ES2860803T3 - Proteína de fusión para su uso en el tratamiento de una infección por el virus de la hepatitis B - Google Patents

Abstract

Proteína de fusión para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección por el virus de la hepatitis B que comprende un polipéptido PreS de la hepatitis B fusionado con un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 1, un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 2, un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 3 y un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 4.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteína de fusión para su uso en el tratamiento de una infección por el virus de la hepatitis B

La presente invención se refiere a una proteína de fusión para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección por el virus de la hepatitis B (VHB).

La hepatitis B es una enfermedad hepática causada por virus de la hepatitis B. La enfermedad afecta a millones de personas cada año en todo el mundo. El VHB está presente en la sangre y en los fluidos corporales de las personas infectadas y puede, por lo tanto, diseminarse por contacto de estos fluidos con los fluidos de las personas sanas.

El VHB interfiere principalmente con las funciones del hígado al replicarse en las células hepáticas. Durante la infección por VHB, la respuesta inmune del huésped causa tanto daño hepatocelular como aclaramiento viral.

Las infecciones agudas por VHB habitualmente no se tratan ya que la mayor parte de las personas son capaces de aclarar la infección espontáneamente. Sin embargo, las infecciones crónicas por VHB deben tratarse con el fin de reducir el riesgo de cirrosis y cáncer de hígado. Los fármacos antivirales usados actualmente en el tratamiento de las infecciones por VHB incluyen lamivudina, adefovir, tenofovir, telbivudina y entecavir. Además, también puede usarse en el tratamiento interferón alfa-2a que actúa como modulador del sistema inmune. Sin embargo, ninguno de estos fármacos puede aclarar las infecciones por VHB. Estos fármacos solo pueden parar la replicación del VHB, minimizando así el daño hepático.

WO 2012/168487 describe un polipéptido que comprende fragmentos de un alergeno de tipo salvaje fusionados con un polipéptido de superficie de un virus de la familia hepadnaviridae (p. ej., PreS del virus de la hepatitis B) para su uso en el tratamiento o prevención de determinadas alergias.

Niespodziana et al. (Allergy Clin Immunol 127 (2011): 1562-1570) describen una vacuna para gatos hipoalergénica basada en péptidos derivado de Fel d1 fusionados con PreS de la hepatitis B.

Una vacuna para la alergia al polen de la hierba hipoalergénica recombinante que consiste en cuatro fragmentos de alergeno de polen de la hierba fusionados con PresS recombinante se describe en Focke-Tejkl et al. (Allergy Clin Immunol 135 (2014): 1207-1271).

Chen et al. (PLOS ONE 7 (2012): e43730) describen la optimización de la inmunización de cebado-refuerzo en ratones usando una vacuna de VHB basada en proteína y basada en vaccinia (tiantan) recombinante.

WO 2009/092612 describe un péptido derivado de preS modificado hidrófobo de un virus de la hepatitis B para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno hepático.

Es un objeto de la presente invención proporcionar nuevos medios en el tratamiento y/o prevención de infecciones por VHB que superen los inconvenientes de los presentes tratamientos de VHB. Un objetivo particularmente importante es el aclaramiento viral del VHB en pacientes infectados de forma crónica mediante la restauración de una respuesta inmune humoral y celular eficiente.

Estos objetivos se consiguen con una proteína de fusión para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección por el virus de la hepatitis B que comprende un polipéptido PreS de la hepatitis B fusionado con un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 1, un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No.

2, un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 3 y un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 4.

Sorprendentemente resultó que una proteína de fusión que comprende un polipéptido PreS de la hepatitis B y un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 1, un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 2, un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 3 y un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 4 induce la formación de anticuerpos específicos de PreS en un individuo en un grado mucho mayor en comparación con PreS solo u otras proteínas de fusión que comprenden péptidos diferentes de la SEQ ID No. 1, SeQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 y SeQ ID No. 4. Además, los anticuerpos producidos en respuesta a la administración de la proteína de fusión de la presente invención muestran efectos neutralizantes de la hepatitis B superiores y son capaces de inhibir las infecciones por el virus de la hepatitis B. Esta es la primera vez que la administración de una proteína de fusión que comprende PreS puede usarse con éxito en el tratamiento y/o prevención de una infección por el virus de la hepatitis B en un sujeto humano.

Como se muestra en la Fig. 2B, la administración de la proteína de fusión de la presente invención da lugar a la formación de anticuerpos que están dirigidos específicamente a los primeros 30 (péptido P1) y 50 (péptido P2) residuos de aminoácidos de PreS de VHB, en menor grado a la región C-terminal (péptidos P6 a P8) y en un grado despreciable a la parte central de PreS de VHB (péptidos P4 y P5). Como se sabe que la parte N-terminal de PreS de VHB juega un papel importante en la unión de VHB a las células hepáticas y en las infecciones por VHB, los anticuerpos dirigidos a esta parte del polipéptido PreS son particularmente útiles en el tratamiento y/o prevención de las infecciones por VHB. Por el contrario, la única administración de PreS de VHB no muestra estos efectos. Los anticuerpos producidos por este son capaces de unirse a casi cualquier parte de PreS de VHB (véase la Fig. 2A). Esto muestra que la respuesta inmune inducida por las proteínas de fusión de la presente invención está más focalizada en aquellas partes

del polipéptido PreS de VHB que están implicadas en la infección por VHB.

Una proteína de fusión de la presente descripción puede comprender uno o más polipéptidos PreS de la hepatitis B o

uno o más fragmentos de los mismos. La presencia de más de un polipéptido PreS de la hepatitis B o fragmentos de

los mismos en la proteína de fusión tiene la ventaja de que se presentan más antígenos al sistema inmune permitiendo

la formación de incluso más anticuerpos dirigidos a PreS. En un aspecto particular de la presente descripción, la proteína de fusión comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez polipéptidos PreS de la hepatitis B o fragmentos de los mismos. Los polipéptidos PreS de VHB, así como sus fragmentos como se definen en

la presente memoria como parte de la proteína de fusión de la presente descripción, pueden derivar del mismo genotipo de VHB o de genotipos diferentes. Por ejemplo, la proteína de fusión de la presente descripción puede comprender el polipéptido PreS o un fragmento del mismo del genotipo A de VHB solo o puede combinarse con un polipéptido PreS adicional o fragmento del mismo derivado del genotipo B, C, D, E, F, G o H de VHB.

En un aspecto particular de la presente descripción, la proteína de fusión comprende al menos un péptido que consiste

en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID No. 1, al menos un péptido

que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID No. 2, al menos un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la

SEQ ID No. 3 y al menos un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID No. 4. Alternativamente, la proteína de fusión de la presente descripción puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez de estos péptidos en cualquier combinación posible o

incluso solo un péptido específico en la misma cantidad.

Los términos "fusionado con" o "proteína de fusión", tal y como se usan en la presente memoria, se refieren a una proteína que comprende un polipéptido PreS de la hepatitis B o fragmento del mismo que se expresa y prepara como

una única cadena polipeptídica recombinante.

Los métodos para la producción de proteínas de fusión son muy conocidos en la técnica y pueden encontrarse en referencias estándar de biología molecular tales como Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) y Ausubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed; Wiley and Sons, 1995). En general, una proteína de fusión se produce construyendo en primer lugar un gen de fusión que se inserta en un vector de expresión adecuado, que, a su vez, se usa para transfectar una célula huésped adecuada. En general, las construcciones de fusión recombinantes se producen por una serie de digestiones con enzimas de restricción y reacciones de ligación que dan lugar a la incorporación de las secuencias deseadas en un plásmido. Si no están disponibles sitios de restricción adecuados, pueden usarse adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos

como conocen los expertos en la técnica y se describe en las referencias citadas anteriormente. Las secuencias de polinucleótidos que codifican alergenos y proteínas nativas pueden ensamblarse antes de la inserción en un vector adecuado o la secuencia que codifica el alergeno puede insertarse adyacente a una secuencia que codifica una secuencia nativa ya presente en un vector. La inserción de la secuencia en el vector debería ser en marco, de manera

que la secuencia pueda transcribirse en una proteína. Será evidente para los expertos en la técnica que las enzimas

de restricción, conectores y/o adaptadores precisos requeridos, así como las condiciones de reacción precisas variarán

con las secuencias y vectores de clonación usados. El ensamblaje de las construcciones de ADN, sin embargo, es rutinario en la técnica y un experto en la técnica puede conseguirlo fácilmente.

Un fragmento de un polipéptido PreS de la hepatitis B consiste preferiblemente en al menos 30, preferiblemente al menos 40, más preferiblemente al menos 50, residuos de aminoácidos consecutivos y puede comprender PreS1 y/o

PreS2 del polipéptido PreS de la hepatitis B. En un aspecto particular de la presente descripción, un fragmento de un polipéptido PreS de la hepatitis B puede comprender los residuos de aminoácidos 1 a 70, preferiblemente los residuos

de aminoácidos 1 a 65, más preferiblemente los residuos de aminoácidos 1 a 60, más prefe aminoácidos 1 a 55, más preferiblemente los residuos de aminoácidos 1 a 50, más pre preferiblemente los residuos de aminoácidos 1 a 40, más preferiblemente los r dos 1 a 35, preferiblemente los residuos de aminoácidos 5 a 70, más preferiblemente los r dos 5 a 65, preferiblemente los residuos de aminoácidos 5 a 60, más preferiblemente los r dos 5 a 55, preferiblemente los residuos de aminoácidos 5 a 50, más preferiblemente 5 a 45, más prefe aminoácidos 5 a 40, más preferiblemente los residuos de aminoácidos 5 a 35, más prefer aminoácidos 10 a 70, más preferiblemente los residuos de aminoácidos 10 a 65, más prefe aminoácidos 10 a 60, más preferiblemente los residuos de aminoácidos 10 a 55, más prefe aminoácidos 10 a 50, más preferiblemente 10 a 45, más preferiblemente los residuos de preferiblemente los residuos de aminoácidos 10 a 35, más preferiblemente los r dos 15 a 70, preferiblemente los residuos de aminoácidos 15 a 65, más preferiblemente los r dos 15 a 60, preferiblemente los residuos de aminoácidos 15 a 55, más preferiblemente los r

dos 15 a 50, preferiblemente 15 a 45, más preferiblemente los residuos de aminoácidos 15 a 40, más s de aminoácidos 15 a 35, del polipéptido PreS de la hepatitis B, preferiblemente de los polipéptidos PreS de VHB que consisten en las SEQ ID No. 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14, en donde las SEQ ID No. 8 a 14 pertenecen a los genotipos

B a H de VHB, respectivamente.

El al menos un péptido que se va a fusionar con al menos un polipéptido PreS de la hepatitis B o fragmento del mismo tiene una identidad de al menos un 80 %, preferiblemente de al menos un 85 %, más preferiblemente de al menos un 90 %, más preferiblemente de al menos un 92 %, más preferiblemente de al menos un 94 %, más preferiblemente de al menos un 96 %, más preferiblemente de al menos un 98 %, más preferiblemente de al menos un 99 %, en particular de un 100%, con la SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 y SEQ ID No. 4. El grado de identidad de una primera secuencia de aminoácidos con un segundo aminoácido puede determinarse por una comparación directa entre ambas secuencias de aminoácidos usando determinados algoritmos. La identidad de secuencia se determina preferiblemente por el alineamiento BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/; Altschul SF et al J. Mol. Biol. 215 (1990): 403-410) usando la matriz BLOSUM62, una penalización por existencia de huecos de 11, y una penalización por extensión de huecos de 1.

Según una realización preferida de la presente invención, la secuencia de aminoácidos del polipéptido PreS consiste en la SEQ ID No. 5.

Según una realización preferida adicional de la presente invención, los péptidos que consisten en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 y SEQ ID No. 4 se fusionan con el extremo N y/o C del polipéptido PreS.

"Fusionado con el extremo N y/o C", tal y como se usa en la presente memoria, significa que los péptidos están fusionados con el extremo N y/o C del polipéptido PreS. La proteína de fusión de la presente invención puede comprender cuatro o más péptidos fusionados con el extremo N del polipéptido PreS o con su extremo C.

Según una realización preferida de la presente invención, la proteína de fusión consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 6.

La proteína de fusión de la presente descripción tiene una identidad de al menos un 80 %, preferiblemente de al menos un 85 %, más preferiblemente de al menos un 90 %, más preferiblemente de al menos un 92 %, más preferiblemente de al menos un 94 %, más preferiblemente de al menos un 96 %, más preferiblemente de al menos un 98 %, más preferiblemente de al menos un 99 %, en particular de un 100 %, con la SEQ ID No. 6.

Según una realización preferida adicional de la presente invención, la infección por el virus de la hepatitis B está causada por un virus de la hepatitis B con el genotipo A, B, C, D, E, F, G, H o un subtipo del mismo. Se prefiere el uso de un polipéptido PreS de v Hb del mismo genotipo para tratar y/o prevenir una VHB causada por este genotipo de VHB (p. ej., se usa PreS de VHB de genotipo A para tratar y/o prevenir una infección por VHB de genotipo A o uno de sus subtipos). Debido a las secuencias de aminoácidos conservadas en las partes del polipéptido PreS que se sabe que están implicadas en la infección por VHB, también es posible, por supuesto, usar un polipéptido PreS de VHB de un genotipo para tratar/prevenir una infección por otro genotipo de VHB (p. ej., se usa PreS de VHB de genotipo A para tratar/prevenir una infección por VHB de genotipo B, C, D, E, F, G y/o H o un subtipo del mismo).

La proteína de fusión de la presente invención puede usarse en el tratamiento y/o prevención de infecciones por VHB de diversos genotipos y subtipos de los mismos. Los subtipos de los virus de la hepatitis B incluyen A1, A2, A3, A4, A5, B1, B2, B3, B4, B5, C1, C2 , C3, C4, C5, D1, D2, D3, D4, D5, F1, F2, F3 y F4 como se discute en Schaefer et al. (World J Gastroenterol 13 (2007): 14-21).

Según una realización particularmente preferida de la presente invención, la proteína de fusión se administra a un individuo al menos una vez en una cantidad de 0,01 pg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal, preferiblemente 0,1 pg/kg de peso corporal a 2 mg/kg de peso corporal. Según una realización preferida adicional de la presente invención, la proteína de fusión se administra a un paciente en una cantidad de 5 a 50 pg, preferiblemente 10 a 40 pg, más preferiblemente 15 a 30 pg, bien de forma independente del peso corporal (es decir, una dosis puede comprender 15, 20, 25 o 30 pg) o por kg de peso corporal.

La cantidad de la proteína de fusión que puede combinarse con excipientes para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del huésped tratado y del modo particular de administración. La dosis de la proteína de fusión puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y de la capacidad para incitar la respuesta de anticuerpos deseada en el individuo. El régimen de dosificación puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden administrarse varias dosis divididas diariamente o la dosis puede reducirse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. La dosis de la vacuna también puede variarse para proporcionar una respuesta a la dosis preventiva óptima dependiendo de las circunstancias. Por ejemplo, los polipéptidos y vacuna de la presente invención pueden administrarse a un individuo a intervalos de varios días, una o dos semanas o incluso meses dependiendo siempre del nivel de la inducción de IgG específica de PreS de la hepatitis B.

En una realización preferida de la presente invención, la proteína de fusión de la presente invención se aplica entre 2 y 10, preferiblemente entre 2 y 7, incluso más preferiblemente hasta 5 y lo más preferiblemente hasta 3 veces. En una realización particularmente preferida, se elige que el intervalo de tiempo entre las vacunaciones posteriores sea entre 2 semanas y 5 años, preferiblemente entre 1 mes y hasta 3 años, más preferiblemente entre 2 meses y 1,5 años. La administración repetida de la proteína de fusión de la presente invención puede maximizar el efecto final del tratamiento.

Según una realización preferida adicional de la presente invención, la proteína de fusión se administra conjuntamente con al menos un adyuvante y/o excipiente farmacéutico aceptable.

La proteína de fusión de la presente invención puede administrarse subcutáneamente, intramuscularmente, intravenosamente, mucosalmente etc. Dependiendo de la forma de dosificación y de la ruta de administración, la proteína de fusión de la presente invención puede combinarse con excipientes, diluyentes, adyuvantes y/o vehículos. Un adyuvante preferido es alúmina. Los protocolos adecuados para la producción de formulaciones de vacunas son conocidos para el experto en la técnica y pueden encontrarse, p. ej., en "Vaccine Protocols" (A. Robinson, M. P. Cranage, M. Hudson; Humana Press Inc., EE. UU.; 2a edición 2003).

La proteína de fusión de la presente invención también puede formularse con otros adyuvantes usados regularmente en vacunas. Por ejemplo, los adyuvantes adecuados pueden ser MF59, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, citoquinas (p. ej., IL-2, lL-12, GM-CSF), saponinas (p. ej., QS21), derivados de MDP, oligonucleótidos CpG, LPS, MPL, polifosfazenos, emulsiones (p. ej., de Freund, SAF), liposomas, virosomas, iscoms, cocleatos, micropartículas de PLG, partículas de poloxámero, partículas semejantes a virus, enterotoxina lábil al calor (LT), toxina del cólera (CT), toxinas mutantes (p. ej., LTK63 y LTR72), micropartículas y/o liposomas polimerizados. Los adyuvantes adecuados están disponibles comercialmente como, por ejemplo, AS01B (MPL y QS21 en una formulación de liposoma), AS02A, AS15, AS-2, AS-03 y derivados de los mismos (GlaxoSmithKline, EE. UU.); CWS (esqueleto de pared celular), TDM (trehalosa-6,6'-dimicolato), LelF (factor de inicio de la elongación de Leishmania), sales de aluminio tales como gel de hidróxido de aluminio (alúmina) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o cinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónicamente o aniónicamente; polifosfazenos; microesferas biodegradables; monofosforil lípido A y quil A. También pueden usarse como adyuvantes citoquinas tales como GM-CSF o interleuquina-2, 7 o 12. Los adyuvantes preferidos para su uso en la incitación de una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL), opcionalmente con una sal de aluminio. Las formulaciones acuosas que comprenden monofosforil lípido A y un tensioactivo se han descrito en WO 98/43670.

Otro adyuvante preferido es una saponina o miméticos o derivados de saponina, preferiblemente QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc.), que puede usarse solo o en combinación con otros adyuvantes. Por ejemplo, un sistema mejorado implica la combinación de un monofosforil lípido A y derivado de saponina, tal como la combinación de QS21 y 3D-MPL. Otras formulaciones preferidas comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Una formulación de adyuvante particularmente potente es QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua. Los adyuvantes de saponina adicionales para su uso en la presente invención incluyen QS7 (descrito en WO 96/33739 y WO 96/11711) y QS17 (descrito en US 5.057.540 y EP 0362279 B1).

Las SEQ ID No. descritas en la presente memoria tienen la siguiente secuencia de aminoácidos (No. de Acc. Genbank:

La presente invención se ilustra adicionalmente por las siguientes figuras y ejemplos, sin embargo, sin estar restringida a los mismos.

La Fig. 1 muestra la asignación de los péptidos PreS a secuencias de PreS alineadas de diferentes genotipos. Los aminoácidos idénticos se indican con puntos, el dominio PreS1 incluye los residuos de aminoácidos 1 a 118 y el dominio PreS2 los residuos de aminoácidos 119 a 173 (véase también la SEQ ID No. 5) y los residuos de aminoácidos 19 a 28 (caja gris) juegan un papel crucial en la unión de VHB a las células del hígado y en la infección.

La Fig. 2 muestra respuestas de IgG de conejos inmunizados con PreS (n=1; Fig. 2A), o 20 pg de una mezcla de la vacuna de fusión de PreS (n=2; Fig. 2B), antes (barras de la izquierda en gris) y después (barras de la derecha en negro) de la inmunización. Los valores de la densidad óptica (ejes y: valores de DO a 405 nm) corresponden a los niveles de IgG frente a PreS y a los péptidos solapados sintéticos derivados de PreS P1-P8 (ejes x). Los resultados representan valores medios con SD de determinaciones en triplicado.

Las Fig. 3A a 3C muestran respuestas de IgG frente a PreS (Fig. 3A) y a los péptidos solapados sintéticos derivados de PreS P1-P8 (Figs. 3B, y 3C) de sujetos vacunados con la mezcla de la vacuna de fusión de PreS o placebo. Se muestran los valores de la densidad óptica (ejes y: valores de DO, medias de determinaciones en triplicado) correspondientes a los niveles de IgG frente a PreS y a péptidos P1-P8 medidos en sujetos con o sin vacunación previa de la hepatitis B que han sido inmunizados con la mezcla de la vacuna de fusión de PreS (n=22) o placebo (n=8) antes (V5) y a diferentes puntos de tiempo después de la inmunización (V8 y V15) (ejes x). Los resultados se representan como valores medios con SD y se indican las diferencias significativas (en todos los individuos vacunados con la mezcla de la vacuna de fusión de PreS a V5, V8, y V15): *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

La Fig. 4 muestra respuestas de anticuerpos específicas de PreS de sujetos vacunados con la mezcla de la vacuna de fusión de PreS (PreS-FVM) o placebo y anticuerpos presentes en individuos infectados con hepatitis B. Se muestran los valores de la densidad óptica (ejes y: valores de DO) correspondientes a los niveles de IgA, IgE, IgM, IgG y las subclases de IgG (IgG1-IgG4) específicos para PreS de sujetos inmunizados con placebo (n=8), 20 pg (n=10) o 40 pg de la mezcla de la vacuna de fusión de PreS (n=12), así como de individuos infectados con hepatitis (n=19) (ejes x). Los gráficos muestran valores medios con SD. Se indican las diferencias significativas: ***p < 0,001.

La Fig. 5 muestra respuestas de IgG específicas para los péptidos PreS P1-P8 de sujetos vacunados con la mezcla de la vacuna de fusión de PreS (PreS-FVM) o placebo e IgG presentes en individuos infectados con hepatitis B. Se muestran los valores de la densidad óptica (ejes y: valores de DO) correspondientes a los niveles de IgG específicas para péptidos derivados de PreS (P1-P8) de sujetos inmunizados con placebo (n=8), 20 pg (n=10) o 40 pg de la mezcla de la vacuna de PreS (n=12) a V15, así como de individuos infectados con hepatitis B (n=19) (ejes x). Los resultados se representan como valores medios con SD.

La Fig. 6 muestra respuestas de células T específicas de PreS y de péptidos. Fig.6A: proliferaciones de PBMC específicas de PreS (ejes y: índices de estimulación SI) evaluadas por incorporación de [3H] timidina en sujetos inmunizados con la mezcla de la vacuna de fusión de PreS (n=19) a diferentes puntos de tiempo (eje x). Se indican los valores medios con SD y las diferencias significativas: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p<0,001. Fig. 6B, y Fig 6C: porcentajes de células T CD4 (B) y CD8 (C) que han proliferado (ejes y) después de la estimulación con péptidos PreS (P1-P8), PreS o una mezcla equimolar de péptidos (ejes x) en muestras de sangre de sujetos inmunizados con la mezcla de la vacuna de fusión de PreS (n=11) en el punto de tiempo M2. Los resultados se representan como valores medios con SD.

La Fig. 7 muestra la inhibición inducida por anticuerpos de la infección por el virus de la hepatitis B en un ensayo de neutralización de virus in-vitro que se basa en células de hígado cultivadas in-vitro. Porcentajes de la inhibición de la infección por hepatitis B de HepG2-hNTCP cultivadas (eje x) conseguidos por la preincubación del virus con antisueros que contienen anticuerpos neutralizantes del virus. Fig. 7A: inhibición de la infección por el virus por Ma 18/7 (control positivo), suero de un sujeto humano tratado con placebo, sueros de sujetos humanos después de la inmunización con la mezcla de la vacuna de fusión de PreS (n=7), todos los sujetos sin vacunación previa para la hepatitis B. Fig. 7B: inhibición de la infección con el virus por sueros de conejos inmunizados con la vacuna de la hepatitis B comercial Engerix o la mezcla de la vacuna de fusión de PreS.

La Fig. 8 muestra una comparación de IgG sérica total frente a PreS en sueros de conejos blancos de Nueva Zelanda (NZW) que han sido sometidos a inmunización, bien con PreS recombinante o proteínas de fusión de PreS (PreS-F1 - PreS-F4), como emulsión en Adyuvante Completo de Freund. El eje x indica la dilución de los sueros y en el eje y, se representan los valores de DO, medidos a 405 nm. El experimento se ensayó en duplicado.

Ejemplos:

Ejemplo 1: expresión y purificación de PreS recombinante, síntesis de péptidos solapados de PreS, alineamientos de secuencias

La expresión y purificación de una proteína PreS recombinante etiquetada con hexahistidina (PreS1+PreS2 (SEQ ID No. 5; genotipo A; subtipo adw2, derivada de GenBank: AAT28735.1) en Escherichia coli BL21 (DE3, Stratagene, EE. UU.) se ha realizado como se describe en Niespodziana K et al. (J Allergy Clin Immunol 127(2011):1562-70).

Se sintetizaron ocho péptidos con una longitud de aproximadamente 30 aminoácidos y un solapamiento de 10 aminoácidos abarcando la secuencia completa de PreS (genotipo A, subtipo adw2; Tabla A; Fig. 1) por una estrategia Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) con activación por HBTU [hexafluorofosfato de 2-(1 H-benzotriazol-1 -il)1,1,3,3 tetrametiluronio] (CEM-Liberty, Matthews, NC; Applied Biosystems, Life technologies, EE. UU.).

Tabla A:

(las regiones solapadas de los péptidos están subrayadas)

Los péptidos se purificaron por HPLC preparativa y su identidad se confirmó por espectrometría de masa (Microflex MALDI-TOF, Bruker, EE. UU.).

Se realizó un alineamiento de la secuencia de PreS genotipo A, serotipo adw2 y las secuencias de péptidos del mismo con los genotipos de VHB B-H con CLUSTAL W usando secuencias de referencia de la base de datos de VHB (VHBdb: https://hbvdb.ibcp.fr/HBVdb/HBVdbIndex) (Hayer J et al. Nucleic Acids Res 2012; gks1022) (véase la Fig. 1).

Ejemplo 2: inmunización de conejos

Se produjeron anticuerpos de conejo específicos frente a PreS recombinante por la inmunización de un conejo blanco de Nueva Zelanda con PreS purificado (200 gg por inyección) usando adyuvante completo de Freund (CFA) para la primera y adyuvante incompleto de Freund (IFA) para la segunda y tercera inyección (Charles River, Alemania). Además, se inmunizaron conejos blancos de Nueva Zelanda tres veces con una mezcla que contenía 20 gg (n=2) o 40 gg (n=2) de cada uno de los cuatro componentes de la mezcla de la vacuna de PreS (mezcla de la vacuna de PreS-20/mezcla de la vacuna de PreS-40) usando Al(OH)3 como adyuvante. Los cuatro componentes de la mezcla de la vacuna de PreS incluyen las proteínas de fusión de PreS PreSFl, PreSF2, PreSF3 y PreSF4 que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

PreSFl (SEQ ID No. 22):

MVRYTTEGGTKTEAEDVIPEGWKADTSYESKVRYTTEGGTKTEAEDVIPEGWKADT SYESKGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHW PAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPI SPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSI SARTGDPVTNVRYTTEGGTKTEAEDVIPEGWKADTSYESKVRYTTEGGTKTEAEDV IPEGWKADTSYESK

PreSF2 (SEQ ID No. 23):

MFRFLTEKGMKNVFDDVVPEKYTIGATYAPEEFRFLTEKGMKNVFDDVVPEKYTIG ATYAPEEGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKD HWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPT PISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHIS SISARTGDPVTNFRFLTEKGMKNVFDDWPEKYTIGATYAPEEFRFLTEKGMKNVF DDVVPEKYTIGATYAPEE

PreSF3 (SEQ ID No. 6):

MEAAFNDATKASTGGAYESYKFIPALEAAVKAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVA ATAANAAPANDKGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDF NPIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQS GRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNI ASHISSISARTGDPVTNADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAAPAGKATTEEQ KLIEKINAGFKAALAAAAGVQPADKYR

PreSF4 (SEQ ID No. 24):

MGKATTEEQKLIEDVNASFRAAMATTANVPPADKGKATTEEQKLIEDVNASFRAAM ATTANVPPADKGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFN PIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSG RQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIA SHISSISARTGDPVTNGKATTEEQKLIEDVNASFRAAMATTANVPPADKGKATTEE QKLIEDVNASFRAAMATTANVPPADK

Además, se obtuvieron los anticuerpos de conejo específicos para la vacuna de la hepatitis B registrada ENGERIX-B mediante la inmunización de conejos blancos de Nueva Zelanda (n=2) tres veces con jeringas precargadas listas para usar disponibles comercialmente a un intervalo de un mes.

Se obtuvieron muestras de suero antes de la inmunización y aproximadamente cuatro semanas después de la tercera inmunización y se almacenaron a -20 °C hasta los análisis.

La inmunización con la mezcla de la vacuna de PreS mostró la inducción de anticuerpos IgG con especificidad para epítopos de PreS secuenciales. La Fig. 2 muestra una comparación de las respuestas de anticuerpos IgG frente a PreS y los péptidos derivados de PreS sintéticos inducidas en conejos con PreS formulado con CFA o la mezcla de la vacuna de PreS adsorbido en hidróxido de aluminio (Fig. 2B). Los anticuerpos de conejos inducidos con PreS formulado con CFA reconocieron PreS y cada uno de los péptidos derivados de PreS excepto P7 (Fig. 2A). La mezcla de la vacuna de PreS adsorbido en hidróxido de aluminio en una dosis de 20 pg indujo anticuerpos IgG específicos de PreS y anticuerpos IgG dirigidos principalmente a los péptidos N-terminales P1, P2, péptido P6 y frente al péptido C-terminal P8 (Fig. 2B). No se encontraron respuestas de IgG específicas de PreS o péptidos en los conejos antes de la inmunización (Fig. 2, barras de la izquierda).

Ejemplo 3: evaluación de las respuestas inmunes humorales específicas de PreS y péptidos de PreS

Se obtuvieron muestras de suero de pacientes que habían recibido tres inyecciones de la mezcla de la vacuna de PreS adsorbido en Al(OH)3 (es decir, mezclas de 10, 20 o 40 pg de cada componente de la mezcla de la vacuna de PreS o placebo, es decir, Al(OH)3). Los sueros se recogieron antes y cuatro semanas después de la tercera inmunización y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Se obtuvo un segundo conjunto de muestras de sueros pacientes que se habían tratado durante un periodo de dos años con siete inyecciones subcutáneas de la mezcla de la vacuna de PreS adsorbido en Al(OH)3 (es decir, mezclas de 20 o 40 pg de cada componente de la mezcla de la vacuna de PreS o Al(OH)3 como placebo). Además, se obtuvieron muestras de suero de pacientes que padecían de infección por hepatitis B que habían sido diagnosticados en base a datos clínicos, ensayo de la función hepática y marcadores séricos de VHB.

Todos los sueros analizados se cribaron para determinar marcadores serológicos para VHB (es decir, antígeno de superficie de la hepatitis B [HBsAg]; anticuerpos frente al antígeno de superficie de la hepatitis B [anti-HBs], así como anticuerpos frente al antígeno central de la hepatitis B [anti-HBc].

Se recubrieron placas de ELISA (NUNC MaxiSorp®, Dinamarca) con los antígenos (PreS recombinante, péptidos solapados de PreS sintéticos: P1-P8) o albúmina de suero humano (control negativo) (Behring, EE. Uu .). La incubación se realizó con sueros de conejos en una dilución de 1:10.000 (CFA) o 1:500 (mezcla de la vacuna de PreS-20/mezcla de la vacuna de PreS-40), con sueros de ratón en una dilución de 1:1.000 y con sueros humanos diluidos de manera diferente para los isotipos y subclases de IgG. Para la detección de IgG total humana, los sueros se diluyeron 1:100, para IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, así como IgM, los sueros se diluyeron 1: 20 y para la detección de anticuerpos IgE los sueros se diluyeron 1:10.

La IgG de conejo se detectó con anticuerpos IgG anti-conejo de burro conjugados con peroxidasa de rábano, diluidos 1:2.500 (GE Healthcare, Buckinghamshire, Gran Bretaña). La IgG1 de ratón unida se detectó con IgG1 monoclonal anti-ratón de rata (BD Pharmingen, EE. UU.) diluida 1:1.000, seguido de anticuerpos IgG anti-rata de cabra conjugados con peroxidasa de rábano (Amersham Bioscience, Suecia) diluidos 1:2.500.

La IgG humana se detectó con anticuerpo específico anti-Fc de IgG humana de conejo (Jackson-Dianova, Alemania) diluido 1:10.000, seguido de IgG anti-conejo de burro unida a peroxidasa (GE Healthcare) a una dilución de 1:2.500. La IgA, las subclases de IgG IgG1, IgG2 e IgG4 humanas, así como la IgM humana se detectaron con anticuerpos purificados de ratón anti-IgA1/IgA2, IgG1, IgG2, IgG4 e IgM humanas (BD Pharmingen), diluidos 1:1.000 respectivamente, seguido de IgG anti ratón de oveja unida a peroxidasa (GE Healthcare) a una dilución de 1:2.500. El anti-IgG3 humana monoclonal (Sigma Aldrich, EE. UU.) se diluyó 1:5.000. La IgE humana se detectó con anticuerpos anti-IgE humana de cabra conjugados con peroxidasa de rábano (KPL, EE. UU.).

Ejemplo 4: las respuestas de anticuerpos específicos de PreS de sujetos inmunizados con la mezcla de la vacuna de PreS no se ven influidas por la inmunidad anterior a hepatitis B

Se ensayaron muestras de suero de sujetos humanos que habían recibido inmunoterapia con la mezcla de la vacuna de PreS o con placebo para determinar la reactividad de IgG frente a PreS y péptidos de PreS sintéticos (Fig. 3a a 3c). Estos pacientes (n=30) se habían cribado para determinar marcadores séricos específicos de la hepatitis B (HBsAg, anticuerpos anti-HBs y anti-HBc) antes del tratamiento y se encontró que eran negativos para HBsAg y anticuerpos anti-HBc. Debido a la vacunación previa con una vacuna de la hepatitis B, veintidós de los sujetos contenían anticuerpos anti-HBs (Fig. 3a a 3c). Se encontró que cada uno de los pacientes que habían recibido inmunoterapia con la mezcla de la vacuna de PreS, independientemente de si se habían vacunado para HB antes o no, pero no los pacientes tratados con placebo, desarrollaron respuestas robustas de IgG específicas de PreS cuando los sueros se ensayaron después de la tercera (V8; tres meses después de la primera inyección), así como después de la séptima inyección (V15; 15 meses después de la primera inyección) (Fig. 3a a 3c). Las respuestas de IgG específicas de PreS se incrementaron significativamente respecto a la línea base antes de la inmunoterapia (es decir, V5 frente a V8) y se incrementaron más significativamente entre V8 y V15 (es decir, después de la séptima inyección) (Fig. 3a a 3c). Las respuestas de IgG específicas de PreS en estos pacientes estaban dirigidas principalmente hacia los péptidos N-terminales P1, P2 y P3 y de nuevo las respuestas de IgG específicas de P1 y P2 mostraron incrementos significativos respecto a la línea base V5 a V8 y de V8 a V15 (Fig. 3a a 3c). También se encontraron incrementos de las repuestas de IgG frente a los otros péptidos derivados de PreS P4, P5, P6, P7 y P8 en los sueros de los pacientes que habían recibido inmunoterapia con la mezcla de la vacuna de PreS pero no en los pacientes tratados con placebo (Fig. 3a a 3c).

Ejemplo 5: las respuestas de anticuerpos específicos de PreS de sujetos inmunizados con la mezcla de la vacuna de PreS están dirigidas frente a epítopos neutralizantes y se diferencian de las de los individuos infectados con hepatitis B

La Fig.4 muestra una comparación de las respuestas de isotipos y subclases de IgG específicas de PreS de pacientes después de la inmunoterapia con la mezcla de la vacuna de PreS o placebo con la de los individuos infectados con hepatitis B. La inmunoterapia con ambas dosis de la mezcla de la vacuna de PreS indujo una respuesta robusta de IgG específica de PreS en cada uno de los pacientes tratados que fue significativamente más alta que la respuesta de IgG en individuos infectados con hepatitis B (Fig. 4). No se detectaron respuestas relevantes de IgA, IgE o IgM específicas de PreS en los sueros de los pacientes que se habían tratado con la mezcla de la vacuna de PreS o placebo, así como en individuos infectados con hepatitis B (Fig. 4). La respuesta de subclase de IgG específica de PreS fue diferente entre los sujetos tratados con la mezcla de la vacuna de PreS y los individuos infectados con hepatitis B. Los sujetos tratados con la mezcla de la vacuna de PreS mostraron una respuesta preferencial de la subclase IgG1 e IgG4, mientras que los individuos infectados con hepatitis B produjeron algunas respuestas de IgG1 e IgG2 frente a PreS (Fig. 4).

También se encontraron diferencias llamativas respecto a la especificidad de epítopo de los anticuerpos específicos de PreS en los pacientes tratados con la mezcla de la vacuna de PreS frente a los individuos infectados con hepatitis B (Fig. 5). Los pacientes inmunizados con la mezcla de la vacuna de PreS, pero no los individuos infectados con hepatitis B, mostraron respuestas fuertes de IgG hacia P1 y P3 (Fig. 5). Este descubrimiento es sorprendente porque la región definida por P1 se corresponde con un resto en PreS1 (véase también la Fig. 1) que se ha reportado que contiene los residuos esenciales para la inhibición de las infecciones por hepatitis B. Además, P7 solo fue reconocido por los sujetos tratados con la mezcla de la vacuna de PreS, pero no por los individuos infectados con hepatitis B, mientras que también se encontraron las respuestas de IgG frente a P2 y P6 en individuos infectados con hepatitis B (Fig. 5).

Ejemplo 6: evaluación de las respuestas de las células T

Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de muestras de sangre heparinizadas a través de centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll (Amersham Biosciences, Suecia). Cuando las muestras de sangre pudieron obtenerse, la proliferación de las PBMC específica de PreS se determinó en los sujetos vacunados con la mezcla de la vacuna de PreS (n=19) a V5, V8, M1 (5 meses después de la primera vacunación) y M2 (17 meses después de la primera vacunación) por incorporación de [3H]-timidina.

Para determinados pacientes inmunizados con la mezcla de la vacuna de PreS (n=11), pudieron evaluarse las respuestas de las células T CD4 y CD8 a M2 por marcaje con succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE).

Las células marcadas con el tinte fluorescente se sembraron a 200.000 células/pocillo en medio sin suero Ultra culture™ (Lonza, Bélgica) suplementado con 2 mmoles/L de L-glutamina (Sigma Aldrich, EE. UU.), 50 mmoles/L de p-mercaptoetanol (Sigma Aldrich), y 0,02 mg de gentamicina por mililitro (Sigma Aldrich), en un volumen total de 200 gl en microplacas de 96 pocillos con fondo en forma de U (Thermo Fisher, EE. UU.). Las células se dejaron sin estimular (control negativo) o se estimularon con Dynabeads® de activador CD3/CD28 de células T humanas (3 gg/pocillo (Invitrogen, EE. UU.)) como control positivo o con PreS (0,15 gg/pocillo), cantidades equimolares de péptidos solapados de PreS (0,03 gg/pocillo) o con una mezcla de los péptidos solapados derivados de PreS que contenía 0,03 gg/pocillo de cada péptido y se cultivaron a 37 °C en CO2 al 5 % durante 7 días antes de realizar la tinción de anticuerpo y el análisis FACS.

Para la citometría de flujo, se usaron los siguientes reactivos: anticuerpo anti-CD3 humano PerCP/Cy5.5 (Clon HIT3a), anticuerpo anti-CD4 humano Violeta Brillante 421 ™ (Clon RPA-T4), anticuerpo anti-CD8a humano ApC (Clon HIT8a), así como los controles de isotipo, es decir, IgG2a de ratón PerCP/Cy5.5, IgG1 de ratón Violeta Brillante 421™, IgG1 de ratón APC (BioLegend, EE. u U.) y tinte de viabilidad fijable eFluor® 780 (eBioscience, EE. UU.).

La citometría de flujo se realizó en un BD FACS Canto II (Becton, Dickinson and Company, EE. UU.). Se adquirieron veinte mil eventos por muestra y el análisis se realizó mediante el Software FlowJo, Versión 10. Los linfocitos se separaron según criterios morfológicos en un gráfico de puntos de dispersión directa y lateral, las células muertas se excluyeron por tinción con el tinte de viabilidad y la separación se centró en las células T positivas para CD3CD4 y CD3CD8. Aquellas células que proliferaron en respuesta a la estimulación del antígeno se identificaron por su reducción en la intensidad de fluorescencia de CFSE. Los resultados representan las medias de cultivos en triplicado y se muestran 235 porcentajes medios de estimulación de CD3+CD4+ y CD3+CD8+ por encima del fondo para los diferentes antígenos y los pacientes analizados.

La Fig. 6 muestra el desarrollo de las respuestas de células T específicas de PreS en pacientes que habían recibido inmunoterapia con la mezcla de la vacuna de PreS. Se encontró una respuesta gradual creciente de células T específica de PreS que fue significativamente más alta a V8, M1 y M2 en comparación con la línea base a V5 (Fig. 6A). Cuando se analizó la especificidad de epítopo de las respuestas de células CD4 específicas de PreS por tinción con CFSE encontramos que P1, P2, P5 y P6 inducían la proliferación más fuerte de células CD4, pero también se encontraron respuestas de CD4 hacia P3, P4 y P7 (Fig. 6B). De forma interesante, los péptidos y la mezcla de péptidos indujeron una proliferación de células CD4 más fuerte que la proteína PreS (Fig. 6B). Aunque a una frecuencia más baja, se detectó algo de respuesta de células CD8 específica de PreS y péptidos de PreS que estaba dirigida principalmente hacia P2, P3, P6 y P8 y PreS completo (Fig. 6B).

Ejemplo 7: ensayos de neutralización del virus de la hepatitis B

El inóculo de VHB para la infección se preparó a partir de sobrenadantes de células HepAd38 usando una columna de heparina (GE Healthcare, Gran Bretaña) para aislar partículas virales. Las células HepG2-hNTCP se sembraron a una densidad de 3 x 105 células/pocillo en una placa de 24 pocillos. En el día dos después de la siembra, el medio de infección (DMEM, Invitrogen, EE. UU.) se suplementó con DMSO al 2,5 % (Merck, Alemania) y en el día tres, las células se infectaron con VHB. Para la neutralización de las partículas de VHB, los sueros de los pacientes (10 gl) se preincubaron con el inóculo de VHB (6,9 x 107 equivalentes genómicos (GE)/pocillo) durante 30 minutos a 37 °C, seguido de la coincubación de las células con los sueros de los pacientes y virus en presencia de polietilenglicol 800 al 4 % (Sigma Aldrich, EE. UU.) durante 16 horas a 37 °C. El anticuerpo monoclonal neutralizante Ma18/721 se usó como control positivo.

Después de 16 horas de inoculación, las células se lavaron extensamente con PBS y se añadió medio de diferenciación fresco, suplementado con DMSO al 2,5 % (Invitrogen). Se realizaron cambios adicionales de medio en el día tres y día cinco después de la infección.

La cuantificación de la infección por VHB se llevó a cabo mediante la medición de antígeno e de la hepatitis B secretado (HBeAg) en el sobrenadante de las células en el día cinco a siete después de la infección. HBeAg se determinó por el sistema de quimioluminiscencia automatizado ADVIA Centaur XPT (Siemens, Alemania). Las muestras se consideraron como positivas a una señal por encima del índice 1.

La expresión de la proteína central de VHB se detectó por inmunofluorescencia específica. El sobrenadante se retiró y las células se lavaron con PBS antes de la fijación con paraformaldehído al 4 % (Sigma Aldrich) durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT). A continuación, las células se lavaron con PBS seguido de la permeabilización con Triton X 100 al 0,25 % (AppliChem GmbH, Alemania) en PBS durante 30 minutos a RT. Después, las células se incubaron toda la noche a 4 °C con el anticuerpo primario (anti-central de VHB, de conejo policlonal AK, DAKO Deutschland GmbH, Hamburgo, Alemania) diluido en BSA al 2 % p/v, PBS. Al día siguiente, las células se lavaron con PBS y finalmente se incubaron con el anticuerpo secundario (a conejo de cabra Alexa 488; Invitrogen, Carlsbad, CA) y 4',6-Diamidin-2-fenilindo/Hoechst 33342 (Roche Applied Science, Alemania) en oscuridad. Para la detección de la proteína central de VHB, el anticuerpo secundario se incubó durante 2 horas a RT, protegido de la luz. Las células se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia usando 480 nm para los anticuerpos secundarios marcados con Alexa-488 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 360 nm para la tinción nuclear.

En el primer tipo de ensayo, la expresión del antígeno central de la hepatitis B (HBcAg) después de la infección de las células se detecta por inmunofluorescencia específica. No se detectó HBcAg en las células no infectadas, sino en las células infectadas y no tratadas y esa expresión puede prevenirse por la preincubación del virus con el anticuerpo monoclonal neutralizante Ma18/721 que está dirigido frente al dominio PreS1 de la proteína de superficie grande de la hepatitis B. Asimismo, se encontró que la preincubación de virus de la hepatitis B con anticuerpos de conejo inducidos por la vacuna comercial Engerix-B o con anticuerpos anti-mezcla de la vacuna de PreS de conejo (dosis de 20 gg) inhibió la infección de las células HepG2-hNTCP. Se realizó un conjunto similar de experimentos con sueros de pacientes tratados con la mezcla de la vacuna de PreS o placebo. Los sueros obtenidos de un paciente antes y después de la inmunización con placebo no inhibieron la infección de las células HepG2-hNTCP, mientras que los sueros obtenidos de un paciente después de la inmunización con 20 gg o de un paciente después de la inmunización con 40 gg inhibieron la infección de las células HepG2-hNTCP.

Además de la tinción del HBcAg, se usó un ensayo basado en la medición de antígeno e de la hepatitis B secretado (HBeAg) por las células HepG2-hNTCP siete días después de la infección con VHB como otro marcador subrogado para cuantificar la inhibición de la infección por VHB. Se encontró que los sueros de tratados con la mezcla de la vacuna de PreS inhibieron la infección por VHB entre el 50-99 % (Fig. 7A). No se encontró ninguna diferencia relevante dependiendo de la dosis y el número de inyecciones de la mezcla de la vacuna de PreS porque se observó una inhibición similar para los sueros de pacientes que habían recibido tres inyecciones (Fig. 7A), así como para los sueros de pacientes que habían recibido siete inyecciones (Fig. 7A, negro). Tampoco hubo una diferencia obvia respecto al grado de inhibición entre los pacientes que recibieron la dosis de 20 gg o 40 gg de la mezcla de la vacuna de PreS (Fig. 7A). No se observó ninguna inhibición para el suero de un paciente tratado con placebo y se observó una inhibición de más del 90 % para el anticuerpo monoclonal Ma 18/7 (Fig. 7A). Los anticuerpos anti-Engerix-B de conejo y anti-mezcla de la vacuna de PreS de conejo causaron una inhibición de más del 99 % de la infección por VHB (Fig. 7B).

Ejemplo 8:

Se utilizaron PreS recombinante y albúmina de suero humano (Behring, EE. UU.), como control negativo, para recubrir microplacas Nunc Maxisorb (Thermo-Fisher Scientific, EE. UU.) a una concentración de 2 pg/ml en tampón fosfato de sodio 100 mM, pH 9,6 toda la noche a 4 °C. El tampón de lavado estaba comprendido por PBS, Tween20 al 0,05 % v/v (PBS/T) y los procedimientos de bloqueo se realizaron con BSA al 2 % p/v, PBS/T durante 2 horas a 37 °C. Todas las diluciones posteriores de suero y reactivos se hicieron en BSA al 0,5 % p/v, PBS/T.

Para determinar las respuestas inmunes humorales de los conejos, que habían sido sometidos a inmunización completa, bien con PreS recombinante o proteínas de fusión de PreS, tales como emulsión en Adyuvante Completo de Freund (CFA), se usaron sueros en diferentes diluciones (4 °C, toda la noche) y se detectó la IgG total de conejo unida usando anticuerpos anti-IgG de conejo de burro conjugados con peroxidasa de rábano diluidos 1:2.000 (GE Healthcare, Gran Bretaña). La reacción de color se indujo con ABTS [ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico] y la detección de la absorbancia, correspondiente a los niveles de anticuerpos específicos de antígeno se realizó a 405 nm y 490 nm usando un lector de microplacas (Molecular Devices, EE. UU.). Todas las determinaciones se realizaron en triplicado.

Sorprendentemente, resultó que solo una proteína de fusión que comprendía uno o más péptidos que tenían las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 y/o SEQ ID No. 4 y PreS (PreS-F3) fueron capaces de inducir la formación de IgG específica de PreS en un grado mucho mayor en comparación con PreS solo u otras proteínas de fusión que comprenden también PreS fusionado con diferentes péptidos (PreS-F1, PreS-F2, PreS-F4) como se representa en la Fig. 8.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Proteína de fusión para su uso en el tratamiento y/o prevención de una infección por el virus de la hepatitis B que comprende un polipéptido PreS de la hepatitis B fusionado con un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 1, un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 2, un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 3 y un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 4.

2. Proteína de fusión para el uso según la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido PreS consiste en la SEQ ID No. 5.

3. Proteína de fusión para el uso según la reivindicación 1 o 2, en donde los péptidos que consisten en las secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 y SEQ ID No. 4 están fusionados con el extremo N y/o C del polipéptido PreS.

4. Proteína de fusión para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proteína de fusión consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID No. 6.

5. Proteína de fusión para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la infección por el virus de la hepatitis B está causada por un virus de la hepatitis B con genotipo A, B, C, D, E, F, G, H o un subtipo de los mismos.

6. Proteína de fusión para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la proteína de fusión se administra a un individuo al menos una vez en una cantidad de 0,01 pg/kg de peso corporal a 5 mg/kg de peso corporal, preferiblemente 0,1 pg/kg de peso corporal a 2 mg/kg de peso corporal.

7. Proteína de fusión para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la proteína de fusión se administra conjuntamente con al menos un adyuvante y/o un excipiente farmacéutico aceptable.