BRPI0613025A2

BRPI0613025A2 - composiÇço para reduzir a resistÊncia a um agente, mÉtodo para a preparaÇço de um veÍculo de levedura e uso da composiÇço

Info

Publication number: BRPI0613025A2
Application number: BRPI0613025-9A
Authority: BR
Inventors: David Apeliam; Alex Franzusoff; Timothy C Rodell
Original assignee: Globeimmune Inc
Priority date: 2005-07-11
Filing date: 2006-07-10
Publication date: 2010-12-14
Also published as: TW200744623A; US20140234375A1; EP2371381A2; WO2007008780A3; JP2009500454A; US20100034840A1; CA2614884A1; EP1906997A2; SG163572A1; CN101262883A; KR20080043775A; IL188717A0; WO2007008780A2; AU2006268333B2; EP2371381A3; AU2006268333A1

Abstract

COMPOSIÇçO PARA REDUZIR A RESISTÊNCIA A UM AGENTE, MÉTODO PARA A PREPARAÇçO DE UM VEÍCULO DE LEVEDURA E USO DA COMPOSIÇçO. São fornecidos células, vetores e vírus em associação com um polipeptídeo mutante que surgiu em resposta a um agente terapêutico ou profilático; composições que compreendem tais células, vetores e vírus e métodos para seu uso para despertar uma resposta imune ao polipeptídeo mutante. Em alguns exemplos, a resposta imune é uma resposta imune celular.

Description

COMPOSIÇÃO PARA REDUZIR A RESISTÊNCIA A UM AGENTE, MÉTODOPARA A PREPARAÇÃO DE UM VEÍCULO DE LEVEDURA E USO DACOMPOSIÇÃO

Referências cruzadas a pedidos relacionados

O pedido é relacionado a e reivindica o benefício doPedido Provisório U.S. N0 de Série 60/698.381, depositadoem 11 de julho de 2005, cujo conteúdo completo está aquiincorporado em sua totalidade por referência.

Direitos governamentais

Não aplicável.

Campo técnico

A presente invenção relaciona-se, de modo geral, acomposições e métodos para seu uso no desencadeamento de umaresposta imune a um polipeptídeo mutante, ou a uma célula queexpresse o polipeptídeo mutante, em que o polipeptídeo mutante éconhecido por surgir ou por ter surgido com uma mutaçãoespecífica em resposta a um agente medicamentoso terapêutico ouprofilático direcionado. As composições e métodos aqui reveladossão úteis para desencadear uma resposta imune, em particular,uma resposta imune mediada por célula, ao polipeptídeo mutante,incluindo a deleção e/ou apreensão da célula que expressa opolipeptídeo mutante, junto com administração do agentemedicamentoso direcionado. As composições e métodos podem serusados profilática ou terapeuticamente.

Fundamento da invenção

Novas descobertas na biologia do câncer têm fornecidoa oportunidade de projetar agentes anticâncer específicospara alvo e encorajaram avanços no desenvolvimento demedicamentos. Essas descobertas tornam possível desenharmoléculas com alta seletividade contra alvos específicos emcélulas cancerosas. Segota & Bukowski, Cleveland Clinic J.Med., 2004, 71 (7) :551-560. Por exemplo, o sucesso doinibidor de Bcr-Abl tirosina quinase imatinib (Gleevec) notratamento de leucemia mielóide crônica (LMC) tem inspiradogrande expectativa por essa abordagem de direcionamento.Capdeville e cols., Nature Reviews, 2002, 1:493-502. Aterapia direcionada para câncer traz um problema crítico:alvos desenvolvem mutações de escape que levam, no final detudo, a resistência a medicamentos. Por exemplo, foirelatado que mutações se elevam em pacientes que eraminicialmente responsivos ao tratamento com Gleevec e que,como um resultado dessas mutações, são refratários atratamento adicional com Gleevec. Gorre e cols., Science2001, 293:876-880; Shah e cols., Câncer Cell 2002, 2:117-125; Branford e cols., Blood 2002, 99 (9) : 3742-3745;Deininger e cols., Blood 2005, 105 (7) : 2640-263. De modosimilar, mutações no receptor de fator de crescimentoepidérmico (EGFR) foram encontradas em pacientes com câncerpulmonar de não-pequenas células (NSCLC) que foramrelatadas por torná-las resistentes à ação de agentesterapêuticos como gefitinib (Iressa) ou erlotinib (Tarceva)que são direcionadas especificamente EGFR. Kobayashi ecols., N. Engl. JMed., 2005, 352 (8) :786-792. Portanto, aeficácia destes medicamentos para câncer ésignificativamente limitada pela ocorrência de mutações deescape.

De forma similar, embora haja vários compostosantivirais aprovados e sendo atualmente usados para otratamento de infecções virais, há um problema substancial,contínuo, com o desenvolvimento de resistência amedicamentos observado com a maioria destes agentes. Porexemplo, resistência a inibidores de transcriptase reversade nucleosídeo usados no tratamento de HIV foi relatada.Por exemplo, mutações identificadas em HIV RT que sãoassociadas com resistência à estavudina incluem M41L, K65R,D67N, K70R, Q151M, L210W, T215Y/F, e K219E. Mutaçõesidentificadas em HIV RT que são associadas com resistênciaa didanosina incluem K65R, L74V e M184V. Mutaçõesidentificadas em HIV RT que são associadas com resistênciaa lamivudina incluem K65R e M184V/I. Veja, por exemplo,Johnson e cols. (2005, International AIDS Society-USA vol.13:51-57) e Schmitt e cols. (2000, AIDS vol.14:653- 658).Suscetibilidade diminuída ou resistência completa amedicamentos antivirais específicos é um grande fatorlimitante da eficácia de terapias contra vários retrovírus,vírus de RNA e alguns vírus de DNA, como vírus da HepatiteB, devido à natureza suscetível a erro das transcriptasesreversas virais ou RNA polimerases dependentes de RNA.Seria desejável minimizar pelo menos a ocorrência demutantes que surgem com a administração de agentesterapêuticos e/ou profiláticos.

Métodos para desencadear uma resposta imune sãorevelados em, por exemplo, Thyphronitis e cols. (2004,Anticancer Research, vol. 24:2443-2454) e Plate e cols.(2005) Journal of Cell Biology, vol. 94:1069). Sistemas deleveduras são revelados em, por exemplo, Pat. U.S. No.5.830.463, Stubbs e cols. (2001, Nature Med. 5:625-629); Lue cols. (2004, Câncer Research 64:5084-5088); e Franzusoff,e cols. (2005, Expert Opin. Bio. Ther. Vol.5:565-575).

Todas as referências aqui citadas, incluindo patentes,pedidos e publicações de patente, são aqui incorporadas emsua totalidade por referência.

Breve sumário da invenção

São aqui fornecidas composições que compreendem umveiculo de levedura e um polipeptideo mutante, um fragmentodeste que compreende uma mutação ou um mimetopo ou ácidonucléico que codifica para um polipeptideo mutante,fragmento deste que compreende uma mutação ou um mimetopo,em que o polipeptideo mutante é conhecido por surgir ou porter surgido com pelo menos uma mutação específica emresposta à administração de um agente terapêutico e/ouprofilático direcionado.

Em alguns exemplos, a composição compreende um ou maisdos seguintes:

i) um veículo de levedura que compreende ácido nucléicoque codifica pelo menos um polipeptideo mutante, umfragmento deste que compreende uma mutação, ou um mimetopo;

ii) um veículo de levedura que compreende pelo menos umpolipeptideo mutante, um fragmento deste que compreende umamutação, ou um mimetopo;

iii) um veículo de levedura em associação com pelo menos umpolipeptideo mutante, um fragmento deste que compreende umamutação, ou um mimetopo;

iv) um veículo de levedura que compreende ácido nucléicoque codifica pelo menos um polipeptideo mutante, umfragmento deste que compreende uma mutação, ou um mimetopocarregado intracelularmente em uma célula dendrítica; ou

v) um veículo de levedura e pelo menos um polipeptideomutante, um fragmento deste que compreende uma mutação, ouum mimetopo carregado intracelularmente em uma céluladendrítica, em que o polipeptídeo mutante é conhecido porsurgir ou por ter surgido com pelo menos uma mutaçãoespecífica em resposta à administração de um agenteterapêutico e/ou profilático direcionado.

Em alguns exemplos, o veículo de levedura é umalevedura inteira, um esferoplasto de levedura, umcitoplasto de levedura, um levedura seca, ou um extrato demembrana de levedura subcelular ou fração destes. Em algunsexemplos o veículo de levedura é obtido de leveduraselecionada do grupo que consiste em Saccharomyces,Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Hansenula, Candida ePiehia. Em alguns exemplos o veículo de levedura é obtidode Saccharomyees, como S. eerevisiae.

Em alguns exemplos o polipeptídeo mutante, fragmentodeste que compreende uma mutação, ou mimetopo compreendedois ou mais epitopos. Em outros exemplos, o polipeptídeomutante, fragmento deste que compreende uma mutação, oumimetopo compreende dois ou mais epitopos que compreendemuma ou mais mutações.

Em alguns exemplos o polipeptídeo mutante, fragmentodeste que compreende uma mutação, ou mimetopo é codificadopor um vírus de RNA ou DNA. Em alguns exemplos o vírus é umretrovírus, flavivírus, reovírus, picornavírus,coronavírus, filovírus, rabdovírus, buniavírus,ortomixovírus, paramixovírus, arenavírus, calicivírus,hepadnavírus, herpesvírus, poxvírus, adenovírus, parvovírusou papovavírus. Em outros exemplos o polipeptídeo mutante,fragmento deste que compreende uma mutação, ou mimetopo écodificado por HIV, HBV ou HCV.

São fornecidas aqui composições que compreendem umveículo de levedura e um polipeptídeo mutante, um fragmentodeste que compreende uma mutação ou um mimetopo ou ácidonucléico que codifica para um polipeptídeo mutante,fragmento deste que compreende uma mutação ou um mimetopo,em que o polipeptídeo mutante é conhecido por surgir ou porter surgido com pelo menos uma mutação específica emresposta à administração de um agente terapêutico e/ouprofilático direcionado.

Em alguns exemplos o polipeptídeo mutante emerge emresposta ao tratamento com um agente terapêutico e/ouprofilático direcionado selecionado de altazanavir,saquinavir, lamivudina, didnosina, embricitabina,zidovudina, estavudina, zalcitabina, abacavir, tenofovir,nevirapina, delavirdina, efavirenz, indinavir, ritonavir,nelfinavir, amprenavir, lopinavir, enfuvirtida, entecavir,adefovir, famciclovir, ganciclovir, interferon, ribavirina,timosina-α, inibidores da quinase, inibidores datranscriptase reversa de nucleosídeo, inibidores datranscriptase reversa não nucleosídicos, inibidores deprotease viral, inibidores de entrada/fusão viral,inibidores de protease viral, análogos de nucleosídeo oucombinações destes.

Em alguns exemplos o polipeptídeo mutante, fragmentodeste que compreende uma mutação, ou mimetopo é codificadopor um oncogene, é um antígeno associado a tumor ou éexpresso por células cancerosas. Em alguns exemplos opolipeptídeo mutante, fragmento deste que compreende umamutação, ou mimetopo é MAGE, MAGE3, MAGEA6, MAGEAl0, NY-ESO-I, gplOO, tirosinase, EGFR, FGFR, PSA, PSMA, VEGF,PDGFR, Kit, PMSA, CEA, Her2/neu, Muc-I, hTERT, Marti, TRP-1, TRP-2, Bcr-Abl, ρ53, ρ73, Ras, PTENSrc, ρ38, BRAF,polipose adenomatosa, myc, proteína de νοη Hippel Iandau,Rb-I, Rb-2, BRACl, BRAC2, receptor androgênico, Smad4, MDRlou Flt3.

Era alguns exemplos o polipeptídeo mutante surge emresposta ao tratamento com um agente terapêutico e/ouprofilâtico direcionado selecionado de imatinib, gefitinib,erlotinib, inibidores da quinase, SB 203580, inibidores datirosina quinase, ou combinações destes.

São fornecidas aqui composições que compreendem umveículo de levedura e um polipeptídeo mutante, um fragmentodeste que compreende uma mutação ou um mimetopo ou ácidonucléico que codifica para um polipeptídeo mutante,fragmento deste que compreende uma mutação ou um mimetopo,era que o polipeptídeo mutante é conhecido por surgir ou porter surgido com pelo menos uma mutação específica emresposta à administração de um agente terapêutico e/ouprofilâtico direcionado. Em alguns exemplos a composiçãotambém compreende um excipiente farmaceuticaraenteaceitável. Em alguns exemplos a composição tambémcompreende pelo menos um adjuvante. Em outros exemplos oadjuvante é selecionado de um agonista de receptor Toll-like, seqüências CpG de dinucleotídeo, RNA de filamentoúnico ou duplo, adjuvante de Freund, uma porção lipídica,mananas, glucanos, sais baseados em alumínio, sais baseadosem cálcio, sílica, polinucleotídeos, toxóides, proteínasséricas, proteínas de revestimento viral, gama interferon,copolímeros, adjuvantes de Ribi, ou saponinas e seusderivados.

São fornecidos aqui métodos para desencadear umaresposta imune a um polipeptídeo mutante, um fragmentodeste que compreende uma mutação ou um mimetopo, ou acélula que compreende ácido nucléico que codifica umpolipeptídeo mutante e/ou expresse o polipeptídeo mutanteou um fragmento deste, em que o polipeptídeo mutante éconhecido por surgir ou por ter surgido com uma mutaçãoespecífica em resposta à administração de um agentemedicamentoso terapêutico e/ou profilático que compreende aadministração de uma quantidade eficaz de uma composiçãojunto com o agente, em que a composição compreende,

a. uma célula, vetor ou vírus que compreende ácidonucléico que codifica o polipeptídeo mutante;

b. uma célula, vetor ou vírus em associação com opolipeptídeo mutante;

c. o polipeptídeo mutante, ou um peptídeo (mimetopo) quedesencadeie uma resposta imune ao polipeptídeo mutante; ou

d. ácido nucléico que codifica o polipeptídeo mutante, ouácido nucléico capaz de se ligar ao ácido nucléico, como,por exemplo, siRNA ou RNA anti-senso;

em que uma quantidade eficaz da composição éadministrada junto com o agente.

Em alguns exemplos, a composição compreende um ou maisdos seguintes:

i) um veículo de levedura que compreende ácido nucléicoque codifica pelo menos um polipeptídeo mutante, umfragmento deste que compreende uma mutação, ou um mimetopo;

ii) um veículo de levedura que compreende pelo menos umpolipeptídeo mutante, um fragmento deste que compreende umamutação, ou um mimetopo;

iii) um veículo de levedura em associação com pelo menos umpolipeptídeo mutante, um fragmento deste que compreende umamutação, ou um mimetopo;

iv) um veículo de levedura que compreende ácido nucléicoque codifica pelo menos um polipeptídeo mutante, umfragmento deste que compreende uma mutação, ou um mimetopocarregado intracelularmente em uma célula dendrítica; ou

v) um veículo de levedura e pelo menos um polipeptídeomutante, um fragmento deste que compreende uma mutação, ouum mimetopo carregado intracelularmente em uma céluladendrítica, em que o polipeptídeo mutante é conhecido porsurgir ou por ter surgido com pelo menos uma mutaçãoespecífica em resposta à administração de um agenteterapêutico e/ou profilático direcionado.

Em alguns exemplos, a resposta imune é uma respostaimune celular. Em alguns exemplos, a resposta imune é umaresposta humoral. Em exemplos adicionais, a resposta imuneinclui tanto respostas imunes celulares quanto humorais. Emoutros exemplos, a composição também compreende umadjuvante, incluindo sem limitação, agonistas para umreceptor Toll-Iike (TLR); seqüências de nucleotídeos CpG;RNA de filamento único ou duplo; porções lipídicas, comolipopolissacarídeo (LPS); mananas e glucanos. Em algunsexemplos, a composição compreende um veículo de levedura.Em alguns exemplos, o veículo de levedura é uma levedurainteira, um esferoplasto de levedura, um citoplasto delevedura, uma levedura seca, ou um extrato ou fração demembrana de levedura subcelular destes. Em alguns exemploso veículo de levedura é obtido de levedura selecionada dogrupo que consiste em Saccharomyces, Schizosaccharomyces,Kluveromyces, Hansenulaf Candida e Piehia. Em algunsexemplos o veículo de levedura é obtido de Saccharomyces,como S. cerevisiae.

Em outros exemplos, o mamífero é um humano. Emexemplos adicionais, o polipeptídeo mutante é expresso poruma célula cancerosa ou é um polipeptídeo mutante viral,como, por exemplo, um polipeptídeo mutante de HIV, umpolipeptídeo mutante de HCV ou um polipeptídeo mutante deHBV.

São fornecidos aqui métodos para melhoria de umsintoma de uma doença em um mamífero, que compreende aadministração ao mamífero de uma quantidade eficaz de umacomposição junto com um agente terapêutico e/ouprofilático, em que um polipeptídeo mutante é conhecido porsurgir ou por ter surgido com uma mutação específica emresposta à administração do agente, em que a composiçãocompreende,

b. uma célula, vetor ou vírus em associação com opolipeptídeo mutante;

c. o polipeptídeo mutante, ou um peptídeo (mimetopo)que desperta uma resposta imune ao polipeptídeo mutante; ou

d. ácido nucléico que codifica o polipeptídeomutante, ou ácido nucléico capaz de se ligar ao ácidonucléico, como, por exemplo, siRNA ou RNA anti-senso; emque uma quantidade eficaz da composição é administradajunto com o agente. Em alguns exemplos a doença é associadacom o polipeptídeo mutante. Em alguns exemplos, a respostaimune é uma resposta imune celular. Em alguns exemplos aresposta imune é uma resposta humoral. Em outros exemplos,a resposta imune inclui tanto uma resposta imune celularquanto humoral.

Também são fornecidas aqui composições que compreendemum ou mais dos seguintes:

Em outros exemplos, a composição também compreende umadjuvante, que inclui, mas não se limita a, agonistas paraum receptor Toll-Iike (TLR); seqüências de nucleotídeosCpG; RNA de filamento único ou duplo; porções lipídicas,como lipopolissacarídeo (LPS); mananas e glucanos. Emalguns exemplos, a composição compreende um veículo delevedura. Em alguns exemplos, o veículo de levedura é umalevedura inteira, um esferoplasto de levedura, umcitoplasto de levedura, uma levedura seca, ou um extrato oufração de membrana de levedura subcelular destes. Em algunsexemplos o veículo de levedura é obtido de leveduraselecionada do grupo que consiste em SaccharomycesfSchizosaccharomyces, Kluveromyces, Hansenula, Candida ePiehia. Em alguns exemplos o veículo de levedura é obtidode Saccharomyees, como S. eerevisiae. Em alguns exemplos, oveículo de levedura é Saeeharomyees, como S. eerevisiae. Emoutros exemplos, o mamífero é um humano. Em exemplosadicionais, o polipeptídeo mutante é expresso por umacélula cancerosa ou é um polipeptídeo mutante viral, como,por exemplo, um polipeptídeo mutante de HIV, umpolipeptídeo mutante de HCV ou um polipeptídeo mutante deHBV.

São fornecidos aqui métodos para reduzir a resistênciaa um agente administrado a um mamífero em risco de doençaou infecção ou sujeito à doença ou infecção, sendo o agenteadministrado profilaticamente e/ou terapeuticamente, quecompreende a administração ao mamífero de uma quantidadeeficaz de uma composição junto com o agente, em que areferida composição compreende,

b. uma célula, vetor ou vírus em associação com opolipeptídeo mutante;

c. o polipeptídeo mutante, ou um peptídeo(mimetopo)que desperta uma resposta imune ao polipeptídeo mutante; ou

d. ácido nucléico que codifica o polipeptídeomutante, ou ácido nucléico, como siRNA ou RNA anti-sensoque se liga ao ácido nucléico,

em que uma quantidade eficaz da composição éadministrada junto com o agente. Em alguns exemplos, aresposta imune é uma resposta imune celular. Em exemplosadicionais, a resposta imune é uma resposta imune celular ehumoral.

Em outros exemplos, a composição também compreende umadjuvante, que inclui, mas não se limita a, agonistas paraum receptor Toll-Iike (TLR); seqüências de nucleotídeosCpG; RNA de filamento único ou duplo; porções lipidicas,como lipopolissacarideo (LPS); mananas e glucanos. Emalguns exemplos, a composição compreende um veiculo delevedura. Em alguns exemplos, o veículo de levedura é umalevedura inteira, um esferoplasto de levedura, umcitoplasto de levedura, uma levedura seca, ou um extrato oufração de membrana de levedura subcelular destes. Em algunsexemplos, o veículo de levedura é obtido de leveduraselecionada do grupo que consiste em Saccharomyces,Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Hansenula, Candida ePiehia. Em alguns exemplos, o veículo de levedura é obtidode Saccharomyees, como S. eerevisiae. Em alguns exemplos, oveículo de levedura é Saccharomyees, como S. eerevisiae. Emoutros exemplos, o mamífero é um humano. Em exemplosadicionais, o polipeptídeo mutante é expresso por umacélula cancerosa ou é um polipeptídeo mutante viral, como,por exemplo, um polipeptídeo mutante de HIV, umpolipeptídeo mutante de HCV ou um polipeptídeo mutante deHBV. Em alguns exemplos dos métodos, agentes medicamentosossão aqui revelados na Tabela I, II e III. Em outrosexemplos, um agente medicamentoso é um anticorpo oumolécula pequena direcionada a uma célula cancerosa, umacélula que tem câncer ou uma célula que expressa um vírus,ou vários vírus.

São fornecidas aqui composições capazes de desencadearuma resposta imune celular que compreendem um vetor ouvírus associado com um polipeptídeo mutante, em que opolipeptídeo mutante é conhecido por surgir ou por tersurgido em resposta à administração de um agenteterapêutico e/ou profilático. Em alguns exemplos, acomposição compreende um veículo de levedura. Em algunsexemplos, o veículo de levedura é uma levedura inteira, umesferoplasto de levedura, um citoplasto de levedura, umalevedura seca, ou um extrato ou fração de membrana delevedura subcelular destes. Em alguns exemplos o veículo delevedura é obtido de levedura selecionada do grupo queconsiste em Saccharomyces, Schizosaccharomyces,Kluveromyces, Hansenulaf Candida e Piehia. Em algunsexemplos o veículo de levedura é obtido de Saccharomyees,como S. eerevisiae. Em outros exemplos, a composiçãocompreende um veículo de levedura que compreende ácidonucléico que codifica um polipeptídeo mutante, um fragmentodeste que compreende uma mutação ou um mimetopo. Em algunsexemplos, a composição compreende um ou mais dos seguintes:

ii) um veículo de levedura que compreende pelo menos umpolipeptídeo mutante, um fragmento deste que compreende umamutação, ou um mimetopo;iii) um veículo de levedura em associação com pelo menos umpolipeptídeo mutante, um fragmento deste que compreende umamutação, ou um mimetopo;

v) um veículo de levedura e pelo menos um polipeptídeomutante, um fragmento deste que compreende uma mutação, ouum mimetopo carregado intracelularmente em uma céluladendrítica, em que o polipeptídeo mutante é conhecido porsurgir ou por ter surgido com pelo menos uma mutaçãoespecífica em resposta à administração de um agenteterapêutico e/ou profilático direcionado. Ainda em outrosexemplos, o polipeptídeo mutante é expresso por uma célulacancerosa. Ainda em outros exemplos, o polipeptídeo mutanteé um polipeptídeo mutante viral. Em exemplos adicionais, acomposição também compreende um adjuvante, que inclui, masnão se limita a, agonistas para um receptor Toll-Iike(TLR) ; seqüências de nucleotídeos CpG; RNA de filamentoúnico ou duplo; porções lipídicas, como lipopolissacarídeo(LPS); mananas e glucanos. São aqui fornecidas células,como células dendríticas que compreendem uma composiçãocomo aqui descrita.

são fornecidos aqui métodos para a preparação de umveículo de levedura que compreende um ácido nucléico quecodifica um polipeptídeo mutante, um fragmento deste quecompreende uma mutação, ou um mimetopo, em que opolipeptídeo mutante é conhecido por surgir ou por tersurgido com pelo menos uma mutação específica em resposta àadministração de um agente terapêutico e/ou profiláticodirecionado e em que o ácido nucléico é transfectado noveículo de levedura por uma técnica selecionada do grupoque consiste em difusão, transporte ativo, sonificação,eletroporação, microinjeção, lipofecção, adsorção e fusãode protoplasto. São fornecidos aqui métodos de preparaçãode um veículo de levedura que compreende um polipeptídeomutante, um fragmento deste que compreende uma mutação, ouum mimetopo, em que o polipeptídeo mutante é conhecido porsurgir ou por ter surgido com pelo menos uma mutaçãoespecífica em resposta à administração de um agenteterapêutico e/ou profilático direcionado e em que opolipeptídeo mutante, fragmento deste que compreende umamutação, ou mimetopo é colocado ou associado com o veículode levedura por uma técnica selecionada do grupo queconsiste em difusão, transporte ativo, fusão de lipossomo,sonificação, eletroporação, fagocitose, lipofecção, ciclode congelamento/descongelamento, entrecruzamento químico,ligação ou mistura biológica. Em alguns métodos, o veículode levedura é carregado intracelularmente em uma céluladendrítica ou um macrófago. Em outros métodos, o veículo delevedura é carregado intracelularmente em uma céluladendrítica.

São aqui fornecidos usos de uma composição napreparação de um medicamento. Em adição, são fornecidosusos de uma composição na preparação de um medicamento paradesencadear uma resposta imune a um polipeptídeo mutante,um fragmento deste que compreende uma mutação, ou ummimetopo em um mamífero. Em alguns exemplos, o medicamentoé para desencadear uma resposta imune a um polipeptídeomutante, um fragmento deste que compreende uma mutação, ouum mimetopo em um mamífero junto com um agente terapêuticoe/ou profilático direcionado. Em outros exemplos, omedicamento é para uso no tratamento de uma doença, em quea doença é associada a um polipeptídeo mutante que surgiuem resposta à administração de um agente terapêutico e/ouprofilático direcionado. Ainda em outros exemplos, omedicamento é para uso na melhoria de um sintoma de umadoença, em que a doença é associada a um polipeptídeomutante que surgiu em resposta à administração de um agenteterapêutico e/ou profilático direcionado. Em algunsexemplos, o medicamento é para uso na redução daresistência a um agente administrado a um mamífero em riscode doença ou infecção ou sujeito à doença ou infecção, emque a doença ou infecção está associada a um polipeptídeomutante que surgiu em resposta à administração de um agenteterapêutico e/ou profilático direcionado.

Também são aqui fornecidos kits que compreendem acomposição conforme acima descrita. Em alguns exemplos, umkit para desencadear uma resposta imune a um polipeptídeomutante, um fragmento deste que compreende uma mutação, ouum mimetopo em um mamífero compreende um veículo delevedura e pelo menos um polipeptídeo mutante, fragmentosdestes que compreende uma mutação, ou mimetopos. Em outrosexemplos o kit compreende a composição compreendendo um oumais dos seguintes:

i) um veículo de levedura que compreende ácido nucléico quecodifica pelo menos um polipeptídeo mutante, um fragmentodeste que compreende uma mutação, ou um mimetopo;

v) um veículo de levedura e pelo menos um polipeptídeomutante, um fragmento deste que compreende uma mutação, ouum mimetopo carregado intracelularmente em uma céluladendrítica,

em que o polipeptídeo mutante é conhecido por surgirou por ter surgido com pelo menos uma mutação específica emresposta à administração de um agente terapêutico e/ouprofilático direcionado. Em alguns exemplos o kit tambémcompreende um agente terapêutico e/ou profiláticodirecionado e/ou material de instruções para o uso do kit.

Breve descrição dos desenhos

Não aplicável.

Descrição detalhada da invenção

Há uma necessidade por agentes medicamentososprofiláticos e terapêuticos que especificamente visa viasque são únicas a células tumorais e vírus, mas há umadesvantagem em que as células tumorais e vírus passam pormutação(ões) o que permite que eles escapem do agentemedicamentoso(s) e/ou se tornem resistentes. São fornecidasaqui composições e métodos para desencadear uma respostaimune a um polipeptídeo mutante que é conhecido por surgirou por ter surgido em resposta a um agente medicamentosodirecionado, ou a uma célula que expressa o polipeptídeomutante. Em alguns exemplos, a resposta imune é umaresposta imune celular, em alguns exemplos a resposta imuneé uma resposta humoral, e em outro exemplo a resposta imuneé tanto celular quanto humoral. Em alguns exemplos, aresposta imune celular é para eliminar a célula, como, porexemplo, uma célula cancerosa, uma célula que sustenta aprogressão do tumor ou uma célula que expressa um vírus,que escapou do controle e compreende mutações nopolipeptídeo visado pelo agente medicamentoso, mas aeliminação da célula não é necessária. Em alguns exemplos,a resposta imune celular e/ou humoral bloqueará aproliferação da célula ou replicação viral.

Assim sendo, são fornecidos aqui métodos paradesencadear uma resposta imune a um polipeptídeo mutante,ou uma célula que compreende ácido nucléico que codifica umpolipeptídeo mutante e/ou expressa um polipeptídeo mutante,que é conhecido por surgir ou por ter surgido com umamutação específica em resposta à administração de um agenteterapêutico e/ou profilático(s). Em alguns exemplos, aresposta imune é uma resposta imune celular. Em algunsexemplos a resposta imune é uma resposta imune humoral. Emoutros exemplos a resposta imune inclui tanto uma respostaimune celular quanto humoral. Em alguns exemplos, umpolipeptídeo mutante é codificado por um oncogene e/ou éexpresso por uma célula cancerosa. Em alguns exemplos, umpolipeptídeo mutante é associado com ou expresso por umacélula cancerosa. Em alguns exemplos, o agente édirecionado à célula cancerosa. Em alguns exemplos, oagente é uma molécula pequena ou anticorpo. Em outrosexemplos, um polipeptídeo mutante é codificado por um víruse/ou é expresso por uma célula que é infectada com umvírus. Em alguns exemplos, o polipeptídeo mutante écodificado por um vírus patogênico, como, por exemplo, HIV,HCV ou HBV. Em alguns exemplos, o agente é direcionado aovírus ou célula que expressa o vírus.

São fornecidos aqui métodos para desencadear umaresposta imune a um polipeptídeo mutante, ou a célula quecompreende ácido nucléico que codifica um polipeptídeomutante e/ou expresse o polipeptídeo mutante, em que opolipeptídeo mutante é conhecido por surgir ou por tersurgido com uma mutação específica em resposta àadministração de um agente terapêutico e/ou profilático(s)que compreende a administração de uma quantidade eficaz deuma composição junto com o agente, em que a composiçãocompreende,

b. uma célula, vetor ou vírus em associação com opolipeptídeo mutante;

d. ácido nucléico que codifica o polipeptídeomutante, ou ácido nucléico capaz de se ligar ao ácidonucléico, como, por exemplo, siRNA ou RNA anti-senso;

em que uma quantidade eficaz da composição éadministrada junto com o agente.

Em alguns exemplos, a composição compreende um ou maisdos seguintes:i) um veículo de levedura que compreende ácido nucléico quecodifica pelo menos um polipeptídeo mutante, um fragmentodeste que compreende uma mutação, ou um mimetopo;

em que o polipeptídeo mutante é conhecido por surgirou por ter surgido com pelo menos uma mutação específica emresposta à administração de um agente terapêutico e/ouprofilático direcionado.

Em alguns exemplos, a composição é capaz dedesencadear uma resposta imune celular. Em alguns exemplos,a composição é capaz de desencadear uma resposta humoral.

Em outros exemplos, a resposta imune celular tambémcompreende uma resposta imune humoral.

Em alguns exemplos dos métodos, a composiçãocompreende um adjuvante. Ainda em outros exemplos, acomposição também compreende um agonista ou ligante para umReceptor Toll-Iike. Em outros exemplos, a composiçãocompreende um veículo de levedura. Ainda em outrosexemplos, a composição compreende uma seqüência CpG. Emoutros exemplos, a célula é uma célula dendrítica.

São fornecidos aqui métodos para melhoria de umsintoma de uma doença em um mamífero, que compreendem aadministração ao mamífero de uma quantidade eficaz de umacomposição junto com um agente terapêutico e/ouprofilático, em que um polipeptídeo mutante é conhecido porsurgir ou por ter surgido com uma mutação específica emresposta à administração do agente, em que a composiçãocompreende,

b. uma célula, vetor ou vírus em associação com opolipeptídeo mutante;

d. ácido nucléico que codifica o polipeptídeomutante, ou ácido nucléico capaz de se ligar ao ácidonucléico, como, por exemplo, siRNA ou RNA anti-senso; emque uma quantidade eficaz da composição é administradajunto com o agente.

Em alguns exemplos, a composição compreende um ou maisdos seguintes:

Em alguns exemplos, a composição é capaz dedesencadear uma resposta imune celular. Em alguns exemplos,a composição desperta uma resposta imune humoral. Em outrosexemplos, a resposta imune celular também compreende umaresposta imune humoral.

Em alguns exemplos, o mamífero tem risco de contrair adoença e é administrado com o agente profilaticamente; emoutros exemplos, o mamífero é submetido a uma doença e oagente é administrado terapeuticamente. Em alguns exemplosa doença é câncer e em outros exemplos a doença é umadoença infecciosa causada por um vírus patogênico, como,por exemplo, HIV, HCV e HBV.

Também são aqui fornecidas células, vetores, vírus,composições, como composições imunogênicas, e kits quecompreendem um polipeptídeo mutante, ou ácido nucléico quecodifica o polipeptídeo mutante, que é conhecido por surgirou por ter surgido com uma mutação específica em resposta àa agente terapêutico e/ou profilático(s). Em algunsexemplos, a composição é capaz de desencadear uma respostaimune quando administrada a um mamífero. Em algunsexemplos, a composição é capaz de desencadear a respostaimune celular quando administrada a um mamífero. Em algunsexemplos, a composição é capaz de desencadear uma respostaimune humoral quando administrada a um mamífero. Em outrosexemplos, a composição é capaz de desencadear a respostaimune celular e humoral quando administrada a um mamífero.

São aqui fornecidos veículos de levedura, que incluemvetores de levedura; composições baseadas em levedura; emétodos para desencadear uma resposta imune a umpolipeptídeo mutante, ou a célula que compreende ácidonucléico que codifica o polipeptídeo mutante e/ou queexpressa o polipeptídeo mutante, que é conhecido por surgirou por ter surgido com uma mutação específica em resposta aum agente terapêutico e/ou profilático(s). Em algunsexemplos, o veículo de levedura compreende ácido nucléicoque codifica um polipeptídeo mutante(s). Em algunsexemplos, o veículo de levedura compreende ácido nucléicoque expressa um polipeptídeo mutante(s). Em outrosexemplos, o veículo de levedura é em associação com opolipeptídeo mutante. Em alguns exemplos, o veículo delevedura é carregado em uma célula transportadora, porexemplo, uma célula dendrítica ou um macrófago também sãofornecidos aqui métodos para fazer tais veículos deleveduras e composições baseadas em levedura que oscompreendem.

Técnica Geral

A prática da presente invenção empregará, a menos queindicado de outra forma, técnicas convencionais de biologiamolecular (incluindo técnicas recombinantes), imunologia,biologia celular, e bioquímica que estão dentro dahabilidade da técnica. Tais técnicas são explicadascompletamente na literatura, como, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, terceira edição (Sambrook e cols.,2001); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel ecols., eds., 1987 e atualizações anuais); FundamentalVirology, segunda edição (ed. Fields e cols. Raven press) eCurrent Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., NY).

Como aqui usado, as formas singulares "um", "uma" e"a/o" incluem referências no plural a menos queexplicitamente determinado em contrário.

Como aqui usado, "câncer" inclui, mas não é limitado amelanomas, carcinoma de célula escamosa, cânceres de mama,carcinomas da cabeça e pescoço, carcinomas da tireóide,sarcomas de tecidos moles, sarcoma ósseo, câncerestesticulares, cânceres prostáticos, cânceres ovarianos,cânceres da bexiga, cânceres da pele, cânceres cerebrais,angiossarcomas, hemangiossarcomas, tumores de mastócitos,cânceres hepáticos primários, cânceres pulmonares, câncerespancreáticos, cânceres gastrointestinais, carcinomas decélula renal, neoplasias hematopoiéticas, e cânceresmetastáticos destes.

Como aqui usado, "doença infecciosa" refere-se àdoença causada por agentes infecciosos como virus de RNAincluindo, sem limitação, Retrovirus (como, por exemplo,HIV) , Flavivírus (como, por exemplo, HCV), Reovirus,

Picornavirus, Coronavirus, Filovírus, Rabdovxrus,Buniavirus, Ortomixovirus, Paramixovirus, Arenavirus,Calicivirus; e DNA virus que pertencem às famílias deHepadnavirus (como, por exemplo, HBV), Herpesvírus,Poxvirus, Adenovírus, Parvovirus, e Papovavirus.

Como aqui usado, um "agente" ou "agente medicamentoso"terapêutico e/ou profilático que é direcionado a uma célulaou vírus significa que o agente é direcionado a umamolécula associada ou funcional para causar a transformaçãode uma célula ou sustentar a progressão de um tumor, nocaso de câncer, ou associada ou funcional para promover ousustentar infecção viral ou replicação viral. Exemplos deagentes terapêuticos e/ou profiláticos que são designadospara serem direcionados a uma célula, como uma célulacancerosa ou célula que expressa um vírus, ou vírus sãoaqui revelados e são conhecidos na técnica.

Como aqui usado, a "polipeptídeo mutante" engloba umpolipeptídeo codificado de comprimento total em um genomabem como um fragmento deste desde que o fragmentocompreenda uma mutação que é conhecida por surgir ou porter surgido com uma mutação específica em resposta a umagente, como um agente profilático e/ou terapêutico. Taispolipeptídeos mutantes que surgem com uma mutaçãoespecifica em resposta a um agente, como um agenteprofilático e/ou terapêutico direcionado a uma célula, comouma célula cancerosa ou célula que expressa vírus, ouvírus, são geralmente referidas na técnica como "mutantesde escape". Uma mutação pode ser encontrada em qualquerregião de um polipeptídeo de comprimento total e podeincluir uma substituição, inserção ou deleção de aminoácidoou combinação destes, ou fusão de seqüências nãoseqüenciais, como encontradas em eventos de translocação.Em alguns exemplos, um polipeptídeo mutante que é conhecidopor surgir ou por ter surgido com uma mutação específica emresposta a um agente é imunogênico em si, ou seja, sem serassociado com um adjuvante, ou outro vetor ou veículo, comoum veículo de levedura, mas isso não é necessário. Emoutros exemplos, um polipeptídeo mutante que é conhecidopor surgir ou por ter surgido em resposta a um agente éimunogênico em associação com um adjuvante que promove suaantigenicidade.

Como aqui usado, "adjuvantes" incluem, por exemplo, umligante de agonista para um receptor Toll-Iike (TLR) quedesencadeia respostas de citocina de imunidade inata, e quesão relatados por estarem associados com maturação eativação de células que apresentam antígeno (APC);seqüências de nucleotídeos CpG; RNA de filamento único ouduplo (agonistas de TLR7); porções lipídicas, comolipopolissacarídeo (LPS) ; mananas e glucanos, constituintesde levedura (que são relatados por funcionar através deinteração com TLRs 2, 4 e 6); e veículos de levedura, comoaqueles aqui descritos.

A administração de um polipeptídeo mutante ou ácidonucléico que codifica o polipeptídeo mutante (que pode serproduzido por qualquer um dos métodos aqui revelados ouconhecidos na técnica) "em conjunto" com o agente não devesignificar que o polipeptídeo mutante e agente estão sendoadministrados simultaneamente, embora isso seja englobadonos métodos aqui revelados. Um polipeptídeo mutante podeser administrado antes, concomitante ou após aadministração do agente, ou uma combinação dos acima. Umpolipeptídeo mutante ou ácido nucléico que codifica opolipeptídeo mutante pode ser administrado horas, dias oumeses depois do agente. Em alguns exemplos, a administraçãode um polipeptídeo mutante ou ácido nucléico que codifica opolipeptídeo mutante (que pode ser produzido por qualquerum dos métodos aqui revelados ou conhecidos na técnica) éanterior à administração do agente, e pode seradicionalmente administrado após a administração do agente,em particular se o agente é conhecido por interferirdiretamente ou indiretamente com a proliferação de qualquertipo de célula.

Como aqui usado, um "mime topo" refere-se a umpolipeptídeo que é capaz de imitar· a capacidade de umpolipeptídeo mutante de desencadear uma resposta imune, eem alguns exemplos, uma resposta imune celular e /ouhumora1, ao polipeptídeo mutante ou célula que expressa opolipeptídeo mutante. Como aqui usado um "mimetopo" inclui,sem limitação, um peptídeo que imita um ou mais epitopos deuma proteína de polipeptídeo mutante que é conhecida porsurgir ou por ter surgido com uma mutação específica emresposta à administração de um agente terapêutico e/ouprofilático; porções imunogênicas não proteináceas de umpolipeptídeo mutante (por exemplo, estruturas decarboidrato); e moléculas orgânicas sintéticas ou naturais,que incluem ácidos nucléicos, que têm uma estrutura similara pelo menos um epitopo do polipeptídeo mutante. Taismimetopos podem ser desenhados com o uso de estruturasgeradas em computador de polipeptídeos mutantes. Mimetopostambém podem ser obtidos por geração de amostras aleatóriasde moléculas como oligonucleotídeos, peptídeos ou outrasmoléculas orgânicas, e rastreamento de tais amostras parasua capacidade de desencadear uma resposta imune, como, porexemplo, uma resposta imune celular, por métodos e ensaioscomo aqui descritos e conhecidos na técnica.

Como aqui usado, "melhoria de um sintoma de uma doençaou infecção" inclui alívio, estabilização, reversão,retardo ou desaceleração de qualquer sintoma e/ouprogressão de um estado de doença, que pode ser medido porcritérios clínicos e/ou subclínicos.

Em alguns exemplos, uma "quantidade eficaz" de umpolipeptídeo mutante (ou mimetopo deste), ou ácido nucléicoque codifica o polipeptídeo mutante refere-se a umaquantidade capaz de desencadear uma resposta imune quandoadministrada a um mamífero. Em alguns exemplos, a respostaimune é uma resposta imune celular. Em outros exemplos aresposta imune é uma resposta humoral. Em alguns exemplos aresposta imune é uma resposta celular e humoral.

Como aqui usado, "mamífero" ou "hospedeiro demamífero" inclui primatas humanos e não humanos comochimpanzés e outros macacos e espécies de macacos; animaisde fazenda como gado, carneiro, porcos, cabras e cavalos;mamíferos domésticos como cães e gatos; animais delaboratório que incluem roedores como camundongos, ratos eporquinhos da índia; pássaros, incluindo pássarosdomésticos, selvagens e outros pássaros de caça comogalinhas, perus e outros pássaros galináceos, patos, gansose outros. O termo não denota uma idade particular. Destemodo, indivíduos adultos, juvenis, e recém-nascidos devemestar incluídos, bem como mamíferos pré-natais.

Um "antígeno" refere-se a uma molécula que contém umou mais epitopos (lineares, conformacionais ou ambos) oudeterminantes imunogênicos que estimularão um sistema imunedo hospedeiro, com um sistema imune de um mamífero, pararealizar uma resposta humoral específica para antígeno e/oucelular específica para antígeno. Um antígeno pode ser um"imunógeno" por si ou junto com um agente que promova suaantigenicidade. O termo «antígeno» inclui proteína inteira,proteína truncada, fragmento de uma proteína e peptídeo.

Antígenos podem ser de ocorrência natural, ou variantesgeneticamente construídos da proteína. O termo "antígeno»inclui subunidades de antígenos, (ou seja, antígenos quesão separados e distintos de um organismo total com o qualo antígeno é associado na natureza). Anticorpos comoanticorpos anti-idiotipo, ou fragmentos destes, e mimetoposde peptídeo sintético, que são peptídeos sintéticos quepodem imitar um antígeno ou determinante antigênico, sãotambém abrangidos pela definição de antígeno como aquiusado. Em alguns exemplos, antígeno engloba um polipeptídeomutante ou é capaz de ser obtido partir de um polipeptídeomutante que é conhecido por surgir ou por ter surgido comuma mutação específica em resposta a um agente profiláticoe/ou terapêutico, e pode ser de ocorrência natural ousintético. Um antígeno pode ser tão pequeno quanto umepitopo único, ou maior, e pode incluir múltiplos epitopos.

Como tal, o tamanho de um antígeno pode ser tão pequenoquanto cerca de 5-12 aminoácidos (por exemplo, um peptídeo)e tão grande quanto uma proteína de comprimento total,incluindo multímeros e proteínas de fusão, proteínasquiméricas, células inteiras, microorganismos inteiros, ouporções destes (por exemplo, lisados de células inteiras ouextratos de microorganismos). Deve-se observar que emalguns exemplos (ou seja, quando o antígeno é expresso porum vetor, como um vetor de levedura, ou vírus de umamolécula de ácido nucléico recombinante), o antígenoinclui, sem limitação, uma proteína, ou fragmento desta,proteína de fusão, proteína quimérica, multímeros, em vezde uma célula inteira ou microorganismo.

Como aqui usado, "epitopo" é aqui definido como umsítio antigênico único em um dado antígeno que é suficientepara desencadear uma resposta imune, que pode ser umaresposta imune celular e/ou humoral. Aqueles habilitados natécnica reconhecerão que epitopos de célula T sãodiferentes em tamanho e composição de epitopos de célula B,e que epitopos apresentados através da via do complexo dehistocompatibilidade principal de Classe I (MHC) diferemdos epitopos apresentados através da via de MHC de ClasseII. Geralmente, um epitopo de célula B incluirá pelo menoscerca de 5 aminoácidos mas pode ser tão pequeno quanto 3-4aminoácidos. Um epitopo de célula T, como um epitopo deIinfócito T citotóxico (LTC), incluirá pelo menos cerca de7-9 aminoácidos, e ura epitopo de célula T helper pelo menoscerca de 12-20 aminoácidos. Normalmente, um epitopoincluirá entre cerca de 7 e 15 aminoácidos, como, 8, 9, 10,12 ou 15 aminoácidos.

Como aqui usado, uma "resposta imunológica" ou"resposta imune" a um polipeptídeo mutante (ou mimetopodeste) ou ácido nucléico que codifica o polipeptídeo (ouácido nucléico capaz de se ligar ao polipeptídeo mutante,como, por exemplo, siRNA ou RNA anti-senso), ou composiçãoque compreende um polipeptídeo ou ácido nucléico, inclui odesenvolvimento em um mamífero de uma resposta imunecelular que reconhece o polipeptídeo. Em alguns exemplos, aresposta imune é uma resposta imune humoral. Em algunsexemplos, a resposta imune celular adicionalmente incluiuma resposta imune humoral. A resposta imune pode serespecífica ao polipeptídeo mutante, mas isso não énecessário. A resposta imune que é desperta pelaadministração de um polipeptídeo mutante, ou ácido nucléicoque codifica o polipeptídeo, pode ser qualquer aumentodetectável em qualquer faceta de uma resposta imune (porexemplo, resposta celular, resposta humoral, produção decitocina), quando comparada à resposta imune na ausência daadministração de o polipeptídeo ou ácido nucléico. Umaresposta imune pode ser uma resposta específica parapolipeptídeo mutante, mas isso não é necessário. Sãoenglobadas na presente invenção composições em associaçãocom um polipeptídeo mutante (ou mimetopo deste), ou ácidonucléico que codifica o polipeptídeo mutante que despertauma resposta imune.

Como aqui usado, uma "resposta imune humoral" refere-se a uma resposta imune mediada por moléculas de anticorpoou imunoglobulinas. Moléculas de anticorpo da presenteinvenção incluem as classes de IgG (bem como subtipos IgGl,IgG2a, e IgG2b) , IgM, IgA, IgD, e IgE. Anticorposfuncionalmente incluem anticorpos de resposta imuneprimária bem como respostas de anticorpo de memória ouanticorpos de neutralização de soro. Com relação à doençainfecciosa, anticorpos da presente invenção podem servirpara, mas não são necessários para, neutralizar ou reduzira infectuosidade do vírus que codifica o polipeptídeomutante, e/ou mediar anticorpo-complemento, oucitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) aopolipeptídeo mutante.

Como aqui usado, uma "resposta imune celular" é umamediada por linfócitos T e/ou outros leucócitos, incluindo,sem limitação, células natural killers (NK) e macrófagos.Linfócitos T da presente invenção incluem células T queexpressam subunidade de receptor de célula T alfa/beta oureceptor gama/delta que expressa células T e podem sercélulas T efetoras ou supressoras.

Como aqui usado, "linfócitos T" ou "células T" sãolinfócitos que não produzem anticorpo que constituem umaparte da via mediada por célula do sistema imune. Células Tsurgem de linfócitos imaturos que migram da medula ósseapara o timo, onde passam por um processo de maturação sob adireção de hormônios tímicos. Células T em maturação setornam imunocompetentes baseadas em sua capacidade dereconhecer e de se ligar a um antígeno específico. Aativação de células t imunocompetentes é realizada quandoum antígeno se liga a receptores de superfície de umIinfócito. É conhecido que para gerar respostas de célulaΤ, o antígeno deve ser sintetizado ou introduzido nascélulas, subseqüentemente processados em pequenos peptídeospelo complexo de proteossomo, e translocados na viasecretora de reticulo endoplasmático/complexo de Golgi paraeventual associação com proteínas da classe I de complexode histocompatibilidade principal (MHC). Alternativamente,antígenos de peptídeo podem ser introduzidos do exterior decélulas para deslocar peptídeos já ligados em receptoresMHC-I ou MHC- II. Imunidade funcionalmente celular incluilinfócitos T citotóxicos específicos para antígeno (LTC).

Como aqui usado, "células T killer específicas paraantígeno", "LTC", ou "células T citotóxicas" como aquiusado refere-se a células que têm especificidade porantígenos de peptídeo apresentados em associação comproteínas do MHC ou antígenos de leucócitos humanos (HLA)uma vez que as proteínas são referidas em humanos. LTCs dapresente invenção incluem LTC ativados que foramdespertados por antígeno específico no contexto de MHC; eLTC de memória ou LTC de lembrança para referir-se acélulas T que se tornaram reativadas como um resultado denova exposição a antígeno bem como LTC de reação cruzada ouciado cruzado. LTCs da presente invenção incluem células TCD4+ e CD8+. LTCs ativados específicos para antígeno dapresente invenção promovem a destruição e/ou Iise decélulas do indivíduo infectadas com o patógeno ao qual osLTCs são específicos, bloqueando a entrada do patógeno viasecreção de quimiocinas e citocinas incluindo, semlimitação, proteína Ia inflamatória de macrófago (MIP-Ia),MIP-IB, e RANTES; e secreção de fatores solúveis quesuprimem infecções. A imunidade celular da presenteinvenção também se refere à resposta específica de antígenoproduzida pelo subconjunto T helper de células T. Células Thelper agem ajudando a estimular a função, e focalizam aatividade de células efetoras não específicas contracélulas que apresentam peptídeo em associação com moléculasde MHC em sua superfície. A resposta imune celular tambémse refere à produção de citocinas, quimiocinas e outrasmoléculas produzidas por células T ativadas e/ou outrosleucócitos incluindo aquelas derivadas de células T CD4 eCD8 e células NK. A composição que desperta uma respostaimune celular pode servir para sensibilizar um mamíferopela apresentação do polipeptídeo em associação commoléculas de MHC na superfície da célula. A resposta imunemediada por célula é direcionada, ou próxima, a células queapresentam antígeno em sua superfície. Além disso,linfócitos T específicos para antígeno podem ser geradospara permitir a futura proteção de um hospedeiro imunizado.

A capacidade de um polipeptídeo ou antígeno particularde estimular uma resposta imunológica mediada por célulapode ser determinada por inúmeros ensaios conhecidos natécnica, como por ensaios de linfoproliferação (ativação delinfócito) , ensaios de morte de LTC, ou por análise delinfócitos T específicos para o antígeno em um indivíduosensibilizado. Tais ensaios são bem conhecidos na técnica.Veja, por exemplo, Erickson e cols., J. Immunol. (1993)151:4189-4199; Doe e cols., Eur. J. Immunol. (1994)24:2369-2376. Outros métodos de medição de respostas imunesmediadas por célula incluem a medição de citocinasintracelulares ou secreção de citocina por populações decélula T ou por medição de células T específicas paraepitopo (por exemplo, pela técnica de tetrâmero) (revisadapor McMichael, A. J., e 0'Callaghan, C. A., J. Exp. Med.187(9)1367-1371, 1998; Mcheyzer-Williams, M. G., et al,Immunol. Rev. 150:5-21, 1996; Lalvani, A., et al, J. Exp.Med. 186:859-865, 1997).

Como aqui usado, uma "resposta imunológica", ou"resposta imune" engloba uma que estimula a produção deLTCs, e/ou a produção ou ativação de células T helper e/ouuma resposta imune mediada por anticorpo. "Linfócitos T" ou"células T" são linfócitos não produtores de anticorpo queconstituem uma parte da via mediada por célula do sistemaimune. Células T surgem de linfócitos imaturos que migramda medula óssea para o timo, onde passam por um processo dematuração sob a direção de hormônios tímicos. Aqui, oslinfócitos maduros rapidamente se dividem aumentado para umgrande número. As células T em maturação se tornamimunocompetentes baseado em sua capacidade de reconhecer ede se ligar a um antígeno específico. A ativação de célulasT imunocompetentes é realizada quando um antígeno se liga areceptores de superfície de um linfócito no contexto deapresentação por receptores MHC/HLA e co-receptores.

Como aqui usado, uma "composição imunogênica" é umacomposição que compreende um polipeptídeo mutante (oumimetopo deste) ou ácido nucléico que codifica opolipeptídeo mutante que é conhecido por surgir ou por tersurgido com uma mutação específica em resposta à agenteterapêutico e/ou profilático, e pode ou não compreender umadjuvante que promove a antigenicidade de um polipeptídeomutante, em que a administração de uma composição a ummamífero resulta no desenvolvimento de uma resposta imunecelular, uma resposta imune humoral ou a resposta imunecelular e humoral. Uma composição imunogênica inclui umacomposição que é capaz de desencadear uma resposta imunecelular protetora, mas isso não é necessário.

Como aqui usado, "composição profilática" refere-se auma composição administrada a um mamífero ou hospedeiro queé "imunologicamente não agressivo" ou que não foipreviamente exposto ao antígeno do patógeno ou um que nãogerou uma resposta imune eficaz ao patógeno para prevenir adoença, como câncer e infecção ou re-infecção (no entanto,a presente invenção não requer que a infecção ou re-infecção seja completamente evitada). Composiçõesprofiláticas da presente invenção não geram necessariamenteimunidade de esterilização no hospedeiro ou indivíduo aoqual elas foram administradas.

Como aqui usado, "composição terapêutica" refere-se auma composição administrada a um indivíduo ou hospedeiroque é sujeito a câncer ou foi infectado com um vírus, nocaso de doença infecciosa, e em alguns exemplos, progrediupara um estado de doença.

Como aqui usado, o termo "imunização", "imunizar" ou"imunizado", refere-se ao processo de administração de umacomposição imunogênica a um mamífero ou hospedeiro em umaquantidade eficaz para induzir uma resposta imune àcomposição. Em alguns exemplos, a resposta imune inclui umaresposta imune celular, por exemplo, uma resposta de célulaT citotóxica. Em alguns exemplos, a resposta imune incluiuma resposta humoral, por exemplo, produção de anticorpo.

Em alguns exemplos, a resposta imune inclui tanto umaresposta celular quanto humoral.

Vetores e Composições

São aqui fornecidos vetores, como, por exemplo,vetores de bactéria, virais, de inseto e de levedura quecompreendem ácido nucléico que codifica um polipeptídeomutante que é conhecido por surgir ou por ter surgido comuma mutação especifica em resposta a um agente. Sãofornecidas aqui composições que compreendem tais vetores evirus em associação com o polipeptídeo mutante. Taisvetores e vírus incluem, sem limitação, vetoresbacterianos, DNA de plasmídeo, vetores de levedura eveículos, rAAV, adenovírus, pox vírus de canário, poxvírus, vaccínia vírus, vaccinia Ankara modificado (MVA),alfavírus, rabdovírus, vírus da encefalite eqüina daVenezuela, e baculovírus e podem ser produzidos por métodosrotineiros na prática médica. Inúmeros sistemas baseados emvírus foram desenvolvidos para transferência de gene emcélulas de mamífero. Por exemplo, o ciclo de vida egenética de AAV são revisados em Muzyczka, Current Topicsin Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).Revelação adicional sobre sistemas de AAV são fornecidos,por exemplo, em RO Snyder, e cols., Human Gene Therapy8:1891-1900, 1997; D Duan, e cols., J.Virol. 8568-8577,1998; Duan D, e cols., J Virol. 73:161-169, 1999; NVincent-Lacaze, e cols., J Virol. 73:1949-1955, 1999; CMcKeon, e cols., NIDDK Workshop on AAV Vectors: Genetransfer into quiescent cells. Human Gene Therapy 7:1615-1619, 1996; H Nakai, e cols., J Virol 75:6969-6976, e 2001;BC Schnepp, e cols., J. Virol. 2003 77: 3495-350. Sistemasde AAV são descritos, por exemplo, em Pat. U.S. No.5.786.211; Pat. U.S. No. 5.871.982; e Pat. U.S. No.6.258.595. Inúmeros vetores de adenovírus e sistemas deexpressão foram descritos. Veja, por exemplo, Haj-Ahmad eGraham, J. Virol. (1986) 57:267-274; Bett e cols., J.Virol. (1993) 67:5911-5921; Mittereder e cols., Human GeneTherapy (1994) 5:717-729; Seth e cols., J. Virol. (1994)68:933- 940; Barr e cols., Gene Therapy (1994) 1:51-58;Berkner, K. L. BioTechniques (1988) 6:616- 629; e Rich ecols., Human Gene Therapy (1993) 4:461-476). Vacinas depoxvirus são descritas, por exemplo, em Small, Jr., Ρ. A.,e cols. (Pat. U.S. No. 5.676.950, emitida em 14 de outubrode 1997). Vetores virais adicionais incluem aquelesderivados da família pox de vírus, incluindo vaccínia víruse poxvirus de ave. Baculovírus são descritos, por exemplo,na Pat. U.S. No. 5.731,182.

São fornecidos aqui métodos para desencadear umaresposta imune, em alguns exemplos, a resposta imunecelular, a um polipeptídeo mutante, ou ácido nucléico quecodifica o polipeptídeo. Em alguns exemplos, a respostaimune é uma resposta humoral e em outros exemplos aresposta imune inclui tanto uma resposta imune celularquanto humoral. Exemplos ilustrativos de polipeptídeosmutantes codificados por oncogenes e vírus que sãoconhecidos por surgir com mutações específicas em respostaa agentes terapêuticos e/ou profiláticos são aqui reveladose outros são conhecidos na técnica. Acredita-se que osurgimento de polipeptídeos mutantes em resposta a talagente(s) esteja associado com, por exemplo,suscetibilidade diminuída e/ou resistência ao agente(s)e/ou um aumento nos sintomas clínicos e/ou subclínicos deuma doença, como, por exemplo, em HIV, presença de umacontagem diminuída de CD4. O benefício de desencadear umaresposta imune, como, por exemplo, uma resposta imunecelular, a um polipeptídeo mutante que é conhecido porsurgir ou por ter surgido com uma mutação específica emresposta a um agente direcionado a uma célula ou vírus queserá, foi ou está sendo administrado a um mamífero podeincluir a extensão da duração da eficácia do agente;minimização ou reversão da resistência ao agente; retardoou minimização do surgimento do polipeptídeo mutanteespecífico; eliminação do polipeptídeo mutante específico(embora a eliminação não seja necessária para ter umbenefício); e minimização, redução ou reversão de umsintoma de uma doença, e/ou retardo da progressão dadoença.

São aqui fornecidos vetores, que incluem, por exemplo,mas não são limitados a, vetores bacterianos, virais, deinseto e levedura, que compreendem ácido nucléico quecodifica um polipeptídeo mutante que é conhecido por surgirou por ter surgido com uma mutação específica em resposta àagente terapêutico e/ou profilático(s) bem como composiçõesque os compreendem. Em alguns exemplos, o vetor é um vetorde levedura. Em outros exemplos, vetores compreendem ácidonucléico capaz de se ligar ao polipeptídeo mutante, como,por exemplo, siRNA ou RNA anti-senso, dessa forma inibindoa expressão do polipeptídeo mutante. São fornecidas aquicomposições que compreendem vetores, que incluem, porexemplo, vetores bacterianos, virais, de inseto e levedura,em associação com um polipeptídeo mutante, um fragmentodeste que compreende uma mutação, ou mimetopo deste, que éconhecido por surgir ou por ter surgido com uma mutaçãoespecífica em resposta à a agente terapêutico e/ouprofilático(s). Em alguns exemplos, o vetor é um vetor delevedura ou veículo. Em outros exemplos, composições quecompreendem um polipeptídeo mutante também compreendem umadjuvante. Exemplos de adjuvantes são aqui descritos e sãoconhecidos na técnica. São aqui fornecidas células, queincluem, por exemplo, mas não são limitadas a, célulasdendríticas, que compreendem ácido nucléico que codifica umpolipeptídeo mutante como aqui descrito e/ou vetores ouvírus que expressam o polipeptídeo mutante. Em algunsexemplos, as células dendríticas compreendem umpolipeptídeo mutante como aqui descrito. Também sãofornecidas aqui composições que compreendem ácido nucléicoque codifica o polipeptídeo mutante. Também são fornecidosaqui métodos para fazer tais células, vetores, vírus ecomposições.

Um polipeptídeo mutante ou fragmento deste quecompreende uma mutação, ou ácido nucléico que codifica opolipeptídeo ou fragmento, e/ou composições ou vetores queos compreendem, é administrado junto com um agenteprofilático e/ou terapêutico e pode ser administrado a ummamífero que tem risco de câncer ou infecção, ou ummamífero sujeito ao câncer ou infecção. Um polipeptídeomutante ou fragmento deste que compreende uma mutação, ouácido nucléico que codifica o polipeptídeo ou fragmento,e/ou composições ou vetores que os compreendem podem seradministrados antes do agente, tenha ou não o polipeptídeomutante surgido em resposta ao agente, e tenha sidodetectada ou não resistência ao agente. A detecção dosurgimento de um polipeptídeo mutante em resposta a umagente pode ser determinada por métodos conhecidos natécnica. Se um polipeptídeo mutante, ou ácido nucléico queo codifica, e/ou composições ou vetores que os compreendem,são administrados a um mamífero junto com um agente e foideterminado que um polipeptídeo mutante surgisse com umamutação específica em resposta a um agente, os métodos aquidescritos não requerem a retirada do polipeptídeo mutantepara que o mamífero se beneficie da administração.

Portanto, um polipeptídeo mutante, um fragmento desteque compreende uma mutação, ou um mime topo, ou ácidonucléico que o codifica e/ou composições ou vetores que oscompreendem podem ser administrados junto com um agente emmétodos como aqui descritos incluindo métodos paradesencadear uma resposta imune, como, por exemplo, umaresposta imune celular, uma resposta imune humoral ouambas; métodos para melhorar os sintomas de câncer ouinfecção em um mamífero; métodos para reduzir resistência aum agente; métodos para aumento da eficácia de um agente;métodos para aumento da suscetibilidade ao agente; métodospara retardo ou minimização do surgimento de umpolipeptídeo mutante; e métodos para diminuir os sintomasclínicos e/ou subclínicos câncer ou infecção. Em algunsexemplos, a administração de um polipeptídeo mutante, ouácido nucléico que o codifica, e/ou composições ou vetoresque os compreendem, junto com um agente retarda ou minimizao surgimento de um polipeptídeo mutante e/ou aumenta aeficácia do agente e/ou diminui os sintomas clínicos e/ousubclínicos de câncer ou infecção em uma maior extensãoquando comparado ã administração do agente isoladamente, ouseja, sem a administração do polipeptídeo mutante, ou ácidonucléico que codifica it, e/ou composições ou vetores queos compreendem.

Composições e métodos baseados em levedura

São aqui fornecidos vetores de levedura, veículos delevedura e composições baseadas em levedura que compreendemum polipeptídeo mutante que é conhecido por surgir ou porter surgido com uma mutação específica em resposta a umagente. Como aqui usado, o termo "vetor de levedura" e"veículo de levedura" são usados de forma intercambiável eincluem, mas não são limitados a, levedura inteira, umesferoplasto de levedura, um citoplasto de levedura, umalevedura seca, e um extrato subcelular de membrana delevedura ou frações destes. Em alguns exemplos, a célula delevedura ou esferoplasto de levedura é usada para prepararo veículo de levedura, que em alguns exemplos compreendemolécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeomutante, de modo que o polipeptídeo é expresso pela célulade levedura ou esferoplasto de levedura. Em algunsexemplos, o veículo de levedura é obtível a partir de umalevedura não patogênica. Em outros exemplos, o veículo delevedura é obtível a partir de uma levedura selecionada dogrupo que consiste em: Saccharomyces, Schizosaccharomyces,Kluveromyces, Hansenula, Candida e Piehia. Em algunsexemplos, o Saccharomyees é S. eerevisiae.

Em geral, o veículo de levedura e polipeptídeo mutantepodem ser associados por qualquer técnica aqui descrita. Emalguns exemplos, o veículo de levedura é carregadointracelularmente com um polipeptídeo mutante. Em outrosexemplos, o polipeptídeo mutante é ligado de formacovalente ou não covalente ao veículo de levedura. Ainda emexemplos adicionais, o veículo de levedura e o polipeptídeomutante são associados por mistura. Em outros exemplos, opolipeptídeo mutante é expresso de forma recombinante peloveículo de levedura ou pela célula de levedura ouesferoplasto de levedura do qual o veículo de levedura foiderivado.

Portanto, são aqui fornecidos veículos de levedura queenglobam qualquer célula de levedura (por exemplo, umacélula inteira ou intacta) ou a derivados destes que podemser usados junto com um polipeptídeo mutante na composição,ou como um adjuvante. 0 veículo de levedura pode incluir,portanto, sem limitação, um microorganismo de levedura vivaintacta (ou seja, uma célula de levedura que tem todos osseus componentes incluindo uma parede celular), ummicroorganismo de levedura intacta morta, ou derivadosdestes incluindo: um esferoplasto de levedura (ou seja, umacélula de levedura desprovida de parede celular), umcitoplasto de levedura (ou seja, uma célula de leveduradesprovida de parede celular e núcleo), uma levedura seca(ou seja, uma célula de levedura desprovida de paredecelular, núcleo e citoplasma), ou um extrato ou fração demembrana de levedura subcelular destes (também referidapreviamente como uma partícula subcelular de levedura).

Esferoplastos de levedura são tipicamente produzidospor digestão enzimática da parede da célula de levedura.Tal método é descrito, por exemplo, em Franzusoff e cola.,1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674., aqui incorporado em suatotalidade por referência. Citoplastos de levedura sãotipicamente produzidos por enucleação das células delevedura. Tal método é descrito, por exemplo, em Coon,197 8, Natl. Câncer Inst. Monogr. 48, 45-55 aqui incorporadoem sua totalidade por referência. Leveduras secas sãotipicamente produzidas por resselagem de uma célulapermeabilizada ou lisada e pode, mas não é preciso, conterpelo menos algumas das organelas daquela célula. Tal métodoé descrito, por exemplo, em Franzusoff e cols., 1983, JBiol. Chem. 258, 3608-3614 e Bussey e cols., 1979, Biochim.Biophys. Acta 553, 185-196, cada um destes é aquiincorporado em sua totalidade por referência. Um extratosubcelular de membrana de levedura ou frações destes serefere a uma membrana de levedura que é desprovida de umnúcleo ou citoplasma natural. A partícula pode ser dequalquer tamanho, incluindo tamanhos que variam do tamanhode uma membrana natural de levedura a micropartícuiasproduzidas por sonificação ou outros métodos de rompimentode membrana conhecidos por aqueles habilitados na técnica,seguido por resselagem. Um método para produção de extratossubcelulares de membrana de levedura é descrito, porexemplo, em Franzusoff e cols., 1991, Meth. Enzymol. 194,662-674. podem-se usar também frações de extratos demembrana de levedura que contêm porções da membrana delevedura e, quando o antígeno é expresso por viarecombinante pela levedura antes da preparação do extratode membrana de levedura, o antígeno de interesse é parte doextrato. Levedura também pode sofrer eletroporação ou sercarregada com antígenos alvo, como peptídeos.

Qualquer cepa de levedura pode ser usada para produzirum veículo de levedura da presente invenção. Leveduras sãomicroorganismos unicelulares que pertencem a uma de trêsclasses: Ascomycetes, Basidiomycetes e Fungi Imperfecti.Embora cepas patogênicas de levedura, ou mutantes nãopatogênicos dessas possam ser usadas, em alguns exemplos,cepas não patogênicas de levedura são usadas. Os gênerosdas cepas de levedura para uso nas composições e métodosaqui revelados incluem Saccharomyees, Candida (que pode serpatogênica), Cryptoeoeeus, Hansenula, Kluyveromyces,Piehia, Rhodotorulaf Schizosaceharomyees e Yarrowia. Emalguns exemplos, as cepas de levedura incluemSaccharomyees, Candida, Hansenula, Piehia eSchizosaceharomyees. Em alguns exemplos, a cepa de leveduraé Saceharomyces. Espécies de cepas de levedura incluemSaccharomyees eerevisiae, Saccharomyees earlsbergensis,Candida albieans, Candida kejn Candida tropiealis,Cryptoeoeeus Iaurentiif Cryptoeoeeus neoformans, Hansenulaanômala, Hansenula polimorpha, Kluyveromyces fragilis,Kluyveromyces laetis, Kluyveromyces marxianus var. laetis,Piehia pastoris, Rhodotorula rubra, Schizosaceharomyeespombe, e Yarrowia lipolitica. Deve-se também observar quevárias dessas espécies incluem uma variedade de sub-espécies, tipos, subtipos, etc. que devem estar incluídosnas espécies anteriormente mencionadas. Em alguns exemplos,as espécies de levedura incluem S. eerevisiae, C. albieans,H. polimorpha, P. pastoris e S. pombe. Em alguns exemplos,S. eerevisiae é usada devido a ser de manipulaçãorelativamente fácil e ser "Geralmente Reconhecida ComoSegura" ou "GRAS" para uso como aditivos em alimentos(GRAS, FDA proposed Rule 62FR18938, 17 de abril de 1997).

Em alguns exemplos, uma cepa de levedura que é capaz dereplicar plasmídeos a um número de cópias particularmentealto, como uma cepa cir° de S. cerevisiae é usada. Outrascepas úteis são conhecidas na técnica.

Em alguns exemplos, um veículo de levedura da presenteinvenção é capaz de fundir com o tipo de célula ao qual oveículo de levedura e polipeptídeo mutante está sendoliberado, como uma célula dendrítica ou macrófago, dessaforma efetuando a liberação particularmente eficiente doveículo de levedura, e em vários exemplos, o antígeno, parao tipo de célula. Como aqui usado, a fusão de um veículo delevedura com um tipo de célula visada refere-se àcapacidade da membrana da célula de levedura, ou partículadesta, de se fundir com a membrana do tipo de célula visada(por exemplo, célula dendrítica ou macrófago), levando aformação de sincícios. Como aqui usado, um sincício é umamassa multinucleada de protoplasma produzida pela fusão decélulas. Várias proteínas de superfície viral (incluindoalgumas proteínas de HIV) e outros fusógenos (como aquelesenvolvidos nas fusões entre óvulos e esperma) são capazesde efetuar fusão entre duas membranas (ou seja, entremembranas de célula viral e de mamífero ou entre membranasde célula de mamífero). Por exemplo, um veículo de leveduraque produz um antígeno heterólogo gpl20/gp41 de HIV em suasuperfície é capaz de fundir com um linfócito T CD4+.

Observa-se que, no entanto, a incorporação de uma porção dedirecionamento ou fusogênica no veículo de levedura, emborapossa ser desejável sob algumas circunstâncias, não énecessária. Foi mostrado que veículos de levedura sãofacilmente incorporados por célula dendríticas (vem comooutras células, como macrófagos).

Veículos de levedura podem ser formulados emcomposições baseadas em levedura, que incluem composiçõespara administração direta a indivíduos sujeitos ou em riscode ter câncer ou infecção diretamente ou primeiramentecarregados ex vivo em um transportador como uma céluladendrítica, usando várias técnicas conhecidas por pessoahabilitada na técnica, antes da administração.

São aqui fornecidos veículos de levedura, ecomposições que os compreendem, que compreendem pelo menosum polipeptídeo mutante para a administração em ummamífero. Em alguns exemplos, a composição compreende um oumais dos seguintes:

em que o polipeptídeo mutante é conhecido por surgir ou porter surgido com pelo menos uma mutação específica emresposta à administração de um agente terapêutico e/ouprofilático direcionado.

Tais composições podem incluir, um, dois, uns poucos,vários ou uma pluralidade de polipeptídeos mutantes (comoaqueles aqui descritos na Tabela II para HIV) incluindo umou mais domínios imunogênicos de um ou mais polipeptídeosmutantes, como desejado. Como aqui usado, polipeptídeoinclui "antígeno". Como aqui usado, um antígeno, incluiqualquer porção de uma proteína (peptídeo, fragmento deproteína, proteína de comprimento total), em que a proteínaé de ocorrência natural ou sinteticamente derivada, umacomposição celular (célula inteira, lisado de célula oucélulas rompidas), um organismo (organismo inteiro, lisadoou células rompidas), um carboidrato, um lipídeo, ou outramolécula, ou uma porção destes, em que o antígeno despertauma resposta imune específica para antígeno (resposta imunehumora1 e/ou celular).

Levedura exibe várias das características particularesde complexos imuno-estimulantes, com a vantagem adicionalde que elas possuem naturalmente propriedades semelhantes aadjuvante e podem ser facilmente projetadas para expressarmúltiplos polipeptídeos, incluindo antígenos. Lu e cols.,(2004) Câncer Research 64, 5084-5088, demonstraram que umaimunoterapia baseada em levedura foi capaz de desencadearrespostas imunes mediadas por célula a tumores queexpressam oncoproteínas Ras que sustentam uma mutação únicade aminoácido. Os resultados demonstraram a capacidade deveículos de levedura e sistemas baseados em levedura dedirecionar imunoterapia contra polipeptídeos que sustentamuma mutação única de aminoácido. Portanto, são aquifornecidos veículos de levedura e composições baseadas emlevedura que compreendem um polipeptídeo mutante(s) que éconhecido por surgir ou por ter surgido em resposta a umagente, e métodos para uso deles para desencadear umaresposta imune ao polipeptídeo mutante. Em alguns exemplos,a resposta imune é uma resposta imune celular. Em algunsexemplos, a resposta imune é uma resposta humoral. Emoutros exemplos, a resposta imune é tanto celular quantohumoral. Em alguns exemplos adicionais, o veículo delevedura é projetado para liberar seletivamente o antígenoaos tipos desejados de célula. Também é fornecido umveículo de levedura que compreende uma cepa de leveduracapaz de produzir uma proteína precursora heteróloga quetem um sítio de processamento de aminoácido dibásico. Talcepa de levedura é capaz de processar corretamente aproteína precursora em pelo menos uma proteína de produtode clivagem.

Em alguns exemplos, o polipeptídeo mutante écodificado por um oncogene, como, por exemplo, ras, oucodificado por um vírus, como, por exemplo, HIV, HCV ouHBV. Em alguns exemplos o polipeptídeo mutante é umantígeno associado a tumor ou a proteína expresso porcélulas cancerosas.

Preparação de Vetores

São fornecidas aqui composições que compreendem avetor, tal como um veículo de levedura, em associação comum polipeptídeo mutante. Tal associação inclui expressão dopolipeptídeo pelo vetor, como, por exemplo, por umalevedura recombinante, introdução de um polipeptídeomutante em um vetor, anexação física do polipeptídeomutante ao vetor, e mistura do vetor e polipeptídeo mutantejuntos, como em um tampão ou outra solução para formulação.Tais métodos são considerados rotineiros para oprofissional habilitado.

Por via de ilustração, um vetor de levedura é descritoabaixo. Em alguns exemplos, a célula de levedura usada parapreparar o veículo de levedura é transformada com umamolécula de ácido nucléico heteróloga que codifica umpolipeptídeo mutante de modo que o polipeptídeo é expressopela célula de levedura. Tal levedura é também aquireferida como uma levedura recombinante ou um veículo delevedura recombinante. A célula de levedura pode ser entãocarregada em uma célula dendrítica como uma célula intacta,a célula de levedura pode ser morta, ou ela pode serderivada como por formação de esferoplasto e citoplastos deleveduras, leveduras secas, ou partículas subcelulares,qualquer uma dessas é seguida por carga do derivado nacélula dendrítica. Esferoplastos de leveduras também podemser diretamente transfectados com uma molécula de ácidonucléico recombinante (por exemplo, o esferoplasto éproduzido a partir de uma levedura inteira, e entãotransfectado) para produzir um esferoplasto recombinanteque expressa um antígeno.

De acordo com a presente invenção, uma molécula deácido nucléico isolada, ou seqüência de ácidos nucléicos, éuma molécula de ácido nucléico ou seqüência que foiremovida de pelo menos um componente como o qual ela énaturalmente associada. Como tal, "isolada" não refletenecessariamente a extensão à qual a molécula de ácidonucléico foi purificada. Uma molécula de ácido nucléicoisolada útil para transfectar um vetor, como um veículo delevedura, inclui DNA, RNA, ou derivados de DNA ou RNA. Umamolécula de ácido nucléico isolada pode ser de filamentoduplo ou de filamento único. Uma molécula de ácido nucléicoisolada útil na presente invenção inclui moléculas deácidos nucléicos que codificam a proteína ou um fragmentodesta, desde que o fragmento contenha pelo menos um epitopoútil na composição da presente invenção.

Moléculas de ácido nucléico podem ser transformadas emum vetor, como um veículo de levedura, por qualquer métodoconhecido na técnica, incluindo, sem limitação, difusão,transporte ativo, fusão de lipossomo, eletroporação,sonificação, e engenharia genética.

Moléculas de ácidos nucléicos transformadas emveículos de levedura podem incluir seqüências de ácidosnucléicos que codificam um ou mais polipeptídeos mutantes.Tais moléculas de ácidos nucléicos podem compreenderregiões codificadoras parciais ou inteiras, regiõesreguladoras ou combinações dessas. Uma vantagem das cepasde levedura é sua capacidade de carregar várias moléculasde ácidos nucléicos e de serem capazes de produzir váriasproteínas heterólogas. Em alguns exemplos, inúmerosantígenos a serem produzidos por um veículo de levedura équalquer número de antígenos que possam ser razoavelmenteproduzidos por um veículo de levedura, e tipicamente variamde pelo menos um a pelo menos cerca de 5 ou mais, com decerca de 2 a cerca de 5 antígenos.

Um polipeptídeo mutante codificado por uma molécula deácido nucléico em um veículo de levedura pode ser umaproteína de comprimento total, ou pode ser uma proteínafuncionalmente equivalente em que aminoácidos foramdeletados (por exemplo, uma versão truncada da proteína),inseridos, invertidos, substituídos e/ou derivatizados (porexemplo, acetilados, glicosilados, fosforilados, atados poruma âncora de glicerofosfatidil inositol (GPI)) de modo quea proteína modificada tenha ma função biológicasubstancialmente similar àquela da proteína natural (ou quetem função aumentada ou inibida quando comprada à proteínanatural, se desejado). Modificações podem ser realizadaspor técnicas conhecidos na prática, que incluem, semlimitação, modificações diretas à proteína ou modificaçõesà seqüência de ácidos nucléicos que codifica a proteínausando, por exemplo, técnicas de DNA clássicas ourecombinantes para efetuar mutagênese aleatória oudirecionada.

A expressão de polipeptídeos mutantes em vetores érealizada com o uso de técnicas conhecidas por aqueleshabilitados na técnica. De forma breve, a molécula de ácidonucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo mutantedesejado é inserida em um vetor de expressão de tal formaque a molécula de ácido nucléico é operacionalmente ligadaa uma seqüência de controle de transcrição para ser capazde efetuar expressão constitutiva ou regulada da moléculade ácido nucléico quando transformada em uma célula delevedura hospedeira. Moléculas de ácidos nucléicos quecodificam um ou mais polipeptídeos mutantes podem estar emum ou mais vetores de expressão operacionalmente ligados auma ou mais seqüências de controle de transcrição.

Em uma molécula recombinante da presente invenção,moléculas de ácidos nucléicos são operacionalmente ligadasa vetores de expressão que contêm seqüências reguladorascomo seqüências de controle de transcrição, seqüências decontrole de tradução, origens de replicação, e outrasseqüências reguladoras que são compatíveis com o vetor eque controlam a expressão de moléculas de ácidos nucléicos.Em particular, moléculas recombinantes da presente invençãoincluem moléculas de ácidos nucléicos que sãooperacionalmente ligadas a uma ou mais seqüências decontrole de transcrição. A frase "operacionalmente ligada"refere-se à ligação de uma molécula de ácido nucléico a umaseqüência de controle de transcrição em uma maneira que amolécula é capaz de ser expressa quando transfectada (ouseja, transformada, transduzida ou transfectada) em umacélula hospedeira.

Seqüências de controle de transcrição, que podemcontrolar a quantidade de proteína produzida, incluemseqüências que controlam a iniciação, alongamento, eterminação da transcrição. Seqüências de controle detranscrição particularmente importantes são aqueles quecontrolam a iniciação da transcrição, como seqüências deativação de promotor e acima. Várias seqüências de ativaçãoacima (UASs), também referidas como intensificadoras, sãoconhecidas e podem ser usadas em vetores.

A transfecção de uma molécula de ácido nucléico em umvetor pode ser realizada por qualquer método pelo qual umamolécula de ácido nucléico seja administrada em uma célulae incluem, sem limitação, difusão, transporte ativo,sonificação, eletroporação, microinj eção, lipofecção,adsorção, e fusão de protoplasto. Moléculas de ácidosnucléicos transfectadas podem ser integradas em umcromossomo ou mantidas em vetores extracromossômicos com ouso de técnicas conhecidas por aqueles habilitados natécnica. No caso de levedura, citoplastos de levedura,fantasmas de levedura, e extratos subcelulares de membranade levedura ou frações destes também podem ser produzidosrecombinantemente por transfecção de levedura intacta ouesferoplasto de leveduras com moléculas de ácidos nucléicosdesejadas, produzindo o antigeno nela, e então manipulaçãoadicional dos microorganismos ou esferoplastos com o uso detécnicas conhecidas por aqueles habilitados na técnica paraproduzir citoplastos de levedura, leveduras secas ouextratos subcelulares de membrana de levedura ou fraçõesdestes que contêm antígenos desejados.

Condições eficazes para a produção de vetoresrecombinantes e expressão do polipeptídeo mutante pelovetor incluem um meio eficaz em que o vetor possa sercultivado. Um meio eficaz é tipicamente um meio aquoso quecompreende fontes assimiláveis de carboidrato, nitrogênio efosfato, bem como sais adequados, minerais, metais e outrosnutrientes, como vitaminas e fatores de crescimento. 0 meiopode compreender nutrientes complexos ou pode ser um meiomínimo definido. Vetores da presente invenção podem sercultivados em vários recipientes, que incluem, semlimitação, biorreatores, frascos de Erlenmeyer, tubos deteste, placas de microtiter, e placas de petri. 0 cultivo érealizado em uma temperatura, pH e conteúdo de oxigênioadequados para a cepa da levedura. Tais condições decultivo estão dentro da experiência de pessoa de habilidadecomum na técnica (veja, por exemplo, Guthrie e cols.(eds.), 1991, Methods in Enzymology, vol. 194, AcademicPress, San Diego).

Em um exemplo da presente invenção, como umaalternativa à expressão de um polipeptídeo mutante em umvetor, um vetor, como um veículo de levedura é carregadointracelularmente no polipeptídeo mutante.

Subseqüentemente, o vetor, que agora contém o polipeptídeomutante intracelularmente, pode ser administrado aopaciente ou carregado em um transportador como uma céluladendrítica (como descrito abaixo). Com relação a veículosde levedura, polipeptídeos mutantes podem ser inseridosdiretamente em veículos de levedura da presente invençãopor técnicas conhecidas por aqueles habilitados na técnica,como por difusão, transporte ativo, fusão de lipossomo,eletroporação, fagocitose, ciclos de congelamento-descongelamento e sonificação.

Veículos de levedura que podem ser diretamentecarregados com um polipeptídeo mutante incluem leveduraintacta, bem como esferoplastos, leveduras secas oucitoplastos, que podem ser carregados com antígenos após aprodução, mas antes de carregar em células dendríticas.

Alternativamente, leveduras intactas podem ser carregadascom o antígeno, e então esferoplastos, leveduras secas,citoplastos, ou partículas subcelulares podem serpreparadas a partir disso. Qualquer número de antígenospode ser carregado em um veículo de levedura, de pelo menos1, 2, 3, 4 ou qualquer número inteiro até centenas oumilhares de antígenos, como seria fornecido pela carga deum microorganismo, pela carga de uma célula de tumor demamífero, ou porções dessas, por exemplo.

Em um outro exemplo, um antígeno mutante é fisicamenteanexado ao vetor, como um veículo de levedura. A anexaçãofísica do polipeptídeo mutante ao vetor pode ser realizadapor qualquer método adequado na técnica, incluindo métodosde associação covalente ou não covalente que incluem, semlimitação, entrecruzamento químico do polipeptídeo mutanteà superfície externa do vetor, ou ligação biológica dopolipeptídeo mutante à superfície externa do vetor, comopor uso de um anticorpo ou outro parceiro de ligação.

Entrecruzamento químico pode ser realizado, por exemplo,por métodos que incluem ligação de glutaraldeído, rotulagempor fotoafinidade, tratamento com carbodiimidas, tratamentocom agentes químicos capazes de unir ligações dedissulfeto, e tratamento com outros agentes químicos deentrecruzamento padronizados na técnica. Alternativamente,no caso de levedura, um agente químico pode fazer contatocom o veículo de levedura que altera a carga da bicamadalipídica da membrana da levedura ou a composição da paredecelular de modo que a superfície externa da levedura temmaior probabilidade de se fundir ou se ligar a antígenosque têm características particulares de carga. Agentes dedirecionamento como anticorpos, peptídeos de ligação,receptores solúveis, e outros ligantes também podem serincorporados em um antígeno mutante como a proteína defusão ou associada com um antígeno para ligação do antígenoao vetor.

Ainda em um outro exemplo, o vetor e polipeptídeomutante são associados um com o outro por um mecanismo deligação não específico ou não covalente mais passivo, comopor mistura leve do vetor e do antígeno juntos em um tampãoou outra formulação adequada.Em alguns exemplos da invenção, um vetor e antígenomutante são carregados intracelularmente em umtransportador como uma célula dendrítica ou macrófago paraformar uma composição imunogênica. A célula dendrítica podeser qualquer célula dendrítica conhecida na técnica.Células dendríticas são células de linhagens de monócitos elinfócitos, e são conhecidas por serem as célulasapresentadoras de antígenos (APC) mais potentes e porestimularem respostas de células T específicas paraantígeno. Células dendríticas maduras são tipicamenteidentificadas como tendo o seguinte fenótipo de marcador desuperfície da célula: MAC3", CD80+, CD86 + , CD401°w, CD54 + ,MHC Classe I e MHC Classe II, e são capazes de retenção deFITC-dextrano. A célula dendrítica usada na composição dapresente invenção é em alguns exemplos, isolada de umpaciente ao qual a composição está sendo administrada (ouseja, células autólogas). Células dendríticas podem serisoladas da medula óssea ou de sangue periférico. Taiscélulas podem ser geradas, por exemplo, de monócitos desangue periférico por cultura na presença de fatorestimulante de colônia de granulócitos macrófagos, IL-4, eTNF-a, por exemplo. Outros métodos para isolação e geraçãode células dendríticas são conhecidos na técnica, (veja,por exemplo, Wilson e cols., 1999, Immunol 162:3070-8;Romani e cols., 1994, I Exp Med 180: 83-93; Cauxetal.,1996,1 Exp Med 184: 695-706; e Kiertscher e cols., 1996,1Leukoc. Biol 59: 208-18).

Para que as células dendríticas apresentem, de formaeficaz, antígenos para células T nativas, célulasdendríticas imaturas devem ser ativadas a maduras, comodefinido pela supra-regulação de MHC e moléculas co-estimulantes. As leveduras fornecem um estímulo de ativaçãopoderoso a células dendríticas, através dos receptoresToll-Iike (TLRs) (veja, por exemplo, Takeda K. e Akira S.,2005, International Immunology, vol. 17: páginas 1-14),manana, glucano e receptores de dectina, resultante em umasupra-regulação de receptores imunes co-estimulantes,moléculas de MHC, e secreção de citocinas imunomoduladoras.Além disso, quando a levedura é pré-carregada com oantígeno antes de ser carregada nas células dendríticas,ela fornece antígeno para as células dendríticas em pacotesdistintos, concentrados que são internalizados, dessaforma, aumentando, de modo eficaz, a quantidade de antígenodisponível para processamento. Como será percebido por umapessoa habilitada, vetores adicionais podem ser usados paracarregar as células dendríticas.

Várias formas em que a carga de ambos componentes podeser realizada são discutidas em maiores detalhes abaixo.Como aqui usado, o termo "carregada" e derivados desterefere-se à inserção, introdução, ou entrada de umcomponente (por exemplo, o veículo de levedura e/ouantígeno) na célula (por exemplo, uma célula dendrítica).Carregar um componente intracelularmente refere-se àinserção ou introdução do componente a um compartimentointracelular da célula (por exemplo, através da membranaplasmática e em um mínimo, no citoplasma, um fagossomo, umlisossomo, ou algum espaço intracelular da célula).Carregar um componente em uma célula faz referências aqualquer técnica pela qual o componente é forçado a entrarna célula (por exemplo, por eletroporação) ou é colocado emum ambiente (por exemplo, com contato com ou próximo a umacélula) em que o componente provavelmente entrará na célulapor algum processo (por exemplo, fagocitose). Técnicas decarga incluem, sem limitação, difusão, transporte ativo,fusão de lipossomo, eletroporação, fagocitose, esonificação. Em alguns exemplos, mecanismos passivos paracarregar uma célula dendrítica com o veículo de levedurae/ou antígeno são usados, tais mecanismos passivos incluemfagocitose do veículo de levedura e/ou antígeno pela céluladendrítica.

No caso de levedura, o veículo de levedura e opolipeptídeo mutante podem ser carregados na céluladendrítica aproximadamente ao mesmo tempo ousimultaneamente, embora também seja possível carregar umcomponente na célula, seguido pelo outro em algum períodoposterior. Em alguns exemplos, o veículo de levedura e opolipeptídeo mutante são associados um com o outro antes decarregar na célula dendrítica. Por exemplo, um veículo delevedura recombinante que expressa um polipeptídeo mutanteou qualquer outro complexo ou mistura de veículo delevedura e polipeptídeo mutante pode ser carregado em umacélula dendrítica. A célula dendrítica pode seradicionalmente carregada com polipeptídeo mutante livre, ouseja, um polipeptídeo que não é diretamente associado comum veículo de levedura quando ele é introduzido (carregado)na célula dendrítica. A adição do polipeptídeo livre com umcomplexo de veículo de levedura-antígeno pode fornecer umamelhoria adicional da resposta imune contra o polipeptídeo.O polipeptídeo(s) livre carregado na célula dendrítica nãoprecisa ser o mesmo que o que é expresso pelo veículo delevedura, carregado no veículo de levedura, ou de outromodo associado com o veículo de levedura. Dessa forma, aresposta imune contra uma célula alvo ou vírus pode seraumentada.

Em alguns exemplos, a composição que compreende opolipeptídeo mutante ou ácido nucléico que o codifica,compreende um ou mais adjuvantes, que incluem aqueles comoaqui descritos, e/ou transportadores, embora esse não sejanecessário. Adjuvantes são tipicamente substâncias quegeralmente melhoram a resposta imune de um animal a umantígeno específico. Adjuvantes adequados incluem, semlimitação, agonistas de TLR como aqui descritos, seqüênciasde CpG (veja, por exemplo, Krieg e cols. WO 96/02555), RNAde filamento único, RNA de duplo filamento, adjuvante deFreundf outros componentes da parede celular bacteriana(incluindo LPS, flagelina), sais baseados em alumínio, saisbaseados em cálcio, sílica, polinucleotídeos, toxóides,proteínas séricas, proteínas de revestimento viral, outraspreparações derivadas de bactérias, gama interferon,adjuvantes de copolímero em bloco, como adjuvante de HunterTitermax (CytRx.TM., Inc. Norcross, Ga.), adjuvantes Ribi(disponível por Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton,Mont.), e saponinas e seus derivados, como Quil A(disponível por Superfos Biosector A/S, Denmark).

Transportadores são tipicamente compostos que aumentama meia-vida de uma composição terapêutica no animaltratado. Transportadores adequados incluem, sem limitação,formulações de liberação controlada poliméricas, implantesbiodegradáveis, lipossomos, óleos, ésteres e glicóis.

Composições imunogênicas da presente invenção tambémpodem compreender um ou mais excipientes farmaceuticamenteaceitáveis. Como aqui usado, um "excipientefarmaceuticamente aceitável" refere-se a qualquersubstância adequada para liberação de uma composição útilnos métodos da presente invenção a um sítio adequado invivo ou ex vivo. Em alguns exemplos, excipientesfarmaceuticamente aceitáveis são capazes de manter um vetor(ou uma célula dendrítica que compreende o vetor) em umaforma que, com a chegada do vetor ou célula em uma célulaalvo, tecido, ou local do corpo, o vetor (associado com umpolipeptídeo mutante) ou a célula dendrítica (carregada comum vetor e antígeno mutante), é capaz de desencadear umaresposta imune, incluindo uma resposta imune celular, umaresposta imune humoral, ou ambas, no local alvo (observandoque o local alvo pode ser sistêmico). Excipientes adequadosda presente invenção incluem excipientes ou formulações quetransportam, mas não direcionam especificamente umacomposição ou vacina a um local (também aqui referido comotransportadores de não direcionamento). Exemplos deexcipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, semlimitação, água, solução salina, solução salina tamponadapor fosfato, solução de Ringer, solução de dextrose,solução contendo soro, solução de Hank, outras soluçõesaquosas fisiologicamente equilibradas, óleos, ésteres eglicóis. Transportadores aquosos podem conter substânciasauxiliares adequadas necessárias para aproximar ascondições fisiológicas do recipiente, por exemplo, poraumento da estabilidade e isotonicidade química.

Substâncias auxiliares adequadas incluem, por exemplo,acetato de sódio, cloreto de sódio, lactato de sódio,cloreto de potássio, cloreto de cálcio, e outrassubstâncias usadas para produzir tampão de fosfato, tampãode Tris e tampão de bicarbonato. Substâncias auxiliarestambém podem incluir conservantes, como timerosal, m- ou o-cresol, formalina e álcool benzilico.

Câncer

Como aqui usado, câncer inclui qualquer tipo de tumorou neoplasia, que incluem, mas não são limitados a, câncerde colo-retal, melanomas, carcinoma de célula escamosa,cânceres de mama, carcinomas da cabeça e pescoço,carcinomas da tireóide, sarcomas de tecidos moles, sarcomaósseo, cânceres testiculares, cânceres prostáticos,cânceres ovarianos, cânceres da bexiga, cânceres da pele,cânceres cerebrais, angiossarcomas, hemangiossarcomas,tumores de mastócito, cânceres hepáticos primários,cânceres pulmonares, cânceres pancreáticos, cânceresgastrointestinais, carcinomas de célula renal, neoplasiashematopoiéticas e cânceres metastáticos destes. Exemplos deantxgenos de câncer específicos incluem, sem limitação,MAGE (incluindo, sem limitação, MAGE3, MAGEA6, MAGEAl0),NY-ESOl, gplOO, tirosinase, EGFR, PSA, PSMA, VEG-F, PDGFR,KIT, PMSA, CEA, HER2/neu, Muc-1, hTERT, MARTI, TRP-1, TRP-2, Bcr-Abl, e formas oncogênicas mutantes de p53 (TP53),p73, Ras, PTENSrc, p38, BRAF, APC (polipose adenomatosa),myc, VHL (proteína de von Hippel Lindau) , Rb-I(retinoblastoma), Rb-2, BRCAl, BRCA2, AR (receptorandrogênico), Smad4, MDRl e FLT3.

Em alguns exemplos, um antígeno de câncer é, ou éobtível a partir de, uma molécula (como uma proteína, umpeptídeo, uma glicoproteína, ou um carboidrato) que éadequada para direcionamento por um agente terapêutico e/ouprofilático. Alvos moleculares para agentes terapêuticose/ou profiláticos de câncer são conhecidos na técnica, eincluem, sem limitação, receptores de superfície celular(como tirosina fosfatases receptora, serina/treoninaquinases receptoras, e tirosina quinases receptoras),moléculas de sinalização intracelular (como tirosinaquinases intracelulares e outras moléculas de sinalizaçãosecundárias), e fatores de transcrição, reguladores deciclo celular, componentes de proteossomo, proteínasenvolvidas na angiogênese, e proteínas envolvidas nocontrole da apoptose. Agentes terapêuticos e/ouprofiláticos de direcionamento para câncer resultam napresença de mutantes de escape, ou seja, polipeptídeosmutantes. Por exemplo, mutações foram encontradas em Bcr-Abl que foram relatados por tornar indivíduos previamenteresponsivos com tratamento do inibidor de tirosina quinaseBcr-Abl imatinib (Gleevec) tornaram-se resistentes aotratamento. Gorre e cols., Science 2001, 293:876-880; Shahe cols., Câncer Cell 2002, 2:117-125; Branford e cols.,Blood 2002, 99(9):3742-3745; Deininger e cols., Blood 2005,105(7) :2640-263. De forma similar, mutações em EGFR tambémforam encontradas em pacientes com câncer pulmonar decélulas não pequenas (NSCLC) que os tornaram resistentes aotratamento com gefitinib (Iressa) ou erlotinib (Tarceva).Kobayashi e cols., N. Engl. J. Med., 2005, 352 (8) :786-792.

A eficácia destes agentes anticâncer é, portanto,significativamente limitada pelo surgimento depolipeptídeos mutantes.

Portanto, são aqui fornecidas composições imunogênicasque compreendem polipeptídeos mutantes codificados poroncogenes e/ou expresso por células cancerosas (oumimetopos dessas), ou ácido nucléico que codifica ospolipeptídeos mutantes que são conhecidos por surgir ou quesurgiram com uma mutação especifica em resposta àadministração de um agente terapêutico e/ou profilático,bem como métodos para desencadear uma resposta imune aopolipeptídeo mutante ou célula que expressa o polipeptídeomutante. Em alguns exemplos, a resposta imune é umaresposta imune celular. Em alguns exemplos, a respostaimune é uma resposta imune humoral. Em outros exemplos, aresposta imune inclui respostas tanto celular quantohumoral.

Polipeptídeos mutantes de antígenos de câncer podemser preexistentes no mamífero, ou seja, presentes nomomento do diagnóstico, e surgem seletivamente como umresultado da administração do agente terapêutico e/ouprofilático(s). Alternativamente, os polipeptídeos mutantespodem surgir como um resultado da pressão imposta peloagente. A mutação pode ser localizada em qualquer posiçãode aminoácido no antígeno de câncer. Embora as mutações dospolipeptídeos sejam descritas no contexto de uma mutaçãoúnica, deve ser compreendido que o polipeptídeo mutantepode compreender mais de uma (como duas, três, quatro,cinco ou mais) mutações de aminoácidos. Por exemplo, oantígeno de câncer pode conter uma ou mais mutações emdiferentes posições de aminoácido. 0 antígeno de câncertambém pode conter outras mutações, como mutaçõesassociadas com eventos de transformação. Exemplosilustrativos de polipeptídeos mutantes de antígenos decâncer são revelados na Tabela I.

Tabela I

<table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table>

* numeração Abl de tipo selvagem de acordo com ABL exon la.**Eyers e cols. , Chem. Biol. 1998, 5, 321-328.

Em alguns exemplos, um polipeptídeo mutante pode serum polipeptídeo de fusão que contém múltiplos domíniosimunogênicos de um ou mais polipeptídeos mutantes deantígenos de câncer. Por exemplo, sabe-se que existemvárias diferentes mutações na proteína Bcr-Abl que surgemcom a administração de Gleevec. Um polipeptídeo mutantepode compreender uma ou mais mutações Bcr-Abl na mesmaposição e/ou diferentes posições e/ou combinações demutações em mais de uma posição.

Em alguns exemplos, o polipeptídeo mutante compreendeuma mutação em Bcr-Abl. Bcr-Abl é uma tirosina quinaseconstitutivamente ativa que resulta de uma translocação deDNA entre os cromossomos 9 e 22. Bcr-Abl é relatado por sercausai à patogênese de leucemia mielóide crônica (LMC), esua atividade de quinase constitutiva central a suacapacidade de transformar células hematopoiéticas in vivo.Imatinib (Gleevec, 2-fenilaminopirimidina) , um inibidor detirosina quinase, é um agente terapêutico para LMC. Váriasmutações de escape em Bcr-Abl que tornam a proteínaresistente a terapia com medicamento (por exemplo,tratamento com Gleevec) foram identificadas in vivo e invitro. Deininger e cols., Bloodl 2005, 105 (7) :2640-2653;Azam e cols., Cell, 2003, 112:831-43. A Tabela I forneceuma lista de exemplos de mutantes de escape de Bcr-Abl(junto com outros antígenos de câncer) identificados emmamíferos que desenvolvem resistência a tratamento deGleevec (Mutações Nos. 1-28), bem como mutações adicionaisidentificadas por métodos in vitro (Mutações Nos. 29-132).Essas mutações são localizadas em vários domínios de Bcr-Abl, incluindo, sem limitação, o domínio de quinase (como aP-alça, a Α-alça, T315, a C-hélice, a região de contatoSH3, ou a região de contato SH2) , o domínio cap, o domínioSH3, o domínio SH2, e outras regiões ligantes.

Em alguns exemplos, o polipeptídeo mutante compreendeuma mutação em EGFR. EGFR é um receptor de tirosina quinaseque tem um papel na iniciação da divisão celular tanto emcélulas normais quanto células cancerosas. Em várioscânceres, incluindo câncer pulmonar de células não pequenas(NSCLC) e glioblastoma (câncer cerebral), é relatado queEGFR é superexpresso ou mutado, e acredita-se que essasmudanças estejam associadas com a formação e crescimento detumores. Dois inibidores da tirosina quinase deanilinoquinazolina EGFR orais, gefitinib (Iressa) eerlotinib (Tarceva), foram aprovados nos Estados Unidospara o tratamento de NSCLC. Uma mutação de escape, T7 90M,foi encontrada em EGFR que é relatada por tornar oindivíduo mamífero resistente ao tratamento de Iressa ouTarceva.

Portanto, são fornecidas aqui composições quecompreendem um polipeptídeo mutante de EGFR (ou mimetopodeste) ou ácido nucléico que codifica EGFR e métodos paraseu uso na geração de uma resposta imune. Em algunsexemplos, a resposta imune é uma resposta imune celular. Emalguns exemplos, a resposta imune é uma resposta imunehumoral. Em outros exemplos, a resposta imune inclui tantouma resposta imune celular quanto humoral. Em algunsexemplos, o polipeptídeo mutante compreende uma mutação nodomínio da quinase de EGFR. Em alguns exemplos, opolipeptídeo mutante compreende a mutação T790M com relaçãoao polipeptídeo de EGFR de tipo selvagem.

Em alguns exemplos, o polipeptídeo mutante compreendeuma mutação em receptor de fator de crescimento derivado deplaquetas (PDGFR). PDGFR é uma tirosina quinase receptora.

A ativação de PDGFR é relatada por ser crítica para aprogressão de vários tipos de cânceres como glioblastoma,dermatofibrossarcoma protuberans, e LMC. Uma única mutaçãode escape (T674I) foi identificada em um paciente comsíndrome de hipereosinofilia tratado com Gleevec. (Cools ecols., New Engl. J. Med., 2003, 348:1201-1214.) Portanto,são fornecidas aqui composições que compreendem umpolipeptídeo mutante de PDGFR (ou mimetopo deste) ou ácidonucléico que codifica PDGFR e métodos para seu uso nageração de uma resposta imune. Em alguns exemplos, aresposta imune é uma resposta imune celular. Em algunsexemplos, a resposta imune é uma resposta imune humoral. Emoutros exemplos, a resposta imune inclui tanto uma respostaimune celular quanto humoral. Em alguns exemplos, opolipeptídeo mutante compreende uma mutação no domínio dequinase de PDGFR. Em alguns exemplos, o polipeptídeomutante compreende a mutação T764I com relação aopolipeptídeo de PDGFR de tipo selvagem.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo mutantecompreende uma mutação de KIT. KIT é um receptor detirosina quinase para fator de célula tronco (SCF). Aativação de KIT por mutações no domínio de quinase érelatada por estar associada com tumor estromalgastrointestinal (GIST) e outros tipos de tumores. Umamutação de escape (T670I) foi encontrada em KIT que foirelatada por tornar o paciente resistente a tratamento comGleevec. (Tamborini e cols., Gastroenterology, 2004,127:294-299.) Portanto, são fornecidas aqui composiçõesque compreendem um polipeptídeo mutante de KIT (ou mimetopodeste) ou ácido nucléico que codifica KIT e métodos paraseu uso na geração de uma resposta imune. Em algunsexemplos, a resposta imune é uma resposta imune celular. Emalguns exemplos, a resposta imune é uma resposta imunehumoral. Em outros exemplos, a resposta imune inclui tantouma resposta imune celular quanto humoral. Em algunsexemplos, o polipeptídeo mutante compreende uma mutação nodomínio de quinase de KIT. Em alguns exemplos, opolipeptídeo mutante compreende a mutação T670I com relaçãoao polipeptídeo de KIT de tipo selvagem.

Em alguns exemplos, o polipeptídeo mutante compreendeuma mutação em FLT3, que surge em resposta à administraçãode um agente direcionado, incluindo mutações de aminoácidoselecionadas do grupo que consiste em A627T, N676D, N676S,F691L, F691I, G697R, e G697S, em relação ao polipeptídeo deFLT-3 de tipo selvagem. Cools e cols., Câncer Res., 2004,64:63856389. Em alguns exemplos, o polipeptídeo mutantecompreende uma mutação em p38, incluindo uma mutação naposição T106 em relação à proteína de tipo selvagem. Emoutros exemplos, o polipeptídeo mutante compreende umamutação em Src, incluindo uma mutação na posição deaminoácido T341 em relação à proteína de tipo selvagem. Emalguns exemplos, o polipeptídeo mutante compreende umamutação em FGFR, incluindo uma mutação de aminoácido naposição V561 em relação à proteína de tipo selvagem.

Portanto, são fornecidas aqui composições que compreendemtais polipeptídeos mutantes (ou mimetopos destes) ou ácidonucléico que codifica os polipeptídeos mutantes e métodospara seu uso na geração de uma resposta imune. Em algunsexemplos, a resposta imune é uma resposta imune celular. Emalguns exemplos, a resposta imune é uma resposta imunehumora1. Em outros exemplos, a resposta imune inclui tantouma resposta imune celular quanto humoral. Em algunsexemplos, um polipeptídeo mutante que é conhecido porsurgir ou por ter surgido com uma mutação específica emresposta a um agente é imunogênico por si, ou seja, semestar associado com um adjuvante, mas isso não énecessário. Em outros exemplos, um polipeptídeo mutante queé conhecido por surgir ou por ter surgido em resposta a umagente é imunogênico em associação com um adjuvante, comoum ligante ou agonista de receptor Toll-Iike, ou seqüênciade nucleotídeos de CpG , ou outro vetor ou veículo, como umveículo de levedura, que promove sua antigenicidade.

Assim sendo, as composições aqui descritas são usadaspara desencadear uma resposta imune a um polipeptídeomutante em um mamífero, que compreende a administração aomamífero de uma quantidade eficaz da composição junto com oagente terapêutico e/ou profilático direcionado. Em algunsexemplos, a composição compreende um ou mais dos seguintes:

Também, as composições podem ser usadas na preparaçãoou fabricação de medicamentos para desencadear uma respostaimune a um polipeptídeo mutante em um mamífero junto com umagente terapêutico e/ou profilático direcionado. Em algunsexemplos, o polipeptídeo mutante é um oncogene, um antígenoassociado a tumor ou um polipeptídeo expresso por umacélula cancerosa. Em alguns exemplos a célula cancerosa éselecionada do grupo que consiste em câncer de colo-retal,melanomas, carcinoma de célula escamosa, cânceres de mama,carcinomas da cabeça e pescoço, carcinomas da tireóide,sarcomas de tecidos moles, sarcoma ósseo, câncerestesticulares, cânceres prostáticos, cânceres ovarianos,cânceres da bexiga, cânceres da pele, cânceres cerebrais,angiossarcomas, hemangiossarcomas, tumores de mastócitos,cânceres hepáticos primários, cânceres pulmonares, câncerespancreáticos, cânceres gastrointestinais, carcinomas decélula renal, neoplasias hematopoiéticas e cânceresmetastáticos.

Em alguns exemplos a resposta imune é uma respostaimune celular. Em outros exemplos a resposta imune é umaresposta imune humoral. Ainda em outros exemplos a respostaimune inclui tanto uma resposta imune celular quantohumoral.

Em adição, as composições aqui descritas são usadaspara tratar uma doença em um mamífero, que compreende aadministração ao mamífero de uma quantidade eficaz dacomposição, em que a doença é associada a um polipeptídeomutante que é conhecido por surgir ou por ter surgido compelo menos uma mutação específica em resposta àadministração de um agente terapêutico e/ou profiláticodirecionado. Em alguns exemplos as composições são usadasjunto com o agente terapêutico e/ou profiláticodirecionado. Também, as composições podem ser usadas napreparação ou fabricação de medicamentos para o tratamentode uma doença em um mamífero junto com um agenteterapêutico e/ou profilático direcionado. Em algunsexemplos, o polipeptídeo mutante, é um oncogene, umantígeno associado a tumor ou um polipeptídeo expresso poruma célula cancerosa. Em alguns exemplos a célula cancerosaé selecionada do grupo que consiste em câncer de colo-retal, melanomas, carcinoma de célula escamosa, cânceres demama, carcinomas da cabeça e pescoço, carcinomas datireóide, sarcomas de tecidos moles, sarcoma ósseo,cânceres testiculares, cânceres prostáticos, cânceresovarianos, cânceres da bexiga, cânceres da pele, câncerescerebrais, angiossarcomas, hemangiossarcomas, tumores demastócitos, cânceres hepáticos primários, câncerespulmonares, cânceres pancreáticos, cânceresgastrointestinais, carcinomas de célula renal, neoplasiashematopoiéticas e cânceres metastáticos. Em alguns exemplosa doença é câncer.

Métodos de identificação de novos polipeptídeosmutantes em um antigeno de câncer que surgem como umresultado de administração de agentes são conhecidos natécnica. Mutações de escape identificadas por métodos invitro mostraram um alto grau de correlação com aquelas quese desenvolvem in vivo. (Azam e cols. , Cell, 2003, 112:831-843; Cools e cols., Câncer Research, 2004, 64:6385-6389;Blencke e cols., Chem. Biol., 2004, 11:691-701.) Porexemplo, Azam e cols. forneceram um método de rastreamentopara identificação de polipeptídeos mutantes resistentes aagentes anticâncer direcionados a alvo, que é geralmenteaplicável a qualquer par agente-polipeptídeo mutante. (Azame cols., Biol. Proced. Online, 2003, 5(1) :204-210) . Deforma breve, o cDNA que codifica o polipeptídeo mutantealvo é c lonado em um vetor de clonagem e submetido amutagênese aleatória, gerando uma biblioteca de mutações nopolipeptídeo de câncer alvo. A biblioteca é entãointroduzida em células suscetíveis ao tratamento com oagente. Colônias que são resistentes ao tratamento com oagente são então selecionadas na presença do agenteterapêutico, isoladas, e seqüenciadas para revelar asmutações supostas. Para validar o fenótipo resistente decada mutação candidata, as mutações também podem sercriadas no cDNA. nativo de novo por mutagênese sítio-direcionada. Os cDNAs mutantes são introduzidos nas célulassensíveis ao medicamento para confirmar seus fenótiposresistentes a medicamento. A resistência medicamentosatambém pode ser confirmada por ensaio de proliferaçãocelular. Mutações também podem ser analisadas para suasconseqüências estruturais por mapeamento em um modelo daestrutura de cristal da proteína.

Doença infecciosa

Como aqui usado, doença infecciosa refere-se à doençacausada por agentes infecciosos como RNA vírus incluindo,mas não se limitando a, Retrovírus (como, por exemplo,HIV), Flavivírus (como, por exemplo, HCV), Reovírus,Picornavxrus, Coronavírus, Filovírus, Rabdovírus,

Buniavírus, Ortomixovírus, Paramixovírus, Arenavírus,Calicivírus; e DNA vírus que pertencem às famílias deHepadnavírus (como, por exemplo, HBV), Herpesvírus,Poxvírus, Adenovírus, Parvovírus, e Papovavírus. Emexemplos ilustrativos, a doença infecciosa é HIV, HBV eHCV. Deve ser entendido pelo profissional habilitado que osmétodos como aqui descritos, como, por exemplo, métodospara gerar uma resposta imune a um polipeptídeo mutante,podem ser aplicados a qualquer doença infecciosa em que umpolipeptídeo mutante é conhecido por surgir ou por tersurgido em resposta a um agente profilático e/outerapêutico.

Vírus da Imunodeficiência Humana

HIV é um retrovírus não oncogênico, especificamente umlentivírus, que causa a Síndrome da ImunodeficiênciaAdquirida (AIDS) em indivíduos infectados. Como avaliadopela Organização Mundial da Saúde, mais de 4 0 milhões depessoas são atualmente infectadas com HIV e 20 milhões depessoas já pereceram de AIDS. Assim, a infecção com HIV éconsiderada uma pandemia mundial.

Há duas cepas atualmente reconhecidas de HIV, HIV-I eHIV-2. HIV-I é a causa principal de AIDS por todo o mundo.HIV-I foi classificado baseado em variação de seqüênciagenômica em ciados. Por exemplo, o ciado B é o maispredominante na América do Norte, Europa, partes da Américado Sul e índia; o ciado C é mais predominante na ÁfricaSub-Saara; e o ciado E é mais predominante no sudesteasiático. A infecção por HIV-1 ocorre primariamente atravésde transmissão sexual, transmissão de mãe para filho ouexposição à sangue contaminado ou produtos de sangue.

HIV-I consiste em um envelope de bicamada lipídica quecircunda proteínas da estrutura viral e um núcleo internode enzimas e proteínas necessárias para replicação viral eum genoma de dois RNAs lineares idênticos. Na bicamadalipídica viral a glicoproteína 41 do envelope viral (gp41)ancora uma outra glicoproteína 120 de envelope viral(gpl20) que se estende da superfície do vírus e interagecom receptores na superfície de células suscetíveis. 0genoma do HIV-I tem aproximadamente 10.000 nucleotídeos detamanho e compreende nove genes. Ele inclui três genescomuns a todos os retrovírus, os genes gag, pol e env. Ogene gag codifica as proteínas estruturais do núcleo, ogene env codifica as proteínas de envelope gpl20 e gp41, eo gene pol codifica as enzimas virais transcriptase reversa(RT) , integrase.e protease (pro) . O genoma compreende doisoutros genes essenciais para a replicação viral, o gene tatque codifica um transativator de promotor viral e o generev que também facilita a transcrição do gene. Finalmente,os genes nef, vpu, vpr, e vif são únicos aos lentivírus ecodificam polipeptídeos cujas funções são descritas emTrono, Celll 82: 189-192 (1995).

O processo pelo qual o HIV-I infecta células humanasenvolve a interação de gpl20 na superfície do vírus comproteínas na superfície da célula. 0 entendimento comum éque a primeira etapa na infecção por HIV é a ligação daglicoproteína Env gpl20 de HIV-I a proteína CD4 celular.Essa interação faz a gpl20 viral passar por uma mudança deconformação e se ligar a outras proteínas de superfíciecelular, como proteínas CCR5 ou CXCR4, permitindosubseqüente fusão do vírus com a célula. CD4 foi assimdescrito como o receptor primário para HIV-I enquanto asoutras proteínas de superfície celular são descritas comoco-receptores para HIV-I. Como aqui usado, HIV engloba HIV-1 e HIV-2. São englobados na presente invençãopolipeptídeos mutantes de HIV que são conhecidos por surgirou que surgiram com uma mutação específica em resposta a umagente, como um agente profilático e/ou terapêutico, eincluem mutações encontradas em qualquer polipeptídeo deHIV, incluindo, por exemplo, sem limitação, Gag7 Env, Pol,e de qualquer família de ciado de HIV, subtipos e/ou cepase incluindo, sem limitação, isolados, HIVmb, HIVsf2, HIV-1SF162, HIV- 1SFI70 , HIVlaV, HIVlai , HIVmn, HIV-1CM235 , HIV-Ius4,outras cepas de HIV-I. Veja, por exemplo, Myers, e cols.,Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, LosAlamos, New México; Myers, e cols., Human Retroviruses andAids, 1990, Los Alamos, New México: Los Alamos NationalLaboratory. Em exemplos ilustrativos aqui revelados,mutações de HIV protease e transcriptase reversa quesurgiram em resposta a agentes são reveladas na Tabela II.

Em alguns exemplos, em que o agente para uso no tratamentode HIV é lamivudina, o polipeptídeo mutante M194V éespecificamente excluído. Em alguns exemplos, umpolipeptídeo mutante de HIV que é conhecido por surgir oupor ter surgido com uma mutação específica em resposta a umagente é imunogênico por si, ou seja, sem estar associadocom um adjuvante, mas isso não é necessário. Em outrosexemplos, um polipeptídeo mutante de HIV que é conhecidopor surgir ou por ter surgido em resposta a um agente éimunogênico em associação com um adjuvante, como aquidescritos e conhecidos na técnica, como, por exemplo, umligante de receptor Toll-like, ou seqüência de nucleotídeosde CpG, ou outro vetor ou veículo, como um veículo delevedura, que promove sua antigenicidade. Em algunsexemplos, o adjuvante é uma seqüência de aminoácidos que éexpressa como uma proteína de fusão com o polipeptídeomutante.

Tabela II

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No momento, terapia com medicamento anti-retroviral éum meio de tratar a infecção por HIV ou de prevenção datransmissão de HIV-I de uma pessoa para outra. Na melhordas hipóteses, mesmo com terapia medicamentosa, a infecçãopor HIV-I é uma condição crônica que requer tratamento delonga duração e ainda pode haver uma progressão lenta paraa doença. A resistência a medicamentos contra HIV tem sedesenvolvido contra medicamentos anti-retrovirais de todasas classes, especificamente os inibidores de transcriptasereversa de análogo de nucleosídeo, os inibidores datranscriptase reversa não nucleosídicos, os inibidores deprotease e os inibidores de entrada/fusão. 0 número demutações associadas, o grau de aumento na resistênciacausada e o mecanismo de resistência diferem entre váriosdestes medicamentos.

Os mecanismos de resistência medicamentosa usados pelovírus foram estudados e caracterizados. Sem estar atado porteoria, a probabilidade de que mutantes resistentes surjamparece ser uma função de pelo menos quatro fatores: 1) afreqüência da mutação viral; 2) a mutabilidade intrínsecado sítio de alvo viral com relação a um antiviralespecífico; 3) a pressão seletiva do medicamento antiviral;e, 4) a magnitude e taxa da replicação viral.

Com relação ao primeiro fator, para alguns RNA vírus,cuja polimerase é desprovida de um mecanismo de revisão, asfreqüências de mutação são de aproximadamente 3 xlO"5/bp/ciclo replicativo (Holland e cols. (1992) Curr. TopicsMicrobiol linmunol. 176, 1-20; Mansky e cols. (1995) JVirol. 69, 5087-94; Coffin (1995) Science 267, 483-489).

Portanto, espera-se que um único genoma de 10 kb, comoaquele do vírus da imunodeficiência humana (HIV), devaconter em medida uma mutação para cada três genomas viraisde progênie. Com cálculos de aproximadamente IO10 novosvírions sendo gerados diariamente durante a infecção porHIV (Ho e cols. (1995) Nature 373, 123-126), uma taxa demutação de IO"4 a IO"5 por nucleotídeo garante a pré-existência de quase qualquer mutação em ponto de tempodurante a infecção por HIV. A rápida evolução do vírus podefacilitar a geração de variantes que escapam de terapiasantivirais.

com relação ao segundo fator, a mutabilidadeintrínseca do sítio de alvo viral em resposta a um agenteantiviral específico pode afetar significativamente aprobabilidade de mutantes resistentes. Por exemplo,zidovudina (AZT) seleciona por mutações na transcriptasereversa de HIV mais facilmente in vitro e in vivo queestavudina.

Com relação ao terceiro fator, com exposição crescenteao medicamento, a pressão seletiva sobre a população devírus em replicação aumenta para promover o surgimento maisrápido de mutantes resistentes a medicamento. Por exemplo,em uma faixa de medicamentos que são eficazes paratratamento de HIV, doses maiores de AZT tendem a selecionarpor vírus resistentes a medicamento mais rapidamente que asdoses menores (Richman e cols. (1990) J AIDS. 3, 743-6).

Essa pressão seletiva por mutantes resistentes aumenta aprobabilidade de tais mutantes surgirem desde que níveissignificativos de replicação viral sejam sustentados.

O quarto fator, a magnitude e taxa de replicação dapopulação de vírus, tem grandes conseqüências sobre aprobabilidade de surgimento de mutantes resistentes. Váriasinfecções por vírus são caracterizadas por altos níveis dereplicação viral com altas taxas de turnover viral. Issoparece verdadeiro em infecções crônicas com HIV. Níveismais altos de vírus aumentam a probabilidade de mutantespreexistentes. Foi mostrado que o surgimento de umapopulação resistente pode resultar da sobrevivência eproliferação seletiva de uma subpopulação previamenteexistente que surge aleatoriamente na ausência de pressãoseletiva. Portanto, um vírus com um alto nível dereplicação na presença de uma pressão seletiva adicionadacomo uma agente antiviral deve produzir grandes números demutantes resistentes. Vem se acumulando evidência de quemutantes resistentes a medicamento de fato existem emsubpopulações de indivíduos infectados com HIV (Najera ecols. (1994) AIDS Res Hum Retroviruses 10, 1479-88; Najerae cols. (1995) J Virol. 69, 23-31). A pré-existência demutantes de picornavírus resistentes a medicamento em umataxa de aproximadamente IO"5 é também bem documentada(Ahmad e cols. (1987) Antiviral Res. 8, 27-39). Abaixoestão classes de agentes conhecidos por serem administradosà mamíferos em risco ou submetidos à infecção por HIV.Agentes adicionais junto com suas mutações específicas deHIV são mostrados na Tabela II. Por exemplo, como discutidoem maiores detalhes nessa, o polipeptídeo mutante de HIV-Iclassificado na Tabela II como "V82A/F" de escapemutacional surgiu como um resultado da administração doagente Ritonavir, da classe de medicamentos de inibidoresde HIV protease.

Inibidores de transcriptase reversa de nucleosídeo

Inibidores de transcriptase reversa de nucleosídeo(NRTIs) foram a primeira classe de compostosantiretrovirais eficazes e zidovudina (AZT) foi o primeiromedicamento a atingir a prática clínica. Alguns dos NRTIsatualmente no mercado incluem, zidovudina (Retrovir),estavudina (Zerit), didanosina (Videx), zalcitabina(Hivid), abacavir (Ziagen), Lamivudina (Epivir),emtricitabina (Emtriva) e tenofovir (Viread). NRTIs inibema enzima transcriptase reversa por competição comnucleosídeos endógenos para incorporação na cadeia de DNAgerada pela transcrição reversa do RNA de HIV e dessa formaresultando em terminação prematura da cadeia.

Pesquisadores isolaram transcriptase reversaresistente a AZT e descobriram locais que sãofreqüentemente mutados nessas enzimas. Met 41, Asp 67, eLys 70 do domínio "dedos" e Leu 210, Thr 215, e Lys 219 dodomínio "palmas" são todas mutações que são encontradaspróximo do sítio ativo em transcriptase reversa resistentea AZT. A maneira na qual esses resíduos são agrupados aoredor do bolso do sítio ativo tende a sustentar que essasmutações afetam diretamente a capacidade do sítio deligação de manter o grupo azido do medicamento. Portanto,são aqui fornecidos vetores, como, por exemplo, veículos delevedura, que são associadas com RT mutante de HIV,incluindo os polipeptídeos mutantes de HIV especificamenteaqui descritos. Em alguns exemplos, um veículo de levedurafoi geneticamente projetado para compreender ácido nucléicoque codifica o polipeptídeo de RT mutante de HIV, ou umfragmento deste que compreende a mutação.

Resistência a NRTIs se desenvolve a partir de mudançasde nucleotídeo no gene de transcriptase reversa (RT) e asubseqüente geração de substituições de aminoácidos naenzima RT. Cada NRTI induz um conjunto previsível dealterações genéticas, geralmente com mutações primáriaschegando primeiro, e mutações secundárias se desenvolvendodurante terapia continuada. Por exemplo, resistência azidovudina é associada com mutações específicas na RT,incluindo M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F e K219Q/E.

Mutações identificadas em RT associadas com resistência aestavudina incluem, sem limitação, M41L, K65R, D67N, K70R,Q151M, L210W, T215Y/F e K219E. Mutações identificadas em RTassociadas com resistência a didanosina incluem, semlimitação, K65R, L74V e M184V. Mutações identificadas em RTassociadas com resistência a zalcitabina incluem, semlimitação, K65R/N, T69D, L74V, V75T/A e M184V. Mutaçõesidentificadas em RT associadas com resistência a abacavirincluem, sem limitação, K65R, L74V, Y115F e M184V/I.

Mutações identificadas em RT associadas com resistência aLamivudina incluem, sem limitação, K65R e M184V/I. Mutaçõesidentificadas em RT associadas com resistência aemtricitabina incluem, sem limitação, K65R e M184V/I.

Mutações identificadas em RT associadas com resistência atenofovir incluem, sem limitação, K65R. A maior partedessas mutações é encontrada próxima ao sítio ativo daenzima transcriptase reversa.

O uso crescente de regimes de análogo de nucleosídeoseqüenciais, alternantes e em combinação podem selecionarvariantes de HIV com mutações que conferem resistência atodos os NRTIs atualmente disponíveis. Dois conjuntos demutações foram descritos, o complexo Q151M e as mutações deinserção T69S. As mutações Q151M são freqüentementeassociadas com mutações secundárias nos códons A62V, V75I,F77L e F116Y que também reduzem a sensibilidade de NRTIs.Inibidores da transcriptase reversa não nucleosídicos

Inibidores da transcriptase reversa não nucleosídicos(NNRTIs) são inibidores não competitivos de transcriçãoreversa de HIV-I e se ligam a um bolso hidrofóbico próximoao sítio ativo da transcriptase reversa, causando umamudança de conformação na enzima. Estão contidos nessebolso hidrofóbico da transcriptase reversa, quatro resíduosque não sofrem mutação, ou seja, Phe 227, Trp 229, e Leu234 e Tyr 319. Há atualmente três NNRTIs aprovados,nevirapina (Viramune), delavirdina (Rescriptor) e efavirenz(Sustiva). Similares a NRTIs, variantes de HIV-I comresistência a NNRTIs freqüentemente têm mutações múltiplas,no entanto, em contraste a maioria dos NRTIs, uma mutaçãoúnica pode causar altos níveis de resistência a NNRTIs.

Variantes de HIV-I resistentes a nevirapina surgemmuito rapidamente com suscetibilidade diminuída evidenteapós apenas 1 semana de terapia e em 8 semanas de terapia100% dos pacientes testados tinham isolados com umadiminuição maior que 100 vezes na suscetibilidade. Mutaçõesidentificadas em RT associadas com resistência a nevirapinaincluem, sem limitação, L100I, K103N, V106A/M, V108I,Y181C/I, Y188C/L/H e G190A. Mutações identificadas em RTassociadas com resistência a delavirdina incluem, semlimitação, K103N, V106M, Y181 C, Y188L e P236L. Mutaçõesidentificadas em RT associadas com resistência a efavirenzincluem, sem limitação, L100I, K103N, V106M, V108I,Y181C/I, Y188L, G190S/A e P225H. Uma rápida indução deresistência foi observada mais fortemente durantemonotropia com NNRTI e esses compostos são aprovados paraadministração em combinação com outros agentes anti-retrovirais.

Inibidores de protease

A enzima HIV protease é uma aspartil protease diméricanecessária para a clivagem pós-tradução de poliproteínasprecursoras Gag-Pol durante a maturação do vírus, paragerar blocos de construção necessários para montagem denovas partículas virais. A atividade dessa proteína éessencial para a infectuosidade do vírus, tornando-o umgrande alvo medicamentoso. Vários inibidores de protease(PIs) são atualmente disponíveis e incluem indinavir(Crixivan), ritonavir (Norvir), saquinavir (Fortovase),nelfinavir (Viracept) , amprenavir (Agenerase) ,lopinavir/ritonavir (Kaletra) e atazanavir (Reyataz) .Mutações identificadas em RT associadas com resistência aindinavir incluem, sem limitação, grandes mutações M46I/L,V82A/F/T e I84V, e outras mutações L10I/RN, K20M/R, L24I,V32I, M3 6I, I54V/A, L63P, I64V, A71T/V, G73S/A, V77I, eL90M. Mutações identificadas em RT associadas comresistência a ritonavir incluem, sem limitação, grandesmutações V82A/F/T/S e I84V e outras mutações L10F/I/R/V,K20M/R, V3 2I, L33F, M36I, M46I/L, I54V/L, A71V/T, V77I, eL90M. Mutações em isolados obtidos de pacientes resistentesa ritonavir parecem ocorrer em uma maneira escalonada eordenada em seqüência de V82A/F, I54V, A71V/T e I36L,seguidas por combinações de mutações em 5 posições deaminoácido específicas adicionais. Mutações identificadasem RT associadas com resistência a saquinavir incluem, semlimitação, grandes mutações G4 8V e L90M e outras mutaçõesL10I/R/V, I54V/L, A71V/T, G73S, V77I, V82A, e I84V.Mutações identificadas em RT associadas com resistência anelfinavir incluem, sem limitação, grandes mutações D30N eL90M, e outras mutações L10F/I, M36I, M46I/L, A71V/T, V77I,V82A/F/T/S, I84V e N88D/S. Mutações identificadas em RTassociadas com resistência a amprenavir incluem, semlimitação, grandes mutações V32I, M46I/L, I47V, 150V,I54L/M e I84V, e outras mutações L10F/I/R/V, G73S e L90M.Mutações identificadas em RT associadas com resistência aatazanavir incluem, sem limitação, grandes mutações M46I,150L, A71V, I84V e N88S, e outras mutações L10I/FN,K20R/M/I, L24I, V32I, L33I/F, M36I/LN, G48V, I54L,G73C/S/T/A, V82A e L90M. Portanto, são aqui fornecidosvetores, como veículos de levedura que são associados comprotease de HIV mutante, incluindo os polipeptídeosmutantes de HIV especificamente aqui descritos. Em algunsexemplos, um veículo de levedura foi geneticamenteprojetado para compreender ácido nucléico que codifica opolipeptídeo de protease de HIV mutante, ou fragmento desteque compreende a mutação.

Inibidores de entrada/fusão

Enfuvirtida (Fuzeon) foi o primeiro em uma classe deagentes antivirais designados para inibir a entrada viral.Diferentemente de medicamentos anti-HIV existentes, quevisam enzimas virais envolvidas na replicação do vírus,enfuvirtida foi projetada para bloquear a fusão do HIV comuma célula hospedeira. Enfuvirtida se liga competitivamentea um motivo (HRl) no ectodomínio de gp41 de HIV e bloqueiaa formação de uma estrutura que é um pré-requisito para afusão da membrana e entrada viral. Mutações associadas comsuscetibilidade reduzida foram observadas e incluem, semlimitação, G36D/S, I37V, V38A/M, Q39R, N42T e N43D.

Especificamente, a mudança de valina para alanina noaminoácido 38 mostrou fornecer uma resistência de 45 vezesa enfuvirtida. Portanto, são aqui fornecidos vetores, comoveículos de levedura, que são associados com mutações deHIV G36D/S, I37V, V38A/M, Q39R, N42T e N43D. Uma pessoahabilitada na técnica perceberá que polipeptídeos mutantesde HIV adicionais podem surgir à medida que novos agentespara administração profilática e terapêutica sãodesenvolvidos. Tais polipeptídeos mutantes de HIV podem seridentificados por métodos considerados rotineiros para oprofissional habilitado e usados em composições e métodoscomo aqui descritos. Portanto, são fornecidas aquicomposições que compreendem um polipeptídeo mutante de HIV(ou mimetopo deste) ou ácido nucléico que codifica umpolipeptídeo mutante de HIV e métodos para seu uso nageração de uma resposta imune. Em alguns exemplos, aresposta imune é uma resposta imune celular. Em algunsexemplos, a resposta imune é uma resposta humoral. Emoutros exemplos, a resposta imune inclui tanto respostascelulares quanto humorais.

Vírus da Hepatite C

O vírus da hepatite C (HCV) é um vírus de filamentoúnico com um genoma de 9,6-kb, que codifica um precursor depoliproteína de cerca de 3.000 aminoácidos. Todos osprodutos de proteína de HCV são produzidos por clivageraproteolítica dessa poliproteína grande. A clivagemproteolítica é realizada por uma de três proteases: apeptidase de sinal do hospedeiro, a metaloproteinase viralde auto-clivagem, NS2, ou a serina protease NS3/4A viral. Aação combinada dessas enzimas produz as proteínasestruturais (C, El e E2) e proteínas não estruturais (NS2,NS3, NS4A, NS4B, NS 5 A e NS5B) que são necessárias parareplicação e empacotamento de RNA genômico viral. NS5B é aRNA polimerase dependente de RNA viral (RDRP) que éresponsável pela conversão do RNA genômico de entrada emuma cópia de filamento negativo (RNA complementar, oucRNA); o cRNA então serve como um modelo para transcriçãopor NS5B de mais RNA genômico/mensageiro senso positivo.

A serina protease NS3 e a RNA polimerase foram grandesalvos para o desenvolvimento de terapêuticos específicospara HCV nas últimas décadas. Interferon e ribavirina sãodois medicamentos atualmente licenciados para o tratamentode indivíduos com infecção crônica de hepatite C.

Interferon é administrado isoladamente ou em combinação comribavirina. Essa terapia de combinação tem demonstrado umefeito antiviral sustentado em apenas 40-50% de pacientesinfectados com HCV de genótipo 1 e em 80-90% de pacientesinfectadas com HCV de genótipos 2 ou 3.

Inibidores de serina protease de HCV BILN 2061 e VX-950 têm entrado em experimentos clínicos. Foi relatado queesses inibidores de protease foram testados in vitro paradeterminar se mutantes resistentes poderiam surgir duranteo tratamento e para caracterizar os mutantes que surgiram.Substituições resistentes a medicamento distintas de umúnico aminoácido foram identificadas no domínio de serinaprotease NS3 de HCV para ambos inibidores. A mutação deresistência principal BILN 2061 foi no aminoácido 168 queconsiste em uma substituição de uma Val (D168V) 64% dotempo, ou uma substituição de Ala (D168A) 24% do tempo. Emcontraste, a mutação de resistência VX-950 principal foi noaminoácido 156 que consiste em uma substituição de Ser(A156S) em 79% das amostras. (Lin C. e cols. JBC, (2004)279:17508-17514. Veja a Tabela III para mutações associadascom agentes para uso no tratamento de mamíferos submetidosa HCV e HBV.

TABELA III

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Uma mutação pode ser localizada em qualquer posição dopolipeptideo de HCV. Embora as mutações sejam descritas nocontexto de mutações únicas, deve ser entendido que oantígeno viral pode compreender mais de uma (como duas,três, quatro ou cinco) mutações que são associadas com aperda de suscetibilidade a um agente anti-viral.

Portanto, são fornecidas aqui composições quecompreendem' um polipeptideo mutante de HCV, um fragmentodeste que compreendem uma mutação, ou um mimetopo, ou ácidonucléico que codifica um polipeptideo mutante de HCV emétodos para seu uso na geração de uma resposta imune. Emalguns exemplos, a resposta imune é uma resposta imunecelular. Em alguns exemplos, a resposta imune é umaresposta humoral. Em outros exemplos, a resposta imuneinclui respostas tanto celulares quanto humorais. Em algunsexemplos, um polipeptideo mutante compreende uma mutação emproteína NS3 protease do vírus da hepatite C, incluindo,sem limitação, os mutantes mostrados na Tabela III.

Vírus da Hepatite B

A infecção por vírus da Hepatite B (HBV) é um problemade saúde global. Estima-se que mais de 2 bilhões de pessoassejam infectadas com HBV (em 2004) e mais de 350 milhõessejam portadores crônicos. A infecção por HBV adquirida navida adulta é freqüentemente inaparente clinicamente, eadultos mais agudamente infectados se recuperamcompletamente da doença e ficam livres do vírus. Raramente,no entanto, a doença hepática aguda pode ser tão severa queo paciente morre de hepatite fulminante. Uma pequenafração, talvez 5 a 10%, de adultos agudamente infectados,se tornam persistentemente infectados pelo vírus.

Entretanto, de acordo com o Centro para Controle ePrevenção de Doenças, até 90% de crianças infectadas nonascimento e 30% de crianças infectadas nas idades de 1-5anos se tornam cronicamente infectadas. Indivíduoscronicamente infectados com HBV desenvolvem doençashepáticas de severidade variável com 15-25% de morte porcirrose e carcinoma hepatocelular primário.

HBV é um membro da família de vírus Hepadnaviridae quetambém inclui o vírus da hepatite B de pato e o vírus dahepatite B da marmota. HBV tem um genoma de 3, 2kb comquatro estruturas de leitura abertas parcialmentesobrepostas que codificam o envelope estrutural ouproteínas de superfície, (HBsAg), proteínas pré-núcleo/núcleo (HBeAg e HBcAg), a enzima de transcrição reversa-DNApolimerase e uma proteína transativadora X. DNA genÔmicoparcialmente de duplo filamento é encapsidado por umamontagem de dímeros de proteína de núcleo. Essenucleocapsídeo por sua vez é circundado por um envelope queconsiste em uma bicamada lipídica derivada da célula dohospedeiro e proteínas de superfície viral.

O ciclo de vida viral de HBV inclui um RNA pré-genômico intracelular que é transcrito de forma reversa aDNA no nucleocapsídeo viral montado. Pelo fato de atranscriptase reversa-DNA polimerase ser desprovida decapacidade de edição, o HBV exibe uma taxa de mutação que émais de 10 vezes maior que outros DNA vírus; a taxaestimada de mutação é de aproximadamente 1nucleotídeo/10.000 bases/ano de infecção. Essa alta taxa demutação e variabilidade de genoma é refletida na ocorrênciade subtipos sorologicamente definidos e por seis diferentesgrupos genotípicos caracterizados até hoje, designados Aaté F.

Atualmente são usadas duas categorias principais defármacos para o tratamento de infecção por HBV: análogos denucleosídeo e imunomoduladores. Os imunomoduladores inclueminterferon-α, timosina-a e vacinas terapêuticas, emborasomente interferon-α seja aprovado atualmente para uso empacientes. Acredita-se que os imunomoduladores promovam adestruição de células hepáticas infectadas e estimulem aprodução de citocina para suprimir a replicação do HBV. Emcontraste, análogos de nucleosídeo interferem com a síntesede DNA de HBV e acredita-se que acelerem a depuração decélulas infectadas. Os medicamentos de análogo denucleosídeo mais comuns usados para o tratamento deinfecção por HBV são lamivudina e adefovir dipivoxil. Alémdisso, entecavir foi recentemente aprovado para o tratamento de infecção crônica por HBV.

Análogos de nucleosídeo, tais como lamivudina,adefovir e entecavir, são compostos sintetizadosquimicamente que são estruturalmente similares aosnucleosídeos naturais. Como tal, eles são incorporados emDNA de HBV recém sintetizado causando a terminaçãoprematura da cadeia e resultando em inibição da replicaçãoviral. Além disso, alguns análogos de nucleosídeo pareceminibir competitivamente a atividade dependente de DNA e detranscriptase reversa da polimerase viral, o que tambémresulta em inibição da replicação viral.

Lamivudina, também conhecida como 3TC e Epivir, é umanálogo de citidina que atua terminando a síntese de DNAviral e por inibir competitivamente apolimerase/transcriptase reversa viral. É preocupante paraos médicos o surgimento de variantes de HBV resistentes amedicamentos após o tratamento com lamivudina. Aresistência medicamentosa foi demonstrada em até 66% detodos os pacientes após períodos prolongados de tratamento.

A HBV polimerase é dividida em quatro domínios, um dosquais funciona como a transcriptase reversa do vírus, econtém pelo menos cinco subdomínios (A-E). Similar a outraspolimerases dependentes de RNA, a HBV polimerase contém ummotivo YMDD característico (tirosina-metionina-aspartato-aspartato) no sítio catalítico, que está localizado dentrodo subdomínio C. Há agora dois sistemas de numeração para aHBV polimerase, o sistema original numerava os aminoácidosde toda a polimerase, enquanto o novo sistema numera osaminoácidos de cada domínio da polimerase separadamente e,deste modo, os aminoácidos do domínio de transcriptasereversa são designados com um nrt".

As substituições de aminoácidos mais comuns que foramdescritas como conferindo resistência à lamivudina ocorremtanto no subdomínio B quanto no subdomínio C. Substituiçõesde aminoácido que estão associadas à resistênciamedicamentosa afetam predominantemente o motivo YMDD, detal forma que a metionina (M) na posição rt204 (novosistema de numeração de rt, 552 no sistema antigo) étrocada por valina ou isoleucina, rtM204V/I (M552V/I). Essamutação está quase sempre associada a uma segunda mutaçãono subdomínio B, uma substituição da leucina na posiçãortl80 com uma metionina, rtL180M (L528M). Outras mutaçõesque foram descritas incluem a rtV173L (V521L) e rtF166L(F541L), ambas no subdomínio B. Outro mutante, rtA181T(A52 9T) demonstrou ser resistente à lamivudina apóstratamento prolongado e, mais recentemente, foi descrito ummutante rtM204S (M552S), normalmente associado a umaalteração rtL180M (L528M).

Adefovir dipivoxil (Hepsera) é um análogo denucleotídeo acíclico de monofosfato de adenosina quedemonstrou ser um inibidor potente da replicação do HBV.

Como ocorre com lamivudina, foram observadas alteraçõesgenotípicas que conferem suscetibilidade reduzida aoadefovir. Foi relatado que a análise de mutantes viraisisolados em 96-144 semanas após o tratamento determinou queas mutações rtN236T e rtA181V contribuem para a resistênciaao adefovir. Entecavir (Baraclude) é um análogo deguanosina de nucleosídeo que também demonstrou atividadecontra HBV polimerase. Em pacientes refratários aotratamento com lamivudina, após o tratamento com entecavirpor 48 semanas, houve evidências de resistência emergenteassociadas com substituições de aminoácidos que incluem,sem limitação, rtI169T, rtT184G, rtS2021 e rtM250V quandohavia mutações de resistência à lamivudina preexistentesrtL180M e/ou rtM204V/I.

Há diversos outros análogos de nucleosídeo que foramtestados ou estão atualmente sendo avaliados contra HBV emestudos clínicos. Esses incluem famciclovir, emtricitabinae ganciclovir. Foi relatado que, similar ao uso delamivudina, o tratamento prolongado com famciclovir resultaem resistência medicamentosa. Até hoje, foram descritasdiversas mutações que afetam aminoácidos nos subdomínios daB e C da transcriptase reversa incluindo, sem limitação,rtL180M, rtV173L, rtP177L, rtT184S, rtR153A e rtV207I.

Assim sendo, são fornecidas aqui composições quecompreendem um polipeptídeo mutante de HBV, um fragmentodeste que compreende uma mutação, ou mimetopo deste ouácido nucléico que codifica um polipeptídeo mutante de HBVe métodos para seu uso na geração de uma resposta imune. Emalguns exemplos, a resposta imune é uma resposta imunecelular. Em alguns exemplos, a resposta imune é umaresposta humoral. Em outros exemplos, a resposta imuneinclui respostas tanto celular quanto humoral. Em algunsexemplos, um polipeptídeo mutante de HBV compreende umamutação mostrada na Tabela III.

Portanto, as composições aqui descritas são usadaspara a geração de uma resposta imune a um polipeptídeomutante em um mamífero, que compreende a administração aomamífero de uma quantidade eficaz da composição junto com oagente terapêutico e/ou profilático direcionado. Alémdisso, as composições podem ser usadas na preparação ou nafabricação de medicamentos para desencadear uma respostaimune a um polipeptídeo mutante em um mamífero junto com umagente terapêutico e/ou profilático direcionado. Em algunsexemplos, o polipeptídeo mutante é um polipeptídeocodificado por um vírus. Em alguns exemplos o polipeptídeomutante é codificado por um vírus que é selecionado dogrupo que consiste em retrovírus, flavivírus, reovírus,picornavírus, coronavírus, filovírus, rabdovírus,buniavirus, ortomixovírus, paramixovírus, arenavírus,calicivírus, hepadnavírus, herpesvírus, poxvírus,adenovírus, parvovírus e papovavírus. Em outros exemplos ovírus é HIV, HBV ou HCV.

Em alguns exemplos a resposta imune é uma respostaimune celular. Em outros exemplos, a resposta imune é umaresposta imune humoral. Ainda em outros exemplos, aresposta imune inclui tanto uma resposta imune celularquanto humoral.

Além disso, as composições aqui descritas são usadaspara tratar uma doença em um mamífero, que compreende aadministração ao mamífero de uma quantidade eficaz dacomposição, em que a doença é associada a um polipeptídeomutante que é conhecido por surgir ou por ter surgidocompelo menos uma mutação específica em resposta àadministração de um agente terapêutico e/ou profiláticodirecionado. Em alguns exemplos as composições são usadasjunto com o agente terapêutico e/ou profiláticodirecionado. Além disso, as composições podem ser usadas nafabricação de medicamentos para o tratamento de uma doençaem um mamífero junto com um agente terapêutico e/ouprofilático direcionado. Em alguns exemplos, o polipeptídeomutante é um polipeptídeo codificado por um vírus. Emalguns exemplos o vírus é selecionado do grupo que consisteem retrovírus, flavivírus, reovírus, picornavírus,coronavírus, filovírus, rabdovírus, buniavirus,ortomixovírus, paramixovírus, arenavírus, calicivírus,hepadnavírus, herpesvírus, poxvírus, adenovírus, parvovíruse papovavírus. Em outros exemplos o vírus é HIV, HBV ouHCV. Em alguns exemplos a doença é infecção por HIV, HBV ouHCV.

Proteína de fusão

Em alguns exemplos, são aqui fornecidos vetores evírus que compreendem uma proteína de fusão que consiste emmenos um polipeptídeo mutante que é conhecido por surgir oupor ter surgido em resposta a um agente. Em algunsexemplos, a proteína de fusão compreende polipeptídeosmutantes adicionais e em outros exemplos compreende umadjuvante, por exemplo, um ligante para um TLR. Em algunsexemplos, são aqui fornecidos vetores, incluindo veículosde levedura, que compreendem tais proteínas de fusão. Umaproteína de fusão pode conter qualquer polipeptídeo mutantecomo aqui descrito ou conhecido na técnica. Como forma deilustração, uma dessas construções de fusão aqui fornecidasé a proteína de fusão que compreende (a) pelo menos umpolipeptídeo mutante ou antígeno de HIV, por exemplo, umaRT ou protease mutante (incluindo domínios imunogênicos eepitopos de um antígeno de comprimento total, além devárias proteínas de fusão e múltiplas construções deantígeno como aqui descritas em outra seção, desde que oantígeno contenha a mutação desejada); e (b) umpolipeptídeo(s), antígeno(s), ou peptídeo(s) sintético(s) .

A proteína de fusão pode conter múltiplos domíniosimunogênicos de um ou mais polipeptídeos mutantes de HIV.Tais proteínas de fusão são particularmente úteis quandofor desejável englobar vários polipeptídeos mutantes de HIVdiferentes e/ou combinações de polipeptídeos mutantes deHIV que podem ocorrer em uma ou em poucas posições noantígeno na natureza, em um único vetor, por exemplo, umveículo de levedura. Em alguns exemplos, um veículo delevedura compreende uma proteína de fusão que compreendedois ou mais polipeptídeos mutantes ou antígenos de HIV. Emalguns exemplos, a proteína de fusão compreende dois oumais epitopos de um ou mais antígenos mutantes de HIV, oudomínios imunogênicos, e em alguns exemplos, múltiplosdomínios, de um antígeno imunogênico, em que os múltiplosdomínios em conjunto englobam várias mutações diferentese/ou combinações de mutações que podem ocorrer em uma oumais posições de aminoácidos no antígeno mutante de HIV emresposta a um agente.

Por exemplo, como mostrado na Tabela II, há váriasmutações identificadas em RT de HIV associadas àresistência a vários medicamentos, como, por exemplo, L74V,K65R e M184V/I. A presente invenção engloba vetores evírus, incluindo vetores de levedura e veículos, ecomposições que os compreende, que estão em associação ouexpressam proteínas de fusão que compreendem múltiplospolipeptídeos mutantes de HIV, como, por exemplo, pelomenos um de L74V, K65R e M184V/I, que são conhecidos porsurgirem em resposta aos inibidores de RT. Como mostrado naTabela II, há várias mutações identificadas na HIVprotease, como, por exemplo, V82A/F, I54V, A71V/T, I36L,150L, N88S, I84V, A71V, M461, G48V, L90M, L101R/VI54V/L,A71VT, G73S, V77I, V82A, e I84V. A presente invençãoengloba vetores e vírus, incluindo vetores de levedura eveículos, e composições que os compreende que estão emassociação ou expressam proteínas de fusão que compreendemmúltiplos polipeptídeos mutantes de HIV, como, por exemplo,pelo menos um de V82A/F, I54V, A71V/T, I36L, 150L, N88S,I84V, A71V, M4 6I, G48V, L90M, L101R/VI54V/L, A71VT, G73S,V77I, V82A e I84V, que surgem em resposta aos inibidores deprotease.

Composições e métodos de usoSão aqui fornecidas composições e métodos para seu usona geração de uma resposta imune, em alguns exemplos, umaresposta imune celular, uma resposta imune humoral ou umaresposta imune celular e humoral, a um polipeptídeo mutanteque é conhecido por surgir ou por ter surgido em resposta aum agente medicamentoso direcionado, ou a uma célula queexpressa o polipeptídeo mutante. Em alguns exemplos, aresposta imune celular se destina a eliminar a célula,como, por exemplo, uma célula cancerosa ou uma célula queexpressa um vírus, que escapou do controle, e compreendemutações no polipeptídeo direcionado pelo agentemedicamentoso, mas isso não é necessário. Em algunsexemplos, a resposta imune celular ou humoral irá bloqueara proliferação celular ou a replicação viral.

São aqui fornecidos vetores, vírus e composições, comocomposições imunogênicas, que compreendem um polipeptídeomutante, um fragmento deste, que compreende uma mutação, ummimetopo (ou ácidos nucléicos que o codifica) que éconhecido por surgir ou por ter surgido com uma mutaçãoespecífica em resposta a um agente(s) terapêutico(s) e/ouprof ilático (s), e métodos para seu uso na geração de umaresposta imune e, em alguns exemplos, uma resposta imunecelular, ao polipeptídeo mutante. Também pode ser geradauma resposta imune humoral. Acredita-se que a emergência detais polipeptídeos mutantes em resposta a tal agente(s)esteja associada, por exemplo, à diminuição dasuscetibilidade e/ou resistência ao agente(s) e/ou a umaumento dos sintomas subclínicos e/ou clínicos da doença.

Como descrito em Stubbs e cols. (Nature Medicine, 2001,vol.7: 1-5), uma composição baseada em levedura, ou seja,levedura recombinante S. cerevisiae inteira que expressa aproteína do envelope HIV-l-gf2-gpl60 administrada acamundongos, como descrito nessa referência, gerou umaresposta imune de LTC. Os LTC gerados pelos camundongosforam capazes de matar células-alvo que expressam gpl60-SF2. 0 benefício de se gerar uma resposta imune celulare/ou uma resposta imune humoral a um polipeptídeo mutantede HIV que é conhecido por surgir ou por ter surgido commutações específicas em resposta a um agente que será, foiou está sendo administrado a um mamífero que necessita podeincluir a extensão da duração da eficácia do agente; aminimização ou reversão de resistência ao agente; o retardoou minimização do surgimento do polipeptídeo mutante HIVespecífico; a eliminação do polipeptídeo mutante de HIVespecífico (embora a eliminação não seja necessária a fimde ter o benefício); e a minimização, redução ou reversãode um sintoma da infecção por HIV e/ou tornar mais lenta aprogressão da infecção por HIV.

Portanto, são aqui fornecidos métodos para desencadearuma resposta imune a um polipeptídeo mutante, incluindo umpolipeptídeo mutante de HIV, que é conhecido por surgir oupor ter surgido com uma mutação específica em resposta a umagente(s) terapêutico(s) e/ou profilático(s) em um mamíferoque compreende a administração ao mamífero de umaquantidade eficaz de uma composição junto com o agente, emque a composição compreende,

b. uma célula, vetor ou vírus em associação com opolipeptídeo mutante;c. o polipeptídeo mutante, ou um peptídeo (mimetopo)que desperta uma resposta imune ao polipeptídeo mutante; ou

d. ácido nucléico que codifica o polipeptídeo mutante,ou ácido nucléico, como siRNA ou RNA anti-senso que se ligaao ácido nucléico,

em que uma quantidade eficaz da composição éadministrada junto com o agente.

Em alguns exemplos, a composição compreende um ou maisdos seguintes:

i) um veículo de levedura que compreende ácidonucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo mutante,um fragmento deste que compreende uma mutação ou ummimetopo;

ii) um veículo de levedura que compreende pelo menosum polipeptídeo mutante, um fragmento deste que compreendeuma mutação ou um mimetopo;

iii) um veículo de levedura em associação com pelomenos um polipeptídeo mutante, um fragmento deste quecompreende uma mutação ou um mimetopo;

iv) um veículo de levedura que compreende ácidonucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo mutante,um fragmento deste que compreende uma mutação ou ummimetopo carregado intracelularmente em uma céluladendrítica; ou

v) um veículo de levedura e pelo menos um polipeptídeomutante, um fragmento deste que compreende uma mutação ouum mimetopo carregado intracelularmente em uma céluladendrítica, em que o polipeptídeo mutante é conhecido porsurgir ou por ter surgido com pelo menos uma mutaçãoespecífica em resposta à administração de um agenteterapêutico e/ou profilático direcionado.

Em alguns exemplos, a composição é capaz dedesencadear uma resposta imune celular. Em outros exemplos,a resposta imune é uma resposta imune humoral. Em outrosexemplos, a resposta imune inclui uma resposta imune tantocelular quanto humoral.

Em alguns exemplos dos métodos, a composiçãocompreende um adjuvante. Ainda em outros exemplos, acomposição também compreende um agonista ou ligante para umReceptor Toll-Iike. Em outros exemplos, a composiçãocompreende um veículo de levedura. Ainda em outrosexemplos, a composição compreende uma seqüência CpG. Emoutros exemplos, a célula é uma célula dendrítica. Emalguns exemplos, o mamífero é um humano.

Em alguns exemplos, em que o agente é conhecido porinterfere com proliferação celular, seja direta ouindiretamente, a administração de um polipeptídeo mutante,ou ácido nucléico que codifica o polipeptídeo mutante,inclui a administração antes e/ou depois da administraçãodo agente, mas não concomitante à administração do agente.

Em alguns exemplos, um polipeptídeo mutante de HIV é L74V,K65R e/ou M184V/I, que são conhecidos por surgirem emresposta aos inibidores de RT de HIV. Em outros exemplos, opolipeptídeo mutante de HIV é V82A/F, I54V, A71V/T, I36L,15 OL, N88S, I84V, A71V, M46I, G48V, L90M, L101R/VI54V/L,A71VT, G73S, V77I, V82A, e/ou I84V, que são conhecidos porsurgirem em resposta aos inibidores de HIV protease. Emoutros exemplos, um polipeptídeo mutante de um antígeno decâncer é selecionado do grupo mostrado na Tabela I. Emoutros exemplos, um polipeptídeo mutante de HCV ou HBV éselecionado do grupo mostrado na Tabela III.

São aqui fornecidos métodos para melhoria de umsintoma de doença em um mamífero, que compreende aadministração ao mamífero de uma quantidade eficaz de umacomposição junto com um agente terapêutico e/ouprofilático, em que a composição compreende,

b. uma célula, vetor ou vírus em associação com opolipeptídeo mutante;

em que uma quantidade eficaz da composição éadministrada junto com o agente.

Em alguns exemplos, a composição compreende um ou maisdos seguintes:

v) um veiculo de levedura e pelo menos um polipeptídeomutante, um fragmento deste que compreende uma mutação ouum mimetopo carregado intracelularmente em uma céluladendrítica, em que o polipeptídeo mutante é conhecido porsurgir ou por ter surgido com pelo menos uma mutaçãoespecífica em resposta à administração de um agenteterapêutico e/ou profilático direcionado.

Em alguns exemplos, a composição é capaz dedesencadear uma resposta imune celular. Em alguns exemplos,a resposta imune é uma resposta imune humoral. Em outrosexemplos, a resposta imune inclui uma tanto uma respostacelular quanto uma resposta humoral.

Em alguns exemplos dos métodos, a composiçãocompreende um adjuvante. Em outros exemplos, a composiçãocompreende um veículo de levedura. Em outros exemplos, acomposição compreende uma seqüência CpG. Ainda em outrosexemplos, a composição também compreende um ligante para umReceptor Toll-Iike. Em outros exemplos, a célula é umacélula dendrítica.

Em alguns exemplos, o mamífero é um humano.

Em alguns exemplos dos métodos, o mamífero está emrisco para a doença e está recebendo o agenteprofilaticamente; em outros exemplos, o mamífero ésubmetido a uma doença e o agente está sendo administradoterapeuticamente.

A Patente U.S. N0 5.830.463, relacionada à sistemas delevedura, demonstra que leveduras projetadas para expressarura antígeno heterólogo é capaz de desencadear respostasimunes tanto celulares quando humorais, quandoadministradas a um mamífero. Portanto, são aqui fornecidosveículos de levedura, incluindo vetores de levedura;composições baseadas em levedura; e métodos para seu uso nageração de uma resposta imune a ura polipeptídeo mutante queé conhecido por surgir ou por ter surgido com uma mutaçãoespecífica em resposta a ura agente(s) terapêutico(s) e/ouprofilático(s). Em alguns exemplos, o veículo de leveduracompreende ácido nucléico que codifica o(s) polipeptídeo(s)mutante(s). Em outros exemplos, o veículo de levedura estáassociado ao polipeptídeo mutante. Em alguns exemplos, acomposição compreende um ou mais dos seguintes:

i) ura veículo de levedura que compreende ácido nucléico quecodifica pelo menos um polipeptídeo mutante, um fragmentodeste que compreende uma mutação ou um mimetopo;

ii) um veículo de levedura que compreende pelo menos umpolipeptídeo mutante, um fragmento deste que compreende umamutação ou um mimetopo;

iii) um veículo de levedura em associação com pelo menos umpolipeptídeo mutante, um fragmento deste que compreende umamutação ou um mimetopo;

iv) um veículo de levedura que compreende ácido nucléicoque codifica pelo menos um polipeptídeo mutante, umfragmento deste que compreende uma mutação ou um mimetopocarregado intracelularmente em uma célula dendrítica; ou

v) um veículo de levedura e pelo menos um polipeptídeomutante, um fragmento deste que compreende uma mutação ouum mimetopo carregado intracelularmente em uma céluladendrítica,

em que o polipeptídeo mutante é conhecido por surgir ou porter surgido com pelo menos uma mutação específica emresposta à administração de um agente terapêutico e/ouprofilático direcionado. Portanto são aqui fornecidosveículos de levedura e composições baseadas em levedurapara uso nos métodos como aqui descritos.

Um polipeptídeo mutante que é conhecido por surgir oupor ter surgido em resposta a um agente, ou ácido nucléicoque codifica o polipeptídeo, pode ser administrado com ousem um adjuvante, desde que o polipeptídeo ou ácidonucléico que codifica o polipeptídeo seja capaz dedesencadear uma resposta imune celular, que pode ser medidapor métodos conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo,a medida da presença de citocinas e/ou quimiocinas, como,por exemplo, MIP-la, MIP-Ib e/ou RANTES. No caso do HIV,por exemplo, ensaios de respostas de células T comespecificidade do antígeno dirigida contra o polipeptídeomutante de HIV específico, incluindo ensaios deproliferação de linfócitos para o monitoramento derespostas de CD4 e ensaios de LTC, podem ser usados paramonitor a eficácia das composições e dos métodos aquirevelados. Alternativamente, a eficácia pode ser avaliadamedindo-se a resposta imune contra ataque com tumores queexpressam o polipeptídeo mutante de HIV. Um polipeptídeomutante de HIV que não seja capaz de desencadear umaresposta imune celular por si próprio, sem um adjuvante,pode ser administrado com um adjuvante, como aqui descrito.

São aqui fornecidas composições que compreendemvetores associados a um polipeptídeo mutante, incluindocomposições a serem administradas e um pacientediretamente, ou primeiro carregadas em um veículo, porexemplo, uma célula dendrítica, utilizando-se diversastecnologias conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

Por exemplo, vetores podem ser secos por liofilização oucongelados por exposição a nitrogênio líquido ou gelo seco.Composições que compreendem veículos de levedura tambémpodem ser preparadas acondicionando-se a levedura em umamassa ou um comprimido, tal como é feito para a levedurausada em operações de confeitaria ou cervejaria. Alémdisso, antes de serem carregados em uma célula dendrítica,ou outro tipo de administração, os vetores também podem sermisturados com um excipiente farmaceuticamente aceitável,por exemplo, um tampão isotônico que seja tolerado pelacélula hospedeira. Exemplos destes excipientes incluemágua, soro fisiológico, solução de Ringer, solução dedextrose, solução de Hank, e outras soluções salinasaquosas fisiologicamente equilibradas. Veículos nãoaquosos, tais como óleos fixos, óleo de gergelim, oleato deetila ou triglicerídeos, também podem ser usados. Outrasformulações úteis incluem suspensões que contêm agentes queaumentam a viscosidade, por exemplo, polietileno glicóis(PEG), carboximetilcelulose sódica, sorbitol, glicerol oudextrana. Excipientes também podem conter quantidadesmenores de aditivos, tais como substâncias que aumentam aisotonicidade e a estabilidade química. Exemplos de tampõesincluem tampão de fosfato, tampão de bicarbonato e tampãoTris, enquanto exemplos de conservantes incluem timerosal,m- ou o-cresol, formalina e álcool benzílico. Formulaçõespadronizadas podem ser injetáveis líquidos ou sólidos quepodem ser reunidos em um líquido adequado como umasuspensão ou solução para injeção. Dessa forma, em umaformulação não líquida, o.excipiente pode compreender, porexemplo, dextrose, albumina sérica humana e/ou conservantesao qual água estéril ou soro fisiológico podem seradicionados antes da administração.

São aqui fornecidos métodos que compreendem aadministração de uma composição (por exemplo, umacomposição imunogênica) que compreende um vetor associado aum antígeno mutante a um mamífero em risco de câncer ouinfecção ou sujeito ao câncer ou à infecção. Os métodos sãogeralmente úteis para desencadear uma resposta imune, aqual, em alguns exemplos, é uma resposta imune celular, nomamífero. Acredita-se que tais métodos sejam úteis nageração de uma resposta imune celular a um polipeptídeomutante que surgiu em resposta a um agente (s) ou quesupostamente surgirá em resposta a um agente; minimizandoou revertendo, dessa forma, resistência ao agente, e/ouestendendo a eficácia do agente e/ou minimizando, reduzindoou revertendo alguns sintomas da doença ou infecção.

Assim sendo, são aqui fornecidos métodos paraminimização da resistência a um agente profilático e/outerapêutico em um mamífero, que compreende a administraçãoao mamífero de uma quantidade eficaz de uma composição quecompreende um vetor como, por exemplo, um veículo delevedura, associado a um polipeptídeo mutante que surgiu emresposta ao agente. Além disso, são aqui fornecidos métodospara reduzir a resistência a um agente administrado a ummamífero em risco de doença ou infecção ou sujeito à doençaou infecção, seja o agente administrado profilática e/outerapeuticamente, que compreende a administração aomamífero de uma quantidade eficaz de uma composição juntocom o agente, em que a referida composição compreende:

b. uma célula, vetor ou vírus em associação com opolipeptídeo mutante;

em que uma quantidade eficaz da composição éadministrada junto com o agente.

Em alguns exemplos, a composição compreende um ou maisdos seguintes:

i) um veículo de levedura que compreende ácido nucléico quecodifica pelo menos um polipeptídeo mutante, um fragmentodeste que compreende uma mutação ou um mimetopo;

Em exemplos adicionais, o polipeptídeo mutante é umpolipeptídeo mutante de HIV que compreende L74V, K65R e/ouM184V/I, que são conhecidos por surgirem em resposta aosinibidores de RT de HIV. Em outros exemplos, o polipeptídeomutante de HIV é V82A/F, I54V, A71V/T, I36L, I50L, N88S,I84V, A71V, M4 6I, G48V, L90M, L101R/VI54V/L, A71VT, G73S,V77I, V82A, e/ou I84V, que são conhecidos por surgirem emresposta aos inibidores de HIV protease. Exemplos deagentes incluem, por exemplo, inibidores de RT de HIV,como, por exemplo, abacavir, tenofovir, didanosina elamivudina, emtricitabina, estavudina e zalcitabina.Exemplos de agentes incluem, por exemplo, inibidores de HIVprotease como, por exemplo, saquinavir, nelfinavir eritonavir, indinavir e atazanavir. Exemplos de outrospolipeptideos mutantes e agentes são aqui descritos nas

Tabelas I e III.

Também são aqui fornecidos vetores, incluindo, porexemplo, veículos de levedura, vírus e composições, taiscomo, por exemplo, composições baseadas em levedura quecompreendem veículos de levedura, incluindo composiçõesimunogênicas, para uso em métodos para a geração de umaresposta imune para um polipeptídeo mutante específico emum mamífero que recebeu, receberá ou está recebendo aadministração do(s) agente(s). Em alguns exemplos, omamífero está em risco para uma doença, e um vetorassociado a um polipeptídeo mutante, um fragmento deste quecompreende uma mutação ou um mimetopo e/ou composições quecompreendem esse vetor, é administrado profilaticamente,antes, concomitantemente e/ou depois do agente. Em outrosexemplos, o mamífero está sujeito à doença e um vetorassociado a um polipeptídeo mutante, e/ou composições quecompreendem tais vetores, é administrado terapeuticamente,antes, concomitantemente e/ou depois do agente. Aadministração de tais veículos de levedura associados a umpolipeptídeo mutante pode ser usada, por exemplo, paraaumentar a suscetibilidade do mamífero a um agenteterapêutico e/ou profilático; e/ou para aumentar a eficáciaterapêutica destes agentes; e/ou para prolongar o ciclo devida efetivo destes agentes. Em alguns exemplos, umpolipeptídeo mutante é identificado antes da administraçãode um vetor ou de uma composição como aqui descritos, e emoutros exemplos, um polipeptídeo mutante é previsto paraocorrer em resposta a um agente.

As composições aqui descritas que compreendem vetores,por exemplo, veículos de levedura, associados a umpolipeptídeo mutante, um fragmento deste que compreende umamutação ou um mimetopo, e o agente terapêutico ouprofilático pode, ser administradas simultânea ouseqüencialmente, tanto antes quanto depois da administraçãodo(s) agente(s). A administração simultânea engloba aadministração junto em uma composição ou, alternativamente,como composições separadas. Em alguns exemplos, o agente eo polipeptídeo mutante, ou o ácido nucléico que o codifica,estão em formulações diferentes e são administradossimultânea e separadamente. Como será observado, em algunsexemplos, nos quais o agente e o polipeptídeo mutante, ou oácido nucléico que o codifica, são administradosseqüencialmente, a administração pode ser diária, semanalou mensal, como for considerado apropriado peloprofissional para o mamífero. 0 termo "administraçãosimultânea", como aqui usado, significa que a composiçãoque compreende o veículo de levedura e o agente terapêuticosão administrados no mesmo dia. Tanto a composição quecompreende o polipeptídeo mutante quanto o agenteterapêutico podem ser administrados primeiro. Quandoadministrados simultaneamente, a composição que compreendeo veículo de levedura e o agente terapêutico pode estarcontido na mesma dosagem (ou seja, uma dosagem unitária quecompreende tanto a composição que compreende o veículo delevedura quanto o agente terapêutico), ou em dosagensdistintas (por exemplo, a composição que compreende oveículo de levedura está contida em uma forma de dosagem eo agente terapêutico está contido em outra forma dedosagem).

Em alguns exemplos, a composição que compreende opolipeptídeo mutante é administrada como um "tratamento deacompanhamento", ou seja, após o tratamento do agente tersido iniciado ou após ser observado um aumento dos sintomasda doença. No entanto, a composição que compreende o vetor,por exemplo, um veículo de levedura, também pode seradministrada antes do tratamento com o agente terapêuticoou profilático ter sido iniciado.

Os métodos aqui descritos também podem compreender aadministração de um vetor e um polipeptídeo mutante a ummamífero, em que o vetor e o polipeptídeo não formam umcomplexo ente eles, ou seja, o polipeptídeo não é expressode forma recombinante pelo vetor, carregado no vetor, oufisicamente anexado ao vetor. 0 vetor e o polipeptídeomutante podem ser misturados em uma formulação antes daadministração ao indivíduo, ou administrados separadamente.O processo de administração pode ser realizado ex vivo, porexemplo, por introdução por células dendríticas carregadascom o veículo de levedura, ou in vivo. A administração exvivo refere-se à realização de parte da etapa reguladorafora do mamífero, por exemplo, a administração de umacomposição da presente invenção a uma população de células(células dendríticas) removidas de um mamífero sob taiscondições que o vetor e o polipeptídeo mutante sãocarregados na célula, e o retorno das células ao mamífero.A composição que compreende um vetor pode então retornar aum mamífero, ou administrada a um mamífero, por modo deadministração adequado.

A administração de uma composição, incluindo umacomposição que compreende uma célula dendrítica carregadacom um vetor e um polipeptídeo mutante, pode ser, porexemplo, sistêmica ou mucosa. As vias de administraçãoserão evidentes para aqueles habilitados na técnica,dependendo do tipo de condição, do polipeptídeo mutanteusado e/ou da população-alvo de células ou tecido. Métodosde administração incluem, sem limitação, administraçãointravenosa, administração intraperitoneal, administraçãointramuscular, administração intranodal, administraçãointracoronária, administração intra-arterial (por exemplo,em uma artéria carótida), administração subcutânea,liberação transdérmica, administração intratraqueal,administração subcutânea, administração intra-articular,administração intraventricular, inalação (por exemplo,aerossol), intracraniana, intramedular, intra-ocular,aural, intranasal, oral, administração pulmonar,impregnação de um cateter e injeção direta em um tecido. Asvias de administração incluem: intravenosa,intraperitoneal, subcutânea, intradérmica, intranodal,intramuscular, transdérmica, inalada, intranasal, oral,intra-ocular, intra-articular, intracraniana eintramedular. A liberação parenteral pode incluir a viaintradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrapleural,intrapulmonar, intravenosa, subcutânea, cateter atrial ecateter venoso. A liberação aural pode incluir gotasotológicas; a liberação intranasal pode incluir gotasnasais ou injeção intranasal; e a liberação intra-ocularpode incluir colírios. A liberação por aerossol (inalação)também pode ser realizada com o uso de métodos padronizadosna técnica (veja, por exemplo, Stribling e cols., Proc.Natl. Acad. Sei. USA 189: 11.277-11.281, 1992, que é aquiincorporado em sua totalidade por referência). Por exemplo,em um exemplo, uma composição que compreende um veículo delevedura pode ser formulada em uma composição adequada paraliberação nebulizada com o uso de um dispositivo deinalação ou nebulizador adequado. A liberação oral podeincluir sólidos e líquidos que podem ser tomados através daboca, e é útil no desenvolvimento de imunidade mucosa e, ascomposições que compreendem veículos de levedura podem serfacilmente preparadas para liberação oral, por exemplo, ascomprimidos ou cápsulas, além de serem formuladas emprodutos alimentícios e em bebidas. Outras vias deadministração que modulam a imunidade mucosa são úteis notratamento de câncer ou de doenças infecciosas. Tais viasincluem a via brônquica, intradérmica, intramuscular,intranasal, outras vias inalatórias, a via retal,subeutânea, tópica, transdérmica, vaginal e uretral. A viade liberação é qualquer via de liberação de uma composiçãoque compreende um veículo de levedura ao sistemarespiratório, incluindo, sem limitação, inalação, a viaintranasal, intratraqueal, e semelhantes.

A administração eficaz de uma célula, um vetor, porexemplo, um veículo de levedura, ou vírus, ou umacomposição que compreende uma célula, um vetor, vírus ouveículo de levedura, como aqui descritos, a um mamífero emrisco ou sujeito à doença não necessita que o mamíferoesteja protegido da doença. Os parâmetros da dose eficazpodem ser determinados com o uso de métodos padronizados natécnica que são adequados para minimizar ou reduzir ossintomas da doença, ou para minimizar a progressão dadoença. Tais métodos incluem, por exemplo, a determinaçãodas taxas de sobrevida, efeitos colaterais (ou seja,toxicidade) e progressão ou regressão da doença.

Para uso com um veículo de levedura, um tamanhoadequado de uma dose única é uma dose que seja capaz dedesencadear uma resposta imune em um mamífero, em algunsexemplos, uma resposta imune celular, que pode ser umaresposta imune com especificidade de antígeno, quandoadministrada um ou mais vezes ao longo de um período detempo adequado. Como será compreendido por aqueleshabilitados na técnica, a dose de uma composição necessáriapara desencadear uma resposta imune depende de váriosfatores. Aqueles habilitados na técnica podem determinarfacilmente tamanhos adequados de doses únicas paraadministração com base no tamanho d o mamífero e da via deadministração.

Uma dose única adequada de uma composição quecompreende um vetor em associação com um polipeptídeomutante é uma dose que é capaz de fornecer eficazmente umvetor e/ou um polipeptídeo mutante a certo tipo de célula,tecido ou região do corpo do paciente em uma quantidadeeficaz para desencadear uma resposta imune, quandoadministrada um ou mais vezes ao longo de um período detempo adequado. No caso de levedura, uma dose única de umveículo de levedura da presente invenção é de cerca de0,004 YU (4 χ IO3 células) a cerca de 100 YU (1 χ IO9células), por exemplo, 0,1 YU (1 χ IO6 células) a cerca de100 YU (1 χ IO9 células) por dose (ou seja, por organismo),incluindo qualquer dose intermediária, em incrementos de0,1 χ IO6 células (ou seja, 1,1 χ IO6, 1,2 χ IO6, 1,3 χ 10 6etc.). Essa faixa de doses pode ser usada eficazmente emqualquer organismo de qualquer tamanho, incluindocamundongos, macacos, seres humanos etc. Quando acomposição é administrada por carga do veiculo de levedurae do antigeno mutante em células dendríticas, uma doseúnica de uma composição aqui descrita é de cerca de 0,5 χIO6 a cerca de 40 χ IO6 células dendríticas por mamíferopor administração. Em outros exemplos, uma dose única é decerca de 1 χ IO6 a cerca de 20 χ IO6 células dendríticaspor indivíduo e, ainda em outros exemplos, de cerca de 1 χIO6 a cerca de 10 χ IO6 células dendríticas por mamífero.

Uma dose "de reforço" de uma composição que compreende umveículo de levedura como aqui descrita pode seradministrada quando for desejada uma resposta imune contrao antigeno mutante, ou como necessário para fornecer umaresposta imune ou induzir uma resposta de memória contra umpolipeptídeo mutante em particular. Doses de reforço podemser administradas de cerca de 1 semana a vários anos após aadministração original. Em um exemplo, um esquema deadministração é aquele no qual cerca de 1 χ IO5 a cerca de1 χ IO9 equivalentes de células de levedura de umacomposição são administrados semanalmente for 3 meses, atésemanalmente por 1 mês (5 doses), seguido por administraçãomensal.

Em alguns exemplos, uma composição de céluladendrítica que compreende um veículo de levedura como aquidescrita contém de cerca de 0,5 χ IO6 a cerca de 40 χ IO6células dendriticas por dose única por paciente e, em umoutro exemplo, de cerca de 1 χ IO6 a cerca de 10 χ IO6células dendriticas por dose única por paciente. Essasdoses são dadas para um homem típico ou outro primata.

Doses adequadas para outros animais podem ser determinadaspor aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, para umcamundongo, uma dose adequada é de cerca de 1 χ IO6 a cercade 3 χ IO6 por dose única por mouse. Outras doses podem serdeterminadas por aqueles habilitados na técnica, e fazemparte do conhecimento daqueles habilitados na técnica. Umacomposição eficaz para administrar a um mamífero contém decerca de 0,5 χ IO6 a cerca de 40 χ IO6 células dendriticaspor dose única por indivíduo mamífero.

Ficará óbvio para aqueles habilitados na técnica que onúmero de doses administrado a um mamífero depende danatureza do veículo de levedura e da resposta de ummamífero ã administração. Dessa forma, está incluído noescopo da presente invenção que um número adequado de dosesinclui qualquer número necessário para a finalidadedesejada. Por exemplo, doses repetidas podem aumentar onúmero de células disponíveis para o ataque a células-alvo.

A dosagem e a freqüência da administração podem serajustadas durante a evolução da administração, como ficaráevidente para aqueles habilitados na técnica.

Kits

São aqui fornecidos kits para a reavaliação dequalquer um dos métodos aqui descritos. Os kits da invençãopodem compreender pelo menos um veículo de levedura e pelomenos um polipeptídeo mutante que é conhecido por surgir oupor ter surgido com uma mutação específica em resposta àadministração de um agente medicamentoso terapêutico e/ouprofilático direcionado. O kit pode ainda compreender umagente medicamentoso terapêutico e/ou profilático. Emalguns exemplos, o agente medicamentoso é direcionado àscélulas cancerosas. Em alguns exemplos, o agentemedicamentoso é direcionado o a um vírus ou célulasinfectadas com um vírus. O kit pode ainda compreenderinstruções para a realização de um método aqui descrito.

Kits que compreendem um único componente terãogeralmente o componente contido em um recipiente (porexemplo, um frasco, uma ampola ou outro recipiente deestocagem adequado). Da mesma forma, kits incluindo mais deum componente também podem ter os reagentes em recipientes(separadamente ou em uma mistura).

As instruções relacionadas ao uso do kit pararealização da invenção geralmente descrevem como o conteúdodo kit é usado para efetuar os métodos da invenção. Asinstruções fornecidas nos kits da invenção são tipicamenteinstruções escritas em um rótulo ou bula (por exemplo, umafolha de papel incluída no kit), mas instruções lidas pormáquinas (por exemplo, instruções colocadas em um disco deestocagem magnético ou óptico) também são aceitáveis.

A invenção inclui um kit para a imunização de umpaciente humano contra uma infecção por poxvírus, o kitcompreendendo uma quantidade imunogênica da proteínasolúvel truncada do envelope de poxvírus codificada por umácido nucléico isolado que codifica uma proteína solúveltruncada do envelope vírus de vacínia.

Embora a invenção tenha sido descrita em algum detalhecomo forma de ilustração e exemplo, para fins de clareza desua compreensão, ficará evidente para aqueles habilitadosna técnica que podem ser praticadas certas alterações emodificações. Portanto, as descrições e exemplos não devemser considerados como limitantes do escopo da invenção.

Claims

1. Composição caracterizada por compreender um oumais dos seguintes:i) um veículo de levedura que compreende ácidonucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo mutante deBcr-Abl que compreende uma mutação ou um mimetopo deste;ii) um veículo de levedura que compreende pelo menosum polipeptídeo mutante de Bcr-Abl que compreende umamutação ou um mimetopo deste;iii) um veículo de levedura em associação com pelomenos um polipeptídeo mutante de Bcr-Abl que compreende umamutação ou um mimetopo deste;iv) um veículo de levedura que compreende ácidonucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo mutante deBcr-Abl que compreende uma mutação ou um mimetopo deste, oveículo de levedura carregado intracelularmente em umacélula dendrítica; ouv) um veículo de levedura e pelo menos um polipeptídeomutante de Bcr-Abl que compreende uma mutação ou ummimetopo deste, o veículo de levedura carregadointracelularmente em uma célula dendrítica;em que o polipeptídeo mutante de Bcr-Abl é conhecidopor surgir ou ter surgido com pelo menos uma mutaçãoespecífica em resposta à administração de um agenteterapêutico e/ou profilático alvo.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a composição compreende umpolipeptídeo mutante de Abi.

3. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que opolipeptídeo mutante de Bcr-Abl compreende uma ou mais dasseguintes mutações: T315I, T315N, T315S, T315G, M244V,L248R, G250E, G250A, Q252H, Q252R, Y253F, Y253H, E255K,E255V, D276G, F311L, F317L, M343T, M351T, E355G, F359A,F359V, V379I, F382L, L387M, H396P, H396R, S417Y, E459K,F486S, L248V, G250R, Y253C, Y257C, E258D, S265T, S265I,L266M, L266V, V268/270A, A269V, E275K , D276V, M278L, E279K,E281K, E282D, F283L, L284F, V289S, M290L, M290T, K291E,K291R, E292Q, K294R, Q300H, L301F, F311V, E316D, G321W,N331S, V338G, V33 9A, V33 9G, A344V, Q346H, M351I, E352K,I360F, A366D, G372R, E373K, V379E, V379A, L384M, M388I,G398R, Y44 0C, E450K, L451M, G463D, M472I, R4 73L, F486S,E494A, E499K, E499I, I502M, E509D, E38K, A45G, A45V, K51Q,E52K, N53D, N53T, A56V, G57E, P58R, E60K, N64Y, V67G, A68E,A68V, Y7 0D, Y70H, Y70N, D71N, W110C, V111L, P112Q, S113N,V119G, S121R, S148C, S157T, S187F, S187P, V205E, A217G,K219E, T224A, P230L, V256A, K271N, E286K, E286V, I313A,M318A, I360F, F382A, T607I, T681I, T790M, T106M, T341M,V561M, A627T, N676D, N676S, F691L, F691I, G697R e G697S.

4. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que opolipeptídeo mutante de Bcr-Abl compreende uma mutaçãoT315I.

5. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizada pelo fato de queas mutações são localizadas em qualquer de um ou mais dosseguintes domínios da Bcr-Abl: domínio quinase, domíniocap, domínio SH3, Domínio SH2 e uma região de ligação.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de que o domínio quinase éselecionado do grupo que consiste em: P-alça, Α-alça, T315,C-hélice, região de contato SH3 ou região de contato SH2.

7. Composição caracterizada pelo fato de compreenderum ou mais dos seguintes:i) um veículo de levedura que compreende ácidonucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo mutante deum antígeno de câncer que compreende uma mutação ou ummimetopo deste;ii) um veículo de levedura que compreende pelo menosum polipeptídeo mutante de um antígeno de câncer quecompreende uma mutação ou um mimetopo deste;iii) um veículo de levedura em associação com pelomenos um polipeptídeo mutante de um antígeno de câncer quecompreende uma mutação ou um mimetopo deste;iv) um veículo de levedura que compreende ácidonucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo mutante deum antígeno de câncer que compreende uma mutação ou ummimetopo deste, o veículo de levedura carregadointracelularmente em uma célula dendrítica; ouv) um veículo de levedura e pelo menos um polipeptídeomutante de um antígeno de câncer que compreende uma mutaçãoou um mimetopo deste, o veículo de levedura carregadointracelularmente em uma célula dendrítica;em que o polipeptídeo mutante de um antígeno de cânceré conhecido por surgir ou ter surgido com pelo menos umamutação específica em resposta à administração de um agenteterapêutico e/ou profilático alvo.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo mutante doantígeno de câncer é codificado por um oncogene, é umantígeno associado a tumor ou é expresso por célulascancerosas.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo mutante doantígeno de Câncer é Bcr-Abl, MAGE, MAGE3, MAGEA6, MAGEAl0,NY-ESO-1, gplOO, tirosinase, EGFR, FGFR, PSAi PSMA, VEGF,PDGFR, Kit, PMSA, CEA, Her2/neu, Muc-1, hTERT, Marti, TRP-1, TRP-2, p53, p73, Ras, PTENSrc, p38, BRAF, poliposeadenomatosa do cólon, myc, proteína de von Hippel landau,Rb-I, Rb-2, BRACl, BRAC2, receptor androgênico, Smad4, MDRlou Flt3.

10. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 7, 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que opolipeptídeo mutante do antígeno de câncer que compreendeuma mutação, ou mimetopo deste, compreende pelo menos umamutação específica que surgiu em resposta à administraçãode um agente selecionado do grupo que consiste em imatinib,gefitinib, erlotinib, inibidores da quinase, SB 203580,inibidores da tirosina quinase ou combinações desses.

11. Composição caracterizada pelo fato de compreenderuma ou mais dos seguintes:i) um veículo de levedura que compreende ácidonucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo mutanteviral que compreende uma mutação ou um mimetopo deste;ii) um veículo de levedura que compreende pelo menosum polipeptídeo mutante viral que compreende uma mutação ouum mimetopo deste;iii) um veículo de levedura em associação com pelomenos um polipeptídeo mutante viral que compreende umamutação ou um mimetopo deste;iv) um veículo de levedura que compreende ácidonucléico que codifica pelo menos um polipeptídeo mutanteviral que compreende uma mutação ou um mimetopo deste, oveículo de levedura carregado intracelularmente em umacélula dendrítica; ouv) um veículo de levedura e pelo menos um polipeptídeomutante viral que compreende uma mutação ou um mimetopodeste, o veículo de levedura carregado intracelularmente emuma célula dendrítica;em que o polipeptídeo mutante viral é conhecido porsurgir ou ter surgido com pelo menos uma mutação específicaem resposta à administração de um agente terapêutico e/ouprofilático alvo.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo mutante viralé codificado por HIV, HBV ou HCV.

13. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12,caracterizada por compreender dois polipeptídeos mutantesque compreendem uma mutação, ou mimetopos destes.

14. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12,caracterizada por compreender três polipeptídeos mutantesque compreendem uma mutação, ou mimetopos destes.

15. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou-14, caracterizada pelo fato de que o veículo de levedura éuma levedura inteira, um esferoplasto de levedura, umcitoplasto de levedura, um levedura seca, ou um extrato demembrana de levedura subcelular ou fração destes.

16. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, IO7 11, 12, 13,-14 ou 15, caracterizada pelo fato de que o veículo delevedura é obtido de Saccharomyces cerevisiae.

17. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeomutante que compreende uma mutação ou mimetopo destecompreende dois ou mais epitopos compreendendo uma ou maismutações.

18. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16 ou 17, caracterizada por também compreender pelomenos um adjuvante.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 18,caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um agonista dereceptor Toll-like, seqüências CpG de dinucleotídeo, RNA defilamento único ou duplo, adjuvante de Freund, uma porçãolipídica, mananas, glucanos, sais baseados em alumínio,sais baseados em cálcio, sílica, polinucleotídeos,toxóides, proteínas séricas, proteínas de revestimentoviral, interferon gama, copolímeros, adjuvantes de Ribi ousaponinas e seus derivados.

20. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizada por despertar umaresposta imune ao polipeptídeo mutante ou mimetopo em ummamífero.

21. Composição, de acordo com a reivindicação 20,caracterizada pelo fato de que uma quantidade eficaz dacomposição é administrada ao mamífero junto com o agenteterapêutico e/ou profilático alvo.

22. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, - 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizada por melhorar um sintoma deuma doença em um mamífero, em que a doença é câncer.

23. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19,caracterizada por melhorar um sintoma de uma doença viralem um mamífero.

24. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15,- 16, 17, 18 ou 19, caracterizada pelo uso na redução daresistência a um agente administrado a um mamífero em riscode câncer.

25. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19,caracterizada pelo uso na redução da resistência a umagente administrado a um mamífero em risco de doença viralou infecção viral ou sujeito à doença viral ou infecçãoviral.

26. Composição para reduzir a resistência a umagente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2,- 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 OU 19, caracterizada pelo fato de que uma quantidade eficaz dacomposição é administrada a um mamífero em risco de doençaou infecção ou sujeito à doença ou infecção junto com oagente terapêutico e/ou profilático alvo.

27. Composição, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,-15, 16, 17, 18 OU 19, caracterizada pelo uso para a reduçãoda resistência a um agente administrado a um mamífero emrisco de doença ou infecção ou sujeito à doença ou infecção,no qual a doença ou infecção está associada a um polipeptídeomutante que surgiu em resposta à administração de um agenteterapêutico e/ou profilático alvo.

28. Método para a preparação de um veículo delevedura caracterizado por compreender um ácido nucléicoque codifica para um mutante de escape, ou um polipeptídeomutante de escape que compreende uma mutação ou um mimetopodeste, em que o mutante de escape é conhecido por surgir outer surgido com pelo menos uma mutação específica emresposta à administração de um agente terapêutico e/ouprofilático alvo, o método compreendendo a transfecção doácido nucléico no veículo de levedura ou a colocação ouassociação do mutante de escape com o veículo de levedura.

29. Uso da composição conforme definida em qualqueruma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,-12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizado para apreparação de um medicamento para reduzir a resistência aum agente administrado a um mamífero em risco de doença ouinfecção ou sujeito à doença ou infecção, no qual a doençaou infecção está associada a um polipeptídeo mutante quesurgiu em resposta à administração de um agente terapêuticoe/ou profilático alvo.

30. Uso da composição conforme definida em qualqueruma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,-12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizado pelapreparação de um medicamento para melhorar os sintomas deuma doença ou infecção em um mamífero.