KR101635829B1 - B형 간염 바이러스 표면 단백질 프리 s 유래 펩타이드 및 이의 항 b형 간염 바이러스 용도 - Google Patents

Abstract

B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus)의 끝이 잘린 preS1 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 HBV 유전자 및 그 용도가 제시되어 있다.
본 발명의 끝이 잘린 pre S1 단백질은 HBV 복제를 저해하므로, B형 간염 바이러스를 타겟으로 하는 HBV 감염 치료용 후보 물질을 스크리닝하는데 유용하며, 기타 HBV 바이리온 형성 및 복제와 관련된 간질환의 악화 유도 기전의 연구에도 사용될 수 있다.

Description

B형 간염 바이러스 표면 단백질 프리 S 유래 펩타이드 및 이의 항 B형 간염 바이러스 용도 {SURFACE PROTEIN PRE S PEPTIDES OF HBV AND THEIR USE AS ANTI-HBV}

본 발명은 B형 간염 바이러스 표면 단백질 pre S 유래 펩타이드 및 이의 항 HBV 용도에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV)는 만성 B형 간염을 유발하는 간 친화성 DNA 바이러스이다. 전 세계적으로 4억 명의 사람들이 만성 B형 간염으로 고통 받고 있으며, 이는 간경변과 간세포암(HCC)으로 진행될 수 있다. 그래서, HBV 감염을 효과적으로 조절하는 것은 만성 B형 간염 관리에서 중요한 문제이다.

최근, B형 간염 환자 치료를 위해 lamivudine(LMV), adefovir(ADV), entecavir(ETV), telmivudine(LdT), tenofovir(TDF)를 포함하는 몇 개의 뉴클레오사이드(또는 뉴클레오타이드) 유사체들이 승인받았다. 이러한 약물들은 바이러스 복제를 억제하고, 간 질환의 완화를 도와주며, 간염이 간경변과 HCC로 진행되는 것을 억제한다. 최초로 승인받은 항-HBV 약물인 LMV는 초기 치료 시 좋은 경과를 보여주었으나 치료 시작 후 5년 동안 유전자 저항성이 70%까지 증가하였다. ADV는 여전히 전 세계적으로 사용되고 있는데, 이는 야생형(wild-type)과 LMV-저항성 HBV 돌연변이 치료에 대해 효과적이다. 그러므로, LMV-저항성 HBV 보유 만성 B형 간염 환자에서는 ADV 단독 또는 ADV-LMV 병용 치료가 효과적인 것으로 알려져 있다. 그러나, 치료받지 않은 환자와 비교하였을 때, LMV-저항성 만성 B형 간염 환자에 ADV 단독 투여 시 종종 ADV-저항성이 나타난다. 그래서, LMV-저항성 HBV에는 ADV와 LMV 병용 치료가 추천된다. 최근 연구에서, ETV가 LMV-저항성, ADV-저항성 HBV를 치료하는 데 효과적인 것으로 나타났다.

몇 가지 돌연변이 유발 약제 저항성 가운데, 단일 rtA181T 돌연변이는 약물에 대한 유전적 장벽을 제거하거나 감소시킴으로써 다중 내성을 유발한다. 이 돌연변이는 LMV, ADV, clevudine(CLV) 또는 LdT 치료 중인 환자에게서 발견된다고 보고된 바 있다. 2012 EASL 지침에 따르면, rtA181T 돌연변이는 HBV에 대하여 LMV, ADV, LdT 저항성을 유발한다. 돌연변이는 중간체를 생성하거나, TDF에 대한 감수성을 감소시키며 돌연변이 종은 오직 ETV에만 감수성이 있다. 본 결과는 시험관 내 표현형 연구에 의해 밝혀졌다.

중합효소와 표면 단백질을 코딩하는 개방형 해독틀(open reading frame)의 중첩하는 성질 때문에, 중합효소의 rtA181T 뉴클레오타이드 기질은 표면 단백질을 코딩하는 mRNA에서 sW172*(정지 코돈) 또는 sW172S 같은 미스센스 돌연변이를 나타낸다. 매우 최근에, 만성 B형 간염 환자에서 검출된 ADV-저항성 HBV 변종의 서열 동학(dynamics)은 소수 바이러스 변종의 수를 밝히기 위해 ultra-deep pyrosequencing 기술을 사용하여 분석되었다. 비록 ADV-저항성 변종들의 동학(dynamics)이 매우 복잡할지라도 치료 중간에 rtA181T 기질이 sW172* 기질(다른 missense 돌연변이와 비교하여 80-90%의 변종)과 매우 연관되어 있음을 밝혀내었다.

반면에, ADV 저항성에 대한 I233V 돌연변이의 영향은 논쟁이 되고 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus)의 끝이 잘린(truncated) preS1 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 HBV의 합성과 증식을 유도할 있는 끝이 잘린(truncated) pre S1을 가지는 B형 간염 바이러스 유전체 및 그 용도를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus) preS1 단백질 절편 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 끝이 잘린 preS1 단백질은 서열번호 2에 기재된 아미노산으로 이루어진 것이 바람직하나 서열번호 2에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 및 전좌를 유발하여 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 보호범위에 포함된다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스 복제 저해용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 HBV 유전자는 서열번호 1에 기재된 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나, 서열번호 1에 기재된 유전자에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 및 전좌를 유발하여 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 보호범위에 포함된다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 하는 B형 간염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 유전자를 포함하는 벡터를 유효성분으로 하는 B형 간염 바이러스 복제 저해용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 단백질 또는 벡터를 포함하는 B 형 간염 예방 및/또는 치료하는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는, 해당 조성물은 상기에서 기재한 본 발명의 펩타이드를 발현하는 재조합 백신 플라스미드, 및 재조합 조제 플라스미드, 및 제약상 허용할 수 벡터를 포함한다.

본 발명에서 'pre S1 단백질'은 HBV DNA의 S, C, X, P의 4개의 유전자 중, 하나인 S 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이며 구체적으로는 S 유전자는 표면 항원을 코딩(encode)하는 유전자로 앞쪽에 Pre-S 영역이 존재하며 이는 Pre S1 영역과 Pre S2 영역으로 나뉘어 있으며, 이들에 의하여 각각 표면 단백의 S 단백질, Pre S1 단백질, Pre S2 단백질을 코딩되는 단백질 중에 하나가 Pre S1 단백질이며,

본 발명에서 'pre S1 단백질 절편'은 표면 단백질인 S1과 S2를 모두 포함하고 S 단백질의 172번째 아미노산이 트립토판에서 종결코돈(stop codon)으로 돌연변이된 단백질 절편(전체 334 아미노산으로 구성됨)을 의미한다.

본 발명의 조성물은 당업계에서 널리 사용되는 바와 같은 약제학적 담체 또는 부형제와 함께 사용될 수 있다.

상기 조성물은 인체 또는 수의용으로 제형화되어. 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경구,복강, 정맥, 근육, 피하, 피내 등의 경로로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 주사제로 제형화하여 투여하는 것이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고,변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트퓸, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등),유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적 유효량으로 투여한다. 용어 "약제학적 유효량"이란 본 발명의 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 항원에 따라 달라지며, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능하다.

간염의 치료를 위한 본 발명의 유효성분의 단백질의 유효량은 1회 분량당 0.005, 0.01, 0.02,0.025, 0.05, 0.075, 0.1mg정도로 적은 양이 되기도 하고 1회 분량당 0.15, 0.5, 0.57, 0.6, 0.7, 0.8, 1.0,1.25, 1.5, 2.0mg정도로 많은 양이 되기도 한다. 투약은 하루에 한 번, 2일, 3일, 4일, 7일, 14일 또는 21일에 한 번으로 이루어질 수 있다. 간염을 치료하는데 투여되는 단백질의 양은 그들의 활성도에 기초한다.

이하 본 발명을 설명한다.

만성 B형 간염 환자에 대한 항바이러스 치료에서 중요한 문제는 약물 내성 HBV의 출현이다. 본 발명에서, 약물-내성 돌연변이의 진화와 바이러스 복제 및 약제 내성에 있어서 rtA181T와 rtI233V 돌연변이의 영향을 분석하였다.항바이러스제 처리 후 바이러스 돌파구(breakthrough) 도중에 혈청 시료로부터 HBV 중합효소 유전자의 복제 분석을 수행하였다. rtA181T 그리고/또는 rtI233V 돌연변이를 포함하는 일련의 돌연변이 복제가 수행되었으며, 이러한 돌연변이의 복제 능력과 약물 내성에 대한 효과를 결론지었다.

시험관 내 실험 결과, 바이러스 복제와 약물 내성에 있어서 rtA181T 돌연변이의 효과는 중첩 유전자에서의 돌연변이에 의존한다. rtA181T 표면 미스센스 돌연변이(rtA181T/sW172S)와 비교하였을 때, rtA181T 표면 넌센스 돌연변이(rtA181T/sW172*)는 바이러스 복제를 감소시키고, 약물 내성을 증가시켰다. 상보성 검사 결과 끝을 자른(truncated) PreS1이 rtA181T/sW172* 돌연변이의 복제 감소에 책임이 있다는 것을 밝혀내었다. 더욱이, rtA181T/sW172* 돌연변이는 바이러스성 분자 분비에서 결함을 보였다. adefovir(ADV) 치료 도중 생기는 rtI233V 돌연변이는 바이러스의 복제를 감소시키고, 또한 ADV에 대한 내성도 감소시킨다.

본 발명의 자료는 복제와 약물 저항성에 있어서 rtA181T 돌연변이의 효과가 상응하는 표면 유전자의 돌연변이 상태에 기반하여 서로 다르다는 것을 시사한다. rtI233V 돌연변이 또한 복제 능력과 약물 저항성에 영향을 미친다. 만약 임상 균주가 rtA181T 돌연변이를 유발한다면 항바이러스제 저항성을 조절하기 위하여 중첩 표면 유전자의 유전자형 분석이 필요하다.

만성 B형 간염 환자에서 연속적인 항바이러스 치료 도중 분리된 HBV 중합효소 RT 의 시퀀스 분석

도 1에 환자의 임상적 특징이 나타나 있다. 표시된 항바이러스 치료 도중 치료 전과 바이러스성 돌파구 시기에 환자로부터 5개의 연속된 혈청 시료를 채취하였다. 혈청 HBV DNA를 정제하였고, 환자로부터 채취한 RT 유전자가 HBV 1.2mer replicons로 전환되었다. 각 혈청 당 약 10개의 클론을 얻었으며, 모든 클론들의 서열을 분석하였으며, HBV RT 도메인의 완전한 서열 데이터는 표 1에 요약하였다. 전술한 바와 같이, RT 도메인 서열과 WT 유전형 C 서열을 비교함으로써 아미노산 기질을 결정하였다. 기준선에서, 어떠한 항바이러스제도 사용되지 않았을 때, rtI233V 돌연변이가 우세하게 탐지되었다. 흥미로운 것은 rtI233V 클론의 대부분은 같은 HBV 게놈에서 rtV191I를 번식(harbor)시켰다는 것이다. 중첩 표면 유전자의 rtV191I에서와 상응하는 변화는 sW182*(정지 코돈을 나타낸다)이다. 그래서, 기준선에서 우성 HBV 클론은 rtV191I/sW182*+rtI233V 돌연변이이다.

LMV 치료 도중의 바이러스성 돌파구에서, 3개의 보존된(conserved) 돌연변이(L801, L199V, 그리고 M204I)가 우세하게 탐지되었고, 같은 게놈으로 들어갔다.(clone #22 series) 클론 분석에 의해 rtH55R+I233V+N236T를 포함하는 돌연변이가 나타났고, ADV 치료 실패의 기간 동안 우세하게 선택되었다는 것을 밝혀내었다.(# 10 series) LMV 치료 도중에 사라졌던 rtI233V의 재출현은 rtN236T를 번식시키는 HBV 돌연변이에 대한 ADV 저항성에 있어서 rtI233V가 어떤 유용한 역할을 함을 시사한다.

LMV와 ADV 병용 치료 후에 가장 눈에 띄는 돌연변이 등장은 rtA181T 돌연변이고, 이는 이 돌연변이가 전술한 두 가지 약물에 대해 다중-내성을 나타냄을 시사한다. 클론 분석으로 대부분의 rtA181T 돌연변이 대부분에서, 이러한 돌연변이가 ADV 또는 LAM+ADV 돌파구 이후에 rtN233V와 rtN236T을 같은 HBV 게놈에 같이 국소화(co-localize)함을 밝혀내었다.(표 1)

HBV 표면 유전자 서열이 중합효소의 그것과 중첩되기 때문에, 표면 유전자에서 rtA181T 돌연변이와 관련하여 상응하는 변화를 분석하였다. LMV와 ADV 치료의 초기에, rtA181T/sW172*로의 표면 유전자 돌연변이가 우세하게 선택되었다; 그러나 대부분의 클론들은 병용 치료의 후기에 환자 혈청에서 바이러스 역가의 작은 상승을 보이며 rtA181T/sW172S로 발달하였다. 이러한 자료는 LMV와 ADV 치료로 유도된 선택 압력(pressure) 하에서 rtA181T/sW172S 돌연변이의 복제 능력이 rtA181T/sW172* 돌연변이보다 뛰어나다는 것을 시사한다.

종합하면, HBV RT 도메인 서열 발달 연구가 rtI233V가 ADV 저항성과 연관되어 있단 것을 밝혔으며, 복제와 약제 저항성에 있어서 rtA181T의 역할이 중첩 표면 유전자에서의 상응하는 돌연변이와는 다를 수도 있다는 것을 밝혔다.

연속적 항바이러스 치료 도중에 얻어진 RT 돌연변이의 시험관 내 약물 감수성

연속적으로 출현하는 클론의 표현형이 임상적 정보와 일치하는지 여부를 분석하기 위해, 표시된 바이러스성 돌파구의 각 시점에서 얻어지는 대표 클론을 사용하여 시험관 내 약물 감수성 어세이를 수행하였다.

기준선(baseline)에서 얻어진 클론의 복제 능력은 WT(NCBI No, GQ872210)와 크게 다르지는 않았으며, 그러한 클론들은 RT 도메인에서 몇 가지 substitution을 가지고 있었다.(도 1b) LMV 치료 후 복제는 WT 수준으로 감소하였고, 이는 이러한 substitution이 LMV LMV 저항성과 연관되어 있지 않다는 것을 보여준다. 눈에 띄는 것은, rtI233V를 하버링하는 돌연변이는 LMV 치료에 감수성을 보인다는 것이다. 이러한 결과는 기준선에서 얻어진 준종(quasispecies)에서 돌연변이가 LMV 저항성에 아무런 역할도 하지 못함을 시사한다.

LMV 치료 도중의 바이러스성 돌파구 후의 혈청 시료에서 얻은 Series 22 클론들은 WT에서보다 복제 수준이 최고 80%까지 감소되었다.(도. 1c) 예상한 대로, rtL80I+M204I 돌연변이는 전술한 바와 같이 LMV에 저항성을 나타낸다. 이러한 돌연변이 클론은 최소 약물 치료 압박에서 낮은 복제 능력을 나타내는 전형적인 약물-저항성 유형을 보여 준다.

ADV 저항성 도중 얻어진 모든 클론은 rtI233V+N236T 돌연변이를 하버링하며, 들은 전 보고서와 일관되게 ADV에 저항성을 보였다.(도 1d)

눈에 띄게, 클론 10-16의 복제 능력은 클론 10-12와 비교하였을 때 극단적으로 낮았다. 더욱이, 클론 10-16은 ADV에 더 저항성을 보였다.(도 1d) 이 두 클론 사이의 돌연변이 프로필에서 유일한 차이점은 rtA181T 돌연변이의 출현 여부이다.(표 1) 이러한 결과는 rtA181T 돌연변이가 복제 능력의 감소와 ADV 저항성 강화에 책임이 있다는 것을 시사한다.

클론 #13과 #51은 LMV와 ADV 병용 치료 도중에 얻어졌다.(도 2a, b) 비록 모든 클론이 LMV-저항성 돌연변이(rtL80I와 rtM204I)를 잃었다고 하더라도, rtA181T 돌연변이는 같은 HBV 게놈에 rtA181T+I233V+N236T를 하버링하는 대부분의 클론에 처음부터 있었다.(표 1) 서던 블랏 분석은 rtI233V 돌연변이가 극적으로 바이러스 복제를 감소시킴을 보여주었다.(도 2a의 clone13-13과 13-19) 그러나, rtA181T+N236T 돌연변이에서 rtI233V 돌연변이의 출현은 LMV 또는 ADV 저항성에 영향을 미치지 않는다.(도 2a) 약물 적응성 어쎄이는 이러한 클론들이 LMV에 대해서는 부분적 저항성을, ADV에 대해서는 완전한 적응성을 나타냄을 밝혀내었다.(도 2a, b)

도 2a에서 보듯이, rtI233V 돌연변이는 바이러스 복제를 감소시킨다. 유사하게, 도 1d에서 보듯이 rtA181T 돌연변이는 유전자 복제를 감소시키는 데 책임이 있는 것처럼 보인다. 그러나, 도 2c에서 요약했듯이 rtA181T 돌연변이를 하버링하는 임상적 분리물은 rtI233V와 관계없이 상대적으로 높은 복제 능력을 보였다.(약 WT 70%) 예상 외로, rtA181T와 rtI233V 양자를 하버링하는 클론 51-14의 복제 능력은 WT나 rtI233V 돌연변이를 포함하지 않는 클론 13-19 클론의 복제능력과 크게 다르지 않았다. 이러한 어떤 불일치하는 결과는 rtA181T와 rtI233V 돌연변이의 감소 효과가 미정의 기전 또는 팩터의 결과일 수 있음을 나타낸다.

종합적으로 보건대, 이러한 결과는 바이러스 복제와 약물 저항성에 대한 rtA181T와 rtNI233V 돌연변이의 효과가 규명되지 않은 기작에 의해 조절되고 있음을 시사한다.

임상학적으로 분리된 rtA181T 과 rtI233V 돌연변이의 HBV 복제와 약제 내성에 대한 효과

먼저, 우리는 세포질의 클론 13-13의 복제능력의 감소가 강화된 바이리온 분비 때문인지 여부를 조사하였다. 도 3a에서 보듯이, 클론 13-13은 바이리온과 벗겨진 캡시드의 분비 결함을 보여주었다. 흥미롭게도, 클론 13-13 표면 항체(HBsAgs)와 WT, 역시 rtA181T 돌연변이를 하버링하는 클론 13-19의 웨스턴 블랏 분석의 비교는 완전히 다른 밴드 패턴을 보였다. 이전 연구에서 보듯이, WT HBV는 얼터너티브 단백질 글리코실화 때문에 6개의 밴드와 함께 3개의 HBsAgs를 발현한다. 그러나, 클론 13-13은 온전한 작은 HBsAg보다도 작은 분자량에 상응하는 오직 하나의 밴드만 보였는데, 이는 끝이 잘린 HBsAGs(도 3)의 발현을 시사한다. 이를 확실히 하기 위해, 우리는 뉴클레오타이드 서열을 비교하였고, 중합효소에서의 rtA181T 돌연변이가 표면 유전자에서 상응하는 두 가지 돌연변이, sW172* 또는 sW172S와 연관이 있다는 사실을 알아내었다.(도 3b) HBV rtA181T/sW172* 돌연변이(클론 13-13)는 복제를 감소시키고 분비 결함을 나타내는데 반해 A181T/sW172S 돌연변이(클론 13-19)는 그렇지 않다.(도 3a) 두 개의 돌연변이로부터 발현되는 중합 효소 단백질은 rtI233V 돌연변이에 의해 코딩되는 부위를 제외하고는 똑같다. 그래서, 우리는 감소된 복제가 이 특정한 부위에서의 표면 정지 코돈의 결과물인지 아닌지 의문이 들었다. 이에 답하기 위해, 우리는 이 발명에서 얻어진 42개의 임상적으로 분리된 것의 서열을 분석하였고, 또 다른 위치에서 표면 유전자 내의 넌센스 돌연변이를 하버링하는 일부 돌연변이, rtA181T/sW172S 돌연변이를 찾아내었다.

이러한 돌연변이를 가지고, 우리는 WT와 비교하여 각 클론의 상대적 복제 능력을 결정하였다.(도 4a) 놀랍게도, rtV191I/sW172*와 연관된 모든 돌연변이(클론 13-11, 13-13, 13-17, 13-18)는 복제 결함을 보였고, 반면에 rtV191I/sW182* 또는 rtA181T/sw172S와 관련된 돌연변이는 상대적으로 높은 복제 수준을 보였다. 다른 위치에서 표면 정지 코돈을 하버링하는 HBV 돌연변이인 rtV191I/sW182*는 강화된 복제능력을 가졌다. 이러한 클론에서 복제에 대한 rtI233V 돌연변이의 효과는 중요하지 않은 것 같다. 모든 돌연변이는 ADV에 저항성을 보였다.(도 4c)

웨스턴 블랏 분석은 표면 정지 코돈을 하버링하는 모든 돌연변이들이 끝이 잘린 HBsAgs 단백질을 발현한다는 것을 밝혀내었다. 끝이 잘려진 HBsAgs 단백질의 탐지 수준은 아마도 단백질 안정성 또는 항원성에서 돌연변이-유발 변화 때문에 다양한 것 같다.(도 4b) 트랜스팩션 효율은 HBeAg ELISA에 의해 확인되었고, 모든 클론들은 HBeAg의 비슷한 수준을 보였다.(도시 안함)

총괄적으로, 이러한 데이터는 바이러스 복제에 있어서 rtA181T의 효과가 중첩 표면 유전자에서의 돌연변이에 의존한다는 것을 시사하며, 또한 rt181 위치에서 표면 정지 코돈을 하버링하는 임상적 분리물이 유전적 복제를 크게 감소시키고 분비 결함을 야기한다는 것을 시사한다.

HBV 복제와 약제 내성에 있어서 rtA181T 와/또는 rtI233V 를 포함하는 인공적 돌연변이의 효과

우리는 rtA181T/sW172*와 I233V 돌연변이를 하버링하는 임상적 분리 돌연변이들은 복제 감소를 나타냄을 주장하였다. 유전적 복제와 약제 내성에 대한 rtA181T/sW172*, rtA181T/sW172S, 및 rtI233V를 포함하는 점 돌연변이의 효과를 조사하기 위해, 우리는 WT HBV 주형을 사용하여 몇 가지 인공 돌연변이를 만들었다.(도 5a) rt181 위치에서 ADV 저항성을 나타낸다고 알려져 있는 또 다른 돌연변이, rtA181V/sL173P가 비교를 위해 사용되었다.

도 5a와 c에서 보듯이, rtI233V 돌연변이는 단독으로 유전적 복제를 감소시키거나 rtA181T와 함께 유전적 복제를 감소시켰다.(lane 2 vs.3, lane4 vs .9, 그리고 lane5 vs .10) rtA181T/sW172S 돌연변이의 복제 능력은 WT와 비슷한 반면 rtA181T/sW172* 돌연변이의 복제 능력은 WT의 약 절반정도 되는데, 이는 rtA181T 돌연변이의 약화된 복제가 표면 절단의 결과임을 나타낸다. HBsAg 발현과 분비 프로필은 돌연변이 HBsAgs 돌연변이의 가능한 항원성의 차이를 피하기 위해 다른 항체와 ELISA에 의해 결정된다.(도 5a) 끝이 잘린 HBsAg의 발현과 돌연변이 HBsAg의 상대적 수준은 웨스턴 블랏과 ELISA에 의해 확인되었다. 각 돌연변이의 유사한 트랜스팩션 효율 역시 HBeAg ELISA에 의해 확인되었다.(도시 안함) ADV 저항성에 대한 rtA181T와 I233V 돌연변이의 효과를 시험하기 위해, 우리는 약물 적응성 검사를 수행하였고,(도 5b) 결과는 도 5c에 요약되어 있다. 결과는 ADV 치료 도중 나타난 rtI233V 돌연변이가 바이러스 복제를 감소시키고, ADV에 저항성을 나타냄을 나타내었다. 가장 중요한 것은 LAM+ADV 치료 도중에 우세하게 나타나는 rtA181T/sW172*+I233V 돌연변이(도 1)가 가장 높은 ADV 저항성과 함께 가장 낮은 복제 수준을 보인다는 것이다. (도 5c)

비록 돌연변이 pgRNA가 같은 아미노산 서열의 중합효소를 생산한다고 하더라도, rtA181T/sW172* 및 rtA181T/sW172S 돌연변이 사이의 복제에서의 눈에 보이는 차이는 뉴클레오타이드 수준(예를 들어, pgRNA의 cis 효과)에 의해 도출될 가능성이 있다. 이를 명확히 하기 위해서 우리는 중합효소-null HBV (HBV 1.2 Pol(-))의 코-트랜스팩션 후에 CMV-driven WT와 돌연변이 중합효소를 가지고 보충 실험을 하였다. 먼저, 우리는 WT와 rtA181T 돌연변이 사이에 바이러스성 RNA의 전사 수준이 변하지 않는 것을 발견하였다.(도 5d) 추가로, HBV1.2 Pol(-)의 복제에 있어서 CMV-driven WT와 돌연변이 중합효소는 유사한 중합효소 활성을 도출한다.(도 5e) 이러한 데이터는 pgRNA에서의 cis 효과가 rtA181T/sW172* 및 rtA181T/sW172S 돌연변이체 사이에서 복제 차이에 관련되어 있지 않음을 시사한다.

결론적으로 우리는 끝이 잘린 표면 단백질 중 어떤 것이 rtA181T/sW172* 돌연변이의 감소된 복제에 책임이 있는지 평가하였다. 이를 위하여 우리는 CMV-유래 돌연변이 surface constructs(truncated PreS1, PreS2, S)를 클론하였고, WT HBV의 복제 능력을 시험하였다. 도 5에서 보듯이, 끝이 잘린 PreS1 단백질만이 바이러스 복제에 대해 강한 우세한-네거티브 효과를 나타내었다. 이러한 데이터는 끝이 잘린 PreS1이 rtA181T/sW172* 돌연변이의 감소된 복제에 책임이 있단 것을 나타낸다.

rtA181T/sW172* 돌연변이는 약물의 일회량에서 rtA181T/sW172S에 비해 증가된 약물 저항성을 보였다. 그래서, 항바이러스제에 대한 rtA181T/sW172* 와 rtA181T/sW172S 돌연변이의 IC50값을 결정하기 위하여, 우리는 최근 승인된 약물을 이용하여 약물 감수성 어쎄이를 수행하였다. (도 6) rtA181T/sW172S 돌연변이의 유전자 복제 수준은 약물 농도가 증가함에 따라 급격하게 감소하였는데, rtA181T/sW172S* 돌연변이의 경우에는 그렇지 않았다.(도 6A, C) 눈에 띄게, ADV를 처리하지 않은 경우, rtA181T/sW172S* 돌연변이의 복제 능력이 rtA181T/sW172S 돌연변이에 비해 절반 수준이었음에도 불구하고, 마지막 약물 농도에서 두 돌연변이의 복제 수준은 유사했다.(도 6A, B) 즉 ADV에 대한 rtA181T/sW172S* 돌연변이의 저항성에서 fold change는 rtA181T/sW172S 돌연변이의 저항성과 비교해 보았을 때 유의미하게 증가하였다. 유사하게, rtA181T/sW172S* 돌연변이의 TDF에 대한 저항성에서 fold change는 약간 증가하였으며, 이는 TDF와 ADV의 화학 구조 유사성 때문인 것 같다. 그러나, 두 돌연변이 모두 TDF와 ETV에 대해 감수성이 있다.(도. 6C)

이러한 데이터는 rtA181T/sW172 돌연변이와 비교하였을 때 rtA181T/sW172* 돌연변이가 바이러스 복제를 감소시키고 약물 내성을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 우리의 관찰은 HBV 복제와 약물 내성에 대한 rtA181T 돌연변이가 표면 유전자에서 중첩 변화에 의해 영향받을 수 있다는 것을 시사한다.

본 발명에서, 우리는 연속적 단일-, 및 다중-항바이러스 치료 중에 양물-저항성 돌연변이의 클론 분석을 수행하였다. 우리는 rtA181T, rtM204I, rtI233V, 및 rtN236T를 포함하는 몇 가지 보존된(conserved) 돌연변이를 확인하였는데, 이는 치료 실패와 연관되어 있다. 우리의 데이터는 rtA181T/sW172* 및 rtI233V 돌연변이가 바이러스 복제와 약물 저항성에 영향을 미쳤다는 것을 보여줬다. ADV 치료 도중에 나타나는 rtI233V 돌연변이는 바이러스 복제를 감소시키고 ADV에 저항성을 나타낸다. 흥미로운 점은 rtA181T/sW172S와 비교하여 rtA181T/sW172* 돌연변이는 바이러스 복제에서 감소를, 약물 저항성 증가를 나타낸다. 중요한 것은, 우리는 LAM-ADV 병용 치료 도중에 우세하게 선택되는 rtA181T/sW172*+I233V 돌연변이는 복제의 최저 수준을, ADV 저항성의 최고 수준을 보였다. (도 1)

ADV 저항성 환자로부터 분리된 HBV 준종의 ultra-deep pyrosequencing은 rtA181T 돌연변이의 80-90%가 표면 유전자의 rtA181T/sW172* 치환체와 연관되어 있음을 나타낸다. 다른 미스센스 돌연변이와는 다르게 약물 치료 도중 표면 유전자에서 rtA181T/sW172 돌연변이의 높은 빈도는 본 발명에서 보여진 증가된 약물 저항성과 연관이 있을 것으로 보인다.(도 6)

ADV, TDF, ETV에 대한 rtA181T 돌연변이의 fold 저항성은 표면 유전자 변화에 의존하는 의미있는 차이를 보여주었다. rtA181T/sW172* 돌연변이는 rtA181T/sW172S missense 돌연변이와 비교하여 볼 때 약물에 대하여 약 2배(fold) 증가한 저항성을 보였다.(도 6)

도 1에서 보듯이, 항바이러스 치료 전에 환자로부터 분리된 대부분의 HBV 클론은 이미 rtI233V 돌연변이를 가지고 있었다. 비록 ADV 저항성에 대한 rtI233V의 효과가 논쟁 중이라 하더라도, 우리는 본 발명에서 rtI233V 돌연변이가 ADV에 저항성이 있다고 주장한다.(도 5c) LMV 저항성에 대한 ADV 단독치료는 ADV 저항성에 대한 더 큰 위험이 있음은 잘 알려져 있다. 그래서, 치료 전 환자에서 rtI233V 돌연변이의 존재는, 우리 환자에서 관찰된 바와 같이, LMV- 저항성 B형 간염 환자에서 ADV 저항성의 높아진 위험에 대한 한 가지 가능한 설명이 된다.

rtA181T/sW172* 돌연변이는 바이러스성 분자 분비 결함을 보였다.(도 3) 최근 연구에서, 우리는 끝이 잘린 PreS1 단백질이 우세하게 WT HBV 복제를 저해함을 주장했다.(도 5f) 바이러스성 돌파구 시점에 환자 혈청에서 얻어진 표면 유전자에 상응하는 rtA181T/sW172* 돌연변이는 언제나 WT 또는 missense 돌연변이와 co-exist되어있다. 이는 분비 결함 돌연변이가 이 돌연변이의 출현에 대한 다른 바이러스성 준종에 의한 표면 단백질의 transcomplementation을 필요로 한다는 것을 시사한다.

pre-S2 돌연변이로 알려진 표면 truncation 돌연변이 또한 ER에서의 축적과 ER 스트레스의 유도를 통해 간암 유발물질과 연관되어 있다. 이러한 관점에서, 만성 B형 간염 환자에서 rtA181T/sW172* 돌연변이의 출현은 종양 형성과 관계 있다. 우리는 다른 군과 같이, rtA181T/sW172* 돌연변이가 HBsAg와 바이리온 분비 결함을 갖고 있음을 주장한다. 그래서, 바이리온과 HBsAgs의 감소된 분비는 ER의 축적으로 인할 수 있고, 이는 ER stress를 유발하고 결국 간 질병을 발생시킨다.

어떻게 rtA181T/sW172* 돌연변이가 약물 저항성을 증가시키는가에 대해서는 하기에 서술한다. ADV 같은 뉴클레오타이드 동족체은 비특이적 및 수용체-매개 세포이물흡수(엔도시토시스) 에 의해 간으로 보내지며, 그 다음에 세포 내 에스테라제(esterase)에 의해 아데포비어로 분해가 일어난다. 아데포비어(Adefovir)는 그 후 adenylate kinases와 nucleoside diphosphate kinases에 의해 인산화되며, HBV 중합효소에 결합하기 위해 dATP와 경쟁한다. 증가된 약물 내성에 대한 한 가지 가능한 설명은 truncated HBsAgs가 sustained ER stress를 유발하고, 결국 ADV 약동학에 관련된 몇 가지 단백질의 하향 조절을 유발하는 것이다.

요약하자면, 우리는 바이러스 복제와 약물 저항성에 대한 rtA181T 돌연변이의 영향이 중첩 표면 유전자에서의 돌연변이에 의존한다는 것을 보여주었다. rtA181T/sW172S 돌연변이와 비교했을 때, rtA181T/sW172S* 돌연변이는 바이러스 복제는 감소, 분비 결함과 함께 증가된 약물 저항성을 보여주었다. rtI233V 돌연변이는 또한 복제 능력과 약제 내성에 영향을 미쳤다. 우리의 발견에 기초하여, 중첩 유전자의 유전형 분석은 임상학적 분리물이 rtA181T 돌연변이를 하버링하는지 여부를 알기 위해 필요한 것 같다.

본 발명의 끝이 잘린 pre S1 단백질은 HBV 복제를 저해하므로, B형 간염 바이러스를 타겟으로 하는 HBV 감염 치료용 후보 물질을 스크리닝하는데 유용하며, 기타 HBV 바이리온 형성 및 복제와 관련된 간질환의 악화 유도 기전의 연구에도 사용될 수 있다.

도 1은 치료 실패 시 분리된 RT 돌연변이의 임상학적 특징과 시험관 내 적응성 검사 결과를 나타내는 그림.
(a) 만성 B형 간염 환자에서 임상학적 진행. 화살표는 본 발명에서 사용된 혈청 샘플링의 시간 지점을 나타냄. 클론 시리즈는 다음 연구를 위해 #로 표시됨. 바이러스 돌파구 시점에 함께 존재(coexisting)하는 HBV 준종의 분석이 요약됨.(b-d) 각 혈청 시료로부터 얻어진 HBV RT Gene은 HBV 1.2mer replicons로 전환되었으며, 치환체는 WT와 비교되었다. 클로닝된 HBV DNAs는 Huh-7 세포로 트랜스팩션되었고, 세포는 5일동안 20 μM LMV 또는 ADV와 함께/없이 처리되었다. 세포 내 HBV DNA는 서던 블랏에 의해 분석되었다. WT와 비교하여 상대적인 복제 능력과 약물 적응성은 PhosphorImager를 사용하여 정량분석하였다. 같은 세포 용해물의 aliquots(부분표본)는 HBV 핵과 액틴 단백질을 탐지하기 위하여 서던 블랏에 의하여 분석되었는데, 이는 트랜스팩션 수율과 로딩 양을 결정하기 위함이다.
도 2는 복합 치료 도중 환자에게서 분리된 HBV RT 돌연변이의 시험관 내 약물 적응성 검사 결과를 나타내는 그림
(a-b) LMV와 ADV 병용 치료 도중 얻어진 클로닝된 HBV DNAs는 Huh7 세포로 트랜스팩션되었고, 세포는 5일동안 20μM LMV, ADV 또는 두 약물 모두와 함께 처리되었다. 세포 내 HBV DNA 수준은 서던 블랏에 의해 분석되었다. WT와 비교하여 상대적 복제 능력과 약물 적응성은 PhosphorImager를 사용하여 정량하였다. (c) rt181과 rt233 위치에서 치환체를 갖는 HBV 클론의 요약. WT와 비교하여 각 클론의 상대적 복제 능력은 3개의 독립된 실험의 평균값으로 나타내었다.
도 3은 바이리온 분비와 표면 단백질 발현에 있어서 rtA181T와 rtI233V의 효과를 나타내는 그림. (a) Huh-7 세포에서 WT, 13-13과 13-19 클론의 트랜스팩션 후에, 세포 내 또는 분비된 HBV DNA는 서던 블랏에 의해 분석되었다. 세포 내 HBsAg는 anti-HBs 항체를 사용하여 탐지되었다. (b) 표면 유전자 서열과 중첩하는 HBV 중합효소 서열의 도식. rt181 위치에서 뉴클레오타이드 변화와 이에 상응하는 WT, 13-13, 13-19를 위한 중첩 표면 유전자에서의 치환체가 표시되었다. HBV1.2mer를 위한 RT 유전자 클로닝을 위해 XhoI 및 NcoI가 사용되었다.
도 4는 rtA181T, rtV191I, rtI233V 돌연변이를 harboring하는 임상학적으로 분리된 HBV 돌연변이의 ADV 저항성과 복제능력을 분석한 그림.
(a) rtA181T, rtV191I, rtI233V 돌연변이를 harboring하는 클론의 서열 분석. 중첩 표면 단백질의 치환체와 WT와 비교하여 상대적 복제 수준을 표시하였다.(b-c) 10개의 선택된 클론이 Huh-7 세포로 트랜스팩션 되었고, 복제능력과 ADV 적응성이 서던 블랏에 의해 분석되었따. ADV 치료(20 μM)는 5일간 지속되었다. 세포 내 HBsAg는 웨스턴 블랏에 의해 탐지되었다.
도 5는 rtA181T/sW172*, rtA181T/sW172S, and rtI233V를 포함하는 인공적 돌연변이의 특징과 돌연변이 중합효소와 표면 단백질의 기능을 분석한 그림.
(a) 인공 돌연변이 클론(2 μg) 이 Huh-7 세포로 트랜스팩션되었다. 세포는 트랜스팩션 후 5일 째 되는날 수확했다. 배양액의 상청액은 분비 HBsAg를 측정하기 위해 사용되었다. 세포 내 HBV DNA와 표면 항체는 각각 서던 과 웨스턴 블랏에 의해 탐지되었다. 항-HBs 항체의 두가지 다른 타입은 세포 내 표면 향체를 탐지하기 위해 사용하였다. 상대적 복제능력(WT와 비교했을 때) 서던 블랏과 PhosphorImager에 의해 계산되었다. (b) 트랜스팩션 된 세포들은 5일 동안 20 μM ADV로 처리되었고, 서던 블랏 분석을 수행하였다. (c) 상응하는 WT 값과 비교하여 인공 돌연변이의 상대적 복제 능력과 ADV 적응성. 데이터는 최소 3개의 서던 블랏 분석을 사용하여 얻어졌다. (d) 표시된 클론 2 μg은 Huh-7 세포로 트랜스팩션되었다. HBV RNA는 total RNA 20 μg을 사용하여 노던 블랏에 의해 탐지되었다. 상대적 HBV RNA는 2개의 독립된 실험의 평균값을 나타낸다. 전체 RNA(2 μg)는 로딩 컨트롤로 0.8% 아가로스 겔에서 분리되었다. (e) 중합효소-null HBV의 복제에 있어서 WT와 돌연변이 중합효소의 효과. HBV1.2 Pol(-) (1 ㎍) 및 CMV-Pol 구축물(1㎍) 이 Huh-7 세포로 코-트랜스팩션됨. HBV 복제와 중합효소 발현의 수준은 각각 서던 블랏과 웨스턴 블랏에 의해 탐지되었다. (f) WT HBV 복제에 있어서 끝이 잘린PreS1 단백질의 우세한 네거티브 효과. Huh-7 세포로 표시된 플라스미드 코-트랜스팩션 후에, 세포 내 HBV DNA는 서던 블랏 분석에 의해 분석되었다. 복제의 정량은 최소 3개의 독립된 분석에 의해 얻어졌다. 표면 단백질의 발현 수준은 표시된 항체에 의해 탐지되었다. 별표는 끝이 잘린 표면 단백질을 표시한다.
도 6은 최근 승인된 항바이러스에 대한 WT, rtA181T/sW172S, rtA181T/sW172*의 시험관 내 감수성을 분석한 그림.
(a) 세포는 표시된 플라스미드로 트랜스팩션되었고, ADV, TDF, ETV의 농도를 올리면서 5일간 처리되었다. 그 후, 세포 내 HBV DNA를 서던 블랏 분석하였다(b, c) IC50 값의 평균과 WT, rtA181T/sW172*, 그리고 rtA181T/sW172S의 저항성의 fold change의 결정. 자료는 최소 3개의 독립적 서던 블랏 분석을 사용하여 얻어졌다. *P<0.01

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1:환자의 선택

HBV 치료의 시작으로 LMV로 치료받은 만성 B형간염에 걸린 47세 남자. HBV DNA는 LMV 치료 후에 real time PCR로 분석해 보았을 때 탐지되지 않는 수준(<300 copies/ml)으로 감소되었다. 그러나, 바이러스성 돌파구(breakthrough)가 LMV 치료 후 36개월에 발생했다. ADV로 바꾼 후에, HBV DNA는 약 40,000 copies/ml로 감소되었다; 그러나 ADV 치료 후 28개월 후에 ADV-저항성 돌연변이와 함께 바이러스성 돌파구가 관찰되었다. LMV가 ADV에 더해졌고, 병용치료 후 HBV DNA 수준은 점차 감소하였다. 상승된 HBV DNA 수준은 병용 치료 후 15달 후에 관찰되었다.(도. 1a)

실시예 2: HBV replicon 제조와 polymerase RT domain 의 다이렉트 시퀀싱

항바이러스 치료 도중에 발현하는 HBV RT 유전자의 완전한 서열을 분석하기 위하여, HBV DNA는 연속으로 치료 이전과 바이러스성 돌파구의 시기에(도 1), QIAamp MinElute Virus spin kit(Qiagen)을 사용하여 제조자의 매뉴얼에 따라 환자 혈청 시료로부터 분리되었다. RT gene PCR 이후에, 환자로부터 분리한 RT geme을 하버링하는 HBV 1.2mer replicons는 pGEM-4z vector(Promega)를 사용하여 만들어졌고, 이전에 설명한대로 시퀀스 분석하였다. rtI233V, rtA181T/sW172S, rtA181T/sW172*, rtN236T, rtA181T/sW172*+rtN236T, rtA181T/sW172S+rtI233V 그리고 rtA181T/sW172*+rtI233V를 포함하는 모든 인공의 HBV1.2mer 클론은 WT HBV1.2mer를 사용하여 위치-다이렉트 돌연변이생성에 의해 생성되었다. truncated PreS1, PreS2, 그리고 S의 발편을 위한 플라스미드는 rt181T/sW172* HBV　1.2mer를 주형으로 하여 pCMV-tag2A로 클로닝되었다. Pol-WT, Pol-rtA181T/sW172S, 그리고 Pol-rtA181T/sW172*를 포함하는 polymerase contsruct는 pCMV-tag2A에 WT를 사용하여, rtA181T / sW172S , rtA181T/sW172* HBV1.2mer를 각각 주형으로 하여 클로닝되었다. polymerase-null HBV replicon(HBV Pol(-))은 류왕식 교수(Yonsei University)가 제공해주었다.

실시예 3:항바이러스제 처리

LMV와 ADV는 각각 GlaxoSmithKlein(Brenford, United Kingdom)과 Gilead Sciences(Foster City, CA)로부터 공급되었다. Huh7 인간 간암세포는 10% 열-불활성화 우태아혈청(Gibco-BRL)과 1% penicillin streptomycin(Gibco-BRL)로 보충되는 Dulbecco's modified Eagle's medium에서 배양되었다.(Gibco-BRL) WT 2 microgram과 돌연변이 HBV replicon은 Huh7 세포로 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 사용하여 트랜스팩션하였다. 전술한 바와 같이 4시간 트랜스팩션 후에, medium은 표시된 농도의 LMV, ADV, TDF 및 ETV를 포함하는 fresh medium으로 교체하였다. 신선한 약물-함유 medium은 5일동안 sao일 교체되었으며, 세포는 거두어들였다.

실시예 4:약물 감수성과 복제 분석

시험관 내 약물 감수성과 복제 분석은 전술한 바와 같이 서던 블롯을 사용하여 수행하였다. 간단히 말해서, 세포 펠렛은 1% NP-40를 포함하는 100 ㎕ HEPES buffer 에 용해되었다. 트랜스팩션된 플라스미드 DNA는 세포 lysate로부터 37°C에서 15분간 반응 완충용액에서 nuclease 처리에 의해 제거되었다. 핵 분자는 26% 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액에서 석출(precipitate)되었다. 얼음 위에서 2시간 배양 후에, 캡시드는 SDS 존재 하에 37°C에서 2시간 동안 Proteinase K로 소화시켰다. HBV DNA는 페놀로 추출되었으며, 에탄올로 석출되었다. 정제된 DNA는 1% agarose gel로 분리되었다. Hybond-N+ membrane (Amersham)으로 트랜스퍼한 후에, HBV DNA는 [α-³²P]dCTP(500μCi/μmol,Perkin-Elmer)로 라벨링된 매우 순수하고 랜덤화된 HBV 프로브를 사용하여 탐지하였다. HBV 복제는 PhosphorImager 및 Multi-Gauge v3.2 software (Fujifilm, Tokyo, Japan)를 사용하여 정량화되었다.

바이리온 분비를 분석하기 위하여, 배양액 상청액이 TEN 버퍼에서 20% sucrose의 위에 채워졌으며, 39,000 rpm에서 18시간 동안 세포 외 HBV 분자를 분리하기 위해 초원심분리하였다. HBV DNA는 위에 설명한 대로 분리되었으며, 서던 블롯 분석을 행하였다.

실시예 5:노던 블랏 분석

토탈 RNA는 제조자의 지시에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 추출되었다. 토탈 RNA의 20 microgram은 1% 포름알데히드-아가로스 겔로 분리되었고, nitrocellulose 막으로 옮겨졌다. HBV RNA는 탐지하기 위하여, 막은 써던 블랏 분석에 사용되는 정제된 ³²P-labeled HBV 프로브를 사용하여 융합되었다. 토탈 RNA 1 ㎍은 loading control로 사용되었다.

실시예 6: 웨스턴 블랏 분석과 HBsAg ELISA

세포 용해물은 12% SDS-polyacrylamide 겔에 용해되었고, polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes (Millipore) 막으로 옮겨졌다. 막은 5% skim milk(BD)를 포함하는 TBS와 Tween 20으로 블락되었고, 그리고 아래와 같이 탐지하였다: 토끼의 다클론성 항-HBV 핵(DAKO), 말의 다클론성 HBs(Novus, Santa-Cruz), 또는 쥐의 단클론성 anti-β-actin (Sigma) 항체. HBsAg 분비를 분석하기 위해, 배양액 상청액이 Enzygnost anti-HBs kit (Dade Behring)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수집되었고 분석되었다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> SURFACE PROTEIN PRE S PEPTIDES OF HBV AND THEIR USE AS ANTI-HBV <130> HY140285 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1005 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 1 atggggcaga atctttccac cagcaatcct ctgggattct ttcccgacca ccagttggat 60 ccagccttca gagcaaacac cgcaaatcca gattgggact tcaatcccaa caaggacacc 120 tggccagacg ccaacaaggt aggagctgga gcattcgggc tgggtttcac cccaccgcac 180 ggaggccttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatac tacaaacttt gccagcaaat 240 ccgcctcctg cctccaccaa tcgccagtca ggaaggcagc ctaccccgct gtctccacct 300 ttgagaaaca ctcatcctca ggccatgcag tggaattcca caaccttcca ccaaactctg 360 caagatccca gagtgagagg cctgtatttc cctgctggtg gctccagttc aggaacagta 420 aaccctgttc tgactactgc ctctccctta tcgtcaatct tctcgaggac tggggaccct 480 gcaccgaaca tggagagcac aacatcagga ttcctaggac ccctgctcgt gttacaggcg 540 gggtttttct tgttgacaag aatcctcaca ataccacaga gtctagactc gtggtggact 600 tctctcaatt ttctaggggg agcacccacg tgtcctggcc aaaattcgca gtccccaacc 660 tccaatcact caccaacctc ttgtcctcca atttgtcctg gctatcgctg gatgtgtctg 720 cggcgtttta tcatattcct cttcatcctg ctgctatgcc tcatcttctt gttggttctt 780 ctggactacc aaggtatgtt gcccgtttgt cctctacttc caggaacatc aactaccagc 840 acgggaccat gcaagacctg cacgattcct gctcaaggaa cctctatgtt tccctcttgt 900 tgctgtacaa aaccttcgga cggaaactgc acttgtattc ccatcccatc atcctgggct 960 ttcgcaagat tcctatggga gtgggcctca gtccgtttct cctga 1005 <210> 2 <211> 334 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp 1 5 10 15 His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp 20 25 30 Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly 35 40 45 Ala Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu 50 55 60 Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr Leu Pro Ala Asn 65 70 75 80 Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro 85 90 95 Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asn Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn 100 105 110 Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu 115 120 125 Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Leu 130 135 140 Thr Thr Ala Ser Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro 145 150 155 160 Ala Pro Asn Met Glu Ser Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu 165 170 175 Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro 180 185 190 Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala 195 200 205 Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser 210 215 220 Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu 225 230 235 240 Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe 245 250 255 Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu 260 265 270 Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr 275 280 285 Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys 290 295 300 Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala 305 310 315 320 Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser 325 330

Claims (8)

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3. 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스 복제 저해용 조성물.
   
   
   
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