KR20220163354A - 헤르페스 바이러스 당단백질 d와 융합된 간염 b 바이러스 항원들을 인코딩하는 아데노바이러스 벡터들 및 이를 이용하는 방법 - Google Patents

헤르페스 바이러스 당단백질 d와 융합된 간염 b 바이러스 항원들을 인코딩하는 아데노바이러스 벡터들 및 이를 이용하는 방법 Download PDF

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콜린 스티븐 마고완
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비리온 테라퓨틱스, 엘엘씨
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Abstract

B형 간염 바이러스(HBV) 코어 단백질의 비자연적으로 발생되는 변이들, HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인 및 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인뿐만 아니라 이의 면역원성 단편들이 여기에 제공된다. 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 당단백질(gD) 서열과 융합된 HBV 변이들을 포함하는 융합 단백질들뿐만 아니라 상기 융합 단백질들을 이용하는 방법들로 제공된다.

Description

헤르페스 바이러스 당단백질 D와 융합된 간염 B 바이러스 항원들을 인코딩하는 아데노바이러스 벡터들 및 이를 이용하는 방법
B형 간염 바이러스(HBV) 코어 단백질의 비자연적으로 발생되는 변이들, HBV 폴리메라아제(polymerase) N-말단 도메인 및 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인뿐만 아니라 이의 면역원성 단편들 그리고 이들을 포함하는 융합 단백질들이 여기에 개시된다.
본 출원은 2020년 1월 9일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/958,809호, 2020년 1월 9일에 출원된 미국 특허 출원 제62/958,827호, 2020년 1월 29일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/967,242호, 2020년 1월 29일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/967,104호, 2020년 8월 12일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제63/064,506호, 2020년 8월 12일에 미국 임시 특허 출원 제63/064,571호, 2020년 11월 11일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제63/112,202호, 그리고 2020년 11월 11일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제63/112,219호를 우선권들로 수반하며, 각각의 개시 하항은 전체적으로 여기에 참조로 포함된다.
서열 리스트
본 출원은 ASCII 형식으로 전자 문서로 제출된 서열 리스트를 포함하며, 여기에 전체적으로 참조로 포함된다. 2021년 1월 7일에 만들어진 상기 ASCII 복사본은 111876_000035_SL.txt로 지칭되며, 151,446바이트의 크기이다.
세계 보건 기구는 2015년에 257백만의 사람들이 만성 B형 간염 감염(B 형 간염 표면 항원 양성인 것으로 정의됨)을 지니고 살았던 것과 B형 간염이 대부분 간경변증 및 간세포암(즉, 원발 간암)으로부터 887,000의 추정되는 사망자들을 야기하였던 것으로 추산하고 있다. 생식 가능 연령의 여성들이 세계 인구의 25.3%(유엔 데이터)을 구성하는 것으로 상정하면, 만성적으로 감염된 성인들은 잠재적으로 HBV를 그들의 아기들에 전달할 수 있는 65백만의 가임기의 여성들을 포함할 수 있다(WHO 세계 간염 보고서 2017: apps_who_int/iris/bitstream/handle/10665/255016/9789241565455-eng.pdf;jsessionid＝D78616700ED7322D4109CA4541FB94EA?sequence＝1에서 입수 가능함). 2016년의 전체 발생률은 100,000명의 인구 당 1.0건이었다(질병 통제 예방 센터(Centers for Disease Control and Prevention)의 "바이러스성 간염 감시-미국 2017"(아틀랜타: 미국 보건 사회 복지부, 질병 통제 예방 센터; 2019). www_cdc_gov/hepatitis/statistics/2017surveillance/index.htm.에서 입수 가능함). 2017년도에만, 전체 3,407건의 급성 B형 간염이 질병 통제 예방 센터(CDC)에 보고되었다.
예방 HBV 백신의 유효성에도 불구하고, 만성 HBV 감염의 부담은 차선적인 치료 선택 사항들 및 대부분의 개발도상국에서의 새로운 감염들의 지속되는 비율들로 인해 세계적인 의료 문제를 상당히 충족시키지 못하고 있다.
B형 간염 바이러스(HBV) 코어 단백질의 비자연적으로 발생되는 변이들, HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인 및 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인뿐만 아니라 이의 면역원성 단편들 그리고 이들을 포함하는 융합 단백질들이 제공된다.
SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편(immunogenic fragment)을 포함하는 B형 간염 바이러스(hepatitis B virus: HBV) 코어 단백질이 여기에 제공된다.
또한, SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인이 제공된다.
또한, SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인이 개시된다.
또한, N-말단 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus: HSV) 당단백질(gD) 서열 또는 이의 변이; 개시되는 HBV 코어 단백질, HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 또는 이의 면역원성 단편들; 및 C-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이를 포함하는 융합 단백질들이 제공된다.
또한, N-말단 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 당단백질(gD) 서열 또는 이의 변이; 개시되는 HBV 코어 단백질, HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인 및/또는 이의 면역원성 단편들의 결합들; 그리고 C-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이를 포함하는 융합 단백질들이 여기에 제공된다.
개시되는 단백질들 또는 융합 단백질들을 포함하는 핵산 분자들, 상기 핵산 분자들을 포함하는 벡터들, 그리고 개시되는 벡터들을 포함하는 백신들이 여기에 개시된다.
또한, 대상에서 HBV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법들이 여기에 제공되며, 상기 방법은 상기 대상에 개시되는 융합 단백질들, 핵산 분자들, 벡터들, 또는 백신들 중의 임의의 것의 유효량을 제공하는 단계를 포함하며, 이에 따라 HBV에 대한 면역 반응을 유도한다.
본 발명의 요약뿐만 아니라 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면들과 함께 파악될 때에 잘 이해될 것이다. 개시되는 단백질들, 백신들 및 방법들을 예시하는 목적을 위해, 상기 단백질들, 백신들 및 방법들의 예시적인 실시예들이 도면에 도시되지만, 상기 단백질들, 백신들 및 방법들이 개시되는 특정한 실시예들에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 에피토프 최적화 코어 아미노산들의 도수를 예시한다. 아미노산 잔기들은 X-축 상에 나타나고, 분석된 모든 게놈들에 걸친 퍼센트 서열 유사성은 Y-축 상에 나타난다.
도 2a, 도 2b, 도 2c, 도 2d, 도 2e 및 도 2f는 gD 내로 유전자적으로 융합된 에피토프 최적화 코어 서열(SEQ ID NO: 15)(AdC6-gD코어)을 포함하는 침팬지 혈청형 6(AdC6)의 복제 결손 아데노바이러스 벡터(도 2a 및 도 2d); gD 내로 유전자적으로 융합된 에피토프 최적화 폴리메라아제 C-말단 도메인 서열을 포함하는 AdC6(SEQ ID NO: 19)(AdC6-gDPolC)(도 2b 및 도 2e); 그리고 gD 내로 유전자적으로 융합된 에피토프 최적화 폴리메라아제 N-말단 도메인 서열을 포함하는 AdC6(SEQ ID NO: 17)(AdC6-gDPolN)(도 2c 및 도 2f)의 나타낸 도스들로 근육 내(i.m.) 주사기 수반된 C57Bl/6 마우스들 내의 백신 삽입-특이적 T 세포 도수들을 예시한다. 마우스들은 주사 후의 14일에 채혈되었고, 다양한 HBV 삽입들에 대한 T 세포 도수들이 HBV 서열들을 나타내는 중첩 펩티드들로의 세포들의 자극에 따라 인터페론(IFN)-g에 대해 세포내 시토카인 염색(ICS)에 의해 분석되었다. 대조군 세포들은 펩티드들이 없이 배양되었다. 그래프들은 라인들로 나타낸 중앙을 갖는 개개의 마우스들에 대한 결과들을 보여준다. 도 2a-도 2c는 삽입-특이적 CD8+ T 세포 도수를 보여주며, 도 2d-도 2f는 삽입-특이적 CD4+ T 세포 도수를 보여준다.
도 3a, 도 3b 및 도 3c는 나타낸 HBV 서열을 대표하는 펩티드들 의 풀들 에 대한 다른 마우스 균주들(A: C57Bl/6 마우스들; B: BALB/c 마우스들; C: HLA-A2 유전자 이식(tg) 마우스들) 내의 T 세포 도수들을 예시한다. 결과들은 면역 후의 4주에 수확된 비장 세포들로 얻어졌고, IFN-g에 대해 ICS에 의해 테스트되었다. 펩티드들은 2의 풀들의 인식이 하나의 펩티드를 확인하도록 기질들 내에 배열되었다. 그래프는 다른 풀들에 대한 반응들을 보여주며, 모든 펩티드들을 포함하는 풀에 대한 반응들이 우측에 도시된다. 상기 펩티드들이 없이 얻어진 배경 도수들은 감산되었다. 반응을 유도하는 것으로 보였던 풀들 및 다른 풀들에 대한 반응에서 확인되는 펩티드들은 각 도면의 하부에 열거된다. CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포 반응들이 BALB/c 마우스들에 대해 도시되고, CD8+ T 세포 반응들이 인간 MHC 클래스 I 분자를 운반하지만 마우스 MHC 클래스 II 분자들인 HLA-A2 tg 마우스들에 대해 도시된다. T 세포들은 활성화된 CD44+ 세포들에 대한 관문이 되었다. 각각의 연속하여 번호가 부여된 "펩티드"는 제1, 제6, 제11 등으로 시작되는 코어, PolN, 또는 PolC 서열의 아미노산의 15의 아미노산들로 구성된다. 따라서 예를 들면, 코어의 펩티드 1은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-15(즉, 상기 에피토프 최적화 코어 아미노산 서열)에 대응되고, 코어의 펩티드 2는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 6-20에 대응되며, 코어의 펩티드 3은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 11-25에 대응되는 등이 된다. 유사하게, PolN의 펩티드 1은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-15(즉, 상기 에피토프 최적화 PolN 아미노산 서열)에 대응되고, PolN의 펩티드 2는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 6-20에 대응되며, PolN의 펩티드 3은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 11-25에 대응되는 등이 된다. 마찬가지로, PolC의 펩티드 1은 SEQ ID NO: 10 아미노산 1-15(즉, 상기 에피토프 최적화 PolC 아미노산 서열)에 대응되고, PolC의 펩티드 2는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 6-20에 대응되며, PolC의 펩티드 3은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 11-25에 대응되는 등이 된다.
도 4a, 도 4b 및 도 4c는 나타낸 벡터들의 다양한 도스들로 면역된 C57Bl/6 마우스들에서 AdC6-gDCore(A), AdC6-gDPolC(B) 및 AdC6-gDPolN(C)으로의 추가 접종에 따른 IFN-γ 반응을 나타낸다. 좌측 그래프들은 AdC6 벡터로의 초회 접종 후의 2주에 혈액으로부터 테스트된 반응들을 나타낸다. 마우스들은 동일한 삽입들을 발현시키는 AdC7 벡터들의 동일한 도스로 8주 이후에 추가 접종되었다. 우측 그래프들은 혈액 내의 상기 추가 후의 2주에서의 반응들을 보여준다.
도 5a, 도 5b 및 도 5c는 나타낸 HBV 서열을 대표하는 펩티드들의 풀들에 대한 다른 마우스 균주들(A: C57Bl/6 마우스들; B: BALB/c 마우스들; C: HLA-A2 tg 마우스들) 내의 T 세포 도수들을 예시한다. 마우스들은 3의 삽입들(즉, 코어, PolC, 또는 PolN) 중의 하나를 발현시키는 AdC6 벡터들로 초회 접종되었으며, 동일한 삽입들을 발현시키는 AdC7 벡터들로 8주 이후에 추가 접종되었다. 결과들은 면역 후의 4주에서 수확된 비장 세포들로 얻어졌고, IFN-g에 대해 ICS로 테스트되었다. 펩티드들은 2의 풀들의 인식이 하나의 펩티드를 확인하도록 기질들 내에 배열되었다. 그래프들은 다른 풀들에 대한 반응들을 나타내며, 모든 펩티드들을 포함하는 풀에 대한 반응들이 우측에 도시된다. 상기 펩티드들이 없이 얻어진 배경 도수들은 감산되었다. 반응을 유도한 것으로 보였던 풀들 및 다른 풀들에 대한 반응에서 확인된 펩티드들은 각 도면의 하부에 열거된다. CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포 반응들이 BALB/c 마우스들에 대해 도시되며, CD8+ T 세포 반응들이 인간 MHC 클래스 I 분자를 운반하지만 마우스 MHC 클래스 II 분자들인 HLA-A2 tg 마우스들에 대해 도시된다. T 세포들은 활성화된 CD44+ 세포들에 대한 관문이 되었다. 각각의 연속적으로 번호가 부여된 "펩티드"는 제1, 제6, 제11 등의 상기 코어, PolN, 또는 PolC 서열의 아미노산으로 시작되는 15의 아미노산들로 구성된다. 따라서 예를 들면, 코어의 펩티드 1은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1-15(즉, 상기 에피토프 최적화 코어 아미노산 서열)에 대응되고, 코어의 펩티드 2는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 6-20에 대응되며, 코어의 펩티드 3은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 11-25에 대응되는 등이 된다. 유사하게, PolN의 펩티드 1은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 1-15(즉, 상기 에피토프 최적화 PolN 아미노산 서열)에 대응되고, PolN의 펩티드 2는 SEQ ID NO: 8 아미노산 6-20에 대응되며, PolN의 펩티드 3은 SEQ ID NO: 8 아미노산 11-25에 대응되는 등이 된다. 마찬가지로, PolC의 펩티드 1은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1-15(즉, 상기 에피토프 최적화 PolC 아미노산 서열)에 대응되고, PolC의 펩티드 2는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 6-20에 대응되며, PolC의 펩티드 3은 SEQ ID NO: 10의 아미노산에 대응되는 등이 된다.
도 6은 AAV-1.3HBV 시험 감염에 따른 혈청 내의 HBV 게놈 복제 숫자들에 대한 접종의 효과를 예시한다. 3의 마우스들의 그룹이 1 x 1010, 1 x 1011 또는 1.5 x 1011 바이러스 게놈들(vg)의 아데노-연관 바이러스 8(AAV8)-1.3HBV 벡터로 시험 감염되었고, 8주 이후에 AdC6-gDPolN로 접종되었다. 바이러스 역가들은 접종 후의 8주에서 테스트되었고, 전-접종 역가들과 비교되었다. 각 치료 그룹에 대해 베이스라인으로부터의 바이러스 변화들이 도시된다.
도 7a, 도 7b, 도 7c, 도 7d 및 도 7e는 예시적인 HBV 에피토프 편위 실험들을 도시한다. 도 7a-마우스들은 AdC6-gDPolN 백신으로 면역되었다. 4주 이후에 비장 세포들이 상기 PolN 서열을 나타내는 펩티드 풀들에 대한 IFN-γ 반응들을 대해 세포내 시토카인 염색에 의해 테스트되었다. 자극 후의 T 세포들은 T 세포 마커들에 대해 염색되었다. 도 7b-결과들은 1 x 1010vg의 AAV8-1.3-HBV로 시험 감염되었던 마우스들로부터의 비장 세포들을 이용하여 동일한 분석으로 얻어졌다. 마우스들은 4주 이후에 접종되었고, T 세포 반응들은 10주 이후에 비장들로부터 테스트되었다. 도 7c-결과들은 1.5 x 1011vg의 AAV8-1.3-HBV로 시험 감염되었던 마우스들로부터의 비장 세포들을 이용하여 동일한 분석으로 얻어졌다. 마우스들은 4주 이후에 접종되었고, T 세포 반응들은 10주 후에 비장들로부터 테스트되었다. 도 7a, 도 7b 및 도 7c는 모든 CD44+ CD8+ T 세포들에 대한 IFN-γ를 생성하는 CD44+ CD8+ T 세포들의 도수들을 보여준다. 펩티드 풀들이 없이 배양된 비장 세포들에 의해 얻어진 배경 반응들은 감산되었다. 도 7d-펩티드 풀들. 도 7e-개개의 펩티드 서열들. 도 7e는 외양의 순서로 각기 SEQ ID NO: 55-NO: 68 및 NO: 189-NO: 233을 개시한다.
도 8a, 도 8b 및 도 8c는 도 7에서 상술한 바와 동일한 실험으로부터의 데이터를 도시한다. 펩티드 풀들에 대한 반응들에 기초하여, 개개의 펩티드들(도 7에 도시된 둘의 풀들 및 펩티드들)이 양성인 지가 결정되었다. 그래프들은 모든 펩티드들에 대한 반응을 나타낸다. 각 펩티드는 둘의 풀들 내에 존재하였으며, 이에 따라 도수들에 대한 두 개의 값들이 각 펩티드에 대해 얻어졌고, 보다 낮은 데이터 포인트들만이 본 도면에 도시된다.
도 9a, 도 9b 및 도 9c는 예시적인 AdC6-gD코어, AdC6-gDPolN, 또는 AdC6-gDPolC 벡터들의 다양한 도스들로 주사되고, 첫 번째 주사 후위 2개월에 동일한 삽입(즉, AdC7-gD코어, AdC7-gDPolN, 또는 AdC7-gDPolC 벡터들)을 포함하는 AdC7 벡터들로 추가 접종된 C57Bl/6 마우스들(그룹 당 n＝5)에 대해 수행된 예시적인 면역원성 실험들로부터의 결과들을 나타낸다. 도 9a는 항원 면역원성을 예시하고, 도 9b는 상기 반응의 지속을 예시하며, 도 9c는 초회-추가 반응을 예시한다.
도 10은 AdC6-gDPolN의 초회 및 AdC7-gDPolN의 추가 접종 후의 BALB/c, C57Bl/6 및 HLA-A2 유전자 이식 마우스들에서 PolN 에피토프들의 CD8+ T 세포 펩티드 인식을 나타낸다. CD8+ T 세포 펩티드 인식은 PolN으로부터의 중첩되는 8의 펩티드들의 전체 숫자(전체 59 펩티드들)에 의해 상기 초회 또는 상기 추가 후의 2주에 인식된 양성 펩티드들의 부분으로 계산되었다.
도 11a 및 도 11b는 나타낸 벡터들로 주사된 C57Bl/6 마우스들의 간들 내의 백신-유도 HBV-특이적 CD8+ T 세포 반응을 나타낸다. 1방(1-way) ANOVA을 통한 * 0.01-0.05 사이의 p-값이고, *** 0.0001-0.001 사이의 p-값이다.
도 12a, 도 12b, 도 12c, 도 12d, 도 12e 및 도 12f는 나타낸 벡터들로 주사된 C57Bl/6 마우스들로부터의 각 샘플들의 헤마톡실린 및 에오신 염색을 나타낸다. 20x 확대. 화살표들은 림프구 침윤물들의 영역들을 나타낸다.
도 13a 및 도 13b는 나타낸 벡터들로 주사된 C57Bl/6 마우스들의 간들에서 CD8+ T 세포 활성화/소진의 백신-유도 마커들을 나타낸다. 1방 ANOVA를 통한 ** 0.001-0.01 사이의 p-값이고, *** 0.0001-0.001 사이의 p-값이다.
도 14a 및 도 14b는 예시적인 AdC6-gDPolN 벡터로 주사된 C57Bl/6 마우스들 내의 HBV 바이러스 역학을 나타낸다. 중간 HBV DNA VL/㎖이 4주-7.3에서 log10 cps/㎖로 제공된다. n＝7; 손실 데이터에 대해 배제된 하나의 마우스.
도 15a 및 도 15b는 1010 또는 1011vg의 AAV-1.3HBV로 첫 번째로 주사되었고, 이후에 4주에서 1010vp의 예시적인 AdC6-gDPolN 벡터로 추가 접종되었던 C57Bl/6 마우스들 내의 CD8+ T 세포 반응들에 대한 AAV-유도 HBV의 영향을 나타낸다. 도 15b에서, 각 슬라이스는 전체의 비율을 보여주는 크기로 개개의 에피토프를 나타내며, ＞0.1%의 반응들만이 포함되었다. 풀 아웃(pullout)들은 AAV8-1.3HBV 감염된 마우스들에서 인식된 에피토프들만을 나타낸다.
도 16은 1010vg의 AAV8-1.3HBV 벡터들로 i.v.로 주사되었고, 4주 이후에 5 x 109vp의 상기 AdC6-gDPolN 벡터로 접종되었으며, 2개월 이후에 동일한 도스의 AdC7-gDPolN 백신으로 추가 접종된 개개의 C57Bl/6 마우스들에 대한 IFN-γ을 생성하는 CD8+ T 세포들의 도수들을 나타낸다. 대조군 마우스들은 상기 백신만을 수용하였다. 나이브 마우스들은 추가적인 대조군들로 기여하였다.
도 17a 및 도 17b는 A) 개개의 마우스들의 간의 림프구 침윤물들 내의 CD8+ T 세포들의 %; 및 B) 동일한 침윤물들 내의 PolN-사합체+ CD8+ T 세포들의 도수들을 나타낸다. C57Bl/6 마우스들은 1010 또는 1011vg의 상기 AAV8-1.3HBV 벡터로 i.v.로 주사되었고, 4주 이후에 5 x 109vp의 상기 AdC6-gDPolN 벡터로 접종되었으며, 2개월 이후에 동일한 도스의 AdC7-gDPolN 백신으로 추가 접종되었다. 대조군 마우스들은 상기 백신만을 수용하였다. 나이브 마우스들은 추가적인 대조군들로 기여하였다.
도 18a, 도 18b, 도 18c, 도 18d, 도 18e 및 도 18f는 나타낸 마커들의 평균 형광 강도(MFI)로 분석된 나이브(즉, 사합체- CD44- CD8+) T 세포들과 비교한 침윤되는 사합체+ CD8+ T 세포들의 표현형들을 나타낸다. 위에 별표들이 있는 라인들은 다중 t-검정에 의해 유의미한 차이들을 나타낸다. (*) p≤0.05-0.01, (**) p≤0.01-0.001, (***) p≤0.001-0.0001, (****) p≤0.0001.
도 19a, 도 19b, 도 19c, 도 19d, 도 19e 및 도 19f는 나타낸 마커들에 대해 양성인 Tet+ 또는 나이브 CD8+ T 세포들의 퍼센티지를 나타낸다. 위에 별표들이 있는 라인들은 다중 t-검정에 의해 유의미한 차이들을 나타낸다. (*) p≤0.05-0.01, (**) p≤0.01-0.001, (***) p≤0.001-0.0001, (****) p≤0.0001.
도 20a, 도 20b, 도 20c, 도 20d, 도 20e 및 도 20f는 PolN 서열에 걸치는 개개의 펩티드들에 대한 CD8+ T 세포 반응; 모든 PolN 펩티드들의 혼합물들에 대한 전체 풀-반응; 모든 PolN 펩티드들의 혼합물들에 대한 나이브 마우스들의 나이브-반응을 나타낸다. 도 20a 및 도 20d는 상기 AdC6-gDPolN 백신을 막 수용하였던 마우스들의 CD8+ T 세포 반응들을 나타낸다. 도 20b 및 도 20e는 AdC6-gDPolN의 접종 이전의 4주에서 1010vg의 AAV8-1.3HBV로 주사되었던 마우스들의 CD8+ T 세포 반응들을 나타낸다. 도 20c 및 도 20f는 AdC6-gDPolN로의 접종 이전의 4주에서 1011vg의 AAV8-1.3HBV로 주사되었던 마우스들의 CD8+ T 세포 반응들을 나타낸다. 도 20a, 도 20b 및 도 20c는 도 7d에 도시된 펩티드 풀들 및 도 7e를 이용하여 인식되는 개개의 펩티드 서열들을 이용하여 개개의 에피토프들에 의한 면역 반응을 계산하는 데 이용될 수 있다.
도 21a 및 도 21b는 마우스들의 비장이나 간 내의 PolN-특이적 CD8+ T 세포들을 예시한다. 도 21a에서 좌측 패널은 후속하여 5 x 1010vp의 AdC6-gDPolN 백신이 없었거나 수용하지 않았던 AAV8-1.3HBV 주사된 마우스들의 비장 내의 CD8+ T 세포 반응들을 나타낸다. 도 21a에서 중앙 패널은 AAV8-1.3HBV의 다른 도스들로 치료되었고, 이후에 초회-추가 요법에서 백신들을 수용하였던 마우스들의 간들 내의 CD8+ T 세포 도수들을 나타낸다. 도 21a에서 우측 패널은 동일한 실험으로부터 PolN-특이적 CD8+ T 세포들 또는 나이브 CD8+ T 세포들 내의 Tox-1 발현의 레벨들을 나타낸다. 도 21b는 % IFN-γ+ CD8+ T 세포들을 예시한다.
도 22a 및 도 22b는 A) 나타낸 AdC6 벡터들로 주사된 마우스들의 혈액 내의 CD8+ T 세포 도수들; 및 B) 사합체+ CD8+ T 세포들의 도수들을 예시한다.
도 23은 나타낸 AdC7 벡터들로 주사된 마우스들의 혈액 내의 CD8+ T 세포 도수들을 예시한다.
도 24a, 도 24b, 도 24c, 도 24d, 도 24e 및 도 24f는 나타낸 AdC7 벡터들로 주사되었고("초회 후"), 이후에 대응하는 AdC6 벡터들("추가 후")로 추가 접종되었던 마우스들의 혈액 내의 gDHBV2 및 gDHBV3 삽입들에 대한 CD8+(도 24a-도 24c) 및 CD4+(도 24d-도 24f) T 세포 도수들을 나타낸다. 그래프들은 IFN-g를 생성하는 T 세포들의 도수들, TNF-a를 생성하는 T 세포들의 도수들 및 시토카인을 생성하는 T 세포들의 도수들의 합계를 보여준다.
도 25a 및 도 25b는 1 x 109vg의 AAV8-1.3HBV로 시험 감염되었고, 4주 이후에 1 x 1010vp의 AdC6-gDPolN("gDPolN"), AdC6-gDHBV2("gDHBV2"), AdC6-gDHBV3("gDHBV3"), 또는 gD가 없는 AdC6-HBV2("HBV2")로 접종되었던 C57Bl/6 마우스들 내의 HBV DNA 바이러스 역가를 예시하며, AAV-감염된 접종되지 않은 동물들("나이브") 및 AAV-감염되지 않고 접종되지 않은 동물들(데이터는 도시되지 않음)은 대조군들로 기여하였다. 도 25a는 AAV 시험 감염 후의 4주 및 8주에서 각 그룹에 대한 바이러스 역가를 예시하며, 도 25b는 AAV 시험 감염 후의 4주 및 8주에서 개개의 마우스들의 결과들을 예시한다.
도 26a, 도 26b, 도 26c 및 도 26d는 나타낸 구성체를 이용하여 초회 후의 2주 및 8주와 추가(평균으로서) 후의 2주 및 4주에서의 부모 IFN-g 및/또는 TNF-α를 생성하는 CD8+ T 세포들(도 26a), CD44+ CD8+ T 세포들(도 26b), CD4+ T 세포들(도 26c) 또는 CD44+ CD4+ T 세포들(도 26d)의 퍼센티지를 나타낸다.
도 27a, 도 27b 및 도 27c는 타낸 구성체들(PolN＝gDPolN; HBV2＝gDHBV2; HBV3＝gDHBV3)로 다중의 시점들인 초회 후의 4주(도 27a); 추가 후의 2주(도 27b); 및 상기 추가 후의 4주(도 27c)에서 CD8+ T 세포들을 나타낸다. 그래프는 ICS에 의해 평가되는 바와 같은 IFN-g+를 생성하는 CD8+ T 세포들의 전체적인 도수들을 보여준다.
도 28a, 도 28b 및 도 28c는 ICS에 의해 평가되는 바와 같은 나타낸 구성체들(PolN＝gDPolN; HBV2＝gDHBV2; HBV3＝gDHBV3)로 다중의 시점들인 초회 후의 4주(도 28a); 추가 후의 2주(도 28b); 및 상기 추가 후의 4주(도 28c)에서 시토카인을 생성하는 CD4+ T 세포들을 나타낸다. 점선은 나이브 마우스들로부터의 결과들에 기초하는 양성 반응들에 대한 컷-오프를 나타낸다.
도 29a 및 도 29b는 나타낸 구성체들(PolN＝gDPolN; HBV2＝gDHBV2)로 초회 후의 4주에서 CD8+ T 세포들(도 29a) 또는 CD44+ CD8+ T 세포들(도 29b)에 대한 관문이 되는 사합체 염색의 결과들을 나타낸다.
도 30a, 도 30b, 도 30c, 도 30d, 도 30e 및 도 30f는 나타낸 항체들인: 도 30a-BV605에 접합된 항-PD1 항체; 도 30b-BV650에 접합된 항-LAG3 항체; 도 30c-Pe-Cy7-A에 접합된 항-TIM3 항체; 도 30d-PE-A에 접합된 항-CTLA4 항체; 도 30e-AF488에 접합된 항-EOMES 항체; 및 도 30f-BV786에 접합된 항-T-베트 항체에 연관되는 염색의 평균 형광 강도를 보여주는 사합체+ CD8+ T 세포들의 표현형들을 나타낸다.
도 31은 5 x 1010vp의 AdC6-gDHBV2로의 접종이 2개월 이후에 수반된 5 x 1010vp의 AdC7-gDHBV2로의 초회 접종 후의 CD8+ T 세포 반응들을 나타낸다. X축 상의 숫자들은 여기에 제공되는 바와 같은 SEQ ID NO에 대응한다.
도 32는 5 x 109vp의 AdC6-gDHBV2로의 접종이 2개월 이후에 수반된 5 x 109vp의 AdC7-gDHBV2로의 초회 접종 후의 CD8+ T 세포 반응들을 나타낸다. X축 상의 숫자들은 여기에 제공되는 바와 같은 SEQ ID NO에 대응한다.
도 33은 5 x 1010vp의 AdC6-gDHBV3으로의 접종이 2개월 이후에 수반된 5 x 1010vp의 AdC7-gDHBV3으로의 초회 접종 후의 면역원성을 나타낸다. X축 상의 숫자들은 여기에 제공되는 바와 같은 SEQ ID NO에 대응된다.
도 34는 여기에 제공되는 바와 같은 SEQ ID NO(X축)에 대응되는 AdC6-gDHBV2 및 AdC7-gDHBV2 백신들의 면역원성을 예시한다. 두 HBV2 구성체들 내의 코어, PolC 및 PolN 영역들은 면역원성이었다.
도 35는 여기에 제공되는 바와 같은 SEQ ID NO(X축)에 대응되는 AdC6-gDHBV3 및 AdC7-gDHBV3 백신들의 면역원성을 예시한다. 두 HBV3 구성체들 내의 코어, PolC 및 PolN 영역들은 면역원성이었다.
개시되는 단백질들, 백신들 및 방법들은 본 발명의 일부를 형성하는 첨부된 도면들과 함께 다음의 상세한 설명을 참조하여 보다 쉽게 이해될 수 있을 것이다. 개시되는 단백질들, 백신들 및 방법들이 여기에 설명되거나 및/또는 도시되는 특정한 단백질들, 백신들 및 방법들에 한정되는 것은 아니고, 여기에 사용되는 용어들이 특정한 실시예들을 예시적으로 설명하는 목적만을 위한 것이며, 청구되는 단백질들, 백신들 및 방법들을 제한하려는 의도는 아닌 점이 이해될 것이다.
구체적으로 다르게 기재되지 않는 한, 개선을 위한 동작이나 이유의 가능한 기전(mechanism)이나 모드에 관한 임의의 설명은 예시적인 것만을 의미하며, 개시되는 단백질들, 백신들 및 방법들이 임의의 이러한 제시되는 개선을 위한 동작이나 이유의 가능한 기전이나 모드의 정확성이나 부정확성에 제한되는 것은 아니다.
본문에 걸쳐, 단백질들 및 상기 단백질들을 이용하는 방법들에 대해 설명된다. 본문에서나 특허 청구 범위에서 단백질들과 연관된 특징이나 실시예가 설명될 경우, 이러한 특징이나 실시예는 상기 단백질들을 이용하는 방법들에도 동등하게 적용 가능하다. 마찬가지로, 본문에서나 특허 청구 범위에서 상기 단백질들을 이용하는 방법들과 연관된 특징이나 실시예가 설명될 경우, 이러한 특징이나 실시예는 상기 단백질들에 동등하게 적용될 수 있다.
수치 값의 범위가 여기에 언급되거나 설정되는 경우, 상기 범위는 그 종료점들과 상기 범위 내의 모든 개별적인 내부 정수들 및 분수들을 포함하며, 기재된 범위 내의 값들의 보다 큰 그룹의 하위 그룹들로부터 각각의 보다 좁은 범위들이 명백하게 언급되는 것과 같은 정도까지 이들 종료점들과 내부 정수들 및 분수들의 모든 다양한 가능한 결합들로 형성되는 각각의 상기 보다 좁은 범위들도 포함한다. 수치 값들의 범위가 기재된 값보다 크게 여기에 언급되는 경우, 상기 범위는 그럼에도 불구하고 유한하며, 여기에 설명되는 바와 같은 본 발명의 내용의 범주 내에서 작동할 수 있는 값에 의해 그 상한이 한정된다. 수치 값들의 범위가 기재된 값보다 작게 여기에 언급되는 경우, 상기 범위는 그럼에도 불구하고 영(zero)이 아닌 값에 의해 그 하한이 한정된다. 본 발명의 범주가 범위를 정의할 때에 언급되는 특정한 값들에 제한되도록 의도되는 것은 아니다. 모든 범위들은 포괄적이며, 결합 가능하다.
값들이 "약"이라는 선행하는 표현을 이용하여 근사치들로 표현될 때, 특정한 값이 다른 실시예를 구성하는 점이 이해될 것이다. 특정한 수치 값에 대한 언급은 본문에서 명확하게 다르게 기재되지 않는 한은 적어도 이러한 특정한 값을 포함한다.
명료성을 위해 별도의 실시예들의 내용에서 여기에 설명되는 개시된 단백질들, 백신들 및 방법들의 특정한 특징들이 단일의 실시예에서 결합되어 제공될 수 있는 점도 이해되어야 할 것이다. 반대로, 간편성을 위해 단일의 실시예의 내용에서 여기에 설명되는 개시된 단백질들, 백신들 및 방법들의 다양한 특징들도 별도로 또는 임의의 하위 결합으로 제공될 수 있다.
여기에 사용되는 바에 있어서, "일", "하나" 및 "한"과 같은 단수의 표현들은 복수를 포함한다.
본 발명의 측면들과 관련하여 다양한 표현들이 명세서와 특허 청구 범위에 걸쳐 사용된다. 이러한 표현들은 다르게 기재되지 않는 한은 해당 기술 분야에서 이들의 통상적인 의미로 주어진다. 다른 상세하게 정의된 표현들은 여기에 제공되는 정의들과 부합되는 방식으로 해석되어야 할 것이다.
여기에 사용되는 바에 있어서, "이의 면역원성 단편(immunogenic fragment)"이라는 표현은 대상에서 면역 반응을 생성할 수 있는 개시되는 HBV 코어(Core), HBV 폴리메라아제(polymerase) N-말단 도메인(PolN), 또는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인(PolC)의 일부를 지칭한다.
여기에 사용되는 바에 있어서, "대상에 제공하는" 및 유사한 표현들은 대상의 신체의 표적 세포들, 조직들, 또는 분절(segment)들이 융합 단백질(fusion protein)들, 핵산 분자들, 벡터들, 또는 백신들과 접촉하도록 상기 대상에 상기 융합 단백질들, 핵산 분자들, 벡터들, 또는 백신들을 전달하는 절차를 나타낸다. "대상에 제공하는"이라는 표현은 투여의 경구 또는 비경구 루트들을 포함한다.
"바이오시밀러(biosimilar)"(승인된 참조 제품/생물학적 약물, 즉 참조 목록 약물의)라는 표현은 (a) 생물학적 제품이 임상적으로 비활성인 성분들에서 미소한 차이들에도 불구하고 참조 제품과 극히 유사한 것을 입증하는 분석 연구들; (b) 동물 연구들(독성의 평가를 포함); 및/또는 (c) 상기 참조 제품이 허가 받고 사용되게 의도되며, 상기 바이오시밀러에 대해 허가되는 것으로 간주되는 하나 또는 그 이상의 적절한 사용 조건들에서 안전성, 순도 및 효능을 입증하기에 충분한 임상 연구나 연구들(면역원성(immunogenicity) 및 약물 동력학(pharmacokinetics) 또는 약력학(pharmacodynamics)의 평가를 포함함)로부터의 데이터에 기초하여, 안전성, 순도 및 효능의 측면들에서 상기 바이오시밀러 및 상기 참조 제품 사이에 임상적으로 비활성인 성분들에서 미소한 차이들에도 불구하고 임상적으로 의미 있는 차이들이 없는 상기 참조 제품과 극히 유사한 생물학적 제품을 지칭한다. 상기 바이오시밀러는 처방하는 건강관리 전문가의 개입 없이 약국에서 상기 참조 제품을 대체할 수 있는 호환적인 제품이 될 수 있다. "호환성"의 추가적인 기준을 만족시키기 위해, 상기 바이오시밀러는 임의의 정해진 환자에서 상기 참조 제품과 동일한 임상 결과를 생성하는 것으로 기대되며, 상기 바이오시밀러가 개인에게 한 번 이상 투여될 경우에 상기 바이오시밀러 및 상기 참조 제품의 사용 사이에 교체되거나 개재되는 안전성이나 감소되는 효능의 측면에서의 위험성은 이러한 교체나 개재 없이 상기 참조 제품을 사용하는 위험성보다 크지 않다. 상기 바이오시밀러는 사용의 정도에 대해 제시되는 조건들에 대해 상기 참조 제품에 대해 알려진 기전과 동일한 작용의 기전을 활용한다. 상기 바이오시밀러를 위해 제시되는 표지들에서 처방되거나, 권고되거나, 제시되는 조건이나 조건들은 이미상기 참조 제품에 대해 승인될 것들이다. 상기 바이오시밀러의 투여의 루트, 복용 형태 및/또는 강도는 상기 참조 제품의 경우들과 동일하며, 상기 바이오시밀러는 상기 바이오시밀러가 지속적으로 안전하고, 순수하며, 효능이 있는 점을 보장하기 위해 설계되는 기준들을 만족시키는 설비 내에서 제조되거나, 처리되거나, 포장된다. 상기 바이오시밀러는 상기 기준 제품과 비교할 때에 상기 바이오시밀러 효능을 변화시킬 것으로 예상되지 않는 N- 또는 C-말단 절단들과 같이 아미노산 서열(amino acid sequence)의 미소한 변경을 포함할 수 있다. 개시되는 단백질들 및 융합 단백질들의 바이오시밀러들은 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 의도된다.
"대상"이라는 표현은 여기에 사용되는 바에 있어서 임의의 동물, 특히 포유동물들을 의미하도록 의도된다. 비록 마우스들에서 면역 반응의 유도가 여기에 예시되지만, 임의의 유형의 포유동물이 개시되는 방법들을 이용하여 치료될 수 있다. 따라서 상기 방법들은 비록 마우스들 및 인간들에서, 가장 바람직하게는 인간들에서 이용되지만, 인간 및 비인간 동물들에도 적용 가능하다.
"포함하는"이라는 표현은 "본질적으로 구성되는" 및 "구성되는"과 같은 표현들에 의해 포괄되는 예들을 포함하도록 의도된다. 유사하게, "본질적으로 구성되는"이라는 표현은 "구성되는"이라는 표현에 의해 포괄되는 예들을 포함하도록 의도된다.
B형 간염 바이러스(hepatitis B virus: HBV); 아데노바이러스(adenovirus: Ad); 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus: HSV); 당단백질(glycoprotein: gD); 및 바이러스 게놈(virus genome: vg)들과 같은 약어들이 본문에서 사용된다.
상기 B형 간염 바이러스(HBV) 코어 단백질(Core protein)의 비자연적으로 발생되는 변이가 여기에 제공된다. 개시되는 HBV 코어 단백질은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함할 수 있다. SEQ ID NO: 6의 예시적인 면역원성 단편들은 다음의 표 3에 제공되는 SEQ ID NO: 20-NO: 54를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 HBV 코어 단백질의 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 HBV 코어 단백질의 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 HBV 코어 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 인코딩하는 핵산 분자들도 제공된다. 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 HBV 코어 단백질을 인코딩할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 핵산 분자들은 표 3에 제공되는 상기 코어 단편들을 인코딩할 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다.
상기 HBV 코어 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 인코딩하는 핵산 분자들을 포함하는 벡터(vector)들도 제공된다. 적합한 벡터들은 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)들, 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)들, 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector)들, 아데노-연관 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector)들, 알파바이러스 레플리콘(alphavirus replicon)들, 헤르페스 바이러스 벡터(herpes virus vector)들, 폭스 바이러스 벡터(pox virus vector)들, 그리고 라브도바이러스 벡터(rhabdovirus vector)들과 같은 바이러스 벡터들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 상기 아데노바이러스 벡터는 침팬지 유래 아데노바이러스 벡터가 될 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 Farina SF, Gao GP, Xiang ZQ, Rux JJ, Burnett RM, Alvira MR, Marsh J, Ertl HC, Wilson JM의 "Replication-defective vector based on a chimpanzee adenovirus"(J Virol. 2001 Dec; 75(23): 11603-13)에 기재되어 있는 바와 같은 AdC68 벡터이다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 Reyes-Sandoval A, Fitzgerald JC, Grant R, Roy S, Xiang ZQ, Li Y, Gao GP, Wilson JM, Ertl HC의 "Human immunodeficiency virus type 1-specific immune responses in primates upon sequential immunization with adenoviral vaccine carriers of human and simian serotypes"(J Virol. 2004 Jul; 78(14): 7392-9)에 기재되어 있는 바와 같은 AdC7 벡터이다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 Pinto AR, Fitzgerald JC, Giles-Davis W, Gao GP, Wilson JM, Ertl HC의 "Induction of CD8+ T cells to an HIV-1 antigen through 초회 추가 요법(prime boost regimen) with heterologous E1-deleted adenoviral vaccine carriers(J Immunol. 2003 Dec 15; 171(12): 6774-9)에 기재되어 있는 바와 같은 AdC6 벡터이다.
일부 실시예들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 AdC6 벡터이다. 일부 실시예들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 AdC7 벡터이다.
일부 실시예들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC6 벡터이다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC7 벡터이다. 일부 실시예들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC6 벡터이다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC7 벡터이다.
상기 HBV 코어 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 인코딩하는 핵산 분자들을 포함하는 벡터들을 포함하는 백신(vaccine)들도 개시된다. 일부 실시예들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 AdC6 벡터를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 AdC7 벡터를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 AdC6 벡터를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 AdC7 벡터를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 AdC6 벡터를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 AdC7 벡터를 포함한다.
상기 백신은 약학적으로 허용 가능한 운반체(carrier) 또는 약학적으로 허용 가능한 부형제(excipient)를 더 포함할 수 있다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "약학적으로 허용 가능한 운반체" 또는 "약학적으로 허용 가능한 부형제"는 개시되는 융합 단백질들, 핵산들, 또는 벡터들과 결합될 때에 상기 융합 단백질들, 핵산들, 또는 벡터들이 생물학적 활성을 유지하고, 상기 대상의 면역 체계와 반응하지 않는 임의의 물질을 포함한다. 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 인산 완충 생리 식염수 용액, 물, 오일/물 에멀션(emulsion)과 같은 에멀션들 및 다양한 유형들의 습윤제(wetting agent)들과 같은 표준 약학적 운반체들 중의 임의의 것을 포함한다. 에어로졸이나 경구 투여를 위한 바람직한 희석제들은 인산 완충 생리 식염수 또는 통상(0.9%) 생리 식염수이다. 이러한 운반체들을 포함하는 조성물들은 잘 알려진 종래의 방법들에 의해 조제될 수 있다(예를 들면, "Remington's Pharmaceutical Sciences"(18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990); 및 "Remington"(The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000) 참조).
상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인(PolN) 및 상기 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인(PolC)의 비자연적으로 발생되는 변이들이 여기에 개시된다. 개시되는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함할 수 있다. SEQ ID NO: 8의 예시적인 면역원성 단편들은 다음의 표 4에 제공되는 SEQ ID NO: 55-NO: 113을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 HBV PolN의 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 178의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 HBV PolN의 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 181의 아미노산 서열을 포함한다. 개시되는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함할 수 있다. SEQ ID NO: 10의 예시적인 면역원성 단편들은 다음의 표 5에 제공되는 SEQ ID NO: 114-NO: 172를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 HBV PolC의 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 179의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 HBV PolC의 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 182의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인 또는 이의 면역원성 단편, 또는 상기 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인 또는 이의 면역원성 단편을 인코딩하는 핵산 분자들도 제공된다. 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인을 인코드할 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인을 인코딩하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 핵산 분자들은 표 4에 제공되는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인 단편들을 인코드할 수 있다. 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인을 인코드할 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인을 인코딩하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 11의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 핵산 분자들은 표 5에 제공되는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인을 인코드할 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 178의 아미노산 서열을 인코드한다. 일부 실시예들에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 181의 아미노산 서열을 인코드한다. 일부 실시예들에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 179의 아미노산 서열을 인코드한다. 일부 실시예들에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 182의 아미노산 서열을 인코드한다.
상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인 또는 이의 면역원성 단편 또는 C-말단 도메인 또는 이의 면역원성 단편을 인코딩하는 핵산 분자들을 포함하는 벡터들도 제공된다. 적합한 벡터들은 앞서 설명한 것들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 적합한 아데노바이러스 벡터들은, 예를 들면, AdC6 또는 AdC7 벡터를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 벡터는 AdC6 벡터는 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 AdC7 벡터이다. 일부 실시예들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 AdC6 벡터이다. 일부 실시예들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 AdC7 벡터이다. 일부 실시예들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 178의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC6 벡터이다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC7 벡터이다. 일부 실시예들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 181의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC6 벡터이다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC7 벡터이다. 일부 실시예들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 179의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC6 벡터이다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC7 벡터이다. 일부 실시예들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 182의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC6 벡터이다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC7 벡터이다.
상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인 또는 이의 면역원성 단편 또는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인 또는 이의 면역원성 단편을 인코딩하는 핵산 분자들을 포함하는 벡터들을 포함하는 백신들도 개시된다. 일부 실시예들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 상기 백신은 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 AdC6 벡터를 포함할 수 있다. 상기 백신은 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 AdC7 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 상기 백신은 SEQ ID NO: 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 AdC6 벡터를 포함할 수 있다. 상기 백신은 SEQ ID NO: 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 AdC7 벡터를 포함할 수 있다. 상기 백신은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 운반체 또는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 178의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC6 벡터이다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC7 벡터이다. 일부 실시예들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 181의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC6 벡터이다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC7 벡터이다. 일부 실시예들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 179의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC6 벡터이다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC7 벡터이다. 일부 실시예들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 182의 아미노산 서열을 인코드하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC6 벡터이다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 AdC7 벡터이다.
개시되는 HBV 코어 단백질 또는 이의 면역원성 단편, 상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인 또는 이의 면역원성 단편 및/또는 상기 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인 또는 이의 면역원성 단편의 결합들을 포함하는 융합 단백질들도 여기에 제공된다. 예를 들면, 상기 융합 단백질은 다음을 포함할 수 있다.
(1) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인.
(2) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 코어 단백질의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들. 예를 들면, 표 3에 제공되는 SEQ ID NO: 20-NO: 54 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 6의 면역원성 단편들) 및 표 4에 제공되는 SEQ ID NO: 55-NO: 113중 의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 8의 면역원성 단편들).
(3) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인.
(4) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열의 포함하는 상기 HBV 코어 단백질의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들. 예를 들면, 표 3에 제공되는 SEQ ID NO: 20-NO: 54 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 6의 면역원성 단편들) 및 표 5에 제공되는 SEQ ID NO: 114-NO: 172 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 10의 면역원성 단편들).
(5) SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인.
(6) SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들. 예를 들면, 표 4에 제공되는 SEQ ID NO: 55-NO: 113 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 8의 면역원성 단편들) 및 표 5에 제공되는 SEQ ID NO: 114-NO: 172 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 10의 면역원성 단편들).
(7) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질, SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인.
(8) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 코어 단백질의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들, SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들, 그리고 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들. 예를 들면, 표 3에 제공되는 SEQ ID NO: 20-NO: 54 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 6의 면역원성 단편들), 표 4에 제공되는 SEQ ID NO: 55-NO: 113 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 8의 면역원성 단편들), 그리고 하나 또는 그 이상의 표 5에 제공되는 SEQ ID NO: 114-NO: 172 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 10의 면역원성 단편들).
(9) SEQ ID NO: 178의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, SEQ ID NO: 179의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질. 또는,
(10) SEQ ID NO: 181의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, SEQ ID NO: 182의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질.
상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 178의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인,SEQ ID NO: 179의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 174의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 181의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, SEQ ID NO: 182의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 175의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 당단백질(gD) 서열 및 개시되는 HBV 코어 단백질, 상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, 상기 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 또는 이들의 다양한 결합들을 포함하는 융합 단백질들이 여기에 제공된다.
상기 HSV gD는 HSV의 수용체 결합(receptor-binding) 당단백질이다. 상기 gD 엑토도메인(ectodomain)은 신호 서열 및 수용체 결합 부위들을 포함하는 아미노-말단과 프로-융합(pro-fusion) 도메인 및 막횡단 도메인(transmembrane domain)을 포함하는 카르복시-말단의 둘의 구조적으로 및 기능적으로 분화된 영역들로 구성된다. gD는 헤르페스 바이러스 침투 매개체(herpesvirus entry mediator: HVEM) 수용체 및 넥틴(nectin) 수용체들과 상호 작용한다. 상기 수용체들과 gD의 상호작용은 T 세포들 상에 발현되는 면역 억제 분자들인 BTLA 또는 CD160에 대한 상기 HVEM 수용체 결합의 하향 조절을 가져온다. 일부 실시예들에서, gD 및 개시되는 HBV 코어 단백질, 상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, 상기 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인(각기 "gD코어", "gDPolN" 또는 "gDPolC"으로 지칭함), 또는 이들의 결합들을 포함하는 개시되는 융합 단백질들은 상기 HBV 코어 및/또는 폴리메라아제 항원들만(즉, gD 없이)의 경우와 비교하여 보다 큰 정도까지 HBV에 대한 대상의 면역 반응을 향상시킬 것으로 예상된다.
개시되는 융합 단백질들에서 이용되기 위한 적합한 HSV gD 단백질들은 1) 항원에 대한 CD8+ T 세포 반응의 증가된 자극 및/또는 2) HVEM-BTLA 경로 활성을 방해하는 능력을 보유하는 야생형 또는 돌연변이 gD를 포함한다.
상기 융합 단백질들은 여기에 개시되는 HBV 코어 단백질 또는 이의 면역원성 단편, HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인 또는 이의 면역원성 단편, HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인 또는 이의 면역원성 단편, 또는 이들의 임의의 결합, N-말단 HSV gD 단백질 서열, 그리고 C-말단 HSV gD 단백질 서열을 포함할 수 있다. 상기 HBV 코어 단백질, HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인 및 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인은 표 9에 제공되는 것들 또는 표 3-표 5에 제공되는 면역원성 단편들이 될 수 있다. 상기 HBV 코어 단백질, HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 또는 이들의 면역원성 단편들은 상기 N-말단 HSV gD 단백질 서열 및 상기 C-말단 HSV gD 단백질 서열 사이에 삽입될 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 N-말단 HSV gD 단백질 서열은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 C-말단 HSV gD 단백질 서열은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 N-말단 HSV gD 단백질 서열은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 잔기 26-269를 포함한다.
상기 융합 단백질은,
N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이;
SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질; 및
C-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이를 포함할 수 있다.
상기 HBV 코어 단백질의 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 20-NO: 54, NO: 180, 또는 NO: 183 중의 임의의 것을 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질은,
N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이;
SEQ ID NO: 180 또는 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열을 포함하는 HBV 코어 단백질; 및
C-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이를 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질은,
N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이;
SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인; 및
C-말단 HSV gD 단백질 서열 또는 이의 변이를 포함할 수 있다.
상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인의 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 55-NO: 113, NO: 178, 또는 NO: 181 중의 임의의 것을 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질은,
N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이;
SEQ ID NO: 178 또는 SEQ ID NO: 181의 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인; 및
C-말단 HSV gD 단백질 서열 또는 이의 변이를 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질은,
N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이;
SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인; 및
C-말단 HSV gD 단백질 서열 또는 이의 변이를 포함할 수 있다.
상기 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인의 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 114-NO: 172, NO: 179, 또는 NO: 182 중의 임의의 것을 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질은,
N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이;
SEQ ID NO: 179 또는 SEQ ID NO: 182의 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인; 및
C-말단 HSV gD 단백질 서열 또는 이의 변이를 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질은,
N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이;
HBV 서열: 및
C-말단 HSV gD 단백질 서열 또는 이의 변이를 포함할 수 있으며,
상기 HBV 서열은 다음을 포함한다.
(1) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인.
(2) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 코어 단백질의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들. 예를 들면, 표 3에 제공되는 SEQ ID NO: 20-NO: 54 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 6의 면역원성 단편들) 및 하나 또는 그 이상의 표 4에 제공되는 SEQ ID NO: 55-NO: 113 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 8의 면역원성 단편들).
(3) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인.
(4) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 코어 단백질의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들. 예를 들면, 표 3에 제공되는 SEQ ID NO: 20-NO: 54 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 6의 면역원성 단편들) 및 표 5에 제공되는 SEQ ID NO: 114-NO: 172 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 10의 면역원성 단편들).
(5) SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인.
(6) SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들. 예를 들면, 표 4에 제공되는 SEQ ID NO: 55-NO: 113 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 8의 면역원성 단편들) 및 표 5에 제공되는 SEQ ID NO: 114-NO: 172 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 10의 면역원성 단편들).
(7) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질, SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인. 또는,
(8) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 코어 단백질의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들, SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들, 그리고 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 상기 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인의 하나 또는 그 이상의 면역원성 단편들. 예를 들면, 표 3에 제공되는 SEQ ID NO: 20-NO: 54 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 6의 면역원성 단편들), 표 4에 제공되는 SEQ ID NO: 55-NO: 113 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 8의 면역원성 단편들), 그리고 표 5에 제공되는 SEQ ID NO: 114-NO: 172 중의 하나 또는 그 이상(SEQ ID NO: 10의 면역원성 단편들).
(9) SEQ ID NO: 178의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, SEQ ID NO: 179의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질. 또는,
(10) SEQ ID NO: 181의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, SEQ ID NO: 182의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질.
일부 실시예들에서, 상기 C-말단 HSV gD 서열은 상기 HSV gD의 막횡단 도메인(transmembrane domain)을 포함한다. 상기 C-말단 HSV gD 서열은, 예를 들면, SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열(gDCore에 대응됨) 또는 이의 면역원성 단편을 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열(gDPolN에 대응됨) 또는 이의 면역원성 단편을 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열(gDPolC에 대응됨) 또는 이의 면역원성 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, SEQ ID NO: 14, NO: 16, 또는 NO: 18 중의 임의의 것의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편은 상기 N-말단 25 아미노산 신호 펩티드를 포함하지 않는다.
상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열(gDHBV2)을 포함할 수 있다. 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열(gDHBV3)을 포함할 수 있다.
개시된 융합 단백질들 중의 임의의 것을 인코딩하는 핵산 분자들도 제공된다. 일부 실시예들에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 15의 뉴클레오티드 서열(gDCore에 대응됨)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 17의 뉴클레오티드 서열(gDPolN에 대응됨)을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 19의 뉴클레오티드 서열(gDPolC에 대응됨)을 포함한다.
상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 184의 뉴클레오티드 서열(gDHBV2)을 포함할 수 있다. 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 186의 뉴클레오티드 서열(gDHBV3)을 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질들을 인코딩하는 핵산 분자들을 포함하는 벡터들도 개시된다. 적합한 벡터들은, 예를 들면, 아데노바이러스 벡터를 포함하여 상술한 것들을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 AdC6 벡터이다. 일부 실시예들에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 AdC7 벡터이다. 상기 벡터는 SEQ ID NO: 184의 뉴클레오티드 서열(gDHBV2)을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 184의 뉴클레오티드 서열(gDHBV2)을 포함하는 AdC6 벡터이다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 184의 뉴클레오티드 서열(gDHBV2)을 포함하는 AdC7 벡터이다. 상기 벡터는 SEQ ID NO: 186의 뉴클레오티드 서열(gDHBV3)을 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 186의 뉴클레오티드 서열(gDHBV3)을 포함하는 AdC6 벡터이다. 일부 측면들에서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 186의 뉴클레오티드 서열(gDHBV3)을 포함하는 AdC7 벡터이다.
개시되는 벡터들 중의 임의의 것을 포함하는 백신들도 제공된다. 상기 백신은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용 가능한 운반체 또는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 더 포함할 수 있다. 상기 백신은 SEQ ID NO: 184의 뉴클레오티드 서열(gDHBV2)을 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 184의 뉴클레오티드 서열(gDHBV2)을 포함하는 AdC6 벡터를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 184의 뉴클레오티드 서열(gDHBV2)을 포함하는 AdC7 벡터를 포함한다. 상기 백신은 SEQ ID NO: 186의 뉴클레오티드 서열(gDHBV3)을 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 일부 측면들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 186의 뉴클레오티드 서열(gDHBV3)을 포함하는 AdC6 벡터를 포함한다. 일부 측면들에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 186의 뉴클레오티드 서열(gDHBV3)을 포함하는 AdC7 벡터를 포함한다.
대상에서 HBV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법들이 여기에 개시되며, 상기 방법들은 상기 대상에 개시되는 융합 단백질들 중의 임의의 것, 개시되는 핵산 분자들 중의 임의의 것, 개시되는 벡터들 중의 임의의 것, 또는 개시되는 백신들 중의 임의의 것의 유효량을 제공하는 단계를 포함하며, 이에 따라 HBV에 대한 면역 반응을 유도한다. 일부 실시예들에서, 상기 방법들은 상기 대상에 개시되는 융합 단백질들 중의 임의의 것의 유효량을 제공하는 단계를 포함하며, 이에 따라 HBV에 대한 면역 반응을 유도한다. 일부 실시예들에서, 상기 방법들은 상기 대상에 개시되는 핵산 분자들 중의 임의의 것을 제공하는 단계를 포함하며, 이에 따라 HBV에 대한 면역 반응을 유도한다. 일부 실시예들에서, 상기 방법들은 상기 대상에 개시되는 벡터들 중의 임의의 것의 유효량을 제공하는 단계를 포함하며, 이에 따라 HBV에 대한 면역 반응을 유도한다. 일부 실시예들에서, 상기 방법들은 상기 대상에 개시되는 백신들 중의 임의의 것을 제공하는 단계를 포함하며, 이에 따라 HBV에 대한 면역 반응을 유도한다.
상기 방법들은 상기 대상에 AdC6 벡터를 포함하는 백신의 유효량을 제공하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 AdC6 벡터는 SEQ ID NO: 14, NO: 16, 또는 NO: 18의 아미노산 서열 중에서 임의의 것, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 방법들은 상기 대상에 상기 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계에 후속하여 SEQ ID NO: 14, NO: 16, 또는 NO: 18의 아미노산 서열 중의 임의의 것, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계를 더 포함한다. 이러한 초회-추가(prime-boost) 방법들은 다음을 포함할 수 있다.
- 상기 대상에 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계, 그리고 후속하여 상기 대상에 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계. 일부 실시예들에서, 상기 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편은 상기 N-말단 25 아미노산 신호 펩티드를 포함하지 않는다.
- 상기 대상에 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계, 그리고 후속하여 상기 대상에 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계. 일부 실시예들에서, 상기 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편은 상기 N-말단 25 아미노산 신호 펩티드를 포함하지 않는다. 또는,
- 상기 대상에 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 제공하는 단계, 그리고 후속하여 상기 대상에 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계. 일부 실시예들에서, 상기 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편은 상기 N-말단 25 아미노산 신호 펩티드를 포함하지 않는다.
[0101] 상기 방법들은 상기 대상에 AdC7 벡터를 포함하는 백신의 유효량을 제공하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 AdC7 벡터는 SEQ ID NO: 14, NO: 16, 또는 NO: 18의 아미노산 서열 중의 임의의 것, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 방법들은 상기 대상에, 상기 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계에 후속하여, SEQ ID NO: 14, NO: 16, 또는 NO: 18의 아미노산 서열 중의 임의의 것, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계를 더 포함한다. 이러한 초회-추가 방법들은 다음을 포함할 수 있다.
- 상기 대상에 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계, 그리고 후속하여 상기 대상에 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계. 일부 실시예들에서, 상기 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편은 상기 N-말단 25 아미노산 신호 펩티드를 포함하지 않는다.
- 상기 대상에 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계, 그리고 후속하여 상기 대상에 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계. 일부 실시예들에서, 상기 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편은 상기 N-말단 25 아미노산 신호 펩티드를 포함하지 않는다. 또는,
- 상기 대상에 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계, 그리고 후속하여 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계. 일부 실시예들에서, 상기 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편은 상기 N-말단 25 아미노산 신호 펩티드를 포함하지 않는다.
상기 방법들은 상기 대상에 AdC6 벡터를 포함하는 백신의 유효량을 제공하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 AdC6 벡터는 SEQ ID NO: 185 또는 NO: 187의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 방법들은 상기 대상에, 상기 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계에 후속하여, SEQ ID NO: 185 또는 NO: 187의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계를 더 포함한다. 이러한 초회-추가 방법들은 다음을 포함할 수 있다.
- 상기 대상에 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계, 그리고 후속하여 상기 대상에 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계. 일부 실시예들에서, 상기 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편은 상기 N-말단 25 아미노산 신호 펩티드를 포함하지 않는다. 또는,
- 상기 대상에SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계, 그리고 후속하여 상기 대상에 SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계. 일부 실시예들에서, 상기 SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편은 상기 N-말단 25 아미노산 신호 펩티드를 포함하지 않는다.
상기 방법들은 상기 대상에 AdC7 벡터를 포함하는 백신의 유효량을 제공하는 단계를 포함할 수 잇으며, 여기서 상기 AdC7 벡터는 SEQ ID NO: 185 또는 NO: 187의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시예들에서, 상기 방법들은 상기 대상에, 상기 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계에 후속하여, SEQ ID NO: 185 또는 NO: 187의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계를 더 포함한다. 이러한 초회-추가 방법들은 다음을 포함할 수 있다.
- 상기 대상에 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계, 그리고 후속하여 상기 대상에 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계. 일부 실시예들에서, 상기 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편은 상기 N-말단 25 아미노산 신호 펩티드를 포함하지 않는다. 또는,
- 상기 대상에 SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계, 그리고 후속하여 상기 대상에 SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계. 일부 실시예들에서, 상기 SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편은 상기 N-말단 25 아미노산 신호 펩티드를 포함하지 않는다.
HBV에 대한 면역 반응을 유도하는 치료 위해 필요한 개시되는 융합 단백질들, 핵산 분자들, 벡터들, 또는 백신들의 양(예를 들어, "유효량")은 상기 대상의 질병 상태, 연령, 성별과 체중, 그리고 상기 대상에서 원하는 반응을 야기하는 상기 융합 단백질들, 핵산 분자들, 벡터들, 또는 백신들의 능력과 같은 인자들에 따라 변화될 수 있다. 예시적인 유효량의 지시자(indicator)들은, 예를 들면, 상기 대상의 개선된 행복감과 HBV 증상들의 감소, 소거 및 예방를 포함한다.
개시되는 방법들에 의해 유도되는 면역 반응은, 이에 한정되는 것은 아니지만, T 세포 반응들, B 세포 반응들, 또는 이들 모두(즉, 세포 및/또는 체액 면역 반응들)를 포함한다. 상기 면역 반응은 1차 면역 반응 또는 2차 면역 반응이 될 수 있다. 개시되는 방법들은 상기 HBV 코어 또는 폴리메라아제 항원들만(즉, gD 없이)과 비교할 경우에 보다 큰 정도로 HBV에 대한 대상의 면역 반응을 유도할 수 있다.
개시되는 방법들은 요법 치료 및 예방적이나 방지 측정들 모두를 위해 이용될 수 있으며, 증상들의 심각도 및/또는 빈도를 감소시킬 수 있고, 증상들 및/또는 증상들의 기저 원인을 제거할 수 있으며, 증상들의 도수(frequency) 또는 가능성 및/또는 이들의 기저 원인을 감소시킬 수 있고, HBV에 의해 직접적으로나 간접적으로 야기되는 손상을 개선하거나 교정할 수 있다. 또한, 치료는 치료를 받지 않은 대상의 기대 생존과 비교할 경우에 연장되는 생존을 포함한다. 치료되는 대상들은 HBV를 지니는 경우들 뿐만 아니라 HBV를 지니기 쉽운 경우들이나 HBV가 방지되어야 하는 경우들을 포함한다.
대상에서 HBV에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용되기 위한 개시되는 융합 단백질들, 핵산 분자들, 벡터들, 또는 백신들이 제공된다.
또한, 대상에서 HBV에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서 개시되는 융합 단백질들, 핵산 분자들, 벡터들, 또는 백신들 중의 임의의 것의 이용이 제공된다.
실험예들
다음의 실험예들은 야기에 개시되는 실시예들 중의 일부를 더 설명하기 위해 제공된다. 실험예들은 예시하도록 의도되며, 개시되는 실시예들을 제한하는 것은 아니다.
에피토프(epitope) 최적화 코어 서열의 발생
B형 간염 바이러스(HBV)는 계통 발생적 군집 분류에 기초하여 몇몇 유전자형(genotype)들로 그룹으로 될 수 있다. 만성 감염들이 있는 환자들을 위한 다중 유전자형 HBV 백신에 대한 항원 삽입의 개발을 보조하기 위해, 유전자형 A, 유전자형 B, 유전자형 C 및 유전자형 D에 걸쳐 상기 HBV 코어 및 HBV 폴리메라아제를 인코딩하는 유전자들의 예비 생물 정보학 평가가 수행되었다.
넷의 주요 HBV 분기군(clade)들로부터의 코어 아미노산 서열들이 B형 간염 바이러스 데이터베이스(HBVdb)(배포 버전 45.0; 2018년 8월 2일에 최종 업데이트됨)로부터의 정렬된 ClustalW 서열들로 다운 로드되었다. 상기 아미노산 서열들은 다음의 표에 요약된 바와 같이 유럽에 걸친 이용자들로부터 입력된 수천의 HBV 게놈들을 나타내었다.
분석된 고유 코어 게놈들의 숫자
유전자형 HBV 유전자 분석된 고유 게놈들
HBV 유전자 A 코어 1,482
HBV 유전자 B 2,800
HBV 유전자 C 2,768
HBV 유전자 D 1,579
"공통(consensus)" 코어 서열들이 로스 앨러모스 국립연구소(Los Alamos National Laboratory)(www.hiv.lanl.gov/content/sequence/ENTROPY/entropy)에 의해 진행된 섀넌 엔트로피 툴(Shannon Entropy tool)을 이용하여 먼저 확인되었으며, 각 아미노산 위치에서 변이 및 빈도가 계산되었다. 이들 계산들은 넷의 "공통" 코어 서열들을 발생시키는 각 유전자형에 대해서 반복되었고, 하나는 분석된 각 유전자형에 대한 것이었다(SEQ ID NO: 1-NO: 4):
유전자형 A 공통(SEQ ID NO: 1)
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLeDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC-
유전자형 B 공통(SEQ ID NO: 2)
MDID p YKEFGAS v ELLSFLPSDFFPS i RDLLDTA s ALYREALESPEHCSPHHTALRQAI l CWGELMNLATWVGSNL e DPASRELVV s YVNVNMGLK i RQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTP p AYRP p NAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRE s QC-
유전자형 C 공통(SEQ ID NO: 3)
MDID p YKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVV s YVNVNMGLK i RQlLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTP p AYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRSQSRESQC-
유전자형 D 공통(SEQ ID NO: 4)
MDIDPYKEFGA t VELLSFLP s DFFPSVRDLLDTASALYR e ALESPEHCSPHHTALRQAILCWG e LMtLATWVG g NLEDP a SRDLVVSYVNTN m GLKFRQLLWFHISCLTFGR e TV i EYLVSFGVWIRTP p AYRPPNAPILSTLPETTV v RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC-
(굵은 밑줄 친 잔기들은 90% 보다 작은 도수를 갖는 아미노산들을 나타낸다).
전술한 "공통" 코어 서열들은 에피토프 최적화(epitope-optimized) 코어 서열을 생성하기 위해 결합되었다. 보존된 아미노산들이 각 유전자형(A, B, C 및 D)으로부터의 코어 단백질의 각 아미노산 잔기에서 확인되었고, 유전자형 게놈들의 주어진 샘플 내의 도수와 변이가 결정되었다. 변이의 부위들에서 아미노산들을 선택하기 위해, 각 변이가 다중의 HLA 유형들에 걸쳐 에피토프 예측 알고리즘들을 이용하여 테스트되었으며, 가장 높은 면역원성 서열이 선택되었다. 구체적으로는,
(1) 동일하였던 상기 넷의 유전자형들에 걸쳐 각 잔기가 유지되었다. 상기 게놈 계량된 도수도 추가되는 스페이서(spacer)를 구비하는 변이성을 알리고, 적용 가능할 경우에 다양성을 위해 상기 서열들을 정렬하도록 계산되었다.
(2) 상기 넷의 유전자형들에 걸쳐 동일하지 않았던 잔기들이 확인되었고, 아미노산 다양성이 기록되었다(표 2 참조). X1―X11로 표기된 상기 넷의 유전자형들에 걸쳐 동일하지 않았던 잔기들 및 진하고 밑줄이 있는 90% 보다 작은 도수를 가지는 잔기들을 구비하는 초기 코어 서열(SEQ ID NO: 5)이 다음에 제공된다:
MDID P YKEFGAX 1 VELLSFLPSDFFPSX 2 DLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMX 3 LATWVGX 4 NLeDPASRX 5 LVV X 6 YVNX 7 NMGLKX 8 RQLLWFHISCLTFGRETVX 9 EYLVSFGVWIRTP P AYRP P NAPILSTLPETTVVRRRX 10 X 11 GRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
상기 넷의 유전자형들에 걸쳐 동일하지 않았던 잔기들
잔기# X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11
표현형 A
공통		 T V T N D N T I L D R
A-공통
도수		 95.4% 98.2% 96.0% 94.0% 99.5% 98.9% 98.3% 98.8% 98.2% 95.8% 99.5%
표현형 B
공통		 S i N S E s V i L - -
B-공통
도수		 97.1% 89.7% 93.5% 90.1% 91.5% 75.2% 93.6% 80.1% 99.4% - -
표현형 C
공통		 S I N S E s V i L - -
C-공통
도수		 99.4% 90.3% 97.3% 96.3% 97.0% 83.7% 97.8% 78.7% 98.8% - -
표현형 D
공통		 t V t g D S T F i - -
D-공통
도수		 75.7% 97.0% 87.5% 58.7% 98.4% 93.7% 96.5% 99.1% 77.8% - -
(3) 이들 위치들에서 최종 아미노산을 결정하기 위해, 에피토프 예측 알고리즘들이 적절한 아미노산을 선택하는 데 이용되었다. 상기 유전자형들 사이에 변이성을 나타내었던 아미노산들에 대해, 상기 유전자형들 중의 3개에 존재하였던 아미노산들이 선택되었거나, MHC 클래스 I 에피토프 예측 소프트웨어가 가장 높은 면역원성 아미노산들을 선택하는 데 이용되었다. 이러한 접근 방식은 가장 큰 숫자의 HLA 유형들에 걸쳐 잠재적인 면역원성을 최대화하였다. 모든 유전자형들에 걸치는 유전자형들 내의 상기 에피토프 최적화 코어 서열을 다음에 나타낸다(SEQ ID NO: 6):
DIDPYKEFGATVELLSFLIPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
분석된 분기군-특이적 게놈들의 숫자로 계량된 모든 게놈들에 걸쳐 각 부위에서의 평균 변이가 계산되었고, 보다 높고 보다 큰 보존의 영역들과 잔기들이 도시된다. 도 1 참조.
에피토프 최적화 폴리메라아제 서열들의 발생
에피토프 최적화 폴리메라아제 서열이 상기 코어 서열에 대해 앞서 논의한 바와 같이 넷의 주요 HBV 분기군들로부터 생성되었다. 상기 폴리메라아제가 길기 때문에, 둘의 단편들-N-말단 단편(상기 유전자형들 사이의 가장 많이 변이될 수 있는 절편은 제거되었음) 및 C-말단 단편-이 발생되었다. 두 단편들은 대략 300 아미노산들의 길이였다. 상기 에피토프 최적화 폴리메라아제 아미노산 서열들은 다음과 표 9에 도시된다:
에피토프 최적화 HBV 폴리메라아제 N-말단 아미노산 서열(SEQ ID NO: 8):
PLSYQHFRKLLLLDEEAGPLEEELPRLADEGLNRRVAEDLNLGNLNVSIPWTHKVGNFTGLYSSTVPVFNPEWQTPSFPKIHLQEDIVDRCKQFVGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIKPYYPEHAVNHYFQTRHYLHTLWKAGILKKRETTRSASFCGSPYSWEQELQHGSCWWLQFRNSKPCSEYCLTHLVNLLEDWGPCDEHGEHHIRIPRTPARVTGGVFLVDKNPHNTAESRLVVDFSQFSRGITRVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHIPLHPAAMP
에피토프 최적화 HBV 폴리메라아제 C-말단 아미노산 서열(SEQ ID NO: 10):
HLLVGSSGLSRYVARLSSNSRIINHQHGTMQNLHDSCSRNLYVSLLLLYKTFGRKLHLYSHPIILKTKRWGYSLNFMGYVIGSWGSLPQDHIIQKIKECFRKLPVNRPIDWKVCQRIVGLLGFAAPFTQCGYPALMPLYACIQSKQAFTFSPTYKAFLSKQYLNLYPVARQRPGLCQVFADATPTGWGLAMGHQRMRGTFVAPLPIHTAELLAACFARSRSGAKILGTDNSVVLSRKYTSFPWLLGCAANWILRGTSFVYVPSALNPADDPSRGRLGLSRPLLRLPFRPTTGRTSLYAVSPSV
에피토프 최적화 코어 및 폴리메라아제 서열들을 발현시키는 AdC6 및 AdC7 벡터들의 발생
상기 에피토프 최적화 코어 또는 폴리메라아제 아미노산 서열들을 인코딩하는 유전자들이 CMV 프로모터(promoter)의 대조군 하에서 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 당단백질 D(gD) 서열을 포함하였던 전이 벡터들 내로 복제되었다. 상기 유전자들은 이후에 다음의 벡터들을 생성하기 위해 E1-결실, E3 또는 F 3, 4, 5, 6 및 7-결실 복제 결핍 아데노바이러스 벡터(PCT/US2017/043315에 기재되어 있는 바와 같은) 내로 복제되었다:
● gD(AdC6-gD코어)에 융합된 상기 에피토프 최적화 코어 서열을 포함하는 AdC6;
● gD(AdC6-gDPolN)에 융합된 상기 에피토프 최적화 폴리메라아제 N-말단 서열을 포함하는 AdC6;
● gD(AdC6-gDPolC)에 융합된 상기 에피토프 최적화 폴리메라아제 C-말단 서열을 포함하는 AdC6;
● gD(AdC7-gD코어)에 융합된 상기 에피토프 최적화 코어 서열을 포함하는 AdC7;
● gD(AdC7-gDPolN)에 융합된 상기 에피토프 최적화 폴리메라아제 N-말단 서열을 포함하는 AdC7; 및
● gD(AdC7-gDPolC)에 융합된 상기 에피토프 최적화 폴리메라아제 C-말단 서열을 포함하는 AdC7.
정확한 클론들이 제한 효소 소화(restriction enzyme digest)에 의해 확인되었고, 클로닝(cloning) 부위들이 서열화되었다. 벡터들은 보호되었고, HEK 293 세포들 내에서 팽창되었으며, 염화세슘(CsCl) 기울기 원심분리로 정제되었고, 상기 벡터 농도(vp)는 분광 광도 측정(spectrophotometry)에 의해 결정되었다. 벡터들은 HEK 293 세포들 내의 연속 희석에서 이들의 팽창에 따라 전염성 단위들에 대해 적정되었고, RNA의 분리 및 역전사와 내포 헥손(hexon)-특이적 PCR 반응이 수반되었다. 상기 벡터들의 유전자 통합성은 정제된 바이러스 DNA의 겔 전기영동(gel electrophoresis)이 수반된 제한 효소 소화에 의해 결정되었다. 단백질 발현은 gD-특이적 항체들을 이용하여 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의해 결정되었다. 유전자 안정성은 정제된 바이러스 DNA의 제한 효소 소화 및 겔 전기영동이 수반된 HEK 293 세포들 내의 상기 벡터들의 연속 삽입들(12-15)에 의해 결정되었다.
마우스들 내의 백신들의 면역원성 시험
C57Bl/6, BALB/c 및 HLA-A2 tg 마우스들(그릅 당 n＝5)은 다양한 농도들의 각각의 전술한 벡터들로 주사되었다. 나이브(naive) 마우스들은 대조군들로 기여하였다. 마우스들은 주사 후의 다른 시간들에서 채혈되었고, 삽입-특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포들의 도수들이 IFN-g에 대해 세포내 시토카인 염색(intracellular cytokine staining: ICS)에 의해 결정되었다. 첫 번째 주사 후의 2개월에서, AdC6-면역 마우스들은 동일한 삽입을 발현시키는 이종의 벡터(AdC7)로 추가 접종되었다. HBV-특이적 T 세포들의 도수들이 다시 테스트되었다. 초회를 접종한 후의 결과들은 도 2a-도 2f와 도 3a(C57Bl/6 마우스들), 도 3b(BALB/c 마우스들) 및 도 3c(HLA-A2 마우스들)에 도시된다. 상기 추가 후의 결과들은 도 4a-도 4c 및 도 5a-도 5b에 도시된다.
C57Bl/6 마우스들은 상기 에피토프 최적화 폴리메라아제 N-말단 서열에 대한 매우 강건한 CD8+ T 세포 반응 및 상기 에피토프 최적화 폴리메라아제 C-말단 서열과 상기 에피토프 최적화 코어 서열에 대한 보다 낮은 반응들을 보여주었지만, CD4+ 반응들은 상기 에피토프 최적화 코어 서열 및 상기 에피토프 최적화 폴리메라아제 C-말단 서열에 대해 보다 우수하였다(도 2a-도 2f). C57Bl/6 마우스들 내의 에피토프 매핑(epitope mapping)은 PolC 보다 PolN에 대해 높고 넓은 반응들을 보였다(도 3a). PolN 내에 전체 14의 펩티드들은 CD8+ T 세포들에 의해 인식되었전 반면, PolC 내에서 하나의 에피토프를 가장 잘 반영할 수 있는 둘의 인접하는 펩티드들이 인식되었다. CD4+ T 세포들은 PolN 또는 PolC에 반응하는 데 실패하였다. 이러한 양상은 BALB/c 마우스들에서 크게 반영되었고, 여기서 CD8+ T 세포 반응들은 4의 펩티드들의 인식으로 PolC가 수반되었던 12의 펩티드들의 인식으로 PolN에 대해 가장 높았다(도 3b). 코어에 대한 반응들은 낮았지만, 놀랍게도 10의 펩티드들의 인식으로 넓었다(도 3b). BALB/c CD4+ T 세포들은 보다 낮은 PolC의 인식(4 펩티드들) 또는 PolN(2 펩티드들)에 비해 15의 펩티드들의 인식으로 코어에 대해 가장 잘 반응하였다. CD8+ T 세포 반응들도 HLA-A2 tg 마우스들에서 테스트되었고, 여기서 PolN이 12의 펩티드들을 수분한 가장 높은 반응을 촉발시켰다(도 3c). PolC에 대한 반응은 낮았지만 넓었던(16의 펩티드들) 반면, 코어의 하나의 펩티드만이 검출되었다(도 3c). 초회 접종 실험들에서 테스트된 펩티드들의 서열들이 표 3(코어 펩티드들), 표 4(PolN 펩티드들) 및 표 5(PolC 펩티드들)에 제공된다. 초회 접종 실험들로부터의 펩티드 풀들의 펩티드 조성은 표 6-표 8에 제공된다. 전체적으로 이들 데이터들은 대부분의 경우들에서 검출 가능한 T 세포 반응들을 유도한 삽입들이 각 서열 내의 다중의 에피토프들에 대해 지향되었던 것을 보여준다.
에피토프 최적화 코어 펩티드들
펩티드 아미노산 서열 SEQ ID NO: 초회
1 DIDPYKEFGATVELL 20 CD8(B/c)
2 KEFGATVELLSFLPS 21 CD8(B/c)
3 TVELLSFLPSDFFPS 22 CD8(B/c)
4 SFLPSDFFPSIRDLL 23 CD8(B/c)
5 DFFPSIRDLLDTASA 24 CD8(B/c)
6 IRDLLDTASALYREA 25
7 DTASALYREALESPE 26 CD8(B/c)
8 LYREALESPEHCSPH 27 CD4(Bl/6); CD4(B/c)
9 LESPEHCSPHHTALR 28 CD4(B/c)
10 HCSPHHTALRQAILC 29 CD4(B/c)
11 HTALRQAILCWGELM 30 CD4(B/c)
12 QAILCWGELMTLATW 31
13 WGELMTLATWVGSNL 32 CD8(B/c); CD4(B/c); CD8(HLA)
14 TLATWVGSNLEDPAS 33 CD8(B/c); CD4(B/c)
15 VGSNLEDPASRELVV 34 CD8(B/c); CD4(B/c)
16 EDPASRELVVSYVNV 35 CD8(B/c); CD4(B/c)
17 RELVVSYVNVNMGLK 36 CD8(B/c); CD4(B/c)
18 SYVNVNMGLKIRQLL 37
19 NMGLKIRQLLWFHIS 38 CD4(B/c)
20 IRQLLWFHISCLTFG 39 CD4(B/c)
21 WFHISCLTFGRETVI 40 CD4(B/c)
22 CLTFGRETVIEYLVS 41 CD4(B/c)
23 RETVIEYLVSFGVWI 42 CD4(B/c)
24 EYLVSFGVWIRTPPA 43
25 FGVWIRTPPAYRPPN 44
26 RTPPAYRPPNAPILS 45 CD8(Bl/6)
27 YRPPNAPILSTLPET 46
28 APILSTLPETTVVRR 47 CD4(Bl/6)
29 TLPETTVVRRRDRGR 48 CD8(Bl/6)
30 TVVRRRDRGRSPRRR 49
31 RDRGRSPRRRTPSPR 50
32 SPRRRTPSPRRRRSQ 51
33 TPSPRRRRSQSPRRR 52
34 RRRSQSPRRRRRSQSR 53
35 SPRRRRRSQSRESQC 54
B/c＝BALB/c; Bl/6＝C57Bl/6; HLA＝HLA-A2
에피토프 최적화 PolN 펩티드들
펩티드 아미노산 서열 SEQ ID NO: 초회
1 PLSYQHFRKLLLLDE 55
2 HFRKLLLLDEEAGPL 56
3 LLLDEEAGPLEEELP 57
4 EAGPLEEELPRLADE 58
5 EEELPRLADEGLNRR 59
6 RLADEGLNRRVAEDL 60
7 GLNRRVAEDLNLGNL 61
8 VAEDLNLGNLNVSIP 62
9 NLGNLNVSIPWTHKV 63
10 NVSIPWTHKVGNFTG 64 CD4(B/c)
11 WTHKVGNFTGLYSST 65
12 GNFTGLYSSTVPVFN 66
13 LYSSTVPVFNPEWQT 67
14 VPVFNPEWQTPSFPK 68 CD4(B/c)
15 PEWQTPSFPKIHKLQE 69
16 PSFPKIHKLQEDIVDR 70
17 IHKLQEDIVDRCKQFV 71
18 EDIVDRCKQFVGPLTV 72
19 RCKQFVGPLTVNEKRR 73
20 VGPLTVNEKRRLKLIM 74
21 VNEKRRLKLIMPARFY 75
22 RLKLIMPARFYPNVTK 76
23 MPARFYPNVTKYLPLD 77
24 YPNVTKYLPLDKGIKP 78
25 KYLPLDKGIKPYYPEH 79
26 DKGIKPYYPEHAVNHY 80
27 PYYPEHAVNHYFQTRH 81
28 HAVNHYFQTRHYLHTL 82
29 YFQTRHYLHTLWKAGI 83
30 HYLHTLWKAGILYKRE 84
31 LWKAGILYKRETTRSA 85
32 ILYKRETTRSASFCGS 86
33 ETTRSASFCGSPYSWE 87
34 ASFCGSPYSWEQELQH 88 CD8(Bl/6); CD8(B/c); CD8(HLA)
35 SPYSWEQELQHGSCWW 89 CD8(Bl/6); CD8(B/c); CD8(HLA)
36 EQELQHGSCWWLQFRN 90
37 HGSCWWLQFRNSKPCS 91 CD8(Bl/6); CD8(B/c); CD8(HLA)
38 WLQFRNSKPCSEYCLT 92 CD8(Bl/6); CD8(B/c); CD8(HLA)
39 NSKPCSEYCLTHLVNL 93 CD8(Bl/6)
40 SEYCLTHLVNLLEDWG 94 CD8(Bl/6); CD8(B/c); CD8(HLA)
41 THLVNLLEDWGPCDEH 95
42 LLEDWGPCDEHGEHHI 96
43 GPCDEHGEHHIRIPRT 97
44 HGEHHIRIPRTPARVT 98
45 IRIPRTPARVTGGVFL 99
46 TPARVTGGVFLVDKNP 100
47 TGGVFLVDKNPHNTAE 101
48 LVDKNPHNTAESRLVV 102
49 PHNTAESRLVVDFSQF 103
50 ESRLVVDFSQFSRGIT 104 CD8(Bl/6); CD8(B/c); CD8(HLA)
51 VDFSQFSRGITRVSWP 105 CD8(Bl/6); CD8(B/c); CD8(HLA)
52 FSRGITRVSWPKFAVP 106
53 TRVSWPKFAVPNLQSL 107 CD8(Bl/6); CD8(B/c); CD8(HLA)
54 PKFAVPNLQSLTNLLS 108 CD8(Bl/6); CD8(B/c); CD8(HLA)
55 PNLQSLTNLLSSNLSW 109 CD8(Bl/6)
56 LTNLLSSNLSWLSLDV 110 CD8(Bl/6); CD8(B/c); CD8(HLA)
57 SSNLSWLSLDVSAAFY 111
58 WLSLDVSAAFYHIPLH 112 CD8(Bl/6); CD8(B/c); CD8(HLA)
59 VSAAFYHIPLHPAAMP 113 CD8(Bl/6); CD8(B/c); CD8(HLA)
B/c＝BALB/c; Bl/6＝C57Bl/6; HLA＝HLA-A2
에피토프 최적화 PolC 펩티드들
펩티드 아미노산 서열 SEQ ID NO: 초회
1 HLLVGSSGLSRYVAR 114
2 SSGLSRYVARLSSNSR 115
3 RYVARLSSNSRIINHQ 116
4 LSSNSRIINHQHGTMQ 117
5 RIINHQHGTMQNLHDS 118
6 QHGTMQNLHDSCSRNL 119
7 QNLHDSCSRNLYVSLL 120
8 SCSRNLYVSLLLLYKT 121
9 LYVSLLLLYKTFGRKL 122
10 LLLYKTFGRKLHLYSH 123 CD8(HLA)
11 TFGRKLHLYSHPIILK 124
12 LHLYSHPIILKTKRWG 125 CD8(B/c); CD8(HLA)
13 HPIILKTKRWGYSLNF 126 CD8(HLA)
14 KTKRWGYSLNFMGYVI 127
15 GYSLNFMGYVIGSWGS 128 CD8(HLA)
16 FMGYVIGSWGSLPQDH 129
17 IGSWGSLPQDHIIQKI 130
18 SLPQDHIIQKIKECFR 131
19 HIIQKIKECFRKLPVN 132
20 IKECFRKLPVNRPIDW 133
21 RKLPVNRPIDWKVCQR 134
22 NRPIDWKVCQRIVGLL 135
23 WKVCQRIVGLLGFAAP 136
24 RIVGLLGFAAPFTQCG 137
25 LGFAAPFTQCGYPALM 138
26 PFTQCGYPALMPLYAC 139 CD8(HLA)
27 GYPALMPLYACIQSKQ 140
28 MPLYACIQSKQAFTFS 141 CD8(B/c); CD8(HLA)
29 CIQSKQAFTFSPTYKA 142 CD8(HLA)
30 QAFTFSPTYKAFLSKQ 143
31 SPTYKAFLSKQYLNLY 144 CD8(Bl/6); CD8(HLA)
32 AFLSKQYLNLYPVARQ 145 CD8(Bl/6)
33 QYLNLYPVARQRPGLC 146
34 YPVARQRPGLCQVFAD 147 CD8(HLA)
35 QRPGLCQVFADATPTG 148 CD4(B/c)
36 CQVFADATPTGWGLAM 149 CD8(B/c); CD8(HLA)
37 DATPTGWGLAMGHQRM 150 CD8(HLA)
38 GWGLAMGHQRMRGTFV 151
39 MGHQRMRGTFVAPLPI 152 CD4(B/c); CD8(HLA)
40 MRGTFVAPLPIHTAEL 153
41 VAPLPIHTAELLAACF 154
42 IHTAELLAACFARSRS 155 CD8(HLA)
43 LLAACFARSRSGAKIL 156
44 FARSRSGAKILGTDNS 157 CD8(B/c); CD8(HLA)
45 SGAKILGTDNSVVLSR 158 CD8(HLA)
46 LGTDNSVVLSRKYTSF 159
47 SVVLSRKYTSFPWLLG 160
48 RKYTSFPWLLGCAANW 161 CD8(HLA)
49 FPWLLGCAANWILRGT 162
50 GCAANWILRGTSFVYV 163
51 WILRGTSFVYVPSALN 164 CD4(B/c)
52 TSFVYVPSALNPADDP 165
53 VPSALNPADDPSRGRL 166
54 NPADDPSRGRLGLSRP 167
55 PSRGRLGLSRPLLRLP 168 CD4(B/c)
56 LGLSRPLLRLPFRPTT 169
57 PLLRLPFRPTTGRTSL 170
58 PFRPTTGRTSLYAVSP 171
59 TGRTSLYAVSPSV 172
B/c＝BALB/c; Bl/6＝C57Bl/6; HLA＝HLA-A2
에피토프 최적화 코어 풀
코어
기질		 A B C D E F
G 1 2 3 4 5 6
H 7 8 9 10 11 12
I 13 14 15 16 17 18
J 19 20 21 22 23 24
K 25 26 27 28 29 30
L 31 32 33 34 35
에피토프 최적화 PolN 풀
PolN
기질		 A B C D E F G H
I 1 2 3 4 5 6 7 8
J 9 10 11 12 13 14 15 16
K 17 18 19 20 21 22 23 24
L 25 26 27 28 29 30 31 32
M 33 34 35 36 37 38 39 40
N 41 42 43 44 45 46 47 48
O 49 50 51 52 53 54 55 56
P 57 58 59
에피토프 최적화 PolC 풀
PolC
기질		 A B C D E F G H
I 1 2 3 4 5 6 7 8
J 9 10 11 12 13 14 15 16
K 17 18 19 20 21 22 23 24
L 25 26 27 28 29 30 31 32
M 33 34 35 36 37 38 39 40
N 41 42 43 44 45 46 47 48
O 49 50 51 52 53 54 55 56
P 57 58
C57Bl/6, BALB/c 및 HLA-A2 tg 마우스들에서 테스트되었던 상기 추가 접종 후, 반응들의 증가는 주로 삽입들에 대해서와 차선의 반응들을 유도하였던 초회 접종에 따른 벡터 도스들, 즉 1 x 109vp 벡터 도스로 테스트된 코어에 대해 주로 보였다(도 4a-도 4c). 비록 벡터들이 높은 도스로 주사되었을 때에 추가 면역이 PolN 또는 PolC에 대한 반응을 증가시키는 데 실패하였지만, 상기 추가는 그럼에도 불구하고 상기 T 세포 반응들을 확장시켰다(도 5a-도 5c).
면역원성 요약
전술한 결과들은 다음의 사항들을 예시한다.
● 상기 백신들은 CD8+ T 세포들에 대해 PolN＞PolC＞코어 및 CD4+ T 세포 반응들에 대해 코어＞PolC＞PolN으로 면역원성이었고;
● 면역 반응들은 이종의 백신 운반체로 추가될 수 있으며;
● 면역 반응들은 확장되고;
● 상기 T 세포 반응들의 폭은 상기 추가 접종 후에 증가한다.
HBV 역가들의 낮은 도스의 AAV-1.3HBV 시험 감염(challenge)에 대한 접종의 효과
3의 마우스들의 그룹이 1 x 1010, 1 x 1011 또는 1.5 x 1011vg의 AAV-1.3HBV로 시험 감염되었고, 8주 이후에 AdC6-gDPolN으로 접종되었다, 바이러스 역가(viral titer)들은 접종 후의 8주에 테스트되었으며, 전-접종(pre-vaccination) 역가들과 비교되었다. 도 6은 각 치료 그룹에 대한 베이스라인으로부터의 바이러스 변화들을 도시한다.
에피토프 편위(epitope shifting)
HBV 항원들에 대한 CD8+ T 세포들은 만성 HBV 감염들 동안에 소진되게 된다. 소진을 향한 진행은 보다 빠르며, 아우세(subdominant)의 에피토프들과 비교할 경우에 CD8+ T 세포들의 우세가 뚜렷하였다. 기저 원인은 소진이 상기 T 세포 수용체를 통한 압도적인 항원 추진 자극에 의해 추진되는 것이며, 우세한 에피토프들이 이들의 제한하는 원소들에 대해 보다 낮은 결합성을 가지는 아우세의 에피토프들에 비해 항원 표출 세포들에 의해 발현되는 MHC 클래스 I 항원들에 대해 보다 높은 레벨들을 제시한다. 통상적인 백신 접근 방식들은 우세한 에피토프들에 대한 면역 반응들을 일차적으로 유도한다. 치료 백신들은 만성 바이러스 감염 동안에 우세한 에피토프들에 대한 T 세포들의 손실을 고려해야 하고, 아우세의 에피토프들에 대한 CD8+ T 세포들의 바람직한 팽창에 대해 설계되어야 하며, 이는 저항하는 질병 추진의 소진, 우수한 질병 대조군에 대한 해석의 보다 높은 가능성을 가진다.
단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D("AdC6-gDPolN", 여기서 gDPolN의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 16임)에 융합된 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인(PolN)을 인코딩하는 아데노바이러스 벡터로 면역된 나이브 마우스들에서 에피토프 프로파일이 결정되었다. 상기 AAV8-1.3HBV 벡터로 전-치료되지 않았던 마우스들에서의 반응들이 상기 AdC6-gDPolN로의 접종 이전에 상기 1.3HBV 게놈을 발현시키는 AAV8 벡터로 감염되었던 마우스들에서 수득된 경우들과 비교되었다. 상기 AAV8-1.3HBV 벡터는 CD8+ T 세포 소진을 추진할 수 있었던 혈청 내의 HBV의 높은 역가들을 유도하였다.
실험들의 첫 번째 시리즈에서, 펩티드 풀 기재가 상기 AdC6-gDPolN 벡터로 접종되었지만, AAV-1.3HBV 벡터로 시험 감염되지 않았던 마우스들 내의 에피토프들을 확인하기 위해 이용되었다. 이들 나이브 마우스들 내의 수많은 영역들이 잠재적인 반응들(예를 들어, 1%의 IFN-γ 생산 CD8+ CD44+ T 세포들 보다 큰)을 유도하였던 것으로 확인되었다. 도 7a 및 도 8a 참조. 두 번째 실험에서, 마우스들은 1 x 1010 바이러스 게놈들(vg)의 상기 AAV-1.3HBV 벡터로 시험 감염되었고, 시험 감염되지 않은 마우스들에서의 초기 실험에서와 같이 동일한 HBV 폴리메라아제 서열(gDPolN)을 발현시키는 AdC6 벡터로 4주 이후에 접종되었으며, 10주 이후에 상기 HBV PolN-특이적 CD8+ T 세포 에피토프 프로파일이 접종 이전에 시험 감염되었던 마우스들로부터의 비장 세포(splenocyte)들 상의 펩티드 풀 기질들을 이용하여 결정되었다. 도 7b 및 도 8b 참조. 상기 실험은 마우스들을 1.5 x 1011vg 도스의 상기 AAV8-1.3HBV 벡터로 시험 감염시키는 보다 엄격한 조건들을 이용하여 반복되었다. 마우스들은 4주 이후에 다시 접종되었고, 접종 후의 대략 10주에서 상기 펩티드 풀 기질들에 대한 CD8+ T 세포 반응들에 대하여 테스트되었다. 도 7c 및 도 8c 참조. 두 실험들에서, 접종되지 않은 마우스들로부터 얻어진 결과들과 비교하여, 편위가 접종의 시간에서 ㎖의 혈청 당 107-109vg 사이의 바이러스 부하들을 가졌던 AAV8-1.3HBV 감염된 마우스들 내에 에피토프 프로파일에서 관찰되었다. 효과는 높은 도스의 AAV8-1.3HBV 벡터로 시험 감염되었던 마우스들에서 보다 현저하였다. 두 실험들에서, 반응들에 대한 감소가 관찰되었다. 또한, 특히 높은 도스의 AAV8-1.3HBV로 시험 감염되었던 마우스들에서, 결과들은
감염되지 않고 접종되지 않은 마우스들에서 면역 우세를 보였던 수많은 에피토프들에 대한 CD8+ T 세포들의 손실(예를 들어, 펩티드들 50 내지 59로 나타낸 영역 내, 도 8), 아우세였던 에피토프들의 보다 우수한 보존(펩티드들 2 내지 8로 나타낸 영역 내의 경우들과 같이)뿐만 아니라 펩티드 10 내지 펩티드 29에 의해 제시되는 영역과 같은 새로운 에피토프들을 보여주었다. 이들 데이터들은 우세의 인식으로부터 아우세의 에피토프들의 인식으로의 이동을 확인하였다.
이들 데이터들에 기초하여, 새로운 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인 삽입(HBV PolN v2)이 발생되었다(SEQ ID NO: 173):
HFRKLLLLDEEAGPLEEELPRLADEGLNRRVAEDLNLGNLPEWQTPSFPKIHLQEDIVDRCKQFVGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIKPYYPEHAVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASFCGSPYSWEQELQHGSCWWLQFRNSKPCSEYCLTHLVNLLEDWGPCDEHGEHHIRIPRTPARVT
이러한 삽입은 반응들이 높은 HBV 바이러스 부하를 가졌던 마우스들 내에 온존하게 남았던 주로 아우세의 에피토프들에 대한 CD8+ T 세포 반응들을 유도하였다.
gD코어, gDPolN 및 gDPolC 백신들의 면역원성 및 효능
AAV8-HBV 마우스 모델에서 상기 AdC6-gD코어, AdC6-gDPolN, AdC6-gDPolC, AdC7-gD코어, AdC7-gDPolN 및 AdC7-gDPolC 백신들의 면역원성 및 효능이 분석되었다.
방법들-면역원성
C57Bl/6 마우스들(그룹 당 n＝5)이 AdC6-gD코어(SEQ ID NO: 15에 대응하는 gD코어 핵산 서열); AdC6-gDPolN(SEQ ID NO: 17에 대응하는 gDPolN 핵산 서열); 또는 AdC6-gDPolC(SEQ ID NO: 19에 대응하는 gDPolC 핵산)의 다양한 도스들로 주사되었다. 첫 번째 주사 후의 2개월에, AdC6 벡터-면역된 마우스들은 동일한 삽입(예를 들어, AdC7-gD코어, AdC7-gDPolN, 또는 AdC7-gDPolC)을 포함하는 AdC7 벡터들로 추가 접종되었다. 마우스들은 상기 주사 후의 14일 및 56일에 채혈되었고, 다양한 HBV 삽입들에 대한 주사 및 T 세포 도수들이 상기 HBV 서열들을 나타내는 중첩 펩티드들로의 세포들의 자극에 따라 인터페론(IFN)-γ에 대한 세포내 시토카인 염색(ICS)에 의해 분석되었다. 대조군 세포들은 펩티드들이 없이 배양되었다. PolN 내의 하나의 면역 우세 에피토프에 대한 CD8+ T 세포들의 도수들 및 표현형이 MHC I 사합체(tetramer)로의 염색에 의해 테스트되었다. 표적 서열 내의 개개의 펩티드들에 대한 CD8+ T 세포 반응들의 폭과 특이성은 비장 세포들(IFN-γ에 대해 ICS로 테스트된 CD8+ T 세포들)의 에피토프 매핑을 통해 수행되었다.
간 내의 CD8+ T 세포들을 평가하기 위해, C57Bl/6 마우스들(그룹 당 n＝8)은 1 x 1010 바이러스 게놈들(vg)의 AAV8-1.3HBV의 정맥 내 투여, 1 x 1011vg의 AAV8-1.HBV의 정맥 내 투여를 수용하였거나, 이들의 꼬리 정맥을 통해 아무것도 수용하지 않았으며, 4주 이후에 5 x 109 바이러스 입자들(vp)의 AdC6-gDPolN의 단일의 IM 주사를 수용하였다. 상기 IM 주사의 8주 후, 마우스들은 희생되었고, 간들이 제거되었으며, 림프구들이 분리되었고, T 세포 마커들 및 상기 PolN 서열 내에 존재하는 면역 우세의 에피토프에 대한 T 세포 수용체를 인식하는 사합체로 염색되었다.
별도의 실험에서, C57Bl/6 마우스들의 세 그룹들(그룹 당 n＝4)은 4주(-)에서 5 x 109vp의 AdC6-gDPolN의 단일의 IM 주사를 수용하였거나, 4주 이후에 5 x 109vp의 AdC6-gDPolN의 단일의 IM 주사를 수용하거나 수용하지 않고 이들의 꼬리 정맥을 통해 1 x 1011 바이러스 게놈들(vg)의 AAV8-1.3HBV의 정맥 내 투여를 수용하였다. AAV8-1.3HBV의 투여 후 대략 2개월에 마우스들은 희생되었고, 간들이 제거되었으며, 간 슬라이스들이 각각의 셋의 그룹들로부터 준비되었고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되었으며, 림프구 침윤물들에 대해 평가되었다. 동일한 실험으로부터, 세포들은 특이적 사합체 및 T-베트에 대한 형광 색소 표시 항체들(클론 4B10, BV785 염색) 또는 PD-1에 대한 항체들(클론 29F.1A12, BF605 염색), TIM-3(클론 RMT3-23, Pe/Cy7 염색), CTLA-4(클론 UC10-4B9, PE 염색), 또는 LAG-3(클론 C9B7W, BV650 염색)으로 염색되었다. 세포들은 유동 세포 분석법(flow cytometry)에 의해 분석되었고, CD44+CD8 사합체 양성 세포들에 대한 관문이 되었으며, 이후에 상기 마커들에 대한 관문이 되었다. 퍼센트 마커 양성 세포들이 나이브 T 세포들과 비교하여 히스토그램(histogram)들로부터 확인되었다.
방법들-효능
AAV8-1.3HBV 벡터 연구들- 만성 HBV 바이러스 노출에 대한 AdC6-gDPolN의 영향을 평가하기 위해, C57Bl/6 마우스들(그룹 당 n＝8)이 이들의 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 1 x 1010vg의 AAV8-1.3HBV로 시험 감염되었고, 4주 이후에 5 x 109vp의 AdC6-gDPolN의 단일의 IM 주사로 면역되었다. HBV DNA 바이러스 역가들은 qPCR에 의해 평가되었고, 베이스라인(log10 복제들(copies)/㎖)으로부터의 전-접종 및 후-접종(post-vaccination) 변화들이 보고되었다. 바이러스 게놈 복제 횟수들은 AAV8 시험 감염 후의 4주, 6주, 8주, 10주 및 12주에 평가되었다. 바이러스 역학(viral dynamics)은 PCR에 의해 시간에 걸쳐 평가되었고, ㎖ 당 HBV 복제들에서 log10의 변화가 평가되었다. 치료 후의 다른 시점들에서 일, 이 또는 삼의 로그 감소들을 보였던 마우스들의 숫자가 평가되었다.
시간에 걸친 CD8+ T 세포 항원 인식에 대한 만성 HBV 바이러스 노출의 영향-백신-유도 간 CD8+ T 세포들에 대한 AAV8-1.3HBV의 효과가 평가되었다. 5 x 109vp의 AdC6-gDPolN의 단일 IM 주사로 면역된 나이브 마우스들의 비장 세포들 내의 에피토프 프로파일이 접종 후의 4주에 결정되었다. 마우스들은 1 x 1010 및 1.5 x 1011vg의 AAV8-1.3HBV로 시험 감염되었고, 후속하여 4주 이후에 5 x 109vp의 AdC6-gDPolN 4주로 접종되었으며, 접종 후의 10주(AAV 주사 후의 14주)에 수행된 비장 세포들 내의 CD8+ T 세포 에피토프 프로파일들을 가졌다. AAV-나이브 및 AAV-치료되고 접종된 동물들 사이의 에피토프 프로파일들이 비교되었다. 간으로부터의 PolN-특이적 CD8+ T 세포들이 분화 마커들에 대해 분석되었다.
결과들
면역원성-접종은 PolN에 대한 강하고 지속된 CD8+ T 세포 반응(모든 순환하는 CD8+ T 세포들에 대한 중앙 도수들: 6.0%) 및 PolC 및 코어에 대한 보다 낮은 반응들(중앙 도수들: 각기 1.0% 및 0.4%; 도 9a 및 도 9b)을 유도하였다. 8주에서 추가로 접종하는 것은 코어에 대해 관찰된 상당한 변화들로 모든 영역들에서 증가되었다(p＝0.007)(도 9C). 도 9a-도 9c는 라인들로 나타낸 중간 값들로 개개의 마우스들에 대하여 모든 CD8+ T 세포들에 대한 % CD8+ T 세포들을 나타낸다. 접종은 추가로 접종한 후에 더 향상되었던 CD8+ T 세포들에 의한 넓은 에피토프 인식을 유도하였다(27% 내지 34%; 도 10).
AdC6-gDPolN 접종에 후속하여 12주에서, AAV8-1.3HBV-감염되고 접종된 마우스들은 간 CD8+ 침윤물들 내의 선호되는 증가(도 11a-도 11b 및 도 12a-도 12f), 백신-유도 HBV-특이적 CD8+ T 세포들의 감소된 존재(도 11a 및 도 11b) 및 T-베트의 약산 감소된 레벨들(효과기(effector) 기능들의 손실을 제시함)(도 13a-도 13b)을 보였다. 도 11a는 개개의 간들로부터의 모든 회수된 림프구들에 대한 % CD8+ T 세포들을 보여준다. 도 11b는 나이브 T 세포들과 비교하여 히스토그램들로부터 확인된 퍼센트 사합체 양성 CD8+ 세포들을 도시한다. 소진 표현형에 대한 T 세포 분화를 제기하는 세포 마커들의 선명한 패턴은 관찰되지 않았지만, 접종된 AAV1.3HBV-감염된 및 감염되지 않은 마우스들 사이에는 있었다(도 13a-도 13b).
효능-상기 AdC6-gDPolN 벡터의 단일의 IM 주사에 후속하여, AAV8-1.3HBV-감염된 마우스들은 8주의 후 접종 기간에 걸쳐 지속되었던 혈청 내의 다중 로그의 HBV DNA 저하를 가졌다(도 14). 접종 후, 4주 및 8주에서 혈청 HBV DNA 바이러스 부하 레벨들 내의 중간 값 저하들은 각기 0.86 및 2.69 log10 복제들(cps)/㎖이었다(도 14a). 8주에서, 모든 동물들은 베이스라인으로부터 ＞1 log10 복제들/㎖ 저하를 가졌고, 6/7(86%)은 ＞2 log10 복제들/㎖ 저하를 가졌으며, 2/7(29%)은 ＞3 log10 복제들/㎖ 저하를 가졌다(도 14b).
단일의 AdC6-gDPolN 벡터 주입에 이어서, 비장 세포들 내의 PolN 펩티드들에 대한 별도의 CD8+ T 세포 인식 양상들이 AAV-HBV-감염된 및 나이브 마우스들과 비교되었을 때에 관찰되었다. 도 15a 및 도 15b는 마우스들이 AAV-1.3HBV로 먼저 주사되었고, 이후의 4주 이후에 1010vp의 상기 AdC6-gDPolN 벡터로 추가 접종되었으며, 비장 세포들이 면역 후의 8주에 수확되었고, 상기 PolN의 서열에 걸치는 개개의 펩티드들로의 짧은 생체외 자극에 따라 IFN-γ에 대해 ICS로 테스트되었던 실험들로부터의 결과들을 예시한다. 펩티드 없이 얻어진 배경 도수들은 감산하였다. 도 15a는 마우스들이 나타낸 도스의 상기 AAV8-1.3HBV 벡터로 먼저 주사되었던 경우가 수반되어 AdC6-gDPolN 백신만을 수용하였던 마우스들의 펩티드 인식 프로파일을 도시한다. 도 15b의 파이(pie) 그래프들은 모든 CD44+ CD8+ 세포들의 0.1%의 임계값에 도달하였던 펩티드들에 대응되는 반응들을 보여준다(도 15a의 경우에 대응하는 데이터). 각 슬라이스/색상은 전체의 비율을 보여주는 크기로 개개의 펩티드에 대한 상기 반응의 도수를 나타내고, 0.1% 보다 큰 반응들만이 포함되었다. 풀 아웃들은 AAV8-1.3HBV 감염된 마우스들에서 인식된 에피토프들만을 나타낸다. AAV로의 전-치료가 단일의 IM 초회 후에 인식되었던 에피토프들의 숫자 및 CD8+ T 세포들의 풀에 대한 IFN-γ를 생성하는 CD8+ T 세포들의 전체 합계로서 면역 반응의 크기를 감소시켰던 것이 발견되었다. AAV 전-치료는 상기 T 세포 인식을 대략 제3의 검출 가능한 CD8+ T 세포 반응을 나타내는 새로운 에피토프들로 이동시켰다. 기능적 HBV-특이적 CD8+ T 세포 반응들의 퍼센티지는 나이브 마우스들에서 가장 높았지만(4.4%, 도 15b), 낮은 및 높은 도스 AAV8-1.3HBV의 존재에서 감소되었다(각기 2.0% 및 0.6%; 도 15b). AAV8-1.3HBV-감염되지 않은 동물들은 새로운 에피토프들의 T 세포 인식을 포함하도록 AAV-HBV-감염된 동물들에서 감소되었고 이동되었던 수많은 에피토프들에 대해 강한 CD8+ T 세포 반응들을 보여주었다.
논의
유전자적으로 인코드된 관문 억제제(checkpoint inhibitor)로서 gD를 이용하여 조기의 CD8+ T 세포 활성화를 목표로 하는 HBV 치료 백신이 생성되었고, 다음의 사항들을 나타내었다.
● 중요 HBV 항원들에 대한 잠재적이고 지속 가능한 CD8+ T 세포 반응들을 유도하고(도 9);
● 아우세의 에피토프 인식(도 15)을 포함하였던 매우 넓은 CD8+ T 세포 반응들(도 10)을 자극하며;
● 간에 대한 기능적 CD8+ T 세포들의 선호되는 진행(도 11 및 도 12)으로 AAV 마우스 모델에서 지속된 다중 로그 HBV DNA 바이러스 부하 감소(도 14)를 구현한다.
개시되는 AAV 연구들에서, AAV-유도 HBV 감염은 AdC6-gDPolN으로의 접종에 이어서 PolN의 우세한 에피토프들에 대한 CD8+ T 세포 인식의 손실을 야기하였다(도 15). 이론에 의해 제한되지 않고, gD에 의해 유도되는 상기 CD8+ T 세포들의 폭 및 지속된 면역 반응과 HBV의 다중 로그 억제를 가져왔던 아우세의 에피토프들을 인식하는 이들의 능력이 있는 것으로 여겨진다.
AAV-유도 HBV-감염된 동물들에서 접종에 후속하는 혈액 및 간 내의 AdC6/7-gDPolN의 면역원성
다음의 연구들은 이미 현존하는 AAV-유도 HBV 감염의 존재에서 동물들의 혈액들, 비장들 및 간들 내의 상기 AdC6-gDPolN 백신에 대한 CD8+ T 세포 반응들을 평가하기 위해 수행되었다.
실험 #1-AAV8-1.3HBV 감염된 마우스들p서의 CD8 + T 세포 반응들: 혈액 내의 반응 동력학
목적-AdC6 벡터 내에 발현되는 바와 같은 gDPolN 항원에 대한 CD8+ T 세포 반응들에 대한 HBV 항원의 지속된 역가들의 효과를 평가하기 위함.
방법들-C57Bl/6 마우스들이 1010의 상기 AAV8-1.3HBV 벡터로 i.v.로 주사되었다. 4주 이후에 이들은 5 x 109vp의 상기 AdC6-gDPolN 벡터로 접종되었다. 대조군 마우스들은 상기 AdC6-gDPolN 벡터만을 수용하였다. 나이브 마우스들이 추가적인 대조군들로 기여하였다. 마우스들은 2개월 이후에 동일한 도스의 AdC7-gDPolN 백신으로 추가 접종되었다. 혈액은 상기 초회 및 상기 추가 후에 다양한 시간들에서 수집되었고, PBMC들이 IFN-g-생성 CD8+ T 세포들에 대해 테스트되었다.
결과들-도 16에 도시한 바와 같이, 마우스들은 접종 후의 2주에서 활발한 PolN-특이적 CD8+ T 세포 반응을 지녔으며, 8주로 점차 저하되었고, 이후에 상기 추가 접종 후에 다시 증가되었다. 상기 CD8+ T 세포 반응은 상기 초회 후 보다 상기 추가 후에 보다 안정하였다. 대부분의 시점들에서 테스트된 반응들은 AAV 벡터가 주사되지 않았던 대조군들에 비하여 상기 AAV8-1.3HBV 벡터가 주사되었던 마우스들에서 낮았다.
실험 #2-AAV8-1.3HBV 감염된 마우스들에서의 CD8 + T 세포 반응들: 간 내의 반응들
목적-AAV8-1.3HBV-감염되고 접종된 마우스들의 간들에서 T 세포 소진을 나타내는 마커들을 포함하는 CD8+ T 세포 반응들을 평가하기 위함.
방법들-C57Bl/6 마우스들은 1010 또는 1011vg의 AAV8-1.3HBV 벡터들로 i.v.로 주사되었다. 4주 이후에 이들은 5 x 109vp의 AdC6-gDPolN 벡터로 접종되었다. 대조군 마우스들은 AdC6-gDPolN 벡터만을 수용하였다. 나이브 마우스들이 추가적인 대조군들로 기여하였다. 마우스들은 2개월 이후에 동일한 도스의 상기 AdC7-gDPolN 백신으로 추가 접종되었다.
간 림프구들을 얻기 위해, 간들은 작은 단편들로 절단되었고, 1시간 동안 교반 하의 L15 내에서 2㎎/㎖의 콜라겐분해효소(collagenase) P, 1㎎/㎖의 DNA 분해효소(DNase) I(모두 로슈(Roche), 바셀, 스위스로부터) 및 2% FBS(티슈 컬처 바이올로지칼스(Tissue Culture Biologicals), 툴레어, 캘리포니아주)로 처리되었다. 간 단편들은 균질화되었고, 70㎛ 여과기(strainer)를 통해 여과되었으며, 림프구들은 페르콜(Percoll)-기울기 원심분리에 의해 정제되었고, 10% FBS로 보강된 DMEM로 세척되었다. 림프구들은 +4℃에서 30분 동안 어둠 속에서 상기 HBV 폴리메라아제의 아미노산들 396-404 FAVPNLQSL(SEQ ID NO: 188)(펩티드 55)에 대응하는 보라색의 라이브/데드(live/dead) 염색(서모피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)), 항-CD8-APC(클론 53-6.7, 바이오레전드(BioLegend)), 항-CD44-알렉사 플로어(Alexa Flour) 700(클론 IM7, 바이오레전드), 항-EOMES-알렉사 플로어 488(클론 Dan11mag, 이바이오사이언스(eBioscience)), 항-PD1-BV605(클론 29F.1A12, 바이오레전드), 항-LAG3-BV650(클론 C9B7W, 바이오레전드), 항-T-베트-BV786(클론 4B10, 바이오레전드), 항-CTLA-4-PE-A(클론 UC10-4B9, 바이오레전드), 항-TIM-3-Pe-Cy7-A(클론 RMT3-23, 바이오레전드), 그리고 APC-표기 MHC 클래스 I 사합체(NIH 사합체 설비, 에모리 대학(Emory University), 아틀랜타, 조지아주)로 염색되었다. 세포들은 세척되었고, BD FACS 셀레스타(Celesta)(BD 바이오사이언시즈(Biosciences), 산 호세, 캘리포니아주) 및 DiVa 소프트웨어에 의해 분석되었다. 획득후 평가들이 FlowJo(트리스타(TreeStar), 애슐랜드, 오리건주)로 수행되었다.
결과들-림프구 간 침윤물들 내의 CD8+ T 세포들의 도수들이 분석되었다. 림프구 간 침윤물들 내의 CD8+ T 세포들의 도수들은 나이브 마우스들과 비교할 경우에 접종된 마우스들에 증가하였고, 상기 AAV8-1.3HBV 벡터로 주사되었던 접종 이전의 마우스들에서 더 증가되는 것으로 보였다(도 17a). 상기 PolN 삽입 내에 존재하는 에피토프에 대해 특이적인 사합체로의 염색에 의해 확인된 PolN-특이적 CD8+ T 세포들의 도수들은 AAV-1.3HBV-주사된 마우스들 내에서 감소하였다(도 17b).
나이브(즉, 사합체- CD44- CD8+T 세포들)와 비교하여 침윤되는 사합체+ CD8+ T 세포들의 표현형들이 주어진 항체(도 18a-도 18f)와 연관된 염색의 평균 형광 강도(mean fluorescent intensity)를 결정하고, 나타낸 마커들에 대해 양성이었던 CD8+ T 세포들의 퍼센티지들(도 19a-도 19f)을 평가하여 분석되었다.
수많은 CD8+ T 세포 기능들을 제어하는 T-베트는 상기 백신만의 그룹에 비하여 접종 이전에 AAV8-1.3HBV로 주사되었던 마우스들로부터의 간 CD8+ T 세포들에 대해 감소되었다. 소진 마커들은 AAV8-1.3HBV-전-치료된 그룹들에서 증가되지 않았으며, HBV의 존재에서 PolN-특이적 CD8+ T 세포들의 관찰된 손실이 통상적인 CD8+ T 세포 소진에 의해 야기되지 않을 수 있었던 점을 제시하였다(도 18a-도 18f 및 도 19a-도 19f).
실험 #3-AAV8-1.3HBV 감염된 마우스들 내의 PolN-특이적 CD8 + T 세포 반응의 폭
목적- HBV의 존재가 상기 AdC 백신들에 의해 gD 내에 발현된 PolN에 대한 상기 CD8+ T 세포 반응의 폭에 영향을 미치는 지를 평가하기 위함.
방법들-마우스들은 1010 또는 1011vg의 상기 AAV8-1.3HBV 벡터들로 i.v.로 주사되었고, 2개월 이후에 대응하는 AdC7 벡터들로 추가 접종되었다. 대조군 마우스들은 상기 AdC6-gDPolN 벡터만을 수용하였다. 마우스들은 10주 이후에 안락사되었으며, 혼주(pooled) 비장 세포들은 상기 AAV 감염되지 않은 동물 연구에서 펩티드들의 풀들에 대해 테스트되었다. 결과들은 도 20a-도 20c에 제공된다.
두 번째 실험에서, 마우스들은 1010 또는 1011vg의 상기 AAV8-1.3HBV 벡터들로 i.v.로 주사되었다. 4주 이후에 이들은 5 x 1010vp의 상기 AdC6-gDPolN 벡터로 접종되었다. 대조군 마우스들은 상기 AdC6-gDPolN 벡터만을 수용하였다. 나이브 마우스들은 추가적인 대조군들로 기여하였다. 비장 세포들은 6주 이후에 상기 PolN 서열에 걸치는 개개의 펩티드들에 대한 반응에서 IFN-g를 생성하는 CD8+ T 세포들에 대해 분석되었다. 결과들은 도 20d-도 20f에 제공된다.
결과들-HBV의 존재, 1011vg 도스의 AAV8-HBV1.3로의 주사 이후와 같이 HBV의 특히 높은 역가들은 상기 AdC6-gDPolN 백신에 의해 제시되는 바와 같이 상기 PolN 서열에 대한 전체적인 CD8+ T 세포 반응들을 감소시켰을 뿐만 아니라 상기 에피토프 인식 프로파일의 이동을 야기하였다.
실험 #4-AAV8-1.3HBV 감염된 마우스들에서 간 PolN-특이적 CD8 + T 세포들의 기능들
목적-간-침윤 PolN-특이적 CD8+ T 세포들이 AAV8-1.3HBV 감염된 마우스들에서 기능성으로 남는 지를 평가지가 위함.
방법들-첫 번째 실험에서, C57BL/6 마우스들은 3 x 1011vg의 AAV8-1.3HBV로 i.v.로 주사되었다. 하나의 그룹은 8주 이후에 5 x 1010vp의 AdC6-gDPolN 벡터로 접종되었다. 다른 그룹들은 접종되지 않고 두어졌다. 마우스들은 4.5개월에 안락사되었고, 비장 세포들이 상기 PolN 펩티드 풀에 반응하여 IFN-g를 생성하는 CD8+ T 세포들의 도수들에 대해 테스트되었다.
두 번째 실험에서, 마우스들은 구배된 농도들의 AAV8-1.3HBV(1 x 1010, 4 x 1010, 또는 1 x 1011)로 주사되었다. 모든 마우스들은 4주 이후에 5 x1010vp의 상기 AdC6-gDPolN 벡터로 접종되었다. 상기 마우스들은 2개월 이후에 동일한 도스의 상기 AdC7-gDPolN 벡터로 추가 접종되었다. 마우스들은 2개월 이후에 안락사되었고, 림프구들은 간들로부터 분리되었으며, 상기 PolN 펩티드 풀에 반응하여 IFN-g를 생성하는 CD8+ T 세포들에 대해 평가되었다. 세포들은 또한 Tox에 대한 항체인 소진된 T 세포들을 증가시키는 전사 인자로 염색되었다.
결과들-도 21에 도시한 바와 같이, 백신-유도 CD8+ T 세포들은 상기 AAV8-1.3HBV 벡터로 주사되었던 마우스들 내에 기능적으로 남아 있었다.
실험 #5-간 조직학 상의 AAV8-1.3HBV 감염된 마우스들의 접종의 효과
목적-AAV.8-1.3HBV-접종된 마우스들의 AdC6/7-gDPolN 접종이 지속적 간 손상을 야기하는 지를 평가하기 위함.
방법들-마우스들은 정해진 i.v.로 1010vg의 상기 AAV8-1.3HPV로 주사되었다. 1개월 이후에 이들은 5 x 109vp의 상기 AdC6-gDPolN 벡터로 접종되었다. 상기 마우스들은 2개월 이후에 정해진 도스에서 동일한 도스의 상기 AdC7-gDPolN 벡터로 추가 접종되었다. 상기 마우스들은~2개월 이후에 안락사되었다. 간 단편들이 수집되었고, 10% 포름알데히드(formaldehyde)로 고정되었다. 단편들(~3㎛의 두께)이 제조되었고, 헤마톡실린 에오신(Hematoxylin Eosin: H&E)으로 염색되었다. 이들은 20x 배율의 광학 현미경으로 검사되었다.
결과들-상기 AAV 벡터 및 상기 백신 모두를 수용하였던 마우스들로부터의 33의 단편들 중에서 하나는 상기 간 단편의 마진(margin)에 있었던 작은 림프구 침윤물을 보여주었다.
도 21b에 도시한 바와 같이, 단일의 gDPolN 접종 in HLA-A2-tg 마우스들에서 단일의 gDPolN 접종에 후속하여, IFN-γ를 생성하는 간 CD8+ T 세포들의 도수들은 접종만이 되었던 경우에 비하여 AAV를 수용한 마우스들에서 감소하였다.
결론
● PolN에 대한 CD8+ T 세포 반응들이 AAV8-1.3HBV 감염된 마우스들에서 감소되었다. 그럼에도 불구하고, 이들은 검출될 수 있게 남았다.
● 소진 마커들은 AAV8-1.3HBV 전-처리된 동물들에서 증가하지 않았으며, HBV의 존재에서 PolN-특이적 CD8+ T 세포들의 관찰된 손실이 통상적인 CD8+ T 세포 소진에 의해 야기되었던 것을 제시하였다.
● AAV-유도 HBV-감염은 상기 PolN에 대한 CD8+ T 세포 반응들의 에피토프 인식 프로파일의 편위를 야기하였다.
● 백신-유도 CD8+ T 세포들은 이전에 상기 AAV8-1.3HBV 벡터로 감염되었던 마우스들 내에 기능성으로 남아 있었다.
● 초회 추가 요법에 사용된 백신은 HBV 양성 마우스들에서 간 손상을 야기하지 않았다.
HBV PolN-PolC-코어 구성체(construct)들의 발생
둘의 다중 항원 삽입들(제2 세대 PolN-PolC-코어 및 제3 세대 PolN-PolC-코어)이 발생되었다. 이들 삽입들의 서열들이 다음에 도시된다.
제2 세대 HBV 백신 삽입("HBV2")(PolN(이탤릭체)-PolC(밑줄)-코어)(SEQIDNO:174)
YLPLDKGIKPYYPEHAVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASFCGSPYSWEQELQHGSCWWLQFRNSKPCSEYCLTHLVNLLEDWGPCDEHGEHHIRIPRTPARVTGGVFLVDKNPHNTAESRLVVDFSQFSRGITRVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDV QAFTFSPTYKAFLSKQYLNLYPVARQRPGLCQVFADATPTGWGLAMGHQRMRGTFVAPLPIHTAELLAACFARSRSGAKILGTDNSVVLSRKYTSFPWLLGCAANWILRGTSFVYVPSALNPADDVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGR
제3 세대 HBV 백신 삽입("HBV3")(Pol N(이탤릭체)-Pol C(밑줄)-코어)(SEQ ID NO: 175)
HFRKLLLLDEEAGPLEEELPRLADEGLNRRVAEDLNLGNLPEWQTPSFPKIHLQEDIVDRCKQFVGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIKPYYPEHAVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASFCGSPYSWEQELQHGSCWWLQFRNSKPCSEYCLTHLVNLLEDWGPCDEHGEHHIRIPRTPARVT QAFTFSPTYKAFLSKQYLNLYPVARQRPGLCQVFADATPTGWGLAMGHQRMRGTFVAPLPIHTAELLAACFARSRSGAKILGTDNSVVLSRKYTSFPWLLGCAANWILRGTSFVYVPSALNPADDVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGR
제2 세대 HBV("HBV2") 삽입은 접종 이전에 상기 AAV8-1.3HBV 벡터로 감염되지 않았던 마우스들로부터 확인된 면역 우세의 PolN 에피토프들을 포함한다. 이들 에피토프들 중의 많은 것들이 AAV8-1.3HBV 벡터를 전-투여하여 일어났던 만성 HBV 감염의 마우스 모델에서 손실되었던 것으로 발견되었다(앞서의 "에피토프 편위(Epitope Shifting)"에서 정의한 바와 같이). 제3 세대 HBV("HBV3") 삽입은 HBV의 높은 부하들로 마우스들에 의해 우선적으로 인식되었던 PolN의 인접하는 영역들에 대해 선택된다(앞서의 사항들 참조). 코어 및 PolC의 영역들이 다음의 일반적인 형식들을 이용하여 두 구성체(construct)들에 대해 선택되었다. C57Bl/6, BALBc 및 HLA-A2 tg 마우스들 내의 초회(도 3) 또는 추가(도 5) 영역들에 대한 가장 높은 면역 반응들을 가지는 영역들 및 고유 에피토프들을 선택하는 대신에 이들 사이에 스페이서 서열들을 삽입하는 인접하는 큰 영역을 선택하는 목적.
상기 2차 및 3차 세대의 HBV 삽입들(HBV2 및 HBV3)의 유전자 통합성 및 안정성
웨스턴 블롯(Western Blot)-정제된 재조합 바이러스 벡터 제형들(AdC6-gDHBV2, AdC6-gDHBV3, AdC7-gDHBV2 및 AdC7-gDHBV3)이 생체외로 이식 유전자-생성물 발현을 유도하는 이들의 능력에 대해 평가되었다. 이를 위하여, 웨스턴 블롯 분석들이 관심의 대상인 벡터로의 세포 배양 감염에 수반되어 세포 용해물들 내의 gD 단백질의 발현을 평가하기 위해 수행되었다. 부착된 HEK293 세포 단일층들은 알려진 양들의 정제된 벡터로 감염되었고, 감염 후의 48시간에서 수확되었으며, 용해물 및프로테아제 억제제(protease inhibitor)들을 포함하는 추출 완충액 내에 다시 현탁되었고, 초음파 처리(sonication)에 의해 용해되었다. 전체 단백질 추출물들은 산화환원제(redox agent)로서 디티오트레이톨(dithiothreitol)의 사용에 의해 변성되었으며, 12% 비스(bis)-트리스 폴리아크릴아미드 겔(Tris polyacrylamide gel: PAGE) 내에서 전기영동이 수행되었다. SDS-PAGE에 의한 단백질 분리에 후속하여, 샘플들은 습식 전기영동 이송에 의해 활성화된 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride) 멤브레인 상으로 옮겨졌다. 상기 멤브레인은 1시간 동안 실온에서 식염수 내에 1:1000까지 희석된 gD에 대한 일차 항체를 이용하여 gD 단백질의 검출을 위해 면역 염색되었다(클론 PA1-30233, 인트로젠(Invitrogen), 칼즈배드, 캘리포니아주). 멤브레인들은 1시간 동안 실온에서 HRP-접합 염소 항-토끼 이차 IgG(ab6721, 앱캠(Abcam), 케임브리지, 영국)로 배양하기 이전에 1X TBS-T로 세척되었다. 이는 루미놀 기반의 화학 발광 기재의 첨가를 수반하였다. 염색된 멤브레인은 방사선 사진 촬영 필름에 노출되었고, 신호 방출이 자동화된 필름 현상기에 의한 처리 후에 평가되었다. 감염된 HEK293 세포 용해물들 내의 상기 gD 단백질 발현의 기록에 후속하여, 상기 멤브레인이 벗겨졌고, 전체 단백질 추출 샘플들 내의 b-액틴의 존재에 대해 다시 탐침으로 조사되었다. 이러한 염색 단계는 PAGE 샘플 적재 단계의 일관성을 평가하기 위해 채용되었으며, 이에 따라 재조합 바이러스 벡터에 의한 gD 단백질 발현의 생체외 자극의 반-정량적 분석을 보다 우수하게 지지하였다.
안정성- 바이러스 구성체의 유전자적 통합성을 확보하기 위해, 각 재조합 바이러스 벡터 로트의 유전적 안정성이 부착된 HEK293 세포 배양들 내의 연속되는 바이러스 통로들을 통해 평가되었다. 각 형질 주입으로부터 야기되는 상기 재조합 바이러스 풀은 전체 12의 계대들에 대해 표준 성장 조건들 하에서 배양되었다. 마지막 통로 내에서, 상기 바이러스 풀이 확장되었고, 조제 수확물들이 염화세슘 구배에 의해 정제되었다. 벡터 정제에 후속하여, 바이러스 DNA가 퀴아젠 DNA 분해효소 혈액 및 조직 키트(QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit)를 이용하여 분리되었고, DNA 템플레이트를 구별되는 구성체-특이적인 결합 양상(banding pattern)들로 분열시키는 둘의 제한 효소들인 Ase I 및 Bgl II로의 제한 효소 소화에 의해 평가되었다. 소화 후, 디지털 겔 영상화 시스템을 이용한 결과들의 기록을 수반하여 소화된 결합들을 가시화하도록 샘플들에 브롬화 에티듐(ethidium bromide)을 포함하는 1% 아가로오스 겔(agarose gel) 내에서 전기영동이 수행되었다. 조기의 계대의 바이러스의 경우들과 동일한 결합 양상들을 나타내었던 바이러스 제형들은 최초 분자 클론 구조를 유지하였던 것으로 여겨졌으며, 이에 따라 12의 바이러스 계대들의 끝에서 안정한 것으로 부였다.
결과들-상기 벡터 게놈들을 나타내는 5의 계대들과 비교하여 12의 계대들 후에 안정하게 남았던 바이러스 벡터 DNA들의 결합 양상들은 안정하였다(데이터는 도시되지 않음).
AdC6 또는 AdC7 벡터들에 의해 발현되는 바와 같은 두 번째 및 세 번째 세대의 HBV 삽입들(HBV2 및 HBV3)의 면역원성
목적-AdC6 벡터들 또는 AdC7 벡터들에 의해 발현된 HBV2 및 HBV3 삽입들에 대한 CD8+ T 세포 반응들을 평가하기 위함.
방법들-C57Bl/6 마우스들의 그룹들은 5 x 109 또는 5 x 1010vp의 AdC6-gDHBV2 또는 AdC6-gDHBV3 벡터로 주사되었다. 동일한 도스들의 상기 AdC6-gDPolN 벡터로 주사된 마우스들은 양성 대조군들로 기여하였고, 나이브 마우스들은 음성 대조군들로 기여하였다. 마우스들은 14일 후에 채혈되었고, PBMC들은 상기 HBV 삽입들에 대응하는 펩티드 풀들에 반응하여 IFN-g를 생성하는 CD8+ T의 도수들에 대해 테스트되었다. 4주 후(접종 후의 6주)에 마우스들은 다시 채혈되었고, 상기 PolN-특이적 사합체로 테스트되었다. AdC6-gDHBV3 면역된 마우스들은 이러한 삽입이 상기 사합체에 대응하는 상기 에피토프가 결핍되기 때문에 배제되었다.
C57Bl/6 마우스들의 그룹들은 5 x 109vp 또는 5x1010vp의 AdC7-gDHBV2 또는 5 x 1010vp의 AdC7-gDHBV3 벡터로 주사되었다. 나이브 마우스들은 음성 대조군으로 기여하였다. 마우스들은 14일 후에 채혈되었고, PBMC들은 상기 HBV 삽입들에 대응하는 펩티드 풀들에 반응하여 IFN-g를 생성하는 CD8+ T 세포들의 도수들에 대해 테스트되었다.
AdC7 초회/AdC6 추가의 면역원성
마우스들은 ~4주 이후에 채혈되었고, PBMC들은 상기 삽입들에 대한 펩티드들에 반응하여 IFN-g 및/또는 TNF-a를 생성하는 CD8+ T 세포들에 대해 ICS 로 다시 테스트되었다. 마우스들 동일한 삽입을 발현시키는 이종의 벡터의 동일한 도스로 상기 초회 후의 2개월에 추가 접종되었다. PBMC들은 ICS 2주 이후에 ICS로 테스트되었고, 전- 및 후-추가(post-boost) CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응들이 비교되었다. 상기 AdC7-gDHBV2 벡터는 초회 후에 IFN-g 및/또는 TNF-a를 생성하는 CD8+ T 세포들의 강한 도수들을 유도하였다. 도수들은 상기 AdC6-gDHBV2 추가 후에 증가하였으며, 이는 특히 상기 낮은 벡터 도스들 이후에 IFN-g를 생성하는 CD8+ T 세포들에 대해 뚜렷하였다. 상기 AdC7-gDHBV3 벡터는 매우 낮은 면역원성이었지만, CD8+ T 세포 반응들은 상기 AdC6-gDHBV3 추가 후에 양성으로 되었다. 동일한 토큰(token)에서, CD4+ T 세포 반응들은 상기 초회 후에 미미하였지만, 상기 추가 후에는 증가하였다. 상기 HBV2 또는 HBV3 삽입에 대한 CD4 반응들에서 두드러진 차이는 없었다.
결론
상기 AdC6-gDHBV2 및 AdC7-gDHBV2 벡터들 모두는 매우 높은 면역원성이었으며(도 22a, 도 22b 및 도 23), 반응들은 동일한 삽입을 발현시키는 이종의 AdC 벡터로의 추가 후에 증가되었다(도 24).
상기 AdC7-gDHBV2 및 AdC7-gDHBV3 벡터들은 이들이 이용된 상기 사합체에 대응하는 에피토프가 결핍되기 때문에 이들의 설계와 부합하는 경계 면역원성을 타나내었다(도 22a 및 도 23).
AdC6-gDHBV2와 함께 AdC7-gDHBV2로의 추가 접종은 CD8+ T 세포 반응들을 향상시킨다.
AdC6-gDPolN, AdC6-gDHBV2, AdC6-gDHBV3, 또는 AdC6-HBV2 AAV-감염된 마우스들 내의 HBV DNA 바이러스 역가들의 비교
방법들
C57Bl/6 마우스들의 다섯의 그룹들이 1 x 109vg의 AAV8-1.3HBV로 시험 감염되었고, 1 x 1010vp의 AdC6-gDPolN(n＝10), AdC6-gDHBV2(n＝10), AdC6-gDHBV3(n＝10), 또는 gD가 없는 AdC6-HBV2(n＝10)로 접종되었으며, AAV-감염된 접종되지 않은 동물들("나이브")(n＝10) 및 AAV-감염되지 않고 접종되지 않은 동물들(n＝2-5)은 대조군들로 기여하였다. 바이러스 역가들은 AAV 주사(접종 전) 후의 4주에 테스트되었고, 접종 후의 4주(AAV 주사 후의 8주)에서 레벨들이 비교되었다.
결과들
8주에서, 중간 HBV 바이러스 역가들은 나이브 마우스들에서 0.98 log10 복제들/㎖로 증가되었고, AdC6-HBV2 접종된 마우스들에서는 변화되지 않고 남았으며, AdC6-gDHBV3, AdC6-gDPolN 및 AdC6-gDHBV2 접종된 동물들에서는 각기 -0.04, -1.09 및 -2.13 log10 복제들/㎖로 저하되었다(도 25a). 개개의 마우스들에 대한 결과들은 도 25b에 도시되며-모든 AdC6-gDPolN 및 AdC6-gDHBV2 접종된 동물들은 각기 1 및 2 log10 복제들/㎖의 저하들 보다 컸었고, 이에 비하여 상기 나이브, AdC6-HBV2 또는 AdC6-gDHBV3 접종된 동물들은 8주에서 1 log10 복제들/㎖ 또는 그 이상의 저하를 보이지 않았다.
gDHBV2 및 gDHBV3에 대한 면역원성 연구들
단일의 초회 주사 또는 동일한 삽입을 포함하는 이종의 벡터로의 추가 접종이 수반된 gDHBV2 또는 gDHBV3 내에 포함된 HBV 코어 및 폴리메라아제의 절편들에 대한 CD8+ T 세포 반응들의 유도 및 이들의 폭들이 평가되었다.
실험예 1
목적: C57Bl/6 마우스들 내의 이종의 침팬지 아데노바이러스 벡터들(AdC6 및 AdC7)에 의해 발현된 gD-HBV2 및 gD-HBV3으로의 초회 및 추가 접종들에 후속하는 IFN-g+ CD8+ T 세포 반응들을 평가함.
방법들: 다섯의 C57Bl/6 마우스들의 네 개의 그룹들이 다음과 같이 근육 내 주사를 통해 면역되었다. (a) 2개월 이후의 5 x 1010vp AdC6-gDHBV2가 수반되는 5 x 1010vp AdC7-gDHBV2; (b) 2개월 이후의 5 x 109vp AdC6-gDHBV2가 수반되는 5 x 109vp의 AdC7-gDHBV2; (c) 2개월 이후의 5 x 1010vp AdC6-gDHBV3가 수반되는 5 x 1010vp AdC7-gDHBV3; 또는 (d) 백신이 없음. 혈액은 상기 초회 후에 상기 추가 이전에 2주 및 6주에서 및 이후의 상기 추가 후의 2주 및 4주에서 IFN-g+ CD8+ T 세포 반응들에 대해 ICS로 평가되었다.
결과들: 모든 시점들에서 테스트된 각 백신 구성체는 IFN-g+ CD8+ T 세포들을 유도하는 것으로 발견되었다.
도 26은 부모 IFN-g 및/또는 TNF-α를 생성하는 CD8+ T 세포들(도 26a), CD44+ CD8+ T 세포들(도 26b), CD4+ T 세포들(도 26c) 또는 CD44+ CD4+ T 세포들(도 26d)의 퍼센트를 나타낸다. 개개의 마우스들의 PBMC들로부터의 ICS에 의해 평가된 면역 반응들이 상기 초회 후의 2주 및 8주에서 뿐만 아니라 평균으로서 상기 추가 후의 2주 및 4주에서 도시된다.
실험예 2
목적: C57Bl/6 마우스들에서 이종의 침팬지 아데노바이러스 벡터들(AdC6 및 AdC7)을 이용하여 gD-PolN의 경우에 대한 gD-HBV2 및 gD-HBV3으로의 다른 도스들의 초회 및 추가 접종들이 수반되는 IFN-g+ CD8+ T 세포 반응들을 비교함.
방법들: C57Bl/6 마우스들의 그룹들(n＝5 마우스들/그룹)이 다음과 같이 면역되었다.
gDPolN 그룹들
(a) 3개월 이후에 5 x 109 vp AdC7-gDPolN이 수반되는 5 x 109 vp AdC6-gDPolN; 및
(b) 3개월 이후에 5 x 1010vp AdC7-gDPolN이 수반되는 5 x 1010vp AdC6-gDPolN.
gDHBV2 그룹들
(c) 3개월 이후에 5 x 109 vp AdC7- gDHBV2가 수반되는 5 x 109vp AdC6-gDHBV2; 및
(d) 3개월 이후에 5 x 1010 vp AdC7-gDHBV2가 수반되는 5 x 1010vp AdC6-gDHBV2.
gDHBV3 그룹들
(e) 3개월 이후에 5 x 109 vp AdC7-gDHBV3이 수반되는 5 x 109vp AdC6-gDHBV3; 및
(f) 3개월 이후에 5 x 1010 vp AdC7-gDHBV3이 수반되는 5 x 1010vp AdC6-gDHBV3.
대조군들로 기여한 치료되지 않은 경우
모든 치료 그룹들에 대해, 면역원성 CD8+ T 세포 반응들이 상기 초회 후의 추가 이전의 2주 및 6주 및 상기 추가 후의 2주 및 6주에서 IFN-g+에 대한 ICS로 혈액으로부터 평가되었다. 면역원성도 상기 초회 후의 4주에서 HBV 폴리메라아제의 아미노산 396-404 FAVPNLQSL(펩티드 55)에 대응하는 APC-표지의 MHC 클래스 I 사합체(NIH 사합체 설비, 에모리 대학, 애틀랜타, 조지아주)를 이용하는 사합체 염색에 의해 평가되었다. HBV3은 상기 FAVPNLQSL 펩티드를 포함하지 않는다.
결과들: 모든 시점들에서, 테스트된 각 백신은 IFN-g+ CD8+ T 세포들을 유도하는 것으로 발견되었다. 상기 gDHBV2 백신으로 얻어진 결과들은 상기 gDPolN 백신으로 얻어진 경우들과 유사하였으며, 상기 gDHBV3 백신은 덜 면역원성이었다. 사합체 염색에 따라, 상기 특이적 CD8+ T 세포들의 도수들은 상기 두 백신들 사이에서 비교될 정도였고, 수많은 활성화 마커들은 상기 gDHBV2-면역된 그룹들로부터의 사합체+ CD8+ T 세포들에 대해 매우 높게 발현되는 경향이 있었다. 도 27은 다중의 시점들인 초회 후의 4주(도 27a), 상기 추가 후의 2주(도 27b) 및 상기 추가 후의 4주(도 27c)에서 CD8+ T 세포들을 나타낸다. 그래프는 ICS에 의해 평가되는 바와 같은 IFN-g+를 생성하는 CD8+ T 세포들의 전체적인 도수들을 보여준다.
도 28은 ICS에 의해 평가되는 바와 같은 다중의 시점들인 상기 추가 후의 4주(도 28a), 상기 추가 후의 2주(도 28b) 및 상기 추가 후의 4주(도 28c)에서 시토카인을 생성하는 CD4+ T 세포들을 나타낸다. 파선들은 나이브 마우스들로부터의 결과들에 기초하여 양성 반응들에 대한 컷-오프(cut-off)를 나타낸다.
도 29는 상기 초회 후의 4주에서 CD8+ T 세포들(도 29a) 또는 CD44+ CD8+ T 세포들(도 29b)에 대한 관문이 된 사합체 염색의 결과들을 나타낸다.
도 30은 나타낸 항체와 연관되는 염색의 평균 형광 강도로서 도시된 상기 사합체+ CD8+ T 세포들의 표현형들을 나타내며, 도 30a는 BV605에 접합된 항-PD1 항체를 나타내고, 도 30b는 BV650에 접합된 항-LAG3 항체를 나타내며, 도 30c는 Pe-Cy7-A에 접합된 항-TIM3 항체를 나타내고, 도 30d는 PE-A에 접합된 항-CTLA4 항체를 나타내며, 도 30e는 AF488에 접합된 항-EOMES 항체를 나타내고, 도 30f는 BV786에 접합된 항-T-베트 항체를 나타낸다.
실험예 3
반응들의 폭은 상기 HBV 백신 삽입들 내에 존재하는 개개의 펩티드들에 대해 ICS로 테스트된 접종된 C57BL/6 마우스들의 혼주 비장 세포들로부터 평가되었다.
방법들: 다섯의 C57Bl/6 마우스들의 네 개의 그룹들이 다음과 같이 근육 내 주사로 면역되었다. (a) 2개월 이후의 5 x 1010 vp AdC6-gDHBV2가 수반되는 5 x 1010vp AdC7-gDHBV2; (b) 2개월 이후의 5 x 109 vp AdC6-gDHBV2가 수반되는 5 x 109 vp AdC7-gDHBV2; (c) 2개월 이후의 5 x 1010 vp AdC6-gDHBV3이 수반되는 5 x 1010 vp AdC7-gDHBV3; 또는 (3) 백신이 없음. 동물들은 상기 추가 후의 8주에서 희생되었고, 혼주 비장 세포들은 개개의 HBV2 또는 HBV3 펩티드들에 대한 IFN-g+ CD8+ T 세포 반응들에 대하여 ICS로 평가되었다(0.1%에서 설정된 양성 반응들에 대한 컷-오프).
결과들: 상기 도스와는 독립적으로, 상기 gDHBV2 백신들로의 초회 추가 요법은 코어 및 폴리메라아제 내에 몇몇 에피토프들에 대한 반응들을 유도하였다. 도 31은 2개월 이후에 5 x 1010vp AdC6-gDHBV2로의 접종이 수반된 5 x 1010vp AdC7-gDHBV2의 초회 접종 후의 CD8+ T 세포 반응들을 나타낸다. X축 상의 숫자들은 여기에 제공되는 바와 같은 SEQ ID NO에 대응한다. 도 32는 2개월 이후에 5 x 109vp AdC6-gDHBV2로의 접종이 수반된 5 x 109vp AdC7-gDHBV2로의 초회 접종 후의 CD8+ T 세포 반응들을 나타낸다. X축 상의 숫자들은 여기에 제공되는 바와 같은 SEQ ID NO에 대응한다. 도 33은 2개월 이후에 5x1010 vp AdC6-gDHBV3으로의 접종이 수반된 5 x 1010vp AdC7-gDHBV3으로의 초회 접종 후의 면역원성을 나타낸다. X축 상의 숫자들은 여기에 제공되는 바와 같은 SEQ ID NO에 대응한다.
실험예 4
반응들의 폭은 상기 HBV 백신 삽입들 내에 존재하는 개개의 펩티드들에 대해 ICS로 테스트되었던 접종된 BALB/c 마우스들의 혼주 비장 세포들로부터 평가되었다.
방법들: 다섯의 BALB/c 마우스들의 다섯 개의 그룹들이 근육 내의 주사를 통하 대음과 같이 면역되었다. (a) 5 x 1010 vp AdC6-gDHBV2; (b) 5 x 1010 vp AdC6-gDHBV3; (c) 5 x 1010 vp AdC7-gDHBV2; (d) 5 x 1010 vp AdC7-gDHBV3; 또는 (e) 백신이 없음. 12주 후에 접종 동물들은 희생되었고, 비장들이 수집되었으며, 혼주 비장 세포들은 개개의 HBV2 또는 HBV3 펩티드들에 대한 IFN-g+ CD8+ T 세포 반응들에 대하여 ICS로 평가되었다(0.1%에서 설정된 양성 반응들에 대한 컷-오프).
결과들: 12주에서, 각 백신 구성체는 상기 백신에 의해 전달되는 상기 코어 및 폴리메라아제 유전자들의 다중의 영역들에 걸쳐 면역원성인 것으로 발견되었다. 도 34는 여기에 제공되는 바와 같은 상기 SEQ ID NO(X축)에 대응하는 상기 AdC6-gDHBV2 및 AdC7-gDHBV2 백신들의 면역원성을 보여준다. 두 HBV2 구성체들 내의 코어, PolC 및 PolN 영역들은 면역원성이었다. 도 35는 여기에 제공되는 바와 같은 상기 SEQ ID NO(X축)에 대응되는 상기 AdC6-gDHBV3 및 AdC7-gDHBV3 백신들의 면역원성을 보여준다. 두 HBV3 구성체들 내의 코어, PolC 및 PolN 영역들은 면역원성이었다.
실험예 5
방법들: C57Bl/6 마우스들의 다섯의 그룹들이 1 x 109vg의 AAV8-1.3HBV로 시험 감염되었고, 접종된 4주 이후에 1 x 1010vp의 AdC6-gDPolN(n＝10), AdC6-gDHBV2(n＝10), AdC6-gDHBV3(n＝10), 또는 gD 없이 AdC6-HBV2(n＝10)로 접종("초회(prime) 접종")되었으며, AAV-감염된 접종되지 않은 동물들(n＝10) 및 AAV-감염되지 않고 접종되지 않은 동물들(n＝2-5)은 대조군들로 기여하였다. 마우스들은 주사 이후에 다양한 시점들에서 채혈될 것이며, 삽입-특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포들의 도수들이 IFN-g에 대해 세포내 시토카인 염색(ICS)에 의해 결정될 것이다. PCR은 상기 초회 접종 후의 2주, 6주 및 8주에서 수행될 것이며, T 세포 분석은 상기 초회 접종 후의 4주에서 수행될 것이다.
상기 초회 접종에 이어서 8주에서, 마우스들은 상기 초회 접종에서 사용된 동일한 항원 삽입을 포함하는 AdC7 벡터들로 추가 접종("추가(boost) 접종")될 것이며, 혈액과 혈청이 접종 후위 다른 시점들에서 앞서 설명한 바와 같이 CD8+/CD4+ T 세포에 대해 테스트될 것이다. PCR은 상기 추가 접종 후의 2주, 6주 및 10주에서 수행될 것이며, T 세포 분석은 상기 추가 접종 후의 4주 및 12주에서 수행될 것이다.
해당 기술 분야의 숙련자는 수많은 변화들과 변경들이 본 발명의 바람직할 실시예들에 대해 이루어질 수 있고, 이러한 변화들과 변경들이 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않고 구현될 수 있는 점을 이해할 수 있을 것이다. 이에 따라, 다음의 특허 청구 범위는 본 발명의 진정한 사상과 범주 내에 해당되는 바와 같은 모든 이러한 균등한 변형들을 포괄하도록 의도된다.
앞서 언급되거나 본문에 기재되는 각 특허, 특허 출원 및 공개의 개시 사항들은 여기에 전체적으로 참조로 포함된다.
서열들
서열
표현형 A
공통
(SEQ ID NO: 1)		 MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGNNLeDPASRDLVVNYVNTNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
표현형 B
공통
(SEQ ID NO: 2)		 MDIDpYKEFGASvELLSFLPSDFFPSiRDLLDTAsALYREALESPEHCSPHHTALRQAIlCWGELMNLATWVGSNLeDPASRELVVsYVNVNMGLKiRQLLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPpAYRPpNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSREsQC
표현형 C
공통
(SEQ ID NO: 3)		 MDIDpYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVsYVNVNMGLKiRQlLWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPpAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRSQSRESQC
표현형 D
공통
(SEQ ID NO: 4)		 MDIDPYKEFGAtVELLSFLPsDFFPSVRDLLDTASALYReALESPEHCSPHHTALRQAILCWGeLMtLATWVGgNLEDPaSRDLVVSYVNTNmGLKFRQLLWFHISCLTFGReTViEYLVSFGVWIRTPpAYRPPNAPILSTLPETTVvRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
초기 코어
서열
(SEQ ID NO: 5)		 MDID P YKEFGAX1VELLSFLPSDFFPSX2DLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMX3LATWVGX4NLeDPASRX5LVV X6 YVNX7NMGLKX8RQLLWFHISCLTFGRETVX9EYLVSFGVWIRTP P AYRP P NAPILSTLPETTVVRRRX10X11GRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
에피토프-최적화
코어 아미노산
서열
(SEQ ID NO: 6)		 DIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
에피토프-최적화
코어 뉴클레오티드
서열
(SEQ ID NO: 7)		 GACATCGACCCCTACAAGGAGTTCGGCGCCACCGTGGAGCTGCTGAGCTTCCTGCCCAGCGACTTCTTCCCCAGCATCAGGGACCTGCTGGACACCGCCAGCGCCCTGTACAGGGAGGCCCTGGAGAGCCCCGAGCACTGCAGCCCCCACCACACCGCCCTGAGGCAGGCCATCCTGTGCTGGGGCGAGCTGATGACCCTGGCCACCTGGGTGGGCAGCAACCTGGAGGACCCCGCCAGCAGGGAGCTGGTGGTGAGCTACGTGAACGTGAACATGGGCCTGAAGATCAGGCAGCTGCTGTGGTTCCACATCAGCTGCCTGACCTTCGGCAGGGAGACCGTGATCGAGTACCTGGTGAGCTTCGGCGTGTGGATCAGGACCCCCCCCGCCTACAGGCCCCCCAACGCCCCCATCCTGAGCACCCTGCCCGAGACCACCGTGGTGAGGAGGAGGGACAGGGGCAGGAGCCCCAGGAGGAGGACCCCCAGCCCCAGGAGGAGGAGGAGCCAGAGCCCCAGGAGGAGGAGGAGCCAGAGCAGGGAGAGCCAGTGC
에피토프-최적화
폴리메라아제 N-말단
아미노산 서열
(SEQ ID NO: 8)		 PLSYQHFRKLLLLDEEAGPLEEELPRLADEGLNRRVAEDLNLGNLNVSIPWTHKVGNFTGLYSSTVPVFNPEWQTPSFPKIHLQEDIVDRCKQFVGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIKPYYPEHAVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASFCGSPYSWEQELQHGSCWWLQFRNSKPCSEYCLTHLVNLLEDWGPCDEHGEHHIRIPRTPARVTGGVFLVDKNPHNTAESRLVVDFSQFSRGITRVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHIPLHPAAMP
에피토프-최적화
폴리메라아제 N-말단
뉴클레오티드 서열
(SEQ ID NO: 9)		 CCCCTGAGCTACCAGCACTTCAGGAAGCTGCTGCTGCTGGACGAGGAGGCCGGCCCCCTGGAGGAGGAGCTGCCCAGGCTGGCCGACGAGGGCCTGAACAGGAGGGTGGCCGAGGACCTGAACCTGGGCAACCTGAACGTGAGCATCCCCTGGACCCACAAGGTGGGCAACTTCACCGGCCTGTACAGCAGCACCGTGCCCGTGTTCAACCCCGAGTGGCAGACCCCCAGCTTCCCCAAGATCCACCTGCAGGAGGACATCGTGGACAGGTGCAAGCAGTTCGTGGGCCCCCTGACCGTGAACGAGAAGAGGAGGCTGAAGCTGATCATGCCCGCCAGGTTCTACCCCAACGTGACCAAGTACCTGCCCCTGGACAAGGGCATCAAGCCCTACTACCCCGAGCACGCCGTGAACCACTACTTCCAGACCAGGCACTACCTGCACACCCTGTGGAAGGCCGGCATCCTGTACAAGAGGGAGACCACCAGGAGCGCCAGCTTCTGCGGCAGCCCCTACAGCTGGGAGCAGGAGCTGCAGCACGGCAGCTGCTGGTGGCTGCAGTTCAGGAACAGCAAGCCCTGCAGCGAGTACTGCCTGACCCACCTGGTGAACCTGCTGGAGGACTGGGGCCCCTGCGACGAGCACGGCGAGCACCACATCAGGATCCCCAGGACCCCCGCCAGGGTGACCGGCGGCGTGTTCCTGGTGGACAAGAACCCCCACAACACCGCCGAGAGCAGGCTGGTGGTGGACTTCAGCCAGTTCAGCAGGGGCATCACCAGGGTGAGCTGGCCCAAGTTCGCCGTGCCCAACCTGCAGAGCCTGACCAACCTGCTGAGCAGCAACCTGAGCTGGCTGAGCCTGGACGTGAGCGCCGCCTTCTACCACATCCCCCTG CACCCCGCCGCCATGCCC
에피토프-최적화
폴리메라아제 C-말단
아미노산 서열
(SEQ ID NO: 10)		 HLLVGSSGLSRYVARLSSNRRIINHQHGTMQNLHDSCSRNLYVSLLLLYKTFGRKLHLYSHPIILKTKRWGYSLNFMGYVIGSWGSLPQDHIIQKIKECFRKLPVNRPIDWKVCQRIVGLLGFAAPFTQCGYPALMPLYACIQSKQAFTFSPTYKAFLSKQYLNLYPVARQRPGLCQVFADATPTGWGLAMGHQRMRGTFVAPLPIHTAELLAACFARSRSGAKILGTDNSVVLSRKYTSFPWLLGCAANWILRGTSFVYVPSALNPADDPSRGRLGLSRPLLRLPFRPTTGRTSLYAVSPSV
에피토프-최적화
폴리메라아제 C-말단
뉴클레오티드 서열
(SEQ ID NO: 11)		 CACCTGCTGGTGGGCAGCAGCGGCCTGAGCAGGTACGTGGCCAGGCTGAGCAGCAACAGCAGGATCATCAACCACCAGCACGGCACCATGCAGAACCTGCACGACAGCTGCAGCAGGAACCTGTACGTGAGCCTGCTGCTGCTGTACAAGACCTTCGGCAGGAAGCTGCACCTGTACAGCCACCCCATCATCCTGAAGACCAAGAGGTGGGGCTACAGCCTGAACTTCATGGGCTACGTGATCGGCAGCTGGGGCAGCCTGCCCCAGGACCACATCATCCAGAAGATCAAGGAGTGCTTCAGGAAGCTGCCCGTGAACAGGCCCATCGACTGGAAGGTGTGCCAGAGGATCGTGGGCCTGCTGGGCTTCGCCGCCCCCTTCACCCAGTGCGGCTACCCCGCCCTGATGCCCCTGTACGCCTGCATCCAGAGCAAGCAGGCCTTCACCTTCAGCCCCACCTACAAGGCCTTCCTGAGCAAGCAGTACCTGAACCTGTACCCCGTGGCCAGGCAGAGGCCCGGCCTGTGCCAGGTGTTCGCCGACGCCACCCCCACCGGCTGGGGCCTGGCCATGGGCCACCAGAGGATGAGGGGCACCTTCGTGGCCCCCCTGCCCATCCACACCGCCGAGCTGCTGGCCGCCTGCTTCGCCAGGAGCAGGAGCGGCGCCAAGATCCTGGGCACCGACAACAGCGTGGTGCTGAGCAGGAAGTACACCAGCTTCCCCTGGCTGCTGGGCTGCGCCGCCAACTGGATCCTGAGGGGCACCAGCTTCGTGTACGTGCCCAGCGCCCTGAACCCCGCCGACGACCCCAGCAGGGGCAGGCTGGGCCTGAGCAGGCCCCTGCTGAGGCTGCCCTTCAGGCCCACCACCGGCAGGACCAGCCTGTACGCCGTGAGCCCCAGCGTG
N-말단 HSV
gD 서열
(SEQ ID NO: 12)
신호 펩티드는 이탤릭체		 MGGAAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLDQLTDPPGVRRVYHIQAGLPDPFQPPSLPITVYYAVLERACRSVLLNAPSEAPQIVRGASEDVRKQPYNLTIAWFRMGGNCAIPITVMEYTECSYNKSLGACPIRTQPRWNYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQFILEHRAKGSCKYALPLRIPPSACLSPQAYQQGVTVDSIGMLPRFIPENQRTVAVYSLKIAGWHGP
C-말단 HSV
gD 서열
(SEQ ID NO: 13)		 GPKAPYTSTLLPPELSETPNATQPELAPEDPEDSALLEDPVGTVAPQIPPNWHIPSIQDAATPYHPPATPNNMGLIAGAVGGSLLAALVICGIVYWMHRRTRKAPKRIRLPHIREDDQPSSHQPLFY
gD코어 아미노산 서열
코어는 밑줄
(SEQ ID NO: 14)
신호 펩티드는 이탤릭체		 MGGAAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLDQLTDPPGVRRVYHIQAGLPDPFQPPSLPITVYYAVLERACRSVLLNAPSEAPQIVRGASEDVRKQPYNLTIAWFRMGGNCAIPITVMEYTECSYNKSLGACPIRTQPRWNYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQFILEHRAKGSCKYALPLRIPPSACLSPQAYQQGVTVDSIGMLPRFIPENQRTVAVYSLKIAGWHGPDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQCGPKAPYTSTLLPPELSETPNATQPELAPEDPEDSALLEDPVGTVAPQIPPNWHIPSIQDAATPYHPPATPNNMGLIAGAVGGSLLAALVICGIVYWMHRRTRKAPKRIRLPHIREDDQPSSHQPLFY
gD코어 핵산
서열
코어는 밑줄
(SEQ ID NO: 15)		 atggggggggctgccgccaggttgggggccgtgattttgtttgtcgtcatagtgggcctccatggggtccgcggcaaatatgccttggcggatgcctctctcaagatggccgaccccaatcgctttcgcggcaaagaccttccggtcctggaccagctgaccgaccctccgggggtccggcgcgtgtaccacatccaggcgggcctaccggacccgttccagccccccagcctcccgatcacggtttactacgccgtgttggagcgcgcctgccgcagcgtgctcctaaacgcaccgtcggaggccccccagattgtccgcggggcctccgaagacgtccggaaacaaccctacaacctgaccatcgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggcctgtcccatccgaacgcagccccgctggaactactatgacagcttcagcgccgtcagcgaggataacctggggttcctgatgcacgcccccgcgtttgagaccgccggcacgtacctgcggctcgtgaagataaacgactggacggagattacacagtttatcctggagcaccgagccaagggctcctgtaagtacgccctcccgctgcgcatccccccgtcagcctgcctctccccccaggcctaccagcagggggtgacggtggacagcatcgggatgctgccccgcttcatccccgagaaccagcgcaccgtcgccgtatacagcttgaagatcgccgggtggcacgggcccgacatcgacccctacaaggagttcggcgccaccgtggagctgctgagcttcctgcccagcgacttcttccccagcatcagggacctgctggacaccgccagcgccctgtacagggaggccctggagagccccgagcactgcagcccccaccacaccgccctgaggcaggccatcctgtgctggggcgagctgatgaccctggccacctgggtgggcagcaacctggaggaccccgccagcagggagctggtggtgagctacgtgaacgtgaacatgggcctgaagatcaggcagctgctgtggttccacatcagctgcctgaccttcggcagggagaccgtgatcgagtacctggtgagcttcggcgtgtggatcaggaccccccccgcctacaggccccccaacgcccccatcctgagcaccctgcccgagaccaccgtggtgaggaggagggacaggggcaggagccccaggaggaggacccccagccccaggaggaggaggagccagagccccaggaggaggaggagccagagcagggagagccagtgcgggcccaaggccccatacacgagcaccctgctgcccccggagctgtccgagacccccaacgccacgcagccagaactcgccccggaagaccccgaggattcggccctcttggaggaccccgtggggacggtggcgccgcaaatcccaccaaactggcacatcccgtcgatccaggacgccgcgacgccttaccatcccccggccaccccgaacaacatgggcctgatcgccggcgcggtgggcggcagtctcctggcagccctggtcatttgcggaattgtgtactggatgcaccgccgcactcggaaagccccaaagcgcatacgcctcccccacatccgggaagacgaccagccgtcctcgcaccagcccttgttttactag
gDPolN 아미노산
서열
PolN은 밑줄
(SEQ ID NO: 16)
신호 펩티드는 이탤릭체		 MGGAAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLDQLTDPPGVRRVYHIAQGLPDPFQPPSLPITVYYAVLERACRSVLLNAPSEAPQIVRGASEDVRKQPYNLTIAWFRMGGNCAIPITVMEYTECSYNKSLGACPIRTQPRWNYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQFILEHRAKGSCKYALPLRIPPSACLSPQAYQQGVTVDSIGMLPRFIPENQRTVAVYSLKIAGWHGPPLSYQHFRKLLLLDEEAGPLEEELPRLADEGLNRRVAEDLNLGNLNVSIPWTHKVGNFTGLYSSTVPVFNPEWQTPSFPKIHLQEDIVDRCKQFVGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIKPYYPEHAVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASFCGSPYSWEQELQHGSCWWLQFRNSKPCSEYCLTHLVNLLEDWGPCDEHGEHHIRIPRTPARVTGGVFLVDKNPHNTAESRLVVDFSQFSRGITRVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHIPLHPAAMPGPKAPYTSTLLPPELSETPNATQPELAPEDPEDSALLEDPVGTVAPQIPPNWHIPSIQDAATPYHPPATPNNMGLIAGAVGGSLLDDLVICGIVYWMHRRTRKAPKRIRLPHIREDDQPSSHQPLFY*
gDPolN 핵산
서열
PolN은 밑줄
(SEQ ID NO: 17)		 atggggggggctgccgccaggttgggggccgtgattttgtttgtcgtcatagtgggcctccatggggtccgcggcaaatatgccttggcggatgcctctctcaagatggccgaccccaatcgctttcgcggcaaagaccttccggtcctggaccagctgaccgaccctccgggggtccggcgcgtgtaccacatccaggcgggcctaccggacccgttccagccccccagcctcccgatcacggtttactacgccgtgttggagcgcgcctgccgcagcgtgctcctaaacgcaccgtcggaggccccccagattgtccgcggggcctccgaagacgtccggaaacaaccctacaacctgaccatcgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggcctgtcccatccgaacgcagccccgctggaactactatgacagcttcagcgccgtcagcgaggataacctggggttcctgatgcacgcccccgcgtttgagaccgccggcacgtacctgcggctcgtgaagataaacgactggacggagattacacagtttatcctggagcaccgagccaagggctcctgtaagtacgccctcccgctgcgcatccccccgtcagcctgcctctccccccaggcctaccagcagggggtgacggtggacagcatcgggatgctgccccgcttcatccccgagaaccagcgcaccgtcgccgtatacagcttgaagatcgccgggtggcacgggccccccctgagctaccagcacttcaggaagctgctgctgctggacgaggaggccggccccctggaggaggagctgcccaggctggccgacgagggcctgaacaggagggtggccgaggacctgaacctgggcaacctgaacgtgagcatcccctggacccacaaggtgggcaacttcaccggcctgtacagcagcaccgtgcccgtgttcaaccccgagtggcagacccccagcttccccaagatccacctgcaggaggacatcgtggacaggtgcaagcagttcgtgggtcccctgaccgtgaacgagaagaggaggctgaagctgatcatgcccgccaggttctaccccaacgtgaccaagtacctgcccctggacaagggcatcaagccctactaccccgagcacgccgtgaaccactacttccagaccaggcactacctgcacaccctgtggaaggccggcatcctgtacaagagggagaccaccaggagcgccagcttctgcggcagcccctacagctgggagcaggagctgcagcacggcagctgctggtggctgcagttcaggaacagcaagccctgcagcgagtactgcctgacccacctggtgaacctgctggaggactggggtccctgcgacgagcacggcgagcaccacatcaggatccccaggacccccgccagggtgaccggcggcgtgttcctggtggacaagaacccccacaacaccgccgagagcaggctggtggtggacttcagccagttcagcaggggcatcaccagggtgagctggcccaagttcgccgtgcccaacctgcagagcctgaccaacctgctgagcagcaacctgagctggctgagcctggacgtgagcgccgccttctaccacatccccctgcaccccgccgccatgcccgggcccaaggccccatacacgagcaccctgctgcccccggagctgtccgagacccccaacgccacgcagccagaactcgccccggaagaccccgaggattcggccctcttggaggaccccgtggggacggtggcgccgcaaatcccaccaaactggcacatcccgtcgatccaggacgccgcgacgccttaccatcccccggccaccccgaacaacatgggcctgatcgccggcgcggtgggcggcagtctcctggcagccctggtcatttgcggaattgtgtactggatgcaccgccgcactcggaaagccccaaagcgcatacgcctcccccacatccgggaagacgaccagccgtcctcgcaccagcccttgttttactag
gDPolC 아미노산
서열
PolC는 밑줄
(SEQ ID NO: 18)
신호 펩티드는 이탤릭체		 MGGAAARLBAVILFVVIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRLRGKDLPVLDQLTDPPGVRRVYHIQAGLPDPFQPPSLPITVYYAVLERACRSVLLNAPSEAPQIVRGASEDVRKQPYNLTIAWFRMGGNCAIPITVMEYTECSYNKSLGACPIRTQPRWNYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQFILEHRAKGSCKYALPLRIPPSACLSPQAYQQGVTVDSIGMLPRFIPENQRTVAVYSLKIAGWHGPHLLVGSSGLSRYVARLSSNSRIINHQHGTMQNLHDSCSRNLYVSLLLLYKTFGRKLHLYSHPIILKTKRWGYSLNFMGYVIGSWGSLPQDHIIQKIKECFRKLPVNRPIDWKVCQRIVGLLGFAAPFTQCGYPALMPLYACIQSKQAFTFSPTYKAFLSKQYLNLYPVARQRPGLCQVFADATPTGWGLAMGHQRMRGTFVAPLPIHTAELLAACFARSRSGAKILGTDNSVVLSRKYTSFPWLLGCAANWILRGTSFVYVPSALNPADDPSRGRLGLSRPLLRLPFRPTTGRTSLYAVSPSVGPKAPYTSTLLPPELSETPNATQPELAPEDPEDSALLEDPVGTVAPQIPPNWHIPSIQDAATPYHPPATPNNMGLIAGAVGGSLLAALVICGIVYWMHRRTRKAPKRIRLPHIREDDQPSSHQPLFY
gDPolC 핵산
서열
PolC는 밑줄
(SEQ ID NO: 19)		 atggggggggctgccgccaggttgggggccgtgattttgtttgtcgtcatagtgggcctccatggggtccgcggcaaatatgccttggcggatgcctctctcaagatggccgaccccaatcgctttcgcggcaaagaccttccggtcctggaccagctgaccgaccctccgggggtccggcgcgtgtaccacatccaggcgggcctaccggacccgttccagccccccagcctcccgatcacggtttactacgccgtgttggagcgcgcctgccgcagcgtgctcctaaacgcaccgtcggaggccccccagattgtccgcggggcctccgaagacgtccggaaacaaccctacaacctgaccatcgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggcctgtcccatccgaacgcagccccgctggaactactatgacagcttcagcgccgtcagcgaggataacctggggttcctgatgcacgcccccgcgtttgagaccgccggcacgtacctgcggctcgtgaagataaacgactggacggagattacacagtttatcctggagcaccgagccaagggctcctgtaagtacgccctcccgctgcgcatccccccgtcagcctgcctctccccccaggcctaccagcagggggtgacggtggacagcatcgggatgctgccccgcttcatccccgagaaccagcgcaccgtcgccgtatacagcttgaagatcgccgggtggcacgggccccccctgagctaccagcacttcaggaagctgctgctgctggacgaggaggccggccccctggaggaggagctgcccaggctggccgacgagggcctgaacaggagggtggccgaggacctgaacctgggcaacctgaacgtgagcatcccctggacccacaaggtgggcaacttcaccggcctgtacagcagcaccgtgcccgtgttcaaccccgagtggcagacccccagcttccccaagatccacctgcaggaggacatcgtggacaggtgcaagcagttcgtgggtcccctgaccgtgaacgagaagaggaggctgaagctgatcatgcccgccaggttctaccccaacgtgaccaagtacctgcccctggacaagggcatcaagccctactaccccgagcacgccgtgaaccactacttccagaccaggcactacctgcacaccctgtggaaggccggcatcctgtacaagagggagaccaccaggagcgccagcttctgcggcagcccctacagctgggagcaggagctgcagcacggcagctgctggtggctgcagttcaggaacagcaagccctgcagcgagtactgcctgacccacctggtgaacctgctggaggactggggtccctgcgacgagcacggcgagcaccacatcaggatccccaggacccccgccagggtgaccggcggcgtgttcctggtggacaagaacccccacaacaccgccgagagcaggctggtggtggacttcagccagttcagcaggggcatcaccagggtgagctggcccaagttcgccgtgcccaacctgcagagcctgaccaacctgctgagcagcaacctgagctggctgagcctggacgtgagcgccgccttctaccacatccccctgcaccccgccgccatgcccgggcccaaggccccatacacgagcaccctgctgcccccggagctgtccgagacccccaacgccacgcagccagaactcgccccggaagaccccgaggattcggccctcttggaggaccccgtggggacggtggcgccgcaaatcccaccaaactggcacatcccgtcgatccaggacgccgcgacgccttaccatcccccggccaccccgaacaacatgggcctgatcgccggcgcggtgggcggcagtctcctggcagccctggtcatttgcggaattgtgtactggatgcaccgccgcactcggaaagccccaaagcgcatacgcctcccccacatccgggaagacgaccagccgtcctcgcaccagcccttgttttactag
HBV PolN v2
아미노산 서열
(SEQ ID NO: 173)		 HFRKLLLLDEEAGPLEEELPRLADEGLNRRVAEDLNLGNLPEWQTPSFPKIHLQEDIVDRCKQFVGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIKPYYPEHAVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASFCGSPYSWEQELQHGSCWWLQFRNSKPCSEYCLTHLVNLLEDWGPCDEHGEHHIRIPRTPARVT
HBV2 아미노산 서열
PolC는 밑줄
(SEQ ID NO: 174)
(Pol N
(이탤릭체)-Pol C
(밑줄)-코어)		 YLPLDKGIKPYYPEHAVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASFCGSPYSWEQELQHGSCWWLQFRNSKPCSEYCLTHLVNLLEDWGPCDEHGEHHIRIPRTPARVTGGVFLVDKNPHNTAESRLVVDFSQFSRGITRVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDV QAFTFSPTYKAFLSKQYLNLYPVARQRPGLCQVFADATPTGWGLAMGHQRMRGTFVAPLPIHTAELLAACFARSRSGAKILGTDNSVVLSRKYTSFPWLLGCAANWILRGTSFVYVPSALNPADDVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGR
HBV3 아미노산 서열
PolC는 밑줄
(SEQ ID NO: 175)
(Pol N
(이탤릭체)-Pol C
(밑줄)-코어)		 HFRKLLLLDEEAGPLEEELPRLADEGLNRRVAEDLNLGNLPEWQTPSFPKIHLQEDIVDRCKQFVGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIKPYYPEHAVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASFCGSPYSWEQELQHGSCWWLQFRNSKPCSEYCLTHLVNLLEDWGPCDEHGEHHIRIPRTPARVT QAFTFSPTYKAFLSKQYLNLYPVARQRPGLCQVFADATPTGWGLAMGHQRMRGTFVAPLPIHTAELLAACFARSRSGAKILGTDNSVVLSRKYTSFPWLLGCAANWILRGTSFVYVPSALNPADDVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGR
HBV2 핵산 서열
(SEQ ID NO: 176)		 tatctgccgctggataaaggcattaaaccgtattatccggaacatgcggtgaaccattattttcagacccgccattatctgcataccctgtggaaagcgggcattctgtataaacgcgaaaccacccgcagcgcgagcttttgcggcagcccgtatagctgggaacaggaactgcagcatggcagctgctggtggctgcagtttcgcaacagcaaaccgtgcagcgaatattgcctgacccatctggtgaacctgctggaagattggggaccgtgcgatgaacatggcgaacatcatattcgcattccgcgcaccccggcgcgcgtgaccggcggcgtgtttctggtggataaaaacccgcataacaccgcggaaagccgcctggtggtggattttagccagtttagccgcggcattacccgcgtgagctggccgaaatttgcggtgccgaacctgcagagcctgaccaacctgctgagcagcaacctgagctggctgagcctggatgtgcaggcgtttacctttagcccgacctataaagcgtttctgagcaaacagtatctgaacctgtatccggtggcgcgccagcgcccgggcctgtgccaggtgtttgcggatgcgaccccgaccggctggggcctggcgatgggccatcagcgcatgcgcggcacctttgtggcgccgctgccgattcataccgcggaactgctggcggcgtgctttgcgcgcagccgcagcggcgcgaaaattctgggcaccgataacagcgtggtgctgagccgcaaatataccagctttccgtggctgctgggctgcgcggcgaactggattctgcgcggcaccagctttgtgtatgtgccgagcgcgctgaacccggcggatgatgtgggcagcaacctggaagatccggcgagccgcgaactggtggtgagctatgtgaacgtgaacatgggcctgaaaattcgccagctgctgtggtttcatattagctgcctgacctttggccgcgaaaccgtgattgaatatctggtgagctttggcgtgtggattcgcaccccgccggcgtatcgcccgccgaacgcgccgattctgagcaccctgccggaaaccaccgtggtgcgccgccgcgatcggggccgc
HBV3 핵산 서열
(SEQ ID NO: 177)		 cattttcgcaaactgctgctgctggatgaagaagcgggaccgctggaagaagaactgccgcgcctggcggatgaaggcctgaaccgccgcgtggcggaagatctgaacctgggcaacctgccggaatggcagaccccgagctttccgaaaattcatctgcaggaagatattgtggatcgctgcaaacagtttgtgggaccgctgaccgtgaacgaaaaacgccgcctgaaactgattatgccggcgcgcttttatccgaacgtgaccaaatatctgccgctggataaaggcattaaaccgtattatccggaacatgcggtgaaccattattttcagacccgccattatctgcataccctgtggaaagcgggcattctgtataaacgcgaaaccacccgcagcgcgagcttttgcggcagcccgtatagctgggaacaggaactgcagcatggcagctgctggtggctgcagtttcgcaacagcaaaccgtgcagcgaatattgcctgacccatctggtgaacctgctggaagattggggaccgtgcgatgaacatggcgaacatcatattcgcattccgcgcaccccggcgcgcgtgacccaggcgtttacctttagcccgacctataaagcgtttctgagcaaacagtatctgaacctgtatccggtggcgcgccagcgcccgggcctgtgccaggtgtttgcggatgcgaccccgaccggctggggcctggcgatgggccatcagcgcatgcgcggcacctttgtggcgccgctgccgattcataccgcggaactgctggcggcgtgctttgcgcgcagccgcagcggcgcgaaaattctgggcaccgataacagcgtggtgctgagccgcaaatataccagctttccgtggctgctgggctgcgcggcgaactggattctgcgcggcaccagctttgtgtatgtgccgagcgcgctgaacccggcggatgatgtgggcagcaacctggaagatccggcgagccgcgaactggtggtgagctatgtgaacgtgaacatgggcctgaaaattcgccagctgctgtggtttcatattagctgcctgacctttggccgcgaaaccgtgattgaatatctggtgagctttggcgtgtggattcgcaccccgccggcgtatcgcccgccgaacgcgccgattctgagcaccctgccggaaaccaccgtggtgcgccgccgagatcgaggccgc
HBV2 PolN 아미노산
서열
(SEQ ID NO: 178)		 YLPLDKGIKPYYPEHAVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASFCGSPYSWEQELQHGSCWWLQFRNSKPCSEYCLTHLVNLLEDWGPCDEHGEHHIRIPRTPARVTGGVFLVDKNPHNTAESRLVVDFSQFSRGITRVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDV
HBV2 PolC 아미노산
서열
(SEQ ID NO: 179)		 QAFTFSPTYKAFLSKQYLNLYPVARQRPGLCQVFADATPTGWGLAMGHQRMRGTFVAPLPIHTAELLAACFARSRSGAKILGTDNSVVLSRKYTSFPWLLGCAANWILRGTSFVYVPSALNPADD
HBV2 코어 아미노산
서열
(SEQ ID NO: 180)		 VGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGR
HBV3 PolN 아미노산
서열
(SEQ ID NO: 181)		 HFRKLLLLDEEAGPLEEELPRLADEGLNRRVAEDLNLGNLPEWQTPSFPKIHLQEDIVDRCKQFVGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIKPYYPEHAVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASFCGSPYSWEQELQHGSCWWLQFRNSKPCSEYCLTHLVNLLEDWGPCDEHGEHHIRIPRTPARVT
HBV3 PolC 아미노산
서열
(SEQ ID NO: 182)		 QAFTFSPTYKAFLSKQYLNLYPVARQRPGLCQVFADATPTGWGLAMGHQRMRGTFVAPLPIHTAELLAACFARSRSGAKILGTDNSVVLSRKYTSFPWLLGCAANWILRGTSFVYVPSALNPADD
HBV3 코어 아미노산
서열
(SEQ ID NO: 183)		 VGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGR
gD-HBV2 핵산
서열
(SEQ ID NO: 184)		 atggggggggctgccgccaggttgggggccgtgattttgtttgtcgtcatagtgggcctccatggggtccgcggcaaatatgccttggcggatgcctctctcaagatggccgaccccaatcgctttcgcggcaaagaccttccggtcctggaccagctgaccgaccctccgggggtccggcgcgtgtaccacatccaggcgggcctaccggacccgttccagccccccagcctcccgatcacggtttactacgccgtgttggagcgcgcctgccgcagcgtgctcctaaacgcaccgtcggaggccccccagattgtccgcggggcctccgaagacgtccggaaacaaccctacaacctgaccatcgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggcctgtcccatccgaacgcagccccgctggaactactatgacagcttcagcgccgtcagcgaggataacctggggttcctgatgcacgcccccgcgtttgagaccgccggcacgtacctgcggctcgtgaagataaacgactggacggagattacacagtttatcctggagcaccgagccaagggctcctgtaagtacgccctcccgctgcgcatccccccgtcagcctgcctctccccccaggcctaccagcagggggtgacggtggacagcatcgggatgctgccccgcttcatccccgagaaccagcgcaccgtcgccgtatacagcttgaagatcgccgggtggcacgggccctatctgccgctggataaaggcattaaaccgtattatccggaacatgcggtgaaccattattttcagacccgccattatctgcataccctgtggaaagcgggcattctgtataaacgcgaaaccacccgcagcgcgagcttttgcggcagcccgtatagctgggaacaggaactgcagcatggcagctgctggtggctgcagtttcgcaacagcaaaccgtgcagcgaatattgcctgacccatctggtgaacctgctggaagattggggaccgtgcgatgaacatggcgaacatcatattcgcattccgcgcaccccggcgcgcgtgaccggcggcgtgtttctggtggataaaaacccgcataacaccgcggaaagccgcctggtggtggattttagccagtttagccgcggcattacccgcgtgagctggccgaaatttgcggtgccgaacctgcagagcctgaccaacctgctgagcagcaacctgagctggctgagcctggatgtgcaggcgtttacctttagcccgacctataaagcgtttctgagcaaacagtatctgaacctgtatccggtggcgcgccagcgcccgggcctgtgccaggtgtttgcggatgcgaccccgaccggctggggcctggcgatgggccatcagcgcatgcgcggcacctttgtggcgccgctgccgattcataccgcggaactgctggcggcgtgctttgcgcgcagccgcagcggcgcgaaaattctgggcaccgataacagcgtggtgctgagccgcaaatataccagctttccgtggctgctgggctgcgcggcgaactggattctgcgcggcaccagctttgtgtatgtgccgagcgcgctgaacccggcggatgatgtgggcagcaacctggaagatccggcgagccgcgaactggtggtgagctatgtgaacgtgaacatgggcctgaaaattcgccagctgctgtggtttcatattagctgcctgacctttggccgcgaaaccgtgattgaatatctggtgagctttggcgtgtggattcgcaccccgccggcgtatcgcccgccgaacgcgccgattctgagcaccctgccggaaaccaccgtggtgcgccgccgcgatcggggccgcgggcccaaggccccatacacgagcaccctgctgcccccggagctgtccgagacccccaacgccacgcagccagaactcgccccggaagaccccgaggattcggccctcttggaggaccccgtggggacggtggcgccgcaaatcccaccaaactggcacatcccgtcgatccaggacgccgcgacgccttaccatcccccggccaccccgaacaacatgggcctgatcgccggcgcggtgggcggcagtctcctggcagccctggtcatttgcggaattgtgtactggatgcaccgccgcactcggaaagccccaaagcgcatacgcctcccccacatccgggaagacgaccagccgtcctcgcaccagcccttgttttactag
gD-HBV2 아미노산
서열
(SEQ ID NO: 185)		 MGGAAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLDQLTDPPGVRRVYHIQAGLPDPFQPPSLPITVYYAVLERACRSVLLNAPSEAPQIVRGASEDVRKQPYNLTIAWFRMGGNCAIPITVMEYTECSYNKSLGACPIRTQPRWNYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQFILEHRAKGSCKYALPLRIPPSACLSPQAYQQGVTVDSIGMLPRFIPENQRTVAVYSLKIAGWHGPYLPLDKGIKPYYPEHAVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASFCGSPYSWEQELQHGSCWWLQFRNSKPCSEYCLTHLVNLLEDWGPCDEHGEHHIRIPRTPARVTGGVFLVDKNPHNTAESRLVVDFSQFSRGITRVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVQAFTFSPTYKAFLSKQYLNLYPVARQRPGLCQVFADATPTGWGLAMGHQRMRGTFVAPLPIHTAELLAACFARSRSGAKILGTDNSVVLSRKYTSFPWLLGCAANWILRGTSFVYVPSALNPADDVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWGHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRGPKAPYTSTLLPPELSRTPNATQPELAPEDPEDSALLEDPVGTVAPQIPPNWHIPSIQDAATPYHPPATPNNMGLIAGAVGGSLLAALVICGIVYWMHRRTRKAPKRIRLPHIREDDQPSSHQPLFY*
gD-HBV3 핵산
서열
(SEQ ID NO: 186)		 atggggggggctgccgccaggttgggggccgtgattttgtttgtcgtcatagtgggcctccatggggtccgcggcaaatatgccttggcggatgcctctctcaagatggccgaccccaatcgctttcgcggcaaagaccttccggtcctggaccagctgaccgaccctccgggggtccggcgcgtgtaccacatccaggcgggcctaccggacccgttccagccccccagcctcccgatcacggtttactacgccgtgttggagcgcgcctgccgcagcgtgctcctaaacgcaccgtcggaggccccccagattgtccgcggggcctccgaagacgtccggaaacaaccctacaacctgaccatcgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggcctgtcccatccgaacgcagccccgctggaactactatgacagcttcagcgccgtcagcgaggataacctggggttcctgatgcacgcccccgcgtttgagaccgccggcacgtacctgcggctcgtgaagataaacgactggacggagattacacagtttatcctggagcaccgagccaagggctcctgtaagtacgccctcccgctgcgcatccccccgtcagcctgcctctccccccaggcctaccagcagggggtgacggtggacagcatcgggatgctgccccgcttcatccccgagaaccagcgcaccgtcgccgtatacagcttgaagatcgccgggtggcacgggccccattttcgcaaactgctgctgctggatgaagaagcgggaccgctggaagaagaactgccgcgcctggcggatgaaggcctgaaccgccgcgtggcggaagatctgaacctgggcaacctgccggaatggcagaccccgagctttccgaaaattcatctgcaggaagatattgtggatcgctgcaaacagtttgtgggaccgctgaccgtgaacgaaaaacgccgcctgaaactgattatgccggcgcgcttttatccgaacgtgaccaaatatctgccgctggataaaggcattaaaccgtattatccggaacatgcggtgaaccattattttcagacccgccattatctgcataccctgtggaaagcgggcattctgtataaacgcgaaaccacccgcagcgcgagcttttgcggcagcccgtatagctgggaacaggaactgcagcatggcagctgctggtggctgcagtttcgcaacagcaaaccgtgcagcgaatattgcctgacccatctggtgaacctgctggaagattggggaccgtgcgatgaacatggcgaacatcatattcgcattccgcgcaccccggcgcgcgtgacccaggcgtttacctttagcccgacctataaagcgtttctgagcaaacagtatctgaacctgtatccggtggcgcgccagcgcccgggcctgtgccaggtgtttgcggatgcgaccccgaccggctggggcctggcgatgggccatcagcgcatgcgcggcacctttgtggcgccgctgccgattcataccgcggaactgctggcggcgtgctttgcgcgcagccgcagcggcgcgaaaattctgggcaccgataacagcgtggtgctgagccgcaaatataccagctttccgtggctgctgggctgcgcggcgaactggattctgcgcggcaccagctttgtgtatgtgccgagcgcgctgaacccggcggatgatgtgggcagcaacctggaagatccggcgagccgcgaactggtggtgagctatgtgaacgtgaacatgggcctgaaaattcgccagctgctgtggtttcatattagctgcctgacctttggccgcgaaaccgtgattgaatatctggtgagctttggcgtgtggattcgcaccccgccggcgtatcgcccgccgaacgcgccgattctgagcaccctgccggaaaccaccgtggtgcgccgccgagatcgaggccgcgggcccaaggccccatacacgagcaccctgctgcccccggagctgtccgagacccccaacgccacgcagccagaactcgccccggaagaccccgaggattcggccctcttggaggaccccgtggggacggtggcgccgcaaatcccaccaaactggcacatcccgtcgatccaggacgccgcgacgccttaccatcccccggccaccccgaacaacatgggcctgatcgccggcgcggtgggcggcagtctcctggcagccctggtcatttgcggaattgtgtactggatgcaccgccgcactcggaaagccccaaagcgcatacgcctcccccacatccgggaagacgaccagccgtcctcgcaccagcccttgttttactag
gD-HBV3 아미노산
서열
(SEQ ID NO: 187)		 MGGAAARLGAVILFVVIVGLHGVRGKYALADSALKMADPNRFRGKDLPVLDQLTDPPGVRRVYHIQAGLPDPFQPPSLPITVYYAVLERACRSVLLNAPSEAPQIVRGASEDVRKQPYNLTIAWFRMGGNCAIPITVMEYTECSYNKSLGACPIRTQPRWNYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQFILEHRAKGSCKYALPLRIPPSACLSPQAYQQGVTVDSIGMLPRFIPENQRTVAVYSLKIAGWHGPHFRKLLLLDEEAGPLEEELPRLADEGLNRRVAEDLNLGNLPEWQTPSFPKIHLQEDIVDRCKQFVGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIKPYYPEHAVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASFCGSPYSWEQELQHGSCWWLQFRNSKPCSEYCLTHLVNLLDEWGPCDEHGEHHRIRPRTPARVTQAFTFSPTYKAFLSKQYLNLYPVARQRPGLCQVFADATPTGWGLAMGHQRMRGTFVAPLPIHTAELLAACFARSRSGAKILGTDNSVVLSRKYTSFPWLLGCAANWILRGTSFYVPSALNPADDVGSNLEDPASRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRDRGRGPKAPYTSTLLPPELSETPNATQPELAPEDPEDSALLEDPVGTVAPQIPPNWHIPSIQDAATPYHPPATPNNMGLIAGAVBBSLAALVICGIVYWMHRRTRKAPKRIRLPHIREDDQPSSHQLFY*
실시예들
다음의 실시예들의 열거는 앞서의 설명들을 대체하거나 대신하는 것이 아니라, 보완을 위해 의도되는 것이다.
실시예 1. SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 B형 간염 바이러스(HBV) 코어 단백질.
실시예 2. 실시예 1의 HBV 코어 단백질에서, 상기 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 20-NO: 54 중의 임의의 것을 포함한다.
실시예 3. SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 B형 간염 바이러스(HBV) 코어 단백질.
실시예 4. 실시예 1-실시예 3 중의 임의의 것의 HBV 코어 단백질을 인코딩하는 핵산 분자.
실시예 5. 실시예 4의 핵산 분자에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
실시예 6. 실시예 4 또는 실시예 5의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
실시예 7. 실시예 6의 벡터에서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.
실시예 8. 실시예 7의 벡터에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 AdC6 벡터 또는 AdC7 벡터이다.
실시예 9. 실시예 6-실시예 8 중의 임의의 것의 벡터를 포함하는 백신.
실시예 10. SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인.
실시예 11. 실시예 10의 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인에서, 상기 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 55-NO: 113 중의 임의의 것을 포함한다.
실시예 12. SEQ ID NO: 178의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 181의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인.
실시예 13. SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인.
실시예 14. 실시예 13의 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인에서, 상기 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 114-NO: 172 중의 임의의 것을 포함한다.
실시예 15. SEQ ID NO: 179의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 182의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인.
실시예 16. 실시예 10-실시예 15 중의 임의의 것의 HBV 폴리메라아제를 인코딩하는 핵산 분자.
실시예 17. 실시예 16의 핵산 분자에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
실시예 18. 실시예 16의 핵산 분자에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 11의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
실시예 19. 실시예 16-실시예 18 중의 임의의 것의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
실시예 20. 실시예 19의 벡터에서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.
실시예 21. 실시예 20의 벡터에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 AdC6 벡터 또는 AdC7 벡터이다.
실시예 22. 실시예 19-실시예 21 중의 임의의 것의 벡터를 포함하는 백신.
실시예 23. 융합 단백질에서,
SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질, SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인 중의 하나 또는 그 이상을 포함한다.
실시예 24. 실시예 23의 융합 단백질에서,
(1) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인;
(2) SEQ ID NO: 20-NO: 54(SEQ ID NO: 6의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상 및 SEQ ID NO: 55-NO: 113(SEQ ID NO: 8의 면역원성 단편) 중의 하나 또는 그 이상;
(3) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인;
(4) SEQ ID NO: 20-NO: 54(SEQ ID NO: 6의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상 및 SEQ ID NO: 114-NO: 172(SEQ ID NO: 10의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상;
(5) SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인;
(6) SEQ ID NO: 55-NO: 113(SEQ ID NO: 8의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상 및 SEQ ID NO: 114-NO: 172(SEQ ID NO: 10의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상;
(7) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질, SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인; 또는
(8) SEQ ID NO: 20-NO: 54(SEQ ID NO: 6의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상, SEQ ID NO: 55-NO: 113(SEQ ID NO: 8의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상, 그리고 SEQ ID NO: 114-NO: 172(SEQ ID NO: 10의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상을 포함한다.
실시예 25. 융합 단백질에서,
SEQ ID NO: 178의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, SEQ ID NO: 179의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질을 포함한다.
실시예 26. 실시예 25의 융합 단백질에서, SEQ ID NO: 174의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 27. 융합 단백질에서,
SEQ ID NO: 181의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, SEQ ID NO: 182의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질을 포함한다.
실시예 28. 실시예 27의 융합 단백질에서, SEQ ID NO: 175의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 29. 융합 단백질에서,
N-말단 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 당단백질(gD) 서열 또는 이의 변이;
SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질; 및
C-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이를 포함한다.
실시예 30. 실시예 29의 융합 단백질에서, 상기 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 20-NO: 54 중의 임의의 것을 포함한다.
실시예 31. 융합 단백질에서,
N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이;
SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인; 및
C-말단 HSV gD 단백질 서열 또는 이의 변이를 포함한다.
실시예 32. 실시예 31의 융합 단백질에서, 상기 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 55-NO: 113 중의 임의의 것을 포함한다.
실시예 33. 융합 단백질에서,
N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이;
SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인; 및
C-말단 HSV gD 단백질 서열 또는 이의 변이를 포함한다.
실시예 34. 실시예 33의 융합 단백질에서, 상기 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 114-NO: 172 중에서 임의의 것을 포함한다.
실시예 35. 융합 단백질에서,
N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이;
HBV 서열을 포함하며, 상기 HBV 서열은,
(1) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인;
(2) SEQ ID NO: 20-NO: 54(SEQ ID NO: 6의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상 및 SEQ ID NO: 55-NO: 113(SEQ ID NO: 8의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상;
(3) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인;
(4) SEQ ID NO: 20-NO: 54(SEQ ID NO: 6의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상 및 SEQ ID NO: 114-NO: 172(SEQ ID NO: 10의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상;
(5) SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인;
(6) SEQ ID NO: 55-NO: 113(SEQ ID NO: 8의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상 및 SEQ ID NO: 114-NO: 172(SEQ ID NO: 10의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상;
(7) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질, SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인; 또는
(8) SEQ ID NO: 20-NO: 54(SEQ ID NO: 6의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상, SEQ ID NO: 55-NO: 113(SEQ ID NO: 8의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상, 그리고 SEQ ID NO: 114-NO: 172(SEQ ID NO: 10의 면역원성 단편들) 중의 하나 또는 그 이상을 포함하며,
C-말단 HSV gD 단백질 서열 또는 이의 변이를 포함한다.
실시예 36. 융합 단백질에서,
N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이;
SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질; 및
C-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이를 포함한다.
실시예 37. 융합 단백질에서,
N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이;
SEQ ID NO: 178의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 181의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인; 및
C-말단 HSV gD 단백질 서열 또는 이의 변이를 포함한다.
실시예 38. 융합 단백질에서,
N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이;
SEQ ID NO: 179의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 182의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인; 및
C-말단 HSV gD 단백질 서열 또는 이의 변이를 포함한다.
실시예 39. 융합 단백질에서,
N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이를 포함하고;
HBV 서열을 포함하며. 상기 HBV 서열은,
(1) SEQ ID NO: 178의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, SEQ ID NO: 179의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질; 또는
(2) SEQ ID NO: 181의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, SEQ ID NO: 182의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질을 포함하며;
C-말단 HSV gD 단백질 서열 또는 이의 변이를 포함한다.
실시예 40. 실시예 39의 융합 단백질에서, 상기 HBV 서열은 SEQ ID NO: 178의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, SEQ ID NO: 179의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질을 포함한다.
실시예 41. 실시예 40의 융합 단백질에서, 상기 HBV 서열은 SEQ ID NO: 174의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 42. 실시예 39의 융합 단백질에서, 상기 HBV 서열은 SEQ ID NO: 181의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, SEQ ID NO: 182의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질을 포함한다.
실시예 43. 실시예 42의 융합 단백질에서, 상기 HBV 서열은 SEQ ID NO: 175의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 44. 실시예 29- 실시예 43 중의 임의의 것의 융합 단백질에서, 상기 N-말단 HSV gD 서열은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 45. 실시예 29-실시예 43 중의 임의의 것의 융합 단백질에서, 상기 N-말단 HSV gD 서열은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 잔기 26-269를 포함한다.
실시예 46. 실시예 29-실시예 45 중의 임의의 것의 융합 단백질에서, 상기 C-말단 HSV gD 서열은 상기 HSV gD의 막횡단 도메인을 포함한다.
실시예 47. 실시예 29-실시예 46 중의 임의의 것의 융합 단백질에서, 상기 C-말단 HSV gD 서열은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 48. 실시예 29-실시예 47 중의 임의의 것의 융합 단백질에서, 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편, SEQ ID NO: 16 또는 이의 면역원성 단편, 또는 SEQ ID NO: 18 또는 이의 면역원성 단편 중의 임의의 것의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 49. 실시예 39-실시예 47의 융합 단백질에서, 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 50. 실시예 39-실시예 47의 융합 단백질에서, 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 포함한다.
실시예 51. 실시예 23-실시예 50 중의 임의의 것의 융합 단백질을 인코딩하는 헥산 분자.
실시예 52. 실시예 51의 핵산 분자에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 15, NO: 17, 또는 NO: 19 중의 임의의 것의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
실시예 53. 실시예 51의 핵산 분자에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 176의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
실시예 54. 실시예 51의 핵산 분자에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 177의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
실시예 55. 실시예 51의 핵산 분자에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 184의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
실시예 56. 실시예 51의 핵산 분자에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 186의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
실시예 57. 실시예 51-실시예 56 중의 임의의 것의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
실시예 58. 실시예 57의 벡터에서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.
실시예 59. 실시예 58의 벡터에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 AdC6 벡터 또는 AdC7 벡터이다.
실시예 60. 실시예 57-실시예 59 중의 임의의 것의 벡터를 포함하는 백신.
실시예 61. 대상에서 HBV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에서, 상기 방법은 상기 대상에 실시예 23-실시예 50 중의 임의의 것의 융합 단백질, 실시예 51-실시예 56 중의 임의의 것의 핵산 분자, 실시예 57-실시예 59 중의 임의의 것의 벡터, 또는 실시예 60의 백신의 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 이에 따라 HBV에 대한 면역 반응을 유도한다.
실시예 62. 실시예 61의 방법에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 14, NO: 16, 또는 NO: 18 중의 임의의 것의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함한다.
실시예 63. 실시예 62의 방법에서, 상기 대상에, 상기 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계에 후속하여, SEQ ID NO: 14, NO: 16, 또는 NO: 18 중의 임의의 것의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계를 더 포함한다.
실시예 64. 실시예 61의 방법에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 14, NO: 16, 또는 NO: 18 중의 임의의 것의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함한다.
실시예 65. 실시예 64의 방법에서, 상기 대상에, 상기 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계에 후속하여, SEQ ID NO: 14, NO: 16, 또는 NO: 18 중의 임의의 것의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계를 더 포함한다.
실시예 66. 실시예 61의 방법에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함한다.
실시예 67. 실시예 66의 방법에서, 상기 대상에, 상기 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계에 후속하여, SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계를 더 포함한다.
실시예 68. 실시예 61의 방법에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함한다.
실시예 69. 실시예 68의 방법에서, 상기 대상에, 상기 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계에 후속하여, SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계를 더 포함한다.
실시예 70. 실시예 61의 방법에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함한다.
실시예 71. 실시예 70의 방법에서, 상기 대상에, 상기 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계에 후속하여, SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계를 더 포함한다.
실시예 72. 실시예 61의 방법에서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함한다.
실시예 73. 실시예 72의 방법에서, 상기 대상에, 상기 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계에 후속하여, SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계를 더 포함한다.
실시예 74. 실시예 61-실시예 73 중의 임의의 것의 방법에서, 상기 SEQ ID NO: 14, NO: 16, NO: 18, NO: 185, 또는 NO: 187 중의 임의의 것의 아미노산 서열, 또는 이의 면역원성 단편은 상기 N-말단 25 아미노산 신호 펩티드를 포함하지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> VIRION THERAPEUTICS, LLC THE WISTAR INSTITUTE <120> ADENOVIRAL VECTORS ENCODING HEPATITIS B VIRAL ANTIGENS FUSED TO HERPES VIRUS GLYCOPROTEIN D AND METHODS OF USING THE SAME <130> 111876.000035 <140> <141> <150> 63/112,219 <151> 2020-11-11 <150> 63/112,202 <151> 2020-11-11 <150> 63/064,571 <151> 2020-08-12 <150> 63/064,506 <151> 2020-08-12 <150> 62/967,242 <151> 2020-01-29 <150> 62/967,104 <151> 2020-01-29 <150> 62/958,827 <151> 2020-01-09 <150> 62/958,809 <151> 2020-01-09 <160> 233 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160 Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175 Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185 <210> 2 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 3 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 3 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp 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/note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 15 atgggggggg ctgccgccag gttgggggcc gtgattttgt ttgtcgtcat agtgggcctc 60 catggggtcc gcggcaaata tgccttggcg gatgcctctc tcaagatggc cgaccccaat 120 cgctttcgcg gcaaagacct tccggtcctg gaccagctga ccgaccctcc gggggtccgg 180 cgcgtgtacc acatccaggc gggcctaccg gacccgttcc agccccccag cctcccgatc 240 acggtttact acgccgtgtt ggagcgcgcc tgccgcagcg tgctcctaaa cgcaccgtcg 300 gaggcccccc agattgtccg cggggcctcc gaagacgtcc ggaaacaacc ctacaacctg 360 accatcgctt ggtttcggat gggaggcaac tgtgctatcc ccatcacggt catggagtac 420 accgaatgct cctacaacaa gtctctgggg gcctgtccca tccgaacgca gccccgctgg 480 aactactatg acagcttcag cgccgtcagc gaggataacc tggggttcct gatgcacgcc 540 cccgcgtttg agaccgccgg cacgtacctg cggctcgtga agataaacga ctggacggag 600 attacacagt ttatcctgga gcaccgagcc aagggctcct gtaagtacgc cctcccgctg 660 cgcatccccc cgtcagcctg cctctccccc caggcctacc agcagggggt gacggtggac 720 agcatcggga tgctgccccg cttcatcccc gagaaccagc gcaccgtcgc cgtatacagc 780 ttgaagatcg 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Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 72 Glu Asp Ile Val Asp Arg Cys Lys Gln Phe Val Gly Pro Leu Thr Val 1 5 10 15 <210> 73 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 73 Arg Cys Lys Gln Phe Val Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg 1 5 10 15 <210> 74 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 74 Val Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met 1 5 10 15 <210> 75 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 75 Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro Ala Arg Phe Tyr 1 5 10 15 <210> 76 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 76 Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val 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199 Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His 1 5 10 15 <210> 200 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 200 Lys Gly Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Ala Val Asn His Tyr 1 5 10 15 <210> 201 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 201 Tyr Tyr Pro Glu His Ala Val Asn His Tyr Phe Gln Thr Arg His 1 5 10 15 <210> 202 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 202 Ala Val Asn His Tyr Phe Gln Thr Arg His Tyr Leu His Thr Leu 1 5 10 15 <210> 203 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 203 Phe Gln Thr Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile 1 5 10 15 <210> 204 <211> 15 <212> PRT <213> 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208 Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu Gln Glu Leu Gln His 1 5 10 15 <210> 209 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 209 Pro Tyr Ser Trp Glu Gln Glu Leu Gln His Gly Ser Cys Trp Trp 1 5 10 15 <210> 210 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 210 Gln Glu Leu Gln His Gly Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn 1 5 10 15 <210> 211 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 211 Gly Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 212 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 212 Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Glu Tyr Cys Leu Thr 1 5 10 15 <210> 213 <211> 15 <212> PRT <213> 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226 Ser Arg Gly Ile Thr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro 1 5 10 15 <210> 227 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 227 Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu 1 5 10 15 <210> 228 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 228 Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser 1 5 10 15 <210> 229 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 229 Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp 1 5 10 15 <210> 230 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 230 Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val 1 5 10 15 <210> 231 <211> 15 <212> PRT <213> 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Claims (23)

  1. 융합 단백질(fusion protein)에 있어서,
    SEQ ID NO: 178의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편(immunogenic fragment)을 포함하는 HBV 폴리메라아제(polymerase) N-말단 도메인, SEQ ID NO: 179의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, SEQ ID NO: 174의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이, C-말단 HSV gD 단백질 서열 또는 이의 변이, 또는 이들 모두를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서,
    N-말단 HSV gD 서열 또는 이의 변이;
    SEQ ID NO: 178의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 N-말단 도메인, SEQ ID NO: 179의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 폴리메라아제 C-말단 도메인, 그리고 SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 HBV 코어 단백질을 포함하는 HBV 서열; 및
    C-말단 HSV gD 단백질 서열 또는 이의 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 HBV 서열은 SEQ ID NO: 174의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-말단 HSV gD 서열은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  7. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N-말단 HSV gD 서열은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 잔기 26-269를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단 HSV gD 서열은 상기 HSV gD의 막횡단 도메인(transmembrane domain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단 HSV gD 서열은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 176의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  13. 제11항에 있어서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 184의 뉴클레오티드 서열을 포함하느 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 상기 벡터는 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector)인 것을 특징으로 하는 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 AdC6 벡터 또는 AdC7 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
  18. 대상에 HBV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 있어서, 상기 대상에 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항의 핵산 분자, 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제17항의 백신의 유효량을 제공하는 단계를 포함하며, 이에 따라 HBV에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 대상에, 상기 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계에 후속하여, SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 백신은 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC7 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 대상에, 상기 AdC7 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계에 후속하여, 상기 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 AdC6 벡터를 포함하는 백신을 제공하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열 또는 이의 면역원성 단편은 상기 N-말단 25 아미노산 신호 펩티드를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
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