JP2023510544A - ヘルペスウイルス糖タンパク質ｄと融合したｂ型肝炎ウイルス抗原をコードするアデノウイルスベクター及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

本明細書には、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）Ｃｏｒｅタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、ＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、並びにこれらの免疫原性断片の非自然起源の変異体が提供される。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質（ｇＤ）配列と融合したＨＢＶ変異体、並びにこの融合タンパク質を使用する方法も提供される。
【選択図】図２５Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本願は、各々の開示の全体を参照により本明細書に援用される、２０２０年１月９日に出願された米国仮特許出願第６２／９５８，８０９号、２０２０年１月９日に出願された米国仮特許出願第６２／９５８，８２７号、２０２０年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／９６７，２４２号、２０２０年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／９６７，１０４号、２０２０年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０６４，５０６号、２０２０年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０６４，５７１号、２０２０年１１月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／１１２，２０２号、２０２０年１１月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／１１２，２１９号の優先権を主張する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体を参照により本明細書に援用される。２０２１年１月７日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、１１１８７６＿００００３５＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは１５１，４４６バイトである。

本明細書には、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、及びＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメインの非自然起源の変異体、並びにその免疫原性断片及びそれを含む融合タンパク質が開示される。

世界保健機関は、２０１５年には、２億５７００万人の人々が慢性Ｂ型肝炎感染症（Ｂ型肝炎表面抗原陽性として定義される）にかかって生活していて、Ｂ型肝炎により、主に肝硬変及び肝細胞癌（すなわち、原発性肝癌）を原因として推定８８万７０００人が死亡したと推定している。生殖年齢の女性が世界人口の２５．３％を占めると仮定すると（国連のデータ）、慢性的に感染した成人は、潜在的にＨＢＶを子供に伝染させることができる６５００万人の妊娠可能年齢の女性を含むことができる（ＷＨＯ Ｇｌｏｂａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｒｅｐｏｒｔ ２０１７． Ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ：ａｐｐｓ＿ｗｈｏ＿ｉｎｔ／ｉｒｉｓ／ｂｉｔｓｔｒｅａｍ／ｈａｎｄｌｅ／１０６６５／２５５０１６／９７８９２４１５６５４５５－ｅｎｇ．ｐｄｆ；ｊｓｅｓｓｉｏｎｉｄ＝Ｄ７８６１６７００ＥＤ７３２２Ｄ４１０９ＣＡ４５４１ＦＢ９４ＥＡ？ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝１）。２０１６年の全発症率は、人口１０万人あたり１．０症例だった（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ－Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ， ２０１７． Ａｔｌａｎｔａ： ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ； ２０１９． Ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ： ｗｗｗ＿ｃｄｃ＿ｇｏｖ／ｈｅｐａｔｉｔｉｓ／ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ／２０１７ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ．）。２０１７年単独でも、総計３，４０７症例の急性Ｂ型肝炎がアメリカ疾病対策予防センター（ＣＤＣ）に報告された。

ＨＢＶ予防ワクチンの利用可能性にもかかわらず、慢性ＨＢＶ感染症の負荷は、最適以下の治療選択及び発展途上世界のほとんどの地域での新規感染数の持続的な割合のため、重要な未だ対処されていない世界的な医学的問題であり続けている。

本明細書には、配列番号６のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質が提供される。

配列番号８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメインも提供される。

配列番号１０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメインも開示される。

Ｎ末端単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質（ｇＤ）配列又はその変異体、開示されるＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、ＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、又はこれらの免疫原性断片、及びＣ末端ＨＳＶｇＤ配列又はその変異体を含む融合タンパク質も提供される。

本明細書には、Ｎ末端単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質（ｇＤ）配列又はその変異体、開示されるＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、ＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、及び／又はそれらの免疫原性断片の組み合わせ、及びＣ末端ＨＳＶｇＤ配列又はその変異体を含む融合タンパク質も提供される。

開示されるタンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、及び開示されるベクターを含むワクチンが本明細書に開示される。

本明細書には、被験体にＨＢＶに対する免疫応答を誘導する方法であって、この方法は、この被験体に有効量の開示される融合タンパク質、核酸分子、ベクター、又はワクチンのいずれかを提供してそれによりＨＢＶに対する免疫応答を誘導することを含む、方法も提供される。

この要約、並びに以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読まれる場合、さらに理解される。開示されるタンパク質、ワクチン、及び方法を説明する目的で、図面中にタンパク質、ワクチン、及び方法の好ましい実施形態が示されるが、このタンパク質、ワクチン、及び方法は、開示される特定の実施形態に限定されるものではない。図面中。

図１は、エピトープ最適化されたコアアミノ酸の頻度を示す。アミノ酸残基をＸ軸に示し、解析された全てのゲノム中の配列類似性の割合Ｙ軸に示す。 図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、及び図２Ｆは、指示量の：ｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたコア配列（配列番号１５）を含むチンパンジー血清型６の複製欠損のアデノウイルスベクター（ＡｄＣ６）（ＡｄＣ６－ｇＤＣｏｒｅ）（図２Ａ及び図２Ｄ）；ｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＣ末端ドメイン配列（配列番号１９）を含むＡｄＣ６（ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＣ）（図２Ｂ及び図２Ｅ）；及びｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＮ末端ドメイン配列（配列番号１７）を含むＡｄＣ６（ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ）（図２Ｃ及び図２Ｆ）を筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した後のＣ５７Ｂｌ／６マウスのワクチン挿入断片特異的Ｔ細胞頻度を示す。注射後１４日目にマウスを出血させ、各種ＨＢＶ挿入断片に対するＴ細胞の頻度を、細胞をＨＢＶ配列を表す重複ペプチドで刺激した時のインターフェロン（ＩＦＮ）γに対する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により分析した。コントロール細胞をペプチドなしで培養した。グラフは、直線によって示された中央値を有する個別のマウスについての結果を示す。図２Ａ～２Ｃは、挿入断片特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度を示し、図２Ｄ～２Ｆは、挿入断片特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞頻度を示す。 図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、及び図２Ｆは、指示量の：ｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたコア配列（配列番号１５）を含むチンパンジー血清型６の複製欠損のアデノウイルスベクター（ＡｄＣ６）（ＡｄＣ６－ｇＤＣｏｒｅ）（図２Ａ及び図２Ｄ）；ｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＣ末端ドメイン配列（配列番号１９）を含むＡｄＣ６（ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＣ）（図２Ｂ及び図２Ｅ）；及びｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＮ末端ドメイン配列（配列番号１７）を含むＡｄＣ６（ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ）（図２Ｃ及び図２Ｆ）を筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した後のＣ５７Ｂｌ／６マウスのワクチン挿入断片特異的Ｔ細胞頻度を示す。注射後１４日目にマウスを出血させ、様々なＨＢＶ挿入断片に対するＴ細胞頻度を、細胞をＨＢＶ配列を表す重複ペプチドで刺激した時のインターフェロン（ＩＦＮ）γの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により分析した。コントロール細胞は、ペプチド無しで培養した。グラフは、直線によって示された中央値を有する個別のマウスについての結果を示す。図２Ａ～２Ｃは、挿入断片特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度を示し、図２Ｄ～２Ｆは、挿入断片特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞頻度を示す。 図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、及び図２Ｆは、指示量の：ｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたコア配列（配列番号１５）を含むチンパンジー血清型６の複製欠損のアデノウイルスベクター（ＡｄＣ６）（ＡｄＣ６－ｇＤＣｏｒｅ）（図２Ａ及び図２Ｄ）；ｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＣ末端ドメイン配列（配列番号１９）を含むＡｄＣ６（ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＣ）（図２Ｂ及び図２Ｅ）；及びｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＮ末端ドメイン配列（配列番号１７）を含むＡｄＣ６（ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ）（図２Ｃ及び図２Ｆ）を筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した後のＣ５７Ｂｌ／６マウスのワクチン挿入断片特異的Ｔ細胞頻度を示す。注射後１４日目にマウスを出血させ、様々なＨＢＶ挿入断片に対するＴ細胞頻度を、細胞をＨＢＶ配列を表す重複ペプチドで刺激した時のインターフェロン（ＩＦＮ）γの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により分析した。コントロール細胞は、ペプチド無しで培養した。グラフは、直線によって示された中央値を有する個別のマウスについての結果を示す。図２Ａ～２Ｃは、挿入断片特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度を示し、図２Ｄ～２Ｆは、挿入断片特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞頻度を示す。 図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、及び図２Ｆは、指示量の：ｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたコア配列（配列番号１５）を含むチンパンジー血清型６の複製欠損のアデノウイルスベクター（ＡｄＣ６）（ＡｄＣ６－ｇＤＣｏｒｅ）（図２Ａ及び図２Ｄ）；ｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＣ末端ドメイン配列（配列番号１９）を含むＡｄＣ６（ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＣ）（図２Ｂ及び図２Ｅ）；及びｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＮ末端ドメイン配列（配列番号１７）を含むＡｄＣ６（ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ）（図２Ｃ及び図２Ｆ）を筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した後のＣ５７Ｂｌ／６マウスのワクチン挿入断片特異的Ｔ細胞頻度を示す。注射後１４日目にマウスを出血させ、様々なＨＢＶ挿入断片に対するＴ細胞頻度を、細胞をＨＢＶ配列を表す重複ペプチドで刺激した時のインターフェロン（ＩＦＮ）γの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により分析した。コントロール細胞は、ペプチド無しで培養した。グラフは、直線によって示された中央値を有する個別のマウスについての結果を示す。図２Ａ～２Ｃは、挿入断片特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度を示し、図２Ｄ～２Ｆは、挿入断片特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞頻度を示す。 図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、及び図２Ｆは、指示量の：ｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたコア配列（配列番号１５）を含むチンパンジー血清型６の複製欠損のアデノウイルスベクター（ＡｄＣ６）（ＡｄＣ６－ｇＤＣｏｒｅ）（図２Ａ及び図２Ｄ）；ｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＣ末端ドメイン配列（配列番号１９）を含むＡｄＣ６（ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＣ）（図２Ｂ及び図２Ｅ）；及びｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＮ末端ドメイン配列（配列番号１７）を含むＡｄＣ６（ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ）（図２Ｃ及び図２Ｆ）を筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した後のＣ５７Ｂｌ／６マウスのワクチン挿入断片特異的Ｔ細胞頻度を示す。注射後１４日目にマウスを出血させ、様々なＨＢＶ挿入断片に対するＴ細胞頻度を、細胞をＨＢＶ配列を表す重複ペプチドで刺激した時のインターフェロン（ＩＦＮ）γの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により分析した。コントロール細胞は、ペプチド無しで培養した。グラフは、直線によって示された中央値を有する個別のマウスについての結果を示す。図２Ａ～２Ｃは、挿入断片特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度を示し、図２Ｄ～２Ｆは、挿入断片特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞頻度を示す。 図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、及び図２Ｆは、指示量の：ｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたコア配列（配列番号１５）を含むチンパンジー血清型６の複製欠損のアデノウイルスベクター（ＡｄＣ６）（ＡｄＣ６－ｇＤＣｏｒｅ）（図２Ａ及び図２Ｄ）；ｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＣ末端ドメイン配列（配列番号１９）を含むＡｄＣ６（ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＣ）（図２Ｂ及び図２Ｅ）；及びｇＤと遺伝的に融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＮ末端ドメイン配列（配列番号１７）を含むＡｄＣ６（ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ）（図２Ｃ及び図２Ｆ）を筋肉内（ｉ．ｍ．）注射した後のＣ５７Ｂｌ／６マウスのワクチン挿入断片特異的Ｔ細胞頻度を示す。注射後１４日目にマウスを出血させ、様々なＨＢＶ挿入断片に対するＴ細胞頻度を、細胞をＨＢＶ配列を表す重複ペプチドで刺激した時のインターフェロン（ＩＦＮ）γの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により分析した。コントロール細胞は、ペプチド無しで培養した。グラフは、直線によって示された中央値を有する個別のマウスについての結果を示す。図２Ａ～２Ｃは、挿入断片特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度を示し、図２Ｄ～２Ｆは、挿入断片特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞頻度を示す。 図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃは、示されるＨＢＶ配列を表すペプチドのプールに対する異なるマウス系統（Ａ：Ｃ５７Ｂｌ／６マウス；Ｂ：ＢＡＬＢ／ｃマウス；Ｃ：ＨＬＡ－Ａ２遺伝子導入（ｔｇ）マウス）のＴ細胞頻度を示す。結果は、免疫化後４週目に収集された脾細胞を用いて得られ、ＩＦＮ－γをＩＣＳによって調べた。ペプチドは、２個のプールの認識により１個のペプチドが同定されるよう行列状に配置された。グラフは、異なるプールに対する応答を示し、全てのペプチドを含むプールに対する応答は右側に示される。ペプチド無しで得られたバックグラウンド頻度を減算した。応答を誘発するとみなされたプール及び異なるプールに応答して同定されたペプチドを各図面の下部に列挙した。ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示し、ヒトＭＨＣクラスＩ分子を保有するが、マウスＭＨＣクラスＩＩ分子を保有しない、ＨＬＡ－Ａ２ｔｇマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。Ｔ細胞を活性化ＣＤ４４＋細胞上にゲートした。継続的に番号付けされた各「ペプチド」は、Ｃｏｒｅ、ＰｏｌＮ、又はＰｏｌＣ配列の１番目、６番目、１１番目などのアミノ酸で始まる１５個のアミノ酸から成る。したがって例えば、Ｃｏｒｅのペプチド１は、配列番号６のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＣｏｒｅアミノ酸配列）、Ｃｏｒｅのペプチド２は、配列番号６のアミノ酸６～２０に対応し、Ｃｏｒｅのペプチド３は、配列番号６のアミノ酸１１～２５に対応する。同様に、ＰｏｌＮのペプチド１は、配列番号８のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＰｏｌＮアミノ酸配列）、ＰｏｌＮのペプチド２は、配列番号８のアミノ酸６～２０に対応し、ＰｏｌＮのペプチド３は、配列番号８のアミノ酸１１～２５に対応する。同様に、ＰｏｌＣのペプチド１は、配列番号１０のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＰｏｌＣアミノ酸配列）、ＰｏｌＣのペプチド２は、配列番号１０のアミノ酸６～２０に対応し、ＰｏｌＣのペプチド３は、配列番号１０のアミノ酸１１～２５に対応する。 図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃは、示されるＨＢＶ配列を表すペプチドのプールに対する異なるマウス系統（Ａ：Ｃ５７Ｂｌ／６マウス；Ｂ：ＢＡＬＢ／ｃマウス；Ｃ：ＨＬＡ－Ａ２遺伝子導入（ｔｇ）マウス）のＴ細胞頻度を示す。結果は、免疫化後４週目に収集された脾細胞を用いて得られ、ＩＦＮ－γをＩＣＳによって調べた。ペプチドは、２個のプールの認識により１個のペプチドが同定されるよう行列状に配置された。グラフは、異なるプールに対する応答を示し、全てのペプチドを含むプールに対する応答は右側に示される。ペプチド無しで得られたバックグラウンド頻度を減算した。応答を誘発するとみなされたプール及び異なるプールに応答して同定されたペプチドを各図面の下部に列挙した。ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示し、ヒトＭＨＣクラスＩ分子を保有するが、マウスＭＨＣクラスＩＩ分子を保有しない、ＨＬＡ－Ａ２ｔｇマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。Ｔ細胞を活性化ＣＤ４４＋細胞上にゲートした。継続的に番号付けされた各「ペプチド」は、Ｃｏｒｅ、ＰｏｌＮ、又はＰｏｌＣ配列の１番目、６番目、１１番目などのアミノ酸で始まる１５個のアミノ酸から成る。したがって例えば、Ｃｏｒｅのペプチド１は、配列番号６のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＣｏｒｅアミノ酸配列）、Ｃｏｒｅのペプチド２は、配列番号６のアミノ酸６～２０に対応し、Ｃｏｒｅのペプチド３は、配列番号６のアミノ酸１１～２５に対応する。同様に、ＰｏｌＮのペプチド１は、配列番号８のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＰｏｌＮアミノ酸配列）、ＰｏｌＮのペプチド２は、配列番号８のアミノ酸６～２０に対応し、ＰｏｌＮのペプチド３は、配列番号８のアミノ酸１１～２５に対応する。同様に、ＰｏｌＣのペプチド１は、配列番号１０のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＰｏｌＣアミノ酸配列）、ＰｏｌＣのペプチド２は、配列番号１０のアミノ酸６～２０に対応し、ＰｏｌＣのペプチド３は、配列番号１０のアミノ酸１１～２５に対応する。 図３Ａ、図３Ｂ、及び図３Ｃは、示されるＨＢＶ配列を表すペプチドのプールに対する異なるマウス系統（Ａ：Ｃ５７Ｂｌ／６マウス；Ｂ：ＢＡＬＢ／ｃマウス；Ｃ：ＨＬＡ－Ａ２遺伝子導入（ｔｇ）マウス）のＴ細胞頻度を示す。結果は、免疫化後４週目に収集された脾細胞を用いて得られ、ＩＦＮ－γをＩＣＳによって調べた。ペプチドは、２個のプールの認識により１個のペプチドが同定されるよう行列状に配置された。グラフは、異なるプールに対する応答を示し、全てのペプチドを含むプールに対する応答は右側に示される。ペプチド無しで得られたバックグラウンド頻度を減算した。応答を誘発するとみなされたプール及び異なるプールに応答して同定されたペプチドを各図面の下部に列挙した。ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示し、ヒトＭＨＣクラスＩ分子を保有するが、マウスＭＨＣクラスＩＩ分子を保有しない、ＨＬＡ－Ａ２ｔｇマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。Ｔ細胞を活性化ＣＤ４４＋細胞上にゲートした。継続的に番号付けされた各「ペプチド」は、Ｃｏｒｅ、ＰｏｌＮ、又はＰｏｌＣ配列の１番目、６番目、１１番目などのアミノ酸で始まる１５個のアミノ酸から成る。したがって例えば、Ｃｏｒｅのペプチド１は、配列番号６のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＣｏｒｅアミノ酸配列）、Ｃｏｒｅのペプチド２は、配列番号６のアミノ酸６～２０に対応し、Ｃｏｒｅのペプチド３は、配列番号６のアミノ酸１１～２５に対応する。同様に、ＰｏｌＮのペプチド１は、配列番号８のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＰｏｌＮアミノ酸配列）、ＰｏｌＮのペプチド２は、配列番号８のアミノ酸６～２０に対応し、ＰｏｌＮのペプチド３は、配列番号８のアミノ酸１１～２５に対応する。同様に、ＰｏｌＣのペプチド１は、配列番号１０のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＰｏｌＣアミノ酸配列）、ＰｏｌＣのペプチド２は、配列番号１０のアミノ酸６～２０に対応し、ＰｏｌＣのペプチド３は、配列番号１０のアミノ酸１１～２５に対応する。 図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃは、各種用量の指示されたベクターで免疫化されたＣ５７Ｂｌ／６マウスにＡｄＣ６－ｇＤＣｏｒｅ（Ａ）、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＣ（Ｂ）、及びＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ（Ｃ）をブースター接種した時のＩＦＮ－γ応答を示す。左のグラフは、ＡｄＣ６ベクターを初回接種した後２週目に血液から調べられた応答を示す。マウスに８週後に同一の挿入断片を発現する同一の用量のＡｄＣ７ベクターをブースター接種した。右のグラフは、ブースター接種後２週目の血液中の応答を示す。 図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃは、各種用量の指示されたベクターで免疫化されたＣ５７Ｂｌ／６マウスにＡｄＣ６－ｇＤＣｏｒｅ（Ａ）、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＣ（Ｂ）、及びＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ（Ｃ）をブースター接種した時のＩＦＮ－γ応答を示す。左のグラフは、ＡｄＣ６ベクターを初回接種した後２週目に血液から調べられた応答を示す。マウスに８週後に同一の挿入断片を発現する同一の用量のＡｄＣ７ベクターをブースター接種した。右のグラフは、ブースター接種後２週目の血液中の応答を示す。 図４Ａ、図４Ｂ及び図４Ｃは、各種用量の指示されたベクターで免疫化されたＣ５７Ｂｌ／６マウスにＡｄＣ６－ｇＤＣｏｒｅ（Ａ）、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＣ（Ｂ）、及びＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ（Ｃ）をブースター接種した時のＩＦＮ－γ応答を示す。左のグラフは、ＡｄＣ６ベクターを初回接種した後２週目に血液から調べられた応答を示す。マウスに８週後に同一の挿入断片を発現する同一の用量のＡｄＣ７ベクターをブースター接種した。右のグラフは、ブースター接種後２週目の血液中の応答を示す。 図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃは、示されるＨＢＶ配列を表すペプチドのプールに対する異なるマウス系統（Ａ：Ｃ５７Ｂｌ／６マウス；Ｂ：ＢＡＬＢ／ｃマウス；Ｃ：ＨＬＡ－Ａ２ｔｇマウス）のＴ細胞頻度を示す。マウスに３種類の挿入断片（すなわち、Ｃｏｒｅ、ＰｏｌＣ、又はＰｏｌＮ）のいずれかを発現するＡｄＣ６ベクターを初回接種し、８週後同一の挿入断片を発現するＡｄＣ７ベクターでブースター接種した。結果は、免疫化後４週目に収集された脾細胞を用いて得られ、ＩＦＮ－γをＩＣＳによって調べた。ペプチドは、２個のプールの認識により１個のペプチドが同定されるよう行列状に配置された。グラフは、異なるプールに対する応答を示し、全てのペプチドを含むプールに対する応答は右側に示される。ペプチド無しで得られたバックグラウンド頻度を減算した。応答を誘発するとみなされたプール及び異なるプールに応答して同定されたペプチドを各図面の下部に列挙した。ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示し、ヒトＭＨＣクラスＩ分子を保有するが、マウスＭＨＣクラスＩＩ分子を保有しない、ＨＬＡ－Ａ２ｔｇマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。Ｔ細胞を活性化ＣＤ４４＋細胞上にゲートした。継続的に番号付けされた各「ペプチド」は、Ｃｏｒｅ、ＰｏｌＮ、又はＰｏｌＣ配列の１番目、６番目、１１番目などのアミノ酸で始まる１５個のアミノ酸から成る。したがって例えば、Ｃｏｒｅのペプチド１は、配列番号６のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＣｏｒｅアミノ酸配列）、Ｃｏｒｅのペプチド２は、配列番号６のアミノ酸６～２０に対応し、Ｃｏｒｅのペプチド３は、配列番号６のアミノ酸１１～２５に対応する。同様に、ＰｏｌＮのペプチド１は、配列番号８のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＰｏｌＮアミノ酸配列）、ＰｏｌＮのペプチド２は、配列番号８のアミノ酸６～２０に対応し、ＰｏｌＮのペプチド３は、配列番号８のアミノ酸１１～２５に対応する。同様に、ＰｏｌＣのペプチド１は、配列番号１０のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＰｏｌＣアミノ酸配列）、ＰｏｌＣのペプチド２は、配列番号１０のアミノ酸６～２０に対応し、ＰｏｌＣのペプチド３は、配列番号１０のアミノ酸１１～２５に対応する。 図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃは、示されるＨＢＶ配列を表すペプチドのプールに対する異なるマウス系統（Ａ：Ｃ５７Ｂｌ／６マウス；Ｂ：ＢＡＬＢ／ｃマウス；Ｃ：ＨＬＡ－Ａ２ｔｇマウス）のＴ細胞頻度を示す。マウスに３種類の挿入断片（すなわち、Ｃｏｒｅ、ＰｏｌＣ、又はＰｏｌＮ）のいずれかを発現するＡｄＣ６ベクターを初回接種し、８週後同一の挿入断片を発現するＡｄＣ７ベクターでブースター接種した。結果は、免疫化後４週目に収集された脾細胞を用いて得られ、ＩＦＮ－γをＩＣＳによって調べた。ペプチドは、２個のプールの認識により１個のペプチドが同定されるよう行列状に配置された。グラフは、異なるプールに対する応答を示し、全てのペプチドを含むプールに対する応答は右側に示される。ペプチド無しで得られたバックグラウンド頻度を減算した。応答を誘発するとみなされたプール及び異なるプールに応答して同定されたペプチドを各図面の下部に列挙した。ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示し、ヒトＭＨＣクラスＩ分子を保有するが、マウスＭＨＣクラスＩＩ分子を保有しない、ＨＬＡ－Ａ２ｔｇマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。Ｔ細胞を活性化ＣＤ４４＋細胞上にゲートした。継続的に番号付けされた各「ペプチド」は、Ｃｏｒｅ、ＰｏｌＮ、又はＰｏｌＣ配列の１番目、６番目、１１番目などのアミノ酸で始まる１５個のアミノ酸から成る。したがって例えば、Ｃｏｒｅのペプチド１は、配列番号６のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＣｏｒｅアミノ酸配列）、Ｃｏｒｅのペプチド２は、配列番号６のアミノ酸６～２０に対応し、Ｃｏｒｅのペプチド３は、配列番号６のアミノ酸１１～２５に対応する。同様に、ＰｏｌＮのペプチド１は、配列番号８のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＰｏｌＮアミノ酸配列）、ＰｏｌＮのペプチド２は、配列番号８のアミノ酸６～２０に対応し、ＰｏｌＮのペプチド３は、配列番号８のアミノ酸１１～２５に対応する。同様に、ＰｏｌＣのペプチド１は、配列番号１０のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＰｏｌＣアミノ酸配列）、ＰｏｌＣのペプチド２は、配列番号１０のアミノ酸６～２０に対応し、ＰｏｌＣのペプチド３は、配列番号１０のアミノ酸１１～２５に対応する。 図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃは、示されるＨＢＶ配列を表すペプチドのプールに対する異なるマウス系統（Ａ：Ｃ５７Ｂｌ／６マウス；Ｂ：ＢＡＬＢ／ｃマウス；Ｃ：ＨＬＡ－Ａ２ｔｇマウス）のＴ細胞頻度を示す。マウスに３種類の挿入断片（すなわち、Ｃｏｒｅ、ＰｏｌＣ、又はＰｏｌＮ）のいずれかを発現するＡｄＣ６ベクターを初回接種し、８週後同一の挿入断片を発現するＡｄＣ７ベクターでブースター接種した。結果は、免疫化後４週目に収集された脾細胞を用いて得られ、ＩＦＮ－γをＩＣＳによって調べた。ペプチドは、２個のプールの認識により１個のペプチドが同定されるよう行列状に配置された。グラフは、異なるプールに対する応答を示し、全てのペプチドを含むプールに対する応答は右側に示される。ペプチド無しで得られたバックグラウンド頻度を減算した。応答を誘発するとみなされたプール及び異なるプールに応答して同定されたペプチドを各図面の下部に列挙した。ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示し、ヒトＭＨＣクラスＩ分子を保有するが、マウスＭＨＣクラスＩＩ分子を保有しない、ＨＬＡ－Ａ２ｔｇマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。Ｔ細胞を活性化ＣＤ４４＋細胞上にゲートした。継続的に番号付けされた各「ペプチド」は、Ｃｏｒｅ、ＰｏｌＮ、又はＰｏｌＣ配列の１番目、６番目、１１番目などのアミノ酸で始まる１５個のアミノ酸から成る。したがって例えば、Ｃｏｒｅのペプチド１は、配列番号６のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＣｏｒｅアミノ酸配列）、Ｃｏｒｅのペプチド２は、配列番号６のアミノ酸６～２０に対応し、Ｃｏｒｅのペプチド３は、配列番号６のアミノ酸１１～２５に対応する。同様に、ＰｏｌＮのペプチド１は、配列番号８のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＰｏｌＮアミノ酸配列）、ＰｏｌＮのペプチド２は、配列番号８のアミノ酸６～２０に対応し、ＰｏｌＮのペプチド３は、配列番号８のアミノ酸１１～２５に対応する。同様に、ＰｏｌＣのペプチド１は、配列番号１０のアミノ酸１～１５に対応し（すなわち、エピトープ最適化されたＰｏｌＣアミノ酸配列）、ＰｏｌＣのペプチド２は、配列番号１０のアミノ酸６～２０に対応し、ＰｏｌＣのペプチド３は、配列番号１０のアミノ酸１１～２５に対応する。 図６は、ＡＡＶ－１．３ＨＢＶ曝露時の血清中のＨＢＶゲノムコピー数に対するワクチン接種の効果を示す。３匹のマウスのグループに１×１０¹⁰、１×１０¹¹又は１．５×１０¹¹ウイルスゲノム（ｖｇ）のアデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）－１．３ＨＢＶベクターを曝露し、８週後にＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮをワクチン接種した。ワクチン接種後８週目にウイルス力価を調べ、ワクチン接種前の力価と比較した。各治療グループのベースラインからのウイルス量変化を示す。 図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、及び図７Ｅは、例示的なＨＢＶエピトープ変化実験を示す。図７Ａ－マウスをＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンで免疫化した。４週後、脾細胞のＰｏｌＮ配列を表すペプチドプールに対するＩＦＮ－γ応答を細胞内サイトカイン染色により調べた。刺激後のＴ細胞をＴ細胞マーカーについて染色した。図７Ｂ－結果は、１×１０¹⁰ｖｇのＡＡＶ８－１．３－ＨＢＶに曝露したマウス由来の脾細胞を使用する同一のアッセイにより得られた。４週後マウスにワクチン接種し、１０週後脾臓のＴ細胞応答を調べた。図７Ｃ－結果は、１．５×１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３－ＨＢＶに曝露したマウス由来の脾細胞を使用する同一のアッセイにより得られた。４週後マウスにワクチン接種し、１０週後脾臓のＴ細胞応答を調べた。図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃは、全てのＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＦＮ－γ産生ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。ペプチドプール無しでインキュベートされた脾細胞により得られたバックグラウンド応答を減算した。図７Ｄ―ペプチドプール。図７Ｅ－個別のペプチド配列。図７Ｅでは、出現の順序で、それぞれ配列番号５５～６８及び１８９～２３３を開示する。 図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、及び図７Ｅは、例示的なＨＢＶエピトープ変化実験を示す。図７Ａ－マウスをＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンで免疫化した。４週後、脾細胞のＰｏｌＮ配列を表すペプチドプールに対するＩＦＮ－γ応答を細胞内サイトカイン染色により調べた。刺激後のＴ細胞をＴ細胞マーカーについて染色した。図７Ｂ－結果は、１×１０¹⁰ｖｇのＡＡＶ８－１．３－ＨＢＶに曝露したマウス由来の脾細胞を使用する同一のアッセイにより得られた。４週後マウスにワクチン接種し、１０週後脾臓のＴ細胞応答を調べた。図７Ｃ－結果は、１．５×１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３－ＨＢＶに曝露したマウス由来の脾細胞を使用する同一のアッセイにより得られた。４週後マウスにワクチン接種し、１０週後脾臓のＴ細胞応答を調べた。図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃは、全てのＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＦＮ－γ産生ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。ペプチドプール無しでインキュベートされた脾細胞により得られたバックグラウンド応答を減算した。図７Ｄ―ペプチドプール。図７Ｅ－個別のペプチド配列。図７Ｅでは、出現の順序で、それぞれ配列番号５５～６８及び１８９～２３３を開示する。 図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、及び図７Ｅは、例示的なＨＢＶエピトープ変化実験を示す。図７Ａ－マウスをＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンで免疫化した。４週後、脾細胞のＰｏｌＮ配列を表すペプチドプールに対するＩＦＮ－γ応答を細胞内サイトカイン染色により調べた。刺激後のＴ細胞をＴ細胞マーカーについて染色した。図７Ｂ－結果は、１×１０¹⁰ｖｇのＡＡＶ８－１．３－ＨＢＶに曝露したマウス由来の脾細胞を使用する同一のアッセイにより得られた。４週後マウスにワクチン接種し、１０週後脾臓のＴ細胞応答を調べた。図７Ｃ－結果は、１．５×１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３－ＨＢＶに曝露したマウス由来の脾細胞を使用する同一のアッセイにより得られた。４週後マウスにワクチン接種し、１０週後脾臓のＴ細胞応答を調べた。図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃは、全てのＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＦＮ－γ産生ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。ペプチドプール無しでインキュベートされた脾細胞により得られたバックグラウンド応答を減算した。図７Ｄ―ペプチドプール。図７Ｅ－個別のペプチド配列。図７Ｅでは、出現の順序で、それぞれ配列番号５５～６８及び１８９～２３３を開示する。 図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、及び図７Ｅは、例示的なＨＢＶエピトープ変化実験を示す。図７Ａ－マウスをＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンで免疫化した。４週後、脾細胞のＰｏｌＮ配列を表すペプチドプールに対するＩＦＮ－γ応答を細胞内サイトカイン染色により調べた。刺激後のＴ細胞をＴ細胞マーカーについて染色した。図７Ｂ－結果は、１×１０¹⁰ｖｇのＡＡＶ８－１．３－ＨＢＶに曝露したマウス由来の脾細胞を使用する同一のアッセイにより得られた。４週後マウスにワクチン接種し、１０週後脾臓のＴ細胞応答を調べた。図７Ｃ－結果は、１．５×１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３－ＨＢＶに曝露したマウス由来の脾細胞を使用する同一のアッセイにより得られた。４週後マウスにワクチン接種し、１０週後脾臓のＴ細胞応答を調べた。図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃは、全てのＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＦＮ－γ産生ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。ペプチドプール無しでインキュベートされた脾細胞により得られたバックグラウンド応答を減算した。図７Ｄ―ペプチドプール。図７Ｅ-個別のペプチド配列。図７Ｅでは、出現の順序で、それぞれ配列番号５５～６８及び１８９～２３３を開示する。 図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、及び図７Ｅは、例示的なＨＢＶエピトープ変化実験を示す。図７Ａ－マウスをＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンで免疫化した。４週後、脾細胞のＰｏｌＮ配列を表すペプチドプールに対するＩＦＮ－γ応答を細胞内サイトカイン染色により調べた。刺激後のＴ細胞をＴ細胞マーカーについて染色した。図７Ｂ－結果は、１×１０¹⁰ｖｇのＡＡＶ８－１．３－ＨＢＶに曝露したマウス由来の脾細胞を使用する同一のアッセイにより得られた。４週後マウスにワクチン接種し、１０週後脾臓のＴ細胞応答を調べた。図７Ｃ－結果は、１．５×１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３－ＨＢＶに曝露したマウス由来の脾細胞を使用する同一のアッセイにより得られた。４週後マウスにワクチン接種し、１０週後脾臓のＴ細胞応答を調べた。図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃは、全てのＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＦＮ－γ産生ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。ペプチドプール無しでインキュベートされた脾細胞により得られたバックグラウンド応答を減算した。図７Ｄ―ペプチドプール。図７Ｅ－個別のペプチド配列。図７Ｅでは、出現の順序で、それぞれ配列番号５５～６８及び１８９～２３３を開示する。 図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃは、図７に上述した同一の実験からのデータを示す。ペプチドプールに対する応答に基づいて、どの個別のペプチド（プールとペプチドの両方は図７に示される）が陽性かを決定した。グラフは、ペプチドの全てに対する応答を示す。各ペプチドは、２個のプールに存在し、したがって各ペプチドに対して２個の頻度値が得られ、低いデータポイントのみをこの図面に示す。 図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃは、図７に上述した同一の実験からのデータを示す。ペプチドプールに対する応答に基づいて、どの個別のペプチド（プールとペプチドの両方は図７に示される）が陽性かを決定した。グラフは、ペプチドの全てに対する応答を示す。各ペプチドは、２個のプールに存在し、したがって各ペプチドに対して２個の頻度値が得られ、低いデータポイントのみをこの図面に示す。 図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃは、図７に上述した同一の実験からのデータを示す。ペプチドプールに対する応答に基づいて、どの個別のペプチド（プールとペプチドの両方は図７に示される）が陽性かを決定した。グラフは、ペプチドの全てに対する応答を示す。各ペプチドは、２個のプールに存在し、したがって各ペプチドに対して２個の頻度値が得られ、低いデータポイントのみをこの図面に示す。 図９Ａ、図９Ｂ、及び図９Ｃは、様々な用量の例示的なＡｄＣ６－ｇＤＣｏｒｅ、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ、又はＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＣベクターを注射し、第１の注射の２か月後に同一の挿入断片を含むＡｄＣ７ベクター（すなわち、ＡｄＣ７－ｇＤＣｏｒｅ、ＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮ、又はＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＣベクター）をブースター接種したＣ５７Ｂｌ／６マウス（グループあたりｎ＝５）に対して実行された例示的な免疫原性実験の結果を示す。図９Ａは、抗原免疫原性を示し、図９Ｂは、応答期間を示し、そして図９Ｃは、プライムブースト応答を示す。 図９Ａ、図９Ｂ、及び図９Ｃは、様々な用量の例示的なＡｄＣ６－ｇＤＣｏｒｅ、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ、又はＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＣベクターを注射し、第１の注射の２か月後に同一の挿入断片を含むＡｄＣ７ベクター（すなわち、ＡｄＣ７－ｇＤＣｏｒｅ、ＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮ、又はＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＣベクター）をブースター接種したＣ５７Ｂｌ／６マウス（グループあたりｎ＝５）に対して実行された例示的な免疫原性実験の結果を示す。図９Ａは、抗原免疫原性を示し、図９Ｂは、応答期間を示し、そして図９Ｃは、プライムブースト応答を示す。 図９Ａ、図９Ｂ、及び図９Ｃは、様々な用量の例示的なＡｄＣ６－ｇＤＣｏｒｅ、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ、又はＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＣベクターを注射し、第１の注射の２か月後に同一の挿入断片を含むＡｄＣ７ベクター（すなわち、ＡｄＣ７－ｇＤＣｏｒｅ、ＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮ、又はＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＣベクター）をブースター接種したＣ５７Ｂｌ／６マウス（グループあたりｎ＝５）に対して実行された例示的な免疫原性実験の結果を示す。図９Ａは、抗原免疫原性を示し、図９Ｂは、応答期間を示し、そして図９Ｃは、プライムブースト応答を示す。 図１０は、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮの初回接種及びＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮのブースター接種によるワクチン接種後のＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７Ｂｌ／６、及びＨＬＡ－Ａ２遺伝子導入マウスのＰｏｌＮエピトープのＣＤ８＋Ｔ細胞ペプチド認識を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞ペプチド認識は、初回接種又はブースター接種のいずれかの２週後に認識された陽性のペプチド数をＰｏｌＮ由来の重複した８個のペプチドの総数（合計５９ペプチド）で割った分数として計算された。 図１１Ａ及び図１１Ｂは、示されるベクターを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウスの肝臓中のワクチンで誘導されたＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。＊０．０１～０．０５のｐ値、＊＊＊０．０００１～０．００１のｐ値、１元配置分散分析による。 図１１Ａ及び図１１Ｂは、示されるベクターを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウスの肝臓中のワクチンで誘導されたＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。＊０．０１～０．０５のｐ値、＊＊＊０．０００１～０．００１のｐ値、１元配置分散分析による。 図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、及び図１２Ｆは、示されるベクターを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウス由来の肝臓サンプルのヘマトキシリン＆エオシン染色を示す。拡大率２０倍。矢印は、リンパ球浸潤物の領域を示す。 図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、及び図１２Ｆは、示されるベクターを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウス由来の肝臓サンプルのヘマトキシリン＆エオシン染色を示す。拡大率２０倍。矢印は、リンパ球浸潤物の領域を示す。 図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、及び図１２Ｆは、示されるベクターを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウス由来の肝臓サンプルのヘマトキシリン＆エオシン染色を示す。拡大率２０倍。矢印は、リンパ球浸潤物の領域を示す。 図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、及び図１２Ｆは、示されるベクターを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウス由来の肝臓サンプルのヘマトキシリン＆エオシン染色を示す。拡大率２０倍。矢印は、リンパ球浸潤物の領域を示す。 図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、及び図１２Ｆは、示されるベクターを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウス由来の肝臓サンプルのヘマトキシリン＆エオシン染色を示す。拡大率２０倍。矢印は、リンパ球浸潤物の領域を示す。 図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、及び図１２Ｆは、示されるベクターを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウス由来の肝臓サンプルのヘマトキシリン＆エオシン染色を示す。拡大率２０倍。矢印は、リンパ球浸潤物の領域を示す。 図１３Ａ及び図１３Ｂは、示されるベクターを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウスの肝臓中のワクチンで誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞活性化／消耗のマーカーを示す。＊＊０．００１～０．０１のｐ値、＊＊＊０．０００１～０．００１のｐ値、１元配置分散分析による。 図１３Ａ及び図１３Ｂは、示されるベクターを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウスの肝臓中のワクチンで誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞活性化／消耗のマーカーを示す。＊＊０．００１～０．０１のｐ値、＊＊＊０．０００１～０．００１のｐ値、１元配置分散分析による。 図１４Ａ及び図１４Ｂは、例示的なＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウスのＨＢＶウイルス動態を示す。４週目のＨＢＶ ＤＮＡ ＶＬ／ｍｌの中央値－７．３ｌｏｇ₁₀ｃｐｓ／ｍＬを提供する。ｎ＝７で、１匹のマウスはデータ欠損により除外した。 図１４Ａ及び図１４Ｂは、例示的なＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターを注射したＣ５７Ｂｌ／６マウスのＨＢＶウイルス動態を示す。４週目のＨＢＶ ＤＮＡ ＶＬ／ｍｌの中央値－７．３ ｌｏｇ₁₀ ｃｐｓ／ｍＬを提供する。ｎ＝７で、１匹のマウスはデータ欠損により除外した。 図１５Ａ及び図１５Ｂは、最初に１０¹⁰又は１０¹¹ｖｇのＡＡＶ－１．３ＨＢＶを注射し、４週後１０¹⁰ｖｐの例示的なＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターをブースター接種したＣ５７Ｂｌ／６マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対するＡＡＶで誘導されたＨＢＶの影響を示す。図１５Ｂでは、各スライスは、大きさが全体の割合を示す、個別のエピトープを表し、０．１％を超える応答のみを含めた。引き抜きは、ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで感染させたマウスでのみ認識されたエピトープを表す。 図１５Ａ及び図１５Ｂは、最初に１０¹⁰又は１０¹¹ｖｇのＡＡＶ－１．３ＨＢＶを注射し、４週後１０¹⁰ｖｐの例示的なＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターをブースター接種したＣ５７Ｂｌ／６マウスのＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対するＡＡＶで誘導されたＨＢＶの影響を示す。図１５Ｂでは、各スライスは、大きさが全体の割合を示す、個別のエピトープを表し、０．１％を超える応答のみを含めた。引き抜きは、ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで感染させたマウスでのみ認識されたエピトープを表す。 図１６は、１０¹⁰ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターを静脈内に注射し、４週後５×１０⁹ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターをワクチン接種し、２か月後に同一の用量のＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮワクチンをブースター接種した個別のＣ５７Ｂｌ／６マウスのＩＦＮ－γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。コントロールマウスは、ワクチンのみを受けた。未処置のマウスは、追加のコントロールとして働いた。 図１７Ａ及び図１７Ｂは、Ａ）個別のマウスの肝臓のリンパ性浸潤物内のＣＤ８⁺Ｔ細胞の割合、及びＢ）同一の浸潤物内のＰｏｌＮ－四量体⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに１０¹⁰又は１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターを静脈内に注射し、４週後５×１０⁹ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターをワクチン接種し、２か月後同一の用量のＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮワクチンをブースター接種した。コントロールマウスは、ワクチンのみを受けた。未処置のマウスは、追加のコントロールとして働いた。 図１７Ａ及び図１７Ｂは、Ａ）個別のマウスの肝臓のリンパ性浸潤物内のＣＤ８⁺Ｔ細胞の割合、及びＢ）同一の浸潤物内のＰｏｌＮ－四量体⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに１０¹⁰又は１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターを静脈内に注射し、４週後５×１０⁹ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターをワクチン接種し、２か月後同一の用量のＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮワクチンをブースター接種した。コントロールマウスは、ワクチンのみを受けた。未処置のマウスは、追加のコントロールとして働いた。 図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃ、図１８Ｄ、図１８Ｅ、及び図１８Ｆは、示されるマーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）で分析した未処理の（すなわち、四量体^-ＣＤ４４^-ＣＤ８⁺）Ｔ細胞と比較した浸潤性四量体⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の表現型を示す。上の星付きの線は、多重ｔ検定による有意な差を示す。（＊）ｐ≦０．０５～０．０１、（＊＊）ｐ≦０．０１～０．００１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１～０．０００１、（＊＊＊＊）ｐ≦０．０００１。 図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃ、図１８Ｄ、図１８Ｅ、及び図１８Ｆは、示されるマーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）で分析した未処理の（すなわち、四量体^-ＣＤ４４^-ＣＤ８⁺）Ｔ細胞と比較した浸潤性四量体⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の表現型を示す。上の星付きの線は、多重ｔ検定による有意な差を示す。（＊）ｐ≦０．０５～０．０１、（＊＊）ｐ≦０．０１～０．００１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１～０．０００１、（＊＊＊＊）ｐ≦０．０００１。 図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃ、図１８Ｄ、図１８Ｅ、及び図１８Ｆは、示されるマーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）で分析した未処理の（すなわち、四量体^-ＣＤ４４^-ＣＤ８⁺）Ｔ細胞と比較した浸潤性四量体⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の表現型を示す。上の星付きの線は、多重ｔ検定による有意な差を示す。（＊）ｐ≦０．０５～０．０１、（＊＊）ｐ≦０．０１～０．００１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１～０．０００１、（＊＊＊＊）ｐ≦０．０００１。 図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃ、図１８Ｄ、図１８Ｅ、及び図１８Ｆは、示されるマーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）で分析した未処理の（すなわち、四量体^-ＣＤ４４^-ＣＤ８⁺）Ｔ細胞と比較した浸潤性四量体⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の表現型を示す。上の星付きの線は、多重ｔ検定による有意な差を示す。（＊）ｐ≦０．０５～０．０１、（＊＊）ｐ≦０．０１～０．００１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１～０．０００１、（＊＊＊＊）ｐ≦０．０００１。 図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃ、図１８Ｄ、図１８Ｅ、及び図１８Ｆは、示されるマーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）で分析した未処理の（すなわち、四量体^-ＣＤ４４^-ＣＤ８⁺）Ｔ細胞と比較した浸潤性四量体⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の表現型を示す。上の星付きの線は、多重ｔ検定による有意な差を示す。（＊）ｐ≦０．０５～０．０１、（＊＊）ｐ≦０．０１～０．００１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１～０．０００１、（＊＊＊＊）ｐ≦０．０００１。 図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃ、図１８Ｄ、図１８Ｅ、及び図１８Ｆは、示されるマーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）で分析した未処理の（すなわち、四量体^-ＣＤ４４^-ＣＤ８⁺）Ｔ細胞と比較した浸潤性四量体⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の表現型を示す。上の星付きの線は、多重ｔ検定による有意な差を示す。（＊）ｐ≦０．０５～０．０１、（＊＊）ｐ≦０．０１～０．００１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１～０．０００１、（＊＊＊＊）ｐ≦０．０００１。 図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃ、図１９Ｄ、図１９Ｅ、及び図１９Ｆは、示されるマーカーについてＴｅｔ⁺又は未処理のＣＤ８⁺Ｔ細胞陽性の割合を示す。上の星付きの線は、多重ｔ検定による有意な差を示す。（＊）ｐ≦０．０５～０．０１、（＊＊）ｐ≦０．０１～０．００１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１～０．０００１、（＊＊＊＊）ｐ≦０．０００１。 図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃ、図１９Ｄ、図１９Ｅ、及び図１９Ｆは、示されるマーカーについてＴｅｔ⁺又は未処理のＣＤ８⁺Ｔ細胞陽性の割合を示す。上の星付きの線は、多重ｔ検定による有意な差を示す。（＊）ｐ≦０．０５～０．０１、（＊＊）ｐ≦０．０１～０．００１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１～０．０００１、（＊＊＊＊）ｐ≦０．０００１。 図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃ、図１９Ｄ、図１９Ｅ、及び図１９Ｆは、示されるマーカーについてＴｅｔ⁺又は未処理のＣＤ８⁺Ｔ細胞陽性の割合を示す。上の星付きの線は、多重ｔ検定による有意な差を示す。（＊）ｐ≦０．０５～０．０１、（＊＊）ｐ≦０．０１～０．００１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１～０．０００１、（＊＊＊＊）ｐ≦０．０００１。 図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃ、図１９Ｄ、図１９Ｅ、及び図１９Ｆは、示されるマーカーについてＴｅｔ⁺又は未処理のＣＤ８⁺Ｔ細胞陽性の割合を示す。上の星付きの線は、多重ｔ検定による有意な差を示す。（＊）ｐ≦０．０５～０．０１、（＊＊）ｐ≦０．０１～０．００１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１～０．０００１、（＊＊＊＊）ｐ≦０．０００１。 図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃ、図１９Ｄ、図１９Ｅ、及び図１９Ｆは、示されるマーカーについてＴｅｔ⁺又は未処理のＣＤ８⁺Ｔ細胞陽性の割合を示す。上の星付きの線は、多重ｔ検定による有意な差を示す。（＊）ｐ≦０．０５～０．０１、（＊＊）ｐ≦０．０１～０．００１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１～０．０００１、（＊＊＊＊）ｐ≦０．０００１。 図１９Ａ、図１９Ｂ、図１９Ｃ、図１９Ｄ、図１９Ｅ、及び図１９Ｆは、示されるマーカーについてＴｅｔ⁺又は未処理のＣＤ８⁺Ｔ細胞陽性の割合を示す。上の星付きの線は、多重ｔ検定による有意な差を示す。（＊）ｐ≦０．０５～０．０１、（＊＊）ｐ≦０．０１～０．００１、（＊＊＊）ｐ≦０．００１～０．０００１、（＊＊＊＊）ｐ≦０．０００１。 図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃ、図２０Ｄ、図２０Ｅ、及び図２０Ｆは、ＰｏｌＮ配列に及ぶ個別のペプチドに対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。全プールー全てのＰｏｌＮペプチドの混合物に対する応答；未処置―全てのＰｏｌＮペプチドの混合物に対する未処置のマウスの応答。図２０Ａ及び図２０Ｄは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンのみを受けたマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ｂ及び図２０Ｅは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮでのワクチン接種の４週前に１０¹⁰ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを注射したマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ｃ及び図２０Ｆは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮでのワクチン接種の４週前に１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを注射したマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ａ、２０Ｂ及び２０Ｃは、図７Ｄに示されるペプチドプール及び図７Ｅを使用して認識された個別のペプチド配列を使用する個別のエピトープによる免疫応答の幅を計算するために使用することができる。 図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃ、図２０Ｄ、図２０Ｅ、及び図２０Ｆは、ＰｏｌＮ配列に及ぶ個別のペプチドに対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。全プールー全てのＰｏｌＮペプチドの混合物に対する応答；未処置―全てのＰｏｌＮペプチドの混合物に対する未処置のマウスの応答。図２０Ａ及び図２０Ｄは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンのみを受けたマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ｂ及び図２０Ｅは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮでのワクチン接種の４週前に１０¹⁰ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを注射したマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ｃ及び図２０Ｆは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮでのワクチン接種の４週前に１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを注射したマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ａ、２０Ｂ及び２０Ｃは、図７Ｄに示されるペプチドプール及び図７Ｅを使用して認識された個別のペプチド配列を使用する個別のエピトープによる免疫応答の幅を計算するために使用することができる。 図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃ、図２０Ｄ、図２０Ｅ、及び図２０Ｆは、ＰｏｌＮ配列に及ぶ個別のペプチドに対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。全プールー全てのＰｏｌＮペプチドの混合物に対する応答；未処置―全てのＰｏｌＮペプチドの混合物に対する未処置のマウスの応答。図２０Ａ及び図２０Ｄは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンのみを受けたマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ｂ及び図２０Ｅは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮでのワクチン接種の４週前に１０¹⁰ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを注射したマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ｃ及び図２０Ｆは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮでのワクチン接種の４週前に１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを注射したマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ａ、２０Ｂ及び２０Ｃは、図７Ｄに示されるペプチドプール及び図７Ｅを使用して認識された個別のペプチド配列を使用する個別のエピトープによる免疫応答の幅を計算するために使用することができる。 図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃ、図２０Ｄ、図２０Ｅ、及び図２０Ｆは、ＰｏｌＮ配列に及ぶ個別のペプチドに対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。全プールー全てのＰｏｌＮペプチドの混合物に対する応答；未処置―全てのＰｏｌＮペプチドの混合物に対する未処置のマウスの応答。図２０Ａ及び図２０Ｄは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンのみを受けたマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ｂ及び図２０Ｅは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮでのワクチン接種の４週前に１０¹⁰ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを注射したマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ｃ及び図２０Ｆは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮでのワクチン接種の４週前に１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを注射したマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ａ、２０Ｂ及び２０Ｃは、図７Ｄに示されるペプチドプール及び図７Ｅを使用して認識された個別のペプチド配列を使用する個別のエピトープによる免疫応答の幅を計算するために使用することができる。 図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃ、図２０Ｄ、図２０Ｅ、及び図２０Ｆは、ＰｏｌＮ配列に及ぶ個別のペプチドに対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。全プールー全てのＰｏｌＮペプチドの混合物に対する応答；未処置―全てのＰｏｌＮペプチドの混合物に対する未処置のマウスの応答。図２０Ａ及び図２０Ｄは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンのみを受けたマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ｂ及び図２０Ｅは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮでのワクチン接種の４週前に１０¹⁰ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを注射したマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ｃ及び図２０Ｆは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮでのワクチン接種の４週前に１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを注射したマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ａ、２０Ｂ及び２０Ｃは、図７Ｄに示されるペプチドプール及び図７Ｅを使用して認識された個別のペプチド配列を使用する個別のエピトープによる免疫応答の幅を計算するために使用することができる。 図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃ、図２０Ｄ、図２０Ｅ、及び図２０Ｆは、ＰｏｌＮ配列に及ぶ個別のペプチドに対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。全プールー全てのＰｏｌＮペプチドの混合物に対する応答；未処置―全てのＰｏｌＮペプチドの混合物に対する未処置のマウスの応答。図２０Ａ及び図２０Ｄは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンのみを受けたマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ｂ及び図２０Ｅは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮでのワクチン接種の４週前に１０¹⁰ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを注射したマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ｃ及び図２０Ｆは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮでのワクチン接種の４週前に１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを注射したマウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２０Ａ、２０Ｂ及び２０Ｃは、図７Ｄに示されるペプチドプール及び図７Ｅを使用して認識された個別のペプチド配列を使用する個別のエピトープによる免疫応答の幅を計算するために使用することができる。 図２１Ａ及び図２１Ｂは、マウスの脾臓又は肝臓のＰｏｌＮ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。図２１Ａの左のパネルは、その後に５×１０¹⁰ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンを受けた又は受けなかったＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを注射したマウスの脾臓のＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２１Ａの中央のパネルは、異なる用量のＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで処置し、プライムブースト計画のワクチンを受けたマウスの肝臓のＣＤ８⁺Ｔ細胞頻度を示す。図２１Ａの右のパネルは、同一の実験由来のＰｏｌＮ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞又は未処理のＣＤ８⁺Ｔ細胞のＴｏｘ－１発現レベルを示す。図２１Ｂは、ＩＦＮ－γ⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の割合を示す。 図２１Ａ及び図２１Ｂは、マウスの脾臓又は肝臓のＰｏｌＮ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。図２１Ａの左のパネルは、その後に５×１０¹⁰ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンを受けた又は受けなかったＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを注射したマウスの脾臓のＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。図２１Ａの中央のパネルは、異なる用量のＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで処置し、プライムブースト計画のワクチンを受けたマウスの肝臓のＣＤ８⁺Ｔ細胞頻度を示す。図２１Ａの右のパネルは、同一の実験由来のＰｏｌＮ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞又は未処理のＣＤ８⁺Ｔ細胞のＴｏｘ－１発現レベルを示す。図２１Ｂは、ＩＦＮ－γ⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の割合を示す。 図２２Ａ及び図２２Ｂは、Ａ）示されるＡｄＣ６ベクターを注射したマウスの血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞頻度、及びＢ）四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。 図２２Ａ及び図２２Ｂは、Ａ）示されるＡｄＣ６ベクターを注射したマウスの血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞頻度、及びＢ）四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。 図２３は、示されるＡｄＣ７ベクターを注射したマウスの血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞頻度を示す。 図２４Ａ、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２４Ｄ、図２４Ｅ、及び図２４Ｆは、示されるＡｄＣ７ベクターを注射し（「初回接種後」）、対応するＡｄＣ６ベクターをブースター接種した（「ブースター接種後」）マウスの血液中のｇＤＨＢＶ２及びｇＤＨＢＶ３挿入断片に対するＣＤ８⁺（図２４Ａ～図２４Ｃ）及びＣＤ４＋（図２４Ｄ～図２４Ｆ）Ｔ細胞頻度を示す。グラフは、ＩＦＮ－γを産生するＴ細胞の頻度、ＴＮＦ－αを産生するＴ細胞の頻度、及びいずれかのサイトカインを産生するＴ細胞の頻度の合計を示す。 図２４Ａ、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２４Ｄ、図２４Ｅ、及び図２４Ｆは、示されるＡｄＣ７ベクターを注射し（「初回接種後」）、対応するＡｄＣ６ベクターをブースター接種した（「ブースター接種後」）マウスの血液中のｇＤＨＢＶ２及びｇＤＨＢＶ３挿入断片に対するＣＤ８⁺（図２４Ａ～図２４Ｃ）及びＣＤ４＋（図２４Ｄ～図２４Ｆ）Ｔ細胞頻度を示す。グラフは、ＩＦＮ－γを産生するＴ細胞の頻度、ＴＮＦ－αを産生するＴ細胞の頻度、及びいずれかのサイトカインを産生するＴ細胞の頻度の合計を示す。 図２４Ａ、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２４Ｄ、図２４Ｅ、及び図２４Ｆは、示されるＡｄＣ７ベクターを注射し（「初回接種後」）、対応するＡｄＣ６ベクターをブースター接種した（「ブースター接種後」）マウスの血液中のｇＤＨＢＶ２及びｇＤＨＢＶ３挿入断片に対するＣＤ８⁺（図２４Ａ～図２４Ｃ）及びＣＤ４＋（図２４Ｄ～図２４Ｆ）Ｔ細胞頻度を示す。グラフは、ＩＦＮ－γを産生するＴ細胞の頻度、ＴＮＦ－αを産生するＴ細胞の頻度、及びいずれかのサイトカインを産生するＴ細胞の頻度の合計を示す。 図２４Ａ、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２４Ｄ、図２４Ｅ、及び図２４Ｆは、示されるＡｄＣ７ベクターを注射し（「初回接種後」）、対応するＡｄＣ６ベクターをブースター接種した（「ブースター接種後」）マウスの血液中のｇＤＨＢＶ２及びｇＤＨＢＶ３挿入断片に対するＣＤ８⁺（図２４Ａ～図２４Ｃ）及びＣＤ４＋（図２４Ｄ～図２４Ｆ）Ｔ細胞頻度を示す。グラフは、ＩＦＮ－γを産生するＴ細胞の頻度、ＴＮＦ－αを産生するＴ細胞の頻度、及びいずれかのサイトカインを産生するＴ細胞の頻度の合計を示す。 図２４Ａ、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２４Ｄ、図２４Ｅ、及び図２４Ｆは、示されるＡｄＣ７ベクターを注射し（「初回接種後」）、対応するＡｄＣ６ベクターをブースター接種した（「ブースター接種後」）マウスの血液中のｇＤＨＢＶ２及びｇＤＨＢＶ３挿入断片に対するＣＤ８⁺（図２４Ａ～図２４Ｃ）及びＣＤ４＋（図２４Ｄ～図２４Ｆ）Ｔ細胞頻度を示す。グラフは、ＩＦＮ－γを産生するＴ細胞の頻度、ＴＮＦ－αを産生するＴ細胞の頻度、及びいずれかのサイトカインを産生するＴ細胞の頻度の合計を示す。 図２４Ａ、図２４Ｂ、図２４Ｃ、図２４Ｄ、図２４Ｅ、及び図２４Ｆは、示されるＡｄＣ７ベクターを注射し（「初回接種後」）、対応するＡｄＣ６ベクターをブースター接種した（「ブースター接種後」）マウスの血液中のｇＤＨＢＶ２及びｇＤＨＢＶ３挿入断片に対するＣＤ８⁺（図２４Ａ～図２４Ｃ）及びＣＤ４＋（図２４Ｄ～図２４Ｆ）Ｔ細胞頻度を示す。グラフは、ＩＦＮ－γを産生するＴ細胞の頻度、ＴＮＦ－αを産生するＴ細胞の頻度、及びいずれかのサイトカインを産生するＴ細胞の頻度の合計を示す。 図２５Ａ及び図２５Ｂは、１×１０⁹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを曝露し、４週後１×１０¹⁰ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ（「ｇＤＰｏｌＮ」）、ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２（「ｇＤＨＢＶ２」）、ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３（「ｇＤＨＢＶ３」）、又はｇＤ無しのＡｄＣ６－ＨＢＶ２（「ＨＢＶ２」）をワクチン接種したＣ５７Ｂｌ／６マウスのＨＢＶＤＮＡウイルス力価を示し、ＡＡＶで感染させ、ワクチン接種していない動物（「未処置」）、及びＡＡＶで感染させず、ワクチン接種していない動物（データを示さず）はコントロールとして働いた。図２５Ａは、ＡＡＶ曝露後４週目及び８週目の各グループのウイルス力価を示し、図２５Ｂは、ＡＡＶ曝露後４週目及び８週目の個別のマウスの結果を示す。 図２５Ａ及び図２５Ｂは、１×１０⁹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを曝露し、４週後１×１０¹⁰ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ（「ｇＤＰｏｌＮ」）、ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２（「ｇＤＨＢＶ２」）、ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３（「ｇＤＨＢＶ３」）、又はｇＤ無しのＡｄＣ６－ＨＢＶ２（「ＨＢＶ２」）をワクチン接種したＣ５７Ｂｌ／６マウスのＨＢＶＤＮＡウイルス力価を示し、ＡＡＶで感染させ、ワクチン接種していない動物（「未処置」）、及びＡＡＶで感染させず、ワクチン接種していない動物（データを示さず）はコントロールとして働いた。図２５Ａは、ＡＡＶ曝露後４週目及び８週目の各グループのウイルス力価を示し、図２５Ｂは、ＡＡＶ曝露後４週目及び８週目の個別のマウスの結果を示す。 図２６Ａ、図２６Ｂ、図２６Ｃ、及び図２６Ｄは、示される構築物を使用した初回接種後２週目及び８週目並びにブースター接種後２週目及び４週目の親のＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－α産生ＣＤ８⁺Ｔ細胞（図２６Ａ）、ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２６Ｂ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２６Ｃ）又はＣＤ４４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２６Ｄ）の割合（平均として）を示す。 図２６Ａ、図２６Ｂ、図２６Ｃ、及び図２６Ｄは、示される構築物を使用した初回接種後２週目及び８週目並びにブースター接種後２週目及び４週目の親のＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－α産生ＣＤ８⁺Ｔ細胞（図２６Ａ）、ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２６Ｂ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２６Ｃ）又はＣＤ４４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２６Ｄ）の割合（平均として）を示す。 図２６Ａ、図２６Ｂ、図２６Ｃ、及び図２６Ｄは、示される構築物を使用した初回接種後２週目及び８週目並びにブースター接種後２週目及び４週目の親のＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－α産生ＣＤ８⁺Ｔ細胞（図２６Ａ）、ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２６Ｂ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２６Ｃ）又はＣＤ４４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２６Ｄ）の割合（平均として）を示す。 図２６Ａ、図２６Ｂ、図２６Ｃ、及び図２６Ｄは、示される構築物を使用した初回接種後２週目及び８週目並びにブースター接種後２週目及び４週目の親のＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－α産生ＣＤ８⁺Ｔ細胞（図２６Ａ）、ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２６Ｂ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２６Ｃ）又はＣＤ４４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２６Ｄ）の割合（平均として）を示す。 図２７Ａ、図２７Ｂ、及び図２７Ｃは、示される構築物（ＰｏｌＮ＝ｇＤＰｏｌＮ；ＨＢＶ２＝ｇＤＨＢＶ２；ＨＢＶ３＝ｇＤＨＢＶ３）で初回接種後４週目（図２７Ａ）；ブースター接種後２週目（図２７Ｂ）；及びブースター接種後４週目（図２７Ｃ）の複数の時点でのＣＤ８⁺Ｔ細胞を示す。グラフは、ＩＣＳにより評価されたＩＦＮ－γ⁺を産生するＣＤ８⁺Ｔ細胞の全体の頻度を示す。 図２７Ａ、図２７Ｂ、及び図２７Ｃは、示される構築物（ＰｏｌＮ＝ｇＤＰｏｌＮ；ＨＢＶ２＝ｇＤＨＢＶ２；ＨＢＶ３＝ｇＤＨＢＶ３）で初回接種後４週目（図２７Ａ）；ブースター接種後２週目（図２７Ｂ）；及びブースター接種後４週目（図２７Ｃ）の複数の時点でのＣＤ８⁺Ｔ細胞を示す。グラフは、ＩＣＳにより評価されたＩＦＮ－γ⁺を産生するＣＤ８⁺Ｔ細胞の全体の頻度を示す。 図２７Ａ、図２７Ｂ、及び図２７Ｃは、示される構築物（ＰｏｌＮ＝ｇＤＰｏｌＮ；ＨＢＶ２＝ｇＤＨＢＶ２；ＨＢＶ３＝ｇＤＨＢＶ３）で初回接種後４週目（図２７Ａ）；ブースター接種後２週目（図２７Ｂ）；及びブースター接種後４週目（図２７Ｃ）の複数の時点でのＣＤ８⁺Ｔ細胞を示す。グラフは、ＩＣＳにより評価されたＩＦＮ－γ⁺を産生するＣＤ８⁺Ｔ細胞の全体の頻度を示す。 図２８Ａ、図２８Ｂ、及び図２８Ｃは、示される構築物（ＰｏｌＮ＝ｇＤＰｏｌＮ；ＨＢＶ２＝ｇＤＨＢＶ２；ＨＢＶ３＝ｇＤＨＢＶ３）で初回接種後４週目、（図２８Ａ）；ブースター接種後２週目（図２８Ｂ）；及びブースター接種後４週目（図２８Ｃ）の複数の時点での、ＩＣＳによって評価されたサイトカイン産生ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。破線は、未処置のマウスからの結果に基づく陽性応答のカットオフを示す。 図２８Ａ、図２８Ｂ、及び図２８Ｃは、示される構築物（ＰｏｌＮ＝ｇＤＰｏｌＮ；ＨＢＶ２＝ｇＤＨＢＶ２；ＨＢＶ３＝ｇＤＨＢＶ３）で初回接種後４週目、（図２８Ａ）；ブースター接種後２週目（図２８Ｂ）；及びブースター接種後４週目（図２８Ｃ）の複数の時点での、ＩＣＳによって評価されたサイトカイン産生ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。破線は、未処置のマウスからの結果に基づく陽性応答のカットオフを示す。 図２８Ａ、図２８Ｂ、及び図２８Ｃは、示される構築物（ＰｏｌＮ＝ｇＤＰｏｌＮ；ＨＢＶ２＝ｇＤＨＢＶ２；ＨＢＶ３＝ｇＤＨＢＶ３）で初回接種後４週目、（図２８Ａ）；ブースター接種後２週目（図２８Ｂ）；及びブースター接種後４週目（図２８Ｃ）の複数の時点での、ＩＣＳによって評価されたサイトカイン産生ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。破線は、未処置のマウスからの結果に基づく陽性応答のカットオフを示す。 図２９Ａ及び図２９Ｂは、示される構築物（ＰｏｌＮ＝ｇＤＰｏｌＮ；ＨＢＶ２＝ｇＤＨＢＶ２）で初回接種後４週目のＣＤ８＋Ｔ細胞（図２９Ａ）又はＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２９Ｂ）にゲートされた四量体染色の結果を示す。 図２９Ａ及び図２９Ｂは、示される構築物（ＰｏｌＮ＝ｇＤＰｏｌＮ；ＨＢＶ２＝ｇＤＨＢＶ２）で初回接種後４週目のＣＤ８＋Ｔ細胞（図２９Ａ）又はＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２９Ｂ）にゲートされた四量体染色の結果を示す。 図３０Ａ、図３０Ｂ、図３０Ｃ、図３０Ｄ、図３０Ｅ、及び図３０Ｆは、示される抗体に結合した色素の平均蛍光強度として示される四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型を示す。図３０Ａ－ＢＶ６０５と結合した抗ＰＤ１抗体、図３０Ｂ－ＢＶ６５０と結合した抗ＬＡＧ３抗体、図３０Ｃ－Ｐｅ－Ｃｙ７－Ａと結合した抗ＴＩＭ３抗体；図３０Ｄ－ＰＥ－Ａと結合した抗ＣＴＬＡ４抗体；図３０Ｅ－ＡＦ４８８と結合した抗ＥＯＭＥＳ抗体；及び図３０Ｆ－ＢＶ７８６と結合した抗Ｔ－ｂｅｔ抗体。 図３０Ａ、図３０Ｂ、図３０Ｃ、図３０Ｄ、図３０Ｅ、及び図３０Ｆは、示される抗体に結合した色素の平均蛍光強度として示される四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型を示す。図３０Ａ－ＢＶ６０５と結合した抗ＰＤ１抗体、図３０Ｂ－ＢＶ６５０と結合した抗ＬＡＧ３抗体、図３０Ｃ－Ｐｅ－Ｃｙ７－Ａと結合した抗ＴＩＭ３抗体；図３０Ｄ－ＰＥ－Ａと結合した抗ＣＴＬＡ４抗体；図３０Ｅ－ＡＦ４８８と結合した抗ＥＯＭＥＳ抗体；及び図３０Ｆ－ＢＶ７８６と結合した抗Ｔ－ｂｅｔ抗体。 図３０Ａ、図３０Ｂ、図３０Ｃ、図３０Ｄ、図３０Ｅ、及び図３０Ｆは、示される抗体に結合した色素の平均蛍光強度として示される四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型を示す。図３０Ａ－ＢＶ６０５と結合した抗ＰＤ１抗体、図３０Ｂ－ＢＶ６５０と結合した抗ＬＡＧ３抗体、図３０Ｃ－Ｐｅ－Ｃｙ７－Ａと結合した抗ＴＩＭ３抗体；図３０Ｄ－ＰＥ－Ａと結合した抗ＣＴＬＡ４抗体；図３０Ｅ－ＡＦ４８８と結合した抗ＥＯＭＥＳ抗体；及び図３０Ｆ－ＢＶ７８６と結合した抗Ｔ－ｂｅｔ抗体。 図３０Ａ、図３０Ｂ、図３０Ｃ、図３０Ｄ、図３０Ｅ、及び図３０Ｆは、示される抗体に結合した色素の平均蛍光強度として示される四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型を示す。図３０Ａ－ＢＶ６０５と結合した抗ＰＤ１抗体、図３０Ｂ－ＢＶ６５０と結合した抗ＬＡＧ３抗体、図３０Ｃ－Ｐｅ－Ｃｙ７－Ａと結合した抗ＴＩＭ３抗体；図３０Ｄ－ＰＥ－Ａと結合した抗ＣＴＬＡ４抗体；図３０Ｅ－ＡＦ４８８と結合した抗ＥＯＭＥＳ抗体；及び図３０Ｆ－ＢＶ７８６と結合した抗Ｔ－ｂｅｔ抗体。 図３０Ａ、図３０Ｂ、図３０Ｃ、図３０Ｄ、図３０Ｅ、及び図３０Ｆは、示される抗体に結合した色素の平均蛍光強度として示される四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型を示す。図３０Ａ－ＢＶ６０５と結合した抗ＰＤ１抗体、図３０Ｂ－ＢＶ６５０と結合した抗ＬＡＧ３抗体、図３０Ｃ－Ｐｅ－Ｃｙ７－Ａと結合した抗ＴＩＭ３抗体；図３０Ｄ－ＰＥ－Ａと結合した抗ＣＴＬＡ４抗体；図３０Ｅ－ＡＦ４８８と結合した抗ＥＯＭＥＳ抗体；及び図３０Ｆ－ＢＶ７８６と結合した抗Ｔ－ｂｅｔ抗体。 図３０Ａ、図３０Ｂ、図３０Ｃ、図３０Ｄ、図３０Ｅ、及び図３０Ｆは、示される抗体に結合した色素の平均蛍光強度として示される四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型を示す。図３０Ａ－ＢＶ６０５と結合した抗ＰＤ１抗体、図３０Ｂ－ＢＶ６５０と結合した抗ＬＡＧ３抗体、図３０Ｃ－Ｐｅ－Ｃｙ７－Ａと結合した抗ＴＩＭ３抗体；図３０Ｄ－ＰＥ－Ａと結合した抗ＣＴＬＡ４抗体；図３０Ｅ－ＡＦ４８８と結合した抗ＥＯＭＥＳ抗体；及び図３０Ｆ－ＢＶ７８６と結合した抗Ｔ－ｂｅｔ抗体。 図３１は、５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２での初回ワクチン接種に続けて２か月後５×１０¹⁰ｖｐＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２をワクチン接種した後のＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。Ｘ軸上の数は、本明細書に提供される配列番号に対応する。 図３２は、５×１０⁹ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２での初回ワクチン接種に続けて２か月後５×１０⁹ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２をワクチン接種した後のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。Ｘ軸上の数は、本明細書に提供される配列番号に対応する。 図３３は、５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ３での初回ワクチン接種に続けて２か月後５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３をワクチン接種した後の免疫原性を示す。Ｘ軸上の数は、本明細書に提供される配列番号に対応する。 図３４は、本明細書に提供される配列番号（Ｘ軸）に対応するＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２及びＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２ワクチンの免疫原性を示す。両ＨＢＶ２構築物のＣｏｒｅ、ＰｏｌＣ、及びＰｏｌＮ領域は、免疫原性だった。 図３５は、本明細書に提供される配列番号（Ｘ軸）に対応するＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３及びＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ３ワクチンの免疫原性を示す。両ＨＢＶ３構築物のＣｏｒｅ、ＰｏｌＣ、及びＰｏｌＮ領域は、免疫原性だった。

開示されるタンパク質、ワクチン、及び方法は、本開示の一部を形成する添付の図面に関して考慮された以下の詳細な説明を参照することにより容易に理解されてよい。開示されるタンパク質、ワクチン、及び方法は、本明細書に記載及び／又は示される特定のタンパク質、ワクチン、及び方法に限定されず、本明細書に用いられる専門用語は、例として特定の実施形態を説明する目的のためにすぎず、請求されるタンパク質、ワクチン、及び方法に限定することを意図されるものではないと理解されるべきである。

別段の具体的な記載がない限り、動作の可能性のある機構若しくはモード、又は改善した理由に関するいずれの説明も例示のみを意図されており、開示されるタンパク質、ワクチン、及び方法は、いずれのこのような提案された動作の機構若しくはモード又は改善した理由の正確さ又は不正確さによって強制されるべきでない。

本文を通じて、説明は、タンパク質及びこのタンパク質の使用方法に関する。本開示がタンパク質に関連する特徴又は実施形態を記載し、又は主張する場合、このような特徴又は実施形態はタンパク質の使用方法にも同様に適用できる。同様に、本開示がこのタンパク質の使用方法に関する特徴又は実施形態を記載し、又は主張する場合、このような特徴又は実施形態は、タンパク質にも同様に適用できる。

数値範囲が明細書中に記載され、又は設定された場合、この範囲には、その端点及び全ての個々の整数並びにこの範囲内の有理数が含まれ、そしてこれらの狭い範囲の各々が明示的に記載されるかのように、定められた範囲内の大きなグループの値の下位グループを同じ程度に形成するためにそれらの端点及び内部の整数並びに有利数の全ての様々な可能な組み合わせによって形成されるこれらの中の狭い範囲の各々も含まれる。数値範囲が定められた値より大きいように本明細書に定められる場合、この範囲はやはり有限であり、本明細書に記載される本発明の文脈内で使用可能な値によって上端に接する。数値範囲が定められた値より小さいように本明細書に定められる場合、この範囲はやはり非ゼロ値により下端に接する。範囲を定義する場合、本発明の範囲が記載される特定の値に限定されることを意図するものではない。全ての範囲は包括的であり、そして結合することができる。

先行する語「約」の使用により、値が近似値として表現される場合、特定の値は別の実施形態を形成すると理解されるだろう。特定の数値に対する参照は、文脈で明確な別段の規定がない限り、少なくともその特定の値を含む。

明確にするために、別個の実施形態の文脈で本明細書に記載される、開示されるタンパク質、ワクチン、及び方法の特定の特徴はまた、単一の実施形態に組み合わせて提供されてよいと理解されるべきである。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で記載される、開示されるタンパク質、ワクチン、及び方法の様々な特徴はまた、別個に又は任意のサブ組み合わせで提供されてもよい。

本明細書で用いる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「１つの（ｔｈｅ）」は、複数形を含む。

説明の態様に関連する各種用語を本明細書及び特許請求の範囲を通じて用いる。このような用語は、別段の指定がない限り、当該技術分野における通常の意味を与えられるべきである。他の具体的に規定された用語は、本明細書に提供される定義と一致するように解釈されるべきである。

本明細書で用いる場合、「その免疫原性断片」とは、被験体に免疫応答を引き起こすことができる開示されるＨＢＶコア（Ｃｏｒｅ）、ＨＢＶポリメラーゼＮ－末端ドメイン（ＰｏｌＮ）、又はＨＢＶポリメラーゼＣ－末端ドメイン（ＰｏｌＣ）の一部を指す。

本明細書で用いる場合、「被験体に提供すること」及び同様の用語は、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、又はワクチンを、被験体の身体の標的細胞、組織又は区域が融合タンパク質、核酸分子、ベクター、又はワクチンと接触するように、被験体に送達する方法を示す。「被験体に提供すること」は、非経口及び経口の投与経路を含む。

用語（承認された参照製品／生物学的製剤、すなわち、参照リスト薬の）「バイオ後続品」とは、参照製品が認可され、使用されることが意図される及び免許交付がバイオ後続品を探索するためである１つ又は複数の適切な使用条件で安全性、純度、及び効力を実証するのに充分な、（ａ）生物由来物質が臨床的に不活性な成分の小さな差異にもかかわらず、参照製品と非常に類似すると実証する分析研究、（ｂ）動物試験（毒性評価を含む）、及び／又は（ｃ）１つ又は複数の臨床試験（免疫原性及び薬物動態又は薬力学）に由来するデータに基づいて、臨床的に不活性な成分の小さな差異にもかかわらず、安全性、純度、及び効力に関してバイオ後続品と参照製品との間に臨床的に有意義な差異がない、参照製品と非常に類似する生物由来物質を指す。バイオ後続品は、処方医療専門家の介入なしに薬局で参照製品に対して置き換えてよい互換性製品であってよい。互換性のさらなる基準に見合うためには、バイオ後続品は、任意の一定の患者に参照製品と同一の臨床成績をもたらすことが想定されるべきであり、バイオ後続品が個人に１回より多く投与されたら、バイオ後続品と参照製品の使用を交替する又は切り換える安全性又は有効性の減少に関するリスクは、このような交替又は切り替えなしに参照製品を使用するリスクより高くない。バイオ後続品は、参照製品について機構が知られている程度の提案される使用条件について同一の作用機序を利用する。バイオ後続品について提案されたラベリングにおいて処方され、推奨され、又は提案された１つ又は複数の使用条件は、参照製品について以前承認されている。バイオ後続品の投与経路、剤形、及び／又は強度は、参照製品ものと同一であり、バイオ後続品は、バイオ後続品が安全で、純粋で、そして強力であり続けることを保証するよう設計された基準に合う施設で製造され、加工され、包装され、そして保持される。バイオ後続品は、参照製品と比較する場合、バイオ後続品の性能を変化することが予想されないＮ末端又はＣ末端の削除などの、アミノ酸配列の小さな修飾を含んでよい。開示されるタンパク質及び融合タンパク質のバイオ後続品は、本開示の範囲内に含まれる。

本明細書で用いる場合、用語「被験体」とは、任意の動物、特に哺乳類を表すことを意図する。本明細書にはマウスにおける免疫応答の誘導が例示されるが、開示される方法を用いていかなる種類の哺乳類を治療することができる。したがって、本方法は、好ましくはマウス及びヒト、最も好ましくはヒトで用いられるが、ヒト及び非ヒト動物に適用できる。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、用語「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」によって包含される例を含むことを意図し、同様に用語「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、用語「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」によって包含される例を含むことを意図する。

本明細書において以下の略語を用いる。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；アデノウイルス（Ａｄ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）；糖タンパク質（ｇＤ）、及びウイルスゲノム（ｖｇ）。

本明細書では、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質の非自然起源の変異体を提供する。開示されるＨＢＶコアタンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むことができる。配列番号６の例示的な免疫原性断片としては、以下の表３に提供される配列番号２０～５４が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＨＢＶコアタンパク質の免疫原性断片は、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＢＶコアタンパク質の免疫原性断片は、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む。

ＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片をコードする核酸分子も提供される。核酸分子は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質をコードすることができる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号７の核酸配列を含む。核酸分子は、表３に提供されるコア断片をコードすることができる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１８０のアミノ酸配列をコードすることができる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１８３のアミノ酸配列をコードすることができる。

ＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片をコードする核酸分子を含むベクターも提供される。適したベクターとしては、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスレプリコン、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、及びラブドウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターは、チンパンジー由来のアデノウイルスベクターとすることができる。いくつかの態様において、ベクターは、Ｆａｒｉｎａ ＳＦ， Ｇａｏ ＧＰ， Ｘｉａｎｇ ＺＱ， Ｒｕｘ ＪＪ， Ｂｕｒｎｅｔｔ ＲＭ， Ａｌｖｉｒａ ＭＲ， Ｍａｒｓｈ Ｊ， Ｅｒｔｌ ＨＣ， Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ． “Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｖｅｃｔｏｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．” Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２００１ Ｄｅｃ； ７５（２３）：１１６０３－１３に記載されるＡｄＣ６８ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、Ｒｅｙｅｓ－Ｓａｎｄｏｖａｌ Ａ， Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ＪＣ， Ｇｒａｎｔ Ｒ， Ｒｏｙ Ｓ， Ｘｉａｎｇ ＺＱ， Ｌｉ Ｙ， Ｇａｏ ＧＰ， Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ， Ｅｒｔｌ ＨＣ． “Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｕｐｏｎ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｓｉｍｉａｎ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ” Ｊ Ｖｉｒｏｌ． ２００４ Ｊｕｌ； ７８（１４）：７３９２－９に記載されるＡｄＣ７ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、Ｐｉｎｔｏ ＡＲ， Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ＪＣ， Ｇｉｌｅｓ－Ｄａｖｉｓ Ｗ， Ｇａｏ ＧＰ， Ｗｉｌｓｏｎ ＪＭ， Ｅｒｔｌ ＨＣ． “Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ａｎ ＨＩＶ－１ ａｎｔｉｇｅｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｐｒｉｍｅ ｂｏｏｓｔ ｒｅｇｉｍｅｎ ｗｉｔｈ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｅ１－ｄｅｌｅｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｒｒｉｅｒｓ” Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００３ Ｄｅｃ １５； １７１（１２）：６７７４－９に記載されるＡｄＣ６ベクターである。

いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号７の核酸配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号７の核酸配列を含む核酸分子を含むＡｄＣ６ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号７の核酸配列を含む核酸分子を含むＡｄＣ７ベクターである。

いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号１８０のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ６ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ７ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、配列番号１８３のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ６ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ７ベクターである。

ＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片をコードする核酸分子を含むベクターを含むワクチンも開示される。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号７の核酸配列を含む核酸分子を含むベクターを含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号７の核酸配列を含む核酸分子を含むＡｄＣ６ベクターを含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号７の核酸配列を含む核酸分子を含むＡｄＣ７ベクターを含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号１８０のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むＡｄＣ６ベクターを含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号１８０のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むＡｄＣ７ベクターを含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号１８３のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むＡｄＣ６ベクターを含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号１８３のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むＡｄＣ７ベクターを含む。

ワクチンはさらに、薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」は、開示される融合タンパク質、核酸、又はベクターと組み合わせる場合、この融合タンパク質、核酸、又はベクターに生物活性を保持させ、被験体の免疫系とは非反応性である、任意の物質を含む。例としては、限定されないが、リン酸緩衝食塩水、水などの標準的な医薬品担体、油／水乳濁液などの乳濁液、及び様々な種類の湿潤剤のいずれかが挙げられる。噴霧剤又は非経口投与用の好ましい希釈剤は、リン酸緩衝食塩水又は通常の（０．９％）食塩水である。このような担体を含む組成物は、周知の通常の方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９９０； ａｎｄ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ２０００）により処方される。

また本明細書には、ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン（ＰｏｌＮ）及びＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン（ＰｏｌＣ）の非自然起源の変異体も開示される。開示されるＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むことができる。配列番号８の例示的な免疫原性断片は、以下の表４に提供される配列番号５５～１１３を含む。いくつかの実施形態において、ＨＢＶ ＰｏｌＮの免疫原性断片は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＢＶ ＰｏｌＮの免疫原性断片は、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む。開示されるＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むことができる。配列番号１０の例示的な免疫原性断片は、以下の表５に提供される配列番号１１４～１７２を含む。いくつかの実施形態において、ＨＢＶ ＰｏｌＣの免疫原性断片は、配列番号１７９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＢＶ ＰｏｌＣの免疫原性断片は、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む。

ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン若しくはその免疫原性断片、又はＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン若しくはその免疫原性断片をコードする核酸分子も提供される。核酸分子は、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメインをコードすることができる。いくつかの実施形態において、ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメインをコードする核酸分子は、配列番号９の核酸配列を含む。核酸分子は、表４に提供されるＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン断片をコードすることができる。核酸分子は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメインをコードすることができる。いくつかの実施形態において、ＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメインをコードする核酸分子は、配列番号１１の核酸配列を含む。核酸分子は、表５に提供されるＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン断片をコードすることができる。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１７８のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１８１のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１７９のアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１８２のアミノ酸配列をコードする。

ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン若しくはその免疫原性断片又はＣ末端ドメイン若しくはその免疫原性断片をコードする核酸分子を含むベクターも提供される。適したベクターには、上述したものが含まれる。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号９の核酸配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号１１の核酸配列を含む核酸分子を含む。いくつかの態様において、ベクターは、アデノウイルスベクターである。適したアデノウイルスベクターとしては、例えば、ＡｄＣ６ベクター又はＡｄＣ７ベクターが挙げられる。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号９の核酸配列を含む核酸分子を含むＡｄＣ６ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号９の核酸配列を含む核酸分子を含むＡｄＣ７ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号１１の核酸配列を含む核酸分子を含むＡｄＣ６ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号１１の核酸配列を含む核酸分子を含むＡｄＣ７ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号１７８のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ６ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ７ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号１８１のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ６ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ７ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号１７９のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ６ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ７ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号１８２のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ６ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ７ベクターである。

ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン若しくはその免疫原性断片又はＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン若しくはその免疫原性断片をコードする核酸分子を含むベクターを含むワクチンも開示される。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号９の核酸配列を含む核酸分子を含むベクターを含む。ワクチンは、配列番号９の核酸配列を含む核酸分子を含むＡｄＣ６ベクターを含むことができる。ワクチンは、配列番号９の核酸配列を含む核酸分子を含むＡｄＣ７ベクターを含むことができる。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号１１の核酸配列を含む核酸分子を含むベクターを含む。ワクチンは、配列番号１１の核酸配列を含む核酸分子を含むＡｄＣ６ベクターを含むことができる。ワクチンは、配列番号１１の核酸配列を含む核酸分子を含むＡｄＣ７ベクターを含むことができる。ワクチンはさらに、上に開示した薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号１７８のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むベクターを含む。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ６ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ７ベクターである。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号１８１のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むベクターを含む。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ６ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ７ベクターである。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号１７９のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むベクターを含む。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ６ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ７ベクターである。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号１８２のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むベクターを含む。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ６ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、ＡｄＣ７ベクターである。

本明細書では、開示されるＨＢＶコアタンパク質若しくはその免疫原性断片、ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン若しくはその免疫原性断片、及び／又はＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン若しくはその免疫原性断片の組み合わせを含む融合タンパク質も提供される。例えば、融合タンパク質は、
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン又はその免疫原性断片、
（２）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質の１つ又は複数の免疫原性断片及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメインの１つ又は複数の免疫原性断片。例えば、表３に提供される１つ又は複数の配列番号２０～５４（配列番号６の免疫原性断片）及び表４に提供される１つ又は複数の配列番号５５～１１３（配列番号８の免疫原性断片）、
（３）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン又はその免疫原性断片、
（４）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質の１つ又は複数の免疫原性断片及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメインの１つ又は複数の免疫原性断片。例えば、表３に提供される１つ又は複数の配列番号２０～５４（配列番号６の免疫原性断片）及び表５に提供される１つ又は複数の配列番号１１４～１７２（配列番号１０の免疫原性断片）、
（５）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン又はその免疫原性断片及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン又はその免疫原性断片、
（６）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメインの１つ又は複数の免疫原性断片及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメインの１つ又は複数の免疫原性断片。例えば、表４に提供される１つ又は複数の配列番号５５～１１３（配列番号８の免疫原性断片）及び表５に提供される１つ又は複数の配列番号１１４～１７２（配列番号１０の免疫原性断片）、
（７）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン又はその免疫原性断片、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン又はその免疫原性断片、
（８）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質の１つ又は複数の免疫原性断片、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメインの１つ又は複数の免疫原性断片、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメインの１つ又は複数の免疫原性断片。例えば、表３に提供される１つ又は複数の配列番号２０～５４（配列番号６の免疫原性断片）、表４に提供される１つ又は複数の配列番号５５～１１３（配列番号８の免疫原性断片）、及び表５に提供される１つ又は複数の配列番号１１４～１７２（配列番号１０の免疫原性断片）、
（９）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン又はその免疫原性断片、配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン又はその免疫原性断片、及び配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片、又は
（１０）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン又はその免疫原性断片、配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン又はその免疫原性断片、及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片
を含むことができる。

融合タンパク質は、配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン又はその免疫原性断片、配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン又はその免疫原性断片、及び配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む。

融合タンパク質は、配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン又はその免疫原性断片、配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン又はその免疫原性断片、配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１７５のアミノ酸配列を含む。

本明細書では、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質（ｇＤ）配列及び開示されるＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、ＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、又はこれらの各種組み合わせを含む融合タンパク質も提供される。

ＨＳＶ ｇＤは、ＨＳＶの受容体結合糖タンパク質である。ｇＤ外部ドメインは、２個の構造的に、機能的に区別される領域に組織化され、すなわちシグナル配列及び受容体結合部位を含むアミノ終端、並びに前駆融合ドメイン及び膜貫通ドメインを含むカルボキシ終端である。ｇＤは、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）受容体及びネクチン受容体と相互作用する。ｇＤとこれらの受容体との相互作用により、ＨＶＥＭ受容体と、Ｔ細胞上に発現する免疫抑制分子であるＢＴＬＡ又はＣＤ１６０との結合が減少する。いくつかの実施形態において、ｇＤ及び開示されるＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、ＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン（それぞれ「ｇＤＣｏｒｅ」、「ｇＤＰｏｌＮ」又は「ｇＤＰｏｌＣ」と呼ばれる）、又はこれらの組み合わせを含む開示される融合タンパク質は、ＨＢＶコア及び／又はポリメラーゼ抗原単独（すなわちｇＤがない）と比較してより大きな程度までＨＢＶに対する被験体の免疫応答を強化すると予想される。

開示される融合タンパク質での使用に適したＨＳＶ ｇＤタンパク質は、１）抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の刺激を増加する、及び／又は２）ＨＶＥＭ－ＢＴＬＡ経路活性化を妨害する能力を保持する野生型又は変異ｇＤを含む。

融合タンパク質は、本明細書に開示されるＨＢＶコアタンパク質若しくはその免疫原性断片、ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン若しくはその免疫原性断片、ＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン若しくはその免疫原性断片、又はこれらの任意の組み合わせ、Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列、及びＣ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列を含むことができる。ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、及びＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメインは、表９に提供されるもの又は表３～５に提供される免疫原性断片とすることができる。ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、ＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、又はこれらの免疫原性断片をＮ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列とＣ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列の間に挿入することができる。いくつかの態様において、Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列は、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列は、配列番号１２のアミノ酸残基２６～２６９を含む。

融合タンパク質は、
Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体、
配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片、及び
Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体
を含むことができる。

ＨＢＶコアタンパク質の免疫原性断片は、配列番号２０～５４、１８０、又は１８３のいずれか１つを含むことができる。

融合タンパク質は、
Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体、
配列番号１８０又は配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質、及び
Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体
を含むことができる。

融合タンパク質は、
Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体、
配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン又はその免疫原性断片、及び
Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列又はその変異体
を含むことができる。

ＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメインの免疫原性断片は、配列番号５５～１１３、１７８、又は１８１のいずれか１つを含むことができる。

融合タンパク質は、
Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体、
配列番号１７８又は配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、及び
Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列又はその変異体
を含むことができる。

融合タンパク質は、
Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体、
配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン又はその免疫原性断片、及び
Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列又はその変異体
を含むことができる。

ＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメインの免疫原性断片は、配列番号１１４～１７２、１７９、又は１８２のいずれか１つを含むことができる。

融合タンパク質は、
Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体、
配列番号１７９又は配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、及び
Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列又はその変異体
を含むことができる。

融合タンパク質は、
Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体、
（１）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン又はその免疫原性断片、
（２）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質の１つ又は複数の免疫原性断片及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメインの１つ又は複数の免疫原性断片。例えば、表３に提供される１つ又は複数の配列番号２０～５４（配列番号６の免疫原性断片）及び表４に提供される１つ又は複数の配列番号５５～１１３（配列番号８の免疫原性断片）、
（３）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン又はその免疫原性断片、
（４）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質の１つ又は複数の免疫原性断片及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン。例えば、表３に提供される１つ又は複数の配列番号２０～５４（配列番号６の免疫原性断片）及び表５に提供される１つ又は複数の配列番号１１４～１７２（配列番号１０の免疫原性断片）、
（５）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン又はその免疫原性断片及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン又はその免疫原性断片、
（６）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメインの１つ又は複数の免疫原性断片及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメインの１つ又は複数の免疫原性断片。例えば、表４に提供される１つ又は複数の配列番号５５～１１３（配列番号８の免疫原性断片）及び表５に提供される１つ又は複数の配列番号１１４～１７２（配列番号１０の免疫原性断片）、
（７）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン又はその免疫原性断片、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン又はその免疫原性断片、又は
（８）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質の１つ又は複数の免疫原性断片、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメインの１つ又は複数の免疫原性断片、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメインの１つ又は複数の免疫原性断片。例えば、表３に提供される１つ又は複数の配列番号２０～５４（配列番号６の免疫原性断片）、表４に提供される１つ又は複数の配列番号５５～１１３（配列番号８の免疫原性断片）、表５に提供される１つ又は複数の配列番号１１４～１７２（配列番号１０の免疫原性断片）、
（９）配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン又はその免疫原性断片、配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン又はその免疫原性断片、及び配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片、又は
（１０）配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン又はその免疫原性断片、配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン又はその免疫原性断片、及び配列番号１８３のアミノ酸配列を含むＨＢＶコアタンパク質又はその免疫原性断片、
を含むＨＢＶ配列、及び
Ｃ末端ＨＳＶｇＤタンパク質配列又はその変異体
を含むことができる。

いくつかの実施形態において、Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列は、ＨＳＶ ｇＤの少なくともアミノ酸１～２６９を含むことができる。Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列は、例えば、配列番号１２のアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列は、配列番号１２のアミノ酸残基２６～２６９を含む。

いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤ配列は、ＨＳＶ ｇＤの膜貫通ドメインを含む。Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤ配列は、例えば、配列番号１３のアミノ酸配列を含むことができる。

融合タンパク質は、配列番号１４のアミノ酸配列（ｇＤＣｏｒｅに対応する）又はその免疫原性断片を含むことができる。融合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列（ｇＤＰｏｌＮに対応する）又はその免疫原性断片を含むことができる。融合タンパク質は、配列番号１８のアミノ酸配列（ｇＤＰｏｌＣに対応する）又はその免疫原性断片を含むことができる。いくつかの実施形態において、配列番号１４、１６、又は１８のいずれか１つのアミノ酸配列又はその免疫原性断片は、Ｎ末端の２５個のアミノ酸シグナルペプチドを含まない。

融合タンパク質は、配列番号１８５のアミノ酸配列（ｇＤＨＢＶ２）を含むことができる。融合タンパク質は、配列番号１８７のアミノ酸配列（ｇＤＨＢＶ３）を含むことができる。

開示される融合タンパク質のいずれかをコードする核酸分子も提供される。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１５の核酸配列（ｇＤＣｏｒｅに対応する）を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１７の核酸配列（ｇＤＰｏｌＮに対応する）を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１９の核酸配列（ｇＤＰｏｌＣに対応する）を含む。

核酸分子は、配列番号１８４の核酸配列（ｇＤＨＢＶ２）を含むことができる。核酸分子は、配列番号１８６の核酸配列（ｇＤＨＢＶ３）を含むことができる。

融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターも開示される。適したベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクターを含む上述したものを含む。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、ＡｄＣ６ベクターである。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、ＡｄＣ７ベクターである。ベクターは、配列番号１８４の核酸配列（ｇＤＨＢＶ２）を含むことができる。いくつかの態様において、ベクターは、配列番号１８４の核酸配列（ｇＤＨＢＶ２）を含むＡｄＣ６ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、配列番号１８４の核酸配列（ｇＤＨＢＶ２）を含むＡｄＣ７ベクターである。ベクターは、配列番号１８６の核酸配列（ｇＤＨＢＶ３）の核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、ベクターは、配列番号１８６の核酸配列（ｇＤＨＢＶ３）を含むＡｄＣ６ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、配列番号１８６の核酸配列（ｇＤＨＢＶ３）を含むＡｄＣ７ベクターである。

開示されるベクターのいずれかを含むワクチンも提供される。ワクチンはさらに、上述した薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。ワクチンは、配列番号１８４の核酸配列（ｇＤＨＢＶ２）を含むベクターを含むことができる。いくつかの態様において、ワクチンは、配列番号１８４の核酸配列（ｇＤＨＢＶ２）を含むＡｄＣ６ベクターを含む。いくつかの態様において、ワクチンは、配列番号１８４の核酸配列（ｇＤＨＢＶ２）を含むＡｄＣ７ベクターを含む。ワクチンは、配列番号１８６の核酸配列（ｇＤＨＢＶ３）を含むベクターを含むことができる。いくつかの態様において、ワクチンは、配列番号１８６の核酸配列（ｇＤＨＢＶ３）を含むＡｄＣ６ベクターを含む。いくつかの態様において、ワクチンは、配列番号１８６の核酸配列（ｇＤＨＢＶ３）を含むＡｄＣ７ベクターを含む。

本明細書には、被験体にＨＢＶに対する免疫応答を誘導する方法であって、この方法は、この被験体に有効量の開示される融合タンパク質のいずれか、開示される核酸分子のいずれか、開示されるベクターのいずれか、又は開示されるワクチンのいずれかを提供してそれによりＨＢＶに対する免疫応答を誘導することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、この方法は、この被験体に、有効量の開示される融合タンパク質のいずれかを提供してそれによりＨＢＶに対する免疫応答を誘導することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、この被験体に、有効量の開示される核酸分子のいずれかを提供してそれによりＨＢＶに対する免疫応答を誘導することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、この被験体に、有効量の開示されるベクターのいずれかを提供してそれによりＨＢＶに対する免疫応答を誘導することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、この被験体に、有効量の開示されるワクチンのいずれかを提供してそれによりＨＢＶに対する免疫応答を誘導することを含む。

この方法は、この被験体に、ＡｄＣ６ベクターを含む有効量のワクチンを提供することを含み、このＡｄＣ６ベクターは、配列番号１４、１６、又は１８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含む。いくつかの実施形態において、この方法はさらに、この被験体に、ＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供した後に、配列番号１４、１６、又は１８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供することを含む。このようなプライムブースト方法は、
この被験体に、配列番号１４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供すること、及び続けてこの被験体に、配列番号１４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供することを含むことができる。いくつかの実施形態において、配列番号１４のアミノ酸配列又はその免疫原性断片は、Ｎ末端の２５個のアミノ酸シグナルペプチドを含まない。
この被験体に、配列番号１６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供すること、及び続けてこの被験体に、配列番号１６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供することを含むことができる。いくつかの実施形態において、配列番号１６のアミノ酸配列又はその免疫原性断片は、Ｎ末端の２５個のアミノ酸シグナルペプチドを含まない。
この被験体に、配列番号１８のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供すること、及び続けてこの被験体に、配列番号１８のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供することを含むことができる。いくつかの実施形態において、配列番号１８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片は、Ｎ末端の２５個のアミノ酸シグナルペプチドを含まない。

この方法は、この被験体に、ＡｄＣ７ベクターを含む有効量のワクチンを提供することを含み、このＡｄＣ７ベクターは、配列番号１４、１６、又は１８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含む。いくつかの実施形態において、この方法はさらに、この被験体に、ＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供した後に、配列番号１４、１６、又は１８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供することを含む。このようなプライムブースト方法は、
この被験体に、配列番号１４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供すること、及び続けてこの被験体に、配列番号１４のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供することを含むことができる。いくつかの実施形態において、配列番号１４のアミノ酸配列又はその免疫原性断片は、Ｎ末端の２５個のアミノ酸シグナルペプチドを含まない。
この被験体に、配列番号１６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供すること、及び続けてこの被験体に、配列番号１６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供することを含むことができる。いくつかの実施形態において、配列番号１６のアミノ酸配列又はその免疫原性断片は、Ｎ末端の２５個のアミノ酸シグナルペプチドを含まない。
この被験体に、配列番号１８のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供すること、及び続けてこの被験体に、配列番号１８のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供することを含むことができる。いくつかの実施形態において、配列番号１８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片は、Ｎ末端の２５個のアミノ酸シグナルペプチドを含まない。

この方法は、この被験体にＡｄＣ６ベクターを含む有効量のワクチンを提供することであって、ＡｄＣ６ベクターは、配列番号１８５又は１８７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含む、提供することを含むことができる。いくつかの実施形態において、この方法はさらに、この被験体に、このＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供した後、配列番号１８５又は１８７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供することを含む。このようなプライムブースト方法は、
この被験体に、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供すること、及び続けてこの被験体に、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供することを含むことができる。いくつかの実施形態において、配列番号１８５のアミノ酸配列又はその免疫原性断片は、Ｎ末端の２５個のアミノ酸シグナルペプチドを含まない、又は
この被験体に、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供すること、及び続けてこの被験体に、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供することを含むことができる。いくつかの実施形態において、配列番号１８７のアミノ酸配列又はその免疫原性断片は、Ｎ末端の２５個のアミノ酸シグナルペプチドを含まない。

この方法は、この被験体にＡｄＣ７ベクターを含む有効量のワクチンを提供することであって、ＡｄＣ７ベクターは、配列番号１８５又は１８７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含む、提供することを含むことができる。いくつかの実施形態において、この方法はさらに、この被験体に、このＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供した後、配列番号１８５又は１８７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供することを含む。このようなプライムブースト方法は、
この被験体に、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供すること、及び続けてこの被験体に、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供することを含むことができる。いくつかの実施形態において、配列番号１８５のアミノ酸配列又はその免疫原性断片は、Ｎ末端の２５個のアミノ酸シグナルペプチドを含まない、又は、
この被験体に、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供すること、及び続けてこの被験体に、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質又はその免疫原性断片を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供することを含むことができる。いくつかの実施形態において、配列番号１８７のアミノ酸配列又はその免疫原性断片は、Ｎ末端の２５個のアミノ酸シグナルペプチドを含まない。

開示される方法により誘導される免疫応答としては、限定されないが、Ｔ細胞応答、Ｂ細胞応答、又は両方が挙げられる（すなわち、細胞性及び／又は液性免疫応答）。免疫応答は、一次免疫応答又は二次免疫応答とすることができる。開示される方法は、ＨＢＶコア及び／又はポリメラーゼ抗原単独（すなわちｇＤがない）と比較してより大きな程度までＨＢＶに対する被験体の免疫応答を誘導することができる。

開示される方法を、治療処置と予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置の両方に用いることができ、症状の重症度及び／又は頻度を低減する、症状及び／又は症状の根底にある原因を除去する、症状及び／又はその根底にある原因の頻度又は可能性を低減する、及びＨＢＶによって直接的又は間接的に起こる傷害を改善又は治療することができる。処置はまた、処置を受けていない被験体の予想される生存時間と比較して生存時間を延長することを含む。治療される被験体には、ＨＢＶを有するもの並びにＨＢＶを有する傾向があるもの又はＨＢＶを予防すべきものが含まれる。

これによりＨＢＶに対する免疫応答を誘導するために必要とされる開示される融合タンパク質、核酸分子、ベクター、又はワクチンの量（例えば、「有効量」）は、被験体の病期、年齢、性別、及び体重などの因子、及び融合タンパク質、核酸分子、ベクター、又はワクチンが被験体に所望の応答を引き起こす能力によって変化してよい。有効量の例示的な指標としては、例えば、被験体の改善された幸福、ＨＢＶ症状の低減、除去又は予防が挙げられる。

被験体のＨＢＶに対する免疫応答を誘導するための薬物の製造における開示される融合タンパク質、核酸分子、ベクター、又はワクチンのいずれかの使用も提供される。

被験体にＨＢＶに対する免疫応答を誘導するのに使用するための開示される融合タンパク質、核酸分子、ベクター、又はワクチンも提供される。

本明細書に開示される実施形態の一部をさらに説明するために以下の実施例を提供する。実施例は、例示することを意図され、開示される実施形態を限定することは意図されない。

エピトープ最適化されたＣｏｒｅ配列の生成
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を、系統学的集団形成に基づいて、いくつかの遺伝子型に分類することができる。慢性感染症の患者用の複数の遺伝子型のＨＢＶワクチンのための抗原インサートの開発を支援するために、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤにわたるＨＢＶＣｏｒｅ及びＨＢＶポリメラーゼをコードする遺伝子の予備的バイオインフォマティクス評価を行った。

４種類の主要なＨＢＶクレード由来のＣｏｒｅアミノ酸配列を、Ｂ型肝炎ウイルスデータベース（ＨＢＶｄｂ）（リリースバージョン４５．０、最終アップデート２０１８年８月２日）からの整列されたＣｌｕｓｔａｌＷ配列としてダウンロードした。これらのアミノ酸配列は、以下の表に要約されるような、ヨーロッパ中の利用者が入力した何千ものＨＢＶゲノムを表す。

各アミノ酸の位置での変異及び頻度を計算する、ロスアラモス国立研究所（ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ＥＮＴＲＯＰＹ／ｅｎｔｒｏｐｙ）によって提供されるＳｈａｎｎｏｎ Ｅｎｔｒｏｐｙ ｔｏｏｌを使用して各遺伝子型について「共通」Ｃｏｒｅ配列を最初に同定した。各遺伝子型に対してこれらの計算を繰り返し、解析された各遺伝子型のものである、４個の「共通」Ｃｏｒｅ配列を生成した（配列番号１～４）。
遺伝子型Ａ 共通配列（配列番号１）
ＭＤＩＤＰＹＫＥＦＧＡＴＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＴＬＡＴＷＶＧＮＮＬｅＤＰＡＳＲＤＬＶＶＮＹＶＮＴＮＭＧＬＫＩＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲＲＤＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ－
遺伝子型Ｂ 共通配列（配列番号２）
ＭＤＩＤｐＹＫＥＦＧＡＳｖＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳｉＲＤＬＬＤＴＡｓＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩｌＣＷＧＥＬＭＮＬＡＴＷＶＧＳＮＬｅＤＰＡＳＲＥＬＶＶｓＹＶＮＶＮＭＧＬＫｉＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰｐＡＹＲＰｐＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥｓＱＣ－
遺伝子型Ｃ 共通配列（配列番号３）ＭＤＩＤｐＹＫＥＦＧＡＳＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＩＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＮＬＡＴＷＶＧＳＮＬＥＤＰＡＳＲＥＬＶＶｓＹＶＮＶＮＭＧＬＫｉＲＱｌＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰｐＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ－
遺伝子型Ｄ 共通配列（配列番号４）
ＭＤＩＤＰＹＫＥＦＧＡｔＶＥＬＬＳＦＬＰｓＤＦＦＰＳＶＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲｅＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧｅＬＭｔＬＡＴＷＶＧｇＮＬＥＤＰａＳＲＤＬＶＶＳＹＶＮＴＮｍＧＬＫＦＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲｅＴＶｉＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰｐＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶｖＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ－
（太字で下線を引いた残基は、９０％未満の頻度を有するアミノ酸を表す）。

上の「共通」Ｃｏｒｅ配列を組み合わせてエピトープ最適化されたＣｏｒｅ配列を生成した。保存されたアミノ酸を、各遺伝子型（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）のＣｏｒｅタンパク質の各アミノ酸残基で同定し、遺伝子型ゲノムの与えられたサンプル内部の頻度及び変異を決定した。変異部位でのアミノ酸を選択するために、複数のＨＬＡタイプ中のエピトープ予測アルゴリズムを使用して各変異を調べ、免疫原性が最も高い配列を選択した。具体的には、
（１）４個の遺伝子型を通じて同一である各残基を維持した。変異についてこれらの配列を整列するために、適用可能な場合は、スペーサーを加えた可変性を特徴づけるために、ゲノム重み付き頻度も計算した。
（２）４個の遺伝子型を通じて同一でない残基を同定し、アミノ酸の変異を記録した（表２を参照）。４個の遺伝子型を通じて同一でない残基をＸ₁～Ｘ₁₁と標識し、９０％未満の頻度を有する残基を太字で下線を引いたフォントで表した、初期のコア配列（配列番号５）を以下に提供する。
ＭＤＩＤＰＹＫＥＦＧＡＸ₁ＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＸ₂ＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＸ₃ＬＡＴＷＶＧＸ₄ＮＬｅＤＰＡＳＲＸ₅ＬＶＶＸ ₆ ＹＶＮＸ₇ＮＭＧＬＫＸ₈ＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＸ₉ＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲＲＸ₁₀Ｘ₁₁ＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ

（３）これらの位置での最終的なアミノ酸を決定する目的で、適切なアミノ酸を選択するためにエピトープ予測アルゴリズムを使用した。遺伝子型間で変異を示すアミノ酸については、これらの遺伝子型のうち３個に存在するアミノ酸を選択するか、又は免疫原性が最も高いアミノ酸を選択するためにＭＨＣクラスＩエピトープ予測ソフトウェアを使用した。この手法を用いると最大数のＨＬＡタイプを通じた潜在的な免疫原性が最大化される。全ての遺伝子型を通じて及び遺伝子型内部でのエピトープが最適化されたＣｏｒｅ配列を以下に示す（配列番号６）。
ｄｉｄｐｙｋｅｆｇａｔｖｅｌｌｓｆｌｐｓｄｆｆｐｓｉｒｄｌｌｄｔａｓａｌｙｒｅａｌｅｓｐｅｈｃｓｐｈｈｔａｌｒｑａｉｌｃｗｇｅｌｍｔｌａｔｗｖｇｓｎｌｅｄｐａｓｒｅｌｖｖｓｙｖｎｖｎｍｇｌｋｉｒｑｌｌｗｆｈｉｓｃｌｔｆｇｒｅｔｖｉｅｙｌｖｓｆｇｖｗｉｒｔｐｐａｙｒｐｐｎａｐｉｌｓｔｌｐｅｔｔｖｖｒｒｒｄｒｇｒｓｐｒｒｒｔｐｓｐｒｒｒｒｓｑｓｐｒｒｒｒｓｑｓｒｅｓｑｃ

解析されるクレード特異的ゲノムの数によって重み付けられた、全てのゲノムを通じた各部位での平均変異を計算し、面積及び保存が高く大きい残基を示した。図１。

エピトープ最適化されたポリメラーゼ配列の生成
エピトープ最適化されたポリメラーゼ配列を、Ｃｏｒｅ配列について上で論じたように４種類の主要なＨＢＶクレードから生成した。ポリメラーゼは長いので、２個の断片―Ｎ末端断片（ここから遺伝子型間の可変性が高いセグメントを除去した）及びＣ末端断片を生成した。両断片は、約３００アミノ酸長である。エピトープ最適化されたポリメラーゼアミノ酸配列を以下及び表９に示す。
エピトープ最適化されたＨＢＶポリメラーゼＮ末端アミノ酸配列（配列番号８）
ｐｌｓｙｑｈｆｒｋｌｌｌｌｄｅｅａｇｐｌｅｅｅｌｐｒｌａｄｅｇｌｎｒｒｖａｅｄｌｎｌｇｎｌｎｖｓｉｐｗｔｈｋｖｇｎｆｔｇｌｙｓｓｔｖｐｖｆｎｐｅｗｑｔｐｓｆｐｋｉｈｌｑｅｄｉｖｄｒｃｋｑｆｖｇｐｌｔｖｎｅｋｒｒｌｋｌｉｍｐａｒｆｙｐｎｖｔｋｙｌｐｌｄｋｇｉｋｐｙｙｐｅｈａｖｎｈｙｆｑｔｒｈｙｌｈｔｌｗｋａｇｉｌｙｋｒｅｔｔｒｓａｓｆｃｇｓｐｙｓｗｅｑｅｌｑｈｇｓｃｗｗｌｑｆｒｎｓｋｐｃｓｅｙｃｌｔｈｌｖｎｌｌｅｄｗｇｐｃｄｅｈｇｅｈｈｉｒｉｐｒｔｐａｒｖｔｇｇｖｆｌｖｄｋｎｐｈｎｔａｅｓｒｌｖｖｄｆｓｑｆｓｒｇｉｔｒｖｓｗｐｋｆａｖｐｎｌｑｓｌｔｎｌｌｓｓｎｌｓｗｌｓｌｄｖｓａａｆｙｈｉｐｌｈｐａａｍｐ
エピトープ最適化されたＨＢＶポリメラーゼＣ末端アミノ酸配列（配列番号１０）
ｈｌｌｖｇｓｓｇｌｓｒｙｖａｒｌｓｓｎｓｒｉｉｎｈｑｈｇｔｍｑｎｌｈｄｓｃｓｒｎｌｙｖｓｌｌｌｌｙｋｔｆｇｒｋｌｈｌｙｓｈｐｉｉｌｋｔｋｒｗｇｙｓｌｎｆｍｇｙｖｉｇｓｗｇｓｌｐｑｄｈｉｉｑｋｉｋｅｃｆｒｋｌｐｖｎｒｐｉｄｗｋｖｃｑｒｉｖｇｌｌｇｆａａｐｆｔｑｃｇｙｐａｌｍｐｌｙａｃｉｑｓｋｑａｆｔｆｓｐｔｙｋａｆｌｓｋｑｙｌｎｌｙｐｖａｒｑｒｐｇｌｃｑｖｆａｄａｔｐｔｇｗｇｌａｍｇｈｑｒｍｒｇｔｆｖａｐｌｐｉｈｔａｅｌｌａａｃｆａｒｓｒｓｇａｋｉｌｇｔｄｎｓｖｖｌｓｒｋｙｔｓｆｐｗｌｌｇｃａａｎｗｉｌｒｇｔｓｆｖｙｖｐｓａｌｎｐａｄｄｐｓｒｇｒｌｇｌｓｒｐｌｌｒｌｐｆｒｐｔｔｇｒｔｓｌｙａｖｓｐｓｖ

エピトープ最適化されたＣｏｒｅ及びポリメラーゼ配列を発現するＡｄＣ６及びＡｄＣ７ベクターの生成
エピトープ最適化されたＣｏｒｅ及びポリメラーゼアミノ酸配列をコードする遺伝子を、ＣＭＶプロモーターの制御下単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）配列を含む導入ベクターにクローニングした。この遺伝子をついで、Ｅ１欠失、Ｅ３ ＯＲＦ３、４、５、６、及び７欠失複製欠損アデノウイルスベクター（ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４３３１５に記載される）にクローニングして以下のベクターを生成した。
・ｇＤと融合したエピトープ最適化されたＣｏｒｅ配列を含むＡｄＣ６（ＡｄＣ６－ｇＤＣｏｒｅ）、
・ｇＤと融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＮ末端配列を含むＡｄＣ６（ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ）、
・ｇＤと融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＣ末端配列を含むＡｄＣ６（ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＣ）、
・ｇＤと融合したエピトープ最適化されたＣｏｒｅ配列を含むＡｄＣ７（ＡｄＣ７－ｇＤＣｏｒｅ）、
・ｇＤと融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＮ末端配列を含むＡｄＣ７（ＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮ）、及び
・ｇＤと融合したエピトープ最適化されたポリメラーゼＣ末端配列を含むＡｄＣ７（ＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＣ）。

妥当なクローンを、制限酵素消化により同定し、クローニング部位を配列決定した。ベクターをレスキューし、ＨＥＫ ２９３細胞中に増やし、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配遠心分離により精製し、分光光度測定によりベクター濃度（ｖｐ）を測定した。ベクターをＨＥＫ ２９３細胞中系列希釈で増やすとき感染性ユニットに対して滴定し、その後ＲＮＡを分離及び逆転写し、ネステッドヘキソン特異的ＰＣＲ反応を行った。ベクターの遺伝的完全性を、制限酵素消化及びその後の精製したウイルスＤＮＡのゲル電気泳動により決定した。タンパク質発現は、ｇＤ特異的抗原を用いるウエスタンブロット法により測定した。遺伝的安定性は、ＨＥＫ ２９３細胞中のベクターの連続継代（１２～１５回）及びその後の精製したウイルスＤＮＡの制限酵素消化及びゲル電気泳動により決定した。

マウス中のワクチンの免疫原性試験
Ｃ５７Ｂｌ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、及びＨＬＡ－Ａ２ ｔｇマウス（グループあたりｎ＝５）に様々な濃度の上のベクターの各々を注射した。未処置のマウスはコントロールとして働いた。注射後の様々な時間にマウスを出血させ、挿入断片特異的なＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度をＩＦＮ－γの細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により測定した。第１の注射の２か月後、ＡｄＣ６免疫マウスに同じ挿入断片を発現する異種ベクター（ＡｄＣ７）でブースター接種した。ＨＢＶ特異的Ｔ細胞の頻度を再度試験した。初回接種後の結果を図２Ａ～２Ｆ及び図３Ａ（Ｃ５７Ｂｌ／６マウス）、図３Ｂ（ＢＡＬＢ／ｃマウス）及び図３Ｃ（ＨＬＡ－Ａ２マウス）に示す。ブースター接種後の結果を図４Ａ～４Ｃ及び５Ａ～５Ｂに示す。

Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、エピトープ最適化されたポリメラーゼＮ末端配列に対して非常にロバストなＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示し、エピトープ最適化されたポリメラーゼＣ末端配列及びエピトープ最適化されたＣｏｒｅ配列に対して低い応答を示した一方、ＣＤ４＋応答はエピトープ最適化されたコア配列及びエピトープ最適化されたポリメラーゼＣ末端配列に対しては良好だった（図２Ａ～図２Ｆ）。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのエピトープマッピングから、ＰｏｌＣよりＰｏｌＮに対して高く幅広い応答が示された（図３Ａ）。ＰｏｌＮ内では総計１４個のペプチドがＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識された一方、ＰｏｌＣ内では、１つのエピトープを最も示すようである、たった２個の隣接するペプチドが認識された。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＰｏｌＮ又はＰｏｌＣに対しては応答しなかった。このパターンは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに大部分は写され、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は１２個のペプチドを認識してＰｏｌＮに対して最も高く、ついで４個のペプチドを認識してＰｏｌＣに対して高かった（図３Ｂ）。コアに対する応答は低かったが、１０個のペプチドを認識して驚くほど幅広かった（図３Ｂ）。ＢＡＬＢ／ｃＣＤ４＋Ｔ細胞は、１５個のペプチドを認識してＣｏｒｅに対して最も良く応答し、ＰｏｌＣ（４個のペプチド）又はＰｏｌＮ（２個のペプチド）の認識は低かった。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答をＨＬＡ－Ａ２ｔｇマウスでも試験し、ＰｏｌＮは再び１２個のペプチドに関与して最も高い応答の引き金を引いた（図３Ｃ）。ＰｏｌＣに対する応答は、低いが幅広かった（１６個のペプチド）一方、コアのたった１個のペプチドのみが検出された（図３Ｃ）。初回刺激実験で試験されたペプチドの配列を表３（Ｃｏｒｅペプチド）、表４（ＰｏｌＮペプチド）、及び表５（ＰｏｌＣペプチド）に提供する。初回接種実験のペプチドプールのペプチド組成を表６～８に提供する。これらのデータ全体から、多くの場合において検出可能なＴ細胞応答を誘発する挿入断片は、各配列内の複数のエピトープに向けられることが示される。

Ｃ５７Ｂｌ／６、ＢＡＬＢ／ｃ及びＨＬＡ－Ａ２ ｔｇマウスで試験されたブースター接種後、応答の増加は初回接種時に最適以下の応答を誘導するベクター投与量で挿入断片に対して、すなわち、１×１０⁹ｖｐベクター投与量で試験されたＣｏｒｅに対して主に見られた（図４Ａ～４Ｃ）。高い投与量でベクターを注射してもブースター免疫化はＰｏｌＮ又はＰｏｌＣに対する応答を増加できなかったが、ブースター接種はそれにもかかわらず、Ｔ細胞応答を広げた（図５Ａ～５Ｃ）。

免疫原性の要約
上の結果から、
・ワクチンは免疫原性であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞についてはＰｏｌＮ＞ＰｏｌＣ＞Ｃｏｒｅであり、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答についてはＣｏｒｅ＞ＰｏｌＣ＞ＰｏｌＮである。
・異種ワクチンキャリアによって免疫応答をブースター接種することができる。
・免疫応答は幅広い、そして
・ブースター接種後、Ｔ細胞応答の幅は広がる、
ということが示される。

低用量ＡＡＶ―１．３ＨＢＶ曝露時のＨＢＶ力価に対するワクチン接種の効果
３匹のマウスのグループに１×１０¹⁰、１×１０¹¹又は１．５×１０¹¹ｖｇのＡＡＶ－１．３ＨＢＶを投与し、８週間後ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮをワクチン接種した。ワクチン接種の８週間後ウイルス力価を調べ、ワクチン接種前の力価と比較した。図６は、各治療グループについてのベースラインからのウイルス量変化を示す。

エピトープ変化
ＨＢＶ抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞は、慢性ＨＢＶ感染症中に消耗した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の消耗までの進行は、準優位なエピトープと比べて優位なエピトープの方が迅速で明白だった。根底にある理由は、消耗がＴ細胞受容体を通じた圧倒的な抗原によって駆動される刺激によって駆り立てられ、そして優位なエピトープは、拘束分子に対する結合活性が低い準優位なエピトープよりも抗原提示細胞によって発現されるＭＨＣクラスＩ抗原上に高レベルで存在することである。典型的なワクチン法では主に、有意なエピトープに対する免疫応答を誘導する。治療ワクチンは、慢性ウイルス性感染症中の優位なエピトープに対するＴ細胞の減少を考慮すべきであり、準優位なエピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を好むよう設計されるべきであり、こうすると疾患により駆動される消耗に抵抗し、優れた疾患管理に転換する可能性が高い。

単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄと融合したＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン（ＰｏｌＮ）をコードする核酸配列を含むアデノウイルスベクター（「ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ」、ｇＤＰｏｌＮのアミノ酸配列は、配列番号１６である）で免疫化した未処置のマウスのエピトーププロフィールを決定した。ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターで事前に処置されていないマウスの応答を、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮでワクチン接種する前に１．３ＨＢＶゲノムを発現するＡＡＶ８ベクターで感染したマウスから得られたものと比較した。ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターは、血清中に高い力価のＨＢＶを誘導し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の消耗を駆り立てる可能性があった。

第１の一連の実験においては、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターでワクチン接種したがＡＡＶ－１．３ＨＢＶベクターに曝露していないマウスのエピトープを同定するためにペプチドプールマトリックスを使用した。これらの未処置のマウスにおいてタンパク質応答を誘発した領域の数を同定した（例えば、１％超のＩＦＮ－γを産生するＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞）。図７Ａ及び図８Ａ。第２の実験においては、マウスに１×１０¹⁰ウイルスゲノム（ｖｇ）のＡＡＶ－１．３ＨＢＶベクターを曝露し、４週間後に最初の実験における曝露していないマウスと同一のＨＢＶポリメラーゼ配列（ｇＤＰｏｌＮ）を発現するＡｄＣ６ベクターでワクチン接種し、それから１０週間後、ワクチン接種前に曝露されているマウス由来の脾細胞上のペプチドプールマトリックスを用いてＨＢＶ ＰｏｌＮ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトーププロフィールを決定した。図７Ｂ及び図８Ｂ。マウスに１．５×１０¹¹ｖｇ用量のＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターを曝露することにより、緊縮条件を使用して実験を繰り返した。４週間後マウスに再度ワクチン接種し、ワクチン接種後約１０週間でペプチドプールマトリックスに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を試験した。図７Ｃ及び図８Ｃ。両実験において、ワクチン接種していないマウスから取得された結果と比較すると、ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで感染したマウスのエピトーププロフィールに変化が観察され、ワクチン接種時にはｍｌ血清あたり１０⁷～１０⁹ｖｇの高いウイルス負荷があった。この効果は、高用量のＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターに曝露したマウスでより明白だった。両実験において、応答の低下が観察された。そのうえ、高用量のＡＡＶ８－１．３ＨＢＶに曝露したマウスにおいて特に、この結果から、未感染でワクチン接種したマウスにおいて免疫優性を示したエピトープの多くに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の減少（例えば、ペプチド５０～５９によって表される領域内、図８）、準優位なエピトープ（ペプチド２～８によって表される領域内のものなど）並びにペプチド１０～２９によって表される領域内などの新規なエピトープの良好な保存が示された。これらのデータから、優位なエピトープの認識から準優位なエピトープの認識への変化が確認される。

これらのデータに基づいて、新規なＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン挿入断片（ＨＢＶ ＰｏｌＮ ｖ２）が生成された（配列番号１７３）。
ＨＦＲＫＬＬＬＬＤＥＥＡＧＰＬＥＥＥＬＰＲＬＡＤＥＧＬＮＲＲＶＡＥＤＬＮＬＧＮＬＰＥＷＱＴＰＳＦＰＫＩＨＬＱＥＤＩＶＤＲＣＫＱＦＶＧＰＬＴＶＮＥＫＲＲＬＫＬＩＭＰＡＲＦＹＰＮＶＴＫＹＬＰＬＤＫＧＩＫＰＹＹＰＥＨＡＶＮＨＹＦＱＴＲＨＹＬＨＴＬＷＫＡＧＩＬＹＫＲＥＴＴＲＳＡＳＦＣＧＳＰＹＳＷＥＱＥＬＱＨＧＳＣＷＷＬＱＦＲＮＳＫＰＣＳＥＹＣＬＴＨＬＶＮＬＬＥＤＷＧＰＣＤＥＨＧＥＨＨＩＲＩＰＲＴＰＡＲＶＴ
この挿入断片は、ＨＢＶウイルス負荷が高いマウスにおける応答を無傷にしたまま主に準優位なエピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導した。

ｇＤＣｏｒｅ、ｇＤＰｏｌＮ、及びｇＤＰｏｌＣワクチンの免疫原性及び有効性
ＡＡＶ８－ＨＢＶマウスモデルにおけるＡｄＣ６－ｇＤＣｏｒｅ、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＣ、ＡｄＣ７－ｇＤＣｏｒｅ、ＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮ、及びＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＣワクチンの免疫原性及び有効性を分析した。

方法―免疫原性
Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（グループあたりｎ＝５）に様々な用量のＡｄＣ６－ｇＤＣｏｒｅ（配列番号１５に対応するｇＤＣｏｒｅ核酸配列）；ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ（配列番号１７に対応するｇＤＰｏｌＮ核酸配列）；又はＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＣ（配列番号１９に対応するｇＤＰｏｌＣ核酸配列）を注射した。第１の注射の２か月後、ＡｄＣ６ベクターで免疫化されたマウスを同一の挿入断片（例えば、ＡｄＣ７－ｇＤＣｏｒｅ、ＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮ、又はＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＣ）を含むＡｄＣ７ベクターでブースター接種した。注射後１４日目及び５６日目にマウスを出血させ、各種ＨＢＶ挿入断片に対するＴ細胞の頻度を、細胞をＨＢＶ配列を表す重複ペプチドで刺激した時のインターフェロン（ＩＦＮ）γに対する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により分析した。コントロール細胞をペプチドなしで培養した。ＰｏｌＮ内の１つの免疫優性エピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度及び表現型を、ＭＨＣＩ四量体で染色することにより試験した。標的配列内の個々のペプチドに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の幅及び特異性を、脾細胞のエピトープマッピングにより実行した（ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ－γをＩＣＳによって試験した）。

肝臓中のＣＤ８＋Ｔ細胞を評価するために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（グループあたりｎ＝８）は、尾静脈を介して１×１０¹⁰ウイルスゲノム（ｖｇ）のＡＡＶ８－１．３ＨＢＶの静脈内投与、１×１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶの静脈内投与を受けた、又は静脈内投与を受けず、４週間後、５×１０⁹個のウイルス粒子（ｖｐ）のＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮの単回ＩＭ注射を受けた。ＩＭ注射の８週間後、マウスを屠殺し、肝臓を除去し、リンパ球を分離し、Ｔ細胞マーカー及びＰｏｌＮ配列に存在する免疫優性エピトープに対するＴ細胞受容体を認識する四量体で染色した。

別の実験において、３グループのＣ５７Ｂｌ／６マウス（グループあたりｎ＝４）が４週間で５×１０⁹ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮの単回ＩＭ注射を受けた（－）又は４週間後５×１０⁹ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮの有り無しのいずれかで尾静脈を介した１×１０¹¹ウイルスゲノム（ｖｇ）のＡＡＶ８－１．３ＨＢＶの静脈内投与を受けた。ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶの投与の約２か月後、マウスを屠殺し、肝臓を除去し、そして３グループの各々から肝臓切片を作製し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、リンパ球浸潤物のために評価された。同じ実験から、細胞を特異的四量体及びＴ－ｂｅｔ（クローン４Ｂ１０，ＢＶ７８５染色）に対する蛍光色素標識抗体又はＰＤ－１（クローン２９Ｆ．１Ａ１２，ＢＦ６０５染色），ＴＩＭ－３（クローンＲＭＴ３－２３，Ｐｅ／Ｃｙ７染色），ＣＴＬＡ－４（クローンＵＣ１０－４Ｂ９，ＰＥ染色）、又はＬＡＧ－３（クローンＣ９Ｂ７Ｗ，ＢＶ６５０染色）に対する抗体で染色した。細胞をフローサイトメトリーにより分析し、ＣＤ４４＋ＣＤ８四量体陽性細胞にゲートし、マーカーにゲートした。未処理のＴ細胞に対するヒストグラムの比較から、マーカー陽性細胞の割合を同定した。

方法―有効性
ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクター試験―慢性的なＨＢＶウイルス曝露に対するＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮの影響を評価するために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（グループあたりｎ＝８）を１×１０¹⁰ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで尾静脈から静脈内に曝露し、４週間後、５×１０⁹ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮの単回ＩＭ注射で免疫化した。ＨＢＶＤＮＡウイルス力価をｑＰＣＲにより評価し、ワクチン曝露前後のベースラインからの変化（ｌｏｇ₁₀ ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ）を報告した。ウイルスゲノムコピー数をＡＡＶ８曝露後４，６，８、１０、及び１２週間後に評価した。ウイルス動態を経時的にＰＣＲにより評価し、ｍＬあたりのＨＢＶコピーのｌｏｇ１０変化を評価した。処置後の異なる時点で１、２又は３の対数減少を示したマウスの数を評価した。

ＣＤ８＋Ｔ細胞抗原認識に対する慢性的なＨＢＶウイルス曝露の経時的な影響―ワクチン誘導肝臓ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＡＡＶ８－１．３ＨＢＶの効果を評価した。５×１０⁹ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮの単回ＩＭ注射で免疫化した未処置のマウスの脾細胞のエピトーププロフィールをワクチン接種の４週間後に決定した。１×１０¹⁰及び１．５×１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶに曝露され、その後４週間後に５×１０⁹ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮをワクチン接種したマウスは、ワクチン接種後１０週間（ＡＡＶ注射後１４週間）で実行された脾細胞中でＣＤ８＋Ｔ細胞エピトーププロフィールを有した。ＡＡＶ―未処置及びＡＡＶ―処置済ワクチン接種済動物のエピトーププロフィールを比較した。肝臓からのＰｏｌＮ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を異なるマーカーに対して分析した。

結果
免疫原性―ワクチン接種は、ＰｏｌＮに対するロバストで持続的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答（全ての循環ＣＤ８＋Ｔ細胞を通じた頻度の中央値：６．０％）並びにＰｏｌＣ及びコアに対する低い応答（頻度の中央値：それぞれ１．０％及び０．４％、図９Ａ及び図９Ｂ）を誘導した。８週間でのブースター接種後により、コアに対して有意な変化が観察され（ｐ＝０．００７）、全ての領域の応答が増加した（図９Ｃ）。図９Ａ～９Ｃは、線によって示される中央値を有する個別のマウスについての全てのＣＤ８＋Ｔ細胞にわたるＣＤ８＋Ｔ細胞変化を示す。ワクチン接種は、ＣＤ８＋Ｔ細胞により幅広いエピトープ認識を誘導し、これはブースター接種後にさらに強化された（２７％から３４％、図１０）。

ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチン接種後１２週間で、ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで感染させたワクチン接種したマウスは、肝臓ＣＤ８＋浸潤物の優先的な増加（図１１Ａ～１１Ｂ及び図１２Ａ～１２Ｆ）、ワクチンで誘導したＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在量の減少（図１１Ａ及び図１１Ｂ）、及びＴ－ｂｅｔレベルの僅かな減少（エフェクター機能の消失を示唆）（図１３Ａ～１３Ｂ）を示した。図１１Ａは、個別の肝臓由来の回復した全てのリンパ球を通じたＣＤ８＋Ｔ細胞変化を示す。図１１Ｂは、四量体陽性ＣＤ８⁺細胞の変化を示し、これは未処置Ｔ細胞と比較したヒストグラムから同定された。しかしながら、ワクチン接種したＡＡＶ１．３ＨＢＶ－感染マウスと未感染マウスの間にＴ細胞の消耗表現型への分化を示唆する細胞マーカーの明確なパターンは観察されなかった（図１３Ａ～１３Ｂ）。

有効性―ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターの単回ＩＭ注射後、ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで感染したマウスは、ワクチン接種後８週間持続した血清中のＨＢＶ ＤＮＡが複数対数減少した（図１４）。ワクチン接種後、４週間及び８週間での血清ＨＢＶ ＤＮＡウイルス負荷レベル減少の中央値は、それぞれ０．８６及び２．６９ ｌｏｇ₁₀ｃｐｓ／ｍＬだった（図１４Ａ）。８週間で、全ての動物は、＞１ｌｏｇ₁₀ｃｐｓ／ｍＬのベースラインからの減少を有し、６／７（８６％）は＞２ｌｏｇ₁₀ｃｐｓ／ｍＬのベースラインからの減少を有し、そして２／７（２９％）は＞３ｌｏｇ₁₀ｃｐｓ／ｍＬのベースラインからの減少を有した（図１４Ｂ）。

単回ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクター注射後、ＡＡＶ－ＨＢＶ－で感染させたマウスと未処置のマウスを比較すると、脾細胞においてＰｏｌＮペプチドに対して異なるＣＤ８＋Ｔ細胞認識パターンが観察された。図１５Ａ及び図１５Ｂは、マウスを最初にＡＡＶ－１．３ＨＢＶで感染させ、４週間後１０¹⁰ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターでブースター接種し、免疫化後８週間で脾細胞を収集し、一連のＰｏｌＮに及ぶ個別のペプチドで短時間生体外刺激時のＩＦＮ－γをＩＣＳによって調べた。ペプチド無しで取得されたバックグラウンド頻度を減算した。図１５Ａは、示された用量のＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターを最初に注射したものにその後ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンのみを受けたマウスのペプチド認識プロフィールを示す。図１５Ｂの円グラフは、全てのＣＤ４４⁺ＣＤ８⁺細胞の０．１％の閾値に達したペプチドに対応する応答を示す（図１５Ａのものに対応するデータ）。各大きさ／色は、大きさが全体の割合を示し、個別のペプチドの応答の頻度を表し、０．１％を超える応答のみを含めた。引き抜きは、ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶに感染させたマウスでのみ認識されたエピトープを示す。ＡＡＶで前処理すると単回ＩＭ刺激後に認識されたエピトープの数とＣＤ８⁺Ｔ細胞のプール中のＩＦＮ－γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の総計としての免疫応答の大きさの両方を低減することが分かった。ＡＡＶで事前処理するとＴ細胞認識を新しいエピトープへと変化させ、これは検出可能なＣＤ８⁺Ｔ細胞応答のおよそ３分の一を表す。機能的ＨＢＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の割合は、未処置のマウスで最も高かったが（４．４％、図１５Ｂ）、低用量及び高用量のＡＡＶ８－１．３ＨＢＶの存在量は減少した（それぞれ２．０％及び０．６％、図１５Ｂ）。ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで感染していない動物は、多くのエピトープに対して強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示したが、ＡＡＶ－ＨＢＶで感染した動物では減少するか変化して新しいエピトープのＴ細胞認識を含んだ。

考察
ｇＤを遺伝的にコードされたチェックポイント阻害剤として使用する早期のＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を標的とするＨＢＶ治療ワクチンを作製し、
・重要なＨＢＶ抗原に対する強力で耐久性のあるＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する（図９）、
・準優位なエピトープ認識を含む（図１５）非常に幅広いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激する（図１０）、そして
・機能的ＣＤ８＋Ｔ細胞が肝臓に対して優先的に輸送され（図１１及び１２）、ＡＡＶマウスモデルで持続的な複数対数ＨＢＶ ＤＮＡウイルス負荷減少を達成した（図１４）。

開示されるＡＡＶ試験において、ＡＡＶが誘導したＨＢＶ感染は、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮでのワクチン接種後、ＰｏｌＮの優勢なエピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞認識の減少を引き起こした（図１５）。理論によって拘束されることを意図するものではないが、ｇＤによって誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞の幅及びこの細胞の準優位なエピトープを認識する能力が持続性の免疫応答及びＨＢＶの複数対数抑制につながると考えられる。

ＡＡＶで誘導されたＨＢＶ感染動物におけるワクチン接種後の血液及び肝臓中のＡｄＣ６／７－ｇＤＰｏｌＮの免疫原性
既存のＡＡＶで誘導されたＨＢＶ感染の存在下、動物の血液、脾臓及び肝臓中のＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンに対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を評価するために、以下の試験を実行した。

実験＃１ ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ感染マウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答：血液中の応答動態
目的―ＡｄＣ６ベクター内で発現するｇＤＰｏｌＮ抗原に対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答についてのＨＢＶ抗原の持続性力価の効果を評価すること。

方法―Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに１０¹⁰のＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターを静脈内に注射した。４週間後、それらに５×１０⁹ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターをワクチン接種した。コントロールマウスは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターのみを受けた。未処置のマウスは、追加のコントロールとして働いた。マウスを２か月後、同一の用量のＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮワクチンでブースター接種した。初回接種及びブースター接種後様々な時間で採血し、ＩＦＮ－γ－産生ＣＤ８⁺Ｔ細胞のＰＢＭＣを調べた。

結果―図１６に示すように、マウスはワクチン接種の２週間後に、活発なＰｏｌＮ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を開始し、これは８週目までに徐々に減少し、ブースター接種後再度上昇した。ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、初回接種後よりブースター接種後に安定した。たいていの時点で、ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターを注射された調べたマウスの応答は、ＡＡＶベクターを注射されなかったコントロールの応答より低かった。

実験＃２ ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ感染マウスのＣＤ８⁺Ｔ細胞応答：肝臓における応答
目的―ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで感染させた、ワクチン接種したマウスの肝臓中のＴ細胞消耗を示すマーカーを含むＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を評価すること。

方法―Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに１０¹⁰又は１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターを静脈内に注射した。４週間後、これらに５×１０⁹ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターをワクチン接種した。コントロールマウスは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターのみを受けた。未処置のマウスは、追加のコントロールとして働いた。マウスを２か月後、同一の用量のＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮワクチンでブースター接種した。

肝臓リンパ球を取得するために、肝臓を小断片に切断し、１時間撹拌下Ｌ１５中２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＰ、１ｍｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ Ｉ（全てＲｏｃｈｅ， Ｂａｓｅｌ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ製）及び２％ＦＢＳ（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ， Ｔｕｌａｒｅ， ＣＡ）で処理した。肝臓断片をホモジナイズし、７０μｍ濾過器によりろ過し、リンパ球をＰｅｒｃｏｌｌ勾配遠心分離により精製し、そして１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで洗浄した。リンパ球を＋４℃で、暗所で３０分間、青紫色ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｄｙｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗ＣＤ８－ＡＰＣ（クローン５３－６．７， ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４４－Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ７００（クローンＩＭ７， ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＥＯＭＥＳ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（クローンＤａｎ１１ｍａｇ， ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＰＤ１－ＢＶ６０５（クローン２９Ｆ．１Ａ１２， ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＬＡＧ３－ＢＶ６５０（クローンＣ９Ｂ７Ｗ， ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗Ｔ－ｂｅｔ－ＢＶ７８６（クローン４Ｂ１０， ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＣＴＬＡ－４－ＰＥ－Ａ（クローンＵＣ１０－４Ｂ９， ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＴＩＭ－３－Ｐｅ－Ｃｙ７－Ａ（クローンＲＭＴ３－２３， ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、及びＨＢＶポリメラーゼのアミノ酸３９６－４０４ ＦＡＶＰＮＬＱＳＬ（配列番号１８８）（ペプチド５５）に対応するＡＰＣ－標識ＭＨＣクラスＩ四量体（ＮＩＨ四量体 Ｆａｃｉｌｉｔｙ， Ｅｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ａｔｌａｎｔａ ＧＡ）で染色した。細胞を洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡ）及びＤｉＶａソフトウェアにより解析した。取得後解析をＦｌｏｗＪｏ （ＴｒｅｅＳｔａｒ， Ａｓｈｌａｎｄ， ＯＲ）で実行した。

結果―リンパ球性肝臓浸潤物中のＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度を解析した。リンパ球性肝臓浸潤物中のＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度は、未処置のマウスと比較してワクチン接種したマウスで上昇し、ワクチン接種前にＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターを注射したマウスではさらに上昇した（図１７Ａ）。ＰｏｌＮ挿入断片に存在するエピトープに特異的な四量体で染色することにより同定されたＰｏｌＮ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度は、ＡＡＶ－１．３ＨＢＶを注射したマウスで減少した（図１７Ｂ）。

未処理のもの（すなわち、四量体^-ＣＤ４４^-ＣＤ８⁺Ｔ細胞）と比較した浸潤性四量体⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の表現型を、ある一定の抗体に結合した色素の平均蛍光強度を測定すること（図１８Ａ～図１８Ｆ）及び指示されたマーカーが陽性であるＣＤ８⁺Ｔ細胞の割合（図１９Ａ～図１９Ｆ）を評価することにより、評価した。

ＣＤ８⁺Ｔ細胞の機能の数を制御するＴ－ｂｅｔは、ワクチンのみのグループと比較してワクチン接種前にＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを注射したマウス由来の肝臓ＣＤ８⁺Ｔ細胞上で減少した。ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで事前に処置したグループでは消耗マーカーは上昇せず、ＨＢＶの存在下ＰｏｌＮ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の観察された減少は、古典的ＣＤ８⁺Ｔ細胞消耗によって起こったわけではさそうであることが示された（図１８Ａ～図１８Ｆ及び図１９Ａ～図１９Ｆ）。

実験＃３ ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで感染させたマウスのＰｏｌＮ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の幅
目的―ＨＢＶの存在が、ＡｄＣワクチンによってｇＤ内に発現されたＰｏｌＮに対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の幅に影響を及ぼすかどうかを評価すること。

方法―マウスに１０¹⁰又は１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターを静脈内に注射し、２か月後に対応するＡｄＣ７ベクターでブースター接種した。コントロールマウスは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターのみを受けた。１０週間後にマウスを安楽死させ、プールした脾細胞を非ＡＡＶ感染動物試験のペプチドのプールに対して調べた。結果を図２０Ａ～図２０Ｃに提供する。

第２の実験において、マウスに１０¹⁰又は１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターを静脈内に注射した。４週間後、これらに５×１０¹⁰ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターをワクチン接種した。コントロールマウスは、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターのみを受けた。未処置のマウスは、追加のコントロールとして働いた。６週間後、ＰｏｌＮ配列に及ぶ個別のペプチドに応答するＩＦＮ－γ産生ＣＤ８⁺Ｔ細胞について脾細胞を分析した。結果を図２０Ｄ～図２０Ｆに提供する。

結果―ＨＢＶの存在、特に１０¹¹ｖｇ用量のＡＡＶ８－ＨＢＶ１．３を注射した後などの高いＨＢＶの力価は、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮワクチンによって提示されるＰｏｌＮ配列に対する全ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を低減するだけでなく、エピトープ認識プロフィールの移行も引き起こした。

実験＃４ -ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで感染させたマウス中の肝臓ＰｏｌＮ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能
目的―ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで感染させたマウスの肝臓浸潤性ＰｏｌＮ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞は機能的なままかどうかを評価すること。

方法―第１の実験において、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに３×１０¹¹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを静脈内に注射した。あるグループは８週間後、５×１０¹⁰ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターでワクチン接種した。他のグループは、ワクチン接種をしていないままにした。４．５か月後、マウスを安楽死させ、ＰｏｌＮペプチドプールに応答するＣＤ８⁺Ｔ細胞産生ＩＦＮ－γの頻度について脾細胞を調べた。

第２の実験において、マウスに段階的濃度のＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ（１×１０¹⁰，４×１０¹⁰，又は１×１０¹¹）を注射した。４週間後、全てのマウスに５×１０¹⁰ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターをワクチン接種した。２か月後、マウスに同一の用量のＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮベクターをブースター接種した。２か月後、マウスを安楽死させ、肝臓からリンパ球を分離し、ＰｏｌＮペプチドプールに応答するＣＤ８⁺Ｔ細胞産生ＩＦＮ－γについて調べた。細胞をまた、消耗したＴ細胞中で増加する転写因子である、Ｔｏｘに対する抗体で染色した。

結果―図２１に示すように、ワクチンで誘導されたＣＤ８⁺Ｔ細胞は、ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターを注射したマウスで機能的なままだった。

実験＃５ －肝臓組織診断についてのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで感染させたマウスのワクチン接種の効果
目的―ＡＡＶ．８－１．３ＨＢＶ－でワクチン接種したマウスのＡｄＣ６／７－ｇＤＰｏｌＮワクチン接種は、持続性肝臓損傷を起こすかどうかを評価すること。

方法―マウスに静脈内に与えられる１０¹⁰ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＰＶを注射した。１か月後、これらに５×１０⁹ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターをワクチン接種した。２か月後、マウスを同一の投与量で与えられる同一の用量のＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮベクターでブースター接種した。２か月後、マウスを安楽死させた。肝臓切片を収集し、１０％ホルムアルデヒドに固定した。切片（厚さ３μｍ以下）を調製し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。これらを拡大率２０倍の光学顕微鏡下で観察した。

結果―ＡＡＶベクターとワクチンの両方を受けたマウス由来の３３枚の切片の１枚は、肝臓切片の周辺部分にある小さなリンパ球浸潤物を示した。

図２１Ｂに示すように、ＨＬＡ－Ａ２－ｔｇマウスの単回ｇＤＰｏｌＮワクチン接種後、ＩＦＮ－γ産生肝臓ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度は、ワクチン接種しただけのものと比較すると、ＡＡＶを受けたマウスで減少した。
結論
・ＰｏｌＮに対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで感染させたマウスで減少した。それにもかかわらず、これらは検出可能なままだった。
・ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶで事前に処置された動物では消耗マーカーは上昇せず、ＨＢＶ存在下のＰｏｌＮ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の観察された減少は、古典的なＣＤ８⁺Ｔ細胞消耗によって起きたわけではなさそうであることが示された。
・ＡＡＶで誘導されたＨＢＶ感染は、ＰｏｌＮに対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答のエピトープ認識プロフィールを変化させた。
・以前ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターで感染したマウスのワクチンで誘導されたＣＤ８⁺Ｔ細胞は、機能的なままだった。
・プライムブースト計画で使用されたワクチンは、ＨＢＶ陽性マウスに明白な肝臓損傷を起こさなかった。

ＨＢＶ ＰｏｌＮ－ＰｏｌＣ－Ｃｏｒｅ構築物の生成
２個の複数抗原挿入断片（第２世代のＰｏｌＮ－ＰｏｌＣ－Ｃｏｒｅ及び第３世代のＰｏｌＮ－ＰｏｌＣ－Ｃｏｒｅ）を生成した。これらの挿入断片の配列を以下に示す。
第２世代のＨＢＶワクチン挿入断片（「ＨＢＶ２」）（Ｐｏｌ Ｎ（イタリック）－Ｐｏｌ Ｃ（下線）－Ｃｏｒｅ）（配列番号１７４）
ＹＬＰＬＤＫＧＩＫＰＹＹＰＥＨＡＶＮＨＹＦＱＴＲＨＹＬＨＴＬＷＫＡＧＩＬＹＫＲＥＴＴＲＳＡＳＦＣＧＳＰＹＳＷＥＱＥＬＱＨＧＳＣＷＷＬＱＦＲＮＳＫＰＣＳＥＹＣＬＴＨＬＶＮＬＬＥＤＷＧＰＣＤＥＨＧＥＨＨＩＲＩＰＲＴＰＡＲＶＴＧＧＶＦＬＶＤＫＮＰＨＮＴＡＥＳＲＬＶＶＤＦＳＱＦＳＲＧＩＴＲＶＳＷＰＫＦＡＶＰＮＬＱＳＬＴＮＬＬＳＳＮＬＳＷＬＳＬＤＶＱＡＦＴＦＳＰＴＹＫＡＦＬＳＫＱＹＬＮＬＹＰＶＡＲＱＲＰＧＬＣＱＶＦＡＤＡＴＰＴＧＷＧＬＡＭＧＨＱＲＭＲＧＴＦＶＡＰＬＰＩＨＴＡＥＬＬＡＡＣＦＡＲＳＲＳＧＡＫＩＬＧＴＤＮＳＶＶＬＳＲＫＹＴＳＦＰＷＬＬＧＣＡＡＮＷＩＬＲＧＴＳＦＶＹＶＰＳＡＬＮＰＡＤＤＶＧＳＮＬＥＤＰＡＳＲＥＬＶＶＳＹＶＮＶＮＭＧＬＫＩＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＩＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲＲＤＲＧＲ

第３世代のＨＢＶ ワクチン挿入断片（「ＨＢＶ３」）（Ｐｏｌ Ｎ（イタリック）－Ｐｏｌ Ｃ（下線）－Ｃｏｒｅ）（配列番号１７５）
ＨＦＲＫＬＬＬＬＤＥＥＡＧＰＬＥＥＥＬＰＲＬＡＤＥＧＬＮＲＲＶＡＥＤＬＮＬＧＮＬＰＥＷＱＴＰＳＦＰＫＩＨＬＱＥＤＩＶＤＲＣＫＱＦＶＧＰＬＴＶＮＥＫＲＲＬＫＬＩＭＰＡＲＦＹＰＮＶＴＫＹＬＰＬＤＫＧＩＫＰＹＹＰＥＨＡＶＮＨＹＦＱＴＲＨＹＬＨＴＬＷＫＡＧＩＬＹＫＲＥＴＴＲＳＡＳＦＣＧＳＰＹＳＷＥＱＥＬＱＨＧＳＣＷＷＬＱＦＲＮＳＫＰＣＳＥＹＣＬＴＨＬＶＮＬＬＥＤＷＧＰＣＤＥＨＧＥＨＨＩＲＩＰＲＴＰＡＲＶＴＱＡＦＴＦＳＰＴＹＫＡＦＬＳＫＱＹＬＮＬＹＰＶＡＲＱＲＰＧＬＣＱＶＦＡＤＡＴＰＴＧＷＧＬＡＭＧＨＱＲＭＲＧＴＦＶＡＰＬＰＩＨＴＡＥＬＬＡＡＣＦＡＲＳＲＳＧＡＫＩＬＧＴＤＮＳＶＶＬＳＲＫＹＴＳＦＰＷＬＬＧＣＡＡＮＷＩＬＲＧＴＳＦＶＹＶＰＳＡＬＮＰＡＤＤＶＧＳＮＬＥＤＰＡＳＲＥＬＶＶＳＹＶＮＶＮＭＧＬＫＩＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＩＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲＲＤＲＧＲ

第２世代のＨＢＶ（「ＨＢＶ２」）挿入断片は、ワクチン接種前にＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターで感染させなかったマウスから同定された免疫優性ＰｏｌＮエピトープを含む。これらのエピトープの多くは、ＡＡＶ８－１．３ＨＢＶベクターを事前に投与することによりもたらされた慢性ＨＢＶ感染症のマウスモデルでは減少することが分かった（上の「エピトープ変化」で定義される）。第３世代のＨＢＶ（「ＨＢＶ３」）挿入断片は、ＨＢＶ負荷の高いマウス（上を参照）によって優先的に認識されるＰｏｌＮの近接領域のために選ばれる。Ｃｏｒｅ及びＰｏｌＣの領域を以下の一般的な処方、Ｃ５７Ｂｌ／６，ＢＡＬＢｃ及びＨＬＡ－Ａ２ｔｇマウスの初回接種（図３）かブースター接種（図５）領域のいずれかに対する最も高い免疫応答を有する領域を使用して、固有のエピトープを選択し、これらの間にスペーサー配列を挿入する代わりに大きな近接領域を選択する目的で、両構築物のために選んだ。

第２及び第３世代のＨＢＶ挿入断片（ＨＢＶ２及びＨＢＶ３）の遺伝的完全性及び安定性
ウエスタンブロット―精製した組換えウイルスベクター製剤（ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２，ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３，ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２，及びＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ３）の生体外で導入遺伝子産物発現を誘発する能力を評価した。そのために、関心のあるベクターによる細胞培養感染に続いて細胞可溶化液中のｇＤタンパク質の発現を評価するためにウエスタンブロットアッセイを実行した。接着性ＨＥＫ２９３細胞単層を既知の量の精製したベクターで感染させ、感染後４８時間で収集し、プロテアーゼ阻害薬を含む溶菌及び抽出バッファーに再懸濁し、超音波処理により溶解した。全タンパク質抽出物を酸化還元剤としてジチオスレイトールを使用することにより変性させ、１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）中の電気泳動にかけた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるタンパク質分離の後、サンプルを湿った電気泳動移動により活性フッ化ポリビニリデン膜上に移動させた。この膜を生理食塩水に１：１０００に希釈したｇＤに対する一次抗体（クローンＰＡ１－３０２３３， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を使用してｇＤタンパク質を検出するために、室温で１時間、免疫染色した。室温で１時間ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ二次ＩｇＧ（ａｂ６７２１， Ａｂｃａｍ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）でインキュベートする前に膜を１ＸＴＢＳ－Ｔで洗浄した。これに続けてルミノールベースの化学発光基質を加えた。染色した膜をオートラジオグラフィーフィルムに曝露し、自動フィルム現像機により処理した後にシグナル発光を評価した。感染したＨＥＫ２９３細胞可溶化液のｇＤタンパク質発現を記述した後、膜を取り除き、全タンパク質抽出物サンプル中のβ－アクチンの存在を再度探索した。この染色段階を、ＰＡＧＥサンプルロードステップの一貫性を評価し、したがって組換えウイルスベクターによるｇＤタンパク質発現の生体外刺激の半定量的解析をより良く支援するために利用した。

安定性―ウイルス構築物の遺伝的完全性を保証するために、各組換えウイルスベクターロットの遺伝的安定性を接着性ＨＥＫ２９３細胞培養液の連続的ウイルス継代により評価した。各遺伝子導入に起因する組換えウイルスプールを標準的な成長条件で合計１２回の継代で培養した。最後の継代において、ウイルスプールを増やし、粗製収集物を塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配により精製した。ベクター精製後、ウイルスＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを使用して分離し、ＤＮＡテンプレートを異なる構築物特異的なあらかじめ定義されたバンド形成パターンに切断する２種類の制限酵素、Ａｓｅ Ｉ及びＢｇｌ ＩＩを用いた制限酵素消化により評価した。消化後、サンプルを消化されたバンドの視覚化を可能にするために臭化エチジウムを含む１％アガロースゲル中の電気泳動にかけてその後デジタルゲルイメージングシステムを使用して結果を記述した。初期継代ウイルスのものと同一のバンド形成パターンを呈するウイルス調製を本来の分子クローン構造を維持するとみなし、したがって１２回のウイルス継代の最後まで安定であるとみなした。

結果―ウイルスベクターＤＮＡのバンド形成パターンは、５回の継代後のものと比較すると１２回の継代後に安定なままであり、ベクターゲノムは安定であることが示された（データは示さない）。

ＡｄＣ６又はＡｄＣ７ベクターによって発現された第２世代及び第３世代のＨＢＶ挿入断片（ＨＢＶ２及びＨＢＶ３）の免疫原性
目的―ＡｄＣ６ベクター又はＡｄＣ７ベクターによって発現されたＨＢＶ２及びＨＢＶ３挿入断片に対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を評価すること。

方法―Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのグループに５×１０⁹又は５×１０¹⁰ｖｐのＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２又はＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３ベクターを注射した。同一の用量のＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮベクターを注射したマウスは、ポジティブコントロールとして働き、未処置のマウスはネガティブコントロールとして働いた。１４日後にマウスを出血させ、ＰＢＭＣを、ＨＢＶ挿入断片に対応するペプチドプールに応答してＩＦＮ－γを産生するＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度について調べた。４週間後（ワクチン接種後６週間）、マウスを再度出血させ、ＰｏｌＮ特異的四量体で調べた。ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３で免疫化したマウスは、この挿入断片が四量体に対応するエピトープを欠如しているので、除外した。

Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのグループに５×１０⁹若しくは５×１０¹⁰ｖｐのＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２又は５×１０¹⁰ｖｐのＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ３ベクターを注射した。未処置のマウスはネガティブコントロールとして働いた。１４日後にマウスを出血させ、ＰＢＭＣを、ＨＢＶ挿入断片に対応するペプチドプールに応答してＩＦＮ－γを産生するＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度について調べた。

ＡｄＣ７初回接種／ＡｄＣ６ブースター接種の免疫原性
マウスを４週間後に出血させ、ＰＢＭＣを、挿入断片に関するペプチドに応答してＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－αを産生するＣＤ８⁺Ｔ細胞についてＩＣＳによって再度調べた。初回接種後２か月で、マウスを同一の挿入断片を発現する同一の用量の異種ベクターでブースター接種した。２か月後にＩＣＳによりＰＢＭＣを調べ、ブースター接種前後のＣＤ８⁺及びＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を比較した。初回接種後、ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２ベクターは、ＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－αを産生するロバストな頻度のＣＤ８⁺Ｔ細胞を誘導した。頻度はＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２ブースター接種後に上昇し、これは低用量のベクター後及びＩＦＮ－γを産生するＣＤ８⁺Ｔ細胞について特に明白だった。ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ３ベクターの免疫原性は不充分だったが、ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３ブースター接種後のＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は陽性になった。同様に、初回接種後のＣＤ４＋Ｔ細胞応答はわずかだったが、ブースター接種後増加した。ＨＢＶ２又はＨＢＶ３挿入断片に対するＣＤ４応答には顕著な差はなかった。
結論
・ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２及びＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２の両ベクターは、高度に免疫原性だったが（図２２Ａ、図２２Ｂ、及び図２３）、同一の挿入断片を発現する異種ＡｄＣベクターによるブースター接種後、応答は上昇した（図２４）。
・ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２及びＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ３ベクターは、使用されている四量体に対応するエピトープを欠如するので、これらの設計と一致する境界線の免疫原性を呈した（図２２Ａ及び図２３）。
・ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２をＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２でブースター接種すると、ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答が強化される。

ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ、ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２、ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３、又はＡｄＣ６－ＨＢＶ２ ＡＡＶ－で感染したマウスのＨＢＶ ＤＮＡウイルス力価の比較
方法
５グループのＣ５７Ｂｌ／６マウスに１×１０⁹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを曝露し、４週間後１×１０¹⁰ｖｐのいずれかのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ（ｎ＝１０）、ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２（ｎ＝１０）、ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３（ｎ＝１０）、又はｇＤなしのＡｄＣ６－ＨＢＶ２（ｎ＝１０）をワクチン接種し、ＡＡＶで感染し、ワクチン接種していない動物（「未処置」）（ｎ＝１０）及びＡＡＶで感染しておらず、ワクチン接種していない動物（ｎ＝２－５）はコントロールとして働いた。ＡＡＶ注射後４週間でウイルス力価を調べ（ワクチン接種前）、ワクチン接種後４週間のレベルと比較した（ＡＡＶ注射後８週目）。

結果
８週目に、ＨＢＶウイルス力価の中央値はそれぞれ、未処置のマウスで０．９８ ｌｏｇ₁₀ ｃｐｓ／ｍＬ上昇し、ＡｄＣ６－ＨＢＶ２でワクチン接種したマウスで未変化のままであり、ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３、ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ及びＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２でワクチン接種した動物では－０．０４、－１．０９及び－２．１３ ｌｏｇ₁₀ ｃｐｓ／ｍＬ減少した（図２５Ａ）。個別のマウスの結果を図２５Ｂに示し、全てのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ及びＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２でワクチン接種した動物はそれぞれ、１ ｌｏｇ₁₀ ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬより大きく、２ ｌｏｇ₁₀ ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬより大きく減少したが、対照的に、未処置、ＡｄＣ６－ＨＢＶ２又はＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３でワクチン接種した動物は８週目に１ ｌｏｇ₁₀ ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以上減少した。

ｇＤＨＢＶ２及びｇＤＨＢＶ３の免疫原性試験
単回初回接種注射又は同一の挿入断片を含む異種ベクターによるブースターワクチン接種が後に続く初回接種後にｇＤＨＢＶ２又はｇＤＨＢＶ３のいずれかに含まれるＨＢＶコア及びポリメラーゼのセグメントに対するＣＤ８⁺Ｔ細胞応答及びその幅を評価した。

実験１
目的―Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの異種チンパンジーアデノウイルスベクター（ＡｄＣ６及びＡｄＣ７）によって発現されるｇＤ－ＨＢＶ２及びｇＤ－ＨＢＶ３での初回接種及びブースターワクチン接種後のＩＦＮ－γ⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を評価する。

方法：５匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスの４個のグループを以下のように、（ａ）５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２、２か月後に５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２；（ｂ）５×１０⁹ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２、２か月後に５×１０⁹ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２；（ｃ）５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ３、２か月後に５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３；又は（ｄ）ワクチン接種しない、筋肉内注射により免疫化した。初回接種の２週間後及び６週間後、ブースター接種前、及びブースター接種の２週間後及び４週間後に血液のＩＦＮ－γ⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答をＩＣＳにより評価した。

結果：調べた全ての時点で各ワクチン構築物がＩＦＮ－γ⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞を誘導することが分かった。図２６は、親のＩＦＮ－γ及び／又はＴＮＦ－α産生ＣＤ８⁺Ｔ細胞（図２６Ａ）、ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２６Ｂ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２６Ｃ）又はＣＤ４４＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２６Ｄ）の割合を示す。初回接種後２週間及び８週間、並びにブースター接種後２週間及び４週間の、個別のマウスのＰＢＭＣ由来のＩＣＳによって評価された免疫応答の平均を示す。

実験２
目的―Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの異種チンパンジーアデノウイルスベクター（ＡｄＣ６及びＡｄＣ７）を使用して異なる用量のｇＤ－ＨＢＶ２及びｇＤ－ＨＢＶ３での初回接種及びブースターワクチン接種後のＩＦＮ－γ⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答をｇＤ－ＰｏｌＮでのものと比較する。

方法：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスのグループ（ｎ＝５マウス／グループ）を、以下のように、
ｇＤＰｏｌＮグループ
（ａ）５×１０⁹ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ、３か月後５×１０⁹ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮ、及び（ｂ）５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ、３か月後５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＰｏｌＮ
ｇＤＨＢＶ２グループ
（ｃ）５×１０⁹ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２、３か月後５×１０⁹ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２、及び
（ｄ）５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２、３か月後５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２
ｇＤＨＢＶ３グループ
（ｅ）５×１０⁹ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３、３か月後５×１０⁹ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ３、及び
（ｆ）５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３、３か月後５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ３
処置無しはコントロールとして働いた。
のように免疫化した。

全ての処置グループについて、免疫原性ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、初回接種後２週間及び６週間、ブースター接種前及びブースター接種後２週間及び６週間のＩＦＮ－γ⁺についてＩＣＳによって評価した。免疫原性をまた、初回接種後４週間で、ＨＢＶポリメラーゼのアミノ酸３９６～４０４ ＦＡＶＰＮＬＱＳＬ（ペプチド５５）に対応するＡＰＣ標識ＭＨＣクラスＩ四量体（ＮＩＨ ｔｅｔｒａｍｅｒ Ｆａｃｉｌｉｔｙ， Ｅｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ａｔｌａｎｔａ ＧＡ）を使用する四量体染色により評価した。ＨＢＶ３は、ＦＡＶＰＮＬＱＳＬペプチドを含まない。

結果：全ての時点で、調べた各ワクチンは、ＩＦＮ－γ⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞を誘導することが分かった。ｇＤＨＢＶ２ワクチンで得られた結果は、ｇＤＰｏｌＮワクチンで得られたものと類似し、ｇＤＨＢＶ３ワクチンはあまり免疫原性でなかった。四量体染色時に、特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の頻度は２個のワクチンの間で同等であり、多くの活性化マーカーは、ｇＤＨＢＶ２免疫化グループ由来の四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞上でより高度に発現される傾向があった。図２７は、複数の時点、初回接種後４週間（図２７Ａ）、ブースター接種後２週間（図２７Ｂ）、及びブースター接種後４週間（図２７Ｃ）でのＣＤ８⁺Ｔ細胞を示す。グラフは、ＩＣＳによって評価されるＩＦＮ－γ⁺を産生するＣＤ８⁺Ｔ細胞の全体の頻度を示す。

図２８は、複数の時点、初回接種後４週間（図２８Ａ）、ブースター接種後２週間（図２８Ｂ）、及びブースター接種後４週間（図２８Ｃ）でのＩＣＳによって評価されたサイトカイン産生ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。破線は、未処置のマウスからの結果に基づく陽性応答のカットオフを示す。

図２９は、初回接種後４週間でのＣＤ８＋Ｔ細胞（図２９Ａ）又はＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２９Ｂ）のいずれか上にゲート制御された四量体染色の結果を示す。

図３０は、示された抗体、図３０Ａ ＢＶ６０５に結合した抗ＰＤ１抗体；図３０Ｂ ＢＶ６５０に結合した抗ＬＡＧ３抗体；図３０Ｃ Ｐｅ－Ｃｙ７－Ａに結合した抗ＴＩＭ３抗体；図３０Ｄ ＰＥ－Ａに結合した抗ＣＴＬＡ４抗体；図３０Ｅ ＡＦ４８８に結合した抗ＥＯＭＥＳ抗体；及び図３０Ｆ ＢＶ７８６に結合した抗Ｔ－ｂｅｔ抗体に結合する色素の平均蛍光強度として示される四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型を示す。

実験３
ワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスのプールした脾細胞から応答の幅を評価し、これをＨＢＶワクチン挿入断片に存在する個別のペプチドに対してＩＣＳにより調べた。

方法：５匹のＣ５７Ｂｌ／６マウスの４個のグループを以下のように、（ａ）５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２、２か月後５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２；（ｂ）５×１０⁹ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２、２か月後５×１０⁹ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２；（ｃ）５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ３、２か月後５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３；又は（３）ワクチン無し、を筋肉内注射により免疫化した。ブースター接種後８週目に動物を屠殺し、プールした脾細胞の個別のＨＢＶ２又はＨＢＶ３ペプチドに対するＩＦＮ－γ⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答をＩＣＳによって評価した（陽性応答のカットオフを０．１％に設定した）。

結果：用量とは独立して、ｇＤＨＢＶ２ワクチンによるプライムブースト計画は、コア及びポリメラーゼ内のいくつかのエピトープに対する応答を誘導した。図３１は、５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２の初回ワクチン接種及びその２か月後の５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２によるワクチン接種後のＣＤ８⁺Ｔ細胞応答を示す。Ｘ軸の数は、本明細書に提供される配列番号に対応する。図３２は、５×１０⁹ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２の初回ワクチン接種及びその２か月後の５×１０⁹ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２によるワクチン接種後のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。Ｘ軸の数は、本明細書に提供される配列番号に対応する。図３３は、５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ３の初回ワクチン接種及びその２か月後の５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３によるワクチン接種後の免疫原性を示す。Ｘ軸の数は、本明細書に提供される配列番号に対応する。

実験４
ワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウスのプールした脾細胞から応答の幅を評価し、これをＨＢＶ挿入断片に存在する個別のペプチドに対してＩＣＳにより調べた。

方法：５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの５個のグループを以下のように、（ａ）５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２；（ｂ）５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３；（ｃ）５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２；（ｄ）５×１０¹⁰ｖｐ ＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ３；又は（ｅ）ワクチン無し、を筋肉内注射により免疫化した。ワクチン接種後１２週目に動物を屠殺し、脾臓を収集し、プールした脾細胞の個別のＨＢＶ２又はＨＢＶ３ペプチドに対するＩＦＮ－γ⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答をＩＣＳによって評価した（陽性応答のカットオフを０．１％に設定した）。

結果：１２週目で、各ワクチン構築物は、ワクチンによって送達されたコア及びポリメラーゼ遺伝子の複数の領域にわたり免疫原性であることが分かった。図３４は、本明細書に提供される配列番号（Ｘ軸）に対応するＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２及びＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ２ワクチンの免疫原性を示す。両ＨＢＶ２構築物のＣｏｒｅ，ＰｏｌＣ、及びＰｏｌＮ領域は、免疫原性だった。図３５は、本明細書に提供される配列番号（Ｘ軸）に対応するＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３及びＡｄＣ７－ｇＤＨＢＶ３ワクチンの免疫原性を示す。両ＨＢＶ３構築物のＣｏｒｅ、ＰｏｌＣ及びＰｏｌＮ領域は、免疫原性だった。

実験５
方法：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの５個のグループに１×１０⁹ｖｇのＡＡＶ８－１．３ＨＢＶを曝露し、４週間後に１×１０¹⁰ｖｐのいずれかのＡｄＣ６－ｇＤＰｏｌＮ（ｎ＝１０）、ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ２（ｎ＝１０）、ＡｄＣ６－ｇＤＨＢＶ３（ｎ＝１０）、又はｇＤ無しのＡｄＣ６－ＨＢＶ２（ｎ＝１０）でワクチン接種し、ＡＡＶで感染させ、ワクチン接種していない動物（ｎ＝１０）及びＡＡＶで感染させておらず、ワクチン接種していない動物（ｎ＝２～５）は、コントロールとして働いた。注射後の様々な時点でマウスを出血させ、挿入断片特異的なＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を、ＩＦＮ－γに対する細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により決定し、ＰＣＲを初回ワクチン接種後２週目、６周目、及び８週目に実行し、Ｔ細胞アッセイを初回ワクチン接種後４週目に実行した。

初回ワクチン接種後８週目に、マウスを初回ワクチン接種で使用した同一の抗原挿入断片を含むＡｄＣ７ベクターでブースター接種し（「ブースターワクチン接種」）、ワクチン接種後の様々な時点で以前記述したように血液及び血清のＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞を調べた。ＰＣＲをブースターワクチン接種後２週目、６週目、及び１０週目に実行し、Ｔ細胞アッセイをブースターワクチン接種後４週目、及び１２週目に実行した。

当業者は、数値的変化及び変形を本発明の好ましい実施形態に対してなすことができ、このような変化及び変形を、本発明の精神から逸脱することなくなすことができることを理解するだろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神及び範囲に含まれるような全ての等価な変化に及ぶことが意図される。

本文書に引用される又は記載される各特許、特許出願、及び特許公開の開示は、その全体を参照により本明細書中にこれにより援用される。

実施形態
以下の実施形態のリストは、以前の記述を置き換える又は取り換えるより補足することを意図される。
実施形態１．配列番号６のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質。
実施形態２．この免疫原性断片は、配列番号２０～５４のいずれか１つを含む、実施形態１に記載のＨＢＶコアタンパク質。
実施形態３．配列番号１８０のアミノ酸配列若しくはその免疫原性断片、又は配列番号１８３のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）コアタンパク質。
実施形態４．実施形態１～３のいずれか１つに記載のＨＢＶコアタンパク質をコードする核酸分子。
実施形態５．この核酸分子は配列番号７の核酸配列を含む、実施形態４に記載の核酸分子。
実施形態６．実施形態４又は５に記載の核酸分子を含むベクター。
実施形態７．このベクターはアデノウイルスベクターである、実施形態６に記載のベクター。
実施形態８．このアデノウイルスベクターは、ＡｄＣ６ベクター又はＡｄＣ７ベクターである、実施形態７に記載のベクター。
実施形態９．実施形態６～８のいずれか１つに記載のベクターを含むワクチン。
実施形態１０．配列番号８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン。
実施形態１１．この免疫原性断片は、配列番号５５～１１３のいずれか１つを含む、実施形態１０に記載のＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン。
実施形態１２．配列番号１７８のアミノ酸配列若しくはその免疫原性断片、又は配列番号１８１のアミノ酸配列若しくはその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン。
実施形態１３．配列番号１０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン。
実施形態１４．この免疫原性断片は、配列番号１１４～１７２のいずれか１つを含む、実施形態１３に記載のＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン。
実施形態１５．配列番号１７９のアミノ酸配列若しくはその免疫原性断片、又は配列番号１８２のアミノ酸配列若しくはその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン。
実施形態１６．実施形態１０～１５のいずれか１つに記載のＨＢＶポリメラーゼをコードする核酸分子。
実施形態１７．この核酸分子は、配列番号９の核酸配列を含む、実施形態１６に記載の核酸分子。
実施形態１８．この核酸分子は、配列番号１１の核酸配列を含む、実施形態１６に記載の核酸分子。
実施形態１９．実施形態１６～１８のいずれか１つの核酸分子を含むベクター。
実施形態２０．このベクターは、アデノウイルスベクターである、実施形態１９に記載のベクター。
実施形態２１．このアデノウイルスベクターは、ＡｄＣ６ベクター又はＡｄＣ７ベクターである、実施形態２０に記載のベクター。
実施形態２２．実施形態１９～２１のいずれか１つのベクターを含むワクチン。
実施形態２３．
１つ又は複数の、配列番号６のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質、配列番号８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、及び配列番号１０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメインを含む融合タンパク質。
実施形態２４．
（１）配列番号６のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、
（２）１つ又は複数の配列番号２０～５４（配列番号６の免疫原性断片）及び１つ又は複数の配列番号５５～１１３（配列番号８の免疫原性断片）、
（３）配列番号６のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質及び配列番号１０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、
（４）１つ又は複数の配列番号２０～５４（配列番号６の免疫原性断片）及び１つ又は複数の配列番号１１４～１７２（配列番号１０の免疫原性断片）、
（５）配列番号８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、
（６）１つ又は複数の配列番号５５～１１３（配列番号８の免疫原性断片）及び１つ又は複数の配列番号１１４～１７２（配列番号１０の免疫原性断片）、
（７）配列番号６のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質、配列番号８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、及び配列番号１０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、又は
（８）１つ又は複数の配列番号２０～５４（配列番号６の免疫原性断片）、１つ又は複数の配列番号５５～１１３（配列番号８の免疫原性断片）、及び１つ又は複数の配列番号１１４～１７２（配列番号１０の免疫原性断片）
を含む、実施形態２３に記載の融合タンパク質。
実施形態２５．配列番号１７８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、配列番号１７９のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、及び配列番号１８０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質を含む、融合タンパク質。
実施形態２６．配列番号１７４のアミノ酸配列を含む、実施形態２５に記載の融合タンパク質。
実施形態２７．配列番号１８１のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、配列番号１８２のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、及び配列番号１８３のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質を含む融合タンパク質。
実施形態２８．配列番号１７５のアミノ酸配列を含む、実施形態２７に記載の融合タンパク質。
実施形態２９．Ｎ末端単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質（ｇＤ）配列又はその変異体、
配列番号６のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質、及び
Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体を含む、融合タンパク質。
実施形態３０．この免疫原性断片は、配列番号２０～５４のいずれか１つを含む、実施形態２９に記載の融合タンパク質。
実施形態３１．Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体、
配列番号８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、及び
Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列又はその変異体を含む、融合タンパク質。
実施形態３２．この免疫原性断片は、配列番号５５～１１３のいずれか１つを含む、実施形態３１に記載の融合タンパク質。
実施形態３３．Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体、
配列番号１０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、及び
Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列又はその変異体
を含む融合タンパク質。
実施形態３４．この免疫原性断片は、配列番号１１４～１７２のいずれか１つを含む、実施形態３３の記載の融合タンパク質。
実施形態３５．Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体、
（１）配列番号６のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質及び配列番号８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、
（２）１つ又は複数の配列番号２０～５４（配列番号６の免疫原性断片）及び１つ又は複数の配列番号５５～１１３（配列番号８の免疫原性断片）、
（３）配列番号６のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質及び配列番号１０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、
（４）１つ又は複数の配列番号２０～５４（配列番号６の免疫原性断片）及び１つ又は複数の配列番号１１４～１７２（配列番号１０の免疫原性断片）、
（５）配列番号８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン及び配列番号１０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、
（６）１つ又は複数の配列番号５５～１１３（配列番号８の免疫原性断片）及び１つ又は複数の配列番号１１４～１７２（配列番号１０の免疫原性断片）、
（７）配列番号６のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質、配列番号８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、及び配列番号１０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、又は
（８）１つ又は複数の配列番号２０～５４（配列番号６の免疫原性断片）、１つ又は複数の配列番号５５～１１３（配列番号８の免疫原性断片）、及び１つ又は複数の配列番号１１４～１７２（配列番号１０の免疫原性断片）、を含むＨＢＶ配列、及び
Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列又はその変異体
を含む融合タンパク質。
実施形態３６．Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体、
配列番号１８０のアミノ酸配列若しくはその免疫原性断片、又は配列番号１８３のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質、及び
Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体を含む融合タンパク質。
実施形態３７．Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体、
配列番号１７８のアミノ酸配列若しくはその免疫原性断片、又は配列番号１８１のアミノ酸配列若しくはその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、及び
Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列又はその変異体を含む融合タンパク質。
実施形態３８．Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体、
配列番号１７９のアミノ酸配列若しくはその免疫原性断片、又は配列番号１８２のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、及び
Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列又はその変異体を含む融合タンパク質。
実施形態３９．
Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体、
（１）配列番号１７８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、配列番号１７９のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、及び配列番号１８０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質、又は
（２）配列番号１８１のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、配列番号１８２のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、及び配列番号１８３のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質
を含むＨＢＶ配列、及び
Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列又はその変異体を含む融合タンパク質。
実施形態４０．このＨＢＶ配列は、配列番号１７８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、配列番号１７９のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、及び配列番号１８０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質を含む、実施形態３９に記載の融合タンパク質。
実施形態４１．このＨＢＶ配列は、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む、実施形態４０に記載の融合タンパク質。
実施形態４２．このＨＢＶ配列は、配列番号１８１のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、配列番号１８２のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、及び配列番号１８３のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質を含む、実施形態３９に記載の融合タンパク質。
実施形態４３．ＨＢＶ配列は、配列番号１７５のアミノ酸配列を含む、実施形態４２に記載の融合タンパク質。
実施形態４４．このＮ末端ＨＳＶ ｇＤ配列は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、実施形態２９～４３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態４５．Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列は、配列番号１２のアミノ酸残基２６～２６９を含む、実施形態２９～４３のいずれか１つを含む融合タンパク質。
実施形態４６．Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤ配列は、ＨＳＶ ｇＤの膜貫通ドメインを含む、実施形態２９～４５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態４７．Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤ配列は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、実施形態２９～４６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態４８．この融合タンパク質は、配列番号１４若しくはその免疫原性断片、配列番号１６若しくはその免疫原性断片、又は配列番号１８若しくはその免疫原性断片のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施形態２９～４７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態４９．この融合タンパク質は、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む、実施形態３９～４７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態５０．この融合タンパク質は、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む、実施形態３９～４７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
実施形態５１．実施形態２３～５０のいずれか１つに記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
実施形態５２．この核酸分子は、配列番号１５、１７、又は１９のいずれか１つに記載の核酸配列を含む、実施形態５１に記載の核酸分子。
実施形態５３．この核酸分子は、配列番号１７６の核酸配列を含む、実施形態５１に記載の核酸分子。
実施形態５４．この核酸分子は、配列番号１７７の核酸配列を含む、実施形態５１に記載の核酸分子。
実施形態５５．この核酸分子は、配列番号１８４の核酸配列を含む、実施形態５１に記載の核酸分子。
実施形態５６．この核酸分子は、配列番号１８６の核酸配列を含む、実施形態５１に記載の核酸分子。
実施形態５７．実施形態５１～５６のいずれか１つに記載の核酸分子を含むベクター。
実施形態５８．このベクターは、アデノウイルスベクターである、実施形態５７に記載のベクター。
実施形態５９．このアデノウイルスベクターは、ＡｄＣ６ベクター又はＡｄＣ７ベクターである、実施形態５８に記載のベクター。
実施形態６０．実施形態５７～５９のいずれか１つに記載のベクターを含むワクチン。
実施形態６１．被験体にＨＢＶに対する免疫応答を誘導する方法であって、この方法は、この被験体に有効量の実施形態２３～５０のいずれか１つに記載の融合タンパク質、実施形態５１～５６のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態５７～５９のいずれか１つに記載のベクター、又は実施形態６０に記載のワクチンを提供して、これによりＨＢＶに対する免疫応答を誘導することを含む、方法。
実施形態６２．このワクチンは、配列番号１４、１６、又は１８のいずれか１つのアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ６ベクターを含む、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６３．この被験体に、ＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供することに続けて、配列番号１４、１６、又は１８のいずれか１つのアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供することをさらに含む、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４．このワクチンは、配列番号１４、１６、又は１８のいずれか１つのアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ７ベクターを含む、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６５．この被験体に、ＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供することに続けて、配列番号１４、１６、又は１８のいずれか１つのアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供することをさらに含む、実施形態６４に記載の方法。
実施形態６６．このワクチンは、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ６ベクターを含む、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６７．この被験体に、このＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供することに続けて、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供することをさらに含む、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８．このワクチンは、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ７ベクターを含む、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６９．この被験体に、このＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供することに続けて、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供することをさらに含む、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７０．このワクチンは、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ６ベクターを含む、実施形態６１に記載の方法。
実施形態７１．この被験体に、このＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供することに続けて、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供することをさらに含む、実施形態７０に記載の方法。
実施形態７２．このワクチンは、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ７ベクターを含む、実施形態６１に記載の方法。
実施形態７３．この被験体に、このＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供することに続けて、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供することをさらに含む、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７４． 配列番号１４、１６、１８、１８５、若しくは１８７のいずれか１つのアミノ酸配列又はその免疫原性断片は、Ｎ末端の２５個のアミノ酸シグナルペプチドを含まない、実施形態６１～７３のいずれか１つに記載の方法。

Claims (23)

1. 配列番号１７８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、配列番号１７９のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、及び配列番号１８０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質を含む、融合タンパク質。
2. 配列番号１７４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列若しくはその変異体、Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列若しくはその変異体、又は両方をさらに含む、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
4. Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列又はその変異体、
   配列番号１７８のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＮ末端ドメイン、配列番号１７９のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶポリメラーゼＣ末端ドメイン、及び配列番号１８０のアミノ酸配列又はその免疫原性断片を含むＨＢＶコアタンパク質を含むＨＢＶ配列、及び
   Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤタンパク質配列又はその変異体を含む、
   請求項３に記載の融合タンパク質。
5. 前記ＨＢＶ配列は、配列番号１７４のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
6. 前記Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項３～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
7. 前記Ｎ末端ＨＳＶ ｇＤ配列は、配列番号１２のアミノ酸残基２６～２６９を含む、請求項３～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
8. 前記Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤ配列は、ＨＳＶ ｇＤの膜貫通ドメインを含む、請求項３～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
9. 前記Ｃ末端ＨＳＶ ｇＤ配列は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、請求項３～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
10. 前記融合タンパク質は、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む、請求項３～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
12. 前記核酸分子は、配列番号１７６の核酸配列を含む、請求項１１に記載の核酸分子。
13. 前記核酸分子は、配列番号１８４の核酸配列を含む、請求項１１に記載の核酸分子。
14. 請求項１１～１３のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
15. 前記ベクターは、アデノウイルスベクターである、請求項１４に記載のベクター。
16. 前記アデノウイルスベクターは、ＡｄＣ６ベクター又はＡｄＣ７ベクターである、請求項１５に記載のベクター。
17. 請求項１４～１６のいずれか一項に記載のベクターを含むワクチン。
18. 被験体のＨＢＶに対する免疫応答を誘導する方法であって、前記方法は、前記被験体に有効量の請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項１７に記載のワクチンを提供してそれによりＨＢＶに対する免疫応答を誘導することを含む、方法。
19. 前記ワクチンは、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ６ベクターを含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記被験体に、前記ＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供した後に、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記ワクチンは、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ７ベクターを含む、請求項１８に記載の方法。
22. 前記被験体に、ＡｄＣ７ベクターを含むワクチンを提供した後に、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含むＡｄＣ６ベクターを含むワクチンを提供することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
23. 配列番号１８５のアミノ酸配列又はその免疫原性断片は、Ｎ末端の２５個のアミノ酸シグナルペプチドを含まない、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。

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