 면역을 조절하는 다른 투여 경로는 바이러스 감염을 치료하는데 유용할 수 있다. 그러한 경로로는 기관지내, 진피내, 근육내, 비강내, 다른 흡입식, 직장, 피하내, 국소, 경피, 질 및 요도 경로를 포함한다. 일 측면에서, 본 발명의 면역치료 조성물은 피하 투여한다.
본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물과 관련하여, 일반적으로 적정 단회 용량은, 적정 기간 동안 1회 이상 투여하였을 때, 한가지 이상의 HBV 항원 또는 에피토프에 대한 항원-특이 면역 반응을 도출하는데 효과적인 양으로 환자 신체의 소정의 세포 타입, 조직 또는 부위에 효모 비히클 및 (포함된 경우) 항원을 효과적으로 제공할 수 있는 양이다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 효모 비히클의 1회 용량은 조성물이 투여되는 유기체의 체중 1 킬로그램 당 약 1 x 105 내지 약 5 x 107의 효모 세포 등량(yeast cell equivalent)이다. 일 측면에서, 본 발명의 효모 비히클의 1회 용량은, 투여 당 (즉, 유기체 당) 약 0.1 Y.U. (세포 1 x 106개) 내지 약 100 Y.U. (세포 1 x 109개), 예컨대, 세포 0.1 x 106개 증가 수준인 상기한 범위내 임의 용량 (즉, 1.1 x 106, 1.2 x 106, 1.3 x 106...)이다. 일 구현예에서, 용량은 1 Y.U - 40 Y.U., 1 Y.U. - 50 Y.U., 1 Y.U. - 60 Y.U., 1 Y.U. - 70 Y.U., 또는 1 Y.U. - 80 Y.U.의 용량이며, 일 측면에서, 10 Y.U. 내지 40 Y.U., 50 Y.U., 60 Y.U., 70 Y.U. 또는 80 Y.U.의 용량이다. 일 구현예에서, 상기한 용량들은 개체의 여러 부위에 동일한 투약 기간 동안 투여한다. 예를 들어, 40 Y.U. 용량은, 개체의 4가지 부위에 한번의 투약 기간 동안 10 Y.U. 용량을 주입함으로써 투여할 수 있거나, 20 Y.U. 용량은, 동일한 투약 기간 동안, 개체의 4가지 부위에 5 Y.U. 용량씩 주입하거나 또는 개체의 2가지 부위에 10 Y.U. 용량씩 주입함으로써 투여할 수 있다. 본 발명은 개체의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 곳 이상의 여러 부위에 효모-기반의 면역치료 조성물의 양 (예, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20 Y.U. 또는 그 이상)의 투여를 포함하여, 1회 용량을 구성한다.
치료 조성물의 "부스터(booster)" 또는 "부스트(boost)"는, 예를 들어, 항원에 대한 면역 반응이 특정 항원 또는 항원(들)에 대한 면역 반응을 제공하거나 기억 반응(memory response)을 유도하는 것이 요구되거나 필요한 경우에 투여된다. 부스터는 최초 투여 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주 간격으로, 매달, 2달에 한번, 분기별로, 매년 또는 수년간 투여할 수 있다. 일 구현예에서, 투여 스케줄은 유기체의 체중 1kg 당 조성물의 약 1 x 105 내지 약 5 x 107의 효모 세포 등량이 몇주에서 수개월 수년간의 기간에 걸쳐서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 투여하는 것이다. 일 구현예에서, 용량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 이상의 투여 동안 매주 투여한 다음, 필요에 따라 매달 투여하여, HBV 바이러스의 바람직한 저해 또는 소멸을 달성한다. 예를 들어, 용량은 개체의 혈청전환이 달성될 때까지, HBV DNA 역가가 2000 IU/ml 아래로 떨어질때까지 및/또는 ALT 농도가 정상화될 때까지 투여할 수 있다. 일 구현예에서, 용량은 4주 프로토콜 (4주에 한번, 또는 1일, 4주, 8주, 12주 등, 임상의의 판단에 따라 2-10회 또는 그 이상)로 투여한다. 추가적인 투약이 필수적이지 않을 수 있지만, 적절한 경우 개체가 혈청전환을 달성한 후에도 투여할 수 있다.
본원에 기술된 효모-기반의 면역치료 조성물의 투여와 관련하여, 단일 조성물은 개체 또는 개체의 집단에 투여할 수 있거나, 또한 이러한 조성물들의 조합을 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 수종의 "단일 단백질" 조성물 또는 특정 유전자형에 특이적인 조성물 뿐만 아니라 다중-단백질 조성물 및 복수의 유전자형 또는 서브-유전자형을 타겟팅하는 조성물을 제공한다. 이에, 2가지 이상의 조성물을 "스파이스 렉" 방식으로 선택하여, 소정의 개체 또는 개체 집단에서 HBV 감염을 가장 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 한가지 이상의 부가적인 치료 제제를 효모-기반의 면역치료 조성물과 순차적으로 투여한다. 다른 구현예에서, 한가지 이상의 부가적인 치료 제제를 효모-기반의 면역치료 조성물의 투여 전에 투여한다. 다른 구현예에서, 한가지 이상의 부가적인 치료 제제를 효모-기반의 면역치료 조성물의 투여 후 투여한다. 일 구현예에서, 한가지 이상의 부가적인 치료 제제를 효모-기반의 면역치료 조성물과 교차 투여하는 방식으로, 또는 효모-기반의 조성물을 상기 부가적인 제제의 연속 투여 사이에 처방된 간격으로 또는 상기 부가적인 제제의 1회 이상의 연속적인 투여하거나 그 반대의 프로토콜로 투여한다. 일 구현예에서, 호모-기반의 면역치료 조성물은 상기 부가적인 제제의 투여를 개시하기 전에 일정 기간 동안 1회 이상 투여한다. 즉, 효모-기반의 면역치료 조성물을 일정 기간 동안 단일요법으로서 투여한 다음, 상기 제제의 투여를 효모-기반의 면역치료의 새로운 용량과 동시에 또는 효모-기반의 면역치료와 교차하는 방식으로 부가한다. 다른 예로, 상기 제제는 효모-기반의 면역치료 조성물의 투여를 개시하기 전에 일정 기간 동알 투여할 수 있다. 일 측면에서, 상기 효모는 상기 제제를 발현 또는 운반하도록 조작되거나, 또는 다른 효모가 상기 제제를 발현 또는 운반하도록 조작 또는 제조된다.
본 발명의 일 측면에서, 인터페론 또는 항-바이러스 화합물 요법의 치료 코스를 개시하였을 때, 부가적인 용량의 면역치료 조성물을 동일한 기간 동안 또는 그 기간 중 적어도 일부 기간 동안 투여하며, 인터페론 또는 항-바이러스 화합물의 코스가 끝난 경우에도 계속 투여할 수 있다. 그러나, 전체 기간에 걸친 면역요법의 투여 스케줄은 전형적으로 인터페론 또는 항-바이러스 화합물의 스케줄과 다를 수 있으며, 전형적으로 다를 것으로 예상된다. 예를 들어, 면역치료 조성물은 인터페론 또는 항-바이러스의 마지막에(가장 최근) 제공된 투약 후 적어도 3-4일 후 (또는 마지막 투여 후 임의의 적정한 일 수 후) 또는 당일에 투여할 수 있으며, 매일, 매주, 2주마다, 매달, 2달마다 또는 3-6달 마다 또는 의사에 의해 결정된 보다 긴 간격으로 투여할 수 있다. 면역치료 조성물의 단일요법 투여에 있어 첫 기간 동안에는, 이용가능한 경우, 면역치료 조성물은 바람직하게는 4-12주간 매주 투여한 다음, (추가적인 인터페론 또는 항-바이러스 요법이 프로토콜에 추가되는 시기와는 무관하게) 매달 투여를 수행한다. 일 측면에서, 치료 조성물은 4-5주간 매주 투여한 다음, 전체 치료 프로토콜이 끝날 때까지 매주 투여를 계속한다.
본 발명의 측면에서, 면역치료 조성물 및 기타 제제는 함께 (동시에) 투여할 수 있다. 본원에서, 동시 사용은 모든 화합물들의 모든 용량을 동일 날에 동시에 투여하는 것을 반드시 의미하는 것은 아니다. 오히려, 동시 사용은 치료 성분들 (예, 면역요법과 인터페론 요법, 또는 면역요법과 항-바이러스 요법) 각각을 거의 동일한 시기 (수시간내에 또는 서로 간 최대 1-7일)에 시작하여, 동일한 전체 기간에 걸쳐 투여하는 것을 의미하며, 각 성분은 다른 투약 스케줄 (예, 인터페론 매주, 면역요법 매달, 항-바이러스 매일 또는 매주)을 가질 수 있음에 주목한다. 아울러, 동시 투여 기간 전 또는 후에, 상기 제제 또는 면역치료 조성물들 중 임의 한가지는 다른 제제(들)없이 투여할 수 있다.
본 발명의 면역치료 조성물을 테노포비르 또는 엔테카비르 등의 항-바이러스제와 함께 사용하면 항-바이러스 약물을 사용하는 시간 코스의 단축이 가능할 것으로 본 발명에서 고려한다. 비슷한 결과는, 본 발명의 면역치료제를 인터페론과 조합하였을 때에도 예상된다. 또한, 항-바이러스제 또는 인터페론의 투약 요건은, 환자의 약물에 대한 허용성을 전반적으로 개선시키기 위해, 본 발명의 면역치료제와 조합한 결과로서, 감축 또는 변형될 수 있다. 아울러, 본 발명의 면역치료 조성물은 항-바이러스 요법 단독으로는 이러한 엔드포인트(endpoin)를 달성하지 못한 환자에 대해 혈청전환 또는 지속적인 바이러스 반응을 가능하게 할 것으로 고려된다. 즉, 본 발명의 면역치료 조성물은, 항-바이러스제 또는 인터페론과 조합하는 경우, 항-바이러스제 또는 인터페론을 단독으로 사용함으로써 혈청전환을 달성하는 것 보다 더 많은 환자들에서 혈청전환이 달성될 것이다. 현행 HBV 감염에 대한 SOC에서는, 항-바이러스제를 6개월 내지 1년, 2년, 3년, 4년, 5년 또는 그 이상 (예, 무한정) 투여할 수 있다. 이러한 요법을 본 발명의 면역치료 조성물을 조합함으로써, 항-바이러스제의 투여 시간을 수개월 또는 수년까지 단축시킬 수 있다. 본 발명의 면역치료 조성물의 단일요법으로서 사용 또는 항-바이러스제 및/또는 면역조절제와의 조합 사용은 HBsAg 및/또는 HBeAg의 소거; HBsAg 혈청전환, HBeAg 혈청전환 또는 완전한 혈청전환; 많은 개체들에서, 치료 종료 후 적어도 6개월간 지속적인 바이러스 소거를 달성하는데 유효할 것으로 보인다. 일부 환자들에서는, 본 발명에 따른 면역요법은, 단일요법으로서 또는 항-바이러스 및/또는 면역조절 방식과 조합하여 사용하는 경우, HBsAg 및/또는 HBeAg의 소거를 달성할 수 있지만, 혈청전환 (항-HB 또는 항-HBeAg의 발생)은 달성할 수 없을 수 있다. 이 시나리오에서, 환자에서 완전한 반응을 달성하기 위해, 본 발명의 효모-기반의 면역요법을 단독으로 또는 현행 예방학적 재조합 HBV 서브유닛 백신 등의 제제인 항-바이러스제 또는 기타 면역조절제와 조합하여 추가적으로 사용하는 것은, 본 발명의 일 구현예이다.
본원에서, 용어 "항-바이러스제"는, 직접적인 항-바이러스 치료 효과를 가진, 바이러스 생활 주기의 하나 이상의 단계를 타겟팅하는, 임의의 화합물 또는 약물, 전형적으로 소분자 저해제 또는 항체를 지칭한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 면역치료 조성물과 동일한 치료 프로토콜로 투여할 항-바이러스 화합물 또는 약물은, 테노포비르(tenofovir) (VIREAD®), 라미부딘(lamivudine) (EPIVIR®), 아데포비르(adefovir) (HEPSERA®), 텔비부딘(telbivudine) (TYZEKA®) 및 엔테카비르(entecavir) (BARACLUDE®), 또는 이들의 임의 유사체 또는 유도체, 또는 상기한 화합물, 약물, 유사체 또는 유도체를 포함 또는 함유하는 임의의 조성물로부터 선택된다.
테노포비르 (테노포비르 디소프록실 퓨마레이트 또는 TDF), 또는 ({[(2R)-1-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)프로판-2-일]옥시}메틸)포스폰산은 뉴클레오티드 유사체 역전사효소 저해제 (nRTIs)이다. 테노포비르는, HBV 감염 치료시, 전형적으로 매일 1회 300 mg (페토포비르 디스프록실 퓨마레이트)의 용량으로 복용하는 환제로서 성인에게 투여된다. 소아과 환자의 용량은 환자의 체중을 기준으로 하며 (체중 1 kg 당 8 mg, 최대 300 mg, 매일 1회), 정제 또는 경구 산제로서 제공될 수 있다.
라미부딘 또는 2',3'-디데옥시-3'-티아시티딘은 통상 3TC로 지칭되는 것으로서, 강력한 뉴클레오시드 유사체 역전사효소 저해제 (nRTI)이다. 라미부딘은, HBV 감염 치료시, 매일 1회 100 mg의 용량으로 복용하는 환제 또는 경구 용액제로서 투여된다 (1.4-2mg/lb. 3개월 내지 12세 어린이의 경우, 매일 2회).
아데포비르 (아데포비르 디피복실) 또는 9-[2-[[비스[(피발로일옥시)메톡시]-포스피닐]-메톡시]에틸]아데닌은 경구로 투여되는 뉴클레오티드 유사체 역전사효소 저해제 (ntRTI)이다. 아데포비르는, HBV 감염 치료시, 매일 1회 10 mg의 용량으로 복용하는 환제로서 투여된다.
텔비부딘 또는 1-(2-데옥시-β-L-에리트로-펜토푸라노실)-5-메틸피리미딘-2,4(1H,3H)-디온은 합성 티미딘 뉴클레오시드 유사체 (티미딘의 L-이성체)이다. 텔비부딘은, HBV 감염 치료시, 매일 1회 600 mg의 용량으로 복용하는 환제 또는 경구 용액제로서 투여된다.
엔테카비르 또는 2-아미노-9-[(1S,3R,4S)-4-하이드록시-3-(하이드록시메틸)-2-메틸리덴사이클로펜틸]-6,9-디하이드로-3H-퓨린-6-온은 바이러스의 역전사, DNA 복제 및 전사를 저해하는 뉴클레오시드 유사체 (구아닌 유사체)이다. 엔테카비르는, HBV 감염 치료시, 매일 1회 0.5 mg의 용량으로 복용하는 환제 또는 경구 용액제로서 투여된다 (라미부딘-불응성 또는 텔비부딘 내성 돌연변이의 경우 매일 1 mg).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 면역치료 조성물과 함께 치료 프로토콜로 투여되는 인터페론은 인터페론이며, 일 측면에서, 인터페론-α이고, 일 측면에서, 인터페론-α2b (주당 3회 피하 주사로 투여됨); 또는 페길화된 인터페론-α2a (예, PEGASYS®)이다. 본원에서, 용어 "인터페론"은 전형적으로 이중 가닥 RNA의 존재에 반응하여 매우 다양한 세포들과 면역 시스템의 세포들에서 생산된다. 인터페론은 숙주 세포내에서의 바이러스 복제를 저해하고, 천연 살상 세포와 대식 세포를 활성화하고, 림프구에 대한 항원 제시를 높이고, 숙주 세포의 바이러스 감염 내성을 유도함으로써, 면역 반응을 보조한다. I형 인터페론은 인터페론-α를 포함한다. III형 인터페론은 인터페론-λ를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용가능한 인터페론으로는 모든 I형 또는 III형 인터페론, 예컨대 인터페론-α, 인터페론-α2, 일 측면에서, 장기 지속형 인터페론, 비제한적인 예로서, 페길화된 인터페론, 인터페론 융합 단백질 (인터페론과 알부민의 융합체) 및 인터페론을 포함하는 조절 방출형 제형 (예, 미소구체 형태의 인터페론 또는 폴리아미노산 나노입자를 구비한 인터페론)을 포함한다. 한가지 인터페론인 PEGASYS®, 페길화된 인터페론-α2a는 재조합 인터페론-α2a (분자량 [MW] 약 20,000 달톤)와 단일 측쇄형의 비스-모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 체인 (분자량 약 40,000 달톤)의 공유결합 접합체이다. PEG 모이어티는 라이신에 안정적인 아미드 결합을 통해 한 위치에서 인터페론-α 모이어티과 연결된다. 페길화된 인터페론-α2a는 분자량이 약 60,000 달톤이다.
인터페론은 전형적으로 근육내 또는 피하 주입으로 투여되며, 3백만 - 천만 유닛(unit)의 용량으로 투여할 수 있으며, 일 구현예에서 3백만 유닛이 바람직하다. 인터페론의 용량들은 주당 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회에서 매주 1회, 2주에 한번, 3주 마다 또는 매달 1회로 다양할 수 있는 일정한 스케줄로 투여한다. 현재 이용가능한 인터페론의 전형적인 용량은 매주 제공되며, 본 발명에 따른 인터페론의 바람직한 투약 스케줄이다. 페길화된 인터페론-α2a는, HBV 치료시, 현재 피하로 주당 1회 180 mg의 용량 (1.0 ml 바이얼 또는 0.5 ml 사전충전된 주사기)으로 총 48주간 투여한다. 투여랑과 시기는 의사의 선호도와 권고에 따라, 사용중인 특정 인터페론에 권고에 따라 달라질 수 있으며, 적절한 용량을 결정하는 것은 당해 기술 분야의 당업자의 능력내에 속한다. 인터페론 요법을 본 발명의 면역치료 조성물과 함께 사용함으로써, 인터페론의 용량 세기 및/또는 투약 횟수 (인터페론 발효 기간 및/또는 인터페론 투약 간격)를 줄일 수 있는 것으로 간주된다.
본 발명의 방법에서, 조성물 및 치료 조성물은 임의의 척추동물 등의 동물, 특히 척추동물 강, 포유류에 속하는 임의 구성원, 비제한적인 예로서, 영장류, 설치류, 가축 및 애완 동물에 투여할 수 있다. 가축은 소비되거나 유용한 생산물을 생산하는 동물 (예, 울 제품을 생산하는 양)을 포함한다. 치료 또는 예방할 포유류는 인간, 개, 고양이, 마우스, 랫, 염소, 양, 소, 말 및 돼지를 포함한다.
"개체"는 척추동물, 예컨대, 포유류, 비제한적인 예로서 인간이다. 포유류는, 비제한적인 예로서, 농장 동물, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 마우스 및 랫을 포함한다. 용어 "개체"는 용어 "동물", "대상" 또는 "환자"와 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 사용가능한 일반적인 기법들
본 발명의 실시는, 달리 언급되지 않은 한, 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있는, (재조합 기술을 포함한) 분자 생물학, 미생물학, 세포생물학, 생화학, 핵산 화학 및 면역학의 통상적인 기술을 채택할 것이다. 이러한 기술들은 다음과 같은 문헌에 충분히 설명되어 있다: Methods of Enzymology, Vol. 194, Guthrie et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Biology and activities of yeasts, Skinner, et al., eds., Academic Press (1980); Methods in yeast genetics : a laboratory course manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); The Yeast Saccharomyces: Cell Cycle and Cell Biology, Pringle et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997); The Yeast Saccharomyces: Gene Expression, Jones et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993); The Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics, Broach et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), (본원에서 공통적으로 "Sambrook"으로 언급됨); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (jointly referred to herein as "Harlow and Lane"), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000); Casarett and Doull's Toxicology The Basic Science of Poisons, C. Klaassen, ed., 6th edition (2001), and Vaccines, S. Plotkin and W. Orenstein, eds., 3rd edition (1999).
일반 정의
"타모젠®"(Tarmogen)(콜로라도 루이빌, GlobeImmune, Inc.)은 일반적으로 하나 이상의 이종성 항원을 세포외로 (그의 표면 상에), 세포내로 (내부로 또는 사이토졸로) 또는 세포외 및 세포내 모두로 발현하는 효모 비히클을 지칭한다. 타모젠®은 당업계에서 널리 언급되고 있다 (예컨대, 미국 특허 5,830,463 참조). 또한, 특정 효모-기반의 면역치료 조성물 및 이의 제조 및 일반적인 사용 방법들도, 예를 들어, 미국 특허 5,830,463, 미국 특허 7,083,787, 미국 특허 7,736,642, Stubbs et al., Nat. Med. 7:625-629 (2001), Lu et al., Cancer Research 64:5084-5088 (2004), 및 Bernstein et al., Vaccine 2008 Jan 24;26(4):509-21에 상세히 기술되어 있으며, 이들 각각은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본원에서, 용어 "유사체"는 다른 화합물과 구조적으로 비슷하지만 (원자 하나가 다른 원소의 원자로 치환되거나, 특정한 기능기가 있거나, 또는 어떤 관능기가 다른 관능기로 치환됨으로써) 조성이 약간 다른 화합물을 지칭한다. 따라서, 유사체는 기능 및 외양 상 유사하거나 비슷하지만, 참조 화합물과 다른 구조나 오리진을 가지는 화합물이다.
용어 "치환된", "치환된 유도체" 및 "유도체"는, 화합물을 설명하는데 사용되는 경우, 비치환된 화합물에 결합된 하나 이상의 수소가 다른 원자나 화학적 모이어티로 치환되는 것을 의미한다.
유도체는 모 화합물과 비슷한 물질적 구조를 가지지만, 유도체는 모 화합물과 다른 화학적 특성 및/또는 생물학적 특성을 가질 수 있다. 이러한 특성들은, 비제한적인 예로서, 모 화합물의 활성 증가 또는 감소, 모 화합물 대비 새로운 활성, 생체이용성 강화 또는 감소, 효능 강화 또는 감소, 시험관내 및/또는 생체내 안정성 강화 또는 감소, 및/또는 흡수 특성 강화 또는 감소를 포함한다.
일반적으로, 용어 "생물학적 활성"은, 생체내 (즉, 천연 생리학적 환경) 또는 시험관내 (즉, 실험실 조건)에서 측정 또는 관찰시, 세포 또는 유기체의 대사성 또는 기타 프로세스에 대해 영향을 미치는 한가지 이상의 검출가능한 활성을 가지는 (단백질 또는 펩타이드를 비롯한) 화합물을 지칭한다.
본 발명에 있어서, 용어 "조절한다(modulate)"는 "규제한다(regulate)"와 상호 호환적으로 사용될 수 있으며, 일반적으로 특정 활성의 상향 조절 또는 하향 조절을 지칭한다. 본원에서, 용어 "상향 조절한다"는 일반적으로 특정 활성에 대한 유도, 증폭, 촉진 또는 제공 중 임의의 의미를 설명하는데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 용어 "하향 조절한다"는 일반적으로 특성 활성에 대한 감소, 경감, 저해, 완화, 축소, 약화, 차단 또는 방지 중 임의의 의미를 설명하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본원에 기술된 임의의 아미노산 서열은 몇시된 아미노산 서열의 C-말단 및/또는 N-말단 각각의 측면에 1개 이상 최대 약 20개의 추가적인 이종의 아미노산을 구비하도록 제조될 수 있다. 제조되는 단백질 또는 폴리펩타이드는 명시된 아미노산 서열로 "필수적으로 구성된"이라고 기술될 수 있다. 본 발명에서, 이종성 아미노산은 명시된 아미노산 서열의 측면에 천연적으로 위치하지 않거나 (즉, 생체내에서 본래 발견되지 않음), 명시된 아미노산 서열의 기능과 관련 없거나, 또는 천연 서열에서 뉴클레오티드가 소정의 아미노산 서열이 유래되는 유기체의 표준 코돈 이용(usage)을 사용하여 번역된다면, 유전자에서 이루어지는 바와 같이, 명시된 아미노산 서열을 코딩하는 천연 핵산 서열의 측면에 위치한 상기한 뉴클레오티드에 의해 코딩되지 않는, 아미노산 서열이다. 마찬가지로, "필수적으로 구성된"이라는 표현은, 본원의 핵산 서열을 참조하여 사용되는 경우, 1개 이상 최대 60개의 추가적인 이종의 뉴클레오티드가 명시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 5'- 및/또는 3'- 말단 각각에 측면에 위치할 수 있는, 상기 명시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다. 이종의 뉴클레오티드는, 천연 유전자에서 이루어지는 바와 같이, 명시된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 측면에 천연적으로 위치하지 않거나 (즉, 생체내에서는 본래 발견되지 않음), 또는 단백질에 임의의 추가적인 기능을 부여하는 단백질을 코딩하지 않거나, 또는 상기 명시된 아미노산 서열을 가진 단백질의 기능을 변화시키는 단백질을 코딩하지 않는다.
본 발명에서, "선택적으로 결합한다"라는 표현은 본 발명의 항체, 항원-결합 단편 또는 결합 파트너의 명시된 단백질에 대한 선호적인 결합력을 지칭한다. 보다 구체적으로는, "선택적으로 결합한다"라는 표현은 어떤 단백질의 다른 단백질에 대한 특이적인 결합 (예컨대, 항원에 대한 항체, 이의 단편 또는 결합 파트너의 결합)을 지칭하는 것으로, 임의의 표준 분석법 (예컨대, 면역 분석법)으로 측정시, 결합 수준은 분석에서 백그라운드 대조군보다 통계적으로 유의하게 높다. 예를 들어, 면역 분석법을 수행하는 경우, 대조군은 전형적으로 항체 또는 항원 결합 단편만을 함유하는 (즉, 항원 부재) 반응 웰/튜브를 포함하고, 항원 부재 시의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의한 반응의 양 (예컨대, 웰에 대한 비특이적 결합)은 백그라운드로 간주된다. 결합은 효소 면역분석법 (예컨대, ELISA, 면역블롯 분석 등) 등의 당해 기술 분야의 다양한 표준적인 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 단백질 또는 폴리펩타이드에 대한 언급은 전장 단백질, 융합 단백질, 또는 상기한 단백질의 임의의 단편, 도메인, 형태적 에피토프 또는 상동체, 예컨대 단백질의 기능성 도메인 및 면역학적 도메인을 포함한다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른, 분리된 단백질은, 이의 천연 환경으로부터 적출된 (즉, 인간 조작이 가해진) (폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함한) 단백질이며, 예를 들어, 정제된 단백질, 부분적으로 정제된 단백질, 재조합에 의해 생산된 단백질 및 합성에 의해 제조된 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, "분리된"은 단백질의 정제 수준을 반영하진 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 분리된 단백질은 재조합에 의해 생산한다. 본 발명에서, 용어 "변형" 및 "돌연변이"는 본 발명에 기술된 단백질 또는 이의 일부의 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)에 대한 변형/돌연변이에 대해서는 상호 호환적으로 사용할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "상동체"는 천연 단백질 또는 펩타이드 (즉, "프로토타입"또는 "야생형" 단백질)가 천연 단백질 또는 펩타이드에 대한 미미한 변형 또는 돌연변이 차이가 있지만, 천연 형태의 측쇄(side chain) 구조와 기본 단백질 구조를 유지하는, 단백질 또는 펩타이드를 지칭하는데 사용된다. 이러한 변화는, 비제한적인 예로서, 하나 또는 수 개의 아미노산 측쇄 변화; 결손 (예, 단백질 또는 펩타이드의 절단 버전), 삽입 및/또는 치환 등의 하나 또는 수 개의 아미노산의 변화; 하나 또는 수개의 원자의 입체화학적 변화; 및/또는 사소한 유도체화, 비제한적인 예로서, 메틸화, 당화, 인산화, 아세틸화, 미리스틸화, 프레닐화, 팔미토일화, 아미드화 및/또는 글리코실포스파티딜 이노시톨의 부가를 포함한다. 상동체는 천연 단백질 또는 펩타이드에 비해 증진된, 감소된 또는 실질적으로 유사한 특성을 가질 수 있다. 상동체는 단백질의 작용제 또는 단백질의 길항제를 포함할 수 있다. 상동체는, 비제한적인 예로서, 분리한 천연 단백질에 대한 직접 변형, 단백질의 직접 합성, 또는 예를 들어, 무작위 또는 표적화된 돌연변이 유발을 수행하기 위한 전통적인 또는 재조합 DNA 기술을 이용한, 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 대한 변형 등의, 단백질의 제조에 대한 당해 기술 분야에 공지된 기법들을 이용하여 제조할 수 있다.
소정의 단백질의 상동체는, 기준 단백질의 아미노산 서열에 대해, 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 55%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 91% 동일한, 또는 적어도 약 92% 동일한, 또는 적어도 약 93% 동일한, 또는 적어도 약 94% 동일한, 또는 적어도 약 95% 동일한, 또는 적어도 약 96% 동일한, 또는 적어도 약 97% 동일한, 또는 적어도 약 98% 동일한, 또는 적어도 약 99% 동일한 (또는 45% 내지 99%의, 전체 정수의 증가분의 모든 %) 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 필수적으로 구성되거나, 구성될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 상동체는, 기준 단백질의 천연 아미노산 서열에 대해, 100% 미만으로 동일한, 약 99% 미만으로 동일한, 약 98% 미만으로 동일한, 약 97% 미만으로 동일한, 약 96% 미만으로 동일한, 약 95% 미만으로 동일한, 등등, 1% 증분으로, 약 70% 미만까지 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 필수적으로 구성되거나, 구성된다.
상동체는, "거의 전장"인 단백질 또는 단백질의 도메인을 포함할 수 있으며, "거의 전장"은, 전장 단백질 또는 전장 기능성 도메인 또는 전장 면역학적 도메인의 N-말단 및/또는 C-말단으로부터 아미노산 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 부가 또는 결손에 의해, 상기 전장 단백질, 기능성 도메인 또는 면역학적 도메인과 차이가 있다는 것을 의미한다 (즉, 단백질, 기능성 도메인 또는 면역학적 도메인들은 본원에 기술되어 있거나 또는 공공의 이용가능한 서열로 공지 또는 개시되어 있음).
본원에서, 달리 언급되지 않은 한, 퍼센트(%) 상동성에 대한 언급은 아미노산 검색용 blastp와 핵산 검색용 blastn을 표준 디폴트 파라미터에서 이용한, (1) BLAST 2.0 Basic BLAST 상동성 검색, 여기에서, 쿼리 서열은 디폴트에 의해 저 복합도 영역에 대해 필터링됨 (Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에 기술되어 있으며, 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨); (2) (후술되는 파라미터를 이용한) BLAST 2 정렬(alignment); 및/또는 (3) 표준 디폴트 파라미터를 이용한 PSI-BLAST (Position-Specific Iterated BLAST)를 이용하여 수행되는 상동성 평가를 지칭한다. BLAST 2.0 Basic BLAST 및 BLAST 2 간의 표준 파라미터에 일부 차이가 존재하므로, 특이적인 서열 2개가 BLAST 2 프로그램 이용시 유의한 상동성을 갖는 것으로 인식되는 반면, 쿼리 서열로서 상기 서열들 중 하나를 이용한 BLAST 2.0 Basic BLAST로 수행된 검색에서는 탑 매치에서 두번째 서열을 동정할 수 없을 수 있음에 유념하여야 한다. 또한, PSI-BLAST는 서열 상동체를 찾기 위한 민감한 방식인, 자동화된, 손쉬운 "프로파일" 조사 버전을 제공한다. 상기 프로그램은 먼저 갭이 부가된 BLAST 데이터베이스 검사를 수행한다. PSI-BLAST 프로그램은, 다음 번 데이터베이스 검색을 위해 쿼리 서열을 치환하는, 위치-특이적인 스코어 매트릭스를 구축하기 위해 복구시킨 임의의 유의한 정렬로부터 정보를 이용한다. 따라서, 이러한 프로그램 중 임의의 한가지를 이용하여 퍼센트 상동성을 결정할 수 있는 것으로 이해된다.
Tatusova and Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250에 기술된 바와 같이, 두 개의 특이적인 서열을 BLAST 2 sequence를 이용하여 서로에 대해 정렬시킬 수 있으며, 상기 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. BLAST 2 서열 정렬은 BLAST 2.0 알고리즘을 이용하여 blastp 또는 blastn에서 수행하여, 수득된 정렬에 갭 도입(결실 및 삽입)을 허용하는 두 서열 간의 Gapped BLAST search (BLAST 2.0)를 수행할 수 있다. 본원에서 명확하게 하기 위해, BLAST 2 서열 배열은 다음과 같은 표준 디폴트 파라미터를 이용하여 이루어진다.
blastn의 경우, 0 BLOSUM62 매트릭스 사용:
매치 보상 = 1
미스패치 패널티 = -2
오픈 갭 (5) 및 연장 갭 (2) 패널티
갭 x_드롭오프 (50) 예상 (10) 글자 크기 (11) 필터 (on)
blastp의 경우, 0 BLOSUM62 매트릭스 사용:
오픈 갭 (11) 및 연장 갭 (1) 패널티
갭 x_드롭오프 (50) 예상 (10) 글자 크기 (3) 필터 (on)
분리된 핵산 분자는 이의 천연 환경, 즉, 상기 핵산 분자가 본래 확인되는 게놈 또는 염색체인 그것의 천연 환경으로부터 적출된 (즉, 인간 조작이 가해진) 핵산 분자이다. 이에 "분리된"은 핵산 분자의 정제 수준을 반드시 반영하는 것은 아니지만, 이 분자가 본래 확인되는 전체 게놈 또는 전체 염색체를 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 분리된 핵산 분자는 유전자를 포함할 수 있다. 유전자를 포함하는 분리된 핵산 분자는 그 유전자를 포함하는 염색체의 단편이 아니라, 동일한 염색체에서 본래 확인되는 부가적인 유전자는 없지만, 상기 유전자와 연관된 코딩 영역과 조절 영역을 포함한다. 분리된 핵산 분자는 천연적으로는 명시된 핵산 서열의 측면에 정상적으로 위치하지 않는 부가적인 핵산 (즉, 이종의 서열)이 측면 (즉, 서열의 5' 및/또는 3'의 말단)에 위치된, 명시된 핵산 서열을 또한 포함할 수 있다. 분리된 핵산 분자는 DNA, RNA (예, mRNA), 또는 DNA 또는 RNA 중 어느 하나의 유도체 (예, cDNA)를 포함할 수 있다. "핵산 분자"라는 표현은 대개 물리적인 핵산 분자를 의미하는 것이고 "핵산 서열"이라는 표현은 대개 일차적으로 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 의미하는 것이지만, 상기 2가지 표현은 특히 단백질 또는 단백질의 도메인을 코딩할 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 서열에 대해서는, 상호 호환적으로 사용할 수 있다.
재조합 핵산 분자는, 형질감염시킬 세포에서 핵산 분자(들)의 발현을 효과적으로 조절할 수 있는 하나 이상의 임의의 전사 조절 서열과 작동가능하게 연결된, 본원에 기술된 하나 이상의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 임의의 핵산 서열을 포함할 수 있는 분자이다. "핵산 분자"라는 표현은 대개 물리적인 핵산 분자를 의미하고, "핵산 서열"이라는 표현은 대개 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 의미하는 것이지만, 이들 2가지 표현들은 특히 단백질을 코딩할 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 서열에 대해서는 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 또한, "재조합 분자"라는 표현은 대개 전사 조절 서열과 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 의미하는 것이지만, 동물에게 투여되는 "핵산 분자"라는 표현과 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
재조합 핵산 분자는, 임의의 핵산 서열, 전형적으로 이종의 서열이며, 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자와 작동가능하게 연결되며,상기 융합 단백질의 재조합 생산을 가능하게 할 수 있으며, 그리고 본 발명에 따라 숙주 세포로 상기 핵산 분자를 전달할 수 있는, 재조합 벡터를 포함한다. 상기한 백터는 천연적으로는 벡터에 삽입시킬 분리된 핵산 분자의 근처에서는 확인되지 않는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 RNA 또는 DNA, 원핵 세포성 또는 진핵 세포성일 수 있으며, 본 발명에서 바람직하게는 바이러스 또는 플라스미드이다. 재조합 벡터는 핵산 분자의 클로닝, 서열분석 및/또는 다른 조작에 사용할 수 있으며, (예컨대, DNA 조성물 또는 바이러스 벡터-기반의 조성물에서와 같이) 상기한 분자를 전달하는데 사용할 수 있다. 재조합 벡터는, 바람직하게는, 핵산의 발현에 사용되며, 또한, 발현 벡터로도 언급할 수 있다. 바람직한 재조합 벡터는 형질전환된 숙주 세포에서 발현될 수 있다.
본 발명의 재조합 분자에서, 핵산 분자는 전사 조절 서열, 번역 조절 서열, 복제 오리진 및 숙주 세포에 적합하며 본 발명의 핵산 분자의 발현을 조절하는 그외 조절 서열과 같은 조절 서열을 포함하는, 발현 벡터와 작동가능하게 연결된다. 특히, 본 발명의 재조합 분자는 하나 이상의 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결된 핵산 서열을 포함한다. "작동가능하게 연결된"이라는 표현은, 숙주 세포를 형질감염시켰을 때 (즉, 형질전환, 형질전이 또는 형질감염시켰을 때), 분자가 발현되는 방식으로, 발현 조절 서열에 핵산 분자를 연결하는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "형질감염"은 외인성 핵산 분자 (즉, 재조합 핵산 분자)를 세포에 삽입시킬 수 있는 모든 방법을 의미한다. 용어 "형질전환"은, 핵산 분자를 조류, 박테리아 및 효모와 같은 미생물 세포에 도입하는 것을 언급하기 위해 사용되는 경우, 용어 "형질감염"과 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 미생물 시스템에서, 용어 "형질전환"은 미생물에 의한 외인성 유전자의 습득으로 인한 유전되는 변화를 의미하며, "형질감염"과 본질적으로 동의어이다. 즉, 형질감염 기법으로는 형질전환, 세포의 화학적 처리, 입자 사격 (particle bombardment), 전기천공, 미세주입, 리포펙션 (lipofection), 흡착, 감염 및 원형질체 융합을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
하기 실험 결과들은 예시의 목적으로서 제공되는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예들
실시예 1
아래 실시예는 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염을 치료 또는 예방하기 위한 효모-기반의 면역치료 조성물의 제조를 기술한다.
본 실험에서, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 도 2에 나타낸 기본 구조를 가진 각각의 다양한 HBV 표면-코어 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작하였다. 각 경우에, HBV 융합 단백질은, 서열번호 34로 표시되는, N-말단에서 C-말단 방향의 골격으로 융합된 하기 서열 요소들을 가진, 약 595개의 아미노산으로 구성된 단일 폴리펩타이드였다: (1) 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정화하기 위한 N-말단 펩타이드 (예, 서열번호 34의 1번 위치에서 6번 위치); 2) SpeI 제한효소 부위를 도입하기 위한 2개의 아미노산 스페이서 (Thr-Ser); 3) 거의 전장 (위치 1번 생략) HBV 유전자형 C 대형 (L) 표면 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 34의 9-407번 위치 또는 서열번호 11의 2-400번 위치에 해당하며, 서열번호 11의 350-351번 위치에서 서열번호 34와 차이가 있으며, 서열번호 11의 Leu-Val 서열이 서열번호 34의 357-358번 위치에서 Gln-Ala로 치환됨)); 4) HBV 코어 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 34의 408-589번 위치); 및 5) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 34의 590-595번 위치). 서열번호 34의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 33으로 표시된다. 서열번호 34의 28-54번 위치는 대형 (L) 표면 단백질의 간세포 수용체 영역을 포함한다. 서열번호 34는 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 여러개의 에피토프와 도메인을 포함한다. 예를 들어, 서열번호 34에서, 209-220번 위치, 389-397번 위치, 360-367번 위치 및 499-506번 위치는 공지된 MHC 클래스 I 결합성 에피토프 및/또는 CTL 에피토프들을 포함한다. 서열번호 34의 305-328번 위치는 항체 에피토프를 포함한다. 이 융합 단백질 및 이 융합 단백질을 포함하는 대응되는 효모-기반의 면역치료제는 본원에서 전체적으로 "Score", "MADEAP-Score", "M-Score", 또는 "GI-13002"로 언급될 수 있다.
간략하게는, 전장 코어 항원에 융합된 거의 전장의 대형 표면 항원 (L)을 코딩하는 DNA를 효모 발현용으로 코돈 최적화한 다음, EcoRI 및 NotI로 절단하여, 효모 2 um 발현 벡터내 CUP1 프로모터 (pGI-100) 또는 TEF2 프로모터 (pTK57-1)의 뒷쪽에 삽입하였다. 이들 구조체에 의해 코딩되는 융합 단백질은 본원에서 서열번호 34로 표시되며 (서열번호 33의 뉴클레오티드 서열로 코딩됨), 분자량은 약 66 kDa으로 예상된다. 제조한 플라스미드를 리튬 아세테이트/폴리에틸렌 글리콜 형질감염을 통해 사카로마이세스 세레비지애 W303α 효모에 도입하였고, 1차 형질감염체들을 우라실이 결여된 고체 최소 플레이트에서 선별하였다 (UDM; 우리딘 드롭아웃 배지). 　콜로니들을 UDM 또는 ULDM (우리딘 및 루신 드롭아웃 배지)에 다시 스크리킹하여, 3일간 30℃에서 배양하였다. 플레이트에서 우리딘이 결핍된 액체 배지 (U2 배지: 글루코스 20g/L; 암모늄 설페이트를 포함하는 효모 질소 베이스 6.7 g/L; 히스티딘, 루신, 트립토판 및 아데닌 각각 0.04 mg/mL) 또는 우리딘 및 루신이 결핍된 액체 배지 (UL2 배지: 글루코스 20g/L; 암모늄 설페이트를 포함하는 효모 질소 베이스 6.7 g/L; 및 히스티딘, 트립토판 및 아데닌 각각 0.04 mg/mL)로 접종하여, 스타터 배양물을 30℃에서 20시간 동안 250 rpm으로 배양하였다. Bis-Tris 4.2g/L를 포함하는 pH 완충화된 배지 (BT-U2; BT-UL2)에도 접종하여, 중성 pH 조건에서 효모 생장을 평가하였다. 일차 배양물을 동일 제형의 최종 배양물에 접종하여, 1.1 내지 4.0 YU/mL의 밀도가 될 때까지 계속 배양하였다.
TEF2 균주 (구성적인 발현(constitutive expression))의 경우, 세포를 회수하고, 세척한 다음 1시간 동안 56℃에서 PBS 중에서 열에 의해 사멸시켰다. 또한, 살아있는 세포를 비교를 위해 가공하였다. CUP1 균주 (유도성 발현)의 경우, 0.5 mM 구리 설페이트가 첨가된 동일 배지에서 30℃에서 5시간 동안 250 rpm 하에서 발현을 유도하였다. 세포를 회수하고, 세척한 다음 1시간 동안 56℃에서 PBS 중에서 열에 의해 사멸시켰다. 또한, 살아있는 세포를 비교를 위해 가공하였다.
TEF2 및 CUP1 배양물을 열에 의해 사멸시킨 후, 세포를 PBS에서 3번 세척하였다. 총 단백질 발현을 TCA 침강/니트로셀룰로스 결합 분석으로 측정하였고, 항원 발현을 항-his 텍 단일클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 항원은 동일한 웨스턴 블롯에 처리한 재조합 헥사-히스티딘 텍이 달린 NS3 단백질의 표준 곡선에서 보간법(interpolation)을 통해 정량화하였다. 그 결과를 도 16 (열-사멸) 및 도 17 (살아있는 효모)에 나타낸다. 이들 도면들은, 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물이 양 프로모터를 이용하여 원활하게 HBV 표면-코어 융합 단백질을 발현하며, 이를 열-사멸 세포와 살아있는 효모 세포 둘다에서 웨스턴 블롯으로 식별할 수 있음을 보여준다. 이러한 효모-기반의 면역치료제에 의한 계산된 항원 발현은 Y.U. 당 단백질 ~5000 ng (Yeast Unit; One Yeast Unit (Y.U.)은 1 x 107개의 효모 세포 또는 효모 세포 등가물임) 또는 Y.U. 당 단백질 76 pmol이다.
실시예 2
아래 실시예는 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염을 치료 또는 예방하기 위한 다른 효모-기반의 면역치료 조성물의 제조를 기술한다.
효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 도 3에 개략적으로 도시된 구조를 각각 구비한 다양한 HBV 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작하였다. 각각의 경우에, 융합 단백질은, 하기 서열 요소들이 N-말단에서 C-말단 방향의 골격으로 융합된, 서열번호 36으로 표시되는, 약 945개의 아미노산으로 구성된 단일 폴리펩타이드이다: (1) 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위한 N-말단 펩타이드 (서열번호 36의 1-5번 위치); 2) HBV 대형 (L) 표면 단백질의 pre-S1 영역의 HBV 유전자형 C 수용체 도메인의 아미노산 서열 (L에 고유함) (예, 서열번호 11의 21-47번 위치 또는 서열번호 36의 6-32번 위치); 3) 전장 HBV 유전자형 C 소형 (S) 표면 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 11의 176-400번 위치 또는 서열번호 36의 33-257번 위치); 4) 서열 클로닝과 조작을 용이하게 하기 위한 2개의 아미노산 스페이서/링커 (Leu-Glu) (서열번호 36의 258-259번 위치); 5) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 유전자형 C 중합효소의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 247-691번 위치 또는 서열번호 36의 260-604번 위치); 6) HBV 유전자형 C 코어 단백질 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 36의 605-786번 위치); 7) HBV 유전자형 C X 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 12의 2-154번 위치 또는 서열번호 36의 787-939번 위치); 및 8) 헥사히스티딘 텍 (서열번호 36의 940-945번 위치). 이 융합 단백질 및 이 융합 단백질을 포함하는 대응되는 효모-기반의 면역치료제는 본원에서 전체적으로 "MADEAP-Spex", "M-Spex", 또는 "GI-13005"로 지칭될 수 있다.
서열번호 36의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 35로 표시된다. 서열번호 36의 예상되는 대략적인 분자량은 106-107 kDa이다. 서열번호 36은 서열번호 34에 대한 전술한 수종을 비롯하여, 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 복수의 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 아울러, 본 융합 단백질에 사용되는 역전사효소 도메인은 항-바이러스 약물 처리에 대해 약물-내성 반응으로서 돌연변이되는 것으로 알려져 있는 몇가지 아미노산 위치들을 포함하므로, 따라서 특이적인 약물 내성(탈출) 돌연변이를 타겟팅하는 치료학적 또는 예방학적 면역치료제를 제공하기 위해서 이 용합 단백질에서 돌연변이될 수 있다. 이들 아미노산 위치들은, 서열번호 36의 경우, 아미노산 432번 위치 (라미부딘 치료 후 Leu로 변이되는 것으로 알려진 Val); 아미노산 439번 위치 (라미부딘 치료 후 Met로 변이되는 것으로 알려진 Leu); 아미노산 453번 위치 (테노포비르 치료 후 Thr로 변이되는 것으로 알려진 Ala); 아미노산 463번 위치 (라미부딘 치료 후 Ile 또는 Val으로 변이되는 것으로 알려진 Met); 및 아미노산 495번 위치 (아데포비르 치료 후 Thr로 변이되는 것으로 알려진 Asn)이다.
항원에 다른 N-말단 펩타이드를 적용한 제2의 효모-기반의 면역치료제를 제조하기 위해, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 도 3에 개략적으로 도시된 기본 구조를 가지는 다양한 HBV 융합 단백질들을 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작하였다. 이 2번째 경우에, 알파 팩터 프리프로 서열 (서열번호 89)을 서열번호 36으로 표시되는 융합 단백질내 전술한 합성 N-말단 펩타이드 대신 사용하였다. 간략하게는, 새로운 융합 단백질은 서열번호 92로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다: (1)프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정화 또는 강화하기 위한 N-말단 펩타이드 (서열번호 89, 서열번호 92의 1-89번 위치); 2) 서열 클로닝과 조작을 용이하게 하기 위한 2개의 아미노산 스페이서/링커 (Thr-Ser) (서열번호 92의 90-91번 위치); 3) HBV 대형 (L) 표면 단백질의 pre-S1 영역의 HBV 유전자형 C 수용체 도메인의 아미노산 서열 (L에 고유함) (예, 서열번호 11의 21-47번 위치 또는 서열번호 92의 92-118번 위치); 4) 전장 HBV 유전자형 C 소형 (S) 표면 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 11의 176-400번 위치 또는 서열번호 92의 119-343번 위치); 5) 서열 클로닝과 조작을 용이하게 하기 위한 2개의 아미노산 스페이서/링커 (Leu-Glu) (예, 서열번호 92의 344-345번 위치); 6) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 유전자형 C 중합효소의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 247-691번 위치 또는 서열번호 92의 346-690번 위치); 7) HBV 유전자형 C 코어 단백질 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 92의 691-872번 위치); 8) HBV 유전자형 C X 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 12의 2-154번 위치 또는 서열번호 92의 873-1025번 위치); 및 9) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 92의 1026-1031번 위치). 이 융합 단백질 및 이 융합 단백질을 포함하는 대응되는 효모-기반의 면역치료제는 본원에서 전체적으로 "alpha-Spex", "a-Spex", 또는 GI-13004"로 지칭될 수 있다.
서열번호 92의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 91로 표시된다. 서열번호 92의 예상되는 대략적인 분자량은 123 kDa이다. 서열번호 92는 서열번호 34 및 서열번호 36에 대한 전술한 수종 등의 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 복수의 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 아울러, 본 융합 단백질에 사용되는 역전사효소 도메인은 항-바이러스 약물 처리에 대해 약물-내성 반응으로서 돌연변이되는 것으로 알려져 있는 몇가지 아미노산 위치들을 포함하므로, 따라서 특이적인 약물 내성(탈출) 돌연변이를 타겟팅하는 치료학적 또는 예방학적 면역치료제를 제공하기 위해서 이 용합 단백질에서 돌연변이될 수 있다. 이들 아미노산 위치들은, 서열번호 92의 경우, 아미노산 518번 위치 (라미부딘 치료 후 Leu로 변이되는 것으로 알려진 Val); 아미노산 525번 위치 (라미부딘 치료 후 Met로 변이되는 것으로 알려진 Leu); 아미노산 539번 위치 (테노포비르 치료 후 Thr로 변이되는 것으로 알려진 Ala); 아미노산 549번 위치 (라미부딘 치료 후 Ile 또는 Val으로 변이되는 것으로 알려진 Met); 및 아미노산 581번 위치 (아데포비르 치료 후 Thr로 변이되는 것으로 알려진 Asn)이다.
서열번호 36 및 서열번호 92로 표시되는 아미노산 서열들을 포함하는 이들 면역치료 조성물을 제조하기 위해, 표면 항원의 전술한 보존된 영역 (pre-S1 또는 대형 표면 항원의 간세포 수용체 영역, 및 전장 소형 표면 항원)과 중합효소의 역전사효소 영역을 코딩하는 DNA를 전장 코어 및 전장 X 항원에 융합하였다. 이 DNA는 효모에서의 발현을 위해 코돈 최적화한 다음, EcoRI 및 NotI로 절단하여, 효모 2 um 발현 벡터내 CUP1 프로모터 (pGI-100) 또는 TEF2 프로모터 (pTK57-1)의 뒷쪽에 삽입하였다. 제조한 플라스미드를 리튬 아세테이트/폴리에틸렌 글리콜 형질감염을 통해 사카로마이세스 세레비지애 W303α 효모에 도입하였고, 1차 형질감염체들을 우라실이 결여된 고체 최소 플레이트에서 선별하였다 (UDM; 우리딘 드롭아웃 배지). 　콜로니들을 UDM 또는 ULDM (우리딘 및 루신 드롭아웃 배지)에 다시 스크리킹하여, 3일간 30℃에서 배양하였다.
플레이트에서 우리딘 결핍 액체 배지 (U2) 또는 우리딘 및 루신 결핍 액체 배지 (UL2)로 접종하여, 스타터 배양물을 30℃에서 20시간 동안 250 rpm으로 배양하였다. Bis-Tris 4.2g/L를 포함하는 pH 완충화된 배지 (BT-U2; BT-UL2)에도 접종하여, 중성 pH 조건에서 효모 생장을 평가하였다 (데이타 미기재). 일차 배양물을 동일 제형의 최종 배양물에 접종하여, 1.1 내지 4.0 YU/mL의 밀도가 될 때까지 계속 배양하였다. TEF2 균주 (구성적인 발현)의 경우, 세포를 회수하고, 세척한 다음 1시간 동안 56℃에서 PBS 중에서 열에 의해 사멸시켰다. CUP1 균주 (유도성 발현)의 경우, 0.5 mM 구리 설페이트가 첨가된 동일 배지에서 30℃에서 5시간 동안 250 rpm 하에서 발현을 유도하였다. 세포를 회수하고, 세척한 다음 1시간 동안 56℃에서 PBS 중에서 열에 의해 사멸시켰다. 또한, 살아있는 세포도 비교를 위해 가공하였다 (데이타 미기재).
TEF2 및 CUP1 배양물을 열에 의해 사멸시킨 후, 세포를 PBS에서 3번 세척하였다. 총 단백질 발현을 TCA 침강/니트로셀룰로스 결합 분석으로 측정하였고, 항원 발현을 항-his 텍 단일클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 항원은 동일한 웨스턴 블롯에 처리한 재조합 헥사-히스티딘 텍이 달린 NS3 단백질의 표준 곡선에서 보간법을 통해 정량하였다.
서열번호 36으로 표시되는 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료제 (GI-13005)에 대한 결과를 도 18에 나타낸다. 도 18은, 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물이 양 프로모터를 이용하여 원활하게 융합 단백질을 발현하며, 이를 열-사멸 세포에서 웨스턴 블롯으로 식별할 수 있음을 보여준다 (또한, 발현은 살아있는 효모 세포에서도 달성됨, 데이타 미기재). 이러한 효모-기반의 면역치료제에 의한 계산된 항원 발현은, UL2에서 발현시킨 경우, Y.U. 당 단백질 ~1200 ng 또는 Y.U. 당 단백질 11 pmol이다.
서열번호 92로 표시되는 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료제 (GI-13004)에 대한 결과를 도 19에 나타낸다. 도 19는, CUP1 프로모터의 통제 하의 본 발명의 효모-기반의 면역치료 조성물의 발현 (도 19에서 Alpha-SPEX로 표시됨)을, 비관련 항원을 발현하는 효모-기반의 면역치료제 (대조군 효모) 및 서열번호 36으로 표시되는 HBV 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물 (SPEX)과 비교하여, 보여준다. 도 19는, 본 효모-기반의 면역치료제가 해당 융합 단백질을 잘 발현하며, 열-사멸된 효모 세포에서 웨스턴 블롯으로 동정할 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 효모-기반의 면역치료제에 의한 계산된 항원 발현은, UL2에서 발현시킨 경우, Y.U. 당 단백질 ~5000 ng 또는 Y.U. 당 단백질 41 pmol이다.
실시예 3
아래 실시예는 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염을 치료 또는 예방하기 위한 부가적인 효모-기반의 면역치료 조성물의 제조를 기술한다.
본 실험에서, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 도 4에 개략적으로 도시된 바와 같이 다양한 HBV 중합효소-코어 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작하였다. 각각의 경우에, 융합 단백질은, 하기 서열 요소들이 N-말단에서 C-말단 방향의 골격으로 융합된, 서열번호 38로 표시되는, 약 527개의 아미노산으로 구성된 단일 폴리펩타이드이다: (1) 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위한 N-말단 펩타이드 (서열번호 37; 서열번호 38의 1-6번 위치); 2) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 유전자형 C 중합효소의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 347-691번 위치 또는 서열번호 38의 7-351번 위치); 3) HBV 유전자형 C 코어 단백질 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 38의 352-533번 위치); 및 4) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 38의 534-539번 위치). 서열번호 38의 예상되는 분자량은 약 58 kDa이다. 상기 서열은, 또한, 상기 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 부가적인 구조체에서, 서열번호 37의 N-말단 펩타이드를, 본 명세서에 상세히 기술된 바와 같이 서열번호 37의 동일한 기본적인 구조 요건들을 충족시키는 서열번호 37의 상동체로 표시되는 다른 합성 N-말단 펩타이드로 치환하거나, 또는 서열번호 37의 N-말단 펩타이드를 서열번호 89 또는 서열번호 90의 N-말단 펩타이드로 치환하며, 다른 구조체에서는, N-말단 펩타이드를 생략하고, 1번 위치에 메티오닌을 포함시킨다.
다른 실험에서, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 도 5에 개략적으로 도시한 바와 같이 다양한 HBV X-코어 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작한다. 각각의 경우에, 융합 단백질은, 하기 서열 요소들이 N-말단에서 C-말단 방향의 골격으로 융합된, 서열번호 39로 표시되는, 약 337개의 아미노산으로 구성되는 단일 폴리펩타이드이다: (1) 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위한 N-말단 펩타이드 (서열번호 37; 서열번호 39의 1-6번 위치); 2) 거의 전장 (위치 1번 생략) HBV 유전자형 C X 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 12의 2-154번 위치 또는 서열번호 39의 7-159번 위치); 3) HBV 유전자형 C 코어 단백질 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 39의 160-341번 위치); 및 4) 헥사히스티딘 텍 (서열번호 39의 342-347번 위치). 서열번호 39의 예상되는 대략적인 분자량은 37 kDa이다. 상기 서열은, 또한, 상기 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 부가적인 구조체에서, 서열번호 37의 N-말단 펩타이드를 본 명세서에 상세히 기술된 바와 같이 서열번호 37의 동일한 기본적인 구조 요건들을 충족시키는 서열번호 37의 상동체로 표시되는 다른 합성 N-말단 펩타이드로 치환하거나, 또는 서열번호 37의 N-말단 펩타이드를 서열번호 89 또는 서열번호 90의 N-말단 펩타이드로 치환하며, 다른 구조체에서는, N-말단 펩타이드를 생략하고, 1번 위치에 메티오닌을 포함시킨다.
다른 실험으로, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 다양한 HBV 중합효소를 도 6에 개략적으로 도시한 바와 같이 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작한다. 각각의 경우에, 융합 단백질은 서열번호 40으로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다: (1) 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위한 N-말단 펩타이드 (서열번호 37, 또는 서열번호 40의 1-6번 위치); 2) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 유전자형 C 중합효소의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 347-691번 위치 또는 서열번호 40의 7-351번 위치); 및 3) 헥사히스티딘 텍 (서열번호 40의 352-357번 위치). 상기 서열은, 또한, 상기 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 아울러, 일 구현예에서, 이 구조체의 서열을 다음과 같은 항-바이러스 내성 돌연변이들 중 하나 이상 또는 전체를 도입하도록 변형시킬 수 있다: rtM204l, rtL180M, rtM204V, rtV173L, rtN236T, rtA194T (HBV 중합효소의 전장 아미노산 서열에 대해 제시된 위치들임). 일 구현예에서, 상기 돌연변이들 중 각각 하나를 포함하는, 6종의 면역치료 조성물을 제조한다. 다른 구현예들에서, 이들 돌연변이들 중 일부 또는 전체가 단일 융합 단백질에 포함된다. 부가적인 구조체에서, 서열번호 37의 N-말단 펩타이드는 본 명세서에 상세히 기술된 바와 같이 서열번호 37의 동일한 기본적인 구조 요건들을 충족시키는 서열번호 37의 상동체로 표시되는 다른 합성 N-말단 펩타이드로 치환하거나, 또는 서열번호 37의 N-말단 펩타이드를 서열번호 89 또는 서열번호 90의 N-말단 펩타이드로 치환하며, 다른 구조체에서는, N-말단 펩타이드를 생략하고, 1번 위치에 메티오닌을 포함시킨다.
다른 실험으로, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 다양한 HBV 중합효소-표면-코어 융합 단백질을 도 7에 개략적으로 도시한 바와 같이 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작한다. 각각의 경우에, 융합 단백질은 서열번호 41로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다: (1) 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위한 N-말단 펩타이드 (예, 서열번호 41의 1-5번 위치); 2) HBV 대형 (L) 표면 단백질의 pre-S1 영역의 HBV 간세포 수용체 도메인의 아미노산 서열 (L에 고유함) (예, 서열번호 11의 21-47번 위치 또는 서열번호 41의 6-32번 위치); 3) HBV 소형 (S) 표면 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 11의 176-400번 위치 또는 서열번호 41의 33-257번 위치); 4) 서열의 클로닝 및 조작을 용이하게 하기 위한 2개의 아미노산 스페이서/링커 (예, 서열번호 41의 258-259번 위치); 5) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 중합효소의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 247-691번 위치 또는 서열번호 41의 260-604번 위치); 6) HBV 코어 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 41의 605-786번 위치); 및 7) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 41의 787-792번 위치). 상기 서열은, 또한, 상기 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 아울러, 일 구현예에서, 이 구조체의 서열을 다음과 같은 항-바이러스 내성 돌연변이들 중 하나 이상 또는 전체를 도입하도록 변형시킬 수 있다: rtM204l, rtL180M, rtM204V, rtV173L, rtN236T, rtA194T (HBV 중합효소의 전장 아미노산 서열에 대해 제시된 위치들임. 일 구현예에서, 상기 돌연변이들 중 각각 하나를 포함하는, 6종의 면역치료 조성물을 제조한다. 다른 구현예들에서, 이들 돌연변이들 중 일부 또는 전체가 단일 융합 단백질에 포함된다. 일 구현예에서, 이 구조체는 표면 항원에 한가지 이상의 항-바이러스 내성을 또한 포함한다. 부가적인 구조체에서, 서열번호 41의 1-5번 위치로 표시되는 N-말단 펩타이드를 본 명세서에 상세히 기술된 바와 같이 서열번호 41의 1-5번 위치 (또는 서열번호 37)의 동일한 기본적인 구조 요건들을 충족시키는 서열번호 41의 1-5번 위치의 상동체로 표시되는 다른 합성 N-말단 펩타이드로 치환하거나, 또는 서열번호 41의 1-5번 위치의 N-말단 펩타이드를 서열번호 89 또는 서열번호 90의 N-말단 펩타이드로 치환하며, 다른 구조체에서는, N-말단 펩타이드를 생략하고, 1번 위치에 메티오닌을 포함시킨다.
전술한 임의의 융합 단백질과 상기한 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물을 제조하기 위해, 간략하게는, 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 효모에서의 발현을 위해 코돈 최적화한 다음, EcoRI 및 NotI로 절단하여, 효모 2 um 발현 벡터내 CUP1 프로모터 (pGI-100) 또는 TEF2 프로모터 (pTK57-1)의 뒷쪽에 삽입하였다. 제조한 플라스미드를 리튬 아세테이트/폴리에틸렌 글리콜 형질감염을 통해 사카로마이세스 세레비지애 W303α 효모에 도입하였고, 1차 형질감염체들을 우라실이 결여된 고체 최소 플레이트에서 선별하였다 (UDM; 우리딘 드롭아웃 배지). 　콜로니들을 UDM 또는 ULDM (우리딘 및 루신 드롭아웃 배지)에 다시 스크리킹하여, 3일간 30℃에서 배양하였다.
플레이트에서 우리딘 결핍 액체 배지 (U2) 또는 우리딘 및 루신 결핍 액체 배지 (UL2)로 접종하여, 스타터 배양물을 30℃에서 20시간 동안 250 rpm으로 배양하였다. Bis-Tris 4.2g/L를 포함하는 pH 완충화된 배지 (BT-U2; BT-UL2)에도 접종하여, 중성 pH 조건에서 효모 생장을 평가하였다. 일차 배양물을 동일 제형의 최종 배양물에 접종하여, 1.1 내지 4.0 YU/mL의 밀도가 될 때까지 계속 배양하였다. TEF2 균주 (구성적인 발현)의 경우, 세포를 회수하고, 세척한 다음 1시간 동안 56℃에서 PBS 중에서 열에 의해 사멸시켰다. CUP1 균주 (유도성 발현)의 경우, 0.5 mM 구리 설페이트가 첨가된 동일 배지에서 30℃에서 5시간 동안 250 rpm 하에서 발현을 유도하였다. 세포를 회수하고, 세척한 다음 1시간 동안 56℃에서 PBS 중에서 열에 의해 사멸시켰다. 또한, 살아있는 세포도 비교를 위해 가공하였다.
TEF2 및 CUP1 배양물을 열에 의해 사멸시킨 후, 세포를 PBS에서 3번 세척하였다. 총 단백질 발현을 TCA 침강/니트로셀룰로스 결합 분석으로 측정하였고, 단백질 발현을 항-his 텍 단일클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 융합 단백질은 동일한 웨스턴 블롯에 처리한 재조합 헥사-히스티딘 텍이 달린 NS3 단백질의 표준 곡선에서 보간법을 통해 정량하였다.
실시예 4
아래 실시예는 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염을 치료 또는 예방하기 위한 부가적인 효모-기반의 면역치료 조성물의 제조를 기술한다.
본 실시예는 한가지 HBV 단백질을 발현하도록 각각 고안된 4종의 다른 효모-기반의 면역치료 조성물의 제조에 대해 기술한다. 이들 "단일 HBV 단백질 효모 면역치료제"들은 서로 조합하여 또는 순차적으로 사용하거나, 및/또는 다른 효모-기반의 면역치료제, 예컨대 실시예 1-3 및 5-8 중 임의의 실시예에 기술된 효모-기반의 면역치료제, 예컨대 본원에 기술된 멀티-HBV 단백질 효모-기반의 면역치료제와 조합하거나 순차적으로 사용할 수 있다. 아울러, 본 실시예에 기술된 조성물과 같이, "단일 HBV 단백질 효모 면역치료제"는, 임의의 소정의 유전자형 또는 서브-유전자형에 대한 HBV 서열을 이용하여 제조할 수 있으며, 각각 본 발명의 하나 이상의 효모-기반의 면역치료제를 포함하는 면역화/투여 전략으로 또는 본 발명의 효모-기반의 면역치료제 측면에서 제공되는, 여러가지 HBV 항원들 및 유전자형 및/또는 서브-유전자형의 "스파이스 렉"을 제공하기 위해, 임의의 한가지 이상의 부가적인 유전자형 또는 서브-유전자형의 HBV 서열들을 이용하여 부가적인 HBV 표면 항원 효모-기반의 면역치료제를 제조할 수 있다.
이러한 예로, 다음과 같은 4가지 효모-기반의 면역치료 산물들을 제조한다:
HBV 표면 항원. 사카로마이세스 세레비지애를 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 HBV 표면 단백질을 발현하도록 조작한다. 각각의 경우에, 융합 단백질은 서열번호 93으로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다: 1) 서열번호 89의 N-말단 펩타이드 (서열번호 93의 1-89번 위치); 2) 거의 전장 (위치 1번 생략) HBV 유전자형 C 대형 (L) 표면 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 11의 2-400번 위치 또는 서열번호 93의 90-488번 위치); 및 3) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 93의 489-494번 위치). 다른 구현예로, 상기 N-말단 펩타이드는 서열번호 37 또는 이의 상동체, 또는 본원에 기술된 다른 N-말단 펩타이드로 치환할 수 있다.
HBV 중합효소 항원. 사카로마이세스 세레비지애를 다음과 같은 HBV 중합효소 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작한다. 각각의 경우에, 융합 단백질은 서열번호 94로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다: 1) 서열번호 89의 N-말단 펩타이드 (서열번호 94의 1-89번 위치); 2) 역전사효소 도메인을 포함하는 HBV 유전자형 C 중합효소의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 10의 347-691번 위치 또는 서열번호 94의 90-434번 위치); 및 3) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 94의 435-440번 위치). 다른 구현예로, 상기 N-말단 펩타이드는 서열번호 37 또는 이의 상동체, 또는 본원에 기술된 다른 N-말단 펩타이드로 치환할 수 있다.
HBV 코어 항원. 사카로마이세스 세레비지애를 다음과 같은 HBV 코어 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작한다. 각각의 경우에, 융합 단백질은 서열번호 95로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다: 1) 서열번호 89의 N-말단 펩타이드 (서열번호 95의 1-89번 위치); 2) HBV 유전자형 C 코어 단백질의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치 또는 서열번호 95의 90-271번 위치); 및 3) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 95의 272-277번 위치). 다른 구현예로, 상기 N-말단 펩타이드는 서열번호 37 또는 이의 상동체, 또는 본원에 기술된 다른 N-말단 펩타이드로 치환할 수 있다.
HBV X 항원. 사카로마이세스 세레비지애를 다음과 같은 HBV X 항원을 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작한다. 각각의 경우에, 융합 단백질은 서열번호 96으로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다: 1) 서열번호 89의 N-말단 펩타이드 (서열번호 96의 1-89번 위치); 2) HBV 유전자형 C X 항원의 일부분의 아미노산 서열 (예, 서열번호 12의 2-154번 위치 또는 서열번호 96의 90-242번 위치); 및 3) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 96의 243-248번 위치). 다른 구현예로, 상기 N-말단 펩타이드는 서열번호 37 또는 이의 상동체, 또는 본원에 기술된 다른 N-말단 펩타이드로 치환할 수 있다.
이들 면역치료 조성물들을 제조하기 위해, 간략하게는 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 효모에서의 발현을 위해 코돈 최적화한 다음, EcoRI 및 NotI로 절단하여, 효모 2 um 발현 벡터내 CUP1 프로모터 (pGI-100) 또는 TEF2 프로모터 (pTK57-1)의 뒷쪽에 삽입하였다. 제조한 플라스미드를 리튬 아세테이트/폴리에틸렌 글리콜 형질감염을 통해 사카로마이세스 세레비지애 W303α 효모에 도입하였고, 1차 형질감염체들을 우라실이 결여된 고체 최소 플레이트에서 선별하였다 (UDM; 우리딘 드롭아웃 배지). 　콜로니들을 UDM 또는 ULDM (우리딘 및 루신 드롭아웃 배지)에 다시 스크리킹하여, 3일간 30℃에서 배양하였다.
플레이트에서 우리딘 결핍 액체 배지 (U2) 또는 우리딘 및 루신 결핍 액체 배지 (UL2)로 접종하여, 스타터 배양물을 30℃에서 20시간 동안 250 rpm으로 배양하였다. Bis-Tris 4.2g/L를 포함하는 pH 완충화된 배지 (BT-U2; BT-UL2)에도 접종하여, 중성 pH 조건에서 효모 생장을 평가하였다. 일차 배양물을 동일 제형의 최종 배양물에 접종하여, 1.1 내지 4.0 YU/mL의 밀도가 될 때까지 계속 배양하였다. TEF2 균주 (구성적인 발현)의 경우, 세포를 회수하고, 세척한 다음 1시간 동안 56℃에서 PBS 중에서 열에 의해 사멸시켰다. CUP1 균주 (유도성 발현)의 경우, 0.5 mM 구리 설페이트가 첨가된 동일 배지에서 30℃에서 5시간 동안 250 rpm 하에서 발현을 유도하였다. 세포를 회수하고, 세척한 다음 1시간 동안 56℃에서 PBS 중에서 열에 의해 사멸시켰다. 또한, 살아있는 세포도 비교를 위해 가공하였다.
TEF2 및 CUP1 배양물을 열에 의해 사멸시킨 후, 세포를 PBS에서 3번 세척하였다. 총 단백질 발현을 TCA 침강/니트로셀룰로스 결합 분석으로 측정하였고, 단백질 발현을 항-his 텍 단일클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 융합 단백질은 동일 웨스턴 블롯에 처리한 재조합 헥사-히스티딘 텍이 달린 NS3 단백질의 표준 곡선에서 보간법을 통해 정량하였다.
실시예 5
아래 실시예는 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염을 치료 또는 예방하기 위한 몇가지 상이한 효모-기반의 면역치료 조성물들의 제조를 기술한다.
본 실시예는 다음과 같은 한가지 이상의 목표를 달성하도록 설계된 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료제의 생산을 기술한다: (1) 필요에 따라 재조합 DNA 자문위원회 (RAC)의 지침을 준수하는 효모-기반의 면역치료적 임상 제품을 제조하기 위해, (HBV 게놈의 2/3 미만에 해당되는) 아미노산을 약 690개 미만으로 포함하는 멀티-항원 HBV 구조체 제조; (2) 급성/자기-제한성 HBV 감염 및/또는 만성 HBV 감염에 대한 면역 반응과 연관된 공지 T 세포 에피토프를 최대 수로 포함하는 멀티-항원 HBV 구조체 제조; (3) 유전자형들 간에 보존성이 가장 높은 T 세포 에피토프를 포함하는 멀티-항원 HBV 구조체의 제조; 및/또는 (4) 특정 유전자형으로부터 유래된 하나 이상의 컨센서스 서열, 컨센서스 에피토프 및/또는 에피토프(들)에 보다 비슷해지도록 변형된 멀티-항원 HBV 구조체의 제조. 본 실시예에 언급된 변형들은 본원에 기술되거나 고려되는 임의의 다른 효모-기반의 면역치료제와 개별적으로 또는 함께 적용할 수 있다.
한가지 실험으로, 상기에 명시된 목표 요건을 충족시키는 융합 단백질을 포함하는 효모를 포함하며, HBV 주요 단백질들 각각의 일부분, HBV 표면 항원, 중합효소, 코어 및 X 항원을 포함하는, 효모-기반의 면역치료 조성물을 설계하였다. 이러한 융합 단백질을 설계하기 위해, 융합체내 개별 HBV 항원들은 (전장과 비교하여) 크기를 축소시켰으며, 융합체 세그먼트들을 각각 표 5에 나타낸 것에 해당되는 공지된 T 세포 에피토프를 최대로 포함하도록 변형시켰다. 이 융합 단백질에 T 세포 에피토프의 함유는 다음과 같이 우선 순위를 매겼다:
급성/자가-제한성 HBV 감염 및 만성 HBV 감염 둘다에 대한 면역 반응에서 동정된 에피토프 > 급성/자가-제한성 HBV 감염에 대한 면역 반응에서 동정된 에피토프 > 만성 HBV 감염 둘다에 대한 면역 반응에서 동정된 에피토프.
또한, 이 융합 단백질의 각 세그먼트 설계에서 인공적인 정션(artificial junction)은 최소화하였기 때문에, 이론으로 결부시키지 않지만, 자연적 진화로, i) 잘 발현되는 바이러스내 인접 서열들; 및 ii) 적절하게 분해하여 면역 시스템에 그 서열을 제시할 수 있는, 항원 제시 세포내 면역프로테아좀(immunoproteasome)이 형성되는 것으로 생각된다. 따라서, 다수의 비천연 정션을 가진 융합 단백질은 천연 HBV 단백질 서열을 더 많이 보유하는 것에 비해 효모-기반의 면역치료제에서의 유용성이 낮을 수 있다.
융합 단백질에 사용하기 위한 HBV 표면 항원을 포함하는 세그먼트를 구축하기 위해, HBV 유전자형 C로부터 유래된 전장 대형 (L) 표면 항원 단백질을 N-말단 서열과 C-말단 서열을 잘라 크기를 줄였다 (서열번호 11로 표시되는 것과 같은 전장 L 표면 항원 단백질과 비교하여, 대형 항원의 1-119번 위치와 369-400번 위치를 제거함). 나머지 부분은, 부분적으로는, 전술한 T 세포 에피토프를 포함시키는 우선화를 이용하여, 표 5에 표시된 것에 해당되는 공지의 MHC 클래스 I T 세포 에피토프가 최대로 포함되도록, 선택하였다. 제조되는 표면 항원 세그먼트는 서열번호 97로 표시된다.
융합 단백질에 사용하기 위한 HBV 중합 효소를 포함하는 세그먼트를 구축하기 위해, HBV 유전자형들과 분리주들간에 가장 잘 보존된 단백질 영역인 (RT 도메인의) 활성부 도메인을 포함시키는데 초점을 맞추어, 아미노산 약 842개로 이루어진 매우 큰 단백질인 HBV 유전자형 C로부터 유래된 전장 중합효소의 상당한 부분들을 제거하였다. 또한, RT 도메인은 약물 내성 돌연변이가 발생하는 것으로 알려져 있는 몇몇 부위를 포함하므로, 필요에 따라 구조체의 이 부위는 타겟화된 요법의 탈출 돌연변이를 타겟팅하기 위해 다른 버전으로 추가적으로 변형시킬 수 있다. 약간의 HBV 단백질을 포함하는 융합 단백질에서, 중합효소 세그먼트의 크기는 적절한 경우 연장할 수 있다. 전술한 우선 순위 전략을 이용하여, HBV 중합효소의 선택된 부분을 포함시켜 공지의 T 세포 에피토프를 최대화하였다. 따라서, 전장 중합효소에서 제거되어진 서열들은, RT 도메인의 바깥쪽 서열과, 공지된 T 세포 에피토프를 포함하지 않거나 또는 에피토프들이 동정된 유전자형 A 환자들에서 각각 17% 또는 5% 미만으로 동정되는 2개의 에피토프를 포함하는 RT 도메인 내부 서열을 포함한다 (Desmond et al., 2008 and 표 5). HBV 중합효소 유전자형 C 세그먼트에서 나머지 T 세포 에피토프들 중 하나를 제외한 나머지 모두는 유전자형 A 분석을 통해 공개된 에피토프들과 완벽하게 일치되었으며, 아미노산 1개에 미스매치가 있는 하나의 에피토프는 공개된 에피토프와 일치되도록 변형시켰다. 제조되는 HBV 중합효소 항원 세그먼트는 서열번호 98로 표시된다.
융합 단백질에 사용하기 위한 HBV 코어 항원을 포함하는 세그먼트를 구축하기 위해, HBV 유전자형 C로부터 유래된 전장 코어 단백질 (예, 서열번호 9의 31-212번 위치와 유사함)을 다음과 같이 변형시켰다: i) 유전자형 C-유래 단백질의 T 세포 에피토프내 하나의 아미노산을 표 5에 기술된 공지의 T 세포 에피토프와 완전히 일치되도록 변형시킴; ii) T 세포 에피토프를 포함하지 않는 N-말단의 아미노산 7개는 제거하고, 단백질에서 첫번째 공지의 T 세포 에피토프의 일부 N-말단 측면 아미노산들은 유지시킴; 및 iii) 코어의 C-말단의 24개의 아미노산을 제거함, 이로써 알려진 에피토프들은 제거되지 않고, 비정상적으로 양으로 하전된 C-말단이 제거됨. 양으로 하전된 C-말단은, 그러한 서열이 일부 구조체들에서는 대게 아르기닌 다량 포함하는 (양으로 하전됨) 효모의 천연 RNA 결합 단백질과 경쟁적으로 간섭함으로써 효모에 유해할 수 있으므로, 효모에서 발현시킬 항원에서 제거하기 좋은 후보서열이다. 따라서, 코어에서 이 부분의 제거는 허용가능하다. 제조되는 HBV 코어 항원 세그먼트는 서열번호 99로 표시된다.
융합 단백질에 사용하기 위한 HBV X 항원을 포함하는 세그먼트를 구축하기 위해, HBV 유전자형 C로부터 유래된 전장 X 항원 (예, 서열번호 12와 유사함)에서 N-말단과 C-말단을 잘라, X 한원에 군집되어 있는 표 5의 공지된 T 세포 에피토프들 대부분을 포함하는 X 항원의 세그먼트를 제조하였다. 에피토프들 중 2종은 단일 아미노산 변화를 가하여 공개된 T 세포 에피토프 서열들과 일치시켰으며, 세그먼트 양 말단의 T 세포 에피토프 측면 서열들은 항원 제시 세포에 의한 효율적인 가공 및 제시를 용이하게 하기 위해 유지시켰다. 제조되는 HBV X 항원 세그먼트는 서열번호 100으로 표시된다.
모두 4개의 HBV 단백질 세그먼트를 포함하는 완전한 융합 단백질을 구축하기 위해, 전술한 HBV 세그먼트 4개를 연결하여 (표면 항원-중합효소-코어-X), HBV 게놈에 의해 코딩되는 모든 단백질들에 걸쳐있는 T 세포 에피토프를 최대로 포함하도록 최적화되고 기대되는 임상적인 용도를 위한 바이러스 단백질 기준을 만족시킬 것으로 예상되는, 단일 단백질을 만들었다.
효모에서 융합 단백질의 발현을 강화 및/또는 안정시키기 위해, 각각 다른 N-말단 펩타이드를 첨가하여, 서로 다른 2종의 융합 단백질을 최종적으로 만들었다. 아울러, 단백질의 동정을 돕기 위해 C-말단에 헥사히스티딘 펩타이드를 포함시켰다. 본원에 기술된 효모-기반의 면역치료 조성물에 사용되는 다른 단백질들 모두에서와 같이, 부가적인 구조체에서는, 본 실시예에서 사용한 서열번호 37 또는 서열번호 89의 N-말단 펩타이드를, 본 명세서에 상세히 기술된 바와 같이, 서열번호 37의 동일한 기본적인 구조 요건들을 충족시키는 다른 합성 N-말단 펩타이드 (예, 서열번호 37의 상동체)로 치환하거나, 또는 서열번호 89 또는 서열번호 90의 N-말단 펩타이드로 치환할 수 있으며, 다른 구조체의 경우에는, N-말단 펩타이드를 생략하고, 1번 위치에 메티오닌을 포함시킨다. 아울러, 적절한 경우, 융합 단백질의 세그먼트들 사이에 1, 2 또는 3개 이상의 아미노산으로 구성된 링커 서열을 첨가할 수 있다. 또한, 이들 구조체들은 벡본으로서 유전자형 C로부터 유래된 HBV 단백질들을 이용하여 설계되었지만, 실시예 7에서 예시된 바와 같이, 임의의 다른 HBV 유전자형, 서브-유전자형 또는 다른 균주나 분리주로부터 유래된 HBV 단백질들을 사용하여 이들 단백질 세그먼트들을 설계할 수 있다. 마지막으로, 전술한 바와 같이 융합 단백질에서 하나 이상의 세그먼트를 배제하는 경우, 남아있는 세그먼트들의 서열들은 단백질의 측면 영역과 추가적인 T 세포 에피토프를 포함하도록 연장될 수 있다 (예, 실시예 8 참조).
전술한 HBV 세그먼트들로 구축된 융합 단백질을 포함하는 효모-기반의 면역치료 조성물을 제조하기 위해, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 전술한 바와 같이 최적화한 다양한 HBV 표면-중합효소-코어-X 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작한다.
제1의 구조체의 경우, 융합 단백질은 서열번호 101로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다: (1) 서열번호 89로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위한, 알파 팩터 프리프로 서열인, N-말단 펩타이드 (서열번호 101의 1-89번 위치); (2) 서열번호 97로 표시되는, HBV 대형 (L) 표면 항원의 최적화된 영역 (서열번호 101의 90-338번 위치); (3) 서열번호 98로 표시되는, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역 (서열번호 101의 339-566번 위치); (4) 서열번호 99로 표시되는, HBV 코어 단백질의 최적화된 영역 (서열번호 101의 567-718번 위치); (5) 서열번호 100으로 표시되는, HBV X 항원의 최적화된 영역 (서열번호 101의 719-778번 위치); 및 (6) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 101의 779-784번 위치).
제2의 구조체의 경우, 융합 단백질은 서열번호 102로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다: (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, N-말단 펩타이드 (서열번호 102의 1-6번 위치); (2) 서열번호 97의 2-248번 위치로 표시되는, HBV 대형 (L) 표면 항원의 최적화된 영역 (서열번호 102의 7-254번 위치); (3) 서열번호 98로 표시되는, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역 (서열번호 102의 255-482번 위치); (4) 서열번호 99로 표시되는, HBV 코어 단백질의 최적화된 영역 (서열번호 102의 483-634번 위치); (5) 서열번호 100으로 표시되는, HBV X 항원의 최적화된 영역(서열번호 102의 635-694번 위치); 및 (6) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 102의 695-700번 위치).
이들 융합 단백질을 포함하는 효모-기반의 면역치료 조성물들은 실시예 1-4에 상세히 기술된 동일한 프로토콜을 이용하여 제조하였다.
실시예 6
하기 실시예는, 다수의 개체 또는 개체 집단을 치료할 수 있는 잠재력을 지닌 단일 조성물을 제공하기 위해, 단일 조성물에 보존된 항원 및/또는 에피토프 함유와 더불어, HBV 유전자형 및/또는 서브-유전자형에 대한 타겟팅을 극대화하는, 추가적인 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물의 제조를 기술한다.
동일한 효모-기반의 면역치료제에 복수의 여러가지 유전자형들을 포함하는 구조체를 제조하기 위해, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 HBV 융합 단백질을 발현하도록 조작한다. 상기 단백질은, 각각이 다른 유전자형 (HBV 유전자형 A, B, C 및 D)으로부터 유래된, 서열번호 105로 표시되는 코어 항원 4종을 포함하는 단일 폴리펩타이드이다: 1) 서열번호 105의 1번 위치에, N-말단 메티오닌; 2) HBV 유전자형 A 유래 거의 전장 코어 단백질의 아미노산 서열(예, 서열번호 1의 31-212번 위치 또는 서열번호 105의 2-183번 위치); 3) HBV 유전자형 B 유래 거의 전장 코어 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 5의 30-212번 위치 또는 서열번호 105의 184-395번 위치); 4) HBV 유전자형 C 유래 거의 전장 코어 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 9의 30-212번 위치 또는 서열번호 105의 396-578번 위치); 5) HBV 유전자형 D 유래 거의 전장 코어 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 13의 30-212번 위치 또는 서열번호 105의 579-761번 위치); 및 5) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 105의 762-767번 위치). 상기 서열은, 또한, 상기 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 1번 위치의 N-말단 메티오닌은 서열번호 37 또는 이의 상동체, 또는 서열번호 89 또는 서열번호 90의 알파 프리프로 서열 또는 이의 상동체, 또는 적절한 경우 임의의 다른 적합한 N-말단 서열로 치환될 수 있다. 아울러, 필요에 따라 구조체의 클로닝 및 조작을 용이하게 하기 위해 HBV 단백질들 사이에 링커 서열을 삽입할 수 있다. 이러한 설계에, 필요에 따라, 임의의 다른 HBV 유전자형 및/또는 서브-유전자형드의 조합으로 치환하여, 임상적인 적용 범위가 넓고 제조 설계가 효율적인 단일 항원 효모-기반의 HBV 면역치료 산물을 구축할 수 있으므로, 상기한 구조체는 예시적인 구조체일 뿐이다. 또한, 서열번호 105의 아미노산 서열은 공지된 T 세포 에피토프 수개와, 예를 들어 표 5에 나타낸 에피토프와 서열 비교함으로써 식별할 수 있는, 소정의 에피토프에 대한 공개된 서열과 일치하도록 변형시킨 특정 에피토프를 포함한다.
동일한 효모-기반의 면역치료제에 2 이상의 HBV 항원과 2 이상의 유전자형을 포함하는 구조체를 제작하기 위해, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 HBV 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1 또는 TEF2 프로모터 등의 적합한 프로모터의 통제 하에 발현하도록 조작한다. 상기 단백질은, 쌍의 각 한쪽이 다른 유전자형(HBV 유전자형 A 및 C)으로부터 유래되는, 코어 항원 2개와 X 항원 2개를 포함하는, 서열번호 106으로 표시되는, 단일 폴리펩타이드이다: 1) 서열번호 106의 1번 위치에 N-말단 메티오닌; 2) HBV 유전자형 A 유래 거의 전장 코어 단백질의 아미노산 서열(예, 서열번호 1의 31-212번 위치 또는 서열번호 106의 2-183번 위치); 3) HBV 유전자형 A 유래 전장 X 항원의 아미노산 서열 (예, 열번호 4 또는 서열번호 106의 184-337번 위치); 4) HBV 유전자형 C 유래 거의 전장 코어 단백질의 아미노산 서열 (예, 서열번호 9의 30-212번 위치 또는 서열번호 106의 338-520번 위치); 5) HBV 유전자형 C 유래 전장 X 항원의 아미노산 서열 (예, 서열번호 8 또는 서열번호 106의 521-674번 위치); 및 5) 헥사히스티딘 텍 (예, 서열번호 106의 675-680번 위치). 상기 서열은, 또한, 상기 융합 단백질의 면역원성을 강화하는 것으로 생각되는 에피토프 또는 도메인들을 포함한다. 1번 위치의 N-말단 메티오닌은 서열번호 37 또는 이의 상동체, 또는 서열번호 89 또는 서열번호 90의 알파 프리프로 서열 또는 이의 상동체, 또는 적절한 경우 임의의 다른 적합한 N-말단 서열로 치환될 수 있다. 또한, 서열번호 106의 아미노산 서열은 몇가지 공지된 T 세포 에피토프들을 포함하며, 특정 에피토프를 표 5에 나타낸 에피토프들에 대한 서열 비교를 통해 확인할 수 있는, 소정의 에피토프에 대해 공개된 서열과 일치되도록 변형시켰다.
이들 융합 단백질을 포함하는 효모-기반의 면역치료 조성물들은 실시예 1-4에 상세히 기술된 동일한 프로토콜을 이용하여 제조하였다.
실시예 7
하기 실시예는, 다수의 개체 또는 개체 집단을 치료할 수 있는 잠재력을 지닌 단일 조성물을 제공하기 위해, 보존된 항원 및/또는 에피토프 함유와 더불어, HBV 유전자형들에 대한 컨센서스 서열을 이용하는, 추가적인 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물의 제조를 기술한다.
표면 항원, 코어, 중합효소 및 X 항원 각각으로부터 유래된 HBV 세그먼트들을 포함하는 몇가지 구조체를 설계하기 위해, 서열번호 101 및 서열번호 102에 대한 실시예 5에 기술된 융합 단백질 구조 (및 따라서 서열번호 97 (표면 항원), 서열번호 98 (중합효소), 서열번호 99 (코어 항원) 및 서열번호 100 (X 항원)으로 표시되는, 상기 융합 단백질의 서브파트)를 주형으로 사용하였다. HBV 서열들에 대한 복수의 소스로부터 구축한 HBV 유전자형 A, B, C 및 D 각각의 컨센서스 서열을 참조하여 (예, Yu and Yuan et al, 2010, S, 코어 및 X의 경우, 컨센서스 서열은 322 HBV 서열로부터 수득하였고, Pol (RT)은 스탠포드 대학 HIV 약물 내성 데이타베이스, HBVseq 및 HBV Site Release Notes로부터 수득하였음), 주형 구조체의 서열을, 공지된 급성 자가-제한성 T 세포 에피토프들 중 컨센서스 서열 변이된 것 또는 공지된 중합효소 탈출 돌연변이 사이트들 중 컨센서스 서열 변이된 것을 사용하지 않는 한, 동일 위치에 해당되는 컨센서스 서열로 치환하였으며, 이 경우 이들 위치들은 이들 에피토프 또는 돌연변이 사이트에 대한 공개된 서열을 따른다. 부가적인 항원은 오직 컨센서스 서열을 기초로 구축하거나 또는 알려지게 됨에 따라 다른 공개된 에피토프를 이용하여 구축할 수 있다.
HBV 유전자형 A의 컨센서스 서열을 토대로 한 제1 구조체를 다음과 같이 설계하였다. 융합 세그먼트들의 크기를 (전장에 비해) 줄이고, 표 5에서 확인되는 바에 해당되는 공지된 T 세포 에피토프를 최대로 포함시키고 5 (우선 순위는 상기와 같음), 인공 정션을 최소화하도록 설계된 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 및 서열번호 100을 이용하여, HBV 유전자형 A의 컨센서스 서열을 토대로 새로운 융합 세그먼트들을 제작하였다. 새로운 표면 항원 세그먼트는 서열번호 107의 1-249번 위치로 표시된다. 새로운 중합효소 (RT) 세그먼트는 서열번호 107의 250-477번 위치로 표시된다. 새로운 코어 세그먼트는 서열번호 107의 478-629번 위치로 표시된다. 새로운 X 항원 세그먼트는 서열번호 107의 630-689번 위치로 표시된다. 이 완성된 융합 단백질은 서열번호 107로 표시되는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다 (비-HBV 서열은 서열번호 107의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 107의 1-249번 위치로 표시되는, HBV 대형 (L) 표면 항원의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 A에 대한 컨센서스 서열임; (4) 서열번호 107의 250-477번 위치로 표시되는, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 A에 대한 컨센서스 서열임; (5) 서열번호 107의 478-629번 위치로 표시되는, HBV 코어 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 A에 대한 컨센서스 서열임; (6) 서열번호 107의 630-689번 위치로 표시되는, HBV X 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 A에 대한 컨센서스 서열임; 및 (7) 선택적인 헥사히스티딘 텍 (히스티딘 잔기 6개는 서열번호 107의 689번 위치 다음에 위치함). 상기한 완전한 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물을 본원에서는 GI-13010으로도 지칭한다. 융합 단백질과 대응되는 효모-기반의 면역치료제를 본원에서는 "SPEXv2-A" 또는 "Spex-A"로도 지칭한다.
HBV 유전자형 B의 컨센서스 서열을 토대로 한 제2 구조체를 다음과 같이 설계하였다. 융합 세그먼트들의 크기를 (전장에 비해) 줄이고장), 표 5에서 확인되는 바에 해당되는 공지된 T 세포 에피토프를 최대로 포함시키고 (우선 순위는 상기와 같음), 인공 정션을 최소화하도록 설계된 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 및 서열번호 100을 이용하여, HBV 유전자형 B의 컨센서스 서열을 토대로 새로운 융합 세그먼트들을 제작하였다. 새로운 표면 항원 세그먼트는 서열번호 108의 1-249번 위치로 표시된다. 새로운 중합효소 (RT) 세그먼트는 서열번호 108의 250-477번 위치로 표시된다. 새로운 코어 세그먼트는 서열번호 108의 478-629번 위치로 표시된다. 새로운 X 항원 세그먼트는 서열번호 108의 630-689번 위치로 표시된다. 이 융합 단백질은 서열번호 108로 표시되는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다 ("선택적인" 것으로 표시된 비-HBV 서열은 서열번호 108의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 108의 1-249번 위치로 표시되는, HBV 대형 (L) 표면 항원의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 B에 대한 컨센서스 서열임; (4) 서열번호 108의 250-477번 위치로 표시되는, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 B에 대한 컨센서스 서열임; (5) 서열번호 108의 478-629번 위치로 표시되는, HBV 코어 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 B에 대한 컨센서스 서열임; (6) 서열번호 108의 630-689번 위치로 표시되는, HBV X 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 B에 대한 컨센서스 서열임; 및 (7) 선택적인 헥사히스티딘 텍. 이 완성된 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 또한 본원에서 GI-13011로 지칭된다. 상기 융합 단백질과 대응되는 효모-기반의 면역치료 조성물은 또한 본원에서 "SPEXv2-B" 또는 "Spex-B"로 지칭된다.
HBV 유전자형 C의 컨센서스 서열을 토대로 한 제3 구조체를 다음과 같이 설계하였다. 융합 세그먼트들의 크기를 (전장에 비해) 줄이고, 표 5에서 확인되는 바에 해당되는 공지된 T 세포 에피토프를 최대로 포함시키고 (우선 순위는 상기와 같음), 인공 정션을 최소화하도록 설계된 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 및 서열번호 100을 이용하여, HBV 유전자형 C의 컨센서스 서열을 토대로 새로운 융합 세그먼트들을 제작하였다. 새로운 표면 항원 세그먼트는 서열번호 109의 1-249번 위치로 표시된다. 새로운 중합효소 (RT) 세그먼트는 서열번호 109의 250-477번 위치로 표시된다. 새로운 코어 세그먼트는 서열번호 109의 478-629번 위치로 표시된다. 새로운 X 항원 세그먼트는 서열번호 109의 630-689번 위치로 표시된다. 이 융합 단백질은 서열번호 109로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다 ("선택적인" 것으로 표시된 비-HBV 서열은 서열번호 109의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 109의 1-249번 위치로 표시되는, HBV 대형 (L) 표면 항원의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 C에 대한 컨센서스 서열임; (4) 서열번호 109의 250-477번 위치로 표시되는, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 C에 대한 컨센서스 서열임; (5) 서열번호 109의 478-629번 위치로 표시되는, HBV 코어 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 C에 대한 컨센서스 서열임; (6) 서열번호 109의 630-689번 위치로 표시되는, HBV X 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 C에 대한 컨센서스 서열임; 및 (7) 선택적인 헥사히스티딘 텍. 이 완성된 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 또한 본원에서 GI-13012로 지칭된다. 상기 융합 단백질과 대응되는 효모-기반의 면역치료 조성물은 또한 본원에서 "SPEXv2-C" 또는 "Spex-C"로 지칭된다.
HBV 유전자형 D의 컨센서스 서열을 토대로 한 제4 구조체를 다음과 같이 설계하였다. 융합 세그먼트들의 크기를 (전장에 비해) 줄이고, 표 5에서 확인되는 바에 해당되는 공지된 T 세포 에피토프를 최대로 포함시키고 (우선 순위는 상기와 같음), 인공 정션을 최소화하도록 설계된 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 및 서열번호 100을 이용하여, HBV 유전자형 D의 컨센서스 서열을 토대로 새로운 융합 세그먼트들을 제작하였다. 새로운 표면 항원 세그먼트는 서열번호 110의 1-249번 위치로 표시된다. 새로운 중합효소 (RT) 세그먼트는 서열번호 110의 250-477번 위치로 표시된다. 새로운 코어 세그먼트는 서열번호 110의 478-629번 위치로 표시된다. 새로운 X 항원 세그먼트는 서열번호 110의 630-689번 위치로 표시된다. 이 융합 단백질은 서열번호 110으로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다 ("선택적인" 것으로 표시된 비-HBV 서열은 서열번호 110의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 110의 1-249번 위치로 표시되는, HBV 대형 (L) 표면 항원의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열임; (4) 서열번호 110의 250-477번 위치로 표시되는, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열임; (5) 서열번호 110의 478-629번 위치로 표시되는, HBV 코어 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열임; (6) 서열번호 110의 630-689번 위치로 표시되는, HBV X 단백질의 최적화된 영역, 이는 전술한 설계 전략을 이용한 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열임; 및 (7) 선택적인 헥사히스티딘 텍. 이 완성된 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 또한 본원에서 GI-13013으로 지칭된다. 서열번호 37의 N-말단 펩타이드가 서열번호 89의 알파 팩터 서열로 치환된 것을 제외하고는, 비슷한 융합 단백질 (서열번호 110 포함)을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 본원에서 GI-13014로 지칭된다. 상기 융합 단백질과 대응되는 효모-기반의 면역치료 조성물은 또한 본원에서 "SPEXv2-D", "Spex-D" 또는 "M-SPEXv2-D" (GI-13013의 경우), 또는 "a-SPEXv2-D" (GI-13014의 경우)로 지칭된다.
전술한 융합 단백질 (서열번호 107-110)에서 행해진 바와 유사한 변형이 HBV 표면 단백질과 HBV 코어 단백질을 포함하는 서열번호 34로 표시되는 단백질 등의 다른 HBV 융합 단백질에 행해지는 방법을 기술하기 위해, 효모-기반의 면역치료제에 사용하기 위한 추가적인 HBV 융합 단백질을 4종의 HBV 유전자형들에 대한 컨센서스 서열을 적용하여 설계하였다. 이들 추가적인 HBV 항원과 대응되는 효모-기반의 면역치료 조성물을 설계하기 위해, 서열번호 34에 대한 전술한 융합 단백질 구조 (따라서, 이들 융합 단백질의 서브파트 (표면 항원 및 코어))를 주형으로 사용하였다. 전술한 구조체에 대한 전술한 바와 같이, HBV 유전자형 A, B, C 및 D 각각의 컨센서스 서열을 HBV 서열들의 복수 소스로부터 구축하였으며 (예, S 및 코어의 경우, Yu and Yuan et al, 2010), 주형 구조체의 서열을, 공지된 급성 자가-제한성 T 세포 에피토프들 중 컨센서스 서열 변이된 것 또는 공지된 중합효소 탈출 돌연변이 사이트들 중 컨센서스 서열 변이된 것을 사용하지 않는 한, 동일 위치에 해당되는 컨센서스 서열로 치환하였으며, 이 경우 이들 위치들은 이들 에피토프 또는 돌연변이 사이트에 대한 공개된 서열을 따랐다.
HBV 유전자형 A의 컨센서스 서열을 토대로 한 제1 구조체를 다음과 같이 설계하였다. 주형으로서 서열번호 34를 사용하여, 서열번호 112로 표시되는, HBV 유전자형 A에 대한 컨센서스 서열을 토대로 새로운 융합 단백질을 제작하였다. 이 융합 단백질은 서열번호 112로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다 ("선택적인" 것으로 표시된 비-HBV 서열은 서열번호 112의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 112의 1-399번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 A 대형 (L) 표면 항원에 대한 컨센서스 서열; 4) 서열번호 112의 400-581번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 A 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열; 및 (5) 선택적인 헥사히스티딘 텍. 서열번호 112를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 111로 표시된다. 이 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 본원에서 또한 GI-13006으로 지칭된다. 상기 융합 단백질과 대응되는 효모-기반의 면역치료 조성물은 또한 본원에서 "Score-A"로 지칭된다.
HBV 유전자형 B의 컨센서스 서열을 토대로 한 제2 구조체를 다음과 같이 설계하였다. 주형으로서 서열번호 34를 사용하여, 서열번호 114로 표시되는, HBV 유전자형 B에 대한 컨센서스 서열을 토대로 새로운 융합 단백질을 제작하였다. 이 융합 단백질은 서열번호 114로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다 ("선택적인" 것으로 표시된 비-HBV 서열은 서열번호 114의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 114의 1-399번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 B 대형 (L) 표면 항원에 대한 컨센서스 서열; 4) 서열번호 114의 400-581번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 B 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열; 및 (5) 선택적인 헥사히스티딘 텍. 서열번호 114를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 113으로 표시된다. 이 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 본원에서 또한 GI-13007로 지칭된다. 상기 융합 단백질과 대응되는 효모-기반의 면역치료 조성물은 또한 본원에서 "Score-B"로 지칭된다.
HBV 유전자형 C의 컨센서스 서열을 토대로 한 제3 구조체를 다음과 같이 설계하였다. 주형으로서 서열번호 34를 사용하여, 서열번호 116으로 표시되는, HBV 유전자형 C에 대한 컨센서스 서열을 토대로 새로운 융합 단백질을 제작하였다. 이 융합 단백질은 서열번호 116으로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다 ("선택적인" 것으로 표시된 비-HBV 서열은 서열번호 116의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 116의 1-399번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 C 대형 (L) 표면 항원에 대한 컨센서스 서열; 4) 서열번호 116의 400-581번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 C 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열; 및 (5) 선택적인 헥사히스티딘 텍. 서열번호 116을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 115로 표시된다. 이 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 본원에서 또한 GI-13008로 지칭된다. 상기 융합 단백질과 대응되는 효모-기반의 면역치료 조성물은 또한 본원에서 "Score-C"로 지칭된다.
HBV 유전자형 D의 컨센서스 서열을 토대로 한 제4 구조체를 다음과 같이 설계하였다. 주형으로서 서열번호 34를 사용하여, 서열번호 118로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 토대로 새로운 융합 단백질을 제작하였다. 이 융합 단백질은 서열번호 118로 표시되는 N-에서 C-말단 방향으로 하기 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드이다 ("선택적인" 것으로 표시된 비-HBV 서열은 서열번호 118의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 118의 1-399번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 컨센서스 서열; 4) 서열번호 118의 400-581번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열; 및 (5) 선택적인 헥사히스티딘 텍. 서열번호 118, N- 및 C-말단 펩타이드 및 링커 펩타이드를 포함하는 전체 융합 단백질의 아미노산 서열은 본원에서 서열번호 151로 표시된다. 서열번호 118 또는 서열번호 151를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 117로 표시된다. 이 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물은 본원에서 또한 GI-13009로 지칭된다. 상기 융합 단백질과 해당되는 효모-기반의 면역치료제는 본원에서 또한 "Score-D"로 지칭된다.
GI-13010 (서열번호 107 포함), GI-13011 (서열번호 108 포함), GI-13012 (서열번호 109 포함), GI-13013 (서열번호 110 포함), GI-13006 (서열번호 112 포함), GI-13007 (서열번호 114 포함), GI-13008 (서열번호 116 포함) 및 GI-13009 (서열번호 118 포함)의 효모-기반의 면역치료 조성물들을 상기 다른 조성물들에 대해 기술된 바와 같이 생산하였다. 간략하게는, 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 효모 발현용으로 코돈 최적화한 다음, 효모 2 um 발현 벡터내 CUP1 프로모터 (pGI-100)의 뒷쪽에 삽입하였다. 제조한 플라스미드를 리튬 아세테이트/폴리에틸렌 글리콜 형질감염을 통해 사카로마이세스 세레비지애 W303α 효모에 도입하였다. 각 플라스미드에 대한 형질감염체들을 우라실이 결여된 고체 최소 플레이트에서 분리하였다 (UDM; 우리딘 드롭아웃 배지). 　콜로니들을 ULDM (우리딘 및 루신 드롭아웃 배지)에 다시 스크리킹하여, 3일간 30℃에서 배양하였다. 플레이트로부터 우리딘 및 루신이 결핍된 액체 스타터 배지 (UL2; 실시예 1에 제시된 제형)로 접종하여, 스타터 배양물을 30℃에서 18시간 동안 250 rpm으로 배양하였다. 일차 배양물을 UL2의 최종 배양물에 접종하여, 2 YU/mL의 밀도가 될 때까지 계속 배양하였다. 배양물을 3시간 동안 0.5 mM 구리 설페이트로 유도한 다음, 세포를 PBS 중에서 세척하고, 1시간 56℃에서 열-불활성화한 후, PBS에서 3번 세척하였다. 총 단백질 함량을 TCA 침강/니트로셀룰로스 결합 분석으로 측정하였고, HBV 항원 발현을 항-his 텍 단일클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 측정하였다.
그 결과들은 도 20에 나타낸다. 도 20에서 블롯 레인들은 다음과 같은 효모-기반의 면역치료제로부터 유래된 단백질을 포함한다: 1번 레인 (v1.0; Score) = GI-13002 (서열번호 34를 발현함); 2번 레인 (v2.0; ScA) = GI-13006 (서열번호 112를 발현함); 3번 레인 (v2.0; ScB) = GI-13007 (서열번호 114를 발현함); 4번 레인 (v2.0; ScC) = GI-13008 (서열번호 116을 발현함); 5번 레인 (v2.0; ScD) = GI-13009 (서열번호 118을 발현함); 6번 레인 (v1.0; Sp) = GI-13005 (서열번호 36을 발현함); 7번 레인 (v1.0; a-Sp) = GI-13004 (서열번호 92를 발현함); 8번 레인 (v2.0; SpA) = GI-13010 (서열번호 107을 발현함); 9번 레인 (v2.0; SpB) = GI-13011 (서열번호 108을 발현함); 10번 레인 (v2.0; SpC) = GI-13012 (서열번호 109를 발현함); 11번 레인 (v2.0; SpD) = GI-13013 (서열번호 110을 발현함).
결과들은, 표면 항원과 코어의 조합을 포함하는 각각의 HBV 항원 ("Score" 항원), 즉, GI-13002 (Score), GI-13006 (ScA; Score-A), GI-13007 (ScB; Score-B), GI-13008 (ScC; Score-C) 및 GI-13009 (ScD; Score-D)가 효모에서 강하게 발현됨을 보여준다. 이들 실험과 유사 실험들에서 전형적인 Score v2.0 발현 수준은 대략 90 내지 140 pmol/YU (즉, 5940 ng/YU 내지 9240 ng/YU)의 범위였다. 4종의 HBV 단백질들 (표면, 중합효소, 코어 및 X, 또는 "Spex")을 모두 포함하는 HBV 항원의 발현 수준은 가변적이었다. 구체적으로, GI-13010 (SpA; Spex-A), GI-13011 (SpB; Spex-B), GI-13012 (SpC; Spex-D) 및 GI-13013 (SpD; Spex-D) 유래 항원들의 발현은 GI-13005 (Sp; Spex) 및 GI-13004 (a-Sp; a-Spex) 유래 항원 뿐만 아니라 "Score" 항원의 발현 보다 상당히 낮았다. GI-13012 (SpC; Spex-C)에서의 항원 발현은 거의 검출되지 않았다. 종합해 보면, 이들 결과는, 표면 항원과 코어를 포함하는 HBV 항원들이 그룹으로서 효모에서 매우 잘 발현되는 반면, 표면 항원, 중합효소, 코어 및 X 모두를 포함하는 HBV 항원들은 효모에서의 발현이 가변적이며, 일반적으로 "Score" 항원들 보다 잘 발현되지 않음을, 보여준다.
실시예 8
아래 실시예는 HBV 유전자형들에 대한 컨센서스 서열을 이용하는 추가적인 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물의 제조에 대해 기술하며, HBV 항원의 면역원성 또는 다른 기능적 속성을 개선 또는 변형시키거나 및/또는 효모에서 HBV 항원의 발현을 변형 또는 개선시키기 위해, 융합 단백질내 HBV 단백질 세그먼트들의 대안적인 배치/배열의 사용을 추가로 기술한다.
본 실시예에서, 코어에 표면 항원이 융합된 조합물의 N-말단 또는 C-말단에 X 항원 및/또는 중합효소 항원을 첨부한 새로운 융합 단백질을 설계하였다. 본원에서 일반적으로 "Score"로 지칭되는 배치로 정렬된 융합 단백질들 (예, 서열번호 34, 서열번호 112, 서열번호 114, 서열번호 116 및 서열번호 118)이 효모에서 매우 원활하게 발현되기 때문에, 추가적인 HBV 단백질 성분들을 포함하는 HBV 항원을 제조하기 위해 이러한 기본 배치 (즉, 표면 항원이 코어 단백질에 융합된 형태)를 활용하는 것이 유익할 수 있다는 논리적인 근거를 부분으로 기초로 하여, 이들 구조체들을 설계하였다. 이러한 전략들은 면역요법 측면에서 상기한 항원들의 기능성을 개선 또는 변형시키거나 및/또는 멀티-단백질 항원들의 발현을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 이론으로 결부시키지 않지만, 본 발명자들은, 베이스로서 표면-코어를 (순서대로) 구축한 다음, 이 구조체에 다른 항원들을 첨가함으로써, HBV 단백질 3종 또는 4종 모두를 이용한 HBV 항원의 발현을 개선시킬 수 있음을 제안하였다.
이에, 본 발명의 본 구현예를 예시하기 위해, 새로운 융합 단백질 8종을 설계 및 구축하여, 이들 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 산물들을 생산하였다. 각 경우에, 융합 단백질은, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용하고 보존된 면역학적 에피토프들의 사용을 극대화하도록 최적화된 실시예 7에 기술된 표면-코어 융합 단백질인, 서열번호 118로 표시되는 융합 단백질들의 세그먼트들로부터 유래된, 표면-코어 융합 단백질을 베이스로서 이용하였다. 단백질 크기를 줄이고, 보존된 면역학적 에피토프의 사용을 최대화하고, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용하도록 구축된, 실시예 7에 기술된 멀티-단백질 HBV 융합 단백질인, 서열번호 110으로 표시되는 융합 단백질 유래의 세그먼트들을 활용하여, 이 베이스 배열에, 중합효소 세그먼트 및/또는 X 항원 세그먼트의 모든 가능한 배열들을 추가하였다. 이들 제조한 항원 8종은 HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 토대로 하지만, 서열번호 107 및/또는 서열번호 112 (유전자형 A), 서열번호 108 및/또는 서열번호 114 (유전자형 B), 서열번호 109 및/또는 서열번호 116 (유전자형 C)으로 표시되는 융합 단백질들로부터 유래된 해당 융합 세그먼트들을 이용하거나 또는 다른 HBV 유전자형, 서브-유전자형, 컨센서스 서열 또는 균주로부터 유래된 대응되는 서열들을 이용하여, 전체 구조가 비슷한 융합 단백질을 제조하는 것은 간단할 것이다.
제1 조성물을 제조하기 위해, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 도 8에 개략적으로 도시된 새로운 HBV 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1의 통제 하에 발현하도록 조작하였다. 제조한 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 GI-13015로 지칭될 수 있다. 본원에서 또한 "Score-Pol"로도 지칭되며 서열번호 120로 표시되는 이 융합 단백질은, 순차적으로 표면 항원, 코어 단백질 및 중합효소 서열을, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음과 같은 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드로서, 포함한다 ("선택적인" 것으로 표시된 비-HBV 서열은 서열번호 120의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 120의 1-399번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); (4) 서열번호 120의 400-581번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); (5) 서열번호 120의 582-809번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역 (서열번호 110의 250-477번 위치에 해당됨); 및 (6) 선택적인 헥사히스티딘 텍. 서열번호 120는 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 120의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 119로 표시된다.
제2 조성물을 제조하기 위해, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 도 9에 개략적으로 도시된 새로운 HBV 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1의 통제 하에 발현하도록 조작하였다. 제조한 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 GI-13016으로 지칭될 수 있다. 본원에서 또한 "Score-X"로도 지칭되며 서열번호 122로 표시되는 이 융합 단백질은, 순차적으로 표면 항원, 코어 및 X 항원 서열을, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음과 같은 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드로서, 포함한다 ("선택적인" 것으로 표시된 비-HBV 서열은 서열번호 122의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 122의 1-399번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); 4) 서열번호 122의 400-581번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); (5) 서열번호 122의 582-641번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV X 항원의 최적화된 영역 (서열번호 110의 630-689번 위치에 해당됨); 및 (6) 선택적인 헥사히스티딘 텍. 서열번호 122는 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 122를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 121로 표시된다.
제3 조성물을 제조하기 위해, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 도 10에 개략적으로 도시된 새로운 HBV 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1의 통제 하에 발현하도록 조작하였다. 제조한 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 GI-13017로 지칭될 수 있다. 본원에서 또한 "Score-Pol-X"로도 지칭되며 서열번호 124로 표시되는 이 융합 단백질은, 순차적으로 표면 항원, 코어, 중합효소 및 X 항원 서열을, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음과 같은 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드로서, 포함한다 ("선택적인" 것으로 표시된 비-HBV 서열은 서열번호 124의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 124의 1-399번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); 4) 서열번호 124의 400-581번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); (5) 서열번호 124의 582-809번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 (서열번호 110의 250-477번 위치에 해당됨); (6) 서열번호 124의 810-869번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV X 항원의 최적화된 영역 (서열번호 110의 630-689번 위치에 해당됨); 및 (7) 선택적인 헥사히스티딘 텍. 서열번호 124는 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 124를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 123으로 표시된다.
제4 조성물을 제조하기 위해, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 도 11에 개략적으로 도시된 새로운 HBV 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1의 통제 하에 발현하도록 조작하였다. 제조한 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 GI-13018로 지칭될 수 있다. 본원에서 또한 "Score-X-Pol"로도 지칭되며 서열번호 126으로 표시되는 이 융합 단백질은, 순차적으로 표면 항원, 코어, X 항원 및 중합효소 서열, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음과 같은 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드로서, 포함한다 ("선택적인" 것으로 표시된 비-HBV 서열은 서열번호 126의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 126의 1-399번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); 4) 서열번호 126의 400-581번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); (5) 서열번호 126의 582-641번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV X 항원의 최적화된 영역 (서열번호 110의 630-689번 위치에 해당됨); (5) 서열번호 126의 642-869번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역 (서열번호 110의 250-477번 위치에 해당됨); 및 (7) 선택적인 헥사히스티딘 텍. 서열번호 126은 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 126을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열126 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 125로 표시된다.
제5 조성물을 제조하기 위해, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 도 12에 개략적으로 도시된 새로운 HBV 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1의 통제 하에 발현하도록 조작하였다. 제조한 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 GI-13019로 지칭될 수 있다. 본원에서 또한 "Pol-Score"로도 지칭되며 서열번호 128로 표시되는 이 융합 단백질은, 순차적으로 중합효소, 표면 항원 및 코어 서열들을, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음과 같은 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드로서, 포함한다 (여기서 예시한 구조체에서 중합효소 세그먼트와 표면 항원 세그먼트 사이의 Leu-Glu 링커를 제외하고는, "선택적인" 것으로 표시된 비-HBV 서열은 서열번호 128의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 120의 1-228번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역 (서열번호 110의 250-477번 위치에 해당됨); (4) 서열번호 128의 229-330번 위치로 표시되는, Leu-Glu 링커 펩타이드 (선택사항); (5) 서열번호 128의 231-629번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); (6) 서열번호 128의 630-811번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); 및 (7) 선택적인 헥사히스티딘 텍. 서열번호 128은 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 128을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 127로 표시된다.
제6 조성물을 제조하기 위해, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 도 13에 개략적으로 도시된 새로운 HBV 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1의 통제 하에 발현하도록 조작하였다. 제조한 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 GI-13020으로 지칭될 수 있다. 본원에서 또한 "X-Score"로도 지칭되며 서열번호 130으로 표시되는 이 융합 단백질은, 순차적으로 X 항원, 표면 항원 및 코어 서열들을, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음과 같은 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드로서, 포함한다 (여기서 예시한 구조체에서 X 세그먼트와 표면 항원 세그먼트 사이의 Leu-Glu 링커를 제외하고는, "선택적인" 것으로 표시된 비-HBV 서열은 서열번호 130의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 130의 1-60번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV X 항원의 최적화된 영역 (서열번호 110의 630-689번 위치에 해당됨); (4) 서열번호 130의 61-62번 위치로 표시되는, Leu-Glu 링커 펩타이드 (선택적임); (5) 서열번호 130의 63-461번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); (6) 서열번호 130의 462-643번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); 및 (7) 선택적인 헥사히스티딘 텍. 서열번호 130은 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 130과 N-말단 및 C-말단 펩타이드 및 링커를 포함하는 완성된 융합 단백질의 아미노산 서열은 본원에서 서열번호 150으로 표시된다. 서열번호 130 또는 서열번호 150을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 129로 표시된다.
제7 조성물을 제조하기 위해, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 도 14에 개략적으로 도시된 새로운 HBV 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1의 통제 하에 발현하도록 조작하였다. 제조한 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 GI-13021로 지칭될 수 있다. 본원에서 또한 "Pol-X-Score"로도 지칭되며 서열번호 132로 표시되는 이 융합 단백질은, 순차적으로 중합효소, X 항원, 표면 항원 및 코어를, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음과 같은 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드로서, 포함한다 ("선택적인" 것으로 표시된 비-HBV 서열은 서열번호 132의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 132의 1-228번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역 (서열번호 110의 250-477번 위치에 해당됨); (4) 서열번호 132의 229-288번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV X 항원의 최적화된 영역(서열번호 110의 630-689번 위치에 해당됨); (5) 서열번호 132의 289-687번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); (6) 서열번호 132의 688-869번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); 및 (7) 선택적인 헥사히스티딘 텍. 서열번호 132는 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 132를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열 (효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 131로 표시된다.
제8 조성물을 제조하기 위해, 효모 (예, 사카로마이세스 세레비지애)를 도 15에 개략적으로 도시된 새로운 HBV 융합 단백질을 구리-유도성 프로모터 CUP1의 통제 하에 발현하도록 조작하였다. 제조한 효모-HBV 면역치료 조성물은 본원에서 GI-13022로 지칭될 수 있다. 본원에서 또한 "X-Pol-Score"로도 지칭되며 서열번호 134로 표시되는 이 융합 단백질은, 순차적으로 X 항원, 중합효소, 표면 항원 및 코어 단백질을, N-말단에서 C-말단 방향으로 다음과 같은 서열 요소들이 골격으로 융합된 단일 폴리펩타이드로서, 포함한다 ("선택적인" 것으로 표시된 비-HBV 서열은 서열번호 134의 기본 서열에 포함되진 않지만, 본 실시예에 기술된 융합 단백질에 실제 부가되었음): (1) 서열번호 37로 표시되는, 프로테아좀 분해에 대한 내성을 부여하고 발현을 안정시키기 위해 설계된 합성 N-말단 펩타이드인, 선택적인 N-말단 펩타이드; (2) Thr-Ser인 선택적인 링커 펩타이드; (3) 서열번호 134의 1-60번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV X 항원의 최적화된 영역 (서열번호 110의 630-689번 위치에 해당됨); (4) 서열번호 134의 61-288번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D에 대한 컨센서스 서열을 이용한, HBV 중합효소의 역전사효소 (RT) 도메인의 최적화된 영역 (서열번호 110의 250-477번 위치에 해당됨); (5) 서열번호 134의 289-687번 위치로 표시되는, HBV 유전자형 D 대형 (L) 표면 항원에 대한 거의 전장 (위치 1번 생략) 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 1-399번 위치에 해당됨); (6) 서열번호 134의 688-869번 위치로 표시되는 HBV 유전자형 D 코어 항원에 대한 컨센서스 서열의 아미노산 서열 (서열번호 118의 400-581번 위치에 해당됨); 및 (7) 선택적인 헥사히스티딘 텍. 서열번호 134는 표 5에서 확인할 수 있는 복수의 T 세포 에피토프들 (인간 및 뮤라인)을 포함한다. 서열번호 134를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열(효모에서의 발현을 위해 최적화된 코돈)은 본원에서 서열번호 133으로 표시된다.
전술한 효모-기반의 면역치료 조성물 각각을 제조하기 위해, 각 플라스미드에 대한 효모-형질감염체들을 우라실이 결여된 고체 최소 플레이트에서 분리하였다 (UDM; 우리딘 드롭아웃 배지). 콜로니들을 ULDM 및 UDM 플레이트에 다시 스크리킹하여, 3일간 30℃에서 배양하였다. 플레이트로부터 우리딘 및 루신이 결핍된 액체 스타터 배지 (UL2) 또는 우리딘 결핍 배지 (U2)로 접종하여, 스타터 배양물을 30℃에서 18시간 동안 250 rpm으로 배양하였다. 일차 배양물을 U2 또는 UL2의 최종 배양물에 접종하여, 약 2 YU/mL의 밀도가 될 때까지 계속 배양하였다. 중간 배양물을 최종 배양물에 밀도 0.05 YU/mL로 접종하여, 세포 밀도가 1-3 YU/mL에 도달할 때까지 배양하였다. 최종 배양물을 3시간 동안 0.5 mM 구리 설페이트로 유도한 다음, 세포를 PBS 중에서 세척하고, 1시간 56℃에서 열-불활성화한 후, PBS에서 3번 세척하였다. 총 단백질 함량을 TCA 침강/니트로셀룰로스 결합 분석으로 측정하였고, HBV 항원 발현을 항-his 텍 단일클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 실시예 7에 GI-13008 (서열번호 116; "Score-C") 또는 GI-13009 (서열번호 118; "Score-D")로 기술된 2가지 효모 면역치료 조성물의 라이세이트 (lysate)를 베이스 표면-코어 항원 산물을 발현하는 효모에 대한 비교 토대로서 사용하였다.
도 21은 UL2 배지에서 배양한 효모에서의 8종의 구조체 전체의 발현 (단백질 로딩 1 ㎍)을, 실시예 7에서 GI-13009 (서열번호 118; "Score-D")로 지칭된 효모 면역치료제에서의 구조체의 발현과 비교하여 나타낸 블롯이다. 도 21에서, 1번 레인과 2번 레인은 분자량 마커이고, 4-6번 레인은 이들 레인들로부터 구한 표준 곡선에서의 보간법에 의해 항원을 정량하기 위해 동일 블롯에서 처리한 재조합 헥사히스티딘 텍이 달린 NS3 단백질이다. 7-14번 레인은 UL2 배지에서 배양한 번호 (예, GI-13015)로 표시된 각 효모-기반의 면역치료제의 라이세이트들이고, 15번 레인은 GI-13009 비교의 라이세이트이다. U2 배지에서 배양한 효모에 대한 추가적인 웨스턴 블롯과 겔 상의 여러가지 함량의 단백질 로딩을 평가하는 추가적인 블롯들은 여기에 나타내지 않았지만, 전체적으로, 결과들은 8종의 항원들 모두 하나 이상의 배양 배지에서 검출가능한 수준으로 발현된다는 것을 보여주었다.
전체 발현 결과들은 U2 또는 UL2 배지에서 타겟 항원을 검출가능한 수준으로 발현하는 배양물을 GI-13008 (Score-C) 및 GI-13009 (Score-D)에서의 항원 발현과 비교한 막대 그래프로서, 도 22에 요약 개시한다. 도 22에서, HBV 항원들은, 상기 각 구조체에 대해 기술된 바와 같이, 융합 단백질에서의 항원 정렬을, 항원을 발현하는 해당 효소를 배양하는데 사용한 배지와 함께, 각 막대 아래에 표시된다 (즉, "Pol-Score-U2"의 경우, HBV 항원은 서열번호 128로 표시되며 U2 배지에서 GI-13019에 의해 발현되는 중합효소-표면-코어 융합 단백질임). 이 결과는, "X-Score" (GI-13020에 의해 발현됨; 서열번호 130)로 지칭되는 항원의 발현이 특히 ~122 pmol/YU로 강한 것으로 나타났는데, 이는 (양쪽 배지) 몰 기준으로 Score-C (GI-13008) 또는 Score-D (GI-13009)에서 수득되는 발현 수준에 대략 79-80%였다. GI-13015 (Score-Pol; 서열번호 120), GI-13016 (Score-X; 서열번호 122), GI-13017 (Score-Pol-X; 서열번호 124) 및 GI-13018 (Score-X-Pol; 서열번호 126) 항원들 각각은 동일한 효모-기반의 면역치료제를 UL2 배지에서 배양하였을 때 발현되었지만, U2 배지에서는 이들에 의해 발현되는 항원의 발현이 본 실험의 정량 수준 보다 낮았다 (도 22 참조). 일반적으로, 중합효소 역전사효소 (RT) 도메인을 포함하는 항원 조합들은 S-core만을 포함하며 X 항원이 첨가 또는 무첨가된 조합들 보다 낮은 수준으로 축적되었다. 본 실험과 앞선 실시예들에서 확인된 데이타을 총괄적으로 종합해 보면, 표면-코어 ("Score" 또는 "SCORE"; 모든 비슷한 구조체들) 및 X-표면-코어 ("X-Score" 또는 "X-SCORE"; GI-13020)의 항원 조합이 테스트한 효모-기반의 HBV 면역치료제들 전체에서 가장 발현성이 높은 항원 조합이었다.
실시예 9
아래 실시예는 본 발명의 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물들의 안전성, 면역원성 및 생체내 효능을 확인하기 위한 마우스를 대상으로 한 전임상 실험을 기술한다.
효모-기반의 HBV 면역치료 조성물들을 전임상 실험으로 평가하기 위해, 본 발명의 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물에 의한 항원-특이적인 림프구의 유도를 검출하는 다양한 시험관내 분석과 생체내 분석, 예컨대 림프구 증식, 세포-매개 세포독성, 사이토카인 분비 및 종양 기회 발생 (tumor challenge) 예방 (예, 생체내 HVC 단백질을 발현하도록 조작된 종양의 사멸) 방법을 이용하였다.
이들 실험을 뒷받침하기 위해, 실시예 1 및 2에 기술된 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 먼저 사용하고, 7 및 8 또는 본원의 도처에 기술된 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 사용하여 추가적인 실험들을 수행하였다. 그러나, 이들 실험들은 본 발명의 임의의 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물에 쉽게 적용할 수 있으며, 본원에 제시되는 결과들은 동일한 항원 베이스 또는 유사한 항원 구조체를 포함하는 다른 HBV 조성물에서도 추론할 수 있다. 이러한 처음 실험의 결과들은 아래에 나타낸다.
임의의 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물에 적합할 수 있는 일반적인 프로토콜로서, 마우스 (예, 암컷 BALB/c 및/또는 C57BL/6 마우스)에 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 적량, 예컨대 4-5 YU로 주입하였다 (2곳의 주입 부위에 2-2.5 YU 주사로 피하 투여함). 선택적으로, 항-CD40 항체의 주입은 상기 효모 조성물을 투여한 다음날 투여한다. 마우스를 1, 2 또는 3회 투여로 매주 또는 2주 마다 면역화하고, 최종 부스터 투약은 마지막 매주 또는 2주에 한번 투여하고 3-4주 후에 투여한다. 최종 주입 후 7-9일 후에 마우스를 희생시킨다. 각 그룹에서 모은 비장 세포 현탁물 및/또는 림프절 현탁물을 준비하여, HBV 항원을 발현하는 효모를 포함할 수 있는 HBV 펩타이드 및/또는 HBV 항원들 형태의 HBV-특이적인 자극을 이용하여 시험관내 자극 (IVS) 상황에 두었다. 대조군 배양물은 오발부민 펩타이드를 포함할 수 있는 비-HBV (non-HBV) 펩타이드 또는 무관련 바이러스 펩타이드 (예, HIV 펩타이드)로 자극한다. 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물의 투여에 의해 유도되는 면역 반응을 평가하기 위한 표준 분석을 이용하며, 그러한 것으로는 3H-티미딘 병합, 51Cr-표지된 타겟 세포 (또는 밤새 CTL로 표지한 다른 타겟)를 이용한 세포-매개 세포독성 분석 (CTL 분석), 사이토카인 분석 또는 ELISPOT에 의한 사이토카인 (예, IFN-γ, IL-12, TNF-α, IL-6 및/또는 IL-2, 등) 분비 정량 및 종양 발생 예방 (예, HBV 항원을 발현하도록 재조합에 의해 조작된 종양 세포를 이용한 생체내 실험(in vivo challenge))으로 분석하는 림프구 증식을 포함한다.
효모-기반의 HVB 면역치료 조성물들은 전술한 분석으로 측정시 HBV 항원-특이적인 T 세포 반응을 발생시키는 능력으로 입증되는 바와 같이 면역원성일 것으로 예상된다.
초기 실험들에서, 실시예 1 및 2에 기술된 2종의 효모-기반의 HBV 면역치료 산물을 림프구 증식 분석 (LPA)으로 테스트하여, 이들 제품을 이용한 면역화가 항원-특이적인 CD4+ T 세포 증식을 발생시키는 지를 확인하였다. 보다 구체적으로, "SCORE"로서 지칭되며 상기 실시예 1에 보다 구체적으로 기술된, CUP1 프로모터의 통제 하에 서열번호 34로 표시되는 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 산물 (GI-13002)과, "a-SPEX"로서 지칭되며 상기 실시예 2에 보다 구체적으로 기술된, CUP1 프로모터의 통제 하에 서열번호 92로 표시되는 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 산물 (GI-13004)을 각각 사용하여, 마우스를 면역화시키고, 림프구 증식 분석 (LPA)을 이용하여 이들 둘다의 산물에서 타겟팅된 표면 및/또는 코어 항원들에 특이적인 CD4+ T 세포를 평가하였다.
암컷 BALB/c 마우스에, "SCORE" 또는 a-SPEX를 마우스의 다른 2곳의 부위에 5 YU (2.5 YU/옆구리)로 피하로 매주 3회 면역화하였다. 대조군 마우스는 빈 벡터 ("YVEC")를 백신 접종하거나 접종하지 않았다 ("naive"). 1/3 면역화한지 1주일 후에, 마우스를 안락사시키고, 비장과 대동맥 주변(periaortal) 및 서혜부 배액성 림프절 (LN)을 적출하여, 단일 세포 현탁물로 가공하였다. 이들 2가지 타입의 림프절 유래 LN 세포들을 모아, 재조합 코어 및 표면 항원의 혼합물 ("S/코어 믹스"), 또는 기존에 SAg-면역화된 BALB/c 마우스로부터 T 세포 증식을 유발하는 것으로 보고된, 클래스 II 제한성 미메토프 펩타이드 (GYHGSSLY, 서열번호 103, "Class II SAg 미메토프 펩타이드"로 표시됨) (Rajadhyaksha et al (1995). PNAS 92: 1575-1579)으로 시험관내 (IVS) 자극하였다.
비장 세포를 자기 활성화된 세포 분류 (MACS)에 의한 CD4+ T 세포 농화시키고, LN에 대해 기술된 동일한 항원과 함께 인큐베이션하였다. 4일간 인큐베이션한 후, IVS 배양물을 18시간 동안 중수소 (3H) 티미딘으로 펄싱하고, 세포 DNA를 유리 섬유 마이크로필터 상에서 회수하였다. 병합된 3H-티미딘의 수준을 신틸레이션 카운팅으로 측정하였다. SCORE-면역화된 마우스로부터 유래된 레플리케이트 LN 배양물들을 함께 분석하였다. ELISpot에 의한 인터페론 γ(IFN-γ) 생산을 T 세포 활성화를 평가하기 위한 부가적인 수단으로서 사용하였다.
도 23, 도 24 및 도 26에 나타낸 바와 같이, SCORE- 또는 a-SPEX-면역화된 마우스로부터 유래된 CD4+ T 세포들은 재조합 S- 및 코어 항원 혼합물에 대해 반응하여 증식하였다. SCORE-면역화된 마우스 유래 비장 T 세포 (도 23)는 YVEC-면역화된 (빈 벡터 대조군) 또는 Naive 마우스로부터 유래된 T 세포에 비해 >5배 이상의 높은 증식 수준을 나타내었으며, 이는 상기한 효과가 표면-코어 융합 단백질 (즉, 항원-특이적인 T 세포 반응)에 특이적임을 시사한다. SCORE-면역화된 마우스로부터 유래된 T 세포는 상기 HBV 미메토프 펩타이드와 함께 인큐베이션하였을 때에도, 펩타이드-펄스형 YVEC 또는 Naive 대조군들 보다 높은 수준으로 증식하였으며, 이는 효모-기반의 면역치료 산물에 대한 반응의 항원-특이성을 보여주는 추가적인 증거를 제공한다. 이러한 효과는, 또한, IVS에 첨가한 항원의 양에 의존적이며, 최상의 활성은 3 ㎍/ml (재조합 항원) 또는 30 ㎍/mL (펩타이드) 수준에서 나타났다.
도 24에 나타낸 바와 같이, SCORE 대 Naive 또는 YVEC-면역화된 동물 간의 증식 차이가 분리된 비장 CD4+ T 세포에 비해서는 낮았지만, SCORE-면역화된 마우스로부터 유래된 LN 세포는, 이들 동일한 항원을 이용한 IVS에 대해 반응하여 증식하였다.
ELISpot 데이타 (도 25)는, S+C 믹스로 재자극한 SCORE-면역화된 마우스로부터 유래된 LN 조제물들이 Naive 동물의 LN 보다 IFN-γ 분비 세포를 >10배 이상 포함하고 있음을 보여준다. 또한, HBV 펩타이드 (서열번호 103)를 이용한 IVS는 IFN-γ 반응을 발생시켰다. 구체적으로, SCORE LN 조제물들은 Naive LN 조제물들에 비해 IFN-γ 생산 세포를 >3.5배 이상으로 함유하였다 (도 25). 이들 데이타는, 종합적으로, SCORE (표면 항원과 코어를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료제)가 비장 및 LN 둘다에서 HBV 항원에 특이적인 T 세포 반응을 유도하며, 이러한 반응들이 용량-의존적인 방식으로 정제된 항원을 이용한 IVS에 의해 증폭될 수 있음을, 보여준다.
a-SPEX를 이용한 유사한 분석들에서 (도 26), 이 효모-기반의 HBV 면역치료 산물은 T 세포 증식성 반응들을 발생시키는 것으로 나타났다. a-SPEX는 재조합 항원 혼합물로 수행한 IVS에서 YVEC 대비 약 30% 증가를 유도하였다. 전체적으로, a-SPEX를 이용한 경우 관찰되는 반응들은 SCORE의 경우에 관찰되는 반응들 보다 낮았다. 반응의 크기 차이는 a-SPEX에서의 항원 발현이 몰 기준으로 SCORE의 절반 미만이라는 점을 반영할 수 있다. 다른 예로, 이론으로 결부시키지 않지만, 이들 결과들은, 효모에 의해 발현되는 항원들의 배치가 발현 수준, 엔도좀/프로테아좀을 통한 처리 효율 또는 면역 반응의 그외 파라미터들에 영향을 미침을 의미할 수 있다. 100 ㎍/mL 펩타이드를 이용한 a-SPEX 마우스 유래 T 세포의 증식은 YVEC 백신접종한 마우스에서의 증식 보다 2배 이상 높았다 (도 26, 우측 막대 3개).
실시예 10
하기 실시예는 사이토카인 프로파일을 이용한 본 발명의 효모-기반의 HBV 면역치료제 2종의 면역학적 평가를 기술한다.
본 발명의 효모-기반의 HBV 면역치료제로 면역시킨 결과로서 발생되는 세포성 면역 반응을 특정화하기 위한 한가지 방식은, 면역화된 동물로부터 유래된 비장 조제물의 생체외 자극시 발생되는 사이토카인 프로파일을 평가하는 것이다.
이들 실험들에서, 암컷 C57BL/6 마우스 마우스를, 다음과 같이, GI-13002 ("SCORE", 서열번호 34로 표시되는 HBV 표면-코어 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료제, 실시예 1) 및 GI-13005 ("M-SPEX", 서열번호 36으로 표시되는, CUP1 프로모터의 통제 하에 HBV 표면-중합효소-코어-X 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료제, 실시예 2), YVEC (빈 벡터 대조군 효모)로 면역화하거나, 또는 면역화하지 않았다 (Naive): 효모-기반의 면역치료제 또는 대조군 효모 2 YU를 동물의 다른 2곳에 피하로 0, 7, & 28일에 피하 주사하였다. 항-CD40 항체를 1일째에 복막내 (IP) 주사로 투여하여, 효모-기반의 치료제에 의해 제공되는 활성화 수준을 초과하는 수지상 세포 (DC)의 추가적인 활성화를 제공하였다. 항-CD40 항체 처리는 선택사항이지만, 항체의 사용은, 직접 펜타머 염색에 의해 이들 세포를 검출하고자 하는 경우 항원-특이적인 CD8+ T 세포 수준을 부스팅할 수 있다 (이러한 데이타는 본 실험에 나타내지 않음). 마지막으로 면역화한 지 9일째에, 비장을 적출하여 단일 세포 현탁물로 가공하였다. 이 세포들을, 2가지 HBV 펩타이드 풀들의 혼합물 (도 27 및 도 28에서 "P"로, 도 29A 및 29B에서 "HBVP"로 표시됨)을 이용한, 또는 2가지 펩타이드 (도 27 및 도 28에서 "PPS"로, 도 29A 및 29B에서 "HPPS"로 표시됨)로 펄싱한 미토마이신 C-처리된 나이브 동계 비장세포 (mitomycin C-treated naive syngeneic splenocyte)를 이용한 48시간의 시험관내 자극 (IVS) 배양에 투입하였다. 펩타이드들은 H-2Kb-제한적이며, 다음과 같은 서열을 가진다: ILSPFLPLL (서열번호 65, 표 5 참조) 및 MGLKFRQL (서열번호 104). 배양물들을 IL1β, IL-12 및 IFN-γ에 대한 레플리케이트 루미넥스 분석을 수행하였다.
이들 사이토카인들은 HBV에 대한 방어적 또는 유효한 면역 반응과 관련있는 것으로 간주되는 면역 반응 타입들과 연관되어 있으므로, 이들 사이토카인들을 평가하였다. IL-1β는 항원 제시 세포에 의해 생산되는 전-염증성 사이토카인으로서, 효모-기반의 면역치료 조성물로 면역화하여 유도되는 것으로 확인된 사이토카인이다. IL-12 역시 항원 제시 세포에 의해 생산되며, CD8+ 세포독성 T 림프구 (CTL) 활성을 촉진시킨다. IFN-γ는 후천적인 면역반응 전개시 CD8+ 세포독성 T 림프구에 의해 생산되며, 또한 Th1 CD4+ T 세포 분화를 촉진시킨다.
도 27 (IL-1β), 도 28 (IL-12), 도 29A (IFN-γ; SCORE-면역화함) 및 도 29B (IFN-γ; M-SPEX-면역화함)에 나타낸 결과들은, 3가지 사이토카인들 모두, 펩타이드 풀 단독으로 이용한 직접 IVS에 대해 반응하여 Score-면역화된 마우스로부터 유래된 비장세포 (도 27, 도 28 및 도 29A에서, "Sc"로 지칭됨)에서 생산되며, 이러한 반응이, SCORE-면역화된 경우가 YVEC (도 27, 도 28, 도 29A 및 도 29B에서, "Y"로 지칭됨) 또는 Naive (도 27, 도 28, 도 29A 및 도 29B에서, "N"으로 지칭됨) 마우스에 비해 높다는 것을 보여주며, 이는 SCORE를 이용한 면역화가 이들 3종의 사이토카인의 생산을 초래하는 항원-특이적인 면역 반응을 유발한다는 것을 입증해준다. 또한, 펩타이드-펄싱한 동계 비장세포를 이용한 IVS도 정도는 낮지만 항원 특이적인 반응을 도출하였다. M-SPEX-백신접종한 마우스 유래의 비장 세포 (도 27, 도 28 및 도 29B에서 "Sp"로 표시됨)는 SCORE-백신접종한 마우스 유래의 비장 세포 보다 사이토카인을 전체적으로 낮은 수준으로 생산하였다. 그럼에도 불구하고, M-SPEX에 반응하여 생산되는 IL12p70의 양은 YVEC 또는 Naive에 의해 생산되는 양 보다 많았으며, 이는 이 효모-기반의 면역치료 조성물에 의해 유발되는 항원-특이적인 면역 반응을 시사한다. 항원을 더 높은 수준으로 발현하며 실시예 9에 기술된 분석에서 CD4+ 증식성 반응을 유도하는, a-SPEX (GI-13004; 실시예 2)는, 사이토카인 생산을 보다 높은 수준을 유도할 것으로 예상된다.
동일한 2가지 효모-기반의 면역치료 산물들 중 한가지로 면역화한 BALB/c 암컷 마우스를 이용하여 추가적인 사이토카인 분석을 수행하였다. 이러한 실험에서, BALB/c 암컷 마우스를 다음과 같이 SCORE (GI-13002; "Sc"로 표시됨, 도 30A-30D), M-SPEX (GI-13005; "Sp"로 표시됨, 도 30A-30D), YVEC ("Y"로 표시됨, 도 30A-30D)로 면역화하거나, 면역화하지 않았다 (Naive, "N"로 표시됨, 도 30A-30D): 효모 산물 2 YU를 0, 11, 39, 46, 60 및 67일째에 2 부위에 투여하였다. 상기한 실험에서와 같이, 항-CD40 항체를 i.p로 투여하였다. 마지막 면역화하고 9일 후에 (76일), 비장을 적출하여 단일 세포 현탁물로 가공한 다음, 재조합 HBV 표면 단백질 및 코어 단백질의 혼합물 ("HBV Sag+Core Ag"로 표시됨, 도 30A-30D)을 이용한 48시간 IVS를 수행하였다. 상층액을 수집하여, IL1β, IL-6, IL-13 및 IL12p70 생산에 대한 루미넥스로 평가하였다. IL-6는 항원 제시 세포와 T 세포에 의해 생산되는 전-염증성 사이토카인으로서, 효모-기반의 면역치료 산물의 작용 기전에 있어 중요한 사이토카인으로 간주된다. 또한, IL-13도 T 세포에 의해 생산되는 전-염증성 사이토카인으로서, IL-4와 밀접하게 관련있으며, Th2 CD4+ 면역 반응을 촉매한다.
도 30A (IL-1β), 도 30B (IL-6), 도 30C (IL-13) 및 도 30D (IL-12)에 나타낸 결과들은, SCORE-면역화된 마우스가 표면 및 코어 항원 믹스에 반응하여 IL-1β, IL-6, IL12p70 및 IL-13을 생산하였으며, 반응의 크기가 YVEC-면역화된 또는 Naive 마우스 유래의 비장세포에 비해 높았음을 보여준다. 이러한 항원 특이성은 BALB/c 마우스의 LPA에 대해 수득한 결과 (실시예 9 참조) 및 C57Bl/6 마우스에서의 사이토카인 분비 분석에 대한 결과 (상기 참조)와 부합된다.
M-SPEX 면역화된 마우스로부터 유래된 비장 세포는 IL-1β에 대한 항원-특이적인 신호를 생산하였지만 (도 30A), 다른 사이토카인에 대해서는 아니었다. C57Bl/6에서의 결과에서와 같이, SCORE와 M-SPEX 간의 명백한 효능 차이는 후자의 낮은 항원 함량으로 설명될 수 있다. 항원을 높은 수준으로 발현하는 (서열번호 92로 표시되는 융합 단백질을 발현하는, 실시예 2에 기술된) a-SPEX는 개선된 항원-특이적인 사이토카인 생산을 유도하며, 아울러, 이 산물 또는 다른 HBV 항원들 (HBV X 및 중합효소 항원)이 병합된 그외 산물에 의해 발현되는 추가적인 항원을 특징으로 포함하는 IVS 분석에서 부가적인 면역원성이 확인될 것으로 예상된다.
실시예 11
아래 실시예는 HBV에 대한 효모-기반의 면여치료 조성물의 생체내 면역원성 검사를 기술한다.
본 실험에서, 서열번호 34로 표시되는 융합 단백질을 CUP1 프로모터의 통제 하에 발현하는, "SCORE"로도 지칭되며, 실시예 1에 보다 구체적으로 기술된, 효모-기반의 면역치료 산물 (GI-13002)을, SCORE-면역화된 마우스로부터 유래된 T 세포를 SCID 마우스에 종양 이식하기 전에 중증 복합 면역 결핍증 (SCID)의 마우스 수여체에 전달하는 입양 전달 방법 (adoptive transfer method)에 사용하였다.
간략하게는, C57BL/6 암컷 마우스 (4-6주령)를, 0, 7 및 14일째에 2부위에, GI-13002 (SCORE), YVEC (빈 벡터 함유 효모)를 사용하여 피하로 (옆구리 2.5 YU, 목덜미 2.5 YU) 면역시키거나, 면역하지 않았다 (naive). SCORE-면역화된 마우스의 한쪽 코호트에는, 각 면역화를 수행하고 하루 후에 항-CD40 항체 50 ㎍을 복막내로 (i.p.) 추가로 주사하였다. 24일째에, 마우스를 희생시키고, 전체 비장세포를 준비하여 계수하였다. 비장 세포 25,000,000개를 200 ㎕ PBS 중에서 4-6주령의 나이브 SCID 암컷 마우스 수여체에 i.p.로 주사하였다. 전달하고 24시간 후, 수용체의 흉곽 부위에 SCORE-항원을 발현하는 EL4 종양 세포 ("EL-4-Score"로 표시됨) 또는 무관련 오발부민 항원을 발현하는 종양 세포 300,000개를 피하로 (s.c.) 기회 주입하였다. 종양 증식은 종양 기회 주입한 후 10일째에 시작하여 1-2일 간격으로 디지탈 캘리퍼로 측정하여 모니터링하였다.
종양 기회 주입 후 10일째 결과는, 도 31에 나타낸 바와 같이, GI-13002 (SCORE) 또는 GI-13002 + 항-CD40 항체로 면역화된 마우스 유래 비장 세포들은 SCORE 항원을 발현하는 EL4 종양의 기회 주입으로부터 상당한 보호를 유도하지만(도 31, 좌측에서 첫번째와 두번째 막대) YVEC 또는 naive 마우스에서는 그렇지 않는 것으로 확인되었다. 기회 주입 후 10일째 종양을 가진 마우스의 수를 도 31의 각 막대 위에 나타낸다. GI-13002-면역화된 마우스로부터 유래된 T 세포들은 무관련 항원을 발현하는 EL4 종양의 증식에는 영향을 나타내지 않았다 (미기재). YVEC-면역화된 마우스로부터 유래된 비장 세포 (도 31, 가운데 막대)는, 종양의 크기 및 수가 비장 세포를 투여받은 마우스 (도 31, 최우측 막대) 또는 naive 마우스로부터 유래된 비장세포를 투여받은 마우스에서와 비슷하였으므로, 종양 증식에 영향을 발휘하지 않았다. 이러한 결과들은, 표면 항원-코어 융합 단백질을 발현하는 효모-기반의 면역치료 조성물를 이용한 면역화는 SCID 마우스를 종양 기회 주입으로부터 보호하는 항원-특이적인 면역 반응을 형성함을 의미한다. 수지상 세포 (DC)-활성화 항-CD40 항체의 공동-투여는 보호 수준에 영향을 미치지 않았다.
실시예 12
아래 실시예는 인터페론-γ (IFN-γ) ELISpot 분석을 이용하여 HBV에 대한 2가지 효모-기반의 면역치료 조성물의 면역원성 테스트를 기술한다.
본 실험은, 실시예 7에 기술된 최적화된 효모-기반의 면역치료 조성물 2종을, 이들 조성물로 면역화한 마우스에서 HBV 항원-특이적인 T 세포를 유도하는 능력에 대해 평가하기 위해, 설계하였다. 또한, 본 실험은, 컴퓨터 알고리즘으로 설계한 새로운 HBV 펩타이드 서열과 간행물에서 수득한 서열들이 이들 면역 조성물들에 의해 발생되는 T 세포 반응들을 재-자극하는데 사용할 수 있는지를, 테스트하였다.
본 실험에서, 실시예 7에 GI-13008 ("Score-C", 서열번호 116 포함)로 기술된 효모-기반의 면역치료 조성물과 실시예 7에 GI-13013 ("Spex-D", 서열번호 110 포함)로 기술된 효모-기반의 면역치료 조성물을 면역원성에 대해 평가하였다. 본 실험에 사용된 펩타이드 서열들은 표 7에 나타낸다. ZGP-5 및 ZGP-7로 지칭된 서열들은 간행물로부터 유래된 것인 반면, 나머지 펩타이드들은 BIMAS 또는 SYFPEITHI 예측 알고리즘으로 컴퓨터로 동정하였다. 접두어 "Db" 또는 "Kb"는 C57BL/6 마우스의 일배체(haplotype)를 의미한다: 각각 H-2Db 및 H2-Kb.
표 7
펩타이드 명 아미노산 서열 서열 식별명 MHC 클래스 HBV 항원
Db9-84 WSPQAQGIL 서열번호 138 I Sag
Db9-94 TVPANPPPA 서열번호 141 I Sag
Db9-283 GMLPVCPLL 서열번호 142 I Sag
Db9-499 MGLKIRQLL 서열번호 143 I Core
Kb8-249 ICPGYRWM 서열번호 144 I Sag
Kb8-262 IIFLFILL 서열번호 145 I Sag
Kb8-277 VLLDYQGM 서열번호 139 I Sag
Kb8-347 ASVRFSWL 서열번호 140 I Sag
Kb8-360 FVQWFVGL 서열번호 146 I Sag
Kb8-396 LLPIFFCL 서열번호 147 I Sag
ZGP-5 VSFGVWIRTPPAYRPPNAPIL 서열번호 148 II Core
ZGP-7 ILSPFLPL 서열번호 149 I Sag
C57BL/6 암컷 마우스 (4-6주령)를, 0, 7 및 14일째에 2부위에, GI-13008 (Score-C), GI-13013 (Spex-D), YVEC (빈 벡터 함유 효모)를 사용하여 피하로 (옆구리 2.5 YU, 목덜미 2.5 YU) 면역시키거나, 면역하지 않았다 (naive). 20일째에, 마우스를 희생시키고, 전체 비장세포를 준비하여 적혈구 세포를 고갈시킨 후 계수하고, 5% 소 태아 혈청 + 표 7에 열거된 펩타이드 자극제 (Db 및 Kb 펩타이드는 10 μM; ZGP 펩타이드는 30 ㎍/mL) 또는 재조합 HBV SAg와 코어 항원의 혼합물 (총 3 ㎍/mL)가 함유된 완전 RPMI에서 4일간 200,000 세포/웰로 배양하였다. 콘카나발린 A를 양성 대조군 자극제로 첨가하였다.
그 결과 (도 32), C57BL/6 마우스의 GI-13008 (Score-C)을 이용한 면역화가, 다음과 같은 펩타이드에 대한 특정한 특이성을 갖춘, HBV 표면 (S) 및 코어 항원들에 대한 IFNγ ELISpot 반응들을 도출하는 것으로 확인되었다: Db9-84, Kb8-277 및/또는 Kb8-347, ZGP-5 및 ZGP-7. 이들 펩타이드들은 배지 단독 함유 웰 또는 GI-13013 (Spex-D)-면역화된 마우스, YVEC-면역화된 마우스 또는 Naive 마우스로부터 유래된 비장 세포들을 포함하는 웰 보다 강력한 IFNγ 반응들을 발생시켰다. 특정 자극원 그룹에서 YVEC 대조군 세포들이 S+코어 항원 믹스에 대한 항원-특이적인 기여 평가를 불가능하게 하는 백그라운드 신호를 발생시켰음에도 불구하고, 재조합 S + 코어 항원 혼합물은 역시 IFNγ 반응을 발생시켰다. 이러한 데이타는 표면-코어 융합 단백질을 발현하는 GI-13008 (Score-C)이 생체외에서 선택된 펩타이드로 재-자극할 수 있는 HBV-항원 특이적인 면역 반응을 발생시키며, 이러한 반응들은 GI-13013 (Spex-D)에 비해 보다 쉽게 검출가능하다는 것을 의미한다.
실시예 13
아래 실시예는, HBV에 대한 효모-기반의 면역치료 조성물을, HBV 시판 예방 백신으로 백신 접종한 개체로부터 유래된 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)에서 IFN γ 생산의 자극력에 대해 테스트하는 실험을 기술한다.
이 실험에서, GI-13002 ("Score", 서열번호 34를 포함함, 실시예 1)로 지칭되는 효모-기반의 면역치료 산물을, 알루미늄계 보강체에 흡착시킨 재조합 정제된 B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg)을 포함하는 예방 백신인, 시판 HBV 예방 백신 (ENGERIX-B®, GlaxoSmithKline)을 백신 주사한 개체에서 분리한 PBMC로부터의 IFNγ 생산의 자극력을 테스트하였다.
간략하게는, HLA-A*0201 대립유전자를 발현하는 건강한 HBV-나이브 인간 개체로부터 혈액을 채혈하여, PBMC를 분리하였다. PBMC는 이후 분석을 위해 동결시켰다. 그런 후, 개체에게 ENGERIX-B® (1차 주사)를 주시하고, 주사 후 12일과 29일째에 혈액을 채혈하여, PBMC를 분리 및 동결하였다. 2차로 개체에게 ENGERIX-B® (2차 주사, "부스트")를 백신 주사하고, 부스트 주사 후 10, 21 및 32일째에 혈액을 채혈하였다. 각 시점에 PBMC를 분리하고, 동결시켰다.
PBMC 샘플 시리즈들을 입수 및 동결시킨 후, 각 시점에 수득한 모든 세포를 해동, 세척한 다음, 효모: PBMC 비율 5:1로 빈 벡터 효모 대조군 (YVEC) 또는 GI-13002와 함께 3일간 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 그런 후, 세포를 IFNγ ELISpot 플레이트로 옮겨 18시간 배양한 다음, 표준화된 공정으로 ELISpots을 현상 처리하였다.
도 33에 나타낸 바와 같이 (컬럼은 면역화 유발 전 및 이후의 시간 또는 부스트 후의 시간을 나타냄), 부스트 투여 후 21일째의 YVEC-처리 PBMC에서 보다 높은 상당한 ELISpot 반응이 GI-13002-처리 PBMC에서 관찰되었다 (GI-13002 ELISpots - YVEC ELISpots = ~ 230 스팟/백만개의 PBMC). YVEC를 공제한 Score ELISpots는 다른 시간대에 관찰되는 수 보다 높았으며, 백신 접종 전 샘플에서 수득되는 신호에 2.8배였다. GI-13002와 YVEC의 효모-기반의 조성물들 간의 유일한 실질적인 구조적 차이는 GI-13002에 의해 운반되는 벡터내 표면-코어 융합 단백질 (HBV 항원)의 존재이다 (즉, YVEC는 "빈 벡터"를 가짐). 따라서, 상기 결과는, GI-13002가 개체의 PBMC에서 T 세포의 항원-특이적인 자극을 유발하였음을 나타낸다. ENGERIX-B® 백신은 재조합 표면 항원을 포함하지만 코어 항원은 포함하지 않으며, 개체는 HBV 바이러스에 대해 음성이었으므로 (HBV로 감염된 적 없음), 이러한 결과는, 관찰된 IFNγ 생산이 코어 항원-특이적인 T 세포 보다는 HBsAg-특이적인 (표면 항원-특이적인) T 세포로부터 유래된 것임을 나타낸다.
실시예 14
아래 실시예는 생체내 뮤라인 면역 모델에서의 HBV에 대한 효모-기반의 면역치료 조성물의 평가를 기술한다.
이 실험에서, GI-13009라고 하는 효모-기반의 면역치료 산물 ("SCORE-D", 서열번호 118을 포함함, 실시예 7)과, GI-13020이라고 하는 효모-기반의 면역치료 산물 ("X-SCORE", 서열번호 130을 포함함, 실시예 8)을 C57BL/6 마우스, BALB/c 마우스 및 HLA-A2 형질전환 마우스 (B6.Cg-Tg(HLA-A/H2-D)2Enge/J; The Jackson Laboratory, 버지니아 대학 특허 재단의 인가 하에 제공받음)에 투여하였다. 이들 실험에 사용된 HLA-A2 형질전환 마우스는, 인간 HLA-A2.1 유전자의 alpha-1 및 alpha-2 도메인들과 마우스 H-2D d 유전자의 alpha-3 막관통 및 사이토플라즘 도메인들을 포함하는, 종간 하이브리드 클래스 I MHC 유전자, AAD를, 인간 HLA-A2.1 프로모터의 지시 하에 발현한다. 키메라 HLA-A2.1/H2-Dd MHC 클래스 I 분자는 마우스 T 세포의 효율적인 양성 선별을 매개하여, HLA-A2.1 클래스 I 분자에 의해 제시된 펩타이드를 인지할 수 있는 보다 완전한 T 세포 레퍼토리를 제공한다. HLA-A2.1/H2-Dd 클래스 I 분자 측면에서, 마우스 T 세포에 의해 제시 및 인지되는 펩타이드 에피토프들은, HLA-A2.1+ 마우스에서 제시되는 것과 동일하다. 즉, 이 형질전환 균주는 HLA-A2에 의한 제시 항원에 대한 인간 T 세포 면역 반응을 모델링할 수 있다.
이들 실험의 목표는, 인간 MHC (HLA) 분자를 발현하는 한가지를 포함하여, 다양한 MHC 대립유전자들을 갖춘 마우스를, 효모-기반의 HBV 면역치료제로 면역화함으로써 형성되는 HBV 항원-특이적인 면역 반응들의 범위와 강도를 평가하는 것이었다. 면역원성 검사는 관련 HBV 항원으로 비장 또는 림프절 세포들을 생체외 자극함으로써 면역화 후에 행하였으며, 그런 후, IFN-γ/IL-2 듀얼 컬러 ELISpot, 림프구 증식 분석 (LPA), 루미넥스 멀티-사이토카인 분석 및/또는 세포내 사이토카인 염색 (ICCS)에 의해 T 세포 반응을 분석하였다. ICCS를 사용하여, 항원-특이적인 IFN-γ 및 TNF-α의 생산에 대한 CD4+ 및 CD8+ T 세포들의 기여를 확인하였다.
전술한 각 실험들에서, 마우스를 효모-기반의 HBV 면역치료제 또는 효모-기반의 대조군 (하기에 기술됨)을 동일한 용법으로 피하 백신 주사하였다: 부위 당 효모 조성물 2.5 YU로, 2곳 (옆구리, 목덜미)에 3주간 주당 1회 주사함, 대조군으로는, YVEC (진 벡터를 포함하는 대조군 효모, 즉, 항원 없음), OVAX2010 (비-HBV 항원, 오발부민을 발현하는 대조군 효모 면역치료 조성물) 및 YVEC와 가용성 재조합 항원들 (오발부민 또는 HBV 항원들) 및 항-CD40 항체의 조합을 포함한다. 구체적인 실험과 치료 코호트는 아래 표 8과 9에 나타낸다. 3차 면역화 후, 8일째 (HLA-A2 형질전환, 실험 1) 또는 14일째 (C57BL/6 및 BALB/c, 실험 2)에 마우스를 안락사시키고, 비장과 서혜부 림프절을 적출하여, 아래 나타낸 바와 같이, 5일간 다양한 항원성 자극물 (HBV 클래스 I 및 클래스 II MHC-제한형 펩타이드, 재조합 단백질, 및 종양 세포주를 발현하는 HBV-항원)과 함께 인큐베이션하였다. 루미넥스 분석을 위해, 배양 상층물을 회수하여, 항원 첨가 하 48시간째에 10종의 여러가지 사이토카인들 (Th1 및 Th2 타입)의 생산을 평가하였다. ELISpot 분석의 경우, 세포를 5일 시험관내 자극 (IVS)으로 마지막 24시간 동안 IFN-γ 항체로 코팅된 플레이트에서 인큐베이션한 다음, 표준화된 스팟 검출 및 카운팅을 수행하였다. LPA의 경우, 세포를 5일간의 IVS에서 마지막 18시간 동안 3H-티미딘을 첨가하고, 신규 합성된 DNA에 혼입된 동위원소의 양을 신틸레이팅 카운팅으로 측정하였다. ICCS의 경우, 전체 7일간 자극한 후, 피콜 구배 원심분리를 수행하여 죽은 세포는 제거하고, (96웰 U자 바닥의 플레이트에) 웰 당 살아있는 세포 백만개를 넣어 5시간 동안 다양한 농도 범위 (타이트레이션)에서 동일한 항원 자극원과 함께 인큐베이션하고, 투과화한 다음, 세포내 IFN-γ 및 TNF-α + 세포 표면 마커 CD4 및 CD8을 인지하는, 형광발색단이 커플링된 항체로 염색하였다. 사이토카인을 발현하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 백분율을 유세포 측정으로 측정하였다.
표 8은 실험 1에 대한 실험 코포트와 프로토콜을 기술한다. 이 실험에서, HLA-A2 코호트 마우스를 전술한 프로토콜을 이용하여 면역화하고, 3차 면역화하고 8일째에 면역 분석을 위해 마우스를 안락사시켰다. 그룹 A ("YVEC")에는 전술한 면역화 스케줄에 따라 효모 YVEC 대조군을 투여하였고; 그룹 B ("SCORE-D (GI-13009-UL2)")에는 전술한 면역화 스케줄에 따라 UL2 배지에서 배양한 GI-13009 (실시예 7 참조)를 투여하였고; 그룹 C ("X-SCORE (GI-13020-U2)")에는 전술한 면역화 스케줄에 따라 U2 배지에서 배양한 GI-13020 (실시예 8 참조)을 투여하였다.
표 8
그룹 HLA-A2 마우스 (#, 처리)
A 3, YVEC
B 3, SCORE-D/GI-13009-UL2
C 3, X-SCORE/GI-13020-U2
실험 1에서 마우스로부터 회수한 림프절 세포에 대한 IFN-γ ELISpot 분석 결과를 도 34에 나타낸다. 도 34는 면역화된 마우스로부터 유래된 림프절 세포에 대한 다양한 HBV 펩타이드를 이용한 재자극 결과를 배지 대조군과 비교하여 보여준다 ("TKO20"으로 언급된 펩타이드는 면역치료제 X-SCORE에 함유된 X 항원 유래 펩타이드 (X52-60)이나, SCORE-D에는 존재하지 않음). 그 결과, SCORE-D (GI-13009)-면역화된 마우스와 X-SCORE (GI-13020)-면역화된 마우스 둘다 그로부터 유래된 림프절 세포들이 재조합 HBV 표면 항원 및 코어 항원 각각 3 ㎍/ml로 구성된 혼합물을 이용한 시험관내 자극에 반응하여 IFN-γ를 생산하는 T 세포를 가지고 있는 것으로 확인되었다 (도 34; "S&C3"로 표시됨). 이러한 ELISpot 반응은 동일한 자극원으로 처리한 YVEC-면역화된 마우스 (효모 대조군)에서 관찰되는 반응 보다 우수하였는데, 이는 효모-기반의 면역치료 조성물(SCORE-D 및 X-SCORE)내 HBV 표면 항원 및/또는 코어 항원이 IFN-γ 반응을 유도하는데 필요하다는 것을 의미한다. 아울러, 이러한 결과는, 배지만 포함된 웰에서는 ELISpot 반응이 훨씬 낮게 나타났으므로, IVS에서 HBV 항원을 이용한 재자극이 IFN-γ 생산을 효과적으로 유도한다는 것을 보여준다.
또한, 도 34는 급성 HBV 노출 및 소멸된 환자에게 실제로 중요한 것으로 알려진 HBV 코어 유래의 선별된 HLA-A2-제한형 에피토프 (TKP16; Core:115-124 VLEYLVSFGV; 서열번호 75)가, 배지만 존재하는 웰에서 관찰되는 반응 보다 강력한 반응을 X-SCORE-면역화된 마우스에서 발생시킨다는 것을 보여준다. ELISpot 분석을 위한 펩타이드 농도와 인큐베이션 시간에 대한 추가적인 조정을 통해, 이들 항원에 대해 관찰되는 반응의 가변성을 줄이고 강도를 높일 수 있을 것으로 예상된다.
도 35는 실험 1에서 SCORE-D-면역화된 마우스로부터 회수한 비장 세포에 대한 IFN-γ ELISpot 분석 결과를 나타낸다. "Core11-27" (ATVELLSFLPSDFFPSV (서열번호 72))로 표시된 HBV 코어 펩타이드는 SCORE-D에 의해 발현되는 항원에 포함되어 있지만, "X92-100"로 표시된 HBV X 펩타이드는 SCORE-D에 의해 발현되는 항원에는 포함되어 있지 않아, 따라서 본 실험에서 대조군 펩타이드이다. 도 35에 나타낸 바와 같이, CORE-D로 면역화된 HLA-A2 형질전환 마우스로부터 유래된 비장 세포들은, "Core 11-27"로 표시된 공지의 HLA-A2 제한형 HBV 코어 에피토프로 시험관내 자극하였을 때, IFN-γ ELISpot 반응을 유도하였다. 이 반응은, 무관련 펩타이드 ("X92-100"), 배지 단독, 또는 YVEC-면역화된 마우스로부터 유래된 비장 세포에 대한 임의의 IVS 처리 웰들로 시험관내 자극한 비장 세포에서 관찰되는 반응 보다 우수하였다.
따라서, 실험 1에서 처음 결과들은 이들 효모-기반의 면역치료 조성물로 면역화한 HLA-A2 형질전환 마우스에서 SCORE-D와 X-SCORE 둘다가 HBV 항원-특이적인 T 세포 반응을 유발한다는 것을 보여준다.
표 9는 실험 2의 실험 코호트와 프로토콜을 나타낸다. 이 실험에서, C57BL/6 및 BALB/c 코호트의 마우스를 전술한 프로토콜에 따라 면역화한 다음, 3차 면역화하고 2주 후에 면역 분석을 위해 마우스를 안락사시켰다. 그룹 A ("Naive")에는 어떠한 처리제도 투여하지 않았고; 그룹 C ("X-SCORE (GI-13020-U2)")에는 전술한 면역화 스케줄에 따라 U2 배지에서 배양한 GI-13020 (실시예 8 참조)을 투여하였고; 그룹 D ("SCORE-D (GI-13009-UL2)")에는 전술한 면역화 스케줄에 따라 UL2 배지에서 배양한 GI-13009 (실시예 7 참조)를 투여하였고; 그룹 E ("OVAX2010")에는 전술한 면역화 스케줄에 따라 오발부민을 발현하는 대조군 효모를 투여하였다.
표 9
그룹 C57BL/6 마우스 (#, 처리) BALB/c 마우스 (#, 처리)
A 8, Naive 8, Naive
B 8, YVEC 8, YVEC
C 8, X-SCORE (GI-13020-U2) 8, X-SCORE (GI-13020-U2)
D 8, SCORE-D (GI-13009-UL2) 8, SCORE-D (GI-13009-UL2)
E 8, OVAX2010 7, OVAX2010
도 36은 실험 2에 나타낸 바와 같이 (표 9) 면역화한 C57BL/6 마우스로부터 분리한 림프절 세포에 대한 ELISpot 분석 결과들을 나타낸다. 이들 결과들은, X-SCORE와 SCORE-D 둘다 야생형 C57BL/6 마우스에서 IFN-γ 반응을 유발한다는 것을 입증하였다. 피키아 파스토리스-발현시킨 정제된 표면 및 코어 항원으로 시험관내 자극한 (yS&C로 표시됨; 피키아-발현된 표면 항원과 코어 항원의 1:1 믹스로 IVS함, 각각 3 ㎍/mL) X-SCORE-면역화된 마우스의 림프절 세포들은 유의한 IFN-γ 면역 반응을 형성하였다. X-SCORE-면역화된 마우스와 SCORE-D-면역화된 마우스로부터 유래된 동일한 림프절 세포 조제물들은 둘다, E. coli-발현된 표면 및 코어 항원으로 자극시 (cS&C로 표시됨; E. coli에서 발현시킨 표면 항원과 코어 항원의 1:1 믹스로 IVS함, 각각 3 ㎍/mL), 피키아-발현된 재조합 항원들에서 관찰되는 반응 보다 전체적으로 우수한 ELISpot 반응을 발생시켰다. 도 36에서 "no stim"으로 표시된 컬럼은, cRPMI 배지만 제공된 IVS 조건이다 (항원 무첨가). 일반적으로, X-SCORE로 면역화하면 SCORE-D 보다 강력한 효과가 발생되었으며, 이들 HBV 효모-기반의 면역치료 조성물 둘다 YVEC-면역화된 (효모 대조군) 또는 Naive 마우스에서 관찰되는 반응에 비해 우수한 반응들을 유발하였다. 이러한 데이타는, SCORE-D 및 X-SCORE 둘다 C57BL/6 마우스로부터 유래된 생체외 림프절 조제물에서 검출가능한 HBV-항원 특이적인 면역 반응들을 발생시킨다는 것을 시사한다.
도 37은 실험 2 (표 9)에서 수행한 C57BL/6 마우스에 대한 세포내 사이토카인 염색 (ICCS) 분석 결과를 보여준다. 그 결과, C57BL/6 마우스를 X-SCORE 또는 SCORE-D로 면역화하면, "VWL" (VWLSVIWM; 서열번호 152)로 표시되는, 표면 항원 유래의 MHC 클래스 I, H-2Kb-제한형 펩타이드에 특이적인 IFN-γ를 생산하는 CD8+ T 세포가 발생됨을 보여준다. 이러한 효과는 ICCS 절차의 5시간 배양 기간 동안에 세포에 첨가되는 펩타이드의 농도에 의존적이며; 펩타이드의 농도가 높을 수록 HBV 효모-기반의 면역치료제 (SCORE-D 및 X-SCORE) 대 무관련 효모 대조군 (Ovax 및 Yvec)에 대한 IFN-γ를 생산하는 CD8+ T 세포의 수준 차이가 증가하며, 최대 차이는 펩타이드 10 ㎍/mL에서 나타났다.
또한, 실험 2의 ICCS 분석에서, X-SCORE 및 SCORE-D로 C57BL/6 마우스를 면역화하면, "ZGP-5"로 표시되는 코어 단백질 유래의 MHC 클래스 II-제한형 HBV 펩타이드(VSFGVWIRTPPAYRPPNAPIL; 서열번호 148)에 특이적인 IFN-γ를 생산하는 CD4+ T 세포가 발생되는 것으로 확인되었으며, ICCS 절차에서 5시간 인큐베이션 기간 동안에 펩타이드는 0.5 ㎍/mL로 첨가하였다 (도 38).
전술한 ELISpot 결과들을 종합하면, 이러한 데이타들은, SCORE-D 및 X-SCORE 효모-기반의 면역치료 조성물 둘다, 재조합 HBV 항원 및 HBV 펩타이드를 이용한 림프절과 비장 세포의 생체외 자극에 의해 검출되는, HBV 항원-특이적인 작동자 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 유도함을 나타낸다. T 세포 반응들은 야생형 C57BL/6 마우스 (H2-Kb)와 HLA-A2 형질전환 마우스 둘다에서 발생하는데, 이는 다양한 주조직적합성 타입 측면에서 면역 반응을 발생시키는 이들 백신의 효능을 시사한다.
상기 실시예에 기술된 HLA-A2 마우스와 C57BL/6 마우스에 대한 결과들과, 아울러 실시예 9, 10, 11 및 12에 기술된 실험의 결과들을 토대로, 또한, SCORE-D 또는 X-SCORE로 면역화된 BALB/c 마우스의 결과는, 효모 기반의 HBV 면역치료 조성물이 이들 마우스에서 HBV 항원-특이적인 작동자 CD4+ 및 CD8+ T 세포들을 유도함을 입증할 것으로 예상된다. 실제, BALB/c 코호트에 대한 초기 결과들은 CD8+ T 세포 반응에 양성이었다 (데이타 미기재). 또한, 림프구 증식 분석 및 루미넥스 사이토카인 방출 분석에서, SCORE-D 및 X-SCORE 둘다가 효모 면역치료제에 존재하는 HBV 항원 서열을 특이적으로 타겟팅하는 면역 반응을 유발하는 것으로 확인될 것이며, 이들 반응들이 3가지 마우스 균주들(HLA-A2 형질전환, C57BL/6 및 BALB/c) 모두에서 관찰될 것으로 예상된다.
실시예 15
아래 실시예는 다양한 HBV 항원 노출 공여체로부터 분리한 PBMC로부터 IFN γ 생산을 자극하는 능력에 대해 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 평가하는 실험을 기술한다.
본 실험에서, GI-13009로 표시되는 효모-기반의 면역치료 산물 ("Score-D", 서열번호 118을 포함함, 실시예 7)과 GI-13020로 표시되는 효모-기반의 면역치료 산물("X-Score", 서열번호 130을 포함함, 실시예 8)을, 다양한 HBV 항원 노출 공여체로부터 분리한 PBMC로부터 IFNγ 생산을 자극하는 능력에 대해 검사하였다. 이 실험에서, 한가지 공여체 그룹은 기준에 ENGERIX-B® (GlaxoSmithKline) 또는 RECOMBIVAX HB® (Merck & Co., Inc.)로 백신 접종받은 적이 있으며, 다른 한가지 공여체 그룹은 HBV 항원에 나이브 ("정상")이며, 다른 한가지 공여체 그룹은 만성 HBV 환자 (만성적으로 HBV에 감염된 개체)이다. ENGERIX-B®는 효모 세포에서 생산하여, 정제한 다음 알루미늄계 보강체에 흡착시킨 정제된 재조합 B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg)을 포함하는, 예방학적 재조합 서브유닛 백신이다. RECOMBIVAX HB®는 효모 세포에서 생산하고 효모 단백질을 1% 미만으로 포함하도록 정제한 HBV 표면 항원 (HBsAg)으로부터 유래된 재조합 서브유닛 예방 백신이다. 공여체들은 모두 HLA-A*0201 대립유전자를 발현한다.
공여체 PBMC를 10% 소 태아 혈청이 함유된 완전한 RPMI 배지에서 3시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 바닥이 평평한 6웰 조직 배양 플레이트 (107 PBMC/웰)에서 인큐베이션한다. 비-부착 세포를 취하여 폐기하고, 부착 세포에 재조힙 안간 인터루킨-4 (IL-4) 및 재조합 인간 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)를 (각각 20 및 50 ng/mL) 5일간 처리하여, 미성숙 수지상 세포 (iDC)를 만든다. 그런 후, iDC를 항-CD40 항체 (1 ㎍/ml), YVEC (빈 벡터를 포함하는 효모 대조군) 또는 효모-기반의 산물들 GI-13020 또는 GI-13009와 함께 48시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하여, 성숙형 DC를 만든다. 항-CD40 항체-처리한 DC의 경우, 세포를 표준 방법에 따라 HLA-A*0201-제한적인 HBV 펩타이드로 추가적으로 처리한다. 모든 DC 그룹들을 PBS-세척한 다음, PBS 중에서 세포 회수물과 함께 플레이트에서 취한다. 세포에 방사선을 조사하여 (30 Gy), DC:PBMC 1:1 비율로 동종 공여체 PBMC를 자극하는데 사용한다. 자극은 7일간 (1라운드) 수행하고, 마지막 4일간은 재조합 인간 IL-2가 포함된 배지에서 수행한다. 그런 후, 자극시킨 PBMC를 피콜 농도 구배 원심분리(Ficoll gradient centrifugation)를 수행하고, 분리한 살아있는 세포를 전술한 바와 같이 준비한 펩타이드-접촉시킨 DC 또는 효모-접촉시킨 DC를 이용한 2라운드 IVS를 수행한다. 그 후, 자극한 PBMC를 IFN-γ에 대해 특이적인 항체로 코팅된 96웰 플레이트에서 20 U/mL rhIL-2의 존재 하에 HBV 펩타이드(들) 또는 대조군과 인큐베이션하고, ELISpot 검출을 표준 제조사의 절차에 따라 수행한다. 동종의 SCORE-D- 또는 X-SCORE-공급받은 DC로, 또는 HBV 펩타이드-펄싱한 DC로 자극한 PBMC가 YVEC-처리하거나 펄싱하지 않은 DC로 자극한 PBMC 보다 높은 수준으로 외인성 HBV 펩타이드에 반응할 것이며, 이러한 효과는 HBV 항원 노출에 나이브한 공여체에서 비해 HBV ENGERIX® 또는 RECOMBIVAX HB® 백신 수여체에서 훨씬 강할 것으로 예상된다.
실시예 16
아래 실시예는 인간에서 본 발명의 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물의 면역원성을 확인하기 위해 인간 PBMC를 이용한 전임상 실험을 기술한다.
구체적으로, 이들 실험은, HBV 표면 항원-특이적인 및/또는 HBV 코어 항원-특이적인 CD8+ T 세포가 HBV 표면 항원 및 HBV 코어를 포함하는 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물로 2라운드 시험관내 자극 (IVS)을 수행한 후 HBV 보균자의 말초혈 단핵구 세포 (PBMC)에서 검출할 수 있는지를 확인하기 위해 설계된 것이다.
PBMC는 (혈청 HBsAg 상태를 토대로) HBV가 양성인 것으로 확인된 인간 공여체로부터 수득한다. 검사에 올바른 HBV 펜타머를 동정하기 위해, 0.5 mL 전혈에서 총 DNA를 분리하여, HLA의 타입을 분석한다 (하기 표 참조).
표 10
HLA 타입 펩타머 펩타이드 서열 항원
A*0201 FLLTRILTI (서열번호 42) 표면
A*0201 GLSPTVWLSV (서열번호 43) 표면
A*0201 FLPSDFFPSI (서열번호 44) 코어
A*1101 YVNVNMGLK (서열번호 48) 코어
A*2402 EYLVSFGVW (서열번호 49) 코어
GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 5일간 PBMC를 배양함으로써, 전술한 공여체로부터 분리한 PBMC로부터 수지상 세포 (DC)를 준비한다. 이후, DC를 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물 (예, 실시예 1-8 중 임의에 또는 본원의 도처에 기술된 조성물) 또는 대조군 효모 (예, 빈 벡터 또는 항원을 코딩하는 인서트를 포함하지 않는 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지애 효모인 "YVEC")와 1:1 (효모:DC)의 비율로 인큐베이션한다. 또한, 대조군 DC 배양물은 HBV 펩타이드 또는 대조군 펩타이드 (비-HBV 펩타이드)와 인큐베이션하거나 또는 아무것과도 인큐베이션하지 않은 DC이다.
48시간 동안 공동-배양한 후, DC를 동종 T 세포 (즉, 공여체 유래 T 세포)를 자극하기 위한 항원 제시 세포 (APC)로 사용한다. IVS (시험관내 자극)로 언급되는 각 자극 사이클은, IL-2의 부재 하의 3일간의 배양과 이후의 재조합 IL-2 (20 U/ml)의 존재 하의 다시 4일간의 배양으로 이루어진다. IVS 2 종료시, T 세포를 대조군 테트라머 또는 펜타머 또는 전술한 HBV 펩타이드 에피토프에 특이적인 테트라머 또는 펜타머로 염색한다. 테트라머 또는 펜타머 염색 결과가 양성인 CD8+ T 세포의 백분율을 유세포 측정으로 정량한다.
본 발명의 효모-HBV 면역치료제를 이용한 HBV-양성 공여체 유래 공여체 T 세포의 자극이, 대조군에 비해, 공여체 대부분 또는 적어도 일부에서, 테트라머/펜타머-양성 CD8+ T 세포의 백분율을 증가시킬 것으로 예상되며, 이는, HBV-감염된 개체로부터 유래된 인간 T 세포가 면역원으로서 효모-기반의 면역치료제가 가지고 있는 HBV 단백질들을 인지하는 능력을 가지고 있다는 것을 의미한다.
전술한 실험과 비슷한 추가적인 실험들을 정상 (HBV 무감염) 개체로부터 유래된 공여체 PBMC를 이용하여 수행한다. 본 발명의 효모-기반의 면역치료제를 이용한 정상 공여체 유래 공여 T 세포의 자극이, 대조군에 비해, 공여체 대부분 또는 적어도 일부에서, 테트라머/펜타머-양성 CD8+ T 세포의 백분율을 증가시킬 것으로 예상되며, 이는, 무감염 개체로부터 유래된 인간 T 세포가 면역원으로서 효모-기반의 면역치료제가 가지고 있는 HBV 단백질들을 인지하는 능력을 가지고 있다는 것을 의미한다.
추가적인 실험으로, 전술한 실험에서의 3가지 공여체들로부터 유래한 HBV-특이적인 T 세포를, IVS 2 사이클로 HBV 효모-기반의 면역치료제 (예, 실시예 1-8 중 임의에 또는 본원의 도처에 기술된 조성물)와 인큐베이션한 DC를 이용하여 시험관내에서 증식시킨다. 3차 IVS는 CD40L의 존재 하에 성숙화한 DC를 이용하여 수행하고, HBV 펩타이드(들)로 펄싱한다. 5일째에, CD8+ T 세포를 분리하여, 다양한 작동자 : 타겟 (ET) 비율로, HBV 항원을 발현하는 종양 세포 타겟에 대한 하룻밤 세포독성 T 림프구 (CTL) 분석에 사용한다. 대조군 테트라머/펜타머 대 HBV-특이적인 테트라머/펜타머에 대해 양성으로 염색되는 CD8+ T 세포의 백분율을 측정한다.
상기 공여체들 중 일부 또는 전부로부터 유래된 T 세포는 HBV 항원을 발현하는 타겟을 사멸시킬 수 있는 CD8+ CTL을 유도할 수 있을 것으로 예상된다. 이러한 데이타는, 효모-HBV 면역치료제 조성물이 HBV 항원을 발현하는 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 HBV-특이적인 CTL을 유도할 수 있음을 입증해 줄 것이다.
실시예 17
아래 실시예는 건강한 지원자를 대상으로 한 1상 임상 실험을 기술한다.
12주의, 개방-표지(open-label) 용량 증가 1상 임상 실험을, GI-13009로 본원에서 언급된 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물 ("SCORE-D", 서열번호 118을 포함함, 실시예 7)을 이용하여 수행하거나, 또는 다른 예로, GI-13020로 본원에서 언급된 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물 ("X-SCORE", 서열번호 130을 포함함, 실시예 8)을 사용한다. 본원에 언급된 그외 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물 (예, 실시예 1-8에 기술된 임의의 조성물)을, 비슷한 1상 임상 실험에 이용할 수 있다. 1상 임상 실험을 위한 효모-기반의 HBV 면역치료 산물 (예, 실시예 9-17 중 임의의 하나에 기술된 조성물)은, 가장 강력한 총 면역 반응 프로파일 (예, 양성 결과를 대부분 예측할 수 있는 T 세포 에피토프에 대한 반응 크기, 및/또는 다양한 에피토프들에 대한 면역 반응의 범위) 등의 고려사항을 기반으로 전-임상 실험들에서 선택한다.
개체는 HBV 감염의 표시 또는 기록이 기존에 또는 현재 없는 면역력이 활발한 건강한 지원자이다.
이들 기준에 부합되는 개체 약 48명 (arm 6개, arm 당 개체 8명)에게 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 다음과 같은 2가지의 다른 투약 프로토콜을 이용하여 순차적인 용량 코호트 상향식 프로토콜로 투여한다:
프로토콜 A: 프라임-부스트 투약 (1일에 개시하여 4주간 매주 투약한 다음 4주 및 8주째에 2달간 매달 투약함
Arm 1A: 20 Y.U. (2곳에 10 Y.U. 용량으로 투여);
Arm 2A: 40 Y.U. (4곳에 10 Y.U. 용량으로 투여);
Arm 3A: 80 Y.U. (4곳에 20 Y.U. 용량으로 투여)
4-주 간격으로 투약 (1일, 4주 및 8주째에 총 3회 투약)
Arm 1B: 20 Y.U. (2곳에 10 Y.U. 용량으로 투여);
Arm 2B: 40 Y.U. (4곳에 10 Y.U. 용량으로 투여);
Arm 3B: 80 Y.U. (4곳에 20 Y.U. 용량으로 투여).
투약은 모두 피하로 투여하고, 용량을 상기 나타낸 바와 같이 (각 참가자마다) 신체의 2곳 또는 4곳에 나누어 투여한다. 안전성과 면역원성 (예, ELISpot 및 T 세포 증식으로 측정하는 항원-특이적인 T 세포 반응)을 평가한다. 구체적으로, ELISpot-기반의 알고리즘을 유형별 반응자에 대해 개발한다. 또한, 조절성 T 세포 (Treg)를 측정하는 ELISpot 분석도 수행하며, HBV 항원에 반응하여 CD4+ T 세포의 증식을 평가하고, 항-사카로마이세스 세레비지애 항체 (ASCA)의 발생과 연관시킨다.
상기 효모-기반의 HBV 면역치료제는 허용성이 우수하며 하나 이상의 ELISpot 분석, 림프구 증식 분석 (LPA), HBV 항원에 의한 생체외 T 세포 자극 및/또는 ASCA로 측정시 면역원성이 확인될 것으로 예상된다.
실시예 18
아래 실시예는 B형 간염 바이러스로 만성적으로 감염된 개체에 대한 1b/2a 상 임상 실험을 기술한다.
HBV 감염 환자가 질병의 자연사의 일환으로서 간염의 불안정형 악화를 경험하게 되는 경향으로 인해, 효모-기반의 HBV 면역요법은, 항-바이러스-계 요법을 이용한 일부 또는 전체 바이러스 방제 기간 중 일정 기간이 경과한 후에, 시작하며, 일차적인 효능 목표는 혈청전환율 개선이다. 이러한 첫번째 강화 방식은, 효모-기반의 HBV 면역요법은, 혈청전환율이 지속적인 항-바이러스 요법과의 병용하여 개선될 수 있는지를 확인하기 위해, PCR을 통해 HBV DNA 음성이 달성된 후, 환자에게 사용한다.
개방-표지 용량 증가 1b/2a 상 임상 실험을, GI-13009로 본원에서 언급된 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물 ("SCORE-D", 서열번호 118을 포함함, 실시예 7)을 이용하여 수행하거나, 또는 다른 예로, GI-13020로 본원에서 언급된 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물 ("X-SCORE", 서열번호 130을 포함함, 실시예 8)을 사용한다. 본원에 언급된 그외 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물 (예, 실시예 1-8에 기술된 임의의 조성물)을, 비슷한 1상 임상 실험에 이용할 수 있다. 대상자는 면역력이 활발하며, HBV DNA 수준으로 측정시 항-바이러스 요법 (즉, 테노포비르 디이소프록실 퓨마레이트 또는 TDF (VIREAD®))으로 충분히 통제되는 B형 간염 바이러스 (HBV)에 만성적으로 감염된 개체이다. 대상자는 HBV DNA에 음성 (PCR로 검출가능한 수준 미만 또는 <2000 IU/ml)이며, 이 실험에 적합하기 위해서는, 대상자는 HBeAg 양성이어야 하며, 간경변 또는 대상부전(decompensation) 증거가 없어야 한다.
이 실험의 1단계에서, 이러한 기준에 부합되는 대상자 약 40명 (대상자 ~5/arm)에게 0.05 Y.U. 내지 80 Y.U. (예, 0.05 Y.U., 10 Y.U., 20 Y.U., 및 40-80 Y.U.) 범위의 용량을 이용한 순차적인 용량 코호트 증가 프로토콜로 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 투여한다. 1차 프로토콜로, 매주 투여로 5회 피하 투여 (4주간 매주 투여)한 다음, 2-4 매달 피하로 투여하고, 효모-기반의 HBV 면역요법으로 치료하는 동안 항-바이러스 요법을 계속한다 (프라임-부스트 프로토콜). 2차 프로토콜로, 4-주 간격의 투여 프로토콜을 수행하며, 이때 대상자에게, 1일, 4주 및 8주째에, 총 3번, 상기와 동일한 용량 증가 전략으로 투여한다. 선택적으로, 한가지 실험에서, 단일 환자 코호트 (환자 5-6명)에는 면역요법 + 계속적인 항-바이러스 요법과 동일한 스케줄로 위약 (PBS)을 피하 주사한다. 보수적인 중지 규칙 (Conservative stopping rule)을 ALT 플레어 (ALT flare) 및 대상부전 신호에 대비하여 준비한다.
이 실험의 두번째 단계로, 대상자 (n=60)들을 arm 당 30명으로 무작위 분류하여, 항-바이러스 (TDF) 단독 또는 항-바이러스 + 효모-기반의 HBV 면역치료 프로토콜 (투약 1 및 투약 2)로 최대 48주간 계속한다.
안전성, HBV 항원 카이네틱스, HBeAg 및 HBsAg 혈청전환, 및 면역원성 (예, ELISpot로 측정하는 항원-특이적인 T 세포 반응)을 평가한다. 아울러, 용량-의존적인 바이오케미칼 (ALT)과 바이러스 부하 (viral load)을 모니터링한다. 구체적으로, 12주, 24주 및 48주째에 3회-처리 arm들 간의 혈청 HBsAg 측정치 감소를 측정하고, 48주째에 HBsAg-소거/혈청전환을 측정한다.
효모-기반의 면역요법 및 TDF를 투여받은 개체에서, 48주째에, TDF 단독 투여 개체와 비교하여, HBsAg 소거율 및/또는 >20%까지의 혈청전환율 증가는 임상적으로 의미있는 진전으로 간주한다. 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물은 만성적으로 감염된 HBV 환자에게 치료학적 효과를 제공할 것으로 예상된다. 면역요법은 전달한 모든 용량에서 안전하고 허용성이 높을 것으로 예상된다. 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 최대 용량 이상으로 투여받은 환자는, ELISPOT로 측정시, 치료시 나타나는 HBV-특이적인 T 세포 반응들을 보일 것으로 예상되며, 기존의 베이스라인 HBV-특이적인 T 세포 반응을 보이는 환자들은 치료하는 동안에 개선된 HBV-특이적인 T 세포 반응을 나타낼 것으로 예상된다. 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 투여받은 환자는 항-바이러스 군 및/또는 이용가능한 경우, 위약-조절군에 비해 혈청전환율 개선을 나타낼 것으로 예상된다. 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 복용한 환자들에서 ALT 정상화 개선이 예상된다.
다른 실험으로, 다른 기준 (면역력 활발함, 만성적으로 HBV에 감염됨, 항-바이러스제로 잘 통제됨, 대상부전 신호가 없음)에 부합되는 HBeAg 음성 환자를 전술한 바와 유사한 용량 증가 실험으로 (또는 상기 실험에서 규명된 최상의 용량 또는 최대 허용량으로) 처리한다. 환자는 안전성, 면역원성 및 HBsAg 혈청전환에 대해 모니터링한다.
실시예 19
아래 실시예는 B형 감염 바이러스로 만성적으로 감염된 개체를 대상으로 하는 1b/2a 상 임상 실험을 기술한다.
개방-표지 용량 증가 1b/2a 상 임상 실험을, GI-13009로 본원에서 언급된 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물 ("SCORE-D", 서열번호 118을 포함함, 실시예 7)을 이용하여 수행하거나, 또는 다른 예로, GI-13020로 본원에서 언급된 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물 ("X-SCORE", 서열번호 130을 포함함, 실시예 8)을 사용한다. 본원에 언급된 그외 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물 (예, 실시예 1-8에 기술된 임의의 조성물)을, 비슷한 1b/2a 상 임상 실험에 이용할 수 있다. 대상자는 면역력이 활발하며, 항-바이러스 요법 (즉, 테노포비르 (VIREAD®))으로 적어도 3달간 통제되는 B형 간염 바이러스 (HBV)에 만성적으로 감염된 개체이다. 대상자는 실험에 참여하기 위해 바이러스가 완전히 소멸되어야 하는 것은 아니며, 즉, 환자는 HBV DNA에 음성 (PCR로 검출가능한 수준 미만 또는 <2000 IU/ml으로 측정되는 음성) 또는 양성일 수 있으며; 이 실험에 적합하기 위해서는, 대상자는 간경변 또는 대상부전 증거가 없다. 환자는 HBeAg 양성일 수 있지만, HBeAg-음성 환자들도 이 실험에 포함시킬 수 있다.
이러한 기준에 부합되는 대상자 30-40명 (코호트 당 환자 6-10명)에게 0.05 Y.U. 내지 480 Y.U. (예, 0.05 Y.U., 0.5 Y.U., 4 Y.U., 및 40 Y.U.) 범위의 용량을 이용하거나 또는 0.05 Y.U. 내지 80 Y.U. (예, 0.05 Y.U., 10 Y.U., 20 Y.U., 40/80 Y.U.) 범위의 용량을 이용한 순차적인 용량 코호트 증가 프로토콜로 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 투여한다. 1차 프로토콜로, 5주간 매주 피하 투여 (4주간 매주 투여)한 다음, 2-4 매달 피하로 투여하고, 효모-기반의 HBV 면역요법으로 치료하는 동안 항-바이러스 요법을 계속한다 (프라임-부스트 프로토콜). 2차 프로토콜로, 4-주 간격의 투여 프로토콜을 수행하며, 이때 대상자에게, 1일, 4주 및 8주째에, 총 3번, 상기와 동일한 용량 증가 전략으로 투여한다. 한가지 실험으로, 단일 환자 코호트 (환자 5-6명)에는 면역요법 + 계속적인 항-바이러스 요법과 동일한 스케줄로 위약 (PBS)을 피하 주사한다. 보수적인 중지 규칙을 ALT 플레어 및 대상부전 신호에 대비하여 준비한다.
안전성, HBeAg 및 HBsAg 혈청전환, 바이러스 방제 (예, 바이러스 음성 형성 또는 바이러스 음성 경향 발현) 및 면역원성 (예, ELISpot로 측정하는 항원-특이적인 T 세포 반응)을 평가한다. 아울러, 용량-의존적인 바이오케미칼 (ALT)과 바이러스 부하 (viral load)을 모니터링한다.
24주까지 HB-SAg의 >1log10 감소 또는 12주까지 HB-eAg >1log10 감소를 2a 상의 엔드포인트로 간주한다. HBV 혈청전환의 경우, SAg 혈청전환율 24주까지 10% 및 48주까지 15%, 및/또는 eAg 혈청전환율 24주까지 25% 또는 48주까지 50%는 성공 기준이다.
효모-기반의 HBV 면역치료 조성물은 HBV로 만성 감염된 환자에게 치료학적 효과를 제공할 것으로 예상된다. 면역요법은 전달한 모든 용량에서 안전하고 허용성이 높을 것으로 예상된다. 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 최대 용량 이상으로 투여받은 환자는, ELISPOT로 측정시, 치료시 나타나는 HBV-특이적인 T 세포 반응들을 보일 것으로 예상되며, 기존의 베이스라인 HBV-특이적인 T 세포 반응을 보이는 환자들은 치료하는 동안에 개선된 HBV-특이적인 T 세포 반응을 나타낼 것으로 예상된다. 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 투여받은 환자는 소정의 항-바이러스제에 대한 이용가능한 비교 데이타 및/또는 위약-조절군에 비해 혈청전환율 개선을 나타낼 것으로 예상된다. 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 복용한 환자들에서 바이러스 소거 개선이 나타날 것이다 (예, PCR로 측정시 바이러스 음성). 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 복용한 환자들에서 ALT 정상화 개선이 예상된다.
실시예 20
아래 실시예는 B형 간염 바이러스로 만성적으로 가염된 대상자에 대한 2상 임상 실험을 기술한다.
HBV로 만성적으로 감염된 환자에서의 무작위 2상 임상 실험에서는, ALT>2x ULN이고 바이러스 부하이 > 백만 카피수인, 치료-나이브의 HBeAg-양성 (및 어쩌면 HBeAg-음성인) 개체를 치료한다. 개체들 (1상 실험의 신호를 토대로 조정한, arm 당 개체 ~60명)은 기존에 항-바이러스 요법을 적어도 6개월 받아야 하며, 적어도 1달 간격으로 2번 연속 진찰시 바이러스 음성이어야 한다. 개체를 2 arm으로 무작위 분류한다. arm 1 환자에게는 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물 (예, GI-13009로 본원에서 언급된 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물 ("SCORE-D", 서열번호 118을 포함함, 실시예 7), 또는 다른 예로, GI-13020로 본원에서 언급된 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물 ("X-SCORE", 서열번호 130을 포함함, 실시예 8)을 투여한다. 면역치료 조성물을 투여하는 환자들 모두에 항-바이러스 요법을 계속 수행한다 (예, 테노포비르 (VIREAD®)). Arm 2 환자에게는 위약 (PBS 대조군 주사)을 투여하고, 계속 항-바이러스 요법을 수행한다. 1차 엔드포인트는 혈청전환과 바이러스 음성이다. 본원에 기술된 추가적인 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물 (예, 실시예 1-8에 기술된 임의의 조성물)도 유사한 방식으로 2 상 실험에 사용할 수 있다.
혈청전환을 달성한 환자에게 효모-면역요법 및 항-바이러스제 (arm 1) 또는 항-바이러스제 단독 (arm 2)으로 강화 요법(consolidation therapy)을 6-12개월간 수행한 다음, 6개월의 치료 중단을 실시한다. 6개월 중단을 끝낸 후 관해 상태로 유지되는 환자의 수는 실험의 2차 엔드포인트이다. 추가적인 엔드포인트는 전술한 인간 임상 실험들이 기술된 실시예들에 언급된 바와 같이, 안전성, 면역원성 및 ALT 정상화를 포함한다.
효모-기반의 HBV 면역치료 조성물은 HBV로 만성 감염된 환자에게 치료학적 효과를 제공할 것으로 예상된다. 면역요법은 안전하고 허용성이 높을 것으로 예상된다. 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 투여받은 환자는, ELISPOT로 측정시, 치료시 나타나는 HBV-특이적인 T 세포 반응들을 보일 것으로 예상되며, 기존의 베이스라인 HBV-특이적인 T 세포 반응을 보이는 환자들은 치료하는 동안에 개선된 HBV-특이적인 T 세포 반응을 나타낼 것으로 예상된다. 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 투여받은 환자는 위약-조절군에 비해 혈청전환율 개선을 나타낼 것으로 예상된다. 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 복용한 환자들에서 바이러스 소거 개선이 나타날 것이다 (예, PCR로 측정시 바이러스 음성). 효모-기반의 HBV 면역치료 조성물을 복용한 환자들에서 ALT 정상화 개선이 예상된다.
본 발명의 다양한 구현예들을 상세하게 기술하였지만, 이들 구현예들에 대한 수정 및 조정이 이루어질 수 있음은 당해 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 그러나, 이러한 수정 및 조정은, 아래 첨부된 청구항에 기술된 바와 같이, 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 명확하게 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> GlobeImmune, Inc. Apelian, David King, Thomas H. Guo, Zhimin Coeshott, Claire M. <120> Compositions and Methods for the Treatment or Prevention of Hepatitis B Virus Infection <130> 3923-32-PCT <150> 61/507,361 <151> 2011-07-13 <150> 61/496,945 <151> 2011-06-14 <150> 61/442,204 <151> 2011-02-12 <160> 152 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 212 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 1 Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Thr Cys Pro Thr 1 5 10 15 Phe Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile 20 25 30 Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu 35 40 45 Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser 50 55 60 Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His 65 70 75 80 His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr 85 90 95 Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp 100 105 110 Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln 115 120 125 Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val 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Arg 500 505 510 Lys Ile Pro Met Gly Leu Gly Leu Ser Pro Phe Leu Met Ala Gln Phe 515 520 525 Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu 530 535 540 Ala Phe Ser Tyr Val Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln 545 550 555 560 His Leu Glu Ser Leu Tyr Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu 565 570 575 Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu 580 585 590 Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln Glu 595 600 605 His Ile Thr Gln Lys Ile Lys Gln Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn 610 615 620 Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Thr Gly Leu Leu Gly 625 630 635 640 Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu 645 650 655 Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr 660 665 670 Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Met Asn Leu Tyr Pro Val Ala Arg 675 680 685 Gln Arg Pro Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Asp Ala Thr Pro Thr Gly 690 695 700 Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Gln Arg Met Arg Gly Thr Phe Val Ala 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Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn 305 310 315 320 Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Tyr Leu 325 330 335 Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Gln 340 345 350 Phe Val Gln Trp Cys Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Leu Val 355 360 365 Ile Trp Met Ile Trp Tyr Trp Gly Pro Asn Leu Cys Ser Ile Leu Ser 370 375 380 Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Cys Tyr Leu Trp Ala Ser Ile 385 390 395 400 <210> 32 <211> 154 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 32 Met Ala Ala Arg Met Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu 1 5 10 15 Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Cys Gly Arg Pro Leu Ser Trp 20 25 30 Ser Leu Gly Ala Leu Pro Pro Ser Ser Pro Pro Ala Val Pro Ala Asp 35 40 45 Asp Gly Ser His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Ala Cys Ala Phe Ser 50 55 60 Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala Arg Arg Met Glu 65 70 75 80 Thr Thr Val Asn Ala Pro Trp Asn Leu Pro Thr Thr Leu His Lys Arg 85 90 95 Thr Leu Gly Leu Ser Pro Arg Ser Thr Thr Trp Ile 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Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro 65 70 75 cat gga ggc ttg tta ggc tgg tca cct caa gca caa ggt att ctg act 291 His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr 80 85 90 act gtc cca gct gca cca cca cct gcc tca act aat agg caa tct ggt 339 Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly 95 100 105 aga cag cct acc cct att agt cca cca ttg aga gac tca cat cct caa 387 Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln 110 115 120 125 gcc atg cag tgg aat agt act act ttc cat caa gcc tta ctg gat cca 435 Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro 130 135 140 aga gta aga gga cta tac ttc cca gca ggt ggt tca tca tca ggc aca 483 Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr 145 150 155 gtg aac cct gtt cca aca aca gca tcc cct ata tct tct atc ttt tct 531 Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser 160 165 170 aga aca gga gat cca gct cca aac atg gaa aac act aca tct gga ttc 579 Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe 175 180 185 ctt ggg cct cta tta gta tta caa gct ggg ttt ttc ctg cta acc cgt 627 Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg 190 195 200 205 att cta act ata cca caa tca tta gat tcc tgg tgg act tca ttg aat 675 Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn 210 215 220 ttc cta gga ggt gcc cca aca tgt cca ggt caa aac tcc cag tct cct 723 Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro 225 230 235 aca tct aat cac tct cct acc agt tgc cca cca ata tgt cct ggc tac 771 Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr 240 245 250 aga tgg atg tgc tta cgt aga ttc atc atc ttc ctt ttc att ttg ctt 819 Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu 255 260 265 ttg tgc ctt atc ttt ttg cta gtg cta ctg gac tac caa gga atg ttg 867 Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu 270 275 280 285 cca gtt tgt cct tta ctg cct gga aca tca act act tct aca ggc cct 915 Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro 290 295 300 tgc aag aca tgt aca atc cca gca caa ggc act tca atg ttt cca tcc 963 Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser 305 310 315 tgt tgc tgt aca aaa cca agt gat ggt aac tgt aca tgt ata cca atc 1011 Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile 320 325 330 cct tca tct tgg gct ttt gct aga ttc ctt tgg gag tgg gcc tct gtt 1059 Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val 335 340 345 aga ttc tcc tgg cta tct ctt caa gct cca ttt gtt caa tgg ttt gtc 1107 Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Gln Ala Pro Phe Val Gln Trp Phe Val 350 355 360 365 gga ttg tca cca act gtt tgg ttg tca gtg atc tgg atg atg tgg tac 1155 Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr 370 375 380 tgg ggt cca tct ttg tac aat atc tta aac cca ttt cta cca ttg ttg 1203 Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Asn Pro Phe Leu Pro Leu Leu 385 390 395 cca atc ttt ttc tgt ctt tgg gtc tac att gat att gat cca tac aaa 1251 Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys 400 405 410 gag ttt ggt gca tct gtc gaa tta cta tcc ttt ttg cca tca gac ttt 1299 Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe 415 420 425 ttc cct agt ata aga gac tta ttg gat act gct tct gct ttg tat aga 1347 Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg 430 435 440 445 gaa gca tta gaa tct cca gag cac tgt tct cca cat cat acc gca ttg 1395 Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu 450 455 460 aga caa gca att ctg tgc tgg ggc gag tta atg aac tta gct acc tgg 1443 Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp 465 470 475 gtt ggt tct aat ctg gaa gat cct gct tct aga gaa ttg gta gtt tcc 1491 Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser 480 485 490 tac gtg aat gta aac atg ggt ttg aag att agg caa cta ctt tgg ttt 1539 Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe 495 500 505 cac atc agt tgt ctg act ttc ggg aga gaa aca gtg ttg gaa tat ctt 1587 His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu 510 515 520 525 gtc tct ttt ggt gtg tgg att aga aca cca cca gct tat aga cct cct 1635 Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro 530 535 540 aat gct cca atc ctg agt aca ttg cca gag act acc gtt gtt aga agg 1683 Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg 545 550 555 aga ggt aga tcc cca aga cgt aga acc cct tct cca agg agg aga aga 1731 Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg 560 565 570 tca caa agt cct cgt cgt aga aga tcc cag agt aga gaa tct caa tgc 1779 Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 575 580 585 cat cat cat cac cac cat taa gcggccgc 1808 His His His His His His 590 595 <210> 34 <211> 595 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Met Ala Asp Glu Ala Pro Thr Ser Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg 1 5 10 15 Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe 20 25 30 Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro 35 40 45 Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln 50 55 60 Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly 65 70 75 80 Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro 85 90 95 Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro 100 105 110 Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln 115 120 125 Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg 130 135 140 Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro 145 150 155 160 Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly 165 170 175 Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro 180 185 190 Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr 195 200 205 Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly 210 215 220 Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn 225 230 235 240 His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met 245 250 255 Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu 260 265 270 Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys 275 280 285 Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr 290 295 300 Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys 305 310 315 320 Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser 325 330 335 Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser 340 345 350 Trp Leu Ser Leu Gln Ala Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 355 360 365 Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro 370 375 380 Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Asn Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe 385 390 395 400 Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly 405 410 415 Ala Ser Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser 420 425 430 Ile Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu 435 440 445 Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala 450 455 460 Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser 465 470 475 480 Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn 485 490 495 Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser 500 505 510 Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe 515 520 525 Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro 530 535 540 Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg 545 550 555 560 Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser 565 570 575 Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys His His His 580 585 590 His His His 595 <210> 35 <211> 2841 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic DNA <220> <221> CDS <222> (1)..(2841) <400> 35 atg gcc gat gaa gct cct tta ggg ttt ttc cct gat cat caa tta gac 48 Met Ala Asp Glu Ala Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp 1 5 10 15 cca gca ttc ggt gcc aat tcc aac aat cct gat tgg gac ttt aac cca 96 Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro 20 25 30 gag aat aca aca tct ggg ttc ctt ggt cca ctt ttg gtg ctg caa gct 144 Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala 35 40 45 ggc ttt ttc ctg tta act aga atc cta aca att cca caa agt ttg gat 192 Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp 50 55 60 tca tgg tgg aca tct ttg aac ttt ttg gga ggt gct cca acc tgt cct 240 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro 65 70 75 80 gga caa aac tcc caa tcc cca act tct aat cat tca cct aca tcc tgc 288 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 85 90 95 cca cct att tgt cct ggt tat cgt tgg atg tgt ctt aga cgt ttc att 336 Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 100 105 110 atc ttt ttg ttc ata cta ctg ttg tgt ctg att ttc ctg ttg gta ttg 384 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 115 120 125 ttg gat tac caa ggc atg ttg cca gtc tgt cct tta ctt cca ggc act 432 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr 130 135 140 tct act aca tca act ggc cct tgt aaa aca tgt act atc cca gct caa 480 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln 145 150 155 160 ggt act tca atg ttt cct agt tgt tgt tgt acc aaa cca tcc gat ggt 528 Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly 165 170 175 aat tgt aca tgc ata cca ata cca tct tca tgg gca ttt gca aga ttc 576 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe 180 185 190 ctt tgg gaa tgg gct tct gtg cgt ttt tcc tgg ctg tct ttg tta gtt 624 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 195 200 205 cct ttt gtc caa tgg ttt gtc ggt tta tct cca aca gta tgg ctg tct 672 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser 210 215 220 gct atc tgg atg atg tgg tat tgg gga cct tcc ttg tac aac att ctg 720 Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu 225 230 235 240 tct cca ttt ctg cct ttg tta cca atc ttt ttc tgt ctt tgg gtg tac 768 Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr 245 250 255 atc ctc gag gaa gat tgg ggt cct tgt act gaa cac ggt gaa cat aac 816 Ile Leu Glu Glu Asp Trp Gly Pro Cys Thr Glu His Gly Glu His Asn 260 265 270 atc aga ata cct aga act cca gct aga gtg aca gga ggt gtt ttc ctg 864 Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu 275 280 285 gta gac aaa aac cca cac aac aca gca gaa tct aga ctt gtc gtt gac 912 Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp 290 295 300 ttc agt caa ttc tcc aga ggg tct act cat gtt tca tgg cca aag ttt 960 Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Ser Thr His Val Ser Trp Pro Lys Phe 305 310 315 320 gca gtt cca aac ttg caa tca ttg act aat cta cta tct tca aat ctt 1008 Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu 325 330 335 agt tgg ttg tcc ttg gat gtc tct gct gca ttc tat cat ata cca ttg 1056 Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Ile Pro Leu 340 345 350 cat cct gca gcc atg cca cat ttg tta gtg ggt agt tct ggt ctg tca 1104 His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser 355 360 365 agg tac gtt gca aga cta tct tct act tct agg aat atc aat tac aaa 1152 Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Thr Ser Arg Asn Ile Asn Tyr Lys 370 375 380 cat ggg aca atg caa gac cta cat gat tca tgt tct aga aac ttg tac 1200 His Gly Thr Met Gln Asp Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr 385 390 395 400 gta tcc ctt tta cta ctt tac aaa aca ttt ggt aga aag ttg cac tta 1248 Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu 405 410 415 tac tca cat cca atc atc tta ggt ttc aga aag ata cct atg ggc gtc 1296 Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val 420 425 430 ggg tta tct cct ttt cta tta gca cag ttt acc tct gcc att tgt tca 1344 Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser 435 440 445 gtg gtt cgt aga gca ttt cct cat tgt cta gca ttt tca tac atg gac 1392 Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp 450 455 460 gat gtt gtc tta ggc gct aag tct gtt caa cac ctt gaa tca ctg ttt 1440 Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe 465 470 475 480 acc agt ata acc aat ttc ctt ttg agt cta ggc att cat ctg aat cct 1488 Thr Ser Ile Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro 485 490 495 aac aaa act aaa aga tgg gga tac tct ctt aac ttt atg ggt tac gtt 1536 Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val 500 505 510 atc gga tca tgg ggc acc ctt cca caa gag cat att gtc ctg aaa atc 1584 Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln Glu His Ile Val Leu Lys Ile 515 520 525 aag cag tgt ttt aga aaa ctg cca gtg aat aga cca att gat tgg aaa 1632 Lys Gln Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys 530 535 540 gtt tgc cag aga atc gta ggt tta ctt ggt ttt gcc gct cct ttc act 1680 Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr 545 550 555 560 cag tgc ggc tat cca gct ttg atg cca ttg tac gct tgt atc caa gct 1728 Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala 565 570 575 aag caa gct ttc aca ttc tct cca acc tat aag gct ttt cta tgc aag 1776 Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys 580 585 590 cag tac tta aac ctt tat cca gtg gct aga caa aga gat att gac cca 1824 Gln Tyr Leu Asn Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gln Arg Asp Ile Asp Pro 595 600 605 tac aaa gag ttt ggg gca tca gtt gaa tta cta tcc ttc cta cca tca 1872 Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser 610 615 620 gac ttt ttc cca tca atc aga gat ttg tta gat act gcc tct gca ttg 1920 Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu 625 630 635 640 tac aga gaa gct cta gaa tct cct gaa cat tgc tct cca cac cat act 1968 Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr 645 650 655 gcc ctt aga caa gca atc ttg tgt tgg ggc gaa ctt atg aat ttg gcc 2016 Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala 660 665 670 aca tgg gtt gga agt aat cta gaa gat cca gcc tca aga gag cta gtt 2064 Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val 675 680 685 gta tct tac gtc aac gtt aac atg ggt cta aag att agg caa tta cta 2112 Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu 690 695 700 tgg ttt cac att agt tgc tta act ttc ggt aga gaa aca gtg cta gag 2160 Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu 705 710 715 720 tat ttg gta tca ttt gga gta tgg atc aga act cca cct gca tat aga 2208 Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg 725 730 735 cca cca aat gct cca atc tta tct aca ctg cct gaa aca act gta gtc 2256 Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val 740 745 750 agg aga aga gga aga tca cca agg agg aga act cca tct cca agg aga 2304 Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg 755 760 765 cgt cgt tct cag tcc cct cgt aga cgt aga tct caa tca aga gaa tct 2352 Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser 770 775 780 caa tgc gca gcc aga gtt tgc tgt aaa ctt gac cca gcc aga gat gta 2400 Gln Cys Ala Ala Arg Val Cys Cys Lys Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val 785 790 795 800 cta tgt ctt aga cca gtt ggc gct gaa tca tct ggt aga cca gtc tca 2448 Leu Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Ser Gly Arg Pro Val Ser 805 810 815 ggc cca ttt ggg aca tta cca tcc cct tca agt agt gcc gta cct gca 2496 Gly Pro Phe Gly Thr Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ala Val Pro Ala 820 825 830 gat cac gga gca cat ctg tct cta aga gga ctt cct gtt tgt gct ttt 2544 Asp His Gly Ala His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe 835 840 845 agt tca gca gga cct tgc gcc ttg aga ttc aca tca gct agg aga atg 2592 Ser Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala Arg Arg Met 850 855 860 gaa aca aca gtt aat gct cat caa gtt ttg cca aaa gta tta cac aag 2640 Glu Thr Thr Val Asn Ala His Gln Val Leu Pro Lys Val Leu His Lys 865 870 875 880 aga aca ttg ggt ttg tct gcc atg agt acc act gac tta gaa gct tac 2688 Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr 885 890 895 ttt aag gat tgc gtt ttc aaa gat tgg gag gaa tta ggt gag gaa atc 2736 Phe Lys Asp Cys Val Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Ile 900 905 910 aga cta aaa gtt ttt gtg tta ggt ggt tgc aga cac aaa ttg gtc tgt 2784 Arg Leu Lys Val Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu Val Cys 915 920 925 tcc cct gct cca tgc aac ttt ttc acc tcc gcc cac cat cat cat cac 2832 Ser Pro Ala Pro Cys Asn Phe Phe Thr Ser Ala His His His His His 930 935 940 cat tga taa 2841 His 945 <210> 36 <211> 945 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Met Ala Asp Glu Ala Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp 1 5 10 15 Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro 20 25 30 Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala 35 40 45 Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp 50 55 60 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro 65 70 75 80 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 85 90 95 Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 100 105 110 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 115 120 125 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr 130 135 140 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln 145 150 155 160 Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly 165 170 175 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe 180 185 190 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 195 200 205 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser 210 215 220 Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu 225 230 235 240 Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr 245 250 255 Ile Leu Glu Glu Asp Trp Gly Pro Cys Thr Glu His Gly Glu His Asn 260 265 270 Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu 275 280 285 Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp 290 295 300 Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Ser Thr His Val Ser Trp Pro Lys Phe 305 310 315 320 Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu 325 330 335 Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Ile Pro Leu 340 345 350 His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser 355 360 365 Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Thr Ser Arg Asn Ile Asn Tyr Lys 370 375 380 His Gly Thr Met Gln Asp Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr 385 390 395 400 Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu 405 410 415 Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val 420 425 430 Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser 435 440 445 Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp 450 455 460 Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe 465 470 475 480 Thr Ser Ile Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro 485 490 495 Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val 500 505 510 Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln Glu His Ile Val Leu Lys Ile 515 520 525 Lys Gln 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Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val 740 745 750 Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg 755 760 765 Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser 770 775 780 Gln Cys Ala Ala Arg Val Cys Cys Lys Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val 785 790 795 800 Leu Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Ser Gly Arg Pro Val Ser 805 810 815 Gly Pro Phe Gly Thr Leu Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ala Val Pro Ala 820 825 830 Asp His Gly Ala His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe 835 840 845 Ser Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala Arg Arg Met 850 855 860 Glu Thr Thr Val Asn Ala His Gln Val Leu Pro Lys Val Leu His Lys 865 870 875 880 Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr 885 890 895 Phe Lys Asp Cys Val Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Ile 900 905 910 Arg Leu Lys Val Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu Val Cys 915 920 925 Ser Pro Ala Pro Cys Asn Phe Phe Thr Ser Ala His His His His His 930 935 940 His 945 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69 Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 70 Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile 1 5 <210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 71 Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 72 Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser 1 5 10 15 Val <210> 73 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 73 Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val 1 5 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 74 Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val 1 5 <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 75 Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val 1 5 10 <210> 76 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 76 Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val 1 5 10 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 77 Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg 1 5 10 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 78 His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Phe Val 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 79 Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu 1 5 <210> 80 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 80 Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu 1 5 10 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 81 Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu 1 5 <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 82 Asn Val Ser Ile Trp Thr His Lys 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 83 Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 84 Gly Leu Tyr Ser Ser Thr Val Pro Val 1 5 <210> 85 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 85 Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys 1 5 10 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 86 Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu 1 5 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 87 Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val 1 5 10 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 88 Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val 1 5 <210> 89 <211> 89 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 89 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Leu Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Asp Lys Arg Glu Ala Glu Ala 85 <210> 90 <211> 89 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 90 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Leu Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Asp Lys Arg Glu Ala Glu Ala 85 <210> 91 <211> 3107 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> CDS <222> (1)..(3096) <400> 91 atg aga ttt cct tca att ttt act gca gtt tta ttc gca gca tcc tcc 48 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 gca tca gct gct cca gtc aac act aca aca gaa gat gaa acg gca caa 96 Ala Ser Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 att ccg gct gaa gct gtc atc ggt tac tta gat tta gaa ggg gat ttc 144 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Leu Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 gat gtt gct gtt ttg cca ttt tcc aac agc aca aat aac ggg tta ttg 192 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 ttt ata aat act act att gcc agc att gct gct aaa gaa gaa ggg gta 240 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 tct cta gat aaa aga gag gct gaa gct act agt cct tta ggg ttt ttc 288 Ser Leu Asp Lys Arg Glu Ala Glu Ala Thr Ser Pro Leu Gly Phe Phe 85 90 95 cct gat cat caa tta gac cca gca ttc ggt gcc aat tcc aac aat cct 336 Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro 100 105 110 gat tgg gac ttt aac cca gag aat aca aca tct ggg ttc ctt ggt cca 384 Asp Trp Asp Phe Asn Pro Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro 115 120 125 ctt ttg gtg ctg caa gct ggc ttt ttc ctg tta act aga atc cta aca 432 Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr 130 135 140 att cca caa agt ttg gat tca tgg tgg aca tct ttg aac ttt ttg gga 480 Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly 145 150 155 160 ggt gct cca acc tgt cct gga caa aac tcc caa tcc cca act tct aat 528 Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn 165 170 175 cat tca cct aca tcc tgc cca cct att tgt cct ggt tat cgt tgg atg 576 His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met 180 185 190 tgt ctt aga cgt ttc att atc ttt ttg ttc ata cta ctg ttg tgt ctg 624 Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu 195 200 205 att ttc ctg ttg gta ttg ttg gat tac caa ggc atg ttg cca gtc tgt 672 Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys 210 215 220 cct tta ctt cca ggc act tct act aca tca act ggc cct tgt aaa aca 720 Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr 225 230 235 240 tgt act atc cca gct caa ggt act tca atg ttt cct agt tgt tgt tgt 768 Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys 245 250 255 acc aaa cca tcc gat ggt aat tgt aca tgc ata cca ata cca tct tca 816 Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser 260 265 270 tgg gca ttt gca aga ttc ctt tgg gaa tgg gct tct gtg cgt ttt tcc 864 Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser 275 280 285 tgg ctg tct ttg tta gtt cct ttt gtc caa tgg ttt gtc ggt tta tct 912 Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 290 295 300 cca aca gta tgg ctg tct gct atc tgg atg atg tgg tat tgg gga cct 960 Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro 305 310 315 320 tcc ttg tac aac att ctg tct cca ttt ctg cct ttg tta cca atc ttt 1008 Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe 325 330 335 ttc tgt ctt tgg gtg tac atc ctc gag gaa gat tgg ggt cct tgt act 1056 Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Leu Glu Glu Asp Trp Gly Pro Cys Thr 340 345 350 gaa cac ggt gaa cat aac atc aga ata cct aga act cca gct aga gtg 1104 Glu His Gly Glu His Asn Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val 355 360 365 aca gga ggt gtt ttc ctg gta gac aaa aac cca cac aac aca gca gaa 1152 Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Ala Glu 370 375 380 tct aga ctt gtc gtt gac ttc agt caa ttc tcc aga ggg tct act cat 1200 Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Ser Thr His 385 390 395 400 gtt tca tgg cca aag ttt gca gtt cca aac ttg caa tca ttg act aat 1248 Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn 405 410 415 cta cta tct tca aat ctt agt tgg ttg tcc ttg gat gtc tct gct gca 1296 Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala 420 425 430 ttc tat cat ata cca ttg cat cct gca gcc atg cca cat ttg tta gtg 1344 Phe Tyr His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Val 435 440 445 ggt agt tct ggt ctg tca agg tac gtt gca aga cta tct tct act tct 1392 Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Thr Ser 450 455 460 agg aat atc aat tac aaa cat ggg aca atg caa gac cta cat gat tca 1440 Arg Asn Ile Asn Tyr Lys His Gly Thr Met Gln Asp Leu His Asp Ser 465 470 475 480 tgt tct aga aac ttg tac gta tcc ctt tta cta ctt tac aaa aca ttt 1488 Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Thr Phe 485 490 495 ggt aga aag ttg cac tta tac tca cat cca atc atc tta ggt ttc aga 1536 Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg 500 505 510 aag ata cct atg ggc gtc ggg tta tct cct ttt cta tta gca cag ttt 1584 Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe 515 520 525 acc tct gcc att tgt tca gtg gtt cgt aga gca ttt cct cat tgt cta 1632 Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu 530 535 540 gca ttt tca tac atg gac gat gtt gtc tta ggc gct aag tct gtt caa 1680 Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln 545 550 555 560 cac ctt gaa tca ctg ttt acc agt ata acc aat ttc ctt ttg agt cta 1728 His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ser Ile Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu 565 570 575 ggc att cat ctg aat cct aac aaa act aaa aga tgg gga tac tct ctt 1776 Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu 580 585 590 aac ttt atg ggt tac gtt atc gga tca tgg ggc acc ctt cca caa gag 1824 Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln Glu 595 600 605 cat att gtc ctg aaa atc aag cag tgt ttt aga aaa ctg cca gtg aat 1872 His Ile Val Leu Lys Ile Lys Gln Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn 610 615 620 aga cca att gat tgg aaa gtt tgc cag aga atc gta ggt tta ctt ggt 1920 Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly 625 630 635 640 ttt gcc gct cct ttc act cag tgc ggc tat cca gct ttg atg cca ttg 1968 Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu 645 650 655 tac gct tgt atc caa gct aag caa gct ttc aca ttc tct cca acc tat 2016 Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr 660 665 670 aag gct ttt cta tgc aag cag tac tta aac ctt tat cca gtg gct aga 2064 Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Leu Asn Leu Tyr Pro Val Ala Arg 675 680 685 caa aga gat att gac cca tac aaa gag ttt ggg gca tca gtt gaa tta 2112 Gln Arg Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu 690 695 700 cta tcc ttc cta cca tca gac ttt ttc cca tca atc aga gat ttg tta 2160 Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu 705 710 715 720 gat act gcc tct gca ttg tac aga gaa gct cta gaa tct cct gaa cat 2208 Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His 725 730 735 tgc tct cca cac cat act gcc ctt aga caa gca atc ttg tgt tgg ggc 2256 Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly 740 745 750 gaa ctt atg aat ttg gcc aca tgg gtt gga agt aat cta gaa gat cca 2304 Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro 755 760 765 gcc tca aga gag cta gtt gta tct tac gtc aac gtt aac atg ggt cta 2352 Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu 770 775 780 aag att agg caa tta cta tgg ttt cac att agt tgc tta act ttc ggt 2400 Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly 785 790 795 800 aga gaa aca gtg cta gag tat ttg gta tca ttt gga gta tgg atc aga 2448 Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg 805 810 815 act cca cct gca tat aga cca cca aat gct cca atc tta tct aca ctg 2496 Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu 820 825 830 cct gaa aca act gta gtc agg aga aga gga aga tca cca agg agg aga 2544 Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg 835 840 845 act cca tct cca agg aga cgt cgt tct cag tcc cct cgt aga cgt aga 2592 Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg 850 855 860 tct caa tca aga gaa tct caa tgc gca gcc aga gtt tgc tgt aaa ctt 2640 Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys Ala Ala Arg Val Cys Cys Lys Leu 865 870 875 880 gac cca gcc aga gat gta cta tgt ctt aga cca gtt ggc gct gaa tca 2688 Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser 885 890 895 tct ggt aga cca gtc tca ggc cca ttt ggg aca tta cca tcc cct tca 2736 Ser Gly Arg Pro Val Ser Gly Pro Phe Gly Thr Leu Pro Ser Pro Ser 900 905 910 agt agt gcc gta cct gca gat cac gga gca cat ctg tct cta aga gga 2784 Ser Ser Ala Val Pro Ala Asp His Gly Ala His Leu Ser Leu Arg Gly 915 920 925 ctt cct gtt tgt gct ttt agt tca gca gga cct tgc gcc ttg aga ttc 2832 Leu Pro Val Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe 930 935 940 aca tca gct agg aga atg gaa aca aca gtt aat gct cat caa gtt ttg 2880 Thr Ser Ala Arg Arg Met Glu Thr Thr Val Asn Ala His Gln Val Leu 945 950 955 960 cca aaa gta tta cac aag aga aca ttg ggt ttg tct gcc atg agt acc 2928 Pro Lys Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr 965 970 975 act gac tta gaa gct tac ttt aag gat tgc gtt ttc aaa gat tgg gag 2976 Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp Cys Val Phe Lys Asp Trp Glu 980 985 990 gaa tta ggt gag gaa atc aga cta aaa gtt ttt gtg tta ggt ggt tgc 3024 Glu Leu Gly Glu Glu Ile Arg Leu Lys Val Phe Val Leu Gly Gly Cys 995 1000 1005 aga cac aaa ttg gtc tgt tcc cct gct cca tgc aac ttt ttc acc 3069 Arg His Lys Leu Val Cys Ser Pro Ala Pro Cys Asn Phe Phe Thr 1010 1015 1020 tcc gcc cac cat cat cat cac cat tga taagcggccg c 3107 Ser Ala His His His His His His 1025 1030 <210> 92 <211> 1031 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 92 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Leu Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Asp Lys Arg Glu Ala Glu Ala Thr Ser Pro Leu Gly Phe Phe 85 90 95 Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro 100 105 110 Asp Trp Asp Phe Asn Pro Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro 115 120 125 Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr 130 135 140 Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly 145 150 155 160 Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn 165 170 175 His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met 180 185 190 Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu 195 200 205 Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys 210 215 220 Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr 225 230 235 240 Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys 245 250 255 Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser 260 265 270 Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser 275 280 285 Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val 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tgg gat ttc aat cct atc aag gat cac tgg cct gaa gca 198 Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp Pro Glu Ala 40 45 50 aat caa gtt gga gtg ggg gca ttt ggt cca ggc ttc act cca cca cac 246 Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His 55 60 65 70 gga ggg gta ctt gga tgg agt cca cag gct caa ggt att ttg act act 294 Gly Gly Val Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr 75 80 85 gtt cca gct gtc cct cct cct gcg tca acc aat aga caa tct ggt aga 342 Val Pro Ala Val Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg 90 95 100 caa cct aca cca att tca cct cca ctt aga gac tct cat cct cag gca 390 Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala 105 110 115 atg caa tgg aac tca act acc ttc cat caa gct ctg ttg gat cct aga 438 Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg 120 125 130 gtt aga ggt ctg tat ttt cca gct ggc gga tca tct agt ggt acc gtg 486 Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val 135 140 145 150 aat cca gta cct act aca gcc tct cca atc agt tcc atc tca agt aga 534 Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Ser Ser Arg 155 160 165 act ggc gac cct gcc cca aat atg gaa aat atc aca tct gga ttt tta 582 Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu 170 175 180 ggg cca ttg cta gtc cta caa gct ggg ttt ttc cta ttg act aga atc 630 Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile 185 190 195 ttg acg att cca cag agt tta gac tcc tgg tgg act agc cta aac ttt 678 Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe 200 205 210 ttg ggt ggc tcc cca aca tgt cct ggc caa aac tct cag tct cca aca 726 Leu Gly Gly Ser Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr 215 220 225 230 agt aac cac tct cct act tca tgt cca cca att tgt cct ggt tac aga 774 Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg 235 240 245 tgg atg tgc ctc aga agg ttt atc att ttc ctt ttc ata ttg tta ttg 822 Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu 250 255 260 tgc ctc ata ttc cta ttg gta tta ttg gat tac caa ggg atg ctt cct 870 Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro 265 270 275 gtc tgt cca ttg ctc cct ggt acg agt aca aca tct act ggc cca tgc 918 Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys 280 285 290 aaa aca tgc acc ata cca gcg caa ggt aca agc atg ttt cca tcc tgt 966 Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys 295 300 305 310 tgt tgc aca aaa cca tcc gat ggc aat tgc aca tgc att cca ata cca 1014 Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro 315 320 325 tct tca tgg gcc ttc gct cgt ttc cta tgg gaa tgg gcc tca gtt aga 1062 Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg 330 335 340 ttt tcc tgg tta tca ttg ttg gtc cca ttt gtg caa tgg ttt gta ggt 1110 Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly 345 350 355 tta tcc cca acc gtc tgg tta tct gta ata tgg atg atg tgg tat tgg 1158 Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp 360 365 370 ggt cca agt tta tac tca atc gtt tca cct ttt atc cct ttg ctg cca 1206 Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro 375 380 385 390 atc ttt ttc tgt ttg tgg gtt tac att gat att gat cct tac aag gag 1254 Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu 395 400 405 ttt ggt gct act gtt gag tta cta tcc ttt tta cct tct gac ttt ttc 1302 Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe 410 415 420 cct tct gtc aga gat ctt ttg gat act gct tct gct tta tac aga gaa 1350 Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu 425 430 435 gct ttg gaa tca cca gaa cat tgt tca cct cat cat acc gcc tta aga 1398 Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg 440 445 450 caa gca att ctg tgt tgg ggc gaa tta atg aac cta gca aca tgg gtg 1446 Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val 455 460 465 470 ggt tcc aat ttg gaa gat cca gca tcc aga gag tta gtg gtt agc tac 1494 Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr 475 480 485 gtg aat gtc aac atg ggc ttg aaa atc aga cag tta ctt tgg ttc cat 1542 Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His 490 495 500 atc tct tgt ctg aca ttt ggt aga gaa aca gtt ctg gaa tat ctc gtt 1590 Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val 505 510 515 agc ttt gga gta tgg att aga act cca cca gcc tac aga cca cct aat 1638 Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn 520 525 530 gca cca ata ttg tca acc ctc cca gag aca aca gtt gtg agg aga aga 1686 Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg 535 540 545 550 gga aga tct cct cgt cgt aga act cca tct cca aga cga agg aga tca 1734 Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 555 560 565 caa agt cct aga cga cgt aga tct caa tct aga gag tct caa tgt 1779 Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 570 575 580 caccaccatc accatcatta agcggccgc 1808 <210> 112 <211> 581 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 112 Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser 1 5 10 15 Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 20 25 30 Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys 35 40 45 Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro 50 55 60 Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Val Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 65 70 75 80 Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Val Pro Pro Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg 100 105 110 Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln 115 120 125 Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ser Ile Ser Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn 165 170 175 Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe 180 185 190 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp 195 200 205 Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Thr Cys Pro Gly Gln 210 215 220 Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro 225 230 235 240 Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe 245 250 255 Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp 260 265 270 Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr 275 280 285 Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr 290 295 300 Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys 305 310 315 320 Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp 325 330 335 Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe 340 345 350 Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile 355 360 365 Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro 370 375 380 Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp 385 390 395 400 Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe 405 410 415 Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala 420 425 430 Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro 435 440 445 His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met 450 455 460 Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg 465 470 475 480 Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg 485 490 495 Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr 500 505 510 Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro 515 520 525 Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr 530 535 540 Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser 545 550 555 560 Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser 565 570 575 Arg Glu Ser Gln Cys 580 <210> 113 <211> 1808 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> CDS <222> (37)..(1779) <400> 113 gaattcgcca ccatggccga cgaggcacca actagt gga ggt tgg tca agt aaa 54 Gly Gly Trp Ser Ser Lys 1 5 cct agg aaa ggt atg gga act aac cta tcc gtc cct aac cct ctt ggg 102 Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly 10 15 20 ttt ttc cct gat cac caa cta gat cca gct ttt aag gcc aat agt gaa 150 Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Lys Ala Asn Ser Glu 25 30 35 aat cct gat tgg gac ttg aac cca cac aag gat aat tgg cca gag gcg 198 Asn Pro Asp Trp Asp Leu Asn Pro His Lys Asp Asn Trp Pro Glu Ala 40 45 50 aat cag gta ggc gtt ggg gcc ttt ggc cca ggc ttc acc cca cca cat 246 Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His 55 60 65 70 ggc ggc tta ctc ggt tgg tca cca caa gcc caa ggc ata ttg acg act 294 Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr 75 80 85 gtg cca gct gct cct cca cca gct agt aca aat aga caa tct ggt aga 342 Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg 90 95 100 caa cct aca cca att tct cca cca ctt aga gat tct cat cct caa gca 390 Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala 105 110 115 atg cag tgg aac agc act aca ttc cat caa gcc ctg tta gac cca aga 438 Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg 120 125 130 gtt aga ggt ttg tac ttt cct gca ggt ggt tca tct tct gga act gtc 486 Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val 135 140 145 150 aat cct gtt cag aca aca gct tca cca atc tct tcc att tta tcc aga 534 Asn Pro Val Gln Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Leu Ser Arg 155 160 165 act ggt gac cca gca cca aac atg gaa aac atc gca tca ggt ttt cta 582 Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Ile Ala Ser Gly Phe Leu 170 175 180 gga cca tta ttg gta ctt caa gct ggt ttc ttt ttg tta aca cgt atc 630 Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile 185 190 195 ttg acc att cca caa agc ttg gat tca tgg tgg act tct ctg aat ttc 678 Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe 200 205 210 ctc ggg gga acc cct aca tgt cct ggt caa aat tct caa tcc cca aca 726 Leu Gly Gly Thr Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr 215 220 225 230 agt tca cat tct cct acg tgc tgt cca cca att tgt cct ggt tac aga 774 Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg 235 240 245 tgg atg tgc ctc aga agg ttt atc att ttc ctt ttc ata ttg tta ttg 822 Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu 250 255 260 tgc ctc ata ttc cta ttg gta tta ttg gat tac caa ggg atg ctt cct 870 Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro 265 270 275 gtc tgt cca ttg ctc cct ggt acg agt aca aca tct act ggc cca tgc 918 Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys 280 285 290 aaa aca tgc acc ata cca gcg caa ggt aca agc atg ttt cca tcc tgt 966 Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys 295 300 305 310 tgt tgc aca aaa cca tcc gat ggc aat tgc aca tgc att cca ata cca 1014 Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro 315 320 325 tct tca tgg gcc ttc gct cgt ttc cta tgg gaa tgg gcc tca gtt aga 1062 Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg 330 335 340 ttt tcc tgg tta tca ttg ttg gtc cca ttt gtg caa tgg ttt gta ggt 1110 Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly 345 350 355 tta tcc cca acc gtc tgg tta tct gta ata tgg atg atg tgg tat tgg 1158 Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp 360 365 370 ggt cca agt tta tac tca atc gtt tca cct ttt atc cct ttg ctg cca 1206 Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro 375 380 385 390 atc ttt ttc tgt ttg tgg gtt tac att gat att gat cct tac aag gag 1254 Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu 395 400 405 ttt ggt gct act gtt gag tta cta tcc ttt tta cct tct gac ttt ttc 1302 Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe 410 415 420 cct tct gtc aga gat ctt ttg gat act gct tct gct tta tac aga gaa 1350 Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu 425 430 435 gct ttg gaa tca cca gaa cat tgt tca cct cat cat acc gcc tta aga 1398 Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg 440 445 450 caa gca att ctg tgt tgg ggc gaa tta atg aac cta gca aca tgg gtg 1446 Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val 455 460 465 470 ggt tcc aat ttg gaa gat cca gca tcc aga gag tta gtg gtt agc tac 1494 Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr 475 480 485 gtg aat gtc aac atg ggc ttg aaa atc aga cag tta ctt tgg ttc cat 1542 Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His 490 495 500 atc tct tgt ctg aca ttt ggt aga gaa aca gtt ctg gaa tat ctc gtt 1590 Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val 505 510 515 agc ttt gga gta tgg att aga act cca cca gcc tac aga cca cct aat 1638 Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn 520 525 530 gca cca ata ttg tca acc ctc cca gag aca aca gtt gtg agg aga aga 1686 Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg 535 540 545 550 gga aga tct cct cgt cgt aga act cca tct cca aga cga agg aga tca 1734 Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 555 560 565 caa agt cct aga cga cgt aga tct caa tct aga gag tct caa tgt 1779 Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 570 575 580 caccaccatc accatcatta agcggccgc 1808 <210> 114 <211> 581 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 114 Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser 1 5 10 15 Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 20 25 30 Phe Lys Ala Asn Ser Glu Asn Pro Asp Trp Asp Leu Asn Pro His Lys 35 40 45 Asp Asn Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro 50 55 60 Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 65 70 75 80 Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg 100 105 110 Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln 115 120 125 Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Gln Thr Thr Ala Ser Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ser Ile Leu Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn 165 170 175 Ile Ala Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe 180 185 190 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp 195 200 205 Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro Thr Cys Pro Gly Gln 210 215 220 Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys Pro Pro 225 230 235 240 Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe 245 250 255 Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp 260 265 270 Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr 275 280 285 Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr 290 295 300 Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys 305 310 315 320 Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp 325 330 335 Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe 340 345 350 Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile 355 360 365 Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro 370 375 380 Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp 385 390 395 400 Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe 405 410 415 Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala 420 425 430 Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro 435 440 445 His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met 450 455 460 Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg 465 470 475 480 Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg 485 490 495 Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr 500 505 510 Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro 515 520 525 Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr 530 535 540 Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser 545 550 555 560 Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser 565 570 575 Arg Glu Ser Gln Cys 580 <210> 115 <211> 1808 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> CDS <222> (37)..(1779) <400> 115 gaattcgcca ccatggccga cgaggcacca actagt ggt ggc tgg tct agt aaa 54 Gly Gly Trp Ser Ser Lys 1 5 cct aga aag ggt atg gga aca aac tta tca gtt cct aac cca ctg gga 102 Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly 10 15 20 ttt ttc cca gat cac caa ttg gat cca gct ttt ggt gca aat agt aac 150 Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn 25 30 35 aat cca gat tgg gac ttt aat cct aac aaa gat cat tgg cca gaa gca 198 Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala 40 45 50 aat cag gtg gga gtc gga gct ttc ggt cca ggc ttt acc cct cca cat 246 Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His 55 60 65 70 ggt ggg ttg tta ggc tgg tcc cca caa gca cag ggg att ttg act act 294 Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr 75 80 85 gtt cct gcc gct cct cct cct gcc tcc aca aat aga caa agt ggt agg 342 Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg 90 95 100 caa cca acc cca att tca cct cca ctt aga gat tct cat cca cag gca 390 Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala 105 110 115 atg caa tgg aac tcc act act ttt cac caa gca tta ctt gat cca aga 438 Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg 120 125 130 gta cgt ggt cta tac ttc cca gct ggg ggt tcc tct tca ggt aca gtt 486 Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val 135 140 145 150 aac cca gta cct aca aca gcc tct cca atc tca agc atc ttt tct aga 534 Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg 155 160 165 aca ggt gat cca gct cct aat atg gag aat acg act tct ggt ttc ctc 582 Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu 170 175 180 ggc cca ctg tta gtc ttg caa gct ggc ttt ttc cta ttg acc aga ata 630 Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile 185 190 195 ctt act atc cca caa tca cta gac agc tgg tgg aca tct ctc aac ttt 678 Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe 200 205 210 ttg gga gga gcg cca aca tgt cca ggc caa aat tca caa tct cct aca 726 Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr 215 220 225 230 tca aat cat tct cct aca agt tgt cca cca att tgt cct ggt tac aga 774 Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg 235 240 245 tgg atg tgc ctc aga agg ttt atc att ttc ctt ttc ata ttg tta ttg 822 Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu 250 255 260 tgc ctc ata ttc cta ttg gta tta ttg gat tac caa ggg atg ctt cct 870 Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro 265 270 275 gtc tgt cca ttg ctc cct ggt acg agt aca aca tct act ggc cca tgc 918 Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys 280 285 290 aaa aca tgc acc ata cca gcg caa ggt aca agc atg ttt cca 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tcc ttt tta cct tct gac ttt ttc 1302 Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe 410 415 420 cct tct gtc aga gat ctt ttg gat act gct tct gct tta tac aga gaa 1350 Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu 425 430 435 gct ttg gaa tca cca gaa cat tgt tca cct cat cat acc gcc tta aga 1398 Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg 440 445 450 caa gca att ctg tgt tgg ggc gaa tta atg aac cta gca aca tgg gtg 1446 Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val 455 460 465 470 ggt tcc aat ttg gaa gat cca gca tcc aga gag tta gtg gtt agc tac 1494 Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr 475 480 485 gtg aat gtc aac atg ggc ttg aaa atc aga cag tta ctt tgg ttc cat 1542 Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His 490 495 500 atc tct tgt ctg aca ttt ggt aga gaa aca gtt ctg gaa tat ctc gtt 1590 Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val 505 510 515 agc ttt gga gta tgg att aga act cca cca gcc tac aga cca cct aat 1638 Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn 520 525 530 gca cca ata ttg tca acc ctc cca gag aca aca gtt gtg agg aga aga 1686 Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg 535 540 545 550 gga aga tct cct cgt cgt aga act cca tct cca aga cga agg aga tca 1734 Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 555 560 565 caa agt cct aga cga cgt aga tct caa tct aga gag tct caa tgt 1779 Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 570 575 580 caccaccatc accatcatta agcggccgc 1808 <210> 116 <211> 581 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 116 Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser 1 5 10 15 Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 20 25 30 Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys 35 40 45 Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro 50 55 60 Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 65 70 75 80 Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg 100 105 110 Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln 115 120 125 Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn 165 170 175 Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe 180 185 190 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp 195 200 205 Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln 210 215 220 Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro 225 230 235 240 Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe 245 250 255 Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp 260 265 270 Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr 275 280 285 Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr 290 295 300 Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys 305 310 315 320 Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp 325 330 335 Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe 340 345 350 Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile 355 360 365 Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro 370 375 380 Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp 385 390 395 400 Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe 405 410 415 Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala 420 425 430 Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro 435 440 445 His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met 450 455 460 Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg 465 470 475 480 Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg 485 490 495 Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr 500 505 510 Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro 515 520 525 Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr 530 535 540 Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser 545 550 555 560 Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser 565 570 575 Arg Glu Ser Gln Cys 580 <210> 117 <211> 1808 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> CDS <222> (37)..(1779) <400> 117 gaattcgcca ccatggctga tgaagctcca actagt gga caa tgg tcc tca aag 54 Gly Gln Trp Ser Ser Lys 1 5 cca agg aaa ggt atg ggt aca aac ttg agt gtt tca aac cca ctt ggc 102 Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Ser Asn Pro Leu Gly 10 15 20 ttt ttc cca gac cat caa ctt gat cca gca ttc aga gca aac tct gcc 150 Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Ser Ala 25 30 35 aac cca gac tgg gat ttc aat cca aac aaa gat acc tgg cct gaa gca 198 Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Glu Ala 40 45 50 aat caa gtt gga gtg ggg gca ttt ggt ttg ggc ttc act cca cca cac 246 Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His 55 60 65 70 gga ggg ttg ctt gga tgg agt cca cag gct caa ggc att ttg caa act 294 Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr 75 80 85 gtt cca gct aat cct cct cct gct tca acc aat aga caa tct ggt aga 342 Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg 90 95 100 caa cct aca cca att tca cct cca ctt aga gac tct cat cct cag gca 390 Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala 105 110 115 atg caa tgg aac tca act acc ttc cat caa gct ctg ttg gat cct aga 438 Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg 120 125 130 gtt aga ggt ctg tat ttc cca gct ggc gga tca tct agt ggt acc gtg 486 Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val 135 140 145 150 aat cca gta cct act aca gcc tct cca atc agt tcc atc ttt agt aga 534 Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg 155 160 165 act ggc gac cct gcc ttg aat atg gag aac atc aca tct gga ttc ctg 582 Thr Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu 170 175 180 ggg cca ttg cta gtc cta caa gct ggg ttt ttc cta ttg act aga atc 630 Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile 185 190 195 ttg aca att cca cag agt tta gac tcc tgg tgg acc agt cta aac ttt 678 Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe 200 205 210 ttg ggt ggc aca aca aca tgt cct ggc caa aac tct cag tct cca aca 726 Leu Gly Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr 215 220 225 230 agt aac cac tct cct act tca tgt cca cca att tgt cct ggt tac aga 774 Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg 235 240 245 tgg atg tgc ctc aga agg ttt atc att ttc ctt ttc ata ttg tta ttg 822 Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu 250 255 260 tgc ctc ata ttc cta ttg gta tta ttg gat tac caa ggg atg ctt cct 870 Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro 265 270 275 gtc tgt cca ttg ctc cct ggt acg agt aca aca tct act ggc cca tgc 918 Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys 280 285 290 aaa aca tgc acc ata cca gcg caa ggt aca agc atg ttt cca tcc tgt 966 Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys 295 300 305 310 tgt tgc aca aaa cca tcc gat ggc aat tgc aca tgc att cca ata cca 1014 Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro 315 320 325 tct tca tgg gcc ttc gct cgt ttc cta tgg gaa tgg gcc tca gtt aga 1062 Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg 330 335 340 ttt tcc tgg tta tca ttg ttg gtc cca ttt gtg caa tgg ttt gta ggt 1110 Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly 345 350 355 tta tcc cca acc gtc tgg tta tct gta ata tgg atg atg tgg tat tgg 1158 Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp 360 365 370 ggt cca agt tta tac tca atc gtt tca cct ttt atc cct ttg ctg cca 1206 Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro 375 380 385 390 atc ttt ttc tgt ttg tgg gtt tac att gat att gat cct tac aag gag 1254 Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu 395 400 405 ttt ggt gct act gtt gag tta cta tcc ttt tta cct tct gac ttt ttc 1302 Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe 410 415 420 cct tct gtc aga gat ctt ttg gat act gct tct gct tta tac aga gaa 1350 Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu 425 430 435 gct ttg gaa tca cca gaa cat tgt tca cct cat cat acc gcc tta aga 1398 Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg 440 445 450 caa gca att ctg tgt tgg ggc gaa tta atg aac cta gca aca tgg gtg 1446 Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val 455 460 465 470 ggt tcc aat ttg gaa gat cca gca tcc aga gag tta gtg gtt agc tac 1494 Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr 475 480 485 gtg aat gtc aac atg ggc ttg aaa atc aga cag tta ctt tgg ttc cat 1542 Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His 490 495 500 atc tct tgt ctg aca ttt ggt aga gaa aca gtt ctg gaa tat ctc gtt 1590 Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val 505 510 515 agc ttt gga gta tgg att aga act cca cca gcc tac aga cca cct aat 1638 Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn 520 525 530 gca cca ata ttg tca acc ctc cca gag aca aca gtt gtg agg aga aga 1686 Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg 535 540 545 550 gga aga tct cct cgt cgt aga act cca tct cca aga cga agg aga tca 1734 Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 555 560 565 caa agt cct aga cga cgt aga tct caa tct aga gag tct caa tgt 1779 Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 570 575 580 caccaccatc accatcatta agcggccgc 1808 <210> 118 <211> 581 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 118 Gly Gln Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser 1 5 10 15 Val Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 20 25 30 Phe Arg Ala Asn Ser Ala Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys 35 40 45 Asp Thr Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu 50 55 60 Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 65 70 75 80 Gln Gly Ile Leu Gln Thr Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg 100 105 110 Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln 115 120 125 Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn 165 170 175 Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe 180 185 190 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp 195 200 205 Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln 210 215 220 Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro 225 230 235 240 Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe 245 250 255 Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp 260 265 270 Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr 275 280 285 Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr 290 295 300 Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys 305 310 315 320 Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp 325 330 335 Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe 340 345 350 Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile 355 360 365 Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro 370 375 380 Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp 385 390 395 400 Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe 405 410 415 Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala 420 425 430 Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro 435 440 445 His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met 450 455 460 Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg 465 470 475 480 Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg 485 490 495 Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr 500 505 510 Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro 515 520 525 Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr 530 535 540 Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser 545 550 555 560 Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser 565 570 575 Arg Glu Ser Gln Cys 580 <210> 119 <211> 2492 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> CDS <222> (37)..(2463) <400> 119 gaattcgcca ccatggctga tgaagctcct actagt ggt cag tgg tcc tcc aaa 54 Gly Gln Trp Ser Ser Lys 1 5 cct aga aag ggt atg ggt act aat ttg tct gta tct aac cct ctc gga 102 Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Ser Asn Pro Leu Gly 10 15 20 ttc ttt cca gat cac cag tta gat cca gct ttt cgt gct aac agt gcc 150 Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Ser Ala 25 30 35 aac cca gat tgg gat ttc aat cct aat aag gat acc tgg cca gag gct 198 Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Glu Ala 40 45 50 aac cag gta gga gtt gga gcc ttc ggt cta ggt ttt acc cca cct cac 246 Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His 55 60 65 70 ggt gga cta tta ggc tgg agc cca caa gca caa ggt atc ttg caa acc 294 Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr 75 80 85 gtt cca gct aac cct cca cca gcg tca aca aat aga cag tct ggt aga 342 Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg 90 95 100 caa cca acc cct att tct cct cct tta aga gac tct cat cct cag gcg 390 Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala 105 110 115 atg caa tgg aac tca acg acc ttt cat caa gct ctt ttg gac cct aga 438 Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg 120 125 130 gtc agg ggt tta tac ttc cca gct ggt gga tcc tca tcc ggc act gtt 486 Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val 135 140 145 150 aat cct gtc cca act aca gca tca cca att tca tcc ata ttt tct aga 534 Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg 155 160 165 act ggg gat cct gct ctt aat atg gaa aac att aca agc ggc ttc cta 582 Thr Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu 170 175 180 gga cca tta tta gtt cta caa gcc gga ttt ttc cta ttg act aga atc 630 Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile 185 190 195 cta act att cct caa agt ctt gac tcc tgg tgg aca tcc ttg aat ttc 678 Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe 200 205 210 ctt ggc ggt aca aca aca tgt cca ggc caa aac tct caa tca cca act 726 Leu Gly Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr 215 220 225 230 tct aat cac tct cca aca tct tgc cct cca att tgc cca ggt tac aga 774 Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg 235 240 245 tgg atg tgc ttg aga agg ttc atc att ttt ctg ttc atc ctc ttg ttg 822 Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu 250 255 260 tgt ttg att ttc ctc tta gta ttg ctg gac tac caa ggc atg ctt cca 870 Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro 265 270 275 gtc tgc cct cta ttg cca gga act tct aca acc tca aca gga cca tgt 918 Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys 280 285 290 aaa aca tgt act atc cct gct caa gga aca tca atg ttt cca tct tgt 966 Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys 295 300 305 310 tgc tgt aca aaa cca tca gat ggt aat tgt act tgt ata cca ata cca 1014 Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro 315 320 325 agt tca tgg gca ttt gcc cgt ttc ctt tgg gag tgg gct tct gta aga 1062 Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu 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tgc ctc gca ttt tca tac 2070 Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr 665 670 675 atg gat gat gtt gtc tta ggt gcc aaa agt gta caa cat ttg gag agt 2118 Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser 680 685 690 ttg ttt aca gcc gta act aac ttt ctc ttg tca tta ggg atc cat ttg 2166 Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu 695 700 705 710 aac cct aac aaa aca aaa aga tgg ggg tac tct cta cat ttt atg ggt 2214 Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu His Phe Met Gly 715 720 725 tat gtt ata ggc tgc tat gga tcc tta cct caa gac cat atc att cag 2262 Tyr Val Ile Gly Cys Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Asp His Ile Ile Gln 730 735 740 aaa atc aaa gag tgc ttt aga aag ttg cct gtt aat aga cca atc gac 2310 Lys Ile Lys Glu Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp 745 750 755 tgg aag gtt tgt caa agg atc gtt ggt tta ctt ggt ttt gca gca cca 2358 Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro 760 765 770 ttc acc caa tgt ggc tac cct gct ctg atg cct tta tat gct tgt ata 2406 Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile 775 780 785 790 caa tct aag caa gct ttt aca ttc tct cca acg tac aag gcc ttt tta 2454 Gln Ser Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu 795 800 805 tgc aaa caa catcaccatc accatcacta agcggccgc 2492 Cys Lys Gln <210> 120 <211> 809 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 120 Gly Gln Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser 1 5 10 15 Val Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 20 25 30 Phe Arg Ala Asn Ser Ala Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys 35 40 45 Asp Thr Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu 50 55 60 Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 65 70 75 80 Gln Gly Ile Leu Gln Thr Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg 100 105 110 Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln 115 120 125 Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn 165 170 175 Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe 180 185 190 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp 195 200 205 Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln 210 215 220 Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro 225 230 235 240 Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe 245 250 255 Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp 260 265 270 Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr 275 280 285 Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr 290 295 300 Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys 305 310 315 320 Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp 325 330 335 Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe 340 345 350 Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile 355 360 365 Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro 370 375 380 Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp 385 390 395 400 Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe 405 410 415 Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala 420 425 430 Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro 435 440 445 His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met 450 455 460 Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg 465 470 475 480 Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg 485 490 495 Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr 500 505 510 Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro 515 520 525 Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr 530 535 540 Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser 545 550 555 560 Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser 565 570 575 Arg Glu Ser Gln Cys Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser 580 585 590 Asn Ser Arg Ile Phe Asn His Gln His Gly Thr Met Gln Asn Leu His 595 600 605 Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Gln 610 615 620 Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly 625 630 635 640 Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala 645 650 655 Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His 660 665 670 Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser 675 680 685 Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu 690 695 700 Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr 705 710 715 720 Ser Leu His Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Cys Tyr Gly Ser Leu Pro 725 730 735 Gln Asp His Ile Ile Gln Lys Ile Lys Glu Cys Phe Arg Lys Leu Pro 740 745 750 Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu 755 760 765 Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met 770 775 780 Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro 785 790 795 800 Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln 805 <210> 121 <211> 1988 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> CDS <222> (37)..(1959) <400> 121 gaattcgcca ccatggccga tgaggcacct actagt ggt cag tgg tcc tcc aaa 54 Gly Gln Trp Ser Ser Lys 1 5 cct aga aag ggt atg ggt act aat ttg tct gta tct aac cct ctc gga 102 Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Ser Asn Pro Leu Gly 10 15 20 ttc ttt cca gat cac cag tta gat cca gct ttt cgt gct aac agt gcc 150 Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Ser Ala 25 30 35 aac cca gat tgg gat ttc aat cct aat aag gat acc tgg cca gag gct 198 Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Glu Ala 40 45 50 aac cag gta gga gtt gga gcc ttc ggt cta ggt ttt acc cca cct cac 246 Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His 55 60 65 70 ggt gga cta tta ggc tgg agc cca caa gca caa ggt atc ttg caa acc 294 Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr 75 80 85 gtt cca gct aac cct cca cca gcg tca aca aat aga cag tct ggt aga 342 Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg 90 95 100 caa cca acc cct att tct cct cct tta aga gac tct cat cct cag gcg 390 Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala 105 110 115 atg caa tgg aac tca acg acc ttt cat caa gct ctt ttg gac cct aga 438 Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg 120 125 130 gtc agg ggt tta tac ttc cca gct ggt gga tcc tca tcc ggc act gtt 486 Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val 135 140 145 150 aat cct gtc cca act aca gca tca cca att tca tcc ata ttt tct aga 534 Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg 155 160 165 act ggg gat cct gct ctt aat atg gaa aac att aca agc ggc ttc cta 582 Thr Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu 170 175 180 gga cca tta tta gtt cta caa gcc gga ttt ttc cta ttg act aga atc 630 Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile 185 190 195 cta act att cct caa agt ctt gac tcc tgg tgg aca tcc ttg aat ttc 678 Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe 200 205 210 ctt ggc ggt aca aca aca tgt cca ggc caa aac tct caa tca cca act 726 Leu Gly Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr 215 220 225 230 tct aat cac tct cca aca tct tgc cct cca att tgc cca ggt tac aga 774 Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg 235 240 245 tgg atg tgc ttg aga agg ttc atc att ttt ctg ttc atc ctc ttg ttg 822 Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu 250 255 260 tgt ttg att ttc ctc tta gta ttg ctg gac tac caa ggc atg ctt cca 870 Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro 265 270 275 gtc tgc cct cta ttg cca gga act tct aca acc tca aca gga cca tgt 918 Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys 280 285 290 aaa aca tgt act atc cct gct caa gga aca tca atg ttt cca tct tgt 966 Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys 295 300 305 310 tgc tgt aca aaa cca tca gat ggt aat tgt act tgt ata cca ata cca 1014 Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro 315 320 325 agt tca tgg gca ttt gcc cgt ttc ctt tgg gag tgg gct tct gta aga 1062 Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg 330 335 340 ttc tct tgg tta agt ttg cta gtc cca ttc gtg cag tgg ttt gtt ggc 1110 Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly 345 350 355 ctg tct cca act gtt tgg tta tct gtt att tgg atg atg tgg tac tgg 1158 Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp 360 365 370 ggt cca agc cta tac tca atc gtg tca cct ttt atc cca ttg cta cct 1206 Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro 375 380 385 390 atc ttt ttc tgc ctc tgg gtt tac atc gat att gac cct tac aag gaa 1254 Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu 395 400 405 ttt ggc gca aca gtt gaa ttg tta tca ttt tta cca tca gat ttc ttt 1302 Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe 410 415 420 cca tca gtg cgt gat ttg tta gat acg gca tcc gct ttg tac aga gaa 1350 Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu 425 430 435 gca ctg gaa tca cca gaa cac tgt tct cca cat cac act gct ctc aga 1398 Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg 440 445 450 caa gct ata ttg tgt tgg gga gag ttg atg aat cta gcc act tgg gta 1446 Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val 455 460 465 470 ggg tcc aat ctg gaa gat cct gcc tct aga gaa ctg gtg gta tct tac 1494 Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr 475 480 485 gtc aat gtt aac atg ggg ttg aag att aga caa ctt tta tgg ttc cat 1542 Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His 490 495 500 att tca tgt tta acg ttt ggt aga gaa aca gta ctg gaa tac tta gtt 1590 Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val 505 510 515 agt ttc ggt gtc tgg att aga aca cca cca gca tat aga cca cca aat 1638 Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn 520 525 530 gcg cct ata ttg agt acg ctc cca gaa acg acg gtc gtt agg aga aga 1686 Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg 535 540 545 550 ggt aga tca cct agg aga agg aca cct tca cct aga cgt aga cgt tct 1734 Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 555 560 565 caa tct cca aga cgt aga aga tct caa tct aga gaa tca caa tgc cac 1782 Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys His 570 575 580 ctc tca tta aga ggc cta ttt gtt tgt gca ttc tcc tct gct ggt cca 1830 Leu Ser Leu Arg Gly Leu Phe Val Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly Pro 585 590 595 aat gct cac caa ttc ctt cct aaa gtc ctg cat aaa cgt acc ctc ggg 1878 Asn Ala His Gln Phe Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly 600 605 610 cta agt gca atg tct act act gac ctt gag gca tat ttc aaa gac tgc 1926 Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp Cys 615 620 625 630 ttg ttt aaa gat tgg gaa gag ctt ggc gaa gag catcaccatc accatcacta 1979 Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu 635 640 agcggccgc 1988 <210> 122 <211> 641 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 122 Gly Gln Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser 1 5 10 15 Val Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 20 25 30 Phe Arg Ala Asn Ser Ala Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys 35 40 45 Asp Thr Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu 50 55 60 Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 65 70 75 80 Gln Gly Ile Leu Gln Thr Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg 100 105 110 Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln 115 120 125 Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn 165 170 175 Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe 180 185 190 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp 195 200 205 Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln 210 215 220 Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro 225 230 235 240 Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe 245 250 255 Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp 260 265 270 Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr 275 280 285 Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr 290 295 300 Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys 305 310 315 320 Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp 325 330 335 Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe 340 345 350 Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile 355 360 365 Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro 370 375 380 Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp 385 390 395 400 Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe 405 410 415 Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala 420 425 430 Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro 435 440 445 His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met 450 455 460 Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg 465 470 475 480 Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg 485 490 495 Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr 500 505 510 Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro 515 520 525 Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr 530 535 540 Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser 545 550 555 560 Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser 565 570 575 Arg Glu Ser Gln Cys His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Phe Val Cys Ala 580 585 590 Phe Ser Ser Ala Gly Pro Asn Ala His Gln Phe Leu Pro Lys Val Leu 595 600 605 His Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu 610 615 620 Ala Tyr Phe Lys Asp Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu 625 630 635 640 Glu <210> 123 <211> 2672 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> CDS <222> (37)..(2643) <400> 123 gaattcgcca ccatggctga tgaagctcct actagt ggt cag tgg tcc tcc aaa 54 Gly Gln Trp Ser Ser Lys 1 5 cct aga aag ggt atg ggt act aat ttg tct gta tct aac cct ctc gga 102 Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Ser Asn Pro Leu Gly 10 15 20 ttc ttt cca gat cac cag tta gat cca gct ttt cgt gct aac agt gcc 150 Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Ser Ala 25 30 35 aac cca gat tgg gat ttc aat cct aat aag gat acc tgg cca gag gct 198 Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Glu Ala 40 45 50 aac cag gta gga gtt gga gcc ttc ggt cta ggt ttt acc cca cct cac 246 Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His 55 60 65 70 ggt gga cta tta ggc tgg agc cca caa gca caa ggt atc ttg caa acc 294 Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr 75 80 85 gtt cca gct aac cct cca cca gcg tca aca aat aga cag tct ggt aga 342 Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg 90 95 100 caa cca acc cct att tct cct cct tta aga gac tct cat cct cag gcg 390 Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala 105 110 115 atg caa tgg aac tca acg acc ttt cat caa gct ctt ttg gac cct aga 438 Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg 120 125 130 gtc agg ggt tta tac ttc cca gct ggt gga tcc tca tcc ggc act gtt 486 Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val 135 140 145 150 aat cct gtc cca act aca gca tca cca att tca 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ctg gac tac caa ggc atg ctt cca 870 Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro 265 270 275 gtc tgc cct cta ttg cca gga act tct aca acc tca aca gga cca tgt 918 Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys 280 285 290 aaa aca tgt act atc cct gct caa gga aca tca atg ttt cca tct tgt 966 Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys 295 300 305 310 tgc tgt aca aaa cca tca gat ggt aat tgt act tgt ata cca ata cca 1014 Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro 315 320 325 agt tca tgg gca ttt gcc cgt ttc ctt tgg gag tgg gct tct gta aga 1062 Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg 330 335 340 ttc tct tgg tta agt ttg cta gtc cca ttc gtg cag tgg ttt gtt ggc 1110 Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly 345 350 355 ctg tct cca act gtt tgg tta tct gtt att tgg atg atg tgg tac tgg 1158 Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp 360 365 370 ggt cca agc cta tac tca atc gtg tca cct ttt atc cca ttg cta cct 1206 Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro 375 380 385 390 atc ttt ttc tgc ctc tgg gtt tac atc gat att gac cct tac aag gaa 1254 Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu 395 400 405 ttt ggc gca aca gtt gaa ttg tta tca ttt tta cca tca gat ttc ttt 1302 Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe 410 415 420 cca tca gtg cgt gat ttg tta gat acg gca tcc gct ttg tac aga gaa 1350 Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu 425 430 435 gca ctg gaa tca cca gaa cac tgt tct cca cat cac act gct ctc aga 1398 Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg 440 445 450 caa gct ata ttg tgt tgg gga gag ttg atg aat cta gcc act tgg gta 1446 Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val 455 460 465 470 ggg tcc aat ctg gaa gat cct gcc tct aga gaa ctg gtg gta tct tac 1494 Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr 475 480 485 gtc aat gtt aac atg ggg ttg aag att aga caa ctt tta tgg ttc cat 1542 Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His 490 495 500 att tca tgt tta acg ttt ggt aga gaa aca gta ctg gaa tac tta gtt 1590 Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val 505 510 515 agt ttc ggt gtc tgg att aga aca cca cca gca tat aga cca cca aat 1638 Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn 520 525 530 gcg cct ata ttg agt acg ctc cca gaa acg acg gtc gtt agg aga aga 1686 Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg 535 540 545 550 ggt aga tca cct agg aga agg aca cct tca cct aga cgt aga cgt tct 1734 Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 555 560 565 caa tct cca aga cgt aga aga tct caa tct aga gaa tca caa tgc ggt 1782 Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys Gly 570 575 580 cta tct aga tat gtc gcc cga cta tca tct aat tct cgt atc ttt aac 1830 Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Phe Asn 585 590 595 cat caa cac ggc acc atg caa aat ctg cat gac tcc tgt agt aga aat 1878 His Gln His Gly Thr Met Gln Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn 600 605 610 ctt tat gtg agt ctc ttg ctt ttg tac caa act ttc ggc aga aaa ttg 1926 Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg Lys Leu 615 620 625 630 cac ctt tac tct cat cca att ata cta ggt ttt aga aaa atc cca atg 1974 His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met 635 640 645 ggg gtg ggt tta tct cca ttt ttg ctt gcg caa ttc aca agt gca atc 2022 Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile 650 655 660 tgt tct gtg gtt agg aga gct ttt cct cat tgc ctc gca ttt tca tac 2070 Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr 665 670 675 atg gat gat gtt gtc tta ggt gcc aaa agt gta caa cat ttg gag agt 2118 Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser 680 685 690 ttg ttt aca gcc gta act aac ttt ctc ttg tca tta ggg atc cat ttg 2166 Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu 695 700 705 710 aac cct aac aaa aca aaa aga tgg ggg tac tct cta cat ttt atg ggt 2214 Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu His Phe Met Gly 715 720 725 tat gtt ata ggc tgc tat gga tcc tta cct caa gac cat atc att cag 2262 Tyr Val Ile Gly Cys Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Asp His Ile Ile Gln 730 735 740 aaa atc aaa gag tgc ttt aga aag ttg cct gtt aat aga cca atc gac 2310 Lys Ile Lys Glu Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp 745 750 755 tgg aag gtt tgt caa agg atc gtt ggt tta ctt ggt ttt gca gca cca 2358 Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro 760 765 770 ttc acc caa tgt ggc tac cct gct ctg atg cct tta tat gct tgt ata 2406 Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile 775 780 785 790 caa tct aag caa gct ttt aca ttc tct cca acg tac aag gcc ttt tta 2454 Gln Ser Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu 795 800 805 tgc aaa caa cac tta tca cta aga gga ctt ttt gtg tgt gct ttc tct 2502 Cys Lys Gln His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Phe Val Cys Ala Phe Ser 810 815 820 tct gca ggc cca aat gca cac cag ttt ttg cct aaa gtg ttg cat aag 2550 Ser Ala Gly Pro Asn Ala His Gln Phe Leu Pro Lys Val Leu His Lys 825 830 835 aga act cta ggc ttg tcc gca atg tcc aca act gat cta gaa gca tat 2598 Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr 840 845 850 ttc aaa gac tgt ctt ttt aag gat tgg gaa gag ttg ggt gaa gag 2643 Phe Lys Asp Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu 855 860 865 catcaccatc atcatcatta agcggccgc 2672 <210> 124 <211> 869 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 124 Gly Gln Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser 1 5 10 15 Val Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 20 25 30 Phe Arg Ala Asn Ser Ala Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys 35 40 45 Asp Thr Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu 50 55 60 Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 65 70 75 80 Gln Gly Ile Leu Gln Thr Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg 100 105 110 Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln 115 120 125 Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn 165 170 175 Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe 180 185 190 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp 195 200 205 Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln 210 215 220 Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro 225 230 235 240 Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe 245 250 255 Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp 260 265 270 Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr 275 280 285 Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr 290 295 300 Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys 305 310 315 320 Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp 325 330 335 Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe 340 345 350 Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile 355 360 365 Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro 370 375 380 Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp 385 390 395 400 Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe 405 410 415 Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala 420 425 430 Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro 435 440 445 His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met 450 455 460 Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg 465 470 475 480 Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg 485 490 495 Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr 500 505 510 Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro 515 520 525 Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr 530 535 540 Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser 545 550 555 560 Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser 565 570 575 Arg Glu Ser Gln Cys Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser 580 585 590 Asn Ser Arg Ile Phe Asn His Gln His Gly Thr Met Gln Asn Leu His 595 600 605 Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Gln 610 615 620 Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly 625 630 635 640 Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala 645 650 655 Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His 660 665 670 Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser 675 680 685 Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu 690 695 700 Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr 705 710 715 720 Ser Leu His Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Cys Tyr Gly Ser Leu Pro 725 730 735 Gln Asp His Ile Ile Gln Lys Ile Lys Glu Cys Phe Arg Lys Leu Pro 740 745 750 Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu 755 760 765 Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met 770 775 780 Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro 785 790 795 800 Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln His Leu Ser Leu Arg Gly Leu 805 810 815 Phe Val Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly Pro Asn Ala His Gln Phe Leu 820 825 830 Pro Lys Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr 835 840 845 Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu 850 855 860 Glu Leu Gly Glu Glu 865 <210> 125 <211> 2672 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> CDS <222> (37)..(2643) <400> 125 gaattcgcca ccatggccga tgaggcacct actagt ggt cag tgg tcc tcc aaa 54 Gly Gln Trp Ser Ser Lys 1 5 cct aga aag ggt atg ggt act aat ttg tct gta tct aac cct ctc gga 102 Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Ser Asn Pro Leu Gly 10 15 20 ttc ttt cca gat cac cag tta gat cca gct ttt cgt gct aac agt gcc 150 Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Ser Ala 25 30 35 aac cca gat tgg gat ttc aat cct aat aag gat acc tgg cca gag gct 198 Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Glu Ala 40 45 50 aac cag gta gga gtt gga gcc ttc ggt cta ggt ttt acc cca cct cac 246 Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His 55 60 65 70 ggt gga cta tta ggc tgg agc cca caa gca caa ggt atc ttg caa acc 294 Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr 75 80 85 gtt cca gct aac cct cca cca gcg tca aca aat aga cag tct ggt aga 342 Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg 90 95 100 caa cca acc cct att tct cct cct tta aga gac tct cat cct cag gcg 390 Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala 105 110 115 atg caa tgg aac tca acg acc ttt cat caa gct ctt ttg gac cct aga 438 Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg 120 125 130 gtc agg ggt tta tac ttc cca gct ggt gga tcc tca tcc ggc act gtt 486 Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val 135 140 145 150 aat cct gtc cca act aca gca tca cca att tca tcc ata ttt tct aga 534 Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg 155 160 165 act ggg gat cct gct ctt aat atg gaa aac att aca agc ggc ttc cta 582 Thr Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu 170 175 180 gga cca tta tta gtt cta caa gcc gga ttt ttc cta ttg act aga atc 630 Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile 185 190 195 cta act att cct caa agt ctt gac tcc tgg tgg aca tcc ttg aat ttc 678 Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe 200 205 210 ctt ggc ggt aca aca aca tgt cca ggc caa aac tct caa tca cca act 726 Leu Gly Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr 215 220 225 230 tct aat cac tct cca aca tct tgc cct cca att tgc cca ggt tac aga 774 Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg 235 240 245 tgg atg tgc ttg aga agg ttc atc att ttt ctg ttc atc ctc ttg ttg 822 Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu 250 255 260 tgt ttg att ttc ctc tta gta ttg ctg gac tac caa ggc atg ctt cca 870 Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro 265 270 275 gtc tgc cct cta ttg cca gga act tct aca acc tca aca gga cca tgt 918 Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys 280 285 290 aaa aca tgt act atc cct gct caa gga aca tca atg ttt cca tct tgt 966 Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys 295 300 305 310 tgc tgt aca aaa cca tca gat ggt aat tgt act tgt ata cca ata cca 1014 Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro 315 320 325 agt tca tgg gca ttt gcc cgt ttc ctt tgg gag tgg gct tct gta aga 1062 Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg 330 335 340 ttc tct tgg tta agt ttg cta gtc cca ttc gtg cag tgg ttt gtt ggc 1110 Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly 345 350 355 ctg tct cca act gtt tgg tta tct gtt att tgg atg atg tgg tac tgg 1158 Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp 360 365 370 ggt cca agc cta tac tca atc gtg tca cct ttt atc cca ttg cta cct 1206 Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro 375 380 385 390 atc ttt ttc tgc ctc tgg gtt tac atc gat att gac cct tac aag gaa 1254 Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu 395 400 405 ttt ggc gca aca gtt gaa ttg tta tca ttt tta cca tca gat ttc ttt 1302 Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe 410 415 420 cca tca gtg cgt gat ttg tta gat acg gca tcc gct ttg tac aga gaa 1350 Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu 425 430 435 gca ctg gaa tca cca gaa cac tgt tct cca cat cac act gct ctc aga 1398 Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg 440 445 450 caa gct ata ttg tgt tgg gga gag ttg atg aat cta gcc act tgg gta 1446 Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val 455 460 465 470 ggg tcc aat ctg gaa gat cct gcc tct aga gaa ctg gtg gta tct tac 1494 Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr 475 480 485 gtc aat gtt aac atg ggg ttg aag att aga caa ctt tta tgg ttc cat 1542 Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His 490 495 500 att tca tgt tta acg ttt ggt aga gaa aca gta ctg gaa tac tta gtt 1590 Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val 505 510 515 agt ttc ggt gtc tgg att aga aca cca cca gca tat aga cca cca aat 1638 Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn 520 525 530 gcg cct ata ttg agt acg ctc cca gaa acg acg gtc gtt agg aga aga 1686 Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg 535 540 545 550 ggt aga tca cct agg aga agg aca cct tca cct aga cgt aga cgt tct 1734 Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 555 560 565 caa tct cca aga cgt aga aga tct caa tct aga gaa tca caa tgc cac 1782 Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys His 570 575 580 ctc tca tta aga ggc cta ttt gtt tgt gca ttc tcc tct gct ggt cca 1830 Leu Ser Leu Arg Gly Leu Phe Val Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly Pro 585 590 595 aat gct cac caa ttc ctt cct aaa gtc ctg cat aaa cgt acc ctc ggg 1878 Asn Ala His Gln Phe Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly 600 605 610 cta agt gca atg tct act act gac ctt gag gca tat ttc aaa gac tgc 1926 Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp Cys 615 620 625 630 ttg ttt aaa gat tgg gaa gag ctt ggc gaa gag ggc ctt agt aga tat 1974 Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Gly Leu Ser Arg Tyr 635 640 645 gtt gcc cga tta tca tct aac tct aga atc ttt aat cat caa cat ggt 2022 Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Phe Asn His Gln His Gly 650 655 660 aca atg caa aac cta cat gat tca tgc tct aga aac ttg tac gtg tcc 2070 Thr Met Gln Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser 665 670 675 tta ttg ctt cta tat caa act ttt ggt aga aag ttg cac ctg tac agt 2118 Leu Leu Leu Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser 680 685 690 cac cca atc atc tta ggc ttt aga aag atc cca atg ggt gta ggt tta 2166 His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu 695 700 705 710 tcc cca ttt ttg ctg gca caa ttc aca tct gca atc tgt agt gtt gta 2214 Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val 715 720 725 cga aga gcc ttt cca cat tgt ttg gct ttt agc tat atg gat gac gtt 2262 Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val 730 735 740 gta ttg ggg gct aaa agc gtg caa cat ctc gaa tct ctg ttt aca gcg 2310 Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala 745 750 755 gtt act aat ttt ctg ctt tca ttg gga ata cat cta aac cct aat aag 2358 Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys 760 765 770 aca aaa aga tgg ggc tac tct ttg cat ttt atg gga tac gtg ata ggg 2406 Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu His Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly 775 780 785 790 tgt tat ggt agt tta cca caa gac cat atc atc caa aag ata aag gaa 2454 Cys Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Asp His Ile Ile Gln Lys Ile Lys Glu 795 800 805 tgt ttt aga aag tta cca gtc aat aga cct att gat tgg aaa gtg tgt 2502 Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys 810 815 820 cag aga atc gtt ggt ttg tta ggg ttt gct gct cca ttc aca caa tgt 2550 Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys 825 830 835 ggt tac cct gcc ctt atg cct ttg tat gca tgc att caa tcc aaa cag 2598 Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln 840 845 850 gct ttt aca ttt tct cca act tac aaa gcc ttc ctt tgc aaa caa 2643 Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln 855 860 865 catcatcacc atcatcatta agcggccgc 2672 <210> 126 <211> 869 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 126 Gly Gln Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser 1 5 10 15 Val Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 20 25 30 Phe Arg Ala Asn Ser Ala Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys 35 40 45 Asp Thr Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu 50 55 60 Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 65 70 75 80 Gln Gly Ile Leu Gln Thr Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg 100 105 110 Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln 115 120 125 Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn 165 170 175 Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe 180 185 190 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp 195 200 205 Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln 210 215 220 Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro 225 230 235 240 Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe 245 250 255 Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp 260 265 270 Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr 275 280 285 Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr 290 295 300 Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys 305 310 315 320 Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp 325 330 335 Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe 340 345 350 Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile 355 360 365 Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro 370 375 380 Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp 385 390 395 400 Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe 405 410 415 Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala 420 425 430 Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro 435 440 445 His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met 450 455 460 Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg 465 470 475 480 Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg 485 490 495 Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr 500 505 510 Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro 515 520 525 Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr 530 535 540 Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser 545 550 555 560 Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser 565 570 575 Arg Glu Ser Gln Cys His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Phe Val Cys Ala 580 585 590 Phe Ser Ser Ala Gly Pro Asn Ala His Gln Phe Leu Pro Lys Val Leu 595 600 605 His Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu 610 615 620 Ala Tyr Phe Lys Asp Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu 625 630 635 640 Glu Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile 645 650 655 Phe Asn His Gln His Gly Thr Met Gln Asn Leu His Asp Ser Cys Ser 660 665 670 Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg 675 680 685 Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile 690 695 700 Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser 705 710 715 720 Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe 725 730 735 Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu 740 745 750 Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile 755 760 765 His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu His Phe 770 775 780 Met Gly Tyr Val Ile Gly Cys Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Asp His Ile 785 790 795 800 Ile Gln Lys Ile Lys Glu Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro 805 810 815 Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala 820 825 830 Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala 835 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Ala Ile Cys Ser Val Val Arg 75 80 85 aga gct ttt cca cat tgt ttg gcc ttt tcc tat atg gat gat gtt gtc 342 Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val 90 95 100 tta gga gct aaa agt gtc caa cac tta gaa tct ctt ttc aca gct gtc 390 Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val 105 110 115 aca aac ttc cta ctt tca tta ggt att cac tta aac cca aac aaa acc 438 Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr 120 125 130 aag aga tgg ggt tac tca ttg cac ttt atg ggt tac gta atc gga tgt 486 Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu His Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Cys 135 140 145 150 tat ggc tct tta cct cag gat cac atc atc cag aag ata aag gaa tgt 534 Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Asp His Ile Ile Gln Lys Ile Lys Glu Cys 155 160 165 ttt aga aag cta cct gtc aat aga cct att gat tgg aaa gtt tgt cag 582 Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln 170 175 180 aga ata gta ggt ttg cta ggg ttt gct gct cca ttc act caa tgc ggg 630 Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly 185 190 195 tac cct gca cta atg cct ttg tac gct tgc atc caa tca aaa caa gca 678 Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala 200 205 210 ttc acc ttc tca cca act tac aag gca ttc ctt tgc aaa caa ctc gag 726 Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Leu Glu 215 220 225 230 gga caa tgg tcc tca aag cca agg aaa ggt atg ggt aca aac ttg agt 774 Gly Gln Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser 235 240 245 gtt tca aac cca ctt ggc ttt ttc cca gac cat caa ctt gat cca gca 822 Val Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 250 255 260 ttc aga gca aac tct gcc aac cca gac tgg gat ttc aat cca aac aaa 870 Phe Arg Ala Asn Ser Ala Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys 265 270 275 gat acc tgg cct gaa gca aat caa gtt gga gtg ggg gca ttt ggt ttg 918 Asp Thr Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu 280 285 290 ggc ttc act cca cca cac gga ggg ttg ctt gga tgg agt cca cag gct 966 Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 295 300 305 310 caa ggc att ttg caa act gtt cca gct aat cct cct cct gct tca acc 1014 Gln Gly Ile Leu Gln Thr Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr 315 320 325 aat aga caa tct ggt aga caa cct aca cca att tca cct cca ctt aga 1062 Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg 330 335 340 gac tct cat cct cag gca atg caa tgg aac tca act acc ttc cat caa 1110 Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln 345 350 355 gct ctg ttg gat cct aga gtt aga ggt ctg tat ttc cca gct ggc gga 1158 Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 360 365 370 tca tct agt ggt acc gtg aat cca gta cct act aca gcc tct cca atc 1206 Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile 375 380 385 390 agt tcc atc ttt agt aga act ggc gac cct gcc ttg aat atg gag aac 1254 Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn 395 400 405 atc aca tct gga ttc ctg ggg cca ttg cta gtc cta caa gct ggg ttt 1302 Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe 410 415 420 ttc cta ttg act aga atc ttg aca att cca cag agt tta gac tcc tgg 1350 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp 425 430 435 tgg acc agt cta aac ttt ttg ggt ggc aca aca aca tgt cct ggc caa 1398 Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln 440 445 450 aac tct cag tct cca aca agt aac cac tct cct act tca tgt cca cca 1446 Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro 455 460 465 470 att tgt cct ggt tac aga tgg atg tgc ctc aga agg ttt atc att ttc 1494 Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe 475 480 485 ctt ttc ata ttg tta ttg tgc ctc ata ttc cta ttg gta tta ttg gat 1542 Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp 490 495 500 tac caa ggg atg ctt cct gtc tgt cca ttg ctc cct ggt acg agt aca 1590 Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr 505 510 515 aca tct act ggc cca tgc aaa aca tgc acc ata cca gcg caa ggt aca 1638 Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr 520 525 530 agc atg ttt cca tcc tgt tgt tgc aca aaa cca tcc gat ggc aat tgc 1686 Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys 535 540 545 550 aca tgc att cca ata cca tct tca tgg gcc ttc gct cgt ttc cta tgg 1734 Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp 555 560 565 gaa tgg gcc tca gtt aga ttt tcc tgg tta tca ttg ttg gtc cca ttt 1782 Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe 570 575 580 gtg caa tgg ttt gta ggt tta tcc cca acc gtc tgg tta tct gta ata 1830 Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile 585 590 595 tgg atg atg tgg tat tgg ggt cca agt tta tac tca atc gtt tca cct 1878 Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro 600 605 610 ttt atc cct ttg ctg cca atc ttt ttc tgt ttg tgg gtt tac att gat 1926 Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp 615 620 625 630 att gat cct tac aag gag ttt ggt gct act gtt gag tta cta tcc ttt 1974 Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe 635 640 645 tta cct tct gac ttt ttc cct tct gtc aga gat ctt ttg gat act gct 2022 Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala 650 655 660 tct gct tta tac aga gaa gct ttg gaa tca cca gaa cat tgt tca cct 2070 Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro 665 670 675 cat cat acc gcc tta aga caa gca att ctg tgt tgg ggc gaa tta atg 2118 His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met 680 685 690 aac cta gca aca tgg gtg ggt tcc aat ttg gaa gat cca gca tcc aga 2166 Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg 695 700 705 710 gag tta gtg gtt agc tac gtg aat gtc aac atg ggc ttg aaa atc aga 2214 Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg 715 720 725 cag tta ctt tgg ttc cat atc tct tgt ctg aca ttt ggt aga gaa aca 2262 Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr 730 735 740 gtt ctg gaa tat ctc gtt agc ttt gga gta tgg att aga act cca cca 2310 Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro 745 750 755 gcc tac aga cca cct aat gca cca ata ttg tca acc ctc cca gag aca 2358 Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr 760 765 770 aca gtt gtg agg aga aga gga aga tct cct cgt cgt aga act cca tct 2406 Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser 775 780 785 790 cca aga cga agg aga tca caa agt cct aga cga cgt aga tct caa tct 2454 Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser 795 800 805 aga gag tct caa tgt caccaccatc accatcatta agcggccgc 2498 Arg Glu Ser Gln Cys 810 <210> 128 <211> 811 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 128 Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Phe 1 5 10 15 Asn His Gln His Gly Thr Met Gln Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg 20 25 30 Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg Lys 35 40 45 Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro 50 55 60 Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala 65 70 75 80 Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser 85 90 95 Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu 100 105 110 Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His 115 120 125 Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu His Phe Met 130 135 140 Gly Tyr Val Ile Gly Cys Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Asp His Ile Ile 145 150 155 160 Gln Lys Ile Lys Glu Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile 165 170 175 Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala 180 185 190 Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys 195 200 205 Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe 210 215 220 Leu Cys Lys Gln Leu Glu Gly Gln Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly 225 230 235 240 Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp 245 250 255 His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Ser Ala Asn Pro Asp Trp 260 265 270 Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly 275 280 285 Val Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu 290 295 300 Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr Val Pro Ala Asn 305 310 315 320 Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro 325 330 335 Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn 340 345 350 Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu 355 360 365 Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro 370 375 380 Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro 385 390 395 400 Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu 405 410 415 Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro 420 425 430 Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr 435 440 445 Thr Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser 450 455 460 Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu 465 470 475 480 Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe 485 490 495 Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu 500 505 510 Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr 515 520 525 Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys 530 535 540 Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala 545 550 555 560 Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu 565 570 575 Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr 580 585 590 Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu 595 600 605 Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys 610 615 620 Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr 625 630 635 640 Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg 645 650 655 Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser 660 665 670 Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu 675 680 685 Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu 690 695 700 Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn 705 710 715 720 Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu 725 730 735 Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val 740 745 750 Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu 755 760 765 Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro 770 775 780 Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg 785 790 795 800 Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 805 810 <210> 129 <211> 1994 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> CDS <222> (37)..(1965) <400> 129 gaattcgcca ccatggccga cgaggcacca actagt cat ttg tct cta aga gga 54 His Leu Ser Leu Arg Gly 1 5 ttg ttt gtg tgt gct ttt agt tcc gct gga cca aat gcc cat cag ttc 102 Leu Phe Val Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly Pro Asn Ala His Gln Phe 10 15 20 ctt cca aaa gtt ttg cat aag aga aca ctt ggt ctt tca gca atg agt 150 Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser 25 30 35 act aca gat ctt gag gct tac ttt aag gat tgt ttg ttt aag gac tgg 198 Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp Cys Leu Phe Lys Asp Trp 40 45 50 gag gaa tta ggt gaa gag ctc gag gga caa tgg tcc tca aag cca agg 246 Glu Glu Leu Gly Glu Glu Leu Glu Gly Gln Trp Ser Ser Lys Pro Arg 55 60 65 70 aaa ggt atg ggt aca aac ttg agt gtt tca aac cca ctt ggc ttt ttc 294 Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe 75 80 85 cca gac cat caa ctt gat cca gca ttc aga gca aac tct gcc aac cca 342 Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Ser Ala Asn Pro 90 95 100 gac tgg gat ttc aat cca aac aaa gat acc tgg cct gaa gca aat caa 390 Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Glu Ala Asn Gln 105 110 115 gtt gga gtg ggg gca ttt ggt ttg ggc ttc act cca cca cac gga ggg 438 Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly 120 125 130 ttg ctt gga tgg agt cca cag gct caa ggc att ttg caa act gtt cca 486 Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr Val Pro 135 140 145 150 gct aat cct cct cct gct tca acc aat aga caa tct ggt aga caa cct 534 Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro 155 160 165 aca cca att tca cct cca ctt aga gac tct cat cct cag gca atg caa 582 Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln 170 175 180 tgg aac tca act acc ttc cat caa gct ctg ttg gat cct aga gtt aga 630 Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg 185 190 195 ggt ctg tat ttc cca gct ggc gga tca tct agt ggt acc gtg aat cca 678 Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro 200 205 210 gta cct act aca gcc tct cca atc agt tcc atc ttt agt aga act ggc 726 Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly 215 220 225 230 gac cct gcc ttg aat atg gag aac atc aca tct gga ttc ctg ggg cca 774 Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro 235 240 245 ttg cta gtc cta caa gct ggg ttt ttc cta ttg act aga atc ttg aca 822 Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr 250 255 260 att cca cag agt tta gac tcc tgg tgg acc agt cta aac ttt ttg ggt 870 Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly 265 270 275 ggc aca aca aca tgt cct ggc caa aac tct cag tct cca aca agt aac 918 Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn 280 285 290 cac tct cct act tca tgt cca cca att tgt cct ggt tac aga tgg atg 966 His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met 295 300 305 310 tgc ctc aga agg ttt atc att ttc ctt ttc ata ttg tta ttg tgc ctc 1014 Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu 315 320 325 ata ttc cta ttg gta tta ttg gat tac caa ggg atg ctt cct gtc tgt 1062 Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys 330 335 340 cca ttg ctc cct ggt acg agt aca aca tct act ggc cca tgc aaa aca 1110 Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr 345 350 355 tgc acc ata cca gcg caa ggt aca agc atg ttt cca tcc tgt tgt tgc 1158 Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys 360 365 370 aca aaa cca tcc gat ggc aat tgc aca tgc att cca ata cca tct tca 1206 Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser 375 380 385 390 tgg gcc ttc gct cgt ttc cta tgg gaa tgg gcc tca gtt aga ttt tcc 1254 Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser 395 400 405 tgg tta tca ttg ttg gtc cca ttt gtg caa tgg ttt gta ggt tta tcc 1302 Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 410 415 420 cca acc gtc tgg tta tct gta ata tgg atg atg tgg tat tgg ggt cca 1350 Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro 425 430 435 agt tta tac tca atc gtt tca cct ttt atc cct ttg ctg cca atc ttt 1398 Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe 440 445 450 ttc tgt ttg tgg gtt tac att gat att gat cct tac aag gag ttt ggt 1446 Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly 455 460 465 470 gct act gtt gag tta cta tcc ttt tta cct tct gac ttt ttc cct tct 1494 Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser 475 480 485 gtc aga gat ctt ttg gat act gct tct gct tta tac aga gaa gct ttg 1542 Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu 490 495 500 gaa tca cca gaa cat tgt tca cct cat cat acc gcc tta aga caa gca 1590 Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala 505 510 515 att ctg tgt tgg ggc gaa tta atg aac cta gca aca tgg gtg ggt tcc 1638 Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser 520 525 530 aat ttg gaa gat cca gca tcc aga gag tta gtg gtt agc tac gtg aat 1686 Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn 535 540 545 550 gtc aac atg ggc ttg aaa atc aga cag tta ctt tgg ttc cat atc tct 1734 Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser 555 560 565 tgt ctg aca ttt ggt aga gaa aca gtt ctg gaa tat ctc gtt agc ttt 1782 Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe 570 575 580 gga gta tgg att aga act cca cca gcc tac aga cca cct aat gca cca 1830 Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro 585 590 595 ata ttg tca acc ctc cca gag aca aca gtt gtg agg aga aga gga aga 1878 Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg 600 605 610 tct cct cgt cgt aga act cca tct cca aga cga agg aga tca caa agt 1926 Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser 615 620 625 630 cct aga cga cgt aga tct caa tct aga gag tct caa tgt caccaccatc 1975 Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 635 640 accatcatta agcggccgc 1994 <210> 130 <211> 643 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 130 His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Phe Val Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly 1 5 10 15 Pro Asn Ala His Gln Phe Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg Thr Leu 20 25 30 Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp 35 40 45 Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Leu Glu Gly Gln 50 55 60 Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg 85 90 95 Ala Asn Ser Ala Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr 100 105 110 Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe 115 120 125 Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly 130 135 140 Ile Leu Gln Thr Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg 145 150 155 160 Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser 165 170 175 His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu 180 185 190 Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser 195 200 205 Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser 210 215 220 Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr 225 230 235 240 Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu 245 250 255 Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr 260 265 270 Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser 275 280 285 Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys 290 295 300 Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe 305 310 315 320 Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln 325 330 335 Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser 340 345 350 Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met 355 360 365 Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys 370 375 380 Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp 385 390 395 400 Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln 405 410 415 Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met 420 425 430 Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile 435 440 445 Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Asp 450 455 460 Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro 465 470 475 480 Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala 485 490 495 Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His 500 505 510 Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu 515 520 525 Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu 530 535 540 Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu 545 550 555 560 Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu 565 570 575 Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr 580 585 590 Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val 595 600 605 Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg 610 615 620 Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu 625 630 635 640 Ser Gln Cys <210> 131 <211> 2672 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> CDS <222> (37)..(2643) <400> 131 gaattcgcca ccatggcaga tgaagcacca actagt ggt cta agt cga tat gtt 54 Gly Leu Ser Arg Tyr Val 1 5 gcc aga tta agt tct aat tcc agg atc ttt aac cat caa cat ggc act 102 Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Phe Asn His Gln His Gly Thr 10 15 20 atg caa aac tta cac gat tca tgt tct aga aac ttg tac gtt agt ttg 150 Met Gln Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu 25 30 35 tta ctt tta tac caa act ttt ggg aga aaa ctg cat ctc tat tcc cat 198 Leu Leu Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His 40 45 50 cct att atc cta ggt ttt aga aaa ata cct atg ggg gta ggg ttg tcc 246 Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser 55 60 65 70 cct ttt ctg ttg gca caa ttc acc tca gcc ata tgt tct gtc gtg aga 294 Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg 75 80 85 aga gct ttt cca cat tgt ctg gcc ttt tcc tat atg gac gat gtg gtg 342 Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val 90 95 100 ttg gga gct aag tct gta caa cat ctt gaa agt ttg ttt aca gcc gtt 390 Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val 105 110 115 act aat ttc ctt tta tct ttg ggt ata cat ctt aat cca aat aag act 438 Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr 120 125 130 aag aga tgg ggc tac tct ttg cac ttt atg ggc tac gtt att ggg tgt 486 Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu His Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Cys 135 140 145 150 tac ggc agt tta cca caa gat cat atc atc cag aaa atc aaa gag tgt 534 Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Asp His Ile Ile Gln Lys Ile Lys Glu Cys 155 160 165 ttt aga aag tta cca gtt aac aga cca atc gac tgg aaa gtg tgc caa 582 Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln 170 175 180 cgt atc gta ggt ttg ctt ggt ttt gca gca cct ttt aca cag tgt ggt 630 Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly 185 190 195 tat cca gct tta atg cca ctt tat gct tgt atc caa tct aaa caa gct 678 Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala 200 205 210 ttt aca ttt tcc cca aca tat aaa gcc ttc ctg tgc aaa caa cat ctc 726 Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln His Leu 215 220 225 230 tct tta aga ggc cta ttc gtc tgc gct ttt tca tcc gct ggt cct aat 774 Ser Leu Arg Gly Leu Phe Val Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly Pro Asn 235 240 245 gca cac caa ttt ctg cct aaa gtt ctg cat aaa cga aca ttg ggt ttg 822 Ala His Gln Phe Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu 250 255 260 tct gca atg agc act acc gac tta gag gcg tac ttc aag gac tgc ttg 870 Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp Cys Leu 265 270 275 ttt aag gat tgg gaa gag ctt gga gag gaa ggt cag tgg tcc tcc aaa 918 Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Gly Gln Trp Ser Ser Lys 280 285 290 cct aga aag ggt atg ggt act aat ttg tct gta tct aac cct ctc gga 966 Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Ser Asn Pro Leu Gly 295 300 305 310 ttc ttt cca gat cac cag tta gat cca gct ttt cgt gct aac agt gcc 1014 Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Ser Ala 315 320 325 aac cca gat tgg gat ttc aat cct aat aag gat acc tgg cca gag gct 1062 Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Glu Ala 330 335 340 aac cag gta gga gtt gga gcc ttc ggt cta ggt ttt acc cca cct cac 1110 Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His 345 350 355 ggt gga cta tta ggc tgg agc cca caa gca caa ggt atc ttg caa acc 1158 Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr 360 365 370 gtt cca gct aac cct cca cca gcg tca aca aat aga cag tct ggt aga 1206 Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg 375 380 385 390 caa cca acc cct att tct cct cct tta aga gac tct cat cct cag gcg 1254 Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala 395 400 405 atg caa tgg aac tca acg acc ttt cat caa gct ctt ttg gac cct aga 1302 Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg 410 415 420 gtc agg ggt tta tac ttc cca gct ggt gga tcc tca tcc ggc act gtt 1350 Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val 425 430 435 aat cct gtc cca act aca gca tca cca att tca tcc ata ttt tct aga 1398 Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg 440 445 450 act ggg gat cct gct ctt aat atg gaa aac att aca agc ggc ttc cta 1446 Thr Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu 455 460 465 470 gga cca tta tta gtt cta caa gcc gga ttt ttc cta ttg act aga atc 1494 Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile 475 480 485 cta act att cct caa agt ctt gac tcc tgg tgg aca tcc ttg aat ttc 1542 Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe 490 495 500 ctt ggc ggt aca aca aca tgt cca ggc caa aac tct caa tca cca act 1590 Leu Gly Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr 505 510 515 tct aat cac tct cca aca tct tgc cct cca att tgc cca ggt tac aga 1638 Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg 520 525 530 tgg atg tgc ttg aga agg ttc atc att ttt ctg ttc atc ctc ttg ttg 1686 Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu 535 540 545 550 tgt ttg att ttc ctc tta gta ttg ctg gac tac caa ggc atg ctt cca 1734 Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro 555 560 565 gtc tgc cct cta ttg cca gga act tct aca acc tca aca gga cca tgt 1782 Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys 570 575 580 aaa aca tgt act atc cct gct caa gga aca tca atg ttt cca tct tgt 1830 Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys 585 590 595 tgc tgt aca aaa cca tca gat ggt aat tgt act tgt ata cca ata cca 1878 Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro 600 605 610 agt tca tgg gca ttt gcc cgt ttc ctt tgg gag tgg gct tct gta aga 1926 Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg 615 620 625 630 ttc tct tgg tta agt ttg cta gtc cca ttc gtg cag tgg ttt gtt ggc 1974 Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly 635 640 645 ctg tct cca act gtt tgg tta tct gtt att tgg atg atg tgg tac tgg 2022 Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp 650 655 660 ggt cca agc cta tac tca atc gtg tca cct ttt atc cca ttg cta cct 2070 Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro 665 670 675 atc ttt ttc tgc ctc tgg gtt tac atc gat att gac cct tac aag gaa 2118 Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu 680 685 690 ttt ggc gca aca gtt gaa ttg tta tca ttt tta cca tca gat ttc ttt 2166 Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe 695 700 705 710 cca tca gtg cgt gat ttg tta gat acg gca tcc gct ttg tac aga gaa 2214 Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu 715 720 725 gca ctg gaa tca cca gaa cac tgt tct cca cat cac act gct ctc aga 2262 Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg 730 735 740 caa gct ata ttg tgt tgg gga gag ttg atg aat cta gcc act tgg gta 2310 Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val 745 750 755 ggg tcc aat ctg gaa gat cct gcc tct aga gaa ctg gtg gta tct tac 2358 Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr 760 765 770 gtc aat gtt aac atg ggg ttg aag att aga caa ctt tta tgg ttc cat 2406 Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His 775 780 785 790 att tca tgt tta acg ttt ggt aga gaa aca gta ctg gaa tac tta gtt 2454 Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val 795 800 805 agt ttc ggt gtc tgg att aga aca cca cca gca tat aga cca cca aat 2502 Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn 810 815 820 gcg cct ata ttg agt acg ctc cca gaa acg acg gtc gtt agg aga aga 2550 Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg 825 830 835 ggt aga tca cct agg aga agg aca cct tca cct aga cgt aga cgt tct 2598 Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 840 845 850 caa tct cca aga cgt aga aga tct caa tct aga gaa tca caa tgc 2643 Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 855 860 865 catcaccacc atcatcatta agcggccgc 2672 <210> 132 <211> 869 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 132 Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Phe 1 5 10 15 Asn His Gln His Gly Thr Met Gln Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg 20 25 30 Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg Lys 35 40 45 Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro 50 55 60 Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala 65 70 75 80 Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser 85 90 95 Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu 100 105 110 Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His 115 120 125 Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu His Phe Met 130 135 140 Gly Tyr Val Ile Gly Cys Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Asp His Ile Ile 145 150 155 160 Gln Lys Ile Lys Glu Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile 165 170 175 Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala 180 185 190 Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys 195 200 205 Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe 210 215 220 Leu Cys Lys Gln His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Phe Val Cys Ala Phe 225 230 235 240 Ser Ser Ala Gly Pro Asn Ala His Gln Phe Leu Pro Lys Val Leu His 245 250 255 Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala 260 265 270 Tyr Phe Lys Asp Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu 275 280 285 Gly Gln Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser 290 295 300 Val Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 305 310 315 320 Phe Arg Ala Asn Ser Ala Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys 325 330 335 Asp Thr Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu 340 345 350 Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 355 360 365 Gln Gly Ile Leu Gln Thr Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr 370 375 380 Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg 385 390 395 400 Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln 405 410 415 Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 420 425 430 Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile 435 440 445 Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn 450 455 460 Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe 465 470 475 480 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp 485 490 495 Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln 500 505 510 Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro 515 520 525 Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe 530 535 540 Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp 545 550 555 560 Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr 565 570 575 Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr 580 585 590 Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys 595 600 605 Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp 610 615 620 Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe 625 630 635 640 Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile 645 650 655 Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro 660 665 670 Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp 675 680 685 Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe 690 695 700 Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala 705 710 715 720 Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro 725 730 735 His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met 740 745 750 Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg 755 760 765 Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg 770 775 780 Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr 785 790 795 800 Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro 805 810 815 Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr 820 825 830 Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser 835 840 845 Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser 850 855 860 Arg Glu Ser Gln Cys 865 <210> 133 <211> 2672 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> CDS <222> (37)..(2643) <400> 133 gaattcgcca ccatggccga cgaggcacct actagt cat ctt tca ctt aga ggg 54 His Leu Ser Leu Arg Gly 1 5 ctc ttt gtt tgt gca ttc agt tct gca ggc cca aac gcc cac caa ttt 102 Leu Phe Val Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly Pro Asn Ala His Gln Phe 10 15 20 ttg cct aag gta ttg cat aaa cgt aca cta gga tta agt gca atg tct 150 Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser 25 30 35 act act gat ttg gaa gcc tat ttc aaa gat tgt ctg ttt aaa gat tgg 198 Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp Cys Leu Phe Lys Asp Trp 40 45 50 gag gaa ttg ggc gag gaa gga ttg tcc aga tat gtt gct aga cta tct 246 Glu Glu Leu Gly Glu Glu Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser 55 60 65 70 tct aat agt aga atc ttt aat cat cag cat ggc aca atg cag aat ttg 294 Ser Asn Ser Arg Ile Phe Asn His Gln His Gly Thr Met Gln Asn Leu 75 80 85 cat gat tca tgt tct aga aat ttg tac gtg tca tta ttg ctt ttg tat 342 His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr 90 95 100 caa act ttt ggt aga aag tta cat ctc tat tct cat cca ata atc ctc 390 Gln Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu 105 110 115 ggc ttt cga aaa atc cct atg ggg gtt ggc tta tcc cca ttt ctg ctg 438 Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu 120 125 130 gcc caa ttc act tct gca att tgt tcc gtg gtt aga aga gct ttt cct 486 Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro 135 140 145 150 cac tgt tta gct ttt agt tac atg gac gat gtg gtc ctt ggg gca aag 534 His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys 155 160 165 tca gtc caa cac tta gaa tca ctt ttt acc gcc gta acc aac ttc ctt 582 Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu 170 175 180 cta agt ttg ggt ata cat ctg aac cct aac aaa aca aaa cga tgg ggt 630 Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly 185 190 195 tac agc tta cat ttt atg ggg tac gtg atc ggt tgc tat ggt tcc ctt 678 Tyr Ser Leu His Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Cys Tyr Gly Ser Leu 200 205 210 cct caa gac cac att atc caa aag ata aaa gag tgc ttt aga aag ctt 726 Pro Gln Asp His Ile Ile Gln Lys Ile Lys Glu Cys Phe Arg Lys Leu 215 220 225 230 cca gtt aat aga cca atc gac tgg aaa gtt tgc caa cga atc gtg ggt 774 Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly 235 240 245 ctg ctg ggt ttt gct gct cca ttc aca caa tgt ggt tac cca gct cta 822 Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu 250 255 260 atg cca tta tat gca tgc atc caa tcc aaa caa gct ttt aca ttt tca 870 Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser 265 270 275 cct act tac aaa gcg ttt ttg tgt aag caa ggt cag tgg tcc tcc aaa 918 Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Gly Gln Trp Ser Ser Lys 280 285 290 cct aga aag ggt atg ggt act aat ttg tct gta tct aac cct ctc gga 966 Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Ser Asn Pro Leu Gly 295 300 305 310 ttc ttt cca gat cac cag tta gat cca gct ttt cgt gct aac agt gcc 1014 Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Ser Ala 315 320 325 aac cca gat tgg gat ttc aat cct aat aag gat acc tgg cca gag gct 1062 Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Glu Ala 330 335 340 aac cag gta gga gtt gga gcc ttc ggt cta ggt ttt acc cca cct cac 1110 Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His 345 350 355 ggt gga cta tta ggc tgg agc cca caa gca caa ggt atc ttg caa acc 1158 Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr 360 365 370 gtt cca gct aac cct cca cca gcg tca aca aat aga cag tct ggt aga 1206 Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg 375 380 385 390 caa cca acc cct att tct cct cct tta aga gac tct cat cct cag gcg 1254 Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala 395 400 405 atg caa tgg aac tca acg acc ttt cat caa gct ctt ttg gac cct aga 1302 Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg 410 415 420 gtc agg ggt tta tac ttc cca gct ggt gga tcc tca tcc ggc act gtt 1350 Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val 425 430 435 aat cct gtc cca act aca gca tca cca att tca tcc ata ttt tct aga 1398 Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg 440 445 450 act ggg gat cct gct ctt aat atg gaa aac att aca agc ggc ttc cta 1446 Thr Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu 455 460 465 470 gga cca tta tta gtt cta caa gcc gga ttt ttc cta ttg act aga atc 1494 Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile 475 480 485 cta act att cct caa agt ctt gac tcc tgg tgg aca tcc ttg aat ttc 1542 Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe 490 495 500 ctt ggc ggt aca aca aca tgt cca ggc caa aac tct caa tca cca act 1590 Leu Gly Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr 505 510 515 tct aat cac tct cca aca tct tgc cct cca att tgc cca ggt tac aga 1638 Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg 520 525 530 tgg atg tgc ttg aga agg ttc atc att ttt ctg ttc atc ctc ttg ttg 1686 Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu 535 540 545 550 tgt ttg att ttc ctc tta gta ttg ctg gac tac caa ggc atg ctt cca 1734 Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro 555 560 565 gtc tgc cct cta ttg cca gga act tct aca acc tca aca gga cca tgt 1782 Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys 570 575 580 aaa aca tgt act atc cct gct caa gga aca tca atg ttt cca tct tgt 1830 Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys 585 590 595 tgc tgt aca aaa cca tca gat ggt aat tgt act tgt ata cca ata cca 1878 Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro 600 605 610 agt tca tgg gca ttt gcc cgt ttc ctt tgg gag tgg gct tct gta aga 1926 Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg 615 620 625 630 ttc tct tgg tta agt ttg cta gtc cca ttc gtg cag tgg ttt gtt ggc 1974 Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly 635 640 645 ctg tct cca act gtt tgg tta tct gtt att tgg atg atg tgg tac tgg 2022 Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp 650 655 660 ggt cca agc cta tac tca atc gtg tca cct ttt atc cca ttg cta cct 2070 Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro 665 670 675 atc ttt ttc tgc ctc tgg gtt tac atc gat att gac cct tac aag gaa 2118 Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu 680 685 690 ttt ggc gca aca gtt gaa ttg tta tca ttt tta cca tca gat ttc ttt 2166 Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe 695 700 705 710 cca tca gtg cgt gat ttg tta gat acg gca tcc gct ttg tac aga gaa 2214 Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu 715 720 725 gca ctg gaa tca cca gaa cac tgt tct cca cat cac act gct ctc aga 2262 Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg 730 735 740 caa gct ata ttg tgt tgg gga gag ttg atg aat cta gcc act tgg gta 2310 Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val 745 750 755 ggg tcc aat ctg gaa gat cct gcc tct aga gaa ctg gtg gta tct tac 2358 Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr 760 765 770 gtc aat gtt aac atg ggg ttg aag att aga caa ctt tta tgg ttc cat 2406 Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His 775 780 785 790 att tca tgt tta acg ttt ggt aga gaa aca gta ctg gaa tac tta gtt 2454 Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val 795 800 805 agt ttc ggt gtc tgg att aga aca cca cca gca tat aga cca cca aat 2502 Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn 810 815 820 gcg cct ata ttg agt acg ctc cca gaa acg acg gtc gtt agg aga aga 2550 Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg 825 830 835 ggt aga tca cct agg aga agg aca cct tca cct aga cgt aga cgt tct 2598 Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 840 845 850 caa tct cca aga cgt aga aga tct caa tct aga gaa tca caa tgc 2643 Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 855 860 865 catcatcatc accatcatta agcggccgc 2672 <210> 134 <211> 869 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 134 His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Phe Val Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly 1 5 10 15 Pro Asn Ala His Gln Phe Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg Thr Leu 20 25 30 Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp 35 40 45 Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Gly Leu Ser Arg 50 55 60 Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Phe Asn His Gln His 65 70 75 80 Gly Thr Met Gln Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val 85 90 95 Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr 100 105 110 Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly 115 120 125 Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val 130 135 140 Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr 165 170 175 Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn 180 185 190 Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu His Phe Met Gly Tyr Val Ile 195 200 205 Gly Cys Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Asp His Ile Ile Gln Lys Ile Lys 210 215 220 Glu Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val 225 230 235 240 Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln 245 250 255 Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys 260 265 270 Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln 275 280 285 Gly Gln Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser 290 295 300 Val Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 305 310 315 320 Phe Arg Ala Asn Ser Ala Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys 325 330 335 Asp Thr Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu 340 345 350 Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 355 360 365 Gln Gly Ile Leu Gln Thr Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr 370 375 380 Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg 385 390 395 400 Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln 405 410 415 Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 420 425 430 Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile 435 440 445 Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn 450 455 460 Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe 465 470 475 480 Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp 485 490 495 Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln 500 505 510 Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro 515 520 525 Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe 530 535 540 Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp 545 550 555 560 Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr 565 570 575 Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr 580 585 590 Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys 595 600 605 Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp 610 615 620 Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe 625 630 635 640 Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile 645 650 655 Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro 660 665 670 Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp 675 680 685 Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe 690 695 700 Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala 705 710 715 720 Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro 725 730 735 His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met 740 745 750 Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg 755 760 765 Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg 770 775 780 Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr 785 790 795 800 Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro 805 810 815 Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr 820 825 830 Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser 835 840 845 Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser 850 855 860 Arg Glu Ser Gln Cys 865 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 135 Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile 1 5 <210> 136 <211> 10 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 136 Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val 1 5 10 <210> 137 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 137 His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu 1 5 <210> 138 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 138 Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu 1 5 <210> 139 <211> 8 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 139 Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met 1 5 <210> 140 <211> 8 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 140 Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu 1 5 <210> 141 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 141 Thr Val Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala 1 5 <210> 142 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 142 Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu 1 5 <210> 143 <211> 9 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 143 Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu 1 5 <210> 144 <211> 8 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 144 Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met 1 5 <210> 145 <211> 8 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 145 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu 1 5 <210> 146 <211> 8 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 146 Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu 1 5 <210> 147 <211> 8 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 147 Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu 1 5 <210> 148 <211> 21 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 148 Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro 1 5 10 15 Asn Ala Pro Ile Leu 20 <210> 149 <211> 8 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 149 Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu 1 5 <210> 150 <211> 657 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 150 Met Ala Asp Glu Ala Pro Thr Ser His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Phe 1 5 10 15 Val Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly Pro Asn Ala His Gln Phe Leu Pro 20 25 30 Lys Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr 35 40 45 Asp Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu 50 55 60 Leu Gly Glu Glu Leu Glu Gly Gln Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly 65 70 75 80 Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp 85 90 95 His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Ser Ala Asn Pro Asp Trp 100 105 110 Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly 115 120 125 Val Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu 130 135 140 Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr Val Pro Ala Asn 145 150 155 160 Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro 165 170 175 Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn 180 185 190 Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu 195 200 205 Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro 210 215 220 Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro 225 230 235 240 Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu 245 250 255 Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro 260 265 270 Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr 275 280 285 Thr Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser 290 295 300 Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu 305 310 315 320 Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe 325 330 335 Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu 340 345 350 Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr 355 360 365 Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys 370 375 380 Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala 385 390 395 400 Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu 405 410 415 Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr 420 425 430 Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu 435 440 445 Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys 450 455 460 Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr 465 470 475 480 Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg 485 490 495 Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser 500 505 510 Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu 515 520 525 Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu 530 535 540 Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn 545 550 555 560 Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu 565 570 575 Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val 580 585 590 Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu 595 600 605 Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro 610 615 620 Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg 625 630 635 640 Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys His His His His His 645 650 655 His <210> 151 <211> 595 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 151 Met Ala Asp Glu Ala Pro Thr Ser Gly Gln Trp Ser Ser Lys Pro Arg 1 5 10 15 Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe 20 25 30 Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Ser Ala Asn Pro 35 40 45 Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Glu Ala Asn Gln 50 55 60 Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly 65 70 75 80 Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr Val Pro 85 90 95 Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro 100 105 110 Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln 115 120 125 Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg 130 135 140 Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro 145 150 155 160 Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly 165 170 175 Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro 180 185 190 Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr 195 200 205 Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly 210 215 220 Gly Thr Thr Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn 225 230 235 240 His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met 245 250 255 Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu 260 265 270 Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys 275 280 285 Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr 290 295 300 Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys 305 310 315 320 Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser 325 330 335 Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser 340 345 350 Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 355 360 365 Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro 370 375 380 Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe 385 390 395 400 Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly 405 410 415 Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser 420 425 430 Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu 435 440 445 Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala 450 455 460 Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser 465 470 475 480 Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn 485 490 495 Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser 500 505 510 Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe 515 520 525 Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro 530 535 540 Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg 545 550 555 560 Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser 565 570 575 Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys His His His 580 585 590 His His His 595 <210> 152 <211> 8 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 152 Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met 1 5

Claims (75)

  1. 면역치료 조성물 (immunotherapeutic composition)로서,
    a) 효모 비히클; 및
    b) HBV 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하며,
    상기 HBV 항원이
    i) HBV X 항원;
    ii) HBV 표면 항원; 및
    iii) HBV 코어 항원으로 구성되고,
    상기 융합 단백질이 상기 효모 비히클에 의해 발현되는, 면역치료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    a) 효모 비히클; 및
    b) HBV 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하며,
    상기 HBV 항원이
    i) 서열번호 130의 1-60번 위치의 아미노산 서열 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열을 가진, HBV X 항원;
    ii) 서열번호 130의 63-461번 위치의 아미노산 서열 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열을 가진, HBV 표면 항원; 및
    iii) 서열번호 130의 462-643번 위치의 아미노산 서열 또는 다른 HBV 균주 유래의 대응 서열을 가진, HBV 코어 항원으로 구성되는, 면역치료 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    i) 상기 HBV X 항원이 전장 HBV X 항원의 52-126번 위치의 아미노산 서열을 가지며;
    ii) 상기 HBV 표면 항원이 전장 HBV 대형 표면 항원 (L)의 아미노산 서열을 가지며;
    iii) 상기 HBV 코어 항원이 전장 HBV 코어 단백질의 아미노산 서열을 가지며,
    상기 조성물이 HBV에 특이적인 면역 반응을 일으키는, 면역치료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    a) 효모 비히클; 및
    b) HBV 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하며,
    상기 HBV 항원이
    i) 서열번호 130의 1-60번 위치의 아미노산 서열을 가진, HBV X 항원;
    ii) 서열번호 130의 63-461번 위치의 아미노산 서열을 가진, HBV 표면 항원; 및
    iii) 서열번호 130의 462-643번 위치의 아미노산 서열을 가진, HBV 코어 항원으로 구성되는, 면역치료 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 HBV 항원들은 상기 융합 단백질에 N-말단에서 C-말단 방향으로 HBV X 항원, HBV 표면 항원 및 HBV 코어 항원 순서로 배열되는, 면역치료 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질이 서열번호 130, 서열번호 150 또는 서열번호 122로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 면역치료 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    a) 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 열에 의해 불활성화된 전효모 (whole, heat-inactivated yeast); 및
    b) 상기 효모에 의해 발현되는 HBV 융합 단백질을 포함하며,
    상기 융합 단백질이 서열번호 130 또는 서열번호 150을 포함하는, 면역치료 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 효모 비히클이 열에 의해 불활성화된 전효모 (whole, heat-inactivated yeast)인, 면역치료 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 효모 비히클이 사카로마에세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래인, 면역치료 조성물.
  10. HBV 항원을 포함하는 융합 단백질로서,
    상기 융합 단백질이 서열번호 130 또는 서열번호 150의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  11. 제10항에 따른 융합 단백질을 코딩하며, 서열번호 129의 핵산 서열을 가지는, 재조합 핵산 분자.
  12. 제11항에 따른 재조합 핵산 분자로 형질전환된 분리된 세포.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서,
    HBV 감염 또는 이의 증상을 치료하는데 사용하기 위한 것인, 면역치료 조성물.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 조성물은 0.1 Y.U. 내지 100 Y.U.의 투여량으로 개체에게 투여되는, 면역치료 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 조성물은 개체에게 매주, 2주 간격으로, 3주 간격으로 또는 매달 투여되는, 면역치료 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 조성물은 개체에 2곳 이상의 부위에서 투여되어 단회 투여량 (single dose)을 형성하는, 면역치료 조성물.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 조성물의 투여가 개체에서 혈청전환을 야기하거나, 개체에서의 HBV 바이러스 부하(viral load)를 낮추거나 또는 개체에서의 간 손상을 완화하는, 면역치료 조성물.
  18. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서,
    HBV 감염 또는 그 증상을 예방하는데 사용하기 위한 것인, 면역치료 조성물.
  19. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서,
    개체 집단을 HBV에 대해 면역화하는데 사용하기 위한 것인, 면역치료 조성물.
  20. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서,
    상기 조성물이 HBV 감염 증상을 치료 또는 완화하는데 유용한 하나 이상의 부가적인 화합물을 더 포함하거나 또는 상기 하나 이상의 부가적인 화합물과 조합하여 사용되는, 면역치료 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 하나 이상의 부가적인 화합물이 항-바이러스 화합물인, 면역치료 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 항-바이러스 화합물이 뉴클레오티드 유사체 역전사효소 저해제인, 면역치료 조성물.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 항-바이러스 화합물이 테노포비르(tenofovir), 라미부딘(lamivudine), 아데포비르(adefovir), 텔비부딘(telbivudine), 엔테카비르(entecavir) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역치료 조성물.
  24. 제13항에 따른 면역치료 조성물을 포함하는, 만성적인 B형 간염 바이러스(HBV)를 치료하기 위한 약제로서,
    상기 조성물이
    a. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 열에 의해 불활성화된 전효모; 및
    b. 상기 효모에 의해 발현되는 융합 단백질을 포함하며,
    상기 융합 단백질이 서열번호 130 또는 서열번호 150을 포함하는, 약제.
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