KR101932683B1

KR101932683B1 - 테노포비어 내성 b형 간염 바이러스의 약제 내성 예측 방법

Info

Publication number: KR101932683B1
Application number: KR1020170114531A
Authority: KR
Inventors: 김균환; 이정훈; 박은숙; 이아람
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단; 서울대학교병원
Priority date: 2017-09-07
Filing date: 2017-09-07
Publication date: 2018-12-27

Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV)의 테노포비어에 대한 신규한 내성 유발 기전에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 HBV의 역전사 효소(RT)의 잔기에서 아미노산의 치환(변이) 여부를 통해 테노포비어에 대한 내성 여부를 확인할 수 있으므로, HBV의 테노포비어에 대한 내성 예측 방법 및 테노포비어에 내성을 갖는 B형 간염의 치료를 위한 약물 선택 정보를 제공할 수 있다.

Description

테노포비어 내성 B형 간염 바이러스의 약제 내성 예측 방법{Methods for predicting drug resistance of Hepatitis B virus}

본 발명은 테노포비어에 약제 내성을 갖는 HBV의 신규한 내성 기전에 관한 것이다.

전세계적으로 약 20억명의 많은 사람들이 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus; 이하, 'HBV'라 함)에 감염되어, 매년 약 69만명이 HBV로 인한 합병증으로 사망한다는 보고가 있다.

최근, 라미부딘, 텔비부딘, 아데포비르, 엔테카비르, 크레부딘 및 테노포비르를 포함하는 몇 종의 핵산 유도체(nucleos(t)ide analogues; NAs)를 HBV의 치료해오는데 사용해왔다(Kim KH, Kim ND, Seong BL. Molecules 2010; 15: 5878-908; Marcellin P, Chang TT, Lim SG et al. N Engl J Med 2003; 348: 808-16;Chang TT, Gish RG, de Man R et al. N Engl J Med 2006; 354: 1001-10).

또한, 임상적으로 사용가능한 HBV 치료 약물들은 바이러스의 역전사 효소(Reverse transcriptase; RT)의 저해에 대한 공통 타겟을 가지므로, 모든 항-HBV 약물들은 RT 도메인에서 특정한 돌연변이로부터 야기되는 바이러스 저항성을 나타낸다고 보고된 바 있다(비특허문헌 1 내지 4).

라미부딘(LMV)은 HBV 복제의 강력한 저해제이나, 라미부딘의 내성율은 단일치료 1년 및 5년 후에 각각 23% 및 80%의 HBV 보균자로 확대됨이 보고되었다(비특허문헌 1). 상기 라미부딘의 내성의 주된 돌연변이는 YYDD 모티프의 rtM204I/V이다. YMDD 돌연변이체는 대부분 복제-결핍(defective)이므로, 이 돌연변이는 종종 항-HBV 약물에 대한 1차 내성 돌연변이의 복제-결손을 보상하는 2차 돌연변이를 수반한다. 2차 내성 돌연변이로는 rtL180M, rtL80I/V 및 rtV173L이 있으며, 이는 복제-결손 rtM204I/V 돌연변이의 바이러스 복제능을 증가시킴이 보고되었다.

엔테카비르(ETV)는 매우 낮은 내성을 가지는 항-HBV 약물로 보고되었으나, 상기 약물과 관련된 돌연변이로 rtI169T, rtL180M, rtS184S/A/I/L/G/C/M, rtM204I/V, rtS202G/I 및 rtM250I/V가 알려져 있다.

테노포비어(TDF)는 매우 낮은 내성을 가지는 항-HBV 약물로, 현재 이용되는 항-HBV 약물 중 가장 강한 약제이며, 아직까지 상기 약물의 내성과 관련된 돌연변이는 확실하게 알려지지 않았다.

항바이러스제 내성 바이러스가 출현할 경우, 해당 바이러스제에 대한 감수성이 현저히 감소하여 치료제를 투여하여도 바이러스의 증식이 억제되지 않는다. 이 경우, 다른 기전의 항바이러스제를 투여하여야 치료 효과를 볼 수 있다. 또는 치료 초기부터 작용 기전이 다른 항바이러스의 병용 요법(combined therapy)을 사용하여 항바이러스제 내성 변이종의 출현을 줄이거나 늦추어 항바이러스 요법의 치료 효과를 향상시킬 수 있다.

따라서, B형 간염의 효과적인 치료를 위해서는, 감염 초기의 바이러스의 돌연변이 여부 판단은 물론, 약물 투여 중 정기적으로 바이러스의 돌연변이 유무를 확인하여 항바이러스제에 대한 내성을 획득했는지의 여부를 확인할 필요가 있다. 이에, 전술한 바와 같이 약물 내성 HBV의 역전사 효소 유전자에서 돌연변이의 발생은 B형 간염 바이러스의 치료 실패와 관련이 있으므로, 상기 돌연변이의 동정은 B형 간염 바이러스 환자의 치료 전략 수립에 영향을 끼칠 것으로 예상된다.

Zoulim F, Locarnini S. Gastroenterology 2009; 137: 1593-608 e1-2. Locarnini S&Mason WS, Cellular and virological mechanisms of HBV drug resistance. J Hepatol 2006; 44: 422-31 Ghany M, Liang TJ. Gastroenterology 2007; 132: 1574-85 Yim HJ, Hwang SG. Clin Mol Hepatol 2013; 19: 195-209

본 발명은 B형 간염 바이러스의 테노포비어에 대한 신규한 내성 유발 기전을 규명하고자 하는 것이다.

이에, 본 발명자들은 테노포비어(Tenofovir)에 내성을 획득한 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus)로부터 돌연변이의 발생과 관련된 돌연변이를 규명하고자 노력한 결과, 테노포비어에 내성을 획득한 B형 간염 바이러스의 역전사 효소(RT)의 몇 군데의 아미노산이 치환됨을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본원발명은 테노포비어에 대해 약제 내성을 획득한 B형 간염 바이러스의 새로운 내성 획득 기전에 관한 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은,

테노포비어(Tenofovir)를 투여한 B형 간염 바이러스(HBV) 감염 환자에서 분리한 생물학적 시료로부터 HBV의 역전사 효소(RT)의 106번째, 126번째 및 134번째 잔기의 아미노산 변이 여부를 확인하는 단계를 포함하고,

변이 여부를 확인한 결과, HBV의 역전사 효소(RT)의 106번째 잔기의 아미노산이 세린에서 시스테인으로 치환되고, 126번째 잔기의 아미노산이 히스티딘에서 티로신으로 치환되며, 134번째 잔기의 아미노산이 아스파틱산에서 글루탐산으로 치환되는 경우 테노포비어에 내성을 획득한 것으로 판단하는, HBV의 테노포비어에 대한 내성 획득 예측 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 HBV의 역전사 효소(RT)는 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 내성 획득 예측 방법은 HBV의 역전사 효소(RT)의 269번째 잔기의 아미노산 변이 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함하고,

상기 269번째 잔기의 아미노산이 류신에서 이소류신으로 치환되는 경우를 테노포비어에 내성을 획득한 것으로 판단하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, “생물학적 시료”는 테노포비어를 투여한 B형 간염 바이러스 환자로부터 분리한 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 변, 타액, 눈물, 척수액, 세포, 조직 또는 그 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, “테노포비어(Tenofovir)”는 급만성 간염의 원인인 B형 간염 바이러스의 치료에 사용되는 경구용 항 바이러스제를 의미한다.

본 발명에 있어서, “변이”는 B형 간염 바이러스의 역전사 효소의 아미노산 잔기의 일부가 다른 아미노산으로 치환된 경우를 의미한다. 예컨대 본 발명에서는, B형 간염 바이러스의 역전사 효소의 106번째 잔기의 아미노산이 세린에서 시스테인으로 치환되고, 126번째 잔기의 아미노산이 히스티딘에서 티로신으로 치환되며, 134번째 잔기의 아미노산이 아스파틱산에서 글루탐산으로 치환된 경우를 의미한다. 또한, 상기 변이는 269번째 잔기의 아미노산이 류신에서 이소류신으로 치환된 경우를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, HBV의 역전사 효소(RT)의 변이 여부를 확인하는 단계는 통상적인 서열 분석 또는 프로브를 통해 확인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, HBV의 RT 변이 여부를 확인하는 단계는 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 이용한 정량적(quantitative) 검사 방법과 역전사 효소(RT) 유전자를 탐지할 수 있는 올리고염기, PNA(peptide nucleic acid), cDNA 또는 앱타며(aptamer)를 프로브로 하여 마이크로어레이 고정한 칩을 이용한 정성적(qualitative) 검사 방법을 수행하여 확인할 수 있다.본 발명에 있어서, 테노포비어에 대한 내성 획득 여부는 B형 간염 바이러스에 감염된 환자에게 B형 간염의 치료를 위해 테노포비어를 일정 기간 투여했을 때, 약물이 투여된 초기의 약물 반응과 비교하여 일정 기간 약물을 투여한 후에 테노포비어에 대해 극히 낮은 감수성을 나타내어 증세가 호전, 완화, 경감 또는 치료 증상을 나타내지 않거나, 테노포비어를 투여한 후에도 B형 간염이 진행성을 나타내었을 때 테노포비어에 대해 비의존적 내성을 획득했다고 말할 수 있다. 상기 B형 간염의 진행은 B형 간염을 확인할 수 있는 모든 수단, 예컨대 일반적인 피 검사 등의 B형 간염을 확인할 수 있는 것이라면 그 수단이 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, B형 간염 바이러스의 역전사 효소의 106번째, 126번째 및 134번째 아미노산에 치환이 동시에 발생하면 테노포비어에 대한 부분내성을 획득했다고 볼 수 있으며, 106번째, 126번째, 134번째 및 269번째 아미노산이 동시에 치환된 경우에는 더 강하고 온전한 내성을 획득했다고 볼 수 있다. 특히 상기와 같이 역전사 효소의 아미노산 치환으로부터 테노포비어에 내성을 획득한 경우, 상기 아미노산의 치환 부위는 내성 유발의 중요한 인자라 말할 수 있다. B형 간염 바이러스의 역전사 효소(RT)의 106번째, 126번째 및 134번째; 및 106번째, 126번째, 134번째 및 269번째 아미노산 잔기에서의 아미노산의 치환에 따른 테노포비어에 대한 내성 유발 기전은 본 발명에서 밝힌 새로운 내성 획득 기전이다.

본 발명에 따른 테노포비어의 새로운 내성 유발 기전을 통해 B형 간염 바이러스의 복제 활성 예측 및 내성 획득 예측에 유용하게 사용될 수 있으며, 상기 B형 간염 바이러스의 치료를 위한 약물 선택에 있어서 정보를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은,

B형 간염 바이러스(HBV) 감염 환자에서 분리한 생물학적 시료로부터 HBV의 역전사 효소(RT)의 106번째, 126번째 및 134번째 잔기의 아미노산 변이 여부를 확인하는 단계를 포함하고,

변이 여부를 확인한 결과, HBV의 역전사 효소(RT)의 106번째 잔기의 아미노산이 세린에서 시스테인으로 치환되고, 126번째 잔기의 아미노산이 히스티딘에서 티로신으로 치환되며, 134번째 잔기의 아미노산이 아스파틱산에서 글루탐산으로 치환되는 경우, 테노포비어 이외의 B형 간염 치료제로써 엔테카비어 또는 HBV 캡시드 어셈블리 억제제를 투여하도록 정보를 제공하는 것을 포함하는,

HBV의 치료를 위한 약물 선택의 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 약물 선택의 정보 제공 방법은 약물 선택의 정보 제공 방법은 HBV의 역전사 효소(RT)의 269번째 잔기의 아미노산 변이 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함하고,

상기 269번째 잔기의 아미노산이 류신에서 이소류신으로 치환되는 경우에 엔테카비어 또는 HBV 캡시드 어셈블리 억제제를 투여하도록 정보를 제공하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약물 선택의 정보 제공 방법에서 HBV의 역전사 효소(RT), 생물학적 시료, 테노포비어에 대한 내성 획득 여부, 변이 등은 위에서 기술한 모든 내용을 그대로 적용 또는 준용할 수 있다.

또한, 본 발명은

엔테카비어; HBV 캡시드 어셈블리 억제제; 또는 약제학적으로 허용가능한 이들의 염을 포함하는,

테노포비어를 투여한 후 B형 간염 바이러스의 역전사 효소(RT)의 106번째, 126번째 및 134번째 잔기의 아미노산이 각각 세린에서 시스테인으로, 히스티딘에서 티로신으로, 아스파틱산에서 글루탐산으로 치환된 B형 간염 바이러스의 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 HBV의 RT의 269번째 잔기의 아미노산이 류신에서 이소류신으로 치환된 경우의 B형 간염을 추가로 치료할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 엔테카비어는 HBV에 선택적 활성을 갖는 만성 B형 간염 바이러스 치료제로 잘 알려진 화합물로서, 구체적인 화합물명은 2-아미노-1,9-디하이드로-9-[(1S,3R,4S)-4-히드록시-3-히드록시메틸-2-메틸렌사이클로펜틸]-6H-퓨린-6-원(2-amino-1,9-dihydro-9-[(1S,3R,4S)-4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-methylenecyclopentyl]-6H-purin-6-one)이다. 또한, 상기 HBV 캡시드 어셈블리 억제제는 B형 간염 바이러스의 핵단백질체인 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)를 억제함으로써 HBV 입자의 생성을 억제하는 약물을 의미한다.

한 구체예에서, 상기 HBV 캡시드 어셈블리 억제제는 페닐프로펜아미드계 화합물 또는 헤테로아릴디하이드로피리미딘계 화합물을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 HBV 캡시드 어셈블리 억제제는 하기 화학식 1 내지 11의 구조를 갖는 화합물일 수 있다. 상기 화합물은 HBV의 증식과 유지에 다양한 역할을 하는 HBV 코어(capsid) 단백질의 어셈블리를 억제하여 HBV의 DNA 증식, 바이러스 결합, cccDNA 증식 등을 억제함으로써 B형 간염에 대해 치료 효과를 나타낼 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 발명에서, “약제학적으로 허용가능한 담체”란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다. 본 발명에서의 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여, 조직 또는 장기에 주입하기에 적합한 주사제의 형태로 제형화할 수 있다. 또한, 등장성 멸균 용액, 또는 경우에 따라 멸균수나 생리식염수를 첨가하여 주사 가능한 용액이 될 수 있는 건조 제제(특히 동결 건조 제제)로 제형화할 수도 있다. 또한, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다.

또한, 바람직하게 본 발명의 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명에서, “투여”는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, “유효량”은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는데 필요한 양을 의미한다. 본 발명에서 조성물은 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 유효량으로 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.

본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

도 1은 테노포비어 요법으로 치료하는 동안 바이러스성 돌파를 보인 환자의 임상 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 HBV DNA의 약물 민감성을 확인하기 위해 야생형(WT) HBV와 clone 1-13에 대해 서던 블랏을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 HBV DNA의 약물 민감성을 확인하기 위해 야생형(WT) HBV와 clone 1-13에 대해 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 야생형(WT) HBV RT와 본원발명에서 제조한 clone이 각각 상응되는 표면 돌연변이를 나타낸 것이다
도 5는 C, Y 및 E를 조합한 다양한 돌연변이체의 HBV 복제능과 테노포비어에 대한 약물 민감성을 분석한 결과이다.
도 6은 MV와 CYEMV; 및 CYELMV 및 CYELMVI의 HBV 복제능과 테노포비어에 대한 약물 민감성을 분석한 결과이다.
도 7은 야생형(WT) HBV와 다양한 조합의 돌연변이체의 HBV 복제능과 테노포비어에 대한 약물 민감성을 PCR을 통해 분석한 결과이다.
도 8은 야생형(WT), clone 1-13, CYEI 및 CYELMVI 돌연변이체의 NVR 3-778에 대한 약물 감수성을 확인한 결과이다.
도 9는 야생형(WT), clone 1-13, CYEI 및 CYELMVI 돌연변이체의 NVR 3-778에 따른 복제능을 확인한 결과이다.
도 10 은 야생형(WT), CYE 및 CYEI 돌연변이체의 엔테카비어에 따른 복제능을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 테노포비어 내성 획득 환자로부터 분리한 HBV RT 돌연변이체의 특성 확인

본 실시예에서 사용된 환자는 테노포비어(Tenofovir; TDF) 요법으로 치료하는 동안 바이러스성 돌파(viral breakthrough)를 보인 2명의 환자이며, 상기 바이러스성 돌파(viral breakthrough)는 HBV DNA 수준이 1 log₁₀ IU/mL 이상 증가한 환자를 의미한다. 상기 환자들의 임상 결과를 도 1에 기재하였다.

상기 HBV DNA는 테노포비어 치료에 대한 임상적 내성을 나타내는 환자의 혈청으로부터 분리하였다. 본 출원인은 원래의 RT 유전자가 환자#1로부터 얻은 8개의 클론(clone 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-6, 1-7, 1-8, 1-13)으로 대체된 것과, 환자#2로부터 얻은 12개의 클론(clone 2-1, 2-2, 2-3, 2-5, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 2-11, 2-12, 2-14, 2-16)으로 대체된 HBV 1.2 mer을 제작하였다. 각 클론은 전체 RT 유전자의 유사종(quasispecies)을 분석하기 위해 sequencing을 수행하였다.

상기 표 1은 테노포비어(TDF) 치료 후 환자#1로부터 분리한 8개의 클론 중 4개의 클론이 RT 도메인에서 동일한 서열을 가지며, dominant HBV 클론으로 진화되었음을 보여주고 있다. 상기 표 1에 따르면 모든 HBV 돌연변이체는 [rtS106C+rtH126Y+rtD134E+rtM204I/V+rtQ267L+rtL269I]를 가지고 있음을 알 수 있다. 환자#2에서 돌연변이는 환자#1보다 복잡해 보이기는 하지만, 환자#1에서 검출된 돌연변이와 동일한 돌연변이를 보였다. 또한 rtV173L과 rtL180M 돌연변이는 두 환자의 클론에서 높은 빈도로 나타남을 알 수 있었다(환자#1은 25%, 환자#2는 42%).

서열 분석 결과, 상기 7가지의 공통된 돌연변이는 테노포비어 내성과 관련 있음을 확인하였다.

실시예 2: 위치 지정 돌연변이화에 의한 HBV RT 돌연변이체 레플리콘의 구축

상기 실시예 1에서 분리한 역전사 효소(RT) 유전자를 PCR로 증폭하고, HBV 1.2mer 레플리콘에 클로닝하여 염기 서열을 결정하였다. 약물 내성과 관련된 돌연변이를 동정하기 위해 HBeAg 양성 무증상 CHB 환자의 혈청으로부터 분리한 야생형(WT) HBV 게놈(NCBI GenBank accession no. GQ872210)의 RT 서열과 비교하였다. 야생형(WT) HBV 1.2mer의 위치 지정 돌연변이화에 의해 9개의 돌연변이를 포함하는 인공 HBV RT 돌연변이체 레플리콘을 제작하였다(Ahn SH, Park YK, Park ES et al. J Virol 2014; 88:6805-18).

① rtS106C (C)

② rtS106C+rtH126Y (CY)

③ rtS106C+rtD134E (CE)

④ rtH126Y+rtD134E (YE)

⑤ rtS106C+rtH126Y+rtD134E (CYE)

⑥ rtD134E (E)

⑦ rtS106C+rtH126Y+rtD134E+rtL269I (CYEI)

⑧ rtL180M+rtM204V (MV)

⑨ rtS106C+rtH126Y+rtD134E+rtL180M+rtM204V (CYEMV)

⑩ rtS106C+rtH126Y+rtD134E+rtV173L+rtL180M+rtM204V (CYELMV)

⑪ rtS106C+rtH126Y+rtD134E+rtV173L+rtL180M+rtM204V+rtL269I (CYELMVI)

모든 돌연변이체 클론들은 서열 분석하여 확인하였다.

실시예 3: 세포 배양, 트랜스펙션 및 약물 처리

상기 실시예 2의 돌연변이체가 테노포비어(TDF)에 저항성이 있는지 평가하기 위해 RT 돌연변이체(clone 1-13)를 선택하여 in vitro 약물 감수성 검정을 수행하였다. 상기 돌연변이체는 7가지의 공통된 돌연변이를 포함하고 있기 때문에 선택되었다.

구체적으로, Huh7 인간 간암 세포주를 10% 우태아 혈청(Gibco, Grand Island, NY, USA) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)(Gibco, Grand Island, NY, USA)가 보충된 Dulbecco's modified Eagle 배지(Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 5% CO₂ 환경에서 37℃에서 배양하였다. 이 세포들은 리포펙타민 2000(Lipofectamine; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 2㎍ HBV WT 및 돌연변이체 1.2 mer 레플리콘으로 형질전환(transfection)하였다. 배양 4시간 후, 테노포비어(Bristol-Myers Squibb, NY, USA)가 포함된 배지로 교환해주어 4일간 약물(항바이러스제)을 처리하였다. 약물의 처리가 끝난 세포와 배양물을 분석에 사용하였다. 상기 NVR 3-778은 US20140178337A1(Novira Therapeutics, Inc., Doylestown, PA, USA)를 참조하여 합성하였다.

1) 서던 블랏 분석(Southern blot analysis)

약물 민감성을 결정하기 위해 세포로부터 DNA를 추출하여 서던 블랏(Kim JH, Park YK, Park ES et al. World J Gastroenterol 2014; 20:5708-20)과 PCR을 수행하였다(도 2 및 3).

상기 돌연변이체로 형질전환한 세포의 복제능 및 약물 감수성을 확인한 결과, 도 2에서 보는 것과 같이, 항바이러스제가 처리되지 않은 경우, clone 1-13은 야생형(WT)에 비해 낮은 복제능을 보이는 것을 알 수 있다. 이는 야생형(WT) HBV의 복제는 테노포비어에 농도 의존적으로 크게 감소되어 WT HBV는 테노포비어에 의해 복제가 저해되어 치료되기 쉽다는 것을 나타낸다. 그러나, clone 1-13은 테노포비어 처리에도 불구하고 복제능의 큰 감소가 관찰되지 않았기 때문에 이 약물에 대한 내성이 있음을 나타낸다.

2) HBeAg 및 HBsAg 측정

HBeAg 및 HBsAg를 측정한 결과, 시료 간 HBeAg 및 HBsAg의 수준에는 큰 차이를 나타내지 않은 것으로 보아, 테노포비어에 의한 DNA의 복제 활성이 억제되었음을 알 수 있었으며, 이는 세포에 발현된 HBV 의 초기 농도가 일정함을 나타낸다. WT HBV에 대한 IC₅₀ 값은 서던 블랏 분석 결과와 real-time PCR 수행에 의해 결정된 3.8μM과 유사하게 4.2μM을 나타내었다. 그러나, 서던 블랏 분석과 real-time PCR 분석에 의해 결정된 것과 같이 clone 1-13에서 사용된 최대 테노포비어 농도인 50μM에서도 HBV의 복제가 50%에 달하지 못했다. 이러한 복제 수준은 테노포비어의 가장 높은 온도인 50μM에서도 대조군(무처리군)의 약 75-85% 정도로 유지되었다. 이는 clone 1-13이 테노포비어에 강한 저항성을 나타내고 있기 때문임을 알 수 있다.

실시예 4: 테노포비어 내성과 관련된 삼중 변이(triple mutation)의 역할

HBV의 복제능 및 테노포비어 내성에서의 각 돌연변이의 역할을 특성화하기 위해, 상기 돌연변이들을 다양하게 조합하여 복제능과 테노포비어의 약물 민감성을 분석하였다. 이를 도 4 내지 도 6에 나타내었다.

도 4는 야생형(WT) HBV RT와 상기 제조한 clone이 각각 상응되는 표면 돌연변이를 나타낸 것이다. 도 5를 살펴보면, C, CY, CE, YE 및 E를 포함하는 돌연변이체는 테노포비어 처리에 영향을 받는 것을 알 수 있으나, 삼중 변이를 나타내는 CYE 돌연변이체는 테노포비어에 내성을 보이는 것을 확인할 수 있다. 또한, I 돌연변이체(rtL269I)가 삼중 변이(CYE)와 결합한 경우(CYEI), 테노포비어의 처리에 관계없이 복제능이 강하게 향상되는 것을 알 수 있었다.

본 실험에서 사용한 clone 1-13가 rtL180M+rtM204V(MV) 돌연변이를 포함하고 있기 때문에 상기 돌연변이가 테노포비어에 내성을 영향을 미치는지 확인하였다.

그 결과, 도 6에서 보는 것과 같이, MV 돌연변이체는 테노포비어에 따른 활성 억제 효과가 나타났으나, MV 돌연변이체를 CYE와 결합시킨 경우(CYEMV) 테노포비어에 내성을 나타내었고 CYE과 비교하여 복제능이 현저히 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 마찬가지로, CYEMV에 rtV173L 돌연변이를 결합시킨 경우(CYELMV), CYEMV에 비해 복제능이 향상된 것을 확인할 수 있었다. 마지막으로, CYELMV에 rtL269I를 결합시킨 경우(CYELMVI), 테노포비어에 대한 내성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

본 실험에 사용된 모든 돌연변이 clone은 HBeAg의 코딩 영역에서 동일한 서열을 가지는 것이나, HBsAg의 코딩 영역은 RT 유전자와 중첩되기 때문에 돌연변이가 발생하였다. 테노포비어의 처리와 관계없이 HBsAg와 HBeAg 모두에서 수준의 차이가 발생하지 않는다는 것은, i) 각 클론의 형질전환 수율이 일정하여 각 clone의 복제능이 전적으로 RT의 돌연변이에 기인하며, ii) 표면 단백질의 돌연변이는 표면 항원성에 큰 영향을 미치지 않는다는 점으로 유추할 수 있다.

실시예 5. 각 clone에 대한 테노포비어의 효과 확인

Huh7 세포의 각 clone에 대해서 테노포비어의 효과를 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR)을 수행하여 확인하였다.

테노포비어의 저항성에 대한 IC50 값과 fold의 변화를 하기 표 2에 기재하였다.

상기 표 2에 따르면 CYE 돌연변이가 테노포비어에 대해 부분적인 내성을, CYEI 돌연변이는 강한 내성을 부여한다는 점이 명백하게 기재되어 있다. 야생형(WT)과 CYE의 경우 IC50 값이 각각 3.8±0.6μM과 14.1±1.8μM로 나타났으나, CYE에 MV 돌연변이를 결합시키는 경우 IC50 값이 약간 증가하는 반면, CYEMV에 L 돌연변이가 결합된 경우에서는 큰 변화가 나타나지 않았다. 이는 CYE 또는 CYELMV에 I를 결합하는 경우에 IC50 값이 크게 증가하는 것을 나타내는 것이다.

또한, 다른 돌연변이의 복제능 및 약물 내성을 비교하기 위해, real-time PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 7에서 보는 것과 같이, CYE가 테노포비어에 저항성을 부여하고 CYE에 I를 결합시키면 테노포비어에 대한 약제 내성이 크게 향상되는 것을 알 수 있다. 또한, CYE에 L 또는 I가 결합되면 복제능이 크게 증가하는 것을 통해 상기 L 또는 I 돌연변이가 CYE 백본의 보완적인 돌연변이 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

실시예 6. HBV 코어 단백질 억제제에 대한 약물 감수성 확인

Huh7 세포의 각 clone에 HBV 코어 억제제(NVR 3-778)를 처리하여 상기 약물에 따른 복제능과 약물 감수성을 확인하였다.

도 8 및 9에 따르면, 테노포비어 내성 돌연변이체는 HBV 코어 억제제인 NVR 3-778에 대해 영향을 받기 쉬운 것으로 볼 수 있다. NVR 3-778에 대한 테노포비어 내성 돌연변이체의 약물 감수성은 야생형(WT) HBV와 비슷한 정도임을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 엔테카비어에 대한 약물 감수성 확인

Huh7 세포의 각 clone에 엔테카비어를 처리하여 상기 약물에 따른 복제능과 약물 감수성을 확인하였다.

도 10에 따르면, 테노포비어 내성 돌연변이체는 엔테카비어에 대해 영향을 받기 쉬운 것으로 볼 수 있다. 엔테카비어에 대한 테노포비어 내성 돌연변이체의 약물 감수성은 야생형(WT) HBV와 비슷한 정도임을 확인할 수 있었다.

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Claims

테노포비어(Tenofovir)를 투여한 B형 간염 바이러스(HBV) 감염 환자에서 분리한 생물학적 시료로부터 테노포비어(Tenofovir)의 투여 후 HBV의 역전사 효소(RT)의 106번째, 126번째 및 134번째 잔기의 아미노산 변이 여부를 확인하는 단계를 포함하고,
변이 여부를 확인한 결과, HBV의 역전사 효소(RT)의 106번째 잔기의 아미노산이 세린에서 시스테인으로 치환되고, 126번째 잔기의 아미노산이 히스티딘에서 티로신으로 치환되며, 134번째 잔기의 아미노산이 아스파틱산에서 글루탐산으로 치환되는 경우 테노포비어에 내성을 획득한 것으로 판단하는, HBV의 테노포비어에 대한 내성 획득 예측 방법.
제1항에 있어서,
테노포비어에 대한 내성 획득 예측 방법은 HBV의 역전사 효소(RT)의 269번째 잔기의 아미노산 변이 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함하고,
상기 269번째 잔기의 아미노산이 류신에서 이소류신으로 치환되는 경우를 테노포비어에 내성을 획득한 것으로 판단하는 것을 추가로 포함하는, HBV의 테노포비어에 대한 내성 획득 예측 방법.
제1항에 있어서,
B형 간염 바이러스(HBV)의 역전사 효소(RT)는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인 HBV의 테노포비어에 대한 내성 획득 예측 방법.
B형 간염 바이러스(HBV) 감염 환자에서 분리한 생물학적 시료로부터 HBV의 역전사 효소(RT)의 106번째, 126번째 및 134번째 잔기의 아미노산 변이 여부를 확인하는 단계를 포함하고,
변이 여부를 확인한 결과, HBV의 역전사 효소(RT)의 106번째 잔기의 아미노산이 세린에서 시스테인으로 치환되고, 126번째 잔기의 아미노산이 히스티딘에서 티로신으로 치환되며, 134번째 잔기의 아미노산이 아스파틱산에서 글루탐산으로 치환되는 경우, 엔테카비어 또는 HBV 캡시드 어셈블리 억제제를 투여하도록 정보를 제공하는 것을 포함하는,
HBV의 치료를 위한 약물 선택의 정보 제공 방법.
제4항에 있어서,
약물 선택의 정보 제공 방법은 HBV의 역전사 효소(RT)의 269번째 잔기의 아미노산 변이 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함하고,
상기 269번째 잔기의 아미노산이 류신에서 이소류신으로 치환되는 경우에 엔테카비어 또는 HBV 캡시드 어셈블리 억제제를 투여하도록 정보를 제공하는 것을 추가로 포함하는, HBV의 치료를 위한 약물 선택의 정보 제공 방법.
제4항에 있어서,
B형 간염 바이러스(HBV)의 역전사 효소(RT)는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인 HBV의 치료를 위한 약물 선택의 정보 제공 방법.
제4항에 있어서,
B형 간염 바이러스(HBV)는 테노포비어(Tenofovir)에 내성을 획득한 것인 HBV의 치료를 위한 약물 선택의 정보 제공 방법.
엔테카비어; HBV 캡시드 어셈블리 억제제; 또는 약제학적으로 허용가능한 이들의 염을 포함하는,
테노포비어를 투여한 후 B형 간염 바이러스의 역전사 효소(RT)의 106번째, 126번째 및 134번째 잔기의 아미노산이 각각 세린에서 시스테인으로, 히스티딘에서 티로신으로, 아스파틱산에서 글루탐산으로 치환된 B형 간염의 치료용 약학 조성물.
제8항에 있어서,
약학 조성물은 테노포비어를 투여한 후 B형 간염 바이러스의 역전사 효소(RT)의 269번째 잔기의 아미노산이 류신에서 이소류신으로 치환된 B형 간염을 추가로 치료할 수 있는, B형 간염의 치료용 약학 조성물.