MX2008012392A

MX2008012392A - Mutacion de ras, y composiciones y metodos relacionados con la misma.

Info

Publication number: MX2008012392A
Application number: MX2008012392A
Authority: MX
Inventors: Alex Franzusoff; Yingnian Lu; Donald Bellgrau; Zhimin Guo
Original assignee: Globeimmune Inc
Priority date: 2006-03-27
Filing date: 2007-03-09
Publication date: 2008-12-17
Also published as: US7745128B2; EP2004666B1; KR20090008290A; SG170763A1; AU2007249639A1; WO2007133835A8; EP2004666A4; WO2007133835A2; CN101448848B; CA2647102A1; US20130344097A1; JP2009531068A; TW200806789A; AU2007249639B2; EP2004666A2; CN101448848A; JP2015043773A; US20070224208A1; US8470313B2; WO2007133835A3

Abstract

Se dan a conocer mutaciones de Ras recién descubiertas, y combinaciones de mutaciones, proteínas y péptidos, y proteínas de fusión que contienen estas mutaciones, moléculas de ácidos nucleicos que codifican estas proteínas, péptidos, y proteínas de fusión, y una variedad de herramientas y métodos de diagnóstico, terapéuticos, y de rastreo asociados con el uso de tales mutaciones.

Description

MUTACIÓN DE RAS. Y COMPOSICIONES Y MÉTODOS RELACIONADOS CON LA MISMA Antecedentes de la Invención La neoplasia, o un proceso de proliferación celular rápida que da como resultado un nuevo crecimiento anormal, es una característica de muchas enfermedades que pueden ser serias y, algunas veces, amenazantes para la vida. Típicamente el crecimiento neoplásico de las células y tejidos se caracteriza por una proliferación de células mayor a la normal, en donde las células continúan creciendo aun después de que el factor instigador (por ejemplo, un promotor de tumor, carcinógeno, virus) ya no está presente. El crecimiento celular tiende a mostrar una falta de organización estructural y/o coordinación de tejido normal y usualmente crea una masa de tejido (por ejemplo, un tumor) que puede ser benigno o maligno. Las mutaciones de Ras son comunes en los adenocarcinomas pulmonares de humanos, ratones, ratas y hámsteres. De hecho, las mutaciones en la familia del proto-oncogén ras son las mutaciones más comunes relacionadas con oncogenes en el cáncer humano y en tumores en animales experimentales. Se sabe que hay varias mutaciones diferentes en los oncogenes de la familia del gen ras que se pueden asociar con un fenotipo de células de tumor en la naturaleza. Las mutaciones en el codón que codifica el aminoácido 12 en la proteína Ras se encuentran en el 78 por ciento de los cánceres pancreáticos, 34 por ciento de los cánceres colorrectales, el 40 por ciento de los adenocarcinomas pulmonares no microcelulares y 24 por ciento de cánceres ováricos. Las mutaciones de Ras en los aminoácidos 13, 59 y 61 también se encuentran en una variedad de cánceres (por ejemplo, véase Lu y colaboradores, Cáncer Res. 2004 agosto 1 ;64(15):5084-8; Abrams y colaboradores, Sem Oncol I996 23,118-134; Friday y Adjei, Biochim Biophys Acta 2005 1756, 127-144). La señalización aberrante a través de la senda del producto del oncogén Ras representa un papel importante en la proliferación celular no controlada y en la tumorigénesis. Estas mutaciones bien caracterizadas en los codones 12, 13 y 61 causan la activación constitutiva de Ras. El crecimiento celular maligno o los tumores malignos son la principal causa de muerte en todo el mundo y el desarrollo de terapia efectiva para la enfermedad neoplásica es el objeto de un gran cuerpo de investigación. Aunque se ha propuesto una variedad de enfoques innovadores para tratar y prevenir los cánceres, muchos cánceres continúan causando una alta tasa de mortalidad y puede ser difícil tratarlos o son relativamente no responsivos a las terapias convencionales. Por lo tanto, hay una necesidad continua en la técnica para la identificación de factores de riesgo de cáncer adicionales y métodos para el diagnóstico temprano y la terapia para los cánceres. Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es un diagrama que muestra el catálogo de las mutaciones de Ras encontradas genotipificando tumores de pacientes con cáncer colorrectal, pancreático o pulmonar no microcelular. Las Figuras 2A y 2B son imágenes digitales de un ensayo de agar blando de crecimiento celular que muestra la formación de colonias ejemplares negativas (Figura 2A, células de ratón BALB/3T3 no transfectadas) y positivas (Figura 2B, clon de células de ratón BALB/3T3 transfectadas con Ras G12V + E76G) en agar blando. Las células epiteliales de cáncer ("transformadas") son capaces de crecer en agar blando, mientras que las células no transformadas no crecen en agar blando. Las Figuras 3A y 3B son unas gráficas que muestran dos experimentos separados que demuestran la sinergia oncogénica en el crecimiento de tumores que llevan las mutaciones de Ras tanto en el codón 12 como en el codón 76 en los ratones sin pelo Balb/c. La Figura 3C es un detalle en expandido del estudio en la Figura 3A para mostrar el crecimiento de las células transfectadas mutantes individuales E76 relativas a las células Balb/3T3 del tipo natural no transfectadas. La Figura 4 es un dibujo esquemático que ilustra la estructura de cristal de la forma mutante del codón 12 de H-Ras (G12D) (izquierda) en comparación con la estructura de una forma mutante del codón 61 de H-Ras (Q61L) (derecha). Las flechas apuntan a la posición estimada de los aminoácidos 12, 61 y 76 en las estructuras terciarias representadas.

Breve Descripción de la Invención. Una modalidad de la presente invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos cinco aminoácidos contiguos de una proteína Ras mutante. La secuencia de aminoácidos contiene la posición 76 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras, o H-ras, y en donde el aminoácido en la posición 76 está mutado en comparación con la proteína del tipo natural. En un aspecto, el aminoácido en la posición 76 se muta de un glutamato a un residuo de aminoácido no glutamato seleccionado entre el grupo que consiste en: glicina, lisina y glutamina. En un aspecto, el residuo de aminoácido que no es glutamato es glicina. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos difiere de cualquiera de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, o SEQ ID NO:13 por una sustitución de un aminoácido no glutamato por el glutamato en la posición 76 de la secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, o SEQ ID NO:13. En un aspecto, la secuencia de aminoácidos además comprende al menos cinco residuos de aminoácidos contiguos de una proteína Ras mutante, en donde la secuencia de aminoácidos contiene la posición de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en 12, 13, 59 y 61 con respecto a una proteína del tipo natural K-ras, N-ras, o H-ras, y en donde el aminoácido en la posición se muta en comparación con la proteína del tipo natural.

En un aspecto de esta modalidad, la secuencia de aminoácidos además comprende al menos cinco aminoácidos contiguos de una proteína Ras mutante, en donde la secuencia de aminoácidos contiene el aminoácido en la posición 12 con respecto a la proteína del tipo natural K-ras, N-ras, o H-ras, y en donde el aminoácido en la posición 12 está mutada en comparación con la proteína del tipo natural. En un aspecto, el aminoácido en las posiciones 12 o 13 se muta de una glicina a un residuo de aminoácido que no es glicina. En un aspecto, el residuo de aminoácido que no es glicina se selecciona entre: valina, cisteína, aspartato, serina, arginina y alanina. En otro aspecto de esta modalidad, la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína de fusión que comprende dos o más dominios, en donde uno de los dominios comprende al menos 5 aminoácidos de la proteína Ras mutante que comprende la mutación en la posición 76, y en donde cada dominio adicional consiste en un inmunógeno. En un aspecto, el inmunógeno es un antígeno de tumor. En un aspecto, el antígeno de tumor es una proteína Ras o un fragmento inmunogénico de la misma que comprende al menos una mutación relativa a la secuencia de aminoácidos de Ras del tipo natural. En un aspecto, el antígeno de tumor es una proteína Ras o un fragmento inmunogénico de la misma que comprende las posiciones 12 o 13 con respecto a la secuencia de aminoácidos de Ras de tipo natural, en donde el aminoácido en las posiciones 12 o 13 se muta de un residuo de glicina a un residuo que no es glicina. En otro aspecto, el antígeno de tumor se selecciona entre el grupo que consiste en: (a) un péptido que comprende al menos desde las posiciones 8-16 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 12 con respecto con la proteína Ras del tipo natural se muta; (b) un péptido que comprende al menos desde las posiciones 9-17 de una proteína Ras, en donde el residuo del aminoácido en la posición 13 con respecto con la proteína Ras del tipo natural se muta; (c) un péptido que comprende al menos de las posiciones 55-63 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 59 con respecto a la proteína Ras del tipo natural se muta; (d) un péptido que comprende al menos de las posiciones 57-65 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 61 con respecto a la proteína Ras del tipo natural se muta; (e) un péptido que comprende al menos de las posiciones 69-77 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 73 con respecto a la proteína Ras del tipo natural se muta; (f) un péptido que comprende al menos de las posiciones 70-78 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 74 con respecto a la proteína Ras del tipo natural se muta; (g) un péptido que comprende al menos de las posiciones 71-79 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 75 con respecto a la proteína Ras del tipo natural se muta; (h) un péptido que comprende al menos de las posiciones 73-81 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 77 con respecto a la proteína Ras del tipo natural se muta; (i) un péptido que comprende al menos de las posiciones 74-82 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 78 con respecto a la proteína Ras del tipo natural se muta. En un aspecto de esta modalidad, la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En otro aspecto, la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. Otra modalidad de la invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico aislada que comprende al menos cinco aminoácidos contiguos de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica Ras (H-Ras, N-Ras, o K-Ras), en donde la prolina en la posición 73 de Ras (P73), la treonina en la posición 74 (T74), la glicina en la posición 75 (G75), la glicina en la posición 77 (G77), y/o la fenilalanina en la posición 78 (F78) de la secuencia de aminoácidos Ras se muta. También abarca la invención a las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquier fragmento de Ras que comprende cualquiera de una o más de estas mutaciones, en donde la molécula de ácido nucleico es útil en cualquier aplicación de rastreo, de diagnóstico o terapéutica. Preferiblemente, el aminoácido en cualquiera o más de estas posiciones se sustituye con un aminoácido diferente que el que se presenta en esa posición en las secuencias de tipo natural de Ras. En otra modalidad, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifican las proteínas Ras (H-ras, N-ras o K-ras) que contienen cualquiera o más de las mutaciones en las posiciones 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 o 78 (o una porción de las mismas), y una o más mutaciones adicionales en una posición diferente en Ras. Una combinación preferida de mutaciones es una mutación G12 y/o una mutación G13 con cualquiera o más de las mutaciones en las posiciones 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77, o 78. En otra modalidad la invención proporciona una combinación de diferentes moléculas de ácido nucleico, al menos una de las cuales codifica Ras (o una porción de la misma) que contiene una o más mutaciones en una posición seleccionada entre 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 o 78 (y de preferencia se selecciona entre cualquiera de las posiciones 73-78), y una o más moléculas de ácido nucleico adicionales que contienen una o más mutaciones adicionales, que incluyen, pero no se limitan a una mutación en G12 y una mutación en G13. En una modalidad de la invención, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente pueden ser una sonda de oligonucleótido o un cebador. Otra modalidad de la invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente, operativamente enlazada a cuando menos una secuencia de control de expresión. Todavía otra modalidad de la invención se relaciona con una célula recombinante que ha sido transfectada con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico recombinantes descritas anteriormente.

En un aspecto, la célula recombinante de la reivindicación 20, en donde la célula es una levadura. Otra modalidad de la presente invención se relaciona con una proteína, o péptido, aislada codificada por la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico identificadas anteriormente. En una modalidad, la proteína, o péptido, aislada es parte de una proteína de fusión. Otra modalidad de la invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico aislada que es completamente complementaria a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente. Todavía otra modalidad de la invención se relaciona con una vacuna que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente. Otra modalidad de la invención se relaciona con una vacuna que comprende cualquiera de las proteínas o péptidos descritos anteriormente. En un aspecto, la vacuna además comprende un vehículo de levadura. En otro aspecto, el vehículo de levadura expresa recombinantemente la proteína o péptido. En un aspecto, la vacuna además comprende una célula dendrítica, en donde la célula dendrítica ha sido cargada intracelularmente con el vehículo de levadura y la proteína o péptido. Todavía otra modalidad de la invención se relaciona con una vacuna que comprende: (a) un vehículo de levadura; y (b) una proteína de fusión que comprende una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o el fragmento de la misma contiene la posición 76 del aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde el aminoácido en la posición 76 se muta en comparación con la proteína de tipo natural, en donde la expresión de la proteína de fusión está bajo el control del promotor Cup1. La proteína de fusión es expresada por el vehículo de levadura. En un aspecto, la proteína de fusión además comprende una segunda proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la segunda proteína o fragmento de la misma contiene la posición 12 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde el aminoácido en la posición 12 se muta en comparación con la proteína de tipo natural. En un aspecto, la proteína de fusión comprende las siguientes proteínas o fragmentos, fusionados en un cuadro: (i) una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o el fragmento contiene la posición 12 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde la glicina en la posición 12 se sustituye con una cisteína; (ii) una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o fragmento de la misma contiene la posición 61 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde la glutamina en la posición 61 se sustituye con una arginina; (iii) una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o fragmento de la misma contiene la posición 12 de aminoácido con 1 I respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde la glicina en la posición 12 se sustituye con un aspartato; (iv) una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o fragmento de la misma contiene la posición 12 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde la glicina en la posición 12 se sustituye con una valina; (v) una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o fragmento contiene la posición 12 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde la glicina en la posición 12 se sustituye con una arginina; (vi) una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o fragmento contiene la posición 76 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde el glutamato en la posición 76 se sustituye con una glicina. En un aspecto, la proteína de fusión comprende las siguientes proteínas o fragmentos, fusionadas en cuadro: (i) una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o el fragmento contiene la posición 12 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde la glicina en la posición 12 se sustituye con una arginina; y (ii) una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o el fragmento contiene la posición 76 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, en donde el glutamato en la posición 76 se sustituye con una glicina. En un aspecto, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14. En otro aspecto, la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15. Todavía otra modalidad de la invención se relaciona con un anticuerpo o fragmento que enlaza antígeno del mismo que selectivamente se enlaza a cualquiera de las proteínas o péptidos Ras mutantes descritos anteriormente. Otra modalidad de la invención se relaciona con un aptámero que selectivamente enlaza a cualquiera de las proteínas o péptidos Ras mutantes descritas anteriormente. Todavía otra modalidad de la invención se relaciona con una molécula de ARNsi que cataliza la disociación selectiva del ARN transcrito por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente, o del ARN transcrito por un gen ras que codifica cualquiera de las proteínas Ras mutantes descritas anteriormente y, en particular, una proteína Ras mutante que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de una secuencia de aminoácidos de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras por al menos una mutación en la posición 76 con respecto a la secuencia de aminoácidos de tipo natural. Otra modalidad de la invención se relaciona con una ribozima que selectivamente cataliza la inactivación de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente, o de un gen ras que codifica cualquiera de las proteínas Ras mutantes descritas anteriormente y, en particular, la proteína Ras mutante que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de una secuencia de aminoácidos de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras en al menos una mutación en la posición 76 con respecto a la secuencia de aminoácidos de tipo natural. Todavía otra modalidad de la invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico antisentido que híbrida bajo condiciones mucho muy estrictas e inhibe la expresión de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente o de un gen ras que codifica cualquiera de las proteínas Ras mutantes descritas anteriormente y, en particular, la proteína Ras mutante que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras en al menos una mutación en la posición 76 con respecto a la secuencia de aminoácidos de tipo natural. Otra modalidad de la invención se relaciona con el uso de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente o cualquiera de las proteínas o péptidos descritos anteriormente, en la preparación de una composición para la prevención o el tratamiento del cáncer. Otra modalidad de la invención se relaciona con el uso de cualquiera de las vacunas descritas anteriormente en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento del cáncer. Otra modalidad de la invención se relaciona con el uso de cualquiera de los aptámeros descritos anteriormente, cualquiera de los ARNsi descritos anteriormente, cualquiera de las ribozimas descritas anteriormente, o cualquiera de las moléculas de ácido nucleico antisentido descritas anteriormente en la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento del cáncer. Todavía otra modalidad de la invención se relaciona con prevenir o tratar un cáncer, que comprende administrar a un animal que tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer, cualquiera de las vacunas descritas anteriormente. Otra modalidad de la invención se relaciona con un método para prevenir o tratar un cáncer, que comprende administrar a un animal que tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer, cualquiera de los aptámetros descritos anteriormente, cualquiera de los ARNsi descritos anteriormente, cualquiera de las ribozimas descritas anteriormente, o cualquiera de las moléculas de ácido nucleico antisentido descritas anteriormente. Otra modalidad de la invención se relaciona con un método para prevenir o tratar un cáncer, que comprende administrar a un animal que tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer, un compuesto que inhiba la expresión de una proteína Ras mutante, en donde la proteína Ras mutante comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de una secuencia de aminoácidos del tipo natural K-ras, N-ras o H-ras en al menos una mutación en la posición 76 con respecto a la secuencia de aminoácidos del tipo natural. Todavía otra modalidad de la invención se relaciona con un método para prevenir o tratar un cáncer, que comprende administrar a un animal que tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer, un compuesto que inicia o dispara la hidrólisis de GTP de una proteína Ras mutante, en donde la proteína Ras mutante comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de una secuencia de aminoácidos de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras por al menos una mutación en la posición 76 con respecto a la secuencia de aminoácidos de tipo natural. Otra modalidad de la invención se relaciona con un método de diagnóstico de un tumor que comprende detectar la expresión o la actividad de una proteína Ras mutante o la secuencia de ácidos nucleicos que codifican a la proteína Ras en una muestra de prueba de un paciente que va a ser diagnosticado, en donde la proteína Ras comprende una mutación en la posición 76 con respecto a la secuencia de aminoácidos Ras de tipo natural. La detección de la proteína Ras o de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica a la proteína Ras en la muestra de prueba indica la presencia de células de tumor o del potencial de las mismas en la muestra de prueba. En un aspecto, la proteína Ras comprende una sustitución de una glicina por el glutamato en la posición 76 en la proteína de tipo natural. En un aspecto, el método además comprende detectar si la proteína Ras también comprende una mutación en la posición 12 con respecto a la secuencia de aminoácidos Ras de tipo natural, en donde la detección de una mutación en la posición 76 y en la posición 12 indica la presencia de células de tumor o potencial de las mismas en la muestra de prueba, y además indica un tumor más agresivo en el paciente en comparación con las células de tumor que alojan una proteína Ras con solamente una mutación o sin mutación en estas posiciones. En un aspecto, el paso de detectar comprende detectar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la mutación Ras en la muestra de prueba. En un aspecto, el paso de detectar comprende la amplificación por PCR de una plantilla de ADN genómico que codifica la mutación o la amplificación por PCR en el sitio de las secuencias de ADN que codifican la mutación. En un aspecto, el paso de detectar es mediante un método seleccionado del grupo que consiste en reacción en cadena de polimerasa (PCR), PCR transcriptasa inversa (RT-PCR), hibridación en el sitio, Northern blot, análisis de secuencias, análisis de microarreglos de genes, y detección de un gen reportero. En un aspecto, el nivel de secuencias de ácido nucleico que codifica a la proteína Ras muíante se determina poniendo en contacto los ácidos nucleicos aislados de la muestra de prueba con un cebador o una sonda que selectivamente se enlaza a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica a la proteína Ras mutante, y detectando si la secuencia de ácido nucleico que codifica a la proteína Ras mutada es enlazada por el cebador o la sonda. En un aspecto, el nivel de la proteína Ras mutante se determina poniendo en contacto la muestra a prueba con un anticuerpo o fragmento del mismo o un aptámero que selectivamente enlaza específicamente a la proteína Ras mutante, y detectando si el anticuerpo o fragmento del mismo o aptámero ha enlazado a la proteína Ras mutante. En un aspecto, la muestra de prueba es de un paciente que está siendo diagnosticado de cáncer y en donde la muestra de prueba se compara con una muestra de control negativo. En un aspecto, la muestra de prueba inmoviliza sobre un sustrato. En un aspecto, el método se usa para diagnosticar cáncer en el paciente. En un aspecto, el método se usa para determinar el pronóstico del cáncer en el paciente. En otro aspecto, el método se usa para determinar la susceptibilidad del paciente al tratamiento terapéutico. Otra modalidad de la invención se relaciona con un kit para su uso en los métodos de diagnóstico de la presente invención. El kit de preferencia contiene cualquier reactivo útil para detectar la presencia o ausencia de la mutación Ras (proteína) o ras (ácido nucleico) de acuerdo con la presente invención en una muestra de prueba, y de preferencia incluye una sonda de oligonucleótido, cebadores de PCR, o un anticuerpo, un péptido que enlaza antigeno, o aptámero, que enlaza al biomarcador (es decir, el gen ras mutado, ARN, ADNc , o la proteína codificada mediante los mismos). El kit puede incluir cualquier reactivo necesario para realizar un método diagnóstico considerado en la presente. El kit también puede incluir reactivos para la detección de otros biomarcadores de cáncer, tales como las mutaciones de Ras descritas anteriormente, o cualquier otro objetivo conveniente para el diagnóstico del cáncer, aún para cánceres que tienen causas o contribuciones no relacionadas con la mutación Ras descrita en la presente. Todavía otra modalidad de la invención se relaciona con un método para identificar un compuesto para prevenir o tratar cáncer, que comprende identificar un inhibidor de una proteína Ras objetivo o una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína Ras objetivo, en donde la proteína Ras objetivo comprende una mutación en la posición 76 relacionada con una proteína Ras de tipo natural. En un aspecto, la mutación es una sustitución de un aminoácido no glutamato seleccionado entre el grupo que consiste en una glicina, una lisina y una glutamina para el glutamato en la posición 76 en la proteína de tipo natural. En un aspecto, el paso de identificar comprende identificar un inhibidor de la expresión o la actividad de la proteína Ras objetivo. En un aspecto, el paso de detectar se selecciona entre el grupo que consiste en: detectar la traducción o la actividad de la proteína Ras objetivo en presencia del compuesto regulador supuesto; y detectar la expresión de un gen que codifica la proteína Ras objetivo en presencia del compuesto regulador supuesto. En un aspecto, el método incluye los pasos de: (a) poner en contacto una célula huésped con un compuesto regulador supuesto, en donde la célula huésped expresa la proteína Ras objetivo o un fragmento biológicamente activo de la misma; y (b) detectar si el compuesto regulador supuesto dispara la hidrólisis de GTP de la proteína Ras objetivo o el fragmento biológicamente activo de la misma, en donde un compuesto regulador supuesto que dispara la hidrólisis de GTP de la proteína Ras objetivo en comparación con la ausencia del compuesto se indica que es un compuesto candidato para la prevención o el tratamiento del cáncer. En un aspecto, la célula huésped es una línea celular de tumor. Otra modalidad de la invención se relaciona con un método para identificar un compuesto para prevenir o tratar cáncer, que comprende identificar un compuesto que dispara la hidrólisis de GTP en una célula que expresa una proteína Ras mutada objetivo, pero no en una célula que expresa una proteína Ras de tipo natural, en donde la proteína Ras mutada objetivo comprende una mutación en la posición 76 en relación con una proteína Ras de tipo natural. En un aspecto de cualquiera de los métodos anteriores de identificación, el compuesto regulador supuesto se puede seleccionar entre: un aptámero, una molécula de ARNsi, una molécula de ácido nucleico antisentido, una ribozima, un anticuerpo o fragmento que enlaza antígeno del mismo, un antagonista conformacional y un inhibidor de molécula pequeña. Descripción Detallada de la Invención. La presente invención en general se relaciona con el descubrimiento por los presentes inventores, de una mutación recientemente descubierta en la Ras humana que se cree que contribuye o causa cáncer en ciertos individuos que tienen la mutación, la cual incluye múltiples variantes de esta mutación particular. Específicamente, los inventores han descubierto que una mutación en el aminoácido número 76 (es decir, codificada por el codón 76) en la secuencia de la Ras humana (K-. N-, o H-Ras) se puede identificar en un porcentaje significativo de tumores de pacientes y aumenta la oncogenicidad de los tumores. Al leal saber y entender de los presentes inventores, esta mutación particular de la Ras no ha sido identificada previamente. La invención también se relaciona con el descubrimiento por los presentes inventores que cuando esta mutación recientemente descubierta está presente en una célula de tumor al mismo tiempo que una segunda mutación Ras, previamente descrita, particularmente una mutación del codón 12, la combinación de mutaciones se sinergiza para aumentar la oncogenicidad de los tumores que llevan estas mutaciones. En particular, la combinación de mutaciones tiene un efecto sinérgico con respecto al aumento del crecimiento del tumor, en comparación con cualquiera de las mutaciones sola, lo cual ha sido demostrado tanto in vitro como in vivo. De conformidad con lo anterior, la presente invención proporciona moléculas y proteínas de ácido nucleico que utilizan estos descubrimientos, así como una variedad de herramientas y métodos de investigación, diagnóstico y terapéuticas de uso basados en este descubrimiento como se describe en detalle más adelante. Específicamente, se caracterizaron secuencias de ADN K-, N-, y H-ras para determinar la presencia de mutaciones asociadas con tumores mediante amplificación por PCR anidada y secuenciamiento directo de los exones 2 y 3 de los tumores de 149 sujetos con cánceres de páncreas (68 por ciento detectados con mutaciones ras del codón 12, 13 o 61), colorrectal (40 por ciento detectados con mutaciones ras del codón 12, 13 o 61), o carcinoma de pulmón no microcelular (NSCLC) (9 por ciento detectados con mutaciones ras en el codón 12, 13 o 61) en un ensayo de inmunoterapia en Fase 1 de levadura aniquilada por calor, entera, que expresa proteínas Ras mutadas (también llamadas en la presente Tarmógenas). Una nueva mutación ras en el codón 76 se detectó en 24 sujetos de los tres tipos de cáncer, siendo 22 mutaciones E76G, mientras que un tumor albergó una mutación E76K, y un tumor albergó una mutación E76Q. Combinaciones dobles de E76 más las mutaciones descritas anteriormente en los codones 12 o 13 se identificaron en 8 tumores.

Más específicamente como se muestra en la Tabla 1 (ver el Ejemplo 1), 5 de 33 (-15 por ciento) de los tumores de pulmón, 12 de 85 de los tumores colorrectales (-14 por ciento), y 7 de 31 (-22.5 por ciento) de los tumores de páncreas, para los cuales se obtuvo información del secuenciamiento completo en los tres genes Ras (exones 2 y 3), exhibieron mutaciones en el aminoácido número 76 (es decir, codificado por el codón 76) en la secuencia de Ras humana (mutación de Ras E76). Uno de los tumores colorrectales de pulmón tuvo mutaciones en el aminoácido 76 tanto en el K- como en H-ras. En el caso de los tumores colorrectales, 10 de las 12 mutaciones en el aminoácido 76 fueron una mutación del glutamato a la glicina (E76G), una mutación fue una mutación de glutamato a mutación lisina (E76K), y una mutación fue una mutación de glutamato a glutamina (E76Q). Todas las mutaciones E76 en los tumores de pulmón y de páncreas fueron mutaciones E76G. En general, la ocurrencia de las mutaciones en el aminoácido 76 de Ras en los tumores estudiados en este ensayo en Fase I fue segunda solamente a la ocurrencia de las mutaciones de aminoácido 12 Ras (véase Figura 1). Las frecuencias de las mutaciones de Ras previamente conocidas, en las posiciones 12, 13 y 61 en este mismo conjunto de muestras de tumor se muestran en la Tabla 2 (véase el Ejemplo 1). Las mutaciones E76 presentadas principalmente en los genes K-ras o H-ras exón 3, aunque la mutación E76K ocurrió en el exón 3 del gen N-ras. También, como se mencionó anteriormente, dobles combinaciones de E76 más las mutaciones descritas previamente en los codones 12 o 13 se identificaron en 8 tumores. Juntos, estos datos indican que las mutaciones en el codón 76 del gen Ras fueron contribuyentes o causaron el cáncer en estos individuos. Estudios adicionales de los inventores han demostrado que sin duda, la expresión de una mutación de Ras en el codón 76 en K-ras murina en células Balb3T3 aumentó la formación de colonias en agar blando por estas células in vitro. Específicamente, se confirmaron mutaciones E76G y E76K de Ras como transformantes en estudios no clínicos. De particular interés, el acoplamiento de las mutaciones del codón 76 y el 12 dio como resultado una sinergia de crecimiento del tumor (es decir, la combinación de las mutaciones sinergizó a aumentar significativamente la oncogenicidad de los tumores que contenían Ras con estas mutaciones dobles). Más aún, cuando varios genes K-ras mutantes se inyectaron en ratones sin pelo BALB/c, la doble mutación de Ras G12-E76 (específicamente una mutación G12V-E76G en este experimento) condujo a un crecimiento de tumor significativamente acelerado en comparación con las células de tumor que llevaban cualquier mutación simple. Habiendo hecho estos descubrimientos, los presentes inventores creen que, sin estar apegados a la teoría, la mutación E76 puede dar como resultado una oncoproteína Ras activada. Las mutaciones previamente descritas en el codón 12 o en el codón 61 bloquean la liberación de ?-fosfato de GTP o evitan que la proteína Ras GAP se enlace con Ras para disparar la hidrólisis de GTP, respectivamente. Cuando la estructura de cristal conocida de Ras fue examinada por los presentes inventores para determinar la posición del aminoácido 76, se vio que este residuo se localiza en el extremo del ciclo designado como Switch 2 o Loop 4 (véase la Figura 4). Haciendo referencia a la Figura 4, la posición estimada de los aminoácidos 12, 13, 61 y 76 están resaltados en la estructura terciaria de la proteína (por ejemplo, para la colocación del aminoácido dentro de la estructura de cristal de Ras véanse las estructuras múltiples en el Banco de datos de proteínas RSSB (PDB), o en Franken, SM y colaboradores, Biochemistry 1993, 32:8411-20. Este dibujo esquemático resalta el cambio en la estructura de cristal de la proteína Ras debido a una mutación del codón 12 en H-Ras (G12D) (izquierda) en comparación con la secuencia del tipo natural (G12) para ese dominio (derecha). Además, la estructura alterada de un dominio que alberga la forma mutante del codón 61 de H-Ras (¡61L (derecha) es evidente por comparación a la secuencia del tipo natural para ese dominio (izquierda). El extremo proximal del Loop 4 alberga el aminoácido 61, donde las mutaciones se han definido antes de la presente invención como que activan la oncoproteína Ras en cánceres de animales y de humanos (por ejemplo, véase Lu y colaboradores, Cáncer Res. 2004 Aagosto 1;64 (15):5084-8; véase también numerosos estudios clínicos --también dos pacientes de cáncer colorrectal en el ensayo actual descrito en el Ejemplo 1 tienen mutaciones en el codón 61 de Ras). Este ciclo en la proteína Ras participa con el enlace de proteínas que activan la GTPasa (las GAP de Ras) que dispara la hidrólisis de GTP enlazado a la proteína Ras activada, para convertir la Ras en la forma enlazada con GDP inactiva. La incapacidad para disparar la hidrólisis de GTP mantiene a la proteína Ras en el estado activado (GTP-enlazados), y por lo tanto se envían constitutivamente señales para la proliferación celular. De este modo, la mutación en el codón 61 evita que las proteínas que interactúan apaguen el estado activado. La mutación en el codón 12 interfiere con la liberación del fosfato terminal, de manera que la proteína permanece en el estado activado. El estado activado de este modo es una conformación de la proteína Ras (con GTP enlazado) que es capaz de asociación con las proteínas efectoras corriente abajo para enviar la señal de proliferación desde los activadores corriente arriba, o en el caso de las proteínas Ras mutadas, entregar una señal de activación constitutiva. La colocación del aminoácido 76 en la otra 'articulación' del dominio Switch 2/Loop 4 (enlace GAP) es consistente con la creencia de los presentes inventores de que las mutaciones en este aminoácido de manera similar interferirán con la función de Ras. Por ejemplo, una mutación de glutamato a glicina (mutación E76G de Ras), por ejemplo, cambiará la secuencia Ras de glicina-glutamato-glicina (GEG para el código de una sola letra para los codones 74-76) a glicina-glicina-glicina (GGG para el código de una sola letra de los codones 'mutados' 74-76). La introducción de glicinas en las estructuras alfa-helicoidales se sabe que interfiere bioquímicamente con el mantenimiento de las estructuras de ciclos alfa-helicoidales. Por lo tanto, se predice que el cambio de GEG a GGG interrumpe la hélice alfa del Loop 4/Switch 2, e interferirá con los cambios de conformación necesarios para promover la hidrólisis de GTP. De manera similar, el cambio de glutamato a lisina, o glutamato a glutamina en el aminoácido 76 (E76K o E76Q, respectivamente) alterará la carga del aminoácido, lo cual también tiene el potencial de interrumpir la estructura de la proteína y la función si la carga negativa del glutamato fuera importante para las interacciones proteína-proteína intra- o Inter-moleculares. De este modo, la observación de los presentes inventores de que una porción significativa de tumores humanos posee la mutación E76 de Ras se puede explicar mediante estudios de la estructura de la función de Ras. La identificación de las mutaciones de ras del codón 76 en los tumores humanos de conformidad con lo anterior, representa un nuevo objetivo para la terapia contra el cáncer. Estas observaciones han conducido a los inventores a proponer adicionalmente en la presente, que las mutaciones de interés en la región de articulación relacionada con E76 también pueden incluir las mutaciones en los aminoácidos P73, T74,G75, E76, G77 y F78, y que las mutaciones en estas posiciones tendrán un efecto similar en la hidrólisis de GTP de Ras y por lo tanto, sobre la proliferación celular (crecimiento de tumores) como la mutación E76 descrita en la presente. De conformidad con lo anterior, las mutaciones en los codones 73, 74, 75, 77 y 78 también representan nuevos objetivos para la terapia contra el cáncer. Los resultados de los inventores también indican que los tumores que llevan mutaciones dobles es más probable que exhiban características de crecimiento agresivo. De este modo, el genotipo de las mutaciones de ras del codón doble 12 y 76 en tumores de pacientes, se cree que son pronóstico de un fenotipo maligno acelerado, lo cual ha sido indicado por los datos proporcionados en la presente. La identificación de las mutaciones en combinación que comprenden mutaciones de ras del codón 76 de conformidad con lo anterior, representa otro nuevo objetivo para la terapia contra el cáncer. Más aún, debido a que los datos de los inventores en el Ejemplo 1 también indican que se pueden encontrar mutaciones en A59 o Q61 de Ras junto con las mutaciones G12 o G13, los inventores proponen en la presente que otras combinaciones de mutaciones en alguno de los dos G12 o G13 (interfiriendo con la liberación del fosfato terminal) con o más de A59, Q61 o E76, o sin duda, con cualquiera otra de los demás aminoácidos en la misma región de articulación que E76 (es decir, P73, T74, G75, E76, G77, F78), también exacerban la proliferación celular a través de la inhibición de la hidrólisis de GTP de Ras y, de conformidad con lo anterior, conducirán a un fenotipo de tumor más agresivo, con potencial metastásico aumentado. Esto se basa en la creencia de los inventores de que la combinación de reducir la capacidad de liberar GTP disociado (impacto de mutaciones en las posiciones 12/13) con la incapacidad para señalar la actividad de la GTPasa (impacto de mutaciones en las posiciones 59, 61, 73-78 de las mutaciones en cualquier lado de la región Switch 2/Loop 4) exacerbarán la señalización de la proliferación celular en un orden de magnitud, como lo indican los datos proporcionados con respecto a la combinación de las mutaciones en G12 y E76. Este fenotipo podría ocurrir vía dos mutaciones en la misma molécula de ADN (el mismo gen) y/o mutaciones que se presentan por separado en cada uno de los alelos de Ras, aunque los datos de los inventores indiquen que la combinación de mutaciones que se presentan sobre la misma molécula de ADN conduce al fenotipo más agresivo y puede potenciar la metástasis maligna. De conformidad con lo anterior, la presente invención incluye moléculas de ácido nucleico que tienen cualquier combinación de las mutaciones en la posición 12 o 13 con las mutaciones en las posiciones 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 o 78, siendo las combinaciones entre las posiciones 12 o 13 con las posiciones 59, 61 o 76 las modalidades particulares de la invención. Todas las proteínas o péptidos que comprenden estas combinaciones y los usos de las moléculas de ácido nucleico y proteínas (y las herramientas relacionadas) están consideradas por la invención, como se describe en mayor detalle más adelante.

Por lo tanto, una modalidad de la presente invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica Ras (H-Ras, N-Ras o K-Ras), en donde el glutamato en la posición 76 de la secuencia de aminoácidos de Ras (E76) está mutado. También la invención abarca las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquier fragmento de Ras que comprende la mutación en la posición 76, esta molécula de ácido nucleico es útil en cualquier aplicación de rastreo, de diagnóstico o terapéutica. De preferencia, el aminoácido en la posición 76 es sustituido con otro aminoácido (un aminoácido que no es glutamato, o "un aminoácido no glutamato") que puede incluir, pero no se limita a, una sustitución glicina, una sustitución lisina o una sustitución glutamina. En otra modalidad, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas, que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica Ras (H-Ras, N-Ras o K-Ras) que contienen una mutación E76 (o una porción de la misma), y una o más mutaciones adicionales en una posición diferente en Ras. Una combinación preferida de mutaciones es una mutación E76 y una mutación G12, aunque este aspecto de la invención no se limita a esta combinación, como se describió anteriormente. En otra modalidad, la invención proporciona una combinación de diferentes moléculas de ácido nucleico, al menos una de las cuales codifica Ras que contiene una mutación E76 (o una porción de la misma) o una o más moléculas de ácido nucleico adicionales que contienen una o más mutaciones adicionales, incluyendo, pero sin limitarse a, una mutación en G12, una mutación en G13, una mutación en A59 y/o una mutación en Q61. Las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas o péptidos Ras que comprenden la mutación en la posición 76, sola o junto con mutaciones adicionales, son útiles, por ejemplo, como sondas o cebadores para herramientas de investigación o diagnóstico, para preparar moléculas antisentido o de ARNsi (descritas más adelante) como reactivos de diagnóstico o terapéuticos, y/o para codificar proteínas y péptidos Ras para su uso como reactivos para investigación, diagnóstico y/o terapéuticos, todos descritos en mayor detalle más adelante. Otra modalidad de la invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica Ras (H-Ras, N-Ras o K-Ras), en donde la prolina en la posición 73 de Ras (P73), la treonina en la posición 74 (T74), la glicina en la posición 75 (G75), la glicina en la posición 77 (G77) y/o la fenilalanina en la posición 78 (F78) de la secuencia de aminoácidos de Ras está mutada. También la invención abarca las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquier fragmento de Ras que comprende cualquiera de una o más de estas mutaciones, esta molécula de ácido nucleico es útil en cualquier aplicación de rastreo, diagnóstico o terapéutica. De preferencia, el aminoácido en cualquiera de una o más de estas posiciones se sustituye con un aminoácido diferente de la que se presenta en esta posición en la secuencia de tipo natural de Ras. En otra modalidad, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica las proteínas Ras (H-ras, N-ras o K-ras) que contienen cualquiera de una o más de las mutaciones en las posición 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 o 78 (o una porción de las mismas), y una o más mutaciones adicionales en una posición diferente en Ras. Una combinación preferida de mutaciones es una mutación G12 y/o una mutación G13 con cualquiera de una o más de las mutaciones en las posiciones 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 o 78. En otra modalidad, la invención proporciona una combinación de diferentes moléculas de ácido nucleico, al menos una de las cuales codifica Ras (o una porción de la misma) que contiene una o más mutaciones en una posición seleccionada entre la 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 o 78 (y de preferencia seleccionada entre cualquiera de una de las posiciones 73-78), y una o más moléculas de ácido nucleico adicionales que contienen una o más mutaciones adicionales, incluyendo, pero sin limitarse a, una mutación en G12 y una mutación en G13. Las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas o péptidos Ras que comprenden cualquiera de las mutaciones descritas anteriormente y combinaciones de las mismas son útiles, por ejemplo, como sondas o cebadores para herramientas de investigación o de diagnóstico, para preparar moléculas antisentido o moléculas de ARNsi (descritas más adelante) como reactivos de diagnóstico o terapéuticos, y/o para codificar proteínas y péptidos Ras para su uso como reactivos para investigación, diagnóstico y/o terapéuticos, todos descritos en mayor detalle más adelante.

También se incluyen en la presente invención las proteínas codificadas por cualquiera de las moléculas de ácido nucleico identificadas anteriormente, incluyendo cualquier fragmento de una proteína Ras que incluye la mutación en la posición 76 (o cualquiera de las mutaciones en las posiciones 73, 74, 75, 77 o 78), sola o en combinación con otras mutaciones, y que son útiles en cualquier aplicación de investigación, diagnóstico, o terapéutica. El uso de la mutación E76 de Ras, así como el uso de una mutación en las posiciones 73, 74, 75, 77 o 78 o cualquiera de las combinaciones de las mutaciones de Ras descritas en la presente, se puede extender adicionalmente para alcanzar una variedad de herramientas de investigación, diagnóstico y terapéuticas, incluyendo el desarrollo de anticuerpos que selectivamente enlazan a proteínas Ras que tienen esta mutación o mutaciones particulares; el desarrollo de aptámeros que selectivamente enlazan a proteínas Ras que tienen esta mutación o mutaciones particulares; el desarrollo de ácidos nucleicos de ARNsi o antisentido útiles como reactivos de diagnóstico o como una herramienta terapéutica para la inhibición de la expresión de Ras que lleva esta mutación o mutaciones particulares; el desarrollo de moléculas terapéuticas, incluyendo antagonistas conformacionales, que disparan la hidrólisis de GTP o de otro modo compensan las deficiencias o la hiperactividad de estas proteínas Ras mutantes con respecto a esto; y/o el desarrollo de modelos animales, incluyendo animales transgénicos y líneas celulares, que expresan esta mutación o mutaciones.

Otra modalidad de la presente invención se relaciona con el uso de la mutación de Ras E76, o una mutación en la posición 73, 74, 75, 77 o 78 o cualquiera de las combinaciones de las mutaciones de Ras descritas en la presente, como un marcador en un ensayo de diagnóstico o pronóstico para el cáncer. Por ejemplo, se pueden obtener muestras biológicas de un paciente que está siendo probado para ver si tiene cáncer o está en riesgo de desarrollar cáncer, y la expresión de una Ras que lleva la mutación E76 (o una mutación en la posición 73, 74, 75, 77 o 78) se puede analizar, ya sea a nivel del gen, del ARN o a nivel proteína. Los pacientes que expresan una Ras que tiene esta mutación se predice que están en riesgo más alto de tener cáncer o se diagnostican como que es más probable que tengan cáncer, en comparación con una persona que no tiene esta mutación. Además, los pacientes que expresan una Ras que tiene una mutación en cualquiera de las posiciones 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 o 78 además de una segunda mutación de Ras, y particularmente una mutación G12 o G13 (siendo las combinaciones de las mutaciones en E76 y G12 de particular interés), se predice que están en un mayor riesgo de tener cáncer, se diagnostica como que tienen un cáncer más agresivo, o se diagnostica que es más probable que tengan cáncer en comparación con una persona que no tiene esta combinación de mutaciones en Ras. Además, la presencia o ausencia de cualquiera de las mutaciones de Ras en la posición 73- 78 (y particularmente, la mutación E76) y las combinaciones de estas mutaciones o la mutación en la posición 59 o 61 con otras mutaciones (por ejemplo, una mutación G12 o una mutación G13) se puede usar para determinar la terapia de cáncer para un paciente o para predecir el resultado de la terapia de un paciente. Por ejemplo, un paciente que tiene la mutación E76G de Ras puede ser tratado de una manera particular o con composiciones terapéuticas particulares basadas en la presencia de la mutación Ras E76 (por ejemplo, mediante la selección de compuestos que efectúan hidrólisis de GTP) . Sin duda las modalidades de la presente invención descritas más adelante se dirigen a enfoques inmunoterapéuticos basados en la identificación de esta mutación particular o de cualquiera de las mutaciones en la posición 73-78 o la combinación de mutaciones descritas en la presente. Un paciente que tiene una combinación de una mutación E76 y otra mutación, tal como una mutación G12, se puede predecir que tiene un tumor particularmente agresivo y/o puede promover la metástasis del tumor primario a partir del sitio de origen, y puede ser tratado de conformidad con esto, incluyendo con enfoques inmunoterapéuticos basados en la lesión E76 o en esta combinación de mutaciones. Otras combinaciones de la mutación G12 o G13 con las mutaciones en la región Switch 2/Loop 4, como se discutió anteriormente, también se predice que indican tumores particularmente agresivos. Todavía otra modalidad de la presente invención se relaciona con el uso de la mutación E76 de Ras (o una mutación en la posición 73, 74, 75, 77 o 78 o cualquiera de las combinaciones de las mutaciones de Ras descritas en la presente) como un objetivo para los enfoques terapéuticos para el tratamiento de cáncer en un paciente. Estos enfoques terapéuticos pueden incluir, pero no se limitan a, enfoques quimioterapéuticos y enfoques inmunoterapéuticos. Por ejemplo, basándose en el mecanismo propuesto de acción de la mutación E76 de Ras como se señaló anteriormente, se puede diseñar o proponer estrategias quimioterapéuticas que, por ejemplo, permitan la hidrólisis de GTP a partir de la proteína Ras o compensar de otro modo la incapacidad de Ras para disparar la hidrólisis de GTP. Preferiblemente se diseñaría un compuesto que fuera capaz de regular la hidrólisis de GTP de una proteína Ras mutada sin impactar la hidrólisis de GTP de la proteína Ras no mutada (descrita con mayor detalle más adelante). A manera de ilustración, se puede desarrollar una variedad de moléculas sintéticas, aptámeros, o antagonistas conformacionales usando la información proporcionada en la presente para disparar la hidrólisis de GTP de las proteínas Ras activas. En un enfoque inmunoterapéutico, la mutación de E76 de Ras (u otras mutaciones en las posiciones 73-78) se usa en la producción o en la provisión de antígenos de Ras mutado para estimular una respuesta inmune contra las células de tumor que expresan este Ras mutado. Las combinaciones de las mutaciones de Ras (por ejemplo, E76 y G12) se pueden usar de igual forma. La proteína o péptido Ras o el ácido nucleico mutado que codifica a la misma se puede usar como un objetivo en pruebas para identificar una molécula pequeña novedosa o fármacos de péptidos que se predice que modifican la expresión o la actividad de la proteína Ras en una célula de tumor, por ejemplo. Los aspectos preferidos de esta modalidad se describen más adelante. Otra modalidad de la presente invención se relaciona con una vacuna profiláctica o terapéutica o una composición y un método de usar la misma para proteger a un animal contra un cáncer. La vacuna o la composición puede incluir un antígeno que comprende una o más porciones inmunogénicas de Ras que comprende la mutación E76 descrita en la presente (o una o más porciones inmunogénicas de una Ras que comprende una mutación en la posición 73, 74, 75, 77 o 78) sola o en combinación con otras porciones inmunogénicas de Ras que comprende otras mutaciones, o en combinación con otros inmunógenos relevantes para el tumor que va a ser tratado o evitado. La vacuna o la composición también puede incluir un antígeno que comprende una o más porciones inmunogénicas de Ras que comprenda cualquiera de las combinaciones de las mutaciones de Ras descritas en la presente, solas o en combinación con otros inmunógenos relevantes al tumor que va a ser tratado o prevenido. Cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable para administrar este antígeno, incluyendo cualquier adyuvante, portador o vehículo administrador se puede incluir en la vacuna o composición. En una modalidad preferida, el vehículo es un vehículo basado en levadura, el cual se describe en detalle más adelante. El antígeno de Ras se puede proporcionar en una composición para el tratamiento de cualquier cáncer que lleva mutaciones de Ras E76 (o una mutación en la posición 73, 74, 75, 77 o 78 o cualquiera de las combinaciones de las mutaciones de Ras descritas en la presente), y también como un elemento de un producto basado en antígeno múltiple y/o multi-epitópico para el tratamiento de una variedad de cánceres, los cuales pueden incluir todos los cánceres que llevan las mutaciones E76 (o una mutación en la posición 73, 74, 75, 77 o 78 o cualquiera de las combinaciones de las mutaciones de Ras descritas en la presente). Como anteriormente, otros antígenos Ras y/o otros antígenos de cáncer o porciones inmunogénicas de los mismos se pueden incluir en la vacuna o composición. Técnicas Generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica, química de ácido nucleico, e inmunología, las cuales son muy conocidas para los expertos. Estas técnicas se explican completamente en la literatura tal como Methods of Enzymology, Vol. 194, Guthrie y colaboradores, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Biology and activities of yeasts, Skinner y colaboradores., eds., Academic Press (1980); Methods in yeast genetics : a laboratory course manual, Rose y colaboradores, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); The Yeast Saccharomyces: Cell Cycle and Cell Biology, Pringle y colaboradores, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997); The Yeast Saccharomyces: Gene Expression, Jones y colaboradores, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993); The Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics, Broach y colaboradores, eds., Coid Spring Harbor Laboratory Press (1992); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook y colaboradores, (1989) y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook y Russel, 2001), (en conjunto se hace referencia a ambos manuales en la presente como "Sambrook"); Current Protocole in Molecular Biology (F.M. Ausubel y colaboradores, eds, 1987, incluyendo los suplementos hasta 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís y colaboradores, eds., (1994); Harlow y Lañe (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Publications, New York; Harlow y Lañe (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY (en conjunto se hace referencia en la presente a ambos manuales como "Harlow y Lañe"), Beaucage y colaboradores, eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000); Casaren and Doull's Toxicology The Basic Science of Poisons, C. Klaassen, ed., 6th edition (2001), y Vaccines, S. Plotkin y W. Orenstein, eds., 3a. edición (1999). Definiciones Generales La referencia general en la presente a una "mutación" Ras, a menos que se especifique otra cosa, se puede referir a una mutación en la secuencia de ácido nucleico del gen ras o un ácido nucleico obtenido o. derivado del mismo (por ejemplo, ARN, ADN), así como una mutación en la secuencia de aminoácidos de la proteína Ras o un péptido de la misma. La referencia a una mutación en una posición particular de la secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de aminoácidos de Ras se puede describir mediante referencia al codón o al número de posición del aminoácido donde ocurre la mutación y estas referencias se pueden usar intercambiablemente (por ejemplo, referencia al "codón 76" o "posición 76" o "E76" todas se pueden usar al referirse al codón en la secuencia de ácido nucleico ras que codifica el aminoácido 76 de Ras o el residuo de aminoácido real (glutamato) en la posición 76, donde se está describiendo una mutación ya sea en las secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos). De acuerdo con la presente invención, una molécula de ácido nucleico aislada, es una molécula de ácido nucleico que ha sido removida de su medio natural (es decir, que ha sido sometida a manipulación humana), siendo su medio natural el genoma o el cromosoma en el cual se encuentra la molécula de ácido nucleico en la naturaleza. Como tal, "aislado" no necesariamente refleja el grado al cual se ha purificado la molécula de ácido nucleico, sino que indica que la molécula no incluye un genoma entero o un cromosoma entero en el cual se encuentre la molécula de ácido nucleico en la naturaleza. Además, una molécula de ácido nucleico aislada no es una biblioteca de moléculas de ácidos nucleicos, tal como una biblioteca de ácidos nucleicos producidas de una muestra de tumor. Una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir un gen. Una molécula de ácido nucleico aislada que incluye un gen no es un fragmento de un cromosoma que incluye este gen, sino en vez de eso incluye la región de codificación y las regiones reguladas por el gen, pero no genes adicionales que se encuentran naturalmente en el mismo cromosoma. Una molécula de ácido nucleico aislada también puede incluir una secuencia de ácidos nucleicos especificada flanqueada (es decir, en el extremo 5' y/o el extremo 3' de la secuencia) por ácidos nucleicos adicionales que normalmente no flanquean la secuencia de ácidos nucleicos especificada en la naturaleza (es decir, secuencias heterólogas). La molécula de ácido nucleico aislada puede incluir ADN, ARN (por ejemplo, ARNm), o derivados ya sea de ADN o ARN (por ejemplo, ADNc, ARNsi). Aunque la frase "molécula de ácido nucleico" principalmente se refiere a la molécula de ácido nucleico física y la frase "secuencia de ácidos nucleicos" principalmente se refiere a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico, las dos frases se pueden usar intercambiablemente, especialmente con respecto a una molécula de ácido nucleico, o una secuencia de ácidos nucleicos, que es capaz de codificar una proteína o dominio o porción de una proteína. El tamaño mínimo de una molécula de ácido nucleico de la presente invención es un tamaño suficiente para formar una sonda o un cebador de oligonucleótido que sea capaz de formar un híbrido estable (por ejemplo, bajo condiciones de rigurosidad moderada, alta o muy alta) con la secuencia complementaria de una molécula de ácido nucleico de la presente invención, o de un tamaño suficiente para codificar una secuencia de aminoácidos que sirve como un epítope inmunogénico, es suficiente para usarlo en producir un anticuerpo o un péptido que enlaza antígeno, o tiene una actividad biológica de una proteína codificada natural (por ejemplo, Ras) o proteína mutada (por ejemplo, una Ras mutada), o fragmento de la misma. Como tal, el tamaño de molécula de ácido nucleico que codifica una proteína así puede depender de la composición de ácido nucleico y de la homología o identidad porcentual entre la molécula de ácido nucleico y la secuencia complementaria, así como de las condiciones de hibridación en sí (por ejemplo, temperatura, concentración de sal, y concentración de formamida). El tamaño mínimo de la molécula de ácido nucleico que se usa como un cebador de oligonucleotido o como una sonda típicamente es de aproximadamente de 12 a aproximadamente 15 nucleótidos de longitud si las moléculas de ácido nucleico son ricas en GC y al menos de aproximadamente 15 a aproximadamente 18 bases de longitud si son ricas en AT. No hay límite, distinto de un límite práctico, en el tamaño máximo de una molécula de ácido nucleico de la presente invención, en que la molécula de ácido nucleico pueda incluir una secuencia suficiente para ser útil en cualquiera de las modalidades de la invención descritas en la presente. Una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención se puede producir usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR), clonación) o síntesis química. Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen moléculas de ácido nucleico naturales y homólogos de las mismas, incluyendo, pero sin limitarse a, variantes alélicas naturales y moléculas de ácido nucleico modificadas en las cuales los nucleótidos han sido insertados, suprimidos, sustituidos y/o invertidos de tal manera que estas modificaciones proporcionan el efecto deseado (por ejemplo, la introducción de una mutación E76G a una secuencia de aminoácidos de Ras como se mencionó en la presente). Un homólogo de molécula de ácido nucleico se puede producir utilizando varios métodos conocidos para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press (1989)). Por ejemplo, se pueden modificar moléculas de ácido nucleico usando una variedad de técnicas que incluyen, pero no se limitan a, técnicas de mutagénesis clásicas y técnicas de ADN recombinante, tales como mutagénesis dirigida al sitio, tratamiento químico de una molécula de ácido nucleico para inducir mutaciones, disociación de enzima de restricción de un fragmento de ácido nucleico, ligación de fragmentos de ácido nucleico, amplificación PCR y/o mutagénesis de regiones seleccionadas de una secuencia de ácidos nucleicos, síntesis de mezclas de oligonucléotidos y ligación de mezclas para "construir" una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos y combinaciones de las mismas. Los homólogos de moléculas de ácidos nucleicos se pueden seleccionar entre una mezcla de ácidos nucleicos modificados seleccionando la función de la proteína codificada por el ácido nucleico y/o mediante hibridación con un gen del tipo natural. Una sonda de oligonucleótido, o sonda, es una molécula de ácido nucleico que típicamente varía en tamaño de aproximadamente 8 nucleótidos hasta varios cientos de nucleótidos de longitud. Esta molécula típicamente se usa para identificar una secuencia de ácidos nucleicos objetivo en una muestra hibridando esta secuencia de ácidos nucleicos objetivo bajo condiciones de hibridación estrictas. Las condiciones de hibridación se han descrito en detalle anteriormente. Los cebadores de PCR también son secuencias de ácidos nucleicos, aunque los cebadores de PCR típicamente son oligonucleótidos de longitud bastante corta que se usan en reacciones de cadena de polimerasa. Los cebadores de PCR y las sondas de hibridación fácilmente pueden ser desarrolladas y producidas por los expertos en la técnica, utilizando información de secuencia de la secuencia objetivo. (Véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra o Glick y colaboradores, supra). Los aptámeros son cadenas cortas de ácidos nucleicos sintéticos (usuaimente de ARN, pero también de ADN) seleccionadas de bibliotecas de ácidos nucleicos combinatorias al azar en virtud de su capacidad de enlazarse con una molécula objetivo específica previamente determinada con una alta afinidad y especificidad. Los aptámeros asumen una estructura tridimensional definida y son capaces de discriminar entre compuestos con muy pocas diferencias en su estructura. La interferencia de ARN (ARNi) es un enfoque para la inactivación de genes vía el silenciamiento de genes, nombrado "interferencia de ARN" (ARNi). Véase, por ejemplo, Fire y colaboradores, Nature 391: 806-811 (1998) y la Patente de los Estados Unidos de América 6,506,559. La interferencia de ARN se refiere a un evento que se presenta cuando el polinucleótido de ARN actúa a través de procesos celulares endógenos para suprimir específicamente la expresión de un gen cuya secuencia corresponde a la del ARN. El silenciamiento del gen objetivo ocurre después de la degradación del ARNm por ARN de doble cadena (ds) por el animal huésped, algunas veces a través de la digestión de Endonucleasa de ARNasa III. La digestión da como resultado moléculas que son de aproximadamente 21 a 23 nucleótidos (o bases) de longitud (o tamaño) aunque el tamaño molecular puede ser tan grande como de 30 bases. Estas especies de ARN cortas (ARN de interferencia corta o ARNsi) mediante la degradación de los mensajes y las transcripciones de ARN correspondientes, posiblemente vía un complejo de nucleasa de ARNi, llamado el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que ayuda a los pequeños ARNds a reconocer los ARNm complementarios a través de las interacciones de los pares de bases. Siguiendo las interacciones de ARNsi con su sustrato, ARNm es elegido para degradación, tal vez por enzimas que están presentes en el RISC. Este tipo de mecanismo parece ser útil en los organismos para inhibir infecciones virales, brincar transposones y fenómenos similares, y para regular la expresión de genes endógenos. La actividad de ARNi ha sido muy documentada en vegetales, insectos, nemátodos y vertebrados entre otros organismos. Para información general de antecedentes, véase, por ejemplo, Schutz y colaboradores, Virology 344(1): 151-7 (2006); Leonard y colaboradores, Gene Ther. 13(6):532-40 (2006); Colbere-Garapin y colaboradores, Microbes Infecí. 7(4):767-75 (2005); Wall, Theriogenology 57(l):189-201 (2002); El-Bashir, y colaboradores, Nature 411: 494-498 (2001); Fire, A., y colaboradores, Science 391: 806-811 (1998); Gitlin y colaboradores, Nature 418: 430-434 (2002); Gitlin, y colaboradores, J. Virol. 79: 1027-1035 (2005); Kahana, y colaboradores, J. Gen. Virol. 85, 3213-3217 (2004); Kronke y colaboradores, /. Virol. 78: 3436-3446 (2004); Leonard y colaboradores, J. Virol. 79:1645-1654 (2005); y Yokota, y colaboradores, EMBO Rep.4: 602-608 (2003). Una ribozima es un segmento de ARN que es capaz de realizar catálisis biológica (por ejemplo, rompiendo o formando lazos covalentes). Más específicamente, las ribozimas son moléculas de ARN antisentido que funcionan enlazándose a la fracción de ARN objetivo y la inactivan disociando la estructura central de fosfodiéster en un sitio de corte específico. Estos agentes basados en ácidos nucleicos pueden ser introducidos en células huésped o tejidos y usarse para inhibir la expresión y/o la función de la proteína Ras mutada.

De conformidad con la invención, una molécula de ácido nucleico recombinante comprende un vector recombinante y una secuencia de ácidos nucleicos de interés. Un vector recombinante es una molécula de ácido nucleico diseñada genéticamente (es decir, producida artificialmente) que se usa como una herramienta para manipular una secuencia de ácidos nucleicos de elección y para introducir esta secuencia de ácidos nucleicos en una célula huésped. El vector recombinante por lo tanto es conveniente para su uso para clonar, secuenciar y/o manipular de otra manera la secuencia de ácidos nucleicos de elección, tal como, mediante expresar y/o administrar la secuencia de ácidos nucleicos de elección a una célula huésped para formar una célula recombinante. Un vector así típicamente contiene secuencias de ácidos nucleicos heterólogas, esto es secuencias de ácidos nucleicos que no se encuentran naturalmente adyacentes a la secuencia de ácidos nucleicos que va a ser clonada o administrada, aunque el vector también puede tener secuencias de ácido nucleico reguladoras (por ejemplo, promotores, regiones no traducidas) que se encuentran naturalmente adyacentes a las moléculas de ácido nucleico de la presente invención o las cuales son útiles para la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención (comentadas en detalle más adelante). El vector puede ser ya sea ARN o DNA, ya sea procariótico o eucariótico, y típicamente es un plásmido. El vector se puede mantener como un elemento extracromosomal (por ejemplo, un plásmido) o se puede integrar en un cromosoma de algún organismo recombinante (por ejemplo, un microbio o una vegetal). El vector entero puede permanecer en su lugar dentro de una célula huésped, o bajo ciertas condiciones, el ADN de plásmido se puede suprimir, dejando atrás la molécula de ácido nucleico de la presente invención. La molécula de ácido nucleico integrada puede estar bajo el control del promotor cromosomal, bajo el control del promotor original o plásmido, o bajo una combinación de varios controles de promotores. Una sola o múltiples copias de la molécula de ácido nucleico se pueden integrar en el cromosoma. Un vector recombinante de la presente invención puede contener al menos un marcador seleccionable. En una modalidad, un vector recombinante usado en una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención es un vector de expresión. Como se usa en la presente, la frase "vector de expresión" se usa para referirse a un vector que es conveniente para la producción de un producto codificado (por ejemplo, una proteína de interés). En esta modalidad, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el producto que va a ser producido se inserta en el vector recombinante para producir una molécula de ácido nucleico recombinante. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína que va a ser producida se inserta en el vector de una manera que operativamente enlaza la secuencia de ácidos nucleicos a secuencias reguladoras en el vector que permiten la transcripción y la traducción de la secuencia de ácidos nucleicos dentro de la célula huésped recombinante.

En otra modalidad, un vector recombinante usado en una molécula de ácido nucleico recombinante de la presente invención es un vector objetivo. Como se usa en la presente, la frase "vector objetivo" se usa para referirse a un vector que se usa para administrar una molécula de ácido nucleico particular en una célula huésped recombinante, en donde la molécula de ácido nucleico se puede usar para suprimir, inactivar o reemplazar un gen endógeno o porción de un gen dentro de la célula huésped (es decir, usado para dirigir la interrupción del gen o tecnología knock-out). Un vector así puede ser conocido también en la técnica, en un aspecto, como un vector "knock-out". En un aspecto de esta modalidad, una porción del vector, pero más típicamente, la molécula de ácido nucleico que es insertada en el vector (es decir, el inserto), tiene una secuencia de ácido nucleico que es homologa a una secuencia de ácido nucleico de un gen objetivo en la célula huésped (es decir, un gen que se dirige a ser suprimido o inactivado). La secuencia de ácido nucleico del inserto de vector se diseña para asociarse con el gen objetivo de manera que el gen objetivo y el inserto puedan seguir en recombinación homologa mediante lo cual el gen objetivo endógeno se suprime, inactiva, se atenúa (es decir, por al menos una porción del gen objetivo endógeno es mutado o suprimido), o es reemplazado. Típicamente, una molécula de ácido nucleico recombinante incluye al menos una molécula de ácido nucleico de la presente invención operativamente enlazada a una o más secuencias de control de expresión. De conformidad con la presente invención, la frase "operativamente enlazadas" se refiere a enlazar una molécula de ácido nucleico a una secuencia de control de expresión (por ejemplo, una secuencia de control de la transcripción y/o una secuencia de control de la traducción) de una manera tal que la molécula se puede expresar cuando se transfecta (es decir, se transforma, se transduce, se transfecta, se conjuga o se conduce) en una célula huésped. Las secuencias de control de la transcripción son secuencias que controlan la iniciación, alargamiento, o la terminación de la transcripción. Las secuencias de control que son particularmente importantes son aquellas que controlan el inicio de la transcripción, tales como secuencias promotoras, mejoradoras, operadoras y represoras. Las secuencias de control de la transcripción convenientes incluyen cualquier secuencia de control de la transcripción que puede funcionar en una célula huésped u organismo huésped en el cual la molécula de ácido nucleico recombinante se va a introducir. Las moléculas de ácido nucleico recombinantes de la presente invención también pueden contener secuencias reguladoras adicionales, tales como secuencias reguladoras de la traducción, orígenes de réplica, y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante. En una modalidad, una molécula recombinante de la presente invención, incluyendo aquellas que están integradas en el cromosoma de la célula huésped, también contiene señales secretoras (es decir, secuencias de ácido nucleico de segmento de señal) para permitir que una proteína expresada sea excretada de la célula que produce la proteína. Los segmentos de señales convenientes incluyen un segmento de señal que está asociado naturalmente con la proteína que se va a expresar o cualquier segmento de señal heteróloga capaz de dirigir la secreción de la proteína de acuerdo con la presente invención. En otra modalidad, una molécula recombinante de la presente invención comprende una secuencia delantera para permitir que una proteína expresada sea entregada a o insertada en la membrana de una célula huésped. Las secuencias delanteras convenientes incluyen una secuencia delantera que está asociada naturalmente con la proteína, o cualquier secuencia delantera heteróloga capaz de dirigir la entrega y la inserción de la proteína en la membrana de una célula. De acuerdo con la presente invención, el término "transfección" se usa para referirse a cualquier método mediante el cual una molécula de ácido nucleico exógena (es decir, una molécula de ácido nucleico recombinante) se puede insertar en una célula. El término "transformación" se puede usar intercambiablemente con el término "transfección" cuando este término se usa para referirse a la introducción de las moléculas de ácido nucleico en las células microbianas, tales como bacterias y levaduras, o en células vegetales. En sistemas microbianos y vegetales, el término "transformación" se usa para describir un cambio heredado debido a la adquisición de ácidos nucleicos exógenos por el microorganismo o vegetal y es esencialmente sinónimo del término "transfeccion". Sin embargo, en células animales, la transformación ha adquirido un segundo significado el cual se puede referir a cambios en las propiedades de crecimiento de las células en un cultivo después de que se vuelven cancerosas, por ejemplo. Por lo tanto, para evitar confusión, el término "transfeccion" de preferencia se usa con respecto a la introducción de ácidos nucleicos exógenos en las células animales, y el término "transfeccion" se usará en la presente para abarcar en general la transfeccion de células animales, y la transformación de células microbianas o células vegetales, hasta el grado en que el término pertenezca a la introducción de ácidos nucleicos exógenos en una célula. Por lo tanto, las técnicas de transfección incluyen, pero no se limitan a, transformación, bombardeo de partículas, difusión, transporte activo, sonificación en baño, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, infección y fusión protoplástica. Como se usa en la presente, las condiciones de hibridación se refieren a condiciones de hibridación estándares, bajo las cuales las moléculas de ácido nucleico se usan para identificar moléculas de ácido nucleico similares. Estas condiciones estándares se describen, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. Sambrook y colaboradores, ibid., se incorporan mediante referencia en la presente por entero (véase, específicamente, las páginas 9.31 -9.62). Además, las fórmulas para calcular las condiciones apropiadas de hibridación y lavado para lograr una hibridación que permita grados variantes de falta de coincidencia en los nucleótidos se describe, por ejemplo en Meinkoth y colaboradores, 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284; Memkoth y colaboradores, ibid., se incorporan mediante referencia en la presente por entero. Las condiciones de hibridación y de lavado de baja rigurosidad, como se refiere en la presente, se refiere a las condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen al menos alrededor del 70 por ciento de identificación de secuencia de ácido nucleico con la molécula de ácido nucleico que se está usando para sonda en la reacción de hibridación (por ejemplo, condiciones que permiten cuando menos el 30 por ciento o menos de falta de coincidencia de nucleótidos). Las condiciones de hibridación y de lavado con rigurosidad, como se hace referencia en la presente, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen al menos aproximadamente 80 por ciento de identificación de secuencia de ácido nucleico con la molécula de ácido nucleico que se está usando como sonda en la reacción de hibridación (por ejemplo, condiciones que permiten al menos aproximadamente el 20 por ciento o menos de falta de coincidencia de nucleótidos). Las condiciones de hibridación y lavado de alta rigurosidad, como se hace referencia en la presente, se refieren a condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen al menos aproximadamente 90 por ciento de identificación de secuencia de ácido nucleico con la molécula de ácido nucleico que se está usando como sonda en la reacción de hibridración (es decir, condiciones que permiten aproximadamente el 10 por ciento o menos de falta de coincidencia de nucleótidos). Las condiciones de hibridación y de lavado de muy alta rigurosidad, como se hace referencia en la presente, se refieren a las condiciones que permiten el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que tienen al menos aproximadamente 95 por ciento de identificación de secuencia de ácido nucleico con la molécula de ácido nucleico que se está usando como sonda en la reacción de hibridación (es decir, condiciones que permiten aproximadamente el 5 por ciento o menos de falta de coincidencia de nucleótidos). Una persona con experiencia en la técnica puede usar las fórmulas en Meinkoth y colaboradores, ibid., para calcular las condiciones de hibridación y de lavado apropiadas para lograr estos niveles particulares de falta de coincidencia de nucleótidos. Estas condiciones variarán, dependiendo si se están formando híbridos de ADN:ARN o de ADN:ADN. Las temperaturas de fusión calculadas para los híbridos de ADN:ADN son 10 grados centígrados menos que para los híbridos de ADN:ARN. En modalidades particulares, las condiciones de hibridación rigurosas para los híbridos de ADN:ADN incluyen la hibridación a una fuerza iónica 6X SSC (0.9 M Na+) a una temperatura entre aproximadamente 20° C y aproximadamente 35° C (rigurosidad más baja), más preferiblemente entre aproximadamente 28° C y aproximadamente 40° C (más rigurosa), y todavía más preferiblemente, entre aproximadamente 35° C y aproximadamente 45° C (todavía más rigurosa), con condiciones de lavado apropiadas. En modalidades particulares, las condiciones de hibridación rigurosas para los híbridos ADN:ARN incluyen la hibridación a una fuerza iónica de 6X SSC (0.9 M Na+) a una temperatura de entre aproximadamente 30° C y aproximadamente 45° C, más preferiblemente, entre aproximadamente 38° C y aproximadamente 50° C, y aún más preferiblemente, entre aproximadamente 45° C y aproximadamente 55° C, con condiciones de lavado igualmente estrictas. Estos valores se basan en cálculos de una temperatura de fusión para moléculas mayor que aproximadamente 100 nucleótidos, cero por ciento formamida y un contenido de G + C de aproximadamente 40 por ciento. Alternativamente, Tm se puede calcular empíricamente cuando se presenta en Sambrook y colaboradores, supra, páginas 9.31 a 9.62. En general, las condiciones de lavado deberán ser tan estrictas como sea posible, y deberán ser apropiadas para las condiciones de hibridación elegidas. Por ejemplo, las condiciones de hibridación pueden incluir una combinación de condiciones de sal y de temperatura que sean aproximadamente 20-25° C por debajo de la Tm calculada de un híbrido particular, y las condiciones de lavado típicamente incluyen una combinación de condiciones de sal y temperatura que son de aproximadamente 12-20° C por debajo de la Tm calculada del híbrido particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación convenientes para su uso con híbridos ADN:ADN incluye una hibridación de 2-24 horas en 6X SSC (50 por ciento formamida) a aproximadamente 42° C, seguida por pasos de lavado que incluyen uno o más lavados a temperatura ambiente en aproximadamente 2X SSC, seguidos por lavados adicionales a temperaturas más altas y fuerza iónica más baja (por ejemplo, al menos un lavado como a aproximadamente 37° C en aproximadamente 0.1X-0.5X SSC, seguido por al menos un lavado a aproximadamente 68° C en aproximadamente 0.1X-0.5X SSC). La referencia a una proteína o polipéptido aislado en la presente invención incluye proteínas de longitud completa, proteínas de fusión, o cualquier fragmento, dominio, epítope conformacional, u homólogo de estas proteínas. Más específicamente, una proteína aislada, de conformidad con la presente invención, es una proteína (incluyendo un polipéptido o péptido) que ha sido removida de su medio natural ( es decir, que ha sido sujeta a manipulación humana) y puede incluir proteínas purificadas, proteínas parcialmente purificadas, proteínas producidas recombinantemente, y proteínas producidas sintéticamente, por ejemplo. Como tal el término "aislado" no refleja el grado al cual se ha purificado la proteína. Como se usa en la presente, el término "homólogo" se usa para referirse a una proteína o péptido que difiere de una proteína o péptido que se presentan naturalmente (es decir, la proteína "prototipo" o del tipo "original") por una o más modificaciones o mutaciones menores a la proteína o péptido que se presenta naturalmente, pero que mantiene la estructura de cadena natural y básica global de la forma que se presenta naturalmente (es decir, tal que el homólogo es identificable estando relacionado a la proteína del tipo original). Estos cambios incluyen, pero no se limitan a, cambios en una o unas pocas cadenas naturales de aminoácidos; cambios de uno o unos pocos aminoácidos, incluyendo supresiones (por ejemplo, una versión truncada de la proteína o el péptido) inserciones y/o sustituciones; cambios en la estereoquímica de uno o unos pocos átomos; y/o derivaciones menores, incluyendo, pero sin limitarse a: metilación, farnesilación, geranilación de geranilo, glicosilación, carboximetilación, fosforilación, acetilación, miristoilación, prenilación, palmitación y/o amidación. Un homólogo puede incluir un agonista de una proteína o un antagonista de una proteína. Un homólogo puede tener propiedades aumentadas, disminuidas, cambiadas, o sustancialmente similares en comparación con la proteína o péptido que se presente naturalmente. Se hace notar que los homólogos pueden incluir homólogos producidos sintéticamente, variantes alélicas que se presentan naturalmente de una proteína o dominio dado, o secuencias homologas de organismos distintos de los organismos a partir de los cuales se derivó la secuencia de referencia. Los homólogos pueden ser el resultado de una variación alélica natural o una mutación natural. Los homólogos se pueden producir usando técnicas conocidas en el campo para la producción de proteínas, incluyendo, pero sin limitarse a, modificaciones a la proteína que se presenta naturalmente aislada o sintetizada, síntesis de proteína directa, o modificaciones a la secuencias de ácidos nucleicos que codifican a la proteína utilizando, por ejemplo, técnicas de ADN clásicas o recombinantes para efectuar mutagénesis aleatoria o dirigida. Un homólogo de una proteína dada, puede comprender, consiste esencialmente en, o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 45 por ciento, o al menos aproximadamente 50 por ciento, o al menos aproximadamente 55 por ciento, o al menos aproximadamente 60 por ciento, o al menos aproximadamente 65 por ciento, o al menos aproximadamente 70 por ciento, o al menos aproximadamente 75 por ciento, o al menos aproximadamente 80 por ciento, o al menos aproximadamente 85 por ciento, o al menos aproximadamente 90 por ciento, o al menos aproximadamente 95 por ciento idéntica, o al menos aproximadamente 95 por ciento idéntica, o al menos aproximadamente 96 por ciento idéntica, o al menos aproximadamente 97 por ciento idéntica, o al menos aproximadamente 98 por ciento idéntica, o al menos aproximadamente 99 por ciento idéntica (o cualquier identificación porcentual entre 45 por ciento y 99 por ciento, en incrementos de números enteros), con la secuencia de aminoácidos de la proteína de referencia. En una modalidad, el homólogo comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, una secuencia de aminoácidos que es menos del 100 por ciento idéntica, menos de aproximadamente 99 por ciento idéntica, menos de aproximadamente 98 por ciento idéntica, menos de aproximadamente 97 por ciento idéntica, menos de aproximadamente 96 por ciento idéntica, menos de aproximadamente 95 por ciento idéntica, y así sucesivamente, en incrementos de 1 por ciento, hasta menos de aproximadamente 70 por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos que se presenta naturalmente de la proteína de referencia. Como se usa en la presente, al menos que se especifique otra cosa, la referencia a una identificación porcentual (%) se refiere a una evaluación de homología que se realiza utilizando: (1) una búsqueda de homología BLAST 2.0 Basic BLAST utilizando blastp para búsquedas de aminoácidos y blastn para búsquedas de ácido nucleico con parámetros por omisión estándares en donde la secuencia de consulta se filtra por regiones de baja complejidad por omisión (descrito en Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, DJ. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein datábase search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, incorporada por referencia en la presente en su totalidad); (2) un alineamiento de BLAST 2 (usando los parámetros descritos más adelante); (3) y/o PSI-BLAST con los parámetros por omisión estándares (BLAST iterado en posición específica. Se nota que debido a unas diferencias en los parámetros estándares entre BLAST 2.0 Basic BLAST y BLAST 2, dos secuencias específicas podrían ser reconocidas por tener homologías significativas utilizando el programa BLAST 2, mientras que una búsqueda realizada en BLAST 2.0 Basic BLAST usando una de las secuencias como la secuencia de consulta podría no identificar la segunda secuencia en las coincidencias principales. Además PSI-BLAST proporciona una versión automatizada fácil de usar de una búsqueda de "perfil", que es una manera sensible de buscar homólogos de secuencias. El programa primero realiza una búsqueda en la base de datos de BLAST con huecos. El programa PSI-BLAST utiliza la información de cualquier alineamiento significativo devuelto para construir una matriz de calificación de posición específica, la cual reemplaza las secuencias de consulta por la siguiente ronda de la búsqueda en la base de datos. Por lo tanto, se entenderá que la identificación porcentual se puede determinar usando cualquiera de estos programas. Dos secuencias específicas se pueden alinear utilizando la secuencia BLAST 2 como se describe en Tatusova y Madden, (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, incorporada en la presente mediante referencia por entero. La alineación de la secuencia BLAST 2 se realiza en blastp o blastn usando el algoritmo de BLAST 2.0 para realizar una búsqueda BLAST con huecos (BLAST 2.0) entre las dos secuencias permitiendo la introducción de huecos (supresiones e inserciones) en la alineación resultante. Para propósitos de claridad en la presente, una alineación de secuencias BLAST 2 se realiza utilizando los parámetros por omisión estándares como sigue. Para blastn, usando 0 BLOSUM62 matriz: Premio por coincidir = 1 Castigo por no coincidir = -2 Castigo por hueco abierto (5) y hueco de extensión (2) gap x_ dropoff (50) esperado (10) tamaño de palabra (11) filtro (on) Para blastp, usando 0 BLOSUM62 matriz: Castigo por hueco abierto (11) y hueco de extensión (1) gap x_ dropoff (50) esperado (10) tamaño de palabra (3) filtro (on). De acuerdo con la presente invención, los términos "modificación" y "mutación" se pueden usar intercambiablemente, particularmente con respecto a las modificaciones/mutaciones a las secuencias de aminoácidos primarias de una proteína o péptido (o secuencias de ácidos nucleicos) descritas en la presente. El término "modificación" también se puede usar para describir modificaciones después de la traducción a una proteína o péptido, o por ejemplo, la complejamiento de una proteína o péptido con otro compuesto o amarrar la proteína tal como mediante un ancla de glicerofosfatildil inositol (GPI). Estas modificaciones se pueden considerar como mutaciones, por ejemplo, si la modificación es diferente que la modificación que ocurre después de la traducción que ocurre en la proteína o péptido del tipo original natural. Las sustituciones conservadoras típicamente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico, ácido glutamico, asparagina, y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Las sustituciones también se pueden hacer con base en la hidrofobicidad conservada o la hidrofilicidad (Kyte y Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105 (1982)), o sobre la base de la capacidad para asumir una estructura secundaria de polipéptido similar (Chou y Fasman, Adv. Enzymol. 47: 45 (1978)), o una estructura terciaria o cuaternaria. El uso general en la presente del término "antígeno" se refiere: a cualquier porción de una proteína (péptido, proteína parcial, proteína de longitud completa), en donde la proteína se presenta naturalmente o se deriva sintéticamente, a proteínas de fusión o proteínas quiméricas, a una composición celular (célula entera, lisado de células o célula alterada), a un organismo (organismo completo, lisado o células alteradas), a un carbohidrato (tal como los expresados en las células de cáncer), o a otra molécula, o cualquier porción de las mismas. Un antígeno provoca una respuesta inmune específica para antígeno (por ejemplo, una respuesta inmune humoral y/o mediada por células) contra el mismo o antígenos similares que se encuentran dentro de las células y tejidos de un individuo al que se le administra el antígeno. Alternativamente, un antígeno puede actuar como un tolerágeno. Cuando se hace referencia a la estimulación de una respuesta inmune, el término "antígeno" se puede usar intercambiablemente con el término "inmunógeno". Un inmunógeno como se usa en la presente, describe un antígeno que provoca una respuesta inmune humoral y/o mediante células (es decir, es antigénica), de manera que la administración del inmunógeno a un animal (por ejemplo, vía una vacuna de la presente invención) monta una respuesta inmune específica de antígeno contra el mismo o antígenos similares que se encuentran dentro de los tejidos del animal. Un " tolerágeno" se usa para describir un antígeno que está provisto en una forma, cantidad, o vía de administración, de manera que hay una respuesta inmune reducida o cambiada al antígeno, y de preferencia sin respuesta sustancial, anergia, otra inactivación o supresión de células del sistema inmune como respuesta al contacto con el tolerágeno o una célula que expresa o presenta este tolerágeno. Un "antígeno de vacunación" puede ser un inmunógeno o un tolerágeno, pero es un antígeno usado en una vacuna (profiláctica o terapéutica), donde se va a provocar una respuesta biológica (provocación de una respuesta inmune, tolerancia) contra el antígeno de vacunación. Un "dominio inmunogénico" de un antígeno dado puede ser cualquier porción, fragmento o epítope de un antígeno (por ejemplo, un fragmento de péptido o subunidad o cualquier epítope de anticuerpo u otro epítope conformacional) que contiene al menos un epítope que actúa como inmunógeno cuando se administra a un animal. Por ejemplo, una sola proteína puede contener múltiples dominios inmunogénicos diferentes. Los dominios inmunogénicos no necesitan ser secuencias lineales dentro de una proteína, tal como en el caso de una respuesta inmune humoral.

Un epítope se define en la presente como un solo sitio inmunogénico dentro de un antígeno dado que es suficiente para provocar una respuesta inmune, o un sitio toleragénico simple dentro de un antígeno dado suficiente para suprimir, borrar o volver inactiva una respuesta inmune. Los expertos en la técnica reconocerán que los epítopes de células T son diferentes en tamaño y composición de los epítopes de las células B, y- que los epítopes presentados a través de la senda MHC Clase I difieren de los epítopes presentados a través de la senda MHC Clase II. Los epítopes pueden ser secuencias lineales o epítopes conformacionales (regiones de enlace conservadas). Un antígeno puede ser tan pequeño como un solo epítope, o más grande, y puede incluir múltiples epítopes. Como tal, el tamaño de un antígeno puede ser tan pequeño como de aproximadamente 5-12 aminoácidos (por ejemplo, un péptido) y tan grande como: una proteína de longitud completa, incluyendo un multímero y proteínas de fusión, proteínas quiméricas, células enteras, microorganismos enteros o porciones de los mismos (por ejemplo, lisados de células enteras o extractos de microorganismos). "Vacunación" o "inmunización" se refiere a la provocación (inducción) de una respuesta inmune contra un antígeno o porción inmunogénica o porción toleragénica del mismo, como resultado de la administración del antígeno, solo o con un adyuvante. La vacunación de preferencia da como resultado un efecto protector o terapéutico, en donde la exposición posterior al antígeno (o a la fuente del antígeno) provoca una respuesta inmune contra el antígeno (o fuente) que reduce o previene una enfermedad o condición en el animal. El concepto de vacunación es muy conocido en la técnica. La respuesta inmune que es provocada por la administración de una composición (vacuna) de la presente invención puede ser cualquier cambio detectable en cualquier faceta de la respuesta inmune (por ejemplo, respuesta mediada por células, respuesta humoral, producción de citocina), en comparación con en la ausencia de la administración de la composición. Un Tarmogen (inmunógeno molecular dirigido) generalmente se refiere a un vehículo de levadura que expresa uno o más antígenos heterólogos extracelularmente (sobre su superficie o como un antígeno secretado), intracelularmente (internamente o citosólicamente) o tanto extracelularmente como intracelularmente. Los tarmógenos generalmente se han descrito en la técnica, Véase, por ejemplo, la patente de Los Estados Unidos de América número 5,830,463. De acuerdo con la presente invención, los "aminoácidos heterólogos" son una secuencia de aminoácidos que no se encuentran naturalmente (es decir, no se encuentran en la naturaleza, en vivo) flanqueando la secuencia de aminoácidos específica, o que no se relacionan con la función de la secuencia de aminoácidos especificada, o que no estaría codificada por los nucleótidos que flanquean la secuencia de ácidos nucleicos que se presentan naturalmente codificando la secuencia de aminoácidos especificada como se presenta en el gen, si estos nucleótidos en la secuencia que se presenta naturalmente se tradujeran usando el uso de codón estándar para el organismo para el cual se deriva la secuencia de aminoácidos dada. Por lo tanto, al menos dos residuos de aminoácidos de los que son heterólogos al antígeno son cualesquiera dos residuos de aminoácidos que no se encuentran naturalmente flanqueando al antígeno. De acuerdo con la presente invención la referencia a una proteína "heteróloga" o antígeno "heterólogo", que incluye una proteína de fusión heteróloga, en conexión con un vehículo de levadura de la invención significa que la proteína o el antígeno no es una proteína o antígeno que es naturalmente expresada por la levadura, aunque una proteína de fusión puede incluir secuencias de levadura o proteínas o porciones de las mismas que son naturalmente expresadas por la levadura (por ejemplo, una proteína Aga como se describe en la presente). Por ejemplo, una proteína de fusión de una proteína Ras de célula de tumor y una proteína Aga de levadura se considera que es una proteína heteróloga con respecto al vehículo de levadura para los propósitos de la presente invención, ya que esta proteína de fusión no es expresada naturalmente por una levadura. Cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente se puede producir con a partir de al menos uno, y hasta aproximadamente 20, aminoácidos heterólogos adicionales flanqueando cada uno de los extremos terminal C y/o terminal N de la secuencia de aminoácidos especificada. La proteína o polipéptido resultante se puede llamar "esencialmente consistente" de la secuencia de aminoácidos especificada. Los aminoácidos heterólogos son una secuencia de aminoácidos que no se encuentran naturalmente (es decir, no se encuentran en la naturaleza, en vivo) flanqueando la secuencia de aminoácidos especificada, o que no se relacionan con la función de la secuencia de aminoácidos especificada, o que no estarían codificadas por los nucleótidos que flanquean la secuencia de ácidos nucleicos que se presentan naturalmente codificando la secuencia de aminoácidos especificada como ocurre en el gen, si estos nucleótidos en la secuencia que se presenta naturalmente se tradujeran utilizando el uso de codón estándar para el organismo del cual se deriva la secuencia de aminoácidos dada. Similarmente, la frase "consiste esencialmente de", cuando se usa con referencia a la secuencia de ácidos nucleicos en la presente, se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos especificada que puede ser flanqueada de al menos uno, y hasta tanto como aproximadamente 60, nucleótidos heterólogos adicionales en cada uno de los extremos 5' y/o 3' de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica a la secuencia de aminoácidos especificada. Los nucleótidos heterólogos no se encuentran naturalmente (es decir, no se encuentran en la naturaleza, en vivo) flanqueando la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos especificada, como se presenta en el gen natural, o no codifica una proteína que imparte cualquier función adicional a la proteína o cambia la función de la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos especificada. De acuerdo con la presente invención, la frase "selectivamente se enlaza a" se refiere a la capacidad de un anticuerpo, fragmento que enlaza antígeno o asociado de enlace de la presente invención para enlazar de preferencia a proteínas especificadas. Más específicamente, la frase "selectivamente se enlaza" se refiere al enlace específico de una proteína con otra (por ejemplo, un anticuerpo, fragmento del mismo, o asociado de enlace a un antígeno), en donde el nivel de enlace, medido por cualquier ensayo estándar (por ejemplo, un inmunoensayo), es estadísticamente más significativo que el control de fondo para el ensayo. Por ejemplo, cuando se realiza un inmunoensayo, los controles típicamente incluyen un pozo/tubo de reacción que contiene anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno solo (es decir, en ausencia del antígeno), en donde una cantidad de actividad (por ejemplo, enlace no específico al pozo) por el anticuerpo o el fragmento de enlace de antígeno del mismo en ausencia del antígeno se considera que es un fondo. El enlace se puede medir utilizando una variedad de métodos estándares en la técnica incluyendo inmunoensayos de enzimas (por ejemplo, ELISA), ensayos de immunoblot, etcétera). El término "enfermedad" se refiere a cualquier desviación de la salud normal de un animal que incluye un estado cuando los síntomas de la enfermedad están presentes, así como las condiciones en las cuales ha ocurrido una desviación (por ejemplo, infección, mutación de genes, defecto genético, etcétera), pero los síntomas todavía no se manifiestan. Un "individuo" es un vertebrado, de preferencia un mamífero, más preferiblemente un humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja, animales deportivos, mascotas, primates, ratones y ratas. El término "individuo" se puede usar intercambiablemente con el término "animal", "sujeto" o "paciente". Aunque las siguientes descripciones de los aspectos de la invención se describen en particular con respecto a la mutación Ras identificadao en el codón 76 y/o con respecto a las combinaciones de las mutaciones de Ras incluyendo una mutación en el codón 76, todos los aspectos de la invención más adelante también se pueden aplicar a Ras que tiene una mutación en cualquiera o en más de las posiciones 73, 74, 75, 77 o 78, o a Ras incluyendo cualquiera de las combinaciones de las mutaciones de Ras descritas anteriormente y en particular, cualquier combinación de una mutación en la posición 12 y/o 13 con una mutación en la posición 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77, y/o 78. Moléculas de Ácido Nucleico y Proteínas de la Invención. De acuerdo con la presente invención, una proteína Ras o una molécula de ácido nucleico que codifica Ras útil en varios aspectos de la presente invención puede incluir proteínas Ras del tipo natural o mutantes, o una o más porciones de las mismas (por ejemplo, dominios o porciones de las mismas útiles en cualquier método de investigación, diagnóstico, rastreo, o terapéutico), así como moléculas de ácido nucleico ("sentido") que codifican esas proteínas o porciones de las mismas (por ejemplo, dominios o porciones de las mismas útiles en cualquier método de investigación, diagnóstico, rastreo, o terapéutico) o cadenas' hibridantes ("anti-sentido") de ácidos nucleicos para estos dominios o proteínas. La presente invención se dirige en particular a las proteínas Ras mutantes y las moléculas de ácido nucleico que codifican estas proteínas o fragmentos de las mismas, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína Ras mutante o el fragmento de la misma contiene una secuencia que incluye la posición 76, en donde hay una mutación en la posición 76, y en particular, en donde hay una sustitución de un aminoácido no glutamato por el glutamato que existe naturalmente en esta posición. De acuerdo con la presente invención, la referencia a un aminoácido "no glutamato" se puede referir a la sustitución de cualquiera de los otros 20 aminoácidos comúnmente encontrados en las proteínas, que son muy conocidos para los expertos. En modalidades particularmente preferidas, el aminoácido no glutamato es una glicina (E76G), una lisina (E76K), o una glutamina (E76Q), aunque otras sustituciones en esta posición, incluyendo cualquier otro aminoácido no glutamato, está abarcado expresamente por la invención. Una molécula de ácido nucleico que codifica Ras puede incluir o se puede derivar de toda o de una porción de un gen ras seleccionado entre los genes: K-ras, N-ras o H-ras. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico que codifica Ras codifica una proteína Ras con la única mutación en la posición 76. En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico que codifica Ras codifica una proteína Ras que comprende una o más de las mutaciones además de la mutación en la posición 76, incluyendo, pero sin limitarse a, mutaciones en las posiciones 12, 13, 59 y/o 61, siendo las posiciones relativas a una secuencia de aminoácidos K-, H- o N-Ras del tipo natural. En otras modalidades, otras varias mutantes de Ras y moléculas de ácido nucleico que codifican a estas mutantes son útiles en la presente invención (incluyendo Ras mutante que comprende las mutaciones en las posiciones 12, 13, 59 y/o 61 con respecto a una secuencia de aminoácidos Ras de tipo natural), y se puede combinar con una proteína E76 separada o péptido mutante de Ras o una molécula de ácido nucleico separada que codifica este mutante. En algunas modalidades, La molécula de ácido nucleico que codifica Ras codifica una proteína Ras con la única mutación en la posición 73, 74, 75, 77 o 78. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico que codifica Ras codifica una proteína Ras que comprende cualquier combinación de dos o más mutaciones en las posiciones 12, 13, 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 o 78, con combinaciones de al menos una mutación en la posición 12 o en la posición 13 con al menos una mutación en la posición 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 o 78 siendo las preferidas. De nuevo, todas las posiciones son relativas a la secuencia de aminoácidos de K-, H- o N-Ras del tipo natural. En otro aspecto, una proteína Ras es útil en la invención (que puede ser codificada por una molécula de aminoácido útil en la invención que codifica una proteína Ras) incluye fragmentos de al menos, pero sin limitarse a, entre 5 y 17 o entre 5 y 50, o más (5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50... etcétera.) residuos de aminoácidos contiguos de una proteína Ras que contiene las posiciones de aminoácidos 12, 13, 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 y/o 78 relativas a la secuencia de aminoácidos Ras del tipo natural, en donde el residuo de aminoácido en la posición 12, 13, 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 y/o 78 está mutada, preferiblemente por sustitución con un aminoácido distinto del aminoácido que se presenta en esta posición en la forma de tipo natural o no tumorigénica, forma de Ras, con respecto a la secuencia de Ras de tipo natural. Típicamente, la proteína Ras tiene una longitud máxima de la proteína Ras de tipo natural o mutada de longitud completa, la cual en el caso de la SEQ ID NOs: 2- 13 descrita en la presente, varía de 188 a 189 a 193, aunque la proteína Ras de tamaño máximo no se limita a estas longitudes. En una modalidad, un fragmento preferido de la proteína Ras incluye entre aproximadamente 5 y 9 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos Ras natural (la secuencia del tipo natural, o la secuencia que se asocia con Ras no oncogénico celular) que flanquea cualquiera de los dos lados de la mutación en la posición 12, 13, 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 y/o 78 (por ejemplo, un fragmento de aminoácido 11 de Ras que comprende el aminoácido en la posición 76 flanqueado por cinco aminoácidos en alguno de los dos lados de la posición 76, en donde la posición del aminoácido en la posición 76 está mutada con respecto al Ras no tumorigénico de tipo natural; o un fragmento de aminoácido 17 de Ras que comprende el aminoácido en la posición 76 flanqueado por ocho aminoácidos en alguno de los dos lados de la posición 76, en donde el aminoácido en la posición 76 está mutado con respecto a la secuencia Ras del tipo natural). En una modalidad, una proteína Ras útil en la invención incluye un fragmento de al menos 5 aminoácidos contiguos, o al menos 10 aminoácidos contiguos, o al menos 15, o al menos 20, o al menos 25, o al menos 30, o al menos 35, o al menos 40, o al menos 50, o al menos 60, o al menos 75, o al menos 100, o al menos 125, o al menos 150, o al menos 175 aminoácidos contiguos, y hasta la longitud completa para la proteína Ras, incluyendo cualquier fragmento de tamaño que interviene de Ras de al menos 5 aminoácidos, en incremento de números enteros (5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,...39, 40, 41, ...46, 47, 48...etcétera). Varios de estos fragmentos de la misma o diferentes longitudes que tienen la misma o diferentes mutaciones se pueden combinar en una sola proteína quimérica, en una modalidad. Ejemplos de estas proteínas se describen en los Ejemplos. De preferencia, el fragmento de la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína Ras mutante o el péptido es de un tamaño suficiente para servir como un cebador o una sonda para la identificación o la amplificación de una molécula de ácido nucleico Ras (por ejemplo, un gen Ras o una molécula de ARN de Ras) que tiene la misma mutación o mutaciones. Un fragmento de la proteína o péptido Ras de preferencia tiene un tamaño suficiente para al menos servir como un epítope de célula T ( en el contexto de MHC clase I o clase II) o como un epítope de anticuerpo, aunque en algunas modalidades, las proteínas Ras que tienen otras cualidades funcionales pueden ser útiles tales como una proteína Ras que se asocia con GTP, la proteína Ras que puede inducir la señalización celular relacionada con la expresión del gen, la proliferación celular y/o motilidad, o la proteína Ras que puede actuar como un objetivo o en un ensayo, a manera de ejemplo. De conformidad con lo anterior, el fragmento (ácido nucleico o proteína) comprende suficiente de la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de Ras que se presenta naturalmente flanqueando el sitio de la mutación particular, respectivamente, para ser útil para estos propósitos y en cualquier método o composición de investigación, diagnóstico, rastreo, o terapéutico o uso descrito en la presente. La referencia a las posiciones con respecto a las proteínas Ras de tipo natural en la presente, generalmente se hacen con referencia a la posición en las proteínas Ras del tipo natural de mamíferos, o al menos con respecto a la posición de K-Ras, H-Ras o N-Ras humanas o murinas. Se hace notar que las posiciones mencionadas anteriormente también corresponden a cualquiera de las secuencias para K-Ras, H-Ras o N-Ras humanas o murinas, ya que las secuencias de aminoácidos humanas de ratón son idénticas en esta región de la proteína y ya que K-Ras, H-Ras y N-Ras son idénticas en esta región. Para las secuencias de aminoácidos que podrían diferir en otras especies animales, una persona con experiencia en la técnica, fácilmente será capaz de determinar las posiciones correspondientes en la secuencia, tales como por simple alineación con las secuencias humanas o murinas. Un fragmento así puede ser de cualquier longitud, de al menos aproximadamente 5 residuos de aminoácidos contiguos de una proteína Ras hasta la longitud completa de la proteína Ras, en incrementos de números enteros (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20...45, 46, 47, etcétera). La secuencia de nucleótidos y aminoácidos para una variedad de miembros de la familia Ras se conoce bien en la técnica. SEQ ID NO:2 es la secuencia de ácidos nucleicos que codifican la K-ras humana (también conocida en GenBank número de Acceso NM 033360). La SEQ ID NO:2 codifica K-ras humana, representada en la presente como SEQ ID NO:3. La SEQ ID NO:4 es la secuencia de ácidos nucleicos que codifica K-ras murina (también conocida en GenBank número de Acceso NM 021284). La SEQ ID NO:4 codifica la K-ras murina, representada en la presente como SEQ ID NO:5. La SEQ ID NO: 6 es la secuencia del ácido nucleico que codifica H-ras humana (también conocida en GenBank Número de Acceso NM 005343). La SEQ ID NO: 6 codifica H-ras humana, representada en la presente como SEQ ID NO:7. La SEQ ID NO:8 es la secuencia de ácidos nucleicos que codifica H-ras murina (también conocida en GenBank número de Acceso NM 008284). La SEQ ID NO:8 codifica H-ras murina, representada en la presente como SEQ ID NO:9. La SEQ ID NO: 10 es la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la N-ras humana (también conocida en GenBank Número de Acceso NM_002524). La SEQ ID NO: 10 codifica N-ras humana, representada en la presente como SEQ ID NO: 11. La SEQ ID NO: 12 es la secuencia de ácidos nucleicos que codifica N-ras murina (también conocida en GenBank Número de Acceso NM 010937). La SEQ ID NO: 12 codifica la N-ras humana, representada en la presente como SEQ ID NO: 13. La SEQ ID NOs:2-13 son representativas de las secuencias de Ras del "tipo natural". Como se comentó anteriormente, Ras es un ejemplo de un oncogén en el cual se sabe que varias mutaciones se presentan en posiciones particulares y se asocian con el desarrollo de uno o más tipos de cáncer. La presente invención reporta el descubrimiento de una nueva mutación que previamente no se había conocido o descrito para Ras, así como una combinación de esta mutación con una mutación conocida que sinergiza para aumentar significativamente la oncogenicidad de un tumor que lleva esta combinación de mutaciones. Por lo tanto, se pueden construir proteínas de fusión útiles en la presente invención (descritas en mayor detalle más adelante) que comprenden, consisten esencialmente o, consisten en péptidos que contienen este residuo mutado y también otros residuos particulares que se sabe que están mutados en ciertos cánceres, en donde cada dominio contiene mutación diferente en ese sitio y/o contiene una mutación en un sitio diferente, con el fin de cubrir varias o todas las mutaciones conocidas en ese sitio o en la proteína. Por ejemplo, con respecto a Ras, se puede proporcionar dos o más dominios inmunogénicos que comprenden al menos 4 aminoácidos en cualquiera de los lados e incluyendo la posición 76 (pero sin limitarse a 4 aminoácidos, como se pueden incluir pedazos más cortos o más largos de aminoácidos que flanquean), en donde cada dominio tiene una sustitución diferente para el glutamato que normalmente se presenta en la proteína Ras no mutada en la posición 76. Una de las sustituciones en esta posición preferiblemente es una sustitución glicina, una sustitución lisina o una sustitución glutamina. En un ejemplo, la proteína o el péptido comprende fragmentos de al menos 5-9 residuos de aminoácidos contiguos de una proteína Ras de tipo natural, y hasta la proteína Ras entera, en incrementos de números enteros, que contienen las posiciones de aminoácidos 12, 13, 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 y/o 78 relativas a la proteína Ras del tipo natural, en donde los residuos de aminoácidos en las posiciones 12, 13, 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 y/o 78 están mutadas con respecto a la proteína Ras del tipo natural. Preferiblemente, la proteína o el péptido comprende al menos una mutación en la posición 76, y más preferiblemente, la mutación es una sustitución de una glicina, lisina o glutamina para el glutamato que normalmente reside en esa posición. En un aspecto, una construcción de proteína de fusión útil en la presente invención consiste en al menos un péptido que se fusiona en un cuadro de otro antígeno de tumor mutado, en donde el péptido se selecciona entre un grupo que consiste en: (a) un péptido que comprende al menos de las posiciones 4-20 o al menos de las posiciones 8-16 de la SEQ ID NO:3 (o un péptido de cualquier tamaño entre estos o más grande), en donde el residuo de aminoácido en la posición 12 con respecto a SEQ ID NO:3 se muta en comparación a SEQ ID NO:3; (b) un péptido que comprende al menos desde las posiciones 5-21 o al menos desde las posiciones 9-17 de la SEQ ID NO:3 (o un péptido de cualquier tamaño entre estos o mayor), en donde el residuo de aminoácido en la posición 13 con respecto a SEQ ID NO:3 se muta en comparación con SEQ ID NO:3; (c) un péptido que comprende al menos desde las posiciones 51-67 o al menos desde las posiciones 55-63 de SEQ ID NO:3 (o un péptido de cualquier tamaño entre estos o mayor), en donde el residuo de aminoácido en la posición 59 con respecto a SEQ ID NO:3 se muta en comparación con SEQ ID NO:3; (d) un péptido que comprende al menos desde las posiciones 53-69 o al menos desde las posiciones 57-65 de SEQ ID NO:3 (o un péptido de cualquier tamaño entre estos o mayor), en donde el residuo de aminoácido en la posición 61 con respecto a SEQ ID NO:3 se muta en comparación con SEQ ID NO:3; (e) un péptido que comprende al menos desde las posiciones 65-81 o al menos desde las posiciones 69-77 de SEQ ID NO:3 (o un péptido de cualquier tamaño entre estos o más grande), en donde el residuo de aminoácido en la posición 73 con respecto a SEQ ID NO:3 se muta en comparación con SEQ ID NO:3; (f) un péptido que comprende al menos desde las posiciones 66-82 o al menos de las posiciones 70-78 de SEQ ID NO:3 (o un péptido de cualquier tamaño entre estos o más grande), en donde el residuo de aminoácido en la posición 74 con respecto a SEQ ID NO: 3 se muta en comparación con SEQ ID NO:3; (g) un péptido que comprende al menos desde las posiciones 67-83 o al menos desde las posiciones 71-79 de SEQ ID NO:3 (o un péptido de cualquier tamaño entre estos o más grande), en donde el residuo de aminoácido en la posición 75 con respecto a SEQ ID NO:3 se muta en comparación con SEQ ID NO:3; (h) un péptido que comprende al menos desde las posiciones 69-84 o al menos desde las posiciones 73-81 de SEQ ID NO:3 (o un péptido de cualquier tamaño entre estos o mayor), en donde el residuo de aminoácido en la posición 77 con respecto a SEQ ID NO: 3 se muta en comparación a SEQ ID NO:3; (i) un péptido que comprende al menos desde las posiciones 70-85 o al menos desde las posiciones 74-82 de SEQ ID NO:3 (o un péptido de cualquier tamaño entre estos o mayor), en donde el residuo de aminoácido en la posición 78 con respecto a SEQ ID NO:3 se muta en comparación con SEQ ID NO:3; y/o la modalidad más preferida de (j) un péptido que comprende al menos desde las posiciones 68-84 o al menos desde las posiciones 72-80 de SEQ ID NO:3 (o un péptido de cualquier tamaño entre estos o más grande), en donde el residuo de aminoácido en la posición 76 con respecto a SEQ ID NO:3 se muta en comparación a SEQ ID NO:3. Se nota que estas posiciones también corresponden a cualquiera de la SEQ ID NOs: 5, 7, 9, 11 o 13, ya que las secuencias de aminoácidos humana y de ratón son idénticas en esta región de la proteína ya que las proteínas K-Ras, H-Ras y N-Ras son idénticas en esta región. Los fragmentos no se limitan a los mencionados anteriormente, los cuales son de ejemplo, en tanto el fragmento tenga al menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, incluya la mutación deseada, y sea útil, o esté codificada por una molécula de ácido nucleico que sea útil, en un método de investigación, diagnóstico, rastreo o terapéutico descrito en la presente. En una modalidad, una construcción de proteína de fusión útil en la presente invención comprende la proteína de fusión representada en la presente como SEQ ID NO: 14. En otra modalidad, la construcción de una proteína de fusión útil en la presente invención comprende una proteína de fusión representada en la presente como SEQ ID NO: 15. De conformidad con lo anterior, la presente invención incluye cualquier molécula de ácido nucleico que codifica, híbrida a, o es un complemento de una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas Ras o fragmentos de las mismas descritas en la presente, e incluye moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las proteínas de fusión descritas en la presente. La invención también incluye moléculas de ARN y ADN basadas en la secuencias de ácido nucleico de la invención, ribozimas basadas en las secuencias de ácidos nucleicos de la invención, ARNi basado en las secuencias de ácido nucleico de la invención, y/o aptámeros basados en la estructura de la proteína Ras terciaria de la invención, que se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica. Estos incluyen técnicas para sintetizar químicamente polinucleótidos muy conocidos en la técnica como la síntesis química de fosforamidita en fase sólida. Alternativamente, las moléculas de ARN se pueden generar mediante transcripción in vitro e in vivo de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN antisentido. Estas secuencias de ADN se pueden incorporar en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores de polimerasa de ARN conveniente, tales como los promotores de polimerasa T7 o SP6. Las construcciones de ADNc antisentido que sintetizan el ARN constitutivamente o induciblemente, dependiendo del promotor usado, se pueden introducir establemente en células huésped. Estos agentes basados en ácido nucleico se pueden introducir en células huésped o tejidos y usarse para inhibir la expresión y/o la función de las proteínas Ras.

Otra modalidad de la presente invención incluye una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un vector recombinante y una secuencia de ácidos nucleicos derivada de un gen ras y/o que codifica una proteína Ras o péptido o fragmentos de los mismos como se describe en la presente. Típicamente, una molécula de ácido nucleico recombinante, incluye al menos una molécula de ácido nucleico de la presente invención operativamente enlazada a una o más secuencias de control de expresión. Varios tipos de vectores recombinantes que se pueden usar en la invención se han descrito anteriormente.

Una o más moléculas recombinantes de la presente invención se pueden usar para producir un producto codificado (por ejemplo, una proteína Ras mutada o porción de la misma). En una modalidad, un producto codificado se produce expresando una molécula de ácido nucleico como se describe en la presente bajo condiciones efectivas para producir la proteína. Un método preferido para producir una proteína codificada es transfectando una célula huésped con una o más moléculas recombinantes para formar una célula recombinante. Las células huésped convenientes para transfectar incluyen, pero no se limitan a, cualquier célula bacteriana, fungal (por ejemplo, levadura), insecto, planta o animal que se pueda transfectar. Las células huésped pueden ser células no transfectadas o células que ya están transfectadas con al menos otra molécula de ácido nucleico recombinante. En una modalidad de la invención, una célula huésped preferida es una célula de levadura. Las moléculas de ácido nucleico transformadas en vehículo de la presente invención pueden incluir secuencias de ácidos nucleicos que codifican una o más, y/o sobre una o más porciones de las mismas. Estas moléculas de ácido nucleico pueden comprender regiones de codificación parcial o enteras, regiones reguladoras, o combinaciones de las mismas. Una ventaja de las cepas de levadura es la capacidad de llevar muchas moléculas de ácido nucleico y ser capaces de producir muchas proteínas heterólogas. Un número preferido de antígenos para ser producido por un vehículo de levadura de la presente invención es cualquier número de antígenos que puede ser razonablemente producido por un vehículo de levadura, y típicamente varía desde al menos uno hasta al menos 5 o más, siendo más preferido de aproximadamente 2 a aproximadamente 5 compuestos. Las huésped de levadura preferidas se comentan en detalle más adelante. Una persona con experiencia en la técnica apreciará que el uso de tecnologías de ADN recombinante pueden mejorar el control de la expresión de las moléculas de ácido nucleico transfectadas manipulando, por ejemplo, el número de copias de las moléculas de ácido nucleico dentro de la célula huésped, la eficiencia con la cual se transcriben esas moléculas de ácido nucleico, la eficiencia con la cual se traducen las transcripciones resultantes, y la eficiencia de las modificaciones post traducción. Adicionalmente, la secuencia promotora podría diseñarse genéticamente para mejorar el nivel de expresión en comparación con el promotor original. Las técnicas recombinantes útiles para controlar la expresión de las moléculas de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, integración de las moléculas de ácido nucleico en uno o más cromosomas de la célula huésped, adición de las secuencias de estabilidad de vector a los plásmidos, sustituciones o modificaciones de las señales de control de la transcripción (por ejemplo, promotores, operadores, mejoradores), sustituciones o modificaciones de las señales de control de la traducción (por ejemplo, sitios de enlace de ribosoma, secuencias de Kozak, secuencias de Shine-Dalgarno), modificación de moléculas de ácido nucleico para corresponder al uso del codón de la célula huésped, y supresión de secuencias que desestabilizan las transcripciones. Proteínas de Fusión Como se comentó anteriormente, se pueden construir proteínas de fusión para usarlas en varias modalidades de la invención, incluyendo proteínas de fusión que contiene al menos un péptido o proteína Ras que contiene el residuo mutado en la posición 76 (o el residuo mutado en la posición 73, 74, 75, 77 o 78 o cualquiera de las combinaciones descritas en la presente) (como se hizo notar anteriormente, la posición 76 se denota con respecto al mamífero del tipo original, y en particular la secuencia de aminoácidos Ras humano o murino), y que también puede incluir otros péptidos o proteínas Ras que contienen mutaciones en otros residuos que se sabe que están mutadas en ciertos cánceres. Otros antígenos distintos que Ras, o porciones de los mismos, incluyendo otros antígenos de cáncer e incluyendo varios mutantes de otras proteínas asociadas con cáncer, también se pueden incluir en estas fusiones. También abarcadas por la invención están las moléculas de ácido nucleico que codifican estas proteínas de fusión. En un aspecto, las proteínas basadas en Ras y los péptidos de la invención, incluyendo las combinaciones de diferentes proteínas y péptidos Ras y/o otras proteínas y péptidos mencionadas anteriormente deben ser incluidas en una proteína de fusión que ha sido diseñada para estabilizar la expresión de la proteína heterologa en un vehículo de levadura y/o prevenir la modificación post transcripción de la proteína heteróloga expresada. Estas proteínas de fusión generalmente se describen en la publicación PCT número WO 2004/058157 A2, la cual se incorpora en la presente mediante referencia por entero. Estas proteínas de fusión típicamente se expresan como proteínas recombinantes mediante un vehículo de levadura (por ejemplo, mediante una levadura intacta o esferoplasto de levadura, la cual opcionalmente se puede procesar a un citoplasto de levadura, espectro de levadura o membrana de levadura o extracto de membrana de levadura o fracción de los mismos, descritos más adelante), aunque es una modalidad de la invención que una o más proteínas de fusión podría ser cargada en un vehículo de levadura o de otro modo complejada o mezclada con el vehículo de levadura como se describe más adelante para formar una vacuna o composición útil en la presente invención. Una de estas proteínas de fusión útil en la presente invención es una proteína de fusión que incluye: (a) al menos un antígeno Ras (incluyendo un péptido o proteína) que incluye la mutación en la posición 76 como se describe en la presente; y (b) un péptido sintético. En una modalidad, una proteína de fusión en la presente invención comprende la proteína de fusión representada en la presente por SEQ ID NO: 14. En otra modalidad, una proteína de fusión útil que comprende la proteína de fusión representada en la presente por SEQ ID NO: 15. En una modalidad, el péptido sintético se enlaza al término N del antígeno, el péptido que consiste al menos en dos residuos de aminoácidos que son heterologos al antígeno, en donde el péptido estabiliza la expresión de la proteína de fusión en el vehículo de levadura o evita la modificación por traducción de la proteína de fusión expresada. El péptido sintético y la porción terminal N del antígeno juntos forman una proteína de fusión que tiene los siguientes requerimientos: (1) El residuo de aminoácido en la posición uno de la proteína de fusión es una metionina (es decir, el primer aminoácido en el péptido sintético es una metionina); (2) El residuo de aminoácido en la posición dos de la proteína de fusión no es una glicina ni una prolina (es decir, el segundo aminoácido en el péptido sintético no es una glicina ni una prolina); (3) ninguno de los residuos de aminoácidos en las posiciones 2-6 de la proteína de fusión es una metionina (es decir, los aminoácidos en las posiciones 2-6, ya sean parte del péptido sintético o de la proteína, si el péptido sintético es más corto que 6 aminoácidos, no incluye una metionina); y (4) ninguno de los aminoácidos en las posiciones 2-6 de la proteína de fusión es una lisina o una arginina (es decir, los aminoácidos en las posiciones 2-6, ya sean parte de un péptido sintético o la proteína, si el péptido sintético es más corto que 5 aminoácidos, no incluye una lisina ni una arginina). El péptido sintético puede ser tan corto como de dos aminoácidos, pero más preferiblemente es al menos 2-6 aminoácidos (incluyendo 3, 4, 5 aminoácidos), y puede ser más largo de 6 aminoácidos, en enteros, hasta aproximadamente 200 aminoácidos, 300 aminoácidos, 400 aminoácidos, 500 aminoácidos, o más.

En una modalidad, una proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de M-X2-X3-X4-X5-X6, en donde M es metionina; en donde X2 es cualquier aminoácido excepto glicina, prolina, lisina o arginina; en donde X3 es cualquier aminoácido excepto metionina, lisina o arginina; en donde X4 es cualquier aminoácido excepto metionina, lisina o arginina; en donde X5 es cualquier aminoácido excepto metionina, lisina o arginina; y en donde X6 es cualquier aminoácido excepto metionina, lisina o arginina. En una modalidad, el residuo X6 es una prolina. Una secuencia sintética ejemplar que aumenta la estabilidad de la expresión de un antígeno en una célula de levadura y/o previene la modificación post traducción de la proteína en la levadura que incluye la secuencia M-A-D-E-A-P (SEQ ID NO: 1). La secuencia MADEAP se puede usar con otros antígenos además del antígeno. Además de la estabilidad mejorada del producto de la expresión, este compañero de fusión no parece que tenga efecto negativo que es la respuesta inmune contra el antígeno vacunante en la construcción. Además, los péptidos de fusión sintéticos se pueden diseñar para proporcionar un epítope que pueda ser reconocido por un agente de selección, tal como un anticuerpo. En otra modalidad de la invención, los ácidos nucleicos que codifican el sitio de inicio de la traducción de un péptido sintético usado en la invención son A-C-C-A-T-G-G, de acuerdo con las reglas de traducción de secuencia de Kozak, en donde ATG en esta secuencia es el sitio de inicio de la traducción y codifica la metionina de M-A-D-E-A-P (SEQ ID NO: 1). Se entenderá que varias modalidades de la invención como se describen en la presente también se pueden combinar. Por ejemplo, en un aspecto de la invención, cuando el péptido sintético es MA-D-E-A-P (SEQ ID NO: 1), los ácidos nucleicos que codifican el sitio de inicio para este péptido pueden ser A-C-C-A-T-G-G. Varias otras combinaciones de modalidades de la invención serán aparentes para los expertos en la técnica. En un aspecto de la invención, el vehículo de levadura se manipula de manera que el antígeno se expresa o se proporciona por entrega o transposición de un producto de antígeno expresado, parcialmente o completamente, sobre la superficie del vehículo de levadura (expresión extracelular). Un método para llevar a cabo este aspecto de la invención es usar un brazo espaciador para colocar uno o más antígenos sobre la superficie del vehículo de levadura. Una manera de usar un brazo espaciador es crear una proteína de fusión del o los antígenos de interés con una proteína que dirige al o a los antígenos a la pared celular de la levadura. Por ejemplo, una proteína que se puede usar es una proteína de levadura (por ejemplo, la proteína de la pared celular 2 (cwp2), Aga2, Pir4 o la proteína Flol) que permite que el o los antígenos sean dirigidos a la pared celular de la levadura de manera que el antígeno se localice sobre la superficie de la levadura. Proteínas distintas de las proteínas de la levadura se pueden usar para el brazo espaciador; sin embargo, para cualquier proteína de brazo espaciador, es más deseable que tenga la respuesta inmunogénica dirigida contra el antígeno objetivo en vez de la proteína del brazo espaciador. Como tal, si se usan otras proteínas para el brazo espaciador, entonces la proteína del brazo espaciador que se usa no deberá generar una respuesta inmune grande a la proteína del brazo espaciador mismo de manera que la respuesta inmune al o a los antígenos objetivos sea sobrepasada. Una persona con experiencia en la técnica deberá apuntar a una respuesta inmune pequeña a la proteína del brazo espaciador en relación con la respuesta inmune para el o los antígenos objetivos. Otro método para colocar el o los antígenos objetivos para ser expuestos sobre la superficie de la levadura es usar secuencias de señales tales como inositol glicosilfosfatidilo (GPI) para anclar el objetivo a la pared de la célula de levadura. Alternativamente, la colocación se puede llevar a cabo anexando secuencias de señales que dirijan el o los antígenos de interés hacia la senda secretora vía la transposición en el retículo endoplásmico (ER) de manera que el antígeno se enlace a una proteína que está enlazada a la pared celular (por ejemplo, cwp). En un aspecto la proteína del brazo espaciador es una proteína de levadura. La proteína de levadura puede consistir de entre aproximadamente dos a aproximadamente 800 aminoácidos de una proteína de levadura. En una modalidad, la proteína de levadura es de aproximadamente 10 a 700 aminoácidos. En otra modalidad, la proteína de levadura es de aproximadamente 40 a 600 aminoácidos.

Otras modalidades de la invención incluyen la proteína de levadura siendo hasta al menos de 250 aminoácidos, al menos 300 aminoácidos, al menos 350 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos, al menos 450 aminoácidos, al menos 500 aminoácidos, al menos 550 aminoácidos, al menos 600 aminoácidos, o al menos 650 aminoácidos. En una modalidad, la proteína de levadura es de al menos 450 aminoácidos de longitud. En otra modalidad, la proteína de levadura estabiliza la expresión de la proteína de fusión en el vehículo de levadura, evita la modificación post traducción de la proteína de fusión expresada, y/o dirige la proteína de fusión a un compartimiento particular de la levadura (por ejemplo, para ser expresada en la superficie de la célula de la levadura). Para la entrega de la senda secretora de levadura, las proteínas de levadura ejemplares para usarse incluyen, pero no se limitan a: Aga (incluyendo, pero sin limitarse a, Agal y/o Aga2); SUC2 ( invertasa de levadura); secuencia delantera de señal del factor alfa; CPY; Cwp2p para su localización y retención en la pared celular; genes BUD para localización en bud de las células de levadura durante la fase inicial de la formación de la célula hija; Flolp; Pir2p; y Pir4p. En otro aspecto de la invención, se pueden usar otras secuencias para dirigir, retener y/o estabilizar la proteína a otras partes del vehículo de levadura, por ejemplo, en el citosol o la mitrocondria. Ejemplos de proteína de levadura convenientes que se pueden usar para cualquiera de las modalidades anteriores, incluyen, pero no se limitan a, SEC7; productos de genes fosfoenolpiruvato carboxicinasa PCKI, fosfoglicerocinasa PGK y triosa fosfato isomerasa TPI para su expresión reprimible en glucosa y localización citosólica; las proteínas de choque de calor SSAI, SSA3, SSA4, SSCI, cuya expresión se induce y cuyas proteínas son más termoestables después de la exposición de las células al tratamiento por calor; la proteína mitocondrial CYCI para la importación hacia la mitocondria; ACTI. Anticuerpos y Péptidos que enlazan Antígeno Una modalidad de la invención se relaciona con un anticuerpo o péptido que enlaza antígeno que selectivamente enlaza a la proteína o péptido Ras que tiene la mutación E76 descrita en la presente, incluyendo, pero sin limitarse a, una mutación E76G, una mutación E76K y/o una mutación E76Q. Otras modalidades de la invención se relacionan con un anticuerpo o péptido que enlaza antígeno que selectivamente enlaza a una proteína Ras que tiene una mutación en cualquiera de una o más de las posiciones 73, 74, 75, 77 o 78, o una Ras que incluye cualquiera de las combinaciones de las mutaciones de Ras descritas anteriormente y en particular, cualquier combinación de una mutación en la posición 12 y/o 13 con una mutación en la posición 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77, y/o 78. Los anticuerpos se caracterizan porque comprenden dominios de inmunoglobulina y como tales, son miembros de la superfamilia de las proteínas de inmunoglobulina. Un anticuerpo de la invención incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos divalentes y monovalentes, anticuerpos bi- o multi-específicos, suero que contiene estos anticuerpos, anticuerpos que han sido purificados a varios grados, y cualquier equivalente funcional de anticuerpos enteros. Los anticuerpos aislados de la presente invención pueden incluir el suero que contienen estos anticuerpos, o anticuerpos que han sido purificados a varios grados. Los anticuerpos enteros de la presente invención pueden ser policlonales o monoclonales. Alternativamente, equivalentes funcionales de anticuerpos enteros, tales como fragmentos que enlazan antígenos en los cuales uno o más dominios de anticuerpos están truncados o ausentes (por ejemplo, los fragmentos Fv, Fab, Fab', o F(ab)2), así como anticuerpos diseñados genéticamente o fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, incluyendo anticuerpos de cadena simple o anticuerpos que se pueden enlazar a más de un epítope (por ejemplo, anticuerpo bi especifico), o anticuerpos que se pueden enlazar a uno o más antígenos diferentes (por ejemplo, anticuerpos bi- o multi- específicos), también se pueden emplear en la invención.

Los anticuerpos, diseñados genéticamente, de la invención incluyen aquellos producidos por técnicas de ADN recombinantes estándares que incluyen la manipulación y la expresión de ADN de las regiones variables y/o constantes del anticuerpo que codifica el ADN. Ejemplos particulares incluyen, anticuerpos quiméricos, donde los dominios VH y/o VL del anticuerpo vienen de una diferente fuente al resto del anticuerpo, y los anticuerpos injertados CDR (y los fragmentos que enlazan antígeno de los mismos), los cuales al menos una secuencia CDR y opcionalmente al menos un aminoácido de estructura de región variable se deriva(n) de una fuente y las porciones restantes de las regiones variable y constante (según sea lo apropiado) se derivan de una fuente diferente. Se describe la construcción de anticuerpos quiméricos e injertados en CDR, por ejemplo en las Solicitudes de Patentes Europeas: EP-A 0194276, EP-A 0239400, EP-A 0451216 y EP-A 0460617. En general, en la producción de un anticuerpo, un animal experimental conveniente, tal como, por ejemplo, pero sin limitarse a, un conejo, una oveja, un hámster, un conejillo de indias, un ratón, una rata, o un pollo, se expone a un antígeno contra el cual se desea un anticuerpo. Típicamente, un animal es inmunizado con una cantidad efectiva de un antígeno que se inyecta a un animal. Una cantidad efectiva de antígeno se refiere a una cantidad necesaria para inducir la producción del anticuerpo por el animal. El sistema inmune del animal se le deja responder durante un periodo de tiempo previamente determinado. El proceso de inmunización se puede repetir hasta que se encuentra que el sistema inmune produce anticuerpos al antígeno. Con el fin de obtener anticuerpos policlonales específicos para el antígeno, se recolecta el suero del animal que contiene los anticuerpos deseados (o en el caso de un pollo el anticuerpo se puede recolectar de los huevos). Este suero es útil como un reactivo. Los anticuerpos policlonales se pueden purificar adicionalmente del suero (o los huevos) mediante, por ejemplo, tratar el suero con sulfato de amonio.

Se pueden producir anticuerpos monoclonales de acuerdo con la metodología de Kohler y Milstein (Nature 256:495-497, 1975). Por ejemplo, se recuperan linfocitos B del bazo (o de cualquier tejido conveniente) de un animal inmunizado y luego se fusionan con células de mieloma para obtener una población de células de hibridoma capaces de crecimiento continuo en el medio de cultivo conveniente. Los hibridomas que producen el anticuerpo deseado se seleccionan probando la capacidad del anticuerpo producido por el hibridoma al enlazarse con el antígeno deseado. La invención se extiende también a polilpéptidos que no son anticuerpos, algunas veces son conocidos como socios del enlace, que han sido diseñados para enlazarse específicamente a, ya sea para activar o inhibir según sea apropiado, una proteína Ras mutada de la invención. Ejemplos del diseño de estos polipéptidos, los cuales poseen una especificidad de ligando prescrita se dan en Beste y colaboradores, {Proc. Nati. Acad. Sci. 96:1898-1903, 1999), incorporada a la presente mediante referencia por entero. Moléculas pequeñas, Antagonistas Conformacionales. y otros Compuestos La invención también incluye compuestos de moléculas pequeñas (por ejemplo, productos del descubrimiento de fármacos utilizando la Ras mutada descubierta por los inventores) tales como antagonistas conformacionales o activadores de hidrólisis por GTP. En una modalidad, estos compuestos pueden ser formas miméticas o modificadas de Ras-GAP que son capaces de interactuar con las proteínas Ras mutadas para disparar la hidrólisis de GTP. En otra modalidad, estos compuestos pueden interactuar directamente con Ras-GAP para adaptar la proteína Ras-GAP endógena para disparar la hidrólisis de GTP en mutantes de Ras, tales como los descritos en la presente. Preferiblemente, estos compuestos no disparan la hidrólisis de GTP de Ras del tipo natural (no mutado o no tumorigénico), de manera que los compuestos son más útiles como compuestos específicos de tumor. Un agente así, se puede obtener, por ejemplo, a partir de estrategias de diversidad molecular (una combinación de estrategias relacionadas que permiten la construcción rápida de bibliotecas moleculares grandes, químicamente diversas), bibliotecas de compuestos naturales o sintéticos, en particular de bibliotecas químicas o combinatoriales (es decir, bibliotecas de compuestos que difieren de secuencia o tamaño, pero que tienen los mismos bloques de construcción) o mediante el diseño racional de fármacos. Véase por ejemplo, Maulik y colaboradores, 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc., la cual se incorpora en la presente mediante referencia por entero. Los compuestos candidatos inicialmente identificados por los métodos de diseño de fármacos se pueden rastrear por su capacidad para modular la hidrólisis de GTP o servir como un antagonista conformacional de una proteína Ras mutante descrita en la presente. En una estrategia de diversidad molecular, se sintetizan bibliotecas de compuestos grandes, por ejemplo, a partir de péptidos, oligonucleótidos, carbohidratos y/o moléculas orgánicas sintéticas, utilizando enfoques biológicos, enzimáticos y/o químicos. Los parámetros críticos para desarrollar una estrategia de diversidad molecular incluyen diversidad por subunidad, tamaño molecular, y diversidad de biblioteca. La meta general del rastreo de estas bibliotecas es utilizar la aplicación secuencial de la selección combinatoria para obtener ligandos de alta afinidad contra un objetivo deseado y luego optimizar las moléculas principales ya sea mediante estrategias de diseño aleatorio o dirigido. Los métodos de diversidad molecular se describen en detalle en Maulik, y colaboradores, supra. En un procedimiento de diseño racional de fármacos, la estructura tridimensional de un compuesto regulador se puede analizar mediante, por ejemplo, resonancia magnética nuclear (R N) o cristalografía de rayos X. Esta estructura tridimensional se puede usar entonces para predecir estructuras de compuestos potenciales, tales como agentes reguladores potenciales mediante, por ejemplo, modelado por computación. La estructura del compuesto predicho se puede utilizar para optimizar los compuestos principales derivados, por ejemplo, por métodos de diversidad molecular. Además, la estructura del compuesto predicho se puede producir mediante, por ejemplo, síntesis química, tecnología de ADN recombinante, o aislando un mimétope a partir de una fuente natural (por ejemplo, vegetales, animales, bacterias y hongos). Otros varios métodos de diseño de fármacos basados en estructura se describen en Maulik y colaboradores, 1997, supra. Maulik y colaboradores describen, por ejemplo, métodos de diseño dirigido, en los cuales el usuario dirige el proceso de crear novedosas moléculas a partir de una biblioteca de fragmentos seleccionados apropiadamente; diseño aleatorio, en el cual el usuario utiliza un algoritmo genético u otro algoritmo para mutar aleatoriamente fragmentos y sus combinaciones mientras que simultáneamente aplica un criterio de selección para evaluar la adecuación de los ligandos candidatos; y un enfoque basado en rejilla en el cual el usuario calcula la energía de interacción entre tres estructuras de receptor tridimensional y sondas de fragmentos pequeños, seguidas por enlazar entre sí los sitios de sondas favorables. Composiciones y Vacunas Como se comentó anteriormente, una modalidad de la invención se relaciona con composiciones o vacunas que incluyen las proteínas Ras mutadas, moléculas de ácido nucleico que codifican a las mismas, o cualquiera de los ácidos nucleicos terapéuticos (por ejemplo, aptámeros, ribozimas, ARNi) o péptidos o moléculas pequeñas (por ejemplo, antagonistas conformacionales, activadores de la hidrólisis de GTP) como se comentó anteriormente. La presente invención incluye una modalidad donde las proteínas Ras mutadas descritas en la presente se pueden usar en una composición o vacuna "convencional" o junto con una vacuna basada en levadura (descrita más adelante Patentes de los Estados Unidos de América números 5,830,463 y 7,083,787, así como la Publicación de Patente de los Estados Unidos de América números 2004-0156858 A1 y 2006-0110755 A1). Cualquiera de los dos tipos de composición o vacuna puede incluir, además de cualquiera de las proteínas Ras mutadas descritas en la presente (por ejemplo, una proteína Ras o péptido que tiene una mutación en la posición 76, y de preferencia, una mutación E76G, E76K o E76Q, o una combinación de la mutación E76 Ras con otra mutación, tal como una mutación G12), un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente, un vehículo farmacéuticamente aceptable se refiere a cualquier sustancia o vehículo conveniente para administrar una proteína Ras mutada útil en un método de la presente invención a un sitio conveniente in vivo o ex vivo. Este vehículo puede incluir, pero no se limita a, un adyuvante, un excipiente, o cualquier otro tipo de vehículo o portador de entrega. De acuerdo con la presente invención, los adyuvantes son típicamente sustancias que generalmente aumentan la respuesta inmune de un animal a un antígeno específico. Adyuvantes convenientes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund; otros componentes de la pared celular bacteriana; sales basadas en aluminio; sales basadas en calcio; óxido de sílice; polinucleótidos; toxoides; proteínas del suero; proteínas de recubrimiento viral; otras preparaciones derivadas de bacterias; gamma interferón; adyuvantes de copolímero de bloque, tales como el adyuvante Titermax Hunter (CytRxMR, Inc. Norcross, GA); adyuvantes Ribi (disponibles de Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT); y saponinas y sus derivados, tales como Quil A (disponible de Superfos Biosector A/S, Dinamarca). Los vehículos típicamente son compuestos que aumentan la vida media de una composición terapéutica en el animal tratado. Los vehículos convenientes incluyen, pero no se limitan a, formulaciones de liberación controlada polimérica, implantes biodegradables, liposomas, aceites, ésteres y glicoles. Las composiciones terapéuticas, incluyendo las vacunas, de la presente invención también pueden contener uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Como se usa en la presente, un excipiente, farmacéuticamente aceptable se refiere, a cualquier sustancia conveniente para administrar una composición terapéutica útil en el método de la presente invención a un sitio conveniente in vivo o ex vivo. Los excipientes farmacéuticamente preferidos son capaces de mantener una composición (o en algunas modalidades, un vehículo de levadura o célula dendrítica que comprende el vehículo de levadura) en una forma que, después de la llegada de la composición a una célula objetivo, tejido, o sitio en el cuerpo, la composición es capaz de provocar una respuesta inmune al sitio objetivo (se hace notar que el sitio objetivo puede ser sistémico). Excipientes convenientes de la presente invención incluyen excipientes o formularios que transportan, pero no dirigen específicamente la vacuna al sitio (también conocidos en la presente como portadores no dirigidos). Ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina, solución salina regulada por fosfato, solución de Ringer, solución de dextrosa, soluciones que contienen suero, solución de Hank, otras soluciones acuosas balanceadas fisiológicamente, aceites, ésteres y glicoles. Los vehículos acuosos pueden contener sustancias auxiliares convenientes requeridas para aproximar las condiciones fisiológicas del receptor, por ejemplo, aumentando la estabilidad química y la isotonicidad. Las sustancias auxiliares convenientes incluyen, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, lactato de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, y otras sustancias usadas para producir un regulador de fosfato, regulador Tris, y regulador bicarbonato. Las sustancias auxiliares también pueden incluir conservadores, tales como timerosal, m-cresol ó o-cresol, formalina y benzol alcohol. Un componente de una composición terapéutica o vacuna de la presente invención incluye al menos un antígeno para vacunar a un animal, y en particular, al menos un antígeno que comprende al menos una porción de la proteína Ras que contiene la mutación en la posición 76 como se describe en la presente. La composición o vacuna puede incluir uno, dos, pocos, varios, o una pluralidad de antígenos, incluyendo uno o más dominios inmunogénicos de uno o más antígenos, como se desee. De acuerdo con la presente invención, un antígeno conveniente para su uso en la presente composición o vacuna puede incluir dos o más dominios inmunogénicos o epítopes del mismo antígeno, dos o más dominios inmunogénicos antígenos o epítopes aparte de la misma célula, tejido u organismo y dos o más antígenos diferentes, dominios inmunogénicos, o epítopes de diferentes células, tejidos u organismos. De preferencia, el antígeno es heterólogo a la cepa de levadura (es decir, no es proteína que sea producida naturalmente por la cepa de levadura en ausencia de manipulación genética o biológica). De preferencia las proteínas Ras mutadas y las proteínas de fusión preferidas para su uso en una vacuna o composición convencional o con un vehículo de levadura de la presente invención, se han descrito anteriormente. En una modalidad de la presente invención, una composición o vacuna también puede incluir compuestos modificadores de la respuesta biológica, o la capacidad de producir estos modificadores (es decir, mediante transfección, con moléculas de ácido nucleico que codifican estos modificadores), aunque estos modificadores no necesariamente logran una respuesta inmune robusta cuando se usa un vehículo de levadura (comentado más adelante). Los modificadores de la respuesta biológica son compuestos que pueden modular las respuestas inmunes. Ciertos modificadores de la respuesta biológica pueden estimular una respuesta inmune protectora mientras que otros pueden suprimir una respuesta inmune dañina. Ciertos modificadores de respuesta biológica preferencialmente aumentan la respuesta inmune mediada por células mientras que otros preferencialmente aumentan una respuesta inmune humoral (es decir, pueden estimular una respuesta inmune en la cual hay un nivel aumentado de inmunidad celular comparada con inmunidad humoral, o viceversa). Hay varias técnicas conocidas para los expertos en la técnica para medir la estimulación o la supresión de las respuestas inmunes, así como diferenciar las respuestas inmunes celulares de las respuestas inmunes humorales. Los modificadores de las respuestas biológicas convenientes incluyen citocinas, hormonas, derivados lipidíeos, fármacos de moléculas pequeñas, y otros moduladores del crecimiento, tales como, pero sin limitarse a, interleucina 2 (IL-2), interleucina 4 (IL-4), interleucina 10 (IL-10), interleucina 12 (IL-12), gamma interferón (IFN-gamma), factor de crecimiento parecido a insulina I (IGF-I), factor de crecimiento de transformación beta (TGF-ß) esteroides, prostaglandinas y leucotrienos. Otros modificadores de respuesta biológica convenientes incluyen, pero no se limitan a, anticuerpo anti-CTLA-4 (por ejemplo, para liberar células T anérgicas); co-estimuladores de células T (por ejemplo, anti-CD 137, anti-CD28, anti-CD40); alemtuzumab (por ejemplo, CamPath®), denileucin diftitox (por ejemplo, ONTAK®), anti-CD4, anti-CD25, anti-PD-1, anti-PD-LI, anti-PD-L2 o agentes que bloquean FOXP3 (por ejemplo, para abrogar la actividad/aniquilar las células reguladoras T del CD4+/CD25+); ligando Flt3, imiquimod (AldaraTM), GM-CSF, sargramostim (Leukine®), receptor parecido a Toll, agonistas (TLR)-7 o agonistas TLR-9 (por ejemplo, agentes que aumentan el número, o aumentan el estado de activación, de las células dendríticas, macrófagos y otras células que presentan antígeno profesionales). Estos modificadores de la respuesta biológica son muy conocidos en la técnica y están públicamente disponibles. Vacunas o Composiciones Basadas en Levaduras. Un aspecto de la invención se relaciona con una composición o vacuna basada en levadura que comprende: (a) un vehículo de levadura; y (b) un antígeno que comprende al menos una de las proteínas o péptidos Ras mutados descritos en la presente (por ejemplo, la proteína Ras que tiene una mutación en la posición 76, o una proteína o combinación de proteínas que incluyen la mutación E76 y otra mutación Ras, tal como una mutación G 12), o múltiples epítopes o antígenos o una proteína de fusión descritos en la presente, expresados por el vehículo de levadura. Como se comentó anteriormente, además de la mutación E76, mutaciones o más de cualquiera de las posiciones 73, 74, 75, 77 o 78, o cualquiera de las combinaciones de las mutaciones de Ras descritas anteriormente y en particular, cualquier combinación de una mutación en la posición 12 y/o 13 con una mutación en la posición 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77, y/o 78, están abarcadas por la invención. De acuerdo con la presente invención, un vehículo de levadura es cualquier célula de levadura (por ejemplo, una célula entera o intacta) o un derivado de la misma (véase más adelante) que se puede usar junto con un antígeno en una vacuna o composición terapéutica de la invención, o como un adyuvante. El vehículo de levadura, puede incluir, pero no se limita a, un microorganismo de levadura intacto vivo (es decir, una célula de levadura que tenga todos sus componentes incluyendo una pared celular), un microorganismo de levadura intacto aniquilado (muerto), o derivados de los mismos que incluyen: un esferoplasto de levadura (es decir, una célula de levadura que carece de pared celular), un citoplasto de levadura (es decir, una célula de levadura que carece de una pared celular y de núcleo), un espectro de levadura (es decir, una célula de levadura que carece de pared celular, núcleo y citoplasma), una preparación de pared de célula de levadura, o un extracto de membrana de levadura subcelular o fracción de la misma (también conocida como partícula de membrana de levadura, y previamente como una partícula de levadura subcelular). Los esferoplastos de levadura típicamente se producen mediante la digestión enzimática de la pared celular de la levadura. Un método así se describe, por ejemplo, en Franzusoff y colaboradores, 1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674., incorporado en la presente mediante referencia por entero. Los citoplastos de levadura típicamente son producidos por la enucleación de las células de levadura. Este método se describe, por ejemplo, en Coon, 1978, Nati. Cáncer Inst. Monogr. 48, 45-55 incorporado en la presente mediante referencia por entero. Los espectros de levadura típicamente son producidos resellando una célula permeabilizada o lisada y pueden, pero no necesariamente, contener al menos unos de los organelos de esa célula. Este método se describe, por ejemplo, en Franzusoff y colaboradores, 1983, J. Biol. Chem. 258, 3608-3614 y Bussey y colaboradores, 1979, Biochim. Biophys. Acta 553, 185-196, cada una de las cuales se incorpora en la presente mediante referencia por entero. Una partícula de membrana de levadura (extracto de membrana de levadura subcelular o fracción de la misma) se refiere a una membrana de levadura que carece de un núcleo natural o citoplasma. La partícula puede ser de cualquier tamaño incluyendo tamaños que varían desde el tamaño de una membrana de levadura natural hasta micropartículas producidas por sonificación u otros métodos de destrucción de la membrana conocidos por los expertos en la técnica, seguido por resellado. Un método para producir extractos de membrana de levadura subcelular se describe, por ejemplo, en Franzusoff y colaboradores, 1991, Meth. Enzymol. 194, 662-674. Uno puede también usar fracciones de partículas de membrana de levadura que contienen porciones de membrana de levadura y, cuando el antígeno fue expresado recombinantemente por la levadura antes de la preparación de las partículas de la membrana de levadura, el antígeno de interés. Los antígenos se pueden llevar dentro de la membrana, en cualquier superficie de la membrana, o combinaciones de las mismas (es decir, el antígeno puede estar tanto dentro como fuera de la membrana y/o extender la membrana de la partícula de la membrana de levadura). En una modalidad, una partícula de membrana de levadura es una partícula de membrana de levadura recombinante que puede estar intacta, rota, o rota y resellada que incluye al menos un antígeno deseado sobre la superficie de la membrana o al menos parcialmente empotrado dentro de la membrana. Un ejemplo de preparación de pared celular de levadura es el de las paredes de células de levadura aisladas que llevan un antígeno sobre su superficie o al menos parcialmente empotrado dentro de la pared de la célula de manera que la preparación de la pared de la célula de levadura, cuando se administra a un animal, estimula una respuesta inmune deseada (por ejemplo, protectora) contra el agente infeccioso. Una cepa de levadura se puede usar para producir un vehículo de levadura de la presente invención. Las levaduras son microorganismos unicelulares que pertenecen a una de tres clases: Ascomycetes, Basidiomycetes y Fungí Imperfecti. Una consideración importante para la selección de un tipo de levadura para su uso como un modulador inmune es la patogenicidad de la levadura. En una modalidad, la levadura es una cepa no patógena tal como Saccháromyces cerevisiae. La selección de una cepa de levaduras no patógenas se hace para minimizar cualquier efecto adverso al individuo al cual se administra el vehículo de levadura. Sin embargo, la levadura patógena se puede usar si la patogenicidad de la levadura puede ser negada por cualquier medio conocido para los expertos en la técnica (por ejemplo, cepas mutantes). Aunque se han usado en el pasado cepas de levadura patógenas o mutantes no patógenas de las mismas, como adyuvantes o como modificadores de la respuesta biológica, y se puedan usar de acuerdo con la presente invención, se prefieren las cepas de levadura no patógenas.

Los géneros preferidos de cepas de levadura incluyen Saccharomyces, Candida (que pueden ser patógenas), siendo Cryptococcus, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Schizosaccharomyces y Yarrowia, con Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia y Schizosaccharomyces más preferidas, y siendo Saccharomyces particularmente preferida. Especies preferidas de cepas de levadura incluyen Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Candida albicans, Candida kefyr, Candida tropicalis, Cryptococcus laurentii, Cryptococcus neoformans, Hansenula anómala, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Pichia pastoris, Rhodotorula rubra, Schizosaccharomyces pombe, y Yarrowia lipolytica. Se apreciará que varias de estas especies incluyen una variedad de subespecies, tipos, subtipos, etcétera, que se pretende que se incluyan dentro de las especies antes mencionadas. Más preferidas especies de levadura incluyen S. cerevisiae, C. albicans, H. polymorpha, P. pastoris y S. pombe. S. cerevisiae es particularmente preferida debido a que es relativamente fácil de manipular y siendo "Reconocida Generalmente Como Segura" o "GRAS" para su uso como aditivo de alimentos (GRAS, FDA Regla propuesta 62FR18938, 17 de abril de 1997). Una modalidad de la presente invención es una cepa de levadura que es capaz de replicar plásmidos a un número de copias particularmente alto, tal como una cepa S. cerevisiae cir°. La cepa de S. cerevisiae es una cepa que es capaz de soportar los vectores de expresión que permiten uno o más antígenos objetivos y/o proteínas de fusión de antígeno para ser expresados a altos niveles. Además cualquier cepa de levadura muíante se puede usar en la presente invención, incluyendo las que exhiben modificaciones post-traducción reducidas de antígenos objetivos expresados, tales como mutaciones en las enzimas que extienden la glicosilación enlazada N. En una modalidad, un vehículo de levadura preferido de la presente invención es capaz de fusionarse con el tipo de célula a la cual el vehículo de levadura y el antígeno están siendo administrados, tal como una célula dendrítica o macrófago, mediante lo cual se efectúa la administración particularmente eficiente del vehículo de levadura, y en muchas modalidades, el antígeno, al tipo de célula. Como se usa en la presente, la fusión de un vehículo de levadura con un tipo de célula objetivo se refiere a la capacidad de la membrana de la célula de levadura, o partícula de la misma, de fusionarse con la membrana del tipo de célula objetivo (por ejemplo, célula dendrítica o macrófago), conduciendo a la formación de syncyitia. Como se usa en la presente, un syncytium es una masa multinucleada de protoplasma producida por la combinación de células. Varias proteínas de superficie virales (incluyendo aquellas de los virus de inmunodeficiencia tales como VIH, el virus de influenza, poliovirus y adenovirus) y otros fusógenos (tales como los involucrados en fusiones entre los huevos y el esperma) se ha demostrado que son capaces de mostrar fusión entre dos membranas (es decir, entre membranas de las células de mamífero y virales o entre membranas de células de mamíferos). Por ejemplo, un vehículo de levadura que produce un antígeno heterólogo VIH gpl20/gp41 sobre su superficie es capaz de fusionarse con un linfocito T CD4+. Se hace notar, sin embargo, que la incorporación de una fracción objetivo al vehículo de levadura, aunque es deseable bajo ciertas circunstancias, no es necesaria. Previamente se ha mostrado que los vehículos de levadura de la presente invención son fácilmente recogidos por las células dendríticas (así como otras células, tales como los macrófagos). De acuerdo con la presente invención, el término "complejo vehículo de levadura-antígeno" o "complejo levadura-antígeno" se usa genéricamente para describir cualquier asociación de un vehículo de levadura con un antígeno. Esta asociación incluye la expresión del antígeno por la levadura (una levadura recombinante), la introducción de un antígeno en una levadura, la unión física del antígeno a la levadura, y la mezcla de la levadura y el antígeno entre si, tales como en un regulador u otra solución o formulación. Estos tipos de complejos se describen en detalle más adelante. En una modalidad, una célula de levadura usada para preparar el vehículo de levadura se transfecta con una molécula de ácido nucleico heteróloga que codifica el antígeno de manera que el antígeno es expresado por la célula de levadura. Esta levadura frecuentemente se le conoce en la presente como una levadura recombinante o un vehículo de levadura recombinante. La célula de levadura se puede también cargar en células dendríticas como una célula intacta, o la célula de levadura puede ser aniquilada, o se puede derivar tal como mediante la formación de esferoplastos de levadura, citoplastos, espectros, o partículas subcelulares, cualquiera de las cuales es seguida por la carga del derivado en la célula dendrítica. Los esferoplastos de levadura también se pueden transfectar directamente con una molécula de ácido nucleico recombinante (por ejemplo, el esferoplasto se produce a partir de la levadura entera, y luego se transfecta) con el fin de producir el esferoplasto recombinante que expresa un antígeno. En un aspecto, una célula de levadura o esferoplasto de levadura usado para preparar el vehículo de levadura se transfecta con una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica el o los antígenos de manera que el antígeno se expresa recombinantemente por la célula de levadura o el esferoplasto de levadura. En este aspecto, la célula de levadura o el esferoplasto de levadura que expresa recombinantemente el o los antígenos se usa para producir un vehículo de levadura que comprende un citoplasto de levadura, un espectro de levadura, o una partícula de membrana de levadura o partícula de la pared celular de la levadura, o fracción de las mismas. En general, el vehículo de levadura y el o los antígenos se pueden asociar mediante cualquier técnica descrita en la presente. En un aspecto, el vehículo de levadura fue cargado intracelularmente con el o los antígenos. En otro aspecto, el o los antígenos se unieron covalentemente o no covalentemente al vehículo de levadura. En todavía otro aspecto, el vehículo de levadura y el o los antígenos se asociaron por mezclado. En otro aspecto, y en la modalidad preferida, el o los antígenos se expresaron recombinantemente por el vehículo de levadura o por la célula de levadura o el esferoplasto de levadura a partir del cual se derivó el vehículo de levadura. La expresión de un antígeno en un vehículo de levadura de la presente invención se lleva a cabo utilizando técnicas conocidas para los expertos en el campo. En resumen, una molécula de ácido nucleico que codifica al menos un antígeno deseado se inserta en un vector de expresión de manera que la molécula de ácido nucleico se enlaza operativamente a una secuencia de control de la transcripción con el fin de ser capaz de efectuar ya sea la expresión constitutiva o regulada de la molécula de ácido nucleico cuando se transforma en una célula de levadura huésped. Las moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más antígenos pueden estar en uno o más vectores de expresión operativamente enlazados a una o más secuencias de control de expresión. Las secuencias de control de expresión particularmente importantes son aquellas que controlan el inicio de la transcripción, tales como las secuencias de activación corriente arriba y de promotor. Cualquier promotor de levadura conveniente se puede usar en la presente invención y una variedad de estos promotores son conocidos para los expertos en la técnica. Los promotores preferidos para la expresión en Saccharomyces cerevisiae incluyen, pero no se limitan a, promotores de genes que codifican las siguientes proteínas de levadura: deshidrogenasa de alcohol I (ADHI) o II (ADH2), CUPI, cinasa de fosfoglicerato (PGK), isomerasa de triosa fosfato (TPI), factor de alargamiento de la traducción EF-I alpha (TEF2), deshidrogenase de gliceraldehído-3 -fosfato (GAPDH; también conocido como TDH3, por deshidrogenasa de triosa fosfato), galactocinasa (GAL1), uridil-transferasa de galactosa-1 -fosfato (GAL7), epimerasa UDP -galactosa (GAL10), citocroma C1 (CYC1), proteína Sec7 (SEC7) y fosfatasa ácida (PH05), con promotores híbridos tales como ADH2/GAPDH siendo los promotores CYC1/GAL10 los más preferidos, y el promotor ADH2/GAPDH, el cual se induce cuando las concentraciones de glucosa en la célula son bajas (por ejemplo, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.2 por ciento), así como el promotor CUP1 y el promotor TEF2, que son todavía más preferidos. Igualmente, se conocen varias secuencias de activación corriente arriba es decir, (UASs), también conocidas como mejoradoras. Las secuencias de activación corriente arriba preferidas para la expresión en Saccharomyces cerevisiae incluyen, pero no se limita a, las UAS de los genes que codifican las siguientes proteínas: PCK1, TP1, TDH3, CYC1, ADH1, ADH2, SUC2, GAL1, GAL7 y GAL10, así como las otras UASs activadas por el producto del gen GAL4, siendo particularmente preferidas las UAS ADH2. Ya que la UAS ADH2 se activan mediante el producto del gen ADR1, es preferible sobreexpresar el gen ADR1 cuando un gen heterologo está enlazado operativamente a la UAS ADH2. Las secuencias de terminación de transcripción preferidas para la expresión en Saccharomyces cerevisiae incluyen las secuencias de terminación del a-factor, GAPDH, y los genes CYC1. Las secuencias de control de la transcripción preferidas para expresar genes en la levadura metiltrófica incluyen las regiones de control de la transcripción de los genes que codifican oxidasa de alcohol y deshidrogenase de formato. Las preocupaciones de optimización y los métodos para la expresión extracelular de los antígenos por levaduras se han comentado en detalle previamente en la presente. La transfección de una molécula de ácido nucleico a una célula de levadura de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo mediante cualquier método por el cual una molécula de ácido nucleico administrada en la célula, e incluye, pero no se limita a, difusión, transporte activo, sonificación de baño, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, y fusión de protoplastos. Las moléculas de ácido nucleico transfectadas se pueden integrar en un cromosoma de levadura o mantener sobre vectores extracromosomales usando técnicas conocidas para los expertos en el campo. Ejemplos de los vehículos de levadura que llevan moléculas de ácido nucleico se describen en detalle en la presente. Como se comentó anteriormente, el citoplasto de levadura, el espectro de levadura, y las partículas de membrana de levadura o preparaciones de la pared celular también se pueden producir recombinantemente transfectando microorganismos de levaduras intactas o esferoplastos de levadura con las moléculas de ácido nucleico deseadas, produciendo el antígeno en las mismas, y luego manipulando adicionalmente los microorganismos o esferoplastos utilizando técnicas conocidas para los expertos en el campo para producir citoplastos, espectros o extractos de membrana de levaduras subcelulares o fracciones de las mismas que contienen los antígenos deseados. Las condiciones efectivas para la producción de vehículos de levadura recombinantes y la expresión del antígeno por el vehículo de levadura incluyen un medio efectivo en el cual se puede cultivar una cepa de levadura. Un medio efectivo es típicamente un medio acuoso que comprende carbohidrato asimilable, nitrógeno y fuentes de fosfato, así como sales, minerales, metales, y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas y factores de crecimiento. El medio puede comprender nutrientes complejos o puede ser un medio mínimo definido. Las cepas de levadura de la presente invención se pueden cultivar en una variedad de recipientes, incluyendo, pero sin limitarse a, biorreactores, matraces de Erlenmeyer, tubos de ensayo, platos de microtitulación, y cajas de petri. El cultivo se lleva a cabo a la temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para la cepa de levadura. Estas condiciones de cultivo están bien dentro de la experiencia de algún experto en la técnica (Véase, por ejemplo, Guthrie y colaboradores, (eds.), 1991, Methods in Enzymology, vol. 194, Academic Press, San Diego). En algunos aspectos de la invención, y particularmente cuando se desea tener suficiente expresión de superficie o se desea una provisión de un antígeno en donde se desean las modalidades de inducción de una respuesta inmune humoral, la levadura se cultiva en un medio mantenido a un pH neutro. Como se usa en la presente, el uso general del término "pH neutro" se refiere a un término de variación de pH de entre aproximadamente pH 5.5 y aproximadamente pH 8, preferiblemente entre aproximadamente pH 6 y aproximadamente pH 8. Una persona con experiencia en la técnica apreciará que fluctuaciones menores (por ejemplo, décimas o centésimas) pueden ocurrir cuando se mide con un medidor de pH. Como tal, el uso de un pH neutro para cultivar células de levadura significa que las células de levadura se cultivan en pH neutro durante la mayoría del tiempo que están en cultivo. De preferencia, las levaduras se cultivan en un medio mantenido a un nivel de pH al menos de 5.5, digamos que el pH del medio de cultivo no se le permite bajar mas del pH 5.5. El uso de un pH neutro para cultivar levaduras promueve varios efectos biológicos con características deseables para usar las levaduras como vehículos para la inmunomodulación. En una modalidad de la presente invención, como una alternativa a la expresión de un antígeno recombinantemente en el vehículo de levadura, un vehículo de levadura se carga intracelularmente con un antígeno de proteína o péptido, o con carbohidratos u otras moléculas que sirven como un antígeno. Posteriormente, el vehículo de levadura, que ahora contiene el antígeno intracelularmente, se puede administrar a un paciente o cargar en un portador como una célula dendrítica (descrita más adelante). Como se usa en la presente, un péptido comprende una secuencia de aminoácidos de menos de o igual a aproximadamente 30-50 aminoácidos, mientras que una proteína comprende una secuencia de aminoácidos de más de aproximadamente 30-50 aminoácidos; las proteínas pueden ser multiméricas. Una proteína o péptido útil como un antígeno puede ser tan pequeña como un epítope de célula T (es decir, mayor que 5 aminoácidos de longitud) y cualquier tamaño mayor que ese que comprende múltiples epítopes, fragmentos de proteína, proteínas de longitud completa, proteínas quiméricas, o proteínas de fusión. Los péptidos y las proteínas se pueden derivar ya sea naturalmente o sintéticamente; esas modificaciones pueden incluir, pero no se limitan a glicosilación, fosforilación, acetilación, miristilación, prenilación, palmitoilación, amidación y/o adición de glicerofosfatidil inositol. Los péptidos y proteínas se pueden insertar directamente en vehículos de levadura de la presente invención mediante técnicas conocidas para expertos en el campo, tales como difusión, transporte activo, fusión de liposomas, electroporación, fagocitosis, ciclos de congelamiento descongelamiento y sonificación en baño. Los vehículos de levadura que se pueden cargar directamente con péptidos, proteínas, carbohidratos u otras moléculas incluyen levaduras intactas, así como esferoplastos, espectros, o citoplastos, que se pueden cargar con antígenos después de la producción, pero antes de cargarlos en células dendríticas. Alternativamente, la levadura intacta se puede cargar con el antígeno y luego se pueden preparar esferoplastos, espectros, citoplastos, o partículas subcelulares a partir de éstos. Cualquier cantidad de antigüenos se pueden cargar en un vehículo de levadura en esta modalidad, a partir de al menos 1, 2, 3, 4 o cualquier número entero hasta cientos o miles de antígenos, tales como se proporcionaría mediante la carga de un microorganismo, mediante la carga de una célula de tumor de un mamífero, o porciones de las mismas, por ejemplo. En otra modalidad de la presente invención, un antígeno está físicamente unido al vehículo de levadura. La unión física del antígeno a la levadura se puede llevar a cabo por cualquier método conveniente en la técnica, incluyendo métodos de asociación covalentes y no covalentes que incluyen, pero no se limitan a, reticular químicamente el antígeno a la superficie externa del vehículo de levadura o enlazar biológicamente el antígeno a la superficie externa del vehículo de levadura, tal como usando un anticuerpo u otro compañero de enlace. La reticulación química se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante métodos que incluyen enlace por glutaraldehído, etiquetamiento de fotoafinidad, tratamiento con carbodimi-imidas, tratamiento con productos químicos capaces de enlazar enlaces di-sulfuro, y tratamiento con otros productos químicos reticuladores regulares en la técnica. Alternativamente, un producto químico se puede poner en contacto con el vehículo de levadura que altera la carga de la bicapa lípida de la membrana de levadura o la composición de la pared celular de manera que la superficie externa de la levadura es más probable que se fusione o enlace con los antígenos que tienen características de carga particulares. Los agentes objetivos tales como los anticuerpos, los péptidos de enlace, receptores solubles y otros ligandos también se pueden incorporar en un antígeno como una proteína de fusión o asociar de otro modo con un antígeno para enlazar el antígeno con el vehículo de levadura. En todavía otra modalidad, el vehículo de levadura y el antígeno se asocian uno con otro mediante un mecanismo de enlace más pasivo, no específico o no covalente, tal como mediante mezclar suavemente el vehículo de levadura y el antígeno entre sí en un regulador o en otra formulación conveniente (por ejemplo, por mezcla). En una modalidad de la invención, el vehículo de levadura y el antígeno se cargan intracelularmente ambos en un portador tal como una célula dendrítica o macrófago para formar la composición terapéutica o vacuna de la presente invención. De manera alternativa, un antígeno de la invención (es decir, una proteína de fusión Ras de la invención) se puede cargar en una célula dendrítica en ausencia del vehículo de levadura. Más adelante se comentan en detalle varias formas en las cuales se puede llevar a cabo la carga de varios componentes. Como se usa en la presente, el término "cargado" y derivados del mismo se refieren a la inserción, introducción o entrada de un componente (por ejemplo, el vehículo de levadura y/o el antígeno) en una célula (por ejemplo, una célula dendrítica). Cargar un componente ¡ntracelularmente se refiere a la inserción o introducción de un componente a un compartimiento intracelular de la célula (por ejemplo, a través de la membrana del plasma y en un mínimo en el citoplasma, un fagosoma, un lisosoma, y algún espacio intracelular de la célula). Cargar un componente a una célula hace referencia a cualquier técnica mediante la cual el componente se fuerza a entrar en la célula (por ejemplo, mediante electroporación) o se coloca en un medio ambiente (por ejemplo, en contacto con o cerca de una célula) en donde el componente probablemente sustancialmente entra en las células por algún proceso (por ejemplo, fagocitosis). Las técnicas de carga incluyen, pero no se limitan a: difusión, transporte activo, fusión de liposoma, electroporación, fagocitosis, y sonificación de baño. En una modalidad preferida, se usan mecanismos pasivos para cargar una célula dendrítica con el vehículo de levadura y/o el antígeno, estos mecanismos pasivos incluyen fagocitosis del vehículo de levadura y/o el antígeno mediante una célula dendrítica. En una modalidad, levadura intacta (con o sin expresión de antígenos heterologos) se puede moler o procesar de una manera para producir preparaciones de pared celular de levadura, partículas de membranas de levadura o fragmentos de levadura (es decir, no intacta) y los fragmentos de levadura pueden, en algunas modalidades, ser proporcionados con o administrados con otras composiciones que incluyen antígenos (por ejemplo, vacunas de ADN, vacunas de subunidades de proteína, patógenos aniquilados o inactivados) para aumentar la respuesta inmune. Por ejemplo, se puede usar tratamiento enzimático, tratamiento químico o fuerza física (por ejemplo, corte mecánico o sonificación) para romper la levadura en las partes que se usan como un adyuvante. Métodos Terapéuticos de la Invención Una modalidad de la invención, se relaciona con el uso de cualquiera de los agentes descritos en la presente relacionados con el Ras mutado de la invención (por ejemplo, un Ras que tiene al menos una mutación en el codón 76, o la combinación de la mutación del codón 76 con otra mutación Ras tal como una mutación en el codón 12) en la preparación de un medicamento o composición o vacuna para proteger a un animal contra el cáncer. Como se comentó anteriormente, además de la mutación E76, mutaciones en cualquiera o más posiciones de la 73, 74, 75, 77 o 78, o cualquiera de las combinaciones de las mutaciones de Ras descritas anteriormente y en particular, cualquier combinación de la mutación en la posición 12 y/o 13 con una mutación en la posición 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77, y/o 78, están abarcadas por la invención. Otras modalidades de la invención se relacionan con un método de proteger a un animal contra un cáncer, que comprende administrar al animal que tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer, una vacuna o composición terapéutica descrita en la presente para reducir o prevenir al menos un síntoma de cáncer en el animal. En un aspecto, la vacuna o composiciones comprenden cualquiera de las vacunas o composiciones descritas anteriormente que contienen al menos el antígeno que comprende al menos una proteína Ras o péptido mutado que comprende la mutación en la posición 76 o un antígeno o antígenos que incluyen una combinación de la mutación en la posición 76 con otra mutación Ras, tal como una mutación en la posición 12, y más preferiblemente, que comprenden los distintos péptidos, proteínas, construcciones quiméricas y/o proteínas de función descritas anteriormente. Otras mutaciones de Ras y otras composiciones terapéuticas útiles en este método de la invención incluyen una composición que comprende un compuesto o agente que se dirige a las proteínas Ras mutadas identificadas por los inventores e inhibe la expresión de esas proteínas por tumores, o inicia o regula descendentemente la hidrólisis GTP de las proteínas Ras para sobrepasar o compensar el efecto de las proteínas Ras mutadas sobre la hidrólisis de GTP. Esos compuestos o agentes pueden incluir, pero no se limitan a, varios ácidos nucleicos inhibidores tales como ribozimas, ARNi, o aptámeros, y/o varios compuestos de péptidos y moléculas pequeñas o sintéticas (por ejemplo, productos de descubrimiento de fármacos usando el Ras mutado descubierto por los inventores) tales como antagonistas conformacionales o activadores de la hidrólisis de GTP. Estos compuestos o agentes y métodos para identificar los mismos se comentan en cualquier parte en la presente. En un aspecto de la invención, los productos Ras mutados de longitud completa (por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico y las proteínas) no se administran a un individuo en conexión con métodos terapéuticos y usos de la invención; en vez de esto, se seleccionan péptidos y fragmentos de esos productos Ras, u otras herramientas asociadas con esos productos Ras (por ejemplo, aptámeros, ARNi, etcétera). En el contexto de la composición para la provocación de una respuesta inmune, particularmente en el contexto de la expresión por un vehículo de levadura de la invención, se puede usar el Ras de longitud completa, aunque se prefieren porciones inmunogénicas y proteínas de fusión de dominios múltiples. La vacuna o composición también comprende un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y en una modalidad (por ejemplo, en donde la composición es una vacuna), incluye el vehículo de levadura descrito en la presente. En un aspecto, las proteínas de fusión incluidas en la vacuna comprenden al menos dos o más antígenos de cáncer. En otro aspecto, esta proteína de fusión comprende al menos uno o más dominios inmunogénicos de uno o más antígenos de cáncer. En otro aspecto, el antígeno de cáncer es un antígeno asociado con un cáncer que incluye, pero no se limita a, melanomas, carcinoma de célula escamosa, cánceres de mama, carcinomas de cabeza y cuello, carcinomas de tiroides, sarcomas de tejido blando, sarcomas de hueso, cánceres testiculares, cánceres prostáticos, cánceres pancreáticos, cánceres ováricos, cánceres de vejiga, cánceres de piel, cánceres de cerebro, angiosarcomas, hemangiosarcomas, tumores de mastocitos, cánceres hepáticos primarios, cánceres de pulmón (incluyendo carcinomas pulmonares no microcelulares), cánceres pancreáticos, cánceres gastrointestinales (incluyendo cánceres colorrectales), carcinomas de células renales, neoplasias hematopoyéticas y cánceres metastásicos de los mismos. En todos los aspectos, al menos un antígeno que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un péptido de Ras que comprende la mutación en la posición 76, una combinación de mutaciones en la posición 76 con al menos una mutación adicional Ras tal como una mutación en la posición 12, una Ras que comprende una mutación en la posición 73, 74, 75, 77 o 78, una Ras que comprende cualquiera de las combinaciones de mutaciones descritas en la presente, o un agente de ácido nucleico u otro agente que hace el uso de estas mutaciones, como se describe anteriormente, se incluye en la vacuna o la composición. La presente invención incluye la administración de una composición o vacuna de la invención a un animal. El proceso de administración se puede realizar ex vivo o in vivo. La administración ex vivo se refiere a realizar parte del paso regulador fuera del paciente, tal como administrar una composición de la presente invención a una población de células (células dendríticas) removidas de un paciente bajo tales condiciones que el vehículo de levadura y el antígeno se cargan en una célula, y se devuelven las células al paciente. La composición terapéutica de la presente invención se puede devolver al paciente, o administrar a un paciente, mediante cualquier modo conveniente de administración. La administración de una vacuna o composición puede ser sistémica, mucosal y/o proximal al lugar del sitio objetivo (por ejemplo, cerca de un tumor). Las vías preferidas de administración serán aparentes para los expertos en la técnica, dependiendo del tipo de condición que se va a prevenir o tratar, el antígeno usado, y/o la población de célula objetivo o tejido. Los métodos preferidos de administración incluyen, pero no se limitan a, administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración intramuscular, administración intranodal, administración intracoronaria, administración intra-arterial (por ejemplo, en la arteria carótida), administración subcutánea, administración transdérmica, administración intrataqueal, administración subcutánea, administración intra-articular, administración intraventricular, inhalación (por ejemplo, aerosol), intracraneal, intraespinal, intraocular, aural, intranasal, oral, administración pulmonar, impregnación de un catéter, y la inyección directa en un tejido. Las vías de administración particularmente preferidas incluyen: intravenosa, intraperitoneal, subcutáneal, intradérmica, intranodal, intramuscular, transdérmica, inhalado, intranasal, oral, intraocular, intra-articular, intracraneal, e intraespinal. La administración parenteral puede incluir intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrapleural, intrapulmonar, intravenosa, subcutánea, catéter atrial y vías de catéter venal. La administración aural puede incluir gotas para los oídos, la administración intranasal puede incluir gotas para la nariz o inyección intranasal, y la administración intraocular puede incluir gotas para los ojos. La administración en aerosol (inhalación) también se puede realizar usando métodos estándares en la técnica (véase, por ejemplo, Stribling y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 189:11277-11281, 1992, la cual se incorpora en la presente mediante referencia por entero). Por ejemplo, en una modalidad, una composición o vacuna de la invención se puede formular en una composición conveniente para administración nebulizada usando un dispositivo de inhalación conveniente o nebulizador. La administración oral puede incluir sólidos y líquidos que puedan ser tomados a través de la boca, y es útil en el desarrollo de la inmunidad mucosal y ya que las composiciones que comprenden vehículos de levadura se pueden preparar fácilmente para la administración oral, por ejemplo, como tabletas o cápsulas, así como ser formuladas en productos de alimentos o bebidas. Otras vías de administración que modulan la inmunidad mucosal son útiles en el tratamiento de infecciones virales. Estas vías incluyen bronquial, intradérmica, intramuscular, intranasal, otras vías inhalatorias, rectales, subcutáneas, tópicas, transdérmicas, vaginales y uretrales. De acuerdo con la presente invención, un protocolo de administración efectivo (es decir, administrar una vacuna o composición terapéutica de una manera efectiva) comprende parámetros de dosis convenientes y modos de administración que dan como resultado la provocación de una respuesta inmune en un animal que tiene una enfermedad o condición o que está en riesgo de contraer una enfermedad o condición, en el caso de la administración de una vacuna (terapéutica o profiláctica), preferiblemente de manera que el animal se protege de la enfermedad. Cuando la composición comprende un compuesto o agente diferente como se describe en la presente, un protocolo de administración efectivo comprende parámetros de dosis convenientes y modos de administración que dan como resultado el alivio o el mejoramiento detectable en al menos un síntoma o indicador de la enfermedad o condición en el paciente, tal como una reducción en el tamaño o los niveles del tumor, o la prevención de la enfermedad cuando el paciente está en riesgo de contraer la enfermedad o condición. Los parámetros de dosis efectivas se pueden determinar utilizando métodos estándares en la técnica para una enfermedad particular. Estos métodos incluyen, por ejemplo la determinación de tasas de supervivencia, efectos secundarios (es decir, toxicidad) y el avance o la regresión de la enfermedad. De acuerdo con la presente invención, un tamaño de sola dosis conveniente es una dosis que es capaz de provocar una respuesta inmune al antígeno ó provocar un mejoramiento en al menos un síntoma o indicador de la enfermedad, en un animal cuando se administra una o más veces durante un periodo de tiempo conveniente. Las dosis pueden variar dependiendo de la enfermedad o condición que se está tratando. Por ejemplo, en una modalidad, cuando un antígeno se administra con un vehículo de levadura, una sola dosis de un vehículo de levadura de la presente invención es de aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 5 x 107 equivalentes de células de levadura por kilogramo de peso corporal del organismo al que se le está administrando la composición. En una modalidad preferida, las células de levadura por dosis no se ajustan por el peso del organismo. En esta modalidad, una sola dosis de un vehículo de levadura de la presente invención es de aproximadamente 1 x 104 a aproximadamente 1 x 109 de células de levadura por dosis. Más preferiblemente, una sola dosis de un vehículo de levadura de la presente invención es de aproximadamente 0.1 Y.U. (1 x 106 células) a aproximadamente 100 Y.U. (1 x 109 células) por dosis (es decir, por organismo), incluyendo cualquier dosis entre éstas, en incrementos de 0.1 x 106 células (es decir, 1.1 x 106, 1.2 x 106, 1.3 x 106...). Este intervalo de variación de dosis se puede usar efectivamente en cualquier organismo de cualquier tamaño, incluyendo ratones, changos, humanos, etcétera. Cuando la vacuna se administra cargando el vehículo de levadura y el antígeno en células dendríticas, una sola dosis preferida de la vacuna de la presente invención es de aproximadamente 0.5 x 106 hasta aproximadamente 40 x 106 células dendríticas por individuo por administración. De preferencia, una sola dosis es de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 20 x 106 células dendríticas por individuo, y más preferiblemente de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 10 x 106 células dendríticas por individuo. Una dosis única preferida de una vacuna de ácido nucleico varía desde aproximadamente 1 nanogramo (ng) a aproximadamente 100 (pg), dependiendo de la vía de administración y/o el método de administración como lo pueden determinar los expertos en la técnica. Los métodos de administración convenientes incluyen, por ejemplo, por inyección, como gotas, como aerosol y/o tópicamente. En una modalidad, las construcciones de ADN puras cubren la superficie de partículas de oro (1 a 3 µ?? de diámetro) y se impulsan dentro de las células de la piel o el músculo con un "cañón de genes." Una dosis única apropiada de complejo de ácido nucleico:liposoma es de aproximadamente 0.1 µg a aproximadamente 100 µg por kilogramo de peso corporal del paciente al cual se va a administrar el complejo. En otra modalidad, una dosis única apropiada es de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 10 pg por kilogramo de peso corporal. En otra modalidad, una sola dosis apropiada de complejo de ácido nucleico:lípido es de al menos aproximadamente 0.1 pg de ácido nucleico, más preferiblemente de al menos aproximadamente 1 pg de ácido nucleico, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 10 pg de ácido nucleico, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 50 pg de ácido nucleico, y todavía más preferiblemente al menos aproximadamente 100 pg de ácido nucleico. Cuando la composición comprende una proteína, una molécula pequeña (es decir, los productos del diseño del fármaco) o anticuerpo, una dosis única preferida de este compuesto típicamente comprende entre aproximadamente 0.01 microgramo x kilogramo"1 y aproximadamente 10 miligramos x kilogramo"1 de peso corporal de un animal. Una dosis única más preferida de un agente así comprende entre aproximadamente 1 microgramo x kilogramo'1 y aproximadamente 10 miligramos x kilogramo"1 de peso corporal de un animal. Una sola dosis aún más preferida de un agente comprende entre aproximadamente 5 microgramos x kilogramo"1 y aproximadamente 7 miligramos x kilogramo"1 de peso corporal de un animal. Una dosis única todavía más preferida de un agente comprende entre aproximadamente 10 microgramos x kilogramo"1 y aproximadamente 5 miligramos x kilogramo'1 de peso corporal de un animal. Otra dosis única particularmente preferida de un agente comprende entre aproximadamente 0.1 microgramo x kilogramo'1 y aproximadamente 10 microgramos x kilogramo'1 de peso corporal de un animal, si el agente se administra parenteralmente. Los "refuerzos" de la composición terapéutica, que es una vacuna, de preferencia se administran cuando la respuesta inmune que está actuando contra el antígeno ha menguado o se necesita proporcionar una respuesta inmune o inducir una respuesta de memoria contra un antígeno o antígenos particulares. Los refuerzos se pueden administrar desde aproximadamente 2 semanas a varios años después de la administración original. En una modalidad, el programa de administración es uno en el cual de aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 5 x 107 equivalentes de células de levaduras de una composición por kilogramo de peso corporal del organismo se administra desde aproximadamente una hasta cuatro veces en un periodo de tiempo de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 6 meses. La dosificación adicional de otras composiciones terapéuticas descritas en la presente la puede determinar el médico tratante basándose en la reevaluación del paciente después de la administración y la valoración del estado de la enfermedad o condición o los síntomas o indicadores de la misma.

En una modalidad de la invención, un paciente identificado como que tiene una mutación Ras como se describe en la presente se le administra, por separado o junto con otra terapia descrita en la presente, terapia de genes para administrar una Ras del tipo natural o "sano" (no mutado) al paciente. Los métodos para administrar una molécula de ácido nucleico en un protocolo de terapia de genes se conocen en la técnica. Los métodos y usos dirigidos a las composiciones terapéuticas y vacunas de la invención principalmente se pretenden para el uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad o condición. El término "proteger" genéricamente se puede usar para llevar la prevención y/o el tratamiento. Una composición terapéutica o vacuna de la presente invención, cuando se administra a un individuo, puede: prevenir que una enfermedad ocurra; curar la enfermedad; retrasar el brote de la enfermedad; y/o aliviar (reducir, retrasar, disminuir) los síntomas de la enfermedad, signos o causas (por ejemplo, reducir uno o más síntomas de la enfermedad; reducir la ocurrencia de la enfermedad; aumentar la supervivencia del individuo que tiene o desarrolla la enfermedad; y/o reducir la gravedad de la enfermedad). Como tal, la invención incluye tanto prevenir la ocurrencia de la enfermedad (tratamiento profiláctico o vacuna profiláctica) como tratar a un animal que tiene una enfermedad o que está experimentando síntomas de una enfermedad (tratamiento terapéutico o vacuna terapéutica). En una modalidad, los métodos de la invención son efectivos para provocar una respuesta inmune en el individuo induciendo una respuesta benéfica o protectora que puede, en algunos casos, adicionalmente suprimir (por ejemplo, reducir, inhibir o bloquear) una respuesta inmune superactiva o dañina. En otro aspecto, los métodos de la invención son efectivos para dar como resultado al menos un mejoramiento detectable o beneficio en al menos un síntoma o indicador de la enfermedad o condición, en la cual para el cáncer puede incluir, pero no se limita a, la reducción en el volumen del tumor, por ejemplo, reducción en el tamaño del tumor, reducción en los niveles del tumor, reducción en la tasa de crecimiento del tumor, y/o reducción en las metástasis y/o retraso del brote de la enfermedad, y/o aumento de la supervivencia del paciente. Métodos de Diagnóstico y Pronóstico de la Invención Otra modalidad de la invención se relaciona con el uso de proteínas Ras mutadas o las moléculas de ácido nucleico ras de la invención, y porciones de las mismas, como un biomarcador en' un ensayo de diagnóstico o pronóstico o kit para el cáncer. En una modalidad preferida, la invención se relaciona con la detección de ácidos nucleicos (genes o ARN) que codifican las proteínas Ras mutadas en un ensayo de diagnóstico o pronóstico para el cáncer. En una modalidad, el método incluye determinar la presencia y/o nivel del marcador mutante E76 (también llamado en la presente genéricamente como un biomarcador) en un ácido nucleico o muestra de proteína. La mutación E76 puede incluir cualquier mutación en E76 como se describe en la presente, y de preferencia incluye la mutación E76G, la mutación E76K, o la mutación E76Q, aunque se entenderá que otros tumores pueden tener diferentes mutaciones en esta posición de Ras en comparación con la proteína o gen del tipo natural. El biomarcador se puede detectar detectando la proteína Ras mutada, pero más preferiblemente se detecta detectando una molécula de ácido nucleico que codifica esa proteína Ras mutada (ARN o ADN). En otra modalidad, el método incluye detectar adicionalmente (concurrentemente, o secuencialmente) la presencia y/o el nivel de otro biomarcador mutante para Ras, que incluye las mutaciones previamente conocidas en las posiciones (codones) 12, 13, 59 o 61 de Ras. En una modalidad, el método incluye detectar la presencia y/o el nivel tanto de una mutación E76 como de una mutación G12 en una sola muestra de paciente (ácido nucleico o proteína). En otra modalidad, el método puede incluir determinar la presencia y/o el nivel de cualquiera de una o más posiciones 73, 74, 75, 77 o 78, o cualquier combinación de las mutaciones de Ras descritas anteriormente y en particular, cualquier combinación de una mutación en la posición 12 y/o 13 con una mutación en la posición 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77, y/o 78. Los aspectos más adelante se describirán con respecto a la mutación E76 por razones de simplicidad, pero se extenderán para abarcar cualquiera de estas mutaciones o combinaciones de las mismas. El primer paso de este método de la presente invención incluye detectar la presencia del gen ras mutado (que comprende la mutación resultante en la mutación de Ras E76) y/o la expresión o la actividad biológica de Ras E76 en una muestra de prueba de un paciente también llamada una muestra de paciente). Métodos convenientes para obtener una muestra del paciente son conocidas para una persona con experiencia en la técnica. Una muestra de paciente puede incluir cualquier fluido corporal o tejido de un paciente que puede contener células de tumor o proteínas de células de tumor. Más específicamente, de acuerdo con la presente invención, el término "muestra de prueba" o "muestra de paciente" se puede usar en general para referirse a una muestra de cualquier tipo que contiene células o productos que han sido secretadas de o que se contienen dentro de las células que van a ser evaluadas por el presente método, incluyendo, pero sin limitarse a, una muestra de células aisladas, una muestra de tejido, una muestra de fluido corporal, o, por ejemplo, una muestra de ácidos nucleicos obtenidos a partir de una muestra de célula aislada del paciente. De acuerdo con la presente invención, una muestra de células aisladas es una espécimen de células, típicamente en suspensión o separada del tejido conectivo el cual puede haber conectado las células dentro de un tejido en vivo, la cual ha sido recolectada de un órgano, tejido o fluido mediante cualquier método conveniente el cual da como resultado la recolección de un número conveniente de células para la evaluación por el método de la presente invención. Las células en la muestra de células no necesariamente son del mismo tipo, aunque se pueden usar métodos de purificación para enriquecer el tipo de células que se evalúan preferiblemente. Las células se pueden obtener, por ejemplo, mediante raspar un tejido, procesar una muestra de tejido para liberar células individuales o el aislamiento de un fluido corporal. Una muestra de tejido, aunque similar a la muestra de células aisladas, se define en la presente como una sección de un órgano o tejido del cuerpo que típicamente incluye varios tipos de células y/o estructura citoesquelética que mantiene a las células juntas. Una persona con experiencia en la técnica apreciará que el término "muestra de tejido" se puede usar, en algunos casos, intercambiablemente con "muestra de células", aunque de preferencia se usa para designar una estructura más compleja que una muestra de células. Una muestra de tejido se puede obtener mediante una biopsia, por ejemplo, incluyendo por corte, deslizamiento o una punción. Una muestra de fluido corporal, al igual que la muestra de tejido, contiene las células que se van a evaluar para la expresión del marcador o la actividad biológica y/o pueden contener un biomarcador soluble que es secretado por las células, y es un fluido obtenido por cualquier método conveniente para el fluido corporal que se va a muestrear. Los fluidos corporales convenientes para el muestreo incluyen, pero no se limitan a, sangre, mocos, fluido seminal, saliva, leche del pecho, bilis y orina. En general, el tipo de muestra (es decir, célula, tejido o fluido corporal) se selecciona basándose en la accesibilidad y estructura del órgano o tejido para ser evaluado para determinar la presencia de células de tumor o el crecimiento y/o sobre qué tipo de cáncer se va a evaluar. Por ejemplo, si el órgano/tejido para ser evaluado es el pecho, la muestra puede ser una muestra de células epiteliales a partir de una biopsia (es decir, una muestra de células) o una muestra de tejido del pecho a partir de una biopsia (una muestra de tejido). La muestra que es más útil en la presente invención serán las células, tejidos o fluidos corporales (y los componentes de los mismos, tales como el ADN) aislados de un paciente mediante una biopsia o cirugía o recolección de fluidos de laboratorio de rutina. En cuanto se obtiene la muestra de un paciente, la muestra se evalúa para detectar la presencia del gen ras mutado, o para detectar la expresión o la actividad biológica del E76 Ras, solo o en combinación con otras mutaciones, tales como otras mutaciones de Ras o ras, y en particular una mutación G12 (por ejemplo, mediante la detección de ARNm que codifica el producto del gen mutado o mediante la detección de la proteína Ras mutada) de la presente invención en las células de la muestra. Por ejemplo, la presencia y/o o el nivel del biomarcador ras se puede determinar mediante métodos convencionales tales como métodos de detección de genes o de ARN (por ejemplo, secuenciamiento de ADN, hibridación de oligonucleótidos, amplificación por PCR con cebadores específicos para la mutación), o métodos de detección de proteínas (por ejemplo, ¡nmunoensayos o ensayos bioquímicos para determinar el nivel del producto de gen). En general, la secuencia de ácidos nucleicos del gen ras o ARN en una muestra de paciente se puede detectar mediante cualquier método conveniente o técnica para medir o detectar la secuencia del gen o la expresión. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, PCR, PCR transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR in situ, hibridación in situ, Southern blot, Northern blot, análisis de secuencias, análisis de microarreglos, detección de un gen reportero, u otras plataformas de hibridación ADN/ARN. La expresión se puede evaluar simplemente para determinar la presencia de la o las secuencias del ras mutado y/o comparar las muestras aisladas de individuos sanos o de otro control negativo. Por ejemplo, una muestra de una biopsia de tumor de un paciente a partir de un bloque de parafina empotrado se puede seccionar y teñir con hematoxilina, después de lo cual las células patológicas de la muestra pueden ser aisladas por microdiseccion de captura en láser. El ADN genómico de las células aisladas se usa entonces como una plantilla para una reacción de PCR para amplificar el fragmento de ADN que aloja la secuencia ras especificada en el exón 3 usando cebadores que flanquean la secuencia de interés. Alternativamente, las secciones de la biopsia de tumor se pueden analizar mediante PCR in situ, de manera que la amplificación sea dependiente de la hibridación con cebadores que se enlazan a la secuencia mutada, y alargada con nucleótidos etiquetados, de manera que la secuencia amplificada específicamente se detecte dentro de las células de tumor. Como todavía otra alternativa, las secciones se pueden cebar con oligonucleótidos que hibridan específicamente con una o más mutaciones E76, pero no con las secuencias de ras del tipo natural.

Cuando se detecta la proteína mutante E76 Ras (o la combinación de mutaciones de Ras como se describe en la presente), la expresión de la proteína se puede detectar en tejidos convenientes, tales como tejido de tumor y material celular obtenido por biopsia. Por ejemplo, la muestra de la biopsia del tumor del paciente, la cual se puede inmovilizar, puede ponerse en contacto con un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, o un aptámero, que selectivamente enlaza a la proteína Ras para ser detectada y determinar si el anticuerpo, fragmento del mismo o aptámero ha enlazado a la proteína Ras. El enlace se puede medir utilizando una variedad de métodos regulares en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a: Western blot, immunoblot, ensayo inmunosorbente de enzima enlazada (ELISA), radioimmunoensayo (RIA), inmunoprecipitación, resonancia de plasmón de superficie, quimiolumiscencia, polarización fluorescente, fosforescencia, análisis inmunohistoquímico, Ionización por desabsorción láser asistida por matriz/tiempo de vuelo (MALDI-TOF), espectrometría de masas, microcitometría, microarreglo, microscopía, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), y citometría de flujo. En un inmunoensayo particular, el enlace a la proteína Ras se determina utilizando un primer anticuerpo monoclonal que se enlaza específicamente a la proteína Ras mutada y un segundo anticuerpo que se enlaza al primer anticuerpo. En los métodos de diagnóstico/ pronóstico de la invención, si se detecta la mutación E76 Ras o ras (o una combinación de mutaciones de Ras o ras descritas en la presente), (ya sea por detección del ácido nucleico o la proteína), esta detección de la mutación se considera que es indicadora de la presencia de células de tumor o la predisposición de desarrollar células de tumor en el paciente, ya que no se espera que esta mutación se presente en individuos "sanos" (es decir, individuos que no tienen y no parece que estén predispuestos a cáncer causado por o contribuido por esta mutación de Ras). Si se desea, sin embargo, se puede comparar la detección de la mutación Ras o ras con el "estatus Ras" (es decir, las secuencias de las proteínas o genes de Ras) en un individuo sano o normal, si se desea. Aunque la detección de la mutación E76 es suficiente para concluir un diagnóstico positivo de la presencia de células de tumor o la predisposición de desarrollar células de tumor en el paciente, la detección de la combinación de E76 con otra mutación de Ras o ras, y en particular, una mutación G12, en la muestra de tumor, se cree que es indicadora no solamente de la presencia de células de tumor o la predisposición de desarrollar células de tumor, sino adicionalmente de un tumor que se predice que será más agresivo (por ejemplo, despliega un crecimiento de tumor en volumen más rápido o de capacidad de invasión aumentada, propensión aumentada para crecimiento metastásico, pronóstico aumentado de un resultado malo), en comparación con la detección de solamente la mutación E76, la detección de solamente la otra mutación Ras (por ejemplo, una mutación G12 ), y/o la detección de ninguna mutación. De acuerdo con la presente invención, el "nivel de línea base" es un nivel de control, y en algunas modalidades (pero no en todas las modalidades, dependiendo del método), un nivel normal de expresión o actividad del biomarcador (por ejemplo, Ras o ras) contra el cual se puede comparar un nivel de prueba de la expresión o actividad biológica del biomarcador (es decir, en la muestra de prueba ). El término "control negativo" usado en referencia a un nivel de línea base de la expresión o actividad biológica del biomarcador típicamente se refiere a la línea base establecida en una muestra del paciente o de una población de individuos que se cree que es normal (es decir, no tumoroso, no canceroso, no sufre transformación neoplásica, que no exhibe la presencia de células de tumor o un crecimiento de células inapropiado). En una modalidad, se puede establecer un nivel de línea base o de control de tejidos no involucrados del paciente que se está examinando (es decir, tejido que se cree que no está afectado por el cáncer), de manera que el estado de tumor (carga de tumor, crecimiento, volumen, etcétera) del paciente se puede monitorear sobre el tiempo y/o de manera en que la eficacia de un protocolo terapéutico dado se puede evaluar en el tiempo. Los métodos para detectar la expresión o la actividad biológica del biomarcador Ras se describen en detalle más adelante. Un "control positivo" puede incluir cualquier control que confirma la detección positiva de un biomarcador, tal como un nivel de la expresión o actividad del biomarcador establecida en un tumor confirmado, o cualquier otro indicador positivo del parámetro que se está evaluando con respecto al biomarcador. Cuando se usa una línea base o control, los expertos en la técnica apreciarán que no es necesario establecer una línea base o de control para cada ensayo conforme el ensayo se realiza sino antes de eso, se puede establecer una línea de base o un control refiriéndose a una forma o información almacenada con respecto a un nivel de línea base determinado previamente de la expresión del biomarcador para una muestra de control dada, tal como un nivel de línea base establecido por cualquiera de los métodos descritos anteriormente. Esta forma de información almacenada puede incluir, por ejemplo, pero no se limita a, una gráfica de referencia, listado o archivo electrónico de población o de datos individuales con respecto a la expresión del biomarcador "sano" (control negativo) o positivo de tumor (incluyendo a los tumores establecidos); un diagrama médico para los datos registrados del paciente de evaluaciones anteriores; o cualquier otra fuente de datos con respecto a la expresión del biomarcador de la línea base que sea útil para que el paciente sea diagnosticado. Después de que se detecta la presencia o ausencia de las proteínas Ras o gen o ARN que codifica a las mismas en la muestra que se va a evaluar para las células de tumor, el paso final de hacer un diagnóstico, monitoreo o señalamiento de etapa de evolución del paciente se puede realizar, y se puede prescribir un tratamiento o protocolo de prevención o rastreo adicional. Adicionalmente, si se detecta la presencia de la mutación Ras, el paciente puede ser evaluado para métodos de diagnóstico o adicionales de cáncer para confirmar el diagnóstico inicial. En una modalidad de la invención, el método de diagnóstico se puede usar para determinar un diagnóstico para un paciente, un pronóstico para un paciente y también para determinar el protocolo de terapia apropiado y predecir el éxito o el resultado del paciente para un protocolo para el cáncer dado. Por ejemplo, si se sospecha que un paciente tiene cáncer o está en riesgo de desarrollar un cáncer, se puede usar el método para determinar si el paciente tiene una mutación de Ras o no la tiene que se asocia con el cáncer y de esta manera se diagnostica un cáncer. Además, si se cree que el paciente tiene un tumor, entonces la identificación de la mutación Ras, en comparación con la identificación de una mutación diferente o al menos la no identificación de la mutación Ras, puede indicar al médico tratante qué tan agresivo será probablemente el tumor del paciente, permitiendo de este modo un pronóstico más específico del cáncer. Como se comentó anteriormente, sin apegarse a la teoría, los presentes inventores creen que la detección de la combinación de una mutación E76 de Ras en combinación con una mutación G12 predice un tumor más agresivo, y de conformidad con lo anterior, el pronóstico para el paciente puede ser más malo que para un paciente sin esta combinación, y/o un paciente con esta combinación puede ser tratado de manera más agresiva que un paciente sin esta combinación de mutaciones. Finalmente, se puede usar la identificación de una mutación Ras o combinación de mutaciones en el tumor del paciente para desarrollar un protocolo de terapia contra el cáncer específico basándose en el conocimiento de cómo efectúa esta mutación particular la actividad celular, y también se puede usar para predecir la respuesta o susceptibilidad del paciente a un tipo de terapia particular. La presente invención también incluye un kit que utiliza los métodos de diagnóstico de la presente invención. El kit de preferencia contiene cualquier reactivo útil para detectar la presencia o ausencia de la mutación Ras (proteína) o ras (ácido nucleico) de acuerdo con la presente invención en una muestra de prueba, y de preferencia incluye una sonda de oligonucleótidos, cebadores para PCR, o un anticuerpo, un péptido que enlaza antígeno, o aptámero, que enlaza al biomarcador (es decir, el gen ras mutado, ARN, ADNc, o proteína codificada mediante el mismo). El kit puede incluir cualquier reactivo necesario para realizar un método de diagnóstico considerado en la presente. El kit también puede incluir reactivos para la detección de otros biomarcadores de cáncer, tales como las mutaciones de Ras previamente descritas o cualquier otro objetivo conveniente para el diagnóstico del cáncer, aún para cánceres que tienen causas o contribuciones no relacionadas con la mutación Ras descrita en la presente. Los reactivos (por ejemplo, sonda, anticuerpo, aptámero) se pueden conjugar a otra unidad, por ejemplo a un marcador o inmovilizar a un portador sólido (sustrato). En una modalidad, el kit puede contener un reactivo para detectar un biomarcador de control característico de un tipo de célula en la muestra de prueba. El reactivo puede estar presente en forma libre o inmovilizado a un sustrato tal como a un plato de plástico, una placa de microarreglo, un tubo de ensayo, una varilla de prueba y así sucesivamente. El kit también puede incluir reactivos convenientes para la detección del reactivo y/o para el etiquetamiento de los controles positivos o negativos, soluciones de lavado, reguladores de dilución y similares. El kit también puede incluir un conjunto de instrucciones por escrito para usar el kit e interpretar los resultados. En una modalidad, el kit se formula para ser un ensayo de alto rendimiento. Más específicamente, de acuerdo con la presente invención, un reactivo para detectar la presencia de un biomarcador, la expresión o la actividad biológica de un biomarcador puede ser cualquier reactivo conveniente que pueda ser usado en un método para la detección de la presencia, la expresión y la actividad biológica del marcador de Ras como se describió previamente en la presente. Estos reactivos incluyen, pero no se limitan a: una sonda que híbrida bajo condiciones de hibridación estricta a una molécula de ácido nucleico que codifica el biomarcador o un fragmento del mismo; cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos que codifican el biomarcador o un fragmento del mismo; un aptámero que específicamente se enlaza a un sitio distinto conformacionalmente sobre la molécula objetivo (es decir, que pueda distinguir el Ras que tiene una mutación E76, incluyendo una mutación E76 particular, tal como E76G, E76K o E76Q, del Ras que no tiene esta mutación); y/o un anticuerpo, fragmento de enlace del mismo u otro péptido de enlace de antígeno que selectivamente se enlaza al biomarcador. Los anticuerpos (incluyendo, pero sin limitarse a, los anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos divalentes o monovalentes, anticuerpos bi específicos o multi específicos, suero que contiene estos anticuerpos, anticuerpos que han sido purificados a varios grados y cualesquier equivalente funcionales a anticuerpos enteros) que selectivamente se enlazan a una proteína Ras mutada en la muestra también se pueden producir utilizando la información disponible en la técnica (descrita anteriormente). En una modalidad, un reactivo para detectar un biomarcador de control es característico del tipo de célula que se está muestreando, generalmente puede ser cualquier tipo de reactivo que se pueda usar en un método para detectar la presencia de un biomarcador conocido (en el ácido nucleico o a nivel proteína) en una muestra, tal como mediante un método para detectar la presencia de un biomarcador descrito previamente en la presente. Específicamente, el reactivo se caracteriza porque identifica un marcador específico del tipo de célula que se está analizando que positivamente identifica el tipo de célula. Por ejemplo, en un ensayo de tumor de mama, es deseable seleccionar células epiteliales para el nivel de la expresión y la actividad biológica del biomarcador. Por lo tanto, el reactivo para detectar un marcador de control identifica un marcador que es característico de una célula epitelial y de preferencia, una célula epitelial de mama, de manera que la célula se distingue de otros tipos de célula, tales como un fibroblasto. Este reactivo aumenta la precisión y la especificidad del ensayo de la presente invención. Este reactivo para detectar un marcador de control incluye, pero no se limita a: una sonda que híbrida bajo condiciones de hibridación estrictas a una molécula de ácido nucleico que codifica un marcador de proteína; cebadores de PCR los cuales amplifican una molécula de ácido nucleico; un aptámero que específicamente se enlaza a un sitio conformacionalemente distinto sobre la molécula objetivo; y/o un anticuerpo, fragmento que enlaza un antígeno del mismo, o péptido que enlaza antígeno que selectivamente se enlaza al marcador de control en la muestra. Secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos para muchos marcadores de células se conocen en la técnica y se pueden usar para producir esos reactivos para la detección. El reactivo para detectar un biomarcador Ras y/o un marcador de control del kit de ensayo de la presente invención se pueden conjugar a una marbete detectable o etiqueta detectable. Este marbete puede ser cualquier marbete conveniente que permita la detección de los reactivos utilizados para detectar el biomarcador o el marcador de control e incluye, pero no se limita a, cualquier composición o etiqueta detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Las etiquetas útiles en la presente invención incluyen biotina para teñir con conjugado de estreptavidina etiquetada, cuentas magnéticas (por ejemplo, Dynabeads®), tintes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rojo texas, rodamina, proteína fluorescente verde, y similares), radioetiquetas (por ejemplo, 3H, 125l, 35S, 14C, o 32P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otras comúnmente usadas en un ELISA), y etiquetas colorimétricas tales como oro coloidal o cuentas de vidrio o plástico coloreado (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etcétera). Además, el reactivo para detectar el kit de ensayo de la presente invención se puede inmovilizar sobre un sustrato. Este sustrato puede incluir cualquier sustrato conveniente para la inmobilización de un reactivo de detección tal como se usaría en cualquiera de los métodos previamente descritos de detección. En resumen, un sustrato conveniente para la inmovilización de un reactivo para detectar incluye cualquier soporte sólido, tal como cualquier soporte orgánico, de biopolímero o inorgánico sólido que pueda formar un enlace con el reactivo para detectar sin efectuar significativamente la actividad y/o la capacidad del reactivo para detectar la molécula objetivo deseada. Los soportes sólidos orgánicos ejemplares incluyen polímeros tales como poliestireno, nylon, resinas de fenol formaldehído, copolímeros acrílicos (por ejemplo, poliacrilamida), células enteras intactas estabilizadas, y homogenados de células enteras/membranas crudas estabilizadas. Los soportes de biopolímero ejemplares incluyen celulosa, polidextrano (por ejemplo, Sep adex®), agarosa, colágeno y quitina. Los soportes inorgánicos ejemplares incluyen cuentas de vidrio (porosas y no porosas), acero inoxidable, óxido de metal (por ejemplo, cerámicas porosas tales como Zr02, Ti02 Al203, y NiO) y arena. Método de Rastreo de la Invención Una modalidad de la presente invención se relaciona con los métodos para identificar compuestos que son útiles para proteger a un paciente del cáncer que lleva un gen Ras mutante o expresa una proteína Ras que tiene la mutación E76 descrita en la presente, o una combinación de la mutación E76 con otra mutación Ras, tal como G12. El método incluye utilizar la proteína o péptido E76 de Ras, o una molécula de ácido nucleico que codifica ésta proteína o péptido, como un objetivo para un ensayo para seleccionar y analizar un compuesto químico y/o un compuesto biológico que tiene actividad como un agente terapéutico antitumor, basado en la capacidad del compuesto para regular descendentemente la expresión del gen ras mutado, para inhibir la actividad de este producto de gen, o para invertir o compensar la actividad biológica de la proteína Ras mutada, tal como un compuesto que dispara la hidrólisis de GTP o Ras a pesar de la presencia de la mutación identificada en la presente. En una modalidad, el método incluye usar como un objetivo una proteína o péptido Ras, o una molécula de ácido nucleico que codifica esa proteína o péptido, en donde la proteína o péptido Ras tiene una mutación en cualquiera de una o más posiciones 73, 74, 75, 77 o 78, o cualquiera de las combinaciones de las mutaciones de Ras descritas anteriormente y en particular, cualquier combinación de una mutación en la posición 12 y/o 13 con una mutación en la posición 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77, y/o 78. Por ejemplo, un compuesto candidato para la identificación incluye un compuesto que dispara la actividad de GTPasa, de manera que el enlace GTP en el Ras mutante se hidroliza a GDP a pesar de la presencia de la mutación, mediante lo cual la actividad de Ras "constitutiva" se apaga, de este modo amortiguando las señales no reguladas de la proliferación celular. La referencia en la presente a inhibir un objetivo puede referirse a uno o ambos de inhibir la expresión del gen objetivo e inhibir la traducción y/o la actividad de su producto de expresión correspondiente (proteína). Los compuestos que modifican la actividad biológica de un objetivo tales como los compuestos mencionados anteriormente que disparan o inician la hidrólisis de GTP de Ras mutado de la invención también están abarcados por el método de identificación. Estos compuestos se pueden llamar en la presente compuestos terapéuticos. En una modalidad, los compuestos para ser identificados incluyen los compuestos que regulan, adaptan o imitan Ras-GAP, en donde el Ras-GAP regulado, adaptado o imitado tiene la capacidad de permitir la hidrólisis de GTP asociado con cualquiera de las proteínas Ras descritas en la presente (por ejemplo, una mutante E76 Ras, cualquier mutante 73-78 de Ras, o cualquiera de las combinaciones de mutantes descritas en la presente), pero no permite la hidrólisis de GTP asociada con el Ras de tipo natural. En este aspecto, las mutaciones novedosas descritas en la presente se usan para identificar los compuestos que pueden restablecer la función de la senda de hidrólisis de Ras GTP en las células (por ejemplo, las células de tumor) que alojan una o más mutaciones de Ras descritas en la presente, mediante lo cual se detiene la proliferación no controlada y la metástasis de estas células al mismo tiempo que se dejan en paz las células "normales" (células no cancerosas). Esta estrategia permite la identificación de compuestos que se dirigen a las células de tumor pero no causan problemas interrumpiendo las funciones celulares normales de Ras en las células que no son de tumor. En esta modalidad, se identifican los compuestos seleccionando los compuestos que restablecen la hidrólisis GTP a células que expresan (naturalmente, o mediante métodos recombinantes) un objetivo Ras mutado, pero no causa hidrólisis de GTP en las células que expresan Ras no mutado (tipo natural). En un aspecto de esta modalidad, los compuestos terapéuticos se identifican exponiendo una proteína objetivo (por ejemplo Ras E76G) de la presente invención (o una célula que expresa la proteína naturalmente o recombinantemente) a un compuesto candidato y medir la capacidad del compuesto a inhibir (reducir, disminuir, boquear) una actividad biológica de la proteína o más particularmente la capacidad de la proteína para contribuir al crecimiento celular no restringido o la proliferación de una célula. En una modalidad, un compuesto candidato se identifica por su capacidad de iniciar o disparar la hidrólisis de GTP y sobrepasar efectivamente o compensar la presencia del Ras mutante de la presente invención. Los métodos para medir la hidrólisis de GTP y la actividad de la GTPasa son muy conocidos en la técnica. En otro aspecto de esta modalidad, una línea celular que expresa naturalmente el gen ras mutante o ha sido transfectada con el gen u otra molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la proteína Ras mutada se incuba con varios compuestos también conocidos como compuestos candidatos, compuestos de prueba, o compuestos reguladores supuestos. Una reducción de la expresión del gen ras mutado o una modificación de las actividades de su producto se pueden usar para identificar un compuesto terapéutico. Por ejemplo, se puede poner en contacto el Ras mutante que expresa la célula con el compuesto candidato e identificar compuestos que disparan la actividad de GTPasa como se comentó anteriormente. Estos compuestos se pueden identificar por su capacidad de enlazar Ras y activar la GTPasa bajo condiciones donde las Ras-GAP se bloquean de enlazarse con Ras por las mutaciones de Ras, y/o puede permitir liberar ?-fosfato del Ras GTP cuando se inicia la hidrólisis. En otras palabras, el ensayo intenta detectar compuestos que superen los efectos de la mutación de Ras o la combinación de mutaciones. Alternativamente, se puede usar una variedad de ensayos de célula libre similares para identificar estos compuestos terapéuticos. Los compuestos terapéuticos identificados de esta manera se pueden volver a probar si se desea en otros ensayos para confirmar sus actividades. De preferencia, se selecciona un compuesto que tampoco dispare la hidrólisis de Ras GTP en células que expresan Ras del tipo natural (que no expresan un Ras mutado). En una modalidad de la invención, se identifican los inhibidores del crecimiento celular no controlado exponiendo un gen objetivo o porción del mismo (es decir, un gen ras E76G mutado) a un compuesto de prueba; midiendo la expresión de un objetivo (E76G Ras); y seleccionando un compuesto que regula descendentemente (reduce, disminuye, inhibe, bloquea) la expresión o modifica la actividad del objetivo. Por ejemplo, el inhibidor supuesto se puede exponer a una célula que expresa el gen objetivo (endógenamente o recombinantemente). Una célula preferida para usarla en un ensayo incluye una célula de mamífero que ya sea que naturalmente exprese el gen objetivo o haya sido transformada con una forma recombinante del gen objetivo, tal como una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína objetivo o un fragmento útil del mismo. Los métodos para determinar los niveles de expresión de un gen son muy conocidos en la técnica. Los métodos para el diseño e identificación de moléculas de ácido nucleico que inhiben la expresión de los genes o las actividades biológicas de las proteínas codificadas mediante esto son muy conocidas en la técnica. En una modalidad de la invención, los compuestos terapéuticos se identifican por exponer un objetivo (por ejemplo, E76G Ras-GTP) a un compuesto candidato; medir el enlace del compuesto candidato al objetivo; y seleccionar un compuesto que se enlaza al objetivo a una concentración, afinidad o avidez deseada. En una modalidad preferida, el ensayo se realiza bajo condiciones conductoras para promover la interacción o el enlace del compuesto al objetivo. Una persona con experiencia en la técnica puede determinar estas condiciones basándose en el objetivo y en el compuesto que se está usando en el ensayo. En una modalidad, se puede usar una máquina BIAcore para determinar la constante de enlace de un complejo entre la proteína objetivo (una proteína codificada por el gen objetivo) y un ligando natural en la presencia y ausencia del compuesto candidato. Por ejemplo, la proteína objetivo o un fragmento que enlaza al ligando del mismo se puede inmovilizar sobre un sustrato. Un ligando natural o sintético se pone en contacto con el sustrato para formar un complejo. La constante de disociación para un complejo se puede monitorear en el índice de refracción con respecto al tiempo conforme el regulador se pasa sobre el chip (O'Shannessy y colaboradores, Anal. Biochem. 212:457-468 (1993); Schuster y colaboradores, Nature 365:343-347 (1993)). Poner en contacto un compuesto candidato a varias concentraciones con el complejo y monitorear la función de respuesta (por ejemplo, el cambio en el índice de refracción con respecto al tiempo) permite que se determine la constante de disociación del complejo en la presencia del compuesto de prueba e indica si el compuesto candidato es un inhibidor o un agonista del complejo. De manera alternativa, el compuesto candidato se puede poner en contacto con la proteína objetivo o inmovilizada al mismo tiempo que el ligando para ver si el compuesto candidato inhibe o estabiliza el enlace del ligando a la proteína objetivo. Los compuestos para ser analizados en los métodos de la invención incluyen compuestos orgánicos conocidos tales como productos de bibliotecas de péptidos, moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ARNi, ribozimas, aptámeros, anti-sentido) , anticuerpos, y productos de bibliotecas combinatorias de química. Los compuestos también se pueden identificar usando un diseño de fármacos racional que depende de la estructura del producto de un gen, solo o en complejo con otro componente (por ejemplo, Ras mutante complejo con GTP). Estos métodos son conocidos para los expertos en la técnica e involucran el uso de programas de software de formación de imágenes tridimensionales. La Figura 4 ilustra los cambios conformacionaies tridimensionales que se presentan en Ras como un resultado de dos mutaciones de Ras, por ejemplo. Varios métodos de diseño de fármacos, útiles para diseñar o seleccionar miméticos u otros compuestos terapéuticos útiles en la presente invención se describen en Maulik y colaboradores, 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc., la cual se incorpora en la presente mediante referencia por entero. Como se usa en la presente, el término "compuesto de prueba", "compuesto inhibidor supuesto" o "compuesto regulador supuesto" se refiere a compuestos que tienen una actividad reguladora desconocida o previamente inapreciada en un proceso particular. Como tal, el término "identificar" con respecto a los métodos para identificar compuestos pretende incluir todos los compuestos, cuya utilidad como un compuesto regulador para el propósito de inhibir el crecimiento celular se determina mediante un método de la presente invención. Las condiciones bajo las cuales una célula, lisado de célula, molécula de ácido nucleico o proteína de la presente invención se expone o se pone en contacto con un compuesto regulador supuesto, tal como mediante mezclado, son cualquier condición de cultivo o de ensayo conveniente. En el caso de un ensayo basado en célula, las condiciones incluyen un medio efectivo en el cual la célula pueda ser cultivada o en el cual se pueda evaluar el lisado celular en la presencia y ausencia de un compuesto regulador supuesto. Las células de la presente invención se pueden cultivar en una variedad de contenedores, incluyendo, pero sin limitarse a, matraces de cultivo de tejido, tubos de ensayo, platos de microtitulación, y cajas de petri. El cultivo se lleva a cabo a temperatura, pH y contenido de dióxido de carbono apropiado para la célula. Estas condiciones de cultivo también están dentro de la experiencia en la técnica. Las células se ponen en contacto con un compuesto regulador supuesto bajo condiciones que toman en cuenta el número de células por contenedor contactado, la concentración del compuesto o compuestos regulador supuesto administrado a una célula, el tiempo de incubación del compuesto regulador supuesto con la célula, y la concentración del compuesto administrado a la célula. La determinación de los protocolos efectivos se puede llevar a cabo por los expertos en la técnica, basándose en las variables tales como el tamaño del recipiente, el volumen de líquido en el recipiente, las condiciones conocidas como convenientes para el cultivo del tipo de célula particular usada en el ensayo, y la composición química del compuesto regulador supuesto (es decir, tamaño, carga, etcétera) que se está probando. Una cantidad preferida de compuesto o compuestos reguladores supuestos puede comprender entre aproximadamente 1 nM a aproximadamente 10 nM de compuestos o compuestos reguladores supuestos por pozo de una charola con 96 pozos. Como se usa en la presente, el término "expresión", cuando se usa en relación con detectar la expresión de un objetivo en la presente invención, se puede referir a detectar la transcripción del gen objetivo y/o detectar la traducción de la proteína objetivo codificada por el gen objetivo. Detectar la expresión de un objetivo se refiere al acto de determinar activamente si un objetivo se expresa o no. Esto puede incluir determinar si la expresión objetivo es regulada ascendentemente comparada con un control, regulada en forma descendente comparada con el control, o no cambia en comparación con un control. Por lo tanto, el paso de detectar la expresión no requiere que la expresión del objetivo se regule ascendente o descendentemente sino en vez de eso puede también incluir detectar que la expresión del objetivo no ha cambiado (es decir, detectar la falta de expresión del objetivo, o ningún cambio en la expresión del objetivo). La expresión de los transcritos y/o proteínas se mide mediante cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Para la expresión de ARN, los métodos incluyen, pero no se limitan a: extracción de ARNm celular y el Northern blot usando sondas etiquetadas que hibridan a transcritos que califican todo o parte de uno o más de los genes de esta invención; amplificación del ARNm expresado a partir de uno o más de los genes de esta invención utilizando cebadores específicos para el gen; reacción dé cadena de polimerasa (PCR), y reacción de cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR) seguida por la detección cuantitativa del producto por cualquiera de una variedad de medios; extracción del ARN total de las células, que se etiqueta entonces y se usa para sondear ADNs u oligonucleótidos que codifican todos o parte de los genes de la invención acomodados en cualquiera de una variedad de superficies; hibridación en el sitio; y detección de un gen reportero. El término "cuantificar" o "contar" cuando se usa en el contexto de cuantificar los niveles de la transcripción de un gen se puede referir a una cuantificación absoluta o a una cuantificación relativa. La cuantificación absoluta se puede llevar a cabo mediante la inclusión de la o las concentraciones conocidas de uno o más ácidos nucleico objetivos y referenciar a la intensidad de hibridación de las incógnitas con los ácidos nucleicos objetivos conocidos (por ejemplo, a través de la generación de una curva estándar). Alternativamente, la cuantificación relativa se puede llevar a cabo mediante la comparación de señales de hibridación entre dos o más genes, o entre dos o más tratamientos para cuantificar los cambios en la intensidad de la hibridación, y por implicación, el nivel de la transcripción. En una modalidad preferida, la expresión del gen objetivo se mide por una reacción en cadena de polimerasa. En otra modalidad, la expresión del gen objetivo se mide utilizando análisis en gel de poliacrilamida, cromatografía o espectroscopia. En otra modalidad preferida, la expresión del gen objetivo se mide midiendo la producción de la proteína codificada (midiendo la traducción de la proteína). La medición de la traducción de la proteína incluye cualquier método conveniente para detectar y/o medir proteínas a partir de una célula o extracto celular. Estos métodos incluyen pero no se limitan a, inmunoblot (por ejemplo, Western blot), ensayo inmunoabsorbente de enzima enlazada (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoprecipitación, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y microscopía por inmunoflueorescencia. Los métodos particularmente preferidos para la detección de proteínas incluyen cualquier ensayo de células simples, incluyendo la inmunohistoquímica y los ensayos de inmunofluorescencia. Por ejemplo, se puede usar un agente de detección, tal como un anticuerpo que específicamente conoce, (selectivamente se enlaza a) la proteína codificada por el gen. Estos métodos son muy conocidos en el campo. Los compuestos candidatos identificados o diseñados por los métodos descritos anteriormente se pueden sintetizar utilizando técnicas conocidas en el campo y dependiendo del tipo de compuesto. Las técnicas de síntesis para la producción de compuestos que no son proteína, incluyendo compuestos orgánicos e inorgánicos son muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, para péptidos más pequeños, se prefieren los métodos de síntesis química. Por ejemplo, estos métodos incluyen procedimientos químicos muy conocidos, tales como síntesis de péptidos en solución o fase sólida, o semi síntesis en solución comenzando con fragmentos de proteínas acoplados a través de métodos de solución convencionales. Estos métodos son muy conocidos en la técnica y se pueden encontrar en textos generales y artículos en el área tales como: Merrifield, 1997, Methods Enzymol. 289:3-13; Wade y colaboradores, 1993, Australas Biotechnol. 3(6):332-336; Wong y colaboradores, 1991, Experientia 47(11 -12): 1123-1129; Carey y colaboradores, 1991, Ciba Found Symp. 158: 187-203; Plaue y colaboradores, 1990, Biologicals 18(3):147-157; Bodanszky, 1985, Int. J. Pept. Protein Res. 25(5):449-474; o H. Dugas and C. Penney, BIOORGANIC CHEMISTRY, (1981) en las páginas 54-92, todos los cuales se incorporan el la presente mediante referencia por entero. Por ejemplo, los péptidos se pueden sintetizar mediante metodología de fase sólida utilizando un sintetizador de péptidos disponible comercialmente y los ciclos de síntesis suministrados por el fabricante. Una persona con experiencia en la técnica reconoce que la síntesis de fase sólida podría llevarse a cabo también utilizando la estrategia FMOC y una mezcla de TFA/depurador disociador. Un compuesto que es una proteína o péptido se puede producir usando tecnología de ADN recombinante y métodos estándares en la técnica, particularmente si se desean cantidades mayores de una proteína. Cualquier compuesto identificado por estos métodos se puede usar en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer, o en otros métodos o usos descritos en la presente. Los siguientes resultados experimentales se proporcionan con propósitos de ilustración y no pretende limitar el alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 : El siguiente ejemplo describe la identificación de una nueva mutación Ras en tumores evaluados durante un ensayo de inmunoterapia en Fase 1 de levadura aniquilada por calor, entera, que expresa proteínas Ras mutadas (Tarmogens).

Materiales y Métodos (Usados en los Ejemplos 1 y 2): Pacientes. 149 pacientes con cáncer pancreático, cáncer colorrectal o cáncer de pulmón no microcelular se inscribieron en un ensayo en Fase I (Globelmmune, Inc.) de inmunoterapia molecular dirigida con levadura aniquilada por calor, entera, que expresa proteínas Ras mutadas. (Termogen). Las muestras de biopsia de los tumores de los pacientes fueron genotipificados para determinar las mutaciones ras para identificar sujetos con mutaciones relacionadas con productos para ser inscritos para el ensayo de inmunoterapia. Muestras de tejidos y aislamiento de ADN genómico. La muestra de tumor de cada paciente fue recibida ya sea en un bloque empotrado de parafina o en portaobjetos montados con secciones cortadas del bloque de parafina. Las células de tumores se aislaron mediante LCM (microscopía de captura láser) o con raspado por escalpelo microscópico de secciones de 6-8pm de grosor, teñidas (HistoGene Staining Solution, Arcturus, CA), luego el ADN genómico de estas células de tumor aisladas se extrajo mediante tratamiento de SDS-proteinasa K y digestión de ARNasa, seguido de precipitación por isopropanol. PCR y secuencias de ras. Se realizó PCR anidado para los exones 2 y 3 de los genes K-, N-, y H-ras utilizando polimerasa ADN Taq platinum en un kit de alta fidelidad (Invitrogen, CA). Los 25 pL de mezcla de la reacción de PCR externa incluye 100 ng de plantilla ADN, 1 X PCR de regulador, 50-100 pmol de MgSQ4, 5 nmol de dNTPs, 10 pmol de cada cebador externo y 2.5 unidades de polimerasa de ADN Taq de alta fidelidad. Se inició el ciclado térmico con la desnaturalización a 94° C durante 5 minutos, seguidos por 35 ciclos de tres pasos a 94° C durante 30 segundos, 55° C durante 30 segundos y 68° C durante 50 segundos, y seguidos por una incubación final por 10 minutos a 68° C. Las reacciones PCR internas se realizaron en un total de 50 µ?_ con 1 µ?_ de los productos PCR externos como plantilla y 20 pmol de cada cebador interno. Se usaron los siguientes cebadores: K-ras exón 2 cebador delantero externo: 5'-AGGTGAGTTTGTATTAAAAG-3' (SEQ ID NO:16); K-ras exón 2 cebador reverso externo: 5'-TCATGAAAATGGTCAGAG-3' (SEQ ID NO:17); K-ras exón 2 cebador delantero interno: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTGTGTGACATGTTCTAAT-3' (SEQ ID NO:18); K-ras exón 2 cebador inverso interno 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAATGGTCCTGCACCAGTAA-3' (SEQ ID NO: 19); K-ras exón 3 cebador hacia adelante externo: 5'-TGAGTTGTATATAACACC-3' (SEQ ID NO:20); K-ras exón 3 cebador inverso externo: 5'-GGCATTAGCAAAGACTCA-3 1 (SEQ ID NO:21); K-ras exón 3 cebador hacia adelante interno: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG TGCACTGTAATAATCCAG-3' (SEQ ID NO: 22); K-ras exón 3 cebador inverso interno: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAA ATTACTCCTTAATGTCAGC-3' (SEQ ID NO: 23); N-ras exón 2 cebador hacia adelante externo: 5'- ATGGAAGGTCACACTAGGG-3' (SEQ ID NO: 24); N-ras exón 2 cebador inverso externo: 5'- AAGATGATCCGACAAGTG-3' (SEQ ID NO: 25); N-ras exón 2 cebador hacia delante interno: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGTACTGTAGATGTGGCTCG-3' (SEQ ID NO: 26); N-ras exón 2 cebador inverso interno: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAGACAGGATCAGGTCAGCG-3' (SEQ ID NO: 27); N-ras exón 3 cebador hacia adelante externo: 5'-TGGCAATAGCATTGCATTC-3' (SEQ ID NO: 28); N-ras exón 3 cebador inverso externo: 5'- GGTAACCTCATTTCCCCA-3' (SEQ ID NO: 29); N-ras exón 3 cebador hacia adelante interno: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTTGAACTTCCCTCCCTCCCTG-3' (SEQ ID NO:30); N-ras exón 3 cebador inverso interno: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATTCAGAACACAAAGATCA-3' (SEQ ID NO: 31); H-ras exón 2 cebador hacia adelante externo: 5'-TTGGCAGGTGGGGCAGGAGA-3' (SEQ ID NO: 32), H-ras exón 2 cebador inverso externo: 5'-CCTATCCTGGCTGTGTCC-3' (SEQ ID NO: 33), H-ras exón 2 cebador hacia adelante interno: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGAGACCCTGTAGGAG-3' (SEQ ID NO: 34), H-ras exón 2 cebador inverso interno: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGCCCGCAGCAGCTGC-3' (SEQ ID NO: 35), H-ras exón 3 cebador hacia adelante externo: 5 '-ACCAGGGAGAGGCTGGC-3' (SEQ ID NO: 36), H-ras exón 3 cebador inverso externo: 5 •-CTCCCGGGCCAGCCTCAC-3' (SEQ ID NO: 37), H-ras exón 3 cebador hacia adelante externo: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTG AACTCCCCCCACGGAAGG-3' (SEQ ID NO: 38), y H-ras exón 3 cebador inverso interno: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGTTCACCTGTACTGGTGGA-3' (SEQ ID NO: 39). Todos los cebadores internos o hacia adelante fueron suplementados con la secuencia de cebador T7 en el extremo 5', y todos los cebadores internos inversos fueron suplementados con secuencias de cebador SP6 en el extremo 5'. Los productos de la PCR se purificaron con un kit de extracción de gel rápida QIA (Qiagen, CA) después de la electroforesis a través de agarosa 1.5 por ciento. El ADN purificado se envió al CU Cáncer Center DNA Sequencing & Analysis Core para el secuenciamiento de dos cadenas usando los cebadores T7 y SP6. Construcción de los vectores de expresión del gen K-ras de ratón. El ARN total se aisló de la línea celular epitelial de pulmón de ratón E9 usando el reactivo Trizol de ¡Invitrogen (Invitrogen, CA). El ADNc del gen K-ras de ratón se transcribió a la inversa de 2.5 pg del ARN total utilizando el cebador inverso m-kras: 5'-GCTCGGCTGCGGCCGCTCACTACATAACTGTACACCTTGTCCT-3' (SEQ ID NO:40) y el kit de Transcriptasa Inversa Superscript R III (Invitrogen, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un décimo de las alícuotas reaccionadas se amplificó posteriormente mediante PCR con el cebador hacia adelante m-kras: 5'-GG AATTCACCATGGGCACTGAGTATAAACTTGTGGTG-3' (SEQ ID NO: 41) y el cebador inverso m-kras que se diseñó para cubrir la región de codificación entera del ADNc de K-ras de ratón. El ciclado térmico se inició con la incubación por 5 minutos a 94° C seguido por 35 ciclos de tres pasos a 94° C por 25 segundos, 55° C por 25 segundos, y 68° C por 30 segundos. El producto de la PCR se clonó al vector pGEM-T (Promega, Wl) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este gen k-ras de ratón contiene la mutación Q61R, entonces el k-ras de ratón de tipo natural y el k-ras de ratón que contenían las mutaciones G12V, E76G, E76K y G12VE76G se hicieron mediante mutagénesis dirigida al sitio y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pUP en los sitios EcoRI y Notl. Se usaron el m-kras hacia adelante, inverso y los siguientes cebadores: rasQ61 5'-TACTCCTCTTGACCTGCTGT-3'. (SEQ ID NO:42) rasG76 5'-AAGAAAGCCCCCCCCAGTTCTC-3\ (SEQ ID NO:43) rasV 12 5'ACGG AATTCACCATGACTGAGTATAAACTTGTGGTGGTTGGA GCTGTT GGCGTAG-3', (SEQ ID NO: 44) ras_K76_ 5'-AAG AAAGCCCTTCCCAGTTCTC-3 '. (SEQ ID NO: 45) Cultivo celular y transfección. Células BALB3T3 se cultivaron en DMEM que contenía 10 por ciento de suero de becerro neonato, 50 U/mililitro de penicilina, y 50 microgramos/mililitro de estreptomicina. Los plasmidos de expresión WT, G12V, E76G, E76K, y G12V + E76G de k-ras fueron transfectados en células BALB3T3 usando el kit Effectene Transfection Reagent (Qiagen, CA). Se seleccionaron células transfectadas con G418 y se purificaron seleccionado clones del plato de cultivo (del tipo natural) o de agar blando (G12V, E76G, E76K, G12V + E76G). La expresión de los genes K-ras del tipo natural (WT) transfectado o K-ras mutado fue confirmada mediante RT-PCR e inmunoblot de proteína Ras. El ARN total se aisló de cada clon de célula transfectada usando el reactivo Trizol y el ADNc del gen ras fue amplificado por inversión usando el kit de Transcriptasa Inversa SuperScriptMn III (Invitrogen, CA) y el cebador inverso m-kras, luego el gen ras exógeno se amplificó mediante PCR usando el cebador inverso m-kras y el cebador hacia adelante en el promotor vector pUP 5 TGGGTCGCGGTTCTTGT-3' (SEQ ID NO:46). La proteína total fue extraída usando regulador de lisis RIPA (Upstate, NY) de cada clon de célula transfectada, y se resolvieron las proteínas sobre 12 por ciento de gels de SDS-Page (Invitrogen, CA) seguido por transferencia a membrana de nitrocelulosa y teñido con anticuerpo anti-Ras (Oncogene, MA) y anticuerpo anti-GAPDH (Abcam, MA), respectivamente. Ensayo de agar blando. 5 x 10" células se suspendieron en DMEM que contenía 0.35 por ciento de agarosa de baja fusión (agarosa SeaPlaque, Cambres BioScience Rockland Inc, ME) y 10 por ciento de suero de becerro neonato(NBCS) sobrepuesto sobre un fondo de agarosa de baja fusión 0.5 por ciento que contenía 10 por ciento de NBCS. Después de un crecimiento de 2-4 semanas, las colonias se observaron o seleccionaron en medio DMEM líquido que contenía 10 por ciento de NBCS. Ensayo de tumorigenicidad. Cada clon transfectante se cultivó, cosechó y suspendió en PBS. 5 x 106 células se inyectaron subcutáneamente en ratones sin pelo Balb/c de 4-6 semanas. Células inyectadas se monitorearon dos veces por semana durante un periodo de 30 días, los tumores se midieron y se calculó el volumen de los tumores como 3.142 x (longitud) x anchura)2/6. Resultados En este estudio, las secuencias de ADN de K-, N- y H-ras se caracterizaron para determinar la presencia de mutaciones asociadas con tumores mediante amplificación por PCR anidada y secuenciamiento directo de tumores de 149 sujetos con cáncer de páncreas (albergando 68 por ciento de mutaciones), colorrectal (40 por ciento con mutaciones) o NCLC (9 por ciento con mutaciones) en un ensayo de inmunoterapia de fase I de levadura aniquilada con calor, entera, que expresa proteínas Ras mutadas (Tarmogens). Una nueva mutación ras en el codón 76 fue detectada en 24 sujetos de los tres tipos de cáncer, siendo 22 E76G, mientras que un tumor albergaba la mutación E76K y otro la E76Q. Combinaciones dobles de E76 más mutaciones en los codones 12 o 13 se identificaron en 8 tumores. Ver las Tablas 1 y 2 y la Figura 1. Tabla 1. Resumen de las Mutaciones en el Codón 76 * Una muestra tiene E76G tanto en K como en H-ras; *señal más débil para la mutación E76 detectada, probablemente debido a poca abundancia de células de tumor en la muestra de biopsia. 01 o Tabla 2. Resu men de m utaciones ras en pu ntos destacados (codones 1 2, 1 3 y 61 ) d #temuesras Tipo de M utaciones dtasreaas rá cncer cáncer Codón 1 2 Codón Codón 61 Sj #teous con dt muaones ras 1 3 (%á) por cncer Total G12V G12C G12D G12R G12S G12A Total G13D Total Q61R Q61L Q61H Q61P Cdorrectal 85 34 29 10 4 10 0 3 2 3 3 2 0 1 1 0 (40%) (85.3%) Pulmón 33 3 2 0 2 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 (9.1%) (66.7%) Páncreas 31 21 19 6 0 10 3 0 0 0 0 2 1 0 1 0 (67.7%) (95%) Total 149 58 50 17 6 20 3 3 2 3 3 5 1 1 2 1 (38.9%) (86.2%) Ejemplo 2 El siguiente Ejemplo demuestra que las mutaciones E76 de Ras son transformantes, y además, que las mutaciones E76 de Ras sinergizan con las mutaciones G12 de Ras para aumentar la oncogenicidad de un tumor. Se confirmó que las mutaciones E76G y E76K son transformantes en estudios no clínicos. De particular interés, acoplando las mutaciones en el codón 76 y el 12 se obtuvo como resultado una sinergia en el crecimiento del tumor. Las mutaciones simples G12V, E76G y E76K o las mutaciones dobles G12V-E78G se introdujeron en el gen K-ras de ratón y luego se transfectaron en fibroblastos de BALB/3T3. Las células transfectadas con ras que albergaban G12V o E76K solo, o la mutación doble G12V-E78G formaron colonias en agar blando (véase Figura 2A y 2B y la Tabla 3). Tabla 3. E76 como una Mutación de Transformación Clon Transcrito de (Genotipo K- Expresión de ARNm de gen Formación de ras proteína Ras ras colonia en transfectado exógena transfectado agar blando células (Western blot) (por RT-PCR) BALB/3T3) Tipo natural + + (WT) Clon Transcrito de (Genotipo liExpresión de ARNm de gen Formación de ras proteína Ras ras colonia en transfectado exógena transfectado agar blando células (Western blot) (por RT-PCR) BALB/3T3) G12V + + +++ + G12V+E76G + + ++ +++ E76G + + - E76K + + + + pUP (vector - - -vacío) Balb3T3 (no - - -transfectado) Las células BALB/3T3 transfectadas con genes K-ras del tipo natural o muíante se inyectaron subcutáneamente (s.c) en ratones sin pelo BALB/c. Las Figuras 3A y 3B son repeticiones del experimento. Las barras indican desviaciones estándares de 3 ratones por grupo. La Figura 3C es un detalle extendido del estudio mostrado en la Figura 3A para mostrar el crecimiento de células E76 transfectadas-mutantes individuales relativas a las células BALB/3T3 no transtectadas (del tipo natural). Las células que llevan mutaciones E76G o E76K solas en K-Ras dieron como resultado un crecimiento detectable en los ratones sin pelo en comparación con las células transtectadas con K-Ras del tipo natural, aunque el crecimiento del tumor con mutaciones únicas E76 fue significativamente menor que las células transtectadas para expresar K-Ras mutado por G12V (véase la Figura 3C). Las células transtectadas con Ras que alojan la doble mutación G12V + E76G de Ras condujeron a un crecimiento de tumor acelerado en comparación con las células que llevan cualquier mutación simple (véase Figuras 3A-3C). Ejemplo 3 El siguiente experimento describe una vacuna basada en levadura que comprende un vehículo de levadura y la proteína de fusión que comprende una mutación E76 de Ras. Se diseñó genéticamente una Saccharomyces cerevisiae para expresar una proteína de fusión Ras muíante de dominios múltiples bajo el control del promotor inducible con cobre, CUPI. La proteína de fusión es un solo polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en cuadro desde el término N hasta el término C (la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión está representada en la presente por SEQ ID NO:14); (1) la secuencia MADEAP (SEQ ID NO:1) para conferir la estabilidad de la proteína heterologa expresada por levadura naciente durante el cultivo celular (posiciones 1 a 6 de SEQ ID NO:14); (2) un fragmento de Ras que contiene el aminoácido en la posición 12 con respecto a la proteína Ras del tipo natural, en donde la glicina en la posición 12 se sustituye con una cisteína (posiciones 7-52 de la SEQ ID NO:14; estando la mutación de la posición 12 en la posición 17 de SEQ ID NO:14); (3) un fragmento de Ras que contiene el aminoácido en la posición 61 con respecto a una proteína Ras del tipo natural, en donde la glicina en la posición 61 se sustituye con una arginina (posiciones 53-91 de la SEQ ID NO:14; estando la mutación de la posición 61 en la posición 66 de SEQ ID NO:14); (4) un fragmento de Ras que contiene el aminoácido en la posición 12 con respecto a una proteína Ras del tipo natural, en donde la glicina en la posición 12 se sustituye con un aspartato (posiciones 92-137 de la SEQ ID NO:14; estando la mutación de la posición 12 en la posición 102 de SEQ ID NO:14); (5) un fragmento de Ras que contiene el aminoácido en la posición 12 con respecto a una proteína Ras del tipo natural, en donde la glicina en la posición 12 se sustituye con una valina (posiciones 138-183 de la SEQ ID NO:14; estando la mutación de la posición 12 en la posición 148 de SEQ ID NO:14); (6) un fragmento de Ras que contiene el aminoácido en la posición 12 con respecto a una proteína Ras del tipo natural, en donde la glicina en la posición 12 se sustituye con una arginina (posiciones 184-229 de la SEQ ID NO:14; estando la mutación de la posición 12 en la posición 194 de SEQ ID NO:14); y (7) un fragmento de Ras que contiene el aminoácido en la posición 76 con respecto a una proteína Ras del tipo natural, en donde el glutamato en la posición 76 se sustituye con una glicina (posiciones 230-275 de la SEQ ID NO:14; estando la mutación de la posición 76 en la posición 258 de SEQ ID NO:14). Se llevó a cabo el crecimiento y la inducción de la levadura que expresa la proteína de fusión Ras, y se detectó la expresión de la proteína. Estas levaduras se administraron a ratones A/J en los cuales se indujeron espontáneamente 25-50 tumores de pulmón mediante exposición al uretano, lo cual dispara las mutaciones en Ras en el codón 61 (80 al 90 por ciento de los tumores) y el codón 12 (aproximadamente el 10 por ciento de los tumores), o tumores que surgieron independientes de las mutaciones de Ras (<10 por ciento de tumores). La administración de las vacunas se llevó a cabo mediante la administración subcutánea a 2 o 5 semanas después de la inducción por uretano. La vacuna redujo la carga de tumor en los ratones de una manera estadísticamente significativa, en comparación con los ratones que no recibieron vacuna, lo que indica que la vacuna de levadura es capaz de provocar una respuesta inmune anti-tumor que se dirige a los tumores que alojan al menos una de las mutaciones codificadas por la construcción de proteína de fusión. En otro experimento para probar la inducción de una respuesta inmune para Ras que aloja una mutación en la posición 76, estas levaduras se administran a ratones en los cuales se han iniciado o están por iniciarse tumores, en donde las células de tumor han sido diseñadas genéticamente para expresar Ras que comprende una mutación E76G o que Ras que expresan naturalmente una mutación E76G (en un ensayo CTL, y/o proliferan en respuesta a Ras que comprende la mutación E76G presentada por una célula que presenta antígeno. Se espera que la carga del tumor se reduzca en los ratones en comparación con en ausencia de la administración de la vacuna. Similarmente, las células T aisladas de estos ratones se espera que puedan aniquilar objetivos que expresan la proteína Ras mutada y/o proliferar como respuesta a la proteína Ras mutada, de una manera específica para antígeno. Ejemplo 4 El siguiente experimento describe una vacuna basada en levadura que comprende un vehículo de levadura y una proteína de fusión que comprende una mutación E76 de Ras. Una Saccharomyces cerevisiae se diseñó genéticamente para expresar la proteína de fusión Ras mutante de dominio doble bajo el control de un promotor. La proteína de fusión es un solo polipéptido con los siguientes elementos de secuencia fusionados en cuadro del término N al término C (la secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión está representado en la presente mediante SEQ ID NO:15; (1) la secuencia MADEAP (SEQ ID NO:1) para conferir la estabilidad de la proteína heteróloga expresada por levadura naciente durante el cultivo celular (posiciones 1 a 6 de SEQ ID NO:15); (2) un fragmento de Ras que contiene el aminoácido en la posición 12 con respecto a la proteína Ras del tipo natural, en donde la glicina en la posición 12 se sustituye con una arginina (posiciones 7-52 de la SEQ ID NO:15; estando la mutación de la posición 12 en la posición 17 de SEQ ID NO:15); y (7) un fragmento de Ras que contiene el aminoácido en la posición 76 con respecto a una proteína Ras del tipo natural, en donde el glutamato en la posición 76 se sustituye con una glicina (posiciones 53-98 de la SEQ ID NO:15; estando la mutación de la posición 76 en la posición 81 de SEQ ID NO:15). Se llevó a cabo el crecimiento y la inducción de la levadura que expresa la proteína de fusión Ras, y se detectó la expresión de la proteína. En un experimento para probar la inducción de una respuesta inmune para Ras que alberga una mutación en la posición 76, estas levaduras se administran a ratones en los cuales se han iniciado tumores o van a ser iniciados, en donde las células de tumor han sido diseñadas genéticamente para expresar Ras que comprende una mutación E76G o que expresan naturalmente Ras que comprende una mutación E76G. El efecto de la vacuna sobre la reducción de carga de tumor se evalúa. Además, las células T de los ratones se aislan y prueban para su capacidad de aniquilar las células objetivo que expresan un Ras que comprende la mutación E76G (en un ensayo CTL), y/o proliferar como respuesta a Ras que comprende la mutación E76G presentado por una célula que presenta antígeno. Se espera que la carga del tumor se reduce en los ratones en comparación con en la ausencia de la administración de la vacuna. Similarmente, las células T aisladas de estos ratones se espera que sean capaces de aniquilar objetivos que expresan la proteína Ras mutada y/o proliferar como respuesta a la proteína Ras mutada, de una manera específica de antígeno. La descripción completa de la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos de América Número 60/786,568 se incorpora en la presente mediante referencia. Aunque varias modalidades de la presente invención se han descrito en detalle, es evidente que los expertos en la técnica pensarán en modificaciones y adaptaciones de esas modalidades. Sin embargo, se entenderá expresamente que estas modificaciones y adaptaciones están dentro del alcance de la presente invención, como se estipula en las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos cinco aminoácidos contiguos de una proteína Ras mutante, en donde la secuencia de aminoácidos contiene la posición 76 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras, o H-ras, y en donde el aminoácido en la posición 76 está mutado en comparación con la proteína del tipo natural. 2. La molécula de aminoácido aislada de la reivindicación 1, en donde el aminoácido en la posición 76 se muta de un glutamato a un residuo de aminoácido no glutamato seleccionado entre el grupo que consiste en: glicina, lisina y glutamina. 3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, en donde el residuo de aminoácido que no es glutamato es glicina. 4. La molécula de aminoácido aislada de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos difiere de cualquiera de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, o SEQ ID NO:13 por una sustitución de un aminoácido no glutamato por el glutamato en la posición 76 de la secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, o SEQ ID NO:13. 5. La molécula de aminoácido aislada de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos además comprende al menos cinco residuos de aminoácidos contiguos de una proteína Ras mutante, en donde la secuencia de aminoácidos contiene la posición de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en 12, 13, 59 y 61 con respecto a una proteína del tipo natural K-ras, N-ras, o H-ras, y en donde el aminoácido en la posición se muta en comparación con la proteína del tipo natural. 6. La molécula de aminoácido aislada de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos además comprende al menos cinco aminoácidos contiguos de una proteína Ras mutante, en donde la secuencia de aminoácidos contiene el aminoácido en la posición 12 con respecto a una proteína del tipo natural K-ras, N-ras, o H-ras, y en donde el aminoácido en la posición 12 está mutada en comparación con la proteína del tipo natural. 7. La molécula de aminoácido aislada de la reivindicación 6, en donde el aminoácido en las posiciones 12 o 13 se muta de una glicina a un residuo de aminoácido que no es glicina. 8. La molécula de aminoácido aislada de la reivindicación6, en donde el aminoácido en la posición 12 se muta de una glicina a un residuo de aminoácido que no es glicina. 9. La molécula de aminoácido aislada de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde el residuo de aminoácido que no es glicina se selecciona entre: valina, cisteína, aspartato, arginina, serina, y alanina. 10. La molécula de aminoácido aislada de la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína de fusión que comprende dos o más dominios, en donde uno de los dominios comprende al menos 5 aminoácidos de la proteína Ras mutante que comprende la mutación en la posición 76, y en donde cada dominio adicional consiste en un inmunógeno. 11. La molécula de aminoácido aislada de la reivindicación 10, en donde el inmunógeno es un antígeno de tumor. 12. La molécula de aminoácido aislada de la reivindicación 11, en donde el antígeno de tumor es una proteína Ras o un fragmento inmunogénico de la misma que comprende al menos una mutación relativa a la secuencia de aminoácidos de Ras del tipo natural. 13. La molécula de aminoácido aislada de la reivindicación 12, en donde el antígeno de tumor es una proteína Ras o un fragmento inmunogénico de la misma que comprende las posiciones 12 o 13 con respecto a la secuencia de aminoácidos de Ras de tipo natural, en donde el aminoácido en las posiciones 12 o 13 se muta de un residuo de glicina a un residuo que no es glicina. 14. La molécula de aminoácido aislada de la reivindicación 10, en donde el antígeno de tumor se selecciona entre el grupo que consiste en: (a) un péptido que comprende al menos desde las posiciones 8-16 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 12 con respecto con la proteína Ras del tipo natural se muta; (b) un péptido que comprende al menos desde las posiciones 9-17 de una proteína Ras, en donde el residuo del aminoácido en la posición 13 con respecto con la proteína Ras del tipo natural se muta; (c) un péptido que comprende al menos de las posiciones 55-63 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 59 con respecto a la proteína Ras del tipo natural se muta; (d) un péptido que comprende al menos de las posiciones 57-65 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 61 con respecto a la proteína Ras del tipo natural se muta; (e) un péptido que comprende al menos de las posiciones 69-77 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 73 con respecto a la proteína Ras del tipo natural se muta; (f) un péptido que comprende al menos de las posiciones 70-78 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 74 con respecto a la proteína Ras del tipo natural se muta; (g) un péptido que comprende al menos de las posiciones 71-79 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 75 con respecto a la proteína Ras del tipo natural se muta; (h) un péptido que comprende al menos de las posiciones 73-81 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 77 con respecto a la proteína Ras del tipo natural se muta; (i) un péptido que comprende al menos de las posiciones 74-82 de una proteína Ras, en donde el residuo de aminoácido en la posición 78 con respecto a la proteína Ras del tipo natural se muta. 15. La molécula de aminoácido aislada de la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. 16. La molécula de aminoácido aislada de la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. 17. Una molécula de aminoácido aislada que es completamente complementaria a la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16. 18. La molécula de aminoácido aislada de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 17, en donde la molécula de ácido nucleico es una sonda de oligonucleótido o un cebador. 19. Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16, operativamente enlazada a al menos una secuencia de control de expresión. 20. Una célula recombinante que ha sido transfectada con la molécula de ácido nucleico recombinante de la reivindicación 19. 21. La célula recombinante de la reivindicación 20, en donde la célula es una levadura. 22. Una proteína, o péptido, aislada codificada por la molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16. 23. La proteína, o péptido, aislada de la reivindicación 22, en donde esta proteína o péptido aislada es parte de una proteína de fusión. 24. Una vacuna que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16. 25. Una vacuna que comprende la proteína o péptido de la reivindicación 22. 26. La vacuna de la reivindicación 25, en donde la vacuna además comprende un vehículo de levadura. 27. La vacuna de la reivindicación 26, en donde el vehículo de levadura expresa recombinantemente la proteína o péptido. 28. La vacuna de la reivindicación 26, en donde la vacuna además comprende una célula dendrítica, en donde la célula dendrítica ha sido cargada intracelularmente con el vehículo de levadura y la proteína o péptido. 29. Una vacuna que comprende: (a) un vehículo de levadura; y (b) una proteína de fusión que comprende una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o el fragmento de la misma contiene la posición 76 del aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural -ras, N-ras o H-ras, y en donde el aminoácido en la posición 76 se muta en comparación con la proteína de tipo natural, en donde la expresión de la proteína de fusión está bajo el control del promotor Cup1; en donde la proteína de fusión es expresada por el vehículo de levadura. 30. La vacuna de la reivindicación 29, en donde la proteína de fusión además comprende una segunda proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la segunda proteína o fragmento de la misma contiene la posición 12 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde el aminoácido en la posición 12 se muta en comparación con la proteína de tipo natural. 31. La vacuna de la reivindicación 29, en donde la proteína de fusión comprende las siguientes proteínas o fragmentos, fusionados en un cuadro: (i) una proteína Ras muíante o fragmento de la misma, en donde la proteína o el fragmento contiene la posición 12 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde la glicina en la posición 12 se sustituye con una cisteína; (ii) una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o fragmento de la misma contiene la posición 61 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde la glutamina en la posición 61 se sustituye con una arginina; (iii) una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o fragmento de la misma contiene la posición 12 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde la glicina en la posición 12 se sustituye con un aspartato; (iv) una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o fragmento de la misma contiene la posición 12 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde la glicina en la posición 12 se sustituye con una valina; (v) una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o fragmento contiene la posición 12 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde la glicina en la posición 12 se sustituye con una arginina; (vi) una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o fragmento contiene la posición 76 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde el glutamato en la posición 76 se sustituye con una glicina. 32. La vacuna de la reivindicación 29, en donde la proteína de fusión comprende las siguientes proteínas o fragmentos, fusionadas en cuadro: (i) una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o el fragmento contiene la posición 12 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, y en donde la glicina en la posición 12 se sustituye con una arginina; y (ii) una proteína Ras mutante o fragmento de la misma, en donde la proteína o el fragmento contiene la posición 76 de aminoácido con respecto a una proteína de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras, en donde el glutamato en la posición 76 se sustituye con una glicina. 33. La vacuna de la reivindicación 29, en donde la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:14. 34. La vacuna de la reivindicación 29, en donde la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:15. 35. Un anticuerpo o fragmento que enlaza antígeno del mismo que selectivamente se enlaza a la proteína o péptido de la reivindicación 22. 36. Un aptámero que selectivamente enlaza a cualquiera de las proteínas o péptidos de la reivindicación 22. 37. Una molécula de ARNsi cataliza la disociación selectiva del ARN transcrito por la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16, o del ARN transcrito por un gen ras que codifica una proteína Ras mutantes, en donde la proteína Ras mutante comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de una secuencia de aminoácidos de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras por al menos una mutación en la posición 76 con respecto a la secuencia de aminoácidos de tipo natural. 38. Una ribozima que selectivamente cataliza la inactivación de la moléculas de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 , o de un gen ras que codifica una proteína Ras mutante, en donde la proteína Ras mutante comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de una secuencia de aminoácidos de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras en al menos una mutación en la posición 76 con respecto a la secuencia de aminoácidos de tipo natural. 39. Una molécula de ácido nucleico antisentido que híbrida bajo condiciones mucho muy estrictas e inhibe la expresión de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16 o de un gen ras que codifica una proteínas Ras mutante, en donde la proteína Ras mutante que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras en al menos una mutación en la posición 76 con respecto a la secuencia de aminoácidos de tipo natural. 40. El uso de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o la proteína o péptido de la reivindicación 22 o 23, en la preparación de una composición para la prevención o el tratamiento del cáncer. 41. El uso de la vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 24 a 34 en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento del cáncer. 42. El uso del aptámero de la reivindicación 36, el ARNsi de la reivindicación 27, la ribozima de la reivindicación 38, o la molécula de ácido nucleico antisentido de la reivindicación 39 en la preparación de un medicamento para la prevención o tratamiento del cáncer. 43. Un método para prevenir o tratar un cáncer, que comprende administrar a un animal que tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer, una vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 24 a la 34. 44. Un método para prevenir o tratar un cáncer, que comprende administrar a un animal que tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer, el aptámero de la reivindicación 36, el ARNsi de la reivindicación 27, la ribozima de la reivindicación 38, o la molécula de ácido nucleico antisentido de la reivindicación 39. 45. Un método para prevenir o tratar un cáncer, que comprende administrar a un animal que tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer, un compuesto que inhibe la expresión de una proteína Ras mutante, en donde la proteína Ras mutante comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de una secuencia de aminoácidos del tipo natural K-ras, N-ras o H-ras en al menos una mutación en la posición 76 con respecto a la secuencia de aminoácidos del tipo natural. 46. Un método para prevenir o tratar un cáncer, que comprende administrar a un animal que tiene o está en riesgo de desarrollar un cáncer, un compuesto que inicia o dispara la hidrólisis de GTP de una proteína Ras mutante, en donde la proteína Ras mutante comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de una secuencia de aminoácidos de tipo natural K-ras, N-ras o H-ras por al menos una mutación en la posición 76 con respecto a la secuencia de aminoácidos de tipo natural. 47. Un método para el diagnóstico de un tumor que comprende detectar la expresión o la actividad de una proteína Ras mutante o la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína Ras en una muestra de prueba de un paciente que va a ser diagnosticado, en donde la proteína Ras comprende una mutación en la posición 76 con respecto a la secuencia de aminoácidos Ras de tipo natural; en donde la detección de la proteína Ras mutante o de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína Ras en la muestra de prueba indica la presencia de células de tumor o el potencial de las mismas en la muestra de prueba. 48. El método de la reivindicación 47, en donde la proteína Ras comprende una sustitución de una glicina por el glutamato en la posición 76 en la proteína de tipo natural. 49. El método de la reivindicación 47, en donde el método además comprende detectar si la proteína Ras también comprende una mutación en la posición 12 con respecto a la secuencia de aminoácidos Ras de tipo natural, en donde la detección de una mutación en la posición 76 y en la posición 12 indica la presencia de células de tumor o potencial de las mismas en la muestra de prueba, y además indica un tumor más agresivo en el paciente en comparación con las células de tumor que alojan una proteína Ras con solamente una mutación o sin mutación en estas posiciones. 50. El método de la reivindicación 50, en donde el paso de detectar comprende detectar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la mutación Ras en la muestra de prueba. 51. El método de la reivindicación 50, en donde el paso de detectar comprende la amplificación por PCR de una plantilla de ADN genómico que codifica la mutación o la amplificación por PCR en el sitio de las secuencias de ADN que codifican la mutación. 52. El método de la reivindicación 50, en donde el paso de detectar es mediante un método seleccionado del grupo que consiste en reacción en cadena de polimerasa (PCR), PCR transcriptasa inversa (RT-PCR), hibridación en el sitio, Northern blot, análisis de secuencias, análisis de microarreglos de genes, y detección de un gen reportero. 53. El método de la reivindicación 47, en donde el nivel de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína Ras mutante se determina poniendo en contacto los ácidos nucleicos aislados de la muestra de prueba con un cebador o una sonda que selectivamente se enlaza a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína Ras mutante, y detectando si la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína Ras mutada es enlazada por el cebador o la sonda. 54. El método de la reivindicación 47, en donde el nivel de la proteína Ras mutante se determina poniendo en contacto la muestra a prueba con un anticuerpo o fragmento del mismo o un aptámero que selectivamente enlaza específicamente a la proteína Ras mutante, y detectando si el anticuerpo o fragmento del mismo o aptámero ha enlazado a la proteína Ras mutante. 55. El método de la reivindicación 47, en donde la muestra de prueba es de un paciente que está siendo diagnosticado de cáncer y en donde la muestra de prueba se compara con una muestra de control negativo. 56. El método de la reivindicación 47, en donde la muestra de prueba se inmoviliza sobre un sustrato. 57. El método de la reivindicación 47, en donde el método se usa para diagnosticar cáncer en el paciente. 58. El método de la reivindicación 47, en donde el método se usa para determinar el pronóstico del cáncer en el paciente. 59. El método de la reivindicación 47, en donde el método se usa para determinar la susceptibilidad del paciente a un tratamiento terapéutico. 60. Un método para identificar un compuesto para prevenir o tratar el cáncer, que comprende identificar un inhibidor de una proteína Ras objetivo o una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína Ras objetivo, en donde la proteína Ras objetivo comprende una mutación en la posición 76 en relación con una proteína Ras del tipo natural. 61. El método de la reivindicación 60, en donde la mutación es una sustitución de un aminoácido no glutamato seleccionado entre el grupo que consiste en una glicina, una lisina y una glutamina para el glutamato en la posición 76 en la proteína de tipo natural. 62. El método de la reivindicación 60, en donde el paso de identificar comprende identificar un inhibidor de la expresión o la actividad de la proteína Ras objetivo. 63. El método de la reivindicación 62, en donde el paso de detectar se selecciona entre el grupo que consiste en: detectar la traducción o la actividad de la proteína Ras objetivo en presencia del compuesto regulador supuesto; y detectar la expresión de un gen que codifica la proteína Ras objetivo en presencia del compuesto regulador supuesto. 64. El método de la reivindicación 62, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una célula huésped con un compuesto regulador supuesto, en donde la célula huésped expresa la proteína Ras objetivo o un fragmento biológicamente activo de la misma; y (b) detectar si el compuesto regulador supuesto dispara la hidrólisis de GTP de la proteína Ras objetivo o el fragmento biológicamente activo de la misma, en donde un compuesto regulador supuesto que dispara la hidrólisis de GTP de la proteína Ras objetivo en comparación con la ausencia del compuesto se indica que es un compuesto candidato para la prevención o el tratamiento del cáncer. 65. El método de la reivindicación 64, en donde la célula huésped es una línea celular de tumor. 66. Un método para identificar un compuesto para prevenir o tratar cáncer, que comprende identificar un compuesto que dispara la hidrólisis de GTP en una célula que expresa una proteína Ras mutada objetivo, pero no en una célula que expresa una proteína Ras de tipo natural, en donde la proteína Ras mutada objetivo comprende una mutación en la posición 76 en relación con una proteína Ras de tipo natural. 67. El método de cualquiera de las reivindicaciones de la 60 a la 66, en donde el compuesto regulador supuesto se selecciona entre el grupo que consiste en: un aptámero, una molécula de ARNsi, una molécula de ácido nucleico antisentido, una ribozima, un anticuerpo o fragmento que enlaza antígeno del mismo, un antagonista conformacional y un inhibidor de molécula pequeña.