UA112859C2 - Терапевтичний засіб на основі дріжджів для лікування хронічного гепатиту в - Google Patents

Терапевтичний засіб на основі дріжджів для лікування хронічного гепатиту в Download PDF

Info

Publication number
UA112859C2
UA112859C2 UAA201310911A UAA201310911A UA112859C2 UA 112859 C2 UA112859 C2 UA 112859C2 UA A201310911 A UAA201310911 A UA A201310911A UA A201310911 A UAA201310911 A UA A201310911A UA 112859 C2 UA112859 C2 UA 112859C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
provisions
antigen
nvm
amino acid
yeast
Prior art date
Application number
UAA201310911A
Other languages
English (en)
Inventor
Девід Ейпеліан
Дэвид ЭЙПЕЛИАН
Томас Х. Кінг
Томас Х. Кинг
Чжимінь Го
Чжиминь Го
Клер Коешотт
Клер Коэшотт
Original Assignee
Глоубіммьюн, Інк.
Глоубиммьюн, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46638950&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA112859(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Глоубіммьюн, Інк., Глоубиммьюн, Инк. filed Critical Глоубіммьюн, Інк.
Publication of UA112859C2 publication Critical patent/UA112859C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/11—Pteridophyta or Filicophyta (ferns)
    • A61K36/12—Filicopsida or Pteridopsida
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6006—Cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/00034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід стосується імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів, антигену вірусу гепатиту В (HBV) і злитого білка для лікування і/або профілактики інфекції HBV і її симптомів, а також застосування імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів, антигену HBV і злитого білка для профілактичного і/або терапевтичного лікування інфекції HBV і/або її симптомів.

Description

(54) ТЕРАПЕВТИЧНИЙ ЗАСІБ НА ОСНОВІ ДРІЖДЖІВ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ХРОНІЧНОГО ГЕПАТИТУ В (57) Реферат:
Винахід стосується імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів, антигену вірусу гепатиту
В (НВМ) їі злитого білка для лікування і/або профілактики інфекції НВМ і її симптомів, а також застосування імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів, антигену НВМ і злитого білка для профілактичного і/або терапевтичного лікування інфекції НВМ і/або її симптомів. 1374 1623 1838 2452 035 1524 1814 2307 2848 3215 зу ни уче ответ п ект РОЇ . о РО с -
Фік і
ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
По даній заявці заявляється пріоритет згідно з 35 О.5.С. 5 119(е) кожної з тимчасової заявки
США Мо 61/442204, поданої 12 лютого 2011 року, тимчасової заявки США Мо 61/496945, поданої 14 червня 2011 року, і тимчасової заявки США Мо 61/507361, поданої 13 липня 2011 року. Зміст кожної з тимчасової заявки США Мо 61/442204, тимчасової заявки США Мо 61/496945 і тимчасової заявки США Мо 61/507361 включений в даний опис як посилання в повному об'ємі.
ПОСИЛАННЯ НА СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Дана заявка включає список послідовностей, наданий в електронному вигляді як текстовий файл через ЕЕ5З-Мер. Текстовий файл під назвою "3923-32-РСТ 5125" має розмір в байтах 476 кБайт, і він був записаний 7 лютого 2012 року. Інформація, що міститься в текстовому файплі, включена в даний опис як посилання в повному об'ємі згідно з 37 СЕК 5 1.52(е)(5).
ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
Даний винахід стосується, головним чином, імунотерапевтичних композицій і способів профілактики і/або лікування інфекції вірусу гепатиту В (НВМ).
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОГО НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД
Вірус гепатиту В (НВУ) є представником сімейства гепаднавірусів і є етіологічним фактором гострого і хронічного гепатиту по всьому світу. Епідемії НВМ широко поширені в Азії і Африці, і інфекція НВМ є ендемічною в Китаї (УміПат»е, К. (2006), "СІоба! спаПйепдев іп Імег аівеавзе",
Нерайіоду (Вакітоге, Ма.) 44 (3): 521 526). Більше 2 мільярдів людей було інфіковано вірусом і, згідно з оцінкою, по всьому світу хронічно інфіковано НВМ 350 мільйонів людей (Нераїййів В", умопа Неайй Огдапігайоп, 2009; "РАО Абоцї Нерайіз В", апгтога зспоої ої Медісіпе. 2008-07-10).
Шляхами інфекції є інфікування через контакт з кров'ю або рідиною організму, включаючи переливання крові і в/в вживання наркотиків, передачу статевим шляхом, укуси і пошкодження і вертикальну передачу (наприклад, дітонародження).
НВМ зустрічається як один з чотирьох основних серотипів (аг, айдм/, ауг, аум), які визначаються антигенними епітопами в білках оболонки вірусів. Існує вісім різних генотипів (А-
Н), виходячи з варіювання нуклеотидної послідовності в геномі. Відмінності в генотипах впливають на тяжкість захворювання, перебіг захворювання і імовірність ускладнень, відповідь на лікування і, можливо, відповідь на вакцинацію (Кгатмів еї аї., (2005), Массіпе 23 (19): 2409 2423; Мадпіих апа Могаег, (1995), Іпеглітоіоду 38 (1-2): 24 34).
Клінічний період інкубації для НВУ, як правило, становить 2-3 місяці; приблизно дві третини індивідуумів з гострою інфекцією не мають симптомів або мають м'які субклінічні симптоми.
Інша одна третина інфікованих індивідуумів можуть мати жовтяницю, запалення печінки, блювання, болі і/або м'яку пропасницю, однак захворювання в кінцевому результаті вирішується у більшості дорослих і рідко приводить до печінкової недостатності. Дійсно, приблизно 9595 дорослих видужують повністю від інфекції НВМ і не стають хронічно інфікованими. Однак приблизно 9095 грудних дітей і 2595 5095 дітей у віці 1-5 років залишаються хронічно інфікованими НВМ (Сепієг5 їог Оібхеазе СопігоЇ апа Ргемепібп, на вересень 2010 року).
Приблизно 2595 індивідуумів, які стають хронічно інфікованими в дитячому віці і 1595 індивідуумів, які стають хронічно інфікованими старше дитячого віку, передчасно вмирають від цирозу або печінково-клітинної карциноми, і більшість хронічно інфікованих індивідуумів залишаються безсимптомними до виникнення цирозу або захворювання печінки кінцевої стадії (СОС, на вересень 2010 року). Результатом хронічної інфекції НВМ є 1 мільйон смертей на рік по всьому світу (приблизно 2000-4000 смертей на рік в США). Хронічно інфіковані індивідууми мають підвищені рівні аланінамінотрансферази (АГ Т) (маркер пошкодження печінки), запалення печінки і/або фіброз при біопсії печінки. Для пацієнтів, у яких розвивається цироз, показник виживання протягом 5 років становить приблизно 5095.
Моніторинг інфекції НВМУ і її лікування, як правило, проводять шляхом виявлення вірусних антигенів і/або антитіл проти антигенів. При інфікуванні НВМ першим антигеном, що піддається виявленню, є поверхневий антиген гепатиту В (НВзЗАОд), а потім антиген "е" гепатиту В (НВедо).
На виведення вірусу вказує поява ІдбС-антитіл в сироватці проти НВ5ЗАад і/або проти корового антигену (НВсАд), також відома як сероконверсія. Численні дослідження вказують на те, що на реплікацію вірусу, рівень віремії і прогресування в хронічний стан у інфікованих НВМ індивідуумів прямо або опосередковано впливає НВМ-специфічний клітинний імунітет, опосередковуваний СО4- хелперними (Тн) ії СО8- цитотоксичними Т лімфоцитами (СТІ).
Пацієнти, що прогресують в хронічне захворювання, мають тенденцію до відсутності, наявності більш слабких або вузько сфокусованих НВМ-специфічних Т-клітинних відповідей в порівнянні з пацієнтами, у яких гостра інфекція проходить. Див., наприклад, СпПізагі, 1997, У Сіїп Іпмев5і 99: 1472-1477; Маїпі єї аї., 1999, Савігоепієегоіїоду 117:1386-1396; Вепептапп еї а!., 2005, Маї Вем 60 Іттипої! 2005; 5:215-229; Тпітте еї а!., 2001, У Міго! 75: 3984-3987; Огбапі еї аї., 2002, У Міго! 76:
12423-12434; Мівіапа апа Спізагі, 2005, У Міо! 79: 9369-9380; Мебрвзієг єї аї., 2000, Нераюіоду 32:1117-1124; Реппа еї а!., 1996, у Сіїп Іпмеві 98: 1185-1194; бргепдегв єї а!., 2006, У Нерай! 2006; 45: 182-189.
Вакцини для профілактики НВМ комерційно доступні з ранніх 1980 років. Сучасні комерційні вакцини являють собою неінфекційні субодиничні вірусні вакцини, що містять очищений рекомбінантний поверхневий антиген вірусу гепатиту В (НВЗАО), і їх можна вводити, починаючи з народження. Вакцини є ефективними відносно зниження зустрічальності інфекції в країнах, де вакцину вводять в плановому порядку. Хоча розробляється декілька імунотерапевтичних засобів, включаючи різні білкові і епітопні вакцини проти НВМ і цитокіни, в США в цей час відсутні схвалені імунотерапевтичні засоби для лікування активної інфекції НВУ.
Поточна стандартна терапія (5ОС) інфекції НВМ включає, головним чином, противірусні лікарські засоби, такі як тенофовір (МІКЕАО-), ламівудин (ЕРІМІКУ), адефовір (НЕРЗЕКАХ), телбівудин (ТУ2ЕКАЄ) і ентекавір (ВАКАСГ ООЕ-У), а також інтерферон-а2а і пегилований інтерферон-а2а (РЕСАЗУ582). Ці лікарські засоби, і, зокрема, противірусні лікарські засоби, як правило, вводять протягом тривалих періодів часу (наприклад, кожнна добу або кожний тиждень протягом від одного до п'яти років або більше), і, хоч вони сповільнюють або зупиняють реплікацію вірусу, вони, як правило, не забезпечують повного "лікування" або усунення вірусу.
Підходи на основі інтерферону є токсичними і мають невисокі показники ремісії. Противірусна терапія інгібує реплікацію вірусів і краще переноситься, ніж інтерферон, але, як згадувалося вище, ці лікарські засоби, як правило, не забезпечують повного лікування від вірусу, і в деяких випадках тривалі показники ремісії не досягаються. Більше того, в деяких випадках відбувається розвиток стійкості до лікарського засобу. Наприклад, ламівудин є потужним пероральним противірусним засобом, який інгібує зворотну транскриптазу НВМ (Рої). Оскільки ламівудин добре переноситься і оскільки він в цей час є дженериковим лікарським засобом, ламівудин є варіантом противірусної терапії НВМ в країнах, що розвиваються. Однак 2090 щорічний рівень стійкості до вірусу внаслідок точкових мутацій в послідовності РоЇ обмежує застосовність ламівудину при НВМ. Більше того, відповідь на лікування поточними противірусними препаратами і інтерфероном має відмінну ефективність серед генотипів НВМУ (Сао, Умопіа доигпа! ої Савзігоепіегоїоду 2009;15(46):5761 9) і у деяких пацієнтів, внаслідок того, що ДНК вірусу гепатиту В може персистувати в організмі, навіть після усунення інфекції з плином часу може відбуватися реактивація вірусу.
Таким чином, хоча стандартна терапія (50) забезпечує найкраще схвалене в цей час лікування пацієнтів, які страждають на хронічний НВУ, тривалість терапії і значні несприятливі явища можуть приводити до недотримання режиму лікування, зниження дози і припинення лікування, в поєднанні з формуванням стійкості вірусу, реактивацією вірусу, і до існування пацієнтів, у яких відповідь все ще відсутня або не підтримується. Таким чином, в даній галузі залишається потреба у вдосконалених терапевтичних способах лікування інфекції НВМ.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Один з варіантів здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції для лікування і/або профілактики інфекції вірусом гепатиту В (НВУ) і/або симптому інфекції НВУ.
Імунотерапевтична композиція містить: (а) дріжджовий носій; і (Б) один або декілька антигенів
НВУ. У одному з аспектів антигени НВМ представлені як один або декілька злитих білків, хоч також можуть бути надані окремі антигени білка НВМ. Антигени НВМ складаються з: (Її) поверхневого антигену НВУ, що містить щонайменше один імуногенний домен повнорозмірного великого (1), середнього (М) і/або малого (5) поверхневого антигену НВУ; (її) антиген полімерази НВУ, що містить щонайменше один імунногенний домен повнорозмірної полімерази
НВУ або її домену (наприклад, домен зворотної транскриптази (КТ)); (ії) коровий антиген НВМ або е-антиген НВУ, що містить щонайменше один імуногенний домен повнорозмірного корового білка НВМ і/або повнорозмірного е-антигену НВУ, відповідно; і/або (ім) Х-антиген НВМ, що містить щонайменше один імуногенний домен повнорозмірного Х-антигену НВМУ. Композиція індукує НВМ-специфічну імунну відповідь проти одного або декількох антигенів НВМ в композиції мМабо проти одного або декількох антигенів вірусу гепатиту В, який інфікував або може інфікувати індивідуума.
У будь-якому з варіантів здійснення винаходу, описаних в даному описі, включаючи будь- який варіант здійснення, що стосується імунотерапевтичної композиції, антигену НВУ, злитого білка або застосування такої композиції, антигену НВМ або злитого білка, в одному з аспектів амінокислотна послідовність великого поверхневого антигену НВМ (І) може включати, але не обмежуватися ними, амінокислотну послідовність, яка відповідає 5БЕО ІЮ МО:3, 5ЕО ІЮ МО:7,
ЗЕО ІЮ МО:11, 5БЕО ІЮО МО:15, 5ЕО ІЮ МО:19, 5ЕО ІЮ МО:23, 5ЕО ІЮО МО:27 або ЗЕО ІЮ МО:31, 60 або відповідну послідовність з іншого штаму/золяту НВМУ. Амінокислотна послідовність полімерази НВМ може включати, але не обмежуватися ними, амінокислотну послідовність, яка відповідає 5ЕО ІЮ МО:2, 5ЕО ІЮО МО:б, 5Е6О ІЮ МО:10, 5ЕО ІЮ МО:14, 5ЕО ІЮ МО:18, 5ЕО ІО
МО:22, БЕО ІЮ МО:26 або 5ЕО ІЮ МО:30, домен цих послідовностей, такий як домен зворотної транскриптази (КТ), або відповідну послідовність з іншого штаму/ізоляту НВМ. Амінокислотна послідовність прекорового білка НВУ, яка включає як послідовність корового білка НВУ, так і послідовність е-антигену НВМ, може включати, але не обмежуватися ними, амінокислотну послідовність, яка відповідає 560 ІЮ МО:1, 5ЕО ІЮ МО:5, 5ЕО ІО МО:9, 5ЕО ІО МО:13, 5ЕО 1ІЮ
МО:17, 5ЕО ІЮ МО:21, 5ЕО ІО МО:25 або 5ЕО ІЮ МО:29, або відповідну послідовність з іншого штаму/ізоляту НВМ. Амінокислотна послідовність Х-антигсену НВМ може включати, але не обмежуватися ними, амінокислотну послідовність, яка відповідає 5БЕО ІЮ МО:4, 5ЕО ІЮ МО:8,
ЗЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІО МО:16, 5ЕО ІЮ МО:20, 5ЕО ІЮО МО:24, 5ЕО ІЮ МО:28 або 5ЕО ІО МО:32, або відповідну послідовність з іншого штаму/золяту НВУ.
У будь-якому з варіантів здійснення винаходу, описаних в даному описі, включаючи будь- який варіант здійснення, що стосується імунотерапевтичної композиції, антигену НВУ, злитого білка або застосування такої композиції, антигену НВМ або злитого білка, в одному з аспектів амінокислоти поверхневого антигену НВУ, прийнятні як антиген НВМ або в злитому білку, або імунотерапевтичної композиції за винаходом, можуть включати, але не обмежуватися ними,
ЗЕО ІЮО МО:3, 5ЕО ІЮ МО:7, БЕО ІЮ МО:11, положення 21-47 5ЕО ІЮО МО:11, положення 176-400
ЗЕО І МО:11, 5ЕО ІЮО МО:15, 5ЕО ІЮ МО:19, 5БО 10 МО:23, 5БО 10 МО:27, 5ЕО ІЮ МО:31, положення 9-407 5ЕО ІЮО МО:34, положення 6-257 5ЕО ІЮ МО:36, положення 6-257 5ЕО І
МО:41, положення 92-343 5ЕО ІЮ МО:92, положення 90-488 5ЕО ІЮ МО:93, 5ЕО ІЮО МО:97, положення 90-338 5ЕО ІЮ МО:101, положення 7-254 5ЕО ІЮО МО:102, положення 1-249 5ЕО ІЮ
МО:107, положення 1-249 5ЕО ІЮ МО:108, положення 1-249 5ЕО ІЮО МО:109, положення 1-249 5ЕО І МО:110, положення 1-399 5ЕО ІЮО МО:112, положення 1-399 5ЕО ІЮ МО:114, або положення 1-399 5ЕО ІЮ МО:116, положення 1-399 5ЕО ІО МО:118, положення 1-399 5ЕО І
МО:120, положення 1-399 5ЕО ІЮ МО:122, положення 1-399 5ЕО ІЮ МО:124, положення 1-399 5ЕО І МО:126, положення 231-629 5ЕО ІЮ МО:128, положення 63-461 5ЕО 10 МО:130, положення 289-687 5БО І МО:132, положення 289-687 5ЕО ІЮ МО:134 або відповідну послідовність з іншого штаму НВУ.
У будь-якому з варіантів здійснення винаходу, описаних в даному описі, включаючи будь- який варіант здійснення, що стосується імунотерапевтичної композиції, антигену НВУ, злитого білка або застосування такої композиції, антигену НВМ або злитого білка, в одному з аспектів амінокислоти антигену НВМ-полімерази, прийнятні як антиген НВМ або в злитому білку або імунотерапевтичній композиції за винаходом, можуть включати, але не обмежуватися ними, положення 383-602 5БЕО ІЮ МО:2, положення 381-600 5ЕО ІЮ МО:6, положення 381-600 5ЕО ІЮ
МО:10, положення 453-680 5ЕО ІЮ МО:10, положення 370-589 5ЕО ІЮ МО:14, положення 380- 599 5ЕО І МО:18, положення 381-600 5ЕО ІЮ МО:22, положення 380-599 5ЕО І МОС26, положення 381-600 5ЕО ІЮ МО:30, положення 260-604 5ЕО ІЮ МО:36, положення 7-351 5ЕО ІЮ
МО:38, положення 7-351 5ЕО ІЮ МО:40, 260-604 5ЕО ІО МОСХА1, положення 346-690 5ЕО І
МО:92, положення 90-434 5ЕО ІЮ МО:94, 5ЕО ІЮО МО:98, положення 339-566 5ЕО ІЮ МО:101, положення 255-482 5ЕО ІЮО МО:102, положення 250-477 5ЕО ІЮ МО:107, положення 250-477 5ЕО ІЮ МО:108, положення 250-477 5ЕО ІО МО:109, положення 250-477 5ЕО ІЮ МО:110, положення 582-809 5ЕО ІЮ МО:120, положення 582-809 5ЕО ІЮ МО:124, положення 642-869
ЗЕО ІЮ МО:126, положення 1-228 5ЕО ІЮ МО:128, положення 1-228 5ЕО ІЮ МО:132, положення 61-288 5ЕО ІО МО:134, або відповідну послідовність з іншого штаму НВУ.
У будь-якому з варіантів здійснення винаходу, описаного в даному описі, включаючи будь- який варіант здійснення, що стосується імунотерапевтичної композиції, антигену НВУ, злитого білка або застосування такої композиції, антигену НВМ або злитого білка, в одному з аспектів амінокислоти корового антигену НВМ, прийнятні як антиген НВМ або в злитому білку або імунотерапевтичній композиції за винаходом, можуть включати, але не обмежуватися ними, положення 31-212 5ЕО ІЮО МО:1, положення 31-212 5ЕО ІЮО МО:5, положення 31-212 5ЕО ІОЮ
МО:9, положення 37-188 5ЕО ІЮ МО:9, положення 31-212 5ЕО ІОЮО МО:13, положення 31-212 5ЕО
ІО МО:17, положення 31-212 5ЕО ІО МО:21, положення 14-194 5ЕО ІЮ МО:25, положення 31-212
ЗЕО ІЮ МО:29, положення 408-589 5ЕО ІЮ МО:34, положення 605-786 5ЕО ІО МО:36, положення 352-533 5БЕО ІЮ МО:38, положення 160-341 5ЕО ІЮ МО:39, положення 605-786 5ЕО І МО:41, положення 691-872 5ЗЕО ІЮ МО:92, положення 90-271 5ЕО ІЮО МО:95, 5ЕО ІЮ МО:99, положення 567-718 5ЕО ІО МО:101, положення 483-634 5ЕО ІЮ МО:102, положення 2-183 5ЕО ІЮ МО:105, положення 184-395 5ЕО ІЮО МО:105, положення 396-578 5ЕО ІЮ МО:105, положення 579-761
ЗЕО ІЮО МО:105, положення 2-183 5ЕО ІЮ МО:106, 338-520 5ЕО ІЮ МО:106, положення 478-629 60 5ЕО ІЮ МО:107, положення 478-629 5ЕО ІО МО:108, положення 478-629 5ЕО ІЮ МО:109,
положення 478-629 5ЕО ІЮО МО:110, положення 400-581 5ЕО ІЮ МО:112, положення 400-581 5ЕО ІЮ МО:114, положення 400-581 5ЕО ІО МО:116, положення 400-581 5ЕО ІЮ МО:118, положення 400-581 5ЕО ІЮО МО:120, положення 400-581 5ЕО ІЮ МО:122, положення 400-581
ЗЕО І МО 124, положення 400-581 5ЕО ІО МО:126, положення 630-811 5ЕО ІЮ МО:128, положення 462-643 5ЕО ІЮО МО:130, положення 688-869 5ЕО ІЮ МО:132, положення 688-869
ЗЕО ІЮ МО:134, або відповідну послідовність з іншого штаму НВУ.
У будь-якому з варіантів здійснення винаходу, описаних в даному описі, включаючи будь- який варіант здійснення, що стосується імунотерапевтичної композиції, антигену НВУ, злитого білка або застосування такої композиції, антигену НВМ або злитого білка, в одному з аспектів амінокислоти Х-антигену НВУ, прийнятні як антиген НВМ або в злитому білку або імунотерапевтичній композиції за винаходом, можуть включати, але не обмежуватися ними, 5ЕО ІЮ МО:4, 5ЕО ІЮ МО:8, 5ЕО ІЮ МО:12, положення 2-154 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО
ІО МО:20, 5ЕО І МО:24, 5ЕО ІЮО МО:28, 5ЕО ІЮО МО:32, положення 52-68, а потім положення 84- 126 5ЕО ІЮ МО:4, положення 52-68, а потім положення 84-126 5ЕО ІЮ МО:8, положення 52-68, а потім положення 84-126 5ЕО ІЮ МО:12, положення 52-68, а потім положення 84-126 5ЕО І
МО:16, положення 52-68, а потім положення 84-126 5ЕО ІЮО МО:20, положення 52-68, а потім положення 84-126 5ЕО ІЮО МО:24, положення 52-68, а потім положення 84-126 5ЕО ІЮ МО:28, положення 52-68, а потім положення 84-126 5ЕО ІО МО:32, положення 787-939 5ЕО І МО:З6, положення 7-159 5ЕО ІЮО МО:39, положення 873-1025 5ЕО ІЮ МО:92, положення 90-242 5ЕО І
МО:96, 5ЕО ІЮ МО:100, положення 719-778 ЗЕО ІЮ МО:101, положення 635-694 5ЕО І МО:102, положення 184-337 5ЕО ІЮ МО:106, положення 521-674 5ЕО ІЮ МО:106, положення 630-689
ЗЕО ІЮ МО:107, положення 630-689 5ЕО ІО МО:108, положення 630-689 5ЕО ІЮ МО:109, положення 630-689 5ЕО ІЮО МО:110, положення 582-641 5ЕО ІЮ МО:122, положення 810-869
ЗЕО ІЮ МО:124, положення 582-641 5ЕО ІЮО МО:126, положення 1-60 5ЕО ІЮО МО:130, положення 229-288 5ЕО І МО:132, положення 1-60 5ЕО ІЮ МО:134, або відповідну послідовність з іншого штаму НВУ.
У одному з варіантів здійснення даний винахід стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) дріжджовий носій; і (Б) злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ складаються з: (і) Х-антигену НВМ, що містить щонайменше один імуногенний домен повнорозмірного Х-антигену НВМ; (ії) поверхневого антигену НВУ, що містить щонайменше один імуногенний домен повнорозмірного великого поверхневого антигену (І) НВУ, ії; (іїї) корового антигену НВМ, що містить щонайменше один імуногенний домен повнорозмірного корового білка НВМ. У одному з аспектів цього варіанту здійснення імунотерапевтична композиція містить: (а) дріжджовий носій; і (Б) злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ складаються з: (і) Х-антигену НВУ, що має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 8095 ідентична положенням 52-126 повнорозмірного Х-антигену НВУ; (ії) поверхневого антигену
НВУ, що має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична амінокислотній послідовності повнорозмірного великого поверхневого антигену (І) НВМУ, і (ії) корового антигену
НВУ, що має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична амінокислотній послідовності повнорозмірного корового білка НВУ. Композиція індукує НВМ-специфічну імунну відповідь.
У одному з аспектів варіанту здійснення винаходу амінокислотна послідовність Х-антигену
НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 1-60 5ЕО ІЮ МО:130, положень 630-689 5ЕО ІО МО:110, положень 582-641 5ЕО ІЮ МО:122, положень 630-689 5ЕО ІЮ МО:107, положень 630-689 5ЕО ІЮ МО:108, положень 630-689 5ЕО ІЮ МО:109, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІО МО:4, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮ МО:8, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮО МО:12, положенні 52-68, а потім положень 84- 126 5ЕО ІЮО МО:16, положенні 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮО МО:20, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІО МО:24, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮ МО:28, положень 52-68, а потім положень 844-126 5ЕО ІЮ МО:32, 5ЕО ІЮ МО:100, положень 719-778
ЗЕО ІЮ МО:101, положень 635-694 5ЕО ІЮО МО:102, положень 810-869 5ЕО ІО МО:124, положень 582-641 5ЕО ІО МО:126, положень 229-288 5ЕО ІЮ МО:132, положень 1-60 5ЕО ІЮ МО:134, або відповідної послідовності з іншого штаму НВУ. У одному з аспектів амінокислотна послідовність
Х-антигену НВМ вибрана з: положень 1-60 5ЕО ІЮ МО:130, положень 630-689 5ЕО ІЮ МО 110, положень 582-641 5ЕО ІЮ МО:122, положень 630-689 5ЕО ІО МО:109, положень 630-689 5ЕО І
МО:108, положень 630-689 5ЕО ІЮ МО:107, 5ЕО ІЮ МО:100 або відповідної послідовності з іншого штаму НВУ. 60 У одному з аспектів варіанту здійснення винаходу амінокислотна послідовність поверхневого антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 63-461 5ЕО ІЮО МО:130, положень 1-399 5ЕО ІЮ МО:118, положень 1-399 5ЕО І
МО:122, положень 9-407 5ЕО ІЮО МО:34, положень 1-399 5ЕО І МО:112, положень 1-399 5ЕО 10
МО:114, положень 1-399 5ЕО 10 МО:116, 5ЕО ІЮ МО:3, 5ЕО 10 МО:7, 5ЕО 10 МО 1, 5ЕО І
МО:15, 5ЕО ІОЮО МО:19, 5ЕО ІЮ МО:23, 5ЕО ІЮ МО:27, 5ЕО ІЮ МО:31, положень 90-488 5ЕО І
МО:93, положень 1-399 БЕО ІЮ МО:120, положень 1-399 5ЕО ІЮО МО:124, положень 1-399 5ЕО 10
МО:126, положень 231-629 5ЕО ІО МО:128, положень 289-687 5ЕО ІЮ МО:132, положень 289- 687 5ЕО ІЮ МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВМ. У одному з аспектів амінокислотна послідовність поверхневого антигену НВМ вибрана з: положень 63-461 5ЕО ІЮ
МО:130, положень 1-399 5ЕО ІЮ МО:118, положень 1-399 5ЕО ІОЮО МО:122, положень 9-407 5ЕО
ІО МО:34, положень 1-399 5ЕО ІЮ МО:112, положень 1-399 5ЕО ІО МО:114, положень 1-399 5ЕО
ІО МО:116, або відповідної послідовності з іншого штаму НВУ.
У одному з аспектів варіанту здійснення винаходу амінокислотна послідовність корового антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 98595 ідентична, або щонайменше на 99965 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 462-643 5ЕО ІЮ
МО:130, положень 400-581 5ЕО ІО МО:118, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:122, положень 408- 589 5ЕО ІО МО:34, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:112, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:114, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:116, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:1, положень 31-212 5ЕО І
МО:5, положень 31-212 ЗЕО ІО МО:9, положень 31-212 5ЕО ІЮ МО:13, положень 31-212 5ЕО І
МО:17, положень 31-212 5ЕО ІЮ МО:21, положень 14-194 5ЕО ІО МО:25, положень 31-212 5ЕО
ІО МО:29, положень 605-786 5ЕО ІЮО МО:36, положень 352-533 5ЕО ІЮ МО:38, положень 160-341
ЗЕО ІЮ МО:39, положень 605-786 5ЕО ІЮ МО:41, положень 691-872 5ЕО ІЮО МО:92, положень 90- 271 5БЕО ІО МО:95, положень 2-183 5ЕБО І МО:105, положень 184-395 5ЕО ІЮ МО:105, положень 396-578 5ЕО ІЮ МО:105, положень 579-761 5ЕО ІЮ МО:105, положень 2-183 5ЕО ІЮ
МО:106, 338-520 5ЕО ІЮ МО:106, положень 400-581 5ЕО ІЮО МО:120, положень 400-581 5ЕО І
МО:124, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:126, положень 630-811 5ЕО ІЮ МО:128, положень 688- 869 5ЕО ІЮ МО:132, положень 688-869 5ЕО ІЮ МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ. У одному з аспектів амінокислотна послідовність корового антигену НВМ вибрана з: положень 462-643 5ЕО ІЮ МО:130, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:118, положень 400-581 5ЕО І
МО:122, положень 408-589 5ЕО ІОЮО МО:34, положень 400-581 5ЕО ІЮО МО:116, положень 400-581
ЗЕО ІЮ МО:112, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:114, або відповідної послідовності з іншого штаму
НВУ.
У одному з аспектів варіанту здійснення винаходу антигени НВМ розташовані в наступному порядку, від М- до С-кінця, в злитому білку: Х-антиген НВУ, поверхневий антиген НВУ, коровий антиген НВМ. У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу антигени НВМ розташовані в наступному порядку, від М- до С-кінцю, в злитому білку: поверхневий антиген
НВУ, коровий антиген НВУ, Х-антиген НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу злитий білок містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 98595 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з 5ЕО ІЮ МО:130, 5ЕО ІО
МО:122 або 5ЕО ІЮО МО:150.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) цілі інактивовані нагріванням дріжджі Засспаготусев сегемізіаеє; і (Б) злитий білок НВМ, експресований дріжджами, де злитий білок містить ЗЕО ІЮ МО:130.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) цілі інактивовані нагріванням дріжджі Засспаготусев5 сегемізіае; і (5) злитий білок НВМ, експресований дріжджами, де злитий білок містить ЗЕО ІЮ МО:150.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) цілі інактивовані нагріванням дріжджі Засспаготусев сегемізіаеє; і (Б) злитий білок НВМ, експресований дріжджами, де злитий білок містить ЗЕО ІЮ МО:122. У одному з аспектів злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними послідовностями, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця: (1) амінокислотна послідовність БЕО ІЮ МО:37; (2) лінкерний пептид з двох амінокислот треонін-серин; (3) амінокислотна послідовність хЕО ІЮ МО:122; і (4) гексагістидиновий пептид.
У іншому варіанті здійснення винаходу імунотерапевтична композиція включає: (а) 60 дріжджовий носій; і (Б) злитий білок, що містить антигени НВМ, що складаються з: (Її)
щонайменше одного імуногенного домену великого поверхневого антигену (І) НВМ і (ії) щонайменше одного імуногенного домену корового білка НВМ або е-антигену НВУ. Композиція індукує НВУ-специфічну імунну відповідь, таку як імунна відповідь проти великого поверхневого антигену НВМ (І) і/або корового білка НВУ або е-антигену НВУ.
У одному з варіантів здійснення даний винахід стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) дріжджовий носій; і (б) злитий білок, що містить антигени НВУ, що складаються з: () поверхневого антигену НВУ, що має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9590 ідентична амінокислотній послідовності повнорозмірного великого поверхневого антигену (І)
НВМУ, ї; (ії) корового антигену НВУ, що має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична амінокислотній послідовності повнорозмірного корового білка НВМ. Композиція індукує НВМ-специфічну імунну відповідь. У одному з аспектів цього варіанту здійснення антигени НВМ складаються з амінокислотної послідовності, що містить щонайменше 95905 повнорозмірного великого поверхневого антигену (ЇЇ) НВМ, злитої з амінокислотною послідовністю, що містить щонайменше 9595 повнорозмірного корового білка НВМ або е- антигену НВМ. У одному з аспектів цього варіанту здійснення антигени НВМ складаються з амінокислотної послідовності, що містить щонайменше 9595 повнорозмірного великого поверхневого антигену (Г) НВУ, злитого з М-кінцем амінокислотної послідовності, що містить щонайменше 9595 повнорозмірного корового білка НВМ. У одному з аспектів антигени НВМ складаються з: амінокислот 2-400 великого поверхневого білка (І) НВУ; і амінокислот 31-212 прекорового білка НВУ, що містить коровий білок НВУ і частина е-антигену НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу амінокислотна послідовність поверхневого антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 1-399 5БЕО ІЮ МО:118, положень 9-407 5ЕО ІО МО:34, положень 1-399 5ЕО І МО:116, положень 1-399 5ЕО ІЮ МО:112, положень 1-399 5ЕО ІО МО:114, 5ЕО ІЮО МО:3З або положень 2- 400 5ЕО ІО МО:З3, ЗЕО ІЮО МО:7 або положень 2-400 5ЕО ІЮО МО:7, 5ЕО ІЮ МО:11 або положень 2-400 5ЕО ІО МО:11, 5ЕО ІЮ МО:15 або положень 2-389 5ЕО ІЮ МО:15, 5ЕО ІЮО МО:19 або положень 2-399 5ЕО ІЮ МО:19, 5ЕО ІЮ МО:23 або положень 2-400 5ЕО ІЮ МО:23, 5ЕО ІЮ МО:27 або положень 2-399 5БЕО ІЮ МО:27, 5ЕО ІЮ МО:31 або положень 2-400 5ЕО ІЮ МО:31, положень 900-488 5ЕБЕО ІЮО МО:93, положень 1-399 5ЕО ІЮО МО:120, положень 1-399 5ЕО ІЮ МО:122, положень 1-399 5ЕО ІЮ МО:124, положень 1-399 5ЕО ІО МО:126, положень 231-629 5ЕО І
МО:128, положень 63-461 5ЕО ІО МО:130, положень 289-687 5ЕО ІЮО МО:132, положень 289-687
ЗЕО ІЮ МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВМ. У одному з аспектів амінокислотна послідовність поверхневого антигену НВМ вибрана з: положень 1-399 5ЕО ІЮ
МО:118, положень 9-407 5ЕО ІЮО МО:34, положень 1-399 5ЕО ІЮ МО:112, положень 1-399 5ЕО І
МО:114, положень 1-399 5ЕО ІЮ МО:116 або відповідної послідовності з іншого штаму НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу амінокислотна послідовність корового антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 400-581 5ЕО
ІО МО:118, положень 408-589 5ЕО ІЮ МО:34, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:116, положень 400- 581 5ЕО ІЮО МО:112, положень 400-581 5ЕО ІЮО МО:114, положень 31-212 5ЕО І МО, положень 31-212 5ЕО ІО МО:5, положень 31-212 5ЕО ІЮ МО:9, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:13, положень 31-212 5ЕО ІО МО:17, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:21, положень 14-194 5ЕО І
МО:25, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:29, положень 605-786 5ЕО ІЮО МО:36, положень 352-533
ЗЕО ІЮ МО:38, положень 160-341 5ЕО ІО МО:39, положень 605-786 5ЕО ІЮО МО:С41, положень 691-872 5ЕО ІО МО:92, положень 90-271 5ЕО ІЮО МО:95, положень 2-183 5ЕО ІЮ МО:105, положень 184-395 5ЕО ІЮ МО:105, положень 396-578 5ЕО ІО МО:105, положень 579-761 5ЕО І
МО:105, положень 2-183 5ЕО ІЮ МО:106, 338-520 5ЕО ІО МО:106, положень 400-581 5ЕО І
МО:120, положень 400-581 5ЕО ІО МО:122, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:124, положень 400- 581 5ЕО ІЮО МО:126, положень 630-811 5ЕО ІЮ МО:128, положень 462-643 5ЕО ІЮ МО 130, положень 688-869 5ЕО ІЮ МО:132, положень 688-869 5БО ІЮО МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ. У одному з аспектів амінокислотна послідовність корового антигену НВМ вибрана з: положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:118, положень 408-589 5ЕО ІЮО МО:34, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:116, положень 400-581 5ЕО ІО МО:112, положень 400-581 5ЕО І
МО:114, або відповідної послідовності з іншого штаму НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу антигени НВМ складаються з амінокислот 9-589 5ЕО ІЮ МО:34, або відповідної послідовності з іншого штаму НВУ. У одному з 60 аспектів антигени НВМ складаються з амінокислотної послідовності, яка щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: 5ЕО ІЮ МО:118, 5ЕО ІО МО:116, положень 9-589 5ЕО
ІО МО:34, 5ЕО ІЮ МО:112, 5ЕО ІО МО:114, або відповідній послідовності для іншого штаму НВУ.
У одному з аспектів антигени НВМ складаються з повнорозмірного або практично повнорозмірного великого поверхневого антигену (3 НВМ і повнорозмірного або практично повнорозмірного корового білка НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу будь-які зі злитих білків можуть включати М-кінцеву амінокислотну послідовність (приєднану до М-кінця злитого білка) зЗЕО ІЮ
МО:37. У іншому аспекті будь-який зі злитих білків може включати М-кінцеву амінокислотну послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮ МО:89 або 5ЕО ІО МО:90. У одному з аспектів злитий білок містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:151.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) цілі інактивовані нагріванням дріжджі Засспаготусев сегемізіаеє; і (Б) злитий білок НВМ, експресований дріжджами, де злитий білок містить ЗЕО ІЮ МО:118.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) цілі інактивовані нагріванням дріжджі Засспаготусев сегемізіаеє; і (Б) злитий білок НВМ, експресований дріжджами, де злитий білок містить ЗЕО ІЮ МО:151.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) цілі інактивовані нагріванням дріжджі Засспаготусев5 сегемізіае; і (5) злитий білок НВМ, експресований дріжджами, де злитий білок містить амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО:34.
У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) дріжджовий носій; і (Б) злитий білок, що містить антигени НВМУ. Антигени НВМ складаються 3з: () поверхневого антигену НВМ, що складається зі щонайменше одного імуногенного домену повнорозмірного великого (І), середнього (М) або малого (5) поверхневого антигену НВМ; (ії) антигену полімерази НВМ, що складається зі щонайменше одного імуногенного домену повнорозмірної полімерази НВУ або домену зворотної транскриптази (КТ)
НВМУ-полімерази; (ії) корового антигену НВМ, що складається зі щонайменше одного імуногенного домену повнорозмірного корового білка НВМ або повнорозмірного е-антигену НВУ; і (їм) Х-антигену НВМУ, що складається зі щонайменше одного імуногенного домену повнорозмірного Х-антигену НВМ. Композиція індукує НВМ-специфічну імунну відповідь. У одному з аспектів цього варіанту здійснення поверхневий антиген НВМ містить щонайменше один імуногенний домен розпізнаваної рецептором для гепатоцитів області Рге-51 великого поверхневого антигену (І) НВМ ії щонайменше один імуногенний домен малого поверхневого антигену (5) НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення антигени НВМ складаються зі: щонайменше 9595 повнорозмірної розпізнаваної рецептором гепатоцитів області Рге-51 великого поверхневого антигену (І) НВМ, щонайменше 9595 повнорозмірного малого поверхневого антигену (5) НВМУ, щонайменше 9595 домену зворотної транскриптази полімерази НВУ, щонайменше 9595 повнорозмірного корового білка НВУМ або е-антигену НВУ, і щонайменше 9595 повнорозмірного Х-антигену. У одному з аспектів антигени НВМ складаються з: великого поверхневого антигену (І) НВМ, що містить щонайменше 9595 з амінокислот 120-368 великого поверхневого антигену (Г) НВМ; КТ-домену полімерази НВМУ, що містить щонайменше 9595 з амінокислот 453-680 ВТ-домену полімерази НВУ; корового білка НВУ, що містить щонайменше 9595 з амінокислот 37-188 корового білка НВУ; і Х-антиген НВУ, що містить щонайменше 8095 з амінокислот 52-127 Х-антигену НВМ. У одному з аспектів антигени НВМ складаються з: амінокислот 21-47 великого поверхневого антигену (І) НВМ, що містять розпізнавану рецепторами гепатоцитів домен Рге-51; амінокислот 176-400 великого поверхневого антигену ()У НВУ, що містять малий поверхневий антиген (5) НВУ; амінокислот 247-691 полімерази НВУ, що містять домен зворотної транскриптази; амінокислот 31-212 прекорового білка НВМ, що містять коровий білок НВМ і частину е-антигену НВУ; і амінокислот 2-154 Х-антигену НВУ. У одному з аспектів антигени НВМ складаються з: амінокислотної послідовності, щонайменше на 9595 ідентичної амінокислотам 120-368 великого поверхневого антигену (І) НВУ; амінокислотної послідовності, щонайменше на 9595 ідентичної амінокислотам 453-680 ВТ-домену полімерази
НВУ; амінокислотної послідовності, щонайменше на 9595 ідентичної амінокислотам 37-188 корового білка НВМ; і амінокислотної послідовності, щонайменше на 8095 ідентичної амінокислотам 52-127 Х-антигену НВМ. У одному з аспектів антигени НВМ модифіковані так, щоб вони включали один або декілька Т-клітинних епітопів, вказаних в таблиці 5 і представлених в даному описі як ЗЕО ІЮ МО:42-88 або 5ЕО ІЮ МО:135-140. В одному з аспектів 60 великий поверхневий антиген (І) НВМ містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО:97 або послідовність, яка на 9595 ідентична 5ЕО ІЮО МО:97. У одному з аспектів КТ-домен полімерази
НВМ містить амінокислотну послідовність 5ЕО І МО:98 або послідовність, яка на 9595 ідентична ЗЕО ІЮ МО:98. У одному з аспектів НВМ коровий білок містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІО МО:99 або послідовність, яка на 9595 ідентична 5ЕО ІЮ МО:99. У одному з аспектів Х-антиген НВМ містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:100 або послідовність, яка на 9595 ідентична 5ЕО ІЮ МО:100.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу амінокислотна послідовність поверхневого антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична амінокислотній послідовності повнорозмірного великого поверхневого антигену (І) НВУ. У одному з аспектів амінокислотна послідовність поверхневого антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 1-399 5ЕО ІЮ МО:124, положень 1-399 5ЕО ІО МО:126, положень 289-687 5ЕО І
МО:132, положень 289-687 5ЕО ІЮ МО:134, 5БЕО ІЮ МО:3, 5ЕО ІЮ МО:7, 5ЕО І МО 11, 5ЕО І
МО:15, 5ЕО ІЮО МО:19, 5ЕО ІЮ МО:23, 5ЕО ІЮ МО:27, 5ЕО ІЮ МО:31, положень 9-407 5ЕО І
МО:34, положень 90-488 5ЕО ІЮО МО:93, положень 1-399 5ЕО ІЮ МО:112, положень 1-399 5ЕО І
МО:114, положень 1-399 5ЕО ІЮ МО:116, положень 1-399 5ЕО ІЮО МО:118, положень 1-399 5ЕО
ІО МО:120, положень 1-399 5ЕО ІЮ МО:122, положень 231-629 5ЕО ІЮ МО:128, положень 63-461
ЗЕО ІЮ МО:130, або відповідній послідовності з іншого штаму НВМ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення амінокислотна послідовність поверхневого антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 98595 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: зЗЕО ІЮ МО:97, положень 1- 249 5ЕО ІЮ МО:107, положень 1-249 5ЕО ІЮ МО:108, положень 1-249 5ЕО ІО МО:109, положень 1--49 5ЕО ІЮ МО:110, положень 21-47 5ЕО ІО МО:11, положень 176-400 5ЕО ІЮ МО-11, положень 6-257 5ЕО ІО МО:З36, положень 6-257 5ЕО ІЮ МОС4А1, положень 92-343 5ЕО І МО:92, положень 90-338 5ЕО ІЮ МО:101, положень 7-254 5ЕО ІЮО МО:102, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення антиген полімерази НВМ складається зі щонайменше одного імуногенного домену КТ-домену полімерази НВМ. У одному з аспектів амінокислотна послідовність антигену полімерази НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: БЕО ІЮО МО:98, положень 582-809 5ЕО ІО МО:124, положень 642-869 5ЕО І МО:126, положень 1-228 5ЗЕО ІЮО МО:132, положень 61-288 5ЕО ІЮО МО:134, положень 250-477 5ЕО І
МО:107, положень 250-477 5ЕО ІО МО:108, положень 250-477 5ЕО ІЮ МО:109, положень 250- 477 5ЕО ІЮ МО:110, положень 383-602 5ЕО ІОЮО МО:2, положень 381-600 5ЕО ІЮ МО:6, положень 381-600 5ЕО ІО МО:10, положень 453-680 5ЕО ІО МО:10, положень 370-589 5ЕО ІЮ МО:14, положень 380-599 5ЕО ІЮО МО:18, положень 381-600 5ЕО ІЮО МО:22, положень 380-599 5ЕО ІЮ
МО:26, положень 381-600 5ЕО ІЮО МО:30, положень 260-604 5ЕО ІО МО:36, положень 7-351 5ЕО
ІО МО:38, положень 7-351 5ЕО ІЮ МО:40, 260-604 5ЕО ІО МО:41, положень 346-690 5ЕО ІЮ
МО:92, положень 90-434 5ЕО ІЮО МО:94, положень 339-566 5ЕО ІЮ МО:101, положень 255-482 5ЕО ІЮ МО:102, положень 582-809 5ЕО ІЮО МО:120, положень 1-228 5ЕО ІЮ МО:128, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення амінокислотна послідовність корового антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична амінокислотній послідовності повнорозмірного корового білка НВУ. У одному з аспектів амінокислотна послідовність корового антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній 3: положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:124, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:126, положень 688-869 5ЕО ІО МО:132, положень 688-869 5ЕО ІЮ
МО:134, положень 408-589 5ЕО ІОЮО МО:34, положень 400-581 5ЕО ІЮО МО:112, положень 400-581
ЗЕО ІО МО:114, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:116, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:118, положень 31-212 5ЕО ІЮ МО:1, положень 31-212 5ЕО ІЮ МО:5, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:9, положень 31-212 5ЕО ІЮ МО:13, положень 31-212 5ЕО ІО МО:17, положень 331-212 5ЕО ІЮ МОС21, положень 14-194 5ЕО ІЮ МО:25, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:29, положень 605-786 5ЕО 10
МО:36, положень 352-533 5ЕО ІЮ МО:38, положень 160-341 5ЕО ІЮ МО:39, положень 605-786
ЗЕО ІЮ МО:41, положень 691-872 5ЕО ІЮ МО:92, положень 90-271 5ЕО ІЮО МО:95, положень 2- 183 5ЕО ІЮО МО:105, положень 184-395 5ЕБЕО ІЮО МО:105, положень 396-578 5ЕО ІЮО МО:105, 60 положень 579-761 5ЕО ІЮ МО:105, положень 2-183 5ЕО ІЮ МО:106, 338-520 5ЕО І МО:106,
положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:120, положень 400-581 5ЕО ІО МО:122, положень 630-811 5ЕО І
МО:128, положень 462-643 БЕО ІЮ МО:130, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення амінокислотна послідовність корового антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 5ЕО ІЮ МО:99, 37- 188 5ЕО ІО МО:9, положень 567-718 5ЕО ІЮО МО:101, положень 483-634 5ЕО ІЮ МО:102, положень 478-629 5ЕО ІЮ МО:107, положень 478-629 5ЕО ІО МО:108, положень 478-629 5ЕО І
МО:109, положень 478-629 5БЕО ІЮ МО:110, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення Х-антиген НВМ складається з амінокислотної послідовності, яка щонайменше на 9595 ідентична повнорозмірному Х-антигену НВУ. У одному з аспектів Х-антиген НВМ щонайменше на 9595 ідентичний, або щонайменше на 9695 ідентичний, або щонайменше на 9795 ідентичний, або щонайменше на 9895 ідентичний, або щонайменше на 9995 ідентичний, або ідентичний, амінокислотній послідовності, вибраній з: «ЕО ІЮ МО:4, ЗЕО ІЮ
МО:8, 5ЕО ІЮ МО:12, положень 2-154 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІО МО:16, 5ЕО ІЮ МО:20, 5ЕО І
МО:24, 5ЕО ІО МО:28, 5ЕО ІО МО:32, положень 787-939 5ЕО ІЮ МО:36, положень 7-159 5ЕО І
МО:39, положень 8733-1025 5ЕО ІО МО:92, положень 90-242 5ЕО ІЮ МО:96, положень 184-337
ЗЕО ІО МО:106, положень 521-674 5ЕО ІО МО:106, або відповідній послідовності з іншого штаму
НВУ.
У одному з аспектів Х-антиген НВМ складається з амінокислотної послідовності, яка щонайменше на 8095 ідентична положенням 52-126 повнорозмірного Х-антигену НВУ. У одному з аспектів амінокислотна послідовність Х-антигсену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: 5ЕО ІЮ МО:100, положень 810-869 5ЕО ІЮ МО:124, положень 582-641 5ЕО ІО
МО:126, положень 229-288 5ЕО ІЮ МО:132, положень 1-60 5ЕО ІЮ МО:134, положень 630-689
ЗЕО ІЮ МО:107, положень 630-689 5ЕО ІЮО МО:108, положень 630-689 5ЕО ІО МО:109, положень 630-689 5ЕО ІЮО МО:110, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІО МО:4, положень 52- 68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮО МО:8, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО І
МО:12, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮО МО:16, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮО МО:20, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮ МО:24, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО І МО:28, положень 52-68, а потім положень 84- 126 5ЕО ІО МО:32, положень 719-778 5ЕО ІЮО МО:101, положень 635-694 5ЕО ІЮ МО:102, положень 582-641 5ЕО ІО МО:122, положень 1-60 5ЕО ІЮО МО:130, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення антигени НВМ мають амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 98595 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 6-939 5ЕО ІО
МО:36, положень 92-1025 5ЕО ІО МО:92, положень 90-778 5ЕО ІЮ МО:101, положень 7-694 5ЕО
ІО МО:102, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення злитий білок містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 98595 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: 5ЕО ІЮ МО:107, 5ЕО ІЮ
МО:108, 5ЕО ІЮ МО:109, 5ЕО ІЮ МО:110, 5ЕО ІЮ МО:124, 5ЕО ІЮ МО:126, 5ЕО І МО:132 або
ЗЕО ІЮ МО:134.
У одному з аспектів будь-який зі злитих білків може містити М-кінцеву послідовність, вибрану з ЗЕО ІЮ МО:37, 5ЕО ІЮ МО:89 або 5ЕО ІЮО МО:90.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення злитий білок містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 98595 ідентична, або щонайменше на 99965 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: 5ЕО І МО:36, 5ЕО І
МО:92, ЗЕО ІО МО:101 або 5ЕО ІЮ МО:102.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) дріжджовий носій; і (б) злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ складаються з: () поверхневого антигену НВУ, що складається зі щонайменше одного імуногенного домену розпізнаваної рецептором гепатоцитів області Рге-51 великого поверхневого антигену (І) НВМ і щонайменше одного імуногенного домену малого поверхневого антигену (5) НВУ; (ії) антигену 60 полімерази НВМ, що складається зі щонайменше одного імуногенного домену з домену зворотної транскриптази полімерази НВМ; і (ії) корового антигену НВМ, що складається зі щонайменше одного імуногенного домену корового білка НВМУ. Композиція індукує НВМ- специфічну імунну відповідь. У одному з аспектів антигени НВМ складаються зі щонайменше 9595 повнорозмірної розпізнаваної рецепторами гепатоцитів області Рге-51 великого поверхневого антигену (3 НВМ, зі щонайменше 9595 повнорозмірного малого поверхневого антигену НВМУ, щонайменше 9595 повнорозмірного домену зворотної транскриптази полімерази
НВУ, і щонайменше 9595 повнорозмірного корового білка НВМ. У одному з аспектів антигени
НВМ складаються зі щонайменше 9595 повнорозмірного великого поверхневого антигену (І)
НВМ, щонайменше 9595 повнорозмірного домену зворотної транскриптази полімерази НВУ, і щонайменше 9595 повнорозмірного корового білка НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення амінокислотна послідовність поверхневого антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 98595 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 1-399 5ЕО ІО
МО:120, положень 231-629 5ЕО ІЮ МО:128, положень 1-399 5ЕО ІЮ МО:112, положень 1-399
ЗЕО ІЮ МО:114, положень 1-399 5ЕО ІО МО:116, положень 1-399 5ЕО ІЮО МО:118, положень 6- 257 5ЕО ІЮ МО:41, 5ЕО І МОЗ, 5ЕО І МО:7, 5ЕО ІЮО МО:11, положень 21-47 5ЕО ІЮ МО:11, положень 176-400 5ЕО ІЮ МО:11, 5ЕО 10 МО:15, 5ЕО 10 МО:19, 5ЕО ІЮ МО:23, 5ЕО ІЮ МО:27,
ЗЕО ІЮО МО:31, положень 9-407 5ЕО ІЮО МО:34, положень 6-257 5ЕО ІЮ МО:36, положень 92-343
ЗЕО І МО:92, положень 90-488 5ЕО ІЮ МО:93, 5ЕО ІЮ МО:97, положень 90-338 5ЕО ІЮ МО:101, положень 7-254 5ЕО ІЮО МО:102, положень 1-249 5ЕО ІЮ МО:107, положень 1-249 5ЕО І
МО:108, положень 1-249 5ЕО ІЮ МО:109, положень 1-249 5ЕО ІОЮО МО:110, положень 1-399 5ЕО
ІО МО:122, положень 1-399 5ЕО ІО МО:124, положень 1-399 5ЕО ІО МО:126, положень 63-461 5ЕО ІО МО:130, положень 289-687 5ЕО ІО МО:132, положень 289-687 5ЕО ІЮ МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу амінокислотна послідовність антигену полімерази НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 582-809 5ЕО
ІО МО:120, положень 1-228 5ЕО ІЮО МО:128, положень 250-477 5ЕО ІЮ МО:107, положень 250- 477 5ЕО ІЮ МО:108, положень 250-477 5ЕО ІЮ МО:109, положень 250-477 5ЕО І МО:110, 260- 604 5ЕО ІЮ МО:41, положень 383-602 5ЕО ІЮО МО:2, положень 381-600 5ЕО ІЮ МО:6, положень 381-600 5ЕО ІО МО:10, положень 453-680 5ЕО ІО МО:10, положень 370-589 5ЕО ІЮ МО:14, положень 380-599 5ЕО ІЮО МО:18, положень 381-600 5ЕО ІЮО МО:22, положень 380-599 5ЕО ІЮ
МО:26, положень 381-600 5ЕО ІЮО МО:30, положень 260-604 5ЕО ІО МО:36, положень 7-351 5ЕО
ІЮО МО:38, положень 7-351 5ЕО ІЮО МО:40, положень 346-690 5ЕО ІЮ МО:92, положень 90-434 5ЕО ІО МО:94, 5ЕО ІЮО МО:98, положень 339-566 5ЕО І МО:101, положень 255-482 5ЕО І
МО:102, положень 582-809 5ЕО ІО МО:124, положень 642-869 5ЕО ІО МО:126, положень 1-228
ЗЕО ІЮ МО:132, положень 61-288 ЗЕО ІЮО МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму
НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу амінокислотна послідовність корового антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 400-581 5ЕО
ІО МО:120, положень 630-811 БЕО ІЮ МО:128, положень 400-581 5ЕО ІО МО:112, положень 400- 581 5ЕО ІЮО МО:114, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:116, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:118, положень 605-786 5ЕО ІЮ МО:41, положень 31-212 5БЕО ІЮО МО:1, положень 31-212 5ЕО ІЮ МО:5, положень 31-212 5ЕО ІО МО:9, положень 37-188 5ЕО ІЮ МО:9, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:13, положень 31-212 5ЕО ІО МО:17, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:21, положень 14-194 5ЕО І
МО:25, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:29, положень 408-589 5ЕО ІЮО МО:34, положень 605-786 5ЕО ІЮ МО:36, положень 352-533 5ЕО І МО:38, положень 160-341 5ЕО ІО МО:39, положень 691-872 ЗЕО ІЮО МО:92, положень 90-271 5ЕО ІО МО:95, 5ЕО ІЮ МО:99, положень 567-718 5ЕО
ІО МО:101, положень 483-634 5ЕО ІЮ МО:102, положень 2-183 5БЕО ІЮ МО:105, положень 184- 395 5ЕО ІЮО МО:105, положень 396-578 5ЕО І МО:105, положень 579-761 5ЕО І МО: 105, положень 2-183 5ЕО І МО:106, 338-520 5ЕО ІО МО:106, положень 478-629 5ЕО 10 МО:107, положень 478-629 5ЕО ІЮ МО:108, положень 478-629 5ЕО ІО МО:109, положень 478-629 5ЕО І
МО:110, положень 400-581 5ЕО ІО МО:122, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:124, положень 400- 581 5ЕО ІО МО:126, положень 462-643 5БЕО І МО:130, положень 688-869 5ЕО ІЮ МО:132, положень 688-869 ЗЕО ІЮ МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВМ. 60 У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу злитий білок має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 98595 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: 5ЕО ІЮ МО:120, 5ЕО ІЮ
МО:128, положень 6-786 5ЕО ІЮО МО:41, або 5ЕО ІЮ МО:41, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) дріжджовий носій; і (б) злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ складаються з: () антигену полімерази НВУ, що складається зі щонайменше одного імуногенного домену з домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМ; і (її) корового антигену НВМ, що складається зі щонайменше одного імуногенного домену корового білка НВМ. Композиція індукує НВМ-специфічну імунну відповідь. У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу антигени НВМ складаються з: амінокислотної послідовності, яка щонайменше на 9595 ідентична повнорозмірному КТ-домену полімерази НВУ, ї амінокислотній послідовності, яка щонайменше на 9595 ідентична повнорозмірному коровому білку НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу амінокислотна послідовність антигену полімерази НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 7-351 5ЕО ІЮ
МО:38, положень 383-602 5ЕО ІО МО:2, положень 381-600 5ЕО ІЮ МО:6, положень 381-600 5ЕО
ІО МО:10, положень 453-680 5ЕО ІЮО МО:10, положень 370-589 5ЕО ІЮ МО:14, положень 380-599
ЗЕО ІЮ МО:18, положень 381-600 5ЕО ІЮО МО:22, положень 380-599 5ЕО ІЮО МО:26, положень 381-600 5ЕО ІО МО:30, положень 260-604 5ЕО ІО МО:36, положень 7-351 5ЕО ІЮ МО:40, 260- 604 5ЕО ІО МО:41, положень 346-690 5ЕО ІЮ МО:92, положень 90-434 5ЕО ІЮО МО:94, 5ЕО І
МО:98, положень 339-566 5ЕО ІЮО МО:101, положень 255-482 5ЕО ІЮО МО:102, положень 250-477
ЗЕО ІЮ МО:107, положень 250-477 5ЕО ІЮ МО:108, положень 250-477 5ЕО ІЮ МО:109, положень 250-477 ЗЕО ІЮ МО:110, положень 582-809 5ЕО ІО МО:120, положень 582-809 5ЕО ІЮ МО:124, положень 642-869 5ЕО ІЮ МО:126, положень 1-228 5ЕО ІО МО:128, положень 1-228 5ЕО І
МО:132, положень 61-288 5ЕО ІЮ МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВМ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу амінокислотна послідовність корового антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 352-533 5ЕО
ІО МО:38, положень 31-212 5БЕО ІЮ МО:1, положень 31-212 5ЕО ІО МО:5, положень 31-212 5ЕО
ІО МО:9, положень 37-188 5ЕО ІЮ МО:9, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:13, положень 31-212 5ЕО
ІО МО:17, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:21, положень 14-194 5ЕО ІЮО МО:25, положень 31-212
ЗЕО ІЮ МО:29, положень 408-589 5ЕО ІЮО МО:34, положень 605-786 5ЕО ІЮО МО:СЗ36, положень 160-341 5ЕО ІО МО:39, положень 605-786 5ЕО ІО МО:41, положень 691-872 5ЕО ІЮ МО:92, положень 90-271 5ЕО ІЮ МО:95, 5ЕО ІЮ МО:99, положень 567-718 5ЕО ІЮ МО:101, положень 483-634 5ЕО ІЮ МО:102, положень 2-183 5ЕО ІЮ МО:105, положень 184-395 5ЕО ІЮО МО:105, положень 396-578 5ЕО ІЮ МО:105, положень 579-761 5ЕО ІЮ МО:105, положень 2-183 5ЕО ІЮ
МО:106, 338-520 5ЕО ІЮ МО:106, положень 478-629 5ЕО ІЮ МО:107, положень 478-629 5ЕО І
МО:108, положень 478-629 5ЕО ІО МО:109, положень 478-629 5ЕО ІЮ МО:110, положень 400- 581 5ЕО ІЮО МО:112, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:114, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:116, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:118, положень 400-581 5ЕО ІО МО:120, положень 400-581 5ЕО І
МО:122, положень 400-581 5ЕО ІО МО:124, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:126, положень 630- 811 5ЕО ІО МО:128, положень 462-643 5БЕО І МО:130, положень 688-869 5ЕО ІЮ МО:132, положень 688-869 ЗЕО ІЮ МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВМ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу злитий білок має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 98595 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності 5ЕО І МО:38, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) дріжджовий носій; і (б) злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ складаються 3: () Х-антигену НВУ, що складається зі щонайменше одного імуногенного домену Х-антигену
НВМ; і (ії) корового антигену НВУ, що складається зі щонайменше одного імуногенного домену корового білка НВУ. Композиція індукує НВМ-специфічну імунну відповідь. У одному з аспектів цього варіанту здійснення антигени НВМ складаються з: амінокислотної послідовності, яка щонайменше на 9595 ідентична повнорозмірному Х-антигену НВМ, і амінокислотної 60 послідовності, яка щонайменше на 9595 ідентична повнорозмірному коровому білку НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу амінокислотна послідовність корового антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 160-341 5ЕО
ІО МО:39, положень 31-212 5БЕО ІЮ МО:1, положень 31-212 5ЕО ІО МО:5, положень 31-212 5ЕО
ІО МО:9, положень 37-188 5ЕО ІЮ МО:9, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:13, положень 31-212 5ЕО
ІО МО:17, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:21, положень 14-194 5ЕО ІЮО МО:25, положень 31-212
ЗЕО ІЮ МО:29, положень 408-589 5ЕО ІЮО МО:34, положень 605-786 5ЕО ІЮО МО:36, положень 352-533 5ЕО ІО МО:38, положень 605-786 5ЕО ІО МО:41, положень 691-872 5ЕО ІЮ МО:92, положень 90-271 5ЕО І МО:95, 5ЕО ІЮО МО:99, положень 567-718 5ЕО ІО МО:101, положень 483-634 5ЕО ІЮ МО:102, положень 2-183 5ЕО ІЮ МО:105, положень 184-395 5ЕО ІЮО МО:105, положень 396-578 5ЕО ІЮ МО:105, положень 579-761 5ЕО ІЮ МО:105, положень 2-183 5ЕО ІЮ
МО:106, 338-520 5ЕО ІО МО:106, положень 478-629 5ЕО ІЮ МО:107, положень 478-629 5ЕО І
МО:108, положень 478-629 5ЕО ІО МО:109, положень 478-629 5ЕО ІЮ МО:110, положень 400- 581 5ЕО ІЮО МО:112, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:114, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:116, положень 400-581 5ЕО ІЮО МО:118, положень 400-581 5ЕО ІО МО:120, положень 400-581 5ЕО І
МО:122, положень 400-581 5ЕО ІО МО:124, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:126, положень 630- 811 5ЕО ІО МО:128, положень 462-643 5БЕО І МО:130, положень 688-869 5ЕО ІЮ МО:132, положень 688-869 5ЕО ІЮ МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВМ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу амінокислотна послідовність Х- антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 7-159 5ЕО ІО
МО:39, 5ЕО І МО:4, 5ЕО ІЮ МО:8, 5ЕО ІЮ МО:12, положень 2-154 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО І
МО:16, 5ЕО ІЮ МО:20, 5ЕО ІЮО МО:24, 5ЕО ІЮО МО:28, 5ЕО ІО МО:32, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІО МО:4, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮ МО:8, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮО МО:12, положень 52-68, а потім положень 84- 126 5ЕО ІО МО:16, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮО МО:20, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІО МО:24, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮ МО:28, положень 52-68, а потім положень 844-126 5ЕО ІЮ МО:32, положень 787-939 5ЕО І МО:З6, положень 873-1025 5ЕО ІЮ МО:92, положень 90-242 5БЕО ІЮ МО:96, 5ЕО ІЮО МО:100, положень 719-778 5ЕО ІО МО:101, положень 635-694 5ЕО ІЮ МО:102, положень 184-337 5ЕО ІЮ МО:106, положень 521-674 5ЕО ІЮ МО:106, положень 630-689 5ЕО ІО МО:107, положень 630-689 5ЕО І
МО:108, положень 630-689 5ЕО ІО МО:109, положень 630-689 5ЕО ІЮ МО:110, положень 582- 641 5ЕО ІЮ МО:122, положень 810-869 5ЕО ІО МО:124, положень 582-641 5ЕО І МО-:126, положень 1-60 5ЕО ІО МО:130, положень 229-288 5ЕО ІО МО:132, положень 1-60 5ЕО І
МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУМ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу злитий білок має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності 5ЕО І МО:39, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) дріжджовий носій; і (Б) злитий білок, що містить поверхневий антиген НВУ, що складається зі щонайменше одного імуногенного домену великого поверхневого антигену (Ї) НВМ, де композиція індукує НВМ-специфічну імунну відповідь. У одному з аспектів цього варіанту здійснення поверхневий антиген НВМ складається зі щонайменше 9595 повнорозмірного великого поверхневого антигену () НВМ. У одному з аспектів амінокислотна послідовність поверхневого антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 90-488 5ЕО ІЮ МО:93, 5ЕО ІЮ МО:3, 5ЕО ІЮ МО:7, 5ЕО ІЮО МО:11, положень 21-47
ЗЕО ІЮ МО:11, положень 176-400 5ЕО ІЮ МО:11, 5ЕО ІЮ МО:15, 5ЕО І МО:19, 5ЕО ІЮО МО:23, 5ЕО ІЮО МО:27, 5ЕО ІЮО МО:31, положень 9-407 5ЕО ІО МО:34, положень 6-257 5ЕО ІЮ МО:36, положень 6-257 5БЕО ІЮ МО:41, положень 92-343 5БЕО ІО МО:92, положень 90-488 5ЕО ІО МО:93,
ЗЕО ІО МО:97, положень 90-338 5ЕО ІО МО:101, положень 7-254 5ЕО ІЮ МО:102, положень 1- 249 5ЕО ІЮ МО:107, положень 1-249 5ЕО ІЮ МО:108, положень 1-249 5ЕО ІО МО:109, положень 1-249 5ЕО ІЮ МО:110, положень 1-399 5ЕО ІЮО МО:112, положень 1-399 5ЕО І МО:114, положень 1-399 5ЕО ІО МО:116, положень 1-399 5ЕО ІЮ МО:118, положень 1-399 5ЕО І 60 МО:120, положень 1-399 5ЕО ІЮ МО:122, положень 1-399 5ЕО ІОЮО МО:124, положень 1-399 5ЕО
ІО МО:126, положень 231-629 5ЕО ІЮ МО:128, положень 63-461 5ЕО ІЮ МО:130, положень 289- 687 5ЕО І МО:132, положень 289-687 5ЕО ІЮ МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВМ. У одному з аспектів злитий білок має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності «ЖЕО ІЮ МО:93, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) дріжджовий носій; і (Б) злитий білок, який містить антиген полімерази НВУ, що складається зі щонайменше одного імуногенного домену з домену зворотної транскриптази полімерази НВМУ, де композиція індукує НВМ-специфічну імунну відповідь. У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу антиген полімерази НВМ складається щонайменше з 9595 повнорозмірного домену зворотної транскриптази полімерази НВМУ. У одному з аспектів амінокислотна послідовність антигену полімерази НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 7-351 5ЕО ІЮ МО:40, положень 90-434 5ЕО ІО МО:94, положень 383-602 5ЕО ІЮ МО:2, положень 381-600 5ЕО І МО:6, положень 381-600 5ЕО ІО МО:10, положень 453-680 5ЕО І
МО:10, положень 370-589 5ЕО ІЮ МО:14, положень 380-599 5ЕО ІЮ МО:18, положень 381-600
ЗЕО ІЮ МО:22, положень 380-599 5ЕО ІЮ МО:26, положень 381-600 5ЕО ІЮО МО:30, положень 260-604 5ЕО ІО МО:36, положень 7-351 5ЕО ІЮ МО:38, 260-604 5ЕО ІЮ МО:41, положень 346- 690 5ЕО ІО МО:92, 5ЕО ІОЮО МО:98, положень 339-566 5ЕО ІЮ МО:101, положень 255-482 5ЕО І
МО:102, положень 250-477 5ЕО ІО МО:107, положень 250-477 5ЕО ІЮ МО:108, положень 250- 477 5ЕО ІЮ МО:109, положень 250-477 5ЕБЕО ІО МО:110, положень 582-809 5ЕО ІЮ МО:120, положень 582-809 5ЕО ІЮО МО:124, положень 642-869 5ЕО ІЮ МО:126, положень 1-228 5ЕО І
МО:128, положень 1-228 5ЕО ІЮ МО:132, положень 61-288 5ЕО ІЮ МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВМ. У одному з аспектів злитий білок має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 98595 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:40 або 5ЕО ІЮО МО:94, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) дріжджовий носій; і (б) злитий білок, який містить коровий антиген НВУ, що складається зі щонайменше одного імуногенного домену корового білка НВМ, де композиція індукує НВМ- специфічну імунну відповідь. У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу антигени
НВМ складаються зі щонайменше 9595 повнорозмірного корового білка НВМ. У одному з аспектів амінокислотна послідовність корового антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 90-271 5ЕО ІЮ МО:95, положень 31-212 5ЕО ІЮ МО, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:5, положень 31-212 5ЕО ІО МО:9, положень 37-188 5ЕО ІЮ МО:9, положень 31-212 5ЕО ІО МО:13, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:17, положень 331-212 5ЕО І
МО:21, положень 14-194 5ЕО ІЮО МО:25, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:29, положень 408-589 5ЕО
ІО МО:34, положень 605-786 5ЕО ІЮ МО:36, положень 352-533 5ЕО ІЮ МО:38, положень 160-341 5ЕО ІЮ МО:39, положень 605-786 5ЕО ІО МО:41, положень 691-872 5ЕО 10 МО:92, 5ЕО І
МО:99, положень 567-718 5ЕО ІЮ МО:101, положень 483-634 5ЕО ІЮ МО:102, положень 2-183
ЗЕО ІЮ МО:105, положень 184-395 БЕО ІЮО МО:105, положень 396-578 5ЕО ІЮО МО:105, положень 579-761 5ЕО ІЮО МО:105, положень 2-183 5ЕО ІЮ МО:106, 338-520 5ЕО ІЮ МО:106, положень 478-629 5ЕО ІЮО МО:107, положень 478-629 5ЕО ІО МО:108, положень 478-629 5ЕО ІЮ МО:109, положень 478-629 5ЕО ІЮ МО:110, положень 400-581 5ЕО ІО МО:112, положень 400-581 5ЕО І
МО:114, положень 400-581 5ЕО ІО МО:116, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:118, положень 400- 581 5ЕО ІЮО МО:120, положень 400-581 5ЕО ІЮО МО:122, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:124, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:126, положень 630-811 5ЕО ІО МО:128, положень 462-643 5ЕО І
МО:130, положень 688-869 5ЕО ІЮ МО:132, положень 688-869 5ЕО ІЮ МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ. У одному з аспектів білок має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності «ЖЕО ІЮ МО:95, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ. 60 Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить:
(а) дріжджовий носій; і (б) злитий білок, який містить Х-антиген НВМ, що складається зі щонайменше одного імуногенного домену повнорозмірного Х-антигену НВМ, де композиція індукує НВМ-специфічну імунну відповідь. У одному з аспектів антиген НВМ складається зі щонайменше 9595 повнорозмірного Х-антигену НВМ. У одному з аспектів амінокислотна послідовність Х-антисену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 90-242 5ЕО ІЮ МО:96, 5ЕО ІЮ МО:4, 5ЕО ІЮ МО:8, 5ЕО ІЮ МО:12, положень 2-154
ЗЕО І МО:12, 5ЕО ІЮ МО:16, 5БО ІЮ МО:20, 5БО 10 МО:24, 5ЕО ІЮ МО:28, 5БЕО ІЮ МО:32, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮ МО:4, положень 52-68, а потім положень 84- 126 5ЕО ІО МО:8, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІО МО:12, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІО МО:16, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮ МО:20, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮО МО:24, положень 52-68, а потім положень 84- 126 5ЕО ІО МО:28, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІО МО:32, положень 787-939 5ЕО ІО МО:36, положень 7-159 5ЕО ІО МО:39, положень 873-1025 5ЕО ІЮ МО:92, 5ЕО І
МО:100, положень 719-778 5ЕО ІО МО:101, положень 635-694 5ЕО ІЮ МО:102, положень 184- 337 5ЕБЕО ІЮ МО:106, положень 521-674 5ЕО ІЮ МО:106, положень 630-689 5ЕО ІЮ МО:107, положень 630-689 5ЕО ІЮ МО:108, положень 630-689 5ЕО ІО МО:109, положень 630-689 5ЕО І
МО:110, положень 582-641 5ЕО ІО МО:122, положень 810-869 5ЕО ІЮ МО:124, положень 582- 641 5Б6О ІО МО:126, положень 1-60 5ЕБО ІО МО:130, положень 229-288 5ЕБО 10 МО: 132, положень 1-60 5ЕО ІЮО МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУМ. У одному з аспектів білок має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності
ЗЕО ІЮ МО:96, або відповідній послідовності з іншого штаму НВМ.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, що містить дві, три або чотири імунотерапевтичні композиції, описані вище або в інших розділах даного опису, і, зокрема, будь-які дві, три або чотири з імунотерапевтичних композицій, описаних вище, які стосуються одиничних білок НВУ.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) дріжджовий носій; і (5) злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ складаються зі щонайменше одного імуногенного домену з двох, трьох або чотирьох білків поверхневого антигену НВУ, де кожний білок поверхневого антигену НВМ походить з відмінного генотипу НВМ.
Композиція індукує НВМ-специфічну імунну відповідь.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) дріжджовий носій; і (б) злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ складаються зі щонайменше одного імуногенного домену з двох, трьох або чотирьох білків полімерази НВУ, де кожний з білків полімерази НВМ походить з відмінного генотипу НВМ. Композиція індукує
НВУ-специфічну імунну відповідь.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) дріжджовий носій; і (б) злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ складаються зі щонайменше одного імуногенного домену з двох, трьох або чотирьох Х-антигенів НВУ, де кожний з Х-антигенів НВМ походить з відмінного генотипу НВМ. Композиція індукує НВМУ- специфічну імунну відповідь.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) дріжджовий носій; і (б) злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ складаються зі щонайменше одного імуногенного домену з двох, трьох або чотирьох корових білків НВУ, де кожний з корових білків НВМ походить з відмінного генотипу НВМ. Композиція індукує НВМ- специфічну імунну відповідь. У одному з аспектів кожний з корових білків НВМ складається щонайменше з 9595 повнорозмірного корового білка НВУ. У одному з аспектів кожний з корових білків НВМ складається з амінокислот 31-212 корового білка НВУ. У одному з аспектів генотипи
НВМ включають генотип С, і в одному з аспектів генотипи НВМ включають генотип 0, і в одному з аспектів генотипи НВМ включають генотип А, і в одному з аспектів генотипи НВМ включають генотип В. В одному з аспектів кожний з корових білків НВМ складається з амінокислот 37-188 корового білка НВМ. У одному з аспектів злитий білок містить чотири корових білки НВМ з генотипу А, генотипу В, генотипу С і генотипу 0.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу амінокислотна послідовність будь- якого одного або декількох корових антигенів НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 60 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності,
вибраній з: положень 90-271 5ЕО ІЮ МО:95, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:1, положень 31-212
ЗЕО ІЮ МО:5, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:9, положень 37-188 5ЕО ІОЮО МО:9, положень 31-212
ЗЕО ІЮ МО:13, положень 31-212 5ЕО ІО МО:17, положень 31-212 5ЕО ІЮ МО:21, положень 14- 194 5ЕО ІЮ МО:25, положень 31-212 5БЕО ІЮ МО:29, положень 408-589 5ЕО ІЮ МО:34, положень 605-786 5ЕО І МО:36, положень 352-533 5ЕО ІО МО:38, положень 160-341 5ЕО ІО МО:39, положень 605-786 5ЕО ІЮО МО:41, положень 691-872 ЗЕО ІЮО МО:92, 5ЕО ІЮО МО:99, положень 567-718 5ЕО ІЮ МО:101, положень 483-634 5ЕО ІЮ МО:102, положень 2-183 5ЕО ІЮ МО: 105, положень 184-395 5ЕО ІЮ МО:105, положень 396-578 5ЕО ІО МО:105, положень 579-761 5ЕО І
МО:105, положень 2-183 5ЕО ІЮО МО:106, 338-520 5ЕО ІЮО МО:106, положень 478-629 5ЕО І
МО:107, положень 478-629 5ЕО ІО МО:108, положень 478-629 5ЕО ІЮ МО:109, положень 478- 629 5ЕО ІЮ МО:110, положень 400-581 5ЕО ІО МО:112, положень 400-581 5ЕО ІЮО МО:114, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:116, положень 400-581 5ЕО ІО МО:118, положень 400-581 5ЕО І
МО:120, положень 400-581 5ЕО ІО МО:122, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:124, положень 400- 581 5ЕО ІО МО:126, положень 630-811 5ЕО ІЮО МО:128, положень 462-643 5ЕО ІЮ МО:130, положень 688-869 5ЕО ІЮ МО:132, положень 688-869 5БО ІЮО МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВМ. У одному з аспектів антигени НВМ мають амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 98595 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО:105, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ.
Інший варіант здійснення винаходу стосується імунотерапевтичної композиції, яка містить: (а) дріжджовий носій; і (Б) злитий білок, що містить щонайменше два корові білки НВМ і щонайменше два Х-антигени НВМ, де кожний з корових білків НВМ походить з відмінного генотипу НВМ ї де кожний з Х-антигенів НВМ походить з відмінного генотипу НВМ. Композиція індукує НВМ-специфічну імунну відповідь. У одному з аспектів генотипи НВМ включають генотип
С; в одному з аспектів генотипи НВМ включають генотип 0; в одному з аспектів генотипи НВМ включають генотип А; і в одному з аспектів генотипи НВМ включають генотип В. В одному з аспектів кожний з корових білків НВМ складається зі щонайменше 9595 повнорозмірного корового білка НВУ. У одному з аспектів кожний з корових білків НВМ містить амінокислоти 31- 212 корового білка НВУ. У одному з аспектів кожний з корових білків НВМ містить амінокислоти 37-188 корового білка НВУ. У одному з аспектів кожний з Х-антигенів НВМ містить щонайменше 9595 повнорозмірного Х-антигену НВМ. У одному з аспектів кожний з Х-антигенів НВМ містить амінокислоти 52-127 Х-антигену НВУ.
У одному з аспектів амінокислотна послідовність корового антигену НВМ щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 90-271 5ЕО ІЮ МО:95, положень 31-212
ЗЕО ІЮ МО:1, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:5, положень 31-212 5ЕО ІО МО:9, положень 37-188
ЗЕО ІЮ МО:9, положень 31-212 5ЕО ІЮ МО:13, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:17, положень 31-212
ЗЕО ІЮО МО:21, положень 14-194 5ЕО ІЮ МО:25, положень 31-212 5ЕО ІЮО МО:29, положень 408- 589 5ЕО ІЮО МО:34, положень 605-786 5ЕО ІЮ МО:36, положень 352-533 5ЕО 10 МО:38, положень 160-341 5ЕО ІЮО МО:39, положень 605-786 5ЕО ІЮО МО:41, положень 691-872 5ЕО І
МО:92, 5ЕО ІЮ МО:99, положень 567-718 5ЕО ІЮО МО:101, положень 483-634 5ЕО ІЮ МО: 102, положень 2-183 5ЕО ІЮ МО:105, положень 184-395 5ЕО ІЮО МО:105, положень 396-578 5ЕО І
МО:105, положень 579-761 5ЕО ІЮ МО:105, положень 2-183 5ЕО ІЮ МО:106, 338-520 5ЕО ІЮ
МО:106, положень 478-629 5ЕО ІОЮО МО:107, положень 478-629 5ЕО ІЮ МО:108, положень 478- 629 5ЕО ІЮО МО:109, положень 478-629 5ЕО ІЮ МО:110, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО 112, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:114, положень 400-581 5ЕО ІО МО:116, положень 400-581 5ЕО І
МО:118, положень 400-581 5ЕО ІО МО:120, положень 400-581 5ЕО ІЮ МО:122, положень 400- 581 5ЕО ІЮ МО:124, положень 400-581 5БО ІЮ МО:126, положень 630-811 5ЕО І МО 28, положень 462-643 5ЕО ІЮ МО:130, положень 688-869 5ЕО ІО МО:132, положень 688-869 5ЕО ІЮ
МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУМ.
У одному з аспектів амінокислотна послідовність Х-антисену НВМ щонайменше на 9590 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 9895 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: положень 90-242 5ЕО ІЮ МО:96, 5ЕО ІЮ МО:4, 5ЕО І
МО:8, 5ЕО ІЮ МО:12, положень 2-154 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІО МО:16, 5ЕО ІЮ МО:20, 5ЕО І
МО:24, 5ЕО ІО МО:28, 5ЕО ІО МО:32, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮ МО 4, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮ МО:8, положень 52-68, а потім положень 84- 60 126 5ЕО ІЮО МО:12, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮО МО:16, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІО МО:20, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮ МО:24, положень 52-68, а потім положень 84-126 5ЕО ІЮО МО:28, положень 52-68, а потім положень 84- 126 5ЕО ІЮО МО:32, положень 787-939 5ЕО ІЮО МО:36, положень 7-159 5ЕО ІЮО МО:39, положень 873-1025 5БЕО ІО МО:92, 5ЕО ІЮ МО:100, положень 719-778 5ЕО ІЮ МО:101, положень 635-694
ЗЕО ІЮ МО:102, положень 184-337 5ЕО ІЮО МО:106, положень 521-674 5ЕО ІОЮО МО:106, положень 630-689 5ЕО ІО МО:107, положень 630-689 5ЕО ІЮ МО:108, положень 630-689 5ЕО ІЮ МО:109, положень 630-689 5ЕО ІЮ МО:110, положень 582-641 5ЕО ІО МО:122, положень 810-869 5ЕО І
МО:124, положень 582-641 5ЕО ІО МО:126, положень 1-60 5ЕО ІЮ МО:130, положень 229-288
ЗЕО ІЮ МО:132, положень 1-60 5ЕО ІЮ МО:134, або відповідній послідовності з іншого штаму
НВУ.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу злитий білок має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 98595 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності 5ЕО ІЮ МО:106, або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ.
У будь-якому з варіантів здійснення, описаних в даному описі, в тому числі вище і нижче, що стосуються злитого білка, антигенів НВМ або імунотерапевтичної композиції, що містить такий злитий білок або антигени НВУ, в одному додатковому варіанті здійснення до злитого білка на його М-кінці може бути приєднана додаткова послідовність. У одному з аспектів М-кінцева послідовність вибрана з амінокислотної послідовності, яка на 9595 ідентична 5ЕО ІЮ МО:37, амінокислотній послідовності, яка на 9595 ідентична 5ЕО ІЮО МО:89, або амінокислотній послідовності, яка на 9595 ідентична 5ЕО ІЮО МО:90. У одному з аспектів М-кінцева послідовність вибрана з 5ЕО ІЮ МО:37, положень 1-5 5ЕО ІЮ МО:37, ЗЕО ІЮО МО:89 або 5ЕО ІЮ МО:90, або відповідної послідовності з іншого штаму НВУ.
У одному з аспектів будь-якого з варіантів здійснення винаходу, описаних вище або в інших розділах даного опису, злитий білок експресується за допомогою дріжджового носія. У іншому аспекті будь-якого з варіантів здійснення винаходу, описаних вище або в інших розділах даного опису, дріжджовий носій являє собою цілі дріжджі. У одному з аспектів цілі дріжджі є убитими. У одному з аспектів цілі дріжджі інактивовані нагріванням.
У одному з аспектів будь-якого з варіантів здійснення винаходу, описаних вище або в інших розділах даного опису, дріжджовий носій може походити з роду дріжджів, вибраного з:
Засспаготусе5, Сапаіїда, Стуріюсоссиб5, Напзепшіа, Кінумеготусев, Рісніа, ВАподоїіогиіа, зЗспілозасспаготусеб5 і МЖМатоміа. У одному з аспектів дріжджовий носій походить з зЗасспаготусе5. У одному з аспектів дріжджовий носій походить з Засспаготусез сегемівіає.
У одному з аспектів будь-якого з варіантів здійснення винаходу, описаних вище або в інших розділах даного опису, композиція складена для введення індивідууму або пацієнту. У одному з аспектів композиція складена для введення шляхом ін'єкції індивідууму або пацієнту (наприклад, парентеральним шляхом, таким як підшкірна або внутрішньоочеревинна, або внутрішньом'язова ін'єкція). У одному з аспектів композицію складають в фармацевтично прийнятному ексципієнті, який підходить для введення людині. У одному з аспектів композиція містить більше 9095 дріжджового білка. У одному з аспектів композиція містить більше 9095 дріжджового білка і складена для введення пацієнту.
У одному з аспектів будь-якого з варіантів здійснення винаходу, описаних вище або в інших розділах даного опису, злитий білок не агрегує в дріжджах. У одному з аспектів злитий білок не утворює тілець включення в дріжджах. У одному з аспектів злитий білок не утворює МІ Р або інших великих антигенних частинок в дріжджах. У одному з аспектів злитий білок не утворює
МІ Р або інших великих антигенних частинок в дріжджах.
У одному з аспектів будь-якого варіанту здійснення винаходу, описаного вище або в інших розділах даного опису, в одному з аспектів послідовності НВМ походять з генотипу А НВМ. У іншому аспекті послідовності НВМ походять з генотипу В НВУ. У іншому аспекті послідовності
НВМ походять з генотипу С НВУ. У іншому аспекті НВМ послідовності походять з генотипу Ю
НВМ. У іншому аспекті послідовності НВМ походять з генотипу Е НВМ. У іншому аспекті послідовності НВМ походять з генотипу Е НВУ. У іншому аспекті послідовності НВМ походять з генотипу С НВУ. У іншому аспекті послідовності НВМ походять з генотипу Н НВУ. У одному з аспектів послідовності НВМ походять з комбінації будь-якого з описаних вище генотипів НВМ або будь-якого з відомих генотипів або підгенотипів НВМ.
Інший варіант здійснення винаходу стосується будь-якого зі злитих білків, описаних вище як частина імунотерапевтичної композиції за винаходом або в інших розділах даного опису. У одному з аспектів цього варіанту здійснення злитий білок містить антигени НВМ, причому 60 антигени НВМ вибрані з, але не обмежуючись ними: (а) антигенів НВМ, що складаються з:
великого поверхневого антигену (І) НВУ, корового білка НВМ і Х-антигену НВУ; (Б) антигенів
НВУ, що складаються з: великого поверхневого антигену (І) НВМ ії корового білка НВУ; (с) антигенів НВМ, що складаються з: розпізнаваної рецепторами гепатоцитів області Рге-51 великого поверхневого антигену (І) НВМ, малого поверхневого антигену (5) НВУ, домену зворотної транскриптази полімерази НВУ, корового білка НВМ або е-антигену НВУ, і Х-антигену
НВУ; (49) антигенів НВУ, що складаються з: великого поверхневого антигену (І) НВУ, домену зворотної транскриптази з полімерази НВМУ, корового білка НВМ або е-антигену НВУ, і Х- антигену НВУ; (є) антигенів НВУ, що складаються з: великого поверхневого антигену (Г) НВМ, домену зворотної транскриптази з полімерази НВУ, і корового білка НВУ; (7) антигенів НВМ, що складаються з: полімерази НВМ (КТ-домен) і корового білка НВМ; (9) антигенів НВМ, що складаються з: Х-антигену НВМ і корового білка НВУ; (п) антигенів НВМ, що складаються з: розпізнаваної рецептором гепатоцитів області Рге-51 великого поверхневого антигену (Г) НВУ, малого поверхневого антигену (5) НВМ, домену зворотної транскриптази полімерази НВУ, і корового білка НВМ або е-антигену НВМ; (ї) антигенів НВМ, що складаються з великого поверхневого антигену (Г) НВУ; ()) антигенів НВУ, що складаються з корового антигену НВУ; (К) антигенів НВУ, що складаються з: полімерази НВУ, що включає домен зворотної транскриптази; () антигенів НВУ, що складаються з Х-антигену НВУ; (т) антигенів НВУ, що складаються з від двох до чотирьох поверхневих антигенів НВУ, антигенів полімерази НВУ, корових антигенів
НВМ або Х-антигенів НВМ, де кожний з від двох до чотирьох антигенів НВМ походить з відмінного генотипу НВУ; і (п) антигенів НВМ, що складаються з двох корових антигенів НВМ і двох Х-антигенів НВУ, де кожний з двох корових антигенів НВМ і кожний з двох Х-антигенів НВМ походить з відмінного генотипу НВУ. Аспекти винаходу, що стосуються кожного з антигенів НВМ, включаючи різні послідовності, прийнятні в цих антигенах, описані вище.
У одному з аспектів цього варіанту здійснення винаходу злитий білок містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 9595 ідентична, або щонайменше на 9695 ідентична, або щонайменше на 9795 ідентична, або щонайменше на 98595 ідентична, або щонайменше на 9995 ідентична, або ідентична, амінокислотній послідовності, вибраній з: ЗЕО ІЮ МО:130, 5ЕО ІЮ
МО:150, БЕО І МО:118, 5ЕО 10 МО:151, 5ЕО І МО:С34, 5ЕО 10 МО:120, 5ЕО ІЮ МО: 122, 5ЕО І
МО:124, 5ЕО ІЮ МО:126, 5ЕО 10 МО 128, 5ЕО І МО:132, 5ЕО ІЮ МО:134, 5ЕО 10 МО:112, 5ЕО
ІО МО:114, 5ЕО ІЮ МО:116, 5ЕО І МО:З36, 5ЕО 10 МО:38, 5ЕО І МО:39, 5ЕО ІЮ МО: 40, 5ЕО І
МО:41, 5ЕО ІЮ МО:92, 5ЕО ІЮО МО:93, 5ЕО І МО:94, 5ЕО ІО МО:95, 5ЕО ІЮ МО:96, 5ЕО І
МО:97, 5ЕО ІЮ МО:98, 5ЕО ІО МО:99, 5ЕО ІЮ МО 100, 5ЕО ІЮ МО: 101, 5ЕО І МО:102, 5ЕО І
МО:105, БЕО ІО МО:106, 5ЕО ІЮ МО:107, 5ЕО ІЮ МО:108, 5ЕО ІО МО:109 і БЕО ІЮ МО:110.
Інший варіант здійснення винаходу стосується рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує будь-який зі злитих білків, описаних в даному описі. У одному з аспектів рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти, вибрану з, але не обмежуючись ними: ЗЕО ІЮ МО:33, 5ЕО ІЮ МО:35, 5ЕО ІО МО:91, 5ЕО І
МО:111, 5ЕО ІЮ МО:113, 5ЕО І МО 115, 5ЕО І МО:117, 5ЕО ІЮ МО:119, 5ЕО ІЮ МО:121, 5ЕО
ІО МО 123, БЕО ІЮ МО:125, 5БЕО ІЮ МО:127, 5БЕО ІЮ МО:129, БЕО ІЮ МО:131 або 5ЕО ІО МО:133.
Інший варіант здійснення винаходу стосується виділеної клітини, трансфікованої будь-якою з рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот, описаних в даному описі. У одному з аспектів клітина являє собою дріжджову клітину.
Інший варіант здійснення винаходу стосується композиції, що містить будь-який зі злитих білків, описаних в даному описі. Інший варіант здійснення винаходу стосується композиції, що містить будь-яку з рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот, описаних в даному описі. Інший варіант здійснення винаходу стосується композиції, що містить будь-яку з виділених клітин, описаних в даному описі.
Інший варіант здійснення винаходу стосується способу лікування інфекції вірусом гепатиту В (НВМУ) або щонайменше одного симптому внаслідок інфекції НВМ у індивідуума, який включає введення індивідууму, який інфікований НВУ, щонайменше однієї з будь-якої з імунотерапевтичних композицій, що включають будь-який антиген НВМ, злитий білок або імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, описані в даному описі. Введення композиції індивідууму зменшує інфекцію НВМ або щонайменше один симптом, що є наслідком інфекції
НВУ у індивідуума.
Інший варіант здійснення винаходу стосується способу індукції антигенспецифічної клітинно- опосередковуваної імунної відповіді проти антигену НВМ, що включає введення індивідууму будь-якої однієї або декількох з композицій, що включають будь-який антиген НВУ, злитий білок, або імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, описані в даному описі.
Інший варіант здійснення винаходу стосується способу профілактики інфекції НВМ у 60 індивідуума, який включає ведення індивідуума, який не інфікований НВУ, будь-якої однієї або декількох з композицій, що включають будь-який антиген НВМ, злитий білок або імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, описаний в даному описі.
Інший варіант здійснення винаходу стосується способу імунізації групи індивідуумів проти
НВУ, що включає введення групі індивідуумів будь-якої однієї або декількох з композицій, що включають будь-який антиген НВУ, злитий білок або імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, описаний в даному описі.
Інший варіант здійснення винаходу стосується будь-якої однієї або декількох з композицій, що включають будь-який антиген НВМ, злитий білок або імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, описаний в даному описі, для застосування для лікування інфекції НВУ або її симптому.
Інший варіант здійснення винаходу стосується будь-якої однієї або декількох з композицій, що включають будь-який антиген НВМ, злитий білок або імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, описаний в даному описі, для застосування для профілактики інфекції НВМ або її симптому.
Інший варіант здійснення винаходу стосується застосування будь-якої або декількох з композицій, що включають будь-який антиген НВМ, злитий білок або імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, описаний в даному описі, для отримання лікарського засобу для лікування інфекції НВУ або її симптому.
Інший варіант здійснення винаходу стосується застосування будь-якої або декількох з композицій, що включають будь-який антиген НВУ, злитий білок або імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, описаний в даному описі, для отримання лікарського засобу для профілактики інфекції НВУ або її симптому.
У одному з аспектів будь-якого з варіантів здійснення, що стосуються способів або застосувань за винаходом, описаних вище або в інших розділах даного опису, причому спосіб може включати введення щонайменше двох, трьох, чотирьох або більше композицій, що включають будь-який антиген НВУ, злитий білок або імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, описані в даному описі. У одному з аспектів можна вводити додаткові композиції або сполуки, відповідні для профілактики або лікування інфекції НВМ (наприклад, противірусні сполуки, інтерферони, інші імунотерапевтичні композиції або їх комбінації). У одному з аспектів різні композиції або сполуки вводять індивідууму одночасно. У одному з аспектів різні композиції або сполуки вводять індивідууму послідовно. У одному з аспектів кожну з різних композицій вводять шляхом ін'єкції у відмінну область у індивідуума. У одному з аспектів однократна доза імунотерапевтичної композиції НВМ на основі дріжджів за винаходом складає від всього 40 Д.О. до всього 80 Д.О., які вводять однаковими частинами в дві, три або чотири різні області у індивідуума, на дозу.
У одному з аспектів будь-якого з варіантів здійснення, що стосуються способів або застосувань за винаходом, описаних вище або в інших розділах даного опису, введення композиції індивідууму забезпечує сероконверсію у індивідуума або збільшує частоту сероконверсії в групі індивідуумів. У одному з аспектів введення композиції індивідууму знижує
НВ5ЗАд в сироватці або приводить до усунення сироваткового НВ5ЗАд у індивідуума або підвищує частоту усунення сироваткового НВ5ЗАд в групі індивідуумів. У одному з аспектів введення композиції індивідууму знижує рівень сироваткового НВеАд або приводить до усунення сироваткового НВеАд у індивідуума або підвищує частоту усунення сироваткового
НВеАо в групі індивідуумів. У одному з аспектів введення композиції індивідууму знижує навантаження вірусом НВУ у індивідуума або підвищує частоту зниження навантаження вірусом
НВМ в групі індивідуумів. У одному з аспектів введення композиції індивідууму приводить до виявлення, що не піддається рівню ДНК НВМ в інфікованих клітинах у індивідуума або приводить до більш високих частот негативності по ДНК НВУ в групі індивідуумів. У одному з аспектів введення композиції індивідууму знижує пошкодження печінки або підвищує функцію печінки у індивідуума або знижує частоту пошкодження печінки або збільшує частоту поліпшення функції печінки в групі індивідуумів. У одному з аспектів введення композиції індивідууму підвищує нормалізацію АЇ Т у індивідуума або в групі індивідуумів.
У будь-якому з варіантів здійснення, що стосуються антигену НВУМ, злитого білка, імунотерапевтичної композиції або будь-якого способу застосування антигену НВУ, злитого білка або імунотерапевтичної композиції описаних в даному описі, в одному з аспектів композиція, крім того, містить або використовується разом щонайменше з одним модифікатором біологічної відповіді. У одному з аспектів композиція, крім того, містить або використовується разом з однією або декількома додатковими сполуками, відповідними для лікування або пом'якшення симптому інфекції НВМ. У одному з аспектів композиція, крім того, 60 містить або використовується разом щонайменше з однією противірусною сполукою. У одному з аспектів противірусна сполука являє собою інгібітор зворотної транскриптази на основі нуклеотидного аналога. Противірусна сполука може включати, але не обмежуватися ними, тенофовір, ламівудин, адефовір, телбівудин, ентекавір і їх комбінації. У одному з аспектів противірусною сполукою є тенофовір. У одному з аспектів противірусною сполукою є ентекавір.
У одному з аспектів композиція додатково містить або використовується разом щонайменше з одним інтерфероном. У одному з аспектів інтерферон являє собою інтерферон-а. У одному з аспектів інтерферон являє собою пегилований інтерферон-ага. У одному з аспектів інтерферон являє собою інтерферон-А.
КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ
На фіг. 1 представлене схематичне зображення організації генома вірусу гепатиту В.
На фіг. 2 представлене схематичне зображення, на якому показана основна структура рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок поверхневий антиген/коровий антиген НВУ, придатний в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів за винаходом.
На фіг. З представлене схематичне зображення основної структури рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок поверхневий антиген/полімераза/коровий антиген/Х НВУ, придатний в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів за винаходом.
На фіг. 4 представлене схематичне зображення основної структури рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок полімераза/коровий антиген НВМУ, придатний в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів за винаходом.
На фіг. 5 представлене схематичне зображення основної структури рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок Х/коровий антиген НВМУ, придатний в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів за винаходом.
На фіг. б представлене схематичне зображення основної структури рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок полімерази НВМ, придатний в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів за винаходом.
На фіг. 7 представлене схематичне зображення основної структури рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок поверхневий антиген/полімераза/коровий антиген НВУ, придатний в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів за винаходом.
На фіг 8 представлене схематичне зображення основної структури рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок поверхневий антиген/коровий антиген/полімераза НВМУ, придатний в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів за винаходом.
На фіг. 9 представлене схематичне зображення основної структури рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок поверхневий антиген/коровий антиген/Х
НВУ, придатний в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів за винаходом.
На фіг. 10 представлене схематичне зображення основної структури рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує поверхневий антиген/коровий антиген/полімераза/Х
НВУ, придатний в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів за винаходом.
На фіг. 11 представлене схематичне зображення основної структури рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок поверхневий антиген/коровий антиген/Х/полімераза НВУ, придатний в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів за винаходом.
На фіг. 12 представлене схематичне зображення основної структури рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок полімераза/поверхневий антиген/коровий антиген НВУ, придатний в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів за винаходом.
На фіг. 13 представлене схематичне зображення основної структури рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок Х/поверхневий антиген/коровий антиген
НВУ, придатний в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів за винаходом.
На фіг. 14 представлене схематичне зображення основної структури рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок полімераза/Х/поверхневий антиген/коровий антиген НВУ, придатний в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів за винаходом.
На фіг. 15 представлене схематичне зображення основної структури рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок Х/полімераза/поверхневий антиген/коровий антиген НВУ, придатний в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів за винаходом.
На фіг. 16 представлене цифрове зображення вестерн-блота, на якому показана експресія декількох імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, які експресують злитий білок 60 поверхневий антиген/коровий антиген НВУ (убиті нагріванням цілі дріжджі).
На фіг. 17 представлене цифрове зображення вестерн-блота, на якому показана експресія декількох імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, які експресують злитий білок поверхневий антиген/коровий антиген НВМ (живі цілі дріжджі).
На фіг. 18 представлене цифрове зображення вестерн-блота, на якому показана експресія декількох імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, які експресують злитий білок поверхневий антиген/полімераза/коровий білок/хХ НВУ.
На фіг. 19 представлене цифрове зображення вестерн-блота, на якому показана експресія декількох імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, які експресують злитий білок поверхневий антиген/полімераза/коровий антиген/х НВМУ.
На фіг. 20 представлене цифрове зображення вестерн-блота, на якому показана експресія декількох імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, які експресують антигени НВУ, що містять злиті білюим поверхневий антиген-коровий антиген (5с) або злиті білки поверхневий антиген-полімераза-коровий антиген-хХ (5р).
На фіг. 21 представлене цифрове зображення вестерн-блота, на якому показана експресія антигенів НВМ з декількох імунотерапевтичних композицій проти НВМ на основі дріжджів, що культивуються в середовищі ЦІ 2.
На фіг. 22 представлена стовпчикова діаграма, на якій показана середня експресія антигенів
НВУ з декількох імунотерапевтичних композицій проти НВМУ на основі дріжджів, культивованих в середовищі 1/2 або середовищі 02 (планки погрішностей являють собою стандартне відхилення).
На фіг. 23 представлений графік, на якому показана проліферація СО4- Т-клітин селезінки мишей, імунізованих імунотерапевтичним продуктом на основі дріжджів, який експресує антиген поверхневий антиген-коровий антиген (ЗСОКЕ) НВУ, у відповідь на суміш антигенів З/коровий антиген або на міметопний пептид 5Ад МНС класу ЇЇ (планки погрішностей являють собою стандартне відхилення).
На фіг. 24 представлений графік, на якому показана проліферація Т-клітин лімфатичних вузлів мишей, імунізованих імунотерапевтичним продуктом на основі дріжджів, який експресує антиген поверхневий антиген-коровий антиген (ЗСОКЕ) НВУ, у відповідь на суміш антигенів з/коровий антиген або на міметопний пептид 5Ад МНС класу ІІ (планки погрішностей являють собою стандартне відхилення).
На фіг. 25 представлений графік, на якому показана відповідь Т-клітин лімфатичних вузлів мишей, імунізованих імунотерапевтичним продуктом на основі дріжджів, який експресує антиген поверхневий антиген-коровий антиген (ЗСОРЕ) НВУ, на суміш антигенів 5/коровий антиген або на міметопний пептид ЗАд МНС класу ІІ, в ЕГІЗрої для інтерферону-у (ІЕМ-у).
На фіг. 26 представлений графік, на якому показана проліферація СО4- Т-клітин селезінки мишей, імунізованих імунотерапевтичним продуктом на основі дріжджів, який експресує антиген поверхневий антиген-РоІ-коровий антиген-Х (що позначається а-5рех) у відповідь на суміш антигенів 5/Соге або на міметопний пептид 5Ад МНС класу ІЇ (планки погрішностей являють собою стандартне відхилення).
На фіг. 27 представлений графік, на якому показана продукція ІІ -1Др в спленоцитах мишей, імунізованих: (а) імунотерапевтичним продуктом на основі дріжджів, який експресує поверхневий антиген-РоІ-Е/коровий антиген-Х (що позначається Зр) НВУ, ліві стовпці; або (Б) імунотерапевтичним продуктом на основі дріжджів, який експресує антиген поверхневий антиген-коровий антиген (що позначається 5с) НВМ (планки погрішностей являють собою стандартне відхилення).
На фіг. 28 представлений графік, на якому показана продукція І-12р70 в спленоцитах мишей, імунізованих: (а) імунотерапевтичним продуктом на основі дріжджів, який експресує антиген поверхневий антиген-РоІ-коровий антиген-Х (що позначається Зр) НВУ, ліві стовпці; або (б) імунотерапевтичним продуктом на основі дріжджів, який експресує антиген поверхневий антиген-коровий антиген (що позначається Зс) НВМ (планки погрішностей являють собою стандартне відхилення).
На фіг. 29А і 298 представлені графіки, на яких показана продукція інтерферону-у (ІЕМ-у) в спленоцитах мишей, імунізованих: (фіг. 29А) імунотерапевтичним продуктом на основі дріжджів, який експресує антиген поверхневий антиген-коровий антиген (що позначається с) НВУ, або (фіг. 298) імунотерапевтичним продуктом на основі дріжджів, який експресує антиген поверхневий антиген-РоІ-коровий антиген-Х (що позначається 5р) НВМ (планки погрішностей являють собою стандартне відхилення).
На фіг. ЗОА-О представлені графіки, на яких показана продукція ІС-1Дф8 (фіг. ЗОА), 1-6 (фіг.
ЗОВ), 11-13 (фіг. 302) і І/-12р70 (фіг. 300) в спленоцитах мишей, імунізованих: (а) 60 імунотерапевтичним продуктом на основі дріжджів, який експресує антиген поверхневий антиген-РоІі-коровий антиген-Х (що позначається Зр) НВМ, ліві стовпці; або (Б) імунотерапевтичним продуктом на основі дріжджів, який експресує антиген поверхневий антиген-коровий антиген (що позначається 5с) НВМ.
На фіг. 31 представлена стовпчикова діаграма, на якій показано, що у мишей, імунізованих
С1І-13002 або 01-13002 ж антитіло проти СО40, але не УУЕС, індукувався порівнянний захист від навантаження пухлинами ЕІ! 4, які експресують цільовий антиген НВМ (планки погрішностей являють собою стандартне відхилення).
На фіг. 32 представлена стовпчикова діаграма, на якій показані результати аналізу ЕГІБрої для ІЕМ-у, в яких порівнюються Т-клітинні відповіді мишей, імунізованих 5І-13008 (5СОВЕ-С) і
СІ-13013 (5РЕХм2), в порівнянні з ММЕС з використанням різних пептидів і антигенів НВМ (планки погрішностей являють собою стандартне відхилення).
На фіг. 33 представлена стовпчикова діаграма, на якій показані відповіді в ЕІ ІЗрої для ІЕМ-у на стимуляцію (3І-43002, у людини до і після імунізації і після допоміжної імунізації профілактичною вакциною НВУ.
На фіг. 34 представлена стовпчикова діаграма, на якій показані специфічні до антигеньв
НВМ відповіді клітин лімфатичних вузлів, виділених з трансгенних по НІГА-А2 мишей, імунізованих (5І-43009 (5СОНВЕ-Ю) або (І-434020 (Х-5СОМКЕ) в порівнянні з мишами, імунізованими контрольними дріжджами (МЕС), в ЕГІЗрої для ІЕМ-у (планки погрішностей являють собою стандартне відхилення).
На фіг. 35 представлена стовпчикова діаграма, на якій показані специфічні до антигенів НВМ відповіді клітин селезінки, виділених з трансгенних по НГА-А2 мишей, імунізованих 01І-13009 (ЗСОВЕ-0), в порівнянні з мишами, імунізованими контрольними дріжджами (УМЕС), в ЕГІЗрої для ІЕМ-у (планки погрішностей являють собою стандартну помилку).
На фіг. 36 представлена стовпчикова діаграма, на якій показані специфічні до антигенів НВМ відповіді клітин лімфатичних вузлів, виділених з мишей С57ВІ/6, імунізованих 01-13009 (ЗСОВЕ-О) або с1І-13020 (Х-5СОРЕ), в порівнянні з мишами, імунізованими контрольними дріжджами (УУЕС), або наївними мишами в ЕГІ5рої для ІЕМ-у (планки погрішностей являють собою стандартне відхилення).
На фіг. 37 представлений лінійний графік, на якому показані специфічні до антигенів НВМ відповіді СО8- Т-клітин на обмежений по МНС класу І пептид НВМ у мишей С57ВІ/6, імунізованих (І-143009 (5СОМВЕ-Ю) або (І-13020 (Х-5СОКЕ), в порівнянні з мишами, імунізованими контрольними дріжджами (УМЕС) або імунотерапевтичним засобом на основі дріжджів, який експресує овальбумін (ОМАХ).
На фіг. 38 представлена стовпчикова діаграма, на якій показані специфічні до антигенів НВМ відповіді СО4- Т-клітин на обмежений по МНС класу ІЇ пептид НВМ у мишей С57ВІ/6, імунізованих (І-143009 (5СОМВЕ-Ю) або (І-13020 (Х-5СОКЕ), в порівнянні з мишами, імунізованими контрольними дріжджами (УМЕС) або імунотерапевтичним засобом на основі дріжджів, який експресує овальбумін (ОМАХ).
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Даний винахід стосується, головним чином, композицій і способів для профілактики і/або лікування інфекції вірусом гепатиту В (НВМ). Винахід стосується імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів (яка також називається "імунотерапевтичним засобом проти НВМ на основі дріжджів"), що містить дріжджовий носій і антиген(и) НВМ, яка призначена для індукції профілактичної і/або терапевтичної імунної відповіді проти інфекції НВМ у індивідуума, і застосування таких композицій для профілактики і/або лікування інфекції НВУ і пов'язаних з нею симптомів. Також винахід стосується рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот, що використовуються в композиціях на основі дріжджів, а також білків і злитих білків, що кодуються ними, для застосування в будь-якій імунотерапевтичній композиції і/або будь-якому терапевтичному або профілактичному протоколі лікування інфекції НВМ, включаючи будь-який терапевтичний або профілактичний протокол, який поєднує в собі специфічні до НВМ композиції на основі дріжджів за винаходом з будь-якою однією або декількома іншими терапевтичними або профілактичними композиціями, засобами, лікарськими засобами, сполуками і/або протоколами лікування інфекції НВУ.
Специфічні до НВМ імунотерапевтичні композиції на основі дріжджів є унікальними серед різних типів імунотерапії в тому, що ці композиції за винаходом індукують природжені імунні відповіді, а також адаптивні імунні відповіді, які специфічно націлені на НВМ, включаючи СО4- залежні ТНІ17 ї ТНІ Т-клітинні відповіді і антигенспецифічні СО8» Т-клітинні відповіді. Об'єм імунної відповіді, що індукується специфічною до НВМ імунотерапією на основі дріжджів, є добре прийнятним для націлювання на НВМ. По-перше, вважають, що НВМ вислизає від 60 природженої імунної відповіді на ранньому етапі інфекції шляхом "приховування" від природженої відповіді і, тим самим, не індукування ї, а не шляхом прямої протидії природженому імунітету (УМеїапа апа Спізагі, 2005, 9. Міго!. 15:9369-9380; УМеїапо, єї аї., 2004,
РМАбБ ИБА 101:6669-6674). Таким чином, можна очікувати, що НВМ буде чутливим до природжених імунних відповідей, якщо вони будуть активуватися іншим механізмом, тобто імунотерапевтичними композиціями на основі дріжджів за винаходом. По-друге, НВМ викликає експресію антигенів на високому рівні в інфікованих клітинах-хазяїнах, які, як вважається, є помітними для адаптивної імунної відповіді ((зцідоці, еї а!., 1999, 5сіепсе 284:825-829; Тпітте єї а!., 2003, 9. Мігої. 77:68-76), і звільнення від гострої інфекції пов'язане зі стійкими СО4: і СО8: Т- клітинними відповідями (Маїпі еї аї., 1999, (зазігоепіегої. 117:1386-1396; ВеНегтапп еї аї., 1995, 9. Ехр. Мей. 181:1047-1058; Тпітте еї аї., 2003, 9. Мікої. 77:68-76; Мівіапа апа Снпізаїі, 2005, 9.
Мігої. 15:9369-9380). Таким чином, очікується, що імунотерапіям НВМУ на основі дріжджів шляхом активації адаптивної імунної відповіді буде ефективно націлюватися на інфіковані НВМ клітини для їх руйнування і/або, очікується, що вона ефективно посилить кліренс вірусу. Більше того, вважають, що імунна відповідь, індукована імунотерапією на основі дріжджів, є інтерферон- незалежною і інтерферон-залежною (Татритгіпі еї аї., 2012, 9. Іттипоїпег. 35(1):14-22); таким чином, вважають, що здатність, або її відсутність, індивідуума відповідати на терапію на основі інтерферонів, яка є стандартним способом лікування НВМУ, не впливає прямо на здатність індивідуума відповідати на імунотерапію на основі дріжджів за винаходом. Крім того, імунотерапевтичні композиції проти НВМ на основі дріжджів, описані в даному описі, призначені для націлювання на імуногенні і консервативні ділянки НВУ, множинні епітопи СТІ, і включають ділянки НВМУ, на яких можна здійснювати націлювання проти вислизання (дозволяють модифікації композицій при необхідності для націлювання на такі мутації, що забезпечують вислизання), що робить їх високо прийнятною терапією НВМ, яка оптимізує можливість ефективних імунних відповідей проти цього вірусу.
Крім того, і без зв'язку з теорією, вважають, що імунотерапія проти НВМ на основі дріжджів індукує імунну відповідь, яка не тільки направлена специфічно проти антигену-мішені, який міститься в імунотерапевтичному продукті на основі дріжджів, але який також розвивається так, що він направлений проти інших імунологічних епітопів на вірусі (тобто відмінних від епітопів, які містяться в антигенній композиції дріжджів). Іншими словами, первинна клітинна імунна відповідь на антиген(и) і/або епітоп(и), що містяться в імунотерапевтичному засобі не основі дріжджів, може приводити до вторинних клітинних імунних відповідей на антиген(и) і/або епітоп(и), який присутній в інфікованих клітинах у індивідуума, що піддається лікуванню, але які не присутні в імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, що, тим самим, приводить до розвитку комплексних і непередбачуваних профілів імунної відповіді, які є унікальними для кожного індивідуума, що піддається лікуванню. Ці вторинні імунні відповіді Є специфічними до молекулярного профілю інфекції НВМ у кожного індивідуума, що піддається лікуванню, і імунотераппвтичний засіб на основі дріжджів може запускати ці подальші ефекти унікальним чином в порівнянні з іншими способами лікування, включаючи інші платформи імунотерапії. Це явище можна загалом назвати "поширенням епітопа" і воно відображає перевагу використання імунотерапії НВМ на основі дріжджів, оскільки очікується, що індукція імунної відповіді проти конкретного антигену НВМ або навіть проти конкретного генотипу НВМ (наприклад, шляхом надавання цього антигену в контексті імунотерапевтичного засобу на основі дріжджів), приведе до каскаду, що націлює імунну систему проти різних додаткових антигенів НВМ, що може приводити до ефективних імунних відповідей проти антигенів з генотипів або штамів НВМ, відмінних від тих, які знаходяться в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів.
Як розглянуто вище, пацієнти, що стали хронічно інфікованими НВУ, мають тенденцію до наявності більш слабкого (або відсутнього) і більш вузького специфічного до НВМ, опосередковуваного Т-клітинами імунітету. Таким чином, імунотерапевтичні композиції проти
НВМУ на основі дріжджів за винаходом направлені на потребу в терапевтичних композиціях для лікування пацієнтів, які активно інфіковані НВМУ, включаючи хронічно інфікованих пацієнтів, і, крім того, забезпечують додаткову вакцину для профілактики інфекції НВМ, яка може мати переваги відносно формування тривалих імунних відповідей пам'яті. Дійсно, очікується, що імунотерапевтичні композиції проти НВМ на основі дріжджів за винаходом будуть стимулювати тривалі Т-клітинні відповіді пам'яті проти НВМ, які можуть попереджати інфекцію, а також забезпечувати довготривалу користь, що полягає в можливості захисту хронічно інфікованого пацієнта від реактивації вірусу. Очікується, що імунотерапевтичні композиції проти НВМ на основі дріжджів як монотерапії або в комбінації з іншими терапевтичними підходами для лікування НВМ (наприклад, в комбінації з противірусними сполуками) збільшать процент хронічно інфікованих пацієнтів, які досягають кліренсу НВзАд і НВедо, які досягають повної 60 сероконверсії і/або які досягають безперервного кліренсу вірусу протягом щонайменше 6 місяців після завершення терапії.
Таким чином, імунотерапію НВМ на основі дріжджів можна комбінувати з противірусними лікарськими засобами і/або терапією інтерфероном, і/або з іншими способами терапії НВУ, для зниження вірусного навантаження у індивідуума до рівня, з яким імунна система може справитися більш ефективно. Титри вірусу НВМ, як правило, є дуже високими (може бути інфіковано аж до 10" гепатоцитів) і, таким чином, вони можуть придушувати здатність індивідуума до індукції ефективної відповіді СТІ таким чином, очікується, що зниження вірусного навантаження з використанням противірусних лікарських засобів в комбінації з індукцією специфічною до НВУ активності СТІ. з використанням імунотерапії на основі дріжджів буде корисним для інфікованого індивідуума. Крім того, зниження вірусного навантаження з використанням противірусних засобів також може знижувати негативні ефекти, при їх наявності, активації імунної системи в контексті високої кількості інфікованих гепатоцитів, націлених на руйнування. Також очікується, що імунотерапія НВМ на основі дріжджів буде відігравати роль в зниженні і/або усуненні областей латентної вірусної інфекції. Наприклад, за допомогою ПЛР показано, що багато які тканини є позитивними по НВУМ, і вони вважаються потенційними джерелами для реактивації НВУ. ДНК НВМ може вбудовуватися в геном хазяїна, що забезпечує пасивну персистенцію НВУ, і кзкДНК є надспіральною формою генома НВУ, що покоїться, яка також приводить до латентності. Без зв'язку з теорією, автори винаходу вважають, що імунотерапія НВМ на основі дріжджів, описана в даному описі, буде відігравати роль в усуненні всіх з цих типів "джерел" НВУ, які, ймовірно, вносять внесок в низьку частоту лікування від захворювання, що спостерігається у випадку сучасних противірусних підходів.
У іншому сценарії після застосування імунотерапевтичного засобу на основі НВМ за винаходом, окремо або в комбінації з противірусним засобом або іншим терапевтичним засобом проти НВМ, якщо він є достатнім для досягнення повного кліренсу НВ5АЯд, але не достатнім для продукування антитіла проти НВ, можуть йти існуючі профілактичні субодиничні вакцини, або додатково його можна комбінувати з ними, для досягнення повної сероконверсії.
Альтернативно, будь-який зі злитих білків, описаних в даному описі, також можна використовувати як субодиничні вакцини для досягнення повної сероконверсії або для захисту індивідуума від інфекції НВУ, окремо або в комбінації з імунотерапевтичним засобом проти НВМ на основі дріжджів за винаходом. Нарешті, імунотерапевтична композиція за винаходом добре підходить для модифікації додатковими імунотерапевтичними композиціями і/або комбінування з ними, включаючи будь-які імунотерапевтичні композиції, описані в даному описі, для лікування
НВМ із забезпечуючими вислизання мутаціями, які індукуються лікуванням противірусними лікарськими засобами.
Імунотерапевтичні композиції на основі дріжджів вводять як біологічні препарати або фармацевтично прийнятні композиції. Таким чином, замість використання дріжджів як системи для продукування антигену з подальшим очищенням антигену з дріжджів, увесь дріжджовий носій, як описано в даному описі, повинен бути придатний, і складений, для введення пацієнту.
Навпаки, існуючі комерційні вакцини проти НВУ, а також багато які вакцини, що розробляються, містять рекомбінантні білки НВМ (наприклад, білки НВзЗАд), які продукуються в Засспаготусев5 сегемізіає, але згодом їх вивільняють з дріжджів шляхом руйнування і очищають від дріжджів так, щоб кінцева вакцина, комбінована з ад'ювантом (наприклад, алюмінію гідроксифосфат сульфат або гідроксид алюмінію), не містила ДНК дріжджів, яка піддається виявленню, і містила не більше 1-595 дріжджового білка. Імунотерапевтичні композиції проти НВМ на основі дріжджів за винаходом, навпаки, містять ДНК дріжджів, яка легко виявляється, і містять істотно більше 595 дріжджового білка; як правило, імунотерапевтичні засоби на основі дріжджів за винаходом містять більше 7095, більше 8095 або, як правило, більше 9095 дріжджового білка.
Імунотерапевтичні композиції на основі дріжджів вводять пацієнту для імунізації пацієнта для терапевтичних і/або профілактичних цілей. У одному з варіантів здійснення винаходу композиції на основі дріжджів складають для введення в фармацевтично прийнятному ексципієнті або складі. У одному з аспектів композиція повинна бути складена так, щоб вона була придатна для введення людині (наприклад, умови отримання повинні підходити для застосування у людини, і будь-які ексципієнти або склади, що використовуються для отримання композиції і/або приготування дози імунотерапевтичного засобу для введення, повинні бути придатні для застосування у людини). У одному з аспектів винаходу імунотерапевтичні композиції на основі дріжджів складають для введення шляхом ін'єкції пацієнту або індивідууму, наприклад, парентеральним шляхом (наприклад, підшкірна, внутрішньоочеревинна, внутрішньом'язова або внутрішньошкірна ін'єкція, або інший прийнятний парентеральний шлях).
У одному з варіантів здійснення дріжджі експресують антиген (наприклад, що виявляється 60 вестерн-блотингом), і антиген не агрегує в дріжджах, антиген не утворює тільця включення в дріжджах і/або не утворює дуже великих частинок (МІ Р) або інших великих антигенних частинок в дріжджах. У одному з варіантів здійснення антиген продукується як розчинний білок в дріжджах і/або не секретується з дріжджів, або по суті або переважно не секретується з дріжджів. У іншому варіанті здійснення без зв'язку з теорією, автори даного винаходу вважають, що конкретні комбінації і, можливо, розташування антигенів в злитому білку НВМУ, включаючи поверхневий антиген і коровий антиген, детально описані в даному описі, можуть утворювати
МІР або агрегувати до деякої міри в дріжджах, які експресуються антигени. У результаті антиген, експресований дріжджами, має імуногенні властивості, які, ймовірно, є пов'язаними з його структурою і формою загалом, як окрема характеристика від імуногенних властивостей імунних епітопів (наприклад, Т-клітинних епітопів), що містяться в антигені. Коли дріжджі, які експресують такі злиті білюю, надають в імунотерапевтичному засобі проти НВМ на основі дріжджів за винаходом, імунотерапевтична композиція набуває властивостей, які активують природжену імунну систему, не тільки з дріжджового носія, як розглянуто вище (як у випадку повністю основаних на дріжджах імунотерапевтичних засобів, описаних в даному описі), але також частково з антигенної структури злитого білка (наприклад, злитий білок поверхневий антиген-коровий антиген, експресований в дріжджах, також має властивості, подібні до ад'юванту); крім того, завдяки злитому білку імунотерапевтична композиція набуває властивостей, які активують адаптивну імунну систему антигенспецифічним чином (шляхом надавання різних Т-клітинних епітопів), також як і для всіх імунотерапевтичних засобів на основі дріжджів, описаних в даному описі. Ця конкретна комбінація властивостей, ймовірно, є унікальною для імунотерапевтичних засобів на основі дріжджів, які експресують конкретні злиті білки поверхневий антиген-коровий антиген з НВМ, описані в даному описі. Однак у всіх варіантах здійснення винаходу, описаних в даному описі, імунотерапевтичні засоби на основі дріжджів повинні легко фагоцитуватися дендритними клітинами імунної системи, і дріжджі і антигени повинні легко процесуватися такими дендритними клітинами для індукції ефективної імунної відповіді проти НВУМ.
Композиції за винаходом
Один з варіантів здійснення даного винаходу стосується імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів, яку можна використовувати для профілактики і/або лікування інфекції НВМ і/або для пом'якшення щонайменше одного симптому, що є результатом інфекції НВМ. Композиція містить: (а) дріжджовий носій; і (б) один або декілька антигенів, що містять білок(и) НВМ і/або його імунногенний домен(и). Що стосується дріжджового носія, білюи НВМ найчастіше експресуються як рекомбінантні білки дріжджовим носієм (наприклад, цілими дріжджами або дріжджовим сферопластом, який необов'язково може далі процесуватися в дріжджовий цитопласт, дріжджову оболонку або дріжджовий мембранний екстракт або його фракцію), хоч існує варіант здійснення, коли одним або декількома такими білками НВМ навантажують дріжджовий носій або їх іншим чином збирають в комплекс, зв'язують, змішують або вводять з дріжджовим носієм, як описано в даному описі, з утворенням композиції за даним винаходом.
Відповідно до даного винаходу, вказівка на "гетерологічний" білок або "гетерологічний" антиген, включаючи гетерологічний злитий білок, застосовно до дріжджового носія за винаходом, означає, що білок або антиген не є білком або антигеном, які природним чином експресуються дріжджами, хоч злитий білок, який включає гетерологічний антиген або гетерологічний білок, також може включати послідовності або білки дріжджів, або їх частини, які природним чином експресуються дріжджами (наприклад, препропослідовність альфа-фактора, як описано в даному описі).
Один з варіантів здійснення винаходу стосується різних злитих білок НВМ. У одному з аспектів такі злиті білки НВМ придатні в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів за винаходом. Такі злиті білки і/або рекомбінантні молекули нуклеїнових кислот, кодуючі такі білки, також можна використовувати у, в комбінації з, або для продукування, неімунотерапевтичної композиції на основі дріжджів, яка може включати, але не обмежуватися ними, вакцину ДНК, білкову субодиничну вакцину, імунотерапевтичну композицію на основі рекомбінантного вірусу, вакцину на основі убитого або інактивованого патогена і/(або вакцину на основі дендритних клітин. У іншому варіанті здійснення такі злиті білюм можна використовувати в діагностичному аналізі для НВМ і/або для отримання антитіл проти НВУ. У даному описі описані ілюстративні злиті білки НВУ, що забезпечують окремі частини антигенів НВМУ, включаючи, наприклад, окремі частини полімерази і/або модифіковану полімеразу; окремі частини і/або модифікований поверхневий антиген; окремі частини і/або модифікований коровий антиген (включаючи щонайменше частини або більшу частину е-антигену); окремі частини і/або модифікований Х- антиген; а також окремі частини і/або розташування будь-яких одного, двох, трьох або всіх 60 чотирьох антигенів (поверхневий антиген, коровий антиген, Х і полімераза), такі як, але не обмежуючись ними, окремі частини і/або розташування поверхневого антигену і корового антигену (включаючи щонайменше частини або більшу частину е-антигену); окремі частини іМабо розташування поверхневого антигену, корового антигену (включаючи щонайменше частини або більшу частину е-антигену), полімерази і Х-антигену; окремі частини і/або розташування поверхневого антигену, корового антигену (включаючи щонайменше частини або більшу частину е-антигену) і полімерази; і окремі частини і/або розташування поверхневого антигену, корового антигену (включаючи щонайменше частини або більшу частину е-антигену) і
Х-антигену.
У одному з варіантів здійснення антигени НВМУ, включаючи імуногенні домени повнорозмірних білків, як описано в даному описі, злиті з білками хазяїна, які надекспресуються в інфікованих НВУ, але не в неінфікованих, клітинах хазяїна. У одному з варіантів здійснення антигени НВУ, включаючи імуногенні домени повнорозмірних білків, як описано в даному описі, злиті з білком К2, фактором хазяїна, необхідним для реплікації НВУ, який в одному з варіантів здійснення експресується в гепатоцитах. К2 являє собою білковий компонент рибонуклеотидредуктази (КМЕК), і є критичним для життєвого циклу НВМ (див., наприклад, бопеп еї аї., 2010, НераїйоїІ. 51(5):1538-1546). Інші варіанти здійснення винаходу будуть очевидними, в зв'язку з описом, представленим в даному описі.
Вірус гепатиту В, гени і білки. Вірус гепатиту В (НВМ) є представником сімейства вірусів
Нерадпамігідає (гепаднавіруси) і викликає тимчасові і хронічні інфекції печінки у людини і людиноподібних приматів. Гепаднавіруси, які інфікують ссавців, мають схожі послідовності ДНК і організацію генома, і згруповані в рід Огіпоперадпаміги5. Вірусна частинка гепатиту В має зовнішню оболонку, що містить ліпід і частинки поверхневого антигену, відомі як НВзАд.
Коровий білок, що містить нуклеокапсидний кор (НВсАд), оточує вірусну ДНК і полімеразу ДНК з активністю зворотної транскриптази. Як розглянуто в Зеєедег апа Мазоп, 2000, Місгобіої. Мої.
Вії. Неу. 64(1):51-68, НВМУ має геном з частково дволанцюжковою релаксованою кільцевою ДНК (рКДНК) розміром 3,2 т. п. н., яка перетворюється в ковалентно замкнену дволанцюжкову молекулу ДНК (кзкДНК) при доставці вірусного геному в ядро інфікованого гепатоциту. РНК- полімераза | клітини-хазяїна транскрибує чотири вірусні РНК з кзкДНК-матриці, які транспортуються в цитоплазму клітини-хазяїна. Вірусні РНК включають мРНК, які транскрибуються з утворенням вірусних корових і оболонкових структурних білків і прекорового, полімеразного і Х неструктурних вірусних білків. РНК, яка транслюється з утворенням корового білка і полімерази, також служить як прегеномна РНК (пгРНК), яка є матрицею для зворотної транскрипції. пгРНК і полімераза інкапсулюються коровим білком, який продукує вірусний нуклеокапсид, де пгРНК зворотно транскрибується в ркДНК. Потім ці ркДНК-вмісні нуклеокапсиди вміщуються в оболонкові білки і секретуються з клітини-хазяїна як зрілі віріони або транспортуються в ядро для ампліфікації вірусної кзкКкДНК.
Структурні і неструктурні білки, продуковані геномом НВУ, представлені в таблиці 1.
Частково дволанцюжковий геном НВМУ містить чотири гени, відомі як С, Х, Р ї 5 (див. також фіг. 1).
Таблиця 1
Гени НВМУ і продукти генів с полімеразу імунодепресивний фактор для адаптивної імунної відповіді
Полімераза для реплікації вірусної ДНК - Домен 1: домен кінцевого білка (ТР) упаковує пгДНК і полімераза слугує затравкою мінус-ланцюга ДНК - Домен 2: домен зворотної транскриптази (КТ), РНК-аза Н; деградує пгРНК антиген; малий) може придушувати імунну функцію
М НВзЗАд (поверхневий) -. б . антиген: середній - Рге- Білок о олонКи і утворює частинки поверхневого антигену в 4248 разом з 5; може придушувати імунну функцію
НВБАд (поверхневий Білок оболонки і утворює частинки поверхневого антигену антиген; великий - Рге-51 разом з 5; домен рге-з1 за езпечує ліганд для корови частинок в ході зборки вірусної оболонки; рецептор для я рге-52 -- 5) ні . у гепатоцитів; може придушувати імунну функцію
Трансактивація транскрипції; регуляція каскадів репарації
ДНК; підвищення цитозольних рівнів кальцію;
Х Х-антиген (НВХ) модулювання каскадів деградації білках модулювання прогресування клітинного циклу і каскадів проліферації клітин в клітині-хазяїні; стимуляція реплікації НВУ
Ген С кодує два близькоспоріднені антигени: білок масою 21 кДа, який називається "коровим білком" або "коровим антигеном" (НВсАд), який утворює вірусний капсид, і білок масою 17 кДа, який називається е-антигеном (НВело), який утворює димери, але не збирається в капсид.
Повнорозмірний коровий білок являє собою білок приблизно з 183 амінокислот, що містить всі, крім М-кінцевих 10 амінокислот е-антигену і містить приблизно 34 додаткові амінокислоти на С- кінці, які протеолітично розщеплюються при утворенні е-антигену. Іншими словами, коровий білок і е-антиген мають 149 загальні амінокислотні залишки (цей фрагмент іноді називають коровим антигеном гепатиту), але відрізняються М-кінцевими і С-кінцевими ділянками.
Прекоровий білок являє собою білок-попередник, що містить амінокислотну послідовність, яка включає послідовність як з корового антигену, так і з е-антигену, з якої утворюється е-антиген шляхом протеолітичного процесингу. Внутрішньоклітинний НВеАд включає залишки прекорового білка від -29 до -1 (нумерація залишків в цьому конкретному описі представлена так, що перший амінокислотний залишок корового білка в прекоровом білку, позначається як положення "1"), який містить сигнальну послідовність, яка направляє білок в ендоплазматичну мережу, де відщеплюються амінокислоти з -29 по -11; інше протеолітичне розщеплення між амінокислотами 149 і 150 видаляє С-кінцеву частину прекорового білка (яка присутня в повнорозмірному коровому білку), а потім НВедд, що залишився (що складається з амінокислот 203 -10 по -1 прекорового білка разом з амінокислотами 1-149 НВсАд або корового білка), секретується як е-антиген (Зіапаїпо еї аї., 1988, РМА5 БА 85: 8405-8409; Ой єї а!., 1986, РМАБ5
ИБА 83:1578-1582; Вгиб5 апа Сепісн, 1988, Мігоїюду 163:268-275; ТаКаНавні еї аї., 1983, 9.
Ітітипої. 130:2903-2907). НВелйо, що складається з повної прекорової ділянки, також зустрічається в сироватці людини (Такапазпі еї аїЇ.,, 1992, 9. Іттипої. 147:3156-3160). Як згадувалося, НВсАд (коровий білок) утворює димери, які збираються у вірусний капсид і містять полімеразу і вірусну ДНК або пгРНК. Функція НВело (е-антигену) невідома, однак він не потрібен для реплікації НВМ або інфекції, і вважають, що він є імунодепресивним фактором, який захищає НВУ від атаки імунної системи (Міїйсй еї аї., 1990, РМАБЗ ОА 87:6599-6603; Спе єї аім,, 2004, РМАБ БА 101:14913-14918; М/ієїапа апа Спізаїгі, 2005, 9. Мігї. 79:9369-9380). Для ясності, в послідовностях НВМУ, описаних в даному описі (наприклад, див. таблицю 3), передбачена послідовність прекорового білка з типових генотипів НВУМУ, і положення корового білка і е-антигену позначені в прекоровій послідовності так, що перша амінокислота прекорового білка позначена як положення 1.
Ген Р кодує ДНК-полімеразу (Рої) НВУ, яка складається з двох основних доменів, зв'язаних спейсером. М-кінцевий домен полімерази (який також називається "кінцевим білком" або ТР) залучений до упакування пгРНК і в здійснення затравки несмислового ланцюга ДНК. С-кінцевий домен являє собою зворотну транскриптазу (КТ), яка має активність РНК-ази Н (КН).
Ген 5 має множину ініціюючих кодонів і кодує три оболонкові білки (які також називаються в даному описі, головним чином, "поверхневим білком" або "поверхневим антигеном"), що позначаються як 5, М і Її, всі з яких є компонентами інфекційних вірусних частинок, також відомих як частинки бапе. 5, сам по собі, і разом з М і Г, також утворює частинки поверхневого антигену (НВЗАОЯ), які можуть секретуватися з інфікованих клітин у великих кількостях (Зеедег апа Мавзоп, 2000, Місгобріої!. Мої. Віої. Нем. 64(1):51-68; Веск, (2007), "Нерайів В мігиз геріїсабоп", умопіа дошигпаї ої Сзавігоепіегоїоду: УМОУЄ 13(1):48 64). Кодони для М і Г. розташовані приблизно на 165 (М) ї 489 (І) нуклеотидів, відповідно, вище ініцюючого кодона для 5. З або "малий" поверхневий антиген є найменшим і найбільш поширеним з поверхневих антигенів. Антитіла, які продукуються проти цього антигену, відображають сероконверсію у інфікованих індивідуумів. М або "середній" поверхневий антиген має додатковий білковий домен в порівнянні з 5, відомий як рге-52, і білюювий домен, який є унікальним для | або "великого" поверхневого антигену, відомий як рге-51 (таким чином, Г. також містить рге-52 і додаткову послідовність, що належить
М ї 5). Рге-51 містить домен вірусного рецептора для гепатоцитів (ділянка зв'язування для рецептора гепатоцитів), який розташований приблизно між положеннями амінокислот 21 і 47 рге-51. Епітопи в рге-51 можуть індукувати нейтралізуючі вірус антитіла. Крім того, рге-51 домен забезпечує ліганд для корових частинок в ході збирання вірусної оболонки. Частинки поверхневого антигену (НВ5Ад) також можуть придушувати елімінацію імунною системою інфікованих клітин шляхом функціонування як толероген у високій дозі (Кеїдпаї еї аї., 2002, 95.
Ехр. Мей. 195:1089-1101; МУ/ерзтег єї а!., 2004, У. Мігої. 78:5707-5719).
Ген Х кодує Х-антиген (НВх) (який також називають "Х-білком"), який залучений в транскрипційну трансактивацію, регуляцію каскадів репарації ДНК, підвищення рівнів кальцію в цитозолі, модулювання каскадів деградації білків, і модулювання прогресування клітинного циклу і каскадів проліферації клітин в клітині-хазяїні (Сеатпай еї аї.,, 2010, 9. Мігої.), які посилюють стимуляцію реплікації НВУ. НВх також пов'язаний з розвитком раку печінки (Кіт еї а!І., Майте 1991, 351:317-320; Теїтадійоз єї а!І., Опсодепе 1997, 14:395-404).
НВМ зустрічається як один з чотирьох основних серотипів (айдг, адм, ауг, аум/), які визначаються, виходячи з антигенних епітопів в їх білках оболонки. Існує вісім різних генотипів
НВМ (А-Н), виходячи з варіацій нуклеотидної послідовності в геномі. Географічний розподіл генотипів представлений в таблиці 2 (Кгатмі5 еї аїЇ.,, 2005, Массіпе 23(19):2409-2423; Мадпійв5 апа Могаеєг, 1995, Іпіегмігоїюду 38(1-2):24-34; ЗаКатоїо єї аї., 2006, У. Сп. Міго!. 87:1873-1882; т еїаї., 2006, Іпі. У. Мед. 5сі. 3:14-20).
Таблиця 2
Центральна Америка, США (Каліфорнія)
Послідовності нуклеїнових кислот і амінокислотні послідовності для генів НВМ і білків, що кодуються ними, відомі в даній галузі для кожного з відомих генотипів. У таблиці З представлене відсилання на ідентифікатори послідовностей для ілюстративних (репрезентативних) амінокислотних послідовностей всіх зі структурних і неструктурних білків
НВМ в кожному з восьми відомих генотипів НВУМ, і, крім того, вказане положення певних структурних доменів. Потрібно зазначити, що між різними ізолятами вірусів можуть зустрічатися невеликі відхилення в амінокислотній послідовності одного і того ж білка або домену з одного і того ж генотипу НВМ. Однак, як розглянуто вище, штами і серотипи НВМ їі генотипи НВМ виявляють високу амінокислотну ідентичність навіть між серотипами і генотипами (наприклад, див. таблицю 4). Таким чином, з використанням посібника, представленого в даному описі, і вказівки ілюстративних послідовностей НВМ, фахівець в даній галузі буде здатний легко отримати різні білки на основі НВУ, включаючи злиті білки, з будь-якого штаму (ізоляту) НВМ, серотипу або генотипу, для застосування в композиціях і способах за даним винаходом, і по суті, винахід не обмежується конкретними послідовностями, описаними в даному описі. Вказівка на білок НВМ або антиген НВМ де-небудь в даному описі, або на їх будь-який функціональний, структурний або імуногенний домен, може бути відповідним чином здійснена шляхом відсилання на конкретну послідовність з однієї або декількох з послідовностей, представлених в даному описі, або шляхом відсилання на ту ж саму, схожу або відповідну послідовність з іншого ізоляту (штаму) НВУ.
Таблиця З
Організм, Генотип, Ген Білок Ідентифікатор послідовності (Мо доступу в базу даних)
Прекоровий білок (Ме Доступу ААХВЗОВВ 1)
НВУ, Генотип А, С шо -- - - - Коровий білок(НВсАад) Положення 30/31-212 5БЕО ІЮ МО 1 - е-антиген (НВедад) "Положення 20-178 ЗЕО І МО: 1
НВУ, Генотип А, Р (Мо доступу ВАІ81985) «Положення 383-602 5ЕО ІЮ МО:2
Поверхневий НВ5до () (Ме доступу ВАОФ1280.1)
НВУ, Генотип А, 5 Поверхневий НВ5АЗ9 (М) "Положення 120-400 ЕС 10 МОЗ
Поверхневий НВзАа (5) "Положення 175-400 5ЕО І МО:З
ЗЕО І МОА
НВУ, Генотип А, Х Хх (НВХ) (Ме доступу ААКУ7189.1) ни"
Прекоровий білок (Ме доступу ВАОЗООБТ)
НВУ, Генотип В, С ш- я- - - Коровий білок(НВсАад) Положення 30/31-212 5ЕО ІЮ МО:5 - е-антиген (НВедад) "Положення 20-178 ЗЕО І МО:5 . ЗЕО ІЮ МО:6
НВУ, Генотип В, Р Мо доступу ВАЮ90068.1 "Положення 381-600 5ЕО ІЮ МО:6
Поверхневий НВ5до () (Ме доступу ВАШОЄЄЗА 1)
НВУ, Генотип В, 5 Поверхневий НВ5АЗ9 (М) "Положення 120-400 ЕС 10 МО 7
Поверхневий НВзАа (5) "Положення 175-400 5ЕО ІЮ МО:7
ЗЕО ІЮ МО:8
НВУ, Генотип В, Х Хх (НВХ) (Ме доступу ВАО90066 1) нквшЬюшд Винний
Прекоровий білок (Ме доступу УР 355335)
НВМУ, Генотип С, С ст хе - : - Коровий білок(іНВсАа) Положення 30/31-212 5ЕО Ір МО:9 - е-антиген (НВедо) "Положення 20-178 ЗЕО І МО:9 . ЗЕО Ір МОТО «Положення 381-600 5ЕО ІЮ МО:10
Поверхневий НВ5АЯ (/) (Ме ДОСТУПУ ВА обба6 1)
НВУ, Генотип С, 5 Поверхневий НВ5АЗ9 (М) "Положення 120-400 ЕС 10 МО-11
Поверхневий НВзАа (5) "Положення 175-400 5ЕО ІЮ МО:11
ЗЕО Ір МОЗ2
НВУ, Генотип С, Х Х (НВХ) (Ме доступу ВА.О6639 1)
Продовження таблиці З нйвєЬшхХиинннннннннншш яд ЗЕО ІЮ МОЗ
ВУ Генотип О С Прекоровий білок (Ме доступу АОЕ29260.1) ' ' - Коровий білок(іНВсАа) "Положення 30/31-212 5ЕО 10 МО: 13 - е-антиген (НВедо) "Положення 20-178 5ЕО ІЮ МОЗ
НВУ, Генотип 0, Р й (Мо доступу АЮО12642.1) «Положення 370-589 5ЕО 1 МО: 14 . ЗЕО ІО МО:15
ВУ Генотип О Поверхневий НВ5до (І) (Ме доступу АСР2О363.1) ' ' Поверхневий НВзАа (М) "Положення 109-389 5ЕО ІЮ МО:15
Поверхневий НВзАа (5) "Положення 164-389 5ЕО ІЮ МО:15
ЗЕО ІО МО:16
НВУ, Генотип 0, Х Х (НВХ) (Ме доступу ВАЕ47226 1) ннвьшьвжаЧсниниининининининининннннннннш яд ЗЕО ІО МО:17
ВУ ГенотипЕ С Прекоровий білок (Ме доступу АСИ25047 1) ' ' - Коровий білок(іНВсАа) "Положення 30/31-212 5ЕО І МО:17 - е-антиген (НВедо) "Положення 20-178 ЗЕО І МО 17 . ЗЕО ІО МО:18
НВУ, Генотип Е, Р (Мо доступу АСО89764.1) «Положення 380-599 5ЕО ІЮ МО:18 . ЗЕО ІЮ МО:19
ВУ ГенотипЕ 8 Поверхневий НВздло () Ме доступу ВАО91274.1 "бвнотип Є, Поверхневий НВ5Ад (М "Положення 119-399 БЕО 1 МО-19
Поверхневий НВзАад (5 "Положення 174-399 5ЕО ІЮ МО:19
ЗЕО ІЮ МО:20
НВУ, Генотип Е, Х Х (НВХ) (Ме доступу АСИ24870 1) н"ьЕжиннинининининиинниннннншш яд ЗЕО ІЮ МОС21
ВУ ГенотипЕ С Прекоровий білок (Ме доступу ВАВ17946 1) ' ' - Коровий білок(іНВсАа) "Положення 30/31-212 5ЕО 10 МО:21 - е-антиген (НВедо) "Положення 20-178 ЗЕО І МО 21
НВУ, Генотип Е, Р й (Мо доступу АСОО3788.2) «Положення 381-600 5ЕО 1Ю МО:22 . ЗЕОІЮ МОС23
ВУ Генотип Е Поверхневий НВ5до (І) (Ме доступу ВАСУ8933.1) ' ' Поверхневий НВзАа (М) "Положення 120-400 5ЕО 10 МО23
Поверхневий НВзАа (5) "Положення 175-400 5ЕО ІЮ МО23
ЗЕО ІО МО:24
НВУ, Генотип Е, Х Х (НВХ) (Ме доступу ААМО9054.1) ни" яд ЗЕО ІЮ МОС25
ВУ Генотип С С Прекоровий білок (Ме доступу АБОб62622 1) " ' - Коровий білок(іНВсАа) "Положення 14-194 5ЕО ІЮ МО 25 - е-антиген (НВедо) "Положення 4-161 5ЕО ІЮ МО:25 . ЗЕОІЮ МОС26
НВУ, Генотип 0, Р (Мо доступу АЮОб62619.1) «Положення 380-599 5ЕО 1Ю МО:26 . ЗЕО ІО МОС:27
ВУ Генотип С. 5 Поверхневий НВ5до (І) (Ме доступу АБОб62620 1) ' ' Поверхневий НВзАа (М) "Положення 119-399 5ЕО ІЮ МО:27
Поверхневий НВзАа (5) "Положення 174-399 5ЕО ІЮ МО:27
ЗЕОІЮ МОС:28
НВУ, Генотип 0, Х Х (НВХ) (Ме доступу ВАВ82400.1)
Продовження таблиці З нйнньркичи7,шннннннннннншн ді ЗЕО І МО:29 . ЗЕО ІЮ МО:30
НВ. Генотип Н. 5 й (Мо доступу ВАЕ20065.1)
ЗЕО І МО:32 "Нумерація положень є приблизною і може включати додаткові амінокислоти, фланкуючі вказане положення з будь-якого боку
Антигени вірусу гепатиту В ії конструкції. Один з варіантів здійснення винаходу стосується нових антигенів НВМ і злитих білків і рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот, які кодують ці антигени і білки. У даному описі описано декілька різних нових антигенів НВМ для застосування в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів або іншій композиції (наприклад, іншій імунотерапевтичній або діагностичній композиції), яка надає один або декілька (два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять або більше) антигенів і/або імуногенних доменів з одного або декількох білків, всі з яких містяться в одному і тому ж злитому білку і кодуються однією і тією ж рекомбінантною конструкцією нуклеїнової кислоти (рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти). Антигени, що використовуються в композиціях за винаходом, включають щонайменше один білок НВМ або його імуногенний домен для імунізації тварини (профілактично або терапевтично). Композиція може включати один, два, три, чотири, декілька, декілька або множину антигенів НВМ, включаючи один, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять або більше імуногенних доменів з одного, двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести, семи, восьми, дев'яти, десяти або більше імуногенних доменів одного, двох, трьох, чотирьох або більше білків НВУ. У деяких варіантах здійснення антиген являє собою злитий білок. У одному з аспектів винаходу злитий білок може включати два або більше білків. У одному з аспектів злитий білок може включати два або більше імуногенних доменів і/або два або більше епітопів одного або декількох білків. Імунотерапевтична композиція, яка містить такі антигени, може забезпечити антигенспецифічну імунізацію у широкого діапазону пацієнтів. Наприклад, антиген або злитий білок що охоплюються винаходом, можуть включати щонайменше частину або повну довжину будь-якого одного або декількох білків НВУ, вибраних з: поверхневого білка НВМ (який також називається поверхневим антигеном або білком оболонки або НВ5Ад), що включає велику (ГУ), середню (М) і/або малу (5) форми поверхневого білка, і/або його домени рге-51 і/або рге-52; прекорового білка НВУ; корового білка НВМ (який також називається коровим антигеном або НВсАд); е-антигену НВМ (який також називається НВело); полімерази НВМ (включаючи один або обидва домени полімерази, які називаються ВТ-доменом і ТР-доменом); Х-антигену
НВМУ (який також називається Х, Х-антигеном або НВУ); і/або будь-якого одного або декількох імуногенних доменів будь-якого одного або декількох з цих білків НВМ. У одному з варіантів здійснення антиген, прийнятний в імунотерапевтичній композиції за винаходом, походить з одного білка НВМ (повнорозмірний, практично повнорозмірний або його частина, що містить щонайменше один, два, три, чотири або більше імуногенних доменів повнорозмірного білка). У одному з варіантів здійснення винаходу імунотерапевтична композиція включає один, два, три, чотири, п'ять або більше окремих дріжджових носіїв, кожний з яких експресує або містить відмінний антигенси) НВУ.
Комбінації антигенів НВУ, прийнятні для даного винаходу, включають, але не обмежуються ними (в будь-якому порядку в злитому білку): (1) поверхневий білок (Її, М і/або 5, і/або будь-який один або комбінацію його функціональних і/або імунологічних доменів, включаючи, але не обмежуючись ними, рге-51 іабо рге-52 і/або розпізнаваний рецепторами гепатоцитів домен рге-51) в комбінації з будь- яким одним або декількома з: (а) прекоровий/коровий/е (прекоровий антиген, коровий антиген,
Зо е-антиген і/або будь-який один або комбінація їх функціональних і/або імунологічних доменів); (Б) полімераза (повнорозмірна, КТ-домен, ТР-домен і/або будь-який один або комбінація її функціональних і/або імунологічних доменів); і/або (с) Х-антиген (або будь-який один або комбінація його функціональних і/або імунологічних доменів); (2) прекоровий/коровий/е (прекоровий антиген, коровий антиген, е-антиген і/або будь-який один, або комбінація їх функціональних і/або імунологічних доменів) в комбінації з будь-яким одним або декількома з: (а) поверхневий білок (І, М і/або 5, і/або будь-який один або комбінація його функціональних і/або імунологічних доменів, включаючи, але не обмежуючись ними, рге-51 мМабо рге-52, і/або розпізнаваний рецепторами гепатоцитів домен рге-51); (Б) полімераза (повнорозмірна, КТ-домен, ТР-домен і/або будь-який один або комбінація її функціональних іабо імунологічних доменів); і/або (с) Х-антиген (або будь-який один або комбінація його функціональних і/або імунологічних доменів); (3) полімераза (повнорозмірна, КТ-домен, ТР-домен і/або будь-який один або комбінація її функціональних і/або імунологічних доменів) в комбінації з будь-яким одним або декількома з: (а) поверхневий білок (І, М і/або 5, і/або будь-який один або комбінація його функціональних іабо імунологічних доменів, включаючи, але не обмежуючись ними, рге-51 і/або рге-52 і/або розпізнаваний рецептором гепатоцитів домен рге-51); (5) прекоровий/коровий/е (прекоровий антиген, коровий антиген, е-антиген і/або будь-який один або комбінація їх функціональних і/або імунологічних доменів); і/або (с) Х-антиген (або будь-який один або комбінація його функціональних і/або імунологічних доменів); або (4) Х-антиген (або будь-який один або комбінація його функціональних і/або імунологічних доменів) в комбінації з будь-яким одним або декількома з: (а) поверхневий білок (І, М і/або 5, іМабо будь-який один або комбінація його функціональних і/або імунологічних доменів, включаючи, але не обмежуючись ними, рге-51 і/або рге-52 і/або розпізнаваний рецептором гепатоцитів домен рге-51); (5) полімераза (повнорозмірна, КТ-домен, ТР-домен і/або будь-який один або комбінація її функціональних і/або імунологічних доменів); і/або (с) прекоровий/коровий/е (прекоровий антиген, коровий антиген, е-антиген і/або будь-який один або комбінація їх функціональних і/або імунологічних доменів).
Рекомбінантні молекули нуклеїнових кислот і білки, що кодуються ними, включаючи злиті білки, як один варіант здійснення винаходу можна використовувати в імунотерапевтичних композиціях на основі дріжджів, або для будь-якого іншого відповідного призначення для антигену(ів) НВМ, в тому числі в аналізі іп міго, для продукування антитіл або в іншій імунотерапевтичній композиції, що включає іншу вакцину, яка не основана на імунотерапії на основі дріжджів, описаній в даному описі. Експресія білків дріжджами є одним з переважних варіантів здійснення, хоч можна використовувати інші експресуючі системи для отримання білків для застосувань, відмінних від імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів.
Відповідно до даного винаходу, загальне використання в даному описі терміну "антиген" стосується: будь-якої частини білка (пептиду, неповного білка, повнорозмірного білка), де білок є природним або отриманим синтетичним шляхом, клітинної композиції (ціла клітина, клітинний лізат або зруйновані клітини), організму (цілий організм, лізат або зруйновані клітини) або вуглеводу, або іншої молекули, або її частини. Антиген може індукувати антигенспецифічну імунну відповідь (наприклад, гуморальну і/або клітинно-опосередковувану імунну відповідь) проти нього самого або схожих антигенів, які виявляються елементом імунної системи (наприклад, Т-клітинами, антитілами).
Антиген може являти собою тільки одиничний епітоп, одиничний імуногенний домен або він може бути більшим, і він може включати декілька епітопів або імуногенних доменів. По суті, розмір антигену може становити тільки 8-12 амінокислот (тобто пептид) і аж яадо: повнорозмірного білка, мультимера, злитого білка, химерного білка, цілої клітини, цілого мікроорганізму або будь-яких його частин (наприклад, лізати цілих клітин або екстракти мікроорганізмів). Крім того, антигени можуть включати вуглеводи, які можуть бути додані до дріжджового носія або в композицію за винаходом. Буде зрозуміло, що в деяких варіантах здійснення (наприклад, коли антиген експресується дріжджовим носієм з рекомбінантної молекули нуклеїнової кислоти), антиген являє собою, злитий білок, химерний білок або їх фрагмент, а не цілу клітину або мікроорганізм.
Коли антиген експресують в дріжджах, антиген має мінімальний розмір, при якому він може рекомбінантно експресуватися в дріжджах, і, як правило, він має довжину щонайменше або більше 25 амінокислот, або щонайменше або більше 26, щонайменше або більше 27, щонайменше або більше 28, щонайменше або більше 29, щонайменше або більше 30, щонайменше або більше 31, щонайменше або більше 32, щонайменше або більше 33, 60 щонайменше або більше 34, щонайменше або більше 35, щонайменше або більше 36,
щонайменше або більше 37, щонайменше або більше 38, щонайменше або більше 39, щонайменше або більше 40, щонайменше або більше 41, щонайменше або більше 42, щонайменше або більше 43, щонайменше або більше 44, щонайменше або більше 45, щонайменше або більше 46, щонайменше або більше 47, щонайменше або більше 48, щонайменше або більше 49, або щонайменше або більше 50 амінокислот, або його довжина складає щонайменше 25-50 амінокислот, щонайменше 30-50 амінокислот, або щонайменше 35- 50 амінокислот, або щонайменше 40-50 амінокислот, або щонайменше 45-50 амінокислот.
Можуть бути експресовані білки менших розмірів і можуть бути експресовані значно більші білки (наприклад, довжиною сотні амінокислот або навіть декілька тисяч амінокислот). У одному з аспектів може експресуватися повнорозмірний білок, або його структурний або функціональний домен, або його імуногенний домен, який позбавлений однієї або декількох амінокислот з М- іабо С-кінця (наприклад, позбавлений від приблизно 1 до приблизно 20 амінокислот з М- і/або
С-кінця). Злиті білки і химерні білки також являють собою антигени, які можуть експресуватися в рамках даного винаходу. "Антиген-мішень" являє собою антиген, на який специфічно націлена імунотерапевтична композиція за винаходом (тобто антиген, проти якого є бажаною індукція імунної відповіді). "Антиген НВ" являє собою антиген, що походить, сконструйований або отриманий з одного або декількох білків НВУ, так що націлювання на антиген також націлене на вірус гепатиту В.
При вказівці на стимуляцію імунної відповіді, термін "імуноген" є різновидом терміну "антиген", і, таким чином, в деяких випадках, його можна використовувати взаємозамінно з терміном "антиген". Імуноген, як використовують в рамках винаходи, описує антиген, який індукує гуморальну і/або клітинно-опосередковувану імунну відповідь (тобто є імуногенним), так що введення імуногену індивідууму індукує антигенспецифічну імунну відповідь проти того ж або схожих антигенів, які зустрічає імунна система індивідуума. У одному з варіантів здійснення імуноген індукує клітинно-опосередковувану імунну відповідь, включаючи СО4: Т-клітинну відповідь (наприклад, ТНІ, ТН2 і/або ТНІ17) і/або СО8- Т-клітинну відповідь (наприклад, СТІ - відповідь). «Імуногенний домен" даного антигену може являти собою будь-яку частину, фрагмент або епітоп антигену (наприклад, пептид фрагмент або субодиниця, або епітоп антитіла, або інший конформаційний епітоп), які містять щонайменше один епітоп, який діє як імуноген при введенні тварині. Таким чином, імуногенний домен більший, ніж одинична амінокислота, і має розмір, щонайменше достатній для того, щоб він містив щонайменше один епітоп, який може діяти як імуноген. Наприклад, одиничний білок може містити множину різних імуногенних доменів.
Імуногенні домени не обов'язково повинні являти собою лінійні послідовності в білку, як наприклад, у випадку гуморального імунної відповіді, де передбачаються конформаційні домени. "Функціональний домен" даного білка являє собою частину або функціональний елемент білка, який включає послідовність або структуру, які прямо або опосередковано відповідальні за щонайменше одну біологічну або хімічну функцію, пов'язану з білюом, що приписується йому або виконується ним. Наприклад, функціональний домен може включати активний центр для ферментативної активності, ділянку зв'язування ліганду, ділянку зв'язування рецептора, ділянку зв'язування для молекули або частини, такої як кальцій, ділянку фосфорилування або домен трансактивації. Приклади функціональних доменів НВМ включають, але не обмежуються ними, вірусний розпізнаваний рецепторами гепатоцитів домен рге-51, або домен зворотної транскриптази або домен РНКази Н в полімеразі. "Структурний домен" даного білка є частиною білка або елементом загальної структури білка, який має структуру (наприклад, це може бути первинна або третинна структура, що належить і вказує на декілька білків в класі або сімействі білків), що піддається ідентифікації, є самостабілізованим і/або може згортатися незалежно від іншої частини білка. Структурний домен пов'язаний з або визначає значною мірою біологічну функцію білка, якому він належить.
Епітоп визначають в даному описі як одиничну імуногенну ділянку в даному антигені, яка є достатньою для індукції імунної відповіді, коли вона надається імунній системі в контексті відповідних костимуляторних сигналів і/або активованих клітин імунної системи. Іншими словами, епітоп є частиною антигену, яка насправді розпізнається компонентами імунної системи, і також він може називатися антигенною детермінантою. Фахівцям в даній галузі буде зрозуміло, що Т-клітинні епітопи відрізняються по розміру і складу від В-клітинних або антитільних епітопів, і що епітопи, що представляються через каскад МНС класу І, відрізняються по розміру і структурних ознаках від епітопів, що представляються через каскад МНС класу ІІ.
Наприклад, Т-клітинні епітопи, що представляються молекулами МНС класу І, як правило, 60 мають довжину 8-11 амінокислот, в той час як епітопи, що представляються молекулами МНС класу ІЇ, менш обмежені по довжині і можуть мати довжину від 8 амінокислот аж до 25 амінокислот або більше. Крім того, Т-клітинні епітопи мають передбачені структурні характеристики, що залежать від конкретних молекул МНС, що зв'язуються епітопом. Множина різних Т-клітинних епітопів ідентифікована в різних штамах НВМ і для багатьох типів НА людини, деякі з яких представлені в таблиці 5. Крім того, в рамках даного винаходу були знову відкриті епітопи для певних гаплотипів МНС миші і вони також представлені в таблиці 5 або в розділі "Приклади". Епітопи можуть являти собою епітопи з лінійною послідовністю або конформаційні епітопи (консервативні зв'язувальні області). Більшість антитіл розпізнають конформаційні епітопи.
Один ілюстративний варіант здійснення винаходу стосується злитого білка, що містить антиген НВМ, який являє собою мультибілюовий антиген НВМ і, в цьому прикладі, злиту конструкцію, яка складається з великого (І) поверхневого антигену НВМ, що включає всі гідрофобні трансмембранні домени, і корового антигену (НВсСАд), детально описаного нижче.
Поверхневий антиген і коровий антиген у великій кількості експресуються в інфікованих клітинах, потрібні для реплікації вірусу і містять множину СО4» ії СО8: Т-клітинних епітопів. Крім того, ці антигени, зокрема, поверхневий антиген, містять відомі ділянки мутації, які можуть індукуватися противірусною терапією; ці ділянки, таким чином, можна модифікувати, при необхідності, для забезпечення додаткових імунотерапевтичних композицій для націлювання на мутації, що забезпечують "вислизання". Додатковою перевагою націлювання на ці білки, і, зокрема, на обидва білки в одній імунотерапевтичній композиції, є високий ступінь консервативності на рівні амінокислот серед різних генотипів НВМ. Як коровий, так і поверхневий (ГІ) білки є у високому ступені консервативними, наприклад, між генотипами А і С
НВУ або між А і Н (див. таблицю 4), які являють собою генотипи, переважаючі в Америці і Азії (таблиця 2). Коровий білок виявляє 9595 ідентичність амінокислот між генотипами А і С і між генотипами А і Н. Великий (І) поверхневий білок також у високому ступені консервативний серед різних генотипів НВУ; 9095 ідентичність амінокислот існує між генотипами А і С, і 8290 ідентичність амінокислот існує між генотипами А і Н.
Таблиця 4 антиген антиген сенотипА НВМопротигенотипуС НВМІ! 95 | 90 2 Б 1 | 89 | 9 /
Таким чином, можна очікувати, що одна імунотерапевтична композиція, створена з використанням одного генотипу НВУ, буде індукувати ефективну імунну відповідь проти високо схожого генотипу НВУ, або шляхом прямого націлювання на консервативні епітопи, або шляхом поширення епітопа внаслідок первинного націлювання на епітопи, які є консервативними між генотипами. Альтернативно, внаслідок простоти отримання імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів за винаходом, їх послідовність можна без великих зусиль модифікувати, щоб вони кодували білок, домен або епітоп з відрізняючого генотипу, або щоб вони включали в тій же конструкції інші Т-клітинні епітопи або цілі домени і/або білки з двох або більше різних генотипів НВМ, для збільшення широкої застосовності імунотерапії. Приклади таких антигенів
НВМ детально описані і проілюстровані нижче. Хоч одна імунотерапевтична композиція за даним винаходом сконструйована для націлювання на два антигени НВМ - поверхневий і коровий білок, в одному продукті, цей підхід можна легко розширити шляхом включення білкових послідовностей інших необхідних, консервативних і імуногенних білків вірусу НВМ, щоб досягнути ще більш широких клітинних імунних відповідей. Такі додаткові злиті білки і імунотерапевтичні композиції описані і проілюстровані в даному описі.
У одному з варіантів здійснення винаходу антиген(и) НВМ для застосування в композиції або способі за винаходом вибрані з антигенів НВУ, які сконструйовані так, щоб оптимізувати або посилити їх корисність як клінічних продуктів, в тому числі в контексті імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів. Такі антигени НВМ сконструйовані для отримання імунотерапевтичного продукту проти НВМ на основі дріжджів, який досягає однієї або декількох з наступних цілей: (1) відповідність рекомендаціям Кесотбіпапі ОМА Аймізогу СоттіЦеє (КАС) в Маїйопаї Іпзійшез ої Неакйй (МІН), по яких не більш двох третин (2/3) інфекційного агента можна використовувати в рекомбінантному терапевтичному засобі або вакцині; (2) включення максимальної кількості відомих Т-клітинних епітопів, пов'язаних з імунною відповіддю на гострі/самообмежувальні інфекції НВМ і/або хронічні інфекції НВМ (в одному з аспектів з пріоритетом репертуару епітопів гострої/самообмежувальної інфекції, як розглянуто нижче); (3) максимізація або пріоритет включення імуногенних доменів і, більш конкретно, Т-клітинних епітопів (СО4- і/або СОВ8- епітопів, і домінантних і/або субдомінантних епітопів), які найбільш консервативні серед генотипів і/або підгенотипів НВМ, або які можна легко модифікувати в консенсусну послідовність або включати в двох або білоше формах, щоб охопити найбільш важливі відмінності послідовностей серед генотипів-мішеней; і/або (4) мінімізація кількості неприродних ділянок з'єднання в послідовності антигену НВМУ в продукті.
Таким чином, в деяких варіантах здійснення винахід включає модифікацію антигенів НВМ від їх природних послідовностей або послідовностей дикого типу в даному штамі так, щоб вони задовольняли один або декілька з критеріїв, розглянутих вище, а також щоб вони включали елементи конструкції і/або критерії конструювання антигену, описані в інших розділах даного опису. Такі критерії і рекомендації по конструюванню антигену застосовні до імунотерапевтичних засобів на основі дріжджів, які містять антигени НВУ, які являють собою індивідуальні білки або домени НВУ, а також антигени НВУ, які включають комбінації білків або доменів НВУ, і, зокрема, мультибілкові антигени/злиті білки (наприклад, антигени НВМ з двох або більше різних білків НВМ і/або їх доменів, такі як комбінації антигенів поверхневого білка, полімерази, корового білка, е-антигену і/або Х-антигену НВМ). Буде зрозуміло, що по мірі збільшення комплексності антигену НВУ, при конструюванні антигену використовується більша кількість цих критеріїв.
Таким чином, в одному з варіантів здійснення винаходу антиген НВУ, придатний в даному винаході як білок або злитий білок, призначений для експресії дріжджами, включає послідовності НВМ, що кодуються нуклеотидними послідовностями, які відповідають менше ніж двом третинам (2/3) генома НВМ (тобто антигени кодуються послідовностями нуклеїнових кислот, які загалом складають менше двох третин (2/3) генома НВМ або задовольняють вимоги
ЕАС для рекомбінантних терапевтичних і профілактичних засобів). У одному з аспектів цей варіант здійснення може бути досягнутий шляхом вибору антигенів НВМ для експресії в імунотерапевтичних засобах на основі дріжджів, які задовольняють вимоги КАС відносно їх повнорозмірної або практично повнорозмірної форми (наприклад, Х-антиген є невеликим і при використанні окремо задовольняє вимоги КАС). У іншому аспекті цей варіант здійснення досягається шляхом модифікації структури білка(ів) і/або домену(ів), які підлягають включенню в антиген НВУ, як наприклад, шляхом делеції послідовності для укорочення білків і видалення внутрішніх послідовностей з білків, шляхом включення тільки вибраних функціональних, структурних або імуногенних доменів білка, або шляхом вибору повної відміни включення конкретного білка в антигенну конструкцію. Крім того, імунотерапевтичні засоби проти НВМ на основі дріжджів в одному з варіантів здійснення можна отримувати як окремі антигени конструкції, а потім використати в комбінації так, щоб це не суперечило яким-небудь обмеженням, пов'язаним з вірусним геномом.
У іншому варіанті здійснення винаходу, як розглянуто вище, включення Т-клітинних епітопів в антигенну конструкцію НВМ (білок або злитий білок) максимізують, наприклад, якщо антиген
НВУ, включений в імунотерапевтичний засіб, модифікований так, щоб він задовольняв інші принципи конструювання, такі як вимоги КАС, розглянуті вище. У цьому варіанті здійснення антигени НВМ, прийнятні в імунотерапевтичних засобах на основі дріжджів, модифікують з метою максимізації кількості імуногенних доменів, і в одному з аспектів кількості Т-клітинних епітопів, які зберігаються в антигені НВУ. У одному з аспектів включення Т-клітинних епітопів в антиген НВМ має наступний пріоритет:
Епітопи, ідентифіковані при імунних відповідях як на гострі/самообмежувальні інфекції НВМ, так і на хронічні інфекції НВМ о» епітопи, ідентифіковані при імунній відповіді на гострі/самообмежувальні інфекції НВМ » епітопи, ідентифіковані при імунній відповіді на хронічні інфекції НВМ.
У цьому варіанті здійснення без зв'язку з теорією, автори винаходу вважають, що імунні відповіді індивідуумів, які мали гострі або самообмежувальні інфекції НВМУ, можуть бути більш продуктивними відносно усунення вірусних інфекцій, ніж імунні відповіді індивідуумів, які мають хронічні інфекції НВУ. Таким чином, включення Т-клітинних епітопів, які, ймовірно, пов'язані з кліренсом вірусу при цих гострих або самообмежувальних інфекціях (як домінантних, так і субдомінантних) є пріоритетним, оскільки вони з більшою імовірністю викличуть сприятливу імунну відповідь у імунізованого індивідуума. Крім того, і знову без зв'язку з теорією, автори винаходу вважають, що індукування імунної відповіді проти одного або декількох антигенів- мішеней НВМ з використанням імунотерапії на основі дріжджів, може забезпечити імунну відповідь у імунізованого індивідуума не тільки проти епітопів, включених в імунотерапевтичні 60 засоби на основі дріжджів, але також проти інших епітопів НВМ, присутніх у індивідуума. Це явище, яке називається "поширенням епітопів" дозволяє конструювати антигени НВУ, які сфокусовані на епітопах, які, ймовірно, в найбільшій мірі пов'язані з терапевтичною користю, а потім механізм дії імунотерапевтичного продукту на основі дріжджів дозволяє імунній системі розширити імунну відповідь для охоплення додаткових епітопів-мішеней, тим самим посилюючи терапевтично продуктивну або сприятливу імунну відповідь проти НВУ.
Таким чином, в одному з варіантів здійснення антиген НВМ містить один або декілька епітопів СТІ. (наприклад, епітопи, які розпізнаються Т-клітинним рецептором цитотоксичного Т- лімфоцита (СТІ), коли вони представляються в контексті відповідної молекули МНС класу І). У одному з аспектів антиген НВМ містить один або декілька епітопів СО4- Т-клітин (наприклад, епітопи, які розпізнаються Т-клітинним рецептором СО4: Т-клітини в контексті відповідної молекули МНС класу ІІ). У одному з аспектів антиген НВМ містить один або декілька епітопів
СТІ ії один або декілька епітопів СО4- Т-клітин. У одному з аспектів антиген НВУ, придатний в імунотерапевтичній композиції за винаходом, містить один або декілька з ілюстративних епітопів СТІ з НВМ, описаних в таблиці 5. Фахівець в даній галузі буде здатний легко ідентифікувати положення відповідної послідовності для кожного епітопа в таблиці 5 в даній послідовності НВМ будь-якого генотипу, підгенотипу, або штаму/ізоляту, з урахуванням рекомендацій, приведених нижче, навіть незважаючи на те, що деякі амінокислоти можуть відрізнятися від амінокислот в таблиці 5. Приклади таких відмінностей проілюстровані в таблиці 5. Винахід не обмежується антигенами, що містять ці епітопи, оскільки інші епітопи стануть відомі в даній галузі і передбачається, що вони застосовні в даному винаході. У одному з варіантів здійснення епітоп може бути модифікований так, щоб він відповідав послідовності епітопа в даному генотипі, підгенотипі або штамі/ізоляті НВУ, оскільки може існувати одна або декілька амінокислотних відмінностей в цих епітопах серед генотипів, підгенотипів або штамів/ізолятів.
Таблиця 5 послідовності
Поверхневий антиген (наприклад, положення 20-28 5; наприклад, які відповідають
ЕС ТАІСТІаеЗ ЗЕО І МО:42 положенням 194-202 5ЕО ІЮ МО:11,| А"0201 положенням 201-209 5ЕО ІО МО:34, або положенням 51-59 5ЕО ІО
МО:З6
Поверхневий антиген (наприклад, положення 185-194 5; наприклад, які відповідають
СІ 5РТУМ/І 59 ЗЕО І МО:43 положенням 359-368 5ЕО ІЮ МО:11,| А"0201 положенням 366-375 5ЕО ІЮ МО:34, або положенням 216-2257 5ЕО І
МО:З6
Коровий антиген (наприклад, положення 47-56 прекорового антигену; наприклад,
ЕСРБОБЕРБІ2ЗА ЗЕО ІЮ МО:44 які відповідають положенням 47-56 А"0201
ЗЕО ІЮО МО:9, положенням 424-433 5ЕО ІЮО МО:34, або положенням 621-630 5ЕО 10 МО:36
Полімераза (наприклад, положення 575-583 Рої; й о наприклад, які відповідають) ,
РШ-ВІ-ВІНІ- ЗО о МО 45 положенням 573-581 5ЕО ІЮ МО:10, АТО201 або положенням 486-494 5ЕО ІО
МО:З6
Продовження таблиці 5
Поверхневий антиген (наприклад, положення 172-180 5; наприклад, які відповідають
МІ БІГ МРЕМ" З» ЗЕО І МО:46 положенням 346-354 5ЕО ІЮ МО:11,| А"0201 положенням 353-3611 5ЕБЕО І
МО:34, або положенням 203-211
ЗЕО ІЮ МО:З6
Полімераза о (наприклад, положення 756-764 Рої; ,,
КМТЗЕРМІ. ЗЕО ІЮ МО:47 наприклад, які відповідають А"2402 положенням 756-764 5ЕО ІЮ МО:10
Коровий антиген (наприклад, положення 117-125 прекорового білка; наприклад, які мУиМмУММа ке ЗЕО ІЮ МОС:48 відповідають положенням 117-125 А"1101
ЗЕО ІЮО МО:9, положенням 494-502 5ЕО ІЮО МО:34, або положенням 691-699 5ЕО 10 МО:36
Коровий антиген (наприклад, положення 146-154 прекорового білка; наприклад, які
ЕМІ МБЕИММУ ЗЕО ІЮ МО:49 відповідають положенням 146-154 А"2402
ЗЕБЕО ІЮ МО:9, положення 523-531 5ЕО ІО МО:34, або положення 720- 728 5ЕО 1 МО:36
Полімераза (наприклад, положення 455-463 Рої; о наприклад, які відповідають) ,
СІ 5АУМАВІЗ ЗЕО І МО:50 положенням 4453-4611 БО І "0201
МО:10, або положенням 366-374
ЗЕО ІЮ МО:З6 х (наприклад, положення 115-123 Х; о наприклад, які відповідають) ,
СІ ЕКОМЕБЇ 5 ЗЕО ІЮ МОС51 положенням 1115-1235 БО І д'б2
МО:12, або положенням 900-9083
ЗЕО ІЮ МО:З6
Поверхневий антиген (наприклад, положення 21-28 рге- 51; наприклад, які відповідають
РІ СЕЄЕРОН»5 ЗЕО І МО:52 положенням 21-28 5ЕО ІЮ МО11, А"11 положенням 28-35 5ЕО ІЮ МО:З4;, або положенням 6-13 5ЕО І
МО:З6
Поверхневий антиген (наприклад, положення 150-158 5; наприклад, які відповідають
ІРІРОБУМ АБ» ЗЕО І МО:5З положенням 324-332 5ЕО ІЮ МО:11,| 8'07 положенням 331-339 5ЕО ІЮ МО:34, або положенням 181-189 5ЕО І
МО:З6
Продовження таблиці 5
Коровий антиген (наприклад, положення 48-56 прекорового антигену; наприклад,
ІРЗОРГЕРБУ5 5ЕО І МО 54 які відповідають положенням 48-561Ї В"51 5ЕО ІЮ МО:9, положенням 425-433 5ЕО ІЮО МО:34, або положенням 619-630Ї 5ЕО 10 МО:З6
Поверхневий антиген , (наприклад, положення 1-15 рге-521,,
МОМУМЗТАЇ НОАГГОЮРУЇ| ЗЕО ІЮ МО:55 наприклад, які відповідають А"З положенням 120-134 5ЕО І МО:З
Поверхневий антиген 5 о (наприклад, положення 12-20 рге-|,,
ПОРВУНОЇ ЗО о МО 56 52; наприклад, """ які відповідають 2 положенням 131-139 5ЕО ІЮ МО:З
Поверхневий антиген 5 , (наприклад, положення 44-53 рге-|,,
ЗІ ЗКТарРУ ЗЕО ІЮ МО:57 82; наприклад, 7" які відповідають дт2 положенням 163-172 5ЕО ІЮ МОЗ
Поверхневий антиген 5 , (наприклад, положення 14-22 51,,
МГ Ода. ЗЕО І МО:58 наприклад, 7 які відповідають дт2 положенням 188-196 5ЕО І МО:З
Поверхневий антиген ви ТВі ТІ ЕО ІЮ МО59 (наприклад, положення 20-28 5; де
І наприклад, "" які відповідають положенням 194-202 5ЕО І МО:З
Поверхневий антиген 5 , (наприклад, положення 41-49 51,, г аатРМУСІ. ЗЕО ІЮ МО:60 наприклад, 7 які відповідають дт2 положенням 215-223 5ЕО ІЮ МО:З
Поверхневий антиген
ПСПЕШ У ЗЕО ІЮ МО:81 (наприклад, положення 88-96 5; д'є
І наприклад, "" які відповідають положенням 262-270 5ЕО ІЮ МО:З
Поверхневий антиген 5 , (наприклад, положення 95-104 571,, гм рхуоамі ЗЕО І МО:62 наприклад, які відповідають дт2 положенням 269-278 5ЕО ІЮ МОЗ
Поверхневий антиген 5 , (наприклад, положення 97-106 57,,
ГОМОСМІ РУ ЗЕО ІЮ МО:63 наприклад, які відповідають дт2 положенням 271-280 5ЕО І МО:З
Поверхневий антиген 5 , (наприклад, положення 207-216 571,,
ЗІМЗРЕЇІРІ Г ЗЕО ІЮ МО:64 наприклад, 7 які відповідають дт2 положенням 381-390 5ЕО І МО:З
Поверхневий антиген
ПРЕ РІ15 ФЕО ІЮ МО-65 (наприклад, положення 208-216 З; де наприклад, відповідні положенням 382-390 5ЕО І МО:З
Полімераза
ТРАВУТОСУЕ5 ЗЕОІ0 Моб | (наприклад, положення 367-376 Рої/ вд»; наприклад, які відповідають положенням 367-376 5ЕО ІЮ МО2
Продовження таблиці 5
Полімераза о (наприклад, положення 390-399 Рої; ,,
ГУМОББОБ5А» ЗЕО ІЮ МО:67 наприклад, які відповідають А"З положенням 390-399 5ЕО 1Ю МОС2
Полімераза о (наприклад, положення 533-541 Рої; ,,
ЗАІС5МУВ А? ЗЕО І МО:68 наприклад, які відповідають А"З положенням 533-541 5ЕО 10 МОС2
Полімераза о (наприклад, положення 551-559 Рої; ,,
УМОорУМІ ад» ЗЕО І МО:69 наприклад, які відповідають Аг положенням 551-559 5БЕО 10 МОС2
Полімераза
ДІ МРІ УАСІ ЕС І МО-70 (наприклад, положення 655-663 Роїу дко наприклад, які відповідають положенням 655-663 5БЕО 10 МОС2
Полімераза о (наприклад, положення 667-676 Рої; ,,
ОАЕТЕ5РТУК»? ЗЕО ІЮ МО:71 наприклад, які відповідають А"З положенням 667-676 5ЕО 10 МОС2
Коровий антиген (наприклад, положення 40-56
АТМЕП 5РЇ РООРБГЕРБМУ 5ЕО ІЮ МО:72 прекорового білка; наприклад, "|А"2 які відповідають положенням 40-56
ЗЕОЮ МО
Коровий антиген (наприклад, положення 48-56
ГРБОБГЕРБУ» ЗЕО ІЮ МО:73 прекорового білка; наприклад В"51 «хвідповідні положенням 48-56
ЗЕОІЮО МО
Коровий антиген (наприклад, положення 136-144
СІ ТРаВЕТУ? ЗЕО ІЮ МО:74 прекорового білка; наприклад А"2 «евідповідні положенням 136-144
ЗЕОІЮО МО
Коровий антиген (наприклад, положення 144-153
МЕМ МЕМ» ЗЕО ІЮ МО:75 прекорового білка; наприклад, "|А"2 які відповідають положенням 144- 153 5ЕО ІЮ МО:
Коровий антиген (наприклад, положення 168-177
І.ЄТІ РЕТТМ9 ЗЕО ІЮ МО:76 прекорового білка; наприклад, "|А"2 які відповідають положенням 168- 177 5ЕО І МО:
Коровий антиген (наприклад, положення 170-180
ЗПГРЕТТМУНН? ЗЕО ІЮ МО:77 прекорового білка; наприклад, "А" які відповідають положенням 170- 180 5ЕО ІЮ МО: х о (наприклад, положення 52-60 Х;,,
НІ 5І/. На гм» ЗЕО І МО:78 наприклад, 7 які відповідають Аг положенням 52-60 5ЕО І МО 4
Продовження таблиці 5
Х
МІНКВТІСІ 5ЕО ІЮ МО:79 (наприклад, положення 92-100 Худо наприклад, які відповідають положенням 92-100 5ЕО ІЮ МО 4
Х о (наприклад, положення 99-108 Х;,,
СІ БАМ5ТТОІ.: ЗЕО І МО:80 наприклад, які відповідають д2 положенням 99-108 5ЕО ІЮ МО 4
Х
5 о (наприклад, положення 133-141 Х;),, м'васвнкі. ЗЕО ІЮ МО:81 наприклад, 7 які відповідають д2 положенням 133-141 5ЕО 10 МО А
Полімераза 5 о (наприклад, положення 49-57 Рої;,,
МУБМТНК ЗЕО ІЮ МО:82 наприклад, які відповідають А"З положенням 49-57 5ЕО І МО:2
Полімераза 5 о (наприклад, положення 57-65 Рої;,,
КУамМмЕТаї У ЗЕО І МО:83 наприклад, які відповідають А"З положенням 57-65 5ЕО І МО:2
Полімераза 5 о (наприклад, положення 63-71 Рої;,,
СІ М55ТУРМУ ЗЕО ІЮ МО:84 наприклад, які відповідають д2 положенням 63-71 5ЕО 10 МОС2
Полімераза 5 , (наприклад, положення 152-161 Рої; ,,
ТІ/МУКАСІЇ УК. ЗЕО ІО МО:85 наприклад, які відповідають А"З положенням 5ЕО І МО:2)
Полімераза
КУТ5ЕРУИ5 5ЕО ІЮ МО:86 (наприклад, положення 756-764 Рої; деод наприклад, які відповідають положенням 758-766 5ЕО І МО 2
Полімераза
І ВСТ5РУУМ 5ЕО ІО МО:87 (наприклад, положення 773-782 Роїу до наприклад, які відповідають положенням 773-782 5ЕО І МО 2
Полімераза 5 о (наприклад, положення 816-824 Рої; ,,
ЗІ МАОБРБУ ЗЕО І МО:88 наприклад, які відповідають д2 положенням 816-824 5ЕО 1Ю МОС2
Полімераза
КІНГ У5НРІЄ ЗБОІр МО:135 | (наприклад, положення 502-510 Рої) дко наприклад, які відповідають положенням 502-510 5ЕО ОО МОС2
Поверхневий антиген
ПИ УРЕМОМ/ЕМ 67 ЗЕОІ0 МО:136 |(Наприклад, положення 349-358 З; деко наприклад, які відповідають положенням 349-358 5ЕО 1Ю МОЗ
Полімераза
НІ У5НРЇ З ЗБОІ0 МО:137 | (наприклад, положення 504-512 Рої) дко наприклад, які відповідають положенням 504-512 5ЕО 10 МОС2
Поверхневий антиген 9 о (наприклад, положення 77-84 5),
МБРОАДОІЇ. ЗЕО ІЮ МО:138 наприклад, які відповідають н-грр положенням 77-84 5ЕО І МО:З
Продовження таблиці 5
Поверхневий антиген о (наприклад, положення 270-277 5;
У гомо Мм'о ЗЕО ІО МО:139 наприклад, які відповідають Н-гКЬ положенням 270-277 5ЕО 10 МОЗ
Поверхневий антиген
АЗУВЕВММІ о ЗЕОІ0 МО:140 |(Чаприклад, положення 340-347 5; окр наприклад, які відповідають положенням 340-347 5ЕО 1Ю МОЗ «Заміна Маї на Аа в положенні 9 5ЕО ІЮ МО:43; в положенні 225 5ЕО ІЮ МО:З6.
Заміна І еи-Маї на СіІп-АІа в положеннях 5 і 6 ЗЕО ІО МО:46; в положеннях 357 і 358 в ЗЕО ІЮ
МО:34.
Заміна 5ег на Рго в положенні З ЗЕО ІЮО МО:50; в положенні 455 5ЕО ІЮ МО:10. 5Заміна ГІ еи на Маї в положенні 2 5ЕО ІЮО МО:51; в положенні 116 ЗЕО ІО МО:12 і в положенні 901 5ЕО І МО:36.
ЇЗаміна маї на Ме в положенні 9 5ЕО І МО:54; в положенні 56 ЗЕО ІЮ МО:9, в положенні 433
ЗЕО ІЮ МО:34, і в положенні 630 5ЕО І МО:36.
Може існувати одна або декілька амінокислотних відмінностей між послідовністю епітопа і справжньою послідовністю відповідного більшого білка або домену внаслідок відмінностей генотипів, підгенотипів або штамів, хоча положення епітопа в більшому білку або домені може бути легко визначена. 17Напа еї а!., доштаї ої Нерайоіоду 50:1163-1173 (2009) 2 орез вії аї., у. Сііп. Іпмеві. 118:1835-1845 (2008) зВоешег вї аї., / Міго! 80(7):3532-3540 (2006) зРепа еї аї., Мої. Іттипої. 45:963-970 (2008) »Безтопа 2008; м/мли.аПеІеїгедцнепсіє5.пеї або Оезтопа еї а!., Апіїміга! Тег. 13:16-175 (2008) вууерзіег евї а!., 2004, 9. Мікої. 78(11)5707-5719 "Мійеїо, 1997, Еиг. у. Іттипої. 27(3): 671-678 8Бецне еї а!., 1994, 9. Іттипої. 153(12): 5586-5592 зЕпітоп Н-20Б5 миші, раніше не описаний 1Епітоп Н-2КБО миші, раніше не описаний
В одному з варіантів здійснення винаходу придатні антигени НВМ можуть включати в одній або декількох імунотерапевтичних композиціях на основі дріжджів антиген, що містить один або декілька Т-клітинних епітопів, які описані або визначені як "домінантний" епітоп (тобто Т- клітинний епітоп, що приводить до розвитку Т-клітинної відповіді проти цілого білка і/або який знаходиться серед відносно невеликої кількості Т-клітинних епітопів у великій групі можливих епітопів, які з більшою імовірністю або легше будуть індукувати відповіді СО4»з і СО8-Т-клітин, який також називається "імунодомінантним епітопом"). В іншому варіанті здійснення антигени
НВУ, що підходять у рамках даного винаходу, можуть включати в тій самій або відмінній або додатковій композиції на основі дріжджів антиген НВМ, що містить один або декілька Т- клітинних епітопів, які описані або визначені як "субдомінантний" епітоп (тобто Т-клітинний епітоп, що є імуногенним, але в меншому ступені, ніж імунодомінантний епітоп; імунна відповідь, індукована субдомінантним епітопом, може придушуватися або витіснятися імунною відповіддю на імунодомінантний епітоп). Для прикладу цього ефекту з відповідями СТІ на Т-клітинні епітопи НВМ у мишей див. 5спіппбреск К., еї аї. 9. іттипоіоду 168: 6253-6262, 2010; або Зеце єї аІ. У Іттипоїоду 166:1389-1397, 2001. В одному з аспектів винаходу різні композиції, які містять імунодомінантні або субдомінантні епітопи, можна вводити в одну ту ж ділянку в індивідуума, або в одному з варіантів здійснення в різні ділянки індивідуума (тобто композицію, що містить домінантні епітопи, вводять в одну ділянку, і композицію, що містить субдомінантні епітопи, вводять в іншу ділянку). У деяких випадках субдомінантний епітоп може індукувати більш сприятливу з терапевтичної точки зору імунну відповідь, ніж домінантний епітоп. Таким чином, при введенні в окремі ділянки може знижуватися імовірність того, що імунна відповідь на домінантний епітоп придушить або витіснить імунну відповідь на субдомінантний епітоп, тим самим, максимізуючи імунну відповідь у цілому і максимізуючи захисну або терапевтичну користь в індивідуума. Цей підхід надавання різних антигенів у різних композиціях, що вводяться в різні ділянки індивідуума, також можна використовувати, навіть якщо всі епітопи є домінантними або субдомінантними. Є загальновизнаним, що імунодомінантні епітопи і субдомінантні епітопи відіграють роль в інфекції НВМ і імунних відповідях на НВМ (див., наприклад, 5ецйе еї аї!., 2001, вище, і Зспіптреск еї аї., 2002, вище).
В одному з варіантів здійснення винаходу антиген НВУ, придатний у імунотерапевтичних засобах на основі дріжджів, забезпечує максимальне включення імуногенних доменів, і, зокрема, Т-клітинних епітопів, що є консервативними серед генотипів і/або підгенотипів, і/або включає імуногенні домени з декількох відмінних генотипів і/або підгенотипів, ілабо включає імуногенні домени, які можна легко модифікувати з одержанням множини імунотерапевтичних продуктів на основі дріжджів, що відрізняються незначно, але адаптовані для лікування різних індивідуумів або груп індивідуумів на основі генотипу(ів) або підгенотипу(ів) НВМ, якими інфіковані такі індивідууми або групи індивідуумів. Наприклад, антиген НВМ можна одержувати на основі генотипу або підгенотипу, що є найбільш розповсюдженим серед індивідуумів або груп індивідуумів, які підлягають захисту або лікуванню, і антиген НВМ включає найбільш консервативні імуногенні домени з цих генотипів. Альтернативно або додатково, імуногенні домени можна модифікувати так, щоб вони відповідали консенсусній послідовності для цього домену або епітопа, або в конструкцію може бути включено більше одного варіанта епітопа.
У будь-якому варіанті здійснення винаходу, що стосується конструювання антигену НВМ для імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів, в одному з аспектів мінімізуються штучні ділянки з'єднання між сегментами злитого білка, що містять антигени НВМ (тобто включення неприродних послідовностей обмежене або мінімізоване настільки, наскільки це можливо). Без зв'язку з теорією, вважають, що природна еволюція привела до: ї) безупинних послідовностей у вірусі, що з найбільшою імовірністю будуть добре експресуватися в іншій клітині, такий як дріжджі; і ії) імунопротеасом в антигенпредставляючих клітинах, що можуть належним чином розщеплювати і представляти ці послідовності імунній системі. Імунотерапевтичний продукт на основі дріжджів за винаходом дозволяє імунній системі хазяїна процесувати і представляти антигени-мішені; таким чином, злитий білок з множиною неприродних ділянок з'єднання може бути менш придатним у імунотерапевтичних засобах на основі дріжджів у порівнянні з засобами, у яких у більшому ступені збережені природні послідовності білка НВУМ.
У будь-якому з антигенів НВМУ, описаних у даному описі, включаючи будь-який зі злитих білків, можуть застосовуватися наступні додаткові варіанти здійснення. По-перше, М-кінцева послідовність для експресії і С-кінцева мітка, включені в деякі зі злитих білків, є необов'язковими, і, якщо їх використовують, можуть бути вибрані з декількох різних послідовностей, описаних в інших розділах даного опису, для підвищення експресії, стабільності лабо для забезпечення ідентифікації і/або очищення білка. Альтернативно одна або обидві з М- або С-кінцевих послідовностей повністю виключені. Крім того, у даній галузі відома множина різних промоторів, придатних у дріжджах, і вони охоплюються для застосування для експресії антигенів НВМ відповідно до даного винаходу. Більше того, короткі проміжні лінкерні послідовності (наприклад, пептиди з 1, 2, 3, 4 або 5, або більше амінокислот) можна вбудовувати між частинами злитого білка для різних цілей, включаючи вбудовування ділянок ферментів рестрикції для полегшення клонування і наступного маніпулювання конструкціями. Нарешті, як докладно розглянуто в інших розділах даного опису, послідовності, описані в даному описі, є ілюстративними, і їх можна модифікувати, як докладно описано в інших розділах даного опису, для заміни, додавання або делеції послідовностей з метою адаптації до переваг відносно генотипу НВУ, підгенотипу НВУ, штаму або ізоляту НВУ, або консенсусних послідовностей, і включення переважних Т-клітинних епітопів, включення домінантних і/або субдомінантних Т-клітинних епітопів. Опис декількох ілюстративних антигенів
НВУ, придатних для винаходу, наданий нижче.
У будь-якому з варіантів здійснення винаходу, описаних у даному описі, що включають будь- який варіант здійснення, що стосується імунотерапевтичної композиції, антигену НВУ, злитого білка або застосування такої композиції, антигену НВМ або злитого білка, в одному з аспектів амінокислоти поверхневого антигену НВУ, що підходять як антиген НВМ або в злитому білку або імунотерапевтичній композиції за винаходом, можуть включати, але не обмежуватися ними,
ЗЕО ІЮО МО:3, 5ЕО ІЮ МО:7, БЕО ІЮ МО:11, положення 21-47 5ЕО ІЮО МО:11, положення 176-400
ЗЕО І МО 11, 5ЕО 10 МО:15, 5ЕО ІЮ МО:19, 5ЕО І МОС23, 5ЕО І МО:27, 5ЕО ІЮ МО:З1, положення 9-407 5ЕО ІЮО МО:34, положення 6-257 5ЕО ІЮ МО:36, положення 6-257 5ЕО І
МО:41, положення 92-343 5ЕО ІЮ МО:92, положення 90-488 5ЕО ІЮ МО:93, 5ЕО ІЮО МО:97, положення 900-338 5ЕО ІЮ МО:101, положення 7-254 5ЕО ІЮО МО:102, положення 1-249 5ЕО І
МО:107, положення 1-249 5ЕО ІЮ МО:108, положення 1-249 5ЕО ІЮО МО:109, положення 1-249 60 5ЕО І МО:110, положення 1-399 5ЕО ІЮО МО:112, положення 1-399 5ЕО ІЮ МО:114, або положення 1-399 5ЕО ІЮ МО:116, положення 1-399 5ЕО ІО МО:118, положення 1-399 5ЕО І
МО:120, положення 1-399 5ЕО ІЮ МО:122, положення 1-399 5ЕО ІЮ МО:124, положення 1-399 5ЕО І МО:126, положення 231-629 5ЕО ІЮ МО:128, положення 63-461 5ЕО 10 МО:130, положення 289-687 5ЕБЕО ІЮ МО:132, положення 289-687 5БО ІЮ МО:134, або відповідну послідовність з іншого штаму НВУ.
У будь-якому з варіантів здійснення винаходу, описаних у даному описі, включаючи будь- який варіант здійснення, що стосується імунотерапевтичної композиції, антигену НВУ, злитого білка або застосування такої композиції, антигену НВМ або злитого білка, в одному з аспектів амінокислоти антигену полімерази НВУ, що підходять як антиген НВМ або в злитому білку або імунотерапевтичній композиції за винаходом, можуть включати, але не обмежуватися ними, положення 383-602 5БЕО ІЮ МО:2, положення 381-600 5ЕО ІЮ МО:6, положення 381-600 5ЕО ІЮ
МО:10, положення 453-680 5ЕО ІЮ МО:10, положення 370-589 5ЕО ІЮ МО:14, положення 380- 599 5БЕО ІЮ МО:18, положення 381-600 5ЕО ІЮ МО:22, положення 380-599 5ЕО І МОС26, положення 381-600 5ЕО ІЮ МО:30, положення 260-604 5ЕО ІЮ МО:36, положення 7-351 5ЕО ІЮ
МО:38, положення 7-351 5ЕО ІЮ МО:40, 260-604 5ЕО ІО МОСХА1, положення 346-690 5ЕО І
МО:92, положення 90-434 5ЕО ІЮ МО:94, 5ЕО ІЮО МО:98, положення 339-566 5ЕО ІЮ МО:101, положення 255-482 5ЕО ІЮО МО:102, положення 250-477 5ЕО ІЮ МО:107, положення 250-477 5ЕО ІЮ МО:108, положення 250-477 5ЕО ІО МО:109, положення 250-477 5ЕО ІЮ МО:110, положення 582-809 5ЕО ІЮО МО:120, положення 582-809 5ЕО ІЮ МО:124, положення 642-869
ЗЕО ІЮ МО:126, положення 1-228 5ЕО ІЮ МО:128, положення 1-228 5ЕО ІЮ МО:132, положення 61-288 5ЕО ІО МО:134, або відповідну послідовність з іншого штаму НВУ.
У будь-якому з варіантів здійснення винаходу, описаних у даному описі, включаючи будь- який варіант здійснення, що стосується імунотерапевтичної композиції, антигену НВУ, злитого білка або застосування такої композиції, антигену НВМ або злитого білка, в одному з аспектів амінокислоти корового антигену НВУ, що підходять як антиген НВМ або в злитому білку або імунотерапевтичній композиції за винаходом, можуть включати, але не обмежуватися ними, положення 31-212 5ЕО ІЮО МО:1, положення 31-212 5ЕО ІЮО МО:5, положення 31-212 5ЕО ІОЮ
МО:9, положення 37-188 5ЕО ІЮ МО:9, положення 31-212 5ЕО ІОЮО МО:13, положення 31-212 5ЕО
ІО МО:17, положення 31-212 5ЕО ІО МО:21, положення 14-194 5ЕО ІЮ МО:25, положення 31-212
ЗЕО ІЮ МО:29, положення 408-589 5ЕО ІЮ МО:34, положення 605-786 5ЕО ІО МО:36, положення 352-533 5БЕО ІЮ МО:38, положення 160-341 5ЕО ІЮ МО:39, положення 605-786 5ЕО І МО:41, положення 691-872 5ЗЕО ІЮ МО:92, положення 90-271 5ЕО ІЮО МО:95, 5ЕО ІЮ МО:99, положення 567-718 5ЕО ІО МО:101, положення 483-634 5ЕО ІЮ МО:102, положення 2-183 5ЕО ІЮ МО:105, положення 184-395 5ЕО ІЮО МО:105, положення 396-578 5ЕО І МО:105, положення 579-761
ЗЕО ІЮО МО:105, положення 2-183 5ЕО ІЮ МО:106, 338-520 5ЕО ІЮ МО:106, положення 478-629 5ЕО ІЮ МО:107, положення 478-629 5ЕО ІО МО:108, положення 478-629 5ЕО ІЮ МО:109, положення 478-629 5ЕО ІЮО МО:110, положення 400-581 5ЕО ІЮ МО:112, положення 400-581 5ЕО ІЮ МО:114, положення 400-581 5ЕО ІО МО:116, положення 400-581 5ЕО ІЮ МО:118, положення 400-581 5ЕО ІЮО МО:120, положення 400-581 5ЕО ІЮ МО:122, положення 400-581 5ЕО ІЮ МО:124, положення 400-581 5ЕО ІО МО:126, положення 630-811 5ЕО ІЮ МО:128, положення 462-643 5ЕО ІЮО МО:130, положення 688-869 5ЕО ІЮ МО:132, положення 688-869
ЗЕО ІЮ МО:134, або відповідну послідовність з іншого штаму НВУ.
У будь-якому з варіантів здійснення винаходу, описаних у даному описі, включаючи будь- який варіант здійснення, що стосується імунотерапевтичної композиції, антигену НВУ, злитого білка або застосування такої композиції, антигену НВМ або злитого білка, в одному з аспектів амінокислоти антигену Х НВМУ, що підходять як антиген НВМ або в злитому білку або імунотерапевтичній композиції за винаходом, можуть включати, але не обмежуватися ними, 5ЕО ІЮ МО:4, 5ЕО ІЮ МО:8, 5ЕО ІЮ МО:12, положення 2-154 5ЕО ІЮ МО:12, 5ЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО
ІО МО:20, БЕО ІОЮО МО:24, 5ЕО ІЮ МО:28, 5ЕО ІО МО:32, положення 52-68, а потім положення 84- 126 5ЕО ІЮ МО:4, положення 52-68, а потім положення 84-126 5ЕО ІЮ МО:8, положення 52-68, а потім положення 84-126 5ЕО ІЮ МО:12, положення 52-68, а потім положення 84-126 5ЕО І
МО:16, положення 52-68, а потім положення 84-126 5ЕО ІЮО МО:20, положення 52-68, а потім положення 84-126 5ЕО ІЮО МО:24, положення 52-68, а потім положення 84-126 5ЕО ІЮ МО:28, положення 52-68, а потім положення 84-126 5ЕО ІО МО:32, положення 787-939 5ЕО І МО:З6, положення 7-159 5ЕО ІЮО МО:39, положення 873-1025 5ЕО ІЮ МО:92, положення 90-242 5ЕО І
МО:96, 5ЕО ІЮ МО:100, положення 719-778 ЗЕО ІЮ МО:101, положення 635-694 5ЕО І МО:102, положення 184-337 5ЕО ІЮ МО:106, положення 521-674 5ЕО ІЮ МО:106, положення 630-689 5ЕО ІЮ МО:107, положення 630-689 5ЕО ІО МО:108, положення 630-689 5ЕО ІЮ МО:109, положення 630-689 5ЕО ІЮО МО:110, положення 582-641 5ЕО ІЮ МО:122, положення 810-869 60 ЗЕО ІЮ МО:124, положення 582-641 5ЕО ІЮО МО:126, положення 1-60 5ЕО ІЮО МО:130, положення
229-288 5ЕО ІЮ МО:132, положення 1-60 5ЕО ІЮ МО:134, або відповідну послідовність з іншого штаму НВУ.
Антигени НВМ, що містять поверхневий антиген і коровий білок. В одному з варіантів здійснення винаходу антиген(и) НВМ для застосування в композиції або способі за винаходом, являє собою злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ містять або складаються з великого (І) поверхневого антигену НВМ або щонайменше одного його імуногенного домену і корового білка НВМ (НВсАд) або щонайменше одного його імуногенного домену. В одному з аспектів великий (І) поверхневий антиген НВМ і/або коровий білок НВМУ є повнорозмірними або практично повнорозмірними. Відповідно до будь-якого варіанта здійснення даного винаходу, указівка на "повнорозмірний" білок (або повнорозмірний функціональний домен або повнорозмірний імунологічний домен) включає повнорозмірну амінокислотну послідовність білка або функціонального домену або імунологічного домену, як описано в даному або описі в іншому випадку як відомо або описано для загальнодоступної послідовності. Білок або домен, який є "практично повнорозмірними", що також є типом гомолога білка, відрізняються від повнорозмірного білка або домену, шляхом вставки або делеції або пропуску 1,2,3,4,5,6,7,8, 9 або 10 амінокислот з М- і/або С-кінця такого повнорозмірного білка або повнорозмірного домену. Загальна вказівка на білок або домен може включати як повнорозмірні, так і практично повнорозмірні білки, а також інші їхні гомологи.
В одному з аспектів великої (І) поверхневий антиген НВМ або коровий білок НВМ містять щонайменше 8095, 8596, 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 96, 97 95, 98 90 або 99 95 лінійної послідовності повнорозмірного великого (І) поверхневого антигену НВМ або корового білка НВУ, відповідно, або лінійної послідовності частини великого поверхневого антигену НВУ, яка містить зв'язувану рецепторами гепатоцитів частину рге-51 і весь або частину малого (5) поверхневого антигену НВУ, з лінійними амінокислотними послідовностями, представленими в
ЗЕО ІЮО МО:97 (оптимізований поверхневий антиген НВМ, описаний нижче), ЗЕО ІЮ МО:99 (оптимізований коровий білок, описаний нижче), або відповідною послідовністю з іншого штаму
НВУ, якщо це застосовно. Різні інші послідовності для придатних поверхневих антигенів НВМ і корових антигенів НВУ, придатних для винаходу, описані в даному описі. В одному з аспектів великий (І) поверхневий антиген НВМ або коровий білок НВМ щонайменше на 80 95, 85 95, 90 9, 309195, 92 9, 93 о, 94 У, 95 9, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичні повнорозмірному великому () поверхневому антигену НВМ або коровому білку НВУ, відповідно, або іншому поверхневому антигену НВМ або коровому антигену НВУ, описаним у даному описі, включаючи амінокислотну послідовність, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:97 (оптимізований поверхневий антиген НВУ, описаний нижче), ЗЕО ІЮ МО:99 (оптимізований коровий білок, описаний нижче), або відповідну послідовність з іншого штаму НВУ, якщо це застосовно.
Такий злитий білок схематично представлений на фіг. 2. Один приклад композиції, що містить такий злитий білок, описаний у прикладі 1. У цьому варіанті здійснення дріжджі (наприклад, Засспаготусе5 сегемізіае) модифікували способами інженерії так, щоб вони експресували різні злиті білки поверхневий антиген-коровий антиген НВУ, як показано на фіг. 2, під контролем індукованого міддю промотору СОР1 або промотору ТЕЕ2. У кожному випадку злитий білок НВМ являв собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:34: (1) М-кінцевий пептид для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабільної експресії (наприклад, положення 1-6 5ЕО ІЮ МО:34); 2) спейсер із двох амінокислот для внесення ділянки ферменту рестрикції ре; 3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного (мінус положення 1) великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 9-407
ЗЕО ІЮ МО:34 або положення 2-400 5ЕО ІЮ МО:11 (які відрізняються від 5ЕО ІЮ МО:34 у положеннях 350-351 5ЕО ІЮО МО:11, де послідовність Геи-МаІ у 5ЕО ІО МО:11 замінена послідовністю (зІп-Аі(а у положеннях 357-358 5ЕО ІЮ МО':34)); 4) амінокислотна послідовність корового антигену НВМ (наприклад, положення 31-212 5ЕО ІЮО МО:9 або положення 408-589
ЗЕБЕО ІЮ МО:34); і 5) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 590-595 5ЕО ІЮО МО':34).
Положення 28-54 5БЕО ІЮ МО:34 містять частину рецептора для гепатоцитів великого (І) поверхневого білка. БЕО ІЮ МО:34 містить множину епітопів або доменів, що ймовірноо будуть підсилювати імуногенність злитого білка. Наприклад, положення 209-220, положення 389-397, положення 360-367 і положення 499-506, відносно ЗЕО ІЮ МО:34, містять відомі епітопи, що зв'язуються МНС класу І і/або епітопи СТІ. Положення 305-328 5ЕО ІЮО МО:34 містять епітоп антитіла. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок 5ЕО ІЮ МО:34 (кодон- оптимізований для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як ЗЕО ІЮ МО:33.
Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, також 60 позначається в даному описі як (3І-13002.
Амінокислотні сегменти, використовувані в будь-якому зі злитих білків, описаних у даному описі, можна модифікувати з використанням додаткових амінокислот, які фланкують будь-який кінець будь-якого домену; описи, представлені в даному описі, є ілюстративними. Наприклад, злитий білок відповідно до цього варіанта здійснення може включати: 1) амінокислотну послідовність практично повнорозмірного (мінус положення 1) великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 2-400 5ЕО ІЮ МО:11 або положення 9-407
ЗЕО ІЮ МО:34); і 2) амінокислотну послідовність корового антигену НВМ (наприклад, положення 31-212 5ЕО ІЮ МО:9 або положення 408-589 5ЕО ІЮО МО:34), і не включати М- або С-кінцевих послідовностей, або включати відмінні М- або С-кінцеві послідовності, і/або включати лінкери або не включати лінкери між послідовностями НВУ. В одному з варіантів здійснення замість М- кінцевого пептиду, що відповідає положенням 1-6 5ЕО ІЮ МО:34, використовується М-кінцевий пептид, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:89 або 5ЕО ІЮ МО:90, за яким йде інша частина злитого білка, що включає або не включає гексагістидинову С-кінцеву мітку. Злитий білок також може включати одну, дві, три, чотири, п'ять, шість або більше лінкерних (спейсерних) амінокислот між білками або доменами НВУ. Ті ж альтернативні варіанти здійснення застосовні до будь-якого злитого білка або антигенної конструкції НВМ, які використовуються у рамках винаходу, як описано в даному описі.
Послідовності НВМ, використовувані для конструювання цього злитого білка і багатьох інших, описаних і/або проілюстрованих у даному описі, основані на ізолятах конкретного генотипу НВМ (наприклад, генотип А, В, С або 0). Однак варіантом здійснення винаходу є вставка або заміна в будь-якій частині антигену НВУ, описаного в даному описі, які основані або походять з одного конкретного генотипу, підгенотипу або штаму, відповідною послідовністю, або заміна, інсерція або делеція навіть однієї амінокислоти або невелика амінокислотна заміна, інсерція або делеція, що зустрічаються у відповідній послідовності, з будь-якого іншого генотипу(ів), підгенотипу(ів) або штаму(ів) НВМ. В одному з варіантів здійснення антиген НВМ можна одержувати шляхом заміни цілої послідовності(ей) антигену НВУ, описаного в даному описі, відповідною послідовністю(ями) з одного або декількох інших генотипів, підгенотипів або штамів/ізолятів НВМ. Додавання або заміна послідовності з одного генотипу або підгенотипу
НВМ іншою послідовністю, наприклад, дозволяє індивідуальну адаптацію імунотерапевтичної композиції для конкретного індивідуума або групи індивідуумів (наприклад, групи індивідуумів у даній країні або області країни, для націлювання на генотип(и) НВУ, що найбільш розповсюджений у цій країні або області країни). Аналогічно, також варіантом здійснення винаходу є застосування всієї або частини консенсусної послідовності, яка походить з, або опублікованої для, даного штаму, генотипу або підтипу НВМ для внесення змін у послідовність даного антигену НВУ, щоб вона більш близько і точно відповідала консенсусній послідовності.
Відповідно до даного винаходу і як у загальному розуміють у даній галузі, "консенсусна послідовність", як правило, являє собою послідовність, основану на більшості поширених нуклеотидів або амінокислот у конкретному положенні даної послідовності після вирівнювання множини послідовностей.
Як конкретний приклад згаданих вище типів модифікацій антиген НВМ можна модифікувати так, щоб змінити Т-клітинний епітоп у даній послідовності 3 одного ізоляту так, щоб він відповідав у більшому ступені або точно Т-клітинному епітопу з іншого ізоляту або відповідав у більшому ступені або точно консенсусній послідовності Т-клітинного епітопа. Такі Т-клітинні епітопи можуть включати домінантні епітопи і/або субдомінантні епітопи. Дійсно, відповідно до винаходу, антигени НВМ можна конструювати так, щоб вони включали консенсусні послідовності з різних генотипів і/або підтипів НВУ, або суміші послідовностей з різних генотипів і або підтипів НВМ. Вирівнювання основних білків НВМ серед ілюстративних послідовностей кожного з основних відомих генотипів можна легко проводити 3 використанням загальнодоступного програмного забезпечення, яке інформує, наприклад, про одержання консенсусних послідовностей. Більше того, консенсусні послідовності для багатьох білків НВМ були опубліковані. Оскільки існує високий ступінь консервативності на рівні амінокислот серед різних генотипів, підгенотипів і штамів НВМ, можна прямо використовувати відповідні частини білків НВМ з генотипів, підгенотипів або штамів, відмінних від генотипів, підгенотипів або штамів, проілюстрованих у даному описі, для одержання антигенів НВУ, що мають подібну або аналогічну загальну структуру, відносно структур, описаних у даному описі. Приклади таких модифікацій проілюстровані і пояснені в даному описі.
Як приклад, можуть існувати невеликі розходження серед послідовностей того самого білка, навіть у тому самому серотипі і генотипі (тобто унаслідок варіювання штамів або ізолятів), хоча такі розходження в ідентичності послідовностей, як правило, можуть складати менше 20 95 60 протягом повної довжини порівнюваних послідовностей (тобто послідовності можуть бути щонайменше на 80 95 ідентичними) і, більш конкретно, послідовності Є щонайменше на 85 95 ідентичними, на 90 95 ідентичними, на 91 95 ідентичними, на 92 95 ідентичними, на 9395 ідентичними, на 94 95 ідентичними, на 9595 ідентичними, на 96 95 ідентичними, на 97 95 ідентичними, на 98 95 ідентичними, на 99 95 ідентичними або на 100 95 ідентичними протягом усієї довжини порівнюваних послідовностей. Наприклад, у злитому білку, описаному вище (5ЕО
ІЮ МО:34), послідовність великого (І) поверхневого антигену, використовуваного в злитій конструкції (положення 9-407 5ЕО ІЮ МО:34) походить з ізоляту НВУ генотипу С, і приблизно на 9995 ідентична положенням 2-400 ЕС ІО МО:11, що також походять з великого (Її) поверхневого антигену з ізоляту НВМ генотипу С (тобто існує дві різні амінокислоти, у положеннях 350-351 5ЕО 1О МО:11 (С1п-АПа) у порівнянні з положеннями 357-358 5ЕО ІЮ МО:34 (Геи-Маї). Однак будь-яка послідовність придатна для застосування в злитому білку, описаному в даному описі, як і послідовності з інших штамів НВМ. Таким чином, в одному з варіантів здійснення послідовності, використовувані в будь-якому з антигенів НВМ, описаних у даному описі, включаючи будь-які зі злитих білків, описаних у даному описі, можуть включати відповідні послідовності з одного або декількох різних генотипів, підгенотипів або штамів НВУ.
Описане вище використання консенсусних послідовностей і індивідуальних генотипів НВМ застосовно для різних антигенів НВМ, описаних у даному описі. Наприклад, конструкція з консенсусною послідовністю застосовна для злитого білка, описаного вище відносно до ЗЕО ІЮ
МО:34, що містять поверхневі білки НВМУ і корові білки НВУ. У прикладі 7 описані додаткові злиті білки, які подібні по конструкції зі злитим білком, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:34, але які основані на консенсусній послідовності для генотипів А, В, С і О, відповідно, НВМ. Злитий білок, що містить поверхневий і коровий білки НВУ, який оснований на консенсусній послідовності для
НВМ генотипу А, що також проілюстрований на фіг. 2, являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають ЗЕО ІЮ МО:112 (необов'язкові послідовності, що не є послідовностями НВУ, не включені в основну послідовність зЕО ІЮ МО:112, але можуть бути додані до цієї послідовності, як у випадку конструкції, описаної в прикладі 7): (1) необов'язково, М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:37, що може бути замінений М- кінцевим пептидом, який відповідає ЗЕО ІЮ МО:89, 5БО ІЮО МО:90, або іншим М-кінцевим пептидом, що підходить для застосування в імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох амінокислотних лінкерних послідовностей з однієї, двох, трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот Тпг-Зег; (3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу А, що відповідає положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО:112; (4) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу А, що відповідає положенням 400-581 5ЕО ІЮО МО:112; і (5) необов'язково, гексагістидинова мітка. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок 5ЗЕО ІЮ МО:112 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як ЗЕО ІЮ МО:111. Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, також позначається в даному описі як (і- 13006.
У прикладі 7 також описаний злитий білок, який схожий по конструкції зі злитим білком, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:34, але який оснований на консенсусній послідовності для НВМ генотипу
В. Цей злитий білок, що також схематично проілюстрований на фіг. 2, являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С- кінця, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:114 (необов'язкові послідовності, що не є послідовностями
НВУ, не включені в основну послідовність ЗЕО ІЮ МО:114, але можуть бути додані до цієї послідовності, як у випадку конструкції, описаної в прикладі 7): (1) необов'язково, М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:37, що може бути замінений М-кінцевим пептидом, який відповідає 5ЕО ІЮ МО:89, 5ЕО ІЮО МО:90, або іншим М-кінцевим пептидом, що підходить для застосування в імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох амінокислотних лінкерних послідовностей з однієї, двох, трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот Тпг-Зег; (3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу В, що відповідає положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО 14; (4) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу В, 60 що відповідає положенням 400-581 5ЕО ІЮО МО:114; і (5) необов'язково, гексагістидинова мітка.
Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок ЗЕО ІЮ МО:114 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах), представлена в даному описі як ХЕО ІЮ МО:113. Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, також позначається в даному описі як І-13007.
У прикладі 7 описаний злитий білок, який схожий по конструкції зі злитим білком, що відповідає ЗЕО ІЮО МО:34, але який оснований на консенсусній послідовності для НВМ генотипу
С. Цей злитий білок, що також схематично проілюстрований на фіг. 2, являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С- кінця, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:116 (необов'язкові послідовності, що не є послідовностями
НВУ, не включені в основну послідовність ЗЕО ІЮ МО:116, але можуть бути додані до цієї послідовності, як у випадку конструкції, описаної в прикладі 7): (1) необов'язково, М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:37, що може бути замінений М-кінцевим пептидом, який відповідає 5ЕО ІЮ МО:89, 5ЕО ІЮО МО:90, або іншим М-кінцевим пептидом, що підходить для застосування в імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох амінокислотних лінкерних послідовностей з однієї, двох, трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот Тпг-Зег; (3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу С, що відповідає положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО 116; (4) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу С, що відповідає положенням 400-581 5ЕО ІЮ МО:116; і (5) необов'язково, гексагістидинова мітка.
Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок ЗЕО ІЮ МО:116 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах), представлена в даному описі як ХЕО ІЮ МО:115. Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, також позначається в даному описі як 2І-13008.
У прикладі 7 описаний злитий білок, який схожий по конструкції зі злитим білком, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:34, але який оснований на консенсусній послідовності для НВМ генотипу р. Цей злитий білок, що також схематично проілюстрований на фіг. 2, являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С- кінця, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:118 (необов'язкові послідовності, що не є послідовностями
НВУ, не включені в основну послідовність ЗЕО ІЮ МО:118, але можуть бути додані до цієї послідовності, як у випадку конструкції, описаної в прикладі 7): (1) необов'язково, М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:37, що може бути замінений М-кінцевим пептидом, який відповідає 5ЕО ІЮ МО:89, 5ЕО ІЮО МО:90, або іншим М-кінцевим пептидом, що підходить для застосування в імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох амінокислотних лінкерних послідовностей з однієї, двох, трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот Тпг-Зег; (3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу О, що відповідає положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО 118; (4) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 400-581 5ЕО ІЮО МО:118; і (5) необов'язково, гексагістидинова мітка.
Амінокислотна послідовність повного злитого білка, описаного в прикладі 7, що містить 5ХЕО ІЮ
МО:118 ї що включає М- і С-кінцевий пептиди і лінкери, представлена в даному описі як ЗЕО ІЮ
МО:151. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок 5ЕО ІЮ МО:118 або 5ЕО ІЮ
МО:151 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах), представлена в даному описі як ЗЕО ІЮ
МО:117. Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, також позначається в даному описі як (3І-13009.
Антигени НВУ, які містять поверхневий антиген, коровий білок, полімеразу і Х-антиген. В одному з варіантів здійснення винаходу антиген(и) НВМ для застосування в композиції або способі за винаходом являє собою злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ містять або складаються з: поверхневого антигену НВМ (великий (І), середній (М) або малий (5)) або щонайменше одного його структурного, функціонального або імуногенного домену), полімерази НВМ або щонайменше одного її структурного, функціонального або імуногенного домену, корового білка НВМ (НВсАд) або е-антигену НВМ (НВедо) або щонайменше одного їх структурного, функціонального або імуногенного домену, і Х-антигену НВМ (НВх) або щонайменше одного його структурного, функціонального або імуногенного домену. В одному з 60 аспектів будь-який один або декілька з поверхневого антигену НВУ, полімерази НВУ, корового білка НВУ, е-антигену НВУ, Х-антигену НВМ або їх домену, є повнорозмірним або практично повнорозмірним. В одному з аспектів будь-який один або декілька з поверхневого антигену
НВУ, полімерази НВУ, корового білка НВМУ, е-антигену НВУ, Х-антигену НВМ або їх домену містять щонайменше 80 95, 85 Зо, 90 95, 91 95, 92 95, 93 96, 94 95, 95 90, 96 95, 97 Уо, 98 95 або 99 965 лінійної послідовності повнорозмірного поверхневого антигену НВУ, полімерази НВУ, корового білка НВУ, е-антигену НВУ, Х-антигену НВМ або їх домену, відповідно, лінійної або амінокислоної послідовності, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:97 (оптимізований поверхневий антиген
НВУ, описаний нижче), ЗЕО ІЮ МО:98 (оптимізована полімераза НВУ, описана нижче), ЗЕО ІЮ
МО:99 (оптимізований коровий білок, описаний нижче), 5ЕО ІЮ МО:100 (оптимізований Х- антиген, описаний нижче) або відповідної послідовності з іншого штаму НВУМ, коли це застосовно. В одному з аспектів будь-який один або декілька з поверхневого антигену НВМ, полімерази НВМ, корового білка НВУ, е-антигену НВМ, Х-антигену НВМ або їх домену щонайменше на 80 95, 85 95, 90 95, 91 95, 92 95, 93 905, 94 95, 95 96, 96 бо, 97 95, 98 90 або 99 95 ідентичний повнорозмірному поверхневому антигену НВУ, полімеразі НВУ, коровому білку НВУ, е-антигену НВМУ, Х-антигену НВМ або їх домену, відповідно, або амінокислотним послідовностям, що відповідають ЗЕО ІЮ МО:97 (оптимізований поверхневий антиген НВМУ, описаний нижче), 5ЕО ІЮ МО:98 (оптимізована полімераза НВУ, описана нижче), хЕО ІЮ МО:99 (оптимізований коровий білок, описаний нижче) або 5ЕО ІЮ МО:100 (оптимізований Х-антиген, описаний нижче) або відповідної послідовності з іншого штаму НВУ, коли це застосовно. Різні придатні й ілюстративні послідовності для поверхневих антигенів НВУ, антигенів полімерази
НВУ, корових антигенів НВУ і Х-антигенів НВУ, описані в даному описі.
В одному з варіантів здійснення винаходу антиген(и) НВМ для застосування в композиції або способі за винаходом являє собою злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ містять або складаються з: розпізнаваної рецепторами гепатоцитів частини рге-51 великого (Г) поверхневого антигену НВМ або щонайменше одного її імуногенного домену, малого (5) поверхневого антигену НВМ (НВ5ЗАд) або щонайменше одного його імуногенного домену, домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМ або щонайменше одного його імуногенного домену, корового білка НВМ (НВсАд) або щонайменше одного його імуногенного домену, і Х-антигену НВМ (НВх) або щонайменше одного його імуногенного домену. В одному з аспектів будь-який один або декілька з розпізнаваної рецепторами гепатоцитів частини рге-51 великого (І) поверхневого антигену НВУ, малого (5) поверхневого антигену НВУ, КТ-домену полімерази НВМ, корового білка НВМ, або Х-антигену їх домену, є повнорозмірними або практично повнорозмірними. В одному з аспектів будь-який один або декілька з розпізнаваної рецепторами гепатоцитів частини рге-51 великого (І) поверхневого антигену НВУ, малого (5) поверхневого антигену НВУ, КТ-домену полімерази НВУ, корового білка НВУ, або Х-антигену їх домену, містять щонайменше 80 95, 85 Уо, 90 95, 91 95, 92 Фо, 93 95, 94 Уо, 95 Уо, 96 90, 97 95, 98 90 або 99 95 лінійної послідовності повнорозмірного рге-51 з великого (І) поверхневого антигену
НВУ, малого (5) поверхневого антигену НВУ, ЕТ-домену полімерази НВУ, корового білка НВМУ, або Х-антигену їх домену, відповідно. В одному з аспектів будь-який один або декілька з розпізнаваної рецепторами гепатоцитів частини рге-51 великого (І) поверхневого антигену
НВУ, малого (5) поверхневого антигену НВУ, ЕТ-домену полімерази НВУ, корового білка НВУ, або Х-антигену їх домену щонайменше на 80 95, 85 Фо, 90 о, 91 95, 92 Фо, 93 У, 94 95, 95 о, 96 95, 97 Уо, 98 95 або 99 95 ідентичні повнорозмірної розпізнаваної рецепторами гепатоцитів частини рге-51 великого (І) поверхневого антигену НВУ, малого (5) поверхневого антигену НВМ, КТ- домену полімерази НВУ, корового білка НВУ, або Х-антигену їх домену, відповідно.
Такий злитий білок схематично представлений на фіг. 3. Приклад композиції, що містить цей злитий білок, описаний у прикладі 2. У цьому варіанті здійснення дріжджі (наприклад,
Засспаготусев сегемізіає) конструювали так, щоб вони експресували різні злиті білки НВМ, як схематично показано на фіг. З, під контролем індукованого міддю промотору, СОР1 або промотору ТЕЕ2. В одному випадку злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає ЗЕО ІЮ
МО:36: (1) М-кінцевий пептид для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабільної експресії (наприклад, положення 1-5 5ЕО ІЮО МО:36); 2) амінокислотна послідовність розпізнаваного рецепторами гепатоцитів домену з частини рге-51 великого (І) поверхневого білка НВМ (унікальна Г) з НВМ генотипу С (наприклад, положення 21-47 5ЕО ІЮО МО:11 або положення 6-32 5ЕО ІЮ МО:36); 3) амінокислотна послідовність повнорозмірного малого (5) поверхневого антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 176-400 5ЕО ІЮ МО:11 або положення 33-257 5ЕО ІО МО:36); 4) спейсер/лінкер із двох амінокислот, що полегшує клонування і маніпулювання послідовностями (наприклад, положення 258 і 259 5ЕО ІЮО МО:36); 60 5) амінокислотна послідовність частини полімерази НВМ генотипу С, що включає домен зворотної транскриптази (наприклад, положення 247-691 5ЕО ІЮ МО:10 або положення 260-604
ЗЕО ІЮ МО:З6); 6) коровий білок НВМ генотипу С (наприклад, положення 31-212 5ЕО ІЮ МО:9 або положення 605-786 ЗЕО ІЮ МО:36); 7) амінокислотна послідовність Х-антигену. НВМ генотипу С (наприклад, положення 2-154 5ЕО ІО МО:12 або положення 787-939 5ЕО ІО МО:36); і 8) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 940-945 ЕС ІЮО МО:36). Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок ЗЕО ІЮ МО:36 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах), представлена в даному описі як БЕО ІЮ МО:35. Імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, позначають у даному описі як (31-13005.
В одному альтернативному прикладі цього варіанта здійснення злитий білок відповідно до варіанта здійснення, описаному вище або нижче, може включати 1) амінокислотну послідовність розпізнаваного рецепторами гепатоцитів домену з частини рге-51 великого (І) поверхневого білка НВУ (унікальну для І) НВМ генотипу С (наприклад, положення 21-47 5ЕО І
МО:11 або положення 6-32 ЗЕО ІЮО МО:36); 2) амінокислотну послідовність повнорозмірного малого (5) поверхневого антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 176-400 5ЕО І
МО:11 або положення 33-257 ЗЕО ІЮО МО:36); 3) амінокислотну послідовність частини полімерази НВМ генотипу С, що включає домен зворотної транскриптази (наприклад, положення 247-691 5ЕО ІО МО:10 або положення 260-604 5ЕО ІЮ МО:36); 4) коровий білок НВМ генотипу С (наприклад, положення 31-212 ЗЕО ІЮ МО:9 або положення 605-786 5ЕО ІО МО:36); і 5) амінокислотну послідовність Х-антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 2-154 5ЕО
ІЮ МО:12 або положення 787-939 ЗЕО ІО МО:36), і не включає М- або С-кінцевих або послідовностей включає відмінні М- або С-кінцеві послідовності, і/або включає лінкери або не включає лінкери між послідовностями НВУ.
В одному з варіантів здійснення замість М-кінцевого пептиду, що відповідає положенням 1-5
ЗЕО ІЮ МО:36, використовують М-кінцевий пептид, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:89 або 5ЕО ІОЮ
МО:90 (або його гомолог), за яким йде інша частина злитого білка, як описано. У прикладі 2 описаний такий злитий білок, який також проілюстрований за допомогою схематичного зображення конструкції на фіг. 3. У цьому варіанті здійснення дріжджі (наприклад,
Засспаготусез сегемізіає) знову модифікували способами інженерії так, щоб вони експресували різні злиті білки НВУ, як схематично представлено на фіг. 3, під контролем індукованого міддю промотору, СОР1, або промотору ТЕР2. У цьому другому випадку злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає БЕО ІЮ МО:92: (1) М-кінцевий пептид для забезпечення стійкості до розщеплення протеасомами і стабілізації або посилення експресії (ЗЕО ІЮ МО:89, положення 1- 89 5ЕО ІЮ МО:92); 2) спейсер/лінкер із двох амінокислот (Тпг-5ег) для полегшення клонування і маніпулювання послідовностями (положення 90-91 5ЕБЕО ІЮ МО:92); 3) амінокислотна послідовність розпізнаваного рецепторами гепатоцитів домену рге-51 частини великого (1) поверхневого білка НВМ (унікальна для І) НВМ генотипу С (наприклад, положення 21-47 5ЕО 10
МО:11 або положення 92-118 5ЕО ІЮ МО:92); 4) амінокислотна послідовність повнорозмірного малого (5) поверхневого антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 176-400 5ЕО І
МО:11 або положення 119-343 5ЕО ІЮ МО:92); 5) спейсер/лінкер із двох амінокислот (І еи-С1и), що полегшує клонування і маніпулювання послідовностями (наприклад, положення 344-345
ЗБО І МО:92); 6) амінокислотна послідовність частини полімерази НВМ генотипу С, що включає домен зворотної транскриптази (наприклад, положення 247-691 5ЕБО ІЮ МО:10 або положення 346-690 ЗЕО ІО МО:92); 7) коровий білок НВМ генотипу С (наприклад, положення 31- 212 5ЕО ІО МО:9 або положення 691-872 5ЕО ІЮО МО:92); 8) амінокислотна послідовність Х- антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 2-154 5ЕО ІО МО:12 або положення 873-1025
ЗЕО ІЮ МО:92); і 9) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 1026-1031 5ЕО ІЮ МО:92).
Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок ЗЕО ІЮ МО:92 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як зХЕО ІЮО МО:91. Імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, позначають у даному описі як
СІ-13004.
ЗЕО ІЮО МО:36 і 5ЕО ІО МО:92 містять множину епітопів або доменів, які ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка, включаючи декілька епітопів або доменів, описаних вище для 5ЕО ІЮ МО:34. Крім того, домен зворотної транскриптази, використовуваний у цьому злитому білку, містить декілька амінокислотних положень, які відомі тим, що вони стають мутантними як відповідь у вигляді стійкості до лікарських засобів на лікування різними противірусними засобами, і, таким чином, у будь-який один або декілька з них можна вносити мутації в цьому злитому білку для забезпечення терапевтичного або профілактичного імунотерапевтичного засобу, який націлений на конкретні мутації, що забезпечують стійкість до 60 лікарських засобів (вислизання). Ці положення амінокислот знаходяться, відносно 5ЕО ІЮ
МО:36, у положеннях амінокислот: 432 (МаїЇ, відомий тим, що він мутує у Геи після терапії ламівудином); положення 439 (І ем, відомий тим, що він мутує у Меї, після терапії ламівудином); положення 453 (Аа, відомий тим, що він мутує у ТПг після терапії тенофовіром); положення 463 (Меї, відомий тим, що він мутує у Пе або Маї, після терапії ламівудином); і положення 495 (Авп, відомий тим, що він мутує у ТПг після терапії адефовіром). Ці положення амінокислот знаходяться, відносно 5ЕО ІЮ МО:92, у положенні амінокислот: 518 (Маї, відомий тим, що він мутує у Геи після терапії ламівудином); положення 525 (І ем, відомий тим, що він мутує у Меї після терапії ламівудином); положення 539 (Аа, відомий тим, що він мутує у ТАг після терапії тенофовіром); положення 549 (Меї, відомий тим, що він мутує у Пе або Маї після терапії ламівудином); і положення 581 (Авп, відомий тим, що він мутує у Тпг після терапії адефовіром).
Додаткові мутації, що забезпечують стійкість до лікарських засобів, які ідентифікують або які були ідентифіковані, можна додавати, якщо бажано, для одержання додаткових імунотерапевтичних засобів, націлених на такі мутації, з використанням рекомендацій, представлених у даному описі.
В одному з варіантів здійснення винаходу валін у положенні 901 5ЕО ІЮО МО:36 або валін у положенні 987 5ЕО ІЮ МО:92 (або валін у положенні 116 5ЕО ІЮ МО:12 або в будь-якому або Х- антигені його домені, що містять це відповідне положення) замінюють на лейцин для одержання
Т-клітинного епітопа, ідентифікованого як ХЕО ІЮО МО:51 (див. таблицю 5).
Як розглянуте вище, винахід включає модифікацію антигенів НВМ з їхньої природної послідовностей або послідовностей дикого типу для включення в імунотерапевтичні засоби на основі дріжджів, що збільшують клінічну застосовність або задовольняють необхідні критерії для терапевтичних або профілактичних засобів, що мають відношення до інфекційних агентів.
Як приклад, в обговоренні і прикладах 5-8 нижче описані моделювання і конструювання імунотерапевтичних засобів на основі дріжджів, у яких враховується один або декілька критеріїв вимог КАС, максимізація кількості імуногенних доменів, пов'язаних з найбільш сприятливими імунними відповідями, максимізація консервативних Т-клітинних епітопів, використання консенсусних послідовностей для конкретного генотипу НВМ і/або мінімізація штучних ділянок з'єднання в антигену НВУ. Наприклад, у наступній імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів проілюстрований злитий білок НВУ, що задовольняє вимоги для описаних вище цілей, і містить частини кожного з основних білків НВУ: поверхневий антиген, полімераза, коровий антиген і Х-антиген НВУ. Для конструювання цього злитого білка окремі антигени НВМУ у злитій конструкції оптимізували і модифікували для зменшення розміру сегментів у білку (наприклад, для забезпечення того, щоб білок відповідав менше 2/3 генома НВУ), а також для максимізації включення Т-клітинних епітопів, які зв'язані Кк! імунною відповіддю при гострій/самообмежувальній інфекції НВМ і/або хронічній інфекції НВМ, для максимізації консервативних епітопів і для мінімізації неприродних послідовностей. Фахівець у даній галузі з використанням цього посібника може одержати оптимізовані білою НВМ для застосування в антигені НВМ за винаходом.
Як більш докладно описано в прикладі 5, для конструювання сегмента поверхневого антигену НВМ, повнорозмірний великий (І) поверхневий білок НВМ генотипу С зменшували шляхом укорочення М- і С-кінцевих послідовностей, при максимізації включення відомих Т- клітинних епітопів МНС, з використанням пріоритету включення Т-клітинних епітопів, зв'язаних з гострими/самообмежувальними інфекціями. Отриманий сегмент поверхневого антигену відповідає ЗЕО ІЮ МО:97.
Для конструювання сегмента злитого білка, що містить полімеразу НВМ (див. приклад 5), значні частини повнорозмірної полімерази з НВМ генотипу С усували при фокусуванні на включенні домену активного центра (з КТ-домену), що є найбільш консервативною областю білка серед генотипів і ізолятів НВУ, і який включає декілька ділянок, відомих тим, що в них відбуваються мутації, які забезпечують стійкість до лікарських засобів. Сегмент полімерази НВМ конструювали так, щоб максимізувати відомі Т-клітинні епітопи з використанням стратегії пріоритету, описаної вище, і модифікувати один з Т-клітинних епітопів, щоб він відповідав у точності відомому Т-клітинний епітопу, що відрізняється на одну амінокислоту. Отриманий сегмент антигену полімерази НВМУ відповідає ЗЕО ІЮ МО:98.
Для конструювання сегмента злитого білка, який містить коровий антиген НВМ (див. приклад 5), повнорозмірний коровий білок з НВМ генотипу С модифікували для зменшення розміру білка при максимізації кількості Т-клітинних епітопів шляхом включення і шляхом модифікації послідовності для досягнення абсолютної відповідності визначеним відомим Т-клітинним епітопам. Крім того, видаляли винятково послідовність, яка містила позитивно заряджений С- кінець, що може бути токсичним для дріжджів унаслідок конкурентного перешкоджання 60 природним зв'язувальним РНК білкам, які часто збагачені аргініном (позитивно заряджені).
Отриманий сегмент корового антигену НВМ відповідає ЗЕО ІЮО МО:99.
Для конструювання сегмента злитого білка, що містить Х-антиген НВМ (див. приклад 5), повнорозмірний Х-антиген з НВМ генотипу С укорочували для зменшення розміру білка при максимізації збереження більшості відомих Т-клітинних епітопів. Також вносили одиничні зміни амінокислот для відповідності опублікованим послідовностям Т-клітинного епітопа, і послідовність, яка фланкує Т-клітинні епітопи на кінцях сегмента, зберігали, щоб вона сприяла ефективному процессингу і представленню правильних епітопів антигенпредставляючою клітиною. Отриманий сегмент Х-антигену НВМ відповідає 5ЕО ІЮ МО:100.
Нарешті, як описано в прикладі 5, повний злитий білок конструювали шляхом зв'язування чотирьох сегментів НВМ, описаних вище, з утворенням єдиного білка, оптимізованого для клінічного застосування. Створювали два різні ілюстративні злиті білки, кожний з яких мав відмінний М-кінцевий пептид, приєднаний для посилення і/або стабілізації експресії злитого білка в дріжджах. Як описано в даному описі вище відносно всіх інших білків, використовуваних у імунотерапевтичних композиціях на основі дріжджів, описаних у даному описі, М-кінцевий пептид можна замінювати відмінним синтетичним або природним М-кінцевим пептидом або його гомологом, або М-кінцевий пептид може бути відсутнім зовсім і в перше положення може бути включений метіонін. Крім того, якщо бажано, між сегментами злитого білка можуть бути додані лінкерні послідовності з однієї, двох, трьох або більше амінокислот. Наприклад, лінкерну послідовність із двох амінокислот, таку як Тпг-5ег, можна вбудовувати між М-кінцевим пептидом і першим антигеном НВМ у злитому білку і/або між двома антигенами НВМ у злитому білку.
Також, хоча ці конструкції конструювали з використанням білків НВМ з генотипу С як каркас, для конструювання сегментів білків можна використовувати будь-як інший генотип, підгенотип НВМ, або білки НВМ з інших штамів або ізолятів. В одному з аспектів консенсусні послідовності з даного генотипу НВМ можна використовувати для конструювання або утворення сегментів білків, як описано для додаткових злитих білків нижче. Нарешті, якщо один або декілька сегментів виключені зі злитого білка, як описано в даному описі, тоді довжина послідовності інших сегментів може бути розширена, якщо бажано, для включення додаткових Т-клітинних епітопів і/або фланкуючих ділянок інших білків.
У прикладі 5 описаний злитий білок НВУ, який також проілюстрований шляхом схематичного зображення конструкції на фіг. 3, що являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:101: (1)
М-кінцевий пептид, що являє собою препропослідовність альфа-фактора, що забезпечує стійкість до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:89 (положення 1-89 БЕО ІЮО МО:101); (2) оптимізована частина великого (І) поверхневого антигену
НВМ, що відповідає ЗЕО ІЮО МО:97 (положення 90-338 5ЕО ІЮ МО:101, наприклад, що відповідають положенням 120-368 5ЕО ІЮ МО:11 плюс оптимізація епітопів); (3) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМ, що відповідає БЕО ІЮ МО:98 (положення 339-566 5ЕО ІЮ МО:101, наприклад, що відповідають положенням 453-680 5ЕО І
МО:10 плюс оптимізація епітопів); (4) оптимізована частина корового білка НВУ, що відповідає
ЗЕО ІЮ МО:99 (положення 567-718 5БЕО ІО МО:101, наприклад, що відповідають положенням 37- 188 5ЕО ІО МО:9 разом з оптимізацією епітопів); (5) оптимізована частина Х-антигену НВУ, що відповідає БЕО ІЮ МО:100 (положення 719-778 5ЕО ІЮ МО:101, наприклад, що відповідають положенням 52-127 5ЕО ІЮ МО:12 разом з оптимізацією епітопів); і (б) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 779-784 5ЕБО ІЮО МО:101). В одному з варіантів здійснення лінкерну послідовність треонін (Тиг або Т)-серин (Зег або 5) використовують між М-кінцневим пептидом
ЗЕО ІЮ МО:89 і першим білком НВМ (оптимізована частина великого поверхневого антигену
НВУ), тим самим, збільшуючи загальну довжину 5ЕО ІЮ МО:101 на двох амінокислот.
У прикладі 5 також описаний злитий білок, який також ілюструється схематичним зображенням конструкції на фіг. З, що являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає ЗЕО ІЮ
МО:102: (1) М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає
ЗБО ІО МО:37 (положення 1-6 5ЕБО ІО МО:102); (2) оптимізована частина великого (І) поверхневого антигену НВУ, що відповідає положенням 2-248 5ЕО ІЮ МО:97 (положення 7-254
ЗЕО І МО:102, наприклад, що відповідають положенням 120-368 5ЕБЕО ІЮ МО:11 разом з оптимізацією епітопів); (3) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВУ, що відповідає ЗЕО ІО МО:98 (положення 255-482 5ЕО ІО МО:102, наприклад, що відповідають положенням 453-680 5БО ІЮ МО:10 разом з оптимізацією епітопів); (4) оптимізована частина корового білка, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:99 (положення 483-634 5ЕО ІЮ 60 МО:102, наприклад, що відповідає положенням 37-188 5ЕБО ІЮ МО:9 разом з оптимізацією епітопів); (5) оптимізована частина Х-антигену НВМ, що відповідає 5ЕО ІЮО МО:100 (положення 635-694 5ЕО ІО МО:102, наприклад, що відповідають положенням 52-127 ЗЕО ІО МО:12 разом з оптимізацією епітопів); і (б) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 695-700 5ЕО І
МО:102). В одному з варіантів здійснення лінкерну послідовність треонін (ТНг або Т)-серин (5ег або 5) використовують між М-кінневим пептидом 5ЕО ІЮ МО:37 і першим білком НВМУ (оптимізована частина великого поверхневого антигену НВУ), тим самим, збільшуючи загальну довжину ЗЕО ІЮ МО:102 на двох амінокислот. В одному з варіантів здійснення оптимізована частина великого (І) поверхневого антигену НВУ, використовувана в злитому білку, описаному вище, відповідає положенням 1-248 ЗЕО ІЮО МО:97 (тим самим, збільшуючи загальну довжину
ЗБЕО ІЮ МО:102 на одну амінокислоту). В одному з варіантів здійснення як лінкер Т-5, так і положення 1-248 5ЕО ІЮ МО:97 використовують у 5ЕО ІЮ МО:102.
Як розглянуто вище, винахід включає модифікацію антигенів НВМ від їх природних послідовностей або послідовностей дикого типу для включення в імунотерапевтичний засіб на основі дріжджів, що підвищує клінічну застосовність або задовольняє необхідні критерії для терапевтичних або профілактичних засобів, що мають відношення до інфекційних агентів, з використанням консенсусних послідовностей з даного генотипу НВМ для або конструювання одержання білкових сегментів. Як приклад, для ілюстрації цього типу модифікації конструювали додаткові антигени НВМ для застосування в імунотерапевтичних засобах на основі дріжджів за винаходом. Як і при конструюванні злитих білків НВУ, що відповідають білкам, описаним вище, для одержання цих додаткових злитих білків окремі антигени НВМ у злитій конструкції оптимізували або модифікували для зменшення розміру сегментів у білку (наприклад, для забезпечення того, щоб білок відповідав менше ніж 2/3 генома НВУ), а також для максимізації включення Т-клітинних епітопів, зв'язаних з імунною відповіддю при гострій/самообмежувальній інфекції НВМ і/або хронічній інфекції НВМ, для максимізації консервативних епітопів, для мінімізації неприродних послідовностей, а також для використання консенсусних послідовностей для кожного з генотипів А-О, сконструйованих з множини джерел послідовностей НВМ (наприклад, Ми апа Учап еї аї, 2010, для 5, корового антигену і Х, де консенсусні послідовності були отримані з 322 послідовностей НВУ, або для Рої (КТ), з Зіапітога
Опімегзйу НІМ Огид Кебзізїапсе ЮОайаразе, НВМ5ед апа НвмМ пе Кеїєазе Моїе5). При конструюванні наступних чотирьох ілюстративних злитих білків, що містять антигени НВУ, використовували консенсусну послідовність для даного генотипу НВУ, якщо тільки консенсусна послідовність не змінювала один з відомих Т-клітинних епітопів гострої/самообмежувальної інфекції, або одну з відомих ділянок мутації полімерази, що забезпечують вислизання, і в цьому випадку ці положення відповідали опублікованій послідовності для цих епітопів або ділянці мутації Можна конструювати додаткові антигени, виходячи тільки з консенсусних послідовностей або з використанням інших опублікованих епітопів, у міру того, як вони стануть відомими.
У прикладі 7 описаний злитий білок, який схожий по конструкції зі злитим білком, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:101 або ЗЕО ІЮ МО:102 (схематично проілюстрований на фіг. 3), але який оснований на консенсусній послідовності для НВМ генотипу А. Цей злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають ЗЕ ІЮ МО:107 (необов'язкові послідовності, що не є послідовностями НВУ, не включені в основну послідовність 560 ІЮ МО:107, але можуть бути додані до цієї послідовності, як у випадку конструкції, описаної в прикладі 7): (1) необов'язково,
М-кінцевий пептид, який являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО
ІО МО:37, що може бути замінений М-кінцевим пептидом, який відповідає ЗЕО ІЮ МО:89, 5ЕО ІЮ
МО:90, або іншим М-кінцевим пептидом, що підходить для застосування в імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох амінокислотних лінкерних послідовностей з однієї, двох, трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот ТПг-5ег; (3) оптимізована частина великого (І) поверхневого антигену НВМ, що відповідає положенням 1-249 5ЕО ІЮ
МО:107, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу А, для якої використовувалася стратегія конструювання, розглянута вище; (4) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВУ, що відповідає положенням 250-477 5ЕО
ІЮ МО:107, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу А, для якої використовувалася стратегія конструювання, розглянута вище; (5) оптимізована частина корового білка НВМ, що відповідає положенням 478-629 5ЕБО ІЮ МО:107, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу А, для якої використовувалася стратегія 60 конструювання, розглянута вище; (б) оптимізована частина Х-антигену НВМУ, що відповідає положенням 630-689 5ЕО ІЮ МО:107, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу А для який використовувалася стратегія конструювання, розглянута вище; і (7) необов'язково, гексагістидинова мітка. Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, також позначається в даному описі як 5І-13010.
У прикладі 7 також описаний злитий білок, що схожий по конструкції зі злитим білком, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:101 або 5ЕО ІЮО МО:102 (схематично представлений на фіг. 3), але який оснований на консенсусній послідовності для НВМ генотипу В. Цей злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають ЗЕ ІЮ МО:108 (необов'язкові послідовності, які не є послідовностями НВУ, не включені в основну послідовність ЗЕО ІЮ МО:108, але можуть бути додані до цієї послідовності, як у випадку конструкції, описаної в прикладі 7): (1) необов'язково,
М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО
ІО МО:37, що може бути замінений М-кінцевим пептидом, який відповідає ЗЕО ІЮ МО:89, 5ЕО ІЮ
МО:90, або іншим М-кінцевим пептидом, що підходить для застосування в імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох амінокислотних лінкерних послідовностей з однієї, двох, трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот ТПг-5ег; (3) оптимізована частина великого (І) поверхневого антигену НВМ, що відповідає положенням 1-249 5ЕО ІЮ
МО:108, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу В, для якої використовувалася стратегія конструювання, розглянута вище; (4) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВУ, що відповідає положенням 250-477 5ЕО
ІЮ МО:108, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу В, для якої використовувалася стратегія конструювання, розглянута вище; (5) оптимізована частина корового білка НВМ, що відповідає положенням 478-629 5ЕБО ІЮ МО:108, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу В, для якої використовувалася стратегія конструювання, розглянута вище; (б) оптимізована частина Х-антигену НВМ, що відповідає положенням 630-689 5ЕО ІЮ МО:108, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу В, для якої використовувалася стратегія конструювання, розглянута вище; і (7) необов'язково, гексагістидинова мітка. Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, також позначається в даному описі як 5І-13011.
У прикладі 7 також описаний злитий білок, що схожий по конструкції зі злитим білком, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:101 або 5ЕО ІО МО:102 (схематично проілюстрований на фіг. 3), але який оснований на консенсусній послідовності для НВМ генотипу С. Цей злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають ЗЕ ІЮ МО:109 (необов'язкові послідовності, що не є послідовностями НВУ, не включені в основну послідовність ЗЕО ІЮ МО:109, але можуть бути додані до цієї послідовності, як у випадку конструкції, описаної в прикладі 7): (1) необов'язково,
М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО
ІО МО:37, що може бути замінений М-кінцевим пептидом, який відповідає ЗЕО ІЮ МО:89, 5ЕО ІЮ
МО:90, або іншим М-кінцевим пептидом, що підходить для застосування в імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох амінокислотних лінкерних послідовностей з однієї, двох, трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот ТПг-5ег; (3) оптимізована частина великого (І) поверхневого антигену НВМ, що відповідає положенням 1-249 5ЕО ІЮ
МО:109, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу С, для якої використовувалася стратегія конструювання, розглянута вище; (4) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВУ, що відповідає положенням 250-477 5ЕО
ІЮ МО:109, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу С, для якої використовувалася стратегія конструювання, розглянута вище; (5) оптимізована частина корового білка НВМ, що відповідає положенням 478-629 5ЕБО ІЮ МО:109, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу С, для якої використовувалася стратегія конструювання, розглянута вище; (б) оптимізована частина для Х-антигену НВУ, що відповідає положенням 630-689 5ЕО ІЮ МО:109, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу С, для якої використовувалася стратегія конструювання, розглянута вище; і (7) необов'язково, гексагістидинова мітка. Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, також позначається в даному описі як 51І-13012.
Також у прикладі 7 описаний злитий білок, що схожий по конструкції зі злитим білком, що 60 відповідає ЗЕО ІЮ МО:101 або ЗЕО ІЮ МО:102 (схематично проілюстрований на фіг. 3), але який оснований на консенсусній послідовності для НВМ генотипу Ю. Цей злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають ЗЕ ІЮ МО:110 (необов'язкові послідовності, що не є послідовностями НВУ, не включені в основну послідовність ЗЕО ІЮ МО:110, але можуть бути додані до цієї послідовності, як у випадку конструкції, описаної в прикладі 7): (1) необов'язково,
М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО
ІО МО:37, що може бути замінений М-кінцевим пептидом, який відповідає ЗЕО ІЮ МО:89, 5ЕО ІЮ
МО:90, або іншим М-кінцевим пептидом, що підходить для застосування в імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох амінокислотних лінкерних послідовностей з однієї, двох, трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот ТПг-5ег; (3) оптимізована частина великого (І) поверхневого антигену НВМ, що відповідає положенням 1-249 5ЕО ІЮ
МО:110, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу О, для якої використовувалася стратегія конструювання, розглянута вище; (4) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВУ, що відповідає положенням 250-477 5ЕО
ІЮ МО:110, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу ОО, для якої використовувалася стратегія конструювання, розглянута вище; (5) оптимізована частина корового білка НВМ, що відповідає положенням 478-629 5ЕБО ІЮ МО:110, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу О, для якої використовувалася стратегія конструювання, розглянута вище; (б) оптимізована частина Х-антигену НВМ, що відповідає положенням 630-689 5ЕО ІЮ МО:110, що являє собою консенсусну послідовність для. НВМ генотипу О, для якої використовувалася стратегія конструювання, розглянута вище; і (7) необов'язково, гексагістидинова мітка. Імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, що містить М-кінцеву послідовність, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:37, позначають у даному описі як (3І-13013. Імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, що містить М-кінцеву послідовність, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:89, позначають у даному описі як 5І-13014.
Як розглянуто вище, одним варіантом здійснення винаходу є зміна порядку білкових сегментів НВУ у злитому білку, описаному в даному описі. Таким чином, хоча конструкції, у яких використовуються чотири білки НВМ, як описано вище, передбачені в порядку: поверхневий антиген, злитий з антигеном полімерази, злитий з коровим антигеном, злитий з Х-антигеном, винахід не обмежується цим конкретним порядком білків у конструкції, і, у дійсності, можна використовувати інші розташування злитих сегментів і, у деяких аспектах, вони можуть поліпшувати отримані імунотерапевтичні композиції. Наприклад, розташування сегментів у злитому білку може підвищувати або модифікувати експресію антигену НВМ у дріжджах, або може підвищувати або модифікувати імуногенність або іншу функціональну ознаку антигену
НВУ. В одному з аспектів цього варіанта здійснення винахід передбачає початок з одного антигену НВМ, що добре експресується в дріжджах і/або забезпечує позитивні функціональні дані (наприклад, є імуногенним), і додавання додаткових білків або доменів НВМ до цього антигену НВМ для розширення потенційних антигенів або епітопів, що містяться в антигені НВУ.
У прикладі 8 наданий приклад додаткових розташувань чотирьох білків НВУ, описаних вище.
У прикладі 8 описаний злитий білок, який містить послідовності з поверхневого антигену
НВУ, корового білка, полімерази і Х-антигену, де послідовності походили із сегментів злитих білків, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:110 ії БЕО ІЮ МО:118, і де в злитому білку використовується відмінний порядок злитих сегментів у порівнянні з БЕО ІЮ МО:110. Цей антиген оснований на консенсусній послідовності для НВМ генотипу О; однак можна прямо продукувати злитий білок, що має подібну загальну структуру, з використанням відповідних злитих сегментів зі злитих білків, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:107 або 5ЕО ІЮ МО:112 (генотип А), ЗЕО ІЮ МО:108 або 5ЕО
ІО МО:114 (генотип В), ЗЕО ІЮ МО:109 або 5ЕО ІОЮО МО:116 (генотип С), або з використанням відповідних послідовностей з іншого генотипу, підгенотипу, консенсусної послідовності або штаму НВУ. У цьому прикладі, дріжджі (наприклад, засспаготусез сегемізіає) конструювали для експресії цього злитого білка під контролем індукованого міддю промотору, СОР, і отримана імунотерапевтична композиція проти НВМ на основі дріжджів може бути позначена в даному описі як 5І-13017, схематично проілюстрована на фіг. 10. Злитий білок, що відповідає 5ЕО ІЮ
МО:124, містить, по порядку, послідовності поверхневого антигену, корового антигену, полімерази і Х-антигену, як єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:124 (необов'язкові послідовності, що не є послідовностями НВУ, не включені в основну послідовність ЗЕО ІЮ 60 МО:124, але можуть бути додані до цієї послідовності, як у випадку конструкції, описаної в прикладі 8): (1) необов'язково, М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:37 (у конструкції, описаній в прикладі 8), що може бути замінений М-кінцевим пептидом, який відповідає 5ЕО ІЮ МО:89, 5ЕО ІЮ МО:90, або іншим М- кінцевим пептидом, що підходить для застосування у імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот Тпг-бег (у конструкції, описаній в прикладі 8); (3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для НВМ генотипу О великого (І) поверхневого антигену, що відповідає положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО:124 (відповідна положенням 1-399 5ЕО
ІО МО:118); 4) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності корового антигену НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 400-581 5ЕО ІЮ МО:124 (відповідна положенням 400-581
ЗБЕО ІЮ МО:118); (5) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази
НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу О, що відповідає положенням 582-809 5ЕО ІЮ МО:124 (відповідна положенням 250-477 5ЕО ІЮ МО:110); (6) оптимізована частина Х-антигену НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 810-869 5ЕО ІЮ МО:124 (відповідна положенням 630-689
ЗЕО ІЮ МО:110); і (7) необов'язково, гексагістидинова мітка (у конструкції, описаній в прикладі 8). ЗЕО ІЮ МО:124 містить множину Т-клітинних епітопів (людини і миші), що можуть бути знайдені в таблиці 5. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок БЕО ІЮ МО:124 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як БХЕО ІЮ МО:123.
У прикладі 8 також описаний інший злитий білок, який містить послідовності з поверхневого антигену НВУ, корового білка, Х-антигену і полімерази, де послідовності походили із сегментів злитих білків, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:110 ії 5БО ІЮО МО:118, але де в злитому білку використовується відмінний порядок злитих сегментів у порівнянні з ЗЕО ІЮ МО:110. Цей антиген також оснований на консенсусній послідовності для НВМ генотипу Ю; однак можна прямо продукувати злитий білок, що має подібну загальну структуру, з використанням відповідних злитих сегментів зі злитих білків, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:107 або 5ЕО ІО
МО:112 (генотип А), 5ЗЕО ІЮ МО:108 або 5ЕО ІЮО МО:114 (генотип В), 5ЕО ІЮ МО:109 або 5ЕО ІЮ
МО:116 (генотип С), або з використанням відповідних послідовностей з відмінного генотипу, підгенотипу, консенсусної послідовності або штаму НВУ. У цьому прикладі дріжджі (наприклад,
Засспаготусев сегемізіаеє) модифікували способами інженерії так, щоб вони експресували цей злитий білок під контролем індукованого міддю промотору, СИРІ, і отримана імунотерапевтична композиція проти НВМ на основі дріжджів може бути позначена в даному описі як СІ-13018, схематично проілюстрована на фіг. 11. Злитий білок, що відповідає ЗЕО ІЮ
МО:126, містить, по порядку, послідовності поверхневого антигену, корового антигену, Х- антигену і полімерази, як єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:126 (необов'язкові послідовності, що не є послідовностями НВУ, не включені в основну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:126, але можуть бути додані до цієї послідовності, як у випадку конструкції, описаної в прикладі 8): (1) необов'язково, М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:37 (у конструкції, описаній в прикладі 8), що може бути замінений М-кінцевим пептидом, який відповідає 5ЕО ІЮ МО:89, 5ЕО ІЮ МО:90, або іншим М- кінцевим пептидом, що підходить для застосування у імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот Тпг-бег (у конструкції, описаній в прикладі 8); (3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу О, що відповідає положенням 1-399 5БЕО ІЮО МО:126 (відповідна положенням 1-399
ЗБО ІЮО МО:118); 4) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу Ю, що відповідає положенням 400-581 5ЕО ІЮ МО:126 (відповідна положенням 400-581 БЕ ІЮ МО:118); (5) оптимізована частина Х-антигену НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 582- 641 5ЕО І МО:126 (відповідна положенням 630-689 5ЕО 10 МО 110); (5) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу О, що відповідає положенням 642-869 5ЕО ІЮ МО:126 (відповідна положенням 250-477 ЗЕО ІЮ МО:110); і (7) необов'язково, гексагістидинова мітка (у конструкції, описаній в прикладі 8). 5ЕО ІЮ МО:126 містить множину Т-клітинних епітопів 60 (людини і миші), що можуть бути знайдені в таблиці 5. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок ЗЕО ІЮ МО:126 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як ХЕО ІЮ МО:125.
У прикладі 8 описаний інший злитий білок, який містить послідовності з полімерази, Х- антигену, поверхневого антигену, корового білка НВУ, де послідовності походили із сегментів злитих білків, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:110 і 5БО ІЮО МО:118, але де в злитому білку використовується відмінний порядок злитих сегментів у порівнянні з ЗЕО ІЮ МО:110. Цей антиген оснований на консенсусній послідовності для НВМ генотипу Ю; однак можна прямо продукувати злитий білок, що має подібну загальну структуру, з використанням відповідних злитих сегментів зі злитих білків, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:107 або 5ЕО ІЮ МО:112 (генотип
А), БЕО ІЮ МО:108 або 5ЕО ІЮ МО:114 (генотип В), ЗЕО І МО:109 або 5ЕО ІО МО:116 (генотип
С), або з використанням відповідних послідовностей з відмінного генотипу, підгенотипу, консенсусної послідовності або штаму НВМУ. У цьому прикладі конструювали дріжджі (наприклад, Засспаготусев5 сегемізіае) для експресії цього злитого білка під контролем індукованого міддю промотору СИРІ, і отримана імунотерапевтична композиція проти НВМ на основі дріжджів може бути позначена в даному описі як СІ-13021, схематично проілюстрована на фіг. 14. Злитий білок, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:132, містить, по порядку, полімеразу, Х- антиген, поверхневий антиген і коровий антиген як єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають ЗЕО
ІО МО:132 (необов'язкові послідовності, що не є послідовностями НВУ, не включені в основну послідовність 5ЕО ІЮО МО:132, але можуть бути додані до цієї послідовності, як у випадку конструкції, описаної в прикладі 8): (1) необов'язково, М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:37 (у конструкції, описаній в прикладі 8), що може бути замінений М-кінцевим пептидом, який відповідає ЗЕО ІЮ МО:89, 5ЗЕО
ІЮ МО:90, або іншим М-кінцевим пептидом, що підходить для застосування в імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот ТПг-Зег (у конструкції, описаній в прикладі 8); (3) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 1-228 5ЕО ІЮО МО:132 (відповідна положенням 250-477 5БЕО ІО МО:110); (4) оптимізована частина Х-антигену НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 229- 288 5ЕБЕО І МО:132 (відповідна положенням 630-689 5БО ІЮ МО:110); (5) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 289-687 5ЕО І
МО:132 (відповідна положенням 1-399 ЕС ІЮ МО:118); (6) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу О, що відповідає положенням 688-869 5ЕО ІО МО:132 (відповідна положенням 400-581 5ЕО ІЮ МО:118); і (7) необов'язково, гексагістидинова мітка (у конструкції, описаній в прикладі 8). хЕО ІЮО МО:132 містить множину Т- клітинних епітопів (людини і миші), що можуть бути знайдені в таблиці 5. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок 5ЗЕО ІЮ МО:132 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як 5ЕО ІЮ МО:131.
У прикладі 8 також описаний злитий білок, який містить послідовності з Х-антигену, полімерази, поверхневого антигену і корового білка НВУ, де послідовності походили із сегментів злитих білків, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:110 ії 5БО ІЮО МО:118, але де в злитому білку використовується відмінний порядок злитих сегментів у порівнянні з ЕС ІЮ МО:110. Цей антиген оснований на консенсусній послідовності для НВМ генотипу Ю; однак можна прямо продукувати злитий білок, що має подібну загальну структуру, з використанням відповідних злитих сегментів зі злитих білків, що відповідають ЗЕО ІЮ МО:107 або 5ЕО ІЮ МО:112 (генотип 50. А), БЕО ІЮ МО:108 або 5ЕО ІЮ МО:114 (генотип В), ЗЕО І МО:109 або 5ЕО ІО МО:116 (генотип
С), або з використанням відповідних послідовностей з відмінного генотипу, підгенотипу, консенсусної послідовності або штаму НВМ. У цьому прикладі дріжджі (наприклад,
Засспаготусев сегемізіає) модифікували способами інженерії так, щоб вони експресували цей злитий білок під контролем індукованого міддю промотору СИРІ, і отримана імунотерапевтична композиція проти НВМ на основі дріжджів може бути позначена в даному описі як І-13022, схематично проілюстрована на фіг. 15. Злитий білок, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:134, містить, по порядку, Х-антиген, полімеразу, поверхневий антиген і коровий білок, як єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають ЗЕО ІЮ МО:134 (необов'язкові послідовності, що не є послідовностями НВУ, не 60 включені в основну послідовність зЕО ІЮ МО:134, але можуть бути додані до цієї послідовності,
як у випадку конструкції, описаної в прикладі 8): (1) необов'язково, М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:37 (у конструкції, описаній в прикладі 8), що може бути замінений М-кінцевим пептидом, який відповідає ЗЕО ІЮ МО:89, 5ЗЕО
ІЮ МО:90, або іншим М-кінцевим пептидом, що підходить для застосування в імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот ТПг-5ег (у конструкції, описаній в прикладі 8); (3) оптимізована частина Х- антигену НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 1-60 5ЗЕО ІЮ МО:134 (відповідна положенням 630-689 5ЕО 10 МО:110); (4) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу Ю, що відповідає положенням 61-288 5ЕО І
МО:134 (відповідна положенням 250-477 5ЕО ІЮО МО:110); (5) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу О, що відповідає положенням 289-687 5ЕО І МО:134 (відповідна положенням 1-399 5ЕО ІО МО:118); (6) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 688-869 5ЕО
ІЮ МО:134 (відповідна положенням 400-581 5БО 10 МО:118); і (7) необов'язково, гексагістидинова мітка (у конструкції, описаній в прикладі 8), 5ЕО ІЮО МО:134 містить множину Т- клітинних епітопів (людини і миші), що можуть бути знайдені в таблиці 5. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок 5ЗЕО ІЮ МО:134 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як ХЕО ІЮ МО:133.
Антигени НВУ, що містять поверхневий антиген, коровий білок і Х-антиген. В одному з варіантів здійснення винаходу антиген(и) НВМ для застосування в композиції або способі за винаходом являє собою злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ містять або складаються з: поверхневого антигену НВМ (великий (І), середній (М) або малий (5)) або щонайменше один їхній структурний, функціональний або імуногенний домен), корового білка
НВМ (НВсАд) або е-антигену НВМ (НВело) або щонайменше одного їх структурного, функціонального або імуногенного домену, і Х-антигену НВМ (НВх) або щонайменше одного його структурного, функціонального або імуногенного домену. В одному з аспектів будь-який один або декілька з поверхневого антигену НВМ, корового білка НВМ, е-антигену НВУ, Х- антигену НВМ або їх домену є повнорозмірним або практично повнорозмірним. В одному з аспектів будь-який один або декілька з поверхневого антигену НВУ, корового білка НВУМ, е- антигену НВМ, Х-антигену НВМ або їх домену містить щонайменше 80 95, 85 95, 90 У, 91 95, 9296, 9396, 94 95, 9595, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95 лінійної послідовності повнорозмірного поверхневого антигену НВМ, корового білка НВМ, е-антигену НВМ, Х-антигену НВМ або їх домену, відповідно, або амінокислотної послідовності, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:97 (оптимізований поверхневий антиген НВМ), 5ЕО ІЮ МО:99 (оптимізований коровий білок), ЗЕО
ІО МО:100 (оптимізований Х-антиген), або відповідної послідовності з іншого штаму НВУ, коли це застосовно. В одному з аспектів будь-який один або декілька з поверхневого антигену НВУ, корового білка НВУ, е-антигену НВМ, Х-антигену НВМ або їх домену щонайменше на 80 95, 85 то, 90 то, 91 зо, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 9895 або 9995 ідентичний повнорозмірному поверхневому антигену НВУ, коровому білку НВУ, е-антигену НВУ, Х-антигену
НВМУ або їх домену, відповідно, або амінокислотним послідовностям, що відповідають ЗЕО ІЮ
МО:97 (оптимізований поверхневий антиген НВМ), 5ЕО ІЮ МО:99 (оптимізований коровий білок),
ЗЕО ІЮ МО:100 (оптимізований Х-антиген) або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ, коли це застосовно. Різні придатні й ілюстративні послідовності для додаткових поверхневих антигенів НВУ, корових антигенів НВМ і Х-антигенів НВУ, що підходять у цій конструкції, описані в даному описі.
У прикладі 8 описаний злитий білок, який містить послідовності з поверхневого антигену, корового білка і Х-антигену НВМ, де послідовності походили із сегментів злитих білків, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:110 ії 5ЕО ІЮО МО:118. Цей антиген оснований на консенсусній послідовності для НВМ генотипу Ю; однак можна прямо продукувати злитий білок, що має подібну структуру, з використанням відповідних злитих сегментів зі злитих білків, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:107 або 5ЕО ІЮ МО:112 (генотип А), ЗЕО ІЮО МО:108 або 5ЕО І
МО:114 (генотип В), ЗЕО ІЮО МО:109 або 5ЕБЕО ІЮ МО:116 (генотип С), або з використанням відповідних послідовностей з іншого генотипу, підгенотипу, консенсусної послідовності або штаму НВМ. У цьому прикладі дріжджі (наприклад, Засспаготусев5 сегемізіае) модифікували способами інженерії для експресії цього злитого білка під контролем індукованого міддю 60 промотору СОРТ, і отримана імунотерапевтична композиція проти НВМ на основі дріжджів може бути позначена в даному описі як 5І-13016, як схематично представлено на фіг. 9. Злитий білок, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:122, містить, по порядку, послідовності поверхневого антигену, корового антигену і Х-антигену як єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:122 (необов'язкові послідовності, що не є послідовностями НВУ, не включені в основну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:122, але можуть бути додані до цієї послідовності, як у випадку конструкції, описаної в прикладі 8): (1) необов'язково, М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:37 (у конструкції, описаній в прикладі 8), що може бути замінений М-кінцевим пептидом, який відповідає 5ЕО ІЮ МО:89, 5ЕО ІЮ МО:90, або іншим М- кінцевим пептидом, що підходить для застосування в імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот Тпг-бег (у конструкції, описаній в прикладі 8); (3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу О, що відповідає положенням 1-399 5ЕО ІЮО МО:122 (відповідна положенням 1-399
ЗБО ІЮО МО:118); 4) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу Ю, що відповідає положенням 400-581 5ЕБЕО ІЮ МО:122 (відповідна положенням 400-581 БЕ ІЮ МО:118); (5) оптимізована частина Х-антигену НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 582- 641 5ЕО ІЮ МО:122 (відповідна положенням 630-689 5ЕО ІЮ МО:110); і (6) необов'язково, гексагістидинова мітка (у конструкції, описаній в прикладі 8). хЕО ІЮО МО:122 містить множину Т- клітинних епітопів (людини і миші), що можуть бути знайдені в таблиці 5. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок 5ЕО ІЮ МО:122 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах), представлена в даному описі як 5ЕО ІЮ МО:121.
У прикладі 8 також описаний злитий білок, який містить послідовності з поверхневого антигену, корового білка і Х-антигену НВУ, де, як і в злитому білку, що містить ЗЕО ІЮ МО:122, послідовності походили із семгентів злитих білків, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:110 і 5ЕО І
МО:118. Однак цей злитий білок відрізняється від злитого білка, що містить 5ЕО ІЮ МО:122 розташуванням злитих сегментів у злитому білку. Цей антиген оснований на консенсусній послідовності для НВМ генотипу Ю; однак можна прямо продукувати злитий білок, що має подібну загальну структуру, з використанням відповідних злитих сегментів зі злитих білків, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:107 або 5ЕО ІЮ МО:112 (генотип А), ЗЕО ІЮО МО:108 або 5ЕО І
МО:114 (генотип В), ЗЕО ІЮО МО:109 або 5ЕБЕО ІЮ МО:116 (генотип С), або з використанням відповідних послідовностей з відмінного генотипу, підгенотипу, консенсусної послідовності або штаму НВМ. У цьому прикладі дріжджі (наприклад, Засспаготусев5 сегемізіае) модифікували способами інженерії для експресії цього злитого білка під контролем індукованого міддю промотору СИРІ, і отримана імунотерапевтична композиція проти НВМ на основі дріжджів може бути позначена в даному описі як 5І-13020, як схематично представлено на фіг. 13. Злитий білок, що відповідає 5ЕО ІЮО МО:130, містить, по порядку, послідовності Х-антигену, поверхневого антигену і корового антигену як єдиного поліпептиду з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають ЗЕО ІЮ МО:130 (необов'язкові послідовності, що не є послідовностями НВМ, не включені в основну послідовність 5ЕО ІЮ МО:130, за винятком лінкера Геи-СІіи між сегментом Х-антигену і сегментом поверхневого антигену в конструкції, проїілюстрованій в даному описі, але можуть бути додані до цієї послідовності, як у випадку конструкції, описаної в прикладі 8): (1) необов'язково, М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО ІЮО МО:37 (у конструкції, описаній в прикладі 8), що може бути замінений М- кінцевим пептидом, який відповідає ЗЕО ІЮ МО:89, 5БО ІЮО МО:90, або іншим М-кінцевим пептидом, що підходить для застосування в імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з однієї до трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот ТАг-Зег (у конструкції, описаній в прикладі 8); (3) оптимізована частина Х-антигену НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу О, що відповідає положенням 1-60 5ЕО ІЮ МО:130 (відповідна положенням 630-689 5ЕО ІЮО МО:110); (4) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот Геи-сїій (у конструкції, описаній в прикладі 8), що відповідає положенням 61-62 5ЕО ІЮ МО 130; (5) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної 60 послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу О, що відповідає положенням 63-461 5ЕО ІЮ МО:130 (відповідна положенням 1-399 5ЕО І0О МО:118); (6) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 462-643 5ЕО ІЮ МО:130 (відповідна положенням 400-581 5ЕО І
МО:118); ї (7) необов'язково, гексагістидинова мітка (у конструкції, описаній в прикладі 8). «ЕО
ІО МО:130 містить множину Т-клітинних епітопів (людини і миші), що можуть бути знайдені в таблиці 5. Амінокислотна послідовність повного злитого білка, описаного в прикладі 8, що містить ЗЕО ІЮ МО:130 і що включає М- ії С-кінцевий пептиди і всі лінкери, представлена в даному описі як ЗЕО ІЮ МО:150. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок ЗЕО
ІО МО:130 або 5ЕО ІЮ МО:150 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як зЕО ІЮ МО:129.
Антигени НВМ, що містять поверхневий антиген, коровий білок і полімеразу. В одному з варіантів здійснення винаходу антиген(и) НВМ для застосування в композиції або способі за винаходом являє собою злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ містять або складаються з: поверхневого антигену НВМ (великий (І), середній (М) або малий (5)) або щонайменше один їхній структурний, функціональний або імуногенний домен), корового білка
НВМ (НВсАд) або е-антигену НВМ (НВедло) або щонайменше одного їх структурного, функціонального або імуногенного домену, і полімерази НВМ або щонайменше одного її структурного, функціонального або імуногенного домену (наприклад, домен зворотної транскриптази (КТ)). В одному з аспектів будь-який один або декілька з поверхневого антигену
НВУ, корового білка НВУ, е-антигену НВУ, полімерази НВУ або їх домену, є повнорозмірним або практично повнорозмірним. В одному з аспектів будь-який один або декілька з поверхневого антигену НВМ, корового білка НВМУ, е-антигену НВМ, полімерази НВМ або їх домену містять щонайменше 80 95, 85 Фо, 90 Уо, 91 95, 92 Уо, 93 Фо, 94 Уо, 95 95, 96 9о, 97 Чо, 98 90 або 99 95 лінійної послідовності повнорозмірного поверхневого антигену НВМУ, корового білка
НВУ, е-антигену НВМ, полімерази НВМ або їх домену, відповідно, або амінокислотних послідовностей, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:97 (оптимізований поверхневий антиген НВМ),
ЗЕО ІЮО МО:99 (оптимізований коровий білок), БЕО ІЮ МО:98 (оптимізована полімераза) або відповідної послідовності з іншого штаму НВУ, коли це застосовно. В одному з аспектів будь- який один або декілька з поверхневого антигену НВМ, корового білка НВУ, е-антигену НВУ, полімерази НВУ або їх домену щонайменше на 80 95, 85 Фо, 90 Фо, 91 95, 92 о, 93 Фо, 94 95, 95 9, 96 оо, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичні повнорозмірному поверхневому антигену НВУ, коровому білку НВУ, е-антигену НВУ, полімеразі НВМ або їх домену, відповідно, або амінокислотним послідовностям, що відповідають ЗЕ ІЮ МО:97 (оптимізований поверхневий антиген НВМ),
ЗЕО ІЮ МО:99 (оптимізований коровий білок), «ЕО ІЮ МО:98 (оптимізована полімераза), або відповідній послідовності з іншого штаму НВУ, коли це застосовно. Різні придатні й ілюстративні послідовності для поверхневих антигенів НВУ, антигенів полімерази НВМУ і корових антигенів
НВМ описані в даному описі.
Один приклад такого злитого білка схематично представлений на фіг. 7. Приклад композиції, що містить цей злитий білок, описаний у прикладі 3. У цьому варіанті здійснення дріжджі (наприклад, бЗасспаготусеб5 сегемізіае) конструюють для експресії різних злитих білків поверхневий антиген-полімераза-коровий антиген НВМ під контролем індукованого міддю промотору СОРТ або промотору ТЕР2. У кожному випадку злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С- кінця, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:41: (1) М-кінцевий пептид для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабільної експресії (наприклад, положення 1-5 5ЕО ІЮ МО:41); 2) амінокислотна послідовність розпізнаваного рецепторами гепатоцитів домену частини рге-51 великого (І) поверхневого білка НВМ (унікальна для І) (наприклад, положення 21-47 5ЕО ІО
МО:11 або положення 6-32 ЗЕО ІЮ МО:41); 3) амінокислотна послідовність малого (5) поверхневого білка НВМ (наприклад, положення 176-400 5ЕО ІЮ МО:11 або положення 33-257
ЗБО ІЮ МО:41); 4) спейсер/лінкер із двох амінокислот для полегшення клонування |і модулювання послідовностей (наприклад, положення 258 і 259 5ЕО ІЮ МО:41); 5) амінокислотна послідовність полімерази НВМ, що містить домен зворотної транскриптази (наприклад, положення 247-691 5ЕО ІЮ МО:10 або положення 260-604 5ЕО ІЮО МО:41); 6) амінокислотна послідовність корового білка НВМ (наприклад, положення 31-212 5ЕО ІЮО МО:9 або положення 605-786 5ЕО ІЮО МО:41); і 7) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 787-792 5ЕО ІЮ
МО:41). Послідовність також містить епітопи або домени, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка. Крім того, в одному з варіантів здійснення послідовність цієї конструкції можна модифікувати внесенням однієї або декількох або усіх з наступних мутацій, спрямованих проти стійкості вірусів: п204І, п18ОМ, п204М, п173Ї, 236Т, й"т194Т (положення 60 приведені відносно повнорозмірної амінокислотної послідовності для полімерази НВМ). В одному з варіантів здійснення створюють шість різних імунотерапевтичних композицій, кожна з яких містить одну з цих мутацій. В інших варіантах здійснення всі або деякі з мутацій включені в єдиний злитий білок. В одному з варіантів здійснення ця конструкція також містить одну або декілька мутацій, спрямованих проти стійкості вірусу, у поверхневому антигені. Амінокислотні сегменти, використовувані в будь-якому зі злитих білків, описаних у даному описі, можна модифікувати з використанням додаткових амінокислот, що фланкують будь-який кінець будь- якого домену; приклади, представлені в даному описі, є ілюстративними. Наприклад, злитий білок відповідно до цього варіанта здійснення може включати: 1) амінокислотну послідовність розпізнаваного рецепторами гепатоцитів домену частини рге-51 великого (І) поверхневого білка НВМ (унікальна для І) (наприклад, положення 21-47 5ЕО ІЮ МО:11 або положення 6-32
ЗЕО ІЮ МО:41); 2) амінокислотну послідовність малого (5) поверхневого білка НВМ (наприклад, положення 176-400 5ЕО І МО:11 або положення 33-257 ЗЕО ІЮ МОС41); 3) амінокислотну послідовність полімерази НВМ, що містить домен зворотної транскриптази (наприклад, положення 247-691 5ЕО ІЮО МО:10 або положення 260-604 5ЕО ІЮ МО:41); і 4) амінокислотну послідовність корового білка НВМ (наприклад, положення 31-212 5ЕО ІЮО МО:9 або положення 605-786 5ЕО ІЮ МО:41), і може не включати М- або С-кінцевих послідовностей, або може включати відмінні М- або С-кінцеві послідовності, і/або може включати лінкери або не включати лінкери між послідовностями НВУ. В одному з варіантів здійснення замість М-кінцевого пептиду, що відповідає положенням 1-5 5БО ІЮ МО:41, використовується М-кінцевий пептид, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:89 або 5ЕБЕО І МО:90, за яким йде інша частина злитого білка, як описано.
Інший приклад такого злитого білка описаний у прикладі 8. У прикладі 8 проілюстрований злитий білок, який містить послідовності з поверхневого антигену, корового білка і полімерази
НВУ, де послідовності походили із сегментів злитих білків, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:110 і
ЗЕО ІЮ МО:118. Цей антиген оснований на консенсусній послідовності для НВМ генотипу 0; однак можна прямо продукувати злитий білок, що має подібну загальну структуру, з використанням відповідних злитих сегментів зі злитих білків, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:107 або 5ЕО ІЮ МО:112 (генотип А), 5ЕО ІЮ МО:108 або 5ЕО ІЮО МО:114 (генотип В), 5ЕО ІЮ МО:109 або 5ЕО ІЮ МО:116 (генотип С), або з використанням відповідних послідовностей з відмінного генотипу, підгенотипу, консенсусної послідовності або штаму НВУ. У цьому прикладі дріжджі (наприклад, Засспаготусев сегемізіае) модифікували способами інженерії для експресії цього злитого білка під контролем індукованого міддю промотору СИРІ, і отримана імунотерапевтична композиція проти НВМ на основі дріжджів може бути позначена в даному описі як 5І-13015, схематично проілюстрована на фіг. 8. Злитий білок, що відповідає ЗЕО ІЮ
МО:120, містить, по порядку, послідовності поверхневого антигену, корового білка і полімерази, як єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від
М- до С-кінця, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:120 (необов'язкові послідовності, що не є послідовностями НВУ, не включені в основну послідовність ЗЕО ІЮ МО:120, але можуть бути додані до цієї послідовності, як у випадку конструкції, описаної в прикладі 8): (1) необов'язково,
М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО
ІО МО:37 (у конструкції, описаній в прикладі 8), що може бути замінений М-кінцевим пептидом, який відповідає 5ЕО ІЮ МО:89, 5ЕО ІЮ МО:90, або іншим М-кінцевим пептидом, що підходить для застосування в імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот ТПг-зег (у конструкції, описаній в прикладі 8); (3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 1-399 5ЗЕО ІЮ МО:120 (відповідна положенням 1-399 5ЕО 10 МО:118); (4) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 400-581 5ЕО ІЮ МО:120 (відповідна положенням 400-581 5ЕО І
МО:118); (5) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 582- 809 5ЕО ІЮ МО:120 (відповідна положенням 250-477 5ЕБЕО ІЮ МО:110); і (6) необов'язково, гексагістидинова мітка (у конструкції, описаній в прикладі 8). хЕО ІЮ МО:120 містить множину Т- клітинних епітопів (людини і миші), що можуть бути знайдені в таблиці 5. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок 5ЕО ІЮ МО:120 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як 5ХЕО ІЮ МО:119.
Інший приклад такого злитого білка описаний у прикладі 8. У прикладі 8 проілюстрований 60 злитий білок, який містить послідовності з полімерази, поверхневого антигену і корового білка
НВУ, де послідовності походили із сегментів злитих білків, що відповідають ЗЕО ІЮ МО:110 і
ЗЕО ІЮ МО:118. Цей злитий білок відрізняється від злитого білка, що містить 5ЕО ІЮ МО:120 розташуванням злитих сегментів злитого білка. Цей антиген оснований на консенсусній послідовності для НВМ генотипу Ю; однак можна прямо продукувати злитий білок, що має подібну загальну структуру з використанням відповідних злитих сегментів зі злитих білків, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:107 або 5ЕО ІЮ МО:112 (генотип А), ЗЕО ІЮО МО:108 або 5ЕО І
МО:114 (генотип В), ЗЕО ІЮО МО:109 або 5ЕБЕО ІЮ МО:116 (генотип С), або з використанням відповідних послідовностей з відмінного генотипу, підгенотипу, консенсусної послідовності або штаму НВМ. У цьому прикладі дріжджі (наприклад, Засспаготусев5 сегемізіае) модифікували способами інженерії для експресії цього злитого білка під контролем індукованого міддю промотору СИРІ, і отримана імунотерапевтична композиція проти НВМУ на основі дріжджів може бути позначена в даному описі як 51-13019, схематично представлена на фіг. 12. Злитий білок, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:128 містить, по порядку, послідовності полімерази, поверхневого антигену і корового антигену, як єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:128 (необов'язкові послідовності, що не є послідовностями НВУ, не включені в основну послідовність ЗЕО ІЮ
МО:128, за винятком лінкера І еи-Сіи між сегментом полімерази і сегментом поверхневого антигену в конструкції, проілюстрованій в даному описі, але можуть бути додані до цієї послідовності, як у випадку конструкції, описаної в прикладі 8): (1) необов'язково, М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:37 (у конструкції, описаній в прикладі 8), що може бути замінений М-кінцевим пептидом, який відповідає БЕО ІЮ МО:89, 5ЕО ІЮ МО:90, або іншим М-кінцевим пептидом, що підходить для застосування в імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, як описано в даному описі; (2) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох або більше амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот ТПг-зег (у конструкції, описаній в прикладі 8); (3) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу ЮО, що відповідає положенням 1-228 5ЕО І
МО:128 (відповідна положенням 250-477 5ЕО ІЮ МО:110); (4) необов'язково, лінкерний пептид з від однієї до трьох амінокислот, такий як амінокислотний лінкер із двох амінокислот І е!и-СіІм (у конструкції, описаній в прикладі 8), що відповідає положенням 229-230 5ЕО І МО 28; (5) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 231-629 5ЕО І МО:128 (відповідна положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО:118); (6) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 630-811 5ЕО ІЮ МО:128 (відповідна положенням 400-581 5ЕО І
МО:118); ї (7) необов'язково, гексагістидинова мітка (у конструкції, описаній в прикладі 8). ЗЕО
ІО МО:128 містить множину Т-клітинних епітопів (людини і миші), що можуть бути знайдені в таблиці 5. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок ЗЕО ІЮ МО:128 (кодон- оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як ЗЕО ІЮ МО:127.
Антигени НВУ, що містять полімеразу і коровий білок. В одному з варіантів здійснення винаходу антиген(и) НВМ для застосування в композиції або способі за винаходом являє собою злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ містять або складаються з полімерази
НВМУ (ВТ-домен) або щонайменше одного її імуногенного домену і корового білка НВМ (НВсАд) або щонайменше одного його імуногенного домену. В одному з аспектів один або обидва з КТ- домену полімерази НВМ або корового білка НВМ є повнорозмірними або практично повнорозмірними. В одному з аспектів один або обидва з КТ-домену полімерази НВМ або корового білка НВМ або їх домену містять щонайменше 80 95, 85 95, 90 о, 91 95, 92 95, 93 9, 94 95, 9595, 9695, 97 95, 9895 або 9995 лінійної послідовності повнорозмірного КТ-домену полімерази НВМ або корового білка НВМ або їхній домену, відповідно, або амінокислотні послідовності, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:98 (оптимізована полімераза НВМ), ЗЕО ІЮ МО:99 (оптимізований коровий білок), або відповідну послідовність з іншого штаму НВУМ, коли це застосовно. В одному з аспектів один або обидва з КТ-домену полімерази НВМ або корового білка НВУ або їх домену щонайменше на 80 95, 85 95, 90 Фо, 91 95, 92 95, 93 о, 94 Фо, 95 95, 96 95, 97 Фо, 98 95 або 99 95 ідентичні повнорозмірному ЕТ-домену полімерази НВУ або корового білка
НВМУ або їх домену, відповідно, або амінокислотним послідовностям, що відповідають ЗЕО ІЮ
МО:98 (оптимізована полімераза НВМ), ЗЕО ІЮ МО:99 (оптимізований коровий білок), або відповідної послідовності з іншого штаму НВУ, коли це застосовно. Різні придатні й ілюстративні послідовності для антигенів полімерази НВУ і корових антигенів НВМ описані в даному описі. 60 Один приклад цього антигену схематично представлений на фіг. 4. Один приклад бо композиції, що містить цей злитий білок, описаний у прикладі 3. У цьому варіанті здійснення дріжджі (наприклад, Засспаготусев сегемізіае) модифікують способами інженерії для експресії різних злитих білків полімераза-коровий антиген НВУ, як схематично представлено на фіг. 4 під контролем індукованого міддю промотору СОРІ або промотору ТЕБ2. У будь-якому випадку злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають 5ЕО ІО МО:38: (1) М-кінцевий пептид для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабільної експресії (наприклад, ЗЕО ІЮ
МО:37 або положення 1-6 5ЕО ІЮ МО:38); 2) амінокислотна послідовність частини полімерази
НВМ генотипу С, що включає домен зворотної транскриптази (наприклад, положення 347-691 5ЕО ІЮ МО:10 або положення 7-351 5ЕБО ІЮ МО:38); 3) коровий білок НВМ генотипу С (наприклад, положення 31-212 5ЗЕО ІЮО МО:9 або положення 352-533 5ЕО ІЮ МО:38); ї 4) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 534-539 5ЕО ІЮ МО:38). Послідовність також містить епітопи або домени, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка.
Амінокислотні сегменти, використовувані в будь-якому зі злитих білків, описаних у даному описі, можна модифікувати з використанням додаткових амінокислот, що фланкують будь-який кінець будь-якого домену; приклади, представлені в даному описі, є ілюстративними. Наприклад, злитий білок відповідно до цього варіанта здійснення може включати: 1) амінокислотну послідовність частини полімерази НВМ генотипу С, що включає домен зворотної транскриптази (наприклад, положення 347-691 5ЕО ІЮ МО:10 або положення 7-351 5ЕО ІО МО:38); і 2) коровий білок НВМ генотипу С (наприклад, положення 31-212 ЗЕО ІЮ МО:9 або положення 352-533 5ЕО
ІО МО:38), і не включає М- або С-кінцевих послідовностей, або включає відмінні М- або С-кінцеві послідовності, і/або включає лінкери або не включає лінкери між послідовностями НВМУ. В одному з варіантів здійснення замість М-кінцевого пептиду, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:37, використовують М-кінцевий пептид, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:89 або 5ЕО ІЮО МО:90, за яким йде інша частина злитого білка.
Антигени НВМ, що містять Х-антиген і коровий білок. В одному з варіантів здійснення винаходу антиген(и) НВМ для застосування в композиції або способі за винаходом являє собою злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМУ містять або складаються з Х-антигену
НВМ або щонайменше одного його імуногенного домену і корового більеа НВМ (НВсАд) або щонайменше одного його імуногенного домену. В одному з аспектів один або обидва з Х- антигену НВМ або корового білка НВМ є повнорозмірними або практично повнорозмірними. В одному з аспектів один або обидва з Х-антигену НВМ або корового білка НВМ або їх домену містять щонайменше 80 95, 85 Зо, 90 95, 91 95, 92 95, 93 96, 94 95, 95 90, 96 95, 97 Уо, 98 95 або 99 95 лінійної послідовності повнорозмірного Х-антигену НВМ або корового білка НВУ, або їхній домену, відповідно, або амінокислотних послідовностей, що відповідають 5ЕО ІЮО МО:99 (оптимізований коровий білою), ЗЕО ІЮ МО:100 (оптимізований Х-антиген), або відповідних послідовностей з іншого штаму НВУ, коли це застосовно. В одному з аспектів один або обидва з
Х-антигену НВМ або корового білка НВУ, або їх домену щонайменше на 80 95, 85 9, 90 9», 91 Ор, 92 Фо, 93 У, 94 95, 95 о, 96 95, 97 Ус, 98 95 або 99 95 ідентичні повнорозмірному Х-антигену НВМ або коровому білку НВМ або їх домену, відповідно, або амінокислотним послідовностям, що відповідають 5ЗЕО ІЮ МО:99 (оптимізований коровий білок), 5ХЕО ІЮ МО:100 (оптимізований Х- антиген), або відповідної послідовності з іншого штаму НВУ, коли це застосовно. Різні придатні й ілюстративні послідовності для корових антигенів НВМ і Х-антигенів НВМ описані в даному описі.
Цей злитий білок схематично представлений на фіг. 5. Приклад композиції, що містить цей злитий білок, описаний у прикладі 3. У цьому варіанті здійснення дріжджі (наприклад,
Засспаготусев сегемізіаеє) модифікують способами інженерії для експресії різних злитих білків
Х-коровий антиген НВМУ, як схематично представлено на фіг. 5 під контролем індукованого міддю промотору СОР1 або промотору ТЕРЕ2. У будь-якому випадку злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає БЕО ІЮ МО:39 (1) М-кінцевий пептид для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабільної експресії (наприклад, 5ЗЕО ІЮ МО:37 або положення 1-6
ЗЕО ІЮ МО:39); 2) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного (мінус положення 1)
Х-антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 2-154 5ЕО ІЮ МО:12 або положення 7-159
ЗЕО ІЮ МО:39); 3) коровий білок НВМ генотипу С (наприклад, положення 31-212 5ЕО ІЮ МО:9 або положення 160-341 5ЕО ІЮ МО:39); і 4) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 342- 347 ЗЕО ІЮ МО:39). Послідовність також містить епітопи або домени, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка. Амінокислотні сегменти, використовувані в будь-якому зі злитих білків, описаних у даному описі, можна модифікувати з використанням додаткових 60 амінокислот, що фланкують будь-який кінець будь-якого домену; приклади, представлені в даному описі, є ілюстративними. Наприклад, злитий білок відповідно до цього варіанта здійснення може включати 1) амінокислотну послідовність практично повнорозмірного (мінус положення 1) Х-антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 2-154 5ЕО ІО МО:12 або положення 7-159 ЗЕО ІЮО МО:39); і 2) коровий білок НВМ генотипу С (наприклад, положення 31- 212 ЗЕБЕО ІЮ МО:9 або положення 160-341 5ЕО ІЮ МО:39), і не включає М- або С-кінцеві послідовності, або включає відмінні М- або С-кінцеві послідовності, ілгабо включає лінкери або не включає лінкери між послідовностями НВУ. В одному з варіантів здійснення замість М-кінцевого пептиду, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:37, використовують М-кінцевий пептид, що відповідає 5ЕО ІЮ
МО:89 або 5ЕО ІЮО МО:90, за яким йде інша частина злитого білка, як описано.
Антигени НВУ, що містять одиничні білки НВМ. В одному з варіантів здійснення винаходу антиген НВМ містить одиничний білок НВМ (наприклад, один білок НВМ, вибраний з поверхневого антигену, корового антигену, е-антигену, полімерази або Х-антигену) або один або декілька доменів (структурні, функціональні і/або імунологічні) з одиничного білка НВУ. Цей варіант здійснення винаходу особливо придатний для створення імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів, яку можна використовувати, наприклад, у комбінації з однією або декількома іншими імунотерапевтичними композиціями на основі дріжджів для лікування або профілактики
НВУ, або послідовно з однією або декількома іншими імунотерапевтичним композиціями на основі дріжджів для лікування або профілактики НВМ, або для продовження профілактичного підходу терапевтичним підходом, якщо пацієнт стає інфікованим. Наприклад, імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, що включає поверхневий антиген НВМ відповідно до цього варіанта здійснення, можна комбінувати з другою імунотерапевтичною композицією на основі дріжджів, що включає інший білок/(антиген НВУ, такий як Х-антиген НВМ (описаний нижче), і, крім того, з додатковими імунотерапевтичними засобами на основі дріжджів з "одиничним білком НВУ", якщо бажано (наприклад, імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, що включає прекоровий антиген, коровий антиген або е-антиген НВМ і/або імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, що включає антиген полімерази НВМ або його домен). Ці "імунотерапевтичні засоби на основі дріжджів з одиничним білком НВУ" можна використовувати в комбінації або послідовно один з одним і/або в комбінації або послідовно з іншими імунотерапевтичними засобами на основі дріжджів з множиною білків НВМ, такими як засоби, описані в або прикладах в інших розділах даного опису. Альтернативно або додатково, "Імунотерапевтичний засіб на основі дріжджів з одиничним білком НВМ", такий як цей імунотерапевтичний засіб на основі дріжджів з поверхневим антигеном НВУ, можна одержувати з використанням послідовності НВМ для будь-якого даного генотипу або підгенотипу, і додаткові імунотерапевтичні засоби на основі дріжджів з поверхневим антигеном НВМ можна одержувати з використанням послідовностей НВМ для будь-якого одного або декількох додаткових генотипів або підгенотипів. Ця стратегія ефективно забезпечує "набір спецій" з різних антигенів і генотипів і або підгенотипів НВМ, де кожний передбачений у контексті імунотерапевтичного засобу на основі дріжджів за винаходом, або в стратегії що включає щонайменше один імунотерапевтичний засіб на основі дріжджів за винаходом. Таким чином, будь-яку комбінацію одного, двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести, семи, восьми, дев'яти, десяти або більше з цих імунотерапевтичних засобів на основі дріжджів можна вибирати для застосування для лікування конкретного пацієнта або групи пацієнтів, інфікованих НВМ, що ілюструє гнучкість даного винаходу для індивідуалізації або адаптації відповідно до потреб конкретного пацієнта, групи пацієнтів, демографічних груп або інших груп пацієнтів.
В одному з варіантів здійснення винаходу антиген(и) НВМ для застосування в композиції або способі за винаходом являє собою антиген НВМ, що містить або складається з: (а) білка поверхневого антигену НВМ і/або одного або декількох його доменів (структурних, функціональних або імуногенних), що можуть включати розпізнавану рецепторами гепатоцитів частину рге-51 великого (І) поверхневого антигену НВУ, великий (І) поверхневий антиген НВМУ, середній (М) поверхневий антиген НВУ, малий (5) поверхневий антиген НВМ (НВзА)З), або будь- який домен або їхню комбінацію; (Б) антигену полімерази НВМ, що може включати один або декілька доменів (структурних, функціональних або імуногенних) полімерази НВМ, таких як домен зворотної транскриптази (КТ) (функціональний домен) полімерази НВУ; (с) прекорового білка НВУ, корового антигену НВМ і/або е-антигену НВУ, або одного або декількох їх доменів (структурних, функціональних або імуногенних), що можуть включати один або декілька доменів або частин прекорового білка НВУ, що містять послідовності як з корового антигену НВУ, так і з е-антигену НВУ, або один або інший з цих білків; або (4) Х-антиген НВМ, що може включати один або декілька доменів (структурних, функціональних або імуногенних) Х-антигену НВУ. В одному з аспектів будь-який один або декілька з цих білків або доменів є повнорозмірними або 60 практично повнорозмірними. В одному з аспектів один або декілька з цих білків або доменів містять або складаються з 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10, або більше імуногенних доменів. В одному з аспектів будь-який один або декілька з цих білків містять щонайменше 80 95, 85 95, 9096, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995 лінійної послідовності відповідної повнорозмірної або послідовності її домену. В одному з аспектів будь-який один або декілька з цих білків або доменів щонайменше на 80 95, 85 95, 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 р, 9595, 9695, 97 95, 9895 або 99 95 ідентичні відповідній повнорозмірній послідовності або її домену. Різні придатні й ілюстративні послідовності для поверхневих антигенів НВУ, антигенів полімерази НВУ, корових антигенів НВУ і Х-антигенів НВМ описані в даному описі.
Приклад композиції, що містить білок поверхневого антигену, описаний у прикладі 5. У цьому варіанті здійснення дріжджі (наприклад, засспаготусев5 сегемізіає) конструюють для експресії поверхневих білків НВМ під контролем придатного промотору, такого як індукований міддю промотор СОР1 або промотор ТЕРЕ2. Білок являє собою єдиний поліпептид, що містить практично повнорозмірний великий (І) поверхневий антиген НВМ (для забезпечення присутності
М-кінцевої послідовності, вибраної для посилення або стабілізації експресії антигену), що відповідає 5ЕО ІЮ МО:93: (1) М-кінцевий пептид ЗЕО ІЮ МО:89 (положення 1-89 5ЕО ІЮ МО:93); 2) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного (мінус положення 1) великого (1) поверхневого антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 2-400 5ЕО ІЮО МО:11 або положення 900-488 5ЕО ІО МО:93); і 3) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 489-494
ЗЕО ІЮ МО:93). Альтернативно М-кінцевий пептид можна замінювати 5ЕО ІЮ МО:37 або її гомологом або іншим М-кінцевим пептидом, описаним у даному описі. В одному з варіантів здійснення ця конструкція також містить одну або декілька мутацій, спрямованих проти стійкості вірусу, у поверхневому антигені. У той час як у цьому прикладі використовується великий (І) поверхневий антиген як антиген НВМ, що може максимізувати надання імуногенних епітопів, сформованих імунною системою, невеликі частини поверхневого антигену, включаючи будь-які домени або комбінації доменів поверхневого антигену, можна одержувати з використанням рекомендацій, представлених у даному описі. Крім того, хоча ілюстративний імунотерапевтичний засіб представлений з використанням послідовності генотипу С, замість цього можна використовувати послідовності з інших генотипів, підгенотипів і/або штамів, або ізолятів НВУ.
Приклад композиції, що містить антиген полімерази НВУ, описаний у прикладі 3, а також у прикладі 5. Антиген НВУ, описаний у прикладі 5, схематично представлений на фіг. 6. У цьому варіанті здійснення дріжджі (наприклад, Засспаготусев сегемізіає) конструюють так, щоб вони експресували різні білки полімерази НВМ під контролем індукованого міддю промотору СОР1 або промотору ТЕЕ2. У будь-якому випадку злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають 5ЗЕО ІЮ МО:40 (1) М-кінцевий пептид для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабільної експресії (ЗЕО ІЮ МО:37, або положення 1-6 5ЕО ІЮО МО:40; 2) амінокислотна послідовність частини полімерази НВМ генотипу С, що включає домен зворотної транскриптази (наприклад, положення 347-691 5ЕО ІЮО МО:10 або положення 7-351 5ЕО І0
МО:40); ії 3) гексагіслидинова мітка (наприклад, положення 352-357 5ЕО ІЮО МО:40).
Послідовність також містить епітопи або домени, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка. Крім того, в одному з варіантів здійснення послідовність цієї конструкції можна модифікувати внесенням однієї або декількох або усіх з наступних мутацій, спрямованих проти стійкості вірусу: гі204І, п180ОМ, п204М, 173, п236Т, п194Т (положення приведені відносно повнорозмірної амінокислотної послідовності полімерази НВМ). В одному з варіантів здійснення створюють шість різних імунотерапевтичних композицій, кожна з яких містить одну з цих мутацій. В інших варіантах здійснення всі або деякі з мутацій включені в єдиний злитий білок.
Амінокислотні сегменти, використовувані в будь-якому зі злитих білків, описаних у даному описі, можна модифікувати з використанням додаткових амінокислот, що фланкують будь-який кінець будь-якого домену; приклади, представлені в даному описі, є ілюстративними. Наприклад, злитий білок відповідно до цього варіанта здійснення може включати амінокислотну послідовність частини полімерази НВМ генотипу С, включаючи домен зворотної транскриптази (наприклад, положення 347-691 5ЕО ІЮ МО:10 або положення 7-351 5БО ІЮ МО:40), ї не включають М- або С-кінцеві послідовності, або включають відмінні М- або С-кінцеві послідовності, і/або включають лінкери або не включають лінкери між послідовностями НВУ. В одному з варіантів здійснення замість М-кінцевого пептиду, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:37, використовують М-кінцевий пептид, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:89 або 5ЕО ІЮО МО:90, за яким йде інша частина злитого білка, як описано.
У варіанті здійснення, представленому в прикладі 5, дріжджі (наприклад, Засспаготусев5 60 сегемізіає) модифікують способами інженерії для експресії білків полімерази НВМ під контролем придатного промотору, такого як індукований міддю промотор СОРІ1 або промотор ТЕРБ2. Білок являє собою єдиний поліпептид, що містить домен зворотної транскриптази (КТ) полімерази (Рої) НВУ, що відповідає БЕО ІЮ МО:94: (1) М-кінцевий пептид 5ЕО ІЮ МО:89 (положення 1-89
ЗБО І МО:94); 2) амінокислотна послідовність частини полімерази НВМ генотипу С, що включає домен зворотної транскриптази домен (наприклад, положення 347-691 5ЕО ІЮ МО:10 або положення 90-434 5ЕО ІЮ МО:94); і 3) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 435- 440 5ЕО ІЮО МО:94). Послідовність також містить епітопи або домени, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка. Крім того, в одному з варіантів здійснення послідовність цієї конструкції можна модифікувати внесенням однієї або декількох або усіх з наступних мутацій, спрямованих проти стійкості вірусу: гі204!І, п180М, п204М, 173, «236,
П194Т (положення приведені відносно повнорозмірної амінокислотної послідовності для полімерази НВМ). Альтернативно М-кінцевий пептид можна замінювати 5ЕО ІЮ МО:37 або її гомологом або іншим М-кінцевим пептидом, описаним у даному описі.
Приклад композиції, що містить прекоровий антиген, коровий антиген або е-антиген НВМУ, описаний у прикладі 5. Дріжджі (наприклад, засспаготусех сегемізіає) модифікують способами інженерії для експресії корових білків НВМ під контролем придатного промотору, такого як індукований міддю промотор СОР1 або промотор ТЕРЕ2. Білок являє собою єдиний поліпептид, що містить практично повнорозмірний коровий білок НВУ, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:95: (1). М- кінцевий пептид 5ЕО ІО МО:89 (положення 1-89 5ЕО ІО МО:95); 2) амінокислотна послідовність частини корового білка НВМ генотипу С (наприклад, положення 31-212 5ЕБЕО ІЮ МО:9 або положення 90-271 5ЕО ІО МО:95); і 3) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 272-277
ЗБЕО ІЮ МО:95). Послідовність також містить епітопи або домени, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка. Альтернативно М-кінцевий пептид можна замінювати
ЗЕО ІЮ МО:37 або її гомологом або іншим М-кінцевим пептидом, описаним у даному описі.
Приклад імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів, що містить Х-антиген НВМУ, описаний у прикладі 5. Дріжджі (наприклад, Засспаготусез сегемізіае) модифікують способами інженерії для експресії Х-антигенів НВМ під контролем придатного промотору, такого як індукований міддю промотор СОР1 або промотор ТЕРЕ2. Білок являє собою єдиний поліпептид, що містить практично повнорозмірний Х-антиген НВМ, що відповідає 5ЗЕО ІЮ МО:96: (1). М- кінцевий пептид 5ЕО ІО МО:89 (положення 1-89 5ЕО ІО МО:96); 2) амінокислотна послідовність частини Х-антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 2-154 5ЕО ІЮ МО:12 або положення 90-242 5ЕО ІЮ МО:96); і 3) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 243-248 5ЕО І
МО:96). Послідовність також містить епітопи або домени, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка. Альтернативно М-кінцевий пептид можна замінювати 5ЕО ІЮ МО:37 або її гомологом або іншим М-кінцевим пептидом, описаним у даному описі.
Антигени НВУ, що містять білки НВМУ із двох або більше генотипів. Інший варіант здійснення винаходу стосується антигенів НВМ для застосування в імунотерапевтичній композиції за винаходом, які максимізують націлювання на генотипи і/або підгенотипи НВУ, для надання композицій з потенціалом до лікування великої кількості індивідуумів або груп індивідуумів з використанням однієї композиції. Такі композиції як правило, можна більш ефективно одержувати (тобто вони мають перевагу при одержанні унаслідок включення множини антигенів іабо консенсусного підходу для націлювання на генотипи) і можна використовувати більш ефективно в широкому діапазоні клінічних умов (наприклад, одна композиція може служити для багатьох різних типів груп пацієнтів у багатьох різних географічних умовах). Як розглянуто вище, для одержання таких антигенів НВМ можна вибирати консервативні антигени і/або консервативні домени (серед генотипів НВУ), і антигени можна конструювати для максимізації включення консервативних імунологічних доменів.
В одному з аспектів цього варіанта здійснення передбачений антиген НВМУ, що включає в єдиній імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів одиничний білок НВМ або його домен (наприклад, поверхневий антиген, полімераза, коровий антиген/е або Х), що повторюється два, три, чотири, п'ять або більше разів в антигенній конструкції, щораз з використанням послідовності з відмінного генотипу або підгенотипу НВУ. У цьому аспекті можна здійснювати націлювання на множину домінантних або переважних генотипів в одному імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, збільшуючи клінічну ефективність і ефективність виробництва. Ці антигени можна модифікувати, якщо бажано, для максимізації включення консенсусних послідовностей, включаючи консенсусні Т-клітинні епітопи в антигенах, що в іншому випадку можуть містити невеликі розходження внаслідок розходжень між підгенотипами, штамами або ізолятами.
Таким чином, в одному з варіантів здійснення винаходу антиген(и) НВМ для застосування в 60 композиції або способі за винаходом являє собою антиген НВУ, що містить або складається з двох або більше повторюваних антигенів НВМ того самого білка або домену, але відмінних генотипів НВМ (наприклад, два або більше корових антигенів або е-антигенів НВМ, що можуть включати один або декілька доменів (структурних, функціональних або імуногенних) корового антигену або е-антигену НВУ, де антигени включають той же або подібний антиген з кожного з
НВМУ генотипу С і НВМ генотипу 0, з утворенням злитого білка коровий антиген-коровий антиген, де кожен коровий білок являє собою білок відмінного генотипу). В одному з аспектів білок НВМ, використовуваний у таких конструкціях, є повнорозмірним або практично повнорозмірним білком або доменом. В одному з аспектів антиген НВМ або містить складається 31,2,3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10 або більше імуногенних доменів. В одному з аспектів будь-який один або декілька з цих білків або доменів містять щонайменше 80 95, 85 бо, 90 У, 91 Фо, 92 Фо, 93 У, 94 Фо, 95 95, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 лінійної послідовності з відповідної повнорозмірної послідовності. В одному з аспектів будь-який один або декілька з цих білків або доменів щонайменше на 80 95, 85 оо, 90 У, 91 Фо, 92 о, 93 95, 94 Фо, 95 У, 96 Фо, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентичні послідовності з відповідної повнорозмірної послідовності.
Такий антиген проілюстрований у прикладі б. У цьому варіанті здійснення дріжджі (наприклад, Засспаготусев сегемізіае) модифікують способами інженерії для експресії злитого білка НВМ під контролем придатного промотору, такого як індукований міддю промотор СОР1 або промотор ТЕРЕ2. Білок являє собою єдиний поліпептид, що містить чотири корові антигени, кожний з яких походить з відмінного генотипу (генотипи А, В, С і ОО НВУ), що відповідає БЕО ІЮ
МО:105: 1) М-кінцевий метіонін у положенні 1 ЗЕО ІЮ МО:105; 2) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного корового білка з НВМ генотипу А (наприклад, положення 31-212
ЗЕО ІОЮО МО:1 або положення 2-183 ЗЕО ІЮ МО:105); 3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного корового білка з НВМ генотипу В (наприклад, положення 30-212 5ЕО І МО:5 або положення 184-395 ЗЕО ІО МО:105); 4) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного корового білка з НВМ генотипу С (наприклад, положення 30-212 5ЕО І МО:9 або положення 396-578 ЗЕО ІО МО:105); 5) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного корового білка з НВМ генотипу О (наприклад, положення 30-212 5ЕО ІЮ МОЗ або положення 579-761 5ЕО ІЮО МО:105); і 5) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 762- 767 5ЕО ІЮ МО:105). Послідовність також містить епітопи або домени, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка. М-кінцевий метіонін у положенні 1 можна замінювати
ЗЕО ІЮ МО:37 або її гомологом, або альфа-препропослідовністю 5ЕО ІЮ МО:89 або 5ЕО ІЮ
МО:90, або її гомологом, або будь-який іншою придатною М-кінцевою послідовністю, якщо бажано. Крім того, між білюьами НВМ можуть бути убудовані лінкерні послідовності для полегшення клонування і маніпулювання конструкцією, якщо бажано. Ця конструкція являє собою ілюстративну конструкцію, оскільки в цю конструкцію може бути внесена будь-яка інша комбінація генотипів і/або підгенотипів НВМ шляхом заміни, якщо бажано, для конструювання імунотерапевтичного продукту проти НВМ на основі дріжджів з єдиним антигеном із широкою клінічною застосовністю й ефективною конструкцією для виробництва. Амінокислотна послідовність 5Е0 ІЮ МО:105 також містить декілька відомих Т-клітинних епітопів, і визначені епітопи модифікують так, щоб вони відповідали опублікованій послідовності для даного епітопа (див. таблицю 5).
В іншому аспекті цього варіанта здійснення більше одного білка або домену з одного генотипу НВМ включено в антиген НВУ, придатний для винаходу, що може бути вибраний для максимізації найбільш консервативних білкових послідовностей, кодованих геномом НВМ, максимізації або включення терапевтично або профілактично придатних імуногенних доменів в антиген. Потім ці антигени повторюють у тому самому злитому білку, але з використанням тих же або подібних послідовностей з відмінного генотипу або підгенотипу НВУ. У цьому аспекті також можна здійснювати націлювання на множину домінантних і переважних генотипів в одному імунотерапевтичному засобі на основі дріжджів, знову збільшуючи клінічну ефективність і ефективність виробництва. Ці антигени також можна модифікувати, якщо бажано, для максимізації включення консенсусних Т-клітинних епітопів в антигени, що в іншому випадку можуть містити тонкі відмінності внаслідок розходжень у субгенотипах, штамах або ізолятах.
Таким чином, в одному з варіантів здійснення винаходу антиген(и) НВМ для застосування в композиції або способі за винаходом являють собою антиген НВУ, що містить або складається зі щонайменше двох різних білків НВМ або їх доменів, кожний з яких повторюється два або більше разів, але де повторювані послідовності походять з відмінних генотипів НВМ (наприклад, два або більше корові антигени і два або більше Х-антигени НВУ, або їх домени, де антигени включають той же або подібний антиген з кожного з НВМ генотипу С і НВМ генотипу 0, з утворенням злитої конструкції коровий антиген-х-коровий антиген-Х (або з будь-яким іншим 60 порядком сегментів у злитій конструкції), де кожен коровий білок являє собою відмінний генотип і кожен Х-антиген являє собою відмінний генотип). В одному з аспектів білок НВМ, використовуваний у таких конструкціях, є повнорозмірним або практично повнорозмірним білком або доменом. В одному з аспектів антиген НВМ або містить складається з 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 або 10 або більше імуногенних доменів. В одному з аспектів будь-який один або декілька з цих білків або доменів містить щонайменше 80 95, 85 95, 90 Фо, 91 95, 92 о, 93 95, 94 о, 95 Об, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95 лінійної послідовності відповідної повнорозмірної послідовності. В одному з аспектів будь-який один або декілька з цих білків або доменів щонайменше на 80 95, 85 Фо, 90 о, 91 95, 92 Фо, 93 У, 94 95, 95 90, 96 У, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичний послідовності відповідної повнорозмірної послідовності.
Такий антиген проілюстрований у прикладі б. У цьому варіанті здійснення дріжджі (наприклад, Засспаготусезх сегемізіае) модифікують способами інженерії для експресії злитого білка НВМ під контролем придатного промотору, такого як індукований міддю промотор СОР або промотор ТЕРЕ2. Білок являє собою єдиний поліпептид, що містить два корові антигени і два
Х-антигени, причому кожний з пари походить з відмінного генотипу (генотипи А і С НВУ), що відповідає ЗЕО 10 МО:106: 1) М-кінцевий метіонін у положенні 1 5ЕО ІО МО:106; 2) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного корового білка з НВМ генотипу А (наприклад, положення 31-212 5ЕО ІЮ МО:1 або положення 2-183 5ЕО ІЮ МО: 106); 3) амінокислотна послідовність повнорозмірного Х антигену з НВМ генотипу А (наприклад, положення 5ЕО І МО:4 або положення 184-337 5ЕБЕО І МО:106); 4) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного корового білка з НВМ генотипу С (наприклад, положення 30-212 5ЕО ІЮ МО:9 або положення 338-520 5БЕО ІЮ МО:106); 5) амінокислотна послідовність повнорозмірного Х-антигену з НВМ генотипу С (наприклад, 5ЕО ІЮ МО:8 або положення 521-674 5ЕО ІЮ МО:106); і 5) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 675-680
ЗЕБЕО ІЮО МО:106). Послідовність також містить епітопи або домени, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка. М-кінцевий метіонін у положенні 1 можна замінювати
ЗЕО ІЮ МО:37 або її гомологом, або альфа-препропослідовністю 5ЕО ІЮ МО:89 або 5ЕО ІЮ
МО:90, або її гомологом. Амінокислотна послідовність ЗЕО ІЮ МО:106 також містить декілька відомих Т-клітинних епітопів і визначені епітопи модифікують так, щоб вони відповідали опублікованій послідовності для даного епітопа (див. таблицю 5).
Додаткові варіанти здійснення, що стосуються антигенів НВУ. У деяких аспектах винаходу вставки, делеції і/або заміни амінокислот можна вносити для однієї, двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести, семи, восьми, дев'яти, десяти або більше амінокислот білка дикого типу або еталонного білка НВУ, за умови, що отриманий білок НВУ, коли його використовують як антиген у імунотерапевтичній композиції проти НВМ на основі дріжджів за винаходом, індукує імунну відповідь проти мішені або білка НВМ дикого типу або еталонного білка НВМ, що може включати посилену імунну відповідь, знижену імунну відповідь, або по суті подібну імунну відповідь.
Наприклад, винахід включає застосування агоністів антигенів НВМ, що можуть включати один або декілька Т-клітинних епітопів, у які внесені мутації для посилення Т-клітинної відповіді проти агоніста НВМ, як наприклад, шляхом підвищення авідності або афінності епітопа відносно молекули МНС або відносно Т-клітинного рецептора, що розпізнає епітоп у контексті представлення МНС. Агоністи білків НВМ, таким чином, можуть підвищувати силу або ефективність Т-клітинної відповіді проти нативних білків НВУ, що інфікують хазяїна.
Що стосується будь-якого з описаних вище антигенів НВУ, включаючи злиті білки, які мають амінокислотні послідовності, що включають або відповідають ЗЕО ІЮ МО:34, 5ЕО ІЮ МО:36,
ЗЕО І МО:38, 5ЕО 10 МО:39, 5ЕО І МО 40, 5ЕО І МОС41, 5ЕО І МО:92, 5ЕО ІЮ МО:101,
ЗЕО ІЮО МО:102, 5ЕО ІЮ МО:107, 5ЕО 10 МО:108, 5ЕО І МО:109, 5ЕО 10 МО:110, 5ЕО І
МО:112, 5ЕО ІЮ МО:114, 5ЕО І МО 116, 5ЕО І МО:118, 5ЕО ІЮ МО:120, 5ЕО ІЮ МО: 122, 5ЕО
ІО МО:124, 5ЕО ІЮ МО:126, 5ЕО 10 МО:128, 5ЕО І МО:130, 5ЕО ІЮ МО:132, 5ЕО ІЮ МО:134,
ЗЕО ІЮ МО:150 або 5ЕО ІЮ МО:151, аспектом винаходу є застосування одного або декількох антигенів НВУ з індивідуальних білків НВУ у злитому білку (наприклад, з поверхневого антигену
НВМ, полімерази НВМ, корового антигену/е-антигену НВМ, і/або Х-антигену НВМ) для конструювання антигенів у вигляді "єдиного білка" (наприклад, антигенів тільки з одного з цих білків НВМ), або для конструювання злитих білків з використанням тільки двох або трьох білкових сегментів НВМ, якщо це застосовно для даного еталонного злитого білка. Також аспектом винаходу є зміна порядку білкових сегментів НВМ у злитому білку. Як іншу альтернативну модель, генотипи і/або консенсусні послідовності НВМ можна комбінувати, де для конструювання злитого білка використовують два, три, чотири або більше генотипів і/або консенсусних послідовностей.
Також винахід включає гомологи будь-якого з описаних вище злитих білків, а також 60 застосування гомологів, варіантів або мутантів окремих білків НВМУ або їхніх частин (включаючи будь-які функціональні і/або імуногенні домени), що є частиною таких злитих білків або іншим способом описані в даному описі. В одному з аспектів винахід включає застосування злитих білків або індивідуальних (окремих) білків НВМ або антигенів НВУ, що мають амінокислотні послідовності, яка щонайменше на 85 95, 86 Ус, 87 9о, 88 95, 89 95, 90 9, 91 Фо, 92 95, 93 9о, 94 9о, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95 або 99 95 ідентичні амінокислотній послідовності будь-якого зі злитих білків або індивідуальних білків НВМ або антигенів НВУ, відповідно, описаних у даному описі, включаючи будь-які з білків НВМ, антигенів НВМ і злитих білків, що згадуються за допомогою конкретного ідентифікатора послідовності в даному описі протягом усієї довжини злитого білка або відносно визначеного сегмента в злитому білку або визначеному білку або його домені (імуногенний домен або функціональний домен (тобто домен щонайменше з одним видом біологічної активності)), що утворює частину злитого білка. Багато які епітопи СТІ. (епітопи, що розпізнаються цитотоксичними Т-лімфоцитами з пацієнтів, інфікованих НВМ) і що забезпечують вислизання мутації (мутації що з'являються в білку НВМ унаслідок селективного тиску противірусного лікарського засобу) відомі в даній галузі, і цю інформацію також можна використовувати для внесення замін або створення варіантів або гомологів антигенів НВМ, описаних у даному описі, для забезпечення конкретної послідовності в антигені НВМ за винаходом.
Імунотерапевтичні композиції на основі дріжджів. У різних варіантах здійснення винаходу винахід включає застосування щонайменше однієї "імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів" (цей вираз може використовуватися взаємозамінно з "імунотерапевтичним продуктом на основі дріжджів", "І"мунотерапевтичною композицією на основі дріжджів", "композицією на основі дріжджів", "імунотерапевтичним засобом на основі дріжджів", "вакциною на основі дріжджів" або похідними цих виразів). "Іімунотерапевтична композиція" являє собою композицію, яка індукує імунну відповідь, достатню для досягнення щонайменше однієї терапевтичної користі в індивідуума. Як використовують у рамках винаходу імунотерапевтична композиція на основі дріжджів стосується композиції, що включає компонент у вигляді дріжджового носія і яка індукує імунну відповідь, достатню для досягнення щонайменше однієї терапевтичної користі в індивідуума. Більш конкретно, імунотерапевтична композиція на основі дріжджів являє собою композицію, що включає компонент у вигляді дріжджового носія і може викликати або індукувати імунну відповідь, таку як клітинна імунна відповідь, включаючи, але не обмежуються цим, опосередковувану Т-клітинами імунну відповідь. В одному з аспектів імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, придатна для винаходу, здатна індукувати опосередковуваний
СорВ8: і/або СОВ4-Т-клітинами імунну відповідь і в одному з аспектів опосередковувану СО8: іа
СбразТ-клітинами імунну відповідь. Необов'язково, імунотерапевтична композиція на основі дріжджів здатна індукувати гуморальну імунну відповідь. Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, придатна для даного винаходу, може, наприклад, індукувати імунну відповідь в індивідуума, так щоб індивідуум був захищений від інфекції НВМ і/або здійснювалося лікування інфекції НВМ або симптомів інфекції НВУ.
Імунотерапевтичні композиції на основі дріжджів за винаходом можуть бути або "профілактичними", або "терапевтичними". Коли їх надають профілактично, композиції за даним винаходом надають до виникнення якого-небудь симптому інфекції НВМУ. Таку композицію можна вводити при народженні, у ранньому дитячому віці або дорослим. Профілактичне введення імунотерапевтичних композицій служить для профілактики наступної інфекції НВМ, для швидшого або більш повного подолання інфекції, якщо інфекція НВМ виникає згодом, і/або для пом'якшення симптомів інфекції НВМ, якщо інфекція виникає згодом. При наданні терапевтичні, імунотерапевтичні композиції надають при або після виникнення інфекції НВМ з метою пом'якшення щонайменше одного симптому інфекції і, переважно, з метою усунення інфекції, забезпечення тривалої ремісії інфекції і/або забезпечення тривалого імунітету проти наступних інфекцій або реактивацій вірусу. В одному з аспектів метою лікування є усунення вірусного навантаження НВУ, що піддається виявленню, або зниження вірусного навантаження
НВМ (наприклад, які нижче піддаються виявленню за допомогою ПЛР рівнів або «2000 МО/мл).
В одному з аспектів метою лікування є безупинний кліренс вірусу протягом щонайменше 6 місяців після завершення терапії. В одному з аспектів метою лікування є усунення сироваткових білків НВеАд і/або НВ5Ад, що піддаються виявленню. В одному з аспектів метою лікування є розвиток антитіл проти поверхневого антигену вірусу гепатиту В (анти-НВ5) і/або антитіл проти
НВедо. В одному з аспектів метою лікування є сероконверсія, яка може бути визначена як: (а) 10 або більше одиниць співвідношення в зразках (5К) при визначенні радіоїмунним аналізом; (Б) позитивний результат при визначенні за допомогою ферментного імуноаналізу; або (с) виявлення концентрації антитіла 210 мМО/мл (10 ЗК!) порівнянні з 10 мМО/мл антитіла). В 60 одному з аспектів метою лікування є нормалізація сироваткових рівнів аланінамінотрансферази
(АГ .Т), пом'якшення запалення печінки і/або пом'якшення фіброзу печінки.
Як правило, імунотерапевтична композиція на основі дріжджів включає дріжджовий носій і щонайменше один антиген або його імунногенний домен, які експресовані дріжджовим носієм, зв'язані або змішані з ним, де антиген є гетерологічним для дріжджів, і де антиген містить один або декілька антигенів НВУ або їх імуногенних доменів. У деяких варіантах здійснення антиген або його імуногенний домен надають як злитий білок. Декілька злитих білків НВУ, придатних для застосування в композиціях і способах за винаходом, описані вище. В одному з аспектів винаходу злитий білок може включати два або більше антигенів. В одному з аспектів злитий білок може включати два або більше імуногенні домени одного або декількох антигенів, або два або більше епітопи одного або декількох антигенів.
У будь-якій з імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, використовуваних у рамках даного винаходу, наступні аспекти, що стосуються дріжджового носія, включені у винахід.
Відповідно до даного винаходу, дріжджовий носій являє собою будь-яку дріжджову клітину (наприклад, цілу або інтактну клітину) або її похідне (див. нижче), яку можна використовувати разом з одним або декількома антигенами, їх імуногенними доменами або їх епітопами в терапевтичній композиції за винаходом, або в одному з аспектів дріжджовий носій можна використовувати окремо або як ад'ювант. Таким чином, дріжджовий носій може включати, але не обмежуватися ними, живий інтактний (цілий) дріжджовий мікроорганізм (тобто дріжджову клітину, що має всі її компоненти, включаючи клітинну стінку), убитий (загиблий) або інактивований дріжджовий мікроорганізм, або похідні інтактних/цілих дріжджів, що включають: сферопласт дріжджів (тобто дріжджова клітина, позбавлена клітинної стінки), цитопласт дріжджів (тобто дріжджова клітина, позбавлена клітинної стінки і ядра), дріжджову оболонку (тобто дріжджова клітина, позбавлена клітинної стінки, ядра і цитоплазми), субклітинний дріжджовий мембранний екстракт або його фракцію (які також називаються дріжджовими мембранними частинками і раніше субклітинною дріжджовою частинкою), будь-яку іншу дріжджову частинку або препарат клітинної стінки дріжджів.
Сферопласти дріжджів, як правило, одержують ферментативним розщепленням клітинної стінки дріжджів. Такий спосіб описаний, наприклад, у Егап7изої еї а!., 1991, Ме. Епгутої. 194, 662-674., включеній в даний опис як посилання в повному обсязі.
Цитопласти дріжджів, як правило, одержують енуклеацією клітин дріжджів. Такий спосіб описаний, наприклад, у Сооп, 1978, Май. Сапсег Іп5і. Моподг. 48, 45-55, включеній в даний опис як посилання в повному обсязі.
Дріжджові оболонки, як правило, одержують повторним ущільненням клітини, у якій збільшили проникність, або лізованої клітини, і вони можуть, але не повинні, містити щонайменше деякі органели цієї клітини. Такий спосіб описаний, наприклад, у Егап2ивої! вї аї., 1983, у. ВіоІ. Спет. 258, 3608-3614 і Вивзеу еї а!., 1979, Віоспіт. Віорпуз. Асіа 553, 185-196, усі з яких включені в даний опис як посилання в повному обсязі.
Дріжджова мембранна частинка (субклітинний дріжджовий мембранний екстракт або його фракція) стосується дріжджової мембрани, яка позбавлена природного ядра або цитоплазми.
Частинка може мати будь-який розмір, включаючи розміри в діапазоні від розміру природної дріжджової мембрани до мікрочастинок, одержуваних обробкою ультразвуком або іншими способами руйнування мембран, відомими фахівцям у даній галузі, з наступним повторним ущільнення. Спосіб одержання екстрактів субклітинних дріжджових мембран описаний, наприклад, у Егап7изхоїї еї аї., 1991, Ме. Епгутої. 194, 662-674. Також можна використовувати фракції мембранних частинок дріжджів, що містять частини дріжджових мембран і, коли антиген або інший білок експресувався рекомбінантно дріжджами перед одержанням дріжджових мембранних частинок, антиген або інший білок, що представляє інтерес. Антигени або інші білки, що представляють інтерес, можуть міститися усередині мембрани, на будь-якій поверхні мембрани або їхніх комбінаціях (тобто білок може бути як усередині, так і зовні мембрани і/або він може проходити через мембрану дріжджової мембранної частинки). В одному з варіантів здійснення дріжджова мембранна частинка являє собою рекомбінантну дріжджову мембранну частку, що може бути незміненою, зруйнованою або зруйнованою і повторно ущільненою дріжджовою мембраною, що включає щонайменше один бажаний антиген або інший білок, що представляє інтерес, на поверхні мембрани або щонайменше частково занурений у мембрану.
Прикладом препарату клітинної стінки дріжджів є препарат виділених клітинних стінок дріжджів, що містять антиген на їх поверхні або щонайменше частково занурених у клітинну стінку, так що препарат клітинної стінки дріжджів при уведенні тварині стимулює бажану імунну відповідь проти цільового захворювання.
Для одержання дріжджового носія за даним винаходом можна використовувати будь-який 60 штам дріжджів. Дріжджі являють собою одноклітинні мікроорганізми, що належать одному з трьох класів: Авсотусеїе5, Вабвідіотусефевз і Еиподі Ітрегіесі. Одним з факторів, що враховуються при виборі типу дріжджів для застосування як імунного модулятора, є патогенність дріжджів. В одному з варіантів здійснення дріжджі являють собою непатогенний штам, такий як Засспаготусев сегемізіае. Вибір непатогенного штаму дріжджів мінімізує які- небудь несприятливі ефекти в індивідуума, якому вводять дріжджовий носій. Однак можна використовувати патогенні дріжджі, якщо патогенність дріжджів можна нейтралізувати будь- якими способами, відомими фахівцю в даній галузі (наприклад, мутантні штами).
Роди штамів дріжджів, які можна використовувати в рамках винаходу, включають, але не обмежуються ними, Засспаготусев, Сапаїда, Стуріососси5, Напзепшціа, Кісумеготусев, Ріспіа,
ЕПодоїогціа, 5спігозасспаготусез і Маггом/іа. В одному з аспектів роди дріжджів вибирають з
Засспаготусев, Сапаїда, Напзепшціа, Ріспіа або Зспі7озасспаготусев, і в одному з аспектів роди дріжджів вибирають з Засспаготусев, Напзепціа і Ріспіа, і в одному з аспектів використовують засспаготусеб5. Види штамів дріжджів, які можна використовувати в рамках винаходу, включають, але не обмежуються ними, Засспаготусез сегемівіає, Засспаготусез сагізрегдепвів,
Сапаїда аїрісап5, Сапаіїда Кеїуг, Сапаїда (ігорісаїї5, Стгуріососсив Іацгепії, Стуріососсив пеоїоптап5, Напзепціа апотаїа, Напзепша роїіутогрна, Кіпоумеготусев ГГадіїв, Кіпсумеготусев5
Іасії5, Кісумеготусе5 тагхіапиз5 варіант Іасії5х, Ріспіа равіогізх, Кподоїогша гибга,
Зспігозасспаготусе5 ротбе і Маїтом/іа Ійроїуїса. Повинно бути зрозуміло, що ряд цих видів включають різні підвиди, типи, підтипи і т. д., що, як мається на увазі, включені в згадані вище види. В одному з аспектів види дріжджів, використовувані у винаході, включають 5. сегемівзіає,
С. аірісапв, Н. роїутогрпа, Р. разіогіз і 5. ротбре. 5. сегемізіае придатні, оскільки ними відносно легко маніпулювати і вони є "загальновизнаними безпечними" або "СКАЗ" для застосування як харчові добавки (СКА5, запропоноване ЕСА Правило 62ЕК18938, 17 квітня 1997 року). Одним варіантом здійснення даного винаходу є штам дріжджів, що здатний реплікувати плазміди до особливо високої кількості копій, такий як штам 5. сегемізіає сіг. Цей штам 5. сегемізіаеє є одним з таких штамів, які здатні підтримувати вектори експресії, що дозволяють експресію одного або декількох антигену(ів)-мішені і/або антигенного злитого білка(ів), і/або інших білків, що підлягають експресії на високих рівнях. Крім того, у рамках даного винаходу можна використовувати будь-які мутантні штами дріжджів, включаючи штами дріжджів, що виявляють знижені посттрансляційні модифікації експресованих мішеней або інших білків, такі як мутації у ферментах, що збільшують М-зв'язане глікозилування.
У більшості варіантів здійснення винаходу імунотерапевтична композиція на основі дріжджів включає щонайменше один антиген, його імуногенний домен або його епітоп. Антигени, що передбачаються для застосування в рамках даного винаходу, включають будь-який антиген
НВМ або його імуногенний домен, включаючи мутанти, варіанти й агоністи білків НВМ або їх доменів, проти яких бажано індукувати імунну відповідь для профілактичної або терапевтичної імунізації хазяїна проти інфекції НВУ. Антигени НВУ, які придатні в різних варіантах здійснення винаходу, докладно описані вище.
Необов'язково, білки, включаючи злиті білки, які використовують як компонент імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів за винаходом, одержують з використанням конструкцій, що особливо придатні для підвищення або посилення експресії або стабільності експресії рекомбінантних антигенів у дріжджах. Як правило, бажаний антиген білок(білки) або пептид(и) злиті на їхньому М-кінці з: (а) конкретним синтетичним пептидом, що стабілізує експресію злитого білка в дріжджовому носії або перешкоджає посттрансляційній модифікації злитого білка (такі пептиди докладно описані, наприклад, у публікації патенту США Мо 2004- 0156858 А1, опублікованій 12 серпня 2004 року, включеній в даний опис як посилання в повному обсязі); (Б) щонайменше частиною ендогенного дріжджового білка, включаючи, але не обмежуються ними, альфа-фактор, де партнер по злиттю забезпечує збільшену стабільність експресії білка в дріжджах і/або перешкоджає посттрансляційній модифікації білків дріжджовими клітинами (такі білки також докладно описані, наприклад, у публікації патенту США Мо 2004- 0156858 А1, вище); і/або (с) щонайменше частиною дріжджового білка, що викликає експресію злитого білка на поверхні дріжджів (наприклад, білок Ада, більш докладно описаний у даному описі). Крім того, даний винахід необов'язковий стосується застосування пептидів, які злиті з С- кінцем конструкції, що кодує антиген, зокрема для застосування у виборі й ідентифікації білка.
Такі пептиди включають, але не обмежуються ними, будь-який синтетичний або природний пептид, такий як пептидна мітка (наприклад, гексагістидин) або будь-яка інша коротка епітопна мітка. Пептиди, зв'язані з С-кінцем антигену відповідно до винаходу, можна використовувати з
М-кінцевими пептидами, розглянутими вище, або без них.
В одному з варіантів здійснення синтетичний пептид, придатний у злитому білку, зв'язаний з 60 М-кінцем антигену, причому пептид складається зі щонайменше двох амінокислотних залишків,
які є гетерологічними для антигену, де пептид стабілізує експресію злитого білка в дріжджовому носії або перешкоджає посттрансляційній модифікації експресованого злитого білка.
Синтетичний пептид і М-кінцева частина антигену разом утворюють злитий білок, що задовольняє наступні вимоги: (1) амінокислотний залишок у першому положенні злитого білка являє собою метіонін (тобто перша амінокислота в синтетичному пептиді являє собою метіонін); (2) амінокислотний залишок у другому положенні злитого білка не є гліцином або проліном (тобто друга амінокислота в синтетичному пептиді не є гліцином або проліном); (3) жоден з амінокислотних залишків у положеннях 2-6 злитого білка не є метіоніном (тобто амінокислоти в положеннях 2-6, що є частиною синтетичного пептиду або білка, якщо синтетичний пептид коротший б амінокислот, не включають метіонін); і (4) жодна з амінокислот у положеннях 2-6 злитого білка не є лізином або аргініном (тобто амінокислоти в положеннях 2-6, що є частиною синтетичного пептиду або білка, якщо синтетичний пептид коротший 5 амінокислот, не включають лізин або аргінін). Синтетичний пептид може мати довжину тільки дві амінокислоти, однак в одному з аспектів він складає 2-6 амінокислот (включаючи 3, 4, 5 амінокислот) і він може бути довший б амінокислот, у цілих числах, аж до приблизно 200 амінокислот, 300 амінокислот, 400 амінокислот, 500 амінокислот або більше.
В одному з варіантів здійснення злитий білок містить амінокислотну послідовність М-Х2-Х3-
Х4-Х5-Х6, де М являє собою метіонін; де Х2 являє собою будь-яку амінокислоту, за винятком гліцину, проліну, лізину або аргініну; де ХЗ являє собою будь-яку амінокислоту, за винятком метіоніну, лізину або аргініну; де Х4 являє собою будь-яку амінокислоту, за винятком метіоніну, лізину або аргініну; де Х5 являє собою будь-яку амінокислоту, за винятком метіоніну, лізину або аргініну; і де Хб являє собою будь-яку амінокислоту, за винятком метіоніну, лізину або аргініну.
В одному з варіантів здійснення залишок Хб являє собою пролін. Ілюстративна синтетична послідовність, що підвищує стабільність експресії антигену в дріжджовій клітині і/або перешкоджає посттрансляційній модифікації білка в дріжджах, включає послідовність М-А-О-Е-
А-Р (5ЕО ІЮ МО:37). Іншою ілюстративною синтетичною послідовністю з тими ж властивостями є М-М. На додаток до збільшеної стабільності продукту експресії, ці партнери по злиттю, очевидно, не чинять негативного впливу на імунну відповідь проти імунізуючого антигену в конструкції. Крім того, синтетичні злиті пептиди можна конструювати для забезпечення епітопа, що може розпізнаватися селектуючим агентом, таким як антитіло.
В одному з варіантів здійснення антиген НВМ зв'язаний на М-кінці з дріжджовим білком, таким як препропослідовність альфа-фактора (яка також позначається як сигнальна лідерна послідовність альфа-фактора), амінокислотна послідовність якої проілюстрована в даному описі за допомогою ЗЕО ІЮ МО:89 або 5ЕО ІЮО МО:90. Інші послідовності для препропослідовності альфа-фактора дріжджів відомі в даній галузі, і їхнє застосування охоплюється даним винаходом.
В одному з аспектів винаходу дріжджовий носій піддають обробці, так щоб антиген експресувався або забезпечувався шляхом доставки або переміщення експресованого білкового продукту, частково або повністю, на поверхні дріжджового носія (позаклітинна експресія). Одним способом здійснення цього аспекту винаходу є застосування спейсера для поміщення одного або декількох білка(ів) на поверхні дріжджового носія. Наприклад, можна використовувати спейсер для створення злитого білка з антигену(ів) або іншого білка, що представляє інтерес, який націлює антиген(и) або інший білок, що представляє інтерес, на клітинну стінку дріжджів. Наприклад, одним таким білком, який можна використовувати для націлювання на інші білки, є дріжджовий білок (наприклад, білок клітинної стінки 2 (смрг), білок
Адаг, Ріг4 або РіІої), який забезпечує націлювання антигену(ів) або іншого білка до клітинної стінки дріжджів, щоб антиген або інший білок були розташовані на поверхні дріжджів. Для спейсера можна використовувати білки, відмінні від дріжджових білків; однак для будь-якого спейсера найбільш бажаною є наявність імуногенної відповіді, спрямованої проти антигену- мішені, а не проти спейсерного білка. По суті, якщо для спейсера використовувати інші білки, тоді спейсерний білок, що використовують, не повинен генерувати таку значну імунну відповідь на сам спейсерний білок, так щоб переважала імунна відповідь на антиген(и)-мішень. Фахівець у даній галузі повинен прагнути до незначної імунної відповіді на спейсерний білок відносно імунної відповіді на антиген(и)-мішень. Спейсер можна конструювати так, щоб він мав ділянки розщеплення (наприклад, ділянки розщеплення протеазою), які дозволяють легке видалення або процесинг антигену з дріжджів, якщо бажано. Можна використовувати будь-як відомий спосіб визначення величини імунної відповіді (наприклад, продукція антитіл, літичні аналізи і т. д.), і вони добре відомі фахівцю в даній галузі.
Іншим способом поміщення антигену(ів)-мішені або інших білків на поверхню дріжджів є 60 використання сигнальних послідовностей, таких як глікозилфосфатидилинозитол (ОРІ), для заякорювання мішені на клітинній стінці дріжджів. Альтернативне поміщення можна проводити шляхом приєднання сигнальних послідовностей, які направляють антиген(и) або інші білки, які представляють інтерес, на секреторний шлях через переміщення в ендоплазматичну мережа (ЕК), так щоб антиген зв'язувався з білком, що зв'язаний із клітинною стінкою (наприклад, см/р).
В одному з аспектів спейсерний білок являє собою білок дріжджів. Білок дріжджів може складатися з від приблизно двох до приблизно 800 амінокислот дріжджового білка. В одному з варіантів здійснення дріжджовий білок складає приблизно від 10 до 700 амінокислот. В іншому варіанті здійснення дріжджовий білок складає приблизно від 40 до 600 амінокислот. Інші варіанти здійснення винаходу включають дріжджовий білок, що складає щонайменше 250 амінокислот, щонайменше 300 амінокислот, щонайменше 350 амінокислот, щонайменше 400 амінокислот, щонайменше 450 амінокислот, щонайменше 500 амінокислот, щонайменше 550 амінокислот, щонайменше 600 амінокислот або щонайменше 650 амінокислот. В одному з варіантів здійснення дріжджовий білок має довжину щонайменше 450 амінокислот. Іншим фактором, що враховується для оптимізації експресії антигену на поверхні, якщо вона є бажаною, є те, або належна комбінація антигену і спейсера експресуватися як мономер або як димер або як тример, або ще більшої кількості елементів, зв'язаних разом. Це застосування мономерів, димерів, тримерів і т. д. забезпечує належне розташування в просторі і згортання антигену, так щоб деяка частина антигену, або весь антиген, експонувалася на поверхні дріжджового носія так, щоб він був більш імуногенним.
Застосування дріжджових білків може стабілізувати експресію злитих білків у дріжджовому носії, перешкоджає посттрансляційній модифікації експресованого злитого білка і/або націлює злитий білок у конкретний компартмент у дріжджів (наприклад, для експресії на клітинній поверхні дріжджів). Для доставки на секреторний шлях дріжджів ілюстративні білки для застосування включають, але не обмежуються ними: Ада (включаючи, але не обмежуються ними, Ада! і/або Адаг2); 50С2 (інвертаза дріжджів); сигнальну лідерну послідовність альфа- фактора; СРУ; См/ргр внаслідок його локалізації й утримання на клітинній стінці; гени ВОЮ унаслідок локалізації на зародку дріжджової клітини в ході первинної фази утворення дочірньої клітини; Ріо1р; Ріггр і Рігар.
Можна використовувати інші послідовності для націлювання, утримання і/або стабілізації білка в інших частинах дріжджового носія, наприклад, в цитозолі або мітохондріях або ендоплазматичній мережі або ядрі. Приклади прийнятного дріжджового білка, який можна використовувати для будь-якого з описаних вище варіантів здійснення, включають, але не обмежуються ними, продукти генів ТК, АР, 5ЕС7; фосфоенолпіруваткарбоксикіназу, РОКІ, фосфогліцерокіназу РОК і триозофосфатизомерази ТРІ унаслідок репресії їхньої експресії при наявності глюкози і локалізації в цитозолі; білюи теплового шоку З5А1, 55АЗ, ЗБА4, 55СС1, експресія яких індукується і які є більш термостабільними при впливі на клітини теплової обробки; мітохондріальний білок СУС1 для імпорту в мітохондрії; АСТ1.
Способи одержання дріжджових носіїв і експресії, комбінування і/або зв'язування дріжджових носіїв з антигенами і/або іншими білками, що представляють інтерес, і/або агентами для одержання імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, охоплюються винаходом.
Відповідно до даного винаходу, термін "комплекс дріжджовий носій-антиген комплекс" або "комплекс дріжджі-антиген" використовують, головним чином, для опису будь-якого зв'язку дріжджового носія 3 антигеном і його можна використовувати взаємозамінно з "мунотерапевтичною композицією на основі дріжджів", коли таку композицію використовують для індукції імунної відповіді, як описано вище. Такий зв'язок включає експресію антигену дріжджами (рекомбінантні дріжджі), введення антигену в дріжджі, фізичне зв'язування антигену з дріжджами і змішування дріжджів і антигену разом, як наприклад, у буфері або іншому розчині або складі. Ці типи комплексів докладно описані нижче.
В одному з варіантів здійснення клітину дріжджів, використовувану для одержання дріжджового носія, трансфікують гетерологічною молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує білок (наприклад, антиген), так, щоб білок експресувався клітиною дріжджів. Такі дріжджі також позначаються в даному описі як рекомбінантні дріжджі або рекомбінантний дріжджовий носій.
Потім клітиною дріжджів можна навантажувати дендритну клітину як інтактну клітину або дріжджову клітину можна убивати, або її можна перетворити, наприклад, шляхом утворення дріжджових сферопластів, цитопластів, оболонок або субклітинних частинок, після чого в будь- якому випадку йде навантаження похідним дендритної клітини. Сферопласти дріжджів також можна прямо трансфікувати рекомбінантною молекулою нуклеїнової кислоти (наприклад, сферопласт одержують з цілих дріжджів, а потім трансфікують) для одержання рекомбінантного сферопласта, що експресує антиген або інший білок. 60 Як правило, дріжджовий носій і антиген(и) і/або інші агенти можна зв'язати будь-яким способом, описаним у даному описі. В одному з аспектів дріжджовий носій навантажений внутрішньоклітинно антигеном(ами) і/або агентом(іами). В іншому аспекті антиген(и) і/або агент(и) ковалентно або нековалентно зв'язаний із дріжджовим носієм. В іншому аспекті дріжджовий носій і антиген(и) і/або агент(и) зв'язані шляхом змішування. В іншому аспекті й в одному з варіантів здійснення антиген(и) і/або агент(и) експресуються рекомбінантно дріжджовим носієм або дріжджовою клітиною або дріжджовим сферопластом, з яких походить дріжджовий носій.
Кількість антигенів і/або інших білків, що підлягають продукуванню дріжджовим носієм за даним винаходом, являє собою будь-яку кількість антигенів і/або інших білків, що можуть у розумних межах продукуватися дріжджовим носієм, і, як правило, вона знаходиться в діапазоні від щонайменше одного до щонайменше приблизно 6 або більше, включаючи від приблизно 2 до приблизно 6 гетерологічних антигенів і/або інших білків.
Експресію антигену або іншого білка в дріжджовому носії за даним винаходом проводять з використанням способів, відомих фахівцям у даній галузі. У короткому викладі, молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує щонайменше один бажаний антиген або інший білок, вбудовують у вектор експресії так, щоб молекула нуклеїнової кислоти була функціонально зв'язана з послідовністю контролю транскрипції для того, щоб вона була здатна здійснювати або конститутивну, або регульовану експресію молекули нуклеїнової кислоти після трансформації в дріжджову клітину хазяїна. Молекули нуклеїнових кислот, що кодують один або декілька антигенів і/або інших білків, можуть являти собою один або декілька векторів експресії, функціонально зв'язаних з однією або декількома послідовностями контролю експресії.
Особливо важливими послідовностями контролю експресії є послідовності, що контролюють ініціацію експресії, такі як промотори і активуючі послідовності, які вище лежать. У рамках даного винаходу можна використовувати будь-який придатний дріжджовий промотор і множина таких промоторів відома фахівцям у даній галузі. Промотори для експресії в Засспаготусев5 сегемізіде включають, але не обмежуються ними, промотори генів, що кодують наступні дріжджові білки: алкогольдегідрогеназа | (АОНІ) або Ії (АСН2г), СОРІ, фосфогліцераткіназа (РОК), триозофосфатизомераза (ТРІ), трансляційний фактор елонгації ЕЕ-1 альфа (ТЕБЕ2), гліцеральдегид-3-фосфатдегідрогеназа (САРОН; яка позначається також як ТОНЗ по триозофосфатдегідрогеназі), галактокіназа (СА11), галактоза-1-фосфатуридилтрансфераза (СА 7), ООР-галактозоепіміраза (ЗАЇ 10), цитохром сі (СУС1), білок Зес7 (5ЕС7) і кисла фосфатаза (РНО5), включаючи гібридні промотори, такі як промотори АВН2г/ЗАРОН і
СУС1/5АЇ 10, і включаючи промотор АОН2г/ЗАРБН, що індукується, коли концентрації глюкози в клітині є низькими (наприклад, від приблизно 0,1 до приблизно 0,2 відсотка), а також промотор
СОРІ ї промотор ТЕРЕ2. Аналогічно, відомий ряд активуючих послідовностей, які вище лежать (АБ), які також називаються енхансерами. Активуючі послідовності, які вище лежать, для експресії в Засспаготусе5 сегемізіде включають, але не обмежуються ними, ОА5 генів, що кодують наступні білки: РОКІ, ТРІ, ТОНЗ, СУС1, АОНІ, АРН2, 5002, СА 1, САІ7 ії СА 10, а також інші АБ, активовані продуктом гена САГА4, причому в одному з аспектів використовують
ОАЗ АБН2. Оскільки ПОШАЗ АОБНО2 активується продуктом гена АОКІ, може бути переважною надекспресія гена АЮОКІ, коли гетерологічний ген функціонально зв'язаний з АБ АНІ.
Послідовності термінації транскрипції для експресії в Ззасспаготусеб5 сегемізіае включають послідовності термінації генів а-фактора, САРОН їі СУСТ1.
Послідовності контролю транскрипції для експресії генів у метилотрофних дріжджах включають ділянки контролю транскрипції генів, що кодують алкогольоксидазу (і форміатдегідрогеназу.
Трансфекцію молекули нуклеїнової кислоти в дріжджову клітину відповідно до даного винаходу можна проводити будь-як способом, за допомогою якого молекулу нуклеїнової кислоти можна вводити в клітину, і він включає, але не обмежується ними, дифузію, активний транспорт, обробку ультразвуком у ванні, електропорацію, мікроін'єкцію, ліпофекцію, адсорбцію і злиття протопластів. Трансфіковані молекули нуклеїнових кислот можуть вбудовуватися в хромосоми дріжджів або залишатися на позахромосомних векторах з використанням способів, відомих фахівцям у даній галузі. Приклади дріжджових носіїв, що несуть такі молекули нуклеїнових кислот, докладно описані в даному описі. Як розглянуто вище, дріжджовий цитопласт, дріжджову оболонку і дріжджові мембранні або частинки препарати клітинної стінки також можна одержувати рекомбінантними способами шляхом трансфекції незмінених дріжджових мікроорганізмів або дріжджових сферопластів бажаними молекулами нуклеїнових кислот, продукування в них антигену, а потім подальшого маніпулювання мікроорганізмам і/або сферопластами з використанням способів, відомих фахівцям у даній галузі, з одержанням 60 цитопласту, оболонки або субклітинної дріжджової мембрани або їхніх фракцій, що містять бажані антигени або інші білки.
Ефективні умови для одержання рекомбінантних дріжджових носіїв і експресії антигену і/або іншого білка дріжджовим носієм включають ефективне середовище, у якому можна культивувати штам дріжджів. Ефективне середовище, як правило, являє собою водне середовище, що містить джерела засвоюваних вуглеводів, азоту і фосфору, а також відповідні солі, мінерали, метали й інші поживні речовини, такі як вітаміни і фактори росту. Середовище може містити комплексні поживні речовини або воно може являти собою мінімальне середовище з певним складом. Штами дріжджів за даним винаходом можна культивувати в різних контейнерах, включаючи, але не обмежуються ними, біореактори, колби Ерленмейера, пробірки, мікротитрувальні чашки і чашки Петри. Культивування проводять при температурі, рН і вмісті кисню, що підходять для дріжджового штаму. Такі умови культивування знаходяться в межах кваліфікації фахівця в даній галузі (див., наприклад, сшїНгіє еї аї. (ед5.), 1991, Меїшйодвз іп
Епгуто!оду, мої. 194, Асадетіс Ргев55, Зап Оіедо).
У деяких варіантах здійснення винаходу дріжджі вирощують в умовах нейтральних значень рН. Як використовують у рамках винаходу загальне застосування терміна "нейтральні значення рН" стосується діапазону рН від приблизно рН 5,5 до приблизно рн 8, і в одному з аспектів від приблизно рН 6 до приблизно 8. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що можуть виникати невеликі відхилення (наприклад, на десяті або соті частинки) при вимірюванні за допомогою рін- метра. По суті, застосування нейтральних значень рН для вирощування клітин дріжджів означає, що клітини дріжджів вирощують у нейтральних значеннях рН протягом найбільшого періоду часу, коли вони знаходяться в культурі. В одному з варіантів здійснення дріжджі вирощують у середовищі, підтримуваному при рівні рН щонайменше 5,5 (тобто рн культурального середовища не дозволяють знижуватися нижче рН 5,5). В іншому аспекті дріжджі вирощують при рівні РН приблизно 6, 6,5, 7, 7,5 або 8. Застосування нейтральних значень рН при культивуванні дріжджів забезпечує кілька біологічних ефектів, що є бажаними характеристиками для застосування дріжджів як носіїв для імунізації. Наприклад, культивування дріжджів у нейтральних значеннях рН забезпечує гарний ріст дріжджів без негативного ефекту на час утворення клітин (наприклад, уповільнення часу подвоєння). Дріжджі можуть продовжувати рости до високих густин без утрати їхньої пластичності клітинної стінки.
Застосування нейтральних значень рН дозволяє одержання дріжджів із пластичними клітинними стінками і/або дріжджів, що є більш чутливими до ферментів, що розщеплюють клітинну стінку (наприклад, глюканаз) при всіх густинах збору. Ця ознака є бажаною, оскільки дріжджі з пластичними клітинними стінками можуть індукувати відмінні і поліпшені імунні відповіді в порівнянні з дріжджами, вирощуваними в більш кислотних умовах, наприклад, шляхом забезпечення секреції цитокінів антигенпредставляючими клітинами, які фагоцитували дріжджі (наприклад, цитокіни ТНі-типу, що включають, але не обмежуються ними, ІЕМ-у, інтерлейкін-12 (ІІ -12) їі 1-2, а також прозапальні цитокіни, такі як ІІ -6). Крім того, такі способи культивування забезпечують більш високу доступність антигенів, розташованих на клітинній стінці. В іншому аспекті використання нейтральних значень рН для деяких антигенів дозволяє вивільнення зв'язаного дисульфідним зв'язком антигену шляхом обробки дитіотреїтолом (ОТ), яка неможлива, коли такі експресуючі антиген дріжджі культивують у середовищі з більш низьким значенням рН (наприклад, рн 5).
В одному з варіантів здійснення контроль рівня глікозилування в дріжджів використовують для контролю експресії антигену дріжджами, зокрема, на поверхні. Рівень глікозилування в дріжджів може впливати на імуногенність і антигенність антигену, який експресується на поверхні, оскільки частини цукрів мають тенденцію до того, щоб бути об'ємними. По суті, існування частин цукрів на поверхні дріжджів і їхній вплив на тривимірний простір навколо антигену(ів)у-мішені варто враховувати при модулюванні дріжджів відповідно до винаходу. Будь- який спосіб можна використовувати для зменшення рівня глікозилування в дріжджів (або збільшення його, якщо бажано). Наприклад, можна використовувати мутантний штам дріжджів, який відібраний так, щоб він мав низький рівень глікозилування (наприклад, мутанти тпп1, осп1 і тпп9), або можна шляхом мутації усувати акцепторні послідовності глікозилування на антигені-мішені. Альтернативно, можна використовувати дріжджі зі зменшеними профілями глікозилування, наприклад, Ріспіа. Також можна обробляти дріжджі з використанням способів, що знижують або змінюють глікозилування.
В одному з варіантів здійснення даного винаходу як альтернатива рекомбінантній експресії антигену або іншого білка в дріжджовому носії, дріжджовий носій внутрішньоклітинно навантажують білком або пептидом, або вуглеводами або іншими молекулами, що служать як антиген і/або придатні як імуномодулюючі засоби або модифікатори біологічної відповіді 60 відповідно до винаходу. Потім дріжджовий носій, що містить антиген і/або інші білки внутрішньоклітинно, можна вводити індивідууму, або ним можна навантажувати носій, такий як дендритна клітина. Пептиди і білюи можна прямо вводити в дріжджові носії за даним винаходом способами, відомими фахівцям у даній галузі, такими як дифузія, активний транспорт, злиття ліпосом, електропорація, фагоцитоз, цикли заморожування-розморожування й обробка ультразвуком у ванні. Дріжджові носії, які можна прямо навантажувати пептидами, білками, вуглеводами або іншими молекулами, включають незмінені дріжджі, а також сферопласти, оболонки або цитопласти, які можна навантажувати антигенами й іншими агентами після їхнього продукування. Альтернативно незмінені дріжджі можна навантажувати антигеном і/або агентом, а потім сферопластами, оболонками, цитопластами, або з них можна одержувати субклітинні частинки. У цьому варіанті здійснення дріжджовий носій можна навантажувати будь- якою кількістю антигенів і/або інших засобів, від щонайменше 1, 2, 3, 4 або будь-якого цілого числа аж до сотень або тисяч антигенів і/або інших агентів, наприклад, як може бути забезпечено навантаженням мікроорганізму або його частин.
В іншому варіанті здійснення даного винаходу антиген і/або інший агент фізично зв'язують із дріжджовим носієм. Фізичне зв'язування антигену і/або іншого агента з дріжджовим носієм можна проводити будь-яким способом, що підходить у даній галузі, включаючи способи ковалентного і нековалентного зв'язування, що включають, але не обмежуються ними, хімічне зшивання антигену і/або іншого агента з зовнішньою поверхнею дріжджового носія або біологічне зв'язування антигену і/або іншого агента з зовнішньою поверхнею дріжджового носія, як наприклад, з використанням антитіла або іншого партнера по зв'язуванню. Хімічного зшивання можна досягати, наприклад, способами, що включають зв'язування через глутаральдегідний зв'язок, фотоафінне мічення, обробку карбодіїмідами, обробку хімічними речовинами, здатними утворювати дисульфідні зв'язки, і обробку іншими зшиваючими хімічними речовинами, які є стандартними в даній галузі. Альтернативно, хімічну речовину можна приводити в контакт із дріжджовим носієм, що змінює заряд ліпідного бішару дріжджової мембрани або композицію клітинної стінки так, щоб зовнішня поверхня дріжджів з більшою імовірністю піддавалася злиттю або зв'язувалася з антигенами і/або іншим засобом, що має конкретні зарядові характеристики. Націлювальні агенти, такі як антитіла, що зв'язують пептиди, розчинні рецептори й інші ліганди, також можна включати в антиген як злитий білок або іншим способом зв'язаними з антигеном, для зв'язування антигену з дріжджовим носієм.
Коли антиген або інший білок експресують або фізично зв'язують з поверхнею дріжджів, в одному з аспектів спейсер можна ретельно вибирати так, щоб оптимізувати експресію антигену або іншого білка, або вміст на поверхні. Розмір спейсера(ів) може впливати на те, скільки антигену або іншого білка буде експоновано для зв'язування на поверхні дріжджів. Таким чином, залежно від того, який антиген(и) або інший білок(білки) використовують, фахівець у даній галузі буде вибирати спейсер, що забезпечує відповідне розташування в просторі антигену або іншого білка на поверхні дріжджів. В одному з варіантів здійснення спейсер являє собою дріжджовий білок щонайменше з 450 амінокислот. Спейсери докладно розглянуті вище.
В іншому варіанті здійснення дріжджовий носій і антиген або інший білок зв'язані один з одним за допомогою більш пасивного, неспецифічного або нековалентного механізму зв'язування, як наприклад, шляхом обережного змішування дріжджового носія і антигену або іншого білка разом у буфері або іншому придатному складі (наприклад, суміші).
В одному з варіантів здійснення винаходу обома з дріжджового носія і антигену або іншого білка навантажують внутрішньоклітинно носій, такий як дендритна клітина або макрофаг, з одержанням терапевтичної композиції або вакцини за даним винаходом. Альтернативно антигеном або іншим білюм можна навантажувати дендритну клітину під час відсутності дріжджового носія.
В одному з варіантів здійснення інтактні дріжджі (з експресією гетерологічних антигенів або інших білків або без неї) можна групувати або обробляти так, щоб одержувати препарати клітинної стінки дріжджів, дріжджові мембранні частинки або дріжджові фрагменти (тобто не є незміненими) і в деяких варіантах здійснення фрагменти дріжджів можуть бути надані або можуть уводитися з іншими композиціями, що включають антигени (наприклад, ДНК-вакцини, білкові субодиничні вакцини, убиті або інактивовані патогени) для посилення імунних відповідей. Наприклад, можна використовувати ферментативну обробку, хімічну обробку або фізичну силу (наприклад, механічне зусилля зрушення або обробку ультразвуком) для руйнування дріжджів на частині, які використовують як ад'ювант.
В одному з варіантів здійснення винаходу дріжджові носії, що підходять у рамках даного винаходу, включають дріжджові носії, які є убитими або інактивованими. Забезпечення загибелі або інактивації дріжджів можна проводити будь-яким з різних придатних способів, відомих у 60 даній галузі. Наприклад, інактивація дріжджів нагріванням є стандартним шляхом інактивації дріжджів, і фахівець у даній галузі може здійснювати моніторинг структурних змін антигену- мішені, якщо бажано, стандартними способами, відомими в даній галузі. Альтернативно можна використовувати інші способи інактивації дріжджів, такі як хімічні, електричні, радіоактивні або
Уф-способи. Див., наприклад, методологію, описану в стандартних довідниках по культивуванню, таких як Меїподз ої ЕпгутоїІоду, Мої. 194, Соїй ргіпд Нагрог Рибіїзпіпуд (1990).
При будь-якій використовуваній стратегії інактивації варто враховувати вторинну, третинну або четвертинну структуру антигену-мішені і зберігати таку структуру, щоб оптимізувати її імуногенність.
Дріжджові носії можна складати в імунотерапевтичні композиції або продукти на основі дріжджів за даним винаходом, включаючи препарати для введення індивідууму прямо або для первинного навантаження ними носія, такого як дендритна клітина, з використанням ряду способів, відомих фахівцям у даній галузі. Наприклад, дріжджові носії можна сушити ліофілізацією. Склади, що містять дріжджові носії також можна одержувати шляхом упаковування дріжджів у випічку або таблетку, як наприклад, проводять для дріжджів, використовуваних у випіканні або пивоварстві. Крім того, дріжджові носії можна змішувати з фармацевтично прийнятним ексципієнтом, таким як ізотонічний буфер, який є переносимим для хазяїна або клітини-хазяїна. Приклади таких ексципієнтів включають воду, сольовий розчин, розчин Рінгера, розчин декстрози, розчин Хенкса й інші водяні фізіологічно збалансовані сольові розчини. Також можна використовувати неводні носії, такі як жирні олії, кунжутну олію, етилолеат або тригліцериди. Інші придатні склади включають суспензії, що містять підвищуючі в'язкість засоби, такі як натрій карбоксиметилцелюлоза, сорбіт, гліцерин або декстран.
Ексципієнти також можуть містити невеликі кількості добавок, таких як речовини, що збільшують ізотонічність і хімічну стабільність. Приклади буферів включають фосфатний буфер, бікарбонатний буфер і Тгіз-буфер, у той час як приклади консервантів включають тимеросал, м- або о-крезол, формалін і бензиловий спирт. Стандартні склади можуть являти собою рідкі або ін'єктовані склади, або тверді речовини, що можуть бути додані в придатну рідину, таку як суспензія або розчин для ін'єкції. Таким чином, у нерідкому складі, ексципієнт може містити, наприклад, декстрозу, сироватковий альбумін людини і/або консерванти, до яких можна додавати стерильну воду або сольовий розчин перед уведенням.
В одному з варіантів здійснення даного винаходу композиція може включати додаткові засоби, що також можуть називатися сполуками, що модифікують біологічну відповідь, або здатна продукувати такі засоби/модифікатори. Наприклад, дріжджовий носій можна трансфікувати або навантажувати щонайменше одним антигеном і щонайменше одним засобом/сполукою, що модифікує біологічну відповідь, або композицію за винаходом можна вводити разом щонайменше з одним засобом/модифікатором біологічної відповіді.
Модифікатори біологічної відповіді включають ад'юванти й інші сполуки, які можуть модулювати імунні відповіді, що можуть називатися імуномодулюючими сполуками, а також сполуки, що модифікують біологічну активність іншої сполуки або засобу, такі як імунотерапевтичні засоби на основі дріжджів, причому така біологічна активність не обмежується ефектами на імунну систему. Певні імуномодулюючі сполуки можуть стимулювати захисну імунну відповідь, у той час як інші можуть придушувати шкідливу імунну відповідь, і те, чи придатний імуномодулюючий засіб у комбінації з даним імунотерапевтичним засобом на основі дріжджів, може залежати щонайменше частково, від захворювання або стану, що підлягає лікуванню або профілактиці, іМабо від індивідуума, що підлягає лікуванню. Певні модифікатори біологічної відповіді, переважно, підсилюють клітинно-опосередковувану імунну відповідь, у той час як інші, переважно, підсилюють гуморальну імунну відповідь (тобто можуть стимулювати імунну відповідь, у якій є збільшений рівень клітинно-опосередковуваного імунітету в порівнянні з гуморальним, або навпаки). Певні модифікатори біологічної відповіді мають одну або декілька спільних властивостей з біологічними властивостями імунотерапевтичних засобів на основі дріжджів або підсилюють або доповнюють біологічні властивості імунотерапевтичних засобів на основі дріжджів. Існує ряд способів, відомих фахівцям у даній галузі, для вимірювання або стимуляції придушення імунних відповідей, а також для відрізнення клітинно- опосередковуваних імунних відповідей від гуморальних імунних відповідей, і для відрізнення одного типу клітинно-опосередковуваної відповіді від іншого (наприклад, відповідь ТН17 проти відповіді ТНІ).
Засоби/модифікатори біологічної відповід), що підходять у рамках винаходу, можуть включати, але не обмежуватися ними, цитокіни, хемокіни, гормони, ліпідні похідні, пептиди, білки, полісахариди, низькомолекулярні лікарські засоби, антитіла і їхній антигензв'язувальні фрагменти (включаючи, але не обмежуються ними, антитіла проти цитокінів, антитіла проти 60 рецепторів цитокінів, антитіла проти хемокінів), вітаміни, полінуклеотиди, зв'язувальні частини нуклеїнових кислот, аптамери і модулятори росту. Деякі придатні засоби включають, але не обмежуються ними, ЇЇ -1 або агоністи 1-1 або 1ІІ-1Е, антитіла проти 1-1 або інші антагоністи І-- 1; 11-6 або агоністи І/-б6 або І/-6Е, антитіла проти ІЇ/-6 або інші антагоністи І--6; І/-12 або агоністи 1-12 або 1Г-12Е, антитіла проти 1-12 або інші антагоністи І--12; 11-17 або агоністи 1-17 або 1-17, антитіла І/-17 або інші антагоністи 1-17; І/-21 або агоністи І/-21 або 1І--218, антитіла проти 1-21 або інші антагоністи І--21; І -22 або агоністи 1-22 або 1 -22К, антитіла проти 1-22 або інші антагоністи 1-22; ІІ -23 або агоністи І--23 або ІІ -23К, антитіла проти 1-23 або інші антагоністи І--23; ІЇ-25 або агоністи 1-25 або ІІ-25К, антитіла проти 1-25 або інші антагоністи І--25; І -27 або агоністи 1-27 або ІІ -27К, антитіла проти 1-27 або інші антагоністи
І. -27; інтерферон типу І (включаючи ІЕМ-а) або агоністи або антагоністи інтерферону типу І або його рецептора; інтерферон типу ІЇ (включаючи ІЕМ-у) або агоністи або антагоністи інтерферону типу ІЇ або його рецептора; антитіло проти СО40, СО401Ї, антитіло проти СТІ А-4 (наприклад, для вивільнення анергічних Т-клітин); костимулятори Т-клітин (наприклад, антитіло проти
СО0137, антитіло проти СО28, антитіло проти СО40); алемтузумаб (наприклад, Сатрацй-), денілейкін дифтитокс (наприклад, ОМТАКУ); антитіло проти СО4; антитіло проти СО25; антитіло проти РО-1, антитіло проти РО-Ї1, антитіло проти РО-12; засоби, які блокують БОХРЗ (наприклад, усувають активністьс'знищують СО4:/2025Т-регуляторні клітини); РІЗ-ліганд, іміквімод (АЇІдага"м), гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор (ЗМ-С5БЕ); гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (5-С5Е), сарграмостим (ГецКіпе"); гормони, що включають, але не обмежуються ними, пролактин і гормон росту; агоністи ТоїІ-подібного рецептора (ТІК), включаючи, але не обмежуються ними, агоністи ТІ К-2, агоністи ТІ К-4, агоністи ТІ К-7 і агоністи ТІ К-9; антагоністи ТК, включаючи, але не обмежуються ними, антагоністи ТІ К-2, антагоністи ТІ К-4, антагоністи ТІ К-7 і антагоністи ТІ К-9; протизапальні засоби і імуномодулятори, включаючи, але не обмежуються ними, інгібітори СОХ-2 (наприклад, целекоксиб, МЗАЇІЮ5), глюкокортикоїди, статини, і талідомід і його аналоги, включаючи ІМІіО 7М5 (які є структурними і функціональними аналогами талідоміду (наприклад, КЕМ'ІМІОЄ (леналідомід), АСТІМІОЄ (помалідомід)); прозапальні засоби, такі як грибкові або бактеріальні компоненти або будь-який прозапальний цитокін або хемокін; імунотерапевтичні вакцини, включаючи, але не обмежуються ними, вірусні вакцини, бактеріальні вакцини або антитільні вакцини; і будь-які інші імуномодулятори, підсилювачі імунної системи, протизапальні засоби і/або прозапальні засоби. Винахід передбачає будь-яку комбінацію таких засобів, і будь-який з таких засобів, комбінований або який вводиться в протоколі (наприклад, одночасно, послідовно або в інших форматах) з імунотерапевтичним засобом на основі дріжджів, є композицією, охоплюваною винаходом. Такі засоби добре відомі в даній галузі. Ці засоби можна використовувати окремо або в комбінації з іншими засобами, описаними в даному описі.
Засоби можуть включати агоністи й антагоністи даного білка або пептиду або їх домену. Як використовують у рамках винаходу, "агоніст" являє собою будь-яку сполуку або засіб, включаючи, але не обмежуються ними, низькомолекулярні сполуки, білки, пептиди, антитіла, засоби, що зв'язують нуклеїнові кислоти і т. д., які зв'язуються з рецептором або лігандом і забезпечують або запускають відповідь, що може включати засоби, які імітують дію природної речовини, що зв'язується з рецептором або лігандом. "Антагоніст" являє собою будь-яку сполуку або засіб, включаючи, але не обмежуються ними, низькомолекулярні сполуки, білки, пептиди, антитіла, засоби, що зв'язують нуклеїнові кислоти, і т. д., які блокують або інгібують або знижують дію агоніста.
Композиції за винаходом, крім того, можуть включати або їх можна вводити з (одночасно, послідовно або по черзі) будь-якими іншими сполуками або композиціями, які придатні для профілактики або лікування інфекції НВУ, або з будь-якими сполуками, які можуть лікувати або пом'якшувати будь-який симптом інфекції НВМ. Відомі різні засоби, що підходять для профілактики і/або лікування або пом'якшення інфекції НВМ. Такі засоби включають, але не обмежуються ними, противірусні сполуки, включаючи, але не обмежуються ними, інгібітор зворотної транскриптази на основі нуклеотидного аналога (ПКТ). В одному з аспектів винаходу, прийнятні противірусні сполуки включають, але не обмежуються ними: тенофовір (МІКЕАОУ), ламівудин (ЕРІМІК-У), адефовір (НЕРЗЕРАЗ), телбівудин (ТУ2ЕКА-), ентекавір (ВАВАСІ О0ЕЗ і їхні комбінації, і/або інтерферони, такі як інтерферон-42а або пегилований інтерферон-аг2а (РЕСА5У52) або інтерферон-. Ці засоби, як правило, уводять протягом тривалих періодів часу (наприклад, раз на добу або раз на тиждень протягом аж до від одного до п'яти років або більше). Крім того, композиції за винаходом можна використовувати разом з іншими імунотерапевтичними композиціями, включаючи профілактичну і/або терапевтичну імунотерапію. Наприклад, профілактичні вакцини від НВМ комерційно доступні з ранніх 1980 60 років. Ці комерційні вакцини являють собою неінфекційні субодиничні вірусні вакцини, що надають очищений рекомбінантний поверхневий антиген вірусу гепатиту В (НВзЗАО), і їх можна вводити, починаючи з народження. Хоча в США відсутні терапевтичні імунотерапевтичні композиції для лікування НВУ, такі композиції можуть включати білкові або епітопні субодиничні вакцини проти НВМ, вакцини проти НВМ на основі вірусного вектора, цитокіни і/або інші імуномодулюючі засоби (наприклад, агоністи ТІ Е, імуномодулюючі лікарські засоби).
Також винахід стосується набору, що містить будь-яку з композицій, описаних у даному описі, і будь-який з індивідуальних компонентів композицій, описаних у даному описі.
Способи введення або застосування композицій за винаходом
Композиції за винаходом, що можуть включати будь-яку одну або декілька (наприклад, комбінації з двох, трьох, чотирьох, п'яти або більше) імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, описаних у даному описі, антигени НВУ, включаючи білки і злитих білків НВУ, і/або рекомбінантні молекули нуклеїнових кислот, що кодують такі білки або злиті білки НВУ, описані вище, і інші композиції, що містять такі композиції на основі дріжджів, антигени, білки, злиті білки або рекомбінантні молекули, описані в даному описі, можна використовувати в різних способах іп мімо і іп міго, включаючи, але не обмежуються ними, лікування і/або профілактику інфекції
НВМУ і її ускладнень, у діагностичних аналізах для НВУ, або для продукування антитіл проти
НВУ.
Один з варіантів здійснення винаходу стосується способу лікування хронічної інфекції вірусом гепатиту В (НВУ), і/або профілактики, пом'якшення або лікування щонайменше одного симптому хронічної інфекції НВУ, у індивідуума або в групі індивідуумів. Спосіб включає стадію введення індивідууму абогрупі індивідуумів, які хронічно інфіковані НВУ, однієї або декількох імунотерапевтичних композицій за винаходом. В одному з аспектів композиція являє собою імунотерапевтичну композицію, що містить один або декілька антигенів НВМ, як описано в даному описі, що може включати імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів. В одному з аспектів композиція включає білок або злитий білок, що містить антигени НВУ, як описано в даному описі, і/або рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує такий білок або злитий білок. В одному з варіантів здійснення індивідуум або група індивідуумів мають хронічну інфекцію НВМУ. В одному з аспектів індивідуума або групу індивідуумів, крім того, лікують щонайменше однією іншою терапевтичною сполукою, що підходить для лікування інфекції НВУ.
Такі терапевтичні сполуки включають, але не обмежуються ними, противірусні лікарські засоби прямої дії (наприклад, лікарські засоби, описані вище або в інших розділах даного опису) і/або інтерферони і/або інші імунотерапевтичні або імуномодулюючі засоби. В одному з аспектів такі терапевтичні сполуки включають націлені на хазяїна лікарські засоби (наприклад, інгібітори циклофіліну, що можуть перешкоджати реплікації вірусу, або інгібітори повторного входження, що можуть перешкоджати життєвому циклу вірусу (повторна інфекція)). "Стандарт лікування" або "5ОС", головним чином, стосується поточного схваленого стандарту лікування конкретного захворювання. При хронічній інфекції НВМ, БОС може являти собою один з декількох різних схвалених терапевтичних протоколів, і включає, але не обмежується ними, терапію інтерфероном і/або противірусну терапію. Схвалені в даний час противірусні лікарські засоби для лікування інфекції НВМ включають тенофовір (МІКЕАБУ), ламівудин (ЕРІМІКУ), адефовір (НЕРБЕКАЗ), телбівудин (ТУ7ЕКАЗ) і ентекавір (ВАКАСІ О0Е).
В даний час найбільш часто призначуваними противірусними лікарськими засобами від хронічної інфекції НВУ є тенофовір і ентекавір. Інтерферон, придатний для лікування хронічної інфекції НВМ, включаючи інтерферон типу І, такий як інтерферон-й, включаючи, але не обмежуються ними, інтерферон-а2 або пегилований інтерферон-а2 (наприклад, РЕСБАЗУ5У). В одному з варіантів здійснення інтерферон являє собою інтерферон типу І, включаючи, але не обмежуються ними, інтерферон-А!, інтерферон-/2 і/або інтерферон-А3. Імунотерапевтичну композицію за винаходом можна вводити до, одночасно, по черзі і/або після одного або декількох противірусного засобу(засобів) і/або інтерферону і/або інших імунотерапевтичних або імуномодулюючих засобів. Інші терапевтичні сполуки також можна вводити до або після лікування імунотерапевтичними композиціями за винаходом.
Інфекцію НВМ, як правило, діагностують в індивідуума шляхом виявлення НВзЗАд (поверхневий антиген вірусу гепатиту В) і/або НВедАд (е-антиген) у крові інфікованого індивідуума. Виявлення НВелАо у сироватці відбиває активну реплікацію вірусу і клінічний результат інфекції може корелювати зі статусом е-антигену, хоча довгострокова ремісія (або лікування) краще прогнозуються з використанням сероконверсії НВ5Ад при використанні сучасних способів лікування (див. нижче). Виявлення ІдМ-антитіла проти корового антигену також можна використовувати для виявлення гострої інфекції НВМ протягом перших 56-12 місяців інфекції. Персистенція НВ5зАд у крові протягом більше ніж б місяців, як правило, 60 ідентифікує хронічну інфекцію НВУ. Крім того, хронічну інфекцію НВМ можна діагностувати шляхом ідентифікації ДНК НВМ (72000 МО/мл), яку можна комбінувати з виявленням або ідентифікацією підвищених рівнів аланінамінотрансферази (А! Т) імабо аспартатамінотрансферази (А5Т) (наприклад, більше ніж у два рази відносно верхньої межі норми).
Видужання від вірусної інфекції (повна відповідь або результат лікування НВУ) визначають по сероконверсії НВела/НВзЗАд, що являє собою втрату НВеАа і НВ5Ад, відповідно, і розвиток антитіл проти поверхневого антигену гепатиту В (анти-НВ5) і/або антитіл проти НВедод. Клінічні випробування визначили сероконверсію або рівень захисних антитіл (анти-НВ5) як: (а) 10 або більше одиниць співвідношення в зразках (ЗК) при визначенні радіоїмунним аналізом; (Б) позитивний результат при визначенні імуноферментним аналізом; або (с) виявлення концентрації антитіл 210 мМоО/мл (10 5КИО порівнянне з 10 мМоО/мл антитіла). Розвиток сероконверсії в хронічно інфікованого пацієнта займає роки при сучасному стандартному лікуванні (тобто противірусні лікарські засоби або інтерферон). Також можна проводити моніторинг пацієнтів відносно втрати або значного зниження ДНК вірусу (нижче піддаються виявленню рівнів за допомогою ПЛР або «2000 МК/мл), нормалізації рівнів аланінамінотрансферази (АЇТ) у сироватці і поліпшення відносно запалення і фіброзу печінки. "АТ" є добре перевіреною мірою ушкодження печінки, і вона служить як ідентифікатор запалення печінки. У попередніх великих випробуваннях по гепатиту було показано, що зниження і/або нормалізація рівнів АЇТ (нормалізація АГТ) корелює з поліпшенням функції печінки і зниженням фіброзу печінки, що визначається шляхом серійної біопсії.
Інший варіант здійснення винаходу стосується способу імунізації індивідуума або групи індивідуумів проти НВМ для профілактики інфекції НВМ, профілактики хронічної інфекції НВМУ іабо зниження тяжкості інфекції НВМ у індивідуума або групи індивідуумів. Спосіб включає стадію введення індивідууму або групі індивідуумів, які не інфіковані НВМ (або ймовірно не інфіковані НВМ) композиції за винаходом. В одному з аспектів композиція являє собою імунотерапевтичну композицію, що містить один або декілька антигенів НВМ, як описано в даному описі, включаючи одну або декілька імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів.
В одному з аспектів композиція включає злитий білок, що містить антигени НВУ, як описано в даному описі, або рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує такий злитий білок.
Як використовують у рамках винаходу, вираз "лікувати" інфекцію НВУ, або будь-яке його похідне (наприклад, "піддається лікуванню від інфекції НВУ", і т.д.), головним чином, стосується застосування або введення композиції за винаходом після виникнення інфекції (гострої або хронічної), з метою зниження або усунення титру вірусу, що піддається виявленню (наприклад, зниження ДНК вірусу (які нижче піддаються виявленню рівнів способом ПЛР або «2000 Мо/мл)), досягнення сероконверсії (розвитку антитіл проти НВ5ЗАд і/або НВедад і одночасне усунення або зниження цих білків із сироватки), зниження щонайменше одного симптому, що є результатом інфекції в індивідуума, уповільнення або профілактики виникнення і/або тяжкості симптомів іабо наступних ускладнень, які викликаються інфекцією, зниження ушкодження органа або фізіологічної системи (наприклад, цирозу) внаслідок інфекції (наприклад, зниження аномальних рівнів АЇТ, зниження запалення печінки, зменшення фіброзу печінки), профілактики і/або зниження частоти або зустрічальності печінково-клітинної карциноми (НСС), поліпшення функції органа або системи, на які негативно вплинула інфекція (нормалізація рівнів АТ у сироватці, поліпшення при запаленні печінки, поліпшення при фіброзі легень), поліпшення імунних відповідей проти інфекції, поліпшення тривалих імунних відповідей пам'яті проти інфекції, зниження реактивації вірусу НВУ, і/або поліпшення загального стану здоров'я індивідуума або групи індивідуумів.
В одному з аспектів метою лікування є безупинний кліренс вірусу протягом щонайменше 6 місяців після завершення терапії. В одному з аспектів метою лікування є зниження рівня білків, що піддаються виявленню, НВелйо і/або НВ5Ад у сироватці В одному з аспектів метою лікування є розвиток антитіл проти поверхневого антигену гепатиту В (анти-НВ5) і/або антитіл проти НВедо. В одному з аспектів метою лікування є сероконверсія, яка може бути визначена як: (а) 10 або більше одиниць співвідношення в зразках (ЗКУ) при визначенні радіоїімунним аналізом; (б) позитивний результат при визначенні за допомогою ферментного імуноаналізу; або (с) виявлення концентрації антитіла 210 мМО/мл (10 БК! порівнянні з 10 мМоО/мл антитіла). "Попереджати" інфекцію НВМУ або будь-яке його похідне (наприклад, "профілактика інфекції
НВУ", і т. д.), головним чином, стосується застосування або введення композиції за винаходом до виникнення інфекції НВМ з метою профілактики інфекції НВМ, профілактики хронічної інфекції НВМ (тобто забезпечення кліренсу в індивідуума гострої інфекції НВМ без подальшого втручання), або, якщо інфекція виникне згодом, щонайменше зниження тяжкості і/або 60 тривалості інфекції і/або фізіологічного ушкодження, викликаного хронічною інфекцією,
включаючи профілактику або зниження тяжкості або зустрічальності щонайменше одного симптому внаслідок інфекції в індивідуума і/або уповільнення або профілактику виникнення і/або тяжкості симптомів і/або наступних ускладнень, які викликаються інфекцією, у індивідуума або в групі індивідуумів. В одному з аспектів даний винахід можна використовувати для профілактики хронічної інфекції НВУ, такої як забезпечення в індивідуума, що став інфікованим гострою інфекцією НВМ уже після введення композиції за винаходом, кліренсу інфекції і того, щоб він не став хронічно інфікованим.
Даний винахід включає доставку (уведення, імунізацію) однієї або декількох імунотерапевтичних композицій за винаходом, включаючи імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, індивідууму. Процес уведення можна здійснювати ех мімо або іп мімо, однак, як правило, його проводять іп мімо. Уведення ех мімо стосується виконання частини необхідної стадії поза пацієнтом, такої як уведення композиції за даним винаходом в групу клітин (дендритні клітини), витягнутих з пацієнта, в умовах, що забезпечують навантаження клітини дріжджовим носієм, антигеном(ами) і будь-якими іншими засобами або композиціями, і повернення клітин пацієнту. Терапевтичну композицію за даним винаходом можна повертати пацієнту або вводити пацієнту будь-яким придатним способом уведення.
Уведення композиції може бути системним, через слизову оболонку і/або поблизу розташування мішеневої області (наприклад, поблизу області інфекції). Придатні шляхи введення будуть очевидними фахівцям у даній галузі, залежно від типу стану, що підлягає профілактиці або лікуванню, використовуваного антигену і/або мішеневої популяції клітин або тканини. Різні прийнятні способи уведення включають, але не обмежуються ними, внутрішньовенне введення, внутрішньоочеревинні введення, внутрішньом'язове введення, внутрішньовузлове введення, внутрішньокоронарне введення, внутрішньоартеріальне введення (наприклад, у сонну артерію), підшкірне введення, черезшкірну доставку, внутрішньотрахеальне введення, внутрішньосуглобове введення, внутрішньошлуночкове введення, інгаляцію (наприклад, аерозоль), внутрішньочерепне, внутрішньохребетне, внутрішньоочне, вушне, інтраназальне, пероральне, легеневе введення, встановлення катетера і пряму ін'єкцію в тканину. В одному з аспектів шляхи уведення включають: внутрішньовенний, внутрішньоочеревинний, підшкірний, внутрішньошкірний, внутрішньовузловий, внутрішньом'язовий, черезшкірний, інгаляційний, інтраназальний, пероральний, внутрішньоочний, внутрішньосуглобовий, внутрішньочерепний і внутрішньохребетний.
Парентеральна доставка може включати внутрішньошкірний, внутрішньом'язовий, внутрішньоочеревинний, внутрішньоплевральний, внутрішньолегеневий, внутрішньовенний, підшкірний шляхи, шлях через передсердний катетер і венозний катетер. Вушна доставка може включати вушні краплі, інтраназальна доставка може включати назальні краплі або інтраназальну ін'єкцію, і внутрішньоочна доставка може включати очні краплі. Також можна здійснювати доставку за допомогою аерозолю (інгаляційну) з використанням способів, стандартних у даній галузі (див., наприклад, Зігіріїпу еї аї., Ргос. Маї!. Асайд. сі. ОБА 189:11277- 11281, 1992). Для лікування вірусних інфекцій можуть бути придатні інші шляхи введення, які модулюють імунітет слизових оболонок. Такі шляхи включають бронхіальний, внутрішньошкірний, внутрішньом'язовий, інтраназальний, інший інгаляційний, ректальний, підшкірний, місцевий, черезшкірний, вагінальний і уретральний шляхи. В одному з аспектів імунотерапевтичну композицію за винаходом вводять підшкірно.
Що стосується імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів за винаходом, як правило, прийнятна одинична доза являє собою дозу, яка здатна ефективно надавати дріжджовий носій й антиген (якщо він включений) даному типу клітини, тканини або області організму пацієнта в кількості, ефективній для індукції антигенспецифічної імунної відповіді проти одного або декількох антигенів або епітопів НВМ при введенні один або декілька разів протягом придатного періоду часу. Наприклад, в одному з варіантів здійснення одинична доза дріжджового носія за даним винаходом складає від приблизно 1х105 до приблизно 5х107 еквівалентів дріжджових клітин на кілограм маси організму, у який уводять композицію. В одному з аспектів одинична доза дріжджового носія за даним винаходом складає від приблизно 0,1 Д.О. (1х105 клітин) до приблизно 100 Д.О. (1х109 клітин) на дозу (тобто на організм), включаючи будь-яку проміжну дозу зі збільшенням 0,1х105 клітин (тобто, 1,1х106, 1,2х106, 1,3х106...)3. В одному з варіантів здійснення дози включають дози від 1 Д.О. до 40 Д.О., дози від 1 Д.О. до 50 Д.О., дози від 1 Д.О. до 60 Д.О., дози від 1 Д.О. до 70 Д.О., або дози від 1 Д.О. до 80 Д.О., і в одному з аспектів від 10
Д.О. до 40 Д.О., 50 Д.О., 60 Д.О., 70 Д.О. або 80 Д.О. В одному з варіантів здійснення дози вводять у різні ділянки індивідуума, але в ході того самого періоду дозування. Наприклад, дозу 40 Д.О. можна вводити шляхом ін'єкції доз 10 Д.О. у чотири різні ділянки індивідуума в ході 60 одного періоду дозування, або дозу 20 Д.О. можна вводити шляхом ін'єкції доз 5 Д.О. у чотири різні ділянки індивідуума, або шляхом ін'єкції доз 10 Д.О. у дві різні ділянки індивідуума в ході того самого періоду дозування. Винахід стосується введення кількості імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів (наприклад, 1, 2, 3,4,5,6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 Д.О. або більше) у 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 або більше різних ділянок індивідуума, досягаючи одиничної дози. "Допоміжні засоби" або "підсилювальні засоби" для терапевтичної композиції вводять, наприклад, коли імунна відповідь проти антигену знижується або якщо необхідно забезпечити імунну відповідь або індукувати пам'ять проти конкретного антигену або антигену антигену(ів).
Підсилювальні засоби можна вводити з інтервалом від приблизно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 тижнів, до інтервалу раз на місяць, раз на два місяці, раз на чотири місяці, раз на рік, раз на декілька років після первинного введення. В одному з варіантів здійснення схема введення являє собою схему, по якій від приблизно 1х107 до приблизно 5х107 еквівалентів дріжджових клітин композиції на кг маси тіла організму вводять щонайменше 1, 2, 3, 4, 5,6, 7,8, 9,10 або більше раз протягом періоду часу від тижнів до місяців і років. В одному з варіантів здійснення дози вводять щотижня для 1, 2, 3,64,5,6, 7, 8, 9, 10 або більше доз, а потім дози вводять раз на місяць при необхідності для досягнення бажаного інгібування або усунення вірусу НВУ.
Наприклад, дози можна вводити до досягнення індивідуумом сероконверсії, доти, поки титри
ДНК НВМ не знижуються нижче 2000 МО/мл, і/або доти, поки рівні АТ не нормалізуються. В одному з варіантів здійснення дози вводять по 4-тижневому протоколі (кожні 4 тижні, або на 1 добу, 4 тижні, 8 тижні, 12 тижні і т. д. протягом від 2 до 10 або дозе більш, як визначає лікар).
Додаткові дози можна вводити навіть після досягнення індивідуумом сероконверсії, якщо бажано, хоча таке дозування може не бути необхідним.
Що стосується введення імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, описаних у даному описі, одну композицію можна вводити індивідууму або групі індивідуумів або можна вводити комбінацію таких композицій. Наприклад, винахід стосується декількох композицій з "одиничним білком" або композицій, спрямованих проти конкретного генотипу, а також мультибілкових композицій і композицій, які націлені проти множини генотипів або підгенотипів.
Таким чином, дві або більше композиції можна відбирати в підході "набору приправ" для найбільш ефективної профілактики або лікування інфекції НВМУ у даного індивідуума або групи індивідуумів.
В одному з аспектів винаходу один або декілька додаткових лікарських засобів уводять послідовно з імунотерапевтичною композицією на основі дріжджів. В іншому варіанті здійснення один або декілька додаткових лікарських засобів уводять до введення імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів. В іншому варіанті здійснення один або декілька додаткових лікарських засобів уводять після введення імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів. В одному з варіантів здійснення один або декілька додаткових лікарських засобів уводять як черговані дози з імунотерапевтичною композицією на основі дріжджів або у протоколі, у якому композицію на основі дріжджів уводять із призначеними інтервалами між або з однією або декількома послідовними дозами додаткових засобів або навпаки. В одному з варіантів здійснення імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів вводять в одній або декількох дозах протягом періоду часу перед початком уведення додаткових засобів. Іншими словами, імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів вводять як монотерапію протягом періоду часу, а потім додають уведення засобу, одночасно або з новими дозами імунотерапії на основі дріжджів, або шляхом чергування з імунотерапією на основі дріжджів. Альтернативний засіб можна вводити протягом періоду часу перед початком уведення імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів. В одному з аспектів дріжджі створюють способами інженерії, щоб вони експресували або містили засіб, або конструюють або одержують інші дріжджі, щоб вони експресували або містили засіб.
В одному з аспектів винаходу коли починають курс лікування інтерфероном або противірусною сполукою, уводять додаткові дози імунотерапевтичної композиції протягом періоду часу або протягом щонайменше частини цього часу, і їх можна продовжувати вводити один раз після закінчення курсу інтерферону або противірусної сполуки. Однак схема дозування для імунотерапії протягом усього періоду часу може, і, як очікують, буде відрізнятися від схеми дозування інтерферону або противірусної сполуки. Наприклад, імунотерапевтичну композицію можна вводити в той же день або щонайменше через 3-4 доби після останньої дози інтерферону, що вводиться (найбільш пізньої), або противірусного засобу (або через будь-яку придатну кількість діб після останньої дози), і її можна вводити раз на добу, раз на тиждень, раз на два тижні, раз на місяць, раз на два місяці або раз на 3-6 місяців, або з більш тривалими інтервалами, як визначить лікар. У ході первинного періоду введення імунотерапевтичної 60 композиції як монотерапії, якщо її використовують, імунотерапевтичну композицію, переважно,
уводять щотижня протягом від 4 до 12 тижнів, а потім уводять раз на місяць (незалежно від того, коли додатковий інтерферон або противірусну терапію додають до протоколу). В одному з аспектів імунотерапевтичну композицію вводять раз на тиждень протягом чотирьох або п'яти тижнів, а потім уведення проводять раз на місяць, до завершення повного протоколу лікування.
В аспектах винаходу імунотерапевтичну композицію й інші засоби можна вводити разом (одночасно). Як використовують у рамках винаходу, одночасне застосування доз не обов'язково означає, що всі дози всіх сполук вводять у той самий день у той самий час. Швидше, одночасне застосування означає, що кожний з компонентів терапії (наприклад, імунотерапія і терапія інтерферонами, або імунотерапія і противірусна терапія) починають приблизно в той самий період (у межах або годин аж до 1-7 доби друг від друга) і вводять протягом того самого загального періоду часу, з огляду на, що кожен компонент може мати схему дозування, що відрізняється (наприклад, інтерферон раз на тиждень, імунотерапія раз на місяць, противірусна терапія раз на добу або раз на тиждень). Крім того, до або після періоду одночасного введення один з або засобів імунотерапевтичних композицій можна вводити без іншого засобу(засобів).
Даний винахід передбачає, що застосування імунотерапевтичної композиції за винаходом з противірусним засобом, таким як тенофовір або ентекавір, забезпечить більш коротку тривалість застосування противірусного лікарського засобу. Подібні результати очікуються при комбінуванні імунотерапевтичного засобу за винаходом з інтерфероном. Вимоги до дозування для противірусного засобу або інтерферону також можуть знижуватися або модифікуватися в результаті комбінації з імунотерапевтичним засобом за винаходом, щоб у загальному підвищити толерантність пацієнта до лікарського засобу. Крім того, передбачається, що імунотерапевтична композиція за винаходом може забезпечувати сероконверсію або безупинні вірусні відповіді для пацієнтів, у яких противірусна терапія окремо не досягає цих результатів.
Іншими словами, більша кількість пацієнтів будуть досягати сероконверсії, коли імунотерапевтичну композицію за винаходом комбінують із противірусним засобом або інтерфероном, ніж при використанні противірусних засобів або інтерферону окремо. При поточному 5ОС для інфекції НВМ противірусні засоби можна вводити протягом від 6 місяців до одного року, двох років, трьох років, чотирьох років, п'яти років або більше (наприклад, на невизначений термін). Шляхом комбінування такої терапії з імунотерапевтичною композицією за винаходом час для введення противірусного засобу може бути знижене на декілька місяців або років. Передбачається, що застосування імунотерапевтичних композицій за даним винаходом, як монотерапії або в комбінації з противірусними і/або імуномодулюючими підходами буде ефективним для досягнення усунення НВзАа і/або НВеАсд; сероконверсії НВело, сероконверсії
НВзЗАЯ або повної сероконверсії; і в багатьох індивідуумів, безупинного кліренсу вірусу протягом щонайменше 6 місяців після завершення терапії. У деяких пацієнтів імунотерапія відповідно до даного винаходу, коли її використовують як монотерапію або в комбінації з противірусним і/або імуномодулюючим підходами, може досягати усунення НВ5ЗАд і/або НВедо, але не досягає сероконверсії (розвитку антитіл проти НВ5 або антитіл проти НВеАд). У цьому сценарії, крім того, варіантом здійснення винаходу є застосування, окремо або в комбінації з імунотерапією на основі дріжджів за винаходом і/або противірусними засобами або іншими імуномодулюючими засобами, засобу, такого як поточна профілактична рекомбінантна субодинична вакцина проти
НВУ, для досягнення повної відповіді в пацієнта.
Як використовують у рамках винаходу, термін "противірусний засіб" стосується будь-якої сполуки або лікарського засобу, як правило, низькомолекулярного інгібітору або антитіла, які націлені на одну або декілька стадій життєвого циклу вірусу з прямими противірусними терапевтичними ефектами. В одному з варіантів здійснення винаходу противірусна сполука або лікарський засіб, що підлягають введенню в одному терапевтичному протоколі з імунотерапевтичною композицією за винаходом, вибирають з тенофовіру (МІКЕАО-), ламівудину (ЕРІМІБУ), адефовіру (НЕРБЕКА?Є), телбівудину (ТМ2ЕКА?); і ентекавіру (ВАВАСІ СОЕЗЄ), або їхнього будь-якого аналога або похідного, або будь-якої композиції, що містить або вміщує таку сполуку, лікарський засіб, аналог або похідне.
Тенофовір (тенофовір дизопроксил фумарат або ТОР), або (((2К)-1-(6б-аміно-9Н-пурин-9- іл)упропан-2-іл|іокси)уметил)уфосфонова кислота, являє собою інгібітор зворотної транскриптази на основі нуклеотидних аналогів (ПКТ). Для лікування інфекції НВМ, тенофовір, як правило, уводять дорослим як пігулки, прийнятих у дозі 300 мг (тенофовір дизопроксил фумарат) один раз на добу. Дозування для педіатричних пацієнтів основані на масі тіла пацієнта (8 мг на кг маси тіла, аж до 300 мг один раз на добу) і воно може бути надане як таблетка або пероральний порошок.
Ламівудин, або 2',3'-дидезокси-3'і-тіадитидин, який позначається звичайно як ЗТС, є 60 потужним інгібітором зворотної транскриптази на основі нуклеозидних аналогів (ПКТ). Для лікування інфекції НВМ ламівудин уводять як пігулку або пероральний розчин, прийнятий в дозі 100 мг один раз на добу (1,4-2 мг/фунт (3,1-4,4 мг/кг) два рази З на добу для дітей від З місяців до 12 років).
Адефовір (адефовір дипівоксил) або 9-(2- ((бісКпівалоїлокси)метокси|фосфініл|метокси|етил|Іаденін, являє собою інгібітор зворотної транскриптази, що вводиться перорально, на основі нуклеотидних аналогів (піКкТІ). Для лікування інфекції НВУ, адефовір уводять як пігулку, що приймається в дозі 10 мг один раз на добу.
Телбувідин, або 1-(2-дезокси-В-І -еритропентофуранозил)-5-метилпіримідин-2,4(1Н, ЗН)- діон, являє собою синтетичний нуклеозидний аналог тимідину (І-ізомер тимідину). Для лікування інфекції НВМ телбівудин уводять як пігулку або пероральний розчин, який приймається в дозі 600 мг один раз на добу.
Ентекавір або 2-аміно-9-К15, ЗВ, 45)-4-гідрокси-3-(гідроксиметил)-2-метиліденциклопентилі|- 6,9-дигідро-«ЗН-пурин-6-он, являє собою нуклеозидний аналог (аналог гуаніну), що інгібує зворотну транскрипцію, реплікацію ДНК і транскрипцію вірусу. Для лікування інфекції НВМ, ентекавір уводять як пігулку або пероральний розчин, які приймаються у дозі 0,5 мг один раз на добу (1 мг раз на добу у випадку забезпечуючих рефрактерність до ламівудину або стійкість до телбівудину мутацій).
В одному з варіантів здійснення винаходу інтерферон, що підлягає введенню в терапевтичному протоколі з імунотерапевтичною композицією за винаходом, являє собою інтерферон, і в одному з аспектів інтерферон-а, і в одному з аспектів інтерферон-а2Б5 (що вводиться шляхом підшкірної ін'єкції З рази на тиждень); або пегилований інтерферон-аг2а (наприклад РЕСА5У59). Як використовують у рамках винаходу, термін "інтерферон" стосується цитокіну, що, як правило, продукується клітинами імунної системи і широкою множиною клітин у відповідь на присутність дволанцюжкової РНК. Інтерферони сприяють імунній відповіді шляхом інгібування реплікації вірусу в клітинах-хазяях, активації природних кілерних клітин і макрофагів, збільшення представлення антигену лімфоцитам, і індукції стійкості клітин-хазяїнів до вірусної інфекції. Інтерферони типу | включають інтерферон-а. Інтерферони типу Ії включають інтерферон-А. Інтерферони, що підходять у способах за даним винаходом, включають будь-як інтерферон типу І або типу Ії, включаючи інтерферон-а, інтерферон-а2, і в одному з аспектів форми інтерферону тривалої дії, включаючи, але не обмежуються ними, пегиловані інтерферони, злиті білки інтерферонів (інтерферон, злитий з альбуміном), і склади з контрольованим вивільненням, що містять інтерферон (наприклад, інтерферон у або мікросферах інтерферон з наночастинками поліамінокислоти). Один інтерферон, РЕСА5У59, пегилований інтерферон-ага, являє собою ковалентний кон'югат рекомбінантного інтерферону- ага (приблизна молекулярна маса ІММІ 20000 дальтон) з одним розгалуженим ланцюгом біс- монометоксиполіетиленгліколю (РЕС) (приблизна ММ 40000 дальтон). Частина РЕС зв'язана в одній ділянці з частиною інтерферону-є через стабільний амідний зв'язок з лізином.
Пегилований інтерферон-оа2а має приблизну молекулярну масу 60000 дальтон.
Інтерферон, як правило, уводять шляхом внутрішньом'язової або підшкірної ін'єкції і його можна вводити в дозі 3-10 мільйонів одиниць, причому в одному з варіантів З мільйони одиниць є переважними. Дози інтерферону вводять з регулярним розкладом, що може варіювати від 1, 2, 3, 4, 5 або 6 разів на тиждень до введення раз на тиждень, раз на два тижні, раз на три тижні або раз на місяць. Типову дозу інтерферону, що доступна в даний час, надають раз на тиждень, і це є переважною схемою дозування для інтерферону відповідно до даного винаходу. Для лікування НВМУ пегилований інтерферон-аг2а у даний час уводять підшкірно один раз на тиждень у дозі 180 мг (попередньо заповнений шприц з 1,0 мл або 0,5 мл для лікування вірусу), протягом всього 48 тижнів. Величина дози і розклад можуть варіювати залежно від переваг і рекомендацій лікаря, а також від рекомендацій для конкретного використовуваного інтерферону, і фахівці в даній галузі здатні визначити належну дозу. Передбачається, що з використанням терапії інтерфероному разом з імунотерапевтичною композицією за винаходом величина дози і/або кількість доз інтерферону (період часу на інтерфероні і/або інтервали між дозами інтерферону) можуть бути знижені.
У способі за даним винаходом композиції і терапевтичні композиції можна уводити тварині, включаючи будь-яке хребетне, і, зокрема, будь-якому представнику хребетних класу ссавці, включаючи, але не обмежуючи, приматів, гризунів, домашню худобу і домашніх тварин.
Домашня худоба включає ссавців, що підлягають вживанню в їжу або які продукують корисні продукти (наприклад, вівці для одержання вовни). Ссавці, що підлягають лікуванню або захисту, включають людини, собак, кішок, мишей, щурів, кіз, овець, велику рогату худобу, коней і свиней. 60 "Індивідуумом" є хребетне, таке як ссавець, включаючи, але не обмежуються цим, людину.
Ссавці включають, але не обмежуються ними, сільськогосподарських тварин, спортивних тварин, домашніх тварин, приматів, мишей і щурів. Термін "індивідуум" можна використовувати взаємозамінно з терміном "тварина", "суб'єкт" або "пацієнт".
Загальні способи, що підходять для винаходу
Для застосування даного винаходу на практиці можуть бути використані, якщо немає інших указівок, загальноприйняті способи молекулярної біології (включаючи рекомбінантні способи), мікробіології, клітинної біології, біохімії, хімії нуклеїнових кислот і імунології, що добре відомі фахівцям у даній галузі. Такі способи повністю проілюстровані в літературі, такій як Меїйоа5 ої
Епгутоіоаду, Мої. 194, Ссішйтє єї аї., єдв., Соїд 5ргіпа Натог І абогаюгу Ргезз (1990); Віоіосаду апа асімціез ої уєавзів, ЗКіппег, еї аї., єд5., Асадетіс Ргеззв (1980); Меїнпод5 іп уєавзі депеїфсв: а
Іабогаїгу сошцг5е тапиа!, МКозе еї аїЇ., Соїд 5ргіпд Нагрог І абогаїогу Ргез5 (1990); Тне Уеаві засспаготусевх: Сеї! Сусіє і СеїІ Віоіоду, Ргіпдіє еї аї., еаз., Соїй 5ргіпд Нагбог Гарогаїогу Ргез5 (1997); Те Уеаві Засспаготусе5: Сепе Ехргеззіоп, дУопе5 еї аї., ейд5., Соїй Зргіпа Наог
Іарогаїогу Рге55 (1993); Тпе Меавзі Засспаготусе5: Сепоте Оупатісв, Ргоївіп Бупіпевів, апа
Епегдеїйсв, Вгоаси еї аї., єдв., Соїд 5ргіпд Натог І арогаюгу Ргезз (1992); МоїІесшаг Сіопіпд: А
І арога(огу Мапиаї, зесопа едйоп (Затьгоок еї аї., 1989) і МоІесшаг Сіопіпд: А Гарогаїгу Мапиаї, іга еайіоп (Затогоок апа Киззеї, 2001), (позначаютьсяразом у даному описі як "Затрбгоок");
Ситепі Ргоїосо!5 іп МоїІесціаг Віоіоду (Е.М. А!йзирбеї еї аї., еа5., 1987, включаючи доповнення по 2001 рік); ПЛР: Те Роїутегазе Спаїп геасіоп, (Миїїв5 еї аї., едв., 1994); Напом апа І апе (1988),
Апііїродієз, А І арогаїюту Мапиа!, Со бргіпд Натог Рибііїсайопе, Мем/ Мої; Напом апа Іапе (1999) Овіпуд Апііродієв: А І абогаюгту Мапиаї, Соїд бргіпа Натог І арогаюгу Ргев55, Соїд брііпд
Нагбог, МУ (які позначаються разом у даному описі як "Нагіож апа І апе"), Веаисаде еї аї. едв.,
Ситепі Ргоїосої!в5 іп Мисівїс Асій Спетівігу, допп У/еу б 5опв5, Іпс., Мем МоїК, 2000); Сазагеїї апа
Боиі5 Тохісоїоду Тпе Вавіс Зсіепсе ої Роізоп5, С. Кіааззеп, ей., бій еайоп (2001), ії Массіпев, 5.
Ріоїкіп апа МУ. Огепвівїіп, єадв., За едйоп (1999).
Загальні визначення "ТАВМОСЕМУ" (СІореІттипе, Іпс., ГоцієміШе, Соіогадо), головним чином, стосується дріжджового носія, який експресує один або декілька гетерологічних антигенів позаклітинно (на його поверхні), внутрішньоклітинно (усередині або в цитозолі) або як позаклітинно, так і внутрішньоклітинно. Продукти ТАЕМОСЕМУ, в основному, описані (див., наприклад, патент
США Мо 5830463). Визначені композиції для імунотерапії на основі дріжджів і способи одержання ії, головним чином, їхні застосування, також докладно описані, наприклад, у патенті
США Мо 5830463, патенті США Мо 7083787, патенті США Мо 7736642, ЗіиББЬ5 еї аї!., Маї. Меа. 7:625-629 (2001), І и єї а)І., Сапсег Везеагсй 64:5084-5088 (2004), і Вегпеїеїп еї аї., Массіпе 2008
Уап 24; 26(4):509-21, кожний з яких включений у даний опис як посилання в повному обсязі.
Як використовують у рамках винаходу, термін "аналог" стосується хімічної сполуки, яка є структурно схожою з іншою сполукою, але небагато відрізняється по складу (як у випадку заміни одного атома атомом іншого елемента або в присутності конкретної функціональної групи, або у випадку заміни однієї функціональної групи іншою функціональною групою). Таким чином, аналог являє собою сполуку, яка є схожою або порівнянною по функції і зовнішньому вигляду, але яка має відмінну структуру або походження відносно еталонної сполуки.
Терміни "заміщений", "заміщене похідне" і "похідне", коли їх використовують для опису сполуки, означають, що щонайменше один водневий зв'язок незаміщеної сполуки замінений відмінним атомом або хімічною групою.
Хоча похідне має подібну фізичну структуру з вихідною сполукою, похідне може мати відмінні хімічні і/або біологічні властивості від вихідної сполуки. Такі властивості можуть включати, але не обмежуються ними, збільшену або знижену активність вихідної сполуки, нову активність у порівнянні з вихідною сполукою, посилену або знижену біодоступність, посилену або знижену ефективність, посилену або знижену стабільність іп мійго і/або іп мімо, і/або властивості посиленого або зниженого усмоктування.
Як правило, термін "біологічно активний" указує на те, що сполука (включаючи білок або пептид) має щонайменше один вид активності, що піддається виявленню, який має ефект на метаболічні або інші процеси в клітині або організмі, при вимірюванні або спостереженні іп мімо (тобто в нейтральних фізіологічних умовах) або іп міїго (тобто в лабораторних умовах).
Відповідно до даного винаходу, термін "модулювати" може використовуватися взаємозамінно з "регулювати" і стосуватися, головним чином, активації або придушення конкретної активності. Як використовують у рамках винаходу, термін "активувати" може використовуватися, головним чином, для опису будь-якого з: індукції, ініціації, збільшення, посилення, форсування, поліпшення, підвищення, множення, стимуляції або забезпечення, 60 відносно конкретної активності. Аналогічно, термін "придушувати" можна використовувати для опису будь-якого зі: зменшення, зниження, інгібування, пом'якшення, скорочення, убавлення, блокування або попередження відносно конкретної активності.
В одному з варіантів здійснення даного винаходу, будь-яку з амінокислотних послідовностей, описаних у даному описі, можна одержувати зі щонайменше однієї й аж до приблизно 20 додаткових гетерологічних амінокислот, що фланкують кожний з С- і/або М-кінців вказаної амінокислотної послідовності. Отриманий білок або поліпептид може бути позначений як "по суті складається з" вказаної амінокислотної послідовності. Відповідно до даного винаходу гетерологічні амінокислоти являють собою послідовність амінокислот, що не зустрічаються природним чином (тобто не зустрічаються в природі, іп мімо), що фланкують конкретну амінокислотну послідовність, або які не зв'язані з функцією вказаної амінокислотної послідовності, або які не кодуються нуклеотидами, що фланкують природну послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує вказану амінокислотну послідовність, як вона зустрічається в гені, якби такі нуклеотиди в природній послідовності транслювалися з використанням стандартного використання кодонів для організму, з якого дана амінокислотна послідовність походить. Аналогічно, вираз "по суті складається з", коли його використовують у рамках даного винаходу відносно послідовності нуклеїнової кислоти, стосується послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує вказану амінокислотну послідовність, що фланкується за допомогою від одного й аж до 60 додаткових гетерологічних нуклеотидів на кожному з 5'- і/або 3'-кінці послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує вказану амінокислотну послідовність. Гетерологічні нуклеотиди являють собою такі, що не зустрічаються природним чином (тобто не зустрічаються в природі, іп мімо) нуклеотиди, що фланкують послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує визначену амінокислотну послідовність, як вона зустрічається в природному гені, або не кодують білок, що надає будь-яку додаткову функцію білку або змінює функцію білка, що має визначену амінокислотну послідовність.
Відповідно до даного винаходу, вираз "селективно зв'язується 3" стосується здатності антитіла, антигензв'язувального фрагмента або зв'язувального партнера за даним винаходом, переважно, зв'язуватися з визначеними білками. Більш конкретно, вираз "селективно зв'язує" стосується специфічного зв'язування одного білка з іншим (наприклад, антитіла, його фрагмента або зв'язувального партнера з антигеном), де рівень зв'язування при вимірюванні в будь-якому стандартному аналізі (наприклад, імуноаналізі), є статистично значущо більш високим, ніж фоновий контроль для аналізу. Наприклад, при виконанні імуноаналізу контролі, як правило, включають реакційну ямку/пробірку, яка містить антитіло або антигензв'язувальний фрагмент окремо (тобто під час відсутності антигену), де величина реактивності (наприклад, неспецифічного зв'язування з ямкою) антитіла або його антигензв'язувального фрагмента під час відсутності антигену вважається фоновим рівнем. Зв'язування можна вимірювати з використанням різних способів, стандартних у даній галузі, включаючи імуноферментні аналізи (наприклад, ЕГІ5А, аналізи з використанням імуноблотингу і т. д.).
Указівка на білок або поліпептид, використовувана в рамках даного винаходу, включає повнорозмірні білки, злиті білюи або будь-який фрагмент, домен, конформаційний епітоп або гомолог таких білків, включаючи функціональні домени й імунологічні домени білків. Більш конкретно, виділений білок відповідно до даного винаходу являє собою білок (який включає поліпептид або пептид), що витягнутий з його природного середовища (тобто який підданий обробці людиною) і може включати, очищені білки, частково очищені білки, рекомбінантно продуковані білки і синтетично продуковані білки. По суті, "виділений" не відбиває ступеня, з яким білок очищений. Переважно, виділений білок за даним винаходом продукують рекомбінантним шляхом. Відповідно до даного винаходу, терміни "модифікація" і "мутація" можуть бути використані взаємозамінно, зокрема, відносно модифікацій/мутацій амінокислотної послідовності білків або їхніх частин (або послідовностей нуклеїнових кислот), описаних у даному описі.
Як використовують у рамках винаходу, термін "гомолог" використовують для позначення білка або пептиду, що відрізняються від природного білка або пептиду (тобто "прототипного" білка або білка "дикого типу") незначними модифікаціями природного білка або пептиду, але який зберігає основну структуру білка і бічного ланцюга природної форми. Такі зміни включають, але не обмежуються ними: зміни одного або декількох бічних ланцюгів амінокислот; зміни однієї або декількох амінокислот, включаючи делеції (наприклад, укорочений варіант білка або пептиду), інсерції і/або заміни; зміни стереохімії одного або декількох атомів; і/або незначні перетворення, включаючи, але не обмежуються ними: метилування, глікозилування, фосфорилування, ацетилування, міристоїлування, пренілування, пальмітування, амідацію і/або приєднання глікозилфосфатидилінозитолу. Гомолог може мати посилені, знижені або по суті 60 подібні властивості в порівнянні з природним білком або пептидом. Гомолог може включати агоніст білка або антагоніст білка. Гомологи можна одержувати з використанням способів одержання білків, відомих у даній галузі включаючи, але не обмежуються ними, прямі модифікації виділеного, природного білка, прямий синтез або білка модифікації послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, з використанням, наприклад, класичних технологій або технологій рекомбінантних ДНК для забезпечення випадкового або спрямованого мутагенезу.
Гомолог даного білка може містити, по суті складатися або складатися з амінокислотної послідовності, що щонайменше приблизно на 45 95, або щонайменше приблизно на 50 95, або щонайменше приблизно на 5595, або щонайменше приблизно на 60 95, або щонайменше приблизно на 65 95, або щонайменше приблизно на 70 95, або щонайменше приблизно на 75 95, або по меншій мері приблизно на 80 95, або щонайменше приблизно на 85 95, або щонайменше приблизно на 9095, або щонайменше приблизно на 9195 ідентична, або щонайменше приблизно на 92 95 ідентична, або щонайменше приблизно на 93 95 ідентична, або щонайменше приблизно на 94 95 ідентична, або щонайменше приблизно на 95 95 ідентична, або щонайменше приблизно на 96 95 ідентична, або щонайменше приблизно на 97 95 ідентична, або щонайменше приблизно на 98 95 ідентична, або щонайменше приблизно на 99 95 ідентична (або будь-яка процентна ідентичність між 4595 і 9995, із кроком, що складає цілі числа), амінокислотної послідовності еталонного білка. В одному з варіантів здійснення гомолог містить, по суті складається або складається з амінокислотної послідовності, що менше ніж на 100 95 ідентична, менше ніж приблизно на 99 95 ідентична, менше ніж приблизно на 98 95 ідентична, менше ніж приблизно на 97 95 ідентична, менше ніж приблизно на 96 95 ідентична, менше ніж приблизно на 95 95 ідентична, і т. д., із кроком 1 95, до менше ніж приблизно 70 95 ідентичності природної амінокислотної послідовності еталонного білка.
Гомолог може включати або білки домени білків, які є "практично повнорозмірними", що означає, що такий гомолог відрізняється від повнорозмірного білка, функціонального домену або імунологічного домену (у тій якості, у якій такий білок, функціональний домен або імунологічний домен описаний у даному описі або в іншому випадку відомий або описаний у загальнодоступній послідовності) шляхом додавання або делеції 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 амінокислот на М- і/або С-кінці такого повнорозмірного білка або повнорозмірного функціонального домену або повнорозмірного імунологічного домену.
Як використовують у рамках винаходу, якщо немає інших указівок, указівка на процентну (95) ідентичність стосується оцінки гомології, що проводять з використанням: (1) пошуку гомології в
ВІ АБ5Т 2.0 Вабхіс ВІ А5Т з використанням бБіазір для пошуку по амінокислотах і Біазіп для пошуку по нуклеїнових кислотах зі стандартними параметрами за умовчанням, де послідовність запиту фільтрують по областях низької комплексності за умовчанням (описане АкКб5сПиї, 5.Е., Мадаеєп,
Т.Г, Зснаанетг, А.А., 7Напа, 9., 2папо, 2., МіПег, М. 6 ртап, 0... (1997) "Сарреа ВІ АТ апа РБІ-
ВІ А5Т: а пем/ депегаїййоп ої ргоїєїп дагїаразе зеагсі ргодгатв", Мисієїс Асід5 Вевз. 25:3389-3402, включена в даний опис як посилання в повному обсязі); (2) вирівнювання ВІА5бТ 2 (з використанням параметрів, описаних нижче); (3) і/або РБІ-ВІ А5Т зі стандартними параметрами за умовчанням (Розйіоп-Зресійс Мегаїєй ВГАБТ). Слід зазначити, що внаслідок деяких відмінностей у стандартних параметрах між ВІ А5Т 2.0 Вавзіс ВГ А5Т і ВІ АБ5Т 2, дві конкретних послідовності можуть бути розпізнані як такі, мають значну гомологію з використанням програми
ВГ А5Т 2, у той час як пошук, проведений у ВГА5Т 2.0 Вавзіс ВІ А5Т з використанням однієї з послідовностей як послідовність запиту, може не ідентифікувати другу послідовність серед найкращих збігів. Крім того, РБІ-ВА5Т забезпечує автоматизовану просту у використанні версії "профільного" пошуку, що є чутливим способом для пошуку гомологів послідовностей. Спочатку програма виконує пошук у базі даних Саррей ВГА5Т. Програма РБІ-ВГА5Т використовує інформацію від будь-яких значних виданих вирівнюваннях для конструювання специфічної до положення оцінної матриці, яка замінює послідовність запиту для наступного раунду пошуку в базі даних. Таким чином, варто розуміти, що процентну ідентичність можна визначати з використанням будь-якої з цих програм.
Дві конкретних послідовності можна вирівнювати одну з одною з використанням ВІА5Т 2 зедшепсе, як описано в Тайзома апа Мадаеп, (1999), "Віазі 2 зедиепсез-а пем/ 00! Тог сотрагіпа ргооїєїп апа писієоііде зедиепсев", РЕЕМ5 Місгобіо! І ей. 174:247-250, включеної в даний опис як посилання в повному обсязі. Вирівнювання послідовностей ВІ А5БТ 2 проводять у Біабір або ріазіп з використанням алгоритму ВГА5Т 2.0 алгоритм для виконання пошуку в Сарреа ВГА5Т (ВГА5Т 2.0) між двома послідовностями, допускаючи внесення пропусків (делецій і інсерцій) у результат вирівнювання. Для цілей зрозумілості в рамках даного опису, вирівнювання послідовностей у ВІ А5Т 2 проводять з використанням наступних стандартних параметрів.
Для Біазіп, використання матриці 0 В ОБИМб2: 60 Нагорода за збіг - 1
Штраф за незбіг - -2
Штрафи за внесення пропуску (5) і продовження пропуску (2) дар х агороїй (50) очікування (10) розмір слова (11) фільтр (оп)
Для Біазір, використання матриці 0 В ОБИМб2:
Штраф за внесення пропуску (11) і продовження пропуску (1) дар х агороїй (50) очікування (10) розмір слова (3) фільтр (оп).
Виділена молекула нуклеїнової кислоти являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка витягнута з її природного середовища (тобто яка піддана обробці людиною), причому її природне середовище являє собою геном або хромосому, у яких молекула нуклеїнової кислоти зустрічаються в природі. По суті, "виділений" необов'язково відбиває ступінь, з яким молекула нуклеїнової кислоти очищена, а вказує на те, що молекула не включає цілий геном або цілу хромосому, у яких молекула нуклеїнової кислоти зустрічається в природі. Виділена молекула нуклеїнової кислоти може включати ген. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що включає ген, не є фрагментом хромосоми, що включає такий ген, а замість цього включає кодуючу область і регуляторні області, зв'язані з геном, але не включає додаткові гени, що зустрічаються в природі на тій же хромосомі. Виділена молекула нуклеїнової кислоти також може включати вказану послідовність нуклеїнової кислоти, фланковану (тобто на 5'- і/або 3'-кінці послідовності) додатковими нуклесновими кислотами, що звичайно не фланкують вказану послідовність нуклеїнової кислоти в природі (тобто гетерологічні послідовності). Виділена молекула нуклеїнової кислоти може включати ДНК, РНК (наприклад, мРНК), або похідні або ДНК, або РНК (наприклад, КДНК). Хоча вираз "молекула нуклеїнової кислоти", головним чином, стосується фізичної молекули нуклеїнової кислоти і вираз "послідовність нуклеїнової кислоти", головним чином, стосується послідовності нуклеотидів у молекулі нуклеїнової кислоти, ці два вираз можуть використовуватися взаємозамінно, особливо відносно молекули нуклеїнової кислоти або послідовності нуклеїнової кислоти, здатної кодувати білок або домен білка.
Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти являє собою молекулу, що може включати щонайменше одну з будь-якої послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує будь-який один або декілька білків, описаних у даному описі, функціонально зв'язаних щонайменше з однією з будь- яких послідовностей контролю транскрипції, здатних ефективно регулювати експресію молекули(молекул) нуклеїнової кислоти в клітині, що підлягає трансфекції. Хоча вираз "молекула нуклеїнової кислоти", головним чином, стосується фізичної молекули нуклеїнової кислоти і вираз "послідовність нуклеїнової кислоти", головним чином, стосується послідовності нуклеотидів у молекулі нуклеїнової кислоти, ці два вирази можуть використовуватися взаємозамінно, особливо відносно молекули нуклеїнової кислоти або послідовності нуклеїнової кислоти, здатної кодувати білок. Крім того, вираз "рекомбінантна молекула", головним чином, стосується молекули нуклеїнової кислоти, функціонально зв'язаної з послідовністю контролю транскрипції однак його можна використовувати взаємозамінно з виразом "молекула нуклеїнової кислоти", яку уводять тварині.
Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти включає рекомбінантний вектор, що являє собою будь-яку послідовність нуклеїнової кислоти, як правило, гетерологічну послідовність, що функціонально зв'язана з виділеною молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок за даним винаходом, що здатний забезпечувати рекомбінантну продукцію злитого білка, і який здатний доставляти молекулу нуклеїнової кислоти в клітину-хазяїна відповідно до даного винаходу. Такий вектор може містити послідовності нуклеїнових кислот, що не зустрічаються в природі поруч з виділеними молекулами нуклеїнових кислот, що підлягають вбудовуванню у вектор. Вектор може являти собою вектор на основі РНК або ДНК, може бути прокаріотичним або еукаріотичним, і, переважно, у рамках даного винаходу вектор являє собою вірус або плазміду. Рекомбінантні вектори можна використовувати в клонуванні, секвенуванні і/або іншому маніпулюванні молекулами нуклеїнових кислот, і його можна використовувати для доставки таких молекул (наприклад, як у композиції ДНК або композиції на основі вірусного вектора). Рекомбінантні вектори, переважно, використовують при експресії молекул нуклеїнових кислот, і також вони можуть називатися векторами експресії. Кращі рекомбінантні вектори можуть експресуватися в трансфікованій клітині-хазяїні.
У рекомбінантній молекулі за даним винаходом молекули нуклеїнових кислот функціонально зв'язані з векторами експресії, що містять регуляторні послідовності, такі як послідовності контролю транскрипції, послідовності контролю трансляції, оріджини реплікації й інші регуляторні послідовності, що сумісні з клітиною-хазяїном і які контролюють експресію молекул нуклеїнових кислот за даним винаходом. Зокрема, рекомбінантні молекули за даним винаходом включають молекули нуклеїнових кислот, що функціонально зв'язані з однією або декількома 60 послідовностями контролю експресії. Вираз "функціонально зв'язаний" стосується зв'язування молекули нуклеїнової кислоти з послідовністю контролю експресії так, щоб молекула експресувалась після трансфекції (тобто трансформації, трансдукції або трансфекції) клітини- хазяїна.
Відповідно до даного винаходу термін ""трансфекція" використовують для позначення будь- якого способу, за допомогою якого екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти (тобто рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти) можна вводити в клітину. Термін "трансформація" може використовуватися взаємозамінно з терміном "трансфекція", коли такий термін використовують для позначення введення молекул нуклеїнових кислот у мікробні клітини, такі як водорості, бактерії і дріжджі. У мікробних системах термін "трансформація" використовують для опису набутої зміни унаслідок введення екзогенних нуклеїнових кислот мікроорганізмом, і він є по суті синонімічним з терміном "трансфекція". Таким чином, способи трансфекції включають, але не обмежуються ними, трансформацію, хімічну обробку клітин, бомбардування частинками, електропорацію, мікроін'єкцію, ліпофекцію, адсорбцію, інфекцію і злиття протопластів.
Наступні експериментальні результати надані для цілей ілюстрації і не призначені для обмеження обсягу винаходу.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1
У представленому нижче прикладі описане одержання імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів для лікування або профілактики інфекції вірусом гепатиту В (НВМ).
У цьому експерименті, дріжджі (наприклад, Засспаготусеб5 сегемізіае) модифікували способами інженерії для експресії різних злитих білків поверхневий антиген-коровий антиген
НВУ, кожний з яких має основну структуру, представлену на фіг. 2, під контролем індукованого міддю промотору СОРТ або промотору ТЕБ2. У кожному випадку, злитий білок НВМ являв собою єдиний поліпептид приблизно з 595 амінокислот з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає 5ХЕО ІЮ МО:34 (1) М- кінцевий пептид для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабільної експресії (положення 1-6 5ЕО ІЮО МО:34); 2) спейсер із двох амінокислот (ТПг-5ег) для внесення ділянки ферменту рестрикції 5ре; 3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного (мінус положення 1) великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 9-407
ЗЕО ІОЮО МО:34, що відповідають положенням 2-400 5ЕО ІЮО МО:11, що відрізняються від 5ЕО ІЮ
МО:34 у положеннях 350-351 5ЕО ІО МО:11, де послідовність І еи-Ма! у БЕО ІЮО МО:11 замінена послідовністю (Іп-Аі(а у положеннях 357-358 5ЕО ІЮО МО:34); 4) амінокислотна послідовність корового антигену НВМ (наприклад, положення 408-589 5ЕО ІЮ МО:34 або положення 31-212
ЗЕО ІЮ МО:9); і 5) гексагістидинова мітка (положення 590-595 5ЕО ІЮ МО:34). Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок 5ЕО ІЮ МО:34 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як 5БЕО ІЮ МО:33. Положення 28-54 5ЕО ІЮ МО:34 містять частину рецептора для гепатоцитів великого () поверхневого білка. БЗЕО ІЮ МО:34 містить множину епітопів або доменів, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка. Наприклад, положення 209-220, положення 389-397, положення 360-367 і положення 499- 506 відносно ЗЕО ІЮ МО:34 містяться відомі зв'язувальні МНС класу І епітопи і/або епітопи СТІ.
Положення 305-328 5ЕО І МО:34 містять епітоп антитіла. Цей злитий білок і відповідна імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, що містить цей білок, можуть бути загалом позначені в даному описі як "Зсоге", "МАСЕАР-5соге", "М-Зсоге" або "5І-13002".
У короткому викладі, ДНК, яка кодує практично повнорозмірний великий поверхневий антиген (3, злитий з повнорозмірним коровим антигеном, піддавали оптимізації кодонів для експресії в дріжджах, а потім розщеплювали ЕсокіІ і Мої! і вбудовували після промотору СОР1 (раІ-100) або промотору ТЕЕ2 (ртк57-1), у 2-мкм векторах експресії дріжджів. Злитий білок, кодований цими конструкціями, представлений у даному описі як ЗЕО ІЮ МО:34 (кодований нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:33) і має очікувану приблизну молекулярну масу 66 кДа. Отримані плазміди вводили в дріжджі засспаготусеб5 сегемізіае УУЗОЗа шляхом трансфекції з ацетатом літію/поліетиленгліколем, і первинні трансфектанти відбирали на чашках із твердим мінімальним середовищем, позбавленим урацилу (ШОМ; середовище з відсутністю уридину). Колонії повторно наносили штрихами на ШОМ або ОГОМ (середовище з відсутністю уридину і лейцину) і дозволяли рости протягом З діб при 30 "С. Рідкі культури, позбавлені уридину (середовище 2:20 г/л глюкози; 6,7 г/л азотистих основ для дріжджів, що містять сульфат амонію; 0,04 мг/мл кожного з гістидину, лейцину, триптофану й аденіну) або позбавлені уридину і лейцину (середовище ШП12:20 г/л глюкози; 6,7 г/л азотистих основ для дріжджів, що містять сульфат амонію; і 0,04 мг/мл будь-якого з гістидину, триптофану й аденіну) 60 інокулювали з чашок і стартові культури вирощували протягом 20 год. при 30 "С, 250 об./хв.
Також інокулювали рН-буферне середовище, що містило 4,2 г/л Віб-Ттів (ВТ-0О2; ВТ-ЦІ 2) для оцінки росту дріжджів в умовах нейтральних значень рН. Первинні культури використовували для інокуляції кінцевих культур з тим же складом, і ріст продовжували до досягнення густини від 1,1 до 4,0 Д.О./мл.
Для штамів ТЕЕ2 (конститутивна експресія), клітини збирали, промивали і забезпечували їхню загибель нагріванням при 56 "С протягом 1 год. у РВ5. Живі клітини також обробляли для порівняння. Для штамів СИРІ (індуцибельна експресія), експресію індукували в тому ж середовищі 0,5 мМ сульфатом міді протягом 5 год. при 30 "С, 250 об./хв. Клітини збирали, промивали і забезпечували їхню загибель нагріванням при 56 "С протягом 1 год. у РВ5. Живі клітини також обробляли для порівняння.
Після забезпечення загибелі нагріванням культур ТЕР2 і СОРІ1, клітини промивали три рази в РВ5. Загальну експресію білка вимірювали за допомогою преципітації з ТСА/аналізу зв'язування з нітроцелюлозою і експресію антигену вимірювали вестерн-блотингом з використанням моноклонального антитіла проти Ппі5-мітки. Антиген кількісно визначали шляхом інтерполяції зі стандартної кривої для рекомбінантного, міченого гексагістидином білка М53, який обробляли на тому же вестерн-блоті. Результати представлені на фіг. 16 (убиті нагріванням) і фіг. 17 (живі дріжджі). На цих фігурах показано, що імунотерапевтична композиція на основі дріжджів за винаходом добре експресує злитий білок поверхневий антиген-коровий антиген НВМ з використанням обох промоторів, і його можна ідентифікувати вестерн-блотингом як в убитих нагріванням, так і живих клітинах. Обчислена експресія антигену цією імунотерапевтичною композицією на основі дріжджів склала «5000 нг білок на Д.О. (дріжджова одиниця; одна дріжджова одиниця (Д.О.) являє собою 1х107 клітин дріжджів або еквівалентів клітин дріжджів) або 76 пмоль білка на Д.О.
Приклад 2
У представленому нижче прикладі описане одержання іншої імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів для лікування або профілактики інфекції вірусом гепатиту В (НВМ).
Дріжджі (наприклад, Засспаготусе5 сегемізіаеє) модифікували способами інженерії для експресії різних злитих білків НВМ, кожний з яких має структуру, схематично представлену на фіг. 3, під контролем індукованого міддю промотору СОР1 або промотору ТЕЕ2. У будь-якому випадку злитий білок являв собою єдиний поліпептид приблизно з 945 амінокислот з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають ЗЕО ІЮ МО:36: (1) М-кінцевий пептид для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабільної експресії (положення 1-5 5ЕБЕО ІЮО МО:36); 2) амінокислотна послідовність розпізнаваного рецепторами гепатоцитів домену частини рге-51 великого (1) поверхневого білка НВМ генотипу С (унікальна для І) (наприклад, положення 21-47 5ЕО ІО
МО:11 або положення 6-32 5ЕО ІЮ МО:36); 3) амінокислотна послідовність повнорозмірного малого (5) поверхневого антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 176-400 5ЕО І
МО:11 або положення 33-257 5ЗЕО ІЮ МО:36); 4) спейсер/лінкер із двох амінокислот (І еи-С1и) для полегшення клонування і маніпулювання послідовностями (положення 258 і 259 5ЕО ІЮ
МО:З6); 5) амінокислотна послідовність частини полімерази НВМ генотипу С, що включає домен зворотної транскриптази (наприклад, положення 247-691 5ЕО ІЮ МО:10 або положення 260-604
ЗЕО ІЮ МО:36); 6) коровий білок НВМ генотипу С (наприклад, положення 31-212 5ЕО ІЮ МО:9 або положення 605-786 ЗЕО ІЮ МО:36); 7) амінокислотна послідовність Х-антигену. НВМ генотипу С (наприклад, положення 2-154 5ЕО ІО МО:12 або положення 787-939 5ЕО ІО МО:36); і 8) гексагістидинова мітка (положення 940-945 5ЕО ІЮ МО:36). Цей злитий білок і відповідна імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, що містить цей білок, можуть бути загалом позначені в даному описі як "МАОЕАР-5рех", "М-5рех" або "5І-13005".
Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок 5ЕБО ІЮО МО:36 (кодон- оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як ЗЕО ІЮ МО:35. 5ЕО ІЮ
МО:36 має очікувану приблизну молекулярну масу 106-107 кДа. 5ЕО ІЮ МО:36 містить множину епітопів або доменів, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка, включаючи декілька епітопів, описаних вище для 5ЕО ІЮ МО:34. Крім того, домен зворотної транскриптази, використовуваний у цьому злитому білку, містить кілька положень амінокислот, які відомі тим, що вони мутують як відповідь, яка полягає в стійкості до лікарського засобу, на лікування противірусними лікарськими засобами, і таким чином, можуть бути мутантними в цьому злитому білку для забезпечення терапевтичного або профілактичного імунотерапевтичного засобу, який націлений на конкретні мутації, що забезпечують стійкість до лікарського засобу (вислизання).
Ці положення амінокислот являють собою, відносно ЗЕО ІЮ МО:36, положення амінокислоти: 432 (МаїЇ, відомий тим, що він мутує у Геи після терапії ламівудином); положення 439 (І еи, 60 відомий тим, що він мутує у Меї після терапії ламівудином); положення 453 (Аа, відомий тим,
що він мутує у ТАг після терапії тенофовиром); положення 463 (Меї, відомий тим, що він мутує у
Пе або Маї після терапії ламівудином); і положення 495 (Азп, відомий тим, що він мутує у ТАг після терапії адефовіром).
Для одержання другого імунотерапевтичного засобу на основі дріжджів з використанням відмінного М-кінцевого пептиду в антигені дріжджі (наприклад, Засспаготусев сегемівзіає) модифікували способами інженерії для експресії різних злитих білків НВМ, що також мають основну структуру, схематично представлену на фіг. З, під контролем індукованого міддю промотору СОР1 або промотору ТЕБ2. У цьому другому випадку препропослідовність альфа- фактора (відповідна 5ЕО ІЮ МО:89) використовували замість синтетичного М-кінцевого пептиду, описаного вище, у злитій конструкції, що відповідає 5БЕО ІЮ МО:36. У короткому викладі, новий злитий білок являв собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає ЕС ІЮ МО:92: (1) М-кінцевий пептид для забезпечення стійкості до розщеплення протеасомами і стабілізації або посилення експресії (ЗЕО І МО:89, положення 1-89 ЗЕО ІО МО:92); 2) спейсер/лінкер із двох амінокислот (ТАг-561г), що полегшує клонування і маніпулювання послідовностями (положення 90-91 5ЕО ІЮ МО:92); 3) амінокислотна послідовність розпізнаваного рецепторами гепатоцитів домену частини рге-51 великого (І) поверхневого білка НВМ генотипу С (унікальна для І) (наприклад, положення 21-47
ЗЕБЕО І МО:11 або положення 92-118 5ЕБО І МО:92); 4) амінокислотна послідовність повнорозмірного малого (5) поверхневого антигену НВМУ генотипу С (наприклад, положення 176- 400 5ЕО ІЮО МО:11 або положення 119-343 5ЕО ІЮ МО:92); 5) спейсер/лінкер із двох амінокислот (Геи-СіІ0), що полегшує клонування і маніпулювання послідовностями (наприклад, положення 344-345 5ЕО ІЮ МО:92); 6) амінокислотна послідовність частини полімерази НВМ генотипу С, що включає домен зворотної транскриптази (наприклад, положення 247-691 5ЕО ІЮ МО:10 або положення 346-690 ЗЕО ІО МО:92); 7) коровий білок НВМ генотипу С (наприклад, положення 31- 212 5ЕО ІО МО:9 або положення 691-872 5ЕО ІЮО МО:92); 8) амінокислотна послідовність Х- антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 2-154 5ЕО ІО МО:12 або положення 873-1025
ЗЕО ІЮ МО:92); і 9) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 1026-1031 5ЕО ІЮ МО:92).
Цей злитий білок і відповідна імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, що містить цей білок, можуть бути загалом позначені в даному описі як "аї(рпа-5рех", "а-Ззрех", або І-13004".
Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок 5ЕБО ІЮО МО:92 (кодон- оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як ЗЕО ІЮ МО:91. 5ЕО ІЮ
МО:92 має очікувану приблизну молекулярну масу 123 кДа. 5ЕО ІЮ МО:92 містить множину епітопів або доменів, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка, включаючи декілька епітопів, описаних вище для ЗЕО ІЮ МО:34 і БЕО ІЮ МО:З36. Крім того, домен зворотної транскриптази, використовуваний у цьому злитому білку, містить декілька положень амінокислот, які відомі тим, що вони мутують як відповідь, яка полягає в стійкості до лікарського засобу, на лікування противірусними лікарськими засобами, і таким чином, можуть бути мутантними в цьому злитому білку для забезпечення терапевтичного або профілактичного імунотерапевтичного засобу, який націлений на конкретні мутації, що забезпечують стійкість до лікарського засобу (вислизання). Ці положення амінокислот являють собою, відносно ЗЕО ІЮ
МО:92, положення амінокислот: 518 (МаіІ, відомий тим, що він мутує у Геи після терапії ламівудином); положення 525 (І еи, відомий тим, що він мутує у Меї після терапії ламівудином); положення 539 (Аа, відомий тим, що він мутує у Тпг після терапії тенофовиром); положення 549 (Меї, відомий тим, що він мутує у Пе або Маї після терапії ламівудином); і положення 581 (Авп, відомий тим, що він мутує у ТПг після терапії адефовіром).
Для створення цих імунотерапевтичних композицій, які містять амінокислотні послідовності, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:36б і 5ЕО ІЮО МО:92, ДНК, що кодує описані вище консервативні області поверхневого антигену (розпізнавана рецептором гепатоцитів область рге-51 або великого поверхневого антигену і повнорозмірного малого поверхневого антигену) і область зворотної транскриптази з полімерази піддавали злиттю з повнорозмірним коровим антигеном і повнорозмірним Х-антигеном. ДНК піддавали оптимізації кодонів для експресії в дріжджах, а потім розщеплювали ЕсокіІ і Мої! і вбудовували після промотору СОР (роІ-100) або промотору
ТЕР2 (ртКк57-1) у 2-мкм векторах експресії дріжджів. Отримані плазміди вводили в дріжджі засспаготусев5 сегемізіае МУЗОЗа шляхом трансфекції з ацетатом літію/поліетиленгліколем, і первинні трансфектанти відбирали на чашках із твердим мінімальним середовищем, позбавленим урацилу (ШОМ; середовище з відсутністю уридину). Колонії повторно наносили штрихами на ШОМ або ШГОМ (середовище з відсутністю уридину і лейцину) і дозволяли рости протягом З діб при 30 "С.
Рідкі культури, позбавлені уридину (02) або позбавлені уридину і лейцину (ШІ2) 60 інокулювали з чашок і стартові культури вирощували протягом 20 год. при 30 "С, 250 об./хв.
Також інокулювали рН-буферне середовище, що містило 4,2 г/л Віб-Ттів (ВТ-0О2; ВТ-ЦІ 2) для оцінки росту дріжджів в умовах нейтральних значень рН (дані не представлені). Первинні культури використовували для інокуляції кінцевих культур з тим же складом і ріст продовжували до досягнення густини від 1,1 до 4,0 Д.О./мл. Для штамів ТЕБ2 (конститутивна експресія), клітини збирали, промивали і забезпечували їхню загибель нагріванням при 56 "С протягом 1 год. у РВ5. Для штамів СОРІ (індуцибельна експресія), експресію індукували в тому ж середовищі 0,5 мМ сульфатом міді протягом 5 год. при 30 "С, 250 об./хв. Клітини збирали, промивали і забезпечували їхню загибель нагріванням при 56 "С протягом 1 год. у РВ5. Живі клітини також обробляли для порівняння (дані не представлені).
Після забезпечення загибелі нагріванням культур ТЕР2 їі СОР'ІІ, клітини промивали три рази в РВ5. Загальну експресію білка вимірювали за допомогою преципітації з ТСА/аналізу зв'язування з нітроцелюлозою і експресію антигену вимірювали вестерн-блотингом з використанням моноклонального антитіла проти Ппі5-мітки. Антиген кількісно визначали шляхом інтерполяції зі стандартної кривої для рекомбінантного, міченого гексагістидином білка М53, який обробляли на тому ж вестерн-блоті.
Для імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів, яка експресує злитий білок, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:36 (01І-13005), результати представлені на фіг. 18. На фіг. 18 показано, що імунотерапевтична композиція на основі дріжджів за винаходом добре експресує злитий білок поверхневий антиген-коровий антиген НВМ з використанням обох промоторів, і його можна ідентифікувати з використання вестерн-блотингу убитих нагріванням клітин (експресії також досягали в живих клітинах дріжджів, дані не представлені). Обчислена експресія антигену цією імунотерапевтичною композицією на основі дріжджів складала «1200 нг білка на Д.О. або 11 пмоль білка на Д.О., для росту в ПІ 2.
Для імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів, яка експресує злитий білок, що відповідає 560 ІЮ МО:92 (01-13004), результати представлені на фіг. 19. На фіг. 19 показана експресія цієї імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів під контролем промотору СОР1 (позначена на фіг. 19 як аїрпа-5РЕХ) у порівнянні з імунотерапевтичною композицією на основі дріжджів, що експресує неспоріднений антиген (контрольні дріжджі) і з імунотерапевтичною композицією на основі дріжджів, яка експресує злитий білок НВУ, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:36 (ЗРЕХ). На фіг. 19 показано, що імунотерапевтичні композиції на основі дріжджів добре експресують відповідні злиті білки, і також можуть бути ідентифіковані вестерн-блотингом в убитих нагріванням клітинах дріжджів. Обчислена експресія антигену цієї імунотерапевтичною композицією на основі дріжджів (аїрпа-5рех) склала 5000 нг білка на Д.О. або 41 пмоль білка на Д.О. для ростув ШІ 2.
Приклад З
У представленому нижче прикладі описане одержання додаткової імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів для лікування або профілактики інфекції вірусом гепатиту В (НВУ).
У цьому експерименті дріжджі (наприклад, зЗасспаготусе5 сегемізіаеє) модифікують способами інженерії для експресії різних злитих білків полімераза-коровий антиген НВМ, як схематично представлено на фіг. 4, під контролем індукованого міддю промотору СОРІ1 або промотору ТЕРЕ2. У будь-якому випадку злитий білок являє собою єдиний поліпептид приблизно 3 527 амінокислот з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають ЗЕО ІЮ МО:38: (1) М-кінцевий пептид для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабільної експресії (ЗЕО ІЮ МО:37; положення 1-6 БЕО ІЮ МО':38); 2) амінокислотна послідовність частини полімерази НВМ генотипу С, що включає домен зворотної транскриптази домен (наприклад, положення 347-691 ЗЕО ІЮ МО:10 або положення 7-351 5ЕО
ІО МО:38); 3) коровий білок НВМ генотипу С (наприклад, положення 31-212 5ЕО ІЮ МО:9 або положення 352-533 5ЕО ІО МО:38); і 4) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 534-539 5ЕО ІЮ МО:38). 5ЕБЕО ІО МО:38 має передбачену молекулярну масу приблизно 58 кДа.
Послідовність також містить епітопи або домени, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка. У додаткових конструкціях М-кінцевий пептид ЗЕО ІЮ МО:37 замінений відмінним синтетичним М-кінцевим пептидом, відповідним гомологу БЕО ІЮ МО:37, що задовольняє ті ж основні структурні вимоги, що і для 5ЕО ІЮ МО:37, як докладно описано в описі, або М-кінцевий пептид ЗЕО ІЮО МО:37 замінений М-кінцевим пептидом 5ЕО ІЮ МО:89 або 5ЕО ІО МО:90, і в іншій конструкції М-кінцевий пептид відсутній і метіонін включений у перше положення.
В іншому експерименті дріжджі (наприклад, 5Засспаготусе5 сегемізіає) модифікують способами інженерії для експресії різних злитих білків Х-коровий антиген НВУ, як схематично представлено на фіг. 5, під контролем індукованого міддю промотору СОР1 або промотору 60 ТЕЕ2. У будь-якому випадку злитий білок являє собою єдиний поліпептид приблизно з 337 амінокислот з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С- кінця, що відповідає 5ЕО ІЮО МО:39 (1) М-кінцевий пептид для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабільної експресії (ЗЕО ІЮ МО:37; положення 1-6 БЕО ІЮ МО:39); 2) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного (мінус положення 1) Х-антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 2-154 ЗЕО ІЮ МО:12 або положення 7-159 5ЕО ІЮО МО':39); 3) коровий білок НВМ генотипу С (наприклад, положення 31-212 5ЕО ІОЮО МО:9 або положення 160- 341 5ЕО ІЮ МО:39); і 4) гексагістидинова мітка (положення 342-347 5ЕО ІЮ МО:39). 5ЕО І
МО:39 має передбачену приблизну молекулярну масу 37 кДа. Послідовність також містить епітопи або домени, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка. У додаткових конструкціях М-кінцевий пептид 5ЕО І МО:37 замінений відмінним синтетичним М-кінцевим пептидом, відповідним гомологу 5ЕО ІЮ МО:37, що задовольняє ті ж основні структурні вимоги, що і для 5ЕО ІОЮО МО:37, як докладно описано в описі, або М-кінцевий пептид ЗЕО ІЮ МО:37 замінений М-кінцевим пептидом ЗЕО ІЮО МО:89 або ЗЕО ІО МО:90, і в іншій конструкції М- кінцевий пептид відсутній і метіонін включений у перше положення.
В іншому експерименті дріжджі (наприклад, Засспаготусев5 сегемізіає) модифікують способами інженерії для експресії різних білків полімерази НВУ, як схематично представлено на фіг. 6 під контролем індукованого міддю промотору СОР1 або промотору ТЕБЕ2. У будь-якому випадку злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають ЗЕО ІЮ МО:40 (1) М-кінцевий пептид для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабільної експресії (ЗЕО ІЮ
МО:37, або положення 1-6 5ЕО ІЮ МО:40; 2) амінокислотна послідовність частини полімерази
НВМ генотипу С, включаючи домен зворотної транскриптази (наприклад, положення 347-691
ЗЕО ІЮ МО:10 або положення 7-351 ЗЕО ІЮ МО:40); і 3) гексагістидинова мітка (положення 352- 357 ЗЕО ІЮ МО:40). Послідовність також містить епітопи або домени, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка. Крім того, в одному з варіантів здійснення послідовність цієї конструкцій можна модифікувати для внесення однієї або декількох з наступних мутацій, що забезпечують стійкість до противірусних засобів: гі204І, п18ОМ, п2го4М,
П173Г, п236Т, п194Т (положення приведені відносно повнорозмірної амінокислотної послідовності для полімерази НВМ). В одному з варіантів здійснення створюють шість різних імунотерапевтичних композицій, кожна з яких містить одну з цих мутацій. В інших варіантах здійснення всі або деякі з мутацій включені в єдиний злитий білок. У додаткових конструкціях М- кінцевий пептид 5ЕО ІЮ МО:37 замінений відмінним синтетичним М-кінцевим пептидом, відповідним гомологу 5ЕО ІЮ МО:37, що задовольняє ті ж основні структурні вимоги, що і для
ЗЕО ІЮ МО:37, як докладно описано в описі, або М-кінцевий пептид 5ЕО ІЮ МО:37 замінений М- кінцевим пептидом 5ЕО ІЮ МО:89 або 5ЗЕО ІЮ МО:90, і в іншій конструкції М-кінцевий пептид відсутній і метіонін включений у перше положення.
В іншому експерименті дріжджі (наприклад, 5Засспаготусе5 сегемізіає) модифікують способами інженерії для експресії різних злитих білків полімераза-поверхневий антиген-коровий антиген НВУ, як схематично показано на фіг. 7, під контролем індукованого міддю промотору
СОР'І або промотору ТЕЕ2. У будь-якому випадку злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають ЗЕО ІЮ МО:41: (1) М-кінцевий пептид для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабільної експресії (наприклад, положення 1-5 5ЕО б МО41); г) амінокислотна послідовність розпізнаваного рецепторами гепатоцитів домену частини рге-51 великого (І) поверхневого білка НВМ (унікальна для І) (наприклад, положення 21-47 5ЕО ІО
МО:11 або положення 6-32 ЗЕО ІЮ МО:41); 3) амінокислотна послідовність малого (5) поверхневого білка НВМ (наприклад, положення 176-400 5ЕО ІЮ МО:11 або положення 33-257
ЗЕО ІО МО 41); 4) спейсер/лінкер із двох амінокислот, що полегшує клонування і маніпулювання послідовностями (наприклад, положення 258 і 259 5БО ІЮ МО41); 5) амінокислотна послідовність полімерази НВМ, що містить домен зворотної транскриптази домен (наприклад, положення 247-691 5ЕО ІЮО МО:10 або положення 260-604 5ЕО ІЮО МО:41); 6) амінокислотна послідовність корового білка НВМ (наприклад, положення 31-212 5ЕО ІЮО МО:9 або положення 605-786 5ЕО ІЮО МО:41); і 7) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 787-792 5ЕО І
МО:41). Послідовність також містить епітопи або домени, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка. Крім того, в одному з варіантів здійснення послідовність цієї конструкції можна модифікувати для внесення однієї або декількох або усіх з наступних мутацій, що забезпечують стійкість до противірусних засобів: гпі204І, П18ОМ, п204М, (1731, п236тТ, "94Т (положення приведені відносно повнорозмірної амінокислотної послідовності для полімерази
НВМ). В одному з варіантів здійснення створюють шість різних композицій для імунотерапії, 60 кожна з яких містить одну з цих мутацій. В інших варіантах здійснення всі або деякі з мутацій включені в єдиний злитий білок. В одному з варіантів здійснення ця конструкція також містить одну або декілька мутацій, що забезпечують стійкість до противірусних засобів, у поверхневому антигені. У додаткових конструкціях М-кінцевий пептид, що відповідає положенням 1-5 5ЕО ІЮ
МО:41, замінений відмінним синтетичним М-кінцевим пептидом, відповідним гомологу положень 1-5 5ЕО ІЮ МО:41, що задовольняє ті ж основні структурні вимоги, що і для положень 1-5 5ЕО
ІО МО:41 (або 5ЕО ІО МО:37) як докладно описано в описі, або М-кінцевий пептид положень 1-5
ЗЕО ІЮ МО:41 замінений М-кінневим пептидом 5ЕО ІЮ МО:89 або 5ЕО ІЮ МО:90, ї в іншій конструкції М-кінцевий пептид відсутній і в перше положення включений метіонін.
Для одержання описаних вище злитих білків і імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, які експресують такі білки, у короткому викладі, ДНК, що кодує злитий білок, піддають оптимізації кодонів для експресії в дріжджах, а потім розщеплюють ЕсокКі і Мої! і вбудовують після промотору СОРІ (роІ-100) або промотору ТЕР2 (ртК57-1) у 2-мкм векторах експресії дріжджів. Отримані плазміди вводять у дріжджі Засспаготусе5 сегемізіае М/ЗОЗа шляхом трансфекції з ацетатом літію/поліетиленгліколем, і первинні трансфектанти відбирають на чашках із твердим мінімальним середовищем, позбавленим урацилу (ШОМ; середовище з відсутністю уридину). Колонії повторно наносять штрихами на ШОМ або ОГОМ (середовище з відсутністю уридину і лейцину) і дозволяють їм рости протягом З діб при 30 "С.
Рідкі культури, позбавлені уридину (02) або позбавлені уридину і лейцину (012), інокулюють з чашок і стартові культури вирощують протягом 20 год. при 30 "С, 250 об./хв. Також інокулюють рН-буферне середовище, що містить 4,2 г/л Віб-Тгів (ВТ-О2; ВТ-ЦІ 2) для оцінки росту дріжджів в умовах нейтральних значень рН. Первинні культури використовують для інокуляції кінцевих культур з тим же складом і ріст продовжують до досягнення густини від 1,1 до 4,0 Д.О./мл. Для штамів ТЕБ2 (конститутивна експресія), клітини збирали, промивали і забезпечували їхню загибель нагріванням при 56 С протягом 1 год. у РВ5. Для штамів СОР1 (індуцибельна експресія), експресію індукували в тому ж середовищі 0,5 мМ сульфатом міді протягом 5 год. при 30 "С, 250 об./хв. Клітини збирають, промивають і забезпечують їхню загибель нагріванням при 56 "С протягом 1 год. у РВ5. Живі клітини також обробляли для порівняння.
Після забезпечення загибелі нагріванням культур ТЕБ2 і СОРІ1, клітини промивають три рази в РВ5. Загальну експресію білка вимірюють за допомогою преципітації з ТСА/аналізу зв'язування з нітроцелюлозою і експресію білка вимірюють вестерн-блотингом з використанням моноклонального антитіла проти Піб-мітки. Злитий білок кількісно визначають шляхом інтерполяції зі стандартної кривої для рекомбінантного, міченого гексагістидином білка М53, який обробляли на тому же вестерн-блоті.
Приклад 4
У представленому нижче прикладі описане одержання додаткових імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів для лікування або профілактики інфекції вірусом гепатиту В (НВУ).
У цьому прикладі описане одержання чотирьох різних імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, кожна з яких призначена для експресії одного білка НВУ. Ці "імунотерапевтичні засоби на основі дріжджів з одним білком НВМ" можна використовувати в комбінації або послідовно один з одним і/або в комбінації або послідовно з іншими імунотерапевтичними засобами на основі дріжджів, такими як засоби, описані в будь-якому із прикладів 1-3 і 5-8, включаючи імунотерапевтичні засоби на основі дріжджів з множиною білків НВМ, описані в даному описі. Крім того, "імунотерапевтичні засоби на основі дріжджів з одним білком НВУ", такі як засоби, описані в цьому прикладі, можна одержувати з використанням послідовності НВМ для будь-якого даного генотипу або підгенотипу, і додаткові імунотерапевтичні засоби на основі дріжджів з поверхневим антигеном НВМ можна одержувати з використанням послідовностей
НВМ для будь-якого одного або декількох додаткових генотипів або підгенотипів для забезпечення "набору приправ" з різних антигенів і генотипів і/або підгенотипів НВМ, кожний з яких надають у контексті імунотерапевтичного засобу на основі дріжджів за винаходом, або в стратегії імунізації/уведення, що може включати щонайменше один імунотерапевтичний засіб на основі дріжджів за винаходом.
У цьому прикладі одержують наступні чотири імунотерапевтичні продукти на основі дріжджів:
Поверхневий антиген НВУ. Засспаготусезх сегемізіае модифікують способами інженерії для експресії поверхневого більюа НВМ під контролем індукованого міддю промотору СОР1 або промотору ТЕБ2. У будь-якому випадку злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:93:1) М-кінцевий пептид 5ЕО ІЮ МО:89 (положення 1-89 5ЕО І МО:93); 2) 60 амінокислотна послідовність практично повнорозмірного (мінус положення 1) великого (І)
поверхневого антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 2-400 5ЕБО ІО МО:11 або положення 900-488 5ЕО ІО МО:93); і 3) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 489-494
ЗЕО ІЮ МО:93). Альтернативно М-кінцевий пептид може бути замінений 5ЕО ІЮ МО:37 або її гомологом або іншим М-кінцевим пептидом, описаним у даному описі.
Антиген полімерази НВУ. Засспаготусев5 сегемізіае модифікують способами інженерії для експресії наступного білка полімерази НВМ під контролем індукованого міддю промотору СОРІ1 або промотору ТЕЕ2. У будь-якому випадку злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:94:1) М-кінцевий пептид 5ЕО ІЮ МО:89 (положення 1-89 5ЕО ІЮ МО:94); 2) амінокислотна послідовність частини полімерази НВМ генотипу С, що включає домен зворотної транскриптази (наприклад, положення 347-691 5ЕО ІЮ МО:10 або положення 90-434 5ЕО І
МО:94); і 3) гексагіслидинова мітка (наприклад, положення 435-440 5ЕО І МО:94).
Альтернативно М-кінцевий пептид можна замінювати 5ЕО ІЮ МО:37 або її гомологом або іншим
М-кінцевим пептидом, описаним у даному описі.
Коровий антиген НВУ. Засспаготусеб5 сегемізіае модифікують способами інженерії для експресії наступного корового білка НВМ під контролем індукованого міддю промотору СОР1 або промотору ТЕЕ2. У будь-якому випадку злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:95:1) М-кінцевий пептид 5ЕО ІЮ МО:89 (положення 1-89 5ЕО І МО:95); 2) амінокислотна послідовність частини корового білка НВУ генотипу С (наприклад, положення 31- 212 ЗЕО ІО МО:9 або положення 90-271 5ЕО ІЮО МО:95); і 3) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 272-277 5ЕО ІЮ МО:95). Альтернативно М-кінцевий пептид можна замінювати 5ЕО
ІО МО:37 або її гомологом або іншим М-кінцевим пептидом, описаним у даному описі.
Х-антиген НВУ. Засспаготусев сегемізіае модифікують способами інженерії для експресії наступного Х-антигену НВМ під контролем індукованого міддю промотору СОР1 або промотору
ТЕБЕ2. У будь-якому випадку злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає ЗЕО ІЮ
МО:96:1) М-кінцевий пептид ЗЕО ІЮ МО:89 (положення 1-89 5ЕО ІЮ МО:96); 2) амінокислотна послідовність частини Х-антигену НВМ генотипу С (наприклад, положення 2-154 5ЕО ІЮ МО 12 або положення 90-242 5ЕО ІЮ МО:96); і 3) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 243- 248 5ЕО ІЮ МО:96). Альтернативно М-кінцевий пептид можна замінювати 5ЕО ІЮ МО:37 або її гомологом або іншим М-кінцевим пептидом, описаним у даному описі.
Для одержання описаних вище імунотерапевтичних композицій, у короткому викладі, ДНК, що кодує злитий білок, піддають оптимізації кодонів для експресії в дріжджах, а потім розщеплюють ЕсоКІ і Мої! і вбудовують після промотору СОР (роІ-100) або промотору ТЕЕ2 (рТКк57-1) у 2-мкм векторах експресії дріжджів. Отримані плазміди вводять у дріжджі засспаготусев5 сегемізіае МУЗОЗа шляхом трансфекції з ацетатом літію/поліетиленгліколем, і первинні трансфектанти відбирають на чашках із твердим мінімальним середовищем, позбавленим урацилу (ШЮОМ; середовище з відсутністю уридину). Колонії повторно наносять штрихами на ШОМ або ОГОМ (середовище з відсутністю уридину і лейцину) і дозволяють їм рости протягом З діб при 30 "С.
Рідкі культури, позбавлені уридину (02) або позбавлені уридину і лейцину (012), інокулюють з чашок і стартові культури вирощують протягом 20 год. при 30 "С, 250 об./хв. Також інокулюють рН-буферне середовище, що містить 4,2 г/л Віб5-Тгів (ВТ-О2; ВТ-ЦІ 2) для оцінки росту дріжджів в умовах нейтральних значень рН. Первинні культури використовують для інокуляції кінцевих культур з тим же складом і ріст продовжують до досягнення густини від 1,1 до 4,0 Д.О./мл. Для штамів ТЕБ2 (конститутивна експресія), клітини збирають, промивають і забезпечують їхню загибель нагріванням при 56 С протягом 1 год. у РВ5. Для штамів СОР1 (індуцибельна експресія), експресію індукують у тому ж середовищі 0,5 мМ сульфатом міді протягом 5 год. при 50.30 "С, 250 об./хв. Клітини збирають, промивають і забезпечують їхню загибель нагріванням при 56 "С протягом 1 год. у РВ5. Живі клітини також обробляють для порівняння.
Після забезпечення загибелі нагріванням культур ТЕБ2 і СОР, клітини промивають три рази в РВ5. Загальну експресію білка вимірюють за допомогою преципітації з ТСА/аналізу зв'язування з нітроцелюлозою і експресію білка вимірюють вестерн-блотингом з використанням моноклонального антитіла проти Піз-мітки. Злитий білок кількісно визначають шляхом інтерполяції зі стандартної кривої для рекомбінантного, міченого гексагістидином білка М53, який обробляли на тому ж вестерн-блоті.
Приклад 5
У представленому нижче прикладі описане одержання декількох різних імунотерапевтичних 60 композицій на основі дріжджів для лікування або профілактики інфекції вірусом гепатиту В
(НВУ).
У цьому прикладі описане одержання імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, які експресують білки, що сконструйовані для досягнення однієї або декількох з наступних цілей: (1) одержання конструкції НВМ з декількома антигенами, що містить менше ніж приблизно 690 амінокислот (які відповідають менше ніж двом третинам генома НВМ), для одержання імунотерапевтичного клінічного продукту на основі дріжджів, що відповідає рекомендаціям
Кесотрбріпапі ОМА Адмізогу Соттее (КАС), якщо це необхідно; (2) одержання конструкції НВМ з множиною антигенів, що містить максимальну кількість відомих Т-клітинних епітопів, зв'язаних з імунними відповідями на гострі/самообмежувальні інфекції НВМ і/або хронічні інфекції НВМ; (3) одержання конструкції НВМ з множиною антигенів, що містить Т-клітинні епітопи, що є найбільш консервативними серед генотипів; і/або (4) одержання конструкції НВМ з множиною антигенів, модифікованої так, щоб вона в більшому ступені відповідала одній або декільком консенсусним послідовностям, консенсусним епітопам і/або епітопу з конкретних генотипів. Модифікації, продемонстровані в цьому прикладі, можна використовувати окремо або разом з будь-якими іншими імунотерапевтичними засобами на основі дріжджів, описаними або розглянутими в даному описі.
В одному експерименті конструювали імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, яка містить дріжджі, які експресують злитий білок, що задовольняє вимоги для описаних вище цілей, і містять частини кожного з основних білків НВУ: поверхневий антиген НВУ, полімераза, коровий антиген і Х-антиген. Для конструювання цього злитого білка окремі антигени НВМ у злитій конструкції були зменшеними в розмірі (у порівнянні з повнорозмірними), і злиті сегменти окремо модифікували для максимізації включення відомих Т-клітинних епітопів, що відповідають епітопам, ідентифікованим у таблиці 5. Включення Т-клітинних епітопів у цей злитий білок мало наступний пріоритет:
Епітопи, ідентифіковані при імунних відповідях як на гострі/самообмежувальні інфекції НВУ, так і на хронічні інфекції НВМ о» епітопи, ідентифіковані при імунній відповіді на гострі/самообмежувальні інфекції НВМ » епітопи, ідентифіковані при імунній відповіді на хронічні інфекції НВМ.
При конструюванні кожного сегмента цього злитого білка також мінімізували штучні області сполуки, оскільки, без зв'язку з теорією вважають, що природна еволюція привела до: і) безперервних послідовностей у вірусі, які добре експресуються; і ії) імунопротеасом в антигенпредставляючих клітинах, що можуть належним чином розщеплювати і представляти ці послідовності імунній системі. Таким чином, злитий білок з багатьма неприродними областями сполуки може бути менш корисний у імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів у порівнянні зі злитим білком, у якому більше збережені природні послідовності білків НВМ.
Для конструювання сегмента, що містить поверхневий антиген НВУ, для застосування в злитому білку, повнорозмірний великий (І) поверхневий антиген білок з НВМ генотипу С зменшували в розмірі шляхом укорочення М- і С-кінцевих послідовностей (положення 1-119 і положення 369-400 великого антигену видаляли, у порівнянні з повнорозмірним поверхневим антигенним білком Г, таким як поверхневий антиген білок, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:11). Іншу частину вибирали, частково, для максимізації включення відомих Т-клітинних епітопів МНС класу І, що відповідають епітопам, ідентифікованим у таблиці 5, з використанням пріоритету для включення Т-клітинних епітопів, описаних вище. Отриманий сегмент поверхневого антигену відповідає ЗЕО ІЮ МО:97.
Для конструювання сегмента, що містить полімеразу НВМУ, для застосування в злитому білку, істотні частини повнорозмірної полімерази з НВМ генотипу С, що являє собою дуже великий білок розміром приблизно 842 амінокислот, усували шляхом зосередження на включенні домену активного центра (з КТ-домену), що являє собою найбільш консервативну область білка серед генотипів і ізолятів НВМУ. КТ-домен також включає кілька областей, у яких, як відомо, виникають мутації, що забезпечують стійкість до лікарських засобів; таким чином, цю частину конструкції можна далі модифікувати в інших версіях, при необхідності, для націлювання на забезпечуючі вислизання мутації в цільовій терапії. У злитих білках, що включають менше білків НВУ, розмір сегмента полімерази може бути збільшений, якщо бажано.
Вибрану частину полімерази НВМ включали для максимізації відомих Т-клітинних епітопів, з використанням стратегії пріоритету, описаної вище. Послідовність повнорозмірної полімерази, що усували таким шляхом, включала послідовність поза КТ-доменом і послідовністю в КТ- домені, що не містили відомих Т-клітинних епітопів, або які включали два епітопи, ідентифіковані у менше ніж 17 95 або 5 95, відповідно, пацієнтів з генотипу А, у яких були ідентифіковані ці епітопи (див. Оехзтопа еї аї., 2008 і таблицю 5). Усі, крім одного з інших Т- 60 клітинних епітопів у сегменті полімерази НВМ генотипу С абсолютно відповідали опублікованим епітопам з аналізу генотипу А, і один епітоп з невідповідністю однієї амінокислоти був модифікований, щоб він відповідав опублікованому епітопу. Отриманий сегмент полімерази
НВМУ відповідає 5ЕО ІЮ МО:98.
Для конструювання сегмента, що містить коровий антиген НВУ, для застосування в злитому білку, повнорозмірний коровий білок (наприклад, схожий з положеннями 31-212 ЗЕО ІЮ МО:9) з
НВМ генотипу С модифікували в такий спосіб: ї) одну амінокислоту в Т-клітинному епітопі білка, який походить з генотипу С, модифікували для забезпечення абсолютної відповідності відомому
Т-клітинному епітопу, описаному в таблиці 5; ії) сім амінокислот на М-кінці, що не містили Т- клітинний епітоп, видаляли, зберігаючи декілька фланкуючих амінокислот на М-кінці першого відомого Т-клітинного епітопа в білку; і ії) 24 С-кінцеві амінокислоти корового антигену видаляли, що не приводило до видалення відомих епітопів, але видаляло винятково позитивно заряджений С-кінець. Позитивно заряджений С-кінець є придатним кандидатом для видалення з антигену, який представлений в дріжджах, оскільки в деяких конструкціях такі послідовності можуть бути токсичними для дріжджів унаслідок конкурентного перешкоджання природним зв'язувальним РНК білкам дріжджів, які часто збагачені аргініном (позитивно заряджені). Таким чином, видалення цієї частини корового антигену є прийнятним. Отриманий сегмент корового антигену НВМ представлений у ЗЕО І МО:99.
Для конструювання сегмента, що містить Х-антиген НВУ, для застосування в злитому білку, повнорозмірний Х-антиген з НВМ генотипу С (наприклад, схожий з 5ЕО ІЮ МО:12) укорочували на М- і С-кінці з одержанням сегмента Х-антигену, що включає більшість з відомих Т-клітинних епітопів з таблиці 5, що кластеризуються в Х-антигені. Два епітопи модифікували однією амінокислотною заміною, щоб вони відповідали опублікованим послідовностям Т-клітинних епітопів, і послідовність, що фланкує Т-клітинні епітопи на кінцях сегмента, залишали для полегшення ефективного процесингу і презентації правильних епітопів антигенпредставляючими клітинами. Отриманий сегмент Х-антигену НВМ відповідає ЗЕО ІЮ
МО:100.
Для конструювання повного злитого білка, що містить усі чотири сегменти білка НВМУ, зв'язували чотири сегменти НВУ, описані вище (поверхневий антиген-роІ-коровий антиген-хХ) з одержанням єдиного білка, що оптимізує включення Т-клітинних епітопів, які охоплюють усі білки, кодовані геномом НВУ, і які, як очікується, задовольняють критерії для вірусних білків для передбачуваного клінічного застосування.
В остаточному підсумку створювали два різні злиті білки, кожний з відмінним М-кінцевим пептидом, доданим для посилення і/або стабілізації злитого білка в дріжджах. Крім того, на С- кінці включали гексагістидиновий пептид для полегшення ідентифікації білка. Як і для всіх інших білків, використовуваних у імунотерапевтичних композиціях на основі дріжджів, описаних у даному описі, у додаткових конструкціях М-кінцевий пептид ЗЕО ІЮ МО:37 або 5ЕО І МО:89, використовуваний у цьому прикладі, може бути замінений відмінним синтетичним М-кінцевим пептидом, (наприклад, гомолог БЕО ІЮО МО:37, що задовольняє основні структурні вимоги для
ЗЕО ІЮ МО:37, як докладно описано в описі), або гомологом М-кінцевого пептиду ЗЕО ІЮ МО:89 або 5ЕО ІЮО МО:90, і в іншій конструкції, М-кінцевий пептид відсутній і метіонін включений у перше положення. Крім того, якщо бажано, між сегментами злитого білка можуть бути додані лінкерні послідовності з однієї, двох, трьох або більше амінокислот. Також, хоча ці конструкції конструювали з використанням білків НВМ з генотипу С як кістяк, для конструювання цих білкових сегментів можна використовувати будь-як інший генотип, підгенотип НВМ або білки
НВМ з інших штамів або ізолятів, як проілюстровано в прикладі 7. Нарешті, якщо один або декілька виключені зі злитого білка, як описано в даному описі, тоді послідовність з інших сегментів можна розширювати для включення додаткових Т-клітинних епітопів і фланкуючих областей білків (наприклад, див. приклад 8).
Для одержання імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, що містять злитий білок, сконструйований із сегментів НВМ, описаних вище, дріжджі (наприклад, Засспаготусев5 сегемізідаех модифікують способами інженерії для експресії різних злитих білків поверхневий антиген-полімераза-коровий антиген-Х НВУ, оптимізованих, як розглянуто вище, під контролем індукованого міддю промотору СОР або промотору ТЕР2.
В одній конструкції злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:101: (1) М-кінцевий пептид, що являє собою препропослідовність альфа-фактора, для надання стійкості до деградації протеосомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО І МО:89 (положення 1-89 БЕО ІЮО МО:101); (2) оптимізована частина великого (І) поверхневого антигену
НВУ, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:97 (положення 90-338 ЗЕО ІЮ МО:101); (3) оптимізована частина 60 домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВУ, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:98 (положення
339-566 5ЕО ІО МО':101); (4) оптимізована частина корового білка НВУ, що відповідає 5ЕО ІЮ
МО:99 (положення 567-718 5ЕБЕО ІО МО:101); (5) оптимізована частина Х-антигену НВУ, відповідна 5ЕО ІЮ МО:100 (положення 719-778 5ЕБЕО ІЮ МО:101); і (6) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 779-784 5ЕО ІЮ МО:101).
В другій конструкції злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:102: (1) М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО
ІО МО:37 (положення 1-6 БЕО ІЮ МО:102); (2) оптимізована частина великого (І) поверхневого антигену НВМ, що відповідає положенням 2-248 5ЕБЕО ІЮ МО:97 (положення 7-254 5ЕО І
МО:102); (3) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВУ, що відповідає 5ЕО І МО:98 (положення 255-482 5ЕО ІЮ МО:102); (4) оптимізована частина корового білка НВМ, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:99 (положення 483-634 5ЕО І МО: 102); (5) оптимізована частина Х-антигену НВУ, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:100 (положення 635-694 5ЕО
ІО МО:102); і (6) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 695-700 5ЕО ІЮ МО:102).
Імунотерапевтичні композиції на основі дріжджів, які експресують ці злиті білки, продукують з використанням протоколу, докладно описаного в прикладі 1-4.
Приклад 6
У представленому нижче прикладі описане одержання додаткових імунотерапевтичних композицій проти НВМ на основі дріжджів, що максимізують націлювання на генотипи і/або підгенотипи НВМ разом із включенням консервативного антигену і/або епітопа в єдиній композиції для забезпечення єдиних композицій з потенціалом до лікування великої кількості індивідуумів або груп індивідуумів.
Для одержання конструкції що містить множину різних генотипів в одній і тій же імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів, дріжджі (наприклад, 5Засспаготусе5 сегемізідаех модифікують способами інженерії для експресії злитого білка НВМ під контролем придатного промотору, такого як індукований міддю промотор СОРІ1 або промотор ТЕРБ2. Білок являє собою єдиний поліпептид, що містить чотири корові антигени, кожний з відмінного генотипу (генотипи А, В, С і О НВМУ), що відповідає 5ЕО ІЮ МО:105: 1) М-кінцевий метіонін у положенні 1 5ЕО ІЮ МО:105; 2) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного корового білка з НВМ генотипу А (наприклад, положення 31-212 ЗЕО ІО МО:1 або положення 2- 183 БЕО ІЮ МО':105); 3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного корового білка з НВМ генотипу В (наприклад, положення 30-212 5ЕО ІОЮ МО:5 або положення 184-395 5ЕО ІЮ
МО:105); 4) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного корового білка з НВМ генотипу С (наприклад, положення 30-212 5ЕО ІЮ МО:9 або положення 396-578 5ЕО І
МО:105); 5) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного корового білка з НВМ генотипу Ю (наприклад, положення 30-212 5ЗЕО ІЮО МО:13 або положення 579-761 5ЕО І
МО:105); і 5) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 762-767 5ЕО ІЮО МО105).
Послідовність також містить епітопи або домени, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка. М-кінцевий метіонін у положенні 1 може бути замінений ЗЕО ІЮ МО:37 або її гомологом, або альфа-препропослідовністю 5ЕО ІЮ МО:89 або 5ЕО ІЮ МО:90, або їх гомологом, або будь-якою іншою придатною М-кінцевою послідовністю, якщо бажано. Крім того, можна вбудовувати лінкерні послідовності між білками НВМ для полегшення клонування і маніпулювання конструкцією, якщо бажано. Ця конструкція є ілюстративною, оскільки будь-яку іншу комбінацію генотипів і/або підгенотипів НВМ можна вносити в цю конструкцію при бажанні для конструювання імунотерапевтичного продукту з єдиним антигеном НВМ із широкою клінічною застосовністю й ефективною конструкцією для одержання. Амінокислотна послідовність 5Е0 ІЮ МО:105 також містить декілька відомих Т-клітинних епітопів, і визначені епітопи модифіковані, щоб вони відповідали опублікованій послідовності для даного епітопа, що може бути ідентифікована шляхом порівняння послідовності з епітопами, представленими, наприклад, у таблиці 5.
Для одержання конструкції, що містить більше одного антигену НВМ і більше одного генотипу в одній і тій же імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів, дріжджі (наприклад,
Засспаготусез сегемізіає) модифікують способами інженерії для експресії злитого білка НВМ під контролем придатного промотору, такого як індукований міддю промотор СОР1 або промотор
ТЕРЕ2. Білок являє собою єдиний поліпептид, що містить два корові антигени і два Х-антигени, причому кожний з пари походить з відмінного генотипу (генотипи А і С НВУМ), що відповідає ЗЕО
ІО МО:106: 1) М-кінцевий метіонін у положенні 1 ЗЕО ІЮ МО:106; 2) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного корового білка з НВМ генотипу А (наприклад, положення 31-212 60 ЗБО ІЮ МО:1 або положення 2-183 5ЕО І МО:106); 3) амінокислотна послідовність повнорозмірного Х-антигену з НВМ генотипу А (наприклад, положення ЗЕО ІЮ МО:4 або положення 184-337 5ЕО ІО МО:106); 4) амінокислотна послідовність практично повнорозмірного корового білка з НВМ генотипу С (наприклад, положення 30-212 5ЕО ІО МО:9 або положення 338-520 5ЕО ІЮ МО:106); 5) амінокислотна послідовність повнорозмірного Х-антигену з НВМ генотипу С (наприклад, 5ЕО ІЮ МО:8 або положення 521-674 5БО ІЮ МО:106); і 5) гексагістидинова мітка (наприклад, положення 675-680 5ЕО ІЮ МО:106). Послідовність також містить епітопи або домени, що ймовірно будуть підсилювати імуногенність злитого білка. М- кінцевий метіонін у положенні 1 можна замінювати ЗЕО ІЮ МО:37 або її гомологом, або альфа- препропослідовністю ЗЕСО ІЮ МО:89 або 5БО ІЮ МО:90, або її гомологом. Амінокислотна послідовність 5Е0О ІЮ МО:106 також містить декілька відомих Т-клітинних епітопів, і визначені епітопи модифіковані, щоб відповідати опублікованій послідовності для даного епітопа, яку можна ідентифікувати шляхом порівняння послідовності, наприклад, з епітопами, представленими в таблиці 5.
Імунотерапевтичні композиції на основі дріжджів, які експресують ці злиті білки, одержують з використанням протоколу, докладно описаного в прикладах 1-4.
Приклад 7
У представленому нижче прикладі описане одержання додаткових імунотерапевтичних композицій проти НВМ на основі дріжджів, у яких використовуються консенсусні послідовності для генотипів НВМ, додатково максимізуючи націлювання на генотипи і/або підгенотипи НВМ разом із включенням консервативного антигену і/або епітопа для надання композицій з потенціалом до лікування великої кількості індивідуумів або груп індивідуумів з використанням однієї композиції.
Для конструювання декількох конструкцій, що включають сегменти НВМ з кожного з поверхневого білка, корового антигену, полімерази і Х-антигену, як матрицю використовували структуру злитого білка, описану в прикладі 5 для 5ЕО ІЮ МО:101 ї БЕО ІО МО:102 (і в такий спосіб підчастини цих злитих білків, що відповідають 5ЕО ІЮ МО:97 (поверхневий антиген), ЗЕО
ІО МО:98 (полімераза), 5БЕО ІЮ МО:99 (коровий антиген), і 5ЕО ІЮ МО:100 (Х-антиген)). Що стосується консенсусних послідовностей для кожного з НВМ генотипу А, В, С ії О, що були сконструйовані з множини джерел послідовностей НВМ (наприклад, и апа Уиап еї аї, 2010, для
З, корового антигену і Х, де консенсусні послідовності одержували з 322 послідовностей НВУ, або для Рої (КТ) з 5біаптога Опімегейу НІМ Огид Кевзібїапсе Багаразе, НВМзед апа НВМ 5іе
Кеїєазе Моїе5), послідовності в матричній структурі матриці замінювали консенсусними послідовностями, що відповідають тим же положенням, якщо використання консенсусної послідовності не змінювало один з відомих Т-клітинних епітопів гострої або самообмежувальної інфекції або одну з відомих ділянок мутації в полімеразі, що забезпечують вислизання, у випадку яких ці положення відповідали опублікованій послідовності для цих епітопів або ділянок мутації. Додаткові антигени можна конструювати, виходячи тільки 3 консенсусних послідовностей або з використанням інших опублікованих епітопів, коли вони стануть відомими.
Першу конструкцію на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу А конструювали в такий спосіб. З використанням 5ЕО ІЮ МО:97, 5ЕО ІЮО МО:98, 5ЕО ІЮО МО:99 і 5ЕО ІЮ МО:100, які були сконструйовані для зменшення розмірів сегментів, що піддаються злиттю (у порівнянні з повнорозмірними), для максимізації включення відомих Т-клітинних епітопів, що відповідають епітопам, ідентифікованим у таблиці 5 (пріоритет, як описано вище), і для мінімізації штучних областей з'єднання, створювали нові сегменти для злиття на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу А. Новий сегмент поверхневого антигену відповідає положенням 1-249 5ЕО
ІЮО МО:107. Новий сегмент полімерази (КТ) відповідає положенням 250-477 5БЕО ІЮ МО:107.
Новий коровий сегмент відповідає положенням 478-629 5ЕО ІЮ МО:107. Новий сегмент Х- антигену відповідає положенням 630-689 5ЕО ІЮ МО:107. Цей повний злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, де послідовності НВМ відповідають ЗЕО ІЮ МО:107 (послідовності не НВУ, які називаються "необов'язковими", не включені в основну послідовність 5ЕО ІЮ МО:107, але в дійсності були додані до злитого білка, описаного в цьому прикладі): (1) необов'язковий М- кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО
ІО МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид Тпг-5ег; (3) оптимізована частина великого (І) поверхневого антигену НВУ, що відповідає положенням 1-249 5ЕО ІЮ МО:107, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу А, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; (4) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМ, що відповідає положенням 250-477 5ЕБО ІЮ МО:107, що являє собою 60 консенсусну послідовність для НВМ генотипу А, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; (5) оптимізована частина корового білка НВМУ, що відповідає положенням 478-629 5БО ІЮ МО:107, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу А, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; (б) оптимізована частина Х-антигену НВУ, що відповідає положенням 630-689 5ЕО ІЮ МО:107, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу А, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; і (7) необов'язкова гексагістидинова мітка (шість залишків гістидину після положення 689 5ЕБО ІЮ МО:107). Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує повний злитий білок, також позначається в даному описі як 1-13010.
Злитий білок і відповідна імунотерапевтична композиція на основі дріжджів також можуть бути позначені в даному описі як "ЗРЕХм2-А" або "Брех-А".
Другу конструкцію на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу В конструювали в такий спосіб. З використанням 5ЕО ІЮ МО:97, ЗЕО ІЮ МО:98, 5ЕО ІЮО МО:99 і БЕО ІЮО МО:100, які були сконструйовані для зменшення розмірів сегментів, що піддаються злиттю (у порівнянні з повнорозмірними), для максимізації включення відомих Т-клітинних епітопів, що відповідають епітопам, ідентифікованим у таблиці 5 (пріоритет, як описано вище), і для мінімізації штучних областей з'єднання, створювали нові сегменти для злиття на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу В. Новий сегмент поверхневого антигену відповідає положенням 1-249 5ЕО
ІЮО МО:108. Новий сегмент полімерази (КТ) відповідає положенням 250-477 5БЕО ІЮ МО:108.
Новий коровий сегмент відповідає положенням 478-629 5ЕО ІЮ МО:108. Новий сегмент Х- антигену відповідає положення 630-689 5ЕО ІЮ МО:108. Цей злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С- кінця, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:108 (послідовності не НВУ, які називаються "необов'язковими", не включені в основну послідовність 5ЕО ІЮО МО:108, але в дійсності були додані до злитого білка, описаного в цьому прикладі): (1) необов'язковий М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО ІЮО МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид ТАг-Бег; (3) оптимізована частина великого (І) поверхневого антигену НВМ, що відповідає положенням 1-249 5ЕО ІЮ МО:108, що являє собою консенсусну послідовність для
НВМ генотипу В, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; (4) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВУ, що відповідає положенням 250-477 ЗЕО ІЮ МО:108, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу В, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; (5) оптимізована частина корового білка НВМ, що відповідає положенням 478-629 5ЕО ІЮО МО:108, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу В, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; (б) оптимізована частина Х-антигену НВМ, що відповідає положенням 630-689 5ЕО ІЮ МО:108, яка являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу В, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; і (7) необов'язкова гексагістидинова мітка. Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує повний злитий білок, також позначається в даному описі як (СІ-13011. Злитий білок і відповідна імунотерапевтична композиція на основі дріжджів також можуть бути позначені в даному описі як "ЗРЕХМ2-В" або "ЗБрех-В".
Третю конструкцію на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу С конструювали в такий спосіб. З використанням 5ЕО ІЮ МО:97, 5ЕО ІЮО МО:98, 5ЕО ІЮО МО:99 і 5ЕО І МО:100, які були сконструйовані для зменшення розмірів сегментів, що піддаються злиттю (у порівнянні з повнорозмірними), для максимізації включення відомих Т-клітинних епітопів, що відповідають епітопам, ідентифікованим у таблиці 5 (пріоритет, як описано вище), і для мінімізації штучних областей з'єднання, створювали нові сегменти для злиття на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу С. Новий сегмент поверхневого антигену відповідає положенням 1-249 5ЕО
ІЮО МО:109. Новий сегмент полімерази (КТ) відповідає положенням 250-477 5БЕО ІЮ МО:109.
Новий коровий сегмент відповідає положенням 478-629 5ЕО ІЮ МО:109. Новий сегмент Х- антигену відповідає положення 630-689 5ЕО ІЮ МО:109. Цей злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С- кінця, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:109 (послідовності не НВУ, які називаються "необов'язковими", не включені в основну послідовність 5ЕО ІЮО МО:109, але в дійсності були додані до злитого білка, описаного в цьому прикладі): (1) необов'язковий М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО ІЮО МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид ТАпг-Бег; (3) оптимізована частина великого (І) поверхневого антигену НВМ, що відповідає положенням 1-249 5ЕО ІЮ МО:109, що являє собою консенсусну послідовність для 60 НВМ генотипу С, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; (4)
оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМ, що відповідає положенням 250-477 ЗЕО ІЮ МО:109, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу С, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; (5) оптимізована частина корового білка НВМ, що відповідає положенням 478-629 5ЕО ІЮО МО:109, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу С, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; (б) оптимізована частина Х-антигену НВУ, що відповідає положенням 630-689 5ЕО ІЮ МО:109, яка являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу С, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; і (7) необов'язкова гексагістидинова мітка. Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує повний злитий білок, також позначається в даному описі як СІ-13012. Злитий білок і відповідна імунотерапевтична композиція на основі дріжджів також можуть бути позначені в даному описі як "ЗРЕХМ2-С" або "Зрех-С".
Четверту конструкцію на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу Ю конструювали в такий спосіб. З використанням ЗЕО ІЮ МО:97, ЗЕО ІО МО:98, 5ЕО ІЮ МО:99 і
ЗЕО ІЮ МО:100, які були сконструйовані для зменшення розмірів сегментів, що піддаються злиттю (у порівнянні з повнорозмірними), для максимізації включення відомих Т-клітинних епітопів, що відповідають епітопам, ідентифікованим у таблиці 5 (пріоритет, як описано вище), і для мінімізації штучних областей з'єднання, створювали нові сегменти для злиття на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу ОО. Новий сегмент поверхневого антигену відповідає положенням 1-249 5ЕО ІЮ МО:110. Новий сегмент полімерази (КТ) відповідає положенням 250-477 5ЕО ІЮ МО:110. Новий коровий сегмент відповідає положенням 478-629
ЗЕО ІЮ МО:110. Новий сегмент Х-антигену відповідає положення 630-689 5ЕО ІЮ МО:110. Цей злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:110 (послідовності не НВУ, які називаються "необов'язковими", не включені в основну послідовність 5ЕО ІЮ МО:110, але в дійсності були додані до злитого білка, описаного в цьому прикладі): (1) необов'язковий М- кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5Е0О
ІО МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид Тпг-5ег; (3) оптимізована частина великого (І) поверхневого антигену НВУ, що відповідає положенням 1-249 5ЕО ІЮ МО:110, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу 0, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; (4) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМ, що відповідає положенням 250-477 5ЕБО ІЮ МО:110, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу 0, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; (5) оптимізована частина корового білка НВУ, що відповідає положенням 478-629 5ЕО ІЮ МО:110, що являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу 0, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; (б) оптимізована частина Х-антигену НВУ, що відповідає положенням 630-689 5ЕО ІЮО МО:110, яка являє собою консенсусну послідовність для НВМ генотипу 0, у якій використовується стратегія конструювання, описана вище; і (7) необов'язкова гексагістидинова мітка. Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує повний злитий білок, також позначається в даному описі як І-13013. Імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, яка експресує схожий злитий білок (який містить 5ЕО ІЮ МО:110), за винятком того, що М-кінцевий пептид ЗЕО ІЮ
МО:37 замінений послідовністю альфа-фактора 5ЕО ІЮ МО:89, позначають у даному описі як
СІ-13014. Злитий білок і відповідна імунотерапевтична композиція на основі дріжджів також можуть бути позначені в даному описі як "ЗРЕХМ2-О", "Зрех-О", або "М-5РЕХмМ2-О" (для (1І- 13013) або "а-5РЕХмМ2-О" (для БІ-13014).
Додаткові злиті біли НВМ для застосування в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів конструювали з використанням консенсусних послідовностей для чотирьох генотипів
НВУ, щоб продемонструвати, яким чином зміни, подібні до змін, внесених в злиті білки, описані вище (ЗЕО ІЮ МО:107-110), можна вносити у відмінний злитий білок НВМ, такий як білок, описаний у 5ЕО ІЮ МО:34, що містить поверхневий білки НВМ і корові білки НВМ. Для конструювання цих додаткових антигенів НВМ і відповідних імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, як матрицю використовували структуру злитого білка, описану вище для 5ЕО
ІО МО:34 (і, таким чином, підчастини цих злитих білків (поверхневий антиген і коровий антиген).
Як у випадку конструкцій, описаних вище, конструювали консенсусні послідовності для кожного з генотипів А, В, С ї О НВМ з множини джерел послідовностей НВМ (наприклад, и апа Миап еї ам, 2010, для 5 і корового антигену), і послідовності в матричній структурі замінювали консенсусними послідовностями, що відповідають тим же положенням, якщо використання 60 консенсусної послідовності не змінювало один 3 відомих Т-клітинних епітопів при гострій/самообмежувальній інфекції або одну з відомих ділянок мутації полімерази, що забезпечують вислизання, у цьому випадку, ці положення відповідали опублікованій послідовності для цих епітопів або ділянок мутації.
Першу конструкцію на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу А конструювали в такий спосіб. З використанням ЗЕО ІЮО МО:34 як матриці, створювали новий злитий білок на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу А, що відповідає в даному описі ЗЕО ІЮ
МО:112. Цей злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає БЕО ІЮ МО:112 (послідовності не НВУ, які називаються "необов'язковими" не включені в основну послідовність
ЗЕО ІО МО:112, але в дійсності були додані до злитого білка, описаного в цьому прикладі): (1) необов'язковий М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид ТПг-бег; (3) консенсусна послідовність великого (Ї) поверхневого антигену для НВМ генотипу А, що відповідає положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО:112; 4) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу А, що відповідає положенням 400-581 5БЕО ІЮО МО:112; ії (5) необов'язкова гексагістидинова мітка. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок, що містить ЗЕО ІЮ МО:112 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як 5ЕБЕО ІЮО МО:111. Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, також позначається в даному описі як 5І-13006. Злитий білок і відповідна імунотерапевтична композиція на основі дріжджів також можуть бути позначені в даному описі як "Зсоге-А".
Другу конструкцію на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу В конструювали в такий спосіб. З використанням ЗЕО ІЮ МО:34 як матриці, створювали новий злитий білок на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу В, що відповідає в даному описі ЗЕО ІЮ
МО:114. Цей злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає БЕО ІЮ МО:114 (послідовності не НВУ, які називаються "необов'язковими" не включені в основну послідовність
ЗЕО ІО МО:114, але в дійсності були додані до злитого білка, описаного в цьому прикладі): (1) необов'язковий М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид ТПг-бег; (3) консенсусна послідовність для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу В, що відповідає положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО:114; 4) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу В, що відповідає положенням 400-581 5БЕО ІЮО МО:114; їі (5) необов'язкова гексагістидинова мітка. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок, що містить ЗЕО ІЮ МО:114 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як 5ЕБЕО ІЮО МО:113. Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, також позначається в даному описі як 5І-13007. Злитий білок і відповідна імунотерапевтична композиція на основі дріжджів також можуть бути позначені в даному описі як "Зсоге-В".
Третю конструкцію на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу С конструювали в такий спосіб. З використанням ЗЕО ІЮ МО:34 як матриці, створювали новий злитий білок на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу С, що відповідає в даному описі ЗЕО ІЮ
МО:116. Цей злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає БЕО ІЮ МО:116 (послідовності не НВУ, які називаються "необов'язковими" не включені в основну послідовність
ЗЕО ІО МО:116, але в дійсності були додані до злитого білка, описаного в цьому прикладі): (1) необов'язковий М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид ТПг-бег; (3) консенсусна послідовність для великого (ЇЇ) поверхневого антигену НВМ генотипу С, що відповідає положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО:116; 4) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу С, що відповідає положенням 400-581 ЗЕО ІЮ МО:116; і (5) необов'язкова гексагістидинова мітка. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок, що містить ЗЕО ІЮ МО:116 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як 5ЕБЕО ІЮО МО:115. Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, також позначається в даному описі як 5І-13008. Злитий білок і відповідна імунотерапевтична композиція на основі дріжджів також можуть бути позначені в 60 даному описі як "Зсоге-С".
Четверту конструкцію на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу 0 конструювали в такий спосіб. З використанням ЗЕО ІЮ МО:34 як матриці, створювали новий злитий білок на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу 0, що відповідає в даному описі ЗЕО ІЮ МО:118. Цей злитий білок являє собою єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця, що відповідає ЗЕО ІЮ
МО:118 (послідовності не НВМ, які називаються "необов'язковими" не включені в основну послідовність ЗЕО ІЮ МО:118, але в дійсності були додані до злитого білка, описаного в цьому прикладі): (1) необов'язковий М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО ІЮО МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид ТАг-5ег; (3) консенсусна послідовність для НВМ генотипу Ю великого поверхневого антигену (І), що відповідає положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО:118; 4) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 400-581 5ЕО
ІЮ МО:118; ї (5) необов'язкова гексагістидинова мітка. Амінокислотна послідовність повного злитого білка, що містить 5ЕБЕО ІЮ МО:118, і М- і С-кінцевий пептиди, і лінкерний пептид представлений у даному описі як БЗЕО ІЮ МО:151. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок, що містить ЗЕО ІЮ МО:118 або 5ЕО ІО МО:151 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як БЗЕО ІЮ МО:117. Імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує цей злитий білок, також позначається в даному описі як (і- 13009. Злиті білки і відповідна імунотерапевтична композиція на основі дріжджів також можуть бути позначені в даному описі як "ЗБсоге-О".
Імунотерапевтичні композиції 5І-13010 (яка містить 5ЕО ІЮ МО:107), 5І-13011 (яка містить
ЗЕО ІЮ МО:108), (І1-13012 (яка містить ЗЕО ІЮ МО:109), 5І-13013 (яка містить ЗЕО ІЮ МО:110),
СІ-13006 (яка містить БЕО ІЮ МО:112), 5І-13007 (яка містить БЕО ІЮ МО:114), (3І-13008 (яка містить 5ЕО ІЮ МО:116) і 5І-13009 (яка містить БЗЕО ІЮ МО:118) одержували, як описано для інших композицій вище. У короткому викладі, ДНК, що кодує злитий білок, піддавали оптимізації кодонів для експресії в дріжджах, а потім вбудовували після промотору СОР (роіІ-100) у 2-мкм експресуючих векторах дріжджів. Отримані плазміди вводили в дріжджі Басспаготусев5 сегемізіае МУЗОЗа шляхом трансфекції з ацетатом літію/поліетиленгліколем. Трансформанти дріжджів для кожної плазміди виділяли на чашках із твердим мінімальним середовищем, позбавленим урацилу (ШОМ; середовище з відсутністю уридину). Колонії повторно наносили штрихами на ПОМ (середовище з відсутністю уридину і лейцину) і дозволяли рости протягом З діб при 30 "С. Рідкі стартові культури, позбавлені уридину і лейцину (012; склад представлений в прикладі 1) інокулювали з чашок і стартові культури вирощували протягом 18 год. при 30 "С, 250 об./хв. Первинні культури використовували для інокуляції кінцевих культур ЦІ2 і ріст продовжували доти, поки не досягали густини 2 Д.О./мл. Культури індукували 0,5 мМ сульфатом міді протягом З год., а потім клітини промивали в РВ5, забезпечували їхню загибель нагріванням при 56 "С протягом 1 год., і промивали три рази в РВ5. Загальний вміст білка вимірювали за допомогою преципітації з ТСА/аналізу зв'язування з нітроцелюлозою і експресію антигену НВМ вимірювали вестерн-блотингом з використанням моноклонального антитіла проти
Пів-мітки.
Результати представлені на фіг. 20. Доріжки на блоті, представленому на фіг. 20, містять білок з наступних імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів: доріжка 1 (м1.0; 5соге) -
СІ-13002 (яка експресує ЗЕО ІЮ МО:34); доріжка 2 (м2.0; Зс) - (5І1-13006 (яка експресує ЗЕО ІЮ
МО:112); доріжка З (м2.0; 5с) - 5І-13007 (яка експресує БЕО ІЮ МО:114); доріжка 4 (м2.0; 5с)
СІ-13008 (яка експресує ЗЕО ІЮ МО:116); доріжка 5 (м2,0; 5с) - 51-13009 (яка експресує БЕО ІЮ
МО:118); доріжка 6 (м1.0; Зр) - 5І-13005 (яка експресує ЗЕО ІЮ МО:36); доріжка 7 (м1.0; а-5р) -
СІ-13004 (яка експресує 5БЕО ІО МО:92); доріжка 8 (м2.0; Зр) - 0І-13010 (яка експресує ЗЕО ІЮ
МО:107); доріжка 9 (м2.0; Бр) - 5І-13011 (яка експресує БЕО ІО МО:108); доріжка 10 (м2.0; 5р) - (І-13012 (яка експресує 5БЕО ІО МО:109); доріжка 11 (м2,0; Зр) - 5І-13013 (яка експресує ЗЕО ІЮ
МО:110).
Результати показують, що кожний з антигенів НВУ, які містять комбінацію поверхневого антигену ї корового антигену (антигени "Зсоге"), тобто (І-13002 (бсоге), СІ-13006 (5с; 5соге-А),
СІ-13007 (с; бсоге-В), СІ-13008 (с; Зсоге-С) і 5І-13009 (с; 5соге-Ю)) стійко експресувався в дріжджах. Типові рівні експресії Зсоге м2.0 у цих і подібних експериментах знаходилися в діапзаоні приблизно від 90 до 140 пмоль/Д.О. (тобто від 5940 нг/Д.О. до 9240 нг/Д.О.). Рівні експресії антигенів НВМ, що містять усі чотири білюи НВМ (поверхневий білок, полімераза, коровий антиген і Х, або "Брех") варіювали. Зокрема, експресія антигенів з (5І-13010 (бр; 5рех-
А), (І-13011 (бр; 5рех-В), СІ-13012 (р; брех-О) і 6І-13013 (бр; брех-О) була істотно більш 60 низькою, ніж експресія антигенів "Зсоге", а також антигенів з 5І-13005 (5р; 5рех) і БІ-13004 (а-
зр; а-Зрех). Експресія антигену в (І-13012 (бр; брех-С) важко піддавалася виявленню. Узяті разом, ці результати вказують на те, що в цілому, антигени НВМ, що містять поверхневий антиген і коровий антиген, дуже добре експресуються в дріжджах, у той час як антигени НВУ, які містять усі з поверхневого антигену, полімерази, корового антигену і Х, мають варіабельну експресію в дріжджах, і, як правило, експресуються гірше, ніж антигени "Зсоге".
Приклад 8
У представленому нижче прикладі описане одержання додаткових імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів проти НВМ, у яких використовуються консенсусні послідовності для генотипів НВМ, і, крім того, продемонстроване застосування альтернативних конфігурацій/розташувань сегментів білка НВУ у злитому білку для модифікації або підвищення експресії антигену НВМ у дріжджах і/або підвищення або модифікації імуногенності або іншої функціональної ознаки антигену НВУ.
У цьому прикладі конструювали нові злиті білки, у яких на М- або С-кінці комбінації поверхневого антигену, злитого з коровим антигеном, додані Х-антиген і/або антигени полімерази. Ці конструкції конструювали, почасти грунтуючись на розуміннях, що, оскільки злиті організовані в конфігурації, загалом позначається в даному описі як "Зсоге" (наприклад, ЗЕО ІЮ
МО:34, 5ЕО ІЮ МО:112, ЗЕО ІОЮО МО:114, 5ЕО ІО МО:116 і ЗЕО ІОЮ МО:118) добре експресуються в дріжджах, може бути переважним використання цієї базової конфігурації (тобто поверхневий антиген, злитий з коровим білком), для одержання антигенів НВМ, що містять додаткові білкові компоненти НВУ. Такі стратегії можуть підвищувати експресію полібілкових антигенів і/або підвищувати або модифікувати функціональність таких антигенів у контексті імунотерапії.
Наприклад, без зв'язку з теорією, автори винаходу припустили, що експресія антигену НВМ з використанням трьох або всіх чотирьох білків НВМ може бути поліпшена шляхом конструювання злитого білка з використанням поверхневого антигену-корового антигену (у даному порядку) як основи, а потім приєднання інших антигенів до цієї конструкції.
Таким чином, щоб проілюструвати цей варіант здійснення винаходу моделювали і конструювали вісім нових злитих білків, і одержували імунотерапевтичні продукти на основі дріжджів, які експресують ці білки. У кожному випадку, у злитому білку використовували злитий білок поверхневий антиген-коровий білок як основу, що походив із сегментів злитого білка, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:118, що являє собою злитий білок поверхневий антиген-коровий антиген, описаний у прикладі 7, у якому використовувалася консенсусна послідовність для НВМ генотипу
О ї який оптимізований для максимізації використання консервативних імунологічних епітопів.
Усі можливі розташування сегмента полімерази і/або сегмента Х-антигену приєднували до цієї основної конфігурації з використанням сегментів, що походять зі злитого білка, що відповідає
ЗЕО І МО:110, що являє собою злитий білок з множини білків НВУ, описаний у прикладі 7, який конструювали для зменшення розміру білкових сегментів, максимізації застосування консервативних імунологічних епітопів і використання консенсусної послідовності для. НВМУ генотипу 0. Хоча ці вісім отриманих антигенів являють собою антигени на основі консенсусної послідовності для НВМ генотипу Ю, можна легко одержати злитий білок, що має подібну загальну структуру, з використанням відповідних злитих сегментів зі злитих білків, що відповідають ЗЕО ІЮ МО:107 і/або 5БЕО ІЮО МО:112 (генотип А), 5ЕО ІЮ МО:108 і/або 5ЕО ІО
МО:114 (генотип В), ЗЕО ІЮО МО:109 і/або 5ЕО ІЮ МО:116 (генотип С), або з використанням відповідних послідовностей з відмінного генотипу, підгенотипу, консенсусної послідовності або штаму НВУ.
Для одержання першої композиції, дріжджі (наприклад, засспаготусе5 сегемівіає) модифікували способами інженерії для експресії нового злитого білка НВУ, схематично проілюстрованого на фіг. 8, під контролем індукованого міддю промотору СОР1. Отримана імунотерапевтична композиція проти НВМ на основі дріжджів може бути позначена в даному описі як СІ-13015. Цей злитий білок, позначається також у даному описі як "Зсоге-Рої" і відповідний ЗЕО ІЮ МО:120, містить, по порядку, послідовності поверхневого антигену, корового білка і полімерази, як єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця (послідовності не НВУ, які називаються "необов'язковими", не включені в основну послідовність 5ЕО ІЮ МО:120, але в дійсності були додані до злитого білку, описаному в цьому прикладі): (1) необов'язковий М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО ІЮО МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид Тпг-5ег; (3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу О, що відповідає положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО:120 (відповідна положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО:118); (4) 60 амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу 0,
що відповідає положенням 400-581 5ЕО ІЮ МО:120 (відповідна положенням 400-581 5ЕО І
МО:118); (5) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 582- 809 5ЕО І МО:120 (відповідна положенням 250-477 5ЕБО ІЮО МО:110); і (6) необов'язкова гексагістидинова мітка. «ЕО ІЮ МО:120 містить множину Т-клітинних епітопів (людини і миші), що можуть бути знайдені в таблиці 5. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок
ЗЕО ІЮ МО:120 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як
ЗЕО ІЮ МО:119.
Для одержання другої композиції дріжджі (наприклад, засспаготусе5 сегемізіає) модифікували способами інженерії для експресії нового злитого білка НВУ, схематично проілюстрованого на фіг. 9, під контролем індукованого міддю промотору СОР1. Отримана імунотерапевтична композиція на основі дріжджів проти НВМ може бути позначена в даному описі як (І-13016. Цей злитий білок, позначається також у даному описі як "Зсоге-Х" і відповідний ЗЕО ІЮ МО:122, містить, по порядку, послідовності поверхневого антигену, корового антигену і Х-антигену як єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця (послідовності не НВУ, які називаються "необов'язковими", не включені в основну послідовність 5ЕО ІЮ МО:122, але в дійсності були додані до злитого білка, описаного в цьому прикладі): (1) необов'язковий М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО ІЮО МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид Тпг-5ег; (3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу О, що відповідає положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО:122 (відповідна положенням 1-399 5ЕО 10 МО:118); 4) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 400-581 5ЕО ІЮ МО:122 (відповідна положенням 400-581 5ЕО І
МО:118); (5) оптимізована частина Х-антигену НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу О, що відповідає положенням 582-641 5ЕО І МО:122 (відповідна положенням 630-689 5ЕО ІЮ МО:110); і (6) необов'язкова гексагістидинова мітка. ХЕО ІЮ МО:122 містить множину Т-клітинних епітопів (людини і миші), що можуть бути знайдені в таблиці 5.
Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок, що містить ХЕО ІЮ МО:122 (кодон- оптимізована для експресії в дріжджах), представлена в даному описі як зЕО ІОЮ МО:121.
Для одержання третьої композиції дріжджі (наприклад, засспаготусев5 сегемівзіає) модифікували способами інженерії для експресії нового злитого білка НВУ, схематично проілюстрованого на фіг. 10, під контролем індукованого міддю промотору СОР1. Отримана імунотерапевтична композиція на основі дріжджів проти НВМ може бути позначена в даному описі як (3І1-13017. Цей злитий білок, позначається також у даному описі як "Зсоге-РоІ-Х" і відповідний ЗЕО ІЮ МО:124, містить, по порядку, послідовності поверхневого антигену, корового антигену, полімерази і Х-антигену як єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця (послідовності не НВУ, які називаються "необов'язковими", не включені в основну послідовність 5ЕО ІЮ МО:124, але в дійсності були додані до злитому білку, описаному в цьому прикладі): (1) необов'язковий М- кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО
ІЮ МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид ТПг-Зег; (3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (Г) поверхневого антигену НВМ генотипу ЮО, що відповідає положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО:124 (відповідна положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО:118); 4) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 400-581 5ЕО
ІО МО:124 (відповідна положенням 400-581 5ЕО ІО МО:118); (5) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМУ з використанням консенсусної послідовності для
НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 582-809 5ЕО ІЮО МО:124 (відповідна положенням 250-477 БО ІЮО МО:110); (б) оптимізована частина Х-антигену НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу Ю, що відповідає положенням 810-869 5ЕО І
МО:124 (відповідна положенням 630-689 5ЕО ІЮО МО:110); і (7) необов'язкова гексагістидинова мітка. ЗЕО ІЮ МО:124 містить множину Т-клітинних епітопів (людини і миші), що можуть бути знайдені в таблиці 5. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок, що містить ЗЕО
ІО МО:124 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як ХЕО
ІО МО:123.
Для одержання четвертої композиції дріжджі (наприклад, Засспаготусе5 сегемівіає) 60 модифікували способами інженерії для експресії нового злитого білка НВУ, схематично проілюстрованого на фіг. 11, під контролем індукованого міддю промотору СОР1. Отримана імунотерапевтична композиція на основі дріжджів проти НВМ може бути позначена в даному описі як І-13018. Цей злитий білок, позначається також у даному описі як "Зсоге-Х-Рої" і відповідний 5ЕО ІЮО МО:126, містить, по порядку, поверхневий антиген, коровий антиген, Х- антиген і послідовності полімерази, як єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця (послідовності не НВУ, які називаються "необов'язковими", не включені в основну послідовність 5ЕО ІЮ МО:126, але в дійсності були додані до злитого білка, описаного в цьому прикладі): (1) необов'язковий М- кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО
ІЮ МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид ТПг-Зег; (3) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу Ю, що відповідає положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО: 126 (відповідна положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО:118); 4) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 400-581 5ЕО
ІЮО МО:126 (відповідна положенням 400-581 5ЕО ІО МО:118); (5) оптимізована частина хХ- антигену НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 582-641 5ЕО ІЮ МО:126 (відповідна положенням 630-689 5ЕО ІЮ МО:110); (5) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу Ю, що відповідає положенням 642-869 5ЕО І
МО:126 (відповідна положенням 250-477 ЗЕО ІЮО МО:110); і (7) необов'язкова гексагістидинова мітка. ЗЕО ІЮ МО:126 містить множину Т-клітинних епітопів (людини і миші), що можуть бути знайдені в таблиці 5. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок, що містить ЗЕО
ІО МО:126 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах), представлена в даному описі як БЗЕО
ІО МО 125.
Для одержання п'ятої композиції, дріжджі (наприклад, засспаготусе5 сегемівіає) модифікували способами інженерії для експресії нового злитого білка НВУ, схематично проілюстрованого на фіг. 12, під контролем індукованого міддю промотору СОР1. Отримана імунотерапевтична композиція на основі дріжджів проти НВМ може бути позначена в даному описі як (3І-13019. Цей злитий білок, позначається також у даному описі як "РоІ-Зсоге" і відповідний ЗЕСО ІЮ МО:128 містить, по порядку, послідовності полімерази, поверхневого антигену і корового антигнену як єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця (послідовності не НВУ, які називаються "необов'язковими", не включені в основну послідовність 5ЕО ІЮ МО:128, за винятком лінкера
ЇГеш-Сіш між сегментом полімерази і сегментом поверхневого антигену в конструкції, проілюстрованій в даному описі, але в дійсності були додані до злитого білка, описаного в цьому прикладі): (1) необов'язковий М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО ІЮО МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид ТАг-5ег; (3) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу ЮО, що відповідає положенням 1-228 5ЕО І
МО:120 (відповідна положенням 250-477 ЗЕО ІЮ МО:110); (4) лінкерний пептид (необов'язковий)
Геш-СІм, що відповідає положенням 229-230 5ЕО ІЮ МО:128; (5) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу О, що відповідає положенням 231-629 5ЕО І МО: 128 (відповідна положенням 1-399 5ЕО ІО МО:118); (6) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 630-811 5ЕО
ІЮ МО:128 (відповідна положенням 400-581 5ЗЕО 10 МО:118); і (7) необов'язкова гексагістидинова мітка. «ЕО ІЮ МО:128 містить множину Т-клітинних епітопів (людини і миші), кожний з яких може бути знайдений у таблиці 5. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок, що містить ЗЕО ІЮ МО:128 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як ЗЕО ІЮ МО:127.
Для одержання шостої композиції дріжджі (наприклад, зЗасспаготусе5 сегемівзіає) модифікували способами інженерії для експресії нового злитого білка НВУ, схематично проілюстрованого на фіг. 13, під контролем індукованого міддю промотору СОР1. Отримана імунотерапевтична композиція на основі дріжджів проти НВМ може бути позначена в даному описі як (І-13020. Цей злитий білок, позначається також у даному описі як "Х-5соге" і відповідний 5ЕО ІЮ МО:130 містить, по порядку, послідовності Х-антигену, поверхневого антигену і корового антигену як єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, 60 злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця (послідовності не НВУ, які називаються
"необов'язковими", не включені в основну послідовність 5ЕО ІЮ МО:130, за винятком лінкера
Їеи-СІи між сегментом Х і сегментом поверхневого антигену в конструкції, проїлюстрованій в даному описі, але в дійсності були додані до злитого білка, описаного в цьому прикладі): (1) необов'язковий М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид ТПг-5ег; (3) оптимізована частина
Х-антигену НВУ, у якій використовується консенсусна послідовність для НВМ генотипу О, що відповідає положенням 1-60 5ЕО ІЮ МО:130 (відповідна положенням 630-689 5ЕО ІЮ МО:110); (4) лінкерний пептид (необов'язковий) І еи-СіІй, що відповідає положенням 61-62 5ЕО ІЮ МО:130; (5) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу ОО, що відповідає положенням 63-461 5ЕО І МО:130 (відповідна положенням 1-399 5ЕО І0О МО:118); (6) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 462-643 5ЕО ІЮ МО:130 (відповідна положенням 400-581 5ЕО 10
МО:118); і (7) необов'язкова гексагістидинова мітка. ЗЕО ІЮ МО:130 містить множину Т-клітинних епітопів (людини і миші), що можуть бути знайдені в таблиці 5. Амінокислотна послідовність повного злитого білка, що містить 5ЕО ІЮ МО:130, їі М- ії С-кінцевий пептиди, і лінкери, представлена в даному описі як зЕО ІЮ МО:150. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок, що містить ЗЕО ІЮ МО:130 або 5ЕО ІО МО:150 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах), представлена в даному описі як ЗЕО ІЮ МО:129.
Для одержання сьомої композиції дріжджі (наприклад, зЗасспаготусе5 сегемівіає) модифікували способами інженерії для експресії нового злитого білка НВУМ, схематично проілюстрованого на фіг. 14, під контролем індукованого міддю промотору СОР1. Отримана імунотерапевтична композиція на основі дріжджів проти НВМ може бути позначена в даному описі як (3І-13021. Цей злитий білок, позначається також у даному описі як "РоІ-Х-5соге" і відповідний 5ЕО ІЮ МО:132 містить, по порядку, полімеразу, Х-антиген, поверхневий антиген і коровий антиген як єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця (послідовності не НВУ, які називаються "необов'язковими", не включені в основну послідовність ЗЕО ІЮ МО:132, але в дійсності були додані до злитого білка, описаного в цьому прикладі): (1) необов'язковий М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид ТПг-5ег; (3) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВМУ з використанням консенсусної послідовності для НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 1- 228 5ЕО І МО:132 (відповідна положенням 250-477 5ЕО ІЮО МО:110); (4) оптимізована частина
Х-антигену НВУ, у якій використовується консенсусна послідовність для НВМ генотипу О, що відповідає положенням 229-288 5ЕО І МО:132 (відповідна положенням 630-689 5ЕО І
МО:110); (5) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу О, що відповідає положенням 289-687 ЗЕО ІЮ МО:132 (відповідна положенням 1-399 5ЕО ІЮ МО:118); (6) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену НВМУ генотипу 0, що відповідає положенням 688-869 5ЕО ІЮ МО:132 (відповідна положенням 400-581
ЗЕО ІЮ МО:118); і (7) необов'язкова гексагістидинова мітка. ЗЕО ІЮ МО:132 містить множину Т- клітинних епітопів (людини і миші), що можуть бути знайдені в таблиці 5. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок, що містить 5ЕО ІЮ МО:132 (кодон-оптимізована для експресії в дріжджах), представлена в даному описі як ЗЕО ІЮ МО:131.
Для одержання восьмої композиції дріжджі (наприклад, засспаготусе5 сегемівіає) модифікували способами інженерії для експресії нового злитого білка НВУМ, схематично проілюстрованого на фіг. 15, під контролем індукованого міддю промотору СОР1. Отримана імунотерапевтична композиція на основі дріжджів проти НВМ може бути позначена в даному описі як (3І-13022. Цей злитий білок, позначається також у даному описі як "Х-РоІ-5соге" і відповідна 5ЕО ІЮ МО:134 містить, по порядку, Х-антиген, полімеразу, поверхневий антиген і коровий білок як єдиний поліпептид з наступними елементами послідовності, злитими в рамці зчитування від М- до С-кінця (послідовності не НВУ, які називаються "необов'язковими", не включені в основну послідовність ЗЕО ІЮ МО:134, але в дійсності були додані до злитого білка, описаного в цьому прикладі): (1) необов'язковий М-кінцевий пептид, що являє собою синтетичний М-кінцевий пептид, призначений для забезпечення стійкості до деградації протеасомами і стабілізації експресії, що відповідає 5ЕО ІЮО МО:37; (2) необов'язковий лінкерний пептид ТАг-5ег; (3) оптимізована частина Х-антигену НВУ, у якій використовується консенсусна 60 послідовність для НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 1-60 5БЕО ІЮ МО:134 (відповідна положенням 630-689 БЕ ОО МО:110); (4) оптимізована частина домену зворотної транскриптази (КТ) полімерази НВУ, у якій використовується консенсусна послідовність для
НВМУ генотипу 0, що відповідає положенням 61-288 5ЕО ІЮ МО:134 (відповідна положенням 250- 477 ЗБЕО ІЮО МО:110); (5) амінокислотна послідовність практично повнорозмірної (мінус положення 1) консенсусної послідовності для великого (І) поверхневого антигену НВМ генотипу
Ор, що відповідає положенням 289-687 5ЕО ІЮ МО:134 (відповідна положенням 1-399 5ЕО ІЮО
МО:118); (6) амінокислотна послідовність консенсусної послідовності для корового антигену
НВМ генотипу 0, що відповідає положенням 688-869 5ЕО ІЮО МО:134 (відповідна положенням 400-581 5ЕО ІЮ МО:118); і (7) необов'язкова гексагістидинова мітка. 5ЕО ІЮ МО:134 містить множину Т-клітинних епітопів (людини і миші), що може бути знайдена в таблиці 5.
Послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок, що містить ХЕО ІЮ МО:134 (кодон- оптимізована для експресії в дріжджах) представлена в даному описі як ЗЕО ІЮО МО:133.
Для одержання імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, описаних вище, трансформанти дріжджів для кожної плазміди виділяли на чашках із твердим мінімальним середовищем, позбавленим урацилу (ШОМ; середовище з відсутністю уридину). Колонії повторно наносили штрихами на ШОМ або ОГОМ (середовище з відсутністю уридину і лейцину) і дозволяли рости протягом З діб при 30 "С. Рідкі стартові культури, позбавлені уридину і лейцину (0/2) або позбавлені уридину (02) інокулювали з чашок і стартові культури вирощували протягом 18 год. при 30 "С, 250 об./хв. Первинні культури використовували для інокуляції проміжних культур 02 або Ц12 і ріст продовжували доти, поки не досягали густини 2
Д.О./мл. Проміжні культури використовували для інокуляції кінцевих культур до густини 0,05
Д.О./мл, і їх інкубували до досягнення густини клітин 1-3 Д.О./мл. Потім кінцеві культури індукували 0,5 мМ сульфатом міді протягом З год., а потім клітини промивали в РВ5, забезпечували їхню загибель нагріванням при 56 "С протягом 1 год., і промивали три рази в
РВ5. Загальний вміст білка вимірювали за допомогою преципітації з ТСА/аналізу зв'язування з нітроцелюлозою і експресію антигену вимірювали вестерн-блотингом з використанням моноклонального антитіла проти Піб5-мітки. Лізати двох імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, описаних у прикладі 7 як І-13008 (5ЕО 10 МО:116; "Зсоге-С") або 0І-13009 (ЗЕБЕО І МО:118; "Зсоге-Ю0"), використовували як основу для порівняння з дріжджами, які експресують основний продукт поверхневий антиген-коровий антиген.
На фіг. 21 представлений блот, на якому показана експресія усіх восьми конструкцій у дріжджах, культивованих у середовищі ШІ 2 (навантажених 1 мкг білка) у порівнянні з експресією конструкцією в імунотерапевтичній композиції на основі дріжджів, описаній в прикладі 7 як сі- 13009 (5ЕО 10 МО:118; "Зсоге-0"). Посилаючись на фіг. 21, доріжки 1 і 2 містять маркери молекулярної маси, і доріжки 4-6 містять рекомбінантний мічений гексагістидином білок М53, який обробляли на тому ж блоті, для кількісного визначення антигену шляхом інтерполяції зі стандартної кривої, отриманої для цих доріжок. Доріжки 7-14 містять лізати з кожної імунотерапевтичної композиції на основі дріжджів, що позначаються номером (наприклад, 5І- 13015), вирощені в середовищі ОЇ/2, і доріжка 15 містить лізат СІ-13009 для порівняння.
Додаткові вестерн-блоти для дріжджів, культивованих у середовищі 02, а також додаткові блоти, що оцінюють різні кількості білка, що навантажує гель, не представлені в даному описі, але в цілому, результати показали, що усі вісім антигенів експресувались на рівнях, що піддаються виявленню, щонайменше в одному середовищі для росту.
Загальні результати експресії узагальнено представлені на фіг. 22 як стовпчиковий графік для культур, які мали експресію антигену-мішені в середовищі 02 або Ш12, що піддається виявленню, у порівнянні з експресією антигенів у І-13008 (Зсоге-С) і 5І-13009 (Зсоге-0).
Посилаючись на фіг. 22, антигени НВМ позначені нижче кожного стовпчика з використанням указівки на розташування антигенів у злитому білку, як описано для кожної конструкції вище, разом із середовищем, використаним для культивування відповідних дріжджів, що експресували антиген (тобто "РоІ-Зсоге-02" стосується антигену НВУ, що являє собою злитий білок полімераза-поверхневий антиген-коровий антиген, що відповідає 5ЕБЕО ІЮО МО:128 і експресований (І-13019 у середовищі 02). Результати показали, що експресія антигену, що позначається як "Х-5соге" (експресованого І-13020; ЗЕО ІЮ МО:130) була особливо стійкою, на рівні 4122 пмоль/Д.О., що складало приблизно 79-80 95 від рівня експресії, отриманого для
Зсоге-С ((01-13008) або Зсоге-Ю ((31-13009) у розрахунку на кількість моль (будь-яке середовище). Експресія антигенів, експресованих (І-13015 (Зсоге-Рої; 5ЕО І МО:120), (а1- 13016 (Зсоге-Х; 5ЕО 10 МО: 122), (31-13017 (бсоге-РоІ-Х; ЗЕО ІЮ МО:124) і 5І-13018 (Зсоге-Х-Рої;
ЗБО ІЮ МО:126) у середовищі 02 була нижче рівня кількісного визначення в цьому експерименті, хоча кожний з цих антигенів експресувались, коли ту ж імунотерапевтичну 60 композицію на основі дріжджів вирощували в середовищі 0/2 (див. фіг. 2). Як правило,
конфігурації антигенів, що містили домен зворотної транскриптази (КТ) полімерази, накопичувалися до більш низьких рівнів, ніж конфігурації антигенів, що містили тільки 5-коровий антиген з додаванням або без додавання Х-антигену. З огляду на дані, представлені в цих і попередніх прикладах у цілому, конфігурації антигенів поверхневий антиген-коровий антиген ("Зсоге" або "ЗСОМКЕ"; усі подібні конструкції) і Х-поверхневий антиген-коровий антиген ("Х-
Зсоге" або "Х-ЗСОВЕ"; (І-13020) являли собою конфігурації антигенів, які найбільш високо експресуються, серед усіх досліджених імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів.
Приклад 9
У наступному прикладі описані доклінічні випробування в мишей для демонстрації безпеки, імуногенності й ефективності іп мімо імунотерапевтичних композицій проти НВМ на основі дріжджів за винаходом.
Для оцінки імунотерапевтичних композицій проти НВМ на основі дріжджів у доклінічних випробуваннях використовували різні аналізи іп мйго і іп мімо, що виявляють індукцію антигенспецифічних лімфоцитів імунотерапевтичними композиціями проти НВМ на основі дріжджів за винаходом, включаючи проліферацію лімфоцитів, клітинно-опосередковувану цитотоксичность, секрецію цитокінів і захист від пухлинного навантаження (наприклад, знищення пухлин, модифікованих способами інженерії для експресії білків НВМ іп мімо).
Для забезпечення цих випробувань спочатку використовували імунотерапевтичні композиції проти НВМ на основі дріжджів, описані в прикладах 1 і 2, а потім проводили додаткові випробування з використанням імунотерапевтичних композицій проти НВМ на основі дріжджів, описаних у прикладах 7 і 8, або в інших розділах даного опису. Однак ці дослідження можна легко застосовувати до будь-якої імунотерапевтичної композиції проти НВМ на основі дріжджів за винаходом, і результати, представлені в даному описі, можна екстраполювати на інші композиції НВУ, що містять ту ж антигенну основу або подібні антигени конструкції. Результати цих первинних експериментів описані нижче.
Як загальний протокол, який можна адаптувати для будь-якої імунотерапевтичної композиції проти НВМ на основі дріжджів, мишам (наприклад, самицям мишей ВАЇВ/с і/або С57ВІ/6) ін'єктують придатну кількість імунотерапевтичної композиції проти НВМ на основі дріжджів, наприклад, 4-5 Д.О. (ін'єкціями, які вводяться підшкірно, по 2-2,5 Д.О. у 2 різні області ін'єкції).
Необов'язково, на наступну добу після введення дріжджових композицій вводять антитіло проти ср40. Мишей імунізують раз на тиждень або раз на два тижні 1, 2 або З дозами, і необов'язково через 3-4 тижні після останньої дози, що вводиться раз на тиждень або раз на два тижні, уводять кінцеву допоміжну дозу. Мишей умертвляють через 7-9 діб після останньої ін'єкції.
Одержують суспензії клітин селезінки і/або суспензії клітин лімфатичних вузлів, об'єднані для кожної групи, і піддають їх умовам стимуляції іп міго (ІМ5) з використанням НВМ-специфічних стимулів у формі пептидів НВМ і/або антигенів НВМ, що можуть включати дріжджі, які експресують антигени НВУ. Контрольні культури стимулюють пептидами, що не належать НВУ, що можуть включати пептид овальбуміну або сторонній вірусний пептид (наприклад, пептид із
ВІЛ). Для оцінки імунних відповідей, які індукуються уведенням імунотерапевтичних композицій проти НВМ на основі дріжджів, використовують стандартні аналізи, і вони включають проліферацію лімфоцитів, оцінювану по включенню ЗН-тимідину, аналізи клітинно- опосередковуваної цитотоксичності (аналізи СТІ) з використанням мічених "'Сг клітин-мішеней (або інших мішеней, мічених протягом ночі, для СТІ), кількісне визначення секреції цитокінів за допомогою аналізу цитокінів або ЕГІ5РОТ (наприклад, ІЕМ-у, І--12, ТМЕ-а, 1-6, і/або 1-2 і т. д.), і захист від пухлинного навантаження (наприклад, навантаження іп мімо пухлинними клітинами, модифікованими рекомбінантними способами для експресії антигенів НВМ).
Очікується, що імунотерапевтичні композиції проти НВМ на основі дріжджів будуть імунногенними, на що вказує їхня здатність індукувати специфічні до антигенів НВМ Т-клітинні відповіді, виміряної в аналізах, описаних вище.
У первинних експериментах два з імунотерапевтичних продуктів проти НВМ на основі дріжджів, описаних у прикладах 1 і 2, досліджували в аналізах проліферації лімфоцитів (І РА) для визначення того, чи індукує імунізація цими продуктами проліферацію антигенспецифічних бра-Т-клітин. Більш конкретно, кожний з імунотерапевтичного продукту на основі дріжджів ((1- 13002), який експресує злитий білок, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:34, під контролем промотору
СОРІ, також відомий як "ЗСОКЕ" і більш конкретно описаний у прикладі 1, і імунотерапевтичного продукту на основі дріжджів ((51-13004), який експресує злитий білок, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:92, під контролем промотору СИРІ і також відомий як "а-5РЕХ" і більш конкретно описаний у прикладі 2, використовували для імунізації мишей і оцінки СО4-Т-клітин, специфічних для поверхневого і/або корового антигенів, на які націлені обидва продукти, з 60 використанням аналізу проліферації лімфоцитів (І РА).
Самиць мишей ВАЇ В/с імунізували три рази на тиждень 5 Д.О. "ЗСОКЕ" або а-5РЕХ підшкірно в 2 різні області миші (2,5 Е.Д./бік). Контрольних мишей вакцинували порожнім дріжджовим вектором (що позначається "УМЕС") або не вакцинували нічим (що позначається "наївними"). Через один тиждень після третьої імунізації мишей гуманним чином умертвляли і селезінки і періаортальні і пахові дренувальні лімфатичні вузли (ІМ) витягали і переробляли в суспензії окремих клітин. Клітини І М із двох типів вузлів об'єднували і стимулювали іп міїго (ІМ5) сумішшю рекомбінантного корового і поверхневого антигенів ("суміш З/коровий антиген") або обмеженим по ІЇ міметопним пептидом (ЗУНОБЗБ5І М, 5ЕБО ІЮ МО:103, що позначається як "міметопний пептид класу ІЇ 5А4"), раніше описаний як індукуючий проліферацію Т-клітин в імунізованих 5ад мишей ВАЇ В/с (Казадпуакзпйа еї а! (1995). РМАБЗ 92: 1575-1579).
Клітини селезінки піддавали збагаченню СО4-Т-клітинами шляхом магнітного активованого сортування клітин (МАС) і інкубували з тими ж антигенами, що описані для І М. Після інкубації протягом 4 діб культури ЇІМ5 обробляли тритованим (ЗН) тимідином протягом 18 год., і ДНК клітин збирали на мікрофільтрах зі скловолокном. Рівень включеного "Н-тимідину вимірювали шляхом сцинтиляційного підрахунку. Паралельно аналізували дублюючі культури ЇМ з імунізованих БСОРКЕ мишей. Як додатковий засіб для оцінки активації Т-клітин використовували продукцію інтерферон-гама (ІЕМ-у) у способі ЕГІЗрої.
Як показано на фіг. 23, фіг. 24 і фіг. 26, С04-Т-клітини з мишей, імунізованих ЗСОКЕ або а-
ЗРЕХ, проліферували у відповідь на суміш рекомбінантних антигену 5 і корового антигену. Т- клітини селезінки з імунізованих БСОКЕ мишей (фіг. 23) продемонстрували рівень проліферації, у 25 разів перевищуючий рівень проліферації Т-клітин з імунізованих УМЕС (контроль у вигляді порожнього вектора) або наївних мишей, що вказує на те, що ефект є специфічним для злитого білка поверхневий антиген-коровий антиген (тобто антигенспецифічна Т-клітинна відповідь). Т- клітини з мишей, імунізованих ЗСОКЕ, інкубовані з міметопним пептидом НВУМ, також проліферували до більш високих рівнів, ніж оброблені пептгидом контролі УМЕС або наївні контролі, забезпечуючи подальший доказ антигенної специфічності відповіді на імунотерапевтичний продукту на основі дріжджів. Ці ефекти також залежать від кількості антигену, доданого до ІМ5, причому оптимальна активність була при З мкг/мл (рекомбінантний антиген) або 30 мкг/мл (пептид).
Як показано на фіг. 24, клітини ЇМ з мишей, імунізованих БСОКЕ, також проліферували у відповідь на ЇМ5 з тими ж самими антигенами, хоча відмінність у проліферації між тваринами, імунізованими 5СОРЕ, проти наївних або імунізованих УМЕС тварин були меншими, ніж для виділених СО4-Т-клітин селезінки.
Дані ЕГІБрої (фіг. 25) указують на те, що препарати ЇМ з імунізованих БХСОКЕ мишей, повторно стимульованих сумішшю 5-С, містять кількість секретуючих ІЕМ-у клітин, » 10 разів більше, ніж для ІМ з наївних тварин. ЇІМ5 з пептгидом НВМ (ЗЕО ІЮ МО:103) також індукувала відповідь ІЕМ-у. Зокрема, препарати ЇМ ЗСОКЕ містили кількість клітин, продукуючих ІЕМ-у, » 3,5 разів більше, ніж для препаратів наївних ІМ (фіг. 25). Ці дані в сукупності показують, що
ЗСОРМЕ (імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує злитий білок, що містить поверхневий антиген і коровий антиген) індукує специфічні до антигенів НВМ Т-клітинні відповіді як у селезінці, такі в ЇМ, ї що ці відповіді можуть бути посилені ЇІМ5 з очищеними антигенами дозозалежним чином.
Подібні аналізи з а-5РЕХ (фіг. 26) показали, що цей імунотерапевтичний продукт проти НВМ на основі дріжджів також індукує проліферативні відповіді Т-клітин. а-5РЕХ індукував приблизно 30 95 збільшення в порівнянні з УУЕС у ІМ5, проведеним із сумішшю рекомбінантних антигенів.
У цілому, відповіді, що спостерігаються для а-5РЕХ, були більш низькими, ніж відповіді, що спостерігаються для ЗСОКЕ. Відмінність у величині відповіді може відбивати той факт, що експресія антигену у випадку 2-5РЕХ є меншою, ніж половина експресії у випадку ЗСОКЕ у розрахунку на кількість моль. Альтернативно, без зв'язку з теорією, ці результати можуть указувати на те, що конфігурація антигенів, які експресуються дріжджами, впливає на рівень експресії, ефективність процесингу через ендосому/протеасому, або інші параметри імунної відповіді. Проліферація Т-клітин з мишей а-5РЕХ з використанням 100 мкг/мл пептиду була щонайменше в 2 рази більшою, ніж проліферація в мишей, вакцинованих УМЕС (фіг. 26, три стовпчики праворуч).
Приклад 10
У наступному прикладі описана імунологічна оцінка двох імунотерапевтичних композицій проти НВМ на основі дріжджів за винаходом з використанням профілів цитокінів.
Одним способом охарактеризації клітинної імунної відповіді, індукованої в результаті імунізації імунотерапевтичними композиціями проти НВМ на основі дріжджів за винаходом, є 60 оцінка профілів цитокінів, продукованих при стимуляції ех мімо препаратів селезінки з імунізованих тварин.
У цих експериментах, самиць мишей С57ВІ/б імунізували (І-13002 ("ЗСОВЕ", імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує злитий білок поверхневий антиген-коровий антиген НВУ, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:34, приклад 1) і 5І-13005 ("М-5РЕХ", імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, яка експресує злитий білок поверхневий антиген-роІі-коровий антиген-Х НВУ, що відповідає 5ЕО ІО МО:36, під контролем промотору
СОРІ, приклад 2), УМЕС (контрольні дріжджі з порожнім вектором), або не імунізували нічим (наївні) у такий спосіб: 2 Д.О. імунотерапевтичного засобу на основі дріжджів або контрольних дріжджів ін'єктували підшкірно в 2 різні області тварини на 0, 7 і 28 добу. Для забезпечення додаткової активації дендритних клітин (ОС), крім рівня активації, забезпечуваного терапевтичним засобом на основі дріжджів, вводили антитіло проти СО40 шляхом внутрішньоочеревинної (в/о) ін'єкції на 1 добу. Лікування антитілом проти СО40 є необов'язковим, однак антитіло може збільшувати рівень антигенспецифічних СО8-Т-клітин при спробі виявити ці клітини шляхом прямого фарбування пентамером (ці дані не представлені в цьому експерименті). Через дев'ять діб після останньої імунізації, селезінки витягали і переробляли в суспензії окремих клітин. Клітини вміщували в культури для стимуляції іп міго (ІМ5) на 48 год. з об'єднаною сумішшю 2 пептидів НВМ (що позначається як "Р" на фіг. 27 і фіг. 28 і "НВМР" на фіг. 29А і 298), або обробленими митоміцином С наївними сингенними спленоцитами, обробленими 2 пептидами (що позначаються як "РР5" на фіг. 27 і фіг. 28 і "НРРБЗ" на фіг. 29А і 298). Пептиди обмежені по Н-2КБ і мають наступні послідовності:
І. ЗРЕГРІГ (ЗЕО ІО МО:65, див. таблицю 5) і МОЇ КЕКОЇ (ЗЕО ІЮ МО:104). Культури піддавали повторному аналізу І итіпех на І-18, 1-12 ії ТЕМ-у.
Ці цитокіни оцінювали, оскільки вони зв'язані з типами імунних відповідей, які ймовірно зв'язані з продуктивною або ефективною імунною відповіддю проти НВУ. І--138 являє собою прозапальний цитокін, що продукується антигенпредставляючими клітинами, і він являє собою цитокін, відомий тим, що він буде індукуватися при імунізації імунотерапевтичними композиціями на основі дріжджів. І-12 також продукується антигенпредставляючими клітинами і стимулює активність СО8 цитотоксичних Т-лімфоцитів (СТІ). ІЕМ-у продукується СО8- цитотоксичними Т-лімфоцитами при розвитку адаптивної імунної відповіді і також стимулює диференціювання Тп1 СО4-Т-клітин.
Результати, представлені на фіг. 27 (1-18), фіг. 28 (1-12), фіг. 29А (ІЕМ-у; імунізовані
ЗСОКЕ,), і фіг. 298 (ІЕМ-у; імунізовані М-5РЕХ) указують на те, що всі три цитокіни продукуються спленоцитами з імунізованих Зсоге мишей (що позначаються "З5с" на фіг. 27, фіг. 28 їі фіг. 29А) у відповідь на пряму ЇМ5 об'єднаними пептидами окремо, і що відповідь є більш високою для імунізованих БХСОРЕ, ніж УМЕС (що позначаються "У" на фіг. 27, фіг. 28 і фіг. 29А і 298) або наївних (що позначається "М" на фіг. 27, фіг. 28 ї фіг. 29А і 298) мишей, демонструючи, що імунізація 5СОКЕ індукує антигенспецифічну імунну відповідь, що приводить до продукування цих трьох цитокінів. ІМ5 з обробленими пептидом сингенними спленоцитами також індукувала антигенспецифічну відповідь, хоча і меншій величині. Спленоцити з мишей, вакцинованих М-
ЗРЕХ (що позначаються "Зр" на фіг. 27, фіг. 28 і фіг. 298) продукували в цілому більш низький рівень цитокінів, ніж спленоцити з мишей, вакцинованих ЗСОКЕ. Проте, кількість І/12р7б, продукована у відповідь на М-5РЕХ, є більш високою, ніж кількість, продукована у випадку
УМЕС або наївних мишей, указуючи на антигенспецифічну імунну відповідь, індуковану цією імунотерапевтичною композицією на основі дріжджів. Очікується, що а-5РЕХ (С1І-13004; приклад 2), яка експресувала більш високі рівні антигену і індукувала СО4- проліферативну відповідь в аналізах, описаних у прикладах 9, будуть індукувати більш високі рівні продукції цитокінів.
Додаткові аналізи цитокінів проводили з використанням самиць мишей ВАГ В/с, імунізованих одним 3з тих же самих двох імунотерапевтичних продуктів на основі дріжджів. У цих експериментах самиць мишей ВАЇ В/с імунізували БСОКЕ (051-13002; познача "Зс" на фіг. З0А- 300), М-5РЕХ (С1-13005; які позначаються "Зр" на фіг. ЗОА-300), УУЕС (які позначаються "У" на фіг. ЗОА-300)), або не імунізували нічим (наївні, що позначаються "М" на фіг. ЗОА-300)) у такий спосіб: 2 Д.Е, дріжджового продукту вводили в 2 області на 0, 11, 39, 46, 60 їі 67 добу. Які в описаному вище експерименті, вводили антитіло проти СО40 в/о. Через дев'ять діб після останньої імунізації (76 доба) селезінки витягали, переробляли в суспензії окремих клітин і піддавали ІМ5 протягом 48 год. із сумішшю рекомбінантних поверхневого і корового білків НВМ (що позначається "НВМ Заджкоровий Ад" на фіг. ЗОА-300). Супернатанти збирали й оцінювали за допомогою І штіпех на продукцію І 18, 1-6, 11-13 ії І 12р70. ІЇ-6 являє собою прозапальний цитокін, що продукується антигенпредставляючими клітинами і Т-клітинами і, як вважають, він є важливим цитокіному у механізмі дії імунотерапевтичних продуктів на основі дріжджів. 1-13 60 також є прозапальним цитокіном, який продукується Т-клітинами і він високо схожий з ІЇ-4 і стимулює Тп2 СО: імунну відповідь.
Результати, представлені на фіг. ЗОА (1 -1рД), фіг. ЗОВ (1-6), фіг. ЗОС (1-13) ї фіг. 300 (1-12) показують, що спленоцити з імунізованих БХСОКЕ мишей продукували 1 -1р, 1-6, І.12ро і 1-13 у відповідь на суміш поверхневого і корового антигену, і що величина відповіді була більш високою, ніж для спленоцитів з імунізованих УМЕС або наївних мишей. Ця антигенна специфічність узгоджується з результатами, отриманими для ІРА у мишей ВАЇВ/с (див. приклад 9) і для аналізу вивільнення цитокінів у мишей С57ВІ/6 (див. вище).
Спленоцити з мишей, імунізованих М-5РЕХ, продукували антигенспецифічні сигнали для ЇЇ - 18 (фіг. З0А), але не для інших цитокінів. Як у випадку результатів для С57ВІ/6, ця помітна відмінність в ефективності між ЗХСОКЕ і М-5РЕХ може бути пояснене більш низьким вмістом антигену в останньому випадку. Очікується, що а-5РЕХ (яка експресує злитий білок, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:92, описаний у прикладі 2), що експресує більш високі рівні антигену, буде індукувати збільшену продукцію антигенспецифічних цитокінів, і, крім того, очікується, що аналізи ЇІМ5 за участю додаткових антигенів, які експресуються цим продуктом або іншими продуктами, що включають інші антигени НВМ (антигени Х і полімерази НВУМ) виявлять додаткову імуногенність.
Приклад 11
У наступному прикладі описане дослідження імуногенності іп мімо для імунотерапевтичної композиції проти НВМ на основі дріжджів.
У цьому експерименті імунотерапевтичний продукт на основі дріжджів (01І-13002), який експресує злитий білок, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:34, під контролем промотору СОР, також відомий "ЗСОМКЕ" і більш конкретно описаний у прикладі 1, використовували в способі адоптивного переносу, у якому Т-клітини 3 імунізованих З5СОКЕ мишей переносили реципієнтним мишам з тяжким комбінованим імунним дефіцитом (5СІЮ) перед імплантацією пухлини мишам СІЮ.
У короткому викладі, самиць мишей С57ВІ/6 (у віці 4-6 тижнів) підшкірно імунізували с1І- 13002 (ЗСОКЕ), УМЕС (дріжджі, що містять порожній вектор) або не імунізували нічим (наївні) у 2 області (2,5 Д.О. у бік, 2,5 Д.О. у задню частину шиї) на 0, 7 їі 14 добу. В одній групі імунізованих ЗСОКЕ мишей додатково внутрішньоочеревинно (в/о) ін'єктували 50 мкг антитіла проти СО40 на наступну добу після кожної імунізації. На 24 добу мишей умертвляли і тотальні спленоцити одержували і підраховували. Двадцять п'ять мільйонів спленоцитів у 200 мкл РВ5 в/о ін'єктували наївним реципієнтним самицям мишей СІЮ у віці 4-6 тижнів. Через двадцять чотири години після перенесення реципієнтів навантажували підшкірно (п/ш) в області грудної клітини 300000 пухлинних клітин ЕЇ 4, які експресуються антиген ЗСОКЕ (що позначаються "ЕЇ - 4-Зсоге"), або пухлинних клітин, які експресують сторонній антиген овальбуміну. Моніторинг росту пухлини проводили шляхом вимірювання за допомогою цифрового товщиномера з інтервалами 1-2 доби, починаючи на 10 добу після навантаження пухлиною.
Результати через 10 діб після навантаження пухлини, представлені на фіг. 31, продемонстрували, що спленоцити з мишей, імунізованих 5І-13002 (ЗСОРМЕ) або 01І-13002 «з антитіло проти СО40, але не з імунізованих УМЕС мишей або наївних мишей, індукували порівнянний захист від навантаження пухлинами ЕГ 4, які експресують антиген 5СОКЕ (фіг. 31, перший і другий стовпчики ліворуч). Кількість мишей з пухлинами через 10 діб після навантаження вказані вище кожного стовпчика на фіг. 31. Т-клітини з мишей, імунізованих (і- 13002, не мали ефекту на ріст пухлин ЕГ 4, які експресують сторонній антиген (не показаний).
Спленоцити з мишей, імунізованих УМЕС (фіг. 31, середній стовпчик) не впливали на ріст пухлини, оскільки розмір і кількість пухлин у цій групі були порівнянними з розміром і кількістю пухлин у мишей, яким не вводили спленоцити (фіг. 31, далекий правий стовпчик) або з розміром і кількістю пухлин у мишей, яким уводили спленоцити від наївних мишей (фіг. 31, другий стовпчик праворуч). Ці результати вказують на те, що імунізація імунотерапевтичною композицією на основі дріжджів, яка експресує злитий білок поверхневий антиген-коровий білок, генерує антигенспецифічну імунну відповідь, що захищає мишей СІЮ від навантаження пухлиною. Спільне введення активуючого дендритні клітини (0С) антитіла проти СО40 не впливало на ступінь захисту.
Приклад 12
У наступному прикладі описане дослідження імуногенності двох імунотерапевтичних композицій проти НВМ на основі дріжджів з використанням аналізів ЕГІЗрої на інтерферон-у (ІРМ-у).
Цей експеримент був призначений для оцінки двох оптимізованих імунотерапевтичних композицій на основі дріжджів, описаних у прикладі 7, відносно здатності індукувати специфічні 60 до антигену НВМ Т-клітини в мишей, імунізованих цими композиціями. В експерименті також досліджували, чи можна нові пептидні послідовності НВМ, змодельовані за допомогою комп'ютерних алгоритмів, і послідовності, отримані з опублікованої літератури, використовувати для повторної стимуляції Т-клітинних відповідей, що були згенеровані цими імунотерапевтичними композиціями.
У цьому експерименті імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, описану в прикладі 7 як 6І-13008 ("Зсоге-С", що містить 5ЕО ІЮ МО:116) і імунотерапевтичну композицію на основі дріжджів, описану в прикладі 7 як 5І-13013 ("Зрех-О", що містить ЗЕО ІЮ МО:110) оцінювали відносно імуногенності. Пептидні послідовності, використані в цьому експерименті, представлені в таблиці 7. Послідовності, що позначаються 2ОР-5 і 7ОР-7, узяті з опублікованої літератури, у той час як інші пептиди були ідентифіковані за допомогою комп'ютерних передбачаючих алгоритмів ВІМАЗ або ЗМЕРЕЇТНІ. Приставки "ОБ" або "Кр" стосуються гаплотипу мишей
С57ВІ/6: Н-205 і Н2-КБ, відповідно.
Таблиця 7 пептиду послідовності МНно НвУ рро-84 МУЗРОДОСІ. 0 ЗБОЮ МОлЛЗ38 01 Зад/ рр9-94 /ТМРАМРРРА 0 ЗБОЮ МОлЛЯТ 01 Зад/ рро-283 СОМІРУСРІИ. 0 ЗБОЮ МОлЯг/////// 01 Зад/ рр9-499 МСІКІВОМ. 0 ЗБОЮ МОЛЯЗ, 0 Коровий9 ("
Кр8-249 ІСРОУВМУМ 0 ЗБОЮ МОлЛЯє 01 За3/
Крв-2б2 ПЕС 0 ЗБОЮ МОлЛЯя5 01 За3/
Крв-277 МШОМОЯМ 777777 1ЗЕОІЮМОл39 7 01 За3/
Кр8-347 АЗМВЕЗММ. 0 ЗБОЮ МОлЛЯб 01 За3/
Кр8-360 ЕМОМУРМОЇ 0 ЗБОЮ МОлЛЯб 7/0 За3/
Кр8-396 ПЕРІЕЕЄЄ. 0/1 1ЗБОІЮМОЛЯ? зад 2Ор-5 УЗЕОУМЛІВТРРАУВРРМАРІ. ІЗЕБОІ0 МОЛ48 ЛИЙ Коровий: " (2О9р-7 5РЕРІ 0 І5Б0ОІ0ЮМОлЯя 0 За3/
Самиць мишей С57ВІ /6 (вік 4-6 тижнів) підшкірно імунізували С1І-13008 (бсоге-С), СІ-13013 (брех-ОЮ), УМЕС (контроль у вигляді дріжджів з порожнім вектором) або не імунізували нічим (наївні) у 2 області (2,5 Д.О. у бік, 2,5 Д.О. у задню частину шиї) на 0, 7 і 14 добу. На 20 добу мишей умертвляли і тотальні спленоцити одержували, видаляли з них еритроцити, підраховували і інкубували в кількості 200000 клітин/ямку протягом чотирьох діб в повному
ЕРМІ, що містить 595 ембріональну телячу сироватку разом з пептидними стимуляторами, приведеними в таблиці 7 (10 мкм для пептидів Ю? ї Ке; 30 мкг/мл для пептидів 2ОР) або сумішшю рекомбінантного 5Ад і корового антигену НВМ (всього З мкг/мл). Додавали конканавалін А як позитивний контрольний стимулятор.
Результати (фіг. 32) показують, що імунізація мишей С57ВІ /6 01І-13008 (бсоге-С) індукує відповіді в ЕГІ5рої на ІЄМ-у, спрямовані проти поверхневого (5) і корового антигенів НВМ з конкретною специфічністю відносно наступних пептидів: 09-84, Кр8-277 і/або Кр8-347, 7ИаР-5 і 7,арР-7. Ці пептиди індукували відповіді ІЕМу, що перевищують відповіді для ямок, що містять середовище окремо, або для ямок, що містять спленоцити з імунізованих 5І-13013 (брех-0), імунізованих УМЕС або наївних мишей. Суміш рекомбінантних антигенів 5-коровий антиген також індукувала відповідь ІЕМу, хоча контрольні клітини ММЕС у цій конкретній групі стимуляторів генерували фоновий сигнал, що виключав оцінку антигенспецифічного внеску для суміші антигенів Зжкоровий антиген. Ці дані вказують на те, що (І-13008 (Зсоге-С), що експресує злитий білок поверхневий антиген-коровий антиген, індукує специфічні до антигенів
НВМ імунні відповіді, які можна повторно стимулювати окремими пептидами ех мімо, і що ці відповіді в більшому ступені піддаються виявленню, ніж відповіді, індуковані 5І-13013 (Зрех-0).
Приклад 13
У наступному прикладі описаний експеримент, у якому імунотерапевтичну композицію проти
НВМ на основі дріжджів досліджували відносно здатності стимулювати продукцію ІЕМУ з мононуклеарних клітин периферичної крові (РВМС) від індивідуума, вакцинованого комерційною профілактичною вакциною проти НВУ.
У цьому експерименті імунотерапевтичний продукт на основі дріжджів, відомий як 1-13002 (Зсоге", що містить ЗЕБЕО І МО:34, приклад 1) досліджували відносно його здатності стимулювати продукцію ІЄМу з РВМС, виділених з індивідуума, якого вакцинували комерційною профілактичною вакциною проти НВМ (ЕМОСЕКІХ-ВУ, СІахобтіййКіїпе), яка являє собою профілактичну вакцину, що містить рекомбінантний очищений поверхневий антиген вірусу гепатиту В (НВ5ЗАд), адсорбований на ад'юванті на основі алюмінію.
У короткому викладі, проводили узяття крові і РВМС виділяли від здорових не наївних по
НВМ людей, у яких експресувався алель НІ А-А"0201. РВМС заморожували для наступного аналізу. Потім індивідуума вакцинували ЕМСЕВІХ-В- (ін'єкція 1), проводили узяття крові на 12 і 29 добу після ін'єкції і РВМС виділяли і заморожували. Індивідуума вакцинували друг раз
ЕМСЕВІХ-В2 (ін'єкція 2, "допоміжна ін'єкція") і проводили узяття крові на 10, 21 і 32 добу після допоміжної ін'єкції. Для кожного моменту часу РВМС виділяли і заморожували.
Після одержання і заморожування серії зразків РВМС клітини для всіх моментів часу розморожували, промивали і інкубували з контролем у вигляді дріжджів з порожнім вектором (УМЕС) або з 0І-13002 у співвідношенні дріжджі""ВМмМС 5:1 протягом З діб в інкубаторі при 372С/5 95 СО». Потім клітини переносили в планшет для ЕЇ ІЗрої на ІЄМу, інкубували протягом 18 год. і обробляли для проявлення ЕГ ІЗрої відповідно до стандартних методик.
Як показано на фіг. 33 (стовпчики позначають періоди часу до і після примуючої імунізації або після допоміжної імунізації), для оброблених 5І-13002 РВМС спостерігали значну відповідь у ЕПІЗрої, що перевищувала відповідь РВМС, оброблених УУЕС, у момент часу 21 доби після допоміжної імунізації (ЕГІЗрої для І-13002 мінус ЕГІЗрої дл УМЕС -- 230 точок на один мільйон
РВМО). Рівень ЕГіІЗрої для Зсоге з відрахуванням УМЕС був вище кількості, що спостерігається для інших моментів часу, і в 2,8 рази перевищував сигнал, отриманий для зразка до вакцинації.
Єдиною істотною структурною відмінністю між композиціями на основі дріжджів 1-13002 і УМЕС є присутність злитого білка поверхневий антиген-коровий антиген (антиген НВМ) у векторі, що міститься в І-13002 (тобто УУЕС мають "порожній" вектор). Таким чином, результат указує на те, що 0І-13002 індукувала антигенспецифічну стимуляцію Т-клітин у РВМС індивідуума.
Оскільки вакцина ЕМСЕКІХ-ВУ містить рекомбінантний поверхневий антиген, але не коровий антиген, і оскільки індивідуум був негативним по вірусу НВМ (не були інфіковані НВМ), цей результат також указує на те, що продукція ІЕМу, що спостерігається, походила зі специфічних до НВзЗАЯд (специфічного до поверхневого антигену), а не зі специфічних до корового антигену,
Т-клітин.
Приклад 14
У наступному прикладі описана оцінка імунотерапевтичних композицій проти НВМ на основі дріжджів іп мімо у моделях імунізації на мишах.
У цьому експерименті імунотерапевтичний продукт на основі дріжджів, відомий як 1-13009 (ЗСОВЕ-О", що містить ЗЕО ІЮО МО:118, приклад 7), і імунотерапевтичний продукт на основі дріжджів, відомий як І-13020 ("Х-ЗСОКЕ", що містить ЗЕО ІЮ МО:130, приклад 8) уводили мишам С57ВІ/б6, мишам ВАГВ/с і трансгенним мишам по НГА-А2 (В6.Са9-Та(НІ А-А/Н2- 0)2Епделу); Тпе Уаскзоп І арогайогу, надані по ліцензії від Опімегейу ої Мігдіпіа Раїепі Еоипааїйоп).
Трансгенні миші по НГА-А2, використані в цих експериментах, експресують міжвидовий гібридний ген МНС класу І, ААБО, що містить домени альфа-1 і альфа-2 гени НІ А-А2.1 людини і альфа-3 трансмембранний і цитоплазматичний домени гени Н-209 миші, під контролем промотору НГА-А2.1 людини. Химерна молекула МНС класу І НІГА-А2.1/Н2-09 опосередковує ефективну позитивну селекцію Т-клітин миші для забезпечення більш повного репертуару Т- клітин, здатних розпізнавати пептиди, що представляються молекулами класу І НІ А-А2.1.
Пептидні епітопи, що представляються і розпізнаються Т-клітинами миші в контексті молекули класу І НГ А-А2.1/Н2-0 є такими ж, як епітопи, що представляються в людей НІ А-А2.1:. Таким чином, ця трансгенна лінія забезпечує моделювання Т-клітинних імунних відповідей людини на
НГА-А2 антигени, які представляються.
Метою цих експериментів була оцінка широти і величини антигенспецифічних імунних відповідей проти НВМУ, що генеруються шляхом імунізації імунотерапевтичними композиціями на основі дріжджів у мишей з різними алелями МНС, включаючи мишей, які експресують молекулу МНС (НГА) людини. Дослідження імуногенності проводили після імунізації шляхом стимуляції ех мімо селезінки або лімфатичних вузлів відповідними антигенами НВМ з наступною оцінкою Т-клітинних відповідей за допомогою: двоколірного ЕГІЗрої на ІЕМ-УуЛІ-2, аналізу проліферації лімфоцитів (ІРА), аналізу множини цитокінів І штіпех і/або внутрішньоклітинного фарбування цитокінів (ІСС5). ІСС5 використовували для визначення внеску СО4- ії СО8-т- клітин в антигенспецифічну продукцію ІЕМ-у ії ТМЕ-а.
У кожному з експериментів, описаних нижче, мишей підшкірно вакцинували імунотерапевтичними композиціями проти НВМ на основі дріжджів або контролем на основі дріжджів (описаним нижче) відповідно до того ж режиму: ін'єкція в 2 області (бік, задня частина шиї) 2,5 Д.О. дріжджової композиції на область, один раз на тиждень протягом 3 тижнів. 60 Контролі включали УМЕС (контрольні дріжджі, що містять порожній вектор, тобто не міститьо антигену), ОМАХ2010 (контрольна імунотерапевтична композиція на основі дріжджів, що експресує антиген не з НВУ, овальбумін), і комбінація УМЕС з розчинними рекомбінантними антигенами (антигени овальбуміну або НВУ) і антитіло проти СО40. Конкретні експерименти і групи введення представлені в таблицях 8 і 9 нижче. Мишей умертвляли через 8 діб (трансгенні по НГА-А2, експеримент 1) або 14 діб (С57ВІ /6 і ВАЇ В/с, експеримент 2) після третьої імунізації, і селезінку і пахові лімфатичні вузли вирізували і інкубували з різними антигенними стимулами (обмежені по МНС класу І і класу ІЇ пептиди НВУ, рекомбінантний білки і експресуючі антиген
НВМУ пухлинні клітинні лінії) протягом 5 діб, як вказано нижче. Для аналізу І итіпех, культуральні супернатанти збирали й оцінювали відносно продукування 10 різних цитокінів (тип ТА їі ТА2) через 48 год. після додавання антигену. Для аналізів ЕГІЗрої, клітини інкубували на планшетах, покритих антитілом проти ІЄМ-у, протягом останніх 24 год. стимуляції іп міго (ІМ5) протягом 5 діб, з наступною стандартизованою детекцією і підрахунком точок. Для ГІ РА клітини обробляли
ЗН-тимідином протягом останніх 18 год. ІМ5 протягом 5 діб, а потім вимірювали кількість ізотопу, включеного в знову синтезовану ДНК, шляхом сцинтиляційного підрахунку. ІСС5, після стимуляції протягом повних 7 діб, піддавали градієнтному центрифугуванню в РісоїЇ для усунення загиблих клітин, а потім 1 мільйон життєздатних клітин на ямку (96-ямкові планшети з
МО-подібним дном) інкубували протягом 5 годин з тими ж самими антигенними стимулами в діапазоні концентрацій (титрування), а потім забезпечували їхню проникність і піддавали фарбуванню зв'язаними з флуорохромом антитілами, що розпізнають внутрішньоклітинний ІЕМ- у ії ТМЕ-а разом з маркерами клітинної поверхні СО4 і СО8. Відсоток СО4" або СО8- Т-клітин, які експресують цитокіни, визначали протоковою цитометрією.
У таблиці 8 описані експериментальні групи і протокол експерименту 1. У цьому експерименті, групи мишей з НГА-А2 імунізували з використанням протоколу, описаного вище, і мишей умертвляли для імунного аналізу через 8 діб після третьої імунізації. У групі А ("МЕС") уводили контрольні дріжджі УМЕС відповідно до схеми імунізації, описаної вище; у групі В ("ЗСОВЕ-О (С01-13009-01233 уводили 0І-13009, вирощені в середовищі ШІ 2 (див. приклад 7) відповідно до схеми імунізації, описаної вище; і в групі С ("Х-5СОВЕ (С1-13020-02)) уводили 051І- 13020, вирощені в середовищі 02 (див. приклад 8) відповідно до схеми імунізації, описаної вище.
Таблиця 8 в 77777771 805СОВЕ0/бІ1300942....777777771
Результати аналізу ЕГІЗрої на ІРМ-у з клітин лімфатичних вузлів, зібраних з мишей в експерименті 1, представлені на фіг. 34. На цій фігурі представлені результати повторної стимуляції клітин лімфатичних вузлів з імунізованих мишей різними пептидами НВУ у порівнянні з контролем у вигляді середовища (слід зазначити, що пептид, що позначається як "ТКО20", являє собою пептид з Х-антигену (Х52-60), що міститься в імунотерапевтичній композиції Х-
ЗСОКЕ, але не є присутнім у «СОКЕ-О). Результати показали, що клітини лімфатичних вузлів як з мишей, імунізованих ЗХСОКЕ-О (С11-13009), так з мишей, імунізованих Х-5СОВЕ ((І-13020), містять Т-клітини, що продукують ІЕМ-у у відповідь на стимуляцію іп міго сумішшю З мкг/мл кожного з рекомбінантного поверхневого і корового антигенів НВМ (фіг. 34; що позначаються як "58С3"). Ця відповідь ЕГІЗрої перевищувала відповідь, що спостерігалася для імунізованих
ММЕС мишей (дріжджові контролі), яких лікували тим же стимулятором, що вказує на те, що поверхневий і/або коровий антигени НВМУ у імунотерапевтичних композиціях на основі дріжджів (ЗСОВЕ-О і Хх-ЗСОКЕ) вимагаються для індукції відповіді ІЕМ-у. Більше того, результати вказують на те, що повторна стимуляція з використанням антигену НВМ у ІМ5 приводить до ефективної продукції ІЕМ-у, оскільки ямки, що містили середовище окремо, продемонстрували значно нижчу відповідь ЕГІзрої.
На фіг. 34 також показано, що окремий обмежений по НІ А-А2 епітоп з корового антигену
НВМ (ТКР16; Соге:115-124 МІ'ЕЄМІ М5ЕСУ; 5ЕО ІЮО МО:75), відомий у даній галузі тим, що він є важливим у пацієнтів з гострою інфекцією і кліренсом НВУ, індукує відповідь в імунізованих у мишей, імунізованих Х-ЗСОКЕ, що перевищує відповідь, яка спостерігається для всіх ямок, у яких було тільки середовище. Очікується, що подальше уточнення концентрації пептиду і часу інкубації для аналізу ЕГ ІЗрої, збільшить величину і знизить варіабельність відповіді, що спостерігається, для цих антигенів.
На фіг. 35 показані результати аналізу ЕГІЗрої на ІЄМ-у для клітин селезінки, отриманих від мишей, імунізованих ЗСОКЕ-О, в експерименті 1. Коровий пептид НВМ, що позначається як "Соге11-27" (АТМЕГ І. ЗР РБОРЕРЗМ (ЗЕО ІЮ МО:72)) міститься в антигені, який експресується
ЗСОВЕ-0, у той час як Х-пептид НВУ, що позначається як "Х92-100" не міститься в антигені, який експресується 5СОМКЕ-О, і, таким чином, він є контрольним пептидом у цьому експерименті. Як показано на фіг. 35, клітини селезінки з трансгенних по НІ А-А2 мишей, імунізованих ЗСОНЕ-О, викликали відповідь у ЕГІЗрої на ІЄМ-у при стимуляції іп міго відомим обмеженим по НІ А-А2 епітопом корового антигену НВМ, що позначається як "Соге11-27". Ця відповідь перевищувала відповідь, що спостерігається для клітин селезінки, які стимулювали іп мійго стороннім пептидом (що позначається як "Х92-100"7), середовищем окремо, або для спленоцитів з мишей, імунізованих УУЕС у будь-яких ямках з обробкою ІМ5.
Таким чином, первинні результати з експерименту 1 показують, що як БХСОКЕ-О, так і хХ-
ЗСОКЕ, індукують специфічні до антигену НВМ Т-клітинні відповіді в трансгенних по НІ А-А2 мишей, імунізованих цими імунотерапевтичними композиціями на основі дріжджів.
У таблиці 9 описані експериментальні групи і протокол для експерименту 2. У цьому експерименті групи мишей С57ВІ/6 і ВАГ В/с імунізували з використанням протоколу, описаного вище, і мишей умертвляли для імунного аналізу через два тижні після третьої імунізації. У групі
А ("наївні") не проводили лікування; у групі В (УМЕС") уводили контрольні дріжджі МЕС, відповідно до схеми імунізації, описаної вище; у групі С ("Х-5СОВЕ (С1І-13020-02)) уводили 01І- 13020, вирощені в середовищі 02 (див. приклад 8) відповідно до схеми імунізації, описаної вище; у групі О ("ЗСОКЕ-О ((1-13009-01233 уводили СІ-13009, вирощені в середовищі ШІ 2 (див. приклад 7) відповідно до схеми імунізації, описаної вище; і в групі Е ("(ОМАХ2010") уводили контрольні дріжджі, які експресують овальбумін, відповідно до схеми імунізації, описаної вище.
Таблиця 9 проводиться) проводиться) ст ши 7 оп ПО: Я 5 со 0 7 | 8.5СОВЕ-0(0І-13009-012) | 8.5СОВЕ-О(0І-13009-Щ12) Щщ
На фіг. 36 показані результати аналізів ЕГІзрої для клітин лімфатичних вузлів, виділених з мишей С57ВІ/6, імунізованих, як вказано в експерименті 2 (таблиця 9). Ці результати продемонстрували, що як Х-ЗСОКЕ, так і 5СОКЕ-О, індукували відповіді ІЕМ-у у мишей
С57ВІ/6 дикого типу. Клітини лімфатичних вузлів мишей, імунізованих Х-ЗСОКЕ, стимульовані іп міго очищеними експресованими Ріспіа равіогіз поверхневим і коровим антигенами (що позначаються ус; ІМ5 із сумішшю 1:1 експресованих Ріспіа поверхневого і корового антигенів, по З мкг/мл кожного), викликали значну імунну відповідь ІЕМ-у. Ті ж препарати клітин лімфатичних вузлів з мишей, імунізованих як Х--СОКЕ, так і БХСОКЕ-О, коли їх стимулювали експресованими Е. соїї поверхневим і коровим антигенами (що позначаються сс; ІМ5 із сумішшю 1:1 експресованих Е. соїї поверхневого і корового антигенів, по З мкг/мл кожного), продукували більш високі загальні відповіді в ЕІ ІЗрої, ніж відповіді, що спостерігаються для експресованих Ріспіа рекомбінантних антигенів. У стовпці, позначеному "без стимуляції" на фіг. 36 позначені умови ІМ5, де надавали середовище СЕРМІ окремо (без антигену). Як правило, імунізація Х-ЗСОКЕ індукувала більший ефект, ніж 5СОКЕ-О, і обидві імунотерапевтичні композиції проти НВМ на основі дріжджів індукували більш високу відповідь, ніж спостерігалося для імунізованих УУЕС (контрольні дріжджі) або наївних мишей. Ці дані вказують на те, що як
ЗСОВЕ-0О, так і Х-5СОКЕ індукують специфічні до антигену НВМУ імунні відповіді, що піддаються виявленню в клітинних препаратах лімфатичних вузлів ех мімо з мишей С57ВІ /6.
На фіг. 37 показані результати аналізу внутрішньоклітинного фарбування цитокінів (СС) для мишей С57ВІ/6, проведеного в експерименті 2 (таблиця 9). Результати показали, що імунізаця мишей С57ВІ/6 або Х-5ЗСОКЕ, або 5СОВЕ-0О, індукує ІРМ-у-продукуючі СО8-Т- клітини, що є специфічними обмеженого по Н-2К? МНС класу І пептиду з поверхневого антигену, що позначається "ММ" (МУМІ ЗМІМУМ; 5ЕО ІЮО МО:152). Цей ефект залежав від концентрації пептиду, доданого до клітин, у ході інкубації протягом 5 годин у процесі ІСС5; більш високі концентрації пептиду приводили до збільшення відмінності в рівні ІЕМ-у- продукуючих СО8"Т-клітин для імунотерапевтичних композицій проти НВМ на основі дріжджів
(ЗСОВЕ-О і Х-ЗСОКЕ) відносно сторонніх контрольних дріжджів (Омах і Умес), з максимальною відмінністю при 10 мкг/мл пептиду.
Аналізи ІСС5 експерименту 2 також показали, що імунізація мишей С57ВІ /6 Х-5СОКЕ і
ЗСОВЕ-О індукувала ІЕМ-у-продукуючі СО4-Т-клітини, специфічні до обмеженого по МНС класу
ІЇ пептиду НВМ з корового білка, що позначається як "2ОР-5" (УЗЕСМУММІАВТРРАУВРРМАРІЇ; 5ЕО
ІО МО:148) з додаванням 0,5 мкг/мл пептиду в ході періоду інкубації протягом 5 годин у процесі
ІСС5 (фіг. 38).
Узяті разом з результатами ЕГІЗрої описаними вище, ці дані вказують на те, що імунотерапевтичні композиції на основі дріжджів як ЗСОКЕ-О, так і Х-ЗСОКЕ, індукують специфічні до антигену НВМ еффекторні СО4: ії СО8Т-клітини, що виявляються шляхом стимуляції ех мімо клітин лімфатичних вузлів і селезінки рекомбінантними антигенами НВМ і пептидами НВУ. Т-клітинні відповіді з'являються як у мишей С57ВІ /б дикого типу (Н2-Кб), так і в трансгенних по НГА-А?2 мишей, указуючи на потенціал цих вакцин відносно індукції імунних відповідей у контексті різноманітних типів головного комплексу гістосумісності.
Виходячи з результатів, описаних у цьому прикладі вище для мишей НІА-А2 і мишей
С57ВИ/б, а також результатів експериментів, описаних у прикладах 9, 10, 11 і 12, очікується, що результати для мишей ВАЇВ/с, імунізованих або 5СОМЕ-О, або Х-5СОРЕ, також продемонструють, що імунотерапевтичні композиції проти НВМ на основі дріжджів індукують антигенспецифічні ефекторні СО4- ї СО8-Т-клітини в цих мишей. Дійсно, первинні результати для груп ВАГ В/с були позитивними по СО8-"Т-клітинних відповідях (дані не представлені). Крім того, очікується, що аналізи проліферації лімфоцитів і аналізи вивільнення цитокінів Гитіпех покажуть, що як ЗСОКЕ-О, так і Х-5СОКЕ, індукують імунні відповіді, специфічно націлені на послідовності антигену НВУ, які присутні у імунотерапевтичних композиціях на основі дріжджів, і що ці відповіді будуть спостерігатися у всіх трьох лініях мишей (трансгенні по НІ А-А2, С57ВІ /6 і
ВА! В/с).
Приклад 15
У наступному прикладі описаний експеримент, у якому імунотерапевтичні композиції проти
НВМ на основі дріжджів оцінюють відносно здатності стимулювати продукцію ІЕМу з РВМС, виділених з донорів з різним впливом антигенів НВМ.
У цьому експерименті імунотерапевтичний продукт на основі дріжджів, відомий як 1-13009 ("Зсоге-О", що містить ЗЕО ІЮ МО:118, приклад 7), і імунотерапевтичний продукт на основі дріжджів, відомий як 5І-13020 ("Х-Зсоге", що містить ЗЕО ІЮ МО:130, приклад 8) досліджують відносно їхньої здатності стимулювати продукцію ІЕМу з РВМС, виділених з донорів з різним впливом антигенів НВМ. У цьому експерименті одну групу донорів раніше вакцинували
ЕМСЕВІХ-Ве (СіахобзітпййКіїпе) або КЕСОМВІМАХ НВ (Мегск 4. Со., Іпс.), одна група донорів є наївною відносно антигену НВМ ("нормальна"), і одна група донорів являє собою пацієнта з хронічним НВМ (індивідуум, хронічно інфікований НВМ) ЕМСЕКІХ-В? являє собою профілактичну рекомбінантну субодиничну вакцину, що містить рекомбінантний очищений поверхневий антиген вірусу гепатиту В (НВ5ЗАд), що продукується у клітинах дріжджів, очищений, а потім адсорбований на ад'юванті на основі алюмінію. ВЕСОМВІМАХ НВ? являє собою профілактичну рекомбінантну субодиничну вакцину, що походить з поверхневого антигену НВМ (НВзАЯд), яка продукується в клітинах дріжджів і очищену так, щоб вона містила менш 1 95 дріжджових білків. У всіх донорів експресується алель НІ А-А"0201.
РВМС донорів інкубують у чашках з 6 комірками з плоским дном для культивування тканин (107 РВМС на комірку) протягом З год. в інкубаторі з 5 95 СО»: у повному середовищі ЕРМІ, що містить 10 95 ембріональну телячу сироватку. Клітини, що не прикріплюються, видаляють і відкидають, а клітини, що прикріплюються, обробляють рекомбінантним інтерлейкіном-4 людини (1-4) їі рекомбінантним гранулоцитарно-макрофагальним колонієстимулюючим фактором людини (5М-С5БЕ) (20 ї 50 нг/мл, відповідно) протягом 5 діб для одержання незрілих дендритних клітин (ОС). Потім С інкубують з антитілом проти СО40 (1 мкг/мл), ММЕС (контрольні дріжджі, що містять порожній вектор), або продуктами на основі дріжджів (1-13020 або СІ-13009, протягом 48 год. в інкубаторі з 5 95 СО» при 37"С, з одержанням зрілих ОС. Для оброблених антитілом проти СО40 ОС, клітини додатково обробляють обмеженими по НІА-
А"0201 пептидами НВУ з використанням стандартних способів. Усі групи ОС промивають РВ5, а потім витягають з чашок за допомогою харвестера в РВ5. Клітини опромінюють (30 Гр) і використовують для стимуляції аутологічних донорських РВМС у співвідношенні ОС:РВМОС 1:10.
Стимуляцію проводять протягом 7 діб (раунд 1), з яких останні 4 доби проводять у середовищі, що містить рекомбінантний І/-2 людини. Потім стимульовані РВМС піддають градієнтному центрифугуванню в РісоїЇ, Її виділені життєздатні клітини піддають другому раунду ІМ5 з 60 обробленими дріжджами або обробленими пептидом ОС, отриманими, як описано вище. Потім стимульовані РВМС інкубують з пептидом(ами) НВМУ або контролями в присутності 20 О/мл гПІ-- 2 у 96-ямкових планшетах, покритих антитілом, специфічним до ІЕМ-у, і проводять виявлення в
ЕГІБрої з використанням стандартних методик виготовлювача. Очікується, що РВМС, стимульовані аутологічними ОС, підживлюваними 5СОКЕ-О або Х-5СОКЕ, або ОС, обробленими пептидом НВУ, будуть відповідати на екзогенні пептиди НВМ у більшому ступені, ніж РВМС, стимульовані підживлюваними УМЕС або необробленими ОС, і що цей ефект буде більш вираженим для реципієнтів вакцин НВМ ЕМСЕВБІХ? або РЕСОМВІМАХ НВ, ніж для донорів, що є наївними відносно впливу антигену НВУ.
Приклад 16
У наступному прикладі описані доклінічні експерименти з використанням РВМС людини для демонстрації імуногенності імунотерапевтичних композицій проти НВМ на основі дріжджів за винаходом в людини.
Зокрема, ці експерименти призначені для визначення того, чи можна специфічні до поверхневого антигену НВМ і/або специфічні до корового антигену НВМ СО8-Т-клітини виявляти в мононуклеарних клітинах периферичної крові (РВМС) носіїв НВМУ після 2 раундів стимуляції іп міго (ІМ5) імунотерапевтичними композиціями проти НВМ на основі дріжджів, що містять поверхневий антиген НВМУ і коровий антиген НВУ.
РВМС одержують з донорів людини, для яких підтверджено, що вони є позитивними по НВМ (виходячи зі статусу НВ5ЗАд у сироватці). Тотальну ДНК виділяють з 0,5 мл цільної крові і типують на НГА для ідентифікації правильного пентамера НВМ для дослідження (див. таблицю нижче).
Таблиця 10
Дендритні клітини (ОС) одержують з РВМС, виділених з донорів, описаних вище, шляхом культивування РВМС протягом 5 діб в присутності ЗМ-С5Е і І/-4. Потім ОС інкубують з імунотерапевтичними композиціями проти НВМ на основі дріжджів (наприклад, імунотерапевтичними композиціями, описаними в будь-якому із прикладів 1-8 або в інших розділах даного опису) або контрольними дріжджами (наприклад, "УМЕС", що являють собою дріжджі Засспаготусез сегемізіає, що трансформовані порожнім вектором, або вектором, що не містить вставку, яка кодує антиген), у співвідношенні 1:1 (дріжджі:0ОС). Контрольні культури ОС також включають ОС, інкубовані з пептидами НВУ, контрольними пептидами (пептидами не з
НВУ) або ні з чим.
Після співкультивування протягом 48 год. ОС використовують як антигенпредставляючі клітини (АРС) для стимуляції аутологічних Т-клітин (тобто Т-клітин з донорів). Кожен цикл стимуляції, що позначається як ІМ5 (стимуляція іп міїго), складається з культивування протягом
З діб під час відсутності ІІ -2, а потім протягом 4 додаткових діб в присутності рекомбінантного
І/-2 (20 О/мл). Наприкінці ІМ5 2, Т-клітини забарвлюють контрольним тетрамером або пентамером, або тетрамером або пентамером, специфічним до пептидного епітопу НВМУ, ідентифікованого вище. Відсоток СО8-Т-клітин, які забарвлюються позитивно тетрамером або пентамером, кількісно визначають протоковою цитометрією.
Очікується, що стимуляція донорних Т-клітин з НВМ-позитивних донорів імунотерапевтичною композицією проти НВМ на основі дріжджів за винаходом, збільшить відсоток позитивних по тетрамеру/пентамеру СО8-Т-клітин щонайменше в деяких або в більшості донорів, у порівнянні з контролями, указуючи на те, що Т-клітини людини з інфікованих НВУ індивідуумів здатні розпізнавати білки НВМУ, що містить імунотерапевтичний засіб на основі дріжджів як імуногенів.
Додаткові експерименти, схожі з експериментами, описаними вище, проводять з використанням донорських РВМС з нормальних (не інфікованих НВУ) індивідуумів. Очікується, що стимуляція донорських Т-клітин з нормальних донорів імунотерапевтичною композицією на основі дріжджів НВМ за винаходом збільшує відсоток позитивних по тетрамеру/пентамеру
СО8 Т-клітин щонайменше в деяких або в більшості донорів, у порівнянні з контролями, указуючи на те, що Т-клітини людини з неінфікованих індивідуумів також мають здатність розпізнавати білки НВМ, що містяться в імуноттерапевтичному засобі на основі дріжджів як імуногенів.
У додатковому експерименті, НВМ-специфічні Т-клітини з трьох донорів з експериментах, описаних вище, збільшують у кількості іп мійго з використанням ОС, інкубованих з імунотерапевтичними композиціями проти НВМ на основі дріжджів (наприклад, композиціями, описаними в будь-якому із прикладів 1-8 або в інших розділах даного опису) протягом 2 циклів
ІМ5 (як описано вище). Третю ІМ5 проводять за допомогою ОС, що дозріли в присутності СО40І. і оброблених пептидом(ами) НВМ. На 5 добу СО8-Т-клітини виділяють і використовують в аналізі цитотоксичних Т-лімфоцитів (СТІ) протягом ночі проти мішеней у вигляді пухлинних клітин, які експресують антигени НВУ, при різних співвідношеннях ефектор:мішень (ЕТ).
Вимірюють відсоток СО8-Т-клітин, що позитивно забарвлюються контрольним тетрамером/пентамером проти НВМ-специфічного тетрамера/пентамера.
Очікується, що Т-клітини з деяких або усіх з донорів будуть здатні генерувати СО8-СТІ, що можуть знищувати мішені, які експресують антигени НВМ. Ці дані продемонструють, що імунотерапевтичні композиції проти НВМ на основі дріжджів можуть генерувати специфічні до
НВМ СТІ, що здатні знищити експресуючу антигени НВМУ пухлинну клітину.
Приклад 17
У наступному прикладі описане клінічне випробування фази 1 у здорових добровольців. 12-тижневе відкрите клінічне випробування фази 1 зі збілошенням дози проводять з використанням імунотерапевтичної композиції проти НВМУ на основі дріжджів, описаної в даному описі як 5І-13009 ("ЗСОВЕ-О", що містить БЕО ІЮ МО:118, приклад 7), або альтернативно використовують імунотерапевтичну композицію проти НВМ на основі дріжджів, описану в даному описі як (І-13020 ("Х-5СОМКЕ", що містить ЗЕО ІЮ МО:130, приклад 8). Можна використовувати інші імунотерапевтичні композиції проти НВМ на основі дріжджів, описані в даному описі (наприклад, будь-які з композицій, описаних у прикладах 1-8) у подібних клінічних випробуваннях фази 1. Імунотерапевтичний продукт проти НВМ на основі дріжджів для клінічного випробування фази 1 вибирають на основі доклінічних випробувань (наприклад, доклінічних випробувань, описаних у будь-якому із прикладів 9-17), виходячи з факторів, що включають найбільш сильний сумарний профіль імунної відповіді (наприклад, амплітуда відповіді для Т-клітинних епітопів, що найбільшою мірою передбачають позитивний результат, і/або широта імунної відповіді серед діапазону епітопів).
Індивідууми являють собою добровольців з активною і здоровою імунною системою без попередніх або поточних ознак або даних про інфекцію НВУ.
Приблизно 48 індивідуумам (6 груп, 8 індивідуумів на групу), що задовольняють ці критерії, уводять імунотерапевтичну композицію проти НВМ на основі дріжджів у протоколі для груп з послідовним збільшенням дози з використанням одного або двох з наступних протоколів дозування:
Протокол А: Дозування для примування-допоміжної імунізації (4 дози раз на тиждень, починаючи з 1 доби, а потім 2 дози раз на місяць на 4 тижні і 8 тижні)
Група 1А: 20 Д.О. (вводи дозами 10 Д.О. у 2 різні області);
Група 2А: 40 Д.О. (вводи дозами 10 Д.О. у 4 різні області);
Група ЗА: 80 Д.О. (вводяться в дозах 20 Д.О. у 4 різні області) 4 дозування раз на тиждень (три загальних дози, що вводяться на 1 добу, 4 тижні і 8 тижні)
Група 18: 20 Д.О. (вводяться в дозах 10 Д.О. у 2 різні області);
Група 2В: 40 Д.О. (вводяться в дозах 10 Д.О. у 4 різні області);
Група ЗВ: 80 Д.О. (вводяться в дозах 20 Д.О. у 4 різні області)
Усі дози вводять підшкірно і дозу розділяють на дві або чотири області організму (кожне відвідування), як вказано вище. Оцінюють безпеку і імуногенність (наприклад, відповіді антигенспецифічних Т-клітин, які вимірюються за допомогою ЕГіІЗрої і проліферації Т-клітин).
Зокрема, розробляють алгоритм на основі ЕГІЗрої для безумовно відповідних пацієнтів. Також проводять аналізи ЕГІЗрої, кількісно визначальні регуляторні Т-клітини (Тгед) і проліферацію бра-Т-клітин у відповідь на антигени НВМ оцінюють і зіставляють з розвитком антитіл проти засспаготусевз сегемівіає (АЗСА).
Очікується, що імунотерапевтична композиція проти НВМ на основі дріжджів буде добре переноситися і покаже імуногенність при вимірюванні в одному або декількох з аналізу ЕГ ІЗрої, аналізу проліферації лімфоцитів (І РА), стимуляції Т-клітин антигенами НВУ ех мімо, і/або АЗСА.
Приклад 18
У наступному прикладі описане клінічне випробування фази 1бБ/2а в індивідуумів, хронічно інфікованих вірусом гепатиту В. 60 Унаслідок тенденції в інфікованих НВМ пацієнтів до появи дестабілізуючих загострень гепатиту як частини природного анамнезу захворювання, після деякого періоду часткового або повного вірологічного контролю починають імунотерапію проти НВМ на основі дріжджів з використанням терапії, основаної на противірусному засобі, з первинною метою ефективності, яка полягає в поліпшенні частоти сероконверсії. У цьому першому підході закріплення, імунотерапію проти НВМ на основі дріжджів використовують у пацієнтів після досягнення ними заперечності по ДНК НВУ в аналізі ПЛР для визначення того, чи може бути збільшена частота сероконверсії в комбінації з триваючою противірусною терапією.
Відкрите клінічне випробування фази 1бБ/г2а зі збільшенням дози проводять з використанням імунотерапевтичної композиції проти НВМ на основі дріжджів, описаної в даному описі як сІ- 13009 ("ЗСОВЕ-0", що містить ЗЕО ІЮ МО:118, приклад 7), або альтернативно використовують імунотерапевтичну композицію проти НВМ на основі дріжджів, описану в даному описі як сі- 13020 ("Х-5СОВЕ", що містить 5ЕО І МО:130, приклад 8). Можна використовувати інші імунотерапевтичні композиції проти НВМ на основі дріжджів, описані в даному описі (наприклад, будь-яка з імунотерапевтичних композицій, описаних у прикладах 1-8) у подібному клінічному випробуванні фази 1. Індивідууми являють собою індивідуумів, що мають активну імунну систему і хронічно інфікованих вірусом гепатиту В (НВМ), які добре контролюються противірусною терапією (тобто тенофовіру дизопроксил фумарат, або ТОЕ (МІБЕАЮ-)) при вимірюванні по рівнях ДНК НВМУ. Індивідууми є негативними відносно ДНК НВМ (нижче піддаються виявленню рівнів способом ПЛР або «2000 Мо/мл), але для відповідності вимогам цього випробування індивідууми повинні бути позитивними по НВеАд і повинні не мати ознак цирозу або декомпенсації.
На першій стадії цього випробування приблизно 40 індивідуумам (75 індивідуумів на групу), що задовольняють ці критерії, уводять імунотерапевтичну композицію проти НВМ на основі дріжджів у протоколі для груп з послідовним збільшенням дози, з використанням діапазонів доз від 0,05 Д.О. до 80 Д.О. (наприклад, 0,05 Д.О., 10 Д.О., 20 Д.О. і 40-80 Д.О.). В одному протоколі будуть уводити 5 доз раз на тиждень підшкірно (дозування раз на тиждень протягом 4 тижнів), а потім також будуть підшкірно вводити 2-4 дози раз на місяць, із триваючою противірусною терапією в ході лікування імунотерапією проти НВМ на основі дріжджів (протокол примування- допоміжна імунізація). В другому протоколі слідують протоколу дозування раз на 4 тижні, де індивідууму уводять всього три дози, що вводяться на 1 добу, 4 тижні і 8 тижні, з використанням стратегії збільшення дози, вказаної вище. Необов'язково, в одному випробуванні в одній групі пацієнтів (5-6 пацієнтів) будуть проводити підшкірні ін'єкції плацебо (РВ5) по тій же схемі, що і для імунотерапії плюс триваюча противірусна терапія. Існують консервативні правила припинення для різкого зростання рівня АЇ Т і ознак декомпенсації.
На другій стадії цього випробування пацієнтів (п-60) випадковим чином розподіляють по 30 на групу для продовження противірусної терапії (ТОЕ) окремо або протоколу противірусної терапії разом з імунотерапевтичним засобом на основі НВУ (доза 1 і доза 2) аж до 48 тижнів.
Оцінюють безпеку, кінетику антигену НВМУ, сероконверсію НВеАаЯ і НВз5АОЗ і імуногенність (наприклад, антигенспецифічні Т-клітинні відповіді, виміряні за допомогою ЕГІЗрої. Крім того, проводять моніторинг дозозалежного біохімічного (АТ) і вірусного навантаження. Зокрема, проводять вимірювання зниження НВзАд у сироватці в ході лікування між З групами введення на 12, 24, 48 тижнях, і усунення НВзАд/сероконверсію вимірюють на 48 тижні.
Збільшення частоти усунення НВ5Ад і/або сероконверсії на »20 95 через 48 тижнів в індивідуумів, яким проводять імунотерапію на основі дріжджів і ТО, у порівнянні з індивідуумами, яким уводять ТОБ окремо, вважається клінічно значимим досягненням.
Очікується, що імунотерапевтична композиція проти НВМ на основі дріжджів забезпечить терапевтичну користь пацієнтам, хронічно інфікованим НВУ. Очікується, що імунотерапія буде безпечною і добре переносимою у всіх дозах, що доставляються. Очікують, що пацієнти, яким уводять щонайменше найбільш високу дозу імунотерапії проти НВМ на основі дріжджів, продемонструють обумовлені лікуванням специфічні до НВМ Т-клітинні відповіді при визначенні за допомогою ЕГІ5РОТ, і очікується, що пацієнти з попередніми специфічними до НВМ Т- клітинними відповідями вихідного рівня продемонструють поліпшені специфічні до НВМ Т- клітинні відповіді під час лікування. Очікується, що пацієнти, яким проводять імунотерапію НВМ на основі дріжджів, покажуть збільшення частоти сероконверсії в порівнянні з групою противірусного засобу і/або в порівнянні з контрольною групою плацебо, якщо її використовують. Збільшення нормалізації АТ очікується в пацієнтів, яким проводили імунотерапію НВМ на основі дріжджів.
В альтернативному випробуванні пацієнтів, негативних по НВеАд, що задовольняють інші критерії (активна імунна система, хронічно інфіковані НВМ, добре контролюються 60 противірусними засобами, без ознак декомпенсації) лікують у подібному випробуванні зі збільшенням дози, як описано вище (або при максимально переносимій дозі або найкращій дозі, ідентифікованій в випробуванні, описаному вище). Проводять моніторинг пацієнтів відносно безпеки, імуногенності і сероконверсії НВ5Аа.
Приклад 19
У наступному прикладі описане клінічне випробування фази 1бБ/2а в індивідуумів, хронічно інфікованих вірусом гепатиту В.
Відкрите клінічне випробування фази 1бБ/г2а зі збільшенням дози проводять з використанням імунотерапевтичної композиції проти НВМ на основі дріжджів, описаної в даному описі як сІ- 13009 ("ЗСОВЕ-0", що містить ЗЕО ІЮ МО:118, приклад 7), або альтернативно використовують імунотерапевтичну композицію проти НВМ на основі дріжджів, описану в даному описі як сі1- 13020 ("Х-ЗСОКЕ", що містить 5ЕО ІЮ МО:130, приклад 8). Інші імунотерапевтичні композиції проти НВМ на основі дріжджів, описані в даному описі (наприклад, кожна з композицій, описаних у прикладах 1-8), можна використовувати в подібному клінічному випробуванні фази 1Б/га.
Індивідууми мають активну імунну систему і є хронічно інфікованими вірусом гепатиту В (НВМ), що контролюється противірусною терапією (наприклад, тенофовір (МІРЕАОУ)) протягом щонайменше З місяців. Для включення в випробування не потрібно, щоб індивідууми мали повний кліренс вірусу, тобто пацієнти можуть бути позитивними або негативними по ДНК НВМ (негативність визначаються як рівні таких, що нижче піддаються виявленню за допомогою ПЛР або «2000 МО/мл); однак для відповідності вимогам для цього випробування індивідууми не повинні мати ознак цирозу або декомпенсації. Пацієнти можуть бути позитивними по НВелдд, хоча в випробування можуть бути включені негативні по НВеАд пацієнти. 30-40 індивідуумам (6-10 пацієнтів на групу), що задовольняють ці критерії, уводять імунотерапевтичну композицію проти НВМ на основі дріжджів у протоколі для груп з послідовним збільшенням дози, з використанням діапазонів доз від 0,05 Д.О. до 40 Д.О. (наприклад, 0,05 Д.О., 0,5 Д.О., 4 Д.О., 40 Д.О.) або з використанням діапазонів доз від 0,05 Д.О. до 80 Д.О. (наприклад, 0,05 Д.О., 10 Д.О., 20 Д.О., 40/80 Д.О). В одному протоколі будуть уводити 5 доз раз на тиждень підшкірно (дозування раз на тиждень протягом 4 тижнів), а потім також будуть підшкірно вводити 2-4 дози раз на місяць, із триваючою противірусною терапією в ході лікування імунотерапією проти НВМ на основі дріжджів (протокол примування-допоміжна імунізація). В другому протоколі слідують протоколу дозування раз на 4 тижні, де індивідууму уводять всього три дози, що вводяться на 1 добу, 4 тижні і 8 тижні, з використанням стратегії збільшення дози, вказаної вище. В одному випробуванні в одній групі пацієнтів (5-6 пацієнтів) будуть проводити підшкірні ін'єкції плацебо (РВ5) по тій же схемі, що їі для імунотерапії плюс триваюча противірусна терапія. Існують консервативні правила припинення для різкого зростання рівня АЇТ і ознак декомпенсації.
Оцінюють безпеку, сероконверсію НВеАад і НВ5АЯ, вірусний контроль (наприклад, розвиток негативності по вірусу або тенденція до негативності по вірусу), і імуногенність (наприклад, відповіді антигенспецифічних Т-клітин, які вимірюються за допомогою ЕГІЗрої!. Крім того, проводять моніторинг дозозалежного біохімічного (АГ Т) і вірусного навантаження.
Зниження НВ-Зад, що складає 2110910, на 24 тижні, або зниження НВ-еАд 21Іод10 на 12 тижні вважаються кінцевими результатами для фази 2а. Для сероконверсії НВУ, критеріями успіху є сероконверсія 5Ад на 1095 на 24 тижні, і на 1595 на 48 тижні, і/або частота сероконверсії еАд, що складає 25 95 на 24 або тижні 50 95 на 48 тижні.
Очікується, що імунотерапевтична композиція проти НВМ на основі дріжджів забезпечить терапевтичну користь у хронічно інфікованих пацієнтів з НВУ. Очікується, що імунотерапія буде безпечною і добре переносимою у всіх дозах, що доставляються. Очікують, що пацієнти, яким уводять щонайменше найбільш високу дозу імунотерапії проти НВМ на основі дріжджів, продемонструють обумовлені лікуванням специфічні до НВМ Т-клітинні відповіді при визначенні за допомогою ЕГІ5РОТ, і очікується, що пацієнти з попередніми специфічними до НВМ Т- клітинними відповідями вихідного рівня продемонструють поліпшені специфічні до НВМ Т- клітинні відповіді під час лікування. Очікується, що пацієнти, яким проводять імунотерапію НВМ на основі дріжджів, покажуть збільшення частоти сероконверсії в порівнянні з доступними порівняльними даними для даного противірусного засобу і/або в порівнянні з контрольною групою плацебо. Пацієнти, яким проводять імунотерапію НВМ на основі дріжджів, покажуть поліпшення усунення вірусу (наприклад, негативність по вірусі при вимірюванні способом ПЛР).
Очікується поліпшення нормалізації АТ у пацієнтів, яким проводять імунотерапію НВМ на основі дріжджів.
Приклад 20
У наступному прикладі описаний клінічний випробування фази 2 в індивідуумів, хронічно 60 інфікованих вірусом гепатиту В.
У рандомізованому клінічному випробуванні фази 2 у пацієнтів, хронічно інфікованих НВУ, проводять лікування наївних по лікуванню, позитивних по НВеда (і, можливо, негативних по
НВедо) індивідуумів з АГ Т»2х ЦІМ і вірусним навантаженням г» 1 мільйона копій. В індивідуумів (460 індивідуумів на групу, з корекцією, залежно від результату випробування фази 1) повинні пройти щонайменше б місяців після попередньої противірусної терапії, і вони повинні бути негативними по вірусу протягом 2 послідовних візитів з інтервалом щонайменше один місяць.
Індивідуумів випадковим чином розподіляють на дві групи. Пацієнтам групи 1 проводять імунотерапію НВМ на основі дріжджів протягом 24-48 тижнів (наприклад, імунотерапевтична композиція проти НВУ на основі дріжджів, описана в даному описі як 5І-13009 ("5СОВЕ-О", що містить БЕО ІЮ МО:118, приклад 7), або альтернативно імунотерапевтична композиція проти
НВМ на основі дріжджів, описана в даному описі як 5І-13020 ("Х-5СОКЕ", що містить 5ЕО ІЮ
МО:130, приклад 8). Усі пацієнти, яким проводять імунотерапію, продовжують противірусну терапію (наприклад, тенофовір (МІКЕАЮЄ)). У групі 2 пацієнтам уводять плацебо (ін'єкція контролю у вигляді РВ5) із триваючою противірусною терапією. Первинним результатом є сероконверсія і негативність по вірусу. Також в випробуванні фази 2 можна використовувати додаткові імунотерапевтичні композиції проти НВМ на основі дріжджів, описані в даному описі (наприклад, будь-які з імунотерапевтичних композицій, описаних у прикладі 1-8) за подібною схемою.
Пацієнтам, що досягають сероконверсії, проводять закріплюючу терапію протягом 6-12 місяців за допомогою імунотерапії або на основі дріжджів і противірусної терапії (група 1), або противірусної терапії окремо (група 2), з наступним відпочинком від лікування протягом 6 місяців. Кількість пацієнтів, що залишилися в ремісії після завершення відпочинку протягом 6 місяців, являє собою вторинний результат випробування. Додаткові результати включають безпеку, імуногенність і нормалізацію АТ, як розглянуто в прикладах вище, у яких описані клінічні випробування в людини.
Очікується, що імунотерапевтична композиція проти НВМ на основі дріжджів забезпечить терапевтичну користь у хронічно інфікованих пацієнтів з НВМ. Очікується, що імунотерапія буде безпечною і добре переносимою. Очікують, що пацієнти, яким проводять імунотерапію проти
НВУ на основі дріжджів, продемонструють обумовлені лікуванням специфічні до НВМ Т-клітинні відповіді при визначенні за допомогою ЕГІЗРОТ, і очікується, що пацієнти з попередніми специфічними до НВМ Т-клітинними відповідями вихідного рівня продемонструють поліпшені специфічні до НВМ Т-клітинні відповіді під час лікування. Очікується, що пацієнти, яким проводять імунотерапію НВМ на основі дріжджів, покажуть збільшення частоти сероконверсії в порівнянні з доступними порівняльними даними для даного противірусного засобу і/або в порівнянні з контрольною групою плацебо. Пацієнти, яким проводять імунотерапію НВМ на основі дріжджів, покажуть поліпшення усунення вірусу (наприклад, негативність по вірусу при вимірюванні способом ПЛР). Очікується поліпшення нормалізації АТ у пацієнтів, яким проводять імунотерапію НВМУ на основі дріжджів.
Хоча різні варіанти здійснення даного винаходу докладно описані, ймовірно, що модифікації й адаптації цих варіантів здійснення будуть приходити на розум фахівцям у даній галузі. Однак варто розуміти, що такі модифікації й адаптації входять в обсяг даного винаходу, як вказано в наступній формулі винаходу.
список послІДОВНОСТЕЙ «ГО» бісрейпшихме, їхйс,
Ареїіап, Рачуій
Ктпадч, ТБошав Я. спо, йпішіЙ
Соеввобе, Сіаітге М. «180 ТЕРАПЕВТИЧНИЙ ЗАСІБ НА ОСНОВІ ЛРІЖИЖІВ ДЛЯ ЛІКУВАБНЯ ХВОНІЧНОГО
ТЕПАХИТУ В
«130» 3923-55 -ВСТ «50» Б1/507,381 «Мат» 8011-07-13 «Ї50ж 1/9, 9А5 «ЗБ» 8011-05-14 «130» Б51/442,808 «1515 5011-02-12 «іБОх 155 «170» рабейсіп тежхвісд 3,5 «Вій» 1 квії2з 15 «ва» БілоЖ «13» Вірус кепатиту в «еййм ії меж сів цен ве Ні Пед Сув ем Іі Ії Чег Сув ТОх Сув Го ТВг 1 5 за 15
ВНе Сід оАта бек був без оСув гео біУ Ткроїе Тер сту Меб даротів 29 5 за
Ар оБкго Тук ПЗув щій ВНе п1у Ата ТК уаії сі) Бем сен бек о рле бен ай 45
Бко дет о Авв о БНе Раз ро Бех уаї Аа во обвиа гнб АврочпЕ Аза ех
ЗО В во
Ві: гей Тух йкч Сіза Аїа Гей бій Бек Его січ Нів Сув Бек Рус БІБ 55 7о т5. що
Ні тих А1а Без ку С1п Аза ї1е їй Сув ТеросіМ біз реа Мек тек чо 55 їн Аїа Тік ЛюЕр Уді б01у Ав дев Мем із Ар о Кжо А1їа бек о дхУ дО 100 105 155 іі Ма1 Уві Ап Тук Уві два тк дай Меб С1Уу Гец буяє ї1е дкУ СІЙ 115 190 155
Па це) тур Рве нів ЖТіе бек оСую Ббеп о Тьх ВНе ОТу да біо твкоМуві 130 125 140 ївч біб тт па маї Бек вна сту Уві Тхр от) дже тиж ро Руб Ата і85 КО 155 155 тТУук бля БКо ко Азйп обіа РКО Ті їхзи беж Те оїєц рус Зі ТЕ ТЕ 55 што ї7Т5
Чаї Мазі Ата Сув йка біу аку Бах ро вх Ако дгеа ТВ о Руо бет руо хво 185 ї9й
Аго до Ак Ако бек бій беу Рг згу Ах Ак Аке Бек був бек АК 195 20а 205 па Бех піп Суз 210 «10 «-й11ї2 ВІ5 «212» Білок -р135 Вірус гевлатиту В «ай
Мес Рхй офеу бег Тук бів» Нів Ріє Ахкч Бу ей Пец Бей Гей бБр АБ ї В їб ІБ сіУ Так біз Аїаозіу го ей зіч Зі бій іа ко Аа тен Ата дво то 5 39
АТа дврпогем Ап оАто ага УаВ Аза бій АвроГмей Ай Пейп о біУу ДвпоГею
С 45 два Уаї Яву д3Ла рус Те отТВвк нів Був уаї сі Аве БВеотне сіУу цей ща 5 бо
Тух Бек бег Тпх Уді рхо їі Бе Авй РрРхо біо Трробіп так хо сах то 75 зо вве о рко Був Ті Мів сечо бій біб во щі Ії Ба Аке був ЩІ сів в 30 з
Бпе уві бі Ро Гей ліс уаї Ап оОім Буд Ака дк ем ГУБ Бем о тІ1є щоб ЩОБ Іо
Ме Рко Аїв Ака Бпе о тТух Руо Тв Нів Тк бує Ту Сени Бро рей о Авр 115 12780 125 ів 1» 116 Був ко Тук жує Его двр о б1іп Уаі У вази Бів Тук о Впе
ІЗ т35 140 іп Так ака Ніз Тух реч НіБ ТНК Мей Тер Був'в1а б1у її рез тук 145 Її 155 ї60 пув Ажа бів тк таж АхЯ бБеїт Аїз бек Ба Сув о біу дек Рро тую важ 155 170 їз тТкрозій бій сі без біп Ні бі Ахо іо уаї 12 фу Тв бек ста 180 185 150
Ага Нів З1у АБробіч бек Ре Сув Бек бій рго бек б1іу Іїє Пец обек 195 200 235
Ага Бек вет увазі пу Ето Суб Ї16 Ату Беє бтй без Був сій Бек сдтга 210 Ж 220
Пед пі Пен бій Рко Нів біпобіу Рго Пец Аза ех бак бій рго осіу иа 230 235 240
Акта бек біу Чет їі Ткр Аїа ака Аїа Нів Рко беж ТВг о Агу Ак Тук за 2За 25
ЕВе піу чаї бій Вко 5ех біу пех сту Нів їі АвроНів бвк о уві Аа ев 255 270
Авп бек Бек Бех Сув пец Нів біп бе А1а Уаї Ага Гув Аза зів ТУух тт тна 285
Бек Ніє Тева Бек ТБк Бек Муз Ак піп беїс бек бек С1Ж Нів Аза маії 230 295 зад піз вве нів Су гемо Бко Бо Зер 5 оАїа бі беж бтіп беж сія іх
З05 З 315 зо
Зек Ууаї Ре бек Сув Тер Ткр ія Пів бе Ак о Ашй бек їв рро був за 335 335
Пежо бій Тук Су ей Беж Нів зей тат вай рей с Акя Зіч Авроткр у
УЖ 345 50
Тко Су дво біб Нів 01у біб Нів Ні Ізїе Ака Іїе Ро Ак Тих РЕо
Зв 350 3655
Аїа ака ві тик біу бі уві Бе їви уді аАвр о Бу АБвп Бто НіВ Ав то 375 з80 тру оАТа бій Бек Аку пен Уві Уеї Авр о ББе бек бів це бек Ахасо1їу 385 390 35 400 ват Тих душ уві Зв Тур орто був БЦе діа уав РКО АБИ пе іп бе 355 0 45
Гей тік Ав оцеч му Бек Бех Ап оїец беж Ткролев бек пен о двр о Уві 429 4125 430 бек ліз втіа Ре Тук Ні ІТе Без йем Мін Бко А1а лів МебоБко Ні 435 440 145 цей Беш п1є Зі век бак Сіу Бей бак Ак тую Узі Аа Ах рем бак 459 455 450 бек Авпобет Аку їіє дво оАБИ два піп Ту ШІіу та Меї сіб Дай Бред 155 «та 415 ч89
Нів о Аво бек Суд бек Аку бій бев Тух Уві бек обоє) меб Бе Бей тує 85 аз 495
ШпПув ТЕ Тут СіУ Тк Був ей Вів Пес Тук бе нів Бро 11і16 Уві беву
Зп 55 510 счьу впе Ахя Ппув Іі Рхо Мебосіу мМаії Сі Бей дет Бе Ва гемо грец зі5 по БАЗ.
Зіз бів вно Тпробах АтТа тів був бек узі Маї Ах де діа ре рт
ЗО 35 па
Нів Сув рез Дід ре бе Тух Мас Ав вк уні баз еп бЗіу вів був 545 ва ва5 ЗО шехк чаї бій Нів Ага бій беж їв бук лак дів маї Тв Ав РБе їец яв 0 ви ей шек рез Сім їіе ЗіБ ви Ап Бо вв Бу Ту Був йха То Сіу вн) за аг
Тух Бех ем йвп о Ре Меб О1у Тух їїеє Ті піу бек Тур обі рних бе
ЗУ 60о зоа5 рРко сій лЕр Чі її уеї 510 руш о ї1іє пу Нів Ств о рРіме бхо Бує Мед 19 515 620 ко Уві Дві дІЯ рхо Іі йвр Ткр Був Уві Сув сід дут І1ї2 уаї ЩуУу ви 631 535 ва п-ва цез о1у рке Аза іа Бко ве тйх Сіп Сув біУу Тує ВБко Аіа Бей в45 50 55
Меє вхо Пес Ту Аіа був їхіз піп Аза рув сілобіаз рве ТБ Ре Бек
БО 565 вл
Бсо Так отут ув Дів влє Гей бек пу біп Тук Меб Аво іди Тух БгО 875 680 Ва
Ууаїі вів Ах бік АгУу Ехо О1у ей сСув бій Ууаї Рйпе вла аБр АТа тик 8835 00 рев твк оО1у ТЕБ зіу ем бз1а тіе сіу Ніє бій дже Ме Аха Б1У ТВ то5 74 7ТЕ5 720 тре уді та Бко пе) вго ї1е Нів Так оАЛіа Зіц без пец Аза Атїа був 725 73а 35
Епе Аіа Аха Бех Агу бБег О1у Аід о пув рей тіє Зі ТЛ АБроАва Бех тай 7тА5 па уаї Маії пи беуоАка пуб Тут Тр Бек Ре орко Тр о бе) Би сіу Суб 785 то т755 тт о ваіа АвпотТІв їі пйейоАху біу Тнж ЖШех ве узь тТух Уа о БКОо бе жо ла тво
Аіз Тем вБОо Рто Аза ввроАБрорко бек АкЯ сіу АхФ огпем біу їей Бех та5 790 У воо
Вка Бк Пец ем Ак Бей рго реж бід Бо Ту Тех о біу вхЯ Твжх Бех во5 яТо 55 ев ТуУух Аза ді бех го Бек Уві Рго Бек нів ій Ро Уаії Акжа Уа
М; ваБ вза
Нів Бре ліа беє Бк йбез нів чаї Аза Ттр Аха БЕка о Бжо
55 ва 45 «Вій З «Віт 490 «їй» Білок «213» Бірдує гепатиту В кад» З
Мек бі Піу Ттр бек бек Буд Бко Яку Мув ЗІ Ме пім так овал бец з 5 16 15 зек Маї РКО Аєп ркоОо Гей 61Уу Бе кпе с вкОо Ар нів СІп тей Аво РКО
В еВ 3. аза ре сіу Аз АєМ бек АБ АБп орго дво тр ав Рре Авп о Бхо ї18 а 45
Був Авр о Нів Тр орто Тит вів Ап о бій Уві ту уві Сб1у АТ рве Му
Зо 55 о рЕо біу Бей так о рха РКО Нів Зі1уУу піу їле пен сО1у Зіу цех Ко 01 то 75 0)
Аіз бів сфБУу тТІе Бей о тТвЕ Тіт узі йех Тож тів БЕка ро вко Аа Бех нь вії 5
Так о Аво Ака із Бек 0іу вка сі око Тахо рко Х1іе Жекх бко Еко цем 120 105 що дз вбБр о пет Нів Рко сія Аза Ме сій ткр дай Зек ТВт дія раз Бів
ТІ5 12 1255 сіпоАїа пви іп о Авробуо зхоа уаї дра сь» Бей тує Ре рго Аазїя піу 150 135 149
ЗУ бе Бех Бах сі ТВ Чаї Ап Бгто Ат КБКро АБИ Її А1іа беконів 145 120 ї55 150
Тіє бек бек ї12 бек дів о Ата Так сту АвББ Рго Маї Аїа Ави Ме и 65 175 175 дви ЇТе Тиг о беб с03ій Бе гей; ШОТу РхЗ Пед реч оУуДі Та бій АТа світ 150 185 193 вве Рпе їди опею Ту Ак 13е Пе») тТнЕ пі ро бії бет лев АвБропег
Та5 200 0
ТЕр отр тТвт бех р дви рпєе Без піу йіу Бек Бхосузі Сув реп с1у 210 215 Р бІб Аа дех біп бехє Его Так Бек Ап оБів бек рго отвкК бек Сув вхо 78 а3о шу йо
Бгто гів оСув руб 5ІУ Тук Ак ТкЕр мес СУБ ва Ак Ах рпе їБе їтае з43 250 255
РЕпе пе Ре тіе Пец ей опе) був зей їі вве лез ев Уві о Беи ей 250 255 270
Авр отут біт біу Мебсє цем Ркоз Уаії Сув Рко їеп ліє Вхо бім беж Тож дл 280 285
Тих тах бат ТВ су ро Сув був тТлт Сув ТВЖ Так охо Аза бій 1уУ 290 255 00
Ае п обех Мей Різ то бе Сує Сув Су ТНК о їуя Ето Так БО сту дв 385 з1о 315 3859
Су Тьх о Сув 118 Бо Тіє Рхо Єву обек Тур Аза Ей Аза Тув Тук ви 395 за 335
Тор осі тер о Аза Бек аз Акту рве бек Ттр о цеза бек Пен обей Уві ро 340 зах 5
Ре уаї біз Ттрорне Мді біт єп бек Рхо Ту Ууаії Тжв ви Бек Ада з5и Зб зва її2 ТгроМес Ме Тгр ух Тухо 21у Буто бек пев Тут Бех їіє УМаї беж 376 375 з80 хо Впе їіе рко Пец йти Рко Тіє ББе бе Сук Пец Тер уаї Тук тів ва 350 235 420 «їх й «ВТїїз 154 «2198 БЕЛОК ка» Вірус гепатиту В «4Пп0» 4 мес діа АТ сАхЯа пев бук о Сув Зій Гей дво бех Зах АхЯ дев оУуві СПєМ 1 5 хо ІБ
Сук цех вто бго Чаї бі Аїа біс бот йку сіу Аку Бто бей обеї пу
2 25 30
Вго Пец біу ТМк Пен бак бе оБго Бех Бро бок Аза уаї зго діа Дер 35 45 45
Нія біу Аїа Нів Бей бер ізо дго сту рем Ро Маї Сує Аза Ре дек за 55 бо
Бех Аіа сі БксоСувз Аїа пе Ага Рре о тТве бех вій йка Суз Меб дів о 75 хо тЗЕ Твх Уаї дво Аза нів ій т135е гемо ВЕо Був Уаї їй нів Був о Ажа я Зо 35
ТВх рец осі ем рРко їв Меб бек бвж ТБ АЮ реп осій діа тую Вце 150 105 110 цув АвроСув Маі ББе Був Авр о їо біз бів ре) біу біш бій 112 Ах 115 170 т25 їз був маї Бе Уаії Бей осі Зі Су ЕФ нів бує пед уві СувоАїв 130 135 140
Вко Аїа РБго був АБИ бе РНе Так беж діа 85. 150 «ех З жи ВТ «212» Бідок -8135 Вірус тецатиту В «ай 5
Ммеє бЗіп рез ре нів ез Суб ей Ї1е ТІ Зах Суб Бех Сув Бо те
Її З 15 І
Чаї піп Аза бек мук о пем Су ей бу Ткр оцей Ткроаіу Меб о азбр о їТїе а 25 за а БКОо Тук ув 010 вра біУ АТа таж уаї пів сем Бей бек Рпе Пей за 20 45 вхо бек Авр о юпе Рре го Бех Уа1 Аха АБр Пе пцем Авор ТИХ АТа Ата
Аза їеа тТуУХ Ата с1а АтТа стю біз беж Бо біз нів Суб Бек оБуо Віш
КО 75 во нів твЕ Аза грец одху ІВ Аза ї1їє рей Сув Тер 0тУу 010 її Мей Те 85 за З5
Ппем о Аіз ТВі тбкроМа1ї сі Ав Ап ої бід дер о рко Аіа бек дк ар хо 105 Іо реч уаї Уві ка Тук о Маі АвлоТех дво Меб сСіу ве бує ї1їе Ака О1в 115 зо 125 іївц Бен Тк Бра Нів 112 Сех Сук пе ТВ Ре 01у АкаЯ бій ТВжх Уаї 130 їЗ5 140 їша боїв тую їви Уаі ех Ріпа о б1їУ Уаї Ткр о тів Ах Те о гко рРко діа 145 ї50 154 150 тих ВхЯ Рто Ро йвоп Аза Рко тіє пей бек оТйх Бен ово піч ТВ То 85 7 ТУ уаї чаї дка лка Аху С1у Ак бек Рко Аг Аку аг Тк о Бго беж Ро 1859 155 1850
АгчЧ аку Акч дка бек бій бшт РКО АкУ Ака Ага Ахо Беж сїЇй Беж ду 155 200 75 сія бек Зіть СУув «10» б «1ї2 843 «01йз Білок «13 вірує репититу В «00 в
Має Ргб їши;ц ек тую ОТ нів Бе Аже муз їм рей їні Пец ввр вар
З 5 10 5 піп Афа піу Бко без пі бі бій пе йо вАхЯ реа Аза Авробій СБУ 75 30 їси Аа! Ні Вк Уа) Аа сі) Авроїед Ай Беб сім вв Бго Ана уві
І 40 45
Зег Т1іе бо Ткр Твк Ну Пув оуаї! Сіу Ави Ббе так о біу рев Бук бек
ВЕ 0 бек Ту Уаі Рро Уаїі Ре Авпоржо бій Тео біп Таг РЕОо Беж рРце Бо
Бо о 75 но айвою їїе Нів пев сій Зі Авооїів Уа) АДвродка Суво був Сід вре баї зо 95
Сі Бго це) Тс Уві Авлосій Авт Ак дкя їі Пує Гей бів Мев Беса 140 ївб5 118
Азїва Ака бле Вре Рко Ап оуаї Тйк Буш Тух Пец рус Пе) дар був біш 115 120 125
ІїТіз Був Бро Тую Тук Рко біб нів Уяї Ууаї АБа Нів Ту Бе бів ТА ї35 Гук хо
Вся нав тую Пед нів тах мес Тхрв о пув Аза сіу їЛе ев Тує був ВХ гав 155 155 150 сів бек Таг Нів Єшїг Афба бЗет Ре Сув піу Бер обро Тух бет Ттроозій хе5 175 175 сСіп Адробво сія нів Су Атарвей Уаї ре св їх беж їв Ах нів 180 ї85 тай піу дво пу баг РВе був Ркс біп обех ро З3У її за Бо Зкб пас 95 РАЗІ В
Єех Маї Стіу Бто Сув Іі бЗіп бек біз Без Аку Був Зах йка ей біу 4160 215 й
Еко бій о вКо Тпк оЗій піу оз бе Аза бЗіу бкЯ Ро біп бі Бу Бек 225 230 235 240 зЗіу Бек жі ака Аіва Акщ Уві нів Рко Бех РІЗ Ткр обі беж о Ууаї З1У
ЗА з53 255 чаї а Вко бек біу бер біУ ція так онівБ Ті СевоАїЗ бех Чех Бех
БО 5 што
Бек бек сув Бем Нів сів век вів Уві Ака оцув о Аїа Азія ТУк бек Гей 275 290 85
Тіє бак тТвХ бек опув біУ Мів бес бех бер обіу Ні дія Маї пам пед 29 255 зай нів оНів ББе Ето Ро АБ обех бет Ах Бех біб бек об3іп о З1Уу Беє уд 355 319 315 320
Пей бек Суй Тер Тв їєц зів пе Аку два Щек Був Бо Сув беж бід за25 333 з35
ТтТук Сув рей Тут НіБ Ії Мяаї АБлоцеюм Її бін Авр Тер осіу вто Сув 348 за5 Зо діа схо НіБ оСтуУ лій Ні йту ТіесАха ТвЕ ро АК Тахо бко АїВв дев з55 ЗО во таі Тих бїу біу чаї Еме Пец Уві Авр обу дви рко Нів Авпотик діа 370 375 зо
Атїа Бех АхЯ без туаї Маї Бр Вбе Бех Сі Ре бек Ах ЗІУ АБа ТВ 355 ззо 395 200
Акоа чаї Бек Тхр Бгто Пув Ре Аїа чаї Рто Авшїоїйеа с35ій Бех Бен отне 405 то 415
Би Бей Гей бек Яек Авт Бей пех Тетроієм бек їжа Авротуаї Бек Аїа 420 8825 430 аіа Ре тує Ніз Пен Бо Без Нік Ро Аза Азіа МеЄ Ркб Ні Мей пеб 435 820 445 ові сіу Бек шет піу ей бег Агу тує Маї Аїе АхУ Тен ех Бех деп 450 абБ5 460
Бек Ака її2 її8 Ап мів О1іп Нів біу ТпкоМек бів оАврвоїво Нів Ап аб ат т а5о бек Сув бек Аго Авпопей тує уаї Бек геч Меб йей Шей Тут Був ча
АВ 48о аз5
Тук біу тТкр був бем Нів Іжні тук Бек Ніш РКО тіє ї1е ї-еи піу РНе 500 з05 510
Вхч ів Ії ро Меб сбіу Уві спіу ей; бек Ро ББе пеп без діа ба ів вий Зиз пе тру бек діа гів Су Зеї уві за) ву дха Аза Ра Ро Нів бує
З ої рем діа Бпе Бех Тук Ме: дар. АБю Хаї Маї ЦПем сім Аза пцув Бах Маї сІіп вні бей із беє рей Тук АзїабАїа уаї Твк дев Ре Пед пей дех 553 570 Уа їч О1у х18 Нів Сей Ав Ро Нів бує Тк оцуз вка ТЕр сту мк бек 380 -В5 Зо їГеи ва Бе Мер біу ТУуж та1 тів бій засо тТтр обі Ту Пео о врко бів
Зах ОО 505 бій пів Ті Маї 614 був Ті Гув їецй Сув Ре дк Був ІТ Рео ба 510 515 вра
АепоАта Ехо 11їе дер оОТКв о був Уві Суз зів ду т1е У СТУ рей Бей ва езіо 535 ай сіІУ Бе Аїв о А1в о рРго Ре ТвкКобій Суб б1у тує Ехо Аза Бей Меї ро вав 50 55
Пез Тук Атіз Сув Тіе біп Аїа Був о сіп Аза Рбе бек Ре бек Бгто Те 560 55 7
ТУЖ Був вів РІЗ гец бек Був бій Ту їшчс ТиК сей Тук Рко Уві діа 575 ВО аз
Акч піп о Ако Бгто біу ей Сув йіп Уві БЧе Аза бвр о Аіа тх ко Тв 530 5-85 100 сіу с ттрошіу без вва сїїіве сьу НівБ С Ага Ме Ака Сіу ТЕ Бде Уві 705 719 тів 729 сеї Ро пецшстхо її Мі тих Віа бій теп пев Ма Аїа Сув Ейа вла 7 то 735 дка Бех вхо цех сіу АтТа Буш пейш отіє 01 ТВх Аво Авий бех о увь ма тла тав ка без ех Ажоа Мув о тує Тих Бех де Рхо Тктробем рей Стлу сув Ата АТа 755 750 75
Ба ТІВ БІ ем Ака сіУу тв обек рай уві тує уві Бгто ак ЇВ тей 7 778 780
Аваи Бо діда Ар ввроБхо бек дру б1іУ Ак о ГТве З1У Пед тує дху ро 75 79о 75 ва ї-ви греч ах Бе) ро Тук Ак вро тк ТБгобіУу дка оту Бек бен Чук 505 810 15
Его дар бек Буо бех Маї Рко Шек о Нів Пей Рекс вро Аку Уаї Кі Ре ва 525 839
Аїа Бек Рхо цем Ні Маї Аза тТкромув БВхо ро 835 Зо «вій 7 «ау 400 «818» Вділок «кеїй» Вірус тепатиту В «Ап 7
Ме сіУу 1у Тгр о бек Бех Ппув рРжхо вх був сіУу МЕ обу Так вай с сбуей
А 5 15 8
Ввк бар свко давня Бко йечосіу РВЕ вве вхо АвБроНія бЗБп бен АБО ОРГ а 25 35 й
Аза рве Гук Лів йви беж АвроАвап о рРто АБО Ткр одер бен Авіа Ро Нів ї5 29 45
Був йо оАВА Тер Ехо Авройевк Ав був Уві бу туаї ху Аза ваш ТУ
ЗО Ба 5
Вто б1у Рпє тах Рхо Рко нів сі біУу пе рез с1іу ТкроБек рхо 1 о 7 во
Аіа бій піу Меб Ізїе Тру Тк Маї Рхо діа Аза Бго Ркео Рхто Аза бек 55 ЗО Зо тТвЕ два Ата сій бєев БіУ Аа бі ру Тих РБкео пед Бак рта Бу. цей ї00 з що
ЗхчЯ Авр Бак нів Рко бій Аза Меб зів Ткр Авп цею Так ТЕ РНе чів
Ві їх 125 пу дв ів сів Ав оРко алко Уаї Ате Аїв цей Тук Ре Бго Афа о сіу 138 холу 345 сію беж ек бек оЗіу ТВЖЕОУЗі АБповБтє Маї Стр оавоа ТВЕ діа бек бек їй їі50 5 їБ
Іф. бек бЗву Тіз ей обву гру ТАК осіУ АвБровко Заї вка! дви Ме 51 155 п ша
Ави Її1вз діа бек бі Бей еп СТУ Рко бе ем 81 їв) бій діа 01уУ 180 185 155
Епе Рпе рей Гей Тр Був 112 ей Так ті Рго БіповВежЖ цей Авробехк 1585 250 295 тр бе тору ше рез йви Бре бец О1Уу бі ТВ Ро Уві Сжво без пу 215 й стій бвпоїцве біп Бех 017 11їе Бех бек нія бек реа ТУ Сув Су кто пак 30 235 280
Ето сте о сСув ко бі Тут АкФ ттромМес Сув їв дхЯ дку Бе тіє їТе зах 250 В
Ре Гей Сув Ті Бем рей Без був цем о Тїв РБе Бей бей Уаі Цеп о Бпеу 259 ЗБ 270
Аве о тує бій бІ1у Меб їец Бро Хаї був РЕ цес їТесРро Сіу Бех Бех от зяб 85 тТаг о лвх бек тТВк о о1Уу Вко Сув Ат ВЕ о Сев о твах Так оРвКе Аїа ()ть су 250 295 350
Тих Бет меж Ре рко бек оСуюк Сув Су Тржх обмв о рко Тр Авропіу АБп зп5 3 315 359
Сув лак Сув тів РБго тів Бо бех 56г ОтТКр лів бле Ма ув отук зе 355 359 335 тхв огра Тер о Аїа Бек уаї дку Бе бек ТтроПем Беж цей Їей Віз врго аа зах зво
Же уві сій Тюер вве уаї С» бе беж вже тТБу Ууаї тТкропебв Бех уд
Зх ЗО 155
Іїе ТЕроМеї Меб отр ре Ткр осі РЕб Яек Пец ТУК оАБп Т1ів без бет 370 375 зво
Кто сБавоМес ро Гей беий РКО іі бе Бе був ет терочаії тую лІв зв5 З ІЗ 105 «вій В «нії 155 -йїоз БІЛОК
«2132 Вірує гепатиту Б кад» В
Меб діа діз Ахш пей Сув Суб бів без АБюогбто Аза аку Авроаї Гей ї 5 ї0 15 су ге дк рко уаї С1У АБа біц бех Ага біу ха Бо ев Рхо б1у 20 5 Зо
Его без БіУу Дів пе Рюб Бко діва Бех Рго Бек о діа Уві ро ТвЕ Ар а о а
Ніз біу діа нів гпец бак Бей орко Піу меча Бо Узі Сув Аза пе бек що Бе БО
Бек Азїа біу Бкго був Аза Пе Ага ве Тк бек азіа Абя Акао МебобіМ 55 70 75 во таж тв уві АБ Ала Нів Ажу АБа о пез о бко Був Уві реа НівБ Пув дк
ВО 55 тах їе) біу Бей Бек йіа Меб Чех тру отих АЮ Без сій лід тТук рве 120 05 щі іїув др був уві ре Авюи біз Тр осо і ев біу біб ЯМ тів Ату 115 125 125 їецй ув уУаі це пе уві ей СЛУ Бу був Ах Нія ув пед ма1ї Сув 130 835 140
Бех Вго Аза рхо Сук Ап Ре Ре ту Бех Вій 155 150 155 и за «В1х 212 «хай» Вілск «213з Вірус гепатиту В «-4п0з З
Меє лій цей ЕНе Бо Мей Су сей т13аз тхе бат Суд Жах був вхо Те ї в то З заї бів Аїа бек був Бен Суд пес сіу ТЕроїн Тхр сім Ме бар о тів
ХО їЗ 35
АБЮ ово Тут їув о Зім Бе бі Аза дех Маф сій іїреи цем бак Бдє пе
Іо бак о двр о вБПе Бе Рко бек її Ах АвроТеч Пец Авротах АТа бер що 55 во ді пей Жук ха О1й іа ей обі) бек Во 01 ніз був бак Рус НІв
ВА 7 п що
Нів Тако віа реп Аку бів Аїа о тТе ей Сув Тер о бпіу ба ей Меє Авп 85 ЗИ 35 їз Аа Тк отТЕр уві О1у Бек ЗБ Г2еМм бів АБр о гго діа Бек Ака сі 100 105 19 їо Уаі уаї бек Тук Уаі АБа чаї Ави Меє бЗіу ей був 118 Акф са 120 вав
Тїецо Бецш Тер овне нів т16 Бех Суб Бей ТОи Рбе біу Ак тв тих уві 130 ї3а 145 їм бій Ту без Уаї беж Бпе бі Уах Тер оті ЗУ ТО о Вго го Ав 155 159 155 іо
Тут Аха во Рсо АБ діа Рко ї1е Бей бек ТНЕ Пец Ро ста Тих ТБ
Іт65 І 175 чаї чаї до Акоа Ага б1у Арч бек Ро Агре Акч Ах Ту БкОо бЗех РКО 180 185 190
Ага. ага вка Ака Бек бій беї Еко Аха Акч аку АКЯ Зек сій Бех АКЕФ 195 Іо 205 піа бек бій Су 215 чеї0» 16 «811» Ба3 «й1їйх Вілок «а1ї» Вкрус топатитУу В «4002» 10
Меє Рто гемо обет Тук іп Нв оре ду Був бе Ге і-й іа АвроАвр 1 З Мо х5 сі: Атіа біх рго бе; 010 бій біб рем Рко Асо їм АТ Авропін сію 2о 25 33
Пемй вп Аке Ахз уаї АтТа стя дер Бпей АБ їв; Зіу два йемйп Аа Уві 35 40 45
Бек 11 рко Тер ТВкс Ні Пув заї 5ІУ Ав пе ТЛЕ О1У Бей о тух Бех 5О 55 Бо бет Ту чаї БЕ Уві РБпе Авй ро З1іЖ Тк о1й Вс сво беї Бпе вга 25 Кс! 78 ва нів їїе ція еп осіп із дер оїіє ті АБа Во Суб шій біб Тух МА 85 0 55 пу Бо цен Тв оУаї Азпосбін Бу Ат Акта Без ув Гей Іі МекоркКо іо 155 ТІ
Ага Ахч Впе Тут Его Авп оген ТЕ Пув Тук Пем о БЕо Гей дво о Був П1У 115 120 135 тів ув Рио Тух тук Ро Зіч нів'АіЗча уаї Авт Ні тую Бе Був о тТНЕї 130 ї135 Ід дтга Нів о Тук Бей Ні ТУ Пен о Тівробжяж зів бі І1в без Тукг був І ї85 150 І55 і5а лій таж Тато Ата ек Аїа бес Бе Су піу ВЕ ВЕ Тук Бах рр оби 155 179 175 сйіп бі рез бі нія 0іУу акя беї Ма Ре сій ТВ Чек був дез НІВ 180 ї85 190 піу Вар пін бек Вре Сув Бех бій Бех деї біу Ї1їє Бех бех Аа бер 155 20о 205
Бко уаї 51 рРЕб Сув уаії Ага беж бій Гей будо бійяй бек АБУ Бей шту 215 215 220 пез Бі ВЕ Збій ота бі беж йея с Аїз Агусбіу Був бек БіУу Ажо беж 25 з3ї 15 ЗАЙ сіу Бек Ії Ага Аіа ато Уаії Ні Ро ТНх Тс дкч Арс обех Ре обіу за5 250 щу тат сла Кто деко сбіу бек б/1уУ Ніє її Аєр Ав бек Аза бек бЗех ТАК 285 я
Єву бек Сув та КБів Зіз Бек діє Узі Аа тує Тих одІВ тут Зак Ні що 255 рев пет тах беж був АЖТа біл бек бех бек бі нів Аїа уді 019 Пец а8о 35 300 нів Авпої1є БКо ко Заж дет ТНК Акае беї СІй бек За біо вко Ті 305 310 315 320
Рипе бЗек Сув ТР ОЧжо Пец сів ре даху Ап бек бує Бгб був о бех Ар 325 330 335
Тук о Сув пей тах нів І1е уаї Ав Ге ей Зі сАвроткросіУу Бко Сув 359 345 35 так обра нів Сіу Бім Вів Ап о ї15 Акш о Тіє Бо лхЯ ТВ РЖОо Аїд Ако 358 зва 305 чаї зак бі сі» уві вве без Узі БЮ був о АБа БІО нів АБв оту ТЕ 370 ЗВ 280 піс бет дку Пец Уві Мат дво Впе Зву ЗІп де Бак бгЯ бі бек ТЕ 385 359 395 400
Нів узі бек тжробто Був Ре діа уаї Рко вп Темі бій бек пе стих 405 іо 415
АБО пей бе) Баї бек АБИ ре) обер ТЕр іже Бет Пец Авр уаї Бех Аа о дих АВО.
Аїа Бле Тук Нів їїе Рко їн Ні РКО Аїа Ата Меб рко Вів Пе Пе ща5 «40 445 туаї біу Чех бек З1у їн Еко йху Тух Заї іа йкаЯ йй бек бек Тек ща Бо бек дкц йсчп їі два Тух 105 йів Бі Те Меї Зі Авр оїєм Вів Авр 255 470 їв ї8о
Бек Суб Бек Акб вв іє тТук Уді бех пев оц о без сей ТУук Був отак 485 . 180 аа
Ре обіу Втщ Був Бах пів пе Лук бек Нів Буб Т16є І16є Пез бі Ррде 380 505 5132 аку пув її веб Мак о О1у уаї Сі1Уу Бей Бех та ре ре) їжи діа зі
Бе пу
Рпе Твї ще Ата ті СубБ бек Умі Уві Ака Ак Аба Ра ро Нів Сув 530 За ай їжах АТа рда бет Тук Меб Авроав5р Ууаї Уві їшеа Ту лів йпув бак ха
За 550 За БИ біп Нів цем ось бех Пец овБе Тих бек ої1є Тк оАва Рце бе Бей бег
БО 5 575 теп ЗІ тіе Нів Пез Аво о Руо Авц оЇЛув тах Був Аку Теробіу Тук беу 5ВО 585 Ба
Бей Авуя Рпе Ме бу тТук Увазі тіс иЯу вет ТЕБ ту ТК Бач око ве 500 Ой ді Нія Т1-е уаї бій Му пед був біл Сув ре Ак був Бей о Рко Уа. вто 515 ее;
АБУ АКкЧ БКо їїе двротТур Пув о Узі Суб 010 АкФ о їТїе Уві бі Пец ей
БІВ 630 635 во
Чіу Ве Аіїа Аїй Бгто Ре Тс біп був біу Ту вро Аза Пец мМев рКо
Ба5 в) 555 їеви ТУКо Аза Сув тів бів діа пув о біб АТтасбнє Ту бе бБет оркОо тн 660 605 вт
Тух ув Аза Ре Пец оСув Був Сів Туг о їз бар опо Туг Еко Маї Віа
ТУ ЩО 585
Ата біп вх бах сфуУ ей Су їй Ууаї бе атїа АВ Аїа Тк обо ТЕ 95 «95 оо біу Ткр щіу Без діа т1е біу Ні біз дру Меб Аго піу Тк о рпе маї 705 715 715 720
Аіз бхо беш Бго їів Нів Чйж діа Зіз Бей без Атїа Аза був Ба лів 78 У 735
Ака бек лк бек б51у АТа пу сей Ї3Зе йп1у Так Авр оАБи дек уаі дії 75 та5 750
Газ бах дка Був Тух Тк БЕЖ рРпе все ТЕрогєц їй біу пе ТвЕ Аді 785 БО 785
Авипоткв о Тіе ре) йка біу Тр бек Рийє Уві тух уаї Бо Бах діа Бей 77 715 7580
АвпоРто Аія Авв АБрорко Бек вка спіу АкЯ без біу ей Ту АК рКо тва 780 785 во їн Бец АгЯ Тео Рка Не дка ркз тре твак о с1іу Ака та бех Бе) тух 805 І 5 діа АБЮ Бех Руб бек оуа1ї Рус беї нів бе Ро Ав о Ака у) нів РБе зи на 830 діа бек Бко Без нів уаї Аза Ткр Гу рРко Бко 835 350. «и Ті «ів 0 е-ві1й Білок хо13і» вірус гецпажиту В «доз ї1
Ме С1у біу Тгр Зек беї рузв РЕ» Ах Буш Сі Меб зі Тр обев о Пе ї В 19 15 пе Заї ро вв Кто Мей Сію пе Ве бю авроНів сій ев во РО 20 5 30
МІіа Бле Біу Азїа Авп о бек АБ Ав рука АБО Тхр АБюЮ Ре Ані; го Авт 35 40 Ак
Бун АвБОНів Тк орго біз аіз Авпобій маї біу уаї Шіу Аза рве ОоТУ 50
Бус обу Рче Тк орго Бгто Ну о О1іу біу бе) Бен» Оіу Ткр обве вже бід 55 ЕД ТУ на віз сів у тів тем тНЕ те у вро Аза Аза во ко рго діа беж щь За 35 лвг два вто Бій Бех озіу вх оОїв Еко твЕ гто їі бу Бго руо пев 109 105 Мо
Аха двробех Нія Кго сіб діа Ме бів Тео Ави Бех ТвВх отак Биє те г То 25 бЗів ві їж; Боч одер бо Ву Заї Ас бБіУу їм Тут ЕВе бто Аза З1У ї150 35 149
СОІУ беж бек Бех -1у Брк Уаї Ав) Рто уаї Вко тТвВх Так Аїа бек ро 145 153 х5З 164
ІТїе Сет бек її РНе бет Аку Тк 01у Акр Ркго дів рРго Аза оМеє (Лу
ІБ то 175
Ав ТВротвйЕ бек сіу ББе Ген біу Вго пбед реп уаї Бе) бів Аха 01У
ІВ інь 130
Епе рпв о рез Бен Тк Аку їїе ва Так отів рко біл обех без АББ бек 1955 200 205
Ттгрлтр тах бБеї Сва АБп о вйе ей сі бі АтТа ро Тк Сув Рго віх 210 215 зай біп Авп бек іп бек пбхо Тр беж Авпонія бек бо Три Бек Су рута 230 235 240
Вко тів Сув рхо сіу Тут Акт ТкромМеє Су це) Ах АкЯ Рне їл1е іє во 255
РНе цез рие Ті тей йед цец Сув Бей тів ве Гея Пед уаї Бей ей 25 25 та
ВБрЮр оТУух біп бі Месію Бко уві Су Бко лем рем Рко сіу тах Зек 275 28 5 тит ту бех тТвгобіУ Ро Сув Був ТВк о Сув Тчк З1іє ро Аїа біп біу 2956 235 Зп
Тпк бек Мес рае Рго бек о Сув о Сув Сує Тк Був ро бек БО З1іу дв за5 10 315 125
Сув 'тих СУБ ІТ Бсо тів руб бек дек тро Зі Бпе дів о вкЯ РВЕ цей 325 0 за тр бін тер оАхТа бек уаї Агу ре бе ТЕ Ге; 5егорев цей Хаї Ехо 340 345 350
Бе уаї сій тЕВОБДе уаї сіу їси бек ра тТЯК о Маї тТкроіеч век Уві з55 зво зЕЗ лів Тхр Мес МессТир о Тук Ткробіу Рхо бе пев Тує Ав їїе Та Бдо ато Бе) 280 вхо Рпа пе Ро їні ев обо іє ре бле був Гей ТкЕр о уді тух 18 355 390 395 400
Вій» «йі1ї5 ї54 «Ел» Вілок «їі Вірус тепдтиту В «асо 12
Ме Аїа Аіа йха уві був Сув Був цдец АБр обро Аза ага Адвр о уаї це) 3 5 Ій 15
Су івч о АкЯ Ро Оаї Зі Ата бій бек бек Ту Аку Бко уааі беж піу 36
РІО Ре зїу Тпт ої) Бо бек РКО шех беробек вїа ах РКО А12 Ар
Зх о 45 нів Сіу Аза Ні Пец бек отїєм Ака Піу без обко Заі Суб о Аїіа Бас бех ва 55 ко бек лід Зі бро Суб діа ей Аха ББе тик Бек Кіа сайхч вка Ме Бі то 7В 8 тв отох Уві Ав діа нів бій Уаі шец Ро ув Уві Мей Бі її Ага 85 чо 5
Твкоіни су їм Яеу Ата Ме бе тру тТвЕ вбБр ем бій Аїв Тух вве ї00 5 118 тв о АвроСув уві бе Був АвБЮ ткв Осій бів бевобіу сіа Та сів Аж 113 120 55 їжа Був Маї Ере Чаі Пеп спіу біж Сув Ако Нів цув о беч УВІ Су о бет 130 135 Іо рез Аїа то Су Авло Брав Бає ТП бах Аїа 148 І5О «210 15 «1 1 киїах Білок «13» вірує тепатиту В «а002 13
Мек бій ей Рба нів без Сув Бей Т1Їе Іїе беє Сув Бех був Рко Тдк і 5 10 15 уаї піп Аза бек цу Пеп обув с пви пу Ттробей Ткр АБр Мес АвБр ої 2 25 36
Аворобрто Тужк рун щі Ре біу ліз ть уві сій Те; пер бек Бйе цечз 35 49 45
Рто пег АБр о Рпе ре го бек сМа1ї Ага Авроїєм Без Аве ОТНу Аїіа б5ег 5О. За во вій рец тТух лк біз та йем зі Бек вто сій нів Суд бек вко Вів
Бо 70 75 50
Ніш Тр Аза ей Аа біп Аза д1є Ббеф см тер обі ба ме) Меб спе
Зо 5
Гемш А1а Тх тр Ма1і б1Уу Уа вт цей Сі Аво Ро Аза Яек Аку АвБр таз 105 150 іа чуаі Маії Беп Тук Уві аБаВ ТЕ Ам Мес сіб пев Був Бе Аа ол її5 І20 їх5
Бей пезчй Тктр о Ббпе Ні ТА Яву Суб обемз ТВЕ Бе о бЇУу АкЯа сі тах Ма
То 235 145 тів бім Тух Пец уа1і бет Бе 51у Уаї Ттр Іі Бгу Тих о Рко Рез АТа
ТАБ 150 55 16а тук о Ака Рто ро Ап Аіа Рхб о Ії Бей беж Тир бем о ро сі Тве отак 155 170 175
Уві Уві йка лкз Ака Зі Ага Бек о РЕс вуЯ Ач Аго Тж Рко бех Рука їн ій 190 м вка Акч Ато бо піп Бех РхОо аку ага Аа ака Шак бі бе вка
УЗ до 205
Зв Бек бівосСув 218 18 «21їз 832 «5195 пілок «2132 Вівус геолатитм В «ах 14
Меб рго Ццеа бек ТуУукобій Нів Бйе ага Агу ем Гей їєт лей авю хо 1 5 10 ї5
Авр Аїа сіу Бо Бей сій б1іа О1ц Іва бко Акчу бе сдіа Дер ат) біу 56 дв 30
Зей АвподтЯа ве уві Ата бі АВвО ба АБИ мезо бі Вей Фей дав Маї
ЗБ ЩО Ек
Бех тів ро тТкв о Тпах Ні бує уаї піу ДЕЙ РКе ТЕ О1уУу бен тук 5ак в 55 5О0
Єви їТвВу уві Рко уаї РБе АвпоРко нів тро Бу Тву о рРко бек дв о вжо е5 7 5 во
Авв о л1іе Нів Гей Нів бій двр оті Ії Буя Буя Сув 01: бів Рае маї
Зо З5 сі рт тей ТБ Маз АвБив обі був до вія пев Бій цей тів Меб Ре хба 105 Іо діа дк ЗНе Тут Ро Авооуві Тв Був тук бен Ро ій С1й Тув 1У 115 1501 а
Ії пуп Вко Ту Тук рус ст Бів Бей маї дЕп Нав Тук Бпе піп ТАК 130 135 159
Ака нів Тух їй Бів ТК о іза Тгробув о йіа біУу її йей Тух був Аг 145 155 у 150
ЗІ тах Твгодхо Бех Аа бех Ре Сув БЗтіУу Бек реко Тук бек ТЕроЗїи і855 179 175 цій біч тео; біп Нів сіу Аіз па беж ве нів бій о бій беж о беу сту 18о їВЬ 135 тіе печ бех Ака вго Еко суві СТУ Бек бек їем сбіп бех ув Нів Ахд 195 РАВ КІ) ру Єв о АкЯд цей сіу їм о біп пеж бів біб С01У Бі Пе» АЇвобсоа ВХ 5 зай зів зІдоббу йха бек Тер обет Тіе Акту АТа біу ї1іе ія рте Твк ва 225 25 255 243 вАха Жха Еко пе Зіу Уві біб Руо шежх су бегб сіу Ні ТВк о Аза даю зах о 55 їши йіа дви уз Бек Атїа бе був Меч Тут 1 бек бек Уаї АБО Тув 2650 65 ато віз вів тух БеК Берг Уві Бек Трг Ре сій був Нів' їх беї ЗІ бах 239 285 285
ВМЕВ іа Маї біз лем Вів Ап без ро ро бай БКо Аівз дуч бас па чо 2з5 3ЗФо бек біз дк Его Уві Бе Рко Су ТтротТкр о пец бій Бе Ач Давобех зо 310 35 320
Бу Бко сСув бек одне Тух Сув рей дех Нів їі Уаї АБИ Без обемж б1й 323 339 335
Авв тк піу кто Сув діа піч ків піу пі; Чів Нів сіє Ак ї1ворко
Зо за5 З5о йха Ти Рко А)а Ако узі Те б1Уу Є1у уУаі Рає пеи Ув1 Авроцув вв 355 350 365 гГхо Нів АБа Так оуаї бій бех Аха пем баї уві дво Бе Бех бій бле 37 375 за
Заг о АкКу спіу Авап о Нів АкаЯа уві бек отТкр орго був о ББе Азїв За1ї Ро Двп зва 390 ха5 00 їем біп бек Пец ТАК дв оїе)з Бечм Зех Бех ви Бей обеї Ткр Гей Бек 05 АХ 415 цей соАшЕІ Маї Беї Аза діа риє тук НівБ Геи Бгто їєб Вів Ре Аїа дів 2 12 ало
Ме срка Ні Іі Бец уаї сву бет Бех бір пен беж ака тТук Уаї АтТа 145 4343 жо Чер бет дет Ает беж ка жів БВе вва Нів бій Пів сту Ск Мер
ЗБ Би бів одЕй рем нів Авж бет Сув Бек Ажо Ав ЇМзи Тук Уві бек Пец Пей 465 470 гуни 489 пез їеч тух дію Те Бе С)іу дко був о цео нів Бе оту шер о нів во
255 490 495
ТІ тів Пец бій Ре Ато ув 31 Бгто Мес біу Маії біу Пеш бек рго 500 БОБ БО тйе пем о іви йїя біпобвБе ТВкобех А1я тів Сує бекоуві уві Ато Ахо и 525
Аза Ре Бхо Нів Суб Бей Аіа пе бер Тут Меб Аво Авроуа! Уві ГПев
ЗО з35 Б
ЗіУу Аіа ув бек чаї бій Ні Ппеб бів бак рев Бе стпх АТа Уві ТЕЖ ва зва 55. БИ дви о Бве іжні Пцечй бек рей сіу тіе чів пе» БО вхо Авдоїув ТАК оМув 555 БЕ У
Вхе Тхв біу Тух Бек Пей Нів Бце Меб О1у Тук Ууаї Іі бБіу бек Тут
БАО вва 530 б1у беї Пед Вго їз дво о ніз ТТЄ бу І; ув ї1е Туя 016 Сув рве а БО БОБ
Акч ру пей Бко Маії АБа дк вбко Дів Ар о ТЕв був Уаї СуБ біп бКа що 515 вай їїєє ві Сбіу Пе: оїшео бі Бе Аїа вата бо бОе Тпхобіп Сув О1У Жук 625 30 535 240
Фхо йіа Бей пув Бхй ей ТУух Атїа Сув ХТа б10й беї Був шіпоАтТа вра. 5ІБ 50 У
Тах вря- баж Рко так обук Був Аів о бпє Бей Су Буш СМ тую пбеп АБИ
БО 5аХ о) мем обтукоркоОо уі АХта дІє лід дуа ВЕ. бІіуУ Бей СУБ Зій Маїс ве діа тв А вай
Авр А1іа Тахо Рко Так обіу Ткросту бей маї Мер сі Бів стіп Ахе Мер
Зо 855 то дк сіу ЧИХ РБе цей Аве рго Бей то їхе Ні ТВжЖ о Аїя Бій рей Бех та 71о 5 72 вів Ата сСує РВе АБа Аку бек Акаф ех зу Аза йбвиа ГІ Тен; зКУу Тве
Ей то 735
Аво Ав беїх Уаї Уві їец бех АкЧ Був Тух Тк Беж Ре Рро Ткр Бей 749 745 750
Пед б1іу був Аза Аїа Аєп ТТ ІТе пе АтЯ бІУу ТвЕ Бек Бе Ущі тук туп 763 тва чаї Еко зет лій рей бзп о рРхо Аза АБЮ Авр око Бех ду бі ахчЧ сей
Іо 75 во біУу пез бат Ага РЕ Пец бе Ата Пец оБро ве ду Ро Три о тТБж о сіу тв то 795 вас
Ага о Таг беж вед Тут Аза йвр о бех Рто пек Уаі Бо Беж Ні Бе рко
Я БІ 215 йно деч ат Ні ве Аза бек Ро Гейснів Уаї Аза гр АкУу Бко РКО о 25 80 «їз 15 «ВТ ЗВ «ака» Біляк «2135 Вірус гепатиту В «апр 15
Ме біу СІпй Авап без бе ТВ бек Ав оБко цей) бі Бе Ве Бко. Авр
Ї 5 19 15
Ні пі дей Авровто Аза Рре Ахо Аза Авю Тех АТа Вел Бхо АБроткр 2 39
Авр оре АБИ го АБооїуЗ АвротТвх Тур Бко АвроАла Аза пув уаї щу «б 45
АтТа б1у Аза Жпе З1у шШей біу РБе Трж рт Бо Нів о пі Сбіж бен ей зо 55 ви біу тко бЗає вро слів АтТа сів сі тів ви бів Тс ей рго Ав Ах то 5 Зо
Ру РБко Ро Аза бех Так АвпоАюжт біб беж сім дк бій Бго ТУ РКО 85 зо 5
Пвш обеї рт Бо цем ду Авиотах Нів Буо сій Алла Ммеє стій ТкроаЕп 00 105 а
Свт о Твк о Твх бе нів сій ТВ бвмосій Авровко да Уаь о Ата Бі Бе 115 120 ї25 туУукК Бе ра о А1з 01у бі беж дех Бех обі Тр чаї АБЗ Ро Уві РЕб 130 ї35 ї4о
ТВ тні уаї бек Вів ТИХ Бех бак тТіє Ре бек Ага І11їє біу двр ро та 150 155 180 діа паб дво Ме сій Ави тів Тек обет сту во пев обОКу РЕМ Гей ви 165 та 175 чаї цей біз Аза бі Ре Рпе рец гер Ту Ако Бі Пе» ТБ о Т1є Рка 18о 185 180
Пій бехоіїсм Авробех Ткр Тур оТах бех Без Ап Бйє Ццед біУу біу тТВкЕ 155 200 205 тих уаї Су рей С1у ств АБпобек сів бек Бка Тпродет АБ Нів Бех 2їа 215 220
Еко Ту бек Сук Рхо РЕ Так оСує Бо С1у Тук Ах Тер о Меб Сув цей 295 аз 235 40 дкш ака Рое ІТе Ті Бпе пев ВББе 118 Гей без Її Суз Гей ї1іе Ре 25 255 їа пейп уві Бей їй Авр о Тук бій бу Мей Гей оБіс Чаї СУБ Рко Бей 26 а й хТ2е Ркбо діу Зах Бек оТцх Так бак отв біу вхо Сує вка ТБ Сув ТВае р з28О 2585 тн о Вго Аза ій БІ тв беж Мес Ту Ро беж Сув Сув СуБ Тк Був 290 255 зо
Ко Бек АБробіу йбвп Сув Тахо Сув 1168 рко їі Ро беї бех Ттр Аїа 305 319 зі5 320 ве сіу пу Бе Бен ТЕвБОсії Торо Аїа дет АТа Ажо Рава беж Ткрогей 325 350 435
Єет їй їец) Уді РКО БРбе уаї Оля Тхо Ре уаі біу Пе. Єву ро тах зва 345 350
Чаї ТЕкв їни Беї уаї тів Тго Меб мес Трротую тТеробім рго Бек Темі
355 350 ЗБ тут Ав отіє Пец бек ро Ве рец ро Ген пед Бко Іів Ріє Рпе о Сув 37 37 хво
ПеаоТтТкр уві Тут тїе 385 «па» 6 «Вії ГУ «йійз Білок «вл Вірус гепатиту В «355 16
Мес Ата дів ака Гей був Суб сій Без Ар о Рго Аіва Ако й5о Уві Пей ї 5 18 ї5
Сує бе Ака о вгкО Уаї бек Аза ій бек о Сув бІіУ Акад хо уУаї баекобіу 5 Зо
Рто Рне о схіу Тпсоїйєецш обеїт бе ро Баг бЕо Беж Аза Маї Бек ТАК ва
ЗЕ 40 45 нів б1і1У Аа сія пед бек о бец Аго біжу пев Ркб Чаї СувБ Аза де бек 5 бо
Бек Аїа злу РхО сСУв о Аза пе) Аа рйе тдк Бет Ата Аа АТО Ме ЛА 65. 7 та ва
Зах бвВЕ Уаї д5п о Аіа Нів біз Ре це Рхо був Хаї ей нів Був'аха ае а їх в: СВІ 35
Жйх бен біу св шеж Маї Меб бех тТйаг Трк Авроцеа біб Аїа о Тук о Бле 100 іп що
Був Ав бує ес Бе пує Ар отв Січ Сі цез бі біз 053 Тв йху 1115 180 ії885
Тем Мес їі Бр Уві без бі шу ув вхо Вів їв Маї Сує діа 130 135 150 то Аіїа Вко був дви аа Бие Тру дек АТа 155 150 «вхйх 17 «115 315 «ВУ ВалОоК
«Ії: Вірус гепатиту В «Оу» М мес бій Бей РБє Був цей Суб Пец ї1іе тів бек о Сувє беж о Сув о ржа лк 1 5 10 15 чаї бЗіп овіа бек пу їжа був Ов ду Тгромемї тр Ту мес Авр 1 20 25 30
Аво гко Туг опцув сі впе бпіу та ТВ Маї бін цен пе) бек Вде Бек 35 49 45
Бхо Бек о Авр Ре Бпе Рго бек ові Акру АБроїу ів АБр о ТВК о АтТа ях 5) 5В 50 йтТа бен ТУук Ах Аве Аза Бей Пий Беж БЕЗ 0ІЗ Нів Сув бекорко. НіБ те Ще во нів ТВЕ АлЛа рен де сіп Аїа тів пез Сув ТхробіУ ЗК їеи Меб ТнЕ 85 зо за тез йіа ТВ Ткроуаї біу Маї Авд пе) 13 Авровго Аза бек йхУ Авр 1059 ї105 112 теп маї Уві Бек Гук ух дДЕТ ТНЖ Ав Ме б1іуУу Пи їлльо Бпе Ах сій 5 155 123
Тез Пец Тк Ре Нів їіє Бек Сув Пе) Так оБНе піу Ага бій Так оаї т3а 115 148 їїе бі: Тух пе чаї бБет Рпе шіу Маі тТтр т1іе Аку Так Ро Бко Ат а 145 150 1855 тай
ТУ ку Ехо Бо два о Аів ово Із Бе) дек т Бе оРБго Пій два Тихе тез та Ма чаї уві Ака Атч вата ОїУ йкч бек хо Ах АКЧ Аа ТНК о рКОо Єву ко ій і185 зо
Сув Вгу Ах Ака Чек олровек ро Ак Ото Аку йка Бе бі пох Вго 195 25 зав діа Бек біт Суб 2530 «рій ІВ
«2її5 на «2122 БхложЖ «2135 Віршис гепатиту В «00 8
Мас вко пен бек Тут сіп Ні БНе АкУ Ако Ті їей Бей цей АБр о ща 1 5 т т5
Ста аїа сту ро пе) сім со Фів тез рр Ага їй Аїа АЮ Ба Авр
Пе АБподту АКЯ Ууаї Афа сій дар ей вай п сій Пебз рго дв очаї
Ао 45
Чех її бхо ТтротТвх ів був Маі біу Авт РБе ток опту рем Чух бек
ВО 55 Ба бех таж Уві го Уаї Бе АБ РКО Авії ТЕр о Був тах Ехо бек Рае Ріо та 75 50
Ав т1а8 нів Бе БІВ Сів одер їЗе ї1іе АБлаоБув суб БІО бій печ оУвї 85 зо 5 бі ро їй Тих МУа1і йди сіа їув дхау Ак пед Авп Гей уві Меб о бко 105 155 їла
Аїа йхта Не Брпе ко їТїз бек ТЕ був о тут іч бро Бех о АвБр обу СТУ її 120 25 тРе оцув вхо Тут тТух РКО АВр о Ани Уві Уві АБИ нів тТук Ве бів Та
У 15 таб дха Нів Тут це) Нів Жак Без Тер о був Аіа піу Іі Гай Ту Був Ага 145 158 155 їв)
Сі тих їх вто беж Аїв бек Ре оСувойіу бек Буо Туг бех Тго бій і65 170 х75 бій са рец Нів Нів біу Аїва БНе пей АБр о слу ЕХО 5ЕК Акад Ме бЬуУ що ІВ85 ува зім 'Сіа бек Бе Нів Пів біпобБек зер сім Те Руе озек бо вхо Бго 195 200 205
Уді Сіу бек Беж ї1е Бій беж Був нія сій Був бек Ага їец б1у сво
Сищ) 215 РК)
аїа бву сіп біп Аку Бго Пез) зво Ака Бех 010 Ор б1іУ Ахя бБег Ту йиЗ 230 235 ра) зек фі Аке АТа сі Маї Ніє бех Рго Сак о Аге АК оБко РБе сбіу Маї 48 250 255
Зі Бко бек осіу Бек о Аху Нів Аза Був йям ті АтТа бет Ага бек АТа до 255 270
Бек Св Пец ів Сів бек АТа Маї Ак пу Атва ВІВ туї вка вп онНІЄ та 80 а
Зек Тк Ре бі; Ах Нів бек обер бег біу Нів Аза уаї Яї4 це Ніє 290 пак що
Ави її ро то беж беїх дів біу ет бів бей бує дДкшовжо Уві ває зла5 ЗІ 315 329
Шах сСув' тбтюе жКо Бей сій віз Ах ЗБ шпекобічз ро Сув Бех Дер Тук 330 35
Су Ппей То Ніє пев уаї й«рп опец цви бів Ав отр о бСіу рго був тах 343 з55. 350 с Нів біу їув й Нів ті АК тїе ро АБУ тах бо АТа Ако Май 355 3З5о 355 тис біу ду уаї ве Бей уУаї дЕр ув йди Бк мів зво тах оА1а пі зт з75 380 бЗех ВЗгУ рец Уа! Уаі Авр Ре Бех сіп о ббе бех бдке біу бек обех Джкц зв5 У 135 400
Уві Чек Тер орто пу о їбе Аза Чаї РКО дви опер Зі Зек реч ТАЖ де 05 АО 15
Флеш Бей бек беж ДЕ їй Чех Ттропей бетопши АБроуУзі бех Аза Віа 42с аа 4з3о
ВЕбе Тук Ні ей Рг Ген Нів рго Аза Аа Меб го Ні Фей оде)з ді ал 442 45 плу век бек біу теє бер да тую ома1 Аїз Ага Гей бек бех дев Беж ї55 460
Аса 118 Ті Ав) Чі бів Тут о б1у Те еп рго Ав Ге) Ні Авробех 4655 ло 475 480
Суш бек Ак двп оПем тує т1е дек Ієу. Ме Ппей бйєш ВВе бує Тл рве аа 490 295
ТУ Аха Був о пез нія Гею о Тух бек НівБ Кто Ме їі Меб біу Ре сАка зай 505 510
ПУБ Олі Бкео Меб бр Уаї ліу земз беє Ре Бе Без Бе Аїа бСьий свВНе 5І15 а а5
Тпк беж А1їв тів Сук беж туаї Уві Ахя Ак Аїів Бе Ро Нів Суя їй -0 535 55О
АТа вБе бек Тук Меї Авр Ар оУаі Уві Бер Сі й1а Був бет Уві сій з45 зво 55 ЗО
Нів Тем Ст) бек бен Бук ТНК о АТа Ууаї Ту Ап Бе Бач їец пек опец 570 515 спіу ті нів їі Аве оБгОо дБА Туз тик обу Ас тТкробі ТтТуд беж Гей во АВ 50 деп о Ббе Меб ЗЧіу Тух Уві Ії бЗіу беж То Зіу бек Гез Бко бі З1ч зч5 530 БО
Ні Тіє АкЯ Тев пу 112 цув АвроСув РО Ак ув пез вто тУаї АБА чтй вІ5 ва
Ага Бгто їі2е дер отр оГСув Узі Суз біб дру ї112 баї бі їем о Пех Ту ви 53 35 543 вна ліз Віта Бпо тде Тс бів Сув бі Тут о рко АТа ле); Ме Бжо Бей 645 65 655
Тит Віа Сує Тар обід Бех Був біп діа РБе Тк Бйе бек бго Тахо тТух 65 565 57
Су Аза Ре бе Су був сій ТУЮ Ме дви дея тТук рго Уві Аіа АКУ ат 68 85
О1з Аку вхо СТІу бе Сує СІ Уді Ре вт йвр Аза Тех о Кко ТВ бі о 535 ТВО
ТЕр сту ува Аїз о Ї1е 01у Нів'осбіап вх МеЄ Абу сІіу ТБ вне ут лій иа тб 75 728
Бго Їїам Бко Її Міє ТП Аза біз Бей рез й1а Аза Сув Ре діа йко 728 30 735 пек Ахо бек 21у Аа Пув Печ їїз с1У Ток о АвроАнд бек уві уві Бек 7Яай тах 75
Чек Ака цув Тук ТрІ Бек Бпе Рро Ткр їм Гей біу Суб йзЗа Ата дей т55 тва те5 тТхв 'І1іе їенча дк сту Тахо оЗек вве та тую уаї рто Бех Аза пе деп 77 ТВ 7809
Рко діа авр АБО Рг Бек АхЯа Сфіу зка при піу гів беж Ака Вко Тед 785 та 755 оо
Пемо Ак Пец рхо Рресзіп жо Тв тк о бію де їТйк бек їед отух Аза : 805 що 815 чав бек РКО пек оувК бхо бек пів їжшчтр РО АДББ Ата ді Вів РМе лід 820 825 30 бек Бко їм Нів Уві Аїа ТтроАка Ро ко 35 вай «10» 15 киїїз 359 «їй» Білюк «-й13з Вірус гепатиту В «200 5
Меє Зіж реп беж Тер Тато Уаї Рго мен бій Тр обіу Був Авп о Нів Дек ї З 1о 15
Тик Тато оАвшпоржо Тева Сбіу баз Ре о Бко АБр Кі піп Пес АБвоБро дів а 25 30
Ріє Ах Аїа АБИ їве о Ака два рко АвооТгр Або НІВ АБІ. БГО АТ Був зв 40 45 дво Ні оТкроїнх 73 Аза Авап був уаїі у Заї біУу дів вовобіу рха
БО пі ре св Рго рге Нав о сту сіу гей опей сіу Ттросбет вро біб Аза 5 то у я
Сі оту Мес пе Був Так їв Ргто діа Ави Бо Рро Рко Аїда бек ждлжЕ 85 Зо 35 дп оАко Зіп бек б1іу Ак о біп Бко тн рко Ті Так око рхо Гу дк 109 108 о
АБЮ Твж Нів РКО біп Аіз Ме сій Ткр Ав бек Тк ТЕ РБве нів ців 115 129 125 діа бе; 510 Ав орто Ату Маї аксе пфу Беша тую тен оРЕОо Аїд сіб спру 130 135 149
Беж бек бек Сіу Тпкоуаі дви РКО уаії ро ТБЕ Твж Аза бех Пей тів
Мах 150 155 150 бех бах 116 Впе бек Ак Т1іе сСіУу Авр вто А1з РКО Аа Ме біз сі ща я - 185 178 175
Хе бак Бех СІу Бе їм; сту реб уем Бей Уаї їз 1 Аа обІМ Ба їв ув ї5З0
Епе рей їм Тв був тів Бец Тих 118 бко іп Бек Пей Авробех Ткр 2050 Я
ТЕр Твробек Бей Аяа Бе Пец зліу Біу Аїйа ро уаї Сув Без Сіу іп
КО 215 ай
Аки бах їілобеє Бро тіб бек ди Мів йех вро ТВг беж Сув Рке о вБКоО
У 230 235 га їїе сСув Ехо бБіу Тут Аку Тхр Мес Сув педа АкФ Ахч оре Тіе Те РНе 225 ЗО 855 тей ве ж12е без геч вип Сув їше о їів Рв ее Пец Маії Кей) цев дав 250 в5 Бе
Ту сів б5)у Маї бе; роз Уві Суд Ето Без Ті Рхо СТу дех бек ТК ат 289 285
Тк вет ТКх О1у ро Сув оАта Твж о Сув ТВІ Тпх ої віза сід осіу Те 290 5 100 чек Меї РНа реко бек Сув Сув Суює Гей Пув РКО бех Авр біу АДяп о Сув
З05 з1о 315 380 пт оСув ї18 о вжо тіє Бо Бех Бех ТКро лів ве Пру був бле ем Чер 355 З30 335 пій Тер Ага бек Аїа Акб Ре ек Тхр Бей бех бен рей Чаї Бко спе 340 3245 Зо "аї бЗіп ЖЖ РБе Авбз бЗім рей бек жо Тахо Уаї Бер обемй Бек аз її 355 зо з65 тТжр.оМек Мей тТкор отук тТкро1у рий Беж рей Тук АвоО тів дей бБаековрро 375 375 зво
Ре тів Бко цец Бей Рко 112 Рце Бпе сСув еп Тто Уаї Тух їТіє ї85 355 зах епі» 70 «й 155 «ей» Відок «132 Вірус пелатиту В «Ой 20
Меї АЇ Аіа Аку Меб Сув Сув пій Пец зв рко б1іа Ав Аве Уві Тви 1 5 то 15
Пув ев АхЯа Рго уві бе дів бі беж був О1у Ак Рко Уві бек 0б1У ве 30 бек тей пу Ар обем Чек Бех Руо ббех Ро бБет ов1іа Уаі Рго Аза Вер
ЗА по 45 нів б1У Аза нів беп беж бе) дже біу бе) го Маї Су Аза жве бек ко 55 БО
Бех АМа піу рко був А1іва їй Аже Рпе то бек вів Акч дк Ме бли 70 їй ва тво отнНЕ уаї АБО Віа Нів бЗіп Тіз Бец рро Був уві Беш Ні Був зКФ 85 я з5
ТнЕ рей БІу бец ек Аза Меб Бек ТИ БЦЕ Авроїву із сАвфа Тук РВЕ 100 155 Но іПув АБроСув ред цес був Авроткр Бій біз ем осіу біц біб Ті Ву
Т1ї5 І2О 125
Тео цує Уві Рів Уві їец біУ п1іу був дто Ні Пув Бей Уаі Сує Аза 130 135 ї4б0 тра Аїа Рго був Два Ре Рів Тр пек АТа 155 1590 «іх 21 каЩТу 512 «їй» Білок «ЗБ» Вівує гепатиту В «400 91
Мек біп рей Ре ні Сева був Тен їхіє ті Ре був бак бує риб тНуУ 1 З 10 15 уаї ста вів Бек ПувБ Пец Сув ем о бБу тТхр оре Тр обіу Меб Авр о ті1ег о Я 39 зво ркКо ТУук Був сій Япе зЗіУу АБа азж Уві бій без бши бек Ве Бей що КЕту
Бто Бех АБроБре Бнпе Рго Бек Уаі Аху Авр оре) цей Авр о ТВк Аїа Зехк во діа Бей Тух Ак АвроАТа цей зі бек Ро СТ Нів Сув Тр ро АБО 55 76 75 о нів ТЕ Аїа цезм дкЯ сів Аїа ї1е рем о Сув Тер обі Зій бе Мої тТБу 85 20 35 їшм дів чек Тер уві С1у Аво Аво ія бій леробто Аїа Дія Ака Авр 150. 105 18 ви Увї Уаії Авя Тут уві Ап о тТвЕ Ав Ме Сіу без їТув 118- Ака ств 315 125 185
Геза бей ттр Ре Ні ЇІЗїє беж Сув Бен Тк о впессбіу Ака бід Лк уві х30 ї35 145 лів сві ту Ген о Маї деж ве біг баї тк тів да Так оОБсо Бко дув їі їз 155 180
Тут Вхо Бко Бо Авй Аіа рко Ііє рем Бех ТВі Ццез Рхо біб ТБ Тох 1655 ї75 ї7З чаї Ууаї Акщ АкО ка сІі1у Аку Беж ркО Ага АкасАта ТКтТ рРко Бех Ехо 180 185 180 ахгу йгу дк ка бек біп о бег гІо ЕФ Аку Аа Аха беж см Бах ра ч135 ой що
Аїа бек Був Су
РичУ «вій й «1 Ваз «АКих ВІіІЛОК «їй» Віруб соепатиту й «а0йх й мес рРго Бей бек тук РІО Нів ре Ахе ув цей рем во їм Аве АБО 1 5 -0 ї5 біз іа біу вто бем бів ЗІ бій рей Бко Акя ей діа дер об); біу
Зо 25 30
Ген АвпоАгЯа Ат баї дій сін Ав обец Аа рен біз їеа Вко Ави Уаї меВІ 43
Бек Ії Рго Ткр Трос Ніз їуз Маї біу АБп оре тс о піу еп отухк Бах за 33 БО
Бу ЖИ о Уді го Тих Бе АБ) оБка Дер отгр о бе ТВ Бо бак о бре с яго 65 то 5 во дЕЮ Тіе снів пес нів осів Ар Пец тів Нів Був Су сій піп орРво маї
З що з5 біу го ім Тк бу5 дви біз Гу Ах Ага цей Бу цей уяа1 Мехо рко 190 155 110 бек о Ака РБе Ре Вко пев Уа! ЖвЕ бує Тук Ре Рко Ме січ Був бі 1 2 ІЗЬ
Жіе Був рко ТукоТух рко Авр о АБа Уаї Узі Ава Мів Тк Ре пуб ТИЖ 130 135 її
Аху Ніз тТук рез Ні Тс опев То Бук Аза сім Т16 пей отух Мув Ах т145 і55 155 ї850 бі бах тах Ахо зех А1а дек рле Св осіу бек о РКО Тух о Зек крови 165 ї7о 175 сію ств тд сіл чів бі бек ТВ бе іє бшап АБО бек дує С1Х нів
ТК і85 196 пі Теж обі бек опез Сув тах біо беб бек Ту лів ред бек Ага ВКо 195 2ба 205
Бех Аїв діу бек бек Іїе 51іп пі1у ув Бе бів біт бех ака Бей бі
ІЙ 2715 яр їй бій ОЇй5 Пув сів бі біп Бей АтТва Аввобіу Су сіру АФ Бех пив ЗУ так А піт ву тів Аго бек Ткр о Маї Нів Тіт бро тк Ага Тер ово уаї 0іу 245 50 255 чаї біз бве о тТчу пІіу Твг о біу Сув дів Тук Ав Ї1е діа бек ку бег 255 за 279
Аїа бек Сув Бра нів ста бек Аїа уаї ка біз Був ТНК Ав орко бек 275 28 285 тей Бек Тит Бак їув гц Ні беї бек тах бі ніа' Азїа Ууаї бій мен за 5 300
Та бех уаії Рко Рко сЗфу Бек уаї Ак пек бій бьУу пув СЕУ бек Чаї
Зо о зів 320 вве бек Сув ТЕр отЕр дес са Бпе Аа Авротлє бій рко Сув 5ек дер 125 330 38
Тук Сув дей бек Нів Тів Її АБИ оце) рез бЗін Авр Тур плуУ Бко Сув 345 35
ТУук шіо Ні біу с1а Нів Нів їі Аку тах хо вхо ТБ РгОо АТа Ах 155 ЗУБ 3655 чаї тк б1іу біу мМаі Бе рей узі Ашро Був йяо Рго Ні Авт оТвєс Та
О10 Бех Ак ем Уві уві Авр о вна беж бій Бе бет АкУ сіУу Ап тТНе
Уув5 зай за5 00
Акоа умаї Бех Тур Рго Туз Епе вата Уві Рез о Авпоцем ЗІ) дет оте Ти 05 516 415
Авт їм Пец бер бат АВ іє Бех Тбіїе ей Бек рем Аве Узі Бек Аа 42й 425 ЗО
Аіа рре Тух нів. Бей оБко пені Нів Бео дія діа Меї РЕО нів Бей ПеЗ
ДЗ за 445 уаь сїу Бек бек сту ши 5 Ако Тук Уві Аїва Ага Беи дек Бек ТНг
Я 4а5У 150
БетоАку Те Нів АБО Чі бій нів'сіУу Тк Ме сій АБй Беи Нів два
Б 70 АВ що
Бех Сув век дку вв о Бе тух уаі бек їй Пез їшнотер; рРне ої Ту 85 490 455
Бе сіу йку Пув їец Ніз пес Тук обаж Нів Бто Т1є Т1іе Без піу ВБНе
ЗО 05 518
Ана вув о Т1їе кко Мек сту уае1ї біУу Бей Бех Во вде рей рез Аїа щій 515 Ба 525
Жпе Тк бах Аївз 118 Сув жех Ууді Уві Ага Ажу Віа Рпе рко нів Сук 53О 55 зай ів Атїа Бпе дех Тує МебЄ Ар о Авройви Уаї Пцеб; біу Віа пув беє уві 5а5 За 555 5З8О спів онів оец сій бек рез тТух тк овіа Уаї Тнх Айва ре тез рез Зехт
ЗБ У ха таї зіу тре Бів Іс Ав) о ТвВКобес Буш Таж о пув ато ТЕросі1у тую оту
ЗНО 55 ча
Без Ап овцесмеє віу ТУЮ Уві їіе (Уу бер откробім Век о бац Вко дід 535 «00 505
Авр Ніз Іїе маї бій пув Бе мув Аяробув бе Аку був тез Рко ух) 510 ІВ хай
Ази Ак око Сіе АБротТхо був Майї Сув о сзлй Ажеа тІтесуаї сЩТУ ей те
Би 30 35 вдо сСіу Ре Аїа Аза Ето Ріє Таж бле Сув біу Тук о рко АТа пе Меб ро вав ва 555 рей тую АтТа Су Тіз Твж АлЛа ув біп о АлЛа ре Мяі Вне бве о вкОо та во: Е5 ат тук бує Віа Бе Тем Сув бів сій Тук МеЄ Аза бец Тукорхо Уаї А1а 575 БО 685
Ах сбіп АжУу рхо біу дей Суя бій Узі Ере Мія АвроАТа стих ко ТНЕ 530 ва 7
БіУ Тсвобіу цей олія Ії біу Ніш бій Ак Меб ку 0іу Те Ре Уві 795 710 715 тра
Віа Буз пем Ро Іїз Мів трх Аза бі Бей рез Аза Ліа Суб Бе Аїа 78 730 735 дез Бех джка Бех Зту АТа пув Ссва тіе сту УНЖ АБрБ Ана бек Уаї Чаї. тай тав 755 їжи Бей вхо о Буз ТУух Тіт Бех Раш ро Ттр Бей Мей осзвБу Сув діа ліг 755 780 7655
Авпоїтр Т1е без Ага сп Тс Бер о рРче Уаї Жук Уві Бро бек Авіа Бей тта 775 то
АвлоКтОо Аза АвроАБр о рко Бак Ах сіу Ак о пейп СІ це Тук одкЯ бо 85 78 7ав вп
Гей о пей Ата Пе рко Ре бій то Та тру зі Ака ТБт бех тен отук 805 вто 815
Аїіа АТа бек Бо Бех ува! Рго Бек нів Пей Рго АвроАга ууаї Ніє рРБе 5-0 825 30 ліва бех бо бу Нув'уаї Ата Ттр вк Бко Бо 535 нав «ВМ «ТЕ 00 «їй Білок «214» Вірус кзпатиту В «пл й
Меб бс1 йта РКО їси бек отвю Тк о Аже дкя п1у Меє сію Бій Ав ол
Х 5 т ІВ ет Уві го Авп ро Сен біу Ра ра Бо ввроНів Сів Без дер рго йо 25 ЗО цем Ре Гув вів Авп Бех бекобеє Ето Авротрр о авБр ейе Ази бує дна ло Фо 45
Ту авроТнж Тер о Рко Ме АтТа АБ пуд уак Ту Маї 01У Ака отут іх
ІВ
Бко сім Бе Таж РКО Рго нів спіу біу реп лей с1у тре оБЕх Бко сх ве 7 тв ва
Атїа піп б1іУу Уві їв тає ТБх Пец рго Аза АБО Бжо рко ВКко дів Бах 85 о 5
Тпх зво йхи дк бек С1іу Ага їув о рхо ЧЕ о Вко уві Бек о Ржо Сто Пе ї0о ща МО
АтЯ Ар о тТвж нів ро біл А1іа мес Бій Ткр Ав беж Тк освй ре нів 115 136 125 сії Аза о йез їеа Авроїто вка чаї вхо Атїа Мей Бе ко) рТО АТЗ Уу 130 ІЗ35 Т240 сСіу бек бат бет січ Тк бій Ав о гко АТа Рхо Те отів АБа Бек Гек 1485 159 ї55 ма
ТЕЖ бБву Зак їі бле бек бує ТВх щу О1у Руо йТа Має Ап Мес Авр 1655 170 175
Авй ІТ ТЕ Бех бу ем опей зву рго Бей Бей уві тей іо Аїа Уві 85 ув5 1-9
Су Рис Тем Без Тк Був Т12 ей ТВх ІТіє Рхо Тр Бех Гес обвшробек їн 26 235
Тхр ткр'їТнх бе опе) би ре цей БіУу біу Бех РКО льу Суворо сту 218 2515 25 ліп о авп о бе бів бек РКО Так бек Аза Ні Без Рто Тв беж Сує Бо 255 230 35 250
РІ Тк був Бко ОЇїу Тук джу Тв Мес Суб Гей дгаоАтц ле бів тів ча авіа ку
Ббе рей Ене лів бу Бей те Сув без тів Бе рец рей Узі рей рен 259 5 270 аяротук зіва БІУу Меє Бей реб у Сув РЕс їв гів о Бко Бі беж ТЕ 75 во ве так отак Бет Тр оцп)у ко Су Бук ТЕ Сув ТБ тТвжх емо ойта сій СТУ 2530 У з09
Те беє Ме пе рто бек Суб був Су беж Був Рхо Беж др сСіу деп з 319 315 зга
Сув пт Су Іі реко ті Бго бек беж ТкроАТа во бі1у був Тук Гем 355 3539 335
Тер ст ТтТкроАТа бек Ата Ак ре бек Ткр Бей бет Пед бе) узі СТО 49 45 355 вне тав іп тжроСую Чаї сіб ей бер орко РТйкоуаїю ТЕросев о Бес 118
ЗБ 360 355
Тіз Тер оМес: Ії8 Тер оТук Ткр Біу Бко Аєпобеу Су бек т1е Тейробву
Зо 75 38
Бко Рче Іі рго Із Гео рРго ї1е ре був бук їм Тер Чаї Беж іє з85 зза 195 409 10» 24 «фїл» 154 «212 БіЛОК. к«вї3» Вірус гепатиту Б с490з 8
Мебє дів віз Ага їм Сув Сув піп пен АБО Бо стах Акая авр о уаї рей 1 З то Не
Сув ем Ак Ро Уві С1у А1їа 01 бех йко Піу Дка бек о йем Зеє у а 25 ТО ат Пен бсіу Діва мМаї Рха РКО Еко бек орто шу АТїа Уві рго Аїя дев 25
АвБоросіу Бек Мія Пец бех без Ага сіу бен Бо Уаї сСув бек Бе бек
ЗО Бе 5 бек Аіїа бі рко був діа зей дк о Рпа Тих Бер Аза Аго Ака Ме 1
БЕ та 75 80
ТЕ теє уаї Ав Аза Бго Ак бек Бер орсо ТдкоУахє йти На Був Ака яв Фо За
ЖИпЕ орво сіу пен Бек сСгу Ата беж Меб ТУ Тер оті біз Авротух 4 таб 105 110
Був АвроСув уаї Рре ПувоАвр Ттр о Бій СІ Пе) 51У біш біз 16 ду 115 о 25 ней їув Маї Ре Ууяії рев Сі Бім Суб ага нів Був о цез уаї Сук ЯвЕ що хт35 142
Рг оззіа рРго сСув АБпорДде рве тах бек лід їж 159 «10 8 «81» ї184 «2198 Білок каї3» Вірус гепатиту В «40» 75
Мек дво да тйх Твк гей Ро тук Щ1у їй ре біу Пец Аєр 118 Авр 1 ре 10 15
Рко стук ув сій Ре сту Від Так оМаї бій Бей їєд бер Рде Бей бго 20 25 19
Бек АвроРНе Різ Рус бек Узі Ака АБО Мем пек Авр о Тих Аїа бек діа 35 45 а5 пей тук Акт бій Бек пев Зіш пек бек Авронів Су Єву Рко Нів Мів за 29 Гек)
ТЕ Аза без дк спі атїа ї1е рей Сув стер бО3У біз Беви Меє тіж Бе 7 75 во
Атїа ве тжр уві ім Ав дви оїви с) Авробхоа Аза дет Ате АБро Без 5 І 5 чаї чаї дві тТУух УМаії БІ Твж АВі Ме З1У їй о Пув її Ак Сія пи ба ща 110
Пед о Ткр Едеснів Т1е Зек Сує цей бу Бе б1у дкЯ бій тех уаї ей
Ті 1582 Не. іш о Тух ен Уві бех гве соку чав о тТкв 16 Ажо ТЕ Вко РЕК йБТа Тук ї20 т135 їй
АтЯ о рго Бгто Аве АтТа Бгто Ті Сей бек Тахо Ммез Бто 51 Тк тв Маї 1 150 155 ой таї Ака АкЯ вт сіу Ак бек РКО Ак Ак Акту Твх роз Бек РКО зго 183 170 175
Атчовта Акха бех біп Ббес ро Ак оАКа дхоа дкЯ бек діа бек о вБго лів 180 І85 1960
Зех бів. «10 96. «21» 82 «81йх Білок «»1і3е Вірус гепатиту В «400 76
Мав ово пей бек ТУух ія МКівБоРйе Агу Ато реч без їе Пей др 10 1 5 19 У біб Аа біу Бо Пец сія сіб бій Беш о вжо аку Пец Аза ддюо біц аб й 25 35 рей два дк Аа уаї діа сій во Бей Нів Беп ій іш) Вро Авіа АБО 35 0 45 бек іє Рко Тжротьк нів Був у) Сі1іу Акл о віе Ту сі1у їв тує Ветг 50 бет Твті ї1їє Рто уді впе Авп орто АБО ТЕробію Тих о Бко Бек Бе РКО 5 7 та що деп ої1іе Вів Печ Ніш 0120 АБроїїе ї1є Тих бує Сув Сів сі РБе Уві 85 що за птіу Бк Пем ТБх Уаі дапобій Ппуз Аку ка Пе був Ге чуаї Ме РКО 197 тп 110
АТа Аху РБе о бде Рко АБпобек ЖБЕ Був Тух беш ро єв Авроїув ТУ 115 125 325 тМТїв Був Еко Тух Тук рЕзО ста Ав уві Маїс Аа нів ТУЮ Би БІВ Те 130 Та 140
Ага Нів Тук Пе» о Нів ТБ Св Торо пує ТБІ сту Ї1є цей тує ру Ат 145 150 155 щей ші тах Бзродго Бех АТла дек Тве Су Піу бек о Бко Тух Тато Тхр о соїй
155 170 178 бі АБроПейц бів пів СОІУ Аза Ре тей Авросіу Ро беж дта уві Су тва 185 150
Гу біо Вто Ве Нів піп біб дет бет Аку Тіе Рго бех дку Єву РЕФб
ІЗ5 0 ох баї зЗіу Бро беж ЇїТз біп бек оПпув Ту бів бів деї Ак о БГец сту Бей 1 215 й сів 'бек біп цув сі ро Бей Аза Ажо Бі бій біпосіу Абу Бек оттр 225 239 2385 я деж тен тур тт Акоа Уві Бі5 оВго Бех ТВ о Агоа Ах Вко вне о бпіу За 45. 85 155 бій рко Бех Уві бек йпіу Бі Твт два да БрБе Аз1а бек Ага бШех Аїд 280 25 за
Чек Сув цем Нія бій Бек бек Ммаї Аку сіб» Ата Аїа Тук бек нія Цей 15 280 285 датотве ТвВробує Ага біп бек бек беж Сі Нів А1іа Уаї 01 без тех ва 295 300
Бет Тіе Еко Еко Бех Бек Так Був Бех бів бек бій біу Рко Чаї Бех 305 хо 5 350 ву Сув Тхт ТЕроіжши біз Бле АхУ АвроБех ін Ркго Сук бег АБр о тук зи 333 335
Сук лез бех Нів Бе Уаї Двгпойєев о Пей Зі АБрвотую ОТу рго Сев ТК
Ко зах 359 зЗім снів біу бі НівБ о Ні тІ1іє Ага 1318 ро) Аха ТУ ро діа деч Уді зво зве таж осіу птіу Уаї Рпе Уеч Уві АБробув лдЕпП рт Нія Ал ТЕ Аіїа Зі 370 375 то
Бек АгЯ їв УуДді Уві Ашр о ЕБпе бех піпогнНє бек ва сІ Бех АТвВСАсо зва зай 355 45о
УВаь цех ТЕрорхо Гув Рпе Віа за гго дво обем бій шежх сер Тих Ави 405 Зу5 аїщ цем огрей бек бек дей Се) бек о туО зей Бек обом о аБв узі Бех віа віа 435 425 430
Епе тух нів лів ро цех Мів Рго Аїа Аїа Мек о Бхо Нє Тєц іа Мв1 235 аа 445. піу Чек Зек біу Бей бек дку Тук Маї Ала Ага Гей Бек бек АБО Вег 450 Аза 450 дкЗ3 ті їец а5р о Нів зт Тут СІіУу Так пез біл АБ Бей Ніш Авр Сех 65 479 З 50 пеудочак Атхяз біз пей тук Мі бек мдею Ма Бей Бецотухк Бжа ТБЕ о вре «85 аа ча5 піу Аго був зец Нів йей Туг беж Нів рРко її: Іі печу біу Ре Агу 500 55 зІій ув Гі Роо Меб бу цец бі Пец бек реко Ре ей Мек Ма сб12 рРБа
І5 За0 БеБ тат опекоАїа їі Суб Явт уаї Уві Аго Ака Аза Ре рсо нів Сув' цей 5іб 235 540
Аква Рбе бек Тух Уві Авр о Авр Уаї Уві їєч бі Аїа був бак Уаі Сіп 545 ЗО зв» ЗЕ
Ні їєц ЗіІч дек рец тую ТК Аза туаї ТЕ БИ Ре тен отен бек То «Б 57 Б зЗіу ті Нів Печ дви Рко Аа букотнх ПБув ака Єкроспіу Бук бек оБрец во зва 5ЗО
Ав рие о Мес бБіу Тух Уаї Щ1іе сіу Бек Тир СКУ Тах Гей орко си со зЗ95 ай 5ОВ
Нів Ії Тпх бі бує ІЛе був Сіп о Сув Ре Яке Ту пен Ро Уві Ав вЕБ 220 дже ко тів Ар оттр був оМаї Су сів Аже тів теє біу ей іГем о сіу за У 540
Ве Віа АТа Ро рве тру 10 Сув бі Тук вхо Ата рес ме рко цецд
Ба5 БО ва
Тук Аіа Сув 16 О1поАїа бує біб дів Бе Те Ве бору рко трЕ Тух
БО БЕ о їув Аз бе ївц був Пув бів Тут Мебс деп Тева бух рко Щуаї Аза хо еВ 5850 85 біз ха Бхо піу пев Сує Сів ома1ї ве АТа АвролЛіа Тк Бо с твр обту
Боо 595 тив
Ттр 51Уу грец АтТа їліе БУ Ві Зіб'Ака Ме Ак сіу вх вйв о уві жа 75 710 715 тий
Жтхо Бей Бго Біє НьЕ ТВЕ Аіїа оз ем темсАтТа АТа був вна Аза хх 75 Па ре!
Зак Ака оЧех ЗіУ діа Сук пес сі ОТу ТВЕодБр оАБМ о бЗет Уві Уаі гей 740 745 7ВО
Бек дка Пув Тук ТВт бех Ре ра Тхір о Меч пе Ту с сСув ВтТа Аїа дай 755 тео тва тв її бец Аж Оіу ТВт Беж Ре уді тут уві РБРго дек АтТа ей АБИ по 775 780
Рхс Аїа ЯБроАвр орто Бек Ак піу вту ем Зтіу без Тук Ах Рхо Шев 75 7за 753 да пец Ак їв Бко Ве рей Ро Так ТЕЖ Зі дху ТЕ бек Бей отук дій що5 81 чІ5
Чаї бек рко Бех Уві хо пек МівоБей ро АвБроАКу Ууаї Нів пе Аза
Бех Ркго їєм о Нівосуаії Так оїжю пув вка Бо а35 4 «ЗРО» 87 «8115 95 «війт БІЛОК из» Вірує гепатиту В «ар 7
Мес Біу без Бех ЩЖхю Те о уУаї реко ппем бій Ттроіу Ту Аби цей Бех ї 5 їб 15 тк оЗет дав ро без Сіу ре бег орго АБронІівВ сій їн зво Рго Аїв
295 Рі За вне ака овпіа АВі ТаХ АБ оАвпогкО АБО Тр о аБр орі дп ро Му Су
Авр рив Тхр о Рго сіб; біа деп пев уві біу баї пі Аїа тук ШІУу рго зу за бо біу зве Тв о рко руб Вів С1У бле ге ге) біу ттр бек ро Бго бек 55 70 75 во ста обі Тпж оіеа Так Тпс це) рго Аза Авр о Бго РІО РКО Аїшд бек Тих
У 30 а5
Авп вхо бій беї віУу дху ій РІО Тс Бко ІТїів бек о рРго рко Бей Ака 100 105 0
АЕр бек Бі ВКко Зіп діш Меб бій Тк о дв бек Те діа Ре нів ТП ї58 120 125
Аіа Бей біп Ава Бго Був Уаї Ако біу Ге Тух рей рко діа щу У 135 135 1349 бех Бек Бек 01У її Уді дви рго Уаі Рко о тТчаї тіе Аївз беє Нів т15 150 155 169
Єех Зек їі Ре пек Ах ї1е біу ДЕю Ро с ліа рко АвпоМеб Сі АБ 155 179 Тих тів тих Бек біу вне пед б1у рко їеба Без Уді пез біо АТа біУу вне 180 185 150
Рпє Тез огач ТБж о Ажо Ті реа тах осів Бо Бій бек Пец опбвр обет о тк т 200 по тркю Тйх Бек і-й Авт Бе ве; Бі б01у Уві ко Маї Сув Рез озтУу Цеб 215 215 го
Автх бву сіп бек рко тре бек Ап Мія Бек реко її Бек Сує ВКо ро 225 230 ХВ 240 тв Сув Еко бі тухк ВЕ ТрроМмес Сув бе вк Ака Бве Т16 ше вна 245 250 ла
Бги Ре Ії Грем ей Пец о Сує цей 112 Бре дез без Маї Пед о бев Ар во ав та
Тує піп сі Мек гец Руш Уві Суб БЕб ей ї18 Во б1у Бех Бак отв «5 288 їй5 твж бек Тк о1у РкЕо Сув бує Три Сув тож Тахо РКО Аіа пів б1Уу деп 230 235 300
Бек Маеї Тук Рхо бек був Су Сув Гак о був Вко бву Аврозіу АвпоСує за5 315 35 зап
Так обує Із реко тів Бо Беж бех Тср йіа Ре Аїа ПувБ ТУТ Ше ТЕр
Зв 330 335 зво Тгр о Аїа беї і Акту Бпе о бех тТжробев шет бю Беч уві рго рНе 340 лав 53 чаї біп Тко Вве уаї біу рев бех во так оУаї Ткробеб беж Аза Ме 355 60 55
Тер Меб мес Тхр Тут Тр осРУ Во АБп їєц Тук АБИ Бі Меч бек ро 370 75 зва пе тів ро Пцей Сей Бгто ТІе пе Рпе Су тей Тхр уаї Тухк 4 Хе 385 536 95 «вах Си хаїі8 58 се2ї1йз Білок «243» Вірує репатиту В «4005 8
Меб Аїа вів Акт Гей був Ак бів пе Авро ото бет Ако АЕрО Уаї Бех 1 З то 15
Су ги Ка Бо Маії Зес Аївя біз бес бву біу дк ркб о бва БЕго о Зіу 2 25 І 30
Бко Бпеоліу Ма гени зах Бтосрко бек То Беж Віа ба) ро Аза дер 0 45
Нік: )у йів Чі йецх Бех Гей дйка ПІіУу Бей: Рто Уві Су бек Ре оба 5 сиЗ Ба
Беж Аїа б1У РЕ СУК о АТа Бер сАко Ве Так бек Аїіа Аку бує Мек 1 7 18 За
Так пів Меє АБИ ТІ бек Кі Пів ше Рус Акч цій їз Туг пу вх 35 30 95 твкобец Сіу цез Рде узі Меб бек ТНЕ тих біу уві Є1ц БУ ТУЮ вп о 05 Іо їує Авр.Сує Маї Ріе дів діч Ткросій пі Бем О1у АБюо бій Яеї Ага 115 150 155
Тїец Меї тах ЯвБе Уві Бей бі Сім Сув о Ажо Пів Був пей уаї Сув олій 130 Т35 143 тка Аза РЕ був Аєй РИБ где тну Беж Аїа 745 152 «2105 28 жеї1їх 81 «1? Біло «13» Вірус гепатиту 8 «ЦО» 29
Мес ет цей бе Бів Дей був рей ті Гі пе Сув о Бех Суб ка ТВЕ 1 5 а 15 у бій діа Бек ув пей Суб ївуз сіуУ Ткробе Тхр сі1у Ме зАвроїіїє 8 30
Ашрв о Вко Тук ув бій РБе біу АТЗ бвт Атїя сім без їЄею беж рн Бей 20 45
Рко бек Ар БНа Ре орто Бех Мі Ак АБр еп Пец сквер оїВкК Аза бек
КО Зх 50
АТта цей тех АтФфосіз Аза їєз лий беї то Зїм нав о Су ТЕХ ОБО Аа
Ба 7о лу а
Мія Твж діа без Акт бій діа сі8 реа Су Тктрв о ціу біз без Меб тре 85 зо 5 цейп АЗчЧа беж Тк Уаї Зіу Ав АБ ОБО бів» АвроБуо діа А1їа дк АВо 100 155 280 івча чаї Уві АБп Тут Уаї Ап Таж Аво Меб бі вх БУ Іі Авто пів, 115 ї180 зи
Пемосієюв Тке Впе Ні Тіє Бек о Сує це Так овре біу дк Сід тих маї ї30 т35 140 їво бій Тук Бец уві бек Рбе о біу ба) Тр 18 Аке ТАК о Руо Рхо Аіа 145 150 ї55 0
Тух Аго жо ро Ав оАза ркго Тіз Пец одеє Ти цеч Бо О15 Тв ТнЕ 155 1795 ї75 тукі Уві джч сій Ас біу Ага Аїз вхо вка Ако зо Бе рго ях хо 1855 ї85 130
Ах АкЯ Акч Ак Бек бів бек Ро дуд Акч Ак дк Бек пій бех го 55 350 205
Атїа беж ОїпосСув 510 «Щі0» 30 «ау наз кій» Білак «йи13з Віршис пелатиту В кА» З
Шев Ро цей Бех Тут сій Нів РпесАкУ Ака Бей їси пев Цей Авр АБ ї 5 10 18 сій діа спіу вргосБем біз сі бію Беш рко Ата Бей Аза Авросій дер а 5 Зо
Бек Авп опе Ас Уаі Аіа бі йвробей АБи лецо бі ев Бгто Авто оМаї їй аз зеє тІе рго Тер олвг нів Ту Маї СТУ Авповве Твж о біу ес Тук бек що
ШекоТлс Те Бхо баї бле йБа Бко Авробхюр рей Тахо Ехо бек епе рго 65 та 78 во вш її Міз ей нів сій Ар опез тіе йій гув Сув піс сій ре уві ях зо 95
Бі вхо реп ТлЕ Тк АБИ 013 вх Агро Аве обеч був Пен ТІо Ме Рго 1 105 119 діа Аку ве тух ЕЖО Буш чаї ТВ Був ТУЕ Ра Ехо Бен оАвробув Су т15 129 ї25 т1е бує РКО ТуК Тут РКО піз Авпоуаі уаї вва Ну Тух рве був АК
І30 135 140 дЕЩ НІівЗ ЖУК Пе нів твк зем о ткр був Аїа біу їзе рей ТУуК був АКУ 145 150 155 160 бій бек Так Ні бек біз бек РНе Сув біу бек Ррко Тут Бех Ткр о щій 165 тла 173 бій сію рей біяо нів Сілу беж ТВкобех без Звп о СІу сю Був'Ову нів 180 185 ї5а біуУу тк біт бех Пе Сув Аза бій Зек Бек О1у їїае їеза шву Ака ро
ІЗ5 250 Кар)
Бус маї біу бБеї тах її бій бек пувз РВЕ бів сївй беж Ак Ма сію 216 215 280 ней біпоНів був піп обі бій рей Аба Аеп обі Гує іп о піу Ак бек 225 230 235 240 сіу Ав Пей вка цех вто Заї нів о твк Бо тн ду ТевовКо Беж сЩТу 245 50 ва
Ммаї бій ро бах сіу Твк біу Нів Бек Авподшпп Гез діа тн Аку Бех
Б 265 аа
Твс бакоСув ББе Нів Збій бек біч таї Ак бій Був діа Ав Рко Бех 275 ви ва рен обевту так обек цув су Ні Таж бес Тпх Зі Нівсодів уаї Ба цей 259 295 зо два Так Заї Кко Бо бек о тик та1 біУ бек 012 бек був бі Аза Маї
З05 31 ЗУ 120 бек дек Сув Тур откробец біз ББе о Ако Ап тик Сід Ро Сув бер о АБр
Та 330 зЗУх тут був цед о бех Нів 112 ТІ Авй Бес о їв біб Авротхр обіу РЕ Сув
Бе за5 350
Фут піз Ніш Оу біш Нід нів 11 Ахе ТВу о рко Ака бак Бо деве АхУ за5 зва 5
Уаї Тк б1у сі Уа) рНе рез узі АвроіцУв деп о Бто Ні ва ТЕ Пує
У 35 БУ) бій 5Звг дра ех уаї Уаї авр вне бек бій Врбз бек дта с1У Тих тах хВ5 зва 385 40
Ахоа Маї беж Ткр Рго Був Ре ліз Уді Рхо Двп Пем бій бек пею тах 405 АТ 415
Квт пей Беа баг обеж Авоа Бред бег ТЕр опе бек цей Авр ові бек Аїв 399 425 330 ків ре Тух бій Пе рго без Ні Рео Аза Віа Меї ржо Нів їмо би 435 «ай 345
Ууаї біу ех бек Сіу ієюд бек па ту о уаї Аза Аха уаї бек Зекотне аа 58 ав)
Бех Акгч їі Ту Два о Ніє сій Нів біу ТБх без бій Авйп Пец Нів о Нів 485 АЗО 15 адо паж сСув Бех Ак о дві Пед о тТух Маі беж їй пеноПео їн-ща Тук ОХ ТЕ та 459 195
Бе бЗіж Аку Був о реч Вів Іду Тук бак о Нів Бжеа Бі ї1із Бей осіу Рог ва 595 5ІВ
Ата йув 12 Рко Мес обіу Уві сту Тен беж Бго Бр рей ей Атїа бів зіЗ ЗО 5иЗ
ЕБаеа тиж бек АТа ріє Сувз бег уві Уді зхч Аг А1іа вБа ре» Нів Су зза 535 518
Без Аіа Ре бзі Тук МебЄ двр о Авр їні УМ пец бтіу вів їв Бак Уві за ЗВО З55 УвО біп вів бе) Сі бек о цец о Тух ТВЕ дів уві Те оАвпо РЕ їсш Гм дек заз 57 575 чаї бі ті нів с тев дат таж Аза був Тс Був то ТЕроязТу тТуковет
Зно зах 53 їні Ні Ре Ме Зіу Тук уві хі аж Беж откроЗіУ Тв ей ко Бе 5З5 евов ва5 сів Ні Її3а уеї нів був 118 Пуз Авробужш Ре Ату Був цечз Бгто Уаї
Ко 515 ехо
АваоАкУ ро ї1іе АБр о Тко Був Маї Су сій Аа діє Уа» о б1Уу Те цей
БІВ 636 235 вА0 сіу цей А14 А1їа вЕго Ре так осів Сув біу Тук Его Аїів Пец Мес ро 650 555 на їТук Іа Сувотів ТЕ Аїза був бій Аїа Бре уаї Бе Бек о Бко тиж
БО ав вто
Тух Пув с йїа Ріє реч Сув Пух піль Тук Ме др обец Тух бро ді діа 575 580 685
АтЯ бій АгЯ Бто О1Уу Бей Сув сів уаї Бле АТ Аве Аїв Бго Бо Тл вза 635 700
Зіу Чтв б1у їев Та Ті б1у Ні біб АхЯ Ме Ак сі Так опвйе чаї 705 Аа 715 тав
Аза ро ів го ї1ів Нів Тк о Афа біз Без пев Аїа Аїв був Ре Від те 73а У
Акт бек Ак бех слу Віа АБО оті тів зу ТВ АБ оАБп о бек Уві Маї та 745 тва їни бек вхо був Тук ле бат Рв жо Тур о Пей Цеа спіу був вів Ата тах БВ 75
Авпоїтр 1Те рей Абу Б1Уу ТтТВж Бех Ра Уаї ТУук Уаї Бко Бех Аза рем то 775 тва
АБ Руб Аз АБО АБробхо Бех Ака біт Аго Бен сЬу реа Сув о вка вто ти І 795 по їец о їБвм Ага йеп Бо Ре АБО хо Тв ТЕ РУ Ак вх бак ге тую ко В10 ІВ діа Ар обеж Бко Ро уві Рко бек оНів ем Бко Діаз Акоа Уукі Ні рРБе 82 25 830 йіа дах ко пей Ні Уві Ала ТктроАга Ето Ред 835 веб «810: 33 хиіїї» 800 «їіаз БІЛОК
«235 Вірус гепатиту 5 «ВО» ЗХ
Меб біу йдіз ро Бей пах ТвВк Аза Ак с Ата 51іУу мес біу бій Авій дей
Х З ха ІВ беж уві ко двпоРхо ви оєізу Це Ре Ріо вБО Нів бій тей двБЮ Бко 20 25 30 пем Епе Ак Аза АБпобех бекобек Бко АвротТхо дЕр Рдпе АБо Трж АБ 49 45 пу дар Анпотхрорко Мес Зіз АвБо Бук Уві біу уаї сїу 01у ре б31у 5 Б п
Рко біУ Рпе їйк Ро РХО НіБ біу біу бен рей сіу Тер 5ак рхо бів в 7о т5 85
Аіїа Стій біу іє Мед ТБ Тих Зв о бко Бо АвБроБко Бгто Бо Аза бБях 85 зи 25 тТвх ваш Ага Ака Зек біУ АКо пу ово Тих Еко уві Бак орто Еко Бен 100 ТО5 110 йкоп йлр тн Ніз Ро бій діа Меб бій тТкро де дет ТЕХ сСіпоБНеЕ Нів 115 ї2га хи бЗіп Аа рей цей АвроРто Аху Маї дк Чіу Бей отуює їд ро діа 01У 130 135 150 сі бек бет беї біз Тк бій Ап орто діа ро Те тів Аїіа схекоцеи 1х5 159 55 їбо
Твг бех бек ї1іє Бне бек бує ТВх зЗім АвроБКо Віа Меб дв Ме сі 185 175 ї78
Ашвпотіїв пк дек 1у гемо цеч ЗГУ рко цех без уаї Пец пів. ма тах 1859 185 1209
Сує Ро Пей Бец Таж Гув їі бен Твпє Тіз ВгОо дув бек пед; Ашо БЕЖ 1553 200 205
ТгротТкв тах беж сей дЕИ Бе пе о біу баї вБго руб Сіу Сув Ро б1у 210 215 вшио іп оАвтЬ бек Ої0 бек Рус ї12 бек АБ Нів Пеб ко Тбх бек СУБ орко
Зо 235 243 І вко Тк Су о Бко Зіу тТук Ак Тер оМес Сув Бей Акч АЕЯ Ре її І1е 245 250 Ж вне їячль Блестїів пей ви бе оСув Гев Хіє Рресїши Дей Уві Бей пей
БИ 5 ат
Азроїхк біпосіу Ме Бео Бко уві Сув Бхо Бе обед Бго біу бекотБЕ
ЩфІ5 зво 285 тих Так обато Тв 51Уу Рто Су ойцув ТБЕ Сув Тлж Ти їй лів бів бі1Ж 2ао 295 30 тих бек Меб Бпв о рко Бак оСув Сув СУБ ТК був реко шех Авр обі ЗБ зо5 319 315 320
Сує Бик оСув Ті Ро ї1ів Рхо бек Зех Тр оАїа Ре 0іу їувБ о Тук Пец 125 530 338
Ттр.бів тТкр о Аїіз бек Аза Ака Ра бек Ткр о Бей Беж Пецоішч Чаї зів 345 345 350
Ре уві бій ТкроСувз маї 0іУу пев Бек о РБко ТВроуаії Тхр оПєш ей Уві 365о 365
І1е ткромеб тіаоткротухк тр біу Рга о АБпоїей Суб беж ї18 Кей зех 370 315 ЗВ вро Бе тт око Беша б) ро їзіе Бпе Суд Тух цен ТкроАіа бек 112» 385 ке 335 409 «81» 32 «211» 154 «2122 Білок «13» Вірус тепатитм В «ай» 3
Меї Аів Атїа АкЧ Мер був о Су Сіл о пей дар ого А1іа АКЯ АвроМаї ей
А 5 що ТУ
Сув Бей дхо Рхо уві ЗіУ Аїй Стів Бек Сув біУу ху Бго їв) Яех Тр 8 25 за
Бек пев о бс1у діа пед; орко Ртбо Бес бек РКО ргОо с Аза сбві Бгто АїВ АБ а що 45
Авр озву бек Нів Пец бет ец Аж б1у ей Бго Віа Сув Аїа РБе дек
ЗО а 50
Зек Віа Му Ро Суєе Дія лен Ата Ре ївВр о беж Аза сАта Ага Меб бо та ТВ но тиж те уаї Авоі діа ра Ткр ай Пей вто тах тТаЕ тей НІБ пу да до зо Кос тНЕ рей С1у їеч бек вхо Аку бек тТвЕ Тек отко т1е іч біб тук її
То 155 110 ув ввроСув Уві Бне ув о АвроТСхр ої; біз бек біу Бім Ом Сей дк 115 123 ї85 їви Пув Заї Бе ба1ї їеп б1іу сіу був Ак Нів був ен уаї СувБ беж 3 155 145
ВкосАТа ро був Авйп Ре Ре ТНК бек д1а 288 350 «5102 33 «8їїМ 808 «лах ДНЕ ді3» Штучна «й «КаЗ3е синтетична ДНК «ах «-й812 СО5 свййг (Ук... УВО) «абйх 33 чавсссцеса се аку здсс заг чаа зо Ссе ас ач за чад шу бра обес -ї
Мес Ма АвБробів вла Рко тах Бе О1у ту тТтр зЗех Зах 1 ро то аа: ссб ва аву сода асчу чЯс вса зас бра сб са ссв о аас сет ска 35
Ммув о Ржа Акч о Гув о б1іу Ме ОТу Тс о Авп Мей бек оМаї рус ави Рко ей
ІВ КІ 25 час БЕЖ ре сеа зас баб осзау ба щас сов Зсе ес дач чес вас бо 147 біу Бре Ре Рко АвроНів біп ви АБр орто АтТа Ра біт діа Ав беж за 35 СН «5 зас ват ста зас р чає пссповаб сс зас даа бас ско бло стра дав 135 деапоАВа Бо дБр отв двБр вне вай срко Авпомуб ЯБЮ Ні Тур Бжо би
ЗУ 5О зес вах сма дра че чо зпс цдста КЕ дав сс дес СЕК аса сс сса газ
Аїа АзпобСійп уаї сіу Ууаї ще Віа Ббеосім ко с1у Бе тах Бро го
55 То 75 сак ча азс Бач Єса дао сце оз ос сза дев саа че о ате сф оасе 251
Ні біу птУ Бейобей О1у Ттр бек Рхо З10 Аза зіп ої 118 Бей ТЕ во п зо ас вес оса с пев єса сса сої чЧос сса ас ває зпа сСазвз Бевз 335
Тато уві Еко Аза Аїа йко ра Рхо Кіа дек Ті АБ Ака Сід Бех З1У
З 160 105 вк пас сс асо со ак ач сса сов ссрада зас са сабо соб ска 287
Акспосіп Ріє ТВ овко Ії бек о рго РІб Бед Аха АБробек Бів Бже бат її їх5 ЕВ 25 пос в саз бод ває вачб саст аб Бе саб сав чес ба сво дає сса А діа Меб біб Тхр о Авпобех Так оТтвкК оре нів піп АТа ій Гед лЛерд о втко ї130 135 143 вла ба «ча зда ства Бас вес сса зов зак о чЯ їса са са зас апа ва ка Маі1 Аха біу пе) о тук РДде Рко Аза сіу ПіУу бах бек бек сту ТАК 145 150 1515 два засо сс ЧЕ ссв овса ага оса сс сс аа кеє сб вро БЕ ово 531 туаї Дей Ре УМаї Бко тн Таг о АТа бех Кко їїе Бек Зак їз Бпе бек ї5о і65 179 аса аса оче зві сса ср осса вас ау чав зас асо аса сс ода вес 59
Ахка ТУ 51 Аво Рг Аїа ро АвбоМеб сім АБИ Так оТаго бек Сїу Ре 175 180 185 сь од ссбосва ба спра ббта свасчєб чез сс осве са сба овсос соч ви пен бЄ1їуУ ЕКО без беж уаї беш сСБа оАза оту Ве бе Бей Тео Те АБУ їз 155 209 255 ас са все аба сса сад ссз хба чаї їсс ба год аск това бру вас 5
Іів рем ТЕЖ їі Рес бій цех Бей АБр обБок ТЕроїкр Тахо бак Пеиа АБИ 510 215 28 ха сБа да ух че сса паса бас ска чаї Сай чає ес Єва шббоссс та
Ре лем біуУ піу А1а Рхо ТП Сув Бо бі Ота Ав Бек бій Бек рко аз 230 235 аса сс вас пах бос сос асс вар рас пса сса вбв оре соб о Зце сає КВЧ так Бек вв о Ні Зек РЕ їМЕ Як Суб ро РО Те Су вто 1у ТУх 40 а 250 згча ос аа Бас са сях вчва вЕссаке асо тес ср обро ке ре се ні
ААУ што Мвб осСУув че дка АксЧ втйе діє її Не їй рве сіє Б пе) йо 250 255 кас се ассосЕс СБУ сса збо са свя Час бас осаз ча ява ся а57 ем Сув пед Ті1е Ре їєма Бен Уві Ццео Сеш йБроТук йЗіпосіє Мебоїей 379 ТЕ ва 285 сса зв с сс го ско сс ЗзЗа вса сао ася вс ек аса чус сс 15 вто а1ї1 був рго Бей гей ВКОо піу Тау Зак отак тОж Бех тТакобЗіУ вка 280 5 зп спро вач аса бас вса абс пса са саа дос абс са аб сб осса бос зЗ63
Сув пув Тйк Сув ТлЛюЕ Ї1іе Бхо Віа піп іуУу тик Бек Меє ве Бро Сех
ЗУ Ки Зк сої бас 5 аса аав сса аа зас зас аво го вса суб ага сса аре 01
Сун Су був ТИХ Буз Руб бех АвБр Піу АБпоСув ТБ Сув ї11е хз Це 380 зе85 БІТЄ сет бса Со Бад Чек СЕ дес аа сбсоссх Боб уаз дб пс бос ее 5053 рко Зав дет о Ткр Аза Ре Аза Аг РББе пе Тжр о Бі Ткр дід ек Уві 135 340 345 зча МО сс са ста ес сср оса оуЄсС оса соб оЯЕЕ сеа бл с оо 1107
АкчЧ РІВ беж тер Бес бех цей бію діа РКО пз Уаї Іа тТрроВБе Узі 159 355 зво 165 зда кс са сов асо дес ба ба са что вос Бач аа вс ов бас 1155 лау їн бек ро так Уві тер Без бек Уай ї1е тхв Меко Меб тер отую 7 375 зо
Боесочас сса сс бу бас вах абс ба вас ста б ства сса сб су 1203 тТтр Зі Рхо бек Пец Гук Авпот1в Бей АБа БКо Бе цей Ро Бреш Цец 355 390 335 пса абс ше сс аб ЗЕс Со УСС Сас аЄ баб ос заЄ сса таб аща 175
Тко Тіз Бе Рпе Сув Бей Ткро маї тук 1іе Ар їТе аББоОрхо Ту Був що 305 ліб чат цс се сса соб очсо чав ба ста сс спек ока сса їса зас ЕЕ 289 сій РП о с0іУу Аза Шет УДІ сСіц Пез стем дет Рпе пез Ро бек АвровНе 415 -ко 425 ре соб азс ага зЧа Час ба сс за абс о деб бст зе соя Євб'ата ІЗа7
ЕВе о рко бек Іїе Ака лЕш пев Гез звротТвЕ іа бек дів Гец тує Ага
ЗО 435 да де чай пса спсба заз Боб сса час бас Бак ов ссва са баб асс ста Со ІЗ
СІпсвіа без 01 бБеї Рго сли ків осбує Бек орхо Нів НЦія так ба пео
ЗО 255 «260 ача саа цса ас ся кос ода чос за га с веч вас сбя ск асо со 14553
Вха бій АтТа тіє пей Суб Ттросту аю без Ме АБ Пей; Атїа Тлх Тжюо айва 570 475 че час рес ває сря ява час сс пев хек вда заа сб яса яв огос 1451
Маї біу чек Аа пе пі ар оРго АЇїв бек АкУ3 сій їєцп уа1і Уві бБеї да анУ За ас да вас сов вас аба дуб сба аву вс азу сва ста се бе се 1535
ТуУук Уаї айви уз! зві МОБ ОТу беп Буб ї1іе АкУ зів гем їви Ткр вне 3955 зо. ОЗ кас асє аце ка ста асо со зчу аа чав саса Зс9 КЕ заз ота сво І587
Нів іє Бех Сув Бех ТБу бе С1у Акау бій ТНЕ бдїі Пед) сім ух Бей о 15 зай 525 чЕс бос КЕ УЗ ЧЕЗ ба аєс ада зса сса ста зе Бас зча соб оосу 18515 маї Бех Ре сі Уаї ТкЕр її Ака Ту Бгто Бто 8Іа тує Яка рго вго
ЗО з За ває сс сова яїс стч ас свса ка сса заз ас вВсс озчеб зе оасе азу 1583 авпоАів Ро Кі рей би тТпх Без Бко йти таг о тис Узі уві Агро до ва 550 що.
ача зас аоа сс сса зча сах взча асс сег сс сса аб ау вза ах 31
Ага зіуУу Ако Бех рРго Аго Ака Ака Тк ОБО беж Рро дго4 АкаЯ ВуЧ АкКа
ЗО БВ, 70 са осаза ащЕ сеї сас соб ада ача бос сазч вче и аЧца чен соб о сва бас КІЗ бек бій Жех РЕ вк АКУ Ака Ака бек сій Бек Ате Січ бек обіп пуб 515 УВО 55 стає сає сво бас сас саб да дсадессое 1808 пів нів нів Ніє Ні НІВ ва ща5 «ві» 34 «2115» 555 «12» БілЗЕ «213» Штучна сао» «ва43» Сицтетична конструкція «800 35 мес Аїа Авр о сіз Аїа Еко ТВ бек оспьу сту Тер беб бЗех Ту БО Ах 1 5 їй 15 їевосію Мет блу таж Авдоїемй бек Уа во АБа ро пей сім Ре рре о аа 30
Рко дБр оМів біп Пец АвроРко Аза Рпе Сіу Аза Авпобек Ав ап Ро 35 зо 43
Авр Тв АБроБре Ав ро ЕП обу ВБрОНів Тер РЕЄС 010 Ата ВЕП ОСИ 50 55 бо
Чаї П1у Маї сту Аїа РБе біу Бо Біу Вре Тк Вухо Ехо нів Ту 1У 70 Її 0 їні реж піу Ттрробзас Рг бій о Аїа бів бТІУ тресопбен Так ТвЕж Уаї Кто а 50 5 ла вів Бжо Буо РЕо Аза Бек Тит АвпоАко бів беж сі Ак бій РКО зо 105 116
ТпК охо Тіе бех ра руб Пе) олАтоа двю беж Нів ро бів Аів Месбобію їх5 120 125 тТсводЛЕЛй беж ЖЕ тТвЕОоВНе нів ціп АТа гез ей АввоБго Ак Маї ху іо х35 18О сіу цец тує Бреосрто Аза ОїУ л71у бек бек шет ЗТуУ ТВ обаі дБ орЕо 145 ї5а ї55 тео чаї Рхо с тТпк Так о АтТа бет го 116 бех Бех 118 Бпе бех Ака Тахо обі 155 17а 175 вне рко Аіа Рхо АвпоМеб біз Авп о ТБс оТйк Зак біу Бпе цез біу ра 185 785 т55 їй їез Ууаї 15 сіпо дів Ту риє бе рем Пец Зве Ака ІУе пев ТЄ 135 ЕН 255
Те о рко зтіай беє іо АБо обег Тр олер о Твгобет о бей яд Впе еп ЗіУ ака й зей
Сіу іа ро Тв Суд о Бсо ЗТУ Сів АБИ Бак був бе орто ТК овВак Ава пох 230 З ай нів бет ро ТВг одею Сув ро Бхо тТіє був Бко Сіу Тук дру откр Меє 245 250 5 був Тез Ага Дкч ле Ті т1Те Ре пед Ве тіє бе бе бедю Суд йей
БО 285 7
ІТїе рі їсц цей Мві Бец рез Авротук СТІЙ сту Меб бер орко вії Сув 280 25
Вто йео їм ро 31у Тв беж Тк о Твйг Бех ТВ о Біу ро був Пув ЖВЕ то 255 заб
Сувотвж Бі рго Аіа бій біуУу ТБк Бек Ме орпе Бко Бак був Сув Сув
Зо 310 315 320
Три був о Ежто Чак дво сту аБа Сув їдкоСує Тіе Рко Гі Ро Бех бек 330 335
ТЕр Ата РНе Аїа Аха РФ пец Тжр осі тТКе»оАла Бех Ууаї Вкца рве ех 340 зав 5
Тер опям бек Без б01п Аза реко вне ах й Тер о РБе баз біу Пец Зек 355 35 85 вто сТНІ «і тео во Бех маї тіє ТтроМев МеЄ ТкротУє ТтТкЕросіу вто
БО! 75 Зя
Бек Мей Тук Авпоїїє Ппез АвпоБко Бре пеи Ркз рей цец Рко ЇТе Роє 385 90 55 230
Бре Сув цез Ткроуаї Тух Ії Авроїіе АБробко Тух їув біз ле 1У 405 410 ІБ
Аїа БбвЕ Ууді ст ей беп Зк Бе їей Ро Бе АвроБбе Ре Ро Бег іга «25 аз її Ака Аво Ген отей Ар ТВ діа Бек Аїв пев ту АкУу сій Ма ів 440 445 бій Бек рхо сій Нів Сув бек Бко нів чів ТК о Аіа би дка бір Аїа 459 255 зву
Ії бе Сув'тко піу із рец Меб АБИ Бемс діа тах то Уаі С1іу бек 4Бв 470 475 «8 дае цей сій АврвоРКОо ліа зе дк бла ес; уаї Заї зах тую Маї два 85 ї15о 35 уаї АБИ Меб З1іу реа Пув 116 дк бій Беб отри Ткв о РБе Нія їТїе бех зо 505 511
Сув бец ТНж вйп біу АгЯя 100 три уаї Те) бін ТУуєк бейпоуві Бер о вне зі5 й За5 бтІУу Уаї Ткр Ії: Ахо Тих Вкго рхто Аза тТух дк РКО РКО Ав АТа РКО
ЗО 35 зай
І1ї6є пез бек тах рей рРто ОІй Тік отТвкота1 ба) бхч ду ле у АК заз У) 55 БО ех Руб вхб Агу дк Тис рго бек Ро Зхо дя вга вх Бек під Бех 565 570 575
РКО АКЗ Ак АТО Абу Бех Сіл беж Аку 51 ЗевК піп бує Ніє Вів о Нів ва ви БО
Нів Нів Нія 595 «8100 35 кві» СТВА «вій» ДНК -2335 ДтУЧНа кий х «й сивтетисня ДЕК
«ві» ССЮ5 каяйх (1) З881) «адОх ЗУ зЕчй Фес сас спав щчсЕ сс св о заз СЕ се со пдв сає сав о ста да 48
Мас Віа Ар осі) АтТа Ро пей обі Бе Ре орко Аво Ні бій ей Аве ї В 10 15 сез сша сс спе со ав ос вас ває ссс оЯаВвЕ Єр шас кб дас о ссв 98
Ето А1а тре біу Вій АбБповек АБИ АБИ Бго АБО Ттр др Ре Ави Рго
Б У Її
РК ж, 30 зво ває асз аса бе ЗчЧе Кс сб ау сса сс Ка зба сефсосав че Мах ім Аби сте отак дек сіу ЕБе Пер о сіу РКО пев пед Ууаії цей біп л1й
ЗУ то 5 чЧс ЕС с5о су бла овсо ада абс ста аса аб сса сва ач ско Зав ува
Зіу ба Ре гемо пей ТародкУ ті Пе Тв ЇБе ко біз Бех пей Ар
ЗУ во са са Боца аса ес обся авс Б са чав се чо сса всс бас се 748
Бек Їїто Тер ТНЕ Беж пе деп Ре цей СіуУу бЗіу АТїа Бхо ТИХ Сув Рго 53 та ТУ 80 сача сав авс бос осаа бос сса асб бсв зас баб їса соб са бе бЧе 28 бпіу біап Ай Бек бСіп Чех рко теж бек Ав Ні бек ово Тк бе Сув аз зо з5 пов сої вес Ба сс яче как о саЄ об аа се соб аза саб єс ав 3365
Рко рхо ІБе Сув орто С1іу Тут Ата Тто Меб Сув бен Ах дрЯ рве 1128 130 105 110 ас БК жЖра рЕС еба ств с с сус са ас сс се ско Яка Со 28 тів вве ви ре жіє цей опе) сопе; був ей Т16 Рпе Бей оте; Маї бе 115 І2О 25 су зас гас сав ядс вся со сса яЯасс баб о себ ба сЕЄ сса ддо аск 3
Гей Авротжт біз Зіу Меб ред то Маї Су Рко Сей Бе) Бе б1іу Те 135 155 150 себоасе асва боса во ооде сес баб пава аса баб озеб або пса опе сва 480 дет ТакотвБт бек ТвкобіУ Бро Суе БуУуБ о ТвкК Су Тих 118 пт Аза ЯЗ 138 19 155 150 чересЕ сез асе єс сеї ад бОЄ бас Сас всос заз сса бос зає дує 58 сіу Жадк бЗех Мех пе рко Бак Су Су Сув Так був Ро Ве Авр біу ї185 10 175 азс ЧЕ аса бос зба пса ага осса СС сСса ча спос БСК доай аа Бо ЗВ дві оСув Таж оСує Тіз Бко Тв рРко бек Бек ТкроАів Рв о Аза джа РБе го 185 ї15о пк їаЧш ба суч щеБ ОК За ся веб о бсе їпо са веб БЕ жа сте вад
Бач тТквозіс Тв о Аза бег уві Ак вве спек Ткр вм бек Тей Бец УВІ 1935 250 ОЗ лет о чосс спа баз сс збо дак о сга сб спа воз оч Бах са Бої 7» тко ВЕ Маї бій Ткрорне Уві біб гео бзЕ РКО ти Увазі Ттробем Беє 230 215 пи здсб асо вБоя ага або Бад бах соч здзасссо боб ба бас вас ас ств 725 діа ї1е гко Меб Мек Тур Тук Тер біу Рко бек Бей о тух Авт 11 Пи вав 25 ря ай ж сса СС сс ос хе сба сса вбе соб сре ЗБ се ббу дра спас тв пет рхо Ре Ппей о Бхо Бер рей Вхо Тіа Ре Ве Сув без стр оУві Тух 255 250 285 авсосіс зач аг чає б бас о сос счс аої апза гає з па саб аас яв те спец стіп біз йБво Ткрозіу рто Сув ТБх СІ Нів'єМУ 10 ніш Ав зва 2655 ато вс ача са себ вЧа асо сеса чес ача чез аса зав зас ач се собу ява її АкчЧ тів Про хо Та Рго Аїа Ар о Ууаї пе піу Бі Мві Ре Іо
В 280 283 зда час ваз авс сса сає адсоваса зса зва сс вдов соб чо ЗЕ Зас 15
Ууаї Авв був Ап о Вхо Ні Ар оТає Аза сіб бек Ага без Маї Уві Аво 230 95 59 стос яачс сваа ріс бос ала зЗа3 боб ассосав Яр без соб єса ваш ге ЗБ тре баж спів гав о бвкодке сіу ес тах нів Маї бек тжроржо ме БКе 305 ЗО 315 323 чЧса ЗЕсС сс зас бу сайа ксв боу абс вав осра ста ек реа ав ос ї008 віза маї Рко Авз Бецо бій Бех тен ТВж АБ) о Зси Без Бех БЕК Авп Бей зЗа5 339 335 ач Ечч ЕТ бсо Кс час Фе шсб цес ссва БЕсС баб саб яра пса су 1056
Бак ТТ їв цею пео Авзр о уві шШек йтїа Аза вве Ту Ні їі Бгто Сей. 34 348 Зо сакосст са чсс ас ста свб собу са чої зак вяї сб дає сба са ї104 нів Ето Аїа Аза Меб Еко нів їжа; тей уві піс бек бе спіу ву бек 355 За 365 вчуч гас ож чса ау ста бсб бс зоб бос зва авс абс ває гас ава 152 яко Тук Ууаї Аза йжо пен Бек бек ТВж бек Акт Авп о т1е Або оТук Був 70 375 380 пак опо аса аго сааз чає сба сас чаї сса сус сс ача аа Б бас 12059
Чів'зіу Твж оМмеє з5Тй АБО» Пец нів Ар о бвк Сув бек Ака Ап обей Тут зав 3230 за5 о ча Ссс веб Ба ств сс бас ада аса сб бо аза аб сс сас сЕв КА В таї бек Би оїєй; Гем пед о Тух бує Те оБбе с1Му Акч їв Пай Ні Пей зп 416 415 час са саєб ссз абс сабсс бра чес сс овуа заг асв о сес аб зас Ябео 1256
Тукойек НіБ Рхе їзе їТ1е це біу Бе Ажс був ї11іє рко Меб чіу Маї чо 425 430 ча са пос ососс ссср оєса са Зсв саз Ск оаше ше зос вбб вав ово 1344 сіу без бек Рус РБНе їн Беч Аза сій Рде ТНж бек ла тів був баг 435 ай 45 чу ЩЕ соус аа чса боб сс осає ка ста зсв Кс їса бас озба дає ща
Уат чаї Аже Ахкеа Аза бле бхо Бів Сув Бей Аза є беє Тух Меї дер 250 чає че Ес са зас чес аво соб ас сав сабо сс чай сСса срЯ сг 1440
Бвроуаї уаї пез Сіу діа Був беж уаї біп нів пен бід беб цей Ра 485 47о 475 йо пс ас асга асо аз осот ссо ска вес ста зе ато сає сс пак сс їд88 ти бек Її Ту ДЕп РБе Бей Бей беї Бец Б1У її Нів Пес АБпорка їв: 490 «85 зас ава асє зав ада созу зба бас сов осеЕ авсо ЕС вс озук Бас че 1536
Анпобув о їв пу Аа Жтв СБу тТук БЕК Бей АБп о БрПе Мев б1у ТУук ХУаї апа зав 10 апс сдча са що ос асо се о сез саа два оса ако збо сс ава або ія
Ів 41у беї Тр біш Тс цей Бро Пій біб Нів їі уаї їшч ТуБ тів зіз зага 525 зач сва бас: БЕ аса аваа о січ сса чЕц да ва сса авкеодає род аза 15 їув СіпоСув Ре Аку Був о Гбвц Бжо Заї вп Ака Рро їі Авшротурю Пув 3 ні 540 ке ос осад заз о абс ота Є сСга сер оче сб дес сс серб ореб веб тео
Узі Сув б1п Аа ТТ уаї бі ів Пейоз1іУ РБш Атїа 1 РЕ РБе тпг заз 550 пе ЗО сазч чес дес бас сса зе бро вбш сов БЕ оїво доб сУуЄ ас сва де 1758 бід був біу Туск Ро Аза тен Меб ро цей Жук Атїа Сув Ті бів лів 655 Уа зу вад сав зсї кс оаса сс ст осса асо ЄВС овауч Усе СЕ Св бус вад 178
Був сій АтТа РКе Так Не ває БтОо тн Тух Шпук Віа Ве Гей Сув Був 58о 05 в каш бас ба вас сс кас сса чи асо вача сга ача чає Вес дво сса 824 біп Тух пейп оАвй сечо тух Рго суді Аа Аторзіз) Аха АБО Хі дю РКО 95 «00 ОВ бас ваз за Се чу са са Зб дав са ста бос обсо ств ссав боса ТВ бут Пув біз РБе Су Аїа бек Майї бій Сей Пез Бек о біе без рхо Щек 513 815 626 чат Б всс сса са абс озча час ва са чає асе ес бсес са ста 1820
Аве о ББе Ре вхо бек тів Ак Авт еп ої Аво твгодіа бек А1Та гогу 525 230 535 БО бас вада чав усе сба два сб о ссб дав сає бус Кс оса бас сах во 195559
Тух Акт біз АТа цей Бім бек о рго біб Ні Сув'Яеу Бго Нів Нів тес ва5 БО Ба дес сії зда сва са вве Бка боб оз зас уай сіб вка ває ба сот 2піе
АтТа їзги дко бів Аза тіє без Сує Тур 1іу біз ей Меб Адвлп йей Аа 580; 565 Ба асз за чЕс оча вяс зас ста два да сов чес роса вза ча сив яв зав тївйк отр уві ззіу беж АБИ Сей біз Аво обко Ма бек да са рей ува 575 8 585 лева шоб бас чес зас щес зас асо чає сбта вачя з азу сав ссвоста ШІТїЙ чаї дек тук туаї дяй Увазі Ава Мак о біу ей пу Тіфіє дж бій ей орех
БО 85 КІ) ща СЕ сає всбоазе тус За БО сс зас вза чав аса я Бас 1650
ТЕ Бце нія т1з Бех Сув їез Те БНе б1у Аху біб ТЯк ові Бец С1ц 705 7. 715 ТЕО так са бра са сс зуб па ол овес ача вск пса соб са баб о аа 2508 тух пец уві бер рве біу уаі Ткр о Іт1іе дтЯ Тпї ко Рко Аза Тук Ага
Та 73 735 сса сов аде ще ссв абс ста шоб аса сб сс два аса во Ка зе Кока ко РКО АБО вій ро Ве Беа бек ТЕ їеа ро біз тах о Тпу узі Маї 740 745 то вз3з аца зада сов вача ста сса азу ат ача вс сса сб оссв'ала вда За
АгФч о АкКа Ака бІіУ Ага бек бо Ахо ВІЗ Ак тТпх орто Бех Рго АкКу о АКО 755 7ео 785 ся су рес свЯ бос сс о сус ваза суб азча сб саа ба вза ав сс 2359 зга ку щеж Зіп бек Ро Аа аку Аг Ака бех зіп бзтодка Бта Бех то 775 780 сай бас одса ос о ача цс кс уб овва сс Час пса дос ача чає за гас сій Сук Аза ВІЗ Ахкч уа1ї бСуш Сув їує Печ аБО Бко діа Агу Ав оуаї 7а5 790 795 що ста сс сб азда спа ЗЕ цоаЄс зсБ чав са сб оч вла сса чре са "аа цеш Сув їей йта Бо уаї зіу Аа біз Бак бек озіУ АхЯа Рто Уві бек 805 во ІЗ щас сба СЕС суб зга са сса сс особ соз ад ач оосс да сс фа 27435 біу вхо РБе сту Тахо Пей Бгто бе РКО бек сет Бех АтТа Маі вхо Ата ща 825 яЗо час сас чав дса сає су ст ста ача здаа сб сс ас са дес ес 544
ВБрочів Сіу д8Іа нів бецобег їсо дго 531 Бва Бго Маї був о діа врБе 835. 3) 45 зав са пов зда сс бас щес Б вав сс асСв о сса чес азч аа або 25 бек бек діва бі Бко СувсАїа Пец дкч ре Так бег діз Ауч дхо Меї 50 855 : чав аса аса Я зак со сес сва со ста сса вав зба соя Сас аву 7ваа пімх тТвЕ ТНК Уа! АБ АТа с Нів біп Уаї рем Рхо Пув Маї бей Нів Був 865 87то вт во ача зса біс ща вся боб дос абу аЗЄ асс асб сас бсба аз сс бас 2658
АкЯ Тв Ббеч біу дей бек одіа Меб бек ТІ Так о Авшоїви сій АТа тує 8855 330 заз сс аах час бос ЯК іс взаа чає под паз здав сса з дач аа аве фа кве гу Акроцбув Маї Ре ув АвроТткр о зій Січ без МУ біб бім о ЇІ1г зо з05 Зо ачаеа сса ваза з СБ чсУ бла з час ле аа сас авн оса Ес Че влва
Акт їей був туаї Ре Чаї ей обі біу Сув ву Ніж був Бен Узі Сув 5315 зла з25 сс себ доб осса Бус аво БЕ БЕс во пос пос сво св сає сабо сас 32 ек Бто діа Рко Суд Авповпое Рош о Твт о бЄех Віа Віє нів Нів нів соні 235 зай стає баа сва вах
Нів а 5 чиїй 36 «11 845 212 Бідок «13» ШеУучиа «йУ Ох «003» Синтетична конструкція «Оп зе
Ме Аїа АБр сій Аза РКО їв сі рде РБе Ого Авр оНів Зі цей дар ї З 1 З
Рго Ма Рре сіу Віз ДЕ Бех Авп ода Ро АвроТтр о Авор рРНе АвповВго 2 шо 30 біз Авп Тв ТВ бек О1у Бе пе 01Уу Бко рем цей уаї бен бій діа 46 4 сі Ре РП Бей Бред так вгоу Тіз с реа ТЕ Тіє Ро біп бек ївч дБ
БО в 50
Сет Тв Ткр о ТБк бек Пец Ав Бе ба сту біУу Аїа Рго ТвВуросСує ВЖО
БЕ 70 75 и піу ії Аз беж щівп Бак обко ТВт Бех АБа Ні беж рго Тпх бак Су 35 ай 95
Рхо вко їїв Сув Вко б1іу Ту Ахо Тер Ме Сувоіви АхаЯ Ака ве 118 100 105 116
Тїє Рпе їец Бреє їзіе ей меш без Сує Бей Ї11е Бпе бе цей уві ей 115 125. 125 еп Ав» Тут Зіп о б1іу Меб Пес Рко Уаї бує вхо реш гей ро біу Тв 130 уз ї8 бек тн тнх Зак о твбтгобіу Его Сув ру Твж Сув тт їі руб діа бій 1423 150 155 їБО
Зі бах Шежх Мес Ре Рго беї був Сує Сує ТВі Гув Бро Бо Авросту 1865 170 175
АжвпоСує тро Сув тіе Рко т12е ро Бех Бк Укр Аза Ре Ала ВКФ РНе їв 185 5)
Без Ттропій Ткр діа бек уаї дк Раз бер Щбтв оцей Чех печу Пе Ууаї 135 2ай 05
Бтс Рне Уаії біп ТкЕр о Ре уві біу мен бек Бко тн Маї Тер Пец беж 18 з15 о діа їіїісє Тр Меї Меб Тр тує ТЕр З1у ре БЕХ цеч ТУК Два ї18 Бей 228 3 235 гав
Бек орко Ре фей Бо Без інве РРО ї1є Вп о Рпое Сук їм тТхв обі тук 245 5 255 її печ йіч бій АБЮ Тр С1у Бго бує Тк обі Ні Зіу біцп Вів Вей 250 2655 РЕНІ
Ії Ака їі Ехо Акч Тк о Бко Аїа Ага Уаії тих біу біу ді БВе Бей 75 282 285 уаї АБЮ цує Адо Рко Нів АБИ Тк Аїва зії беж Ак цей Маї уві Авр 250 25 іо
ЕБе бех сід ге бву Аку Сіу бет Твх нів Уві Яех Ткробко Був ге 305 310 315 за
Аїа Мат рго Ав Пей біб бек Бей тих Ап Пец ієбм бек Бак АБ Мед 325 330 зза
Чек отТтроібеюв бек лез АвроУа1 бек Аза АТа Риє Туж Нів їїе Яке Пе) 345 355 355 із во Ма діа Мек: Ехо Ні Бец зей ав сту ет Бек сіу Бем шк
ЗБ 150 365 дтп отут мМаї Аза Ак це беє бех Тс о бек йжеа Ап о ТТє дви Тухк Був 370 375 зву віш спіу тах Мас бів АБроцей Ні Авродек був беж деш Ав ей ту 385 3590 їа5 ОО чаї беж СПеп реворей беб Тух ув о СвЕ вва 5іУу Ака Був іно Бів Бей 119 4І5 тТук Бет Нів хо іє БІіє реросіУу ББе Ах був ІТ ро Меб біу Ууаї 450 225 330 пу Пец обех Еко Ве рез пси Аїа Зіп Вре Ток Бех діа ї12 Сув бех
815 450 45 уві уаї Ага Ах Аза Ре рко Ні Су їви АТа рре бек Тухк Мес Авю
БО АБ 460 дви чаї Уаї зей БіУ Аїа Бу бЗет у бій нів їи сл бек тец вна 1655 70 375 480
Трж бек ї16є Твт дви Ре Пец оре) Єву бецш СТУ її Вів реп дай руд 485 90 155
ЯАвИ Гуз ТВжЖ гу ака тТтрозі ТУ бех цей два Рра Меб сіу тух маї
Зой Зо Іо кіз бі Бе Тхр ОКУ Зйї Бей РЕ Сіп бій нів ї3з3е Уаї їй був її 55 Зий 525 був бій був Бае АкФ був Пец Рто Уві Ява хо Бго їі Ввр тер обув 30 ЗІ 53 ув Су сів Ажо ті Уатї сптіу Бе) о Зев СОІУ Рбе дів дта Бге Бора оте 545 ьо 555 50 бів осСув спіу ТугоРко діа пей Меб Ро рей Тух Ата був тів сій ДІВ 5ІО УГУ
Бує Сіподіа рае ТЕ Рпе о бет бо ЖАЄ Тук КТув ойфа Рпде ви був ув 8 585 ЗО
Сбіт тує рей Авп ем Тук о Рг Уві Аіз вкя5 бів Ака Лев т1есдвро РКО вч5 во 6О5
Жук озуУув сій бе бтіУу Жха бек омаї Бій цем ей бетх Же пес ро бек ето 515 Бай дви рве раз вто Бек ї1е Ага Авромбви цей АБО ТБ оАіа дек оАіз реч
БВ еаа 35 64 ту дкч біз атТа пев о бій бет рез бі вів Св беж реа Нів нів ТЕ
БАХ 55 55
Аїв пез ко іп Аїта їіє їла Сув Жжробвіу сій тїши Мей вва їм діа 5 603 -73
Та откросаї Сіу дек Ап оїлсй 14 АБр ото Аіа беу с Ато б1М пев уаї 575 680 ся чаї век тТух Мах дво» Уаї Ав Має Чу без пуб їТіє ку сій Бей Бей 690 595 то
ТЕЖ о рае нів ті Бех був Пеи тних Ре бо1у Акщ Сім Твх Маї еЗ бій за5 та 715 7233 тТУЖ Пец уаї бек БПпе біУу Уаї Ткрї і2 Ахч тег Рез вже Атїа тУук дет 725 то у
Рус ро Ап Віа рко Ї1е бе дек ТНкорен Бко сла так Тк Маї Уві 743 745 750
Ахо вхо АрУ Спіу Ахоа бек оркОо кл ода Бк Тр РКО Бек РЕО с Агу дКЗ тва 760 пев ато Аа бек ЧІ бек орга Ату вка Аку Агро бек бій бех Ак Зі Бег тла Б тво біпосСув Віа Аіа вкч Уві Сус Сує Був ї-и Аво Ріо Аза вч АБО Маї 785 90 755 00 цеа Су рей Аку ро Уаї біу АтТа бій бек бак бпіу Ах Рто Уаі Бех 05 втай 815 сі вко вне сім отак огец Рко бек Біо вт Жек Бек А1я Мах Рко Аза 820 па5 Зо
Аввонів 01уУ АТа ців Пез беж рем діа сім без Бгто уві СУБ Аза бе 835 вай а5 бе ЧекоАїа біу Ре? Сув Ага Пе) АтЯ Бпе Ту ех Аза Акз ку Ме
У КЕ у Е в . с щу вто ва зас сі ТНК ТЕ Ууаї Азподіа піз біз Уві еп Бко Бу Уві йец Нів був 255 яо 8375 во
Ата ВЕ ва піу пезй Зак Аза мес бек тс отпк о Аер оГеб» Бі Аїа туф яз яз. вав
Ве Був бю Пує уні Ре буз АЮ ттр СІЧ бій бец о біУу біш вм сів що за5 10
Акта ївгп Був Маі Рпе баї Бей Сіу 51у Сув АкЯ Нів Пувоїецз чаї Сув 315 20 25
Бек рко АтТа Рто Суб БероБпе рве Тк беж АТа нНІБ Нів нів Нів НіБ 33 535 580 нів
З25 «1 7 «ие в хЕїй» Білок «131» Штучна «ЙО «й» синтетичний пеллилх «Од 37
Мек Аіа Авр сін діа БКо 4 5 «10йх 38 «В1ї 538 «їй» Білок «е«аї3з штучна кох «Ег3» Синтетична конструкцхя «ОО ЗВ
Мес А1а Авросіз діа реко Січ Авротувз Сіу Бко Сув дак бій Ні і1у ї а 10 їв
За нів дви Її Ата ів вро Ака ТрЕ рРхс вів о дк Уві ТЕ 1у іїу за 75 зо
КВ. же Зх
Ууаї Бе гей укі Др о Бую два Рко Мі беп ТВ Аза іч бек Ар ред 13 45 чаї уаї дер Бра бет сід бНе бек йкй сіу Бек їнтї Нів уаї Беж отТкВ «0
Рко їуз Ріє Аза Ма1ї рРЕз АБИ бе) бій беє рен ТНІ АБий їй Бей век ва 78 75 щу
Шеу Авап орев бет Ткр о ГПец бек ів; Авротві бех А1іа Аза овре ТУ НІВ 85 20 за хТІв рге Бей Мія Рго Атїа АїТа Меї рРко нів рей Пей уаї біу Зех Євхю 105 105 11 ц1іУу га Бех Ага ТУук уаї АТа ха їви беї бек так бегодЕд АБи 18 т2о 125
АБІі Ту пу снів Піу дк оМеб Сіз АБО пебв нів АБр Бек Сув бек Ах 130 135 ї20
Ава тей тТук о мМаї бек цем сем Пей пеб» тую бує ТАЖ це піу вх ук 125 150 155 60 ем Нів Гей Тух беж Нів Бго її їїз Бен Піу Рпе АкаЧ був Ті ро т155 ї170 ни мекв зі Хаіїі бЗіу БейшобБек рхо вВпе їспісїдні Аза Бій бре так обЗех Аїа їнО 1.85 т130 ті Сув бек Маї уві Або вхо Аїів рве ро Чі Сув пед Аза бле бек 135 200 га
Тук Меї Ар Ар оуаї аї Бец сту Аїа їв Зег Уа1ї бій нів їй бій під 2і5 229
Бак рей Ре ТВЄ бек гїе їщк одна вне бей бер бак ев 1у ї18 МНів жав 230 235 240
ТІєзг вва о Рго Ап Гу ТУ ув Ві Ткроспіу Тук о Зек Без зви Ре Меб 245 ко БУ
ЯпРТУу тТукоУуаї ТІв бі бек ТжробіУ Тв о Бей орто ОТїпа біз Нів ті Уві ке 285 2
Бей Ппув Ті Пув Піп Су Бе зх пу Кв рко Маї АБ оАгФ рко Ше
А ВО 285 дво откр Сук Уді Сув бій дка ї1з мМаї бЗІіУу їм пе сі ве Аза ль 295 Ві ЗО то Бпе Таж сій Су Сіу Тух РЕо вія Гей Ме уп обей Тух Ата су 598 310 315 320 тіе піп Аза Гув обіп Від Бмпе тю Епе Бад о Бго Ту Тур Ітв Ата вне зи Зо з35 їец Сув ув'ста Тук цей оАвп їеа Тук Рро уаї Аза Бу біп Ака Авр
КУ 345 350
Ії Авробто туї БУ Сі пе піу Аїа бек Узі шій беи Бе дет орне
55 36 365 рец Рхо бек Ар РП вве ро зак тів Аку АвБрогец пей Аве ТЕ ОМІв
Уа 35 Уво беж Аїа рей тТук ака 1 Аія без біш бек Бго бій нів Сув бех Рко за 395. 409 нів Ні ТУ Аів Тем Ак сій Аза їіе їед був тк сіу біа Бей Меф 305 10 З15 дви їси Аїа тп Тр оуаї сіу бек Авий цепш біз Авр рго Аїда Бек Ахф
Рій 225 «30
ОІз це уві уяі Зек туї Чаї Авпоуаї Аємо мес Є1у іви Був лів дха 435 145 ау
ОБ Бей рей о ткв ве нів Її! Беж Суб Гей Трі ЕБе бі с Аку сій Твк 5О 455 зва маї цез бім Тут Та Уулі бек Ре о біу Уві Тге тіє Ак ОТИХ са ехо ак5 али ду 480
Аїа Тук Вгу Во ро Авпойіа Вко Т7є Пей Шек Так пе Ро іш о твЕ
Аа ало 495
ТІ узі хмаї Акч ака Ага СІ1у йку бек рРто АкЧ Ага Дта ТВЕ Рко бах 50о 55 зій
Ро Ака Апто Ах дко дек бій бек Бхо Ака вра Ас Аж Зежк З) сек зів 523 585
Ах сі Бех бій Су Бі Бі Ні нів Нів Па я 55 «йї0» 35 «її» 0347 -812х Бідок «иМ3» Штучна «ах «вва» синтетична конструкція «80» 9
Ме Ата Ар обі Аза Бко віа лів Ада МаА1 Сув ПуБ Пуш Пец о Аво Бо ї 5 хо 15 діа Акч Ар оуаі Бечц сСув сей оду рРто уаї сі1у Аі6 бій беж бек бІіУ 2 да 30 вка Рко Уаі беж сіу Бо вне О1їу Тк Зец реко Бек рко бех бек БЕ 35 40 5
Ата уаї ро вів Авро Мі С1іу Аза Нів цеп бек Пец АБа Сіу бер; ро о 5 59
Чаї Сув віз Бе Бех Бек Аїа сту Бгто Сув віз пер Ака ріне Тако Бек 55 то та во іа Аку Ах Меї сів Так Тв оуаї Аба Аза нів Сп Уаї рев вже Був
ЗИ 55
Мі рей Нівз Пув о дКо Твкореа б1у ппеч бек діа Меб Беї тТЬжх ТЕ дер ї0о ї05 119
Бен бі йіа Туг Ра о Ппув бар Сув уві впе тує ввр отр сС1й біа Беб їз 175 сіу бів біб їі Ах Пе: був Маії БВе уаї бе) 01у біу Сув Аг Нів 138 135 150
Ху цем уаї Сув бек Рко ліва ро Су дДяв Рпе ре тик Зет діа Ар 145 155 ї5У 10 тів о авв о рко тУух ув бій Бе п1іу 5іа бек Заї біб Бе) Бей бек Вре 155 ї7тО 5 їт6а Рус Шехк Авр бБе Бе Рго Бех 118: Ахе АБЮ Сей Ге Ар отат Ата їВО 185 190 бек Аїв Бей Тухк дка бін Вта їв сій 5Заї реко Та Ні Сук бек о рео 195 2 по 205 нів чі Ту Аза Бу Ака о СВяЯ Адта ті реа був Ткб ЗІУ бі це Мас 210 215 220 дах лен Віа ТвВх Ттв о баї С1у Зеху Авп їн 15 Ашо Ро Діа бе ода 225 ла 235 з4о тв їжа Уві уві Бек Тут Уаї АБ Узі Ади Меб Зіу їв Був їі вк
АБ в 5 біп'їєц Пен ткр о ЕКе Ні Т3іе Бех Сув рей тре о Ере бі вищ бла ох
БО 2755 27о чаї їжи сій Тух це Уа1і бек Епеа б1іУу маї ТЕр о ї1е Ас Твк Ро рхо ау ря в
Аїа бук Ак о рко Рго Ак Аза рго І11е безпо бет Тут еп руб СПРИ Тех 290 85 зр
ТАК уаї уві Аку Ахе дгу спіу вхо беї БО Ага дей Ак Так о Бко ЗеЕ 305 3 315 зб
Рго АгеЯ Ата ака біз ек бій бок Бго Ага йкЯ Ага дку 5ек бій Бек
З25 339 383
Аз бі бем сіз Сув Віз Нів Ніш Ніє Бів Пів 340 345 кві» 20 «ПМЖ 357 «йій» вВідок «132 Штучна хавО» «8232 Синтетична конструкній «41905 49
Мер Аїа ар біз віз БРго біз деротко біу БРго бує Ти О13 Нів о сїу і 5 10 І5 біз нія Ав ої1з Ат ї1е Рко деФ Тк РКО Аза дкчЯЧ баї тах о бЗіу лу о 25 за чаї вне Без Увї Аво бує Авп Бто Ні Ави ТВк дів ст: бек Ага Пе чаї чаї АБО овне ббеє лій РБе бЗет Аг жу бек таж Нів чаї бек отв «й 55 Бо
Фто їує ка А1а Уаї Бко дви їешч Оїй бак ев; Тит АБО фі лей шех 70 т на веж Акпл о Ппец Бех Тгрісти бек йши Авроуві Яех Аїв о АзКа БНе тТух мів 85 зо 25 їтТесрхо ей о Нів РЕб5 Аів о АТЗ Ме ко Ні Без гей Маї бО1у бШех дек іп 95 1162
Зі їцец Бех Ак Тух уаі дів Ага бей осеє беж ТНК Бек агу Авт ота 115 129 ї125
Ав ТУ Му Ні ТУ Так оМев сій Ав Бе) нів Аво Беж Сув бБег дк ї30 МБ ва
Ав бе) тук Маї Беж паб Ти ої пцей тТух пув ТВЕ оре 1у Ак їув 145 150 155 НВ! іїевц Нів о прец бут Бех Нів Руб 12 Ті де) 01у ББе Ах пув їі1іє вро тав 170 ТВ. мес Ііу маї сІіУу іо бек Буй рРпе спец це) Аза бів БРре тих бак Аїа ї80 їх5 90 ї1ї6 був ех мані уві дкчЧ Ак діа Рйє РЖО Нів бує цем о АтТа Ре сбех 7253 па 8345 тТУук Меї АБвВ оАБр Уві Чаі реа 51іУ АТа Був бЗех Уаї бів Нів рей їй й 215 8250 ек рани РЮе тих бек тіе Таж Авпорйа ео Ом щей Пе; сбїу тів Ні ач 235 й тай їхні Ап о Бро Ап Гуз ТВакК Був Акчо Тр Зі Тук Бек ей Ав Рпе Меє ав 25о 255 сСіу тук уаї Ії Б1У бек ТЕросіу твк Беп Ркб Зій сів Нів ті Узі га ва 270 цем був Їїе ув сі був Ре Ак Пуя Ге; Еко Уаі Ап о Акз Его 116
ТЕ 28 25
АвроТЕр був Уаф Сув Сій Аж Лі баї біу Бей обо бік рнае вла лід ай 235. за0
Рко Ебйе Тк сої Суб о біу ту вгосАза їв Ме ро цей Тут Аїв Сув з05 з10 15 32
Ті СіІпоАїа Був сіп Ата бе Таж Ре бшех Ехо Ток оТук Гув Аза па 385 339 135 їн Сув їув о СЗІій о Тух тез двпогйей ТектоврКо Уаї Аз вх СІВ АКе нів
Бе з45 350 нів нів Нів НІВ Ні
ЗУ
«2105 4 «вії 793 «рід Бклоє «й шШеучна. «ИЙ «Ед» Синтетична конструкція «айх І
Меб Ка дер біз Віа Рго бе сту РНе ре Рро АБЮ Чів бЗіп Бей дво 1 5 то т5 рРЕо діа рре сї1у Віз да 5Зас доп оз рІо дво ТКо АБ о бве Ави бує
З 25 30 013 Ввия тах о Тьх бек Сіу Ре їеци сб1уУ Рус ред вед маї їеб бів Аза чо 5 бі Бпе РБе еп їеМм ТП Ажа ї1іє рей) ТЯх Т1е с бко сіп Бех Бей дБр
ЗВ 60 пек отЕротко тп Бек пей АБ Бл пес: Сі Зіу Віа ркб Твх був ово 655 То 75 5О сту біл ойвпобех підп бек го ЧБгобех АвлпоНів беж Рго Тк Бех о сСув 85 зо че жо Бі її Сує БкгО о 51У Тух Зк ТуромМеє Сув ва да ка вне гів ща 105 118
Ізе впе без Бе Ті пем оГем без був Се) їі Бе цей рем У) Без 115 ї20 т25 ї-еш дар отут С1й Зі Ме Тев рЖОо Уаї Суб Бжо зоєй їй: Бо дру Те 135 135 їй беж тат тагобек твх бі Рео був ЦувотТБЕ Сув Таж їі РКО А1із сів ї45 150 155 150 51Уу Тк беї Месб ре Ро бек був був Су ТпК Був орхОо цех АВво іє 165 170 шк дей був ат Сув 11їе бо її бко беж бек Ткр Аів Бе АтТа Ака Ре 185 185 лі
Тен Тв сій Тео діа бех уві Агу вва беж Тгр о Тез беб реа бевомаї 735 200 205 ро Рпе Уві біп о Ткр о Ре Маі Сб1іу їеа беї Бго ТЕ Уві Ткро огні бер 210 215 229
Аіїва її Тур Мес Мас тер отут Ттробіу Рко бек Пем Тухк дви тів Бей 225 230 35 280 бФ ек вБго вас рей бо де; Бе; Рг тів ББе Бле був Овеч Тер Ууді Тут 245 зо моз
Те цею біз біз бр отр бїу Рхо Сув тах біз нів біу 15 нів лав
За 265 270
ТІе Аж Іі Рхо дка ть о вБко Аіа дга баї Так обіу біу Уві Ве леч 275 2850 285 чУуаї Ар Пув АБ Біо НіБ АБО Те Аів Сіа бех Ажхо Бей Маї Ууаї лер 250 2955 за0
Ре бЗет бій Рце Зак бу Сіу бек ТвроНів уаї бех Ттр Вхо Був Ре 43405 310 315 зад хів маї ро АБИ йем Біт; беї Бей о Твак оАвип їхха цем бек Бек Ав Сей 325 330 35 бек Тхр Пец Бех цез АвпоУаі бек Аіа Ата ББре Тук Ніз 12 Бка Бей 340 ЯЗ 50 нів ро Віа Ата Меї йо ців Бей Бей Уа1ї 1у беж Беж Сіу ви Бек 155 360 3655
Бхо тую Маії АТвн Ак Сена дет лек Тай бек АкФ о Ави ТТе Авт тую Був 373 375 БИ
Ніз сіу ТТ Ме бій Бер їй нів Ар обек Сув Бет Ак Ап пе) тут
З їЗ0 295 150 уаї Бек бе Бен Бей Бей Тує Пує ТЕБЕ ОСРНе б1у АхЯ пу цею мів ем 205 10 215 тую БЕЖ нив ово 1 пі ву О1Уу Ра Ак Пув тіє Вкб о мМеє сту меї їго 125 450 б1у Пи бек орто Ре мен пев Віа бій Бпе Твк о Зег йїа ї1е був бек
435 Я 145 чаї Маї Ака аха Аїа Ре Рто Нів Сув Пец Ліза Віе бер Тук Меї Авр
Ф5О 455 4850 двр Уві Чаї цей с1у Аа Бу Бех Уаії бій Нія ей Зб бек ей ве
Б АлО ув во тТвт бет Т18е Так АБ) ря пев осез век без спіу тів снів Бей Аямй РЕ 85 45 95 ви Був Так Тує Акч о Ткр біу Тук Бек рем АБИ Рре Меб біу тує Уді 05 5
Іїа біУ Беж Тер сіу ТЕ Пеш Бхо Зіп 31 нів Ті уаї Гей Гув'тів.
ВІЙ 525
Був бів був Ре Ахко пуво без вхо Уаї АБО Ах Бка Іі Ар оТтр о Був 50 535 54 чаї сив бій дко Жтіе Уві біу ем дей Чі Бе Аза с АтТа Рка Ре їВЕ
ЗАЗ 550 БВ 58О сій сСув бу о тТух ко діа Гей Ме орко Пед тТух Ата Сув її бій Ада ве 570 УТ їув біп Аза Рпс Тк о ББае Бех Ро Ток Тук Ццув Ата Бе бе) Сув Був зно 55 59
Пій Тук пеш дви їні Тук рт Уві діа дека Бій вата Бр ої18 АвроБхо зз5 ва0 ОВ
Жук їжв о сіц Ре сіу Віа бек ав Бей Сей бек Рпє бен Бо бег 510 515 вай
АвроБпе Ббе Рго бек їїе АкФф о Аврогсец без Авроїбу А)а бех Вів Беч
Бах 530 535 вав тукК Ат спі) Аза Ге бів Бак о Бко бів нів Су бек Бо Ні нів о тТБЕ
І ва 550 55 аа ви ака бій вата тів бем був Тко о біУ С1й пев Мес Ав бен дів во БЕ є)
Твх тТЕр УВУ бу Бех Авто гва біз АБроБІо А1їхя бах дтЯ ЗІ бе та? 875 689 685 уаї Хек Тук Уві АвлоМаї Ал Меї б1іу рей Був 112 Ако ЗІ пед Ббеш вай 595 783
Тв Ве Ні Іїе бек Суб Пед ТрЕ Ре бі йгоа сію ТЕ Уаї Пец сіб 795 719 т15 726 тТук во Уві ех рле сту Увь тЕротів Аже тах Рко Буш ВТіа тую Ага 725 730 735
Ро Ркз Ав Ліва ріб її. Бе; дей Так ем Бго 1 Тк Та уві ай. 158 тав ТО
Ахч Ах Ака сіу Аку бек рго Ака АгЯ аку ТпкоБко 5ек БКро ку АкФ тах тей 765
Мта Ах Бек сів Бек Во вх ка Ако Вку Бех піп Бет Ак Бій Бех 70 775 ТВ сіп о сСув Зів Нівг мів Ні Ні Ніє 785 то «А ай «ті З «182 АЛОЕ «213» Вірус гепатиту В «ат 4 ре сцецй зе ТІ Ага тЗТєе Бей тв о тіє
Ї 5 «ик» ах «Тр ОТО «1» БАЛОК «ІЗ Вірую Бепатиту В «во» 43 соіу пе Беж РБео їв уаї ТЕроївч Бех Уді 1 5 ТО «10» 44 «21 10 «їй» БІЛОЮ «йуа» Вірус гепатиту В «ай» ва
Епе меч Рко пежх дво пе ББе Ррго бек їТе: ї З їй
«вій» 45 «в З «212» Бшцлок «213» Вірус гепатиту В «ай» 45 вне їі цей беж Без біУу Тіе нів ей ї 5 «їй В «ам З «й» БУлОВ «213 пірує гепатиту В «4005 46 тТкр.пей беж Бе без о уаї Рто ББе ді ї І З «Зі» А «біїм 8 «їй» Білих «13» Вірус гепатиту В «005 47 цув о ТУую тТВЕ бек Рое Бте ТЕеВ Цей епі ї З «ій А шию «21» Білою «і3». Вірую гепатиту: В «Од В туг уаї Авпоуаі Ава Мер біУ зви огув
Ії «81п» 48 «2115 З
АВТйМ БІЛОЮ «ВІЗ» Вірує гепатиту В «00» 4 зі Ту вес хв) бве о рРпе 51 Уві Тео ї 5 «ті» 80 «11» З «Ки Білок «Ії» Вірує гепатиту В
«ОО» 59 сіу рез Бех Ага Тухк УуУаї Аіїа Аку Гей 1 су «210 51 «ямі 8 «їз Бідок «2135 БіВує гепатиту. В «0 О51
Сук бе Бпе ув АбБротюхв ій біа пев 1 1 «0 5 кі «1722 Білок «їі: дірує гепатиту В «айв о Ул
Ехо с пецч піу Ре рне рус АБронів
Е у «10 53 «118 9 «їз Вилок «2ї3з вВ3ІрБус генатитУ В «ап» 53
Тів вхо тіє Рхо бек бек Тур оАтТа Ре 1 Б «вк Ба «сії» З «вій» БІЛОК «21ї» вірує тепатиту В «аж За пшЕо оБжО бек Аеро рпе Бе Бко бек Уді1 1. х «и» 55 «Ті 15 «212» БІЛОК -913» Бірме тгепатижкУу В «Оз 5
Мек іп теор бви бек тк АтТа спео Мі біб АїЕ о Гво б1О аБро вБгОо ї З 10 їж
«10» 55 «й» З «12» БТдлОеК й -2535 Бірус гепатиту В «ап 56 цей бе дврорРко вка уві дкУ бішЖ Бех і тк «ві 57 «ії 10 «айв вулОоК «Аа» Вірую гпепатиту В «в0йх 57
Бек Ії Бач бек Був ТБт піУу Аво Рхо Уді х 5 І «ХО» БВ «аїїх З «йійз БаилоЖ хаї3» вірує гелатиту В «апОоз Б5я чав'еи сІй лів 51Уу Рре Бре Бей ей 1 5 «пл 58 «їз З ейійз БідоК «Т13» Вірус пепатиту В «а0» 59
РЕпе тей ви ту Ахо їїе бе тих Іхе ї 5 «ФО» 80 ких З хаїйз Білок «213з Вірус вепатиту В «00» 050
Бе цей ЩІУ СПіу ТНК о Бхо баї Сув ем ї в «вій» БІ «рії» З «ійж Бідож «13 Вірус поцдатиту В
«Оз Бі іжчі Те Сув іє ЇІїв рБрлпе Гей обсц уа1 ї їй «10 53 «811 0 «-212» БІЛОК «513» Вірус гепатиту В -00х 5 зей Уві їшч Бей АвОотуюк їв біу Меш Лу 1 5 18 «їх 3 «12 10 коїах Білок «213» ВБірує гепатиту В «Об» 63 пез Сем дев отут бів ліу Мес ес ко суді їх 5 10 «10» 84 ха1їх 14 «вїше Білок «й1їм Віриє гепатиту В «ад» 64
Бек їїе уаї Бех Рус РБе Тів'рко їз ей 1 5 19 «10 55 «81х5 5 «й» Білок «13» Вірус тепатиту В «вада ва їі Пец бер Бо Рпе Пе бро Сем дей 1 5 «віз ЄВ «10 «жи» Банк «аїй2 Вибус гедатниеу В «або» 55
Так хо АТ Ак Уві ТБ пі біУу Уа) вла х 5 10
«210» 57 «Мія 1 «212» Білок -2135 Вірус гепатиту В «400» 67
Без Мі аз Аврогде беу 01 рпе Бех Ах ї 5 КО «іх БВ «Ті я «Бик. Вілок «вкї» Вжарус тепатиту В каб» вв бБег вла тів був бБет Уві аю Акч ха ії Бо «-ї0» 68 «95113 З «вит Білок хтій» Вірус тепатиту В «апдоз 59
Тух Меб дар одвроуві Уаї Пеий Сіу Аа ї а «ДІ 70 «хіх З «їі Вл «213» Вірус гепатиту. В «Оп» То
Віа пен Меї РЕО Пец Тук діа СУвотів ї 5 кхаїбю «41ї7 10 «51й» Білок «ії» Бірус тепатиту й «АВ ту під іа Еде тре о БЦе бат Бо Тахо тую Му ї Ку То «Вб и «а У «каз 0 Біо гїі3» Бірмсе гепатиту В «аПпйж 7
Аїа Тир омаії бій Пец брем беж Різ Пем Рго Шех одвр Ре Бе рго Бех ї 5 10 15 чаї «-2305 Д73 «М З «кій» Білок «а1їм Вірус гепатиту В ка» 75 їши рто бек АБр о Бде о ББре рко бек Уаї ня в -е1О0» 75 «вії 8 «ій» Білок «5132 Вірус гепатиту В «ПО» 74 ув обеч Таж Бне біу АкЯ бій так уві ї 5 «10 т5 «211» 10 «21йх Біло катіз вірує гепатиту В -вйоз л чаї рей бій Тут їеп Маї беї рре Біу Уві 1 З їй «Від 76 «п» 10 «йїаз Білок кіз ВЗЕрусє гепатиту в ее ле їТе песп бек ТВробей гро ам тв ТВ Уві 1 У то «10 077 «її 1 «2185 БІЛО «Кк1З3» Вірус гепатиту З «аб
Зат отв еп руб ші Так та обаї Мазї Ака Аа
І З 10 «й10бж 7 «811 З «їй» Білок -213У Вірус генатиту в «ай» и нів цен бех Пец Акч о стУ Без РБе Заї ї В «йкох 79 «112 З «212» Білок «2135 Вірус гепатиту В «ап» 73 чав ей Нів пу Ак тк пез бі Бей 1 КІ «Від» а київ ЩО ка1а» Білою «В13» Бірус гепатиту В «Ом ВО оіу пеп бек БАтїа Меє Бех ТІ Так Авр їв 1 5 10 «шій» ВІ «11 В «12 Бійсок «віт ВУурує гепатиту В ка: в
Уаі їв щу с1Уу був Аха Нів був пен 1 а «102 82 «Е1Е» В «1 Білок сей» Війус гецдатиту в «Об» 8
Аєп о Уді бет тів Ткр Таж Нів Пцув ї Е «8405 НІ ме «кит Бінок
«13» вірує репатиту З «а00з 8 пу уві біусАвп Ре Так о біу реп Тут 1 5 «ТО 86 «Вії»в З «рій» Білок «813» Вірус гецатиту В «300 84
З1іу пен тує бек бет Ті Ма1ї рхо Уві ї 5 «їй» 85 «41» 10 «21йи» Білок «21їз Вірус гепатиту 8 «400 85 твг оре» Тр о Був Аїа біуУу 116 Пец Тук Був 4 Б 48 «2105 85 вх 9 «вій» Білою «вії» Вірус гепатиту В «ап х Ве
Був тує Тву Бек ББа вто Тов Пец о пев ї 5 «вій 8 «211» 18 «п3И» Білок ші» БІБУує гепатиту В «4005 87 тіє Бей дтоЗ біу ТвЕ бет вве маї Тує чаї і З 15 «Еко жх ВЕ «її 9 «їй Білок чаї» вірує гепатиту З «асо» В
Бек грец тух ал1а Ар оБет Ркбосек ай ї З
«210 85 «81їз 85 «йїйз Білок «Кк13з зЗвсспакопусев сетгесіяіаєе «400» 859
Ме Аха Бве реко бат Ті РНе ЇдковІа Уаї Пец пе Віа діа бек бек ї вх 16 1 із бек дів із Бо аії АБи Тк ТУ Тв бі Бр обіц ТВ діва зів ай 25 ЕН 116 Ркб Аза Бій Адта та те ві ТУ Бред вв опечц січ О1Уу АБровве 35 То 35
Авроуві АТа Уаі Пеп ро Рів обет АБп обех Тк о двт Авп Оу бейоБеу
Зо 55 ва вне її звп оте ТиУ ї112 Аза Пес ті АТа Аа був біб То) бію ма ве та 75 0 беж оре) АЕр оБує дка сід Аїа бім Ат 85 «Мій» ЗИ «рії 83 «їй Білок «13» Єаєстакоювусев свуєтуініве «400» за мас Акта рРНе Рус дех їїє Ре ТБ Аза чаї! рей ве Аїа діз бет бек
В З то ща ліз тез Аїа АтТа ро баї Аа ТАЄ ТПУ тах 015 Аво Ота ТвК діа вій 2 25 З їіз Рто Авіа сій Аза уаі Ті сіу Лук опегич ДБр без біз біу Авр Ббе 35 а З
Авеоуаї Віз мау їжі буз Ре Бех Авт бех ТВЖ Ав) АЕС соту Бей бей 5 бо впе тів дв ТМ ТП їїче віа бе ї1ї2 Аїа Аза був ямі ЗІЗ бі Маї
Ба о а во
Шет о пвм ойворобуз Ага бі Аів біз ліз евій»м Зі «йІЕх 3107 «Ка ДНК «13» Штучна «ох «гаї» Сиктетичва ковструкція «й «еаїз Ср «ййа» (5). 13095) «Ч00» З асо вача СЕ сс Жев вв БЕК асо зва яв Ба сс пов йса бос обес 18
Мес дгу Ре Рго бех Ії бе ТБІ АТа мМма1ї зей РИ Афа Аза бек беж ї 5 19 ї5 здсеа св есе де сса чес айо асс вс асяодва чаї чЧаа асет пса сла 5
Ата бек Аіва А1їа рко уві дев ТНК ТЕ Таж бі Аве ос1а Тв Аїа Сід 5 що асЕ соя Зсс дав ще Збс ас За пас са чає Са чав ца зак во 114
Ії Рко Аіа бЗіб діа бді їіе 1у Тух Бей АвЮ о Гец 01) СТУ Ар БДде час пе дес ак ро сса сеЄ сес зас зус аба ваяс авс зач ба сов 197
Авро чаї Аїва Узі їй ВКо Ріє беж Ав бек Зп АБИ Ав сту ет Гуз -О ща 50 сс ага зе ас ясе вбЕ дес вас веб о Ядск Ясї заа чав даз сх ява ай пе тів АБ оїці ТІ Іі іа беж їі Аїа Аа ів сі біз бЗіу Маї 65 Та йде: ЗО вес са чає зва зза зац чсЕ дав осв ас ач соб ка оця Бе Ко 288
Бех йдем Ар іув вк сій Аїз сії діа Твх бек совжо ово 1у ББе вве 85 ЗО 95 горб озаєЄ сабо спа ба о чат сса чо іс заг пос аа гос одаєс ав оспсе Же
Руб АБО о нів зЗій ів АБроРгОо дів Рі ОРТу Аів ни Бех Ап ЛЕП рРга то 395 119 час суч Зас СС авс сов зал вес аса асв ск ЗуЗ бе ско Фує ста, зва. зо ТЕвр одно Ве АвлпоБто СІ Аа таб о твкК о бех піу вда сопе) бім РЕ 115 120 125 се бу дру сва пек до ВЕ ЕС сбе сСра асс аза абс ста с авса 338 їей їм кю ре; бі Аїа сі Ре Бпе спе оЦев Та Ака Ті їшь ТВ що 135 ще) авЕ сса єсвза ащзб сее пак тс ся Бу щдсеа єс Ка вас сс ср уча 80
Ті Бто біп БЕХ пе дер озек ТЕО тка Тит бек цей АБИ Ве без с біу 145 150 і155 153 ач ек ста вос ос соб ода соя вас бос свза сс ссз вс сг очас БЖ сіу Аїї: рко ТВ о Сув ро бі бів о двкпобак о бів Бек ро Ту бек пвх 185 170 пл сан кса шесС вса їсс Бас сса бссб о ас СЯЄ сс за бас суб сб асо 575
Ні бек Рго так обек Су Рго рхо Тіє Сув Бо О1у Тух Ако ТуроМмеє 180 185 із са сх аза сяє сб ас оавс БЕ Бебф сс еба ста зса Бу сує су 828
Сув еп дка Ака Вас Тів 112 Ре Темі Рпе Тіе Пец Бей Пе) Сув цей 195 апа 205 ас со сту гу за су гу зас гас осаа сде вбу боб сба де са 572 жів рпа ред їм уаф гей бем АБротук бій піу Меб пев Ртго тУуаї Сув ій ВІВ 20 псЕ віз сб са час ас босбоась аса сса вс пас СО сс вада са ТЕО
Бгто їн Бех рро ЗУ Твкобех ТЕО ОТвЕ Бет тТрх оту Ро Сув Був ТЕ 7525 23 35 ай пс веб вс осса здсб о сва осас ас їса абе вв сеє ач ба се ЗЕ 758
Сув Твг тів рко А1а бій сіу Так бек мес Ве бко Бек Сув Сув Су тА 250 255 асо вва сова СС Чаї за ває Боб аса сс ва бса аба оса сек о ггсСа та
ТВт Пує Рко бек Авробіу Авп оСув Так оСує Ше бко ГТ)е ро Бек бек 5) 285 то за Зса с Одса о едЧа все сс хоз Чаз соФфозсЕ сес ве є кв се вва
Тв діа РБе АТа Ак бра рей Тер бів Тур Аза бек уаії Ака Рів бех 285 285 че са жов обі бСа сб се Ср о чсс о сва без сб усо аа о сса ре ЗІ
Ттр оте бек цей їні Хаф Рко Рпе Узі Зіп Ткр оре Ма! біу їй Бек 250 255 заз пса аса зЗкв о буч січ Кс аск абсо кат абсо ака соч ак кас са сс збо
Еко тах уаії ТкЕроїєйш Зек Аза Ті осттр Мес Меї Ткр тТук ЖЕр біу ргао
Зп5 ла 315 330 ес Бо Сас озвзас або оса сб осса БЕК са сс С Єба сов аро сег мВ
ЩШек їзви Тук Ай тів Пец бек Бго Рпе пем о РкО цей ГИ Рко Тіз ЕБе 5 330 335
ЕС КаЄ ско бач оче бас ас осєс ча чЧаз зас Єзч о соб дв асо 12556
Вле ЄСує цею Ттроуаї Тук ї1е ей; СТш бімсАвБр о Тко сіу Бк о сСув Ту зай ЗА зв
Зав сає зчб цаа сасє вас асо аца аса сер оаза ас олова зе ача ча 11054 сії нів піу бБіч НІВ АБ тів дка їз Ко да ТТ Рго Аіїа БЖ чві1 зх5 35 365 аса зча ча зе Со обо пса час аза азс осова бас вас йса зЗса зва 155
Так о біж сі уаї Бвое Без Уаї Ар був зи ро Нів'Ави ТВвЕ дів З 379 375 з80 с аа сб ско се ас їссоаяде сва Брс без ач сс сс ас св 1250 нет вкл пей Заї Уаї др о рдш шет біб Бае о бек Ат сту бвж тах НІВ зва зао0 35 450 чЕЕ са код сса заз Кс дса чес сса авас оса сав са Єву ас зає 1248
Чаї бек ЖЕО рко був БП» Аїа Маї Ржо ЗИ Пем ій Бек па Тк Ап 4 170 815 сса ссбассссб бов вав оєсЕ ЗУЄ Саб су со ре заб чо бо зоб оса 1295 реп Бей ех бек Аа Ббем о бех Тер оевиа бек Бей Абр уаї Бек Аза ДІВ 4240 5 130 вс баб сас аа сса сксаб сої са чес сабЯ ста сає Сб бра са Узад
Рпе тук Нів Тіз Ро без Нів Рко АТа Азїа Меб РБРро Нів ей о пей ЗВ 435 440 445 ча аз соб оз ста са ауд бас аск пса аба ста тс сшБ ас о 1352
СР бек оШех Бір їео Бек акЯ Тух Уаї Аїа йка рей Чех Щек ТВХ БЖ 45 6 йша вав асо зах гас аза сає За аса акФф осав Час ста св чаї ба 3440
Ак Ба тіє Ав отук обу нів о зіу Тк Ме бів оАвр осо Ні АБробекє 4655 ра АВ ав ше сб аза вас са Бас а пес соб бра ста сії бас ава аса СБ 1488 сСув ех ага Ав пез тую уві Бех Бей рей Пец Пец Тук Ту Тпи Рде 485 455 495 чаї ача ввя сб сас ся бас са са сса абс оасс са доб сс аа ТБ3б бСіу Ага був їх Ні Бей Туг о Зек Зів Рхо Ті Ії Пец піу Ре Зх
За 55 5 азяч аба себс агро пас йо аа ва бе єс с сєса са дса свуа СК 15856
Буш Її6 Брко мМеб ПтУу уві Сі ей бек рхо Ве їеб пеоа дій бів рве 515 зе зав ас її дсо ас ар оїса пра сс су о ача зба КЕ ств о саб баб сса 1839
ТЕ бе Аїа 118 Сув Беж аз чаї Ах дхЗ діа Ре Ехо Ні Сув Бе 5За 35 зна са СЕК са бас ау час чає зб чес Сра зує сої зву бебБ УСЕ Сай 1ї6в8О діа вне бак Тук Ме Ар о АБр Заї Уа! цез сіу Аіа ув Бек уві бій 5А5 во з БЖ сас ссЕ за са со Кб восоаче аа асс вдає Есе сеї со ач ста зав
Нія цес бі беж тб ре ти бек ті ТИЖ АБа ве Без Бей бек тей 555 575 575 час айс осає сєвБа ваї сс дає ава ас заз вача сад одсоа вс беб пе ІЕЕ
Сі її Бі Пем ан Бус АБ Гуз ТйгоГує Ага тТрробіу Тук беїг ем
УВО -в5 -9о дас сб о аса За брас у віє шча са бач де вос сс ста спа дай таза
Ав гпе Ме бі1У Тую уві її Сі БЕК отТІвВ біУ Трж о йец вс бій ЗІ 555 що ОБ са: асс чус сто заз ас зач сач сах сс азча заз сто сова че аа 1873
Нія« тів Маї Пец Був Кі був бЗіпоСме ББе ДАДка був о їем Бгто Уві Ап 519 вів во апа сев о асЕ час созд дав пе гас сач асвоасе чста зд ба сво са 1525
Ак Ро щї1їа дО тТтропув Заї був сіб дж тів Уві 0іу Боб о пей біу ва 50 535 540 ск дос зес соб о асс сач сао дас баб сса ст ббщ5 абс ста сша 1568 пе Віа ліз Бко Бпе Тк бів Сув блу тук Бго Аза Бец Меб овхо Ге 535 во 555
Бас пес каї аке сва сс заз са сеї Бтсє вса Бе Боб соа абс ваБ 2015 тує Віа був Ті іп Аза гу іп оАТа ре тТБЕ пе Бек БЕжО ТНЇ Ту
550 655 570 азч ще ЕЕ ста сов ав са бас ба вас ск ба сов з чої двох 26 був йіа ЕБе пен Сув Був бій Тут Бей АБИ Тен Тух Рго уаі дта АкКФ ба 559 БА саз вза чаї ас дає сса бас вааа заз СЕ дод яса боса чес дав БІВ Км
Зіл дк бвроїіе Авю ро Сук Буш Сіз рве б1у АТа бек уві сі Бецй о ва5 той сота косо кс осока сса жов о сас се сс бе о сгсва абс аа час ба Са іно печ бек Ве їй о бБго беїг свв РНе Бе Бко бек тіє Ак Авроїец КеУ 716 715 Ше ав аст цес ве дчса сс гас оавча зва чиї ста зда сб сес чав сає газ
Авв отих ла Бах Аіа ге Тук Ага зі діа рей бій бех ркб бій нів та5 7 735 кає жсї сов осас саве асбочсо ср аа саа зса або Ба бас со пос 2356 був вах вхо Мів' нів Тк Аза рей Аха бій Аза їі пе) Сув о їтвробію 745 745 75а ва сс від зав щу дес аса суч з да зуб ває ста даа Заб оса ЗА бів рем Ме Ав опен Аза ТВК о ТкроМаї Сіу бек о Авп ої сіб Вврорго 755 750 те чссе Са ача зад ста як адба ес бас зро вас зві ває во За сса 2358 іа бек Ах сі Бей Маі УМаї Бек Тук Маії Аєп Уві АБлоМес б5іУу пдем пло 75 тва заз ак вад сва бра ста бод сг са ав зуб бас ба всб о ббс одо КАО ув їі2 Ага бій без пе Тр оре ів Іі бек Сув ред Звх Ре СТУ 8 тей 735 по ача чаа аса че ста ча ас ба бра са сББ зба чба Бо абс апа А
Ззха бі: Те Маї беї бій Ту це Уві Бек Рпе біу Уаї Ткр Ізе АкФ
Во5 810 іа аск сей соб ба баб зав сс сса зас зсо сса ар ста об одла су 2436 тиж Рго ВБко Аїа Тук ху Рге тро дом Азаовко ще пе) бек Ж Пец по вав 83 се чаз аса асї зба шіс аце аза васпа соцЧа за са ссаз ап аа ад Бай ве бІіа три тТвкоуаві Уаї дЕт джу Вхч СТУ Ах бек Бко ду Дку АКО 3435 в45 845 асе сов Каб осса доз вас су сс соб бах сбесо соб оса вда сло зу иБаВ
Твт о рго дех Бжто аку Ага Аха АкЯ о бек Са бех Бо АтЯ дра Акча Ач 5 55 БО св сна са вуа ва дб сав бас дса зоб апа Зб Бас баб вва себе 2в4О
Бех бій Вех Ака Бі беж іп о був Аіа зїв да Уаї Сув Сув Був Пи 855. то 875 в час со здсс вда Чаї Зла оство гої сс здав осса збо бас ас пава са ва
АвроБго діа Ак лЛяш Ул це) бує Пе АКЧ орга уві сті о АтТа січ цеху за й яЗ5 ск чої ваба сса кс са суб сса СК: соч аса їКаосса тес сс св лів
Хекосту ак орка маі беж О1у Бко РБе бО1у ЧВк без РКО бек оБко Бех зоб 205 510 азс ау дес яса сес уса чає сає за уса сає сш бе св аа оду опяй
Бек БЕ АіїЗз уві Бра діа Авр Бів ЗМУ 1 пі Пес Бех Пен до Бу
ЗЕ5 з20 за5 сЕБ соб Ес тав асо ЕС ває са чеа дова сс бус оос соя ав бе 28375
Тєц то Маї СУБ Аіа Рі бву Зек АТа біу боб Суб АТа ей Ах рве з3и зав 49 аса пса чоб або ау асо аз аса аса зеЕ вас оаскт оса свза Ус са ЯВО
Таж ви Ава Ато бха оМес сі) ТБЕ ТБжЖ Уві лей Аів Нів біп Уві Гей за5 авБоа 355 360 сса пай да са саб лаз ацуа аса СБ зас Я БсЄ чес ага вує дос -а8
Ехо Був чаї бек вія ув Ака Так ге сту рей бек віз Меб Бех ТУ зЗа5 970 375 всї чає ка чаз Чо сас СС ззау час бас Зк о Бсгс дай дак ро аа дає
ТНЕ Авб пе біб Аза Тух ВБйе Був АБр Сув Уаї Бпе пуд Авротер о зво зд5 330 чаа ста сах зва саа ас взув сао вва з со за сов зас по грає зоза
Січ їжа шіу сій сів Тіе Ако ей був ув) РБе Ма! дей Лу сі1у був 95 І950 хоа5 аца сас заа сія Фреш бсо соб одем пса бяс ад б бе овос 1055
Втч нів Чув іє Маї Сув бе оркОо Аза Рто Сув дет бе Бле Тк то ТОт5 1036 бос одсс сас са сає сає бас о саб ча баазечдєся 3197 век Атїа Нішв Ні Нів Ніз Нів Пів
Тп25 ОЗ «чиї» ЗИ «211» БОЗУ «аа» Біло «3» Штучна «8802 «ваз» Синтетизна конструкцій «ай» 39
Месб Акеа фе руб бе ІТ рле ТБ Аїйв Маї бе» Рпе да Алла чав бах 1 5 16 1.5
Ахв бек вів Аза ро Маї Азп ОТАК ота ТОе Та АвБа обом осн Аїа бій 2) 25 35 їз рго Аз біп діа Уві їіє біїу Тук печ о дкробей ЗБ озіУ два вне ху 5 48 кр отуві Аа Маз цею» овуо Ре Бех Авпобек Тк о ЯБл АВ остіу Тнмдо Пе ва щ5 о
Ре її Ав ТбЕ ТЕ оті Аїва бек х1е Аза АТа був їй бі с01У Уаї
Зек опе АБб оцув Аг 1 Аза біч Аза ТВ БЕК Руб Бе біу пе вце 55 а5 5
Рко АБр»онів піп їси Аве оБро 8іа впе С1у Аїа Ав Сех Авп дБ РКО 105 1605 то аБроткр Ар вра Авіп Рко 03) Ав ствЕ Ту бек сіє Бпе пев 01у РКО 120 125 ем цви Уа) Без біп Аза сіу Рпеє Ре обев цецд ТБ сАкоа ГТіе їем Те 130 135 149 тії рко біз бек Сем АБр Бек Ттр и тТхр ТНК беж Пей Ав пе Мей сту 145 155 1535 160 у йів бро ТНе Сув жо С1уУ бій АвпобБак сій Бек вто ТвВт бек АБИ 165 іа 75
Нів Чех ро Тахо бек Сув рРго Бго Т1іе Суб Бго піу Тукойха Тр Мех 185 185 150
Сув це) Ага За РБе т1із жів Ре цец Бе їіє цей Бе Бец Су Бе 195 Фо за ті БНе цем Ппей зві Цей пен АворотТух бів Сім Мет без Ро уаії Сув
І 715 80
Рко йео тез Ро Оу Тбк бек Тбж тну бек ТВК ОСіу РЖО Суб мув ТЕ 275 330 233 2) пу ТВХ їі Кхо Дія Бій б5іУ Та обехоМес гпе ро Бек Сув Сув Суб
Ай 350 да
Тк тує Ро беж Авросіу АБИ Сув ТЕ був сіє Рто ї1їе Рко беж Зек
Ей 5 279
Ткр. Аза Ре дів Вку Ре ГБем о Ткр обід Тхр вія бек Уді дк РНе Бек 27 Моз) 2585 тЕр рей беж репо пецй уаї рте РБе уа1 01 Ткв о Бре уді сї1у рей Бех 9 235 зп
Бко тн уві тТхропей бек ові ІїФ Тер Ме мес Теротутє ТЕр піу ре
ЗИ Зх 35 Зо бтех цем тує АБИ т1з Пец обег рко ВДе Ббем Бо цей рей Бко ті ро ай 330 за5
Ріпа Суш ім рероузь Туг її тео сія біз АБр отр оду вхо Сув тп 340 345 35 біз вів піу бів Ні Авпотів бе Тіз Рго дкз Тк Ро Аза кеш чаї з55 36о 35
Тв біу йіу Уві РБе пе Уві Др буз дви ого Нів Ава тру Аза сій
За та зва беї Аку рен Уві Уві Ар Ре Бех ій Рре бех й 51У бех тТнх нів аа 335 ов
Чаї бах то вБКОо зу рРпе лів мМаі РЕО АБИ Пец піп бек Цей Я АБИ 105 ті 415 рез пец бек бек Депп Пец Бех Тур о ем бех Мей АвроЗаї бет Ада АІїа 42 425 31
Бпе Тут Кі І11їз Рус Бей нів ро Аза Аїа мес Бко Нів Сем Беп Уві 435 140 ї48
О1Уу Бет йех Ту їси беж Ак Тук Маї діа Акоа їши Бек бек Тк пек 450 5 452 йта йБи їіє Ап Тур Буш Ні спі Тато Меб біл АБр оце) Ніводвроветг 455 470 475 чо
Сув бех Аку дей ре» тує уаї Бек пен Тжмі їй іні Тук Був Тр РНе 385 4305 ав піу Атч Був Пец Нів Пейп о Тук бЗет Нів Рко Тіїє-єе Ії Пец ОІ1у Ре Ажу за 805 1
Був ї1іє КЖко Мебє біу уві Сі Її бек Рус Бе пе) Тез Аза біп гве
ЗІЗ зво ваз
Те бек Аза ТІВ Сув бек Уві уаї бхз АуЯ Аза Ре БкОо Ще Сув пву 535 535 ай
Атїа Ре бек Тук Меї аБр авр мар Уді ге біу дід Пцув дек уді бій
БА 50. 555 Зв
Нів Зец сі) бесг їз Вне ток бег ХК тах ЗБ Ре пе; бе бе їец з55 БО 575 сіу ті нів Гез Аєповго АБп бує ТК був Ак Тв 01у Тух ах Ппей
Уна 585 БУВ
Ана Раш Ме осСіу Тук Ві 118 сі» баб Ткросіу вк ред ркоссій сій 595 по 505
Ніє Т1є Маї цем Гув 116 Був Зіп Су Бе Ага Бу реш Вко Уаї Азп 510 515 вай
Аг ржОо ї18 АБроТтко Бу5 уваь Сув бій Ах тів Уві біу ей сей сту в25 що 63 6430 вне діа діа Рей Ре твх бій Сув бьустух вко Ата сп Меб Бо Бем 545 55О вх тук Аїа Су її біз іа Був біз вла Ре Так орБе бе о рго Так о тТух вд 855 67 їув о Аїа ра рей Сув Був бій Тухк пей АБа опец тТук Бк Ма! АтТа Ака во 685 сій Ася АБО 12 Ар орто Тут ув Зх Ре Зх іа бвт Уаї с Гей
База 95 то) їв Ббед бБре Гесд Бсо Заг Бр Ре Рбе Рго баг їТіє дДку Бвр Пец 795 716 Ту 723 хвротвЕ Ата беє Аза зей тет Ака Бій діа реп сви бек Бко Сто нів 7 7.0 738 сСув бек рко нів ців ТИХ Аїа Бей АК бЗіп Віа ті пес Суб оТрробі1у 740 745 т5о
ОБи іч Ме о Авпоїсна Аза Ту Тур умі шШіу Бек АвпоПей січ овбнрогто 755 тео ТО
Ма бет лгу іш бе Маї уаї Бек тТук чні Авп Уді АБ Меб сту Пес по У 78 му Тіє Ага бі Бей тав ТХв гпе нів Хі шек Сув ем тих вве іт 785 79 735 оо
Дт бім Твх раї ец із Тур оцез уві бек Ве біу Уві Ту Ії АгЗ
Вох 810 5Зі5
ТВ рЕо хо Ма тус с Акоа Рхо РхОо АвБпоАЇВ рРго іє пец бак ТК Бей 520 325. 830 то сія Тв Трх ма1ї Маї вся Ака Ат б1Уу Вка бех БРго Ахка йкч АКх 85 840 845 так оВкго дек орко дка ху АхЯ Аку бек бій Бех рго ЗКо вка4 Ак Ага 850 дя ЕВ бЗек біп бексоАка бій бак Зі Сув АтТа с Аїв Аку баз був Сує 1ГуБ Пец ще Б; 875 БО
Ави РКО Ада Ато во Уво Пец Сув зей бе рго ба! Бу іа за Бех яв 890 335
Бек Сіу Аку рго Маі бек 0іу ро пс б1у Ток це» руо Бех Бко бек 506 05 910 бек бех дів Уаї Ехо А1а Ар нів Оу Аза Ні ей бек Бей АхЯ Ту 915 20 925 тез сову уві Сув дів Бе бер очах Аіа бту Ркосбув о йіа оц АкЯ вве 339 515 зас
Тк бек діа Аку Аг ме бли отв так оуаї АБа Аза Нік о бСіп Ууаї Пец 945 зЗ0 зу зво ро ув Уаї цецй НІ Був Аха ТП Бей біб ей Бех Аіз Мер беї ТВЕ 65 НУ ат
Тв оАвропен бій АІТа Тух Пе бує Авр Сув Уві Рпе йпуз Авроїхр їв ва 55 з90 біз Пем Сі 13 піс ті Акч еп пув уаї Бе Уві це 0їу Зіу Сув 955 то9о ї095
Атя Нів БУБ реа Чаї Су Бего вБКо Із вже СувсоАВИп Бе Бе ТВ 1015 1015 1059 бек о Аїа: нів Нія Ні Нія Нів нів 1035 1030 «10 83
«фії» Ва «ТІ» Бідож «213» Штучна «пах «ба3» Синтетична констоУкНІя «4005 аз
Мес Ака Бае рко бек тіє Кнпе Тах Аїа Маї реч Бра А1а Аїд ех Чек ії 5 та 15
Кіа БЕ діа вів ро дав лев Те ТЕ Токосьі др о СТЯ так о Аїва зів 2 5 30 її ко Аза бій дів саї тТіе СіУу Тук без Авроїієи па ТУ Аве о Вле 49 45
Аврочаї щіва Уві їм рко Ба Беж Ап бек ТОЖ АБ оАБа су еп Бе 0 55 5
Тпе ї1іе двп ої Тв їтТе Азїа бек Ї112 Аїа Аза бує біб Сі Ззіу Маї 85 79 5 ко чзеї пев АБр бує дра Сі діа сій Аіа сту сту ТЕр беї Бек Був бузЗ
В ЗО 55
Ака ув сбіу Меє біу Твх Авп оБец ех Уаії вхо дДвпоРко Ге біу пе 159 105 155
Бпе кто Авр о Нів сій Гец АвроРхо Аза Бе б1у АтТа АБИ дек АБИ деп 115 158 772З рко АвБробкор АВ ОоРБе АБИ Руб АБИ їж о Две НівБ ТХВБ ЕКО Сім Аза дв 130 135 142 біп уаї ЗКУ Уві біу Аза Ре сбіу бко 5іу ББе так огжхо БКо нів сї9 145 150 155 159 с1іу їечу цецпобзіу Тхр бех Рг бів дів З1п біУ 112 Пец тр отак Ууді 155 178 175
БкО Аза АТ Бо РкО Его Аза бек ТИХ Ави ЗКУ бій Зех бу вка іп 180 ув ТО ко тах о Ркго Тіз бож ро бо Гей Ага АБробеє нів ро бій діа Меї 19 200 2935 сій Ткродяп бек Так ТОу Ре нів біп Аїа Бец геї АБ Бгто йха Уаї 219 315 828 вх біУу без Тут ББе ро Аза піу іт Боб бе деї Сбіу ТнЕ уві АБАа рек аа Ж 250
Бхо уві Ро тк Тах Аіа бех Рро Іїе бек бек 112 Бпе бе Акч тТНх 245 259 55 п1У Авр о рто віз бо АБ Мес Бій АБ о бБЕ тн бак обім ВБе Без бі 255 270
Бке їй Бей уаї пе) сій оАіз бу Ре о БВе спец тез Тих Ага гів Бей 275 Во 285
Таке ще Вго сів бак рез Авробек ТЕротто Ту Бек рей Авп Ве пе 285 300
Оту 01у АтТа во ТвкоСув Бгто СІ Зі Ав пвх о сіп беж ркЕо ТтвНЕ Бек 305 За 315 23 ви Нів пет РКО ТПсо беж Суворо Бгто ї1е Сув Бо 01у Тух Ак ТЕО 3275 330 ЗУ
Меб Сує цей йку Ах Ре ї11е її Рле Цей РБе ТІ Пе Пед Без Сув 340 345 350 їеь ті БНе пей о бем Уві цей це) АеротТук Сій Сіу Меб їзди о ркго Чаї 358 зво зв5
Сув Рхо Цей їні Рей о біу ТВ бек Так о ТВжобБех ТВк обі Вро Сево Був
У ЗУ зво тиж сСув ТНЕХ Ії РКО АТа бО1а Ру тні бек Меб Ре рРко бет Сук Суб 355 зво 95 а2цо
Сув Брж Гуз ВкосВек Аворо Зіу бяп оСув Тк о Сувз І1їв Ро ЇЇе Сказ беж ап5 1 їх дек те Аза Ріє Аїша вк Рі її ТІ біб ТероАїа бек туаї Ак ве 420 а до
Кек тор цем бетх їв рем Уві Рго рРіпє Уді бій Тжробле Уа Ту Бех ізх 48й 445
Бех Вус ТНжЖ баї тро Бей бех ді Тіє ТЕв Мей Мес ТкроТук Тер о сту
АБО 4553 465 во бек Бе) Ту Або ЇІТе Пец АБ ово ББе ре Бк Тед Бей ро Ії 455 478 Аль 380
Бле оре був сем Ткр Уа тує ті ні ців нів ів нів нів 83 430 «віп вд «йїї» 440 «аз Вілок «813» Штучна «ох каз СинмтеФична коаструкція «400 94
Меє то овБе рхо бег тів Ре Тр Аїа ма) пец Ре дій Аїа бек бек ї В НЯ 15
Атїа шет діа Ата рко Заії Дал отв ТАК оТВк бід дБросати так о ЗТа 1 2 пу о
ІТ Ро дів біз ліз уаї ї1е 1іу Тук ба Ав Пед Та піУу Авровце. 55 Ао 45
Зв р уаї Аїа Уві Пез бро Бе бек АБр о бек Те Ал оАна сіУу Мем бен 5 5о вве тіє вп Тато оту тіє 83Зз Бех 11е Аза йтїа був ста бій бі Маї 65 та т ВО
Бек цецоАвБо Су Акад сіб Віа біз Аза ія АвротЕр осіу вро був ТЕк 85 30 95 піч нів Зіу бій Нів Ази Тіе Ага Ті РКО Аку так оБто Аіа Ак отаї оо 05 118 тек 0іу іу уві Бе Ппеч уаї Авробує Ав Рго Нів два тТвк йїа бім
АВ ее: 125
Шех вВЕч їв Мві Уа! АвВр Бе шет біт Ре ЗеаЖ Ак зіу бек Такт Ні
Ії32 135 ї40 чаї бек Тв ро Пув'кпяа Біш Узі Бо бами тем осіп Бек Гени Так дал 145 МО 155 ІБ
Ппеп ев бек бек Ви Пец пек дж Па бех Ієч Авр Ууаі бек Діва ді 155 то 175
Ше Тук Нів Тіе рез Це) Нав сорго Аїа Аїа Меб ро Ні цей бе уаї 180 85 155
ОІУу бет Бех бі їз» дек вка Тухк Чаї Біа Ак їн беж бех тру бБат 195 КА ОВ
Аха Ав Ті се Тує Був Кіз Зіу ТБ Мей сів др оїеви Нів Ер оВед за 215 220
Сув бек АгУ оАяп о пей Ту Уаї Бек Бех Бецоіїєц рей тТух цув Таж сце
УхЬ 230 233 245 біуУу дкЧ ув їв Нв цем отух Зак Нав РКО ї1е ї1е осей сіу Бе ВІЗ 255 259 За му Тіз Рго Мес біу Чаї Сіу Без бек Бко Бе Пез Поп АЗа біб де ре 2655 210 таж беж діа КШіе Сув бБет уаї уаї вч о Аку А1в о впе Бко нів Сувобей 275 зво 285 віа рре бдеї Тух Мес зві Авроуа1ї Ма) Без слу Зіз о Буя беж туаї сів 293 255 320
Нів ем іч обех їец Ре Тв бех 11е ТК два Бе цей ей беб Шен 315 320 1 І1е НівБ г) АБИ вто Авпоцув о тТАаХ Був ага ТтробіУу Тує бек ву 325 335 335
Аа Бра Мес біу Тух Уаї її біу Бех Ткр біу Тіх Бесб Ро бів 1
З40 345 зва ніз ліє УМаі цви Пузв Тіє Муз біп о буз Рре Ак оїуя Пез бо маї дев 455 зва зв
Ага вто Ії вер Тер уз Уущі Сув іп аку ті УВІ 01у пед їжа Ту
Зо а5 ЗВО не дія Віа рРко Бресті бій сСув ПІУ жук Рко Діва Бец мес рГО Гей 385 195 з3Зл5 асо
Тут АТа був ї1іаа Піп АБа бує Сіп Аіа Вае о тйт ве бек РКО сТЬх Тух
205 10 35 пцув АтТа Ре Пеу Су їв ців тує цей дев оїей Тут РЕо Хаі АтТа АкФ 420 да за
Сів дка нів нія нів нів Нів Нів 435 420 «їй» 85 ша З «Ям Кідок «2135 шеучна «20» «гаї» Синтетична констврукоуя «00 95
Мес Ака рпе Рко бег Ї12е рРде Ти діа Ууаї Бец Рре Аза Аза бек бек у 5 10 їз ліз бек АТа ліф рко Чаї лЛейп тах Те Тахо біз Абробсії ТБ дів сСіп хи 75 за тїе руб діа іш Аїа Уві ч11іе ц1у Тує пе Двропцец Сі» О1у дДнро вне 20 45 дво Маі АТа маї пей сбко Ре бах дей бек ТВу Ап о бно бО1у ей Пец бо Зв ва
Рце ті АБастнк тв Кіа Аїз Бех т11е Аїа АТа був біз Зіш біу уві 65 70 та 8 дех Гей АБЮ БПув вкч пі) АтТа бБіц ата АБО тів АвБр ко тую Бувсоїй 85 з з5 вве сіу віз пет уві бій пей Бе; аю Рйє їла рРко ак сАви Ре ре що їаЗ 119
Бгто бак тів АкЯ Авроївй їм Ар Ту діа бек Діаз ей Тух Ак 15 115 Що ї2У
Аїа пез бій бах ро сій Ні Суд бек о Бко Мія нів ТВ Віа бе дта 1350 13 180
Сів А18а ї1е іїносСув тЕроЗіУ ОТ цей Мебс АБИ Гей А1а Те Ткроуаї 145 155 Т55 150 біу бек Авподев сій двроБго А1а бех Акт бій пе) Чаї Уві бек Тух
ВЕБ Ко 175
Уа1ї Авп о Маії ап Мессі рей Пув 118 кад піп Бей Па Ткр о рде нів 180 185 199
Ії бек Сув Пец Таж Ере б1у Аго 0із Те Уві Гец Стів Тухк пес Уві 1955 МАКІВ) 205 бек Епе спіу уаї Тур ої1е лка4 Твк о Бто Ро Аіа Тухк Ажя Бгеа БКо ДЕЛ 810 215 220
Аїа РЕЗ тів оіту Беї Таж Пе) оБжо 014 ТІ ТК уві ба1ї ака Або Ах 230 235 250
ОіУу Ака Звук о Рко Ако Ако вхя тик о рБко бЗву Рго Аха Ага ака дго век 245 БО. 2755
Сів бек Бкго Ака Акта Ак Аку бек біп дек Ак 01й бек біп Суб Нія 1 з с З З кч У 250 йв5 Кано! нів нів НівБ Ні нів 275 «7105 95 «11 928 ій» «Вілок «ї13з шШтУузна «й «803» Сичтетична ковструкнія «їх У5
Мес вка Рпе Бо беж 16 ре ТЕ лід о Уаї ей пе Аіїа діа беж бек не ри 18 15 дів Бек Аза Аїа хо Чаі йБиа Тік Тит ТЕ озх) Вр оСі1а Тахо Аза бів 25 30 їїе БкО Аїв сій діа уаї діє Щ1у тук реве д5БО Пец сла б1у АБроРпе 46 25
Ззр уаії Кіз За)! ей оБсо ББе Зег АБО бах Ту вп о авпобіу ва цей
БО 55 00 пе т1е АБИ ТЦК тах Бі Ата Бек їів Аза АТа муз СІЯ бій сіу чаї 5 75 75 Кн:
пек Без Ар буяє аку іч Ата йіш АЗїа діа Аза дхя Уаі Сув с сув був 85 за 55 пей ЯкроБхо діа Ага Азробаї Бей Сув реи Ак рго маї У Аза 010
Іо 105 115 ех бек сіу Ак Руо Уві бек Зі Бко Ба піуУу ТвЕ бе; бо бек ро 115 28 тах беї бат бех Аїз Уві Бо Аів Авр ніш сбіу Ада Нів Із бет пей Ах їЗо Ї35 155 бі їй Ро Уві Сув Аіа Бе бек беж Аїз Зіу го був Віа бем дк та 150 155 ув тре ТнНж бех Аів Аха Ака Меб бі тю Тнж Уді дев Аза Нів бійп Уві 165 370 Її
Бей о рго ув Уаї ей нів о ув да ТВІ Бей С1у бе) беж дів Мебс бе 180 ї85 150
ТвВх тт АБроїез біз Ата Тух Ре Пує АБр о Сув уаї Бе пуб АнроТто 55 209 205 сіб бій без біу 015 біз їїе дкЯ без Був Ма) бе Маі тей біу с01у 210 ів 225
Сув йку Нів Бу рей уаї Сув беж Бко Аза рко Су Ав вапе Бест 225 2 235 вай дек Віа Нів Нів Ні Кі Нів Нів 245 кві) 87 каді» газ хвійз Білок «913» ЩШктусна коайх «йй3ух СиМтетична хонструкція «ВО 87 мес сів ттро Абе беї тТйгодіа Бей нів їй Аза Бей цей дво Ро да
Ні 5 о 15
Чаї дка бЕж са стук Бо Бро Аза бі біу Зежх беж о бег піу Так о Уді
АвпоРхо Уві Ро ЇїВт Тпу Аа бег рго тів бек Бак Іч1їев еп бек був дО 5 твж Віу вро вхо Уаї Рко Вей Моб біз АБИ ТВХ Та» беж о сбіУу ВЕПе Без 5О 55 бо бЗіу Бо Пец еп маї пезм сзй Азів обуу Рпе Ве Певи цей Тах Ак їіє то тв що
Тез так тіє рЕо бзіп Бек їєц АБО Бек Ткр Бте Ск беє ей Ап где вх 30 Зз їез п1у агу тТвх Рта Уаї Сув Тїей сіу сів бБпосек Пій обех бко дх таг 105 119
Зек дви оБіз его хо Таж беб був овВго Вко тів Сув рго с Сіу Тук дк кЕЗ ї20 135
Тер Меаб Су де) бо дхо бе їїє їІіе БНе о пей Ре їТ1їе Сез рем Пей 130 135 140
Сув бен тіе Бе без Бей Уаї теп Бей АБр о тух бів спіу Меб Бей о рка 115 ї50 155 15 чаї Суб Рхо без Бен Рксо о юІУ Бак обеж тб Тк обвУ ТК сту рко був 165 170 17 був ЕЕ Сув ТНХ її вБЕО Ара о зіп Зіу тр бек Ме Бе реко Зех Сув 159 185 530
Су Сув Тато ув РЕо Беж АБ ЗМУ АБ Сув Так оСув тів Рко їзв о рко 55 2010 йо бек ет ТероАза Ре Аїда джу Ре Ппей Бкросій ТЕродіяа Бет Уві Ах 230 215 280
Ре бек Тхр о єп бек Пед ед чаї Рко Ре уві біп Тко бле ма1і 01У 225 30 238 549 їжі Бек рхо Тпж Мах тТюЕв їєн: Бає Уві «8105 98 хитіх 398 «їй» ВЕДОК
«213 Шхучна «й» «пйЗ3» Синтетична хонструкнія «400» 88 піуУу пец Бех Акт о тТух аз іа Ака цен бек беж Тих Бех Ак дДвп (12 1 Ка 19 18 дан отут біл Нів бу жк Меб біп Авробей Ні Авробеї Сув беж Ах ва 5 30 дви опа Тух уві бек ей се; цей пез тр був ТВакК о ЕВпе бІіУ АкЯа Бук 45 цеш Нів цей о Тух бек Нів Ро ї1є їз пе) біу Ре дха цУуБ ї1в РКО 5 55 КО
Ме Сіу маї бік рем бек Рке Ре Мей Пер АТа Зі Ре тн беж Аза 7о 75 во 1 Сув бак уаї Уаії Акчш Ака Аїз Рйе Ріо нів Сує Бей діа вне бег о 25 5
Тут Меє АвроАвБроУуді Уві ем сі й1їа Був чек уаї бій Нів Пею біх 100 105 їіїа бес оцей РВЕ ТЕ бек Т18 ТпЕ АБа Бе во їєй беж рем біу їте Нів 115 га 125 ра Ав РКО Авпо був ТЕ пух Ві Тер обіу тук дек Бей дво Бе Меє 139 ї35 140 сім Тухк Уаї ї11іє біу цех Ткр бі ХВхт Сей бко бій бли нів тіесуаї
І145 155 155 180 біпоцув цей Буз бій Сув Бле Ага цУуБ ей Ро Упі АБподко рЕо с їїе
ЕВ 170 та
Аве откр Був маї Су піп Ат ї1е Уві С1у цей Без 01 вре Ата лів
НВ 185 І50 рко Рпе Тпк бій Суш С1у Тух Ро Аїа пед о Меб Рус ей отТук АТа сСув 1-5 ОВ 255
Тте іп Аїа був Зіп діа Бе Тв Бре бе го ТЕ ТУЖ І1у5 Аза Бе го 715 ВО
Бей був Був пів аа ка30» 99 -251ї55 157 «212» Білок «213» Штучна я «иа бминтетична конструкчін «АЛ» ща сі овлде біу АЗча бек уаї сій рей лев бе Рпе рей ро Шех Ар се 1 а та 15 врпе рРуо беж уаї Ак Авротїез єм Двротах Аза пек Аза іа тТук ку
КІ б» Ака рей осіб беб Бко сіл Ні Сув бек о бго Ніш нів тб із Аіз Бей
Аа Біп о Аїа Ті ей Су Тр ОобІу Пій Цей Мер АБИ їй Аза Тк тк ке. У 50
Заї зі бес ава рем біз АБО го Кіа Секс вкч бім цец уаї Уаї бех 65 70 75 во тТухк чаї ви Уаї Авт Мек бі Бец їйув ті Аа бій без це тжр о вре 85 зо 5
Нів Іі Зв Сув Беи Тк оре біу Аха сіз тйк Уаі цец Сфа Ту ей 159 105 110
Чех век пе Зіу ні тТтр ів Ас ЖТБЕ Рко рко Аза тук Ак Бо вго 115 ке 125 І
АЛєп діа Рко ї1е Пец Вех Тк Пец Еко біз Те ТВх о таї Уаї Вец дху 138 135 150
Аа піч вч сек во ах ла ВГ 125 5О «Вій» по «ит во чиїй Білок «135 тУЧчНА
«дО» «232 Синтетична конструкції «ВО» 190
Ні рез Бех за Ак оіу Пе; Бе Уві Суз Азїа Бе бех бек АтТа С1Уу 1 5 15 ІВ ко Авп о Атїа Ні сій уаї цес Бко був чаї Ббем пів Був Аа ТИжх ей 2 ве 39 плу цем бак Віа Мет Бех Так ТВ АБр ге) біз Аза ТУЮ рЧе Був Авр 35 45 45
Сжя Печ Рее Був АБроТер Бім біз Пец Біу Ст ста 50 5 о «105 101 «11» 784 «2182 Білок 2й13з Штучна «Ва» «йші» Синтетична конструкція хай 10 мес АкФ Ре Вко бе З1їе рресчнж Аза аз її же Ата Атїа беж дех 1 ї 1 15 авіа бет дів А1ів Ро Уві ав оту Тато ТВ б1їц Аве біз Тв Ата пів й 25 30 т1е вто АтТа сіз Аза уваї тліє СІу тує тез дво Тех віч бі двв'свве 49 4ї5
Авроуаії лів уаї Без Ро Бе Зах деп бек ТНж депо Ав обі Би ех «В 5 50 вве Ії Ав о ТБе Те тів Аїа бек їтїе дід АТа Пув та сій біу Уді 7о 75 я
Зек гей др оїцув дже 015 Ата зів Аза Меб пів Тер Ав бак ТНУ АтТа 55 зи а5
Бе; нів сій Аіа ей пе АБроБго Ата Уві Аку біу зи Тут вне бго їпо | 105 110
Ав біу піу бех Зак беж З1у ТБ Уа! дви рю ар Рко Трх Тлю дів 115 125 125
Бех Ехо ї1а бек бер Ії пез ЗБК Гув ТПХ біу АвроБжхо Уа! ко АБа 130 135 150
Мес бій Аза Тс тп дек Бім ие їни пе Бо ре) рей чаї їні сій 1535 159 ї55 155 діа Сіу бе Ра пе Пе: тат оАкУу ї1з рем тр гів рЕо сі) бек пей 155 179 ї75 вві Зех Ткротто тох бек Без АДкпо бе Бец Ту фу щих бу» уві Сув 8 ї85 180 пе фу 010 зва о бех бій бе Бко Твг Бек Ави Нія Бех Рко ТрроЗек 135 200 ОВ
Сув рко Еко її Сув ро 61у ТУух Ако Тур Меє сСув їй) Ата Амку Це
РІО а 220 їі Ме бе Пец рре її цей цей пеб був іа Ті різ Пей емо хаї зІх 230 235 зай
Пе бец о АвроТук бід сіуУу Ме Бе Ркбо Ма1їі Сує Рхо рей беп Бкго Піу а 250 25 тик Бек Тнх ТЕ бех с тцдЕ біу Вко Сув о був ТВж Сув ТНК їїє Бо Аза 265 5 27 іп бі Так бек Меб Бле Ро бек Сує Сув Сув Тахо був рко бех Дер 275 з8О 285
Зі йвй Сув Тих Сув о бі Бхо тів реко бек бет Тхр А1їа Ре АТ лко
БК, 235 Зо
Рв їі Теробіа Тер о АТа Бех Уаі Аку ББе обБех Тур Мем бех бей Мей 305 315 з БЕ) чаї Рхо БчЧе чаї бій Тер о РНе узі пі їй беж бко ТвБх Уві тТЕбБ о беш 355 330 335
Бек чаї Сіу Пей бек Аке Туг Уві Аїа Акц Бом ех бах то Бех Аа 340 345 350 вв тт Ави тує Бій нів біу ТНК оМаб ПІВ Авроцей) Мів дер бег о Сув
ЗБ Зо 31655 бек АкУ АБИ Пец Тук Уаї Єву Бей Бем оБбед бес Ту Був ТИХ Епе бду 373 315 зво
Вч пуво'ївуи Нів ей тує Беж Нів о рКО їз ті Бей 515 вВде АкУ цу з5 380 35 аз
Ііїш рко Мей піу уаї Сбіу ем бах Вго ре Пец гей дів біб ре Тк 405 410 ду ех Аіа її Сув бек Уві Маї Аку дка АТа Бе Рго ів Сув Бей лід 380 425 130
Ере бек тує Мес Ав ово Маї Узі Бей 01 Аза був Зак Уаї іп нів «35 340 445
Мей сім бек Бей ре Тік БЗеї тТ1іе тТНх Ав Бе Сей бе бек Бей сіу 452 45 450
Ії Ні їй АБИ Бко Авп бує Тркогув Ата Ткр Сіу тук беж Пец Ав 85 479 аа 480 пе мес б1Уу ТтТук уаї ГТе сТу Бех ттр о зіу Твк реп о ркго бій З1й нів 485 аз0 435 тіе уаї бів бує Гео був бів Сук Ба Акд му Пва ро Уді Ава Аг 5а5 50
Рко Т1е АвротТкр цув маї Сув біп Акта Тіжв Мі Сіу цед Пем бОїЖ БНе
ІБ 529 За5 аіа Аїа рт пе тТнх озій Сув 01у Тух Рій Аза беб ме рус ей тут
ЗУ 35 зай
А1а був ті біп іа Був пів Аза Бде Ту Ра бек о Рхо Ток о Тук Був 545 БО 585 БО
Атїа Ра Пец Сув Туз ЗіБ ЗБ РБе осі Аза беж ба1ї бій ва дей ех 565 57о 5 пе реп го Бек АБровне Рца ВЕБ Сех оуаї Ака АБв Гей цез АБрОТВЕ 80 55 за віза беж о Аїа без тукоАкУу біз Віа тва м бат Бро біз МІ Сув дек
ЗА оо БО5
РБко Ніє Ніз Так Аїа їв дЕчЧ осСіп Аіа тіє без Сув ТхробіУ біо їх 618 вія вий
Мет дв бе діа Тих Стр уяі сту Бех дво ву 010 Аврорхо Аза бет 6525 630 ві5 ако
АхЯ піз пбех Маї баї бас Тук уа1ї Аа Маї вл оМеб сту рес; пув 116 ва5 550 655
Ака зЗіп о їец Печ осгср рве нів Ті Беж Сув Пец Тптх РБе о сБу Ахе бій о ба 57
Тв уаї бец сій тух рей уві бек рБа біу баї тТкроїїв Ату ТЕ РІО
БВ 89 585
РЕ Аіа тТук лк Бгто РБко АєпоАта Рхо т1іе ей бер так обем вхо БІВ 839 85 7230
Твк Тако уаі таї Ак Ак ака Зіу Ахе беї рко Акт Ага Ага Ні Бец т55 7718 715 ля бех їец Ата сіу пеб Ве уві був віз Ре о бет бБеї АЗїа 515 Біо ДБ та5 7309 735
Віа Нівсбівп уві цес Руо руд Маї дез нів ув Ага ТВк тез обіу Бей тай АБ 755о бек Аіа Мебс бе отих ТВк АвБроцєй ЗІЗ АТа Тух Биє ув Ар о Сув Бей 755 7655 755
Бае пцув АБЕо б тр осЇ) ота Бе; опіу біз біз нів Діво Нів Нів Нів НВ рик 775 тво «пі» 107 «211 пай киїй» БІЛОК «й13з Штучна «ВВ -й3ж синтетична консторукиія 40» 105 мес Аза вро зі Аза рго біб Тур о Ав бек ТК ОоА1а пен Нівосій Аїд ї 5 Та і5
Ппей пеб АБ ого Ах аз дЕз оту ей тТук о біе Рхо діа с1у біу ВЕ
В дБ 30
Бек Зек Б1у Тіх Уві Авп РКО таї Рео Тйк ТІ АТа бек Рко от1а Бех 33 40 «5
Беж ї11е ре) бек був тах с1у Авр о вБко Уві Бо ДЕЙ Меж св АБИ тах 5О 55 60
Тис бех сСьу РБес ри йіу вгОо Беч реа уві тен бів Аза біу РБе Ре 55 70 73 о їжа пев Так оАжу ї1е їю Тву Її1е Ро бів бек под Авр обЗак ТкКр жур
ВЕ зо 55
ТЕ бек опец йви Бе бей їїу ОТу тТБж рко Уві Су Бей 1у біл АБИ 100 То5 115 чех сій Зак Рхо Те Бек АБО ків бек Кко тро Бех Суя РЕО рко тМ1е 115 1759 їх5
Сув вто З1Уу Туг зкя Тер Мек Сує пев Ако Ах Рне їі 11е Ре Гею 130 135 тай вве о тіе їси їж Тей Сув Пец їїе Бе бе) без Уві їй тен дво» тує 145 150 155 ї60 сип о аіу Меб їв рго Уві Сув Ро Бед їв бо СіуУ Тк бек о тТнк ле 165 170 175 бЄсх ТЕ сіу Ро Сув Гуз ТВх Сув Тс Ії Бко діа піп біу Тр обет 180 т85 180 мес Ре ро бекосСув Сув Суб ТВ БУЄ ро 55 Авр о піу Ави Су ТНПУ 195 2 205
Сув діє Вто її2е рко Бест бсу ТтроАїа Бе Аїа йкд РНе би Ткр Піх 10 215 о
Ткв ліва бек Уаї дкч БНе Євек Тур Пед бек ей Бе) чаї руоз Рпе уві 25 230 2135 г)
Зіп тер Ріє Уаї щі Ге) бек руо ТБ Заї Тер Гей бек уві біу Пец 250 252 беж Акшостух Заї діа АкаЩ пей беж бве ТУвЕ Бек Ага Ап 118 зви тує 26 5 та бій Нів б1іу Тпжх Меб біп АБО їй нів АвБробет Сув Бек АкКу дво їеу 275 280 285
Тук Маї Бек Цей ел Сей Бей Тук цуз Тау де Оіу йха Пув тей Нів 230 295 390
Іва тук Бек Нів Рко їз ї1іе БеО0 Ту Ре оду Буш БТБе ре Ме Ту 305 зІй 315 32а чаї зву пей Чек ЕКО ЕБа пен Пе) АтБТа бій Нео тк Бек Аіїва сіє Су 225 335 зх дех баї уаї Аг ду дів Ре рго Нія Су ред Аїа Ре бек отук Мекг за 345 зво
АБр о Авр о Ууаі уйі без бі Азїа Був Бек ущі бід Нів Тео біз бек Бей 3558 350 355
Раз отТвЕ бек тІтТе Тк Ав вне о бей бе беж Бей бім Гі Ні ред дви 70 375 зва
Рхкб АБ Був ТК Гу Аку Ткробїу ук Беж їй Днй Ре Ме сту Тут з85 390 355 300 7аї тів ву бБетг тр бі Тах Бей орто бін сіз нів Тіе уафобіа ГБує 805 ато 215 пев їж бі Суд РНе Ася бух їв ро Уві АБ АкУ Бго ті Авротхр я 425 4зо їув Хафі Суя бій о Ата І1е уві сіу Пе рев сім Ре АтТа Ата Ро Ве 135 449 445 тТвВжх ів о сСув бі Тук Бо АтТа реа Меб Ро цем Ту Аза сСув її-е бій ахО 455 260 діа цу Сів Аїа пе Трт о Бре бек Ехо ТК оОТук Був Аїва Же їза Сув 455 70 475 480 пуд піп бім Ре зі Аза Єву чаї бій гли Срец Беж впе о їа Рхо Бех
АВ 93 за вро ве ре Его бег Уві АкФ Авр ей опа АвроТаК Афа бек Аїіа Бей 500 вп Іо
Тут дка бід іа бец осі) бах бко ЗІ нів СУв бех Фко Нія Ні ТОЖ
520 БАЗ
Аіа бе Акоа біз іа Сів це Сує хр о біу БШІЯ Тед МеЄ Ар Преп лЛіа
ІЙ 5335 40
Тв о тЕВ таї бі За АБИ ББи ОЗ Авровто Аа Бех Ажо ба Тева хаї 550 ноз во чаї Зеї Тух чаї д«о Уаї АБИ Меї сІіу їз Був ті Аж 31 Бей Бед 365 57 в
Ттр Вре пів їі бвт Суз бец ТБж Ре бЗіу два біо Тиг уді Без обій 5ВО ЗВ 5ЗО
Тук пеи чаї Бек Ре цім Уа) Тер Ті6 Аха Ту Рго Рто діа Тут АкФ дав СТО БО хо рко Авй о Ата Бго т1ісє бе беж ТБЕ Пец вто Зі тре о тБжЖ Уві Мах 510 15 вао дхч Ака Ака сіу Агу Бех РкЕз о АкУ Агу Арч Ні ів бек Те Акч біу вай 53 5 540 рем Ре уаї буя діа ре бек Бек діа йіу Ро Ав Аїа Ні біп Уві
Бая 550 5 реф Рго 1ув Уві цез нів Був дк Твж цем обіу дей Бек Аїа Ма Бек
Бо 6653 57О
Тахо ТВу днрообєц бій А1Та Тує ре Був о Авв Су Бен о Ббпе бує АвротТкр. 67 580 65
Зі стій рей БіУу 01 бій Нів нів НІВ НІВ Пів ів 90 55 тов «53102 103 «11 Я «19» Білок «КіЗв Штучна «ВК «йй3» сСивтетичзний пептид «40бй» 103 сту Тут нів бБіУу Бек бек пепотує ї 5
«10 104 «їж В «Мих Білою і «213» Штучна «вих «ді» сСмитетичний пептид «400» 105
Має ЗУ йва Був Брав АхФЯ сій пе ї ї -й305 195 «каві 767 кота» БІЛОК хаї3» Штучна «рах «Зм Синтетична кочструкція «Аа» 105
Мек Авр о їїе АБр о Бго тую Був ос сій Ре ЗіУу Аїа те уаї сіа без Бе ї З 19 15 бЗеїт Ре цей оРко чех Авр Ре српе Рго бек Маї Акт Аяв сей ей АБО 20 5 30 тп о АЇа Бест Аіїа пе) ТУкК Аку біз Аїа пец бій беж Рке бій НівосСув 45 40 45 бек рко нів нія ти Аза Бей ха сій Аза дл1ле рей Суд тТЕрожву с 30 Кс. 5о їеу о Меб тТргоБеп А1а Тх ТтТгроуді Сіу Ап оздБВ Бен 01 АвроБко Аза 55 79 ТО во
Бек оаха Авр Тем Уаї Уаї Авип Туг Уаї Авмл уаї Ави Ме с0іУу ем Був
ЗО 95
ТТе Ак біп Бем пез Тур РБе Нів ІТ Бек Сув Гезо Тах Ре Лу Аха 103 ї65 т36 піз тк Ууаї Тео бій тую пе Уаї бех ре біб уві Ткроїі1іе Аг ств
ТЕ В Ми вто рРхо Аза Тук Ака ко Рго Аа Аза то Т1е Мед Бек Тато цей Рго
ІЗ) 135 380
Сім тпх твЕ уві уві Ач Ач вка Му Акт обБек РЕО Ага дієт Ака ТВЕ тАВ 155 155 тка вто беу Ро Акт Аку Ака Акоа Бех біп бех рхо АкЯ Ару Ако Ахо Бек 155 їі7а 178
Му бек вкУ ст) ет біп Сув Меб Сі бем Ре ів Пец Суб Бен І1е 185 Т85 150 тів бохо сСув бек о Сув рго Тбк уві бій Віа Чех Був Бей був ем сіу 1985 730 205 тЕвр оре) тТкробіу Мей Ар Т1Те АБо Ро тук опув З1) Бе 01у Ата ств 219 215 по уаї зії це) рей бек Ріє рец Рго бек ЗБ Ре Ре Рхо беж Уаії Аху 225 239 235 2595
Ав ої) цей АБО ТВ оАЛіа Аїа лів їй Тує Ака біз Ара Бей СТО бек 250 255 ве З1а нів Сув бек РКО Нів ів Тк оАза Бей о АКо біт діа ті реч
Б) Б 270
Суб Тхр СТУ сб ге Мебє тих бе Аїа Тв тТко аз зву Ави дай о Бец 5 з8о 285 бі йЕроБро АТа бек Аку АБроцей аз уУкі Аби о Туї уві Ап оУві Ай ивО 295 запо
Мас П1у рем Гув 1іе Ах бів Пен лей Тер РБе Нів ЇТїе Бек був Пех 308 310 315 32 тах Ре сіу Ак бі тру маї гей сій тує пе УВІ бек о Бпе бІіУу Уві
З85 зо за
Тр шіе дкЗ3 Тих РКО Рго дІз Тук Зк Ро вКкосАвБаА А1з Вго 118 Бей зо 345 ї5О ву Тк оїва рко Зі ТВу Тк уві таї йху да Аа пі Ахо бр ро зв5 зво 165
Аква Ахеа АкКУ Тих вхо бес о Ето АК Ага Зту Ага Бех по бот Рго АкФ
Зло 375 | ї8о го птч вка ах біб б Аз об бек біп Су Мебє Авшо тів Аврорко 355 З) ЗУ дпа тух їв Із ВНе с1у Афв Твж Уаї ія бен без беж Ве їед рКо Бах 405 10 415 дво оБВе ве ра бек о уаї Ак АБ о Оеоа 120 Ар тах Аза беб АТ ей 420 125 430
Тув Ака пім Аів пев ОЇ бех охо бі Нів Суб беї Рус Нід НІВ ТБЕ 455 о дах
Віа Та зго бів АТа Ті Пес; Сув Тер о піу біз Без Меї вп огє) діа 455 355 460
ТВжІ Тер оМа1їі сіу Бех Авпоїео 015 Авр РЕо Аіа бек Ахкч бі Гей уді 455 ЗИ. щі о уві веж Тук Ууаії АБ Чаї Ави Меї сту без Ппув тів Аку бій Бей їєй 85 433 435
Ти Бре Нів ї1їз бек Суб Гей ТБ оРбе сіу Дка4 біб ТВ баї йейпссів
ВО о Іо
Жук би чаї Бех Ріш З1у Уаї Тв 318 АкКФ Ту Ро ро Аїа ТУХ Аго ме: ЗРО 5
Зхка ро Ап Аїа Рез ТТ фей бек оТпК ре); орто За ТВ ТвХ Уаї маї1
БЖ 535 за
Ах дк Ака Оіу ВкЯ бек оРко вкгу вах Аку ТВх о РгОо Бек БРго АкЯ4 Ако вІ5 ЗО 555 Зо вка дхч бек біп дек рко ака Аж Ата Ага Бех біп Бе; Аге сМлі БЕ
І вет І ЕКО) 575 зів о Сув Ме АБ о гієс Аврорхо тут щу о біц ВНе біу Ата Тк оМаї бі
ВП 55. ЗО
Пе ген бек оБпе без о Бко бек дво Бе Рре Рго бек Уаі Агя Ар Тем 585 оо 505
Тен АвротТвЕ Аіа Беж від Бей Тук ка СІЧ о АТча їз ОТ бек Бо 1 є10 515 629
Нів Суш йдек ро нів Нів тех діа рез аку йо оАїіа 18 ї-ц був Ттр 825 50 535 вки бі бра пей мес Тв бе діа Тнх То Уві сіу Уді Ави о пей із Авр 45 550 55
Его Авіа беїх Ат Бер о пей Мах маі пеж тує уаї Авт» оуазї дапоМеє Зі
БО БЕЗ 570
Бе Му вне Аа бій обей Пец тк бе Ні Ті чех був бео Тв о рНе
БВ. вва 585 піу ака ста Твх уаї їєа біз Тук їеб Маї бек РНеобіу Маї Тер о ї1е 530 595 700 ака вт о Бко Рхо Віа Тух Аха Рко ро Авп о АТа ро Її пейобек ТЕ ндоз тів 715 То пе сжхо іа тах тТнт Уаї Угі Ах Ака Ат п1У Ак Бак тго Ва Ах та 30 75 ага тих орко бек о Рто Ако Ато ВкЯ Аку Чек бів Беї Рко Агу Ако пу тав зав 750
Ако бек біп Бех Акоа БІ) вак біл Сув Ні Нів Ні Нів ів НЕ
Б тво 7655 «210» 196 «Рі» во «Ки ВІлЛОоЖ «гі» ШтУчнка «Ве «криз Синтетична конструкція «й» 106
Мет Аве отіє бр оРго Тук Був бі ЕБПе біу Авфа тах Мад би рем бемц 1 5 Мо 15 дет Впе Пер Руб Чек Авр о Ре пе Рхо ву Заі дДкч двроцев Бей Ар 25. 30 тато Аза Бех Аіїа рей ТУук дра сій Аза реж Сів Бек оркоа сіш снУЕ СУує 45 дар Бо НівБ Чі Тек Аза пез Аки обійп Аї1а ті гей Сув Тв бпіУу біц щи БВ во
Печ Мер ответ о їе»с Кіа Тк о Тхр Уві сіу Ав оавИ їжпоїро йврорхо АТа то 75 80
Бек та Авр о Бенц уві уза) АвпотТук уві Абвоу«їі Ав оМеб сіу Бей гГув 85 90 35 ті Ак бів рей Бей Тер впе нів Тіє Бак сувз Бец Тв: вне біу дку щу 125 113
Зі Тв Уві Гем бай тТук пен уві дек бе б1у чаї Тжкрог1іе бха ТЬХ 115 122 тЗ5 ко срго АТїа Тут Аку што рро АБ Аіа Бжо 16 реа бек ТЕБЕ Тем рко 130 135 140
Зіч тк Ток уза Уаї дто дкЧ Яга бСіу вто Зек ро АтаЧ вга да тн 145 ьо 135 150 рко Зек Вко Ак Акт дса Аква ех бів зек Рко Ак Ат ака дка бах 155 то 175
Туз бек АкУ 01 бах бБів Суш Мес Атїа АЛіа згЯ їез Тук Сув бій Пей 180 185 195
Авробек бек Аж Авроуві пев Сув цей Атоа Бкос уві біУу Аїа бід бБеб ї35 Зоо 295
Акт б1У Аа ВХ Без Бегобіу Рко Цен біу Ту бе бах бех Рго ех 215 215 о рко беж А18 Уві Рко дів АБО нів ОТу Аїв Ні Гей дек Мем йка б1іу 225 230 235 249 ва Бре чаї Су АТїа Це Бек беж А1й сіу Кеш був о Аза пе Ака вне 2а5 а5о 25а тв Зак А1а зкЯ був Ме біз тру Тих аї Ам Віз нів бід о тіє Без 250 дух йо
Вко пу о уві Мем Бі Ппуво Аку ТВх Гой біу йбенв о беж лід Меб бек ТНЕ та 380 в
ТпкЕк о АБробец ЗТ. йіа Тух Рів Суд АвроСув о бец вВпеобув дно ТурробІй 250 гав зо бій цем бі бі Спій тів Ахо Пед о іув За1і Рпє Узі Пезп біУу біу Сув 305 З1о 515 зло
Ахч Вів ув їв ба) сув дія Ро Кіз руб Сув Аа Ре Рце ТНК бе з25 33 335 віза Мебс Аєр її дер о Рко Ту був ЗМ РБе піу Аза Трж Уві іп сви зад 345 353 їв Бак Бе пен Рко бех Аврорре РНе Рко 5зек чаї Ак Ар о йем цей зва 365 двр о ТВх А1їа Бех Аза їйви ТуксАта 010 АТа пев бій дес Рко си Ніз 170 375 зво
Сув Бек орко нів Нів Ту Аїа пе Агу сліпі жіє рей Сув ТЕр ому
За 350 3958 400 пли пец мес Ашпоїей Аівз Тс оТЕе Ууаї ліу бер Двп оїєд Сбіц АБ вто о 30 815 діз бек йхо ЗТ ей уаї Уві беж Тут о уаі баб хаї Ави Меб сту пемй
АО 3425 430 ів їі Аку бій Бей пе Ткровбе Ні І1Є бек був Гей ТК о РНна біу 215 440 445
Ага бій Тк Уаї бе) СЛ Тух беп уві беж Ре сіу Уді Тер І112 лка 450 455 бе твкорго тб Аза Тук АкФо Рко Ро Ави А1а ро тів ба беж ТНЕ бе 255 аа 75 250
Ето сіз ле тп уві Маї Ага Абе Ах б1У Акта бек рус ДКЗ Ах Ах 485 до аа тв вто ех Гкб Акч АТО Вк аку Бек осів беї РКО АКОа сАКа Ак АКщ
ЗИ 5:О5 5І0 ех бів шех Ах січ бек біл Сув Ме іа Аїа дра рем оСув Сув бІ1д
Зі зва 5 тез вва ро діа Аку Ар оуаї це був Гей ака с рко май 01уУ тикобіх
БЕ) їв 52
Бех Аго спі» АкЧа ро Маі бетоажу Руб БпПе сім Тл оба беж шекорко з45 5 о 55 зва
Пежх діа Бех віза уві рро Аіа Бо Ні спі Аіа Нів лен Бек ем ВКФ 55 57 55 їж бе) Ре тТаї Сув вла Рре бек бек Аїа су Рко Смя Аза їн КУ 5аО ЗВУ Зао вве тк бек діа Ака Аха Меб сту Тву отву Збаії дво» Азїа нія бій Уві 55 ва 505
Пец Ро їшв Чаї Ббем о Нів ув Ака о Тапгоцва Зі Пец рРхОо Аїа Мес бек 510 БІВ 62О тве ТЕ двробео біц Аїа о тук рда був АБроСув Бец РБе був сАвр Тер 525 Кв) 635 БАЗ
Фі Січ цей біу Сі піо Ії2 дуФ іа Меб Ізїє ББе уаї їй бі1уУ ПТУ
АБ вв 655
Су дка Нів Був бен Уві Сув 5ех Рго Аза Ро був Ай о Впе ве тТвЕ
БО вв о
Зек Аза Нів Нів нів оні5 нів нів
БТ 580 «ро» 197 «вх 589 «в1йз Білок «а Штучка «й» «й» Синтетична конструкция «аОах 197
Ме сій То Аа бек тТвюк о АТа Бей нів о сіп Аза Бей їю Аврорко ху 1 5 10 ї5 уаї Акч сту Без Тук Бе вхо Аза пі» біу беї Бек беж біу Тах Маї и ря 30
Авиортс Уві Рко Тк То Аза бе Ро ЇТе бек бех Гібв о Ббсц бек Був
Тв сі Абр о вБко Уві Бго АБ омМек 10 Аа отТве тн бек с1у вне ід 5О 35 во зіу вхо гей їв оУуді Пец осів віз б1у Ра свБе їєц бе Твк аку їт1е 3 по 75 80 рей отпх тіє Рхо піп бек рез АБр обет ттр ТтКе ТИХ бах Гей Ап ОРЕ
ВУ 0 25 їез іу щу тк оРКО Уаї був ей О1у сій Ап обек бій бек Бко тТнЕ 150 05 115 зек йяй Ніє Бекорко Таж бек Сув Рко Ра Щіє Сов ОоркКо сіу ТУух дКО 115 Кг Ко - то Меї Сув без дху Ако Ве ї1е Т16 Ре Пец оре Х185 Беш ей Тед 150 135 156
Сув ївц І1із Боє рец лез мМаї йеч пев Авротут бій Сіу Меє бе) ро
Ме ї воОтТу Ку 145 150 155 150
Уві Сув Рро тео Че реко сі Твт о бБехє тТпх твкобек ТвЕ оку Рко Сув 155 170 175
Був ТЕЖ Сув Трг о ГІЗМе рЖо Азіа біп О1у Тнкозек о Меб Бе рко бек Сув 180 183 ї80 сув Сув Тпх Бу Рко бех АБр й1у АБО Сув ТЕ Сув Ії Рко ї1ї8 вко 195 200 205 цек бек о Ттв Атїа РНе Аза Акта Ре пе Тв оз Ттр Ма бек уві Аке ії 215 223
Епе Бек Тго їей бек цей їі Маі Рюо Бе хаї іп Тхр оре Уві сІ1у дз 230 235 240 цецобЗек Рго тих Уді ткр пе; бек Уві СІіу тез бек аа Тут Узі від 245 250 255 зкчЧ Бе) бек пех Анп о дсект Ах Тіє депоАбБа АБИ дбав о Тук зу Тлх Мет лео 55 27 спіпоавО їеви мів о АБробек Сук бек Аху Пій цез тТук Уві бет ей Мес
У 253 зв
Ге гемо ТУЮ Дуб ТЕЖ Тук біУ Ттр пу беои Нів Бей Тук бек о Нів Бго тів Уві Гей Сту Бе Ак ув Ті Бко Меб сіу Маф'б1у їєи бек о рко 305 10 315 зий пе пец бец діа сіп бе ТБ бек Біа Т1е Сув Беж 7аі Чаї зго ву зи 330 335
Аза Рчо рго Ні Сук Цей Аза Бре бЗех Бут Меб дар ойвв уаї Маї бен
БО за5 35 сіу Ага мув бек Уаії сій Нів ВкЧ сіл Бек оре) тТук ТвжЖ Аїа уаї ТЕ
ЗО 3655
Авип Ббіе їши Пец бву ей ссбу Ті Вів без йвй о рКо ВлпоГбувоїбх Цув 370 З во
Аха Теробіу уж Сех беб Авт Рре Мебє піу Тук Іі ї1е с1у Бек Тер з85 390 395 ща
З1у тих іє Ро сій АвронНів тів Ууаї бій Був лів Був Нів Сув Ре 405 ій 415
Аха Був пе) РКО УВК Ава о Аку ГЕО Те дев о тТхроБув маі Су сій АтУ ай 435 азо ї1е уаї щі цем Бей біу Ре Аза Аїяз Во РБе тих піп Сув П1у ТУук 435 440 445
Рто діа тїечп мес ро ї-а тТУук Аза Сув о тте бів Аїв був Зів Аїа Ве 4-0 455 4650
ТвкоБце Бек орто ТвЕотТуХ пуб Ата Вре пев беж був бій бій гне сту 155 о 175 480 діа дет туаї бі їм Бей Єех ве ге) ржо бе Авровйе пе Бо бек 485 485 95 чак вто Авр о їєц ей АБО отлаж Аіїз бек Аїв їша Ту дя сі» Аза Пей 5ой 505 ча зі Бек вко сви Нів ств обек Рко нів НівБ ТНК Аза пеи Агу сів о Аїа
ТІїе гей Су ТжроСьу бій рей Мей Ап Тен ойіа б гро Уа1і Є1у бех 530 зав 549
Авп іс бій АЗро ву АТа шех Аж о оій ї-а Маї Уа бек отут Уві Ав 545 50 555 550 уаі АБ Мебє злу Бей Су ЇТЛе ДЕ сій їз іти терор Нів Ті6сдех
З 570 575
Стев бен Тс о Рпе бі Ак біб Тнк Узі без біц Тухк без Уві Беж ре 50: 585 З90 сіу чаї ТЕвр о її Аку Тк рко Ко АтТа Ту дра рко Ко Ап АкБа ркао 595 вав 605 їїв пед Бек Так Гей РЕо Зі) Та осв оУуваї Уві Ако АкУ Ака б1у Ак
БІО ЕВ 20
Бек Ркго АлкКап Ахо дха нів рей бек їси лк сьу тех Бе уаї був АБа 830 535 БІО
Бпе бек бек Зіа бЗіу Рго Аби діа Ні Сіпй бТе Пен Рго пуб уаї їйев 6545 5532 55
Нів Був Акц Тк оїеи 01іу рей бек Аїа Меє Бех Тк Тлк Аве ей 1 або БУ ато йіа Тух РИ Туз дДвроСув Те) РБе Ббуя АББЮ Ттрр ліс; бій ан ОсТУ 01 75 685 685
Зіц «й 108 «8115 589 «й?» Білок «ій» Штучна «Ох «віх Синтетична конотрукцин «430» 3108
Ме За ТЕр АБ) Бект ТП Атїа Тез Ні З1й Аза пе Сей Аве гхо Ак ї З Ка 15
Чаї Ака біу це) Тух жа Руо АТа о біу ЗіУу Бек обБеву бех сбіу ТвВк о уві чі 28 39 аа РКО уві піп Тву ТНК АТа ще Еко ті бек бек ті їв Бек Гу 48
Тит оО1у АвроБхе Уві Рко АБа Меб При Акпої1е Аза бех сі вм пен
БІ с 5о сіу Рг їец цей Мазі їєр біз їв сту вве Вре бе бер Тв о Ака 115 й б 7о 75 ча тей тТнж гів ре сій бек о Бео Авробет Ткр о Ттр Твк Бех тез Авв рпе 85 за 35 їм БіУ сбіуУу Тк РКосмвВ1і Суд їй біу бі) АБ бву піп бегорко Те 03 5: 1 цех бек Нів Сек Рто Тк бак оСув Рко ко ї11е Сув вхо 1іу Тук Акщ 115 129 т25
Тер оМеє був пе) Ако Аа Сув Ії ІТе впе Бей рБе Її Бе Бей пех 130 135 140
Сук о бемй лів рн рей пед Узі пем ей бшротук сій зЗіу Ммек цей рРЕО 145 Ба 55 тва маії був ржо рей бео реко біу ТК Бех Так оТвк бе ТвВЕ бі Веб Ст 155 їто ї75
Пиво ТЕ осСув о Те отіє ро діа сл біУу Ту зак оМеє РОе Бгто Зех Сув ї8О 85 1930
Сув Сув Члк обу РКО Бех Аб5р о бБіУ Ав Сув Тр оСув ТІ с рко тів врЕо 195 200 295
Чет базах ТуроАзїа ре Аі Ага Рів пем о ТгробЗіч Тур А/а бек оУаії ко та 215 а внз Бех Тсроієй бех Пем ви Чаї Ріє ве бів Тетровреа Уа оіУ 225 230 235 І вай тей бек вхо ТВк Уві Ткр ги бех уа1їі біу без бех йхо тую Уаї Аза 235 50 255 дис іє Зек бетїт АбБп беє Акч їі 12 АБпонів СІЙ мів Ажа тТИйгєс Має 250 285 ато бій два ей нНіЗз АБи бек Сув Бех Ах АБ о беп туго Уві дет пей Мех та 2 яв
Меч іви Тух був ТртотТух біу Аха Був їжі Нів Гей Тук бех мів вБКО 230 шу За її х1е пезч бі Рце Аку буд 1ї9 біо Меб сіу Уді сіу ей бек їуо
З05 310 з: 329 вде пса г) Діва бів Бе Ту бек Ай1іа 112 Схув бех Хаї Уаї Ах Ка 325 Ж 335 та Рра ско нів Сув Бей Аза РБе беж Ту МебЄ Ар о АБроМаї Уві Пец з40 345 З50 сту два Пуко бек уді бію Ні Бей СТ) бек се) Тук Кіа АтТа ба1ї ТВ з55 зво 365 два Ре ївц Бен бек цей ді тіє нів цей дай Бто Ні Був Тв Був зт 315 зо
АхЯ Тер біу Тужг беж Грей Ав пе Ме сСіу тТук маї ї1іе Щ1Уу Сех тЕр
У 380 335 455
ЗІ1У ТЕ ей вто Зійосіш мів ї18 Уві бій ув іє Був Меб Сув БНе кдУ дта її15
Атч іш фей ржо Маї Ави Аха хо Ї1іе АввотТкро був Маії Сув Зій Ак 485 аз тів Уві сСіу ей Бей З1у Бне Аїа Алла Рко Бе тТнк бій Сув П1у Тух 435 240 па
Ів ові тей Мес рхо еп тук від Сув тіє біз Аїв був бій» лід рве а щ25 450
ЖВк ББе Бех Рго ТК отТує рув Аза вре Гей бЗех МПув біпобія Ве 1у 455 70 ат Во
Аїа бек Уві стій їши меш бек овце Бем РКО беж АБЮ Бе ре ро Єву. 485 90 35 чаї Вжа АБроїво Ба АБО тТВк о Аіа бек АТа ївча Тує Ак са дів бе
ОС З 310 січ Чех Бо 01 Нів СеУю Єву Бо Ніж Ні Те Аїа Бенц дкга біз лій - зі5 ЗжО за т15 їжи був ткробіу 010 Бей о Меї Авіпоїем бів ТВЕ Тто ув) біу Бех
У З3а5 ЩО дви Сех бій Аво хо Аїа чех йкз ба еи уаї Уді беж Тек оуаї два
ВІВ ЗО 555 550 таї вп о Меб біт бен їв о 1їів Ак Зір опе; Тед Ткр о Ре нів ї11е Бек 565 57 5
Сув ти ТВх Ре б1у Акта піз тож уаії Пец бій Тух без Маї бек рРпе 80 Ва ЗО сіу Уві тв ї13е Ак Трпг о Бко Рго Аїа Тут Ага гЕОо гро Ав Аїа РКФ вах БО 505
І1іє цеч шак ТБ еп Кто 01 тик оТВЕ Уаї баз вхо вка Вкч сту Ка
Ся віх БО
Зен рРюеш Аг дка аку Нів ев бек пезц АхУ біу Гей ре Уві Су Віа
Ба5 530 ваз 550 бе бек о бех Аїа Сіу ЕКО АвпоАзіа НіБ Ака АБ Гей во Був баї рей 545 за Ба
Нів Був Ат ЧЖВк Бей пі їм обех Ава Ме бек Тк так Ар опе 91
Ба бв5 570
А1з Тує Рве Пув дер о Сув Пен Рре Ппув Вер Тїхр сія Зіб Ім біу 014 68О ва
С: «210 їба «їж ад «іш» Білок «їй» Штучна «Й «йо» Сбичтетична ковструкція «4005 ОВ.
Меї СіпосткроАвйа Бек таж Ада пев нів шій А1їа Гей їжчі Аве ро СВУ ї в 16. 15 чаї вка біуУу пе» ТУух Ріє РКО Аїз бтіу ЗіУ веж бак бек соту ТВ охУаї а 5 30 «АвБІ. хо уаі Бхо ТІ ТвроАіа беж орто ГІресбек бек Т15 Бей Бех Був
За 40 АБ тве біУ Аврогто Маї Бко АБи Мекобімї дБ Так Три бек іу Бе Без піу Во тем рей уаії це) біп Аза цім бе Ре Пец ме) Так одкоа Т1е 55 70 75 Во
Пец Зйх ІТе Рко Пій Зек Пец оАво ех тр о Ткр бух Бех рей два РПЄ 85 90 а5 цей біу сіу тах Рго Уві Суб Бей Січ бій оАвдп Бех біп бек вко тих 1600 195 їха
Бек Авії пів бет Ро Тбипх бек Сув Бк Буре їі Св о бко пі Тукойхо 115 20 135 тів Ме сСує Дей зо Ах Бе Її їТів пе цей Рнеа її беш меш Гйей
Ії3О 135 її
Сув'бец їі вве реп пе уві рей Бей Дер Тут сої о біу Мек їй С рго 125 жо ї55 16 чаї Сув рРЕо іей цец Во ЗУ ТБ бек ТпЕ Тпк беж Тк осо1у рко Сув 1655 170 175
Був'тТвьк Смив ТвВг оїТ1е вто МЖва Оз біу Ту бек Меж Бе Еко бек був 180 185 190
Сув Сув Тс осув Бко Бек дар О1Уу АБИ Су Таж Су Т1і1в8 Бко ї1е рго 1935 200 205 бек Бак Тур Аіа Бпе с АЇВв дк де Бец Тер біз ТКр о АТасбех Мі Ак 2160 2ї5 220 вве Бех ТЕ Бей беж цей пеп ав Ро Рце маї біт тер оввВе Ууаї 51уУ ня 230 235. 249 їей бек рю тах Уві Тер оцей бек уаї ЗріУ рен бек Ата тук ТЕ Аїа 245 258 255
Ата іївем бек ошех ТВ Чек Ако Авт 1 Авт Тук піч ніш бі ти Ме
Ем БУ 270 б5іп Аврорец Нів АвроБех Сув'обає АкаФ о Авло бе; Тук ав бек рей їеу 273 Ва 25
Тез опи Тут пу Те огпе ЗУ Акб Був ти Мі Бей отут Бек ВІ РКО 235 Зоо ті Іїз рей біу вБре Аг Був їіе Рто Мес біу уаі СТУ Бе; Беї Ред 305 310 5 320 пе пепоіва Аїв сій Ре ТБкК бек дів її Су Свт Уаї та) Акта АкЯ 325 50 335 дів Епе ржо Нів Сув пен діа Ре бек Тук Меб АБюЮ Авро уві уві Тец
Бач 345 по ту Віа ув Звк баї Пі Ні песо бід бер ією Бре Так бек ів Тк 355 ЗЕ 365
АБ Бе іще бек Тез біу тієЄ нів ей о АБвіорко Або о Ппув ТАК Був зт 375 185
Аха стТЕв 01 тую Бек їец депо Ра Ме Оу ту Уа тів біу Зак то зв ке 355 00 біУу тиж депо орБхо сМл4а01З Ніз ї12 Уа1ї рем був Х1е ув біпоСув Рне 405 Бо) 415
Атшч Бук оївЧ гбто Узі Ап оАхад Рко Ті АвБротхроїув Маї Сув бів о АкУ 1250 425 430 їїе Мавї сту Бе дез Зі Бе Аїа Аїа охо Бе Ттапх Ота був біу Тук
Ух аа 144 фрто Аїа цеп Мек Рко іїва стук Аа Сув 112 Ота беж дув ій Аїа Ба 453 2255 БО тик о ВБе беж Бжхо Тих гук Бує ід о вБпе Пец Сує був біб Зі Ра 01у 455 7 275 вп
Аїа бех Маі сти їй2гУу їй ек Ба Бей Рго бак о АвроВве вне Рго бах 485 «50. 595 маї Акч АБр їз рей Авр о блх Аза Бех АтТа Пед стух Ажха біо іа цей
ЗО ру Бій
Іо Євк РкОо сіз Ні Сук бетг Ро Кіз Ніз Тахо Аіва їз вка бій Віа
ВЕБ БІО 525 ті схе) Су тптробіу сп1ів Мен Ме йо цем Аїа тТвж тЕроУаї бі бек
ЗО 5 ЗІ
Ави омем сія Бр о вБКОо АтТа Бех Ага сій Бей узі Ууаї бет Тук уві Авз
БІБ За З5У ЗВО чаї вва Мес сСьу Бей орув Т1іє ка бій цез пем Тхро вве нія ті 5вЕ
Б 5) зЗ'в
Сув рес Тах Ре б1у Ака ім тт уаі рез біз Тук пен уаі беж РНа
ЗО 585 за сіу аї Тер тіє Аху Так о Бхо Рхо дів Тухк Ак Бко Рез дві діа бко 95 ща Бо тїе пе) Зак тврк ред Бго Пій ТЕ ТВ оЗаї Ммві Аж вже вх Ту дк 818 15 520
Бек рес вх Ака АкчЧ о Мів еи беж Кец ВкЯ біу ши Еде Узі Суб Аїв
Би 533 15. 5ій
ЕБе бех бек А1іа щу Ро Ап АТ Нів б3) Маї Пец БРко бує Уві Гей
БУ 50 55 нів Був о Ако Так опе сОїу рей Бек Алла мес бек ТВ Тах Авробев ози ко БУ 570
АТа тує Ббе цув ДБр Суд о йвц де буд Ар о Тур обі бій Пе С1у бі ви ВО 685 о «510» 1) «7511» 89 «па» Білок «Ех Штучна «БИ «йИЗУ Синтетична ковструкція «400» 25
Меб бів Тер о Аво Бех Тих Аза цей мів 010 А183 бен Тем дар ро бо ї З 18 ше
Чаї жк зву без Тух ре Бто діа зЗрУ Біу Бех Зек Бек щу Тпу Уві до 25 30
АБаоБко Уаії Ро так пах о АТа ек го їі бет дек ЇРБе Бей бек був 459 25
Тих біу АБ руб уаї ро Ав Мас сом Ав Пе ТВ Бех су РЕ Бей 50 55 ва
Сухого бен їн уаі пен обій Аїа біу Рйе Бне тео бен Тв АДка 118 55 7 ТУ 30 гемо отТвк її Бко бій Бех Бей двр Бех ТІВ Тер Так обек Тем Авп Бе я5 90 з пен шіу єб1у Тих рко уві Су ем біу бій Ап ойШек 03п бек РЕо тах 00 105 115
Бех Аєп Ніз ех вого Тату бек Су срхо Рко її Сув РКО 01у тот АК 120 ї2У
Ткр меє Сув Пец да Ахоа Рпе Тіє Ізїє Рі Без Бе їїе ем ем Бей 150 1355 145
Сув'ьвни їзеа ре Гей Теп Уа йеа Мей АБ оту піп азу Меб рей орха 145 150 5 і59 чаї Сув Ро тей пев Руо Б1у ТЬх бег Таготи» бах Тк о біу РЕ Сув 155 ВК 175 пув їни Сув тБж 12 Бко Атла піп о З1іУ Трг Бех Меб не освто бек Сув 185 185 135 ув Сув Так опув5 ркб бек Авр осі Ава був ТНу Сув 116 Бко її рго 1935 290 205
Жет Бех Тр о Мм1а ав АТа Ака Ре Тен Тер о Сд Ткр Аїв дек Уві до 219 215 МО
Ре Бек тТтр о зе бек рей Ов; Ммаї ро Бе оуві ств тТтвоввБа уві у й З 255 ло цей бек Ро так оуві тТетропец бех Ма) йпіу с дей бек Ак Тук уві Аїа 245 ДЗЗ 255 вка Без беж век АБ рег о дк т1іс БЕпе Аве нів сілоців сту ТВ мекв
Бо 55 ТО піп оАБп Гей нів Авро Бек Сує Бек Але Авпоїти Тук о уві дет Бей Гей ах зво зва пек оїви Тук бій тох вра піу йту Сув без Вів їй тує бех Нів РКО 220. 25У 00 їїе тів пей б1іФ ре Ах був 1 Рко мес Му чаї З1у пед бек вто 355 310 35 зва
Епе реа мезо ліва бід ББе тах бек Атїа ті Сує бу Ууаії Мваі Аха Ак за5 339 Бо діа Рбе ро Ні Сує Цеш АТа Ббе бсу Тух Меб АБ? оАвр о Маї Уві ем 40 345 50 сту Аза цув Бех Уаї Збій о Нів Пе Сіш бех рем Ре Тк Віа уві тТвк 155 зо 255 дев вне Пецсотец бек ред Сі тів Ні дей дви сВко АБИ ТМ ЖЕК ув
Я) а зва
ДАха Ткр біу Тук бек Це) Нів Ре Меб Сіу Тук 781 ї12е й1у Суя Тут 385 350 295 430 зі Бек Бей ра біз АвронНів діє ті6 сів Був ї2е був бів Сув рре ап А 15
Ажа Гу рем Ркй Уа1і Аво Ак Буб Те аБроїут. цУво уві Сув ШКО АК 26 125 438
Тіє Уві Сі Шен пез біУу Рпе Аїа діа рко Бе ТЕ піп Сув Ту Тут 435 ї48а 445 вхо Азїа рем Ме Бо це отух Аїа Су Т1е біп бе Бук обіп дів вве 450 455. 460 тих РНе Бек рко ТВвХ тТук Сув Аза Бае Бей Сживобув ОТ бій Рпе Ту ев Ал ї75 480
Віа бат Уаї Сію рем цем ех бде Бей Ро бек двр Бпае Бе Рхо Єву 488 880 55 чав Ажоа Аве їєю їм о Авр о Тих ата бет АТЯа рев тух ато бі Аїа пПей запа 505 І
ЗМз Бек РКО 13 Ніє Су бат Рго Вів Нів вк о Ата без АДку 15 діа
БИЙ в
І1е Пез Су Тер осСіу Сі бей Мес Ап опем Аза ТВу Тез Уві 01іу бе 53О 535 54
Авап цеч 01 АБО Ркос дів бек вка ій пе; Уаї Узі бех Тух Уві дет 545 Ва 525 вЕо
Ууакї Ат Мес біу Пез бує її Акт сій Пец Ббем Тхр вде нів тІ1іе бек
За То 78
Сув Бей Те рве спіУ Ага б тн узі бе га туї Пец туаї бек бре
ЗО ВВ 580 сіу чаї Тв о Зі АжУ ТИ Ркосогко Аіа ТукоАкуа РКО вго Ап оАта вто 595 Боб 605
ТТ пе бет Тато Бей брто біз то Тк Мад уві Ах Ага Аа О1У дхй то 515 620 дек реко вхо Агу Ага Нія реа беж без АжЯ біу їй Ре стуа1ї Суво'Аїа 825 З 35 40
Брпе о бех бек діа сСіУ Рго два Аіз МНів біп Рпе їй Ро Ппувоущі цей 645 е50 435
Ні Був о Ахо Тк пей бі реш бек А1а Ме бек Тіт ТБ Авр рез ій
БО 5855 Б віа тую пе був АБЮБ був Бей Ре їув о АБр о Тхр біз Сіп без ЗУ 1 5УЗ е8О 85
Сів «910 111 «1їз 1808 «-З1Тив пНК «13» ПптучнаА «их «ай» Синтетична конструкція «вх «бі тО5 «з3й5 137р..177Т8) кара 1 лавсссцсса сосвксодусста сузопсассв астачс сбча зак сЯа сс ссСя вад пд сіУу спаму тТхо бек бек гла пса воз зай оч ака зас аса ас ста пек ЯКЕ ссродаєс сова сво па 107 вко Ака пув сіУу Меб піу Тис оАву Гей бек Уа) Ро дай Бу Гецп опіу
Іо 15 35 їБс о бЕс сса дає сас сва сб дає сса са ССС за дса вас обБеб ває ІБ
Ре Бпе Бгто лавр оНів біз бен АБр орто Аїа Рре біу Аїа Аа бйеїх деп аз 350 315 вас сса час баз дає бесоазве особ ато зач дає саєс Єчеф соб отлдав зчеа 198
Ави рко зворот АБр ве Авп орто ї1їє Ту двр оНів лЛероркго стій діа «5 50 вас сав чо сда ску ча Фев СЕ ядУє сса дає ко ас сов сса сає 245
Ав Зі хаї Зіу туаї зву Аіа Ве бІ1Уу Бо Шіу Бе ТВкорко Рхо нів
За 0 5 70
Зла зош пса сс св о гоеч аз сова сва ас слав зав ас ста ваесоасте 254 спіу шщіу Маі рей сіу тТср бек Рго біб іа пів бі тіе Бе твою
З ва вх чи са ст чо соб стос соб де сса асо зас ада сва бої Зуб взуа З4й туаї рго діва уаі Рхо Рко Бко Аів бек ТАК дБб Ат бій дет О1Уу дк
Зо 5 109 бза бос зба ссасаро св осот сса сб вза час бе сабо ссс сад са 30 сів Бко Тих РТО л1іе бех Ро Ргб еп зт Авр о Зех Нів Руб бійоАза 105 ша 175 ак свза сло авас їса всб озос брс саб сва зсб5 сбч ся чає ссе аза 38 мак бід Тр лБп бек ТВУ Так Ре нів бі та Бей бе; АБрорКко Аке 128 125 130
ЗЕ ача зуб ся сабо сс сся зсЄ сс да ба Бер веб сз абс сЧкя ав
Уві дка ші Бей Тук РБе ко Аїа сСіу сзіу бес пек Бек біу Тит Уві 135 140 14 ї5о зак спа ча сої асї аса прис сб ста абс зас со зіє са аа ва 53
Ав рко уаї фФго ТК ОТвк Аїіа бак орто тів бек дек Тіе бек бек Ха 155 150 ї65 асЕ дує щас сс оЗос сса ває ас даяа вай асо аса беб оуа с ока 5 тТвк біж АБр Бко іа Рго АБв Меб біс двпохіе ТЕ Бек біу Бре бе 179 175 чо чоч са Босха зс ста саа чес ач ово со ста сс вої ала зе -вщЩ3о
Зіу Бхо цез без Уді цецщ бів Аза сі Бе ре пецз Беб Так оба Т1є 185 іч ТЕ з ас аб сса сач аз ста час сесоєсЯ ач восовзас ста авас бро В їшєо. тВх тів рко іа бек цей Авробеж тр тур тат бек бец Авт Ре 200 25 210 са зах дос о їос пса аса бас сс дае саа аас соб сач сб ссасаса тав цец біу БЗіу бБев Бко Тк оСув Ра біу бі) АзпоБбев сій Бек Рге Тк
Тх 220 25 20 вс вай осво сб сер о асе бса бує сля ссво аб ся сс Зо Касова та бет Ай Мі Бек ро ТЛ беї Суб Бо Бо І11і6 Сув Рко бі тТУуК Ах 235 а тах таз аб азс ско Заа ва се вес ас Сес се Кс ва са вра соя 8
Ткр МеЄ Сує цей Ак Ат Ре 119 116 Ре Гей РНе їі ей ром грец 255 260
ЕЧОС сс абв бос сса ст очба Єба са себ бас сайв соч або ск сої вто був рен Її Рде їед Бец уві а Пец Аврю Тух Зі діУу Ме еп орто
БО 279 2175 чес ус сса б ско се оч агу вче додовсв сег вс оче ста бас 18 чі Су рю рей Без РгО 5іу НЕ БЕХ ТБуУ ТК бек Так осіу Вко Суб й за о ава всв кас асо ва ссв ус сва зас вса пзує абе в сов о сос ва 86
Тїув Так осСув ТЕ Хі Ркб АЗіа біп о іу ТВ о бех Мек Ре рко бак Су 300 05 ки, її бас овса вва сса бес заї сс вас бус васа бас ав ссва вбвосса 5014
Су Сув Трх Був Руо Бех сАвр 01ж АБ оСув Тс Сув Іі Рко тТ1іє їко 315 320 325
Б сса сад чес со чес се оз ста сю даа Соч ес баса вда 16942
Зак Бек стр АТа бпе АТїа Ака Ре ва Ткрозіз Тжр о віа Єву Уаї дид за 335 здо
Ес сс де ска Єса бо Ста спро сбса СЕ оба сва са СЕ оба да 1115
Рває бек тТсробем бек це) Бей Заї Рко РОе аз бів тю Бпе о уві Їх 345 359 355
Ева їссосса асс чес баз Ба беб зба ага об ас асо без таб вад 1555 цей бек о Ркго Тих Маї Ттр о цеж бек Уаї Ті сТкр о Мес Меб Ттр Ту Ткр 35 355 70
ЩЕ спа зас Са кає Сса зе аск сов сс СС ас серб сру сб сов тов іуУу Бхо бек Пец отТук бек оті: Ууаг об5еє Руб Рпе їі рро Бем це РКО 375 350 385 12980 асс сс ж ос вс кс гая ас бас ас дассавс дає соб бас зад чад та
Хе жвпе Риеа Суб Пе Тхв уві Тук тТтїе вер К1іе АБр обо Тук Був Та з95 Сан 05
ЕЄ спас че асе ас чад сга сса бос єхЕ сжа бсс обоє дас СЕ со 1305
Бр піУу іа тиж Ууаї ТЯ ей їв) бек Бе Та рко бек Аве» РБе ВНе
С 215 ий соб хе збо вача чає соб сс чає асб се боб Фобоса бас ода дав ї35О
Бкє бек Уаі Вку Авр оГея пед АвкоТнх Аїд бек вій їжа Тух ду би ал5 375 235
Щек бу чЧеаз са сса сдава гаї баб Ста сс сСар сах всс олчос ка ада ї1з88
Аїв тей бБ10й дек рус о1й Вів Сув Бет РО Нія нів Тит АтТа цей пт 340 а5 350 сав чса вс оса срає а час ча їсїа ас вас ста чса аса са З 1446 бій Аза ів рес сСув Тор СІУ бій пез МОЄ Ав опеч Віа Тк ТкЕр Уві 455 6 26558 ЕК час сс оавї ге дЧаз пає сбса пса сс овазча са са ча З ад гає. 14954 сіу бек Авп о пей біц ввроБкоО Аїа Зак Ака біз гей узі Уяі Бежт ТУЮ
З 450 4 со ваї чес вас абз дес ска зав абс аа саз са сеї де Ес са ха чві Ап оуаї йдо Меї сіу Пец був її Ак біп їм о їем Тур Бпа Нів 459 295 500 ай се СБ сід аса сс суб аса зав вса чес оба дай баб о ссс се 1590
Тіє бек Суз Її Так РОе піу Вк Сім Твх Уві без бій Тук Бей Майї
З05 15 ЗІ ач Кб аа Чеа Бо абс вод зоб ссв сов зсс бас аа сса се ває 1535 вех ре сіу Узі Тжр тТ1е Ако Тато рко Бго вів Тук Ак Бо Бо авіа
БІЙ во У
Зса пса ва сбу бсв'всс со сов ча аса ас о ЧІ аг ас вав ї586
Ліва Бко 118 Сец бек отТвЕ беб о рхо са ТБ тах уві Уйі Аху Ага су 535 ап 54 5 ча вца се осесї саЄ суб ачза вос осса сої сов аза сча азч адуа тва 1734 біу Ака ех Еко Акоа Ак Ах тах рез бек Рко Ак Ато ВхЯ Ака беу 5а5 хво за5 саа а соб вача сца бас аа Сес сав сб ауа чад поеб саа бух Тут бі беж о рко Ажо вхо Акч зх бех Сіп бек Ага бі Бек бік Сує 57 ла НО сапсаєссасс ассассассв зоасозосус 1808 «вій» 112 «вї12: 8581 «йі1й» БІЛОК «В» штучна «Ве «д»3» Синтатична конструкцкя «4005 519 слру З1У хе бах Бек Був РБЕо АкФб Буд ПіУу Меї спіу ТБЕ Авпоїец бер ї х 10 х5 уаі ко два рРхо Бей біу не ЗдДе Ркго йвр о Нів Сіпойєц АБр о Рко д3а 20 ре за вве біу Аіїа ба о беву Аа Зв РКО Вяр о ТК Ар вне вда рко стіє пув 35 А 48 авроКів Туворто бій А1а АшВ Ота туаї Біу чаї 51у Аіа рве біу реко во 55 5О
Сіу РцеЕ ТЕ ро Кто Вів Сіу 01у Уві рей бі Ткр век Бхо біб дів о 7В 8 стій ос1іу тт Оеа тих тТвк уаї рРкЕо Аза оаі рхо вхо ро АїТа бек ТУ чо я
Аве Акта іп бак пі Акуспій РжоО тру вто пре баг ово гІб їм АК
100 ї95 110 йнвробех Нів вто бій Аїа Ме бій Тер. АБ бах Тру Ту Бе Нав ос1о 115 150 125
Аїа бе лет бо Рко Аку уаії ака біу беп Тук РНЕ Рко А1іаз бі Сб1У 130 135 150 бек бек бех (1у Так аії Авл Бгто Уаї ро Тк о тТНу аіа бек Руо їїа 145 159 155 їкО
Єви Бек їі Бе бек Аа ТпкКкосіу двроРко Аза Рго АшпоМеє га дво ї5 іо 175
Їїе тне бак 01у ре без б1у Вко це бев уві пе бів Аїа піу вве 180 185 180
Ре цей Тем ТВІ Джо її бе Тк о ЇТ2 рко іп дех Гей Авр о бЗет Тур їз5 200 205 ттв тк обек де Ап оРпе Бей біу пі бак ож ТЖ Суво орто Зіу бій 219 ал 220
Аа Бет іп йег Рко Тпх бак оАБИ Нів ЯЄех вБКо Тк бек Сув Его рРІй 28 230 2353 аа ті сСув бхо Зі стук Акта ттв Меб Сув оце: Ака Ака Раз лів ч11е рве 245 250 255 ем о Ббе де без реф орви Су Мер та вле пев бен ув) тей їжк дер 26 з55 27
Жук біп сік Мебсїем хо баії Су Вксо Бе це) Ро Біу Тбу бек Твр
В ВИ 25
ТЕ Шех ТИ ОТу Бко був Був Тр Сув їде ліе го вій біл Сіу ТЕ 230 595 300 век Ме Ріе ро беж Сув Сбуз Су Ту рев ржо бета о піу Вп Су зо 310 ЕК 350
Три о Суш Іі РКО 11іє Бро бек Бек Ттр Аій рпєе діа дку Ббвосем То 325 336 355 бій Тгтр Азіа Бех Уві Ак раз беж ТЕр Ге» Бек Ппем бец аз! Рюкз Ре 216 345 350 чаї бій стгр Ра суві у Пец пек ржо Те Уаї Ткрієвєї Бак Уві Ії 135 1650 365 тхр МесС Мес Ттр Тух тур осгу Бо бер дея Тух Бех їтТє Уві Беж різ
Зо 375 зв
Ве тів рРтш їевип Іечя РхоО ті це РБе Сув ої бкроМаі тек Ті двр з за 95 зба
Те Авроруо Ту був обіш Ре сіу Аїа ТВк о Уаї спі пе Бей пак РБе 405 410 415 ей Бко бек АБр рпе ве ро бек Уві АхЯ АБропец пей Аве СтНЕ віз 4425 425 430 вк віа бен тую Акт біз діа ей бфц бек Рко 010 Ніє Суб бек Бхе пів 145 245
Нік Нів тТаеж Аа гей Аахоа пів Аза Ті ей Сує Тер обіу бій пей Меб
БО «55 АБО вАвпоїям Атїа Тв отгв оуаї спіу бек Ава Без О10 Ав орко Аза Бек ва 465 то а зво
Зі пе уаї Маї бек Тук Улі Аєт уаї АвпоМеє с1у пец пу Ті до 85. ЗО 255 сіп рей сіє Тв РИ Нів їїе беж був Пеюй ТЕ оРне зіу Ак бі ТЕ за 55 БІВ чаї рей ліз Тук лем уаї бек Бе сіу Ууді Тхр о тіе дкУу Таг РКО ро зі БУ) заз
Алта тк с Аж рКо ЕКО АБО Аа вус: її Без бек ТК гер овгОо пр Тих за за 54
Твк Уві Уаі йкчЧ Акта Акоч біуУу Аг Бех Ро Ар Акса Ака Тож рко дек 545 БО 55 5 ро Ага вкФ АКо АКа бек обій Сех Ро за ВК Акч Акч Бе біпобяатє
ЗО З
АкчЧ іч Бех біп о Сув
«ІМ 13 «ВЕ» 1808 «713» ДНК «Ві» Штучно. «й «ВИЗ» Синсевуйчна кКопстрикикя «ред «дії СБ киш 37): 78 «ай 113 павесксоусса ссавсочссца сдазасасса ассзус оуа чав од пса ад аах 5
Зі Бі ткр Бек беж був 1 5 ссб азз ваа пої абу зув аск оавс сба сс очдос соб дас ось ос дод Іч02
Ро Ач їув біУу Меб Біу тат ЗБпоїев бех Уаі Рро АБ Его Пен о біу 16 15 тв бос ЄсЕ чяб сас сва соа ча бса ясї вс вач сс ваї зує чай Зо
Бпе обра бро Аввонів бій Бей о Аво БЕо Аів реє Був Аїа дЕп о бек БІ
За ав се час бач дає Єбс вас ста сво дая паб вав без стса час чес 138
Два рко Авротів Авроїта Авп о Бко Ні ГбувосАвюЮ Ап о Ттрорко біз Ата
ЗВ) ЕІ За зас сад яба зчос че Чад осо сс шос сса зас Ес ас ста сса са 225
Вей бій уУаї Бі таї 01у Аїва пе О1іу РКо 01іу Бе Твк о рко Бро Нів ва 85 7о чує ад ста ско За суч са сса сала Зсс о спа час аса са асо асе Зй
СіУ Щ1у їв Бе бЇу ТкЕроек реко бій діа сСіп бі їїе дез тек отвг та 80 З ча сса зсь осяє соб сса сса ст ач аса даг аде саа сс єї аа заг уаї рко Аіа дів рто Рко Рко Дів бек Тіт Азлодта Бім Бех біу Ако
ЗО 25 хо саа слот аса сса ав Се ссба сей ст аза зас соб сабо ссс тва зса 390 зіва жо ТвЖж ро жів бак орко ркО Пец да дБр Бех ніє рЕБ ій Аа 05 М 17.5 ага саз суч авс ває вої аса Бо сабє сав дос січ баз Час сса вда 58
Меб бій ТкроАвп бек Ту Те впе нів сій Аза Бец Бу АшроБхо Ахе 120 125 ї39 зе азла об бо пас б сс зса чає чає дов сб сб да аск ово 485 чуаі Аджа СіУ ів; тук Ре рго Аіз БхУу біу дет бек бек пІ1Уу Тлк Уві 135 140 145 ВИ зар сс чсс сач аса аса сс сЄса ста ас беб бос ам о сба ос аза за
Авпобко Уві) пів Тр оТвж Віа Бек Бо ї3За пех Бек їТї2е в) бек АхФ 155 155 155 ас ЧК пас сса зеа сса ас асцет ааа вес єс чса са Заг БЕК ств, 5 :
ТВкЕ бі ввровКо А1з рко АБА С Меб біб Ай Те о А1а бе щЗіуУу ВЕДде те
175 175 ї8о чча сса ба сс Зв сів сза ще зе рес Кс сот са аса суб асо езй сій РКО цей тео Уаї Пеп біп о йаіа с1іу с вДде Ре по пе ТВх вгя тів
ТВ 190 195 са асо ас осса саа вас Сб зас са тощ ах аст сс су ває Є 578
Те ть Ї18 Бко бів» Бер обец дер дек ТІр о Тквф тТпж Бех Бе) да) РБе 350 205 210 «Ес аца зда асс осот вса баб ссе чЧЯс сава ває сх пав бос сса ага ие рез біу Зі ТВж Рхо Тву о Сув Рго йЗіу бів йБип бек біп бек ро ТВЕ 215 280 за5 230 аз тва бак сс соб ас бас сс бсса сСса ас соб сс за ас злча Ул
Бах беж Нів Беж Бро Ту Суб Сув Ро РО д3є Сув Бго сшРу РУК дхи 235 2 245 тач ацч вує секс ада вуз 55 абс ас СЕС ос ЄС» авіа кіз ба СБУ 825 ттІв Меб Сув пем АКОЗ Ат Бпе Тіе Іч11ев ре пе) Ре Тіє ей Пец рей 25О0 55 в ас спро аба бсс осса бс5 зба сба сб дає їтас саа задо абероєве сс то
Сук Пви Іі Де Бей бе Чаї Бей бе; АБО Тут біп ЧіуУу Мебє Пей ро 255 ато 275 чес а сса все сво сс Я вет азс аса асае бе асе бує сса гас зЗІВ уаї був РКО Бей ев рко сіу Твж бек ТВХ Так бБає ТОЖ сту ко Суз ай аа 280 аза вса с вос аа сса чсуу сза яса аса ачс ака ЕЕ сса все Са ЗеБ ув лі Су Так оті Бко діа бів біу ть: бер Мек оБне ре бек Суб 235 390 305 з10 са сс аса ваз сова сссо чаї о зуЗс вас бус аса бло ав сса вбвзоєра 1914
Су Сув Три Мув Рхо Бех Аяр о С1у АБО Сув Так о Сує Тіє Рго тТіе рко 320 325 ес оса кад чес вес очЧеб бує сс оссв без Чад кала сосс оСса че: ада доба бек Бек РЕ Аза пе д15 Ако Ре ей ТБ бій тр іа Бе Узі Агу 350 335 І 345 шЕБ -со КоЯЧ са бса ска бо де сса СЕС бу саа счЯ БЕ яра суб т1та
ЕВе обех Ттрогей Бех ем Бец Уаі Бхо Рпе Чаї бзіп о тТхрорБе уаії СТУ 345 3595 55 а бес сса овсс цко спа жа с зга ася пу згч асо зб баб соч 1158 ей бе РКО тр Уукі Тор обем бек Уві ї1е Тр моб Мес тер отбух Тур 350 за5 З
Чаї сса за ска бас яса абс ЗБ са бе КЕ асо соб ста бобу са 1206 спіу Буо Бек БМ Тук Бек тів Маї беж РгоОо рБре ї1е Біо Пец ої; ВО 375 зо Та ЗО абс бе вес бує со Боя ЧЕ Бас ас дес аїгр Час сеї бас зач за 255 ттІв зле ББв оСує дез її Уаї Тух ї1е АБ Тіз АБЮ РхОо Тук рев 385 Ас 405
Ес чає доб ас зББ бач св свв со Ср яба соб осв дає БЕ БЕ 1302 вве біУу Аїа ТВЕ Хаї БЕХ Гео беп бек Ве Іс Ро бек Авр Ре бе 410 215 АТО
2 Се зо зда чає ср пу чаб ас Зоб сс осо ста гас аа дав ї1350
Бгто бех Уаї Ач дер ої ви йво тні дів бек іа пеб тук ака с 425 30 435 чес со дав сей совс'зва св СЯ ссеа со сао баб асо чес са вода 398
Аза цей біз бе оБро Зі Нів Суб бек РКО Ні Нів ТБЕСА1а цей лкЗ дах 45 450 сва пса вії сф пах Бас оадє сдаз ба астї ває сбеа сдсвовса бо че аа сій Аїа її рец був Тур ЗІіУу спі без Мет Ал їв 21 Так Ткр уві 155 АБ 85 ав спас бес аа са два дав сса чсв Жсс зча ча са чсФ оса вас о бас Іч1А54
З1іу бек Ав Пец бій АЛЕЮ Рхо Аза Бех Або біб їез Чві ув» бек ТУуХ 75 ва ік йо аайс ус вас аку час сво айа аєс вада бяч сов сів Бу сс св ї5а? чаї Авп ові вв Мес у Сем був тів Ат сій Тео рем ТКОо ББе НІВ 59 435 50 акс Ес бе ста аса СЕК ча аа два аса сс сб дах зав со че і5о
І1еєе бек Сув пей ТтбК ЕМНе біу ко сії тТрх уві тей 1 стук бен май
Бк 51 ЗІ ас ЕЕ ста ста бозя аїї ачча ас ссев сса чссс бас аза сса ссх вас 165138
Чеш ЕнЧе бі МВ Тв оОї1е дто Тв о дто Рко діа сту Аж ро БкКо Адп 520 во 53 чса сов ага са їса апс сто сса час всз ага сб чсу абу та вав. ІВ;
Аїа Рко Бі ї2и обет ТЕ пев руб бій Тих ІВкоуаї Маїс Ака Ака АКх 5і5 зай 545 5БО сса вав сок сес осцє суб ада асб сов сс сса апа сча валу апа св. 134 с1Уу Агсу бак Бгто гу аку Ако Так о Рго бек Рго дка Ако Ах Акоа обег 555 БО зав сза аб ссс ача са Сб вуа бсб сСаа СЕ вач чад гоє сваа бу 778
О1п бе рко Ага Ак Ахо Ако бек бій бек Ака біз бек обій Сує
З 5 5ВО сассвссаєс ассазссасста доасацесис ї1805 «и» 1114 «11 581 «вІйИь Білок «ції» Штучна «ЙО» «аїз Синтетична конструкція «4100 114 пруУ біо тре Бах бек був РКО Ахо Був Ш1іу Ме сту Тнк Ада це) дет 4 щ пк 5 1 З 16 ї5 ба о бго Авіа обро ем обіу Рів овпе реко АБронів бід оцез Аве Рго дів га 15.
ве гув Аїз Ав бек біб АБ Бко Авроттр АБр оБей АвпорКо Ні Був що 45
АБроАБпотТКв о Бго біз пі Ав бій Уаї бі ах Сіу Аза Бе СБу рЕо 5о ЗО бо
О1уУ Бра те сорго РКО нів сіу шіу ме пев Су Тр озеї РКО ої А1а ва 70 75 аб сів біу їЇзТа Без о тйаг Тв оуах Бгто Аза Кіа Рко ро Рус діа бек Тв
Зо 95
АБ ОдхЗЯ Бій бек оку вЕЯ бій Бо ТвВг оРхо Ії бек Ріо ко пей беж
То ї05 110
АвюоБек Нів Рго їіп Аїа Мес зів тур дви бах Так отих ве нів см ї15 150 125
Віа без пев йвроврко Ак УуУаї Ако бік їм Тут о Бпе Бо Віа 01у бу 136 5 149 бек Шех Бек сі Тв ХМащі Авповхо Уаї бів Та отТВг о АтТа зако Ро ї1ї8 145 155 - 155 їБи
Бак ех І11е во бек Атоа Тк о спіу Аар рута А1а РКО Ап оОМеж бін дл 53 ї70 175
І18' АТа бех біу РБре ей обіу Рко реє Ле; Ууаї ге) 301 о Аїа ту вНе 189 185 1930 вне рей бец ТНІЕ Ару ті Мзи ТНЕ Біє вто бій Бех Без АБо бак То іа 2 25
Ткроляах бБеб рец дви Бе бецп БТу сту тТНЕ Рко Так о СувоБко аїу ій 216 215 220
АБ Севк іп оВек Рко тах обек чех НівБ БЕК то То Сук Сув Ре Бо
КЗ ЗО хі иа
ТЧе Су рко лу ТУ Аа Тер Мес Сук мем о Акоа АКБ о Рвпе тТіє ї16є рце 225 йо 25
Шез Бпе ІТ2е Пец Цей без Сує цем Т1фе бе Пей пецсоуві Каб стей Вар
БО 655 0
Тук біяй сСіу Мес Го Рго уаї Сув рез бен оБем ро б51у ТЕ Бех ТАК аа 283 285
ТБ Бек ТвЕ біу РКО був Був ТрЕ Су Ж їїз Рхо ма сів Б51у Так 258 235 З00 ек о Меб бра РКО бек був Сув був ТБж Був Бго бех о Авросіу дв Суб 335 310 зї5 ЗО
ТИЖ Сув 118 Бко тіє ржо бек бер тор А1а Не віа Акс Ме Тей Тур 325 30 335 із Ткр Аїа Бех туаї ди Ре бах ТурогГей бек ба дев уві о рха бле 319 145 350 туаю біб Тв Ра уаї бі Пео обеї Ро оТнЕ уаї Тв їва БЕХ Уві Ті з58 60 365
Ткр Меє Меї Ткр Тут ТтТкр бБіу Бко бек Мец Тух бек І1е Уаі бек Ро зло 75 80
РНе Ті Ро рей цей орко щі РБе рре Сув те ТхроУаії Тух 116 Ар з855 зе 325 4050 те ав о рго Туг був Сі Ре 01у ліва Тк уаї дів цею рез бек Бе 405 41 «Іі18
Без вк Бех бр оре Ре Ко бек Ук Акуа Вер Пес Тез Авор Трх Аїв 495 чи хо
Зек Аза пе Тук о дтоа С01й Аза Бей сі) бек бро біз Нів о Сує ех ро
В а АВ
Нів нів Тв Аза лемодку Сій Ата тів бе; був Тр озіу шій цей Мяех 459 55 60
АБ Пец АтТа Твг оТкроЧа1 бЗіу бдех Ап обей бій двр обхо дід бек Ака 165 ато «75 ан бін їши уві бі Бек Тут ЗЗї дви УаЗі Ав Ме сіу би бує ї1і2 АКЯа жща5 2956 435 їі) Бей ем тер оре пів сте бет був їву ТБ Бе обі Ага біз Тег
ЗП 55 ЗЕ чаї цем бій Тук бен оуавюк ек Ра сіу Маї ТЕр їТе Ака Те ро РКО зів 520 55 ліва Тух Ас Рко Рго АБпоАТа Рхо 112 Гез бек Тк Бей Рко біз ТИХ 530 55 5аО
Тк туаї Уві Адха Ака о зта біу дка бех РКО Ага Ага Ага тп РЕв век 545 ЗО ЗВ зао
ЕКО Ага АК АкЧ Або Зек бій ех врКб о АкКУ АхЯ Аха Втч Ббеї бів бек 555 70 Уа
Ага сій бак бій Суб 58 «10» 15 к?ії» 808 «и12з ДНК «13» прЕУана «вий» «2» Синтетична конструкція аа» «Віз СО «вий» (37.79 «Об» 115 чазсссусса ссасцяасеза счапасассасассзак Я ас сая сс ах вав 54 зЗКу оту Ткр о Бек деї пув х 5 сесії аца ав ча або зда паса вас о сва боса о ЯЕб ошсс вес сссв о січ су ї92 хо Ака Був Б1у Меаб сту ТАК Ав цей бек Уаї Ро АвдоркКо деп під 10 15 8
ЕЕ їсс осей дві сас саз б дз сов щес сс зпує са ваб зас вас ї5о рБа рна Рго дар нів ів Пец двр ро Аїда ве о біу Аза Аві бет АБИ 25 ЗИ 35 зак оєса забєссвч пас ск да сс ас вза чає са су са дав зба В
Ай ро АБО ТКЮ АБроБве аа Бко Аве Був о АББОНів Бтробто бій діа 40 48 5 кві осаз че слзча дес дча Зсб боса сса о дсс со асо сс сса сяг 226 авп бів о уа1ї біу "ві зуУу Ата рве Сіу Бко зуу ВВе оТрє Рко Рга ні 55 ва 55 по леї заа со ба соас бод бос сова саз са сас чаш в сс аск оасе аа ому двіу беч Ге сСіу Тер Бек Еко сій Аїа зія Зіу їїТе без тТпЕОоТАЕ 5 85 в оссб здст зи соб пос соу чес сс вса за аа сая аа де са 45 чаї РтОо АТа віз вка рго Еко Віа пзу ТИЖ АВ! дк СІЙ о щех ст Ату 0 за 100 саа ссеа асс сса аб бса сеї сса сб ада слаб сбеб осаї сеа сафФф о зса 390 сій вхо тп орто Т1іе бек Вго Рей ово Ака АБО бек Ні рео бів Аїа 1605 їм 115 акз саа го авсо бос ас ас КЕ сао спа дова сба сБе зає сов вста 4138
Маб 01» Тр оАвп о бех Тахо тк РП Нів біл АТа їв їй АБроркКо Ах 150 125 о ча су де соа кас Ес сса ЗЕ чоз зас оссвсе бса зає аса У 45
Уві ха сту Пец сТую Ей Ркз Аїа 01у б1у бекобег бЄех піу ТпПк Маї 135 145 145 15 азва зов За сєЄ аса аса сес сс особа арре са або ве соб сосозда За
Аврпорко Уві Ро ТвЕ Тік Аза Бех бо ї1є 5ек бетг Ї15 рлпе Бек АгУ ї55 - 60 165 аса зас ЗаЕ сса зсб сег оааб віб Чазу вас оазоз ас боб ше бо се 82 тТвжЕ оліу Ар оРко Ада РЕО АвпоМес бій Ав отьК тн обех п1у ББесгей ї70 БТ ї89 счас ссв са ба с са свя ЗЕ дує Кб о сбоа са сбл асо вада аба ЗІ
Сіу Бко Пец речо Ууа1 Без бів А1із бьу Рресббе цер Без Тих оАго Т1е ьВ5 130 185 шЕЄ асо абс оса саз ба ств зас аує сзч суч аса бсЄ стю вас БЕ вла їес Тих тів о рко сів бе рез АвБробет ТЕр ото Тв обек без Авп бе 200 З05 га їсщч уява ча чеу сса асе бос ссе зує сай вас Сса сая Сб себ о аса 726 гц біу сіу Аза ро ТВК обСув Рго бЗіу біп АБл бак бій бек орто ТИЖ 215 ей 285 230 тса вас са Коб сс За азс СБ сба сба ав БеЄ соб дчує бас ача па бек ав Бі Бек Вко Тк Беж Сув Ето Ро Ті був Бхо (1у Тут АкКФ 335 740 145
Копо зб бас сбсовча вод сб вс абе вбс сбб о бсо аба ко са БУ ваз
Тер мес Су це ВХ Ака Ра ТІЇ Тіз ре Бей Бйе тт ей Бе опей 25о 255 256 ас се аба сс сра с са бя сб дає бас сва зач ат сб сер в) пу їєч бів ре Пемй обей Маї Пец ойви АдроТУук сів йіу Меб ем РКО 255 270 275 чес був сса Бо скс ссс осв асу вп апа аса Се веб час пса бос 9ї8
Уві Сув вко Беьоїєну ре О1У Тк обеж Так тпр обеє Тахо сіу Еко Су го 285 9) зав зса сяс аос аба сса чої сза зас о аса вус ву Б сова бос са зеб ув тТвкоСув ТЕ ТХТт1е рро Аза бій фу Тк Бех Моб Бе ретО бек Сув 235 зва 305 Би; кас позс аса вая сса ос чаї дує за» бас яса кас ар сса абщ сса 1214
Сув Сук тТпж їуУув Бго Бех АвБвопіу Ар оСує Таж Сув тів РКО 116 рго 320 35 ев са су а4се сс аск сав бе са їау Здай вза со ссга ЗЕ вай 1055 беж бек тор ойза Бе йіа ку Бе Бей тів бій Тур овіа Бех Чаї Агє 335 335 зкй ро пес слу Ка Ккеа тя са Бкс о сса ССС ссч саа бу СБ ста сдео їл10 ве бе тро пе) беж їец оцезй Уві вБко ре Заії бів Тгрорре уві 01У за5 359 355 са ес сса асо ясс оїаш ва ст Яба аса бу або вібФ Боєг баєЄ 959 1158 ївшеа бек орРго Тйх о Уаі ТхО о Бсо бек Уві тів ТкроМес Меї Ткротук ТІВ з5о 365 Зо чає сов вес сба бас са абсо збе Ера соб Кб абс сок бу соц сса 1366 бу ржо бех ї-що Туж беж ї1іе уаії бес Рхо Ре Ії рко Ге Бей ро зле Зно з 380 абс веж сСьс ово БУ сау -КЄ бас асб озає вс спа сс гас вай сай ї25а їїе вне Бре Сув ем Тхр Узі тух І1їе ВвБр Х15 Авробто ук був біц з З, 405
ЕЕ Заг цс ас ЗЕ зач Са ста пес КСВ о Срасссб ек дає СБ Ос 362
ЕНе б1у Аїа ТВЖХ Уаї ОО Бей і; Бер Ре їй РКО бек АвБроРБе с сРне стві 415 5 се оїсєб чкс ваза заб сб Сба чає асб обо сс пев са кас вада дах 1358
Кко Бех Узі Ако двр о рем ей даро Тк аіа бек Аза цен тТуж вже ТИ пив 430 435. чо са чав Сса сої даа са бас са соб осаб баб асос о одос Єреа аа ї1398
Атїа рєт бій беї ро біз Нів Су Жак Бто НівВ о Нів ТВ Ата без хх 489 545 450 саа са ас оса се соб одо чав сов сабо авс ста зса все бач ос Та4е сід АтТа тів Гей Сук Ргроб1у біб цей Мебє зап опе Аїа о твх ШЖкроУуві. 4135 йо 165 о че тес зав са баз чає сса пса ес апа зву ба сова ої о адс ох їв
СіУу Бех АБи Гец сій АБЮ Рго діа БбБет Ат Зісй їй Уві уві бек Тук а а 485 ча ває лес азс пос гсоасааа ас адча бач ба сс Са бо сах ї34аи
Уві Ап уал дв Меб 2іУ Бей Тув ТХіє дкУ щіп Гей о пей ТерорнНе Нів 490 195 НВ) абс ожсс сс сбу аса СБ дує зча Чаа аса ск ссо чЧаа баб сб Б 580 їїе Бек Сув цем Тіт РБе бБіу Аа б5я ТБ аз без бій о Тух їж: Хаї 505 5і1й 515 зас вс Зла зба сс дос воза во сов осса пис бас вай осса сст паї 15385
Беб ре зі1у тат Ттр о тіїє ди о ТвЕ вхо БЕо Аза тут ДЕ ро рко Ав 5250 ав З) са сова аса ся са асо осо сба чат зса аса чес а заз вача саса т585 від Бхо Тіе пе бет тв ме; БІО бій Тих так ові УЗ Ак вка Ах 535 заа Ба, 55 з3а ває бос сс сво спа вада ас ссяа Єссроссз аза спа ацо аа са 3 сік Аж беж оРко вхо Ак Акоа Тк о руо пет Рго АКо Аку Ак о Акт овег 555 Ер 585 саз ач соб вда сча са ача об саа сссо вов ач сб о сва БЕ ЩІ сій бек Еко Аку па ах Ак век осбій ет АкЯа б51ти бек о піп Сув
БНО) У ЗО сагевзсовкс вссвесвіса воасойссає вок еп 116 «1» 81 «й1й» Білок «813» Штучна аву «йш3» Синтетична конструкція «00» 116 сіу му ттроБеаї Бек ув Бко ЖЖ Був штТУу Ме сСіу тйх Авт опей бек ї 5 10 ї5
Маї Бто АБИ Бсо ем біу Бпе Ре орто двроНів сій Ге Авробро Аза 5 30
Рре бі дів Ап о Зег о АБп ЗБ бко Ар Тр о АвроББе Ап о во Ав о гу
За ко ї5
Аве онНьв Тхрв о рко сім Кта Авпосів уаї іу уаї біУу Аїд Рие Ту Бо
За 50
Сіу Бе Так оБго рго ніз Б1іу бЗішж пе Геї ЗУ Тур бек Бго Зтп дів
У У У У Е щу 7 75 я
Сів яку Ті зо ТБ ТВ Уві го Аза лів ро Бо рхОо Аба дет ТОНЕ 85 зо з5 дві Акту біп Бек б1іу Ага біа бхо Чвжх Рко тів бек Рко Рко Бей Акд 182 305 1їй
Авробек Нів Рхб біп АТ Мех сів Тто дай бак ТвВЕОТат вБе снів сЗій 115 120 125
Міазспей пе) бврорко Ах Уа Ага ПіУу реп отух ве Бо Аза сіїу СТУ 130 ї35 140 зЗея бех бек 5іу тТпЕ УМаі АБа о Бже Уді ркоО тк Так АТа Бах ро Те 145 150 155 160 йех бек їі Ре бек ака ТБ о 01у Вар орхо АЇїз ро ва Межб о зЗій АвБп 183 І7О 175 тик тає бек ЗіУ Ре бец сіу то зецсіни таї те) бій Аа сзгу рве 185 185 ї5Оо
Раз 2 Гед ТпЕ Акта діє БПез Так ої1є Рго біп бек їси Авробет Тер 1595 ап 295
ТІр Тк Бек Гей Ап о РБПпе Пец бО1у б1іу діа Рко бе Суворо п1у сЇй 218 2515 й
Авіа Бек біп Беж Ро Гах бек одно Нів бек Рко Тк обек Сує Рко Рко зах 30 235 га тіе сСув Ркро сіу тТух ЗКУ Тв о Мес був Мей Ахя Ач Бе т1е Ті пе 245 250 255
Тєш Ве Т1е без огев пеп оСує Мей тів рае о пей тей оуві тей Бей дер 60 2655 7 тТух З1з біУу Меє цез Руоз Уві Сув Бо Бей Бей Еко біу Тпх йех Таг 275 280 85
ТтТвх бек Тих піу Бжо був пу тах Сув Тк т11е рко Аза Ста пьу ТНх 290 295 300 бек Має Ре рго бех Суб Сув Суб ТВК Був Рро зак о АвБр о ОТу АБИ був 355 зо 315 зго
Тне о Сув 118 Ркго 112 Рко бек беж Тгтр Віа Рпе Аїа Ай Ре цец Ттр 325 130 335 січ лив Аза Єву уві АхЯ Ре Бех Тер їм Бех це) тей Уві ро вра 340 4 З5О0 й чаї біп Тко Ре Уві БіУу Пе бах Рез о Тпх Уві Ткв' беч бек уаї тів 355 ЗБ за5
Тхр о Мек Меж ТкЕр о Тух Ттр о біу ро бек Бей Тук ех ї16 Уві Щек Ро за 375. 189
Ве їМїе Ре їен ією Рхо Гг1іе рве РНа Сув Беж Ткр чаї Тук Щ1е Авр
ЗВ. 3зп 3535 бе тів АБрорко Ту був бід Бне о біу Віа ТЕ о та1 ти Без во Бех рве 45 ато 415
Гей Рго бах йБЮ ре ле Рюо зет Уаї дучЧ Ар обеи Мед дер Так Овід
Яво 25 435 цех Аїа пецйп тТух Ажу СІ Аза пе бід беж ржо бій нів Сув бек рго я 445
Нів нів ТЕ Аза ей Аку сій віза Ще ва Суз тТтроту бій пе Мех 450 455 «ба
АЕт рем АТа тк тТкр о уай о1іу бах Авпобей бій АвроБго дія Беї Ах 470 475 180 сій Би оуаї уаї пех Тук чаї дп баі Ав Меб б1у цец бує І1їє йо 455 290 з5 бій пеа еп Тур о РБе Нів Ііїє бек оСув цеч ТНК бе біу Аку Зіч ТВЕ 5оа Зо 550
Уу«ь рез іп тую реп маї бек рпе сСіу Уа) Лур Те Ага Ту о рго вто 515 ЗО ЗаВ іа стук Аж РКО РЕО АБИ Аза веб Їїе пе) бек ТВ рей бро ій ТВЖ 530 535 54) тк уаї уаї Ахо Ак ака З1іУу Ага бек рРто Ага вАкЧ Ак Так оБко бек 5Ч5 550 55 де
Ехо вка АтУу Ага сакУу бех сіб бе Бко Аж Мч АкЯ о АгЯ йех піп век 579 575;
Акта 012 беї бій Сує 5ВО «В у «81ї: 1808 ки12х ПИК «213 Штучна «Ва ух «ай3» Сицтетична ковструкнія «220» хзлї» СВБ «ййаз 37. УРТЗ кА 1717 звасссооса ссасеоссяа коазаоєсов асеатє себе сев су бос їса ват 54
Сіу Зїй Тер оЗек о бек Був ї 5 пса азч зав обо асп о бч ата азс ба азс оте бса аво сс ск дус 102
Рго Аке цув Бі Ме Бу Тит Ав бею бат чаї беж дви ро іа оту 19 15 й
ЕВ Ес сса ас са сад осЕЄ зчаб ста пса сс вада чсоа азео соб єр нах
Те впе Рко бо о Нія бій Гей Ар Бо АТа Бпе с Аго Аїа Ав о беж лід
25 за 15 вас сса бас бас ЯдаЄ с ває сса зас сазга аб асо суд сс чдва са 198
Ава Бко АвроТхр о АвроРпєе Аво РКО Ап обу АвроТтТШЕ Тр оРко сій Аза
БО 45 ЗО ває саа чої чав че чЧеч са БЕ себ ссУу дос об асб сов осов сес 746
Авпосій уві біу узі 1у АТа Ве 01у Бей Су Ре Таж Рхо Рко нів
БО Ба 7 за зач су сс зЧа гач ад сса баз ЗусЄ сва усе ав та сва свеє 2за біс ску рей пес злу тТкр Бек Бго біпо діа сій біжу Ті Бецосій тВх т що 55 чек ссв чсЄ ває се особ се зсс кса асс вах зада саа бе аб аа 32 чаї без АТа Авіа орто кто Рхо А) бек ТАТ Ал о Ася бій бек Шу АКу за ч5 ї2о сва сс асав ссва вс о сса соб сса сс адча час вс о сає соб о са дса т8о зва о Бго Тих Бго Тіє баг о рхо Бго реп Акщ Ар обак Нів Рго зЗіп діа 105 що ! 115 асца ска сво вас кова асбоабсс се сек сва сб сія бу час обсв ауа 155
Ме біп ТЕр Ав бех ТБг ТЛ Бре Ні Сів іа цей рей АБровБго Ак 129 125 І30 т аша ща сту хаб вес ссв чст зас ца боса бок аб учує асо З «яб чУуаї Аг біу пей туї Епе ро Аза сіу біу беї Бех Бех біу Таж Маї 135 ї40 125 150 аз оссв «ка ссс асо аса сачсс се сса с асс заЄ рсс ово Сб аз оаса 5
Авт то Чаї ро Ту та Атїа бех ко Її бек ошех ї1е Ре бет Атга 155 і5а 165 аск дас дас сс дес сса аз ася зач вас овес вса сс да со ссх яз ти се АБЮ РЕФБ о АТВа їй айви Ме бій Ей ті ть; бек ТУ Ве пе) і7о 175 150 зп тов ся ста чре ста сцаа яса вс о бре ста вся асб вда вс 530 піу Рко Пец оБем Узі Брей бів Аза СТУ Рпе Ве Це Пец Тк дко ї18 їа5 ї50 195
Ба вся аб сса сзч ває са чає ес ба Бач авобс аз са ває БВ іа тру тів рЕо Сів Бех їв авБр обеж ттр тур тТрх бех їй Авап Бе заб тав 210
БІ засоаса аса ага суб сс сов осав вас сб сас сот соа аса таб пей збу біу УХи Так баг оСув ко білу зів Авдобах бій Чек Бго так 2ї5 ато 22 що вас дас сас ссжт сс ас пса баб осса сса аб ба ссб чу Сас ауа па бат Аві нів Бех бко Тву бек оСув о Рго вто їі Сув Бус бТіу тТук Ат я 2 245 бач асч бас єс вда аа БСК абсоабс сс соб Ббс аса ся ба бо ва
Ттр Кеї Су цем йкчЧ о Ака пе Т12 Ті Бе решоРбе Т1іш вм обем Бен 250 255 250 те срсоаба вес ска Б вка ста са чає бас сад фа авяЯ ссб сек 87о
Сув ей тів ББе бе: Пец Чаї рей реп дЕр тую піп Оз Меє Бей вта 28 270 т чЕсС бук сса СЯ сос соб пу асу азс асв аса Бек о абб дае сов бос 18
Чаї Сув Бко їеп Бей Рко Сіу вк бек ТНЕ ТвВКобех Бк с1у Рко Сув 280 288, 90 ага аса сус зосоата оса зсу сна чує аса азс ас ЕЕ бра бшс У ЗБ їув тк Сув ТВх Ті рко Аїа бів сіу ТІ бек Месб Рпе рко шет сув 225 300 5 з1б
КУ бос аса аза сса с бсо зає ус аа Бус аса зо зе ссва аса с сса 31014
Сук Сув Так ГУБ Рхо Бек АвроО1у АБВ бує ТВ Сую Ї18 Рко їі РКО
З15 ЕВ, 35 ге о Бса боаФф осо сс Че саб со са соч уза су зесоссга сб ада 105
Зеж бек ТкроА1а8 Бе Аів Ага Ре ви Теробій ТероАїв бек Хаї с Агу 339 335 За
Я Бсс со ба са бої Ес дес осса СЕК два сав о суз КЕ ща ов 1710 ре беж Тер обез бек Гей без уаії го ре маї бОіпоТер Різ о чУваї бІу зд 350 355 тва бос осса айс зЯвс Буш са сс да зба соч ага вЕбз ач па о боФф ТІВ пец Зезш Ро Так уві ТІр о сбзи бек уші їівз Тур оМмеб ме тв Ту тІр
БІ зей зта зас сс вус ба бас боса акс оз боса сов б абс соб Се ста сса 1325 сЗіУу Вко бек бец о тух бек т1іе уаї бех Бко Ве ї1їє Бко Бек пе РК 375 350 385 90 аше ЕЕ бЕс ЧЕ ЄсЧ бЗз чес бас акс се ас зас сс са вач оолер та5а її Бе рве сСув пед о Тгроуаї Тук ТТе АБ отТе АВрорхо Пух уз щЩщ 335 ай 05 іс од асо ас аб де Еба о сса бео Ес ба се беб час Ес се 1302 не зЗІіУу дта Так Мві сю їі їмо бех ре цей ро бат авро вре Ре 350 415 ай ссж СЕ ЯЕс вче да ССС со зак аст дес Зеб Че Ка бас ада ай 1350
Бко Бек Уаї АгЯ бр цей пцец АвротТВк діа бек Віа Бей Тук ака сі 425 130 435.
Фе Я даа цоз оса чав сай аб са ос баб бас асо вдос ра во. 1398 дів цеч біц бех Руб Сі) нів о Сув бак орко нів Ні ТБж о А1Та гей Аху дай 345 450 сва чса ве скУ бас са сачас дав са ау аво сво са зса СЯ авг таб б ів Аїа тїе теп Сук Ттр о О1у їй Бей Меб Ав ойвмз АТа Тк Тур уві 155 150 4б5 а7о «ча шсс вас Я спза час сса щсоа Собс азда чач ба ча ас вас сгас 1434 слу Бек авп цей б5ім др о бо КІ беж йка 51 Бей Уві уаї бех Тук 480 Ана ча зах зе зас аба зЯс Єбд ава асс ва са ба со ау се са 154
Уві АБп чаї дви Меб ЗІУ Гей Бу ї16є АгУу їй Бец ге Тхв Ве Нів 491 495 з ас кас сус ст аса Кб Зах ауа дав всв Зо осо сза став піс ас 75850 те бек бує реп ТВж Ре б51у Ак ЗІ Тих чаї реа пі тТух пей Маї 505 еВ ЗІ5 азде гс5 зба зба гуч асо яйз або оса сов дес бас зба сСса сс аа 1858
Бек Бе С1у Маї Ттр їїе Ат тах Бко рко Ма Тух Аж Ето о Бхо Авл 20 55 З30 зса ссз аа ска Са всс сов сса ча зса аов оч засо ачя вв вв. 1586 дів ко її без бех ТВх без Бгто 03; їВЕ Тву Уві Уві Аг Аку Акт 5і5 зай 515 850 зда вача сб сс сЯс сук своа ас осса бсо ссвоача сза вух ача са їі734
ПТУ Ато Бек хо АтЯ Асо Аху тах орто бе РКО Зїха вк Ага Ако Бех 555 зва Бе тва ваз сс ацча сода се ада ев осва сс вча чдаФф боб осаав са 79 сіп бах ро ву аку зго бу бек сій беж ака Зі бет бій сСув
УНН) 55 ВО сассассасо всбаєсасса засадесас 1808 «3105 ЛВ «415 581 -й12» БІЛОК «йЙ13з Штучна «Вяйх «223» Синтетична конструкцілт «АбОж 128
Сіу піп отЕр бек пек пуб хо АКЯ Пув обі Меє зіУ тає АВ йй Ще
Ії З 0 15
УВІ бек Авп о ру ва біу Раш ре го дер нів ІЙ Бей ЗББ рко Аїа хо 25 30
ЕБе Агу Аза Ап обех Ліз аа Бго АБротТкроАвр Рпе деп обко АБ. був 0 15 двиотТих ТЕВБОРКОо Сі Афа Ав но СІЙ Уві біуУу ува біу вта рне сім ем
ЗО У 50 сім пе ТпровБго Рго нів зіу БіУ без пе біу Тер бек Бко бій Аа е5 то 7 Во бЗіп сіу сів ей пів ТК Уві ро Ата Аві ро Ро руо АФа бек отв 85 зо 35
Ап о Аху ів бек Ту Ажкч 31 Бго сТВак вхо її Бек ВБжо Рго бе» г 160 105 110
Анти бесо нів ро ЗБ о АтТа Меї сій ТхроАва бек очну ТЕ Ре Ні І
МІ5 120 525 діа їжи Тем оАвр ртОо Ак Уаії Ат ст Бей лук Ббе ко Аїа О1у СТУ 139 135 110 бек Бек беж Сі Тв Уаї би Руо Уві рко Тахо ТАК оАтТа беж рко ІТ 145 120 155 1650
Чех бет Ті Раш бек Ак ТВкКоСтіу дев РКО Аїволез Ба Меб ос1іц АБЗ
БУ 170 175 ї1є тех дек бБіу вБе беа сіу Ро Бей бец Уві Бей бій Аз пТу Бе 180 185 180 пе пей їн Тк ху т1е Бей; тах чІ1а ко бЗіп Бек Бем Авробех тТго тав І) ОБ тТеротйє Бек тей ДЕЙ Ре пез б1у сту тасотвк так Суб Бко щу віп мн. 215 аг двт бет сій бйет о Рко Тк бек зва Нів бет Бжо ТВкобеє Сув реа рго аз 230 о 240
Те Сув о ргро піу Тук АжхЯ тро Ме Сув беи Агу Аку вве іа тІ1ї2 Ре ак рагтв) 255 їн Ра тт рев Бши рей був Бе тів рпе ей пез УЩі Бен Топ двр 255 270
Тух бів 01у Меб Пен оРко Уві був Вко й пе ро СіУу Тк Бех ТЕ ат «80 28 тв беїх Тнг обі вБга Суб Був ТАК Сув Тт ІЗ Рхо оА13 біз о О1у ТБЕ 28 295 зай беж Ме обпе Бо Бех Сув Сув був Тако Був Рхо ех АвБр обі АзвоСув за5 219 315 3280 тк оСув о тіє Ро 116 Бхо Бех бет ттр. АТ ЕБе Аза Вк Ре цей; ТХЮо зав з 335
ЗтБи тто Аза бек Маі Ак Бне ек тТхвВ о пезч Шех ей без ув)У РКО рпе 343 345 ЗО аї бій ТкроБае Ууаї б1Уу без обех рко тТрк о уаї Тер тей бер оту Щів 355 зво 3285
Зкр Мер Меб Тер оТут о тТкрозіу Ро бет пей Тух Зак о їіе уві бек о бБка
370 375 зва рре гіє РКО цез Мен Рус Ті Ррєе Ре був рем Тер оуаї Тук Іїе Авр 155 38 Учь ай
Іі двр о Бгро Тук Цув С1й4 БЕпе біу Аіїіа ТЕ Уві Сі ей Пе Бек Ра 205 410 415
Пем о Бко беї АвБр ЕЧе Ре Еко пет Узі Ака АБроПцен Бе АвротВх лів 420 дз 439 деко Аіїа цей Тух Ака бір АїЇв зи бів бек Бто Сіш нів був бет РЕд 3385 440 445
Ніє Ніє їпг о Аїа цем Ак осів АТа їі бец Сує Ткробіу біш цем МеЄ аа 155 о
АБ їмо Аіа Кт Тко уаі біУу беж Аа Бец 214 Авр орто Аіа бек АК 185 аа 475 дво
З1ій йем уаї Заї бек Тук Чаї дво» туаї АДвп Мек біу беш був 1185 Агу 185 489 аз5 біп рей й) Чер Ре Вів Іі бу Сув Бей Бе Бе Зі Аку ОЇ Та юю 505 510 чав ви біз тую рем ав Бех Ре сту уві Бер їі Агро Твк ро РКО
ЗАЙ Зи5
Віз Тук Ак Бо Рко Би ліва Бхо Т12е Пе)оЗех ТВт їжа Рко біз Тк за Аз БУД, тик Заї Уаї ака Аа Бка сіУ Ажа бех БгосАКч АкКа Аг ТйЕ Бро беж 545 550 558 во
Рго ка Ага вк Акоа бах біб Бех Рго Аху Ака Аа бху бек піпй Бек
БУ 57й 575
Аткч ЗІіа беж іп був
БО
«192 13 е«21їх 8485 «їж ДНЕ «ії» Штучна ох хкка» Синтетична конструкція ких «Увї СО «род» (371,.(24531 «4035 35 чавкссосса ссзказосча буавасесск аствук ЗУ сафз суб сс ес вад за
Зі 1 Ткр обер бек Буд 1 5 се аца за соб аз уує асї аз сво сб опа сб дес св обо по 108
Ркс Акта ув 5ІУ Мас собу бик Авпоцевц бек ах бек АБИ рко цеб О1У 10. їз 20 ре сс сса дає сає сво ба ав сса чес б сх засво дас аз оссо 150
Рпе Бе гкоО кр о Нів сій цей АБр оБго Атїа ріе Вк Аза АБО бек 81 айс осса чає соч чає сс аавоссє аабє адво заб абс соб сса дад че 158
Авп БРко АворотТхр Авро ше Азю Руо АБИ ув Ар Тв ТкроБго Бім Аза
За 45 за авсосаз їз зЗча че дра чо се за са дак ск асо сов ссросає -
Ав сбіп уаї бу маї сзіу АтТа Бе БІіу во обі Бае Тв о Бго Ко нів ва 5 7о
ЧУЄ чаа са ба час со вас сса сова дов саа зу вве їб9 сав все 294 біу піу цез їм Сфіу Тгр о бак Ро б1в5 ді бів б1У т11е Бевобій ТВе 7 во 85
ЧЕ сев че вавас сб сов ссва чеуї са аса заї аа сву Є з аа зай
Уві Бхо Аза йо о Бго вКко Руб Аія бек ТВ Аа дто бій Зех о сіу го п ав 190 сва ссвоасс сов абс боб себ єс ба оваом здає всех саб сес са чсев 390
Обіг рко тих вБго їз1е бек Рке вго цем о дкч Авробет нів РЕ Сій діа і05 ТЕЗ 115 або газ бду авс о їса асяч асо с осаб сза Ззсс сс бе час ссбосада 438
Мет бів Ттр о Ал бек ТВт бе Бе Вів біл АТа йеб еиа Ар Бо Ас
То 125 1359 чс ас ччЕ ста тво Бсо сба щоб ач ода сос бсв кос оз аст з ав че дя БІ цей тик ва ру діа лі у бЗес бек дек осіу Твж Ууаї 135 140 1АВ 155 зак соб: чо сбса ас аса пса са ссв овес бра сс ва СБ СВ вда 534 ве РкЕО я во Тл ТБж о А1іа Зек о Рхо Тіе беїх Бек ї11е РП дек да
І55 150 1855 асї чо зас сть сс сс пай зб лаз вас вогозса вус зас бос сев Зх
ТвЕ біУ Ар орто Аза пес; оАва Меє 01 АБ т11е тах бек СТУ Бе Пец 170 їт5 1850 ча соа ба БВ ЧЕ ста саа дос ча Бе сс ста Ба вс апа або 30 пі Бко їеа Тез Уаф гпез бів Аїа біуУ. Бе Ре реч Бем Та дко І11Те 155 таб 195 єства «стае бог сова ач св Фас бБососцо соб зса ес га зав вес те їези ТпЕ ті вхо піп бе рей зБр обох Ткрогтга Теж бек дей дяп оре 200 225 210 сс дує да абасаса вса ак ссзаз зЗс спа вас сс сва са оса ас ТИВ
Бевпосзтзу 01 Тьх Че ТВі бує Вго обСіу іп два Бех біз с беє Бго тТНЕ зі5 2 ви5 2 ож ав саб ор сса всв о бсеї бас бос осса аб обас ста зя5Е бас да та бек Ава Нік Бек обре Тк бек сув РЖОо рхо Щіе Суб Рхе біу Тук Акч 240 245 ет ас Сас з вда аб сс асо аб осєсс ссоа сс абс оске сса се 25 тТтвомМекоСув пес; дхУу Аго Ре ТІ ІГеє ре пе) Бе Ії їево рем Пец 250 255 БО кс Ен асо сс сс се зга ста себя дає бас саа дає ау св сс 570 пув їей Тіе вра пен тео лаї рев ре) АБо о Тук іп оту МеБ Те Ро 255 270 й5
ЗЕсе сас сес ста се ссаз зча зе оБсеб аса асо о сса аса уча сса бот 518 чаї Сув РкОо їі ієм РКО 01у Тйх дет Так Тих бек Тк бту врко сув а80 235 230 заа аса бас аск ас сс пс соза дда аса са або БЕ сса сов баб пеб
Ппув Тв Сув ТЕ І1є Бро іа біп Сіу Тк о бет Меї Бе Бо бет був 233 зав 305 315 рас паї аса аза сса бса зак чує вас Ба азс: Сес аса сса аа ста па пув о Су Ти руб рго сеї Авробіу Авй був Трж Сув їі реко їле рхо з15 180 48 вус са точ дса СсЖ асо са брс се дя са ба Чек веб фета ача 7042
Бех Бек Тхр Аза пе Ата Ака ре ре) тктр ба Тке АтТа Бех Мадз ву 3 315 3140
Ес хе Ба Ба аз су сса бе сба Се ча сач БУЯ БЕб яко че ВЕТО вка Бех Ттр цей бех бен Ішьи Уаї ржо рРпе уаї Сів Тхев впе хаї сту 359 355 се кс сса асе оч бачу ба сб соб абс тедч аку або ваз кас соФ 1158
Пей обех ВО тих уаї Стр оеа Бек чаї Тіз тр Ме Меб тер отух тем зо 355 370 ччУх ста аас ста бас обса або ус сСса со кр ас осса с са се 1206 пі о рго бек пев Тут Бак Її1є Уаї бек Ро Ре тіе Бро цей і Ра 75 зай | за5 380 а пев кро сус сс бло «СК о Євс ас зас авг час соб зас ваач дав 12582 тів Ре Бйе Став Сем тхр Уві бує Тіз Лев ої11їе дБЮ Ро тук був 1 385 4по 305
ЖЕ дас са абса чес дав Са жа бса СЕК бра Сса са аб Ес Бе 1305 впе сіу Аїа тКЕ ук) сі пей їез спек оБце бен РКО бек оАво Ре ства дій 15 429 ста са ЧУ сус чає се ста чає всб пса сс сс сб гас апа спав 1250
Без дет Маіїі Ба дер ей Бей паро Тих Аіво обер Аза рез стук да ота 4 139 435 пса осо ува са соя ав осає бас п сова сво оса ас ес сус аа 1298 кіз їз бім бет Вго бій нів Суб бек о Всо Ні Нів Твк о Аїа ем Ахх а30 345 АВ сав чсс аса сет ас сзо уза чач Со відб заб ста зсс ас бах ка їлає
Сіп Аіа тів гей Суз Тер щу бі й) Мес Авпобец діз ТвВкг Тер оуаї 355 450 455 0 ччч бесоває ста дав час сск оо бос ваа чава сез чЕЗ За сс бас та54 бі Бек Авй цей Січ Дар оБхо Аза бек вка СІ цем уаії Уві Бе стук іт «Во АВ сс озат чо авас зач спож що зач абс аа сад сс ста сут ке сас 1515 чаї АБ уві Ав Меє Зі ем ойув її Ако біп цев Сей Тер РЕБе Бів дао ща ОО зв са аб са асо БЕ дос вда саа аса зба сб Ява бас са че 1599
Іі бек Сув Пеш о тцкоРле б1Уу дк; Зіз так оУуаї пер; бім Жук ем оуа1 505 БІЙ 5І5 ааЕ СЕС су ЗІ суч асЕ вуа аса соб ссводса сах зуа Сса сса ав 1533 век Ре біу Чаї Тр Т1е вхо тв оБко БВко Аза тТук Ажоа Рго РкосАвИ вай 55 530 чЧез соб аба ссу аує зсЯя се сса аз зо о асаЯ ас цеЕб зуз аа аа 15955
Аїа Бгро тіє Те) бек Тр беи ро сій Так отнк Ууаї УР сАху Аа овжу аа за ва5 550 ччс вача бса сс аз аа азу аса се са сс зада са аа с сс 1734
Сіу АкФ Бек Рго йкч о Аку Ага Тву Рко бек Бко АкУу Ак АкЯ Акч Бех ве 5655 сва сс бса ача сяє ада аа сс саа Себ ацда чав сов сва кКус ді їв? біп бет Кго Ага Ака Ару Ага бех сій бек Ака біз бет зів Сув бЩу 57 5ІВ Во ска ссс авча баб чес озсс єча ссв о сїса все аа сс сеї вс Б зас Зо їви бет Ах тТук уві А1а Акоа їсм дек одеу два о бег до тіе Еде дай 5995 55 сах сай сас дос всосоабя бсаа зас сб саєр час со СЯЄ за адасває Щв78
Нів' бів Нів біу ТЕ Мес біп Азп о рей нів Авробехт Суз Бех дк бБИ 500 605 1 сс зб Яся вай сце ст сої КУ сао баз асо чує зда ава сс їЗ265
Бей бух Уаї Бак Без Бей без бе Тут сбіп тах Ре СТУ Ажхб Був Га 55 «га 25 3 став р сво го обав сса ах аба сса баб Сб зда зай ас сса аа 974
Нія цей стук Бежт Бів вто ЧІВ її Бей Зіу ВБе Аку Пувоїіє РЕО Меб 535 640 ваз зуч пс сс са се севз БЕ ря сс чор сва кс зса аб дса ао зохе
Зк Уві фу газ бек орко РБе рей їеи А1із Зіп Ре ТБ бек діа Тіт 55 БВ БО вес же дво Чис ву зав очок ер осо свас бас сво чев гож са хас що сув Бет уаії Маї Ака Дка олія Рре Рго Ні Сув Пец Аза Ріє бек Тух
Ба БО вла згз зас Час зсб о дро ста чес бос дав зоб лса сав о сабє бу чая вас А 18 мес аАвр оаєр Ма! Уві цеа біу йіа Цув Бех Уаі Стр Ні їви 010 Бек 80 Б Уа с БЕ аса чсо са асо овас ск ост СБУ са са дач аксосає с 2165 пец о впе Тк оАіа Уві ТВкодБИА Ре Мей Геа беж Гей БіУу їле Нія цей 5З5 тай 705 то вас сс гас азв аса ваза вача бос до Сас бер о єта саєЄ СЕ во ЗцЕ 2218
Аві);роржо АБИ Гув ТВ орув дго Тер обіу Тух бек ей нів Бе Меї сбху ох тей 725 кає чес ака зас Бас їає зда бос Єва ссес сва засо осає вже асе саз вав
Тук Чаї їі З1іу був Ту щіу бек рей Бо сія дронів Ті ті бій 73б 735 740 ваа абс зай заз гос сеї зда заз вс сес чої ааб да сса асп час го
Буш Щі уж сій Сув РБе АксЧ о Пув о без Бго уаї вп одкЯа Рко Іїе Ар 745 75 735 бач ваз ЧЕ бу спа вол асо сс азс га се За сс оса оса сса 2358
Тер їув узі Сув сія Аку Т1іс Маї О1у їви бе о біу вве АтТа Аїа рко
ТБ 75 то їЕсоапє саа Бу Зае бас о сесс дес ост аб се ба баб зсЄ боЄ вів 2406
Бре Тнж Бій Сув с1У Ту Рхо Аїа Пец Меб Рро цен Тук Аіа Сув о ї11е 780 тя 7960 саа сс: аз сад сс хек аса Сбс Боб о сса дося баб ай ссс БЕ сБд аа
ЗІ бек пув бтіа Аїа Ба ТЕ РЦе Зах ро тТйї Тук пуб іа РБе цей 785 во ва5 ас апа свая саксассатс ассабсаста ачесудссос 2832
Сув Пув спіл крій» їй «»х1з ВОЗ «Вій» вІЛОК «13» Штучна ко» 235 Синтетична конструкція «АПОз 120 сіу бід ТЕО дек бет був ювко АкФ Був сіу Меб с1іу Ту Дей рен Беж ї 5 10 15 чаї Беж Авлогхо (ем об1ім Ре Бе Бгто Ав онНів біп Пец ойвю Ркго діа о 25 Зо ри Ату АТа Ап озех АЗа АБО ЯКО АБроОТЕр одЛЕр пе вва РКО Аа був 45
АвроТрк ТтроРео сіб аТа АБ обіп Уаії сіу уаї сіу віза Рпе сту дей п 55 650
Сі Рае Тпх го рРко Нів піу 519 Бей Пец сім тур обек Бхо ПЗіпоА1а
13 а о сіп біУу тів Пез бів Тк Уа) вто Аіа АБапорко Рко Рко АТа Бек о тТвЕ 5 3 55 ав оАкУ сій Бек СІу Ак Та РО Тв Бгто Те Бет Бе рго БМ Ага о їп5 ї1о
Ар бек ків то бів Аза мес сій ТТ оАва бек ТВу ТВх Впе нів ста 115 хво 125 діа пей йши Адв орко Акт Маі Ахщш Сіу Сей тТук Рпе рРго діа у ЩіуУ 49 135 140 дет Бех Бек О1іу ТЕ Уаї вп орго Маі Ре ТВ ота Аза бе Рко Це 145 150 135 150
Зет Бех тів Бе беж Ага ТргоОсіу Авр ого дія Би Ав Мер 10 АВМ ї65 179 ту тів те Бех бі Ре Пей бЬу Ро Бей Без уаї їібсщ Пів о Ав с1У вве
ІННО 185 190 рве пей Тєні ТК о Ако Ї1е Гео ТВ тів рко бБіп бе рез Аво Зеб Тер хВва 25 205 тТЕр оТнх баг без АБ Рре лез б1у Бі1у тТвж тах Тв Суд вто ОБУ б1
ЗІ 23 дви бер іп бек Бко тн дех вип Ні бах Рто ТВх бек Сув Рго ВРго 225 230 2435 ай ї1їє Суз Рі ТУ ТЧТук о Акоа ТгромМек Сув цей Аже ду ве Ті їі вне з45 250 ЗЕ їй Бпе лів Пе Пд ей Су пе) ті пе Бей їєд; Уві пев ей дер 250 265 З
Тук бів сту Мек ред врко Уві Сує Рко рез оБви ро п01у Мрх бекотну 275 кв Ва бак Бек тп оці РКО Суд о був бат Св оТНЖ 1Те сБко АТа Ів О0Іу так 795 Зо
Бек Ме Бе Еко Бек оСув був був ТП о цув го Бех Авроє1У Аби Сув з5 ЗО І 3185 ВО
ТвгоСув ї1е Рко 116 Рко бек бек Тур діа Бзе А1а дкЯ Рпе Бей Ткр 325 330 355 піз Тур діа беє Уаї Ак ЕКре бек Тер цем бек їйей Ба ді Ро Рре 2 3а5 50
Уві бій Тер Бе уві БіуУу Бен обех Бгто стих ді Ткр о Гей бек уаї їїе 355 ЗО 355 тТЕжромМес Меб То Тух Тгробіу ро Бек Пен отТук бБет Ії Маії бек РЕа 31 375 Зо де тіє Еко Бей тий Рто Ті Рпе о впе Суб оїєй Ттроуаї Тук 118 бер заз 80 395 що
Тіз Бр оВко тук Був біз ле біу йїа тих уві бід пцей Пец бек Ре
Абе 410 ЛВ
Бе Бко беж Ар ре Рів бксо Бех уаї АтЯ Ав оГец Ге) Авро лок Аїд о 325 430
Бек діа цей Тух акт ОТ Аїз Бе» ба бех Рго О1їч нів Сук бЯет рка 1435 зап 445
Нів нів ТБЕж Аїв Бе Аг сів Аїа її бе був с тур О1іу бій без Ме - 450 У5 зба
Авро їм Ата ЩЕ ТкВ'уаті сву дех давл оцей боїв вно вс діа Бех дка 455 АТО АТ 480 піс їем уві Маї бет о Тух баї вва Уві Ава оМес З1у бец Гу Ме Ахд 285 дз: аз
Зїп без без Тур ормо Нів ті бек Сув зей Ту Ре Б1іу Аху бій те : ЕЕ У ЗМУ З
БО заз БІО чаї ви бі тую цей баї бек Бе Щі1у тах стр 115 Ага тТвкК Ета-туо 5ї5 50 за5 віщ Тук Ака рко рко Авподіа Бо Тіз їжи бек Те Іва; оБрко Сід отех 3 аа
ТНх.о Ма1ї Уві Аг АкчЧ Ага ПіУ дк Бек ро БхЗ ка Асо Таж хо бег зії ЗО З55 во пко ве о АгУ Ахо Ак бек о зіп Бе Рго Ага бу Акй Аке бех спів 5екх ва 57 5
Ака зі бек ой Сув О1Уу пва Бек вату Тує УаЇ Аза дкч їшо бБегобеюК
ВИ 585 590 вва Зак Ага Ії Ва Бий йіз ЗБ нів СІУу жає мМев бія дБ Гедо нів 555 00 505 ввробет сСув бек Ахау дви дез тує Мафї бек Пай Пец тей Ппей Тує сій 51 Біб во
ТАК оре бСіу Ага пу рей Нів без ТуУуж чек нів Рло Ііє тТіе Пец сіу
Би хо ві вай впе о АКУ Пук тїтїв о рто Ме: Зі ай б1іу Бей бек Ркб ве Бем Гей Аза
Бо 55 бСіп Бе Ту 5шк віа Ів Сув вет Уві а1і дха АкчЯ АїВ Рів Ро Бів ав 565 Б
Сув цен Азїа Ре 5ак Тут Меб Ар Авроуаї Маї! Бемш Зіу Аїз пуб бат вва 685 чаї січ Ні пе) бі бес Це) жпе Так Аза уаї ТТ Авло Вле Бей пед 530 5а5 700 бек беч піу ТІ Ніє Бед Ав обо АвпоМув Щає був Абу Тер обіу Туг та5 й 715 то бек Бен Нія Рпе Меє 51у Тух Уаї ї1іє СТУ Су вуж біу бек Пеи го
Ше 730 735 сіп Ар нів ї118 Хі біп бук ТІ Був Бу Суб Ре дя Гув цей ВКо та 7а5 ща
Маії пет вхо РКО ї1е Ар огКо Буя Уаї Су бій Акш о тів чаї бли та: т 760 753
Тна МІУ Екпе, Аїв Аіа Бко РнеаотТвк Зфи о Сув б1у Тут Бко Аза гей Ме о 775 тео
Его Тем Тут ліз Пуя ЗЗ4е сів Ват Був о сіп Ата РБе о твВк Ве бек его 78 За 5 бо
ТптІ тує Був Аіїа Бе пед) Сув Бу 1 05 «я» Тих «її» 1988 «Вій» ДЕК -213х Штумна «в? «Ви» Пинтатачна конструкція «ВО» каву ЩО5 жом (а71..11959, «4005 151 схаєксцсса ссасочусєсяв буачусассю зсуаЗз щує са бору ос Ссс о аза 5А спіу піп Тур Бех Бех Му 1 З сс ача аач яЯче ас час асо ав Са ЄС зба шоб аас о ссж сес зда хо
Еко Ака ру: бБіу Меї біу Тит о АвпоПемй бе оуаї бек Авпобко рен С1У їй 15 кт)
Ес сс сса лає пас осад ста дає сса Ясе СЕ со ясе засоацї дес їз
Ріше ве рРко АвБр Нв Са це) Авробто АтТа впе Ату Аїа дв о бет 1 75 15 35 айс сса чає бачу час ссс аа соб озає зач чає асс тла ста дач ясс 138
Ані РКО сАво Тир о Ав рле дл вхо Ава ув АБЮ ТК Отто хо бім діа 49 ал ЗО вас сач ча ча збе са ос Ес озає сва як се вот сов сб сао пак
АБ біп Уві сіу уаї біу Аіа ре біу ем піу Ріє Тих бро Ро Нів
За 59 5 76 с аа ста ста час бод во сса бай сса сел ЗУ вс Ка сва о всо аа
Сіу пу Беж їв Сі1у Туробек РКО бій АтТа сі пСіу дів Беч бій тик
ТБ що 85 ж ссвсуєс аяво сст о сса ссв зп бса пасе заб вча свя беб зд аа за уві БРко Аза ДвпоБбко рхсо Рко Аіа дек ТБ Ази Ага Сіп дек ЗіУу йте зо 5 160 тав сса апс лего ав сс осск сес сСсв о ваов дай сок осак ос тає пед 350 сій ого тн рко тів бек обро рез це) Ахч АБ Бех нів Ра сів дій т05 ІТО ї14 акч са зу йас са асз асс сЕжЕ баб сова зас сс БЕ цвс ше ящх 438
Мек сій Тхродво бер тпЕ Ток РАЄ Ні Зі Аа дес пе) АвроБко Ах 150 хаЗ 150 чес айву чує боса Сас бо сов зе сок бча се бра песо зас абс ех 285
Уві та Бі реа Тук рНе Рг А1їа біу СІМ беж бек бек Бі ТТ Уві
УЗ. 148 145 МБ зає сеї дос сса ас аса чса са бєса ВЕ са сс аса БЕ се адде Ба
ЗвпоВко Маі рко Тк Тв Аза Бех о бго І1еБ бве бех Ї1із Бе бе дру
УЗ ї50 їв ас пеЧ цзб сс дер сс азб аб дай зас абс яса аб ооає сс о сга 82
Так осіу дво оРко Азївз Беца аАБВ о Мек слі Ап отів тих Бек бі ве опе ї178 Іїт5 ї80 ча сса сса сба ЯсбЕ сра баа Ясс о дда бСЖ бро ста вро васв во ве 550 піу Бо цех їєйп Уді Бей Бій АТ сіу Бпе вне без Би ТНЕ Ач Т18
ТВ їв ЕЗ5 се асе вої сеї сад вас сеї дас бос обч соя асваоссс ба ває рес 57
Тем Тв тів Бо біпобех Тез Авробех Тур Тгв о Тах беж рез Авпо Ре ща ев 1 сс сдадс паче аса аса аса суч сов час сваа аво Коб саа са ссвовсє таб її сіУу піу ТАЄ ТвеЄ тах був ро сіу блю Ази обБеюо бід беж Бгто Тех
Ії НІ 25.5 236 їсж ав себс боб ссв асСа Ссї сус соб сса абс Бае сба зує сассада: ТА
Бек два Нів бек РКО Типу бек Сує РКО Рто Т1е Сув ро Б1у Тук Ака 235 пай АВ та аб сасє бод ваа ацо сс ве сво БЕ ств пес аре соо ра со даї
ТЕв Ме Су оцез Бхз Абу Ейе Ма ї1а Бк ії: бе Те Бей їн Се
БО 285 650 ба ск ас вс сс са адба Єсп скдподас бал сва зше вбу стс сса я7О
Сув рен ї1іе Епе їсгц Пец уві Бей Гей Ав о ТУс с1побіуУу Меб ред Вго 26 27 Кая щі кас сс св сс о ссва аа ас сс аса абсссра аса уча сова са. ВІВ чаї Сув Ро ей бе» Бо З1уУ Тк Зежї Тк оте Бех Тк обі Бкго Сув 28 285 з айа аса бас вс абсо ссс зоб сала сдаа аса са ай БЕК сса єї бе зб
Тув тре оСув Тк о БІіе Рко ліа о зів бі Тех бек МЕС Бе Рго бек оСув 300 ЗО 319 кос кас асае дав сса са чає з4с аає сабЄ асо ває вса ссоа вба соа ї0ха
Сушко Сув ТНК оБув о вБко Зет АБрозіж вва Сув ТТН Суд Ті Ббто її Бкб 315 зго 3 ач коса гГочя єса сег цес о сУуЄ ес се бо дач бод зе бої чЕЗ вах 16057
Зак бцех тр віа че вій дкоа Ра Бей тТкробіЯ Тгтволіз Бек ма вка з30 з35 340
Есе жеК Боу БВ ач ссу ста дес сса се збу са са сбЕ сб де їла
Ра Бек Ткр без бдаеж пей пен уві Бо сбав Уа ба тур Бе уд пі з45 35 355 ск ос сса асо ЩЕ Фу ств о ЄсеЕ сс есе бб5 аа аба сша бас осо 1158 їз бех Рто ТВ Узі Ттро іє бек Уві Тіз Тр Меб Меб ТЕротТук Тер 150 385 316 чяс сса вас пса бас боса абсо Бар бла се ре ас сс ска ста се ї2аб біу Рко бек їсм Тух беж ТІ Маї Бек Рко вйе ІЗе пко Би інцовко 375 зво 385 380 ак яв со Єде сс су3 УС пас або сдаб ав одає ссе бас оавадг заз МР Ба 112 вра вЕце Сув Тез тир оуаї тую тіє Аво І)є Авю Рус; ГПує у І 335 00 до
СЕ спос яса вса чсс два га Еба бса СЕ ста ссз боса чає ССС ск 1302 вве біУу АТа ТвВк Уаї сій ва Бе бек Ре Пед Всо Бек дер Ре Ре 450 15 420 --гта са с сус чаї ССЗ са чає асе са бос оче се паб заз дай 1350 вко дек Уві Аку Авробєі ебч Ав отТах Аїа бек діа пец Тух Ак жк 425 4аза 435 зса су ува са сся дав сво пас сс сса сає гас абс оасе стос азча їз88
Аіз'ре бій бех Рго бЗа ну сСув бех Рхо Ні Ні Ту йта Бей дгу 245 445 до са сб аа кс бос саЗ зов зо сіб ас еаб ста бос ас сад саса ІЕЕ ія аїа т1іе їв Сув коробі піц пез Меє Ав пем о Аїа ТАкКоткр Уві 455 50 165 о чачЧ гес азс са дав Чаї сс ос веб оача здза со Че За ес оба Тева піу бек дви йо Ти дБр орто Аїв Бек Акщ бій ьо Чаї уаї бЗехотух аЗ Аа «ва зсс ває зо вас асо пу сс ваз ас аа саа сс са ссже вес сає 1545
Уу«і Авп Уві Ав оМес ЗіУ рей їв Ті бра блю бю ін тр ррде нів «90 485 зба акЕ са баб бра зсе ЕВ чої аза ав аба за обу баа бас гез ас щ59о тіє бек Сув Пе) тур о рде бі Ага біс тах Уаї без ста ТуУух тез Уві
ОБ 5Ій зів ак кс ої щЕс суд ас ада асвосса сов дса зб ачЧа сса сса зас тва дат ве» оіу Ууаї Тер тТіс дта ТІ рко Вко АТя Тук дк вВкКо рРБО Ах вас пи 53 й са сер оаса ко зяб ас о сбс сса заз зо асо збо зо вд зоаа зда 1885 діва ро їіє рез Бех ТНЕ ви Вго біл тТвх Тк уві Уві без АкУ Аа 5а5 80 зах 0 чес ача пса сс: ва ада вач са соб ба сс вза суб аа сЯб Бе 1738 сІіу Ак Бек ро Ак Ага АхЯ ТВпж РКО ех Рто АхЯ Аку Ак Акту бек 555 І 555 сза сс сса аа сс зада аа сб сав сб оача ува боз саа бас осає 17852 іп обБех ро Ака АкФф Ак Ага беї біз бех Ак с)іш Бех біп обСув Нів
КИ 5ВО стс са са вза час ста кб ос боє дса бе о кес сб Че дао оса Во
Без бек огмей Аку З1У йна Ре Маїс бує іа РБе Бек бек Аза У ро 285 з 585 гає дсх сас сад Ес соб сес аза піс са сає зав сяє аср о сес ау ї878 дви ваза мів пів ре гей Бко Му Маїф Хей МНів пу Ака Так оїеу ПТУ 09 505 510 пса вує дсв аа сс ас ас аб се: саду пса баАЕ со заз дат що 1926 гей беж діа Меє бек ТИХ ТБ оввробец біб АбФа Тує Ре 1уБО Ар СУ 5І5 536 625 630 ба КЕ заз дає ба зва чач сво Зо паз чає сазссдесвос восассвска БУ іа вп ув АкроТкв спів бішорез Сім со 9 535 вай звцспусєеще 198
«81й» 29 «ЗУ» 654 хшЖ1?х Бідок «2132 Штучна вх «вий» бинтеткчна канеструкція «400 192
Зі стій ТХробек Бек Був РКО Атст був о с1уУу Ме 01у ТЕБЕ АБпотец бак ї 5 15 15 чаї ак Ази Бко Мей біу Ріо РБе гро АвБЮ нів бій без АброрЕо Аїа 2з 35
Епе Акта Аза Ба бек діа Авд о РтОо Авр отр о Авр Бе Ап, Рко Ав Був
ЕІ 45
Адеротах Тв оВхо піз біз Бл сій Увь піу Маї б5іж АтТа вБе бі без:
ЗО Ба Ко
ОІу вне Тк оБхо рхо Ні СІ1у Сбіу ев пед піу тув бЗегоркго сів діа 63 то 75 ай сіп бі» Ті Без Ота тех Уді Бо Аза Ави Бо вКо рхо Аза бах тп 85 з0 ах вві Ага сів Бек ооіу дто Сіп оРро ТАЄ Ро тів Бек ре о РеО Без да 1650 105 110 хвробет Мін Рхо бій Аза Ме Сіп ТктроАва Євк Тк ТВ Ре нів 31
ТЕ 120 Т5
Аїв їем сей АБИ ро Ако Маї до сі їБеу Тужш БНе Бо Аїа б1у 01у 130 135 їла бек бех бек бі Тк Маї двй ро Маїі бо тах ТВж Атїа бек о всОо Т1є 145 Бо 155 186
Зак бек лів пе бек Акт ТВ сіУ АБв оБко Аза Пе Авп о Меб ср Ав т 170 175 їіе ТЕ Сех ку пе реп БЗЬу рЕО їей іс Уаі Мей біз діа сіу Різ
НУ; їх 190 впе опей Тей тій ака ті пез тп І1їе рхо бі бек Пер АвроЗек ТТ
1955 240 295
Тке Тв бек ей Ав вце Бей П1іу піу ТВЕ ТАК о ТнтоСув о Рко бі іп 210 215 320
Ал обек бЗй о беб Бгто ТВк бат АвБп оНів бек РІО тре бек Суб РЕ РІО вах 230 35 24) тІе був Бе ОІУ Тут дгЧа Тур Меб Сує Бем йха аку впе ї1Ке 118 РКе 245 ша 235
Тез оврое 118 цео цев МеноСує Без Ї3Зе вре Пец Гей Узі Сен Бей двр 2560 ва 519 тТук біл Сі Месє ей рко уаї Сув ржа Без БпеморЕО Зіу ТЕ бек ТВЕ 275 зно 285 тв дек Тк бім Рко Су оГує Тк оСув Гвк о Т1є Рез» Аїа бів о сіу ТВ 290 295 300 бех Ме Ріє Рхо бек Сув Сув Сув Тр опув Ро Чек Ар о Зіу Дек Су 305 510 315 330
Тих о Сув ТІ вхо Тіз Рго Беж бет Тер одів КНе діа Ако Ре Бе чо зах 330 335 бій Тер Аза бек Уа) Ака Бе беж Тюкр ої) бек рев їв); Уаї Бо Еве 440 345 150
Уч бів Тв рРАае УуУаї сбіу Тез бе Руб твхоУаї кр оївоиа базу Уві її 360 365
Тіт ме Мес тео Ту откроплу руо Бют цей обтук Беж ї1е туаї бек вка за 5 350
Вие їі Ро пез Бей Бо тів впе Рпе сСує реп оТер чаї Тут Із Авр за 1390 395 за
Ті двр о Рко ус рує Сі Бде Бім Ліва тик уві іп Гей Бей бек БВе 405 ї0 415 ес орхо беж дер Бл Бреста беж Уаі Ага дЕб 1еа цей АБО оТикК дів 20 . 45 230 пер ойАів Па тух йку Сід о Аївз Пей сіл лек вто сій Мія Сувобех РКО 445 з4а 45 нів о Нібв ТБк дів рез АкУу бій Атїай Тіе їеб Суб Тер обіу бій їей Мер що 55 що
АБп ої вів Те откооЗаї БЗіу ех Ав Бей піс Ар Бко Аа бек Аху 465 473 475 480 сип среп угь бах Бех Тух Уаі Авпоуаії Ава Ме ту паз ув 11 ко 185 аз ач
СІп оцей ойец Тжхро Ре Ніє Ї1е бех був оцей Ту ББе обі Ах бін Твте до 55 я о уві Бей бій Тук Бей Маі бек Бпеосіу уаї Тер оті йо Тк Рко Еко 515 30 за25 вра Ту Ако Вухо ко вай Аза РКО ті Бец бек ТК тен во 01: ТЕ 550 535 БИ тик Уді Уаі Ака Ак Ату іх дка Зек Руо Ака Ак Аго щаЕ о ркКо беу ва зво 555 во ро Ах вхо Ах Аха Беж бій бек вхо Ако Аху АкЯ о Аку Бек обіп бек 2655 зб а
Акта бім цеху піпобу нів Без бат ої: да біу їй пе уаї Сув Ата
За 55 530
Бпе Бех бех Ада біу Бко Авюи АтТа нів пі Ре гец РКО Був Чаї Бем 55 5 205 ів пувз дксстТйпх Бей сту цес бек Аїа Мек бву ТНЕ ТЕЖ Авробе) 01И 615 52
Аза жук вне тує Бр оСув цей пе пуб дО ТЕрВ Бі сія ев оту БТ
БИ 63 ві35 640 сід «й ІЙ «вії Вб «ВМ» ДНЕ «813» птучна и «3» Синтетична конструкція
«вах «2012 СО5 хай» 31..(0БЕЗ) «апОз 183 завсссоооса ссасчасова Ззавзесссе зссваяс зб сву са со со оазва 54
Оту піп Тр бек ех Лув х 5 сет оача аву ус асо еле аст зав ся сії Яра сс вас соб со зцча То» жо дк ів осСіу Ме БІУ ТБ Ап оМец бек уаї Зак о АБдоБко пес Б1у 18 15 29 есе ЖЕК себа чає бас сву сш чає бса чсї ЕЕ бої зсє вас азс чсх І50 тпе вве го дю Ні Бій Бе) АБроОвБтоа Лія ра Ака діа дви Бех АТа 25 зо 35 азс ссав чає сзт чаї Кс ває соб аз азу чає асос бе о сса дв че 138
Аапорто АБО Тр АвроБре Аа орко АБО Був дер оТНу жур Рко бій АТ 49 45 о зас сза чса зча че сла сс сс дцУук сва чер сов оасс осса ссв осас 246 деп опіп уві сту Ммаї піу АТа РНе бЗ1іуУу Бец о О1у ре ТБк Бко рео Нів а 5 79 час аза са ба заде поау ачб о сса саа са сад зах абс и; саа асо 29 сіу іу певи ре) бі Тр о бек Рко Зі Аїа Сів сту лів гей бів ТЕ 5 Во 85 сс сбса дес вас соб осса сса псу са вса аах звуа пає боб чуб ада заз
Маї кто Аза два БО ЕКО Бо Аза Бек ТЬБксоАво Ага сій беж с1у Агу зо Зх їб0а паз пса асс сов аве їсвонсв ссс їса ауа сас соб сає соб осау ас за сіп ого ТВ о ркго с тіє Зак Бто Рго Ба Асу бвробек Нів бро біп о Аїв і05 110 115 ві саз бо аас Сса зсу асо ББЕС осає сва сс се гу Час оссе ацда 18
Мес сів Тгр оазп обет ТЕ Та Бпе вів Сів Аіта йвеч їем Аврорго Ах 125 125 30 чес аза чав їжа тає бо сса чо ши Зча сс бсвосбсс зде с ЗЕ ве у«і вка сіу їеип тую Бе ро АтТа О1у біу Бек Бех дек ЩЗ1у Тк Уві хао ав 50 ав се дсс сса ас аса дса бса сса ак оєса ес ава сб сс аса 534
Ави рРго уаіїі Рхо Тк Жак оба ех то 116 бех Бек Хі Ре слехк За 155 їв 155 ас соч чає сок вес сс авт ау уда аас ас асв асо оце бе оста 582 тНеЄ сіу АвроБго діа пец АБИ Ме сі АБ ї1е ЇВ Зек бі пес цей 170 5 ІННО ста ссв Єба са зубр о сха сава засос осча БЕБ СЕС ста пса асе апа абс 530
Сту Рко Ббесп бен Уві Пем 510 Аза зЗіу Рце Бйе цез без ТЗ оду 11 185 уча ї95 ства заб ас со: сад аз сб: Зав пос по бл зса боб сБу зай во Я їм Тву Гі ко сіп ех пезч АБ овек Тер отТур ТО бек ей АБ пе
200 ак 215 сте дос ва аса аса аса счі осса пас о сва аас сс сва са сса асб ТБ ем бі ЗКУ ТВу Ту Так оСув Рко бі біля йо бех бів бех ро Тих 215 220 275 735 сеє айс сас сб осса аса беб де се оба абс бус сса зчЕ Бас вада а бек Ап ція Чех Рго ТБт о бех був рхо Ру їі Схв оБко СТу тук йху 35 240 245
Сад оахо Сас СЗЗ ача зо сс абс аб ЄС са Бе сабс сбо сх св ни
Тер о Меє Сув цей Аг Ак Бе тів Її РБе Без Бйае ї1їе пей Бей їв 250 255 БО с ст ас со сес ста зуба сов сбЯ зас оїас бай бас зра сс со 870
Сув ее» Ії» сбБе їдеш Бей Узі Пец ови Ар» отТУХ піп 5БіУу Мевопез ра 2655 270 а пс бас сеї ста сбу сса Яча асо о ссс аса вес обса с аса зда сса з з15
Уаї Су Рхо Ме; пен ро СіуУу Тк беж Тк оїнЕ дес Так О1У вКо Сув 850 285 230 ваа ос аса Еш все озЕс сс Япсб осза ча дов о бса ах СЕ сова сб оси че ув о Тпк Суб ТЕ о Тіє Рго Аїа біп 01ЇУу ТП обех Меб Бе ко бек осСув 295 БІ 305 за ас сСоУб аса зай сса ба зас ЯщчЕ зає ся зеС бас аба пса аба ста 1014
Су Сув Так Був Рто бек Акрозіу дп о Сув Ту Сув Т12е Рхо тів о рЕб 350 325 ач ста го чса б дос о сУуЄ бос сс Со4 чат очо се Ко УбСа аа 1952 ек обеїт о ткр Аза Бп» Атїа ру їйе бен Тхр сі Тер Атїа бах Уаі1і Бха 330 335 лад се ЩЕ Бач ста вас б ста зоб са сс зЗбЯ сач Су ЕСЕ чо зас 1110
Ве беж то ей шек Мен Бей уаї Ро ББе баї шів То Бе Уаі 01у 345 35о 455 сЕщш СЕ сов асо Я Кау ба ср ЗЕ ас стає асо оо Вс са 1158 їец бек рко ТБк уаї тр ооеа чех уаЗі її тк оМмеє Мер оТкр о тТук о тхр
ЗО 365 то час сса азс сва каб бса або Усе сова соб СБ абс осса ре ста сс 1206 біУу Рко Бек Пец Тук беж їі уві Бек РКО Ре 1їє Рко Пей пБеморхо з75 285 зв 330 вто ЕЕ Бк хаос сбо оц б базсозбс дбає вс оцас ссс бас ваз уаа ї234 її Ре рРае Сув без Тер оча1ї Кук охіє Ляр Ії АвроБхо Тух Був бій 135 00 чо5
КК зао зсв апа чес чаа бе сбсз ба СЕс св осев сСсвао дає сб се 1305 вро біу іа тик уаї сій ресйогеєві Бак Ре мед ро беж АввоБпе РБе 41 415 ато тов са за сук чес бус Ка час асу дев ссс Ус бу бас озза зав 1350
Кто бек Ча3з вус Авр оце Шєед АБЮ бик Ада шах Аїа рем Тут ако бій аа 830 235 уса сь баа бсасспоа зЗая сСсес бер шої сса сас све асбозчев сс вав 1398
Авіа без ЗІ бек Ро Зі нів був Зах Бгто Нів Мія ТВж о АТа ту АкКа
А 45 250 са чес ака ста сб соу да чЧчаЗ Бо аку аз особа Зсеб ас їз два 1545 бій дів те бїец Суя То СТУ 015 іїєц Меб Зв о Гец йіа Те ТкроУді 555 46 55 КАТІ щоеч сс азб ос зва зак о ссб смс все аа дай сбЗ За ака бе бас 1454
Сіу Бех Авп оре) сій двБр Бгто Аза Бех дху 51 йейп уві Уві Бек Тук
ЕІ 480 485 зЗ-с вас бе вас за зба бро ваш ас зда ссав сек Ба Бу сс саб 15123
Чаї дов Чаї йепоМеЄ сОїхж пея Був ті Аха бід без еЯ Те Бас Нів 290 ав 500 ас са бої ббБасасу СЕС Зб вода аа аса діа сс дай баб с вба св І5ЗО ії1е бек Су пед Тк пе Му ка бій ТВ оуаї Бей обіз Тух Гей Меї 55 5 БУне! ат Ес З ЗЕо Ешу ас ада ясз ссв сба здса баб вса сса сса ває ї6538
Бех ле бі Уаї Тер ті Акоа Таке Ро Ббко АТва Тук Ака рго Ро Авт зай виб 530 цез соб ака сгоа звук ас бо сов даа вс асо уко ЧЕ во зда вача 15
Аіїза Рго тіє реф бет ТК рей вхо 13 ТЬжх Таї Ма) Маї5 Акч Ак АКа
Ай зах або чує вза са сс ауч ача азу аса соб са сеї ада суб вда са бек 1735 піу йхо бек Ртго Ак Ах Аха Трг Бо бековБго джу Ах Ак Аг бех а55 560 з65 сва ксї оба ауа суб ача ада ве сва сб о аца чаа са сав сус дае 82 сіп о бек Рхо ха ака Аг Ах бекобійп беж йге (із бек бій Сув ШІ1У 51 та БО ста себБ ача баб чо чес сла ста бса кс ав бег осзї абс се нас 1830
Бей беж дк Тух Заї вів дка ей бех бак ки бек ку жі РБе Авй 585. ЗО 55 стає саа сас здче зоб аб сав заб сб саб одає ес Са вас вада вас 1875
Нішв сі) НЕв о 01у Ту Меє бів Ав опер Нів Авр бек Сув беж АкФ Ал
БО ох. біб зкЕ хає зба за сус ска сб оєса сао саа асе всс дос ада вав се 1875 їй тТук маії Бер Бей се) зей ео Тух бів Твх Ре слу Аку Був Тез 5І5 652О 625 я сас єв бас бес саб пса ас зба сег Час ЕС апа ваз воо сба аса їаза
Нів рез Тук Бек Нів Рко ї1іе її Без Піу Ріє Ахе Пує Ті Ро Меб 535 546 Бай чач ча дає са бос осса КЕ сво СЕС усу саза кс засва веб аса ас 92й
Зі Уві сьж бей ет РЖОо бе реа дез Ата бів вра Тпє бе АтТа 118 ев ва ЕВ ес сс я чес ача аа че сво сов св ше сс са сс св Бас 070 сту бек та чаї АкУ Ако АтТа вре РЕО Нік Сув цем діа Ра ех Тук 255 87 575 аа чає чаю чЕсосис ва оте чес ваза ач доз сай сві ср чай ЗУ 2115
МеК Ар Авроуаії Узі цей Бі Ата Пув йвргоуаї сіп Ні Бей біз бек
ВО 5 59 сл Бсе всв зсс зга асї вас б о стс соя са ссз дя абс св сх 215 тем Ре тп Аза та) ТвЕ АБИ Ре Пец Те бат ей осв їТес нів рей 635 ай 75 ту азс соб щас вала аса аав апа са лег бас веб ста се сс абе за 2215 двпобВко АЙ Ту Твт опжв Ат ТхросСтіуУ тТук бек перо Нія бе Месозіу
ТІВ 720 ТЕ5
Бас сс аба деп бдс баб яда сс ба сс гаа час сає абс веб осад вве
Чухк уві Ще о1у Сув Тух біу бек пе Рко Зій Авр о Бів Г1е тТіе ЗМ 730 735 ТА) аза йо ваз два ас ссср оаза аву ККУ сої ор вас аа соз ато чає 2338 ув Тіе Пув С1з Сув Різ Аку Був Ше) Рко Маї Ав Аку Рко Ті Дер пав то 755 гоз аву ЗсЕ БУЄ сва ауд аб пес зу віа ск сао сс оз яса ссвба 2358 тЕр гшв чаї Сув сій Ака їїе уві сІ1Уу пей МПецп бі вне Аіїа Аїа Ро тво тва о
ЕС асо саав БЯЄ дес бас соб Я4сЕ ста всб се ка бах зо зр оаба ай
Ре Твх сів був біу Тук Ехо діа пи Меб о Рхо бви тую діа був 118 та 7 "785 730 сва бсє вад саа сш БЕ аса бро ск ссв абса їас зад псо БЕК Єва ря дій беж був біз діа Бе Таро Ре Як о Бко Такотух був Аза Бе Гей т95 80 во5 гас аза саа бас ска сса ста аза ча се сб чех се зе ско пос ой
Сув бує Сівпонів Без бЗетг цез Ах біу Бей Ре УМа1їі сСув Ат ріпа бек вто ІВ вжа пар одса дос ста паї дса сас сад СЕ ся сс ава зб ба са вах 55
Бек Аїа зЗіу Ро Авповіа нів бій ге пем ро Бук уаі Тем Ніє Був 825 вза 835 зча ас ста ячо СБУ сс дцеа ас пс аба ас чає сба зай сов са 2598 дка таж пей сіу ем бвт Аїа Ме беї ТЕ ТВ АвБю Тез б1в Ата тує ща 45 850
Кс аа час СчУЄ с сс заз чаї оч са чаЗу Соя Че чай чау 2643
Ре їув АБЮ Суд ре; Рпє пу Авр отТто ої сій фев сІтУу би о1ч
БО 85 сзассвісавс абсаксаєса азсадсосоє 2572 «10 ІЙ «11 ВЗ «й Шілоне «її» птучна «ЙО «ПЗУ Синтатилна конструкція -00» 1525
Сіу бій Тер оБег бек Був РК Ага Пув СЛУ Меб Сіу Те о Авоаорец Бех 1 їх 16 їх уві бБаж АБИ РхО рей су Бде Бе ро Авронів біб во) АБровго Аза й 55 30
Епе Асч АТа АВ Бек ата Ав Бгто Бор оТкр дар пе Ап орто Авт Му 35 40 45 вАво ТйЕ Ткрорго бій Аїа ляп ЗІ уаї сіу уві Б1У АїЗ Ре бу Бен 55 во
Зі Рце Трх Ехо ко Кіз піу БУ їв реч біу ТткробБет РКО сіб вза 5 то В во
Сіяй біу ї18 це) бій Тк оуа1ї Бгто Аза дю Бко Рко Бко Віза бек Тк
В чо 5
АБИ дхуФ4 сСіп бех БіУ дк Бій РКО тр ро ї1е бехсорко Ре ем дкхФ
ОО 105 ВМ
Вер обет нів го біз М1а Мес бій Тер Ява бек ТВ о тТНЕ РАе Ні сла 1285 Т2
Аїн їен о сец АБО Рро ка Ууаії Ара б1у цей Тук Бе орко діа біу Б1уУ 130 135 40 зах Бек Зак ЗІу їлх Уві дви Бко Ууді рек ТВЖ так Аза Зек вВЕОо їїа 145 150 155 160
Бек Бек її Рие беї Дко ТБжх біу дДвроВко АТа Бец АбпоМеє бій дат 855 ї73 175 її таж бЗеб біу Ре їси бі во цей рез уві зей бсівпоАка ту Бе ї8о 185 136
Бе іецй пей ТВж о дка Іі пез ТВ оті Бо бір» зек о їйеи Абробек ПЕВ 185 200 а0А
ТЕвр ТБ Белл Гео дви Ре Пец о зЗку О1уУу Ті о тТву ТвУу Сув ко Сіу пів 25 ТЗ
Авю Бек біп обеб Рго Так о бех АБО Ні бек Рко ТАК о бет Су орко рРхо во КУ 35 233 тре Су ко біу тТук Ак ТКр Ме Сув о звмсАкКу ДІЯ вне ге її реа пах ча 255
Бей оВне тів тва ре Бей о Сув пен Т12 Бе сер о Гец Уаї цей їй АБр ко 255 ато
Тук бів бСіу Меб Гей оБко уві Су Рко без цем о рко сі Фпгробех ТЕ а РЕНІ) 85
Так бек ТАК ОЗІУ Рго був су ТЕ Сув ВК Ті бро Аза опа с1у так 290 ж 35
Бек Меє Ре РЕо бек Сув Суб Сув ТЕ Був РКО Бек АвБр сту Ай Сув 319 315 зо
Тк Сув ІТїе Рхо її2е ко бет Чех Тго діа ре Аїв Аа Бе Гец Тур 325 зу 335 бій откер діз бек Уа! Аку ББеобех Ткр огбсе ех пеу йем Уві Рго вде 350 заз 350 чаї сіп то вре ба! біу зем бек РрЄЯ Твк узі Ттроїшм Бе Уві ТІїв 355 350 165 тхр меє Мав жор ТУЮ Ттр О1іу Рко бєх їви Тут бек Ті уві бек Рго 373 375 380 вне тів Еко ем іє Ето тт Ре Ре Суб зей тро Уаі Тук Їіе Або 385 КченвІ 1935 оо
ТТБ АБровжо тТук Був ліз РВае о біУ АтТа тах Маії СТ св огеизч бесб Ра 205 4160 315 тей Бго ЗероАєр Ве Бе орто бек уаї ку Авроїео Пе) дер о Твк Аза 480 4-5 230 пек дів цей тує Аа стій Аза ооа сій Беж Бо бі: нів Сує пек рго 135 440 745
Нів нів так дів пед Ат О1Ь Аза шіє Без Сув бюро біу бій Бей Мей
БЕ 45 яко
Двпоїяи АТа с тТцЕ Тур уві Піу бек ав оч 013 Аер Бко діа Бех Ага 455 Аа 475 480
Зі гей таї маї Бет Тур уві Айва уаї Ап Меб сту Тен тує Т18 ду «85 80 АБЗ біпоіеи б тер Ре мів тів бек Сув бен Те Ре Зі Бка сіл ту 5 ЗБ ТО
Чаї їеч біш Тух їеч уаї Зех Ре біу уаї Тер Іїв дхо так ово Бгто вай 525 діа ту о Атч Ріс ро Авп оАТа Рко тів це бек ЖвкК пещ Бко біб трЕ 536 535 БІО
Тис Уві чаї дгу ка АкЯ О1у Ага бех рко дха Ат АКа Тпх вко бех
АБ 550 555 БО
Рто Ака да вка АКЯ Бек о Зій бет Бго Ака Ву АКо дра ех сій дек 7655 570 БВ ахч їн век бів Сув сіУ Гео ше дз тТук уат Атїа йжку тей Бек важ зви 585 50
ВвюИ Жех Ак І1е Рпе Авп Нів Сі нів я1у ТВ Меб білоАвв ей Нів 595 во 605
АвробБек Сув бек о Ако зв опей оТух уаї Зекопем цей пцеа пев; о тук бів їй 515 МУ
Твк о вбре біу Ахч Туя Пе нів без Тух екс нів Бго Ті ті пейобїу 58 53 58 АС вве ака пуз Те рко Мер бігу туаї б1іу бе) бет хо Ре Гей Геч АТа 545 650 655 сій Бпе БЕ бех діа 116 Сув Зех Маї Уаї АтЯ Ага Аіа Ре рус нія
Ба 65 67
Су їєш Афіа Ре Бех ТуУук Меб АвродвО Ууді Уві бецп о б1іу Аїа Був Беу 575 Баб е85 чуаї бів онів печ бТа беж тео Вде ТНЕ о Аїв МАї ТвВт айви Ре о бецй бе 530 ва бо
Зек уеч З1у 12 Ні Гем АБ Бо Ви Пую тах був Аху Тхробіу тук по 710 т7ІВв ШЕКЯЗ. бес ей Ні РЕБе МебобіУ Тук уаїф їі ЗВУ Сув о тТук 51У бек рей ВКо 7» Та та бів дво онів тіе тів бі бує тів Був Біл Сук РЕ вхЯ Був Ппей вго тла ев тва уаї Ап Ако Рто ІТе АвроТтропув Уві Пув бій Аго Ііє Уаї біу Грей 755 50 755 їей щі Бе Аїд Ата Рус о рРНе Тк обі Сув о сЗТу Тух Ркб АЇв Гпей Мес 778 75 780
Бо ем бух Аїа Суб ї1е Стів Беж Пує Сів бів Ре ТЕХ ре б Руо 7аз їза 795 80 тик Тук Був діа Рпш Бей Сує зує СТ Ні бес дет без Ася с1Уу ви ой вів 15
Рпе Узі Сув Аїа Ре бет пек вла сру гго дей віа Ні бій Бе ей 82 25 830 рого пуд о Маї Ппем нів Був Аго ЖНю вва піу ев бек Аїа Мес бог ТЕ ва5 4 бА5 так оАвБр о без сі АтТа Тух Рре Був АБЮ Сув ев Рпе бує Двр о Ттв Та 85 55 БО сім гей сі дім Б 555 «2105 195 «211» 8572 жо НК. «2135: Штучна «ЙО» к«воЗ3» Синтетична конструкоія ях «ді СІЮ «й» (37 р..іх5БАЗІ «500з 175 чавессозссв ссасачосза сааочсзссс аосваб ча сви сЯдб бос рес аза 54
ЗіУ бій Тер Бех бек. Гу ї Б спі зов азу чес веб че асе ває су соб ба вок вас се осто зда 1025 вхо дку їм 0іу Меї біу ТНеЕ АБ Тею бек уггі Бек АБИ ргКс Пенобіу 19 ї5 о
Ес сс сов аб сао сау ба дає са сб КК ся сс вас зуб дос ї50
Ве РБе гго Авр Нів сіп Мей АБрорхо Азія ре Ак й1іа АБпобЗек ХАІ
КІ 35 зас ссв пас слу чає ес аа бос ває заст дво асс сах ссеа Зд3 Чо ВВ йБІ ко АвО ТЕроАБр Ра АБИ гро Азй Був АБО ТИ Ткр о рЕо бЗіч діа ча 5 хо зас сваз чра ода чес зда псс Іс лаб ста зЗаЄ сс асо сса веб осаєс 246
Ада бію уз бБіу уді віт Аїа ра біу реа сіу Ре о Тве рко рЕФ Вів
Б Б 65 то час ча ста ска дує соч адс сса сав зса саав чає асе ру саа асо 254 сту сіу Бей тео бі Ткробак Рто 01 АтТа сій біу Т1е їіви Сів тлу 75 о 85
ЧЕ сса зо ав: сс о стса ста чся са во аа аба сач4 сх Фах за За уві Бко Аіа вп Рко Бо гло Аіа йех ТУ Ап обха бій бах З1У дра зо 5 100 сза сса асс спо або сої ссс сс ба ваза час сб саєс ос беф че 330 бій оБко тах БЕ її Бех о рхо вго їз дгО двробек Нів Бго сій дів 105 110 115 аа саз сс ває са вод асс с сає саа зоб сс г дає соб оаза 439 мес бій тр одяв Шех ТВх теж ББе Нів бів Аза пе Бей АБр ово АхФ 129 125 130 чі азя Чу ба бас сс о сса ясс ЧУЄ одЧа бос осбса бссодас ас я 486 уаї дка Зі рез тут Бе рРто Ата біу піу бек беж бех сіу Тк Чаї 135 1433 145 150 азс соб сс сова аск аса са бса сса аб осо шбс вка сб бек аа 53
Авіа орРко Маї Ро Те тах ака беє рРкб їЗе Бек бег Ті це щех Ато 155 160 155 асї чоз чає сов зсо сбк ав ва ува адо аб аса асо дес сс отера 582
Так о сіу Ав о РхО Аїд пей деп Меє сій Авпотіз сп бек о біу РБе оцей 179 175 180 зчза сса пса стба про ста сва дос пава Б оБсСс ста ссФ асо аха асо 53 біш Бко дез Бем Уаі їеа біп Віа сСюу ре бре Бей Бей Тк оАко тів
Іва 1980 Та5 пса асо аск соб сза аз сс зас об да бу аса Єбе ба авабобсс 578 пемотвх тів ре сій зак овБей Аве дек отже тер оте бек Бе) АБповвае па 205 210 ст пас оуегб ага аса всвобас ссаА дос сав зас СС сад оз ссвоасе тав печ бі шіу Свт ТЕ Тк обув Ро пім біпоАвпп дек пій бвау ко тар 215 ко ОВ 230 -»о ває свое жо бсе аса се бас ссб ссяа вії бас о сса Зззї баз вача па цех йБА Нів бет Рко ТК беб сув Бка РКО стфш Сув ржо 0ІУу Тут дк 235 ха 245 взч ас кас сеу ача зо кс оасс веб сов су бес овес се сова Ссх ви
Ткр Меб Сув пе Ага Ас Ре їт1е Т1е Ре без Ре сті Ппечз бем Бей ее! З зво таб ста зе пос сос без дта с ся пас бас осав зо вч сов ошса 87 сЄбув беч т11іє пе Бей цей Мі цей те) АБротТує бій сіУу Меб беш рхо 255 ТО ша дес бас сс ста сб сбса чуа асо ст аса асс са зса дай пса со ВІВ
Уві Сув Рг Пец цец бро Озу Тв дек Тк оте бек Три бі Ра Сук о 285 ЗО заз аса Сас вс або сої чсс сва да аса са асщробес сова ЄсІ Ух бе мув тТВвк Сув ТЕ ІТе РЕБ АтТа біп сту Тех бек МеЄ Ре Рхо бек Сув аз БІ 35 310 бас бас вса ваа сса Сса зак пос аає ер оаст бас асба сса ага сов і0т4
Сув Су о отТнпжх ії о бхо бзЕ Ар б1іу АБп був ТБ Су ї1зе вгОо тів Вко 38 з20 з25 зас са СЯ са Кб асо суб сс се точ дач боб Яасв боб зла вда іп дер Чех ТкроА1а Ро Аїа дя Рпе Бей) оТтросфій Бер Аза дек Уві АкО 235 35 з сс ссе ка та аа су сса дес сса бос с сад су сх асе оУде 119
Еве беж Ткробем бек опец Пец Уа) руб Бе уаї Сів ТкроРБе чаї п3у за 350 355 сте вс сса асії чБЕ сЗє сба сс ус абс бо зба ас скзя пає оо 1158 їеш беж Ро ТЕх Уві ТЕробен бек баз тів Тср Ме Меє Ткротух ТЕр
ЗЕ з855 370 чаї ссв'адс ста бас са абс зба са ссб Вб асо сса сб сб осеб 1206 цім Бко Бех Бац отТуУую бех Ті Уді бек РхОо БМе тів вхо цер опва Ро 375 380 35 30 аке свв сс вас сбо се зоб бас вс зав абе вас сов бас аво два. таза
І1е Бе ре Сув Пец ТЕр чаї Тух ті Аврої1е Аврорго Тук о Пув бі 395 00 405
БЕ 5ас зпса аса ще цеа са Сева бса БЕ бра бсса са чає сво се ї302 пе піу йїа Так Маї Оїй пей тем Бек Бе цем ро дех Ввроввпе Вга 810 аї5 42а сса са чер су дас ба сса дат вся дса ссс зе сб бас зда здаа 1350
Бкго беж узі Аго Авробец Бен АвроТВх Аїа Бех о Аіз Бред ТУух Ако сів 425 аз 435 зса сьо здавав бса сса дав сас зе сб осса са сабс ас о чсЕ ско зда 358. діа пеб біз Бех ро біз Нів Сув Сех оВжКо нів нів ТвКодьа пеп Авт 445 43 450 свза св ака сов ас Сало очса чач сте ад вас са дес овес суч ча 1425 піп Ата Тіз Бей був тТерозіу бір без Меб деп без Аза бру Ткроуді
І 125 Ат щезч бссоаак су заз зво се сел сої азча за січ з ча бе бас ї4з4 спіу бек АвпоБец січ АвроБЕОо АТЗ Беж йгУ щі пей Оу) уаї бек тує
Ат | «80 ав5 ше ває сіб вас аса чує сб зач абс абфа сав сб ба уч вес сах 1555 чаї йяеюп ча) АвтпоМеє саіу Гм опув о їїе КАТЯ бій бе; без Тко Рв Ні 490 493 що
ЗЕ Са сус са ас БЕ аз за дав асе ча стада бас овта ЗЕ 1550 ті беж Св ле Тк орЧе сіу АкаЯа Зм: Тк Узі їзо бів тую без Майї
Б. ій БУ ач се чес с оп ак зуа яса сса ств зса каб зош о сса сса ве тез
Зек Гре ссіу Маї тТквотів Аку тру рко Бо Аїа тук Аха рео вго ДЕЙ -й 525 53 са сої ака сс аа оф сіб сса дав воч все Яес оч вучу за вуа хво
Аїа рко тів Пец бБеб ТйжЕ цеча ро бі ТнЕотТру чаї Уаії АкФ о Ака Аку -й 540 545 5БО чає ва са соб зоз3 зда аз ас сс са соб вда зб аца с обоє ї734
Сім Аква бак оБхо Аку АТО Аа Тпж Бго бек Вго АхУу АкУ Ага Ага БЕК у БО зев сава соб оса ада сб вда ау сор осаа реб аза даа са са Бус сво 13859 піп оЗак вхо гай Аа Ак Аку бе біп Зех бхрд 13 Бек бів Сувонів 57а Б ЗВО се їтсга Ста ача сає ста Ес ЗБ гсдЕ деа сс сс шоб чеб паб сса ї1830 ї-а бас Бей дк сСіуУу Бео ре уві Сув Аза вдє бек Бех Азїа Піу Ру 85 5530 595 аак вс сас саа Кс сб ссЕ аая Чеє ста сає аза су вс осо оо КВля
Ап оАЗча Ні сій Ре цей Рго Був Уаї Пец о Нів був АкФОотТВЕ цепобІж 600 5 ва ста ачЕ са ака Сос овсБ ас ас соб ува са ває сс Сава спас бас 19576 їв-иа Бех діа Меб дек ТВУ ТпкоАБр їхні ів АТа бух БЦе зув АнроСбСув бІ5 бога вв 63 з СЕ ава час а аа чай сх бяс заз Чад чес сб о аЯ аа тає Та
Ів дЦц ВВ цув двротТкр біз па бе піду 01: пім біу ва бак Ак тує віз 640 45 тс осс сда са бса сб зас Бес аза всс С зас саї баа сак де орга а1 Аїа доз рей бек бех айви бек Акч Ї1їе ре дей Нія піп нів обіх 80 85а 250 аса ау сда вас ста сабо чаї са бе соб за ав су тас яч бесс 2970 тв МебЄ біб зви ієей НіБ Авробек Сув Євї Аа дв їєй Тух Маї бет
Ба ета 5 ва бо се ссба баб саз асБ ої сус зов ввая сад сас сб басоває 2118
Іжма їєм Пен ей Тут Сід ТЕ РБе біу Аку Був рес Нів Пе Ту овБає 580. 685 Ба сасосса абсо або сра спос с ада зач абс боса аб заз сасба Ус ска хв
Ніз Бко ї1їе Ті ем С1у Рре с Аха Буш Тї1е Еко Мак бі Уаї БІ1У Бец 535 той 75 710
Шес'сса СЕС Бех соц сса ва бос ас Се осв о'асс бос вч зо да чиїй ех Був о РБе Гл Гей вів о сбій бе вк бот АтБТа Тів Сує бек Чаї Уаї тх5 тей 75 сча ача Зоес СЕ ссСа свв бе су чек сс ато бах зб озає дес ЧЕ аби йко вАтаЯ АТа Бде Бк Бів Суд цем Аїв ве Бек отут Меє Аяр Ави Уаї 735 7235 Ай чса ра сад су вай вус збе саа сабо сес заа Се сс баса чо 2319 уаї Бен сім Ата ув бек Маї Ір Бів безобіц бе цей бе Тк Аїа
КЗ во 755 чек ас ває ЄСВ сра сб ба сг ЯЗа аба саєс ста вас соб ав азу иЗ5Я чаї Тв АБ обБе бей їжі Беж це); спіу тіж Нв орей АБ БтОо Авт Був 7ва 755 Кн) аса зав вча год пес бай боб біс пає є асч сеча баб оз аа са 205
Зоо
Тв о Буз ага Ткробіу Тук бех Гем Нів Бе Мек біу Тух чаї Ті біу 75 78 785 750 їст бас аа азс бра ссвосва дас св абс асо сав ааа аба взає ва зАБА
Сув тую С1у бег рем Бхо Біп двр Ців ї11є ТТ Сі гук Хі пу 1 пу о 805 са ССЄ ачая зач са ссз сс аа овзоа сс ВЕ зак аа вза ЗУ сає 502
Сув Ре Аг гу рей Бо Маї АБ ода Бо тіє АБО Ттроцув Увь Суд ла 815 2 сач ва асо зсс ЯЗб ЕБУ Я ЧуЗ СЕ СС чес сса БОС аса сна св 2559 бій ас гів уді стіУу Бей їм сі ВББе Віа Ата Ро ВнНа тБЕх Сів Су 25 830 дз за бас соб здсс ств абощо сої сЕЗ баб чдсз бос ав сза со вав осад 2598.
СіУу Тух Буо АТа ре) Месб Ро Сей тую діа Сув 11е бій беї Пув Їй вай вл 850 пе: ск аса БЕЖ ср оєсса ас гас дав дес ББс сс зо даз саз БАЗ
Аів Бе Те рБе Беї Ро ТвгоТук був Аіа Ре ПечоСуїз Був Сім ва ява вва тассавссасс ассабсаєса вусозссче 27 «10» 195 -41їз 855 «212» Білок «Ва» Штучна «950 «223 Сиптетизна конструкція тай 195 сіу ШІ Тер бат бек ув Біо сАкКа Був Фу Меб біУ ТпК оАвЮ пемш шех 1 5 165 18
Чаї бек бо рРХОо їша біУу Бе ре хо АвроНів біп о Ббеи Дврорко А1а 20 25 за
БКйе Акш дів Азпобек Аїд АБ обго двроТхр о АвровБпе АвБй РрРКОо Ава пув 35 40 45
Авр тих ЛхроБхо із бВіа АБпоЗів Уві бі Уаії Бім Аза ре біу Без а 0
Сіу вве так обуб СРО нів 01у бі ем о пейосіт Тер о дДех ро зіва сія 58 70 75 но піл обіу Із їз біп ЧК Ууаі рхо Азія Ап оБхо рго Рко Аїа Бек ТТН 85 0 З
Кава Акп піп Бег 1іуУ Ат Бій вжо ств Бо ті дек Вко ка це; дку па 95 їла
Авробат Нів Рго Сійп Аїа Ме обі ТгроАвІ» ех БЕ Ту Ре НЦувоО1п 1Т5 50 125
Аїа їй рей Авровго Аг Уві Ато Піу бе Ту РБе рго Аіа Сіу Ффіу 39 135 140
Чек бек дек пі тах Уві Ав Ро Уаї Рус ТБ Ту ззіа Бек Бтхо ї12г 145 Т5О 155 156
Зек бвї її КЕпае бек Ау ТТ сіу АБр обго ТЯ пед АБ! Ме 10 сАБа 155 179 175 тів тп дех с і рав ей Сі срто рей обрей уаії Пез Бі Аза сім ЕВ 180 185 ї90 бле пек огец тТйжх Аз Щі Боб Ту ї1їе Рус біз дех реп; Дер бек Тхр 555 М 85
Тжр Тват Бех їжи Авзворде рей оспу сім Твкотпж тв Сув рез БІіуУ сів 210 215 220 вва обек піп бек рко То о беїт Ак Нів бек ро Три Бех бує Рро БКо па 230 235 Зо тів сув ро піу Тук Дху Тур Мес Сук пен Аха Ах оБбве І18 ї1їе ве зах 750 255
Гей ве ттТе Сей йей Пеж Сувспез її бе ред ез мах Бей бем Авр зо 25 270
ТУух сіп біу Месб їец оБро Уаї СеувоБуо пеб поем РхЗ фу тк обЗет ТК
КН на 25 тик Бак їни сіу вЖОо Суд Був от Су ТЕ тів ко Віа біл Зіу ве 280 295 зо
Бех Ме БРре Рро Бех був Сув Су Пк Був РхОоспех Авробсіу ваБИ Сув 205 310 ЗІ ло
ТНЕ Сув 16 Руб 12 РрРкз Бех щеж Тур вів рРне Аза Ако Ре премйоткю 325 зза 335
Сі ттроАїа бех Уаі БВка Ре шШех Теро'їен бер оїєю цен УЮ рю Свне 345 тав 15)
Чаї піп ту о ВБе Маї бЗіу Бей обекв Ро ТВж уві тр опе бек ув ГІ 355 550 365
Тер Має Мес о тгтротук Тувоу ВБко бу Бей Тук бах Її8 Уаї Бек БКо 379 75 35О
Би: 11е о рВко бец оїей Ро 1іе Рре РБе Сув без тр уа1ї Тух їїе Ар зва 395 жа чо їїв авр о рко Тук бує БІ1й Бе іу Аза Та Маї сф їєй Бей оЗек Рре
РО 410 ат
Бей рес Бек АвроРре Ре рхо беж Уаї Ахе АБО о їей зе; Ар тик оАта а 425 5а
Бет Аїа те Тух дха Пій Аза Бей сія бек Ро тв нів Сув Зек вто 435 149 л45 пів о Яїа Трх АїТа Пец дка Фів діа тів їв Суб Ткр 1у ста Бе) Ме «85О 455 Як
Аяп рей Атфа ТЕ Тир Уаі С1у Бек АБпоцец біц АврорЕо АтТа Щек Ахе 455 НУРНЗ! 475 48
Сій рен уУаї узі бек Тух Уаї Ав Уві Авп Мак обі цем о Ппув її Аг 1485 за 435
Сів бе їея ТЕровбе Вів їі Зек Сув Беа Таж рве біу АкЯ бін отак
Зпй ЗОВ ЗО туаї без бій Тук бер мМаі бетг ве бЗіу Уві ТЕр Ті Ак ТБЕк о БкЕо рго
Вих «20 зЗи5
А1ів тую Кра хо РЕ Ап оОВІа Бко Тів'рем беж ТК Без БкОо ши тТНЕ що 535 зай
Тих туаї Уві Бго вч Ахео П1у зка Чех Бко Ак оАку Ако Тик бро о дех 545 55О ЗБ зво
РКО Асо вк дго Ат бет Оп бек БКО Ак АЕЧ АКО ато Бек 01 бех 565 57о 575 аха спі) Зеє біз оСув Біж ев пек пед Ага 0ЬУ Пец орНе уві був 815 580 5 ЗО
ЗОЗ пз бек бек Аза бі Рго АвБаоліа Нта СІа Ре бен о Бу був Маї Ппез 595 БО ОВ нів Пув дк таж пе бій бен бех Дія Мес бек ТВ ТвЕ Ар Бей 0 510 БІВ Бай йіза ТУ Ра Пув АБр обув Гео Ре пув Авроткр біс біз Те О1у 0 65 630 «35 540 бінобіу семи Бех АКо бук Уві АтТа Ага Бец бет беж вп о бег о дкКоа Ії 55) в пе Ав нів с сіп Чі о біУ ТЕ Мас біп Авпоїви Нів о Авробег Сув Бех во па5 вта дко АВ Пец Тут Маї бек оце» пезш цей ем тТук С1й Тих вне С01у ака оту 2850 ва
Тув цем ніє Пец о тТук бек Чі рко ї1е їі позу біуУу Ре Ака Був ї18 ба 95 лох
Еко Ме сіу баї пі Бен Бек роб Ре Бей зи АтТа біп о рае ТНЕ Бек за ня. тів йо
Аіа Т1іе Сув бек уаії Узі йху Ах Та вде Рко Нів Су Пец Аа Ре 3235 730 7тза бек тТук Меб Авр о Ашр чаї уві рец озіУ Аїа ув бек Уві Оїіпй Нів бе 740 45 75 бін бак Бей ве оту Аіїяа Уді ТЕ деп Ре тео) Щеб; бек бе бтіу ТІ1е. тах т5О те нів зей деп сто АБИ Був ТИХ Гук Акт о ТкроЗьу Тух бек цец нНіє БЦе: то 775 7яй
Мек Біу ТУук Уаії Іїе с1іу Су Тух Б3іу беж пай обга Під Авр Ні ї1е 785 75о 7283 НИЗ тів бів БубБ її Пув бій Сув Вбе бка був їец БКо Маї АЕЛоОлКО ВКОо по 310 515 тів Авротжробув маї Сув СІ Ат їїа Уаї 1у Меб рей біу Ре діа вто 825 330
Аза ро впе ТЕ бів Су О1у Тук Рхо АтТа пей Меб Ріс цем Тух Аїд 35 вай ВІ
СУув т1е сій бвроцув бів діа Бе Тк Ре Беж Бко тах тук ув АтТа що 55 Зо
Рпе гемо був Був Б ех «10 157 «ії 48 «15 ДНК каїаз Цтучна «й 02 сашів синтетична конструкція «Оз -22їз СІВ «Вйй 371. .ї194651 «00» 127 чазессасса ссврачссза сзачусасса асьаає аа ба Бе вада баб со За сьу їм бБет вка Тук Уаї 1 5
СЕ асав со Бевз сб авс сс соб ас СЕ зас осає сваа сабє чує аса 105
Кіа Аке бец цех Бех Авт. бЗех Аху Тіе Бпе Ако нів біп Ні о1у Ту 19 15 20 ас сеа вас св са лдас са бз9 са воч вас с баз ще Сса ска 58
Ме іп Ав їв) нів БО дех Су ЗВЖ АКУ Ави іїєю тує уав Бех цем
З 20 35 ста сск бор жає саа всс сс здзс вача аза сбу сас се Сас боса бас ї88 пеа Бе опе) Тух бів Тк орзе 51у Ах ПУ їши Нів ем Тут Ббет нія 40 45 о сс ас ов сва чує сс овоча авч асо сса вбч здає чоч ез та пт а вро ІЛлЛе її ва сіу Бре Ак Був Т182 рко Меб піу Уві Сім Мем бек 55 БВ 55 7а ссв шшЕь сьФ Ба чЯсс оса ЕСЕ аса бса зсї асб бос азуб соя Ясб соб 294
Бко Бе мем без Аза бій РБе ТК оБеє Ата іє Су Сех Уаї маї дк 75 о 85 ача зош Бе сова бас цу са се го ссс пар асч с вас се Ес зай
АТ Аза гає Рко Нів Суд цез Аза вйе беж Тук Ме Авр о Анр оууаї ув
ЗО. ях 100 са ча Ясс вав аск о сеЕс саз гас Єба дай ке сс ре зса це пос 39
Тени обіу йіа ув дек Маї біз Пів Пец бі дек рен Бпе тик дія таї мо 115 аса вас БЕ Ста се обся са чає яр сає ста вас сса зас авасе асо 18
Твж Ав жвє цей пен беж бен Зіу Ії Ні Пец АвповБко АВИи Пув ТВЕ 120 175 135 зач аа бас се бас сса сб сас сб абе бах бас ука абс одуа саб 85 пув Ак ттроіу Тут Зес Бей Нів Ббе Меб с1у Тух Уаі ї1е сіу Св 135 150 145 ї5О кабодус СЕ Га соб сао час сас збо абс сад вад зба дазг аа пує ЗА
Тух пі бек ред Бко п одвроНів Ті ТТіе Сіла Пув ї11є Гуд сів Сув 155 153 1655 вЕЄ ча авс ста сої зес ває за сої ас дає 5 вва з кс са за
РБае Аку пув пе Бк уаї деп о Ато Біо Її1е двБЮОтТтЮ ув УЗ Сме МО 17 її І80 ача аба зга аУус сів ссба здоч ЕЕ сб ас сса бо асо осавз гас до 653 дАка тіє Уаі СТУ Теш Бе Ту Ре Азіа Аза Ро Ре ТВ сів Суз С1У 185 ай 155 ас шок осв о ств асо ост сто бассзчсї сс ас сза са ваз сла се влВ трух хо Аіа дез мес Бо бев бук Аїа Сув 116 б5іп беж Пув біповіз 200 208 10 вс асо сте ков сса ас бас зач деа ре СБ Бас аваа сода со Чад Зб
Епе Ту Бпе Сву Ро Тк оТукопБув А1а ре Без Суб бує біп о Без іш 220 728 23 са сад со ес бса вод сса заоч вва зУух аба дуб аса зас ої ау та сЗіу б тТкр о шех Бак пу Рко Вку пу с1у мес сьу Так Авпоретп бах 235 243 А че: роса ас сса сб час СБ сс сса час са сва сЕї дає сесев доа ва чаї Бет Авпорко Пец біу Бпе пе Рго АвроНів біп рез Адр о Рг діа 250 255 25
Ес аза уса вас ЄсБ о щес вас сса ув сце дав сс ває єса зас ава 87 пе Аха Аїа айви Бек Аїа Авопобто АвроТрроАвр о Бпе АБоп о Рхо Авп Гу 285 о 275 ча асо зу сої аз зса зас сва ЗзсБ За ча Зо са рос га чад лер Так ТЕ о рко Січ Авіа дв о с1п Уді піу уаї 5іу та це бБіу Бей 8 а 2930 зас песо асє сса сса сас дев бач ЄбЯ сб сла б вах ста сащ ос зве бі Ейе Тит Рхо Бкро нів О1Уу біу Пец це) С1іу Тр обек Рго біп діа 255 з0а за5 310 сова бе абр оскз сав васб ще сов зс авї сої сс ошеб Ус поса во 1014 піп 'сіу тіе Пе Суп ота Уа ВБжо Аїй Авт оркОо Ркєбс жо Аза бек тре хі зо 325 зас па са 5 Чек вача сев сс аба ссз асо ба све бсса зрЕ зда ОБ
АБпоАку бій бет Зіу АКЯ Сів Бжо Так Ро їіе беж Бко Ро ем Акч 350 335 80. час шск сак ссо са дова с вка сла бу вас са асо овсс пос сабо сав ТО
Аврожех нів Бк зіп ові МеЄ сії Тео Яви ев тТвВЕ ТВ Бе Ніш осів 345 359 355 зоб сту ста чає Єсб оаза зб ача дос соя Бак ово сса ус сус ода 158 діа зе) цем двро вро ахя Уві Аха 1 Сем Тух Рве вро Аза піу сіу 350 365 37а са сек ач дує асс я ав сса ча соб асб аса уЄєс соЄ сова оаее ов бек бак бек сіуУу Твгоуаі Ашп обро Уві Бго ТвроТвж від бех Бко Тіе 175 зв 35 18 ач сс асо ЄБс ящс аа зас зас чає себ'усо су аакоасцу баз пас т1254
Зех Бех тії Бе бек аку Тих Сіу Авроруо Аза пе Ап оМеб Зін би 395 300 05 акт аста об да сс сп зач сса Су ска уро сов са Че пах Со 1305 її тих бет біу вв о цец бі го рей пев уч) їеб; біб Віа біу РБа ж19 1 ага
Бо ста стро зсбоеда вс ста аса ас ссд свя аб ста зас ссс ста 1555 впе це) геиа стих Ахо їІе бец тах ї115 ко сів о5ек Бей ввробек Тр 235 380 а35 су асо аує ста авс БЕ ра ЧУї дос аса зса аса бу соб дує саза 38 ткротвЕ Бек цез Ави вп їжа бу б1У Тих рах тик Су ркго О1У бій 420 445 50 вас сс са соб Сса асв зас вас сас еї соб ас сса Її ссаосса 1445
АБ бек Сіп бех Руо Тйпт бек о Ап Бів Шех ро ТБ бек Суд Рго Бто «55 «60 55 470 аск ба ес оч бас аа Оу аб се сїс зда азЗя кб о ас ас Се ЗА їре сСув Рко спіу тук АхЧ о тТкр Мес Су Пви Ажп ЗКУ вве о ї1е тів Ра аль тво 85 се СЕС ага сер ра ко сус сс ака бе сс сс ча са сб чає 1545 пед орпе діє цез Пем Пед Сув пев; 11іе Ре Пей бе) маї Пец Бем АБр 359 495 ОО бас сага зач вої сов соб кос Ба о сса ру сс сої Заб асЯя аа аса 15ВО тут бів 5іУу Меє реч орто Уві Сув Бро ей Бей Бо Зіу ТАЄ Звкотбу 5о5 50 БІБ аса о бск айс зчоє сса бос ваз вса бос впсе абз осса са сва за ас ї638
Тих зак тайт біу Бо Су Буш тик оСув Так їЇ6 Бра АТа бій зу ТЕ
ЗаО пу 53Зо ас ага Би о сса рес СО бас бос аса зав о сса бос дає Час ваботає їБ8Є
Беж меє ПКе Рхо Бек Сув Сув Сув Тк Був Рко зак Аво 51у ДдвоСув
За 540 зав Уа аса кас абс ссв зба сса сб оз Бо5 чЧос СБс очок са ро ха сух 1734
ТЕ СуБ Іїе о кто ї12 ро бек бек ТЕр Бія Ре Аза Аку Бе ев; во
БО ЗВО ЗБ чав рчч Ясс боса Я ва Бе жов сю ска са ба щу збе сба ЕЕ 1782
Сі тер Ата йеї Маі Агу пе бег тТкО цей обех їн ей УБЬ Бо рве 57 875 ЗО чере осав ба ССС ба зас сеа гес о ссвоасс чес пуб та все ка дга їаза чУаі зіп ттрорпе уаї! с1У ІТ) бек Вге ббх уі тТКр о цем бах уві гіе нав за Бах
Кос асу аса ба5 баЄє чу зас сса азс ссвокас бса ас ЯК о ЄСа осо КВта
ТЕр Мес Мес Ткр Тут Тжроплу рко Беж Га Тухо бек Хе Уві бек отка
БИ ва 51 сте ас сов сі су оса аве с Со ва бе ге ЕЕ бас вк чає зи
Рпе Іта о рко Пец пем Рто Ті Рбе РіПз Суб рем ТкроУаі Тук Те Авр вій вий 625 630 вкЕ зак сс бас ваз ву СЕ зак псї ас аск чає сба сба бос БЕ ї974
ТІ Ар о рхо Ту був бід ББе СіУу Віз Те Заї бі ем пей Бакорне 638 рУая 55 еа се сб дас век о ссс сеБ соб сс ада са се сб дас ас де ап їв вто бек Авроїве Ре Бко бек Маї Ак Авропей їн о Авротве А1а 650 553 БИ
БссощцеЄ Ста хас аа дза чес СЯ дав Бса ссв дав сабо я шов осо ато
БШек Аіа Без Тук Аха бі А1а бе піз век рхо біз Ні Суб беж ро 65 570 65 пвк оса впс чес га аа саза са аб св таб сСерішщс Чав ста ах БВ
НЕ омів СТІ АТа Поза Ака бій Аза їїе Сей Суб ТЕР оОББу біз демо мес
БО ва 5 азо са зса аса з ЗО за сс дає вся дай ча сов че пессвоя 2165 дві» ви Аза Так отТкроуві сіу бек Ав Пец СІЯ Авробхо Аза бех Ага вах то та5 710 чаз ба за я ар сас ова ав ЧЕ авас аБа ас сбЕч ава ас ву зи14
Зіч Пец о оаі Заі Бек Тут уаї зви та1ї Аєю Ме осСіу пен Був ТІ1е Акт 715 78 Тти5 ба вса сс баб сс баб во ВСЕ Сас бі4 аса СЕ суб аза ай вса пВвй біп без мей Тс оре вів тів ех Сув пе Тр о рпе сіу дже Сія тв 230 735 да. чес ста дЧав баб осо я аудс Ке Здуа За баз абс ача ас ссвосса 2310 уаї пес бі Тух цеж Уві бет Вб бі чЗаії Ткр о хіе Або Бк о Бхо РКО тА 750 755. чес тас яауа боса соб аа за сба ака Б бра всб бо сба чач аса 2358
АТКТВ Тут АгУу бто го Ав Аїа БЖОо Тіз бе бек тп Пе; око ОТ Тв тво ТтЕ5 то аса чі чра ацдо ваза аа дова зда сб ссб суї соб ада ас сса се Об тік оМаї Маї Ак Ак вка спіу Акоа бек рРго джу АХУ Ага рах рко бер
ТЕ 78 785 тво са зва сча вс езча са сав вас соб ауа сза сзс аса сб свза Бе 2454
Рко Ага Акту Акч Аг пек Сід бек о Бто дктоАако Ач Ак деко бід Бек 785 Зо вО5 ача ач шспж сва ба сассассаєсс ассктосавка вачодассое 498
Ат пін бек осів бує що кій» 18 «тлі В «ій» Білом «вій» етична «вух «иа Сбимсоетична ковструкцхя «ах ТВ сіУ бе бек оАкод Тух Уаі діа Ато їни бек бек АБПп обер Ахо їІ1е РДе 1 5 10 15 вп оДів сСіп Піє 01у вх Меє Сів Авп без Пів дар обБекг Сув ех Аг
Ав оїем Тук Уві Бех Ше ей ій бо тук біп ТпгоРНе О1У Акя Був зу до 45 бен Нів іш тук бах Нів орто ї12 т1і2 пе) 01іу Рве Аху Був 112 БРЕо ка 55 БО
Ме бІіу Заї біу їва Бех Рго Ре Цей їєц с Аїа Зіп Бпе Тл бек Аза 65 70 75 но тів Сув бек Уві узі Ака Ага діа Впе рго Нів Сув ей іа о рРНе бех
З 20 а5
Тук Маг Авр др уаї аї Пе) біу Аза пує Бек уві бій Пів с пейш 11
І00 105 Ка
Бек бен Ріо ТЕК Аза уві ТБ зва о ББе рей бей дек о Гец О1у Їїе Нів 115 120 175 ва Ав БкоО зва Був ТБпт Був о дхо ТтробіУ Тух бек Тез НІВ БВНеЕ Меє а 135 140 сіу тТукоуві її сіу Су Тух сТу бек Бей рхо піз АввоБів Те 118 15й 155 150 біпобув ї12а їв біз Сув Ре джу му Бей ро узі два Ак Рко ті 155 а ї175
Авв Штр о ймя Уві Сув ліп вже Ті чаї біу без Оео сліу ре Ата діа 185 тя 130
Рго бра так оспій Сув о бБіу Тут рус вій цей Мес во Дей Тек Аза Сув 155 зай 205
Іі піп о беє Гув Зіп Аіа Ве тах Рпе бек Рко Так Тут Був Жіа Роз зт 315 270
Бей Сув' був бій Сей Зі біу іп тт Бек бек Був сорго КЕЯЧ цу Ту 255 239 У вав
Ме: Біу Тік АБ Пец беж уві Бек АБО ро ей біу бе Бапе Рко Аве ах Зо 253 нів бій Пец бвроБко Аїз Ре Ако Ата АБО бек Віз двроРкКо Ар Тр о) 255 ато двр о ВНе Ап о Рхо Ай був Аве оТх Ттроркго Зі діа два сіп ча Оу ту 250 2 чаї сїу Аїа8 Бде ОТу ше БІУ рРБо Тк о БКо Рко чіБ'ЄЇУ щу Се ем 250 55 00 біу Ткр бек Рхо бій Аза бїа біу тТіє певосів Тк уві Бко дія Ап 305 318 315 32
Бхо рго Бго Аза бекотах Ап ода Сів оЗеїт пі Ака бій Рро Тк Рко 325 330 335 ї1іе беж Еко Рус їм АЖЧ АБробех нів ро бів Аїа Меб Сіо ткро Ява
ЗА зак 350 бек Тих Тих Ре нів бів Аїа пед пен о Авр обКо Ага узі Ака бІіУ Бей 355 зей .385 тух Ре Рко Аіа біу сіу бех беж бек ОІ1У тт уз авпоБкКо Уві РКО за 375 389 тнЕ ТВ діа бах РЕОо 12 дек обБет Ті ре беї Ака тТрт С1у вер ро за5 зо 395 «по
Атїа цем дБ Мес біз АБИ Ті ТКт бек Біу БРПе Гей біу рхо бец сей па рака 15 ві цен біз Аза 1у рРКе ве Гео тех ТВХ САХЯ Іїе їз тк ожів РКО. 4129 125 430 іп Беж рей АБ Бест оТтв о ттр Тв беж Бей йвповпе їм с1У 0б1у ТЕ 1-5 та «ай
Тих Твбк Су Рко бі бір Авп обет бів бек бро ТВ бек Ави нів бек 455 450 рхо ТВжх бек Сув ко Рхо Т1ів Суш рко Б1у Тук Агу Ттр меє Сув ей 4655 чив 75 80
Ага Аро Епе тів те ре Ге) Бае оті» бен обви бед бує бе Хе ве
488 4 295 зец ви Уаї теп рен АБр оТух піз біу Мебс пей орто Уві Сув орто Цей яд БІ. ій ей рхо щіу тик обехє ТПУ Тагобеє ТЕ біу Бго був Гу Тпж о Суд ТЕХ 515 БІЙ 525 тів рко 3іа бій сту ТВхІ Беб Мер Ре Рко бек Сув Сув Сув Ту Мув й 535 Бао
Рке бвхі дер обіу дві Сув ТП оСує ТТ ро їїв ро бек бех Тр А1в ва Уа ЗУ 5650
РБе діа Акта впе ей тКропів тур о Атїа ех Уваї ВО вне век ТКе бе о КН цпек ії їєч Маї Ро Бе уа1ї біз Ткр о вне Уа! Біу їз бех рРго Так 580 В 59О уаї Тв» цез бек уві Її) Ткр Ме Мес Тер отух ТЕроОзїуУ РЕб бах без
Зав БО 535 тТук беж ї12 Маї Бек Рко Ріг їіе Рхо Мей Гей Рко І1іе ре Рпе Сув
Ії ві5 Бий рем тЕр уаї Тух її дер о Г1іе дви ро ту йув сім Бве біу діва ТЕ ва 5за 535 во уаї Біч їз їез Звг оре ей ро бБехт дв оБне ре орто Бек уаї Ага ба 55 55
Авробем Мер Авр Тахо Віа Бех Афіа Бей о Тух Ахоа сі Зіа Тез йій бек ава 55 670
Бго Піч ків Су Веб Рко нія пів ТБ АТа бе Вка ОЇ Дій тіє Пец 575 БИ 585
Сув тб» бі січ цеа мес АБаоБейц Аза ти Трроузі бТїУу пе олег Де 530 вв пай сій йвроРко із Шек вуха Сі Пе; Уві Уаї бек тую Уаі Авпоуаі Ап то то ТІВ 72
Мем 015 їі Пувотіе Бжч сій пе ем отув Ре Мі ї7е Зек Суз Пец ї5 та 75 тТвж Ре зу Ака біс Тіт уві бе 014 тую Бей Ууаї бБеб Бе Сіу Уат тав тя 750
Ткро ІТ Аку тру вто Рхо дла Тук Аг РКО Ржхз Ава лів Вго тів Бей т55 750 те
Бех Так опеа Вко іх Лв те Мал узі Аку ау АгУ сіу вка барокко дея тів тва дко Ахе духу тах Бо бех Рко вхо Ак Ако Ака бех бій бег Гко Ак 785 та 795 80о
Аказ Аго ака бек бій обБег Ака бій бек біп Суб 05 810 «РіО 129 «211з 1894 тазі» ОДНЕ «2їі32: Штучна кв» кава» Синтетична конствукнія «ев «й» Сп «ий 371..11365І «до» 159 цаассесуєса ссабссчусоча счаччсвсса яса са ста сб осса вада сяца за нів цей бек пеза Ака сбіу ї 5 жо вс: зба баб ЗзсЕ Сб во Кос че ода сбсе авбоядео бак осад тес 1599
Бей вче Уаї Суб Ада Роде бет 5ехк Аїа пру рко йви Аза Вів сій Бе що І5 о сь ра зай ЗЕ ско тав зач вав апа сс са сс їса чел аєщ ах ї5О0 ів; бує мук о Маї без Вів був ку тах песо сіу їео бек Віа Ме бек ас вса чаї соб чац сс сас БЕ зач чає СЯЄ сб сс зач час сот ї88
Твт оту дЕо Гей січ АтаоТух РБе Гує Двр оСув ей Ве Був Ав Тур
А 5О чач аа кс з баз аг сс баз ба сав газ бос Сов овач сс о тло віз вій їв сіу ій зів пед обі; бі бів їхр Бек бех Був га АК -5 Б 55 то авг зас зі со аса авс со ас ЯаБЕ са пас о сса св дес сс. Ес 5 ув обі Меб ту Тих зво рев ояекоУаі бех Авп о рко Беа сіу ве бББе 75 що 55 пса чає сабо бза сб чаї осса оса Ес овауа уса вас БеЄ ЗосСозває сова за
Рхо Авр оНів біпопей АБроБко Зла Ре Аква дів Ап Бак Аза Ап освсо 90 За 100 час ба дає Сесоааб сСсоз азс вав чає асо ач соб одаз дез ааї сад 390
АБр Ткр АБО оОРпе Ава о ркго Авп опув АБроТвг Ткр о Бго бій АТа Ав сій 105 Що 1155 чЕс ча пе до деа ріс доб Ева уЯдс рсс ас сса сса сас дча дод ай чві офу Уві пІіу Аза Раде О1У Пед сіб Ре тає оБго Рко снів О1у Б1У 125 ї98 130
БЕ СЕК дав баз ау сов сад пох сСаз бує аб сто саз ас зро оса 485 їа цей Оі1у ТхробБех Бгто бів Аза бів бі діє Пед Пій бТлгоМаії бко 135 149 т45 150 зсї ад себ осЕ сс способ осїса асо зас ацеа саа СЕ Зус за са опе вів
Аїа дай Ро срко ко діа бок Тпх Ав Ахчц біб бек о сіу Акб бій во ї855 ї5а Іб65 вса сса ар сса ссб сса сіб ваз зас соб осає ссб сад уса ау сав 585 тиж ро її беж Бсо го ей Ага АБюо Беж НхБ рКко піп Віа МеЄ спів то 175 180 ач вас їсасась асс сс саї сза зе са сечо чає сої зча чо ваза 30
ТЕв'дЕвВ бек ТВ тТПх бле Нів піл оА)уа пе) рей дврорго дху Узі да
ІВя ї1за 135 ач: ся мас се сов зоб час дала ссвоссв ач ЯчЧї авос зе ав сов 67 сіу іти Ту сРБае Ро із Сі сіу Бех бех бег біМ тру Маї Азпорго 200 205 210 чЕа соб вс аса дос сСес сса абс аз бос абс се ваб ада ас дос 726
Уві Рко Тох Тв оАза бек ско їі бек бек Тіє Тре бек Ага Тих С1у 215 РО 225 За зас сос дес с вас ау Зау вас абс оаса ср ча Се ста За сра ча йворорхо дів Це АвБа МеЄ бі Ази Тіз тн бах сї1у ве ей сту ро пах 2450 255 ва ста зсс о сба сза чсб зач СЕС брс ска бо ас вада асо сс аса 822 бе) зей Узі їєм Сів діа піу ле Бре пев) ес; Тиг АкЯ тів цей Так о 255 250 ашкосса саз зяк са цес бос зх З асс ве сса азе БЕ са а то їїз вто бій Чек оїей Авробеж Тор ТЕр ТІ бех Ше; Авп рве бе біу дБ то 275
Фр аса аса аса чо сс рас саа вас сс саз бр сса аса ває адо зів
Сім твк о ТОпх о ТвВс: Сук о Рко йіу бів АБИ Зехї іп беж Ро ТВкоБек Ал
КІВ: зв 90 пає сої сс ас гса баб сза бсеа ас осв сег очЧеЄ Сес зуй бОЯ а ЗБЕ нівоЗех Рхо Тих дак Су веб ртс ї1є Суб рю сТу ТУЖ Ак ттю Мек 95 00 05 І зІпй тс сс аца аву С врсоакєе сс сту ес оаха єсе бра сба бро сте МО
Сув Гей ха оАжку Впе 18 ї1е Ве бер Ре Т1єе Беб гемо оїец шує Пец
З5 390 ЗБ «Ка кс ста ба зва сра ссз зас бас бяв уча абЯ ср пес яке ся 1085
І1З ББе їем пес Уаії цей рез АвроТут сій бЗіу Мер цец о Бко ат СУБ
335 335 дей сте су се сс зо ас азс зба аса беб о асї бур сса бЄдб аа аса 1119
Во цей цво Бго БІіу ТЬу обек ТрЕ тТНЕ бек Тк о біу Ро Сув був ТЕ 345 350 185
Бус асе абз са че саа чос асз зас ас СК осса бе реє баб ос 1158
Сув так о тіе Ртоа Аза б7п Бу Тих бак Мес ррє ро Бек був Сув Суб
ЗБ 255 370 зса вав сса Бес чає зо вас суб аса бас все ссз авта сова СЕ са 1506
Так пу Ро зве йвБО СІУ АвопосСув ТАК оСує ТІ18 орто їі Рко бек беж 375 здо 355 39 ктач дос СЕС дос сас со ста бач аа Бу дес сса у аа б сс 1255 тТтвр Аіао ре Аїа лк ве рем Ткш пі. Тр оАїа бек Уді Ахе ре бек зя5 а 05 ся са ста сс сет о щЕС ста сс Яябо спа суб СЕ Са дає са ссс І3ах
ТЕр їец Єв Гео рей чаї рко Бе Ущі сіб тТкЕв'овБНе таї СІУ Без бек 4то щух 425 сса все пс пе срта ст зба ага сао зіч асч боз ас баб з сса 1359 рко тн: уві ство рен обех Уві їїе Ттр Ме Меє Тго тТух Ттр бтТуУу рЖо ау аз 435 ас сса бас овоз асе о зчЕв овса сс Ус абс особ са ся сса абс кое і3а8
Яек їв Тут вх діє Уа1ї Бех Ркоо Рпе т1тїє Рхо рем оїе) Ето Тіє ре 44 4а5 50 се сСеб беч сба пос бас веб зас аїе ча сеї сзсо вазу сау СЕБЕ їадь вна ссСув ба тжр о Ууваі Тут Ї1е двр Ії АЮ обро Тут Був Зі Бпе б1у
АБУ 480 455 27о чес виб озЕс дуаз бЄса ста с бос БЕ Ка сет бе дає БСК овес сс сс 1454 діа Твх мМаї піз бем о цец дек пе Гей Бко Зег о АвроРЕо рРБе ро бек 475 180 ях чес ада са сб Зб дає ассб ос сСеб зЗеЄ ба бас вда зпаа со се 1545 чаї вк Аво Бей пен АвроїпВЕ Аїа бех Азія пен оТух Ага стІз АТїа бец 490 У 500 чаа ссв спра сав паж боб Єсв сс са сабо ворс осо ста зоза сда дса Не бі обеж жо бій нія Сув бек Б Ніяш нів о тВх АтТа бе Ага сіро лів 5аВ цій 15 ак ско сас соч час ува ба абз зас сса зба ас соч яса ця сс еВ.
ЖтТа гей Су Тк о біу сія ей оМеб дей пез два Тпї тер о уаї Сі Бит 320 ве 53 зас ср баз здає сса дова сс аа чаш са бу лоб вус ес збо ває 1685
ЗвпоПем пі йвроБго Віа бек ду біц Іва; уа1і Уві бдех Тух Уаї Авп 35 дО заз БО сс зас віч щОс сс ава абс вай сад ста сг оту бе сабо зЕс сб 1735 чаї Аво о Мес сіу тез бує Ті Ату бій Гей їєй ТкроРре нів їте ЗаЖ 555 5аО Зб
БаєЄ сг зса го оч вача аз аса чі сту чав баб сос ЗК аце с 788
Сув іга Так о Ре Зі Ак січ Тк оУді бе) 514 тує це) Чаї бек вве
У во за зба сю вс вада ас сса сса щсес Бас апа бса ссї аа яса сса 1830 бін Уаіїі Тко їі Аку Тв орко ко Аза Тут оАкаЯ рхо БКо АвБповіа рко 585 ау Зав аса бу бса асо о ссс сса чаз аса зса ФчЕс з зуу ада ачца дча аа 1878 їта без бах тб Сем орко зі Те отТно Узі Уаї Аху ака Ак бу Ах о 05 510 сб соб суб сек аца ас сса сб сова зада са ад аца са сад ау Уа
Зек рго Акч лкЗ АКе Тс Бро Вес Ркго ака дуб Ахо вхо дек Зіб бехт 515 ви 55 ЗО пс аца сааоссЯє ача пос Сав сеї аа ей веб сяна бас сассасовоє 1975 хо Акч Ака Ат Ака бех бі) Бек Ат бій Зак 01п Сх 515 548 ассассвиса вусаошеас 1354 «її 130 «21ї БИ «ВШ Білок «2ї3з Штучна «ий «йо» пШинтетичниа конструкція «00 30 нів еп бок пез аку біу пе рі Уві Су Аіва Бра бек бву Аїд БІіУ х 5 о 15
Ето АзпоАла Ні біп Рає Бей го Був Уві іви НівБ Був йгу Тк. рен 20 5 30 сіу Пеб Бех Від Мес бек ТБт так Авроїеи Зі Аїа Тук РНе Їлив. Арі 35 49 45
Сув пев ВБае Був Аеротгроб3ію бій Її Ту біз бій пез біцш біу бій
За 5 БО тво баг бехї туз Ро вка був о біУу мМеб щі1Уу ТНх БбБп о пей Зекоуаї Бех то тв о
Ав орто цем бІУ Рпе Бе Вко АБО» Нів 01 рей Авр РКО Аза ве Ав 85 20 щу авіа два Бак вій АБИ ро АБО тТКр дер Раш Ав о вБУО дБ Суд дво Те ї09 105 її1О
Тир око біч діа Авп обі Уві б)» Майї о1іу АТз спе бі пе З1у ВБОе 120 125
Чиковко Ро Ніші Біу Тем ївеп Біу Тер бек Бко біпоАіа О1їп б1У 130 135 ї40 те ба бій Ту Маї Ро Аіа Ап о Рко Бко Рко Аза бек ТЕ Ав АКу 145 1565 15 ї60 біп Чек біу Ако Бія Руб Тк ро ї16 бек Бгто рко Печ Ах Аве оба
Тї65 То 175
Нів вто бій Аза Мер бів Ткродва Зет тв ТВх вве НіБ бій діа па і80 155 во рей двр хо Ака Маі вка б1іУ лец Ту ВБе Рко Аза 01у Оу Бек бек ї95 00 25 бек Зіу ЖЕ уві дви рРко УЗЬ хо ТНк о Твк ліз век оБус її БеЄ бат 210 215 220 її ре бек о Аку Тих біу АБрОоБхо Аза ім АБИ Мессі АБО ті ТВЕ
Вакд: за 255 аа
Веж біу вВле пев опіу Бо Беч бе Маї пез біл Аїя Ту ве Рае Пед гпец Тк ду їТїе Пен ТАК тів Ро О1їп о беє без АБв обеї То тТЕротнае во йо 270
Бек тез Авйп ре іа спіу зіу тр тв бах Суб Бгто міу сСбпоАБІ бак ле 250 га
Зіп бек вго Так Зеї Ап ція бер ро Тк оЗек Сук Бко Бко тів бує 259 795 з00
РЕс сіу Тук дху ТтроМеб Суво цем дху га Рпе їі її Бе о пец о вбе зу Ух зї5 32 її Бей їжі Пей Сув Пец ї1є рне Бей бе Ууді Бей Беа Аврвобух сО1яї
ЗУ 30 35
Сі Меб пев Бго уві Сув Бхо Цей бе Бра ЗКУ Тк о бет Тай Тбх обер 140 355 350 тв Зі ро Сув Гу ТВк був Тру їїе Кто Аза сій сіу Так оБек Ме 3855 зай зЗ05
Ре Ркбо Бек Суб Сук Сув ТНК оСув ро Бек Аве осіу АвБоСув Таж Суб 370 375 зво
ХІІ Рго тіє Ре Бер Беж Тр Аїа Бе бів лу ве їв ТЕв зі гер 385 390 335 429
Аїів бек Маі дгч вне бек Трр оцей бек Би пцейп а1ї Рхо ре туаї сів 135 410 Уа
Тер оВде баї біу без Ввт Рго тк Ууді Ткрореч Бек уві ше тТкр Меї 420 425 430
Меє Тр Тук о Ткв Біу ро бек сів Тук беж пів Маї бвБжЕ ко Ре сті 435 40 345 вго бем тей РЕ Те РВе Ре Сув бйем Тк оуаї Тух хів АБр тТіяа Хар 350 55 460
Бхо Бук Був бів Ере 01Уу Аза ТВі Маї ба цея це) бБег Бе Пец Его 455 479 475 480 цех АБО о Ера рРпе Рко бек Маії АК АвБробецп ги Ар Ток Аза бек дід 85 390 455
Без тую да Зім Аза цем біб беж Рко сін Нів СУБ оцек ржо Нів нів що зо 5 тТВж о АтТаспез Ата біз Аїв її рей Сув Тр обі бій бе; Мевб Авт Сей 515 зуп аз
Аїа тн тер. маії біу беж АБли Бей бі одно хо Аза бек дка бро Бех ка за Ай туаї чаї Бех Тук уаї Ави таз АвпоМеї ОТУу еп мує Ті Ажу бій Те за5 зво
Бей тур оре Ну Х1е дех Суб Гек Тпж Ре б1у Аме біч бл Уві сені -653 7о з75 сій тує реч уві бек Ре сту Маї тк тів вт Тв рРео бо Аза стух 58 55 5ЗО дко Рус Рго Ап діа Рго їі без бек Так Ббем Бго бій ТЕ ТЕ Уві 5БЗ5 ОЗ па
Чаї ва да вка ЗІіУ Вуд о Жек орто Аж дка АТО Та ЕЖО Бек БЕо АКЧ
510 віз бо йгу Дт Аху бе бій Бех рРго дк Ак хо Ага бет бій бек одко ПВ 525 630 535 ва бек пів сСув «ев 3 «ії дата «їй» ДЕК хаті» Шемчна хийох «й» Синтетична конструкція сй б «Ви СО «ийе (37),..136543) «4005 131 чаавсєсисса ссабозсацча Сцчвазсаєссв вссае сс ста азс сча їв о оЕ За
Сіу Сей Яех Ако Тухт Мді 1 з чЧос ваза са ас сс аа обсес аца з Кс вавсо сабо сва сай зас асе 185 іа Ага пев бех чек Ап бер АбЯ ТІВ вне два Ні п нів Бу Тв 10 15 20 ач саа зас ста сас даї бса аб бос ета аа сб ас оче; ач Софт 159 мес сій дяй пво нія Авробеху був бБег Ак Ав оївеи тТух Маії бек Бей 25 30 35 та с сба сзс осаво'ась КЕКС ЗУ аа ава ся саст сс раб ощос све 158 тен ем бенотує тіпа тТяк о вБВе бі Аз Бук ем Вів цец Тук бек нів «0 45 50 сс акс асо ста сус сб ада заз аса соб ага зца са у соя свое 46
Бгто Її1е її ем о сіу Бпе ДЕС Пув о їів Бо Ме су у боіу бенсЗек
БУ БО Ба то сс ВЕБ ба Сея пса сгаа бе асо ссв о пес аа ба Бей збе За аза 284 ко Рче бен це дів бій Ре ТиробБет Ата її був Зак оуаї Заії Акд во в ача сб сук сса саЄ са ско чес КЕ Єсс сабо абу час чає зс ябу 45
Ака Аза Ре Ехо Нів сСув пек Аїа Бе Зек їук Мей дер дер Уді Хаї
ЗО 5 ува ж зЧа де аая се ста саа сао сої дай азс со ес ара де це 280 їпез біу Аза Буз беїх уаї боїв Ні Пец 01 беж се бін СВК овіа Мах 165 1 5 аст аб СЕС сс Са гер осСку зар аса саб сс ваг обса чає заст все 438 тих авО ре тер реа бек обей зіу її нів ПеИ АБИ вто двпомув Тпх хо 155 130 авч ачза ба зас Бас сб бо сяс СБС: аб дос бас дев абс за ЧЕ 86
Тув Аха Ткр сіу Тук беж Пе Нів Ре Меє б1у Тук уді Тіє біу Сук
Мая 40 ї4у 150 вс оздаде азс ба сей саз ЧУВ сах абс ас сао заз ахсоаде зав кує зав
Тут Сру бек Пен Рхо піп оАвроНів 11 ті бід був Т1іа Пух біз Сув 155 150 165
С ада аву бсз сса Ус авас вда сса абс Час бзч ана зу счс о сда ЗАЗ.
Ре АрЯ був Бей Бко Маї Ав о Ака Ро їз Авр обжр був Уві був СТО 170 175 80 соб аїс бдса час ба сс ся КБ о сса зба со се аса сад ває а во жххо тів уаї біу рей бе); 01у Рпе Аза діа Ро Ейе Тпх сій був БІУ 185 ев) 155 саї ста пої ба абд сса се обабє Ядеб ся ас дав сс вай бСаа ес 5В
Туї Рка Аза ме) Мес Рко Гей Тут Аза Сув 118 515 бес ув лін діа 205 2595 йо
БЕ аса с Боб осса аса сві озаа песо сс ся ле сав осавосає се 7
Ре оїпу ЕБе беї рЕостах Тук Був Аза ВНеобед Сув Був сій нів пем го 2925 23 пе га азз ззс ста Об ЗЕс баб зер КК боса со ЯсЄ ща сок овас 776
Бек ви АгЯ біУ тей Бе уаї Сув Аза Це бве Бех вла сіу Бко Авр 235 жа 245 са сас саа БЕ сту соб ваза ЗК сто саб ааа ста аса Са дав со пив
Віз нія Сі Бе без Рко пу Маї Без Нів Був дику ТВк оте) щу цей зво 253 2650 се са ваба ас ас асо час са дат су єне ЕС вач зас сяє су 87
Зак Ма Ммебє Бек ЩЖре ТИЖ Авробец сід Аїа Тук рпе Су Бр оСув ей 75 271) ат
Ес аа дає соч чна чад соб чса чаз за заЄ сау гау бсс со ваа зі8
Ве Був АвроТткр січ біш Сеч Ту 14 сій: о1у бів Тер обет бек Був 255 285 290 сет ада зач зав ара чаї ас вас сСсбш сб оУка кс дає соб остс зда заб вто сАга МеВ о стіу Меб сіУу Таж Ав зеа ех Уаї бех о АвпорРро рев ОДУ жав Зо 305 310 спе ЇжЕ сса дас сає саз ка час сса зоб СБ суч оо зас оауї со 1015
Рпе Ре Рто Аво Нів сів Пе Ар Рто Аза Ре Аху Аза деЗ дек Віа 315 150 зи зас ста чає созЗ зас сс ває сос ває ав част всс ча соа час чес 1082 деп Еко ав Тер одар о РВЕ Дер оБруо Ави о їув Авр Тау Терору Бій Аїа 3305 315 зай зас са члла Зча сс дай щоес бесощоє ста сус со аосс сса сс ас МІб
АвБлосіп Уві піу баї Бім Дів пе біу їжи б1у Ре Ти о Ббкс ро ів 345 350 5
Зсс ппе ста са сс Єр оадс сса саза пса сав зу асо ся Сеаз вес 1158 пЕу СТУ Бем оїєвр С1У Ттробех вко бій Аіз бів о сьу тів те бій ту зва 35 Зло
Ек сся зо вас особ сова сса чеч бса вовзоаає зуа сая св зує аца 1285
Ме вго діа Авт Бхо Рео БЖКо Аза Бех ТНХ Аа обку піп бек б1іу Аа 375 180 285 380 сав сса ас сс ас сс свв се са зда час Боб сає сс са Зсу їй5а сій Ро ТВХ о вко ті бег орхо Рко пз Ака бер ех Нів Рко сій Ма жав 400 апй5 ахта сва оз аас кса абая асо ЕК св осва чес сш са час сс ваож 1305 мес бій ТгроаБоп бек Твр отВк вне Нав обіп ів пеш реч Ар овто Хо 459 415 що чис вза зак ска бас бро сса сс ча ча сс бов ос одо всі чех 1355 уа1 Ак пух Бе) лук Ре рес Аїа С1у бЗіу Зек Бех Бек п1Уу ТВх Уа ай до 35 ааб сеї чо соя ас оаса ба сов о сеа аб оба бос зба же соб аца ізая дви рРго Уді Бко ТркотТВх Аза беї Ро Ті6е бек Беї їі: Ре 5ає Аг 445 Ах два асо чаз чає сс чер СЕ ав ас пава аз оасЕ са здо зас сег ста 1446 те СТУ АвроБко й1а Бей Авї Меб бій Дей Тіє ТНї Бех Сі вве гей 5У 469 455 ЕК чЧча сса ста ба з сса сва дос зда БЕК ссс ста т асб вада азс 1284 сім Бха пев ге баї пеп біп іа сйіу тре РБе рез цей ТВх Ак л1е 415 480 4883 пса асо вс со сза аує сб час со бзе орд о аса бес ставок 15 пецш тн тів Бо піп щек ої др ойек Тр отр їв бек Бей Ап орла 930 495 5ОО
СЕК чус зас аса аса аса баб сса зує саа вас беє саа бса бов о авеї 15550 пен о біу сь Тс Таж ТВІ Суб бро іу піп Авп бек біп о бах ко тах 55 519 515 ср аає Сас бе сба аса сб їЯо соб єса ав бає сба зак таб зда 1538 бек зви нів бек Ргто ТБх бех Сує Рхо Рко 112 Суб ро ОІу ТУух АКО зай 525 Зо соч або сс су аа зча со абс або Є се сс абс осбс су БУ 15565
Тер Меї був Гей йка Ак о Рпе Т1і6 ІМе Ре тай Впе ї1е пей Пец дез зас аз 55 сабо ка веб о бсс сс Са зва ся сот чає бас саа час акс се сса 1738
Сув цез ї1їе ре Печ Бех Уві цез пев Аво Тухк бій біу Меб Без Бко 5А5 50 БВ
Зс кос соб ста сбоа сса за асб осо аса асс їса асв за сса 505 17857 туї був вк рев реп рко сіУу Мат беж Тх Твх о Зеж ТП Ту Рко Сув 57 зі Зно вав яса сає ас асо ссе зе сза ба аса са асо се обся хе ще 1830 цув Трх Су ТЕ ТІЛе рує Аза Оу Таж беж Ме Ре рос бек осСув 585 Бай за тс таї азса ава ста са дає ач вас бос ас баб аа сса ваба сса І878
Су Сув Тк Сув о рхо ех АвБрозіу вий Сує ТВХ Сув їі Рго ї1ів РЕ вро вив 510 ач коса сад сов СЄ дес сб ре спе бла дЧач ох ще сс чав ада 1596 беж о Бекг Же Аза Рре Ма Аа Ре рей Ттр сі) Ттр Аза бе уаї Ак
БІ вий 525 53 сс ес сю Ба ау СЕЗ свв дес бса сс Як сач у БО Я пує ї974 рпе век ТЕр Теч бет ей Бе узі Бко рве Узі бій отр Бр уві б1у 535 640 45 ска ис сеа ас єс баз бра СС сс ав б а абсо сова бас Со дах їза Бех РКО ТЕ чаї ТІр Бо бек Маі Іїе Тр о Мес меї Тер отук Ткр бо 655 вва «с сеа вас ста бас са асо чо са по є ас сса Сб сбвосс 2070 піу вВко бек без ТУух ек Ії баї бек. ВБсо Ре їїз Бхо їй Сем ро
Ба во 675 арс ше СЕС бас оссс суф ве бас асс щас ав бас сеЄ бас вагу заз 318 тів Рпе Бе Сув рем о Ткроуаві Тук їі Авротів Ар Буо тТух му сій 80 85 ва
СЕ Час са аса Я Зав ТКУ сб роса бе св сса о бса чає Се БВ »81685 ва спіу Ата Те Уві іа Сей цей беж Бпе це) ро беж Авр оРле опе 555 та зо5 тро ссвА'єса ша са дає ссз са чає ас зба ес осв ва бас вза чав 2514
Бхо Бех чаї Ах двроїєз Пей Бр ТЕ діа бЗаж йліа Тед тую Акоросво та 720 725 са сб ода пса ссбса пав осас Суб БбсБ осса саб сає сабо зсї сс вча 2257 діа ге сій бек Бко іа Ні Сув бех Рко Ніє Нів ТБжх діа пПей АкУ " 730 735. 740 сва здсЕ всв ся сЯС Єдер да дав са ас дат ста Збо ясЕ счу Чеа 2310 зійп діа Тіз бен Суб тТхр біт бій сБрей Ме два те Аіа Ті ткроуаї тав 750 тав ж сс ває єс чай зас сої дсс сб зда дав ска зда два об бас ЗУ
Сі Зет ам пбеб біз АкроРКгОо Аза Бех Акоа Та бе уаї Уві бек тую тва 785 пло чес ав чо лає асу за сс зач ас яда сав 5 Ба соб бро сає вео чаї дво Узі Ап Ме БІУ бе Був пі дк бій Без обез Тур Ре Бі тво Тв 7 аск Еса баб сса ас с зуб вада заз аса дя сіб дав Бас ба ее 245а тів 'бех Суб ї- Че оре спіу га 1 Твко уві Бей бін о тТУук рей Ууах 7а5 ща ви5 ач бро ор опо см; есЕ аа авсвз сса сба зЗееа бас вза сба пса ах ВОЗ ек Бе бі Уаї тТхе тів Дт ТвЕ орто РЕ Діда тТук Ак реко Бо дей
Вт 315 о пс ссЕ зга ста аб вс сіб оса чав асч вся ЗЕс ЗЕ ат вЧа вив захо
Аїа вто тіє рей бек ТВ о Гез Бхо Зі Так Тк За1ї Хаї Ага Аа Акд
ЗО 835 зав аа їса сес епу вада Бач аса сеї са соб вЧа спас вда сб ев. УА
Зіу Ат бет Рко АхаЯ АхЯ Ат ТЕ рко бек рго Ак АкУу Ака вка ву ща ва: 85 сав ксб сов зда са ву зза бос саа св вда чав са ссва сус ваз
Сіпобек хо Ако Ака АуЯ Аку Бек біпобек Аку біз дек співа Су 855 вс чав свісвссаєс агсассаєса засучесекі 2572 «ВІ що -811їз. ЕВ «їй Білок «3» Штучна «тих «ижі» Синтетична ковструкція «ПО» 135
З1іУу ей бок Ако Ток Уаї Аїз'АКаЯ Ппей Бек Бек Ака Бек Ак Тв рве ї 5 ТО 15
Авпонів біп нів О1Уу ТВу о Мек сій Ай зви Нів АвроБек Сук бек Ах 20 25 30
Ава цей о тбук Уві Сет бе; Бей Бей іє) Тук біз Тс Ре 51У Аг Був з до 45 ей нів Бей тТук бек нів бро 16 ті бе сі пе ака Буя 118 го 50 55 50
Ме сту ба1ї біу їецч бек ке Рве Без Без АТа Зій РрестТпх дет АТа 55 76 Ще во тів Сув беж уа1і чаї Ахе АКч АТ вве РЕ нів Сувз рей Аза вне бех зо 5
Тух Меє АБр Авр Уві Уві цей сіу Бла Пув о бет УВІ біп Ні рей сій 120 105 т1а дет пец Бве отих Аза мМаії Тиї АвповБе Гео гей беж Без Оо1у ї1іе Нів 115 150 їжа їєч йвп о Ргоо Авпопув Ту ув вх Ттрошіу Тух бак Пец ів Блпє Ме
Іза 140 сіу тух Уаї т1іе бфіу Сув5 Тук зі Бак пед Руб ід ва снів гіеостів таз 15 ї55 їв ій бук оті був осі; Су РБесАко Му цей о Ббко Уаї Адп Ах Бхо т16 їа5 ї70 ї75 аБЮ тТкробув Узі Сув' 510 АхЧ Ті Уаї бі Бей пер обїу вве АТа дув. 1855 185 Не ркго Рцвао отак сій Суб С1іу Тух Ро Аіз пе) Мек Рко ев тТух вла Був 535 290 205 тІїе бій Бех Був їй АТа Ре Три Рде бек оВко Тх Тук бує Віа рРпе 2139 715 229
Теч о Суа ув 010 о Нія Ге) бек бец Ат Зіу Без Ре уаі Сук Аіта РНе 2Е5 30 213 ай
Шех бак Аза сіу Рус Ап вла Ні із Ре Ба Рко Був о маї ПО Ві 255 259 255 ту вхо тих гез О1У йеи бек лів Мес бек ТВх Тнх Веропем бід АТа о БА -7о
Тк Ба ув АБр оСув зем бе був дер о Ткр бій сій Тез) Біу бі сім для 289 зва сту піз Ткр бек Бек був БЕ Ах цу біу Ме сблу Трж АБи Меш бак зай 295 зб
Уаї Бех Авповуо пей 0іу Ре Бе Бко АДяр Ні Зіп рей АвроБро ДІВ 395 350 315 23
РНе Аг АТа АБпоВек ойіа Авдорко аБЮ Тер оАБЮО Рре Аві рко АБИ ув 395 339 335 бвруотвх Тр орто бій Аїа АвпосСіп Маї бу уаї сіУу Авіа Ве с1у пев 345 345 340
Зі Ре Так о рРхо Рго нів о О1у Сі пед рез біУ бтробеж ко бід Аза 155 350 365 сів біу їТїєе цЦед біп Так очаї Ро Аза Аа ово РКО Рко іа Бех ТЕ за 375 зах
Ап одкф сСіп бек СІУ Ако бій о рхо Чкт о РКО гів бер орко рхо Бец Ако 385 за3 заз 450
Ашр їжх ів Бгто Пів біа Меб бів Ттровйнв сек тик тах РВе о Нів біл 105 мо 415
Атїа пен гев Авб БО Аа аз Ака БЗРТу ли Ту Ра Ба Аза сту сту ах 430
БЗеє дежх шШех У ТНжЕ Уві Авлорко уві Бо Тв Так дія бех БрЕо тїе 435 дО 455 бек бек її ре Бек да Тит СІУу Аво Ру Віа пе Ав Мек сій де 450 ау 469 тів тик Бет сіу Бе Тез 01у бко Бен гео Уві їез о зЗіп оАха оіуУ ве 4185 575 АТ жЖво те тев їем тн Ака 1ї8е ін тру їїе Бо бів бех цен о АБробек оТргр 205 230 335
Ттр Тек дек ей йо ле Пец сту 01у ТЕ ТЕСТУ Сук бхо О1у бій
БО 05 510
Азп бек бО1й Бу ко ТвВЕ Бер два Ні Бек рко Так озЗек був Рхо рРхо їїе Сув Вхо б1у Туг Акч Ттр Меб Суз їни Джо Бху Ре тів їів ББа з3й 535 540
Гей РОє тіе їи цей пе Сув Бей ї18 Бме Бей Гей уаї цем Без Ар вав 550 55 БО тТук іп піУ Мер цей Рто баї бує Руо Бер обер Руе Сту тих бек БЕ ве5 57 5
Тв беж Тих с1у Бхо Су оПув Сх Су Тк їі БРго Аза сб1позіу ТЕ 80 вв 55
Зак Меї винесе Бо ЗБкг о Сув Сув Суя ТВ обу Рго бек кб сіу Авй пу 595 вад поз тнхоСув ті Руе тів Еко Бек обеву гео іа пе саїа джу Бе Ге: стер 510 515 6230 ста тТев о Аба дек уаі Ак Рне бек Тер огем о Зек рем Гей Уа) Рро Ре ва5 530 535 вда
Маї сій ТкроБне Чаї бу гей бек Рус Ту Уаї тв Бей бек о уаі тів 65245 55 55
Тто Мер Мек отхрогух тв спі еко бак Бей ТУух бек їі У«ї бах вхо 560 без ета
Бе Ті Бко Пез дей Бко Т1е Еде Рпє Сув це) тро о уУді ТУх 16 АБО
875 680 585
Т1їе двр о Рто Тут Мув О1н рРпз сіу йтТа тру уа1ї 0105 Бей їжа бех вне 50 5 тва
Гала о рко Бех дер Бе РНео ро Бек уві АКаЯ Ар обеи цей АБЮ тк лів 70З та 715 720
Зау ама їєец Тут Аг ТМ дія без 014 бе то пли Ніє Сув бех Рко
ЗО 738
Нів Нів Так Віз рем дка бів Аза її деп Сув Трв О1у Сі: бе) Меє 743 745 750
Ав Сей з1іаза ТЕ Тер Ммаї С61у бек дай опе) Сі Дер о ВБКо Аза Шех Ако
У 60 Б іш Бе Маї Уа1і Яех Тух Уаї деп оуаї АБю Меб сіє Бей був ї1їе АкФ а 5 тво св їв їх лк ВБНе нів її1е бЖех Суєяє ва тв яве бл охо За тТие
Й та 730 735 во чуаі реп сли Тук пе) Маї бех Ре сху уві То ІТе Ака ТБе оРКго Руо во я 835 іа тує Ага рко Рго Авпод1іа рго 116 Пес бек оТах рев Бко О1Ч Те 820 825 30 тТакомаі Уві АСУ да Ак З1Уу Аку беу ро дк Ак АК рпк о БЕс Ба 835 ай аб
Ро дта Вк Акту дко бек піп бек го Акта вху Ако Акту Бех їхій Ззех авоа 855 вай
Ахп оім бех біл Сув 855 «вІйх 133 «а» Ба «фійх ДНЕ «213 Штучна шах «аа» Сивжетична конструкція «ах
«й ОБ «ваз СУТЬ. БАЗ «8005 133 чвасксцеса ссвсузесаа савадчсассь ассвчв са пс охса сЕб зспа чат за нів ПМ бак Пец дя Ту ї 5 сЕп ЄБЕ ЯСЕ Бої дса Ко зе їсв одса удо сса дає зососає сва бр ня
Мей БНе уві був Азіа БВе бех бек Аіа сіу Ро дв Ака Нів біповБе 10 їЗ ра
Сву соб ва уа БФ саеасє ваз соб йса ста чча ба ащЕ пса ас Боє 150
Гей Бко Пув Маї Без Ні Ппув дка ТБу бе) Оїу ем бет Азїа Меє бБег
Зб 35 ясЕ Всі бак бБЧ Чай пес сабо бос заз дей га сБУ СЕ аза час со ІВ тру ТВ дво їем Зі Аїа тук ББе Був АвроСув зац ре був ба Ттр 49 42 5 асп слава сі ас паст дав зов Еш бос ваза Ка ЯБЕ зоб вада ста сб 288 біз шій їєц біу бів Сів (1Уу Тен бек Ако Тух Уа1ї діа Ак їж Бег 5 БО 5 то сс зас вує вда абсо Кб дас св сзу сабє сфе аса вагу сац ва вх 22
Зет о АБи Шехк оАка 118 Ре АвБи нів біб5 нів сіу Же Меб сів Ап о рей т5 83 5 сає час са пак бос аса ває с бас ча сов ка ро се Ба баб 345
Нів Авр о беї був бек Ахо Аква ії тує Ууаї бек пе тей їз; єв Тук 5 95 150 саа всї КЕ бас аса ваз га сає сос бас сх саї сса аба с ако сс зай бів твВж Бе сту Ата пу цем оНія Меч Тут бек Нуя Бко Ііз Т18 Бен 1695 119 115
Час КС сах заа віє сс зба ЗдсЗ ЗЕ дає ба боб оспа СЕ су се 438 ріУу БВНе душ Був Ті РжОо Мех о зіу Уаї біу їжа бек Рко Бе їейп еч 1959 125 УЗо чес сла се асо бої ас аб баб Кос чоч с ача запа чес ВЕК єс а діа зва рле те о йеср діз 115 Сув зак оМаї Ууаї Ак Вк діа рбе рго ї35 10 ї35 50 сасє сс Ка щсЕ СЕ зус бас ау час чає яса сс сб оч ща ша вне
Нів Сує Ге дра це бЗекотух Меє ар оАвроЗаї Уві їец Сім о віа Пуз 155 о в са спос осав савсква чай Сса сб Сх ассссо зба ассоаво Єбо с зах чеку Чаї біп Ні цей біз бек цеч ріж Тр А1іа Маї Тв оАвБи ре деч 175 їта їяо ств ва: ке зас ав пас сту вас сор вас вав зса ава суд со оче 530
Би дежоїви со1у тів Нів Бей Аа Бо Зак обу ТУ Був Ач ТтЕр Оу 85 х80 95 сассвує са са СЕ асєц сю бас збу абс ся бос таб озаб хосс сек 58 тТуж Беж Бей; Нів Бпе Мес йіу Тух Маї їїе (лу Сув тук біу Бех цей 200 ваз їв се спа цяс осає вс вїс саа зач на заз о дац бус ВЕС сяда зад се тив
Рко біп АБроНів Тіе Т1е бів бує Ті був біз Сує РБе Акш був Бе 215 зи0 225 230 пса чсЕ заб адуа сса зЕс зас сод аза чбЄБ бас сав суа вс де ще тв
Бгто Уді Ап Ажа Рко Ііє Двр Ткр Гув Уді Сув Сіп Адго Ті уії оту 235 240 й січ су суб ЕСЕ дес со о сса сс авса сай с ЧаЄ тає сса де ска Генон пей сте) бі" Врпе та АТа рхо ве тек бі Су СТУ Тук Бо та гей во 255 250 аса ста са баб ссв особ або сав бос ава свза з БЕ аса Б са ато мес вхо пе ТУук дів Сує х1е пів Бек Буш стра Аіа впе тек Зде ек 58 зо та шпора бас вза дяся ВСЕ ТЕ З: дат сва час сау суч косо ссс о аза зЗіВ тра ТЕ оТук цпує діа Вце рем Сув був біп 01у Сіп їкробБек Бех Був що 235 239 пор о ача зач уч ас вус ас вас ба її да ССС с здс сек о ссс да зве вро АК оцув БіУ Меї сіу тк од Пец бек уві щех Ав РБго Бей біу 235 300 305 3 кс сб сса час сає саз о бба зає сеод о зчоб р ся се вабоває дос 1014 тазове рРко АвроНів Сів Без Ав вро Аїа Бе Ак о Аїа Ав обБех А1Я 315 за З25 зас сса зас бач уає Стс взає ос ваб аву даЄ вос кда сса чау че 182
АвпоРто Авр о Ттр АБр оРпе Ап оБго Ап обув АвороТБЕ Терорто біз д1а 330 335 ща зас савч дра сла Ус са чсс бе дес сба ча БЕ асо сса себ осяде 1115
Ав осалоуаії сту чаї біу Азв РНе сіу їеи Ку РБе стих вко Кко нів 345 зв5а 355
ЗЕ ЗчЧа ста ба зу бач зас сс саа са сова чуб вабе сбЯ сез асо 1155 сіУу бі Без йпеч С1іу Ткробек Рго піп Аза біз бі Тіе Пец са Та 150 зЕ5 БВ)
ЧЕ ська чес вас соб сса ссв оче жез асв зай аа се со За за Т25
Уві ржа Дік Ав ЕГО Ро Рко вів беу Тйх Ав бе са дех СТУ Акщ
Зк зво 385 І 390 саа'о'сса асст сб абс об соб сс стаз вада бас бсб саї соб сач до тА5А біп рКо так орто 1Хе бек РКО ро Теми АкУ Авр Бех Нв Рто біп Вів 395 209 щап5 зба саа оч зас їса асз асс Б саросвяа осв сб бо дас сс апа їзах
Меє сів Тер оавп бек Ту Так Бе НіБ бЗіп Атїа ей Тед АБ бо дкФ 410 415 аа чес вача за ра бас ссс сеа зсс зб дев обес бо БОС здесоасб ас 1350
Чаі Ага Оїу пей о Тук Вре о рго Аза С1у ау Бек бек Бей сі трк Уді 425 «3а 4235 зак осссї чувс сса всбоасв оса са ссва аб са Кос овба ЕС сб апа ї1завВ вві оБко МаЗі Ррхо тис Тк діз бек вхо ті дак Бек Ті Ре бек Аа 445 159
Ії аа Час сс доб соб дас аси чав аабс ас зса вдос зе ртє ста і545
ТрЕ обі азроБго діа бом одер Ме СІЧ Авп одіж бат бек слу Брегг
Ба 460 465 ато
Яча ста ба сга Зк ста сав асо зда ЕС сс ста Єр ас заз або 1554 сім Вжо Бей Бей Уаї Без Сій Аіа 61 Бе Ре рез бе тво Аго 118 475 480 285 ска ас аїе сс сза ау се уас бос суч сф аса сс сс аа Бо 1545
Те) твер ощ1є го біп Бек те)'дячр бе Тер ото тах бу бво АВУя вве ща аз пОоо сек дос зяб аса дба са боб осса дос сва зас с саа пса сса о восє 1590 пев Оу сь с тТВвх Шк отвЕ Севовха с1у сбіпо Ав беж сій Бек ко ТНЕ 5) ві св аа сає соб осса аса кої Бас сеї Ста аб ще ссба ЗоЄ свсе аза їезв
Зеко Зап Ні бек ко Так Шег Сув Рто Рко Іте Су Рко Зіу Бух ДуФ
БО 5иВ 530 каз акя сяс Б ача ад со есе абссєбк со с во сс бе осв 1586 тжр Меє Сув цеч Ага АкУ Рпеотів ТРе ве рем ВНе тів еп Бей ей 535 ЕДО 45 55О ев Бе аїс сс сс ба зба бу сг Час гас сад ддо абу сб о сса 1754
Сув рем їТ1е РБє Те) ем Уаї Без гей АвБроБук Сів біу меб Бей Ехо
За5 5 55 чес Бас о сес ста Се сса дада асЕ сс оаса аос оїба аса ууа сса Я 1789 паї Сув РкбО пей Сей рго 0Т1у Тк опер ТНу ТЕ бех ТВЕ СОіу Бка бує і ЗУ ІВІ ааа аса каб ас вс бе де сад сда аса сса зба сб осса по ЕЕ 1839
Був Ти Сув ТвВук тів ржо діа бів осбіу ТЕ бі Меб вве о Бко бех Сув 85 5 -аБ5 ас схЯдв аса апа сса са чає дек ває ас вс бує ака ссва всвобєса 1878
Сув о Сув ТИС бу Рго Бех Бвросіу АшпоСує Тв Сув Х1е рхо т11е Рго 50О ва5 БІ ач св оруз чес ес усе пок Сбс сс поч за Бач Зп беб срра ада учив цек бек Ткродіа РНе Аза Ах С РНе їец Тер бій тгвоАтіа бек УЗ Ак 515 ехо 525 530 сс бої соас ба зяс бе ста збсобса сечо сву беЯ ЕК ЯЕб до Т374 ке бек Тжр оцез беє ей Тео Уві Бо Рре Ув3 сіп ТртрорРБе Уал ху 535 64 віз ска ес ств ас сс боб са ше ак оасс со а ас соч бас СоФ запа ївмобБех РЕ Так Уві Ткр бе) бех Уві ТТе Тгр о Мек мес тТстротук ТЕкр
ВО 535 Бо за сса вас сса бас св абс зр реа соб б оасс сов свя бба со ато бпіу Бгто бек пе Тут Ббех тт Уві бек рРхо Ре оїтїз Бк ва еп жо 565 5 578 або Б до вес со кчО Ззс бас збе Чаї аб зас сс бас заз Зав я1ї18
Ії Бпе РБпе Сув Пец оТероУаї Тух пів с йБр Т1е АшроБго тТуУук БолвоО ЗІЗ «8 еВ 5ЗО
ЕЕ Чос очев азса с дан са са сов ЕЕ ЄС сса сса чає ес ве 166
ЕВе біу діа Тл Уві бів Гей Беб бек ре їец Рус беж Аврорле Рая 695 76 тав о ста пса з са час Сбсо ба чві асу са псо чес опора Сас вда заа 2318
Бко Бек уві Ак Авор оїей їй дер оТвнх Аза бех йіа Без Тук акУ 510 7І5 780 75 часа ся заа сре о бса зав о сас Я сс осса бає сас асо дес ско вса ва
АтТа без біб бек Рео бл) Ніз Су Чех Еко Пів нів тво Дів цем о дку 730 735 а) саа ясс аїта ЕсС5 Сас сау бдзча дат Сер або ває сса дсо асо уз оба 2319 сСіп діа ті тїеч Сув ТЕробпіУ біа Сей Меї Авия Пем аїа тиж тер о Уаї та 759 Та чач їЕСс вас ссФ зак Чак сс дес сх аа чза соч чсбЯ4 зва ос бас 2358 сту бек Ав; Гей стіп Ар орто Аза ех дга сіб Бемоуа1ї ві Бех тут 75ва тевБ5 о
Зс вав зх аас абз уз сс заз абс аа сва сс сбса бе бо сає 2438
Маї бвип Узі дв оМес біу Пец був Т1іе Аку біп Пез рей Ткр Ре Нів т 78о ТЗ 10 аск сова ба са вся Сб пас аца Чак вса ба ссяч чай бас Ева ЧЕ ша. іє бек Сув Іжа Те РНе сту вхо біз тнж Уві пев бія Тує беч Ух 795 ва во ацші ЕС шЯЕ Ззс:с Ся акбоайа са ста сса зса ває ада сса сба ав 2508 дек гре бі уаї Тв тів Атч Тл рРЕО ОВО Аа о ТУК Бжч рЕхо БЕ АБ
БИК зі вий са серб аба бу аук асу ско сова ува абс асу дво вс оу еча аа по
Атїа рго іє Ппей Бех Тк оцей Бо бій Тпк о ТБх уві Уаї ба Ако АхУ 830 я35 час зча са сс ача ача айх аса сов сса соб аЗа счК ача соб бе 25ЗВ
ОТу Акт бек рко Ах Ата Ак Тв Вк бек Бго Ага Ага АК Ак бе вай вах 85о саза Бе сса вча са ача аа себ осаа СсЄ заз чаа бса бва бос 53 біпо бах Ехо Ак джо та АкУ Бех бій Бек о АкУ сій Зек зів був 855 бо 895 саєсакєсаус зссевісассв ачсздссцє 27 «йїбе 135 -и1ї5 853 «В1й». Білок «ах» Штучна «дя «223 Синтетична конструкцій «доОЯь 13А нів Гед Бек рем Ак Зіу Бевз орпє Уаї Суб А1іа РМе Бех Бек Зіа С1у х 5 18 15
Еко Ав оАіа нія сій бе гео то був уві ей Нів Був бжу Ск гец 7 25 30 піу зей Бек Аїа Ме бех Так ТБ АБроБем сій Аіз Туг РБе о Пув леЕр 35 40 45
Сув Гей Бе Буз Авроткр біз бі) їй бі штй бів біу їй бЄвж Ажщ в З 6 туї Уві Атла АкЧ цей Бах беж АВ пек дуя ті Рпе АБй НІВ бій Нів
ТО Ще я сіу так Мебє Сів Авап рев НІВ АБО бе Сув Бек дк Ай їв) тук Уві 85 Зо я
Бвї Пеп їза Бец їй тух бів ТЗІ ре біу Ак губ Бей нів гей тТух 105 105 1:5о вк Бів рро їїе Ті ей б1іУу Ре Аго ув 312 ро Меб піу Зав іє 115 ке) 125 рем обех Бо Ре рей рей діа біповве Так обеїх Азїа 112 Сув дек уаї 1395 ІЗ5 140 чаї вт ка Аїз Бе гко нів Су цей Ліва Ре ех Тук Ме АБ дер 145 ї50 155 їБО чаї Уві цей Ш1у А1їа Гу бек Маії сів Ні рем Та бак реа Бне ТЕ 185 170 175
Аїа уді Тк Ав Не ес о їіЄбн Бек ре) зіу їТе Нів їен Авап о рко Ави іди т85 190 мув ТВЕ Бук Акт Тр о Зіу Тут Бек ецоНів Ре Ме сіу Тук омадз Ле 195 209 5 су Су тТух біу деж дей руб Пій АБронів ті їТ1е бій був тів тлу 219 215 20 піч був пе Аа пу Пец ро Маї Авп оАке ро Тіз АзвотбкроБбув Чаї 725 220 235 250
Сув о зіп озка тів уві бі рєц Бей Сім Ре віа діа ро Бреста ств
АБ 25 255
Св сім тТук РкЕо АТїа цем Меб вто їеа Тук о Ата Сув ТІЇ біб беж Гуз 350 Зб за бій Аха воє ївж ре Бех ро ТБ Тух Гув Аза БК рем Су Був С1п зт 280 285 сі біб тТгроБех зеї Був рхо Акт Гув біу Ме біу Тс оАвБп о Бей ЗБЕ 230 пз зас чаї бек Ав орго бен бі Бпе Бо бро АБр оОНії сій рей АБр око іа 305 315 15 32
Ене Ах діа дно бек діа зви го ЗБр оТхр йБЮ Ре яп охо бвп був 325 320 ЗВ
АБрю тих Тр орго СЛль Ата Аво сів Майї б5іу Уві Зі АТа ре Олу Пепй 340 345 Зо піу вне ТЕ Ро рко нів СОту біУу рем ев біу Тр бек ро бів Аза 355 360 355 піп зу її8 їев їв о їТвс оУаї рРго іа Ав орха Ро жо Ата Бех Тит 370 зв 389
ВЕ оОАКЧа біп веї сіу Аг бів рко тТпї руб тів бек ВКОо РО Сбец Аг 385 20 395 00
АвробБех Нів Рхо сіп'АЗа Меб бій Тер ляп Бех їж ТБ Рче Нів сбіп 405 «10 415
Аза пей гео вАврорго Ага Маї да сіу пец лук Ре Рко АТа зі 51 420 23 3530
Бек обеж пек біУу Так оувзі Ан о РХОо Маз Бго ТБ ТНК Аза бе вжо іє 435 140 445
ШЦек дек піе Ре бек одхЯа Те сі Ар о Рхко Та те; Авіпо Ме б1ія Авт 450 ау «во
І1їе тб бекобіу де пе: с0ІТу Рко реч Пес Уаї Тео СХпоАфТа 5іУу Ре 455 о ак во пе ов ба тах дха лів о їшнз ТЕ ч11а рко бтїй бек Бей Ар Бех Тур 485 Аза 295 іїхвроїйс бек їн Ав Рв о їезч спіу П01уУ Те Час Тк о Сув о Бко бу ОІВ
ЗОЗ 519 деп бет бО1лп бек Бко Тек обек двд Нів о шек Ро ТЬжх бек Сув Бко Рхо
ЗШ 535 її Сув Бго п01у ТУук о Аку Тер ОМеб Суб рем Ак Акт Ре тів ті пе 540 535 зай ем Рпе І12е Пем їм Пе) о Сує їеб Ті Бве це) Тен уаії Бемо лей Ажр ек 550 585 555
Тух біп бсіу Меї Бей Бгто Уві Сув БІо пев опе рт 01уУ Трх ех Трх з55 -7а 575 тик бек тик ЗЕБусРКО Сув о пув ТБ СувБ тн Ще вко Аїа ЗіБ цім тТНу 5ВО ах зво
Зв оМеї Ре Ето бех Сув Сув Суд ТБг обувоБро Бвг о Авр о б1у АБИ Сув 535 00 ОВ тиж Сув Ті Рхо тів о рго Бех беї Тр Віа Рпе АТтТа дя Рре ей Тер за 515 БІО чів тув'аіа Бех уаї Аку Впе беї Тр о їжи беї Ппей Ппей Уві рко Рпе
Уч 530 55 540 чаї біп Ткр Ре Ууді Сіу йез о бБеїг Рко Тпкоуаі Ткропей бек уві їт1Ф 545 550 5855 тер о Мек Мес ТЕ о тТук Тхр сі Бо бек ей тую ех рів Уаі бекорко 5б6БО в 67
Впе Тіє Руб Бей пев Ро Ті рае Бе Сув без ТкЕр баї тух Чїє бвр 675 БВ яз її с АлеЕроржо Тук Був сіла рпе сту Вата твЕ МаБф о бтТЯ цей тез Зак ОвВБе 630 5З5 70
Пец о Бго Бех Аяр о влпе Рпе Рко Бек узі АхЯ АвБр о пец Бен дер Тих А їв та 7 715 Тих
Зак Аїв Баш Тук ака 0ій дів Пец бій бек Рхо пі Вів Сук бак орхо та 730 7135 нів Ні тТлЕ Аіа Гей Аху О1й Аза ТІ Пез Суб Тхр С1У Стих оїей Меї 740 ав ВО
Абію інт діа ТаХ Тер омаї сСіу бек Ав Сей сі АБроБто Аа бек АТО тва їж тв зії без Уві Уві бек тує 7аї Авп оуаї Аква мес Бі Беч цув тів Ат то 75 тво
Пій пем рем Ткробре Нія Тіє дек бує Пе) ТНЕ о вБе Сіу Аку бід отр 785 759 735 щлО
Маї Бей бій чут Тем Уві чек Ре 01Уу Уа1ї Тер 112 Ак Тахо ро вхо 805 810 815 вла Тук лкч о рЖО рЕб АБпоАТа уз 11е Бей Беакотйє Бец орто сіло тах о вах 830
Тасгоувді Уві Ак АкаЯ Аха йпіу ДкУ бек Рго Ак Ах вхо ТНК обко бек 835 Ас 845
Рто ака Ак Ага Вк Бех сіп бек Бго с Ахту Аго Ахт Агу дек біп бек 853 55 Кео
Ах бій Бех сїп о Сув
Б5 «дій 135 «іх а «ий. Білок «її» Вірус кепатиту В «4905 135 цук ім Вів бе) Тук бек Нів Ро 116 ї 5 «ВІЗ 136 «11 18 «їй» Білок «213» Вірус гепатиту В «400» 36 їей без Маї Рус: рпе уаї біло Тло Ре уві їх 5 15 «210з 137 «рії В «йї2е Білок с«кїїх Вірус теацпатиту В «Ох 137 нів Гек Тук бет нів Бжхо Ів Ті Пец
В. з хтібз 38 «її «ати» БІЛОК «213» Вірус гепатиту В «аа 538 тжробек ЕЖо Сі АТа сп сту Т1е беч 1 5 е10з 139
ТІМ Я
«1 Білок «13» Вірус гепатиту В -й0дз 139 уаї ей бен Авр о Тук сів Сру Меб ї В «Ввід 140) «рі Я «12 Білок «дії» Вірус гепатиту В «-3005 149
Аа бет таї Ав Ре йех Тк оцей 1 Б «вІ0» Аї «118 «812: Білок «2135 Вірує гепатиту В «430з 181 тТвк уві ркз Аіа двповто РТ рго дів 1 в «й10з 47 «811 5 «піт Білок ха» Вірус гепзтиту В хадоз 145 сОіїу Мей рей рко маї був РКО мем оцей 1 З «іч» т143 «й З «2177 Білож «0132 Бірус гепатиту Б
«АТ» 143
Ме сСіу їей Був Іів Ак бій Пец Гей ї 5 «й1л ех 154 киїїз 8 кйїй» БІіНОК «тій» вірує гепатиту В «800 145 тів сСув Рхо с1у Тух АкУ Тур Меб 1 5 «пл 145 «пі В «5їй» БІЛОК «ІЗ» Вірус гепатиту В «ай» ЛЕ тів тів Ре рез ЕВе Ії Пец пей ї 5 хВІій»х 145 киїїз В «їм Будок «8135 Вірус гепатиту В «400 148 вне чаї бл; ттрорне баї б5ІіУу Бей т. Кк
КУ З
«йї0ж 147 «ву В «вій бінок «Ва» Вірус гепатиту В «вп 147
Пец їм РКО Ії Бе ВБе Суд ре ї 5 «Ох і88 «из 4 «фі1йх Білок «її» Бірує пепатиту в ха0О2 148; уаї Бек Бе піч Мі Тур тів Ата ТВ рго Бо Аза Тег о Аг то Ріо 1 - 19 35
Ав лів Бко тів гео «3105 153
Вії» й «То» пклою «8Ї3» Вірус гепатиту В «00 та їїє бе бек охо Ре Бей рЕО Пец ї 5 2105 150 «2315 557 кеійв БІЛОК «й Штучна «ВД хб»Зх Сицтетизчна конструкція «АвОо» 150 мес Аіа двр ОТ А1а вто Тптх бек пів Пец чех їеч Ахеа біу ей пе ї З 10 ї5
Чві Суд Авіа вав деїх бек Аїа піу Рхо дей Аза НІВ біз ве цем орхо 20 25 30 тує Уві Гем Нів Сує Ася Тпс оїеа Оу Пед бех Аза Ме бек тп Тпе 35 30 15 ев Пе Ота Атїа тух Бпе Бу БЮ Сув мем Ре їв АБЮ Тр БІ БИ 5О 58 во
Без біу Бі бій іш обїз бі зів ТЕробек оЗек іУв о Рко вка Був обруУ то 75 во
Мас ссіу ТІ АБИ Бе бек аї беж Ав бто Бе біт срРпе Ре реж Ар 85 за за
Ніє бій Бей АБО рЕОо АТа Впе Ако Віа дво бек А1В АЕБ БГО Авротхо іо 105 114
Ар оРве деп Орко АБИ Пув о азр ОТНЕ ТЕ о Бко сти діа АБ пі Уві СіУ то ї95 уаї біу АтТа Еве Сіу ї-о Оу Бйе ТБк о Руо Рко Шія п1іУу Біу їйєю рей 115 140
Сі Ткробех Бо біл Аза б1ілозіУу ї1е цей бів таж уві Ро» Ава бать ї45 ї50 155 160
Вго рко го Аіа дет ту Ап оАха сій обех ім вхЯ сій Ро ЖлК БКо 155 178 175
Тіз бек то ко цей АкЯ АБО Бес Ні ргос51о діа Мес біб Ттквр Аа 185 ї85 га бек тах тв впе ків бій Аза йей йей АБр орто дк Ууаї Акоа бі гей 135 ДІ 205
Тут Ре рРго діа 01у Су бах бек беж бБіу Тк Уві АБ оБсо Маї Ро 71 215 ку
Твт ТВу Аза Бак о РЕб тї1іе бЗехї Бас ї1е ББа бек ака Тк ЗІУу Аврора аз 73 235 Ес;
А1їа їй Ав Меб біч деп обі Тк обет Зіу Бе рей біу ро цей пем 2485 йо 25 уаї Без бій Аїа біу ВБе Бе реч цен ТЕ Акоу Ті Ббец ТБх ті8 Рто еВ 255 та
Сі Бех тей дер век тТЕр оту Та Чек бен овяв Ре їви ОТу шіу це 273 280 285
Три тв оСув Рко п1іу бзілоАвт бог осліп бек Ро Ту бек АБО! Нів пед а за 30
РкО Тих бек Су ро РКО їТ1е Су РБго Сху тук йкч Тур, Ме Сув цей
Зо зо 315 Зо
Ажа дк Рне Її Іїе Бе по) Бйе Х12е Гей пе Пец Суб пев тів пе жав З 235
Певмоійви Маі їв ей Ар отТук біп Біу Мех Пеа Рго уві Су ово Без зай 345 ЗУ їжи Бко Сіу ГВт бет о тйк Тв бек ТЕ біу вто Сув був ТЯ СувотТВЕ 155 355 з65
ІзіасРко Аїа сії біу так щех Ме: Бе РБросзЗег Сув Су Сув ТрЕ ов 37) 375 Зо:
Рхо Вет зер Сіу Ап осув Так Сув Х1е Рго Ті рко ех Бех Ттродіа 385 330 395 лой
Ре Аїа ху Рпе бе ТІросій Тур Віа бЄех Чаї га ББе бек тТкр и печ. 4015 АТО 515
Бек їей їеа Зі Бхо Ре уаї біта Тр вне ба) бі Бей дет РКО ТБх
А2О 425 аз чаї Тер опемз бет маї їТе о їкр МекоМмеб Ткрогух Тхробіу вхо Беж ей аа дО 145
Тух бек ті узі бек Брхо Різ 11є Рхо Цеви цец Бко З1іе Ре Рне сСув «ва 55 «00
Мей Ттр Уві Туїт Ті пБр ОтіЗ Авв о Рго Тух ів бій реє сіу А1а тТву 655 79 475 За чаї січ бен Па бу о ВВе ре) ро бек о бдвр о Бре Ра бо бег уві АкФ 455 та 2955
Авроцец їв Авроїбпт АтТа бек АївоГез Ту йха Сіа Ат о пей бід о бет 500 5 БІО хо біз Нів Су Бех Рко Ні Ніз Таг о діа бе» дКе біп Аїа тів те 515 5а 55
Сув тв сС1іу біб Тео Мес Ап рез Аза Так То уві біу шек Авпогреє
ЗО 535 зап сій дер вко Аїа бек ахоа сім Бей Угі Ууаі Бак Тут Уві Ав Ома Ав 545 50 58 50 меє сіу мем Був ТТЄє Аку сій Мей Пе) Ткр ве Нік Іїє бек Сув пей 5 575
Твх ле с1іу Ату біш тТву Уві бецосіми Тук цей Чаї ссву БОе біт Маї во на 590 тТЕр Тів ака Тих вхо Рхо Аїд тую Асф вБжо ву АБИ Аїв о рко їтїе цей
Бек Тйх цех Ро біц Те тк обаї щі зд до Ака ПТУ Ага бек Бо 513 вІ5 У ака ака вка ТВ Рко беїх їїо ДкЧ ока Атя ка Зек бій Бех вро деко
75 530 аз 54й дха ду Ако бек біб бег о Асу бій бек осіп Сув Бів Нік Ні Нія Нід
Ба 559 еВ нів «ТО ОСІБ «ех 555 «812» Білок -2135 Штучна «ВИХ кб» Сивтетична конструкція «4002 ТБ) мес дів двр СТ Аза Рте тк бек б1у сію Ткр оЗекобек ув вка Ак 1 5 19 т5
Був сіу Мей бі тТце Ап оїей обех Уві бБет Ап око ем О1у Бпестпе 0 а 30
Рко АвронНіВв бів ей Ар орга діа Ре йо дій Ав обес діа АБла рЕВ 35 я у вАвротїТхр АвюЮ Рбе ав Бго Ап Бує Авр о ТНК охо ко ба Атїа Автю ЯХл уаї су Уві ж5іУу дів рве о біу ей біу ве тнЕ Рго рта Ні біу О1У 55 70 Та во ішиа Гео біу Тер Бех Рро бів о Ата бів б1у т1іе Пем білоТВк чаї РКО ай 35
АтТа АВ ко ЕЖжОо ргоОо Аїз бес Тих Авп о зуч бій бек біу го й ро 109 Тов 110 тиж Був ї1іе Бек орго Бхз Грей вх АББ БЕ НІВ БКо сій ла Меє сій
ІТ5 129 155 тТтр Ав бек Тр тах Бде Нів бій Аїа їй зей АвровВКо Аха Уаї Аку 130 135 140 шім Гей ТУжЖ Ре Бкро АТа с1у СбіУу бек бек бек О1у Тк ові два РКО їх5 159 155 155
Уаї Бро Тву Тр Азіа бес рко БТіє Чер о бво ТТ Ре бех Ак Ту б1у 165 Іча х75
Авворко Аів реп Ат Мес 01о Ави Іі ТПх Бех Сі Ре рев щіу Рто 185 ї85 5 їхц цем уаї пен бів Аіа ру Бе Бче Пец ої) дк Ака тів їй) ТНК 85 га 205 тре орто бій бек цероАнр о йех Тер Тхр тах Бек лез Ав Ре ей спіу ау 215 ра! піу твж Тих Твгобув Ркоосіх біп Ав Яехк Зій шШек Ро ТЕХ бек Ал ов 230 235 240
Нів бек Рко ТВк обер Сув Рго ро ті Сув Бко с3у Тук Ака тТхв МвЕ 245 ав 285
Сув пев дкч Ак Рпе ї1ів ї1е Ра Пез вБе ї116 Цей це) без сСує рем 260 2765 27О
Хі Ре пец реа Уаї Ббеноїем Ар отуює бОіп обі Меб бе вго уді Сув 275 80 285
Рко ГПез лей РЕ сіу ТБк бек ТВ ТвЕ Бех Тк обіу ро Сув пув о ТНЕ 299 25 00
Сув ТЕ Ії го Аза біп осі Тпж обех Меб Рве Рго Бек Су Сув Сув тав зла 315 329
Тк оцув рго Бек Аво піУу АвпоСув ТНЕ Сув Т15 Бко 1ІТе Бко Бек бех
І за 33 335
Тр Аів Ре Ата Ахо Бе цей твоїй Тут Аза Бек Уві лк вве бек 349 за їЗО
Тер оПез бек Ппем тем оуаї Рсо Ре Уві Сів осТкр о Бйе Уві Су рем бек 355 х50 аби
Трос ствк о Уаї Тер ей бБет аз її Тхр Ме меб тер тує тбЕр сСіу Рке 373 375 зва дех тей Тух бах 112е Уві Єеї РусОа Ре їт1ів'рко без ей о рко 112 вве 385 390 355 499
Ве Сув Гео лтв о уаї туї 115 Бр 116 Авр око тут пу 31 Бе біу
05 416 ІВ
Кіа тих уві бій гей їей бек РБе тей РКО беж Ар ве вра Бжо Бек 383 425 430
Уві дкщ Ав оБбей іп АБЮ Тит Аза бБетг вій рей; Тут АкеУ са Айїя Сех 435 440 415 піч Бех Рхо бій Нів Сув бек око Мів Бів Тех Аза їв) Ако бів Аів
БО 45 452 те цей був тк сІіу сій ем Мес Аа рей лів тик оТхр мах зЗту Бак за5 що 5 485
Авт Бей бім лдврорко Атїя дек ака Сів пен уві уаї бек Тук паї Ап 485 зо 4955 чаї АБИ Мес біу Без Був Ііз Аха Сіп бен їз Тер Бое нів їїе Бех
БО 505 510
Сув сбей Тпж Ре сіу вка сій ТНК Уві Бей сої тую цей ар бех Ре
ВАЄ БАБ сіу баї Ткр її Ак Трк о Рко хо Аіа Тух Ак Рко Бо Ашв дів Ро о 538 30
Ії ем обеж Тк оїей то бід так ТБж Уві уаї лга вкЧ Акау ЗіУу Ах зав Во 55 вед
Чек Бо вк Ага дка Тк оБуо дек о рхо Аку Акт Ак дкУ Чех їв оВек 5-55 ій 575
Ро вАКОр Ах ДЕ АКУ Бек Зі Бех сажа бі бек піп Сук Ні НІВ Ні
ВО я за
Нів Ні нев «й1йх 157 ша кіж В «ВИ Вій ягіЗ» Вірус тепатиту В «00» 153 чаї щпжте те) бер Маії ї11їе ТроомМмеє ї І

Claims (21)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Імунотерапевтична композиція, яка містить: а) дріжджовий носій; і р) злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ складаються з: ї) Х-антигену НВУ, що має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90 95 ідентична положенням 1-60 послідовності «ЕО ІЮ МО: 130 або відповідній послідовності іншого штаму НВУ; ЗА і) поверхневого антигену НВУ, що має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90 95 ідентична положенням 63-461 послідовності 5ЕО ІЮ МО: 130 або відповідній послідовності іншого штаму НВМУ ї; ії) корового антигену НВМ, що має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90 95 ідентична положенням 462-643 послідовності 5ЕО ІЮ МО: 130 або відповідній послідовності іншого штаму НВУ.
2. Імунотерапевтична композиція за п. 1, що містить: а) дріжджовий носій; і р) злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ складаються з: ї) Х-антигену НВМ, що має амінокислотну послідовність положень 1-60 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 130 або відповідної послідовності іншого штаму НВУ; і) поверхневого антигену НВУ, що має амінокислотну послідовність положень 663-461 послідовності зЗЕО ІЮ МО: 130 або відповідної послідовності іншого штаму НВМ, ії; ії) корового антигену НВУ, що має амінокислотну послідовність положень 462-643 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 130 або відповідної послідовності іншого штаму НВМ.
3. Імунотерапевтична композиція за п. 1 або 2, що містить: а) дріжджовий носій; і р) злитий білок, що містить антигени НВУ, де антигени НВМ складаються з: ї) Х-антигену НВМ, що має амінокислотну послідовність положень 1-60 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 130; і) поверхневого антигену НВУ, що має амінокислотну послідовність положень 563-461 послідовності зЕО ІЮ МО: 130, і; ії) корового антигену НВУ, що має амінокислотну послідовність положень 462-643 послідовності ЗЕО І МО: 130.
4. Імунотерапевтична композиція за будь-яким з пп. 1-3, де антигени НВМ розташовані в наступному порядку, від М- до С-кінця, у злитому білку: Х-антиген НВУ, поверхневий антиген НВУ, коровий антиген НВУ.
5. Імунотерапевтична композиція за будь-яким з пп. 1-3, де злитий білок містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 90 95 ідентична амінокислотній послідовності, вибраній з ЗЕОІЮ МО: 130, ЗЕО ІЮ МО: 150 або 5ЕО ІЮ МО: 122.
6. Імунотерапевтична композиція за будь-яким з пп. 1-3, де злитий білок містить амінокислотну послідовність, вибрану з БЕО ІЮ МО: 130, 5ЕО ІЮО МО: 150 або 5ЕО ІО МО: 122.
7. Імунотерапевтична композиція за п. 1, яка містить: а) цілі інактивовані нагріванням дріжджі Засспаготусез сегемівіає; і р) злитий білок НВМ, експресований дріжджами, де злитий білок містить 5ЕО ІЮ МО: 130 або ЗЕО ІО МО: 150.
8. Імунотерапевтична композиція за будь-яким з пп. 1-7, де злитий білок експресується дріжджовим носієм.
9. Імунотерапевтична композиція за будь-яким з пп. 1-8, де дріжджовий носій являє собою цілі дріжджі, інактивовані нагріванням.
10. Імунотерапевтична композиція за будь-яким з пп. 1-9, де дріжджовий носій походить з Засспаготусез сегемівіає.
11. Злитий білок, що містить антигени НВМ, де злитий білок містить амінокислотну послідовність, що щонайменше на 90 95 ідентична амінокислотній послідовності: ЗЕО ІЮ МО: 130 або 5ЕО ІЮ МО: 150.
12. Злитий білок за п. 11, де злитий білок містить амінокислотну послідовність: 5Е0 ІЮ МО: 130 або 5ЕО ІЮ МО: 150.
13. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок за п. 12 з нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 129.
14. Виділена клітина, трансфікована рекомбінантною молекулою нуклеїнової кислоти за п. 13.
15. Застосування композиції за будь-яким з пп. 1-10 для лікування інфекції НВУ або її симптому.
16. Застосування композиції за будь-яким з пп. 1-10 для профілактики інфекції НВМ або її симптому.
17. Застосування композиції за будь-яким з пп. 1-10 для імунізації групи індивідуумів проти НВМ.
18. Застосування за будь-яким з пп. 15-17, яке додатково включає введення індивідууму однієї або кількох додаткових сполук, прийнятних для лікування або пом'якшення симптому інфекції
НВ.
19. Застосування за п. 18, де одна або кілька сполук являють собою противірусну сполуку.
20. Застосування за п. 19, де противірусна сполука являє собою аналог інгібітору зворотної 60 транскриптази.
21. Застосування за п. 19, де противірусна сполука вибрана з групи, яка складається з: тенофовіру, ламівудину, адефовіру, телбівудину, ентекавіру і їхніх комбінацій. 1374 1623 18395 2452 835 1524 п814 -307 3 2848 3215 Б 5 Фі М-кінцевнй єскепресований пептил (пів) Промотор о Поверхневий Ав) 0000 Коровнй антен!
Фіг. 2 М-кінцевий скспросований пептид
Я г. (нів и ПОД вн Зо В ВН екв свв досто сля о оон сонета Промоюе | ие воцнт я
Фіг. 3 М-кннцевий експресований пебхтиц, Й Я - «: (п5)5 , ї нд век во ни ово ва о кп ов в Промотор с РОН домен) с корови антиген
Фіг. 4 М-кінцевий експресований пептид (ів)6 Промот і Коровий антиген ор Й п ні ЖК УМ сфірг. 5 М-кінцевий експресований пептид (пів)ю питні дддітнтнтноддукя ! поктеестетн тенти
Фіг. 6
Т-кінцений експресований пептид (Вів)в й І Промотор | о ВБге і Поверянсвий Ав(5) 00000 ДОМЕН 00//010/|Коровий антиген
ФІГ. 7 М-кізцевий експресований пептид (пів)в пикніощення ВО о о ій ВАН і с ню нав о В КО Промот що Новерхневнй АВ) 00 Коровий антиген Її Ов о в. ромотр ГО 00 Ловерхневнй дв) пні ВОНА явне Фіг, 8 М-ктиевий екопребований пептид й (нів) Промотор. ЩЕ 00 Поверхневий Ав.) 000 урКоровий антиген Ох
Чиг. 9 М-кінцевий експресований пептид ! (пів) гусака: ща в ВОК пет КОКОН ОК Ко КЕ я т Промотор ЩО 000 Поверхневий Ав) 0000 уКоровні антнген І орні дене НК . і Шок Шан нн НВ.
Фіг. 10 М-кінцевий експресований пептид і (вів Б ті "вевий МЕ Кок а ген гом 5; поко ще п іоверохвевнИ Ас Ї. ВМО оравий антиген костювктт ПЕВ хо ЕЕ їх пи щи -Промотор ооо доеерхневий дві) уп Кк доме
Фіг. і М-кінцевий експреєованнй пептид : : : я (лВе Промотор ВОГНЮ Я ) 00000 Поверхневий Ані) 700 Коровнікантисея ОМ ОИ ера МЕМ р в ші
Фіг. 12 М-кінцевий екесприсовання пептид (вів)ю Промотор | "їх ТО Понерхневий АН ПО Коровкй антиген и
Фіг. ІЗ М-кінвовзай експресоввний Іситид п (півь Промотор ! Рон у | ПО Ж ОО Поверхвевий Ав) 00000 Коровий автитен, С ВАННУ ння ВО і М ВХ - . . я
Фіг. 14 М-ківцевий експресовамий пептид : (піз пошана | ТИЛ | Воннт доме | А ОТ оповий антите З Промотор ЖК 5. ІН до ес лою Поверхневий Ле (13 с зКоровий антиген й й Шо Й Б ШИ і опи ОМ ПИВО пак сход
Фіг. 15
. Промотор: СОР: бив СОРТ ОР: ОТЕБО ! Середовище: 2 втце а втане Ви? ; : Мама М Ов М ов В ро р М в ї древню вю ВЕД. З - - БІ ББЕ 6. Б З и ши и СН | вес и ши ни
Фіг. 16 Е ні пів пі в і о пн п сни нн в в інн з
! . і , нк ! о Промотор: суб особ єюР су тЕЕ тТЕЕ в СТЕК
І. Сереловмийс: бе о Вго ма во ча вт яса і. - ШЕ - М Шо о мамознеа 00 інн . . ЩИо5 Бо 100 200 сок .
Е. ЗК. ще як: Кох оо - - БсОога . Б ші. й ча Кіт бод а: Й жа х ще ЖК нею я . ж «М. Ше | пролуєх - з й ії: вими й йк-ае драм - З - й с й "- мне Що у рубнування зсоге я шко : що Ж ких .
Фіг. 17
- ОЦРІ ТЕЕе М М5З-лів «Та о Ше 2 шШ2 хуБО п ши ше ОН НЯ шо щ п ах ЕЕ 0000: Ес ян о я ве иа пед не Еш я кожно Що -5-100 «Да - І ше її Її її. її щі її її.
Фіг. 18 Мо Мезев бовтрольнідрікажі реж дірна-яРЕХ 8 Я БЮ дш сн дж цлянє цьо ж в її,
в. 5 с ЕЕ ше
Фіг. 19 мій У2.0 У1і.0 м2.0 бсоге СА бБеВ боб 0 бр а-бр 5рА 5рВ 5ро 5ро т ОЗ 5 о ше оо а з же :
В. я і . Е о о. : і. що о. ко, ці . Є ря . Ж Бо сдишяи МБО М С С ДИККУжех од шо - у ше: з и с: 7 феож ща «ко
Фіг. 20 ж ж 5 х 8 й ж 8 ! сш ШЕ Шк в» Мр» Шк Же Я Яна ШИ» МИ ШИ в ш в я я З З З З 5 5 5 З а ш Б вЕ В Б Ж айвою ож м х їх В -3 і З О «-- ж - ще ях «- с «- Кз т 55БШ Б 8 В В 8 8 8 я я НІЖ Ж Ж Ж 9 0 Ки и о и ОМ с ас жі шо ан ж В ей І. ОО ння ж ше 30 ша ДВК п ПІВНІ КЕНЕ ПОП КИ ЕК КЕ КК и КИЕВ ЕЛ Ж Є ШІ ДМИИ АЛЕШТ ИЙ а пи о о
Фіг. 21 в) 0160 - : --- : 120 ношу однин сп ЩО й ! рт що 00. трест - . Шини пен нин ин ще в 80080 он Я нн У Я В ва г -
В 1. і. ч |. шщ шк що г: не шк шини ко шення ще А -- в Е ш ши «в ші ши шк шк ші щі щ що С м як шк Я Ж -ші і М Ос Ї чи ТУ у й т Шх З ій я й ) цу о о во ве; 8 М З и Ки Кк о ме Я я семи: ШИЯ о дн ША З є Фе со ее ек осяй о ди кое в и а а А Гой у; с х ву що У - г А З с ей ві з 4-Х Ковструкція Ту 02 або 0) Фіг 22 10000: 9000: фот 80003 , Інша 7000 но інн пн но пгт 8000 нн 9 В ВСОВЕ Кз 5060 -- Пт ве МЕС в 40004. 2 фо ентятннннтттюни НАЇВНІ АК в ШІ 000: я шо нн ни "НИ т Пік ця а | Шйез як 3 1 100 30 10 Суми 5'коровий антен смкелмт Міметопний пепгнд зАр класу Й (мкг/мл Фіг, 23 25000 -- т -- 200004 | ет тннннннннннннннтннння ех . т ше шо Ів сов й і. "що чАЇВНІ 10000. Я. шко нн нн нн й Я Г -0606- 11 в с сік с шо питво ли 100.30 10. Суміш в/коровий антиген (мкг/мл) Міметонний пептид 5 Ак класу П (мкг/мл)
Фіг. 24 в У 6500 - - ЗЕ ак нини нн ни он нн кн о по нн нн А БК ро Н у шани ш-щ- шннннннннншнини ши ш « оішш ШИ /(хф смш (3 і я З 1 100 30 10 Суміші 5/коровий адтнгев (мкм) Миметопний пептид ЗА класу (мкм)
Фіг. 25 4000, 1---- 3500 | рот ння 3000 Гр няття еп Ше ніи н Г аВРЕХ 20800044 НА рон Й УМЕС 100044 ЩА Верн Я нн вт в З 1 100 30 10 Суміцекв/коровий антиген мкг/мл) Міметенний дептид 5 класу НП (мкг/мл) Фіг, 26 75 ча ї ж т БО що з о що р. я; ДО ща Ух о ни Е: ШІ шій ш ше Бр у М р у М 5С у М 5с У М вррь р рР5 в Фіг: 27 се 20- Е 10 І Е бр їх ЦІ р Кй М зе , т м 5с й. М рр , рр Р Чис, 28 175-- т : я с ї ще . и і я вс ум 5 М м НРРЬ НЕМР 5 Фіг. 29А 2 - 50 шо ЗО Зр ї М ар у М НРРЬ НВУР ФЧиг. 293 І-15 І -6 - Фо З й. ще в її. 5 тат і г е і. хатка й І. Щщ і БК З х неті йо КО я щ ТЕ ши ши я м С о Ії - р 5 у М р с Б М НВУ Задня корови Ав НБУ баці. коровий Ав Фіг; ЗО Фіс. ЗОВ с» 600 | 40. т 500 Та в. - Е о ЗО -2 4005 а - Я 0. т і що Е 300; бо. тт 200 | п | і г 10 ! | . і І і есе І І о. - : ш ш- шщ- ше ШИ шщ ш ш Бе у ! Р М Бр вс у М НУ ад коровий А НЕБУ Бад коровий ле Фіг, 3ЗОС Фіг. 300 14 3/5 1/5 5/5 4/5 5 я х 10 | стнзяттяннтт тити тт тити тт тт тир тт ту Ж тиинн птктиттятятяттттттттт тт ж У форт й в ж Ко се ще о Сай зе сх су що «Х ше ЯК нс не щей я: й о що - шо є Ки ек су сх щі м о г ще а « : и ; й Вакцинація павантаження фік. Зі ш 1200 ПК ВЕ соб В вебовео Б ш-е и А пн ві вСшс ш й ш ш ш- ш. ще ШО ее в в й р -к ГУ Фі се ї- «о се 5 й В а В КЕ. « ща 8 КІ ТМ
Е. з ві Б н зу (22) 3 о 2: с Ко Ехо а
Фів. 32 жо . я Е гов. пеня от в. ве І КО «- БО зе ВЕ. ре; | |! | т о Ше НИ ши пеня ооо: ване нннаввнн нан і. т А -Б50 - іш а голех іш, Ж їд Е яз ес ва БЕ я ЕЕ В чок кох що щодо вд Ж - Бод Фо Фф Ж - в тов - ее ш ЗЕ - щої т - Момент часу Фів: 33 ж чай В жо 500. я 450 нн нні діння дня 5 8002 олені рр ет пп дв 505) ння шин ШЕ ша ши аа я З ПН МЕ» щі у шини и шо и ши шк шо ше - ж до є ото» жі жіФві в во -чжіФів| м ь. Бл -- Н Н ж - роя т Ге Н ЗАеВНЕ че зачин пдв вів пів я УС 5 | 5СОВЕО Є ЖВСОВЕ Фіг, 34 АД ренту Е ож нн в нн нин В і шт нн Во гя ! 5 ВО рення ве ння х Ов фронтит рт с о ен НИ о ни и ин є : і ко о шо в 03 Сотютї-27 | Хе2-100 Ї ба стинулнюре | І бопемі-е7 і Херов | песни Е | ЕС всоВЕ-о
Фіг. 35 г кі Е З Е ! - 120 ниИИИТИИиЖтжтжтчтнлЛтлтятИяАиАии ооо п пп пп поп мили Ва я 100 ниннТтнтТчвтннннннннннш ХО О60 34 ок і . Її 5 їв БІ, ЕЕ) ше | В ІВ. і ще ни. ве Паівні | г УЧЕС шк ЗСОВЕ-О ! 7 Х-ВСОНЕ і о
Фіг. 36
2.5 А
8 2.0 Й ій Ж от ухес (ММ 1,5 ОМ ОА ВбОВЕ-О (ММ) о й о Х-БООНЕ (ММ)
» 8. ра | є Омах (МУЛ) р ко. ; й - я іш ше Я і - | 4
0.0 м ее : поко 5 - З є Б й «ж Еш ши ши: НИ ши З ге Пептид У Ума для стимуляцн ОС Фіг 37
0.75 ше їх ке Без стимулятора зеет за Ще З | Ж 7ОР-5 (0,5 мкг/мл) о: Іі- зкнк 050 --к я ва ж рай - 025 ро х ї - май у Янка І ши еще во Бу, вк БІБ КК. 1 49 49 45 а ЖЕ с: сх 4 за ке Ж Імунізація (ГУБ) Фіг: 35
UAA201310911A 2011-02-12 2012-09-02 Терапевтичний засіб на основі дріжджів для лікування хронічного гепатиту в UA112859C2 (uk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161442204P 2011-02-12 2011-02-12
US201161496945P 2011-06-14 2011-06-14
US201161507361P 2011-07-13 2011-07-13
PCT/US2012/024409 WO2012109404A1 (en) 2011-02-12 2012-02-09 Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis b infection

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA112859C2 true UA112859C2 (uk) 2016-11-10

Family

ID=46638950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201310911A UA112859C2 (uk) 2011-02-12 2012-09-02 Терапевтичний засіб на основі дріжджів для лікування хронічного гепатиту в

Country Status (24)

Country Link
US (7) US8877205B2 (uk)
EP (2) EP2672991B1 (uk)
JP (4) JP5745102B2 (uk)
KR (1) KR102026840B1 (uk)
CN (1) CN103476426B (uk)
AP (1) AP2013007110A0 (uk)
AU (2) AU2012214394B2 (uk)
BR (1) BR112013020425A2 (uk)
CA (1) CA2827150C (uk)
CL (1) CL2013002334A1 (uk)
CO (1) CO6791572A2 (uk)
CR (1) CR20130424A (uk)
EA (1) EA028659B1 (uk)
EC (1) ECSP13012862A (uk)
ES (1) ES2643389T3 (uk)
HK (1) HK1248120A1 (uk)
IL (1) IL227900B (uk)
MA (1) MA34956B1 (uk)
PE (1) PE20140844A1 (uk)
SG (1) SG192285A1 (uk)
TW (1) TWI504608B (uk)
UA (1) UA112859C2 (uk)
WO (1) WO2012109404A1 (uk)
ZA (1) ZA201306481B (uk)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2696551T3 (es) 2010-12-17 2019-01-16 Globeimmune Inc Composiciones y métodos para el tratamiento o la prevención de la infección por adenovirus-36 humano
PL2672992T3 (pl) 2011-02-11 2020-11-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko rdzeniowe wirusa zapalenia wątroby typu B i szczepionka je zawierająca
US9238679B2 (en) * 2011-02-11 2016-01-19 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Nucleic acid molecule encoding hepatitis B virus core protein and surface antigen protein and vaccine comprising the same
AU2012214394B2 (en) 2011-02-12 2016-08-11 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis B infection
MX350661B (es) 2011-03-17 2017-09-13 Us Health Composiciones inmunoterapeuticas de levadura-brachyuri.
US9579377B2 (en) 2011-06-14 2017-02-28 Globeimmune, Inc. Yeast-based compositions and methods for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection
KR102049928B1 (ko) 2011-08-17 2019-11-28 글로브이뮨 효모-muc1 면역요법 조성물 및 그 용도
WO2014003853A1 (en) 2012-06-26 2014-01-03 Biodesix, Inc. Mass-spectral method for selection, and de-selection, of cancer patients for treatment with immune response generating therapies
EP2976100B1 (en) 2013-03-19 2020-07-01 Globeimmune, Inc. Yeast-based immunotherapy for chordoma
TWI728239B (zh) 2013-03-26 2021-05-21 美商環球免疫公司 治療或預防人類免疫缺乏病毒感染之組合物及方法
WO2015031778A2 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Globeimmune, Inc. Compositions and methods for the treatment or prevention of tuberculosis
CN113419058A (zh) 2014-04-11 2021-09-21 全球免疫股份有限公司 基于酵母的免疫疗法和i型干扰素敏感性
WO2016085284A1 (ko) * 2014-11-28 2016-06-02 (주)셀트리온 B형 간염 바이러스 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 b형 간염 바이러스 중화 결합 분자
CN107530383A (zh) 2015-01-09 2018-01-02 埃图比克斯公司 用于埃博拉病毒疫苗接种的方法和组合物
KR101756050B1 (ko) 2015-03-04 2017-07-07 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 톨 유사 수용체 조정제 화합물
KR20180054587A (ko) 2015-08-03 2018-05-24 글로브이뮨 변형된 효모-브라큐리 면역치료학적 조성물
WO2017035230A1 (en) 2015-08-26 2017-03-02 Gilead Sciences, Inc. Deuterated toll-like receptor modulators
CA3002508A1 (en) * 2016-01-12 2017-07-20 Ulrike Protzer Means and methods for treating hbv
BR102017010009A2 (pt) 2016-05-27 2017-12-12 Gilead Sciences, Inc. Compounds for the treatment of hepatitis b virus infection
EP3276006A1 (en) * 2016-07-27 2018-01-31 Theravectys Lentiviral vectors for expression of hepatitis b virus (hbv) antigens
US10640499B2 (en) 2016-09-02 2020-05-05 Gilead Sciences, Inc. Toll like receptor modulator compounds
SI3507276T1 (sl) 2016-09-02 2022-01-31 Gilead Sciences, Inc. Spojine modulatorja toličnih receptorjev
CN106421774B (zh) * 2016-09-08 2019-05-28 中国科学院生物物理研究所 PreS1用于制备乙肝疫苗以及治疗慢性乙型肝炎的用途
MA46535A (fr) 2016-10-14 2019-08-21 Prec Biosciences Inc Méganucléases modifiées spécifiques de séquences de reconnaissance dans le génome du virus de l'hépatite b
TW202402300A (zh) 2017-01-31 2024-01-16 美商基利科學股份有限公司 替諾福韋埃拉酚胺(tenofovir alafenamide)之晶型
JOP20180008A1 (ar) 2017-02-02 2019-01-30 Gilead Sciences Inc مركبات لعلاج إصابة بعدوى فيروس الالتهاب الكبدي b
GB201705765D0 (en) * 2017-04-10 2017-05-24 Univ Oxford Innovation Ltd HBV vaccine
JOP20180040A1 (ar) 2017-04-20 2019-01-30 Gilead Sciences Inc مثبطات pd-1/pd-l1
WO2018225731A1 (ja) * 2017-06-05 2018-12-13 株式会社ビークル Ｈｂｖに対する免疫応答を生じさせるために用いられるウイルス様粒子
JP6934562B2 (ja) 2017-08-22 2021-09-15 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド 治療用複素環式化合物
JP7317017B2 (ja) * 2017-12-19 2023-07-28 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・アンリミテッド・カンパニー Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）ワクチンおよびその使用
AU2018390825A1 (en) * 2017-12-19 2020-06-18 Ichor Medical Systems, Inc. Methods and apparatus for the delivery of hepatitis B virus (HBV) vaccines
EA202091517A1 (ru) 2017-12-19 2020-11-03 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Способы и устройство для доставки вакцин против вируса гепатита b (hbv)
EA202091516A1 (ru) 2017-12-19 2020-11-03 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Способы и композиции для индукции иммунного ответа против вируса гепатита b (hbv)
US11021692B2 (en) 2017-12-19 2021-06-01 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Hepatitis B virus (HBV) vaccines and uses thereof
CA3084582A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. 2'3' cyclic dinucleotides with phosphonate bond activating the sting adaptor protein
WO2019123340A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. 3'3' cyclic dinucleotides with phosphonate bond activating the sting adaptor protein
TWI796596B (zh) 2018-02-13 2023-03-21 美商基利科學股份有限公司 Pd‐1/pd‐l1抑制劑
EP3759109B1 (en) 2018-02-26 2023-08-30 Gilead Sciences, Inc. Substituted pyrrolizine compounds as hbv replication inhibitors
CA3092935A1 (en) * 2018-03-06 2019-09-12 Precigen, Inc. Hepatitis b vaccines and uses of the same
WO2019195181A1 (en) 2018-04-05 2019-10-10 Gilead Sciences, Inc. Antibodies and fragments thereof that bind hepatitis b virus protein x
TWI818007B (zh) 2018-04-06 2023-10-11 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 2'3'-環二核苷酸
TW202005654A (zh) 2018-04-06 2020-02-01 捷克科學院有機化學與生物化學研究所 ２，２，─環二核苷酸
JP7296398B2 (ja) 2018-04-06 2023-06-22 インスティチュート オブ オーガニック ケミストリー アンド バイオケミストリー エーエスシーアール，ヴイ．ヴイ．アイ． ３’３’－環状ジヌクレオチド
TW201945388A (zh) 2018-04-12 2019-12-01 美商精密生物科學公司 對b型肝炎病毒基因體中之識別序列具有特異性之最佳化之經工程化巨核酸酶
CA3093130C (en) 2018-04-19 2023-10-17 Gilead Sciences, Inc. Pd-1/pd-l1 inhibitors
US20190359645A1 (en) 2018-05-03 2019-11-28 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. 2'3'-cyclic dinucleotides comprising carbocyclic nucleotide
US20210154250A1 (en) * 2018-05-15 2021-05-27 Globeimmune, Inc. Lysates of recombinant yeast for inducing cellular immune responses
AU2019297362B2 (en) 2018-07-06 2022-05-26 Gilead Sciences, Inc. Therapeutic heterocyclic compounds
US11186579B2 (en) 2018-07-06 2021-11-30 Gilead Sciences, Inc. Therapeutic heterocyclic compounds
KR20230159715A (ko) 2018-07-13 2023-11-21 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Pd-1/pd-l1 억제제
WO2020028097A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 Gilead Sciences, Inc. Solid forms of (r)-11-(methoxymethyl)-12-(3-methoxypropoxy)-3,3-dimethyl-8-0x0-2,3,8,13b-tetrahydro-1h-pyrido[2,1-a]pyrrolo[1,2-c] phthalazine-7-c arboxylic acid
KR102635333B1 (ko) 2018-10-24 2024-02-15 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Pd-1/pd-l1 억제제
US11203591B2 (en) 2018-10-31 2021-12-21 Gilead Sciences, Inc. Substituted 6-azabenzimidazole compounds
WO2020092528A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Gilead Sciences, Inc. Substituted 6-azabenzimidazole compounds having hpk1 inhibitory activity
EP3935065A1 (en) 2019-03-07 2022-01-12 Institute of Organic Chemistry and Biochemistry ASCR, V.V.I. 3'3'-cyclic dinucleotide analogue comprising a cyclopentanyl modified nucleotide as sting modulator
EP3934757B1 (en) 2019-03-07 2023-02-22 Institute of Organic Chemistry and Biochemistry ASCR, V.V.I. 2'3'-cyclic dinucleotides and prodrugs thereof
US20220143061A1 (en) 2019-03-07 2022-05-12 Institute Of Organic Chemistry And Biochemistry Ascr, V.V.I. 3'3'-cyclic dinucleotides and prodrugs thereof
TWI751517B (zh) 2019-04-17 2022-01-01 美商基利科學股份有限公司 類鐸受體調節劑之固體形式
TW202210480A (zh) 2019-04-17 2022-03-16 美商基利科學股份有限公司 類鐸受體調節劑之固體形式
EP3972695A1 (en) 2019-05-23 2022-03-30 Gilead Sciences, Inc. Substituted exo-methylene-oxindoles which are hpk1/map4k1 inhibitors
WO2020254876A1 (en) * 2019-06-18 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Virus-like particle delivery of hepatitis b virus (hbv) vaccines
US20220305115A1 (en) 2019-06-18 2022-09-29 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and pyridopyrimidine derivatives
CA3142513A1 (en) 2019-06-25 2020-12-30 Gilead Sciences, Inc. Flt3l-fc fusion proteins and methods of use
US20220257619A1 (en) 2019-07-18 2022-08-18 Gilead Sciences, Inc. Long-acting formulations of tenofovir alafenamide
WO2021034804A1 (en) 2019-08-19 2021-02-25 Gilead Sciences, Inc. Pharmaceutical formulations of tenofovir alafenamide
EP4036111A4 (en) * 2019-09-27 2023-10-25 Fujirebio Inc. HEPATITIS B VIRUS CORE ANTIGEN IMMUNOASSAY AND KIT THEREOF
CR20220129A (es) 2019-09-30 2022-05-06 Gilead Sciences Inc Vacunas para vhb y métodos de tratamiento de vhb
US20230031465A1 (en) 2019-12-06 2023-02-02 Precision Biosciences, Inc. Optimized engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the hepatitis b virus genome
JP2023510544A (ja) * 2020-01-09 2023-03-14 ビリオン セラピューティクス，リミティド ライアビリティ カンパニー ヘルペスウイルス糖タンパク質ｄと融合したｂ型肝炎ウイルス抗原をコードするアデノウイルスベクター及びその使用方法
US20210284716A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Immunitybio, Inc. ACE2-Fc Trap
US11857620B2 (en) 2020-03-11 2024-01-02 Immunitybio, Inc. Method of inducing immunity against SARS-CoV-2 using spike (s) and nucleocapsid (N)-ETSD immunogens delivered by a replication-defective adenovirus
CA3169348A1 (en) 2020-03-20 2021-09-23 Gilead Sciences, Inc. Prodrugs of 4'-c-substituted-2-halo-2'-deoxyadenosine nucleosides and methods of making and using the same
US20220119426A1 (en) 2020-08-07 2022-04-21 Gilead Sciences, Inc. Prodrugs of phosphonamide nucleotide analogues and their pharmaceutical use
TWI815194B (zh) 2020-10-22 2023-09-11 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
TW202310852A (zh) 2021-05-13 2023-03-16 美商基利科學股份有限公司 ＴＬＲ８調節化合物及抗ＨＢＶ ｓｉＲＮＡ療法之組合
US11926628B2 (en) 2021-06-23 2024-03-12 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
US11976072B2 (en) 2021-06-23 2024-05-07 Gilead Sciences, Inc. Diacylglycerol kinase modulating compounds
CA3220923A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
AU2022298639A1 (en) 2021-06-23 2023-12-07 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
WO2023085956A1 (en) * 2021-11-09 2023-05-19 Avalia Immunotherapies Limited Novel therapeutic vaccines

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2486400B1 (fr) 1980-07-09 1986-05-30 Univablot Medicaments a base de levures ou de leurs extraits insolubles
NZ199722A (en) 1981-02-25 1985-12-13 Genentech Inc Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain
US4775622A (en) 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
US5310654A (en) 1985-07-31 1994-05-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for determining virulence of Yersinia
US5164485A (en) * 1985-08-20 1992-11-17 Takeda Chemical Industries, Ltd. Modified hepatitis B virus surface antigen P31 and production thereof
US5234830A (en) 1988-02-03 1993-08-10 Suntory Limited DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region
US6306625B1 (en) * 1988-12-30 2001-10-23 Smithkline Beecham Biologicals, Sa Method for obtaining expression of mixed polypeptide particles in yeast
IL95019A0 (en) 1989-08-09 1991-06-10 Mycogen Corp Process for encapsulation of biologicals
US6607727B1 (en) 1991-08-26 2003-08-19 The Scripps Research Institute Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitus B virus
AU5679394A (en) * 1992-11-25 1994-06-22 International Biotechnology Laboratories, Inc. Hepatitis b virus vaccines
US5830463A (en) 1993-07-07 1998-11-03 University Technology Corporation Yeast-based delivery vehicles
US5413914A (en) 1993-07-07 1995-05-09 The Regents Of The University Of Colorado Yeast assay to identify inhibitors of dibasic amino acid processing endoproteases
US5858378A (en) 1996-05-02 1999-01-12 Galagen, Inc. Pharmaceutical composition comprising cryptosporidium parvum oocysts antigen and whole cell candida species antigen
JP3713900B2 (ja) 1996-07-19 2005-11-09 ソニー株式会社 負極材料及びこれを用いた非水電解液二次電池
DE69911175T2 (de) * 1998-02-12 2004-07-29 Apovia, Inc., San Diego Strategisch modifizierte hepatitis b kernproteine und ihre derivate
WO2001040279A2 (en) * 1999-12-03 2001-06-07 Innogenetics N.V. Hbv sequences
GB0216074D0 (en) * 2002-07-11 2002-08-21 Weatherford Lamb Improving collapse resistance of tubing
US20020044948A1 (en) 2000-03-15 2002-04-18 Samir Khleif Methods and compositions for co-stimulation of immunological responses to peptide antigens
AU1951001A (en) 2000-04-06 2001-09-17 Panacea Pharm Llc Microbial delivery system
US7083787B2 (en) 2000-11-15 2006-08-01 Globeimmune, Inc. Yeast-dendritic cell vaccines and uses thereof
CN1171636C (zh) * 2001-06-06 2004-10-20 中国人民解放军第二军医大学 一种乙型肝炎dna疫苗
US8029803B2 (en) * 2002-06-20 2011-10-04 Paladin Labs, Inc. Chimeric antigens for eliciting an immune response
US7439042B2 (en) 2002-12-16 2008-10-21 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis C infection
US8343502B2 (en) 2002-12-16 2013-01-01 Globeimmune, Inc. Yeast-based vaccines as immunotherapy
WO2004058157A2 (en) * 2002-12-16 2004-07-15 Globeimmune, Inc. Yeast-based vaccines as immunotherapy
EP1609107A4 (en) 2003-03-28 2006-08-30 Idm Pharma Inc METHOD FOR IDENTIFYING OPTIMAL PEPTIDE PITOPARIANTS
DE10339927A1 (de) * 2003-08-29 2005-03-24 Rhein Biotech Gesellschaft für neue Biotechnologische Prozesse und Produkte mbH Zusammensetzung zur Prophylaxe/Therapie von HBV-Infektionen und HBV-vermittelten Erkrankungen
AU2005295317B2 (en) 2004-10-18 2011-10-13 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis C infection
BRPI0613025A2 (pt) 2005-07-11 2010-12-14 Globeimmune Inc composiÇço para reduzir a resistÊncia a um agente, mÉtodo para a preparaÇço de um veÍculo de levedura e uso da composiÇço
US20070172503A1 (en) 2005-12-13 2007-07-26 Mycologics,Inc. Compositions and Methods to Elicit Immune Responses Against Pathogenic Organisms Using Yeast Based Vaccines
TW201412329A (zh) 2006-02-02 2014-04-01 Globeimmune Inc 用於誘發免疫反應之以酵母菌爲基礎之疫苗
MX2008012392A (es) 2006-03-27 2008-12-17 Globeimmune Inc Mutacion de ras, y composiciones y metodos relacionados con la misma.
KR100836745B1 (ko) * 2007-01-31 2008-06-10 (주)두비엘 Ｈｂｖ 백신 및 그의 제조 방법
CA2676783C (en) 2007-02-02 2016-04-05 Globeimmune, Inc. Improved methods for producing yeast-based vaccines
CN101036784B (zh) * 2007-03-09 2010-11-10 中国人民解放军第二军医大学 一种乙型肝炎治疗性细胞毒性t细胞表位疫苗及其制备方法
JP5579451B2 (ja) 2007-03-19 2014-08-27 グローブイミューン，インコーポレイテッド ガンのための標的化治療の変異性回避の標的化アブレーションのための組成物
WO2010033841A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Globeimmune, Inc. Immunotherapy for chronic hepatitis c virus infection
WO2010065626A1 (en) 2008-12-02 2010-06-10 Globeimmune, Inc. Genotyping tools, methods and kits
KR102019728B1 (ko) 2009-04-17 2019-09-09 글로브이뮨 암에 대한 병용 면역요법 조성물 및 방법
JP5913103B2 (ja) 2009-09-14 2016-04-27 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイトＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＬＯＲＡＤＯ，ａ ｂｏｄｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｅ 酵母ベースの免疫療法組成物を含む組合せ物及び被験者のスクリーニング方法
EP2547792A4 (en) 2010-03-14 2013-11-27 Globeimmune Inc PHARMACOGENOMIC TREATMENT AND ADAPTATION TO THE RESPONSE OF AN INFECTIOUS DISEASE USING YEAST IMMUNOTHERAPY
WO2012019127A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 The Regents Of The University Of Colorado Combination yeast-based immunotherapy and arginine therapy for the treatment of myeloid-derived supressor cell-associated diseases
ES2696551T3 (es) 2010-12-17 2019-01-16 Globeimmune Inc Composiciones y métodos para el tratamiento o la prevención de la infección por adenovirus-36 humano
AU2012214394B2 (en) 2011-02-12 2016-08-11 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis B infection
MX350661B (es) 2011-03-17 2017-09-13 Us Health Composiciones inmunoterapeuticas de levadura-brachyuri.
US9579377B2 (en) 2011-06-14 2017-02-28 Globeimmune, Inc. Yeast-based compositions and methods for the treatment or prevention of hepatitis delta virus infection
KR102049928B1 (ko) 2011-08-17 2019-11-28 글로브이뮨 효모-muc1 면역요법 조성물 및 그 용도

Also Published As

Publication number Publication date
JP2014507144A (ja) 2014-03-27
US20140065182A1 (en) 2014-03-06
US8877205B2 (en) 2014-11-04
CR20130424A (es) 2013-11-29
CN103476426A (zh) 2013-12-25
IL227900B (en) 2018-02-28
ES2643389T3 (es) 2017-11-22
ZA201306481B (en) 2016-07-27
AP2013007110A0 (en) 2013-09-30
US10441650B2 (en) 2019-10-15
TW201309721A (zh) 2013-03-01
BR112013020425A2 (pt) 2017-06-13
NZ705184A (en) 2016-09-30
US8722054B2 (en) 2014-05-13
JP5911983B2 (ja) 2016-04-27
EP3266464A2 (en) 2018-01-10
ECSP13012862A (es) 2013-11-29
EP2672991A1 (en) 2013-12-18
US20130243805A1 (en) 2013-09-19
EP3266464A3 (en) 2018-03-14
CN103476426B (zh) 2021-08-10
AU2016256751A1 (en) 2016-12-01
TWI504608B (zh) 2015-10-21
US20150110828A1 (en) 2015-04-23
JP2015096557A (ja) 2015-05-21
JP5745102B2 (ja) 2015-07-08
PE20140844A1 (es) 2014-07-14
KR102026840B1 (ko) 2019-09-30
NZ614733A (en) 2015-03-27
US20180311339A1 (en) 2018-11-01
US9428556B2 (en) 2016-08-30
EP2672991B1 (en) 2017-07-19
JP6109989B2 (ja) 2017-04-05
US20140286984A1 (en) 2014-09-25
CA2827150A1 (en) 2012-08-16
WO2012109404A1 (en) 2012-08-16
AU2012214394A1 (en) 2013-09-12
IL227900A0 (en) 2013-09-30
US8961988B2 (en) 2015-02-24
CA2827150C (en) 2018-09-11
US20150191509A1 (en) 2015-07-09
KR20140009344A (ko) 2014-01-22
EA201391170A1 (ru) 2014-02-28
CO6791572A2 (es) 2013-11-14
EA028659B1 (ru) 2017-12-29
US9290547B2 (en) 2016-03-22
CL2013002334A1 (es) 2014-08-01
SG192285A1 (en) 2013-09-30
HK1248120A1 (zh) 2018-10-12
MA34956B1 (fr) 2014-03-01
JP2016128513A (ja) 2016-07-14
JP2017105834A (ja) 2017-06-15
EP2672991A4 (en) 2015-07-29
AU2016256751B2 (en) 2018-06-14
US9943591B2 (en) 2018-04-17
US20170000879A1 (en) 2017-01-05
AU2012214394B2 (en) 2016-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA112859C2 (uk) Терапевтичний засіб на основі дріжджів для лікування хронічного гепатиту в
JP5730514B2 (ja) 免疫療法としての酵母ベースの治療用組成物
ES2671381T3 (es) Composiciones inmunoterapéuticas para el tratamiento o prevención de infección por virus de hepatitis delta
JP2006510718A5 (ja) 組成物の使用方法およびワクチン
NZ614733B2 (en) Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis b infection