JP2010516807A - Hbvワクチンおよびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1)HBVのpreSおよびS抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに導入する段階、
2)段階1)の発現ベクターを宿主細胞に形質導入する段階、および
3)前記形質導入された宿主細胞を培養して組み換えHBVの全体表面抗原(preS抗原およびS抗原)タンパク質を得る段階を含む。
4)HBVコア抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに導入する段階、
5)段階4)で製造された発現ベクターを宿主細胞に形質導入する段階、および
6)形質導入された宿主細胞を培養して組み換えHBVコアタンパク質を得る段階。
1.1.組み換え全体表面抗原(preSおよびS抗原;L−HBsAg)の製造
(1)−1 クローニング
HBVゲノムを含むベクター(HBV 315、Korean Biochem. J. 17:70-79, 1984)を鋳型として外皮遺伝子のコード領域(coding region)(preS1−preS2−S)およびポリアデニル化部位を含む3−UTR全体(配列番号1)をPCR法によって増幅して発現ベクターに導入した。この際、PCR反応は、Pfu DNAポリメラーゼを用いて行い、HBsAgのコード部位と3−UTR全体が増幅されるようにプライマーを製作した(前方プライマー:5−GGA AGA TCT CAA TCT CGG GAA−3(配列番号2)、後方プライマー:5−GGA AGA TCT CGA ATA GAA GGA AAG−3(配列番号3)、下線部分はBglII認識配列である)。約2.75kbpサイズのPCR産物を得てBglII酵素で線形化したpMSGベクター(韓国特許出願第10−2000−0043996号およびPCT/KR01/01285号参照)とリゲーション反応させた。このように製作したベクター(pMSG−L−HBsAg)の概要図を図1に示した。これをCHO細胞にトランスフェクションして形質転換体を得、全体表面抗原(L−HBsAg、配列番号4)の発現をウエスタンブロット法で比較して高発現率の高い形質転換体を選別した。選別された形質転換体をCHO DG44/L−HBsAg(J2.1)−G101と命名し、2006年12月28日付で韓国大田広域市魚隠洞に所在の韓国生命工学研究院生物資源センター(Korean Collection for Type Cultures)に寄託し、受託番号KCTC 11058BPを与えられた。
選別された細胞株をT−175フラスコに5×105個接種した。T−フラスコで付着して10%血清培地の条件で成長した細胞を0.25%トリプシンで取り外した後、1200rpmで5分間遠心分離して残留トリプシンを除去し、無タンパク質培地(HyQ SFM4CHO、Hyclone)に単一細胞でよく懸濁した。これを100mLの培養体積で250mLのスピナーフラスコに接種して37℃で80rpm速度で培養した。初期の細胞濃度を5×105cells/mLにして接種し、細胞成長が約1.5×106cells/mLに到達するとき、同じ初期濃度で連続継代培養することにより、浮遊培養に適応された細胞株を確保した。
MCB(Master Cell Bank)から継代培養して接種用細胞を準備した。この際、培養培地は無血清培地(HyQ SFM4CHO、Hyclone)を基本培地として250mLのスピナーフラスコに5×105cells/mLの濃度で接種した後、34℃で80rpmの速度で培養した。培養3日後、培養された細胞を1Lのスピナーフラスコで継代培養して細胞数を増やした後、これを7.5Lの生物培養器に接種してpH7.2、34℃および80rpmの攪拌速度で培養した。培養3日後、クエン酸とHyQ LS1000を添加して3日間さらに培養した。
生物培養器で培養された培養液を遠心分離して回収した後、0.45μmのフィルターを通過させて不純物を除去した。これを、平衡化させておいたフェニル−セファロースクロマトグラフィー(Phenyl-Sepharose chromatography)、DEAE−セファロースクロマトグラフィー(Sepharose chromatography)、セファロース4FFクロマトグラフィー(Sepharose 4 FF chromatography)を経て精製した。精製された全体表面抗原は、Sタンパク質、Mタンパク質およびLタンパク質から構成されており、糖化有無に応じて6つの組み換えタンパク質からなることを確認した(図2)。図2Aは精製された全体表面抗原のSDS−PAGE結果であり、図2Bは精製された表面抗原をそれぞれ抗−S抗体(レイン1)、抗−preS1抗体(レイン2)、および抗−preS2抗体(レイン3)でウエスタンブロックした図である。糖化有無は、糖鎖を除去することが可能な酵素N−グリコシダーゼFを用いてS抗原部分とMタンパク質のpresS2部分にN−糖化がなされたことを確認した(図3)。また、電子顕微鏡写真で精製されたL−HBsAgがウイルス様粒子の形態を成していることを確認した(図4)。
(1)クローニング
コア抗原のC末端にあるアルギニンクラスター(arginine cluster)を除いたアミノ酸配列1番〜149番を組み換えタンパク質(配列番号5)で発現した。前記タンパク質をコードする核酸配列を配列番号6で示した。HBVゲノムを含むベクター(HBV315)を鋳型として、この部分に該当する遺伝子をPCR法で増幅してpET11a(Novagen)ベクターの制限酵素NdeIおよびBamHI切断部位に挿入してpET11a−core発現ベクターを製作した。コア遺伝子のPCR増幅には、前方(forward)プライマー:5−CCC CAT ATG GAC ATT GAC CCG TA−3(配列番号7)と後方(reverse)プライマー:5−CGC GGA TCC AAC AAC AGT AGT TTC CGG−3(配列番号8)が使用された。pET11a−core発現ベクターをE.coli BL21(DE3)に形質転換して発現を確認し、高発現率の生産クローンを選別した。
生産菌株の最適の生産条件を5Lの発酵槽を用いて確立した。培地は2%バクトトリプトン、1%酵母エキス、2% NaCl、2%グルコース、1.33% KH2PO4、0.4%(NH4)2HPO4、0.17%クエン酸、0.12% MgSO4、0.01%チアミン−HCl、および0.0371%アンピシリンを使用し、11時間37℃で培養した後、0.05mM/g cellとなる条件でIPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)を添加した。IPTG添加の後、18時間誘導させてから細胞を収穫した。
細胞を収穫した後、溶解バッファ(50mM Tris−Cl pH7.6、150mM NaCl、5mM EDTA、10mM 2−メルカプトエタノール、0.2mM PMSF)で3回洗浄した後、溶媒バッファを入れてソニケーショを介して細胞を破砕した。遠心分離によって上澄液を収去した後、65℃で30分間加熱した後、さらに遠心分離して上澄液を分離し、30%硫酸アンモニウムを添加してコア抗原を沈殿させた。遠心分離の後、沈殿物を50mM Tris−Cl(pH7.6)に溶かした後、ブチルセファロースカラム(Butyl sepharose column)を介してコア抗原のみを純粋分離した。
本発明によって開発された組み換え全体表面抗原(L−HBsAg)が高い免疫原生を有しかつ優れた防御効果を誘導することを解明するために、公知の第2世代ワクチンと比較するために動物免疫実験を行った。
(1)目的:組み換えL−HBsAg抗原によって誘導される抗体価と免疫反応が誘導される時期を比較した。
(a)実験動物:6週齢C57BL/6雌マウス
(b)試験ワクチン
実施例1−1によって製造および精製された全体表面抗原(L−HBsAg)をミョウバンに吸着して試験ワクチンを製造した。比較群として、ハンセヌラポリモルファで生産された組み換えS抗原を含んだワクチン(Hepavax−Gene、緑十字ワクチン)、およびCHO細胞で発現したpreS抗原を含まない組み換えS抗原(Recombinant Hepatitis B Vaccine、中国Hualton社)を使用した。各試験ワクチンはドース(dose)当たり抗原0.5μgを使用した。
−免疫グループ
1.実験群1:ハンセヌラポリモルファで生産された組み換えS抗原(Hepavax−gene、緑十字ワクチン)
2.実験群2:CHO細胞で生産された組み換えS抗原(Recombinant Hepatitis B Vaccine、中国Hualton社)
3.実験群3:実施例1−1によって製造および精製されたCHO細胞で生産された組み換えL−HBsAg抗原
−投与方法:各試験ワクチンを2週間隔で3回筋肉注射した。
各試験ワクチンによって誘導された体液性免疫反応を分析するために、Diasorin kitを用いて抗体価をインターナショナルユニット(mIU/mL)で決定した。
本発明に係る組み換えL−HBsAgは、既存のワクチンに使用される組み換えS抗原より高い体液性免疫反応を誘導して高い抗体価を示した(図7)。すなわち、組み換えL−HBsAgは、既存の抗原に比べて免疫原性が高いことを確認した。また、ハンセヌラポリモルファで生産されたS抗原に比べて、抗体反応が先に現れるので、速い防御効果を誘導することができる。
(1)目的:実施例1−1によって製造および精製された組み換えL−HBsAg抗原の免疫原性を実験動物50%においてセロコンバージョン(sero-conversion)の起こるED50(Effective Dose 50)で比較した。
(a)実験動物:6週齢C57BL/6雌マウス。
実施例1−1によって製造および精製された全体表面抗原(L−HBsAg)をミョウバンに吸着して試験ワクチンを製造した。比較群として、酵母で生産された組み換えS抗原(Recombinant Hepatitis B Vaccine、中国Kangtai社)、およびCHO細胞で発現したpreS抗原を含まない組み換えS抗原(Recombinant Hepatitis B Vaccine、中国Hualton社)を使用した。
−免疫グループ:各実験群をさらに希釈された試験ワクチンに該当するように小グループに分け、各小グループ当たり10匹ずつの動物を用いて免疫した。
2.実験群2:比較群として実施例2−1で使用した、CHO細胞で生産された組み換えS抗原(Recombinant Hepatitis B Vaccine、中国Hualton社)(実験群2−1:0.156μg投与、実験群2−2:0.312μg投与、実験群2−3:0.625μg投与、実験群2−4:1.25μg投与、実験群2−5:2.5μg投与、実験群2−6:5μg投与)。
−投与方法:希釈された試験ワクチンを1回腹腔注射した。
各個体から誘導された体液性免疫反応は、Diasorin kitを用いて抗体価をインターナショナルユニット(mIU/mL)で決定し、決定された抗体が10mIU/mLの場合をセロコンバージョンの起こったものと定義した。各グループで免疫された個体の50%でセロコンバージョンを誘導することが可能な試験ワクチン量(ED50)を決定した。
実施例1−1によって製造および精製された組み換えL−HBsAsを使用したワクチンのED50が既存のワクチンと比較して最も低い値を示した。すなわち、本発明に係る組み換えL−HBsAgは既存の抗原より体液性免疫反応を効果的に誘導することができることを確認した(図8)。
3.1 免疫実験の条件および分析方法
(1)目的:本発明によって製造されたHBVワクチンの効能を確認するために、HBV全体表面抗原のみを含むワクチン(以下、「単一抗原ワクチン」という)またはHBV全体表面抗原とコア抗原を共に含むワクチン(以下、「複合抗原ワクチン」という)をマウスに免疫し、誘導された免疫反応を分析した。
(a)実験動物:6週齢のC57BL/6雌マウス
(b)試験ワクチン
−実施例1で製造および精製された組み換えコア抗原と組み換え全体表面抗原それぞれをミョウバンに吸着させて単一抗原ワクチンを製造し、複合抗原ワクチンはミョウバンに吸着された組み換えコア抗原と組み換え全体表面抗原とを混合して使用した。ドース当り各抗原0.5μgを使用した。
−免疫グループ
1.実験群1:PBS(Phosphate buffered saline)で免疫した陰性対照群(negative control)
2.実験群2:ミョウバンに吸着させた組み換え全体表面抗原
3.実験群3:ミョウバンに吸着させた組み換えコア抗原
4.実験群4:ミョウバンに吸着させた組み換え表面抗原と組み換えコア抗原(複合抗原ワクチン)
−投与方法:各試験ワクチンを2週間隔で3回にわたって筋肉注射した。
1)体液性免疫反応の分析
免疫前と免疫投与後2週目に血清を分離し、生成された抗体をELISA法で分析することにより、抗体価を決定した。抗体を分析するために、まず精製された各抗原を96wellマイクロプレートに100ng/wellの濃度でコートした後、Bovine Serum Albumin(1%)で1時間ブロッキングした。マイクロプレートを洗浄した後、各ウェルに順次希釈血清を入れて2時間37℃で反応させた後、2次抗体として抗−マウスIgG−HRPを入れて1時間同一の条件で反応させる。洗浄の後、発色試薬を入れて20分間常温で反応させた後、ELISAリーダーを用いて450nmでOD値を測定した。抗体価は、陰性対照群のOD値の3倍に相当するOD値で示す抗体希釈倍数の逆数で定義した。
最終免疫の後、マウスから脾臓(spleen)を摘出して全体脾細胞(splenocyte)を分離および培養し、インターフェロン−γを分泌する脾細胞をELISPOT法で測定して細胞性免疫反応を確認した。
組み換え全体表面抗原(L−HBsAg)と組み換えコア抗原とを混合した複合抗原ワクチンを投与した場合、組み換え全体表面抗原(L−HBsAg)を単独で使用した場合と比較して表面抗原に対する抗体形成が速く行われた(図9)。組み換えコア抗原を混合する場合、表面抗原に対する免疫反応を増加させる効果を示した。ところが、最終免疫後には、単一抗原ワクチンと複合抗原ワクチンが同じ抗体価を示した。
組み換え全体表面抗原(L−HBsAg)と組み換えコア抗原とを混合した複合抗原ワクチンを投与した場合、組み換え全体表面抗原(L−HBsAg)を単独で使用した場合、あるいは組み換えコア抗原を単独で免疫した場合と比較して高い細胞性免疫反応を示した(図10)。したがって、コア抗原を追加した場合より効率的に細胞性免疫反応を誘導することができた。したがって、細胞性免疫反応の誘導が必須的な治療ワクチンの場合、複合抗原ワクチンを使用することが適する。
4.1.コロイド金(Colloidal gold)の製造
Frens(Frens G, Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold solutions. Nature Phys. Sci. 241:20, 1973)によって開発されたクエン酸ナトリウム法(Sodium citrate procedure)を基本としてコロイド金を製造した。塩化金(Gold chloride:HAuCl43H2O)0.2gを10mLの蒸留水に溶かして2%の金ストック溶液(gold stock solution)を準備した。100mLの蒸留水を攪拌しながら加熱して沸かした。ここに2%の金ストック溶液1mLを入れて最終濃度0.02%の金溶液を作り、加熱と攪拌を約5分間持続した。10%クエン酸ナトリウム溶液を最終濃度が0.032〜0.036%となるように入れ、5〜10分間加熱と攪拌を持続した。この際、溶液は、初期には灰色を呈するが、益々紫色に変わり、1〜3分後には赤色を呈した。これを水浴に入れて冷やし、OD540とOD600-を測定した。OD540は粒子の数または金粒子の濃度を意味し、2〜4の値を示した。OD-600は粒子サイズ(particle size)または粒子の質(quality of particle)を意味し、0.55〜0.75の値を示した。製造されたコロイド金の粒子サイズは約10〜40nmであった。
製造されたコロイド金溶液に100mMの炭酸ソーダ一水和物(sodium carbonate monohydrate)(または別のバッファ)を添加して溶液をpHが7.5となるように滴定した後、コロイド金溶液を攪拌しながら溶液1mL(200μgのコロイド金を含む)当り20μgの牛血清アルブミン(Bovine Serum Albumin:BSA)または10μgのpreS抗原を添加した後、常温で15分間持続的に攪拌した。遠心分離の後、上澄液を除去し、滅菌したPBS(Phosphate Buffered Saline)バッファで3回洗浄し、吸着されていないBSAあるいはpreS抗原を除去した後、PBSに再び希釈して4℃に保管した。preSタンパク質がコートされたコロイド金コンジュゲートの電子顕微鏡写真を図11に示した(JEM1010、67.0k)。タンパク質の吸着度合いは、BSAまたはpreS抗原を吸着させた後、遠心分離し、上澄液に残っているタンパク質の量を定量して確認した。
5.1 免疫実験の条件および分析方法
(1)目的:アジュバントとして、コロイド金複合体の効能を確認するために、マウスに免疫し、誘導された免疫反応を分析した。
(a)実験動物:6週齢のC57BL/6雌マウス
(b)試験ワクチン
−試験ワクチンは、精製された組み換えコア抗原と組み換え全体表面抗原をミョウバンに吸着させて製造し、ドース当り各抗原0.5μgを使用した。また、ミョウバンに吸着されていない自由抗原0.5μgを200μgのコロイド金コンジュゲートと混合して使用した。
−免疫グループ
1.実験群1:PBS(Phosphate buffered saline)で免疫した陰性対照群
2.実験群2:ミョウバンに吸着した組み換え全体表面抗原と組み換えコア抗原で免疫
3.実験群3:ミョウバンに吸着していない組み換え全体表面抗原と組み換えコア抗原をコロイド金コンジュゲートと混合して免疫
−投与方法:各試験ワクチンを2週間隔で2回にわたって筋肉注射した。
1)体液性免疫反応の分析
実施例3で記述したように、ELISA法で体液性免疫反応を分析した。
2次免疫後2週以内に全てのマウスから脾臓を摘出して全体脾細胞を分離および培養し、細胞性免疫反応を確認した。それぞれのマウスから分離した脾臓を細胞ストレーナーに入れて破砕した後、RBC溶解バッファを用いて赤血球を完全に除去した後、脾細胞のみを純粋分離した。分離された脾細胞を完全培地(RPMI1640 mediumに1Xグルタミンと1X抗生物質を添加)で培養した。各抗原に特異的な免疫反応を観察するために、培養培地にコア抗原と全体表面抗原をそれぞれ1μg/mLの濃度で添加して抗原特異的免疫細胞のみを分化するように刺激した後、細胞から分泌されたサイトカイン(細胞性免疫反応の指標でインターフェロン−gを分析)をELISA方法で分析した(BD Biosciences)。
(1)体液性免疫反応に及ぶ影響
ワクチン抗原を投与した実験群(実験群2および3)は全て、ワクチンを与えていない陰性対照群(実験群1)と比較して、抗原特異的な抗体形成である抗−HBs抗原と抗−HBc抗体が誘導された。ところが、誘導された抗体は、ミョウバンをアジュバントとして使用した場合(実験群2)がコロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用した場合(実験群3)より高い抗体形成を示した(図12)。ミョウバンは、周知の如く、体液性免疫反応を強力に誘導することが可能なアジュバントであり、本特許で使用したコロイド金コンジュゲートも、体液性免疫反応を誘導することが可能な機能があることが確認された。ところが、治療ワクチン用アジュバントは細胞性免疫反応を誘導しなければならないので、2つのアジュバントによって誘導された細胞性免疫反応を比較した。
コロイド金コンジュゲートによって細胞性免疫反応が誘導されたかを確認するために、2次免疫の後、それぞれマウスから脾細胞を分離してコア抗原あるいは表面抗原特異的なインターフェロン−gの生産をELISA方法で確認した。ミョウバンをアジュバントとして使用した場合(実験群2)は、各抗原に対するインターフェロン−gの生産が、免疫していない対照群に比べて2.5倍増加したが、コロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用した場合にはこれよりさらに高かった(図13)。特に、表面抗原に特異的な細胞性免疫反応は、ミョウバンを使用したときより4倍さらに高かった。すなわち、B型肝炎ウイルス抗原に対する免疫反応がコロイド金コンジュゲートをアジュバントとして用いて免疫したとき、治療ワクチンに必要な細胞性免疫反応がよく誘導され、ウイルスの除去に必要なインターフェロン−gの生産が増加した。したがって、コロイド金コンジュゲートは、細胞性免疫反応を強力に誘導することができ、効果的な治療ワクチンの開発にアジュバントとして用いることができる。
6.1 免疫実験の条件および分析方法
(1)目的:体液性免疫反応と細胞性免疫反応を全て最大に誘導するために、治療ワクチンの組成を比較した。
(a)実験動物:6週齢のC57BL/6雌マウス
(b)試験ワクチン
−精製された組み換えコア抗原と組み換え全体表面抗原をミョウバンに吸着してドース当り各抗原0.5μgを使用した。また、ミョウバンに吸着された各抗原0.5μgと、BSAでコートされたコロイド金コンジュゲート200μgととを混合して免疫した。
−免疫グループ
1.実験群1:PBSで免疫した陰性対照群
2.実験群2:ミョウバンに吸着した組み換え全体表面抗原と組み換えコア抗原で免疫
3.実験群3:ミョウバンに吸着した組み換え全体表面抗原と組み換えコア抗原をコロイド金コンジュゲートと混合して免疫
−投与方法:各試験ワクチンを2週間隔で2回にわたって筋肉注射した。
試験ワクチンによって誘導された体液性免疫反応および細胞性免疫反応は、実施例3および5に提示された方法で分析した。
(1)体液性免疫反応に及ぶ影響
ワクチン抗原を投与した実験群(実験群2、3)は、ワクチンを与えていない陰性対照群(実験群1)と比較して抗原特異的な抗体形成が誘導された。この際、誘導された抗体は、ミョウバンに吸着された試験ワクチンのみを免疫した場合(実験群2)と、コロイド金コンジュゲートをアジュバントと混合して免疫した場合(実験群3)との間にはあまり大きい差異がなかった(図14)。すなわち、この実験結果、ミョウバンとコロイド金コンジュゲートを共に使用して体液性免疫反応を高めることができた。
コロイド金コンジュゲートが細胞性免疫反応を誘導したかを確認するために、2次免疫の後、各マウスから脾細胞を分離してインターフェロン−gの生産をELISA方法で確認した。
7.1 免疫実験の条件および分析方法
(1)目的:正常マウスで確立された治療ワクチンの組成を形質転換マウス(HBsAg/HLA−A2)を用いて治療ワクチンの効能を分析した。
(a)実験動物
6週齢のHBsAg/HLA−A2形質転換雌マウスを使用した(Loirat D et al HBsAg/HLA-A2 transgenic mice : a model for T cell tolerance to hepatitis B surface antigen in chronic hepatitis B virus infection International Immunology 15 : 1125-1136, 2003)。この動物モデルは、HBV表面抗原(HBsAg)遺伝子がトランスジェニックされて持続的に発現し、血液内に表面抗原からなるウイルス様粒子を分泌する。また、トランスジェニックされた表面抗原遺伝子を自体遺伝子として認識し、これに対する免疫反応を誘導せず免疫寛容状態を示す。したがって、このモデルはHBV感染状態でこれに対する十分な免疫反応を誘導することができないため、ウイルスを除去することができず、感染状態が持続される慢性肝炎患者と類似のモデルである。
精製された組み換えコア抗原と組み換え全体表面抗原をミョウバンに吸着させてワクチン抗原として使用し、治療ワクチン用アジュバントとして、BSAがコートされたコロイド金コンジュゲートを使用した。
−免疫グループ
1.実験群1:PBS(Phosphate buffered saline)を免疫した陰性対照群
2.実験群2:ミョウバンに吸着した組み換え全体表面抗原と組み換えコア抗原で免疫
3.実験群3:ミョウバンに吸着した組み換え全体表面抗原と組み換えコア抗原をコロイド金コンジュゲートと混合して免疫
−投与方法:各試験ワクチンを2週間隔で3回にわたって筋肉注射した。
免疫前と3次免疫後に血清を分離し、血清内の表面抗原(HBsAg)からなるウイルス様粒子の量をGenedia HBsAg ELISA kit 3.0(緑十字)を用いて分析した。
免疫前と3次免疫後に血清を分離し、抗原特異的な抗体の生成を実施例4に提示された方法によって分析した。また、誘導された抗体のサブタイプを決定してIgG2aとIgG1の比率を決定した。
実施例4に提示された方法で脾細胞を分離、培養することにより、細胞性免疫反応の指標であるインターフェロン−gが誘導されることをELISA法とELISPOT法で分析した。
マウスの肝から全体RNAを抽出して遺伝子の発現度合いをRT−PCR法によって分析した。Total RNAはRNeasy Mini kit(Qiagen)を用いて分離し、次のプライマーとOne−step RT−PCR kit(Qiagen)を用いて表面抗原遺伝子(配列番号9、10を使用)およびインターフェロン−g遺伝子(配列番号11、12を使用)の発現度合いを確認した。この際、β−actin遺伝子(配列番号13、14を使用)の発現度合いを陰性対照群として使用した。
S−(R) 5’−TTA AAT GTA TAC CCT AAG−3’(配列番号10)
INF−γ(F) 5’−AGC GGC TGA CTG AAC TCA GAT TGT AG−3’(配列番号11)
INF−γ(R) 5’−GTC ACA GTT TTC AGC TGT ATA GGG−3’(配列番号12)
β−actin(F) 5’−TCC TGT GGC ATC CAT GAA AC−3’(配列番号13)
β−actin(R) 5’−CTT CGT GAA CGC CAC GTG C−3’(配列番号14)
7.2 コロイド金コンジュゲートの治療ワクチン用アジュバント効能確認
1)免疫寛容の解消
使用された形質転換マウスモデルは、表面抗原遺伝子を自体遺伝子として認識し、これに対する免疫反応を誘導せず免疫寛容状態を示す。ここに治療ワクチンを投与した結果、表面抗原に対する免疫寛容を解消することにより、体液性免疫反応および細胞性免疫反応が誘導された。
免疫前と3次免疫後に分離した血清を用いて表面抗原に対する抗体生成の度合いを確認した。陰性対照群(実験群1)では、血液内に抗原の濃度が高く維持されるにも拘らず、表面抗原に対する抗体は全く現れなかった。ワクチン抗原が投与された場合(実験群2および実験群3)、表面抗原に対する免疫寛容が解消されて表面抗原に対する抗体が生成されたことを確認することができた。BSAがコートされたコロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用した場合(実験群3)、ミョウバンに吸着したワクチン抗原のみを免疫した場合(実験群2)に比べて、誘導された抗体がやや低かったが、あまり大きい差異はなかった(図16)。ところが、誘導された抗体のイソタイプ(isotype)を決定してIgG2aとIgG1間の比率を比較した結果、コロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用した実験群3が、ミョウバンのみを使用した実験群2に比べてさらに高かった(図17)。すなわち、コロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用すると、免疫反応がTh1側に誘導されることが分かった。
ウイルスを除去するためには、強い細胞性免疫反応が必須的であると知られている。したがって、治療ワクチンが免疫寛容を解消し、表面抗原に特異的な細胞性免疫反応を誘導することができるかを確認するために、免疫の後に脾細胞を分離して、細胞性免疫反応の指標であるインターフェロン−gの生成をELISPOT法とELISA法で比較した。正常マウスを使用した実施例5と同様に、遺伝子操作マウスを使用した動物免疫実験においても、コロイド金コンジュゲートをアジュバントとして用いた実験群3で高い細胞性免疫反応が誘導された(図18のAおよびB)。
免疫前と免疫後の血清を分離して、血液内の表面抗原(HBsAg)からなるウイルス様粒子の量を分析した。既に報告したように、陰性対照群では血液内のウイルス様粒子の量が約40%程度自然的に減少した。ところが、治療ワクチンを免疫した場合には、ウイルス様粒子の量が急激に減少した。また、ミョウバンに吸着したワクチン抗原のみを免疫した場合(実験群2)よりコロイド金コンジュゲートを共に免疫した場合(実験群3)、3次免疫の後に最も低いウイルス様粒子の量が観察された(図19)。ミョウバンに吸着したワクチン抗原のみを免疫した場合(実験群2)、一時的な抗原の減少を示したが、ウイルス感染細胞を除去するための細胞性免疫反応を誘導することができないので、ウイルスの完全な除去が難しいだろうと思われる。
B型肝炎ウイルスに感染した肝細胞からウイルスを除去するためには、インターフェロン−gを分泌し、細胞溶解活性(cytolytic activity)を持つ免疫細胞が肝に移動してウイルス遺伝子の転写を抑制し、あるいは感染細胞を直接破壊する過程が必要である。したがって、抗原特異的な細胞性免疫反応が実際マウスの肝でも起こるかを確認するために、マウスの肝から全体RNAを抽出してインターフェロン−g遺伝子の発現度合いをRT−PCR法で分析した。対照群(実験群1)と実験群2では、インターフェロン−g遺伝子の発現率が低かったが、コロイド金コンジュゲートを使用した実験群3ではインターフェロン−g遺伝子が約3〜4倍高く発現することを確認することができた(図20)。また、生成されたインターフェロン−gによって肝細胞内のウイルス遺伝子、すなわち表面抗原遺伝子の発現が抑制されるかを確認するために同一の方法で表現抗原遺伝子の発現を比較した。対照群(実験群1)およびミョウバンに吸着された抗原のみを免疫した実験群2では表面抗原遺伝子の発現が高く維持されたが、実験群3では表面抗原遺伝子の発現が抑制されることを確認することができた(図20)。
8.1 免疫実験の条件および分析方法
治療ワクチン用アジュバントとして、HBV表面抗原タンパク質の一部であるpreSタンパク質でコートされたコロイド金コンジュゲートを使用した。実験動物、免疫グループおよび分析方法などは実施例7と同一であった。
1)免疫寛容の解消
preSでコートされたコロイド金コンジュゲートを治療ワクチン用アジュバントとして使用した場合にも、BSAでコートされたコロイド金コンジュゲートを使用した実施例6と同様に免疫寛容が解消され、体液性免疫反応および細胞性免疫反応が誘導された。
免疫前と3次免疫後に分離した血清を用いて、表面抗原に対する抗体生成の度合いを確認した。陰性対照群(実験群1)では、血液内に抗原の濃度が高く維持されるにも拘らず、表面抗原に対する抗体は全く現れなかった。ワクチン抗原が投与された場合(実験群2および実験群3)、表面抗原に対する免疫寛容が解消されて表面抗原に対する抗体が生成されたことを確認することができた。BSAがコートされたコロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用した場合(実験群3)、ミョウバンに吸着したワクチン抗原のみを免疫した場合(実験群2)と比較したとき、誘導された抗体の量がやや低かったが、あまり大きい差異はなかった(図21)。ところが、誘導された抗体のイソタイプを決定してIgG2aとIgG1間の比率を比較した結果、コロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用した実験群3がミョウバンのみを使用した実験群2に比べてさらに高かった(図22)。すなわち、コロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用すると、免疫反応がTh1側に誘導されることが分かった。
ウイルスを除去するためには、強い細胞性免疫反応が必須的であると知られている。したがって、治療ワクチンが免疫寛容を解消し、表面抗原に特異的な細胞性免疫反応を誘導することができるかを確認するために、免疫後に脾細胞を分離して、細胞性免疫反応の指標であるインターフェロン−gの生成をELISPOT法とELISA法で比較した。正常マウスを使用した実施例5と同様に、遺伝子操作マウスを使用した動物免疫実験においても、コロイド金コンジュゲートをアジュバントとして使用した実験群3で高い細胞性免疫反応が誘導された(図23のAおよびB)。
免疫前と3次免疫後に血清を分離し、血液内の表面抗原(HBsAg)からなるウイルス様粒子の量を分析した。既に報告されたように、陰性対照群では血液内のウイルス様粒子の量が自然的に減少した。ところが、治療ワクチンを免疫した場合にはウイルス様粒子の量が急激に減少した。また、ミョウバンに吸着したワクチン抗原のみを免疫した場合(実験群2)よりコロイド金コンジュゲートを共に免疫した場合(実験群3)、3次免疫の後に最も低いウイルス様粒子の量が観察された(図24)。ミョウバンに吸着したワクチン抗原のみを免疫した場合(実験群2)、一時的な抗原の減少を示したが、細胞性免疫反応を誘導することができないので、ウイルスの完全な除去が難しいものと思われる。
Claims (29)
- B型肝炎ウイルス(HBV)の3種の表面タンパク質(Lタンパク質、Mタンパク質およびSタンパク質)から構成され、preS1およびpresSからなるpreS抗原が、S抗原間の結合によって形成される粒子の表面に位置した、HBVの組み換え全体表面抗原(L−HBsAg)およびHBVのコア抗原を含むHBVワクチン。
- HBVのコア抗原はHBVのコア抗原をコードするヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターを大腸菌に形質転換して培養することにより得られることを特徴とする、請求項1に記載のHBVワクチン。
- HBVのコア抗原をコードするヌクレオチドは配列番号6の塩基配列を有することを特徴とする、請求項2に記載のHBVワクチン。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のワクチンと免疫補助剤を含む、HBVワクチン組成物。
- 免疫補助剤がミョウバン(alum)、コロイド金、またはこれらの両方ともであることを特徴とする、請求項4に記載のHBVワクチン組成物。
- 免疫補助剤がミョウバンおよびコロイド金を全て含むことを特徴とする、請求項4に記載のHBVワクチン組成物。
- ワクチンが治療用ワクチンであることを特徴とする、請求項6に記載のHBVワクチン組成物。
- HBVの全体外皮遺伝子のコード領域およびポリアデニル化部位を含んだ3’−UTR全体ヌクレオチドをpSGMベクター(受託番号KCCM10202)に挿入することにより製造される、HBVの3種の表面タンパク質(Lタンパク質、Mタンパク質およびSタンパク質)を同時発現する組み換え発現ベクター。
- HBVの全体外皮遺伝子のコード領域およびポリアデニル化部位を含んだ3’−UTR全体ヌクレオチドは配列番号1の塩基配列を有することを特徴とする、請求項8に記載の組み換え発現ベクター。
- 請求項8の組み換え発現ベクターで形質導入された細胞。
- 受託番号KCTC 11058BPであることを特徴とする、請求項10に記載の形質導入細胞。
- 下記段階を含むHBVワクチンの製造方法:
1)HBVの全体外皮遺伝子のコード領域およびポリアデニル化部位を含んだ3’−UTR全体ヌクレオチドをpMSGベクター(受託番号KCCM 10202ベクター)に導入する段階、
2)段階1)で製造された発現ベクターを動物細胞に形質導入する段階、および
3)形質導入された動物細胞を培養して組み換え全体表面抗原(L−HBsAg)タンパク質を得る段階。 - 段階1)のポリヌクレオチドは配列番号1の塩基配列を有することを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記動物細胞がCHO細胞であることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 段階3)の形質導入された動物細胞が受託番号KCTC 11058BPの形質転換体であることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 4)得られた全体表面抗原タンパク質を免疫補助剤と混合する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 免疫補助剤がミョウバン、コロイド金、またはこれらの両方ともであることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 下記段階をさらに含むことを特徴とする、請求項12に記載の方法:
4)HBVコア抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに導入する段階、
5)段階4)で製造された発現ベクターを宿主細胞に形質導入する段階、および
6)形質導入された宿主細胞を培養して組み換えHBVコアタンパク質を得る段階。 - 段階6)で得たHBVコア抗原タンパク質を、段階3)で得たHBV全体表面抗原タンパク質と混合する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項18に記載のHBVワクチンの製造方法。
- 段階4)のポリヌクレオチドは配列番号5のアミノ酸配列を有するHBVのコア抗原を暗号化するポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 段階4)の宿主細胞が原核細胞であることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 前記原核細胞がE.coliであることを特徴とする、請求項21に記載の方法。
- 混合した抗原タンパク質を免疫補助剤と混合する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- 免疫補助剤がミョウバン、コロイド金、またはこれらの両方ともであることを特徴とする、請求項23に記載の方法。
- 請求項10または11の細胞を培養する段階を含む、Lタンパク質、Mタンパク質およびSタンパク質からなる組み換えHBV全体表面抗原を製造する方法。
- 請求項25の方法で製造された組み換えHBV全体表面抗原と組み換えHBVコア抗原とを混合する段階を含む、HBVワクチンの製造方法。
- 前記Lタンパク質、Mタンパク質およびSタンパク質は一つの発現ベクターから同時に発現することを特徴とする、請求項1に記載のHBVワクチン。
- 前記発現ベクターは、HBVの全体外皮遺伝子のコード領域およびポリアデニル化部位を含んだ3’−UTR全体ヌクレオチドをpMSGベクター(受託番号KCCM 10202)に挿入することにより製造される、請求項27に記載のHBVワクチン。
- HBVの全体外皮遺伝子のコード領域およびポリアデニル化部位を含んだ3’−UTR全体ヌクレオチドは配列番号1の塩基配列を有することを特徴とする、請求項28に記載のHBVワクチン。
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