KR102096937B1 - 비경구 노로바이러스 백신 제제 - Google Patents

비경구 노로바이러스 백신 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단가 노로바이러스 바이러스 유사 입자들의 혼합물들을 포함하는 1회 투약 비경구 백신 조성물에 관한 것이다. 이런 조성물을 투여함으로써 인간 대사의 노로바이러스 감염에 대항하는 보호 면역원성을 제공하는 방법이 또한 개시된다.

Description

비경구 노로바이러스 백신 제제{Parenteral norovirus vaccine formulations}
본 발명은 백신 분야, 특히 노로바이러스에 대한 백신 분야이다. 또한, 본 발명은 백신 조성물의 제조 방법 및 인간의 노로바이러스에 대항하는 보호 면역반응을 유도 및 평가하는 방법에 관한 것이다.
노로바이러스는 비박테리아성 위장염의 유행성 발생의 한 중요한 원인으로 출현한 배양할 수 없는 인간 칼리시바이러스이다(Glass et al, 2000; Hardy et at, 1999). 노로바이러스의 임상적 중요성은 민감한 분자 진단법의 개발 이전에는 저평가되었다. 유전자형 유전자군 I 놀워크 바이러스(NV) 게놈의 복제 및 재조합 바큘로바이러스 발현 시스템으로부터 바이러스-유사 입자들(VLPs)의 생산은 널리 퍼진 노로바이러스 감염을 밝혀낸 분석법의 개발을 유도하였다(Jiang et al 1990; 1992).
노로바이러스는 절단되지 않은 RNA 게놈을 함유하는 단일가닥의 양성 센스 RNA 바이러스이다. 바이러스 게놈은 3개의 오픈 리딩 프레임을 암호화하고, 이중 후자 둘은 각각 중요한 캡시드 단백질과 중요하지 않은 구조 단백질의 생산을 특징으로 한다(Glass et al 2000). 진핵세포 발현 시스템에서 높은 수준으로 발현될 때, NV의 캡시드 단백질 및 특정 다른 노로바이러스들은 천연 노로바이러스 비리온들과 구조적으로 유사한 VLP 속에서 자가결합된다. 투과전자현미경으로 관찰할 때, VLP는 인간 대변 샘플로부터 분리한 감염성 비리온들과 형태적으로 분간할 수 없다.
노로바이러스들에 대한 면역 반응은 복잡하고 보호의 상관관계의 한쪽은 이제 설명되고 있다. 천연 바이러스로 수행된 인간 지원자 연구들은 점막-유도 기억 면역 반응들이 감염으로부터 단기간의 보호를 제공한다는 것을 증명하고 백신-매개 보호가 실현 가능하다는 것을 나타내었다(Lindesmith et al. 2003; Parrino et al.1997; Wyatt et al., 1974))
비록 노로바이러스는, VLP의 이용가능성과 대량으로 생산되는 이들의 능력 때문에 인비트로 배양될 수 없으나, 노로바이러스 캡시드의 항원 및 구조 정밀사진을 뚜렷이 보이게 하는데 상당한 진전이 이루어졌다. VLP는 감염성 유전자 물질이 없으면서 바이러스 캡시드 단백질의 확실한 증거를 보유한다. 결과적으로, VLP는 바이러스의 세포 수용체와의 기능적 상호작용을 모방하여, 감염을 재생하거나 일으키는 능력이 없으면서 적절한 숙주 면역반응을 유도한다. NIH와 공동으로, 베일러 의대는 학문적, 투자자-지원 I 단계 임상 시험에서 인간 지원자들에서 NV VLP에 대한 체액, 점막 및 세포 면역 반응들을 연구하였다. 경구 투여된 VLP는 건강한 어른들에서 안전하고 면역원성이 있다(Ball et al. 1999; Tacket et al. 2003). 그러나, 수회 투여의 상대적으로 다량의 VLP는 면역반응을 관찰하는 것이 필요하였다. 다른 연구 센터에서, 동물 모델에서의 임상전 실험들은 박테리아 엑소토신 항원보강제로 비강으로 투여될 때 VLP에 대한 면역반응의 증가를 증명하였다(Guerrero et al. 2001; Nicollier-Jamot et al. 2004; Periwal et al. 2003; Souza et al.(2007) Vaccine, Vol. 25(50):8448-59). 그러나, 인간의 노로바이러스에 대항하는 보호 면역성은 알기 어려운 상태인데 이는 인간의 보호 면역반응의 지표들이 여전히 분명하게 확인되지 않았기 때문이다(Herbst-Kralovetz et al.(2010) Expert Rev. Vaccines 9(3), 299-307).
본 발명의 상기 문제점을 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 1회 투약 노로바이러스 백신은 비경구로 투여될 때 인간의 노로바이러스에 대항하는 빠르고, 강한 보호 면역반응을 유도한다는 발견을 부분적으로 기초로 한다. 따라서, 본 발명은 1회 투약 이하의 백신 조성물을 인간에게 비경구로 투여하는 단계를 포함하여 인간의 노로바이러스에 대항하는 보호 면역원성을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 조성물은 유전자군 I 및/또는 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함하며, 상기 조성물은 조성물의 투여 이전에 인간의 역가와 비교하여 노로바이러스-특이적 혈청 항체 역가의 적어도 3배 증가를 유도한다. 특정 실시태양에서, 노로바이러스-특이적 항체 역가의 증가는 1회 투약 조성물의 투여 7일 내에 유도된다. 일부 실시태양에서, 백신 조성물은 정맥, 피하, 피내 또는 근내 투여 경로를 통해 인간에게 투여된다. 한 실시태양에서, 백신 조성물은 근내 투여 경로에 의해 인간에게 투여된다.
1회 투약 백신 조성물은 약 5㎍ 내지 약 150㎍의 유전자군 I 노로바이러스 VLP, 유전자군 II 노로바이러스 VLP 또는 둘 다의 투약량을 포함할 수 있다. 1회 투약 백신 조성물이 유전자군 I 및 유전자군 II 노로바이러스 VLP 둘 다를 포함하는 실시태양에서, 각 VLP의 투약량은 동일하거나 다를 수 있다. 한 실시태양에서, 조성물은 50㎍ 이하의 유전자군 I 노로바이러스 VLP를 포함한다. 다른 실시태양에서, 조성물은 25㎍ 이하의 유전자군 I 노로바이러스 VLP를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 조성물은 150㎍ 이하의 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 조성물은 50㎍ 이하의 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함한다. 노로바이러스 VLP는 단가 VLP 또는 다가 VLP일 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 백신 조성물의 유전자군 I 노로바이러스 VLP는 유전자군 I 바이러스 균주로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함한다. 한 실시태양에서, 유전자군 I 노로바이러스 VLP는 유전자군 I, 유전자형 1 노로바이러스로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 다른 실시태양에서, 유전자군 I 노로바이러스 VLP는 놀워크 바이러스로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 본 발명의 다른 양태에서, 백신 조성물의 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 유전자군 II 바이러스 균주로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 실시태양에서, 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 유전자군 II, 유전자형 4 노로바이러스로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 특정 실시태양에서, 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 유전자군 II 노로바이러스의 일치 서열의 발현으로부터 발생된 VLP이다. 한 특정 실시태양에서, 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 SEQ ID NO: 1의 서열을 가진 캡시드 단백질을 포함한다.
특정 실시태양들에서, 백신 조성물은 적어도 하나의 항원보강제를 더 포함한다. 항원보강제는 바람직하게는 박테리아 외독소 항원보강제가 아니다. 한 실시태양에서, 모노포스포릴 지질 A(MPL), 플라겔린 또는 CpG와 같은 톨-라이크 리셉터 효현제이다. 다른 실시태양에서, 항원보강제는 수산화알루미늄(예를 들어, 명반)이다. 특정 실시태양에서, 백신 조성물은 MPL 및 수산화알루미늄과 같은 두 항원보강제를 포함한다. 일부 실시태양에서, 백신 조성물은 L-히스티딘, 이미다졸, 숙신산, 트리스 및 시트르산과 같은 버퍼를 더 포함할 수 있다. 백신 조성물은 건조 분말 또는 액체로서 제제화될 수 있다. 한 실시태양에서, 백신 조성물은 액체(예를 들어, 수성 제제)로 제제화된다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1. 위약(식염수) 또는 5, 15, 50 또는 150㎍의 유전자군 I.1 노로바이러스 VLP 및 유전자군 II.4 노로바이러스 VLP를 포함하는 백신 제제에 의해 근내로 면역접종된 인간 지원자로부터의 혼합 혈청 IgG, IgA 및 IgM 수준을 측정하는 pan-ELISA 분석법의 결과. 항-GI.1(A) 및 항-GII.4(B) 항체에 대한 기하학적 평균 역가는 1차 면역화 후 7 및 21일 그리고 2차 면역화 후 7 및 28일에 투약 수준의 각각에 대해 도시된다. 지원자는 연구 0 및 28일에 면역화되었다.
도 2. 위약(식염수) 또는 5, 15, 50 또는 150㎍의 유전자군 I.1 노로바이러스 VLP 및 유전자군 II.4 노로바이러스 VLP를 포함하는 백신 제제에 의해 근내로 면역접종된 인간 지원자로부터의 혼합 혈청 IgG, IgA 및 IgM 수준을 측정하는 pan-ELISA 분석법의 결과. 항-GI.1(A) 및 항-GII.4(B) 항체에 대한 기하학적 평균 배수 증가는 1차 면역화 후 7 및 21일 그리고 2차 면역화 후 7 및 28일에 투약 수준의 각각에 대해 도시된다. 지원자는 연구 0 및 28일에 면역화되었다.
도 3. 위약(식염수) 또는 5, 15, 50 또는 150㎍의 유전자군 I.1 노로바이러스 VLP 및 유전자군 II.4 노로바이러스 VLP를 포함하는 백신 제제에 의해 근내로 면역접종된 인간 지원자로부터의 혼합 혈청 IgG, IgA 및 IgM 수준을 측정하는 pan-ELISA 분석법의 결과. 항-GI.1(A) 및 항-GII.4(B) 항체에 대한 백분율 혈청반응율(즉, 선-면역화 역가와 비교된 항체 역가의 4배 증가)은 1차 면역화 후 7 및 21일 그리고 2차 면역화 후 7 및 28일에 투약 수준의 각각에 대해 도시된다. 지원자는 연구 0 및 28일에 면역화되었다.
도 4. 위약(식염수) 또는 5, 15 또는 50㎍의 유전자군 I.1 노로바이러스 VLP 및 유전자군 II.4 노로바이러스 VLP를 포함하는 백신 제제에 의해 근내로 면역접종된 인간 지원자로부터의 혈청 IgA를 측정하는 pan-ELISA 분석법의 결과. 항-GI.1(A) 및 항-GII.4(B) 항체에 대한 기하학적 평균 역가는 1차 면역화 후 7 및 21일 그리고 2차 면역화 후 7 및 28일에 투약 수준의 각각에 대해 도시된다. 지원자는 연구 0 및 28일에 면역화되었다.
도 5. 위약(식염수) 또는 5, 15 또는 50㎍의 유전자군 I.1 노로바이러스 VLP 및 유전자군 II.4 노로바이러스 VLP를 포함하는 백신 제제에 의해 근내로 면역접종된 인간 지원자로부터의 혈청 IgA를 측정하는 pan-ELISA 분석법의 결과. 항-GI.1(A) 및 항-GII.4(B) 항체에 대한 기하학적 평균 배수 증가는 1차 면역화 후 7 및 21일 그리고 2차 면역화 후 7 및 28일에 투약 수준의 각각에 대해 도시된다. 지원자는 연구 0 및 28일에 면역화되었다.
도 6. 위약(식염수) 또는 5, 15 또는 50㎍의 유전자군 I.1 노로바이러스 VLP 및 유전자군 II.4 노로바이러스 VLP를 포함하는 백신 제제에 의해 근내로 면역접종된 인간 지원자로부터의 혈청 IgA를 측정하는 pan-ELISA 분석법의 결과. 항-GI.1(A) 및 항-GII.4(B) 항체에 대한 백분율 혈청반응율(즉, 선-면역화 역가와 비교된 항체 역가의 4배 증가)은 1차 면역화 후 7 및 21일 그리고 2차 면역화 후 7 및 28일에 투약 수준의 각각에 대해 도시된다. 지원자는 연구 0 및 28일에 면역화되었다.
도 7. 위약(식염수) 또는 5, 15 또는 50㎍의 유전자군 I.1 노로바이러스 VLP 및 유전자군 II.4 노로바이러스 VLP를 포함하는 백신 제제에 의해 근내로 면역접종된 인간 지원자로부터의 혈청 IgG를 측정하는 pan-ELISA 분석법의 결과. 항-GI.1(A) 및 항-GII.4(B) 항체에 대한 기하학적 평균 역가는 1차 면역화 후 7 및 21일 그리고 2차 면역화 후 7 및 28일에 투약 수준의 각각에 대해 도시된다. 지원자는 연구 0 및 28일에 면역화되었다.
도 8. 위약(식염수) 또는 5, 15 또는 50㎍의 유전자군 I.1 노로바이러스 VLP 및 유전자군 II.4 노로바이러스 VLP를 포함하는 백신 제제에 의해 근내로 면역접종된 인간 지원자로부터의 혈청 IgG를 측정하는 pan-ELISA 분석법의 결과. 항-GI.1(A) 및 항-GII.4(B) 항체에 대한 기하학적 평균 배수 증가는 1차 면역화 후 7 및 21일 그리고 2차 면역화 후 7 및 28일에 투약 수준의 각각에 대해 도시된다. 지원자는 연구 0 및 28일에 면역화되었다.
도 9. 위약(식염수) 또는 5, 15 또는 50㎍의 유전자군 I.1 노로바이러스 VLP 및 유전자군 II.4 노로바이러스 VLP를 포함하는 백신 제제에 의해 근내로 면역접종된 인간 지원자로부터의 혈청 IgG를 측정하는 pan-ELISA 분석법의 결과. 항-GI.1(A) 및 항-GII.4(B) 항체에 대한 백분율 혈청반응율(즉, 선-면역화 역가와 비교된 항체 역가의 4배 증가)은 1차 면역화 후 7 및 21일 그리고 2차 면역화 후 7 및 28일에 투약 수준의 각각에 대해 도시된다. 지원자는 연구 0 및 28일에 면역화되었다.
도 10. El Kamary et al.(2010) J Infect Dis, Vol. 202(11): 1649-1658(LV01-103 그룹)에 기술된 대로 노로바이러스 비강내, 단가 백신 또는 지정한 시점에 실시예 1(LV03-104 그룹)에 기술된 대로 노로바이러스 근내, 2가 백신으로 면역화된 인간 지원자로부터의 혼합 혈청 IgG, IgA 및 IgM 수준을 측정하는 pan-ELISA 분석법의 결과. 인간 지원자는 위약 또는 2회 투약량의 근내 또는 비강내 백신 제제를 투여받았다. 근내, 2가 노로바이러스 백신은 5㎍의 유전자군 I.1 노로바이러스 VLP 및 유전자군 II.4 노로바이러스 VLP를 포함하였다. 비강내, 단가 백신은 100㎍의 유전자군 I.1 노로바이러스를 포함하였다. 비강내 백신 또는 위약을 투여받은 지원자들은 2차 면역화 이후 생 노로바이러스로 면역성 검사를 받았다.
도 11. 5㎍ 투약량의 노로바이러스 근내, 2가 백신(A) 또는 위약(B)로 면역화 이전 0일 및 면역화 7일 후 인간 지원자로부터 얻은 말초 혈액 단핵구 세포의 FACS 분석. CD19+ PBMC는 알파 4/베타 7 호밍 수용체(homing receptor) 및 케모카인 CCR10 수용체의 발현의 증거로서 점막으로 표적이 된다.
본 발명은 대상의 노로바이러스 감염에 대한 보호 면역원성을 유도하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 노로바이러스 VLP 및 선택적으로 적어도 하나의 항원보강제를 포함하는 1회 이하 투약량의 백신을 인간에게 비경구 투여함으로써 인간의 노로바이러스에 대항하는 보호 면역원성을 유도하는 방법을 제공하며, 백신은 노로바이러스 감염의 적어도 하나의 증상으로부터의 보호 또는 증상의 완화를 제공한다. 본 발명자는 노로바이러스 VLP를 포함하는 백신 조성물의 1회 이하 투약량의 인간에 대한 근내 투여가 노로바이러스 감염 및 병에 대항하는 보호 면역반응의 지표인 빠른(즉, 면역화의 7일 내) 혈청 전환(즉, 선-백신접종 수준 이상의 항원-특이적 혈청 항체 역가의 적어도 3배 증가)을 유도한다는 것을 놀랍게 발견하였다. 이런 1회 투약 백신 조성물에 의해 유도된 면역 반응은 인간 면역성 검사 연구에서 간 바이러스의 투여에 의한 자연 감염에 의해 관찰된 것과 유사한 높은 항체 역가에서 정체기에 든다. 흥미롭게도, 백신의 추가 투약량이 필요하지 않은데 이는 면역 반응이 추가 백신 투약량의 추가 투여에 의해 증가하지 않기 때문이다.
본 발명은 하나 이상의 노로바이러스 항원을 포함하는 조성물을 제공한다. "노로바이러스(NOR)"는 칼리시바이러스과의 노로바이러스속의 일원을 의미한다. 일부 실시예에서, 노로바이러스는 인간 또는 비인간 포유류 종들에 감염성인 관련된, 양성-센스 단일-가닥 RNA, 외피가 없는 바이러스의 그룹을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 노로바이러스는 인간에게 급성 위장염을 일으킬 수 있다. 또한 노로바이러스는 전자현미경으로 관찰할 때 경계가 정해진 구조 또는 가장자리를 가진 소형 원형 구조 바이러스(SRSVs)로 부를 수 있다.
노로바이러스 내에 포함되는 것은 적어도 5개 유전자군(GI, GII, GIII, GIV 및 GV)이다. GI, GII 및 GIV 노로바이러스는 인간들에서 감염성인 반면, GIII 노로바이러스는 주로 소 종들을 감염시킨다. GV는 생쥐로부터 최근에 분리되었다(Zheng et al. (2006) Virology, Vol 346: 312-323). 대표적인 GIII는 제나 및 뉴버리 균주인 반면 알파트론, 포트 라우데르달레 및 세인트 클라우드 균주는 대표적인 GIV이다. GI 및 GII 그룹은 유전적 분류를 기초로 하여 유전 클러스터 또는 유전자형으로 추가로 분리될 수 있다(Ando et al. (2000) J. Infectious Diseases, Vol. 181(Supp2):S336-S348; Lindell et al. (2005) J. Clin. Microbiol., Vol. 43(3): 1086-1092). 본 발명에 사용된 대로, 유전 클러스터라는 용어는 유전자형이란 용어와 교환적으로 사용된다. 유전자군 I 내에서, (원형 바이러스 균주 이름을 가진) 현재 알려진 8개 GI 클러스터가 있다: GI.1(Norwalk(NV-USA93)); GI.2(Southhampton(SOV-GBR93)); GI.3(Desert Shield(DSV-USA93)); GI.4(Cruise Ship virus/Chiba (Chiba-JPN00)); GI.5(318/Musgrove(Musgrov-GBR00)); GI.6(Hesse (Hesse-DEU98)); GI.7(Wnchest-GBR00); 및 GI.8 (Boxer-USA02). 유전자군 II 내에서, (원형 바이러스 균주 이름을 가진) 현재 알려진 19개 GII 클러스터가 있다: GII.1(Hawaii(Hawaii-USA94)); GII.2(Snow Mountain/Melksham (Msham-GBR95)); GII.3(Toronto(Toronto-CAN93)); GII.4(Bristol/Lordsdale(Bristol-GBR93)); GII.5(290/Hillingdon(Hilingd-GBR00)); GII.6(269/Seacroft (Seacrof-GBR00)); GII.7(273/Leeds (Leeds-GBR00)); GII.8(539/Amsterdam(Amstdam-NLD99)); GII.9(378(VABeach-USA01)), GII.10(Erfurt-DEU01); GII.11(SW9180JPN01); GII.12(Wortley-GBR00); GII.13(Faytvil-USA02); GII.14(M7-USA03); GII.15(J23-USA02); GII.16(Tiffin-USA03); GII.17(CSE1-USA03); GII.18(QW101/2003/US) 및 GII.19(QW170/2003/US).
"노로바이러스"는 재조합 노로바이러스 바이러스-유사 입자들(rNOR VLP)을 의미한다. 일부 실시예들에서, 예를 들어, Sf9 세포들에서 바큘로바이러스 벡터로부터, 세포들의 ORF2에 의해 암호화된 노로바이러스 캡시드 단백질의 재조합 발현은 캡시드 단백질의 VLP 속으로의 자발적인 자가결합을 유도할 수 있다. 일부 실시예들에서, 예를 들어, Sf9 세포들에서 바큘로바이러스 벡터로부터, ORF1 및 ORF2에 의해 암호화된 적어도 하나의 노로바이러스 단백질들의 재조합 발현은 캡시드 단백질의 VLP 속으로의 자발적인 자가결합을 유도할 수 있다. VLP는 노로바이러스와 구조적으로 유사하나 바이러스 RNA 게놈이 없어서 감염성이 없다. 따라서, "노로바이러스"는 결핍 입자들을 포함하는 감염성 또는 비감염성 입자들일 수 있는 비리온을 포함한다.
노로바이러스의 비제한적인 예들은 노로바이러스 유전자군 1 균주 Hu/NoV/West Chester/2001/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502016; 치바 바이러스(CHV, 진뱅크 AB042808); 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Braddock Heights/1999/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502015; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Fayette/1999/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502014; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Fairfield/1999/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502013; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Sandusky/1999/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502012; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Canton/1999/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502011; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Tiffin/1999/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502010; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/CS-E1/2002/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY50200; 노로바이러스 유전자군 1 균주 Hu/NoV/Wisconsin/2001/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502008; 노로바이러스 유전자군 1 균주 Hu/NoV/CS-841/2001/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502007; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Hiram/2000/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502006; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Tontogany/1999/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502005; 놀워크 바이러스, 완전 지놈, 진뱅크 등록번호 No. NC.sub.--001959; 노로바이러스 Hu/GI/Otofuke/1979/JP 지놈 RNA, 완전 지놈, 진뱅크 등록번호 No. AB187514; 노로바이러스 Hu/Hokkaido/133/2003/JP, 진뱅크 등록번호 No. AB212306; 노로바이러스 시드니 2212, 진뱅크 등록번호 No. AY588132; 놀워크 바이러스 균주 SN2000JA, 진뱅크 등록번호 No. AB190457; 로즈데일 바이러스 완전 지놈, 진뱅크 등록번호 No. X86557; 놀워크 유사 바이러스 지놈 RNA, Gifu'96, 진뱅크 등록번호 No. AB045603; 놀워크 바이러스 균주 베트남 026, 완전 지놈, 진뱅크 등록번호 No. AF504671; 노로바이러스 Hu/GII.4/2004/N/L, 진뱅크 등록번호 No. AY883096; 노로바이러스 Hu/GII/Hokushin/03/JP, 진뱅크 등록번호 No. AB195227; 노로바이러스 Hu/GII/Kamo/03/JP, 진뱅크 등록번호 No. AB195228; 노로바이러스 Hu/GII/Sinsiro/97/JP, 진뱅크 등록번호 No. AB195226; 노로바이러스 Hu/GII/Ina/02/JP, 진뱅크 등록번호 No. AB195225; 노로바이러스 Hu/NLV/GII/Neustrelitz260/2000/DE, 진뱅크 등록번호 No. AY772730; 노로바이러스 Hu/NLV/Dresden174/pUS-NorII/1997/GE, 진뱅크 등록번호 No. AY741811; 노로바이러스 Hu/NLV/Oxford/B2S16/2002/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY587989; 노로바이러스 Hu/NLV/Oxford/B4S7/2002/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY587987; 노로바이러스 Hu/NLV/Witney/B7S2/2003/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY588030; 노로바이러스 Hu/NLV/Banbury/B9S23/2003/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY588029; 노로바이러스 Hu/NLV/ChippingNorton/2003/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY588028; 노로바이러스 Hu/NLV/Didcot/B9S2/2003/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY588027; 노로바이러스 Hu/NLV/Oxford/B8S5/2002/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY588026; 노로바이러스 Hu/NLV/Oxford/B6S4/2003/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY588025; 노로바이러스 Hu/NLV/Oxford/B6S5/2003/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY588024; 노로바이러스 Hu/NLV/Oxford/B5S23/2003/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY588023; 노로바이러스 Hu/NLV/Oxford/B6S2/2003/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY588022; 노로바이러스 Hu/NLV/Oxford/B6S6/2003/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY588021; 놀워크 유사 바이러스 분리주 Bo/Thirsk10/00/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY126468; 놀워크 유사 바이러스 분리주 Bo/Penrith55/00/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY126476; 놀워크 유사 바이러스 분리주 Bo/Aberystwyth24/00/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY126475; 놀워크 유사 바이러스 분리주 Bo/Dumfries/94/UK, 진뱅크 등록번호 No. AY126474; 노로바이러스 NLV/IF2036/2003/Iraq, 진뱅크 등록번호 No. AY675555; 노로바이러스 NLV/IF1998/2003/Iraq, 진뱅크 등록번호 No. AY675554; 노로바이러스 NLV/BUDS/2002/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY660568; 노로바이러스 NLV/Paris Island/2003/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY652979; 스노우 마운틴 바이러스, 완전 지놈, 진뱅크 등록번호 No. AY134748; 놀워크 유사 바이러스 NLV/Fort Lauderdale/560/1998/US, 진뱅크 등록번호 No. AF414426; Hu/노로바이러스/hiroshima/1999/JP(9912-02F), 진뱅크 등록번호 No. AB044366; 놀워크 유사 바이러스 균주 11MSU-MW, 진뱅크 등록번호 No. AY274820; 놀워크 유사 바이러스 균주 B-1SVD, 진뱅크 등록번호 No. AY274819; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Farmington Hills/2002/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502023; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/CS-G4/2002/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502022; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/CS-G2/2002/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502021; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/CS-G12002/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502020; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Anchorage/2002/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502019; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/CS-D1/2002/CAN, 진뱅크 등록번호 No. AY502018; 노로바이러스 유전자군 2 균주 Hu/NoV/Germanton/2002/USA, 진뱅크 등록번호 No. AY502017; 인간 칼리시바이러스 NLV/GII/Langen1061/2002/DE, 완전 지놈, 진뱅크 등록번호 No. AY485642; Murine 노로바이러스 1 폴리단백질, 진뱅크 등록번호 No. AY228235; 놀워크 바이러스, 진뱅크 등록번호 No. AB067536; 인간 칼리시바이러스 NLV/Mex7076/1999, 진뱅크 등록번호 No. AF542090; 인간 칼리시바이러스 NLV/Oberhausen 455/01/DE, 진뱅크 등록번호 No. AF539440; 인간 칼리시바이러스 NLV/Herzberg 385/01/DE, 진뱅크 등록번호 No. AF539439; 인간 칼리시바이러스 NLV/Boxer/2001/US, 진뱅크 등록번호 No. AF538679; 놀워크 유사 바이러스 지놈 RNA, 완전 지놈, 진뱅크 등록번호 No. AB081723; 놀워크 유사 바이러스 지놈 RNA, 완전 지놈, 분리주: Saitama U201, 진뱅크 등록번호 No. AB039782; 놀워크 유사 바이러스 지놈 RNA, 완전 지놈, 분리주: Saitama U18, 진뱅크 등록번호 No. AB039781; 놀워크 유사 바이러스 지놈 RNA, 완전 지놈, 분리주: Saitama U25, 진뱅크 등록번호 No. AB039780; 놀워크 바이러스 균주:U25GII, 진뱅크 등록번호 No. AB067543; 놀워크 바이러스 균주:U201 GII, 진뱅크 등록번호 No. AB067542; 놀워크 유사 바이러스 균주 416/97003156/1996/LA, 진뱅크 등록번호 No. AF080559; 놀워크 유사 바이러스 균주 408/97003012/1996/FL, 진뱅크 등록번호 No. AF080558; 놀워크 유사 바이러스 NLV/Burwash Landing/331/1995/US, 진뱅크 등록번호 No. AF414425; 놀워크 유사 바이러스 NLV/Miami Beach/326/1995/US, 진뱅크 등록번호 No. AF414424; 놀워크 유사 바이러스 NLV/White River/290/1994/US, 진뱅크 등록번호 No. AF414423; 놀워크 유사 바이러스 NLV/New Orleans/306/1994/US, 진뱅크 등록번호 No. AF414422; 놀워크 유사 바이러스 NLV/Port Canaveral/301/1994/US, 진뱅크 등록번호 No. AF414421; 놀워크 유사 바이러스 NLV/Honolulu/314/1994/US, 진뱅크 등록번호 No. AF414420; 놀워크 유사 바이러스 NLV/Richmond/283/1994/US, 진뱅크 등록번호 No. AF414419; 놀워크 유사 바이러스 NLV/Westover/302/1994/US, 진뱅크 등록번호 No. AF414418; 놀워크 유사 바이러스 NLV/UK3-17/12700/1992/GB, 진뱅크 등록번호 No. AF414417; 놀워크 유사 바이러스 NLV/Miami/81/1986/US, 진뱅크 등록번호 No. AF414416; 스노우 마운틴 균주, 진뱅크 등록번호 No. U70059; 사막 방패 바이러스 DSV395, 진뱅크 등록번호 No. U04469; 놀워크 바이러스, 완전 지놈, 진뱅크 등록번호 No. AF093797; 하와이 칼리시바이러스, 진뱅크 등록번호 No. U07611; 사우스햄튼 바이러스, 진뱅크 등록번호 No. L07418; 놀워크 바이러스 (SRSV-KY-89/89/J), 진뱅크 등록번호 No. L23828; 놀워크 바이러스 (SRSV-SMA/76/US), 진뱅크 등록번호 No. L23831; 캠베르웰 바이러스, 진뱅크 등록번호 No. U46500; 인간 칼리시바이러스 균주 멜크샴, 진뱅크 등록번호 No. X81879; 인간 칼리시바이러스 균주 MX, 진뱅크 등록번호 No. U22498; 미니레오바이러스 TV24, 진뱅크 등록번호 No. U02030; 및 놀워크 유사 바이러스 NLV/Gwynedd/273/1994/US, 진뱅크 등록번호 No. AF414409; (본 출원의 출원일에 등록된) 것의 전부의 서열들은 참조로 본 발명에 포함된다. 추가 노로바이러스 서열들은 다음 특허 공개공보에 개시된다: WO 2005/030806, WO 2000/79280, JP2002020399, US2003129588, U.S. Pat. No. 6,572,862, WO 1994/05700, 및 WO 05/032457, 이의 전부는 전문이 참조로 본 발명에 포함된다. 또한 노로바이러스들의 서열 비교 및 유전 다양성 및 계통 발생 분석의 논의에 대해 Green et al . (2000) J. Infect. Dis., Vol. 181(Suppl. 2):S322-330; Wang et al . (1994) J. Virol., Vol. 68:5982-5990; Chen et al . (2004) J. Virol., Vol. 78: 6469-6479; Chakravarty et al . (2005) J. Virol., Vol. 79: 554-568; Hansman et al . (2006) J. Gen. Virol., Vol. 87:909-919; Bull et al . (2006) J. Clin. Micro., Vol. 44(2):327-333; Siebenga, et al . (2007) J. Virol., Vol. 81(18):9932-9941, 및 Fankhauser et al . (1998) J. Infect. Dis., Vol. 178:1571-1578 참조. 핵산 및 이의 상응하는 아미노산 서열은 전체가 참조로 포함된다. 일부 실시예들에서, 암호문이 동정 목적을 위해 사용될 수 있고 구성된다: 바이러스가 분리된 숙주 종들/속 약어/종 약어/균주 이름/발생 연도/기원 국가((Green et al., Human Caliciviruses, in Fields Virology Vol. 1 841- 874 (Knipe and Howley, editors-in-chief, 4th ed., Lippincott Williams & Wilkins 2001)).
유전자군 II, 유전자형 4(GII.4) 바이러스 균주(예를 들어, 휴스턴, 미네르바(또한 덴하흐로 알려짐), 및 라우렌(또한 에르세케로 알려짐) 균주)가 일부 실시태양에서 바람직하다. 새로운 균주들이 동정되고 이들의 유전자 서열이 이용가능함에 따라, 당업자는 일반적인 기술을 사용하여 본 발명의 조성물 및 방법에서 이들 당대 균주를 사용하여 VLP를 이용할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 기술된 조성물과 방법에서 사용하기 위한 적절한 항원으로서 이런 균주로 만들어진 VLP를 고려한다.
노로바이러스 항원은 펩타이드, 단백질 또는 바이러스-유사 입자들(VLPs)의 형태일 수 있다. 한 바람직한 실시예에서, 노로바이러스 항원은 VLP를 포함한다. 본 발명에서 사용된 대로, "바이러스-유사 입자(들) 또는 VLP"는 바이러스-유사 입자(들), 단편(들), 응집체 또는 노로바이러스의 서열을 암호화하고 감염성 노로바이러스 입자들의 항원 특성(들)과 유사한 항원 특성(들)을 포함하는 캡시드 단백질로부터 생산된 이의 부분(들)을 의미한다. 노로바이러스 항원들은 캡시드 모노머, 캡시드 멀티머, 단백질 또는 VLP의 펩타이드 단편 또는 응집체 또는 이의 혼합물 형태일 수 있다. 노로바이러스 항원 단백질 또는 펩타이드는 당업계에 공지된 방법들을 사용하여 생산된 변형 형태일 수 있다.
본 발명의 VLP는 VP1 및/또는 VP2와 같은 전장 노로바이러스 캡시드 단백질 또는 단백질 또는 당업계의 표준 방법을 사용하는 특정 VP1 또는 VP2 유도체로 형성될 수 있다. 선택적으로, VLP를 형성하는데 사용된 캡시드 단백질은 절단된 캡시드 단백질이다. 일부 실시예들에서, 예를 들어, VLP의 적어도 하나는 절단된 VP1 단백질을 포함한다. 다른 실시예들에서, 모든 VLP는 절단된 VP1 캡시드를 포함한다. 절단은 N-또는 C-말단 절단일 수 있다. 절단된 캡시드 단백질들은 적절한 기능성 캡시드 단백질 유도체들이다. 기능성 캡시드 단백질 유도체들은 면역반응이 전장 캡시드 단백질로 이루어진 VLP에 의해 일어나는 것과 동일한 방식으로 면역반응(필요한 경우, 적절하게 도움이 될 때)을 일으킬 수 있다.
VLP는 중요한 VP1 단백질 및/또는 중요하지 않은 VP2 단백질을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 각 VLP는 단가 VLP를 생산하는 단지 하나의 노로바이러스 유전자군으로부터의 VP1 및/또는 VP2 단백질을 함유한다. 본 발명에서 사용된 대로, "단가"라는 용어는 항원 단백질들이 단일 노로바이러스 유전자군으로부터 유도된다는 것을 의미한다. 예를 들어, VLP는 유전자군 I(예를 들어, 놀워크 바이러스로부터의 VP1 및 VP2)의 바이러스 균주로부터의 VP1 및/또는 VP2를 함유한다. 바람직하게는, VLP는 주로 VP1 단백질로 구성된다. 본 발명의 한 실시예에서, 항원은 단가 VLP의 혼합물이고 여기서 조성물은 여러 바이러스 균주(예를 들어, 놀워크 바이러스 및 휴스톤 바이러스)로부터 얻은 다른 노로바이러스 유전자군으로부터의 VP1 및/또는 VP2로 구성된 VLP와 혼합된 단일 노로바이러스 유전자군으로부터의 VP1 및 VP2로 구성된 VLP를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 노로바이러스 유전자군 II의 하나 이상의 균주로부터의 단가 VLP와 함께 노로바이러스 유전자군 I의 하나 이상의 균주로부터의 단가 VLP를 함유할 수 있다. 균주들은 소정의 시간에 이들의 순환의 우위를 기초로 선택될 수 있다. 특정 실시태양에서, 노로바이러스 VLP 혼합물은 GI.1 및 GII.4 바이러스 균주로 구성된다. 더욱 바람직하게는, 노로바이러스 VLP 혼합물은 놀워크의 균주 및 유전자군 II 노로바이러스로부터 유래된 일치 캡시드 서열로 구성된다. 순환하는 노로바이러스 서열로부터 유래된 일치 캡시드 서열 및 이런 서열로 만들어진 VLP는 전문이 참조로 본 발명에 포함된 WO 2010/017542에 기술된다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 유전자군 II, 유전자형 4(GII.4) 바이러스 균주로부터 유래된 일치 캡시드 서열은 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 백신 조성물은 단가 VLP의 혼합물을 포함하며, 하나의 단가 VLP는 유전자군 I 노로바이러스(예를 들어, 놀워크)로부터의 캡시드 단백질을 포함하며 다른 단가 VLP는 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 일치 캡시드 단백질을 포함한다.
Figure 112014013385953-pct00001
그러나, 본 발명의 다른 실시예에서, VLP는, 예를 들어, 제 2 노로바이러스 유전자군으로부터의 VP1 및/또는 VP2와 상호혼합된 하나의 노로바이러스 유전자군으로부터의 VP1 및/또는 VP2 단백질을 포함하는 다가 VLP일 수 있고, 여기서 다른 VP1 및 VP2 단백질은 키메릭 VP1 및 VP2 단백질이 아니나, 동일한 캡시드 구조 내에 함께 결합되어 면역성 VLP를 형성한다. 본 발명에서 사용된 대로, "다가"라는 용어는 항원 단백질들이 노로바이러스 둘 이상의 유전자군으로부터 유도된다는 것을 의미한다. 다가 VLP는 둘 이상의 바이러스 균주로부터 얻은 VLP 항원을 함유할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 노로바이러스 유전자군 II(예를 들어, 휴스톤 바이러스)의 하나 이상의 균주로부터의 캡시드 모노머 또는 멀티머와 함께 노로바이러스 유전자군 I(예를 들어, 놀워크 바이러스)의 하나 이상의 균주로부터의 캡시드 모노머 또는 멀티머로 구성된 다가 VLP를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 다가 VLP는 놀워크 및 휴스톤 노로바이러스의 균주들 또는 소정의 시간에 다른 지배적으로 순환하는 균주들로부터의 캡시드 단백질들을 함유한다.
조성물 내에서 단가 또는 다가 VLP의 조합은 각각의 VLP 형태의 면역원성을 차단하지 않은 것이 바람직하다. 특히 본 발명의 조합에서 노로바이러스 VLP 사이에 간섭이 없는 것이 바람직하며, 본 발명의 결합된 VLP 조성물은 백신에서 나타낸 각 노로바이러스 유전자형에 의해 감염에 대해 면역성을 유발할 수 있다. 적합하게는 조합에서 소정의 VLP 형태에 대한 면역 반응은 개별적으로 측정될 때 동일한 VLP 형태의 면역 반응의 적어도 50%, 바람직하게는 100% 또는 실질적으로 100%이다. 면역 반응은 실시예들에서 기술된 대로 항체 반응에 의해 적절하게 측정될 수 있다.
본 발명에 사용된 대로, "유전자군 I 노로바이러스 VLP"는 하나 이상의 유전자군 I 노로바이러스 균주로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함하는 단가 또는 다가 VLP를 의미한다. 일부 실시태양에서, 유전자군 I 노로바이러스 VLP는 유전자군 I 노로바이러스(예를 들어, 놀워크 바이러스)로부터의 전장 캡시드 단백질을 포함한다. 다른 실시태양에서, 유전자군 I 노로바이러스 VLP는 다양한 유전자군 I 균주로부터 유래된 일치 캡시드 단백질을 포함한다. 일치 캡시드 서열이 유래된 유전자군 I 균주는 동일한 유전자형 또는 유전자 클러스터 내일 수 있거나 다른 유전자형 또는 유전자 클러스터로부터일 수 있다. 유사하게, 본 발명에 사용된 대로, "유전자군 II 노로바이러스 VLP"는 하나 이상의 유전자군 II 노로바이러스 균주로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함하는 단가 또는 다가 VLP를 의미한다. 일부 실시태양에서, 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 유전자군 II 노로바이러스(예를 들어, 라우렌 또는 미네르바 바이러스)로부터의 전장 캡시드 단백질을 포함한다. 다른 실시태양에서, 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 다양한 유전자군 II 균주로부터 유래된 일치 캡시드 단백질을 포함한다. 일치 캡시드 서열이 유래된 유전자군 II 균주는 동일한 유전자형 또는 유전자 클러스터 내일 수 있거나 다른 유전자형 또는 유전자 클러스터로부터일 수 있다. 한 실시태양에서, 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 유전자군 II, 유전자형 4(GII.4) 노로바이러스의 캡시드 일치 서열을 포함한다. 따라서, 일부 실시태양에서, 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 SEQ ID NO: 1의 캡시드 서열을 포함한다.
다가 VLP는 개별 캡시드 단백질의 개별 발현에 의해 생산될 수 있고 조합에 의해 VLP를 형성한다. 선택적으로 여러 캡시드 단백질들은 하나 이상의 DNA 구조물로부터 동일한 세포 내에 발현될 수 있다. 예를 들어, 여러 DNA 구조물들은 숙주 세포들 속으로 형질변환 또는 형질감염될 수 있고, 각 벡터는 다른 캡시드 단백질을 암호화한다. 선택적으로 공유된 프로모터 또는 다가 개별 프로모터에 의해 제어될 수 있는 여러 캡시드 유전자를 가진 단일 벡터가 사용될 수 있다. 적절한 경우, IRES 요소들은 벡터 속에 혼합될 수 있다. 이런 발현 전략들을 사용하여, 공동 발현된 캡시드 단백질들은 뒤이은 VLP 형성을 위해 공동 정제될 수 있거나 자연적으로 다가 VLP를 형성할 수 있고 이후 정제될 수 있다.
다가 VLP 생산을 위한 바람직한 방법은 다른 노로바이러스 유전자형으로부터 VLP 캡시드 단백질 또는 VP1 단백질과 같은 유도체를 제조하는 단계, 단백질들을 혼합하는 단계 및 단백질을 결합하여 다가 VLP를 생산하는 단계를 포함한다. VP1 단백질들은 미정제 추출물의 형태일 수 있고, 혼합 이전에 부분적으로 정제되거나 정제될 수 있다. 다른 유전자군의 결합된 단가 VLP는 분해될 수 있고, 함께 혼합되어 다가 VLP 속에 재결합될 수 있다. 바람직하게는, 단백질 또는 VLP는 결합하기 전에 적어도 부분적으로 정제된다. 선택적으로, 다가 VLP의 추가 정제는 결합 후 수행될 수 있다.
적합하게는 본 발명의 VLP는 VLP의 분해 및 재결합에 의해 제조되어, 균질 및 순수 VLP를 제공한다. 한 실시예에서 다가 VLP는 둘 이상의 VLP의 분해, 뒤이어 재결합하기 이전에 임의의 적절한 시점에서 분해된 VLP의 조합에 의해 제조될 수 있다. 이런 방법은, 예를 들어, 일부 효모 균주에서 발생하는 것과 같이, VLP가 발현된 VP1 단백질로부터 자연적으로 형성될 때 적합하다. VP1 단백질의 발현이 자연적인 VLP 형성으로 유도되지 않는 경우, VP1 단백질 또는 캡소머의 제제들은 VLP 속에 모이기 전에 결합될 수 있다.
다가 VLP가 사용되는 경우, 바람직하게는 VLP의 성분들은 이들이 최종 혼합된 VLP에 있는 것이 바람직한 비율로 혼합된다. 예를 들어, 놀워크 및 휴스톤 바이러스(또는 다른 노로바이러스 균주)로부터의 부분적으로 정제된 VP1 단백질의 동일한 양의 혼합물은 다가 VLP에 대략 동일한 양의 각 단백질을 제공한다.
다가 VLP를 포함하는 조성물들은 본 발명에 참조로 포함된 WO 98/44944, WO0045841의 용액들과 같이 당업계에 공지된 용액들에 의해 안정화될 수 있다.
본 발명의 조성물들은 VP1 및 VP2 단백질 또는 유도체 이외에 다른 단백질 또는 단백질 단편을 포함할 수 있다. 다른 단백질 또는 펩타이드는 본 발명의 조성물과 공동 투여될 수 있다. 선택적으로 조성물은 비-노로바이러스 항원으로 제제화될 수 있거나 공동 투여될 수 있다. 이런 항원들은 다른 질환들에 대한 보호를 제공하는 것이 적절하다.
VP1 단백질 또는 기능성 단백질 유도체는 VLP를 형성할 수 있고, VLP 형성은 전자현미경 및 동적 레이저광 산란과 같은 표준 기술들로 분석될 수 있다.
본 발명의 항원 분자들은 유기체들로부터의 분리 및 정제에 의해 제조되며 여기서 항원 분자들은 자연적으로 발생하거나 재조합 기술들에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 비록 대장균 또는 S. cerevisiae , S. pombe , Pichia pastori와 같은 효모 세포들 또는 다른 피키아 발현 시스템, CHO 또는 HEK 시스템과 같은 포유류 세포 발현과 같은 임의의 적절한 세포들이 사용될 수 있지만, 노로바이러스 VLP 항원들은 Sf9 또는 H5 세포들과 같은 곤충 세포들로 제조된다. 재조합 방법 또는 합성에 의해 제조될 때, 펩타이드를 구성하는 아미노산의 하나 이상의 삽입, 결실, 역위 또는 치환이 이루어질 수 있다. 상기 항원들의 각각은 실질적으로 순수한 상태로 사용되는 것이 바람직하다.
곤충 세포 배양액에 노로바이러스 VLP의 생산 방법은 전문이 참조로 포함된 미국특허 제 6,942,865호에 이미 개시되어 있다. 간단히, 바이러스 캡시드 유전자(OFR2) 및 중요하지 않은 구조 유전자(ORF3)를 함유하는 게놈의 3' 말단으로부터의 cDNA가 복제되었다. 바이러스 캡시드 유전자들을 운반하는 재조합 바큘로바이러스들은 복제된 cDNAs로부터 제조되었다. 노로바이러스 VLP는 Sf9 또는 H5 곤충 세포 배양액에서 생산되었다.
일부 실시태양에서, 백신 조성물은 노로바이러스 항원과 조합으로 하나 이상의 항원보강제를 포함한다. 대부분의 항원보강제는 빠른 이화작용으로부터 항원을 보호하도록 설계된 물질, 예를 들어, 수산화알루미늄 또는 미네랄 오일 및 단백질로부터 유도된 백일해(Bordatella pertussis) 또는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)과 같은 면역반응의 자극제를 함유한다. 적절한 항원보강제들은 구입할 수 있고, 예를 들어, 프레운드 불완전 항원보강제 및 완전 항원보강제(Pifco Laboratories, Detroit, Mich.); 머크 항원보강제 65(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ.); 수산화알루미늄 겔(알룸)과 같은 알루미늄 염 또는 인산알루미늄; 칼슘, 철 또는 아연염; 아실화 티로신의 불용성 현탁액; 아실화 당; 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도된 폴리사카라이드; 폴리포스파젠; 생분해성 미세구; 및 퀼 A이다.
또한 적절한 항원보강제는 톨-라이크 리셉터(TLR) 효현제, 특히, 톨-라이크 리셉터 타입 4(TLR-4) 효현제(예를 들어, 모노포스포릴 지질 A(MPL), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체), 알루미늄 염, 사이토카인, 사포닌, 무라밀 다이펩타이드(MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람-음성 박테리아의 리포폴리사카라이드(LPS), 폴리포스파젠, 에멀젼, 비로솜, 코크리트, 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG) 미세입자, 폴록사머 입자, 미세입자, 리포솜, 유중수 에멀젼, MF59 및 스쿠알렌을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 항원보강제는 박테리아로 유도되지 않은 엑소톡신이다. 바람직한 항원보강제는 3DMPL 또는 QS21과 같은 Th1 형태 반응을 자극하는 것들이다.
살모넬라로부터의 지질 A의 비독성 유도체인 모노포스포릴 지질 A(MPL)는 백신 항원보강제로 개발된 강력한 TLR-4 효현제이다(Evans et al. 2003). 임상전 설치류 연구에서, 비강 MPL은 전신, 체액 반응뿐만 아니라 분비 반응을 향상시키는 것으로 나타났다(Baldridge et al. 2000; Yang et al. 2002). 120,000 이상의 환자들의 임상 연구에서 백신 항원보강제로서 안정하고 효과적인 것으로 증명되었다(Baldrick et al, 2002; 2004). MPL은 TLR-4 수용체를 통해 선천성 면역성의 유도를 자극하고 따라서 그람 음성 및 그람 양성 박테리아, 바이러스, 및 기생충을 포함하는 매우 넓은 범위의 감염성 병원균에 대해 비특이적 면역 반응을 일으킬 수 있다(Baldrick et al. 2004; Persing et al. 2002). 백신 제제에 MPL을 포함하면 선천성 반응을 빠르게 유도하여, 면역성 검사로부터 비특이적 면역반응을 유발하는 반면 백신의 항원 성분들에 의해 발생한 특이적 반응을 향상시킨다.
한 실시태양에서, 본 발명은 후천성 및 선천성 면역성의 인핸서로서 모노포스포릴 지질 A(MPL) 또는 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)를 포함하는 조성물을 제공한다. 화학적으로 3D-MPL은 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6개 아실화 사슬의 혼합물이다. 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 형태는 유럽특허 0 689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)에 개시되며, 참조로 본 발명에 포함된다. 다른 실시예에서, 본 발명은 BioMira's PET 지질 A 또는 TLR-4 효현제와 같이 작용하도록 설계된 합성 유도체와 같은 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 실시태양에서, 백신 조성물은 2개의 항원보강제를 포함한다. 항원보강제들의 조합은 상기한 것들로부터 선택될 수 있다. 한 특정 실시태양에서, 2개의 항원보강제는 MPL 및 수산화알루미늄(예를 들어, 명반)이다. 다른 특정 실시태양에서, 2개의 항원보강제는 MPL 및 오일이다.
용어 "유효량의 항원보강제"는 당업자가 잘 이해할 것이고, 투여된 항원에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 하나 이상의 항원보강제의 양, 즉, 비강 세척에서 IgA 수준, 혈청 IgG 또는 IgM 수준 또는 B 및 T-세포 증식의 면에서 측정된 대로, 투여된 항원 조성물의 면역 반응을 증가시키는 양을 포함한다. 면역글로불린 수준의 적절하게 효과적인 증가는 임의의 항원보강제 없는 동일한 항원 조성물과 비교해서 5%이상, 바람직하게는 25%이상 및 특히 50%이상을 포함한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 비경구 투여용으로 제제화된 백신 조성물을 제공하며, 조성물은 수산화알루미늄 및 버퍼와 조합으로 적어도 두 종류의 노로바이러스 VLP를 포함한다. 버퍼는 L-히스티딘, 이미다졸, 숙신산, 트리스, 시트르산, 비스-트리스, 파이페스, 메스, 헤페스, 글리신 아마이드 및 트리신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 한 실시태양에서, 버퍼는 L-히스티딘 또는 이미다졸이다. 바람직하게는, 버퍼는 약 15mM 내지 약 50mM, 더욱 바람직하게는 약 18mM 내지 약 40mM 또는 가장 바람직하게는 약 20mM 내지 약 25mM의 농도로 존재한다. 일부 실시태양에서, 항원 또는 백신 조성물의 pH는 약 6.0 내지 약 7.0 또는 약 6.2 내지 약 6.8 또는 약 6.5이다. 백신 조성물은 수성 제제일 수 있다. 일부 실시태양에서, 백신 조성물은 동결건조 분말이며 수성 제제로 재구성된다.
특정 실시태양에서, 백신 조성물은 둘 이상의 종류의 노로바이러스 VLP, 수산화알루미늄 및 버퍼 이외에 적어도 하나의 항원보강제를 더 포함한다. 예를 들어, 항원보강제는 MPL, 플라겔린, CpG 올리고, 합성 지질 A 또는 지질 A 모방체 또는 유사체와 같은 톨-라이크 리셉터 효현제일 수 있다. 한 특정 실시태양에서, 항원보강제는 MPL이다.
본 발명의 백신 조성물에 포함된 노로바이러스 VLP는 본 발명에 기술된 VLP의 임의의 것일 수 있다. 한 실시태양에서, 두 종류의 노로바이러스 VLP는 다른 유전자군(예를 들어, 유전자군 I 및 유전자군 II)으로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 예를 들어, 한 종류의 노로바이러스 VLP는 유전자군 I 노로바이러스로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함하여 다른 종류의 노로바이러스 VLP는 유전자군 II 노로바이러스로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함한다. 한 실시태양에서, 한 종류의 노로바이러스 VLP는 놀워크 바이러스로부터의 캡시드 단백질을 포함하며 다른 종류는 노로바이러스 VLP는 유전자군 II, 유전자형 4 노로바이러스(예를 들어, SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 캡시드 단백질)로부터 유래된 일치 캡시드 단백질을 포함한다. 백신 조성물은 약 5㎍ 내지 약 200㎍의 노로바이러스 VLP, 더욱 바람직하게는 약 15㎍ 내지 약 50㎍의 노로바이러스 VLP를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 한 종류의 노로바이러스 VLP의 투약량은 다른 종류의 노로바이러스 VLP의 투약량과 다르다. 예를 들어, 특정 실시태양에서, 백신 조성물은 약 5㎍ 내지 약 15㎍의 유전자군 I VLP 및 약 15㎍ 내지 약 50㎍의 유전자군 II VLP를 포함한다. 다른 실시태양에서, 백신 조성물은 약 15㎍ 내지 약 50㎍의 유전자군 I VLP 및 약 50㎍ 내지 약 150㎍의 유전자군 II VLP를 포함한다.
일부 실시태양에서, 백신 조성물은 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 황산암모늄 및 시트르산나트륨을 포함하나 이에 제한되지 않는 약학적으로 허용가능한 염을 더 포함한다. 한 실시태양에서, 약학적으로 허용가능한 염은 염화나트륨이다. 약학적으로 허용가능한 염의 농도는 약 10mM 내지 약 200mM일 수 있으며, 바람직한 농도는 약 100mM 내지 약 150mM의 범위이다. 바람직하게는 본 발명의 백신 조성물은 2mM 미만의 유리 인산염을 포함한다. 일부 실시태양에서, 백신 조성물은 1mM 미만의 유리 인산염을 포함한다. 백신 조성물은 또한 당(예를 들어, 수크로오스, 트레할로스, 만니톨)과 같은 약학적으로 허용가능한 부형제 및 계면활성제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물들은 백신 또는 항원 제제로서 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 본 발명에서 사용된 "백신"이란 용어는 척추동물에게 투여될 수 있는 형태이고 노로바이러스 감염 또는 노로바이러스 유도 질병을 예방 및/또는 완화 및/또는 노로바이러스 감염 또는 질병의 적어도 하나의 증상을 감소하는 면역원성을 유도하는 충분한 보호 면역 반응을 유도하는 상기 본 발명의 노로바이러스 VLPs 또는 다른 노로바이러스 항원을 포함하는 제제를 의미한다.
본 발명에서 사용된 "항원 제제" 또는 "항원 조성물"이란 용어는 척추동물, 예를 들어, 포유류에게 투여될 때, 면역반응을 유도할 제제를 의미한다. 본 발명에서 사용된 "면역반응"이란 용어는 체액 면역반응 및 세포-매개 면역반응 모두를 의미한다. 체액 면역반응은, 예를 들어, 감염성 물질을 중성화하고, 감염성 물질이 세포에 들어가는 것을 막고, 상기 감염성 물질의 복제를 막고 및/또는 숙주 세포가 감염되고 파괴되는 것을 보호하는 B 림프구에 의한 항체들의 생산의 자극을 포함한다. 세포-매개 면역반응은 감염을 예방하거나 완화하거나 이의 적어도 하나의 증상을 완화시키는 척추동물(예를 들어, 인간)에 의해 나타나는 감염성 물질에 대한 T-림프구 및/또는 매크로파아지와 같은 다른 세포에 의해 매개되는 면역반응을 의미한다. 특히, "보호 면역성" 또는 "보호면역반응"은 감염을 예방 또는 완화하거나 감염의 적어도 하나의 증상을 완화시키는 척추동물(예를 들어, 인간)에 의해 나타나는 감염 물질에 대한 면역성 또는 면역반응을 유도하는 것을 의미한다. 구체적으로, 백신의 투여에 의한 보호면역반응의 유도는 위장염의 하나 이상의 증상의 존재를 제거 또는 완화 또는 이런 증상들의 지속 또는 심각성의 완화에 의해 명백하다. 노로바이러스에 의한 위장염의 임상적 증상들은 구역질, 설사, 묽은 변, 구토, 열 및 전신권태를 포함한다. 질환 증상들을 완화 또는 제거하는 보호면역반응은 사람들에서 노로바이러스 발생의 속도를 줄이거나 멈추게 할 것이다. 백신 제제는 일반적으로 백신 설계에서 개시된다(("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York). 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 경구, 위장관 및 호흡기(예를 들어, 코) 점막의 하나 이상에 전달하기 위해 제제화될 수 있다. 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 비경구 주사(예를 들어, 정맥, 피하, 피내 또는 근내 주사)와 같은 주사에 의한 전달용으로 제제화될 수 있다.
조성물이 호흡기(예를 들어, 코) 점막에 전달하기 위한 것인 경우, 통상적으로 에어로졸 또는 비액과 같은 투여용 수용액 또는 선택적으로, 비강 내에서 빠른 침적을 위한 건조 분말로 제제화된다.
비액으로 투여하기 위한 조성물은 방부제, 점도 조절제, 긴장 조절제, 완충제 등과 같이 이런 조성물에 주로 포함되는 형태의 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 점도 조절제는 미세결정 셀룰로오스, 키토산, 전분, 폴리사카라이드 등일 수 있다. 건조 분말로 투여하기 위한 조성물은 점막 접착제, 증량제 및 적절한 분말 흐름 및 크기 특성을 전달하기 위한 물질과 같이 이런 조성물에 주로 포함되는 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 증량제 및 분말 흐름 및 크기 물질은 만니톨, 수크로오스, 트레할로스 및 자일리톨을 포함할 수 있다.
조성물이 정맥(i.v.), 피하(s.c.), 피내 또는 근내(i.m.) 주사와 같은 비경구 주사용인 경우, 통상적으로 적어도 한 종류의 노로바이러스 VLP 및 선택적으로 적어도 하나의 항원보강제로 구성된 액체 현탁액(즉, 수성 제제)으로 제제화된다. 한 실시태양에서, 항원보강제는 MPL일 수 있다. 다른 실시태양에서, 비경구 투여용으로 제제화된 액체 백신은 하나 이상의 항원보강제를 가질 수 있다. 한 바람직한 실시태양에서, 비경구적으로 제제화된(예를 들어, i.m., i.v., 또는 s.c.-제제화) 액체 백신은 항원보강제로서 수산화알루미늄(예를 들어, 명반) 및 모노포스포필 지질 A(MPL)와 노로바이러스 유전자군 I 및/또는 유전자군 II VLP를 포함한다. 한 실시태양에서, 비경구 투여용 액체 제제는 본 발명에 기술된 하나 이상의 종류의 노로바이러스 VLP와 같은 노로바이러스 유전자군 항원(들), MPL, 수산화알루미늄 및 버퍼를 포함한다. 다른 실시태양에서, 비경구 투여용 액체 제제는 노로바이러스 유전자군 항원(들), MPL, 오일 및 버퍼를 포함한다. 특정 실시태양에서, 비경구 백신 제제에서 버퍼는 L-히스티딘 또는 이미다졸이다. 액체 백신의 비경구 투여는 당업계에 주지되어 있는 것과 같이 바늘 및 주사기에 의할 수 있다.
특정 실시태양에서, 인간의 노로바이러스에 대항하는 보호 면역반응을 유도하기 위한 본 발명의 백신 조성물은 150㎍ 이하의 투약량으로 유전자군 I 및/또는 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 백신 조성물은 150㎍ 이하, 100㎍ 이하, 50㎍ 이하, 25㎍ 이하, 15㎍ 이하 또는 10㎍ 이하의 유전자군 I 노로바이러스 VLP를 포함한다. 다른 실시태양에서, 백신 조성물은 150㎍ 이하, 100㎍ 이하, 50㎍ 이하, 25㎍ 이하, 15㎍ 이하 또는 10㎍ 이하의 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함한다. 특정 실시태양에서, 백신 조성물은 150㎍ 이하의 유전자군 I 및 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함한다. 이런 실시태양에서, 유전자군 I 노로바이러스 VLP 및 유전자군 II VLP의 투약량은 동일하거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 백신 조성물은 50㎍ 이하의 유전자군 I 노로바이러스 VLP 및 150㎍ 이하의 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함한다. 다른 실시태양에서, 백신 조성물은 25㎍ 이하의 유전자군 I 노로바이러스 VLP 및 50㎍ 이하의 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함한다. 다른 실시태양에서, 백신 조성물은 15㎍ 이하의 유전자군 I 노로바이러스 VLP 및 50㎍ 이하의 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 백신 조성물은 25㎍ 이하의 유전자군 I 노로바이러스 VLP 및 150㎍ 이하의 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함한다.
유전자군 I 및 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 본 발명에 기술된 노로바이러스 균주의 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 한 실시태양에서, 유전자군 I 노로바이러스 VLP는 유전자군 I, 유전자형 1(GI.1) VLP이다(즉, GI.1 노로바이러스로부터의 캡시드 단백질을 포함한다). 다른 실시태양에서, 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 유전자군 II, 유전자형 4(GII.4) VLP이다. 또 다른 실시태양에서, 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 유전자군 II 노로바이러스의 일치 서열의 발현으로부터 생성된 VLP이다. 특정 실시태양에서, 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 SEQ ID NO: 1의 서열을 가진 캡시드 단백질을 포함한다.
상기한 백신 조성물은 동결건조되어 사용될 때까지 무수 상태로 저장되며, 사용시점에 희석제로 재구성된다. 선택적으로, 본 발명의 다른 성분들은 키트 또는 장치(어떤 성분 또는 모든 성분이 동결건조됨)에 개별적으로 저장될 수 있다. 성분들은 건조 제제를 위해 동결건조 형태로 존재하거나 액체 제제를 위해 재구성될 수 있고 사용하기 이전에 혼합되거나 환자에게 개별적으로 투여될 수 있다. 일부 실시태양에서, 백신 조성물은 액체 제제에 키트에 저장되며 바늘이 장착된 주사기와 같은 전달 장치가 동반될 수 있다. 다른 실시태양에서, 액체 백신 조성물은 키트에 전달 장치 내에 저장될 수 있다. 예를 들어, 키트는 본 발명에 기술된 백신 조성물의 액체 제제를 포함하는 미리 채워진 주사기, 자동주사기, 또는 주사 펜 장치를 포함할 수 있다.
항원 제제 및 백신의 동결건조는 당업계에 주지되어 있다. 통상적으로 액체 항원은 동결건조되는 동안 항원을 보호하고 원하는 특성들을 가진 분말을 생산하기 위해 물질들의 존재하에서 동결건조된다. 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 락토오스(10-200mg/mL의 초기 농도로 존재)와 같은 당들이 단백질 항원을 냉동 보호 및 동결 보호하고 원하는 특성들을 가진 동결건조 덩어리 또는 분말을 생산하기 위해 통상적으로 사용된다. 조성물을 동결건조하면 이론적으로 더 안정한 조성물을 생성한다.
각 백신 조성물에서 항원의 양은 현저한 부작용 없이 강한 면역반응을 유도하는 양으로 선택된다. 이런 양은 특이적 항원(들)이 사용되고, 투여 경로 및 사용된 항원보강제에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 본 발명의 내용에서 환자에게 투여된 투약량은 시간이 지남에 따라 환자에서 유익한 치료 반응을 일으키거나 항원-특이적 항체들의 생산을 유도하는데 충분해야 한다. 따라서, 조성물은 특이적 항원에 대한 면역반응을 유발 및/또는 질환 또는 감염으로부터의 증상 및/또는 합병증을 예방, 완화, 감소 또는 치료하는데 충분한 양으로 환자에게 투여되어 사람들에게 노로바이러스 발생의 속도를 줄이거나 멈추게 한다. 이것을 이루지는데 적합한 양은 "치료적으로 유효한 투약량"으로 정의된다.
본 발명의 백신 조성물은 비-점막 또는 점막 경로를 통해 투여될 수 있다. 이런 투여는 비경구 주사(예를 들어, 정맥, 피하 및 근내) 또는 볼/설하, 직장, 경구, 비강, 국부(경피 및 눈), 질, 폐, 동맥내, 복강, 안구내 또는 비강 경로 또는 특정 조직에 직접과 같은 다른 전통적인 직접 경로를 통한 인비보 투여를 포함한다. 투여의 다른 적절한 경로는 경피, 피하 및 좌약을 포함한다. 한 실시태양에서, 백신은 정맥, 피하, 피내 또는 근내와 같은 비경구 투여 경로로 투여된다. 투여는 패치, 바늘, 카테테르 또는 관련 장치(예를 들어, 미리 채워진 주사기 또는 자동주사기)를 사용하여, 1회 또는 수회 직접 투여함으로써 간단하게 이루어질 수 있다. 다른 비경구 제제는 미세주사 또는 피부 패치 전달 방법에 의해 피하 또는 내피로 전달될 수 있다.
본 발명은 대상에게 1회 이하 투약량의 본 발명의 백신 조성물을 비경구 투여하는 단계를 포함하여 대상의 노로바이러스 감염에 대한 보호 면역원성을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 백신은 본 발명에 기술된 유전자군 I 및/또는 유전자군 II 노로바이러스 VLP 및 선택적으로 적어도 하나의 항원보강제를 포함한다. 이런 실시태양에서, 1회 투약 백신 조성물은 조성물의 투여 이전에 인간의 역가와 비교하여 노로바이러스-특이적 혈청 항체 역가의 적어도 3배 증가를 유도한다. 일부 실시태양에서, 1회 투약 백신 조성물은 조성물의 투여 이전에 인간의 역가와 비교하여 노로바이러스-특이적 혈청 항체 역가의 적어도 6배 증가를 유도한다. 일부 실시태양에서, 1회 투약 백신 조성물은 자연 감염에서 생 노로바이러스에 대한 노출에 의해 유도된 항체 역가에 필적할만한 노로바이러스-특이적 혈청 항체 역가를 유도한다-즉, 조성물의 투여 이전에 인간의 역가와 비교하여 노로바이러스-특이적 혈청 항체 역가의 10배 초과 증가. 특정 실시태양에서, 1회 투약 백신 조성물은 조성물의 투여의 7일 내에 노로바이러스-특이적 혈청 항체에 증가를 유도한다. 바람직하게는, 1회 투약 백신 조성물은 정맥, 경피 또는 근내 투여 경로에 의해 투여된다. 특정 실시태양에서, 1회 투약 백신 조성물은 인간에게 근내로 투여된다.
본 발명에 기술된 대로, 일부 실시태양에서, 본 방법에 사용하기에 적합한 1회 투약 백신 조성물은 150㎍ 이하의 유전자군 I 및/또는 유전자군 II 노로바이러스를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 백신 조성물은 150㎍ 이하, 100㎍ 이하, 50㎍ 이하, 25㎍ 이하, 15㎍ 이하 또는 10㎍ 이하의 유전자군 I 노로바이러스 VLP를 포함한다. 다른 실시태양에서, 백신 조성물은 150㎍ 이하, 100㎍ 이하, 50㎍ 이하, 25㎍ 이하, 15㎍ 이하 또는 10㎍ 이하의 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함한다. 특정 실시태양에서, 백신 조성물은 50㎍ 이하의 유전자군 I 및 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함한다. 1회 투약 백신 조성물이 유전군 I 및 유전자군 II 노로바이러스 VLP 모두ㄹ르 포함하는 실시태양에서, 유전자군 I 노로바이러스 VLP 및 유전자군 II VLP의 투약량은 동일하거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 백신 조성물은 50㎍ 이하의 유전자군 I 노로바이러스 VLP 및 150㎍ 이하의 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함한다. 다른 실시태양에서, 백신 조성물은 25㎍ 이하의 유전자군 I 노로바이러스 VLP 및 50㎍ 이하의 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함한다. 다른 실시태양에서, 백신 조성물은 15㎍ 이하의 유전자군 I 노로바이러스 VLP 및 50㎍ 이하의 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 백신 조성물은 25㎍ 이하의 유전자군 I 노로바이러스 VLP 및 150㎍ 이하의 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함한다.
본 방법의 한 실시태양에서, 대상은 인간이며 백신은 노로바이러스 감염의 하나 이상의 증상으로부터 보호를 제공한다. 비록 다른 것들이 노로바이러스 항원에 의해 면역반응을 유도하는 방법을 보고하였지만(미국특허 출원공개공보 No. US2007/0207526 참조), 인간의 노로바이러스에 대한 보호 면역반응의 지표들은 아직 분명하게 확인되지 않았다(Herbst-Kralovetz et al. (2010) Expert Rev. Vaccines 9(3), 299-307). 백신의 유효성이 혈청 항체들과 관련이 있는 미국에서 현재 허가된 여러 백신들과 달리, 연구들은 놀워크 바이러스에 대한 혈청 항체들의 증가된 역가와 같은 면역반응의 마커들은 인간들에서 보호면역반응과 관련이 없다는 것을 보여주었다(Johnson et al. (1990) J. Infectious Diseases 161 : 18-21). 또한, 인간들에서 놀워크 면역성 검사를 실험하는 다른 연구는 놀워크 감염에 대한 민감함은 다인자성이었고 분비상태와 메모리 점막 면역반응과 같은 인자들을 포함하였다는 것을 나타내었다(Lindesmith et al (2003) Nature Medicine 9: 548-553).
노로바이러스는 인비트로 배양되지 않을 수 있기 때문에, 바이러스 중성화 분석법은 현재 이용할 수 없다. 중성화 분석법을 대체하는 기능성 분석법은 혈구응집억제(HAI) 분석법이다(실시예 1 참조). HAI는 노로바이러스 VLP는 적혈구 세포 항원들(예를 들어, 히스토-혈액 그룹 항원)과 결합하기 때문에 노로바이러스에 의한 항원-코팅 적혈구 세포들의 응집을 억제하는 노로바이러스 백신 유도 항체들의 능력을 측정한다. 이런 분석법에서, 노로바이러스 VLP의 고정된 양은 면역된 피험자들의 적혈구 세포와 혈청의 고정된 양과 혼합된다. 만일 혈청 샘플이 기능성 항체들을 포함하는 경우, 항체들은 적혈구 세포들과 결합하는 VLP와 경쟁할 것이어서, 적혈구 세포들의 응집을 억제한다. 본 발명에 사용된 대로, "기능성 항체들"은 노로바이러스 입자들과 적혈 세포 항원들 사이의 상호작용을 억제할 수 있는 항체들을 의미한다. 다시 말하면, 기능성 항체 역가는 히스토-혈액 그룹 항원(HBGA) 탄수화물 차단 항체 역가와 동일하다. 노로바이러스-특이적 기능성 항체들의 혈청 역가는 상기한 HAI 분석법에 의해 측정될 수 있다. 노로바이러스-특이적 기능성 항체들의 혈청 역가는 탄수화물 H 항원이 마이크로티터 웰에 결합되고 H 항원에 결합되는 노로바이러스 VLP가 혈청의 존재하에서 탐지되는 ELISA-기반 분석법을 사용하여 측정될 수 있다(실시예 1 및 Reeck et al . (2010) J Infect Dis, Vol. 202(8):1212-1218 참조). 노로바이러스-특이적 기능성 항체들의 수준의 증가는 보호 면역반응의 지표일 수 있다. 따라서, 한 실시태양에서, 백신의 투여는 백신을 투여받지 않은 인간의 혈청 역가와 비교된 노로바이러스-특이적 기능성 항체들의 혈청 역가의 증가를 포함하는 보호 면역원성을 유도한다. 보호 면역반응의 지표인 노로바이러스-특이적 기능성 항체들의 혈청 역가는 바람직하게는 HAI 분석법에 의해 측정된 대로 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200보다 큰 기하학적 평균 역가 또는 H 항원 결합 분석법에 의해 측정된 대로 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500보다 큰 차단 역가(BT)50(노로바이러스 VLP에 의한 H 항원 결합의 50% 억제) 기하학적 평균 역가이다. 한 실시태양에서, 노로바이러스-특이적 기능성 항체들의 혈청 역가는 HAI 분석법에 의해 측정된 대로 40보다 큰 기하학적 평균 역가이다. 한 실시태양에서, 노로바이러스-특이적 기능성 항체들의 혈청 역가는 HAI 분석법에 의해 측정된 대로 100보다 큰 기하학적 평균 역가이다. 다른 실시태양에서, 노로바이러스-특이적 기능성 항체들의 혈청 역가는 H 항원 결합 분석법에 의해 측정한 대로 100보다 큰 BT50 기하학적 평균 역가이다. 또 다른 실시태양에서, 노로바이러스-특이적 기능성 항체들의 혈청 역가는 H 항원 결합 분석법에 의해 측정한 대로 200보다 큰 BT50 기하학적 평균 역가이다.
다른 양태에서, 백신의 투여는 하나 이상의 종류의 노로바이러스 항원 및 선택적으로 적어도 하나의 유효 항원보강제를 포함하는 항원 또는 백신 조성물의 1회 이하 투약량을 대상에게 비경구(바람직하게는 근내) 투여함으로써 IgA 점막 면역반응 및 IgG 전신 면역반응을 포함하는 보호 면역원성을 유도한다. 본 발명자들은 본 발명에 기술된 노로바이러스 백신 조성물의 비경구 투여가 강한 IgG 반응 이외에 강력한 IgA 반응을 유도한다는 것을 놀랍게 발견하였다. 통상적으로, 강한 IgA 반응은 단지 백신이 점막 투여 경로를 통해 투여될 때 관찰된다.
특정 실시태양에서, 백신의 투여는 백신을 투여받지 않은 인간의 수준과 비교된 혈액에서 IgA 노로바이러스-특이적 항체 분비 세포들의 수준의 증가를 포함하는 보호 면역원성을 유도한다. 일부 실시태양에서, 백신의 투여는 백신을 투여받기 전 인간의 수준과 비교하여 혈액에서 IgA 노로바이러스-특이적 항체 분비 세포들의 수준의 증가를 포함하는 보호 면역원성을 유도한다. 한 실시태양에서, IgA 노로바이러스-특이적 항체 분비 세포들은 CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L+ 및 α4β7+이다. 이런 마커 프로파일을 가진 항체 분비 세포들은 장의 파이어 판(Peyer's patch)과 같은 말초 림프구 조직 및 장 점막과 같은 점막 림프구 조직 모두에 호밍(homing)할 수 있다. 한 실시태양에서, CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L+ 및 α4β7+ IgA 항체 분비 세포들의 수는 1 x 106 말초 혈액 단핵구 당 약 500, 약 700, 약 1,000, 약 1,500 또는 약 2,000 세포보다 크다. 다른 실시태양에서, IgA 노로바이러스-특이적 항체 분비 세포들은 CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L- 및 α4β7+이다. 이런 마커 프로파일을 가진 항체 분비 세포들은 점막 부위들에만 호밍을 나타내며 기억 B-세포 반응의 지표일 수 있다. 백신이 근내로 투여되는 일부 실시태양에서, CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L- 및 α4β7+ IgA 항체 분비 세포들의 수는 1 x 106 말초 혈액 단핵구 당 약 5,000, 약 6,500, 약 7,000, 약 10,000, 약 13,000, 약 15,000 또는 약 20,000 세포보다 크다.
유사한 발견들이 로타바이러스와 같은 다른 바이러스들에 대한 백신들로 관찰되었다. 로타바이러스 백신들의 경우, 혈청 항체들이 보호에 직접 관여하는지 또는 최근 감염을 단순히 나타내는지에 대한 논란이 있다(Jiang, 2002; Franco, 2006). 보호의 이런 상관관계를 정의하는 것은 특히 로타바이러스 또는 노로바이러스와 같은 설사 질환들의 내용에서 특히 어렵고, 보호를 다루는 임상전 연구들은 점막 면역성(장 IgA), 사이토카인 동화 및 세포 매개 면역성의 기여들과 여러 면에서 관련될 수 있다. 임상 개발 동안 이런 면역 반응들을 측정하는데 어려움 및 혈청 항체 측정값들 대한 상관관계의 부족은 이런 형태의 바이러스들에 대한 백신의 효과는 인간 임상 면역성 검사 실험을 통해서만 입증될 수 있다는 것을 요한다.
상기한 대로, 본 발명의 백신 제제들의 투여는 노로바이러스 감염의 적어도 하나의 증상을 예방 및/또는 치료한다. 노로바이러스 감염의 증상들은 당업계에 주지되어 있고 구역질, 구토, 설사 및 위 경련을 포함한다. 또한, 노로바이러스 감염된 환자는 낮은 등급 열, 두통, 한기, 근육통 및 피로를 가질 수 있다. 본 발명은 피험자에게 본 발명의 백신 제제를 투여함으로써 노로바이러스 감염을 앓고 있는 피험자의 보호면역반응을 유도하는 방법을 포함하며 노로바이러스 감염과 관련된 적어도 하나의 증상은 완화 및/또는 감소된다. 증상의 감소는, 예를 들어, 피험자에 의한 자가평가, 의사의 평가 또는 삶의 질 평가, 노로바이러스 감염 또는 다른 증상들의 느린 진행, 노로바이러스 증상의 심각성 감소를 포함하는 적절한 분석 또는 측정(예를 들어, 체온) 또는 적절한 분석(예를 들어, 항체 역가 및/또는 B-세포 또는 T-세포 활성화 분석)을 수행함으로써 주관적으로 또는 객관적으로 측정될 수 있다. 유효 반응은 장으로부터 나온 바이러스의 양을 나타내는 대변 샘플들에서 바이러스 양을 직접 측정(예를 들어, RT-PCR)함으로써 측정될 수 있다. 객관적 평가는 동물 및 인간 평가를 모두 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 노로바이러스 항원에 대한 항체들을 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상에게 상기한 대로 본 발명의 백신 조성물의 투여를 포함한다. 이런 항체들은 당업계에 통상적인 방법에 의해 분리되고 정제될 수 있다. 노로바이러스 항원들에 특이적인 분리된 항체들은 진단 면역학적 분석법의 개발에 사용될 수 있다. 이런 분석법은 임상 샘플에서 노로바이러스를 탐지하고 감염을 일으키는 특정 바이러스(예를 들어, 놀워크, 휴스턴, 스노우 마운틴 등)을 동정하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 분리된 항체들은 수동적 또는 단기간 면역원성을 제공하도록 노로바이러스 감염에 민감한 대상들에 투여될 수 있다.
본 발명은 이제 다음 실시예들에 기술된 특정 실시태양을 참조하여 더욱 상세하게 기술될 것이다. 실시예들은 단지 본 발명의 설명을 위한 것이며 어떠한 방식으로도 이의 범위를 제한하지 않는다.
실시예들
실시예 1. 인간에서 근내 노로바이러스 2가 바이러스 유사 입자(VLP) 백신의 투약량 증가, 안전성 및 면역원성 연구(LV03-104 연구), 그룹 A
이 실시예는 성인 대상에서 위약과 비교한 모노포스포릴 지질 A(MPL) 및 수산화알루미늄(AlOH)로 항원보강된 근내(IM) 노로바이러스 2가 VLP 백신의 4회 투약 수준의 안전성 및 면역원성의 무작위, 다부위, 투약량 증가 연구의 그룹 A를 기술한다. 18 내지 49세 대략 48명 대상을 그룹에 등록하였다. 대상들은 1.5인치(38mm) 바늘을 사용하여 28일 간격으로, 근내(IM) 주사로 2회 투약량의 백신 또는 위약을 투여받았다.
노로바이러스 2가 VLP 백신은 항원으로서 유전자군 I, 유전자형 1(GI.1) 및 유전자군 II, 유전자형 IV(GII.4) VLP 및 항원보강제로서 모노포스포릴 지질 A(MPL) 및 수산화알루미늄(AlOH), 버퍼(pH 6.3-6.7)로서 염화나트륨(NaCl) 및 L-히스티딘(L-His), 에탄올 및 주사용 물을 포함하였다. 근내 노로바이러스 2가 VLP 백신의 조성물은 표 1에 요약된다. GII.4 VLP는 3개의 GII.4 균주로부터 유래된 SEQ ID NO: 1의 캡시드 서열을 포함하였다.
0.5mL 당 4개 IM 노로바이러스 2가 VLP 백신 제제에 대한 최종 약품 조성물
제제 GI.1-VLP
(㎍)		 GII.4 VLP(㎍) MPL
(㎍)		 Al*
(mg)		 NaCl
(mg)		 L-His
(mg)		 에탄올
(mg)
10 ㎍ 투약 5 5 50 0.5 4.38 1.55 19.7
30 ㎍ 투약 15 15 50 0.5 4.38 1.55 19.7
100 ㎍ 투약 50 50 50 0.5 4.38 1.55 19.7
300 ㎍ 투약 150 150 50 0.5 4.38 1.55 19.7
* 수산화알루미늄
위약은 주사용 살균 규정 식염수이었다(0.9% NaCl 및 방부제 없음). 백신의 투약량 증가는 다음과 같이 실행하였다: 좋은 몸 상태를 적절하게 선별한 후, 그룹 A의 대상들을 ~12명 대상의 각 4 투약 그룹(투약 그룹 A1, A2, A3 및 A4)으로 연속적으로 등록하였다. 투약 그룹 A1, A2, A3 및 A4는 GI.1 및 GII.4 노로바이러스의 각각 5/5㎍, 15/15㎍, 50/50㎍ 및 150/150㎍의 2가 항원 투약을 나타낸다. 각 투약 그룹의 대상들을 무작위로 5:1로 백신 또는 위약을 투여받았다. 투약 그룹 A1의 대상들은 개개의 무작위 처리(10명 대상은 5/5㎍ 백신을 투여받았고 2명 대상은 위약을 투여받았다)를 받았다. 대상들에 기억의 도움(0-7일)으로 기록된 증상 및 7, 21, 28, 35 및 56일 방문으로부터의 중간 의료 기록의 검토에 의해 안전성 평가가 이어졌다. 안전성 데이터는 중앙 안전성 모니터(CSM)에 의해 검토하였다. 2차 투약 7일 후 안전성 데이터(연구 35일)를 투약 그룹 A1의 대상들로부터의 검토에 이용하였고 허용가능하다고 생각했고, 투약 그룹 A2의 대상들은 이들의 최초 투약량을 투여받기에 적당하였다. 동일한 규칙을 이후 투약 그룹에서의 투약에 적용하였다; 즉, 2차 투약 7일 후 안전성 데이터(연구 35일)를 투약 그룹 A1의 대상들로부터의 검토에 이용하였고, 다음 투약 그룹은 이들의 최초 투약량을 투여받기에 적당하였다.
그룹 A에 등록의 종료시에, 각 투약 그룹에서 대략 10명 대상이 백신을 투여받았고(전체 40 백신) 각 그룹에서 2명 대상은 식염수를 투여받았다(전체 대략 8명 식염수 대조군 수취인).
대상들은 IM 노로바이러스 2가 VLP 백신 또는 대조군의 각 투약 후 0 내지 7일 동안 통증, 민감함, 적열 및 붓기와 같은 4개의 국소 주사 부위 반응 및 일일 구강 온도, 두통, 피로, 근육통, 오한, 관절통 및 구역질, 구토, 설사, 복부 경련/통증의 위장관 증상을 포함하는 10개 전신 신호 또는 증상을 포함하는 유도된 증상들의 일일 기억 도움을 유지하였다. 주사 부위에서 적열 및 붓기를 측정하고 각 주사 후 7일 동안 매일 기록하였다.
중간 의료 기록들을 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14 및 393+14일에 각 다음 방문 및 265+14일에 다음 전화에서 얻었다; 대상들에게 중간 병, 의사 방문, 임의의 심각한 부작용(SAEs) 및 임의의 현저한 새로운 질환의 개시에 대해 질문하였다. 대상들은 각각 지속적인 적합성 및 안전성을 평가하기 위해 스크리닝시 및 21 및 35일(각 투약량 ~7일 후)에 평가된 WBC 감별 및 혈소판 계산 및 혈청 BUN, 크레아틴, 글루코스, AST 및 ALT에 의한 CBC를 가졌다.
대상들로부터의 혈액을 백신 접종 이전 0일 및 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14 및 393+14일에 수집하여 효소-결합 면역흡수 분석법(ELISA)에 의해 IM 노로바이러스 2가 VLP 백신에 대한 혈청 항체들(개별적으로 그리고 결합된 IgG, IgA 및 IgM)을 측정하였다. 또한 혈청 탄수화물 차단 활성 및 혈청 HAI 항체들을 측정하였다. 그룹 A에 있는 대상들의 경우, 항체 분비 세포들(ASCs), 호밍 마커(homing markers), 메모리 B 세포 및 세포 면역반응을 분석하였다.
다음 방법들을 사용하여 면역화된 개인 또는 위약을 투여받은 개인으로부터 수집한 혈액 샘플들을 분석하였다.
ELISA 에 의한 혈청 항체 측정
ELISA에 의한 노로바이러스에 대한 항체들의 측정을 암호화된 표본들을 스크린하기 위한 표적 항원들로서 정제된 재조합 노로바이러스 VLP(개별적으로 GI.1 및 GII.4)를 사용하여 모든 대상들에 대해 실행하였다. 간단하게, 탄산염 코팅 버퍼 pH 9.6에 있는 노로바이러스 VLP를 미세적정 판을 코팅하기 위해 사용하였다. 코팅된 판들을 세척하고, 차단하고 검사 혈청의 연속된 두 배 희석으로 배양하였고 뒤이어 세척하고 인간 전체 IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgM에 대해 특이적인 효소-접합 2차 항체 시약들로 배양하였다. 적절한 기질 용액들을 첨가하고, 색을 현상하고, 판들을 읽고 IgG, IgM 및 IgA 종점 역가를 각 항체 종류에 대한 기준 표준 곡선과 비교하여 측정하였다. 각 그룹에 대해 기하학적 평균 역가(GMTs), 기하학적 평균 배수 증가(GMFRs) 및 혈청반응율을 측정하였다. 혈청반응은 선-면역화 역가와 비교하여 항체 역가의 4배 증가로 정의하였다.
노로바이러스 탄수화물 히스토 -혈액-그룹 항원( HBGA ) 차단 활성
H 타입 1 또는 H 타입 3 합성 탄수화물에 대한 NV VLP 결합을 억제하는 혈청 항체들의 능력을 측정하는 차단 분석법을 이전에 기술한 대로 실행하였다(Reeck et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(8):1212-1218). 간단하게, 차단 분석법을 위한 NV VLP를 동일한 부피의 혈청으로 배양하고, 1:25의 출발 희석으로부터 연속적으로 2배 희석하였다. 뉴트라비딘 코팅, 96웰 마이크로티터 플레이터를 세척하고 2.5㎍/mL의 합성 다가 H 타입 1-PAA-비오틴 또는 다가 H 타입 3-PAA-비오틴으로 코팅하였다. 혈청-VLP 용액을 첨가하였다. 플레이트들을 세척하고 NV VLP에 특이적인 토끼 다클론 혈청을 첨가하고, 세척하고 뒤이어 호오스래디쉬 퍼옥시다아제 접합 염소 항-토끼 IgG로 배양하였다. 색을 테트라메틸벤지딘 퍼옥시다제 액체 기질로 현상하고 1M 인산으로 정지시켰다. 광학 밀도를 450에서 측정하였다. 양성 및 음성 대조군을 실행하였다. OD 리딩(블랭크의 삭제 후)이 양성 대조군의 50%인 역가로 정의된 50 퍼센트 차단 역가(BT50)를 측정하였다. 12.5의 값을 25 미만의 BT50을 가진 샘플들에 할당하였다. 각 그룹에 대한 기하학적 평균 역가(GMTs), 기하학적 평균 배수 증가(GMFRs) 및 혈청반응율을 측정하였다. 혈청반응은 선-면역화 역가와 비교하여 항체 역가의 4배 증가로 정의하였다. 차단 대조군 혈청 샘플을 내부 대조군으로 사용하였다. 차단의 특이성을 확인하는 분석법을 차단 분석법을 위한 동일한 프로토콜을 사용하여 실행하였고 다음의 제외를 가진다: 탄수화물로 코팅 후, 혈청을 VLP로 먼저 선 배양하지 않고 플레이트 상에 직접 배양하였다. 세척 후, VLP를 플레이트 상에 배양하고 차단 분석법을 위해 탐지하였다.
노로바이러스 혈구응집 항체 억제( HAI ) 분석법
백신-유도 항체들을 상기한 대로 노로바이러스 VLP에 의한 O-타입 인간 RBC의 혈구응집을 억제하는 능력에 대해 검사하였다(El Kamary et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(11): 1649-58). HAI 역가를 컴팩트 음성 RBC 패턴을 가진 혈구응집을 억제한 최고 희석의 역으로 계산하였고 GMT, GMFR 및 ≥4배 증가로 제공된다.
노로바이러스 GI.1 및 GII.4 VLP를 개별적으로 연속적으로 희석하고 96우레 V 바닥 플레이트에서 0.5% 인간 RBC 현탁액의 동일한 부피로 배양하였다. 4 HA 유닛에 해당하는 노로바이러스 VLP 항원의 양을 측정하였고 역 적정으로 확인하였다. 테스트 혈청을 30분 동안 56C에서 가열 불활성화하였고 새롭게 제조한 25% 고령토 현탁액으로 처리하였다. 혈청 억제제를 제거하기 위해서, 테스트 샘플을 RBC로 미리 흡착하였다. HAI 분석법을 다음과 같이 실행하였다: 선처리된 혈청(PBS pH 5.5에서 2배 희석)을 96웰 V 플레이트에 첨가하고 4 HA 유닛을 포함하는 동일한 부피의 노로바이러스 GI.1 및 GII.4 VLP 항원으로 배양하였다. 0.5% RBC의 현탁액을 4C에서 추가 90분 동안 배양된 각 웰과 플레이트에 첨가하였다. 혈청 없이 단지 PBS 또는 항원을 포함하는 웰들은 각각 음성 및 양성 대조군으로서 역할하였다. 각 그룹에 대한 기하학적 평균 역가(GMTs), 기하학적 평균 배수 증가(GMFRs) 및 혈청반응율을 측정하였다. 혈청반응은 선-면역화 역가와 비교하여 항체 역가의 4배 증가로 정의하였다.
항체 분비 세포 분석법
PBMC를 IM 노로바이러스 2가 VLP 백신 또는 위약의 투여 후 0, 7+3, 28+3 및 35+3일에 대략 60mL의 항-응고 혈액으로부터 분리하였다. 신선한 PBMC 분석법을 위한 대략 25mL의 혈액 및 PBMC의 동결방지용 35mL의 혈액을 얻었다. ASC 분석법은 노로바이러스 VLP에 대한 항체들을 분비하는 세포들을 탐지하였다(Tacket et al . (2000) J. Infect. Dis., Vol. 182:302-305; Tacket et al. (2003) Clin. Immunol., Vol. 108:241-247; El Kamary et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(11): 1649-58)). 새로운 PBMC를 대상들의 하부집단으로부터의 호밍 마커의 ASC 주기 및 측정에 대해 평가하였다. 그룹 A에 참여하는 대상들로부터의 동결방지 PBMC를 ASC 주기에 대해 평가하였다. 각 그룹에 대한 각각의 시점에서 106 PBMC 당 ASC의 반응 속도 및 평균 숫자를 기술하였다. 양성 반응은 모든 대상들(긴 거리에서)에 대한 평균 백신접종 이전 카운트 이상의 적어도 3배 표준 편차(SD)이고 유사한 분석법으로 측정한 대로 매질 자극 음성 대조군 웰(2 지점(spots) 더하기 3 SD의 평균에 해당하는 적어도 8 ASC 지점인 106 PBMC 당 백신접종 이후 ASC 카운트로 정의된다.
노로바이러스 바이러스-특이적 기억 B-세포의 측정
인비트로 항원 자극보다 선행하는 ELISpot 분석법을 사용하여 백신접종 0, 28, 56 및 180일에 기억 B 세포를 측정하기 위해 단지 그룹 A 대상에서 항 응고 혈액을 수집하였다(0, 28, 56 및 180일에 대략 25mL)(Crotty et al. (2004) J. Immunol. Methods, Vol. 286:111-122.; Li et al. (2006) J. Immunol. Methods, Vol. 313:110-118). 말초 혈액 단핵구 세포들(5x106 cells/mL, 24웰 플레이트에 1mL/well)을 4일 동안 노로바이러스 GI.1 및 GII.4 VLP 항원으로 개별적으로 배양하여 항원 특이적 기억 B 세포들의 클론 팽창 및 항체 분비 세포들로의 분화를 허용하였다. 대조군들은 항원의 부존재하에서 동일한 조건들에서 배양된 세포들 및/또는 관련이 없는 항원으로 배양된 세포들을 포함하였다. 자극 이후, 세포들을 세척하고, 계수하고 놀워크 VLP로 코팅된 ELISpot 플레이트에 옮겼다. 전체 Ig-분비 B 림프구 당 바이러스-특이적 기억 B 세포들의 주기를 측정하기 위해서, 팽창된 B 세포들을 또한 항 인간 IgG 및 항 인간 IgA 항체들로 코팅한 웰들에 첨가하였다.결합된 항체들을 HRP-표지된 항 인간 IgG 또는 항 인간 IgA로 이후에 적절한 기질로 나타내었다. IgA 및 IgG 서브클래스(IgA1, IgA2 및 IgG1-4)에 대한 접합체들은 뚜렷한 효과기 메커니즘 및 면역 프라이밍(priming)의 위치와 관련이 있을 수 있는 항원 특이적 서브클래스 반응들을 측정하는데 사용된다. 지점들을 ELISpot 리더로 계수하였다. 각 대상에 대한 팽창된 세포 집단들을 다른 것들 중에서 이들의 기억 B 세포 표현형, 즉. CD19+, CD27+, IgG+, IgM+, CD38+, IgD를 확인하도록 흐름 세포분석기로 조사하였다(Crotty et al. (2004) J. Immunol. Methods, Vol. 286:111-122.; Li et al. (2006) J. Immunol. Methods, Vol. 313:110-118).
세포 면역 반응
그룹 A에 있는 대상들로부터의 항 응고 혈액(0, 28, 56 및 180일에 대략 25mL)을 암호화된 표본들 및 노로바이러스 GI.1 및 GII.4 VLP 항원에 대한 CMI 반응들의 가능한 미래 평가를 위해 액체 질소에 분리되고 동결건조방지된 PBMC로 수집하였다. 실행되는 분석법은 확립된 기술들에 따른 다른 것들 중에서 인터페론(IFN)-γ 및 인터루킨(IL)-4 레벨을 측정함으로써 노로바이러스 GI.1 및 GII.4 VLP 항원들에 대한 PBMC 증식 및 사이토카인 반응을 포함한다(Samandari et al. (2000) J. Immunol., Vol. 164:2221-2232; Tacket et al. (2003) Clin. Immunol., Vol. 108:241-247). T 세포 반응들 또한 평가된다.
결과
안전성 평가는 각 투여 후 7일 동안 국소 및 전신 유도 증상들 및 28일 동안 미유도 증상들을 포함하였다. 심각한 부작용들은 12달 동안 관찰된다. Elispot를 통한 IgG 및 IgA 항체 분비 세포(ASC)에 대한 Pan-ELISA 항체들(결합된 IgG, IgA 및 IgM) 및 말초 혈액 단핵구 세포들(PBMCs)에 대한 각각의 백신접종 이전 및 이후 얻은 혈청에 의해 면역원성을 평가하였다.
모든 4개 투여 그룹을 그룹 A로 등록하였고 2회 투여 후 안전성 데이터는 전부 4개 투여 그룹(전체 40명 예방접종자)으로부터 이용가능하다. 40명 예방접종자 중에서, 통증 또는 민감함이 각 투여 후 보고된 가장 일반적인 국소 증상들인 반면, 붓기 또는 적열은 드물었다. 심각한 국소 증상들은 보고되지 않았다. 각 투여 후 두통, 편두통 또는 부조의 전신 증상들은 예방접종자의 절반 미만에 의해 보고되었다. 열을 나타낸 예방접종자는 없었다. 관련된 SAE도 보고되지 않았다.
도 1-3에 도시된 대로, 강한 기왕(anamnestic) Pan-ELISA 항체 반응들(결합된 IgG, IgA 및 IgM)을 최저 투여량의 1차 투약 7일 후 VLP 항원들에 대해 관찰하였다(5㎍ GI.1 + 5㎍ GII.4 VLP). 2차 투약는 1차 투약 후 반응들을 늘리지 않았다. 유사한 결과들이 개별적으로 측정한 항원 특이적 혈청 IgG 및 혈청 IgA 반응에 대해 관찰되었다(도 4-9). 투여량-의존 반응들이 두 항원들에 대한 항체 반응들에 대해 관찰되었다(도 1-9). 그러나, GI.1 VLP에 대한 최대 반응은 GII.4 VLP에 대한 최대 반응보다 더 낮은 투여량으로 얻을 수 있을 것으로 보인다(15㎍ vs. 50㎍). 흥미롭게도, 근내 투여된 노로바이러스 2가 백신의 1회 투약량은 놀랍게도, 20배 더 높은 VLP 투약량을 포함하는 2회 투여의 비강으로 투여된 단가 VLP 백신에 의해 유도된 역가보다 현저하게 더 큰 항원 특이적 항체 역가를 유도하였다(도 10; LV03-104 5㎍ 그룹 대 LV01-103 100㎍ 그룹). 또한, 낮은 투여량(5㎍), IM 2가 노로바이러스 백신은 천연 노로바이러스에 노출된 인간에서 유도된 것과 유사한 노로바이러스 특이적 항체 역가를 생산하였다(도 10).
강한 IgG 및 IgA Elispot 반응들이 두 VLP 항원에 대한 최저 투여량(5㎍)의 1차 투약 7일 후 관찰되었다(표 2). 특히, 항체 분비 세포(ASC) 반응들은 IgA vs. IgG로 편향되었고 ASC는 흐름 세포분석기에 의해 평가한 대로 점막 호밍(알파4/베타7) 및 케모카인(CCR10) 수용체 표현형을 나타내었다(도 11; 표 3). 표 3에 도시된 대로, 더 큰 수의 ASC가 이중 점막/말초 호밍 마커(베타7+, CD62L+)와 비교된 점막 호밍 마커(베타7+, CD62L-)를 나타낸다. 표 4는 VLP 항원들에 반응하는 106 말초 혈액 단핵구당 기억 B 세포들의 백분율을 도시한다. 더 큰 백분율의 항원 특이적 기억 B 세포들은 또한 이중 점막/말초 호밍 마커와 비교된 점막 호밍 마커를 나타낸다. 유사한 반응들이 또한 15㎍ 및 50㎍ 투여량을 투여받은 수취인들에 관찰되었다(표 2-4).
7일, PBMC 반응의 특징묘사. 항체 분비 세포들(ASCs)/백만 CD19+ 세포들의 추정
　 ASC /백만 CD19 + 세포들 - 7일 백신 반응 백분율 백신 특이적
노로바이러스 -특이적 B 세포 IgA
GI .1 		IgG
GI .1 		IgA
GII .4 		IgG
GII .4 		GI .1에 특이적 GII .4에 특이적 전체 순환 PBMC의 백분율
기하학적 평균 A1 5 ㎍ 투여량 (n=5) 30947 13807 10947 3945 4.48% 1.49% 5.96%
표준 편차 A1
5 ㎍ 투여량 		6674 9780 3651 2261
기하학적 평균 A2 15 ㎍ 투여량 (n=4) 25296 17004 7108 4336 4.23% 1.14% 5.37%
표준 편차 A2
15 ㎍ 투여량 		10846 18770 6055 5697
기하학적 평균 A3 50 ㎍ 투여량 (n=4) 36158 20572 14103 2549 5.67% 1.67% 7.34%
표준 편차 A3
50 ㎍ 투여량 		11470 418 7627 2230
기하학적 평균 A4 150 ㎍ 투여량 (n=4) 34183 9566 26213 11310 4.37% 3.75% 8.13%
표준 편차 A4
150 ㎍ 투여량 		32938 4466 89769 15226
위약 (n=2) 0 152 0 108 0.02% 0.01% 0.03%
흐름 세포분석기에 의해 백신 및 위약 수취인의 ASC 마커-7일
CD27 + & CD38+인 전체 CD19 +B 세포들의 % % 전체 CD27+, CD38+, CCR10+ Beta 7+, CD62L -의 % % 전체 CD27+, CD38+, CCR10+ Beta 7+, CD62L+의 % % 전체 ASC
CD27 +, CD38 +, CCR10+, Beta 7+ CD62L (+)&(-) 		백만 세포당 백신 특이적 전체 *
CD27 +, CD38 +, CCR10+, Beta 7+ CD62L (+)&(-) 		백신 특이적 백분율의 전체* 순환하는 PBMC 점막 호밍
기하학적 평균 A1 5 ㎍ 투여량 (n=5) 25.10% 6.86% 1.06% 2.78% 1656 0.17%
표준 편차 A1
5 ㎍ 투여량 		10.45 3.13 1.01
기하학적 평균 A2 15 ㎍ 투여량 (n=4) 12.99% 16.98% 2.43% 4.63% 1355 0.14%
표준 편차 A2
15 ㎍ 투여량 		9.13 1.56 0.23
기하학적 평균 A3 50 ㎍ 투여량 (n=4) 31.71% 26.43% 3.63% 12.01% 23915 2.39%
표준 편차 A3
50 ㎍ 투여량 		6.32 1.82 1.38
기하학적 평균 A4 150 ㎍ 투여량 (n=4) 33.46% 30.06% 5.68% 15.74% 31350 3.14%
표준 편차 A4
150 ㎍ 투여량 		9.86 2.97 1.70
위약 (n=2) 1.26% 22.00% 0.87% 1.20% 5 0.001%
* 대다수의 ASC는 노로바이러스 특이적인 것으로 생각한다.
백신 및 위약 수취인의 기억 B 세포 반응-7일
CD27 +, CD38+, CD138+인 전체 CD19+B 세포들의 % % 전체 CD27+, CD38+, CD138+, CCR10+ Beta 7+, CD62L -의 % % 전체 CD27+, CD38+, CD138+, CCR10+ Beta 7+, CD62L+의 % % 전체 기억
CD27 +, CD38+, CD138+, CCR10+, Beta 7+ CD62L (+)&(-) 		백만 세포당 백신 특이적 전체 *
CD27 +, CD38+, CCR10+, Beta 7+ CD62L (+)&(-) 		백신 특이적 백분율의 전체* 순환하는 PBMC 점막 호밍
기하학적 평균 A1 5 ㎍ 투여량 N/D N/D N/D N/D N/D N/D
기하학적 평균 A2 15 ㎍ 투여량 (n=4) 1.54% 11.58% 1.92% 0.21% 61 0.01%
표준 편차 A2
15 ㎍ 투여량 		1.54 3.94 0.94
기하학적 평균 A3 50 ㎍ 투여량 (n=4) 3.31% 16.10% 4.60% 0.68% 1364 0.14%
표준 편차 A3
50 ㎍ 투여량 		1.11 2.16 0.97
기하학적 평균 A4 150 ㎍ 투여량 (n=4) 1.56% 16.90% 8.10% 0.39% 778 0.08%
표준 편차 A4
150 ㎍ 투여량 		0.22 3.26 4.57
위약 (n=1) 0.10% 12.50% 0.00% 0.01% 0 0%
* 대다수의 ASC는 노로바이러스 특이적인 것으로 생각한다.
인비트로로 노로바이러스를 배양할 수 없기 때문에 이용가능한 직접 바이러스 중성화 분석법의 부존재하에서, 바이러스 중성화 분석법에 대한 대체물로 역할하는 기능성 분석법을 수행하여 예방접종자들의 기능성 항체들을 측정하였다.
상기한 탄수화물 H 항원 차단 활성 분석법을 사용하여, 백신 유도 혈청 항체들에 의해 매개된 H 항원에 결합하는 GI.1 VLP의 억제를 측정하였다. 데이터는 표 5에 기하학적 평균 배수 증가(GMFR) 및 혈청반응(4배 증가)로 제공되며 표 6에 기하학적 평균 역가(GMT)로 제공된다. 놀랍게도, 단지 백신 제제의 1회 근내 주사 후, 모든 투여 그룹에서 현저한 탄수화물 차단 활성이 관찰되었다; 사실상, 2회 투여량의 백신의 투여는 1회 투약 후 수준과 비교하여 차단 활성을 현저하게 증가시키지 않는다. 결합 활성의 억제는 1회 투약 후 56일까지 테스트 기간 내내 유지되었다.
탄수화물 차단 활성(HBGA BT50), 항-노로바이러스 GI.1 기하학적 평균 배수 증가(GMFR) 및 혈청반응(4배 증가)
연구일
1차 투약 후 7일 1차 투약 후 21일 1차 투약 후 28일
(2차 투약 전) 		2차 투약 후 7일
(1차 투약 후 35일) 		2차 투약 후 28일
(1차 투약 후 56일)
치료 그룹 N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI )
5/5 mcg VLP 백신 9 26.6 (8.3, 85.1) 88.9 (51.8, 99.7) 9 25.1 (8.9, 70.3) 88.9 (51.8, 99.7) 9 19.7 (8.2, 47.1) 100.0 (66.4, 100.0) 9 20 (7.7, 51.7) 88.9 (51.8, 99.7) 9 16.6 (5.7, 48.1) 77.8 (40.0, 97.2)
15/15 mcg VLP 백신 8 33.2 (13.6, 80.8) 100.0 (63.1, 100.0) 8 25.5 (10.5, 61.8) 100.0 (63.1, 100.0) 8 18.5 (8.4, 40.6) 100.0 (63.1, 100.0) 7 22.2 (8.8, 56) 100.0 (59.0, 100.0) 7 8.4 (2.4, 29.6) 57.1 (18.4, 90.1)
50/50 mcg VLP 백신 10 38.6 (18.3, 81.6) 100.0 (69.2, 100.0) 10 27.9 (13.4, 58) 100.0 (69.2, 100.0) 10 20.9 (10, 43.5) 100.0 (69.2, 100.0) 10 19 (9.9, 36.4) 100.0 (69.2, 100.0) 9 10.2 (4.6, 22.8) 77.8 (40.0, 97.2)
150/150 mcg VLP 백신 7 30.6 (16.3, 57.6) 100.0 (59.0, 100.0) 8 19.4 (13.1, 28.5) 100.0 (63.1, 100.0) 8 16.3 (11.7, 22.6) 100.0 (63.1, 100.0) 8 18.8 (12.8, 27.5) 100.0 (63.1, 100.0) 8 23.8 (17, 33.3) 100.0 (63.1, 100.0)
위약 8 0.9 (0.8, 1) 0.0 (0.0, 36.9) 8 0.8 (0.7, 1.1) 0.0 (0.0, 36.9) 8 0.8 (0.6, 1.1) 0.0 (0.0, 36.9) 8 0.8 (0.7, 1.1) 0.0 (0.0, 36.9) 8 0.6 (0.3, 1.2) 0.0 (0.0, 36.9)
결과들은 연구 생성물의 투여를 받은 모든 대상을 기초로 한다.
두 대상의 데이터 포인트는 가능한 표본의 혼합 때문에 배제된다; 이런 데이터 포인트들의 하나는 임의의 시점에 대해 이용가능한 배수 증가 데이터를 갖지 않는 대상을 초래하는 기준선 표본이다.
탄수화물 차단 활성(HBGA BT50), 항-노로바이러스 GI.1 기하학적 평균 역가(GMT)
연구일
1차 투약 전 1차 투약 후 7일 1차 투약 후 21일 1차 투약 후 28일
(2차 투약 전) 		2차 투약 후 7일
(1차 투약 후 35일) 		2차 28일
(1차 투약 후 56일)
치료 그룹 N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI )
5/5 mcg VLP 백신 9 28.9 (12.7, 65.9) 9 768.5 (344.1, 1716) 9 723.7 (398.1, 1316) 9 568 (321.8, 1003) 9 577.1 (351.2, 948.3) 9 478.3 (293.3, 780.1)
15/15 mcg VLP 백신 8 24.9 (12.7, 48.7) 8 826.1 (524.9, 1300) 8 634.3 (285.9, 1407) 8 459.8 (225.3, 938.6) 7 610.3 (354.6, 1050) 7 230.9 (105.2, 506.7)
50/50 mcg VLP 백신 10 17.3 (9.9, 30.3) 10 669.2 (329.1, 1361) 10 483.7 (258.7, 904.2) 10 362.4 (192.9, 680.7) 10 328.9 (191.9, 563.8) 9 184 (97.2, 348.3)
150/150 mcg VLP 백신 8 15.5 (11.1, 21.8) 7 435 (262.5, 720.8) 8 300.7 (173.9, 520) 8 252.7 (146.7, 435.2) 8 291.5 (171.5, 495.4) 8 369.7 (233.8, 584.6)
위약 8 29 (9.1, 92.8) 9 24.6 (9.8, 62.1) 9 22.5 (8.8, 57.3) 9 22.2 (8.9, 55.5) 8 24.6 (8.4, 72.6) 8 18.3 (10.1, 33.3)
결과들은 연구 생성물의 투여를 받은 모든 대상을 기초로 한다.
두 대상의 데이터 포인트는 가능한 표본의 혼합 때문에 배제된다.
유사하게, GII.4 VLP에 대항하는 혈청 항체들의 탄수화물 차단 활성을 측정하였다. 현저 반응을 GMFR 및 혈청반응(표 7)뿐만 아니라 GMT(표 8)에 의해 측정된 대로 모든 투여 그룹에서 관찰하였다. 상기한 GI.1 결합의 항체 매개 차단과 유사하게, GII.4 VLP 탄수화물 결합 활성의 강한 차단을 단지 1회 투여 후 탐지하였고 2차 투약는 차단 활성을 증가시키는 것으로 보이지 않았다.
탄수화물 차단 활성(HBGA BT50), 항-노로바이러스 GII.4 기하학적 평균 배수 증가(GMFR) 및 혈청반응(4배 증가)
연구일
1차 투약 후 7일 1차 투약 후 21일 1차 투약 후 28일(2차 투약 전) 2차 투약 후 7일
(1차 투약 후 35일) 		2차 투약 후 28일
(1차 투약 후 56일)
치료 그룹 N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI )
5/5 mcg VLP 백신 9 5 (1.6, 16.1) 33.3 (7.5, 70.1) 9 5.9 (1.7, 20.3) 55.6 (21.2, 86.3) 9 4.7 (1.4, 15.7) 44.4 (13.7, 78.8) 9 4.7 (1.6, 13.8) 44.4 (13.7, 78.8) 9 5 (1.6, 15.9) 55.6 (21.2, 86.3)
15/15 mcg VLP 백신 8 11 (2.7, 45.3) 62.5 (24.5, 91.5) 8 9.2 (3, 27.9) 62.5 (24.5, 91.5) 8 7.4 (2.5, 21.8) 62.5 (24.5, 91.5) 7 7 (2.1, 23) 57.1 (18.4, 90.1) 7 5.6 (2.3, 14) 57.1 (18.4, 90.1)
50/50 mcg VLP 백신 10 18.6 (4.9, 70.8) 70.0 (34.8, 93.3) 10 12.2 (3.8, 39.4) 70.0 (34.8, 93.3) 10 8.4 (2.9, 24.1) 70.0 (34.8, 93.3) 10 8.7 (2.9, 26.1) 70.0 (34.8, 93.3) 9 5.2 (2.2, 12) 66.7 (29.9, 92.5)
150/150 mcg VLP 백신 7 10.1 (2, 51.8) 57.1 (18.4, 90.1) 8 5.5 (1.9, 16.5) 50.0 (15.7, 84.3) 8 4.4 (1.6, 12.2) 50.0 (15.7, 84.3) 8 4.3 (1.7, 10.7) 37.5 (8.5, 75.5) 8 3.1 (1.3, 7.2) 25.0 (3.2, 65.1)
위약 8 1 (0.9, 1.1) 0.0 (0.0, 36.9) 8 1.1 (1, 1.3) 0.0 (0.0, 36.9) 8 1.3 (0.9, 2.1) 12.5 (0.3, 52.7) 8 1.8 (0.5, 6.7) 12.5 (0.3, 52.7) 8 2 (0.7, 6.1) 12.5 (0.3, 52.7)
결과들은 연구 생성물의 투여를 받은 모든 대상을 기초로 한다.
두 대상의 데이터 포인트는 가능한 표본의 혼합 때문에 배제된다; 이런 데이터 포인트들의 하나는 임의의 시점에 대해 이용가능한 배수 증가 데이터를 갖지 않는 대상을 초래하는 기준선 표본이다.
탄수화물 차단 활성(HBGA BT50), 항-노로바이러스 GII.4 기하학적 평균 역가(GMT)
연구일
1차 투약 전 1차 투약 후 7일 1차 투약 후 21일 1차 투약 후 28일
(2차 투약 전) 		2차 투약 후 7일
(1차 투약 후 35일) 		2차 투약 후 28일
(1차 투약 후 56일)
치료 그룹 N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI )
5/5 mcg VLP 백신 9 40.3 (18, 90) 9 202.1 (106.3, 384.3) 9 236.9 (133.4, 420.6) 9 189.7 (108.6, 331.3) 9 188.7 (118.7, 300.1) 9 201.6 (116.4, 349.5)
15/15 mcg VLP 백신 8 23.7 (12.8, 43.8) 8 260.1 (95.1, 711.1) 8 218.1 (104.2, 456.3) 8 175.4 (82.7, 372) 7 182.3 (89.1, 372.8) 7 146.3 (92.4, 231.5)
50/50 mcg VLP 백신 10 28.4 (13.1, 61.5) 10 527.2 (271.1, 1025) 10 345.2 (195.5, 609.6) 10 238.3 (139.4, 407.3) 10 246.5 (138.7, 438.2) 9 160.2 (107.4, 238.8)
150/150 mcg VLP 백신 8 63 (24.8, 160.4) 7 721.8 (344.6, 1512) 8 347.7 (186.1, 649.5) 8 277 (145.6, 527) 8 267.9 (158.7, 452.2) 8 193.5 (121.6, 308.2)
위약 8 24.1 (12.9, 45) 9 22.8 (12.6, 41.6) 9 24.9 (12.7, 48.7) 9 29.1 (15.1, 56.1) 8 44 (12.6, 154.2) 8 48.2 (16.7, 139.5)
결과들은 연구 생성물의 투여를 받은 모든 대상을 기초로 한다.
두 대상의 데이터 포인트는 가능한 표본의 혼합 때문에 배제된다.
혈구응집 억제 분석법(HAI)을 또한 사용하여 표적 노로바이러스 VLP 항원들에 대항하는 백신접종된 대상들로부터의 혈청 항체들의 반응을 테스트하였다. 탄수화물 H 항원 결합 연구와 유사하게, 단지 1회 투여의 VLP 백신이 GMFR(표 9), 4배 증가(표 9) 및 GMT(표 10)에 의해 측정된 대로, 모든 투여 그룹에서 혈구응집을 억제하는 항체들을 유도하였다. 비록 혈구응집 억제의 수준이 테스트 최종일 동안 유지되었지만(2차 투약 후 28일, 1차 투약 후 56일), 2차 투약의 VLP는 혈구응집의 백신 유도 항체 매개 억제를 증가시키는 것으로 보이지 않았다.
혈구응집 억제 분석법 항-노로바이러스 GI.1 기하학적 평균 배수 증가(GMFR) 및 혈청반응(4배 증가)
연구일
1차 투약 후 7일 1차 투약 후 21일 1차 투약 후 28일
(2차 투약 전) 		2차 투약 후 7일
(1차 투약 후 35일) 		2차 투약 후 28일
(1차 투약 후 56일)
치료 그룹 N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI )
5/5 mcg VLP 백신 9 5.4 (3, 9.8) 77.8 (40.0, 97.2) 9 7 (4.6, 10.7) 88.9 (51.8, 99.7) 9 6.1 (4.1, 9.3) 88.9 (51.8, 99.7) 9 6 (3.7, 9.5) 77.8 (40.0, 97.2) 9 6.3 (3.9, 10.3) 88.9 (51.8, 99.7)
15/15 mcg VLP 백신 8 8.9 (4.4, 18) 100.0 (63.1, 100.0) 8 9.5 (4, 22.5) 87.5 (47.3, 99.7) 8 7.1 (3.1, 16.1) 75.0 (34.9, 96.8) 7 8.5 (4.1, 17.7) 85.7 (42.1, 99.6) 7 8.1 (4.4, 15.2) 100.0 (59.0, 100.0)
50/50 mcg VLP 백신 10 22.4 (11.6, 43) 100.0 (69.2, 100.0) 10 16.7 (9.3, 29.8) 100.0 (69.2, 100.0) 10 13.9 (8.1, 24) 100.0 (69.2, 100.0) 10 14.5 (9.3, 22.7) 100.0 (69.2, 100.0) 9 11.8 (6.3, 21.9) 100.0 (66.4, 100.0)
150/150 mcg VLP 백신 7 12.6 (5.7, 28) 85.7 (42.1, 99.6) 8 11.1 (6.4, 19.3) 100.0 (63.1, 100.0) 8 8.4 (5, 14) 100.0 (63.1, 100.0) 8 8.4 (5, 14) 100.0 (63.1, 100.0) 8 7.3 (4.5, 11.9) 100.0 (63.1, 100.0)
위약 8 1 (0.8, 1.2) 0.0 (0.0, 36.9) 8 1 (0.9, 1.2) 0.0 (0.0, 36.9) 8 1 (0.9, 1.1) 0.0 (0.0, 36.9) 8 0.9 (0.7, 1.1) 0.0 (0.0, 36.9) 8 1 (0.8, 1.2) 0.0 (0.0, 36.9)
결과들은 연구 생성물의 투여를 받은 모든 대상을 기초로 한다.
두 대상의 데이터 포인트는 가능한 표본의 혼합 때문에 배제된다; 이런 데이터 포인트들의 하나는 임의의 시점에 대해 이용가능한 배수 증가 데이터를 갖지 않는 대상을 초래하는 기준선 표본이다.
혈구응집 억제 분석법 항-노로바이러스 GI.1 기하학적 평균 역가(GMT)
연구일
1차 투약 전 1차 투약 후 7일 1차 투약 후 21일 1차 투약 후 28일(2차 투약 전) 2차 투약 후 7일(1차 투약 후 35일) 2차 투약 후 28일 (1차 투약 후 56일)
치료 그룹 N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI )
5/5 mcg VLP 백신 9 26.4 (14.1, 49.4) 9 143.5 (53.6, 383.8) 9 185.3 (88.6, 387.6) 9 162.1 (83.3, 315.6) 9 157 (80.3, 307.1) 9 167.4 (88.4, 316.8)
15/15 mcg VLP 백신 8 11.9 (6.1, 23.4) 8 105.3 (56.1, 197.6) 8 113.1 (42.5, 301.3) 8 84.2 (31.1, 227.6) 7 103.3 (43.3, 246.6) 7 99.2 (46.9, 209.7)
50/50 mcg VLP 백신 10 7.2 (5.3, 9.6) 10 160 (79.4, 322.6) 10 119.2 (60.4, 235.1) 10 99.7 (51.8, 191.8) 10 103.8 (58.4, 184.5) 9 81.1 (38.8, 169.5)
150/150 mcg VLP 백신 8 9.2 (7.5, 11.3) 7 114.1 (50.9, 255.7) 8 101.6 (62, 166.4) 8 77.2 (51.8, 115) 8 77.2 (51.8, 115) 8 67.3 (44.7, 101.3)
위약 8 16.8 (10.1, 28.1) 9 16.6 (11.7, 23.7) 9 16.1 (10.7, 24.1) 9 16.6 (11, 25) 8 15.4 (10, 23.7) 8 16.2 (10.8, 24.4)
결과들은 연구 생성물의 투여를 받은 모든 대상을 기초로 한다.
두 대상의 데이터 포인트는 가능한 표본의 혼합 때문에 배제된다.
표적 VLP가 불일치 바이러스이었을 때 혈구응집의 억제가 또한 성취되었다. 백신 유도 혈청 항체들은 GMFR 및 혈청반응(표 11)뿐만 아니라 GMT(표 12)에 의해 측정된 대로, 휴스턴 바이러스 균주 VLP에 의해 혈구응집을 억제하였다. 이 경우에, 더 높은 VLP 백신 투여량은 특히 4배 증가 또는 GMT에 의해 측정된 대로 더 강한 반응을 제공하였다. GMFR 및 4배 증가는 표적 VLP가 2003 신시네티 바이러스 균주이었을 때, 1차 투약 후 7일에 측정된 대로 현저하게 증가되었다(표 13).
혈구응집 억제 분석법(휴스톤 바이러스 균주 VLP), 항-노로바이러스 GII.4 기하학적 평균 배수 증가(GMFR) 및 혈청반응(4배 증가)
연구일
1차 투약 후 7일 1차 투약 후 21일 1차 투약 후 28일
(2차 투약 전) 		2차 투약 후 7일
(1차 투약 후 35일) 		2차 투약 후 28 일(1차 투약 후 56일)
치료 그룹 N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI ) 		N GMFR
(95% CI ) 		4배 증가
(95% CI )
5/5 mcg VLP 백신 9 1.2 (1, 1.5) 0.0 (0.0, 33.6) 9 1.3 (0.9, 1.7) 0.0 (0.0, 33.6) 9 1.3 (0.9, 1.7) 0.0 (0.0, 33.6) 9 1.3 (1, 1.7) 0.0 (0.0, 33.6) 9 1.3 (1, 1.6) 0.0 (0.0, 33.6)
15/15 mcg VLP 백신 8 1.7 (0.9, 3) 12.5 (0.3, 52.7) 8 1.6 (1.1, 2.4) 12.5 (0.3, 52.7) 8 1.5 (1.1, 2.2) 0.0 (0.0, 36.9) 7 1.5 (1, 2.2) 0.0 (0.0, 41.0) 7 1.6 (1.1, 2.4) 0.0 (0.0, 41.0)
50/50 mcg VLP 백신 10 2 (0.9, 4.3) 10.0 (0.3, 44.5) 10 1.6 (0.8, 3.1) 10.0 (0.3, 44.5) 10 1.7 (0.9, 3.1) 10.0 (0.3, 44.5) 10 1.5 (0.9, 2.4) 10.0 (0.3, 44.5) 9 1.3 (0.8, 2) 11.1 (0.3, 48.2)
150/150 mcg VLP 백신 7 4.3 (1.5, 12.4) 57.1 (18.4, 90.1) 8 2.6 (1.2, 5.8) 50.0 (15.7, 84.3) 8 1.9 (1.1, 3.3) 12.5 (0.3, 52.7) 8 1.9 (1.1, 3.5) 12.5 (0.3, 52.7) 8 1.7 (1.1, 2.6) 12.5 (0.3, 52.7)
위약 8 1 (0.9, 1.1) 0.0 (0.0, 36.9) 8 1.1 (0.9, 1.3) 0.0 (0.0, 36.9) 8 1.1 (1, 1.2) 0.0 (0.0, 36.9) 8 1.2 (0.8, 1.9) 12.5 (0.3, 52.7) 8 1.1 (0.7, 1.8) 12.5 (0.3, 52.7)
결과들은 연구 생성물의 투여를 받은 모든 대상을 기초로 한다.
두 대상의 데이터 포인트는 가능한 표본의 혼합 때문에 배제된다; 이런 데이터 포인트들의 하나는 임의의 시점에 대해 이용가능한 배수 증가 데이터를 갖지 않는 대상을 초래하는 기준선 표본이다.
혈구응집 억제 분석법(휴스톤 바이러스 균주 VLP), 항-노로바이러스 GII.4 기하학적 평균 역가(GMT)
연구일
1차 투약 전 1차 투약 후 7일 1차 투약 후 21일 1차 투약 후 28일(2차 투약 전) 2차 투약 후 7일(1차 투약 후 35일) 2차 투약 후 28일 (1차 투약 후 56일)
치료 그룹 N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI ) 		N GMT
(95% CI )
5/5 mcg VLP 백신 9 143.5 (97.9, 210.3) 9 177.4 (122.7, 256.5) 9 180.8 (114.4, 285.6) 9 180.8 (114.4, 285.6) 9 189.1 (119.2, 299.9) 9 180.8 (122.7, 266.3)
15/15 mcg VLP 백신 8 129.8 (86.4, 194.9) 8 218.3 (129.2, 368.8) 8 207.5 (134.8, 319.3) 8 200.2 (132.8, 301.7) 7 169.5 (114.1, 252) 7 187.2 (119.1, 294.2)
50/50 mcg VLP 백신 10 161.9 (119.7, 219) 10 323.8 (156.5, 669.8) 10 252.5 (130.4, 489.2) 10 273.9 (150.9, 497.2) 10 242.5 (150.2, 391.5) 9 195.2 (125, 304.9)
150/150 mcg VLP 백신 8 210.6 (108.8, 407.5) 7 853.5 (297.4, 2449) 8 546.2 (237.6, 1255) 8 406.3 (201.5, 819.1) 8 406.3 (180.3, 915.4) 8 354.1 (184.6, 679.5)
위약 8 148.9 (73.8, 300.3) 9 150.1 (80.1, 281.1) 9 157 (77.9, 316.5) 9 167.4 (91.4, 306.4) 8 183.6 (95, 354.5) 8 162.4 (88.5, 297.9)
결과들은 연구 생성물의 투여를 받은 모든 대상을 기초로 한다.
두 대상의 데이터 포인트는 가능한 표본의 혼합 때문에 배제된다.
위약 vs 50/50㎍ VLP 백신에서 혈구응집의 억제
혈구응집억제 분석법(2003 신시네티 바이러스 균주 VLP), 항-노로바이러스 GII.4 기하학적 평균 배수(GMFR) 및 기하학적 혈청반응(4배 증가)
치료 그룹에 의한 결과 1차 투약 후 7일
치료 그룹 N GMFR (95% CI ) 4배 증가 (95% CI )
위약 2 1.0 (0.6, 1.8) 0.0 (0.0, 84.2)
50/50㎍ VLP 백신 10 4.4 (1.6, 11.9) 50.0 (18.7, 81.3)
이 연구로부터의 결과들은 2가 IM 노로바이러스 VLP 백신은 일반적으로 잘 인내되었다는 것을 증명하였다. 면역원성 데이터는 1회 백신 투여량은 혈청양성 인간 성인을 보호하는데 충분할 수 있다는 것을 나타내었다. 탄수화물 차단 활성 및 혈구응집 억제 분석법으로부터의 결과들은 1회 백신 투여량은 강력한 항 노로바이러스 활성을 가진 혈청 항체들을 유도하였다는 추가 증거를 제공하였다. 인간에서 1회 비경구 투여 이후 관찰된 면역 반응들의 크기와 속도는 훨씬 더 높은 VLP 투여량으로 수회 비강 VLP 백신 투여에 의해 보고된 초기 면역 반응들과 비교할 때 매우 효과적이었다(El Kamary et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(11): 1649-1658).
이런 반응들은 경구 투여된 노로바이러스 VLP에 의해 유도된 반응들(Tacket et al. (2003) Clin Immunol 108:241-247; Ball et al. (1999, Gastroenterology 117:40-48)뿐만 아니라 형질전환 식물들에 의해 유도된 반응들(Tacket et al. (2000) J Infect Dis 182:302-305)보다 더 뛰어났다. 특히, 이런 근내 백신 제제는 면역화 7일 내에 기왕 반응들을 일으켰고 최대 혈청 항체 반응들은 1회 투여 후 관찰되었으며, 현저한 IgA 반응 및 기능성 탄수화물 차단 활성 및 혈구응집 억제 활성을 포함한다. 따라서, 이 노로바이러스 2가 백신은 임의의 현재 이용가능한 노로바이러스 백신에 의해 유도된 면역 반응들보다 뛰어난 인간에서 강한 보호 면역반응을 유도하였다.
실시예 2.
인간에서 근내 노로바이러스 2가 바이러스 유사 입자(VLP) 백신의 투약량 증가, 안전성 및 면역원성 연구(LV03-104 연구)
다음 실시예는 실시예 1에 기술된 임상 연구의 나머지 계획 부분을 제공하며, 무작위, 다부위, 투약량 증가 연구를 위약과 비교한 모노포스포릴 지질 A(MPL) 및 수산화알루미늄(AlOH)로 항원보강된 근내(IM) 노로바이러스 2가 VLP 백신의 4회 투약 수준의 안전성 및 면역원성의 18세 이상 성인에서 실행한다. 대상들은 1.5인치(38mm) 바늘을 사용하여 28일 간격으로, 근내(IM) 주사로 2회 투약량의 백신 또는 위약을 투여받을 것이다. 이 실시예는 본 발명의 원리들을 추가로 설명하려는 것이다.
그룹 A는 연구에 등록을 완료하였고 실시예 1에서 상기하였다. 그룹 B는 50-64세의 ~20명 대상을 포함한다. 그룹 C는 65-85세의 ~30명 대상을 포함한다. 대략 98명 대상이 전체로 연구에 등록된다.
그룹 B에, 50-64세의 ~20명 대상이 등록되며 1:1로 무작위로 백신(N=10) 또는 위약(N=10)을 투여받는다. 2차 투약 7일 후 안전성 데이터(연구 35일)는 그룹 B의 대상들로부터 검토를 위해 이용가능하며, 그룹 C의 대상들은 최초 투여량을 투여받기에 적합하다. 그룹 C에, 65-85세의 ~30명 대상이 등록되며 1:1:1로 무작위로 MPL 및 AlOH로 항원보강된 백신(N=10) 또는 AlOH 단독으로 항원보강된 백신, 즉, MPL 없음(N=10) 또는 위약(N=10)을 투여받는다. 그룹 C에서 평가될 2개의 백신 제제에서 노로바이러스 VLP 및 AlOH의 항원 농도는 동일하며; 단지 MPL의 존재 또는 부존재가 다르다.
노로바이러스 2가 VLP 백신은 항원으로서 유전자군 I, 유전자형 1(GI.1) 및 유전자군 II, 유전자형 IV(GII.4) VLP 및 항원보강제로서 모노포스포릴 지질 A(MPL) 및 수산화알루미늄(AlOH), 버퍼(pH 6.3-6.7)로서 염화나트륨(NaCl) 및 L-히스티딘(L-His), 에탄올 및 주사용 물을 포함하였다. GII.4 VLP는 3개의 GII.4 균주로부터 유래된 SEQ ID NO: 1의 캡시드 서열을 포함하였다.
그룹 B 및 C에서 추가 평가를 위해 선택된 백신의 1회 투여량은 일반적으로 잘 인내되는 가장 강력하고 재생가능한 면역 반응을 초래하는 그룹 A에서 최저 투여량이다. 그룹 A에서 대상들로부터의 56일 안전성 및 면역원성 데이터는 CSM/SMC에 의해 검토되며 2가 투여량은 그룹 B 및 C에서 평가를 위해 선택된다.
대상들은 IM 노로바이러스 2가 VLP 백신 또는 대조군의 각 투약 후 0 내지 7일 동안 통증, 민감함, 적열 및 붓기와 같은 4개의 국소 주사 부위 반응 및 일일 구강 온도, 두통, 피로, 근육통, 오한, 관절통 및 구역질, 구토, 설사, 복부 경련/통증의 위장관 증상을 포함하는 10개 전신 신호 또는 증상을 포함하는 유도된 증상들의 일일 기억 도움을 유지하였다. 주사 부위에서 적열 및 붓기를 측정하고 각 주사 후 7일 동안 매일 기록하였다.
중간 의료 기록들을 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14 및 393+14일에 각 다음 방문 및 265+14일에 다음 전화에서 얻었다; 대상들에게 중간 병, 의사 방문, 임의의 심각한 부작용(SAEs) 및 임의의 현저한 새로운 질환의 개시에 대해 질문하였다. 대상들은 각각 지속적인 적합성 및 안전성을 평가하기 위해 스크리닝시 및 21 및 35일(각 투약량 ~7일 후)에 평가된 WBC 감별 및 혈소판 계산 및 혈청 BUN, 크레아틴, 글루코스, AST 및 ALT에 의한 CBC를 가졌다.
대상들로부터의 혈액을 백신 접종 이전 0일 및 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14 및 393+14일에 수집하여 효소-결합 면역흡수 분석법(ELISA)에 의해 IM 노로바이러스 2가 VLP 백신에 대한 혈청 항체들(개별적으로 그리고 결합된 IgG, IgA 및 IgM)을 측정하였다. 또한 혈청 탄수화물 차단 활성 및 혈청 HAI 항체들을 측정하였다.
그룹 A에 대해 상기한 방법들은 면역화된 개인 또는 위약을 투여받은 개인으로부터 수집된 혈액 샘플들을 분석하는데 사용된다. 연구의 결과들은 본 발명의 백신 제제의 투여를 위한 임상 프로토콜의 개발에 사용될 것이다.
본 발명은 본 발명의 개별 태양의 한 설명인 특정 실시예들에 의해 범위가 제한되지 않으며 기능적으로 균등한 방법 및 구성요소는 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, 본 발명에서 도시되고 개시된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형은 일상적인 실험들을 사용하여 상기 설명과 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이런 변형과 균등물은 첨부된 청구항의 범위 내에 해당할 것이다.
본 명세서에서 언급한 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 공보, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 같이 어느 정도 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명에서 참조문헌의 인용 또는 언급은 이런 문헌이 본 발명에 대한 종래기술이라는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
참조문헌
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Claims (45)

  1. 인간에서 노로바이러스에 대항하는 보호 면역원성을 유도함으로써 노로바이러스 감염을 예방하거나 완화하기 위한 비경구 투여의 1회 투여를 위한 백신 조성물로서,
    상기 조성물은 유전자군(genogroup) I 노로바이러스 바이러스 유사 입자(VLP, virus-like particles) 및 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함하며,
    상기 유전자군 I 노로바이러스 VLP 및 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 상이한 양으로 조성물에 존재하며, 상기 조성물은 15㎍ 내지 50㎍의 유전자군 I 노로바이러스 VLP 및 50㎍ 내지 150㎍의 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함하고,
    상기 조성물은 조성물의 투여 이전에 인간의 역가와 비교하여 노로바이러스-특이적 혈청 항체 역가의 적어도 3배 증가를 유도하며, 상기 유전자군 I 노로바이러스 VLP는 유전자군 I 바이러스 균주로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함하고, 상기 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 유전자군 II 바이러스 균주로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함하는 것인 백신 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    조성물은 조성물의 투여 이전 인간의 역가와 비교하여 노로바이러스 특이적 혈청 항체 역가의 적어도 6배 증가를 유도하는 것인 백신 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 유전자군 I 노로바이러스 VLP는 놀워크 바이러스 VLP이며, 상기 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 노로바이러스 유전자군 II 캡시드 단백질의 공통 서열의 발현으로부터 생성된 VLP인 것인 백신 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 유전자군 II, 유전자형(genotype) 4 바이러스 균주로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함하는 것인 백신 조성물.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    조성물은 적어도 하나의 항원보강제를 더 포함하는 것인 백신 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 항원보강제는 톨-라이크 리셉터 효현제인 것인 백신 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 항원보강제는 수산화알루미늄인 것인 백신 조성물.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    조성물은 2개의 항원보강제를 더 포함하는 것인 백신 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 2개의 항원보강제는 모노포스포릴 지질 A 및 수산화알루미늄인 것인 백신 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 버퍼를 더 포함하는 것인 백신 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 버퍼는 L-히스티딘, 이미다졸, 숙신산, 트리스 및 시트르산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 백신 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서,
    백신 조성물은 정맥, 피하, 경피 또는 근내 투여 경로에 의해 인간에게 투여되는 것인 백신 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    백신 조성물은 근내 투여 경로에 의해 인간에게 투여되는 것인 백신 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서,
    백신 조성물은 액체로 제제화되는 것인 백신 조성물.
  15. 제 1 항에 있어서,
    노로바이러스 특이적 항체 역가의 증가는 1회 투여 조성물의 투여 7일 내에 유도되는 것인 백신 조성물.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 노로바이러스 감염의 하나 이상의 증상으로부터 보호를 제공하는 것인 백신 조성물.
  17. 제 1 노로바이러스 유전자군으로부터 유래된 제 1 단가 VLP 및 제 2 노로바이러스 유전자군으로부터 유래된 제 2 단가 VLP를 포함하는 버퍼화된 백신 조성물로서,
    제 1 노로바이러스 유전자군은 유전자군 I이고, 제 2 노로바이러스 유전자군은 유전자군 II이고,
    상기 유전자군 I 노로바이러스 VLP 및 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 상이한 양으로 조성물에 존재하며, 상기 조성물은 15㎍ 내지 50㎍의 유전자군 I 노로바이러스 VLP 및 50㎍ 내지 150㎍의 유전자군 II 노로바이러스 VLP를 포함하고,
    상기 버퍼는 L-히스티딘 및 이미다졸로부터 선택되고, 조성물은 액체로서 제제화되는 것인 버퍼화된 백신 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 L-히스티딘 또는 이미다졸은 15 mM 내지 50 mM의 농도로 존재하는 것인 버퍼화된 백신 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 L-히스티딘 또는 이미다졸은 20 mM 내지 25 mM의 농도로 존재하는 것인 버퍼화된 백신 조성물.
  20. 제 17 항에 있어서,
    상기 조성물의 pH는 6.0 내지 7.0인 것인 버퍼화된 백신 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 조성물의 pH는 6.2 내지 6.8인 것인 버퍼화된 백신 조성물.
  22. 제 17 항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 염을 더 포함하는 버퍼화된 백신 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서,
    염은 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 황산암모늄 및 시트르산나트륨으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 버퍼화된 백신 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    염화나트륨의 농도는 10mM 내지 200mM인 것인 버퍼화된 백신 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서,
    염은 염화나트륨이고, 염화나트륨의 농도는 100mM 내지 150mM인 것인 버퍼화된 백신 조성물.
  26. 제 17 항에 있어서,
    제 1 단가 VLP는 노로바이러스 유전자형 GI.1으로부터 유래되고, 제 2 단가 VLP는 노로바이러스 유전자형 GII.4로부터 유래되는 것인 버퍼화된 백신 조성물.
  27. 제 17 항에 있어서,
    상기 유전자군 II 노로바이러스 VLP는 유전자군 II 노로바이러스의 공통 서열(consensus sequence)로부터 유래된 캡시드 단백질을 함유하는 것인 버퍼화된 백신 조성물.
  28. 제 17 항에 있어서,
    적어도 하나의 항원보강제를 포함하는 것인 버퍼화된 백신 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 항원보강제는 모노포스포릴 지질 A(MPL) 및 수산화알루미늄으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 버퍼화된 백신 조성물.
  30. 제 17 항에 있어서,
    MPL 및 수산화알루미늄을 더 포함하는 것인 버퍼화된 백신 조성물.
  31. 제 17 항에 있어서,
    알룸을 더 포함하는 것인 버퍼화된 백신 조성물.
  32. 제 17 항에 있어서,
    대상에서 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용하기 위한 버퍼화된 백신 조성물로서, 상기 방법은 버퍼화된 백신 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 버퍼화된 백신 조성물.
  33. 제 17 항의 버퍼화된 백신 조성물을 포함하는 백신 제제.
  34. 제 33 항에 있어서,
    대상에서 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위한 백신 제제로서, 백신 제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 백신 제제.
  35. 삭제
  36. 삭제
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