CN103476426B - 用于慢性乙型肝炎病毒感染的基于酵母的治疗剂 - Google Patents

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Abstract

披露了用于治疗和/或预防HBV感染及其症状的基于酵母的免疫治疗组合物、乙肝病毒(HBV)抗原和融合蛋白，以及使用基于酵母的免疫治疗组合物、HBV抗原和融合蛋白来预防性和/或治疗性治疗HBV和/或其症状的方法。

Description

用于慢性乙型肝炎病毒感染的基于酵母的治疗剂
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求下述各项申请的优先权：2011年2月12日提交的美国临时申请61/442,204、2011年6月14日提交的美国临时申请61/496,945和2011年7月13日提交的美国临时申请61/507,361。美国临时申请61/442,204、美国临时申请61/496,945和美国临时申请61/507,361各自的全部公开内容通过引用并入本文。
序列表的引用
本申请含有通过EFS-Web以文本文件形式电子提交的序列表。该名为“3923-32-PCT_ST25”的文本文件的大小为476KB，2012年2月7日记录。该文本文件所含的信息根据37CFR§1.52(e)(5)通过引用全部并入本文。
发明领域
本发明一般地涉及用于预防和/或治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的免疫治疗组合物和方法。
发明背景
乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝病毒家族的成员，是世界范围内急性和慢性肝炎的致病因素。HBV疫情在亚洲和非洲流行，HBV感染是中国的地方性流行病(Williams,R.(2006),"Global challenges in liver disease",Hepatology(Baltimore,Md.)44(3):521–526)。已有超过20亿人口感染该病毒，据估计全世界有3亿5千万慢性HBV感染个体(“Hepatitis B”,World Health Organization,2009;“FAQ About Hepatitis B”,Stanford School of Medicine.2008-07-10)。感染途径是通过血液和体液接触，包括输血和静脉注射毒品、性传播、咬伤和损口，以及垂直传播(例如分娩)。
已发现的HBV根据其包膜蛋白内的抗原表位确定有四种主要血清型(adr、adw、ayr、ayw)。根据基因组中的核苷酸序列变异有八种不同基因型(A-H)。基因型的差别影响着疾病的严重程度、病程和并发症的可能性、对治疗的响应和对接种疫苗的可能响应(Kramvis et al.,(2005),Vaccine23(19):2409–2423;Magnius and Norder,(1995),Intervirology38(1-2):24–34)。
HBV的临床潜伏期通常为2-3个月；约三分之二这些急性感染者无症状或只有轻度、亚临床症状。其余三分之一的急性感染者可能出现黄疸、肝的炎症、呕吐、疼痛和/或轻度发热，但在多数成年人中疾病最终消退，很少会导致肝衰竭。事实上，约95％的成年人能够从HBV感染完全恢复，不会成为慢性感染。然而，约90％的婴儿和25％-50％的1-5岁儿童会持续慢性感染HBV(Centers for Disease Control and Prevention，2010年9月)。在童年成为慢性感染的个体约有25％、童年后成为慢性感染的约有15％会过早地死于肝硬化或肝癌，大多数慢性感染者在出现肝硬化或末期肝病之前仍然没有症状(CDC，2010年9月）。每年全球有1百万人(美国每年的死亡人数约2000-4000)死于慢性HBV感染。慢性感染者有升高的血清谷丙转氨酶(ALT)水平(肝损伤标记物)、肝脏炎症和/或肝活检时可见的纤维化。对于那些发展为肝硬化的患者，5年生存率约50％。
HBV感染及其治疗通常是通过检测病毒抗原和/或针对抗原的抗体来监测。感染HBV后，第一个可检测到的抗原是乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，然后是乙型肝炎“e”抗原(HBeAg)。表明病毒清除的是血清中出现抗HBsAg和/或抗核心抗原(HBcAg)的抗体，又称为血清转换。大量研究表明在感染HBV的个体中病毒复制、血症水平和发展为慢性感染状态受到通过辅助性CD4+（TH）和CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）介导的HBV特异性细胞免疫的直接和间接影响。发展为慢性疾病的患者与消除了急性感染的患者相比，往往没有、有较弱的或者狭隘的HBV特异性T细胞反应。参见例如Chisari,1997,J Clin Invest99:1472-1477;Maini et al.,1999,Gastroenterology 117:1386-1396;Rehermann et al.,2005,NatRev Immunol2005;5:215-229;Thimme et al.,2001,J Virol75:3984-3987;Urbani etal.,2002,J Virol76:12423-12434;Wieland and Chisari,2005,J Virol79:9369-9380;Webster et al.,2000,Hepatology32:1117-1124;Penna et al.,1996,J Clin Invest98:1185-1194;Sprengers et al.,2006,J Hepatol2006;45:182-189。
用于预防HBV的疫苗从1980年代早期已有商品。目前的商品疫苗是没有传染性的亚基病毒疫苗，其提供纯化的重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，在出生时即可开始给药。该疫苗已经有效地降低了常规给予疫苗的那些国家的感染发生率。虽然有几项免疫疗法正在开发中，包括各种HBV蛋白或抗原表位疫苗和细胞因子，目前美国没有已被批准的用于治疗活性HBV感染的免疫疗法。
目前HBV感染的护理标准(SOC)疗法主要包括抗病毒药物，比如替诺福韦(tenofovir)
Figure BDA0000394678840000031
拉米夫定(lamivudine)
Figure BDA0000394678840000032
阿德福韦(adefovir)
Figure BDA0000394678840000033
替比夫定(telbivudine)
Figure BDA0000394678840000034
和恩替卡韦(entecavir)
Figure BDA0000394678840000035
以及干扰素α2a和聚乙二醇干扰素α2a
Figure BDA0000394678840000036
这些药物，特别是抗病毒药物通常要长时间给药(例如每日或者每周给药一到五年或者更久)，而且它们虽然能减慢或者终止病毒复制，但一般不能提供完全“愈合”或者消除病毒。基于干扰素的方法有毒性并且缓解率不太大。抗病毒疗法能够抑制病毒复制，比干扰素的耐受性好，但正如以上提到的，这些药物一般无法彻底地治愈病毒，一些情况中不能达到长期缓解率。而且在一些病例中发展出了药物抗性。例如，拉米夫定是一种强力的抑制HBV逆转录酶(Pol)的口服抗病毒药物。因为拉米夫定能够被较好地耐受，并且现在是非专利药物，在发展中国家中它是HBV抗病毒疗法的一个选项。然而，由Pol序列中的点突变造成的每年20%病毒抗性率限制了拉米夫定对HBV的用途。此外，HBV基因型之间对目前的抗病毒和干扰素治疗的反应效率不同(Cao,World Journal of Gastroenterology2009;15(46):5761–9)，在一些患者中，由于乙型肝炎病毒DNA在感染被清除后仍能呆在体内，有可能随着时间病毒发生再次激活。
因此，虽然标准治疗(SOC)疗法对罹患慢性HBV的患者是目前最好的已被批准的疗法，治疗时间长和治疗方案的明显副作用会导致不依从、减少剂量和停止治疗,以及病毒逃避、病毒再活化和对疗法仍然没有响应或者不能维持响应的患者。因此，改进的HBV感染治疗方法是该领域中仍然需要的。
发明概述
发明的一个实施方案涉及用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒(HBV)感染和/或HBV感染症状的免疫治疗组合物。所述免疫治疗组合物包含:(a)酵母媒介物；和(b)一或多个HBV抗原。在一个方面中，HBV抗原被提供为一或多个融合蛋白，虽然也可以提供单蛋白HBV抗原。HBV抗原由下述构成:(i)HBV表面抗原，其包含全长HBV大(L)、中(M)和/或小(S)表面抗原的至少一个免疫原性结构域；(ii)HBV聚合酶抗原，其包含全长HBV聚合酶或其结构域(例如逆转录酶(RT)结构域)的至少一个免疫原性结构域；(iii)HBV核心抗原或者HBV e-抗原，分别包含全长HBV核心蛋白和/或全长HBV e抗原的至少一个免疫原性结构域；和/或(iv)HBV X抗原，其包含全长HBV X抗原的至少一个免疫原性结构域。组合物能够激发HBV特异性免疫反应，所述免疫反应对抗组合物中的一或多个HBV抗原，和/或对抗感染了或者可能感染某个体的乙型肝炎病毒HBV的一或多个抗原。
在本文描述的任何发明实施方案中，包括涉及免疫治疗组合物、HBV抗原、融合蛋白或者所述组合物、HBV抗原或融合蛋白的用途的任何实施方案中，在一个方面中，HBV大表面抗原(L)的氨基酸序列包括，但不限于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ DI NO:27或SEQ ID NO:31所代表的氨基酸序列，或者来自另一HBV毒株/分离株的对应序列。HBV聚合酶的氨基酸序列包括，但不限于SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:32所代表的氨基酸序列，或者来自另一HBV毒株/分离株的对应序列。
在本文描述的任何发明实施方案中，包括涉及免疫治疗组合物、HBV抗原、融合蛋白或者所述组合物、HBV抗原或融合蛋白的用途的任何实施方案中，在一个方面中，作为HBV抗原或者用在本发明的融合蛋白或免疫治疗组合物中的HBV表面抗原的氨基酸可以包括，但不限于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:11的位点21-47、SEQ IDNO:11的位点176-400、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:34的位点9-407、SEQ ID NO:36的位点6-257、SEQ ID NO:41的位点6-257、SEQ ID NO:92的位点92-343、SEQ ID NO:93的位点90-488、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:101的位点90-338、SEQ ID NO:102的位点7-254、SEQ ID NO:107的位点1-249、SEQ ID NO:108的位点1-249、SEQ ID NO:109的位点1-249、SEQ ID NO:110的位点1-249、SEQ ID NO:112的位点1-399、SEQ ID NO:114的位点1-399、或者SEQ ID NO:116的位点1-399、SEQ IDNO:118的位点1-399、SEQ ID NO:120的位点1-399、SEQ ID NO:122的位点1-399、SEQ IDNO:124的位点1-399、SEQ ID NO:126的位点1-399、SEQ ID NO:128的位点231-629、SEQ IDNO:130的位点63-461、SEQ ID NO:132的位点289-687、SEQ ID NO:134的位点289-687、或者来自不同HBV株的对应序列。
在本文描述的任何发明实施方案中，包括涉及免疫治疗组合物、HBV抗原、融合蛋白或者所述组合物、HBV抗原或融合蛋白的用途的任何实施方案中，在一个方面中，作为HBV抗原或者用在本发明的融合蛋白或免疫治疗组合物中的HBV聚合酶抗原的氨基酸可以包括，但不限于SEQ ID NO:2的位点383-602、SEQ ID NO:6的位点381-600、SEQ ID NO:10的位点381-600、SEQ ID NO:10的位点453-680、SEQ ID NO:14的位点370-589、SEQ ID NO:18的位点380-599、SEQ ID NO:22的位点381-600、SEQ ID NO:26的位点380-599、SEQ ID NO:30的位点381-600、SEQ ID NO:36的位点260-604、SEQ ID NO:38的位点7-351、SEQ ID NO:40的位点7-351、SEQ ID NO:41的位点260-604、SEQ ID NO:92的位点346-690、SEQ ID NO:94的位点90-434、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:101的位点339-566、SEQ ID NO:102的位点255-482、SEQ ID NO:107的位点250-477、SEQ ID NO:108的位点250-477、SEQ ID NO:109的位点250-477、SEQ ID NO:110的位点250-477、SEQ ID NO:120的位点582-809、SEQ ID NO:124的位点582-809、SEQ ID NO:126的位点642-869、SEQ ID NO:128的位点1-228、SEQ ID NO:132的位点位点1-228、SEQ ID NO:134的位点61-288、或者来自不同HBV株的对应序列。
在本文描述的任何发明实施方案中，包括涉及免疫治疗组合物、HBV抗原、融合蛋白或者所述组合物、HBV抗原或融合蛋白的用途的任何实施方案中，在一个方面中，作为HBV抗原或者用在本发明的融合蛋白或免疫治疗组合物中的HBV核心抗原的氨基酸可以包括，但不限于SEQ ID NO:1的位点31-212、SEQ ID NO:5的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点37-188、SEQ ID NO:13的位点31-212、SEQ ID NO:17的位点31-212、SEQ ID NO:21的位点31-212、SEQ ID NO:25的位点14-194、SEQ ID NO:29的位点31-212、SEQ ID NO:34的位点408-589、SEQ ID NO:36的位点605-786、SEQ ID NO:38的位点352-533、SEQ ID NO:39的位点160-341、SEQ ID NO:41的位点605-786、SEQ ID NO:92的位点691-872、SEQ ID NO:95的位点90-271、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101的位点567-718、SEQ ID NO:102的位点483-634、SEQ ID NO:105的位点2-183、SEQ ID NO:105的位点184-395、SEQ ID NO:105的位点396-578、SEQ ID NO:105的位点579-761、SEQ ID NO:106的位点2-183、SEQ ID NO:106的位点338-520、SEQ ID NO:107的位点478-629、SEQ ID NO:108的位点478-629、SEQ ID NO:109的位点478-629、SEQ ID NO:110的位点478-629、SEQ ID NO:112的位点400-581、SEQ ID NO:114的位点400-581、SEQ ID NO:116的位点400-581、SEQ IDNO:118的位点400-581、SEQ ID NO:120的位点400-581、SEQ ID NO:122的位点400-581、SEQID NO:124的位点400-581、SEQ ID NO:126的位点400-581、SEQ ID NO:128的位点630-811、SEQ ID NO:130的位点462-643、SEQ ID NO:132的位点688-869、SEQ ID NO:134的位点688-869，或者来自不同HBV株的对应序列。
在本文描述的任何发明实施方案中，包括涉及免疫治疗组合物、HBV抗原、融合蛋白或者所述组合物、HBV抗原或融合蛋白的用途的任何实施方案中，在一个方面中，作为HBV抗原或者用在本发明的融合蛋白或免疫治疗组合物中的HBV X抗原的氨基酸可以包括，但不限于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:12的位点2-154、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:4的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:8的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:12的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:16的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:20的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:24的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:28的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:32的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:36的位点787-939、SEQ ID NO:39的位点7-159、SEQ ID NO:92的位点873-1025、SEQ ID NO:96的位点90-242、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101的位点719-778、SEQ ID NO:102的位点635-694、SEQ ID NO:106的位点184-337、SEQ ID NO:106的位点521-674、SEQ ID NO:107的位点630-689、SEQ ID NO:108的位点630-689、SEQ ID NO:109的位点630-689、SEQ ID NO:110的位点630-689、SEQ ID NO:122的位点582-641、SEQ ID NO:124的位点810-869、SEQ IDNO:126的位点582-641、SEQ ID NO:130的位点1-60、SEQ ID NO:132的位点229-288、SEQ IDNO:134的位点1-60，或者来自不同HBV株的对应序列。
在一个实施方案中，本发明包括免疫治疗组合物，其包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由下述构成:(i)包含全长HBV X抗原的至少一个免疫原性结构域的HBV X抗原；(ii)包含全长HBV大表面抗原(L)的至少一个免疫原性结构域的HBV表面抗原，和(iii)包含全长HBV核心蛋白的至少一个免疫原性结构域的HBV核心抗原。在该实施方案的一个方面中，免疫治疗组合物包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由下述构成:(i)HBV X抗原，其含有的氨基酸序列与全长HBV X抗原的位点52-126至少80%相同；(ii)HBV表面抗原，其含有的氨基酸序列与全长HBV大表面抗原(L)的氨基酸序列至少95%相同，和(iii)HBV核心抗原，其含有的氨基酸序列与全长HBV核心蛋白的氨基酸序列至少95%相同。所述组合物引发HBV特异性免疫反应。
在该发明实施方案的一个方面中，HBV X抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:130的位点1-60、SEQ ID NO:110的位点630-689、SEQ ID NO:122的位点582-641、SEQ ID NO:107的位点630-689、SEQ ID NO:108的位点630-689、SEQ ID NO:109的位点630-689、SEQ ID NO:4的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:8的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:12的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:16的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:20的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:24的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:28的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:32的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101的位点719-778、SEQ ID NO:102的位点635-694、SEQ ID NO:124的位点810-869、SEQ ID NO:126的位点582-641、SEQ IDNO:132的位点229-288、SEQ ID NO:134的位点1-60，或者来自不同HBV株的对应序列。在一个方面中，HBV X抗原的氨基酸序列选自:SEQ ID NO:130的位点1-60、SEQ ID NO:110的位点630-689、SEQ ID NO:109的位点630-689、SEQ ID NO:108的位点630-689、SEQ ID NO:107的位点630-689、SEQ ID NO:100，或者来自不同HBV株的对应序列。
在该发明实施方案的一个方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:130的位点63-461、SEQ ID NO:118的位点1-399、SEQ ID NO:122的位点1-399、SEQ ID NO:34的位点9-407、SEQ ID NO:112的位点1-399、SEQ ID NO:114的位点1-399、SEQ ID NO:116的位点1-399、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:93的位点90-488、SEQ ID NO:120的位点1-399、SEQ ID NO:124的位点1-399、SEQ ID NO:126的位点1-399、SEQ ID NO:128的位点231-629、SEQ ID NO:132的位点289-687、SEQ ID NO:134的位点289-687，或者来自不同HBV株的对应序列。在一个方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列选自:SEQ ID NO:130的位点63-461、SEQ ID NO:118的位点1-399、SEQ ID NO:122的位点1-399、SEQ ID NO:34的位点9-407、SEQ ID NO:112的位点1-399、SEQ ID NO:114的位点1-399、SEQ ID NO:116的位点1-399，或者来自不同HBV株的对应序列。
在该发明实施方案的一个方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:130的位点462-643、SEQ ID NO:118的位点400-581、SEQ ID NO:122的位点400-581、SEQ ID NO:34的位点408-589、SEQ ID NO:112的位点400-581、SEQ IDNO:114的位点400-581、SEQ ID NO:116的位点400-581、SEQ ID NO:1的位点31-212、SEQ IDNO:5的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点31-212、SEQ ID NO:13的位点31-212、SEQ ID NO:17的位点31-212、SEQ ID NO:21的位点31-212、SEQ ID NO:25的位点14-194、SEQ ID NO:29的位点31-212、SEQ ID NO:36的位点605-786、SEQ ID NO:38的位点352-533、SEQ ID NO:39的位点160-341、SEQ ID NO:41的位点605-786、SEQ ID NO:92的位点691-872、SEQ ID NO:95的位点90-271、SEQ ID NO:105的位点2-183、SEQ ID NO:105的位点184-395、SEQ ID NO:105的位点396-578、SEQ ID NO:105的位点579-761、SEQ ID NO:106的位点2-183、SEQ IDNO:106的位点338-520、SEQ ID NO:120的位点400-581、SEQ ID NO:124的位点400-581、SEQID NO:126的位点400-581、SEQ ID NO:128的位点630-811、SEQ ID NO:132的位点688-869、SEQ ID NO:134的位点688-869，或者来自不同HBV株的对应序列。在一个方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列选自:SEQ ID NO:130的位点462-643、SEQ ID NO:118的位点400-581、SEQID NO:122的位点400-581、SEQ ID NO:34的位点408-589、SEQ ID NO:116的位点400-581、SEQ ID NO:112的位点400-581、SEQ ID NO:114的位点400-581，或者来自不同HBV株的对应序列.
在该发明实施方案的一个方面中，融合蛋白中HBV抗原从N到C端以下列顺序排列:HBV X抗原、HBV表面抗原、HBV核心抗原。在该发明实施方案的一个方面中，融合蛋白中HBV抗原从N到C端以下列顺序排列:HBV表面抗原、HBV核心抗原、HBV X抗原。
在该发明实施方案的一个方面中，融合蛋白包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:122或SEQ ID NO:150的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同，或者完全相同。
发明再一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)来自酿酒酵母的完整热灭活酵母菌；和(b)所述酵母表达的HBV融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO:130。
发明另一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)来自酿酒酵母的完整热灭活酵母菌；和(b)所述酵母表达的HBV融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO:150。
发明再一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)来自酿酒酵母的完整热灭活酵母菌；和(b)所述酵母表达的HBV融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO:122。在一个方面中，融合蛋白是下述序列从N到C端读框内融合的单个多肽:(1)SEQ ID NO:37的氨基酸序列;(2)苏氨酸-丝氨酸的双氨基酸连接肽；(3)SEQ ID NO:122的氨基酸序列；和(4)六氨基酸肽。
在发明的另一实施方案中，免疫治疗组合物包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由下述构成:(i)HBV大表面抗原(L)的至少一个免疫原性结构域；和(ii)HBV核心蛋白或HBV e抗原的至少一个免疫原性结构域。组合物引发HBV特异性免疫反应，比如抗HBV大表面抗原(L)和/或HBV核心蛋白或HBV e抗原的免疫反应。
在一个实施方案中，本发明包括免疫治疗组合物，其包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由下述构成:(i)HBV表面抗原，其含有的氨基酸序列与全长HBV大表面抗原(L)的氨基酸序列至少95%相同；和(ii)HBV核心抗原，其含有的氨基酸序列与全长HBV核心蛋白的氨基酸序列至少95%相同。所述组合物引发HBV特异性免疫反应。在该实施方案的一个方面中，构成HBV抗原的是包含至少95%全长HBV大表面抗原(L)的氨基酸序列融合了包含至少95%全长HBV核心蛋白或HBV e抗原的氨基酸序列。在该实施方案的一个方面中，构成HBV抗原的是包含至少95%全长HBV大表面抗原(L)的氨基酸序列融合在包含至少95%全长HBV核心蛋白的氨基酸序列的N端。在一个方面中，构成HBV抗原的是HBV大表面抗原(L)的氨基酸2-400；和包含HBV核心蛋白和部分HBVe抗原的HBV前核心蛋白的氨基酸31-212。
在该发明实施方案的一个方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:118的位点1-399、SEQ ID NO:34的位点9-407、SEQ ID NO:116的位点1-399、SEQ ID NO:112的位点1-399、SEQ ID NO:114的位点1-399、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:3的位点2-400、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:7的位点2-400、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:11的位点2-400、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:15的位点2-389、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:19的位点2-399、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:23的位点2-400、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:27的位点2-399、SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:31的位点2-400、SEQ ID NO:93的位点90-488、SEQ ID NO:120的位点1-399、SEQ ID NO:122的位点1-399、SEQ ID NO:124的位点1-399、SEQ ID NO:126的位点1-399、SEQ ID NO:128的位点231-629、SEQ ID NO:130的位点63-461、SEQ ID NO:132的位点289-687、SEQ ID NO:134的位点289-687，或者来自不同HBV株的对应序列。在一个方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列选自:SEQ ID NO:118的位点1-399、SEQ ID NO:34的位点9-407、SEQ ID NO:112的位点1-399、SEQ ID NO:114的位点1-399、SEQID NO:116的位点1-399，或者来自不同HBV株的对应序列。
在该发明实施方案的一个方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:118的位点400-581、SEQ ID NO:34的位点408-589、SEQ ID NO:116的位点400-581、SEQ ID NO:112的位点400-581、SEQ ID NO:114的位点400-581、SEQ IDNO:1的位点31-212、SEQ ID NO:5的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点31-212、SEQ ID NO:13的位点31-212、SEQ ID NO:17的位点31-212、SEQ ID NO:21的位点31-212、SEQ ID NO:25的位点14-194、SEQ ID NO:29的位点31-212、SEQ ID NO:36的位点605-786、SEQ ID NO:38的位点352-533、SEQ ID NO:39的位点160-341、SEQ ID NO:41的位点605-786、SEQ ID NO:92的位点691-872、SEQ ID NO:95的位点90-271、SEQ ID NO:105的位点2-183、SEQ ID NO:105的位点184-395、SEQ ID NO:105的位点396-578、SEQ ID NO:105的位点579-761、SEQ IDNO:106的位点2-183、SEQ ID NO:106的位点338-520、SEQ ID NO:120的位点400-581、SEQID NO:122的位点400-581、SEQ ID NO:124的位点400-581、SEQ ID NO:126的位点400-581、SEQ ID NO:128的位点630-811、SEQ ID NO:130的位点462-643、SEQ ID NO:132的位点688-869、SEQ ID NO:134的位点688-869，或者来自不同HBV株的对应序列。在一个方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列选自:SEQ ID NO:118的位点400-581、SEQ ID NO:34的位点408-589、SEQ ID NO:116的位点400-581、SEQ ID NO:112的位点400-581、SEQ ID NO:114的位点400-581，或者来自不同HBV株的对应序列。
在该发明实施方案的一个方面中，HBV抗原由SEQ ID NO:34的氨基酸9-589，或者来自不同HBV株的对应序列构成。在一个方面中，构成HBV抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或者至少99%相同、或完全相同:SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:34的位点9-589、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114，或者来自不同HBV株的对应序列。在一个方面中，HBV抗原由全长或接近全长的HBV大表面抗原(L)和全长或接近全长的HBV核心蛋白构成。
在该发明实施方案的一个方面中，任何一个融合蛋白可以包含SEQ ID NO:37的N末端氨基酸序列(附着在融合蛋白的N端)。在另一个方面中，任何一个融合蛋白可以包含选自SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90的N端氨基酸序列。在一个方面中，融合蛋白包含SEQ IDNO:151的氨基酸序列。
发明再一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)来自酿酒酵母的完整热灭活酵母菌；和(b)所述酵母表达的HBV融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO:118。
发明另一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)来自酿酒酵母的完整热灭活酵母菌；和(b)所述酵母表达的HBV融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO:151。
发明再一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)来自酿酒酵母的完整热灭活酵母菌；和(b)所述酵母表达的HBV融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明包括免疫治疗组合物，其包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV抗原的融合蛋白。所述HBV抗原由下述构成:(i)由全长HBV大(L)、中(M)或小(S)表面抗原的至少一个免疫原性结构域构成的HBV表面抗原；(ii)由全长HBV聚合酶的至少一个免疫原性结构域或者HBV聚合酶的逆转录酶(RT)结构域构成的HBV聚合酶抗原；(iii)由全长HBV核心蛋白的至少一个免疫原性结构域或者全长HBV e抗原构成的HBV核心抗原；以及(iv)由全长HBV X抗原的至少一个免疫原性结构域构成的HBV X抗原。组合物引发HBV特异性免疫反应。在该实施方案的一个方面中，HBV表面抗原包含HBV大表面抗原(L)的前S1的肝细胞受体区的至少一个免疫原性结构域和HBV小表面抗原(S)的至少一个免疫原性结构域。
在该实施方案的一个方面中，HBV抗原由下述构成：HBV大表面抗原(L)的前S1的全长肝细胞受体区的至少95%、全长HBV小表面抗原(S)的至少95%、HBVB聚合酶的逆转录酶结构域的至少95%、全长HBV核心蛋白或HBV e-抗原的至少95%，以及全长X抗原的至少95%。在一个方面中，HBV抗原由下述构成:HBV大表面抗原(L)，其包含HBV大表面抗原(L)中氨基酸120-368的至少95%；HBV聚合酶的RT结构域，其包含HBV聚合酶的RT结构域中氨基酸453-680的至少95%；HBV核心蛋白，其包含HBV核心蛋白中氨基酸37-188的至少95%；和HBV X抗原，其包含HBV X抗原中氨基酸52-127的至少80%。在一个方面中，HBV抗原由下述构成:HBV大表面抗原(L)的氨基酸21-47，包含前S1的肝细胞受体结构域；HBV大表面抗原(L)的氨基酸176-400，包含HBV小表面抗原(S)；HBV聚合酶的氨基酸247–691，包含逆转录酶结构域；HBV前核心蛋白的氨基酸31-212，包含HBV核心蛋白和一部分HBV e抗原；以及HBV X抗原的氨基酸2-154。在一个方面中，HBV抗原由下述构成:与HBV大表面抗原(L)的氨基酸120-368至少95%相同的氨基酸序列；与HBV聚合酶的RT结构域中氨基酸453-680至少95%相同的氨基酸序列；与HBV核心蛋白的氨基酸37-188至少95%相同的氨基酸序列;以及与HBV X抗原的氨基酸52-127至少80%相同的氨基酸序列。在一个方面中，HBV抗原经过改造引入了一或多个表5中列出的T细胞表位，在此以SEQ ID NOs:42-88或者SEQ ID NOs:135-140代表。在一个方面中，HBV大表面抗原(L)包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:9795%相同的序列。在一个方面中，HBV聚合酶的RT结构域SEQ ID NO:98的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:9895%相同的序列。在一个方面中，HBV核心蛋白包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列或者与SEQ IDNO:9995%相同的序列。在一个方面中，HBV X抗原包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10095%相同的序列。
在该发明实施方案的一个方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列与全长HBV大表面抗原(L)的氨基酸序列至少95%相同。在一个方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同:SEQ ID NO:124的位点1-399、SEQ ID NO:126的位点1-399、SEQ ID NO:132的位点289-687、SEQ ID NO:134的位点289-687、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:34的位点9-407、SEQ ID NO:93的位点90-488、SEQ ID NO:112的位点1-399、SEQ ID NO:114的位点1-399、SEQ ID NO:116的位点1-399、SEQ ID NO:118的位点1-399、SEQ ID NO:120的位点1-399、SEQ ID NO:122的位点1-399、SEQ ID NO:128的位点231-629、SEQ ID NO:130的位点63-461，或者来自不同HBV株的对应序列.
在该实施方案的一个方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:107的位点1-249、SEQ ID NO:108的位点1-249、SEQ IDNO:109的位点1-249、SEQ ID NO:110的位点1-249、SEQ ID NO:11的位点21-47、SEQ ID NO:11的位点176-400、SEQ ID NO:36的位点6-257、SEQ ID NO:41的位点6-257、SEQ ID NO:92的位点92-343、SEQ ID NO:101的位点90-338、SEQ ID NO:102的位点7-254，或者来自不同HBV株的对应序列。
在该实施方案的一个方面中，HBV聚合酶抗原由HBV聚合酶的RT结构域的至少一个免疫原性结构域构成。在一个方面中，HBV聚合酶抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:124的位点582-809、SEQ ID NO:126的位点642-869、SEQID NO:132的位点1-228、SEQ ID NO:134的位点61–288、SEQ ID NO:107的位点250-477、SEQID NO:108的位点250-477、SEQ ID NO:109的位点250-477、SEQ ID NO:110的位点250-477、SEQ ID NO:2的位点383-602、SEQ ID NO:6的位点381-600、SEQ ID NO:10的位点381-600、SEQ ID NO:10的位点453-680、SEQ ID NO:14的位点370-589、SEQ ID NO:18的位点380-599、SEQ ID NO:22的位点381-600、SEQ ID NO:26的位点380-599、SEQ ID NO:30的位点381-600、SEQ ID NO:36的位点260-604、SEQ ID NO:38的位点7-351、SEQ ID NO:40的位点7-351、SEQ ID NO:41的位点260-604、SEQ ID NO:92的位点346-690、SEQ ID NO:94的位点90-434、SEQ ID NO:101的位点339-566、SEQ ID NO:102的位点255-482、SEQ ID NO:120的位点582-809、SEQ ID NO:128的位点1-228，或者来自不同HBV株的对应序列。
在该实施方案的一个方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列与全长HBV核心蛋白的氨基酸序列至少95%相同。在一个方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:124的位点400-581、SEQ ID NO:126的位点400-581、SEQ ID NO:132的位点688-869、SEQ ID NO:134的位点688-869、SEQ ID NO:34的位点408-589、SEQ ID NO:112的位点400-581、SEQ ID NO:114的位点400-581、SEQ ID NO:116的位点400-581、SEQ IDNO:118的位点400-581、SEQ ID NO:1的位点31-212、SEQ ID NO:5的位点31-212、SEQ IDNO:9的位点31-212、SEQ ID NO:13的位点31-212、SEQ ID NO:17的位点31-212、SEQ ID NO:21的位点31-212、SEQ ID NO:25的位点14-194、SEQ ID NO:29的位点31-212、SEQ ID NO:36的位点605-786、SEQ ID NO:38的位点352-533、SEQ ID NO:39的位点160-341、SEQ ID NO:41的位点605-786、SEQ ID NO:92的位点691-872、SEQ ID NO:95的位点90-271、SEQ ID NO:105的位点2-183、SEQ ID NO:105的位点184-395、SEQ ID NO:105的位点396-578、SEQ IDNO:105的位点579-761、SEQ ID NO:106的位点2-183、SEQ ID NO:106的位点338-520、SEQID NO:120的位点400-581、SEQ ID NO:122的位点400-581、SEQ ID NO:128的位点630-811、SEQ ID NO:130的位点462-643，或者来自不同HBV株的对应序列.
在该实施方案的一个方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:99的位点、SEQ ID NO:9的位点37-188、SEQ ID NO:101的位点567-718、SEQ ID NO:102的位点483-634、SEQ ID NO:107的位点478-629、SEQ ID NO:108的位点478-629、SEQ ID NO:109的位点478-629、SEQ ID NO:110的位点478-629，或者来自不同HBV株的对应序列。
在该实施方案的一个方面中，HBV X抗原由与全长HBV X抗原至少95%相同的氨基酸序列构成。在一个方面中，HBV X抗原与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:4、SEQID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:12的位点2-154、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36的位点787-939、SEQ ID NO:39的位点7-159、SEQ ID NO:92的位点873-1025、SEQ ID NO:96的位点90-242、SEQ ID NO:106的位点184-337、SEQ ID NO:106的位点521-674、或者来自不同HBV株的对应序列.
在一个方面中，HBV X抗原由与全长HBV X抗原位点52-126至少80%相同的氨基酸序列构成。在一个方面中，HBV X抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:124的位点810-869、SEQ ID NO:126的位点582-641、SEQ ID NO:132的位点229-288、SEQ ID NO:134的位点1-60、SEQ ID NO:107的位点630-689、SEQ ID NO:108的位点630-689、SEQ ID NO:109的位点630-689、SEQ ID NO:110的位点630-689、SEQ IDNO:4的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:8的位点52-68接着是位点84-126、SEQ IDNO:12的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:16的位点52-68接着是位点84-126、SEQID NO:20的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:24的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:28的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:32的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:101的位点719-778、SEQ ID NO:102的位点635-694、SEQ ID NO:122的位点582-641、SEQ ID NO:130的位点1-60，或者来自不同HBV株的对应序列.
在该实施方案的一个方面中，HBV抗原具有的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:36的位点6-939、SEQ ID NO:92的位点92-1025、SEQ ID NO:101的位点90-778、SEQ ID NO:102的位点7-694，或者来自不同HBV株的对应序列.
在该实施方案的一个方面中，融合蛋白包含的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:132或SEQ ID NO:134。
任何一个融合蛋白可能在一个方面中包含选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90的N端序列。
在该实施方案的一个方面中，融合蛋白包含的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:102。
发明另一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由下述构成:(i)由HBV大(L)表面抗原的前S1的肝细胞受体区的至少一个免疫原性结构域和HBV小表面抗原(S)的至少一个免疫原性结构域构成的HBV表面抗原；(ii)由HBV聚合酶的逆转录酶结构域的至少一个免疫原性结构域构成的HBV聚合酶抗原和(iii)由HBV核心蛋白的至少一个免疫原性结构域构成的HBV核心抗原。组合物引发HBV特异性免疫反应。在一个方面中，HBV抗原由下述构成：HBV大表面抗原(L)的前S1的全长肝细胞受体区的至少95%、全长HBV小表面抗原的至少95%、HBV聚合酶的全长逆转录酶结构域的至少95%，和全长HBV核心蛋白的至少95%。在一个方面中，HBV抗原由下述构成：全长HBV大表面抗原(L)的至少95%、HBV聚合酶的全长逆转录酶结构域的至少95%，和全长HBV核心蛋白的至少95%。
在该实施方案的一个方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:120的位点1-399、SEQ ID NO:128的位点231-629、SEQ ID NO:112的位点1-399、SEQ ID NO:114的位点1-399、SEQ ID NO:116的位点1-399、SEQ ID NO:118的位点1-399、SEQ ID NO:41的位点6-257、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:11的位点21-47、SEQ ID NO:11的位点176-400、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34的位点9-407、SEQ ID NO:36的位点6-257、SEQ ID NO:92的位点92-343、SEQ ID NO:93的位点90-488、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:101的位点90-338、SEQ ID NO:102的位点7-254、SEQ ID NO:107的位点1-249、SEQ ID NO:108的位点1-249、SEQ ID NO:109的位点1-249、SEQ ID NO:110的位点1-249、SEQ ID NO:122的位点1-399、SEQ ID NO:124的位点1-399、SEQ ID NO:126的位点1-399、SEQ ID NO:130的位点63-461、SEQ ID NO:132的位点289-687、SEQ ID NO:134的位点289-687，或者来自不同HBV株的对应序列。
在该发明实施方案的一个方面中，氨基酸序列of HBV聚合酶抗原与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:120的位点582-809、SEQ ID NO:128的位点1-228、SEQ ID NO:107的位点250-477、SEQ ID NO:108的位点250-477、SEQ ID NO:109的位点250-477、SEQ IDNO:110的位点250-477、SEQ ID NO:41的位点260-604、SEQ ID NO:2的位点383-602、SEQ IDNO:6的位点381-600、SEQ ID NO:10的位点381-600、SEQ ID NO:10的位点453-680、SEQ IDNO:14的位点370-589、SEQ ID NO:18的位点380-599、SEQ ID NO:22的位点381-600、SEQ IDNO:26的位点380-599、SEQ ID NO:30的位点381-600、SEQ ID NO:36的位点260-604、SEQ IDNO:38的位点7-351、SEQ ID NO:40的位点7-351、SEQ ID NO:92的位点346-690、SEQ ID NO:94的位点90-434、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:101的位点339-566、SEQ ID NO:102的位点255-482、SEQ ID NO:124的位点582-809、SEQ ID NO:126的位点642-869、SEQ ID NO:132的位点1-228、SEQ ID NO:134的位点61-288，或者来自不同HBV株的对应序列。
在该发明实施方案的一个方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:120的位点400-581、SEQ ID NO:128的位点630-811、SEQ ID NO:112的位点400-581、SEQ ID NO:114的位点400-581、SEQ ID NO:116的位点400-581、SEQ IDNO:118的位点400-581、SEQ ID NO:41的位点605-786、SEQ ID NO:1的位点31-212、SEQ IDNO:5的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点37-188、SEQ ID NO:13的位点31-212、SEQ ID NO:17的位点31-212、SEQ ID NO:21的位点31-212、SEQ ID NO:25的位点14-194、SEQ ID NO:29的位点31-212、SEQ ID NO:34的位点408-589、SEQ ID NO:36的位点605-786、SEQ ID NO:38的位点352-533、SEQ ID NO:39的位点160-341、SEQ ID NO:92的位点691-872、SEQ ID NO:95的位点90-271、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101的位点567-718、SEQ ID NO:102的位点483-634、SEQ ID NO:105的位点2-183、SEQ ID NO:105的位点184-395、SEQ ID NO:105的位点396-578、SEQ ID NO:105的位点579-761、SEQ ID NO:106的位点2-183、SEQ ID NO:106的位点338-520、SEQ ID NO:107的位点478-629、SEQ ID NO:108的位点478-629、SEQ ID NO:109的位点478-629、SEQ ID NO:110的位点478-629、SEQ IDNO:122的位点400-581、SEQ ID NO:124的位点400-581、SEQ ID NO:126的位点400-581、SEQID NO:130的位点462-643、SEQ ID NO:132的位点688-869、SEQ ID NO:134的位点688-869，或者来自不同HBV株的对应序列。
在该发明实施方案的一个方面中，融合蛋白具有的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:41的位点6-786或SEQ ID NO:41，或者来自不同HBV株的对应序列。
发明另一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由下述构成:(i)由HBV聚合酶的逆转录酶(RT)结构域的至少一个免疫原性结构域构成的HBV聚合酶抗原；和(ii)由HBV核心蛋白的至少一个免疫原性结构域构成的HBV核心抗原。组合物引发HBV特异性免疫反应。在该发明实施方案的一个方面中，HBV抗原由下述构成：与HBV聚合酶的全长RT结构域至少95%相同的氨基酸序列，和与全长HBV核心蛋白至少95%相同的氨基酸序列。
在该发明实施方案的一个方面中，HBV聚合酶抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:38的位点7-351、SEQ ID NO:2的位点383-602、SEQ ID NO:6的位点381-600、SEQ ID NO:10的位点381-600、SEQ ID NO:10的位点453-680、SEQ ID NO:14的位点370-589、SEQ ID NO:18的位点380-599、SEQ ID NO:22的位点381-600、SEQ ID NO:26的位点380-599、SEQ ID NO:30的位点381-600、SEQ ID NO:36的位点260-604、SEQ ID NO:40的位点7-351、SEQ ID NO:41的位点260-604、SEQ ID NO:92的位点346-690、SEQ ID NO:94的位点90-434、SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:101的位点339-566、SEQ ID NO:102的位点255-482、SEQ ID NO:107的位点250-477、SEQ ID NO:108的位点250-477、SEQ ID NO:109的位点250-477、SEQ ID NO:110的位点250-477、SEQ ID NO:120的位点582-809、SEQ ID NO:124的位点582-809、SEQ ID NO:126的位点642-869、SEQ ID NO:128的位点1-228、SEQ IDNO:132的位点1-228、SEQ ID NO:134的位点61-288，或者来自不同HBV株的对应序列。
在该发明实施方案的一个方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:38的位点352-533、SEQ ID NO:1的位点31-212、SEQ ID NO:5的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点37-188、SEQ ID NO:13的位点31-212、SEQ ID NO:17的位点31-212、SEQ ID NO:21的位点31-212、SEQ ID NO:25的位点14-194、SEQ ID NO:29的位点31-212、SEQ ID NO:34的位点408-589、SEQ ID NO:36的位点605-786、SEQ ID NO:39的位点160-341、SEQ ID NO:41的位点605-786、SEQ ID NO:92的位点691-872、SEQ ID NO:95的位点90-271、SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:101的位点567-718、SEQ ID NO:102的位点483-634、SEQ ID NO:105的位点2-183、SEQ ID NO:105的位点184-395、SEQ ID NO:105的位点396-578、SEQ ID NO:105的位点579-761、SEQ ID NO:106的位点2-183、SEQ ID NO:106的位点338-520、SEQ ID NO:107的位点478-629、SEQ ID NO:108的位点478-629、SEQ ID NO:109的位点478-629、SEQ ID NO:110的位点478-629、SEQ ID NO:112的位点400-581、SEQ ID NO:114的位点400-581、SEQ ID NO:116的位点400-581、SEQ IDNO:118的位点400-581、SEQ ID NO:120的位点400-581、SEQ ID NO:122的位点400-581、SEQID NO:124的位点400-581,SEQ ID NO:126的位点400-581,SEQ ID NO:128的位点630-811、SEQ ID NO:130的位点462-643、SEQ ID NO:132的位点688-869、SEQ ID NO:134的位点688-869，或者来自不同HBV株的对应序列.
在该发明实施方案的一个方面中，融合蛋白具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:38的氨基酸序列，或者来自不同HBV株的对应序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
发明再一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由下述构成:(i)由HBV X抗原的至少一个免疫原性结构域构成的HBV X抗原；和(ii)由HBV核心蛋白的至少一个免疫原性结构域构成的HBV核心抗原。组合物引发HBV特异性免疫反应。在该实施方案的一个方面中，HBV抗原由下述构成：与全长HBV X抗原至少95%相同的氨基酸序列，和与全长HBV核心蛋白至少95%相同的氨基酸序列。
在该发明实施方案的一个方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:39的位点160-341、SEQ ID NO:1的位点31-212、SEQ ID NO:5的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点37-188、SEQ ID NO:13的位点31-212、SEQ ID NO:17的位点31-212、SEQ ID NO:21的位点31-212、SEQ ID NO:25的位点14-194、SEQ ID NO:29的位点31-212、SEQ ID NO:34的位点408-589、SEQ ID NO:36的位点605-786、SEQ ID NO:38的位点352-533、SEQ ID NO:41的位点605-786、SEQ ID NO:92的位点691-872、SEQ ID NO:95的位点90-271、SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:101的位点567-718、SEQ ID NO:102的位点483-634、SEQ ID NO:105的位点2-183、SEQ ID NO:105的位点184-395、SEQ ID NO:105的位点396-578、SEQ ID NO:105的位点579-761、SEQ ID NO:106的位点2-183、SEQ ID NO:106的位点338-520、SEQ ID NO:107的位点478-629、SEQ ID NO:108的位点478-629、SEQ ID NO:109的位点478-629、SEQ ID NO:110的位点478-629、SEQ ID NO:112的位点400-581、SEQ ID NO:114的位点400-581、SEQ ID NO:116的位点400-581、SEQ IDNO:118的位点400-581、SEQ ID NO:120的位点400-581、SEQ ID NO:122的位点400-581、SEQID NO:124的位点400-581、SEQ ID NO:126的位点400-581、SEQ ID NO:128的位点630-811、SEQ ID NO:130的位点462-643、SEQ ID NO:132的位点688-869、SEQ ID NO:134的位点688-869，或者来自不同HBV株的对应序列.
在该发明实施方案的一个方面中，HBV X抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:39的位点7-159、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:12的位点2-154、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:4的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:8的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:12的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:16的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:20的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:24的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:28的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:32的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:36的位点787-939、SEQ ID NO:92的位点873-1025、SEQID NO:96的位点90-242、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101的位点719-778、SEQ ID NO:102的位点635-694、SEQ ID NO:106的位点184-337、SEQ ID NO:106的位点521-674、SEQ ID NO:107的位点630-689、SEQ ID NO:108的位点630-689、SEQ ID NO:109的位点630-689、SEQ IDNO:110的位点630-689、SEQ ID NO:122的位点582-641、SEQ ID NO:124的位点810-869、SEQID NO:126的位点582-641、SEQ ID NO:130的位点1-60、SEQ ID NO:132的位点229-288、SEQID NO:134的位点1-60，或者来自不同HBV株的对应序列.
在该发明实施方案的一个方面中，融合蛋白具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:39的氨基酸序列，或者来自不同HBV株的对应序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
发明另一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，所述融合蛋白由HBV大表面抗原(L)的至少一个免疫原性结构域构成，其中组合物引发HBV特异性免疫反应。在该实施方案的一个方面中，HBV表面抗原由全长HBV大表面抗原(L)的至少95%构成。在一个方面中，HBV表面抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:93的位点90-488、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:11的位点21-47、SEQ ID NO:11的位点176-400、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34的位点9-407、SEQ ID NO:36的位点6-257、SEQ ID NO:41的位点6-257、SEQ ID NO:92的位点92-343、SEQ ID NO:93的位点90-488、SEQ ID NO:97,SEQ ID NO:101的位点90-338、SEQ ID NO:102的位点7-254、SEQ IDNO:107的位点1-249、SEQ ID NO:108的位点1-249、SEQ ID NO:109的位点1-249、SEQ IDNO:110的位点1-249、SEQ ID NO:112的位点1-399、SEQ ID NO:114的位点1-399、SEQ IDNO:116的位点1-399、SEQ ID NO:118的位点1-399、SEQ ID NO:120的位点1-399、SEQ IDNO:122的位点1-399、SEQ ID NO:124的位点1-399、SEQ ID NO:126的位点1-399、SEQ IDNO:128的位点231-629、SEQ ID NO:130的位点63-461、SEQ ID NO:132的位点289-687、SEQID NO:134的位点289-687，或者来自不同HBV株的对应序列。在一个方面中，融合蛋白具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:93的氨基酸序列，或者来自不同HBV株的对应序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
发明再一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV聚合酶抗原的融合蛋白，所述融合蛋白由HBV聚合酶的逆转录酶结构域的至少一个免疫原性结构域构成，其中组合物引发HBV特异性免疫反应。在该发明实施方案的一个方面中，HBV聚合酶抗原由HBV聚合酶的全长逆转录酶结构域的至少95%构成。在一个方面中，HBV聚合酶抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同，或者完全相同：SEQ ID NO:40的位点7-351、SEQ IDNO:94的位点90-434、SEQ ID NO:2的位点383-602、SEQ ID NO:6的位点381-600、SEQ IDNO:10的位点381-600、SEQ ID NO:10的位点453-680、SEQ ID NO:14的位点370-589、SEQ IDNO:18的位点380-599、SEQ ID NO:22的位点381-600、SEQ ID NO:26的位点380-599、SEQ IDNO:30的位点381-600、SEQ ID NO:36的位点260-604、SEQ ID NO:38的位点7-351、SEQ IDNO:41的位点260-604、SEQ ID NO:92的位点346-690、SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:101的位点339-566、SEQ ID NO:102的位点255-482、SEQ ID NO:107的位点250-477、SEQ ID NO:108的位点250-477、SEQ ID NO:109的位点250-477、SEQ ID NO:110的位点250-477、SEQ ID NO:120的位点582-809、SEQ ID NO:124的位点582-809、SEQ ID NO:126的位点642-869、SEQ IDNO:128的位点1-228、SEQ ID NO:132的位点1-228、SEQ ID NO:134的位点61-288，或者来自不同HBV株的对应序列。在一个方面中，融合蛋白具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:40或SEQID NO:94的氨基酸序列，或者来自不同HBV株的对应序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
发明另一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV核心抗原的融合蛋白，所述融合蛋白由HBV核心蛋白的至少一个免疫原性结构域构成，其中组合物引发HBV特异性免疫反应。在该发明实施方案的一个方面中，HBV抗原由全长HBV核心蛋白的至少95%构成。在一个方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:95的位点90-271、SEQ ID NO:1的位点31-212、SEQ ID NO:5的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点37-188、SEQ ID NO:13的位点31-212、SEQ ID NO:17的位点31-212、SEQ ID NO:21的位点31-212、SEQ ID NO:25的位点14-194、SEQ ID NO:29的位点31-212、SEQ ID NO:34的位点408-589、SEQ ID NO:36的位点605-786、SEQ ID NO:38的位点352-533、SEQ ID NO:39的位点160-341、SEQ ID NO:41的位点605-786、SEQ ID NO:92的位点691-872、SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:101的位点567-718、SEQID NO:102的位点483-634、SEQ ID NO:105的位点2-183、SEQ ID NO:105的位点184-395、SEQ ID NO:105的位点396-578、SEQ ID NO:105的位点579-761、SEQ ID NO:106的位点2-183、SEQ ID NO:106的位点338-520、SEQ ID NO:107的位点478-629、SEQ ID NO:108的位点478-629、SEQ ID NO:109的位点478-629、SEQ ID NO:110的位点478-629、SEQ ID NO:112的位点400-581、SEQ ID NO:114的位点400-581、SEQ ID NO:116的位点400-581、SEQ ID NO:118的位点400-581、SEQ ID NO:120的位点400-581、SEQ ID NO:122的位点400-581、SEQ IDNO:124的位点400-581、SEQ ID NO:126的位点400-581、SEQ ID NO:128的位点630-811、SEQID NO:130的位点462-643、SEQ ID NO:132的位点688-869、SEQ ID NO:134的位点688-869，或者来自不同HBV株的对应序列。在一个方面中，蛋白具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:95的氨基酸序列，或者来自不同HBV株的对应序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
发明再一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV X抗原的融合蛋白，所述融合蛋白由全长HBV X抗原的至少一个免疫原性结构域构成，其中组合物引发HBV特异性免疫反应。在一个方面中，HBV抗原由全长HBV X抗原的至少95%构成。在一个方面中，HBV X抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:96的位点90-242、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:12的位点2-154、SEQID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:4的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:8的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:12的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:16的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:20的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:24的位点52-68接着是位点84-126、SEQ IDNO:28的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:32的位点52-68接着是位点84-126、SEQID NO:36的位点787-939、SEQ ID NO:39的位点7-159、SEQ ID NO:92的位点873-1025、SEQID NO:100、SEQ ID NO:101的位点719-778、SEQ ID NO:102的位点635-694、SEQ ID NO:106的位点184-337、SEQ ID NO:106的位点521-674、SEQ ID NO:107的位点630-689、SEQ IDNO:108的位点630-689、SEQ ID NO:109的位点630-689、SEQ ID NO:110的位点630-689、SEQID NO:122的位点582-641、SEQ ID NO:124的位点810-869、SEQ ID NO:126的位点582-641、SEQ ID NO:130的位点1-60、SEQ ID NO:132的位点229-288、SEQ ID NO:134的位点1-60，或者来自不同HBV株的对应序列。在一个方面中，蛋白具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:96的氨基酸序列，或者来自不同HBV株的对应序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
发明另一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含任意两种、三种或四种以上或者本文其他地方描述的免疫治疗组合物，特别是任意两种、三种或四种以上描述的涉及单一HBV蛋白的免疫治疗组合物。
发明再一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由两个、三个或四个HBV表面抗原蛋白的至少一个免疫原性结构域构成，其中每个HBV表面抗原来自不同HBV基因型。组合物引发HBV特异性免疫反应。
发明再一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由两个、三个或四个HBV聚合酶蛋白的至少一个免疫原性结构域构成，其中每个HBV聚合酶蛋白来自不同HBV基因型。组合物引发HBV特异性免疫反应。
发明再一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由两个、三个或四个HBV X抗原的至少一个免疫原性结构域构成，其中每个HBV X抗原来自不同HBV基因型。组合物引发HBV特异性免疫反应。
发明再一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含:(a)酵母媒介物;和(b)包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原由两个、三个或四个HBV核心蛋白的至少一个免疫原性结构域构成，其中每个HBV核心蛋白来自不同HBV基因型。组合物引发HBV特异性免疫反应。在一个方面中，每个HBV核心蛋白由全长HBV核心蛋白的至少95%构成。在一个方面中，每个HBV核心蛋白由HBV核心蛋白的氨基酸31-212构成。在一个方面中，HBV基因型包括基因型C；在一个方面中，HBV基因型包括基因型D；在一个方面中，HBV基因型包括基因型A；在一个方面中，HBV基因型包括基因型B。在一个方面中，每个HBV核心蛋白由HBV核心蛋白的氨基酸37-188构成。在一个方面中，融合蛋白包含来自基因型A、基因型B、基因型C和基因型D的四个HBV核心蛋白。
在该发明实施方案的一个方面中，任何一或多个HBV核心抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:95的位点90-271、SEQ ID NO:1的位点31-212、SEQID NO:5的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点37-188、SEQ IDNO:13的位点31-212、SEQ ID NO:17的位点31-212、SEQ ID NO:21的位点31-212、SEQ IDNO:25的位点14-194、SEQ ID NO:29的位点31-212、SEQ ID NO:34的位点408-589、SEQ IDNO:36的位点605-786、SEQ ID NO:38的位点352-533、SEQ ID NO:39的位点160-341、SEQ IDNO:41的位点605-786、SEQ ID NO:92的位点691-872、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101的位点567-718、SEQ ID NO:102的位点483-634、SEQ ID NO:105的位点2-183、SEQ ID NO:105的位点184-395、SEQ ID NO:105的位点396-578、SEQ ID NO:105的位点579-761、SEQ ID NO:106的位点2-183、SEQ ID NO:106的位点338-520、SEQ ID NO:107的位点478-629、SEQ ID NO:108的位点478-629、SEQ ID NO:109的位点478-629、SEQ ID NO:110的位点478-629、SEQ IDNO:112的位点400-581、SEQ ID NO:114的位点400-581、SEQ ID NO:116的位点400-581、SEQID NO:118的位点400-581、SEQ ID NO:120的位点400-581、SEQ ID NO:122的位点400-581、SEQ ID NO:124的位点400-581,SEQ ID NO:126的位点400-581,SEQ ID NO:128的位点630-811、SEQ ID NO:130的位点462-643、SEQ ID NO:132的位点688-869、SEQ ID NO:134的位点688-869、或者来自不同HBV株的对应序列.在一个方面中，HBV抗原具有的氨基酸序列与SEQID NO:105的氨基酸序列，或者来自不同HBV株的对应序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
发明再一个实施方案涉及免疫治疗组合物，其包含：(a)酵母媒介物；和(b)包含至少两个HBV核心蛋白和至少两个HBV X抗原的融合蛋白，其中每个HBV核心蛋白来自不同HBV基因型，每个HBV X抗原来自不同HBV基因型。组合物引发HBV特异性免疫反应。在一个方面中，HBV基因型包括基因型C；在一个方面中，HBV基因型包括基因型D；在一个方面中，HBV基因型包括基因型A；在一个方面中，HBV基因型包括基因型B。在一个方面中，每个HBV核心蛋白由全长HBV核心蛋白的至少95%构成。在一个方面中，每个HBV核心蛋白由HBV核心蛋白的氨基酸31-212构成。在一个方面中，每个HBV核心蛋白由HBV核心蛋白的氨基酸37-188构成。在一个方面中，每个HBV X抗原由全长HBV X抗原的至少95%构成。在一个方面中，每个HBV X抗原包含HBV X抗原的氨基酸52-127。
在一个方面中，HBV核心抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQID NO:95的位点90-271、SEQ ID NO:1的位点31-212、SEQ ID NO:5的位点31-212、SEQ IDNO:9的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点37-188、SEQ ID NO:13的位点31-212、SEQ ID NO:17的位点31-212、SEQ ID NO:21的位点31-212、SEQ ID NO:25的位点14-194、SEQ ID NO:29的位点31-212、SEQ ID NO:34的位点408-589、SEQ ID NO:36的位点605-786、SEQ ID NO:38的位点352-533、SEQ ID NO:39的位点160-341、SEQ ID NO:41的位点605-786、SEQ ID NO:92的位点691-872、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101的位点567-718、SEQ ID NO:102的位点483-634、SEQ ID NO:105的位点2-183、SEQ ID NO:105的位点184-395、SEQ ID NO:105的位点396-578、SEQ ID NO:105的位点579-761、SEQ ID NO:106的位点2-183、SEQ ID NO:106的位点338-520、SEQ ID NO:107的位点478-629、SEQ ID NO:108的位点478-629、SEQ ID NO:109的位点478-629、SEQ ID NO:110的位点478-629、SEQ ID NO:112的位点400-581、SEQ IDNO:114的位点400-581、SEQ ID NO:116的位点400-581、SEQ ID NO:118的位点400-581、SEQID NO:120的位点400-581、SEQ ID NO:122的位点400-581、SEQ ID NO:124的位点400-581、SEQ ID NO:126的位点400-581、SEQ ID NO:128的位点630-811、SEQ ID NO:130的位点462-643、SEQ ID NO:132的位点688-869、SEQ ID NO:134的位点688-869，或者来自不同HBV株的对应序列。
在一个方面中，HBV X抗原的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ IDNO:96的位点90-242、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:12的位点2-154、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:4的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:8的位点52-68接着是位点84-126、SEQ IDNO:12的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:16的位点52-68接着是位点84-126、SEQID NO:20的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:24的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:28的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:32的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:36的位点787-939、SEQ ID NO:39的位点7-159、SEQ ID NO:92的位点873-1025、SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101的位点719-778、SEQ ID NO:102的位点635-694、SEQID NO:106的位点184-337、SEQ ID NO:106的位点521-674、SEQ ID NO:107的位点630-689、SEQ ID NO:108的位点630-689、SEQ ID NO:109的位点630-689、SEQ ID NO:110的位点630-689、SEQ ID NO:122的位点582-641、SEQ ID NO:124的位点810-869、SEQ ID NO:126的位点582-641、SEQ ID NO:130的位点1-60、SEQ ID NO:132的位点229-288、SEQ ID NO:134的位点1-60、或者来自不同HBV株的对应序列.
在该发明实施方案的一个方面中，融合蛋白具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:106的氨基酸序列,或者来自不同HBV株的对应序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同。
在本文，包括上文或下文描述的任何实施方案中，涉及融合蛋白、HBV抗原，或者包含所述融合蛋白或HBV抗原的免疫治疗组合物。在再一个实施方案中，融合蛋白的N端可以附加额外的序列。在一个方面中，N端序列选自与SEQ ID NO:3795%相同的氨基酸序列、与SEQ ID NO:8995%相同的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:9095%相同的氨基酸序列。在一个方面中，N端序列选自SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:37的位点1-5、SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90，或者来自不同HBV株的对应序列.
在以上或者本文其他地方描述的任何发明实施方案的一个方面中，融合蛋白由酵母媒介物表达。在以上或者本文其他地方描述的任何发明实施方案的另一个方面中，酵母媒介物是完整酵母。所述完整酵母在一个方面中是被杀死的。在一个方面中，完整酵母被热灭活。
在以上或者本文其他地方描述的任何发明实施方案的一个方面中，酵母媒介物所来自的酵母属选自：酵母菌属、假丝酵母属、隐球菌属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、裂殖酵母属和耶氏酵母属。在一个方面中，酵母媒介物来自酵母菌属。在一个方面中，酵母媒介物来自酿酒酵母。
在以上或者本文其他地方描述的任何发明实施方案的一个方面中，组合物被配制用于给予受试对象或患者。在一个方面中，组合物被配制成通过注射给予受试对象或患者(例如经胃肠外途径，比如皮下或腹腔内或肌内注射)。在一个方面中，组合物在适合给予人的药学上可接受的赋形剂中配制。在一个方面中，组合物含有90%以上的酵母蛋白。在一个方面中，组合物含有90%以上的酵母蛋白，并且配制成给予患者。
在以上或者本文其他地方描述的任何发明实施方案的一个方面中，融合蛋白在酵母中没有凝聚。在一个方面中，融合蛋白在酵母中不形成内含体。在一个方面中，融合蛋白不在酵母中形成VLPs或其他大的抗原颗粒。在一个方面中，融合蛋白在酵母中形成VLPs或其他大的抗原颗粒。
在以上或者本文其他地方描述的任何发明实施方案的一个方面中，在一个方面中，HBV序列来自HBV基因型A。在另一个方面中，HBV序列来自HBV基因型B。在另一个方面中，HBV序列来自HBV基因型C。在另一个方面中，HBV序列来自HBV基因型D。在另一个方面中，HBV序列来自HBV基因型E。在另一个方面中，HBV序列来自HBV基因型F。在另一个方面中，HBV序列来自HBV基因型G。在另一个方面中，HBV序列来自HBV基因型H。在一个方面中，HBV序列来自任何以上提到的HBV基因型或者任何已知的HBV基因型或基因亚型的组合。
发明另一个实施方案涉及作为本发明免疫治疗组合物一部分的以上描述的或者本文其他地方描述的任何融合蛋白。在该实施方案的一个方面中，融合蛋白包含HBV抗原，所述HBV抗原选自，但不限于：(a)由HBV大表面抗原(L)、HBV核心蛋白和HBV X抗原构成的HBV抗原；(b)由HBV大表面抗原(L)和HBV核心蛋白构成的HBV抗原；(c)由HBV大表面抗原(L)的前S1的肝细胞受体结构域、HBV小表面抗原(S)、HBV聚合酶的逆转录酶结构域、HBV核心蛋白或HBV e抗原，以及HBV X抗原构成的HBV抗原；(d)由HBV大表面抗原(L)、HBV聚合酶的逆转录酶结构域、HBV核心蛋白或HBV e抗原，以及HBV X抗原构成的HBV抗原；(e)由HBV大表面抗原(L)、HBV聚合酶的逆转录酶结构域和HBV核心蛋白构成的HBV抗原；(f)由HBV聚合酶(RT结构域)和HBV核心蛋白构成的HBV抗原；(g)由HBV X抗原和HBV核心蛋白构成的HBV抗原；(h)由HBV大表面抗原(L)的前S1的肝细胞受体结构域、HBV小表面抗原(S)、HBV聚合酶的逆转录酶结构域，以及HBV核心蛋白或HBV e抗原构成的HBV抗原；(i)由HBV大表面抗原(L)构成的HBV抗原；(j)由HBV核心抗原构成的HBV抗原；(k)HBV聚合酶，包括逆转录酶结构域构成的HBV抗原；(l)由HBV X抗原构成的HBV抗原；(m)由两个到四个HBV表面抗原、HBV聚合酶抗原、HBV核心抗原，或者HBV X抗原构成的HBV抗原，其中所述两个到四个HBV抗原来自不同HBV基因型；以及(n)由两个HBV核心抗原和两个HBV X抗原构成的HBV抗原，其中两个HBV核心抗原中的每一个或者两个HBV X抗原中的每一个来自不同HBV基因型。以上描述了涉及各个HBV抗原(包括可用于这些抗原的多种序列)的发明方面。
在该发明实施方案的一个方面中，融合蛋白包含的氨基酸序列与选自下述的氨基酸序列至少95%相同、或至少96%相同、或至少97%相同、或至少98%相同、或至少99%相同、或者完全相同：SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:128、SEQID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110。
发明另一个实施方案涉及编码本文描述的任何一个融合蛋白的重组核酸分子。在一个方面中，所述重组核酸分子包含的核酸序列选自，但不限于:SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ IDNO:129、SEQ ID NO:131或者SEQ ID NO:133。
发明再一个实施方案涉及分离的细胞，所述细胞转染了本文描述的任何重组核酸分子。在一个方面中，细胞是酵母细胞。
发明另一个实施方案涉及组合物，其包含本文描述的任何融合蛋白。发明再一个实施方案涉及组合物，其包含本文描述的任何重组核酸分子。发明另一个实施方案涉及组合物，其包含本文描述的任何分离的细胞。
发明再一个实施方案涉及治疗受试对象中乙型肝炎病毒(HBV)感染或者至少一个由HBV感染导致的症状的方法，所述方法包括给予感染了HBV的受试对象本文描述的任何免疫治疗组合物中的至少一个，包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治疗组合物。给予受试对象所述组合物减少受试对象中的HBV感染或者至少一个由HBV感染导致的症状。
发明再一个实施方案涉及引发抗HBV抗原的抗原特异性细胞介导的免疫反应的方法，所述方法包括给予受试对象本文描述的任何免疫治疗组合物中的至少一个，包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治疗组合物。
发明再一个实施方案涉及防止受试对象中HBV感染的方法，所述方法包括给予还未感染HBV的受试对象本文描述的一或多个组合物，包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治疗组合物。
发明另一个实施方案涉及将一个群体免疫抗HBV，所述方法包括给予所述群体本文描述的一或多个组合物，包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治疗组合物。
发明另一个实施方案涉及本文描述的任何一或多个组合物(包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治疗组合物)用于治疗HBV感染或其症状。
发明另一个实施方案涉及本文描述的任何一或多个组合物(包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治疗组合物)用于预防HBV感染或其症状。
发明再一个实施方案涉及本文描述的任何一或多个组合物(包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治疗组合物)在制备治疗HBV感染或其症状的药物中的用途。
发明再一个实施方案涉及本文描述的任何一或多个组合物(包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治疗组合物)在制备预防HBV感染或其症状的药物中的用途。
在涉及以上或者本文其他地方描述的发明方法或者用途的任何实施方案的一个方面中，方法可以包括给予本文描述的至少两、三、四或更多个组合物，包括任何HBV抗原、融合蛋白或者基于酵母的免疫治疗组合物。在一个方面中，可以给予其他能够预防或治疗HBV感染的组合物或化合物(例如抗病毒化合物、干扰素、其他免疫治疗组合物，或者它们的组合)。在一个方面中，各种组合物或化合物是同时给予个体的。在一个方面中，各种组合物或化合物是顺序给予个体的。在一个方面中，各种组合物中的每一个是通过注射到个体的不同部位给予的。在一个方面中，本发明的基于酵母的HBV免疫治疗组合物的单个剂量是每剂共40Y.U.-80Y.U.，等量地在个体的两个、三个或四个不同部位给予。
在涉及以上或者本文其他地方描述的发明方法或者用途的任何实施方案的一个方面中，给予受试对象组合物导致受试对象中血清转化或者提高了受试对象群体中的血清转换率。在一个方面中，给予受试对象组合物减少血清HBsAg或者造成受试对象中血清HBsAg丢失或者提高受试对象群体中血清HBsAg丢失率。在一个方面中，给予受试对象组合物减少血清HBeAg或者造成受试对象中血清HBeAg丢失或者提高受试对象群体中血清HBeAg丢失率。在一个方面中，给予受试对象组合物减少受试对象中的HBV病毒负荷或者提高受试对象群体中HBV病毒负荷的减少率。在一个方面中，给予受试对象组合物造成受试对象感染细胞内不能检测到HBV DNA，或者造成受试对象群体中HBV DNA阴性率更高。在一个方面中，给予受试对象组合物减少了受试对象中的肝损伤或提高了肝功，或者减少了受试对象群体中的肝损伤率或提高了肝功好转率。在一个方面中，给予受试对象组合物提高了受试对象或者受试对象群体中的ALT正常化。
在任何涉及本文描述的HBV抗原、融合蛋白、免疫治疗组合物，或者任何使用本文描述的HBV抗原、融合蛋白、免疫治疗组合物的方法的实施方案中，在一个方面中，组合物还包含至少一个生物反应调节剂，或者与之联用。在一个方面中，组合物还包含一或多个其他可用于治疗HBV感染或缓解症状的化合物，或者与之联用。在一个方面中，组合物还包含至少一个抗病毒化合物，或者与之联用。在一个方面中，抗病毒是核苷酸类似物逆转录酶抑制剂。抗病毒化合物可以包括，但不限于替诺福韦、拉米夫定、恩替卡韦、替比夫定、恩替卡韦以及它们的组合。在一个方面中，抗病毒化合物是替诺福韦。在一个方面中，抗病毒化合物是恩替卡韦。在一个方面中，组合物还包含至少一个干扰素，或者与之联用。在一个方面中，干扰素是干扰素α。在一个方面中，干扰素是聚乙二醇干扰素α2a。在一个方面中，干扰素是干扰素λ。
附图简述
图1的示意图显示了乙型肝炎病毒基因组排列。
图2的示意图显示了编码用于本发明基于酵母的免疫治疗组合物的HBV表面抗原/core融合蛋白的重组核酸分子基本结构。
图3的示意图显示了编码用于本发明基于酵母的免疫治疗组合物的HBV表面抗原/聚合酶/core/X融合蛋白的重组核酸分子基本结构。
图4的示意图显示了编码用于本发明基于酵母的免疫治疗组合物的HBV聚合酶/core融合蛋白的重组核酸分子基本结构。
图5的示意图显示了编码用于本发明基于酵母的免疫治疗组合物的HBV X/core融合蛋白的重组核酸分子基本结构。
图6的示意图显示了编码用于本发明基于酵母的免疫治疗组合物的HBV聚合酶融合蛋白的重组核酸分子基本结构。
图7的示意图显示了编码用于本发明基于酵母的免疫治疗组合物的HBV表面抗原/聚合酶/core融合蛋白的重组核酸分子基本结构。
图8的示意图显示了编码用于本发明基于酵母的免疫治疗组合物的HBV表面抗原/core/聚合酶融合蛋白的重组核酸分子基本结构。
图9的示意图显示了编码用于本发明基于酵母的免疫治疗组合物的HBV表面抗原/core/X融合蛋白的重组核酸分子基本结构。
图10的示意图显示了编码用于本发明基于酵母的免疫治疗组合物的HBV表面抗原/core/聚合酶/X融合蛋白的重组核酸分子基本结构。
图11的示意图显示了编码用于本发明基于酵母的免疫治疗组合物的HBV表面抗原/core/聚合酶融合蛋白的重组核酸分子基本结构。
图12的示意图显示了编码用于本发明基于酵母的免疫治疗组合物的HBV聚合酶/表面抗原/core融合蛋白的重组核酸分子基本结构。
图13的示意图显示了编码用于本发明基于酵母的免疫治疗组合物的HBV X/表面抗原/core融合蛋白的重组核酸分子基本结构。
图14的示意图显示了编码用于本发明基于酵母的免疫治疗组合物的HBV聚合酶/X/表面抗原/core融合蛋白的重组核酸分子基本结构。
图15的示意图显示了编码用于本发明基于酵母的免疫治疗组合物的HBV X/聚合酶/表面抗原/core融合蛋白的重组核酸分子基本结构。
图16的Western印迹数码图像显示了表达HBV表面抗原/Core融合蛋白的多个基于酵母的免疫治疗组合物的表达情况(热灭活的完整酵母)。
图17的Western印迹数码图像显示了表达HBV表面抗原/Core融合蛋白的多个基于酵母的免疫治疗组合物的表达情况(活的完整酵母)。
图18的Western印迹数码图像显示了表达HBV表面抗原/聚合酶/Core/X融合蛋白的多个基于酵母的免疫治疗组合物的表达情况。
图19的Western印迹数码图像显示了表达HBV表面抗原/聚合酶/Core/X融合蛋白的多个基于酵母的免疫治疗组合物的表达情况。
图20的Western印迹数码图像显示了多个基于酵母的免疫治疗组合物的表达情况，其表达包含表面-core融合蛋白(Sc)或表面-聚合酶-core-X融合蛋白(Sp)的HBV抗原。
图21的Western印迹数码图像显示了HBV抗原的表达情况，所述抗原来自培养在UL2培养基中的基于酵母的HBV免疫治疗组合物。
图22的条形图显示了HBV抗原的平均表达情况，所述抗原来自培养在UL2培养基或U2培养基中的多个基于酵母的HBV免疫治疗组合物(误差条带是标准差)。
图23的图形显示了脾CD4+T细胞应答S/Core抗原混合物或者II型MHC SAg模拟表位(mimetope)肽的增殖情况(误差条带是标准差)，所述T细胞来自用表达HBV表面-Core抗原(SCORE)的基于酵母的免疫治疗产物免疫的小鼠。
图24的图形显示了淋巴结T细胞应答S/Core抗原混合物或者II型MHCSag模拟表位肽的增殖情况(误差条带是标准差)，所述T细胞来自用表达HBV表面-Core抗原(SCORE)的基于酵母的免疫治疗产物免疫的小鼠。
图25的图形显示了淋巴结T细胞应答S/Core抗原混合物或者II型MHC SAg模拟表位肽的干扰素γ(IFN-γ)ELISpot反应，所述T细胞来自用表达HBV表面-Core抗原(SCORE)的基于酵母的免疫治疗产物免疫的小鼠。
图26的图显示了脾CD4+T细胞应答S/Core抗原混合物或者II型MHCSAg模拟表位肽的增殖情况(误差条带是标准差)，所述T细胞来自用表达HBV表面-Pol-Core-X抗原(以Spex表示)的基于酵母的免疫治疗产物免疫的小鼠。
图27的图显示了脾细胞中的IL-1β产生情况，所述脾细胞来自用下述免疫的小鼠:(a)基于酵母的免疫治疗产物，其表达HBV表面-Pol-E/Core-X抗原(以Sp表示)，左栏；或者(b)基于酵母的免疫治疗产物，其表达HBV表面-Core抗原(以Sc表示)(误差条带是标准差)。
图28的图显示了脾细胞中的IL-12p70产生情况，所述脾细胞来自用下述免疫的小鼠:(a)基于酵母的免疫治疗产物，其表达HBV表面-Pol-Core-X抗原(以Sp表示)，左栏；或者(b)基于酵母的免疫治疗产物，其表达HBV表面-Core抗原(以Sc表示)(误差条带是标准差)。
图29A和29B的图显示了脾细胞中的干扰素γ(IFN-γ)产生情况，所述脾细胞来自用下述免疫的小鼠:(图29A)基于酵母的免疫治疗产物，其表达HBV表面-Core抗原(以Sc表示)或者(图29B)基于酵母的免疫治疗产物，其表达HBV表面-Pol-Core-X抗原(以Sp表示)(误差条带是标准差)。
图30A-D的图显示了脾细胞中IL-1β(图30A)、IL-6(图30B)、IL-13(图30C)和IL-12p70(图30D)的产生情况，所述脾细胞来自用下述免疫的小鼠:(a)基于酵母的免疫治疗产物，其表达HBV表面-Pol-Core-X抗原(以Sp表示)，左栏；或者(b)基于酵母的免疫治疗产物，其表达HBV表面-Core抗原(以Sc表示)。
图31的条形图显示了用GI-13002或者GI-13002+抗CD40抗体，但没有YVEC免疫的小鼠，引发了与用表达HBV抗原的EL4肿瘤攻击时相当的保护(误差条带是标准差)。
图32的条形图显示了IFN-γELISpot检测结果，该检测比较了相对YVEC，用GI-13008(SCORE-C)和GI-13013(SPEXv2)免疫的小鼠用各种HBV肽和抗原的T细胞反应(误差条带是标准差)。
图33的条形图显示了对用GI-13002进行的刺激的IFN-γELISpot反应，所述GI-13002来自用预防性HBV疫苗免疫前和免疫后，以及给予强化剂后的人类受试对象。
图34的条形图显示了淋巴结细胞的HBV抗原特异性IFN-γELISpot反应，所述淋巴结细胞分离自用GI-13009(SCORE-D)或GI-13020(X-SCORE)免疫的HLA-A2转基因小鼠，相对用酵母对照(YVEC)免疫的小鼠(误差条带是标准差)。
图35的条形图显示了脾细胞的HBV抗原特异性IFN-γELISpot反应，所述脾细胞分离自用GI-13009(SCORE-D)免疫的HLA-A2转基因小鼠，相对用酵母对照(YVEC)免疫的小鼠(误差条带是标准误差)。
图36的条形图显示了淋巴结细胞的HBV抗原特异性IFN-γELISpot反应，所述淋巴结细胞分离自用GI-13009(SCORE-D)或GI-13020(X-SCORE)免疫的C57BL/6小鼠，相对用酵母对照(YVEC)免疫的小鼠或者初次试验小鼠(误差条带是标准差)。
图37的线形图显示了C57BL/6小鼠中对I型MHC限制性HBV肽的HBV抗原特异性CD8+T细胞反应，所述小鼠用GI-13009(SCORE-D)或GI-13020(X-SCORE)免疫，相对用酵母对照(YVEC)或基于酵母的免疫治疗表达卵清白蛋白(OVAX)免疫的小鼠。
图38的条形图显示了C57BL/6小鼠中对II型MHC限制性HBV肽的HBV抗原特异性CD4+T细胞反应，所述小鼠用GI-13009(SCORE-D)或GI-13020(X-SCORE)免疫，相对用酵母对照(YVEC)或基于酵母的免疫治疗表达卵清白蛋白(OVAX)免疫的小鼠。
发明详述
本发明一般地涉及用于防止和/或治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染的组合物和方法。发明包括基于酵母的免疫治疗组合物(又被称为“基于酵母的HBV免疫疗法”)，其包含酵母媒介物和HBV抗原，经过设计能够在个体中引发抗HBV感染的预防性和/或治疗性免疫反应；以及所述组合物在防止和/或治疗HBV感染及其相关症状中的用途。发明还包括用于发明所述的基于酵母的组合物中的重组核酸分子，以及它们编码的蛋白和融合蛋白在HBV感染的任何免疫治疗组合物和/或任何治疗性或预防性方案中的用途，包括任何结合了本发明的基于酵母的HBV特异性组合物和任何一种或多种其他HBV感染的治疗性或预防性组合物、试剂、药物、化合物和/或方案的治疗性或预防性方案。
在各种免疫疗法中，基于酵母的HBV特异性免疫治疗组合物的独特之处在于本发明的这些组合物能够诱发特异性靶向HBV的先天性免疫反应，以及适应性免疫反应，包括CD4依赖性TH17和TH1T细胞反应和抗原特异性CD8+T细胞反应。基于酵母的HBV特异性免疫疗法所引发的免疫反应的广度很适合靶向HBV。首先，据信HBV能够通过“藏起来”，不诱发先天性反应，因此在感染早期可以躲避先天性免疫反应，而不是直接抵消先天免疫(Wielandand Chisari,2005,J.Virol.15:9369-9380;Wieland,et al.,2004,PNAS USA101:6669-6674)。相应地，可以预期如果通过另一种机制，即本发明的基于酵母的免疫治疗组合物激活，HBV会对先天性免疫反应敏感。第二，HBV在被感染的宿主细胞中产生高水平的抗原表达，预计适应性免疫反应可以察觉到(Guidotti,et al.,1999,Science284:825-829;Thimme et al.,2003,J.Virol.77:68-76)，急性感染的清除与强力的CD4+和CD8+T细胞反应相关(Maini et al.,1999,Gastroenterol.117:1386-1396;Rehermann et al.,1995,J.Exp.Med.181:1047-1058;Thimme et al.,2003,J.Virol.77:68-76;Wieland andChisari,2005,J.Virol.15:9369-9380)。因此，预期基于酵母的HBV免疫疗法通过激活适应性免疫反应能够有效地靶向HBV感染的细胞进行破坏和/或有效地增强病毒清除。而且，基于酵母的免疫疗法所产生的免疫反应被认为既有干扰素独立性也有干扰素依赖性(Tamburini et al.,2012,J.Immunother.35(1):14-22)；相应地，个体对HBV治疗标准之一的基于干扰素的疗法有或没有响应的能力相信不会直接影响受试对象对本发明基于酵母的免疫疗法的响应能力。此外，本文描述的基于酵母的HBV免疫疗法组合物经设计可以靶向HBV的免疫原性和保守性区域、多个CTL表位并且包括HBV中那些可能用于靶向规避的区域(允许根据需要对组合物进行改进以靶向这类规避突变)，使它成为一种能够优化抗该病毒的有效免疫反应的高度适应性HBV疗法。
此外，尽管不被理论所约束，相信基于酵母的HBV免疫疗法所诱导的免疫反应不仅能够特异性地针对基于酵母的免疫治疗产物所携带的靶抗原，还能发展成可以针对病毒上的其他免疫表位(即,酵母-抗原组合物带有的那些之外的表位)。换句话说，对基于酵母的免疫治疗组合物所含抗原和/或表位的初级细胞免疫反应会导致次级细胞免疫反应，所述次级细胞免疫反应针对的抗原和/或表位是被治疗受试对象的感染细胞中存在的，而基于酵母的免疫治疗组合物中没有的。这样就发展出对每个被治疗受试对象来说特有的复合体和无法预计的免疫反应特性。这些次级免疫反应对每个被治疗受试对象的HBV感染分子谱是特异的。与其他治疗方式，包括其他免疫治疗平台相比，基于酵母的免疫治疗组合物可能以独特的方式推动这些下游效应。这种现象还可以大概地称为“表位扩展”，代表着使用基于酵母的HBV免疫疗法的一个优点，因为抗特定HBV抗原或者甚至抗特定HBV基因型的免疫反应的诱导(例如，通过在酵母免疫治疗组合物中提供抗原)预计会导致免疫系统级联靶向多种额外的HBV抗原，从而产生有效的免疫反应，能够对抗基于酵母的免疫治疗组合物中代表的那些抗原之外的来自不同HBV基因型或病毒株的抗原。
正如以上讨论过的，变成慢性HBV感染的患者倾向具有较弱的(或没有)和更狭隘的HBV特异性的T细胞介导的免疫。相应地，本发明的基于酵母的HBV免疫治疗组合物致力于解决治疗活跃感染HBV的患者(包括慢性感染患者)所需要的治疗组合物，并进一步提供了防止HBV感染的再一种疫苗，其具有产生持久性记忆免疫反应的优点。的确，本发明的基于酵母的HBV免疫治疗组合物预期能够促进抗HBV的持久性记忆T细胞反应(可以预防感染)，并且提供了保护慢性感染患者不发生病毒再激活的长期益处。基于酵母的HBV免疫治疗组合物作为单一疗法或者与其他用于治疗HBV的治疗方法联用(例如与抗病毒化合物联用)预期可以提高慢性感染患者中的下述百分比：实现清除HBsAg和HBeAg的患者、实现完全血清转化的患者和/或实现在治疗结束后保持病毒清除至少6个月的患者。
相应地，为了将个体中的病毒负荷降低到免疫系统能更有效地处理的水平，可以将基于酵母的HBV免疫疗法与抗病毒药物和/或干扰素疗法，和/或其他HBV疗法联用。HBV病毒效价一般非常高(可能有多达1011肝细胞被感染)，因此可能战胜个体发起有效CTL反应的能力；相应地，利用抗病毒药物减少病毒负荷结合利用基于酵母的免疫疗法减少HBV特异性CTL活性预计对被感染个体是有益的。此外，通过使用抗病毒药物减少病毒负荷可能还可以减少在大量被感染肝细胞被靶向破坏的情况下免疫激活的任何副作用。基于酵母的HBV免疫疗法预计还在减少和/或消除潜伏病毒感染的区室化中发挥作用。例如，通过PCR显示有许多组织是HBV阳性的，这些组织被认为是潜在的HBV再活化的庇护所。HBV DNA可以整合到宿主基因组中，使HBV能够以休眠态持续存在，cccDNA是超卷曲的HBV基因组的主要形式，也对休眠有贡献。不受到理论的约束，发明人相信本文描述的基于酵母的HBV免疫疗法在消除所有这些类型的可能造成了目前抗病毒方法中看到的无病治愈率低的HBV“庇护所”中都有作用。
在另一种情形中，单独使用或者与抗病毒或其他HBV疗法联合使用本发明的基于酵母的HBV免疫治疗组合物，如果足够实现完全清除HBsAg，但不能实现抗HB产生，可以随后使用或者进一步联用已有的预防性亚基疫苗来实现完全的血清转化。替代地，本文描述的任何一个融合蛋白还可以作为亚基疫苗单独地或者与本发明的基于酵母的HBV免疫治疗组合物联用，从而实现完全的血清转化，或者保护受试对象免于HBV感染。最后，本发明的免疫治疗组合物非常适于改造和/或与其他免疫治疗组合物(包括本文描述的任何免疫治疗组合物)联用，用于治疗抗病毒药物处理引起的HBV的规避突变。
基于酵母的免疫治疗组合物以生物学或药学上可接受的组合物给予。相应地，如本文描述的完整酵母媒介物必须适合，并且配制成适合对患者给药，而不是将酵母作为抗原生产系统，然后从酵母中纯化抗原。相反，现有的商品HBV疫苗以及许多开发中的HBV疫苗，包含在酿酒酵母中产生的随后通过破坏和纯化从酵母释放的重组HBV蛋白(例如，HBsAg蛋白)，因此最终的结合了佐剂(例如羟基磷酸铝硫酸盐或氢氧化铝)的疫苗不含可检测得到的酵母DNA，并且含有不超过1-5%的酵母蛋白。而本发明的基于酵母的HBV免疫治疗组合物含有很容易检测到的酵母DNA，并且含有远远大于5%的酵母蛋白；通常本发明的基于酵母的免疫治疗剂含有70%以上、80%以上或者一般是90%以上的酵母蛋白。
为了治疗和/或预防目的，将基于酵母的免疫治疗组合物给予患者以便对患者进行免疫。在发明的一个实施方案中，基于酵母的组合物被配制成在药学上可接受的赋形剂或制剂中给药。在一个方面中，组合物应当配制成适合给予人类受试对象(例如，生产条件应当适合在人体中使用，用于完成组合物和/或制备免疫治疗剂的给药剂量的任何赋形剂或配方应当适合在人体中使用)。在发明的一个方面中，基于酵母的免疫治疗组合物被配制成通过比如胃肠外途径注射(例如通过皮下、腹腔内、肌内或皮内注射，或者另一种合适的胃肠外途径)给予患者或受试对象。
在一个实施方案中，酵母表达抗原(例如，通过Western印迹可以检测到的)，并且抗原不会在酵母中凝聚，抗原不会在酵母中形成内涵体，和/或不会在酵母中形成很大的颗粒(VLPs)或其他大的抗原颗粒。在一个实施方案中，产生的抗原在酵母中是可溶性蛋白，和/或不从酵母中分泌出来，或者基本或主要不从酵母中分泌出来。在另一个实施方案中，不被理论约束，本发明人相信本文中详细描述的HBV融合蛋白中抗原(包括表面抗原和core抗原)的特定组合，可能还有抗原的排列会在表达抗原的酵母中形成VLPs或发生一定程度的凝聚。结果，酵母表达的抗原具有似乎与其整体结构和形式有关的免疫原性特性，这与抗原内带有的免疫表位(例如，T细胞表位)的免疫原性特性是分开的特征。当本发明的基于酵母的HBV免疫治疗剂中提供了表达这种融合蛋白的酵母时，免疫治疗组合物获得了激活先天性免疫系统的性能，这不仅是如以上讨论的来自酵母媒介物(象本文描述的所有基于酵母的免疫治疗剂)，部分还来自融合蛋白的抗原结构(例如，在酵母中表达的表面-core融合蛋白也具有类似佐剂的属性)；此外，正如本文描述的所有基于酵母的免疫治疗剂，免疫治疗组合物由于融合蛋白(通过提供各种T细胞表位)获得了以抗原特异性的方式激活适应性免疫系统的性能。这种特定的性能组合似乎是基于酵母的免疫治疗剂特有的，其中所述免疫治疗剂表达如文中所述的来自HBV的特定表面-core融合蛋白。但是，在本文描述的发明所有实施方案中，为了引发有效的抗HBV免疫反应，基于酵母的免疫治疗剂应当很容易被免疫系统的树突状细胞吞噬，酵母和抗原容易被这些树突状细胞加工。
本发明的组合物
本发明的一个实施方案涉及基于酵母的免疫治疗组合物，其可以被用于防止和/或治疗HBV感染和/或缓解HBV感染导致的至少一个症状。所述组合物包含:(a)酵母媒介物；和(b)一或多个包含HBV蛋白和/或其免疫原性结构域的抗原。在联合酵母媒介物的情况下，HBV蛋白最一般是由酵母媒介物(例如，由完整的酵母或酵母原生质体酵母原生质球，任选进一步加工为酵母胞质体、酵母空胞(yeast ghost)或者酵母膜提取物或其组分)表达为重组蛋白，虽然本发明的实施方案包括如文中所述将一或多个这种HBV蛋白加载到酵母媒介物中或者以其他方式与酵母媒介物一起复合化、附着、混合或者给药以形成本发明的组合物。根据本发明，在与本发明的酵母媒介物相关提到“异源”蛋白或“异源”抗原，包括异源融合蛋白时，意味着所述蛋白或抗原不是酵母天然表达的蛋白或抗原，虽然包含异源抗原或异源蛋白的融合蛋白可能也包含酵母天然表达的酵母序列或蛋白或者它们的组分(例如，如本文描述的α因子前原序列)。
发明的一个实施方案涉及各种HBV融合蛋白。在一个方面中，这种HBV融合蛋白可以用于本发明的基于酵母的免疫治疗组合物中。这种融合蛋白,和/或编码该蛋白的重组核酸分子还可以用于与不是基于酵母的免疫治疗组合物联用，或者用于产生不是基于酵母的免疫治疗组合物，所述组合物包括，但不限于DNA疫苗、蛋白亚基疫苗、重组的基于病毒的免疫治疗组合物、杀死的或灭活的病原体疫苗，和/或树突状细胞疫苗。在另一个实施方案中，这种融合蛋白可以用于HBV的诊断检测和/或用于生成抗HBV的抗体。本文描述的示范性HBV融合蛋白提供了HBV抗原选中的部分，例如聚合酶的选中部分和/或改造的聚合酶；表面抗原的选中部分和/或改造的表面抗原；核心的选中部分和/或改造的核心(包括e抗原的至少一部分或者大部分)；X抗原的选中部分和/或改造的X抗原；以及任何一、二、三或全部四种抗原(表面抗原、核心、X和聚合酶)的选中部分和/或排列，比如，但不限于表面抗原和核心(包括e抗原的至少一部分或者大部分)的选中部分和/或排列；表面抗原、核心(包括e抗原的至少一部分或者大部分)、聚合酶和X抗原的选中部分和/或排列；表面抗原、核心(包括e抗原的至少一部分或者大部分)和聚合酶的选中部分和/或排列；以及表面抗原、核心(包括e抗原的至少一部分或者大部分)和X抗原的选中部分和/或排列。
在一个实施方案中，本文描述的HBV抗原(包括全长蛋白的免疫原性结构域)被融合到宿主蛋白上，所述宿主蛋白在HBV感染的宿主细胞中过表达，而在未感染的细胞中没有过表达。在一个实施方案中，本文描述的HBV抗原(包括全长蛋白的免疫原性结构域)被融合到蛋白R2上，所述R2是HBV复制所需要的宿主因子，在一个实施方案中，在肝细胞中表达。R2是核糖核苷酸还原酶(RNR)的一个蛋白成分，对于HBV的生命周期非常关键(参见例如Cohenet al.,2010,Hepatol.51(5):1538-1546)。参照本文提供的公开，发明的其他实施方案是显而易见的。
乙肝病毒、基因和蛋白。乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝病毒家族的成员，在人和大猩猩类人猿中导致暂时和慢性肝脏感染。感染哺乳动物的嗜肝病毒具有相似的DNA序列和基因组安排，被划分在正嗜肝病毒(Orthohepadnavirus)属。乙型肝炎病毒颗粒的外被膜含有脂类和被称为HBsAg的表面抗原。含有核心蛋白(HBcAg)的核壳体core包围着病毒DNA和具有逆转录酶活性的DNA聚合酶。正如Seeger and Mason,2000,Microbiol.Mol.Biol.Rev.64(1):51-68中综述的，HBV具有一个3.2kb的部分双链松弛环形DNA(rcDNA)基因组，当病毒基因组被递送到感染肝细胞的细胞核时，被转化为共价闭合的环形双链DNA(cccDNA)分子。宿主细胞RNA聚合酶II由cccDNA转录出四个病毒RNAs，转运到宿主细胞细胞质。所述病毒RNAs包括转录后产生病毒核心和被膜结构蛋白以及前核心、聚合酶和X非结构病毒蛋白的mRNAs。被翻译产生core和聚合酶的RNA还作为前基因组RNA(pgRNA)，是逆转录的模板。pgRNA和聚合酶被核心蛋白包裹，产生病毒核壳体，pgRNA在此被逆转录为rcDNA。然后含有rcDNA的核壳体被被膜蛋白封闭，从宿主细胞分泌出来成为成熟的病毒粒子或者被运输到细胞核以便扩增病毒cccDNA。
表1中显示了HBV基因组产生的结构和非结构蛋白。部分双链的HBV基因组含有被称为C、X、P和S的四个基因(也可参见图1)。
表1.HBV基因和基因产物
Figure BDA0000394678840000421
基因C编码两个密切相关的抗原:一个21-kDa，被称为“核心蛋白”或“core抗原”(HBcAg)的蛋白，它能形成病毒衣壳；和17-kDa，被称为e抗原(HBeAg)的蛋白，它能形成二聚体，但不会组装成衣壳。全长核心蛋白是一个大概183个氨基酸的蛋白质，包含除了N端10个氨基酸的整个e抗原，并在C端含有大约34个额外的氨基酸，这34个氨基酸在产生e抗原时被蛋白水解切割掉。换句话说，核心蛋白和e抗原有149个共有的氨基酸残基(这个区段有时被称为肝炎core抗原)，但N端和C端区域不同。前核心蛋白是一个前体蛋白，包含的氨基酸序列含有来自core和e抗原的序列，由该蛋白经过蛋白水解加工产生e抗原。细胞内的HBeAg包含前核心残基-29到-1(本发明书中的残基编号是按照前核心蛋白内的核心蛋白的第一个氨基酸残基定义为位点“1”提供的)，这个区段含有信号序列，能够引导蛋白进入内质网，氨基酸-29到-11在此被切割；位于氨基酸149和150之间的另一个蛋白水解切割去除了前核心的C端部分(存在于全长核心蛋白中)，然后剩下的HBeAg(由前核心的氨基酸-10到-1加上HBcAg或core的氨基酸1-149构成)被分泌为e抗原(Standing et al.,1988,PNAS USA85:8405-8409;Ou et al.,1986,PNAS USA83:1578-1582;Bruss and Gerlich,1988,Virology163:268-275;Takahashi et al.,1983,J.Immunol.130:2903-2907)。在人血清中还发现了由整个前核心区域构成的HBeAg(Takahashi et al.,1992,J.Immunol.147:3156-3160)。正如提过的，HBcAg(core)形成二聚体组装成病毒衣壳，含有聚合酶和病毒DNA或pgRNA。HBeAg(e抗原)的功能未知，但它不是HBV复制或感染所必需的，被认为是保护HBV对抗免疫系统攻击的免疫抑制因子(Milich et al.,1990,PNAS USA87:6599-6603;Che etal.,2004,PNAS USA101:14913-14918;Wieland and Chisari,2005,J.Virol.79:9369-9380)。为了清楚起见，在本文描述的HBV序列中(例如，见表3)，提供了来自代表性HBV基因型的前核心的序列，并在前核心序列中标识了核心蛋白和e抗原的位点，其中前核心的第一个氨基酸被指定为位点1。
基因P编码HBV DNA聚合酶(Pol)，该酶由两个通过间隔区连接的主要结构域构成。聚合酶的N端结构域(又被称为“末端蛋白”或TP)参与pgRNA的包装和无义链DNA的合成引导。C端结构域是具有RNase H(RH)活性的逆转录酶(RT)。
基因S含有多个起始密码子，编码三个以S、M和L表示的被膜蛋白(文中还一般地称为“表面蛋白”或“表面抗原”)，它们均是感染性病毒颗粒的成分，又被称为Dane颗粒。S本身还与M和L一起形成表面抗原颗粒(HBsAg)，该表面抗原颗粒会从被感染细胞大量分泌(Seeger and Mason,2000,Microbiol.Mol.Biol.Rev.64(1):51-68;Beck,(2007),"Hepatitis B virus replication",World Journal of Gastroenterology:WJG13(1):48–64)。M和L的密码子分别位于S的起始密码子上游大约165(M)和489(L)个核苷酸处。S或“小”表面抗原是表面抗原中最小和最丰富的一种。产生的抗该抗原的抗体代表被感染个体中的血清转化。M或“中”表面抗原与S相比含有一个额外的蛋白结构域，被称为前S2，而L或“large”表面抗原特有的蛋白结构域被称为前S1(因此L也含有前S2和属于M和S的其他序列)。前S1含有大概位于前S1的氨基酸位点21和47之间的病毒肝细胞受体结构域(肝细胞受体结合位点)。前S1中的表位可以激发中和病毒的抗体。此外，前S1结构域提供了病毒被膜组装过程中核心颗粒的配体。表面抗原颗粒(HBsAg)可能还通过作为高剂量耐受原抑制免疫系统对感染细胞的清除(Reignat et al.,2002,J.Exp.Med.195:1089-1101;Webster etal.,2004,J.Virol.78:5707-5719)。
基因X编码的X抗原(HBx)(还称为“X蛋白”)参与转录反式激活、DNA修复途径的调控、提高胞浆的钙水平、蛋白降解途径的调制、在宿主细胞中的细胞周期进展和细胞增殖途径的调制(Gearhart et al.,2010,J.Virol.)，这增强了对HBV复制的刺激。HBx还与肝癌的进展相关(Kim et al.,Nature1991,351:317-320;Terradillos et al.,Oncogene1997,14:395-404)。
HBV是发现的四种主要血清型(adr、adw、ayr、ayw)之一，这些血清型的确定是根据病毒被膜蛋白内的抗原表位。根据基因组中的核苷酸序列变异共有八个不同的HBV基因型(A-H)。表2显示了基因型的地理分布(Kramvis et al.,2005,Vaccine23(19):2409-2423;Magnius and Norder,1995,Intervirology38(1-2):24-34;Sakamoto et al.,2006,J.Gen.Virol.87:1873-1882;Lim et al.,2006,Int.J.Med.Sci.3:14-20)。
表2
HBV基因型 流行地理分布
HBV/A 美洲、欧洲、非洲、东南亚
HBV基因型 流行地理分布
HBV/B 亚洲(中国、日本、东南亚)、美国
HBV/C 亚洲(中国、日本、东南亚)、美国
HBV/D 美国、地中海、中东和印度
HBV/E 撒哈拉以南非洲国家和西非
HBV/F 中南美洲
HBV/G 法国、德国、美国
HBV/H 中美洲、美国(加州)
HBV基因和所编码的蛋白的核酸和氨基酸序列对于每个已知基因型是已知的。表3提供的序列标识号是8个已知HBV基因型的所有HBV结构和非结构蛋白的示范性(代表性)氨基酸序列，并进一步表明了某些结构域的位点。其中指出了不同病毒分离株之间在相同的蛋白或者来自相同HBV基因型的结构域的氨基酸序列可能发生小的变异。但是，正如以上讨论的，HBV毒株和血清型以及HBV的基因型甚至在血清型和基因型之间也表现出高的氨基酸同一性(例如，参见表4)。因此，利用本文提供的指导和示范性HBV序列的参考文献，本领域技术人员可以容易地制备多种基于HBV的来自任何HBV株(分离物)、血清型或基因型的蛋白(包括融合蛋白)，以便用于本发明的组合物和方法，因此本发明不限于文中公开的特定序列。在本公开中任何地方提到的HBV蛋白或HBV抗原，或者它们的任何功能、结构或免疫原性结构域，可以通过参考本公开中给出的一或多个序列中的特定序列，或者通过参考来自不同HBV分离物(株)的相同、相似或对应序列。
表3
Figure BDA0000394678840000451
Figure BDA0000394678840000461
Figure BDA0000394678840000471
*位点编号是大概的，可能包含所指位点任意一侧邻接的其他氨基酸
乙型肝炎病毒抗原和构建体。发明的一个实施方案涉及新的HBV抗原和融合蛋白以及编码这些抗原和蛋白的重组核酸分子。本文描述了多种不同的新HBV抗原用于基于酵母的免疫治疗组合物或其他组合物(例如，其他免疫治疗性或诊断性组合物)，所述组合物提供了包含在相同融合蛋白并由相同重组核酸构建体(重组核酸分子)编码的一或多个(两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或更多)抗原和/或来自一或多个蛋白的免疫原性结构域。发明所述组合物中使用的抗原包含至少一个HBV蛋白或其免疫原性结构域用于免疫动物(预防性或治疗性)。组合物可以包含一个、两个、三个、四个、少数个、几个或复数个HBV抗原，包括一个、两个、三个、四个或更多个HBV蛋白的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个免疫原性结构域。在一些实施方案中，抗原是融合蛋白。在发明的一个方面中，融合蛋白可以包含两个或更多个蛋白。在一个方面中，融合蛋白可以包含两个或更多个免疫原性结构域，和/或一或多个蛋白的两个或更多个表位。含有这类抗原的免疫治疗组合物可能在大范围患者中提供抗原特异性免疫。例如，本发明涵盖的抗原融合蛋白可以包含选自下述的任何一个或多个HBV蛋白的至少一部分或者全长:HBV表面蛋白(又称为表面抗原或被膜蛋白或HBsAg)，包括大(L)、中(M)和/或小(S)形式的表面蛋白，和/或它们的前S1和/或前S2结构域；HBV前核心蛋白；HBV核心蛋白(又称为核心抗原或HBcAg)；HBV e抗原(又称为HBeAg)；HBV聚合酶(包括聚合酶的一个或者两个结构域，即RT结构域和TP结构域)；HBV X抗原(又称为X、X抗原或HBx)；和/或一或多个这些HBV抗原的任何一个或多个免疫原性结构域。在一个实施方案中，可用于本发明的免疫治疗组合物的抗原来自单个HBV蛋白(全长、几乎全长、或全长蛋白中包含至少一个、两个、三个、四个或更多个免疫原性结构域的一部分)。在发明的一个实施方案中，免疫治疗组合物包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个单独的酵母媒介物，每个表达或含有不同的HBV抗原。
可以用于本发明的HBV抗原组合包括，但不限于(在融合蛋白中处于任何顺序):
(1)表面蛋白(L,M和/或S，和/或它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合，包括但不限于前S1和/或前S2和/或前S1的肝细胞受体结构域)，与下述任何一个或多个的组合:(a)前核心/核心/e(前核心、核心、e抗原，和/或它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合);(b)聚合酶(全长、RT结构域、TP结构域，和/或它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合)；和/或(c)X抗原(或者它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合)；
(2)前核心/核心/e(前核心、核心、e抗原,和/或它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合)，与下述任何一个或多个的组合:(a)表面蛋白(L、M和/或S，和/或它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合，包括但不限于前S1和/或前S2和/或前S1的肝细胞受体结构域)；(b)聚合酶(全长、RT结构域、TP结构域，和/或它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合)；和/或(c)X抗原(或者它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合)；
(3)聚合酶(全长、RT结构域、TP结构域，和/或它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合)，与下述任何一个或多个的组合:(a)表面蛋白(L、M和/或S，和/或它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合，包括但不限于前S1和/或前S2和/或前S1的肝细胞受体结构域);(b)前核心/核心/e(前核心、核心、e抗原，和/或它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合)；和/或(c)X抗原(或者它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合)；或者
(4)X抗原(或者它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合)，与下述任何一个或多个的组合:(a)表面蛋白(L、M和/或S，和/或它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合，包括但不限于前S1和/或前S2和/或前S1的肝细胞受体结构域)；(b)聚合酶(全长、RT结构域、TP结构域，和/或它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合)；和/或(c)前核心/核心/e(前核心、核心、e抗原,和/或它们的功能性和/或免疫结构域中的任何一个或组合)。
正如本发明的一个实施方案，重组核酸分子及其编码的蛋白(包括融合蛋白)可以用在基于酵母的免疫治疗组合物中，或者任何其他HBV抗原合适的目的中，包括用于体外分析、抗体的生成或者另一个不是本文描述的基于酵母的免疫疗法的免疫治疗组合物(包括另一个疫苗)。由酵母表达蛋白是优选的实施方案，虽然可以使用其他表达系统来产生蛋白，以便用于基于酵母的免疫治疗组合物之外的应用。
根据本发明，术语“抗原”在本文的一般用法是指:蛋白(肽、部分代表、全长蛋白)的任何部分，其中蛋白是天然产生的或者合成的；细胞成分(完整细胞、细胞裂解物或者被破碎的细胞)；生物体(完整生物体、裂解物或破损的细胞)；或者碳水化合物、或其他分子或者它们的一部分。所述抗原可能引发抗原特异性免疫反应(例如，体液和/或细胞介导的免疫反应)，针对免疫系统元件(例如T细胞、抗体)遭遇的相同或相似抗原。
抗原可以小到单个表位、单个免疫原性结构域，或者更大一些，包括多个表位或免疫原性结构域。因此抗原的大小可以只有大约8-12个氨基酸(即，肽)，也可以达到全长蛋白、多聚体、融合蛋白、嵌合蛋白、完整细胞、完整微生物或其任何部分(例如，完整细胞的裂解物或者微生物的提取物)。此外，抗原可以包含碳水化合物，可以被载入酵母媒介物或者本发明的组合物中。可以理解在一些实施方案(例如，当抗原是由酵母媒介物从重组核酸分子表达的)中，抗原是蛋白、融合蛋白、嵌合蛋白、或者它们的片段，而不是完整的细胞或微生物。
当抗原在酵母中表达时，抗原处于能在酵母中重组表达的最小体积，通常长度是至少或大于25个氨基酸、或至少或大于26、至少或大于27、至少或大于28、至少或大于29、至少或大于30、至少或大于31、至少或大于32、至少或大于33、至少或大于34、至少或大于35、至少或大于36、至少或大于37、至少或大于38、至少或大于39、至少或大于40、至少或大于41、至少或大于42、至少或大于43、至少或大于44、至少或大于45、至少或大于46、至少或大于47、至少或大于48、至少或大于49或者至少或大于50个氨基酸，或者至少25-50个氨基酸长、至少30-50个氨基酸长、或者至少35-50个氨基酸长、或者至少40-50个氨基酸长、或者至少45-50个氨基酸长。可以表达较小的蛋白，也可以表达颇大的蛋白(例如，长几百个氨基酸，甚至几千个氨基酸)。在一个方面中，可以表达全长蛋白、或者N和/或C端缺少一或多个氨基酸(例如N和/或C端缺少大约1到大约20个氨基酸)的它的结构或功能结构域、或者它的免疫原性结构域。融合蛋白和嵌合蛋白也是本发明可以表达的抗原。“靶抗原”是被本发明的免疫治疗组合物特异靶向的抗原(即，希望引起针对它的免疫反应的抗原)。“HBV抗原”是由一或多个HBV蛋白衍生、设计或生产的，因此靶向所述抗原也就靶向了乙肝病毒。
提到免疫反应的刺激时，术语“免疫原”是术语“抗原”的子集，因此在一些情况中，可以与术语“抗原”交换使用。用于本文的免疫原描述了引发体液和/或细胞介导的免疫反应(即是免疫原性的)的抗原，因此将免疫原给予个体会发动抗原特异性免疫反应，针对与个体免疫系统遭遇的相同或相似的抗原。在一个实施方案中，免疫原引发细胞介导的免疫反应，包括CD4+T细胞反应(例如，TH1,TH2和/或TH17)和/或CD8+T细胞反应(例如，CTL反应)。
给定蛋白的“免疫原性结构域”可以是抗原中含有至少一个在给予动物时能够作为免疫原的部分、片段或表位(例如，肽片段或亚基或抗体表位或其他构象表位)。因此，免疫原性结构域大于单个氨基酸，大小要至少足够含有可以作为免疫原的至少一个表位。例如，单个蛋白可以含有多个不同的免疫原性结构域。免疫原性结构域不需要是蛋白内的线性序列，比如在体液免疫反应的情况中，考虑了构象结构域。
给定蛋白的“功能性结构域”是蛋白中这样的部分或者功能单位，所述部分或单位包含的序列或结构直接或间接负责至少一个与蛋白相关的、属于该蛋白的或者蛋白执行的生物或化学功能。例如，功能结构域可以包括酶活性的活性部位、配体结合位点、受体结合位点、分子或部分(比如钙)的结合位点、磷酸化部位或者反式激活结构域。HBV的功能性结构域的例子包括，但不限于前S1中的病毒肝细胞受体结构域，或者聚合酶的逆转录酶结构域或RNase H结构域。
给定蛋白的“结构结构域”是具有可鉴定结构(例如)的蛋白部分或者蛋白整体结构中的元件，它们可以自我稳定和/或独立于蛋白的其他部分折叠。结构结构域往往与它所属蛋白的生物功能相关或者是蛋白的突出特点。
表位在本文定义为给定抗原中的单个免疫原性位点，所述免疫原性位点在被提供给免疫系统(对于合适的共刺激信号的情况)和/或活化的免疫系统细胞时足以引发免疫反应。换句话说，表位是抗原中真正被免疫系统成分识别的部分，还可以被称为抗原决定簇。本领域技术人员可以认识到T细胞表位与B细胞或者抗体表位的大小和组成不同，通过I型MHC途径呈递的表位与通过II型MHC途径呈递的表位在大小和结构特性上不同。例如，通过I型MHC分子呈递的T细胞表位通常长度在8-11氨基酸，而通过II型MHC分子呈递的表位的长度没有太多限制，可以在8个氨基酸到25个氨基酸或更长。此外，根据表位结合的特定MHC分子，T细胞表位有预测得到的结构特点。在各种HBV毒株中和许多人HLA型鉴定到了多种不同T细胞表位，表5中确认了其中的几个。此外，本文中最新发现了某些鼠MHC单倍型的表位，显示在表5或实施例中。表位可以是线性序列表位或者构象表位(保守结合区)。多数抗体识别构象表位。
本发明的一个示范性实施方案涉及包含HBV抗原的融合蛋白；所述HBV抗原是多蛋白HBV抗原，在这个例子中，如下文详细描述的是由HBV大(L)表面抗原(包括所有疏水性跨膜结构域)和core抗原(HBcAg)构成的融合。表面抗原和core在感染细胞中表达丰富，是病毒复制所必需的，并且含有多个CD4+和CD8+T细胞表位。此外，这些抗原，特别是表面抗原含有可以被抗病毒疗法诱导的已知的突变位点；因此可以根据需要对这些区域进行改造以便提供其他的免疫治疗组合物来靶向这些“逃避”突变。靶向这些蛋白，特别是单一免疫治疗组合物中的这两种蛋白的另外一个优势是不同HBV基因型在氨基酸水平上的高度保守。例如，美洲和亚洲流行(表2)的HBV基因型A和C之间或者A和H之间core和表面(L)蛋白都是高度保守的(见表4)。核心蛋白在基因型A和C之间，以及基因型A和H之间表现出95%的氨基酸同一性。大(L)表面蛋白在不同HBV基因型中也是高度保守的；在基因型A和C之间显示90%的氨基酸同一性，在基因型A和H之间显示82%的氨基酸同一性。
表4
比较 Core 表面(L) X 聚合酶
HBV基因型Avs.HBV基因型C 95 90 89 90
HBV基因型Avs.HBV基因型H 95 82 79 82
因此，可以预见利用一个HBV基因型设计的一个免疫治疗组合物能够通过直接靶向保守表位或者通过一开始靶向基因型之间的保守表位而发生的表位扩展，诱导抗高度相似的HBV基因型的有效免疫反应。替代地，由于本发明的基于酵母的免疫治疗组合物易于生产，为了提高该免疫疗法的应用广泛性，容易想到改造序列以便编码来自不同基因型的蛋白、结构域或表位，或者在同一个构建体中包含上来自两个或更多个不同HBV基因型的不同T细胞表位或整个结构域和/或蛋白。下文中详细描述和示范了这类HBV抗原的例子。本发明的一个免疫治疗组合物经过设计可以在单个产品中针对两个HBV抗原(表面和核心蛋白)，这个方法可以方便地扩展到引入其他关键的保守免疫原性HBV病毒蛋白的蛋白序列，从而导致更广泛的细胞免疫反应。本文描述和示范了其他额外的融合蛋白和免疫治疗组合物。
在发明的一个实施方案中，用于本发明的组合物或方法的HBV抗原选自那些经过设计，其作为临床产品(包括基于酵母的免疫治疗组合物的情况)的用途得到了优化或加强的HBV抗原。这些HBV抗原经过设计制备的基于酵母的HBV免疫治疗产品实现了以下目的中的一或多个:(1)遵从National Institutes of Health(NIH)的Recombinant DNAAdvisory Committee(RAC)指南，其中重组治疗剂或疫苗中不能使用超过三分之二(2/3)的感染剂基因组；(2)包含最大数量的已知T细胞表位，所述T细胞表位与对急性/自限性HBV感染和/或慢性HBV感染的免疫反应相关(如下文中讨论的，一个方面中优先级基于急性/自限性表位库)；(3)最大化或优先化包括免疫原性结构域，特别是这样的T细胞表位(CD4+和/或CD8+表位，以及优势和/或亚优势表位)，所述T细胞表位在HBV基因型和/或亚基因型中是最保守的，或者可以容易地被改造为共有序列或者以两种或更多种形式包含以便覆盖目标基因型中最重要的序列差别；和/或(4)最小化产品中HBV抗原序列内的非天然连接。
相应地，在一些实施方案中，发明包括将HBV抗原从它们在给定毒株中的天然或者野生型序列改造为符合一或多个以上描述的标准，以及包含本文其他地方描述的设计元件和/或抗原设计准则。这样的标准化抗原设计准则适用于包含HBV抗原的基于酵母的免疫治疗剂，其中所述HBV抗原是单独的HBV蛋白或结构域，以及包含HBV蛋白或结构域组合的HBV抗原，特别是多蛋白抗原/融合蛋白(例如，来自两个或更多个不同HBV蛋白和/或其结构域的HBV抗原，比如来自HBV表面蛋白、聚合酶、核心、e抗原和/或X抗原的抗原组合)。可以理解，随着HBV抗原的复杂度增加，抗原的构建中要应用更多这些标准。
因此，在发明的一个实施方案中，用于本发明作为通过酵母表达的蛋白或融合蛋白的HBV抗原包括核苷酸序列编码的HBV序列，所述核苷酸序列代表不超过三分之二(2/3)的HBV基因组(即，编码抗原的全部核酸序列占HBV基因组的三分之二(2/3)以下或者符合重组治疗剂和预防剂的RAC规定)。在一个方面中，该实施方案可以通过选择其全长或接近全长形式即满足RAC规定(例如X抗原较小，单独使用可以满足RAC规定)的HBV抗原在基于酵母的免疫治疗剂中表达来实现。在另一方面中，该实施方案的实现可以通过改造HBV抗原中包含的蛋白和/或结构域的结构，比如通过删除序列来截短蛋白或去除蛋白的内部序列；通过只包含蛋白中的选中的功能、结构或免疫原性结构域；或者通过选择在抗原构建体中完全不包含某个特定蛋白。此外，在一个实施方案中，HBV基于酵母的免疫治疗剂可以制备为单个抗原构建体，然后以不违反任何与病毒基因组相关的限制的方式组合使用。
在发明的另一实施方案中，正如上文讨论过的，HBV抗原构建体(蛋白或融合蛋白)中包含的T细胞表位被最大化，例如如果免疫治疗剂中包含的HBV抗原经过改造以符合另一个设计考虑，比如象上文讨论过的RAC规定。在该实施方案中，可以在基于酵母的免疫治疗剂中使用的HBV抗原为了最大化免疫原性结构域数量的目的被改造；在一个方面中，T细胞表位在HBV抗原中的数量得到保持。在一个方面中，按照以下优先HBV抗原中包含的T细胞表位：
在对急性/自限性HBV感染和慢性HBV感染的免疫反应中鉴定到的表位>在对急性/自限性HBV感染的免疫反应中鉴定到的表位>在对慢性HBV感染的免疫反应中鉴定到的表位。
在该实施方案中，不受到理论的约束，发明人相信来自患有急性或自限性HBV感染的个体的免疫反应可能比来自患有慢性HBV感染的个体的免疫反应能更好地消除病毒感染。因此，包含那些似乎与这些急性或自限性感染中病毒清除的T细胞表位(无论是优势或亚优势)由于更可能在被免疫的个体中引发有益免疫反应而被优先选择。此外，同样不被理论约束，发明人相信利用基于酵母的免疫疗法产生的抗一或多个HBV靶抗原的免疫反应在被免疫个体中造成的免疫反应不仅会针对基于酵母的免疫治疗剂中包含的表位，还会针对个体中存在的其他HBV表位。这种被称为“表位扩展”的现象使得可以将HBV抗原的设计集中在似乎最具有治疗益处的表位，和基于酵母的免疫治疗产品的作用机制，然后允许免疫系统将免疫反应扩展到覆盖其他目标表位，从而增强抗HBV的有效或有益的治疗性免疫反应。
相应地，一个实施方案中的HBV抗原包含一或多个CTL表位(例如，在合适的I型MHC分子情况下，被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的表位)。在一个方面中，HBV抗原包含一或多个CD4+T细胞表位(例如，在合适的II型MHC分子情况下，被CD4+T细胞的T细胞识别的表位)。在一个方面中，HBV抗原包含一或多个CTL表位以及一或多个CD4+T细胞表位。在一个方面中，可用于本发明的免疫治疗组合物的HBV抗原包含表5中描述的示范性HBV CTL表位中的一或多个。根据下文提供的指导，本领域技术人员可以容易地鉴定到表5中每个表位在任何基因型、亚基因型或者毒株/分离物中对应序列的位点，虽然一些氨基酸可能与表5中的不同。表5中展示了这种不同的例子。本发明不限于包含这些表位的抗原，因为现有技术中还有其他已知的，并且考虑了它们在发明中的应用。在一个实施方案中，可以对表位进行改造以便对应给定HBV基因型、亚基因型或毒株/分离物内的表位序列，因为这些表位在所述基因型、亚基因型或毒株/分离物之间可能有一或多个氨基酸不同。
表5
Figure BDA0000394678840000551
Figure BDA0000394678840000561
Figure BDA0000394678840000571
Figure BDA0000394678840000581
Figure BDA0000394678840000591
Figure BDA0000394678840000601
**在SEQ ID NO:43的位点9、SEQ ID NO:36的位点225，以Ala取代Val。
Figure BDA0000394678840000602
在SEQ ID NO:46的位点5和6、SEQ ID NO:34的位点357和358，以Gln-Ala取代Leu-Val。
Figure BDA0000394678840000603
在SEQ ID NO:50的位点3、SEQ ID NO:10的位点455，以Pro取代Ser。
§在SEQ ID NO:51的位点2、SEQ ID NO:12的位点116和SEQ ID NO:36的位点901，以Val取代Leu。
‖在SEQ ID NO:54的位点9、SEQ ID NO:9的位点56、SEQ ID NO:34的位点433和SEQID NO:36的位点630，以Ile取代Val。
***表位序列和相应更大蛋白或结构域的实际序列之间可能由于基因型、亚基因型或毒株差异存在一或多个氨基酸不同，虽然可以容易地确定表位在所述更大蛋白或结构域内的位点。
1Zhang et al.,Journal of Hepatology50:1163-1173(2009)
2Lopes et al.,J.Clin.Invest.118:1835-1845(2008)
3Boettler et al.,J Virol80(7):3532-3540(2006)
4Peng et al.,Mol.Immunol.45:963-970(2008)
5Desmond2008;www.allelefrequencies.net or Desmond et al.,AntiviralTher.13:16-175(2008)
6Webster et al.,2004,J.Virol.78(11)5707-5719
7Vitiello,1997,Eur.J.Immunol.27(3):671-678
8Sette et al.,1994,J.Immunol.153(12):5586-5592
9Murine H-2Db表位，以前没有报道
10Murine H-2Kb表位，以前没有报道
在发明的一个实施方案中，有用的HBV抗原可以包括在一或多个基于酵母的免疫治疗组合物中包含一或多个T细胞表位的抗原，所述T细胞表位被描述或者确定为“优势”表位(即对抗整个蛋白的T细胞反应的发展有贡献的T细胞表位，和/或在一大组可能的表位中相对少量的最可能或最容易引发CD4+和CD8+T细胞反应的T细胞表位，又被称为“免疫优势表位”)。在另一个实施方案中，可以用于发明的HBV抗原包括在相同或不同或其他基于酵母的组合物中包含一或多个T细胞表位的HBV抗原，所述所述T细胞表位被描述或者确定为“亚优势”表位(即所述T细胞表位是免疫原性的，但比免疫优势表位的程度低一些；亚优势表位生成的免疫反应可能被免疫优势表位的免疫反应抑制或取代)。对于小鼠中对HBV T细胞表位的CTL反应的这个效应，参见Schirmbeck R.,et al.J.immunology168:6253-6262,2010；或者Sette et al.J Immunology166:1389-1397,2001。在发明的一个方面中，可以在个体的相同部位，或者在一个实施方案中在个体的不同部位给予包含免疫优势或亚优势表位的不同组合物(即包含优势表位的组合物被给予一个部位，包含亚优势表位的组合物被给予不同的部位)。在一些情况中，亚优势表位可能引发比优势表位在治疗上更有益的免疫反应。因此，如果给予分开的表位，可能降低针对优势表位的免疫反应抑制或者取代针对亚优势表位的免疫反应的机会，从而最大化整个免疫反应以及最大化对个体的保护或治疗效果。这种在给予个体不同部位的不同组合物中提供不同抗原的方法也可以在所有表位都是优势的或者亚优势的情况下使用。已经认识到免疫优势表位和亚优势表位在HBV感染和免疫反应中发挥作用(参见例如Sette et al.,2001,同前，和Schirmbeck et al.,2002,同前)。
在发明的一个实施方案中，可以在基于酵母的免疫治疗剂中使用的HBV抗原最大化包含免疫原性结构域，特别是那些在基因型和/或亚基因型之间保守的T细胞表位；和/或包括来自几个不同基因型和/或亚基因型的免疫原性结构域；和/或包括可以容易地经过改造产生多种基于酵母的免疫治疗产物的免疫原性结构域，所述多种免疫治疗产物在某些次要方面不同，但能够根据感染个体或个体群的HBV基因型或亚基因型，针对性地治疗所述不同个体或个体群。例如，可以根据想要保护或者治疗的个体或个体群中最流行的基因型或亚基因型来产生HBV抗原，并且HBV抗原包括来自那些基因型的最保守的免疫原性结构域。替代地或者除此之外的，可以将免疫原性结构域改造以便对应该结构域或表位的共有序列，或者构建体中可以包含表位的一个以上的版本。
在本发明涉及基于酵母的免疫治疗组合物中使用的HBV抗原的设计的任何实施方案中，在一个方面中，包含HBV抗原的融合蛋白中区段之间的人工连接被最小化(即，包含的非天然序列被限制或者最小化到可能的程度)。不受到理论的约束，相信自然进化已经产生:i)病毒中最可能在另一个细胞(比如酵母)中良好表达的连续序列；或ii)抗原呈递细胞中的免疫蛋白酶体，可以适当地消化这些序列并呈递给免疫系统。本发明基于酵母的免疫治疗产物使得宿主免疫系统能够加工和呈递目标抗原；相应地，与保持较多天然HBV蛋白序列的融合蛋白相比，带有许多非天然连接的融合蛋白可能在基于酵母的免疫治疗剂中用处更小。
在本文描述的任何HBV抗原，包括任何融合蛋白中，可以适用以下额外的实施方案。首先，某些融合蛋白中包含的N端表达序列和C端标签是任选的，如果使用了，可以从本文其他地方描述的几个不同序列中选择以便提高蛋白的表达、稳定性，和/或鉴定和/或纯化。替代地，可以完全省略N或C端序列中的一个或者两者。此外，本领域已知许多不同的启动子适合在酵母中使用，包括在本发明中用于表达HBV抗原。再者，有多种原因可以在融合蛋白的部分之间引入短的间隔连接序列(例如，1、2、3、4或5或者更大的氨基酸肽)，这些原因包括引入限制酶切位点以便协助克隆和以后对构建体的操作。最后，正如文中其他地方详细讨论的，本文描述的序列是示范性的，可以象文中其他地方描述的，对它们进行改造以取代、添加或删除序列从而容纳对HBV基因型、HBV亚基因型、HBV株或分离物、或者共有序列和包含优选的T细胞表位(包括优势和/或亚优势T细胞表位)的偏好。下文中提供了可以用于发明的几个不同示范性HBV抗原的描述。
在本文描述的任何发明实施方案中，包括涉及免疫治疗组合物、HBV抗原、融合蛋白或者所述组合物、HBV抗原或融合蛋白的用途的任何实施方案中，在一个方面中，可以作为HBV抗原或者用于本发明的融合蛋白或免疫治疗组合物的HBV表面抗原的氨基酸可以包括，但不限于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:11的位点21-47、SEQID NO:11的位点176-400、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQID NO:31、SEQ ID NO:34的位点9-407、SEQ ID NO:36的位点6-257、SEQ ID NO:41的位点6-257、SEQ ID NO:92的位点92-343、SEQ ID NO:93的位点90-488、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:101的位点90-338、SEQ ID NO:102的位点7-254、SEQ ID NO:107的位点1-249、SEQ ID NO:108的位点1-249、SEQ ID NO:109的位点1-249、SEQ ID NO:110的位点1-249、SEQ ID NO:112的位点1-399、SEQ ID NO:114的位点1-399、或SEQ ID NO:116的位点1-399、SEQ ID NO:118的位点1-399、SEQ ID NO:120的位点1-399、SEQ ID NO:122的位点1-399、SEQ ID NO:124的位点1-399、SEQ ID NO:126的位点1-399、SEQ ID NO:128的位点231-629、SEQ ID NO:130的位点63-461、SEQ ID NO:132的位点289-687、SEQ ID NO:134的位点289-687，或者来自不同HBV株的对应序列。
在本文描述的任何发明实施方案中，包括涉及免疫治疗组合物、HBV抗原、融合蛋白或者所述组合物、HBV抗原或融合蛋白的用途的任何实施方案中，在一个方面中，可以作为HBV抗原或者用于本发明的融合蛋白或免疫治疗组合物的HBV聚合酶抗原的氨基酸可以包括，但不限于SEQ ID NO:2的位点383-602、SEQ ID NO:6的位点381-600、SEQ ID NO:10的位点381-600、SEQ ID NO:10的位点453-680、SEQ ID NO:14的位点370-589、SEQ ID NO:18的位点380-599、SEQ ID NO:22的位点381-600、SEQ ID NO:26的位点380-599、SEQ ID NO:30的位点381-600、SEQ ID NO:36的位点260-604、SEQ ID NO:38的位点7-351、SEQ ID NO:40的位点7-351、SEQ ID NO:41的位点260-604、SEQ ID NO:92的位点346-690、SEQ ID NO:94的位点90-434、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:101的位点339-566、SEQ ID NO:102的位点255-482、SEQ ID NO:107的位点250-477、SEQ ID NO:108的位点250-477、SEQ ID NO:109的位点250-477、SEQ ID NO:110的位点250-477、SEQ ID NO:120的位点582-809、SEQ ID NO:124的位点582-809、SEQ ID NO:126的位点642-869、SEQ ID NO:128的位点1-228、SEQ IDNO:132的位点1-228、SEQ ID NO:134的位点61-288，或者来自不同HBV株的对应序列.
在本文描述的任何发明实施方案中，包括涉及免疫治疗组合物、HBV抗原、融合蛋白或者所述组合物、HBV抗原或融合蛋白的用途的任何实施方案中，在一个方面中，可以作为HBV抗原或者用于本发明的融合蛋白或免疫治疗组合物的HBV核心抗原的氨基酸可以包括，但不限于SEQ ID NO:1的位点31-212、SEQ ID NO:5的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点31-212、SEQ ID NO:9的位点37-188、SEQ ID NO:13的位点31-212、SEQ ID NO:17的位点31-212、SEQ ID NO:21的位点31-212、SEQ ID NO:25的位点14-194、SEQ ID NO:29的位点31-212、SEQ ID NO:34的位点408-589、SEQ ID NO:36的位点605-786、SEQ ID NO:38的位点352-533SEQ ID NO:39的位点160-341、SEQ ID NO:41的位点605-786、SEQ ID NO:92的位点691-872、SEQ ID NO:95的位点90-271、SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:101的位点567-718、SEQID NO:102的位点483-634、SEQ ID NO:105的位点2-183、SEQ ID NO:105的位点184-395、SEQ ID NO:105的位点396-578、SEQ ID NO:105的位点579-761、SEQ ID NO:106的位点2-183、SEQ ID NO:106的位点338-520、SEQ ID NO:107的位点478-629、SEQ ID NO:108的位点478-629、SEQ ID NO:109的位点478-629、SEQ ID NO:110的位点478-629、SEQ ID NO:112的位点400-581、SEQ ID NO:114的位点400-581、SEQ ID NO:116的位点400-581、SEQ ID NO:118的位点400-581、SEQ ID NO:120的位点400-581、SEQ ID NO:122的位点400-581、SEQ IDNO:124的位点400-581、SEQ ID NO:126的位点400-581、SEQ ID NO:128的位点630-811、SEQID NO:130的位点462-643、SEQ ID NO:132的位点688-869、SEQ ID NO:134的位点688-869，或者来自不同HBV株的对应序列.
在本文描述的任何发明实施方案中，包括涉及免疫治疗组合物、HBV抗原、融合蛋白或者所述组合物、HBV抗原或融合蛋白的用途的任何实施方案中，在一个方面中，可以作为HBV抗原或者用于本发明的融合蛋白或免疫治疗组合物的HBV X抗原的氨基酸可以包括，但不限于SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:12的位点2-154、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:4的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:8的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:12的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:16的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:20的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:24的位点52-68接着是位点84-126、SEQ IDNO:28的位点52-68接着是位点84-126、SEQ ID NO:32的位点52-68接着是位点84-126、SEQID NO:36的位点787-939、SEQ ID NO:39的位点7-159、SEQ ID NO:92的位点873-1025、SEQID NO:96的位点90-242、SEQ ID NO:100,SEQ ID NO:101的位点719-778、SEQ ID NO:102的位点635-694、SEQ ID NO:106的位点184-337、SEQ ID NO:106的位点521-674、SEQ ID NO:107的位点630-689、SEQ ID NO:108的位点630-689、SEQ ID NO:109的位点630-689、SEQ IDNO:110的位点630-689、SEQ ID NO:122的位点582-641、SEQ ID NO:124的位点810-869、SEQID NO:126的位点582-641、SEQ ID NO:130的位点1-60、SEQ ID NO:132的位点229-288、SEQID NO:134的位点1-60，或者来自不同HBV株的对应序列。
包含表面抗原和核心蛋白的HBV抗原。在发明的一个实施方案中，用于本发明的组合物或方法的HBV抗原是包含HBV抗原的融合蛋白，其中HBV抗原包含HBV大(L)表面抗原或其至少一个免疫原性结构域以及HBV核心蛋白(HBcAg)或其至少一个免疫原性结构域，或者由它们构成。在一个方面中，HBV大(L)表面抗原和/或HBV核心蛋白是全长或接近全长的。根据本发明的任何实施方案，提到“全长”蛋白(或全长功能性结构域或全长免疫结构域)包括蛋白或功能性结构域或免疫结构域的全长氨基酸序列，正如本文中描述的或其他方式已知的或者公开序列中描述的。同样是蛋白的一种同源物的“接近”全长蛋白或结构域与全长蛋白或结构域的区别在于在全长蛋白或全长结构域的N和/或C端添加或缺失或省略了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。一般性地提到蛋白或结构域可以包括全长和接近全长蛋白，以及它们的其他同源物。
在一个方面中，HBV大(L)表面抗原或HBV核心蛋白包含下述序列的至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%：全长HBV大(L)表面抗原或HBV核心蛋白各自的线性序列；HBV大表面抗原的一部分的线性序列，所述部分包含前S1的肝细胞受体结合部分和HBV小(S)表面抗原的全部或部分；SEQ ID NO:97(经优化的HBV表面抗原，描述见下文)、SEQ ID NO:99(经优化的核心蛋白，描述见下文)代表的线性氨基酸序列；或者适用的情况下，包含来自另一个HBV毒株的对应序列。文中描述了可以用于本发明的合适HBV表面抗原或HBV核心抗原的多种其他序列。在一个方面中，HBV大(L)表面抗原或HBV核心蛋白与下述序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同：分别的全长HBV大(L)表面抗或HBV核心蛋白；文中描述的另一个HBV表面抗或HBV核心抗原，包括SEQ IDNO:97(优化的HBV表面抗原，描述见下文)、SEQ ID NO:99(优化的核心蛋白,描述见下文)所代表的氨基酸序列；或者适用的情况下，来自另一个HBV毒株的对应序列。
图2中示意了这样的融合蛋白。实施例1描述了包含这种融合蛋白的组合物的一个例子。在该实施方案中，如图2所示，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造在铜诱导启动子CUP1或TEF2启动子的调控下表达各种HBV表面-core融合蛋白。每种情况中，HBV融合蛋白是单个多肽，以SEQ ID NO:34为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)赋予对蛋白酶体降解抗性或表达稳定性的N端肽(例如，SEQ ID NO:34的位点1-6)；2)引入SpeI限制酶切位点的双氨基酸间隔区；3)接近全长(除去位点1)的HBV基因型C大(L)表面抗原的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:34的位点9-407或者SEQ ID NO:11(其与SEQ ID NO:34的差别在于SEQ ID NO:11的位点350-351，在这里SEQ ID NO:11的Leu-Val序列被SEQ ID NO:34位点357-358的Gln-Ala序列代替))的位点2-400；4)HBV核心抗原的氨基酸序列(例如，SEQID NO:9的位点31-212；或者SEQ ID NO:34的位点408-589)；和5)六组氨酸标签(例如，SEQID NO:34的位点590-595)。SEQ ID NO:34的位点28-54包含大(L)表面蛋白的肝细胞受体部分。SEQ ID NO:34含有多个被认为能够增强融合蛋白的免疫原性的表位或结构域。例如，相对SEQ ID NO:34来说的位点209-220、位点389-397、位点360-367和位点499-506包含已知的I型MHC结合和/或CTL表位。SEQ ID NO:34的位点305-328包含抗体表位。编码SEQ ID NO:34的融合蛋白的核酸序列(为了在酵母中表达对密码子进行了优化)在文中以SEQ ID NO:33代表。表达该融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在文中还以GI-13002表示。
用于本文描述的任何融合蛋白的氨基酸区段可以通过使用额外的氨基酸进行改造，所述额外的氨基酸侧接在任何结构域的任意一侧；这里提供的描述是示范性的。例如，根据本实施方案的融合蛋白可以包含1)接近全长(除去位点1)的HBV基因型C大(L)表面抗原(例如，SEQ ID NO:11的位点2-400或SEQ ID NO:34的位点9-407)的氨基酸序列；和2)HBV核心抗原(例如，SEQ ID NO:9的位点31-212或者SEQ ID NO:34的位点408-589)的氨基酸序列，不使用N或C端序列，或者使用不同N或C端序列和/或HBV序列之间有或没有接头。在一个实施方案中，代替以SEQ ID NO:34的位点1-6为代表的N端肽，使用了以SEQ ID NO:89或SEQID NO:90为代表的N端肽，之后是融合蛋白的其余部分，包括或者不包括六组氨酸的C端标签。融合蛋白还可以包含位于HBV蛋白或结构域之间的一、二、三、四、五、六或更多个连接(间隔)氨基酸。如本文所述，同样的替代实施方案还适用发明使用的任何融合蛋白或HBV抗原构建体。
用于设计这个融合蛋白和文中描述和/或举例的许多其他融合蛋白的HBV序列基于特定HBV基因型(例如，基因型A、B、C或D)的分离物。然而，发明的一个实施方案是向本文描述的基于或者来源于一个特定基因型、亚基因型或毒株的HBV抗原的任何部分添加或者取代来自任何其他HBV基因型、亚基因型或毒株的一个对应序列，或者甚至对应序列中发生的单个或小的氨基酸取代、插入或缺失。在一个实施方案中，可以通过将本文描述的HBV抗原的完整序列用来自一或多个不同HBV基因型、亚基因型或毒株/分离物的对应序列取代来产生HBV抗原。添加或者用来自一个HBV基因型或亚基因型的序列取代另一个使得能够例如将免疫治疗组合物针对特定个体或个体群(例如，为了针对在某个国家或该国家地区最流行的HBV基因型，所述国家或国家地区内的个体群)定制。类似地，本发明还有一个实施方案使用从给定HBV毒株、基因型或亚型来源的、确定的或者公开的共有序列的全部或一部分对给定HBV抗原的序列进行改变，从而更紧密地或者完全对应共有序列。根据本发明和本领域的一般理解，“共有序列”通常是将多重序列比对后，给定序列中某个特定位点最常见的核苷酸或氨基酸。
作为以上提到的改造类型的一个具体例子，可以对HBV抗原进行改造，从而将来自一个分离物的给定序列中的T细胞表位改变为与来自不同分离物的T细胞表位，或者T细胞表位的共有序列更紧密地或者完全对应。这类T细胞表位可以包括优势表位和/或亚优势表位。的确，根据发明，可以设计这样的HBV抗原，所述HBV抗原引入了来自各种HBV基因型和/或亚型的共有序列，或者来自不同HBV基因型和/或亚型的混合序列。利用可以显示生成共有序列的公用软件，可以容易地由来自各个主要已知基因型的示范性序列生成主要HBV蛋白比对。此外，已经公开了许多HBV蛋白的共有序列。因为不同HBV基因型、亚基因型和毒株之间在氨基酸水平上高度保守，很容易想到利用来自本文示范的那些之外的基因型、亚型或毒株的对应HBV蛋白部分制备与文中描述的那些有相似或相同整体结构的HBV抗原。文中阐述并示范了这类改造的例子。
作为例子，即使是相同血清型或基因型以内的同一个蛋白的序列也可能有细微差别(即，由于毒株或分离物变异)，虽然这种序列同一性的差别通常在被比较的序列的全长范围内低于20%(即，序列至少80%相同)，更一般来说，在被比较的序列的全长范围内，序列至少85%相同、90%相同、91%相同、92%相同、93%相同、94%相同、95%相同、96%相同、97%相同、98%相同、99%相同、或者100%相同。例如，在以上描述的融合蛋白(SEQ ID NO:34)中，融合蛋白中使用的大(L)表面抗原序列(SEQ ID NO:34的位点9-407)来自HBV基因型C分离物，与SEQ ID NO:11的位点2-400大约99%相同，SEQ ID NO:11也是来自HBV基因型C分离物的大(L)表面抗原(即，与SEQ ID NO:34(Leu-Val)的位点357-358相比，SEQ ID NO:11(Gln-Ala)的位点350-351有两个不同氨基酸。但是，与来自其他HBV毒株的序列一样，这两个序列都适合在本文描述的融合蛋白中使用。相应地，在一个实施方案中，本文描述的任何HBV抗原(包括文中描述的任何一个融合蛋白)中使用的序列可以包括来自一或多个不同HBV基因型、亚基因型或毒株的对应序列。
以上描述的对共有序列或个别HBV基因型的使用已经应用到本文描述的各种HBV抗原。例如，共有序列设计已被应用到上文描述的融合蛋白中，可参考含有HBV表面蛋白和HBV核心蛋白的SEQ ID NO:34。实施例7描述的其他融合蛋白与SEQ ID NO:34所代表的融合蛋白在设计上类似，但是分别基于HBV基因型A、B、C和D的共有序列。图2也示意了这样的融合蛋白，其包含的HBV表面和核心蛋白基于HBV基因型A的共有序列，所述融合蛋白是单个多肽，以SEQ ID NO:112(SEQ ID NO:112的基本序列中没有包含不是HBV序列的任选序列，但可以象实施例7中描述的构建体那样加入该序列)为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽，可以用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸连接序列，每个序列有一、二、三或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser；(3)接近全长(除去位点1)的HBV基因型A大(L)表面抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:112的位点1-399为代表；4)HBV基因型A核心抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:112的位点400-581为代表；和(5)任选地，六组氨酸标签。编码SEQ ID NO:112的融合蛋白的核酸序列(为了在酵母中表达对密码子进行了优化)在文中以SEQ ID NO:111代表。表达该融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在文中又被称为GI-13006。
实施例7还描述的融合蛋白与SEQ ID NO:34所代表的融合蛋白在设计上类似，但是基于HBV基因型B的共有序列。这个也在图2中示意的融合蛋白是单个多肽，以SEQ ID NO:114(SEQ ID NO:114的基本序列中没有包含非HBV序列的任选序列，但可以象实施例7中描述的构建体那样加入该序列)为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽，可以用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸连接序列，每个序列有一、二、三或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser；(3)接近全长(除去位点1)的HBV基因型B大(L)表面抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:114的位点1-399为代表；4)HBV基因型B核心抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:114的位点400-581为代表；和(5)任选地，六组氨酸标签。编码SEQ IDNO:114的融合蛋白的核酸序列(为了在酵母中表达对密码子进行了优化)在文中以SEQ IDNO:113代表。表达该融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在文中又被称为GI-13007。
实施例7还描述的融合蛋白与SEQ ID NO:34所代表的融合蛋白在设计上类似，但是基于HBV基因型C的共有序列。这个也在图2中示意的融合蛋白是单个多肽，以SEQ ID NO:116(SEQ ID NO:116的基本序列中没有包含非HBV序列的任选序列，但可以象实施例7中描述的构建体那样加入该序列)为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽，可以用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸连接序列，每个序列有一、二、三或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser；(3)接近全长(除去位点1)的HBV基因型C大(L)表面抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:116的位点1-399为代表；4)HBV基因型C核心抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:116的位点400-581为代表；和(5)任选地，六组氨酸标签。编码SEQ IDNO:116的融合蛋白的核酸序列(为了在酵母中表达对密码子进行了优化)在文中以SEQ IDNO:115代表。表达该融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在文中又被称为GI-13008。
实施例7还描述的融合蛋白与SEQ ID NO:34所代表的融合蛋白在设计上类似，但是基于HBV基因型D的共有序列。这个也在图2中示意的融合蛋白是单个多肽，以SEQ ID NO:118(SEQ ID NO:118的基本序列中没有包含非HBV序列的任选序列，但可以象实施例7中描述的构建体那样加入该序列)为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽，可以用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸连接序列，每个序列有一、二、三或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser；(3)接近全长(除去位点1)的HBV基因型D大(L)表面抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:118的位点1-399为代表；4)HBV基因型D核心抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:118的位点400-581为代表；和(5)任选地，六组氨酸标签。实施例7中描述的包含SEQ ID NO:118并含有N-和C-端肽以及接头的完整融合蛋白的氨基酸序列以SEQID NO:151表示。编码SEQ ID NO:118或SEQ ID NO:151的融合蛋白的核酸序列(为了在酵母中表达对密码子进行了优化)在文中以SEQ ID NO:117代表。表达该融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在文中又被称为GI-13009。
包含表面抗原、核心蛋白、聚合酶和X抗原的HBV抗原。在发明的一个实施方案中，用于本发明的组合物或方法中的HBV抗原是包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原包含下述，或者由它们构成:HBV表面抗原(大(L)、中(M)或小(S)或其至少一个结构的、功能的或者免疫原性结构域)；HBV聚合酶或其至少一个结构的、功能的或者免疫原性结构域；HBV核心蛋白(HBcAg)或HBV e抗原(HBeAg)或其至少一个结构的、功能的或者免疫原性结构域；以及HBV X抗原(HBx)或其至少一个结构的、功能的或者免疫原性结构域。在一个方面中，HBV表面抗原、HBV聚合酶、HBV核心蛋白、HBV e抗原、HBV X抗原或者它们的结构域中的任何一或多个是全长或接近全长的。在一个方面中，HBV表面抗原、HBV聚合酶、HBV核心蛋白、HBVe抗原、HBV X抗原或者它们的结构域中的任何一或多个分别包含下述序列的至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%：全长HBV表面抗原、HBV聚合酶、HBV核心蛋白、HBV e抗原、HBV X抗原或者它们的结构域的线性序列；SEQ ID NO:97(优化的HBV表面抗原，描述见下文)、SEQ ID NO:98(优化的HBV聚合酶，描述见下文)、SEQ ID NO:99(优化的核心蛋白，描述见下文)、SEQ ID NO:100(优化的X抗原，描述见下文)所代表的线性氨基酸序列；或者适合的情况下，来自另一个HBV毒株的对应序列。在一个方面中，HBV表面抗原、HBV聚合酶、HBV核心蛋白、HBV e抗原、HBV X抗原或者它们的结构域中的任何一或多个分别与下述序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同：全长HBV表面抗原、HBV聚合酶、HBV核心蛋白、HBV e抗原、HBV X抗原或者它们的结构域；或者SEQ ID NO:97(优化的HBV表面抗原,描述见下文)、SEQ ID NO:98(优化的HBV聚合酶，描述见下文)、SEQID NO:99(优化的核心蛋白，描述见下文)或SEQ ID NO:100(优化的X抗原，描述见下文)所代表的氨基酸序列；或者适合的情况下，来自另一个HBV毒株的对应序列。本文描述了HBV表面抗原、HBV聚合酶抗原、HBV核心抗原和HBV X抗原的多种合适的示范序列。
在发明的一个实施方案中，用于本发明的组合物或方法中的HBV抗原是包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原包含下述，或者由它们构成:HBV大(L)表面抗原的前S1的肝细胞受体部分或其至少一个免疫原性结构域；HBV小(S)表面抗原(HBsAg)或其至少一个免疫原性结构域；HBV聚合酶的逆转录酶(RT)结构域或其至少一个免疫原性结构域；HBV核心蛋白(HBcAg)或其至少一个免疫原性结构域；以及HBV X抗原(HBx)或其至少一个免疫原性结构域。在一个方面中，HBV大(L)表面抗原的前S1的肝细胞受体部分、HBV小(S)表面抗原(HBsAg)、HBV聚合酶的RT结构域、HBV核心蛋白、X抗原或者它们的结构域中的任何一或多个是全长或接近全长的。在一个方面中，HBV大(L)表面抗原的前S1的肝细胞受体部分、HBV小(S)表面抗原、HBV聚合酶的RT结构域、HBV核心蛋白、X抗原或者它们的结构域中的任何一或多个分别包含下述序列的至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%：全长HBV大(L)表面抗原的前S1、HBV小(S)表面抗原、HBV聚合酶的RT结构域、HBV核心蛋白、X抗原或者它们的结构域的线性序列。在一个方面中，HBV大(L)表面抗原的前S1的肝细胞受体部分、HBV小(S)表面抗原、HBV聚合酶的RT结构域、HBV核心蛋白、X抗原或者它们的结构域中的任何一或多个分别与下述序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同：全长HBV大(L)表面抗原的前S1、HBV小(S)表面抗原、HBV聚合酶的RT结构域、HBV核心蛋白、X抗原或者它们的结构域。
图3中示意了这样的融合蛋白。实施例2描述了包含这种融合蛋白的组合物的一个例子。在该实施方案中，如图3所示，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造在铜诱导启动子CUP1或TEF2启动子的调控下表达各种HBV融合蛋白。在一个例子中，HBV融合蛋白是单个多肽，以SEQ ID NO:36为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:1)赋予对蛋白酶体降解抗性或表达稳定性的N端肽(例如，SEQ ID NO:36的位点1-5)；2)HBV基因型C的HBV大(L)表面抗原的前S1肝细胞受体部分(L所特有的)的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:11的位点21-47或者SEQ ID NO:36的位点6-32)；3)全长HBV基因型C小(S)表面抗原的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:11的位点176-400或者SEQ ID NO:36的位点33-257)；4)用于协助克隆和操作序列的双氨基酸间隔区(例如，SEQ ID NO:36的位点258和259)；5)HBV基因型C聚合酶中包含逆转录酶结构域部分的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:10的位点247-691或者SEQID NO:36的位点260-604)；6)HBV基因型C核心蛋白(例如，SEQ ID NO:9的位点31-212或者SEQ ID NO:36的位点605-786)；7)HBV基因型CX抗原的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:12的位点2-154或者SEQ ID NO:36的位点787-939)；和8)六组氨酸标签(例如，SEQ ID NO:36的位点940-945)。编码SEQ ID NO:36的融合蛋白的核酸序列(为了在酵母中表达对密码子进行了优化)在文中以SEQ ID NO:35代表。表达该融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在文中以GI-13005表示。
在该实施方案的一个替代例子中，根据以上或下文描述的实施方案的融合蛋白可以包含1)HBV基因型C的HBV大(L)表面抗原的前S1肝细胞受体部分(L所特有的)的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:11的位点21-47或者SEQ ID NO:36的位点6-32)；2)全长HBV基因型C小(S)表面抗原的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:11的位点176-400或者SEQ ID NO:36的位点33-257)；3)HBV基因型C聚合酶中包含逆转录酶结构域部分的氨基酸序列(例如，SEQ IDNO:10的位点247-691或者SEQ ID NO:36的位点260-604)；4)HBV基因型C核心蛋白(例如，SEQ ID NO:9的位点31-212或者SEQ ID NO:36的位点605-786)；和5)HBV基因型C X抗原的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:12的位点2-154或者SEQ ID NO:36的位点787-939)，没有使用N或C端序列，或者使用不同的N或C端序列，和/或在HBV序列之间使用了接头或者没有接头。
在一个实施方案中，代替SEQ ID NO:36的位点1-5所代表的N端肽，使用了以SEQID NO:89或SEQ ID NO:90为代表的N端肽(或者它们的同源物)，之后是所述的融合蛋白的其余部分。实施例2描述了这样的融合蛋白，图3中也有对该蛋白的构建体的示意图。在这个实施方案中，酵母(例如，酿酒酵母)再次经过改造在铜诱导启动子CUP1或TEF2启动子的调控下表达图3示意的各种HBV融合蛋白。在这个第二个例子中，融合蛋白是单个多肽，以SEQID NO:92为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)赋予对蛋白酶体降解抗性或提高表达的N端肽(SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:92的位点1-89)；2)用于协助克隆和操作序列的双氨基酸间隔区/接头(Thr-Ser)(SEQ ID NO:92的位点90-91)；3)HBV基因型C的HBV大(L)表面抗原的前S1肝细胞受体部分(L所特有的)的氨基酸序列(例如，SEQ IDNO:11的位点21-47或者SEQ ID NO:92的位点92-118)；4)全长HBV基因型C小(S)表面抗原的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:11的位点176-400或者SEQ ID NO:92的位点119-343)；5)用于协助克隆和操作序列的双氨基酸间隔区/接头(Leu-Glu)(例如，SEQ ID NO:92的位点344-345)；6)HBV基因型C聚合酶中包含逆转录酶结构域部分的氨基酸序列(例如，SEQ IDNO:10的位点247-691或者SEQ ID NO:92的位点346-690)；7)HBV基因型C核心蛋白(例如，SEQ ID NO:9的位点31-212或者SEQ ID NO:92的位点691-872)；8)HBV基因型C X抗原的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:12的位点2-154或者SEQ ID NO:92的位点873-1025)；以及9)六组氨酸标签(例如，SEQ ID NO:92的位点1026-1031)。编码SEQ ID NO:92的融合蛋白的核酸序列(为了在酵母中表达对密码子进行了优化)在文中以SEQ ID NO:91代表。表达该融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在文中以GI-13004表示。
SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:92含有多个被认为能够增强融合蛋白的免疫原性的表位或结构域，包括上文给SEQ ID NO:34描述的几个。此外，该融合蛋白中使用的逆转录酶结构域含有几个氨基酸位点，已知在用各种抗病毒药物处理后作为一种抗药反应会发生突变，因此可以将该融合蛋白中的任何一或多个这样的位点突变，以便提供能够靶向特定药物抗性(逃避)突变的治疗或预防性免疫治疗剂。这些氨基酸位点，就SEQ ID NO:36来说位于:位点432(Val，已知在拉米夫定疗法后突变为Leu)；位点439(Leu，已知在拉米夫定疗法后突变为Met)；位点453(Ala，已知在替诺福韦疗法后突变为Thr)；位点463(Met，已知在拉米夫定疗法后突变为Ile或Val)；和位点495(Asn，已知在阿德福韦疗法后突变为Thr)。这些氨基酸位点，就SEQ ID NO:92来说位于:位点518(Val，已知在拉米夫定疗法后突变为Leu)；位点525(Leu，已知在拉米夫定疗法后突变为Met)；位点539(Ala，已知在替诺福韦疗法后突变为Thr)；位点549(Met，已知在拉米夫定疗法后突变为Ile或Val)；和位点581(Asn，已知在阿德福韦疗法后突变为Thr)。利用这里提供的指导，根据需要可以增加其他的鉴定到的或者曾经鉴定的药物抗性突变，从而产生更多的靶向这类突变的免疫治疗剂。
在发明的一个实施方案中，SEQ ID NO:36中位点901的缬氨酸或者SEQ ID NO:92中位点987的缬氨酸(或者SEQ ID NO:12或者含有该相应位点的任何X抗原或其结构域中位点116的缬氨酸)被取代为亮氨酸，从而产生SEQ ID NO:51代表的T细胞表位(参见表5)。
正如以上讨论的，发明包括对HBV抗原天然或者野生型序列进行改造，以包含在基于酵母的免疫治疗剂中，所述改造能够提高临床应用或者满足与感染剂相关的治疗或预防标准。作为一个例子，以下讨论和实施例5-8描述了基于酵母的免疫治疗剂的设计和构建，其中考虑了RAC规则的一或多个标准、与最有益免疫反应相关的免疫原性结构域的最大化、保守T细胞表位的最大化、对特定HBV基因型的共有序列的使用和/或HBV抗原内人工连接的最小化。例如，以下基于酵母的免疫治疗组合物示范了满足以上规定的目标要求的HBV融合蛋白，其包含HBV主要蛋白(HBV表面抗原、聚合酶、core和X抗原)中每一个的一部分。为了设计这个融合蛋白，融合内的个体HBV抗原被优化或改造，从而减小区段在蛋白中的大小(例如，保证蛋白代表小于2/3的HBV基因组)，并最大化包含那些与急性/自限性HBV感染和/或慢性HBV感染中的免疫反应相关的T细胞表位，最大化保守表位或最小化非天然序列。利用这一指导，本领域技术人员可以制备替代的优化HBV蛋白以用于本发明的HBV抗原中。
正如实施例5中更详细描述的，为了构建HBV表面抗原区段，通过截断其N和C端序列将来自HBV基因型C的全长大(L)表面抗原蛋白体积缩小，同时利用优先引入与急性/自限性感染相关的T细胞表位，最大程度地包含上已知的MHC T细胞表位。这样得到的表面抗原区段以SEQ ID NO:97表示。
为了构建包含HBV聚合酶的融合蛋白区段(参见实施例5)，将来自HBV基因型C的全长聚合酶除去相当大一部分，而是集中在包含活性部位结构域(来自RT结构域)，该结构域是HBV基因型和分离物之间最保守的蛋白区域，并且包含已知会发生药物抗性突变的几个位点。利用以上讨论的优先策略，将HBV聚合酶区段经过设计最大化包含已知T细胞表位，并且将一个T细胞表位改造成与已知T细胞表位密切对应，只有一个氨基酸不同。这样得到的HBV聚合酶抗原区段以SEQ ID NO:98表示。
为了构建包含HBV核心抗原的融合蛋白区段(参见实施例5)，将来自HBV基因型C的全长核心蛋白改造以便减小蛋白的体积，同时通过引入或者通过改造序列与某些已知T细胞表位完全匹配来最大化T细胞表位的数量。此外，除去含有明显带正电荷的C端的序列，因为这种序列通过竞争干扰往往富含精氨酸(带正电荷)的天然酵母RNA结合蛋白可能对酵母有毒性。这样得到的HBV核心抗原区段以SEQ ID NO:99表示。
为了构建包含HBV X抗原的融合蛋白区段(参见实施例5)，将来自HBV基因型C的全长X抗原截短以便减小蛋白的体积，同时最大化保留多种已知T细胞表位。还引入了单氨基酸改变以对应公开的T细胞表位序列，并且保留了区段末端侧接T细胞表位的序列以便协助抗原呈递细胞有效加工和呈递正确的表位。这样得到的HBV X抗原区段以SEQ ID NO:100表示。
最后，正如实施例5中描述的，通过将以上描述的四个HBV区段连接起来构建了完整的融合蛋白，从而形成优化用于临床的单个蛋白。产生了两个不同的示范性融合蛋白，每个添加了不同的N端肽以便增强和/或稳定融合蛋白在酵母中的表达。正如本文前面描述过的，对于在文中描述的基于酵母的免疫治疗组合物中使用的所有其他蛋白，可以用不同的合成或天然N端肽，或者它的同源物来代替所述N端肽，或者可以完全省略N端肽，在位点1包含甲硫氨酸。此外，如果需要，可以在融合蛋白的区段之间添加含有一、二、三或更多个氨基酸的接头序列。例如，可以在融合蛋白的N端肽和第一个HBV抗原之间，和/或融合蛋白中的两个HBV抗原之间插入一个双氨基酸接头序列，比如Thr-Ser。而且，虽然这些构建体是利用来自基因型C的HBV蛋白作为骨架设计的，也可以使用任何其他HBV基因型、亚基因型或者来自不同毒株或分离物的HBV蛋白设计蛋白区段。在一个方面中，正如下文描述的其他融合蛋白，可以使用来自给定HBV基因型的共有序列来设计或形成蛋白区段。最后，如果象文中描述的，融合蛋白中的一或多个区段被排除，那么如果需要可以将剩余区段的序列加长以包含额外的T细胞表位和/或剩余蛋白的侧翼区。
实施例5描述了HBV融合蛋白，图3中也有对该蛋白的构建体的示意图。该蛋白是单个多肽，以SEQ ID NO:101为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)赋予对蛋白酶体降解抗性和表达稳定性的N端肽，该N端肽是α因子前原序列，以SEQ ID NO:89(SEQ ID NO:101的位点1-89)为代表；2)以SEQ ID NO:97为代表的优化HBV大(L)表面抗原部分(SEQ ID NO:101的位点90-338，例如对应SEQ ID NO:11的位点120-368加上表位优化)；3)以SEQ ID NO:98为代表的HBV聚合酶的优化逆转录酶(RT)结构域部分(SEQ ID NO:101的位点339-566，例如对应SEQ ID NO:10的位点453-680加上表位优化)；(4)以SEQ IDNO:99为代表的HBV核心蛋白的优化部分(SEQ ID NO:101的位点567-718，例如对应SEQ IDNO:9的位点37-188加上表位优化)；(5)以SEQ ID NO:100为代表的优化HBV X抗原部分(SEQID NO:101的位点719-778，例如对应SEQ ID NO:12的位点52-127加上表位优化)；以及(6)六组氨酸标签(例如，SEQ ID NO:101的位点779-784)。在一个实施方案中，在SEQ ID NO:89的N端肽和第一个HBV蛋白(优化的HBV大表面抗原部分)之间使用了接头序列苏氨酸(Thr或T)-丝氨酸(Ser或S)，因此SEQ ID NO:101的总长度延长了两个氨基酸。
实施例5还描述了HBV融合蛋白，图3中也有对该蛋白的构建体的示意图。该蛋白是单个多肽，以SEQ ID NO:102为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)赋予对蛋白酶体降解抗性和表达稳定性的N端肽，该N端肽是合成N端肽，以SEQ ID NO:37(SEQ ID NO:102的位点1-6)为代表；2)以SEQ ID NO:97的位点2-248为代表的优化HBV大(L)表面抗原部分(SEQ ID NO:102的位点7-254，例如对应SEQ ID NO:11的位点120-368加上表位优化)；3)以SEQ ID NO:98为代表的HBV聚合酶的优化逆转录酶(RT)结构域部分(SEQID NO:102的位点255-482，例如对应SEQ ID NO:10的位点453-680加上表位优化)；(4)以SEQ ID NO:99为代表的HBV核心蛋白的优化部分(SEQ ID NO:102的位点483-634，例如对应SEQ ID NO:9的位点37-188加上表位优化)；(5)以SEQ ID NO:100为代表的优化HBV X抗原部分(SEQ ID NO:102的位点635-694，例如对应SEQ ID NO:12的位点52-127加上表位优化)；以及(6)六组氨酸标签(例如，SEQ ID NO:102的位点695-700)。在一个实施方案中，在SEQ ID NO:37的N端肽和第一个HBV蛋白(优化的HBV大表面抗原部分)之间使用了接头序列苏氨酸(Thr或T)-丝氨酸(Ser或S)，因此SEQ ID NO:102的总长度延长了两个氨基酸。在一个实施方案中，以上描述的融合蛋白中使用的HBV大(L)表面抗原优化部分以SEQ ID NO:97的位点1-248代表(因此SEQ ID NO:102的总长度延长了一个氨基酸)。在一个实施方案中，SEQ ID NO:102中使用了T-S接头和SEQ ID NO:97的位点1-248。
正如以上讨论的，发明包括利用来自给定HBV基因型的共有序列设计或形成蛋白区段对HBV抗原天然或者野生型序列进行改造，以包含在基于酵母的免疫治疗剂中，所述改造能够提高临床应用或者满足与感染剂相关的治疗或预防标准。作为一个例子，设计了其他用于本发明的基于酵母的免疫治疗剂的HBV抗原来阐述这类突变。正如在以上描述的HBV融合蛋白的设计中，为了产生这些其他的融合蛋白，将融合蛋白内的个别HBV抗原优化或改造以便减少蛋白中的区段大小(例如，为了保证蛋白代表小于2/3的HBV基因组)，并且最大化含有与急性/自限性HBV感染和/或慢性HBV感染中的免疫反应相关的T细胞表位、最大化保守表位、最小化非天然序列，和利用由多种HBV序列来源建立的基因型A-D中每一个的共有序列(例如，对于S、Core和X，Yu and Yuan et al,2010，其中共有序列由322个HBV序列生成；或者对于Pol(RT)，来自Stanford University HIV Drug Resistance Database，HBVseq and HBV Site Release Notes)。在设计以下四种包含HBV抗原的示范性融合蛋白时，使用了给定HBV基因型的共有序列，除非使用共有序列会改变一个已知的急性自限性T细胞表位或者一个已知的聚合酶逃避突变位点，对于这两种情况，这些位点遵循所述表位或突变位点的公开序列。可以完全基于共有序列或者利用其他以后知道后公开的表位来构建额外的抗原。
实施例7描述的融合蛋白与SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:102所代表的融合蛋白在设计上类似(示意图见图3)，但是基于HBV基因型A的共有序列。该融合蛋白以SEQ ID NO:107(SEQ ID NO:107的基本序列中没有包含非HBV序列的任选序列，但可以象实施例7中描述的构建体那样加入该序列)为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽，可以用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸连接序列，每个序列有一、二、三或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser；(3)优化的HBV大(L)表面抗原部分，以SEQ ID NO:107的位点1-249为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型A的共有序列；(4)优化的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)结构域部分，以SEQ ID NO:107的位点250-477为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型A的共有序列；(5)优化的HBV核心抗原部分，以SEQ ID NO:107的位点478-629为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型A的共有序列；(6)优化的HBV X抗原部分，以SEQ ID NO:107的位点630-689为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型A的共有序列；和(7)任选地，六组氨酸标签。表达该融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在文中又被称为GI-13010。
实施例7还描述的融合蛋白与SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:102所代表的融合蛋白在设计上类似(示意图见图3)，但是基于HBV基因型B的共有序列。该融合蛋白以SEQ ID NO:108(SEQ ID NO:108的基本序列中没有包含非HBV序列的任选序列，但可以象实施例7中描述的构建体那样加入该序列)为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽，可以用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸连接序列，每个序列有一、二、三或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser；(3)优化的HBV大(L)表面抗原部分，以SEQ ID NO:108的位点1-249为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型B的共有序列；(4)优化的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)结构域部分，以SEQ ID NO:108的位点250-477为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型B的共有序列；(5)优化的HBV核心抗原部分，以SEQ ID NO:108的位点478-629为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型B的共有序列；(6)优化的HBV X抗原部分，以SEQ ID NO:108的位点630-689为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型B的共有序列；和(7)任选地，六组氨酸标签。表达该融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在文中又被称为GI-13011。
实施例7还描述的融合蛋白与SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:102所代表的融合蛋白在设计上类似(示意图见图3)，但是基于HBV基因型C的共有序列。该融合蛋白以SEQ ID NO:109(SEQ ID NO:109的基本序列中没有包含非HBV序列的任选序列，但可以象实施例7中描述的构建体那样加入该序列)为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽，可以用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸连接序列，每个序列有一、二、三或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser；(3)优化的HBV大(L)表面抗原部分，以SEQ ID NO:109的位点1-249为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型C的共有序列；(4)优化的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)结构域部分，以SEQ ID NO:109的位点250-477为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型C的共有序列；(5)优化的HBV核心抗原部分，以SEQ ID NO:109的位点478-629为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型C的共有序列；(6)优化的HBV X抗原部分，以SEQ ID NO:109的位点630-689为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型C的共有序列；和(7)任选地，六组氨酸标签。表达该融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在文中又被称为GI-13012。
实施例7还描述的融合蛋白与SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:102所代表的融合蛋白在设计上类似(示意图见图3)，但是基于HBV基因型D的共有序列。该融合蛋白以SEQ ID NO:110(SEQ ID NO:110的基本序列中没有包含非HBV序列的任选序列，但可以象实施例7中描述的构建体那样加入该序列)为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽，可以用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸连接序列，每个序列有一、二、三或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser；(3)优化的HBV大(L)表面抗原部分，以SEQ ID NO:110的位点1-249为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型D的共有序列；(4)优化的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)结构域部分，以SEQ ID NO:110的位点250-477为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型D的共有序列；(5)优化的HBV核心抗原部分，以SEQ ID NO:110的位点478-629为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型D的共有序列；(6)优化的HBV X抗原部分，以SEQ ID NO:110的位点630-689为代表，它是使用以上讨论的设计策略的HBV基因型D的共有序列；和(7)任选地，六组氨酸标签。表达该融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在文中被称为GI-13013。表达包含以SEQ ID NO:89为代表的N端序列的融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在文中被称为GI-13014。
正如以上讨论过的，发明的一个实施方案是改变本文描述的融合蛋白内的HBV蛋白区段的顺序。相应地，虽然以上描述的使用四种HBV蛋白的构建体是处于表面抗原融合了聚合酶抗原，然后融合Core抗原，然后融合X抗原，发明不限于构建体内的这个特定蛋白顺序，可以使用其他融合区段排列，某些方面中，可能会改进所得到的免疫治疗组合物。例如，融合蛋白内区段的重新排列可能提高或改进HBV抗原在酵母中的表达，或者可能提高或改进HBV抗原的免疫原性或其他功能属性。在该实施方案的一个方面中，发明考虑了由在酵母中表达良好和/或提供阳性功能数据(例如是免疫原性的)的一个HBV抗原开始，然后向该HBV抗原添加其他HBV蛋白或结构域以便扩展HBV抗原内含有的潜在抗原或表位。实施例8提供了以上描述的四种HBV蛋白的其他排列方式。
实施例8描述了含有来自HBV表面抗原、核心蛋白、聚合酶和X抗原的序列的融合蛋白，其中所述序列来源于以SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:118为代表的融合蛋白的区段，并且与SEQ ID NO:110相比，融合蛋白使用了不同的融合区段顺序。该抗原基于HBV基因型D的共有序列，但是很容易利用下述序列产生具有类似整体结构的融合蛋白：来自以SEQ IDNO:107或SEQ ID NO:112(基因型A)、SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:114(基因型B)、SEQ IDNO:109或SEQ ID NO:116(基因型C)为代表的融合蛋白的对应融合区段；或者来自不同HBV基因型、亚基因型、共有序列或毒株的对应序列。在这个实施方案中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造表达处于铜诱导启动子CUP1调控下的融合蛋白，这样得到的酵母-HBV免疫治疗组合物在文中可以称为GI-13017，如图10所示。以SEQ ID NO:124代表的融合蛋白按顺序包含表面抗原、核心、聚合酶和X抗原序列，该单一多肽以SEQ ID NO:124(SEQ ID NO:124的基本序列中没有包含非HBV序列的任选序列，但可以象实施例8中描述的构建体那样加入该序列)为代表，含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽(在实施例8中描述的构建体中)，可以用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸连接序列，每个序列有一、二、三或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser(实施例8中描述的构建体中)；(3)接近全长(除去位点1)的HBV基因型C大(L)表面抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:124的位点1-399(对应SEQ ID NO:118的位点1-399)为代表；4)HBV基因型D核心抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:124的位点400-581(对应SEQ ID NO:118的位点400-581)为代表；(5)使用了HBV基因型D共有序列的HBV聚合酶优化逆转录酶(RT)结构域部分，以SEQ ID NO:124的位点582-809(对应SEQ IDNO:110的位点250-477)代表；(6)使用了HBV基因型D共有序列的HBV X抗原优化部分，以SEQID NO:124的位点810-869(对应SEQ ID NO:110的位点630-689)代表；和(7)任选地，六组氨酸标签(在实施例8描述的构建体中)。SEQ ID NO:124含有多个T细胞表位(人和小鼠)，在表5中可以找到。编码SEQ ID NO:124的融合蛋白的核酸序列(为了在酵母中表达对密码子进行了优化)在文中以SEQ ID NO:123代表。
实施例8还描述了含有来自HBV表面抗原、核心蛋白、X抗原和聚合酶的序列的另一个融合蛋白，其中所述序列来源于以SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:118为代表的融合蛋白的区段，但是与SEQ ID NO:110相比，融合蛋白使用了不同的融合区段顺序。该抗原也是基于HBV基因型D的共有序列，但是很容易利用下述序列产生具有类似整体结构的融合蛋白：来自以SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:112(基因型A)、SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:114(基因型B)、SEQ ID NO:109或SEQ ID NO:116(基因型C)为代表的融合蛋白的对应融合区段；或者来自不同HBV基因型、亚基因型、共有序列或毒株的对应序列。在这个实施方案中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造表达处于铜诱导启动子CUP1调控下的融合蛋白，这样得到的酵母-HBV免疫治疗组合物在文中可以称为GI-13018，如图11所示。以SEQ ID NO:126代表的融合蛋白按顺序包含表面抗原、核心、X抗原和聚合酶序列，该单一多肽以SEQ ID NO:126(SEQ IDNO:126的基本序列中没有包含非HBV序列的任选序列，但可以象实施例8中描述的构建体那样加入该序列)为代表，含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ IDNO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽(在实施例8中描述的构建体中)，可以用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸连接序列，每个序列有一、二、三或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser(实施例8中描述的构建体中)；(3)接近全长(除去位点1)的HBV基因型C大(L)表面抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:126的位点1-399(对应SEQ ID NO:118的位点1-399)为代表；4)HBV基因型D核心抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:126的位点400-581(对应SEQ ID NO:118的位点400-581)为代表；(5)使用了HBV基因型D共有序列的HBV X抗原优化部分，以SEQ ID NO:126的位点582-641-869(对应SEQ ID NO:110的位点630-689)代表；(6)使用了HBV基因型D共有序列的HBV聚合酶优化逆转录酶(RT)结构域部分，以SEQ ID NO:126的位点6422-869(对应SEQ ID NO:110的位点250-477)代表；和(7)任选地，六组氨酸标签(在实施例8描述的构建体中)。SEQ ID NO:126含有多个T细胞表位(人和小鼠)，在表5中可以找到。编码SEQ ID NO:126的融合蛋白的核酸序列(为了在酵母中表达对密码子进行了优化)在文中以SEQ ID NO:125代表。
实施例8还描述了含有来自HBV聚合酶、X抗原、表面抗原、核心蛋白的序列的另一个融合蛋白，其中所述序列来源于以SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:118为代表的融合蛋白的区段，但是与SEQ ID NO:110相比，融合蛋白使用了不同的融合区段顺序。该抗原基于HBV基因型D的共有序列，但是很容易利用下述序列产生具有类似整体结构的融合蛋白：来自以SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:112(基因型A)、SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:114(基因型B)、SEQ ID NO:109或SEQ ID NO:116(基因型C)为代表的融合蛋白的对应融合区段；或者来自不同HBV基因型、亚基因型、共有序列或毒株的对应序列。在这个例子中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造表达处于铜诱导启动子CUP1调控下的融合蛋白，这样得到的酵母-HBV免疫治疗组合物在文中可以称为GI-13021，如图14所示。以SEQ ID NO:132代表的融合蛋白按顺序包含聚合酶、X抗原、表面抗原和core，该单一多肽以SEQ ID NO:132(SEQ ID NO:132的基本序列中没有包含非HBV序列的任选序列，但可以象实施例8中描述的构建体那样加入该序列)为代表，含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽(在实施例8中描述的构建体中)，可以用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸连接序列，每个序列有一、二、三或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser(实施例8中描述的构建体中)；(3)使用了HBV基因型D共有序列的HBV聚合酶优化逆转录酶(RT)结构域部分，以SEQ ID NO:132的位点1-228(对应SEQ ID NO:110的位点250-477)代表；(4)使用了HBV基因型D共有序列的HBV X抗原优化部分，以SEQ ID NO:132的位点229-288(对应SEQ ID NO:110的位点630-689)代表；(5)接近全长(除去位点1)的HBV基因型C大(L)表面抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:132的位点289-687(对应SEQ IDNO:118的位点1-399)为代表；(6)HBV基因型D核心抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ IDNO:132的位点688-869(对应SEQ ID NO:118的位点400-581)为代表；和(7)任选地，六组氨酸标签(在实施例8描述的构建体中)。SEQ ID NO:132含有多个T细胞表位(人和小鼠)，在表5中可以找到。编码SEQ ID NO:132的融合蛋白的核酸序列(为了在酵母中表达对密码子进行了优化)在文中以SEQ ID NO:131代表。
实施例8还描述了含有来自HBV X抗原、聚合酶、表面抗原和核心蛋白的序列的融合蛋白，其中所述序列来源于以SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:118为代表的融合蛋白的区段，但是与SEQ ID NO:110相比，融合蛋白使用了不同的融合区段顺序。该抗原基于HBV基因型D的共有序列，但是很容易利用下述序列产生具有类似整体结构的融合蛋白：来自以SEQID NO:107或SEQ ID NO:112(基因型A)、SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:114(基因型B)、SEQID NO:109或SEQ ID NO:116(基因型C)为代表的融合蛋白的对应融合区段；或者来自不同HBV基因型、亚基因型、共有序列或毒株的对应序列。在这个例子中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造表达处于铜诱导启动子CUP1调控下的融合蛋白，这样得到的酵母-HBV免疫治疗组合物在文中可以称为GI-13022，如图15所示。以SEQ ID NO:134代表的融合蛋白按顺序包含X抗原、聚合酶、表面抗原和核心蛋白，该单一多肽以SEQ ID NO:134(SEQ ID NO:134的基本序列中没有包含非HBV序列的任选序列，但可以象实施例8中描述的构建体那样加入该序列)为代表，含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽(在实施例8中描述的构建体中)，可以用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser(实施例8中描述的构建体中)；(3)使用了HBV基因型D共有序列的HBV X抗原优化部分，以SEQ ID NO:134的位点1-60(对应SEQ IDNO:110的位点630-689)代表；(4)使用了HBV基因型D共有序列的HBV聚合酶优化逆转录酶(RT)结构域部分，以SEQ ID NO:134的位点61-228(对应SEQ ID NO:110的位点250-477)代表；(5)接近全长(除去位点1)的HBV基因型C大(L)表面抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:134的位点289-687(对应SEQ ID NO:118的位点1-399)为代表；(6)HBV基因型D核心抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:134的位点688-869(对应SEQ ID NO:118的位点400-581)为代表；以及(7)任选地，六组氨酸标签(在实施例8描述的构建体中)。SEQID NO:134含有多个T细胞表位(人和小鼠)，在表5中可以找到。编码SEQ ID NO:134的融合蛋白的核酸序列(为了在酵母中表达对密码子进行了优化)在文中以SEQ ID NO:133代表。
包含表面抗原、核心蛋白和X抗原的HBV抗原。在发明的一个实施方案中，用于本发明的组合物或方法中的HBV抗原是包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原包含下述，或者由它们构成:HBV表面抗原(大(L)、中(M)或小(S)或其至少一个结构的、功能的或者免疫原性结构域)；HBV核心蛋白(HBcAg)或HBV e抗原(HBeAg)或其至少一个结构的、功能的或者免疫原性结构域；以及HBV X抗原(HBx)或其至少一个结构的、功能的或者免疫原性结构域。在一个方面中，HBV表面抗原、HBV核心蛋白、HBV e抗原、HBV X抗原或者它们的结构域中的任何一或多个是全长或接近全长的。在一个方面中，HBV表面抗原、HBV核心蛋白、HBV e抗原、HBV X抗原或者它们的结构域中的任何一或多个分别包含下述序列的至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%：全长HBV表面抗原、HBV核心蛋白、HBV e抗原、HBV X抗原或者它们的结构域的线性序列；SEQ ID NO:97(优化的HBV表面抗原)、SEQ IDNO:99(优化的核心蛋白)、SEQ ID NO:100(优化的X抗原)所代表的线性氨基酸序列；或者适合的情况下，来自另一个HBV毒株的对应序列。在一个方面中，HBV表面抗原、HBV核心蛋白、HBV e抗原、HBV X抗原或者它们的结构域中的任何一或多个分别与下述序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同：全长HBV表面抗原、HBV核心蛋白、HBVe抗原、HBV X抗原或者它们的结构域；或者SEQ ID NO:97(优化的HBV表面抗原)、SEQ IDNO:99(优化的核心蛋白)、SEQ ID NO:100(优化的X抗原)所代表的氨基酸序列；或者适合的情况下，来自另一个HBV毒株的对应序列。本文描述了可以用于所述构建体的其他HBV表面抗原、HBV核心抗原和HBV X抗原的多种合适的示范序列。
实施例8描述了含有来自HBV表面抗原、核心蛋白和X抗原的序列的融合蛋白，其中所述序列来源于以SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:118为代表的融合蛋白的区段。该抗原基于HBV基因型D的共有序列，但是很容易利用下述序列产生具有类似整体结构的融合蛋白：来自以SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:112(基因型A)、SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:114(基因型B)、SEQ ID NO:109或SEQ ID NO:116(基因型C)为代表的融合蛋白的对应融合区段；或者来自不同HBV基因型、亚基因型、共有序列或毒株的对应序列。在这个例子中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造表达处于铜诱导启动子CUP1调控下的融合蛋白，这样得到的酵母-HBV免疫治疗组合物在文中可以称为GI-13016，如图9所示。以SEQ ID NO:122代表的融合蛋白按顺序包含表面抗原、核心蛋白和X抗原，该单一多肽以SEQ ID NO:122(SEQ ID NO:122的基本序列中没有包含非HBV序列的任选序列，但可以象实施例8中描述的构建体那样加入该序列)为代表，含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽(在实施例8中描述的构建体中)，可以用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸连接序列，每个序列有一、二、三或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser(实施例8中描述的构建体中)；(3)接近全长(除去位点1)的HBV基因型D大(L)表面抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:122的位点1-399(对应SEQ ID NO:118的位点1-399)为代表；(4)HBV基因型D核心抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:122的位点400-581(对应SEQ ID NO:118的位点400-581)为代表；(5)使用了HBV基因型D共有序列的HBV X抗原优化部分，以SEQ ID NO:122的位点582-641(对应SEQ ID NO:110的位点630-689)代表；和(6)任选地，六组氨酸标签(在实施例8描述的构建体中)。SEQ ID NO:122含有多个T细胞表位(人和小鼠)，在表5中可以找到。编码SEQ ID NO:122的融合蛋白的核酸序列(为了在酵母中表达对密码子进行了优化)在文中以SEQ ID NO:121代表。
实施例8还描述了含有来自HBV表面抗原、核心蛋白和X抗原的序列的融合蛋白，其中正如包含SEQ ID NO:122的融合蛋白，序列来源于以SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:118为代表的融合蛋白的区段。但是该融合蛋白与包含SEQ ID NO:122的融合蛋白区别在于该融合蛋白内的融合区段的排列不同。该抗原基于HBV基因型D的共有序列，但是很容易利用下述序列产生具有类似整体结构的融合蛋白：来自以SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:112(基因型A)、SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:114(基因型B)、SEQ ID NO:109或SEQ ID NO:116(基因型C)为代表的融合蛋白的对应融合区段；或者来自不同HBV基因型、亚基因型、共有序列或毒株的对应序列。在这个例子中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造表达处于铜诱导启动子CUP1调控下的融合蛋白，这样得到的酵母-HBV免疫治疗组合物在文中可以称为GI-13030，如图13所示。以SEQ ID NO:122代表的融合蛋白按顺序包含表面抗原、核心蛋白和X抗原，该单一多肽以SEQ ID NO:130(SEQ ID NO:130的基本序列中没有包含非HBV序列的任选序列(除了这里示范的构建体中X抗原区段和表面抗原区段之间的Leu-Glu接头)，但可以象实施例8中描述的构建体那样加入该序列)为代表，含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽(在实施例8中描述的构建体中)，可以用SEQ ID NO:89、SEQID NO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸连接序列，每个序列有一、二、三或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser(实施例8中描述的构建体中)；(3)使用了HBV基因型D共有序列的HBV X抗原优化部分，以SEQ ID NO:130的位点1-60(对应SEQ ID NO:110的位点630-689)代表；(4)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Leu-Glu(实施例8中描述的构建体中)，以SEQ ID NO:130的位点61-62代表；(5)接近全长(除去位点1)的HBV基因型D大(L)表面抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:130的位点63-461(对应SEQ ID NO:118的位点1-399)为代表；(6)HBV基因型D核心抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:130的位点462-643(对应SEQ ID NO:118的位点400-581)为代表；和(7)任选地，六组氨酸标签(在实施例8描述的构建体中)。SEQ IDNO:130含有多个T细胞表位(人和小鼠)，在表5中可以找到。实施例8描述的包含SEQ ID NO:130并且含有N和C端肽以及所有接头的完整融合蛋白的氨基酸序列在文中以SEQ ID NO:150表示。编码SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:150的融合蛋白的核酸序列(为了在酵母中表达对密码子进行了优化)在文中以SEQ ID NO:129代表。
包含表面抗原、核心蛋白和聚合酶的HBV抗原。在发明的一个实施方案中，用于本发明的组合物或方法中的HBV抗原是包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原包含下述，或者由它们构成:HBV表面抗原(大(L)、中(M)或小(S)或其至少一个结构的、功能的或者免疫原性结构域)；HBV核心蛋白(HBcAg)或HBV e抗原(HBeAg)或其至少一个结构的、功能的或者免疫原性结构域；以及HBV聚合酶或其至少一个结构的、功能的或者免疫原性结构域(例如逆转录酶(RT)结构域)。在一个方面中，HBV表面抗原、HBV核心蛋白、HBV e抗原、HBV聚合酶或者它们的结构域中的任何一或多个是全长或接近全长的。在一个方面中，HBV表面抗原、HBV核心蛋白、HBV e抗原、HBV聚合酶或者它们的结构域中的任何一或多个分别包含下述序列的至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%：全长HBV表面抗原、HBV核心蛋白、HBV e抗原、HBV聚合酶或者它们的结构域的线性序列；SEQ ID NO:97(优化的HBV表面抗原)、SEQ ID NO:99(优化的核心蛋白)、SEQ ID NO:98(优化的聚合酶)所代表的线性氨基酸序列；或者适合的情况下，来自另一个HBV毒株的对应序列。在一个方面中，HBV表面抗原、HBV核心蛋白、HBV e抗原、HBV聚合酶或者它们的结构域中的任何一或多个分别与下述序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同：全长HBV表面抗原、HBV核心蛋白、HBV e抗原、HBV聚合酶或者它们的结构域；或者SEQ ID NO:97(优化的HBV表面抗原)、SEQ ID NO:99(优化的核心蛋白)、SEQ ID NO:98(优化的聚合酶)所代表的氨基酸序列；或者适合的情况下，来自另一个HBV毒株的对应序列。本文描述了可以用于所述构建体的其他HBV表面抗原、HBV聚合酶抗原和HBV核心抗原的多种合适的示范序列。
图7中有所述融合蛋白的一个例子的示意图。实施例3描述了包含该融合蛋白的组合物的例子。在该实施方案中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造在铜诱导启动子CUP1或TEF2启动子的调控下表达各种HBV表面-聚合酶-core融合蛋白。每种情况中，融合蛋白均为单个多肽，以SEQ ID NO:41为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)赋予对蛋白酶体降解抗性和表达稳定性的N端肽(例如SEQ ID NO:41的位点1-5)；2)HBV大(L)表面抗原的前S1部分的氨基HBV肝细胞受体结构域(L特有的)的氨基酸序列(SEQ ID NO:11的位点21-47或者SEQ ID NO:41的位点6-32)；3)HBV小(S)表面蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:11的位点176-400或者SEQ ID NO:41的位点33-257)；4)用于协助克隆和操作序列的双氨基酸间隔区/接头(例如，SEQ ID NO:41的位点258和259)；5)包含逆转录酶结构域部分的HBV聚合酶的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:10的位点247-691或者SEQ ID NO:41的位点260-604)；6)HBV核心蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:9的位点31-212或者SEQ IDNO:41的位点605-786)；以及7)六组氨酸标签(例如，SEQ ID NO:41的位点787-792)。序列还含有被认为能够增加融合蛋白的免疫原性的表位或结构域。此外，在一个实施方案中，可以将该构建体的序列改造从而引入以下抗病毒抗性突变中的一或多个或者全部:rtM204l、rtL180M、rtM204V、rtV173L、rtN236T、rtA194T(参照HBV聚合酶的全长氨基酸序列给出的位点)。在一个实施方案中，产生了六个不同的免疫治疗组合物，每个含有一个这样的突变。在其他实施方案中，全部突变或者其中的一些包含在单个融合蛋白中。在一个实施方案中，该构建体还含有一或多个位于表面抗原中的抗病毒抗性突变。本文描述的任何一个融合蛋白中使用的氨基酸区段可以通过使用位于任何结构域的任意一端的额外侧翼氨基酸来进行改造；文中提供的例子是示范性的。例如，根据该实施方案的融合蛋白可以包含1)HBV大(L)表面抗原的前S1部分的氨基HBV肝细胞受体结构域(L特有的)的氨基酸序列(SEQ ID NO:11的位点21-47或者SEQ ID NO:41的位点6-32)；2)HBV小(S)表面蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:11的位点176-400或者SEQ ID NO:41的位点33-257)；3)包含逆转录酶结构域的HBV聚合酶的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:10的位点247-691或者SEQ ID NO:41的位点260-604)；以及4)HBV核心蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:9的位点31-212或者SEQ IDNO:41的位点605-786)；并且没有使用N或C端序列，或者使用了不同的N或C端序列，和/或在HBV序列之间使用或未使用接头。在一个实施方案中，代替以SEQ ID NO:41的位点1-5为代表的N端肽，使用了SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90所代表的N端肽，之后是所述的融合蛋白的其余部分。
实施例8描述了另外一例这样的融合蛋白。实施例8示范了含有来自HBV表面抗原、核心蛋白和聚合酶的序列的融合蛋白，其中所述序列来源于以SEQ ID NO:110和SEQ IDNO:118为代表的融合蛋白的区段。该抗原基于HBV基因型D的共有序列，但是很容易利用下述序列产生具有类似整体结构的融合蛋白：来自以SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:112(基因型A)、SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:114(基因型B)、SEQ ID NO:109或SEQ ID NO:116(基因型C)为代表的融合蛋白的对应融合区段；或者来自不同HBV基因型、亚基因型、共有序列或毒株的对应序列。在这个例子中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造表达处于铜诱导启动子CUP1调控下的融合蛋白，这样得到的酵母-HBV免疫治疗剂在文中可以称为GI-13015，如图8所示。
以SEQ ID NO:120代表的融合蛋白按顺序包含表面抗原、核心蛋白和聚合酶，该单一多肽以SEQ ID NO:120(SEQ ID NO:120的基本序列中没有包含非HBV序列的任选序列，但可以象实施例8中描述的构建体那样加入该序列)为代表，含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽(在实施例8中描述的构建体中)，可以用SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser(实施例8中描述的构建体中)；(3)接近全长(除去位点1)的HBV基因型D大(L)表面抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:120的位点1-399(对应SEQ ID NO:118的位点1-399)为代表；(4)HBV基因型D核心抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:120的位点400-581(对应SEQ ID NO:118的位点400-581)为代表；(5)使用了HBV基因型D共有序列的HBV聚合酶优化逆转录酶(RT)结构域部分，以SEQ ID NO:120的位点582-809(对应SEQ IDNO:110的位点250-477)代表；以及(6)任选地，六组氨酸标签(在实施例8描述的构建体中)。SEQ ID NO:120含有多个T细胞表位(人和小鼠)，在表5中可以找到。编码SEQ ID NO:120的融合蛋白的氨基酸序列在文中以SEQ ID NO:119表示。
实施例8描述了再一例这样的融合蛋白。实施例8示范了含有来自HBV聚合酶、表面抗原和核心蛋白的序列的融合蛋白，其中所述序列来源于以SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:118为代表的融合蛋白区段。该融合蛋白与包含SEQ ID NO:120的融合蛋白的不同在于融合蛋白内融合区段的排列不同。该抗原基于HBV基因型D的共有序列，但是很容易利用下述序列产生具有类似整体结构的融合蛋白：来自以SEQ ID NO:107或SEQ ID NO:112(基因型A)、SEQ ID NO:108或SEQ ID NO:114(基因型B)、SEQ ID NO:109或SEQ ID NO:116(基因型C)为代表的融合蛋白的对应融合区段；或者来自不同HBV基因型、亚基因型、共有序列或毒株的对应序列。在这个例子中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造表达处于铜诱导启动子CUP1调控下的融合蛋白，这样得到的酵母-HBV免疫治疗剂在文中可以称为GI-13019，如图12所示。
以SEQ ID NO:128代表的融合蛋白按顺序包含聚合酶、表面抗原和core序列，该单一多肽以SEQ ID NO:128(SEQ ID NO:128的基本序列中没有包含非HBV序列的任选序列(除了这里示范的构建体中聚合酶区段和表面抗原区段之间的Leu-Glu接头)，但可以象实施例8中描述的构建体那样加入该序列)为代表，含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)任选地，以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，其为经过设计用于赋予对蛋白酶体降解的抗性和表达稳定性的合成N端肽(在实施例8中描述的构建体中)，可以用SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:90所代表的N端肽或者适合与基于酵母的免疫治疗剂使用的另一个N端肽取代；(2)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Thr-Ser(实施例8中描述的构建体中)；(3)使用了HBV基因型D共有序列的优化HBV聚合酶逆转录酶(RT)结构域，以SEQ ID NO:128的位点1-228(对应SEQ ID NO:110的位点250-477)代表；(4)任选地，连接肽，所述连接肽含有一到三个或更多个氨基酸，比如双氨基酸接头Leu-Glu(实施例8中描述的构建体中)，以SEQ ID NO:128的位点229-230代表；(5)接近全长(除去位点1)的HBV基因型D大(L)表面抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:128的位点231-629(对应SEQ ID NO:118的位点1-399)为代表；(6)HBV基因型D核心抗原的共有序列的氨基酸序列，以SEQ ID NO:128的位点630-811(对应SEQ ID NO:118的位点400-581)为代表；和(7)任选地，六组氨酸标签(在实施例8描述的构建体中)。SEQ ID NO:128含有多个T细胞表位(人和小鼠)，在表5中可以找到。编码SEQ ID NO:128的融合蛋白的核酸序列(为了在酵母中表达对密码子进行了优化)在文中以SEQ ID NO:127代表。
包含聚合酶和核心蛋白的HBV抗原。在发明的一个实施方案中，用于本发明的组合物或方法中的HBV抗原是包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原包含下述，或者由它们构成:HBV聚合酶(RT结构域)或其至少一个免疫原性结构域和HBV核心蛋白(HBcAg)或其至少一个免疫原性结构域。在一个方面中，HBV聚合酶的RT结构域和HBV核心蛋白中的一个或两者是全长或接近全长的。在一个方面中，HBV聚合酶的RT结构域或HBV核心蛋白中的任何一个或两者或者它们的结构域分别包含下述序列的至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%：全长HBV聚合酶的RT结构域、HBV核心蛋白或者它们的结构域的线性序列；SEQ ID NO:98(优化的聚合酶)、SEQ ID NO:99(优化的核心蛋白)所代表的线性氨基酸序列；或者适合的情况下，来自另一个HBV毒株的对应序列。在一个方面中，HBV聚合酶的RT结构域或HBV核心蛋白中的任何一个或两者或者它们的结构域分别与下述序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同：全长HBV聚合酶的RT结构域或HBV核心蛋白或者它们的结构域；或者SEQ ID NO:98(优化的聚合酶)、SEQ ID NO:99(优化的核心蛋白)所代表的氨基酸序列；或者适合的情况下，来自另一个HBV毒株的对应序列。本文描述了HBV聚合酶抗原和HBV核心抗原的多种合适的示范序列。
图4中有所述抗原的一个例子的示意图。实施例3描述了包含该融合蛋白的组合物的例子。在该实施方案中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造在铜诱导启动子CUP1或TEF2启动子的调控下表达如图4示意的各种HBV聚合酶-core融合蛋白。每种情况中，融合蛋白均为单个多肽，以SEQ ID NO:38为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)赋予对蛋白酶体降解抗性和表达稳定性的N端肽(例如SEQ ID NO:37或者SEQ ID NO:38的位点1-6)；2)包含逆转录酶结构域的HBV基因型C聚合酶的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:10的位点347-691或者SEQ ID NO:38的位点7-351)；3)HBV基因型C核心蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:9的位点31-212或者SEQ ID NO:38的位点352-533)；以及4)六组氨酸标签(例如，SEQ ID NO:38的位点534-539)。序列还含有被认为能够增加融合蛋白的免疫原性的表位或结构域。本文描述的任何一个融合蛋白中使用的氨基酸区段可以通过使用位于任何结构域的任意一端的额外侧翼氨基酸来进行改造；文中提供的例子是示范性的。例如，根据该实施方案的融合蛋白可以包含1)包含逆转录酶结构域的HBV基因型C聚合酶部分的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:10的位点347-691或者SEQ ID NO:38的位点7-351)；和2)HBV基因型C核心蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:9的位点31-212或者SEQ ID NO:38的位点352-533)；并且没有使用N或C端序列，或者使用了不同的N或C端序列，和/或在HBV序列之间使用或未使用接头。在一个实施方案中，代替以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，使用了SEQID NO:89或SEQ ID NO:90所代表的N端肽，之后是所述的融合蛋白的其余部分。
包含X抗原和核心蛋白的HBV抗原。在发明的一个实施方案中，用于本发明的组合物或方法中的HBV抗原是包含HBV抗原的融合蛋白，其中所述HBV抗原包含下述，或者由它们构成:HBV X抗原或其至少一个免疫原性结构域和HBV核心蛋白(HBcAg)或其至少一个免疫原性结构域。在一个方面中，HBV X抗原和HBV核心蛋白中的一个或两者是全长或接近全长的。在一个方面中，HBV X抗原或HBV核心蛋白中的任何一个或两者或者它们的结构域分别包含下述序列的至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%：全长HBV X抗原或HBV核心蛋白或者它们的结构域的线性序列；SEQ ID NO:99(优化的核心蛋白)、SEQID NO:100(优化的X抗原)所代表的线性氨基酸序列；或者适合的情况下，来自另一个HBV毒株的对应序列。在一个方面中，HBV X抗原或HBV核心蛋白中的任何一个或两者或者它们的结构域分别与下述序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同：全长HBV X抗原或HBV核心蛋白或者它们的结构域；或者SEQ ID NO:99(优化的核心蛋白)、SEQ ID NO:100(优化的X抗原)所代表的氨基酸序列；或者适合的情况下，来自另一个HBV毒株的对应序列。本文描述了HBV核心抗原和HBV X抗原的多种合适的示范序列。
图5中有所述融合蛋白的示意图。实施例3描述了包含该融合蛋白的组合物的例子。在该实施方案中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造在铜诱导启动子CUP1或TEF2启动子的调控下表达如图5示意的各种HBV X-core融合蛋白。每种情况中，融合蛋白均为单个多肽，以SEQ ID NO:39为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列:(1)赋予对蛋白酶体降解抗性和表达稳定性的N端肽(例如SEQ ID NO:37或者SEQ ID NO:39的位点1-6)；2)接近全长(除去位点1)的HBV基因型C X抗原的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:12的位点2-154或者SEQ ID NO:39的位点7-159)；3)HBV基因型C核心蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ IDNO:9的位点31-212或者SEQ ID NO:39的位点160-341)；以及4)六组氨酸标签(例如，SEQ IDNO:39的位点342-347)。序列还含有被认为能够增加融合蛋白的免疫原性的表位或结构域。本文描述的任何一个融合蛋白中使用的氨基酸区段可以通过使用位于任何结构域的任意一端的额外侧翼氨基酸来进行改造；文中提供的例子是示范性的。例如，根据该实施方案的融合蛋白可以包含1)接近全长(除去位点1)的HBV基因型C X抗原的氨基酸序列(例如，SEQID NO:12的位点2-154或者SEQ ID NO:39的位点7-159)；和2)HBV基因型C核心蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ IDNO:9的位点31-212或者SEQ ID NO:39的位点160-341)；并且没有使用N或C端序列，或者使用了不同的N或C端序列，和/或在HBV序列之间使用或未使用接头。在一个实施方案中，代替以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，使用了SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90所代表的N端肽，之后是所述的融合蛋白的其余部分。
包含单个HBV蛋白的HBV抗原组合物。在发明的一个实施方案中，HBV抗原由单个HBV蛋白(例如，选自表面、核心、e抗原、聚合酶或X抗原的一个HBV蛋白)或者来自单个HBV蛋白的一或多个(结构、功能和/或免疫原性)结构域构成。该发明实施方案对制备基于酵母的免疫治疗组合物尤其有用，所述组合物可以例如与一或多种其他基于酵母的免疫治疗组合物联用以治疗或预防HBV；或者与一或多种其他基于酵母的免疫治疗组合物顺序使用以治疗或预防HBV；或者如果患者被感染了，在预防措施后进行治疗措施。例如，本实施方案的包含HBV表面抗原的基于酵母的免疫治疗组合物可以与包含不同HBV蛋白/抗原(比如HBV X抗原，如下所述)的第二个基于酵母的免疫治疗组合物联用，并且如果需要的话，进一步与其他基于酵母的“单个HBV蛋白”免疫治疗剂(例如，包含HBV前核心、核心或e抗原的基于酵母的免疫治疗组合物，和/或包含HBV聚合酶抗原或其结构域的基于酵母的免疫治疗组合物)联用。这些“单个HBV蛋白酵母免疫治疗剂”可以相互组合使用或顺序使用，和/或与其他基于酵母的多HBV蛋白免疫治疗剂(比如实施例或文中其他地方描述的那些)组合使用或顺序使用。替代地或者另外，诸如该基于酵母的HBV表面抗原免疫治疗剂的“单个HBV蛋白酵母免疫治疗剂”可以利用任何给定基因型或基因亚型的HBV序列来制备，另外的HBV表面抗原基于酵母的免疫治疗剂可以利用来自任何一或多个其他基因型或亚基因型的HBV序列制备。这种策略可以有效地产生不同HBV抗原和基因型和/或亚基因型“调味品架(spice rack)”，每个是在本发明的基于酵母的免疫治疗剂的情境中提供的，或者是在包括至少一个本发明的基于酵母的免疫治疗剂的策略中提供的。相应地，可以选择一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个这些基于酵母的免疫治疗剂的任意组合来治疗感染了HBV的特定患者或患者群，这表明了本发明可以通过个性化或定制来满足具体患者、患者群、人口或者其他患者群。
在发明的一个实施方案中，用于本发明的组合物或方法中的HBV抗原是包含下述，或者由它们构成的HBV抗原:(a)HBV表面抗原蛋白和/或其一或多个(结构的、功能的或者免疫原性的)结构域，可以包括HBV大(L)表面抗原的前S1的肝细胞受体部分、HBV大(L)表面抗原、HBV中(M)表面抗原、HBV小(S)表面抗原(HBsAg)，或者它们的任何结构域或组合；(b)HBV聚合酶抗原，可以包括一或多个HBV聚合酶(结构的、功能的或者免疫原性的)结构域，比如HBV聚合酶的逆转录酶(RT)结构域(功能结构域)；(c)HBV前核心抗原、HBV核心抗原和/或HBV e抗原，或者它们的一或多个(结构的、功能的或者免疫原性的)结构域，可以包括一或多个HBV前核心结构域或部分，其中含有来自HBV核心和HBV e抗原的序列，或者含有只来自HBV核心或只来自HBV e抗原的序列；或者(d)HBV X抗原，可以包括HBV X抗原的一或多个结构域。在一个方面中，这些蛋白或结构域中的任何一个或多个是全长或接近全长的。在一个方面中，这些蛋白或结构域中的一或多个包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或者更多个免疫原性结构域或者由它们构成。在一个方面中，这些蛋白或结构域中的任何一个或多个包含相应全长序列或其结构域的线性序列的至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一个方面中，这些蛋白或结构域中的任何一个或多个与相应全长序列或其结构域的线性序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。本文描述了HBV表面抗原、HBV聚合酶抗原、HBV核心抗原和HBV X抗原的多种合适的示范序列。
实施例5中描述了包含表面抗原蛋白的组合物的一个例子。在该实施方案中，在这个实施方案中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造在合适的启动子(比如铜诱导启动子CUP1或TEF2启动子)的调控下表达HBV表面蛋白。该蛋白是包含HBV接近全长的HBV大(L)表面抗原(为了容纳选择用于增强或稳定抗原表达的N端序列)的单个多肽，以SEQ ID NO:93为代表:(1)SEQ ID NO:89N端肽(SEQ ID NO:93的位点1-89)；2)接近全长(除去位点1)的HBV基因型C大(L)表面抗原(例如，SEQ ID NO:11的位点2-400或者SEQ ID NO:93的位点90-488)的氨基酸序列；以及3)六组氨酸标签(例如，SEQ ID NO:93的位点489-494)。替代地，N端肽可以被SEQ ID NO:37或其同源物或者文中描述的另一个N端肽代替。在一个实施方案中，该构建体还含有一或多个位于表面抗原的抗病毒抗性突变。虽然这个例子中使用了大(L)表面抗原作为HBV抗原，可能会最大化免疫系统形成的对免疫原性表位的接触，但可以利用文中提供的指南产生小的表面抗原部分，包括表面抗原的任何结构域或结构域组合。此外，显示的示范性免疫治疗剂使用的是基因型C序列，但是可以使用其他基因型、亚基因型和/或HBV毒株或分离物代替。
实施例3和实施例5中描述了包含HBV聚合酶抗原的组合物的一个例子。实施例5中描述的HBV抗原如图6所示。在这个实施方案中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造在铜诱导启动子CUP1或TEF2启动子的调控下表达各种HBV聚合酶蛋白。每种情况中，融合蛋白均是单个多肽，以SEQ ID NO:40为代表，所述多肽含有从N到C端符合读框地融合的以下序列：1)N端肽，赋予对蛋白酶体降解抗性和表达稳定性(SEQ ID NO:37，或者SEQ ID NO:40的位点1-6)；2)包含逆转录酶结构域的HBV基因型C聚合酶部分的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:10的位点347-691或者SEQ ID NO:40的位点7-351)；以及3)六组氨酸标签(例如，SEQ ID NO:40的位点352-357)。序列还含有被认为能够增强融合蛋白免疫原性的表位或结构域。此外，在一个实施方案中，可以将该构建体的序列改造从而引入以下抗病毒抗性突变中的一或多个或者全部:rtM204l、rtL180M、rtM204V、rtV173L、rtN236T、rtA194T(参照HBV聚合酶的全长氨基酸序列给出的位点)。在一个实施方案中，产生了六个不同的免疫治疗组合物，每个含有一个这样的突变。在其他实施方案中，全部突变或者其中的一些包含在单个融合蛋白中。本文描述的任何一个融合蛋白中使用的氨基酸区段可以通过使用位于任何结构域的任意一端的额外侧翼氨基酸来进行改造；文中提供的例子是示范性的。例如，根据该实施方案的融合蛋白可以包含含有逆转录酶结构域的HBV基因型C聚合酶部分的氨基酸序列(例如，SEQID NO:10的位点347-691或者SEQ ID NO:40的位点7-351)；并且没有使用N或C端序列，或者使用了不同的N或C端序列，和/或在HBV序列之间使用或未使用接头。在一个实施方案中，代替以SEQ ID NO:37为代表的N端肽，使用了SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90所代表的N端肽，之后是所述融合蛋白的其余部分。
在实施例5显示的实施方案中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造在合适的启动子(比如铜诱导启动子CUP1或TEF2启动子)的调控下表达HBV聚合酶蛋白。所述蛋白是包含HBV聚合酶的逆转录酶(RT)结构域的单个多肽，以SEQ ID NO:94代表:(1)SEQ ID NO:89N端肽(SEQ ID NO:94的位点1-89)；2)包含逆转录酶结构域的HBV基因型C聚合酶部分的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:10的位点347-691或者SEQ ID NO:94的位点90-434)；以及3)六组氨酸标签(例如，SEQ ID NO:94的位点435-440)。序列还含有被认为能够增强融合蛋白免疫原性的表位或结构域。此外，在一个实施方案中，可以将该构建体的序列改造从而引入以下抗病毒抗性突变中的一或多个或者全部:rtM204l、rtL180M、rtM204V、rtV173L、rtN236T、rtA194T(参照HBV聚合酶的全长氨基酸序列给出的位点)。替代地，N端肽可以被SEQ ID NO:37或其同源物或者文中描述的另一个N端肽代替。
实施例5描述了包含HBV前核心、核心或e抗原的组合物的一个例子。酵母(例如，酿酒酵母)经过改造在合适的启动子(比如铜诱导启动子CUP1或TEF2启动子)的调控下表达HBV核心蛋白。所述蛋白是包含接近全长HBV核心蛋白的单个多肽，以SEQ ID NO:95代表:(1)SEQ ID NO:89N端肽(SEQ ID NO:95的位点1-89)；2)HBV基因型C核心蛋白部分的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:9的位点31-212或者SEQ ID NO:95的位点90-271)；以及3)六组氨酸标签(例如，SEQ ID NO:95的位点272-277)。序列还含有被认为能够增强融合蛋白免疫原性的表位或结构域。替代地，N端肽可以被SEQ ID NO:37或其同源物或者文中描述的另一个N端肽代替。
实施例5中描述了包含HBV X抗原的基于酵母的免疫治疗组合物的一个例子。酵母(例如，酿酒酵母)经过改造在合适的启动子(比如铜诱导启动子CUP1或TEF2启动子)的调控下表达HBV X抗原。所述蛋白是包含接近全长HBV X抗原的单个多肽，以SEQ ID NO:96代表:(1)SEQ ID NO:89N端肽(SEQ ID NO:96的位点1-89);2)HBV基因型C X抗原部分的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:12的位点2-154或者SEQ ID NO:96的位点90-242)；以及3)六组氨酸标签(例如，SEQ ID NO:96的位点243-248)。序列还含有被认为能够增加融合蛋白的免疫原性的表位或结构域。替代地，N端肽可以被SEQ ID NO:37或其同源物或者文中描述的另一个N端肽代替。
包含来自两个或更多个基因型的HBV蛋白的HBV抗原。发明另一个实施方案涉及用于本发明的免疫治疗组合物的HBV抗原，其中为了提供具有以一种组合物即可治疗大量个体或个体群的潜力的组合物，所述HBV抗原最大化对HBV基因型和/或亚基因型的定靶。这种组合物通常生产效率高(即通过包含have a production advantage by includingmultiple抗原和/或a consensus approach to targeting基因型)并且能更有效地用于多种临床情景(例如，一个组合物可以供多种不同地理情形的多种不同类型的患者使用)。正如以上讨论的，为了生产这种HBV抗原，可以选择(在HBV基因型之间的)保守抗原和/或保守结构域，并且设计最大化包含保守免疫结构域的抗原。
在该实施方案的一个方面中，提供的HBV抗原在单个基于酵母的免疫治疗剂中包含单个HBV蛋白或其结构域(例如，表面、聚合酶、核心/e或X)，所述单个蛋白或其结构域在抗原构建体中重复了二、三、四、五或更多次，每次使用的是来自不同HBV基因型或亚基因型的序列。在这个方面中，一个基于酵母的免疫治疗剂可以靶向多个优势或流行基因型，从而提高临床和生产效率。如果需要，这些抗原可以经过改造最大化地包含共有序列，包括抗原内的共有T细胞表位，否则可能含有由于亚基因型、毒株或分离物的不同带来的细微差异。
相应地，在发明的一个实施方案中，用于本发明的组合物或方法的HBV抗原包含两个或更多个重复的HBV抗原，或者由它们构成，所述HBV抗原是相同的蛋白或结构域，但是来自不同HBV基因型(例如，两个或更多个HBV核心或e抗原，它们可以包括一或多个HBV核心或e抗原结构域(结构的、功能的或者免疫原性的)，其中所述抗原包含来自HBV基因型C和HBV基因型D之一的相同或相似抗原，从而形成核心-核心融合，每个核心蛋白来自不同基因型)。在一个方面中，所述构建体中使用的HBV蛋白是全长或接近全长的蛋白或结构域。在一个方面中，HBV抗原包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或者更多免疫原性结构域，或者由它们构成。在一个方面中，这些蛋白或结构域中的任何一个或多个包含对应全长序列的线性序列的至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一个方面中，这些蛋白或结构域中的任何一个或多个与对应全长序列的序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
实施例6中示范了这样的抗原。在这个实施方案中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造在合适的启动子(比如铜诱导启动子CUP1或TEF2启动子)的调控下表达HBV融合蛋白。蛋白是包含四个核心抗原的单个多肽，每个核心抗原来自不同的基因型(HBV基因型A、B、C和D)，以SEQ ID NO:105代表:1)位于SEQ ID NO:105的位点1的N端甲硫氨酸；2)来自HBV基因型A的接近全长核心蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:1的位点31-212或者SEQ ID NO:105的位点2-183)；3)来自HBV基因型B的接近全长核心蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ IDNO:5的位点30-212或者SEQ ID NO:105的位点184-395)；4)来自HBV基因型C的接近全长核心蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:9的位点30-212或者SEQ ID NO:105的位点396-578)；5)来自HBV基因型D的接近全长核心蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:13的位点30-212或者SEQ ID NO:105的位点579-761)；以及5)六组氨酸标签(例如，SEQ ID NO:105的位点762-767)。序列还含有被认为能够增加融合蛋白的免疫原性的表位或结构域。位点1的N端甲硫氨酸可以用SEQ ID NO:37或其同源物取代，或者用SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90的α前原序列或其同源物取代，或者如果需要用任何其他的合适N端序列取代。此外，可以根据需要在HBV蛋白之间插入接头序列以便协助构建体的克隆和操作。这是一个示范性构建体，可以给该设计取代HBV基因型和/或亚基因型的任何其他组合从而构建单抗原的基于酵母的HBV免疫治疗产物，其具有广泛的临床应用性和高效生产的设计。SEQ ID NO:105的氨基酸序列还含有几个已知的T细胞表位，并且某些表位经过改造对应给定表位的公开序列(参见表5)。
在该实施方案的另一个方面，用于本发明的HBV抗原中包含了来自单个HBV基因型的一个以上的蛋白或结构域，所述蛋白或结构域被选中用于最大化HBV基因组所编码的最保守的蛋白序列，或者最大化在抗原内包含治疗或预防有用的免疫原性结构域。然后在同一融合蛋白中重复这些抗原，但使用的是来自不同HBV基因型或亚基因型的相同或相似序列。在这个方面中，也可以在一个基于酵母的免疫治疗剂中靶向多个优势或流行基因型，同样提高临床和生产效率。根据需要这些抗原还可以经过改造最大地包含抗原内的共有T细胞表位，否则可能含有由于亚基因型、毒株或分离物的不同带来的细微差异。
相应地，在发明的一个实施方案中，用于本发明的组合物或方法的HBV抗原包含至少两个不同HBV蛋白或其结构域，或者由它们构成，其中所述HBV蛋白重复了两次或更多次，但重复序列来自不同的HBV基因型(例如，两个或更多个HBV核心和两个或更多个X抗原，或其结构域，其中抗原包括来自HBV基因型C和HBV基因型D之一的相同或相似抗原，从而形成核心-X-核心-X融合(或者融合内是任何其他区段顺序)，每个核心蛋白来自不同基因型，每个X抗原来自不同基因型)。在一个方面中，所述构建体中使用的HBV蛋白是全长或接近全长的蛋白或结构域。在一个方面中，HBV抗原包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或者更多免疫原性结构域，或者由它们构成。在一个方面中，这些蛋白或结构域中的任何一个或多个包含对应全长序列的线性序列的至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一个方面中，这些蛋白或结构域中的任何一个或多个与对应全长序列的序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
实施例6中示范了这样的抗原。在这个实施方案中，酵母(例如，酿酒酵母)经过改造在合适的启动子(比如铜诱导启动子CUP1或TEF2启动子)的调控下表达HBV融合蛋白。蛋白是包含两个核心抗原和两个X抗原的单个多肽，每对中的一个来自不同的基因型(HBV基因型A和C)，以SEQ ID NO:106代表:1)位于SEQ ID NO:106的位点1的N端甲硫氨酸；2)来自HBV基因型A的接近全长核心蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:1的位点31-212或者SEQID NO:106的位点2-183)；3)来自HBV基因型A的全长X抗原的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:4的位点或者SEQ ID NO:106的位点184-337)；4)来自HBV基因型C的接近全长核心蛋白的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:9的位点30-212或者SEQ ID NO:106的位点338-520)；5)来自HBV基因型C的全长X抗原的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:8或者SEQ ID NO:106的位点521-674)；以及5)六组氨酸标签(例如，SEQ ID NO:106的位点675-680)。序列还含有被认为能够增加融合蛋白的免疫原性的表位或结构域。位点1的N端甲硫氨酸可以用SEQ ID NO:37或其同源物取代，或者用SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90的α前原序列或其同源物取代。SEQ IDNO:106的氨基酸序列还含有几个已知的T细胞表位，并且某些表位经过改造对应给定表位的公开序列(参见表5)
涉及HBV抗原的其他实施方案。在本发明的一些方面中，可以对野生型或参照HBV蛋白中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多个氨基酸进行氨基酸插入、缺失和/或取代，只要得到的HBV蛋白在作为本发明的酵母HBV免疫治疗组合物中的抗原时能够引发抗目标或野生型或参照HBV蛋白的免疫反应，所述免疫反应可能包括增强的免疫反应、减弱的免疫反应或者基本相似的免疫反应。例如，发明包括HBV激动抗原的用途，所述HBV激动抗原可能包括一或多个经过突变的T细胞表位，突变增强了抗HBV激动剂的T细胞反应，比如通过提高表位对MHC分子的亲合力或亲和力，或者通过提高表位对就MHC递呈而言识别表位的T细胞受体的亲合力或亲和力。因此HBV蛋白激动剂可能提高抗感染宿主的天然HBV蛋白的T细胞反应能力或效力。
提到任何以上描述的HBV抗原，包括那些其氨基酸序列包含下述序列或者以下述序列代表的融合蛋白:SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:107、SEQID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:126、SEQID NO:128、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:150或SEQ ID NO:151，本发明的一个方面使用来自融合蛋白内个体HBV蛋白(例如来自HBV表面抗原、HBV聚合酶、HBV核心/e抗原和/或HBV X抗原)的一或多个HBV抗原以构建“单个蛋白”抗原(例如，只有一个来自这些HBV蛋白的抗原)，或者如果适合给定的参照融合蛋白，可以只利用HBV蛋白区段中的两个或三个来构建融合蛋白。本发明还有一个方面是改变融合蛋白内HBV蛋白区段的顺序。作为另一个替代的设计，可以将HBV基因型和/或共有序列组合，这种情况中使用两个、三个、四个或更多个基因型和/或共有序列来构建融合蛋白。
发明还包括任何以上描述的融合蛋白的同源物，以及个体HBV蛋白或其部分(包括任何功能的和/或免疫原性的结构域)的同源物、变体或突变体的用途，其中所述部分是这些融合蛋白的一部分或者其他在文中描述过的。在一个方面中，发明包括融合蛋白或个体(单个)HBV蛋白或HBV抗原的用途，其中就融合蛋白的全长或者融合蛋白的限定区段或者形成融合蛋白部分的限定蛋白或结构域(免疫原性结构域或功能性结构域(即具有至少一个生物活性的结构域))而言，所述融合蛋白或个体HBV蛋白或HBV抗原的氨基酸序列分别与本文描述的任何一个融合蛋白或个体HBV蛋白或HBV抗原的氨基酸序列至少85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,or99%相同。许多CTL表位(被来自感染HBV的患者的细胞毒性T淋巴细胞识别的表位)和逃避突变(由于抗病毒药物的选择压力，在HBV蛋白中产生的突变)是本领域已知的，为了提供发明所述HBV抗原的特定序列，这个信息也可以用于产生取代或者生成本文描述的HBV抗原的变体或同源物。
基于酵母的免疫治疗组合物。在发明的各个实施方案中，发明包括至少一个“基于酵母的免疫治疗组合物”(该短语可以与“基于酵母的免疫治疗产物”、“基于酵母的免疫治疗组合物”、“基于酵母的组合物”、“基于酵母的免疫治疗剂”、“基于酵母的疫苗”或者这些短语的衍生词交换使用)的用途。“免疫治疗组合物”是这样的组合物，所述组合物引发的免疫反应足以在受试对象中取得至少一个治疗好处。用于本文，基于酵母的免疫治疗组合物是指包含酵母媒介物成分并且引发足以在受试对象中取得至少一个治疗好处的组合物。更具体地说，基于酵母的免疫治疗组合物是包含酵母媒介物成分并且引发或诱导免疫反应(比如细胞免疫反应，包括但不限于T细胞介导的细胞免疫反应)的组合物。在一个方面中，用于本发明的基于酵母的免疫治疗组合物能够诱发CD8+和/或CD4+T细胞介导的免疫反应；在一个方面中，诱发的是CD8+和CD4+T细胞介导的免疫反应.任选地，基于酵母的免疫治疗组合物能够诱发体液免疫反应。用于本发明的基于酵母的免疫治疗组合物例如可以在个体中引发免疫反应，从而使个体免于HBV感染，和/或HBV感染或由HBV感染造成的症状得以治疗。
本发明的基于酵母的免疫治疗组合物可能是“预防性的”或者“治疗性的”。当预防性使用时，在出现任何HBV感染症状之前提供本发明的组合物。这样的组合物可以在出生时、幼儿期或者成年给予。免疫治疗组合物的预防性给药用于防止后续的HBV感染、如果随后发生了HBV感染可以更快或更彻底地消退感染，和/或如果随后发生了感染可以减轻症状。当用于治疗时，免疫治疗组合物是在HBV感染开始时或者之后提供，目的是减轻感染的至少一个症状，优选地，目的是消除感染、提供对感染的长期持续缓解，和/或提供抗后续感染或病毒再活化的长期免疫力。在一个方面中，治疗的目的是丧失可检测到的HBV病毒负荷或者减少HBV病毒负荷(例如，低于PCR可检测的水平或者<2000IU/ml)。在一个方面中，治疗目的是在疗法结束后保持病毒清除状态至少6个月。在一个方面中，治疗目的是丧失可检测的血清HBeAg和/或HBsAg蛋白。在一个方面中，治疗目的是建立抗乙型肝炎表面抗原(anti-HBs)的抗体和/或抗HBeAg的抗体。在一个方面中，治疗目的是血清转化，其定义是:(a)通过放射性免疫检测确定的10或更多的样品比率单位(SRU)；(b)通过酶免疫检测确定的阳性结果；或者(c)检测到浓度>10mIU/ml的抗体(10SRU与10mIU/mL抗体相当)。在一个方面中，治疗目的是血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的正常化、肝脏炎症的改善和/或肝纤维化的改善。
一般来说，基于酵母的免疫治疗组合物包含酵母媒介物和由所述酵母媒介物表达的、附着在酵母媒介物的或者与酵母媒介物混合的至少一个抗原或其免疫原性结构域，其中所述抗原对于酵母是异源的，并且抗原包含一或多个HBV抗原或其免疫原性结构域。在一些实施方案中，抗原或其免疫原性结构域是以融合蛋白提供的。以上已经描述了适合在本发明的组合物和方法中使用的几个HBV融合蛋白。在发明的一个方面中，所述融合蛋白可以包含两个或更多个抗原。在一个方面中，融合蛋白抗原包含一或多个抗原的两个或更多个免疫原性结构域，或者一或多个抗原的两个或更多个表位。
在本发明使用的任何基于酵母的免疫治疗组合物中，以下与酵母媒介物有关的方面包括在发明中。根据本发明，酵母媒介物是可以与一或多个抗原、其免疫原性结构域或其表位在发明所述治疗组合物中联合使用的任何酵母细胞(例如，整个或者完整细胞)或其衍生物(见下文)；或者在一个方面中，酵母媒介物可以单独使用或者作为佐剂。因此酵母媒介物抗原包括，但不限于活的完整(整个)酵母微生物(即具有包括细胞壁在内的所有成分的酵母细胞)、被杀死(死的)或者灭活的完整酵母微生物，或者完整/整个酵母的衍生物，包括:原生质球(即缺少细胞壁的酵母细胞)、酵母胞质体(即缺少细胞壁或细胞核的酵母细胞)、酵母ghost(即缺少细胞壁、细胞核或细胞质的酵母细胞)、亚细胞酵母膜提取物或其组分(又被称为酵母膜颗粒，以前被称为亚细胞酵母颗粒)、任何其他酵母颗粒或者酵母细胞壁制备物。
酵母原生质球通常是通过对酵母细胞壁进行酶解产生的。这类方法在例如Franzusoff et al.,1991,Meth.Enzymol.194,662-674中有描述，该文献通过引用全部并入本文。
酵母胞质体通常是通过酵母细胞去核仁产生的。这类方法在例如Coon,1978,Natl.Cancer Inst.Monogr.48,45-55中有描述，该文献通过引用全部并入本文。
酵母ghosts通常是通过将发生通透化或者裂解的细胞重新密封产生的，可以但不必须含有该细胞的至少部分细胞器。这类方法在例如Franzusoff et al.,1983,J.Biol.Chem.258,3608-3614和Bussey et al.,1979,Biochim.Biophys.Acta553,185-196中有描述，每个文献都通过引用全部并入本文。
酵母膜颗粒(亚细胞酵母膜提取物或其组分)是指缺少天然细胞核或细胞质的酵母膜。颗粒可以是任何大小，大小的范围包括从天然酵母膜到通过超声处理或其他本领域技术人员已知的膜破碎方法产生的微颗粒，然后重新密封。产生亚细胞酵母膜提取物的方法在例如Franzusoff et al.,1991,Meth.Enzymol.194,662-674中有描述。还可以使用含有酵母膜部分的酵母膜颗粒组分，以及如果抗原或其他蛋白是在制备酵母膜颗粒之前由酵母重组表达的，可以使用抗原或其他目标蛋白。抗原或其他目标蛋白可以被运送到膜内，或者膜表面或者它们的组合(即，蛋白可以是膜内或者膜外的，和/或跨酵母膜颗粒的膜)。在一个实施方案中，酵母膜颗粒是重组酵母膜颗粒，所述重组酵母膜颗粒可以是完整的、破碎的或者破碎并重新密封的酵母膜，所述酵母膜包含位于膜表面或者至少部分镶嵌在膜内的至少一个所需抗原或其他目标蛋白。
酵母细胞壁制备物的一个例子是带有抗原的分离酵母细胞壁制品，所述抗原在细胞壁表面或者至少部分嵌在细胞壁内，这样将所述酵母细胞壁制备物给予动物时，会刺激抗疾病目标的所需免疫反应。
可以使用任何酵母株来产生本发明的酵母媒介物。酵母是单细胞微生物，属于以下三类之一:子囊菌纲、担子菌纲或半知菌纲。选择作为免疫调节剂的酵母的类型时的一个考虑是酵母的病原性。在一个实施方案中，酵母是诸如酿酒酵母的非致病菌株。选择非致病酵母菌株最小化了对给予酵母媒介物的个体的任何不良效应。但是，如果酵母的致病性可以通过本领域技术人员已知的任何手段(例如突变菌株)取消，则可以使用致病酵母。
可以用于本发明的酵母菌株的属包括，但不限于酵母属、假丝酵母属、隐球菌属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、红酵母属、裂殖酵母属和耶氏酵母属。在一个方面中，酵母的属选自酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属或裂殖酵母属；并且在一个方面中，酵母的属选自酵母属、汉逊酵母属和毕赤酵母属，并且在一个方面中，使用了酵母属。可以用于本发明的酵母株的种包括，但不限于酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、白色假丝酵母、克菲假丝酵母(Candida kefyr)、热带假丝酵母、罗伦特隐球菌(Cryptococcus laurentii)、新型隐球菌、异常汉逊酵母、多形汉逊酵母、脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母马克斯变种、巴斯德毕赤酵母、深红酵母、粟酒裂殖酵母和解脂耶氏酵母。应当理解，这些种中有许多包括多种亚种、型、亚型等，它们都是意图包括在以上提到的种中的。在一个方面中，用于发明的酵母种包括酿酒酵母、白色假丝酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母和粟酒裂殖酵母。酿酒酵母很有用因为它相对容易操作，并且对于作为食品添加剂被“通常认为是安全的”或"GRAS"(GRAS,FDA proposedRule62FR18938,April17,1997)。本发明的一个实施方案是能够将质粒复制到特别高的拷贝数的酵母株，比如酿酒酵母cir°株。酿酒酵母株是这样的菌株，所述菌株能够支持高水平表达一或多个目标抗原和/或抗原融合蛋白和/或其他蛋白的表达载体。此外，本发明中可以使用任何突变酵母株，包括那些表现出对所表达的目标抗原或其他蛋白的翻译后修饰减少(比如延伸N端连接糖基化的酶发生突变)的菌株。
在发明的多数实施方案中，基于酵母的免疫治疗组合物包含至少一个抗原、其免疫原性结构域或其表位。考虑用于本发明的抗原包括为了预防或治疗性免疫宿主抗HBV感染，希望针对它们引发免疫反应的任何HBV抗原或其免疫原性结构域，包括HBV蛋白的突变体、变体和激动剂或其结构域。以上已经详细描述了可用于发明各个实施方案的HBV抗原。
任选地，作为本发明的基于酵母的免疫治疗组合物成分的蛋白，包括融合蛋白可以利用构建体来制备，所述构建体对于提高或增强重组抗原在酵母中的表达，或者表达稳定性尤其有用。一般来说，所需抗原性蛋白或肽在它们的氨基端融合了:(a)特定合成肽，其能够稳定融合蛋白在酵母媒介物中的表达或者防止被表达的融合蛋白的翻译后修饰(这类蛋白在例如美国专利公开2004-0156858A1中有详细描述，该专利公开于2004年8月12日出版，通过引用全文并入本文)；(b)内源酵母蛋白(包括但不限于α因子)的至少一部分，其中融合伙伴之一使得蛋白在酵母中的表达稳定性提高，和/或防止酵母细胞对蛋白的翻译后修饰(这类蛋白在例如美国专利公开2004-0156858A1中也有详细描述，同前)；和/或(c)酵母蛋白的至少一部分，其导致融合蛋白被表达在酵母的表面(例如Aga蛋白，文中有更详细描述)。此外，本发明任选地包括被融合在编码抗原的构建体C端的肽的用途，特别是在蛋白选择和鉴定中的用途。这类肽包括，但不限于任何合成或天然肽，比如肽标签(例如六组氨酸)或任何其他短的表位标签。根据本发明附着在抗原C端的肽可以添加或者不添加以上讨论的N端肽使用。
在一个实施方案中，可以在融合蛋白中使用的合成肽被连接在抗原的N端，所述肽由对于抗原是异源的至少两个氨基酸残基构成，其中肽能够稳定融合蛋白在酵母媒介物中的表达，或者防止被表达融合蛋白的翻译后修饰。合成肽和抗原的N端部分一起形成满足以下要求的融合蛋白:(1)融合蛋白位点1的氨基酸残基是甲硫氨酸(即合成肽中的第一个氨基酸是甲硫氨酸)；(2)融合蛋白位点2的氨基酸残基不是甘氨酸或脯氨酸(即合成肽中的第二个氨基酸不是甘氨酸或者脯氨酸)；(3)融合蛋白位点2-6的氨基酸残基都不是甲硫氨酸(即如果合成肽短于6个氨基酸，不论合成肽部分或蛋白的位点2-6的氨基酸都不包含甲硫氨酸)；以及(4)融合蛋白位点2-6的氨基酸没有赖氨酸或精氨酸(即如果合成肽短于5个氨基酸，不论合成肽部分或蛋白的位点2-6的氨基酸都不包含赖氨酸或精氨酸)。合成肽可以短到只有两个氨基酸，但在一个方面中，是2-6个氨基酸(包括3、4、5个氨基酸)，并且可以超过6个氨基酸，均为整数，最多大约200个氨基酸、300个氨基酸、400个氨基酸、500个氨基酸或者更多。
在一个实施方案中，融合蛋白包含氨基酸序列M-X2-X3-X4-X5-X6，其中M是甲硫氨酸；其中X2是除了甘氨酸、脯氨酸、赖氨酸或精氨酸的任何氨基酸；其中X3是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸的任何氨基酸；其中X4是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸的任何氨基酸；其中X5是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸的任何氨基酸；其中X6是除了甲硫氨酸、赖氨酸或精氨酸的任何氨基酸。在一个实施方案中，X6残基是脯氨酸。能够提高抗原在酵母细胞中表达稳定性和/或防止蛋白在酵母中的翻译后修饰的一个示范性合成序列包括序列M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO:37)。具有相同性能的另一个示范性合成序列是M-V。除了更高的表达产物稳定性，这些融合伙伴似乎不会负面影响抗构建体中免疫抗原的免疫反应。此外，可以设计合成融合肽来提供能被选择剂(比如抗体)识别的表位。
在一个实施方案中，HBV抗原被连接在酵母蛋白的N端，所述酵母蛋白是比如α因子前原序列(又被称为α因子信号前导序列)，它的氨基酸序列在文中以SEQ ID NO:89或SEQID NO:90示范。酵母α因子前原序列的其他序列是本领域已知的，也可以在本发明中使用。
在发明的一个方面中，酵母媒介物经过操作，使得抗原被部分或全部表达在酵母媒介物(胞外表达)的表面，或者通过被表达蛋白产物的递送或转运部分或全部地提供在酵母媒介物的表面。实现发明这一方面的一个方法是利用间隔臂将一或多个蛋白定位在酵母媒介物的表面。例如，可以利用间隔臂来制备抗原或其他目标蛋白与那些能够将抗原或其他目标蛋白定靶到酵母细胞壁的蛋白的融合蛋白。例如，可以用来定靶其他蛋白的一个这样的蛋白是酵母蛋白(例如，细胞壁蛋白2(cwp2)、Aga2、Pir4或Flo1蛋白)，所述酵母蛋白能够将抗原或其他蛋白定靶到酵母细胞壁，从而使所述抗原或其他蛋白定位到酵母的表面。可以使用酵母蛋白之外的蛋白作为间隔臂；但是，对于任何间隔臂蛋白，最需要的是使免疫反应针对靶抗原而不是间隔臂蛋白。因此，如果使用其他蛋白作为间隔臂，则所使用的间隔臂蛋白不应当造成对间隔臂蛋白自身的强大免疫反应超越了对靶抗原的免疫反应。本领域技术人员应当致力使针对间隔臂蛋白的免疫反应相对靶抗原的免疫反应较小。可以将间隔臂构建成带有切割位点(例如，蛋白酶切割位点)，从而使需要的情况下，抗原能够容易地从酵母中除去或处理掉。可以使用任何已知的确定免疫反应强度的方法(例如抗体产生、裂解分析等)，这些对本领域技术人员是熟知的。
另一种将靶抗原或其他蛋白定位到暴露在酵母表面的方法是利用信号序列(比如糖基磷脂酰肌醇(GPI))将目标分子锚定到酵母细胞壁上。替代地，可以通过附加某些信号序列来实现定位，所述信号序列将抗原或其他目标蛋白定靶到分泌途径中，经由转位到内质网(ER)，从而使抗原与会结合细胞壁(例如cwp)的蛋白结合。
在一个方面中，间隔臂蛋白是酵母蛋白。所述酵母蛋白可以由大约两个到大约800个酵母蛋白的氨基酸构成。在一个实施方案中，酵母蛋白是大约10–700个氨基酸。在另一个实施方案中，酵母蛋白是大约40–600个氨基酸。本发明的其他实施方案包括至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少350个氨基酸、至少400个氨基酸、至少450个氨基酸、至少500个氨基酸、至少550个氨基酸、至少600个氨基酸，或者至少650个氨基酸的酵母蛋白。在一个实施方案中，酵母蛋白长至少450个氨基酸。如果希望优化抗原的表面表达，另一个考虑是抗原和间隔臂组合是否应当表达为单体或二聚体或三聚体，或者甚至更多的单位连接在一起。单体、二聚体、三聚体等的这种用途使得抗原可以有适当的间隔或折叠，从而抗原的某些部分(如果不是所有部分)在酵母媒介物表面的展示方式使它更有免疫原性。
使用酵母蛋白可以稳定融合蛋白在酵母媒介物中的表达，防止被表达的融合蛋白发生翻译后修饰，和/或将融合蛋白定靶到酵母中的特定区室(例如，被表达在酵母细胞表面上)。为了递送到酵母的分泌途径，可以使用的示范性酵母蛋白包括，但不限于Aga(包括但不限于Agal和/或Aga2)；SUC2(酵母转化酶)；α因子信号前导序列；CPY；Cwp2p，因为它能定位并保持在细胞壁中；BUD基因，用于在形成子细胞的初始阶段定位在酵母细胞芽；Flo1p；Pir2p和Pir4p。
可以使用其他序列将蛋白靶向、保持和/或稳定在酵母媒介物的其他部分，例如细胞浆或线粒体或内质网或者细胞核。可以用于以上任何实施方案的合适酵母蛋白的例子包括，但不限于TK、AF、SEC7；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PCK1、磷酸甘油激酶PGK和磷酸丙酮异构酶TPI基因产物，因为它们在葡萄糖中表达会受到抑制，以及它们的胞质定位；热震惊蛋白SSA1、SSA3、SSA4、SSC1，其表达在细胞接触热处理时被诱导并且蛋白热稳定性更好；用于输入到线粒体的线粒体蛋白CYC1；ACT1。
发明考虑了制备酵母媒介物和用酵母媒介物表达并与抗原和/或其他蛋白和/或目标试剂组合和/或连接从而产生基于酵母的免疫治疗组合物的方法。
根据本发明，术语“酵母媒介物抗原复合体”或“酵母-抗原复合体”用于一般性描述酵母媒介物与抗原的任何结合，并且可以与“基于酵母的免疫治疗组合物”在所述组合物被用于如上所述引发免疫反应的情况下交换使用。这种结合包括由酵母(重组酵母)表达抗原、将抗原引入酵母、抗原与酵母的物理附着，和酵母与抗原在比如缓冲液或其他溶液或制剂中的混合。以下详细描述了这些类型的复合体。
在一个实施方案中，用于制备酵母媒介物的酵母细胞被转染编码蛋白(例如抗原)的异源核酸分子，从而由酵母细胞表达蛋白。这样的酵母在本文又被称为重组酵母或重组酵母媒介物。然后可以将酵母细胞装载到树突细胞中作为完整细胞；或者可以将酵母细胞杀死；或者通过形成酵母原生质球、胞质、ghosts或亚细胞颗粒进行衍生化，之后将上述衍生物中的任何一种装载到树突细胞中。为了产生能够表达抗原或其他蛋白的重组原生质球，还可以直接用重组核酸分子转染酵母原生质球(例如，由整个酵母产生原生质球，然后转染)。
一般来说，酵母媒介物或抗原和/或其他试剂可以通过本文描述的任何技术进行结合。在一个方面中，用抗原和/或试剂胞内装载酵母媒介物。在另一个方面中，抗原和/或试剂共价地或者非共价地附着酵母媒介物。在再一个方面中，酵母媒介物和抗原和/或试剂通过混合来结合。另一个方面中，在一个实施方案中，抗原和/或试剂是由酵母媒介物或酵母细胞或者衍生酵母媒介物的酵母原生质球重组表达。
由本发明的酵母媒介物产生的抗原和/或其他蛋白的数量是可以通过酵母媒介物合理产生的任何抗原和/或其他蛋白数量，通常在至少一个到至少大约6个或更多个，包括大约2个到大约6个异源抗原和/或其他蛋白。
抗原或其他蛋白在本发明的酵母媒介物中的表达是利用本领域技术人员已知的技术实现的。简单来说，将编码至少一个所需抗原或其他蛋白的核酸分子插入表达载体，其方式使得核酸分子与转录调控序列可操纵地连接，从而在转化到宿主酵母细胞中时，能够影响核酸分子的组成性表达或调控表达。编码一或多个抗原和/或其他蛋白的核酸分子可以在一或多个表达载体上与一或多个表达调控序列可操纵地连接。特别重要的表达调控序列是那些控制转录起始的序列，比如启动子和上游激活序列。任何合适的酵母启动子都可以用于本发明，许多这样的启动子是本领域技术人员已知的。用于酿酒酵母表达的启动子包括，但不限于编码以下酵母蛋白的基因的启动子：乙醇脱氢酶I(ADH1)或II(ADH2)、CUP1、磷酸甘油酸激酶(PGK)、磷酸丙酮异构酶(TPI)、翻译延伸因子EF-1α(TEF2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH;又被称为TDH3，代表磷酸丙酮脱氢酶)、半乳糖激酶(GAL1)、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(GAL7),UDP-半乳糖表异构酶(GAL10)、细胞色素c1(CYC1)、Sec7蛋白(SEC7)和酸性磷酸酶(PHO5)，包括诸如ADH2/GAPDH和CYC1/GAL10启动子的杂合启动子，包括细胞内的葡萄糖浓度低(例如，大约百分之0.1到大约百分之0.2)时被诱导的ADH2/GAPDH启动子，以及CUP1启动子和TEF2启动子。同样的，多个上游激活序列(UASs)，又被称为增强子是已知的。用于酿酒酵母表达的上游激活序列包括，但不限于编码以下蛋白的基因的UASs：PCK1、TPI、TDH3、CYC1、ADH1、ADH2、SUC2、GAL1、GAL7和GAL10，以及被GAL4基因产物活化的其他UASs，一个方面中使用的是ADH2UAS。因为ADH2UAS被ADR1基因产物所激活，当异源基因与ADH21UAS可操纵地连接时，优选用ADH2UAS来过表达ADR1基因。用于酿酒酵母表达的转录终止序列包括α因子、GAPDH或CYC1基因的终止序列。
用于在甲基营养型酵母中表达基因的转录调控序列包括编码乙醇氧化酶和甲酸脱氢酶的基因的转录调控区。
根据本发明，核酸分子转染酵母细胞可以通过任何核酸分子导入细胞的方法来实现，包括但不限于扩散、主动运输、浴超声处理、电穿孔、微量注射、脂质转染、吸附和原生质体融合。被转染的核酸分子可以利用本领域技术人员已知的技术整合到酵母染色体中或者维持在染色体外的载体中。带有这样的核酸分子的酵母媒介物的例子在文中有详细公开。正如以上讨论的，还可以通过用所需核酸分子转染完整的酵母微生物或酵母原生质球从而重组产生酵母胞质体、酵母ghost和酵母膜颗粒或者细胞壁制品，在其中产生抗原，然后利用本领域技术人员已知的技术进一步操纵微生物或原生质球，产生含有所需抗原或其他蛋白的胞质、ghost或亚细胞酵母膜提取物或其部分。
产生重组酵母媒介物并由酵母媒介物表达抗原和/或其他蛋白的有效条件包括可以培养酵母菌株的有效培养基。有效培养基通常是包含可同化的碳水化合物、氮和磷源，以及合适的盐、矿物质、金属和其他营养(比如维生素和生长因子)的水样培养基。培养基可以包含复杂营养或者是限定的基础培养基。本发明的酵母株可以培养在多种容器内，包括但不限于生物反应器、锥形瓶、试管、微量滴定板和培养皿。培养在适合酵母菌株的温度、pH和氧气含量进行。这些培养条件是本领域技术人员的专业知识范围内的(参见例如，Guthrieet al.(eds.),1991,Methods in Enzymology,vol.194,Academic Press,San Diego)。
在发明的一些实施方案中，酵母生长在中性pH条件下。用于本文，术语“中性pH”的一般用法是指在大约pH5.5和大约pH8之的pH范围，在一个方面中，在大约pH6和大约8之间。本领域技术人员可以理解，用pH计测量时会发生小的浮动(例如，十分之几或百分之几)。因此，使用中性pH来培养酵母细胞意味着酵母细胞在培养过程中的多数时间是生长在中性pH的。在一个实施方案中，酵母生长的培养基维持在至少5.5的pH水平(即不允许培养基的pH降到pH5.5以下)。在另一个方面中，酵母生长在维持在大约6、6.5、7、7.5或8的pH水平。培养酵母中使用中性pH促进了对于使用酵母作为免疫调节媒介物来说是有益特性的几个生物效应。例如，在中性pH培养酵母允许酵母有良好的生长，同时对细胞传代时间没有负面影响(例如，加倍时间变慢)。酵母可以在不丧失细胞壁柔性的情况下继续生长到高密度。使用中性pH可以在所有收集密度产生具有柔性细胞壁的酵母和/或对细胞壁消化酶(例如葡聚糖酶)更敏感的酵母。这个特点是可取的，因为具有柔性细胞壁的酵母与在更酸性条件下生长的酵母相比，可以诱导不同的或者改善的免疫反应，例如通过促进胞吞了酵母的抗原递呈细胞分泌细胞因子(例如，TH1型细胞因子，包括但不限于IFN-γ、白介素12(IL-12)和IL-2，以及促炎细胞因子，比如IL-6)。此外，这类培养方法可以提供对位于细胞壁内的抗原的更高的可接触性。在另一方方面中，对于一些抗原使用中性pH可以利用二硫苏糖醇(DTT)处理来释放二硫键结合的抗原，而这对于培养在较低pH(例如pH5)的培养基中的抗原表达酵母是不可能的。
在一个实施方案中，利用控制酵母糖基化的量来控制酵母表达抗原，特别是在表面上的表达。酵母糖基化的量会影响表面上表达的抗原的免疫原性和抗原性，因为糖部分往往较庞大。因此，根据发明在调整酵母时应当考虑到酵母表面上存在的糖部分以及它对目标抗原周围的三维空间的影响。可以使用任何方法来减少酵母糖基化的量(或者需要的话，增加这个量)。例如，可以使用经过选择具有低糖基化水平的酵母突变株(例如，mnn1、och1和mnn9突变体)，或者可以通过突变目标抗原上的糖基化受体序列来消除糖基化。替代地，可以使用具有简短糖基化模式的酵母，例如，毕赤酵母。还可以使用能够减少或改变糖基化的方法来处理酵母。
在本发明的一个实施方案中，作为在酵母媒介物中重组表达抗原或其他蛋白的一个替代方法，将酵母媒介物胞内装载蛋白或肽，或者碳水化合物或其他分子，这些装载的分子可以作为本发明的抗原和/或作为免疫调节剂或生物反应调节剂。随后可以将现在胞内含有抗原和/或其他蛋白的酵母媒介物给予个体或装载到载体(比如树突细胞)中。肽和蛋白可以通过本领域技术人员已知的技术直接插入到酵母媒介物中，比如通过扩散、主动运输、脂质体融合、电穿孔、胞吞、冻融循环和浴超声处理。可以直接装载肽、蛋白、碳水化合物或其他分子的酵母媒介物包括完整酵母，以及原生质球、ghosts或胞质，它们可以在生产后装载抗原和其他试剂。替代地，可以给完整酵母装载抗原和/或试剂，然后由它制备原生质球、ghosts、胞质或亚细胞颗粒。在这个实施方案中，可以将任何数量的抗原和/或其他试剂装载到酵母媒介物中，从至少1、2、3、4或任何整数到几百或几千抗原和/或其他试剂，比如通过装载例如微生物或某些部分可以提供的数量。
在本发明的另一个实施方案中，抗原和/或其他试剂物理附着于酵母媒介物。抗原和/或其他试剂与酵母媒介物的物理附着可以通过本领域的任何合适方法来实现，包括共价和非共价结合方法，包括但不限于将抗原和/或其他试剂化学交联到酵母媒介物的外表面；或者将抗原和/或其他试剂生物连接到酵母媒介物的外表面，比如通过利用抗体或其他结合伙伴。化学交联的实现可以通过例如包括戊二醛连接、光亲和标记的方法、用二亚胺碳进行处理、用能够连接二硫键的化学物质进行处理，以及用其他本领域标准的交联化学剂进行处理。替代地，可以将化学剂与酵母媒介物进行接触，所述化学剂会改变酵母细胞膜脂双层的电荷或细胞壁的成分，从而使酵母外表面更可能与具有特定电荷特性的抗原和/或其他试剂发生融合或结合。还可以将诸如抗体、结合肽、可溶性受体和其他配体的靶向试剂并入抗原作为融合蛋白，或者以其他方式与抗原关联从而使抗原结合酵母媒介物。
当抗原或其他蛋白被表达或者物理附着在酵母表面上时，在一个方面中可以仔细挑选间隔臂来优化抗原或其他蛋白的表达或者表面的成分。间隔臂的大小会影响抗原或其他蛋白有多少暴露在酵母表面进行结合。因此，根据所使用的抗原或其他蛋白，本领域技术人员可以挑选能够在酵母表面上的抗原或其他蛋白之间形成合适间隔的间隔臂。在一个实施方案中，间隔臂是至少有450个氨基酸的酵母蛋白。上文已经详细讨论了间隔臂。
在再另一个实施方案中，酵母媒介物和抗原或其他蛋白通过更被动、非特异性的或者非共价的结合机制相互结合，比如通过将酵母媒介物和抗原或其他蛋白在缓冲液或其他合适的制剂(例如混合液)中轻轻混合。
在发明的一个实施方案中，酵母媒介物和抗原或其他蛋白被一起胞内装载到载体，比如树突细胞或巨噬细胞的细胞内，以形成本发明的治疗组合物或疫苗。替代地，可以在没有酵母媒介物的情况下将抗原或其他蛋白装载到树突细胞中。
在一个实施方案中，可以将完整酵母(有或没有异源抗原或其他蛋白表达)以能够产生酵母细胞壁制品、酵母膜颗粒或酵母片段(即不是完整的)的方式磨碎或加工，在在一些实施方案中，可以将酵母片段与包含抗原的其他组合物(例如DNA疫苗、蛋白亚基疫苗、杀死或灭活的病原体)一起提供或给予从而追加免疫反应。例如，可以利用酶处理、化学处理或物理力(例如，机械剪切或超声处理)将酵母破成可以作为佐剂的部分。
在发明的一个实施方案中，可用于发明的酵母媒介物包括已经杀死或灭活的酵母媒介物。杀死或灭活酵母可以通过本领域已知的多种合适方法中的任何一种来完成。例如，酵母热灭活是灭活酵母的一种标准途径，如果希望，本领域技术人员可以通过本领域已知的常规方法来监测目标抗原的结构变化。替代地，可以使用其他酵母灭活方法，比如化学、电学、放射性或UV方法。参见例如标准酵母培养参考书，比如Methods of Enzymology,Vol.194,Cold Spring Harbor Publishing(1990)中公开的方法。任何使用的灭活策略都应当考虑到目标抗原的二级、三级或四级结构，并且保存这些结构以便优化抗原的免疫原性。
酵母媒介物可以配制成本发明的基于酵母的免疫治疗组合物或产品，包括直接给予受试对象或者利用本领域技术人员已知的多种技术先装载到载体(比如树突细胞)中的制品。例如，酵母媒介物可以通过冻干进行干燥。包含酵母媒介物的制剂还可以通过将酵母制成饼或片剂，比如象用于烘培或酿造工艺中的酵母。此外，可以将酵母媒介物与药学上可接受的赋形剂混合，比如宿主或宿主细胞能够耐受的等渗缓冲液。这类赋形剂的例子包括水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液、Hank's溶液，和其他水性生理平衡盐溶液。还可以使用非水性的媒介物，比如固定油类、芝麻油、油酸乙酯或甘油三酯。其他有用的制剂包括含有增稠剂(比如羧甲基纤维素钠、山梨醇、甘油或葡聚糖)的悬浮液。赋形剂还可以含有微量的添加剂，比如能增强等渗性和化学稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸缓冲液、碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，防腐剂的例子包括噻汞撒(thimerosal)、m-或o-甲苯酚、福尔马林和苯甲醇。标准的制剂可以是液态注射剂，或者能够加入合适液体成为用于注射的悬浮液或溶液的固体。因此，在非液体制剂中，赋形剂可以包含例如葡萄糖、人血清白蛋白，和/或防腐剂，然后在给药前可以加入无菌水或盐水。
在本发明的一个实施方案中，组合物可以包含其他试剂，这些试剂也可以被称为生物反应调节剂化合物，或者产生这些试剂/改造剂的能力。例如，可以用至少一种抗原和至少一种抗原/生物反应调节剂化合物转染或装载酵母媒介物，或者可以将本发明的组合物与至少一种试剂/生物反应调节剂一起给予。生物反应调节剂包括能调节免疫应答的佐剂和其他化合物，它们可以被称为免疫调节性化合物；还包括能改造另一种化合物或试剂的生物活性的化合物，比如基于酵母的免疫治疗剂，所述生物活性不限于免疫系统的效应。某些免疫调节化合物能刺激保护性免疫反应，而其它的能抑制有害的免疫反应，免疫调节与给定基于酵母的免疫治疗剂的组合是否有用可能至少部分取决于要治疗或防止的疾病状态或状况，或者待治疗的个体。某些生物反应调节剂优先增强细胞介导型免疫反应，而其它的优先增强体液免疫反应(即，与体液免疫相比，能激发细胞介导的免疫反应的水平，或者反过来)。某些生物反应调节剂与基于酵母的免疫治疗剂有一或多个共同的特性，或者对基于酵母的免疫治疗剂的生物特性能够增强或互补。本领域技术人员知道多种测量免疫反应的激发或抑制的方法，以及区分细胞介导的免疫反应和体液介导的免疫反应的方法，和区分一类细胞介导的反应与另一类反应(例如，TH17反应对TH1反应)。
可用于发明的抗原/生物反应调节剂可以包括，但不限于细胞因子、趋化因子、激素、脂类衍生物、肽、蛋白、多糖、小分子药物、抗体及其抗原结合片段(包括，但不限于抗细胞因子抗体、抗细胞因子受体抗体、抗趋化因子抗体)、维生素、多核苷酸、核酸结合部分、适配体和生长调节剂。一些合适的试剂包括，但不限于IL-1，或者IL-1或IL-1R的激动剂，抗IL-1或其他IL-1拮抗剂；IL-6，或者IL-6或IL-6R的激动剂，抗IL-6或其他IL-6拮抗剂；IL-12，或者IL-12或IL-12R的激动剂，抗IL-12或其他IL-12拮抗剂；IL-17，或者IL-17或IL-17R的激动剂，抗IL-17或其他IL-17拮抗剂；IL-21，或者IL-21或IL-21R的激动剂，抗IL-21或其他IL-21拮抗剂；IL-22，或者IL-22或IL-22R的激动剂，抗IL-22或其他IL-22拮抗剂；IL-23，或者IL-23或IL-23R的激动剂，抗IL-23或其他IL-23拮抗剂；IL-25，或者IL-25或IL-25R的激动剂，抗IL-25或其他IL-25拮抗剂；IL-27，或者IL-27或IL-27R的激动剂，抗IL-27或其他IL-27拮抗剂；I型干扰素(包括IFN-α)，或者I型干扰素或其受体的激动剂或拮抗剂；II型干扰素(包括IFN-γ)，或者II型干扰素或其受体的激动剂或拮抗剂；抗CD40抗体、CD40L、抗CTLA-4抗体(例如，为了释放无反应性T细胞)；T细胞共刺激剂(例如，抗CD137、抗CD28、抗CD40)；阿来组单抗(alemtuzumab)(例如
Figure BDA0000394678840001141
地尼白介素2(denileukindiftitox，例如
Figure BDA0000394678840001142
抗CD4；抗CD25；抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2；FOXP3的阻断剂(例如，以消除CD4+/CD25+T调节细胞的活性或杀死该细胞)；Flt3配体、咪喹莫特(imiquimod，AldaraTM)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、沙格司亭(sargramostim，
Figure BDA0000394678840001143
激素，包括但不限于催乳素和生长激素；Toll样受体(TLR)激动剂，包括但不限于TLR-2激动剂、TLR-4激动剂、TLR-7激动剂和TLR-9激动剂；TLR拮抗剂，包括但不限于TLR-2拮抗剂、TLR-4拮抗剂、TLR-7拮抗剂和TLR-9拮抗剂；抗炎剂和免疫调节剂，包括但不限于COX-2抑制剂(例如，赛来昔布(Celecoxib)、NSAIDS)、糖皮质激素、他汀类(statins)和沙利度胺(thalidomide)以及它们的类似物，包括IMiDTMs(它是沙利度胺(例如，
Figure BDA0000394678840001144
(来那度胺(lenalidomide))、
Figure BDA0000394678840001145
(泊马度胺(pomalidomide))的结构和功能类似物；促炎剂，比如真菌或细菌成分或任何促炎细胞因子或趋化因子；免疫治疗疫苗，包括但不限于基于病毒的疫苗、基于细菌的疫苗，或者基于抗体的疫苗；和任何其他免疫调节剂、免疫增强剂、抗炎剂和/或促炎剂。发明考虑了这些试剂的任何组合，并且任何这类试剂与基于酵母的免疫治疗剂的组合或者与基于酵母的免疫治疗剂一起的(例如同时、顺序或者其他格式)给药方案都是发明涵盖的组合物。这类试剂是本领域公知的。这些试剂可以单独使用或者与文中描述的其他试剂组合使用。
制剂可以包括给定蛋白或肽或其结构域的激动剂和拮抗剂。用于本文，“激动剂”是能够与受体或配体结合并产生或引发反应的任何化合物或试剂，包括但不限于小分子、蛋白、肽、抗体、核酸结合剂等，其中可能包括那些模拟天然物质结合受体或配体的作用的试剂。“拮抗剂”是能够阻断或抑制或减少激动剂的作用的任何化合物或试剂，包括但不限于小分子、蛋白、肽、抗体、核酸结合剂等。
本发明的组合物还可以包含任何其他化合物或组合物，或者与它们一起(同时、顺序或间歇地)给药，所述化合物或组合物可以用于防止或治疗HBV感染，或者治疗或缓解HBV感染的任何症状。多种试剂是已知可以防止和/或治疗或缓解HBV感染的。这类试剂包括但不限于抗病毒化合物，包括，但不限于核苷酸类似物逆转录酶抑制剂(nRTIs)。在发明的一个方面中，合适的抗病毒化合物包括，但不限于替诺福韦
Figure BDA0000394678840001151
拉米夫定
Figure BDA0000394678840001152
阿德福韦
Figure BDA0000394678840001153
替比夫定
Figure BDA0000394678840001154
恩替卡韦
Figure BDA0000394678840001155
以及它们的组合，和/或干扰素，比如干扰素α2a或聚乙二醇干扰素α2a
Figure BDA0000394678840001156
或干扰素λ。这些试剂通常要长期给予(例如，每日或每周，共给予一到五年或者更长时间)。此外，发明的组合物可以与其他免疫治疗组合物，包括预防性和/或治疗性免疫治疗剂一起使用。例如，HBV的预防性疫苗从1980年代早期已有销售。这些商品疫苗是非感染性的，提供纯化重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的亚基病毒疫苗，可以在出生时给予。虽然还未有治疗性免疫治疗组合物在美国被批准用于治疗HBV，这类组合物可以包含HBV蛋白或表位亚基疫苗、HBV病毒载体疫苗、细胞因子和/或其他免疫调节剂(例如，TLR激动剂、免疫调节药物)。
发明还包括含有本文描述的任何组合物或本文描述的组合物的任何个别成分的试剂盒。
发明组合物的给药或使用方法
发明的组合物(包括任何一或多个(例如，两个、三个、四个、五个或更多个的组合)本文描述的基于酵母的免疫治疗组合物)、包含HBV蛋白和融合蛋白的HBV抗原、和/或编码以上描述的这类HBV蛋白或融合蛋白的重组核酸分子，以及其他包含基于酵母的组合物、抗原、蛋白、融合蛋白的组合物，可以用于多种体内和体外方法，包括但不限于治疗和/或防止HBV感染及其后遗症、HBV的诊断检测，或者产生抗HBV抗体。
发明的一个实施方案涉及治疗个体或个体群中慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，和/或防止、缓解或治疗慢性HBV感染的至少一个症状的方法。所述方法包括将本发明的一或多个免疫治疗组合物给予慢性感染HBV的个体或个体群的步骤。在一个方面中，组合物是包含本文描述的一或多个HBV抗原的免疫治疗组合物，其包括基于酵母的免疫治疗组合物。在一个方面中，组合物包括包含本文描述的HBV抗原的蛋白或融合蛋白，和/或编码所述蛋白或融合蛋白的重组核酸分子。在一个实施方案中，个体或个体群含有慢性HBV感染。在一个方面中，个体或个体群另外用至少一种可以治疗HBV感染的其他治疗化合物处置。所述治疗化合物包括，但不限于直接作用的抗病毒药物(例如，以上或文中其他地方描述的那些)和/或干扰素和/或其他免疫治疗或免疫调节剂。在一个方面中，这类治疗组合物包括靶向宿主的治疗剂(例如，会干扰病毒复制的亲环蛋白抑制剂，或者干扰病毒生命周期(再感染)的再进入抑制剂)。
“护理标准”或者“SOC”通常是指治疗特定疾病的目前批准的护理标准。在慢性HBV感染中，SOC可能是几种不同的批准治疗方案之一，包括但不限于干扰素疗法和/或抗病毒疗法。目前批准的治疗HBV感染的抗病毒药物包括替诺福韦
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拉米夫定
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阿德福韦
Figure BDA0000394678840001163
替比夫定
Figure BDA0000394678840001164
和恩替卡韦
Figure BDA0000394678840001165
慢性HBV感染目前最经常处方的抗病毒药物是替诺福韦和恩替卡韦。可用于治疗慢性HBV感染的干扰素包括I型干扰素，比如干扰素α，包括但不限于干扰素α2或聚乙二醇干扰素-α2(例如，
Figure BDA0000394678840001166
在一个实施方案中，干扰素是III型干扰素，包括但不限于干扰素λ1、干扰素λ2和/或干扰素-λ3。本发明的免疫治疗组合物可以在一或多个抗病毒和/或干扰素和/或其他免疫治疗或免疫调节剂之前、同时、间歇和/或之后给予。也可以在用本发明的免疫治疗组合物处理之前或之后给予其他治疗化合物。
HBV感染在个体中的诊断通常是通过检测被感染个体的血液中的HBsAg(乙型肝炎病毒表面抗原)和/或HBeAg(e抗原)。血清中检测到HBeAg反映了活跃的病毒复制，感染的临床结果与e抗原状态相关，虽然使用目前的疗法时利用HBsAg血清转化能更好地预测长期缓和(或治愈)(见下文)。还可以在感染开始的6-12个月利用检测IgM核心抗体来检测急性HBV感染。血液中HBsAg持续6个月以上一般表明有慢性HBV感染。此外，慢性HBV感染可以通过鉴定HBV DNA(>2000IU/ml)来诊断，HBV DNA的鉴定可以与检测或鉴定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和/或天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平升高(例如，超过正常上限的两倍)联用。
病毒感染后痊愈(完全反应或HBV治疗终点)是通过HBeAg/HBsAg血清转化确定的，所述HBeAg/HBsAg血清转化分别是HBeAg和HBsAg的丢失，以及抗乙型肝炎表面抗原(抗HBs)抗体和/或抗HBeAg抗体的建立。临床研究规定血清转化或保护性抗体(抗HBs)水平是:(a)经放射性免疫分析确定的10或以上样品比率单位(SRU)；(b)经酶免疫分析确定的阳性结果；或者(c)检测到抗体浓度>10mIU/ml(10SRU与10mIU/mL抗体相当)。按照目前的护理标准治疗(即抗病毒药物或干扰素)，血清转化在慢性感染患者中可能需要几年的时间。还可以监测患者是否有病毒DNA的丢失或明显下降(低于PCR的检测水平或者<2000IU/ml)、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的正常化，或肝脏炎症和纤维化的改善。“ALT”是肝损伤的一个很完善的衡量标准，可以作为肝脏炎症的代替。在先前的大规模肝炎试验中，ALT水平的下降和/或正常化(ALT正常化)已被证实与肝功能提高和通过系列生物活检确定的减轻的肝纤维化相关。
发明另一个实施方案涉及为了防止个体或个体群中HBV感染、防止慢性HBV感染，和/或减少HBV感染严重程度，将个体或个体群免疫以抵抗HBV的方法。所述方法包括将本发明的组合物给予未感染HBV(或者被认为没有感染HBV)的个体或个体群的步骤。在一个方面中，组合物是包含一或多个本文描述的HBV抗原的免疫治疗组合物，包括一或多个基于酵母的免疫治疗组合物。在一个方面中，组合物包含含有本文描述的HBV抗原的融合蛋白，或者编码这类融合蛋白的重组核酸分子。
用于本文，短语“治疗”HBV感染(treat HBV感染)，或其任何排列组合(例如，对HBV感染进行了治疗“treated for HBV感染”等)通常是指感染(急性或慢性)已经发生后施用或者给予本发明的组合物，目的在于减轻或消除可检测的病毒滴度(例如，病毒DNA减少(低于PCR的检测水平或者<2000IU/ml))、达到血清转化(发展抗HBsAg和/或HBeAg的抗体，同时这些蛋白从血清中消失或减少)、减少个体中感染造成的至少一个症状、延缓或防止症状的开始和/或严重性和/或感染造成的下游后遗症、减少感染造成的器官或生理系统损伤(例如，肝硬化)(例如，异常ALT水平下降、肝炎症的减轻、肝纤维化的减轻)、防止和/或减少肝细胞癌(HCC)的频率和发生、改善被感染负面影响的器官或系统的功能(血清ALT水平正常化、肝炎症的改善、肝纤维化的改善)、抗感染免疫反应的提高、抗感染的长期记忆免疫反应的提高、HBV病毒再活化的减少和/或个体或个体群整体健康的改善。
在一个方面中，治疗目的是在结束疗法后维持病毒清除至少6个月。在一个方面中，治疗目的是可检测的血清HBeAg和/或HBsAg蛋白的消失。在一个方面中，治疗目的是发展抗乙型肝炎表面抗原的抗体(抗HBs)和/或抗HBeAg的抗体。在一个方面中，治疗目的是血清转化，可以定义为:(a)经放射性免疫分析确定的10或以上样品比率单位(SRU)；(b)经酶免疫分析确定的阳性结果；或者(c)检测到抗体浓度>10mIU/ml(10SRU与10mIU/mL抗体相当)。
“防止(prevent)”HBV感染，或其任何排列组合(例如，“HBV感染的防止(prevention)”等)通常是指在HBV感染发生之前施用或给予本发明的组合物，目的在于防止HBV感染、防止慢性HBV感染(即，使个体能够在没有进一步干预的情况下清除急性HBV感染)，或者如果后来发生了感染，至少减轻感染的严重程度和/或长度和/或慢性感染造成的生理损伤，包括防止或减少个体中感染导致的至少一个症状的严重程度或发生率，和/或延缓或防止个体或个体群中感染造成的症状和/或下游后遗症的发生和/或严重程度。在一个方面中，可以利用本发明防止慢性HBV感染，比如通过使急性感染了HBV的个体接受本发明的组合物从而清除感染，不变成慢性感染者。
本发明包括发明所述一或多个免疫治疗组合物(包括基于酵母的免疫治疗组合物)对受试对象的递送(给药、免疫)。给药过程可以在离体或体内进行。离体给药是指在患者体外进行部分调节步骤，例如在一定条件下将本发明的组合物给予从患者分离的细胞(树突细胞)群体，使得酵母媒介物、抗原和任何其他试剂或组合物被装载到细胞中，并将这些细胞返回给患者。本发明的治疗性组合物可以用任何合适的给药模式返回给患者，或给予患者。
组合物的给予可以是系统性的、粘膜的和/或目标位点的位置附近(例如，感染部位附近)。合适的给药途径对本领域技术人员而言是显然的，取决于要防止或治疗的状况、所用的抗原和/或目标细胞群体或组织。各种可接受的给药方法包括，但不限于静脉内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、结内给药、冠状动脉内给药、动脉内给药(例如到颈动脉中)、皮下给药、经皮递送、气管内给药、关节内给药、脑室内(intraventricular)给药、吸入(例如气溶胶)、颅内、脊柱内、眼内、耳、鼻内、口服、肺给药、导管浸渍(impregnation)及直接注射入组织。在一个方面中，给药途径包括：静脉内、腹膜内、皮下、皮内、结内、肌肉内、经皮、吸入、鼻内、口服、眼内、关节内、颅内和脊柱内。胃肠外递送可包括皮内、肌肉内、腹膜内、胸膜内、肺内、静脉内、皮下、心房导管和静脉导管途径。耳递送可包括滴耳剂，鼻内递送可包括滴鼻剂或鼻内注射，眼内递送可包括滴眼剂。也可以利用本领域的标准方法进行气溶胶(吸入)递送(参见例如Stribling等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA189:11277-11281,1992)进行。其它调节粘膜免疫的递送途径在病毒感染的治疗中是有用的。这样的途径包括支气管、皮内、肌肉内、鼻内、其它吸入、直肠、皮下、表面、经皮、阴道和尿道途径。在一个方面中，本发明的免疫治疗组合物是经皮下给予的。
对于本发明的基于酵母的免疫治疗组合物，合适的单个剂量是在合适的时间段内给予一次或多次时，能够有效地给患者身体的特定细胞类型、组织或区域提供有效量的酵母媒介物和抗原(如果含有)，从而引发抗一或多个HBV抗原或表位的抗原特异性免疫反应的剂量。例如，在一个实施方案中，本发明的酵母媒介物的单个剂量是每千克被给予该组合物的生物体重约1x105到约5x107个酵母细胞当量。在一个方面中，本发明的酵母媒介物的单个剂量是每剂(即每个生物)约0.1Y.U.(1x106个细胞)到约100Y.U.(1x109个细胞)，包括任何中间剂量，按0.1x106个细胞的增量递增(即，1.1x106,1.2x106,1.3x106...)。在一个实施方案中，剂量包括1Y.U和40Y.U.之间的剂量、1Y.U.和50Y.U.之间的剂量、1Y.U.和60Y.U.之间的剂量、1Y.U.和70Y.U.之间的剂量、或者1Y.U.和80Y.U.之间的剂量；在一个方面中，在10Y.U.和40Y.U.、50Y.U.、60Y.U.、70Y.U.或80Y.U.之间。在一个实施方案中，剂量在相同的给剂时期内被给予到个体的不同部位。例如，40Y.U.的剂量可以在一个给剂时期内通过在个体的四个不同部位注射10Y.U.剂量来给予；或者20Y.U.的剂量在一个给剂时期内通过在个体的四个不同部位注射5Y.U.剂量来给予，或者通过在个体的两个不同部位注射10Y.U.剂量来给予。发明包括将一定量基于酵母的免疫治疗组合物(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20Y.U.或更多)给予到个体的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同部位形成单个剂量。
治疗性组合物的“加强剂”(booster或boosts)在针对抗原的免疫反应已减弱时给予或按需要给予，以提供免疫反应或诱发针对特定抗原的记忆应答。加强剂可以在初始给药后约1、2、3、4、5、6、7、或8周到每月到每两月到每季度到每年到数年后给予。在一个实施方案中，给药计划包括在几周到几个月到几年的时间段内，给予至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次等同每kg生物体重约1x105到约5x107个酵母细胞的组合物。在一个实施方案中，剂量每周给予，共给予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个剂量，然后根据需要每月给剂以达到对HBV病毒的抑制或消除。例如，可以给予剂量直至个体实现血清转化、直至HBV DNA滴度降到2000IU/ml以下，和/或直至ALT水平正常化。在一个实施方案中，按照四周计划(每4周；或者由临床医师确定在第1天、第四周、第八周、第12周等，共2个和10个剂量之间，或者更长时间)给予剂量。如果需要，甚至在个体实现血清转化后可以给予额外的剂量，虽然这样的给剂可能不是必须的。
对于本文描述的基于酵母的免疫治疗组合物的给药，可以将单个组合物给予个体或个体群或者可以给予这类组合物的组合。例如，发明提供了几个“单个蛋白”组合物或者针对特定基因型的组合物，也提供了多蛋白组合物和针对多种基因型或亚基因型的组合物。相应地，在“调味品架”策略中，可以选择两个或多个组合物来最有效地防止或治疗给定个体或个体群中的HBV感染。
在发明的一个方面中，将一或多个另外的治疗剂与基于酵母的免疫治疗组合物顺序给予。在另一个实施方案中，在给予基于酵母的免疫治疗组合物之前给予一或多个另外的治疗剂。在另一个实施方案中，在给予基于酵母的免疫治疗组合物之后给予一或多个另外的治疗剂。在一个实施方案中，一或多个另外的治疗剂与基于酵母的免疫治疗组合物交替给予；或者在一个方案中，基于酵母的组合物以预定的间隔在其他试剂的一或多个连续剂量之间或者与其他试剂的一或多个联系剂量一起给予；或者反过来。在一个实施方案中，开始给予另外的试剂之前，在一个时间段内给予一或多个剂量的基于酵母的免疫治疗组合物。换句话说，基于酵母的免疫治疗组合物作为单一疗法给予一段时间，然后增加试剂给药，或者是与新剂量的基于酵母的免疫疗法同时进行，或者与基于酵母的免疫疗法交替进行。替代地，在开始给予基于酵母的免疫治疗组合物之前，将试剂给予一段时间。在一个方面中，酵母经过改造表达或携带试剂，或者不同酵母经过改造或制备表达或携带所述试剂。
在发明的一个方面中，当干扰素或抗病毒化合物疗程开始时，可以在相同的时期内给予另外剂量的免疫治疗组合物或者至少部分这段时间，并且可以在干扰素或抗病毒药物疗程结束后继续给药。但是，整个过程中免疫疗法的给剂计划一般预期与干扰素或抗病毒化合物的不同。例如，可以在和给予干扰素或抗病毒药物相同的那些天，或者给予干扰素或抗病毒药物最末剂量(最近期的)后的至少3-4天(或者最末剂量后任何合适的天数)给予免疫治疗组合物，所述免疫治疗组合物还可以每天、每周、每两周、每月、每两月或每3-6个月，或者按照医师确定的更长间隔给予。如果使用免疫治疗组合物的单一疗法，在开始的阶段，优选将免疫治疗组合物每周给药，共4-12周，然后每月给予(无论何时在方案中另外增加干扰素或抗病毒疗法)。在一个方面中，将免疫治疗组合物每周给药，共4或5周，然后每月给药，直至全部治疗方案结束。
在发明的方面中，可以将免疫治疗组合物和其他试剂一起给药(同时)。用于本文，同时用药不一定表示所有化合物的所有剂量在同一天的同一时间给予。同时用药而是意味着每个疗法(例如免疫疗法和干扰素疗法，或者免疫疗法和抗病毒疗法)的成分在大概相同的阶段开始(几小时以内，或者相互间隔最多1-7天)，并且给予同样的大体时间段，注意每个成分可能有不同的给剂计划(例如，干扰素是每周、免疫疗法是每月、抗病毒是每日或每周给予)。此外，在同时给药时期之前或之后，可以在没有其他试剂的情况下给予任何一种试剂或免疫治疗组合物。
本发明考虑了将发明所述免疫治疗组合物与抗病毒药物(比如替诺福韦或恩替卡韦)一起使用能够缩短抗病毒药物的用药时程。预期将发明的免疫治疗剂与干扰素联用时可以得到类似的结果。与本发明的免疫治疗剂联用，也会导致抗病毒或干扰素的给剂要求被减少或改变，从而整体地提高患者对药物的耐受。此外，考虑了本发明的免疫治疗组合物能够给那些单独使用抗病毒疗法时不能达到血清转化或者维持病毒反应的患者实现这些终点。换句话说，本发明的免疫治疗组合物与抗病毒或干扰素联用时，实现血清转化的患者比单独使用抗病毒或者干扰素实现血清转化的患者多。按照目前的HBV感染SOC，可以给予抗病毒6个月到一年、两年、三年、四年、五年或更长(例如，无限期地)。通过将这样的疗法与本发明的免疫治疗组合物联用，抗病毒的给药时间可能被减少几个月或几年。考虑了使用本发明的免疫治疗组合物作为单一疗法或者与抗病毒和/或免疫调节策略联用，能够有效地达到HBsAg和/或HBeAg的消失；HBeAg血清转化、HBsAg血清转化或完全血清转化；在许多个体中，疗法结束后保持病毒清除至少6个月。在一些患者中，根据本发明的免疫疗法在作为单一疗法使用或者与抗病毒和/或免疫调节策略联用时，可以实现HBsAg和/或HBeAg的消除，但不能达到血清转化(发展出抗HBs或抗HBeAg)。在这种情况下，本发明的一个实施方案是另外使用诸如目前的预防性重组HBV亚基疫苗的试剂，单独或者与本发明的基于酵母的免疫疗法和/或抗病毒或其他免疫调节剂联用，以便在患者中获得完全反应。
用于本文，术语“抗病毒”是指任何这样的化合物或药物，通常是小分子抑制剂或抗体，所述化合物或药物靶向病毒生命周期的一或多个步骤，具有直接的抗病毒治疗效果。在发明的一个实施方案中，可以与发明的免疫治疗组合物在相同治疗方案中给药的抗病毒化合物或药物选自替诺福韦
Figure BDA0000394678840001221
拉米夫定
Figure BDA0000394678840001222
阿德福韦
Figure BDA0000394678840001223
替比夫定
Figure BDA0000394678840001224
或恩替卡韦
Figure BDA0000394678840001225
或者它们的任何类似物或衍生物，或者包含或含有这样的化合物、药物、类似物或衍生物的任何组合物。
替诺福韦(富马酸替诺福韦二吡呋酯或TDF)或者({[(2R)-1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙烷-2-基]氧}甲基)磷酸，是核苷酸类似物逆转录酶抑制剂(nRTIs)。对于HBV感染的治疗，替诺福韦一般作为丸剂给予成人，每日一次的剂量为300mg(富马酸替诺福韦二吡呋酯)。给儿科患者的剂量取决于患者体重(每日一次，每kg体重8mg，最多300mg)，可以提供为片剂或口服粉末。
拉米夫定或者2',3'-二脱氧-3'-硫代胞苷，通常被称为3TC，是强力的核苷类似物逆转录酶抑制剂(nRTI)。对于HBV感染的治疗，拉米夫定作为丸剂或口服液给药，每日一次剂量为100mg(对3个月到12岁的儿童每日两次1.4-2mg/lb.)。
阿德福韦(阿德福韦二吡呋酯)或者9-[2-[[二[(pivaloyloxy)甲氧基]-氧膦基]-甲氧基]乙基]腺嘌呤是一种口服的核苷酸类似物逆转录酶抑制剂(ntRTI)。对于HBV感染的治疗，阿德福韦作为丸剂给药，每日一次剂量为10mg。
替比夫定或者1-(2-脱氧-β-L-erythro-pentofuranosyl)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮是合成的胸腺嘧啶核苷类似物(胸腺嘧啶的L-异构体)。对于HBV感染的治疗，替比夫定作为丸剂或口服液给药，每日一次剂量为600mg。
恩替卡韦或者2-氨基-9-[(1S,3R,4S)-4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊]-6,9-二氢-3H-嘌呤-6-酮是核苷类似物(脲嘌呤类似物)，能够抑制逆转录、DNA复制和病毒的转录。对于HBV感染的治疗，恩替卡韦作为丸剂或口服液给药，每日一次剂量为0.5mg(对拉米夫定难治型或替比夫定抗性突变每日1mg)。
在发明的一个实施方案中，与本发明的免疫治疗组合物在治疗方案中给药的干扰素在一个方面中，是干扰素α，在一个方面中，是干扰素α2b(通过每周三次经皮下注射给药)；或者聚乙二醇干扰素-α2a(例如
Figure BDA0000394678840001231
用于本文，术语“干扰素”是指通常是由免疫系统的细胞和多种细胞在应答双链RNA时产生的细胞因子。干扰素对免疫反应的帮助是通过抑制宿主细胞内的病毒复制、激活天然杀伤细胞和巨噬细胞、提高抗原递呈给淋巴细胞，以及诱导宿主细胞对病毒感染的抗性。I型干扰素包括干扰素α。III型干扰素包括干扰素λ。可用于本发明的干扰素包括任何I型或III型干扰素，包括干扰素α、干扰素α2。在一个方面中，效力更长的干扰素形式，包括但不限于聚乙二醇干扰素、干扰素融合蛋白(融合了白蛋白的干扰素)和包含干扰素的缓释制剂(例如，处于微球的干扰素或者有聚氨基酸纳米颗粒的干扰素)。一个干扰素-
Figure BDA0000394678840001232
聚乙二醇干扰素α2a是重组干扰素-α2a(分子量[MW]大约20,000道尔顿)与单个支链的二-单甲氧基聚乙二醇(PEG)链(大约MW40,000道尔顿)的共价偶联物。PEG部分经由与赖氨酸的稳定酰胺键连接到干扰素α部分的单一位点。聚乙二醇干扰素-α2a的分子量大约60,000道尔顿。
干扰素通常是通过肌肉内或皮下注射给药的，可以按照3百万和1千万单位的剂量给予，其中在一个实施方案中优选3百万单位。干扰素剂量的给予遵循规律的计划，可以从每周1、2、3、4、5或6次，到每周一次、每两周一次、每三周一次或者每月一次。现有干扰素的典型剂量是每周给药，根据本发明这是干扰素的有效给剂计划。对于HBV的治疗，聚乙二醇干扰素-α2a目前是每周一次皮下给药，剂量为180mg(1.0ml病毒或0.5ml预装注射器)，共48周。剂量和给药时机可以根据医师的优先级和推荐，以及对所用的特定干扰素的建议改变，本领域技术人员有能力确定合适的剂量。考虑了通过将干扰素疗法与本发明的免疫治疗组合物一起使用，可以减少干扰素的剂量强度和/或剂量数目(接受干扰素的时间长度和/或干扰素剂量之间的间隔)。
在本发明的方法中，可以将组合物和治疗性组合物给予动物，包括任何脊椎动物，特别是脊椎动物纲、哺乳纲的任何成员，包括但不限于灵长类、啮齿动物、家畜和家庭宠物。家畜包括被食用或能产生有用产品的哺乳动物(例如，用于生产羊毛的绵羊)。可以治疗或保护的哺乳动物包括人、犬、猫、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、马和猪。
“个体”是脊椎动物，比如哺乳动物，包括但不限于人。哺乳动物包括，但不限于农场动物、体育运动动物、宠物、灵长类、小鼠和大鼠。术语“个体”可以与术语“动物”、“受试对象”或“患者”交换使用。
可用于本发明的一般技术
本发明的实施会应用(除非另有说明)到本领域技术人员熟知的分子生物学、微生物、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术(包括重组技术)。这类技术在文献中有充分解释，比如Methods of Enzymology,Vol.194,Guthrie et al.,eds.,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1990)；Biology and activities of yeasts，Skinner，et al.，eds.，Academic Press(1980)；Methods in yeast genetics:a laboratory course manual，Rose et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990)；The Yeast Saccharomyces:Cell Cycle and Cell Biology，Pringle et al.，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1997)；The YeastSaccharomyces:Gene Expression，Jones et al.，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1993)；The Yeast Saccharomyces:Genome Dynamics，Protein Synthesis，and Energetics，Broachet al.，eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1992)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual，second edition (Sambrook et al.，1989)和Molecular Cloning:A Laboratory Manual，third edition(Sambrook and Russel,2001)(文中统称为“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987，包括至2001年的补充材料)；PCR:The Polymerase Chain Reaction，(Mullis etal.，eds.，1994)；Harlow and Lane(1988),Antibodies,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Publications,New York；Harlow and Lane(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(文中统称为“Harlow and Lane”)；Beaucage et al.eds.，Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,John Wiley&Sons,Inc.,New York,2000)；Casarett andDoull’s Toxicology The Basic Science of Poisons，C.Klaassen，ed.，6th edition(2001)以及Vaccines,S.Plotkin and W.Orenstein,eds.,3rd edition(1999)。
一般定义
Figure BDA0000394678840001251
(GlobeImmune,Inc.,Louisville,Colorado)通常是指胞外(在表面)、胞内(内部或者胞质)或者既有胞外也有胞内地表达一或多个异源抗原的酵母媒介物。
Figure BDA0000394678840001252
产品已有概括描述(参见例如美国专利5,830,463)。某些基于酵母的免疫治疗组合物以及它们的制备方法和一般使用方法也有详细描述，例如美国专利5,830,463、美国专利7,083,787、美国专利7,736,642、Stubbs et al.,Nat.Med.7:625-629(2001)、Lu et al.,Cancer Research64:5084-5088(2004)和Bernstein et al.,Vaccine2008Jan 24;26(4):509-21，这些文献中的每一个都通过引用全部并入本文。
用于本文，术语“类似物”是指与另一种化合物结构上相似但组成上略有不同(象用不同元素的原子替代一个原子，或者在有特定功能团存在时，一个功能团被另一个功能团替代)的化学化合物。因此，类似物是功能和外表上相似或相当的化合物，但相对参照化合物有不同的结构或来源。
术语“取代的”、“取代衍生物”和“衍生物”在用于描述化合物时，意味着结合在未取代化合物上的至少一个氢被不同原子或化学部分所替代。
衍生物虽然具有和母体化合物相似的物理结构，但衍生物可能有和母体化合物不同的化学和/或生物学性能。这类性能可能包括，但不限于与母体化合物相比提高或下降的活性、与母体化合物相比的新活性、提高或下降的生物可得性、提高或下降的效力、提高或下降的体外和/或体内稳定性，和/或提高或下降的吸附性能。
一般来说，术语“生物活性的”表明化合物(包括蛋白或肽)通过体内(即在天然生理环境中)或体外(即在实验室条件下)测量或观察，具有至少一种对细胞或生物的代谢或其他过程有影响的可检测活性。
根据本发明，术语“调整(modulate)”可以与调节(regulate)交换使用，通常是指对特定活性的上调或下调。用于本文，术语“上调”可以一般性地描述：相对特定活性来说的引发、启动、增加、增多、加强、提高、增强、扩大、促进或提供。类似地，术语“下调”可以一般性地描述：相对特定活性来说的下降、减少(reducing)、抑制、减轻、消除、减少(lessening)、阻断或防止。
在本发明的一个实施方案中，文中描述的任何氨基酸序列可以制备为在限定的氨基酸序列的C和/或N端各侧接了至少1个到最多大约20个额外的异源氨基酸。这样得到的蛋白或多肽可以被称为“基本由(所述限定氨基酸序列)构成”。根据本发明，异源氨基酸是这样的氨基酸序列，所述序列不是天然(即自然界、体内没有)侧接着限定的氨基酸序列的；或者与限定的氨基酸序列的功能无关；或者如果使用给定氨基酸序列所来源的生物的标准密码子对天然序列中的核苷酸进行翻译，则编码所述限定的氨基酸序列的基因中的天然核酸序列的侧翼核苷酸不编码所述序列(即异源序列)。类似地，短语“基本由…构成”在提到本文的核酸序列时使用是指编码限定氨基酸序列的核酸序列，可以在编码该限定氨基酸序列的核酸序列的5’和/或3’端各侧接从至少一个到最多大约60个额外的异源核苷酸。异源核苷酸不象在天然基因中那样，天然侧接编码限定氨基酸序列的核酸序列(即自然界、体内没有)；或者不编码能够给具有限定氨基酸序列的蛋白带来任何额外功能或者改变蛋白的功能的蛋白。
根据本发明，短语“选择性结合”是指本发明的抗体、抗原结合片段或结合伙伴优先结合特定蛋白的能力。更具体地说，短语“选择性结合”是指一个蛋白与另一个(例如，针对某抗原的抗体、抗体片段或结合伙伴)的特异结合，其中通过标准检验(例如免疫学分析)测量到它们的结合水平比检验中的背景对照在统计学上显著更高。例如，在进行免疫学分析时，对照一般包括只含有抗体或抗原结合片段的反应孔/管(即没有抗原)，其中在没有抗原情况下，抗体或其抗原结合片段产生的反应量(例如，与孔的非特异性结合)被认为是背景。结合可以利用本领域的多种标准方法(包括酶免疫分析，例如ELISA、免疫印迹分析等)来测量。
提到的本发明中使用的蛋白或多肽包括全长蛋白、融合蛋白或者这些蛋白的任何片段、结构域、构象表位或同源物，包括蛋白的功能结构域和免疫学结构域。更具体地说，根据本发明分离的蛋白是已经被从其自然环境移出(即已经经过人的操作)的蛋白(包括多肽或肽)，并且可以包括例如纯化蛋白、部分纯化的蛋白、重组产生的蛋白和合成产生的蛋白。因此“分离的”不反映蛋白的纯化程度。优选地，本发明的分离的蛋白是重组产生的。根据本发明，术语“修饰”和“突变”可以交换使用，特别是就对本文描述的蛋白或其部分的氨基酸序列(或核酸序列)进行的修饰/突变来说。
用于本文，术语“同源物”用来指这样的蛋白或肽，所述蛋白或肽由于对天然蛋白或肽(即“原型”或“野生型”蛋白)的次要修饰而不同于天然蛋白或肽，但维持了所述天然形式的基本蛋白和侧链结构。这样的变化包括，但不限于，一个或数个氨基酸侧链的变化；一个或数个氨基酸的变化，包括缺失(例如，蛋白或肽的截短形式)、插入和/或取代；一个或数个原子的立体化学的变化；和/或次要的衍生化，包括但不限于甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊二烯化、棕榈酰化、酰胺化和/或糖基磷脂酰肌醇的添加。同源物与天然蛋白或肽相比可具有加强的、降低的，或基本相似的性能。同源物可以包括蛋白质的激动剂或蛋白质的拮抗剂。同源物可以用本领域已知的制备蛋白的方法来制备，包括，但不限于直接对分离的天然蛋白进行修饰、直接合成蛋白，或者使用例如经典技术或重组DNA技术对编码该蛋白的核酸序列进行修饰以产生随机或定向突变。
给定蛋白的同源物可能包含这样的氨基酸序列、基本由其构成，或者由其构成，所述氨基酸序列与参照蛋白的氨基酸序列至少约45%、或至少约50%、或至少约55%、或至少约60%、或至少约65%、或至少约70%、或至少约75%、或至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约91%相同、或至少约92%相同、或至少约93%相同、或至少约94%相同、或至少约95%相同、或至少约96%相同、或至少约97%相同、或至少约98%相同、或至少约99%相同(或者45%和99%之间的按整数增加的任何百分比同一性)。在一个实施方案中，同源物包含这样的氨基酸序列、基本由其构成，或者由其构成，所述氨基酸序列与参照蛋白的氨基酸序列小于100%相同、小于约99%相同、小于约98%相同、小于约97%相同、小于约96%相同、小于约95%相同等等，按1%递减到小于约70%相同。
同源物包括“接近全长”的蛋白或蛋白结构域，这意味着所述同源物与全长蛋白、功能结构域或免疫学结构域(比如本文描述的或者其他方式已知的或公开序列中过的蛋白、功能结构域或免疫学结构域)的差别在于在全长蛋白或全长功能结构域或全长免疫学结构域的N和/或C端添加或删除了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。
用于本文，除非另有说明，提到百分比(%)同一性是指利用下述程序进行的同源性评估：(1)BLAST2.0Basic BLAST同源性检索，以标准缺省参数使用blastp进行氨基酸检索，使用blastn进行核酸检索，其中缺省将查询序列进行低复杂度区域的过滤(在Altschul,S.F.,Madden,T.L.,
Figure BDA0000394678840001281
A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.&Lipman,D.J.(1997)"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database searchprograms."Nucleic Acids Res.25:3389-3402中有描述，该文献通过引用并入全部本文)；(2)BLAST2比对(使用以下描述的参数)；(3)和/或PSI-BLAST，使用标准缺省参数(Position-Specific Iterated BLAST。应当注意，由于BLAST2.0Basic BLAST和BLAST2之间的标准参数存在一些差异，两个特定序列在使用BLAST2程序时可能被识别为有显著的同源性，而在BLAST2.0Basic BLAST中使用序列之一作为查询序列进行的检索可能最佳匹配中没有鉴定到第二个序列。此外，PSI-BLAST提供了“profile”检索的自动化使用简便版本，是一种寻找同源序列的敏感方式。程序首先进行gapped BLAST数据库检索。PSI-BLAST程序利用来自返回的任何明显比对的信息以构建位点特异性打分矩阵，以此在下一轮数据库检索中替代查询序列。因此，可以理解通过使用这些程序中的任意一种能够确定百分比同一性。
使用BLAST2sequence，按照Tatusova and Madden,(1999),"Blast2sequences-anew tool for comparing protein and nucleotide sequences"(FEMS MicrobiolLett.174:247-250，通过引用全部并入本文)中描述的那样，将两个特定序列进行相互比对。BLAST2序列比对在blastp或blastn中进行，使用BLAST2.0算法在两个序列间进行Gapped BLAST检索(BLAST2.0)，以便在最后得到的比对中引入空位(缺失和插入)。为了清楚起见，利用如下标准缺省参数进行了BLAST2序列比对。
对于blastn，使用0BLOSUM62矩阵:
匹配得分=1
错配罚分=-2
开放空位(5)或延伸空位(2)罚分
gap x_dropoff(50)期望值(10)字长(11)滤器(开)
对于blastp，使用0BLOSUM62矩阵:
开放空位(11)和延伸空位(1)罚分
gap x_dropoff(50)期望值(10)字长(3)滤器(开).
分离的核酸分子是已经被从其自然环境移出(即，已经经过人的操作)的核酸分子，其自然环境是自然界中发现该核酸分子的基因组或染色体。因此，“分离的”并不反映该核酸分子的纯化程度，而是表明所述分子未包含自然界中发现该核酸分子所处的整个基因组或整个染色体。分离的核酸分子可包括基因。包含某基因的核酸分子并不是包含该基因的染色体片段，而是包含与该基因相关的编码区和调控区，但不包含天然存在于同一染色体上的其它基因。分离的核酸分子还可包含(在序列的5’和/或3’端)侧接有其他核酸的限定的核酸序列，所述其他核酸在自然界中通常不位于该限定的核酸序列的侧翼(即为异源序列)。分离的核酸分子可包含DNA、RNA(例如mRNA)、或者DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。尽管短语“核酸分子”主要指物理的核酸分子，短语“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，这两个短语可以互换使用，尤其是对于能编码蛋白或蛋白结构域的核酸分子或核酸序列而言。
重组核酸分子是这样的分子，所述分子包含的编码本文描述的任何一或多个蛋白的任何一个核酸序列可操纵地连接着至少一个任意转录调控序列，其中所述转录调控序列能有效地调控该核酸分子在要转染的细胞中的表达。虽然短语“核酸分子”主要指物理的核酸分子，短语“核酸序列”主要指核酸分子上的核苷酸序列，这两个短语可以互换使用，尤其是对于能编码蛋白的核酸分子或核酸序列而言。此外，短语“重组分子”主要指可操纵地连接转录控制序列的核酸分子，但可以与给予动物的短语“核酸分子”互换使用。
重组核酸分子包括重组载体，所述重组载体是与编码本发明融合蛋白的分离的核酸分子可操纵地连接的任何核酸序列，一般是异源序列，其能使所述融合蛋白得以重组产生，并能将所述核酸分子递送到本发明的宿主细胞中。这样的载体可以含有天然状态下与待插入该载体的分离核酸分子不相邻的核酸序列。载体可以是RNA或DNA，原核的或真核的，而且在本发明中优选是病毒或质粒。重组载体可用在克隆、测序和/或其它对核酸分子的操作中，并可以用于递送这样的分子(例如，象在DNA组合物或基于病毒的组合物中那样)。重组载体优选用于核酸分子的表达，还可称为表达载体。优选的重组载体能在所转染的宿主细胞中表达。
在本发明的重组分子中，核酸分子可操纵地与表达载体连接，其中所述表达载体含有调控序列，比如转录控制序列、翻译控制序列、复制原点，以及其它与宿主细胞相容并控制本发明的核酸分子的表达的调控序列。特别地，本发明的重组分子包括与一或多个转录控制序列可操纵地连接的核酸分子。短语“可操纵地连接”是指核酸分子和表达控制序列的连接方式使得该分子在转染(即，转化、转导或转染)到宿主细胞中后被表达。
根据本发明，术语“转染”用来指可将外源核酸分子(即重组核酸分子)插入细胞中的任何方法。当用来指将核酸分子导入微生物细胞，例如藻类、细菌和酵母时，术语“转化”可与术语“转染”互换使用。在微生物系统中，术语“转化”用于描述由于微生物获取了外源核酸而继承的变化，并且基本上与术语“转染”同义。因此，转染技术包括但不限于，转化、细胞的化学处理、粒子轰击、电穿孔、显微注射、脂质转染、吸附、感染和原生质体融合。
以下实验结果是为说明目的而提供的，并不意在限制发明的范围。
实施例
实施例1
以下实施例描述了用于治疗或预防乙肝病毒(HBV)感染的基于酵母的免疫治疗组合物的生成。
在此实验中，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1或TEF2启动子的控制下表达各种HBV表面-核心融合蛋白，其各自具有图2中显示的基本结构。在各情况下，HBV融合蛋白是由SEQ ID NO:34代表的约595个氨基酸的单一多肽，其中从N末端至C末端符合阅读框地融合以下序列元件：1)赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的N末端肽(SEQ ID NO:34的第1至6位)；2)用于引入SpeI限制酶位点的两氨基酸的接头(Thr-Ser)；3)近乎全长的(-1位)HBV基因型C大(L)表面抗原的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:34的第9至407位，其对应于SEQ ID NO:11的2-400位，SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:34在SEQ IDNO:11的第350-351位不同，其中SEQ ID NO:11中的Leu-Val序列被SEQ ID NO:34的第357-358位的Gln-Ala序列替换)；4)HBV核心抗原的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:34的第408至589位或SEQ ID NO:9的第31-212位)；和5)6组氨酸标签(SEQ ID NO:34的第590-595位)。编码SEQ ID NO:34所示融合蛋白的核酸序列(针对酵母表达进行过密码子优化)在本文中由SEQ ID NO:33代表。SEQ ID NO:34的第28-54位包含大(L)表面蛋白的肝细胞受体部分。SEQID NO:34含有据信增强融合蛋白的免疫原性的多个表位或域。例如，对于SEQ ID NO:34，在第209-220位、第389-397位、第360-367位和第499-506位包含已知的MHC I类结合表位和/或CTL表位。SEQ ID NO:34的第305-328位包含抗体表位。此融合蛋白和包含此蛋白的相应的基于酵母的免疫治疗剂可以在本文中统称为“Score”、“MADEAP-Score”、“M-Score”或“GI-13002”。
简言之，将编码融合至全长核心抗原的近乎全长的大表面抗原(L)的DNA进行密码子优化以在酵母中表达，然后用EcoRI和NotI消化并插入到酵母2um表达载体中的CUP1启动子之后(pGI-100)或TEF2启动子之后(pTK57-1)。由这些构建体编码的融合蛋白在本文中由SEQ ID NO:34(由核苷酸序列SEQ ID NO:33编码)代表，并具有预期约66kDa的分子量。将所得质粒通过醋酸锂/聚乙二醇转染引入酿酒酵母W303α酵母，并在缺少尿嘧啶的固体基本平板(UDM；尿苷缺失培养基)上选择原代转染体。将菌落再划线接种到UDM或ULDM(缺失尿苷和亮氨酸的培养基)上并允许在30℃生长3天。从平板接种缺少尿苷的液体培养基(U2培养基：20g/L葡萄糖；6.7g/L含有硫酸铵的酵母基础氮源(nitrogen base)；组氨酸、亮氨酸、色氨酸和腺嘌呤各0.04mg/mL)或缺少尿苷和亮氨酸的液体培养基(UL2培养基：20g/L葡萄糖；6.7g/L含有硫酸铵的酵母基础氮源；以及组氨酸、色氨酸和腺嘌呤各0.04mg/mL)并在30℃以250rpm生长起始培养物达20小时。含有4.2g/L Bis-Tris的经pH缓冲的培养基(BT-U2；BT-UL2)也进行接种以评估酵母在中性pH条件下的生长。使用原代培养物来接种同样配制的最终培养物，并持续生长直至密度达到1.1至4.0YU/mL。
对于TEF2株系(组成型表达)，收获、清洗细胞并在56℃于PBS中1小时将其热杀死。还处理活细胞以用于比较。对于CUP1株系(诱导型表达)，在有0.5mM硫酸铜的相同培养基中在30℃、250rpm达5小时来诱导表达。收获、清洗细胞并在56℃于PBS中1小时将其热杀死。还处理活细胞以用于比较。
在热杀死TEF2和CUP1培养物后，将细胞在PBS中清洗3次。通过TCA沉淀/硝酸纤维素结合测定法来测量总蛋白表达，并使用抗his标签单克隆抗体通过Western印迹来测量抗原表达。通过从在同一Western印迹上处理的重组的有6组氨酸标签的NS3蛋白的标准曲线内插来对抗原定量。结果显示于图16(被热杀死的)和图17(活酵母)。这些图显示，本发明的基于酵母的免疫治疗组合物使用两种启动子均较好地表达HBV表面-核心融合蛋白，并且可以在被热杀死的和活的酵母细胞中通过Western印迹鉴定出来。通过此基于酵母的免疫治疗剂所计算出的抗原表达为每Y.U.(酵母单位；1酵母单位(Y.U.)是1x107个酵母细胞或酵母细胞等同物)～5000ng蛋白质或每Y.U76pmol蛋白质。
实施例2
以下实施例描述了另一种基于酵母的免疫治疗组合物用于治疗或预防乙肝病毒(HBV)感染的生成。
将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1或TEF2启动子的控制下表达各种HBV融合蛋白，其各自具有图3中示意性显示的结构。在各情况下，融合蛋白是由SEQ ID NO:36代表的约945个氨基酸的单一多肽，其从N末端至C末端符合阅读框地融合以下序列元件：(1)赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的N末端肽(SEQ ID NO:36的第1至5位)；2)HBV大(L)表面蛋白pre-S1部分的HBV基因型C肝细胞受体域的氨基酸序列(L特有的)(例如SEQ ID NO:11的第21-47位或SEQ ID NO:36的第6至32位)；3)全长HBV基因型C小(S)表面抗原的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:11的第176至400位或SEQ ID NO:36的第33至257位)；4)协助序列克隆和操作的两氨基酸间隔物/接头(Leu-Glu)(SEQ ID NO:36的第258和259位)；5)包括逆转录酶域在内的HBV基因型C聚合酶的一部分的氨基酸序列(例如SEQID NO:10的第247至691位或SEQ ID NO:36的第260至604位)；6)HBV基因型C核心蛋白(例如SEQ ID NO:9的第31-212位或SEQ ID NO:36的第605至786位)；7)HBV基因型C X抗原的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:12的第2至154位或SEQ ID NO:36的第787至939位)；和8)6组氨酸标签(SEQ ID NO:36的第940至945位)。此融合蛋白和包含此蛋白的相应的基于酵母的免疫治疗剂可以在本文中一般性称为“MADEAP-Spex”、“M-Spex”或“GI-13005”。
编码SEQ ID NO:36的融合蛋白的核酸序列(针对酵母表达进行过密码子优化)在本文中由SEQ ID NO:35代表。SEQ ID NO:36具有预期为约106-107kDa的分子量。SEQ IDNO:36含有据信增强融合蛋白的免疫原性的多个表位或域，包括上文对于SEQ ID NO:34所描述的数个。另外，此融合蛋白中使用的逆转录酶域含有几个已知作为对用抗病毒药物治疗的药物抗性响应而发生突变的氨基酸位置，并且因此可以在此融合蛋白中突变以提供靶向特定药物抗性(逃逸)突变的治疗性或预防性免疫治疗剂。对于SEQ ID NO:36，这些氨基酸位置为：氨基酸第432位(Val，已知在拉米夫定(lamivudine)疗法后突变为Leu)；第439位(Leu，已知在拉米夫定疗法后突变为Met)；第453位(Ala，已知在替诺福韦(tenofovir)疗法后突变为Thr)；第463位(Met，已知在拉米夫定疗法后突变为Ile或Val)；和第495位(Asn，已知在阿德福韦(adefovir)疗法后突变为Thr)。
为了利用抗原中不同的N末端肽来创建第二种基于酵母的免疫治疗剂，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1或TEF2启动子的控制下表达各种HBV融合蛋白，其也具有如图3中示意性显示的基本结构。在此第二种情况下，用alpha因子前原序列(由SEQ ID NO:89代表)代替由SEQ ID NO:36代表的融合物中上文所描述的合成N末端肽。简言之，新融合蛋白是由SEQ ID NO:92代表的单一多肽，其从N末端至C末端符合阅读框地融合以下序列元件：(1)赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定或增强表达的N末端肽(SEQ IDNO:89，SEQ ID NO:92的第1至89位)；2)协助序列的克隆和操作的两氨基酸间隔物/接头(Thr-Ser)(SEQ ID NO:92的第90至91位)；3)HBV大(L)表面蛋白pre-S1部分的HBV基因型C肝细胞受体域的氨基酸序列(L特有的)(例如SEQ ID NO:11的第21-47位或SEQ ID NO:92的第92至118位)；4)全长HBV基因型C小(S)表面抗原的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:11的第176至400位或SEQ ID NO:92的第119至343位)；5)协助序列的克隆和操作的两氨基酸间隔物/接头(Leu-Glu)(例如SEQ ID NO:92的第344至345位)；6)包括逆转录酶域在内的HBV基因型C聚合酶的一部分的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:10的第247至691位或SEQ ID NO:92的第346至690位)；7)HBV基因型C核心蛋白(例如SEQ ID NO:9的第31-212位或SEQ ID NO:92的第691至872位)；8)HBV基因型C X抗原的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:12的第2至154位或SEQ ID NO:92的第873至1025位)；以及9)6组氨酸标签(例如SEQ ID NO:92的第1026至1031位)。此融合蛋白和包含此蛋白的相应的基于酵母的免疫治疗剂可以在本文中一般性称为“alpha-Spex”、“a-Spex”或“GI-13004”。
编码SEQ ID NO:92的融合蛋白的核酸序列(针对酵母表达进行过密码子优化)在本文中由SEQ ID NO:91代表。SEQ ID NO:92具有预期约123kDa的分子量。SEQ ID NO:92含有据信增强融合蛋白的免疫原性的多个表位或域，包括在上文对于SEQ ID NO:34和SEQ IDNO:36所描述的数个。另外，此融合蛋白中使用的逆转录酶域含有几个已知作为对用抗病毒药物治疗的药物抗性响应而发生突变的氨基酸位置，并且因此可以在此融合蛋白中突变以提供靶向特定药物抗性(逃逸)突变的治疗性或预防性免疫治疗剂。对于SEQ ID NO:92，这些氨基酸位置为：氨基酸第518位(Val，已知在拉米夫定疗法后突变为Leu)；第525位(Leu，已知在拉米夫定疗法后突变为Met)；第539位(Ala，已知在替诺福韦疗法后突变为Thr)；第549位(Met，已知在拉米夫定疗法后突变为Ile或Val)；和第581位(Asn，已知在阿德福韦疗法后突变为Thr)。
为了创建这些包含由SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:92代表的氨基酸序列的免疫治疗组合物，将编码上文描述的表面抗原的保守区(pre-S1或大表面抗原的肝细胞受体区，和全长小表面抗原)和聚合酶的逆转录酶区的DNA融合至全长核心和全长X抗原。对DNA进行密码子优化以在酵母中表达，然后用EcoRI和NotI消化并插入到酵母2um表达载体中的CUP1启动子(pGI-100)或TEF2启动子(pTK57-1)之后。将所得质粒通过醋酸锂/聚乙二醇转染引入酿酒酵母W303α酵母，并在缺少尿嘧啶的固体基本平板(UDM；尿苷缺失培养基)上选择原代转染体。将菌落再划线接种到UDM或ULDM(缺失尿苷和亮氨酸的培养基)上并允许在30℃生长3天。
从平板接种缺少尿苷(U2)或缺少尿苷和亮氨酸(UL2)的液体培养基并在30℃以250rpm生长起始培养物达20小时。含有4.2g/L Bis-Tris(BT-U2；BT-UL2)的经pH缓冲的培养基也进行接种以评估酵母在中性pH条件下的生长(数据未显示)。使用原代培养物来接种同样配制的最终培养物，并持续生长直至密度达到1.1至4.0YU/mL。对于TEF2株系(组成型表达)，收获、清洗细胞并在56℃于PBS中1小时将其热杀死。对于CUP1株系(诱导型表达)，在有0.5mM硫酸铜的相同培养基中在30℃、250rpm达5小时来诱导表达。收获、清洗细胞并在56℃于PBS中1小时将其热杀死。还处理活细胞以用于比较(数据未显示)。
在热杀死TEF2和CUP1培养物后，将细胞在PBS中清洗3次。通过TCA沉淀/硝酸纤维素结合测定法来测量总蛋白表达，并使用抗his标签单克隆抗体通过Western印迹来测量抗原表达。通过从在同一Western印迹上处理的重组的有6组氨酸标签的NS3蛋白的标准曲线内插来对抗原定量。
对于表达由SEQ ID NO:36代表的融合蛋白的基于酵母的免疫治疗剂(GI-13005)，结果显示于图18。图18显示，本发明的基于酵母的免疫治疗组合物使用两种启动子均较好地表达融合蛋白，并且可以通过Western印迹在被热杀死的酵母细胞中鉴定出来(在活酵母细胞中也实现表达，数据未显示)。对于在UL2中的生长，通过此基于酵母的免疫治疗剂所计算出的抗原表达为每Y.U.～1200ng蛋白质或每Y.U11pmol蛋白质。
对于表达由SEQ ID NO:92代表的融合蛋白的基于酵母的免疫治疗剂(GI-13004)，结果显示于图19。图19显示在CUP1启动子控制下此基于酵母的免疫治疗组合物的表达(在图19中鉴定为Alpha-SPEX)，如相比于表达不相关抗原的基于酵母的免疫治疗剂(对照酵母)以及相比于表达由SEQ ID NO:36代表的HBV融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物(SPEX)的。图19显示基于酵母的免疫治疗剂较好地表达有关的融合蛋白，并且可以在热杀死的酵母细胞中通过Western印迹鉴定出来。对于在UL2中的生长，通过此基于酵母的免疫治疗剂所计算出的抗原表达为每Y.U.～5000ng蛋白质或每Y.U41pmol蛋白质。
实施例3
以下实施例描述了另外的基于酵母的免疫治疗组合物用于治疗或预防乙肝病毒(HBV)感染的生成。
在此实验中，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1或TEF2启动子的控制下表达各种HBV聚合酶-核心融合蛋白，如图4中示意性显示的。在各情况下，融合蛋白是由SEQ ID NO:38代表的约527个氨基酸的单一多肽，其从N末端至C末端符合阅读框地融合以下序列元件：1)赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的N末端肽(SEQ IDNO:37；SEQ ID NO:38的第1至6位)；2)包括逆转录酶域在内的HBV基因型C聚合酶的一部分的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:10的第347至691位或SEQ ID NO:38的第7至351位)；3)HBV基因型C核心蛋白(例如SEQ ID NO:9的第31-212位或SEQ ID NO:38的第352至533位)；和4)6组氨酸标签(例如SEQ ID NO:38的第534至539位)。SEQ ID NO:38具有预期为约58kDa的分子量。该序列还含有据信增强融合蛋白的免疫原性的表位或域。在另外的构建体中，将SEQID NO:37的N末端肽用由SEQ ID NO:37同源物代表的、满足与说明书中详述的相同的SEQID NO:37的基本结构要求的不同的合成N末端肽替换，或将SEQ ID NO:37的N末端肽用SEQID NO:89或SEQ ID NO:90的N末端肽替换，而在另一种构建体中，省去N末端肽并在第1位纳入甲硫氨酸。
在另一项实验中，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1或TEF2启动子的控制下表达如图5中示意性显示的各种HBV X-核心融合蛋白。在各情况下，融合蛋白是由SEQ ID NO:39代表的约337个氨基酸的单一多肽，其从N末端至C末端符合阅读框地融合以下序列元件：1)赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的N末端肽(SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:39的第1至6位)；2)近乎全长的(-1位)HBV基因型C X抗原的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:12的第2至154位或SEQ ID NO:39的第7-159位)；3)HBV基因型C核心蛋白(例如SEQ ID NO:9的第31至212位或SEQ ID NO:39的第160至341位)；和4)6组氨酸标签(SEQID NO:39的第342至347位)。SEQ ID NO:39具有预期为约37kDa的分子量。该序列还含有据信增强融合蛋白的免疫原性的表位或域。在另外的构建体中，将SEQ ID NO:37的N末端肽用由SEQ ID NO:37同源物代表的、满足与说明书中详述的相同的SEQ ID NO:37的基本结构要求的不同的合成N末端肽替换，或将SEQ ID NO:37的N末端肽用SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90的N末端肽替换，而在另一种构建体中，省去N末端肽并在第1位纳入甲硫氨酸。
在另一项实验中，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1或TEF2启动子的控制下表达如图6中示意性显示的各种HBV聚合酶蛋白。在各情况下，融合蛋白是由SEQ ID NO:40代表的单一多肽，其具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件：(1)赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的N末端肽(SEQ ID NO:37，或SEQ IDNO:40的第1至6位)；2)包括逆转录酶域在内的HBV基因型C聚合酶的一部分的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:10的第347至691位或SEQ ID NO:40的第7至351位)；和3)6组氨酸标签(SEQ ID NO:40的第352至357位)。该序列还含有据信增强融合蛋白的免疫原性的表位或域。另外，在一个实施方案中，可以修饰此构建体的序列以引入一种或多种或所有以下抗病毒抗性突变：rtM204l,rtL180M,rtM204V,rtV173L,rtN236T,rtA194T(相对于HBV聚合酶的全长氨基酸序列给出位置)。在一个实施方案中，创造6种不同的免疫治疗组合物，每一种均含有这些突变之一。在其它实施方案中，在单一融合蛋白中纳入所有或一些所述突变。在另外的构建体中，将SEQ ID NO:37的N末端肽用由SEQ ID NO:37同源物代表的、满足与说明书中详述的相同的SEQ ID NO:37的基本结构要求的不同的合成N末端肽替换，或将SEQ IDNO:37的N末端肽用SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90的N末端肽替换，而在另一种构建体中，省去N末端肽并在第1位纳入甲硫氨酸。
在另一项实验中，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1或TEF2启动子的控制下表达如图7中示意性显示的各种HBV聚合酶表面-核心融合蛋白。在各情况下，融合蛋白是由SEQ ID NO:41代表的单一多肽，其具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件：1)赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的N末端肽(SEQ ID NO:41的第1至5位)；2)HBV大(L)表面蛋白pre-S1部分的氨基HBV肝细胞受体域的氨基酸序列(L特有的)(例如SEQ ID NO:11的第21-47位或SEQ ID NO:41的第6至32位)；3)HBV小(S)表面抗原的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:11的第176至400位或SEQ ID NO:41的第33至257位)；4)协助序列克隆和操作的两氨基酸间隔物/接头(例如SEQ ID NO:41的第258和259位)；5)包括逆转录酶域在内的HBV聚合酶的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:10的第247至691位或SEQID NO:41的第260至604位)；6)HBV核心蛋白的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:9的第31-212位或SEQ ID NO:41的第605至786位)；和7)6组氨酸标签(例如SEQ ID NO:41的第787至792位)。该序列还含有据信增强融合蛋白的免疫原性的表位或域。另外，在一个实施方案中，可以修饰此构建体的序列以引入一种或多种或所有以下抗病毒抗性突变：rtM204l,rtL180M,rtM204V,rtV173L,rtN236T,rtA194T(相对于HBV聚合酶的全长氨基酸序列给出位置)。在一个实施方案中，创造6种不同的免疫治疗组合物，每一种均含有这些突变之一。在其它实施方案中，在单一融合蛋白中纳入所有或一些所述突变。在一个实施方案中，此构建体还含有表面抗原中的一或多种抗病毒抗性突变。在另外的构建体中，将由SEQ ID NO:41的第1至5位代表的N末端肽用由SEQ ID NO:41的第1至5位的同源物代表的、满足与说明书中详述的相同的SEQ ID NO:41的第1至5位(或SEQ ID NO:37)的基本结构要求的不同的合成N末端肽替换，或将SEQ ID NO:41的第1至5位的N末端肽用SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90的N末端肽替换，而在另一种构建体中，省去N末端肽并在第1位纳入甲硫氨酸。
为了生成任何上述融合蛋白和表达这类蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物，简言之，将编码融合蛋白的DNA进行密码子优化以在酵母中表达，然后用EcoRI和NotI消化并插入到酵母2um表达载体中的CUP1启动子(pGI-100)或TEF2启动子(pTK57-1)之后。将所得质粒通过醋酸锂/聚乙二醇转染引入酿酒酵母W303α酵母，并在缺少尿嘧啶的固体基本平板(UDM；尿苷缺失培养基)上选择原代转染体。将菌落再划线接种到UDM或ULDM(缺失尿苷和亮氨酸的培养基)上并允许在30℃生长3天。
从平板接种缺少尿苷(U2)或缺少尿苷和亮氨酸(UL2)的液体培养基并在30℃以250rpm生长起始培养物达20小时。还将含有4.2g/L Bis-Tris(BT-U2；BT-UL2)的pH缓冲的培养基接种以评估酵母在中性pH条件下的生长。使用原代培养物来接种同样配制的最终培养物，并持续生长直至密度达到1.1至4.0YU/mL。对于TEF2株系(组成型表达)，收获、清洗细胞并在56℃于PBS中1小时将其热杀死。对于CUP1株系(诱导型表达)，在有0.5mM硫酸铜的相同培养基中在30℃、250rpm达5小时来诱导表达。收获、清洗细胞并在56℃于PBS中1小时将其热杀死。还处理活细胞以用于比较。
在热杀死TEF2和CUP1培养物后，将细胞在PBS中清洗3次。通过TCA沉淀/硝酸纤维素结合测定法来测量总蛋白表达，并使用抗his标签单克隆抗体通过Western印迹来测量抗原表达。通过从在同一Western印迹上处理的重组的有6组氨酸标签的NS3蛋白的标准曲线内插来对抗原定量。
实施例4
以下实施例描述了用于治疗或预防乙肝病毒(HBV)感染的另外的基于酵母的免疫治疗组合物的生成。
此实施例描述了生成4种不同的基于酵母的免疫治疗组合物，每种设计为表达一种HBV蛋白。可以彼此组合或序贯使用，和/或与其它基于酵母的免疫治疗剂组合或序贯使用这些“单HBV蛋白酵母免疫治疗剂”，所述其它基于酵母的免疫治疗剂如那些记载于实施例1-3和5-8的任一个中的，包括本文中描述的多HBV蛋白的基于酵母的免疫治疗剂。另外，能使用任何给定的基因型或基因亚型的HBV序列生成“单HBV蛋白酵母免疫治疗剂”，如记载于本实施例中的那些，并且能使用任意一种或多种另外的基因型或基因亚型的HBV序列来生成另外的HBV表面抗原基于酵母的免疫治疗剂，从而提供不同HBV抗原和基因型和/或基因亚型的“调味品架(spice rack)”，其中每一种是在本发明的基于酵母的免疫治疗剂的上下文中，或在包括至少一种本发明的基于酵母的免疫治疗剂的免疫/施用策略中提供的。
在此实施例中，生成以下4种基于酵母的免疫治疗产品：
HBV表面抗原.将酿酒酵母工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1或TEF2启动子的控制下表达HBV表面蛋白。在各情况下，融合蛋白是由SEQ ID NO:93代表的单一多肽，其从N末端至C末端符合阅读框地融合以下序列元件：1)SEQ ID NO:89的N末端肽(SEQ ID NO:93的第1-89位)；2)近乎全长的(-1位)HBV基因型C大(L)表面抗原的氨基酸序列(例如SEQID NO:11的第2-400位或SEQ ID NO:93的第90至488位)；和3)6组氨酸标签(例如SEQ IDNO:93的第489至494位)。或者，可以用SEQ ID NO:37或其同源物或本文中描述的另一种N末端肽替换此N末端肽。
HBV聚合酶抗原.将酿酒酵母工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1或TEF2启动子的控制下表达以下HBV聚合酶蛋白。在各情况下，融合蛋白是由SEQ ID NO:94代表的单一多肽，其从N末端至C末端符合阅读框地融合以下序列元件：1)SEQ ID NO:89的N末端肽(SEQID NO:94的第1-89位)；2)包括逆转录酶域在内的HBV基因型C聚合酶的一部分的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:10的第347至691位或SEQ ID NO:94的第90至434位)；和3)6组氨酸标签(例如SEQ ID NO:94的第435至440位)。或者，可以用SEQ ID NO:37或其同源物或本文中描述的另一种N末端肽替换此N末端肽。
HBV核心抗原.将酿酒酵母工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1或TEF2启动子的控制下表达以下HBV核心蛋白。在各情况下，融合蛋白是由SEQ ID NO:95代表的单一多肽，其从N末端至C末端符合阅读框地融合以下序列元件：1)SEQ ID NO:89的N末端肽(SEQID NO:95的第1-89位)；2)HBV基因型C核心蛋白的一部分的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:9的第31至212位或SEQ ID NO:95的第90至271位)；和3)6组氨酸标签(例如SEQ ID NO:95的第272至277位)。或者，可以用SEQ ID NO:37或其同源物或本文中描述的另一种N末端肽替换此N末端肽。
HBV X抗原.将酿酒酵母工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1或TEF2启动子的控制下表达以下HBV X抗原。在各情况下，融合蛋白是由SEQ ID NO:96代表的单一多肽，其从N末端至C末端符合阅读框地融合以下序列元件：1)SEQ ID NO:89的N末端肽(SEQ ID NO:96的第1-89位)；2)HBV基因型C X抗原的一部分的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:12的第2至154位或SEQ ID NO:96的第90至242位)；和3)6组氨酸标签(例如SEQ ID NO:96的第243至248位)。或者，可以用SEQ ID NO:37或其同源物或本文中描述的另一种N末端肽替换此N末端肽。
为了创建这些免疫治疗组合物，简言之，将编码融合蛋白的DNA进行密码子优化以在酵母中表达，然后用EcoRI和NotI消化并插入到酵母2um表达载体中的CUP1启动子(pGI-100)或TEF2启动子(pTK57-1)之后。将所得质粒通过醋酸锂/聚乙二醇转染引入酿酒酵母W303α酵母，并在缺少尿嘧啶的固体基本平板(UDM；尿苷缺失培养基)上选择原代转染体。将菌落再划线接种到UDM或ULDM(缺失尿苷和亮氨酸的培养基)上并允许在30℃生长3天。
从平板接种缺少尿苷(U2)或缺少尿苷和亮氨酸(UL2)的液体培养基并在30℃以250rpm生长起始培养物达20小时。还将含有4.2g/L Bis-Tris(BT-U2；BT-UL2)的pH缓冲的培养基接种以评估酵母在中性pH条件下的生长。使用原代培养物来接种同样配制的最终培养物，并持续生长直至密度达到1.1至4.0YU/mL。对于TEF2株系(组成型表达)，收获、清洗细胞并在56℃于PBS中1小时将其热杀死。对于CUP1株系(诱导型表达)，在有0.5mM硫酸铜的相同培养基中在30℃、250rpm达5小时来诱导表达。收获、清洗细胞并在56℃于PBS中1小时将其热杀死。还处理活细胞以用于比较。
在热杀死TEF2和CUP1培养物后，将细胞在PBS中清洗3次。通过TCA沉淀/硝酸纤维素结合测定法来测量总蛋白表达，并使用抗his标签单克隆抗体通过Western印迹来测量抗原表达。通过从在同一Western印迹上处理的重组的有6组氨酸标签的NS3蛋白的标准曲线内插来对融合蛋白定量。
实施例5
以下实施例描述了用于治疗或预防乙肝病毒(HBV)感染的数种不同的基于酵母的免疫治疗组合物的生成。
此实施例描述了表达已设计为实现以下一或多个目的的蛋白质的基于酵母的免疫治疗剂的生成：(1)生成包含少于约690个氨基酸(对应于HBV基因组的不到2/3)的多抗原HBV构建体，从而若需要的话生成与RecombinantDNA Advisory Committee(RAC)的指南一致的基于酵母的免疫治疗临床产品；(2)生成多抗原HBV构建体，其含有最大数目的与对急性/自身限制性HBV感染和/或慢性HBV感染的免疫应答有关的已知T细胞表位；(3)生成含有在基因型之间最保守的T细胞表位的多抗原HBV构建体；和/或(4)生成经修饰以与一或多种通用序列、通用表位和/或来自特定基因型的表位更紧密对应的多抗原HBV构建体。可以将本实施例中示范的修饰单独或一起应用于本文中描述或涵盖的任何其它基于酵母的免疫治疗剂。
在一项实验中，设计了一种基于酵母的疫治疗组合物，其包含表达满足上文指定目的的要求且包含以下每种HBV主要蛋白的部分的融合蛋白的酵母：HBV表面抗原、聚合酶、核心和X抗原。为了设计此融合蛋白，减小融合物内各HBV抗原的大小(如相比于全长的)，并分别修饰融合区段以使得对应于表5中鉴定的那些的已知T细胞表位的纳入最大化。T细胞表位在此融合蛋白中纳入的优先级如下：
在对急性/自身限制性HBV感染和慢性HBV感染的免疫应答中鉴定的表位>在对急性/自身限制性HBV感染的免疫应答中鉴定的表位>在对慢性HBV感染的免疫应答中鉴定的表位
在此融合蛋白的各区段的设计中还使人工接合最小化，因为，不受理论束缚地，认为自然进化导致：i)表达较好的病毒中的连续序列；和ii)抗原呈递细胞中的免疫蛋白酶体，其能够适当消化并向免疫系统呈现那些序列。因此，具有许多非天然的接合的融合蛋白相比于保留更多天然HBV蛋白序列的融合蛋白在基于酵母的免疫治疗剂中可能不那么有用。
为了构建包含HBV表面抗原的区段以用于融合蛋白，通过截短N末端和C末端序列来减小来自HBV基因型C的全长大(L)表面抗原蛋白的大小(除去大抗原的第1-119位和第369-400位，如相比于如由SEQ ID NO:11代表的全长L表面抗原蛋白的)。选择剩余部分，部分地，使得对应于表5中鉴定的那些的已知MHC I类T细胞表位的纳入最大化，其使用上文描述的针对T细胞表位的纳入的优先级。所得表面抗原区段由SEQ ID NO:97代表。
为了构建包含HBV聚合酶的区段以用于融合蛋白，消除来自HBV基因型C的全长聚合酶，一种约842个氨基酸的非常大的蛋白质的实质性部分，其通过聚焦于活性位点域(来自RT域)的纳入，所述活性位点域是HBV基因型和分离物中最保守的蛋白质区域。RT域还包含其中已知会发生药物抗性突变的数个位点；如此，能够如需要的进一步以其它版本修饰此构建体部分来靶向靶向疗法的逃逸突变。在包含较少HBV蛋白的融合蛋白中，可以按期望的扩大聚合酶区段的大小。纳入所选的HBV聚合酶部分以使得已知的T细胞表位最大化，其使用上文论述的优先级策略。由此消除的全长聚合酶的序列包含RT域以外的序列，和RT域内不含已知T细胞表位或包含分别在不到17%或5%的其中鉴定这些表位的基因型A患者中鉴定出的两种表位的序列(参见Desmond等,2008和表5)。除了一种T细胞表位以外，HBV聚合酶基因型C区段中的所有剩余的T细胞表位均为基因型A分析所公开的表位的完美匹配，并且将具有单个氨基酸错配的该表位修饰以对应于公开的表位。所得HBV聚合酶抗原区段由SEQID NO:98代表。
为了构建包含HBV核心抗原的区段以用于融合蛋白，如下修饰来自HBV基因型C的全长核心蛋白(例如类似于SEQ ID NO:9的第31-212位)：i)修饰基因型C衍生蛋白质的T细胞表位内的单个氨基酸以创建对表5中描述的已知T细胞表位的完美匹配；ii)除去N末端的不含T细胞表位的7个氨基酸，保留对蛋白质中第一已知T细胞表位N末端的一些侧接氨基酸；和iii)除去核心的24个C末端氨基酸，其不删除已知表位但确实除去带过多正电荷的C末端。带正电荷的C末端是从要在酵母中表达的抗原除去的好的候选物，因为这类序列在一些构建体中可能通过与经常富含精氨酸的天然酵母RNA结合蛋白(带正电荷)的竞争性干扰而对酵母是毒性的。因此，除去此核心部分是可接受的。所得HBV核心抗原区段由SEQ IDNO:99代表。
为了构建包含HBV X抗原的区段以用于融合蛋白，将来自HBV基因型C的全长X抗原蛋白(例如类似于SEQ ID NO:12)在N末端和C末端截短以生成包含来自表5的大多数已知T细胞表位(聚集在X抗原中)的X抗原区段。通过单氨基酸改变来修饰两种表位以对应于公开的T细胞表位序列，并保留在区段端侧接T细胞表位的序列以协助有效加工和经由抗原呈递细胞呈现正确的表位。所得HBV X抗原区段由SEQ ID NO:100代表。
为了构建含有所有4种HBV蛋白区段的完整的融合蛋白，将上述4种HBV区段连接(表面-聚合酶-核心-X)以形成单一的蛋白质，其优化了跨越HBV基因组编码的所有蛋白质的T细胞表位的纳入，并且预期其满足用于期望临床用途的病毒性蛋白的标准。
最终创建两种不同的融合蛋白，每种均添加有不同的N-末端肽以提高和/或稳定融合蛋白在酵母中的表达。另外，在C-末端纳入6组氨酸肽以帮助对蛋白质的鉴定。至于在本文中描述的基于酵母的免疫治疗组合物中使用的所有其他蛋白质，在另外的构建体中，能将在此实施例中利用的SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：89的N-末端肽用不同的合成N-末端肽(例如满足与本说明书中详述的相同的SEQ ID NO：37的基本结构要求的SEQ ID NO：37的同源物)替换，或用SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：90的N末端肽的同源物替换，而在另一个构建体中，省去N-末端肽并在第1位包含甲硫氨酸。另外，若期望的话，可以在融合蛋白的区段之间添加具有一个、两个、三个或更多个氨基酸的接头序列。还有，尽管这些构建体设计为使用来自基因型C的HBV蛋白质为骨架，但可以使用任何其他的HBV基因型、基因亚型或来自不同株系或分离物的HBV蛋白来设计这些蛋白区段，如实施例7中例示的。最后，如果一个或多个区段被排除在如本文所述的融合蛋白以外，那么可以扩大来自剩余区段的序列以包含另外的T细胞表位和蛋白质侧接区(例如见实施例8)。
为了生成包含由上述HBV区段构建的融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1或TEF2启动子的控制下表达各种如上文论述的优化过的HBV表面-聚合酶-核心-X融合蛋白。
在一个构建体中，融合蛋白是由SEQ ID NO:101代表的单一多肽，其具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件：(1)由SEQ ID NO:89代表的赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的N末端肽，其为alpha因子前原序列(SEQ ID NO:101的第1-89位)；(2)由SEQ ID NO:97代表的HBV大(L)表面抗原的优化部分(SEQ ID NO:101的第90至338位)；(3)由SEQ ID NO:98代表的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)域的优化部分(SEQ ID NO:101的第339至566位)；(4)由SEQ ID NO:99代表的HBV核心蛋白的优化部分(SEQ ID NO:101的第567至718位)；(5)由SEQ ID NO:100代表的HBV X抗原的优化部分(SEQ ID NO:101的第719至778位)；和(6)6组氨酸标签(例如SEQ ID NO:101的第779至784位)。
在第二个构建体中，融合蛋白是由SEQ ID NO:102代表的单一多肽，其具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件：(1)由SEQ ID NO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的N末端肽，其为合成的N末端肽(SEQ ID NO:102的第1-6位)；(2)由SEQ ID NO:97的第2-248位代表的HBV大(L)表面抗原的优化部分(SEQ ID NO:102的第7至254位)；(3)由SEQ ID NO:98代表的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)域的优化部分(SEQ IDNO:102的第255至482位)；(4)由SEQ ID NO:99代表的HBV核心蛋白的优化部分(SEQ ID NO:102的第483至634位)；(5)由SEQ ID NO:100代表的HBV X抗原的优化部分(SEQ ID NO:102的第635至694位)；和(6)6组氨酸标签(例如SEQ ID NO:102的第695至700位)。
使用与实施例1-4中详述的相同的方案生成表达这些融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物。
实施例6
以下实施例描述了另外的基于酵母的HBV免疫治疗组合物的生成，所述HBV免疫治疗组合物使HBV基因型和/或基因亚型的靶向连同单一组合物中保守的抗原和/或表位的纳入最大化，从而提供具有治疗大量个体或个体的群体的潜力的单一组合物。
为了制备在同一种基于酵母的免疫治疗剂中包含多种不同基因型的构建体，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在合适的启动子，如铜可诱导的启动子CUP1或TEF2启动子的控制下表达HBV融合蛋白。该蛋白是由SEQ ID NO:105代表的单一多肽，其包含四种各来自不同基因型(HBV基因型A、B、C和D)的核心抗原：1)在SEQ ID NO:105第1位的N末端甲硫氨酸；2)来自HBV基因型A的近乎全长核心蛋白的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1的第31至212位或SEQ ID NO:105的第2至183位)；3)来自HBV基因型B的近乎全长核心蛋白的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:5的第30至212位或SEQ ID NO:105的第184至395位)；4)来自HBV基因型C的近乎全长核心蛋白的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:9的第30至212位或SEQ ID NO:105的第396至578位)；5)来自HBV基因型D的近乎全长核心蛋白的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:13的第30至212位或SEQ ID NO:105的第579至761位)；和5)6组氨酸标签(例如SEQ ID NO:105的第762至767位)。该序列还含有据信增强融合蛋白的免疫原性的表位或域。第1位的N末端甲硫氨酸可以被SEQ ID NO:37或其同源物取代，或被SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90的alpha前原序列或其同源物取代，或若期望的话被任何其它合适的N末端序列取代。另外，若期望的话可以在HBV蛋白之间插入接头序列以协助构建体的克隆和操作。这是一种例示性构建体，因为可以按期望的将HBV基因型和/或基因亚型的任何其它组合取代到此设计中以构建具有广泛临床适用性和针对制备的有效设计的单抗原的基于酵母的HBV免疫治疗产品。SEQ ID NO:105的氨基酸序列还含有数个已知的T细胞表位，并且某些表位已经过修饰以对应于针对给定表位所公开的序列，所述公开序列可以通过例如将序列与表5中显示的表位比较来鉴定。
为了制备在同一种基于酵母的免疫治疗剂中包含超过一种HBV抗原和超过一种基因型的构建体，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在合适的启动子，如铜可诱导的启动子CUP1或TEF2启动子的控制下表达HBV融合蛋白。该蛋白是由SEQ ID NO:106代表的包含两种核心抗原和两种X抗原的单一多肽，其每一对来自不同基因型(HBV基因型A和C)：1)在SEQID NO:106第1位的N末端甲硫氨酸；2)来自HBV基因型A的近乎全长核心蛋白的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:1的第31至212位或SEQ ID NO:106的第2至183位)；3)来自HBV基因型A的全长X抗原的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:106的第184至337位)；4)来自HBV基因型C的近乎全长核心蛋白的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:9的第30至212位或SEQ IDNO:106的第338至520位)；5)来自HBV基因型C的全长X抗原的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:106的第521至674位)；和5)6组氨酸标签(例如SEQ ID NO:106的第675至680位)。该序列还含有据信增强融合蛋白的免疫原性的表位或域。第1位的N末端甲硫氨酸可以被SEQ ID NO:37或其同源物取代，或被SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:90的alpha前原序列或其同源物取代。SEQ ID NO:106的氨基酸序列还含有数个已知的T细胞表位，并且某些表位已经过修饰以对应于给定表位的公开序列，所述公开序列可以通过例如将序列与表5中显示的表位比较来鉴定。
使用与实施例1-4中详述的相同的方案生成表达这些融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物。
实施例7
以下实施例描述了另外的基于酵母的HBV免疫治疗组合物的生成，所述HBV免疫治疗组合物利用HBV基因型的通用序列，使得对HBV基因型和/或基因亚型的靶向连同对保守抗原和/或表位的纳入都进一步最大化，从而提供具有用一种组合物治疗大量个体或个体的群体的潜力的组合物。
为了设计包含来自表面蛋白、核心、聚合酶和X抗原每一种的数个构建体，将实施例5中对SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102描述的融合蛋白结构(以及因此由SEQ ID NO:97(表面抗原)、SEQ ID NO:98(聚合酶)、SEQ ID NO:99(核心抗原)和SEQ ID NO:100(X抗原)代表的这些融合蛋白的子部分)用作模板。参照从多个HBV序列来源建立的HBV基因型A、B、C和D的每一种的通用序列(例如Yu和Yuan等,2010，对于S、核心和X，其中通用序列从322HBV序列产生，或对于Pol(RT)，来自Stanford University HIV Drug Resistance Database,HBVseq and HBV Site Release Notes)，将模板结构中的序列用对应于相同位置的通用序列替换，除非使用通用序列变更了一种已知的急性自身限制性T细胞表位或一种已知的聚合酶逃逸突变位点，在此情况下，这些位置遵循这些表位或突变位点的公开序列。可以仅基于通用序列或使用其它因公开而变成已知的表位来构建另外的抗原。
如下设计基于HBV基因型A的通用序列的第一种构建体。使用SEQ ID NO:97、SEQID NO:98、SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100(设计为减小融合区段的大小(如相比于全长的)，纳入最多的对应于表5中鉴定的那些的已知T细胞表位(优先级如上文论述的)，并使人工接头最小化)，来创建基于HBV基因型A的通用序列的新融合区段。新表面抗原区段由SEQID NO:107的第1-249位代表。新的聚合酶(RT)区段由SEQ ID NO:107的第250-477位代表。新的核心区段由SEQ ID NO:107的第478-629位代表。新的X抗原由SEQ ID NO:107的第630-689位代表。此完整的融合蛋白是具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽，其中HBV序列由SEQ ID NO:107代表(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQID NO:107的基础序列中，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白):(1)任选的N末端肽，其为由SEQ ID NO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)由SEQ ID NO:107的第1至249位代表的HBV大(L)表面抗原的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型A的通用序列；(4)由SEQ IDNO:107的第250至477位代表的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)域的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型A的通用序列；(5)由SEQ ID NO:107的第478至629位代表的HBV核心蛋白的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型A的通用序列；(6)由SEQID NO:107的第630至689位代表的HBV X抗原的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型A的通用序列；和(7)任选的6组氨酸标签(在SEQ ID NO:107的第689位之后的6个组氨酸残基)。表达此融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在本文中还称为GI-13010。此融合蛋白和相应的基于酵母的免疫治疗剂在本文中还可以称为“SPEXv2-A”或“Spex-A”。
如下设计基于HBV基因型B的通用序列的第二种构建体。使用SEQ ID NO:97、SEQID NO:98、SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100(设计为减小融合区段的大小(如相比于全长的)，纳入最多的对应于表5中鉴定的那些的已知T细胞表位(优先级如上文论述的)，并使人工接头最小化)，来创建基于HBV基因型B的通用序列的新融合区段。新表面抗原区段由SEQID NO:108的第1-249位代表。新的聚合酶(RT)区段由SEQ ID NO:108的第250-477位代表。新的核心区段由SEQ ID NO:108的第478-629位代表。新的X抗原由SEQ ID NO:108的第630-689位代表。此融合蛋白是由SEQ ID NO:108代表的具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQ ID NO:108的基础序列中，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白)：(1)任选的N末端肽，其为由SEQ IDNO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)由SEQ ID NO:108的第1至249位代表的HBV大(L)表面抗原的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型B的通用序列；(4)由SEQ ID NO:108的第250至477位代表的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)域的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型B的通用序列；(5)由SEQ ID NO:108的第478至629位代表的HBV核心蛋白的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型B的通用序列；(6)由SEQ ID NO:108的第630至689位代表的HBV X抗原的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型B的通用序列；和(7)任选的6组氨酸标签。表达此完整融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在本文中还称为GI-13011。此融合蛋白和相应的基于酵母的免疫治疗剂在本文中还可以称为“SPEXv2-B”或“Spex-B”。
如下设计基于HBV基因型C的通用序列的第三种构建体。使用SEQ ID NO:97、SEQID NO:98、SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100(设计为减小融合区段的大小(如相比于全长的)，纳入最多的对应于表5中鉴定的那些的已知T细胞表位(优先级如上文论述的)，并使人工接头最小化)，来创建基于HBV基因型C的通用序列的新融合区段。新表面抗原区段由SEQID NO:109的第1-249位代表。新的聚合酶(RT)区段由SEQ ID NO:109的第250-477位代表。新的核心区段由SEQ ID NO:109的第478-629位代表。新的X抗原由SEQ ID NO:109的第630-689位代表。此融合蛋白是由SEQ ID NO:109代表的具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQ ID NO:109的基础序列中，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白)：(1)任选的N末端肽，其为由SEQ IDNO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)由SEQ ID NO:109的第1至249位代表的HBV大(L)表面抗原的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型C的通用序列；(4)由SEQ ID NO:109的第250至477位代表的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)域的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型C的通用序列；(5)由SEQ ID NO:109的第478至629位代表的HBV核心蛋白的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型C的通用序列；(6)由SEQ ID NO:109的第630至689位代表的HBV X抗原的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型C的通用序列；和(7)任选的6组氨酸标签。表达此完整融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在本文中还称为GI-13012。此融合蛋白和相应的基于酵母的免疫治疗剂在本文中还可以称为“SPEXv2-C”或“Spex-C”。
如下设计基于HBV基因型D的通用序列的第四种构建体。使用SEQ ID NO:97、SEQID NO:98、SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100(设计为减小融合区段的大小(如相比于全长的)，纳入最多的对应于表5中鉴定的那些的已知T细胞表位(优先级如上文论述的)，并使人工接头最小化)，来创建基于HBV基因型D的通用序列的新融合区段。新表面抗原区段由SEQID NO:110的第1-249位代表。新的聚合酶(RT)区段由SEQ ID NO:110的第250-477位代表。新的核心区段由SEQ ID NO:110的第478-629位代表。新的X抗原由SEQ ID NO:110的第630-689位代表。此融合蛋白是由SEQ ID NO:110代表的具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQ ID NO:110的基础序列中，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白)：(1)任选的N末端肽，其为由SEQ IDNO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)由SEQ ID NO:110的第1至249位代表的HBV大(L)表面抗原的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型D的通用序列；(4)由SEQ ID NO:110的第250至477位代表的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)域的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型D的通用序列；(5)由SEQ ID NO:110的第478至629位代表的HBV核心蛋白的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型D的通用序列；(6)由SEQ ID NO:110的第630至689位代表的HBV X抗原的优化部分，其为利用上文论述的设计策略的HBV基因型D的通用序列；和(7)任选的6组氨酸标签。表达此完整融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在本文中还称为GI-13013。表达类似的融合蛋白(含有SEQ ID NO:110)，只不过SEQ ID NO:37的N末端肽被SEQ ID NO:89的alpha因子序列取代的基于酵母的免疫治疗组合物在本文中称为GI-13014。此融合蛋白和相应的基于酵母的免疫治疗剂在本文中还可以称为“SPEXv2-D”、“Spex-D”或“M-SPEXv2-D”(对于GI-13013)或“a-SPEXv2-D”(对于GI-13014)。
利用四种HBV基因型的通用序列，设计了在基于酵母的免疫治疗剂中用到的的另外的HBV融合蛋白，以证实，如何能够在不同的HBV融合蛋白(如由SEQ ID NO:34描述的，其含有HBV表面蛋白和HBV核心蛋白)中进行类似于在上述融合蛋白(SEQ ID NO:107-110)中进行的那些的变更。为了设计这些另外的HBV抗原和相应的基于酵母的免疫治疗组合物，将上文对SEQ ID NO:34(以及因此这些融合蛋白(表面抗原和核心)的子部分)描述的融合蛋白结构用作模板。如用于上文描述的构建体的，从多个HBV序列来源建立HBV基因型A、B、C和D的每一种的通用序列(例如Yu和Yuan等,2010，对于S和核心)，并将模板结构中的序列用对应于相同位置的通用序列替换，除非使用通用序列变更了一种已知的急性自身限制性T细胞表位或一种已知的聚合酶逃逸突变位点，在此情况下，这些位置遵循这些表位或突变位点的公开序列。
如下设计基于HBV基因型A的通用序列的第一种构建体。使用SEQ ID NO:34作为模板，基于HBV基因型A的通用序列来创建新的融合蛋白，本文中由SEQ ID NO:112代表。此融合蛋白是由SEQ ID NO:112代表的具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQ ID NO:112的基础序列中，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白)：(1)任选的N末端肽，其为由SEQ ID NO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)由SEQ ID NO:112的第1至399位代表的HBV基因型A大(L)表面抗原的通用序列；(4)由SEQ ID NO:112的第400至581位代表的HBV基因型A核心抗原的通用序列的氨基酸序列；和(5)任选的6组氨酸标签。编码包含SEQ ID NO:112的融合蛋白的核酸序列(针对酵母表达进行过密码子优化)在本文中由SEQ ID NO:111代表。表达此融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在本文中还称为GI-13006。此融合蛋白和相应的基于酵母的免疫治疗剂在本文中还可以称为“Score-A”。
如下设计基于HBV基因型B的通用序列的第二种构建体。使用SEQ ID NO:34作为模板，基于HBV基因型B的通用序列来创建新的融合蛋白，本文中由SEQ ID NO:114代表。此融合蛋白是由SEQ ID NO:114代表的具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQ ID NO:114的基础序列中，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白)：(1)任选的N末端肽，其为由SEQ ID NO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)由SEQ ID NO:114的第1至399位代表的HBV基因型B大(L)表面抗原的通用序列；(4)由SEQ ID NO:114的第400至581位代表的HBV基因型B核心抗原的通用序列的氨基酸序列；和(5)任选的6组氨酸标签。编码包含SEQ ID NO:114的融合蛋白的核酸序列(针对酵母表达进行过密码子优化)在本文中由SEQ ID NO:113代表。表达此融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在本文中还称为GI-13007。此融合蛋白和相应的基于酵母的免疫治疗剂在本文中还可以称为“Score-B”。
如下设计基于HBV基因型C的通用序列的第三种构建体。使用SEQ ID NO:34作为模板，基于HBV基因型C的通用序列来创建新的融合蛋白，本文中由SEQ ID NO:116代表。此融合蛋白是由SEQ ID NO:116代表的具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQ ID NO:116的基础序列中，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白)：(1)任选的N末端肽，其为由SEQ ID NO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)由SEQ ID NO:116的第1至399位代表的HBV基因型C大(L)表面抗原的通用序列；(4)由SEQ ID NO:116的第400至581位代表的HBV基因型C核心抗原的通用序列的氨基酸序列；和(5)任选的6组氨酸标签。编码包含SEQ ID NO:116的融合蛋白的核酸序列(针对酵母表达进行过密码子优化)在本文中由SEQ ID NO:115代表。表达此融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在本文中还称为GI-13008。此融合蛋白和相应的基于酵母的免疫治疗剂在本文中还可以称为“Score-C”。
如下设计基于HBV基因型D的通用序列的第四种构建体。使用SEQ ID NO:34作为模板，基于HBV基因型D的通用序列来创建新的融合蛋白，本文中由SEQ ID NO:118代表。此融合蛋白是由SEQ ID NO:118代表的具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQ ID NO:118的基础序列中，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白)：(1)任选的N末端肽，其为由SEQ ID NO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)由SEQ ID NO:118的第1至399位代表的HBV基因型D大(L)表面抗原的通用序列；(4)由SEQ ID NO:118的第400至581位代表的HBV基因型D核心抗原的通用序列的氨基酸序列；和(5)任选的6组氨酸标签。包含SEQ ID NO:118以及N末端和C末端肽和接头肽的完整的融合蛋白的氨基酸序列在本文中由SEQ ID NO:151代表。编码包含SEQ ID NO:118或SEQ ID NO:151的融合蛋白的核酸序列(针对酵母表达进行过密码子优化)在本文中由SEQ ID NO:117代表。表达此融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物在本文中还称为GI-13009。此融合蛋白和相应的基于酵母的免疫治疗剂在本文中还可以称为“Score-D”。
如上文针对其它组合物所描述的生成GI-13010(包含SEQ ID NO:107)、GI-13011(包含SEQ ID NO:108)、GI-13012(包含SEQ ID NO:109)、GI-13013(包含SEQ ID NO:110)、GI-13006(包含SEQ ID NO:112)、GI-13007(包含SEQ ID NO:114)、GI-13008(包含SEQ IDNO:116)和GI-13009(包含SEQ ID NO:118)的基于酵母的免疫治疗组合物。简言之，将编码所述融合蛋白的DNA进行密码子优化以在酵母中表达，然后插入到酵母2um表达载体中的CUP1启动子(pGI-100)之后。将所得质粒通过醋酸锂/聚乙二醇转染引入酿酒酵母W303α酵母中。在缺少尿嘧啶的固体基本平板(UDM；尿苷缺失培养基)上分离每种质粒的酵母转化体。将菌落再划线接种到ULDM(缺失尿苷和亮氨酸的培养基)上并允许在30℃生长3天。从平板接种缺少尿苷和亮氨酸(UL2；在实施例1中提供配方)的液体起始培养基并在30℃以250rpm生长起始培养物达18小时。使用原代培养物来接种UL2的最终培养物，并持续生长直至密度达到2YU/mL。用0.5mM硫酸铜诱导培养物3小时，然后在PBS中清洗细胞，在56℃达1小时热杀死，并在PBS中清洗3次。。通过TCA沉淀/硝酸纤维素结合测定法来测量总蛋白表达，并使用抗his标签单克隆抗体通过Western印迹来测量HBV抗原表达。
结果显示于图20。图20中显示的印迹中的道含有来自以下基于酵母的免疫治疗剂的蛋白质：第1道(v1.0；Score)=GI-13002(表达SEQ ID NO:34)；第2道(v2.0；ScA)=GI-13006(表达SEQ ID NO:112)；第3道(v2.0；ScB)=GI-13007(表达SEQ ID NO:114)；第4道(v2.0；ScC)=GI-13008(表达SEQ ID NO:116)；第5道(v2.0；ScD)=GI-13009(表达SEQ IDNO:118)；第6道(v1.0；Sp)=GI-13005(表达SEQ ID NO:36)；第7道(v1.0；a-Sp)=GI-13004(表达SEQ ID NO:92)；第8道(v2.0；SpA)=GI-13010(表达SEQ ID NO:107)；第9道(v2.0；SpB)=GI-13011(表达SEQ ID NO:108)；第10道(v2.0；SpC)=GI-13012(表达SEQ ID NO:109)；第11道(v2.0；SpD)=GI-13013(表达SEQ ID NO:110)。
结果显示包含表面抗原和核心的组合的每种HBV抗原(“Score”抗原)，即GI-13002(Score)、GI-13006(ScA；Score-A)、GI-13007(ScB；Score-B)、GI-13008(ScC；Score-C)和GI-13009(ScD；Score-D)在酵母中有力表达。在这些和类似的实验中的典型Score v2.0表达水平在约90至140pmol/YU(即5940ng/YU至9240ng/YU)的范围内。包含所有4种HBV蛋白(表面、聚合酶、核心和X)的HBV抗原的表达水平是差异化的。具体地，来自GI-13010(SpA；Spex-A),GI-13011(SpB；Spex-B),GI-13012(SpC；Spex-D)和GI-13013(SpD；Spex-D)的抗原的表达实质性低于“Score”抗原的表达以及来自GI-13005(Sp；Spex)和GI-13004(a-Sp；a-Spex)的抗原的表达。GI-13012(SpC；Spex-C)中的抗原的表达几乎不能检测出来。总之，这些结果指示作为一组，包含表面抗原和核心的HBV抗原在酵母中表达得非常好，而包含所有的表面抗原、聚合酶、核心和X的HBV抗原在酵母中具有不同的表达，并且一般表达得没有“Score”抗原好。
实施例8
以下实施例描述了利用HBV基因型通用序列的另外的基于酵母的HBV免疫治疗组合物的生成，并另外示范了在融合蛋白内使用备选的HBV蛋白区段的配置/排列以改良或改进HBV抗原在酵母中的表达和/或改进或改良HBV抗原的免疫原性或其它功能属性。
在此实施例中，新的融合蛋白设计为将X抗原和/或聚合酶抗原附加到融合至核心的表面抗原的组合的N末端或C末端。这些构建体部分基于以下原理设计，即由于以本文中统称为“Score”的配置排列的融合蛋白(例如SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:112,SEQ ID NO:114,SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:118)在酵母中表达得非常好，利用此基础配置(即融合至核心蛋白的表面抗原)来生成包含另外的HBV蛋白组分的HBV抗原可能是有利的。这类策略可能改进多蛋白抗原的表达和/或改进或改良这类抗原在免疫治疗背景中的功能性。例如，不受理论束缚地，本发明人提出通过使用表面-核心(按次序)作为基础，然后向此构建体附加其它抗原来构建融合蛋白能够改进使用3种或所有4种HBV蛋白的HBV抗原的表达。
因此，为了例示本发明的此实施方案，设计并构建8种新的融合蛋白，并生成表达这些蛋白质的基于酵母的免疫治疗产品。在每种情况下，融合蛋白使用自由SEQ ID NO:118代表的融合蛋白(其为实施例7中描述的、利用HBV基因型D的通用序列并经优化以使保守的免疫学表位的使用最大化的表面-核心融合蛋白)的区段衍生的表面-核心融合蛋白作为基础。利用自由SEQ ID NO:110代表的融合蛋白(其为实施例7中描述的、构建为减小蛋白区段的大小、使保守的免疫学表位的使用最大化并且利用HBV基因型D的通用序列的多蛋白HBV融合蛋白)衍生的区段将所有可能的聚合酶区段和/或X抗原区段排列附加到此基础配置上。尽管这8种所得抗原基于HBV基因型D的通用序列，但使用来自由SEQ ID NO:107和/或SEQ ID NO:112(基因型A)、SEQ ID NO:108和/或SEQ ID NO:114(基因型B)、SEQ ID NO:109和/或SEQ ID NO:116(基因型C)代表的融合蛋白的相应融合区段，或使用来自不同的HBV基因型、基因亚型、通用序列或株系的相应序列生成具有类似的总体结构的融合蛋白将是简单明了的。
为了生成第1种组合物，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1的控制下表达图8中示意性例示的新的HBV融合蛋白。所得酵母-HBV免疫治疗组合物在本文中可以被称为GI-13015。此融合蛋白(在本文中还称为“Score-Pol”并由SEQ ID NO:120代表)依次序包含表面抗原、核心蛋白和聚合酶序列，是具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQ ID NO:120的基础序列中，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白)：(1)任选的N末端肽，其为由SEQ ID NO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)由SEQ ID NO:120的第1至399位代表的HBV基因型D大(L)表面抗原的近乎全长(-1位)通用序列的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:118的第1至399位)；(4)由SEQ ID NO:120的第400至581位代表的HBV基因型D核心抗原的通用序列的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:118的第400至581位)；(5)使用HBV基因型D通用序列的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)域的优化部分，其由SEQ ID NO:120的第582至809位代表(对应于SEQ ID NO:110的第250至477位)；和(6)任选的6组氨酸标签。SEQ ID NO:120含有可见于表5的多个T细胞表位(人和鼠的)。编码SEQ ID NO:120的融合蛋白的核酸序列(针对酵母中表达进行过密码子优化)在本文中由SEQ ID NO:119代表。
为了生成第2种组合物，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1的控制下表达图9中示意性例示的新的HBV融合蛋白。所得酵母-HBV免疫治疗组合物在本文中可以被称为GI-13016。此融合蛋白(在本文中还称为“Score-X”并由SEQ ID NO:122代表)依次序包含表面抗原、核心和X抗原序列，是具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQ ID NO:122的基础序列中，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白)：(1)任选的N末端肽，其为由SEQ IDNO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)由SEQ ID NO:122的第1至399位代表的HBV基因型D大(L)表面抗原的近乎全长(-1位)通用序列的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:118的第1至399位)；(4)由SEQID NO:122的第400至581位代表的HBV基因型D核心抗原的通用序列的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:118的第400至581位)；(5)使用HBV基因型D通用序列的HBV X抗原的优化部分，其由SEQ ID NO:122的第582至641位代表(对应于SEQ ID NO:110的第630至689位)；和(6)任选的6组氨酸标签。SEQ ID NO:122含有可见于表5的多个T细胞表位(人和鼠的)。编码包含SEQ ID NO:122的融合蛋白的核酸序列(针对酵母中表达进行过密码子优化)在本文中由SEQ ID NO:121代表。
为了生成第3种组合物，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1的控制下表达图10中示意性例示的新的HBV融合蛋白。所得酵母-HBV免疫治疗组合物在本文中可以被称为GI-13017。此融合蛋白(在本文中还称为“Score-Pol-X”并由SEQ IDNO:124代表)依次序包含表面抗原、核心、聚合酶和X抗原序列，是具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQ IDNO:124的基础序列中，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白)：(1)任选的N末端肽，其为由SEQ ID NO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)由SEQ ID NO:124的第1至399位代表的HBV基因型D大(L)表面抗原的近乎全长(-1位)通用序列的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:118的第1至399位)；(4)由SEQ ID NO:124的第400至581位代表的HBV基因型D核心抗原的通用序列的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:118的第400至581位)；(5)使用HBV基因型D通用序列的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)域的优化部分，其由SEQ ID NO:124的第582至809位代表(对应于SEQ IDNO:110的第250至477位)；(6)使用HBV基因型D通用序列的HBV X抗原的优化部分，其由SEQID NO:124的第810至869位代表(对应于SEQ ID NO:110的第630至689位)；和(7)任选的6组氨酸标签。SEQ ID NO:124含有可见于表5的多个T细胞表位(人和鼠的)。编码包含SEQ IDNO:124的融合蛋白的核酸序列(针对酵母中表达进行过密码子优化)在本文中由SEQ IDNO:123代表。
为了生成第4种组合物，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1的控制下表达图11中示意性例示的新的HBV融合蛋白。所得酵母-HBV免疫治疗组合物在本文中可以被称为GI-13018。此融合蛋白(在本文中还称为“Score-X-Pol”并由SEQ IDNO:126代表)依次序包含表面抗原、核心、X抗原和聚合酶序列，是具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQ IDNO:126的基础序列中，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白)：(1)任选的N末端肽，其为由SEQ ID NO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)由SEQ ID NO:126的第1至399位代表的HBV基因型D大(L)表面抗原的近乎全长(-1位)通用序列的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:118的第1至399位)；(4)由SEQ ID NO:126的第400至581位代表的HBV基因型D核心抗原的通用序列的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:118的第400至581位)；(5)使用HBV基因型D通用序列的HBV X抗原的优化部分，其由SEQ ID NO:126的第582至641位代表(对应于SEQ ID NO:110的第630至689位)；(6)使用HBV基因型D通用序列的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)域的优化部分，其由SEQID NO:126的第642至809位代表(对应于SEQ ID NO:110的第250至477位)；和(7)任选的6组氨酸标签。SEQ ID NO:126含有可见于表5的多个T细胞表位(人和鼠的)。编码包含SEQ IDNO:126的融合蛋白的核酸序列(针对酵母中表达进行过密码子优化)在本文中由SEQ IDNO:125代表。
为了生成第5种组合物，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1的控制下表达图12中示意性例示的新的HBV融合蛋白。所得酵母-HBV免疫治疗组合物在本文中可以被称为GI-13019。此融合蛋白(在本文中还称为“Pol-Score”并由SEQ IDNO:128代表)依次序包含聚合酶、表面抗原和核心序列，是具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQ ID NO:128的基础序列中(此处例示的构建体中的聚合酶区段和表面抗原区段之间的Leu-Glu接头例外)，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白)：(1)任选的N末端肽，其为由SEQ ID NO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)使用HBV基因型D通用序列的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)域的优化部分，其由SEQ ID NO:120的第1至228位代表(对应于SEQ ID NO:110的第250至477位)；(4)Leu-Glu的接头肽(任选的)，由SEQ ID NO:128的第229至230位代表；(5)由SEQ ID NO:128的第231至629位代表的HBV基因型D大(L)表面抗原的近乎全长(-1位)通用序列的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:118的第1至399位)；(6)由SEQ ID NO:128的第630至811位代表的HBV基因型D核心抗原的通用序列的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:118的第400至581位)；和(7)任选的6组氨酸标签。SEQ ID NO:128含有可见于表5的多个T细胞表位(人和鼠的)。编码包含SEQID NO:128的融合蛋白的核酸序列(针对酵母中表达进行过密码子优化)在本文中由SEQ IDNO:127代表。
为了生成第6种组合物，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1的控制下表达图13中示意性例示的新的HBV融合蛋白。所得酵母-HBV免疫治疗组合物在本文中可以被称为GI-13020。此融合蛋白(在本文中还称为“X-Score”并由SEQ ID NO:130代表)依次序包含X抗原、表面抗原和核心序列，是具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQ ID NO:130的基础序列中(此处例示的构建体中的X区段和表面抗原区段之间的Leu-Glu接头例外)，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白)：(1)任选的N末端肽，其为由SEQ ID NO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)使用HBV基因型D通用序列的HBV X抗原的优化部分，其由SEQ ID NO:130的第1至60位代表(对应于SEQ ID NO:110的第630至689位)；(4)Leu-Glu的接头肽(任选的)，由SEQ ID NO:130的第61至62位代表；(5)由SEQ ID NO:130的第63至461位代表的HBV基因型D大(L)表面抗原的近乎全长(-1位)通用序列的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:118的第1至399位)；(6)由SEQ ID NO:130的第462至643位代表的HBV基因型D核心抗原的通用序列的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:118的第400至581位)；和(7)任选的6组氨酸标签。SEQ ID NO:130含有可见于表5的多个T细胞表位(人和鼠的)。包含SEQ ID NO:130以及N末端和C末端肽和接头的完整融合蛋白的氨基酸序列在本文中由SEQ ID NO:150代表。编码包含SEQ ID NO:130或SEQ ID NO:150的融合蛋白的核酸序列(针对酵母中表达进行过密码子优化)在本文中由SEQ ID NO:129代表。
为了生成第7种组合物，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1的控制下表达图14中示意性例示的新的HBV融合蛋白。所得酵母-HBV免疫治疗组合物在本文中可以被称为GI-13021。此融合蛋白(在本文中还称为“Pol-X-Score”并由SEQ IDNO:132代表)依次序包含聚合酶、X抗原、表面抗原和核心，是具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQ ID NO:132的基础序列中，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白)：(1)任选的N末端肽，其为由SEQ ID NO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)使用HBV基因型D通用序列的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)域的优化部分，其由SEQ ID NO:132的第1至228位代表(对应于SEQ ID NO:110的第250至477位)；(4)使用HBV基因型D通用序列的HBV X抗原的优化部分，其由SEQ ID NO:132的第229至288位代表(对应于SEQ ID NO:110的第630至689位)；(5)由SEQ ID NO:132的第289至687位代表的HBV基因型D大(L)表面抗原的近乎全长(-1位)通用序列的氨基酸序列(对应于SEQ IDNO:118的第1至399位)；(6)由SEQ ID NO:132的第688至869位代表的HBV基因型D核心抗原的通用序列的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:118的第400至581位)；和(7)任选的6组氨酸标签。SEQ ID NO:132含有可见于表5的多个T细胞表位(人和鼠的)。编码包含SEQ ID NO:132的融合蛋白的核酸序列(针对酵母中表达进行过密码子优化)在本文中由SEQ ID NO:121代表。
为了生成第8种组合物，将酵母(例如酿酒酵母)工程化改造为在铜可诱导的启动子CUP1的控制下表达图15中示意性例示的新的HBV融合蛋白。所得酵母-HBV免疫治疗组合物在本文中可以被称为GI-13022。此融合蛋白(在本文中还称为“X-Pol-Score”并由SEQ IDNO:134代表)依次序包含X抗原、聚合酶、表面抗原和核心蛋白，是具有从N末端至C末端符合阅读框地融合的以下序列元件的单一多肽(指示为“任选的”非HBV序列不包含在SEQ IDNO:134的基础序列中，但实际上添加到本实施例中描述的融合蛋白)：(1)任选的N末端肽，其为由SEQ ID NO:37代表的设计为赋予对蛋白酶体降解抗性并稳定表达的合成的N末端肽；(2)任选的Thr-Ser的接头肽；(3)使用HBV基因型D通用序列的HBV X抗原的优化部分，其由SEQ ID NO:134的第1至60位代表(对应于SEQ ID NO:110的第630至689位)；(4)使用HBV基因型D通用序列的HBV聚合酶的逆转录酶(RT)域的优化部分，其由SEQ ID NO:134的第61至288位代表(对应于SEQ ID NO:110的第250至477位)；(5)由SEQ ID NO:134的第289至687位代表的HBV基因型D大(L)表面抗原的近乎全长(-1位)通用序列的氨基酸序列(对应于SEQID NO:118的第1至399位)；(6)由SEQ ID NO:134的第688至869位代表的HBV基因型D核心抗原的通用序列的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO:118的第400至581位)；和(7)任选的6组氨酸标签。SEQ ID NO:134含有可见于表5的多个T细胞表位(人和鼠的)。编码包含SEQ ID NO:134的融合蛋白的核酸序列(针对酵母中表达进行过密码子优化)在本文中由SEQ ID NO:133代表。
为了生成上文所述的每种基于酵母的免疫治疗组合物，在缺少尿嘧啶的固体基本平板(UDM；尿苷缺失培养基)上分离每种质粒的酵母转化物。将菌落再划线接种到UDM或ULDM上并允许在30℃生长3天。从平板接种缺少尿苷和亮氨酸(UL2)或缺少尿苷(U2)的液体起始培养基，并在30℃以250rpm生长起始培养物达18小时。使用原代培养物来接种U2或UL2的中间培养物，并持续生长直至密度达到约2YU/mL。将中间培养物用于接种最终培养物至密度为0.05YU/mL，并将这些温育直至细胞密度达到1-3YU/mL。然后用0.5mM硫酸铜诱导最终培养物3小时，在PBS中清洗细胞，在56℃达1小时将其热杀死，并在PBS中清洗3次。通过TCA沉淀/硝酸纤维素结合测定法来测量总蛋白表达，并使用抗his标签单克隆抗体通过Western印迹来测量HBV抗原表达。将来自实施例7中描述为GI-13008(SEQ ID NO:116；“Score-C”)或GI-13009(SEQ ID NO:118；“Score-D”)的两种酵母免疫治疗组合物的裂解物用作与表达基础表面核心抗原产物的酵母进行比较的基础。
图21是显示与在实施例7中描述为GI-13009(SEQ ID NO:118；“Score-D”)的酵母免疫治疗剂中构建体的表达相比，在UL2培养基中培养的酵母中所有8种构建体的表达的印迹(加载1μg蛋白)。参照图21，第1道和第2道含有分子量标志，第4-6道含有在同一印迹上处理的重组的有6组氨酸标签的NS3蛋白，从而通过从这些道产生的标准曲线内插来对抗原定量。第7-14道含有来自UL2培养基中生长的由编号指示的(例如GI-13015)每种基于酵母的免疫治疗剂的裂解物，第15道含有来自GI-13009比较的裂解物。本文中未显示来自在U2培养基中培养的酵母的另外的Western印迹以及评估凝胶上所加载的不同量蛋白质的另外的印迹，但总体而言，该结果指示所有8种抗原在至少一种生长培养基中表达为可检测水平。
对于那些相比于在GI-13008(Score-C)和GI-13009(Score-D)中的抗原表达在U2或UL2培养基中具有可检测的靶抗原表达的培养物，将全部表达结果汇总于图22为条形图。参见图22，使用如上文对每种构建体所描述的在融合蛋白中的抗原排列连同用于培养表达抗原的相应酵母的培养基的参照在每个条下面指明HBV抗原(即“Pol-Score-U2”指为聚合酶-表面-核心融合蛋白的HBV抗原，由SEQ ID NO:128代表并由GI-13019在U2培养基中表达)。结果指示，表示为“X-Score”(由GI-13020表达；SEQ ID NO:130)的抗原的表达尤其有力，为～122pmol/YU，这是Score-C(GI-13008)或Score-D(GI-13009)获得的表达水平按摩尔计的约79-80%(任一培养基)。GI-13015(Score-Pol；SEQ ID NO:120)、GI-13016(Score-X；SEQ ID NO:122)、GI-13017(Score-Pol-X；SEQ ID NO:124)和GI-13018(Score-X-Pol；SEQ ID NO:126)在U2培养基中表达的抗原表达低于本实验中的定量水平，尽管在UL2培养基中生长相同的基于酵母的免疫治疗剂时这些抗原中每一种均表达(参见图22)。一般地，含有聚合酶逆转录酶(RT)域的抗原配置比那些仅含有S-core(添加或未添加X抗原)的抗原配置积累的水平要低。将此实施例和之前的实施例作为整体来看，表面核心(“Score”或“SCORE”；所有类似的构建体)和X-表面-核心(“X-Score”或“X-SCORE”；GI-13020)的抗原配置在所有测试的基于酵母的HBV免疫治疗剂中是最高表达的抗原配置。
实施例9
以下实施例描述了证明本发明的基于酵母的HBV免疫治疗组合物在小鼠中的安全性、免疫原性和体内功效的预临床实验。
为了在预临床研究中评估基于酵母的HBV免疫治疗组合物，采用了多种体外和体内测定法，其检测通过本发明的基于酵母的HBV免疫治疗组合物对抗原特异性淋巴细胞的诱导，所述测定法包括淋巴细胞增殖、细胞介导的细胞毒性、细胞因子分泌和保护免于肿瘤攻击(例如杀死工程化改造为体内表达HBV蛋白的肿瘤)。
为了支持这些研究，初始使用在实施例1和2中描述的基于酵母的HBV免疫治疗组合物，另外的研究使用实施例7和8或本文中别处描述的基于酵母的HBV免疫治疗组合物实施。然而，可以将这些研究容易地应用于本发明的任何基于酵母的HBV免疫治疗组合物，而且本文中提供的结果可以外推至包含相同抗原基础或类似的抗原构建体的其它HBV组合物。在下文中描述了这些初始实验的结果。
作为能适用于任何基于酵母的HBV免疫治疗组合物的通用方案，用合适量的基于酵母的HBV免疫治疗组合物，例如4-5YU来注射小鼠(例如雌性BALB/c和/或C57BL/6小鼠)(在两个不同的注射部位以2-2.5YU注射皮下施用)。任选地，在酵母组合物后的次日注射抗CD40抗体。每周或每两周用1、2或3次剂量免疫小鼠，并任选地在每周一次或每两周一次方案的最后一剂的3-4周后施用最终追加剂量。在最终注射后7-9天杀死小鼠。制备从每组合并的脾细胞悬液和/或淋巴结悬液，并置于体外刺激(IVS)条件下，所述条件利用HBV肽和/或HBV抗原形式的HBV特异性的刺激物，其可以包含表达HBV抗原的酵母。用非HBV肽刺激对照培养物，所述非HBV肽可以包含卵清蛋白肽或不相关的病毒性肽(例如来自HIV的肽)。采用标准测定法来评估由施用基于酵母的HBV免疫治疗组合物所诱发的免疫应答，并且包括如由3H-胸苷掺入评估的淋巴细胞增殖、采用51Cr标记的靶细胞(或其它针对过夜CTL标记的靶物)的细胞介导的细胞毒性测定法(CTL测定法)、通过细胞因子测定法或ELISPOT对细胞因子分泌定量(例如IFN-γ、IL-12、TNF-α、IL-6和/或IL-2等)、以及保护免于肿瘤攻击(例如用重组工程化为表达HBV抗原的肿瘤细胞体内攻击)。
预期基于酵母的HBV免疫治疗组合物为免疫原性的，如通过其引发HBV抗原特异性的T细胞应答(如通过上文描述的测定法测量的)所证明的。
在初始实验中，在淋巴细胞增殖测定法(LPA)中测试实施例1和2中描述的两种基于酵母的HBV免疫治疗产品以确定用这些产品免疫是否引发抗原特异性的CD4+T细胞增殖。更具体地，各自使用在CUP1启动子的控制下表达由SEQ ID NO:34代表的融合蛋白的基于酵母的免疫治疗产品(GI-13002，也称为“SCORE”，并在上文实施例1中更具体地描述)和在CUP1启动子的控制下表达由SEQ ID NO:92代表的融合蛋白的基于酵母的免疫治疗产品(GI-13004，也称为“a-SPEX”，并在上文实施例2中更具体地描述)来免疫小鼠并使用淋巴细胞增殖测定法(LPA)评估对两种产品靶定的的表面和/或核心抗原特异性的CD4+T细胞。
将雌性BALB/c小鼠每周3次地用5YU“SCORE”或a-SPEX在小鼠上的两个不同部位皮下免疫(2.5YU/侧腹)。对照小鼠用空载体酵母(称为“YVEC”)或全无(称为“未免疫的(naive)”)接种。在第3次免疫后一周时，将小鼠人道地杀死并取出脾和主动脉周以及腹股沟的引流淋巴结(LN)，处理为单细胞悬液。合并来自两种类型的节的LN细胞并用重组核心和表面抗原的混合物(“S/核心混合物”)或II类受限模拟表位肽(GYHGSSLY，SEQ ID NO:103，表示为“II类SAg模拟表位肽”)体外刺激(IVS)，之前已报告所述模拟表位肽引发来自用SAg免疫的BALB/c小鼠的T细胞的增殖(Rajadhyaksha等(1995).PNAS92:1575-1579)。
将脾细胞通过磁性活化细胞分选(MACS)进行CD4+T细胞富集，并与对LN描述的相同抗原温育。在4天温育后，将IVS培养物用氚化的(3H)胸苷脉冲达18小时，并在玻璃纤维微型滤器上收获细胞DNA。通过闪烁计数测量掺入的3H-胸苷的水平。平行测定来自经SCORE免疫的小鼠的多份LN培养物。用ELISpot所测定的干扰素gamma(IFN-γ)生成作为评估T细胞活化的另外手段。
如图23、图24和图26中显示的，来自经SCORE或a-SPEX免疫小鼠的CD4+T细胞应答重组的S和核心抗原混合物而增殖。来自经SCORE免疫的小鼠的脾T细胞(图23)比来自经YVEC免疫(空载体对照)或未免疫小鼠的T细胞显示出高5倍的增殖水平，指示该作用是对表面-核心融合蛋白特异性的(即抗原特异性的T细胞应答)。与HBV模拟表位肽温育的来自经SCORE免疫小鼠的T细胞也增殖至比经肽脉冲的YVEC对照或未免疫对照高的水平，提供了基于酵母的免疫治疗产品应答的抗原特异性的进一步证据。这些效应还依赖于加入IVS的抗原的量，最佳活性发生在3μg/ml(重组抗原)或30μg/mL(肽)。
如图24中显示的，来自经SCORE免疫小鼠的LN细胞也应答使用这些相同抗原的IVS而增殖，尽管经SCORE免疫相对于未免疫或经YVEC免疫的动物在增殖中的差异比分离的脾CD4+T细胞小。
ELISpot数据(图25)指示来自用S+C混合物再刺激的经SCORE免疫的小鼠的LN制备物含有比来自未免疫动物的LN高超过10倍的IFN-γ分泌细胞。使用HBV肽(SEQ ID NO:103)的IVS也引发IFN-γ应答。具体地，SCORE LN制备物含有比未免疫的LN制备物高超过3.5倍的IFN-γ生成细胞(图25)。这些数据共同显示，SCORE(表达包含表面抗原和核心的融合蛋白的基于酵母的免疫治疗物)在脾和LN中均引发HBV抗原特异性的T细胞应答，并且可以通过使用纯化抗原的IVS以剂量依赖性方式将这些应答放大。
用a-SPEX进行的类似分析(图26)显示此基于酵母的HBV免疫治疗产品也引发T细胞增殖应答。在用重组抗原混合物实施的IVS中，a-SPEX相比于YVEC引发增加约30%。总体而言，用a-SPEX观察到的应答低于用SCORE观察到的那些。应答幅度的差异可能反映以下事实，即a-SPEX中的抗原表达在摩尔基础上低于SCORE的一半的抗原表达。或者，不受理论束缚地，这些结果可能指示酵母表达的抗原的配置影响表达水平、经由内体/蛋白酶体加工的效率或免疫应答的其它参数。使用100μg/mL肽的来自a-SPEX小鼠的T细胞的增殖比用YVEC接种的小鼠中的增殖高至少2倍(图26，右边3个柱)。
实施例10
以下实施例描述了使用细胞因子谱对本发明的两种基于酵母的HBV免疫治疗剂的免疫学评估。
一种表征作为用本发明的基于酵母的HBV免疫治疗剂免疫的结果而引发的细胞免疫应答的方式是去评估对来自经免疫动物的脾制备物进行离体刺激时所产生的细胞因子谱。
在这些实验中，将雌性C57Bl/6小鼠用GI-13002(“SCORE”，一种表达由SEQ ID NO:34代表的HBV表面-核心融合蛋白的基于酵母的免疫治疗剂，实施例1)和GI-13005(“M-SPEX”，一种在CUP1启动子控制下表达由SEQ ID NO:36代表的HBV表面-聚合酶-核心-X融合蛋白的基于酵母的免疫治疗剂，实施例2)、YVEC(空载体对照酵母)或全无(未免疫)如下免疫：在第0、7和28天将2YU的基于酵母的免疫治疗剂或对照酵母在动物上的2个不同部位进行皮下注射。在第1天通过腹膜内(IP)注射施用抗CD40抗体以对树突细胞(DC)提供除基于酵母的治疗剂所提供的活化水平以外的额外活化。抗CD40抗体处理是任选的，但该抗体的使用在试图通过直接五聚体染色检测这些细胞时能强化抗原特异性CD8+T细胞的水平(这类数据未显示于此实验中)。在最后一次免疫后9天，取出脾并加工成单细胞悬液。将细胞放置到体外刺激(IVS)培养物中与2种HBV肽合并物的混合物(在图27和图28中表示为“P”，在图29A和29B中表示为“HBVP”)一起，或者与用2种肽(在图27和图28中表示为“PPS”，在图29A和29B中表示为“HPPS”)脉冲的经丝裂霉素C处理的未免疫同系脾细胞一起达48小时。所述肽是H-2Kb限制性的并且具有以下序列：ILSPFLPLL(SEQ ID NO:65，参见表5)和MGLKFRQL(SEQ ID NO:104)。对这些培养物进行IL1β、IL-12和IFN-γ的重复Luminex分析。
评估这些细胞因子，因为它们与免疫应答的类型有关，而据信免疫应答的类型与针对HBV的产生性免疫应答或效力性免疫应答有关。IL-1β是由抗原呈递细胞生成的促炎性细胞因子，并且是已知由基于酵母的免疫治疗组合物免疫所诱导的细胞因子。IL-12也由抗原呈递细胞生成并且促进CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。IFN-γ由CD8+细胞毒性T淋巴细胞在产生适应性免疫应答时生成，并且还促进Th1CD4+T细胞分化。
显示于图27(IL-1β)、图28(IL-12)、图29A(IFN-γ；经SCORE免疫)和图29B(IFN-γ；经M-SPEX免疫)的这些结果显示，所有3种细胞因子均由来自经Score免疫小鼠(在图27、图28和图29A中表示为“Sc”)的脾细胞应答仅用肽合并物的直接IVS而生成，并且对经SCORE免疫的小鼠，应答大于对YVEC(在图27、图28以及图29A和29B中表示为“Y”)或未免疫(在图27、图28以及图29A和29B中指示为“N”)小鼠的应答，证明用SCORE免疫引发抗原特异性免疫应答，从而导致这3种细胞因子的生成。使用肽脉冲的同系脾细胞的IVS也引发抗原特异性应答，尽管幅度较低。来自用M-SPEX接种的小鼠的脾细胞(在图27,图28和图29B中表示为“Sp”)生成的细胞因子水平总体低于来自经SCORE接种的小鼠的那些细胞因子水平。但是，应答M-SPEX生成的IL12p70的量高于由YVE或未免疫的生成的量，指示由此基于酵母的免疫治疗组合物诱发的抗原特异性免疫应答。预期在实施例9中描述的测定法中表达更高水平的抗原并诱发CD4+增殖性应答的a-SPEX(GI-13004；实施例2)将引发更高水平的细胞因子生成。
使用用同样的两种基于酵母的免疫治疗产品之一免疫的雌性BALB/c小鼠实施另外的细胞因子测定法。在这些实验中，将雌性BALB/c小鼠用SCORE(GI-13002；在图30A-30D中表示为“Sc”)、M-SPEX(GI-13005；在图30A-30D中表示为“Sp”)、YVEC(在图30A-30D中表示为“Y”)或全无
Figure BDA0000394678840001641
在图30A-30D中表示为“N”)如下免疫：在第0、11、39、46、60和67天在2个部位施用2YU的酵母产品。如在上文实验中的，i.p.施用抗CD40抗体。在最后一次免疫后9天(第76天)，取出脾，加工成单细胞悬液并用重组HBV表面和核心蛋白的混合物进行IVS达48小时(在图30A-30D中表示为“HBV Sag+核心Ag”)。收获上清液并通过Luminex评估IL1β,IL-6,IL-13，和IL12p70的生成。IL-6是由抗原呈递细胞和T细胞生成的促炎性细胞因子，并且据信其为基于酵母的免疫治疗产品的作用机制中的重要的细胞因子。IL-13也是由T细胞生成的促炎性细胞因子，并且与IL-4和Th2CD4+免疫应答的促进紧密相关。
显示于图30A(IL-1β)、图30B(IL-6)、图30C(IL-13)和图30D(IL-12)的结果显示，来自经SCORE免疫小鼠的脾细胞应答表面和核心抗原混合物而生成IL-1β、IL-6、IL12p70和IL-13，并且应答的幅度高于来自经YVEC免疫或未免疫小鼠的脾细胞的。此抗原特异性与在BALB/c小鼠中的LPA(见实施例9)和C57Bl/6小鼠中的细胞因子释放测定法(见上文)所获得的结果一致。
来自经M-SPEX免疫小鼠的脾细胞产生针对IL-1β而不是其它细胞因子的抗原特异性信号(图30A)。如C57Bl/6中发现的，SCORE和M-SPEX之间的效力中的这一明显差异可以用后者的较低抗原含量解释。预期表达更高水平抗原的a-SPEX(表达由SEQ ID NO:92代表的融合蛋白，记载于实施例2)将诱发更高水平的抗原特异性细胞因子的生成，另外，预期由此产品或掺入了其它HBV抗原(HBV X和聚合酶抗原)的其它产品所表达的另外的抗原的IVS测定将显示额外的免疫原性。
实施例11
以下实施例描述了基于酵母的HBV的免疫治疗组合物的体内免疫原性测试。
在此实验中，将在CUP1启动子的控制下表达由SEQ ID NO:34代表的融合蛋白的基于酵母的免疫治疗产品(GI-13002，也称为“SCORE”且更具体地记载于实施例1中)用于过继性转移方法中，其中在重症联合免疫(SCID)小鼠中，在肿瘤移植之前，将SCORE免疫小鼠的T细胞转移给接受者SCID小鼠。
简言之，在第0、7和14天将雌性C57BL/6小鼠(4-6周龄)用GI-13002(SCORE)、YVEC(含有空载体的酵母)或全无(未免疫)在2个部位皮下免疫(2.5YU侧腹，2.5YU颈背)。在每次免疫后的次日，将经SCORE免疫的同窝小鼠另外腹膜内(i.p.)注射50μg抗CD40抗体。在第24天，杀死小鼠，制备总的脾细胞并计数。将200μL PBS中的2500万个脾细胞i.p.注射到未免疫的受体4-6周龄的雌性SCID小鼠中。在转移后24小时，在胸腔(ribcage)区域用300,000个表达SCORE抗原的EL4肿瘤细胞(表示为“EL-4-Score”)或表达不相关的卵清蛋白抗原的肿瘤细胞皮下(s.c.)攻击接受者。从肿瘤攻击后第10天开始，通过数字式测径器以1至2天的时间间隔监测肿瘤生长。
显示于图31的在肿瘤攻击后10天的结果显示，来自用GI-13002(SCORE)或GI-13002+抗CD40抗体免疫的小鼠的脾细胞而非来自YVEC或未免疫小鼠的脾细胞，针对表达SCORE抗原的EL4肿瘤的攻击引发明显的保护作用(图31，从左起第1和第2个条)。在图31的每个条上方指示在攻击后第10天时有肿瘤的小鼠数。来自经GI-13002免疫的小鼠的T细胞在表达不相关抗原的EL4肿瘤的生长上没有影响(未显示)。来自经YVEC免疫小鼠的脾细胞(图31，中间的条)不影响肿瘤生长，因为此组中肿瘤的大小和数目与未接受脾细胞的小鼠(图31，最右边的条)或接受来自未免疫小鼠的脾细胞的小鼠(图31，右起第二个条)的肿瘤的大小和数目相当。这些结果指示，用表达表面抗原-核心融合蛋白的基于酵母的免疫治疗组合物免疫产生了抗原特异性的免疫应答，其保护SCID小鼠免受肿瘤攻击。共施用活化树突细胞(DC)的抗CD40抗体未影响保护程度。
实施例12
以下实施例描述了使用干扰素-γ(IFN-γ)ELISpot测定法，对两种基于酵母的针对HBV的免疫治疗组合物的免疫原性测试。
本实验设计为评估实施例7中描述的两种优化过的基于酵母的免疫治疗组合物在用这些组合物免疫的小鼠中诱导HBV抗原特异性T细胞的能力。本实验还测试用从公开文献获取的计算机算法和序列设计的新的HBV肽序列能否用于再刺激通过这些免疫治疗组合物生成的T细胞应答。
在此实验中，评估在实施例7中描述为GI-13008(“Score-C”，包含SEQ ID NO:116)的基于酵母的免疫治疗组合物和在实施例7中描述为GI-13013(“Spex-D”，包含SEQ ID NO:110)的基于酵母的免疫治疗组合物的免疫原性。在此实验中使用的肽序列显示于表7。表示为ZGP-5和ZGP-7的序列来自公开文献，而剩余的肽是用BIMAS或SYFPEITHI预测性算法用计算机鉴定出来的。前缀“Db”或“Kb”分别指C57BL/6小鼠的单倍型：H-2Db和H2-Kb。
表7
Figure BDA0000394678840001661
Figure BDA0000394678840001671
在第0、7和14天将雌性C57BL/6小鼠(4-6周龄)用GI-13008(Score-C)、GI-13013(Spex-D)、YVEC(空载体酵母对照)或全无(未免疫)在2个部位皮下免疫(2.5YU侧腹，2.5YU颈背)。在第20天，杀死小鼠并制备总的脾细胞，耗尽红细胞，计数，并在含有5%胎牛血清加表7中列出的肽刺激物(对于Db和Kb肽为10μM；对于ZGP肽为30μg/mL)或重组的HBV SAg和核心抗原混合物(总共为3μg/mL)的完全RPMI中以200,000个细胞/孔温育4天。加入伴刀豆球蛋白作为阳性对照刺激物。
结果(图32)显示用GI-13008(Score-C)免疫C57BL/6小鼠引发针对HBV表面抗原(S)和核心抗原的IFNγELISpot应答，其对下列肽具有特定的特异性：Db9-84、Kb8-277和/或Kb8-347、ZGP-5和ZGP-7。这些肽引发的IFNγ应答大于那些来自仅含培养基的孔的应答，或那些含有来自经GI-13013(Spex-D)免疫的、经YVEC免疫的或未免疫小鼠的脾细胞的孔的应答。重组的S+核心抗原混合物也引发IFNγ应答，尽管该特定刺激物组中的YVEC对照细胞产生了阻碍评估S+核心抗原混合物的抗原特异性贡献的背景信号。这些数据指示表达表面-核心融合蛋白的GI-13008(Score-C)引发能用所选肽离体再刺激的HBV抗原特异性免疫应答，并且这些应答比那些由GI-13013(Spex-D)引发的应答更容易检测到。
实施例13
以下实施例描述一项实验，其中测试了针对HBV的基于酵母的免疫治疗组合物刺激外周血单核细胞(PBMC)的IFNγ生成的能力，所述外周血单核细胞来自用商品化HBV预防性疫苗接种的受试者。
在此实验中，测试称为GI-13002(“Score”，包含SEQ ID NO:34，实施例1)的基于酵母的免疫治疗产品刺激外周血单核细胞(PBMC)的IFNγ生成的能力，所述外周血单核细胞分离自用商品化HBV预防性疫苗
Figure BDA0000394678840001672
GlaxoSmithKline)接种的受试者，该疫苗是含有吸附在铝基佐剂上的重组纯化的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的预防性疫苗。
简言之，从表达HLA-A*0201等位基因的健康未接触过HBV的人受试者收集血液并分离PBMC。将PBMC冻存用于后续分析。然后用
Figure BDA0000394678840001681
接种受试者(注射1)，在注射后12天和29天收集血液，并分离和冻存PBMC。受试者第二次用
Figure BDA0000394678840001682
接种(注射2，“追加”)，并在追加后10天、21天和32天收集血液。在每个时间点分离并冻存PBMC。
在采集并冻存一系列PBMC样品后，将来自所有时间点的细胞解冻、清洗、并与空载体酵母对照(YVEC)或与GI-13002以5:1酵母:PBMC比率在37℃/5%CO2培养箱中温育3天。然后，将细胞转移至IFNγELISpot平板，温育18小时，并依照标准化规程处理以进行ELISpot。
如图33(柱指示初次免疫之前和之后或追加免疫后的时间段)中显示的，在追加后21天的时间点处，对于经GI-13002处理的PBMC，观察到高于经YVEC处理的PBMC的实质性ELISpot应答(GI-13002ELISpot减去YVECELISpot～230个点每100万PBMC)。减去YVEC的Score ELISpot水平高于对其它时间点所观察到的数目，并且比接种前样品获得的信号高2.8倍。GI-13002和YVEC的基于酵母的组合物之间唯一的实质性结构差异是在GI-13002携带的载体中存在表面-核心融合蛋白(HBV抗原)(即YVEC具有“空”载体)。因此，这些结果指示GI-13002在受试者的PBMC中引发对T细胞的抗原特异性刺激。由于
Figure BDA0000394678840001683
疫苗含有重组的表面抗原而无核心抗原，并且由于受试者是HBV病毒阴性的(未被HBV感染)，因此该结果还指示观察到的IFNγ生成来自HBsAg特异性(表面抗原特异性)而非核心抗原特异性的T细胞。
实施例14
以下实施例描述了在鼠免疫模型中对针对HBV的基于酵母的免疫治疗组合物的体内评估。
在此实验中，将称为GI-13009(“SCORE-D”，包含SEQ ID NO:118，实施例7)的基于酵母的免疫治疗产品和称为GI-13020(“X-SCORE”，包含SEQ ID NO:130，实施例8)的基于酵母的免疫治疗产品施用给C57BL/6小鼠、BALB/c小鼠和HLA-A2转基因小鼠(B6.Cg-Tg(HLA-A/H2-D)2Enge/J；The Jackson Laboratory，在University of Virginia PatentFoundation的许可下提供)。在这些实验中使用的HLA-A2转基因小鼠表达种间杂合的I类MHC基因AAD，其含有处于人HLA-A2.1启动子指导下的人HLA-A2.1基因的alpha-1和alpha-2域以及小鼠H-2Dd基因的alpha-3跨膜域和细胞质域。嵌合的HLA-A2.1/H2-DdMHC I类分子介导对小鼠T细胞的有效阳性选择以提供能够识别由HLA-A2.1I类分子呈递的肽的更完全的T细胞全集。HLA-A2.1/H2-DdI类分子的背景中由小鼠T细胞呈递并识别的肽表位与在HLA-A2.1+人中呈递的那些相同。因此，该转基因株系能够将人T细胞对HLA-A2呈现的抗原的免疫应答建模。
这些实验的目的是评估在具有各种MHC等位基因的小鼠，包括表达人MHC(HLA)分子的小鼠中用基于酵母的HBV免疫治疗剂免疫所生成的HBV抗原特异性免疫应答的广度和幅度。在免疫之后进行免疫原性测试，其通过用相关HBV抗原离体刺激脾或淋巴结细胞，接着通过IFN-γ/IL-2双色ELISpot、淋巴细胞增殖测定法(LPA)、Luminex多细胞因子分析、和/或胞内细胞因子染色(ICCS)评估T细胞应答。将ICCS用于测定CD4+和CD8+T细胞对IFN-γ和TNF-α的抗原特异性生成的贡献。
在下文描述的每项实验中，依照同一方案用基于酵母的HBV免疫治疗剂或基于酵母的对照(在下文描述)皮下接种小鼠：以每部位2.5YU酵母组合物在2个部位注射(侧腹、颈背)，每周一次达3周。对照包括YVEC(含有空载体的对照酵母，即无抗原)、OVAX2010(表达非HBV抗原卵清蛋白的对照酵母免疫治疗组合物)，以及YVEC与可溶性重组抗原(卵清蛋白或HBV抗原)和抗CD40抗体的组合。具体的实验和治疗分组显示于下表8和9中。在第3次免疫后8天(HLA-A2转基因，实验1)或14天(C57BL/6和BALB/c，实验2)使小鼠无痛死亡，切取脾和腹股沟淋巴结，并与各种抗原刺激物(HBV I类和II类MHC限制性肽、重组蛋白和表达HBV抗原的肿瘤细胞系)温育5天，如下文指示的。对于Luminex分析，收获培养上清液并评估加入抗原后48小时10种不同的细胞因子(Th1和Th2型)的生成。对于ELISpot测定法，在5天体外刺激(IVS)的最后24小时在IFN-γ抗体包被的平板上温育细胞，接着是标准化的点检测和计数。对于LPA，在5天IVS的最后18小时用3H-胸苷脉冲于细胞，然后通过闪烁计数测量掺入新合成的DNA内的同位素的量。对于ICCS，在完整的7天刺激后，进行Ficoll梯度沉淀除去死细胞，然后将每孔100万个存活细胞(96孔U形底平板)与一系列浓度(滴定)的相同抗原刺激物温育5小时，接着透化(permeablize)，并用识别胞内IFN-γ和TNF-α加细胞表面标志物CD4和CD8的偶联荧光染料的抗体染色。通过流式细胞术测定表达细胞因子的CD4+或CD8+T细胞的百分数。
表8描述了实验1的实验分组和方案。在此实验中，使用上文描述的方案对HLA-A2同窝小鼠免疫，并在第3次免疫的8天后使小鼠无痛死亡用于免疫分析。组A(“YVEC”)依照上述免疫日程接受酵母YVEC对照；组B(“SCORE-D(GI-13009-UL2)”)依照上述免疫日程接受UL2培养基中生长的GI-13009(见实施例7)；而组C(“X-SCORE(GI-13020-U2)”)依照上述免疫日程接受U2培养基中生长的GI-13020(见实施例8)。
表8
组 HLA-A2小鼠(#，治疗)
A 3，YVEC
B 3，SCORE-D/GI-13009-UL2
C 3，X-SCORE/GI-13020-U2
图34中显示来自从实验1中的小鼠收获的淋巴结细胞的IFN-γELISpot测定结果。该图显示，对来自用各种HBV肽免疫的小鼠的淋巴结细胞的再刺激的结果，如相比于培养基对照的(注意表示为“TKO20”的肽是来自在免疫治疗剂X-SCORE中含有的X抗原(X52-60)的肽，但不存在于SCORE-D中)。这些结果指示来自经SCORE-D(GI-13009)免疫和经X-SCORE(GI-13020)免疫的小鼠的淋巴结细胞拥有应答体外刺激而生成IFN-γ的T细胞，所述体外刺激使用重组HBV表面和核心抗原各3μg/ml的混合物(图34；表示为“S&C3”)。此ELISpot应答大于对用相同刺激物处理的经YVEC免疫的小鼠(酵母对照)所观察到的，指示需要基于酵母的免疫治疗组合物(SCORE-D和X-SCORE)内的HBV表面和/或核心抗原来诱导IFN-γ应答。此外，这些结果指示在IVS中使用HBV抗原再刺激导致有效的IFN-γ生成，因为仅含培养基的孔显示低得多的ELISpot应答。
图34还显示，本领域中已知对有急性HBV暴露和清除的患者重要的来自HBV核心的选定的HLA-A2限制性表位(TKP16；核心:115-124VLEYLVSFGV；SEQ ID NO:75)，在经X-SCORE免疫的小鼠中引发大于仅培养基的孔所观察到的应答。预期对ELISpot测定法的肽浓度和温育时间的进一步精化会在所观察到的对这些抗原的应答中增加幅度并减小可变性。
图35显示来自从实验1中经SCORE-D免疫小鼠收获的脾细胞的IFN-γELISpot测定法结果。SCORE-D表达的抗原内含有表示为“核心11-27”的HBV核心肽(ATVELLSFLPSDFFPSV(SEQ ID NO:72))，而SCORE-D表达的抗原内不含表示为“X92-100”的HBV X肽，因此是此实验中的对照肽。如图35中显示的，来自经SCORE-D免疫的HLA-A2转基因小鼠的脾细胞在用已知的HLA-A2限制性HBV核心表位(表示为“核心11-27”)体外刺激时生成IFN-γELISpot应答。此应答大于对用不相关肽(表示为“X92-100”)、单独的培养基体外刺激的脾细胞或来自经YVEC免疫小鼠的脾细胞的任何IVS处理孔所观察到的应答。
因此，来自实验1的初始结果显示SCORE-D和X-SCORE在用这些基于酵母的免疫治疗组合物免疫的HLA-A2转基因小鼠中均引发HBV抗原特异性的T细胞应答。
表9描述了实验2的实验分组和方案。在此实验中，使用上文所述方案免疫C57BL/6和BALB/c同窝小鼠，并在第3次免疫后2周将小鼠无痛杀死用于免疫分析。组A(“未免疫
Figure BDA0000394678840001711
”)未接受处理；组B(“YVEC”)依照上述免疫日程接受酵母YVEC对照；组C(“X-SCORE(GI-13020-U2)”)依照上述免疫日程接受U2培养基中生长的GI-13020(见实施例8)；组D(“SCORE-D(GI-13009-UL2)”)依照上述免疫日程接受UL2培养基中生长的GI-13009(见实施例7)；而组E(“OVAX2010”)依照上述免疫日程接受表达卵清蛋白的酵母对照。
表9
组 C57BL/6小鼠(#，处理) BALB/c小鼠(#，处理)
A 8，未免疫 8，未免疫
B 8，YVEC 8，YVEC
C 8，X-SCORE(GI-13020-U2) 8，X-SCORE(GI-13020-U2)
D 8，SCORE-D(GI-13009-UL2) 8，SCORE-D(GI-13009-UL2)
E 8，OVAX2010 7，OVAX2010
图36显示对于从如实验2中指示(表9)免疫的C57BL/6小鼠分离的淋巴结细胞进行ELISpot测定法的结果。这些结果证明，X-SCORE和SCORE-D在野生型C57BL/6小鼠中均引发IFN-γ应答。用纯化的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达的表面和核心抗原(表示为yS&C；用毕赤酵母表达的表面和核心抗原各3μg/mL的1:1混合物进行IVS)体外刺激来自经X-SCORE免疫的小鼠的淋巴结细胞产生有意义的IFN-γ免疫应答。当用大肠杆菌(E.coli)表达的表面和核心抗原(表示为cS&C；用大肠杆菌表达的表面和核心抗原各3μg/mL的1:1混合物进行IVS)刺激时，来自经X-SCORE和SCORE-D免疫的小鼠的相同的淋巴结细胞制备物产生比对毕赤酵母表达的重组抗原所观察到的那些应答更高的总体ELISpot应答。图36中标记为“无刺激”的柱指示其中仅提供cRPMI培养基的IVS情况(无抗原)。一般地，用X-SCORE免疫比用SCORE-D引发更大的效应，并且两种HBV的基于酵母的免疫治疗组合物均引发比对经YVEC免疫的(酵母对照)或未免疫小鼠所观察到的应答更大的应答。这些数据指示，SCORE-D和X-SCORE均在来自C57BL/6小鼠的离体淋巴结细胞制备物中产生可检测的HBV抗原特异性免疫应答。
图37显示在实验2中进行的对C57BL/6小鼠的胞内细胞因子染色(ICCS)测定法结果(表9)。这些结果显示，用X-SCORE或SCORE-D免疫C57BL/6小鼠引发对来自表面抗原的MHCI类H-2Kb限制性肽(表示为“VWL”，VWLSVIWM；SEQ ID NO:152)特异性的生成IFN-γ的CD8+T细胞。该效应依赖于在ICCS规程的5小时温育期间加入细胞的肽的浓度；肽浓度越高，HBV的基于酵母的免疫治疗剂(SCORE-D和X-SCORE)相对于不相关酵母对照(Ovax和Yvec)在生成IFN-γ的CD8+T细胞水平中的差异也越大，最大差距发生在10μg/mL肽处。
实验2的ICCS测定法还显示用X-SCORE和SCORE-D免疫C57BL/6小鼠引发对来自核心蛋白的表示为“ZGP-5”的MHC II类限制性HBV肽(VSFGVWIRTPPAYRPPNAPIL；SEQ ID NO:148)特异性的生成IFN-γ的CD4+T细胞，其中在ICCS规程的5小时温育期间加入0.5μg/mL肽(图38)。
结合上文所述的ELISpot结果，这些数据指示基于酵母的免疫治疗组合物SCORE-D和X-SCORE均引发HBV抗原特异性的CD4+ 和CD8+效应T细胞，其通过用重组HBV抗原和HBV肽离体刺激淋巴结和脾细胞来检测出来。T细胞应答发生在野生型C57BL/6小鼠(H2-Kb)和HLA-A2转基因小鼠两者中，指示这些疫苗在各种主要组织相容性类型的背景中引发免疫应答的潜力。
基于上文此实施例中对于HLA-A2小鼠和C57BL/6小鼠所描述的结果，以及实施例9、10、11和12中所描述的实验的结果，预期用SCORE-D或X-SCORE免疫BALB/c小鼠得到的结果也将显示，基于酵母的HBV免疫治疗组合物在这些小鼠中引发HBV抗原特异性的效应器CD4+和CD8+T细胞。实际上，来自BALB/c分组的初始结果对于CD8+T细胞应答是阳性的(数据未显示)。还预期淋巴细胞增殖测定法和Luminex细胞因子释放分析将显示SCORE-D和X-SCORE均诱导特异性靶向酵母免疫治疗剂中存在的HBV抗原序列的免疫应答，并且这些应答将在所有3种小鼠株系中观察到(HLA-A2转基因、C57BL/6和BALB/c)。
实施例15
以下实施例描述了一项实验，其中评估针对HBV的基于酵母的免疫治疗组合物刺激PBMC的IFNγ生成的能力，所述PBMC从具有各种HBV抗原暴露的供体分离得到。
在此实验中，测试称为GI-13009(“Score-D”，包含SEQ ID NO:118，实施例7)的基于酵母的免疫治疗产品以及称为GI-13020(“X-Score”，包含SEQ ID NO:130，实施例8)的基于酵母的免疫治疗产品刺激PBMC的IFNγ生成的能力，所述PBMC从具有各种HBV抗原暴露的供体分离得到。在此实验中，一组供体之前已用
Figure BDA0000394678840001731
(GlaxoSmithKline)或RECOMBIVAX
Figure BDA0000394678840001732
(Merck&Co.,Inc.)接种，一组供体未经历HBV抗原(“正常”)，一组供体是慢性HBV患者(慢性感染有HBV的受试者)。
Figure BDA0000394678840001733
是一种预防性重组亚基疫苗，其含有在酵母细胞中生成、纯化，然后吸附在铝基佐剂上的重组纯化的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)。RECOMBIVAX
Figure BDA0000394678840001734
是自在酵母细胞中生成的HBV表面抗原(HBsAg)衍生并纯化为含有低于1%的酵母蛋白的预防性重组亚基疫苗。所有供体均表达HLA-A*0201等位基因。
在5%CO2培养箱中，将供体PBMC在6孔平底组织培养板中(每孔107个PBMC)在含有10%胎牛血清的完全RPMI培养基中温育3小时。移出未粘附细胞并弃去，用重组的人白介素-4(IL-4)和重组的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(分别为20和50ng/mL)处理粘附细胞5天以生成不成熟的树突细胞(iDC)。然后将iDC与抗CD40抗体(1μg/ml)、YVEC(包含空载体的酵母对照)或基于酵母的产品GI-13020或GI-13009在5%CO2培养箱中于37℃温育48小时以生成成熟的DC。对于用抗CD40抗体处理的DC，另外使用标准方法用HLA-A*0201限制性HBV肽脉冲于细胞。所有DC组均用PBS清洗，然后在PBS中用细胞收集器从平板取出。细胞经过辐射(30Gy)并用于以1:10的DC:PBMC比率刺激自体同源的供体PBMC。刺激进行7天(第1轮)，其中最后4天在含有重组的人IL-2的培养基中进行。然后，将刺激过的PBMC进行Ficoll梯度离心，并将分离的存活细胞用如上述制备的经酵母脉冲或肽脉冲的DC进行第二轮IVS。接着，在20U/mL rhIL-2的存在下，将刺激过的PBMC与HBV肽或对照在用特异于IFN-γ的抗体包被的96孔板中温育，并使用标准的制造商规程进行ELISpot检测。预期用自体同源的SCORE-D或X-SCORE饲养的DC或用HBV肽脉冲的DC刺激的PBMC对外源HBV肽的应答程度将高于用YVEC饲养或未脉冲的DC刺激的PBMC，并且此效应对于HBV
Figure BDA0000394678840001741
或RECOMBIVAX
Figure BDA0000394678840001742
疫苗接受者将比未经历HBV抗原暴露的供体更突出。
实施例16
以下实施例描述了预临床实验，其使用人PBMC来显示本发明的基于酵母的HBV免疫治疗组合物在人中的免疫原性。
具体地，这些实验设计为确定在用含有HBV表面抗原和HBV核心的基于酵母的HBV免疫治疗组合物进行2轮体外刺激(IVS)后，是否能在HBV携带者的外周血单核细胞(PBMC)中检出HBV表面抗原特异性和/或HBV核心抗原特异性的CD8+T细胞。
PBMC自确认为HBV阳性(基于血清HBsAg状态)的人供体获得。从0.5mL全血分离总DNA，并针对HLA分型以鉴定出用于测试的正确的HBV五聚物(参见下表)。
表10
HLA型 五聚物肽序列 抗原
A*0201 FLLTRILTL（SEQ ID NO：42) 表面
A*0201 GLSPTVWLSV(SEQ ID NO：43) 表面
A*0201 FLPSDFFPSI(SEQ ID NO：44) 核心
A*1101 YVNVNMGLK(SEQ ID NO：48) 核心
A*2402 EYLVSFGVW(SEQ ID NO：49) 核心
从上述供体分离的PBMC制备树突细胞(DC)，其通过在GM-CSF和IL-4的存在下培养PBMC5天。其后将DC与基于酵母的HBV免疫治疗组合物(例如那些记载于实施例1-8中任一个或本文中别处的)或对照酵母(例如“YVEC”，其为用空载体转化的酿酒酵母，或不含抗原编码插入的载体)以1:1的比率(酵母:DC)温育。对照DC培养物还包括DC与HBV肽、对照肽(非HBV肽)或全无温育。
在共培养48小时后，将DC用作抗原呈递细胞(APC)来刺激自体同源T细胞(即来自供体的T细胞)。每轮刺激(称为IVS(体外刺激))由在缺乏IL-2的情况下培养3天，接着在存在重组IL-2(20U/ml)的情况下再培养4天组成。在IVS2结束时，用对照四聚体或五聚体或特异于上文鉴定的HBV肽表位的四聚体或五聚体将T细胞染色。通过流式细胞术对用四聚体或五聚体染色阳性的CD8+T细胞百分数定量。
预期用本发明的酵母-HBV免疫治疗剂刺激来自HBV阳性供体的供体T细胞相比于对照在至少一些或主要的供体中提高了四聚体/五聚体阳性CD8+T细胞的百分数，这指示来自HBV感染个体的人T细胞具有将基于酵母的免疫治疗物携带的HBV蛋白识别为免疫原的能力。
使用来自正常(未被HBV感染)个体的供体PBMC来运行类似于上文的其它实验。预期用本发明的酵母-HBV免疫治疗剂刺激来自正常的供体供体T细胞相比于对照在至少一些或主要的供体中提高了四聚体/五聚体阳性的CD8+T细胞的百分数，这指示来自未感染个体的人T细胞也具有将基于酵母的免疫治疗物携带的HBV蛋白识别为免疫原的能力。
在另外的一项实验中，将来自上述实验的3个供体的HBV特异性T细胞体外扩大，其使用与HBV的基于酵母的免疫治疗剂(例如记载于实施例1-8中任一个或本文中别处的那些)温育2轮IVS(如上文所述)的DC。第3轮IVS用在CD40L的存在下成熟的DC实施并用HBV肽脉冲。在第5天，分离CD8+T细胞并以各种效应器:靶物(ET)比率用于针对表达HBV抗原的肿瘤细胞靶物的过夜细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定法。测量用对照四聚体/五聚体相对HBV特异性四聚体/五聚体染色阳性的CD8+T细胞的百分数。
预期来自一些或所有供体的T细胞将能够生成能杀死表达HBV抗原的靶物的CD8+CTL。这些数据将证明，酵母-HBV免疫治疗组合物能生成能够杀死表达HBV抗原的肿瘤细胞的HBV特异性CTL。
实施例17
以下实施例描述了在健康志愿者中的1期临床试验。
实施一项12周的开放标签的剂量扩大的1期临床研究，其使用本文中描述为GI-13009(“SCORE-D”，包含SEQ ID NO:118，实施例7)的基于酵母的HBV免疫治疗组合物、或本文中描述为GI-13020(“X-SCORE”，包含SEQ ID NO:130，实施例8)的基于酵母的HBV免疫治疗组合物。可以在类似的1期临床试验中利用本文中描述的其它基于酵母的HBV免疫治疗组合物(例如实施例1-8中描述的那些中的任一种)。基于包括最强净免疫应答概况在内的考虑(例如对阳性结果最具预测性的对T细胞表位的应答幅度和/或在各表位范围内免疫应答的广度)，从预临床研究(例如实施例9-17中描述的那些中的任一种)选择用于1期临床试验的基于酵母的HBV免疫治疗产品。
受试者为免疫活性且健康的志愿者，之前或现在没有HBV感染的适应证或HBV感染的记录。
对满足这些标准的约48位受试者(6组，每组8位受试者)以连续剂量分组扩大方案施用基于酵母的HBV免疫治疗组合物，其利用如下两种不同的给药方案之一：
方案A：初始-追加给药(开始于第1天的4次每周剂量，接着是在第4周和第8周的2 次每月剂量)
组1A：20Y.U.(以10Y.U.剂量对2个不同部位施用)；
组2A：40Y.U.(以10Y.U.剂量对4个不同部位施用)；
组3A：80Y.U.(以20Y.U.剂量对4个不同部位施用)
每4周给药(在第1天、第4周和第8周总共施用3次剂量)
组1B:20Y.U.(以10Y.U.剂量对2个不同部位施用)；
组2B：40Y.U.(以10Y.U.剂量对4个不同部位施用)；
组3B：80Y.U.(以20Y.U.剂量对4个不同部位施用)
所有剂量均为皮下施用并且如上文指示的在身体上的2个或4个部位(每次访问)分开剂量。评估安全性和免疫原性(例如通过ELISpot和T细胞增殖测量抗原特异性T细胞应答)。具体地，对分类的应答者开发基于ELISpot的算法。还评估测量调节性T细胞(Treg)的ELISpot测定法，评估应答HBV抗原的CD4+T细胞增殖，并与抗酿酒酵母抗体(ASCA)的产生关联。
预期将较好地耐受基于酵母的HBV免疫治疗剂，并且显示如通过ELISpot测定法、淋巴细胞增殖测定法(LPA)、通过HBV抗原的离体T细胞刺激和/或ASCA中的一种或多种测量的免疫原性。
实施例18
以下实施例描述在慢性感染乙肝病毒的受试者中进行的1b/2a期临床试验。
由于HBV感染的患者作为该疾病的自然史的一部分有经历不稳定的肝炎恶化的倾向，在使用基于抗病毒疗法进行部分或完全病毒控制的一些时段之后启动基于酵母的HBV免疫治疗，主要功效目标是改进血清转化率。在该首个强化办法中，在患者实现HBV DNA阴性(通过PCR)后使用基于酵母的HBV免疫治疗以确定与持续的抗病毒疗法组合是否能改进血清转化率。
运行一项开放标签的剂量扩大的1b/2a期临床试验，其使用本文中描述为GI-13009(“SCORE-D”，包含SEQ ID NO:118，实施例7)的基于酵母的HBV免疫治疗组合物、或本文中描述为GI-13020(“X-SCORE”，包含SEQ ID NO:130，实施例8)的基于酵母的HBV免疫治疗组合物。可以在类似的1期临床试验中利用本文中描述的其它基于酵母的HBV免疫治疗组合物(例如实施例1-8中描述的那些中的任一种)。受试者是免疫活性的，并且慢性感染被抗病毒疗法(即富马酸替诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate)，或TDF
Figure BDA0000394678840001771
较好地控制的乙肝病毒(HBV)，如通过HBV DNA水平测量的。受试者对于HBV DNA是阴性的(低于PCR可检测水平或<2000IU/ml)，但为了对此研究定性，受试者必须是HBeAg阳性的并且没有硬化或代偿失调的迹象。
在本研究的第1阶段，对满足这些标准的约40位受试者(每组～5位受试者)以连续剂量分组扩大方案施用基于酵母的HBV免疫治疗组合物，其利用0.05Y.U.至80Y.U.的剂量范围(例如0.05Y.U.,10Y.U.,20Y.U.，和40-80Y.U.)。在一个方案中，将皮下施用5次每周剂量(每周给药达4周)，接着是也皮下施用的2-4个每月剂量，并在用基于酵母的HBV免疫治疗(初始-追加方案)治疗期间持续抗病毒疗法。在第2个方案中，遵循每4周给药方案，其中受试者总共接受在第1天、第4周和第8周施用的3次剂量，其使用与上文陈述的相同的扩大剂量策略。任选地，在一项研究中，单个患者分组(5-6位患者)将以与免疫疗法加持续的抗病毒疗法相同的日程接受安慰剂(PBS)的皮下注射。当ALT突高和有代偿失调迹象时，采用保守的停止原则。
在该试验的第2阶段，将受试者(n=60)随机化为每组30位以继续单独的抗病毒(TDF)或抗病毒加基于酵母的HBV免疫治疗方案(剂量1和剂量2)长达48周。
评估安全性、HBV抗原动力学、HBeAg和HBsAg血清转化、和免疫原性(例如通过ELISpot测量的抗原特异性T细胞应答)。另外，监测剂量依赖性的生化(ALT)和病毒负载。具体地，测量在第12、24、48周时3个治疗组之间在治疗期间的血清HBsAg降低，并在第48周时测量HBsAg降低/血清转化。
在48周时在接受基于酵母的免疫疗法和TDF的受试者中，如相比于仅接受TDF的受试者的，HBsAg降低率和/或血清转化率中的增加>20%被视为临床有意义的进展。预期基于酵母的HBV免疫治疗组合物为慢性感染HBV的患者提供治疗益处。预期此免疫疗法在投递的所有剂量上均为安全且耐受较好的。预期接受至少最高剂量的基于酵母的HBV免疫治疗物的患者显示治疗出现的、HBV特异性的T细胞应答，如通过ELISPOT测定的，并且预期具有之前基线HBV特异性T细胞应答的患者在治疗时显示改进的HBV特异性的T细胞应答。预期接受基于酵母的HBV免疫治疗的患者显示血清转化率中的改进，如相比于抗病毒组和/或如相比于安慰剂控制组(若采用的话)的。预期接受基于酵母的HBV免疫治疗的患者中有ALT正常化中的改进。
在备选的试验中，用如上文所述的类似剂量扩大试验(或以上述试验中鉴定的最大耐受剂量或最佳剂量)治疗满足其他标准(免疫活性、慢性HBV感染、抗病毒控制较好，没有代偿失调迹象)的HBeAg阴性患者。监测患者的安全性、免疫原性和HBsAg血清转化。
实施例19
以下实施例描述了在慢性感染乙肝病毒的受试者中进行的1b/2a期临床试验。
运行一项开放标签的剂量扩大的1b/2a期临床试验，其使用本文中描述为GI-13009(“SCORE-D”，包含SEQ ID NO:118，实施例7)的基于酵母的HBV免疫治疗组合物、或本文中描述为GI-13020(“X-SCORE”，包含SEQ ID NO:130，实施例8)的基于酵母的HBV免疫治疗组合物。可以在类似的1b/2a期临床试验中利用本文中描述的其它基于酵母的HBV免疫治疗组合物(例如实施例1-8中描述的那些中的任一种)。受试者是免疫活性的，并且慢性感染已被抗病毒疗法(例如替诺福韦
Figure BDA0000394678840001781
控制的乙肝病毒(HBV)达至少3个月。不需要受试者全部清除病毒以进入研究，即患者对于HBV DNA可以是阳性或阴性的(阴性测定为低于PCR可检测水平或<2000IU/ml)；然而，为了对此研究定性，受试者没有硬化或代偿失调的迹象。患者可以是HBeAg阳性的，尽管HBeAg阴性患者也可以纳入本研究。
对满足这些标准的30-40位受试者(每分组6-10位患者)以连续剂量分组扩大方案施用基于酵母的HBV免疫治疗组合物，其利用0.05Y.U.至40Y.U.的剂量范围(例如0.05Y.U.、0.5Y.U.、4Y.U.、40Y.U.)，或利用0.05Y.U.至80Y.U.的剂量范围(例如0.05Y.U.、10Y.U.、20Y.U.、40/80Y.U.)。在一个方案中，将皮下施用5次每周剂量(每周给药达4周)，接着是也皮下施用的2-4次每月剂量，并在用基于酵母的HBV免疫治疗(初始-追加方案)治疗期间持续抗病毒疗法。在第2个方案中，遵循每4周给药方案，其中受试者总共接受在第1天、第4周和第8周施用的3次剂量，其使用与上文陈述的相同的扩大剂量策略。在一项研究中，单个患者分组(5-6位患者)将以与免疫疗法加持续的抗病毒疗法相同的日程接受安慰剂(PBS)的皮下注射。当ALT突高和有代偿失调迹象时，采用保守的停止原则。
评估安全性、HBeAg和HBsAg血清转化、病毒对照(例如形成病毒阴性或朝向病毒阴性的趋势)和免疫原性(例如通过ELISpot测量的抗原特异性T细胞应答)。另外，监测剂量依赖性的生化(ALT)和病毒负载。
HB-SAg中>1log10降低达24周或HB-eAg中>1log10降低达12周被视为2a期的终点。对于HBV血清转化，10%的SAg血清转化达24周和15%达48周，和/或25%的eAg血清转化率达24周或50%达48周是成功标准。
预期基于酵母的HBV免疫治疗组合物为慢性感染的HBV患者提供治疗益处。预期此免疫疗法在投递的所有剂量上均为安全且耐受较好的。预期接受至少最高剂量的基于酵母的HBV免疫治疗物的患者显示治疗出现的、HBV特异性的T细胞应答，如通过ELISPOT测定的，并且预期具有之前基线HBV特异性T细胞应答的患者在治疗时显示改进的HBV特异性的T细胞应答。接受基于酵母的HBV免疫治疗的患者将显示血清转化率中的改进，如相比于给定的抗病毒和/或如相比于安慰剂控制组的可获比较数据的。接受基于酵母的HBV免疫治疗的患者将显示病毒降低中的改进(例如如通过PCR测量的病毒阴性)。预期在接受基于酵母的HBV免疫治疗的患者中的ALT正常化中的改进。
实施例20
以下实施例描述了在慢性感染乙肝病毒的受试者中进行的2期临床试验。
在慢性感染HBV的患者中进行的随机化2期临床试验治疗未接受过治疗的、HBeAg阳性的(且可能HBeAg阴性)的受试者，所述受试者ALT>2x ULN且病毒负载>100万个拷贝。所述受试者(基于1期研究信号调整为每组～60位受试者)必须具有至少6个月的之前的抗病毒治疗，并且对于至少间隔1个月的2次连续访问为病毒阴性。将受试者随机化分为2个组。组1患者接受24-48周的基于酵母的HBV免疫治疗(例如本文中描述为GI-13009(“SCORE-D”，包含SEQ ID NO:118，实施例7)的基于酵母的HBV免疫治疗组合物、或本文中描述为GI-13020(“X-SCORE”，包含SEQ ID NO:130，实施例8)的基于酵母的HBV免疫治疗组合物)。所有患者均接受免疫疗法并继续抗病毒治疗(例如替诺福韦
Figure BDA0000394678840001801
组2患者接受安慰剂(PBS对照注射)并继续抗病毒治疗。主要终点是血清转化和病毒阴性。还可以在具有类似设计的2期试验中利用本文中描述的其它基于酵母的HBV免疫治疗组合物(例如实施例1-8中描述的那些中的任一种)。
实现血清转化的患者接受6-12个月的酵母免疫疗法和抗病毒(组1)或仅抗病毒(组2)的强化治疗，接着是6个月的治疗休假。在完成6个月休假后仍处于好转的患者数代表本研究的次级终点。另外的终点包括安全性、免疫原性和ALT正常化，如在上文描述人临床试验的实施例中论述的。
预期基于酵母的HBV免疫治疗组合物为慢性感染的HBV患者提供治疗益处。预期此免疫疗法是安全且耐受较好的。预期接受基于酵母的HBV免疫治疗的患者显示治疗出现的、HBV特异性的T细胞应答，如通过ELISPOT测定的，并且预期具有之前基线HBV特异性T细胞应答的患者在治疗时显示改进的HBV特异性的T细胞应答。预期接受基于酵母的HBV免疫治疗的患者显示血清转化率中的改进，如相比于安慰剂控制组的。预期接受基于酵母的HBV免疫治疗的患者显示病毒降低中的改进(如通过PCR测量的病毒阴性)。预期在接受基于酵母的HBV免疫治疗的患者中有ALT正常化中的改进。
尽管已详细描述了本发明的各种实施方案，但显然本领域技术人员会想到对那些实施方案的修改和改变。然而，必须明确理解的是，这类修改和改变在本发明的范围内，如在下面的权利要求中列出的。
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Claims (18)

1.免疫治疗组合物，其包含：
a) 来自酵母属（Saccharomyces）的全酵母；和
b) 包含多个HBV抗原的融合蛋白，其中所述多个HBV抗原由SEQ ID NO: 130或SEQ IDNO: 150的氨基酸序列组成，
所述组合物激发HBV特异性免疫应答。
2.权利要求1的免疫治疗组合物，其中所述融合蛋白由酵母表达。
3.权利要求1的免疫治疗组合物，其中所述全酵母被杀死。
4.权利要求1的免疫治疗组合物，其中所述全酵母被热灭活。
5.权利要求1的免疫治疗组合物，其中所述酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
6.权利要求1的免疫治疗组合物，其中所述组合物配制为通过注射来对患者施用。
7.免疫治疗组合物，其包含：
a) 来自酿酒酵母的加热灭活的全酵母；和
b) 由所述酵母表达的HBV融合蛋白，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO:130组成。
8.免疫治疗组合物，其包含：
a) 来自酿酒酵母的加热灭活的全酵母；和
b) 由所述酵母表达的HBV融合蛋白，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO:150组成。
9.包含多个HBV抗原的融合蛋白，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO:130, 或SEQ ID NO:150的氨基酸序列组成。
10.编码权利要求9的融合蛋白的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子包含SEQ IDNO:129。
11.用权利要求10的重组核酸分子转染的分离的细胞。
12.权利要求11的分离的细胞，其中所述细胞是酵母细胞。
13.包含权利要求9的融合蛋白的组合物。
14.包含权利要求10的重组核酸分子的组合物。
15.包含权利要求11或权利要求12的分离的细胞的组合物。
16.权利要求1-8或13-15中任一项的组合物在制备用于治疗HBV感染的药物中的用途。
17.权利要求1-8或13-15中任一项的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于激发抗原特异性、细胞介导的抗HBV抗原的免疫应答。
18.权利要求1-8或13-15中任一项的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于给一群个体免疫以抵抗HBV。
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