WO2011140984A1 - 抗hbv的多肽、其药物组合物及应用 - Google Patents

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Description

抗 HBV的多肽、 其药物组合物及应用
技术领域
本申请涉及一种病毒感染阻断剂及其应用， 具体而言， 本申请涉及 N末端 和 C末端均修饰的可阻断 HBV感染的多肽。 背景技术
1. HBV的流行病学
HBV感染是全球最为严重的公共卫生问题之一，是仅次于性病和水痘的第 三常见疾病。 全球约有 20亿人感染过 HBV， 75 %的世界人口生活在乙型肝炎 高发区， 慢性 HBV感染者超过 3.5亿。 每年与 HBV感染相关的死亡人数高达 100万， 每年新增感染估计是 HIV新增感染的 2.5〜4倍。 世界上 75 %的 HBV 慢性感染者集中在亚洲 （约为 2.87亿） ， 中国是乙型肝炎的高流行区， 70年 代末、 90年代初和最近的三次全国肝炎流行病学调査的数据显示， 我国感染过 HBV者 6.9亿， 感染率为 57.6 %， 全国长期携带 HBV者 0.87亿， 现有的慢性 乙型肝炎患者 2000余万。
2. HBV感染的预防与治疗现状
HBV的重要性早已在世界范围内得到广泛公认，其预防和治疗也被置于优 先地位。 但迄今尚缺乏可清除体内 HBV 的药物， 疗效相对确切的抗病毒药物 主要是 α干扰素和核苷类似物（拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和特必夫定等）。 α干扰素主要通过免疫调节和诱生靶细胞内抗病毒蛋白而发挥抗病毒作用； 核 苷类似物则作用于 HBV逆转录酶， 抑制病毒 DNA链的合成， 从而抑制 HBV DNA的复制。经过 1年的标准疗程治疗，约 33%的 a干扰素治疗患者和约 16% 的拉米夫定治疗患者可获得彻底或部分血清学应答 （HBsAg 转阴、 HBeAg 均 转阴、 出现或不出现抗 -HBe抗体） 、 完全的病毒学应答 （HBV DNA转阴） 和 生化应答（丙氨酸氨基转移酶间隔 1个月连续 2次检测均正常， 肝功能复常）。
自从 1970年 Kmgman获得最早的乙型肝炎疫苗后， 各国相继利用无症状 HBsAg携带者的血浆提取血源性 HBsAg制备 HBV疫苗。 血源性 HBV疫苗经 过长期使用被证明安全有效， 但由于其来源有限， 制备成本高昂， 已被基因重 组 HBV疫苗取代。 目前主要的重组疫苗包括酵母和中国仓鼠卵巢细胞表达的 重组乙肝疫苗。 这些疫苗免疫原性强， 3针全程免疫后抗 HBsAg抗体阳转率不 低于 85 %。 但其主要缺点是抗体应答较迟， HBV感染产妇的新生儿初次免疫 若超过 7天以上，则失去 HBV疫苗对新生儿阻断垂直传播的作用。而且 10 %〜 15 %接种者不产生应答或低应答， 该人群仍可被 HBV感染。
乙型肝炎免疫球蛋白 (HBIG)系用经乙型肝炎疫苗免疫健康人后， 采集的高 效价血浆或血清分离提取制备的免疫球蛋白制剂， 其抗体效价在 100 IU/ml以 上。 适用于突发意外感染人群、 免疫功能低下者以及 HBV感染产妇新生儿的 被动免疫预防。 我国的慢性 HBV感染者约有 30%-50%通过母婴传播， 为阻断 HBV 母婴围产期传播， 普遍将 HBIG 与乙肝疫苗联合应用， 虽然保护率可达 80%以上， 但 HBIG提供的阻断贡献并不明显， 联合应用仅较乙肝疫苗单用提 高 5 %〜10 %的阻断率， 而且联合应用后 HBV感染产妇新生儿 HBV感染率仍 较健康产妇新生儿高 4倍。 近年发现， 宫内感染可能是母婴传播的重要途径， HBV感染孕妇引产胎儿肝脏或血液的 HBV感染标志检出率可达 40%， HBsAg 阳性母亲的婴儿的宫内感染率约 16%。 因此国内有些医院在妊娠的最后 3〜4 个月中对 HBV感染孕妇每月一次注射大于 200 IU的 HBIG，以期预防胎儿 HBV 宫内感染。但该方法宫内传播阻断效果并不理想， 且可能导致 HBV S区变异株 的出现和免疫复合物病理免疫反应的发生。
HBIG还广泛应用于乙型肝炎相关肝移植术后 HBV感染复发的预防。在没 有预防措施的情况下， 乙型肝炎相关肝移植术后 6个月内 HBV再感染率高达 约 4 0 % , 2年内再感染率高达约 6 0 %。 多数再感染病例历经急性、 慢性肝 炎而发展为肝硬化、 肝功能衰竭， 远期预后不佳， 需再次肝移植。 单独采用拉 米夫定预防肝移植术后乙型肝炎复发， 其长期 HBV-DNA、 HBeAg 及 HBsAg 转阴率约 60〜70%， 且易发生 HBV基因突变， YMDD耐药变异率高达 21%。 加之患者移植前多长期使用抗病毒药物， 多数出现抗病毒药物抵抗现象， 增加 了移植后病毒感染复发率和预防的难度。 因此国外加用大剂量 HBIG以预防乙 型肝炎相关肝移植术后乙肝复发。 肝移植术后没有接受 HBIG治疗的受者中， 术后早期体内出现不同滴度的 HBsAb，随后血清 HBsAb逐渐消失，而使用 HBIG 的患者血清 HBsAb能长期维持较高滴度。高剂量无限制性 HBIG单一治疗能阻 止 6 5 %〜 8 0 %患者复发， 但 HBIG价格昂贵， 费用每年高达约 130万元人 民币。 国内采用拉米夫定与小剂量 HBIG联合应用阻止移植后 HBV感染复发 的疗效虽然显示良好， 但未经大样本临床试验证实。 且长期应用 HBIG带来的 免疫压力会造成 HBV基因变异而出现免疫逃逸现象， 使 HBIG用于乙型肝炎 相关肝移植术后 HBV再感染的预防受到很大限制。
综上所述， 目前用于防治 HBV感染的手段主要限于核苷酸类似抑制物、 抗病毒细胞因子和中和性抗体的主动被动免疫， 缺少对 HBV病毒其他感染环 节的抑制手段。 本发明所涉及的多肽可与肝细胞结合， 直接阻断病毒对肝细胞 的感染， 为 HBV感染的治疗和预防提供新的手段。
3. 关于本发明公开的可阻断 HBV感染的多肽
HBV病毒包膜含有大 (； L；)、 中 (； M；)、 小 (； S)三种表面抗原蛋白， 这些蛋白由具 有 3个不同翻译起始位点的 S区基因单一开放阅读框编码， 即 L (Pre-S l+Pre S2+S ) 、 M ( Pre S2+S ) 和 S ( S ) 。 HBV的 L蛋白 Pre-Sl区存在与肝细胞特 异性受体结合的关键氨基酸序列， 本发明合成关键序列多肽， 并对其两端进行 修饰改造， 提高了多肽对 HBV感染阻断的效能， 增强了多肽的稳定性。 目前 治疗 HBV慢性感染的药物均作用于 HBV细胞内复制环节， 而本发明涉及的多 肽可高效直接抑制 HBV对细胞的感染， 且十分稳定， 为 HBV感染的防治提供 了优良的药用化合物。 发明内容
本发明涉及一种可阻断 HBV感染的多肽， 该多肽自 N端至 C端具有氨基 酸序列 SEQ ID NO: 1， 其 N端被疏水集团修饰， 其 C端被稳定化修饰。 在一 个实施例中， 所述多肽的 N端被豆蔻酰化修饰、 硬脂酸修饰、 棕榈酸修饰、 胆 固醇修饰， 其 C端被酰胺化 （Amidation, 氨基化） 修饰、 或异戊二醇化修饰。 其中 N端的疏水基团修饰可增强所述多肽阻断 HBV感染的效能， 而 C端的稳 定性修饰可增强所述多肽的稳定性。 本发明还涉及一种药物组合物， 它含有本 发明公开的多肽和药学上可接受的载体。 本发明还涉及所述多肽在制备预防和 /或治疗乙型肝炎的药剂中的用途。
具体而言， 本申请提供一种多肽， 该多肽选自：
( 1 ) SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； 或
(2 )在 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列基础上具有 1一 10个氨基酸取代、 缺失或插入、 并保持 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的阻断 HBV感染的活性的 氨基酸序列；
其中， 该多肽 N端带有疏水基团修饰且 C端被稳定化修饰。
在一具体实施例中， 所述多肽选自：
( 3 )在 SEQ ID NO: 1 -4任一所示的氨基酸序列基础上 N端和 /或 C端添 加 1一 10个天然侧翼氨基酸序列、并保持 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的阻断 HBV感染的活性的氨基酸序列； 或
(4 )在 SEQ ID NO: 1 -4任一所示的氨基酸序列基础上 N端和 /或 C端截 短 1一 3个氨基酸序列、 并保持 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的阻断 HBV感 染的活性的氨基酸序列。
在一具体实施例中， 所述的 N端疏水性修饰为豆蔻酰化修饰、 或硬脂酸修 饰、 或棕榈酸修饰、 或胆固醇修饰。
在一具体实施例中， 所述的 C端稳定化修饰为酰胺化修饰或异戊二醇化修 饰。
在一具体实施例中， 所述的 N端疏水性修饰为豆蔻酰化修饰， 所述的 C端 稳定化修饰为酰胺化修饰。
在一具体实施例中，所述多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2-12任一所示。 在一具体实施例中， 多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2-12任一所示， 所 述多肽的 N端为豆蔻酰化修饰、 C端为酰胺化修饰。
在一具体实施例中，所述多肽的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸 序列， 其 N端为豆蔻酰化修饰、 C端为酰胺化修饰。
本申请提供一种药物组合物， 该药物组合物含有本申请所述的多肽和药学 上可接受的载体。
在一具体实施例中，所述多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1 - 12中任一条 序列所述。
在一具体实施例中，所述药物组合物含有至少一条 SEQ ID NO: 1 - 12所示 的氨基酸序列。
在一具体实施例中，所述药物组合物中的多肽为 SEQ ID NO: 1所示的氨基 酸序列， 其 N端为豆蔻酰化修饰、 C端为酰胺化修饰。
在一具体实施例中，所述多肽的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸 序列， 其 N端为豆蔻酰化修饰、 C端为酰胺化修饰。 在一具体实施例中， 药物组合物中多肽的浓度为大于等于 20ng/ml， 优选 为大于等于 100ng/ml。
本申请还涉及所述的多肽在制备治疗 HBV感染用的药剂中的用途。
在一具体实施例中，所述多肽的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1一 12任一所示 的氨基酸序列， 其 N端为豆蔻酰化修饰、 C端为酰胺化修饰。
在一具体实施例中， 所述对象为已感染 HBV或可能感染 HBV的人。 附图说明
图 1显示具有 SEQ ID NO: 1氨基酸序列， C端酰胺化修饰， N端疏水基 团修饰的多肽对 HBV感染的阻断。
图 2显示具有 SEQ ID NO: 1氨基酸序列， N端豆蔻酰化修饰， C端稳定 化修饰的多肽的稳定性。
图 3显示具有 SEQ ID NO: 1氨基酸序列， N端豆蔻酰化修饰， C端稳定 化修饰的多肽对 HBV感染的阻断。
图 4显示氨基酸突变对 SEQ ID NO: 1 -4氨基酸序列多肽阻断 HBV感染 的影响和稳定性。
图 5显示具有 SEQ ID NO: 5— 8氨基酸序列， N端豆蔻酰化修饰， C端 酰胺化修饰的多肽对 HB V感染的阻断和稳定性。
图 6显示具有 SEQ ID NO: 9— 12氨基酸序列， N端豆蔻酰化修饰， C端 酰胺化修饰的多肽对 HBV感染的阻断。 具体实施方式
如上所述， 本发明提供了一种可抑制 HBV感染的多肽。 该多肽自 N端至 C端具有 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列， 其 N端带有疏水基团修饰， 其 C端 被稳定化修饰。以上所述的 N端疏水基团修饰，这些疏水基团优选地是豆蔻酸、 棕榈酸、 硬脂酸、 油酸、 亚油酸、 胆固醇、 花生四烯酸及其类似基团。 进一步 优选地为豆蔻酸、 棕榈酸、 硬脂酸或胆固醇， 更优选地为豆蔻酸。 以上所述的 C端稳定化修饰， 这些稳定化修饰包括酰胺化修饰 （即氨基化修饰） 、 异戊二 醇化修饰及其他多肽 C端稳定化修饰。优选地为酰胺化修饰（即氨基化修饰）。
在本发明的一个优选方案中， 序列为 SEQ ID NO: 1的多肽的 C末端经酰 胺化修饰， 而其 N末端分别进行了豆蔻酰化、 硬脂酸、 棕榈酸和胆固醇修饰， 其中优选地 N端豆蔻酰化修饰的多肽具有更高的病毒感染抑制活性。在另外一 个优选方案中， 序列为 SEQ ID NO: 1的多肽的 N末端经豆蔻酰化修饰， 而其 C末端分别进行了酰胺化修饰和异戊二醇化修饰， 其中优选地 C端酰胺化修饰 的多肽具有更高的病毒感染抑制活性和优良的稳定性。 因此在本发明的进一步 优选方案中， 序列为 SEQ ID NO: 1的多肽的 C末端经酰胺化修饰， 而且 N末 端进行了豆蔻酰化修饰。
本申请所涉及多肽的任何同系物均为本申请的一部分,包括经过一个或多 个氨基酸突变， 如包括 1-10个氨基酸、较佳 1-8个氨基酸、 更佳 1-5个氨基酸、 更佳 1-3个氨基酸的删除、保守 /非保守氨基酸替换、或插入而获得的多肽序列。 这里的 "同系物" 还包括与本申请涉及多肽具有大于 30% (如 40 %、 50 %、 60%、 70 %、 80 %、 85 %、 90%、 95 %或更大） 同源性的多肽。 在本发明的一 个优选方案中， 对序列为 SEQ ID NO: 1的多肽进行 1一 3个氨基酸的突变获得 的多肽序列 （SEQ ID NO: 2-4 ) 。
具体而言，氨基酸一般被分成四类：（1) 酸性——天冬氨酸和谷氨酸；（2) 碱 性 赖氨酸、 精氨酸、 组氨酸； （3) 非极性 丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 脯氨酸、 苯丙氨酸、 甲硫氨酸、 色氨酸； （4) 无电荷的极性 甘 氨酸、 天冬酰胺、 谷氨酰胺、 半胱氨酸、 丝氨酸、 苏氨酸、 酪氨酸。 有时将苯 丙氨酸、 色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。 例如， 有理由预测： 单独用异亮氨 酸或缬氨酸取代亮氨酸、 用谷氨酸取代天冬氨酸、 用丝氨酸取代苏氨酸， 或者 用结构上相关的氨基酸取代类似的保守的氨基酸， 这样的替代将不会对生物活 性有重要影响。
或者， 可在 SEQ ID NO: l的 N和 /或 C末端添加 1一 10个、 优选 1一 8个、 更优选 1一 5个、 更优选 1一 3个天然侧翼氨基酸序列。 所述 "天然侧翼氨基酸 序列"来源于 HBV基因型 C的 Consensus序列， 以 NCBI gene bank AF461363 公布的毒株序列为参考。其中， SEQ ID NO:6的第 2-11位显示了所述 N末端的 "天然侧翼氨基酸序列" ； 而 SEQ ID NO:8的第 48-57显示了所述的 C末端的 "天然侧翼氨基酸序列" 。 应理解， 本发明 SEQ ID ΝΟ: 1-4任一序列在 N和 / 或 C末端延伸出存在任意长度上述 "天然侧翼氨基酸序列" ， 所得的氨基酸序 列都能保留或部分保留 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的阻断 HBV感染的活 性。
同样， 本发明也包括删除 SEQ ID ΝΟ: 1-4任一序列 1-3个 N和 /或 C末端 氨基酸， 所得氨基酸也能部分保留 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的阻断 HBV 感染的活性。 本文中， "部分保留" 指保留例如至少 40%、 优选至少 50 %、 更优选至少 60 %、 更优选至少 70 %、 更优选至少 80 %、 更优选至少 90%、 更 优选至少 95 %的 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的阻断 HBV感染的活性。
示例性的这类氨基酸的例子包括但不限于 SEQ ID NO:5— 12中任一条氨基 酸序列所示。 如前文所述， 可对这些序列的 N和 /或 C末端进行修饰。
本申请还包括将提供的多肽用作阻断或防止 HBV感染的药物以及与适当 药学上可接受的载体组成的药物制剂。 本申请还包括含有所述多肽的药物组合 物。
本发明的药物制剂或药物组合物含有有效量的本发明多肽。 如本文所用， 所述 "有效量" 是指可对人和 /或动物产生功能或活性的且可被人和 /或动物所 接受的量。例如， 对于液体制剂或组合物而言， 所述多肽的浓度可以为 20ng/ml 以上， 例如 50ng/ml以上、 80ng/ml以上、 100ng/ml以上或更高。
所述 "药学上可接受的载体" 指用于治疗剂给药的载体， 包括各种赋形剂 和稀释剂。 该术语指这样一些药剂载体： 它们本身并不是必要的活性成分， 且 施用后没有过分的毒性。 合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。 在组合 物中药学上可接受的载体可含有液体， 如水、 盐水、 缓冲液。 另外， 这些载体 中还可能存在辅助性的物质， 如填充剂、 润滑剂、 助流剂、 润湿剂或乳化剂、 pH缓冲物质等。
可采用本领域各种常规的合适方式给予对象本发明的药物组合物或药物 制剂， 所述方式包括但不限于： 口服、 皮下注射、 肌肉注射、 经皮给予、 局部 给予、 植入、 缓释给予等。
本申请也包括以所提供的多肽作为治疗或预防 HBV感染的措施， 以及涉 及本申请多肽在内的患者所需要的任何预防、 治疗措施。 本申请特别包含本申 请多肽体内抑制 HBV感染的预防和治疗措施， 其中包括阻止 HBV传播到生物 体未受感染的细胞中。 这里的预防措施是指降低或避免患者感染 HBV 的可能 性， 治疗措施是指改善或稳定患者状况的所有措施。所指的患者是任何被 HBV 感染、 可能被 HBV感染和可能即将被 HBV感染的人。
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条 件。 实施例一： 具有 SEQ ID NO: 1氨基酸序列， C端酰胺化修饰， N端疏水 基团修饰的多肽对 HBV感染的阻断
1、 多肽的制备和修饰
以 AB 431A型多肽合成仪按标准 Fmoc方案， 以 0.25mM 树脂起始， 按照 SEQ ID NO: 1序列自羧基端向氨基端逐个残基延伸合成， 最后添加疏水集团 修饰。 肽合成结束后， 经切割液切割， G6玻砂漏斗滤除树脂， 滤液真空抽干， 多肽的 C末端进一步酰胺化。 无离子水溶解多肽产物， AKTA explorer 100型 中压液相色谱仪 C18柱纯化， 分步收集主峰。 目标峰收集样以 Delta 600型反 相高压液相色谱 Symmetry C18分析柱纯度鉴定， API 2000 LC/MS/MS型质谱 仪分子量鉴定。 中压液相色谱纯化所得的收集液冻干， 溶于 PBS 形成多肽储 存液， 0.20 μ Μ过滤除菌， -80°C冻存。
2、 树齣原代肝细胞的培养
树鼠句麻醉后经门静脉插管， 按照 BD公司肝细胞培养基使用手册提供的经 典两步灌注法消化肝脏组织， 分离原代肝细胞， 经洗涤后铺板于肝细胞培养板 (BD公司产品 BD354408 ) ,采用肝细胞培养基培养（BD公司产品 BD355056) , 每 3天更换培养基， 37度、 5 %二氧化碳环境培养。
3、 HBV病毒对肝细胞的感染。
将我国临床收集的混合的 HBV感染患者的病毒血清 2 ml加入培养 3天的 树鼠句原代肝细胞， 37°C孵育感染 12 小时。 感染完成后移除感染血清， 洗涤细 胞 3次， 补充新鲜培养基连续培养 12天。
4、 HBV感染后肝细胞培养上清 HBsAg的检测
培养上清中的 HBsAg通过三明治夹心法 （in-house sandwich) 酶联免疫分 析 （ELISA) 检测。 1 ug /ml抗 HBsAg单克隆抗体 37°C包被 96孔板 2小时。 充分洗涤后 （0.1% Tween 20 PBS洗涤 3次、 PBS洗涤 2次） ， 10 %胎牛血清 37°C封闭 1小时。 去除封闭液， 加入 HBV感染的肝细胞培养上清 100 μ 1 4°C 孵育 12小时。 去除培养上清， 充分洗涤， 加入过氧化物酶偶联的抗 HBsAg 抗 体 37°C孵育 1小时。 去除多余抗体， 加入苯二胺 -H2O2反应底物室温反应 15分 钟， 2N H2SO4中止反应， 测定反应产物的 OD492, 计算感染上清中 HBsAg含
5、 具有 SEQ ID NO: 1氨基酸序列、 C端酰胺化修饰、 N端疏水基团修饰 的多肽对 HBV感染的阻断
树鼠句原代肝细胞于 24孔培养板中培养 3天， 在 HBV病毒感染的同时， 在 感染上清中加入不同 N端修饰的多肽各 20ng/ml， 共同孵育 12小时。 移除感染 上清， 洗涤细胞 3次。 继续培养 12天后检测肝细胞培养上清中 HBsAg含量。 如图 1A所示， 以未受多肽处理肝细胞的 HBV感染为对照， 带有 N端不同疏 水基团修饰的多肽对 HBV感染肝细胞具有不同程度的阻断效应， 其中 N末端 为豆蔻酸修饰、 硬脂酸修饰、 棕榈酸修饰、 胆固醇修饰和 N末端无修饰的多肽 分别可抑制 HBV对肝细胞感染的 57.4 %、 49.2 %、 46.8 %43.2 %和 9.7%。 可 见， N末端为豆蔻酸修饰的多肽具有较高的 HBV感染抑制效应， 且 FITC荧光 标记的 N、 C末端为豆蔻酸和酰胺化修饰的 SEQ ID NO: 1多肽可与原代肝细 胞结合 （图 1B ) 。 实施例二： 具有 SEQ ID NO: 1氨基酸序列， N端豆蔻酰化修饰， C端稳 定化修饰的多肽的稳定性
1、 多肽的制备和修饰
以 AB 431A型多肽合成仪按标准 Fmoc方案， 以 0.25mM 树脂起始， 按照 SEQ ID NO: 1序列自羧基端向氨基端逐个残基延伸合成， 最后豆蔻酸修饰。 肽合成结束后， 经切割液切割， G6玻砂漏斗滤除树脂， 滤液真空抽干， 多肽的 C末端进一步酰胺化、 或异戊二醇化修饰、 或 C端不修饰。 无离子水溶解多肽 产物， AKTA explorer 100型中压液相色谱仪 C18柱纯化， 分步收集主峰。 目 标峰收集样以 Delta 600型反相高压液相色谱 Symmetry C18分析柱纯度鉴定， API 2000 LC/MS/MS型质谱仪分子量鉴定。 中压液相色谱纯化所得的收集液冻 干， 溶于 PBS形成多肽储存液， 0.20 μ Μ过滤除菌， -80°C冻存。
2、 多肽的稳定性 多肽溶于 0.02MPBS, 形成 0.25mg/ml浓度溶液， 置于 37度放置 3天。 采 用 LunaC18， 150X4.6mm， 5μ， 100Α色谱柱， 采用 Delta 600型反相高压液 相色谱仪分别进行 HPLC纯度分析。 如图 2所示， N端均经豆蔻酰化修饰， 而 C末端分别酰胺化修饰、 异戊二醇化修饰和 C末端未修饰的多肽 37度放置前 纯度分别为 98.2%、 98.7%和 98.3% (图 2A) ； 37度放置 12小时后纯度分别 为 95.4%、 95.6%和 95.5% (图 2B) ； 37度放置 3天后纯度分别降低至 83.9%、 87.7%和 43.9% (图 2C) 。 可见 C端未修饰的多肽缺乏稳定性， 而经 C端酰 胺化修饰和异戊二醇化修饰后多肽稳定性明显增加。 实施例三： 具有 SEQ ID NO: 1氨基酸序列， N端豆蔻酰化修饰， C端稳 定化修饰的多肽对 HB V感染的阻断
1、 多肽的制备和修饰 （同实例二） 。
2、 树齣原代肝细胞的培养和 HBV病毒的感染 （同实施例一）
3、 HBV感染后肝细胞培养上清 HBsAg的检测 （同实施例一）
4、 具有 SEQIDNO: 1氨基酸序列， N端豆蔻酰化修饰， C端稳定化修饰 的多肽对 HBV感染的阻断
1) 多肽低浓度下对 HBV感染的阻断效应： 树齣原代肝细胞于 24孔培养 板中培养 3天， 在 HBV病毒感染的同时， 在感染上清中加入不同 C端修饰的 多肽各 20ng/ml， 共同孵育 12小时。 移除感染上清， 洗涤细胞 3次。 继续培养 12天后检测肝细胞培养上清中 HBsAg含量。如图 3A所示， 以未受多肽处理肝 细胞的 HBV感染为对照， N末端均被豆蔻酰化修饰而 C端带有不同稳定化修 饰和 C端未修饰的多肽对 HBV感染肝细胞具有不同程度的阻断效应， 其中 C 末端为酰胺化修饰、 异戊二醇化修饰和 C端未修饰的多肽分别可抑制 HBV对 肝细胞感染的 55.9%、 42.4%和 57.3%。 可见， 在低浓度条件下 C末端酰胺修 饰多肽与 C端未修饰多肽对 HBV感染的阻断效应相当， 而 C末端异戊二醇化 修饰则影响多肽对病毒感染的阻断效应。
2) 多肽高浓度下对 HBV感染的阻断效应： 树齣原代肝细胞于 24孔培养 板中培养 3天， 在 HBV病毒感染的同时， 在感染上清中加入不同 C端修饰的 多肽各 100ng/ml， 共同孵育 12小时。 移除感染上清， 洗涤细胞 3次。 继续培 养 12天后检测肝细胞培养上清中 HBsAg含量。 如图 3B所示， 以未受多肽处 理肝细胞的 HBV感染为对照， N末端均被豆蔻酰化修饰而 C端为酰胺化修饰、 异戊二醇化修饰和 C端未修饰的多肽对 HBV感染肝细胞具有不同程度的阻断 效应， 其中 C末端为酰胺化修饰、异戊二醇化修饰和 C端未修饰的多肽分别可 抑制 HBV对肝细胞感染的 95.1 %、 60.9 %和 81.5 %。 可见， C末端异戊二醇化 修饰阻断 HBV效应仍不及 C端未修饰的多肽。 而出乎意料地， C末端酰胺化 修饰的多肽在高浓度时较 C端未修饰的多肽阻断 HBV效应明显提高。 这种增 强效应可能存在两方面原因： 1)多肽经酰胺化修饰后， 半衰期延长， 使试验阻 断时间（12小时）内的多肽有效浓度增加。但实施例二中稳定性的研究却显示， 12小时末 C端未修饰与 C端酰胺化修饰的多肽相比， 降解无差别。 因此不能 用半衰期优势解释高浓度条件下 C端酰胺化修饰对多肽病毒阻断能力的增强作 用。 2) C端酰胺化修饰增强了多肽的某些生物学性状（如分子空间结构、 亲疏 水性、 高浓度条件下的多聚体等） ， 更适合与 HBV竞争， 进而增强了多肽阻 断感染的效应。 但由于目前该多肽的生物学性状尚不了解， 因此无法预料和解 释高浓度条件下 C端酰胺化修饰对多肽病毒阻断能力的增强作用。 实施例四：氨基酸突变对 SEQ ID NO: 1氨基酸序列多肽阻断 HBV感染的 影响
1、 多肽的制备和修饰
以 AB 431A型多肽合成仪按标准 Fmoc方案， 以 0.25mM 树脂起始， 按照 SEQ ID NO: 2— 4序歹 ϋ (分别带有 1个突变 F13L， 2个突变 F13L、 H39Q和 3 个突变 F13L、 H39Q、 N44D) 自羧基端向氨基端逐个残基延伸合成， 最后豆蔻 酸修饰。肽合成结束后， 经切割液切割， G6玻砂漏斗滤除树脂， 滤液真空抽干， 多肽的 C末端进一步酰胺化修饰。 无离子水溶解多肽产物， AKTA explorer 100 型中压液相色谱仪 C18柱纯化， 分步收集主峰。 目标峰收集样以 Delta 600型 反相高压液相色谱 Symmetry C18分析柱纯度鉴定， API 2000 LC/MS/MS型质 谱仪分子量鉴定。 中压液相色谱纯化所得的收集液冻干， 溶于 PBS 形成多肽 储存液， 0.20 μ Μ过滤除菌， -80°C冻存。
2、 树齣原代肝细胞的培养和 HBV病毒的感染 （同实施例一） 。
3、 HBV感染后肝细胞培养上清 HBsAg的检测 （同实施例一） 。
4、 具有 SEQ ID NO: 1— 4氨基酸序列， N端豆蔻酰胺化修饰， C端酰胺 化修饰的多肽对 HBV感染的阻断
1 ) 树齣原代肝细胞于 24孔培养板中培养 3天， 在 HBV病毒感染的同时， 在感染上清中加入 SEQ ID NO: 1-4序列的多肽各 20ng/ml，共同孵育 12小时。 移除感染上清，洗涤细胞 3次。继续培养 12天后检测肝细胞培养上清中 HBsAg 含量。如图 4A所示， 以未受多肽处理肝细胞的 HBV感染为对照， SEQIDNO: 1-4序列的多肽分别可抑制 HBV对肝细胞感染的 56.7%、 55.9%、 59.3%和 52.6%。 可见， 1一 3个氨基酸序列的突变不影响 SEQIDNO: 1序列的多肽阻 断 HBV感染的效应。
2) 树齣原代肝细胞于 24孔培养板中培养 3天， 在 HBV病毒感染的同时， 在感染上清中加入 SEQIDNO: 1— 4序列的多肽各 100ng/ml， 共同孵育 12小 时。 移除感染上清， 洗涤细胞 3 次。 继续培养 12天后检测肝细胞培养上清中 HBsAg含量。 如图 4B所示， 以未受多肽处理肝细胞的 HBV感染为对照， SEQ ID NO: 1一 4序列的多肽分别可抑制 HBV对肝细胞感染的 94.7%、 96.2%、 95.7 %和 93.9%。 可见， 1一 3个氨基酸序列的突变不影响 SEQ ID NO: 1序列的 多肽阻断 HBV感染的效应。
5、 突变多肽的稳定性
多肽溶于 0.02MPBS, 形成 0.25mg/ml浓度溶液， 置于 37度放置 3天。 采 用 LunaC18， 150X4.6mm， 5μ， 100Α色谱柱， 采用 Delta 600型反相高压液 相色谱仪分别进行 HPLC纯度分析。 SEQ ID NO: 1一 4多肽 37度放置前纯度 分别为 98.2%、 98.9%、 98.6%和 98.8%， 如图 4C所示， 37度放置 3天后纯度 分别降低至 83.9%、 84.1%、 82.7%和 83.2%。 可见， 1一 3个氨基酸序列的突变 不影响 SEQIDNO: 1序列的多肽稳定性。 实施例五： 两端添加自然侧翼序列对 SEQ IDNO: 1氨基酸序列多肽阻断 HBV感染的影响
1、 多肽的制备和修饰
以 AB431A型多肽合成仪按标准 Fmoc方案， 以 0.25mM 树脂起始， 按照 SEQIDNO: 5— 8序列 （分别带有 N端 6个氨基酸天然侧翼氨基酸序列、 N端 10个氨基酸天然侧翼氨基酸序列、 C端 5个氨基酸天然侧翼氨基酸序列和 C端 10个氨基酸天然侧翼氨基酸序列。 天然侧翼氨基酸序列来源于 HBV基因型 C 的 Consensus序列， 以 NCBI gene bank AF461363公布的毒株序列为参考） 。 自羧基端向氨基端逐个残基延伸合成， 最后豆蔻酸修饰 （其中 SEQ ID NO: 5 的 N端为添加一个甘氨酸 G后进行豆蔻酸修饰） 。 肽合成结束后， 经切割液切 割， G6玻砂漏斗滤除树脂， 滤液真空抽干， 多肽的 C末端进一步酰胺化修饰。 无离子水溶解多肽产物， AKTA explorer 100型中压液相色谱仪 C18柱纯化， 分步收集主峰。 目标峰收集样以 Delta 600型反相高压液相色谱 Symmetry C18 分析柱纯度鉴定， API 2000 LC/MS/MS型质谱仪分子量鉴定。 中压液相色谱纯 化所得的收集液冻干， 溶于 PBS 形成多肽储存液， 0.20 μΜ 过滤除菌， -80 °C冻存。
2、 树齣原代肝细胞的培养和 HBV病毒的感染 （同实施例一） 。
3、 HBV感染后肝细胞培养上清 HBsAg的检测 （同实施例一） 。
4、 具有 SEQ ID NO: 5— 8氨基酸序列， N端豆蔻酰胺化修饰， C端酰胺 化修饰的多肽对 HBV感染的阻断
1) 树齣原代肝细胞于 24孔培养板中培养 3天， 在 HBV病毒感染的同时， 在感染上清中加入 SEQ IDNO:5— 8序列的多肽各 20ng/ml，共同孵育 12小时。 移除感染上清，洗涤细胞 3次。继续培养 12天后检测肝细胞培养上清中 HBsAg 含量。如图 5A所示， 以未受多肽处理肝细胞的 HBV感染为对照， SEQIDNO: 5-8序列的多肽分别可抑制 HBV对肝细胞感染的 58.3%、 70.5%、 57.0%和 62.4%。
2) 树齣原代肝细胞于 24孔培养板中培养 3天， 在 HBV病毒感染的同时， 在感染上清中加入 SEQIDNO: 5— 8序列的多肽各 100ng/ml， 共同孵育 12小 时。 移除感染上清， 洗涤细胞 3 次。 继续培养 12天后检测肝细胞培养上清中 HBsAg含量。 如图 5B所示， 以未受多肽处理肝细胞的 HBV感染为对照， SEQ ID NO: 5-8序列的多肽分别可抑制 HBV对肝细胞感染的 96.2%、 94.3 %、 92.5 %和 96.1%。
3) 树齣原代肝细胞于 24孔培养板中培养 3天， 在 HBV病毒感染的同时， 在感染上清中加入 SEQ IDNO:5— 8序列的多肽各 60ng/ml，共同孵育 12小时。 移除感染上清，洗涤细胞 3次。继续培养 12天后检测肝细胞培养上清中 HBsAg 含量。如图 5C所示， 以未受多肽处理肝细胞的 HBV感染为对照， SEQIDNO: 1、 5— 8序列的多肽分别可抑制 HBV对肝细胞感染的 65.7%、 64.4%、 91.3%、 62.5%和 75.6%。 可见， N或 C端添加天然侧翼序列的 SEQ ID NO: 6、 8在中 等浓度条件下显示出增强 SEQIDNO: 1序列的多肽阻断 HBV感染的效应。
5、 侧翼延长多肽的稳定性
多肽溶于 0.02MPBS, 形成 0.25mg/ml浓度溶液， 置于 37度放置 3天。 采 用 LunaC18， 150X4.6mm， 5μ， 100A色谱柱， 采用 Delta 600型反相高压液 相色谱仪分别进行 HPLC纯度分析。 SEQ ID NO: 5— 8多肽 37度放置前纯度 分别为 98.3%、 98.5%、 98.2%和 98.9%， 如图 5D所示， 37度放置 3天后纯度 分别降低至 72.3%、 80.1%、 84.2%和 70.7%。 实施例六：两端序列截短对 SEQ ID NO: 1氨基酸序列多肽阻断 HBV感染 的影响
1、 多肽的制备和修饰
以 AB431A型多肽合成仪按标准 Fmoc方案， 以 0.25mM 树脂起始， 按照 SEQ ID NO: 9一 12序列 （分别缺失： N端 3个氨基酸序列、 N端 6个氨基酸 序列、 C端 3个氨基酸序列和 C端 6个氨基酸序列） 。 自羧基端向氨基端逐个 残基延伸合成， 最后豆蔻酸修饰 （其中 SEQ ID NO: 9和 10的 N端为添加一 个甘氨酸 G后进行豆蔻酸修饰） 。 肽合成结束后， 经切割液切割， G6玻砂漏 斗滤除树脂， 滤液真空抽干， 多肽的 C末端进一步酰胺化修饰。 无离子水溶解 多肽产物， AKTA explorer 100型中压液相色谱仪 C18柱纯化， 分步收集主峰。 目标峰收集样以 Delta 600型反相高压液相色谱 Symmetry C18分析柱纯度鉴 定， API 2000 LC/MS/MS型质谱仪分子量鉴定。 中压液相色谱纯化所得的收集 液冻干， 溶于 PBS形成多肽储存液， 0.20 μΜ过滤除菌， -80°C冻存。
2、 树齣原代肝细胞的培养和 HBV病毒的感染 （同实施例一） 。
3、 HBV感染后肝细胞培养上清 HBsAg的检测 （同实施例一） 。
4、 具有 SEQIDNO: 9— 12氨基酸序列， N端豆蔻酰胺化修饰， C端酰胺 化修饰的多肽对 HBV感染的阻断
1) 树齣原代肝细胞于 24孔培养板中培养 3天， 在 HBV病毒感染的同时， 在感染上清中加入 SEQIDNO: 9— 12序列的多肽各 20ng/ml， 共同孵育 12小 时。 移除感染上清， 洗涤细胞 3 次。 继续培养 12天后检测肝细胞培养上清中 HBsAg含量。 如图 6A所示， 以未受多肽处理肝细胞的 HBV感染为对照， SEQ ID NO: 9一 12序列的多肽分别可抑制 HBV对肝细胞感染的 45.1%、 30.8%、 44.6%和 35.9%。 可见， N或 C端序列截短大于 3个氨基酸明显减弱 SEQ ID NO: 1序列的多肽阻断 HBV感染的效应。
2) 树齣原代肝细胞于 24孔培养板中培养 3天， 在 HBV病毒感染的同时， 在感染上清中加入 SEQ ID NO: 9-12序列的多肽各 100ng/ml， 共同孵育 12 小时。 移除感染上清， 洗涤细胞 3 次。 继续培养 12天后检测肝细胞培养上清 中 HBsAg含量。 如图 6B所示， 以未受多肽处理肝细胞的 HBV感染为对照， SEQIDNO: 9— 12序列的多肽分别可抑制 HBV对肝细胞感染的 80.3%、 62.4 %、 81.4%禾卩 66.3%。 N或 C端序列截短大于 3个氨基酸明显减弱 SEQ ID NO: 1序列的多肽阻断 HBV感染的效应。
5、 截短多肽的稳定性
多肽溶于 0.02MPBS, 形成 0.25mg/ml浓度溶液， 置于 37度放置 3天。 采 用 LunaC18， 150X4.6mm， 5μ， 100Α色谱柱， 采用 Delta 600型反相高压液 相色谱仪分别进行 HPLC纯度分析。 SEQIDNO: 9— 12多肽 37度放置前纯度 分别为 98.6%、 98.4%、 98.0%和 98.5%， 如图 6C所示， 37度放置 3天后纯度 分别降低至 80.3%、 81.6%、 74.2%和 87.7%。 可见， 截短 N端或 C端 6个氨 基酸序列后， SEQIDNO: 11多肽的稳定性有所降低； 其他序列对多肽稳定性 没有明显影响。 实施例七： 具有 SEQIDNO: 5— 8、 9、 11氨基酸序列， C端酰胺化修饰，
N端疏水基团修饰的多肽对 HBV感染的阻断
1、 多肽的制备和修饰 （同实施例一）
2、 树齣原代肝细胞的培养 （同实施例一）
3、 HBV病毒对肝细胞的感染。 （同实施例一）
4、 HBV感染后肝细胞培养上清 HBsAg的检测 （同实施例一）
5、 具有 SEQIDNO: 5— 8、 9、 11氨基酸序列、 C端酰胺化修饰、 N端疏 水基团修饰的多肽对 HBV感染的阻断。 结果显示， N末端为豆蔻酸修饰的多 肽具有较高的 HBV感染抑制效应。 实施例八： 具有 SEQ IDNO: 5— 8、 9、 11氨基酸序列， N端豆蔻酰化修 饰， C端稳定化修饰的多肽的稳定性
1、 多肽的制备和修饰 （同实施例二）
2、 多肽的稳定性 （同实施例二）
多肽溶于 0.02MPBS, 形成 0.25mg/ml浓度溶液， 置于 37度放置 3天。 采 用 LunaC18， 150X4.6mm， 5μ， 100Α色谱柱， 采用 Delta 600型反相高压液 相色谱仪分别进行 HPLC纯度分析。结果显示， C端未修饰的多肽缺乏稳定性， 而经 c端酰胺化修饰和异戊二醇化修饰后多肽稳定性明显增加。 实施例九： 具有 SEQ ID NO: 5— 8、 9、 11氨基酸序列， N端豆蔻酰化修 饰， C端稳定化修饰的多肽对 HBV感染的阻断
1、 多肽的制备和修饰 （同实施例二） 。
2、 树齣原代肝细胞的培养和 HBV病毒的感染 （同实施例一）
3、 HBV感染后肝细胞培养上清 HBsAg的检测 （同实施例一）
4、 具有 SEQ ID NO: 5— 8、 9、 11氨基酸序列， N端豆蔻酰化修饰， C端 稳定化修饰的多肽对 HBV感染的阻断。 试验过程同实例三。 结果显示， 在低 浓度条件下 C末端酰胺修饰多肽与 C端未修饰多肽对 HBV感染的阻断效应相 当， 而 C末端异戊二醇化修饰则影响多肽对病毒感染的阻断效应。 在高浓度条 件下， C末端异戊二醇化修饰阻断 HBV效应仍不及 C端未修饰的多肽。 C末 端酰胺化修饰的多肽在高浓度时较 C端未修饰的多肽阻断 HBV效应明显提高。 上述具体实施例仅仅是阐述性的， 而非限制性的。 本申请的保护范围将由 权利要求来限定。 本领域技术人员将理解， 在不偏离本发明的精神和范围的情 况下， 可对本发明的技术方案作出各种修改和变动， 这些修改和变动依然包括 在本发明的范围之内。

Claims

1. 一种多肽， 选自：
( 1 ) SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列； 或
(2 )在 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列基础上具有 1一 10个氨基酸取代、 缺失或插入、 并保持 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的阻断 HBV感染的活性的 氨基酸序列； 或
( 3 )在 SEQ ID NO: 1 -4任一所示的氨基酸序列基础上 N端和 /或 C端添 加 1一 10个天然侧翼氨基酸序列、并保持部分 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的 阻断 HBV感染的活性的氨基酸序列； 或
(4 )在 SEQ ID NO: 1 -4任一所示的氨基酸序列基础上 N端和 /或 C端截 短 1一 3个氨基酸序列、并保持部分 SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的阻断 HBV 感染的活性的氨基酸序列；
其中， 该多肽 N端带有疏水基团修饰且 C端被稳定化修饰。
2. 如权利要求 1所述的多肽， 其特征在于， 所述的 N端疏水性修饰为豆 蔻酰化修饰、 或硬脂酸修饰、 或棕榈酸修饰、 或胆固醇修饰。
3. 如权利要求 1所述的多肽， 其特征在于， 所述的 C端稳定化修饰为酰 胺化修饰、 或异戊二醇化修饰。
4. 权利要求 1所述的多肽， 其特征在于， 所述的 N端疏水性修饰为豆蔻 酰化修饰、 所述的 C端稳定化修饰为酰胺化修饰。
5.权利要求 1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2- 12所示。
6. 如权利要求 5所述的多肽， 其特征在于， 所述多肽的 N端为豆蔻酰化 修饰、 C端为酰胺化修饰。
7. 如权利要求 1所述的多肽， 其特征在于， 所述多肽的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列， 其 N端为豆蔻酰化修饰、 C端为酰胺化修饰。
8. 一种药物组合物， 其特征在于， 它含有权利要求 1-7中任一项所述的多 肽和药学上可接受的载体。
9. 权利要求 1-7中任一项所述的多肽在制备治疗 HBV感染用的药剂中的 用途。
10.如权利要求 9所述的用途，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1— 12任一所示的氨基酸序列， 其 N端为豆蔻酰化修饰、 C端为酰胺化 修饰。
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