CN114340661A - Hiv抗原和mhc复合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开了包含抗原编码核酸序列和/或抗原肽的组合物。还公开了与所述组合物相关的核苷酸、细胞和方法，包括它们作为针对感染性疾病如HIV的疫苗的用途。

Description

HIV抗原和MHC复合物
交叉参考
本申请要求2019年7月2日提交的美国临时专利申请第62/869,877号和2020年5月26日提交的美国临时专利申请第63/029,981号的权益和优先权，所述临时专利申请的全部公开内容特此出于所有目的通过引用整体并入。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式以电子方式提交并特此通过引用整体并入。所述ASCII副本创建于2020年6月29日，命名为GSO-034WO_SL.txt并且大小为5,642,000字节。
背景技术
感染性疾病，例如人类免疫缺陷病毒(HIV)，仍然难以预防、治疗和/或治愈。治疗性疫苗很有前景，但对于例如HIV的疾病，它们尚未达到治疗功效，因此它们可用作人群的治疗或预防性疫苗。
疫苗设计的一个问题是如何鉴定和包括用于引发抗HIV响应的“最佳”治疗性抗原。用于鉴定和预测抗原呈递的现有方法仅实现了低阳性预测值(PPV)并成为疫苗设计的重大障碍。如果疫苗是使用低PPV的预测设计的，则大多数患者不太可能接受治疗性抗原，而更少的患者仍可能接受超过一种(即使假设所有呈递的肽都是免疫原性的)。因此，用当前方法进行抗原疫苗接种不太可能成功预防感染性疾病的感染。
除了当前抗原预测方法的挑战之外，可用于人类抗原递送的可用载体系统也存在某些挑战，其中许多来源于人类。例如，由于先前的自然暴露，许多人对人类病毒具有预先存在的免疫性，并且这种免疫性可能是使用重组人类病毒进行抗原递送以治疗感染性疾病的主要障碍。
发明内容
本文公开了一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述抗原表达系统包含：载体骨架，所述载体骨架包含：黑猩猩腺病毒载体，任选地其中所述黑猩猩腺病毒载体是ChAdV68载体，或甲病毒载体，任选地其中所述甲病毒载体是委内瑞拉马脑炎(Venezuelanequine encephalitis)病毒载体，所述载体骨架包含至少一种HIV MHC I类抗原编码核酸序列，所述核酸序列包含MHC I类表位编码核酸序列，任选地其中所述MHC I类表位编码核酸序列编码MHC I类表位，其包含至少一种选自由SEQ ID NO:325-22349所示序列组成的组的HIV表位。在各种实施方案中，所述至少一种HIV表位选自由SEQ ID NO:4113、4114、4115、4427、4439、4494、4495、4545、4561、4956、4968、4975、4982、5259、5261、5459、5460、5610、5643和5661所示序列组成的组。在各种实施方案中，所述抗原表达系统包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID No:325-22349所示序列组成的组的HIV表位。在各种实施方案中，每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种HIV表位，所述HIV表位选自由SEQ ID NO:4113、4114、4115、4427、4439、4494、4495、4545、4561、4956、4968、4975、4982、5259、5261、5459、5460、5610、5643和5661所示序列组成的组。
本文另外公开了一种用于递送一种或多种抗原的组合物，所述组合物包含一种或多种HIV MHC I类抗原或一种或多种编码一种或多种HIV MHC I类抗原的核酸序列，每种HIV MHC I类抗原包含MHC I类表位，所述表位包含至少一种选自由SEQ ID No:325-22349所示序列组成的组的HIV表位。在各种实施方案中，所述至少一种HIV表位选自由SEQ IDNO:4113、4114、4115、4427、4439、4494、4495、4545、4561、4956、4968、4975、4982、5259、5261、5459、5460、5610、5643和5661所示序列组成的组。在各种实施方案中，所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种HIV MHC I类抗原，其中每种HIV MHC I类抗原包含MHC I类表位，所述表位包含至少一种选自由SEQ ID No:325-22349所示序列组成的组的HIV表位。在各种实施方案中，每种HIV MHC I类抗原包含MHC I类表位，所述表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:4113、4114、4115、4427、4439、4494、4495、4545、4561、4956、4968、4975、4982、5259、5261、5459、5460、5610、5643和5661所示序列组成的组的HIV表位。
在各种实施方案中，通过执行以下步骤来选择MHC I类表位：(a)获得外显子组、转录组或全基因组核苷酸测序中的至少一者，其中所述核苷酸测序数据用于获得代表抗原集合中的每一者的肽序列的数据；(b)将每个抗原的所述肽序列输入到呈递模型中，以产生所述抗原中的每一者由MHC蛋白中的一者或多者呈递的数值可能性集合，所述数值可能性集合已至少基于所接收的质谱数据进行鉴定；以及(c)基于所述数值可能性集合选择所述抗原集合的子集以产生经选择抗原集合，所述经选择抗原用于产生所述MHC I类表位。
本文另外公开了一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(a)载体骨架，其中所述骨架包含：(i)至少一种启动子核苷酸序列，和(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：(i)至少一种抗原编码核酸序列，其包含：(I)至少一种HIV MHC I类抗原编码核酸序列，包含：(A)MHC I类表位编码核酸序列，其中所述MHC I类表位编码核酸序列编码MHC I类表位，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID No:325-22349所示序列组成的组的HIV表位，(B)任选地，5'接头序列，和(C)任选地，3'接头序列；(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:57)氨基酸接头序列的核酸序列；和(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
本文另外公开了一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(a)载体骨架，其中所述骨架包含：(i)至少一种启动子核苷酸序列，和(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：(i)至少一种抗原编码核酸序列，其包含：(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:325-2165所示序列组成的组的HIV表位，其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；(A)任选地，5'接头序列，和(B)任选地，3'接头序列；(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:58)氨基酸接头序列的核酸序列；和(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
本文另外公开了一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(a)载体骨架，其中所述骨架包含：(i)至少一种启动子核苷酸序列，和(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：(i)至少一种抗原编码核酸序列，其包含：(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:2166-4106所示序列组成的组的HIV表位，其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；(A)任选地，5'接头序列，和(B)任选地，3'接头序列；(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:59)氨基酸接头序列的核酸序列；和(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
本文另外公开了一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(a)载体骨架，其中所述骨架包含：(i)至少一种启动子核苷酸序列，和(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：(i)至少一种抗原编码核酸序列，其包含：(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:4107-6241所示序列组成的组的HIV表位，其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；(A)任选地，5'接头序列，和(B)任选地，3'接头序列；(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:60)氨基酸接头序列的核酸序列；和(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
本文另外公开了一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(a)载体骨架，其中所述骨架包含：(i)至少一种启动子核苷酸序列，和(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：(i)至少一种抗原编码核酸序列，其包含：(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:6242-8389所示序列组成的组的HIV表位，其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；(A)任选地，5'接头序列，和(B)任选地，3'接头序列；(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:61)氨基酸接头序列的核酸序列；和(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
本文另外公开了一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(a)载体骨架，其中所述骨架包含：(i)至少一种启动子核苷酸序列，和(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：(i)至少一种抗原编码核酸序列，其包含：(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:8930-10626所示序列组成的组的HIV表位，其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；(A)任选地，5'接头序列，和(B)任选地，3'接头序列；(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:62)氨基酸接头序列的核酸序列；和(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(a)载体骨架，其中所述骨架包含：(i)至少一种启动子核苷酸序列，和(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：(i)至少一种抗原编码核酸序列，其包含：(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQID NO:10627-12810所示序列组成的组的HIV表位，其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；(A)任选地，5'接头序列，和(B)任选地，3'接头序列；(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:63)氨基酸接头序列的核酸序列；和(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
本文另外公开了一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(a)载体骨架，其中所述骨架包含：(i)至少一种启动子核苷酸序列，和(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：(i)至少一种抗原编码核酸序列，其包含：(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:12811-15079所示序列组成的组的HIV表位，其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；(A)任选地，5'接头序列，和(B)任选地，3'接头序列；(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:64)氨基酸接头序列的核酸序列；和(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
本文另外公开了一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(a)载体骨架，其中所述骨架包含：(i)至少一种启动子核苷酸序列，和(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：(i)至少一种抗原编码核酸序列，其包含：(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:15080-17174所示序列组成的组的HIV表位，其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；(A)任选地，5'接头序列，和(B)任选地，3'接头序列；(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:65)氨基酸接头序列的核酸序列；和(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
本文另外公开了一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(a)载体骨架，其中所述骨架包含：(i)至少一种启动子核苷酸序列，和(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：(i)至少一种抗原编码核酸序列，其包含：(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:17175-19388所示序列组成的组的HIV表位，其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；(A)任选地，5'接头序列，和(B)任选地，3'接头序列；(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:66)氨基酸接头序列的核酸序列；和(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
本文另外公开了一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(a)载体骨架，其中所述骨架包含：(i)至少一种启动子核苷酸序列，和(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：(i)至少一种抗原编码核酸序列，其包含：(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:19389-21003所示序列组成的组的HIV表位，其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；(A)任选地，5'接头序列，和(B)任选地，3'接头序列；(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:67)氨基酸接头序列的核酸序列；和(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
本文另外公开了一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(a)载体骨架，其中所述骨架包含：(i)至少一种启动子核苷酸序列，和(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：(i)至少一种抗原编码核酸序列，其包含：(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:21004-22349所示序列组成的组的HIV表位，其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；(A)任选地，5'接头序列，和(B)任选地，3'接头序列；(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:68)氨基酸接头序列的核酸序列；和(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
本文另外公开了一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：(a)载体骨架，其中所述载体骨架包含(i)黑猩猩腺病毒载体，任选地其中所述黑猩猩腺病毒载体是ChAdV68载体，或甲病毒载体，任选地其中所述甲病毒载体是委内瑞拉马脑炎病毒载体，和(ii)26S启动子核苷酸序列，和(iii)聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及(b)整合在所述26S启动子核苷酸序列和所述poly(A)序列之间的抗原盒，其中所述抗原盒包含：(i)至少一种抗原编码核酸序列，其包含：(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，并且其各自包含：(A)MHC I类表位编码核酸序列，其中所述MHC I类表位编码核酸序列编码长度为7-15个氨基酸的MHC I类表位，并且其中所述MHC I类表位中的至少一者选自由SEQ ID No:325-22349中的任一者的表位序列组成的组，(B)5'接头序列，其中所述5'接头序列编码所述MHC I类表位的原生N末端氨基酸序列，并且其中所述5'接头序列编码长度为至少3个氨基酸的肽，(C)3'接头序列，其中所述3'接头序列编码所述MHC I类表位的原生C末端酸序列，并且其中所述3'接头序列编码长度为至少3个氨基酸的肽，并且其中所述抗原盒与所述26S启动子核苷酸序列可操作地连接，其中每个MHC I类抗原编码核酸序列编码长度介于13个和25个之间的氨基酸的多肽，并且其中每个MHC I类抗原编码核酸序列的每个3'端连接到除了所述抗原盒中的最后MHC I类抗原编码核酸序列之外的后接MHC I类抗原编码核酸序列的5'端；和(ii)至少两个MHC II类抗原编码核酸序列，其包含：(I)PADRE MHC II类序列，(II)破伤风类毒素MHC II类序列，(III)编码GPGPG(SEQ ID NO:69)氨基酸接头序列的第一核酸序列，所述接头序列连接所述PADRE MHC II类序列与所述破伤风类毒素MHC II类序列，(IV)编码GPGPG(SEQ ID NO:70)氨基酸接头序列的第二核酸序列，所述接头序列连接所述至少两个MHC II类抗原编码核酸序列的5'端与所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列，(V)任选地，在所述至少两个MHC II类抗原编码核酸序列的3'端处编码GPGPG(SEQ ID NO:71)氨基酸接头序列的第三核酸序列。
在各种实施方案中，所述抗原盒的每个元件的有序序列描述于下式，从5'至3'包含Pa-(L5b-Nc-L3d)X-(G5e-Uf)Y-G3g，其中P包含第二启动子核苷酸序列，其中a＝0或1，N包含MHC I类表位编码核酸序列之一，其中c＝1，L5包含5'接头序列，其中b＝0或1，L3包含3'接头序列，其中d＝0或1，G5包含至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:72)氨基酸接头的核酸序列之一，其中e＝0或1，G3包含至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:73)氨基酸接头的核酸序列之一，其中g＝0或1，U包含至少一种MHC II类抗原编码核酸序列之一，其中f＝1，X＝1至400，其中对于每个X，相应的Nc是表位编码核酸序列，并且Y＝0、1或2，其中对于每个Y，相应的Uf是抗原编码核酸序列。
在各种实施方案中，对于每个X，相应的Nc是不同的MHC I类表位编码核酸序列。在各种实施方案中，对于每个Y，相应的Uf是不同的MHC II类抗原编码核酸序列。
在各种实施方案中，a＝0，b＝1，d＝1，e＝1，g＝1，h＝1，X＝20，Y＝2，所述至少一种启动子核苷酸序列是由骨架提供的单个26S启动子核苷酸序列，所述至少一种聚腺苷酸化poly(A)序列是由骨架提供的至少100个连续A核苷酸的poly(A)序列(SEQ ID NO:74)，每个N编码长度为7-15个氨基酸的MHC I类表位，L5是编码MHC I表位的原生N末端氨基酸序列的原生5'接头序列，并且其中所述5'接头序列编码长度为至少3个氨基酸的肽，L3是编码MHC I表位的原生核酸末端酸序列的原生3'接头序列，并且其中所述3'接头序列编码长度为至少3个氨基酸的肽，U是PADRE II类序列和破伤风类毒素MHC II类序列中的每一者，所述载体骨架包含黑猩猩腺病毒载体，任选地其中所述黑猩猩腺病毒载体是ChAdV68载体，或甲病毒载体，任选地其中所述甲病毒载体是委内瑞拉马脑炎病毒载体，并且所述MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者编码长度介于13个和25个之间的氨基酸的多肽。
在各种实施方案中，所述组合物还包含纳米微粒递送媒介物。在各种实施方案中，所述纳米微粒递送媒介物是脂质纳米粒子(LNP)。在各种实施方案中，所述LNP包含可电离氨基脂质。在各种实施方案中，所述可电离氨基脂质包含MC3样(二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯)分子。在各种实施方案中，所述纳米微粒递送媒介物包封抗原表达系统。在各种实施方案中，所述抗原盒整合在至少一种启动子核苷酸序列和至少一种poly(A)序列之间。在各种实施方案中，其中所述至少一种启动子核苷酸序列可操作地连接到所述抗原编码核酸序列。在各种实施方案中，所述一种或多种载体包含一种或多种+链RNA载体。在各种实施方案中，所述一种或多种+链RNA载体包含5'7-甲基鸟苷(m7g)帽。在各种实施方案中，所述一种或多种+链RNA载体是通过体外转录产生的。在各种实施方案中，所述一种或多种载体在哺乳动物细胞内自我复制。在各种实施方案中，所述骨架包含奥拉病毒(Aura virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、委内瑞拉马脑炎病毒、罗斯河病毒(Ross River virus)、塞姆利基森林病毒(Semiliki Forest virus)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)或马雅罗病毒(Mayaro virus)的至少一种核苷酸序列。在各种实施方案中，所述骨架包含委内瑞拉马脑炎病毒的至少一种核苷酸序列。在各种实施方案中，所述骨架至少包含由奥拉病毒、摩根堡病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、罗斯河病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒或马雅罗病毒的核苷酸序列编码的用于非结构蛋白介导的扩增的序列、26S启动子序列、poly(A)序列、非结构蛋白1(nsP1)基因、nsP2基因、nsP3基因和nsP4基因。在各种实施方案中，所述骨架至少包含由奥拉病毒、摩根堡病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、罗斯河病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒或马雅罗病毒的核苷酸序列编码的用于非结构蛋白介导的扩增的序列、26S启动子序列和poly(A)序列。
在各种实施方案中，所述用于非结构蛋白介导的扩增的序列选自由以下组成的组：甲病毒5'UTR、51-nt CSE、24-nt CSE、26S亚基因组启动子序列、19-nt CSE、甲病毒3'UTR或其组合。在各种实施方案中，所述骨架不编码结构性病毒粒子蛋白衣壳E2和E1。在各种实施方案中，所述抗原盒被插入以代替奥拉病毒、摩根堡病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、罗斯河病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒或马雅罗病毒的核苷酸序列内的结构性病毒粒子蛋白。在各种实施方案中，所述委内瑞拉马脑炎病毒包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的序列。在各种实施方案中，所述委内瑞拉马脑炎病毒包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的序列，其还包含碱基对7544和11175之间的缺失。在各种实施方案中，所述骨架包含以SEQID NO:6或SEQ ID NO:7所示的序列。
在各种实施方案中，所述抗原盒被插入在位置7544以代替如SEQ ID NO:3或SEQID NO:5的序列中所示的碱基对7544和11175之间的缺失。在各种实施方案中，所述抗原盒的插入提供了包含nsP1-4基因和至少一种抗原编码核酸序列的多顺反子RNA的转录，其中所述nsP1-4基因和所述至少一种抗原编码核酸序列在单独的开放阅读框中。在各种实施方案中，所述骨架包含黑猩猩腺病毒载体的至少一种核苷酸序列。在各种实施方案中，所述黑猩猩腺病毒载体是ChAdV68载体。在各种实施方案中，所述至少一种启动子核苷酸序列是由骨架编码的原生26S启动子核苷酸序列。在各种实施方案中，所述至少一种启动子核苷酸序列是外源RNA启动子。在各种实施方案中，所述第二启动子核苷酸序列是26S启动子核苷酸序列。在各种实施方案中，所述第二启动子核苷酸序列包含多个26S启动子核苷酸序列，其中每个26S启动子核苷酸序列提供所述单独的开放阅读框中的一者或多者的转录。在各种实施方案中，所述一种或多种载体的大小各自为至少300nt。
在各种实施方案中，所述一种或多种载体的大小各自为至少1kb。在各种实施方案中，所述一种或多种载体的大小各自为2kb。在各种实施方案中，所述一种或多种载体的大小各自小于5kb。在各种实施方案中，所述至少一种抗原编码核酸序列中的至少一者编码由MHC I类蛋白呈递的多肽序列或其部分。在各种实施方案中，每个抗原编码核酸序列彼此直接连接。在各种实施方案中，所述至少一种抗原编码核酸序列中的至少一者利用编码接头的核酸序列与不同的抗原编码核酸序列连接。在各种实施方案中，所述接头连接两个MHC I类表位序列或将一个MHC I类表位序列连接到一个MHC II类序列。在各种实施方案中，所述接头选自由以下组成的组：(1)连续甘氨酸残基，长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基(SEQ ID NO:75)；(2)连续丙氨酸残基，长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基(SEQ IDNO:76)；(3)两个精氨酸残基(RR)；(4)丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸(AAY)；(5)由哺乳动物蛋白酶体有效加工的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的共有序列；和(6)侧接源自同源蛋白的抗原并且长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或2-20个氨基酸残基的一种或多种原生序列。在各种实施方案中，所述接头连接两个MHCII类序列或将一个MHC II类序列连接到一个MHC I类表位序列。在各种实施方案中，所述接头包含序列GPGPG(SEQ ID NO:77)。在各种实施方案中，所述至少一种抗原编码核酸序列中的至少一个序列可操作地或直接地连接到增强至少一种抗原编码核酸序列的表达、稳定性、细胞运输、加工和呈递和/或免疫原性的分离或连续的序列。
在各种实施方案中，所述分离或连续的序列包含以下中的至少一者：泛素序列、经修饰以增加蛋白酶体靶向的泛素序列(例如，泛素序列在位置76处含有Gly至Ala取代)、免疫球蛋白信号序列(例如，IgK)、主要组织相容性I类序列、溶酶体相关膜蛋白(LAMP)-1、人树突状细胞溶酶体相关膜蛋白和主要组织相容性II类序列；任选地其中所述经修饰以增加蛋白酶体靶向的泛素序列是A76。在各种实施方案中，所述至少一种抗原编码核酸序列包含至少2-10、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种核酸序列。在各种实施方案中，所述至少一种HIV MHC I类抗原编码核酸序列或至少一种抗原编码核酸序列包含至少15-20、11-100、11-200、11-300、11-400或多达400种核酸序列。在各种实施方案中，其中至少一种HIV MHC I类抗原编码核酸序列或至少一种抗原编码核酸序列包含至少2-400种核酸序列，并且其中所述抗原编码核酸序列中的至少两者编码由MHC I类蛋白呈递的多肽序列或其部分。在各种实施方案中，所述抗原编码核酸序列中的至少两者编码由MHC I类蛋白呈递的多肽序列或其部分。
在各种实施方案中，当施用于受试者并被翻译时，由所述至少一种HIV MHC I类抗原编码核酸编码的所述抗原中的至少一者或所述MHC I类表位中的至少一者被呈递在抗原呈递细胞上，产生免疫响应。在各种实施方案中，所述至少一种HIV MHC I类抗原编码核酸序列在施用于受试者并被翻译时，所述抗原中的至少一者被呈递在抗原呈递细胞上，产生免疫响应，并且任选地其中所述至少一种抗原编码核酸序列中的每一者的表达由所述至少一种启动子核苷酸序列驱动。在各种实施方案中，每个MHC I类抗原编码核酸序列编码长度介于8个和35个之间的氨基酸，任选地长度为9-17、9-25、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸的多肽序列。在各种实施方案中，存在至少一种MHC II类抗原编码核酸序列。在各种实施方案中，所述至少一种MHC II类抗原编码核酸序列的长度为12-20、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20-40个氨基酸。在各种实施方案中，存在至少一种MHC II类抗原编码核酸序列并且包含至少一种通用MHC II类抗原编码核酸序列，任选地其中所述至少一种通用序列包含破伤风类毒素和PADRE中的至少一者。在各种实施方案中，至少一种启动子核苷酸序列或第二启动子核苷酸序列是诱导型的。在各种实施方案中，至少一种启动子核苷酸序列或第二启动子核苷酸序列是非诱导型的。在各种实施方案中，所述至少一种poly(A)序列包含所述骨架的原生poly(A)序列。在各种实施方案中，所述至少一种poly(A)序列包含所述骨架的外源poly(A)序列。在各种实施方案中，所述至少一种poly(A)序列可操作地连接到所述至少一种抗原编码核酸序列中的至少一者。在各种实施方案中，所述至少一种poly(A)序列是至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个或至少90个连续的A核苷酸(SEQID NO:78)。在各种实施方案中，所述至少一种poly(A)序列是至少100个连续的A核苷酸(SEQ ID NO:79)。
在各种实施方案中，所述抗原表达系统还包含以下中的至少一者：内含子序列，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)序列，内部核糖体进入序列(IRES)序列，编码2A自切割肽序列的核苷酸序列，编码弗林蛋白酶切割位点的核苷酸序列，或已知增强可操作地连接到所述至少一种抗原编码核酸序列中的至少一者的mRNA的核输出、稳定性或翻译效率的5'或3'非编码区中的序列。在各种实施方案中，所述抗原表达系统还包含报告子，包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、GFP变体、分泌型碱性磷酸酶、荧光素酶、荧光素酶变体、或可检测的肽或表位。在各种实施方案中，所述可检测的肽或表位选自由HA标签、Flag标签、His标签或V5标签组成的组。在各种实施方案中，通过执行以下步骤来选择至少一种MHC I类抗原编码核酸序列：(a)获得外显子组、转录组或全基因组核苷酸测序中的至少一者，其中所述核苷酸测序数据用于获得代表抗原集合中的每一者的肽序列的数据；(b)将每个抗原的所述肽序列输入到呈递模型中，以产生所述抗原中的每一者由MHC蛋白中的一者或多者呈递的数值可能性集合，所述数值可能性集合已至少基于所接收的质谱数据进行鉴定；以及(c)基于所述数值可能性集合选择所述抗原集合的子集以产生经选择抗原集合，所述经选择抗原用于产生所述至少一种MHC I类抗原编码核酸序列。
在各种实施方案中，通过执行以下步骤来选择MHC I类表位编码核酸序列中的每一者：(a)获得外显子组、转录组或全基因组核苷酸测序数据中的至少一者，其中所述核苷酸测序数据用于获得代表抗原集合中的每一者的肽序列的数据；(b)将每个抗原的所述肽序列输入到呈递模型中，以产生所述抗原中的每一者由一个或多个MHC蛋白呈递的数值可能性集合，所述数值可能性集合已至少基于所接收的质谱数据进行鉴定；以及(c)基于所述数值可能性集合选择所述抗原集合的子集以产生经选择抗原集合，所述经选择抗原用于产生至少20种MHC I类抗原编码核酸序列。在各种实施方案中，所述经选择抗原集合的数目是2-20个。在各种实施方案中，所述呈递模型表示以下两者之间的依赖性：(a)所述MHC等位基因中的特定一者和在肽序列的特定位置处的特定氨基酸的一对的存在；和(b)由所述对的所述MHC等位基因中的所述特定一者呈递在所述特定位置处包含所述特定氨基酸的所述肽序列的可能性。
在各种实施方案中，选择所述经选择抗原集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的抗原被呈递的可能性增加的抗原，任选地其中所述经选择抗原已被验证为由一种或多种特异性HLA等位基因呈递。在各种实施方案中，选择所述经选择抗原集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的抗原能够响应于受试者中HIV的存在而诱导免疫响应的可能性增加的抗原。在各种实施方案中，选择所述经选择抗原集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的抗原能够由专职抗原呈递细胞(APC)呈递给初始T细胞的可能性增加的抗原，任选地其中所述APC是树突状细胞(DC)。在各种实施方案中，选择所述经选择抗原集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的抗原经由中心或外周耐受性受抑制的可能性降低的抗原。在各种实施方案中，选择所述经选择抗原集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的抗原能够在受试者中诱导对正常组织的自身免疫响应的可能性降低的抗原。
在各种实施方案中，外显子组或转录组核苷酸测序数据是通过执行下一代测序(NGS)或任何大规模平行测序方法获得。在各种实施方案中，所述抗原盒包含由抗原盒中的相邻序列形成的连接表位序列。在各种实施方案中，至少一个或每个连接表位序列对MHC具有大于500nM的亲和力。在各种实施方案中，每个连接表位序列都是非自身的。在各种实施方案中，MHC I类表位中的每一者经预测或验证为能够由存在于至少5％的群体中的至少一种HLA等位基因呈递。在各种实施方案中，MHC I类表位中的每一者经预测或验证为能够由至少一个HLA等位基因呈递，其中每个抗原/HLA对在群体中具有至少0.01％的抗原/HLA发生率。在各种实施方案中，MHC I类表位中的每一者经预测或验证为能够由至少一个HLA等位基因呈递，其中每个抗原/HLA对在群体中具有至少0.1％的抗原/HLA发生率。
本文另外公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述组合物和药学上可接受的载剂。在各种实施方案中，所述组合物还包含佐剂。
本文另外公开了一种分离的核苷酸序列或分离的核苷酸序列集合，其包含任何上述组合物的抗原盒和一种或多种从SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的序列获得的元件，任选地其中所述一种或多种元件选自由以下组成的组：非结构蛋白介导的扩增所必需的序列、26S启动子核苷酸序列、poly(A)序列以及SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的序列的nsP1-4基因，并且任选地其中所述核苷酸序列是cDNA。在各种实施方案中，所述序列或分离的核苷酸序列集合包含插入在SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示序列的位置7544处的任何上述组合物的抗原盒。在各种实施方案中，所述分离的核苷酸序列还包含：从SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:5的序列获得的一种或多种元件的T7或SP6 RNA聚合酶启动子核苷酸序列5'；和任选地，poly(A)序列的一个或多个限制性位点3'。在各种实施方案中，任何上述组合物的抗原盒被插入在SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的位置7563处。
本文另外公开了包含上述核苷酸序列的载体或载体集合。本文另外公开了包含上述核苷酸序列或分离的核苷酸序列集合的分离的细胞，任选地其中所述细胞是BHK-21、CHO、HEK293或其变体、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6或AE1-2a细胞。
本文另外公开了一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用任何上述组合物或上述药物组合物的组合物。本文另外公开了一种用于在受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用任何上述组合物或上述药物组合物的组合物。在各种实施方案中，所述受试者表达至少一种经预测或已知呈递由抗原表达系统的一种或多种载体编码的MHC I类表位中的至少一者的HLA等位基因。在各种实施方案中，所述组合物是经肌肉内(IM)、皮内(ID)、皮下(SC)或静脉内(IV)施用的。
在各种实施方案中，所述组合物是经肌肉内施用的。在各种实施方案中，所述方法还包括向受试者施用第二疫苗组合物。在各种实施方案中，所述第二疫苗组合物是在施用所述组合物或所述药物组合物之前施用。在各种实施方案中，所述第二疫苗组合物是在施用所述组合物或所述药物组合物之后施用。在各种实施方案中，所述第二疫苗组合物与所述组合物或所述药物组合物相同。在各种实施方案中，所述第二疫苗组合物与所述组合物或所述药物组合物不同。在各种实施方案中，所述第二疫苗组合物包含编码至少一种抗原编码核酸序列的黑猩猩腺病毒载体。在各种实施方案中，由黑猩猩腺病毒载体编码的所述至少一种抗原编码核酸序列与任何上述组合物的至少一种抗原编码核酸序列相同。
本文另外公开了一种制造上述抗原表达系统的方法，所述方法包括：(a)获得包含骨架和抗原盒的线性化DNA序列；(b)通过将所述线性化DNA序列添加到包含将所述线性化DNA序列转录成RNA的所有必要组分的体外转录反应中，体外转录所述线性化DNA序列，任选地还包括将m7g帽体外添加到所得RNA中；以及(c)从所述体外转录反应中分离一种或多种载体。在各种实施方案中，所述线性化DNA序列是通过线性化DNA质粒序列或通过使用PCR扩增产生的。在各种实施方案中，使用细菌重组或全基因组DNA合成或全基因组DNA合成与所合成DNA在细菌细胞中扩增中的一者产生DNA质粒序列。在各种实施方案中，从所述体外转录反应中分离一种或多种载体涉及苯酚氯仿提取、基于硅胶柱的纯化或类似的RNA纯化方法中的一者或多者。
本文另外公开了一种制造用于递送抗原表达系统的组合物的方法，所述方法包括：(a)提供用于纳米微粒递送媒介物的组分；(b)提供抗原表达系统；以及(c)为所述纳米微粒递送媒介物和所述抗原表达系统提供足以产生用于递送所述抗原表达系统的组合物的条件。在各种实施方案中，所述条件由微流体混合提供。
本文另外公开了一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：a)确定或已经确定所述受试者的HIV的HIV亚型；b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，其中所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQID No:325-22349中任一者的表位序列组成的组的MHC I类表位序列，以及d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。在各种实施方案中，由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表35-45中的HLA等位基因组成的组。
本文另外公开了一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型A1；b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:325-2165所示序列组成的组的HIV表位，以及d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。在各种实施方案中，由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表35中的HLA等位基因组成的组。
本文另外公开了一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型A2；b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:2166-4106所示序列组成的组的HIV表位，以及d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。在各种实施方案中，由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表36中的HLA等位基因组成的组。
本文另外公开了一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型B；b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:4107-6241所示序列组成的组的HIV表位，以及d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。在各种实施方案中，由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表37中的HLA等位基因组成的组。
本文另外公开了一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型C；b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:6242-8389所示序列组成的组的HIV表位，以及d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。在各种实施方案中，由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表38中的HLA等位基因组成的组。
本文另外公开了一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型D；b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:8930-10626所示序列组成的组的HIV表位，以及d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。在各种实施方案中，由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表39中的HLA等位基因组成的组。
本文另外公开了一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型F1；b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:10627-12810所示序列组成的组的HIV表位，以及d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。在各种实施方案中，由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表40中的HLA等位基因组成的组。
本文另外公开了一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型F2；b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:12811-15079所示序列组成的组的HIV表位，以及d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。在各种实施方案中，由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表41中的HLA等位基因组成的组。
本文另外公开了一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型G；b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:15080-17174所示序列组成的组的HIV表位，以及d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。在各种实施方案中，由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表42中的HLA等位基因组成的组。
本文另外公开了一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型H；b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:17175-19388所示序列组成的组的HIV表位，以及d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。在各种实施方案中，由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表43中的HLA等位基因组成的组。
本文另外公开了一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型J；b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:19389-21003所示序列组成的组的HIV表位，以及d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。在各种实施方案中，由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表44中的HLA等位基因组成的组。
本文另外公开了一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型K；b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:21004-22349所示序列组成的组的HIV表位，以及d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。在各种实施方案中，由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表45中的HLA等位基因组成的组。
在各种实施方案中，确定或已经确定所述受试者的HIV的HIV亚型包括从已经处理来自所述受试者的样品的第三方获得指示所述HIV亚型的数据集。在各种实施方案中，确定或已经确定所述受试者是否表达HLA等位基因包括从已经处理来自所述受试者的样品的第三方获得数据集。在各种实施方案中，确定或已经确定所述受试者是否表达HLA等位基因包括从所述受试者获得样品并使用选自由以下组成的组的方法测定所述样品：外显子组测序、靶向外显子组测序、转录组测序、Sanger测序、基于PCR的基因分型测定、基于质谱的方法、微阵列、Nanostring、ISH和IHC。在各种实施方案中，所述样品选自组织、体液、血液、脊髓液或针吸液。在各种实施方案中，所述HLA等位基因具有至少1％的HLA频率。
本文另外公开了一种用于治疗受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHCI类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID No:325-22349所示序列组成的组的HIV表位。本文另外公开了一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型A1，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHCI类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:325-2165所示序列组成的组的HIV表位。
本文另外公开了一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型A2，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:2166-4106所示序列组成的组的HIV表位。
本文另外公开了一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型B，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:4107-6241所示序列组成的组的HIV表位。
本文另外公开了一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型C，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:6242-8389所示序列组成的组的HIV表位。
本文另外公开了一种方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型D，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:8930-10626所示序列组成的组的HIV表位。
本文另外公开了一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型F1，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:10627-12810所示序列组成的组的HIV表位序列。
本文另外公开了一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型F2，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:12811-15079所示序列组成的组的HIV表位序列。
本文另外公开了一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型G，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:15080-17174所示序列组成的组的HIV表位序列。
本文另外公开了一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型H，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:17175-19388所示序列组成的组的HIV表位。
本文另外公开了一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型J，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:19389-21003所示序列组成的组的HIV表位。
本文另外公开了一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型K，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:21004-22349所示序列组成的组的HIV表位。
本文另外公开了一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID No:325-22349所示序列组成的组的HIV表位。
本文另外公开了一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型A1，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:325-2165所示序列组成的组的HIV表位。
本文另外公开了一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型A2，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:2166-4106所示序列组成的组的HIV表位。
本文另外公开了一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型B，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:4107-6241所示序列组成的组的HIV表位。
一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHCI类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型C，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:6242-8389所示序列组成的组的HIV表位。
本文另外公开了一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型D，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列选自由来自SEQ ID NO:8930-10626中任一者的表位序列组成的组。
本文另外公开了一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型F1，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含选自由SEQ ID NO:10627-12810所示序列组成的组的至少一种HIV表位序列。
本文另外公开了一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型F2，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含选自由SEQ ID NO:12811-15079所示序列组成的组的至少一种HIV表位序列。
本文另外公开了一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型G，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含选自由SEQ ID NO:15080-17174所示序列组成的组的至少一种HIV表位序列。
本文另外公开了一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型H，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:17175-19388所示序列组成的组的HIV表位。
本文另外公开了一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型J，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:19389-21003所示序列组成的组的HIV表位。
本文另外公开了一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型K，或2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:21004-22349所示序列组成的组的HIV表位。
在各种实施方案中，所述受试者表达至少一种经预测或已知呈递至少一种MHC I类表位序列的HLA等位基因。在各种实施方案中，所述方法还包括：在向所述受试者施用所述基于抗原的疫苗之前，确定所述受试者是接受所述基于抗原的疫苗的候选者，其中所述确定包括鉴定1)所述受试者表达已知或经预测呈递至少一种MHC I类表位的HLA等位基因，并且2)所述受试者已经暴露于HIV亚型或易暴露于HIV亚型。在各种实施方案中，所述至少一种HLA等位基因选自由表35-45中的HLA等位基因组成的组。
在各种实施方案中，其中所述基于抗原的疫苗包含抗原表达系统。在各种实施方案中，所述抗原表达系统包括上述抗原表达系统中的任一者。在各种实施方案中，所述基于抗原的疫苗包含所述药物组合物中的任一者。
在各种实施方案中，每个MHC I类表位包含选自由SEQ ID NO:325-2165中任一者的表位序列组成的组的序列。在各种实施方案中，每个MHC I类表位包含选自由SEQ ID NO:2166-4106中任一者的表位序列组成的组的序列。在各种实施方案中，每个MHC I类表位包含选自由SEQ ID NO:4107-6241中任一者的表位序列组成的组的序列。在各种实施方案中，每个MHC I类表位包含选自由SEQ ID NO:6242-8389中任一者的表位序列组成的组的序列。在各种实施方案中，每个MHC I类表位包含选自由SEQ ID NO:8930-10626中任一者的表位序列组成的组的序列。在各种实施方案中，每个MHC I类表位包含选自由SEQ ID NO:10627-12810中任一者的表位序列组成的组的序列。在各种实施方案中，每个MHC I类表位包含选自由SEQ ID NO:12811-15079中任一者的表位序列组成的组的序列。在各种实施方案中，每个MHC I类表位包含选自由SEQ ID NO:15080-17174中任一者的表位序列组成的组的序列。在各种实施方案中，每个MHC I类表位包含选自由SEQ ID NO:17175-19388中任一者的表位序列组成的组的序列。在各种实施方案中，每个MHC I类表位包含选自由SEQ ID NO:19389-21003中任一者的表位序列组成的组的序列。在各种实施方案中，每个MHC I类表位包含选自由SEQ ID NO:21004-22349中任一者的表位序列组成的组的序列。
本文另外公开了一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：a)确定或已经确定所述受试者表达HLA等位基因；b)获得或已经获得所述受试者中存在的HIV的测序数据；c)选择包含在基于抗原的疫苗中的候选表位序列，其中第一候选表位序列选自由来自SEQ ID No:325-22349中任一者的表位序列组成的组，并且其中第二候选表位序列是突变的表位序列，所述第一候选表位序列和所述第二候选表位序列中的每一者经预测由所述受试者表达的所述HLA等位基因呈递；d)产生包括经选择候选表位序列的所述基于抗原的疫苗；以及e)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
本文另外公开了一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：a)确定或已经确定所述受试者表达HLA等位基因；b)获得或已经获得所述受试者中存在的HIV的测序数据；c)选择包含在基于抗原的疫苗中的候选表位序列，其中第一候选表位序列选自由来自SEQ ID No:325-22349中任一者的表位序列组成的组，并且其中第二候选表位序列是突变的表位序列，所述第一候选表位序列和所述第二候选表位序列中的每一者经预测由所述受试者表达的所述HLA等位基因呈递；d)产生包括经选择候选表位序列的所述基于抗原的疫苗；以及e)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
在各种实施方案中，SEQ ID No:325-22349中任一者的表位序列是通过应用在通过质谱法测序的HLA呈递肽上训练的呈递模型来鉴定。在各种实施方案中，所述呈递模型在40％的召回率(recall rate)下表现出0.28的精度值。在各种实施方案中，所述呈递模型表现出0.24的AUC。
附图说明
关于以下描述和附图将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优势，在所述附图中：
图1说明了体外T细胞活化测定的发展。将疫苗盒递送至抗原呈递细胞引起独特肽抗原的表达、加工和MHC限制性呈递的测定的示意图。被工程化成具有匹配特定肽-MHC组合的T细胞受体的报告T细胞被激活，导致荧光素酶表达。
图2A说明了对短盒中接头序列的评价并且显示了在相对于彼此相同的位置中串接的五个I类MHC限制性表位(表位1至5)，接着是两个通用的II类MHC表位(MHC-II)。使用不同接头产生各种迭代。在一些情况下，T细胞表位彼此直接连接。在其他情况下，T细胞表位侧接于其天然序列的一侧或两侧上。在其他迭代中，T细胞表位通过非天然序列AAY、RR和DPP连接。
图2B说明了对短盒中接头序列的评价并且显示了有关嵌入所述短盒中的T细胞表位的序列信息。按出现顺序，图分别公开了SEQ ID NO 274-280。
图3说明了对添加至模型疫苗盒中的细胞靶向序列的评价。所述靶向盒用泛素(Ub)、信号肽(SP)和/或跨膜(TM)结构域延伸所述短盒设计，特征在于紧邻所述五个标志物人类T细胞表位(表位1至5)以及两个小鼠T细胞表位SIINFEKL(SEQ ID NO:80)(SII)和SPSYAYHQF(SEQ ID NO:81)(A5)，并且使用非天然接头AAY-或天然接头侧接两侧上的T细胞表位(25聚体)。
图4A说明了对21聚体长盒中表位位置的影响的体内评价并且显示了长盒的设计需要用25聚体天然序列中所包含的另外的熟知T细胞I类表位(表位6至21)隔开的包含在25聚体天然序列中的五个标志物I类表位(表位1至5)(接头＝天然侧接序列)，和两个通用的II类表位(MHC-II0，其中仅I类表位的相对位置变化。
图4B说明了对21聚体长盒中表位位置的影响的体内评价并且显示了有关所用T细胞表位的序列信息。按出现顺序，图分别公开了SEQ ID NO 281-301。
图5A说明了临床前IND授权研究(IND-enabling study)的最终盒设计并且显示了最终盒的设计包含在25聚体天然序列中所含有的20个MHC I表位(接头＝天然侧接序列)以及2个通用MHC II类表位，所述20个MHC I表位由6个非人类灵长类动物(NHP)表位、5个人类表位、9个鼠类表位构成。
图5B说明了临床前IND授权研究的最终盒设计并且显示了呈递在非人类灵长类动物、小鼠和人类来源的I类MHC上的所用T细胞表位的序列信息，以及2个通用MHC II类表位PADRE和破伤风类毒素的序列。按出现顺序，图分别公开了SEQ ID NO 302-323。
图6A说明了在转染之后产生ChAdV68.4WTnt.GFP病毒。使用磷酸钙方案，用ChAdV68.4WTnt.GFP DNA转染HEK293A细胞。在转染之后10天，观测到病毒复制并且使用光学显微镜检查(40×放大率)观测到ChAdV68.4WTnt.GFP病毒蚀斑。
图6B说明了在转染之后产生ChAdV68.4WTnt.GFP病毒。使用磷酸钙方案，用ChAdV68.4WTnt.GFP DNA转染HEK293A细胞。在转染之后10天观测到病毒复制并且使用荧光显微镜检查在40×放大率下观测到ChAdV68.4WTnt.GFP病毒蚀斑。
图6C说明了在转染之后产生ChAdV68.4WTnt.GFP病毒。使用磷酸钙方案，用ChAdV68.4WTnt.GFP DNA转染HEK293A细胞。在转染之后10天观测到病毒复制并且使用荧光显微镜检查在100×放大率下观测到ChAdV68.4WTnt.GFP病毒蚀斑。
图7A说明了转染之后产生ChAdV68.5WTnt.GFP病毒。使用脂染胺方案，用ChAdV68.5WTnt.GFP DNA转染HEK293A细胞。在转染之后10天，观测到病毒复制(蚀斑)。制备裂解物并用于再感染T25烧瓶中的293A细胞。3天后，使用光学显微镜检查(40×放大率)观测到ChAdV68.5WTnt.GFP病毒蚀斑并拍照。
图7B说明了转染之后产生ChAdV68.5WTnt.GFP病毒。使用脂染胺方案，用ChAdV68.5WTnt.GFP DNA转染HEK293A细胞。在转染之后10天，观测到病毒复制(蚀斑)。制备裂解物并用于再感染T25烧瓶中的293A细胞。3天后，使用荧光显微镜检查在40×放大率下观测到ChAdV68.5WTnt.GFP病毒蚀斑并拍照。
图7C说明了转染之后产生ChAdV68.5WTnt.GFP病毒。使用脂染胺方案，用ChAdV68.5WTnt.GFP DNA转染HEK293A细胞。在转染之后10天，观测到病毒复制(蚀斑)。制备裂解物并用于再感染T25烧瓶中的293A细胞。3天后，使用荧光显微镜检查在100×放大率下观测到ChAdV68.5WTnt.GFP病毒蚀斑并拍照。
图8说明了病毒颗粒制造方案。
图9说明了甲病毒源性VEE自我复制型RNA(srRNA)载体。
图10说明了在用VEE-荧光素酶srRNA接种C57BL/6J小鼠之后的体内报告子表达。显示出在各种时间点用VEE-荧光素酶srRNA免疫接种C57BL/6J小鼠(每只小鼠10ug，两侧肌肉内注射，MC3包封)之后的代表性荧光素酶信号图像。
图11A说明了在带有B16-OVA肿瘤的小鼠中免疫接种用MC3 LNP配制的VEE srRNA之后14天测量的T细胞反应。向带有B16-OVA肿瘤的C57BL/6J小鼠注射10ug VEE-荧光素酶srRNA(对照)、VEE-UbAAY srRNA(Vax)、VEE-荧光素酶srRNA和抗CTLA-4(aCTLA-4)或VEE-UbAAY srRNA和抗CTLA-4(Vax+aCTLA-4)。此外，从第7天开始，用抗PD1 mAb治疗所有小鼠。每组由8只小鼠组成。在免疫接种之后14天，处死小鼠并收集脾脏和淋巴结。通过IFN-γELISPOT评估SIINFEKL(SEQ ID NO:82)特异性T细胞响应并以每106个脾细胞的斑点形成细胞(SFC)数报道。线表示中值。
图11B说明在带有B16-OVA肿瘤的小鼠中免疫接种用MC3LNP配制的VEE srRNA之后14天测量的T细胞响应。向带有B16-OVA肿瘤的C57BL/6J小鼠注射10ug VEE-荧光素酶srRNA(对照)、VEE-UbAAY srRNA(Vax)、VEE-荧光素酶srRNA和抗CTLA-4(aCTLA-4)或VEE-UbAAYsrRNA和抗CTLA-4(Vax+aCTLA-4)。此外，从第7天开始，用抗PD1 mAb治疗所有小鼠。每组由8只小鼠组成。在免疫接种之后14天，处死小鼠并收集脾和淋巴结。通过MHCI-五聚体染色评估SIINFEKL(SEQ ID NO:83)特异性T细胞响应，以五聚体阳性细胞占CD8阳性细胞的百分比报道。线表示中值。
图12A说明了在带有B16-OVA肿瘤的小鼠中进行异源初免/加强免疫之后的抗原特异性T细胞响应。向带有B16-OVA肿瘤的C57BL/6J小鼠注射表达GFP的腺病毒(Ad5-GFP)并用经MC3 LNP配制的VEE-荧光素酶srRNA(对照)加强免疫或者注射Ad5-UbAAY并用VEE-UbAAYsrRNA(Vax)加强免疫。也用IgG对照mAb治疗对照组和Vax组。第三组用Ad5-GFP初免/VEE-荧光素酶srRNA加强免疫与抗CTLA-4(aCTLA-4)的组合治疗，而第四组用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY加强免疫与抗CTLA-4的组合(Vax+aCTLA-4)治疗。此外，从第21天开始，用抗PD-1mAb治疗所有小鼠。通过IFN-γELISPOT测量T细胞响应。在用腺病毒免疫接种后14天，处死小鼠并收集脾脏和淋巴结。
图12B说明了在带有B16-OVA肿瘤的小鼠中进行异源初免/加强免疫之后的抗原特异性T细胞响应。向带有B16-OVA肿瘤的C57BL/6J小鼠注射表达GFP的腺病毒(Ad5-GFP)并用经MC3 LNP配制的VEE-荧光素酶srRNA(对照)加强免疫或者注射Ad5-UbAAY并用VEE-UbAAYsrRNA(Vax)加强免疫。也用IgG对照mAb治疗对照组和Vax组。第三组用Ad5-GFP初免/VEE-荧光素酶srRNA加强免疫与抗CTLA-4(aCTLA-4)的组合治疗，而第四组用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY加强免疫与抗CTLA-4的组合(Vax+aCTLA-4)治疗。此外，从第21天开始，用抗PD-1mAb治疗所有小鼠。通过IFN-γELISPOT测量T细胞响应。在用腺病毒免疫接种后14天和在用srRNA加强免疫后14天(初免后第28天)，处死小鼠并收集脾脏和淋巴结。
图12C说明了在带有B16-OVA肿瘤的小鼠中进行异源初免/加强免疫之后的抗原特异性T细胞响应。向带有B16-OVA肿瘤的C57BL/6J小鼠注射表达GFP的腺病毒(Ad5-GFP)并用经MC3 LNP配制的VEE-荧光素酶srRNA(对照)加强免疫或者注射Ad5-UbAAY并用VEE-UbAAYsrRNA(Vax)加强免疫。也用IgG对照mAb治疗对照组和Vax组。第三组用Ad5-GFP初免/VEE-荧光素酶srRNA加强免疫与抗CTLA-4(aCTLA-4)的组合治疗，而第四组用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY加强免疫与抗CTLA-4的组合(Vax+aCTLA-4)治疗。此外，从第21天开始，用抗PD-1mAb治疗所有小鼠。通过MHC I类五聚体染色测量T细胞响应。在用腺病毒免疫接种后14天，处死小鼠并收集脾脏和淋巴结。
图12D说明了在带有B16-OVA肿瘤的小鼠中进行异源初免/加强免疫之后的抗原特异性T细胞响应。向带有B16-OVA肿瘤的C57BL/6J小鼠注射表达GFP的腺病毒(Ad5-GFP)并用经MC3 LNP配制的VEE-荧光素酶srRNA(对照)加强免疫或者注射Ad5-UbAAY并用VEE-UbAAYsrRNA(Vax)加强免疫。也用IgG对照mAb治疗对照组和Vax组。第三组用Ad5-GFP初免/VEE-荧光素酶srRNA加强免疫与抗CTLA-4(aCTLA-4)的组合治疗，而第四组用Ad5-UbAAY初免/VEE-UbAAY加强免疫与抗CTLA-4的组合(Vax+aCTLA-4)治疗。此外，从第21天开始，用抗PD-1mAb治疗所有小鼠。通过MHC I类五聚体染色测量T细胞响应。在用腺病毒免疫接种后14天和在用srRNA加强免疫后14天(初免后第28天)，处死小鼠并收集脾脏和淋巴结。
图13A说明了在带有CT26(Balb/c)肿瘤的小鼠中进行异源初免/加强免疫之后的抗原特异性T细胞响应。对小鼠免疫接种Ad5-GFP并且在腺病毒初免后15天用经MC3 LNP配制的VEE-荧光素酶srRNA(对照)加强免疫，或用Ad5-UbAAY进行初免并用VEE-UbAAY srRNA(Vax)加强免疫。也用IgG对照mAb治疗对照组和Vax组。向一个独立组施用Ad5-GFP/VEE-荧光素酶srRNA初免/加强免疫与抗PD-1(aPD1)的组合，而第四组接受Ad5-UbAAY/VEE-UbAAYsrRNA初免/加强免疫与抗PD-1mAb的组合(Vax+aPD1)。使用IFN-γELISPOT测量T细胞对AH1肽的响应。在用腺病毒免疫接种后12天，处死小鼠并收集脾脏和淋巴结。
图13B说明了在带有CT26(Balb/c)肿瘤的小鼠中进行异源初免/加强免疫之后的抗原特异性T细胞响应。对小鼠免疫接种Ad5-GFP并且在腺病毒初免后15天用经MC3 LNP配制的VEE-荧光素酶srRNA(对照)加强免疫，或用Ad5-UbAAY进行初免并用VEE-UbAAY srRNA(Vax)加强免疫。也用IgG对照mAb治疗对照组和Vax组。向一个独立组施用Ad5-GFP/VEE-荧光素酶srRNA初免/加强免疫与抗PD-1(aPD1)的组合，而第四组接受Ad5-UbAAY/VEE-UbAAYsrRNA初免/加强免疫与抗PD-1mAb的组合(Vax+aPD1)。使用IFN-γELI SPOT测量T细胞对AH1肽的响应。在用腺病毒免疫接种后12天和在用srRNA加强免疫后6天(初免后第21天)，处死小鼠并收集脾脏和淋巴结。
图14说明了ChAdV68引起针对小鼠中小鼠肿瘤抗原的T细胞响应。对小鼠免疫接种ChAdV68.5WTnt.MAG25mer，并且在C57BL/6J雌性小鼠中测量针对MHC I类表位SIINFEKL(SEQ ID NO:84)(OVA)的T细胞响应并在Balb/c小鼠中测量针对MHC I类表位AH1-A5的T细胞响应。呈现在ELISpot测定中测量的每106个脾细胞的平均斑点形成细胞(SFC)数。误差条表示标准偏差。
图15说明了使用ELISpot测量的抗原特异性细胞免疫响应。在第一次加强免疫接种(每组6只恒河猴)1、2、3、4、5、6、8、9或10周之后，使用ELISpot针对VEE-MAG25mer srRNA-LNP1(30μg)(图15A)、VEE-MAG25mer srRNA-LNP1(100μg)(图15B)、或VEE-MAG25mer srRNA-LNP2(100μg)(图15C)同源初免/加强免疫或ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mersrRNA异源初免/加强免疫组(图15D)，在PBMC中测量的对六种不同mamu A01限制性表位的抗原特异性IFN-γ产量。结果以堆叠条形图形式呈现为每个表位每106个PBMC的平均斑点形成细胞(SFC)数。相对于在放血前(第0周)的水平将每个动物的值归一化。
图16显示了使用ELISpot测量的抗原特异性细胞免疫响应。在免疫接种之前和初始免疫接种4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24周之后，在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA异源初免/加强免疫方案免疫接种之后，使用ELISpot在PBMC中测量对六种不同mamu A01限制性表位的抗原特异性IFN-γ产量。结果以堆叠条形图形式呈现为每个表位(每组6只恒河猴)每106个PBMC的平均斑点形成细胞(SFC)数。
图17显示了使用ELISpot测量的抗原特异性细胞免疫响应。在免疫接种之前和初始免疫接种4、5、6、7、8、10、11、12、13、14或15周之后，在用VEE-MAG25mer srRNA LNP2同源初免/加强免疫方案免疫接种之后，使用ELISpot在PBMC中测量对六种不同mamu A01限制性表位的抗原特异性IFN-γ产量。结果以堆叠条形图形式呈现为每个表位(每组6只恒河猴)每106个PBMC的平均斑点形成细胞(SFC)数。
图18显示了使用ELISpot测量的抗原特异性细胞免疫响应。在免疫接种之前和初始免疫接种4、5、6、7、8、10、11、12、13、14或15周之后，在用VEE-MAG25mer srRNA LNP1同源初免/加强免疫方案免疫接种之后，使用ELISpot在PBMC中测量对六种不同mamu A01限制性表位的抗原特异性IFN-γ产量。结果以堆叠条形图形式呈现为每个表位(每组6只恒河猴)每106个PBMC的平均斑点形成细胞(SFC)数。
图19A和图19B显示了由Promega动态范围标准产生的示例肽光谱。图公开了SEQID NO:324。
图20说明了一般TCR测序策略和流程图。
图21说明了具有30个(L)、40个(XL)或50个(XXL)表位的大抗原盒的各种物种的模型表位的一般组织化。
图22显示了ChAd载体表达长盒，如由使用识别为所有盒所共有的序列的抗II类(PADRE)抗体的上述蛋白质印迹指示。HEK293细胞经表达不同大小的大盒(chAd68-50XXL、chAd68-40XL和chAd68-30L)的chAd68载体感染。感染设定在0.2的MOI下。在感染二十四小时后，将蛋白酶体抑制剂MG132添加至一组感染孔(由加号指示)。另一组经病毒处理的孔未用MG132处理(由负号指示)。未感染的HEK293细胞(293F)用作阴性对照。在感染四十八小时后，收集细胞团粒并通过SDS/PAGE电泳和使用兔抗II类PADRE抗体的免疫印迹分析。将HRP抗兔抗体和ECL化学发光基质用于检测。
图23显示了通过ICS对AH1(顶部)和SIINFEKL(SEQ ID NO:85)(底部)检测的经chAd68大盒免疫接种的小鼠中的CD8+免疫响应。数据呈现为对模型表位占总CD8细胞的百分比的IFNg+细胞。
图24显示了在chAd68大盒疫苗接种后对LD-AH1+(顶部)和Kb-SIINFEKL+(SEQ IDNO:86)(底部)四聚体的CD8+响应。数据呈现为对模型四聚体肽复合物具有反应性的总CD8细胞的百分比。利用图基检验(Tukey's test)根据ANOVA，*p<0.05，**p<0.01。所有p值均与MAG 20-抗原盒进行比较。
图25显示了通过ICS对AH1(顶部)和SIINFEKL(SEQ ID NO:87)(底部)检测的经甲病毒大盒处理的小鼠中的CD8+免疫响应。数据呈现为对模型表位占总CD8细胞的百分比的IFNg+细胞。利用图基检验根据ANOVA，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。所有p值均与MAG 20-抗原盒进行比较。
图26说明了用于评价恒河猴中含有抗原盒的载体的免疫原性的疫苗接种策略。三角形指示第0周和第32周的chAd68疫苗接种(1e12 vp/动物)。圆形表示第0周、第4周、第12周、第20周、第28周和第32周的甲病毒疫苗接种。正方形表示抗CTLA4抗体的施用。
图27显示了用单独chAd-MAG给药的恒河猴中的CD8+抗表位响应的时程(第4组)。显示了平均SFC/1e6个脾细胞。
图28显示了用IV递送的chAd-MAG加抗CTLA4抗体(伊匹单抗(Ipilimumab))给药的恒河猴中的CD8+抗表位响应的时程(第5组)。显示了平均SFC/1e6个脾细胞。
图29显示了用SC递送的chAd-MAG加抗CTLA4抗体(伊匹单抗)给药的恒河猴中的CD8+抗表位响应的时程(第6组)。显示了平均SFC/1e6个脾细胞。
图30显示了通过ELISpot测量的由ChAdV68/samRNA疫苗方案产生的抗原特异性记忆响应。结果呈现为个体点图，其中每个点表示单个动物。显示了免疫接种前基线(左图)和初免后18个月时的记忆响应(右图)。
图31显示了通过使用组合四聚体染色和CD45RA/CCR7共同染色的流式细胞术的抗原特异性CD8+ T细胞的记忆细胞表型。
图32显示了在研究第18个月时四个Mamu-A*01四聚体+CD8+ T细胞群体的总和内记忆细胞类型的分布。记忆细胞表征如下：CD45RA+CCR7+＝初始，CD45RA+CCR7-＝效应(Teff)，CD45RA-CCR7+＝中央记忆(Tcm)，CD45RA-CCR7-＝效应记忆(Tem)。
图33显示了识别CT26肿瘤携带小鼠中的CT26肿瘤抗原AH1的CD8+ T细胞的频率。P值使用单向ANOVA以及图基多重比较检验确定；**P<0.001，*P<0.05。ChAdV＝ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；aCTLA4＝抗CTLA4抗体，克隆9D9。
图34描绘了根据一个实施方案向受试者提供基于抗原的疫苗的流程。
图35描绘了根据第二个实施方案向受试者提供基于抗原的疫苗的流程。
图36描绘了EDGE模型与用于预测由I类HLA等位基因呈递的HIV表位的公共预测工具相比的预测能力。
具体实施方式
I.定义
一般来说，权利要求书和本说明书中所用的术语旨在解释为具有本领域普通技术人员所理解的普通含义。为了更清楚，某些术语定义如下。在普通含义与所提供的定义之间存在矛盾的情况下，将使用所提供的定义。
如本文所用，术语“抗原”是诱导免疫响应的物质。
如本文所用，术语“基于抗原的疫苗”是基于一种或多种抗原(例如多种抗原)的疫苗组合物。疫苗可为基于核苷酸(例如基于病毒、基于RNA或基于DNA)的疫苗、基于蛋白质(例如基于肽)的疫苗或其组合。
如本文所用，术语“候选抗原”是指经选择用于包含在基于抗原的疫苗中的抗原。
如本文所用，术语“候选表位序列”是指经选择用于包含在基于抗原的疫苗中的候选抗原上的表位序列。
如本文所用，术语“编码区”是编码蛋白质的基因的部分。
如本文所用，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语百分比“同一性”是指当出于最大对应性比较和比对时，两个或更多个序列或子序列具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基，如使用下文所描述的序列比较算法(例如BLASTP和BLASTN或技术人员可用的其他算法)中的一者或通过目视检查所测量。取决于应用，“同一性”百分比可存在于所比较的序列区域上，例如在功能结构域上，或者存在于待比较的两个序列的全长上。
关于序列比较，通常一个序列充当与测试序列比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据所指定的程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。或者，序列相似性或不相似性可通过组合存在或不存在特定核苷酸，或对于翻译序列，在所选择的序列位置(例如序列基序)处的氨基酸来建立。
比较序列的最佳比对可例如通过以下进行：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法；Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜寻方法；这些算法的计算机化实施方式(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)；或目视检查(一般参见Ausubel等人,同上)。
适合于测定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，其描述于Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。
如本文所用，术语“表位”是通常由抗体或T细胞受体结合的抗原的特异性部分。
如本文所用，术语“免疫原性”是例如经由T细胞、B细胞或两者引发免疫响应的能力。
如本文所用，术语“HLA结合亲和力”、“MHC结合亲和力”意指特异性抗原与特异性HLA或MHC等位基因之间结合的亲和力。
如本文所用，术语“变体”是受试者的核酸与用作对照的参考人类基因组之间的差异。
如本文所用，术语“变体调用(variant call)”是通常根据测序的变体存在的算法确定。
如本文所用，术语“多态性”是生殖系变体，即在个体的所有携带DNA的细胞中发现的变体。
如本文所用，术语“体细胞变体”是在个体的非生殖系细胞中产生的变体。
如本文所用，术语“等位基因”是基因的形式或基因序列的形式或蛋白质的形式。
如本文所用，术语“HLA型”是HLA基因等位基因的补体。
如本文所用，术语“外显子组”是编码蛋白质的基因组的子集。外显子组可为基因组的集合外显子。
如本文所用，术语“逻辑回归”是来自统计的二进制数据的回归模型，其中因变量等于1的概率的逻辑被建模为因变量的线性函数。
如本文所用，术语“神经网络”是用于分类或回归的机器学习模型，其由多层线性变换，接着是通常经由随机梯度下降和反向传播进行训练的逐元素非线性组成。
如本文所用，术语“蛋白质组”是由细胞、细胞群或个体表达和/或翻译的全部蛋白质的集合。
如本文所用，术语“肽组”是由MHC-I或MHC-II在细胞表面上呈递的所有肽的集合。肽组可指细胞或细胞集合的特性。
如本文所用，术语“ELISPOT”意指酶联免疫吸附斑点测定，其是用于监测人类和动物中的免疫响应的常用方法。
如本文所用，术语“葡聚糖肽多聚体”是在流式细胞术中用于抗原特异性T细胞染色的基于葡聚糖的肽-MHC多聚体。
如本文所用，术语“耐受性或免疫耐受性”是对一种或多种抗原(例如自身抗原)免疫无响应性的状态。
如本文所用，术语“中心耐受性”是通过缺失自身反应性T细胞克隆或通过促进自身反应性T细胞克隆分化成免疫抑制性调控T细胞(Treg)而在胸腺中遭受的耐受性。
如本文所用，术语“外周耐受性”是通过下调或不激活经受中心耐受性的自身反应性T细胞或促进这些T细胞分化成Treg而在外周遭受的耐受性。
术语“样品”可包括通过包括静脉穿刺、排泄、射精、按摩、活组织检查、针抽吸、灌洗样品、刮取、手术切口或干预的手段或本领域中已知的其他手段从受试者获取的单细胞或多细胞或细胞碎片或体液等分试样。
术语“受试者”涵盖人类或非人类，无论体内、离体或体外，雄性或雌性的细胞、组织或生物体。术语受试者包括包含人类的哺乳动物。
术语“哺乳动物”涵盖人类和非人类，并且包括(但不限于)人类、非人类灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪科动物。
术语“临床因素”是指受试者状况的量度，例如疾病活动或严重程度。“临床因素”涵盖受试者健康状况的所有标志物，包括非样品标志物，和/或受试者的其他特征，例如(但不限于)年龄和性别。临床因素可为可在确定条件下评价来自受试者的样品(或样品群体)或受试者而获得的评分、值或值集合。临床因素也可通过标志物和/或其他参数(例如基因表达替代物)来预测。临床因素可包括过去的适应症(例如，患者病史)和吸烟史。
术语“甲病毒”是指披膜病毒科(Togaviridae)的成员，并且是正义单链RNA病毒。甲病毒通常分类为旧世界，例如辛德毕斯、罗斯河、马雅罗、基孔肯尼亚(Chikungunya)和塞姆利基森林病毒，或新世界，例如东部马脑炎、奥拉、摩根堡、或委内瑞拉马脑炎及其衍生病毒株TC-83。甲病毒通常是自我复制RNA病毒。
术语“甲病毒骨架”是指允许病毒基因组自我复制的甲病毒的最小序列。最小序列可包括用于非结构蛋白质介导的扩增的保守序列、非结构蛋白质1(nsP1)基因、nsP2基因、nsP3基因、nsP4基因和polyA序列，以及用于亚基因组病毒RNA表达的序列，包括26S启动子元件。
术语“用于非结构蛋白质介导的扩增的序列”包括本领域技术人员熟知的甲病毒保守序列元件(CSE)。CSE包括(但不限于)甲病毒5'UTR、51-nt CSE、24-nt CSE或其他26S亚基因组启动子序列、19-nt CSE和甲病毒3'UTR。
术语“RNA聚合酶”包括催化由DNA模板产生RNA多核苷酸的聚合酶。RNA聚合酶包括(但不限于)源自噬菌体的聚合酶，包括T3、T7和SP6。
术语“脂质”包括疏水性和/或两亲性分子。脂质可为阳离子、阴离子或中性的。脂质可为合成或天然来源的，并且在一些情况下是可生物降解的。脂质可包括胆固醇、磷脂、脂质缀合物，包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)缀合物(聚乙二醇化脂质)、蜡、油、甘油酯、脂肪和脂溶性维生素。脂质还可包括二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(MC3)和MC3样分子。
术语“脂质纳米粒子”或“LNP”包括使用含脂质膜围绕水性内部形成的小泡样结构，也称为脂质体。脂质纳米粒子包括具有通过表面活性剂稳定的固体脂质核心的基于脂质的组合物。核心脂质可为脂肪酸、酰基甘油、蜡和这些表面活性剂的混合物。生物膜脂质，例如磷脂、鞘磷脂、胆汁盐(牛磺胆酸钠)和固醇(胆固醇)，可用作稳定剂。脂质纳米粒子可使用限定比率的不同脂质分子形成，包括(但不限于)限定比率的一种或多种阳离子脂质、阴离子脂质或中性脂质。脂质纳米粒子可将分子包封在外膜壳内，并且随后可与靶细胞接触以将包封的分子递送至宿主细胞细胞溶质。脂质纳米粒子可用非脂质分子修饰或官能化，包括在其表面上。脂质纳米粒子可为单层的(单层)或多层的(多层)。脂质纳米粒子可与核酸复合。单层脂质纳米粒子可与核酸复合，其中核酸在水性内部。多层脂质纳米粒子可与核酸复合，其中核酸在水性内部，或者形成或包夹在其间。
缩写：MHC：主要组织相容性复合物；HLA：人白细胞抗原或人MHC基因座；NGS：下一代测序；PPV：阳性预测值；FFPE：福尔马林固定、石蜡包埋；NMD：无义介导的衰变；DC：树突状细胞。
应注意，除非上下文另外明确规定，否则如本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。
除非上下文特别陈述或以其他方式显而易见，否则如本文中所用，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可理解为在陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非上下文另有明确说明，否则本文所提供的所有数值均通过术语约修饰。
本文中未直接定义的任何术语应理解为具有与本发明的技术领域中所理解通常相关的含义。本文论述某些术语，以向从业者提供描述本发明的方面的组合物、装置、方法等以及如何制造或使用其的额外指导。应了解，相同事物可以超过一种方式表示。因此，替代性措辞和同义词可用于本文所论述的术语中的任何一者或多者。无论本文中是否详述或论述术语都无关紧要。提供一些同义词或可取代的方法、材料等。除非明确陈述，否则对一个或数个同义词或等效物的叙述不排除使用其他同义词或等效物。包括术语实例在内的实例的使用仅用于说明性目的，并且不在本文中限制本发明的方面的范围和含义。
在本说明书正文内引用的所有参考文献、颁布专利和专利申请均出于所有目的特此通过引用整体并入。
II.鉴定抗原的方法
本文公开的方法描述了鉴定候选抗原以包含在个性化的基于抗原的疫苗中。候选抗原代表感染性疾病如HIV的抗原，对于特定受试者，其可能呈递在免疫细胞(包括专职抗原呈递细胞如树突状细胞)的细胞表面上，和/或可能是免疫原性的。
举例来说，一种此类方法可包括以下步骤：获得HIV测序数据，其中所述HIV测序数据用于获得代表抗原集合中的每一者的肽序列的数据；将每个抗原的所述肽序列输入到一个或多个呈递模型中，以产生所述抗原中的每一者由受试者的一个或多个MHC蛋白呈递的数值可能性集合，所述数值可能性集合已至少基于所接收的质谱数据进行鉴定；以及基于所述数值可能性集合选择所述抗原集合的子集以产生经选择抗原集合。在一个方面，所述抗原集合中的每个抗原由HIV基因组中的基因(例如，env、gag、阴性因子(nef)、pol、rev、反式转录激活因子(Tat)、病毒感染性因子(vif)、病毒蛋白r(vir)或病毒蛋白u(viu))的编码区编码。
呈递模型可包括统计回归或机器学习(例如，深度学习)模型，所述模型在包括一组相应标签的参考数据集合(也称为训练数据集)上训练，其中所述参考数据集合是从多个不同受试者中的每一者获得，其中任选地一些受试者感染了HIV。所述参考数据还可包括被工程化以表达随后暴露于合成蛋白质的预定MHC等位基因的单等位基因细胞系、正常人类细胞系、以及新鲜和冷冻原始样品的质谱数据、测序数据、RNA测序数据、表达谱数据和蛋白质组学数据，以及T细胞测定(例如ELISPOT)。在某些方面，所述参考数据集合包括每种形式的参考数据。
呈递模型可包含至少部分从所述参考数据集合导出的特征集合，并且其中所述特征集合包含等位基因依赖性特征和等位基因非依赖性特征中的至少一者。在某些方面，包括每个特征。
用于鉴定候选抗原的方法还包括通过鉴定一种或多种可能呈递的HIV抗原来产生用于构建个性化的基于抗原的疫苗的输出。举例来说，一种此类方法可包括以下步骤：获得HIV测序数据，其中所述HIV测序数据用于获得代表抗原集合中的每一者的肽序列的数据；将抗原中的每一者的肽序列编码于相应数值向量中，每个数值向量包括关于构成肽序列的多种氨基酸以及肽序列中氨基酸的位置集合的信息；使用计算机处理器将所述数值向量输入深度学习呈递模型以产生抗原集合的呈递可能性的集合，所述集合中的每个呈递可能性代表相应抗原由I类MHC等位基因的MHC蛋白呈递的可能性；基于所述呈递可能性的集合选择抗原集合的子集以产生经选择抗原集合；以及基于所述经选择抗原集合产生用于构建个性化的基于抗原的疫苗的输出。在一个方面，所述抗原集合中的每个抗原由HIV基因组中的基因(例如，env、gag、nef、pol、rev、tat、vif、vir或viu)编码。
用于鉴定抗原的具体方法是本领域技术人员已知的，例如国际专利申请公开WO/2017/106638、WO/2018/195357和WO/2018/208856中更详细描述的方法，所述公开出于所有目的各自通过引用整体并入本文。
本文中公开了一种治疗受试者的方法，所述方法包括进行本文所述的抗原鉴定方法中的任一者的步骤，并且还包括获得包含经选择抗原集合的基于抗原的疫苗，以及向所述受试者施用所述基于抗原的疫苗，其中，任选地，所述受试者患有HIV。
本文公开的方法还可包括鉴定对子集中的抗原中的至少一者具有抗原特异性的一种或多种T细胞。在一些实施方案中，鉴定包括在扩增一种或多种抗原特异性T细胞的条件下使一种或多种T细胞与子集中的一种或多种抗原共同培养。在其他实施方案中，鉴定包括使一种或多种T细胞与包含子集中的一种或多种抗原的四聚体在允许T细胞与四聚体之间结合的条件下接触。在甚至其他实施方案中，本文公开的方法还可包括鉴定一种或多种经鉴定T细胞的一种或多种T细胞受体(TCR)。在某些实施方案中，鉴定一种或多种T细胞受体包括对一种或多种经鉴定T细胞的T细胞受体序列进行测序。本文公开的方法可还包括对多个T细胞进行基因工程化以表达一种或多种经鉴定T细胞受体中的至少一者；在扩增所述多个T细胞的条件下培养所述多个T细胞；以及将扩增T细胞注入受试者体内。在一些实施方案中，对多个T细胞进行基因工程化以表达一种或多种经鉴定T细胞受体中的至少一者包括将一种或多种经鉴定T细胞的T细胞受体序列克隆到表达载体中；以及用所述表达载体转染所述多个T细胞中的每一者。在一些实施方案中，本文公开的方法还包括在扩增一种或多种经鉴定T细胞的条件下培养所述一种或多种经鉴定T细胞；以及将扩增T细胞注入受试者中。
本文还公开了一种分离的T细胞，其对子集中的至少一种经选择抗原具有抗原特异性。
本文还公开了一种用于制造HIV疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：获得HIV测序数据，其中所述HIV测序数据用于获得代表抗原集合中的每一者的肽序列的数据；将每个抗原的所述肽序列输入到一个或多个呈递模型中以产生所述抗原中的每一者由一个或多个MHC等位基因呈递的数值可能性集合，所述数值可能性集合已至少基于所接收的质谱数据进行鉴定；以及基于所述数值可能性集合选择所述抗原集合的子集以产生经选择抗原集合；以及生产或已经生产包含所述经选择抗原集合的HIV疫苗。在一个方面，所述抗原集合中的每个抗原由HIV基因组中的基因(例如，env、gag、nef、pol、rev、tat、vif、vir或viu)编码。
本文还公开了一种基于抗原的疫苗，其包括通过执行包括以下步骤的方法选择的经选择抗原集合：获得HIV测序数据，其中所述HIV测序数据用于获得代表抗原集合中的每一者的肽序列的数据；将每个抗原的所述肽序列输入到一个或多个呈递模型中以产生所述抗原中的每一者由一个或多个MHC等位基因呈递的数值可能性集合，所述数值可能性集合已至少基于所接收的质谱数据进行鉴定；以及基于所述数值可能性集合选择所述抗原集合的子集以产生经选择抗原集合；以及生产或已经生产包含所述经选择抗原集合的HIV疫苗。在一个方面，所述抗原集合中的每个抗原由HIV基因组中的基因(例如，env、gag、nef、pol、rev、tat、vif、vir或viu)编码。
所述基于抗原的疫苗可包括核苷酸序列、多肽序列、RNA、DNA、细胞、质粒或载体中的一者或多者。
所述基于抗原的疫苗可包括一种或多种在受试者中具有免疫原性的抗原。
所述基于抗原的疫苗可不包括一种或多种在受试者中诱导针对正常组织的自身免疫响应的抗原。
所述基于抗原的疫苗可包括佐剂。
所述基于抗原的疫苗可包括赋形剂。
本文公开的方法还可包括基于呈递模型选择相对于未选择的抗原由受试者的免疫细胞呈递的可能性增加的抗原。
本文公开的方法还可包括基于呈递模型选择相对于未选择的抗原能够由专职抗原呈递细胞(APC)呈递给初始T细胞的可能性增加的抗原，任选地其中所述APC是树突状细胞(DC)。
本文公开的方法还可包括基于呈递模型选择相对于未选择的抗原能够在受试者中诱导HIV特异性免疫响应的可能性增加的抗原。
本文公开的方法还可包括基于呈递模型选择相对于未选择的抗原经由中心或外周耐受性受抑制的可能性降低的抗原。
本文公开的方法还可包括基于呈递模型选择相对于未选择的抗原能够诱发对受试者中的正常组织的自身免疫响应的可能性降低的抗原。
外显子组或转录组核苷酸测序和/或表达数据可通过对组织进行测序而获得。
测序可为下一代测序(NGS)或任何大规模平行测序方法。
数值可能性集合可通过至少MHC-等位基因相互作用特征来进一步鉴定，所述特征包括以下中的至少一者：经预测的MHC等位基因与抗原编码肽结合的亲和力；经预测的抗原编码肽-MHC复合物的稳定性；抗原编码肽的序列和长度；如通过质谱蛋白质组学或其他手段所评估，在来自表达特定MHC等位基因的其他个体的细胞中呈递具有类似序列的抗原编码肽的概率；所讨论的受试者中特定MHC等位基因的表达水平(例如，如通过RNA-seq或质谱法所测量)；在表达特定MHC等位基因的其他不同受试者中由特定MHC等位基因呈递的总体抗原编码肽序列独立性概率；在其他不同受试者中由同一家族分子(例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-DP)中的MHC等位基因呈递的总体抗原编码肽序列独立性概率。
数值可能性集合进一步通过至少MHC-等位基因非相互作用特征来鉴定，所述特征包括以下中的至少一者：侧接其源蛋白序列内的抗原编码肽的C末端和N末端序列；在抗原编码肽中存在蛋白酶切割基序，任选地根据组织中相应蛋白酶的表达加权(如通过RNA-seq或质谱法所测量)；如在适当细胞类型中测量的源蛋白的周转率；源蛋白的长度，蛋白酶体、免疫蛋白酶体、胸腺蛋白酶体或其他蛋白酶的表达水平(其可通过RNA-seq、蛋白质组质谱法或免疫组织化学测量)；抗原编码肽的源基因(例如，env、gag、nef、pol、rev、tat、vif、vir或viu)的表达(例如，如通过RNA-seq或质谱法所测量)；描述含有肽的源蛋白的结构域特性的特征，例如：二级或三级结构(例如α螺旋相对于β折叠)；选择性剪接；在其他不同受试者中由所讨论的抗原编码肽的源蛋白呈递肽的概率；由于技术偏差，肽将不会由质谱法检测到或过量表示的概率；通过RNASeq(其无需含有肽的源蛋白)所测量的提供关于免疫细胞状态的信息的各种基因模块/通路的表达；肽与TAP结合的概率或所测量或所预测的肽对TAP的结合亲和力；TAP的表达水平(其可通过RNA-seq、蛋白质组质谱法、免疫组织化学测量)；存在或不存在功能种系多态性，包括但不限于：在编码参与抗原呈递机制的蛋白质的基因(例如B2M、HLA-A、HLA-B、HLA-C、TAP-1、TAP-2、TAPBP、CALR、CNX、ERP57、HLA-DM、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DO、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DP、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQ、HLA-DQA1、HLA-DQA2、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DR、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5或者编码蛋白酶体或免疫蛋白酶体的组分的基因中的任一者)中；和HIV亚型(例如，A1、A2、B、C、D、F1、F2、G、H、J和K)；吸烟史。
本文公开的方法还可包括获得包含经选择抗原集合或其子集的基于抗原的疫苗，任选地另外包括向受试者施用所述基于抗原的疫苗。
候选抗原集合中的至少一种抗原在呈多肽形式时可包括以下中的至少一者：IC50值小于1000nM的与MHC的结合亲和力，对于MHC I类多肽，长度为8-15、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸，对于MHC II类多肽，长度为6-30、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸，在亲本蛋白质序列中的多肽内或多肽附近存在促进蛋白酶体切割的序列基序，以及存在促进TAP转运的序列基序。对于MHC II类，存在位于肽内或肽附近通过胞外或溶酶体蛋白酶(例如组织蛋白酶)或HLA-DM催化的HLA结合促进切割的序列基序。
本文公开的方法还可包括选择抗原子集，其中所述抗原子集经选择是因为每种抗原相对于一种或多种其他抗原呈递在HIV表面上的可能性增加。
本文公开的方法还可包括选择候选抗原子集。在一个方面，所述候选抗原子集经选择是因为每种抗原相对于一种或多种其他抗原能够在受试者中诱导HIV特异性免疫响应的可能性增加。在一个方面，所述候选抗原子集经选择是因为每种抗原相对于一种或多种不同抗原能够被专职抗原呈递细胞(APC)呈递给初始T细胞的可能性增加，任选地其中所述APC是树突状细胞(DC)。在一个方面，所述候选抗原子集经选择是因为每种抗原相对于一种或多种其他抗原经由中心或外周耐受性受抑制的可能性降低。在一个方面，所述抗原子集经选择是因为每种抗原相对于一种或多种其他抗原能够诱导对受试者中正常组织的自身免疫响应的可能性降低。
除非另外指明，否则本文方法的实践将采用本领域的技能范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。在文献中充分解释此类技术。参见例如T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.，现行版)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版.(Plenum Press)第A卷和第B卷(1992)。
III.鉴定HIV表位序列
本文还公开了用于鉴定HIV表位序列的方法。在一个方面，从HIV基因组测序的HIV核苷酸序列鉴定HIV表位序列。
HIV核苷酸序列可由九种HIV基因之一编码，包括env、gag、nef、pol、rev、tat、vif、vpr和vpu。可对从任何细胞类型或组织获得的核酸样品进行HIV基因组的测序。例如，可从通过已知技术(例如静脉穿刺)或唾液获得的体液(例如血液)中获得HIV样品。
HIV核苷酸序列信息可直接从获自HIV的数百万个单独的核酸分子产生。实时单分子合成测序技术依赖于荧光核苷酸的检测，因为其并入至与正测序的模板互补的DNA的新生链中。在一种方法中，将长度为30-50个碱基的寡核苷酸在5'端共价锚定于玻璃盖玻片上。这些锚定链执行两种功能。首先，如果模板被配置为具有与表面结合的寡核苷酸互补的捕捉尾部，则其充当靶模板链的捕捉位点。它们还充当模板引导的引物延伸的引物，形成序列阅读的基础。捕捉引物充当固定位点以便使用多个合成、检测和化学切割染料-接头以去除染料的循环进行序列测定。每个循环由添加聚合酶/经标记的核苷酸混合物、冲洗、成像和染料切割组成。在一个替代方法中，聚合酶经荧光供体分子修饰并固定在载玻片上，而每个核苷酸用连接到γ-磷酸酯的受体荧光部分进行颜色编码。系统检测经荧光标记的聚合酶与经荧光修饰的核苷酸之间的相互作用，因为核苷酸并入至从头链中。还存在其他合成测序技术。
可使用任何适合的边合成边测序平台来产生HIV核酸序列。如上所述，目前可用四种主要合成测序平台：来自Roche/454 Life Sciences的基因组测序仪、来自Illumina/Solexa的1G分析仪、来自Applied BioSystems的SOLiD系统和来自Helicos Biosciences的Heliscope系统。合成测序平台也已由Pacific BioSciences和VisiGen Biotechnologies描述。在一些实施方案中，将所测序的多个核酸分子结合于支撑物(例如固体支撑物)。为了将核酸固定在支撑物上，可在模板的3'和/或5'端添加捕捉序列/通用引发位点。核酸可通过将捕捉序列与共价连接于支撑物的互补序列杂交而结合于支撑物。捕捉序列(也称为通用捕捉序列)是与连接到支撑物的序列互补的核酸序列，其可双重充当通用引物。
作为捕捉序列的替代方案，偶联对(例如抗体/抗原、受体/配体或如例如美国专利申请第2006/0252077号中所述的抗生物素蛋白-生物素对)的一个成员可连接于每个片段，以捕捉在用所述偶联对的相应第二成员涂布的表面上。
在捕捉后，可例如通过单分子检测/测序来分析序列，例如，如实施例和美国专利第7,283,337号中所述，包括模板依赖性合成测序。在合成测序中，表面结合的分子在聚合酶存在下暴露于多个经标记的核苷酸三磷酸。模板的序列通过并入至生长链的3'端的经标记的核苷酸的顺序来测定。这可实时进行或可以分步重复模式进行。对于实时分析，可将不同的光学标记并入每个核苷酸并且可利用多个激光器刺激并入的核苷酸。
测序还可包括其他大规模平行测序或下一代测序(NGS)技术和平台。大规模平行测序技术和平台的额外实例是Illumina HiSeq或MiSeq、Thermo PGM或Proton、Pac Bio RSII或Sequel、Qiagen的Gene Reader和Oxford Nanopore MinION。可使用其他类似的当前大规模平行测序技术，以及这些技术的后代。
在一些方面，不同HIV类别、类型和亚型的HIV核苷酸序列从可用的开源数据库(例如，洛斯阿拉莫斯国家实验室(Los Alamos National Lab)的HIV数据库)中获得。
在获得HIV核苷酸序列后，从HIV核苷酸序列中提取HIV表位序列。作为一个实例，可通过使用滑动窗口来进行HIV表位序列的提取，其中所述滑动窗口的长度对应于HIV表位序列的长度。为了说明提取过程，将滑动窗口应用于第一个HIV核苷酸序列。将滑动窗口中的一组核苷酸碱基序列提取为第一HIV表位序列。滑动窗口移动一个核苷酸碱基，并且移动的滑动窗口中的下一组核苷酸碱基序列是第二HIV表位序列。这个过程一直重复，直到滑动窗口应用于所有HIV核苷酸序列。
在一个方面，每个HIV表位序列的长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个核苷酸碱基(例如长度为6-13个氨基酸序列)。在一个方面，每个HIV表位序列的长度为24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸碱基(例如，长度为8-11个氨基酸序列)。
另外，多种方法可用于检测HIV序列中特定突变的存在。本领域中的进步已提供精确、容易且便宜的大规模SNP基因分型。例如，已描述数种技术，包括动态等位基因特异性杂交(DASH)、微板阵列对角线凝胶电泳(MADGE)、焦磷酸测序、寡核苷酸特异性连接、TaqMan系统以及各种DNA“芯片”技术，例如Affymetrix SNP芯片。这些方法利用通常通过PCR扩增靶基因区。仍有其他方法，基于通过侵入性切割产生小信号分子，然后进行质谱法或固定化挂锁探针和滚环扩增。下文汇总本领域中已知用于检测特异性突变的数种方法。
基于PCR的检测手段可包括同时多重扩增多个标志物。例如，选择PCR引物以产生大小不重叠并且可同时分析的PCR产物是本领域中所熟知的。或者，可用经差异性标记并因此可各自被差异性检测的引物扩增不同的标志物。当然，基于杂交的检测手段允许样品中多个PCR产物的差异检测。本领域中已知其他技术以允许多个标志物的多重分析。
已开发数种方法以便于基因组DNA或细胞RNA中单核苷酸多态性的分析。例如，单碱基多态性可通过使用特殊化核酸外切酶抗性核苷酸来检测，如例如Mundy,C.R.(美国专利第4,656,127号)中所公开。根据所述方法，允许与紧靠着多形位点3'的等位基因序列互补的引物与获自特定动物或人类的靶分子杂交。如果靶分子上的多形位点含有与所存在的特定核酸外切酶抗性核苷酸衍生物互补的核苷酸，则所述衍生物将并入在杂交引物的末端上。此类并入使得引物对核酸外切酶具有抗性，从而允许其检测。由于样品的核酸外切酶抗性衍生物的身分是已知的，因此引物已对核酸外切酶具有抗性的发现揭示靶分子的多形位点中存在的核苷酸与反应中所用的核苷酸衍生物互补。这种方法的优势在于其不需要判定大量无关序列数据。
可使用基于溶液的方法确定多形位点的核苷酸的身分。Cohen,D.等人(法国专利2,650,840；PCT申请第WO91/02087号)。如在美国专利第4,656,127号的Mundy方法中，采用与紧靠着多形位点3'的等位基因序列互补的引物。所述方法使用经标记的双脱氧核苷酸衍生物确定所述位点的核苷酸的身分，如果所述核苷酸与多形位点的核苷酸互补，则将并入在引物的末端上。
称为遗传位分析或GBA的替代方法由Goelet,P.等人(PCT申请第92/15712号)描述。Goelet,P.等人的方法使用经标记的终止子和与多形位点3'序列互补的引物的混合物。所并入的经标记的终止子因此通过所评价的靶分子的多形位点中存在的核苷酸确定并与其互补。与Cohen等人(法国专利2,650,840；PCT申请第WO91/02087号)的方法相比，Goelet,P.等人的方法可为非均相测定，其中引物或靶分子固定于固相。
IV.抗原
抗原可包括核苷酸或多肽。例如，抗原可以是编码多肽序列的RNA序列。可用于疫苗的抗原因此可包括核苷酸序列或多肽序列。在一个方面，抗原肽可在其编码序列的背景下进行描述，其中抗原包括编码相关多肽序列的核苷酸序列(例如，DNA或RNA)。在一个方面，抗原与MHC蛋白结合，因此可由抗原呈递细胞呈递，从而抗原上的表位序列可与T细胞受体结合。在一些情形下，抗原与MHC I类蛋白结合。在一些情形下，抗原与MHC II类蛋白结合。在一些情形下，抗原与MHC I类和II类蛋白结合。
抗原可来源于两种主要类别的HIV(HIV-1或HIV-2)中的任一者。此外，抗原可源自不同类型的HIV-1，包括N组、O组或P组。此外，来自N组的抗原可来自亚型A1、A2、B、C、D、F1、F2、G、H、J或K之一。
源自HIV的抗原(和相应的表位序列)可根据HIV的类别、类型或亚型而不同。例如，源自不同HIV亚型的HIV抗原的表位序列显示在表35-45的第二列中。此外，有许多表位序列在各HIV亚型中是不变的。因此，某些表位序列包含在表35-45中的一者以上中。
由抗原核苷酸序列编码的一种或多种多肽可包含以下中的至少一者：IC50值小于1000nM的与MHC的结合亲和力，对于MHC I类肽，长度为8-15、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸，在肽内或肽附近存在促进蛋白酶体切割的序列基序，以及存在促进TAP转运的序列基序。对于长度为6-30、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸的MHC II类肽，在肽内或附近存在促进通过胞外或溶酶体蛋白酶(例如组织蛋白酶)切割或HLA-DM催化的HLA结合的序列基序。
一种或多种抗原可呈递在HIV上。
一种或多种抗原在受试者中可为免疫原性的，例如，能够在受试者中引发T细胞响应或B细胞响应。任选地，受试者可能患有HIV。
在疫苗生产背景下，对于任选地患有HIV的受试者，可不考虑在受试者中诱发自身免疫响应的一种或多种抗原。
至少一种抗原肽分子的大小可包含但不限于约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120或更多个氨基分子残基，和可源自其中的任何范围。在具体实施方案中，抗原肽分子等于或小于50个氨基酸。
抗原肽和多肽可为：对于MHC I类，15个残基或更少的长度并且通常由约8个与约11个之间的残基、特别是9或10个残基组成；对于MHC II类，6-30个残基(包括端值)。
如果需要，可以数种方式设计较长的肽。在一种情况下，当HLA等位基因上肽的呈递可能性经预测或已知时，较长的肽可由以下任一者组成：(1)个别呈递的具有朝向每个相应基因产物的N末端和C末端延伸2-5个氨基酸的肽；(2)所呈递的肽中的一些或全部与各自的延伸序列的串接。使用较长的肽允许患者细胞进行内源性加工，并且可引起更有效的抗原呈递和诱发T细胞响应。
抗原肽和多肽可呈递在HLA蛋白上。在一些方面，抗原肽或多肽的IC50可至少小于5000nM、至少小于1000nM、至少小于500nM、至少小于250nM、至少小于200nM、至少小于150nM、至少小于100nM、至少小于50nM或更小。
在一些方面，抗原肽和多肽在施用至受试者时不诱发自身免疫响应和/或引起免疫耐受性。
具有所需活性或特性的抗原肽和多肽可经修饰以提供某些所需属性，例如改善的药理学特征，同时增加或至少保留基本上所有未经修饰的肽与所需MHC分子结合和激活适当T细胞的生物活性。例如，抗原肽和多肽可进行各种变化，例如保守或非保守取代，其中此类变化可在其使用中提供某些优势，例如改进的MHC结合、稳定性或呈递。保守取代意指用生物和/或化学类似的另一氨基酸残基置换氨基酸残基(例如，一个疏水性残基置换另一个氨基酸残基，或一个极性残基置换另一氨基酸残基)。取代包括以下组合，例如Gly、Ala；Val、Ile、Leu、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；和Phe、Tyr。单氨基酸取代的效应也可使用D-氨基酸探测。此类修饰可使用熟知的肽合成程序进行，如例如Merrifield,Science 232:341-347(1986),Barany和Merrifield,The Peptides,Gross和Meienhofer编(N.Y.,Academic Press),第1-284页(1979)；以及Stewart和Young,Solid Phase PeptideSynthesis,(Rockford,Ill.,Pierce),第2版(1984)中所述。
肽和多肽用各种氨基酸模拟物或非天然氨基酸修饰可在提高肽和多肽的体内稳定性方面特别有用。稳定性可以多种方式加以测定。例如，肽酶和各种生物介质(例如人类血浆和血清)已用于测试稳定性。参见例如Verhoef等人,Eur.J.Drug MetabPharmacokin.11:291-302(1986)。肽的半衰期可使用25％人类血清(v/v)测定方便地确定。方案一般如下。汇集的人类血清(AB型，非热灭活)在使用之前通过离心去脂。血清然后用RPMI组织培养基稀释至25％并用于测试肽稳定性。在预定时间间隔下，移出少量反应溶液并添加至6％三氯乙酸或乙醇水溶液中。将混浊的反应样品冷却(4℃)15分钟，并且然后旋转集结沉淀的血清蛋白质。然后使用稳定性特异性色谱条件通过反相HPLC来判定肽的存在。
肽和多肽可经修饰以提供除改进的血清半衰期以外的所需属性。例如，肽诱发CTL活性的能力可通过与含有至少一个能够诱发T辅助细胞响应的表位的序列连接来增强。免疫原性肽/T辅助细胞缀合物可通过间隔分子连接。间隔子通常由相对较小的中性分子(例如氨基酸或氨基酸模拟物)构成，其在生理条件下基本上不带电。间隔子通常选自例如Ala、Gly或非极性氨基酸或中性极性氨基酸的其他中性间隔子。应理解，任选存在的间隔子无需由相同残基组成，并且因此可为杂寡聚物或均寡聚物。当存在时，间隔子将通常是至少一个或两个残基，更通常是三至六个残基。或者，肽可在无间隔子的情况下连接到T辅助肽。
抗原肽可直接或经由在肽的氨基或羧基端处的间隔子连接到T辅助肽。抗原肽或T辅助肽的氨基端可被酰化。示例性T辅助肽包括破伤风类毒素830-843、流感307-319、疟疾环子孢子382-398和378-389。
蛋白质或肽可通过本领域技术人员已知的任何技术制造，包括经由标准分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽；从天然来源分离蛋白质或肽；或化学合成蛋白质或肽。先前已公开对应于各种基因的核苷酸和蛋白质、多肽和肽序列，并且可见于本领域普通技术人员已知的计算机化数据库中。一种此类数据库是位于美国国家卫生研究院(NationalInstitutes of Health)网站的国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)的Genbank和GenPept数据库。已知基因的编码区可使用本文所公开或本领域普通技术人员应知晓的技术扩增和/或表达。或者，蛋白质、多肽和肽的各种市售制剂是本领域技术人员已知的。
在另一方面，抗原包括编码抗原肽或其部分的核酸(例如多核苷酸)。多核苷酸可为例如DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA(例如mRNA)、单链和/或双链、或原生或稳定形式的多核苷酸，例如具有硫代磷酸骨架的多核苷酸，或其组合，并且其可含有或可不含内含子。另一方面提供一种能够表达多肽或其部分的表达载体。不同细胞类型的表达载体在本领域中已熟知并且无需过度实验便可选择。一般来说，DNA以适当定向插入至表达载体(例如质粒)中并以正确阅读框进行表达。如果需要，DNA可连接到由所需宿主识别的适当转录和翻译调节控制核苷酸序列，但此类控制件一般可用于表达载体中。载体然后经由标准技术引入至宿主中。指导可见于例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.中。
V.疫苗组合物
本文还公开了一种免疫原性组合物，例如疫苗组合物，其能够引起特异性免疫响应，例如HIV特异性免疫响应。疫苗组合物通常包含使用本文描述的方法选择的一种或多种抗原。
在一个方面，所述疫苗组合物包括一种抗原，其表位序列选自SEQ ID No:325-22349中的任一者。在其他方面，所述疫苗组合物包括多种抗原，其表位序列选自SEQ IDNo:325-22349中的任一者。在此类情形下，多种抗原中的至少两种可以是不同的肽。不同的多肽是指肽因长度、氨基酸序列或两者而异。
在一些方面，所述疫苗组合物包括一种或多种表位编码核酸序列。在一个方面，表位编码核酸序列是MHC I类表位编码核酸序列。每个表位编码核酸序列可编码具有选自SEQID No:325-22349中任一者的表位序列的抗原。
在一些方面，疫苗组合物可包含1至30种肽；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30种不同的肽；6、7、8、9、10、11、12、13或14种不同的肽；或12、13或14种不同的肽。在各种实施方案中，包含在疫苗组合物中的肽包括选自表35-45中所示的SEQ ID No:325-22349中的任一者的表位序列。肽可包括翻译后修饰。疫苗可包含1至100或更多种核苷酸序列；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多种不同的核苷酸序列；6、7、8、9、10、11、12、13或14种不同的核苷酸序列；或12、13或14种不同的核苷酸序列。疫苗可包含1至30种抗原序列；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多种不同的抗原序列；6、7、8、9、10、11、12、13或14种不同的抗原序列；或12、13或14种不同的抗原序列。疫苗可包含1至30种抗原编码序列；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多种不同的抗原编码序列；6、7、8、9、10、11、12、13或14种不同的抗原编码序列；或12、13或14种不同的抗原编码序列。在各种实施方案中，抗原编码序列编码的抗原包含选自表35-45中所示的SEQ ID No:325-22349中任一者的表位序列。
下文描述了选择待包括在疫苗组合物中的候选表位序列或抗原编码核酸序列的进一步细节。
在一个实施方案中，选择不同肽和/或多肽或编码其的核苷酸序列，使得肽和/或多肽能够与不同MHC分子(例如不同MHC I类分子和/或不同MHC II类分子)结合。在一些方面，一种疫苗组合物包含能够与最常出现的MHC I类分子和/或不同MHC II类分子缔合的肽和/或多肽的编码序列。因此，疫苗组合物可包含能够与至少2个优选的、至少3个优选的或至少4个优选的MHC I类分子和/或不同MHC II类分子缔合的不同片段。
疫苗组合物能够引起特异性细胞毒性T细胞响应和/或特异性辅助T细胞响应。
抗原还可包括于基于病毒载体的疫苗平台中，例如牛痘、禽痘、自我复制甲病毒、马拉巴病毒(marabavirus)、腺病毒(参见例如Tatsis等人,Adenoviruses,MolecularTherapy(2004)10,616-629)或慢病毒，包括(但不限于)第二、第三或杂交第二/第三代慢病毒和任一代的重组慢病毒，其设计成靶向特定细胞类型或受体(参见例如Hu等人,Immunization Del ivered by Lentiviral Vectors for Cancer and InfectiousDiseases,Immunol Rev.(2011)239(1):45-61；Sakuma等人,Lentiviral vectors:basicto translational,Biochem J.(2012)443(3):603-18；Cooper等人,Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containingthe human ubiquitin C promoter,Nucl.Acids Res.(2015)43(1):682-690；Zufferey等人,Self-Inactivating Lentivirus Vector for Safe and Efficient In Vivo GeneDelivery,J.Virol.(1998)72(12):9873-9880)。取决于上述基于病毒载体的疫苗平台的包装能力，这种方法可递送编码一个或多个抗原肽的一个或多个核苷酸序列。序列可侧接非突变序列，可由接头分开或者可在前面有一个或多个靶向亚细胞区室的序列(参见例如Gros等人,Prospective identification of antigen-specific lymphocytes in theperipheral blood of melanoma patients,Nat Med.(2016)22(4):433-8；Stronen等人,Targeting of cancer antigens with donor-derived T cell receptor repertoires,Science.(2016)352(6291):1337-41；Lu等人,Efficient identification of mutatedcancer antigens recognized by T cells associated with durable tumorregressions,Clin Cancer Res.(2014)20(13):3401-10)。在引入宿主后，经感染细胞表达抗原，从而引发针对肽的宿主免疫(例如CTL)响应。可用于免疫方案中的牛痘载体和方法描述于例如美国专利第4,722,848号中。另一种载体是卡介苗(Bacille Calmet te Guerin，BCG)。BCG载体描述于Stover等人(Nature 351:456-460(1991))中。根据本文描述，可用于抗原的治疗性施用或免疫接种的各种其他疫苗载体，例如伤寒沙门氏菌载体等，对于本领域技术人员将是显而易见的。
V.A.抗原疫苗序列选择
所选择的具有表位序列的候选抗原包括在基于抗原的疫苗中。在各种实施方案中，使用呈递模型选择候选抗原的表位序列，如下面参考呈递模型进一步详细描述的。在各种实施方案中，候选抗原的表位序列选自洛斯阿拉莫斯国家实验室的HIV数据库，例如洛斯阿拉莫斯最佳定义(“A-list”)CTL表位，108其通过引用整体并入。在各种实施方案中，候选抗原的表位序列是使用呈递模型来选择，所述呈递模型被用于评估来自洛斯阿拉莫斯最佳定义(“A-list”)CTL表位的表位序列。108尽管随后的描述是指在基于抗原的疫苗中包含抗原肽，但是本领域技术人员可理解，随后的描述可适用于在抗原盒中包含抗原编码核酸序列，其中所述抗原编码核酸序列编码这些抗原肽。下面讨论抗原盒的进一步细节。
在一个方面，可以为具有包括一个或多个特定HLA等位基因的单倍型的患者开发每种基于抗原的疫苗。因此，具有特定HLA的患者可使用针对特定HLA等位基因特定开发的基于抗原的疫苗进行治疗或接种。在一些方面，每种基于抗原的疫苗都是为具有包括特定HLA等位基因组合的单倍型的患者开发的。在一个实施方案中，已知HLA等位基因的特定组合由具有特定祖先血统的个体群体表达。因此，具有所述祖先血统的患者也可能表达HLA等位基因的组合，并因此可成为疫苗的候选者，所述疫苗包括可能由所表达的HLA等位基因组合呈递的抗原。在一些方面，可开发具有足够数量的抗原的基于抗原的疫苗，使得任何祖先血统的患者都可能呈递包含在基于抗原的疫苗中的抗原子集。换句话说，在基于抗原的疫苗中具有足够数量的抗原时，这种基于抗原的疫苗对任何患者都是有效的。
举例来说，可针对以下HLA等位基因中的任何一种或多种开发基于抗原的疫苗：A0101、A0201、A0203、A0204、A0205、A0206、A0207、A0208、A0301、A0302、A1101、A2301、A2402、A2501、A2601、A2602、A2603、A2901、A2902、A3001、A3002、A3004、A3101、A3201、A3301、A3303、A6801、A6802、B0702、B0801、B1301、B1302、B1401、B1402、B1501、B1502、B1503、B1510、B1513、B1801、B2702、B2705、B3501、B3502、B3503、B3508、B3512、B3701、B3801、B3901、B3906、B4001、B4002、B4006、B4102、B4402、B4403、B4405、B4601、B4801、B4901、B5001、B5101、B5401、B5501、B5502、B5601、B5701、B5801、C0102、C0202、C0302、C0303、C0304、C0401、C0501、C0602、C0701、C0702、C0704、C0801、C0802、C0803、C1203、C1402、C1403、C1502、C1601、C1602、C1604、C1701。包含在基于抗原的疫苗中的抗原可通过参考表35-45(例如，SEQ ID No:325-22349中的任一者)来选择，其中包含的抗原的每个相关表位序列是通过鉴定列出开发基于抗原的疫苗的特定HLA等位基因的行来选择的。值得注意的是，某些表位序列在多个HIV亚型中是不变的，因此出现在表35-45中的多个表中。在一些方面，用于包含在基于抗原的疫苗中的抗原可各自包括出现在表35-45中的多于一者中的表位序列。此外，可从经过验证的HIV表位列表中选择包含在基于抗原的疫苗中的抗原。经验证的HIV表位的实例可见于期刊文章“Best-Characterized HIV-1 CTL Epitopes:The 2013 Update”中(将经验证的HIV表位称为“表I-A-1中最佳定义的HIV CTL表位”)，所述文章特此通过引用整体并入。105经验证的HIV表位的其他实例可见于期刊文章“The 2019Optimal HIV CTL epitopes update:Growing diversity in epitope length and HLArestriction”中，所述文章特此通过引用整体并入本文。109
例如，参考表35的第一行，如果针对A2501 HLA等位基因开发基于抗原的疫苗，则可选择表位序列“DTIAIAVAGW(SEQ ID NO:756)”用于包含。这种基于抗原的疫苗可包括来自表35-45的额外表位序列，其与A2501 HLA等位基因共用一行。例如，参见表36，表位序列“DTIAVAVAEW(SEQ ID NO:2606)”可另外被选择用于包含在基于抗原的疫苗中。
在一些方面，可针对上述HLA等位基因的组合开发基于抗原的疫苗。例如，如果已知HLA等位基因的某些组合由受试者一起表达，则可针对所表达的HLA等位基因的组合开发基于抗原的疫苗。在一些方面，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个HLA等位基因包括在HLA等位基因的组合中。可通过参考表35-45来选择用于包含在基于抗原的疫苗中的抗原(例如，SEQ IDNo:325-22349中的任一者)，其中用于包含的抗原的每个相关表位序列是通过鉴定列出HLA等位基因组合中的任一个HLA等位基因的行来选择的。
在一个方面，可为感染、暴露于特定类别、类型或亚型HIV或易受特定类别、类型或亚型HIV感染的患者开发每种基于抗原的疫苗。因此，可用针对患者感染、暴露或易受感染的特定类别、类型或亚型HIV特别开发的基于抗原的疫苗对患者进行治疗或接种。
例如，可针对HIV的类别(例如，HIV-1或HIV-2)、类型(N组、O组或P组)或亚型(A1、A2、B、C、D、F1、F2、G、H、J或K)中的任一者开发基于抗原的疫苗。可通过参考表35-45来选择包含在基于抗原的疫苗中的抗原(例如，SEQ ID No:325-22349中的任一者)。
在各种实施方案中，针对HIV亚型A1开发的基于抗原的疫苗可包括一种或多种具有表35中所示的HIV表位序列的抗原(例如，SEQ ID NO:325-2165中的任一者)。
在各种实施方案中，针对HIV亚型A2开发的基于抗原的疫苗可包括一种或多种具有表36中所示的HIV表位序列的抗原(例如，SEQ ID NO:2166-4106中的任一者)。
在各种实施方案中，针对HIV亚型B开发的基于抗原的疫苗可包括一种或多种具有表37中所示的HIV表位序列的抗原(例如，SEQ ID NO:2166-4106中的任一者)。
在各种实施方案中，针对HIV亚型C开发的基于抗原的疫苗可包括一种或多种具有表38中所示的HIV表位序列的抗原(例如，SEQ ID NO:6242-8389中的任一者)。
在各种实施方案中，针对HIV亚型D开发的基于抗原的疫苗可包括一种或多种具有表39中所示的HIV表位序列的抗原(例如，SEQ ID NO:8930-10626中的任一者)。
在各种实施方案中，针对HIV亚型F1开发的基于抗原的疫苗可包括一种或多种具有表40中所示的HIV表位序列的抗原(例如，SEQ ID NO:10627-12810中的任一者)。
在各种实施方案中，针对HIV亚型F2开发的基于抗原的疫苗可包括一种或多种具有表41中所示的HIV表位序列的抗原(例如，SEQ ID NO:12811-15079中的任一者)。
在各种实施方案中，针对HIV亚型G开发的基于抗原的疫苗可包括一种或多种具有表42中所示的HIV表位序列的抗原(例如，SEQ ID NO:15080-17174中的任一者)。
在各种实施方案中，针对HIV亚型H开发的基于抗原的疫苗可包括一种或多种具有表43中所示的HIV表位序列的抗原(例如，SEQ ID NO:17175-19388中的任一者)。
在各种实施方案中，针对HIV亚型J开发的基于抗原的疫苗可包括一种或多种具有表44中所示的HIV表位序列的抗原(例如，SEQ ID NO:19389-21003中的任一者)。
在各种实施方案中，针对HIV亚型K开发的基于抗原的疫苗可包括一种或多种具有表45中所示的HIV表位序列的抗原(例如，SEQ ID NO:21004-22349中的任一者)。
在一个方面，可为患者开发每种基于抗原的疫苗，同时考虑以下两者：1)患者的HLA类型，包括一个或多个特定HLA等位基因的表达和2)患者感染、暴露或易暴露的HIV的特定类别、类型或亚型。举例来说，表达特定HLA等位基因并且暴露于或易暴露于HIV亚型的患者可用针对所述HIV亚型和所述患者所表达的HLA等位基因特别开发的基于抗原的疫苗进行治疗或接种。用于包含在基于抗原的疫苗中的抗原可通过参考表35-45之一来选择(例如，SEQ ID No:325-22349中的任一者)，其中用于包含的抗原的每个相关表位序列是通过鉴定列出特定HLA等位基因的所述表中的行来选择的。
例如，可针对HIV亚型A1和具有B4102 HLA等位基因的患者开发基于抗原的疫苗。参考表35，可选择具有表位序列“AEVVQKVTM(SEQ ID NO:1594)”的第一抗原和具有表位序列“AEVVQKVVM(SEQ ID NO:1595)”的第二抗原用于包含在基于抗原的疫苗中。这种基于抗原的疫苗可包括来自表35的另外的HIV表位序列(例如，SEQ ID NO:1594-1642中的任一者)，其与B4102 HLA等位基因共用一行。作为另一个实例，可为HIV亚型A2和具有B4001 HLA等位基因的患者开发基于抗原的疫苗。参考表36，可选择具有表位序列“TESNDTITL(SEQ IDNO:3424)”的第一抗原和具有表位序列“AEDPEREVL(SEQ ID NO:3425)”的第二抗原以包含在基于抗原的疫苗中。这种基于抗原的疫苗可包括来自表36的另外的HIV表位序列，其与B4001 HLA等位基因共用一行(例如，SEQ ID NO:3424-3458中的任一者)。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：325-328、2166-2178、4107-4113、6242-6248、8390-8397、10627-10633、12811-12820、15080-15086、17175-17184、19389-19396或21004-21009。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：329-353、2179-2200、4114-4134、6249-6270、8398-8415、10634-10654、12821-12850、15087-15107、17185-17213、19397-19420或21010-21031。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：354-403、2201-2248、4135-4177、6271-6315、8416-8474、10655-10700、12851-12912、15108-15155、17214-17264、19421-19463或21032-21064。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：404-469、2249-2326、4178-4261、6316-6400、8475-8558、10701-10768、12913-12994、15156-15214、17265-17349、19464-19518、21065-21117。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下中的任一者：470-526、2327-2379、6401-6450、8559-8626、10769-10822、12995-13056、15215-15263、17350-17405、19519-19570和21118-21161。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：527-565、2380-2421、6451-6492、8627-8671、10823-10867、10357-13098、15264-15292、17406-17448、19571-19604和21162-21192。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下中的任一者：566-587、2422-2438、6493-6509、8672-8689、10868-10887、13099-13125、15293-15307、17449-17473、19605-19618和21193-21205。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：588-630、2439-2477、6510-6548、8690-8733、10888-10931、13126-13179、15308-15336、17474-17512、19619-19649和21206-21233。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下中的任一者：631-650、2478-2501、6549-6573、8734-8761、10932-10969、13180-13224、15337-15354、17513-17543、19650-19665和21234-21247。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下中的任一者：651-682、2502-2541、6574-6618、8762-8809、10970-11026、13225-13290、15355-15396、17544-17603、19666-19697和21248-21274。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：683-726、2542-2583、6619-6668、8810-8862、11027-11087、13291-13370、15397-15451、17604-17652、19698-19726和21275-21309。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：727-741、2584-2593、6669-6685、8863-8871、11088-11103、13371-13385、15452-15465、17653-17667、19727-19738和21310-21317。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因A2301的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：742-755、2594-2605、6686-6698、8872-8885、11104-11116、13386-13397、15466-15479、17668-17679、19739-19750和21318-21323。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因A2402的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：756-769、2606-2622、6699-6711、8886-8903、11117-11132、13398-13414、15480-15505、17680-17693、19751-19760和21324-21333。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因2501的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：770-783、2623-2640、6712-6728、8904-8927、11133-11155、13415-13433、15506-15533、17694-17714、19761-19773和21334-21346。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因2601的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：784-790、2641-2652、6729-6739、8928-8937、11156-11168、13434-13446、1553-15550、17715-17723、19774-19782和21347-21353。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因2602的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：791-802、2653-2671、6740-6759、8938-8959、11169-11189、13447-13464、15551-15569、17724-17739、19783-19797和21354-21360。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因2603的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：803-814、2672-2679、6760-6768、8960-8976、11190-11195、13465-13474、15570-15588、17740-17751、19798-19808和21361-21366。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因A2901的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：815-828、2680-2698、6769-6784、8977-9000、11196-11210、13475-13493、15589-15612、17752-17773、19809-19821和21367-21376。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因A2902的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：829-842、2699-2707、6785-6793、9001-9012、11211-11216、13494-13501、15613-15617、17774-17781、19822-19828和21377-21383)。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因A3001的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：843-857、2708-2722、6794-6807、9013-9040、11217-11235、13502-13519、15618-15636、17782-17809、19829-19843和21384-21390)。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因A3002的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：858-864、2723-2728、6808-6817、9041-9060、11236-11246、13520-13530、15637-15649、17810-17828、19844-19850和21391-21393)。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因A3004的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：865-895、2729-2757、6818-6846、9061-9082、11247-11272、13531-13558、15650-15683、17829-17862、19851-19869和21394-21407)。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因A3101的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：896-899、2758-2761、6847-6850、9083-9091、11273-11275、13559-13567、15684-15688、17863-17870、19870-19874和21408-21409)。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因A3201的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：900-920、2762-2793、6851-6880、9092-9112、11276-11300、13568-13585、15689-15707、17871-17900、19875-19898和21410-21425。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因A3301的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：921-955、2794-2851、6881-6935、9113-9164、11301-11346、13586-13619、15708-15742、17901-17964、19899-19933和21426-21459。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因A3303的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：956-997、2852-2908、6936-6986、9165-9228、11347-11410、13620-13667、15743-15785、17965-18029、19934-19986和21460-24192。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因A6801的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：998-1032、2909-2946、6897-7037、9229-9292、11411-11461、13668-13715、15786-15828、18030-18068、19987-20027和24193-21523)。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因A6802的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1033-1050、2947-2969、7038-7065、9293-9312、11462-11485、13716-13738、15829-15849、18069-18091、20028-20038和21524-21540。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B0702的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1051-1066、2970-2984、7066-7078、9313-9325、11486-11497、13739-13752、15850-15862、18092-18112、20039-20051和21541-21549)。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B0801的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1067-1080、2985-2999、7079-7095、9326-9347、11498-11516、13753-13767、15863-15875、18113-18128、20052-20062和21550-21557)。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B1301的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1081-1117、3000-3052、7096-7140、9348-9406、11517-11557、13768-13821、15876-15923、18129-18178、20063-20093和21558-21593。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B1302的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1118-1125、3053-3058、7141-7145、9407-9411、11558-11562、13822-13827、15924-15931、18179-18185、20094-20098和21594-21599。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B1401的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1126-1139、3059-3070、7146-7159、9412-9418、11563-11574、13828-13837、15932-15943、18186-18197、20099-20109和21600-21606。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B1402的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1140-1192、3071-3111、7160-7211、9419-9481、11575-11633、13838-13895、15944-16001、18198-18259、20110-20141和21607-21635。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B1501的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1193-1220、3112-3135、7212-7247、9482-9501、11634-11670、13896-13937、16002-16036、18260-18300、20142-20165和21636-21656。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B1502的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1221-1245、3136-3152、7248-7273、9502-9526、11671-11693、13938-13968、16037-16065、18301-18324、20166-20179和21657-21669。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B1503的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1246-1266、3153-3178、7274-7296、9527-9548、11694-11722、13969-13995、16066-16083、18325-18352、20180-20200和21670-21689。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B1510的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1267-1270、3179-3183、7297-7300、9549-9551、11723-11725、13996-14005、16084-16091、18353-18358、20201-20205和21690-21692。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B1513的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1271-1286、3184-3203、7301-7328、9552-9565、11726-11742、14006-14024、16092-16107、18359-18375、20206-20224和21693-21705。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B1801的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1287-1304、3204-3225、7329-7355、9566-9594、11743-11756、14025-14048、16108-16135、18376-18408、20225-20241和21706-21716。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B2702的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1305-1319、3226-3234、7356-7370、9595-9610、11757-11771、14049-14063、16136-16145、18409-18422、20242-20254和21717-21723。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B2705的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1320-1338、3235-3260、7371-7405、9611-9641、11772-11812、14064-14095、16146-16186、18423-18463、20255-20279和21724-21745。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B3501的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1339-1349、3261-3272、7406-7424、9642-9661、11813-11833、14096-14112、16187-16205、18464-18482、20280-20291和21746-21754。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B3502的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1350-1373、3273-3298、7425-7457、9662-9697、11834-11877、14113-14148、16206-16238、18483-18513、20292-20316和21755-21772。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B3503的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1374-1386、3299-3309、7458-7477、9698-9719、11878-11899、14149-14166、16239-16256、18514-18538、20317-20331和21773-21786。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B3508的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1387-1405、3310-3326、7478-7498、9720-9744、11900-11930、14167-14185、16257-16280、18539-18560、20332-20344和21787-21799。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B3512的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1406-1425、3327-3338、7499-7512、9745-9757、11931-11944、14186-14196、16281-16291、18561-18572、20345-20359和21800-21808。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B3701的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1426-1451、3339-3367、7513-7533、9758-9782、11945-11970、14197-14219、16292-16310、18573-18599、20360-20381和21809-21828。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B3801的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1452-1476、3368-3391、7534-7551、9783-9802、11971-11992、14220-14242、16311-16323、18600-18619、20382-20395和21829-21844。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B3901的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1477-1499、3392-3423、7552-7571、9803-9831、11993-12020、14243-14277、16324-16349、18620-18653、20396-20411和21845-21861。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B3906的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1500-1527、3424-3458、7572-7614、9832-9867、12021-12057、14278-14309、16350-16384、18654-18686、20412-20431和21862-21888。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B4001的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1528-1576、3459-3497、7615-7665、9868-9913、12058-12110、14310-14359、16385-16431、18687-18736、20432-20460和21889-21924)。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B4002的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1577-1593、3498-3517、7666-7689、9914-9942、12111-12136、14360-14380、16432-16463、18737-18759、20461-20479和21925-21940。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B4006的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1594-1642、3518-3554、7690-7742、9943-9988、12137-12175、14381-14429、16437-16510、18760-18811、20480-20512和21941-21975。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B4102的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1643-1663、3555-3575、7743-7772、9989-10011、12176-12202、14430-14448、16510-16527、18812-18834、20513-20530和21976-21992。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B4402的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1664-1697、3576-3611、7773-7826、10012-10058、12203-12254、14449-14493、16528-16562、18835-18883、20531-20564和21993-22024。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B4403的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1698-1745、3612-3674、7827-7903、10059-10134、12255-12327、14494-14560、16563-16633、18884-18953、20565-20613和22025-22067。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B4405的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1746-1752、3675-3679、7904-7910、10135-10146、12328-12339、14561-14574、16634-16645、18954-18957、20614-20619和22068-22069。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B4601的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1753-1785、3680-3695、7911-7926、10147-10161、12340-12359、14575-14596、16646-16664、18958-18974、20620-20636和22070-22081。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B4801的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1786-1824、3696-3719、7927-7967、10162-10207、12360-12395、14597-14634、16665-16709、18975-19013、20637-20656和22082-22109。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B4901的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1825-1855、3720-3755、7968-8008、10208-10251、12396-12438、14635-14675、16710-16748、19014-19051、20657-20682和22110-22129。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B5001的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1856-1872、3756-3789、8009-8037、10252-10287、12439-12467、14676-14708、16749-16783、19052-19076、20683-20711和22130-22158。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B5101的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1873-1900、3790-3823、8038-8075、10288-10327、12468-12507、14709-14745、16784-16826、19077-19108、207120-20748和22159-22178。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B5401的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1901-1907、3824-3827、8076-8088、10328-10341、12508-12520、14746-14756、16827-16841、19109-19113、20749-20759和22179-22184。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B5501的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1908-1924、3828-3843、8089-8109、10342-10364、12521-12543、14757-14777、16842-16867、19114-19135、20760-20785和22185-22194。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B5502的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1925-1945、3844-3865、8110-8136、10365-10392、12544-12565、14778-14802、16868-16897、19136-19156、20786-20810和22195-22209。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B5601的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1946-1985、3866-3908、8137-8188、10393-10441、12566-12606、14803-14849、16898-16956、19157-19202、20811-20848和22210-22234。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B5701的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：1986-2019、3909-3942、8189-8218、10442-10467、12607-12632、14850-14873、16957-16992、19203-19232、20849-20875和22235-22252。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因B5801的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2020-2026、3943-3945、8219-8224、10468-10472、12633-12644、14874-14881、16993-16996、19233-19242、20876-20880和22253-22255。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C0102的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2027-2028、3946-3947、8225-8227、10473-10476、12645-12647、14882-14887、16997-16999、19243-19245、20881-20883和22256-22262。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C0202的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2029-2034、3948-3956、8228-8233、10477-10484、12648-12657、14888-14900、17000-17007、19246-19253、20884-20888和22263-22266。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C0302的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2035-2039、3957-3962、8234-8239、10485-10491、12658-12663、14901-14911、17008-17016、19254-19257、20889-20893和22267-22272。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C0303的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2040-2047、3963-3974、8240-8250、10492-10502、12664-12676、14912-14927、17017-17029、19258-19270、20894-20901和22273-22274。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C0304的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2048-2052、3975-3979、8251-8257、10503-10505、12677-12680、14928-14932、17030-17033、19271-19277、20902-20903和22275-22281。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C0401的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2053-2057、3980-3992、8258-8262、10506-10514、12681-12692、14933-14944、17034-17041、19278-19288、20904-20911和22282-22283。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C0501的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2058-2059、3993-3995、8263、10515-10518、12693-12697、14945-14948、17042-17045、19289-19290、20912-20913、22284-22295)。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C0602的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：8264和17046。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C0701的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2060、3996-3997、12698和14949)。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C0702的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2061、3998、10519和17047。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C0704的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2062-2079、3999-4013、8265-8274、10520-10533、12699-12721、14950-14974、17048-17069、19291-19304、20914-20923和22284-22295。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C0801的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2080-2088、4014-4031、8275-8288、10534-10545、12722-12739、14975-14987、17070-1076、19305-19321、20924-20929和22296-22300)。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C0802的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2089-2100、4032-4035、8289-8295、10546-10548、12740-12742、14988-14997、17077-17079、19322-19324、20930-20938和22301-22304。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C0803的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2101-2105、4036-4043、8296-8302、10549-10555、102743-12748、14998-15007、17080-17089、19325-19332、20939-20947和22305-22310。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C1203的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2106-2122、4044-4058、8303-8329、10556-10574、12749-12763、15008-15025、17090-17108、19333-19348、20948-20962和22311-22320。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C1402的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2123-2133、4059-4069、8330-8342、10575-10587、12764-12772 15026-15035、17109-17124、19349-19361、20963-20970和22321-22327。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C1403的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2134-2138、4070-4074、8343-8354、10588-10591、12773-12778、15036-15040、17125-17135、19362-19366、20971-20978和22328-22332。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C1502的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2139-2143、4075-4079、8355-8358、10592-10595、12779-12782、15041-15048、17136-17144、19367-19370、20979-20983和22333-22334。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C1601的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2144-2151、4080-4089、8359-8367、10596-10602、12783-12792、15049-15058、17145-17157、19371-19376、20984-20992和22335-22340。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C1602的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2152-2160、4090-4098、8368-8381、10603-10615、12793-12803、15059-15069、17158-17165、19377-19382、20994-20998和22341-22345。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C1604的患者。
在特定实施方案中，被选择用于包含在基于抗原的疫苗中的一种或多种HIV表位序列或由HIV表位编码序列编码的一种或多种HIV表位序列可包括以下SEQ ID NO中的任一者：2161-2165、4099-4106、8382-8389、10616-10626、12804-12810、15070-15079、17166-17174、19383-19388、20999-21003和22346-22349。这种基于抗原的疫苗可用于治疗表达HLA等位基因C1701的患者。
在各种实施方案中，可产生基于抗原的疫苗以包括至少一种HIV表位序列，或至少一种编码所述至少一种HIV表位序列的HIV表位编码序列，其经预测(例如，如呈递模型所预测)最有可能由HLA等位基因呈递。在各种实施方案中，基于抗原的疫苗可包括一种或多种HIV表位编码序列，其编码一种或多种选自以下SEQ ID NO中任一者的HIV表位序列：4178、4178和5329、5239、756、1594、3184、6851、6936、7773、10970、11027、11028、12508、13291、13768、13838、14597、14874、16634、20396、20480和21755。在各种实施方案中，基于抗原的疫苗可包括一种或多种选自以下SEQ ID NO中任一者的HIV表位序列：4178、4178和5329、5239、756、1594、3184、6851、6936、7773、10970、11027、11028、12508、13291、13768、13838、14597、14874、16634、20396、20480和21755。
在各种实施方案中，可针对特定的HIV亚型产生基于抗原的疫苗。例如，所有经选择的HIV表位均源自HIV亚型并且经预测由一种或多种HLA等位基因呈递。在各种实施方案中，经选择的表位来自HIV亚型B并且经预测由频繁表达的HLA等位基因(例如，A0101、A0201、A0301、A1101、A2301、A2402、B0702、B0801、B3501、B4001、B4402和B4403中的任一者)呈递。可针对HIV亚型B选择的示例性表位序列和相应的SEQ ID NO如下表1所示：
表1：候选表位序列
Figure BDA0003517553280000581
Figure BDA0003517553280000591
在各种实施方案中，基于抗原的疫苗可包括一种或多种选自SEQ ID NO:4113、4114、4115、4427、4439、4494、4495、4545、4561、4956、4968、4975、4982、5259、5261、5459、5460、5610、5643和5661的HIV表位序列。在各种实施方案中，基于抗原的疫苗可包括一种或多种HIV表位编码序列，所述序列编码一种或多种选自SEQ ID NO:4113、4114、4115、4427、4439、4494、4495、4545、4561、4956、4968、4975、4982、5259、5261、5459、5460、5610、5643和5661的HIV表位序列。在各种实施方案中，基于抗原的疫苗可包括二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九或二十种选自SEQ ID NO:4113、4114、4115、4427、4439、4494、4495、4545、4561、4956、4968、4975、4982、5259、5261、5459、5460、5610、5643和5661的HIV表位序列。在各种实施方案中，基于抗原的疫苗可包括二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九或二十种HIV表位编码序列，所述序列编码二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九或二十种选自SEQ ID NO:4113、4114、4115、4427、4439、4494、4495、4545、4561、4956、4968、4975、4982、5259、5261、5459、5460、5610、5643和5661的HIV表位序列。
V.B.抗原盒
“抗原盒”是指所选择的抗原或多个抗原与转录抗原并表达转录产物所必需的其他调控元件的组合。一个抗原或多个抗原可以允许转录的方式可操作地连接到调控组件。此类组件包括可驱动用病毒载体转染的细胞中的抗原表达的常规调控元件。因此，抗原盒还可含有所选择的启动子，其连接于所述抗原并用其他任选的调控元件定位在重组载体的经选择病毒序列内。盒可包括具有选自SEQ ID No:325-22349中任一者的表位序列的抗原。
有用的启动子可为组成型启动子或经调控(诱导型)启动子，其将能够控制有待表达的抗原的量。例如，合乎需要的启动子是巨细胞病毒立即早期启动子/增强子的启动子[参见例如Boshart等人,Cell,41:521-530(1985)]。另一种合乎需要的启动子包括劳斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒LTR启动子/增强子。另一种启动子/增强子序列是鸡细胞质β-肌动蛋白启动子[T.A.Kost等人,Nucl.Acids Res.,11(23):8287(1983)]。其他适合或合乎需要的启动子可由本领域技术人员选择。
抗原盒还可包括对病毒载体序列异源的核酸序列，包括提供转录物的有效聚腺苷酸化(poly(A)、poly-A或pA)的信号的序列和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。本发明的示例性载体中采用的普通poly-A序列是源自乳多泡病毒SV-40的poly-A序列。poly-A序列一般可在基于抗原的序列之后和在病毒载体序列之前插入盒中。普通内含子序列也可源自SV-40，并且被称为SV-40T内含子序列。抗原盒还可含有此类内含子，位于启动子/增强子序列与抗原之间。这些和其他普通载体元件的选择是常规的[参见例如Sambrook等人,“Molecular Cloning.A Laboratory Manual.”,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)和其中引用的参考文献]并且许多此类序列可从商业和工业来源以及Genbank获得。
抗原盒可具有一个或多个抗原。例如，给定盒可包括1-10、1-20、1-30、10-20、15-25、15-20、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个抗原。抗原可直接彼此连接。抗原也可利用接头彼此连接。抗原相对于彼此可处于任何方向，包括N至C或C至N。
如上陈述，抗原盒可定位于病毒载体中的任何经选择缺失的位点中，例如E1基因区缺失或E3基因区缺失的位点，以及可选择的其他位点。
抗原盒可使用下式描述以描述每个元件的有序序列，从5'至3'：
(Pa-(L5b-Nc-L3d)X)Z-(P2h-(G5e-Uf)Y)W-G3g
其中P和P2包含启动子核苷酸序列，N包含MHC I类表位编码核酸序列，L5包含5'接头序列，L3包含3'接头序列，G5包含编码氨基酸接头的核酸序列，G3包含编码氨基酸接头的至少一个核酸序列中的一者，U包含MHC II类抗原编码核酸序列，其中对于每个X，相应Nc是表位编码核酸序列，其中对于每个Y，相应Uf是抗原编码核酸序列。所述组合物和有序序列可进一步通过选择存在元件的数目来定义，例如其中a＝0或1，其中b＝0或1，其中c＝1，其中d＝0或1，其中e＝0或1，其中f＝1，其中g＝0或1，其中h＝0或1，X＝1至400，Y＝0、1、2、3、4或5，Z＝1至400，并且W＝0、1、2、3、4或5。
在一个实例中，存在的元件包括其中a＝0，b＝1，d＝1，e＝1，g＝1，h＝0，X＝10，Y＝2，Z＝1，和W＝1，其描述其中无其他启动子存在(即仅存在由RNA甲病毒骨架提供的启动子核苷酸序列)，存在20个MHC I类表位，每个N存在5'接头，每个N存在3'接头，存在2个MHCII类表位，存在连接两个MHC II类表位的接头，存在将两个MHC II类表位的5'端连接到最终MHC I类表位的3'接头的接头，并且存在将两个MHC II类表位的3'端连接到RNA甲病毒骨架的接头。将抗原盒的3'端连接到RNA甲病毒骨架的实例包括直接连接到由RNA甲病毒骨架提供的3'UTR元件(例如3'19-nt CSE)。将抗原盒的5'端连接到RNA甲病毒骨架的实例包括直接连接到26S启动子序列、甲病毒5'UTR、51-nt CSE或24-nt CSE。
其他实例包括：其中a＝1，描述其中存在除RNA甲病毒骨架所提供的启动子核苷酸序列以外的启动子；其中a＝1并且Z大于1，其中存在除RNA甲病毒骨架所提供的启动子核苷酸序列以外的多个启动子，其各自驱动1个或更多个不同MHC I类表位编码核酸序列的表达；其中h＝1，描述其中存在单独启动子以驱动MHC II类抗原编码核酸序列的表达；以及其中g＝0，描述MHC II类抗原编码核酸序列(如果存在)直接连接到RNA甲病毒骨架。
其他实例包括其中所存在的每个MHC I类表位可具有5'接头、3'接头，两者都不具有，或具有两者。在其中同一抗原盒中存在超过一种MHC I类表位的实例中，一些MHC I类表位可具有5'接头和3'接头两者，而其他MHC I类表位可具有5'接头、3'接头或两者均不具有。在其中同一抗原盒中存在超过一种MHC I类表位的其他实例中，一些MHC I类表位可具有5'接头或3'接头，而其他MHC I类表位可具有5'接头、3'接头或两者均不具有。
在其中同一抗原盒中存在超过一种MHC II类表位的实例中，一些MHC II类表位可具有5'接头和3'接头两者，而其他MHC II类表位可具有5'接头、3'接头或两者均不具有。在其中同一抗原盒中存在超过一种MHC II类表位的其他实例中，一些MHC II类表位可具有5'接头或3'接头，而其他MHC II类表位可具有5'接头、3'接头或两者均不具有。
启动子核苷酸序列P和/或P2可与RNA甲病毒骨架所提供的启动子核苷酸序列相同。例如，由RNA甲病毒骨架提供的启动子序列Pn和P2可各自包含26S次基因组启动子。启动子核苷酸序列P和/或P2可不同于RNA甲病毒骨架所提供的启动子核苷酸序列，以及可彼此不同。
5'接头L5可为原生序列或非天然序列。非天然序列包括但不限于AAY、RR和DPP。3'接头L3也可为原生序列或非天然序列。另外，L5和L3可两者均为原生序列，两者均为非天然序列，或者一者可为原生的并且另一者可为非天然的。对于每个X，氨基酸接头可为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个氨基酸长。对于每个X，氨基酸接头也可为至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、或至少30个氨基酸长。
对于每个Y，氨基酸接头G5可为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个氨基酸长。对于每个Y，氨基酸接头也可为至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、或至少30个氨基酸长。
氨基酸接头G3可为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个氨基酸长。G3也可为至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、或至少30个氨基酸长。
对于每个X，每个N可编码7-15个氨基酸长的MHC I类表位。对于每个X，每个N也可编码5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸长的MHC I类表位。对于每个X，每个N也可编码至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个氨基酸长的MHC I类表位。
V.C.抗原优先排序
可能有比疫苗技术可支撑的更多的候选抗原可用于疫苗包涵。另外，可保留关于抗原分析的各个方面的不确定性，并且候选疫苗抗原的不同特性之间可存在折衷。因此，可考虑整合式多维模型代替选择过程的每个步骤中的预定过滤器，将候选抗原置于具有至少以下轴的空间中并使用整合方法优化选择。
1.自身免疫或耐受性的风险(生殖系的风险)(自身免疫的风险较低通常是优选的)
2.测序伪影的概率(伪影的概率较低通常是优选的)
3.免疫原性的概率(免疫原性的概率较高通常是优选的)
4.呈递的概率(呈递的概率较高通常是优选的)
5.基因表达(较高表达通常是优选的)
6.HLA基因的覆盖率(参与抗原集合呈递的HLA分子数目较大可降低HIV经由HLA分子的下调或突变逃避免疫攻击的概率)
7.HLA类别的覆盖率(覆盖HLA-I和HLA-II两者可增加治疗响应的概率并降低HIV逃避的概率)
另外，任选地，如果预测抗原由对应于损失或失活的HLA等位基因的蛋白质呈递，则可从疫苗接种去除所述抗原的优先排序(例如排除所述抗原)。HLA等位基因损失可通过体细胞突变、杂合性缺失或基因座的同型接合缺失发生。用于检测HLA等位基因体细胞突变的方法是本领域中所熟知，例如(Shukla等人,2015)。用于检测体细胞LOH和同型接合缺失(包括HLA基因座)的方法同样被充分描述。(Carter等人,2012；McGranahan等人,2017；VanLoo等人,2010)。如果质谱数据表明所预测的抗原未被预测的HLA等位基因呈递，则还可去除抗原的优先排序。
V.D.甲病毒
V.D.1.甲病毒生物学
甲病毒是披膜病毒科的成员，并且是正义单链RNA病毒。成员通常分类为旧世界，例如辛德毕斯、罗斯河、马雅罗、基孔肯尼亚和塞姆利基森林病毒，或新世界，例如东部马脑炎、奥拉、摩根堡、或委内瑞拉马脑炎及其衍生病毒株TC-83(Strauss Microbrial Review1994)。天然甲病毒基因组通常约12kb长，其中前三分之二含有编码非结构蛋白(nsP)的基因，所述非结构蛋白形成用于病毒基因组自我复制的RNA复制复合物，并且最后三分之一含有编码用于病毒粒子产生的结构蛋白的亚基因组表达盒(Frolov RNA 2001)。
甲病毒的模型生命周期涉及数个不同步骤(Strauss Microbrial Review 1994,Jose Future Microbiol 2009)。在病毒附着于宿主细胞后，病毒粒子与内饮区室内的膜融合，导致基因组RNA最终释放至细胞溶质中。以正链定向并包含5'甲基鸟苷酸帽和3'polyA尾部的基因组RNA被翻译以产生形成复制复合物的非结构蛋白nsP1-4。在感染早期，正链然后由复合物复制成负链模板。在当前模型中，复制复合物随着感染进展被进一步加工，使得所得经加工的复合物转换成将负链转录成全长正链基因组RNA以及含有结构基因的26S亚基因组正链RNA。甲病毒的数个保守序列元件(CSE)已鉴定为可能在各种RNA复制步骤中起作用，包括：负链模板的正链RNA复制中的5'UTR的互补序列、基因组模板的负链合成复制中的51-nt CSE、负链的亚基因组RNA转录中的在nsP与26S RNA之间的接合区中的24-nt CSE、和正链模板的负链合成中的3'19-nt CSE。
在各种RNA物种复制后，病毒颗粒然后通常在病毒的天然生命周期中组装。26SRNA被翻译并且所得蛋白质经进一步加工以产生结构蛋白，其包括衣壳蛋白、糖蛋白E1和E2以及两个小多肽E3和6K(Strauss 1994)。发生病毒RNA的衣壳化，衣壳蛋白通常仅特异性针对所包装的基因组RNA，然后病毒粒子组装并在膜表面出芽。
V.D.2.作为递送载体的甲病毒
甲病毒(包括甲病毒序列、特征和其他元件)可用于产生基于甲病毒的递送载体(也称为甲病毒载体、甲病毒病毒载体、甲病毒疫苗载体、自我复制RNA(srRNA)载体或自扩增RNA(samRNA)载体)。甲病毒先前已被工程化以用作表达载体系统(Pushko 1997,Rheme2004)。甲病毒提供数种优势，特别是在可能需要异源抗原表达的疫苗环境中。由于在宿主细胞溶质中自我复制的能力，因此甲病毒载体一般能够在细胞内产生高拷贝数的表达盒，从而导致高水平的异源抗原产生。另外，载体一般是瞬时的，从而使得生物安全性得以提高以及减少对载体的免疫耐受性的诱导。与其他标准病毒载体(例如人类腺病毒)相比，公众通常还缺乏对甲病毒载体预先存在的免疫性。基于甲病毒的载体也通常导致对受感染细胞的细胞毒性响应。在一定程度上，细胞毒性在疫苗环境中对于适当引发对所表达的异源抗原的免疫响应可为重要的。然而，所需细胞毒性的程度可为平衡作用，并且因此已开发数种减毒甲病毒，包括VEE的TC-83病毒株。因此，本文所述的抗原表达载体的实例可利用甲病毒骨架，其允许高水平的抗原表达、引发对抗原的稳固免疫响应、不引发对载体本身的免疫响应，并且可以安全方式使用。此外，抗原表达盒可经设计以经由优化载体使用的甲病毒序列(包括但不限于源自VEE或其减毒衍生物TC-83的序列)而引发不同水平的免疫响应。
已使用甲病毒序列对数种表达载体设计策略进行工程化(Pushko 1997)。在一个策略中，甲病毒载体设计包括在结构蛋白基因下游插入26S启动子序列元件的第二拷贝，接着是异源基因(Frolov 1993)。因此，除天然非结构蛋白和结构蛋白之外，还产生表达异源蛋白的额外亚基因组RNA。在这种系统中，存在用于产生感染性病毒粒子的所有元件，并且因此可能发生在非感染细胞中表达载体的反复轮感染。
另一种表达载体设计利用辅助病毒系统(Pushko 1997)。在这种策略中，结构蛋白由异源基因代替。因此，在由仍完整的非结构基因介导病毒RNA的自我复制之后，26S亚基因组RNA提供异源蛋白的表达。传统上，表达结构蛋白的额外载体然后例如通过细胞系的共转染以反式供应，以产生感染性病毒。系统详细描述于USPN 8,093,021中，其出于所有目的通过引用整体并入本文。辅助载体系统提供限制形成感染性颗粒的可能性的益处，因此提高生物安全性。另外，辅助载体系统减小总载体长度，潜在提高复制和表达效率。因此，本文所述的抗原表达载体的实例可利用结构蛋白由抗原盒代替的甲病毒骨架，所得载体降低生物安全问题，同时由于整体表达载体尺寸减小而促进有效表达。
V.D.3.体外甲病毒产生
甲病毒递送载体一般是正义RNA多核苷酸。本领域中熟知的用于产生RNA的便利技术是体外转录(IVT)。在这种技术中，首先通过本领域技术人员熟知的技术产生所需载体的DNA模板，包括标准分子生物学技术，例如克隆、限制性消化、连接、基因合成和聚合酶链反应(PCR)。DNA模板在期望转录成RNA的序列的5'端处含有RNA聚合酶启动子。启动子包括(但不限于)噬菌体聚合酶启动子，例如T3、T7或SP6。DNA模板然后与适当RNA聚合酶、缓冲剂和核苷酸(NTP)一起温育。所得RNA多核苷酸可任选地经进一步修饰，包括(但不限于)添加5'帽结构，例如7-甲基鸟苷或相关结构，并且任选地修饰3'端以包括多聚腺苷酸(polyA)尾部。RNA可然后使用本领域中熟知的技术纯化，例如苯酚-氯仿提取。
V.D.4.经由脂质纳米粒子递送
在疫苗载体设计中考虑的一个方面是针对载体本身的免疫性(Riley 2017)。这可呈对载体本身(例如某些人类腺病毒系统)预先存在的免疫性形式，或呈在疫苗施用后对载体产生免疫性的形式。如果进行相同疫苗的多次施用(例如分开的初免和增强剂量)，或者如果使用相同疫苗载体系统递送不同抗原盒，则后者是重要的考虑因素。例如，如果那些载体被中和抗体靶向，则可能会降低外来载体的功效。
一个替代策略是使用纳米材料递送表达载体(Riley 2017)。重要的是，纳米材料媒介物可由非免疫原性材料制成并且一般避免引发对递送载体本身的免疫性。这些材料可包括(但不限于)脂质、无机纳米材料和其他聚合材料。脂质可为阳离子、阴离子或中性的。材料可为合成或天然来源的，并且在一些情况下是可生物降解的。脂质可包括脂肪、胆固醇、磷脂、脂质缀合物，包括(但不限于)聚乙二醇(PEG)缀合物(聚乙二醇化脂质)、蜡、油、甘油酯和脂溶性维生素。
脂质纳米粒子(LNP)是有吸引力的递送系统，因为脂质的两亲性使得能够形成膜和囊泡状结构(Riley 2017)。一般来说，这些囊泡通过吸收至靶细胞的膜中并且将核酸释放至细胞溶质中来递送表达载体。另外，LNP可经进一步修饰或官能化以有助于靶向特定细胞类型。LNP设计中的另一个考虑因素是靶向效率与细胞毒性之间的平衡。脂质组合物一般包括阳离子、中性、阴离子和两性脂质的限定混合物。在一些情况下，包括特定脂质以防止LNP聚集、防止脂质氧化、或提供有助于额外部分附着的功能性化学基团。脂质组合物可影响整体LNP大小和稳定性。在一个实例中，脂质组合物包含二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(MC3)和MC3样分子。MC3和MC3样脂质组合物可经配制以包括一种或多种其他脂质，例如PEG或PEG缀合的脂质、固醇或中性脂质。
直接暴露于血清的核酸载体(例如表达载体)可具有数种不期望的结果，包括核酸由血清核酸酶降解或游离核酸对免疫系统的脱靶刺激。因此，包封甲病毒载体可用于避免降解，同时还避免潜在的脱靶影响。在某些实例中，甲病毒载体完全包封在递送媒介物内，例如在LNP的含水内部。甲病毒载体包封在LNP内可通过本领域技术人员熟知的技术来进行，例如在微流体液滴生成装置上进行的微流体混合和液滴生成。此类装置包括(但不限于)标准T形接头装置或流动聚焦装置。在一个实例中，所需脂质制剂(例如含有MC3或MC3样的组合物)与甲病毒递送载体和其他所需药剂并行提供至液滴生成装置，使得递送载体和所需药剂完全包封在基于MC3或MC3样的LNP内部。在一个实例中，液滴生成装置可控制所产生的LNP的尺寸范围和尺寸分布。例如，LNP的尺寸可在1至1000纳米直径范围内，例如1、10、50、100、500或1000纳米。在液滴生成后，包封表达载体的递送媒介物可经进一步处理或修饰以使其准备用于施用。
V.E.黑猩猩腺病毒(ChAd)
V.E.1.用黑猩猩腺病毒递送病毒
用于递送一种或多种抗原的疫苗组合物可通过提供黑猩猩来源的腺病毒核苷酸序列、多种新颖载体和表达黑猩猩腺病毒基因的细胞系来产生。黑猩猩C68腺病毒(在本文中也称为ChAdV68)的核苷酸序列可用于抗原递送的疫苗组合物中(参见SEQ ID NO:1)。源自C68腺病毒的载体的使用进一步详细描述于USPN 6,083,716中，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
在另一方面，本文提供了包含黑猩猩腺病毒的DNA序列的重组腺病毒(例如C68)和以操作方式连接到引导其表达的调控序列的抗原盒。重组病毒能够感染哺乳动物细胞、优选人类细胞，并且能够在细胞中表达抗原盒产物。在这种载体中，原生黑猩猩E1基因和/或E3基因和/或E4基因可缺失。抗原盒可插入至这些基因缺失位点中的任一者中。抗原盒可包括抗原，针对其引发的免疫响应是所需的。
在另一方面，本文提供了一种经黑猩猩腺病毒(例如C68)感染的哺乳动物细胞。
在另一方面，提供了一种新颖的哺乳动物细胞系，其表达黑猩猩腺病毒基因(例如来自C68)或其功能片段。
在另一方面，本文提供了一种用于将抗原盒递送至哺乳动物细胞中的方法，其包括以下步骤：向细胞中引入有效量的已被工程化以表达抗原盒的黑猩猩腺病毒，例如C68。
另一方面提供了一种用于在哺乳动物宿主中引发免疫响应以治疗HIV的方法。所述方法可包括向宿主施用有效量的重组黑猩猩腺病毒，例如C68的步骤，所述重组黑猩猩腺病毒包含抗原盒，所述抗原盒编码免疫响应靶向的来自HIV的一个或多个抗原。
还公开了一种非猿猴哺乳动物细胞，其表达获自SEQ ID NO:1序列的黑猩猩腺病毒基因。所述基因可选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4和L5。
还公开了一种包含黑猩猩腺病毒DNA序列的核酸分子，所述黑猩猩腺病毒DNA序列包含获自SEQ ID NO:1序列的基因。所述基因可选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1的所述黑猩猩腺病毒E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4和L5基因。在一些方面，核酸分子包含SEQ ID NO:1。在一些方面，核酸分子包含SEQ ID NO:1序列，缺少选自由以下组成的组的至少一个基因：SEQ ID NO:1的E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4和L5基因。
还公开了一种载体，其包含获自SEQ ID NO:1的黑猩猩腺病毒DNA序列和可操作地连接到一个或多个调控序列的抗原盒，所述一个或多个调控序列引导所述盒在异源宿主细胞中的表达，任选地其中所述黑猩猩腺病毒DNA序列包含至少用于复制和病毒粒子衣壳化所必需的顺式元件，所述顺式元件侧接抗原盒和调控序列。在一些方面，黑猩猩腺病毒DNA序列包含选自由以下组成的组的基因：SEQ ID NO:1的E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4和L5基因序列。在一些方面，载体可缺乏E1A和/或E1B基因。
本文还公开了经本文公开的载体转染的宿主细胞，所述载体例如被工程化以表达抗原盒的C68载体。本文还公开了经由将本文公开的载体引入细胞中而表达其中引入的所选择基因的人类细胞。
本文还公开了一种用于将抗原盒递送至哺乳动物细胞的方法，所述方法包括向所述细胞中引入有效量的本文公开的载体，例如被工程化以表达抗原盒的C68载体。
本文还公开了一种用于产生抗原的方法，所述方法包括将本文公开的载体引入哺乳动物细胞中，在适合的条件下培养细胞并产生抗原。
V.E.2.表达E1的互补细胞系
为了产生缺失本文所述的基因中的任一者的重组黑猩猩腺病毒(Ad)，缺失基因区的功能如果对于病毒的复制和感染性必不可少，则可通过辅助病毒或细胞系(即互补或包装细胞系)供应至重组病毒。例如，为了产生复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，可使用表达人类或黑猩猩腺病毒的E1基因产物的细胞系；这种细胞系可包括HEK293或其变体。可遵循产生表达黑猩猩E1基因产物的细胞系的方案(USPN 6,083,716的实施例3和4)，以产生表达任何所选择的黑猩猩腺病毒基因的细胞系。
AAV增强测定可用于鉴定表达黑猩猩腺病毒E1的细胞系。这种测定可用于鉴定通过使用例如来自其他物种的其他未表征的腺病毒的E1基因制备的细胞系中的E1功能。所述测定描述于USPN 6,083,716的实施例4B中。
所选择的黑猩猩腺病毒基因(例如E1)可在启动子的转录控制下用于在所选择的亲本细胞系中表达。诱导型或组成型启动子可用于此目的。在诱导型启动子中包括可由锌诱导的绵羊金属硫蛋白启动子，或可由糖皮质激素、特别是地塞米松(dexamethasone)诱导的小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子。其他诱导型启动子，例如通过引用并入本文的国际专利申请WO95/13392中所鉴定的那些诱导型启动子，还可用于产生包装细胞系。还可采用控制黑猩猩腺病毒基因表达的组成型启动子。
亲本细胞可经选择以产生表达任何所需C68基因的新颖细胞系。此类亲本细胞系可为(但不限于)HeLa[ATCC登录号CCL 2]、A549[ATCC登录号CCL 185]、KB[CCL 17]、Detroit[例如Detroit 510、CCL 72]和WI-38[CCL 75]细胞。其他适合的亲本细胞系可获自其他来源。亲本细胞系可包括CHO、HEK293或其变体、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6或AE1-2a。
表达E1的细胞系可用于产生重组黑猩猩腺病毒E1缺失的载体。使用基本上相同的程序构建的表达一种或多种其他黑猩猩腺病毒基因产物的细胞系用于产生缺失编码那些产物的基因的重组黑猩猩腺病毒载体。另外，表达其他人类Ad E1基因产物的细胞系还可用于产生黑猩猩重组Ad。
V.E.3.作为载体的重组病毒颗粒
本文公开的组合物可包含病毒载体，其将至少一种抗原递送至细胞。此类载体包含黑猩猩腺病毒DNA序列(例如C68)和可操作地连接到引导盒表达的调控序列的抗原盒。C68载体能够在经感染的哺乳动物细胞中表达盒。C68载体可功能性缺失一个或多个病毒基因。抗原盒包含至少一个在一个或多个调控序列(例如启动子)控制下的抗原。任选的辅助病毒和/或包装细胞系可向黑猩猩病毒载体供应缺失的腺病毒基因的任何必需产物。
术语“功能性缺失”意指去除或以其他方式改变(例如通过突变或修饰)足够量的基因区，使得基因区不再能够产生一种或多种基因表达的功能性产物。可导致功能性缺失的突变或修饰包括但不限于无义突变，例如引入提前终止密码子和去除典型和非典型的起始密码子，改变mRNA剪接或其他转录加工的突变，或其组合。如果需要，可去除整个基因区。
形成本文公开的载体的核酸序列的修饰，包括序列缺失、插入和其他突变，可使用标准分子生物学技术产生并且在本发明的范围内。
V.E.4.病毒质粒载体的构建
黑猩猩腺病毒C68载体包括重组缺陷型腺病毒，即在E1a或E1b基因中功能性缺失并且任选地携带其他突变(例如其他基因中的温度敏感性突变或缺失)的黑猩猩腺病毒序列。预期这些黑猩猩序列也可用于形成来自其他腺病毒和/或腺相关病毒序列的杂交载体。由人类腺病毒制备的同源腺病毒载体描述于公开文献中[参见例如上文所引用的KozarskyI和II，和其中引用的参考文献，美国专利第5,240,846号]。
在构建可用于将抗原盒递送至人类(或其他哺乳动物)细胞的有用黑猩猩腺病毒C68载体时，可将一系列腺病毒核酸序列用于载体。包含最小黑猩猩C68腺病毒序列的载体可与辅助病毒结合使用以产生感染性重组病毒颗粒。辅助病毒提供最小黑猩猩腺病毒载体的病毒感染性和繁殖所需的基本基因产物。当在另外的功能性病毒载体中仅产生黑猩猩腺病毒基因的一个或多个所选择的缺失时，可通过在所选择的包装细胞系中繁殖病毒而在病毒载体生产过程中供应缺失的基因产物，所述包装细胞系提供反式缺失的基因功能。
V.E.5.重组最小腺病毒
最小的黑猩猩Ad C68病毒是仅含有复制和病毒粒子衣壳化所必需的腺病毒顺式元件的病毒颗粒。也就是说，载体含有腺病毒的顺式作用5'和3'反向末端重复(ITR)序列(其充当复制起点)和原生5'包装/增强子结构域(其含有用于包装线性Ad基因组所必需的序列和E1启动子的增强子元件)。参见例如在国际专利申请WO96/13597中所描述并通过引用并入本文的用于制备“最小”人类Ad载体的技术。
V.E.6.其他缺陷型腺病毒
重组复制缺陷型腺病毒也可比最小黑猩猩腺病毒序列含有更多。这些其他Ad载体可通过病毒基因区的各个部分的缺失和通过任选地使用辅助病毒和/或包装细胞系形成的感染性病毒颗粒来表征。
作为一个实例，适合的载体可通过使C68腺病毒立即早期基因E1a和延迟早期基因E1b的全部或足够部分缺失来形成，从而消除其正常的生物功能。当在含有提供相应反式基因产物的功能性腺病毒E1a和E1b基因的黑猩猩腺病毒转化的互补细胞系上生长时，复制缺陷型E1缺失病毒能够复制并产生感染性病毒。基于已知腺病毒序列的同源性，预期正如本领域的人类重组E1缺失腺病毒，所得重组黑猩猩腺病毒能够感染许多细胞类型并且可表达抗原，但除非以极高感染倍率感染细胞，否则无法在不携带黑猩猩E1区DNA的大多数细胞中复制。
作为另一个实例，C68腺病毒延迟早期基因E3的全部或一部分可从形成重组病毒的一部分的黑猩猩腺病毒序列消除。
还可构建具有E4基因缺失的黑猩猩腺病毒C68载体。另一个载体可在延迟早期基因E2a中含有缺失。
还可在黑猩猩C68腺病毒基因组的晚期基因L1至L5中的任一者中获得缺失。类似地，中间基因IX和IVa2中的缺失可用于一些目的。可在其他结构性或非结构性腺病毒基因中获得其他缺失。
上述缺失可单独使用，即腺病毒序列可仅含有E1缺失。或者，可以任何组合使用有效破坏或降低其生物活性的完整基因或其部分的缺失。例如，在一个示例性载体中，腺病毒C68序列可缺失E1基因和E4基因，或缺失E1、E2a和E3基因，或缺失E1和E3基因，或在缺失或不缺失E3的情况下缺失E1、E2a和E4基因等等。如上文所论述，此类缺失可与其他突变(例如温度敏感性突变)组合使用，以达到所需结果。
包含一直或多种抗原的盒可任选地插入至黑猩猩C68 Ad病毒的任一缺失区中。或者，如果需要，可将盒插入至现有基因区中以破坏所述区的功能。
V.E.7.辅助病毒
取决于用于携带抗原盒的病毒载体的黑猩猩腺病毒基因含量，可使用辅助腺病毒或非复制性病毒片段来提供足够的黑猩猩腺病毒基因序列以产生含有所述盒的感染性重组病毒颗粒。
有用的辅助病毒含有所选择的腺病毒基因序列，其不存在于腺病毒载体构建体中和/或不由载体转染的包装细胞系表达。辅助病毒可为复制缺陷型并且除上述序列之外，还含有多种腺病毒基因。辅助病毒可与本文所述的表达E1的细胞系组合使用。
对于C68，“辅助”病毒可为通过用SspI剪切C68基因组的C末端形成的片段，其从病毒的左端去除约1300bp。这种经剪切的病毒然后与质粒DNA共转染至表达E1的细胞系中，由此通过与质粒中的C68序列同源重组形成重组病毒。
辅助病毒还可形成聚阳离子缀合物，如Wu等人,J.Biol.Chem.,264:16985-16987(1989)；K.J.Fisher和J.M.Wilson,Biochem.J.,299:49(1994年4月1日)中所述。辅助病毒可任选地含有报告子。许多此类报告子是本领域已知的。与腺病毒载体上的抗原盒不同，辅助病毒上报告子的存在允许独立地监测Ad载体和辅助病毒。这种第二报告子用于纯化后能够将所得重组病毒与辅助病毒分离。
V.E.8.病毒颗粒的组装和细胞系的感染
将腺病毒的经选择DNA序列、抗原盒和其他载体元件组装于各种中间质粒和穿梭载体中，以及使用质粒和载体制造重组病毒颗粒均可使用常规技术实现。此类技术包括cDNA的常规克隆技术、体外重组技术(例如吉布森组装(Gibson assembly))、腺病毒基因组的重叠寡核苷酸序列的使用、聚合酶链反应和提供所需核苷酸序列的任何适合的方法。采用标准转染和共转染技术，例如CaPO4沉淀技术或脂质体介导的转染方法，例如脂染胺。所采用的其他常规方法包括病毒基因组的同源重组、琼脂覆层中病毒的蚀斑、测量信号产生的方法等。
例如，在构建和组装所需含抗原盒的病毒载体之后，可在辅助病毒存在下将载体转染于包装细胞系中。同源重组发生在辅助序列与载体序列之间，其允许载体中的腺病毒-抗原序列被复制并包装至病毒粒子衣壳中，从而产生重组病毒载体粒子。
所得重组黑猩猩C68腺病毒可用于将抗原盒转移至所选择的细胞中。在使用包装细胞系中生长的重组病毒的体内实验中，E1缺失的重组黑猩猩腺病毒在将盒转移至非黑猩猩(优选人类)细胞中展现效用。
V.E.9.重组病毒载体的用途
所得含有抗原盒的重组黑猩猩C68腺病毒因此提供可在体内或离体将一种或多种抗原递送至受试者的有效基因转移媒介物。
上述重组载体根据基因疗法的公开方法施用于人类。携带抗原盒的黑猩猩病毒载体可施用于患者，优选悬浮于生物相容性溶液或药学上可接受的递送媒介物中，如本文所述。适合的媒介物包括无菌盐水。已知为药学上可接受的载剂并且为本领域技术人员所熟知的其他水性和非水性等渗无菌注射溶液以及水性和非水性无菌悬浮液可用于此目的。
黑猩猩腺病毒载体是以足以转导人类细胞并提供足够水平的抗原转移和表达的量施用，从而提供治疗益处而无过度不良效应或具有医学上可接受的生理效应，其可由医药领域的技术人员来确定。常规和药学上可接受的施用途径包括(但不限于)直接递送至肝脏、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、口服和其他肠胃外施用途径。如果需要，可组合施用途径。
病毒载体的剂量将主要取决于以下因素，例如所治疗的疾患、患者的年龄、体重和健康状况，并且因此可在患者当中变化。剂量将经调节以平衡治疗益处与任何副作用，并且此类剂量可根据采用重组载体的治疗应用而变化。可监测抗原表达水平以确定剂量施用频率。
重组复制缺陷型腺病毒可以“药学有效量”施用，即在施用途径中有效转染所需细胞并提供所选择的基因的足够表达水平以提供疫苗益处(即一些可测量的保护性免疫水平)的重组腺病毒的量。包含抗原盒的C68载体可与佐剂共同施用。佐剂可与载体分开(例如明矾)或在载体内编码，特别是在佐剂为蛋白质时。佐剂是本领域中所熟知的。
常规且药学上可接受的施用途径包括(但不限于)鼻内、肌肉内、气管内、皮下、皮内、经直肠、口服和其他肠胃外施用途径。如果需要，可组合或调整施用途径，取决于免疫原或疾病。例如，在狂犬病预防中，皮下、气管内和鼻内途径是优选的。施用途径主要将取决于所治疗的疾病的性质。
可监测对抗原的免疫水平以确定是否需要加强剂。例如，在评估血清中的抗体滴度后，可能需要任选的加强免疫。
V.F.药物组合物
疫苗组合物可为另外包含佐剂和/或载剂的药物组合物。有用的佐剂和载剂的实例在下文中给出。组合物可与载剂缔合，例如蛋白质或抗原呈递细胞，例如能够将肽呈递至T细胞的树突状细胞(DC)。
佐剂是混合至疫苗组合物中增加或以其他方式修饰对抗原的免疫响应的任何物质。载剂可为支架结构，例如能够与抗原缔合的多肽或多糖。任选地，佐剂是共价或非共价缀合的。
佐剂提高对抗原的免疫响应的能力通常显现为免疫介导性响应的显著或实质性增加或疾病症状的减少。例如，体液免疫的增强典型地显现为针对抗原所产生的抗体滴度的显著增大，并且T细胞活性的增强典型地显现为细胞增殖或细胞性细胞毒性或细胞因子分泌的增强。佐剂还可改变免疫响应，例如通过将主要体液或Th响应变为主要细胞或Th响应。
适合的佐剂包括(但不限于)1018ISS、明矾、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特(Imiquimod)、ImuFact IMP321、ISPatch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰基脂质A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel载体系统、PLG微粒、雷西莫特(resiquimod)、SRL172、病毒颗粒和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF捕获剂、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Aquila的源自皂素的QS21刺激子(Aquila Biotech,Worcester,Mass.,USA)、分支杆菌提取物和合成细菌细胞壁模拟物，以及其他专用佐剂，例如Ribi的Detox.Quil或Superfos。例如弗氏(Freund's)不完全或GM-CSF的佐剂是有用的。先前已描述对树突状细胞具有特异性的数种免疫佐剂(例如MF59)及其制备(Dupuis M等人,Cell Immunol.1998；186(1):18-27；Allison A C；Dev BiolStand.1998；92:3-11)。还可使用细胞因子。数种细胞因子已直接关联于：影响树突状细胞迁移至淋巴组织(例如TNF-α)、加速树突状细胞成熟变为T-淋巴细胞的有效抗原呈递细胞(例如GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国专利第5,849,589号，其通过引用整体明确并入本文)以及充当免疫佐剂(例如IL-12)(Gabrilovich D I等人,J Immunother Emphasis TumorImmunol.1996(6):414-418)。
还已报道CpG免疫刺激性寡核苷酸增强佐剂在疫苗环境中的效应。还可使用其他TLR结合分子，例如结合RNA的TLR 7、TLR 8和/或TLR 9。
有用佐剂的其他实例包括(但不限于)经化学修饰的CpG(例如CpR、Idera)、聚(I:C)(例如聚i:CI2U)、非CpG细菌DNA或RNA以及免疫活性小分子和抗体，例如环磷酰胺、舒尼替尼(sunitinib)、贝伐单抗(bevacizumab)、西乐葆(celebrex)、NCX-4016、西地那非(sildenafil)、他达拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、索拉菲尼(sorafinib)、XL-999、CP-547632、帕佐泮尼(pazopanib)、ZD2171、AZD2171、伊匹单抗、曲美单抗(tremelimumab)和SC58175，其可起治疗作用和/或充当佐剂。佐剂和添加剂的量和浓度可容易由本领域技术人员确定而无需过度实验。额外佐剂包括集落刺激因子，例如颗粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，沙格司亭(sargramostim))。
疫苗组合物可包含超过一种的不同佐剂。此外，治疗性组合物可包含任何佐剂物质，包括以上各者中的任一者或其组合。还预期，疫苗和佐剂可一起或以任何适当的顺序分开施用。
载剂(或赋形剂)可独立于佐剂存在。在一些方面，载剂与佐剂结合存在。载剂的功能可例如是增加分子量以提高活性或免疫原性、赋予稳定性、增加生物活性或增加血清半衰期。此外，载剂可辅助呈递肽至T细胞。载剂可为本领域技术人员已知的任何适合的载剂，例如蛋白质或抗原呈递细胞。载剂蛋白质可为(但不限于)匙孔螺血氰蛋白、血清蛋白质(例如转铁蛋白)、牛血清白蛋白、人类血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵白蛋白、免疫球蛋白或激素，例如胰岛素或棕榈酸。为了用于人类免疫接种，载剂一般是生理学上可接受的载剂，其为人类可接受的并且安全的。然而，破伤风类毒素和/或白喉类毒素是适合的载剂。或者，载剂可为葡聚糖，例如琼脂糖。
载剂的其他实例可为水性载剂，例如水、缓冲水、0.9％生理食盐水、0.3％甘氨酸、玻尿酸等。这些组合物可通过常规的熟知灭菌技术灭菌或可经无菌过滤。所得水溶液可经包装以按原样使用或冻干，冻干制剂在施用之前与无菌溶液组合。组合物可含有为接近生理条件而需要的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
细胞毒性T细胞(CTL)识别呈结合至MHC分子的肽形式而非完整外来抗原自身的抗原。MHC分子本身位于抗原呈递细胞的细胞表面上。因此，如果存在肽抗原、MHC分子和APC的三聚体复合物，则可能激活CTL。相应地，如果不仅将肽用于激活CTL，而且如果另外添加具有相应MHC分子的APC，则可加强免疫响应。因此，在一些实施方案中，疫苗组合物另外含有至少一种抗原呈递细胞。
在一些方面，任何上述组合物还包含纳米微粒递送媒介物。在一些方面，所述纳米微粒递送媒介物可以是脂质纳米粒子(LNP)或脂质体。在一些方面，所述LNP包含可电离氨基脂质。在一些方面，所述可电离氨基脂质包含MC3样(二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯)分子。在一些方面，所述纳米微粒递送媒介物包封抗原表达系统。
在一些方面，任何上述组合物还包含多个LNP，其中所述LNP包含：抗原表达系统；阳离子脂质；非阳离子脂质；和抑制LNP聚集的缀合脂质，其中所述多个LNP中至少约95％的LNP：具有非层状形态；或者是电子致密的。
在一些方面，所述非阳离子脂质是(1)磷脂和(2)胆固醇或胆固醇衍生物的混合物。
在一些方面，所述抑制LNP聚集的缀合脂质是聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。在一些方面，所述PEG-脂质缀合物选自由以下组成的组：PEG-二酰基甘油(PEG-DAG)缀合物、PEG二烷氧基丙基(PEG-DAA)缀合物、PEG-磷脂缀合物、PEG-神经酰胺(PEG-Cer)缀合物及其混合物。在一些方面，所述PEG-DAA缀合物是选自由以下组成的组的成员：PEG-二癸氧基丙基(C10)缀合物、PEG-二月桂氧基丙基(C12)缀合物、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基(C14)缀合物、PEG-二棕榈酰氧基丙基(C16)缀合物、PEG-二硬脂酰氧基丙基(C18)缀合物及其混合物。
在一些方面，所述抗原表达系统完全包封在LNP中。
在一些方面，所述LNP的非层状形态包括反六角形(HII)或立方相结构。
在一些方面，所述阳离子脂质占LNP中存在的总脂质的约10摩尔％至约50摩尔％。在一些方面，所述阳离子脂质占LNP中存在的总脂质的约20摩尔％至约50摩尔％。在一些方面，所述阳离子脂质占LNP中存在的总脂质的约20摩尔％至约40摩尔％。
在一些方面，所述非阳离子脂质占LNP中存在的总脂质的约10摩尔％至约60摩尔％。在一些方面，所述非阳离子脂质占LNP中存在的总脂质的约20摩尔％至约55摩尔％。在一些方面，所述非阳离子脂质占LNP中存在的总脂质的约25摩尔％至约50摩尔％。
在一些方面，所述缀合脂质占LNP中存在的总脂质的约0.5摩尔％至约20摩尔％。在一些方面，所述缀合脂质占LNP中存在的总脂质的约2摩尔％至约20摩尔％。在一些方面，所述缀合脂质占LNP中存在的总脂质的约1.5摩尔％至约18摩尔％。
在一些方面，大于95％的LNP具有非层状形态。在一些方面，大于95％的LNP是电子致密的。
在一些方面，任何上述组合物还包含多个LNP，其中所述LNP包含：阳离子脂质，其占LNP中存在的总脂质的50摩尔％至65摩尔％；抑制LNP聚集的缀合脂质，其占LNP中存在的总脂质的0.5摩尔％至2摩尔％；和非阳离子脂质，其包含：磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物，其中所述磷脂占LNP中存在的总脂质的4摩尔％至10摩尔％，并且所述胆固醇或其衍生物占LNP中存在的总脂质的30摩尔％至40摩尔％；磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物，其中所述磷脂占LNP中存在的总脂质的3摩尔％至15摩尔％，并且所述胆固醇或其衍生物占LNP中存在的总脂质的30摩尔％至40摩尔％；或LNP中存在的总脂质的高达49.5摩尔％，并包含磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物，其中所述胆固醇或其衍生物占LNP中存在的总脂质的30摩尔％至40摩尔％。
在一些方面，任何上述组合物还包含多个LNP，其中所述LNP包含：阳离子脂质，其占LNP中存在的总脂质的50摩尔％至85摩尔％；抑制LNP聚集的缀合脂质，其占LNP中存在的总脂质的0.5摩尔％至2摩尔％；和非阳离子脂质，其占LNP中存在的总脂质的13摩尔％至49.5摩尔％。
在一些方面，所述磷脂包含二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)或其混合物。
在一些方面，所述缀合脂质包含聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。在一些方面，所述PEG-脂质缀合物包含PEG-二酰基甘油(PEG-DAG)缀合物、PEG-二烷氧基丙基(PEG-DAA)缀合物或其混合物。在一些方面，所述PEG-DAA缀合物包含PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基(PEG-DMA)缀合物、PEG-二硬脂酰氧基丙基(PEG-DSA)缀合物或其混合物。在一些方面，所述缀合物的PEG部分具有约2,000道尔顿的平均分子量。
在一些方面，所述缀合脂质占LNP中存在的总脂质的1摩尔％至2摩尔％。
在一些方面，所述LNP包含具有式I结构的化合物：
Figure BDA0003517553280000741
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：L1和L2各自独立地是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-RaC(＝O)-、-C(＝O)Ra-、-RaC(＝O)Ra-、-OC(＝O)Ra-、-RaC(＝O)O-或直接键；G1是Ci-C2亚烷基、-(C＝O)-、-O(C＝O)-、-SC(＝O)-、-RaC(＝O)-或直接键；-C(＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)S-、-C(＝O)Ra-或直接键；G是C1-C6亚烷基；Ra是H或C1-C12烷基；R1a和R1b在每次出现时独立地是：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R1a是H或C1-C12烷基，并且R1b和其所结合的碳原子一起与相邻R1b和其所结合的碳原子一起形成碳碳双键；R2a和R2b在每次出现时独立地是：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R2a是H或C1-C12烷基，并且R2b和其所结合的碳原子一起与相邻R2b和其所结合的碳原子一起形成碳碳双键；R3a和R3b在每次出现时独立地是：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R3a是H或C1-C12烷基，并且R3b和其所结合的碳原子一起与相邻R和其所结合的碳原子一起形成碳碳双键；R4a和R4b在每次出现时独立地是：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R4a是H或C1-C12烷基，并且R4b和其所结合的碳原子一起与相邻R4b和其所结合的碳原子一起形成碳碳双键；R5和R6各自独立地是H或甲基；R7是C4-C20烷基；R8和R9各自独立地是C1-C12烷基；或者R8和R9与其所连接的氮原子一起形成5元、6元或7元杂环；a、b、c和d各自独立地是1至24的整数；并且x是0、1或2。
在一些方面，所述LNP包含具有式II结构的化合物：
Figure BDA0003517553280000742
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：L1和L2各自独立地是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或碳碳双键；R1a和R1b在每次出现时独立地是(a)H或C1-C12烷基，或(b)R1a是H或C1-C12烷基，并且R1b和其所结合的碳原子一起与相邻R1b和其所结合的碳原子一起形成碳碳双键；R2a和R2b在每次出现时独立地是(a)H或C1-C12烷基，或(b)R2a是H或C1-C12烷基，并且R2b和其所结合的碳原子一起与相邻R2b和其所结合的碳原子一起形成碳碳双键；R3a和R3b在每次出现时独立地是(a)H或C1-C12烷基，或(b)R3a是H或C1-C12烷基，并且R3b和其所结合的碳原子一起与相邻R3b和其所结合的碳原子一起形成碳碳双键；R4a和R4b在每次出现时独立地是(a)H或C1-C12烷基，或(b)R4a是H或C1-C12烷基，并且R4b和其所结合的碳原子一起与相邻R4b和其所结合的碳原子一起形成碳碳双键；R5和R6各自独立地是甲基或环烷基；R7在每次出现时独立地是H或C1-C12烷基；R8和R9各自独立地是未被取代的C1-C12烷基；或者R8和R9与其所连接的氮原子一起形成包含一个氮原子的5元、6元或7元杂环；a和d各自独立地是0至24的整数；b和c各自独立地是1至24的整数；并且e是1或2，其条件是：R1a、R2a、R3a或R4a中的至少一者是C1-C12烷基，或者L1或L2中的至少一者是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；并且R1a和R1b当a为6时不是异丙基或者当a为8时不是正丁基。
在一些方面，任何上述组合物还包含一种或多种赋形剂，所述赋形剂包含中性脂质、类固醇和聚合物缀合脂质。在一些方面，所述中性脂质包含1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)中的至少一种。在一些方面，所述中性脂质是DSPC。
在一些方面，所述化合物与所述中性脂质的摩尔比在约2:1至约8:1的范围内。
在一些方面，所述类固醇是胆固醇。在一些方面，所述化合物与胆固醇的摩尔比在约2:1至1:1的范围内。
在一些方面，所述聚合物缀合脂质是聚乙二醇化脂质。在一些方面，所述化合物与所述聚乙二醇化脂质的摩尔比在约100:1至约25:1的范围内。在一些方面，所述聚乙二醇化脂质是PEG-DAG、PEG聚乙烯(PEG-PE)、PEG-琥珀酰基-二酰基甘油(PEG-S-DAG)、PEG-cer或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯。在一些方面，所述聚乙二醇化脂质具有以下结构III：
Figure BDA0003517553280000751
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：R10和R11各自独立地是含有10至30个碳原子的直链或支链的饱和或不饱和的烷基链，其中所述烷基链任选地被一个或多个酯键中断；并且z具有30至60范围内的平均值。在一些方面，R10和R11各自独立地是具有12至16个碳原子的直链的饱和烷基链。在一些方面，平均z是约45。
在一些方面，所述LNP在与聚阴离子核酸混合时自组装成非双层结构。在一些方面，所述非双层结构的直径介于60nm和120nm之间。在一些方面，所述非双层结构的直径为约70nm、约80nm、约90nm或约100nm。在一些方面，其中纳米微粒递送媒介物具有约100nm的直径。
在一些方面，靶向配体可包括在脂质纳米粒子中。例如，所述靶向配体可并入脂质体中并且可包括对所需免疫系统细胞的细胞表面决定簇特异的抗体或其片段。
本文还公开了一种药物组合物，其包含本文公开的任何组合物(例如本文公开的基于甲病毒或基于ChAd的载体)和药学上可接受的佐剂和/或载剂。
VI.治疗方法
还提供了一种在受试者中诱导HIV特异性免疫响应，针对HIV接种疫苗(例如，预防性治疗)，通过向所述受试者施用一种或多种抗原例如使用本文公开的方法鉴定的多种抗原来治疗和或减轻受试者的HIV症状的方法。
在一些方面，受试者已被诊断患有HIV、处于感染HIV的风险中或处于暴露于HIV的风险中。受试者可以是人、狗、猫、马或其中需要HIV特异性免疫响应的任何动物。
可施用疫苗组合物，使得所述疫苗组合物中一种或多种抗原的量足以诱导CTL响应。
疫苗组合物可单独施用或与其他治疗剂组合施用。治疗剂是例如抗逆转录病毒药物，例如核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、融合抑制剂、进入抑制剂—CCr5共受体拮抗剂或HIV整合酶链转移抑制剂。
可确定待包含在疫苗组合物中的每种抗原的最佳量和最佳给药方案。例如，抗原或其变体可制备用于静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i.d.)注射、腹膜内(i.p.)注射、肌肉内(i.m.)注射、肠胃外、局部、经鼻、口服或局部施用。注射方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.。DNA或RNA注射方法包括i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.。其他施用疫苗组合物的方法是本领域技术人员已知的。
可将包含抗原的组合物施用于已经患有HIV的个体。在治疗应用中，组合物以足以引发对HIV抗原的有效CTL响应并治愈或至少部分阻止HIV的症状、并发症和/或进展的量向患者施用。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”。对这种用途有效的量将取决于例如组合物、施用方式、所治疗HIV的阶段和严重程度、患者的体重和一般健康状况、以及处方医师的判断。在一些情况下，可依序施用疫苗组合物，其中后续施用代表加强剂量。可进一步施用这种加强剂量直到至少症状基本上减轻并且持续一段时间。
疫苗可经编译以使得组合物中存在的抗原的选择、数目和/或量对于HIV的特定类别、类型或亚型是特异性的并且对于患者是特异性的。此外，选择可取决于疾病的状态(例如早期或晚期)、早期治疗方案、患者的免疫状态和患者的HLA单倍型。此外，根据特定患者的个人需要，疫苗可包含个性化组分。实例包括根据特定患者中抗原的表达来改变抗原的选择或在第一轮或治疗方案之后调整二次治疗。
VII.选择用于施用基于抗原的疫苗的受试者
可通过使用各种诊断方法将受试者鉴定为接受基于抗原的疫苗的候选者。参考图34，其描绘了根据一个实施方案的用于向受试者提供基于抗原的疫苗的流程3400。
在一个方面，用于抗原疫苗接种的患者选择是通过考虑受试者的HLA类型来进行的。在一个方面，通过考虑受试者暴露于或可能暴露于的HIV亚型来进行抗原疫苗接种的患者选择。在一些方面，通过考虑以下两者来进行抗原疫苗接种的患者选择：1)受试者的HLA类型和2)受试者暴露于或可能暴露于的HIV亚型。
作为一个实例，如果1)受试者携带经预测或已知呈递具有疫苗中包含的表位序列的抗原的HLA等位基因，并且2)受试者暴露于表达具有表位序列的抗原的HIV亚型，则所述受试者被视为合格的。作为另一个实例，如果1)受试者携带经预测或已知呈递具有疫苗中包含的表位序列的抗原的HLA等位基因，并且2)患者易暴露于表达具有表位序列的抗原的特定HIV亚型，则所述受试者被视为对于疫苗疗法是合格的。
VII.A.HLA肽的分离与检测
在步骤3410，确定受试者是否表达一种或多种HLA等位基因。在一个方面，所述一种或多种HLA等位基因是I类HLA等位基因、II类HLA等位基因、或I类和II类HLA等位基因。
在一个方面，确定受试者是否表达一种或多种HLA等位基因涉及基于群体的分析。更具体地，确定受试者是否表达一种或多种HLA等位基因包括确定受试者的起源并进一步鉴定已知由所述起源的个体群体普遍表达的一种或多种HLA等位基因。起源的实例可以是种族、地理位置、出生地或血统。在一个实施方案中，如果所述起源的个体表达HLA等位基因的几率大于95％，则认为所述HLA等位基因通常由所述起源的个体群体表达。在一些实施方案中，如果所述起源的个体表达HLA等位基因的几率大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％，则认为所述HLA等位基因通常由所述起源的个体群体表达。例如，受试者被确定为欧洲起源，并且已知欧洲起源的个体表达一种或多种HLA等位基因。因此，欧洲起源的受试者被确定为表达由欧洲起源的个体表达的已知的一种或多种HLA等位基因。基于起源的HLA等位基因的常见表达可见于可用的数据库如http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/ambig.html。
在一个方面，确定受试者是否表达一种或多种HLA等位基因涉及通过高通量测序或Sanger测序诊断方法鉴定患者的单倍型。示例性患者单倍型记录在表35-45中标题为“HLA等位基因”的列中。首先，使用经典的免疫沉淀(IP)方法对样品进行HLA-肽分子的分离。在一些方面，样品是组织样品并且在IP之前，组织样品被裂解和溶解。澄清的裂解物被用于HLA特异性IP。
免疫沉淀是使用与珠粒偶联的抗体来进行，其中抗体特异性针对HLA分子。对于泛I类HLA免疫沉淀，使用泛I类CR抗体；对于II类HLA-DR，使用HLA-DR抗体。在过夜温育期间，抗体共价连接到NHS-琼脂糖珠粒。在共价连接后，将珠粒洗涤并等分用于IP。免疫沉淀也可用未共价连接到珠粒的抗体来进行。这通常使用涂布有蛋白A和/或蛋白G的琼脂糖或磁性珠粒来完成，所述珠粒将抗体固定于柱。下文列出可用于选择性地富集MHC/肽复合物的一些抗体。
抗体名称 特异性
W6/32 I类HLA-A、B、C
L243 II类—HLA-DR
Tu36 II类—HLA-DR
LN3 II类—HLA-DR
Tu39 II类—HLA-DR、DP、DQ
将澄清的组织裂解物添加至抗体珠粒中进行免疫沉淀。在免疫沉淀后，从裂解物去除珠粒并且将裂解物储存用于额外实验，包括额外IP。洗涤IP珠粒以去除非特异性结合并且使用标准技术从珠粒洗脱HLA/肽复合物。使用分子量旋转柱或C18分级分离从肽去除蛋白质组分。所得肽通过SpeedVac蒸发变干并且在一些情况下在MS分析之前储存在-20C下。
干燥的肽在适于反相色谱的HPLC缓冲液中重构并装载于C-18微毛细管HPLC柱上，以便在Fusion Lumos质谱仪(Thermo)中梯度洗脱。在Orbitrap检测器中以高分辨率收集肽质量/电荷(m/z)的MS1谱，接着在所选择的离子的HCD片段化后，在离子阱检测器中收集MS2低分辨率扫描。另外，可使用CID或ETD片段化方法或三种技术的任何组合来获得MS2谱，以达到肽的更大的氨基酸覆盖率。MS2谱也可在Orbitrap检测器中以高分辨率质量精度测量。
使用Comet对来自每个分析的MS2谱进行蛋白质数据库搜索，并使用Percolator对肽鉴定进行评分。使用PEAKS studio(Bioinformatics Solutions Inc.)来进行额外测序，并且可使用其他搜索引擎或测序方法，包括频谱匹配和从头测序。
在一个方面，如果HLA等位基因具有至少0.5％的HLA频率，则认为受试者表达HLA等位基因。在一些方面，如果HLA等位基因具有至少1％、2％、3％、4％或5％的HLA频率，则认为受试者表达HLA等位基因。
VII.B.1.支持综合HLA肽测序的MS检测极限研究。
使用肽YVYVADVAAK(SEQ ID NO:94)，使用装载于LC柱上的不同量的肽确定检测极限。所测试的肽的量是1pmol、100fmol、10fmol、1fmol和100amol。(表2)结果示于图19A和图19B中。这些结果表明，最低检测极限(LoD)在埃摩尔范围(10-18)中，动态范围跨越五个数量级，并且信噪比足以在低飞摩尔范围(10-15)测序。
表2
肽m/z 装载于柱上 1e9个细胞中的拷贝数/细胞
566.830 1pmol 600
562.823 100fmol 60
559.816 10fmol 6
556.810 1fmol 0.6
553.802 100amol 0.06
VII.B.鉴定HIV亚型
回到图34，在步骤3420，鉴定受试者已经暴露于的HIV亚型或受试者易感的HIV亚型。
为了鉴定受试者已经暴露于的HIV亚型，从受试者获得测试样品。测试样品可以是血液、精液、晶状体液、脑脊髓液、唾液、滑液、腹膜液、羊水、组织或针吸液中的任一者。从测试样品中提取HIV分离物。在一个方面，提取包括通过离心从HIV分离物中分离测试样品中的细胞组分，并且HIV分离物可保留在上清液中。在一个方面，提取包括裂解和溶解测试样品。裂解物可进一步澄清(例如，离心/过滤)以获得HIV分离物。
可使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、斑点印迹测定、HIV斑点和梳状试验、免疫荧光试验或蛋白质印迹(Western blot)来检测HIV分离物中的HIV亚型。在一些方面，通过扩增HIV分离物中的病毒核酸(例如聚合酶链反应)来检测HIV分离物中的HIV亚型。HIV分离物与扩增试剂和一组引物混合以扩增特定HIV亚型的靶序列。然后可使用多种检测技术来检测扩增的靶序列。例如，靶序列暴露于探针将形成探针/序列产物，其可进一步被检测为存在特定HIV亚型的指示。用于检测特定HIV亚型的示例性引物和探针描述于WO 2003020878中，所述文献通过引用整体并入本文。
基于HIV亚型在患者的当前地理位置或患者未来计划的地理目的地的流行率，患者可能易暴露于特定HIV亚型。例如，如果患者位于或计划前往中非和东非国家，则所述患者可能易感染HIV亚型A1和A2。如果患者位于或计划前往西欧和中欧、北美或南美、澳大利亚或东南亚，则所述患者可能易感染HIV亚型B。如果患者位于或计划前往撒哈拉以南非洲、印度或巴西，则所述患者可能易感染HIV亚型C。如果患者位于或计划前往北非或中东，则所述患者可能易感染HIV亚型D。如果患者位于或计划前往南亚或东南亚，则所述患者可能易感染HIV亚型F1或F2。如果患者位于或计划前往西非或中非，则所述患者可能易感染HIV亚型G。如果患者位于或计划前往中非，则所述患者可能易感染HIV亚型H。如果患者位于或计划前往北非、中非或西非或加勒比地区，则所述患者可能易感染HIV亚型J。如果患者位于或计划前往刚果民主共和国或喀麦隆，则患者可能易感染HIV亚型K。
在一些实施方案中，不需要了解HIV亚型，因此不需要执行步骤3420。例如，如果疫苗包含足够的抗原，从而可预测所述疫苗对多种HIV亚型有效，则不需要确定该受试者的特定HIV亚型。
VII.C.候选患者
回到图34，在步骤3430，受试者被鉴定为接受基于抗原的疫苗的候选者。通常，如果受试者表达HLA等位基因(在步骤3410确定)并且已知或预测HLA等位基因可能呈递具有由所鉴定的HIV亚型表达的表位序列的HIV抗原(在步骤3420鉴定)，则所述受试者被鉴定为候选者。表35-45显示了HLA等位基因和表位序列的配对，其中一对中的每个HLA等位基因经预测呈递相应的表位序列。
在步骤3440，基于由受试者表达的HLA等位基因和所鉴定的HIV亚型选择基于抗原的疫苗。在一个方面，所述基于抗原的疫苗是一种个性化疫苗，其之前被开发1)用于表达HLA等位基因的受试者和2)用于特定的所鉴定的HIV亚型。例如，基于抗原的疫苗可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种已知由所鉴定的HIV亚型表达的表位，每个表位是已知或预测为可能由对应于受试者表达的HLA等位基因的蛋白质呈递。作为另一个实例，基于抗原的疫苗可包括编码抗原的抗原编码核酸序列，所述抗原包括表位序列。此类表位序列已知或预测为可能由对应于受试者表达的HLA等位基因的蛋白质呈递。
在步骤3450，将基于所选择抗原的疫苗施用于受试者。
在一些方面，流程3400中的步骤的顺序可不同于图34中所示的顺序。例如，可在确定受试者的一种或多种HLA等位基因的表达(步骤3410)之前鉴定HIV亚型(步骤3420)。
VII.D.选择用于施用基于抗原的疫苗的受试者的替代实施方案
参考图35，其描绘了根据第二个实施方案的用于向受试者提供基于抗原的疫苗的流程3500。鉴于HIV的高突变率，在一些情形下，源自HIV的蛋白质的特定表位序列可能会突变。在HIV感染受试者后，此类突变可能在HIV中出现。此外，这些突变的表位序列可能由受试者的HLA等位基因呈递。因此，图35描绘了用于向受试者提供个性化的基于抗原的疫苗的流程，其中所述基于抗原的疫苗包括具有对应于受试者先前暴露于的HIV的突变表位序列的抗原。
在步骤3510，确定受试者是否表达一种或多种HLA等位基因。类似于图34中所示的步骤3410，确定受试者是否表达一种或多种HLA等位基因涉及进行基于祖先群体的分析或涉及鉴定患者的单倍型。
在步骤3520，获得受试者暴露于的HIV的测序数据。在一个方面，可从受试者获得含有HIV的样品并且然后对HIV进行测序。举例来说，可从受试者的淋巴结获得样品，并且可根据上面标题为“鉴定HIV表位序列”的部分中描述的方法对HIV进行测序。
在步骤3530，选择候选表位序列以包含在基于抗原的疫苗中。为了鉴定候选表位序列，可将呈递模型应用于HIV的测序数据。下面更详细地描述呈递模型。在一些方面，候选表位序列包括从获得的HIV测序数据中鉴定的突变表位序列。此类突变表位序列可能不出现在表35-45中。在一些方面，候选表位序列包括表35-45中所示的任何表位序列(例如，SEQID No:325-22349中的任一者)。在一些方面，候选表位序列包括经验证的HIV表位序列。在一些方面，候选表位序列包括突变表位序列、表35-45中所示的表位序列(SEQ ID No:325-22349中的任一者)和经验证的HIV表位序列的任何组合。
在步骤3540，产生基于抗原的疫苗，所述疫苗包括经选择的候选表位序列。因此，所述基于抗原的疫苗是针对受试者的个性化疫苗，因为它包括突变表位序列，所述突变表位序列对感染受试者的HIV表达的突变表位序列具有特异性。
在步骤3550，将基于抗原的疫苗施用于受试者。
VIII.疫苗制造
还公开了一种制造基于抗原的疫苗的方法，所述方法包括进行本文公开的方法的步骤；以及生产包含多种抗原或多种抗原的子集的基于抗原的疫苗。
本文公开的抗原可使用本领域中已知的方法制造。例如，制备本文公开的抗原或载体(例如，包括至少一种编码一种或多种抗原的序列的载体)的方法可包括在适合表达所述抗原或载体的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码所述抗原或载体的至少一种多核苷酸，以及纯化所述抗原或载体。标准纯化方法包括色谱技术、电泳、免疫、沉淀、透析、过滤、浓缩和色谱聚焦技术。
宿主细胞可包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、酵母或HEK293细胞。宿主细胞可用一种或多种多核苷酸转化，所述一种或多种多核苷酸包含至少一种编码本文公开的抗原或载体的核酸序列，任选地其中经分离的多核苷酸还包含可操作地连接到编码抗原或载体的至少一种核酸序列的启动子序列。在某些实施方案中，经分离的多核苷酸可为cDNA。
IX.疫苗接种方案
疫苗接种方案可用于向受试者给与一种或多种抗原。可使用初免疫苗和加强疫苗对受试者进行给药。在各种实施方案中，初免疫苗可基于C68(例如，SEQ ID NO:1或2中所示的序列)或srRNA(例如，SEQ ID NO:3或4中所示的序列)，并且加强疫苗可基于C68(例如，SEQ ID NO:1或2中所示的序列)或srRNA(例如，SEQ ID NO:3或4中所示的序列)。在各种实施方案中，初免疫苗可基于甲病毒并且加强疫苗可基于甲病毒。在各种实施方案中，初免疫苗可基于C68并且加强疫苗可基于甲病毒。
每个载体通常包括包含抗原的盒。盒可包括约20种抗原，由例如通常围绕每个抗原的天然序列或其他非天然间隔区序列如AAY的间隔区分开。盒还可包括MHCII抗原，例如破伤风类毒素抗原和PADRE抗原，它们可被认为是通用II类抗原。盒还可包括靶向序列，例如泛素靶向序列。此外，每个疫苗剂量可与抗逆转录病毒药物如核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、融合抑制剂、进入抑制剂—CCr5共受体拮抗剂或HIV整合酶链转移抑制剂联合(例如，同时、之前或之后)施用于受试者。
初免疫苗可注射(例如肌肉内)于受试者。可使用每剂量双侧注射。例如，可使用一次或多次ChAdV68(C68)注射(例如总剂量1×1012个病毒颗粒)；可使用选自0.001至1ugRNA、特别是0.1或1ug范围的低疫苗剂量的一次或多次自我复制RNA(srRNA)注射；或者可使用选自1至100ug RNA、特别是10或100ug范围的高疫苗剂量的一次或多次srRNA注射。
可在初免疫苗接种之后注射(例如肌肉内)疫苗加强剂(加强疫苗)。加强疫苗可在初免后约每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周，例如每4周和/或8周施用。可使用每剂量双侧注射。例如，可使用一次或多次ChAdV68(C68)注射(例如总剂量1×1012个病毒颗粒)；可使用选自0.001至1ug RNA、特别是0.1或1ug范围的低疫苗剂量的一次或多次自我复制RNA(srRNA)注射；或者可使用选自1至100ug RNA、特别是10或100ug范围的高疫苗剂量的一次或多次srRNA注射。
免疫监测可在疫苗施用之前、期间和/或之后进行。这种监测可告知安全性和功效以及其他参数。
为了进行免疫监测，通常使用PBMC。PBMC可在初免疫苗接种之前和在初免疫苗接种之后(例如4周和8周)分离。PBMC可仅在加强疫苗接种之前和在每次加强疫苗接种之后(例如4周和8周)收集。
可评估T细胞响应作为免疫监测方案的一部分。可使用本领域中已知的一种或多种方法测量T细胞响应，例如ELISpot、细胞内细胞因子染色、细胞因子分泌和细胞表面捕捉、T细胞增殖、MHC多聚体染色或通过细胞毒性测定。针对疫苗中编码的表位的T细胞响应可通过使用ELISpot测定来测量细胞因子(例如IFN-γ)的诱导而从PBMC监测。针对疫苗中编码的表位的特异性CD4或CD8 T细胞响应可通过使用流式细胞术测量胞内或胞外捕捉的细胞因子(例如IFN-γ)的诱导而从PBMC监测。针对疫苗中编码的表位的特异性CD4或CD8T细胞响应可通过使用MHC多聚体染色测量表达特异性针对表位/MHC I类复合物的T细胞受体的T细胞群体而从PBMC监测。针对疫苗中编码的表位的特异性CD4或CD8 T细胞响应可通过在3H-胸苷、溴脱氧尿苷和羧基荧光素-二乙酸酯-琥珀酰亚胺酯(CFSE)并入后测量T细胞群的离体扩增而从PBMC监测。特异性针对疫苗中编码的表位的源自PBMC的T细胞的抗原识别能力和溶解活性可通过铬释放测定或替代性比色细胞毒性测定来功能性评估。
X.鉴定候选抗原
可使用计算预测模型来鉴定候选抗原，所述计算预测模型预测不同抗原被HLA等位基因呈递的可能性有多大。此类计算预测模型(也称为呈递模型或机器学习模型)的训练和部署将在以下部分中讨论。
X.A.呈递模型
呈递模型，也称为机器学习模型，可用于鉴定在患者中肽呈递的可能性。本领域技术人员已知各种呈递模型，例如在国际专利申请公开WO/2017/106638、WO/2018/195357、WO/2018/208856、WO2016187508、美国专利申请US20110293637和PCT/US19/33830中更详细描述的呈递模型，所述文献出于所有目的各自通过引用整体并入本文。
X.B.训练模块
训练模块可用于基于训练数据集构建一个或多个呈递模型，所述模型产生肽序列是否会被与所述肽序列相关联的MHC等位基因呈递的可能性。各种训练模块是本领域技术人员已知的，例如更详细地描述于国际专利申请公开WO/2017/106638、WO/2018/195357、WO/2018/208856和PCT/US19/33830中的呈递模型，所述文献出于所有目的各自通过引用整体并入本文。训练模块可在独立等位基因(per-allele)基础上构建呈递模型以预测肽的呈递可能性。训练模块也可在存在两种或更多种MHC等位基因的多等位基因环境中构建呈递模型以预测抗原的呈递可能性。
X.C.预测模块
预测模块可用于接收序列数据并使用呈递模型在序列数据中选择候选表位序列。具体地，序列数据可以是对应于HIV基因组的DNA序列、RNA序列和/或蛋白质序列。例如，序列数据可以是由HIV基因组中的基因编码的HIV表位序列(例如，长度为8-11个氨基酸残基)。
通常，呈递模块可应用一种或多种呈递模型来估计每个肽序列的呈递可能性。预测模块基于所估计的呈递可能性来选择一种或多种可能呈递在HLA分子上的候选表位序列。在一个实施方案中，呈递模块将呈递模型应用于表位序列以估计呈递可能性。在一些实施方案中，呈递模块将呈递模型应用于表位序列的编码表示以估计呈递可能性。这样的编码表示可以是肽序列的特征载体。呈递模型输出患者中抗原呈递的估计呈递可能性。
在一种实现方式中，呈递模块选择具有高于预定阈值的估计呈递可能性的候选表位序列。在另一种实现方式中，呈递模型选择具有最高估计呈递可能性的N个候选表位序列(其中N通常是可在疫苗中递送的表位的最大数量)。
在一些方面，呈递模块可通过分析包括候选表位序列的抗原结构而进一步对候选表位序列优先排序。例如，呈递模块可分析包括候选表位序列的HIV抗原的结构，以鉴定对HIV活性(例如，病毒复制/感染和逃避免疫系统的能力)具有高度影响的特定氨基酸残基或特定氨基酸残基的突变。具有这些已鉴定的特定氨基酸残基的表位序列可排名更高。示例性分析，也称为基于结构的网络分析，在“Structural topology defines protective CD8+ T cell epitopes in the HIV proteome”中进一步详细描述，所述文献特此通过引用整体并入。106
XI.盒设计模块
盒设计模块可基于所选择的候选肽产生疫苗盒序列。例如，所述盒设计模块可选择编码所选择的候选肽的抗原编码核酸序列，以包含在疫苗盒序列中。本领域技术人员已知各种盒设计模块，例如在国际专利申请公开WO/2017/106638、WO/2018/195357和WO/2018/208856中更详细描述的盒设计模块，所述文献出于所有目的各自通过引用整体并入本文。
可基于由预测模块确定的与超过预定阈值的呈递可能性相关联的所选肽产生治疗性表位集合，其中所述呈递可能性是由呈递模型确定。然而，应了解，在其他实施方案中，可基于多种方法中的任一种或多种(单独或组合形式)，例如基于针对患者的HLA I类或II类等位基因的结合亲和力或预测的结合亲和力、针对患者的HLA I类或II类等位基因的结合稳定性或预测的结合稳定性、随机取样等产生治疗性表位的集合。
治疗性表位可对应于自身选择的肽。除所选肽外，治疗性表位还可包括C末端和/或N末端侧接序列。N末端和C末端侧接序列可为治疗性疫苗表位在其源蛋白的背景下的原生N末端和C末端侧接序列。治疗性表位可表示固定长度的表位。治疗性表位可表示可变长度的表位，其中表位的长度可根据例如C-侧接序列或N-侧接序列的长度而改变。例如，C末端侧接序列和N末端侧接序列可各自具有2-5个残基的变化长度，由此产生16种可能的表位选择。
盒设计模块也可通过考虑横跨所述盒中一对治疗性表位之间的接合点的接合点表位的呈递来产生盒序列。接合点表位是由于在所述盒中串接治疗性表位和接头序列的过程而在所述盒中产生的新颖非自身但不相关的表位序列。接合点表位的新颖序列不同于所述盒的治疗性表位本身。
盒设计模块可产生降低在患者中呈递接合点表位的可能性的盒序列。具体来说，当将盒注射至患者体内时，接合点表位有可能被患者的I类HLA或II类HLA等位基因呈递，并且分别刺激CD8或CD4 T细胞响应。由于T细胞与接合点表位的响应没有治疗益处，并且可能因抗原竞争而减弱针对所述盒中所选治疗性表位的免疫响应，因此此类响应常常是不合需要的。76
盒设计模块可迭代一个或多个候选盒，并确定与盒序列相关联的接合点表位的呈递评分低于数字阈值的盒序列。接合点表位呈递评分是与所述盒中接合点表位的呈递可能性相关联的量，并且较高的接合点表位呈递评分值指示所述盒的接合点表位将由I类HLA蛋白或II类HLA蛋白或两者呈递的可能性较高。
在一个实施方案中，盒设计模块可确定候选盒序列中与最低接合点表位呈递评分相关联的盒序列。
盒设计模块可迭代一个或多个候选盒序列，确定候选盒的接合点表位呈递评分，并且鉴定与低于阈值的接合点表位呈递评分相关联的最佳盒序列。
盒设计模块可进一步检查所述一个或多个候选盒序列以鉴定候选盒序列中的接合点表位中的任一个是否是设计使用所述疫苗的给定患者的自身表位。为了实现此目的，盒设计模块针对已知数据库，例如BLAST检查接合点表位。在一个实施方案中，盒设计模块可被配置以设计避免接合点自身表位的盒。
盒设计模块可执行蛮力方法并且迭代所有或大部分可能的候选盒序列以选择具有最小接合点表位呈递评分的序列。然而，由于疫苗容量增加，此类候选盒的数量可能极大。例如，对于20个表位的疫苗容量，盒设计模块必须迭代约1018个可能的候选盒，才能确定具有最低接合点表位呈递评分的盒。对于盒设计模块在合理的时间量内完成以产生用于患者的疫苗而言，这种确定在计算上可能较为繁琐(就所需的计算处理资源而言)并且有时难以处理。另外，考虑到每个候选盒的可能接合点表位，甚至可能更繁琐。因此，盒设计模块可基于迭代明显少于蛮力方法中的候选盒序列数量的候选盒数量来选择盒序列。
盒设计模块可产生随机产生或至少伪随机产生的候选盒子集，并且选择与低于预定阈值的接合点表位呈递评分相关联的候选盒作为盒序列。另外，盒设计模块可从所述子集中选择具有最低接合点表位呈递评分的候选盒作为盒序列。例如，盒设计模块可针对20个所选表位的集合产生约1百万个候选盒的子集，并且选出具有最小接合点表位呈递评分的候选盒。尽管产生随机盒序列的子集并从所述子集中选出具有低接合点表位呈递评分的盒序列可能不如蛮力方法好，但其需要明显较少的计算资源，由此使其实施在技术上是可行的。另外，相对于这种更高效的技术，执行蛮力法可能仅引起接合点表位呈递评分的微小或甚至可忽略的改进，因此，从资源分配的观点看，蛮力法是不值得实施的。盒设计模块可通过将盒的表位序列用非对称旅行商问题(TSP)公式表示来确定改进的盒配置。根据节点列表和每对节点之间的距离，TSP确定与最短总距离相关联的节点的序列以访问每个节点恰好一次并返回至原始节点。例如，鉴于彼此之间距离已知的城市A、B和C，TSP的解决方案产生一个闭合的城市序列，对于所述序列，访问每个城市恰好一次所行进的总距离是可能途径当中最短的。TSP的非对称形式确定当一对节点之间的距离不对称时节点的最佳序列。例如，从节点A行进至节点B的“距离”可以不同于从节点B行进至节点A的“距离”。通过使用非对称TSP解决改进的最佳盒，盒设计模块可找到使所述盒的表位之间的接合点的呈递评分降低的盒序列。非对称TSP解决方案指示对应于应当在盒中串接表位以使所述盒的所有接合点的接合点表位呈递评分减到最小的次序的治疗性表位序列。相较于随机取样方法，通过这种方法确定的盒序列可产生具有明显较少接合点表位呈递的序列，同时可能需要明显较少的计算资源，尤其是在所产生的候选盒序列数量很大时。不同计算方法和用于优化盒设计的比较的说明性实例更详细地描述于国际专利申请公开WO/2017/106638、WO/2018/195357和WO/2018/208856中，所述文献出于所有目的各自通过引用整体并入本文。
XII.示例计算机
计算机可用于计算本文所述的方法中的任一者。本领域技术人员将认识到计算机可具有不同架构。计算机的实例是本领域技术人员已知的，例如更详细地描述于国际专利申请公开WO/2017/106638、WO/2018/195357和WO/2018/208856中的计算机，所述文献出于所有目的各自通过引用整体并入本文。
实施例
XIII.实施例1:抗原递送载体实施例
下文是执行本发明的特定实施方案的实施例。所述实施例仅出于说明性目的提供，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。已作出努力以确保所使用数字的精确性(例如，量、温度等)，但一些实验性误差和偏差应是允许的。
除非另外指明，否则本发明将采用本领域的技能范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学常规方法实施。在文献中充分解释此类技术。参见例如T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.，现行版)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版.(Plenum Press)第A卷和第B卷(1992)。
XIII.A.抗原盒设计
可通过疫苗接种递送诱导免疫响应的多个I类MHC限制性HIV特异性抗原。在一个实施例中，疫苗盒被工程化而以单一基因产物形式编码多个表位序列，其中所述表位是嵌入其天然的周围肽序列内或通过非天然接头序列隔开。鉴定出会潜在地影响抗原加工和呈递并因此影响TSNA特异性CD8 T细胞响应的量值和广度的若干设计参数。在本实施例中，设计和构建出若干模型盒以评价：(1)是否可针对并入单一表达盒中的多个表位产生稳定T细胞响应；(2)什么使得最佳接头置放于表达盒内的TSNA之间，引起所有表位的最佳加工和呈递；(3)所述表位在盒内的相对位置是否影响T细胞响应；(4)盒内表位的数量是否影响针对个别表位的T细胞响应的量值或质量；(5)添加细胞靶向序列是否改善T细胞响应。
产生两个读出结果以评价抗原呈递和对模型盒内的标志物表位具有特异性的T细胞响应：(1)基于体外细胞的筛选，其允许通过专门工程化的报告T细胞的活化进行衡量，来评估抗原呈递(Aarnoudse等人,2002；Nagai等人,2012)；以及(2)使用HLA-A2转基因小鼠(Vitiello等人,1991)，通过其相应表位特异性T细胞响应评估盒来源的人源表位的疫苗接种后免疫原性的体内测定(Cornet等人,2006；Depla等人,2008；Ishioka等人,1999)。
XIII.B.抗原盒设计评价
XIII.B.1.方法与材料
TCR和盒设计和克隆
当由A*0201等位基因的蛋白质呈递时，所选择的TCR识别肽NLVPMVATV(SEQ IDNO:95)(PDB#5D2N)、CLGGLLTMV(SEQ ID NO:96)(PDB#3REV)、GILGFVFTL(SEQ ID NO:97)(PDB#1OGA)LLFGYPVYV(SEQ ID NO:98)(PDB#1AO7)。构建含有2A肽连接的TCR亚基(β接着是α)、EMCV IRES和2A连接的CD8亚基(β接着是α和嘌呤霉素抗性基因)的转移载体。对开放阅读框序列进行密码子优化并由GeneArt合成。
产生用于体外表位加工和呈递研究的细胞系
肽是购自ProImmune或Genscript，在含10mM三(2-羧基乙基)膦(TCEP)的水/DMSO(2:8，v/v)中稀释至10mg/mL。除非另外指出，否则细胞培养基和补充剂是来自Gibco。热灭活胎牛血清(FBShi)是来自Seradigm。QUANTI-Luc底物、吉欧霉素(Zeocin)和嘌呤霉素是来自InvivoGen。将Jurkat-Lucia NFAT细胞(InvivoGen)维持在补充有10％FBShi、丙酮酸钠和100μg/mL吉欧霉素的RPMI 1640中。一旦转导后，这些细胞立即另外接受0.3μg/mL嘌呤霉素。在伊氏培养基(Iscove's Medium，IMDM)加20％FBShi中培养T2细胞(ATCC CRL-1992)。U-87MG(ATCC HTB-14)细胞是维持在补充有10％FBShi的MEM伊格尔培养基(MEM EaglesMedium)中。
Jurkat-Lucia NFAT细胞含有NFAT诱导型Lucia报告构建体。Lucia基因在通过接合T细胞受体(TCR)激活时，将利用腔肠素的荧光素酶分泌至培养基中。这种荧光素酶可使用QUANTI-Luc荧光素酶检测试剂测量。Jurkat-Lucia细胞经慢病毒转导以表达抗原特异性TCR。HIV源性慢病毒转移载体是从GeneCopoeia获得，并且表达VSV-G的慢病毒辅助质粒(support plasmid)(pCMV-VsvG)、Rev(pRSV-Rev)和Gag-pol(pCgpV)是从Cell DesignLabs获得。
通过使用40μl脂染胺和20μg DNA混合物(以重量计4:2:1:1的转移质粒:pCgpV:pRSV-Rev:pCMV-VsvG)，用脂染胺2000(Thermo Fisher)转染T75烧瓶中50-80％汇合的HEK293细胞，来制备慢病毒。使用Lenti-X系统(Clontech)浓缩8-10mL含病毒的培养基，并且使病毒重悬于100-200μl新鲜培养基中。使用此体积覆盖相等体积的Jurkat-Lucia细胞(在不同实验中使用5×10E4-1×10E6个细胞)。在含0.3μg/ml嘌呤霉素的培养基中培养之后，分选细胞以获得克隆性。使用装载肽的T2细胞测试这些Jurkat-Lucia TCR克隆的活性和选择性。
体外表位加工和呈递测定
常规地使用T2细胞，通过TCR检查抗原识别。T2细胞缺乏用于抗原加工的肽转运蛋白(TAP缺陷型)并且不能在内质网中装载内源性肽以在MHC上呈递。然而，T2细胞可轻易装载有外源肽。将五种标志物肽(NLVPMVATV(SEQ ID NO:99)、CLGGLLTMV(SEQ ID NO:100)、GLCTLVAML(SEQ ID NO:101)、LLFGYPVYV(SEQ ID NO:102)、GILGFVFTL(SEQ ID NO:103))和两种不相关肽(WLSLLVPFV(SEQ ID NO:104)、FLLTRICT(SEQ ID NO:105))装载于T2细胞上。简言之，对T2细胞计数并用IMDM加1％FBShi稀释至1×106个细胞/毫升。添加肽以产生10μg肽/1×106个细胞。然后在37℃下温育细胞90分钟。用IMDM加20％FBShi洗涤细胞两次，稀释至5×10E5个细胞/毫升并且将100μL涂铺至96孔Costar组织培养板中。对Jurkat-LuciaTCR克隆计数并且在RPMI 1640加10％FBShi中稀释至5×10E5个细胞/毫升，并且将100μL添加至T2细胞中。板在37℃、5％CO2下温育过夜。然后以400g将板离心3分钟并且将20μL上清液移至白色平底Greiner板。QUANTI-Luc底物是根据说明书制备的并以每孔50μL添加。在Molecular Devices SpectraMax iE3x上读取荧光素酶表达。
为了测试腺病毒盒的标志物表位呈递，使用U-87MG细胞作为替代抗原呈递细胞(APC)并用腺病毒载体转导。收集U-87MG细胞并以5×10E5个细胞/100μl涂铺于96孔Costar组织培养板中的培养基中。板在37℃温育约2小时。用MEM加10％FBShi将腺病毒盒稀释至MOI为100、50、10、5、1和0并且将其以每孔5μl添加至U-87MG细胞中。板在37℃下再温育约2小时。对Jurkat-Lucia TCR克隆计数并在RPMI加10％FBShi中稀释至5×10E5个细胞/毫升，并且将其以每孔100μL添加至U-87MG细胞中。板然后在37℃、5％CO2下温育约24小时。板以400g离心3分钟并且将20μL上清液移至白色平底Greiner板。QUANTI-Luc底物是根据说明书制备并且以每孔50μL添加。在Molecular Devices SpectraMax iE3x上读取荧光素酶表达。
用于免疫原性研究的小鼠品系
转基因HLA-A2.1(HLA-A2 Tg)小鼠是从Taconic Labs,Inc获得。这些小鼠携带由嵌合I类分子组成的转基因，所述嵌合I类分子包含人类HLA-A2.1前导序列、α1和α2结构域以及鼠类H2-Kbα3、跨膜和细胞质结构域(Vitiello等人,1991)。用于这些研究的小鼠是基于C57Bl/6背景的野生型BALB/cAnNTac雌性和同型接合HLA-A2.1 Tg雄性的第一代后代(F1)。
腺病毒载体(Ad5v)免疫接种
经由两侧肌肉内注射至胫前肌中对HLA-A2 Tg小鼠免疫接种1×1010至1×106个腺病毒载体病毒颗粒。在免疫接种后12天测量免疫响应。
淋巴细胞分离
从新鲜收集的经免疫接种小鼠的脾脏和淋巴结分离淋巴细胞。使用GentleMACS组织解离器，根据制造商的说明，在含有10％胎牛血清以及青霉素和链霉素的RPMI(完全RPMI)中解离组织。
离体酶联免疫斑点(ELISPOT)分析
ELISPOT分析是根据ELISPOT统一准则(Janetzki等人,2015)，利用小鼠IFNgELISpotPLUS试剂盒(MABTECH)进行。将1×105个脾细胞与10uM指定肽一起在包被有IFNg抗体的96孔板中温育16小时。使用碱性磷酸酶使斑点显色。对反应定时10分钟并通过用自来水流过板来猝灭反应。使用AID vSpot读取器谱图对斑点计数。对于ELISPOT分析，将饱和度>50％的孔记录为“太多而无法计数”。将重复孔的偏差>10％的样品从分析中排除。然后使用下式针对孔汇合校正斑点计数：斑点计数+2×(斑点计数×汇合％/[100％-汇合％])。通过用抗原刺激的孔减去阴性肽刺激孔中的斑点计数来校正阴性背景。最后，将标记为太多而无法计数的孔设定成最高观测校正值，四舍五入至最接近的百分数。
离体细胞内细胞因子染色(ICS)和流式细胞术分析
将2-5×106个细胞/毫升密度的新鲜分离的淋巴细胞与10uM指定肽一起温育2小时。两小时后，添加布雷菲尔德菌素A(brefeldin A)达到5ug/ml浓度并且将细胞与刺激剂一起再温育4小时。刺激后，用可固定的活力染料eFluor780，根据制造商的方案标记活细胞，并用以1:400稀释的抗CD8 APC(克隆53-6.7,BioLegend)染色。对于细胞内染色，使用1:100稀释的抗IFNg PE(克隆XMG1.2,BioLegend)。将样品收集在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Scientific)上。使用FlowJo标绘流式细胞术数据并分析。为了评估抗原特异性响应的程度，计算响应于每个肽刺激剂的IFNg+的CD8+细胞百分比和总IFNg+细胞数量/1×106个活细胞。
XIII.B.2.抗原盒设计的体外评价
作为抗原盒设计评价的实施例，开发基于体外细胞的测定以评估在模型疫苗盒内的所选人类表位是否经抗原呈递细胞表达、加工和呈递(图1)。在识别后，被工程化成表达五种对明确表征的肽-HLA组合具有特异性的TCR之一的Jurkat-Lucia报告T细胞变得活化并且将活化T细胞核因子(NFAT)易位至核中，引起荧光素酶报告子的转录活化。通过生物发光定量个别报告子CD8 T细胞系的抗原刺激。
通过用表达构建体转导慢病毒来改良个别Jurkat-Lucia报告细胞系，所述表达构建体包括通过P2A核糖体跳跃序列分离以确保等摩尔量翻译产物的抗原特异性TCRβ和TCRα链(Banu等人，2014)。将第二CD8β-P2A-CD8α元件添加至慢病毒构建体提供亲本报告细胞系缺乏的CD8辅助受体的表达，因为细胞表面上的CD8对于与目标pMHC分子的结合亲和力至关重要并通过其胞质尾接合增强信号传导(Lyons等人，2006；Yachi等人，2006)。
在慢病毒转导后，使Jurkat-Lucia报告子在嘌呤霉素选择下扩增，经历单细胞荧光辅助细胞分选(FACS)，并且测试单克隆群的荧光素酶表达。这得到具有功能性细胞响应的针对特定肽抗原1、2、4和5的稳定转导的报告细胞系。(表3A)。
表3A：体外T细胞活化测定的研究。如通过荧光素酶的诱导所测量的肽特异性T细胞识别指示疫苗盒抗原的有效加工和呈递。
短盒设计
表位 AAY
1 24.5±0.5
2 11.3±0.4
3* n/a
4 26.1±3.1
5 46.3±1.9
*尚未产生的针对表位3的报告T细胞
在另一个实施例中，将一系列短盒、所有标志物表位并入同一位置(图2A)中并且仅改变分离HLA-A*0201限制性表位的接头(图2B)。报告T细胞个别地与U-87抗原呈递细胞(APC)混合，所述抗原呈递细胞经表达这些短盒的腺病毒构建体感染，并且相对于未感染的对照测量荧光素酶表达。通过匹配报告T细胞识别模型盒中的全部四个抗原，展示多个抗原的有效加工和呈递。T细胞响应的量值在很大程度上遵循天然和AAY-接头的类似趋势。从基于RR-接头的盒释放的抗原显示较低荧光素酶诱导(表3B)。被设计以破坏抗原加工的DPP-接头制造引起较低表位呈递的疫苗盒(表3B)。
表3B：短盒中接头序列的评价。在体外T细胞活化测定中的荧光素酶诱导指示，除基于DPP的盒外，所有接头均有助于盒抗原的有效释放。仅T细胞表位(无接头)＝9AA，天然接头一侧＝17AA，天然接头两侧＝25AA，非天然接头＝AAY、RR、DPP
Figure BDA0003517553280000901
*尚未产生的针对表位3的报告T细胞
在另一个实施例中，构建另外一系列的短盒，所述盒除人类和小鼠表位外，还含有定位于所述盒的N或C末端上的靶向序列，例如泛素(Ub)、MHC和Ig-κ信号肽(SP)和/或MHC跨膜(TM)基序。(图3)。当通过腺病毒载体递送至U-87APC时，报告T细胞再次展示多个盒源性抗原的有效加工和呈递。然而，各种靶向特征对于T细胞响应的量值无明显影响(表4)。
表4：添加至模型疫苗盒的细胞靶向序列的评价。采用体外T细胞活化测定证实，四个HLA-A*0201限制性标志物表位从模型盒有效释放并且靶向序列没有明显改善T细胞识别和活化。
Figure BDA0003517553280000902
*尚未产生的针对表位3的报告T细胞
XIII.B.3.抗原盒设计的体内评价
作为抗原盒设计评价的另一个实施例，疫苗盒被设计以含有5个已知以HLA-A*02:01限制性方式刺激CD8 T细胞的明确表征的人类I类MHC表位(图2A、图3、图5A)。为了评价体内免疫原性，将含有这些标志物表位的疫苗盒并入腺病毒载体中并用于感染HLA-A2转基因小鼠。这种小鼠模型携带的转基因部分由人类HLAA*0201和小鼠H2-Kb组成，因此编码由人类HLA-A2.1前导序列、连接到鼠类α3的α1和α2结构域、跨膜和细胞质H2-Kb结构域组成的嵌合I类MHC分子(Vitiello等人,1991)。所述嵌合分子允许HLA-A*02:01限制性抗原呈递，同时维持CD8辅助受体与MHC上的α3结构域的物种匹配的相互作用。
对于短盒，所有标志物表位均产生比已通常报道者强大约10-50倍的T细胞响应，如通过IFN-γELISPOT所测定(Cornet等人,2006；Depla等人,2008；Ishioka等人,1999)。在评价的所有接头中，各自含有通过天然氨基酸序列侧接的最小表位的25聚体序列多联体产生最大且最广泛的T细胞响应(表5)。细胞内细胞因子染色(ICS)和流式细胞术分析揭示，抗原特异性T细胞响应是源自CD8 T细胞。
表5：短盒中接头序列的体内评价。ELISPOT数据指示，HLA-A2转基因小鼠在用1e11个腺病毒病毒颗粒感染后17天，针对盒中的所有I类MHC限制性表位产生T细胞响应。
Figure BDA0003517553280000911
在另一个实施例中，构建一系列长疫苗盒并将其并入腺病毒载体中，其紧邻着原始的5个标志物表位含有另外16个具有已知CD8 T细胞响应性的HLA-A*02:01、A*03:01和B*44:05表位(图4A、图4B)。这些长盒的尺寸近似地模仿最终临床盒设计，并且仅表位相对于彼此的位置是不同的。对于长疫苗盒与短疫苗盒，CD8 T细胞响应在量值和广度方面是相当的，证实(a)添加更多表位不会显著影响针对原始表位集合的免疫响应的量值，和(b)表位在盒中的位置基本上不影响随之而来的针对其的T细胞响应(表6)。
表6：有关长盒中表位位置的影响的体内评价。ELISPOT数据指示，对于长疫苗盒与短疫苗盒，HLA-A2转基因小鼠在用5e10个腺病毒病毒颗粒感染后17天，产生的T细胞响应的量值相当。
Figure BDA0003517553280000912
*疑似技术误差引起T细胞响应的缺乏。
XIII.B.4.用于免疫原性和毒理学研究的抗原盒设计
总体而言，有关模型盒评价的发现(图2-5，表2-6)证实，对于模型疫苗盒，当采用“串珠(string of beads)”法在基于腺病毒的载体的背景下编码约20个表位时，实现强力的免疫原性。表位通过串接25聚体序列组装，所述序列各自嵌入在两侧上通过其天然、周围肽序列(例如在每一侧上的8个氨基酸残基)侧接的最小CD8 T细胞表位(例如9个氨基酸残基)。如本文所用，“天然”或“原生”侧接序列是指给定表位在所述表位处于其源蛋白内的天然存在环境中的N和/或C末端侧接序列。例如，HCMV pp65 MHC I表位NLVPMVATV(SEQ IDNO:106)是通过原生5'序列WQAGILAR(SEQ ID NO:107)侧接于其5'端上并且通过原生3'序列QGQNLKYQ(SEQ ID NO:108)侧接于其3'端上，由此产生在HCMV pp65源蛋白内发现的25聚体肽WQAGILARNLVPMVATVQGQNLKYQ(SEQ ID NO:109)。天然或原生序列还可指编码通过原生侧接序列侧接的表位的核苷酸序列。每个25聚体序列是直接连接到随后的25聚体序列。在最小CD8 T细胞表位大于或小于9个氨基酸的实例中，侧接肽长度可经调整以使得总长度仍是25聚体肽序列。例如，10个氨基酸的CD8 T细胞表位可通过8个氨基酸的序列和7个氨基酸侧接。多联体后接着是两个通用的II类MHC表位，包括所述表位是为了刺激CD4 T辅助细胞和改善疫苗盒抗原的总体体内免疫原性。(Alexander等人,1994；Panina-Bordignon等人,1989)II类表位是通过GPGPG氨基酸接头(SEQ ID NO:56)连接到最终I类表位。所述两个II类表位也通过GPGPG(SEQ ID NO:110)氨基酸接头彼此连接以及通过GPGPG(SEQ ID NO:111)氨基酸接头侧接于C末端上。看起来，表位的位置和数量基本上不影响T细胞识别或响应。靶向序列似乎也基本上不影响盒源性抗原的免疫原性。
作为另一个实施例，基于用模型盒获得的体外和体内数据(图2-5，表2-6)，产生已知在非人类灵长类动物(NHP)、小鼠和人类中具有免疫原性的交替明确表征的T细胞表位的盒设计。所述全部嵌入天然25聚体序列中的20个表位之后是存在于所评价的所有模型盒中的两个通用II类MHC表位(图5A、图5B)。使用此盒设计在多个物种中研究免疫原性以及药理学和毒理学研究。
XIII.B.5.30、40和50个抗原的抗原盒设计和评价
设计具有30(L)、40(XL)或50(XXL)个表位的大抗原盒，各自长度为25个氨基酸。表位是用以模拟感染性疾病抗原的人类、NHP和小鼠表位的混合。图21说明了来自各种物种的表位的一般组织化。所使用的模型抗原分别针对人类、灵长类动物和小鼠模型表位描述于表7、表8和表9中。表7、表8和表9各自描述表位位置、名称、最小表位描述和MHC类别。
将这些盒克隆到如所描述的chAd68和甲病毒疫苗载体中以评价较长多表位盒的功效。图22显示，大抗原盒中的每一者从ChAdV载体表达，如通过蛋白质印迹由至少一个预期尺寸的主要条带指示。
如所描述对小鼠免疫接种以评价大盒的功效。针对表位AH1(上图)和SINNFEKL(SEQ ID NO:112)(下图)，通过以下分析T细胞响应：用chAd68载体免疫接种之后通过ICS和四聚体染色(分别为图23/表10和图24/表11)和用srRNA载体免疫接种之后通过ICS(图25/表12)。使用表达30(L)、40(XL)或50(XXL)个表位的chAd68和srRNA疫苗载体的免疫接种诱导对模型疾病表位的CD8+免疫响应。
表7-大盒中的人类表位(按列的顺序，分别为SEQ ID NO 174-203)
Figure BDA0003517553280000931
表8-大盒中的NHP表位(按列的顺序，分别为SEQ ID NO 204-233)
Figure BDA0003517553280000941
表9-大盒中的小鼠表位(按列的顺序，分别为SEQ ID NO 234-273)
Figure BDA0003517553280000951
表10：经ChAd大盒处理的小鼠中响应于AH1和SIINFEKL(SEQ ID NO:113)肽的平均IFNg+细胞。数据呈现为占总CD8细胞的百分比。显示了通过ANOVA以及图基检验获得的每组的平均值和标准偏差以及p值。所有p值均与MAG 20-抗原盒进行比较。
Figure BDA0003517553280000961
表11：经ChAd大盒处理的小鼠中对于AH1和SIINFEKL(SEQ ID NO:118)抗原的平均四聚体+细胞。数据呈现为占总CD8细胞的百分比。显示了通过ANOVA以及图基检验获得的每组的平均值和标准偏差以及p值。所有p值均与MAG 20-抗原盒进行比较。
Figure BDA0003517553280000962
表12：经SAM大盒处理的小鼠中响应于AH1和SIINFEKL(SEQ ID NO:123)肽的平均IFNg+细胞。数据呈现为占总CD8细胞的百分比。显示了通过ANOVA以及图基检验获得的每组的平均值和标准偏差以及p值。所有p值均与MAG 20-抗原盒进行比较。
Figure BDA0003517553280000963
Figure BDA0003517553280000971
XIV.实施例2：ChAd抗原盒递送载体
XIV.A.ChAd抗原盒递送载体构建
在一个实施例中，将黑猩猩腺病毒(ChAd)工程化成用于抗原盒的递送载体。在另一个实施例中，基于缺失E1(nt 457至3014)和E3(nt 27,816-31,332)序列的AC_000011.1(来自专利US 6083716的序列2)合成全长ChAdV68载体。插入处于CMV启动子/增强子控制下的报告子代替缺失的E1序列。将此克隆转染至HEK293细胞中不会产生感染性病毒。为了确认野生型C68病毒的序列，从ATCC获得分离株VR-594，传代，并且然后独立地测序(SEQ IDNO:10)。当将AC_000011.1序列与野生型ChAdV68病毒的ATCC VR-594序列(SEQ ID NO:10)相比较时，鉴定出6个核苷酸差异。在一个实施例中，基于相应ATCC VR-594核苷酸在五个位置被取代的AC_000011.1产生经修饰的ChAdV68载体(ChAdV68.5WTnt SEQ ID NO:1)。
在另一个实施例中，基于缺失E1(nt 577至3403)和E3(nt 27,816-31,332)序列并且相应ATCC VR-594核苷酸在四个位置被取代的AC_000011.1产生经修饰的ChAdV68载体。插入处于CMV启动子/增强子控制下的GFP报告子(ChAdV68.4WTnt.GFP；SEQ ID NO:11)或模型抗原盒(ChAdV68.4WTnt.MAG25mer；SEQ ID NO:12)代替缺失的E1序列。
在另一个实施例中，基于缺失E1(nt 577至3403)和E3(nt 27,125-31,825)序列并且相应ATCC VR-594核苷酸在五个位置被取代的AC_000011.1产生经修饰的ChAdV68载体。插入处于CMV启动子/增强子控制下的GFP报告子(ChAdV68.5WTnt.GFP；SEQ ID NO:13)或模型抗原盒(ChAdV68.5WTnt.MAG25mer；SEQ ID NO:2)代替缺失的E1序列。
相关载体在下文描述：
-全长ChAdVC68序列“ChAdV68.5WTnt”(SEQ ID NO:1)；相应ATCC VR-594核苷酸在五个位置被取代的AC_000011.1序列。
-ATCC VR-594C68(SEQ ID NO:10)；独立测序；全长C68
-ChAdV68.4WTnt.GFP(SEQ ID NO:11)；缺失E1(nt 577至3403)和E3(nt 27,816-31,332)序列；相应ATCC VR-594核苷酸在四个位置被取代；插入处于CMV启动子/增强子控制下的GFP报告子代替缺失的E1的AC_000011.1
-ChAdV68.4WTnt.MAG25mer(SEQ ID NO:12)；缺失E1(577至3403)和E3(nt27,816-31,332)序列；相应ATCC VR-594核苷酸在四个位置经取代；插入处于CMV启动子/增强子控制下的模型抗原盒代替缺失的E1的AC_000011.1
-ChAdV68.5WTnt.GFP(SEQ ID NO:13)；缺失E1(nt 577至3403)和E3(nt 27,125-31,825)序列；相应ATCC VR-594核苷酸在五个位置被取代；插入处于CMV启动子/增强子控制下的GFP报告子代替缺失的E1的AC_000011.1
XIV.B.ChAd抗原盒递送载体测试
XIV.B.1.ChAd载体评价方法和材料
使用脂染胺转染HEK293A细胞
使用以下方案，制备ChAdV68构建体(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25mer和ChAdV68.5WTnt.MAG25mer)的DNA并将其转染至HEK293A细胞中。
用PacI消化10μg质粒DNA以释放病毒基因组。然后使用GeneJet DNA清除微柱(Thermo Fisher)根据制造商对长DNA片段的说明来纯化DNA，并且在20ul经预加热的水中洗脱；在洗脱步骤之前将柱在37度下静置0.5-1小时。
在转染前，将HEK293A细胞以106个细胞/孔的细胞密度引入6孔板中，保持14-18小时。用每孔1ml新鲜培养基(含青霉素/链霉素和谷氨酸的DMEM-10％hiFBS)覆盖细胞。在根据制造商的方案，用微升体积(2-4ul)脂染胺2000两次转染中使用每孔1-2ug的纯化DNA。将0.5ml含有转染混合物的OPTI-MEM培养基添加至每个孔中的1ml标准生长培养基中并在细胞上保持过夜。
经转染的细胞培养物在37℃下温育至少5-7天。如果在转染后第7天未见到病毒蚀斑，则将细胞以1:4或1:6拆分，并且在37℃下温育以监测蚀斑的产生。或者，收集经转染的细胞并进行3个冷冻和解冻循环，并且使用细胞裂解物感染HEK293A细胞并温育细胞直至观测到病毒蚀斑。
使用磷酸钙将ChAdV68转染至HEK293A细胞中并产生第三代病毒原液
使用以下方案，制备ChAdV68构建体(ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP、ChAdV68.4WTnt.MAG25mer、ChAdV68.5WTnt.MAG25mer)的DNA并将其转染至HEK293A细胞中。
在转染前一天，将HEK293A细胞以106个细胞/孔接种于6孔板的5％BS/DMEM/1XP/S、1XGlutamax中。每次转染需要两个孔。在转染前二至四小时，将培养基更换成新鲜培养基。用PacI使ChAdV68.4WTnt.GFP质粒线性化。然后，用酚氯仿提取经线性化的DNA并使用十分之一体积的3M乙酸钠pH 5.3和两体积的100％乙醇使其沉淀。通过以12,000xg离心5分钟使沉淀的DNA成粒，然后用70％乙醇洗涤1次。将团粒空气干燥并重悬于50μL无菌水中。使用NanoDropTM(ThermoFisher)测定DNA浓度并将体积调整至5μg DNA/50μL。
将169μL无菌水添加至微量离心管中。然后将5μL 2M CaCl2添加至水并通过移液轻轻地混合。将50μL DNA滴加至CaCl2水溶液。然后添加26微升2M CaCl2并通过用微量移液管移液两次轻轻地混合。这种最终溶液应由在250μL 0.25M CaCl2中的5μg DNA组成。然后制备含有250μL 2XHBS(Hepes缓冲溶液)的第二管。使用连接到Pipet-Aid空气的2mL无菌移液管缓慢鼓泡通过2XHBS溶液。同时，以逐滴方式添加于0.25M CaCl2溶液中的DNA溶液。在添加最终DNA液滴之后，继续鼓泡约5秒。然后在室温下温育溶液达20分钟，然后添加至293A细胞中。将250μL DNA/磷酸钙溶液滴加至前一天以106个细胞/孔接种于6孔板中的293A细胞单层中。将细胞放回恒温箱中并温育过夜。24小时后更换培养基。72小时后，将细胞以1:6拆分至6孔板中。每天通过光学显微镜检查监测细胞单层的细胞病变效应(CPE)的迹象。转染后7-10天，观测到病毒蚀斑并通过用移液管移取孔中的培养基以使细胞升高来收集细胞单层。将收集的细胞和培养基转移至50mL离心管中，接着进行三轮冷冻解冻(在-80℃和37℃下)。随后的裂解物，称为初代病毒原液，通过在桌上型离心机(4300Xg)上全速离心来澄清并使用一部分裂解物(10-50％)感染T25烧瓶中的293A细胞。将感染的细胞温育48小时，然后在完全CPE下收集细胞和培养基。再次收集细胞，冷冻解冻并澄清，然后使用此第二代病毒原液感染以每个烧瓶1.5×107个细胞接种的T150烧瓶。一旦在72小时实现完全CPE后，就以与先前病毒原液相同的方式收集并处理培养基和细胞以产生第三代原液。
在293F细胞中的制造
在8％CO2的恒温箱中，在293FreeStyleTM(ThermoFisher)培养基中生长的293F细胞中产生ChAdV68病毒。感染当天，将细胞稀释至106个细胞/毫升，并具有98％活力，并且在每个生产周期于1L摇瓶(Corning)中使用400mL。每次感染使用靶MOI>3.3的4mL第三代病毒原液。将细胞温育48-72小时，直至通过锥虫蓝测量到活力<70％。然后，通过全速桌上型离心机离心来收集经感染细胞并在1XPBS中洗涤，再离心，并且然后使其重悬于20mL的10mMTris pH 7.4中。通过冷冻解冻3次将细胞团粒溶解并通过以4,300Xg离心5分钟使其澄清。
通过CsCl离心纯化
通过CsCl离心使病毒DNA纯化。执行两次不连续梯度操作。第一次是从细胞组分中纯化出病毒并且第二次是从细胞组分进一步优化分离并且将缺陷性粒子与感染性粒子分离。
将10mL的1.2(26.8g CsCl溶解于92mL的10mM Tris pH 8.0中)CsCl添加至异质同晶聚合物管中。然后，使用移液管递送至管底部，小心地添加8mL的1.4CsCl(53g CsCl溶解于87mL的10mM Tris pH 8.0中)。将澄清的病毒小心地铺在所述1.2层的顶部上。必要时，再添加10mM Tris以使各管平衡。然后将所述管置放于SW-32Ti旋转器中并在10℃下离心2小时30分钟。然后将所述管移至层流柜中并且使用18号针和10mL注射器抽吸病毒带。应避免取出污染性宿主细胞DNA和蛋白质。然后用10mM Tris pH 8.0将所述病毒带稀释至少2倍并如前所述铺在如上文所描述的不连续梯度上。如前所述进行操作，然而，此时进行所述操作过夜。次日，小心抽吸病毒带以避免抽吸出任何缺陷性粒子带。然后使用Slide-a-LyzerTM盒(Pierce)针对ARM缓冲液(20mM Tris pH 8.0、25mM NaCl、2.5％甘油)透析病毒。进行此操作3次，每次更换缓冲液保持1小时。然后将病毒等分以在-80℃下储存。
病毒测定
基于1.1×1012个病毒颗粒(VP)的消光系数相当于在OD260nm下的吸光度值1，通过使用OD 260测定来确定VP浓度。在病毒溶解缓冲液(0.1％SDS、10mM Tris pH 7.4、1mMEDTA)中制备腺病毒的两种稀释液(1:5和1:10)。一式两份测量所述两种稀释液的OD并通过用OD260值乘以稀释因子乘以1.1×1012VP来测量每毫升VP浓度。
利用病毒原液的限制性稀释测定来计算感染单位(IU)滴度。病毒起初在DMEM/5％NS/1X PS中100倍稀释并且随后，使用10倍稀释法稀释至1×10-7。然后，将100μL这些稀释液添加至在之前至少一小时以3e5个细胞/孔接种于24孔板中的293A细胞中。一式两份地执行此操作。板在37℃下在CO2(5％)温育箱中温育48小时。然后用1×PBS洗涤细胞，并且然后用100％冷甲醇(-20℃)固定。板然后在-20℃温育最少20分钟。用1XPBS洗涤各孔，然后在室温下在1XPBS/0.1％BSA中封闭1小时。添加兔抗Ad抗体(Abcam,Cambridge,MA)于封闭缓冲液中的1:8,000稀释液(每孔0.25ml)并在室温下温育1小时。用每孔0.5mL PBS洗涤各孔4次。每孔添加1000倍稀释的HRP缀合的山羊抗兔抗体(Bethyl Labs,Montgomery Texas)并温育1小时，然后进行最后一轮洗涤。进行5次PBS洗涤并使用于含0.01％H2O2的Tris缓冲生理食盐水中的二氨基联苯胺四盐酸盐(Diaminobenzidine tetrahydrochloride，DAB)底物(0.67mg/mL DAB于50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl)使所述板显色。使各孔显色5分钟，然后计数。使用产生每个视野4-40个经染色细胞的稀释液，在10X下对细胞计数。所用视野是0.32mm2栅格，相当于在24孔板上每个视野有625个栅格。可通过每个栅格中经染色细胞的数量乘以每个视野的栅格数量乘以稀释因子10来确定每毫升中感染性病毒的数量。类似地，当用GFP表达细胞操作时，可使用荧光而非衣壳染色来确定每毫升中GFP表达病毒粒子的数量。
免疫接种
经两侧肌肉内注射向C57BL/6J雌性小鼠和Balb/c雌性小鼠注射1×108个ChAdV68.5WTnt.MAG25mer病毒颗粒(VP)，体积为100uL(每条腿50uL)。
脾细胞解离
将每只小鼠的脾脏和淋巴结汇集于3mL完全RPMI(RPMI、10％FBS、青霉素/链霉素)中。使用gentleMACS解离器(Miltenyi Biotec)，遵循制造商的方案进行机械解离。经由40微米过滤器过滤解离的细胞并用ACK溶解缓冲液(150mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mMNa2EDTA)溶解红细胞。再次经由30微米过滤器过滤细胞并且然后使其重悬于完全RPMI中。在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上使用碘化丙锭染色对细胞计数以排除死亡和凋亡的细胞。然后将细胞调整至适当活细胞浓度以供后续分析。
离体酶联免疫斑点(ELISPOT)分析
ELISPOT分析是根据ELISPOT统一准则{DOI:10.1038/nprot.2015.068}，利用小鼠IFNg ELISpotPLUS试剂盒(MABTECH)进行。将5×104个脾细胞与10uM指定肽一起在包被有IFNg抗体的96孔板中温育16小时。使用碱性磷酸酶使斑点显色。对反应定时10分钟并通过用自来水流过板终止反应。使用AID vSpot读取器谱图对斑点计数。对于ELISPOT分析，将饱和度＞50％的孔记录为“太多而无法计数”。将重复孔的偏差＞10％的样品从分析中排除。然后，使用下式，针对孔汇合校正斑点计数：斑点计数+2×(斑点计数×汇合％/[100％-汇合％])。通过用抗原刺激的孔减去阴性肽刺激孔中的斑点计数来校正阴性背景。最后，将标记为太多而无法计数的孔设定成最高观测校正值，四舍五入至最接近的百分数。
XIV.B.2.在DNA转染后ChAdV68病毒递送粒子的制造
在一个实施例中，将ChAdV68.4WTnt.GFP(图6)和ChAdV68.5WTnt.GFP(图7)DNA转染至HEK293A细胞中并且在转染后7-10天观测病毒复制(病毒蚀斑)。使用光学显微镜检查(图6A和图7A)和荧光显微镜检查(图6B-C和图7B-C)观测ChAdV68病毒蚀斑。GFP表示产毒ChAdV68病毒递送粒子的产生。
XIV.B.3.ChAdV68病毒递送粒子扩增
在一个实施例中，使ChAdV68.4WTnt.GFP、ChAdV68.5WTnt.GFP和ChAdV68.5WTnt.MAG25mer病毒在HEK293F细胞中扩增并且在转染后18天，制备纯化的病毒原液(图8)。定量经纯化ChAdV68病毒原液中的病毒颗粒数并与使用相同方案制造的5型腺病毒(Ad5)和ChAdVY25(密切相关的ChAdV；Dicks，2012，PloS ONE 7，e40385)病毒原液进行比较。ChAdV68病毒滴度与Ad5和ChAdVY25相当(表13)。
表13.在293F悬浮细胞中产生腺病毒载体
构建体 平均VP/单元+/-SD
Ad5-载体(多载体) 2.96e4+/-2.26e4
Ad5-GFP 3.89e4
chAdY25-GFP 1.75e3+/-6.03e1
ChAdV68.4WTnt.GFP 1.2e4+/-6.5e3
ChAdV68.5WTnt.GFP 1.8e3
ChAdV68.5WTnt.MAG25mer 1.39e3+/-1.1e3
*SD仅在执行多个生产周期情况下报道
XIV.B.4.评价免疫原性
在小鼠免疫原性研究中评价表达小鼠肿瘤抗原的C68载体以证实C68载体引起T细胞响应。在C57BL/6J雌性小鼠中测量针对I类MHC表位SIINFEKL(SEQ ID NO：128)的T细胞响应并且在Balb/c小鼠中测量针对I类MHC表位AH1-A5(Slansky等人，2000，Immunity13：529-538)的T细胞响应。如图14中所示，在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer免疫接种小鼠之后测量相对于对照的强烈的T细胞响应。当对C57BL/6J或Balb/c小鼠免疫接种ChAdV68.5WTnt.MAG25mer时，在免疫接种之后10天，在ELISpot测定中分别观测到每106个脾细胞8957个或4019个斑点形成细胞(SFC)的平均细胞免疫响应。
还在评估ChAdV和抗CTLA4抗体的共同施用的CT26肿瘤模型中评估肿瘤浸润性淋巴细胞。小鼠被植入CT26肿瘤细胞并且在植入7天后用ChAdV疫苗免疫接种并用抗CTLA4抗体(克隆9D9)或IgG处理作为对照。在免疫接种12天后分析肿瘤浸润性淋巴细胞。使用gentleMACS解离器(Miltenyi Biotec)和小鼠肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotec)解离来自每个小鼠的肿瘤。经由30微米过滤器过滤解离细胞并使其重悬于完全RPMI中。在AttuneNxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上使用碘化丙锭染色对细胞计数以排除死亡和凋亡的细胞。然后将细胞调整至适当活细胞浓度以供后续分析。通过MHC-四聚体复合物鉴定抗原特异性细胞并用抗CD8和活力标志物共同染色。在初次免疫接种12天后收集肿瘤。
肿瘤内的抗原特异性CD8+ T细胞分别在经ChAdV、抗CTLA4和ChAdV+抗CTLA4处理的组中包含占总活细胞群的3.3％、2.2％或8.1％的中值(图33和表14)。用抗CTLA与活性ChAdV免疫接种的组合处理相比于单独ChAdV和单独抗CTLA4两者导致抗原特异性CD8+ T细胞频率统计显著增加，从而说明抗CTLA4在与chAd68疫苗共同施用时增加肿瘤内的浸润性T细胞数目。
表14-CT26肿瘤中的四聚体+浸润性CD8 T细胞频率
Figure BDA0003517553280001021
XV.实施例3：甲病毒抗原盒递送载体
XV.A.甲病毒递送载体评价的材料和方法
体外转录以产生RNA
对于体外测试：通过用PmeI限制性消化使质粒DNA线性化，遵循制造商的方案(GeneJet DNA净化试剂盒,Thermo)进行柱纯化并用作模板。根据制造商的方案，使用RiboMAX大规模RNA生产系统(Promega)，利用m7G帽类似物(Promega)进行体外转录。根据制造商的方案，使用RNeasy试剂盒(Qiagen)纯化mRNA。
对于体内研究：产生RNA并且由TriLInk Biotechnologies纯化并用EnzymaticCap1封端。
RNA转染
转染前约16小时，HEK293A细胞对于96孔以6e4个细胞/孔接种并且对于24孔以2e5个细胞/孔接种。使用MessengerMAX脂染胺(Invitrogen)并遵循制造商的方案，用mRNA转染细胞。对于96孔，每孔使用0.15uL脂染胺和10ng mRNA，并且对于24孔，每孔使用0.75uL脂染胺和150ng mRNA。GFP表达mRNA(TriLink Biotechnologies)用作转染对照。
荧光素酶测定
使用ONE-Glo荧光素酶测定(Promega)，遵循制造商的方案，在每种条件下于白色壁96孔板中一式三份进行荧光素酶报告子测定。使用SpectraMax测量发光。
qRT-PCR
在转染后2小时，用新鲜培养基冲洗经转染的细胞并且更换培养基以去除任何未经转染的mRNA。然后，在各种时间点，将细胞收集于RLT plus溶解缓冲液(Qiagen)中，使用QiaShredder(Qiagen)均质化并使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取RNA，所有操作均遵循制造商的方案。使用Nanodrop(Thermo Scientific)量化总RNA。每次反应使用20ng总RNA，使用Quantitect Probe One-Step RT-PCR试剂盒(Qiagen)在qTower3(Analytik Jena)上根据制造商的方案进行qRT-PCR。对于每个探针，一式三份地操作每个样品。肌动蛋白或GusB用作参考基因。定制引物/探针是由IDT产生(表15)。
表15.qPCR引物/探针
Figure BDA0003517553280001031
B16-OVA肿瘤模型
在C57BL/6J小鼠左下方侧腹部中注射105个B16-OVA细胞/动物。在免疫接种之前，使肿瘤生长3天。
CT26肿瘤模型
在Balb/c小鼠左下方侧腹部中注射106个CT26细胞/动物。在免疫接种之前，使肿瘤生长7天。
免疫接种
对于srRNA疫苗，经两侧肌肉内注射向小鼠注射10ug RNA，体积100uL(每条腿50uL)。对于Ad5疫苗，经两侧肌肉内注射向小鼠注射5×1010个病毒颗粒(VP)，体积100uL(每条腿50uL)。每周2次，经由腹膜内注射向动物注射250ug剂量的抗CTLA-4(克隆9D9,BioXcell)、抗PD-1(克隆RMP1-14,BioXcell)或抗IgG(克隆MPC-11,BioXcell)。
体内生物发光成像
在每个时间点，经由腹膜内注射向小鼠注射150mg/kg荧光素底物并且在注射后10-15分钟，使用IVIS体内成像系统(PerkinElmer)测量生物发光。
脾细胞解离
将每只小鼠的脾脏和淋巴结汇集于3mL完全RPMI(RPMI、10％FBS、青霉素/链霉素)中。使用gentleMACS解离器(Miltenyi Biotec)，遵循制造商的方案进行机械解离。经由40微米过滤器过滤解离的细胞并用ACK溶解缓冲液(150mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mMNa2EDTA)溶解红细胞。再次经由30微米过滤器过滤细胞并且然后使其重悬于完全RPMI中。在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上使用碘化丙锭染色对细胞计数以排除死亡和凋亡的细胞。然后将细胞调整至适当活细胞浓度以供后续分析。
离体酶联免疫斑点(ELISPOT)分析
ELISPOT分析是根据ELISPOT统一准则{DOI:10.1038/nprot.2015.068}，利用小鼠IFNg ELISpotPLUS试剂盒(MABTECH)进行。将5×104个脾细胞与10uM指定肽一起在包被有IFNg抗体的96孔板中温育16小时。使用碱性磷酸酶使斑点显色。对反应定时10分钟并通过用自来水流过板终止反应。使用AID vSpot读取器谱图对斑点计数。对于ELISPOT分析，将饱和度>50％的孔记录为“太多而无法计数”。将重复孔的偏差>10％的样品从分析中排除。然后，使用下式，针对孔汇合校正斑点计数：斑点计数+2×(斑点计数×汇合％/[100％-汇合％])。通过用抗原刺激的孔减去阴性肽刺激孔中的斑点计数来校正阴性背景。最后，将标记为太多而无法计数的孔设定成最高观测校正值，四舍五入至最接近的百分数。
XV.B.甲病毒载体
XV.B.1.甲病毒载体体外评价
在本发明的一个实现方式中，由基于委内瑞拉马脑炎(Venezuelan EquineEncephalitis，VEE)(Kinney,1986,Virology 152:400-413)的自我复制RNA(srRNA)载体产生用于抗原表达系统的RNA甲病毒骨架。在一个实施例中，编码位于26S亚基因组启动子3'端的VEE结构蛋白的序列缺失(VEE序列7544至11,175缺失；编号基于Kinney等人1986；SEQID NO:6)并且用抗原序列(SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:4)或荧光素酶报告子(例如VEE-荧光素酶，SEQ ID NO:15)替换(图9)。由srRNA DNA载体体外转录RNA，将其转染至HEK293A细胞中并测量荧光素酶报告子表达。此外，用编码荧光素酶的(非复制性)mRNA转染以供比较。当比较23小时测量值与2小时测量值时，对于VEE-荧光素酶srRNA观测到srRNA报告子信号有约30,000倍增加(表16)。相比之下，在相同时间段内，mRNA报告子展现<10倍的信号增加(表16)。
表16.来自VEE自我复制载体的荧光素酶的表达随时间增加。在96孔中用每孔10ngVEE-荧光素酶srRNA或10ng非复制性荧光素酶mRNA(TriLink L-6307)转染HEK293A细胞。在转染后各种时间测量发光。荧光素酶表达以相对发光单位(RLU)报道。每个数据点是3个转染孔的平均值+/-SD。
Figure BDA0003517553280001051
在另一个实施例中，通过使用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)测量编码荧光素酶的srRNA(VEE-荧光素酶)或编码多表位盒的srRNA(VEE-MAG25mer)转染之后的RNA水平来直接验证srRNA的复制。对于VEE-荧光素酶srRNA观测到约150倍的RNA增加(表17)，而对于VEE-MAG25mer srRNA观测到30-50倍的RNA增加(表18)。这些数据证实，当转染至细胞中时，VEE srRNA载体复制。
表17.VEE-荧光素酶srRNA转染的细胞中RNA复制的直接测量。用VEE-荧光素酶srRNA(150ng/孔，24孔)转染HEK293A细胞并且在转染后各种时间，通过qRT-PCR定量RNA水平。基于肌动蛋白参考基因使每个测量值归一化并且呈递相对于2小时时间点的倍数变化。
Figure BDA0003517553280001052
表18.VEE-MAG25mer srRNA转染的细胞中RNA复制的直接测量。用VEEMAG25mersrRNA(150ng/孔，24孔)转染HEK293细胞并且在转染后各种时间，通过qRT-PCR定量RNA水平。基于GusB参考基因使每个测量值归一化并且呈递相对于2小时时间点的倍数变化。图上的不同线表示2个不同的qPCR引物/探针集，所述两个集合均检测srRNA的表位盒区。
Figure BDA0003517553280001053
Figure BDA0003517553280001061
XV.B.2.甲病毒载体的体内评价
在另一个实施例中，在体内评价VEE-荧光素酶报告子表达。对小鼠注射10μg包封于脂质纳米粒子(MC3)中的VEE-荧光素酶srRNA并且在注射后24小时和48小时以及7天和14天使其成像以测定生物发光信号。在注射后24小时检测到荧光素酶信号并且其随时间增加，并且在srRNA注射后7天出现峰值(图10)。
XV.B.3.甲病毒载体肿瘤模型评价
在一个实现方式中，为了确定VEE srRNA载体是否在体内引导抗原特异性免疫响应，产生表达2种不同I类MHC小鼠肿瘤表位SIINFEKL(SEQ ID NO:144)和AH1-A5的VEEsrRNA载体(VEE-UbAAY，SEQ ID NO:14)(Slansky等人,2000,Immunity 13:529-538)。利用B16-OVA黑色素瘤细胞系表达SFL(SIINFEKL(SEQ ID NO:145))表位，并且AH1-A5(SPSYAYHQF(SEQ ID NO:146)；Slansky等人,2000,Immunity)表位诱导T细胞靶向由CT26结肠癌细胞系表达的相关表位(AH1/SPSYVYHQF(SEQ ID NO:147)；Huang等人,1996,ProcNatl Acad Sci USA 93:9730-9735)。在一个实施例中，对于体内研究，通过使用T7聚合酶(TriLink Biotechnologies)体外转录来产生VEEUbAAY srRNA并且将其包封于脂质纳米粒子(MC3)中。
在用MC3配制的VEE-UbAAY srRNA免疫接种带有B16-OVA肿瘤的小鼠之后两周，观测到相对于对照，靶向SFL的强烈抗原特异性T细胞响应。在一个实施例中，在用SFL肽刺激之后，在ELISpot测定中测量到每106个脾细胞3835个(中值)斑点形成细胞(SFC)(图11A，表19)并且如通过五聚体染色所测量，1.8％(中值)的CD8 T细胞具有SFL抗原特异性(图11B，表19)。在另一个实施例中，共施用抗CTLA-4单克隆抗体(mAb)和VEE srRNA疫苗引起总体T细胞响应的中度增加，并且在ELISpot测定中测量到每106个脾细胞的4794.5个(中值)SFC(图11A，表19)。
表19.在带有B16-OVA肿瘤的C57BL/6J小鼠中VEE srRNA免疫接种后14天ELISPOT和MHCI-五聚体染色测定的结果。
Figure BDA0003517553280001062
Figure BDA0003517553280001071
*应注意，从Vax组中小鼠#6得到的结果由于三重复孔之间变化较大而从分析中排除。
在另一个实现方式中，为反映临床方法，在B16-OVA和CT26小鼠肿瘤模型中进行异源初免/加强免疫，其中带有肿瘤的小鼠先用表达相同抗原盒的腺病毒载体(Ad5-UbAAY)免疫接种，接着在Ad5-UbAAY初免之后14天，用VEE-UbAAY srRNA疫苗加强免疫。在一个实施例中，通过Ad5-UbAAY疫苗诱发抗原特异性免疫响应，由此在ELISpot测定中测量到每106个脾细胞7330个(中值)SFC(图12A，表20)并且通过五聚体染色测量到2.9％(中值)的CD8 T细胞靶向SFL抗原(图12C，表20)。在另一个实施例中，在VEE-UbAAY srRNA加强免疫之后2周，B16-OVA模型中仍维持T细胞响应，并且在ELISpot测定中测量到每106个脾细胞3960个(中值)SFL特异性SFC(图12B，表20)并且通过五聚体染色测量到3.1％(中值)的CD8 T细胞靶向SFL抗原(图12D，表20)。
表20.用Ad5疫苗初免和srRNA加强免疫进行异源初免/加强免疫之后B16-OVA小鼠的免疫监测。
第14天
Figure BDA0003517553280001072
Figure BDA0003517553280001081
第28天
Figure BDA0003517553280001082
在另一个实现方式中，在Ad5-UbAAY初免和VEE-UbAAY srRNA加强免疫之后，在CT26小鼠模型中观测到类似结果。在一个实施例中，在Ad5-UbAAY初免(第14天)之后观测到AH1抗原特异性响应并且在ELISpot测定中测量到每106个脾细胞平均5187个SFC(图13A，表21)并且在VEE-UbAAY srRNA加强免疫(第28天)之后于ELISpot测定中测量到每106个脾细胞平均3799个SFC(图13B，表21)。
表21.在CT26肿瘤小鼠模型中异源初免/加强免疫之后的免疫监测。
Figure BDA0003517553280001083
Figure BDA0003517553280001091
XVI.实施例4：非人类灵长类动物研究
在非人类灵长类动物(NHP)中评价使用ChAdV68和自我复制RNA(srRNA)的各种给药方案。
材料和方法
向每个NHP中肌肉内注射初免疫苗以起始研究(疫苗初免)。还向每个NHP中肌肉内注射一种或多种加强免疫疫苗(疫苗加强免疫)。根据表格中概述的组施用每剂两侧注射液并且在下文概述。
免疫接种
对Mamu-A*01印度恒河猴两侧免疫接种以LNP-1或LNP-2配制的1×1012个ChAdV68.5WTnt.MAG25mer病毒颗粒(每侧注射5×1011个病毒颗粒)、30μgVEE-MAG25MERsrRNA、100μg VEE-MAG25mer srRNA或300ug VEE-MAG25mer srRNA。在初免疫苗接种后指定时间时，经肌肉内施用30ug、100ug或300ug VEE-MAG25mer srRNA的疫苗加强免疫。
免疫监测
在初免疫苗接种后指定时间时，使用淋巴细胞分离培养基(LymphocyteSeparation Medium，LSM；MP Biomedicals)和LeucoSep分离管(Greiner Bio-One)分离PBMC并使其重悬于含有10％FBS和青霉素/链霉素的RPMI中。在Attune NxT流式细胞仪(Thermo Fisher)上使用碘化丙锭染色对细胞计数以排除死亡和凋亡的细胞。然后将细胞调整至适当活细胞浓度以供后续分析。对于研究中的每只猴，使用ELISpot或流式细胞术方法测量T细胞响应。通过使用离体酶联免疫斑点(ELISpot)分析测量例如IFN-γ的细胞因子的诱导来监测PBMC中针对疫苗中编码的6个不同恒河猴Mamu-A*01的I类表位的T细胞响应。ELISpot分析是根据ELISPOT统一准则{DOI:10.1038/nprot.2015.068}，利用猴IFNgELISpotPLUS试剂盒(MABTECH)进行。将200,000个PBMC与10uM指定肽一起在包被有IFNg抗体的96孔板中温育16小时。使用碱性磷酸酶使斑点显色。对反应定时10分钟并通过用自来水流过板终止反应。使用AID vSpot读取器谱图对斑点计数。对于ELISPOT分析，将饱和度>50％的孔记录为“太多而无法计数”。将重复孔的偏差>10％的样品从分析中排除。然后，使用下式，针对孔汇合校正斑点计数：斑点计数+2×(斑点计数×汇合％/[100％-汇合％])。通过用抗原刺激的孔减去阴性肽刺激孔中的斑点计数来校正阴性背景。最后，将标记为太多而无法计数的孔设定成最高观测校正值，四舍五入至最接近的百分数。
通过使用流式细胞术测量例如IFN-γ的细胞内细胞因子的诱导来监测PBMC中针对疫苗中编码的6个不同恒河猴Mamu-A*01的I类表位的特异性CD4和CD8 T细胞响应。由两种方法得到的结果指示，以抗原特异性方式诱导针对表位的细胞因子。
恒河猴中的免疫原性
本研究被设计用于(a)评价30μg和100μg剂量VEE-MAG25mer srRNA以同源初免/加强免疫形式与ChAdV68.5WTnt.MAG25mer的组合的免疫原性和初步安全性；(b)比较在使用LNP1相对LNP2的脂质纳米粒子中VEE-MAG25mer srRNA的免疫响应；(c)评价针对VEE-MAG25mer srRNA和ChAdV68.5WTnt.MAG25mer免疫接种的T细胞响应的动力学。
所述研究组是在Mamu-A*01印度恒河猴中进行以展示免疫原性。用于本研究中的选择抗原仅在恒河猴中识别到，具体来说，具有Mamu-A*01 I类MHC单倍型的抗原。将Mamu-A*01印度恒河猴随机分成不同研究组(6只恒河猴/组)并且经两侧IM注射施用编码包括多个Mamu-A*01限制性表位的模型抗原的ChAdV68.5WTnt.MAG25mer或VEEMAG25mer srRNA载体。研究组如下所述。
表22：印度恒河猴中的非GLP免疫原性研究
Figure BDA0003517553280001101
在免疫接种之前以及在初始免疫接种之后第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周、第8周、第9周和第10周收集PBMC以供免疫监测。
结果
在免疫接种之前以及在初始免疫接种之后第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周、第8周、第9周和第10周针对六种不同Mamu-A*01限制性表位测量外周血液单核细胞(PBMC)的抗原特异性细胞免疫响应。动物在第4周和第8周接受30μg或100μg剂量并以LNP1或LNP2配制的VEE-MAG25mer srRNA的加强免疫接种，如表22中所描述。标绘在每个免疫监测时间点下针对全部六个表位的组合免疫响应(图15A-D和表23-26)。
在初始VEE-MAG25mer srRNA-LNP1(30μg)初次免疫接种之后第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周、第8周、第9周或第10周在所有测量下观测到组合的抗原特异性免疫响应，分别为每106个PBMC 170、14、15、11、7、8、14、17、12个SFC(六个表位组合)(图15A)。在初始VEE-MAG25mer srRNA-LNP1(100μg)初次免疫接种之后第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周、第8周、第9周或第10周在所有测量下观测到组合的抗原特异性免疫响应，分别为每106个PBMC 108、-3、14、1、37、4、105、17、25个SFC(六个表位组合)(图15B)。在初始VEE-MAG25mer srRNA-LNP2(100μg)初次免疫接种之后第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周、第8周、第9周或第10周在所有测量下观测到组合的抗原特异性免疫响应，分别为每106个PBMC-17、38、14、-2、87、21、104、129、89个SFC(六个表位组合)(图15C)。负值是每个表位/动物的相对于放血前值的归一化结果。
在初始ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初次免疫接种之后第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周、第8周、第9周或第10周在所有测量下观测到组合的抗原特异性免疫响应，分别为每106个PBMC 1218、1784、1866、973、1813、747、797、1249和547个SFC(六个表位组合)(图15D)。免疫响应显示出预期的型态，其中在初次免疫接种之后约2-3周测量到峰值免疫响应，接着在4周后免疫响应缩减。在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初始免疫接种之后5周(即，在用VEEMAG25mer srRNA第一加强免疫之后1周)测量到每106个PBMC 1813个SFC的组合的抗原特异性细胞免疫响应(六个表位组合)。在用VEEMAG25mer srRNA第一加强免疫之后1周(第5周)测量到的免疫响应与针对ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初次免疫接种(第3周)测量到的峰值免疫响应相当(图15D)。分别在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初始免疫接种之后9周(即，用VEE-MAG25mer srRNA第二加强免疫之后1周)测量到每106个PBMC 1249个SFC的组合的抗原特异性细胞免疫响应(六个表位组合)。在用VEE-MAG25mer srRNA第二加强免疫之后1周(第9周)测量到的免疫响应比即将加强免疫接种之前测量到的免疫响应高约2倍(图15D)。
表23：对于VEE-MAG25mer srRNA-LNP1(30μg)(第1组)的每个表位每106个PBMC的平均斑点形成细胞(SFC)数±SEM
Figure BDA0003517553280001111
表24：对于VEE-MAG25mer srRNA-LNP1(100μg)(第2组)的每个表位每106个PBMC的平均斑点形成细胞(SFC)数±SEM
Figure BDA0003517553280001112
Figure BDA0003517553280001121
表25：对于VEE-MAG25mer srRNA-LNP2(100μg)(第3组)的每个表位每106个PBMC的平均斑点形成细胞(SFC)数±SEM
Figure BDA0003517553280001122
表26：对于ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免的每个表位每106个PBMC的平均斑点形成细胞(SFC)数±SEM
Figure BDA0003517553280001123
印度恒河猴中的非GLP RNA剂量范围研究(较高剂量)
本研究被设计用于(a)评价300μg剂量VEE-MAG25mer srRNA以同源初免/加强免疫或异源初免/加强免疫形式与ChAdV68.5WTnt.MAG25mer的组合的免疫原性；(b)比较在使用300μg剂量LNP1对LNP2的脂质纳米粒子中VEE-MAG25mer srRNA的免疫响应；以及(c)评价针对VEE-MAG25mer srRNA和ChAdV68.5WTnt.MAG25mer免疫接种的T细胞响应的动力学。
所述研究组是在Mamu-A*01印度恒河猴中进行以证实免疫原性。在例如恒河猴的非人类灵长类动物物种中的疫苗免疫原性是在人类中疫苗效力的最佳预测指标。此外，用于本研究中的选择抗原仅在恒河猴中识别到，具体来说，那些具有Mamu-A*01I类MHC单倍型的抗原。将Mamu-A*01印度恒河猴随机分成不同研究组(6只恒河猴/组)并且经两侧IM注射施用编码包括多个Mamu-A*01限制性抗原的模型抗原的ChAdV68.5-WTnt.MAG25mer或VEE-MAG25mer srRNA。研究组如下所述。
对于第1组(异源初免/加强免疫)，在免疫接种之前以及在初始免疫接种之后第4周、第5周、第6周、第7周、第8周、第10周、第11周、第12周、第13周、第14周、第15周、第16周、第17周、第18周、第19周、第20周、第21周、第22周、第23周或第24周收集PBMC以供免疫监测。对于第2组和第3组(同源初免/加强免疫)，在免疫接种之前以及在初始免疫接种之后第4周、第5周、第7周、第8周、第10周、第11周、第12周、第13周、第14周或第15周收集PBMC以供免疫监测。
表27：印度恒河猴中的非GLP免疫原性研究
Figure BDA0003517553280001131
结果
用ChAdV68.5-WTnt.MAG25mer免疫接种Mamu-A*01印度恒河猴。在免疫接种之前以及在初始免疫接种之后第4周、第5周、第6周、第7周、第8周、第10周、第11周、第12周、第13周、第14周、第15周、第16周、第17周、第18周、第19周、第20周、第21周、第22周、第23周或第24周针对六种不同Mamu-A*01限制性表位测量外周血液单核细胞(PBMC)的抗原特异性细胞免疫响应(图16和表28)。动物在第4周、第12周和第20周接受用使用LNP2制剂的VEE-MAG25mer srRNA加强免疫接种。在用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初始免疫接种之后第4周、第5周、第6周、第7周、第8周、第10周、第11周、第12周、第13周、第14周、第15周、第16周、第17周、第18周、第19周、第20周、第21周、第22周、第23周或第24周测量到每106个PBMC 1750、4225、1100、2529、3218、1915、1708、1561、5077、4543、4920、5820、3395、2728、1996、1465、4730、2984、2828或3043个SFC的组合的抗原特异性免疫响应(六个表位组合)(图16)。在用VEE-MAG25mer srRNA第二加强免疫接种之后1周(第13周)测量到的免疫响应比在即将加强免疫接种之前(第12周)测量到的免疫响应高约3倍。在用VEE-MAG25mer srRNA第三加强免疫接种之后1周(第21周)测量到的免疫响应比在即将加强免疫接种之前(第20周)测量到的免疫响应高约3倍，类似于针对第二加强免疫观测到的响应。
Mamu-A*01印度恒河猴也用使用两种不同LNP制剂(LNP1和LNP2)的VEE-MAG25mersrRNA免疫接种。在免疫接种之前以及在初始免疫接种之后第4周、第5周、第6周、第7周、第8周、第10周、第11周、第12周、第13周、第14周或第15周针对六种不同Mamu-A*01限制性表位测量外周血液单核细胞(PBMC)的抗原特异性细胞免疫响应(图22和图23，表29和表30)。动物在第4周和第12周接受用使用相应LNP1或LNP2制剂的VEE-MAG25mer srRNA加强免疫接种。在用VEEMAG25mer srRNA-LNP2免疫接种之后第4周、第5周、第7周、第8周、第10周、第11周、第13周、第14周、第15周测量到每106个PBMC 168、204、103、126、140、145、330、203和162个SFC的组合的抗原特异性免疫响应(六个表位组合)(图17)。在用VEE-MAG25mer srRNA-LNP1免疫接种之后第4周、第5周、第7周、第8周、第10周、第11周、第12周、第13周、第14周、第15周测量到每106个PBMC189、185、349、437、492、570、233、886、369和381个SFC的组合的抗原特异性免疫响应(六个表位组合)(图18)。
表28：对于用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer初免疫苗接种(第1组)的每个表位每106个PBMC的平均斑点形成细胞(SFC)数±SEM
Figure BDA0003517553280001141
表29：对于用VEE-MAG25mer srRNA-LNP2(300μg)初免疫苗接种(第2组)的每个表位每106个PBMC的平均斑点形成细胞(SFC)数±SEM
Figure BDA0003517553280001142
表30：对于用VEE-MAG25mer srRNA-LNP1(300μg)初免疫苗接种(第3组)的每个表位每106个PBMC的平均斑点形成细胞(SFC)数±SEM
Figure BDA0003517553280001151
srRNA剂量范围研究
在本发明的一个实现方式中，可在mamu A01印度恒河猴中进行srRNA剂量范围研究以鉴定用于进行NHP免疫原性研究的srRNA剂量。在一个实施例中，可通过IM注射向MamuA01印度恒河猴施用编码包括多个mamu A01限制性表位的模型抗原的srRNA载体。在另一个实施例中，可靠近IM疫苗注射部位SC施用抗CTLA-4单克隆抗体以靶向一组动物中的疫苗引流淋巴结。可在初始疫苗接种之后每2周收集PBMC以供免疫监测。研究组描述于下文中(表31)。
表31：印度恒河猴中的非GLP RNA剂量范围研究
Figure BDA0003517553280001152
*有待以高剂量≤300μg测定的srRNA的剂量范围。
印度恒河猴中的免疫原性研究
在mamu A01印度恒河猴(NHP)中进行疫苗研究以说明使用抗原载体的免疫原性。图26说明疫苗接种策略。三组NHP经免疫接种ChAdV68.5-WTnt.MAG25mer并且免疫接种检查点抑制剂抗CTLA-4抗体伊匹单抗(第5组和第6组)或不免疫接种检查点抑制剂(第4组)。所述抗体经静脉内(第5组)或皮下(第6组)施用。三角形指示第0周和第32周的chAd68疫苗接种(1e12 vp/动物)。圆形表示第0周、第4周、第12周、第20周、第28周和第32周的甲病毒疫苗接种。
呈现了在经免疫接种的NHP中对于单独chAd-MAG免疫接种(图27和表32A)、ChAd-MAG免疫接种与IV递送的检查点抑制剂(图28和表32B)，以及chAd-MAG免疫接种与SC递送的检查点抑制剂(图29和表32C)的CD8+抗表位响应的时程。结果表明，chAd68载体有效引发灵长类动物中的CD8+响应，甲病毒载体有效加强chAD68疫苗初免响应，检查点抑制剂无论IV还是SC递送均放大初免和加强免疫响应，并且在疫苗接种后再施用chAd载体以有效加强免疫响应。
表32A：用chAd-MAG给药的恒河猴中的CD8+抗表位响应(第4组)。显示了平均SFC/1e6个脾细胞+/-标准误差
Figure BDA0003517553280001161
表32B：用chAd-MAG加IV递送的抗CTLA4抗体(伊匹单抗)给药的恒河猴中的CD8+抗表位响应。(第5组)。显示了平均SFC/1e6个脾细胞+/-标准误差
Figure BDA0003517553280001162
Figure BDA0003517553280001171
表32C：用chAd-MAG加SC递送的抗CTLA4抗体(伊匹单抗)给药的恒河猴中的CD8+抗表位响应(第6组)。显示了平均SFC/1e6个脾细胞+/-标准误差
Figure BDA0003517553280001172
Figure BDA0003517553280001181
印度恒河猴中的记忆表型分析
恒河猴经免疫接种具有或不具有抗CTLA4的ChAdV68.5WTnt.MAG25mer/VEE-MAG25mer srRNA异源初免/加强免疫方案，并且再次用ChAdV68.5WTnt.MAG25mer加强。在最终ChAdV68施用后11个月评估各组(研究第18个月)。ELISpot如所描述进行。图30和表33显示了在免疫接种前(左图)和免疫接种后18个月(右图)如通过ELISpot所测量的对六种不同Mamu-A*01限制性表位的细胞响应。对限制性表位的响应的检测表明，抗原特异性记忆响应由ChAdV68/samRNA疫苗方案产生。
为了评估记忆，使用双色Mamu-A*01四聚体标记监测识别在疫苗中编码的4种不同恒河猴Mamu-A*01I类表位的CD8+ T细胞，其中每个抗原由独特的双阳性组合表示，并允许鉴定单个样品内的所有4个抗原特异性群体。通过用细胞表面标志物CD45RA和CCR7共同染色来进行记忆细胞表型分析。图31和表34显示了识别四种不同Mamu-A*01限制性表位的记忆T细胞的组合四聚体染色和CD45RA/CCR7共同染色的结果。T细胞表型也通过流式细胞术评估。图32显示了在研究第18个月时四个Mamu-A*01四聚体+CD8+ T细胞群体的总和内记忆细胞类型的分布。记忆细胞表征如下：CD45RA+CCR7+＝初始，CD45RA+CCR7-＝效应(Teff)，CD45RA-CCR7+＝中央记忆(Tcm)，CD45RA-CCR7-＝效应记忆(Tem)。总体而言，结果表明，在最后一次加强免疫之后至少一年检测到记忆响应，从而表明持久的免疫性，包括效应、中央记忆和效应记忆群体。
表33：在初免前和记忆评估时间点(18个月)时每个动物每106个PBMC的平均斑点形成细胞(SFC)数。
Figure BDA0003517553280001182
ND＝由于技术排除未测定
表34：来自存活CD8+细胞的Mamu-A*01四聚体阳性百分比
Figure BDA0003517553280001183
Figure BDA0003517553280001191
XVII.实施例5：鉴定MHC/肽靶反应性T细胞和TCR
针对表35-45中所示的HIV亚型/HLA等位基因/表位序列组合中的一者或多者鉴定靶反应性T细胞和TCR。
从患者的血液、淋巴结或组织中分离出T细胞。可例如通过分选抗原-MHC四聚体结合细胞或通过分选在T细胞和抗原脉冲的抗原呈递细胞的体外共培养物中刺激的活化细胞来富集T细胞的抗原特异性T细胞。本领域中已知用于抗原特异性T细胞鉴定的各种试剂，包括载有抗原的四聚体和其他基于MHC的试剂。
可通过抗原特异性T细胞的TCR的单细胞测序来鉴定与抗原相关的α-β(或γ-δ)TCR二聚体。或者，可进行抗原特异性T细胞的整体TCR测序，并且可使用本领域中已知的TCR配对方法确定具有高匹配概率的α-β对。
或者或另外，可经由体外引发来自健康供体的初始T细胞来获得抗原特异性T细胞。从PBMC、淋巴结或脐带血中获得的T细胞可经抗原脉冲的抗原呈递细胞反复刺激，从而引发经历抗原的T细胞分化。然后可类似于上文针对来自患者的抗原特异性T细胞所述来鉴定TCR。
XVIII.实施例6：候选抗原的鉴定
使用一系列步骤鉴定候选HIV抗原以包含在基于抗原的疫苗中。对于每个HIV亚型(亚型A1、A2、B、C、D、F1、F2、G、H、J和K)，九种HIV基因(env、gag、nef、pol、rev、tat、vif、vpr和vpu)中的每一者的序列获自洛斯阿拉莫斯国家实验室的HIV数据库(Los AlamosNational Lab’s HIV database)104。从每个HIV亚型的九种HIV基因的序列中提取氨基酸序列(长度为8-11个氨基酸)。具体来说，对九种HIV基因的序列应用滑动窗口以获得氨基酸序列(长度为8-11个氨基酸)。在所有建模的HLA等位基因中，将这些氨基酸序列应用于EDGE预测模型(一种在通过MS/MS测序的HLA呈递肽上训练的深度学习模型，如国际专利申请公开WO/2017/106638、WO/2018/195357、WO/2018/208856和PCT/US19/33830中所述，所述文献出于所有目的各自通过引用整体并入本文)。对于每个HIV亚型，记录了所有具有EDGE评分>0.01的表位序列/HLA等位基因对。共鉴定了7096种独特的表位序列，并且每个序列的相应HLA等位基因示于表35-45中。
XIX.实施例7：候选抗原呈递的验证
候选抗原的质谱(MS)验证使用靶向质谱方法进行。获得HIV组织样品、均质化并用于RNASeq转录组测序和HLA/肽复合物的免疫沉淀。通过分析转录组为每个样品生成一个肽靶列表。将抗原呈递的EDGE深度学习模型应用于突变序列和表达数据，以对靶向列表中的肽进行优先排序。在质谱法之前，使用尺寸排阻洗脱和收集来自HLA分子的肽以分离呈递的肽。具有相同氨基酸序列的合成重标记肽与每个样品共同加载用于靶向质谱。重标记肽与实验肽的共洗脱和断裂模式的分析都用于验证候选表位序列。Gillete等人(NatMethods.2013年1月；10(1):28-34)更详细地描述了质谱分析方法，所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。
进一步评价MS数据以评估精确靶向具有特定HLA的患者进行治疗的价值，例如，要求患者具有至少一个经验证或预测的HLA等位基因呈递包含在疫苗盒中的抗原。例如，候选表位序列可被选择用于包含是因为它被预测为由特定的HLA蛋白呈递。然而，如果MS数据证明相反并且候选表位序列不是由HLA蛋白呈递，则出于疫苗选择标准的目的，可排除表位序列/HLA蛋白对。
XX.实施例8：疫苗盒抗原选择
选择了包含在基于抗原的疫苗中的包括表位序列的抗原。尽管随后的描述涉及抗原肽的选择和随后包含抗原盒中的序列、编码此类经选择的抗原肽的序列，但本领域技术人员可理解，随后的描述也可应用于在基于抗原的疫苗中包含抗原肽本身。
首先，对于每个HIV亚型(A1、A2、B、C、D、F1、F2、G、H、J和K)，鉴定了表35-45中的相应表(例如，A1–表35，A2–表36，B–表37，C–表38，D–表39，F1–表40，F2–表41，G–表42，H–表43，J–表44，和K–表45)。
接下来，对于表中的每个HLA等位基因，通过鉴定列出特定HLA等位基因的表中的行，选择了用于包含在基于抗原的疫苗中的表位序列(或编码所述表位序列中的每一者的抗原编码序列)。
具体来说，对于HIV亚型和HLA等位基因A0101，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A0101的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:325-328、2166-2178、4107-4113、6242-6248、8390-8397、10627-10633、12811-12820、15080-15086、17175-17184、19389-19396或21004-21009中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A0201，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A0201的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:329-353、2179-2200、4114-4134、6249-6270、8398-8415、10634-10654、12821-12850、15087-15107、17185-17213、19397-19420或21010-21031中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A0203，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A0203的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:354-403、2201-2248、4135-4177、6271-6315、8416-8474、10655-10700、12851-12912、15108-15155、17214-17264、19421-19463或21032-21064中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A0204，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A0204的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:404-469、2249-2326、4178-4261、6316-6400、8475-8558、10701-10768、12913-12994、15156-15214、17265-17349、19464-19518、21065-21117中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A0205，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A0205的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:470-526、2327-2379、6401-6450、8559-8626、10769-10822、12995-13056、15215-15263、17350-17405、19519-19570和21118-21161中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A0206，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A0206的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:527-565、2380-2421、6451-6492、8627-8671、10823-10867、10357-13098、15264-15292、17406-17448、19571-19604和21162-21192中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A0207，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A0207的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:566-587、2422-2438、6493-6509、8672-8689、10868-10887、13099-13125、15293-15307、17449-17473、19605-19618和21193-21205中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A0208，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A0208的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:588-630、2439-2477、6510-6548、8690-8733、10888-10931、13126-13179、15308-15336、17474-17512、19619-19649和21206-21233中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A0301，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A0301的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:631-650、2478-2501、6549-6573、8734-8761、10932-10969、13180-13224、15337-15354、17513-17543、19650-19665和21234-21247中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A0302，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A0302的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:651-682、2502-2541、6574-6618、8762-8809、10970-11026、13225-13290、15355-15396、17544-17603、19666-19697和21248-21274中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A1011，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A1011的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:683-726、2542-2583、6619-6668、8810-8862、11027-11087、13291-13370、15397-15451、17604-17652、19698-19726和21275-21309中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A2301，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A2301的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:727-741、2584-2593、6669-6685、8863-8871、11088-11103、13371-13385、15452-15465、17653-17667、19727-19738和21310-21317中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A2302，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A2402的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:742-755、2594-2605、6686-6698、8872-8885、11104-11116、13386-13397、15466-15479、17668-17679、19739-19750和21318-21323中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A2501，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A2501的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:756-769、2606-2622、6699-6711、8886-8903、11117-11132、13398-13414、15480-15505、17680-17693、19751-19760和21324-21333中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A2601，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A2601的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:770-783、2623-2640、6712-6728、8904-8927、11133-11155、13415-13433、15506-15533、17694-17714、19761-19773和21334-21346中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A2602，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A2602的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:784-790、2641-2652、6729-6739、8928-8937、11156-11168、13434-13446、1553-15550、17715-17723、19774-19782和21347-21353中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A2603，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A2603的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:791-802、2653-2671、6740-6759、8938-8959、11169-11189、13447-13464、15551-15569、17724-17739、19783-19797和21354-21360中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A2901，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A2901的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:803-814、2672-2679、6760-6768、8960-8976、11190-11195、13465-13474、15570-15588、17740-17751、19798-19808和21361-21366中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A2902，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A2902的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:815-828、2680-2698、6769-6784、8977-9000、11196-11210、13475-13493、15589-15612、17752-17773、19809-19821和21367-21376中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A3001，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A3001的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:829-842、2699-2707、6785-6793、9001-9012、11211-11216、13494-13501、15613-15617、17774-17781、19822-19828和21377-21383中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A3002，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A3002的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:843-857、2708-2722、6794-6807、9013-9040、11217-11235、13502-13519、15618-15636、17782-17809、19829-19843和21384-21390中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A3004，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A3004的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:858-864、2723-2728、6808-6817、9041-9060、11236-11246、13520-13530、15637-15649、17810-17828、19844-19850和21391-21393中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A3101，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A3101的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:865-895、2729-2757、6818-6846、9061-9082、11247-11272、13531-13558、15650-15683、17829-17862、19851-19869和21394-21407中的任一者)。。
对于HIV亚型和HLA等位基因A3201，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A3201的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:896-899、2758-2761、6847-6850、9083-9091、11273-11275、13559-13567、15684-15688、17863-17870、19870-19874和21408-21409中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A3301，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A3301的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:900-920、2762-2793、6851-6880、9092-9112、11276-11300、13568-13585、15689-15707、17871-17900、19875-19898和21410-21425中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A3303，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A3303的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:921-955、2794-2851、6881-6935、9113-9164、11301-11346、13586-13619、15708-15742、17901-17964、19899-19933和21426-21459中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A6801，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A6801的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:956-997、2852-2908、6936-6986、9165-9228、11347-11410、13620-13667、15743-15785、17965-18029、19934-19986和21460-24192中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因A6802，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出A6802的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:998-1032、2909-2946、6897-7037、9229-9292、11411-11461、13668-13715、15786-15828、18030-18068、19987-20027和24193-21523中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B0702，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B0702的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1033-1050、2947-2969、7038-7065、9293-9312、11462-11485、13716-13738、15829-15849、18069-18091、20028-20038和21524-21540中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B0801，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B0801的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1051-1066、2970-2984、7066-7078、9313-9325、11486-11497、13739-13752、15850-15862、18092-18112、20039-20051和21541-21549中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B1301，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B1301的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1067-1080、2985-2999、7079-7095、9326-9347、11498-11516、13753-13767、15863-15875、18113-18128、20052-20062和21550-21557中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B1302，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B1302的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1081-1117、3000-3052、7096-7140、9348-9406、11517-11557、13768-13821、15876-15923、18129-18178、20063-20093和21558-21593中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B1401，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B1401的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1118-1125、3053-3058、7141-7145、9407-9411、11558-11562、13822-13827、15924-15931、18179-18185、20094-20098和21594-21599中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B1402，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B1402的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1126-1139、3059-3070、7146-7159、9412-9418、11563-11574、13828-13837、15932-15943、18186-18197、20099-20109和21600-21606中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B1501，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B1501的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1140-1192、3071-3111、7160-7211、9419-9481、11575-11633、13838-13895、15944-16001、18198-18259、20110-20141和21607-21635中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B1502，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B1502的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1193-1220、3112-3135、7212-7247、9482-9501、11634-11670、13896-13937、16002-16036、18260-18300、20142-20165和21636-21656中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B1503，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B1503的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1221-1245、3136-3152、7248-7273、9502-9526、11671-11693、13938-13968、16037-16065、18301-18324、20166-20179和21657-21669中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B1510，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B1510的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1246-1266、3153-3178、7274-7296、9527-9548、11694-11722、13969-13995、16066-16083、18325-18352、20180-20200和21670-21689中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B1513，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B1513的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1267-1270、3179-3183、7297-7300、9549-9551、11723-11725、13996-14005、16084-16091、18353-18358、20201-20205和21690-21692中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B1801，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B1801的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1271-1286、3184-3203、7301-7328、9552-9565、11726-11742、14006-14024、16092-16107、18359-18375、20206-20224和21693-21705中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B2702，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B2702的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1287-1304、3204-3225、7329-7355、9566-9594、11743-11756、14025-14048、16108-16135、18376-18408、20225-20241和21706-21716中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B2705，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B2705的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1305-1319、3226-3234、7356-7370、9595-9610、11757-11771、14049-14063、16136-16145、18409-18422、20242-20254和21717-21723中的任一者)-。
对于HIV亚型和HLA等位基因B3501，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B3501的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1320-1338、3235-3260、7371-7405、9611-9641、11772-11812、14064-14095、16146-16186、18423-18463、20255-20279和21724-21745中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B3502，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B3502的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1339-1349、3261-3272、7406-7424、9642-9661、11813-11833、14096-14112、16187-16205、18464-18482、20280-20291和21746-21754中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B3503，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B3503的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1350-1373、3273-3298、7425-7457、9662-9697、11834-11877、14113-14148、16206-16238、18483-18513、20292-20316和21755-21772中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B3508，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B3508的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1374-1386、3299-3309、7458-7477、9698-9719、11878-11899、14149-14166、16239-16256、18514-18538、20317-20331和21773-21786中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B3512，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B3512的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1387-1405、3310-3326、7478-7498、9720-9744、11900-11930、14167-14185、16257-16280、18539-18560、20332-20344和21787-21799中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B3701，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出BB3701的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1406-1425、3327-3338、7499-7512、9745-9757、11931-11944、14186-14196、16281-16291、18561-18572、20345-20359和21800-21808中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B3801，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B3801的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1426-1451、3339-3367、7513-7533、9758-9782、11945-11970、14197-14219、16292-16310、18573-18599、20360-20381和21809-21828中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B3901，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B3901的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1452-1476、3368-3391、7534-7551、9783-9802、11971-11992、14220-14242、16311-16323、18600-18619、20382-20395和21829-21844中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B3906，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B3906的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1477-1499、3392-3423、7552-7571、9803-9831、11993-12020、14243-14277、16324-16349、18620-18653、20396-20411和21845-21861中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B4001，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B4001的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1500-1527、3424-3458、7572-7614、9832-9867、12021-12057、14278-14309、16350-16384、18654-18686、20412-20431和21862-21888中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B4002，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B4002的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1528-1576、3459-3497、7615-7665、9868-9913、12058-12110、14310-14359、16385-16431、18687-18736、20432-20460和21889-21924中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B4006，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B4006的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1577-1593、3498-3517、7666-7689、9914-9942、12111-12136、14360-14380、16432-16463、18737-18759、20461-20479和21925-21940中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因4102，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B4102的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1594-1642、3518-3554、7690-7742、9943-9988、12137-12175、14381-14429、16437-16510、18760-18811、20480-20512和21941-21975中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B4402，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B4402的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1643-1663、3555-3575、7743-7772、9989-10011、12176-12202、14430-14448、16510-16527、18812-18834、20513-20530和21976-21992中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B4403，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B4403的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1664-1697、3576-3611、7773-7826、10012-10058、12203-12254、14449-14493、16528-16562、18835-18883、20531-20564和21993-22024中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B4405，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B4405的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1698-1745、3612-3674、7827-7903、10059-10134、12255-12327、14494-14560、16563-16633、18884-18953、20565-20613和22025-22067中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B4601，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B4601的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1746-1752、3675-3679、7904-7910、10135-10146、12328-12339、14561-14574、16634-16645、18954-18957、20614-20619和22068-22069中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B4801，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B4801的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1753-1785、3680-3695、7911-7926、10147-10161、12340-12359、14575-14596、16646-16664、18958-18974、20620-20636和22070-22081中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B4901，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B4901的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1786-1824、3696-3719、7927-7967、10162-10207、12360-12395、14597-14634、16665-16709、18975-19013、20637-20656和22082-22109中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B5001，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B5001的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1825-1855、3720-3755、7968-8008、10208-10251、12396-12438、14635-14675、16710-16748、19014-19051、20657-20682和22110-22129中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B5101，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B5101的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1856-1872、3756-3789、8009-8037、10252-10287、12439-12467、14676-14708、16749-16783、19052-19076、20683-20711和22130-22158中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B5401，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B5401的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1873-1900、3790-3823、8038-8075、10288-10327、12468-12507、14709-14745、16784-16826、19077-19108、207120-20748和22159-22178中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B5501，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B5501的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1901-1907、3824-3827、8076-8088、10328-10341、12508-12520、14746-14756、16827-16841、19109-19113、20749-20759和22179-22184中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B5502，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B5502的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1908-1924、3828-3843、8089-8109、10342-10364、12521-12543、14757-14777、16842-16867、19114-19135、20760-20785和22185-22194中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B5601，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B5601的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1925-1945、3844-3865、8110-8136、10365-10392、12544-12565、14778-14802、16868-16897、19136-19156、20786-20810和22195-22209中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B5701，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B5701的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1946-1985、3866-3908、8137-8188、10393-10441、12566-12606、14803-14849、16898-16956、19157-19202、20811-20848和22210-22234中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因B5801，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出B5801的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:1986-2019、3909-3942、8189-8218、10442-10467、12607-12632、14850-14873、16957-16992、19203-19232、20849-20875和22235-22252中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C0102，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C0102的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2020-2026、3943-3945、8219-8224、10468-10472、12633-12644、14874-14881、16993-16996、19233-19242、20876-20880和22253-22255中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C0202，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C0202的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2027-2028、3946-3947、8225-8227、10473-10476、12645-12647、14882-14887、16997-16999、19243-19245、20881-20883和22256-22262中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C0302，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C0302的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2029-2034、3948-3956、8228-8233、10477-10484、12648-12657、14888-14900、17000-17007、19246-19253、20884-20888和22263-22266中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C0303，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C0303的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2035-2039、3957-3962、8234-8239、10485-10491、12658-12663、14901-14911、17008-17016、19254-19257、20889-20893和22267-22272中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C0304，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C0304的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2040-2047、3963-3974、8240-8250、10492-10502、12664-12676、14912-14927、17017-17029、19258-19270、20894-20901和22273-22274中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C0401，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C0401的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2048-2052、3975-3979、8251-8257、10503-10505、12677-12680、14928-14932、17030-17033、19271-19277、20902-20903和22275-22281中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C0501，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C0501的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2053-2057、3980-3992、8258-8262、10506-10514、12681-12692、14933-14944、17034-17041、19278-19288、20904-20911和22282-22283中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C0602，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C0602的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2058-2059、3993-3995、8263、10515-10518、12693-12697、14945-14948、17042-17045、19289-19290、20912-20913、22284-22295中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C0701，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C0701的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:8264和17046中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C0702，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C0702的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2060、3996-3997、12698和14949中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C0704，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C0704的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2061、3998、10519和17047中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C0801，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C0801的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2062-2079、3999-4013、8265-8274、10520-10533、12699-12721、14950-14974、17048-17069、19291-19304、20914-20923和22284-22295中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C0802，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C0802的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2080-2088、4014-4031、8275-8288、10534-10545、12722-12739、14975-14987、17070-1076、19305-19321、20924-20929和22296-22300中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C0803，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C0803的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2089-2100、4032-4035、8289-8295、10546-10548、12740-12742、14988-14997、17077-17079、19322-19324、20930-20938和22301-22304中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C1203，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C1203的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2101-2105、4036-4043、8296-8302、10549-10555、102743-12748、14998-15007、17080-17089、19325-19332、20939-20947和22305-22310中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C1402，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C1402的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2106-2122、4044-4058、8303-8329、10556-10574、12749-12763、15008-15025、17090-17108、19333-19348、20948-20962和22311-22320中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C1403，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C1403的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2123-2133、4059-4069、8330-8342、10575-10587、12764-12772 15026-15035、17109-17124、19349-19361、20963-20970和22321-22327中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C1502，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C1502的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2134-2138、4070-4074、8343-8354、10588-10591、12773-12778、15036-15040、17125-17135、19362-19366、20971-20978和22328-22332中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C1601，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C1601的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2139-2143、4075-4079、8355-8358、10592-10595、12779-12782、15041-15048、17136-17144、19367-19370、20979-20983和22333-22334中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C1602，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C1602的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2144-2151、4080-4089、8359-8367、10596-10602、12783-12792、15049-15058、17145-17157、19371-19376、20984-20992和22335-22340中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C1604，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C1604的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2152-2160、4090-4098、8368-8381、10603-10615、12793-12803、15059-15069、17158-17165、19377-19382、20994-20998和22341-22345中的任一者)。
对于HIV亚型和HLA等位基因C1701，疫苗中包含的抗原编码序列是通过参考对应于HIV亚型的表来选择的，其中所考虑的每个相关序列是通过鉴定列出C1701的所述表中的所有行来选择的(例如，SEQ ID NO:2161-2165、4099-4106、8382-8389、10616-10626、12804-12810、15070-15079、17166-17174、19383-19388、20999-21003和22346-22349中的任一者)。
XXI.实施例9：评价T细胞对候选抗原的识别
评价候选抗原以确定它们是否在患者中诱导免疫响应。具体来说，来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)富含初始CD8+ T细胞。健康供体被证实具有HLA等位基因B4102。CD8+T细胞用MHC多聚体染色，所述MHC多聚体呈递几种候选抗原，包括疫苗盒中存在的表位序列：第一抗原包括表位序列“AEVVQKVTM(SEQ ID NO:148)”并且第二抗原包括表位序列“AEVVQKVVM(SEQ ID NO:149)”。HLA-肽结合细胞被分选、扩增并确认其对抗原的特异性。进行抗原特异性T细胞的TCR测序。图20说明了一般的TCR测序策略和工作流程。TCR测序策略揭示了多克隆响应。初始T细胞库分析表明，当通过疫苗接种施用时，候选抗原预期在选定患者中诱导免疫响应。
XXI.实施例10：鉴定HIV表位的EDGE机器学习模型的性能
图36描绘了EDGE机器学习模型与用于预测由I类HLA等位基因呈递的HIV表位的公共预测工具相比的预测能力。具体来说，EDGE机器学习模型在398个样品的质谱中呈现的507,502个肽上进行了训练，并且涵盖116个已鉴定的等位基因。EDGE机器学习模型生成独立等位基因评分，每个独立等位基因评分代表了特定I类HLA等位基因呈递HIV表位的可能性。示例等位基因显示在表35-45中的任一者中标题为“HLA”的列中。此外，这些独立等位基因可能性可集合以确定HIV表位由至少一个I类HLA等位基因呈递的可能性。相比之下，预测HIV表位的公共预测工具是MHCflurry107。
部署EDGE模型和MHCflurry于从洛斯阿拉莫斯HIV数据库获得的HIV CD8+表位的测试数据集上，以预测由至少一个I类HLA等位基因呈递的HIV表位。如图36所示，EDGE模型的表现优于MHCflurry。具体来说，在40％的召回率下，EDGE模型表现出0.28的精度值，而MHCflurry表现出0.15的精度值。此外，EDGE的表现优于MHCflurry，EDGE的曲线下面积(AUC)＝0.24，相比之下MHCflurry为0.13。
总而言之，该实施例表明，与常规的、可公开获得的模型相比，EDGE机器学习模型能够更好地预测由一种或多种I类HLA等位基因呈递的HIV表位。因此，与通过常规方法鉴定的表位相比，通过使用EDGE机器学习模型鉴定的表位，例如表35-45中任一者中标题为“表位序列”的列中所示的表位(例如，SEQ ID NO:325-22349中的任一者)，更可能由一种或多种I类HLA等位基因呈递。
某些序列
本文提及的载体、盒和抗体在下文描述并由SEQ ID NO.提及。
Figure BDA0003517553280001331
Figure BDA0003517553280001341
Figure BDA0003517553280001351
Figure BDA0003517553280001361
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Claims (205)

1.一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述抗原表达系统包含：
载体骨架，所述载体骨架包含：黑猩猩腺病毒载体，任选地其中所述黑猩猩腺病毒载体是ChAdV68载体，或甲病毒载体，任选地其中所述甲病毒载体是委内瑞拉马脑炎病毒载体，所述载体骨架包含包含MHC I类表位编码核酸序列的至少一种HIV MHC I类抗原编码核酸序列，任选地其中所述MHC I类表位编码核酸序列编码MHC I类表位，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:325-22349所示序列组成的组的HIV表位。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种HIV表位选自由SEQ ID NO:4113、4114、4115、4427、4439、4494、4495、4545、4561、4956、4968、4975、4982、5259、5261、5459、5460、5610、5643和5661所示序列组成的组。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述抗原表达系统包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID No:325-22349所示序列组成的组的HIV表位。
4.如权利要求3所述的组合物，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHCI类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种HIV表位，所述HIV表位选自由SEQ ID NO:4113、4114、4115、4427、4439、4494、4495、4545、4561、4956、4968、4975、4982、5259、5261、5459、5460、5610、5643和5661所示序列组成的组。
5.一种用于递送一种或多种抗原的组合物，所述组合物包含一种或多种HIV MHC I类抗原或一种或多种编码一种或多种HIV MHC I类抗原的核酸序列，每种HIV MHC I类抗原包含MHC I类表位，所述表位包含至少一种选自由SEQ ID No:325-22349所示序列组成的组的HIV表位。
6.如权利要求5所述的组合物，其中每种HIV MHC I类抗原包含MHC I类表位，所述表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:4113、4114、4115、4427、4439、4494、4495、4545、4561、4956、4968、4975、4982、5259、5261、5459、5460、5610、5643和5661所示序列组成的组的HIV表位。
7.如权利要求5或6所述的组合物，其中所述组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种HIV MHC I类抗原，其中每种HIV MHC I类抗原包含MHC I类表位，所述表位包含至少一种选自由SEQ ID No:325-22349所示序列组成的组的HIV表位。
8.如权利要求7所述的组合物，其中每种HIV MHC I类抗原包含MHC I类表位，所述表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:4113、4114、4115、4427、4439、4494、4495、4545、4561、4956、4968、4975、4982、5259、5261、5459、5460、5610、5643和5661所示序列组成的组的HIV表位。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述MHC I类表位通过执行以下步骤来选择：
(a)获得外显子组、转录组或全基因组核苷酸测序中的至少一者，其中核苷酸测序数据用于获得代表抗原集合中的每一者的肽序列的数据；
(b)将每个抗原的所述肽序列输入到呈递模型中，以产生所述抗原中的每一者由MHC蛋白中的一者或多者呈递的数值可能性集合，所述数值可能性集合已至少基于所接收的质谱数据进行鉴定；以及
(c)基于所述数值可能性集合选择所述抗原集合的子集以产生经选择抗原集合，所述经选择抗原用于产生所述MHC I类表位。
10.一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
(a)载体骨架，其中所述骨架包含：
(i)至少一种启动子核苷酸序列，和
(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及
(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：
(i)至少一种抗原编码核酸序列，包含：
(I)至少一种HIV MHC I类抗原编码核酸序列，包含：
(A)MHC I类表位编码核酸序列，其中所述MHC I类表位编码核酸序列编码MHC I类表位，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID No:325-22349所示序列组成的组的HIV表位，
(B)任选地，5'接头序列，和
(C)任选地，3'接头序列；
(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和
(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；
(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:151)氨基酸接头序列的核酸序列；和
(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
11.一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
(a)载体骨架，其中所述骨架包含：
(i)至少一种启动子核苷酸序列，和
(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及
(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：
(i)至少一种抗原编码核酸序列，包含：
(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:325-2165所示序列组成的组的HIV表位，
其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；
(A)任选地，5'接头序列，和
(B)任选地，3'接头序列；
(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和
(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；
(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:152)氨基酸接头序列的核酸序列；和
(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
12.一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
(a)载体骨架，其中所述骨架包含：
(i)至少一种启动子核苷酸序列，和
(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及
(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：
(i)至少一种抗原编码核酸序列，包含：
(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:2166-4106所示序列组成的组的HIV表位，
其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；
(A)任选地，5'接头序列，和
(B)任选地，3'接头序列；
(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和
(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；
(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:153)氨基酸接头序列的核酸序列；和
(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
13.一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
(a)载体骨架，其中所述骨架包含：
(i)至少一种启动子核苷酸序列，和
(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及
(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：
(i)至少一种抗原编码核酸序列，包含：
(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:4107-6241所示序列组成的组的HIV表位，
其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；
(A)任选地，5'接头序列，和
(B)任选地，3'接头序列；
(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和
(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；
(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:154)氨基酸接头序列的核酸序列；和
(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
14.一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
(a)载体骨架，其中所述骨架包含：
(i)至少一种启动子核苷酸序列，和
(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及
(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：
(i)至少一种抗原编码核酸序列，包含：
(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:6242-8389所示序列组成的组的HIV表位，
其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；
(A)任选地，5'接头序列，和
(B)任选地，3'接头序列；
(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和
(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；
(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:155)氨基酸接头序列的核酸序列；和
(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
15.一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
(a)载体骨架，其中所述骨架包含：
(i)至少一种启动子核苷酸序列，和
(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及
(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：
(i)至少一种抗原编码核酸序列，包含：
(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:8930-10626所示序列组成的组的HIV表位，
其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；
(A)任选地，5'接头序列，和
(B)任选地，3'接头序列；
(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和
(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；
(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:156)氨基酸接头序列的核酸序列；和
(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
16.一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
(a)载体骨架，其中所述骨架包含：
(i)至少一种启动子核苷酸序列，和
(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及
(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：
(i)至少一种抗原编码核酸序列，包含：
(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:10627-12810所示序列组成的组的HIV表位，
其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；
(A)任选地，5'接头序列，和
(B)任选地，3'接头序列；
(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和
(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；
(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:157)氨基酸接头序列的核酸序列；和
(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
17.一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
(a)载体骨架，其中所述骨架包含：
(i)至少一种启动子核苷酸序列，和
(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及
(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：
(i)至少一种抗原编码核酸序列，包含：
(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:12811-15079所示序列组成的组的HIV表位，
其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；
(A)任选地，5'接头序列，和
(B)任选地，3'接头序列；
(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和
(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；
(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:158)氨基酸接头序列的核酸序列；和
(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
18.一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
(a)载体骨架，其中所述骨架包含：
(i)至少一种启动子核苷酸序列，和
(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及
(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：
(i)至少一种抗原编码核酸序列，包含：
(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位选自由SEQ ID NO:15080-17174中任一者的表位序列组成的组，
其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；
(A)任选地，5'接头序列，和
(B)任选地，3'接头序列；
(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和
(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；
(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:159)氨基酸接头序列的核酸序列；和
(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
19.一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
(a)载体骨架，其中所述骨架包含：
(i)至少一种启动子核苷酸序列，和
(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及
(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：
(i)至少一种抗原编码核酸序列，包含：
(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:17175-19388所示序列组成的组的HIV表位，
其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；
(A)任选地，5'接头序列，和
(B)任选地，3'接头序列；
(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和
(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；
(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:160)氨基酸接头序列的核酸序列；和
(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
20.一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
(a)载体骨架，其中所述骨架包含：
(i)至少一种启动子核苷酸序列，和
(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及
(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：
(i)至少一种抗原编码核酸序列，包含：
(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:19389-21003所示序列组成的组的HIV表位，
其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；
(A)任选地，5'接头序列，和
(B)任选地，3'接头序列；
(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和
(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；
(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:161)氨基酸接头序列的核酸序列；和
(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
21.一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
(a)载体骨架，其中所述骨架包含：
(i)至少一种启动子核苷酸序列，和
(ii)至少一种聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及
(b)抗原盒，其中所述抗原盒包含：
(i)至少一种抗原编码核酸序列，包含：
(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，其中每种HIV MHC I类抗原编码核酸序列包含编码MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:21004-22349所示序列组成的组的HIV表位，
其中所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者还包含；
(A)任选地，5'接头序列，和
(B)任选地，3'接头序列；
(ii)任选地，可操作地连接到所述抗原编码核酸序列的第二启动子核苷酸序列；和
(iii)任选地，至少一种MHC II类抗原编码核酸序列；
(iv)任选地，至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:162)氨基酸接头序列的核酸序列；和
(v)任选地，至少一种第二poly(A)序列，其中所述第二poly(A)序列是至所述载体骨架的原生poly(A)序列或外源poly(A)序列。
22.一种用于递送抗原表达系统的组合物，所述组合物包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
(a)载体骨架，其中所述载体骨架包含
(i)黑猩猩腺病毒载体，任选地其中所述黑猩猩腺病毒载体是ChAdV68载体，或甲病毒载体，任选地其中所述甲病毒载体是委内瑞拉马脑炎病毒载体，和
(ii)26S启动子核苷酸序列，和
(iii)聚腺苷酸化(poly(A))序列；以及
(b)整合在所述26S启动子核苷酸序列和所述poly(A)序列之间的抗原盒，其中所述抗原盒包含：
(i)至少一种抗原编码核酸序列，包含：
(I)至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种彼此线性连接的HIV MHC I类抗原编码核酸序列，并且其各自包含：
(A)MHC I类表位编码核酸序列，其中所述MHC I类表位编码核酸序列编码长度为7-15个氨基酸的MHC I类表位，并且其中所述MHC I类表位中的至少一者选自由来自SEQ ID No:325-22349中任一者的表位序列组成的组，
(B)5'接头序列，其中所述5'接头序列编码所述MHC I类表位的原生N末端氨基酸序列，并且其中所述5'接头序列编码长度为至少3个氨基酸的肽，
(C)3'接头序列，其中所述3'接头序列编码所述MHC I类表位的原生C末端酸序列，并且其中所述3'接头序列编码长度为至少3个氨基酸的肽，并且
其中所述抗原盒可操作地连接到所述26S启动子核苷酸序列，其中所述MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者编码长度介于13个和25个之间的氨基酸的多肽，并且其中每个MHCI类抗原编码核酸序列的每个3'端连接到除了所述抗原盒中的最后MHC I类抗原编码核酸序列之外的后接MHC I类抗原编码核酸序列的5'端；和
(ii)至少两个MHC II类抗原编码核酸序列，包含：
(I)PADRE MHC II类序列，
(II)破伤风类毒素MHC II类序列，
(III)编码GPGPG(SEQ ID NO:163)氨基酸接头序列的第一核酸序列，所述接头序列连接所述PADRE MHC II类序列与所述破伤风类毒素MHC II类序列，
(IV)编码GPGPG(SEQ ID NO:164)氨基酸接头序列的第二核酸序列，所述接头序列连接所述至少两个MHC II类抗原编码核酸序列的5'端与所述HIV MHC I类抗原编码核酸序列，
(V)任选地，在所述至少两个MHC II类抗原编码核酸序列的3'端处编码GPGPG(SEQ IDNO:165)氨基酸接头序列的第三核酸序列。
23.如权利要求10-21中任一项所述的组合物，其中所述抗原盒的每个元件的有序序列描述于下式，从5'至3'包含：
Pa-(L5b-Nc-L3d)X-(G5e-Uf)Y-G3g
其中P包含所述第二启动子核苷酸序列，其中a＝0或1，
N包含所述MHC I类表位编码核酸序列之一，其中c＝1，
L5包含所述5'接头序列，其中b＝0或1，
L3包含所述3'接头序列，其中d＝0或1，
G5包含至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:166)氨基酸接头的核酸序列之一，其中e＝0或1，
G3包含至少一种编码GPGPG(SEQ ID NO:167)氨基酸接头的核酸序列之一，其中g＝0或1，
U包含至少一种MHC II类抗原编码核酸序列之一，其中f＝1，
X＝1至400，其中对于每个X，相应的Nc是表位编码核酸序列，并且
Y＝0、1或2，其中对于每个Y，相应的Uf是抗原编码核酸序列。
24.如权利要求22所述的组合物，其中对于每个X，相应的Nc是不同的MHC I类表位编码核酸序列。
25.如权利要求22或24所述的组合物，其中对于每个Y，相应的Uf是不同的MHC II类抗原编码核酸序列。
26.如权利要求22-25中任一项所述的组合物，其中
a＝0，b＝1，d＝1，e＝1，g＝1，h＝1，X＝20，Y＝2，
所述至少一种启动子核苷酸序列是由所述骨架提供的单个26S启动子核苷酸序列，
所述至少一个聚腺苷酸化poly(A)序列是由所述骨架提供的至少100个连续A核苷酸(SEQ ID NO:168)的poly(A)序列，
每个N编码长度为7-15个氨基酸的MHC I类表位，
L5是编码所述MHC I表位的原生N末端氨基酸序列的原生5'接头序列，并且其中所述5'接头序列编码长度为至少3个氨基酸的肽，
L3是编码所述MHC I表位的原生核酸末端酸序列的原生3'接头序列，并且其中所述3'接头序列编码长度为至少3个氨基酸的肽，
U是PADRE II类序列和破伤风类毒素MHC II类序列中的每一者，
所述载体骨架包含黑猩猩腺病毒载体，任选地其中所述黑猩猩腺病毒载体是ChAdV68载体，或甲病毒载体，任选地其中所述甲病毒载体是委内瑞拉马脑炎病毒载体，并且
所述MHC I类抗原编码核酸序列中的每一者编码长度介于13个和25个之间的氨基酸的多肽。
27.如上述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物还包含纳米微粒递送媒介物。
28.如权利要求27所述的组合物，其中所述纳米微粒递送媒介物是脂质纳米粒子(LNP)。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述LNP包含可电离氨基脂质。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述可电离氨基脂质包含MC3样(二亚油基甲基-4-二甲基氨基丁酸酯)分子。
31.如权利要求27-30中任一项所述的组合物，其中所述纳米微粒递送媒介物包封所述抗原表达系统。
32.如权利要求10-21、23-25或27-31中任一项所述的组合物，其中所述抗原盒整合在所述至少一种启动子核苷酸序列和所述至少一种poly(A)序列之间。
33.如权利要求10-21、23-25或27-32中任一项所述的组合物，其中所述至少一种启动子核苷酸序列可操作地连接到所述抗原编码核酸序列。
34.如权利要求10-21、23-25或27-33中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种载体包含一种或多种+链RNA载体。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述一种或多种+-链RNA载体包含5'7-甲基鸟苷(m7g)帽。
36.如权利要求34或35所述的组合物，其中所述一种或多种+链RNA载体通过体外转录产生。
37.如权利要求10-21、23-25或27-36中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种载体在哺乳动物细胞内自我复制。
38.如权利要求10-21、23-25或27-37中任一项所述的组合物，其中所述骨架包含奥拉病毒、摩根堡病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、罗斯河病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒或马雅罗病毒的至少一种核苷酸序列。
39.如权利要求10-21、23-25或27-37中任一项所述的组合物，其中所述骨架包含委内瑞拉马脑炎病毒的至少一种核苷酸序列。
40.如权利要求38或39所述的组合物，其中所述骨架至少包含由所述奥拉病毒、所述摩根堡病毒、所述委内瑞拉马脑炎病毒、所述罗斯河病毒、所述塞姆利基森林病毒、所述辛德毕斯病毒或所述马雅罗病毒的所述核苷酸序列编码的用于非结构蛋白介导的扩增的序列、26S启动子序列、poly(A)序列、非结构蛋白1(nsP1)基因、nsP2基因、nsP3基因和nsP4基因。
41.如权利要求38或39所述的组合物，其中所述骨架至少包含由所述奥拉病毒、所述摩根堡病毒、所述委内瑞拉马脑炎病毒、所述罗斯河病毒、所述塞姆利基森林病毒、所述辛德毕斯病毒或所述马雅罗病毒的所述核苷酸序列编码的用于非结构蛋白介导的扩增的序列、26S启动子序列和poly(A)序列。
42.如权利要求40或41所述的组合物，其中用于非结构蛋白介导的扩增的序列选自由以下组成的组：甲病毒5'UTR、51-nt CSE、24-nt CSE、26S亚基因组启动子序列、19-nt CSE、甲病毒3'UTR或其组合。
43.如权利要求40-42中任一项所述的组合物，其中所述骨架不编码结构性病毒粒子蛋白衣壳E2和E1。
44.如权利要求43所述的组合物，其中所述抗原盒被插入以代替所述奥拉病毒、所述摩根堡病毒、所述委内瑞拉马脑炎病毒、所述罗斯河病毒、所述塞姆利基森林病毒、所述辛德毕斯病毒或所述马雅罗病毒的所述核苷酸序列内的结构性病毒粒子蛋白。
45.如权利要求38或39所述的组合物，其中所述委内瑞拉马脑炎病毒包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的序列。
46.如权利要求38或39所述的组合物，其中所述委内瑞拉马脑炎病毒包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的序列，还包含碱基对7544和11175之间的缺失。
47.如权利要求46所述的组合物，其中所述骨架包含以SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的序列。
48.如权利要求46或47所述的组合物，其中所述抗原盒被插入在位置7544以代替SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的序列中所示的碱基对7544和11175之间的缺失。
49.如权利要求44-48所述的组合物，其中所述抗原盒的插入提供了包含所述nsP1-4基因和所述至少一种抗原编码核酸序列的多顺反子RNA的转录，其中所述nsP1-4基因和所述至少一种抗原编码核酸序列在单独的开放阅读框中。
50.如权利要求10-21、23-25或27-37中任一项所述的组合物，其中所述骨架包含黑猩猩腺病毒载体的至少一种核苷酸序列。
51.如权利要求50所述的组合物，其中所述黑猩猩腺病毒载体是ChAdV68载体。
52.如权利要求10-21、23-25或27-51中任一项所述的组合物，其中所述至少一种启动子核苷酸序列是由所述骨架编码的原生26S启动子核苷酸序列。
53.如权利要求10-21、23-25或27-51中任一项所述的组合物，其中所述至少一种启动子核苷酸序列是外源RNA启动子。
54.如权利要求10-21、23-25或27-53中任一项所述的组合物，其中所述第二启动子核苷酸序列是26S启动子核苷酸序列。
55.如权利要求10-21、23-25或27-53中任一项所述的组合物，其中所述第二启动子核苷酸序列包含多个26S启动子核苷酸序列，其中每个26S启动子核苷酸序列提供所述单独的开放阅读框中的一者或多者的转录。
56.如权利要求10-55中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种载体的大小各自为至少300nt。
57.如权利要求10-56中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种载体的大小各自为至少1kb。
58.如权利要求10-57中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种载体的大小各自为2kb。
59.如权利要求10-58中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种载体的大小各自小于5kb。
60.如权利要求10-59中任一项所述的组合物，其中所述至少一种抗原编码核酸序列中的至少一者编码由MHC I类蛋白呈递的多肽序列或其部分。
61.如权利要求10-21、23-25或27-60中任一项所述的组合物，其中每个抗原编码核酸序列彼此直接连接。
62.如权利要求10-21、23-25或27-61中任一项所述的组合物，其中所述至少一种抗原编码核酸序列中的至少一者利用编码接头的核酸序列与不同的抗原编码核酸序列连接。
63.如权利要求62所述的组合物，其中所述接头连接两个MHC I类表位序列或将一个MHC I类表位序列连接到一个MHC II类序列。
64.如权利要求63所述的组合物，其中所述接头选自由以下组成的组：(1)连续甘氨酸残基，长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个(SEQ ID NO:169)残基；(2)连续丙氨酸残基，长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个(SEQ ID NO:170)残基；(3)两个精氨酸残基(RR)；(4)丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸(AAY)；(5)由哺乳动物蛋白酶体有效加工的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基的共有序列；和(6)侧接源自同源蛋白的抗原并且长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或2-20个氨基酸残基的一种或多种原生序列。
65.如权利要求62所述的组合物，其中所述接头连接两个MHC II类序列或将一个MHCII类序列连接到一个MHC I类表位序列。
66.如权利要求64所述的组合物，其中所述接头包含序列GPGPG(SEQ ID NO:171)。
67.如权利要求10-21、23-25或27-66中任一项所述的组合物，其中所述至少一种抗原编码核酸序列中的至少一个序列可操作地或直接地连接到增强所述至少一种抗原编码核酸序列的表达、稳定性、细胞运输、加工和呈递和/或免疫原性的分离或连续的序列。
68.如权利要求67所述的组合物，其中所述分离或连续的序列包含以下中的至少一者：泛素序列、经修饰以增加蛋白酶体靶向的泛素序列(例如，泛素序列在位置76处含有Gly至Ala取代)、免疫球蛋白信号序列(例如，IgK)、主要组织相容性I类序列、溶酶体相关膜蛋白(LAMP)-1、人树突状细胞溶酶体相关膜蛋白和主要组织相容性II类序列；任选地其中所述经修饰以增加蛋白酶体靶向的泛素序列是A76。
69.如权利要求10-21、23-25或27-68中任一项所述的组合物，其中所述至少一种抗原编码核酸序列包含至少2-10、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核酸序列。
70.如权利要求1-3、10-21、23-25或27-68中任一项所述的组合物，其中所述至少一种HIV MHC I类抗原编码核酸序列或所述至少一种抗原编码核酸序列包含至少15-20、11-100、11-200、11-300、11-400或多达400种核酸序列。
71.如权利要求1-3、10-21、23-25或27-68中任一项所述的组合物，其中所述至少一种HIV MHC I类抗原编码核酸序列或所述至少一种抗原编码核酸序列包含至少2-400种核酸序列，并且其中所述抗原编码核酸序列中的至少两者编码由MHC I类蛋白呈递的多肽序列或其部分。
72.如权利要求22或26所述的组合物，其中所述抗原编码核酸序列中的至少两者编码由MHC I类蛋白呈递的多肽序列或其部分。
73.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中当施用于所述受试者并被翻译时，由所述至少一种HIV MHC I类抗原编码核酸编码的所述抗原中的至少一者或所述MHC I类表位中的至少一者被呈递在抗原呈递细胞上，产生免疫响应。
74.如权利要求1-3或10-73中任一项所述的组合物，其中所述至少一种HIV MHC I类抗原编码核酸序列在施用于所述受试者并被翻译时，所述抗原中的至少一者被呈递在抗原呈递细胞上，产生免疫响应，并且任选地其中所述至少一种抗原编码核酸序列中的每一者的表达由所述至少一种启动子核苷酸序列驱动。
75.如权利要求1-3或10-74中任一项所述的组合物，其中每个MHC I类抗原编码核酸序列编码长度介于8个和35个之间的氨基酸，任选地长度为9-17、9-25、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸的多肽序列。
76.如权利要求10-21、23-25或27-75中任一项所述的组合物，其中存在所述至少一种MHC II类抗原编码核酸序列。
77.如权利要求10-21、23-25或27-76中任一项所述的组合物，其中所述至少一种MHCII类抗原编码核酸序列的长度为12-20、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20-40个氨基酸。
78.如权利要求10-21、23-25或27-77中任一项所述的组合物，其中存在所述至少一种MHC II类抗原编码核酸序列并且包含至少一种通用MHC II类抗原编码核酸序列，任选地其中所述至少一种通用序列包含破伤风类毒素和PADRE中的至少一者。
79.如权利要求10-21、23-25或27-78中任一项所述的组合物，其中所述至少一种启动子核苷酸序列或所述第二启动子核苷酸序列是诱导型的。
80.如权利要求10-21、23-25或27-78中任一项所述的组合物，其中所述至少一种启动子核苷酸序列或所述第二启动子核苷酸序列是非诱导型的。
81.如权利要求10-21、23-25或27-80中任一项所述的组合物，其中所述至少一种poly(A)序列包含所述骨架的原生poly(A)序列。
82.如权利要求10-21、23-25或27-80中任一项所述的组合物，其中所述至少一种poly(A)序列包含所述骨架的外源poly(A)序列。
83.如权利要求10-21、23-25或27-82中任一项所述的组合物，其中所述至少一种poly(A)序列可操作地连接到所述至少一种抗原编码核酸序列中的至少一者。
84.如权利要求10-21、23-25或27-83中任一项所述的组合物，其中所述至少一种poly(A)序列是至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个或至少90个连续的A核苷酸(SEQ ID NO:172)。
85.如权利要求10-21、23-25或27-83中任一项所述的组合物，其中所述至少一种poly(A)序列是至少100个连续的A核苷酸(SEQ ID NO:173)。
86.如权利要求1-3或10-85中任一项所述的组合物，其中所述抗原表达系统还包含以下中的至少一者：内含子序列，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)序列，内部核糖体进入序列(IRES)序列，编码2A自切割肽序列的核苷酸序列，编码弗林蛋白酶切割位点的核苷酸序列，或已知增强可操作地连接到所述至少一种抗原编码核酸序列中的至少一者的mRNA的核输出、稳定性或翻译效率的5'或3'非编码区中的序列。
87.如权利要求1-3或10-86中任一项所述的组合物，其中所述抗原表达系统还包含报告子，包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、GFP变体、分泌型碱性磷酸酶、荧光素酶、荧光素酶变体、或可检测的肽或表位。
88.如权利要求87所述的组合物，其中所述可检测的肽或表位选自由HA标签、Flag标签、His标签或V5标签组成的组。
89.如权利要求10-21、23-25或27-75中任一项所述的组合物，其中所述至少一种MHC I类抗原编码核酸序列通过执行以下步骤来选择：
(a)获得外显子组、转录组或全基因组核苷酸测序中的至少一者，其中所述核苷酸测序数据用于获得代表抗原集合中的每一者的肽序列的数据；
(b)将每个抗原的所述肽序列输入到呈递模型中，以产生所述抗原中的每一者由MHC蛋白中的一者或多者呈递的数值可能性集合，所述数值可能性集合已至少基于所接收的质谱数据进行鉴定；以及
(c)基于所述数值可能性集合选择所述抗原集合的子集以产生经选择抗原集合，所述经选择抗原用于产生所述至少一种MHC I类抗原编码核酸序列。
90.如权利要求22或26所述的组合物，其中所述MHC I类表位编码核酸序列中的每一者通过执行以下步骤来选择：
(a)获得外显子组、转录组或全基因组核苷酸测序数据中的至少一者，其中所述核苷酸测序数据用于获得代表抗原集合中的每一者的肽序列的数据；
(b)将每个抗原的所述肽序列输入到呈递模型中，以产生所述抗原中的每一者由一个或多个MHC蛋白呈递的数值可能性集合，所述数值可能性集合已至少基于所接收的质谱数据进行鉴定；以及
(c)基于所述数值可能性集合选择所述抗原集合的子集以产生经选择抗原集合，所述经选择抗原用于产生至少20种MHC I类抗原编码核酸序列。
91.如权利要求9、89或90所述的组合物，其中所述经选择抗原集合的数目是2-20个。
92.如权利要求9或89-91所述的组合物，其中所述呈递模型表示以下两者之间的依赖性：
(a)所述MHC等位基因中的特定一者和在肽序列的特定位置处的特定氨基酸的一对的存在；和
(b)由所述对的所述MHC等位基因中的所述特定一者呈递在所述特定位置处包含所述特定氨基酸的所述肽序列的可能性。
93.如权利要求9或89-92所述的组合物，其中选择所述经选择抗原集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的抗原被呈递的可能性增加的抗原，任选地其中所述经选择抗原已被验证为由一种或多种特异性HLA等位基因呈递。
94.如权利要求9或89-93所述的组合物，其中选择所述经选择抗原集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的抗原能够响应于所述受试者中HIV的存在而诱导免疫响应的可能性增加的抗原。
95.如权利要求9或89-94所述的组合物，其中选择所述经选择抗原集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的抗原能够由专职抗原呈递细胞(APC)呈递给初始T细胞的可能性增加的抗原，任选地其中所述APC是树突状细胞(DC)。
96.如权利要求9或89-95所述的组合物，其中选择所述经选择抗原集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的抗原经由中心或外周耐受性受抑制的可能性降低的抗原。
97.如权利要求9或89-96所述的组合物，其中选择所述经选择抗原集合包括基于所述呈递模型选择相对于未选择的抗原能够在所述受试者中诱导对正常组织的自身免疫响应的可能性降低的抗原。
98.如权利要求9或89-97所述的组合物，其中外显子组或转录组核苷酸测序数据是通过执行下一代测序(NGS)或任何大规模平行测序方法获得。
99.如权利要求1-3或10-98中任一项所述的组合物，其中所述抗原盒包含由所述抗原盒中的相邻序列形成的连接表位序列。
100.如权利要求99所述的组合物，其中至少一个或每个连接表位序列对MHC具有大于500nM的亲和力。
101.如权利要求99或100所述的组合物，其中每个连接表位序列是非自身的。
102.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述MHC I类表位中的每一者经预测或验证为能够由存在于至少5％的群体中的至少一种HLA等位基因呈递。
103.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述MHC I类表位中的每一者经预测或验证为能够由至少一个HLA等位基因呈递，其中每个抗原/HLA对在群体中具有至少0.01％的抗原/HLA发生率。
104.如上述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述MHC I类表位中的每一者经预测或验证为能够由至少一个HLA等位基因呈递，其中每个抗原/HLA对在群体中具有至少0.1％的抗原/HLA发生率。
105.一种药物组合物，所述药物组合物包含上述权利要求中任一项所述的组合物和药学上可接受的载剂。
106.如权利要求105所述的组合物，其中所述组合物还包含佐剂。
107.一种分离的核苷酸序列或分离的核苷酸序列集合，所述分离的核苷酸序列或分离的核苷酸序列集合包含上述组合物权利要求中任一项所述的抗原盒和一种或多种从SEQID NO:3或SEQ ID NO:5的序列获得的元件，任选地其中所述一种或多种元件选自由以下组成的组：非结构蛋白介导的扩增所必需的序列、26S启动子核苷酸序列、poly(A)序列以及SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的序列的nsP1-4基因，并且任选地其中所述核苷酸序列是cDNA。
108.如权利要求107所述的分离的核苷酸序列，其中所述序列或分离的核苷酸序列集合包含插入在SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示序列的位置7544处的上述组合物权利要求中任一项所述的抗原盒。
109.如权利要求107或108所述的分离的核苷酸序列，所述分离的核苷酸序列还包含：
从SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的所述序列获得的所述一种或多种元件的T7或SP6RNA聚合酶启动子核苷酸序列5'；和
任选地，所述poly(A)序列的一个或多个限制性位点3'。
110.如权利要求107所述的分离的核苷酸序列，其中上述组合物权利要求中任一项所述的抗原盒被插入在SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的位置7563处。
111.一种载体或载体集合，所述载体或载体集合包含如权利要求107-110所述的核苷酸序列。
112.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含如权利要求107-111所述的核苷酸序列或分离的核苷酸序列集合，任选地其中所述细胞是BHK-21、CHO、HEK293或其变体、911、HeLa、A549、LP-293、PER.C6或AE1-2a细胞。
113.一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用上述组合物权利要求中任一项所述的组合物或如权利要求105-106中任一项所述的药物组合物。
114.一种用于在受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用上述组合物权利要求中任一项所述的组合物或如权利要求105-106中任一项所述的药物组合物。
115.如权利要求113-114中任一项所述的方法，其中所述受试者表达至少一种经预测或已知呈递由所述抗原表达系统的所述一种或多种载体编码的所述MHC I类表位中的至少一者的HLA等位基因。
116.如权利要求113-115中任一项所述的方法，其中所述组合物是经肌肉内(IM)、皮内(ID)、皮下(SC)或静脉内(IV)施用的。
117.如权利要求113-115中任一项所述的方法，其中所述组合物是经肌肉内施用的。
118.如权利要求113-117中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用第二疫苗组合物。
119.如权利要求118所述的方法，其中所述第二疫苗组合物是在施用如权利要求113-114中任一项所述的组合物或药物组合物之前施用。
120.如权利要求118所述的方法，其中所述第二疫苗组合物是在施用如权利要求113-114中任一项所述的组合物或药物组合物之后施用。
121.如权利要求119或120所述的方法，其中所述第二疫苗组合物与如113-114中任一项所述的组合物或药物组合物相同。
122.如权利要求119或120所述的方法，其中所述第二疫苗组合物与如权利要求113-114中任一项所述的组合物或药物组合物不同。
123.如权利要求122所述的方法，其中所述第二疫苗组合物包含编码至少一种抗原编码核酸序列的黑猩猩腺病毒载体。
124.如权利要求123所述的方法，其中由所述黑猩猩腺病毒载体编码的所述至少一种抗原编码核酸序列与上述组合物权利要求中任一项所述的至少一种抗原编码核酸序列相同。
125.一种制造如权利要求1-4或10-106中任一项所述的抗原表达系统的方法，所述方法包括：
(a)获得包含骨架和抗原盒的线性化DNA序列；
(b)通过将所述线性化DNA序列添加到包含将所述线性化DNA序列转录成RNA的所有必要组分的体外转录反应中，体外转录所述线性化DNA序列，任选地还包括将m7g帽体外添加到所得RNA中；以及
(c)从所述体外转录反应中分离一种或多种载体。
126.如权利要求125所述的制造方法，其中所述线性化DNA序列是通过线性化DNA质粒序列或通过使用PCR扩增产生的。
127.如权利要求126所述的制造方法，其中所述DNA质粒序列是使用细菌重组或全基因组DNA合成或全基因组DNA合成与所合成DNA在细菌细胞中扩增中的一者产生的。
128.如权利要求125所述的制造方法，其中从所述体外转录反应中分离所述一种或多种载体涉及苯酚氯仿提取、基于硅胶柱的纯化或类似的RNA纯化方法中的一者或多者。
129.一种制造用于递送抗原表达系统的如权利要求1-4或10-106中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括：
(a)提供用于纳米微粒递送媒介物的组分；
(b)提供所述抗原表达系统；以及
(c)为所述纳米微粒递送媒介物和所述抗原表达系统提供足以产生用于递送所述抗原表达系统的组合物的条件。
130.如权利要求129所述的制造方法，其中所述条件由微流体混合提供。
131.一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定或已经确定所述受试者的HIV的HIV亚型；
b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及
c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，
其中所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID No:325-22349中任一者的表位序列组成的组的MHC I类表位序列，以及
d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
132.如权利要求131所述的方法，其中由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表35-45中的HLA等位基因组成的组。
133.一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型A1；
b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及
c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，
其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:325-2165所示序列组成的组的HIV表位，以及
d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
134.如权利要求133所述的方法，其中由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表35中的HLA等位基因组成的组。
135.一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型A2；
b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及
c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，
其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:2166-4106所示序列组成的组的HIV表位，以及
d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
136.如权利要求135所述的方法，其中由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表36中的HLA等位基因组成的组。
137.一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型B；
b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及
c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，
其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:4107-6241所示序列组成的组的HIV表位，以及
d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
138.如权利要求137所述的方法，其中由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表37中的HLA等位基因组成的组。
139.一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型C；
b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及
c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，
其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:6242-8389所示序列组成的组的HIV表位，以及
d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
140.如权利要求139所述的方法，其中由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表38中的HLA等位基因组成的组。
141.一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型D；
b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及
c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，
其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:8930-10626所示序列组成的组的HIV表位，以及
d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
142.如权利要求141所述的方法，其中由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表39中的HLA等位基因组成的组。
143.一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型F1；
b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及
c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，
其中所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:10627-12810所示序列组成的组的HIV表位，以及
d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
144.如权利要求143所述的方法，其中由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表40中的HLA等位基因组成的组。
145.一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型F2；
b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及
c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，
其中所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:12811-15079所示序列组成的组的HIV表位，以及
d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
146.如权利要求145所述的方法，其中由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表41中的HLA等位基因组成的组。
147.一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型G；
b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及
c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，
其中所述MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:15080-17174所示序列组成的组的HIV表位，以及
d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
148.如权利要求147所述的方法，其中由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表42中的HLA等位基因组成的组。
149.一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型H；
b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及
c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，
其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:17175-19388所示序列组成的组的HIV表位，以及
d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
150.如权利要求149所述的方法，其中由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表43中的HLA等位基因组成的组。
151.一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型J；
b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及
c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，
其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:19389-21003所示序列组成的组的HIV表位，以及
d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
152.如权利要求151所述的方法，其中由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表44中的HLA等位基因组成的组。
153.一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定或已经确定所述受试者的HIV是HIV亚型K；
b)确定或已经确定所述受试者是否表达经预测或已知呈递由基于抗原的疫苗中的抗原编码核酸序列编码的MHC I类表位的HLA等位基因，以及
c)确定或已经确定所述受试者是当所述受试者表达所述HLA等位基因并且所述HIV亚型表达由所述基于抗原的疫苗中的所述抗原编码核酸序列编码的所述MHC I类表位时利用所述基于抗原的疫苗进行治疗的候选者，
其中所述MHC I类表位包含至少一种MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:21004-22349所示序列组成的组的HIV表位，以及
d)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
154.如权利要求153所述的方法，其中由所述受试者表达的所述HLA等位基因选自由表45中的HLA等位基因组成的组。
155.如权利要求131-154中任一项所述的方法，其中确定或已经确定所述受试者的HIV的HIV亚型包括从已经处理来自所述受试者的样品的第三方获得指示所述HIV亚型的数据集。
156.如权利要求131-154中任一项所述的方法，其中确定或已经确定所述受试者是否表达HLA等位基因包括从已经处理来自所述受试者的样品的第三方获得数据集。
157.如权利要求131-154中任一项所述的方法，其中确定或已经确定所述受试者是否表达HLA等位基因包括从所述受试者获得样品并使用选自由以下组成的组的方法测定所述样品：外显子组测序、靶向外显子组测序、转录组测序、Sanger测序、基于PCR的基因分型测定、基于质谱的方法、微阵列、Nanostring、ISH和IHC。
158.如权利要求157所述的方法，其中所述样品选自组织、体液、血液、脊髓液或针吸液。
159.如权利要求131-158中任一项所述的方法，其中所述HLA等位基因具有至少1％的HLA频率。
160.一种用于治疗受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID No:325-22349所示序列组成的组的HIV表位序列。
161.一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型A1，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:325-2165所示序列组成的组的HIV表位。
162.一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型A2，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:2166-4106所示序列组成的组的HIV表位。
163.一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型B，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:4107-6241所示序列组成的组的HIV表位。
164.一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型C，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:6242-8389所示序列组成的组的HIV表位。
165.一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型D，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:8930-10626所示序列组成的组的HIV表位。
166.一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型F1，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:10627-12810中所示的序列组成的组的HIV表位序列。
167.一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型F2，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:12811-15079中所示的序列组成的组的HIV表位序列。
168.一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型G，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:15080-17174中所示的序列组成的组的HIV表位序列。
169.一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型H，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:17175-19388所示序列组成的组的HIV表位。
170.一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型J，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:19389-21003所示序列组成的组的HIV表位。
171.一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型K，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:21004-22349所示序列组成的组的HIV表位。
172.一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID No:325-22349中所示的序列组成的组的HIV表位序列。
173.一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型A1，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:325-2165所示序列组成的组的HIV表位。
174.一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型A2，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:2166-4106所示序列组成的组的HIV表位。
175.一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型B，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:4107-6241所示序列组成的组的HIV表位。
176.一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型C，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:6242-8389所示序列组成的组的HIV表位。
177.一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型D，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含选自由SEQ ID NO:8930-10626中任一者的表位序列组成的组的MHC I类表位序列。
178.一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型F1，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:10627-12810所示序列组成的组的HIV表位序列。
179.一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型F2，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:12811-15079所示序列组成的组的HIV表位序列。
180.一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型G，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:15080-17174所示序列组成的组的HIV表位序列。
181.一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型H，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:17175-19388所示序列组成的组的HIV表位。
182.一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型J，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:19389-21003所示序列组成的组的HIV表位。
183.一种用于在患有HIV的受试者中诱导免疫响应的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于抗原的疫苗，其中所述基于抗原的疫苗包含：
1)至少一种由HIV亚型表达的MHC I类表位，其中所述HIV亚型是HIV亚型K，或
2)编码所述至少一种MHC I类表位的MHC I类表位编码核酸序列，
其中所述至少一种MHC I类表位包含MHC I类表位序列，所述MHC I类表位序列包含至少一种选自由SEQ ID NO:21004-22349所示序列组成的组的HIV表位。
184.如权利要求160-183中任一项所述的方法，其中所述受试者表达至少一种经预测或已知呈递所述至少一种MHC I类表位序列的HLA等位基因。
185.如权利要求160-183中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：
在向所述受试者施用所述基于抗原的疫苗之前，确定所述受试者是接受所述基于抗原的疫苗的候选者，其中所述确定包括鉴定1)所述受试者表达已知或经预测呈递所述至少一种MHC I类表位的HLA等位基因，并且2)所述受试者已经暴露于所述HIV亚型或易暴露于所述HIV亚型。
186.如权利要求184或185中任一项所述的方法，其中所述至少一种HLA等位基因选自由表35-45中的HLA等位基因组成的组。
187.如权利要求131-186中任一项所述的方法，其中所述基于抗原的疫苗包含抗原表达系统。
188.如权利要求187所述的方法，其中所述抗原表达系统包含如权利要求10-104中任一项所述的抗原表达系统中的任一者。
189.如权利要求131-188中任一项所述的方法，其中所述基于抗原的疫苗包含如权利要求105-106中任一项所述的药物组合物中的任一者。
190.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中每个MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:325-2165所示序列组成的组的HIV表位。
191.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中每个MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:2166-4106所示序列组成的组的HIV表位。
192.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中每个MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:4107-6241所示序列组成的组的HIV表位。
193.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中每个MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:6242-8389所示序列组成的组的HIV表位。
194.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中每个MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:8930-10626所示序列组成的组的HIV表位。
195.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中每个MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:10627-12810所示序列组成的组的HIV表位。
196.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中每个MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:12811-15079所示序列组成的组的HIV表位。
197.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中每个MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:15080-17174所示序列组成的组的HIV表位。
198.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中每个MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:17175-19388所示序列组成的组的HIV表位。
199.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中每个MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:19389-21003所示序列组成的组的HIV表位。
200.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中每个MHC I类表位包含至少一种选自由SEQ ID NO:21004-22349所示序列组成的组的HIV表位。
201.一种评估患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定或已经确定所述受试者表达HLA等位基因；
b)获得或已经获得所述受试者中存在的HIV的测序数据；
c)选择包含在基于抗原的疫苗中的候选表位序列，其中第一候选表位序列包含至少一种选自由SEQ ID No:325-22349所示序列组成的组的HIV表位，并且其中第二候选表位序列是突变的表位序列，所述第一候选表位序列和所述第二候选表位序列中的每一者经预测由所述受试者表达的所述HLA等位基因呈递；
d)产生包括经选择候选表位序列的所述基于抗原的疫苗；以及
e)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
202.一种用于治疗患有HIV的受试者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定或已经确定所述受试者表达HLA等位基因；
b)获得或已经获得所述受试者中存在的HIV的测序数据；
c)选择包含在基于抗原的疫苗中的候选表位序列，其中第一候选表位序列包含至少一种选自由SEQ ID No:325-22349所示序列组成的组的HIV表位，并且其中第二候选表位序列是突变的表位序列，所述第一候选表位序列和所述第二候选表位序列中的每一者经预测由所述受试者表达的所述HLA等位基因呈递；
d)产生包括经选择候选表位序列的所述基于抗原的疫苗；以及
e)任选地，向所述受试者施用或已经施用所述基于抗原的疫苗。
203.如权利要求1-8或131-202中任一项所述的方法，其中SEQ ID No:325-22349中任一者的表位序列是通过应用在通过质谱法测序的HLA呈递肽上训练的呈递模型来鉴定。
204.如权利要求203所述的方法，其中所述呈递模型在40％的召回率下表现出0.28的精度值。
205.如权利要求203所述的方法，其中所述呈递模型表现出0.24的AUC。
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