WO2018225731A1 - Ｈｂｖに対する免疫応答を生じさせるために用いられるウイルス様粒子 - Google Patents

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particle
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康則 織田
千夏 大橋
健太郎 磯谷
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    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • This relates to virus-like particles that are used to generate an immune response against HBV.
  • the invention also relates to a virus-like particle composition used to generate an immune response against HBV.
  • the present invention also relates to a vaccine for treating and / or preventing HBV containing these as active ingredients.
  • Hepatitis B is an infection caused by hepatitis B virus (this may be referred to as “HBV” in this specification). This disease is known as a major cause of various liver diseases represented by acute hepatitis, chronic hepatitis, cirrhosis, hepatocellular carcinoma and the like. It is said that 300 million people are infected with HBV worldwide, and hepatitis B is one of the global health problems.
  • HBV is a particle composed of DNA at its center and a capsid surrounding it, and has an envelope structure containing a large number of proteins in the lipid membrane on its surface. Since the envelope is a structure located on the outermost part of the virus and is used for immunological detection of HBV, it may also be called a surface antigen (FIG. 1).
  • the full-length protein that forms the surface antigen of HBV is called L protein, and there are three regions, Pre-S1 region, Pre-S2 region, and S region in order from the N-terminus displayed on the outermost part of the particle (Fig. 1). .
  • the Pre-S1 region plays a role as a sensor that recognizes and binds to cells when HBV infects human hepatocytes.
  • Human hepatocytes have an NTCP receptor as a receptor for HBV (Non-patent Document 1).
  • cell lines derived from human hepatocytes that do not infect HBV become infected with HBV if the NTCP receptor is highly expressed (Non-Patent Document 2). Recently, these cells have been used to infect HBV. Confirming the defensive effect is becoming widely used.
  • the full-length L protein called HBs-L antigen protein lacks the Pre-S1 region, the protein consisting of the Pre-S2 region and S region lacks the M protein, and the HBs-L antigen protein lacks the Pre-S1 and Pre-S2 regions.
  • a protein consisting only of the S region is called an S protein.
  • the definition of the word may be ambiguous, such as the surface antigen of HBV (Hepatitis B Surface Antigen, HBsAg) may mean S antigen particles consisting only of S protein.
  • HBV surface antigen protein antigen particles consisting only of S protein are defined as S antigen or HBs-S antigen, and antigen particles consisting only of M protein are defined as M antigen or HBs-M antigen.
  • the antigen particle consisting only of the L protein is defined as L antigen or HBs-L antigen (FIG. 1).
  • HBV antigen proteins described above can be produced in an expression system in which a host cell is a eukaryotic cell such as a yeast or animal cell into which a gene encoding the same is introduced. Is widely used as a preventive vaccine against HBV. Among them, using the S antigen produced in yeast is the mainstream in the current market. Exceptionally, vaccines for prevention (Genhevac B Paste and Sci-B-Vac) using antigens containing M protein and L protein produced in CHO cells are also commercially available (Non-patent Documents 3 and 4). Genhevac B Pasteur is an HBV surface antigen protein, which is an antigen mixed with M protein and S protein, and Sci-B-Vac is an antigen consisting of L protein, M protein and S protein.
  • the major problems are that there are non-responders to the vaccine and that the onset of the protective effect is slow.
  • Pre-S2 region According to clinical results of prophylactic vaccine using M antigen consisting only of M protein produced in yeast, Pre-S2 region has higher immunogenicity than S antigen, and in addition to antibody against S region, Pre-S2 region Is also produced, and it is reported to be effective in reducing non-responders or early onset (Non-patent Document 5).
  • the L antigen In addition to the S region and the Pre-S2 region contained in the M antigen, the L antigen further has a Pre-S1 region that is a sensor part of HBV.
  • the L antigen when used as a preventive vaccine, antibodies against the pre-S1 region presented on the outermost side are also produced. Therefore, the non-responder can be reduced and / or turned on more than the S antigen vaccine or M antigen vaccine. From the viewpoint of early set, it is considered to be an excellent preventive vaccine.
  • escape mutant HBV is an HBV in which an antigenic determinant “a” region having strong antigenicity of S antigen is mutated. In an antibody produced against a commonly used S antigen vaccine, A defensive effect cannot be obtained.
  • the number of escape mutants is expected to increase with the spread of antiviral drugs used for the treatment of hepatitis B, and this will become a bigger problem in the future.
  • the M antigen vaccine produces antibodies against the S region, as well as antibodies against the Pre-S2 region, and thus provides a stronger protective effect against the HBV mutant than the S antigen vaccine.
  • L antigen since the antibody against the Pre-S1 region can be made, the incidence of HBV with mutations in the above three regions is further reduced, and it is more robust against HBV mutation than M antigen vaccine. It will be a vaccine. From the above, the L antigen vaccine is expected to be a superior vaccine than the preventive vaccine using the existing S antigen or M antigen.
  • HBV genotypes are known as HBV genotypes. Recently, type I and type J have been added to these (Non-Patent Document 6), but types A, B, C, and D are the main genotypes of HBV.
  • S region and the Pre-S2 region the relationship between each genotype and phenotype described above has been clarified. For example, in the S region, the amino acid sequence of positions 124 to 147 is generally known as the highly immunogenic antigenic determinant “a”. In the Pre-S2 region, it is known that an antigenic determinant “b” exists in common with each genotype (Non-patent Document 7). Therefore, regarding these regions, even if genotypes are different, it is considered that production of a common antibody occurs for at least some genotypes.
  • the Pre-S1 region has not been sufficiently analyzed for each genotype and phenotype, and the homology of amino acid sequences between HBV genotypes is low. Therefore, even if a vaccine is produced using an L antigen containing a Pre-S1 region derived from one genotype as an active ingredient, the HBV having other types of genotypes is mediated through the Pre-S1 region. It is considered that an immune response cannot always be elicited. Needless to say, it is not possible to expect a degree of infection protection that can be used as a preventive vaccine.
  • Non-patent Document 8 It is known that anti-Pre-S1 antibody has a protective effect against HBV infection by an HBV infection experiment using chimpanzees.
  • Non-patent Document 8 protects chimpanzees from infection with phenotype adw HBV, it has been reported that infection with phenotype ayw HBV does not protect. is there.
  • this antibody is effective for HBV genotypes A, B, C, F, and H due to the epitope analysis of anti-Pre-S1 antibody and the relationship between the amino acid sequences of the Pre-S1 region. Argues that genotypes D, E and G would have no effect.
  • L antigen is excellent as a preventive vaccine, but it is necessary to cope with the difference in genotype.
  • the vaccine (Sci-B-Vac) containing the L protein mentioned above does not deal with the difference in genotypes of the Pre-S1 region contained in the L protein, and many (two or more) It cannot be said that it is a preventive vaccine that exerts an infection-preventing effect on HBV of any genotype.
  • the basic component of the therapeutic vaccine is the core antigen (C antigen) that forms the surface antigen and capsid of HBV, and the HBV from infected cells is mainly due to the induction of infection protection by cellular humoral immunity and the induction of cellular immunity. It is aimed at exclusion.
  • C antigen core antigen
  • S antigen and C antigen are administered, it has been reported that the immune response including cellular immunity has increased without safety problems.
  • Non-patent Document 10 Non-patent Document 10
  • Non-patent Document 14 also reports that NK cells are involved in HBV exclusion.
  • an object of the present invention is to provide an antigen that elicits an immune response against various (several or more) genotypes of HBV. Furthermore, another object of the present invention is to provide a vaccine for preventing or treating hepatitis B that develops due to infection with various (more than several) genotypes of HBV.
  • the present inventors have caused an immune reaction against various (several types) by using virus-like particles containing HBs-L antigen protein derived from a specific genotype. Found to get. Also, by using a virus-like particle composition containing a combination of virus-like particles containing HBs-L antigen protein derived from a specific genotype, an immune response against various (several) genotypes of HBV It has been found that can be produced. It was also clarified that the virus-like particles and virus-like particle compositions described above have neutralizing activity against various (more than several) genotypes of HBV. The present invention has been completed based on these findings, and broadly encompasses the inventions of the embodiments shown below.
  • Item 1 A virus-like particle containing a single type of HBs-L antigen protein, wherein the genotype of the HBs-L antigen protein is A, B, D, E, F, G, H or each of these genotypes A virus-like particle that is used to generate an immune response against several genotypes of HBV.
  • Item 2 A virus-like particle containing two or more types of HBs-L antigen proteins, wherein the HBs-L antigen protein has a genotype of A, B, C, D, E, F, G, H and each of these A virus-like particle selected from the group consisting of genotype variants and used to generate an immune response against several genotypes of HBV.
  • Item 3 The virus-like particle according to Item 1 or 2, wherein the immune reaction is humoral immunity or cellular immunity.
  • a virus-like particle composition comprising a virus-like particle containing only a genotype C HBs-L antigen protein or a variant thereof as the HBs-L antigen protein and the virus-like particle described in Item 1.
  • a virus-like particle composition comprising at least two kinds of virus-like particles according to items 1 to 3.
  • a virus-like particle composition comprising a virus-like particle containing only the genotype C HBs-L antigen protein or a variant thereof as the HBs-L antigen protein, and the virus-like particle composition of Item 5.
  • the amino acid sequence of the HBs-L antigen protein of genotype A is the sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 9, and the amino acid sequence of the HBs-L antigen protein of genotype B is any of SEQ ID NOs: 10 to 18
  • the amino acid sequence of the HBs-L antigen protein of genotype C is the sequence shown in any of SEQ ID NOs: 19 to 28, and the amino acid sequence of the HBs-L antigen protein of genotype D is that of SEQ ID NOs: 29 to 38
  • the sequence shown in any of the above, the amino acid sequence of the HBs-L antigen protein of genotype E is the sequence shown in any of SEQ ID NOs: 39 to 42, and the amino acid sequence of the HBs-L antigen protein of genotype F is SEQ ID NO: 43 to The sequence shown in any of 47, the amino acid sequence of the HBs-L antigen protein of genotype G is the sequence shown in any of SEQ ID NOs: 48 to 53, the amino acid sequence of the
  • Item 8 A virus-like particle composition comprising the virus-like particle or virus-like particle composition according to any one of Items 1 to 7 and a virus-like particle containing an HBV core antigen.
  • Item 9 A vaccine for treatment and / or prevention of hepatitis B, comprising the virus-like particle or virus-like particle composition described in any one of Items 1 to 8.
  • the virus-like particle or virus-like particle composition of the present invention can elicit an immune reaction against several types of HBV.
  • the virus-like particle or virus-like particle composition of the present invention can be used as a vaccine for preventing infection of hepatitis B or a vaccine for treating it.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the structure of HBV and the L-type HBV surface antigen.
  • FIG. 2 shows pET32a-3C-Pre-S1-A, pET32a-3C-Pre-S1-B, pET32a-3C-Pre-S1-C, and pET32a-3C-Pre-S1- constructed in Example 1. D is shown.
  • Pre-S1 is Pre-S1 region
  • Trx is Thioredoxin
  • lacl is Lac repressor gene
  • ori E coli replication origin
  • Amp R is Ampicilline resistant gene.
  • FIG. 3 shows the analysis results of Pre-S1-Trx and Pre-S1 peptides of each genotype prepared in Example 1.
  • FIG. 3 shows the analysis results of Pre-S1-Trx and Pre-S1 peptides of each genotype prepared in Example 1.
  • FIG. 3 shows the analysis results of Pre-S1-Trx and Pre-S1 peptides of each genotype prepared
  • FIG. 4 shows pGLD-MC constructed in Example 2.
  • GLDp is GLD Promoter
  • MC is M gengen gene (Genotype C)
  • PGKt is PGKLterminator
  • Leu2 is Lue2 gene
  • ori and Amp R are the same as above.
  • FIG. 5 shows the analysis results of the Lc antigen and the Mc antigen prepared in Example 2.
  • FIG. 6 shows the analysis results of the Lc antigen and Sci-B-Vac antigen prepared in Example 2.
  • FIG. 7 shows pGLD-His4 constructed in Example 3.
  • FIG. 8 shows pGLD-His4-LA, pGLD-His4-LB and pGLD-His4-LD constructed in Example 4.
  • LA, LB and LD are L antigen gene A (Genotype A, B and D), respectively, and GLDp, PGKt, ori, Amp R, Leu 2 and 2 micron are the same as above.
  • FIG. 9 shows the analysis results of the La, Lb, and Ld antigens prepared in Example 4.
  • FIG. 10 shows pRS-Ura3-LC3 constructed in Example 5.
  • pr is promoter
  • LC is L antigen gene (Genotype C)
  • Term is Terminator
  • URA3 is Ura3 gene
  • ori and Amp R are the same as above.
  • FIG. 11 shows pRS-Leu2-LC2 constructed in Example 5.
  • pr, LC, Term, ori, Amp R and Lue2 are the same as above.
  • FIG. 12 shows the analysis results of the Lc antigen prepared in Example 6.
  • FIG. 13 shows the experimental results of Example 7.
  • the vertical axis of each graph in the figure indicates the production amount of each antibody (anti-S antibody, anti-Pre-S2 antibody and anti-Pre-S1 antibody) against L antigen, M antigen and S antigen.
  • FIG. 14 shows the experimental results of Example 8.
  • A, B, C, and D in each graph in the figure show the results obtained with antisera obtained by immunization with pre-S1 peptide immunization with genotypes A, B, C, and D, respectively.
  • the horizontal axis of each graph in the figure indicates the dilution ratio of each antiserum used.
  • FIG. 15 shows the experimental results of Example 9.
  • the horizontal axis of each graph in the figure indicates immunized L antigens (La antigen, Lb antigen, Lc antigen and Ld antigen from the left), and the vertical axis of each graph indicates anti-S antibody, anti-Pre- The production amounts of S2 antibody and anti-Pre-S1 antibody are shown.
  • FIG. 16 shows the experimental results of Example 9.
  • each graph in the figure indicates the degree of binding (relative value) between each antiserum and each Pre-S1, and the horizontal axis of each graph in the figure is the same as FIG.
  • FIG. 17 shows the experimental results of Example 9.
  • the vertical and horizontal axes of each graph in the figure are the same as those in FIG.
  • FIG. 18 shows the experimental results of Example 10.
  • the vertical and horizontal axes of each graph in the figure are the same as those in FIG.
  • FIG. 19 shows pRS-His4-LD2 constructed in Example 11 (2).
  • pr, LD, Term, ori, Amp R and His4 are the same as above.
  • FIG. 20 shows pRS-Ura3-LD2 constructed in Example 11 (3).
  • FIG. 21 shows the analysis results of Lh1 antigen prepared in Example 12.
  • FIG. 22 shows a schematic diagram of the Lh1 antigen prepared in Example 12.
  • FIG. 23 shows pGLD-His4-LD2 constructed in Example 13.
  • LD2 in the figure is LD2 antigen gene (Genotype D PreS-1 + Genotype C PreS-2 and S), and GLDp, PGKt, His4, ori, Amp R, Leu2 and 2micron are the same as above.
  • FIG. 24 shows the analysis results of the Ld2 antigen and Lh1b antigen prepared in Example 13.
  • FIG. 25 shows pRS-Leu2-LA2 constructed in Example 14.
  • FIG. 26 shows the analysis results of the Lh2 antigen prepared in Example 14.
  • FIG. 27 shows pRS-Leu2-LB2 constructed in Example 15.
  • pr, LB, Term, ori, Amp R and Lue2 are the same as above.
  • FIG. 28 shows the analysis results of the Lh3 antigen prepared in Example 15.
  • FIG. 29 shows the analysis result of Lh4 antigen prepared in Example 16.
  • FIG. 30 shows the experimental results of Example 17.
  • Lh in the figure indicates immunity with the Lh1 antigen.
  • FIG. 31 shows the experimental results of Example 17. The vertical axis and horizontal axis of the graph in the figure are the same as those in FIG.
  • FIG. 32 shows the experimental results of Example 18.
  • the vertical axis on the left side of the graph in the figure indicates the production amount of anti-S antibody and anti-Pre-S2 antibody, and the vertical axis on the right side indicates the production amount of Pre-S1.
  • the horizontal axis of the graph in the figure indicates the number of days after immunization with Lh1 antigen.
  • the inset shows the three antibodies on the same vertical scale.
  • FIG. 33 shows the experimental results of Example 19.
  • the left figure shows anti-S antibody and the right figure shows the binding of anti-Lh1 antibody to various antigens.
  • FIG. 34 shows pET19b-HBcAg constructed in Example 22.
  • HBcAg in the figure is C antigen gene, and lacl, ori and Amp R are the same as above.
  • FIG. 35 shows the analysis results of the C antigen prepared in Example 22.
  • FIG. 36 shows the experimental results of Example 23.
  • the vehicle on the horizontal axis of each graph is negative control, Lh 10 is Lh1 antigen, C 10 is C antigen, Lh + C 10 is Lh1 and C antigen, and ConA 10 is stimulation of spleen cells by concanavalin A. means.
  • Virus-like particles The virus-like particles of the present invention can be used to elicit an immune response against several genotypes of HBV.
  • the HBV genotype is a group that is distinguished by HBV variants, and is defined as a different genotype when the difference in HBV gene sequence exceeds 8%. In the future, genotype classification may increase further, and there is no particular limitation as long as it is a confirmed HBV genotype.
  • the identity between the amino acid sequences of HBV of each genotype thus distinguished is about 92% or more.
  • Specific examples of HBV genotypes include A, B, C, D, E, F, G, H, I, and J.
  • the expression “genotype A HBs-L antigen protein” means “HBs-L antigen protein derived from genotype A HBV”. The same applies to the description of HBs-L antigen proteins of other genotypes B to J.
  • the immune reaction elicited by the virus-like particle of the present invention is not particularly limited as long as it is an immune reaction elicited when administered in vivo.
  • a humoral immune reaction or a cellular immune reaction can be exemplified.
  • the virus-like particle of the present invention contains HBs-L antigen protein.
  • the HBs-L antigen protein contained in the virus-like particle of the present invention is classified into two embodiments depending on whether it is single or plural.
  • the virus-like particle of the first embodiment is a virus-like particle containing a single type of HBs-L antigen protein.
  • the HBs-L antigen protein contained in the virus-like particle of the first embodiment is a single type of HBs-L antigen protein except for the mutants described later.
  • the virus-like particle of the first embodiment can elicit an immune response against several types of HBV.
  • the number of HBV genotypes that the virus-like particle of the first embodiment can generate an immune response is preferably as many as possible, and is not particularly limited. For example, two or more genotypes are preferable, and three or more or four or more types are more preferable.
  • the virus-like particle of the second embodiment is a virus-like particle containing two or more types of HBs-L antigen proteins.
  • the virus-like particle of the second embodiment can also elicit an immune response against several types of HBV.
  • the virus-like particles cause three or more types of HBV that cause an immune reaction, preferably There are more than 4 types.
  • the second virus-like particle can cause an immune reaction against HBV having a genotype equal to or more than the number of HBs-L antigen protein genes contained therein.
  • the virus-like particle of the second aspect containing the HBs-L antigen of genotype C and the HBs-L antigen of genotype D is not limited to genotype C or D. It is also possible to elicit an immune response against HBV of genotype A or B.
  • the virus-like particles of the two embodiments described above will be described in detail.
  • the virus-like particle of the first embodiment is a virus-like particle in which the HBs-L antigen protein contained therein is a single type of genotype.
  • the number of HBs-L antigen proteins contained in the virus-like particle of the first embodiment is one or two or more.
  • the virus-like particle of the first aspect is a particle mainly composed of HBs-L antigen protein, which is a protein having one or more transmembrane domains, and a lipid bilayer, and the inside of the particle. Particles that do not have nucleic acid such as DNA or RNA that controls genetic information.
  • the genotype of the HBs-L antigen protein contained in the virus-like particle of the first aspect of the present invention is any one of A, B, D, E, F, G, H, and J.
  • variants of these genotypes are also included in the HBs-L antigen protein contained in the virus-like particle of the first embodiment.
  • the mutants defined in the present specification are not limited to mutants by mutation, but also include mutants obtained by artificially introducing mutations.
  • the specific amino acid sequence of the HBs-L antigen protein of each genotype is not particularly limited.
  • the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 9 as genotype A the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 10 to 18 as genotype B, and any of SEQ ID NOs: 29 to 38 as genotype D
  • Amino acid sequence, amino acid sequence shown as any of SEQ ID NOs: 39 to 42 as genotype E amino acid sequence shown as any of SEQ ID NOs: 43 to 47 as genotype F, and any of SEQ ID NOs: 48 to 53 as genotype G
  • Examples of the amino acid sequence shown and genotype H include the amino acid sequences shown in any of SEQ ID NOs: 54 to 57.
  • amino acid sequences that specify the HBs-L antigen protein of each genotype described above are amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 57 that specify the HBs-L antigen protein of each genotype within a range that does not significantly impair the effects of the present invention. It can also be a variant of Such a mutation is not particularly limited, and examples thereof include substitution, insertion, or deletion.
  • the degree of mutation with respect to the amino acid sequence of each genotype described above is not particularly limited. For example, mutagenesis of about 33 amino acids is introduced into the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 9 (genotype A), and the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 10 to 18 (genotype B).
  • the amino acid sequence shown in (Genotype G) is introduced with a mutation of about 9 amino acids
  • the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 54 to 57 (genotype H) is introduced with a mutation of about 27 amino acids. be able to.
  • the degree of mutation introduction to the amino acid sequence of each genotype defined in the present invention was determined by analyzing each amino acid sequence obtained from a database such as NCBI (National Center for Biotechnology Information) using gene analysis software. Genotypes A to D were analyzed using 20 different amino acid sequences, E was 10, F was 8 and G and H were each 7 different amino acid sequences.
  • the number of amino acids is 400 in SEQ ID NOs: 1 to 57, a region of 11 amino acids and / or a region of 6 amino acids from the 163rd to 168th from the N-terminus thereof Mention may be made of deleted mutants. Further, in SEQ ID NOs: 1 to 57, when the number of amino acids is not 400, a mutant in which the amino acid sequence of the region corresponding to these is deleted can be mentioned.
  • the three regions of the HBs-L antigen protein, the Pre-S1 region, the Pre-S2 region, and the S region are replaced with regions derived from different genotypes.
  • a mutant to be deleted can be mentioned.
  • the Pre-S1 region of a certain genotype is replaced with a Pre-S1 region derived from another genotype, and the other genotypes of the Pre-S1 region and Pre-S2 region of a certain genotype are changed. Examples include substitution to the pre-S1 region and the pre-S2 region derived from the gene, and the substitution of the pre-S2 region of a certain genotype to the pre-S2 derived from another genotype.
  • Pre-S2 region it is also possible to replace the Pre-S2 region with a Pre-S1 region derived from another genotype, and further include mutants lacking the Pre-S2 region. In the case of these artificial substitutions, it is possible to introduce a mutation exceeding the number of mutations introduced into the amino acid sequence of each genotype described above.
  • the virus-like particle of the second embodiment is a virus-like particle containing two or more types of HBs-L antigen proteins.
  • the number of HBs-L antigen proteins contained in the virus-like particle of the second embodiment is one or two or more.
  • the virus particle of the second aspect is also a particle mainly composed of HBs-L antigen protein, which is a protein having one or two or more transmembrane domains, and a lipid bilayer, and the genetic information is contained in the particle. It is a particle that does not have nucleic acid such as DNA or RNA.
  • the genotype of the HBs-L antigen protein contained in the virus-like particle of the second embodiment is selected from the group consisting of A, B, C, D, E, F, G, H, I and J That's it.
  • variants of these genotypes are also included in the HBs-L antigen protein contained in the virus-like particle of the second embodiment.
  • Specific amino acid sequences of HBs-L antigen proteins of each genotype and variants thereof are not particularly limited. For example, it can be the same as the virus-like particle of the first aspect described above.
  • Examples of the genotype C HBs-L antigen protein include the amino acid sequences shown in any of SEQ ID NOs: 19 to 28. Further, a mutation of about 28 amino acids can be introduced into the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 19 to 28.
  • the preferred embodiment of the HBs-L antigen protein of two or more genotypes contained in the virus-like particle of the second embodiment is the same amino acid sequence in various putative epitopes for the Pre-S1 region of HBV of each genotype Can be determined by sex. Since the Pre-S1 region is a region where the amino acid sequence identity is low even between HBV genotypes, finding combinations where the amino acid sequences of the putative epitopes in this region are almost identical is found in several types of HBV. It can be important information that determines the preferred embodiment of virus-like particles that can be used to elicit an immune response.
  • Table 1 shows the results of assuming that a typical amino acid sequence of each genotype A, B, C, D, E, and F has a different amino acid sequence region (indicated by one letter) throughout the genotype as a putative epitope.
  • the amino acids shown in bold in the table indicate that the amino acid residues are two or more consecutively common amino acid residues in two or more genotype putative epitopes.
  • the virus-like particle according to the second aspect includes, as an HBs-L antigen protein, any one of HBs-L antigen proteins of genotype A, genotype B and genotype C, and other HBs-L antigen proteins. As mentioned above, it is presumed that it preferably contains HBs-L antigen protein of genotype D and / or E.
  • Virus-like particles that are HBs-L antigenic proteins consisting of amino acid sequences that are -L antigenic proteins or variants thereof are specifically excluded.
  • the variant of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 19 to 28 consists of an amino acid sequence in which about 28 amino acids have been introduced into the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 19 to 28. Is.
  • the virus-like particle of the present invention described above may contain other components as long as the effects of the present invention are not significantly impaired.
  • Such other components are not particularly limited.
  • Specific examples include other antigen proteins other than HBs-L antigen protein derived from HBV.
  • Other antigenic proteins are not particularly limited.
  • S antigen protein, M antigen protein, or core antigen protein derived from HBV can be mentioned.
  • S antigen protein or core antigen protein or a variant thereof is preferable. Since the core antigen is known to have a plurality of epitopes that elicit an immune response, the mutants include those containing one or more of the above-described epitopes.
  • genotypes of other antigen proteins other than HBs-L antigen proteins derived from these HBVs are not particularly limited. For example, it shall be derived from genotypes A, B, C, D, E, F, G, H, I and J, similar to the HBs-L antigen protein contained in the virus-like particle of the present invention described above. be able to.
  • the genotype of the HBs-L antigen protein contained in the virus-like particle of the present invention described above may be the same as the genotype of an antigen protein other than the HBs-L antigen protein contained therein. Or it can be different.
  • the method for producing the virus-like particle of the present invention described above is not particularly limited. Specifically, biotechnology in which a host cell is transformed with a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding an HBs-L antigen protein contained in a virus-like particle, and such a transformant is bred in an appropriate medium. It can be easily obtained by an appropriate means.
  • the host cell is not particularly limited. For example, eukaryotic cells can be mentioned, among which yeast cells or CHO cells are preferable. In particular, yeast cells are preferred.
  • the nucleic acid containing the base sequence encoding the HBs-L antigen protein described above can also be used for transformation of a host cell in the form of a plasmid. It can also be incorporated within.
  • Virus-like particle composition The present invention also includes a virus-like particle composition containing a combination of virus-like particles that can be used to elicit an immune response against two or more genotypes of HBV. Is done. Such virus-like particle compositions can also be used to elicit an immune response against several genotypes of HBV. Examples of such virus-like particle composition include the following four embodiments.
  • virus-like particle composition according to the first aspect comprises any one of the virus-like particles according to the first aspect and a genotype as an HBs-L antigen protein.
  • a virus-like particle composition containing a virus-like particle containing only C HBs-L antigen protein or a variant thereof this may be referred to as “C particle” in the present specification).
  • virus-like particle composition of the first embodiment for example, a virus containing the virus-like particle of the first embodiment consisting of only the HBs-L antigen protein of genotype D as the HBs-L antigen protein and a virus containing C particles Like particle composition.
  • the genotype C HBs-L antigen protein or a variant thereof is preferably used in combination with the genotype D HBs-L antigen protein.
  • the specific amino acid sequence of the genotype C HBs-L antigen protein contained in the C particles is not particularly limited.
  • the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 19 to 28 can be mentioned.
  • the mutant of the above-described genotype C HBs-L antigen protein is not particularly limited. Specifically, it can be a variant of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 19 to 28, which is a genotype C HBs-L antigen protein.
  • Such mutation introduction is not particularly limited.
  • mutations such as substitution, insertion or deletion can be mentioned.
  • the degree of mutation of the genotype C HBs-L antigen protein is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not significantly impaired. Specifically, a mutation introduction of about 28 amino acids can be exemplified with respect to the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 19 to 28.
  • the content ratio of C particles in the virus-like particle composition of the first aspect is not particularly limited. Usually, it can be determined as appropriate as long as the effects of the present invention are not significantly impaired.
  • the virus-like particle composition of the second aspect of the present invention is a virus-like particle composition containing a plurality of mixtures of the virus-like particles of the first aspect. .
  • the genotypes of the HBs-L antigen protein contained in the virus-like particle composition of the second aspect and possessed by each virus-like particle of the first aspect can be different.
  • virus-like particles containing only genotype A HBs-L antigen protein as HBs-L antigen protein and virus-like particles containing only genotype B HBs-L antigen protein as HBs-L antigen protein.
  • virus-like particle compositions include virus-like particle compositions.
  • the number of HBs-L antigen protein genotypes contained in the virus-like particle composition of the second aspect is not particularly limited. For example, 2 types, 3 types, 4 types, 5 types, 6 types, 7 types, 8 types, 9 types, or 10 types can be mentioned.
  • the content ratio of the virus-like particle of the first aspect in the virus-like particle composition of the second aspect is not particularly limited. Usually, it can be determined as appropriate as long as the effects of the present invention are not significantly impaired.
  • the virus-like particle composition according to the second aspect may contain C particles.
  • the content ratio of the C particles in the virus-like particle composition of the second embodiment is not particularly limited. Usually, it can be determined as appropriate as long as the effects of the present invention are not significantly impaired.
  • the specific amino acid sequence and variant thereof of the genotype C HBs-L antigen protein contained in the C particle can be the same as the virus-like particle composition of the first embodiment.
  • the virus-like particle composition according to the third aspect of the present invention is a virus-like particle composition containing a plurality of mixtures of the virus-like particles according to the second aspect. .
  • the genotypes of the HBs-L antigen protein possessed by each virus-like particle contained in the virus-like particle composition of the second aspect may be different types of genotypes.
  • HBs-L antigen protein of the genotype A HBs-L antigen protein of the genotype A and virus-like particles consisting only of the HBs-L antigen protein of the genotype B and HBs-L antigen protein of the genotype C as the HBs-L antigen protein and A virus-like particle composition containing virus-like particles consisting only of the genotype D HBs-L antigen protein can be mentioned.
  • the number of HBs-L antigen protein genotypes contained in the virus-like particle composition of the third aspect is not particularly limited.
  • 2 types, 3 types, 4 types, 5 types, 6 types, 7 types, 8 types, 9 types, or 10 types can be mentioned.
  • the content ratio of the various virus-like particles of the second aspect in the virus-like particle composition of the third aspect is not particularly limited. Usually, it can be appropriately determined within a range that does not significantly impair the effects of the invention.
  • the virus-like particle composition according to the third aspect may contain C particles.
  • the content ratio of C particles in the virus-like particle composition of the third embodiment is the same as that of the virus-like particle composition of the second embodiment.
  • the specific amino acid sequence or variant thereof of the genotype C HBs-L antigen protein contained in the C particle can be the same as that of the virus-like particle composition of the first embodiment.
  • the virus-like particle composition of the fourth embodiment comprises the virus-like particle of the first embodiment and the virus-like particle of the second embodiment described above.
  • the HBs-L antigen protein genotypes of each virus-like particle contained in the virus-like particle composition of the fourth aspect may include the same genotype.
  • virus-like particle of the first embodiment consisting only of the genotype A HBs-L antigen protein as the HBs-L antigen protein and the HBs-L antigen protein of genotype A and the HBs of genotype C as the HBs-L antigen protein
  • virus-like particle composition containing the virus-like particle of the second embodiment consisting only of the -L antigen protein can be mentioned.
  • the number of HBs-L antigen protein genotypes contained in the virus-like particle composition of the fourth aspect is not particularly limited. For example, 2 types, 3 types, 4 types, 5 types, 6 types, 7 types, 8 types, 9 types, or 10 types can be mentioned.
  • the content ratio of the virus-like particle of the first embodiment and the virus-like particle of the second embodiment in the virus-like particle composition of the fourth embodiment is not particularly limited. Usually, it can be determined as appropriate as long as the effects of the present invention are not significantly impaired.
  • the virus-like particle composition according to the fourth aspect may contain C particles.
  • the content ratio of C particles in the virus-like particle composition of the fourth aspect is the same as that of the virus-like particle composition of the second aspect.
  • the specific amino acid sequence or variant thereof of the genotype C HBs-L antigen protein contained in the C particle can be the same as that of the virus-like particle composition of the first embodiment.
  • the virus-like particle or virus-like particle composition of the present invention described above may contain virus-like particles containing the HBV core antigen and variants thereof.
  • virus-like particles containing the core antigen of HBV are known to easily induce cellular immunity against HBV. Therefore, the virus-like particle composition obtained by containing this contains HBV of several genotypes. In particular, it is expected to induce an immune response particularly suitably.
  • the mixing amount of the virus-like particle containing the HBV core antigen to the virus-like particle or virus-like particle composition of the present invention is not particularly limited. Usually, it can be appropriately determined within a range that can be used to elicit an immune response against several or more types of HBV.
  • virus-like particle or virus-like particle composition of the present invention can be expected to be used to elicit an immune response against several types of HBV, it can be used as a vaccine against HBV (for prevention and / or treatment). ).
  • the vaccine for preventing and / or treating HBV of the present invention contains the virus-like particle or virus-like particle composition described above.
  • the amount of the virus-like particle or virus-like particle composition contained in the vaccine for preventing and / or treating HBV of the present invention is not particularly limited. For example, it can be usually about 0.0001 to 100% by mass per preventive and / or therapeutic vaccine for HBV.
  • a known pharmaceutically acceptable carrier or additive used for producing a composition in the pharmaceutical field can be blended.
  • a carrier or additive is not particularly limited.
  • the vaccine for prevention and / or treatment of HBV of the present invention can be made into any dosage form by appropriately combining the above carriers or formulations.
  • injections such as infusions, implantable injections, microneedles or continuous injections; dialysis agents such as peritoneal dialysis agents or hemodialysis agents; orally disintegrating tablets, chewable tablets, effervescent tablets, Tablets such as dispersible tablets or dissolving tablets; capsules such as hard capsules or soft capsules; granules containing foamed granules, sustained-release granules or enteric granules; powders, elixirs, suspensions Oral solutions such as emulsions or limonades; Oral tablets such as syrups, oral jelly agents, troches, sublingual tablets, buccal tablets, adhesive tablets or gums; oral sprays, semisolids for oral use, gargles Agents, inhalants, inhalants, inhalants, etc .; eye drops such as
  • External preparations such as liniments or lotions; sprays such as external aerosols or pump sprays; patches such as ointments, creams, gels, tapes or poultices .
  • These dosage forms can be manufactured based on known documents such as the 16th revised Japanese Pharmacopoeia Manual.
  • the subject of administration of the vaccine for prevention and / or treatment of HBV of the present invention can include patients suffering from these diseases, humans who are likely to suffer, or humans who are judged to need prevention.
  • the method for administering the preventive and / or therapeutic vaccine for HBV of the present invention is not particularly limited.
  • a known administration method can be adopted with appropriate attention to the administration subject or dosage form described above.
  • oral administration, intramuscular administration, intravenous administration, intraarterial administration, intrathecal administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, intraocular administration, intravaginal administration examples thereof include intracervical administration, rectal administration, and subcutaneous administration.
  • the dose of the vaccine for preventing and / or treating HBV of the present invention is not particularly limited.
  • the administration subject is a human, it may be usually about 0.001 to 20 ⁇ g / kg.
  • the frequency of administration of the therapeutic agent of the vaccine for preventing and / or treating HBV of the present invention is not particularly limited.
  • the above-mentioned amount may be administered once a day, or may be divided into several times as long as the therapeutic effect on the preventive and / or therapeutic vaccine for HBV can be exhibited.
  • the frequency of administration of the therapeutic agent for the preventive and / or therapeutic vaccine for HBV of the present invention is not particularly limited. For example, every day, every other day, every week, every other week, every 2 to 3 weeks, every month, every other month or every 2 to 6 months, etc.
  • Example 1 Preparation of pre-S1 fusion proteins of genotypes A, B, C and D and their peptides (1) Construction of vector A DNA sequence encoding the Pre-S1 peptide of each genotype was prepared by PCR based on the template shown in Table 2 below.
  • the four types of DNA fragments obtained were inserted into the pET-32a vector (Novagen).
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 59 encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58 that is specifically cleaved by human rhinovirus 3C protease is inserted.
  • Each of the vectors obtained in this way was pET-32a-3C-Pre-S1-A, pET-32a-3C-Pre-S1-B, pET-32a-3C-Pre-S1-C and pET-32a- It was named 3C-Pre-S1-D (Fig. 2).
  • Genotype C HBsAg-L antigen protein (this may be referred to herein as “Lc protein”)
  • the antigen particle consisting of was prepared by the purification method shown in Japanese Patent No. 4937272 using the vector shown in Japanese Patent No. 4085231.
  • the antigenic protein contained in the particles thus obtained consists only of Lc protein, and this particle may be referred to as “Lc antigen” in the present specification.
  • the expression vector pGLD-MC shown in FIG. 4 lacking the Pre-S1 region of the LC gene was prepared, and an expression strain was prepared in the same manner as the Lc antigen.
  • the resulting Mc antigen (M antigen particles) was purified.
  • Sci-B-Vac antigen is composed of various proteins that appear to be different due to glycosylation (main bands are around 24, 27, 33, 36, 39 and 42 kDa in molecular weight). The positions of these bands were in good agreement with the results disclosed in Non-Patent Document 15 in which proteins were expressed by the same method as Sci-B-VacV antigen. As a result of WB, all of these bands were detected for the anti-S antibody, but not for the anti-Pre-S1 antibody. The above results indicate that the Sci-B-Vac antigen has little or no Pre-S1.
  • the prepared Lc antigen is a particle composed of L protein having three regions of S region, Pre-S2 region and Pre-S1 region, and is composed of monomer and dimer. It was also revealed that the Mc antigen consists of S region and Pre-S2 region.
  • the particle size of Lc antigen was about 59.7 nm, and the particle size of Mc antigen was about 62.5 nm. It was.
  • Example 3 Preparation of Plasmid Type Expression Vector pGLD-His4 Based on the Lc antigen expression plasmid pGLD-LIIP39-RcT (Japanese Patent No. 4085231), the pGLD-His4 vector shown in FIG. 7 was prepared. The His4 gene fragment was prepared from the genomic DNA of the NA87-11A strain of budding yeast.
  • ⁇ Example 4> Preparation of L antigen particles of genotypes A, B and D using plasmid type expression vectors L proteins of genotypes A, B and D (in this specification, these are referred to as ⁇ La protein '' and ⁇ Lb, respectively '' Genes that may be referred to as “protein” and “Ld protein” (in the present specification, these may be referred to as “LA gene”, “LB gene”, and “LD gene”, respectively).
  • PCR was performed using the templates described in Table 2 above, and these were amplified.
  • LA SISART
  • SEQ ID NO: 60, LB SILSKT
  • SEQ ID NO: 61 and 6 6 amino acid residues (LA: SISART; SEQ ID NO: 60, LB: SILSKT; SEQ ID NO: 61 and 6) of the Pre-S2 region that are likely to be degraded by proteases in yeast LD: SIFSRI; SEQ ID NO: 62) is deleted, and the sequence corresponding to the signal peptide sequence shown in Japanese Patent No. 4085231 is inserted into the 5 ′ side of each gene, as shown in FIG. pGLD-His4-LA, pGLD-His4-LB and pGLD-His4-LD were prepared.
  • grains which consist only of La protein as an antigen protein obtained using pGLD-His4-LA may be called "La antigen” in this specification.
  • a particle consisting only of Lb protein may be referred to herein as “Lb antigen”
  • a particle consisting only of Ld protein may be referred to herein as “Ld antigen”.
  • Yeast (AH22R-, Lue2 and His4 mutants) was transformed with each of the vectors described above and screened by a predetermined method to obtain La, Lb and Ld antigen expression strains.
  • La, Lb, and Ld antigen particles were purified from the expressed cells obtained by culturing these.
  • the S region and Pre-S1 region detection antibodies used in WB are the same as in Example 2.
  • the antibody for detecting the Pre-S2 region is an anti-Pre-S2 antibody (vehicle, BCL-ABP2-01), and the secondary antibody is anti-rabbit IgG-HRP (Santacruz, sc-2004).
  • the L antigens of each genotype prepared in (1) consist of full-length L protein having S region, Pre-S2 region and Pre-S1 region, from monomers and a few dimers. It shows that it becomes.
  • Example 5 Production of Lc antigen expression genomic integration vectors pRS-Ura3-LC3 and pRS-Leu2-LC2 An Lc protein expression cassette comprising an LC gene, a promoter and a terminator prepared from the Lc antigen expression vector used in Example 2, By inserting stepwise into pRS406 (Stratagene), pRS-Ura3-LC3 containing three LC genes shown in FIG. 10 was prepared.
  • a vector pRS-Leu2 was prepared by replacing Ura3 of pRS406 with Leu2.
  • the Lc antigen expression cassette was inserted stepwise into pRS-Leu2 to prepare pRS-Leu2-LC2 containing two LC genes shown in FIG.
  • Example 6 (1) Preparation of Lc antigen expression strains using genome-integrated vectors pRS-Ura3-LC3 and pRS-Leu2-LC2 and purification of Lc antigen particles Using linearized pRS-Ura3-LC3, yeast strain AH22R- U (Ura3, Leu2, and His4 mutants) was transformed. This was screened according to a conventional method to obtain an Lc antigen expression strain (AH22R-U / Ura3 strain).
  • the linearized pRS-Leu2-LC2 was used to transform the AH22R-U / Ura3 strain, and this was screened according to a conventional method to obtain an Lc antigen-expressing strain (AH22R-U / Ura3 / Leu2 strain). It was. Lc antigen particles were purified from expression cells obtained by liquid culture of this expression strain in the same manner as in Example 2.
  • Example 7 Antibody production at the time of L antigen administration
  • the Lc antigen particles and Mc antigen particles prepared in Example 2 were mixed with alum adjuvant to prepare a dosage formulation.
  • a genotype C S antigen particle a commercially available beamgen (Kakekenken) prepared using alum adjuvant was used. These were administered to ICR strain mice (3 mice as a group) 5 ⁇ g of each antigen per mouse 3 times at 2-week intervals, and blood was collected 4 weeks after the final administration to prepare antiserum.
  • FIG. 13 shows the results of measuring the amount of antibody binding to each antigen using HRP-labeled anti-mouse IgG as a secondary antibody.
  • Mouse monoclonal anti-Pre-S1 antibody (vehicle, BCL-AB-001), mouse monoclonal anti-Pre-S2 antibody (vehicle, BCL-ABM2-01) and mouse monoclonal anti-S antibody (HB5 EXBIO) was used as a standard antibody for preparing a calibration curve.
  • Example 8 Recognizing antisera prepared with various genotypes of Pre-S1 peptides and pre-S1 of each genotype Prescription of four genotypes of Pre-S1 peptides obtained in Example 1 and Freund's adjuvant was prepared. Antiserum was prepared using these in the same manner as in Example 7. Each diluted antiserum was added to the ELISA plate on which the four types of Pre-S1-TRX fusion proteins prepared in Example 1 were immobilized, and an HRP-labeled anti-mouse antibody was used as a detection antibody (substrate is TMB).
  • FIG. 14 shows the results of measuring the degree of binding between each antiserum and each Pre-S1.
  • Example 9 Antibody production by administration of various genotypes of L antigens
  • the L preparation (5 ⁇ g each) of each genotype (A to D type) prepared in Examples 2 and 4 and Freund's adjuvant were mixed to prepare a preparation for administration. These were immunized to ICR strain mice by the method of Example 7 to prepare antisera, and the production amounts of anti-S antibody, anti-Pre-S2 antibody and anti-Pre-S1 antibody were measured in the same manner as in Example 7. The results are shown in FIG.
  • the production amount of anti-Pre-S1 antibody was the highest, 4 to several hundred times that of anti-S antibody or anti-Pre-S2 antibody.
  • the antiserum obtained by immunization with the Lb antigen from the results of the binding of the average value of the three individuals of each antiserum to Pre-S1 of each genotype shows that Pre-S1 of other genotypes.
  • antiserum obtained by immunization with Ld antigen tended to show poor binding to genotype A Pre-S1.
  • the antiserum obtained by immunization with La antigen has extremely poor binding to genotype B Pre-S1, and Lb
  • the antiserum obtained by immunization with Lc and Ld antigens sometimes had extremely poor binding to Pre-S1 having a genotype different from that of the immune antigen.
  • Example 10 Recognition of various genotypes Pre-S1 by antisera mixed with different genotypes of L antigens Table 3 below shows the binding of each genotype to Pre-S1 when mixed with different genotypes of L antigen. Thus, two or three genotypes of L antigens prepared in Example 2 and Example 4 were mixed in equal amounts, and the total amount of L antigen was 5 ⁇ g. Strain mice were immunized to obtain antisera.
  • the degree of binding of each obtained antiserum to Pre-S1 of genotypes A, B, C and D was measured by the method shown in Example 8.
  • the measured value of the degree of binding is that when immunized with a mixture of La and Lb and a mixture of La and Lb, the degree of binding of genotype A to Pre-S1 is 100%, and other genotypes of Pre Table 3 shows the relative value of the degree of binding to -S1.
  • the degree of binding of genotype B to Pre-S1 is assumed to be 100%, and the mixture of Lc and Ld and Lc, Lb and Ld Table 3 shows the relative values of the degree of binding of genotype C to Pre-S1 and the degree of binding of other genotypes to Pre-S1. All values are average values of antisera obtained from 3 individuals.
  • FIG. 18 shows the measurement results of antiserum obtained by immunization with a mixture of Lc and Ld.
  • FIG. 18 reveals that the antiserum obtained by immunization with a mixture of Lc and Ld binds to Pre-S1 of genotypes C and D almost equally.
  • the degree of binding of genotypes A and B to Pre-S1 is about 85%, and when two types of L antigens are mixed, the L antigens of each genotype shown in Example 9 (FIG. 17)
  • the binding to different genotypes of Pre-S1 was improved as compared to when administered alone. In addition, even in individual individuals, 73% showed the lowest degree of binding, and none showed extremely low binding.
  • Hybrid L antigen expression strain consisting of Lc and Ld proteins as antigen
  • the Lc antigen expression strain (AH22R-U / Ura3 / Leu2 strain) prepared in Example 6 was transformed with linearized pRS-His4-LD2, and this was screened according to a conventional method to obtain an Lh1 expression strain. .
  • Example 12 Production and confirmation of Lh1 antigen (1) Culture and purification of Lh1 antigen From the cells obtained by culturing the Lh1 expression strain obtained in (1) to (3) of Example 11 in a liquid medium, Lh1 antigen particles were obtained in the same manner as in Example 2. Purified.
  • FIG. 21A shows the result of silver staining after subjecting Lh1 antigen purified from the expression strain of Example 11 (2) to SDS-PAGE.
  • the L protein was found at a position slightly larger than the molecular weight of 42 kDa due to sugar chain modification.
  • Lh1 The antigen was found to be detected by any anti-Pre-S1 antibody.
  • control Lc antigen and Ld antigen were detected only with antibodies against the respective genotypes.
  • the above results indicate that the Lh1 antigen is an antigen having both Lc protein and Ld protein.
  • the particle size of the Lh1 antigen obtained from the expression strains of (1) to (3) in Example 11 was measured using a zeta sizer. As a result, it was about 58 to 63 nm. It turns out that it forms.
  • anti-Pre-S2u epitope antibody that specifically binds to genotype D (Special Immunology Institute, Non-Patent Document 7), anti-Pre-S1c antibody prepared in (2) and used in Example 7 Whether the Lh1 antigen obtained in (1) using an anti-S antibody has the structure shown in FIG. 22 in which the L protein of genotype D and the L protein of genotype C are presented on one particle It was investigated.
  • Anti-Pre-S2u antibody or anti-Pre-S1c antibody was immobilized on an ELISA plate, and the Lc antigen of Example 6, the Ld antigen of Example 4 and the Lh1 antigen described above were captured by these antibodies, and the captured antigen Table 4 (analysis results of Lh1 antigen with anti-Pre-S2u antibody, anti-Pre-S1c antibody and anti-S antibody) is shown in Table 4.
  • the cut-off value in this measurement system is 0.4.
  • the anti-Pre-S2u antibody When the anti-Pre-S2u antibody was immobilized and the anti-Pre-S1c antibody or anti-S antibody was used as a detection antibody, no Lc antigen was detected. Since it is known from the results of Example 2 and Example 12 that the Lc antigen binds to the anti-Pre-S1c antibody or the anti-S antibody, the results show that the Lc antigen is specific to genotype D. This indicates that it did not bind to the anti-Pre-S2u antibody having sex and was not captured by the ELISA plate. On the other hand, the Ld antigen was detected by the anti-S antibody because it was supplemented by the anti-Pre-S2u antibody, but not detected by the anti-Pre-S1c antibody having specificity for genotype C. In the case of Lh1 antigen, since it was supplemented by anti-Pre-S2u antibody, it was detected by both anti-Pre-S1c antibody and anti-S antibody.
  • the immobilized antibody is an anti-Pre-S1c antibody and an anti-Pre-S2u antibody or an anti-anti-S antibody is used as a detection antibody
  • the Lc antigen is detected only by the anti-S antibody
  • the Ld antigen is Since it was not supplemented by the Pre-S1c antibody, none of the detection antibodies were detected.
  • Lh1 antigen was detected by any antibody supplemented with anti-Pre-S1c antibody.
  • FIG. 22 shows the antigens having the structure shown in FIG. 22 in which the L protein of genotype D and the L protein of genotype C are presented.
  • Hybrid type L antigen particles consisting of Lc and Ld2 antigens (Lh1b antigen)
  • Ld2 protein expression vector consisting of a genotype D Pre-S1 region and genotype C Pre-S2 and S regions was prepared as follows. Using the Ld expression vector pGLD-His4-LD prepared in Example 4 as a template, regions other than the Pre-S2 and S regions (Pre-S1 and vector portions) were amplified by inverse PCR. Separately, genotype C pre-S2 region and S region fragments were prepared using genotype C described in Table 2 as a template.
  • Ld2 antigen a particle consisting only of Ld2 protein may be referred to as “Ld2 antigen” in the present specification.
  • the antiserum prepared with the Ld2 antigen has the strongest binding to genotype D Pre-S1, and the weak binding to genotype A and genotype B Pre-S1, etc.
  • the antiserum prepared in (1) was similar to the mode of binding to each genotype Pre-S1. The above results indicate that by replacing only the Pre-S1 region of Lc antigen with genotype D Pre-S1, it is possible to produce the same properties as antibodies against pre-S1 produced by genotype D L antigen. Indicates that can be done.
  • Hybrid L antigen consisting of La and Ld antigens as antigen
  • a genome-integrated La expression vector pRS-Leu2-LA2 shown in FIG. 25 was prepared in the same manner as in Example 5.
  • the yeast strain AH22R-U was transformed and screened according to a conventional method to obtain a La antigen-expressing strain.
  • the obtained La antigen expression strain was transformed with the Ld expression vector pRS-His4-LD2 prepared in Example 11, and this was screened according to a conventional method to obtain a yeast strain that expresses La protein and Ld protein. did.
  • the Lh2 antigen was purified in the same manner as in Example 2.
  • the obtained purified Lh2 antigen was subjected to SDS-PAGE and then subjected to silver staining. As a result, as shown in FIG. 26, bands were observed at molecular weight positions in the vicinity of the monomer and dimer.
  • Hybrid L antigen consisting of Lb and Lc antigens as antigen
  • a genome-integrated Lb expression vector pRS-Leu2-LB2 shown in FIG. 27 was prepared in the same manner as in Example 5.
  • the Lc antigen expression strain (AH22R-U / Ura3 strain) prepared in Example 6 was transformed and screened according to a standard method to obtain a yeast strain that expresses Lb protein and Lc protein. From the cells obtained by culturing this strain, the Lh3 antigen was purified in the same manner as in Example 2. The obtained purified Lh3 antigen was subjected to SDS-PAGE and then subjected to silver staining. As a result, as shown in FIG. 28, bands were observed near the monomer and dimer.
  • Hybrid L antigen consisting of Lb, Lc and Ld proteins as antigen
  • the Lh3 antigen Lb and Lc protein expression strain prepared in Example 15 was transformed, and this was transformed according to a standard method.
  • a yeast strain expressing Lb, Lc and Ld proteins was obtained by screening (Method 1).
  • the Lh1 expression strain (Lc and Ld protein) prepared in Example 11 (3) was transformed with pGLD-His4-LB prepared in Example 4, and this was screened according to a conventional method to obtain Lb, Lc and A yeast strain expressing Ld protein was obtained (Method 2).
  • Lh4 antigen was purified from the cells obtained by culturing the obtained two types of Lh4 antigen-expressing strains in the same manner as in Example 2.
  • the Lh4 antigen obtained from any of the expression strains also had a band near the monomer and dimer. Admitted.
  • Example 17 Antibody production at the time of Lh1 antigen administration and binding to La, Lb, Lc and Ld antigens Lh1 antigen and S antigen particles produced in Example 12 (Fitzgerald), in the same manner as in Example 9, 4 mice in each group And antiserum was prepared, and the production amounts of anti-Pre-S1 antibody, anti-Pre-S2 antibody and anti-S antibody were measured in the same manner as in Example 7. The results are shown in FIG. In control immunization with S antigen, only anti-S antibody was produced, but in immunization with Lh1 antigen, anti-S antibody, anti-Pre-S2 antibody and anti-Pre-S1 antibody were produced.
  • the production amount of the anti-S antibody was almost the same as that produced by the immunization with the S antigen, and the production amount of the anti-Pre-S2 antibody was slightly lower than the production amount of the anti-S antibody.
  • the anti-Pre-S1 antibody was produced in a significantly larger amount than the other two types of antibodies, and the production amount was 4 times or more that of the anti-S antibody and about 10 times that of the anti-Pre-S2 antibody.
  • FIG. 31 shows the results of examining the degree of binding of these antisera to genotypes A, B, C, and D to Pre-S1 in the same manner as in Example 8.
  • the Lh1 antigen not only produces a large number of anti-Pre-S1 antibodies but also various genes. Since it binds to the type of Pre-S1, it can be concluded that it is an ideal antigen as a vaccine for inhibiting HBV infection.
  • Example 18 Time course of antibody production at the time of Lh1 antigen administration
  • the production amount of anti-Pre-S1 antibody increased the earliest, and an increase in anti-Pre-S1 antibody could be confirmed after 7 days from immunization.
  • the production of anti-Pre-S2 antibody could be confirmed after the 11th day after immunization.
  • the production of anti-S antibody was slow, and only a slight production was observed on the 14th day after immunization.
  • the production of anti-Pre-S1 antibody was about 4.4 times that of anti-Pre-S2 antibody and about 40 times that of anti-S antibody.
  • HBs-L-ST antigen (vehicle: BCL-AGS-02), which is an escape mutant by introducing arginine into positions 129 and 145 in the S region of the Lc antigen, was immobilized and used in Example 7.
  • the result of observing the binding of the anti-S antibody is shown in FIG.
  • HBs-L-ST antigen could hardly be detected, but control S antigen and Lh1 antigen were detected. That is, it shows that the HBs-L-ST antigen has an escape mutant property that cannot be detected by ordinary anti-S antibodies.
  • Example 17 the HBs-L-ST antigen and Lh antigen were solid-phased, and the antiserum against the Lh1 antigen obtained in Example 17 was detected with an anti-Lh1 antibody purified to IgG with protein A / G resin. Detected with the strength of.
  • the above results indicate that the antibody obtained by immunization with the Lh1 antigen also binds to the escape mutant, and it can be said that an infection protective effect can be expected for the escape mutant.
  • Antibody production with Lh1b, Lh2, Lh3 and Lh4 Anti-serum was obtained by immunizing ICR strain mice with the Lh1b, Lh2, Lh3 and Lh4 antigens prepared in Examples 13 to 16 in the same manner as in Example 9. The degree of binding of each obtained antiserum to Pre-S1 of genotypes A, B, C and D was measured by the method shown in Example 8.
  • Lh1b antiserum genotype C Pre-S1, Lh2 antiserum genotype A Pre-S1, Lh3 antiserum genotype B Pre-S1, and Lh4 antiserum genotype C
  • the degree of binding to Pre-S1 was defined as 100%, and the relative values of the degree of binding to Pre-S1 of other genotypes were shown. All values are averages of measured values of antisera obtained from 3 individuals.
  • Table 6 binding of antisera obtained by immunization with various hybrid L antigens to various genotypes Pre-S1).
  • Example 21 HBV infection neutralizing activity by antiserum obtained with Lh1 and Lh4 antigens Antiserum against La, Lb, Lc and Ld antigens prepared in Example 9, antiserum against Lh1 antigen prepared in Example 17, in Example 20 The antiserum against the prepared Lh4 antigen and the serum (negative control) prepared from normal mice were observed for HBV infection neutralizing activity using HepG2-hNTCP-C4 cells (Non-patent Document 2).
  • Each antiserum mentioned above was diluted 500 times in a prescribed medium (however, the control serum was 50 times), and a sample obtained by adding HBV (1.8 ⁇ 10 4 genome equivalent) of genotype A or genotype C to these was added. Prepared. These samples were added to HepG2-hNTCP-C4 cells and cultured for 16 hours. After the culture medium was removed and washed, the cells were further cultured in a normal medium for 12 days.
  • HBV-DNA was quantified by RT-PCR.
  • RT-PCR primers shown in SEQ ID NO: 63 and SEQ ID NO: 64 were used, and a probe shown in SEQ ID NO: 65 was used.
  • the measured amount of HBV-DNA was expressed as a relative value to the amount of HBV-DNA obtained with the negative control serum.
  • Table 7 results are shown in Table 7 (result of anti-serum neutralization experiment of antiserum obtained by administering various L antigens).
  • C antigen hepatitis B virus core antigen
  • the hepatitis B virus core antigen (C antigen) gene was artificially synthesized based on the amino acid sequence of accesion No: LC090200 (SEQ ID NO: 66) and inserted into pET19b (Novagen).
  • the C antigen expression vector pET19b-HBcAg shown was constructed.
  • E. coli strain BL21 (DE3) pLysS was transformed with this vector to obtain a C antigen-expressing strain. From the cells obtained by culturing this, the C antigen was purified in the same manner as reported by Palenzuela et al. (Palenzuela PO et al, Biotecnologia PVda, 2002, 19: 138-142).
  • Example 23 Cellular immunity at the time of Lh antigen and C antigen administration
  • the Lh1 antigen prepared in Example 12 and the C antigen prepared in Example 22 were each individually 5 ⁇ g or a mixture of both in an equal amount (5 ⁇ g each)
  • the ICR strain mice were immunized by subcutaneous administration 3 times at 10-day intervals with the administration preparation mixed with Freund's adjuvant. One week after the final administration, the spleen cells were collected and cultured according to a standard method.
  • the cultured cells were stimulated with Lh1 antigen, C antigen or a mixture thereof at a final concentration of 10 ⁇ g / mL, and the amount of interferon ⁇ (INF ⁇ ) in the culture supernatant on the 4th day after stimulation was determined by ELISA (Murine INF ⁇ ELISA kit). , Diaclone) to investigate the activation of cellular immunity.
  • Concanavalin A (10 ⁇ g / mL) was also stimulated as a positive control stimulus for confirming the ability of spleen cells to release INF ⁇ . The results are shown in FIG.
  • Spleen cells obtained from mice immunized with Lh1 antigen or C antigen did not release INF ⁇ even when stimulated with Lh1 antigen, but stimulated with a mixture of Ch antigen and Lh1 antigen and C antigen. In some cases, release of INF ⁇ was observed. The amount of INF ⁇ released was greater when immunized with C antigen than when immunized with Lh1 antigen, and the promoting effect of C antigen immunization was observed.
  • Spleen cells obtained from mice immunized with a mixture of Lh1 and C antigens have far more INF ⁇ release than when immunized with Lh1 antigen or C antigen alone, and when immunized with these two antigens A synergistic effect of cellular immunity activation was observed. In spleen cells obtained from mixed immunized mice, release of INF ⁇ was also observed when Lh1 antigen was stimulated alone.
  • Example 24 Activation of cellular immunity when immunized with a mixture of Lh1 antigen and C antigen or S antigen and C antigen.
  • a mixture of Lh1 antigen and C antigen or a mixture of S antigen and C antigen (each 5 ⁇ g) was the same as in Example 23.
  • the mice were immunized, and spleen cells were collected and cultured. On the day after collection, the cultured cells were stimulated with various antigens (final concentration 10 ⁇ g / ml), and the release amount of INF ⁇ was measured.
  • Table 8 (Lh1 antigen and C antigen or mixture of S antigen and C antigen immunized) Activation of cellular immunity). Each numerical value in Table 8 indicates the amount of INF ⁇ released (pg / ml).
  • Spleen cells obtained from mice immunized with Lh1 antigen and C antigen were more spleen than those spleen cells obtained from mice immunized with S antigen and C antigen, regardless of the genotype of the stimulated antigen.
  • the amount of INF ⁇ released increased.

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Abstract

本発明は、種々の遺伝子型のHBVに対して免疫反応を惹起させる抗原を提供することを目的とする、数種類以上のHBs-L抗原タンパク質を含むウイルス様粒子又はそれらを組み合わせてなるウイルス様粒子組成物を提供する。

Description

ＨＢＶに対する免疫応答を生じさせるために用いられるウイルス様粒子
　HBVに対する免疫応答を生じさせるために用いられるウイルス様粒子に関する。また、本発明は、HBVに対する免疫応答を生じさせるために用いられるウイルス様粒子組成物に関する。また、本発明は、これらを有効成分として含有する、HBVの治療用及び/又は予防用ワクチンに関する。
　B型肝炎は、B型肝炎ウイルス(本明細書において、これを「HBV」と呼ぶことがある。)による感染症である。本疾患は、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変及び肝細胞癌等に代表される種々の肝臓疾患の主要な原因として知られる。HBVの感染者は、全世界で3億人とも言われており、B型肝炎は、世界的な健康問題の一つである。
　HBVは、その中心にDNAと、それを取り囲むカプシドとから構成された粒子であり、さらにその表面の脂質膜中に、多数のタンパク質を含むエンベロープ構造を有している。当該エンベロープは、ウイルスの最外部に位置する構造であり、HBVの免疫学的な検出に利用されるため、これを表面抗原とも呼ぶこともある(図1)。
　HBVの表面抗原を形成する全長のタンパク質をLタンパク質と呼び、粒子最外部に提示されたN末端から順にPre-S1領域、Pre-S2領域及びS領域の3つの領域が存在する(図1)。Pre-S1領域は、HBVがヒト肝細胞へ感染する際に細胞を認識し、細胞へ結合するセンサーとしての役割を担っている。ヒト肝細胞は、HBVに対する受容体としてNTCP受容体を有している(非特許文献1)。なお、HBVに感染しないヒト肝細胞由来のセルラインに、当該NTCP受容体を高発現させるとHBVに感染するようになるため(非特許文献2)、最近は、こうした細胞を用いてHBVの感染防御効果を確認することが、広く利用されるようになっている。
　全長のLタンパク質と呼ばれるHBs-L抗原タンパク質からPre-S1領域を欠き、Pre-S2領域及びS領域からなるタンパク質をMタンパク質、そしてHBs-L抗原タンパク質からPre-S1及びPre-S2領域を欠き、S領域のみからなるタンパク質をSタンパク質と呼ぶ。なお、HBVの表面抗原(Hepatitis B Surface Antigen, HBsAg)をSタンパク質のみからなるS抗原粒子を意味する場合があるなど、本分野では、言葉の定義が曖昧な場合がある。本明細書中では、特に断らない限り、HBV表面抗原タンパク質として、Sタンパク質のみからなる抗原粒子をS抗原又はHBs-S抗原と、Mタンパク質のみからなる抗原粒子をM抗原又はHBs-M抗原と、そしてLタンパク質のみからなる抗原粒子をL抗原又は又はHBs-L抗原と定義する(図1)。
　上記する各種のHBVの抗原タンパク質は、それをコードする遺伝子を導入した酵母又は動物細胞等の真核細胞を宿主細胞とした発現系で製造することが可能であり、こうした遺伝子組換の表面抗原は、HBVに対する予防用ワクチンとして広く利用されている。中でも、酵母で産生したS抗原を用いることが現在の市場での主流である。例外的に、CHO細胞で製造したMタンパク質及びLタンパク質を含有する抗原を利用した予防用ワクチン（Genhevac B Pasteur及びSci-B-Vac）も市販されている(非特許文献3及び4)。Genhevac B Pasteurは、HBV表面抗原タンパク質として、Mタンパク質及びSタンパク質が混合した抗原が原料であり、Sci-B-Vacは、Lタンパク質、Mタンパク質及びSタンパク質からなる抗原が原料である。
　S抗原を利用した予防ワクチンでは、ワクチンに対する非応答者が存在すること及び防御効果のオンセットが遅いということが大きな課題である。酵母で製造したMタンパク質のみからなるM抗原を利用した予防用ワクチンの臨床成績によると、Pre-S2領域は、S抗原より高い免疫原性を持ち、S領域に対する抗体に加え、Pre-S2領域に対する抗体も産生されることから、不応答者を減じること又はオンセットの早期化等に効果があると報告される(非特許文献5)。L抗原は、M抗原が含有するS領域及びPre-S2領域に加え、更に、HBVのセンサー部であるPre-S1領域を持つ。したがって、L抗原を予防用ワクチンとした場合、更に、最外部に提示されたPre-S1領域に対する抗体も産生されるため、S抗原ワクチン又はM抗原ワクチンより、非応答者の減少及び/又はオンセット早期化の点で、優れた予防用ワクチンとなると考えられる。
　既存の予防用ワクチンのもう一つの大きな課題として、エスケープ変異体のHBVに対して効果がないという問題がある。エスケープ変異体は、S抗原の抗原性の強い抗原決定基“a”領域に変異が起きたHBVのことであり、通常利用されているS抗原ワクチンに対して作られる抗体では、該変異体に対して防御効果が得られない。エスケープ変異体は、B型肝炎治療に用いられる抗ウイルス薬の普及に伴って益々増えていることが想定され、このことは今後、更に大きな問題になる。
　これに対し、M抗原ワクチンは、S領域に対する抗体に加え、Pre-S2領域に対する抗体も産生されるため、S抗原ワクチンよりHBV変異体に対し、更に強靭な防御効果が得られる。そして、L抗原の場合、更にPre-S1領域に対する抗体が出来るため、上記する3つの領域に変異が入ったHBVの発生頻度は更に減少し、M抗原ワクチンよりHBV変異に対し更に強靭な予防用ワクチンになると考えられる。以上のことから、L抗原ワクチンは、既存のS抗原又はM抗原を利用した予防用ワクチンより、優れたワクチンとなることが期待される。
　HBVの遺伝子型として、A型、B型、C型、D型、E型、F型、G型、及びH型が知られる。最近、これらにI型及びJ型が追加されている(非特許文献6)が、A型、B型、C型及びD型が、HBVの主な遺伝子型である。S領域及びPre-S2領域について、前記する各遺伝子型と表現型との関係が明らかになっている。例えば、S領域では、一般的に124～147番目のアミノ酸配列が、免疫原性の高い抗原決定基“a”として知られている。Pre-S2領域では、抗原決定基“b”が各遺伝子型に共通して存在することが知られている(非特許文献7)。したがって、これらの領域に関して、たとえ遺伝子型が異なっても、少なくとも一部の遺伝子型に対して、共通の抗体の産生が生じると考えられる。
　Pre-S1領域については、各遺伝子型と表現型との解析が十分に行われておらず、HBVの各遺伝子型間のアミノ酸配列の相同性が低い。従って、ある1種類の遺伝子型に由来するPre-S1領域を含有するL抗原を有効成分とするワクチンを製造したとしても、その他の種類の遺伝子型を有するHBVへのPre-S1領域を介した免疫反応を惹起させることは必ずしも出来ないと考えられる。ましてや、予防用ワクチンとして用い得る程度の感染防御を見込めないことは言わずもがなである。
　抗Pre-S1抗体は、チンパンジーを用いたHBV感染実験により、HBVの感染防御効果があることが公知である（非特許文献8）。しかしながら、非特許文献8で利用した抗Pre-S1抗体は、チンパンジーに対して、表現型adwのHBVの感染を防御するのに対し、表現型aywのHBVの感染は、防御しないとの報告がある。更に、非特許文献8では、抗Pre-S1抗体のエピトープ解析とPre-S1領域とのアミノ酸配列の関係から、本抗体がHBVの遺伝子型A、B、C、F及びHに効果があるが、遺伝子型D、E及びGには、効果がないであろうと論じている。また、チンパンジーに対して感染防止効果のあった別の抗Pre-S1抗体は、当時のGenBankのデータベースにあった12種のHBVの遺伝子配列から合成したPre-S1領域のペプチドには結合したが、本抗体が結合するPre-S1領域のエピトープのアミノ酸を1つ置換することで、結合しなくなったことも報告されている（非特許文献9）。
　以上、L抗原は、予防用ワクチンとして優れているが、遺伝子型の違いに対して対応することが必要である。なお、上記したLタンパク質を含むワクチン(Sci-B-Vac)は、Lタンパク質に含まれるPre-S1領域の遺伝子型の違いに対処することが何らされておらず、多数（2種以上の）の遺伝子型のHBVに対する感染防止効果を発揮する予防用ワクチンとは言えない。
　B型肝炎の治療には、抗ウイルス剤及びインターフェロン等の投与が効果的であることが知られている。しかしながら、抗ウイルス剤は、その効果が持続せず、HBVに対するエスケープ変異体が増加するという問題点を抱えている。また、インターフェロンは、治療効果が比較的弱く、副作用が非常に多いという問題点も抱えている。そして、上記する何れの治療薬も、HBVを患者から排除する効果は殆どなく、HBV感染からの完治が期待できるものではない。こうしたことから、B型肝炎に対する種々の治療用ワクチンの開発が進められている(非特許文献10～14)。
　治療用ワクチンの基本成分は、HBVの表面抗原及びカプシドを形成するコア抗原(C抗原)であり、主として体液性免疫による感染防御作用の惹起及び細胞性免疫作用の惹起によって、感染細胞からのHBV排除を狙ったものである。なお、S抗原及びC抗原の混合物を投与した臨床試験において、安全性に問題なく、細胞性免疫を含む免疫反応が上昇したことが報告されている（非特許文献13）。更に、同じ2種の抗原の混合物を用いた比較臨床試験において、S抗原及びC抗原の混合物が、ペグ化インターフェロンより効果を示したことが示されている（非特許文献10）。また、非特許文献14には、HBV排除にNK細胞が関与していることも報告されている。
　以上の様に、慢性B型肝炎に対する治療用ワクチンの開発が種々の手法で進められている。治療ワクチンの作用メカニズムの一つは、抗体によるHBV感染の防止であるため、上記した予防用ワクチンに求められる特徴は治療用ワクチンでも求められることになる。即ち、治療用ワクチンとしても、S抗原よりもPre-S1領域含むL抗原を使うことが望ましい。実際、より効果の高い予防用ワクチンとして、Pre-S1領域を含む表面抗原を利用した手法も開示されている(特許文献1、非特許文献15)。しかしながら、この手法においても上記する種々の遺伝子型のHBVに対する対応はされておらず、適切な治療用ワクチンが提供できるとは言えない。
特表2010-516807
Yan et al.(2012) elife, 2012 Nov 13;1:e00049 Iwamoto et al. (2014) BBRC, 443, 808-813 Shouval D et al.(2015) Med Microbiol Immunol, 204:57-68 Soulie JC et al. (1991) Vaccine, 9: 545-548 Suzuki H et al.(1994) Vaccine,12,1090-1096 Sunbul M (2014) World J Gastroenterol 20 (18), 5427-5434 Usuda S et al. (1999) J Virol Methods. 80(1),97-112 Zhang P et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 9214-9219 Hong HJ et al.(2004) Virology 318, 134-141 Akbar SM et al.(2016) Ann Transl Med , 4(18), 335 Li J et al.(2015) Vaccine 33, 4247-4254 Kosinska AD et al (2015). Med Microbiol Immunol, 204, 103-104 Al-Mahtab M et al.(2013) Hepatol Int, 7, 981-989 Tong S et al.(2017) Sci. Rep. 7: 314 Yum JS et al. (2012) Clin. Vaccine Immunol. 19, 120-127 Diminsky et al. (2000) Vaccine 18, 3-17
　このような従来技術に鑑みて、本発明は種々の（数種類以上の）遺伝子型のHBVに対して免疫反応を惹起させる抗原を提供することを課題とする。更に、本発明は、種々の（数種類以上の）遺伝子型のHBVの感染によって発症するB型肝炎を予防するための又は治療するためのワクチンを提供することも課題とする。
　本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、特定の遺伝子型に由来するHBs-L抗原タンパク質を含有するウイルス様粒子を用いることによって、種々の（数種類以上の）に対して免疫反応を生じさせ得ることを見出した。また、特定の遺伝子型に由来するHBs-L抗原タンパク質を含有するウイルス様粒子の組み合わせを含有するウイルス様粒子組成物を用いることによっても、種々の（数種類以上の）遺伝子型のHBVに対する免疫反応を生じさせ得ることを見出した。そして、上記するウイルス様粒子及びウイルス様粒子組成物が、種々の（数種類以上の）遺伝子型のHBVに対する中和活性を有することも明らかにした。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、下記に示す態様の発明を、広く包含するものである。
　項1　単一種類のHBs-L抗原タンパク質を含有するウイルス様粒子であって、前記HBs-L抗原タンパク質の遺伝子型がA、B、D、E、F、G、H又はこれらの各遺伝子型の変異体の何れかであり、数種類の遺伝子型のHBVに対する免疫反応を生じさせるために用いられる、ウイルス様粒子。
　項2　2種類以上のHBs-L抗原タンパク質を含有するウイルス様粒子であって、前記HBs-L抗原タンパク質の遺伝子型がA、B、C、D、E、F、G、H及びこれらの各遺伝子型の変異体からなる群より選択され、数種類の遺伝子型のHBVに対する免疫反応を生じさせるために用いられる、ウイルス様粒子。
　項3　免疫反応が、体液性免疫又は細胞性免疫である、項1又は2に記載する、ウイルス様粒子。
　項4　HBs-L抗原タンパク質として遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質又はその変異体のみを含有するウイルス様粒子と、項1に記載するウイルス様粒子とを含有する、ウイルス様粒子組成物。
　項5　項1～3に記載するウイルス様粒子の少なくとも2種類以上を含有する、ウイルス様粒子組成物。
　項6　HBs-L抗原タンパク質として遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質又はその変異体のみを含有するウイルス様粒子と、項5に記載のウイルス様粒子組成物とを含有する、ウイルス様粒子組成物。
　項7　遺伝子型AのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号1～9の何れかに示す配列、遺伝子型BのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号10～18の何れかに示す配列、遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号19～28の何れかに示す配列、遺伝子型DのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号29～38の何れかに示す配列、遺伝子型EのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号39～42の何れかに示す配列、遺伝子型FのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号43～47の何れかに示す配列、遺伝子型GのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号48～53の何れかに示す配列、遺伝子型HのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号54～57の何れか示す配列である、項1～6の何れかに記載する、ウイルス様粒子又はウイルス様粒子組成物。
　項8　項1～7の何れかに記載するウイルス様粒子又はウイルス様粒子組成物と、HBVのコア抗原を含有するウイルス様粒子とを含有する、ウイルス様粒子組成物。
　項9　項1～8の何れか1項に記載するウイルス様粒子又はウイルス様粒子組成物を含有する、B型肝炎の治療用及び/又は予防用ワクチン。
　本発明のウイルス様粒子又はウイルス様粒子組成物は、数種類の遺伝子型のHBVに対して免疫反応を惹起させることができる。本発明のウイルス様粒子又はウイルス様粒子組成物は、B型肝炎の感染を予防するためのワクチン又はこれを治療するためのワクチンとして用いることができる。
図1は、HBVの構造とL型のHBV表面抗原の模式図を示す。 図2は、実施例1にて構築した、pET32a-3C-Pre-S1-A、pET32a-3C-Pre-S1-B、pET32a-3C-Pre-S1-C及びpET32a-3C-Pre-S1-Dを示す。図中のPre-S1は、Pre-S1 region、Trxは、Thioredoxin、laclは、Lac repressor gene、oriは、E coli replication origin、そしてAmp Rは、Ampicilline resistant geneである。 図3は、実施例1にて作製した各遺伝子型のPre-S1-Trx及びPre-S1ペプチドの解析結果を示す。 図4は、実施例2にて構築したpGLD-MCを示す。図中のGLDpは、GLD Promoter、MCは、M antigen gene (Genotype C)、PGKtは、PGK terminator、そしてLeu2は、Lue2 geneであり、ori及びAmp Rは、それぞれ上記に同じである。 図5は、実施例2にて作製したLc抗原及びMc抗原の解析結果を示す。 図6は、実施例2にて作製したLc抗原及びSci-B-Vac抗原の解析結果を示す。 図7は、実施例3にて構築したpGLD-His4を示す。図中のSac Iは、Sac I site、His4は、His4 gene、Leu2は、Lue2 gene、そして2micronは、yeast 2micron sequenceであり、GLDp、PGKt、ori及びAmp Rは、それぞれ上記に同じである。 図8は、実施例4にて構築した、pGLD-His4-LA、pGLD-His4-LB及びpGLD-His4-LDを示す。図中のLA、LB及びLDは、それぞれL antigen gene (Genotype A、B及びD)であり、GLDp、PGKt、ori、Amp R、Leu2及び2micronは、それぞれ上記に同じである。 図9は、実施例4にて作製したLa、Lb及びLd抗原の解析結果を示す。 図10は、実施例5にて構築したpRS-Ura3-LC3を示す。図中のprは、promoter、LCは、L antigen gene (Genotype C)、Termは、Terminator、そしてURA3は、Ura3 geneであり、ori及びAmp Rは、それぞれ上記に同じである。 図11は、実施例5にて構築したpRS-Leu2-LC2を示す。図中の、pr、LC、Term、ori、Amp R及びLue2は、それぞれ上記に同じである。 図12は、実施例6にて作製したLc抗原の解析結果を示す 図13は、実施例7の実験結果を示す。図中の各グラフの縦軸は、L抗原、M抗原及びS抗原に対する各抗体（抗S抗体、抗Pre-S2抗体及び抗Pre-S1抗体）の産生量を示す。 図14は、実施例8の実験結果を示す。図中の各グラフのA、B、C及びDは、それぞれ免疫した遺伝子型A、B、C及びDのPre-S1ペプチド免疫で得られた抗血清による結果を示す。図中の各グラフの横軸は、使用した各抗血清の希釈割合を示す。 図15は、実施例9の実験結果を示す。図中の各グラフの横軸は、免疫した各種遺伝子型のL抗原（左からLa抗原、Lb抗原、Lc抗原及びLd抗原）を示し、各グラフの縦軸は、抗S抗体、抗Pre-S2抗体及び抗Pre-S1抗体の産生量を示す。 図16は、実施例9の実験結果を示す。図中の各グラフの縦軸は、各抗血清と各Pre-S1との結合の程度（相対値）を示し、図中の各グラフの横軸は、図14と同じである。 図17は、実施例9の実験結果を示す。図中の各グラフの縦軸及び横軸は、図16と同じである。 図18は、実施例10の実験結果を示す。図中の各グラフの縦軸及び横軸は、図16と同じである。 図19は、実施例11(2)にて構築したpRS-His4-LD2を示す。図中のpr、LD、Term、ori、Amp R及びHis4は、それぞれ上記に同じである。 図20は、実施例11(3)にて構築したpRS-Ura3-LD2を示す。図中のpr、LD、Term、ori、Amp R及びUra3は、それぞれ上記に同じである。 図21は、実施例12にて作製したLh1抗原の解析結果を示す 図22は、実施例12にて作製したLh1抗原の模式図を示す。 図23は、実施例13にて構築したpGLD-His4-LD2を示す。図中のLD2は、LD2 antigen gene (Genotype D PreS-1+Genotype C PreS-2 and S)であり、GLDp、PGKt、His4、ori、Amp R、Leu2及び2micronは、それぞれ上記に同じである。 図24は、実施例13にて作製したLd2抗原及びLh1b抗原の解析結果を示す。 図25は、実施例14にて構築したpRS-Leu2-LA2を示す。図中のpr、LA、Term、ori、Amp R及びLue2は、それぞれ上記に同じである。 図26は、実施例14にて作製したLh2抗原の解析結果を示す。 図27は、実施例15にて構築したpRS-Leu2-LB2を示す。図中のpr、LB、Term、ori、Amp R及びLue2は、それぞれ上記に同じである。 図28は、実施例15にて作製したLh3抗原の解析結果を示す。 図29は、実施例16にて作製したLh4抗原の解析結果を示す。 図30は、実施例17の実験結果を示す。図中のLhは、Lh1抗原による免疫を示す。 図31は、実施例17の実験結果を示す。図中のグラフの縦軸及び横軸は、図14と同じである。 図32は、実施例18の実験結果を示す。図中のグラフの左側の縦軸は、抗S抗体及び抗Pre-S2抗体の産生量を示し、右側の縦軸はPre-S1の産生量を示す。図中のグラフの横軸は、Lh1抗原による免疫後の日数を示す。挿入図は3種の抗体を同じ縦軸スケールで示した図である。 図33は、実施例19の実験結果を示す。左図は、抗S抗体そして右図は、抗Lh1抗体の各種抗原への結合を示す。 図34は、実施例22にて構築したpET19b-HBcAgを示す。図中のHBcAgはC antigen geneであり、lacl 、ori及びAmp Rは、それぞれ上記に同じである。 図35は、実施例22にて作製したC抗原の解析結果を示す。 図36は、実施例23の実験結果を示す。図中の各グラフの横軸のvehicleは、ネガティブコントロール、Lh 10はLh1抗原、C 10はC抗原、Lh+C 10はLh1及びC抗原、そしてConA 10はコンカナバリンAによる、脾臓細胞に対する刺激を意味する。
　本明細書において使用する「含む」との意味は、「本質的にからなる」との意味及び「からなる」との意味を包含する。
ウイルス様粒子
　本発明のウイルス様粒子は、数種類の遺伝子型のHBVに対して免疫反応を惹起させるために用いることができる。HBVの遺伝子型とは、HBVの変異体に伴って区別された群であり、HBV遺伝子配列の相違が8%を超える場合には異なる遺伝子型と定義されている。今後、更に遺伝子型の分類が増える場合もあり、確認されているHBVの遺伝子型である限り、特に限定はされない。このように区別される各遺伝子型のHBVが有するアミノ酸配列間の同一性は、約92％以上である。具体的なHBVの遺伝子型として、例えば、A、B、C、D、E、F、G、H、I及びJを挙げることができる。本明細書において「遺伝子型AのHBs-L抗原タンパク質」との表記は、「遺伝子型AのHBVに由来するHBs-L抗原タンパク質」であることを意味する。他の遺伝子型B～JのHBs-L抗原タンパク質との記載も同様である。
　本発明のウイルス様粒子が惹起する免疫反応は、これを生体内に投与した際に惹起される免疫反応である限り、特に限定はされない。例えば、体液性免疫反応又は細胞性免疫反応等を挙げることができる。
　本発明のウイルス様粒子は、HBs-L抗原タンパク質を含有する。本発明のウイルス様粒子に含有されるHBs-L抗原タンパク質の種類が、単一であるか又は複数であるかによって、2つの態様に区別される。
　第一の態様のウイルス様粒子は、単一種類のHBs-L抗原タンパク質を含有するウイルス様粒子である。このような第一の態様のウイルス様粒子に含有されるHBs-L抗原タンパク質は、後記する変異体を除き、単一種類のHBs-L抗原タンパク質である。第一の態様のウイルス様粒子は、数種類の遺伝子型のHBVに対して免疫反応を惹起させることができる。第一の態様のウイルス様粒子が免疫反応を生じさせることができるHBVの遺伝子型の種類は、多ければ多いほど好ましく、特に限定されない。その例として、二種類以上の遺伝子型が好ましく、三種類以上又は四種類以上が更に好ましい。
　第二の態様のウイルス様粒子は、2種類以上の遺伝子型のHBs-L抗原タンパク質を含有するウイルス様粒子である。第二の態様のウイルス様粒子も、数種類の遺伝子型のHBVに対して免疫反応を惹起させることができる。第二の態様のウイルス様粒子が免疫反応を生じさせることができるHBVの遺伝子型の種数も、多ければ多いほど好ましく、特に限定されない。例えば、第二の態様のウイルス様粒子に含有されるHBs-L抗原タンパク質の遺伝子型が2種類であるとき、該ウイルス様粒子が免疫反応を生じさせるHBVの遺伝子型は3種類以上、好ましくは4種類以上である。このように、第二のウイルス様粒子は、これに含有されるHBs-L抗原タンパク質の遺伝子の種数以上の遺伝子型のHBVに対して、免疫反応を生じさせることができる。
　後記する実施例で説明するように、遺伝子型CのHBs-L抗原及び遺伝子型DのHBs-L抗原を含有する第二の態様のウイルス様粒子は、遺伝子型C又はDのみならず、その他の遺伝子型A又はBのHBVに対しても免疫反応を惹起することができる。以下に、上記した2つの態様のウイルス様粒子について詳述する。
(1)第一の態様のウイルス様粒子
　第一の態様のウイルス様粒子は、これに含有されるHBs-L抗原タンパク質が単一種類の遺伝子型であるウイルス様粒子である。第一の態様のウイルス様粒子に含有されるHBs-L抗原タンパク質の個数は、1個又は2個以上である。第一の態様のウイルス様粒子とは、1個又は2個以上の膜貫通ドメインを有するタンパク質であるHBs-L抗原タンパク質及び脂質二重膜を主成分とする粒子であり、斯かる粒子内部に遺伝情報を司るDNA又はRNA等の核酸を有さない粒子である。
　本発明の第一の態様のウイルス様粒子に含有されるHBs-L抗原タンパク質の遺伝子型は、A、B、D、E、F、G、H、及びJの何れか一種類である。また、これらの遺伝子型の変異体も、第一の態様のウイルス様粒子に含有されるHBs-L抗原タンパク質に包含される。なお、本明細書にて定義する変異体は、突然変異による変異体に限定されず、人工的に変異導入して得られる変異体も包含される。
　具体的な各遺伝子型のHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列は、特に限定されない。例えば、遺伝子型Aとして配列番号1～9の何れかに示すアミノ酸配列、遺伝子型Bとして配列番号10～18の何れかに示すアミノ酸配列、遺伝子型Dとして配列番号29～38の何れかに示すアミノ酸配列、遺伝子型Eとして配列番号39～42の何れかに示すアミノ酸配列、遺伝子型Fとして配列番号43～47の何れかに示すアミノ酸配列、遺伝子型Gとして配列番号48～53の何れかに示すアミノ酸配列、及び遺伝子型Hとして配列番号54～57の何れかに示すアミノ酸配列を挙げることができる。
　上記する各遺伝子型のHBs-L抗原タンパク質を特定するアミノ酸配列は、本発明の効果を著しく損なわない範囲において、各遺伝子型のHBs-L抗原タンパク質を特定する配列番号1～57に示すアミノ酸配列の変異体とすることもできる。このような変異は、特に限定されず、例えば置換、挿入又は欠失等の変異を挙げることができる。
　上記する各遺伝子型のアミノ酸配列に対する変異の程度は、特に限定されない。例えば、配列番号1～9の何れかに示すアミノ酸配列（遺伝子型A）に対してアミノ酸33個程度の変異導入、配列番号10～18の何れかに示すアミノ酸配列（遺伝子型B）に対してアミノ酸26個程度の変異導入、配列番号29～38の何れかに示すアミノ酸配列（遺伝子型D）に対してアミノ酸38個程度の変異導入、配列番号39～42の何れかに示すアミノ酸配列（遺伝子型E）に対してアミノ酸21個程度の変異導入、配列番号43～47の何れかに示すアミノ酸配列（遺伝子型F）に対してアミノ酸16個程度の変異導入、配列番号48～53の何れかに示すアミノ酸配列（遺伝子型G）に対してアミノ酸9個程度の変異導入、及び配列番号54～57の何れかに示すアミノ酸配列（遺伝子型H）に対してアミノ酸27個程度の変異導入を挙げることができる。
　本発明において定義する各遺伝子型のアミノ酸配列に対する変異導入の程度は、NCBI (National Center for Biotechnology Information)等のデータベースから入手した各アミノ酸配列を、遺伝子解析ソフトによって解析することによって決定した。遺伝子型A～Dは各20個、Eは10個、Fは8個、そしてG及びHは各7個の異なるアミノ酸配列を用いて解析した。
　上記する変異体の具体例として、配列番号１～57の中でアミノ酸数が400からなる場合であれば、そのN末端から11アミノ酸の領域及び/又は163番目～168番目の6アミノ酸の領域を欠失した変異体を挙げることができる。また、配列番号１～57の中で、アミノ酸数が400ではない場合は、これらに相当する領域のアミノ酸配列が欠失した変異体を挙げることができる。
　人工的に変異導入した変異体として、例えば、HBs-L抗原タンパク質が有する3つの領域である、Pre-S1領域、Pre-S2領域及びS領域を、それぞれ異なる遺伝子型に由来する領域に、置換又は欠失する変異体を挙げることができる。具体的には、ある遺伝子型のPre-S1領域の、他の遺伝子型に由来するPre-S1領域への置換、ある遺伝子型のPre-S1領域及びPre-S2領域の、他の遺伝子型に由来するPre-S1領域及びPre-S2領域への置換、さらに、ある遺伝子型のPre-S2領域の、他の遺伝子型に由来するPre-S2への置換する変異体を挙げることができる。また、Pre-S2領域を他の遺伝子型に由来するPre-S1領域に置換することも可能であり、さらに、Pre-S2領域の欠失した変異体も挙げることができる。なお、これらの人工的な置換の場合には、上記する各遺伝子型のアミノ酸配列に対する変異導入数を超えた変異導入が可能である。
(2)第二の態様のウイルス様粒子
　第二の態様のウイルス様粒子は、2種以上の遺伝子型のHBs-L抗原タンパク質を含有する、ウイルス様粒子である。第二の態様のウイルス様粒子に含有されるHBs-L抗原タンパク質の個数は、1個又は2個以上である。第二の態様のウイルス粒子も、1個又は2個以上の膜貫通ドメインを有するタンパク質であるHBs-L抗原タンパク質及び脂質二重膜を主成分とする粒子であり、斯かる粒子内部に遺伝情報を司るDNA又はRNA等の核酸を有さない粒子である。
　第二の態様のウイルス様粒子に含有されるHBs-L抗原タンパク質の遺伝子型は、A、B、C、D、E、F、G、H、I及びJからなる群より選択される2種以上である。また、これらの遺伝子型の変異体も、第二の態様のウイルス様粒子に含有されるHBs-L抗原タンパク質に包含される。具体的な各遺伝子型のHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列及びそれらの変異体は、特に限定されない。例えば、上記する、第一の態様のウイルス様粒子と同様とすることができる。なお、遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質として、配列番号19～28の何れかに示すアミノ酸配列を挙げることができる。また、配列番号19～28の何れかに示すアミノ酸配列に対してアミノ酸28個程度の変異導入することができる。
　第二の態様のウイルス様粒子に含有される、2種以上の遺伝子型のHBs-L抗原タンパク質の好ましい態様は、各遺伝子型のHBVのPre-S1領域に対する各種の推定エピトープにおけるアミノ酸配列の同一性によって決定することができる。Pre-S1領域は、HBVの遺伝子型間でもアミノ酸配列の同一性が低い領域であるため、この領域の推定エピトープのアミノ酸配列がほぼ同一となる組み合わせを見いだすことは、数種類の遺伝子型のHBVに対して免疫反応を惹起させるために用いることができるウイルス様粒子の好ましい態様を決定する重要な情報となり得る。
　下記の表1に、各遺伝子型A、B、C、D、E及びFの代表的なアミノ酸配列において、遺伝子型を通して異なるアミノ酸配列領域(一文字表記)を推定エピトープと仮定した結果を示す。表中の太字にて表すアミノ酸は、二種類以上の遺伝子型の推定エピトープにおいて2つ以上連続して共通するアミノ酸残基であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　例えば、遺伝子型A、B及びCの推定エピトープのアミノ酸配列は、相互に共通している部分が多い事が分かる。また、遺伝子型Dの推定エピトープにおけるアミノ酸配列は、遺伝子型A、B及びCとかなり異なり、遺伝子型E及びFのアミノ酸と共通している部分が多い事が分かる。よって、第二の態様のウイルス様粒子は、HBs-L抗原タンパク質として、遺伝子型A、遺伝子型B及び遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質の何れか一つ、そしてその他のHBs-L抗原タンパク質として、遺伝子型D及び/又はEのHBs-L抗原タンパク質を含有することが好ましいと推定される。
　本発明のウイルス様粒子から、単一の種類のHBs-L抗原タンパク質を含有するウイルス様粒子であって、前記HBs-L抗原タンパク質が配列番号19～28の何れかに示すアミノ酸配列からなるHBs-L抗原タンパク質又はその変異体であるアミノ酸配列からなるHBs-L抗原タンパク質であるウイルス様粒子は、明確に除外される。ここで、配列番号19～28の何れかに示すアミノ酸配列の変異体とは、配列番号19～28の何れかに示すアミノ酸配列に対してアミノ酸28個程度の変異導入がされたアミノ酸配列からなるものである。
　上記する本発明のウイルス様粒子には、上記するHBs-L抗原タンパク質のほかに、本発明の効果を著しく損なわない範囲において、他の成分を含有するものとすることができる。このような他の成分とは、特に限定されない。具体的には、HBVに由来するHBs-L抗原タンパク質以外の、他の抗原タンパク質を挙げることができる。他の抗原タンパク質とは、特に限定されない。例えば、HBVに由来するＳ抗原タンパク質、Ｍ抗原タンパク質又はコア抗原タンパク質等を挙げることができる。中でも、S抗原タンパク質又はコア抗原タンパク質又はこれらの変異体が好ましい。コア抗原は、免疫反応を惹起する複数のエピトープを有することが知られているため、それらの変異体としては、上記するエピトープを一つ以上を含むものが挙げられる。これらのHBVに由来するHBs-L抗原タンパク質以外の、他の抗原タンパク質の遺伝子型は、特に限定されない。例えば、上記する本発明のウイルス様粒子に含有されるHBs-L抗原タンパク質と同様に、遺伝子型A、B、C、D、E、F、G、H、I及びJに由来するものとすることができる。ここで、上記する本発明のウイルス様粒子に含有されるHBs-L抗原タンパク質の遺伝子型と、これに含有されるHBs-L抗原タンパク質以外の抗原タンパク質の遺伝子型とは同一とすることもできるし、異なるものとすることもできる。
　上記する本発明のウイルス様粒子の製造方法は特に限定されない。具体的には、ウイルス様粒子に含有されるHBs-L抗原タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸を用いて宿主細胞を形質転換し、斯かる形質転換体を適切な培地で育種する生物工学的手段によって、容易に得ることができる。前記宿主細胞とは、特に限定されない。例えば、真核細胞が挙げられ、中でも酵母細胞又はCHO細胞が好ましい。特に、酵母細胞が好ましい。なお、上記するHBs-L抗原タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸はプラスミドの状態にて宿主細胞の形質転換に用いることもでき、上記の核酸を直鎖の状態にして宿主細胞のゲノムDNA内に組み込むこともできる。
ウイルス様粒子組成物
　本発明には、上記する二種類以上の遺伝子型のHBVに対して免疫反応を惹起させるために用いることができるウイルス様粒子の組み合わせを含有する、ウイルス様粒子組成物も包含される。このようなウイルス様粒子組成物も、数種類の遺伝子型のHBVに対して免疫反応を惹起させるために用いることができる。このようなウイルス様粒子組成物として、下記に示す4つの態様を挙げることができる。
(1)第一の態様のウイルス様粒子組成物
　本発明の第一の態様のウイルス様粒子組成物は、第一の態様のウイルス様粒子の何れか1種及びHBs-L抗原タンパク質として遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質若しくはその変異体のみを含有するウイルス様粒子（本明細書において、これを「C粒子」と呼ぶことがある。）を含有するウイルス様粒子組成物である。
　第一の態様のウイルス様粒子組成物の具体例として、例えば、HBs-L抗原タンパク質として遺伝子型DのHBs-L抗原タンパク質のみからなる第一の態様のウイルス様粒子及びC粒子を含有するウイルス様粒子組成物を挙げることができる。本発明の第二の態様のウイルス様粒子にて説明した通り、遺伝型CのHBs-L抗原タンパク質又はその変異体は、遺伝型DのHBs-L抗原タンパク質と組みわせて用いることが好ましい。
　C粒子に含有される、遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質の具体的なアミノ酸配列は、特に限定されない。例えば、配列番号19～28の何れかに示すアミノ酸配列を挙げることができる。上記する遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質の変異体とは、特に限定されない。具体的には、遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質である配列番号19～28の何れかに示すアミノ酸配列の変異体とすることができる。このような変異導入は、特に限定されない。例えば、置換、挿入又は欠失等の変異を挙げることができる。遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質に対する変異の程度は、本発明の効果を著しく損なわない範囲において、特に限定されない。具体的に、配列番号19～28の何れかに示すアミノ酸配列に対して、アミノ酸28個程度の変異導入を例示することができる。
　第一の態様のウイルス様粒子組成物におけるC粒子の含有割合は、特に限定されない。通常は、本発明の効果を著しく損なわない範囲において、適宜決定することができる。
(2)第二の態様のウイルス様粒子組成物
　本発明の第二の態様のウイルス様粒子組成物は、第一の態様のウイルス様粒子の複数の混合物を含有するウイルス様粒子組成物である。第二の態様のウイルス様粒子組成物に含有される、第一の態様の各ウイルス様粒子が有するHBs-L抗原タンパク質の遺伝子型は、異なる種類とすることができる。
　例えば、HBs-L抗原タンパク質として遺伝子型AのHBs-L抗原タンパク質のみを含有するウイルス様粒子及びHBs-L抗原タンパク質として遺伝子型BのHBs-L抗原タンパク質のみを含有するウイルス様粒子の混合物を含有するウイルス様粒子組成物を挙げることができる。
　第二の態様のウイルス様粒子組成物に含有される、HBs-L抗原タンパク質の遺伝子型の種数は、特に限定されない。例えば、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類又は10種類を挙げることができる。第二の態様のウイルス様粒子組成物における、第一の態様のウイルス様粒子の含有割合は、特に限定されない。通常は、本発明の効果を著しく損なわない範囲において、適宜決定することができる。
　第二の態様のウイルス様粒子組成物には、C粒子が含有されるものとすることができる。このような第二の態様のウイルス様粒子組成物におけるC粒子の含有割合は、特に限定されない。通常は、本発明の効果を著しく損なわない範囲において、適宜決定することができる。C粒子に含有される遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質の、具体的なアミノ酸配列及びその変異体は、第一の態様のウイルス様粒子組成物と同様にすることができる。
(3)第三の態様のウイルス様粒子組成物
　本発明の第三の態様のウイルス様粒子組成物は、第二の態様のウイルス様粒子の複数の混合物を含有するウイルス様粒子組成物である。第二の態様のウイルス様粒子組成物に含有される、各ウイルス様粒子が有するHBs-L抗原タンパク質の遺伝子型は、異なる種類の遺伝子型となっていてもよい。
　例えば、HBs-L抗原タンパク質として遺伝子型AのHBs-L抗原タンパク質並びに遺伝子型BのHBs-L抗原タンパク質のみからなるウイルス様粒子及びHBs-L抗原タンパク質として遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質並びに遺伝子型DのHBs-L抗原タンパク質のみからなるウイルス様粒子を含有するウイルス様粒子組成物を挙げることができる。
　第三の態様のウイルス様粒子組成物に含有される、HBs-L抗原タンパク質の遺伝子型の種数は、特に限定されない。例えば、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類又は10種類を挙げることができる。第三の態様のウイルス様粒子組成物における各種の第二の態様のウイルス様粒子の含有割合は、特に限定されない。通常は、発明の効果を著しく損なわない範囲において、適宜決定することができる。
　第三の態様のウイルス様粒子組成物は、C粒子が含有されるものとすることができる。このような第三の態様のウイルス様粒子組成物におけるC粒子の含有割合は、第二の態様のウイルス様粒子組成物と同様である。C粒子に含有される遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質の、具体的なアミノ酸配列又はその変異体は、第一の態様のウイルス様粒子組成物と同様にすることができる。
(4)第四の態様のウイルス様粒子組成物
　本発明のウイルス様粒子組成物の第四の態様は、第一の態様のウイルス様粒子及び上記する第二の態様のウイルス様粒子を含有するウイルス様粒子組成物である。第四の態様のウイルス様粒子組成物に含有される、各ウイルス様粒子が有するHBs-L抗原タンパク質の遺伝子型は、同一の遺伝子型のものが含まれていてもよい。
　例えば、HBs-L抗原タンパク質として遺伝子型AのHBs-L抗原タンパク質のみからなる第一の態様のウイルス様粒子及びHBs-L抗原タンパク質として遺伝子型AのHBs-L抗原タンパク質並びに遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質のみからなる第二の態様のウイルス様粒子を含有するウイルス様粒子組成物を挙げることができる。
　第四の態様のウイルス様粒子組成物に含有される、HBs-L抗原タンパク質の遺伝子型の種数は、特に限定されない。例えば、2種類、3種類、4種類、5種類、6種類、7種類、8種類、9種類又は10種類を挙げることができる。第四の態様のウイルス様粒子組成物における、第一の態様のウイルス様粒子及び第二の態様のウイルス様粒子の含有割合は、特に限定されない。通常は、本発明の効果を著しく損なわない範囲において、適宜決定することができる。
　第四の態様のウイルス様粒子組成物は、C粒子が含有されるものとすることができる。このような第四の態様のウイルス様粒子組成物におけるC粒子の含有割合は、第二の態様のウイルス様粒子組成物と同様である。C粒子に含有される遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質の、具体的なアミノ酸配列又はその変異体は、第一の態様のウイルス様粒子組成物と同様にすることができる。
　上記する本発明のウイルス様粒子又はウイルス様粒子組成物には、HBVのコア抗原及びその変異体を含有するウイルス様粒子を含有させることもできる。HBVのコア抗原を含有するウイルス様粒子は、HBVに対して細胞性免疫を惹起させやすいと知られるので、これを含有させることによって得られるウイルス様粒子組成物は、数種類の遺伝子型のHBVに対して免疫反応を惹起することが、特に好適に期待される。このような、本発明のウイルス様粒子又はウイルス様粒子組成物に対する、HBVのコア抗原を含有するウイルス様粒子の混合量は、特に限定されない。通常は、数種類以上の遺伝子型のHBVに対して免疫反応を惹起させるために用いることができる範囲内で、適宜決定することができる。
　本発明のウイルス様粒子又はウイルス様粒子組成物は、数種類の遺伝子型のHBVに対して免疫反応を惹起させるために用いることが期待できるので、これらをHBVに対するワクチン（予防用及び/又は治療用）として用いることができる。
HBVの予防用及び/又は治療用ワクチン
　本発明のHBVの予防用及び/又は治療用ワクチンは、上記するウイルス様粒子又はウイルス様粒子組成物を含有する。本発明のHBVの予防用及び/又は治療用ワクチンに含有されるウイルス様粒子又はウイルス様粒子組成物の量は、特に限定されない。例えば、HBVの予防用及び/又は治療用ワクチン当たり、通常は0.0001～100質量％程度とすることができる。
　本発明のHBVの予防用及び/又は治療用ワクチンには、薬学分野の組成物を製造する際に使用される薬学的に許容可能な公知の担体又は添加物を配合することができる。このような担体又は添加物は、特に限定されない。例えば、任意の担体、希釈剤、賦形剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、媒体、送達システム、乳化剤、錠剤分解物質、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香料又は甘味料等を挙げることができる。特に、アジュバンドを配合することが好ましい。
　本発明のHBVの予防用及び/又は治療用ワクチンは、上記する担体又は配合物を適宜組み合わせて、あらゆる剤形とすることができる。具体的には、輸液剤、埋め込み注射剤、マイクロニードル又は持続性注射剤等の注射剤；腹膜透析用剤又は血液透析用剤等の透析用剤；口腔内崩壊錠、チュアブル錠、発泡錠、分散錠又は溶解錠等の錠剤；硬カプセル錠又は軟カプセル錠等のカプセル剤；発泡顆粒剤、徐放性顆粒剤又は腸溶性顆粒剤等を含有する顆粒剤；散剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤又はリモナーデ剤等の経口液剤；シロップ剤、経口ゼリー剤、トローチ剤、舌下錠、バッカル錠、付着錠又はガム剤等の口腔用錠剤；口腔用スプレー剤、口腔用半固形剤、含嗽剤、吸入粉末剤、吸入液剤又は吸入エアゾール剤等の吸入剤；眼軟膏剤等の点眼剤；点耳剤；点鼻粉末剤：鼻腔噴霧又は点鼻液剤等の点鼻剤；坐剤、直腸用半固形剤、注腸剤、膣錠、膣用坐剤、又は外用散剤等の外用固形剤；リニメント剤又はローション剤等の外用液剤；外用エアゾール剤又はポンプスプレー剤等のスプレー剤；軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、テープ剤又はパップ剤等の貼付剤等を挙げることができる。これらの剤形は、第16改正日本薬局方解説書等の公知の文献に基づいて製造することができる。
　本発明のHBVの予防用及び/又は治療用ワクチンの投与対象は、これらの疾患に罹患する患者、罹患する可能性のあるヒト又は予防が必要と判断されるヒト等を挙げることができる。
　本発明のHBVの予防用及び/又は治療用ワクチンの投与方法は、特に限定されない。例えば、上記する投与対象又は剤形等に適宜留意して、公知の投与方法を採用することができる。具体的には、経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、くも膜下腔内投与、皮内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、肺内投与、眼内投与、腟内投与、頸部内投与、直腸内投与又は皮下投与等を挙げることができる。
　本発明のHBVの予防用及び/又は治療用ワクチンの投与量は、特に限定されない。例えば、投与対象がヒトであれば、通常は0.001～20μg/kg程度とすればよい。本発明のHBVの予防用及び/又は治療用ワクチンの治療剤の投与回数は、特に限定されない。例えば、HBVの予防用及び/又は治療用ワクチンに対する治療効果を発揮することができる範囲において、上記の量を一日に一度に投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。本発明のHBVの予防用及び/又は治療用ワクチンの治療剤の投与頻度は、特に限定されない。例えば、毎日、隔日、毎週、隔週、2～3週毎、毎月、隔月又は2～6ヶ月毎等とすることができる。
　以下に、本発明をより詳細に説明するための実施例を示す。なお、本発明が以下に示す実施例に限定されないのは言うまでもない。
＜実施例1＞
遺伝子型A、B、C及びDのPre-S1の融合タンパク質及びそれらのペプチドの作製
(1)ベクターの構築
　各遺伝子型のPre-S1ペプチドをコードするDNA配列は、以下の表2に示すテンプレートを基に、PCR法にて作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
※表中のAccは、NBCIのアクセッション番号であり、Reference No 1は、Kuroda et al, J Biol Chem, 1992, 267: 1953-1961；PMID:137048及び特許第4085231号に記載されたベクター(pGLD LIIP39-RcT)である。
　得られた4種のDNA断片をpET-32aベクター(Novagen)に挿入した。次に、これらのベクターのPre-S1ペプチドをコードする塩基配列の直前に、ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼによって特異的に切断される配列番号58のアミノ酸配列をコードする配列番号59に示す塩基配列を挿入して得られた各ベクターを、それぞれpET-32a-3C-Pre-S1-A、pET-32a-3C-Pre-S1-B、pET-32a-3C-Pre-S1-C及びpET-32a-3C-Pre-S1-D(図2)と命名した。
(2)大腸菌を用いたPre-S1-TRX融合タンパク質及びPre-S1ペプチドの調製
　上記(1)で作製したベクターを用いて、大腸菌株BL21(DE3)pLysSを形質転換し、それらの発現株を得た。各発現株をIPTG誘導下で培養し、その破砕液からChelating Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)カラムを使用して、各遺伝子型のPre-S1-TRX融合タンパク質を得た。これらにヒトライノウイルス3Cプロテアーゼを添加して、各遺伝子型のPre-S1ペプチドとTRXタンパク質とを分離後、上記カラムに添加し、その溶出液を精製Pre-S1ペプチドとした。
(3)各遺伝子型のPre-S1-TRX融合タンパク質及びPre-S1ペプチドの確認
　得られた各遺伝子型のPre-S1-TRX融合タンパク質をSDS-PAGEに供した後、CBB染色を行った結果、分子量が約31kDaの位置にバンドを認めた(図3A)。Pre-S1-TRX融合タンパク質を抗Pre-S1抗体(マウスモノクローナル抗体、ビークル社；BCL-AB-001)と2次抗体として抗マウスIgG-HRP(Rockland, 210-4302)とを用いたウェスタンブロット（本明細書において、これを「WB」と呼ぶことがある。）解析に供した結果、分子量約31kDaの位置にバンドが検出された(図3B)。これらの結果から、各遺伝子型のPre-S1-TRX融合タンパク質の精製を確認することができた。また、上記する精製後のPre-S1ペプチドをSDS電気泳動に供した結果、分子量が約11kDaとなる位置にバンドを認めた(図3C)。この結果から、目的とする各遺伝子型のPre-S1-ペプチドの精製を確認することができた。
　＜実施例2＞
(1)プラスミド型発現ベクターを用いた、遺伝子型CのL抗原及びM抗原粒子の作製
　遺伝子型CのHBsAg-L抗原タンパク質(これを、本明細書において「Lcタンパク質」呼ぶことがある。)からなる抗原粒子は、特許第4085231号に示したベクターを用いて、特許第4936272号に示した精製法によって調製した。このようにして得られた粒子に含有される抗原タンパク質は、Lcタンパク質のみからなり、この粒子を本明細書において「Lc抗原」と呼ぶことがある。また、LC遺伝子のPre-S1領域を欠いた、図4に示す発現ベクターpGLD-MCを作製し、Lc抗原と同じ手法で発現株を調製して、これを培養した菌体からMc抗原タンパク質からなるMc抗原（M抗原粒子）を精製した。
(2)プラスミド発現によるLc抗原及びMc抗原の確認
　(1)にて得られたLc抗原をSDS-PAGEに供した後、銀染色を行った結果を図5Aに示す。Lcタンパク質（分子量約42kDa）は糖鎖修飾の影響を受けて45kDaよりやや大きい所にモノマーに該当するバンドが認められ、97kDa付近にダイマーに該当するバンドが認められた。Mc抗原も同様に解析した結果、図5Cに示すように、Mc抗原は、分子量約32kDa付近にモノマーに該当するバンドが認められた。
　Lc抗原を抗S抗体(ウサギポリクローナル抗体、Abcam社、ab32916)、抗Pre-S1抗体(ビークル社；BCL-AB-001)又は抗Pre-S2抗体(特殊免疫研究所、2APS42)を用いたWBに供すると、いずれにおいてもモノマー及びダイマーの位置にバンドが検出された(図5B)。また、Mc抗原も同様に解析すると、抗S抗体及び抗Pre-S2抗体では、モノマーの位置にバンドが検出されたが、抗Pre-S1抗体では、検出されなかった(図5D)。なお、WBで使用した二次抗体は、抗ウサギIgG-HRP抗体(Santacruz, sc-2004)及び抗マウスIgG－HRP抗体(Rockland, 210-4302)である。
　また、従来品のSci-B-Vacワクチンで利用されている抗原をScigen社から入手し、Lc抗原を対照としてSDS-PAGEに供した後、銀染色及びWBを行った結果を図6に示す。銀染色の結果から、Sci-B-Vac抗原は、糖鎖修飾による違いと思われる種々のタンパク質から構成されており（主なバンドは分子量で24、27、33、36、39及び42kDa付近）、これらの各バンドの位置は、Sci-B-Vac 抗原と同じ手法でタンパク質を発現させた非特許文献15が開示する結果と良く一致した。WBに供した結果、抗S抗体に対してこれらのバンドが全て検出されたが、抗Pre-S1抗体に対しては全く検出されなかった。以上の結果は、Sci-B-Vac抗原はPre-S1を殆ど持っていないか、持っていても極めて少ないことを示す。
　以上の結果は、調製したLc抗原は、S領域、Pre-S2領域及びPre-S1領域の3つの領域を持つLタンパク質からなる粒子であることを示し、モノマー及びダイマーからなることを示す。また、Mc抗原はS領域及びPre-S2領域からなることも明らかとなった。なお、ゼータサイザー(マルバーン社)を用いて動的光散乱法による粒子径測定を行った結果、Lc抗原の粒子径は、59.7nm程度であり、Mc抗原の粒子径は、62.5nm程度であった。
＜実施例3＞
プラスミド型発現ベクターpGLD-His4の作製
　Lc抗原発現用プラスミドpGLD-LIIP39-RcT(特許第4085231号)を基に、図7に示すpGLD-His4ベクターを作製した。His4遺伝子断片は、出芽酵母のNA87-11A株のゲノムDNAから調製したものである。
＜実施例4＞
(1)プラスミド型発現ベクターを用いた遺伝子型A、B及びDのL抗原粒子の作製
　遺伝子型A、B及びDのLタンパク質(本明細書において、これらを、それぞれ「Laタンパク質」、「Lbタンパク質」及び「Ldタンパク質」と呼ぶことがある。)をコードする遺伝子(本明細書において、これらを、それぞれ「LA遺伝子」、「LB遺伝子」及び「LD遺伝子」と呼ぶことがある。)を、上記する表2に記載のテンプレートを用いてPCRを行い、これらを増幅した。
　増幅したLA、LB及びLDの各遺伝子から、酵母内のプロテアーゼによって分解を受ける可能性が高いPre-S2領域の6アミノ酸残基(LA:SISART；配列番号60、 LB:SILSKT；配列番号61及びLD:SIFSRI；配列番号62)に該当する遺伝子配列を欠失させ、また、各遺伝子の5’側には特許第4085231号で示すシグナルペプチド配列に該当する配列を挿入して、図8に示すpGLD-His4-LA、pGLD-His4-LB及びpGLD-His4-LDを作製した。
　なお、pGLD-His4-LAを利用して得られた、抗原タンパク質としてLaタンパク質のみからなる粒子を、本明細書において「La抗原」と呼ぶことがある。同様に、Lbタンパク質のみからなる粒子を、本明細書において「Lb抗原」、そしてLdタンパク質のみからなる粒子を、本明細書において「Ld抗原」と呼ぶことがある。
　酵母(AH22R-, Lue2及びHis4変異株)を、上記する各ベクターで形質転換し、それを所定の方法にてスクリーニングして、La、Lb及びLd抗原発現株を取得した。これらを培養して得られた発現菌体から、実施例2と同様にLa、Lb及びLd抗原粒子を精製した。
(2)プラスミド発現によるLa、Lb及びLd抗原粒子の確認
　(1)にて調製した抗原粒子をSDS-PAGEに供した後、銀染色を行った結果を図9Aに示す。La、Lb及びLdタンパク質の分子量は、それぞれ約42kDaであるが、糖鎖修飾により、それより大きい位置にモノマーバンドが認められ、その倍の位置に僅かにダイマーバンドが認められた。
　また、各抗原粒子を抗S抗体、抗Pre-S2抗体及び抗Pre-S1抗体を用いたWBに供した結果、モノマー及びダイマーの位置にバンドが検出された(図9B)。なお、何れの抗原でも電気泳動に供したタンパク量が多かったために、検出されるバンドがブロード状となり、特に、La抗原では、ダイマー位置で2本のバンドが検出された。これは、糖鎖修飾の違いを反映しているものと考えられる。
　なお、WBにおいて使用したS領域及びPre-S1領域の検出用抗体は、実施例２と同じである。そしてPre-S2領域の検出用抗体は、抗Pre-S2抗体(ビークル社、BCL-ABP2-01)であり、2次抗体は抗ウサギIgG-HRP(Santacruz, sc-2004)である。
　以上の結果は、(1)にて調製した各遺伝子型のL抗原が、S領域、Pre-S2領域及びPre-S1領域を持つ全長のLタンパク質からなることを示し、モノマー及び僅かなダイマーからなることを示す。なお、ゼータサイザー(マルバーン社)を用いて動的光散乱法による(1)にて調製した各遺伝子型のL抗原の粒子径測定をした結果、55～65nm程度であった。
＜実施例5＞
Lc抗原発現用ゲノム組込型ベクターpRS-Ura3-LC3及びpRS-Leu2-LC2の作製
　実施例2で使用したLc抗原発現用ベクターから調製したLC遺伝子、プロモーター及びターミネーターを含むLcタンパク質発現カセットを、pRS406(Stratagene)に段階的に挿入し、図10に示すLC遺伝子を3つ含むpRS-Ura3-LC3を作製した。
　他方、pRS406のUra3をLeu2に置き換えたベクターpRS-Leu2を作製した。次に、上記Lc抗原発現カセットを、pRS-Leu2に段階的に挿入し、図11に示すLC遺伝子を2つ含むpRS-Leu2-LC2を作製した。
　＜実施例6＞
(1)ゲノム組み込み型ベクターpRS-Ura3-LC3及びpRS-Leu2-LC2を用いたLc抗原発現株の作製及びLc抗原粒子の精製
　直鎖化したpRS-Ura3-LC3を用いて、酵母株AH22R-U（Ura3、Leu2、及びHis4変異株）を形質転換した。これを定法に従ってスクリーニングし、Lc抗原発現株(AH22R-U/Ura3株)を得た。続いて、直鎖化したpRS-Leu2-LC2を用いて、AH22R-U/Ura3株を形質転換し、これを定法に従ってスクリーニングしてLc抗原発現株(AH22R-U/Ura3/Leu2株)を得た。この発現株を液体培養して得られた発現菌体から、実施例2と同様の方法でLc抗原粒子を精製した。
(2)ゲノム組込型ベクターを用いて作製したLc抗原粒子の確認
　(1)にて得られた抗原粒子をSDS-PAGEに供した後、銀染色を行った結果を図12Aに示す。ゲノム組込型のLc抗原も、図5に示すプラスミド発現型のLc抗原と同じ位置に、モノマーが認められ、その倍の位置にダイマーバンドが認められた。なお、上記実施例２及び４と同様に(1)で得られたLc抗原粒子の粒子径は、60.1nm程度であった。
　また、この抗原を抗S抗体、抗Pre-S1抗体及び抗Pre-S2抗体を用いたWBに供すると、図12Bに示すように、いずれにおいてもモノマー及びダイマーの位置にバンドが出現した。なお、WBで使用した抗体は、実施例２と同じである。
　以上の結果は、ゲノム組込型のベクターを使用して作製したLc抗原は、プラスミドを用いて発現させて得られるLc抗原と、タンパク質の分子量及びその粒子サイズ的から、ほぼ同等であることを示す。
　＜実施例7＞
L抗原投与時の抗体産生
　実施例2にて作製したLc抗原粒子及びMc抗原粒子と、アラムアジュバントとを混合させて投与製剤を調製した。遺伝子型CのS抗原粒子として、アラムアジュバントを用いて調製された市販のビームゲン(化血研)を利用した。これらをICR系統マウス（3個体を一群とする）に、1匹当り各抗原の5μgを、2週間間隔で3回投与し、最終投与から4週間後に採血して、抗血清を調製した。
　実施例1で調製したPre-S1-TRXを固相化したELISAプレート（Pre-S1抗体測定用）、Pre-S2-TRX(ビークル社製、BCL-AGS2-21)を固相化したELISAプレート（Pre-S2抗体測定用）及びS抗原(Fitzgerald社、米国より購入)を固相化したELISAプレート（S抗体測定用）に、それぞれ上記にて調製した抗血清を添加し、固相化した各抗原に結合する抗体の量を、HRP標識した抗マウスIgGを2次抗体として利用して測定した結果を図13に示す。なお、マウスモノクローナル抗Pre-S1抗体(ビークル社製、BCL-AB-001)、マウスモノクローナル抗Pre-S2抗体(ビークル社製、BCL-ABM2-01)及びマウスモノクローナル抗S抗体(HB5 EXBIO社)を検量線作成用の標準抗体として利用した。
　S抗原粒子で免疫すると、抗S抗体のみが産生され、M抗原粒子で免疫すると、抗S抗体及び抗Pre-S2抗体が産生された。Lc抗原粒子で免疫すると、抗S抗体及び抗Pre-S2抗体に加え、抗Pre-S1抗体も産生された。この時、抗Pre-S1抗体は、抗Pre-S2抗体又は抗S抗体に対して、約5倍から10倍程度産生されることが分かった。以上の結果は、Lcタンパク質のみからなるLc抗原粒子は、大量の抗Pre-S1抗体を作るのに適していることを示し、Pre-S1領域の免疫原性が他の領域より遥かに高いことを示す。
　＜実施例8＞
各種遺伝子型のPre-S1ペプチドで調製した抗血清及び各遺伝子型のPre-S1の認識
　実施例1で得られた4種の遺伝子型のPre-S1ペプチドとフロイントアジュバントとを混合させて投与製剤を調製した。これらを用いて実施例7と同様に、抗血清を調製した。実施例1で調製した4種のPre-S1-TRX融合タンパク質を固相化させたELISAプレートに、希釈した各抗血清を添加し、HRP標識抗マウス抗体を検出抗体として用い（基質はTMB）、各抗血清と各Pre-S1との結合の程度を測定した結果を図14に示す。
　遺伝子型A及びCのPre-S1ペプチドで免疫して得られた抗血清は、共に、遺伝子型A、B及びCのPre-S1には良く結合したが、遺伝子型DのPre-S1に対する結合は弱かった(図14A及びC)。その一方で、遺伝子型DのPre-S1ペプチドで免疫して得られた抗血清の遺伝子型DのPre-S1に対する結合の程度は比較的高いものの、遺伝子型A、B及びCのPre-S1に対する結合の程度は低かった(図14D)。以上の結果は、遺伝子型A及びCのPre-S1領域は、類似の抗体産生を惹起することを示しており、両者が共通のエピトープを有していることを示唆する。その一方で、遺伝子型DのPre-S1領域は、遺伝子型A又はCとは明らかに異なったエピトープを持つことを示している。そして、遺伝子型Bは、遺伝子型A及びCと比較的類似したエピトープを持つことが示唆された。
　＜実施例9＞
各種遺伝子型L抗原投与による抗体産生
　実施例2及び4で調製した各遺伝子型（A～D型）のL抗原（各５μg）とフロイントアジュバントとを混合させて投与製剤を調製した。これらを、実施例7の方法でICR系統のマウスに免疫して抗血清を調製し、抗S抗体、抗Pre-S2抗体及び抗Pre-S1抗体の産生量を、実施例７と同様に測定した結果を図15に示す。各遺伝子型のL抗原粒子の免疫により、抗S抗体、抗Pre-S2抗体及び抗Pre-S1抗体が産生された。いずれの遺伝子型でも抗Pre-S1抗体の産生量が最も高く、抗S抗体又は抗Pre-S2抗体の4倍～数100倍であった。
　また、実施例8と同様の方法で、各遺伝子型（A～D型）のPre-S1に対する、上記する各抗血清の結合を観察した。結合の強さは、免疫したL抗原と、測定対象のPre-S1の遺伝子型とが合致した場合の値を100％として、他の遺伝子型のPre-S1に対する結合を相対値で表した結果を図16及び17に示す。
　図16に示す、各遺伝子型のPre-S1に対する、各抗血清の3個体の平均値の結合の結果から、Lb抗原で免疫して得られた抗血清は、他の遺伝子型のPre-S1にも良く結合し、その一方で、例えば、Ld抗原で免疫して得られた抗血清は、遺伝子型AのPre-S1に対する結合が悪い傾向が見えた。
　また、図17に示す個々の個体の結果から、La抗原で免疫して得られた得られた抗血清は、遺伝子型BのPre-S1に対しては結合が極端に悪いものがあり、Lb、Lc及びLd抗原で免疫して得られた抗血清も、免疫抗原とは異なる遺伝子型のPre-S1に対する結合が極端に悪い場合があった。
　以上の結果は、遺伝子型の違いに関わらず、L抗原粒子の投与によって抗S抗体、抗Pre-S2抗体及び抗Pre-S1抗体が産生され、その産生量は、抗Pre-S1抗体が最も高いことを示す。また、ある遺伝子型のL抗原粒子の投与で産生される抗Pre-S1抗体は、他の遺伝子型のPre-S1領域に対し、極端に結合が弱い場合があることも明らかとなった。よって、単独の遺伝子型のL抗原で免疫して産生される抗Pre-S1抗体は、その遺伝子型が異なると、他の遺伝子型のPre-S1領域を必ずしも認識しないことを示している。本発明の目的は、複数の遺伝子型のPre-S1領域を認識可能なウイルス様粒子を創製することであるため、以下の検討を行った。
　＜実施例10＞
異なる遺伝子型のL抗原を混合投与した抗血清による各種遺伝子型Pre-S1の認識
　下記の表3（各種遺伝子型のL抗原を混合投与した時の各遺伝子型のPre-S1に対する結合）に示すように、実施例2及び実施例4で調製した2種又は3種の遺伝子型のL抗原を等量混合し、L抗原の総量として5μgを、実施例9と同様の方法で3個体のICR系統マウスに免疫し、抗血清を得た。
　得られた各抗血清の、遺伝子型A、B、C及びDのPre-S1に対する結合の程度を、実施例8に示す方法で測定した。なお、結合の程度の測定値は、LaとLbとの混合物及びLaとLbとの混合物で免疫した場合、遺伝子型AのPre-S1に対する結合の程度を100％として、その他の遺伝子型のPre-S1に対する結合の程度の相対値を表3に示している。同様に、LbとLcとの混合物及びLbとLdとの混合物で免疫した場合、遺伝子型BのPre-S1に対する結合の程度を100％として、そしてLcとLdとの混合物及びLc、Lb及びLdの混合物で免疫した場合、遺伝子型CのPre-S1に対する結合の程度を100％として、その他の遺伝子型のPre-S1に対する結合の程度の相対値を表3に示す。なお、全ての値は、3個体から得られた抗血清の平均値である。また、一例としてLcとLdとの混合物で免疫して得た抗血清の測定結果を、図18に示す。
　図18から、LcとLdとの混合物で免疫して得られる抗血清は、遺伝子型C及びDのPre-S1にほぼ同等に結合することが明らかとなった。また、遺伝子型A及びBのPre-S1に対する結合の程度は、85％前後となり、2種の遺伝子型のL抗原を混合すると、実施例9（図17）に示した各遺伝子型のL抗原を単独で投与した場合よりも、異なる遺伝子型のPre-S1に対する結合は向上した。また、個々の個体で見ても、最も低い結合の程度を示したものは、73％であり、極端に結合が低いものはなかった。また、表3に示す様に、他の遺伝子型のL抗原の組合せで混合した場合も同様の現象が認められ、特に3種の遺伝子型のL抗原を混合して免疫して得られる抗血清の、各種遺伝子型のPre-S1に対する結合の程度が、最も良好であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜実施例11＞
抗原として、Lc及びLdタンパク質からなるハイブリッド型L抗原発現株（Lh1抗原）
(1)プラスミド型によるLh1発現株の作製
　実施例4で調製したLd抗原発現用プラスミドpGLD-His4-LDを用いて、実施例6で調製したゲノム組込型Lc抗原発現株(AH22R-U/Ura3/Leu2株)を形質転換し、これを定法に従ってスクリーニングして、1つの粒子内にLcタンパク質及びLdタンパク質を含むハイブリッドL抗原（本明細書において、これを「Lh1抗原」と呼ぶことがある。）の発現株を得た。
(2)ゲノム組込型によるLh1抗原発現株の作製-1
　pRS406のURA3をHIS4に置き換えたpRS-His4を作製し、これに実施例4で調製したLd抗原発現用ベクターから調製したLD遺伝子、プロモーター及びターミネーターを含むLd抗原発現カセットを挿入し、図19に示す2つのLD遺伝子を含むpRS-His4-LD2を作製した。
　実施例6で作製したLc抗原発現株(AH22R-U/Ura3/Leu2株)を、直鎖化したpRS-His4-LD2で形質転換し、これを定法に従ってスクリーニングして、Lh1発現株を取得した。
(3)ゲノム組込型によるLh1抗原発現株の作製-2
　酵母株(AH22R-U)を、実施例5で作製したLc抗原発現ベクターpRS-Leu2-LC2で形質転換し、これを定法に従ってスクリーニングして、Lc発現株を得た。このLc発現株を、実施例5と同様の方法で作製した、図20に示すLd抗原発現ベクターpRS-Ura3-LD2で形質転換し、これを定法に従ってスクリーニングして、Lh1発現株を取得した。
　＜実施例12＞
Lh1抗原の製造と確認
(1)Lh1抗原の培養と精製
　実施例11の(1)から(3)で得たLh1発現株を液体培地で培養して得られた菌体から、実施例2と同様にLh1抗原粒子を精製した。
(2)遺伝子型C及びDのPre-S1領域を認識する抗体の作製
　遺伝子型CのPre-S1-TRX抗原をウサギに免疫して得られた抗血清からIgGを精製した。このIgGを遺伝子型D型のPre-S1-TRX固定カラムに2回通して、遺伝子型DのPre-S1に結合するIgGを除去し、遺伝子型CのPre-S1を特異的に検出する抗Pre-S1c抗体とした。また、遺伝子型DのPre-S1-TRX抗原をウサギに免疫して得られた抗血清からIgGを精製し、これを遺伝子型CのPre-S1-TRX固定カラムに2回通して、遺伝子型DのPre-S1を特異的に検出する抗Pre-S1d抗体とした。
(3)Lcタンパク質およびLdタンパク質を含むLh1抗原粒子の確認
　実施例11(2)の発現株から精製したLh1抗原をSDS-PAGEに供した後、銀染色を行った結果を図21Aに示す。Lタンパク質は、糖鎖修飾により分子量の42 kDaよりやや大きい位置に認められた。
　また、上記(2)にて作製した遺伝子型C型およびD型のPre-S1領域を特異的に認識する抗Pre-S1c抗体と抗Pre-S1d抗体とを用いたWBを行った結果、Lh1抗原は、いずれの抗Pre-S1抗体でも検出されることが分かった。その一方で、コントロールのLc抗原及びLd抗原は、それぞれの遺伝子型に対する抗体のみで検出された。以上の結果は、Lh1抗原がLcタンパク質及びLdタンパク質の両者を持つ抗原であることを示す。なお、実施例11の(1)から(3)の発現株から得たLh1抗原について、ゼータサイザーを用いて粒子径を測定した結果、58～63nm程度であり、これらの抗原が同様に粒子を形成していることが分かった。
　次いで、遺伝子型Dに対して特異的に結合する、抗Pre-S2uエピトープ抗体(特殊免疫研究所、非特許文献7)、(2)で調製した抗Pre-S1c抗体及び実施例7で使用した抗S抗体を用いて、(1)で得られたLh1抗原が、一つの粒子上に遺伝子型DのLタンパク質及び遺伝子型CのLタンパク質が提示された、図22に示す構造を有するかどうかを検討した。
　ELISAプレートに抗Pre-S2u抗体又は抗Pre-S1c抗体を固相化し、これらの抗体によって、実施例6のLc抗原、実施例4のLd抗原及び上記するLh1抗原を捕捉し、捕捉された抗原をこれら3種の抗体で検出した結果を表4（Lh1抗原のanti-Pre-S2u抗体、anti-Pre-S1c抗体及びanti-S抗体による解析結果）に示す。なお、本測定系でのカットオフ値は0.4である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　抗Pre-S2u抗体を固相化し、検出抗体として抗Pre-S1c抗体又は抗S抗体を用いた場合、Lc抗原は、全く検出されなった。Lc抗原は抗Pre-S1c抗体又は抗S抗体に結合することが、上記のWBの結果、実施例２及び実施例12の結果から分かっているため、この結果はLc抗原が遺伝子型Dに特異性を持つ抗Pre-S2u抗体には結合せずELISAプレートに補足されなかったことを示している。その一方で、Ld抗原の場合は、抗Pre-S2u抗体に補足されたため、抗S抗体により検出されるが、遺伝子型Cに特異性を持つ抗Pre-S1c抗体には検出されなかった。Lh1抗原の場合は、抗Pre-S2u抗体に補足されたため、抗Pre-S1c抗体及び抗S抗体の何れでも検出された。
　また、固相化抗体を抗Pre-S1c抗体とし、検出抗体として抗Pre-S2u抗体又は抗anti-S抗体を用いた場合、Lc抗原は、抗S抗体のみで検出され、Ld抗原は、抗Pre-S1c抗体に補足されなかったため、何れの検出抗体でも検出されなった。その一方で、Lh1抗原は、抗Pre-S1c抗体に補足され何れの抗体でも検出された。
　以上の結果は、作製したLh1抗原粒子上には、遺伝子型DのPre-S2と遺伝子型CのPre-S1とが提示されていることを示しており、即ちLh1抗原が一つの粒子上に遺伝子型DのLタンパク質と遺伝子型CのLタンパク質とが提示された図22に示す構造の抗原であることを示している。
　＜実施例13＞
抗原として、Lc及びLd2抗原からなるハイブリッド型L抗原粒子（Lh1b抗原）
(1)プラスミド型Ld2抗原発現ベクターの作製
　遺伝子型DのPre-S1領域と遺伝子型CのPre-S2及びS領域とからなるLd2タンパク質の発現ベクターを下記の様に作製した。実施例4で作製したLd発現ベクターpGLD-His4-LDをテンプレートとして、Pre-S2及びS領域以外の領域（Pre-S1及びベクター部分）をインバースPCR法で増幅した。別途、表2に記載する遺伝子型Cをテンプレートとして、遺伝子型CのPre-S2領域及びS領域の断片を作製した。これを、上記Pre-S1領域を有するベクター断片に組み込んで、図23に示すpGLD-His4-LD2を作製した。なお、Ld2タンパク質のみからなる粒子を、本明細書において「Ld2抗原」と呼ぶことがある。
(2) Ld2抗原粒子発現株とハイブリッド型L抗原粒子(Lh1b抗原)発現株との各抗原の作製
　実施例4と同様に、酵母(AH22R-株)をpGLD-His4-LD2で形質転換し、Ld2抗原発現株を取得した。また、実施例6で作製したLc抗原発現株をpGLD-His4-LD2で形質転換し、これを定法に従ってスクリーニングして、Lh1b抗原発現株を取得した。これを培養して得られた菌体から、実施例2と同様の方法でLd2抗原とLh1b抗原とを精製した。精製したLd2抗原と、精製Lh1b抗原とをSDS-PAGEに供した後、銀染色を行った結果、図24に示すように、モノマー及びダイマー付近の位置にバンドが認められた。また両者をWBに供した結果、抗Pre-S1d抗体ではいずれの抗原も所定の位置に検出され、抗Pre-S1c抗体ではLd抗原では検出されなかったが、Lh1d抗原では検出された。なお、WBで利用した抗体は、実施例12で用いたものと同じである。
(3) Ld2抗原の免疫学的特性の検討
　実施例2で作製したLc抗原と精製したLd2抗原とのそれぞれ5μgを実施例7と同様の方法で、各3個体のマウスに免疫し、抗血清を得た。得られた抗血清を用いて、実施例8と同様の方法で、4種の遺伝子型のPre-S1に対する結合を観察した。各群で得られた結果の平均値を表5に示す。 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　Ld2抗原で調製した抗血清は、遺伝子型DのPre-S1に対する結合が最も強く、遺伝子型A及び遺伝子型BのPre-S1に対する結合が弱いなど、実施例9で示した図16のLd抗原で調製した抗血清の各遺伝子型Pre-S1に対する結合の様式と類似したものとなった。以上の結果は、Lc抗原のPre-S1領域のみを遺伝子型DのPre-S1へ置換することで、遺伝子型DのL抗原が産生するPre-S1に対する抗体と同様の性質を持つ産生させることが出来ることを示す。
　＜実施例14＞
抗原として、La及びLd抗原からなるハイブリッド型L抗原(Lh2抗原)
　実施例5と同様の方法で、図25に示すゲノム組込型La発現ベクターpRS-Leu2-LA2を作製した。これを用いて酵母株AH22R-U株を形質転換し、これを定法に従ってスクリーニングして、La抗原発現株を得た。次いで、得られたLa抗原発現株を、実施例11で作製したLd発現ベクターpRS-His4-LD2で形質転換し、これを定法に従ってスクリーニングして、Laタンパク質及びLdタンパク質を発現する酵母株を取得した。この株を培養して得られた菌体から、実施例2と同様の方法でLh2抗原を精製した。得られた精製Lh2抗原をSDS-PAGEに供した後、銀染色を行った結果、図26に示すように、モノマー及びダイマー付近の分子量の位置にバンドが認められた。
　＜実施例15＞
抗原として、Lb及びLc抗原からなるハイブリッド型L抗原(Lh3抗原)
　実施例5と同様の方法で、図27に示すゲノム組込型Lb発現ベクターpRS-Leu2-LB2を作製した。これを用いて、実施例6で作製したLc抗原発現株(AH22R-U/Ura3株)を形質転換し、これを定法に従ってスクリーニングして、Lbタンパク質及びLcタンパク質を発現する酵母株を取得した。この株を培養して得られた菌体から、実施例2と同様の方法でLh3抗原を精製した。得られた精製Lh3抗原をSDS-PAGEに供した後、銀染色を行った結果、図28に示すように、モノマー及びダイマー付近の位置にバンドが認められた。
　＜実施例16＞
抗原として、Lb、Lc及びLdタンパク質からなるハイブリッド型L抗原(Lh4抗原)
　実施例11(2)で作製したゲノム組込型Ld発現ベクターpRS-His4-LD2を用いて、実施例15で作製したLh3抗原（Lb及びLcタンパク質）発現株を形質転換し、これを定法に従ってスクリーニングして、Lb、Lc及びLdタンパク質を発現する酵母株を取得した(Method1)。また、実施例11(3)で作製したLh1発現株(Lc及びLdタンパク質)を、実施例4で作製したpGLD-His4-LBで形質転換し、これを定法に従ってスクリーニングして、Lb、Lc及びLdタンパク質を発現する酵母株を取得した(Method2)。得られた2種のLh4抗原発現株を培養して得られた菌体から、実施例2と同様の方法でLh4抗原を精製した。得られた精製Lh4抗原をSDS-PAGEに供した後、銀染色を行った結果、図29に示すように、いずれの発現株から得られたLh4抗原も、モノマー及びダイマー付近の位置にバンドが認められた。
　＜実施例17＞
Lh1抗原投与時の抗体産生及びLa、Lb、Lc及びLd抗原に対する結合
　実施例12で製造したLh1抗原及びS抗原粒子(Fitzgerald社)で、実施例9と同じ方法により、各群4個体のマウスを免疫して抗血清を調製し、実施例7と同様の方法で抗Pre-S1抗体、抗Pre-S2抗体及び抗S抗体の産生量を測定した。この結果を図30に示す。コントロールであるS抗原による免疫では、抗S抗体のみを産生したが、Lh1抗原による免疫では、抗S抗体、抗Pre-S2抗体及び抗Pre-S1抗体を産生した。この場合の抗S抗体の産生量は、S抗原の免疫による産生量とほぼ同等であり、抗Pre-S2抗体の産生量は、抗S抗体の産生量より僅かに低かった。また、抗Pre-S1抗体は、他の2種の抗体より著しく多く産生され、その産生量は、抗S抗体の4倍以上、そして抗Pre-S2抗体の10倍程度であった。
　また、これらの抗血清の遺伝子型A、B、C、DのPre-S1に対する結合の程度を実施例8と同じ方法で調べた結果を図31に示す。Lh1抗原で免疫して得られる抗血清は、何れの遺伝子型のPre-S1に対しても、ほぼ同等の強さで結合した。Pre-S1領域に対する抗体が、HBVの感染防御に有効であると思われることは上記の通りであるが、Lh1抗原は、非常に多くの抗Pre-S1抗体を産生するのみならず、各種遺伝子型のPre-S1に結合するため、HBV感染を阻害するためのワクチンとして理想的な抗原であると結論できる。
　＜実施例18＞
Lh1抗原投与時の抗体産生のタイムコース
　20μgのLh1抗原及びアラムアジュバントの混合物を、ICR系統マウスに1回、皮下投与で免疫し、免疫したマウスから得られる抗血清中の抗Pre-S1抗体、抗Pre-S2抗体及び抗S抗体が産生されるタイムコースを検討した。各抗体の測定は、実施例7と同様に行った。この結果を図32に示す。
　図32から分かる様に、抗Pre-S1抗体の産生量が最も早期に上昇し、免疫から7日目以降で抗Pre-S1抗体の上昇が確認できた。抗Pre-S2抗体の産生は、免疫から11日目以降に確認できた。その一方で、抗S抗体の産生は遅く、免疫から14日目に僅かな産生が認められたに過ぎなかった。なお、免疫から14日目では、抗Pre-S1抗体の産生量は、抗Pre-S2抗体の4.4倍程度、そして抗S抗体の40倍程度であった。
　以上の結果は、Lh1抗原で免疫した場合、体内で早く抗Pre-S1抗体が産生され、Lh1抗原の投与は、HBVによる感染に対する防御効果が早期に期待できることを示唆する。
　＜実施例19＞
抗Lh1抗体によるエスケープ変異抗原の検出　
　Lc抗原のS領域の129及び145位にアルギニンを導入しエスケープ変異体とした抗原であるHBs-L-ST抗原(ビークル社製:BCL-AGS-02)を固相化し、実施例7で使用した抗S抗体の結合を観察した結果を図33に示す。HBs-L-ST抗原は殆ど検出できなかったが、対照のS抗原及びLh1抗原は検出された。即ち、HBs-L-ST抗原は通常の抗S抗体では検出できないエスケープ変異体の性質を持つことを示す。
　次いで、HBs-L-ST抗原とLh抗原とを固相化し、実施例17で得たLh1抗原に対する抗血清をプロテインA/G樹脂でIgGに精製した抗Lh1抗体で検出した所、何れも同等の強さで検出された。以上の結果は、Lh1抗原を免疫して得られる抗体は、エスケープ変異体にも結合することを示しており、エスケープ変異体に対しても感染防御効果が期待できると言える。
　＜実施例20＞
Lh1b、Lh2、Lh3及びLh4による抗体産生
　実施例13～16で調製したLh1b、Lh2、Lh3及びLh4抗原を、実施例9と同じ方法でICR系統マウスに免疫して抗血清を得た。得られた各抗血清の、遺伝子型A、B、C及びDのPre-S1に対する結合の程度を、実施例8に示す方法で測定した。なお、結果は、Lh1b抗血清では遺伝子型CのPre-S1、Lh2抗血清では遺伝子型AのPre-S1、Lh3抗血清では遺伝子型BのPre-S1、及びLh4抗血清では遺伝子型CのPre-S1への結合の程度を100％として、その他の遺伝子型のPre-S1に対する結合の程度の相対値で示した。なお、全ての値は、3個体から得られた抗血清の測定値の平均である。結果を表6（各種ハイブリッド型L抗原による免疫で得られた抗血清の各種遺伝子型Pre-S1に対する結合）に示す。
　Lh1b、Lh2、Lh3及びLh4抗原で調製した抗血清は、いずれの遺伝子型のPre-S1に対しても良好に結合することから、これらのハイブリッド型のL抗原は、各種遺伝子型のPre-S1に良好に結合する抗体を産生させる抗原、すなわち、数種類以上の遺伝子型のHBVに対して免疫反応を生じさせることが出来ることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜実施例21＞
Lh1及びLh4抗原で得られた抗血清によるHBV感染中和活性
　実施例9で調製したLa、Lb、Lc及びLd抗原に対する抗血清、実施例17で調製したLh1抗原に対する抗血清、実施例20で調製したLh4抗原に対する抗血清及び正常マウスから調製した血清（陰性コントロール）の、HepG2-hNTCP-C4細胞(非特許文献2)を用いたHBV感染中和活性を観察した。
　上記する各抗血清を所定の培地にて500倍(但し、コントロール血清は50倍)に希釈し、これらに遺伝子型A又は遺伝子型CのHBV(1.8×104 genome equivalent)を加えたサンプルを調製した。これらのサンプルを、HepG2-hNTCP-C4細胞に添加し、16時間培養した後、培養液を除去して洗浄後、正常培地で更に12日間培養した。
　培養終了後に細胞からDNAを抽出し、HBV-DNAをRT-PCRで定量した。なお、RT-PCRでは、配列番号63及び配列番号64に示すプライマーを使用し、配列番号65に示すプローブを利用した。測定されたHBV-DNA量は、陰性コントロール血清で得られたHBV-DNA量に対する相対値で示した。その結果を表7（各種L抗原を投与して得られた抗血清のHBV感染中和実験の結果）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　La、Lb、Lc及びLd抗原を免疫して得た抗血清は、何れもHBV-DNA量が減少し、HBV感染に対する中和活性を示したが、その強さは遺伝子型AのHBVに対してはLa抗血清が最も強く、Lb抗血清が最も弱かった。他方、遺伝子型CのHBVに対してはLc抗血清が最も強くLd抗血清が最も弱かった。
　ハイブリット型抗原である、Lh1抗原(Lc及びLdタンパク質)及びLh4抗原(Lb、Lc及びLdタンパク質)に対する抗血清は、何れの遺伝子型のHBVに対しても強い中和活性を示した。以上の結果は、ハイブリット型抗原を免疫すると、数種類の遺伝子型のHBV感染に対し、同等に強い感染防御効果を示す抗体が産生されることを示す。以上の結果から、ハイブリッド型抗原は、数種類の遺伝子型のHBVに対するワクチンとして有用であることが確認された。
　＜実施例22＞
コア抗原の製造
　B型肝炎ウイルスのコア抗原(C抗原)遺伝子を accesion No: LC090200 のアミノ酸配列（配列番号66）を基に人工合成し、これをpET19b(Novagen)に挿入して、図34に示すC抗原発現ベクターpET19b-HBcAgを作製した。このベクターで大腸菌株BL21(DE3)pLysSを形質転換し、C抗原発現株を得た。これを培養して得られた菌体から、Palenzuela等の報告(Palenzuela PO et al, Biotecnologia Aplicada, 2002, 19: 138-142)と同様の方法でC抗原を精製した。
　上記する精製C抗原を電気泳動に供した後にCBB染色を行った結果、図35に示すように、分子量が約22kDaのモノマーと思われる位置と、ダイマーと思われるその倍の分子量の位置にバンドが認められた。ゼータサイザーを用いて動的光散乱法によって粒子径を測定した結果、38.2nm程度であり、作製したC抗原が粒子形成していることが分かった。
　＜実施例23＞
Lh抗原及びC抗原投与時の細胞性免疫
　実施例12で調製したLh1抗原及び実施例22で調製したC抗原を、各々単独で各5μgで又はそれらの両者の等量の混合物（各5μg)と、フロイントアジュバントとを混合した投与製剤を、ICR系統マウスに10日間隔で3回皮下投与により免疫した。最終投与の1週間後に、その脾臓細胞を採取し、定法に従ってこれを培養した。採取の翌日にLh1抗原、C抗原又はその混合物を終濃度10μg/mLで培養細胞を刺激し、刺激後4日目の培養上清中のインターフェロンγ(INFγ)量を、ELISA(Murine INFγ ELISA kit, Diaclone社)にて測定して細胞性免疫の活性化を検討した。脾臓細胞のINFγの放出能を確認するための陽性対照刺激としてコンカナバリンA(10μg/mL)の刺激も行った。その結果を図36に示す。
　Lh1抗原又はC抗原で免疫したマウスから得た脾臓細胞では、Lh1抗原で刺激してもINFγの放出は見られなったが、C抗原で刺激した場合とLh1抗原及びC抗原の混合物で刺激した場合とでは、INFγの放出が認められた。このINFγの放出量は、Lh1抗原で免疫した場合よりも、C抗原で免疫した方が多く、C抗原免疫による促進効果が認められた。Lh1抗原及びC抗原の混合物で免疫したマウスから得られた脾臓細胞は、Lh1抗原又はC抗原を単独で免疫した場合よりINFγの放出量が遥かに多く、これら2種の抗原を免疫した場合に、細胞性免疫の活性化の相乗効果が見られた。なお、混合免疫したマウスから得た脾臓細胞では、Lh1抗原を単独で刺激した場合もINFγの放出が認められた。これらの結果は、Lh1抗原の単独の免疫による細胞性免疫活性化能は低いが、C抗原の単独の免疫でも細胞性免疫を活性化し、これにLh1抗原を共存させると細胞性免疫が相乗的に活性化されることを示す。
　＜実施例24＞
Lh1抗原及びC抗原又はS抗原及びC抗原の混合物で免疫した場合の細胞性免疫の活性化
　Lh1抗原及びC抗原の混合物又はS抗原及びC抗原の混合物(各5μg)を実施例23と同様に、マウスに免疫し、脾臓細胞を採取し培養した。採取の翌日に培養細胞を各種抗原で刺激（終濃度10μg/ml）し、INFγの放出量を測定した結果を表8（Lh1抗原及びC抗原またはS抗原及びC抗原の混合物で免疫した場合の細胞性免疫の活性化）に示す。表8の各数値は、INFγの放出量（pg/ml）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　Lh1抗原及びC抗原で免疫したマウスから得た脾臓細胞は、全ての抗原による刺激において、刺激した抗原の遺伝子型には関係なく、S抗原及びC抗原で免疫したマウスから得た脾臓細胞よりもINFγの放出量が高くなった。以上の結果は、遺伝子型を問わずL1抗原とC抗原とで混合免疫すると、S抗原とC抗原とで混合免疫した場合より強く細胞性免疫を刺激し、また、刺激する抗原としてはS抗原よりL抗原の方が強く、L抗原の中ではLh1抗原が最も強いことを示す。

Claims (9)

  1. 　単一種類のHBs-L抗原タンパク質を含有するウイルス様粒子であって、前記HBs-L抗原タンパク質の遺伝子型がA、B、D、E、F、G、H、又はこれらの各遺伝子型の変異体の何れかであり、数種類以上の遺伝子型のHBVに対する免疫反応を生じさせるために用いられる、ウイルス様粒子。
  2. 　2種類以上のHBs-L抗原タンパク質を含有するウイルス様粒子であって、前記HBs-L抗原タンパク質の遺伝子型がA、B、C、D、E、F、G、H及びこれらの各遺伝子型の変異体からなる群より選択され、数種類の遺伝子型のHBVに対する免疫反応を生じさせるために用いられる、ウイルス様粒子。
  3. 　免疫反応が体液性免疫又は細胞性免疫である、請求項1又は2に記載する、ウイルス様粒子。
  4. 　HBs-L抗原タンパク質として、遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質又はその変異体のみを含有するウイルス様粒子と、請求項1に記載するウイルス様粒子とを含有する、ウイルス様粒子組成物。
  5. 　請求項1～3に記載するウイルス様粒子の少なくとも2種類以上を含有する、ウイルス様粒子組成物。
  6. 　HBs-L抗原タンパク質として、遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質又はその変異体のみを含有するウイルス様粒子と、請求項5に記載するウイルス様粒子組成物とを含有する、ウイルス様粒子組成物。
  7. 　遺伝子型AのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が配列番号1～9の何れかに示す配列、遺伝子型BのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が配列番号10～18の何れか示す配列、遺伝子型CのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が配列番号19～28の何れかに示す配列、遺伝子型DのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が配列番号29～38の何れかに示す配列、遺伝子型EのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が配列番号39～42の何れかに示す配列、遺伝子型FのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が配列番号43～47の何れかに示す配列、遺伝子型GのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が配列番号48～53の何れかに示す配列、遺伝子型HのHBs-L抗原タンパク質のアミノ酸配列が配列番号54～57の何れかに示す配列である、請求項1～6の何れかに記載する、ウイルス様粒子又はウイルス様粒子組成物。
  8. 　請求項1～7の何れかに記載するウイルス様粒子又はウイルス様粒子組成物と、HBVのコア抗原を含有するウイルス様粒子とを含有する、ウイルス様粒子組成物。
  9. 　請求項1～8の何れか1項に記載するウイルス様粒子又はウイルス様粒子組成物を含む、B型肝炎の治療用及び/又は予防用ワクチン。
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