KR20180039739A

KR20180039739A - 융합 단백질

Info

Publication number: KR20180039739A
Application number: KR1020187009430A
Authority: KR
Inventors: 루돌프 발렌타; 카롤린 크르넬리우스
Original assignee: 비라백스 아게
Priority date: 2015-09-05
Filing date: 2016-09-05
Publication date: 2018-04-18
Also published as: RU2748643C2; US20220048955A1; CN108472356A; EP3344292A1; RU2018112060A3; AU2016316811A1; JP6830955B2; US20180244726A1; PH12018500468A1; ZA201801394B; RU2018112060A; UA126059C2; CN108472356B; AU2016316811B2; WO2017037280A1; MX2018002616A; EP3138579A1; ES2860803T3; CA2997511C; EP3344292B1

Abstract

본 발명은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 및 SEQ ID No. 4로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 적어도 80% 상동성을 가진 아미노산 서열로 구성된 적어도 하나의 펩타이드에 융합된 적어도 하나의 B형 간염 PreS 폴리펩타이드 또는 그것의 단편을 포함하는 B형 간염 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 융합 단백질에 관한 것이다.

Description

융합 단백질

본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 융합 단백질에 관한 것이다.

B형 간염은 B형 간염 바이러스에 의해 야기되는 간 질환이다. 이 질환은 전 세계적으로 매년 수백만명의 사람에게 영향을 미친다. HBV는 감염된 사람의 혈액과 체액에 존재하며, 따라서 이들 체액과 건강한 사람의 체액이 접촉함으로써 전파될 수 있다.

HBV는 주로 간세포에서 복제됨으로써 간의 기능을 방해한다. HBV 감염 동안 숙주 면역반응은 간세포 손상과 바이러스 청소를 둘 다 야기한다.

대부분의 사람은 자발적으로 감염을 청소할 수 있기 때문에 급성 HBV 감염은 보통은 치료되지 않는다. 그러나, 만성 HBV 감염은 간경변 및 간암의 위험을 줄이기 위해 치료되어야 한다. HBV 감염의 치료에서 현재 사용되는 항바이러스 약물은 라미부딘, 아데포비르, 테노포비르, 텔비부딘 및 엔테카비르를 포함한다. 더욱이, 면역시스템 조정제로서 작용하는 인터페론 알파-2a가 또한 치료에 사용될 수 있다. 그러나, 이들 약물 중 어느 것도 HBV 감염을 청소할 수 없다. 이들 약물은 HBV가 복제하는 것을 멈추게 함으로써 간 손상을 최소화할 수 있을 뿐이다.

본 발명의 목적은 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에서 현재 HBV 치료의 단점을 극복한 새로운 수단을 제공하는 것이다. 특히 중요한 목적은 효과적인 체액 및 세포 면역반응의 회복에 의한 만성 감염 환자에서 HBV의 바이러스 청소이다.

이들 목적은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 및 SEQ ID No. 4로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 적어도 80% 상동성을 가진 아미노산 서열로 구성된 적어도 하나의 펩타이드에 융합된 적어도 하나의 B형 간염 PreS 폴리펩타이드 또는 그것의 단편을 포함하는 B형 간염 바이러스의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 융합 단백질에 의해 달성된다.

놀랍게도, B형 간염 PreS 폴리펩타이드 또는 그것의 단편 및 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 및 SEQ ID No. 4로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 적어도 80% 상동성을 가진 아미노산 서열로 구성된 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 융합 단백질은 PreS 단독 또는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 및 SEQ ID No. 4와 상이한 펩타이드를 포함하는 다른 융합 단백질과 비교하여 훨씬 더 높은 정도로 개체에서 PreS 특이적 항체의 형성을 유도한다는 것이 판명되었다. 더욱이, 본 발명의 융합 단백질의 투여에 반응하여 생성된 항체는 탁월한 B형 간염 중화 효과를 나타내고, B형 간염 바이러스 감염을 억제할 수 있다. PreS를 포함하는 융합 단백질의 투여가 사람 대상에서 B형 간염 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방에 성공적으로 사용될 수 있었던 것은 최초이다.

도 2b에 도시된 대로, 본 발명의 융합 단백질의 투여는, C-말단 영역(펩타이드 P6에서 P8)에 비해 더 낮은 정도, 그리고 HBV PreS의 중앙 부분(펩타이드 P4 및 P5)에 비해 무시할만한 정도로, HBV PreS의 처음 30개(펩타이드 P1) 및 50개(펩타이드 P2) 아미노산 잔기에 대해 특이적으로 지향된 항체의 형성을 가져온다. HBV PreS의 N-말단 부분은 HBV의 간세포 부착 및 HBV 감염에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있으므로, PreS 폴리펩타이드의 이 부분에 지향된 항체는 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에 특히 유용하다. 이와 반대로, HBV PreS의 단독 투여는 이런 효과를 나타내지 않는다. 이렇게 생성된 항체는 HBV PreS의 거의 모든 부분에 결합할 수 있다(도 2a 참조). 이것은 본 발명의 융합 단백질에 의해 유도된 면역반응이 HBV 감염에 수반되는 HBV PreS 폴리펩타이드의 부분들에 더욱 집중됨을 보여준다.

본 발명의 융합 단백질은 하나 이상의 B형 간염 PreS 폴리펩타이드 또는 그것의 하나 이상의 단편을 포함할 수 있다. 융합 단백질에 하나보다 많은 B형 간염 PreS 폴리펩타이드 또는 그것의 단편의 존재는 더 많은 항원이 면역시스템에 제시됨으로써 PreS에 대해 지향된 더욱더 많은 항체의 형성을 허용한다고 하는 이점을 가진다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 B형 간염 PreS 폴리펩타이드 또는 그것의 단편을 포함한다. 본 발명의 융합 단백질의 일부인 여기 정의된 HBV PreS 폴리펩타이드뿐만 아니라 그것의 단편은 동일한 HBV 유전자형으로부터 또는 상이한 유전자형으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질은 HBV 유전자형 A만의 PreS 폴리펩타이드 또는 그것의 단편을 포함할 수 있거나, 또는 HBV 유전자형 B, C, D, E, F, G 또는 H로부터 유래된 추가의 PreS 폴리펩타이드 또는 그것의 단편과 조합될 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 SEQ ID No. 1에 적어도 80% 상동성을 가진 아미노산 서열로 구성된 적어도 하나의 펩타이드, SEQ ID No. 2에 적어도 80% 상동성을 가진 아미노산 서열로 구성된 적어도 하나의 펩타이드, SEQ ID No. 3에 적어도 80% 상동성을 가진 아미노산 서열로 구성된 적어도 하나의 펩타이드 및 SEQ ID No. 4에 적어도 80% 상동성을 가진 아미노산 서열로 구성된 적어도 하나의 펩타이드를 포함한다. 또는 달리, 본 발명의 융합 단백질은 이들 펩타이드 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개를 임의의 가능한 조합으로 또는 단지 하나의 특정 펩타이드를 동일한 양으로 포함할 수 있다.

여기 사용된 용어 '~에 융합된' 또는 '융합 단백질'은 하나의 단일 재조합 폴리펩타이드 사슬로서 발현되고 제조된 B형 간염 PreS 폴리펩타이드 또는 그것의 단편을 포함하는 단백질을 말한다.

융합 단백질의 생성을 위한 방법은 본 분야에 잘 알려져 있고, Sambrook et al.(Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 및 Ausubel et al.(Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed; Wiley and Sons, 1995)와 같은 표준 분자생물학 레퍼런스에서 찾을 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질은 먼저 적합한 발현 벡터에 삽입되는 융합 유전자를 구성하고, 차례로 이것을 사용하여 적합한 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 생성된다. 일반적으로, 재조합 융합 구성물은 플라스미드에 통합된 원하는 서열을 가져오는 일련의 제한 효소 분해 및 결찰 반응에 의해 생성된다. 적합한 제한 부위가 이용될 수 없다면, 통상의 기술자에게 알려지고 상기 인용된 레퍼런스에 설명된 대로 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 사용될 수 있다. 알레르겐 및 자생 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 적합한 벡터에 삽입 전에 조립될 수 있거나, 또는 알레르겐을 암호화하는 서열은 벡터에 이미 존재하는 자생 서열을 암호화하는 서열에 인접하여 삽입될 수 있다. 벡터 내에 서열의 삽입은 인 프레임 방식이어야 하며, 이로써 서열이 단백질로 전사될 수 있다. 정확한 제한 효소, 링커 및/또는 어댑터가 필요할 뿐만 아니라 정확한 반응 조건은 사용된 서열 및 클로닝 벡터에 따라 변할 것이라는 점이 당업자에게 자명할 것이다. 그러나, DNA 구성물의 조립체는 본 분야에서 통상적이며, 당업자에 의해 쉽게 달성될 수 있다.

B형 간염 PreS 폴리펩타이드의 단편은 바람직하게 적어도 30개, 바람직하게 적어도 40개, 더 바람직하게 적어도 50개, 연속 아미노산 잔기로 구성되며, B형 간염 PreS 폴리펩타이드의 PreS1 및/또는 PreS2를 포함할 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, B형 간염 PreS 폴리펩타이드의 단편은 B형 간염 PreS 폴리펩타이드, 바람직하게 SEQ ID Nos. 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14(여기서 SEQ ID Nos. 8 내지 14는 각각 HBV 유전자형 B 내지 H에 속한다)로 구성되는 HBV PreS 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 1 내지 70, 바람직하게 아미노산 잔기 1 내지 65, 더 바람직하게 아미노산 잔기 1 내지 60, 더 바람직하게 아미노산 잔기 1 내지 55, 더 바람직하게 아미노산 잔기 1 내지 50, 더 바람직하게 1 내지 45, 더 바람직하게 아미노산 잔기 1 내지 40, 더 바람직하게 아미노산 잔기 1 내지 35, 더 바람직하게 아미노산 잔기 5 내지 70, 더 바람직하게 아미노산 잔기 5 내지 65, 더 바람직하게 아미노산 잔기 5 내지 60, 더 바람직하게 아미노산 잔기 5 내지 55, 더 바람직하게 아미노산 잔기 5 내지 50, 더 바람직하게 5 내지 45, 더 바람직하게 아미노산 잔기 5 내지 40, 더 바람직하게 아미노산 잔기 5 내지 35, 더 바람직하게 아미노산 잔기 10 내지 70, 더 바람직하게 아미노산 잔기 10 내지 65, 더 바람직하게 아미노산 잔기 10 내지 60, 더 바람직하게 아미노산 잔기 10 내지 55, 더 바람직하게 아미노산 잔기 10 내지 50, 더 바람직하게 10 내지 45, 더 바람직하게 아미노산 잔기 10 내지 40, 더 바람직하게 아미노산 잔기 10 내지 35, 더 바람직하게 아미노산 잔기 15 내지 70, 더 바람직하게 아미노산 잔기 15 내지 65, 더 바람직하게 아미노산 잔기 15 내지 60, 더 바람직하게 아미노산 잔기 15 내지 55, 더 바람직하게 아미노산 잔기 15 내지 50, 더 바람직하게 15 내지 45, 더 바람직하게 아미노산 잔기 15 내지 40, 더 바람직하게 아미노산 잔기 15 내지 35를 포함할 수 있다.

적어도 하나의 B형 간염 PreS 폴리펩타이드 또는 그것의 단편에 융합될 수 있는 적어도 하나의 펩타이드는 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 및 SEQ ID No. 4에 적어도 80%, 바람직하게 적어도 85%, 더 바람직하게 적어도 90%, 더 바람직하게 적어도 92%, 더 바람직하게 적어도 94%, 더 바람직하게 적어도 96%, 더 바람직하게 적어도 98%, 더 바람직하게 적어도 99%, 특히 100%의 상동성을 가진다. 제2 아미노산에 대한 제1 아미노산 서열의 상동성의 정도는 특정한 알고리즘을 사용하여 두 아미노산 서열을 직접 비교함으로써 결정될 수 있다. 서열 상동성은 바람직하게 BLAST 정렬(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/; Altschul SF et al J. Mol. Bi ol. 215 (1990): 403-410)에 의해 BLOSUM62 매트릭스, 갭 이그지스턴스 패널티 11, 및 갭 익스텐션 패널티 1을 사용하는 결정될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따라서, PreS 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 또는 SEQ ID No. 13에, 가장 바람직하게 SEQ ID No. 5에 적어도 80% 동일하다.

상기 설명된 펩티드들 중 적어도 하나에 융합될 수 있는 B형 간염 PreS 폴리펩타이드는 SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 또는 SEQ ID No. 13에 적어도 80%, 바람직하게 적어도 85%, 더 바람직하게 적어도 90%, 더 바람직하게 적어도 92%, 더 바람직하게 적어도 94%, 더 바람직하게 적어도 96%, 더 바람직하게 적어도 98%, 더 바람직하게 적어도 99%, 특히 100%의 상동성을 가진다.

본 발명의 더 바람직한 구체예에 따라서, 적어도 하나의 펩타이드는 PreS 폴리펩타이드의 N- 및/또는 C-말단에 융합된다.

여기 사용된 용어 'N- 및/또는 C-말단에 융합된'은 적어도 하나의 펩타이드가 PreS 폴리펩타이드 또는 그것의 단편의 N- 및/또는 C-말단에 융합된다는 것을 의미한다.

본 발명의 융합 단백질은 PreS 폴리펩타이드 또는 그것의 단편의 N-말단에 또는 그것의 C-말단에 융합된 하나 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따라서, 융합 단백질은 SEQ ID No. 6에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 융합 단백질은 SEQ ID No. 6에 적어도 80%, 바람직하게 적어도 85%, 더 바람직하게 적어도 90%, 더 바람직하게 적어도 92%, 더 바람직하게 적어도 94%, 더 바람직하게 적어도 96%, 더 바람직하게 적어도 98%, 더 바람직하게 적어도 99%, 특히 100%의 상동성을 가진다.

본 발명의 더 바람직한 구체예에 따라서, B형 간염 바이러스 간염은 B형 간염 바이러스 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, H 또는 그것의 아형에 의해 야기된다. 이 HBV 유전자형에 의해 야기된 HBV를 치료 및/또는 예방하기 위해 동일한 유전자형의 HBV PreS 폴리펩타이드 또는 그것의 단편을 사용하는 것이 바람직하다(예를 들어, HBV 유전자형 A의 PreS를 사용하여 HBV 유전자형 A 또는 그것의 아형 중 하나의 감염을 치료/예방한다). HBV 감염에 수반된다고 알려진 PreS 폴리펩타이드의 부분에 보존된 아미노산 서열로 인하여, 하나의 유전자형의 HBV PreS 폴리펩타이드 또는 그것의 단편을 사용하여 다른 HBV 유전자형의 감염을 치료/예방하는 것도 물론 가능하다(예를 들어, HBV 유전자형 A의 PreS를 사용하여 HBV 유전자형 B, C, D, E, F, G 및/또는 H 또는 이들의 아형의 감염을 치료/예방한다).

본 발명의 융합 단백질은 다양한 유전자형 및 그들의 아형의 HBV 감염의 치료 및/또는 예방에서 사용될 수 있다. B형 간염 바이러스의 아형은 Schaefer et al.(World J Gastroenterol 13 (2007): 14-21)에 논의된 대로 A1, A2, A3, A4, A5, B1, B2, B3, B4, B5, C1, C2, C3, C4, C5, D1, D2, D3, D4, D5, F1, F2, F3 및 F4를 포함한다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따라서, 융합 단백질은 0.01 μg/kg 체중 내지 5 mg/kg 체중, 바람직하게 0.1 μg/kg 체중 내지 2 mg/kg 체중의 양으로 적어도 한번 개체에 투여된다. 본 발명의 더 바람직한 구체예에 따라서, 융합 단백질은 체중에 독립적으로(즉, 용량은 15, 20, 25 또는 30 μg을 포함할 수 있다) 또는 kg 체중 당 5 내지 50μg, 바람직하게 10 내지 40μg, 더 바람직하게 15 내지 30μg의 양으로 환자에 투여된다.

단일 제형을 생성하기 위해 부형제와 조합될 수 있는 융합 단백질의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 변할 것이다. 융합 단백질의 용량은 질환 상태, 나이, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 항체 반응을 도출하는 능력과 같은 요인들에 따라서 변할 수 있다. 용량 요법(dosage regimen)은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 몇 번의 분할된 용량이 매일 투여될 수 있거나, 또는 용량은 치료 상황의 긴급사태에 의해 지시되는 바대로 비례해서 감소될 수 있다. 백신의 용량은 또한 상황에 따라 최적의 예방 용량 반응을 제공하도록 변화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드 및 백신은 B형 간염 PreS 특이적 IgG 유도의 수준에 따라 며칠 간격으로, 1 또는 2주 간격으로, 또는 심지어 수 개월 간격으로 개체에 투여될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 융합 단백질은 2 내지 10회, 바람직하게 2 내지 7회, 더욱더 바람직하게 최대 5회 및 가장 바람직하게 최대 3회 적용된다. 특히 바람직한 구체예에서, 후속 백신접종 사이의 시간 간격은 2주 내지 5년, 바람직하게 1개월 내지 최대 3년, 더 바람직하게 2개월 내지 1.5년이 되도록 선택된다. 본 발명의 융합 단백질의 반복 투여는 치료의 최종 효과를 최대화할 수 있다.

본 발명의 더 바람직한 구체예에 따라서, 융합 단백질은 적어도 하나의 애쥬번트 및/또는 제약학적으로 허용되는 부형제와 함께 투여된다.

본 발명의 융합 단백질은 피하, 근육내, 정맥내, 점막 경로 등으로 투여될 수 있다. 제형 및 투여 경로에 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 부형제, 희석제, 애쥬번트 및/또는 담체와 조합될 수 있다. 바람직한 애쥬번트는 명반이다. 백신 제제를 생산하기 위한 적합한 프로토콜은 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 "Vaccine Protocols"(A. Robinson, M. P. Cranage, M. Hudson; Humana Press Inc., U. S.; 2nd edition 2003)에서 찾을 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 또한 백신에 정규적으로 사용되는 다른 애쥬번트들과 함께 조제될 수 있다. 예를 들어, 적합한 애쥬번트는 MF59, 인산알루미늄, 인산칼슘, 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-12, GM-CSF), 사포닌(예를 들어, QS21), MDP 유도체, CpG 올리고뉴클레오타이드, LPS, MPL, 폴리포스파젠, 에멀젼(예를 들어, Freund's, SAF), 리포솜, 비로솜, 이스콤, 콜킬렛, PLG 마이크로입자, 폴록사머 입자, 바이러스-유사 입자, 열-불안정 엔테로톡신(LT), 콜레라 톡신(CT), 돌연변이 톡신(예를 들어, LTK63 및 LTR72), 마이크로입자 및/또는 중합된 리포솜일 수 있다. 적합한 애쥬번트는, 예를 들어 AS01B(리포솜 제제로 MPL 및 QS21), AS02A, AS15, AS-2, AS-03 및 이들의 유도체(GlaxoSmithKline, USA); CWS(세포벽 골격), TDM(트레할로오스-6,6'-디미콜레이트), LeIF(리슈만편모충 신장 개시 인자), 알루미늄 염, 예컨대 수산화알루미늄 겔(명반) 또는 인산알루미늄; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화 티로신의 불용성 현탁액; 아실화 당류; 양이온 또는 음이온 유도체화된 다당류; 폴리포스파젠; 생분해성 마이크로스피어; 모노포스포릴 리피드 A 및 퀼 A로서 상업적으로 이용가능하다. 사이토카인, 예컨대 GM-CSF 또는 인터류킨-2, -7 또는 -12가 또한 애쥬번트로서 사용될 수 있다. 우세한 Th1-타입 반응을 도출하는데 사용하기 위한 바람직한 애쥬번트는, 예를 들어 모노포스포릴 리피드 A, 바람직하게 3-O-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A(3D-MPL)와 선택적으로 알루미늄 염의 조합을 포함한다. 모노포스포릴 리피드 A와 계면활성제를 포함하는 수성 제제가 WO 98/43670에 설명되었다.

다른 바람직한 애쥬번트는 사포닌 또는 사포닌 의태체 또는 유도체, 바람직하게 QS21(Aquila Biopharmaceuticals Inc.)이며, 이것은 단독으로 또는 다른 애쥬번트와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 증진된 시스템은 모노포스포릴 리피드 A와 사포닌 유도체의 조합, 예컨대 QS21과 3D-MPL의 조합을 수반한다. 다른 바람직한 제제는 유-중-수 에멀젼 및 토코페롤을 포함한다. 특히 효능 있는 애쥬번트 제제는 유-중-수 에멀젼 중의 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤이다. 본 발명에서 사용하기 위한 추가의 사포닌 애쥬번트는 QS7(WO 96/33739 및 WO 96/11711에 설명됨) 및 QS17(US 5,057,540 및 EP 0 362 279 B1에 설명됨)을 포함한다.

여기 설명된 SEQ ID No.들은 다음의 아미노산 서열을 가진다(Genbank Acc. No.):

본 발명은 이후의 도면 및 실시예에 의해 더 예시되지만, 그것에 제한되지는 않는다.

도 1은 상이한 유전자형으로부터 정렬된 PreS 서열에 배정된 PreS 펩타이드를 도시한다. 동일한 아미노산은 점으로 표시되며, PreS1 도메인은 아미노산 잔기 1 내지 118을 포함하고, PreS2 도메인은 아미노산 잔기 119 내지 173을 포함하며(또한 SEQ ID No. 5 참조), 아미노산 잔기 19 내지 28(회색 상자)은 HBV의 간 세포 부착 및 감염에서 중요한 역할을 한다.
도 2는 면역화 전(좌측 회색 막대)과 후(우측 검은색 막대)에, PreS로 면역화된 토끼(n=1; 도 2a), 또는 PreS-융합 백신 혼합물 20μg으로 면역화된 토끼(n=2; 도 2b)의 IgG 반응을 도시한다. 광학 밀도 값(y-축; 405nm에서 OD 값)은 PreS 및 PreS-유래 합성 중첩 펩타이드 P1-P8을 향한 IgG 수준에 상응한다(x-축). 결과는 3번 중복 결정으로부터 평균값과 SD로 표시한다.
도 3a 내지 도 3c는 PreS-융합 백신 혼합물 또는 위약으로 백신접종된 대상의 PreS(도 3a) 및 합성 PreS-유래 중첩 펩타이드 P1-P8(도 3b 및 3c)을 향한 IgG 반응을 도시한다. 면역화 전(V5)과 면역화 후 상이한 시점(V8 및 V15)에서(x-축), PreS-융합 백신 혼합물(n=22) 또는 위약(n=8)으로 면역화된 이전에 B형 간염 백신접종을 했거나 하지 않았던 대상에서 측정된 PreS 및 펩타이드 P1-P8을 향한 IgG 수준에 상응하는 광학 밀도 값(y-축: OD 값, 3번 중복 결정의 평균)이 도시된다. 결과는 평균값과 SD로 표시하며, 유의한 차이(V5, V8 및 V15에서 모든 PreS-융합 백신 혼합물-백신접종된 개체에서)가 제시된다: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
도 4는 PreS-융합 백신 혼합물(PreS-FVM) 또는 위약으로 백신접종된 대상 및 및 B형 간염-감염된 개체에 존재하는 항체를 가진 대상의 PreS-특이적 항체 반응을 도시한다. 위약(n=8), 20μg(n=10) 또는 40μg의 PreS-융합 백신 혼합물(n=12)로 면역화된 대상 및 B형 간염-감염된 개체(n=19)(x-축)의 PreS에 특이적인 IgA, IgE, IgM, IgG 및 IgG 아형(IgG1-IgG4) 수준에 상응하는 광학 밀도 값(y-축: OD 값)이 도시된다. 그래프는 평균값과 SD를 나타낸다. 유의한 차이가 제시된다: ***p < 0.001.
도 5는 PreS-융합 백신 혼합물(PreS-FVM) 또는 위약으로 백신접종된 대상 및 및 B형 간염-감염된 개체에 존재하는 IgG를 가진 대상의 PreS 펩타이드 P1-P8에 특이적인 IgG 반응을 도시한다. V15에서 위약(n=8), 20μg(n=10) 또는 40μg의 PreS 백신 혼합물(n=12)로 면역화된 대상 및 B형 간염-감염된 개체(n=19)(x-축)의 PreS-유래 펩타이드(P1-P8)에 특이적인 IgG 수준에 상응하는 광학 밀도 값(y-축: OD 값)이 도시된다. 결과는 평균값과 SD로 표시된다.
도 6은 PreS- 및 펩타이드-특이적 T 세포 반응을 도시한다. 도 6a: 상이한 시점(x-축)에서 PreS-융합 백신 혼합물(n=19)로 면역화된 대상에서 [3H]-티미딘 통합에 의해 평가된 PreS-특이적 PBMC 증식(y-축: 자극 지수 SI). 평균값과 SD 및 유의한 차이가 제시된다: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p<0.001. 도 6b 및 도 6c: 시점 M2에서 PreS-융합 백신 혼합물(n=11)로 면역화된 대상의 혈액 샘플에서 PreS 펩타이드(P1-P8), PreS 또는 등몰 펩타이드 혼합물(x-축)로의 자극 후 증식된 CD4(b) 및 CD8(c) T 세포(y-축)의 퍼센트. 결과는 평균값과 SD로 표시된다.
도 7은 시험관내 배양된 간 세포에 기초한 시험관내 바이러스 중화 분석에서 B형 간염 바이러스 감염의 항체-유도 억제를 도시한다. 바이러스 중화 항체를 함유하는 항-혈청과 함께 바이러스를 예비인큐베이션함으로써 달성된 배양된 HepG2-hNTCP(x-축)의 B형 간염 감염의 억제 퍼센트. 도 7a: Ma 18/7(양성 대조군), 위약-치료된 사람 대상의 혈청, PreS-융합 백신 혼합물(n=7)로 면역화 후 사람 대상의 혈청에 의한 바이러스 감염의 억제, 모든 대상은 이전에 B형 간염 백신접종을 하지 않음. 도 7b: 상업용 B형 간염 백신 Engerix 또는 PreS-융합 백신 혼합물로 면역화된 토끼의 혈청에 의한 바이러스 감염의 억제.
도 8은 완전 Freund's 애쥬번트 중의 에멀젼으로서, 재조합 PreS 또는 PreS-융합-단백질(PreS-F1 - PreS-F4)로 면역화된 뉴질랜드 흰색(NZW) 토끼의 혈청에서 PreS를 향한 총 혈청 IgG의 비교를 도시한다. x-축은 혈청의 희석 상태를 표시하고, y-축에는 405nm에서 측정된 OD 값이 표시된다. 실험은 2번 중복하여 분석되었다.

실시예

실시예 1: 재조합 PreS의 발현 및 정제, PreS 중첩 펩타이드의 합성, 서열 정렬

대장균(에스체리키아 콜리 Escherichia coli) BL21(DE3, Stratagene, USA)에서 헥사히스티딘-택 재조합 PreS 단백질(PreS1+PreS2(SEQ ID No. 5; 유전자형 A; 아형 adw2, GenBank: AAT28735.1에서 유래))의 발현 및 정제가 Niespodziana K et al.(J Allergy Clin Immunol 127(2011):1562-70)에 설명된 대로 수행되었다.

대략 30개 아미노산 길이의 8개 펩타이드와 PreS의 완전한 서열에 걸친 10개 아미노산의 중첩부(유전자형 A, 아형 adw2; 표 A; 도 1)가 Fmoc(9-플루오렌일메톡시카보닐)-전략과 HBTU[2-(1H-벤조트리아졸-1-일)1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트] 활성화에 의해 합성되었다(CEM-Liberty, Matthews, NC; Applied Biosystems, Life technologies, USA).

[표 A]

분취 HPLC에 의해 펩티드를 정제했고, 이들의 존재를 질량분광법(Microflex MALDI-TOF, Bruker, USA)에 의해 확인했다.

PreS 유전자형 A, 혈청형 adw2 서열 및 이들의 펩타이드 서열과 HBV 유전자형 B-H의 정렬을 HBV 데이터베이스로부터의 기준서열을 사용하여 CLUSTAL W를 가지고 수행했다(HBVdb: https://hbvdb.ibcp.fr/HBVdb/HBVdb/HBVdbIndex)(Hayer J et al. Nucleic Acids Res 2012; gksl 022)(도 1 참조).

실시예 2: 토끼의 면역화

1차 주사에는 Freund's 완전 애쥬번트(CFA)를 사용하고 2차 및 3차 주사에는 불완전 Freund's 애쥬번트(IFA)를 사용하여 정제된 PreS(주사당 200μg)로 뉴질랜드 흰색 토끼를 면역화함에 의해 재조합 PreS에 대한 특이적 토끼 항체를 발생시켰다(Charles River, Germany). 또한, 뉴질랜드 흰색 토끼는 애쥬번트로서 Al(OH)₃을 사용하여 4개의 PreS 백신 혼합물 성분의 각각을 20μg(n=2) 또는 40μg(n=2)을 함유하는 혼합물(PreS 백신 혼합물-20/PreS 백신 혼합물-40)로 3번 면역화되었다. 4개의 백신 혼합물 성분은 다음의 아미노산 서열을 가진 PreS 융합 단백질 PreSF1, PreSF2, PreSF3 및 PreSF4를 포함한다:

PreSF1(SEQ ID No. 22)

PreSF2(SEQ ID No. 23)

PreSF3(SEQ ID No. 6)

PreSF4(SEQ ID No. 24)

또한, 상업적으로 이용가능한 바로 사용하도록 준비된 미리 충전된 주사기로 1개월 간격으로 3회 뉴질랜드 흰색 토끼(n=2)를 면역화하여 등록된 B형 간염 백신 ENGERIX-B에 특이적인 토끼 항체를 얻었다.

면역화 전과 3차 면역화 후 대략 4주 뒤에 혈청 샘플을 얻었고, 분석할 때까지 -20℃에 보관했다.

PreS 백신 혼합물로의 면역화는 순차적 PreS 에피토프에 대해 특이성을 가지고 IgG 항체의 유도를 나타냈다. 도 2는 토끼에서 유도된 PreS 및 합성 PreS-유래 펩타이드를 향한 IgG 항체 반응과 CFA-조제된 PreS 또는 수산화알루미늄-흡착 PreS 백신 혼합물의 비교를 도시한다(도 2b). CFA-조제된 PreS에 의해 유도된 토끼 항체는 P7을 제외하고 PreS와 PreS-유래 펩티드의 각각을 인식했다(도 2a). 수산화알루미늄-흡착 PreS 백신 혼합물은 20μg 용량에서 PreS-특이적 IgG 항체 및 주로 N-말단 펩타이드 P1, P2, 펩타이드 P6에 대해 지정되고 C-말단 펩타이드 P8을 향한 IgG 항체를 유도했다(도 2b). 면역화 전의 토끼에서는 PreS 또는 펩타이드-특이적 IgG 반응은 발견되지 않았다(도 2, 좌측 막대).

실시예 3: PreS - 및 PreS 펩타이드 -특이적 체액성 면역 반응의 평가

Al(OH)₃-흡착 PreS 백신 혼합물(즉, 각 PreS 백신 혼합물 성분의 10, 20 또는 40μg의 혼합물 또는 위약, 즉 Al(OH)₃)의 3회 주사를 받은 환자로부터 혈청 샘플을 얻었다. 3차 면역화 전과 4주 후에 혈청을 수집하고 사용할 때까지 -20℃에 보관했다. Al(OH)₃-흡착 PreS 백신 혼합물(즉, 각 PreS 백신 혼합물 성분의 20 또는 40μg의 혼합물 또는 위약으로서 즉 Al(OH)₃)의 7번의 피하 주사로 2년의 기간에 걸쳐서 치료된 환자로부터 두 번째 세트의 혈청 샘플을 얻었다. 또한, 임상 데이터, 간 기능 검사 및 HBV 혈청 마커에 기초하여 진단된 B형 간염 감염에 걸린 환자로부터 혈청 샘플을 얻었다.

HBV에 대한 혈청학적 마커(즉, B형 간염 표면 항원[HBsAg]); B형 간염 표면 항원에 대한 항체[항-HBs]; 뿐만 아니라 B형 간염 코어 항원에 대한 항체[항-HBc]에 대해 분석된 모든 혈청을 스크리닝했다.

ELISA 플레이트(NUNC MaxiSorp®, Denmark)를 항원(재조합 PreS, 합성 PreS-중첩 펩타이드: P1-P8) 또는 사람 혈청 알부민(음성 대조군)(Behring, USA)으로 코팅했다. 1:10,000(CFA) 또는 1:500(PreS 백신 혼합물-20/PreS 백신 혼합물-40)의 희석의 토끼 혈청, 1;1,000의 희석의 마우스 혈청 및 동형 및 IgG 아형에 대해 상이하게 희석된 사람 혈청과 함께 인큐베이션을 수행했다. 사람 총 IgG의 검출을 위해 1:100으로 혈청을 희석했고, IgA, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgM에 대해 1:20으로 혈청을 희석했고, IgE 항체의 검출을 위해 1:10으로 혈청을 희석했다.

1:2,500으로 희석된 당나귀 항-토끼 양고추냉이 퍼옥시다아제-콘쥬게이트 IgG 항체(GE Healthcare, Buckinghamshire, Great Britain)로 토끼 IgG를 검출했다. 결합된 마우스 IgG1은 1:1,000으로 희석된 단클론성 래트 항-마우스 IgG1(BD Pharmingen, USA), 이후 1:2,500으로 희석된 양고추냉이 퍼옥시다아제-콘쥬게이트 염소 항-래트 IgG 항체(Amersham Bioscience, Sweden)로 검출했다.

사람 IgG는 1:10,000으로 희석된 토끼 항-사람 IgG Fc-특이적 항체(Jackson-Dianova, Germany)와 1:2,500으로 희석된 퍼옥시다아제-결합 당나귀 항-토끼 IgG(GE Healthcare)로 차례로 검출했다. 사람 IgA, IgG 아형 IgG1, IgG2 및 IgG4, 뿐만 아니라 사람 IgM은 각각 1:1,000으로 희석된 정제된 마우스 항-사람 IgA1/IgA2, IgG1, IgG2, IgG4 및 IgM(BD Pharmingen), 이후 1:2,500으로 희석된 퍼옥시다아제-결합 양 항-마우스 IgG(GE Healthcare)로 검출되었다. 단클론성 항-사람 IgG3(Sigma Aldrich, USA)은 1:5,000으로 희석되었다. 사람 IgE는 염소 항-사람 양고추냉이 퍼옥시다아제-콘쥬게이트 IgE 항체(KPL, USA)로 검출되었다.

실시예 4: PreS 백신 혼합물 면역화된 대상의 PreS -특이적 항체 반응은 이전 B형 간염 면역에 의해 영향받지 않음

PreS 백신 혼합물 또는 위약으로 면역요법을 받은 사람 대상으로부터의 혈청 샘플을 PreS 및 합성 PreS 펩타이드에 대한 IgG 반응성에 대해 시험했다(도 3a 내지 3c). 이들 환자(n=30)는 치료 전에 B형 간염-특이적 혈청 마커(HBsAg, 항-HBs 및 항-HBc 항체)에 대해 스크리닝되었고, HBsAg 및 항-HBc 항체에 대해 음성인 것으로 판명되었다. B형 간염 백신으로의 이전의 백신접종으로 인해 대상들 중 22명은 항-HBs 항체를 함유했다(도 3a 내지 3c). 위약-치료된 환자는 아니었지만, PreS 백신 혼합물로 면역요법을 받은 환자들의 각각은 이들이 이전에 HB-백신접종되었는지 아니었는지와 무관하게 3차 주사 후(V8; 1차 주사 후 3개월) 및 7차 주사 후(V15; 1차 주사 후 15개월) 혈청이 시험되었을 때 견고한 PreS-특이적 IgG 반응을 발생시켰던 것으로 판명되었다(도 3a 내지 3c). PreS-특이적 IgG 반응은 면역요법 전 베이스라인으로부터 유의하게 증가했고(즉, V5 대 V8), V8과 V15 사이에 유의하게 더 증가했다(즉, 7차 주사 후)(도 3a 내지 3c). 이들 환자에서 PreS-특이적 IgG 반응은 주로 N-말단 펩타이드 P1, P2 및 P3을 향해 지정되었고, 다시 P1- 및 P2-특이적 IgG 반응은 베이스라인 V5에서부터 V8까지, 그리고 V8에서부터 V15까지 유의한 증가를 나타냈다(도 3a 내지 3c). 또한, 위약-치료된 환자에서는 아니었지만 나머지 PreS-유래 펩타이드 P4, P5, P6, P7 및 P8에 대한 IgG 반응의 증가도 PreS 백신 혼합물로 면역요법을 받은 환자의 혈청에서 발견되었다(도 3a 내지 3c).

실시예 5: PreS 백신 혼합물 면역화된 대상의 PreS -특이적 항체 반응은 중화 에피토프에 대해 지정되며, B형 간염-감염된 개체의 반응과 상이함

도 4는 PreS 백신 혼합물 또는 위약으로 면역요법 후 환자의 PreS-특이적 동형 및 IgG 아형 반응과 B형 간염-감염된 개체의 반응의 비교를 도시한다. PreS 백신 혼합물의 두 용량으로의 면역요법은 모두 치료된 환자들 각각에서 견고한 PreS-특이적 IgG 반응을 유도했으며, 이것은 B형 간염-감염된 개체에서의 IgG 반응보다 유의하게 더 높았다(도 4). PreS 백신 혼합물 또는 위약으로 치료된 환자뿐만 아니라 B형 간염-감염된 개체의 혈청에서는 관련된 PreS-특이적 IgA, IgE 또는 IgM 반응이 검출되지 않았다(도 4). PreS-특이적 IgG 아형 반응은 PreS 백신 혼합물-치료된 대상과 B형 간염-감염된 개체에서 상이했다. PreS 백신 혼합물-치료된 대상은 PreS에 대해 우선적인 IgG1 및 IgG4 아형 반응을 나타냈지만, B형 간염-감염된 개체는 PreS를 향해 동일한 IgG1 및 IgG2 반응을 장착했다(도 4).

또한, PreS 백신 혼합물-치료된 환자 대 B형 간염-감염된 개체에서 PreS-특이적 항체의 에피토프 특이성에 관해 엄격한 차이가 발견되었다(도 5). PreS 백신 혼합물-면역화된 환자는 P1 및 P3을 향해 강한 IgG 반응을 나타냈지만, B형 간염-감염된 개체는 그렇지 않았다(도 5). P1에 의해 한정된 영역이 PreS1 내의 모티프에 상응하고(또한 도 1 참조), 이것은 B형 간염-감염의 억제를 위한 필수적인 잔기를 함유한다고 보고되었기 때문에 상기 발견은 놀라운 일이다.

또한, P7은 PreS 백신 혼합물-치료된 대상에 의해서만 인식되었고 B형 간염-감염된 개체에 의해서는 인식되지 않았지만, P2 및 P6을 향한 IgG 반응은 B형 간염-감염된 개체에서도 발견되었다(도 5).

실시예 6: T 세포 반응의 평가

말초혈 단핵세포(PBMC)를 Ficoll(Amersham Biosciences, Sweden)을 사용하여 밀도 구배 원심분리를 통해 헤파린화된 혈액 샘플로부터 얻었다. 혈액 샘플이 얻어졌다면, [3H]-티미딘 통합에 의해 V5, V8, M1(1차 백신접종 후 5개월) 및 M2(1차 백신접종 후 17개월) 때에 PreS 백신 혼합물-백신접종된 대상(n=19)에서 PreS-특이적 PBMC 증식을 결정했다.

특정 PreS 백신 혼합물-면역화된 환자(n=11)의 경우, CD4 및 CD8 T 세포 반응은 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE) 표지화에 의해 평가될 수 있었다.

형광 염료-표지된 세포를 바닥이 U자 모양인 96-웰 마이크로플레이트(Thermo Fisher, USA)에 총 부피 200μl로, 2 mmol/L L-글루타민(Sigma Aldrich, USA), 50 mmol/L β-머캡토에탄올(Sigma Aldrich) 및 0.02mg/mL 젠타마이신(Sigma Aldrich)으로 보충된 Ultra culture™ 혈청-무함유 매질(Lonza, Belgium)에서 웰당 200,000 세포를 파종했다. 세포를 자극 없이 방치하거나(음성 대조군), 또는 양성 대조군으로서 Dynabeads® 사람 T-활성화인자 CD3/CD28(3μg/웰(Invitrogen, USA)), 등몰량의 PreS-중첩 펩타이드(0.03μg/웰) 또는 각 펩타이드를 웰당 0.03μg 함유하는 PreS-유래 중첩 펩타이드의 혼합물로 자극했고, 7일 동안 5% CO₂ 중에서 37℃에서 배양한 후, 항체 염색 및 FACS 분석을 수행했다.

유세포계수를 위해 다음의 시약들을 사용했다: PerCP/Cy5.5 항-사람 CD3 항체(Clone HIT3a), Brilliant Violet 421™ 항-사람 CD4 항체(Clone RPA-T4), APC 항-사람 CD8a 항체(Clone HIT8a), 뿐만 아니라 동형 대조군, 즉 PerCP/Cy5.5 마우스 IgG2a, Brilliant Violet 421™ 마우스 IgG1, APC 마우스 IgG1(BioLegend, USA) 및 Fixable Viability Dye eFluor® 780(eBioscience, USA).

BD FACS Canto II(Becton, Dickinson and Company, USA)에서 유세포계수를 수행했다. 샘플당 20,000개의 사례를 취득했고, FlowJo 소프트웨어(버전 10)를 통해서 분석을 수행했다. 림프구는 포워드 및 사이드워드 스캐터 도트 블랏에 대한 형태학적 기준에 따라서 게이트가 작동되었고, 생육성 염료의 염색에 의해 죽은 세포는 배제했으며, 게이팅은 CD3CD4 및 CD3CD8-양성 T 세포에 집중되었다. 항원 자극에 반응하여 증식한 세포는 CFSE 형광 강도의 감소에 의해 확인되었다. 결과는 3개의 중복 배양물의 평균으로 나타내며, 상이한 항원 및 분석된 환자에 대해 바탕값을 넘는 CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+의 235 중간 퍼센트 자극이 제시된다.

도 6은 PreS 백신 혼합물로 면역요법을 받은 환자에서 PreS-특이적 T 세포 반응의 발생을 도시한다. 점차 증가하는 PreS-특이적 T 세포 반응이 발견되었고, 이것은 V5에서의 베이스라인과 비교하여 V8, M1 및 M2에서 유의하게 더 높았다(도 6a). PreS-특이적 CD4 세포 반응의 에피토프 특이성이 CFSE 염색에 의해 분석되었을 때, 우리는 P1, P2, P5 및 P6이 가장 강한 CD4 세포 증식을 유도했다는 것을 발견했지만, P3, P4 및 P7을 향한 CD4 반응도 또한 발견되었다(도 6b). 흥미롭게도, 펩타이드 및 펩타이드 혼합물은 PreS 단백질보다 더 강한 CD4 세포 증식을 유도했다(도 6b). 낮은 빈도에도 불구하고 일부 PreS 및 PreS 펩타이드-특이적 CD8 세포 반응이 검출되었고, 이것은 주로 P2, P3, P6 및 P8 및 완전한 PreS를 향해 지정되었다(도 6b).

실시예 7: B형 간염 바이러스 중화 분석

헤파린 칼럼(GE Healthcare, Great Britain)을 사용하여 바이러스 입자를 분리함으로써 HepAd38 세포의 상청액으로부터 감염을 위한 HBV 접종물을 제조했다. HepG2-hNTCP 세포20를 24-웰 플레이트에 웰당 3x10⁵ 세포의 밀도로 파종했다. 파종 2일 후에 감염 매질(DMEM, Invitrogen, USA)을 2.5% DMSO(Merck, Germany)로 보충했고, 3일째에 세포를 HBV로 감염시켰다. HBV 입자의 중화를 위해 환자 혈청(10μl)을 37℃에서 30분 동안 HBV 접종물(6.9x10⁷ 게놈 등가물(GE)/웰)과 함께 예비인큐베이션하고, 이후 37℃에서 16시간 동안 4% 폴리에틸렌글리콜 800(Sigma Aldrich, USA)의 존재하에 환자의 혈청 및 바이러스와 함께 세포를 공-인큐베이션했다. 중화 단클론성 항체 Mal8/721을 양성 대조군으로 사용했다.

접종 16시간 후 세포를 PBS로 광범하게 세척했고, 2.5% DMSO(Invitrogen)로 보충된 신선한 분화 매질을 첨가했다. 감염 후 3일째와 5일째에 추가적인 매질 변경을 수행했다. 감염 후 5일째 내지 7일째에 세포로부터 상청액에 분비된 B형 간염 e 항원(HBeAg)의 측정에 의해 HBV 감염의 정량을 수행했다. ADVIA Centaur XPT 자동 화학발광 시스템(Siemens, Germany)에 의해 HBeAg를 결정했다. 지수 1 이상의 신호에서 샘플을 양성으로 간주했다.

특이적 면역형광에 의해 HBV 코어 단백질의 발현을 검출했다. 상청액을 제거하고 세포를 PBS로 세척 후 실온(RT)에서 30분 동안 4% 파라폼알데하이드(Sigma Aldrich)로 고정했다. 다음에, 세포를 PBS로 세척하고, 이어서 RT에서 30분 동안 PBS 중에서 0.25% Triton X 100(AppliChem GmbH, Germany)으로 투과화했다. 다음에, 세포를 2% w/v BSA, PBS에 희석된 1차 항체(항-HBV 코어, 토끼 다클론성 AK, DAKO Deutschland GmbH, Hamburg, Germany)와 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. 다음날 세포를 PBS로 세척하고, 마지막으로 암소에서 2차 항체(염소 α 토끼 Alexa 488;Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 4',6-디아미딘-2-페닐인도/Hoechst 33342 (Roche Applied Science, Germany)와 함께 인큐베이션했다. HBV 코어 단백질의 검출을 위해 2차 항체를 빛을 차단한 상태에서 RT에서 2시간 동안 인큐베이션했다. Alexa-488-표지된 2차 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA)는 480nm, 핵 염색은 360nm를 사용하여 형광현미경 아래서 세포를 검사했다.

첫 번째 타입의 분석에서, 특이적 면역형광에 의해 세포의 감염 후 B형 간염 코어 항원(HBeAg)이 검출된다. 감염되지 않은 세포에서는 HBeAg가 검출되지 않았지만, 감염된 세포와 미처리 세포에서는 검출되었으며, 이 발현은 커다란 B형 간염 표면 단백질의 PreS1 도메인에 대해 지정된 중화 단클론성 항체 Mal8/721과 함께 바이러스를 예비인큐베이션함에 의해 방지될 수 있다. 마찬가지로, 상업용 백신 Engerix-B에 의해 유도된 토끼 항체 또는 토끼 항-PreS 백신 혼합물(20μg 용량) 항체와 함께 B형 간염 바이러스의 예비인큐베이션은 HepG2-hNTCP 세포의 감염을 억제했다는 것이 판명되었다. PreS 백신 혼합물- 또는 위약-치료된 환자로부터의 혈청을 가지고 유사한 세트의 실험을 수행했다. 위약에 의한 면역화 전후에 환자로부터 얻어진 혈청은 HepG2-hNTCP 세포의 감염을 억제하지 않았지만, 20μg으로 면역화한 후의 환자 또는 40μg으로 면역화한 후의 환자로부터 얻어진 혈청은 HepG2-hNTCP 세포의 감염을 억제했다.

HBcAg의 염색에 더하여, 다른 대용 마커로서 HBV를 사용하여 감염 후 7일째에 HepG2-hNTCP 세포에 의해 분비된 B형 간염 e 항원(HBeAg)의 측정에 기반한 분석을 수행함으로써 HBV 감염의 억제를 정량했다. PreS 백신 혼합물-처리된 것으로부터의 혈청은 HBV 감염을 50-99% 억제했다는 것이 판명되었다(도 7a). 3회 주사를 받은 환자(도 7a)의 혈청뿐만 아니라 7회 주사를 받은 환자(도 7a, 검은색)의 혈청에서도 유사한 억제가 관찰되었기 때문에 PreS 백신 혼합물 주사의 용량 및 횟수에 따른 관련된 차이는 발견되지 않았다. 또한, PreS 백신 혼합물을 20μg 또는 40μg 용량을 받은 환자들에 억제 정도와 관련하여 명백한 차이는 없었다(도 7a). 위약 치료된 환자의 혈청에서는 억제가 관찰되지 않았고, 단클론성 항체 Ma 18/7에서는 90%를 넘는 억제가 관찰되었다(도 7a). 토끼 항-Engerix-B 및 토끼 항-PreS 백신 혼합물 항체는 HBV 감염을 99% 넘게 억제했다(도 7b).

실시예 8:

재조합 PreS 및 음성 대조군으로서 사람 혈청 알부민(Behring, USA)을 Nunc Maxisorb 마이크로플레이트(Thermo-Fisher Scientific, USA) 위에 100mM 인산나트륨 버퍼 pH 9.6 중 2μg/ml의 농도로 4℃에서 하룻밤 코팅했다. 세척 버퍼는 PBS, 0.05% v/v Tween 20(PBS/T)으로 이루어졌고, 차단 과정을 37℃에서 2시간 동안 2% w/v BSA, PBS/T로 수행했다. 모든 후속 혈청 및 시약 희석은 0.5% w/v BSA, PBS/T에서 행했다.

완전 Freund's 애쥬번트(CFA) 중의 에멀젼으로서, 재조합 PreS 또는 PreS-융합-단백질로 완전한 면역화를 거친 토끼의 체액성 면역 반응을 결정하기 위해, 혈청을 상이한 희석 상태로 사용했고(4℃, 하룻밤), 1:2.000 희석된 당나귀 항-토끼 양고추냉이 퍼옥시다아제-콘쥬게이트 IgG 항체(GE Healthcare, Great Britain)를 사용하여 결합된 총 토끼 IgG를 검출했다. ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산]에 의해 색 반응을 유도했고, 항원-특이적 항체의 수준에 상응하는 흡광도 검출을 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, USA)를 사용하여 405nm 및 490nm에서 수행했다. 모든 결정은 3번 중복하여 수행되었다.

놀랍게도 아미노산 서열 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 및/또는 SEQ ID No. 4를 가진 하나 이상의 펩타이드와 PreS의 융합 단백질(PreS-F3)만이 도 8에 묘사된 대로 PreS 단독 또는 상이한 펩타이드에 융합된 PreS를 포함하는 다른 융합 단백질(PreS-Fl, PreS-F2, PreS-F4)과 비교하여 훨씬 더 높은 규모로 PreS 특이적 IgG의 형성을 유도할 수 있었다는 것이 밝혀졌다.

<110> Biomay AG <120> Fusion protein <130> 47640 <150> EP 15183983.4 <151> 2015-09-05 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <400> 1 Glu Ala Ala Phe Asn Asp Ala Ile Lys Ala Ser Thr Gly Gly Ala Tyr 1 5 10 15 Glu Ser Tyr Lys Phe Ile Pro Ala Leu Glu Ala Ala Val Lys 20 25 30 <210> 2 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <400> 2 Ala Glu Glu Val Lys Val Ile Pro Ala Gly Glu Leu Gln Val Ile Glu 1 5 10 15 Lys Val Asp Ala Ala Phe Lys Val Ala Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala 20 25 30 Pro Ala Asn Asp Lys 35 <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <400> 3 Ala Asp Leu Gly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Ala Gly 1 5 10 15 Tyr Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Glu Ala Ala Pro Ala Gly 20 25 30 Lys <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial peptide <400> 4 Ala Thr Thr Glu Glu Gln Lys Leu Ile Glu Lys Ile Asn Ala Gly Phe 1 5 10 15 Lys Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly Val Gln Pro Ala Asp Lys Tyr 20 25 30 Arg <210> 5 <211> 173 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 5 Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser 1 5 10 15 Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 20 25 30 Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys 35 40 45 Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro 50 55 60 Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 65 70 75 80 Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg 100 105 110 Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln 115 120 125 Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile 145 150 155 160 Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn 165 170 <210> 6 <211> 307 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PreSF3 <400> 6 Met Glu Ala Ala Phe Asn Asp Ala Ile Lys Ala Ser Thr Gly Gly Ala 1 5 10 15 Tyr Glu Ser Tyr Lys Phe Ile Pro Ala Leu Glu Ala Ala Val Lys Ala 20 25 30 Glu Glu Val Lys Val Ile Pro Ala Gly Glu Leu Gln Val Ile Glu Lys 35 40 45 Val Asp Ala Ala Phe Lys Val Ala Ala Thr Ala Ala Asn Ala Ala Pro 50 55 60 Ala Asn Asp Lys Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly 65 70 75 80 Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln 85 90 95 Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe 100 105 110 Asn Pro Ile Lys Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly 115 120 125 Ala Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp 130 135 140 Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro 145 150 155 160 Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser 165 170 175 Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr 180 185 190 Ala Phe His Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe 195 200 205 Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile 210 215 220 Ala Ser His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr 225 230 235 240 Asn Ala Asp Leu Gly Tyr Gly Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Ala 245 250 255 Gly Tyr Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ala Pro Ala Glu Ala Ala Pro Ala 260 265 270 Gly Lys Ala Thr Thr Glu Glu Gln Lys Leu Ile Glu Lys Ile Asn Ala 275 280 285 Gly Phe Lys Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly Val Gln Pro Ala Asp 290 295 300 Lys Tyr Arg 305 <210> 7 <211> 173 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 7 Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser 1 5 10 15 Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 20 25 30 Phe Lys Ala Asn Ser Asp Asn Pro Asp Trp Asp Leu Asn Pro His Lys 35 40 45 Asp Asn Trp Pro Asp Ser Asn Lys Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Leu 50 55 60 Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 65 70 75 80 Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Arg Gln Val Ala Arg Pro Pro Thr Pro Leu Ser Pro Pro Leu Arg 100 105 110 Asp Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln 115 120 125 Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Ala Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Gln Asn Thr Ala Ser Ser Ile 145 150 155 160 Ser Ser Ile Leu Ser Lys Thr Gly Asp Pro Val Pro Asn 165 170 <210> 8 <211> 173 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 8 Gly Gly Tyr Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser 1 5 10 15 Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 20 25 30 Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys 35 40 45 Asp Pro Trp Pro Glu Ala Trp Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro 50 55 60 Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 65 70 75 80 Gln Gly Ile Leu Thr Pro Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg 100 105 110 Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln 115 120 125 Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Gly Thr Thr Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile 145 150 155 160 Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn 165 170 <210> 9 <211> 162 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 9 Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 10 15 Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp Asp 20 25 30 Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly 50 55 60 Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr Leu Pro Thr Asn Pro 65 70 75 80 Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu 85 90 95 Ser Pro Pro Leu Arg Asn Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser 100 105 110 Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr 115 120 125 Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr 130 135 140 Thr Val Ser His Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro Ala 145 150 155 160 Leu Asn <210> 10 <211> 172 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 10 Gly Leu Ser Trp Thr Val Pro Leu Glu Trp Gly Lys Asn His Ser Thr 1 5 10 15 Thr Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe 20 25 30 Arg Ala Asn Thr Arg Asn Pro Asp Trp Asp His Asn Pro Asn Lys Asp 35 40 45 His Trp Thr Ala Ala Asn Lys Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly 50 55 60 Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln 65 70 75 80 Gly Met Leu Lys Thr Leu Pro Ala Asp Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn 85 90 95 Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Thr Pro Pro Leu Arg Asp 100 105 110 Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala 115 120 125 Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Leu Ile Ser 145 150 155 160 Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro Ala Pro Asn 165 170 <210> 11 <211> 173 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 11 Gly Ala Pro Leu Ser Thr Thr Arg Arg Gly Met Gly Gln Asn Leu Ser 1 5 10 15 Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Leu 20 25 30 Phe Arg Ala Asn Ser Ser Ser Pro Asp Trp Asp Phe Asn Lys Ser Lys 35 40 45 Asp Asn Trp Pro Met Ala Asn Lys Val Gly Val Gly Gly Tyr Gly Pro 50 55 60 Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 65 70 75 80 Gln Gly Val Leu Thr Thr Leu Pro Ala Asp Pro Pro Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Arg Arg Ser Gly Arg Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro Pro Leu Arg 100 105 110 Asp Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Gln Phe His Gln 115 120 125 Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Ala Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Glu Thr Gln Asn Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Leu Thr 145 150 155 160 Ser Ser Ile Phe Leu Lys Thr Gly Gly Pro Ala Met Asn 165 170 <210> 12 <211> 172 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 12 Gly Leu Ser Trp Thr Val Pro Leu Glu Trp Gly Lys Asn Leu Ser Thr 1 5 10 15 Ser Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe 20 25 30 Arg Ala Asn Thr Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Lys Lys Asp 35 40 45 Pro Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly Val Gly Ala Tyr Gly Pro Gly 50 55 60 Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ser Gln 65 70 75 80 Gly Thr Leu Thr Thr Leu Pro Ala Asp Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn 85 90 95 Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp 100 105 110 Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala 115 120 125 Leu Gln Asn Pro Lys Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Gly Ile Val Asn Pro Val Pro Thr Ile Ala Ser His Ile Ser 145 150 155 160 Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro Ala Pro Asn 165 170 <210> 13 <211> 173 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 13 Gly Ala Pro Leu Ser Thr Ala Arg Arg Gly Met Gly Gln Asn Leu Ser 1 5 10 15 Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Leu 20 25 30 Phe Arg Ala Asn Ser Ser Ser Pro Asp Trp Asp Phe Asn Thr Asn Lys 35 40 45 Asp Asn Trp Pro Met Ala Asn Lys Val Gly Val Gly Gly Phe Gly Pro 50 55 60 Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala 65 70 75 80 Gln Gly Ile Leu Thr Thr Ser Pro Pro Asp Pro Pro Pro Ala Ser Thr 85 90 95 Asn Arg Arg Ser Gly Arg Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro Pro Leu Arg 100 105 110 Asp Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Gln Phe His Gln 115 120 125 Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly 130 135 140 Ser Ser Ser Glu Thr Gln Asn Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Leu Thr 145 150 155 160 Ser Ser Ile Phe Ser Lys Thr Gly Asp Pro Ala Met Asn 165 170 <210> 14 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> preS fragment <400> 14 Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser 1 5 10 15 Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp 20 25 30 <210> 15 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> preS fragment <400> 15 Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn 1 5 10 15 Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His 20 25 30 <210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> preS fragment <400> 16 Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln 1 5 10 15 Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His 20 25 30 <210> 17 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> preS fragment <400> 17 Ala Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp 1 5 10 15 Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile 20 25 30 <210> 18 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> preS fragment <400> 18 Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr 1 5 10 15 Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro 20 25 30 <210> 19 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> preS fragment <400> 19 Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro 1 5 10 15 Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu 20 25 30 <210> 20 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> preS fragment <400> 20 Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg 1 5 10 15 Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val 20 25 30 <210> 21 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> preS fragment <400> 21 Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile 1 5 10 15 Ala Ser His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr 20 25 30 Asn <210> 22 <211> 294 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PreSF1 <400> 22 Met Val Arg Tyr Thr Thr Glu Gly Gly Thr Lys Thr Glu Ala Glu Asp 1 5 10 15 Val Ile Pro Glu Gly Trp Lys Ala Asp Thr Ser Tyr Glu Ser Lys Val 20 25 30 Arg Tyr Thr Thr Glu Gly Gly Thr Lys Thr Glu Ala Glu Asp Val Ile 35 40 45 Pro Glu Gly Trp Lys Ala Asp Thr Ser Tyr Glu Ser Lys Gly Gly Trp 50 55 60 Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn 65 70 75 80 Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala 85 90 95 Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp 100 105 110 Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu Thr 115 120 125 Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile 130 135 140 Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln 145 150 155 160 Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His 165 170 175 Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln 180 185 190 Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser 195 200 205 Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile 210 215 220 Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Val Arg Tyr Thr Thr Glu 225 230 235 240 Gly Gly Thr Lys Thr Glu Ala Glu Asp Val Ile Pro Glu Gly Trp Lys 245 250 255 Ala Asp Thr Ser Tyr Glu Ser Lys Val Arg Tyr Thr Thr Glu Gly Gly 260 265 270 Thr Lys Thr Glu Ala Glu Asp Val Ile Pro Glu Gly Trp Lys Ala Asp 275 280 285 Thr Ser Tyr Glu Ser Lys 290 <210> 23 <211> 298 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PreSF2 <400> 23 Met Phe Arg Phe Leu Thr Glu Lys Gly Met Lys Asn Val Phe Asp Asp 1 5 10 15 Val Val Pro Glu Lys Tyr Thr Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Pro Glu Glu 20 25 30 Phe Arg Phe Leu Thr Glu Lys Gly Met Lys Asn Val Phe Asp Asp Val 35 40 45 Val Pro Glu Lys Tyr Thr Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Pro Glu Glu Gly 50 55 60 Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val 65 70 75 80 Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe 85 90 95 Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp 100 105 110 His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly 115 120 125 Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln 130 135 140 Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn 145 150 155 160 Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp 165 170 175 Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala 180 185 190 Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser 195 200 205 Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile Ser 210 215 220 Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Phe Arg Phe Leu 225 230 235 240 Thr Glu Lys Gly Met Lys Asn Val Phe Asp Asp Val Val Pro Glu Lys 245 250 255 Tyr Thr Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Pro Glu Glu Phe Arg Phe Leu Thr 260 265 270 Glu Lys Gly Met Lys Asn Val Phe Asp Asp Val Val Pro Glu Lys Tyr 275 280 285 Thr Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Pro Glu Glu 290 295 <210> 24 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PreSF4 <400> 24 Met Gly Lys Ala Thr Thr Glu Glu Gln Lys Leu Ile Glu Asp Val Asn 1 5 10 15 Ala Ser Phe Arg Ala Ala Met Ala Thr Thr Ala Asn Val Pro Pro Ala 20 25 30 Asp Lys Gly Lys Ala Thr Thr Glu Glu Gln Lys Leu Ile Glu Asp Val 35 40 45 Asn Ala Ser Phe Arg Ala Ala Met Ala Thr Thr Ala Asn Val Pro Pro 50 55 60 Ala Asp Lys Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr 65 70 75 80 Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu 85 90 95 Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn 100 105 110 Pro Ile Lys Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala 115 120 125 Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser 130 135 140 Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro 145 150 155 160 Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro 165 170 175 Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala 180 185 190 Phe His Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro 195 200 205 Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala 210 215 220 Ser His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn 225 230 235 240 Gly Lys Ala Thr Thr Glu Glu Gln Lys Leu Ile Glu Asp Val Asn Ala 245 250 255 Ser Phe Arg Ala Ala Met Ala Thr Thr Ala Asn Val Pro Pro Ala Asp 260 265 270 Lys Gly Lys Ala Thr Thr Glu Glu Gln Lys Leu Ile Glu Asp Val Asn 275 280 285 Ala Ser Phe Arg Ala Ala Met Ala Thr Thr Ala Asn Val Pro Pro Ala 290 295 300 Asp Lys 305

Claims

SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 및 SEQ ID No. 4로 구성되는 군으로부터 선택된 서열에 적어도 80% 상동성을 가진 아미노산 서열로 구성된 적어도 하나의 펩타이드에 융합된 적어도 하나의 B형 간염 PreS 폴리펩타이드 또는 그것의 단편을 포함하는 B형 간염 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 융합 단백질.
제 1 항에 있어서, 상기 PreS 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 또는 SEQ ID No. 13에 적어도 80% 상동성인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 펩타이드는 PreS 폴리펩타이드의 N- 및/또는 C-말단에 융합되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 SEQ ID No. 6에 적어도 80% 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, B형 간염 바이러스 감염은 B형 간염 바이러스 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, H 또는 이들의 아형에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 0.01 μg/kg 체중 내지 5 mg/kg 체중, 바람직하게 0.1 μg/kg 체중 내지 2 mg/kg 체중의 양으로 적어도 1회 개체에 투여되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 적어도 하나의 애쥬번트 및/또는 제약학적으로 허용되는 부형제와 함께 투여되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.