MX2014000411A

MX2014000411A - Formulaciones parenterales de vacunas contra los norovirus.

Info

Publication number: MX2014000411A
Application number: MX2014000411A
Authority: MX
Inventors: Charles Richardson; Robert F Bargatze; Paul M Mendelman
Original assignee: Takeda Vaccines Inc
Priority date: 2011-07-11
Filing date: 2012-07-11
Publication date: 2014-08-26
Also published as: PL3299030T3; ZA201401012B; PE20140845A1; CN108567975A; IL230356B; EA201792407A2; NZ710919A; GEP201706668B; US20160000899A1; DOP2022000030A; EP2731621B1; JP2014520852A; EP3299030B1; EA201490258A1; DOP2014000004A; AU2015200836B2; CR20190540A; CR20140069A; US20130273102A1; US9801934B2

Abstract

Composiciones de vacuna parenterales de dosis individuales que comprenden mezclas de partículas tipo virus monovalentes de Norovirus. También se divulgan métodos para conferir una inmunidad protectora contra infecciones por Norovirus en un ser humano por administración de dichas composiciones.

Description

FORMULACIONES PARENTERALES DE VACUNAS CONTRA LOS NOROVIRUS REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud invoca prioridad de la Solicitud Provisional de Patente de los EE.UU. N° : 61/506.447, presentada el 11 de julio, 2011, cuyos contenidos se incorporan por completo en la presente a modo de referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención pertenece al campo de las vacunas, en particular de vacunas contra los Norovirus. Además, la invención se relaciona con métodos de preparación de composiciones de vacunas y métodos para inducir y evaluar las respuestas inmunes protectoras contra los Norovirus en seres humanos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los Norovirus son Calicivirus humanos no cultivables que representan la principal causa individual de brotes epidémicos de gastroenteritis no bacteriana (Glass et al., 2000; Hardy et al., 1999). Previo al desarrollo de ensayos precisos de diagnóstico molecular, el significado clínico de los Norovirus fue subestimado. La clonación del genogrupo I prototipo del genoma del virus Norwalk (NV) y la producción de partículas tipo virus (VLP) con un sistema de expresión en Baculovirus recombinante condujo al desarrollo de ensayos que revelaron infecciones de Norovirus ampliamente distribuidas (Jiang et al., 1990; 1992).

Los Norovirus son virus a ARN de cadena simple, de orientación positiva, que contienen un genoma de ARN no segmentado. El genoma viral codifica tres marcos de lectura abiertos, de los cuales los últimos dos especifican la producción de la proteina principal de la cápside y una proteina estructural menor, respectivamente (Glass et al., 2000) . Cuando se expresa a niveles altos en sistemas de expresión eucariotas, la proteina de la cápside de NV, y otros determinados Norovirus, se autoensambla forman VLP que imitan estructuralmente a los viriones nativos de Norovirus. Cuando se visualizan por microscopía electrónica de transmisión, no es posible distinguir morfológicamente las VLP de los viriones infecciosos aislados de muestras de heces humanas .

Las respuestas inmunes a los Norovirus son complejas, y actualmente se están dilucidando sus correlaciones de protección. Estudios en voluntarios humanos realizados usando virus nativos demostraron que las respuestas inmunes de memoria derivados de mucosas proporcionaron una protección a corto plazo contra una infección y sugirieron que era factible una protección mediada por vacunas (Lindesmith et al., 2003; Parrino et al., 1977; Wyatt et al., 1974).

Aunque no se pueden cultivar Norovirus in vitro, debido a la disponibilidad de las VLP y su capacidad para ser producidas en grandes cantidades, se ha logrado un progreso considerable en la definición de la topografía antigénica y estructural de la cápside de Norovirus. Las VLP conservan la confirmación de autenticación de la proteína de la cápside viral en tanto carecen del material genético infeccioso. En consecuencia, las VLP imitan las interacciones funcionales del virus con los receptores celulares, generando de esa manera una respuesta inmune apropiada en el huésped en tanto carecen de la capacidad para reproducirse o para causar una infección. En un trabajo conjunto con el NIH, en el Baylor College of Medicine se estudiaron las respuestas inmunes humorales, de mucosas y celulares a las VLP de NV en voluntarios humanos en un estudio clínico académico, de fase I patrocinado por investigadores. Las VLP administradas por vía oral eran seguras e inmunogénicas en adultos saludables (Ball et al., 1999; Tacket et al., 2003). Pero se necesitaron múltiples dosis de una cantidad relativamente alta de VLP para observar una respuesta inmune. En otros centros académicos se demostró en experimentos preclínicos en modelos de animales una mejora de las respuestas inmunes a las VLP cuando son administradas por vía intranasal con adyuvantes de exotoxinas bacterianas (Guerrero et al., 2001; Nicollier- Jamot et al., 2004; Periwal et al. , 2003; Souza et al., (2007) Vaccine, volumen 25(50): 8448-59). Sin embargo, la inmunidad protectora contra los Norovirus en humanos continúa siendo difícil de lograr debido a que aún no se han podido identificar claramente los indicadores de una respuesta inmune protectora en humanos (Herbst-Kralovetz et al., (2010) Expert Rev. Vaccines 9(3), 299-307).

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento que una sola dosis de una vacuna contra los Norovirus genera una respuesta inmune protectora rápida y robusta contra los Norovirus en humanos cuando es administrada por vía parenteral. Por lo tanto, la presente invención provee un método para generar inmunidad protectora contra los Norovirus en un ser humano que comprende administrar por vía parenteral a dicho ser humano no más de una sola dosis de una composición de vacuna, donde dicha composición comprende VLP del genogrupo I y/o del genogrupo II de Norovirus, en donde dicha composición induce un aumento de por lo menos tres veces en el título de anticuerpos específicos de Norovirus en suero en comparación con el título en el ser humano antes de la administración de la composición. En determinadas formas de realización, el aumento del título de anticuerpos específicos de Norovirus es inducido dentro de los siete días después de la administración de la dosis única de la composición. En algunas formas de realización, la composición de vacuna se administra a dicho ser humano por una ruta de administración intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular. En una forma de realización, la composición de vacuna se administra a dicho ser humano por una ruta de administración intramuscular .

Las composiciones de vacuna de dosis única pueden comprender dosis de entre aproximadamente 5 yg y aproximadamente 150 µg de las VLP del genogrupo I de Norovirus, las VLP del genogrupo II de Norovirus o de ambas. En las formas de realización donde las composiciones de vacuna de dosis única comprenden VLP del genogrupo I y del genogrupo II de Norovirus, la dosis de cada VLP puede ser igual o diferente. En una forma de realización, la composición no comprende más que 50 µg de VLP del genogrupo I de Norovirus. En otra forma de realización, la composición no comprende más que 25 µ? de VLP del genogrupo I de Norovirus. En aún otra forma de realización, la composición no comprende más que 150 g de VLP del genogrupo II de Norovirus. En aún otra forma de realización, la composición no comprende más que 50 yg de VLP del genogrupo II de Norovirus. Las VLP de Norovirus pueden ser VLP monovalentes o VLP multivalentes .

En algunos aspectos de la invención, las VLP del genogrupo I de Norovirus en las composiciones de vacuna comprenden una proteina de la cápside derivada de una cepa viral del genogrupo I. En una forma de realización, las VLP del genogrupo I de Norovirus comprenden una proteina de la cápside del genotipo 1 del genogrupo I de Norovirus. En otra forma de realización, las VLP del genogrupo I de Norovirus comprenden una proteina de la cápside del virus Norwalk. En otros aspectos de la invención, las VLP del genogrupo I de Norovirus en las composiciones de vacuna comprenden una proteina de la cápside derivada de una cepa viral del genogrupo I. En algunas formas de realización, las VLP del genogrupo II de Norovirus comprenden una proteina de la cápside del genotipo 4 del genogrupo II de Norovirus. En determinadas formas de realización, las VLP del genogrupo II de Norovirus son VLP generadas a partir de la expresión de una secuencia consenso del genogrupo II de Norovirus. En una forma de realización particular, las VLP del genogrupo II de Norovirus comprenden una proteina de la cápside cuya secuencia se muestra en la SEQ ID N° : 1.

En determinadas formas de realización, la composición de vacuna comprende además por lo menos un adyuvante. Preferiblemente, el adyuvante no es un adyuvante de una exotoxina bacteriana. En una forma de realización, el adyuvante es un agonista de un receptor tipo toll, tal como monofosforil lipido A (MPL) , flagelina o CpG. En otra forma de realización, el adyuvante es hidróxido de aluminio (por ejemplo, alúmina) . En determinadas formas de realización, la composición de vacuna comprende dos adyuvantes, tales como MPL e hidróxido de aluminio. En algunas formas de realización, la composición de vacuna puede comprender además una solución amortiguadora, tal como L-histidina, imidazol, ácido succinico, tris y ácido cítrico. La composición de vacuna se puede formular como un polvo seco o como un líquido. En una forma de realización, la composición de vacuna se formula como un líquido (por ejemplo, como una formulación acuosa) .

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS Figura 1. Resultados de ensayos de pan-ELISA que miden los niveles séricos combinados de IgG, IgA e IgM de voluntarios humanos inmunizados intramuscularmente con placebo (solución salina) o una formulación para vacuna que contiene 5, 15, 50 o 150 \iq de cada uno de VLP genogrupo 1.1 de Norovirus y VLP genogrupo II.4 de Norovirus. La media geométrica del título para los anticuerpos anti-GI.l (A) y anti-GII.4 (B) se muestra para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 días después de la primera inmunización y 7 y 28 días después de la segunda inmunización. Los voluntarios recibieron inmunizaciones en los dias de estudio 0 y 28.

Figura 2. Resultados de ensayos de pan-ELISA que miden los niveles séricos combinados de IgG, IgA e IgM de voluntarios humanos inmunizados intramuscularmente con placebo (solución salina) o una formulación para vacuna que contiene 5, 15, 50 o 150 µ? de cada uno de VLP genogrupo 1.1 de Norovirus y VLP genogrupo II.4 de Norovirus. El aumento en veces de la media geométrica para los anticuerpos anti-GI.l (A) y anti-GII.4 (B) se muestra para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 dias después de la primera inmunización y 7 y 28 dias después de la segunda inmunización. Los voluntarios recibieron inmunizaciones en los dias de estudio 0 y 28.

Figura 3. Resultados de ensayos de pan-ELISA que miden los niveles séricos combinados de IgG, IgA e IgM de voluntarios humanos inmunizados intramuscularmente con placebo (solución salina) o una formulación para vacuna que contiene 5, 15, 50 o 150 µg de cada uno de VLP genogrupo 1.1 de Norovirus y VLP genogrupo II.4 de Norovirus. Las tasas de serorespuesta porcentual (es decir aumento de cuatro veces en el titulo de anticuerpo en comparación a los títulos previos a la inmunización) para los anticuerpos anti-GI.l (A) y anti-GII.4 (B) se muestran para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 días después de la primera inmunización y 7 y 28 dias después de la segunda inmunización. Los voluntarios recibieron inmunizaciones en los dias de estudio 0 y 28.

Figura 4. Resultados de ensayos de ELISA que miden IgA sérica de voluntarios humanos inmunizados intramuscularmente con placebo (solución salina) o una formulación para vacuna que contiene 5, 15 o 50 pg de cada uno de VLP genogrupo 1.1 de Norovirus y VLP genogrupo II.4 de Norovirus. La media geométrica del titulo para los anticuerpos anti-GI.l (A) y anti-GII.4 (B) se muestra para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 dias después de la primera inmunización y 7 y 28 dias después de la segunda inmunización. Los voluntarios recibieron inmunizaciones en los dias de estudio 0 y 28.

Figura 5. Resultados de ensayos de ELISA que miden IgA sérica de voluntarios humanos inmunizados intramuscularmente con placebo (solución salina) o una formulación para vacuna que contiene 5, 15 o 50 µg de cada uno de VLP genogrupo 1.1 de Norovirus y VLP genogrupo II.4 de Norovirus. El aumento en veces de la media geométrica para los anticuerpos anti-GI.l (A) y anti-GII.4 (B) se muestra para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 dias después de la primera inmunización y 7 y 28 dias después de la segunda inmunización. Los voluntarios recibieron inmunizaciones en los días de estudio 0 y 28.

Figura 6. Resultados de ensayos de ELISA que miden IgA sérica de voluntarios humanos inmunizados intramuscularmente con placebo (solución salina) o una formulación para vacuna que contiene 5, 15 o 50 µ? de cada uno de VLP genogrupo 1.1 de Norovirus y VLP genogrupo II.4 de Norovirus. Las tasas de serorespuesta porcentual (es decir aumento de cuatro veces en el titulo de anticuerpo en comparación a los títulos previos a la inmunización) para los anticuerpos anti-GI.l (A) y anti-GII.4 (B) se muestran para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 días después de la primera inmunización y 7 y 28 días después de la segunda inmunización. Los voluntarios recibieron inmunizaciones en los días de estudio 0 y 28.

Figura 7. Resultados de ensayos de ELISA que miden IgG sérica de voluntarios humanos inmunizados intramuscularmente con placebo (solución salina) o una formulación para vacuna que contiene 5, 15 o 50 µg de cada uno de VLP genogrupo 1.1 de Norovirus y VLP genogrupo II.4 de Norovirus. La media geométrica del título para los anticuerpos anti-GI.l (A) y anti-GII.4 (B) se muestra para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 días después de la primera inmunización y 7 y 28 días después de la segunda inmunización. Los voluntarios recibieron inmunizaciones en los días de estudio 0 y 28.

Figura 8. Resultados de ensayos de ELISA que miden IgG sérica de voluntarios humanos inmunizados intramuscularmente con placebo (solución salina) o una formulación para vacuna que contiene 5, 15 o 50 g de cada uno de VLP genogrupo 1.1 de Norovxrus y VLP genogrupo II.4 de Norovirus. El aumento en veces de la media geométrica para los anticuerpos anti-GI.l (A) y anti-GII.4 (B) se muestra para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 días después de la primera inmunización y 7 y 28 días después de la segunda inmunización. Los voluntarios recibieron inmunizaciones en los días de estudio 0 y 28.

Figura 9. Resultados de ensayos de ELISA que miden IgG sérica de voluntarios humanos inmunizados intramuscularmente con placebo (solución salina) o una formulación para vacuna que contiene 5, 15 o 50 µg de cada uno de VLP genogrupo 1.1 de Norovirus y VLP genogrupo II.4 de Norovirus. Las tasas de serorespuesta porcentual (es decir aumento de cuatro veces en el título de anticuerpo en comparación a los títulos previos a la inmunización) para los anticuerpos anti-GI.l (A) y anti-GII.4 (B) se muestran para cada uno de los niveles de dosificación a los 7 y 21 días después de la primera inmunización y 7 y 28 días después de la segunda inmunización. Los voluntarios recibieron inmunizaciones en los dias de estudio 0 y 28.

Figura 10. Resultados de ensayos de pan-ELISA que miden los niveles séricos combinados de IgG, IgA e IgM de voluntarios humanos inmunizados con una vacuna de Norovirus intranasal, monovalente como se describe en El Kamary et al. (2010) J Infect Dis, Vol . 202 (11): 1649-1658 (grupos LV01-103) o una vacuna de Norovirus intramuscular, bivalente como se describe en el Ejemplo 1 (grupos LV03-104) a los puntos de tiempo indicados. Los voluntarios humanos recibieron placebo o dos dosis de la formulación para vacuna intramuscular o intranasal. La vacuna de Norovirus intramuscular, bivalente contenia 5 ]iq de cada uno de VLP genogrupo 1.1 de Norovirus y VLP genogrupo II.4 de Norovirus. La vacuna intranasal, monovalente contenia 100 g de un genogrupo 1.1 Norovirus. Los voluntarios que recibieron la vacuna intranasal o placebo fueron desafiados con Norovirus vivo luego de la segunda inmuni zación .

Figura 11. Análisis por FACS de células mononucleares de sangre periférica obtenidas de voluntarios humanos en el Dia 0 antes de la inmunización con una dosis de 5 µg de vacuna de Norovirus intramuscular, bivalente (A) o placebo (B) y el Dia 7 luego de la inmunización. Las PB C CD19+ están dirigidas a mucosa tal como resulta evidente de la expresión del receptor de migración alfa 4 /beta 7 y el receptor de quimoquina CCR10.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para generar una inmunidad protectora contra infecciones por Norovirus en un sujeto. En particular, la presente invención provee métodos para generar una inmunidad protectora contra los Norovirus en un ser humano mediante la administración por vía parenteral a dicho ser humano de no más de una sola dosis de una vacuna que comprende VLP de Norovirus y opcionalmente por lo menos un adyuvante, en donde la vacuna confiere protección contra por lo menos un síntoma de infección por Norovirus, la mejora del mismo. Los inventores han descubierto sorprendentemente que la administración intramuscular de no más de una sola dosis de una composición de vacuna que comprende VLP de Norovirus a seres humanos induce una seroconversión sérica rápida (es decir, dentro de los 7 días desde la inmunización) (o sea, un aumento de por lo menos tres veces del título de anticuerpos específicos del antígeno en suero por encima de los niveles de prevacunacion) que es indicativa de una respuesta inmune protectora contra una infección y enfermedad debidas a Norovirus. Las respuestas inmunes inducidas por esta composición de vacuna de dosis única alcanzan un plateau a títulos altos de anticuerpos similares a los observados con una infección natural con la administración de virus vivos en estudios de desafio en humanos. Notablemente, no es necesaria una dosis de refuerzo de la vacuna ya que la respuesta inmune no aumenta con otra administración de una dosis de vacuna adicional .

La invención provee una composición de vacuna que comprende uno o más antigenos de Norovirus. Los términos "Norovirus", "Norovirus (ÑOR)", "norovirus" y equivalentes gramaticales utilizados en la presente, se refieren a los miembros del género Norovirus de la familia Caliciviridae . En algunas formas de realización, un Norovirus puede incluir un grupo de virus con envoltura a ARN, de cadena simple, de orientación positive, relacionados que pueden ser infecciosos para especies de mamíferos humanos o no humanos. En algunas formas de realización, un Norovirus puede causar una gastroenteritis aguda en seres humanos. Los Norovirus también se conocen como virus estructurados redondos pequeños (SRSV) que tienen una estructura de superficie definida o un borde irregular cuando se observa por microscopía electrónica.

Los Norovirus incluyen por lo menos cinco genogrupos (GI, Gil, Gilí, GIV y GV) . Los Norovirus de los grupos GI, Gil, y GIV son infecciosos en seres humanos, en tanto los Norovirus del grupo Gilí infectan primariamente especies de bovinos. El grupo GV fue aislado recientemente de ratones (Zheng et al., (2006) Virology, volumen 346: 312-323) . Son representativas de Gilí las cepas Jena y Newbury, en tanto las cepas Alphatron, Fort Lauderdale y Saint Cloud son representativas de GIV. Los grupos GI y Gil pueden segregarse además en agrupaciones genéticas o genotipos basado en la clasificación genética (Ando et al., (2000) J. Infectious Diseases, volumen 181 (Supl. 2): S336-S348; Lindell et al., (2005) J. Clin. Microbiol., volumen 43(3): 1086-1092) . Según se usa en la presente, el término agrupaciones genéticas se usa indistintamente con el término genotipos. En el genogrupo I, hasta la fecha se conocen 8 agrupaciones GI (con el nombre de la cepa del virus prototipo): GI .1 (Norwalk (NV-USA93 ) ) ; GI .2 ( Southhampton (SOV-GBR93) ) ; GI.3 (Desert Shield (DSV-USA93) ) ; GI .4 (virus Cruise Ship/Chiba (Chiba-JPNOO) ) ; GI .5 (318/Musgrove (Musgrov-GBROO)); GI .6 (Hesse (Hesse-DEU98 ) ) ; GI.7 (Wnchest-GBR00); y GI.8 (Boxer-USA02 ) . En el genogrupo II, hasta la fecha se conocen 19 agrupaciones Gil (con el nombre de la cepa del virus prototipo): GII.l (Hawaii (Hawaii-USA9 ) ) ; Gil.2 (Snow Mountain/Melksham (Msham-GBR95) ) ; Gil.3 (Toronto (Toronto-CAN93) ) ; Gil.4 (Bristol/Lordsdale (Bristol-GBR93) ) ; Gil.5 (290/Hillingdon (Hilingd-GBROO) ) ; Gil.6 (269/Seacroft (Seacrof-GBROO) ) ; Gil.7 (273/Leeds (Leeds-GBROO ) ) ; Gil.8 (539/Amsterdam (Amstdam- NLD99) ) ; GII.9 (378 (VABeach- USA01)), GII.10 (Erfurt-DEUOl) ; GII.11 (SW9180JPNOl) ; GII.12 (Wortley-GBROO) ; GII.13 ( Faytvil-USA02 ) ; GII.14 (M7-USA03); GII.15 (J23-USA02); GII.16 (Tiffin-USA03) ; GII.17 (CSEl-USA03); GII.18 (Q 101/2003/US) y GII.19 (QW170/2003/US) .

En la presente, el término "Norovirus" también significa partículas tipo virus de Norovirus recombinante (VLP de rNOR) . En algunas formas de realización, la expresión recombinante de por lo menos la proteína de la cápside de Norovirus codificada por ORF2 en las células, por ejemplo, a partir de un vector de baculovirus en células Sf9, puede dar como resultado el autoensambl j e espontáneo de la proteína de la cápside en VLP. En algunas formas de realización, la expresión recombinante de por lo menos las proteínas de Norovirus codificadas por ORFl y ORF2 en las células, por ejemplo, a partir de un vector de baculovirus en las células Sf9, puede dar como resultado el autoensamblaj e espontáneo de la proteína de la cápside en VLP. Las VLP son estructuralmente similares a los Norovirus pero carecen del genoma de ARN viral y por ello no son infecciosas. Por lo tanto, el término "Norovirus" incluye los viriones que pueden ser partículas infecciosas o no infecciosas, que incluyen partículas defectuosas.

Los ejemplos no taxativos de Norovirus incluyen la cepa Hu/NoV/ est Chester/2001/USA del genogrupo 1 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502016; virus Chiba (CHV, GenBank AB042808); cepa Hu/NoV/Braddock Heights/1999/USA del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502015; cepa Hu/NoV/Fayette/1999/USA del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502014; cepa Hu/NoV/Fairfield/1999/USA del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502013; cepa Hu/NoV/Sandusky/1999/USA del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502012; cepa Hu/NoV/Canton/1999/USA del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502011; cepa Hu/NoV/Tiffin/1999/USA del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502010; cepa Hu/NoV/CS-El/2002/USA del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY50200; cepa Hu/NoV/Wisconsin/2001/USA del genogrupo 1 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502008; cepa Hu/NoV/CS-841/2001/USA del genogrupo 1 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502007; cepa Hu/NoV/Hiram/2000/USA del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502006; cepa Hu/NoV/Tontogany/1999/USA del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502005; virus Norwalk, genoma completo, Acceso de GenBank N° NC.sub.--001959; ARN genómico Hu/GI/Otofuke/1979/JP de Norovirus, genoma completo, Acceso de GenBank N° AB187514; Hu/Hokkaido/133/2003/JP de Norovirus, Acceso de GenBank N° AB212306; Sydney 2212 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY588132; cepa SN2000JA del virus Norwalk, Acceso de GenBank N° AB190457; genoma completo del virus Lordsdale, Acceso de GenBank N° X86557; ARN genómico del virus tipo Norwalk, Gifu'96, Acceso de GenBank N° AB045603; cepa Vietnam 026 del virus Norwalk, genoma completo, Acceso de GenBank N° AF504671; Hu/GII , 4 /2004 /N/L de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY883096; Hu/GII/Hokushin/03/JP de Norovirus, Acceso de GenBank N° AB195227; Hu/GII/Kamo/03/JP de Norovirus, Acceso de GenBank N° AB195228; Hu/GII /Sinsiro/ 7/JP de Norovirus, Acceso de GenBank N° AB195226; Hu/GII/Ina/02/JP de Norovirus, Acceso de GenBank N° AB195225; Hu/NLV/GII/Neustrelitz260/2000/DE de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY772730; Hu/NLV/Dresdenl74/pUS-NorII/1997/GE de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY741811; Hu/NLV/Oxford/B2S16/2002/UK de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY587989; Hu/NLV/Oxford/B4S7/2002/UK de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY587987; Hu/NLV/Witney/B7S2/2003/UK de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY588030; Hu/NLV/Banbury/B9S23/2003/UK de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY588029; Hu/NLV/ChippingNorton/2003/UK de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY588028; Hu/NLV/Didcot/B9S2/2003/UK de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY588027; Hu/NLV/Oxford/B8S5/2002/UK de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY588026; Hu/NLV/Oxford/B6S4/2003/UK de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY588025; Hu/NLV/Oxford/B6S5/2003/UK de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY588024; Hu/NLV/Oxford/B5S23/2003/UK de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY588023; Hu/NLV/Oxford/B6S2/2003/UK de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY588022; Hu/NLV/Oxford/B6S6/2003/UK de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY588021; forma aislada Bo/ThirsklO/00/UK del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AY126468; forma aislada Bo/Penrith55/00/UK del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AY126476; forma aislada Bo/Aberystwyth24/00/UK del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AY126475; forma aislada Bo/Dumfries/94/UK del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AY126474; NLV/IF2036/2003/Iraq de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY675555; NLV/IF1998/2003/Iraq de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY675554; NLV/BUDS/2002/USA de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY660568; NLV/Paris Island/2003/USA de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY652979; virus Snow Mountain, genoma completo, Acceso de GenBank N° AY134748; NLV/Fort Lauderdale/560/1998/US del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AF414426; Hu/Norovirus/hiroshima/1999/JP (9912-02F) , Acceso de GenBank N° AB044366; cepa 11MSU-MW del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AY274820; cepa B-1SVD del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AY274819; cepa Hu/NoV/Farmington Hills/2002/USA del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502023; cepa Hu/NoV/CS-G4/2002/USA del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502022; cepa Hu/NoV/CS-G2/2002/USA del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502021; cepa Hu/NoV/CS-G12002 /USA del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502020; cepa Hu/NoV/Anchorage/2002/USA del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502019; cepa Hu/NoV/CS-Dl/2002 /CAN del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502018; cepa Hu/NoV/Germanton/2002/USA del genogrupo 2 de Norovirus, Acceso de GenBank N° AY502017; NLV/GII/Langenl061/2002/DE del calicivirus humano, genoma completo, Acceso de GenBank N° AY485642; poliproteina de Norovirus 1 de Murinos, Acceso de GenBank N° AY228235; virus Norwalk, Acceso de GenBank N° AB067536; NLV/Mex7076/1999 del Calicivirus humano, Acceso de GenBank N° AF542090; NLV/Oberhausen 455/01/DE del Calicivirus humano, Acceso de GenBank N° AF539440; NLV/Herzberg 385/01/DE del Calicivirus humano, Acceso de GenBank N° AF539439; NLV/Boxer/2001/US del Calicivirus humano, Acceso de GenBank N° AF538679; ARN genómico del virus tipo Norwalk, genoma completo, Acceso de GenBank N° AB081723 ARN genómico del virus tipo Norwalk, genoma completo, forma aislada: Saitama U201, Acceso de GenBank N° AB039782; ARN genómico del virus tipo Norwalk, genoma completo, forma aislada: Saitama U18, Acceso de GenBank N° AB039781; ARN genómico del virus tipo Norwalk, genoma completo, forma aislada: Saitama U25, Acceso de GenBank N° AB039780; virus Norwalk cepa: U25GII, Acceso de GenBank N° AB067543; virus Norwalk cepa: U201 Gil, Acceso de GenBank N° AB067542; cepa 416/97003156/1996/LA del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AF080559; cepa 408/97003012/1996/FL de virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AF080558; NLV/Burwash Landing/331/1995/US del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AF414425; NLV/Miami Beach/326/1995/US del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AF414424; NLV/White River/290/1994/US del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AF414423; NLV/New Orleans/306/1994/US del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AF414422; NLV/Port Canaveral/301/1994/US del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AF414421; NLV/Honolulu/314/1994/US del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AF414420; NLV/Richmond/283/1994/US del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AF414419; NLV/Westover/302/1994/US del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AF414418; NLV/UK3-17/12700/1992/GB del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AF414417; NLV/ iami/81/1986/US del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AF414416; cepa Snow Mountain, Acceso de GenBank N° U70059; virus Desert Shield DSV395, Acceso de GenBank N° UO4469 ; virus Norwalk, genoma completo, Acceso de GenBank N° AF093797; calicivirus de Hawaii, Acceso de GenBank N° U07611; virus Southampton, Acceso de GenBank N° L07418; virus Norwalk (SRSV-KY-89/89/J) , Acceso de GenBank N° L23828; virus Norwalk (SRSV-SMA/76/US) , Acceso de GenBank N° L23831; virus Camberwell, Acceso de GenBank N° U46500; cepa elksham de Calicivirus humano, Acceso de GenBank N° X81879; cepa MX de Calicivirus humano, Acceso de GenBank N° U22498; Minireovirus TV24, Acceso de GenBank N° U02030; y NLV/Gwynedd/273/1994/US del virus tipo Norwalk, Acceso de GenBank N° AF414409; todas cuyas secuencias (para la fecha de presentación de esta solicitud) se incorporan en la presente a modo de referencia. Otras secuencias de Norovirus se divulgan en las siguientes publicaciones de patentes: WO 2005/030806, WO 2000/79280, JP2002020399, US2003129588, Patente de los EE.UU. N°: 6.572.862, WO 1994/05700 y WO 05/032457, todas las cuales se incorporan por completo en la presente a modo de referencia. Véase también Green et al., (2000) J. Infect. Dis.r volumen 181 (Supl. 2): S322-330; Wang et al., (1994) J. Virol., volumen 68: 5982-5990; Chen et al., (2004) J. Virol., volumen 78: 6469-6479; Chakravarty et al., (2005) J. Virol., volumen 79: 554-568; Hansman et al., (2006) J. Gen. Virol., volumen 87: 909-919; Bull et al., (2006) J. Clin. Micro., volumen 44(2): 327-333; Siebenga, et al., (2007) J. Virol., volumen 81(18): 9932-9941, y Fankhauser et al., (1998) J.

Infect. Dis.r volumen 178: 1571-1578; por la comparaciones de secuencias y una discusión sobre la diversidad genética y el análisis filogenético de los Norovirus. El ácido nucleico y la correspondiente secuencia de aminoácidos de cada una se incorporan todos por completo en la presente a modo de referencia. En algunas formas de realización, se puede usar un criptograma para la identificación y se organiza según: especie de huésped a partir de la cual se aisló el virus/abreviatura del género/abreviatura de la especie/nombre de la cepa/año de aparición/pais de origen. (Green et al., Human Caliciviruses, en Fields Virology volumen 1 841-874 (Knipe y Howley, editores ejecutivos, 4a. ed., Lippincott Williams & Wilkins 2001)). En algunas formas de realización se prefieren las cepas virales del genotipo 4 (Gil.4) del genogrupo II, (por ejemplo, las cepas Houston, Minerva (también conocida como Den Haag) y Laurens (también conocida como Yerseke) ) . A medida que se identifican nuevas cepas y se vuelven disponibles secuencias genéticas, el especialista en el arte podría emplear VLP usando estas cepas contemporáneas en las composiciones y los métodos de la presente invención usando conocimientos comunes. Por consiguiente, la presente invención contempla las VLP elaboradas a partir de dichas cepas como antigenos adecuados para su uso en las composiciones y los métodos que se describen en la presente .

El antígeno de Norovirus se puede encontrar en la forma de péptidos, proteínas o partículas tipo virus (VLP) . En una forma de realización preferida, el antígeno de Norovirus comprende VLP. Según se usa en la presente, "las partículas tipo virus o VLP" se refieren a partículas tipo virus, fragmento (s) , agregados o porciones de las mismas producidas a partir de la secuencia que codifica la proteína de la cápside de Norovirus y que comprende características antigénicas similares a las de partículas infecciosas de Norovirus. Los antígenos de Norovirus también se pueden encontrar en la forma de monómeros de la cápside, multímeros de la cápside, proteínas o fragmentos de péptidos de VLP, o agregados o mezclas de los mismos. Las proteínas o los péptidos antigénicos de Norovirus también se pueden encontrar en una forma desnaturalizada, producida usando métodos conocidos en el arte.

Las VLP de la presente invención se pueden formar ya sea a partir de la proteína de la cápside de Norovirus de longitud completa tales como las proteínas VP1 y/o VP2 o determinados derivados de VP1 o VP2 usando métodos estándar en el arte. Como alternativa, la proteína de la cápside usada para formar la VLP es una proteína de la cápside truncada. En algunas formas de realización, por ejemplo, por lo menos una de las VLP comprende una proteina VPl truncada. En otras formas de realización, todas las VLP comprenden proteínas VPl truncadas. El truncamiento puede ser un truncamiento N- o C-terminal . Las proteínas de la cápside truncadas convenientemente son derivados funcionales de la proteína de la cápside. Los derivados funcionales de la proteína de la cápside tienen la capacidad para generar una respuesta inmune (si fuera necesario, con el uso adyuvantes apropiados) de la misma manera que la respuesta inmune generada por una VLP que consiste en la proteína de la cápside de longitud completa.

Las VLP pueden contener proteínas VPl principales y/o proteínas VP2 menores. En algunas formas de realización, cada VLP contiene una proteína VPl y/o VP2 de un sólo genogrupo de Norovirus lo que origina una VLP monovalente. Según se usa en la presente, el término "monovalente" significa que las proteínas antigénicas derivan de un solo genogrupo de Norovirus. Por ejemplo, las VLP contienen VPl y/o VP2 de una cepa de virus del genogrupo I (por ejemplo, VPl y VP2 del virus Norwalk) . Preferiblemente la VLP está compuesta predominantemente por proteínas VPl. En una forma de realización de la invención, el antígeno es una mezcla de VLP monovalentes, en donde la composición incluye VLP compuestas por VPl y VP2 de un solo genogrupo de Norovirus mezcladas con VLP compuestas por VPl y VP2 de un genogrupo de Norovirus diferente (por ejemplo, del virus Norwalk y del virus Houston) tomadas de múltiples cepas virales. A modo de ejemplo solamente, la composición puede contener VLP monovalentes de una o más cepas del genogrupo I de Norovirus junto con VLP monovalentes de una o más cepas del genogrupo II de Norovirus. Las cepas se pueden seleccionar basado en su predominancia en la circulación en un momento dado. En determinadas formas de realización, la mezcla de VLP de Norovirus está compuesta por las cepas virales GI.l y Gil.4. Más preferiblemente, la mezcla de VLP de Norovirus está compuesta por cepas de Norwalk y una secuencia consenso de la cápside derivada del genogrupo II de Norovirus. Las secuencias consenso de la cápside derivadas de secuencias de Norovirus Norovirus y las VLP elaboradas con dichas secuencias se describen en WO 2010/017542, que se incorpora por completo en la presente a modo de referencia. Por ejemplo, en una forma de realización, la secuencia consenso de la cápside derivada de cepas virales del genotipo 4 (Gil.4) del genogrupo II comprende una secuencia de la SEQ ID N°: 1. Por consiguiente, en algunas formas de realización, la composición de vacuna comprende una mezcla de VLP monovalentes, en donde una VLP monovalente comprende una proteína de la cápside del genogrupo I de Norovirus (por ejemplo, Norwalk) y la otra VLP monovalente comprende una proteina de la cápside consenso que comprende una secuencia de la SEQ ID N° : 1.

M K M A S S D A N P S D G S T A N L V P E V N N E V A L E P V V G A A I A A P V A G Q Q N V I D P W I R N N F V Q A P G G E F T V S P R N A P G E I L W S A P L G P D L N P Y L S H L A R M Y N G Y A G G F E V Q V I L A G N A F T A G K I I F A A V P P N F P T E G L S P S Q V T M F P H I I V D V R Q L E P V L I P L P D V R N N F Y H Y N Q S N D P T I K L I A M L Y T P L R A N N A G D D V F T V S C R V L T R P S P D F D F I F L V P P T V E S R T K P F T V P I L T V E E M T N S R F P I P L E K L F T G P S G A F V V Q P Q N G R C T T D G V L L G T T Q L S P V N I C T F R G D V T. H I A G T Q E Y T M N L A S Q N W N N Y D P T E E I P A P L G T P D F V G K I Q G V L T Q T T R G D G S T R G H K A T V S T G S V H F T P K L G S V Q F S T D T S N D F E T G Q N T K F T P V G V V Q D G S T T H Q N E P Q Q V L P D Y S G R D S H N V H L A P A V A P T F P G E Q L L F F R S T M P G C S G Y P N N L D C L L P Q E W V Q H F Y Q E A A P A Q S D V A L L R F V N P D T G R V L F E C K L H K S G Y V T V A H T G Q H D L V I P P N G Y F R F D S W V N Q F Y T L A P M G N G T G R R R A L (SEQ ID N°:l) Sin embargo, en una forma de realización alternativa de la invención, las VLP pueden ser VLP multivalentes que comprenden, por ejemplo, proteínas VP1 y/o VP2 de uno genogrupo de Norovirus entremezcladas con proteínas VP1 y/o VP2 de un segundo genogrupo de Norovirus, en donde las diferentes proteínas VP1 y VP2 no son proteínas VP1 y VP2 quiméricas, pero se asociado juntos dentro de la misma estructura de cápside para formar VLP inmunogénicas. Según se usa en la presente, el término "multivalente" significa que las proteínas antigénicas derivan de dos o más genogrupos o cepas de Norovirus. Las VLP multivalentes pueden contener antígenos VLP tomados de dos o más cepas virales. A modo de ejemplo solamente, la composición puede contener VLP multivalentes compuestas por monómeros o multímeros de la cápside de una o más cepas del genogrupo I de Norovirus (por ejemplo, del virus Norwalk) junto con monómeros o multímeros de la cápside de una o más cepas del genogrupo I de Norovirus (por ejemplo, el virus Houston) . Preferiblemente, las VLP multivalentes contienen proteínas de la cápside de las cepas de Norwalk y Houston de Norovirus, u otras cepas predominantes en la circulación en un momento dado.

La combinación de VLP monovalentes o multivalentes en la composición preferiblemente no reducirá la inmunogenicidad de cada tipo de VLP. En particular se prefiere que no haya interferencia entre las VLP de Norovirus en la combinación de la invención, de modo tal que la composición de VLP combinadas de la invención puede generar inmunidad contra una infección por cada genotipo de Norovirus representado en la vacuna. Convenientemente, la respuesta inmune contra un tipo de VLP dado en la combinación es por lo menos un 50% de la respuesta inmune del mismo tipo de VLP cuando se mide individualmente, preferiblemente un 100% o sustancialmente un 100%. La respuesta inmune se puede medir convenientemente, por ejemplo, por las respuestas de anticuerpos, como se ilustra en los ejemplos en la presente.

Según se usa en la presente, las "VLP del genogrupo I de Norovirus" se refieren ya sea a VLP monovalentes o multivalentes que comprenden una proteina de la cápside derivada de una o más cepas del genogrupo I de Norovirus. En algunas formas de realización, las VLP del genogrupo I de Norovirus comprenden una proteina de la cápside de longitud completa de una del genogrupo I de Norovirus (por ejemplo, el virus Norwalk) . En otras formas de realización, las VLP del genogrupo I de Norovirus comprenden una proteina consenso de la cápside derivada de diversas cepas del genogrupo I. Las cepas del genogrupo I a partir de las cuales deriva la secuencia consenso de la cápside pueden ser del mismo genotipo o agrupación genética o de genotipos o agrupaciones genéticas diferentes. De manera similar, las "VLP del genogrupo II de Norovirus" se refieren ya sea a VLP monovalentes o multivalentes que comprenden una proteína de la cápside derivada de una o más cepas del genogrupo II de Norovirus. En algunas formas de realización, las VLP del genogrupo II de Norovirus comprenden una proteína de la cápside de longitud completa de una del genogrupo II de Norovirus (por ejemplo, los virus Laurens o Minerva). En otras formas de realización, las VLP del genogrupo II de Norovirus comprenden una proteína consenso de la cápside derivada de diversas cepas del genogrupo II. Las cepas del genogrupo II a partir de las cuales deriva la secuencia consenso de la cápside pueden ser del mismo genotipo o agrupación genética o de genotipos o agrupaciones genéticas diferentes. En una forma de realización, las VLP del genogrupo II de Norovirus comprenden una secuencia consenso de la cápside del genotipo 4 (Gil.4) del genogrupo II de Norovirus. Por consiguiente, en algunas formas de realización, las VLP del genogrupo II de Norovirus comprenden una secuencia de la cápside cuya secuencial se muestra en la SEQ ID N° : 1.

Las VLP multivalentes se pueden producir por expresión separada de proteínas individuales de la cápside seguido por combinación para formar VLP. Como alternativa, se pueden expresar múltiples proteínas de la cápside en la misma célula, de una o más construcciones de ADN. Por ejemplo, se pueden transformar o transfectar múltiples construcciones de ADN en células huésped, donde cada vector codifica una proteina de la cápside diferente. Como alternativa, se puede usar un solo vector que contiene múltiples genes de la cápside, controlados por un promotor compartido o múltiples promotores individuales. También se pueden incorporar elementos IRES en el vector, cuando fuera apropiado. Cuando se usan tales estrategias de expresión, las proteínas de la cápside coexpresadas se pueden copurificar para la subsiguiente formación de VLP, o pueden formar espontáneamente VLP multivalentes que luego se pueden purificar.

Un proceso preferido para la producción de VLP multivalentes comprende la preparación de las proteínas de la cápside de VLP o derivados de las mismas, tales como proteínas VP1, de diferentes genotipos de Norovirus, el mezclado de las proteínas y el ensamblaje de las proteínas para producir dichas VLP multivalentes. Las proteínas VPl se pueden encontrar en la forma de un extracto crudo, se pueden purificar parcialmente o se pueden purificar antes del mezclado. Las VLP monovalentes ensambladas de diferentes genogrupos se pueden desensamblar, mezclar y volver a ensamblar en VLP multivalentes. Preferiblemente, las proteínas o VLP se purifican por lo menos parcialmente antes de combinarlas. Opcionalmente, se puede llevar a cabo una purificación adicional de las VLP multivalentes después del ensamblaje.

Convenientemente las VLP de la invención se elaboran por desensamblaje y reensamblaje de las VLP, para proveer VLP homogéneas y puras. En una forma de realización, las VLP multivalentes se pueden elaborar por desensamblaje de dos o más VLP, seguido por combinación de los componentes de VLP desensamblados en cualquier momento adecuado antes del reensamblaje. Este abordaje es adecuado cuando las VLP se forman espontáneamente a partir de una proteina VPl expresada, como es el caso, por ejemplo, en algunas cepas de levadura. Cuando la expresión de la proteina VPl no conduce a la formación espontánea de VLP, las preparaciones de proteínas VPl o capsómeros se pueden combinar antes de su ensamblaje en VLP.

Cuando se usan VLP multivalentes, los componentes de las VLP preferiblemente se mezclan en las proporciones que se desean en la VLP mezclada final. Por ejemplo, una mezcla de la misma cantidad de una proteína VPl parcialmente purificada de los virus Norwalk y Houston (u otras cepas de Norovirus) provee una VLP multivalente con cantidades aproximadamente iguales de cada proteína.

Las composiciones que comprenden VLP multivalentes se pueden estabilizar con soluciones conocidas en el arte, tales como las descritas en WO 98/44944, O 00/45841, incorporadas en la presente a modo de referencia.

Las composiciones de la invención pueden comprender otras proteínas o fragmentos de proteínas además de las proteínas VP1 y VP2 de Norovirus o derivados de las mismas. También se pueden coadministrar otras proteínas o péptidos con la composición de la invención. Opcionalmente, la composición también se puede formular o coadministrar con antígenos que no son de Norovirus. Convenientemente, estos antígenos pueden proporcionar protección contra otras enfermedades .

La proteína VP1, o un derivado funcional de la proteína, convenientemente puede formar una VLP, y la formación de VLP puede ser evaluada mediante técnicas estándar tales como, por ejemplo, cromatografía por exclusión de tamaño, microscopía electrónica y dispersión dinámica de luz.

Las moléculas antigénicas de la presente invención se pueden preparar por aislamiento y purificación a partir de los organismos en los cuales se encuentran naturalmente, o se pueden preparar mediante técnicas recombinantes . Preferiblemente, los antígenos VLP de Norovirus se preparan a partir de células de insecto tales como células Sf9 o H5, aunque también se puede usar cualquier célula adecuada, tales como células de E. coli o de levadura, por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastori u otros sistemas de expresión de Pichia, expresión en células de mamífero tal como en sistemas CHO o HEK. Cuando se preparan mediante un método recombinante o mediante síntesis, se pueden efectuar una o más inserciones, supresiones, inversiones o sustituciones de los aminoácidos que constituyen al péptido. Cada uno de los antígenos mencionados previamente se usa preferiblemente en un estado sustancialmente puro.

Los procedimientos de producción de las VLP de Norovirus en cultivo de células de insecto ya fueron divulgados con anterioridad en la Patente de los EE.UU. N°: 6.942.865, que se incorpora por completo en la presente a modo de referencia. Brevemente, se clona un ADNc del extreme 3' del genoma que contiene al gen de la cápside viral (0RF2) con un gen estructural menor (0RF3) . Los baculovirus recombinantes que comprenden a los genes de la cápside viral se construyen a partir de los ADNc clonados. Las VLP de Norovirus se producen en cultivos de células de insecto Sf9 o H5.

En algunas formas de realización, la composición de vacuna comprende uno o más adyuvantes en combinación con el antígeno de Norovirus. La mayoría de los adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger al antígeno contra un catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulante de respuestas inmunes, tal como proteínas derivadas de Bordatella pertussis o Mycobacterium tuberculosis . Los adyuvantes adecuado se encuentran disponibles comercialmente, por ejemplo, el adyuvante incompleto y el adyuvante completo de de Freund (Pifco Laboratories, Detroit, Mich.); el adyuvante Merck 65 (Merck y Company, Inc., Rahway, N.J.); sales de aluminio tal como hidróxido de aluminio en gel (alúmina) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o zinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada y azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónicamente o aniónicamente ; polifosfazenos; microesferas biodegradables; y Quil A.

Los adyuvantes adecuados también incluyen, pero en un sentido no taxativo, agonistas de receptores tipo toll (TLR) , en particular agonistas de receptores tipo toll tipo 4 (TLR-4) (por ejemplo, el lípido A monofosforilo (MPL) , lipido A sintético, miméticos o análogos de lípido A) , sales de aluminio, citoquinas, saponinas, derivados muramilo dipéptido (MDP) , oligos CpG, lipopolisacáridos (LPS) de bacterias Gram negativas, polifosfazenos , emulsiones, virosomas, cocleatos, micropartículas de poli ( láctido-co-glicólidos ) (PLG), partículas, micropartículas de de poloxámero, liposomas, emulsiones de aceite en agua, MF59 y escualeno. En algunas formas de realización, los adyuvantes no son exotoxinas de derivadas de bacterias. Los adyuvantes preferidos incluyen adyuvantes que estimulan una respuesta tipo Thl, tal como 3DMPL o QS21.

El Lipido A monofosforilo (MPL) , un derivado no tóxico del lipido A de Salmonella , es un potente agonista de TLR-4 que fue desarrollado como un adyuvante de vacuna (Evans et al., 2003). Se ha demostrado en estudios preclinicos en murinos que la administración de MPL intranasal mejora las respuestas humorales secretoras, asi como sistémicas (Baldridge et al., 2000; Yang et al., 2002). También se ha demostrado que es segura y efectiva como un adyuvante de vacuna en estudios clínicos con más de 120.000 pacientes (Baldrick et al., 2002; Baldridge et al., 2004). La MPL estimula la inducción de la inmunidad innata a través del receptor TLR-4 y por consiguiente tiene la capacidad para generar respuestas inmunes no especificas contra un amplio rango de patógenos infecciosos, incluyendo bacterias Gram negativas y Gram positivas, virus y parásitos (Baldridge et al., 2004; Persing et al., 2002). La inclusión de MPL en las formulaciones de vacunas debería proveer una inducción rápida de respuestas innatas, generar respuestas inmunes no específicas a partir de pruebas virales al tiempo que mejora las respuestas específicas generadas por los componentes antigénicos de la vacuna.

En una forma de realización, la presente invención provee una vacuna que comprende lipido A monofosforilo (MPL) o lipido A monofosforilo 3-des-0-acilado (3D-MPL) como un mej orador de la inmunidad adaptativa e innata. Químicamente, la 3D-MPL es una mezcla de lipido A monofosforilo 3-des-0-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. Una forma preferida del lipido A monofosforilo 3-des-0-acilado se divulga en la Patente Europea 0 689 454 Bl (Smith Kline Beecham Biologicals SA) , incorporada en la presente a modo de referencia. En otra forma de realización, la presente invención provee una composición que comprende el lipido A sintético, miméticos o análogos del lipido A, tal como el Lipido A PET de BioMira, o derivados sintéticos diseñados para funcionar como los agonistas TLR-4.

En determinadas formas de realización, la composición de vacuna comprende dos adyuvantes. Se puede seleccionar una combinación de adyuvantes entre los que se describieron previamente. En una forma de realización particular, los dos adyuvantes son MPL e hidróxido de aluminio (por ejemplo, alúmina) . En otra forma de realización particular, los dos adyuvantes son MPL y aceite.

El término "cantidad eficaz como adyuvante" o "cantidad eficaz de adyuvante" son bien conocidos por los especialistas en el arte, e incluyen una cantidad de uno o más adyuvantes capaz de estimular la respuesta inmune a un antigeno administrado, es decir, una cantidad que aumenta la respuesta inmune de una composición de antigeno administrada, medida en términos de los niveles de IgA en los lavados nasales, los niveles séricos de IgG o IgM o la proliferación de células B y T. Los aumentos convenientemente eficaces de los niveles de inmunoglobulina incluyen más que un 5%, preferiblemente más que un 25% y en particular más que un 50%, en comparación con la misma composición de antigeno sin ningún adyuvante.

En una forma de realización, la presente invención provee una composición de vacuna formulada para una administración parenteral, en donde la composición incluye al menos dos tipos de Norovirus VLP purificadas en combinación con hidróxido de aluminio y una solución amortiguadora. La solución amortiguadora se puede seleccionar del grupo que consiste de L-histidina, imidazol, ácido succinico, Tris, ácido cítrico, bis-Tris, Pipes, Mes, Hepes, glicinamida y tricina. En una forma de realización, la solución amortiguadora es L-histidina o imidazol. Preferiblemente, la solución amortiguadora está presente a una concentración de entre aproximadamente 15 mM y aproximadamente 50 mM, más preferiblemente entre aproximadamente 18 mM y aproximadamente 40 mM o con mayor preferencia entre aproximadamente 20 mM y aproximadamente 25 mM. En algunas formas de realización, el pH de la composición antigénica o de vacuna es de entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 7,0 o entre aproximadamente 6,2 y aproximadamente 6,8 o es de aproximadamente 6,5. La composición de vacuna puede ser una formulación acuosa. En algunas formas de realización, la composición de vacuna es un polvo liofilizado y se reconstituye en una formulación acuosa.

En determinadas formas de realización, la composición de vacuna además comprende por lo menos un adyuvante además de los dos o más tipos de VLP de Norovirus, hidróxido de aluminio y una solución amortiguadora. Por ejemplo, el adyuvante puede ser un agonista del receptor tipo toll, tal como MPL, flagelina, oligos CpG, lípido A sintético o miméticos o análogos del lípido A. En una forma de realización particular, el adyuvante es MPL.

Las VLP de Norovirus incluidas en las composiciones de vacuna de la invención pueden comprender cualquiera de las VLP descritas en la presente. En una forma de realización, cada uno de los dos tipos de VLP de Norovirus comprenden una proteína de la cápside de diferentes genogrupos (por ejemplo, del genogrupo I y del genogrupo II) . Por ejemplo, un tipo de VLP de Norovirus comprende una proteína de la cápside derivada de un genogrupo I de Norovirus y el otro tipo de VLP de Norovirus comprende una proteína de la cápside derivada de un genogrupo II de Norovirus. En una forma de realización, un tipo de VLP de Norovirus comprende una proteína de la cápside del virus Norwalk y el otro tipo de VLP de Norovirus comprende una proteína de la cápside consenso derivada del genotipo 4 del genogrupo II de Norovirus (por ejemplo, una proteína de la cápside que comprende una secuencia de la SEQ ID N°: 1). La composición de vacuna puede comprender entre aproximadamente 5 µg y aproximadamente 200 µg de cada VLP de Norovirus, más preferiblemente entre aproximadamente 15 iq y aproximadamente 50 µg de cada VLP de Norovirus. En algunas formas de realización, la dosis de un tipo de VLP de Norovirus es diferente de la dosis del otro tipo de VLP de Norovirus. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, la composición de vacuna comprende entre aproximadamente 5 y aproximadamente 15 µg de una VLP del genogrupo I y entre aproximadamente 15 µg y aproximadamente 50 µg de una VLP del genogrupo II. En otras formas de realización, en determinadas formas de realización, la composición de vacuna comprende entre aproximadamente 15 µg y aproximadamente 50 µg de una VLP del genogrupo I y entre aproximadamente 50 \iq y aproximadamente 150 µg de una VLP del genogrupo II.

En algunas formas de realización, las composiciones de vacuna además comprenden una sal farmacéuticamente aceptable, incluyendo, pero en un sentido no taxativo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, sulfato de amonio y citrato de sodio. En una forma de realización, la sal farmacéuticamente aceptable es cloruro de sodio. La concentración de la sal farmacéuticamente aceptable puede ser de entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 200 mM, con concentraciones preferidas en el rango de entre aproximadamente 100 mM y aproximadamente 150 mM. Preferiblemente, las composiciones de vacuna de la invención contienen menos que 2 mM de fosfato libre. En algunas formas de realización, las composiciones de vacuna comprenden menos que 1 mM de fosfato libre. Las composiciones de vacuna también pueden comprender además otros excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como azúcares (por ejemplo, sacarosa, trehalosa, manitol) y agentes tensioactivos .

Según se describe en la presente, las composiciones de la invención se pueden formular para su administración como formulaciones de vacunas. Según se usa en la presente, el término "vacuna" se refiere a una formulación que contiene VLP de Norovirus u otros antigenos de Norovirus de la presente invención descritos previamente, que se encuentra en una forma que se puede administrar a un vertebrado, en particular a un ser humano, y que induce una respuesta inmune protectora suficiente como para inducir inmunidad con el fin de prevenir y/o mejorar una infección por Norovirus o una enfermedad inducida por Norovirus y/o de reducir por lo menos un sintoma de una infección o enfermedad por Norovirus.

Según se usa en la presente, el término "respuesta inmune" se refiere a una respuesta inmune humoral y a una respuesta inmune mediada por células. La respuesta inmune humoral comprende la estimulación de la producción de anticuerpos por linfocitos B que, por ejemplo, neutralizan los agentes infecciosos, bloquean el ingreso de los agentes infecciosos en las células, bloquean la replicación de dichos agentes infecciosos y/o protegen a las células huésped contra una infección y destrucción. La respuesta inmune mediada por células se refiere a una respuesta inmune que está mediada por linfocitos T y/u otras células, tales como macrófagos, contra un agente infeccioso, que se observa en un vertebrado (por ejemplo, un ser humano), que previene o mejora una infección o reduce por lo menos un sintoma de la misma. En particular, una "inmunidad protectora" o una "respuesta inmune protectora" se refieré a la inmunidad o a la generación de una respuesta inmune contra un agente infeccioso, que se observa en un vertebrado (por ejemplo, un ser humano), que previene o mejora una infección o reduce al menos un síntoma de la misma. Específicamente, la inducción de una respuesta inmune protectora con la administración de la vacuna se evidencia por la eliminación o reducción de la presencia de uno o más síntomas de gastroenteritis aguda o por una reducción en la duración o severidad de dichos síntomas. Los síntomas clínicos de gastroenteritis por Norovirus incluyen náuseas, diarrea, deposiciones blandas, vómitos, fiebre y malestar general. Una respuesta inmune protectora que reduces o elimina los síntomas de la enfermedad reducirá o detendrá la dispersión de un brote de Norovirus en una población. La preparación de vacunas se describe en general en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M. J. ) (1995) Plenum Press, Nueva York) . Las composiciones de la presente invención se pueden formular, por ejemplo, para su administración a una o más de las mucosas oral, gastrointestinal y respiratoria (por ejemplo, nasal) . Las composiciones de la presente invención se pueden formular, por ejemplo, para su administración mediante inyección, tal como inyección parenteral (por ejemplo, una inyección intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular) .

Cuando la composición se pretende administrar en la mucosa respiratoria (por ejemplo, nasal) , típicamente se formula como una solución acuosa para su administración como un aerosol o como gotas nasales o, como alternativa, como un polvo seco, por ejemplo para una deposición rápida dentro del pasaje nasal. Las composiciones destinadas a una administración como gotas nasales pueden contener uno o más excipientes del tipo habitualmente incluido en dichas composiciones, por ejemplo conservantes, agentes para ajustar la viscosidad, agentes para ajustar la tonicidad, agentes amortiguadores y semejantes. Los agentes para la viscosidad pueden ser celulosa microcristalina, quitosán, almidones, polisacáridos y semejantes. Las composiciones destinadas a una administración como un polvo seco también pueden contener uno o más de los excipientes incluidos habitualmente en dichas composiciones, por ejemplo, agentes mucoadhesivos , agentes de relleno y agentes para distribuir un flujo de polvo y proveer características de tamaño apropiados. Los agentes de relleno y de flujo de polvo y características de tamaño pueden incluir manitol, sacarosa, trehalosa y xilitol.

Cuando se pretende administrar la composición como una inyección parenteral, tal como una inyección intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c), intradérmica o intramuscular (i.m.), típicamente se formula como una suspensión líquida (es decir, una formulación acuosa) compuesta por al menos un tipo de VLP de Norovirus y opcionalmente por al menos un adyuvante. En una forma de realización, el adyuvante puede ser MPL. En otra forma de realización, la vacuna liquida formulada para la administración parenteral puede tener más de un adyuvante. En una forma de realización preferida, una vacuna liquida formulada para la vía parenteral (por ejemplo, formulada para la via i.m., i.v. o s.c.) comprende VLP del genogrupo I y/o del genogrupo II de Norovirus con hidróxido de aluminio (por ejemplo, alúmina) y monofosforil lipido A (MPL) como adyuvantes. En una forma de realización, una formulación liquido para una administración parenteral comprende uno o más antigenos del genogrupo de Norovirus, tal como uno o más de los tipos de VLP de Norovirus descritos en la presente, MPL, hidróxido de aluminio y una solución amortiguadora. En otra forma de realización, una formulación liquido para una administración parenteral comprende uno o más antigenos del genogrupo de Norovirus, MPL, aceite y una solución amortiguadora. En determinadas formas de realización, la solución amortiguadora en las formulaciones de vacunas parenterales es L-histidina o imidazol. La administración parenteral de vacunas liquidas puede efectuarse con aguja y jeringa, como es bien conocido en el arte.

En determinadas formas de realización, una composición de vacuna de la invención para generar una respuesta inmune protectora contra los Norovirus en seres humanos comprende VLP del genogrupo I y/o del genogrupo II de Norovirus a una dosis no mayor que 150 ]iq . Por ejemplo, en algunas formas de realización, la composición de vacuna no comprende más que 150 µq , no más que 100 µq, no más que 50 µ?, no más que 25 µgr no más que 15 ig o no más que 10 µg de las VLP del genogrupo I de Norovirus. En otras formas de realización, la composición de vacuna no comprende más que 150 ]iq , no más que 100 µq, no más que 50 µq, no más que 25 µq f no más que 15 µq 0 no más que 10 µg de las VLP del genogrupo II de Norovirus. En determinadas formas de realización, la composición de vacuna no comprende más que 150 q de cada VLP del genogrupo 1 y del genogrupo II de Norovirus. En dichas formas de realización, la dosis de las VLP del genogrupo I de Norovirus y de las VLP del genogrupo II pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, en una forma de realización, la composición de vacuna pueden comprender no más que 50 µ? de las VLP del genogrupo I de Norovirus y no más que 150 µq de las VLP del genogrupo II de Norovirus. En otra forma de realización, la composición de vacuna pueden comprender no más que 25 µq de las VLP del genogrupo I de Norovirus y no más que 50 µq de las VLP del genogrupo II de Norovirus. En otras formas de realización, la composición de vacuna pueden comprender no más que 15 µg de las VLP del genogrupo I de Norovirus y no más que 50 q de las VLP del genogrupo II de Norovirus. En aún otras formas de realización, la composición de vacuna pueden comprender no más que 25 µg de las VLP del genogrupo I de Norovirus y no más que 150 ]iq de las VLP del genogrupo II de Norovirus.

Las VLP del genogrupo I y del genogrupo II de Norovirus pueden derivar de cualquiera de las cepas de Norovirus descritas en la presente. En una forma de realización, las VLP del genogrupo I de Norovirus son VLP del genogrupo I, del genotipo 1 (GI.l) (es decir, comprenden una proteina de la cápside de un GI.l de Norovirus). En otra forma de realización, las VLP del genogrupo I de Norovirus son VLP de Norwalk. En otra forma de realización, las VLP del genogrupo II de Norovirus son VLP del genotipo 4 (Gil.4) del genogrupo II. En a aún otra forma de realización, las VLP del genogrupo II de Norovirus son VLP generadas a partir de la expresión de una secuencia consenso del genogrupo II de Norovirus. En una forma de realización particular, las VLP del genogrupo II de Norovirus comprenden una proteina de la cápside cuya secuencia se muestra en la SEQ ID N°: 1.

Las composiciones de vacuna descritas precedentemente se pueden liofilizar y guardar en forma anhidra hasta el momento del uso, en cuyo momento se reconstituyen con un diluyente. Como alternativa, los diferentes componentes de la composición se pueden guardar por separado en un conjunto de elementos (cualquiera o todos los componentes pueden estar liofilizados) . Los componentes pueden permanecer en la forma liofilizada para una formulación seca o se pueden reconstituir para las formulaciones liquidas, y luego se pueden mezclar antes del uso o administrar por separado al paciente. En algunas formas de realización, las composiciones de vacuna se guardan en conjuntos de elementos en formulaciones liquidas y pueden venir con dispositivos de suministro, tales como jeringas equipadas con agujas. En otras formas de realización, las composiciones de vacuna liquidas se pueden guardar en los dispositivos de suministro en un conjunto de elementos. Por ejemplo, el conjunto de elementos puede comprender dispositivos de jeringas llenadas previamente, autoinyectores o lápices de inyección que contienen la formulación liquida de una composición de vacuna descrita en la presente.

La liofilización de vacunas es bien conocida en el arte. Típicamente el antígeno líquido se seca por congelamiento en la presencia de agentes para proteger al antígeno durante el proceso de liofilización y para obtener una torta con las características de polvo deseables. Los azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o lactosa (presentes a una concentración inicial de 10-200 mg/ml) , se usan comúnmente para la crioprotección de antígenos proteicos y para obtener una torta liofilizada con las características de polvo deseables. La liofilización de las composiciones teóricamente da como resultado en una composición más estable.

La cantidad de antígeno en cada composición de vacuna se selecciona como aquella cantidad que induce una respuesta inmune robusta sin efectos secundarios adversos significativos. Dicha cantidad puede variar dependiendo de los antígenos específicos empleados, la ruta de administración y los adyuvantes utilizados. En general, la dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención debería ser suficiente para obtener una respuesta inmune protectora en el paciente en el tiempo, o para inducir la producción de anticuerpos específicos del antígeno. Por consiguiente, la composición se administra a un paciente en una cantidad suficiente como para generar una respuesta inmune a los antígenos específicos y/o para prevenir, aliviar, reducir o curar los síntomas y/o las complicaciones debidas a la enfermedad o infección, y por consiguiente reducir o detener la dispersión de un brote de Norovirus en una población. La cantidad adecuada para lograrlo se define como una "dosis terapéuticamente eficaz".

Las composiciones de vacuna de la presente invención se puede administrar por una ruta no mucosa o mucosa. Estas administraciones pueden incluir la administración in vivo mediante inyección parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intradérmica e intramuscular) u otras rutas directas tradicionales, tales como las rutas bucal/sublingual, rectal, oral, nasal, tópica (tal como transdérmica y oftálmica) , vaginal, pulmonar, intraarterial, intraperitoneal , intraocular o intranasal o directamente en un tejido especifico. Otras rutas de administración adecuadas incluyen las vías transcutánea, subdérmica y con supositorio. En una forma de realización, la vacuna se administra por una ruta de administración parenteral, tal como la ruta intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular. En determinadas formas de realización, la vacuna se administra por una ruta de administración intramuscular. La administración se puede llevar a cabo simplemente por administración directa usando una aguja, un catéter o un dispositivo relacionado (por ejemplo jeringas llenadas previamente o autoinyectores) , en un único punto de tiempo o en múltiples puntos de tiempo. Otras formulaciones parenterales se pueden administrar por via subcutánea o intradérmica utilizando métodos de suministro por microinyección o parches en la piel.

La presente invención provee métodos para generar inmunidad protectora contra los Norovirus en un sujeto que comprende administrar por via parenteral al sujeto no más de una sola dosis de una composición de vacuna de la invención, en donde dicha vacuna comprende VLP del genogrupo I y/o del genogrupo II de Norovirus como se describe en la presente, y opcionalmente por lo menos un adyuvante. En dichas formas de realización, la composición de una sola dosis induce un aumento de por lo menos tres veces del titulo de anticuerpos específicos de Norovirus en suero en comparación con el título en el ser humano antes de la administración de la composición. En algunas formas de realización, la composición de una sola dosis induce un aumento de por lo menos seis veces del título de anticuerpos específicos de Norovirus en suero en comparación con el título en el ser humano antes de la administración de la composición. En otras formas de realización, la composición de vacuna de dosis única induce un título de anticuerpos específicos de Norovirus en suero comparables al título de anticuerpos inducido por exposición a Norovirus vivos en una infección natural; es decir, un aumento de más de diez veces de anticuerpos séricos específicos de Norovirus en comparación con el título en el ser humano antes de la administración de la composición. En determinadas formas de realización, la composición de vacuna de dosis única induce el aumento en el título de anticuerpos específicos de Norovirus en suero dentro de los siete días después de la administración de la composición. Preferiblemente, la composición de vacuna de dosis única se administra por una ruta de administración intravenosa, subcutánea o intramuscular. En una forma de realización determinada, la composición de vacuna de dosis única se administra por vía intramuscular a dicho ser humano.

Según se describe en la presente, en algunas formas de realización, las composiciones de vacuna de dosis única adecuadas para su uso en el método comprenden no más que 150 µg de cada genogrupo I y/o genogrupo II de Norovirus. Por ejemplo, en algunas formas de realización, la composición de vacuna no comprende más que 150 µg, no más que 100 µg, no más que 50 xg, no más que 25 ig, no más que 15 ]iq o no más que 10 µg de las VLP del genogrupo I de Norovirus. En otras formas de realización, la composición de vacuna no comprende más que 150 µg, no más que 100 µg, no más que 50 µg, no más que 25 µg, no más que 15 µg o no más que 10 \ig de las VLP del genogrupo II de Norovirus. En determinadas formas de realización, la composición de vacuna no comprende más que 50 µg de cada VLP del genogrupo I y del genogrupo II de Norovirus. En las formas de realización en las cuales la composición de vacuna de dosis única comprende VLP tanto del genogrupo I como del genogrupo II de Norovirus, la dosis de las VLP del genogrupo I y las VLP del genogrupo II de Norovirus pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, en una forma de realización, la composición de vacuna pueden comprender no más que 50 µg de las VLP del genogrupo I de Norovirus y no más que 150 µ? de las VLP del genogrupo II de Norovirus. En otra forma de realización, la composición de vacuna pueden comprender no más que 25 g de las VLP del genogrupo I de Norovirus y no más que 50 µg de las VLP del genogrupo II de Norovirus. En otras formas de realización, la composición de vacuna pueden comprender no más que 15 µg de las VLP del genogrupo I de Norovirus y no más que 50 µg de las VLP del genogrupo II de Norovirus. En aún otras formas de realización, la composición de vacuna pueden comprender no más que 25 µg de las VLP del genogrupo I de Norovirus y no más que 150 µg de las VLP del genogrupo II de Norovirus.

En una forma de realización del método, el sujeto es un ser humano y la vacuna confiere protección contra uno o más síntomas de una infección por Norovirus. Aunque otros han descrito métodos para inducir una respuesta inmune con antígenos de Norovirus (véase la publicación de Patente de los EE.UU. N°: US 2007/0207526), los indicadores de una respuesta inmune protectora contra los Norovirus en seres humanos aún no han sido claramente identificados (Herbst-Kralovetz et al., (2010) Expert Rev. Vaccines 9(3), 299-307). A diferencia de las diferentes vacunas que actualmente cuentan con licencia en los EE.UU., donde la eficacia de la vacuna se correlaciona con los anticuerpos séricos, los estudios han mostrado que los marcadores de una respuesta inmune, tal como mayores títulos de anticuerpos de IgG contra el virus Norwalk en suero, no están asociados con una inmunidad protectora en seres humanos (Johnson et ai., (1990) J. Infectious Diseases 161: 18-21). Aún más, en otro estudio se examinó un desafío viral con Norwalk en seres humanos e indicó que la susceptibilidad a una infección por Norwalk era multifactorial e incluyó factores tales como el estado secretor y la respuesta inmune de memoria de mucosas (Lindesmith et al., (2003) Nature Medicine 9: 548-553).

Dado que no se puede cultivar el Norovirus in vitro, no existen actualmente ensayos de neutralización viral. Un ensayo funcional que se puede usar en lugar del ensayo de neutralización es el ensayo de inhibición de hemaglutinación (HAI) (véase el Ejemplo 1) . En el HAI se mide la capacidad de una vacuna contra anticuerpos inducidos por Norovirus para inhibir la aglutinación de glóbulos rojos recubiertos con antígeno por las VLP de Norovirus porque dichas VLP de Norovirus se unen a los antígenos de los glóbulos rojos (por ejemplo antígenos de grupo histológico sanguíneo) . Este ensayo también se conoce como ensayo de bloqueo de carbohidratos, ya que es indicativo de la capacidad funcional de los anticuerpos para bloquear la unión del virus o de las VLP a los carbohidratos de los antigenos de grupo sanguíneos sobre los glóbulos rojos. En este ensayo, se mezcla una cantidad fija de VLP de Norovirus con una cantidad fija de glóbulos rojos y suero de los sujetos inmunizados . ' Si la muestra de suero contiene anticuerpos funcionales, los anticuerpos se unirán a las VLP, inhibiendo de esa manera la aglutinación de los glóbulos rojos. Según se usa en la presente, los "anticuerpos funcionales" se refieren a los anticuerpos que pueden inhibir la interacción entre las partículas de Norovirus y los antígenos de glóbulos rojos. En otras palabras, el título de anticuerpos funcionales es equivalente al título de anticuerpos para antígenos de grupos histológicos sanguíneos (HBGA) o para el bloqueo de carbohidratos. El título en suero de anticuerpos funcionales específicos de Norovirus se pueden medir con el ensayo HAI descrito previamente. El título en suero de anticuerpos funcionales específicos de Norovirus también se pueden medir usando un ensayo basado en ELISA, en donde se une un antígeno de carbohidrato H a los pocilios de microtitulación y se detecta la unión de las VLP de Norovirus al antígeno H en la presencia de suero (véase el Ejemplo 1 y Reeck et al., (2010) J Infect Dis, volumen 202(8): 1212-1218). Un aumento en el nivel de anticuerpos funcionales específicos de Norovirus puede ser un indicador de la respuesta inmune protectora. Por consiguiente, en una forma de realización, la administración de la vacuna genera una inmunidad protectora que comprende un aumento en el titulo en suero de anticuerpos funcionales específicos de Norovirus en comparación con el título en suero en un ser humano que no recibió la vacuna. El título en suero de los anticuerpos funcionales específicos de Norovirus indicativo de una respuesta inmune protectora preferiblemente es una media geométrica del título mayor que 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 medida con el ensayo HAI o título de bloqueo (BT)so (50% de inhibición de la unión del antígeno H por las VLP de Norovirus) , media geométrica del título mayor que 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ó 500 medida en el ensayo de unión al antígeno H. En una forma de realización, el título en suero de los anticuerpos funcionales específicos de Norovirus es una media geométrica del título mayor que 40, medida con el ensayo HAI. En otra forma de realización, el título en suero de los anticuerpos funcionales específicos de Norovirus es una media geométrica del título mayor que 100, medida con el ensayo HAI. En otra forma de realización, el título en suero de los anticuerpos funcionales específicos de Norovirus es una media geométrica BT50 del título mayor que 100, medida con el ensayo de unión al antígeno H. En aún otra forma de realización, el título en suero de los anticuerpos funcionales específicos de Norovirus es una media geométrica BT5o del título mayor que 200, medida con el ensayo de unión al antígeno H.

En un aspecto adicional, la administración de la vacuna genera una inmunidad protectora que. comprende una respuesta inmune de IgA en mucosa y una respuesta inmune de IgG sistémica por administración parenteral (preferiblemente intramuscular) al sujeto de no más de una sola dosis de una composición antigénica o de vacuna que comprende uno o más tipos de antígenos de Norovirus y opcionalmente por lo menos un adyuvante eficaz. Los inventores han encontrado sorprendentemente que la administración parenteral de las composiciones de vacuna contra los Norovirus descritas en la presente induce una respuesta de IgA robusta además de una fuerte respuesta de IgG. Típicamente, las respuestas de IgA fuertes solo se observan cuando las vacunas se administran por una ruta de administración en mucosas.

En determinadas formas de realización, la administración de la vacuna genera una inmunidad protectora que comprende un aumento en el nivel de células secretoras de anticuerpos de IgA específicos de Norovirus en la sangre en comparación con el nivel en un ser humano que no recibió la vacuna. En algunas formas de realización, la administración de la vacuna genera una inmunidad protectora que comprende un aumento en el nivel de células secretoras de anticuerpos de IgA específicos de Norovirus en la sangre en comparación con el nivel en el ser humano antes de recibir la vacuna. En una forma de realización, las células secretoras de anticuerpos de IgA específicos de Norovirus son CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L+ y a4ß7+. Las células secretoras de anticuerpos con este perfil marcador tienen la capacidad de migrar tanto hacia el tejido linfoide periférico, tal como el parche de Peyer en el intestino, como hacia el tejido linfoide de las mucosas, tal como la mucosa del intestino. En una forma de realización, el número de células secretoras de anticuerpos de IgA CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L+ y 4ß7+ es mayor que aproximadamente 500, aproximadamente 700, aproximadamente 1.000, aproximadamente 1.500 o mayor que aproximadamente 2.000 células por 1 x 106 monocitos de sangre periférica. En otra forma de realización, las células secretoras de anticuerpos de IgA específicos de Norovirus son CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L- y a4ß7+. Las células secretoras de anticuerpos con este perfil marcador generalmente sólo migran hacia sitios de las mucosas y pueden ser indicativos de una respuesta de células B de memoria. En algunas formas de realización, en las cuales la vacuna se administra por vía intramuscular, el número de células secretoras de anticuerpos de IgA CCR10+, CD19+, CD27+, CD62L- y a4ß7+ es mayor que aproximadamente 5.000, aproximadamente 6.500, aproximadamente 7.000, aproximadamente 10.000, aproximadamente 13.000, aproximadamente 15.000, o mayor que aproximadamente 20.000 células por 1 x 106 monocitos de sangre periférica.

Se han observado hallazgos similares con las vacunas para otros virus, tal como un rotavirus. En el caso de las vacunas contra rotavirus, existe una controversia acerca de si los anticuerpos en suero están involucrados directamente en la protección o si meramente reflejan una infección reciente (Jiang, 2002/ Franco, 2006) . La definición de tales correlaciones de protección es particularmente difícil en el contexto de las enfermedades de diarrea, tales como por rotavirus o norovirus, donde los estudios preclínicos que infieren la protección pueden ser de múltiples facetas, con contribuciones de inmunidad mucosa (tal como con IgA intestinal) , elaboración de citoquina e inmunidad mediada por células. La dificultad de medir tales respuestas inmunes durante el desarrollo clínico, y la falta de correlación con las mediciones de anticuerpos en suero, requieren que la eficacia de una vacuna para estos tipos de virus solamente pueda demostrarse mediante experimentos de desafío clínico en humanos .

Según se mencionó previamente, la administración de una composición de vacuna de la presente invención previene y/o reduce por lo menos un síntoma de una infección por Norovirus. Los síntomas de una infección por Norovirus son bien conocidos en el arte e incluyen náuseas, vómitos, diarrea y calambres de estómago. Adicionalmente, un paciente con una infección por Norovirus puede sufrir de un grado bajo de fiebre, cefalea, escalofríos, dolor muscular y fatiga. La invención también abarca un método para inducir una respuesta inmune protectora en un sujeto que experimenta una infección por Norovirus mediante la administración al sujeto de una formulación de vacuna de la invención de manera tal que se alivia y/o reduce por lo menos un síntoma asociado con la infección por Norovirus. La reducción de un síntoma se puede determinar subjetivamente u objetivamente, por ejemplo, por autoevaluación por un sujeto, por evaluación de un médico clínico o mediante un ensayo o una medición apropiada (por ejemplo, la temperatura corporal) , incluyendo, por ejemplo, la evaluación de la calidad de vida, la progresión lenta de una infección por Norovirus o de síntomas adicionales, la severidad reducida de los síntomas del Norovirus o ensayos adecuados (por ejemplo, título de anticuerpos, detección de antígenos con RT-PCR y/o un ensayo de activación de células T o B) . Una respuesta eficaz también se puede determinar mediante medición directa (por ejemplo, con RT-PCR) de la carga viral en muestras de heces, lo cual refleja la cantidad de virus desprendida de los intestinos) . La evaluación objetiva comprende evaluaciones tanto en animales como en humanos .

La invención también provee un método para generar anticuerpos contra uno o más antigenos de Norovirus, donde dicho método comprende la administración de una composición de vacuna de la invención descrita previamente a un sujeto. Estos anticuerpos se pueden aislar y purificar mediante métodos que son de rutina en el arte. Los anticuerpos aislados específicos de los antígenos de Norovirus se pueden usar en el desarrollo de ensayos de diagnóstico inmunológicos . Estos ensayos se podrían emplear para detectar Norovirus en muestras clínicas y para identificar el virus particular que causa la infección (por ejemplo Norwalk, Houston, Snow Mountain, etc.). Como alternativa, los anticuerpos aislados pueden administrarse a sujetos susceptibles a una infección por Norovirus para conferir una inmunidad pasiva o de corto plazo.

A continuación la invención se ilustrará con mayor detalle con referencia a las formas de realización específicas que se describen en los siguientes ejemplos. Los ejemplos son puramente ilustrativos de la invención y no pretenden limitar su alcance en modo alguno.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Estudio de escalado de dosis, seguridad e inmunogenicidad de vacuna de partícula similar a virus de Norovirus intramuscular bivalente en humanos (Estudio LV03-104) , Cohorte A Este ejemplo describe la Cohorte A de un estudio randomizado, multisitio, con escalado de dosis de la seguridad e inmunogenicidad de cuatro niveles de dosificación de una vacuna bivalente intramuscular (IM) de VLP de Norovirus con adyuvante de lipido monofosforil A ( PL) e hidróxido de aluminio (A10H) en comparación a placebo en sujetos adultos. En la cohorte se enrolaron aproximadamente 48 sujetos entre 18 y 49 años de edad. Los sujetos recibieron dos dosis de la vacuna o placebo, por inyección intramuscular (IM), 28 dias después usando una aguja de 1,5 pulgadas (38 mm) .

La vacuna bivalente de VLP de Norovirus contenia las VLP genogrupo I, genotipo 1 (GI.l) y genogrupo II, genotipo IV (Gil.4) como antigenos, y lipido monofosforil A (MPL) e hidróxido de aluminio (A10H) como adyuvantes, cloruro de sodio (NaCl) y L-histidina (L-His) como solución amortiguadora (pH entre 6,3 y 6,7), etanol y agua para inyección. La composición de la vacuna bivalente intramuscular de VLP de Norovirus se resume en la Tabla 1.

Las VLP Gil.4 comprendieron una secuencia de cápside de SEQ ID NO: 1, que se derivó de tres cepas Gil. .

Tabla 1. Composición del producto farmacológico final para cuatro formulaciones de vacuna bivalente IM de VLP de Norovirus cada 0,5 MI * como hidróxido de aluminio El placebo fue solución salina estéril normal para inyección (NaCl 0,9% y libre de conservantes). El escalado de dosis de la vacuna se realizó como a continuación: luego del tamizaje apropiado de buena salud, los sujetos en la Cohorte A se enrolaron secuencialmente en cada uno de los cuatro grupos de dosificación de aproximadamente 12 sujetos cada uno (Grupos de dosificación Al, A2, A3 y A4 ) . Los grupos de dosificación Al, A2, A3 y A4 representan dosificaciones antigénicas bivalentes de 5/5 µq, 15/15 \iq, 50/50 \iq y 150/150 µg, respectivamente, del norovirus GI .1 y Gil.4. Los sujetos en cada grupo de dosificación se randomizaron 5:1 para recibir vacuna o placebo. Los sujetos en el Grupo de dosificación Al recibieron su respectivo tratamiento de randomización (10 sujetos recibieron 5/5 µg de vacuna y 2 sujetos recibieron placebo) . Los sujetos fueron seguidos para evaluación de seguridad por revisión de los síntomas registrados en el ayuda memoria (Días 0-7) e historias clínicas internas de las Visitas del Día 7, 21, 28, 35 y 56. Los datos de seguridad fueron revisados por el Monitor de Seguridad Central (CSM) . Luego de estar disponibles los datos de seguridad de 7 días después de la dosis 2 (Día de estudio 35) para revisión de sujetos en el Grupo de dosificación Al y que fueron consideraron aceptables, los sujetos en el Grupo de dosificación A2 fueron elegibles para recibir su dosis inicial. La misma regla se aplicó para la dosificación en los otros grupos de dosificación; es decir, luego de estar disponibles los datos de seguridad de 7 días luego de la dosis 2 (Día de estudio 35) para revisión de un grupo de dosificación, el siguiente grupo de dosificación fue elegible para recibir la dosis inicial .

Al final del enrolamiento en la Cohorte A, aproximadamente 10 sujetos en cada Grupo de dosificación recibieron vacuna (total de 40 vacunas) y 2 sujetos en cada uno de los grupos recibieron solución salina (total de aproximadamente 8 receptores control de solución salina) .

Los sujetos llevaron el registro en un ayuda memoria diario de los síntomas solicitados que incluyen cuatro reacciones en el sitio de inyección local, tal como dolor, sensibilidad al contacto, coloración rojiza e hinchazón, y 10 signos o síntomas sistémicos que incluyen temperatura oral diaria, dolor de cabeza, fatiga, dolores musculares, escalofríos, dolores de articulaciones y síntomas gastrointestinales de náuseas, vómitos, diarrea, calambres/dolor abdominales para los Días 0 a 7 luego de cada dosis de vacuna bivalente IM de VLP de Norovirus o control. La coloración rojiza e hinchazón en el sitio de inyección se midió y se registró diariamente durante los 7 días luego de cada inyección.

Las historias clínicas internas se obtuvieron en cada visita de seguimiento en los Días 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14 y 393+14 y en la llamada telefónica de seguimiento en el Día 265 +14; los sujetos fueron cuestionados sobre enfermedad, visitas al doctor, cualquier evento adverso serio (SAE) , e inicio de cualquier condición médica nueva significativa durante el período. Los sujetos tuvieron un CBC con recuento diferencial de WBC y plaquetas, y BUN sérico, creatinina, glucosa, AST y ALT evaluados durante el tamizaje a los Días 21 y 35 aproximadamente 7 días después de cada dosis) para evaluar la continua elegibilidad y seguridad, respectivamente.

Se recolectó sangre de sujetos antes de la vacunación en el Día 0 y a los Días 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14 y 393 +14 para medir los anticuerpos séricos (IgG, IgA e IgM separadamente y combinados) contra la vacuna bivalente IM de VLP de Norovirus por ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA) . También se midieron la actividad de bloqueo de hidratos de carbono séricos y los anticuerpos HAI séricos. Para los sujetos en la Cohorte A, se ensayaron las células secretoras de anticuerpo (ASC) , marcadores de migración, células B de memoria y respuestas inmunes celulares.

Se usaron los siguientes métodos para analizar las muestras de sangre recolectadas de individuos inmunizados o individuos que recibieron el placebo.

Medidas de anticuerpo sérico por ELISA Las medidas por ELISA de anticuerpos dirigidos contra los Norovirus se realizaron para todos los sujetos, usando VLP de Norovirus purificadas recombinantes (GI.l y Gil.4 separadamente) como antigenos blanco para tamizar las muestras codificadas. Brevemente, Se usaron VLP de norovirus en solución amortiguadora de recubrimiento de carbonato de pH 9,6 para recubrir placas para microtitulación . Las placas recubiertas se lavaron, se bloquearon y se incubaron con diluciones en serie de dos veces de suero de prueba seguido por lavado e incubación con los reactivos de anticuerpo secundario conjugado a enzima específicos para IgG total, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgM humanas. Se agregaron soluciones de sustrato apropiadas, se desarrolló color, se leyeron las placas y se determinaron los títulos de puntos de valoración para IgG, IgA e IgM en comparación a una curva de estándar de referencia para cada clase de anticuerpo. Se determinaron la media geométrica de los títulos (G T) , los aumentos en veces de la media geométrica (GMFR) y tasas de serorespuesta para cada grupo. La serorespuesta se definió como un aumento de 4 veces en el título del anticuerpo en comparación a títulos previos a la inmunización.

Actividad bloqueadora de antígenos de grupo histológico de sangre (HBGA) de hidratos de carbono de Norovirus Se realizaron ensayos de bloqueo para medir la capacidad de los anticuerpos séricos para inhibir la unión de VLP de NV a los hidratos de carbono sintéticos tipo H 1 o tipo H 3 de acuerdo a lo previamente descrito (Reeck et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202 ( 8 ): 1212-1218 ) . Brevemente, se incubaron las VLP de NV para los ensayos de bloqueo con un volumen igual de suero, y se diluyeron en series de dos veces a partir de una dilución de inicio de 1:25. Se lavaron placas para microtitulación de 96 pocilios, recubiertas con Neutravidina, y se recubrieron con 2,5 µg/mL de PAA-biotina tipo H 1 polivalente sintética o PAA-biotina tipo H 3 polivalente. Se agregaron soluciones de suero-VLP. Las placas se lavaron y se agregó suero policlonal de conejo especifico para las VLP de NV, se lavaron, y luego se incubaron con IgG de cabra anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante. El color se desarrolló con sustrato liquido para peroxidasa tetrametilbenzidina y se detuvo con ácido fosfórico 1M. Se midió la densidad óptica a 450. Se realizaron controles positivo y negativo. Se determinaron los títulos de bloqueo del 50 por ciento (BT50), definidos como el título al cual las lecturas de OD (luego de la sustracción del blanco) fueron el 50% del control positivo. Se asignó un valor de 12,5 a las muestras con una BT50 menor de 25. Se determinaron los títulos de la media geométrica (GMT) , aumentos en veces de la media geométrica (GMFR) y tasa de serorespuesta para cada grupo. La serorespuesta se definió como un aumento de 4 veces el titulo de anticuerpo en comparación a los títulos previos a la inmunización. Se usó una muestra de suero control de bloqueo como control interno. Se realizó un ensayo para confirmar la especificidad del bloqueo usando el mismo protocolo para el ensayo de bloqueo con las siguientes excepciones: luego del recubrimiento con hidrato de carbono, se incubó el suero directamente en la placa sin preincubar primero con VLP. Luego del lavado, las VLP se incubaron en la placa y se realizó la detección como para el ensayo de bloqueo.

Ensayo de inhibición por anticuerpos de la hemaglutinación (HAI) por Norovirus Se examinaron los anticuerpos inducidos por vacuna para estudiar la capacidad de inhibir la hemaglutinación de RBC humanos tipo 0 por las VLP de norovirus como se describió previamente (El Kamary et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(11): 1649-58). Los títulos de HAI se calcularon como la inversa de la mayor dilución que inhibió la hemaglutinación con un patrón de RBC negativo compacto y se presentan como GMT, GMFR y = aumentos de 4 veces.

Las VLP de Norovirus GI .1 y Gil.4 se diluyeron serialmente por separado y se incubaron con un volumen igual de una suspensión 0,5% de RBC humanos en una placa de 96 pocilios con fondo en V. La cantidad de antígenos de VLP de norovirus correspondiente a 4 unidades de HA se determinó y se confirmó por titulación por retroceso. Los sueros de prueba se inactivaron por calor a 56 °C durante 30 minutos y se trataron con suspensión preparada fresca de caolin al 25%. Para eliminar los inhibidores séricos, las muestras de prueba se preadsorbieron con RBC. Los ensayos de HAI se realizaron como a continuación: se agregaron los sueros pretratados (diluidos 2 veces en PBS pH 5,5) a placas de 96 pocilios en V y se incubaron con un volumen igual de antigeno VLP de Norovirus GI .1 y Gil.4, respectivamente, que contenia 4 unidades de HA. Se agregó una suspensión de RBC al 0,5% a cada pocilio y se incubaron las placas durante 90 minutos adicionales a 4 °C. Los pocilios que contenían solo PBS o antígeno sin suero sirvieron como controles negativos y positivos, respectivamente. Se determinaron las medias geométricas de los títulos (GMT) , aumentos en veces de la media geométrica (GMFR) y tasas de serorespuesta para cada grupo. La serorespuesta se definió como un aumento de 4 veces en el título de anticuerpo respecto a los títulos previos a la inmunización.

Ensayo de células secretoras de anticuerpos Las PBMC se aislaron de aproximadamente 60 mL de sangre anticoagulada en los Días 0, 7+3, 28+3 y 35+3 luego de la administración de vacuna bivalente IM de VLP de Norovirus o placebo. Se obtuvieron aproximadamente 25 mL de sangre para ensayos de PBMC frescas y 35 mL de sangre para criopreservación de PBMC. Los ensayos de ASC detectan las células que secretan anticuerpos dirigidos contra las VLP de norovirus (Tacket et al. (2000) J. Infect. Dis . , Vol. 182:302-305; Tacket et al. (2003) Clin. Immunol., Vol. 108:241-247; El Kamary et al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(11): 1649-58). Las PBMC frescas se evaluaron según la frecuencia y determinación de ASC de marcadores de migración de un subconjunto de sujetos. Se evaluaron las PBMC de sujetos participando en la Cohorte A según la frecuencia de ASC. Se describe la tasa de respuesta y media del número de ASC cada 106 PBMC en cada punto de tiempo para cada grupo. Una respuesta positiva se define como un recuento de ASC luego de la vacunación cada 106 PBMC que está al menos 3 desviaciones estándares (SD) por encima de la media del recuento para todos los sujetos (en métrica de logaritmo) y al menos 8 puntos de ASC, que corresponde con la media de los pocilios controles negativos estimulados con medio (2 puntos) más 3 SD como se determinó en ensayos similares.

Medida de células B de memoria especificas por el virus Norovirus Se recolectó sangre anticoagulada solo en sujetos de la Cohorte A (aproximadamente 25 mL en los Dias 0, 28, 56 y 180) para medir las células B de memoria en los Días 0, 28, 56 y 180 luego de la vacunación usando un ensayo ELISpot precedido por estimulación in vitro por antigeno (Crotty et al. (2004) J. Immunol. ethods, Vol. 286:111-122.; Li et al. (2006) J. Immunol. Methods, Vol. 313:110-118). Se incubaron las células mononucleares de sangre periférica (5xl06 células/mL, 1 mL/pocillo en placas de 24 pocilios) durante 4 días con antigenos de VLP de norovirus GI .1 y Gil.4 por separado para permitir la expansión clonal de las células B de memoria especificas de antigeno y la diferenciación a células secretoras de anticuerpo. Los controles incluyeron células incubadas en las mismas condiciones en ausencia de antigeno y/o células incubadas con antigeno no relacionado. Luego de la estimulación, las células se lavaron, se contaron, y se transfirieron a placas de ELISpot recubiertas con VLP de Norwalk. Para determinar la frecuencia de células B de memoria especificas de virus por total linfocitos B secretores de Ig, también se agregaron células B expandidas a los pocilios recubiertos con anticuerpos IgG anti-humano e IgA anti-humano. Los anticuerpos unidos se revelaron con IgG anti-humano o IgA anti-humano marcada con HRP seguido por el sustrato apropiado. Los conjugados a las subclases IgA e IgG (IgAl, IgA2 e IgGl-4) también se usaron para determinar las respuestas a subclases especificas de antigeno que pueden estar relacionados con diferentes mecanismos efectores y lugares de sensibilización inmune. Los puntos se contaron con un lector de ELISpot. Las poblaciones de células expandidas para cada sujeto se examinaron por citometria de flujo para confirmar su fenotipo de célula B de memoria, es decir CD19+, CD27+, IgG+, IgM+, CD38+, IgD, entre otros (Crotty et al. (2004) J. Immunol. Methods, Vol. 286:111-122.; Li et al. (2006) J. Immunol. Methods, Vol. 313:110-118).

Respuestas inmunes celulares Se recolectó sangre anticoagulada (aproximadamente 25 mL en los Días 0, 28, 56 y 180) de sujetos en la Cohorte A como muestras codificadas y las PBMC aisladas y criopreservadas en nitrógeno liquido para una posible evaluación futura de respuestas CMI a antigenos de VLP de norovirus GI.l y Gil.4. Los ensayos que se realizan incluyen respuestas proliferativas de PBMC y citoquinas contra los antigenos de VLP de norovirus GI.l y Gil.4 por medida de los niveles de interferón (IFN)-y e interleuquina (IL)-4 entre otros de acuerdo a técnicas establecidas (Samandari et al. (2000) J. Immunol., Vol. 164:2221-2232; Tacket et al. (2003) Clin. Immunol., Vol. 108:241-247). También se evaluaron las respuestas de células T.

Resultados La evaluación de seguridad incluyó síntomas solicitados locales y sistémicos durante 7 días y síntomas no solicitados durante 28 días luego de cada dosis. Los eventos adversos serios son monitoreados durante 12 meses. La inmunogenicidad se evaluó con suero obtenido antes y después de cada vacunación para anticuerpos Pan-ELISA (IgG, IgA e IgM combinados) y células mononucleares de sangre periférica (PB C) para células secretoras de anticuerpos (ASC) IgG e IgA por medio de ELIspot.

Los cuatro grupos de dosificación han sido enrolados para la Cohorte A con los datos de seguridad luego de la dosis dos disponibles de los cuatro grupos de dosificación (40 vacunas en total). Entre las 40 vacunas, los síntomas locales más comunes informados luego de cada dosis estuvieron el dolor o sensibilidad al tacto, mientras que la hinchazón o coloración rojiza fue menos frecuente. No se informaron síntomas locales severos. Los síntomas sistémicos de dolor de cabeza, mialgia o malestar luego de cada dosis se informaron en menos de la mitad de las vacunas. Ninguna vacuna se reportó con fiebre. No se informaron SAE relacionados.

Como se muestra en las Figuras 1-3, se observaron respuestas de anticuerpos Pan-ELISA robustas anamnésticas (IgG, IgA e IgM combinadas) para ambos antígenos de VLP 7 días después de la primera dosis de de la dosificación menor (VLP 5 de GI .1 + 5 pg de Gil.4). La segunda dosis no potenció las respuestas luego de la dosis uno. Se observaron resultados similares para las respuestas de IgG sérica e IgA sérica especificas de antigeno medidas por separado (Figuras 4-9) . Las respuestas dependientes de la dosis se observaron para las respuestas de anticuerpos para ambos antigenos (Figuras 1-9) . Sin embargo, la respuesta máxima a la VLP de GI.l pareció alcanzarse con una dosis menor que la de la respuesta máxima a la VLP de Gil.4 (15 yg vs . 50 ug) . interesantemente, la dosis única de la vacuna bivalente administrada intramuscularmente de Norovirus indujo un titulo de anticuerpo especifico de antigeno sorprendentemente y significativamente mayor que el titulo inducido por las dos dosis de una vacuna de VLP monovalente administrada intranasalmente que comprende una dosis de VLP 20 veces mayor (Figura 10; comparar el grupo 5 µg de LV03-104 con el grupo 100 µg de LV01-103) . Adicionalmente, la dosis baja (5 yg) , de vacuna bivalente IM de Norovirus produjo un titulo de anticuerpo especifico de Norovirus similar al inducido en humanos expuestos al Norovirus nativo (Figura 10) .

También se observaron respuestas robustas de ELIspot de IgG e IgA a los 7 días luego de la primera dosis de la dosificación menor (5 \ig) para ambos antigenos de VLP (Tabla 2) . Notablemente, las respuestas de células secretoras de anticuerpo (ASC) se desplazaron hacia IgA vs. IgG y las ASC exhibieron un fenotipo de migración a mucosas (alfa 4/beta7) y receptor de quimoquina (CCR10) evaluado por citometria de flujo (Figura 11; Tabla 3) . Como se muestra la Tabla 3, un mayor número de ASC exhiben marcadores de migración a mucosa (beta 7+, CD62L-) en comparación con marcadores de migración duales a mucosa/periféricos (beta 7+, CD62L+) . La Tabla 4 muestra el porcentaje de células B de memoria cada 106 de monocitos de sangre periférica que responden a los antigenos de VLP. Un mayor porcentaje de células B especificas de antigeno también expresan marcadores de migración a mucosa en comparación con los marcadores duales a mucosa/periféricos o periféricos. También se observaron respuestas similares en receptores que recibieron las dosis de 15 µg y 50 µg (Tablas 2-4).

Tabla 2. Día 7, Caracterización de la respuesta de PBMC. Aproximación de anticuerpo Células secretoras (ASC) /millón de células CD19+.

Tabla 3. Marcadores de ASC en receptores de vacuna y placebo por citometria de flujo-Dia 7 * Asume que la mayoría de las ASC son especificas por norovirus .

Tabla 4. Respuestas de células B de memoria en receptores de vacuna y placebo-Día 7 E specí ico P de vacuna. orcentaja Total de P or millón E de % de * D27+, de células* speo fico da CD27+, CD27+, CD38+ , C de vacuna. células CD38+, CD38+, CD138+, D27+, Porcentaje B CD19+ CD138+, CD138+, CCR10+ , CD38+, de totales CCR10+ CCR10+ Bata 7+ CD138+, migración a que son Beta Beta CD62L(+)t(- CCR10+, mucoea de CD27+, 7+, 7·*, ) de Beta 7+ BMC CD38+ , C062L- CD62L+ memoria CD62L(+) circulantes CD138+ totales totales totales ) totales* Media geométrica de Al con dosis de Media geométrica de A2 con dosis de 15 (n Desviación estándar de A2 con dosis de 15 Media geométrica de A3 con dosis de 50 ug (n * Se asume que la mayoría de las ASC son específicas por norovirus .

En ausencia de un ensayo de neutralización viral directo disponible debido a la incapacidad de cultivar Norovirus in vitro, se realizaron ensayos funcionales que sirvieron como sustitutos para los ensayos de neutralización viral para medir los anticuerpos funcionales en vacunas.

Usando el ensayo de actividad bloqueadora del antígeno H de hidratos de carbono descrito anteriormente, se midió la inhibición de la unión de VLP de GI .1 al antígeno H mediada por los anticuerpos séricos inducidos por la vacuna. Los datos se presentan como aumento en veces de la media geométrica (GMFR) y serorespuesta (aumento de 4 veces) en la Tabla 5, y como media geométrica del título (GMT) en la Tabla 6. Sorprendentemente, luego de solo una inyección intramuscular de la formulación para vacuna, se observó significativa actividad bloqueadora de hidratos de carbono en todos los grupos de dosis; de hecho, la administración de una segunda dosis de vacuna no aumentó significativamente la actividad bloqueadora en comparación a los niveles luego de la dosis 1. La inhibición de la actividad de unión se mantuvo durante todo el periodo de prueba, hasta 56 días luego de la dosis 1.

Tabla 5. Actividad bloqueadora de hidratos de carbono (HBGA BT50) , aumento en veces de la media geométrica (GMFR) y serorespuesta (aumento de 4 veces) de anti-Norovirus GI .1 Resultados basados en todos los sujetos que recibieron ambas dosis del producto del estudio.

Se excluyen puntos de datos de dos sujetos debido a una posible mezcla de muestras; uno de estos puntos de datos es una muestra basal que resulta en que el sujeto no tenga datos de aumento en veces para ningún punto en el tiempo.

Tabla 6. Actividad blo ueadora de hidratos de carbono (HBGA BT50) , media geométrica del titulo (GMT) de anti-Norovirus 61.1 Resultados basados en todos los sujetos que recibieron ambas dosis del producto del estudio.

Se excluyen puntos de datos de dos sujetos debido a una posible mezcla de muestras.

Similarmente, se midió la actividad bloqueadora de hidratos de carbono de anticuerpos séricos dirigidos contra VLP de Gil.4. Se observó una respuesta significativa en todos los grupos de dosificación medido por GMFR y serorespuesta (Tabla 7) asi como GMT (Tabla 8) . Similar al bloqueo mediado por anticuerpos de la unión de GI.l descrito anteriormente, se detectó un bloqueo robusto de la actividad de unión a hidrato de carbono de VLP de Gil.4 luego de solo una dosis, y una segunda dosis no pareció potenciar la actividad bloqueadora .

Tabla 7. Actividad bloqueadora de hidratos de carbono (HBGA BT50) , alimento en veces de la media geométrica (GMFR) y serorespuesta (alimento de 4 veces) de anti- orovirus Gil .4 Resultados basados en todos los sujetos que recibieron ambas dosis del producto del estudio.

Se excluyen puntos de datos de dos sujetos debido a una posible mezcla de muestras; uno de estos puntos de datos es una muestra basal que resulta en que el sujeto no tenga disponibles datos de aumentos en veces para ningún punto en el tiempo.

Tabla 8. Actividad bloqueadora de hidratos de carbono (HBGA BT50) , media geométrica del titulo (GMT) de anti- Norovirus 611.

Resultados basados en todos los sujetos que recibieron ambas dosis del producto del estudio.

Los ensayos de inhibición de hemaglutinación (HAI) también se utilizaron para probar la respuesta de anticuerpos séricos de sujetos vacunados contra los antigenos VLP de Norovirus blanco. De manera similar a los estudios de antigeno H de hidratos de carbono, solo una dosis de vacuna de VLP indujo anticuerpos que inhibieron la hemaglutinación en todos los grupos de dosificación, medido por GMFR (Tabla 9), aumento de 4 veces (Tabla 9) y GMT (Tabla 10). Aunque el nivel de inhibición de hemaglutinación se mantuvo hasta el último dia ensayado (28 días luego de la dosis 2, 56 días luego de la dosis 1) , la segunda dosis de vacuna de VLP no pareció aumentar la inhibición de hemaglutinación mediada por anticuerpos inducidos por la vacuna.

Tabla 9. Ensayo de inhibición de hemaglutinación , aumento en veces de la media geométrica (GMFR) y serorespuesta (aumento de 4 veces) de anti-Norovirus GI.l Resultados basados en todos los sujetos que recibieron ambas dosis del producto del estudio.

Tabla 10. Ensayo de inhibición de hemaglutinación . Media geométrica del titulo (GMT) de anti-Norovirus GI .1 Resultados basados en todos los sujetos que recibieron ambas dosis del producto del estudio.

La inhibición de la hemaglutinación se produjo cuando la VLP blanco era un virus no coincidente. Los anticuerpos séricos inducidos por la vacuna inhibieron la hemaglutinación por una VLP de una cepa de virus Houston, medido por GMFR y serorespuesta (Tabla 11) asi como GMT (Tabla 12) . En este caso, las mayores dosis de vacuna de VLP lograron respuestas más fuertes, particularmente medido por el aumento de 4 veces o GMT. El GMFR y el aumento de 4 veces también aumentaron significativamente cuando la VLP blanco fue la cepa del virus Cincinnati 2003, medido justo 7 días luego de la dosis 1 (Tabla 13) .

Tabla 11. Ensayo de inhibición de hemaglutinación (VLP de cepa de virus Houston) , alimento en veces de la media geométrica (GMFR) y serorespuesta (aumento de 4 veces) de anti-Norovirus 611.4 Resultados basados en todos los sujetos que recibieron ambas dosis del producto del estudio, Se excluyen puntos de datos de dos sujetos debido a una posible mezcla de muestras; uno de estos puntos de datos es una muestra basal que resulta en que el sujeto no tenga disponibles datos de aumentos en veces para ningún punto en el tiempo.

Tabla 12. Ensayo de inhibición de hemaglutinacion (VLP de cepa de virus Houston) , titulo da media geométrica (GMT) de anti-Norovirus 611.4 Resultados basados en todos los sujetos que recibieron ambas dosis del producto del estudio.

Tabla 13. Inhibición de hemaglutinación en placebo versus vacuna de VLP 50/50 ]iq Ensayo de inhibición de hemaglutinación (VLP de cepa de virus Cincinnati 2003) , aumento en veces de media geométrica (G FR) y serorespuesta (aumento de 4 veces) de anti-Norovirus Gil.4 Resultados por grupo de tratamiento 7 Dias luego de la dosis 1 Grupo de N GMFR (IC Alimento tratamiento del 95%) de 4 veces (IC del 95%) Placebo 2 1,0 (0,6, 0,0 (0,0, 1,8) 84,2) Vacuna de VLP 10 4,4 (1,6, 50, 0 50/50 11,9) ¦ (18,7, 81,3) Los resultados de este estudio demostraron que la vacuna de VLP IM de IM de Norovirus bivalente fue en general bien tolerada. Los datos de inmunogenicidad sugirieron que una dosis de vacuna única puede ser suficiente para proteger los adultos humanos seropositivos . Los resultados de los ensayos de actividad bloqueadora de hidratos de carbono y de inhibición de hemaglutinación proveyeron evidencia adicional de que una dosis de vacuna única indujo anticuerpos séricos con actividad potente anti-Norovirus. La magnitud y rapidez de las respuestas inmunes observadas luego de una dosis parenteral única en humanos fueron dramáticas cuando se compararon con respuestas inmunes anteriores por administraciones de vacunas de VLP nasales múltiples con dosificaciones de VLP mucho mayores (El Kamary efc al. (2010) J Infect Dis, Vol. 202(11): 1649-1658). Estas respuestas fueron también superiores a aquellas inducidas por las VLP de Norovirus administradas oralmente (Tacket et al. (2003) Clin Immunol 108:241-247; Ball et al. (1999, Gastroenterology 117:40-48) asi como aquellas inducidas por VLP de Norovirus producidas por plantas transgénicas (Tacket et al. (2000) J Infect Dis 182:302-305). En particular, esta formulación para vacuna intramuscular produjo respuestas anamnésticas dentro de los siete días de inmunización y se observaron respuestas máximas de anticuerpos séricos luego de una dosis única, que incluyen una respuesta de IgA significativa y actividad bloqueadora funcional de hidratos de carbono y actividad de inhibición de hemaglutinación . Por lo tanto, esta vacuna bivalente de Norovirus indujo una respuesta inmune fuerte, protectora, en humanos que fue superior a las respuestas inmunes inducidas por cualquier vacuna de Norovirus disponible .

Ejemplo 2. Estudio de escalado de dosis, seguridad e inmunogenicidad de vacuna intramuscular de partícula similar a virus (VLP) de Norovirus bivalente en humanos (estudio LV03-104) El siguiente ejemplo provee la porción planeada remanente del estudio clínico descrito en el Ejemplo 1, en donde se realizó un estudio randomizado, multisitio, con escalado de dosis en adultos = 18 años de edad para la seguridad e inmunogenicidad de cuatro niveles de dosificación de una vacuna intramuscular (I ) bivalente de VLP de Norovirus con lípido monofosforil A ( PL) e hidróxido de aluminio (A10H) como adyuvante, en comparación a placebo. Los sujetos recibirán dos dosis de la vacuna o placebo, por inyección intramuscular (IM), separadas 28 días usando una aguja de 1,5 pulgadas (38 mm) . Este ejemplo tiene como intención ilustrar adicionalmente los principios de la presente invención.

La cohorte A ha completado el enrolamiento en el estudio y se describió anteriormente en el Ejemplo 1. La Cohorte B contiene aproximadamente 20 sujetos de entre 50 y 64 años de edad. La Cohorte C contiene aproximadamente 30 sujetos de entre 65 y 85 años de edad. Aproximadamente 98 sujetos se enrolaron en el estudio en total.

En la Cohorte B, aproximadamente 20 sujetos de entre 50 y 64 años de edad se enrolaron y se randomizaron 1:1 para recibir vacuna (N=10) o placebo (N=10) . Luego de que los datos de seguridad 7 días luego de la dosis 2 (Día de estudio 35) se encuentran disponibles para revisión de sujetos en la Cohorte B, los sujetos en la Cohorte C son elegibles para recibir su dosis inicial. En la Cohorte C, aproximadamente 30 sujetos de entre 65 y 85 años de edad se enrolan y se randomizan 1:1:1 para recibir vacuna con MPL y AlOH como adyuvante (N=10) o vacuna con A10H solo como adyuvante, es decir sin MPL (N=10) o placebo (N=10) . Las concentraciones de antígeno de las VLP de norovirus y del AlOH en las dos formulaciones de vacuna a ser evaluadas en la Cohorte C son idénticas; solo es diferente la presencia o ausencia de MPL.

La vacuna de VLP bivalente de Norovirus contiene VLP de genogrupo I, genotipo 1 (GI.l) y genogrupo II, genotipo IV (Gil.4) como los antígenos, y Lípido monofosforil A (MPL) e hidróxido de aluminio (AlOH) como adyuvantes, cloruro de sodio (NaCl) y L-histidina (L-His) como solución amortiguadora (pH entre 6,3 y 6,7), etanol y agua para inyección. Las VLP de Gil.4 comprendían una secuencia de cápside de la SEQ ID NO: 1, que se derivó de tres cepas de Gil .4.

La dosificación única de vacuna seleccionada para la evaluación adicional en las Cohortes B y C es la menor dosificación en la Cohorte A que da como resultado la respuesta inmune más robusta y reproducible que también es generalmente bien tolerada. Los datos de seguridad e inmunogenicidad del Dia 56 de sujetos en la Cohorte A son revisados por el CSM/SMC y se selecciona la dosificación bivalente para evaluación en las Cohortes B y C.

Los sujetos mantienen un ayuda memoria diario de los síntomas solicitados que incluyen cuatro reacciones en el sitio de inyección local, tal como dolor, sensibilidad al contacto, coloración rojiza e hinchazón, y 10 signos o síntomas sistémicos que incluyen temperatura oral diaria, dolor de cabeza, fatiga, dolores musculares, escalofríos, dolores de articulaciones y síntomas gastrointestinales de náuseas, vómitos, diarrea, calambres/dolor abdominales para los Días 0 a 7 luego de cada dosis de vacuna bivalente IM de VLP de Norovirus o control. La coloración rojiza e hinchazón en el sitio de inyección se midió y se registró diariamente durante los 7 días luego de cada inyección.

Las historias clínicas internas se obtienen en cada visita de seguimiento en los Días 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14 y 393+14 y en la llamada telefónica de seguimiento en el Día 265 +14; los sujetos son cuestionados sobre enfermedad, visitas al doctor, cualquier evento adverso serio (SAE) , e inicio de cualquier condición médica nueva significativa durante el período. Los sujetos tienen un CBC con recuento diferencial de WBC y plaquetas, y BUN sérico, creatinina, glucosa, AST y ALT evaluados durante el tamizaje a los Días 21 y 35 aproximadamente 7 días después de cada dosis) para evaluar la continua elegibilidad y seguridad, respectivamente.

Se recolecta sangre de sujetos antes de la vacunación en el Día 0 y a los Días 7+3, 21+3, 28+3, 35+3, 56+7, 180+14 y 393 +14 para medir los anticuerpos séricos (IgG, IgA e IgM separadamente y combinados) contra la vacuna bivalente IM de VLP de Norovirus por ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA) . También se midieron la actividad de bloqueo de hidratos de carbono séricos y los anticuerpos HAI séricos. Para los sujetos en la Cohorte A, se ensayaron las células secretoras de anticuerpo (ASC) , marcadores de migración, células B de memoria y respuestas inmunes celulares.

Se usan los métodos descritos anteriormente para la Cohorte A para analizar las muestras de sangre recolectadas de individuos inmunizados o individuos que reciben placebo. Los resultados del estudio se emplearán en el desarrollo de un protocolo clínico para la administración de las formulaciones para vacuna de la invención.

La presente invención no pretende estar limitada en el alcance por las formas de realización específicas que tienen como intención la simple ilustración de los aspectos individuales de la invención, y los métodos y componentes funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. De hecho, diferentes modificaciones de la invención, además de aquellas mostradas y descritas en la presente, resultarán evidentes para aquellos con experiencia en el arte a partir de la descripción anterior y figuras anexas usando no más de una experimentación de rutina. Dichas modificaciones y equivalentes tienen como intención caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en esta memoria descriptiva se incorporan a la presente a modo de referencia a esta memoria descriptiva en la misma medida que si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fue especifica e individualmente indicada como incorporada a la presente a modo de referencia.

La cita o exposición de una referencia no se debe interpretar como una admisión de que la misma es arte previo para la presente invención.

REFERENCIAS 1. Glass, RI, JS Noel, T Ando, RL Fankhauser, G Belloit, A Mounts, UD Parasher, JS Bresee y SS Monroe. The Epidemiology of Enteric Caliciviruses from Human: A Reassessment Using New Diagnostics. J Infect Dis 2000; 181 (Sup 2) : S254-S261. 2. Hardy, ME. Norwalk and "Norwalk-like Viruses" in Epidemic Gastroenteritis. Clin Lab Med 1999;19(3): 675-90. 3. Jiang, X, DY Graham, KN Wang, y MK Estes. Norwalk Virus Genome Cloning and Characterization. Science 1990; 250: 1580-1583. 4. Jiang, X, M ant, DY Graham, y MK Estes. Expression, Self-Assembly, and Antigenicity of the Norwalk Virus Capsid Protein. J Virol 1992; 66: 6527-6532. 5. Glass, P, LJ White, JM Ball, I Leparc-Goffart, ME Hardy, y MK Estes. Norwalk Virus Open Reading Frame 3 Encodes a Minor Structural Protein. J Virol 2000; 74: 6581-6591. 6. Lindesmith, L, C Moe, S Marionneau, N Ruvoen, X Jiang, L Lindblad, P Stewart, J LePendu, y R Baric. Human Susceptibility and Resistance to Norwalk Virus Infection. Nat Med 2003; 9: 548-553. 7. Parrino, TA, DS Schreiber, JS Trier, AZ Kapikian, y NR Blacklow. Clinical Immunity in Acute Gastroenteritis Caused by Norwalk Agent . N Engl J Med 1977; 297: 86-89. 8. Wyatt, RG, R Dolin, NR Blacklow, HL DuPont, RF Buscho, TS Thornhill, AZ Kapikian, y RM Chanock. Comparison of Three Agents of Acute Infectious Nonbacterial Gastroenteritis by Cross-challenge in Volunteers. J Infect Dis 1974; 129: 709. 9. Ball, JM, DY Graham, AR Opekum, MA Gilger, RA Guerrero, y MK Estes. Recombinant Norwalk Virus-like Partióles Gi en Orally to Volunteers: Phase I Study. Gastroenterology 1999; 117: 40-48. 10. Tacket, CO, MB Sztein, GA Losonky, SS Wasserman, y MK Estes. Humoral, Mucosal, and Cellular Immune Responses to Oral Norwalk Virus-like Partióles in Volunteers. Clin Immunol 2003; 108: 241. 11. Guerrero, RA, JM Ball, SS Krater, SE Pacheco, JD Clements, y MK Estes. Recombinant Norwalk Virus-like Partióles Administered Intranasally to Mice Induce Systemic and Mucosal (Fecal and Vaginal) Immune Responses. J Virol 2001; 75: 9713. 12. Nicollier-Jamot, B, A Ogier, L Piroth, P Pothier, y E Kohli. Recombinant Virus-like Partióles of a Norovirus (Genogroup II Strain) Administered Intranasally and Orally with Mucosal Adjuvants LT and LT(R192G) in BALB/c Mice Induce Specific Humoral and Cellular Thl/Th2-like Immune Responses. Vaccine 2004; 22:1079-1086. 13. Periwal, SB, KR Kourie, N Ramachandaran, SJ Blakeney, S DeBruin, D Zhu, TJ Zamb, L Smith, S Udem, JH Eldridge, KE Shroff, y PA Reilly. A Modified Cholera Holotoxin CT-E29H Enhances Systemic and Mucosal Immune Responses to Recombinant Norwalk Virus- like Particle Vaccine. Vaccine 2003; 21: 376-385. 14. Isaka, M, Y Yasuda, S Kozuka, T Taniguchi, K atano, J Maeyama, T Komi a, K Ohkuma, N Goto, y K Tochikubo. Induction of systemic and mucosal antibody responses in mice immunized intranasally with aluminum-non-adsorbed diphtheria toxoid together with recombinant cholera toxin B subunit as an adjuvant. Vaccine 1999; 18: 743-751. 15. Kozlowski, PA, S Cu-Uvin, MR Neutra, y TP Flanigan. Comparison of the oral, rectal, and vaginal immunization routes for induction of antibodies in rectal and genital tract secretions of women. Infect Immun 1997; 65: 1387-1394. 16. Mestecky, J, SM Michalek, Z Moldoveanu, y M Russell. Routes of immunization and antigen delivery systems for optimal mucosal immune responses in humans. Behring Inst Mitt 1997; 33-43. 17. Wu, HY, y MW Russell. Nasal lymphoid tissue, intranasal immunization, and compartmentalization of the common mucosal immune system. Immunol Res 1997; 16: 187-201. 18. Evans, JT, CW Cluff, DA Johnson, MJ Lacy, DH Persing, y JR Baldridge. Enhancement of antigen-specific immunity via the TLR4 ligands MPL adjuvant and Ribi 529. Expert Rev Vaccines 2003; 2: 219-229. 19. Baldridge, JR, Y Yorgensen, JR Ward, y JT Ulrich. Monophosphoryl lipid A enhances mucosal and systemic immunity to vaccine antigens following intranasal administration [In Process Citation] . Vaccine 2000; 18: 2416-2425. 20. Yang, QB, M Martin, SM Michalek, y J Katz. Mechanisms of monophosphoryl lipid A augmentation of host responses to recombinant HagB from Porphyromonas gingivalis . Infect Immun 2002; 70: 3557-3565. 21. Baldrick, P, D Richardson, G Elliott, y AW Wheeler. Safety evaluation of monophosphoryl lipid A (MPL) : an immunostimulatory adjuvant. Regul Toxicol Pharmacol 2002; 35: 398-413. 22. Baldridge, JR, P McGowan, JT Evans, C Cluff, S Mossman, D Johnson, y D Persing. Taking a toll on human disease: Toll-like receptor 4 agonists as vaccine adjuvants and monotherapeutic agents. Expert Opin Biol Ther 2004; 4: 1129-1138. 23. Persing, DH, RN Coler, MJ Lacy, DA Johnson, JR Baldridge, RM Hershberg, y SG Reed. Taking toll: lipid A mimetics as adjuvants and immunomodulators . Trends Microbiol 2002; 10: S32-37.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes. REIVINDICACIONES

, 1. Un método para generar inmunidad protectora contra los Norovirus en un ser humano que comprende administrar por vía parenteral a dicho ser humano no más de una sola dosis de una composición de vacuna, donde dicha composición comprende partículas tipo virus (VLP) del genogrupo I de Norovirus, en donde dicha composición induce un aumento de por lo menos tres veces del titulo de anticuerpos específicos de Norovirus en suero en comparación con el título en dicho ser humano antes de la administración de la composición, y en donde dichas VLP del genogrupo I de Norovirus comprenden una proteína de la cápside derivada de una cepa viral del genogrupo I .
2. El método de la reivindicación 1, en donde la composición no comprende más que 150 µg de dichas VLP del genogrupo I de Norovirus.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la composición no comprende más que 50 \iq de dichas VLP del genogrupo I de Norovirus.
4. El método de la reivindicación 1, en donde la composición no comprende más que 25 g de dichas VLP del genogrupo I de Norovirus.
5. El método de la reivindicación 1, en donde la composición no comprende más que 15 g de dichas VLP del genogrupo I de Norovirus.
6. El método de la reivindicación 1, en donde la composición induce un aumento de por lo menos seis veces del titulo de anticuerpos específicos de Norovirus en suero en comparación con el título en el ser humano antes de la administración de la composición.
7. El método de la reivindicación 1, en donde dichas VLP de Norovirus son VLP monovalentes o VLP multivalentes .
8. El método de la reivindicación 1, en donde dicha composición además comprende VLP del genogrupo II de Norovirus, donde dichas VLP del genogrupo II de Norovirus comprenden una proteína de la cápside derivada de una cepa viral del genogrupo II.
9. El método de la reivindicación 8, en donde dicha composición no comprende más que 150 µg de VLP del genogrupo II de Norovirus.
10. El método de la reivindicación 8, en donde dicha composición no comprende más que 50 µg de VLP del genogrupo II de Norovirus.
11. El método de la reivindicación 8, en donde dicha composición no comprende más que 25 \iq de VLP del genogrupo II de Norovirus.
12. El método de la reivindicación 8, en donde dicha composición no comprende más que 15 µg de VLP del genogrupo II de Norovirus.
13. El método de la reivindicación 8, en donde dichas VLP del genogrupo I de Norovirus son VLP del virus Norwalk y dichas VLP del genogrupo II de Norovirus son VLP generadas a partir de la expresión de una secuencia consenso del genogrupo II de Norovirus.
14. Un método para generar inmunidad protectora contra los Norovirus en un ser humano que comprende administrar por vía parenteral a dicho ser humano no más de una sola dosis de una composición de vacuna, donde dicha composición comprende partículas tipo virus (VLP) del genogrupo II de Norovirus, en donde dicha composición induce un aumento de por lo menos tres veces del título de anticuerpos específicos de Norovirus en suero en comparación con el título en dicho ser humano antes de la administración de la composición, y en donde dichas VLP del genogrupo II de Norovirus comprenden una proteína de la cápside derivada de una cepa viral del genogrupo II.
15. El método de la reivindicación 14, en donde la composición no comprende más que 150 iq de dichas VLP del genogrupo II de Norovirus.
16. El método de la reivindicación 14, en donde la composición no comprende más que 50 iq de dichas VLP del genogrupo II de Norovirus.
17. El método de la reivindicación 14, en donde la composición no comprende más que 25 ]iq de dichas VLP del genogrupo II de Norovirus.
18. El método de la reivindicación 14, en donde la composición no comprende más que 15 \ig de dichas VLP del genogrupo II de Norovirus.
19. El método de la reivindicación 14, en donde dichas VLP del genogrupo II de Norovirus comprenden una proteina de la cápside derivada de cepas virales del genotipo 4 del genogrupo II.
20. El método de la reivindicación 14, en donde la composición induce un aumento de por lo menos seis veces del titulo de anticuerpos específicos de Norovirus en suero en comparación con el título en el ser humano antes de la administración de la composición.
21. El método de la reivindicación 14, en donde dichas VLP de Norovirus son VLP monovalentes o VLP multivalentes .
22. El método de la reivindicación 14, en donde dicha composición además comprende VLP del genogrupo I de Norovirus, donde dichas VLP del genogrupo I de Norovirus comprenden una proteina de la cápside derivada de una cepa viral del genogrupo I .
23. El método de la reivindicación 22, en donde dicha composición no comprende más que 150 µg de VLP del genogrupo I de Norovirus.
24. El método de la reivindicación 22, en donde dicha composición no comprende más que 50 µg de VLP del genogrupo I de Norovirus.
25. El método de la reivindicación 22, en donde dicha composición no comprende más que 25 µg de VLP del genogrupo I de Norovirus.
26. El método de la reivindicación 22, en donde dicha composición no comprende más que 15 µg de VLP del genogrupo I de Norovirus.
27. El método de la reivindicación 14, en donde dichas VLP del genogrupo II de Norovirus son VLP generadas a partir de la expresión de una secuencia consenso del genogrupo II de Norovirus.
28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en donde la composición además comprende por lo menos un adyuvante .
29. El método de la reivindicación 28, en donde dicho por lo menos un adyuvante es un agonista de un receptor tipo toll.
30. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en donde dicha composición además comprende dos adyuvantes .
31. El método de la reivindicación 30, en donde dichos dos adyuvantes son monofosforil lipido A e hidróxido de aluminio .
32. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, en donde dicha composición además comprende una solución amortiguadora .
33. El método de la reivindicación 32, en donde dicha solución amortiguadora se selecciona del grupo que consiste en L-histidina, imidazol, ácido succinico, tris y ácido cítrico .
34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en donde la composición de vacuna se administra a dicho ser humano por una ruta de administración intravenosa, subcutánea, intradérmica o intramuscular.
35. El método de la reivindicación 34, en donde la composición de vacuna se administra a dicho ser humano por una ruta de administración intramuscular.
36. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, en donde la composición de vacuna se formula como un liquido .
37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, en donde el aumento del titulo de anticuerpos específicos de Norovirus es inducido dentro de los siete días de la administración de la dosis individual de la composición.
38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, en donde dicha composición de vacuna confiere protección contra uno o más síntomas de una infección por Norovirus.