ES2926487T3

ES2926487T3 - Formulaciones parenterales de vacunas de norovirus

Info

Publication number: ES2926487T3
Application number: ES17199372T
Authority: ES
Inventors: Charles Richardson; Robert Bargatze; Paul Mendelman
Original assignee: Takeda Vaccines Inc
Current assignee: Takeda Vaccines Inc
Priority date: 2011-07-11
Filing date: 2012-07-11
Publication date: 2022-10-26
Anticipated expiration: 2032-07-11
Also published as: JP2014520852A; EP4112074A1; US9867876B2; SG10201605644WA; EP2731621B1; ZA201500915B; EP3299030B1; EP2731621A1; DOP2022000030A; EA202090699A3; EA201792407A3; UA117732C2; MY170746A; KR102096937B1; EA029470B1; WO2013009849A1; PE20140845A1; EA035442B1; CA2841356C; JP6208659B2

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones de vacunas parenterales de dosis única que comprenden mezclas de partículas similares a virus de Norovirus monovalentes. También se describen métodos para conferir inmunidad protectora frente a infecciones por norovirus en un sujeto humano mediante la administración de dichas composiciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones parenterales de vacunas de norovlrus

Campo de la invención

La Invención pertenece al campo de las vacunas, particularmente las vacunas para norovlrus. Además, la divulgación se refiere a métodos para preparar composiciones de vacuna y a métodos para Inducir y evaluar respuestas ¡nmunltarlas protectoras contra norovlrus en humanos.

Antecedentes de la invención

Los norovlrus son callclvlrus humanos no cultivables que se han convertido en la causa más Importante de brotes epidémicos de gastroenteritis no bacteriana (Glass et al., 2000; Hardy et al., 1999). La importancia clínica de los norovlrus fue subestimada antes del desarrollo de ensayos de diagnóstico molecular sensibles. La clonación del prototipo del genoma del virus de Norwalk (NV) del genogrupo I y la producción de partículas similares a virus (VLP) a partir de un sistema de expresión de baculovlrus recombinante condujo al desarrollo de ensayos que revelaron Infecciones de norovlrus generalizadas (Jlang etal., 1990; 1992).

Los norovlrus son virus de ARN de sentido positivo monocatenarios que contienen un genoma de ARN no segmentado. El genoma viral codifica para tres marcos de lectura abiertos, de los cuales los dos últimos especifican la producción de la proteína principal de la cápslde y una proteína estructural minoritaria, respectivamente (Glass et al., 2000). Cuando se expresa a niveles elevados en sistemas de expresión de eucarlotas, la proteína de la cápslde de NV, y algunos otros norovlrus, se autoensambla en VLP que Imitan estructuralmente los vlriones de norovlrus nativos. Cuando se observan mediante microscopía electrónica de transmisión, las VLP son morfológicamente Indistinguibles de los vlriones Infecciosos aislados de muestras de heces humanas.

Las respuestas ¡nmunltarlas frente a los norovlrus son complejas, y los correlatos de protección están dilucidándose justo ahora. Los estudios en voluntarios humanos realizados con virus nativos demostraron que las respuestas ¡nmunltarlas de memoria derivadas de la mucosa proporcionaron protección a corto plazo contra la Infección y sugirieron que la protección mediada por vacunas es factible (Lindesmith etal., 2003; Panino etal., 1977; Wyatt etal., 1974).

Aunque el norovlrus no puede cultivarse in vitro, debido a la disponibilidad de las VLP y su capacidad para producirse en grandes cantidades, se ha realizado un progreso considerable en la definición de la topografía antlgénlca y estructural de la cápslde del norovlrus. Las VLP conservan la confirmación auténtica de la proteína de la cápslde viral a la vez que carecen del material genético Infeccioso. Por consiguiente, las VLP Imitan las Interacciones funcionales del virus con los receptores celulares, provocando así una respuesta ¡nmunltarla del huésped apropiada a la vez que carecen de la capacidad para reproducirse o causar Infección. Junto con el NIH, el Baylor College of Medicine estudió las respuestas ¡nmunltarlas humorales, de la mucosa y celulares frente a VLP de NV en voluntarlos humanos en un ensayo clínico de fase I académico patrocinado por un Investigador. Las VLP administradas por vía oral eran seguras e inmunogénicas en adultos sanos (Ball et al., 1999; Tacket et al., 2003). Sin embargo, se requirieron múltiples dosis de una cantidad relativamente alta de VLP para observar una respuesta ¡nmunltarla. En otros centros académicos, los experimentos preclínicos en modelos animales han demostrado una mejora de las respuestas ¡nmunltarlas frente a las VLP cuando se administran por vía ¡ntranasal con adyuvantes de exotoxlnas bacterianas (Guerrero et al., 2001; Nicollier-Jamot et al., 2004; Periwal et al., 2003; Souza et al., (2007) Vaccine, vol. 25(50):8448-59). Sin embargo, la Inmunidad protectora contra los norovlrus en humanos sigue siendo esquiva debido a que todavía no se han Identificado claramente los Indicadores de una respuesta ¡nmunltarla protectora en humanos (Herbst-Kralovetz et al., (2010) Expert Rev. Vaccines 9 (3), 299-307).

El documento W02009/039229 A2 divulga una vacuna de norovlrus que se administra por vía ¡ntranasal en dos dosis, pero también menciona la posibilidad de una administración en 1-4 dosis y una administración Intramuscular.

Sumario de la invención

La Invención se expone en el juego adjunto de reivindicaciones. Se considera que las realizaciones y/o los ejemplos de la siguiente descripción que no están cubiertos por las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la presente Invención. Las referencias a métodos de tratamiento en los posteriores párrafos de esta descripción deben Interpretarse como referencias a los compuestos, a las composiciones farmacéuticas y a los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

La presente Invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que una dosis única de una vacuna de norovlrus provoca una respuesta inmunitaria protectora rápida y robusta contra norovirus en humanos cuando se administra por vía parenteral. Por consiguiente, en el presente documento se divulga un método para provocar inmunidad protectora contra norovlrus en un humano que comprende administrar por vía parenteral al humano no más de una dosis única de una composición de vacuna, comprendiendo dicha composición VLP de norovlrus del genogrupo I y/o genogrupo II, en la que dicha composición Induce al menos un aumento de tres veces en el título sérico de anticuerpos específicos de norovirus en comparación con el título en el humano antes de la administración de la composición. En determinadas realizaciones, el aumento en el título de anticuerpos específicos de norovirus se induce en los siguientes siete días de la administración de la dosis única de la composición.

En una realización, la composición de vacuna se administra al humano mediante una vía de administración intramuscular.

Las composiciones de vacuna de dosis única pueden comprender dosis de aproximadamente 5 ng a aproximadamente 150 ng de VLP de norovirus del genogrupo I y VLP de norovirus del genogrupo II. En realizaciones en las que las composiciones de vacuna de dosis única comprenden VLP de norovirus del genogrupo I y genogrupo II, la dosis de cada VLP puede ser Igual o diferente. En una realización, la composición comprende no más de 50 ng de VLP de norovirus del genogrupo I. En otra realización, la composición comprende no más de 25 ng de VLP de norovirus del genogrupo I. Todavía en otra realización, la composición comprende no más de 150 ng de VLP de norovirus del genogrupo II. Las VLP de norovirus pueden ser VLP monovalentes o VLP multivalentes.

En algunos aspectos de la Invención, las VLP de norovirus del genogrupo I en las composiciones de vacuna comprenden una proteína de la cápside derivada de una cepa viral del genogrupo I. En una realización, las VLP de norovirus del genogrupo I comprenden una proteína de la cápside de un norovirus del genogrupo I, genotipo 1. En otra realización, las VLP de norovirus del genogrupo I comprenden una proteína de la cápside del virus de Norwalk. En otros aspectos de la Invención, las VLP de norovirus del genogrupo II en las composiciones de vacuna comprenden una proteína de la cápside derivada de una cepa viral del genogrupo II. En algunas realizaciones, las VLP de norovirus del genogrupo II comprenden una proteína de la cápside de un norovirus del genogrupo II, genotipo 4. En determinadas realizaciones, las VLP de norovirus del genogrupo II son VLP generadas a partir de la expresión de una secuencia de consenso de norovirus del genogrupo II. En una realización particular, las VLP de norovirus del genogrupo II comprenden una proteína de la cápside que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1.

La composición de vacuna comprende dos adyuvantes, MPL e hidróxido de aluminio. En algunas realizaciones, la composición de vacuna puede comprender además un tampón, tal como L-histidina, imidazol, ácido succínlco, tris y ácido cítrico. La composición de vacuna puede formularse como un polvo seco o un líquido. En una realización, la composición de vacuna se formula como un líquido (por ejemplo, una formulación acuosa).

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Resultados de los ensayos pan-ELISA que miden los niveles séricos combinados de IgG, IgA e IgM de voluntarios humanos Inmunizados por vía Intramuscular con placebo (solución salina) o una formulación de vacuna que contiene 5, 15, 50 ó 150 ng de cada una de una VLP de norovirus del genogrupo 1.1 y una VLP de norovirus del genogrupo II.4. La media geométrica de los títulos para los anticuerpos anti-GI.1 (A) y anti-GII.4 (B) se muestra para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 días después de la primera Inmunización y 7 y 28 días después de la segunda Inmunización. Los voluntarios recibieron Inmunizaciones los días de estudio 0 y 28.

Figura 2. Resultados de los ensayos pan-ELISA que miden los niveles séricos combinados de IgG, IgA e IgM de voluntarios humanos Inmunizados por vía Intramuscular con placebo (solución salina) o una formulación de vacuna que contiene 5, 15, 50 ó 150 ng de cada una de una VLP de norovirus del genogrupo 1.1 y una VLP de norovirus del genogrupo II.4. El aumento de veces de la media geométrica para los anticuerpos anti-GI.1 (A) y anti-GII.4 (B) se muestra para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 días después de la primera Inmunización y 7 y 28 días después de la segunda Inmunización. Los voluntarios recibieron Inmunizaciones los días de estudio 0 y 28.

Figura 3. Resultados de los ensayos pan-ELISA que miden los niveles séricos combinados de IgG, IgA e IgM de voluntarios humanos Inmunizados por vía Intramuscular con placebo (solución salina) o una formulación de vacuna que contiene 5, 15, 50 ó 150 ng de cada una de una VLP de norovirus del genogrupo 1.1 y una VLP de norovirus del genogrupo II.4. Las tasas de sero-respuestas en porcentaje (es decir, un aumento de cuatro veces en el título de anticuerpos en comparación con los títulos previos a la Inmunización) para los anticuerpos anti-GI.1 (A) y anti-GII.4 (B) se muestran para cada uno de los niveles de dosificación a los días 7 y 21 después de la primera Inmunización y 7 y 28 días después de la segunda Inmunización. Los voluntarios recibieron Inmunizaciones los días de estudio 0 y 28.

Figura 4. Resultados de ensayos ELISA que miden IgA sérica de voluntarios humanos Inmunizados por vía intramuscular con placebo (solución salina) o una formulación de vacuna que contiene 5, 15 ó 50 ng de una VLP de cada una de una VLP de norovirus del genogrupo 1.1 y una VLP de norovirus del genogrupo II.4. La media geométrica de los títulos para los anticuerpos anti-GI.1 (A) y anti-GII.4 (B) se muestra para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 días después de la primera Inmunización y 7 y 28 días después de la segunda Inmunización. Los voluntarlos recibieron Inmunizaciones los días de estudio 0 y 28.

Figura 5. Resultados de los ensayos ELISA que miden IgA sérica de voluntarios humanos Inmunizados por vía intramuscular con placebo (solución salina) o una formulación de vacuna que contiene 5 ,15 ó 50 ng de cada una de una VLP de norovirus del genogrupo 1.1 y una VLP de norovirus del genogrupo II.4. El aumento en veces de la media geométrica para los anticuerpos anti-GI.1 (A) y anti-GII.4 (B) se muestra para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 días después de la primera Inmunización y 7 y 28 días después de la segunda Inmunización. Los voluntarlos recibieron Inmunizaciones los días de estudio 0 y 28.

Figura 6. Resultados de los ensayos ELISA que miden la IgA sérica de voluntarios humanos Inmunizados por vía Intramuscular con placebo (solución salina) o una formulación de vacuna que contiene 5 ,15 ó 50 ng de cada una de una VLP de norovlrus del genogrupo 1.1 y una VLP de norovlrus del genogrupo II.4. Se muestran las tasas de serorespuestas en porcentaje (es decir, un aumento de cuatro veces en el título de anticuerpos en comparación con los títulos previos a la Inmunización) para los anticuerpos antl-GI.1 (A) y anti-GII.4 (B) para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 días después de la primera Inmunización y 7 y 28 días después de la segunda Inmunización. Los voluntarlos recibieron Inmunizaciones los días de estudio 0 y 28.

Figura 7. Resultados de ensayos ELISA que miden IgG sérica de voluntarios humanos Inmunizados por vía Intramuscular con placebo (solución salina) o una formulación de vacuna que contiene 5 ,15 ó 50 ng de cada una de una VLP de norovlrus del genogrupo 1.1 y una VLP de norovlrus del genogrupo II.4. La media geométrica de los títulos para los anticuerpos anti-GI.1 (A) y anti-GII.4 (B) se muestra para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 días después de la primera Inmunización y 7 y 28 días después de la segunda Inmunización. Los voluntarlos recibieron Inmunizaciones los días de estudio 0 y 28.

Figura 8. Resultados de los ensayos ELISA que miden IgG sérica de voluntarios humanos se Inmunizaron por vía Intramuscular con placebo (solución salina) o una formulación de vacuna que contenía 5 ,15 ó 50 ng de cada una de una VLP de norovlrus de genogrupo 1.1 y una VLP de norovlrus del genogrupo II.4. El aumento en veces de la media geométrica para los anticuerpos antl-GI.1 (A) y anti-GII.4 (B) se muestra para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 días después de la primera Inmunización y 7 y 28 días después de la segunda Inmunización. Los voluntarlos recibieron Inmunizaciones los días de estudio 0 y 28.

Figura 9. Resultados de los ensayos ELISA que miden la IgG sérica de voluntarios humanos Inmunizados por vía Intramuscular con placebo (solución salina) o una formulación de vacuna que contiene 5 ,15 ó 50 ng de cada una de una VLP de norovlrus del genogrupo 1.1 y una VLP de norovlrus del genogrupo II.4. Las tasas de sero-respuestas en porcentaje (es decir, un aumento de cuatro veces en el título de anticuerpos en comparación con los títulos previos a la Inmunización) se muestran para los anticuerpos antl-GI.1 (A) y anti-GII.4 (B) para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 días después de la primera Inmunización y 7 y 28 días después de la segunda Inmunización. Los voluntarlos recibieron Inmunizaciones los días de estudio 0 y 28.

Figura 10. Resultados de los ensayos pan-ELISA que miden los niveles séricos combinados de IgG, IgA e IgM de voluntarios humanos Inmunizados con una vacuna monovalente ¡ntranasal de norovlrus tal como se describe en El Kamary etal., (2010) J Infecí Dis, vol. 202(11): 1649-1658 (grupos LV01-103) o una vacuna bivalente intramuscular de norovirus tal como se describe en el ejemplo 1 (grupos LV03-104) en los puntos de tiempo indicados. Los voluntarlos humanos recibieron o bien placebo o bien dos dosis de la formulación de vacuna Intramuscular o ¡ntranasal. La vacuna bivalente Intramuscular de norovlrus contenía 5 ng de cada una de una VLP de norovlrus del genotipo 1.1 y una VLP de norovlrus del genotipo II.4. La vacuna monovalente ¡ntranasal contenía 100 ng de un norovlrus del genogrupo 1.1. Los voluntarlos que recibieron la vacuna ¡ntranasal o el placebo se expusieron a norovlrus vivos después de la segunda Inmunización.

Figura 11. Análisis por FACS de células mononucleares de sangre periférica obtenidas de voluntarios humanos el día 0 antes de la Inmunización con una dosis de 5 (xg de vacuna bivalente Intramuscular de norovlrus (A) o placebo (B) y 7 días después de la Inmunización. Las PBMC CD19+ se dirigen por las mucosas tal como se evidencia a partir de la expresión del receptor de asentamiento alfa4/beta7 y del receptor CCR10 de quimiocinas.

Descripción detallada de la invención

La presente divulgación se refiere a métodos para provocar una Inmunidad protectora contra Infecciones por norovlrus en un sujeto. En particular, la presente divulgación proporciona métodos para provocar una inmunidad protectora contra norovlrus en un humano administrando por vía parenteral al humano no más que una dosis única de una vacuna que comprende VLP de norovlrus y un adyuvante, en los que la vacuna confiere protección frente a o mejora de, al menos, un síntoma de la Infección por norovlrus. Los Inventores han descubierto sorprendentemente que la administración Intramuscular de no más de una dosis única de una composición de vacuna que comprende VLP de norovlrus a humanos Induce una seroconverslón sérica rápida (es decir, dentro de los 7 días de la Inmunización) (es decir, al menos un aumento de tres veces en los títulos séricos de anticuerpos específicos del antígeno por encima de los niveles previos a la vacunación) que es Indicativo de una respuesta inmunitaria protectora contra la Infección y enfermedad por norovlrus. Las respuestas ¡nmunltarlas Inducidas por esta meseta de composición de vacuna de dosis única a títulos de anticuerpos elevados son similares a las observadas con la Infección natural mediante la administración de virus vivos en estudios de exposición en humanos. Curiosamente, no se requiere una dosis de refuerzo de la vacuna ya que la respuesta ¡nmunltarla no aumenta tras la administración adicional de una dosis de vacuna adicional.

La Invención proporciona una composición de vacuna que comprende uno o más antígenos de norovlrus. Por “Norovirus, “norovirus (ÑOR)”, “norovirus” y los equivalentes gramaticales en el presente documento se entiende los miembros del género Norovirus de la familia Caliciviridae. En algunas realizaciones, un norovirus puede incluir un grupo de virus no encapsulados de ARN monocatenario, de sentido positivo, relacionados que pueden ser infecciosos para especies de mamíferos humanos o no humanos. En algunas realizaciones, un norovirus puede causar gastroenteritis aguda en humanos. Los norovirus también pueden denominarse virus estructurados redondos pequeños (SRSV) que tienen una estructura superficial definida o un borde irregular cuando se observan mediante microscopía electrónica.

Incluidos dentro de los norovirus hay al menos cinco genogrupos (Gl, Gil, GUI, GIV y GV). Los norovirus Gl, Gil y GIV son infecciosos en humanos, mientras que los norovirus GUI infectan principalmente a las especies bovinas. GV se ha aislado recientemente de ratones (Zheng etal., (2006) Virology, vol. 346: 312-323). Representativas de GUI son las cepas de Jena y Newbury, mientras que las cepas Alphatron, Fort Lauderdale y Saint Cloud son representativas de GIV. Los grupos Gl y Gil pueden segregarse adicionalmente en grupos genéticos o genotipos basándose en la clasificación genética (Ando etal., (2000) J. Infectious Diseases, vol. 181 (supl. 2): S336-S348; Lindell etal., (2005) J. Clin. MIcrobiol, vol. 43(3): 1086-1092). Tal como se usa en el presente documento, la expresión agrupaciones genéticas se usa de manera Intercambiable con el término genotipos. Dentro del genogrupo I, hay 8 grupos de Gl conocidos hasta la fecha (con el nombre de la cepa de virus prototipo): GI.1 (Norwalk (NV-USA93)); GI.2 (Southhampton (SOV-GBR93)); GI.3 (Desert Shield (DSV-USA93)); GI.4 (virus Cruise Ship/Chiba (Chiba-JPNOO)); GI.5 (318/Musgrove (Musgrov-GBROO)); GI.6 (Hesse (Hesse-DEU98)); GI.7 (Wnchest-GBROO); y GI.8 (Boxer-USA02). Dentro del genogrupo II, hay 19 grupos de Gil conocidos hasta la fecha (con el nombre de la cepa de virus prototipo): Gil.1 (Hawaii (Hawaii-USA94)); GII.2 (Snow Mountain-Melksham (Msham-GBR95)); GII.3 (Toronto (Toronto-CAN93)); Gil.4 (Bristol/Lordsdale (Bristol-GBR93)); GII.5 (290/Hillingdon (Hilingd-GBROO)); GII.6 (269/Seacroft (Seacrof-GBR00)); Gil.7 (273/Leeds (Leeds-GBROO)); GII.8 (539/Amsterdam (Amstdam-NLD99)); GII.9 (378 (VABeach-USA01)), G il.10 (Erfurt-DEU01); GII.11 (SW9180JPN01); GII.12 (Wortley-GBROO); GII.13 (Faytvil-USA02); G il.14 (M7-USA03); G il.15 (J23-USA02); GII.16 (Tiffin-USA03); G il.17 (CSE1-USA03); GII.18 (QW101/2003/US); y GII.19 (QW170/2003/US).

Por “norovirus” también se entiende en el presente documento partículas similares a virus de norovirus recombinantes (VLP de rNOR). En algunas realizaciones, la expresión recombinante de al menos la proteína de la cápside del norovirus codificada por ORF2 en células, por ejemplo, a partir de un vector de baculovirus en células Sf9, puede dar como resultado el autoensamblaje espontáneo de la proteína de la cápside en las VLP. En algunas realizaciones, la expresión recomblnante de al menos las proteínas de norovirus codificadas porORFI y ORF2 en células, por ejemplo, a partir de un vector de baculovirus en células Sf9, puede dar como resultado el autoensamblaje espontáneo de la proteína de la cápside en las VLP. Las VLP son estructuralmente similares a los norovirus pero carecen del genoma de ARN viral y, por tanto, no son infecciosas. Por consiguiente, los “norovirus” incluyen viriones que pueden ser partículas Infecciosas o no Infecciosas, que incluyen partículas defectuosas.

Los ejemplos no limitativos de norovirus incluyen la cepa del genogrupo 1 del norovirus Hu/NoV/West Chester/2001/USA, n.° de registro de GenBank AY502016; virus Chiba (CHV, GenBank AB042808); cepa del genogrupo 2 del norovirus Hu/NoV/Braddock Heights/1999/USA, n.° de registro de GenBank AY502015; cepa del genogrupo 2 del norovirus Hu/NoV/Fayette/1999/USA, n.° de registro de GenBank AY502014; cepa del genogrupo 2 del norovirus Hu/NoV/Fairfield/1999/USA, n.° de registro de GenBank AY502013; cepa del genogrupo 2 del norovirus Hu/NoV/Sandusky/1999/USA, N.° de registro de GenBank AY502012; cepa del genogrupo 2 del norovirus Hu/NoV/Canton/1999/USA, n.° de registro de GenBank AY502011; cepa del genogrupo 2 del norovirus Hu/NoV/Tiffin/1999/USA, n.° de registro de GenBank AY502010; cepa del genogrupo 2 del norovirus Hu/NoV/CS-E1/2002/USA, n.° de registro de GenBank AY50200; cepa del genogrupo 1 del norovirus Hu/NoV/Wisconsin/2001/USA, n.° de registro de GenBank AY502008; cepa del genogrupo 1 del norovirus Hu/NoV/CS-841/2001/USA, n.° de registro de GenBank AY502007; cepa del genogrupo 2 del norovirus Hu/NoV/Hiram/2000/USA, n.° de registro de GenBank AY502006; cepa del genogrupo 2 del norovirus Hu/NoV/Tontogany/1999/USA, n.° de registro de GenBank AY502005; virus de Norwalk, genoma completo, n.° de registro de GenBank NC. Sub.-001959; ARN genómico del norovirus Hu/GI/Otofuke/1979/JP, genoma completo, n.° de registro de GenBank AB187514; norovirus Hu/Hokkaido/133/2003/JP, n.° de registro de GenBank AB212306; norovirus Sydney 2212, n.° de registro de GenBank AY588132; cepa SN2000JA del virus de Norwalk, n.° de registro de GenBank AB190457; genoma completo del virus Lordsdale, n.° de registro de GenBank X86557; ARN genómico del virus tipo Norwalk, Gifu”96, n.° de registro de GenBank AB045603; cepa del virus de Norwalk Vietnam 026, genoma completo, n.° de registro de GenBank, AF504671; norovirus Hu/GII.4/2004/N/L, n.° de registro de GenBank AY883096; norovirus Hu/GII/Hokushin/03/JP, n.° de registro de GenBank AB195227; norovirus Hu/GII/Kamo/03/JP, n.° de registro de GenBank AB195228; norovirus Hu/GII/Sinsiro/97/JP, n.° de registro de GenBank AB195226; norovirus Hu/GII/lna/02/JP, n.° de registro de GenBank AB195225; norovirus Hu/NLV/GII/Neustrelitz260/2000/DE, n.° de registro de GenBank AY772730; norovirus Hu/NLV/Dresden174/pUS-Norll/1997/GE, n.° de registro de GenBank AY741811; norovirus Hu/NLV/Oxford/B2S16/2002/UK, n.° de registro de GenBank AY587989; norovirus Hu/NLV/Oxford/B4S7/2002/UK, n.° de registro de GenBank AY587987; norovirus Hu/NLV/Witney/B7S2/2003/UK, n.° de registro de GenBank AY588030; norovirus Hu/NLV/Banbury/B9S23/2003/UK, n.° de registro de GenBank AY588029; norovirus Hu/NLV/ChippingNorton/2003/UK, n.° de registro de GenBank AY588028; norovirus Hu/NLV/Didcot/B9S2/2003/UK, n.° de registro de GenBank AY588027; norovirus Hu/NLV/Oxford B8S5/2002/UK, n.° de registro de GenBank AY588026; norovirus Hu/NLV/Oxford/B6S4/2003/UK, n.° de registro de GenBank AY588025; norovirus Hu/NLV/Oxford B6S5/2003/UK, n.° de registro de GenBank AY588024; norovirus Hu/NLV/Oxford/B5S23/2003/UK, n.° de registro de GenBank AY588023; norovirus Hu/NLV/Oxford/B6S2/2003/UK, n.° de registro de GenBank AY588022; norovirus Hu/NLV/Oxford/B6S6/2003/UK, n.° de registro de GenBank AY588021; aislado del virus tipo Norwalk Bo/Thirsk10/00/UK, n.° de registro de GenBank AY126468; aislado del virus tipo Norwalk Bo/Penrith55/00/UK, n.° de registro de GenBank AY126476; aislado del virus tipo Norwalk Bo/Aberystwyth24/00/UK, n.° de registro de GenBank AY126475; aislado del virus tipo Norwalk Bo/Dumfries/94/UK, n.° de registro de GenBank AY126474; norovirus NLV/IF2036/2003/lraq, n.° de registro de GenBank AY675555; norovirus NLV/IF1998/2003/lraq, n.° de registro de GenBank AY675554; norovirus NLV/BUDS/2002/USA, n.° de registro de GenBank AY660568; norovirus NLV/Paris lsland/2003/USA, n.° de registro de GenBank AY652979; virus SnowMountain, genoma completo, n.° de registro de GenBank AY134748; virus tipo Norwalk NLV/Fort Lauderdale/560/1998/US, n.° de registro de GenBank AF414426; Hu/norovirus/6iroshima/1999/JP (9912-02F), n.° de registro de GenBank AB044366; cepa 11MSU-MW del virus tipo Norwalk, n.° de registro de GenBank AY274820; cepa B-1SVD del virus tipo Norwalk, n.° de registro de GenBank AY274819; cepa del genogrupo 2 de norovirus Hu/NoV/Farmington Hills/2002/USA, n.° de registro de GenBank AY502023; cepa del genogrupo 2 de norovirus Hu/NoV/CS-G4/2002/USA, n.° de registro de GenBank AY502022; cepa del genogrupo 2 de norovirus Hu/NoV/CS-G2/2002/USA, n.° de registro de GenBank AY502021; cepa del genogrupo 2 de norovirus Hu/NoV/CS-G1/2002/USA, n.° de registro de GenBank AY502020; cepa del genogrupo 2 de norovirus Hu/NoV/Anchorage/2002/USA, N.° de registro de GenBank AY502019; cepa del genogrupo 2 de norovirus Hu/NoV/CS-D1/2002/CAN, n.° de registro de GenBank AY502018; cepa del genogrupo 2 de norovirus Hu/NoV/Germanton/2002/USA, n.° de registro de GenBank AY502017; calicivirus humano NLV/GII/Langen1061/2002/DE, genoma completo, n.° de registro de GenBank AY485642; poliproteína de norovirus 1 murino, n.° de registro de GenBank AY228235; virus de Norwalk, n.° de registro de GenBank AB067536; calicivirus humano NLV/Mex7076/1999, n.° de registro de GenBank AF542090; calicivirus humano NLV/Oberhausen 455/01/DE, n.° de registro de GenBank AF539440; calicivirus humano NLV/Herzberg 385/01/DE, n.° de registro de GenBank AF539439; calicivirus humano NLV/Boxer/2001/US, n.° de registro de GenBank AF538679; ARN genómico del virus tipo Norwalk, genoma completo, n.° de registro de GenBank AB081723; ARN genómico del virus tipo Norwalk, genoma completo, aislado: Saltama U201, n.° de registro de GenBank AB039782; ARN genómico del virus tipo Norwalk, genoma completo, aislado: Saltama U18, n.° de registro de GenBank AB039781; ARN genómico del virus tipo Norwalk, genoma completo, aislado: Saltama U25, n.° de registro de GenBank AB039780; cepa del virus de Norwalk: U25GII, n.° de registro de GenBank AB067543; cepa del virus de Norwalk: U201 Gil, n.° de registro de GenBank AB067542; virus tipo Norwalk, cepa 416/97003156/1996/LA, n.° de registro de GenBank AF080559; virus tipo Norwalk, cepa 408/97003012/1996/FL, n.° de registro de GenBank AF080558; virus tipo Norwalk NLV/Burwash Landing/331/1995/US, n.° de registro de GenBank AF414425; virus tipo Norwalk NLV/Miami Beach/326/1995/US, n.° de registro de GenBank AF414424; virus tipo Norwalk NLV/White River/290/1994/US, n.° de registro de GenBank AF414423; virus tipo Norwalk NLV/New Orleans/306/1994/US, n.° de registro de GenBank AF414422; virus tipo Norwalk NLV/Port Canaveral/301/1994/US, n.° de registro de GenBank AF414421; virus tipo Norwalk NLV/Honolulu/314/1994/US, n.° de registro de GenBank, AF414420; virus tipo Norwalk NLV/Richmond/283/1994/US, n.° de registro de GenBank AF414419; virus tipo Norwalk NLV/Westover/302/1994/US, n.° de registro de GenBank AF414418; virus tipo Norwalk NLV/UK3-17/12700/1992/GB, n.° de registro de GenBank AF414417; virus tipo Norwalk NLV/Miami/81/1986/US, n.° de registro de GenBank AF414416; cepa Snow Mountain, n.° de registro de GenBank U70059; virus Desert Shield DSV395, n.° de registro de GenBank U04469; virus de Norwalk, genoma completo, n.° de registro de GenBank AF093797; calicivirus de Hawaii, n.° de registro de GenBank U07611; virus de Southampton, n.° de registro de GenBank L07418; virus de Norwalk (SRSV-KY-89/89/J), n.° de registro de GenBank L23828; virus de Norwalk (SRSV-SMA/76/US), n.° de registro de GenBank L23831; Virus de Camberwell, n.° de registro de GenBank U46500; cepa de calicivirus humano Melksham, n.° de registro de GenBank X81879; cepa de calicivirus humano MX, n.° de registro de GenBank U22498; Minireovirus TV24, n.° de registro de GenBank U02030; y virus tipo Norwalk NLV/Gwynedd/273/1994/US, n.° de registro de GenBank AF414409; cuyas secuencias (según se ingresaron antes de la fecha de presentación de esta solicitud) se Incorporan al presente documento como referencia. Secuencias de norovirus adicionales se divulgan en las siguientes publicaciones de patentes: WO 2005/030806, WO 2000/79280, JP2002020399, US2003129588, patente estadounidense n.° 6.572.862, WO 1994/05700 y WO 05/032457. Véase también Green etal., (2000) J. Infect. Dis, vol. 181 (supl. 2): S322-330; Wang etal., (1994) J. Viral, vol. 68: 5982-5990; Chen et al., (2004) J. Viral, vol. 78:6469-6479; Chakravarty et al., (2005) J. Viral, vol. 79:554-568; Hansman et al., (2006) J. Gen. Viral., vol. 87: 909-919; Bull etal., (2006) J. Clin. Micro., vol. 44(2): 327 - 333; Siebenga, etal., (2007) J. Viral, vol. 81 (18): 9932-9941, y Fankhauser et al., (1998) J. Infect. Dis., vol. 178: 1571 - 1578; para las comparaciones de secuencias y una discusión de la diversidad genética y el análisis filogenétlco de norovirus. Las secuencias de ácidos nucleicos y las correspondientes secuencias de aminoácidos de cada uno se Incorporan todas ellas como referencia en su totalidad. En algunas realizaciones, puede usarse un criptograma con fines de Identificación y está organizado: especie huésped de la que se aisló el virus/abreviatura de génera/abreviatura de especle/nombre de cepa/año de apariclón/país de origen (Green et al., Human Calicivirus, en Fields Virology vol. 1 841-874 (Knipe y Howley, editores ejecutivos, 4a ed., Lippincott Williams & Wilkins 2001)). Las cepas virales del genogrupo II, genotipo 4 (GII.4) (por ejemplo, cepas Houston, Minerva (también conocida como Den Haag) y Laurens (también conocida como Yerseke) son preferidas en algunas realizaciones. A medida que se identifican nuevas cepas y se ponen a disposición sus secuencias genéticas, los expertos en la técnica pueden emplear las VLP usando estas cepas contemporáneas en las composiciones y los métodos de la presente invención usando la técnica habitual. Por tanto, la presente invención contempla VLP preparadas a partir de tales cepas como antígenos adecuados para su uso en las composiciones y los métodos descritos en el presente documento.

El antígeno de norovlrus puede estar en forma de péptldos, proteínas o partículas similares a virus (VLP). En una realización preferida, el antígeno de norovlrus comprende VLP. Tal como se usa en el presente documento, “partícula(s) similares) a virus o VLP” se refiere a una(s) partícula(s) similar(es) a virus, fragmento(s), agregados o porción/porciones de la(s) misma(s) producida(s) a partir de la secuencia codificante de proteína de la cápslde del norovlrus y que comprende(n) una(s) característica(s) antigénica(s) slmllar(es) a las de las partículas Infecciosas del norovlrus. Los antígenos de norovlrus también pueden estar en forma de monómeros de cápslde, multímeros de cápslde, fragmentos proteicos o peptídicos de VLP, o agregados o mezclas de los mismos. Las proteínas o los péptldos antlgénlcos de norovlrus también pueden estar en forma desnaturalizada, producida usando métodos conocidos en la técnica.

Las VLP de la presente Invención pueden formarse a partir de la proteína de la cápslde de norovlrus de longitud completa tal como las proteínas VP1 y/o VP2 o determinados derivados de VP1 o VP2 usando métodos convencionales en la técnica. Alternativamente, la proteína de la cápslde usada para formar la VLP es una proteína de la cápslde truncada. En algunas realizaciones, por ejemplo, al menos una de las VLP comprende una proteína VP1 truncada. En otras realizaciones, todas las VLP comprenden proteínas VP1 truncadas. El truncamiento puede ser un truncamiento N-termlnal o C-terminal. Las proteínas de la cápslde truncadas son derivados funclonalmente adecuados de la proteína de la cápslde. Los derivados funcionales de la proteína de la cápslde son capaces de generar una respuesta ¡nmunltarla (si es necesario, cuando están adecuadamente en presencia de adyuvantes) de la misma manera que la respuesta ¡nmunltarla generada por una VLP que consiste en la proteína de la cápslde de longitud completa.

Las VLP pueden contener proteínas VP1 mayoritarias y/o proteínas VP2 minoritarias. En algunas realizaciones, cada VLP contiene proteína VP1 y/o VP2 de un único genogrupo de norovirus que da lugar a una VLP monovalente. Tal como se usa en el presente documento, el término “monovalente” significa que las proteínas antlgénlcas derivan de un genogrupo de norovirus único. Por ejemplo, las VLP contienen VP1 y/o VP2 de una cepa de virus del genogrupo I (por ejemplo, VP1 y VP2 del virus de Norwalk). Preferiblemente, la VLP se compone principalmente de proteínas VP1. En una realización de la Invención, el antígeno es una mezcla de VLP monovalentes en la que la composición Incluye VLP compuestas por VP1 y VP2 de un solo genogrupo de norovirus mezcladas con VLP compuestas por VP1 y VP2 de un genogrupo de norovirus diferente (por ejemplo, virus de Norwalk y virus de Houston) tomado de múltiples cepas virales. Puramente a modo de ejemplo, la composición puede contener VLP monovalentes de una o más cepas del genogrupo I de norovlrus junto con VLP monovalentes de una o más cepas del genogrupo II de norovlrus. Las cepas pueden seleccionarse en función de su predominio de la circulación en un momento dado. En determinadas realizaciones, la mezcla de VLP de norovlrus se compone de cepas virales GI.1 y GII.4. Más preferiblemente, la mezcla de VLP de norovlrus se compone de las cepas de Norwalk y una secuencia de cápslde de consenso derivada de norovlrus del genogrupo II. Las secuencias de cápslde de consenso derivadas de secuencias de norovlrus circulantes y las VLP preparadas con tales secuencias se describen en el documento WO 2010/017542, que se incorpora al presente documento como referencia en su totalidad. Por ejemplo, en una realización, una secuencia de cápslde de consenso derivada de cepas virales del genogrupo II, genotipo 4 (GII.4) comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1. Por tanto, en algunas realizaciones, la composición de vacuna comprende una mezcla de VLP monovalentes, en la que una VLP monovalente comprende una proteína de la cápside de un norovirus del genogrupo I (por ejemplo, Norwalk) y la otra VLP monovalente comprende una proteína de la cápslde consenso que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1.

M K M A S S D A N p S D G S T A N L V P E V N N E V M A L E P V V G A A I A A P V A G _{Q G}N V I D P ^wI R N N F V _GA P G G E F

T V S P R N A P G E I L w S A P L G p D L N P Y L s H L A R M Y

N G Y A G G F E V Q V I L A G N A F T A G K I I F A A V P P N F P T E G L S P S Q V T M F P H I I V D V R G L E P V L I P L P D V R N N F Y H Y N Q S N D P T I K L I A M L Y T P L R A N N A G D D V F T V S C R V L T R P S P D F D F I F L V P P T V E S R T K P F T V P I L T V E E M T N S R F P I P L E K L F T G P S G A F V V _QP _QN G R c T T D G V L L G T T Q L S P V N I C T F R G

D V T H I A G T Q E Y T M N L A S Q N W N N Y D P T E E I P A P L G T P D F V G K I Q G V L T Q T T R G D G S T R G H K A T V S T G S V H F T P K L G S V G F S T D T S N D F E T G G N T K F T P V G V V Q D G S T T H G N E P _{Q Q}W V L P D Y S G R D S H _NV H L A p A V A P T F P G E _QL L F F R s T M P G C S G Y P N M N

L D C L L p Q E W V Q H F Y Q E A A P A Q S D V A L L R F V N P

D T G R V L F E C K L H K S G Y V T V A H T G Q H D L V I P P N G Y F R F D S W V N Q F Y T L A P M G N G T G R R R A L ( S E Q ID

N O : 1 )

Sin embargo, en una realización alternativa de la invención, las VLP pueden ser VLP multivalentes que comprenden, por ejemplo, proteínas VP1 y/o VP2 de un genogrupo de norovirus entremezclado con proteínas VP1 y/o VP2 de un segundo genogrupo de norovirus, en las que las diferentes proteínas VP1 y VP2 no son proteínas VP1 y VP2 quiméricas, sino que se asocian juntas dentro de la misma estructura de cápslde para formar VLP ¡nmunogénlcas. Tal como se usa en el presente documento, el término “multlvalente” significa que las proteínas antlgénlcas derivan de dos o más genogrupos o cepas de norovirus. Las VLP multivalentes pueden contener antígenos de VLP tomados de dos o más cepas virales. Puramente a modo de ejemplo, la composición puede contener VLP multivalentes que se componen de monómeros o multímeros de cápside de una o más cepas del genogrupo I de norovirus (por ejemplo, virus de Norwalk) junto con monómeros o multímeros de cápslde de una o más cepas del genogrupo II de norovirus (por ejemplo, virus de Houston). Preferiblemente, las VLP multivalentes contienen proteínas de la cápside de las cepas de norovirus de Norwalk y Houston, u otras cepas predominantemente circulantes en un momento dado.

La combinación de VLP monovalentes o multivalentes dentro de la composición preferiblemente no reduciría la ¡nmunogenlcldad de cada tipo de VLP. En particular, se prefiere que no haya Interferencia entre las VLP de norovirus en la combinación de la Invención, de manera que la composición de VLP combinadas de la Invención sea capaz de provocar Inmunidad contra la Infección por cada genotipo de norovirus representado en la vacuna. Adecuadamente, la respuesta ¡nmunltarla contra un tipo de VLP dado en la combinación es al menos el 50% de la respuesta ¡nmunltarla del mismo tipo de VLP cuando se mide Individualmente, preferiblemente el 100% o sustancial mente el 100%. La respuesta ¡nmunltarla puede medirse adecuadamente, por ejemplo, mediante respuestas de anticuerpos, tal como se ¡lustra en los ejemplos en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, “VLP de norovirus del genogrupo I” se refiere a VLP monovalentes o multivalentes que comprenden una proteína de la cápslde derivada de una o más cepas de norovirus del genogrupo I. En algunas realizaciones, las VLP de norovirus del genogrupo I comprenden una proteína de la cápslde de longitud completa de un norovirus del genogrupo I (por ejemplo, virus de Norwalk). En otras realizaciones, las VLP de norovirus del genogrupo I comprenden una proteína de la cápslde de consenso derivada de diversas cepas del genogrupo I. Las cepas del genogrupo I de las que deriva la secuencia de cápslde de consenso pueden estar dentro del mismo genotipo o grupo genético o pueden ser de diferentes genotipos o grupos genéticos. De forma similar, tal como se usa en el presente documento, “VLP de norovirus del genogrupo II” se refiere a VLP monovalentes o multivalentes que comprenden una proteína de la cápslde derivada de una o más cepas de norovirus del genogrupo II. En algunas realizaciones, las VLP de norovirus del genogrupo II comprenden una proteína de la cápslde de longitud completa de un norovirus del genogrupo II (por ejemplo, virus Laurens o Minerva). En otras realizaciones, las VLP de norovirus del genogrupo II comprenden una proteína de la cápslde de consenso derivada de diversas cepas del genogrupo II. Las cepas del genogrupo II de las que deriva la secuencia de cápslde de consenso pueden estar dentro del mismo genotipo o grupo genético o pueden ser de diferentes genotipos o grupos genéticos. En una realización, las VLP de norovirus del genogrupo II comprenden una secuencia de cápslde de consenso de norovirus del genogrupo II, genotipo 4 (GII.4). Por tanto, en algunas realizaciones, las VLP de norovirus del genogrupo II comprenden una secuencia de cápslde de SEQ ID NO: 1.

Las VLP multlvalentes pueden producirse por expresión separada de las proteínas de la cápslde Individuales seguido de su combinación para formar las VLP. Alternativamente, pueden expresarse múltiples proteínas de la cápslde dentro de la misma célula, a partir de uno o más constructos de ADN. Por ejemplo, pueden transformarse o transfectarse múltiples constructos de ADN en células huésped, codificando cada vector para una proteína de la cápslde diferente. Alternativamente, puede usarse un único vector que tenga múltiples genes de cápside, controlados por un promotor compartido o múltiples promotores Individuales. También pueden Incorporarse elementos IRES al vector, según sea apropiado. Usando tales estrategias de expresión, las proteínas de la cápslde coexpresadas pueden purificarse conjuntamente para la posterior formación de VLP, o pueden formar espontáneamente VLP multlvalentes que luego pueden purificarse.

Un procedimiento preferido para la producción de VLP multlvalentes comprende la preparación de proteínas o derivados de la cápslde de VLP, tales como proteínas VP1, a partir de diferentes genotipos de norovirus, el mezclado de las proteínas y el ensamblaje de las proteínas para producir VLP multlvalentes. Las proteínas VP1 pueden estar en forma de un extracto en bruto, purificarse parcialmente o purificarse antes del mezclado. Las VLP monovalentes ensambladas de diferentes genogrupos pueden desensamblarse, mezclarse y reensamblarse para dar VLP multlvalentes. Preferiblemente, las proteínas o VLP se purifican, al menos parcialmente, antes de combinarse. Opclonalmente, puede llevarse a cabo una purificación adicional de las VLP multlvalentes después del ensamblaje.

Adecuadamente, las VLP de la Invención se preparan mediante el desensamblaje y el reensamblaje de las VLP para proporcionar VLP homogéneas y puras. En una realización, las VLP multlvalentes pueden prepararse mediante el desensamblaje de dos o más VLP, seguido de la combinación de los componentes de VLP desensamblados en cualquier momento adecuado antes del reensamblaje. Este enfoque es adecuado cuando las VLP se forman espontáneamente a partir de la proteína VP1 expresada, como ocurre, por ejemplo, en algunas cepas de levadura. Cuando la expresión de la proteína VP1 no conduce a la formación espontánea de VLP, pueden combinarse las preparaciones de proteínas VP1 o capsómeros antes del ensamblaje para dar las VLP.

Cuando se usan VLP multlvalentes, preferiblemente los componentes de las VLP se mezclan en las proporciones en que se desean en la VLP mixta final. Por ejemplo, una mezcla de la misma cantidad de una proteína VP1 parcialmente purificada de los virus de Norwalk y Houston (u otras cepas de norovirus) proporciona una VLP multivalente con cantidades aproximadamente ¡guales de cada proteína.

Las composiciones que comprenden VLP multlvalentes pueden estabilizarse mediante soluciones conocidas en la técnica, tales como las de los documentos WO 98/44944, WO 00/45841.

Las composiciones de la invención pueden comprender otras proteínas o fragmentos de proteínas además de proteínas VP1 y VP2, o derivados de las mismas, de norovirus. También pueden coadmlnlstrarse otras proteínas o péptidos con la composición de la Invención. Opclonalmente, la composición también puede formularse o coadministrarse con antígenos que no sean de norovirus. Adecuadamente, estos antígenos pueden proporcionar protección contra otras enfermedades.

La proteína VP1 o el derivado proteico funcional es adecuadamente capaz de formar una VLP, y la formación de VLP puede evaluarse mediante técnicas convencionales tales como, por ejemplo, cromatografía de exclusión molecular, microscopía electrónica y dispersión dinámica de luz láser.

Las moléculas antlgénlcas de la presente Invención pueden prepararse mediante aislamiento y purificación a partir de los organismos en los que se producen de forma natural, o pueden prepararse mediante técnicas recomblnantes. Preferiblemente los antígenos de VLP de norovirus se preparan a partir de células de Insecto tales como células Sf9 o H5, aunque también puede usarse cualquier célula adecuada tal como sistemas de expresión de E. coli o células de levadura, por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastori u otros sistemas de expresión de Pichia, sistemas de expresión de células de mamífero tales como CHO o HE. Cuando se preparan mediante un método recomblnante o mediante síntesis, pueden realizarse una o más Inserciones, deleclones, Inversiones o sustituciones de los aminoácidos que constituyen el péptldo. Cada uno de los antígenos mencionados anteriormente se usa preferiblemente en un estado sustanclalmente puro.

Los procedimientos de producción de VLP de norovirus en cultivos de células de Insecto se han descrito previamente en la patente estadounidense n.° 6.942.865. Brevemente, se clona un ADNc del extremo 3' del genoma que contiene el gen de la cápslde viral (ORF2) y un gen estructural minoritario (ORF3). Los baculovlrus recomblnantes que portan los genes de la cápslde viral se construyen a partir de los ADNc clonados. Las VLP de norovirus se producen en cultivos de células de Insecto Sf9 o H5.

La composición de vacuna comprende uno o más adyuvantes en combinación con el antígeno de norovirus. La mayoría de los adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger al antígeno del catabolismo rápido, tal como hldróxldo de aluminio o aceite mineral, y un estimulador de respuestas ¡nmunltarlas, tal como las proteínas derivadas de Bordatella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Se dispone comercialmente de adyuvantes adecuados tales como, por ejemplo, adyuvante incompleto y adyuvante completo de Freund (Piteo Laboratories, Detroit, Mlch.); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); sales de aluminio tales como gel de hldróxldo de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio; sales de caldo, hierro o zinc; una suspensión ¡nsoluble de azúcares adiados de tirosina adiada; polisacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente; polifosfazenos; microesferas biodegradables; y Quil A.

Los adyuvantes adecuados también incluyen, pero no se limitan a, agonistas del receptor tipo toll (TLR), particularmente agonistas del receptor tipo toll tipo 4 (TLR-4) (por ejemplo, monofosforil lípido A (MPL), lípido sintético A, miméticos o análogos del lípido A), sales de aluminio, atocinas, saponlnas, derivados de muramll dipéptido (MDP), oligos CpG, lipopolisacáridos (LPS) de bacterias gram-negativas, polifosfazenos, emulsiones, vlrosomas, cocleatos, micropartículas de poli(lactida-co-glicolida) (PLG), partículas de poloxámero, micropartículas, liposomas, emulsiones de aceite en agua, MF59 y escualeno. En algunas realizaciones, los adyuvantes no son exotoxlnas derivadas de bacterias. Los adyuvantes preferidos incluyen adyuvantes que estimulan una respuesta tipo Th1, tales como 3DMPL o QS21.

El monofosforil lípido A (MPL), un derivado no tóxico del lípido A de Salmonella, es un potente agonista de TLR-4 que se ha desarrollado como adyuvante de vacuna (Evans etal., 2003). En estudios preclínicos murinos, se ha demostrado que el MPL ¡ntranasal mejora las respuestas humorales secretoras, así como las sistémlcas (Baldrldge et al., 2000; Yang etal., 2002). También se ha demostrado que es seguro y eficaz como adyuvante de vacuna en estudios clínicos de más de 120.000 pacientes (Baldrick etal., 2002; Baldrldge etal., 2004). El MPL estimula la Inducción de Inmunidad innata a través del receptor TLR-4 y, por tanto, es capaz de provocar respuestas inmunitarias inespecíficas contra una amplia gama de patógenos infecciosos, Incluyendo bacterias tanto gran-negativas como gran-positivas, virus y parásitos (Baldridge et al., 2004; Persing et al., 2002). La Inclusión de MPL en formulaciones de vacuna debe proporcionar una Inducción rápida de respuestas innatas, provocando respuestas ¡nmunltarlas ¡nespecífícas a partir de la exposición viral a la vez que mejora las respuestas específicas generadas por los componentes antígénlcos de la vacuna.

La presente divulgación proporciona una composición que comprende monofosforil lípido A (MPL) o monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) como potencíador de la Inmunidad adaptatíva e Innata. Químicamente, el 3D-MPL es una mezcla de monofosforil lípido A 3-des-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas adiadas. Una forma preferida del monofosforil lípido A 3-des-O-acilado se divulga en la patente europea 0689454 B1 (SmithKIine Beecham Biologicals S A), que se incorpora al presente documento como referencia. En el presente documento se divulga una composición que comprende lípido A sintético, miméticos o análogos del lípido A, tales como PET-Iípldo A de BloMIra, o derivados sintéticos diseñados para funcionar como agonistas de TLR-4.

La composición de vacuna comprende dos adyuvantes. Los dos adyuvantes son MPL e hldróxldo de aluminio (por ejemplo, alumbre).

La expresión “cantidad de adyuvante eficaz” o “cantidad eficaz de adyuvante” la entenderán bien los expertos en la técnica, e incluye una cantidad de uno o más adyuvantes que es capaz de estimular la respuesta ¡nmunltaría frente a un antígeno administrado, es decir, una cantidad que aumenta la respuesta ¡nmunltaría de una composición de antígeno administrada, medida en términos de los niveles de IgA en los lavados nasales, niveles séricos de IgG o IgM, o proliferación de células B y T. Los aumentos adecuadamente eficaces en los niveles de ¡nmunoglobulína Incluyen más del 5%, preferiblemente más del 25%, y en particular más del 50%, en comparación con la misma composición de antígeno sin ningún adyuvante.

En una realización, la presente Invención proporciona una composición de vacuna formulada para administración párente ral, en la que la composición Incluye al menos dos tipos de VLP de norovirus en combinación con hldróxldo de aluminio y un tampón. El tampón puede seleccionarse del grupo que consiste en L-histidina, imidazol, ácido succínlco, tris, ácido cítrico, bis-tris, pipes, mes, hepes, glicinamida y tricina. En una realización, el tampón es L-histidina o imidazol. Preferiblemente, el tampón está presente en una concentración de desde aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 50 mM, más preferiblemente desde aproximadamente 18 mM hasta aproximadamente 40 mM, o lo más preferiblemente desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 25 mM. En algunas realizaciones, el pH de la composición antigénica o de vacuna es de desde aproximadamente 6,0 hasta aproximadamente 7,0, o desde aproximadamente 6,2 hasta aproximadamente 6 ,8 , o de aproximadamente 6,5. La composición de vacuna puede ser una formulación acuosa. En algunas realizaciones, la composición de vacuna es un polvo liofllizado y reconstituido en una formulación acuosa.

La composición de vacuna comprende además al menos un adyuvante además de los dos o más tipos de VLP de norovirus, hldróxldo de aluminio y un tampón. El adyuvante es MPL.

Las VLP de norovirus Incluidas en las composiciones de vacuna de la divulgación pueden ser cualquiera de las VLP descritas en el presente documento. En una realización, los dos tipos de VLP de norovirus comprenden, cada uno, una proteína de la cápslde de diferentes genogrupos (por ejemplo, genogrupo I y genogrupo II). Por ejemplo, un tipo de VLP de norovirus comprende una proteína de la cápside derivada de un norovirus del genogrupo I y el otro tipo de VLP de norovirus comprende una proteína de la cápslde derivada de un norovirus del genogrupo II. En una realización, un tipo de VLP de norovirus comprende una proteína de la cápslde del virus de Norwalk y el otro tipo de VLP de norovirus comprende una proteína de la cápside de consenso derivada de norovirus del genogrupo II, genotipo 4 (por ejemplo, una proteína de la cápslde que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1). La composición de vacuna puede comprender de aproximadamente 5 ng a aproximadamente 200 ^g de cada VLP de norovirus, más preferiblemente de aproximadamente 15 ng a aproximadamente 50 ^g de cada VLP de norovirus. En algunas realizaciones, la dosis de un tipo de VLP de norovirus es diferente de la dosis del otro tipo de VLP de norovirus. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la composición de vacuna comprende de aproximadamente 5 ng a aproximadamente 15 ng de una VLP del genogrupo I y de aproximadamente 15 ng a aproximadamente 50 ng de una VLP del genogrupo II. En otras realizaciones, la composición de vacuna comprende de aproximadamente 15 ng a aproximadamente 50 ng de una VLP del genogrupo I y de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 150 ng de una VLP del genogrupo II.

En algunas realizaciones, las composiciones de vacuna comprenden además una sal farmacéuticamente aceptable, Incluyendo, pero sin limitarse a, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, sulfato de amonio y citrato de sodio. En una realización, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio. La concentración de la sal farmacéuticamente aceptable puede ser de desde aproximadamente 10 mM hasta aproximadamente 200 mM, con concentraciones preferidas en el Intervalo de desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 150 mM. Preferiblemente, las composiciones de vacuna de la Invención contienen menos de 2 mM de fosfato libre. En algunas realizaciones, las composiciones de vacuna comprenden menos de 1 mM de fosfato libre. Las composiciones de vacuna también pueden comprender además otros excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como azúcares (por ejemplo, sacarosa, trehalosa, manitol) y tensioactivos.

Tal como se comentó en el presente documento, las composiciones de la divulgación pueden formularse para su administración como formulaciones de vacuna. Tal como se usa en el presente documento, el término “vacuna” se refiere a una formulación que contiene VLP de norovirus u otros antígenos de norovirus de la presente divulgación, tal como se describió anteriormente, que está en una forma que es capaz de administrarse a un vertebrado, particularmente un humano, y que Induce una respuesta ¡nmunltarla protectora suficiente para Inducir Inmunidad para prevenir y/o mejorar una infección por norovirus o una enfermedad inducida por norovirus y/o reducir al menos un síntoma de una Infección o enfermedad por norovirus.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “respuesta ¡nmunltarla” se refiere tanto a una respuesta ¡nmunltarla humoral como a una respuesta ¡nmunltarla mediada por células. La respuesta ¡nmunltarla humoral Implica la estimulación de la producción de anticuerpos por llnfocltos B que, por ejemplo, neutralizan agentes Infecciosos, bloquean la entrada de agentes Infecciosos en las células, bloquean la repllcaclón de dichos agentes Infecciosos y/o protegen a las células huésped de su Infección y destrucción. La respuesta ¡nmunltarla mediada por células se refiere a una respuesta ¡nmunltarla que está mediada por llnfocltos T y/u otras células, tales como macrófagos, contra un agente infeccioso, que presenta un vertebrado (por ejemplo, un humano), que previene o mejora la infección o reduce al menos un síntoma de la misma. En particular, “Inmunidad protectora” o “respuesta ¡nmunltarla protectora” se refiere a la inmunidad o a provocar una respuesta inmunitaria contra un agente infeccioso, que presenta un vertebrado (por ejemplo, un humano), que previene o mejora una Infección o reduce al menos un síntoma de la misma. Específicamente, la Inducción de una respuesta ¡nmunltarla protectora a partir de la administración de la vacuna es evidente mediante la eliminación o reducción de la presencia de uno o más síntomas de gastroenteritis aguda o una reducción en la duración o gravedad de tales síntomas. Los síntomas clínicos de gastroenteritis por norovirus Incluyen náuseas, diarrea, heces sueltas, vómitos, fiebre y malestar general. Una respuesta ¡nmunltarla protectora que reduce o elimina los síntomas de la enfermedad reducirá o detendrá la propagación de un brote de norovirus en una población. La preparación de vacunas se describe generalmente en Vaccine Design (“The subunit and adyuvant approach” (eds. Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York). Las composiciones de la presente divulgación pueden formularse, por ejemplo, para su administración mediante Inyección, tal como Inyección parenteral (por ejemplo, Inyección Intravenosa, subcutánea, ¡ntradérmlca o Intramuscular).

Cuando la composición está destinada a la Inyección parenteral, tal como Inyección Intravenosa (I.v.), subcutánea (s.c.), ¡ntradérmlca o Intramuscular (I.m.), normalmente se formula como una suspensión líquida (es decir, formulación acuosa) compuesta por la VLP de norovirus y el adyuvante. La vacuna líquida formulada parenteralmente (por ejemplo, formulada para I.m., I.v. o s.c.) comprende VLP de norovirus del genogrupo I y/o genogrupo II con hldróxldo de aluminio (por ejemplo, alumbre) y monofosforil lípido A (MPL) como adyuvantes. En una realización, una formulación líquida para su administración parenteral comprende antígeno(s) del genogrupo de norovirus, tales como VLP de norovirus tal como se describen en el presente documento, MPL, hldróxldo de aluminio y un tampón. En determinadas realizaciones, el tampón en las formulaciones de vacuna parenterales es L-histidina o imidazol. La administración parenteral de vacunas líquidas puede realizarse mediante aguja y jeringa, tal como se conoce bien en la técnica.

En determinadas realizaciones, una composición de vacuna de la divulgación para provocar una respuesta Inmunitaria protectora contra norovirus en humanos comprende VLP de norovirus del genogrupo I y/o genogrupo II a una dosis de no más de 150 ^g. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición de vacuna comprende no más de 150 ng, no más de 100 ng, no más de 50 ng, no más de 25 ng, no más de 15 ng o no más de 10 ng de VLP de norovirus del genogrupo I. En otras realizaciones, la composición de vacuna comprende no más de 150 ng, no más de 100 ng, no más de 50 ng, no más de 25 ng, no más de 15 ng o no más de 10 ng de VLP de norovirus del genogrupo II. En determinadas realizaciones, la composición de vacuna comprende no más de 150 ^g de cada VLP de norovirus del genogrupo I y genogrupo II. En tales realizaciones, la dosis de VLP de norovirus del genogrupo I y VLP del genogrupo II puede ser la misma o diferente. Por ejemplo, en una realización, la composición de vacuna puede comprender no más de 50 ng de VLP de norovirus del genogrupo I y no más de 150 ng de VLP de norovirus del genogrupo II. En otra realización, la composición de vacuna puede comprender no más de 25 ng de VLP de norovirus del genogrupo I y no más de 50 ^g de VLP de norovirus del genogrupo II. En otras realizaciones, la composición de vacuna puede comprender no más de 15 ng de VLP de norovirus del genogrupo I y no más de 50 ng de VLP de norovirus del genogrupo II. En todavía otras realizaciones, la composición de vacuna puede comprender no más de 25 ^g de VLP de norovirus del genogrupo I y no más de 150 ng de VLP de norovirus del genogrupo.

Las VLP de norovirus del genogrupo I y genogrupo II pueden derivar de cualquiera de las cepas de norovirus descritas en el presente documento. En una realización, las VLP de norovirus del genogrupo I son VLP del genogrupo I, genotipo 1 (GI.1) (es decir, comprenden una proteína de la cápslde de un norovirus GI.1). En otra realización, las VLP de norovirus del genogrupo I son VLP de Norwalk. En otra realización, las VLP de norovirus del genogrupo II son VLP del genogrupo II, genotipo 4 (GII.4). En todavía otra realización, las VLP de norovirus del genogrupo II son VLP generadas a partir de la expresión de una secuencia de consenso de norovirus del genogrupo II. En una realización particular, las VLP de norovirus del genogrupo II comprenden una proteína de la cápslde que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 1.

Las composiciones de vacuna descritas anteriormente en el presente documento pueden liofilizarse y almacenarse en forma anhidra hasta que estén listas para su uso, momento en el cual se reconstituyen con dlluyente. Alternativamente, diferentes componentes de la composición pueden almacenarse por separado en un kit (estando cualquiera o la totalidad de los componentes liofilizados). Los componentes pueden permanecer en forma liofilizada para una formulación seca o reconstituirse para formulaciones líquidas, y mezclarse antes del uso o administrarse por separado al paciente. En algunas realizaciones, las composiciones de vacuna se almacenan en kits en formulaciones líquidas y pueden estar acompañadas por dispositivos de administración, tales como jeringas equipadas con agujas. En otras realizaciones, las composiciones de vacuna líquidas pueden almacenarse dentro de los dispositivos de administración en un kit. Por ejemplo, un kit puede comprender jeringas precargadas, dispositivos de autolnyecclón o dispositivos de pluma de Inyección que contienen una formulación líquida de una composición de vacuna descrita en el presente documento.

La liofilización de vacunas es bien conocida en la técnica. Normalmente, el antígeno líquido se liofiliza en presencia de agentes para proteger el antígeno durante el procedimiento de liofilización y producir una torta con características de polvo deseables. Habltualmente se usan azúcares tales como sacarosa, manltol, trehalosa o lactosa (presentes a una concentración inicial de 10-200 mg/ml) para la crioprotección de antígenos proteicos y la producción de tortas liofilizadas con características de polvo deseables. La liofilización de las composiciones teóricamente da como resultado una composición más estable.

La cantidad de antígeno en cada composición de vacuna se selecciona como una cantidad que Induce una respuesta ¡nmunltarla robusta sin efectos secundarios adversos significativos. Tal cantidad variará dependiendo de qué antígeno(s) específico(s) se emplee(n), la vía de administración y los adyuvantes usados. En general, la dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente Invención, debe ser suficiente para efectuar una respuesta ¡nmunltarla protectora en el paciente a lo largo del tiempo, o para Inducir la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por tanto, la composición se administra a un paciente en una cantidad suficiente para provocar una respuesta ¡nmunltarla frente a los antígenos específicos y/o para prevenir, aliviar, reducir o curar los síntomas y/o las complicaciones de una enfermedad o Infección y, por tanto, reducir o detener la propagación de un brote de norovirus en una población. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una “dosis terapéuticamente eficaz”.

Las composiciones de vacuna de la presente divulgación pueden administrarse a través de una vía distinta de la mucosa. Estas administraciones pueden Incluir la administración in vivo a través de una Inyección parenteral (por ejemplo, Intravenosa, subcutánea, ¡ntradérmlca e Intramuscular). Otras vías de administración adecuadas Incluyen transcutánea, subdérmlca y a través de supositorio. En una realización, la vacuna se administra por una vía de administración parenteral, tal como Intravenosa, subcutánea, ¡ntradérmlca o Intramuscular. En determinadas realizaciones, la vacuna se administra mediante una vía de administración Intramuscular. La administración puede llevarse a cabo simplemente mediante una administración directa usando una aguja, un catéter o un dispositivo relacionado (por ejemplo, jeringas precargadas o dispositivos de autolnyecclón), en un punto de tiempo único o en múltiples puntos de tiempo. Otras formulaciones parenterales pueden administrarse por vía subcutánea o ¡ntradérmlca mediante métodos de administración por mlcrolnyecclón o parches cutáneos.

La presente divulgación proporciona métodos para provocar inmunidad protectora contra norovirus en un sujeto que comprenden administrar por vía parenteral al sujeto no más de una dosis única de una composición de vacuna de la divulgación, en los que dicha vacuna comprende VLP de norovirus del genogrupo I y/o genogrupo II tal como se describen en el presente documento y un adyuvante. En tales realizaciones, la composición de vacuna de dosis única induce al menos un aumento de tres veces en el título séricos de anticuerpos específicos de norovirus en comparación con el título en el humano antes de la administración de la composición. En algunas realizaciones, la composición de vacuna de dosis única induce al menos un aumento de seis veces en el título séricos de anticuerpos específicos de norovirus en comparación con el título en el humano antes de la administración de la composición. En otras realizaciones, la composición de vacuna de dosis única induce un título sérico de anticuerpos específicos de norovirus comparable al título de anticuerpos inducido por la exposición al norovirus vivo en una Infección natural; es decir, un aumento mayor de diez veces en el título sérico de anticuerpos específicos de norovirus en comparación con el título en el humano antes de la administración de la composición. En determinadas realizaciones, la composición de vacuna de dosis única induce el aumento en el título séricos de anticuerpos específicos de norovirus dentro de los siete días siguientes a la administración de la composición. Preferiblemente, la composición de vacuna de dosis única se administra por vía de administración Intravenosa, subcutánea o Intramuscular. En una determinada realización, la composición de vacuna de dosis única se administra por vía Intramuscular al humano.

Tal como se describe en el presente documento, en algunas realizaciones, las composiciones de vacuna de dosis única adecuadas para su uso en el método comprenden no más de 150 ng de cada uno de los norovirus del genogrupo I y genogrupo II. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición de vacuna comprende no más de 150 ^g, no más de 100 ng, no más de 50 ng, no más de 25 ng, no más de 15 ng o no más de 10 ng de VLP de norovirus del genogrupo I. En otras realizaciones, la composición de vacuna comprende no más de 150 ^g, no más de 100 ^g, no más de 50 ng, no más de 25 ng, no más de 15 ng o no más de 10 ng de VLP de norovirus del genogrupo II. En determinadas realizaciones, la composición de vacuna comprende no más de 50 ^g de cada VLP de norovirus del genogrupo I y genogrupo II. En realizaciones en las que la composición de vacuna de dosis única comprende VLP de norovirus tanto del genogrupo I como del genogrupo II, la dosis de VLP de norovirus del genogrupo I y VLP del genogrupo II puede ser la misma o diferente. Por ejemplo, en una realización, la composición de vacuna puede comprender no más de 50 ng de VLP de norovirus del genogrupo I y no más de 150 ng de VLP de norovirus del genogrupo II. En otra realización, la composición de vacuna puede comprender no más de 25 ng de VLP de norovirus del genogrupo I y no más de 50 ^g de VLP de norovirus del genogrupo II. En otras realizaciones, la composición de vacuna puede comprender no más de 15 ng de VLP de norovirus del genogrupo I y no más de 50 ng de VLP de norovirus del genogrupo II. En todavía otras realizaciones, la composición de vacuna puede comprender no más de 25 ng de VLP de norovirus del genogrupo I y no más de 150 ng de VLP de norovirus del genogrupo II.

En una realización del método, el sujeto es un humano y la vacuna confiere protección contra uno o más síntomas de la Infección por norovirus. Aunque se hayan publicado otros métodos para Inducir una respuesta ¡nmunltaría con antígenos de norovirus (véase la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° US 2007/0207526), todavía no se han Identificado claramente los indicadores de una respuesta ¡nmunltaría protectora contra norovirus en humanos (Herbst-Kralovetz et al., (2010) Expert Rev, Vaccines 9 (3), 299-307). A diferencia de varias vacunas actualmente autorizadas en los EE.UU. en las que la eficacia de la vacuna se correlaciona con anticuerpos séricos, los estudios han demostrado que los marcadores de una respuesta ¡nmunltaría, tales como títulos elevados de anticuerpos IgG en suero contra el virus de Norwalk, no están asociados con una Inmunidad protectora en humanos (Johnson et al., (1990) J. Infectious Diseases 161: 18-21). Además, otro estudio que examinó la exposición viral de Norwalk en humanos Indicó que la susceptibilidad frente a la Infección por Norwalk era multífactorial e Incluía factores tales como el estado secretor y la respuesta ¡nmunltaría de memoria de la mucosa (Llndesmlth et al., (2003) Nature Medicine 9: 548 - 553).

Debido a que el norovirus no puede cultivarse in vitro, actualmente no se dispone de ensayos de neutralización viral. Un ensayo funcional que sirve como un sustituto para el ensayo de neutralización es el ensayo de Inhibición de la hemaglutinación (HAI) (véase el ejemplo 1). La HAI mide la capacidad de los anticuerpos inducidos por la vacuna de norovirus para Inhibir la aglutinación de los glóbulos rojos recubíertos de antígeno por las VLP de norovirus porque las VLP de norovirus se unen a los antígenos de los glóbulos rojos (por ejemplo, antígenos de grupo histosanguíneo). Este ensayo también se conoce como el ensayo de bloqueo de hidratos de carbono, ya que es Indicativo de la capacidad funcional de los anticuerpos para bloquear la unión del virus o las VLP a los hidratos de carbono del antígeno de grupo sanguíneo en un glóbulo rojo. En este ensayo, se mezcla una cantidad fija de VLP de norovirus con una cantidad fija de glóbulos rojos y suero de sujetos Inmunizados. S¡ la muestra de suero contiene anticuerpos funcionales, los anticuerpos se unirán a las VLP, Inhibiendo así la aglutinación de los glóbulos rojos. Tal como se usa en el presente documento, “anticuerpos funcionales” se refiere a anticuerpos que son capaces de Inhibir la Interacción entre partículas de norovirus y antígenos de glóbulos rojos. Dicho de otro modo, el título de anticuerpos funcionales es equivalente al título del antígeno de grupo histosanguíneo (HBGA) o al título de anticuerpos bloqueantes de hidratos de carbono. El título sérico de anticuerpos funcionales específicos de norovirus puede medirse medíante el ensayo de HAI descrito anteriormente. El título sérico de anticuerpos funcionales específicos de norovirus también puede medirse usando un ensayo basado en ELISA en el que un antígeno H de hidratos de carbono se une a pocilios de mlcrotítulacíón y se detecta la unión de VLP de norovirus al antígeno H en presencia de suero (véanse el ejemplo 1 y Reeck etal., (2010) J Infect Dls, vol.202(8): 1212-1218). Un aumento en el nivel de anticuerpos funcionales específicos de norovirus puede ser un Indicador de una respuesta ¡nmunltaría protectora. Por tanto, en una realización, la administración de la vacuna provoca una inmunidad protectora que comprende un aumento en el título sérico de anticuerpos funcionales específicos de norovirus en comparación con el título sérico en un humano que no recibe la vacuna. El título sérico de anticuerpos funcionales específicos de norovirus Indicativo de una respuesta ¡nmunltaría protectora es preferiblemente una medía geométrica de los títulos mayor de 40, 50, 75,100,125, 150, 175,200 tal como se mide mediante el ensayo de HAI o el título de bloqueo (BT)50 (50% de Inhibición de la unión del antígeno H por VLP de norovlrus), una medía geométrica de los títulos superior a 100,150, 200, 250, 300, 350,400,450 ó 500, tal como se mide mediante el ensayo de unión al antígeno H. En una realización, el título sérico de anticuerpos funcionales específicos de norovlrus es una medía geométrica de los títulos mayor de 40 tal como se mide medíante el ensayo de HAI. En otra realización, el título sérico de anticuerpos funcionales específicos de norovlrus es una medía geométrica de los títulos mayor de 100 tal como se mide medíante el ensayo de HAI. En otra realización, el título sérico de anticuerpos funcionales específicos de norovlrus es una medía geométrica de los títulos BT50 mayor de 100, tal como se mide medíante el ensayo de unión al antígeno H. En todavía otra realización, el título sérico de anticuerpos funcionales específicos de norovlrus es una medía geométrica de los títulos BT50 mayor de 200 tal como se mide medíante el ensayo de unión al antígeno H.

En un aspecto adicional, la administración de la vacuna provoca una Inmunidad protectora que comprende una respuesta ¡nmunltarla de la mucosa de IgA y una respuesta ¡nmunltarla sistémica de IgG, administrando por vía parenteral (preferiblemente por vía Intramuscular) al sujeto no más de una dosis única de una composición antígénlca o de vacuna que comprende uno o más tipos de antígenos de norovlrus y opcionalmente al menos un adyuvante eficaz. Los Inventores han descubierto sorprendentemente que la administración parenteral de las composiciones de vacuna de norovlrus descritas en el presente documento induce una respuesta de IgA robusta además de una respuesta de IgG fuerte. Normalmente, las respuestas de IgA fuertes sólo se observan cuando las vacunas se administran medíante una vía de administración a través de la mucosa.

En determinadas realizaciones, la administración de la vacuna provoca una Inmunidad protectora que comprende un aumento en el nivel de células secretoras de anticuerpos específicos de norovlrus IgA en la sangre en comparación con el nivel en un humano que no recibe la vacuna. En algunas realizaciones, la administración de la vacuna provoca una Inmunidad protectora que comprende un aumento en el nivel de células secretoras de anticuerpos específicos de norovlrus IgA en la sangre en comparación con el nivel en el humano antes de recibir la vacuna. En una realización, las células secretoras de anticuerpos específicos de norovirus IgA son CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L+ y a4(37+. Las células secretoras de anticuerpos con este perfil de marcadores son capaces de asentarse tanto en el tejido linfoide periférico, tal como las placas de Peyer en el intestino, como en el tejido linfoide de la mucosa, tal como la mucosa Intestinal. En una realización, el número de células secretoras de anticuerpos lgACCR10+, CD19+, CD27+, CD62L+ y a4(37+ es mayor de aproximadamente 500, aproximadamente 700, aproximadamente 1.000, aproximadamente 1.500 o mayor de aproximadamente 2.000 células por 1 x 106 monocitos de sangre periférica. En otra realización, las células secretoras de anticuerpos específicos de norovlrus IgA son CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L- y a4(37+. Las células secretoras de anticuerpos con este perfil de marcadores generalmente presentan sólo un asentamiento en los sitios de la mucosa y pueden ser Indicativos de una respuesta de células B de memoria. En algunas realizaciones en las que la vacuna se administra por vía intramuscular, el número de células secretoras de anticuerpos IgA CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L- y a4(37+ es mayor de aproximadamente 5.000, aproximadamente 6.500, aproximadamente 7.000, aproximadamente 10.000, aproximadamente, 13.000, aproximadamente 15.000 o mayor de aproximadamente 20.000 células por 1 x 106 monocitos de sangre periférica.

Se han observado hallazgos similares con vacunas para otros virus, tales como el rotavlrus. Para las vacunas contra el rotavlrus, existe controversia sobre s¡ los anticuerpos séricos están directamente implicados en la protección o simplemente reflejan una Infección reciente (Jlang, 2002; Franco, 2006). Definir tales correlatos de protección es particularmente difícil en el contexto de enfermedades díarreícas, tales como rotavlrus o norovlrus, donde los estudios preclínicos que Infieren protección pueden ser multífacétícos con contribuciones de la Inmunidad de la mucosa (tal como IgA Intestinal), la elaboración de atocinas y la Inmunidad mediada por células. La dificultad para medir tales respuestas ¡nmunltarías durante el desarrollo clínico y la falta de correlación con las mediciones de anticuerpos séricos requieren que la eficacia de una vacuna para estos tipos de virus sólo pueda demostrarse medíante experimentos de exposición clínica en humanos.

Tal como se mencionó anteriormente, la administración de una composición de vacuna de la presente Invención previene y/o reduce al menos un síntoma de la Infección por norovlrus. Los síntomas de la Infección por norovlrus se conocen bien en la técnica e Incluyen náuseas, vómitos, diarrea y calambres estomacales. Además, un paciente con una Infección por norovlrus puede tener febrícula, cefalea, escalofríos, dolores musculares y fatiga. La divulgación también abarca un método para Inducir una respuesta ¡nmunltarla protectora en un sujeto que experimenta una infección por norovlrus, administrando al sujeto una formulación de vacuna de la divulgación de manera que se alivie y/o reduzca al menos un síntoma asociado con la Infección por norovlrus. Una reducción en un síntoma puede determinarse de forma subjetiva u objetiva, por ejemplo, autoevaluacíón por parte de un sujeto, medíante la evaluación por parte de un médico o realizando una medición o un ensayo apropiado (por ejemplo, temperatura corporal), incluyendo, por ejemplo, una evaluación de la calidad de vida, una progresión lenta de una Infección por norovlrus o síntomas adicionales, una gravedad reducida de los síntomas por norovlrus o ensayos adecuados (por ejemplo, título de anticuerpos, detección de antígenos por RT-PCR y ensayo de activación de células B o células T). También puede determinarse una respuesta eficaz midiendo directamente (por ejemplo, medíante RT-PCR) la carga del virus en muestras de heces, lo que refleja la cantidad de virus liberado a partir de los intestinos. La evaluación objetiva comprende evaluaciones tanto animales como humanas.

La divulgación también proporciona un método para generar anticuerpos contra uno o más antígenos de norovlrus, comprendiendo dicho método la administración de una composición de vacuna de la divulgación tal como se describió anteriormente a un sujeto. Estos anticuerpos pueden aislarse y purificarse mediante métodos rutinarios en la técnica. Los anticuerpos aislados específicos para antígenos de norovirus pueden usarse en el desarrollo de ensayos inmunológlcos de diagnóstico. Estos ensayos pueden emplearse para detectar un norovirus en muestras clínicas e identificar el virus particular que causa la infección (por ejemplo, Norwalk, Houston, Snow Mountaln, etc.). Alternativamente, los anticuerpos aislados pueden administrarse a sujetos susceptibles a la infección por norovirus para conferir inmunidad pasiva o de corto plazo.

La invención se ¡lustrará ahora con mayor detalle medíante referencia a las realizaciones específicas descritas en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1. Estudio de aumento de dosis, seguridad e inmunogenicidad de la vacuna de partículas similares a virus (VLP) bivalente de norovirus intramuscular en humanos (estudio LV03-104), cohorte A

Este ejemplo describe la cohorte A de un estudio de aumento de dosis aleatorizado, de múltiples sitios de la seguridad e inmunogenicidad de cuatro niveles de dosificación de una vacuna de VLP bivalente de norovirus intramuscular (i.m.) en presencia de los adyuvantes monofosforil lípido A (MPL) e hidróxido de aluminio (AIOH) en comparación con placebo en sujetos adultos. Aproximadamente 48 sujetos de 18 a 49 años se inscribieron en la cohorte. Los sujetos recibieron dos dosis de la vacuna o placebo, medíante inyección intramuscular (¡.m.), con una separación de 28 días usando una aguja de 1,5 pulgadas (38 mm).

La vacuna de VLP bivalente de norovirus contenía VLP del genogrupo I, genotipo 1 (GI.1) y del genogrupo II, genotipo 4 (GII.4) como antígenos, y monofosforil lípido A (MPL) e hidróxido de aluminio (AIOH) como adyuvantes, cloruro de sodio (NaCI) y L-histidina (L-His) comotampón (pH 6,3-6,7), etanol y agua para inyección. La composición de la vacuna de VLP bivalente de norovirus intramuscular se resume en la tabla 1. Las VLP de GII.4 comprendían una secuencia de cápsíde de SEQ ID NO: 1, que derivaba de tres cepas de GII.4.

Tabla 1. Composición final del producto terminado para cuatro formulaciones de vacuna de VLP bivalente de norovirus i.m. por 0,5 mi

* como hidróxido de aluminio

El placebo era solución salina normal estéril para inyección (NaCI al 0,9% y líbre de conservantes). El aumento de dosis de la vacuna se realizó de la siguiente manera: después de un examen apropiado para determinar una buena salud, los sujetos en la cohorte A se inscribieron secuencialmente en cada uno de cuatro grupos de dosificación de ~12 sujetos cada uno (grupos de dosificación A1, A2, A3 y A4). Los grupos de dosificación A1, A2, A3 y A4 representan dosificaciones antigénicas bivalentes de 5/5 ng, 15/15 ng, 50/50 ng y 150/150 ng, respectivamente, de los norovirus GI.1 y GII.4. Los sujetos en cada grupo de dosificación se aleatorizaron 5:1 para recibir la vacuna o el placebo. Los sujetos del grupo de dosificación A 1 recibieron su tratamiento aleatorizado respectivo (10 sujetos recibieron vacuna 5/5 ng y 2 sujetos recibieron placebo). Se monitorizó a los sujetos para una evaluación de seguridad medíante la revisión de los síntomas registrados en la ayuda de memoria (días 0-7) y los historiales médicos provisionales de las visitas de los días 7, 21, 28, 35 y 56. Los datos de seguridad fueron revisados por el Central Safety Monitor (CSM). Después de que los datos de seguridad 7 días posteriores a la dosis 2 (día de estudio 35) estuvieran disponibles para su revisión en los sujetos del grupo de dosificación A 1 y fueran considerados aceptables, los sujetos en el grupo de dosificación A2 fueron elegibles para recibir su dosis ¡nidal. Se aplica la misma regla para la dosificación en los siguientes grupos de dosificación; es decir, después de que los datos de seguridad 7 días posteriores a la dosis 2 (día de estudio 35) estuvieran disponibles para su revisión en un grupo de dosificación, el siguiente grupo de dosificación fue elegible para recibir su dosis ¡nidal.

Al final de la inscripción en la cohorte A, aproximadamente 10 sujetos en cada grupo de dosificación recibieron la vacuna (un total de 40 vacunados) y 2 sujetos en cada grupo recibieron solución salina (un total de aproximadamente 8 receptores de control de solución salina).

Los sujetos mantuvieron una ayuda de memoria diaria de síntomas solicitados que incluyeron cuatro reacciones locales en el sitio de inyección, tales como dolor, sensibilidad a la palpación, enrojecimiento e hinchazón, y 10 signos o síntomas sistémicos que incluyeron temperatura oral diaria, cefalea, fatiga, dolores musculares, escalofríos y dolores en las articulaciones y síntomas gastrointestinales de náuseas, vómitos, diarrea, dolor/calambres abdominales durante los días 0 a 7 después de cada dosis de vacuna de VLP bivalente de norovlrus i.m. o control. El enrojecimiento y la hinchazón en el sitio de Inyección se midieron y registraron diariamente durante los 7 días después de cada Inyección.

Se obtuvieron historiales médicos provisionales en cada visita de seguimiento en los días 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7,180+14 y 393+14 y en la llamada telefónica de seguimiento del día 265+14; se les preguntó a los sujetos acerca de enfermedades temporales, visitas al médico, cualquier acontecimiento adverso grave (AAG) y la aparición de cualquier nuevo estado médico significativo. Los sujetos tuvieron CBC con diferencial de WBC y recuento de plaquetas, y BUN, creatlnina, glucosa, AST y ALT en suero evaluados en la selección y en los días 21 y 35 (~7 días después de cada dosis) para evaluar la elegibilidad y seguridad de la continuación, respectivamente.

Se recogió sangre de los sujetos antes de la vacunación en el día 0 y en los días 7+3,21+3, 28+3, 35+3, 56+7,180+14 y 393+14 para medir los anticuerpos séricos (IgG, IgA e IgM por separado y combinados) frente a la vacuna de VLP bivalente de norovirus I.m. mediante ensayos de inmunoabsorclón ligados a enzimas (ELISA). También se midieron la actividad de bloqueo de hidratos de carbono en suero y los anticuerpos contra HAI en suero. Para los sujetos en la cohorte A, se analizaron las células secretoras de anticuerpos (ASC), los marcadores de asentamiento, las células B de memoria y las respuestas inmunitarias celulares.

Los siguientes métodos se usaron para analizar las muestras de sangre recogidas de individuos inmunizados o Individuos que reciben el placebo.

Mediciones de anticuerpos séricos mediante ELISA

La medición de anticuerpos contra el norovirus mediante ELISA se realizó para todos los sujetos, usando VLP de norovirus recomblnantes purificadas (GI.1 y GII.4 por separado) como antígenos diana para seleccionar las muestras codificadas. Brevemente, se usaron VLP de norovirus en tampón de recubrimiento de carbonato pH 9,6 para recubrir placas de microtltulaclón. Las placas recubiertas se lavaron, bloquearon e incubaron con diluciones dobles en serie de suero de prueba seguido de lavado e incubación con reactivos de anticuerpos secundarios conjugados con enzimas específicos para IgG total, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA e IgM humanas. Se añadieron disoluciones de sustrato apropiadas, se desarrollaron colores, se leyeron las placas y se determinaron los títulos de punto final de IgG, IgA e IgM en comparación con una curva de calibración de referencia para cada clase de anticuerpo. Se determinaron la media geométrica de los títulos (GMT), los aumentos en veces de la media geométrica (GMFR) y las tasas de serorespuestas para cada grupo. La sero-respuesta se definió como un aumento de 4 veces en el título de anticuerpos en comparación con los títulos previos a la inmunización.

Actividad de bloqueo de los antígenos de grupo histosanauíneo (HBGA1 de hidratos de carbono de norovirus

Se realizaron ensayos de bloqueo para medir la capacidad de los anticuerpos séricos para inhibir la unión de VLP de NV a hidratos de carbono sintéticos de H tipo 1 o H tipo 3, tal como se describió previamente (Reeck etal., (2010) J Infect Dis, vol. 202(8): 1212 - 1218). Brevemente, las VLP de NV para los ensayos de bloqueo se incubaron con un volumen igual de suero, y se diluyeron dos veces en serie a partir de una dilución inicial de 1:25. Se lavaron las placas de microtitulación de 96 pocilios recubiertas de neutravidina y se recubrieron con 2,5 ng/ml de H tipo 1 polivalente slntétlco-PAA-blotlna o H tipo 3 polivalente-PAA-biotina. Se añadieron las disoluciones de suero-VLP. Se lavaron las placas y se añadieron sueros pollclonales de conejo específicos para VLP de NV, se lavaron y a esto le siguió la Incubación con anticuerpo de cabra antl-lgG de conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante. El color se desarrolló con sustrato líquido de tetrametllbenzidlna peroxidasa y se detuvo con ácido fosfórico 1 M. La densidad óptica (DO) se midió a 450. Se realizaron controles positivos y negativos. Se determinaron títulos de bloqueo del cincuenta por ciento (BT50), definidos como el título en el que las lecturas de DO (después de la resta del blanco) son el 50% del control positivo. Se asignó un valor de 12,5 a las muestras con un BT50 menor de 25. Se determinaron la media geométrica de los títulos (GMT), los aumentos en veces de la media geométrica (GMFR) y las tasas de serorespuestas para cada grupo. La sero-respuesta se definió como un aumento de 4 veces en el título de anticuerpos en comparación con los títulos previos a la inmunización. Se usó una muestra de suero de control de bloqueo como control interno. Se realizó un ensayo para confirmar la especificidad del bloqueo usando el mismo protocolo que para el ensayo de bloqueo con las siguientes excepciones: después del recubrimiento con hidratos de carbono, los sueros se incubaron directamente en la placa sin incubar previamente en primer lugar con VLP. Después del lavado, se Incubaron las VLP en la placa y se detectaron como para el ensayo de bloqueo.

Ensayo de inhibición de anticuerpos de hemaalutinación (HAH de norovirus

Los anticuerpos Inducidos por vacuna se examinaron para determinar la capacidad de inhibir la hemaglutlnaclón de glóbulos rojos humanos de tipo O mediante las VLP de norovirus tal como se describió previamente (El Kamary etal., (2010) J Infect Dis, vol. 202(11): 1649-58). Los títulos de HAI se calcularon como la inversa de la dilución más alta que inhibía la hemaglutlnaclón con un patrón de RBC negativo compacto y se presentan como GMT, GMFR y aumentos £ 4 veces.

Las VLP de GI.1 y GII.4 de norovirus se diluyeron en serie por separado y se incubaron con un volumen igual de una suspensión de RBC humanos al 0,5% en una placa de fondo en V de 96 pocilios. La cantidad de antígenos de VLP de norovirus correspondientes a 4 unidades de HA se determinó y confirmó mediante retrovaloración. Los sueros de prueba se inactivaron por calor a 56°C durante 30 minutos y se trataron con suspensión de caolín al 25% recién preparada. Para eliminar los Inhibidores séricos, las muestras de prueba se adsorbieron previamente con RBC. El ensayo de HAI se realizó de la siguiente manera: se añadieron sueros pretratados (diluidos 2 veces en PBS, pH 5,5) a placas con fondo en V de 96 pocilios y se Incubaron con un volumen Igual de antígeno de VLP de GI.1 y GII.4 de norovirus, respectivamente, que contenía 4 unidades de HA. Se añadió una suspensión de RBC al 0,5% a cada pocilio y se Incubaron las placas durante 90 minutos adicionales a 4°C. Los pocilios que contenían sólo PBS o antígeno sin suero sirvieron como controles negativos y positivos, respectivamente. Se determinaron la media geométrica de los títulos (GMT), los aumentos en veces de la media geométrica (GMFR) y las tasas de sero-respuestas para cada grupo. La sero-respuesta se definió como un aumento de 4 veces en el título de anticuerpos en comparación con los títulos previos a la Inmunización.

Ensayos de células secretoras de anticuerpos

Se aislaron PBMC a partir de aproximadamente 60 mi de sangre anticoagulada los días 0, 7+3, 28+3 y 35+3 después de la administración de vacuna de VLP bivalente de norovirus i.m. o placebo. Se obtuvieron aproximadamente 25 mi de sangre para ensayos de PBMC recientes y 35 mi de sangre para la críoconservación de PBMC. Los ensayos de ASC detectan células que secretan anticuerpos contra VLP de norovirus (Tacket etal., (2000) J. Infect. Dis., vol. 182: 302-305; Tacket et al., (2003) Clin. Immunol., vol. 108: 241-247; El Kamary et al., (2010) J Infecí Dis, vol. 202(11): 1649-58). Se evaluaron PBMC recientes para determinar la frecuencia de ASC y la determinación de marcadores de asentamiento de un subconjunto de sujetos. Las PBMC críoconservadas de sujetos que participaban en la cohorte A se evaluaron para determinar la frecuencia de ASC. Se describen la tasa de respuesta y el número medio de ASC por 106 PBMC en cada punto de tiempo para cada grupo. Una respuesta positiva se define como un recuento de ASC posterior a la vacunación por 106 PBMC que está al menos 3 desviaciones estándar (DE) por encima del recuento medio previo a la vacunación para todos los sujetos (en la métrica logarítmica) y al menos 8 puntos de ASC, que corresponde a la media de los pocilios de control negativo estimulados por medio (2 puntos) más 3 DE tal como se determina en ensayos similares.

Medición de células B de memoria específicas de virus del norovirus

Se recogió sangre anticoagulada sólo en sujetos de la cohorte A (aproximadamente 25 mi en los días 0, 28, 56 y 180) para medir las células B de memoria en los días 0, 28, 56 y 180 después de la vacunación usando un ensayo ELISpot precedido por estimulación antigénica in vitro (Crotty et al., (2004) J. Immunol. Methods, vol. 286: 111-122; Li et al., (2006) J. Immunol. Methods, vol. 313: 110-118). Se Incubaron células mononucleares de sangre periférica (5x106 células/ml, 1 ml/pocillo en placas de 24 pocilios) durante 4 días con antígenos de VLP de GI.1 y GII.4 de norovirus por separado para permitir la expansión clonal de las células B de memoria específicas de antígeno y la diferenciación en células secretoras de anticuerpos. Los controles Incluyeron células incubadas en las mismas condiciones en ausencia de antígeno y/o células incubadas con un antígeno no relacionado. Después de la estimulación, las células se lavaron, se contaron y se transfirieron a placas de ELISpot recubiertas con VLP de Norwalk. Para determinar la frecuencia de las células B de memoria específicas de virus por llnfocitos B secretores de Ig total, también se añadieron células B expandidas a pocilios recubiertos con anticuerpos anti-lgG humana y anti-lgA humana. Los anticuerpos unidos se revelaron con anticuerpo anti-lgG humana o anti-lgA humana marcados con HRP seguido del sustrato apropiado. También se usaron conjugados con las subclases de IgA e IgG (lgA1, lgA2 e lgG1-4) para determinar respuestas de subclases específicas de antígeno que pueden estar relacionadas con ubicaciones y mecanismos efectores distintos de la sensibilización ¡nmunltarla. Las manchas se contaron con un lector de ELISpot. Las poblaciones de células expandidas para cada sujeto se examinaron mediante citometría de flujo para confirmar su fenotipo de células B de memoria, es decir, CD19+, CD27+, lgG+, lgM+, CD38+, IgD, entre otros (Crotty et al., (2004) J. Immunol. Methods, vol. 286: 111-122; Li etal., (2006) J. Immunol. Methods, vol. 313:110-118).

Respuestas inmunitarias celulares

Se recogió sangre anticoagulada (aproximadamente 25 mi en los días 0, 28, 56 y 180) de los sujetos en la cohorte A como muestras codificadas y se aislaron las PBMC y se crioconservaron en nitrógeno líquido para una posible evaluación futura de las respuestas de CMI frente a antígenos de VLP IG de GI.1 y GII.4 de norovirus. Los ensayos que se realizan Incluyen respuestas de atocinas y proliterativas de PBMC frente a antígenos de VLP de GI.1 y GII.4 de norovirus midiendo los niveles de ¡nterferón (IFN)-y e ¡nterleucina (IL)-4, entre otros, según técnicas establecidas (Samandari et al., (2000) J. Immunol., vol. 164: 2221 - 2232; Tacket ef al., (2003) Clin. Immunol., vol. 108:241 - 247). También se evalúan las respuestas de células T.

Resultados

La evaluación de la seguridad incluyó los síntomas locales y sistémicos solicitados durante 7 días y los síntomas no solicitados durante 28 días después de cada dosis. Los acontecimientos adversos graves se monltorizan durante 12 meses. La ¡nmunogenlcidad se evaluó con suero obtenido antes y después de cada vacunación para anticuerpos Pan ELISA (IgG, IgA e IgM combinados) y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para células secretoras de anticuerpos IgG e IgA (ASC) a través de Elispot.

Los cuatro grupos de dosificación se han inscrito para la cohorte A con dos datos de seguridad posteriores a la dosis disponibles de los cuatro grupos de dosificación (40 vacunados en total). Entre los 40 vacunados, el dolor o la sensibilidad a la palpación fueron los síntomas locales más comunes notificados después de cada dosis, mientras que la hinchazón o el enrojecimiento fueron poco frecuentes. No se notificaron síntomas locales graves. Los síntomas sistémlcos de cefalea, mlalgia o malestar general después de cada dosis fueron notificados por menos de la mitad de los vacunados. Ningún vacunado notificó fiebre. No se notificaron AAG relacionados.

Tal como se muestra en las figuras 1-3, se observaron respuestas de anticuerpos Pan-ELISA anamnésicas robustas (IgG, IgA e IgM combinados) a ambos antígenos de VLP 7 días después de la primera dosis de la dosis más baja (VLP de 5 (ig de GI.1 5 ng de GII.4). La segunda dosis no reforzó las respuestas posteriores a la dosis. Se observaron resultados similares para las respuestas de IgG sérica e IgA sérica específica de antígeno medidas por separado (figuras 4-9). Se observaron respuestas dependientes de la dosis para las respuestas de anticuerpos a ambos antígenos (figuras 1 - 9). Sin embargo, la respuesta máxima frente a VLP de GI.1 pareció lograrse con una dosis más baja que la respuesta máxima frente a VLP de GII.4 (15 ng frente a 50 ng). Curiosamente, la dosis única de la vacuna bivalente de norovirus administrada por vía intramuscular indujo un título de anticuerpos específicos de antígeno sorprendente y significativamente mayor que el título Inducido por dos dosis de una vacuna de VLP monovalente administrada por vía ¡ntranasal que comprendía una dosis de VLP 20 veces mayor (figura 10; compárese el grupo de LV03-1045 ng frente al grupo de LV01-103 100 ng). Además, la dosis baja (5 ng) de la vacuna bivalente de norovirus i.m. produjo un título de anticuerpos específicos de norovirus similar al inducido en humanos expuestos al norovirus nativo (figura 10).

También se observaron respuestas robustas por Elispot de IgG e IgA a los 7 días después de la primera dosis de la dosis más baja (5 ng) para ambos antígenos de VLP (tabla 2). Notablemente, las respuestas de células secretoras de anticuerpos (ASC) estaban sesgadas a IgA frente a IgG y las ASC presentaron un asentamiento en la mucosa (alfa4/beta7) y un fenotipo del receptor de quimiocinas (CCR10) tal como se evaluó mediante citometría de flujo (figura 11, tabla 3). Tal como se muestra en la tabla 3, un mayor número de ASC presentan marcadores de asentamiento en la mucosa (beta7+, CD62L-) en comparación con marcadores de asentamiento en la mucosa/periféricos duales (beta7+, CD62L+). La tabla 4 muestra el porcentaje de células B de memoria por 106 monocitos de sangre periférica que responden a los antígenos de VLP. Un porcentaje más grande de células B de memoria específicas de antígeno también expresa marcadores de asentamiento en la mucosa en comparación con los marcadores de asentamiento en la mucosa/periféricos duales o periféricos. También se observaron respuestas similares en los receptores que recibieron las dosis de 15 ng y 50 ng (tablas 2-4).

Tabla 2. Día 7, Caracterización de la respuesta de PBMC. Aproximación de células secretoras de anticuerpos (ASC)/millón de células CD19+.

Tabla 3. Marcadores de ASC en receptores de vacunas y placebo mediante citometría de flujo - Día 7

*Se supone que la mayoría de ASC son específicas de norovirus.

Tabla 4. Respuestas de células B de memoria en receptores de vacunas y placebo - Día 7

*Se supone que la mayoría de ASC son específicas de norovirus.

En ausencia de un ensayo de neutralización viral directa disponible debido a la Incapacidad de cultivar norovirus in vitro, se realizaron ensayos funcionales que sirven como sustitutos de los ensayos de neutralización viral para medir anticuerpos funcionales en vacunados.

Usando el ensayo de actividad de bloqueo del antígeno H de hidrato de carbono descrito anteriormente, se midió la Inhibición de la unión de VLP de GI.1 al antígeno H mediada por anticuerpos séricos Inducidos por la vacuna. Los datos se presentan como el aumento en veces de la media geométrica (GMFR) y la sero-respuesta (aumento de 4 veces) en la tabla 5, y como la media geométrica de los títulos (GMT) en la tabla 6. Sorprendentemente, después de tan solo una Inyección Intramuscular de la formulación de vacuna, se observó una actividad de bloqueo de hidratos de carbono significativa en todos los grupos de dosis; de hecho, la administración de una segunda dosis de vacuna no aumentó significativamente la actividad de bloqueo en comparación con los niveles posteriores a la dosis 1. La Inhibición de la actividad de unión se mantuvo durante todo el periodo de prueba, hasta 56 días después de la dosis 1.

De forma similar, se midió la actividad de bloqueo de hidratos de carbono de los anticuerpos séricos contra las VLP de GII.4. Se observó una respuesta significativa en todos los grupos de dosificación, tal como se mide por el GMFR y la sero-respuesta (tabla 7), así como por la GMT (tabla 8). De forma similar al bloqueo mediado por anticuerpos de la unión de GI.1 descrita anteriormente, se detectó un bloqueo robusto de la actividad de unión a hidratos de carbono de VLP de GII.4 después de tan solo una dosis, y una segunda dosis no pareció mejorar la actividad de bloqueo.

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Los ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HAI) también se utilizaron para someter a prueba la respuesta de anticuerpos séricos de sujetos vacunados contra antígenos de VLP de norovlrus diana. De forma similar a los estudios de unión al antígeno H de hidratos de carbono, tan solo una dosis de vacuna de VLP Indujo anticuerpos que Inhibieron la hemaglutinación en todos los grupos de dosificación, tal como se mide por el GMFR (tabla 9), el aumento de 4 veces (tabla 9) y la GMT (tabla 10). Aunque el nivel de Inhibición de la hemaglutinación se mantuvo hasta el último día de la prueba (28 días después de la dosis 2, 56 días después de la dosis 1), la segunda dosis de la vacuna de VLP no pareció mejorar la inhibición de la hemaglutinación mediada por anticuerpos e Inducida por la vacuna.

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La inhibición de la hemaglutinación también se logró cuando la VLP diana era un virus no coincidente. Los anticuerpos séricos inducidos por la vacuna Inhibieron la hemaglutinación por una VLP de la cepa del virus de Houston, tal como se mide por el GMFR y la sero-respuesta (tabla 11) así como por la GMT (tabla 12). En este caso, las dosis de vacuna de VLP más altas proporcionaron respuestas más fuertes, particularmente tal como se midió por el aumento de 4 veces o la GMT. El GMFR y el aumento de 4 veces también aumentaron significativamente cuando la VLP diana era la cepa del virus de Cincinnati 2003, tal como se mide tan solo 7 días después de la dosis 1 (tabla 13).

Tabla 13. Inhibición de la hemaglutlnaclón en placebo frente a vacuna de VLP 50/50 ng

Los resultados de este estudio demostraron que, en general, se toleró bien la vacuna de VLP bivalente de norovlrus i.m. Los datos de ¡nmunogenlcldad sugirieron que una dosis única de vacuna puede ser suficiente para proteger a los adultos humanos seroposltlvos. Los resultados de la actividad de bloqueo de hidratos de carbono y los ensayos de Inhibición de la hemaglutlnaclón proporcionaron evidencias adicionales de que una dosis única de vacuna Inducía anticuerpos séricos con una potente actividad antl-norovlrus. La magnitud y la rapidez de las respuestas ¡nmunltarlas observadas después de una dosis única parenteral en humanos fueron drásticas cuando se compararon con las respuestas ¡nmunltarlas anteriores mostradas por múltiples administraciones nasales de la vacuna de VLP a dosificaciones mucho más altas de VLP (El Kamary et al., (2010) J Infecí Dis, vol. 202(11): 1649-1658). Estas respuestas también fueron superiores a las Inducidas por la administración oral de VLP de norovlrus (Tacket et al., (2003) Clin Immunol 108: 241 - 247; Ball et al., (1999, Gastroenterology 117: 40-48), así como las inducidas por VLP de norovirus producidas por plantas transgénicas (Tacket etal., (2000) J Infect Dis 182: 302-305). En particular, esta formulación de vacuna Intramuscular produjo respuestas anamnéslcas dentro de los siete días de la Inmunización y se observaron respuestas de anticuerpos séricos máximas después de una dosis única, Incluyendo una respuesta de IgA significativa y una actividad de bloqueo de hidratos de carbono y una actividad de Inhibición de la hemaglutlnaclón funcionales. Por tanto, esta vacuna bivalente de norovlrus Indujo una respuesta ¡nmunltarla fuerte y protectora en humanos que fue superior a las respuestas ¡nmunltarlas Inducidas por cualquier vacuna de norovlrus actualmente disponible.

Ejemplo 2. Estudio de aumento de dosis, seguridad e ¡nmunogenlcldad de la vacuna de partículas similares a virus (VLP) bivalente de norovirus intramuscular en humanos (estudio LV03-104)

El siguiente ejemplo proporciona la parte planificada restante del estudio clínico descrito en el ejemplo 1, en el que se lleva a cabo un estudio de aumento de la dosis aleatorlzado, de sitios múltiples, en adultos > 18 años de la seguridad e ¡nmunogenlcldad de cuatro niveles de dosificación de una vacuna de VLP bivalente de norovlrus Intramuscular (I.m.) en presencia de los adyuvantes monofosforll lípido A (MPL) e hidróxido de aluminio (AIOH), en comparación con placebo. Los sujetos recibirán dos dosis de la vacuna o placebo, mediante Inyección Intramuscular (I.m.), con una separación de 28 días usando una aguja de 1,5 pulgadas (38 mm). Este ejemplo está destinado a ¡lustrar adlclonalmente los principios de la presente Invención.

La cohorte A completó la Inscripción en el estudio y se describió anteriormente en el ejemplo 1. La cohorte B contiene ~20 sujetos de 50-64 años. La cohorte C contiene ~30 sujetos de 65-85 años. En conjunto, aproximadamente 98 sujetos están Inscritos en el estudio.

En la cohorte B, se Inscribieron ~20 sujetos de 50-64 años y se aleatorlzaron 1:1 para recibir la vacuna (N = 10) o el placebo (N = 10). Después de que los datos de segundad 7 días posteriores a la dosis 2 (día de estudio 35) estuvieran disponibles para su revisión en sujetos de la cohorte B, los sujetos de la cohorte C son elegibles para recibir su dosis Inicial. En la cohorte C, se Inscribieron -30 sujetos de 65 a 85 años y se aleatorlzaron 1:1:1 para recibir la vacuna con los adyuvantes MPL y AIOH (N = 10), o una vacuna con adyuvante AIOH solo, es decir, sin MPL (N = 10), o placebo (N = 10). Las concentraciones de antígeno de las VLP de norovlrus y de AIOH en las dos formulaciones de vacuna que se evaluaron en la cohorte C son Idénticas; sólo la presencia o ausencia de MPL es diferente.

La vacuna de VLP bivalente de norovlrus contiene VLP del genogrupo I, genotipo 1 (GI.1) y genogrupo II, genotipo 4 (GII.4) como antígenos y monofosforil lípido A (MPL) e hidróxido de aluminio (AIOH) como adyuvantes, cloruro de sodio (NaCI) y L-histidina (L-His) como tampón (pH 6,3-6,7), etanol y agua para inyección. Las VLP de GII.4 comprendían una secuencia de cápslde de SEQ ID NO: 1, que derivó de tres cepas de GII.4.

La dosificación única de la vacuna seleccionada para una evaluación adicional en las cohortes B y C es la dosificación más baja en la cohorte A que da como resultado la respuesta ¡nmunltarla más robusta y reproduclble que, en general, también se tolera bien. Los datos de seguridad e ¡nmunogenlcldad del día 56 de los sujetos de la cohorte A son revisados por el CSM/SMC y la dosificación bivalente se selecciona para su evaluación en las cohortes B y C.

Los sujetos mantienen una ayuda de memoria diaria de síntomas solicitados que incluyen cuatro reacciones locales en el sitio de inyección, tales como dolor, sensibilidad a la palpación, enrojecimiento e hinchazón, y 10 signos o síntomas sistémlcos que Incluyen temperatura oral diaria, cefalea, fatiga, dolores musculares, escalofríos, dolores en las articulaciones y síntomas gastrointestinales de náuseas, vómitos, diarrea, dolor/calambres abdominales durante los días 0 a 7 después de cada dosis de vacuna de VLP bivalente de norovlrus i.m. o control. El enrojecimiento y la hinchazón en el sitio de Inyección se miden y registran diariamente durante 7 días después de cada Inyección.

Los historíales médicos provisionales se obtienen en cada visita de seguimiento en los días 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7,180+14 y 393+14 y en la llamada telefónica de seguimiento del día 265+14; se les pregunta a los sujetos acerca de enfermedades temporales, visitas al médico, cualquier acontecimiento adverso grave (AAG) y la aparición de cualquier nuevo estado médico significativo. Los sujetos tienen CBC con diferencial de WBC y recuento de plaquetas, y BUN, creatinlna, glucosa, AST y ALT en suero evaluados en la selección y en los días 21 y 35 (~7 días después de cada dosis) para evaluar la elegibilidad y seguridad de la continuación, respectivamente.

Se recoge sangre de los sujetos antes de la vacunación en el día 0 y en los días 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7,180+14 y 393+14 para medir los anticuerpos séricos (IgG, IgA, e IgM por separado y combinados) frente a la vacuna de VLP bivalente de norovlrus i.m. mediante ensayos de ¡nmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA). También se miden la actividad de bloqueo de hidratos de carbono en suero y los anticuerpos HAI séricos.

Los métodos descritos anteriormente para la cohorte A se usan para analizar las muestras de sangre recogidas de individuos Inmunizados o de Individuos que recibieron el placebo. Los resultados del estudio se emplearán en el desarrollo de un protocolo clínico para la administración de las formulaciones de vacuna de la Invención.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición de vacuna para su uso en un método para prevenir y/o mejorar la infección por norovirus o enfermedad Inducida por norovirus y/o reducir al menos un síntoma de una infección o enfermedad por norovirus, en la que el método Induce al menos un aumento de tres veces en el título sérico de anticuerpos específicos de norovirus en un humano, en comparación con el título en el humano antes de la administración de la composición, comprendiendo el método administrar por vía Intramuscular al humano no más de una dosis única de la composición de vacuna, comprendiendo dicha composición de 15 ng a 50 ng de partículas similares a virus (VLP) de norovirus del genogrupo I y de 50 ng a 150 ng de VLP de norovirus del genogrupo II, en la que dichas VLP de norovirus del genogrupo I comprenden una proteína de la cápside de una cepa viral del genogrupo I y en la que dichas VLP de norovirus del genogrupo II comprenden una proteína de la cápside de una cepa viral del genogrupo II; en la que dicha composición comprende además al menos un adyuvante y dicho al menos un adyuvante es un hldróxldo de aluminio.

2. Composición de vacuna para su uso según la reivindicación 1, en la que dichas VLP de norovirus son VLP monovalentes.

3. Composición de vacuna para su uso según la reivindicación 1, en la que dichas VLP de norovirus del genogrupo II comprenden una proteína de la cápside de cepas virales del genogrupo II, genotipo 4.

4. Composición de vacuna para su uso según la reivindicación 1, en la que dichas VLP de norovirus del genogrupo II son VLP generadas a partir de la expresión de una secuencia de consenso de norovirus del genogrupo II.

5. Composición de vacuna para su uso según la reivindicación 1, en la que dichas VLP de norovirus del genogrupo I son VLP del virus de Norwalk y dichas VLP de norovirus del genogrupo II son VLP generadas a partir de la expresión de una secuencia de consenso de norovirus del genogrupo II.

6. Composición de vacuna para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha composición comprende además un tampón seleccionado del grupo que consiste en L-histidina, imidazol, ácido succínlco, tris y ácido cítrico.

7. Composición de vacuna para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 , en la que la composición de vacuna se formula como un líquido.

8. Composición de vacuna para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la dosis de un tipo de VLP de norovirus es diferente de la dosis del otro tipo de VLP de norovirus.