CN104911154A - 交叉反应性增强的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒 - Google Patents

交叉反应性增强的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒 Download PDF

Info

Publication number
CN104911154A
CN104911154A CN201510127943.5A CN201510127943A CN104911154A CN 104911154 A CN104911154 A CN 104911154A CN 201510127943 A CN201510127943 A CN 201510127943A CN 104911154 A CN104911154 A CN 104911154A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
sequence
norovirus
vlp
particle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510127943.5A
Other languages
English (en)
Inventor
查尔斯·理查森
罗伯特·巴加策
乔尔·海恩斯
布赖恩·斯特德曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Vaccines Inc
Original Assignee
Takeda Vaccines Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Vaccines Inc filed Critical Takeda Vaccines Inc
Publication of CN104911154A publication Critical patent/CN104911154A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C12N7/045—Pseudoviral particles; Non infectious pseudovirions, e.g. genetically engineered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55583—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了交叉反应性增强的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒。本发明提供具有复合氨基酸序列的多肽，所述序列源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列。具体而言，本发明提供了包含至少一种复合多肽的病毒样颗粒。上述病毒样颗粒具有无包膜病毒的两种或更多种流行株的抗原性表位，并使得与所述无包膜病毒的一种或多种流行株的抗血清交叉反应性增加。还公开了制备复合病毒样颗粒和包含复合病毒样颗粒的疫苗制剂的方法。

Description

交叉反应性增强的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒
本申请是中国发明专利申请(申请日：2009年8月10日；申请号：200980139886.5(国际申请号：PCT/US2009/053249)；发明名称：交叉反应性增强的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒)的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2008年8月8日提交的美国临时申请61/087,504号和2009年6月19日提交的美国临时申请61/218,603号的权益，两者均通过全文提述并入本文。
技术领域
本发明属于疫苗领域，特别是包含具有复合氨基酸序列的病毒样颗粒的疫苗，所述复合氨基酸序列源自代表来自无包膜病毒的两个或更多个衣壳蛋白的共有序列。此外，本发明涉及制备疫苗组合物的方法和使用本发明的疫苗组合物诱导保护性免疫应答的方法。
背景技术
针对具有季节性或年际模式(year-to-year pattern)的病毒的疫苗的流行制备方法是以商业性流感疫苗为模型的，当病毒演化为呈现不同的抗原性概貌时，需要预测、公开并随后合成新的疫苗。该方法造成可观的时间延迟和花费，因为新抗原的合成是基于对下一年病毒株的预测。此外，如2008年流感疫苗的失败所彰显的，在预测的毒株中的失误可导致可观的疾病相关花费，因为对患者的保护不足。因此，需要改进的方法用于设计并制备疫苗以针对致病病毒的多种流行株采取保护。
诺如病毒(Norovirus)是无法培养的人杯状病毒(Calicivirus)，其凸显为非细菌性胃肠炎流行性爆发的唯一最重要的原因(Glass等(2000)J Infect Dis,Vol.181(Sup 2):S254-S261；Hardy等(1999)Clin Lab Med,Vol.19(3):675-90)。这些病毒已归为5个不同的基因型组(genogroup)，其中基因型组I和II进一步细分为超过25个基因型，且其为人类中归咎于该病毒的绝大多数疾病的致病体。开发针对诺如病毒的疫苗遭受严峻的考验，包括无法在培养状态和在合适的急性胃肠炎动物模型中繁殖该病毒。因此，如今无法使用标准的病毒学技术，包括病毒减毒(varil attenuation)或体外中和分析。
诺如病毒含有7.5Kb单链正义RNA基因组，其含有三个开放阅读框。主要病毒衣壳蛋白(VP1)由ORF2编码，且该蛋白的表达导致病毒样颗粒(VLP)的自发装配，所述颗粒模拟病毒的结构，但不能复制。该结构由180个VP1单体亚基组成，且其为预防急性胃肠炎的候选疫苗。VP1单体具有两个域：外壳(S)域，其形成病毒内部核心，以及由柔性铰链连接的突起的突出(P)域。P域进一步细分为两个亚域P1和P2，其为最暴露于表面的区，且认为其含有重要的细胞识别和抗原性位点。同源性分析表明VP1超可变氨基酸区的大部分位于P2域(Allen等(2008)PLoS One,Vol.1:1-9)。
近来的流行病学研究得出了下述假说：诺如病毒的进化是间断性的(epochal)，其中在停滞期之后出现新的流行性株，这与对流感病毒的观测结果类似。新近的爆发似乎涉及GII.4基因型中变体病毒以两年左右的持续间隔出现。在本领域需要下述疫苗候选，其提供针对多种诺如病毒，或其他无包膜病毒株会有交叉保护性的抗原性表位，这会消除对于每个现存的爆发株构建疫苗的需要。
发明内容
本发明部分基于下述发现，即包含复合衣壳序列的多肽(其组合了来自多种流行病毒株的表位)可用于产生更强烈而稳定的(robust)针对多种病毒株的免疫应答。上述多肽可用于制备针对病毒的数种流行株提供保护的疫苗制剂，并因此改进对不同菌株和不同年份的保护。
本发明提供了至少一种具有复合氨基酸序列的多肽，其中所述复合氨基酸序列源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列，且其中所述至少一种多肽当在宿主中表达时形成病毒样颗粒，且其如与所述两种或更多种流行株的各个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸。在一个实施方案中，所述包含至少一种复合多肽的病毒样颗粒具有无包膜病毒的两种或更多种流行株的抗原性质。在另一个实施方案中，所述复合多肽或复合病毒样颗粒使得在无包膜病毒的一种或多种流行株的抗血清交叉反应性方面如与通过用仅含有来自所述一种或多种流行株的蛋白质的病毒样颗粒免疫而获得的抗血清交叉反应性相比有所增加。
所述病毒样颗粒可包含至少一种具有复合氨基酸序列的多肽，所述序列源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列，其中所述无包膜病毒选自下组：杯状病毒(Calicivirus)、小RNA病毒(Picornavirus)、星状病毒(Astrovirus)、腺病毒(Adenovirus)、呼肠孤病毒(Reovirus)、多瘤病毒(Polyomavirus)、乳头瘤病毒(Papillomavirus)、细小病毒(Parvovirus)和戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus)。在一个实施方案中，所述无包膜病毒是杯状病毒。在另一个实施方案中，所述杯状病毒是诺如病毒或札幌病毒(sapovirus)。所述诺如病毒可为基因型组I或基因型组II诺如病毒。
所述共有序列可源自归类于相同基因型组和基因型的两种或更多种诺如病毒株。在一个实施方案中，所述共有序列源自基因型组II，基因型4诺如病毒株，如Houston、Minerva和Laurens株。在另一个实施方案中，所述共有序列源自来自一个基因型组内至少两个不同的基因型的诺如病毒株。还在另一个实施方案中，所述共有序列源自来自至少两个不同的基因型组的诺如病毒株。
本发明还涵盖包含至少一种源自两种或更多种流行杯状病毒株的复合多肽和来自第二无包膜病毒(如诺如病毒)的衣壳蛋白的病毒样颗粒。所述衣壳蛋白可为来自基因型组I或基因型组II诺如病毒的VP1和/或VP2蛋白。在另一个实施方案中，所述病毒样颗粒包含至少一种源自两种或更多种杯状病毒流行株的复合多肽和源自第二杯状病毒的两种或更多种流行株的第二复合多肽。优选地，所述病毒样颗粒具有所述第一杯状病毒的两种或更多种流行株和所述第二杯状病毒的两种或更多种流行株的抗原性质。
本发明还提供了具有复合氨基酸序列的分离的多肽或其片段，其中所述复合氨基酸序列源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列，且其中所述多肽如与所述两种或更多种流行株的各个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸。所述无包膜病毒可为杯状病毒，如札幌病毒或诺如病毒。或者，所述无包膜病毒可为乳头瘤病毒。
本发明涵盖包含本发明的一种或多种复合多肽或复合病毒样颗粒的疫苗制剂。每一种复合病毒样颗粒包含至少一种具有复合氨基酸序列的多肽，所述复合氨基酸序列源自代表来自无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列。所述无包膜病毒可为基因型组I或基因型组II诺如病毒。在一些实施方案中，所述疫苗制剂进一步包含佐剂。在另一个实施方案中，所述疫苗制剂进一步包含递送剂。还在另一个实施方案中，所述疫苗制剂进一步包含药学上可接受的载体。所述疫苗制剂可为液体制剂或干粉制剂。
本发明还提供在受试者中诱导针对病毒感染的保护性免疫的方法，包括向所述受试者给药本文中公开的疫苗制剂。在一个实施方案中，所述病毒感染是诺如病毒感染。在另一个实施方案中，所述疫苗制剂赋予针对诺如病毒感染的一种或多种症状的保护。
本发明还涵盖制备复合病毒样颗粒的方法。在一个实施方案中，该方法包括比对来自无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的氨基酸序列；从所述比对的氨基酸序列确定共有序列；基于所述共有序列制备复合序列，所述复合序列如与所述两种或更多种流行株的各个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸；和在宿主细胞中表达所述复合序列，由此产生了病毒样颗粒。所述无包膜病毒可为杯状病毒、小RNA病毒、星状病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、乳头瘤病毒、细小病毒和戊型肝炎病毒。
本发明涉及下述各项。
1.一种病毒样颗粒，其包含至少一种具有复合氨基酸序列的多肽，其中所述复合氨基酸序列源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列，且其中所述至少一种多肽当在宿主细胞中表达时形成病毒样颗粒并且与所述两种或更多种流行株的各个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸。
2.项1的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒具有所述无包膜病毒的两种或更多种流行株的抗原性质。
3.项1的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒在与所述无包膜病毒的一种或多种流行株的抗血清交叉反应性方面与通过用仅含有来自所述一种或多种流行株的蛋白质的病毒样颗粒免疫而获得的抗血清交叉反应性相比增加至少两倍。
4.项1的病毒样颗粒，其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行株的衣壳序列相比含有至少3个不同的氨基酸。
5.项1的病毒样颗粒，其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行株的衣壳序列相比含有至少5个不同的氨基酸。
6.项1的病毒样颗粒，其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行株的衣壳序列相比含有至少9个不同的氨基酸。
7.项1的病毒样颗粒，其中所述共有序列是SEQ ID NO:2。
8.项1的病毒样颗粒，其中所述无包膜病毒选自下组：杯状病毒(Calicivirus)、小RNA病毒(Picornavirus)、星状病毒(Astrovirus)、腺病毒(Adenovirus)、呼肠孤病毒(Reovirus)、多瘤病毒(Polyomavirus)、乳头瘤病毒(Papillomavirus)、细小病毒(Parvovirus)和戊型肝炎病毒(Hepatitis Evirus)。
9.项8的病毒样颗粒，其中所述无包膜病毒是杯状病毒。
10.项9的病毒样颗粒，其中所述杯状病毒是诺如病毒(Norovirus)或札幌病毒(Sapovirus)。
11.项10的病毒样颗粒，其中所述诺如病毒是基因型组I诺如病毒(genogroup I Norovirus)。
12.项10的病毒样颗粒，其中所述诺如病毒是基因型组II诺如病毒(genogroup II Norovirus)。
13.项12的病毒样颗粒，其中所述共有序列源自基因型组II，基因型4诺如病毒株。
14.项13的病毒样颗粒，其中所述基因型组II，基因型4诺如病毒株选自Houston株、Minerva株和Laurens株。
15.项14的病毒样颗粒，其中所述复合序列是SEQ ID NO:1。
16.项10的病毒样颗粒，其中所述共有序列源自来自一个基因型组内至少两个不同的基因型的诺如病毒株。
17.项16的病毒样颗粒，其中所述共有序列源自基因型组II，基因型2和基因型组II，基因型4诺如病毒株。
18.项10的病毒样颗粒，其中所述共有序列源自来自至少两个不同的基因型组的诺如病毒株。
19.项18的病毒样颗粒，其中所述共有序列源自基因型组I，基因型1和基因型组II，基因型4诺如病毒株。
20.项10的病毒样颗粒，进一步包含来自第二诺如病毒的衣壳蛋白。
21.项20的病毒样颗粒，其中所述第二诺如病毒是基因型组I或基因型组II诺如病毒。
22.项21的病毒样颗粒，其中所述来自第二诺如病毒的衣壳蛋白是来自基因型组I诺如病毒的VP1蛋白。
23.项9的病毒样颗粒，进一步包含具有第二复合氨基酸序列的第二多肽，其中所述第二复合氨基酸序列源自代表第二杯状病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列，且与第二杯状病毒的所述两种或更多种流行株的各个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸。
24.项23的病毒样颗粒，其中所述复合序列与所述第二杯状病毒的一种或多种流行株的衣壳序列相比含有5-50个不同的氨基酸。
25.项23的病毒样颗粒，其中所述第二杯状病毒是诺如病毒。
26.项25的病毒样颗粒，其中所述诺如病毒是基因型组I诺如病毒。
27.项26的病毒样颗粒，其中所述基因型组I诺如病毒选自下组：诺沃克病毒(Norwalk virus)、Southampton病毒、Hesse病毒和Chiba病毒。
28.项23的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒具有所述第一杯状病毒的两种或更多种流行株和第二杯状病毒的两种或更多种流行株的抗原性质。
29.一种分离的多肽或其片段，其具有复合氨基酸序列，其中所述复合氨基酸序列源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列，且其中所述多肽如与所述两种或更多种流行株的各个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸。
30.项29的分离的多肽，其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行株的衣壳序列相比含有至少3个不同的氨基酸。
31.项29的分离的多肽，其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行株的衣壳序列相比含有5-50个不同的氨基酸。
32.项29的分离的多肽，其中所述共有序列是SEQ ID NO:2。
33.项29的分离的多肽，其中所述无包膜病毒是杯状病毒。
34.项33的分离的多肽，其中所述杯状病毒是诺如病毒或札幌病毒。
35.项34的分离的多肽，其中所述诺如病毒是基因型组I或基因型组II诺如病毒，或其组合。
36.项35的分离的多肽，其中所述分离的多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
37.一种分离的核酸，其编码SEQ ID NO:29的多肽。
38.项37的分离的核酸，其中所述核酸具有SEQ ID NO:3的序列。
39.一种载体，其包含SEQ ID NO:37的分离的核酸。
40.一种宿主细胞，其包含SEQ ID NO:39的载体。
41.一种疫苗制剂，其包含项1、项20或项23的病毒样颗粒。
42.一种疫苗制剂，其包含项1的病毒样颗粒和第二病毒样颗粒，其中所述第二病毒样颗粒包含来自诺如病毒的衣壳蛋白。
43.项42的疫苗制剂，其中所述诺如病毒是基因型组I或基因型组II诺如病毒。
44.项41的疫苗制剂，其进一步包含佐剂。
45.项44的疫苗制剂，其中所述佐剂选自下组：toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰基脂质A(MPL)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、铝盐、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、蜗状佐剂(cochleate)、聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(poly(lactide-co-glycolides)(PLG))微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、水包油乳剂、MF59和鲨烯。
46.项44的疫苗制剂，其进一步包含递送剂。
47.项46的疫苗制剂，其中所述递送剂是粘膜粘着剂。
48.项47的疫苗制剂，其中所述粘膜粘着剂选自下组：糖胺聚糖(例如硫酸软骨素、硫酸皮肤素软骨素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸(hyaluronan))、糖聚合物(例如果胶、藻酸盐、糖原、淀粉酶、支链淀粉、纤维素、壳多糖、水苏糖、unulin、糊精、葡聚糖)、聚(丙烯酸)的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖(包括粘蛋白、其他粘多糖和，一种从芦荟植物提取的天然酸性多糖)、聚离子化合物(polyion)、纤维素衍生物(例如，羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素)、蛋白质(例如凝集素、菌毛蛋白(fimbrial protein))和脱氧核糖核酸。
49.项48的疫苗制剂，其中所述粘膜粘着剂是多糖。
50.项49的疫苗制剂，其中所述多糖是壳聚糖、壳聚糖盐或壳聚糖碱。
51.项44的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂是液体制剂。
52.项44的疫苗制剂，其中所述疫苗制剂是干粉制剂。
53.项52的干粉制剂，其与一种或多种用于给药一剂或多剂所述制剂的装置组合。
54.项53的干粉制剂，其中所述一剂或多剂为单位剂量。
55.项53的干粉制剂，其中所述装置为一次性鼻给药装置。
56.项41的疫苗制剂，其中所述制剂通过选自下组的途径向受试者给药：粘膜、肌肉内、静脉内、表皮下、真皮内、真皮下和经皮给药途径。
57.项56的疫苗制剂，其中所述粘膜给药是鼻内、经口或阴道给药。
58.项57的疫苗制剂，其中所述制剂为鼻喷雾剂、滴鼻剂或干粉的形式。
59.一种疫苗制剂，其包含项39的载体。
60.一种在受试者中诱导针对病毒感染的保护性免疫的方法，包括向所述受试者给药项41的疫苗制剂。
61.项60的方法，其中所述病毒感染是诺如病毒感染。
62.项61的方法，其中所述疫苗制剂赋予针对诺如病毒感染的一种或多种症状的保护。
63.一种制备病毒样颗粒的方法，包括在宿主细胞中表达项29的多肽；使所述细胞在形成病毒样颗粒的条件下生长；和分离所述病毒样颗粒。
64.项63的方法，其中所述无包膜病毒是杯状病毒。
65.项64的方法，其中所述杯状病毒是诺如病毒或札幌病毒。
66.项65的方法，其中所述诺如病毒是基因型组I或基因型组II诺如病毒。
67.项66的方法，其中所述多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
68.项63的方法，其中所述共有序列是SEQ ID NO:2。
69.一种制备病毒样颗粒的方法，包括：
比对来自无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的氨基酸序列；
从所述比对的氨基酸序列确定共有序列；
基于所述共有序列制备复合序列，其与所述两种或更多种流行株的各个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸；和
在宿主细胞中表达所述复合序列，由此产生病毒样颗粒。
70.项69的方法，其中所述无包膜病毒选自下组：杯状病毒、小RNA病毒、星状病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、乳头瘤病毒、细小病毒和戊型肝炎病毒。
71.项70的方法，其中所述无包膜病毒是杯状病毒。
72.项71的方法，其中所述杯状病毒是诺如病毒或札幌病毒。
73.项72的方法，其中所述诺如病毒是基因型组I或基因型组II诺如病毒。
74.项1的病毒样颗粒，其中所述多肽包含由SEQ ID NO:3的核酸序列编码的复合氨基酸序列。
附图简述
图1.来自基因型组II，基因型4诺如病毒的VP1蛋白的共有氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。该共有序列是从Houston、Minerva和Laurens株的比对确定的。
图2.编码来自基因型组II，基因型4诺如病毒的复合VP1蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。
图3.经蔗糖梯度纯化的复合VLP的SDS-PAGE/考马斯分析。
图4.通过蔗糖梯度纯化的复合表达细胞培养上清在220nm(顶部)和280nm(底部)读数的HPLC SEC色谱图。
图5.通过柱层析纯化的复合序列VLP的SDS-PAGE/银染分析。
图6.复合VLP在280nm读数的HPLC SEC色谱图。
图7.用复合VLP(CVLP)进行免疫引发抗原特异性IgG。将一组7只小鼠用多种浓度的CVLP(在X轴标明)在第0日和第7日免疫(i.p.)。在第14日收集血清，并通过ELISA测量CVLP特异性IgG。水平线表明每个处理组的几何平均值。
图8.用复合VLP/诺沃克VLP(CVLP/NVLP)组合进行免疫引发NVLP特异性IgG。将一组7只小鼠用多种浓度的NVLP本身(紫色棒)或其与等量CVLP(黑色棒)的组合在第0日和第14日免疫(i.p.)。在第21日收集血清，并通过ELISA测量NVLP特异性的IgG。数据报道为平均值+平均值的标准误差(SEM)。
图9.用复合VLP/诺沃克VLP(CVLP/NVLP)组合进行免疫引发CVLP特异性IgG。将一组7只小鼠用多种浓度的复合VLP本身(绿色棒)或其与等量NVLP(黑色棒)的组合在第0日和第14日免疫(i.p.)。在第21日收集血清，并通过ELISA测量CVLP特异性的IgG。数据报道为平均值+平均值的标准误差(SEM)。
图10.CVLP特异性IgG与其他诺如病毒分离株交叉反应。在用复合VLP或GII.42002VLP进行单一免疫之后21日测量的抗体效价显示复合VLP与GII.42002VLP相比引发高～10倍的效价。针对用所有GII.4VLP免疫的动物的抗体效价显示与GI.1VLP的不良交叉反应性。数据表示为几何平均值+平均值的标准误差(SEM)。
图11.将家兔在第0日和第21日用等量的诺沃克VLP(NVLP)和复合VLP(CVLP)免疫(IM)。在第28日收集血清，并评估VLP特异性IgG。将所得的数据log转化，并通过线性回归分析评估。IgG效价表示为稀释倍数的倒数，并作为几何平均值效价显示。
图12.将家兔在第0日和第21日用等量的诺沃克VLP(NVLP)和复合VLP(CVLP)免疫(IM)。在第75日收集脾，并在培养物中用NVLP或CVLP刺激未分级的细胞5日，并测量胸苷的掺入量。对于在X轴上表示的处理组中的每只家兔显示平均值和SD。数据表示为平均值+SD。
图13.将家兔在第0日和第21日用等量的诺沃克VLP(NVLP)和复合VLP(CVLP)免疫(IM)。在第75日收集脾和肠系膜淋巴结(LN)，并就VLP特异性记忆B细胞的存在通过ELISPOT进行分析。显示了针对NVLP和CVLP的个体应答。数据表示为存在的每百万个细胞中VLP特异性IgG分泌细胞的数量。
图14.将家兔在第0、14和21日用等量的诺沃克VLP(NVLP)和复合VLP(CVLP)如图例中所示进行免疫(IM)。在第21和35日收集血清，并通过ELISA测量NVLP特异性IgG和IgA。结果表示为组的几何平均值+SEM。
图15.将家兔在第0、14和21日用等量的诺沃克VLP(NVLP)和复合VLP(CVLP)如图例中所示进行免疫接种(IM)。在第21和35日收集血清，并通过ELISA测量CVLP特异性IgG和IgA。结果表示为组的几何平均值+SEM。
图16.将家兔在第0、14和21日用等量的诺沃克VLP(NVLP)和复合VLP(CVLP)免疫(IM)。在第35日收集脾，并在体外刺激未分级的细胞5日。用来自两个基因型组的多种VLP如图例中所示刺激脾细胞。结果表示为组的几何平均值+SD。
图17.将小鼠在第0和7日用等量的诺沃克VLP(NVLP)和复合VLP(CVLP)如X轴上所示进行免疫(IP)。在第14日收集血清，并通过ELISA就VLP特异性IgG的存在进行分析。显示个体的应答，且效价表示为稀释倍数的倒数。水平棒代表组的几何平均值。
图18.将小鼠在第0和7日用等量的诺沃克VLP(NVLP)和复合VLP(CVLP)如X轴上所示进行免疫(IP)。在第14日收集血清，并就能够抑制人红细胞(O型阳性)血凝的抗体的存在进行分析。显示个体应答，且效价表示为稀释倍数的倒数。水平棒代表组的几何平均值。
图19.用50μg VLP疫苗制剂(诺沃克VLP+复合GII.4VLP)在第0和21日进行鼻内免疫的家兔中的血清抗VLP IgG。显示来自第35日收集的血清的个体应答，并将其表示为μg/mL。棒表明组的几何平均值。
图20.来自基因型组II诺如病毒的VP1蛋白的氨基酸共有序列(SEQID NO:7)。该共有序列是从GII.1(登录号：AAL13001)、GII.2SnowMountain(登录号：AAB61685)和GII.3(登录号：AAL12998)株的比对确定的。“x”代表在全部三个株之间氨基酸均不同的位置。
图21.来自基因型组I诺如病毒的VP1蛋白的氨基酸共有序列(SEQ IDNO:12)。该共有序列是从诺沃克病毒(登录号：M87661)、Southampton(登录号：Q04542)和Chiba病毒(登录号：BAB18267)株的比对确定的。“x”代表在全部三个株之间氨基酸均不同的位置。
图22.来自人乳头瘤病毒的L1蛋白的氨基酸共有序列(SEQ IDNO:17)。该共有序列是从HPV-11、HPV-16和HPV18病毒株的比对确定的。“x”代表在全部三个株之间氨基酸均不同的位置。
具体实施方式
本发明提供包含具有复合氨基酸序列的多肽的疫苗组合物，其中所述复合氨基酸序列源自无包膜病毒流行株的衣壳序列。从上述多肽序列产生的病毒样颗粒为几种病毒株提供抗原性表位，并可用于诱导针对来自多种株的病毒感染提供保护的免疫应答。相应地，本发明提供包含至少一种具有复合氨基酸序列的多肽的病毒样颗粒。如本文中使用的“复合氨基酸序列”或“复合序列”是源自至少两种病毒蛋白序列的共有序列的序列。在一个实施方案中，所述病毒蛋白序列是衣壳序列。复合氨基酸序列可通过在共有序列中的可变位置选择两种或更多种氨基酸之一而源自共有序列。
如本文中使用的“共有序列”是含有一个或多个可变氨基酸的序列，且其是通过比对和比较两种或更多种病毒的病毒蛋白序列来确定的。共有序列还可通过比对和比较两种或更多种病毒的核苷酸序列来确定。所述共有序列可从无包膜病毒的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种或者九种或更多种流行株的蛋白质或核苷酸序列来确定。
所述具有复合氨基酸序列的多肽与用于确定共有序列的两种或更多种流行株的各个蛋白质序列相比可含有至少一个不同的、至少两个不同的、至少三个不同的、至少四个不同的、至少五个不同的、至少六个不同的、至少七个不同的、至少八个不同的、至少九个不同的、至少十个不同的、至少十五个不同的、至少二十个不同的、至少二十五个不同的、至少三十个不同的、至少三十五个不同的、至少四十个不同的、至少四十五个不同的或至少五十个不同的氨基酸。在一些实施方案中，具有复合氨基酸序列的多肽当在宿主细胞中表达时可形成病毒样颗粒。
在本发明的一个实施方案中，所述病毒样颗粒(VLP)包含至少一个具有复合氨基酸序列的多肽，其中所述复合氨基酸序列源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列，且其中所述至少一个多肽当在宿主细胞中表达时形成病毒样颗粒，并与所述两种或更多种流行株的各个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸。优选地，所述病毒样颗粒具有无包膜病毒的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种或者九种或更多种流行株的抗原性质。在一些实施方案中，所述病毒样颗粒使得针对无包膜病毒的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种或者九种或更多种流行株的抗血清交叉反应性与用仅含有来自一种或多种流行株的蛋白质的病毒样颗粒免疫而获得的抗血清交叉反应性相比有所增加。在一个实施方案中，所述病毒样颗粒提供在抗血清交叉反应性上为至少两倍的增加(two-fold increase)。
在另一个实施方案中，所述病毒样颗粒包含至少一种具有复合氨基酸序列的多肽，所述复合氨基酸序列源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列，其中所述无包膜病毒选自下组：杯状病毒、小RNA病毒、星状病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、乳头瘤病毒、细小病毒和戊型肝炎病毒。本发明还包括在提交时尚未表征或发现的无包膜病毒株。在一些实施方案中，除了其他之外，所述无包膜病毒为杯状病毒。杯状病毒分为四个属：导致人类感染的诺如病毒(Norovirus)和札幌病毒(Sapovirus)，以及与动物感染相关的兔病毒(Lagovirus)和囊泡病毒(Vesivirus)。在优选的实施方案中，所述杯状病毒是札幌病毒或诺如病毒。
诺如病毒属主要地分为两个大基因型组(GI和GII)。提出了两个其他的组(GIII和GIV)，且其一般而言被接受。GIII的代表是牛、Jena株。GIV目前含有一个病毒，Alphatron。GI和GII组可进一步基于遗传分类分为簇或基因型(Ando等(2000)J.Infectious Diseases,Vol.181(Supp2):S336-S348；Lindell等(2005)J.Clin.Microbiol.,Vol.43(3):1086–1092)。如本文中使用的术语遗传簇(genetic cluster)可与术语基因型互换使用。在基因型组I内，有6个GI簇(括号内为原型病毒株名)：GI.1(诺沃克)；GI.2(Southhampton)；GI.3(Desert Shield)；GI.4(Cruise Ship virus/Chiba)；GI.5(318/Musgrove)；以及GI.6(Hesse)。在基因型组II内，有9个GII簇(括号内为原型病毒株名)：GII.1(Hawaii)；GII.2(Snow Mountain/Melksham)；GII.3(Toronto)；GII.4(Bristol/Lordsdale)；GII.5(290/Hillingdon)；GII.6(269/Seacroft)；GII.7(273/Leeds)；GII.8(539/Amsterdam)；以及GII.9(378)。流行诺如病毒株是通过将其与属于这些遗传簇的原型株相比较来进行分类的。最流行的流行株属于基因型组II。
已知多种诺如病毒分离株的核酸和蛋白质序列。其他来自诺如病毒分离株的代表性、非限定性序列，包括ORF1、ORF2、ORF3及其编码的多肽的序列列于National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库。在本发明的一个实施方案中，所述诺如病毒可为基因型组I或基因型组II诺如病毒。可根据任何已知的诺如病毒株确定复合和共有氨基酸序列。参见，例如GenBank条目：诺如病毒基因型组1株Hu/NoV/WestChester/2001/USA，GenBank登录号AY502016；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/Braddock Heights/1999/USA，GenBank登录号AY502015；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/Fayette/1999/USA，GenBank登录号AY502014；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/Fairfield/1999/USA，GenBank登录号AY502013；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/Sandusky/1999/USA，GenBank登录号AY502012；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/Canton/1999/USA，GenBank登录号AY502011；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/Tiffin/1999/USA，GenBank登录号AY502010；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/CS-E1/2002/USA，GenBank登录号AY50200；诺如病毒基因型组1株Hu/NoV/Wisconsin/2001/USA，GenBank登录号AY502008；诺如病毒基因型组1株Hu/NoV/CS-841/2001/USA，GenBank登录号AY502007；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/Hiram/2000/USA，GenBank登录号AY502006；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/Tontogany/1999/USA，GenBank登录号AY502005；诺沃克病毒，全基因组，GenBank登录号NC.sub.--001959；诺如病毒Hu/GI/Otofuke/1979/JP基因组RNA，全基因组，GenBank登录号AB187514；诺如病毒Hu/Hokkaido/133/2003/JP，GenBank登录号AB212306；诺如病毒Sydney 2212，GenBank登录号AY588132；诺沃克病毒株SN2000JA，GenBank登录号AB190457；Lordsdale病毒全基因组，GenBank登录号X86557；诺沃克样病毒基因组RNA，Gifu'96，GenBank登录号AB045603；诺沃克病毒株Vietnam 026，全基因组，GenBank登录号AF504671；诺如病毒Hu/GII.4/2004/N/L，GenBank登录号AY883096；诺如病毒Hu/GII/Hokushin/03/JP，GenBank登录号AB195227；诺如病毒Hu/GII/Kamo/03/JP，GenBank登录号AB195228；诺如病毒Hu/GII/Sinsiro/97/JP，GenBank登录号AB195226；诺如病毒Hu/GII/Ina/02/JP，GenBank登录号AB195225；诺如病毒Hu/NLV/GII/Neustrelitz260/2000/DE，GenBank登录号AY772730；诺如病毒Hu/NLV/Dresden174/pUS-NorII/1997/GE，GenBank登录号AY741811；诺如病毒Hu/NLV/Oxford/B2S16/2002/UK，GenBank登录号AY587989；诺如病毒Hu/NLV/Oxford/B4S7/2002/UK，GenBank登录号AY587987；诺如病毒Hu/NLV/Witney/B7S2/2003/UK，GenBank登录号AY588030；诺如病毒Hu/NLV/Banbury/B9S23/2003/UK，GenBank登录号AY588029；诺如病毒Hu/NLV/ChippingNorton/2003/UK，GenBank登录号AY588028；诺如病毒Hu/NLV/Didcot/B9S2/2003/UK，GenBank登录号AY588027；诺如病毒Hu/NLV/Oxford/B8S5/2002/UK，GenBank登录号AY588026；诺如病毒Hu/NLV/Oxford/B6S4/2003/UK，GenBank登录号AY588025；诺如病毒Hu/NLV/Oxford/B6S5/2003/UK，GenBank登录号AY588024；诺如病毒Hu/NLV/Oxford/B5S23/2003/UK，GenBank登录号AY588023；诺如病毒Hu/NLV/Oxford/B6S2/2003/UK，GenBank登录号AY588022；诺如病毒Hu/NLV/Oxford/B6S6/2003/UK，GenBank登录号AY588021；诺沃克样病毒分离株Bo/Thirsk10/00/UK，GenBank登录号AY126468；诺沃克样病毒分离株Bo/Penrith55/00/UK，GenBank登录号AY126476；诺沃克样病毒分离株Bo/Aberystwyth24/00/UK，GenBank登录号AY126475；诺沃克样病毒分离株Bo/Dumfries/94/UK，GenBank登录号AY126474；诺如病毒NLV/IF2036/2003/Iraq，GenBank登录号AY675555；诺如病毒NLV/IF1998/2003/Iraq，GenBank登录号AY675554；诺如病毒NLV/BUDS/2002/USA，GenBank登录号AY660568；诺如病毒NLV/ParisIsland/2003/USA，GenBank登录号AY652979；Snow Mountain病毒，全基因组，GenBank登录号AY134748；诺沃克样病毒NLV/FortLauderdale/560/1998/US，GenBank登录号AF414426；Hu/Norovirus/hiroshima/1999/JP(9912-02F)，GenBank登录号AB044366；诺沃克样病毒株11MSU-MW，GenBank登录号AY274820；诺沃克样病毒株B-1SVD，GenBank登录号AY274819；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/Farmington Hills/2002/USA，GenBank登录号AY502023；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/CS-G4/2002/USA，GenBank登录号AY502022；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/CS-G2/2002/USA，GenBank登录号AY502021；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/CS-G12002/USA，GenBank登录号AY502020；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/Anchorage/2002/USA，GenBank登录号AY502019；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/CS-D1/2002/CAN，GenBank登录号AY502018；诺如病毒基因型组2株Hu/NoV/Germanton/2002/USA，GenBank登录号AY502017；人杯状病毒NLV/GII/Langen1061/2002/DE，全基因组，GenBank登录号AY485642；鼠类诺如病毒1多蛋白，GenBank登录号AY228235；诺沃克病毒，GenBank登录号AB067536；人杯状病毒NLV/Mex7076/1999，GenBank登录号AF542090；人杯状病毒NLV/Oberhausen 455/01/DE，GenBank登录号AF539440；人杯状病毒NLV/Herzberg 385/01/DE，GenBank登录号AF539439；人杯状病毒NLV/Boxer/2001/US，GenBank登录号AF538679；诺沃克样病毒基因组RNA，全基因组，GenBank登录号AB081723；诺沃克样病毒基因组RNA，全基因组，分离株：Saitama U201，GenBank登录号AB039782；诺沃克样病毒基因组RNA，全基因组，分离株：SaitamaU18，GenBank登录号AB039781；诺沃克样病毒基因组RNA，全基因组，分离株：Saitama U25，GenBank登录号AB039780；诺沃克病毒株:U25GII，GenBank登录号AB067543；诺沃克病毒株：U201GII，GenBank登录号AB067542；诺沃克样病毒株416/97003156/1996/LA，GenBank登录号AF080559；诺沃克样病毒株408/97003012/1996/FL，GenBank登录号AF080558；诺沃克样病毒NLV/BurwashLanding/331/1995/US，GenBank登录号AF414425；诺沃克样病毒NLV/Miami Beach/326/1995/US，GenBank登录号AF414424；诺沃克样病毒NLV/White River/290/1994/US，GenBank登录号AF414423；诺沃克样病毒NLV/New Orleans/306/1994/US，GenBank登录号AF414422；诺沃克样病毒NLV/Port Canaveral/301/1994/US，GenBank登录号AF414421；诺沃克样病毒NLV/Honolulu/314/1994/US，GenBank登录号AF414420；诺沃克样病毒NLV/Richmond/283/1994/US，GenBank登录号AF414419；诺沃克样病毒NLV/Westover/302/1994/US，GenBank登录号AF414418；诺沃克样病毒NLV/UK3-17/12700/1992/GB，GenBank登录号AF414417；诺沃克样病毒NLV/Miami/81/1986/US，GenBank登录号AF414416；Snow Mountain株，GenBank登录号U70059；Desert Shield病毒DSV395，GenBank登录号U04469；诺沃克病毒，全基因组，GenBank登录号AF093797；Hawaii杯状病毒，GenBank登录号U07611；Southampton病毒，GenBank登录号L07418；诺沃克病毒(SRSV-KY-89/89/J)，GenBank登录号L23828；诺沃克病毒(SRSV-SMA/76/US)，GenBank登录号L23831；Camberwell病毒，GenBank登录号U46500；人杯状病毒株Melksham，GenBank登录号X81879；人杯状病毒株MX，GenBank登录号U22498；小呼肠孤病毒TV24，GenBank登录号U02030；以及诺沃克样病毒NLV/Gwynedd/273/1994/US，GenBank登录号AF414409；所有这些的序列(如本申请的提交日时登入的)通过提述并入本文。其他诺如病毒序列公开于下述专利公开：WO 2005/030806，WO 2000/79280，JP2002020399，US2003129588，U.S.Pat.No.6,572,862，WO 1994/05700，以及WO05/032457，其均通过全文提述并入本文。还参见Green等(2000)J.Infect.Dis.,Vol.181(Suppl.2):S322-330；Wang等(1994)J.Virol.,Vol.68:5982-5990；Chen等(2004)J.Virol.,Vol.78:6469-6479；Chakravarty等(2005)J.Virol.,Vol.79:554-568；Hansman等(2006)J.Gen.Virol.,Vol.87:909-919；Bull等(2006)J.Clin.Micro.,Vol.44(2):327-333；Siebenga,et al.(2007)J.Virol.,Vol.81(18):9932-9941,and Fankhauser等(1998)J.Infect.Dis.,Vol.178:1571-1578；以供序列比较以及诺如病毒的遗传多样性的讨论和系统进化分析。
还已知多种札幌病毒分离株的核酸和蛋白质序列。代表性札幌病毒序列，包括ORF1和ORF2的序列，和其来自札幌病毒分离株的编码的多肽列于National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库。参见，例如GenBank条目：札幌病毒Mc10，GenBank登录号NC.sub.--010624；Sapporo病毒，GenBank登录号U65427；札幌病毒Mc10，GenBank登录号AY237420；札幌病毒SaKaeo-15/Thailand，GenBank登录号AY646855；Sapporo病毒，GenBank登录号NC.sub.--006269；札幌病毒C12，GenBank登录号NC.sub.--006554；札幌病毒C12，GenBank登录号AY603425；札幌病毒Hu/Dresden/pJG-Sap01/DE，GenBank登录号AY694184；人杯状病毒SLV/cruise ship/2000/USA，GenBank登录号AY289804；人杯状病毒SLV/Arg39，GenBank登录号AY289803；猪肠杯状病毒株LL14，GenBank登录号AY425671；猪肠杯状病毒，GenBank登录号NC.sub.--000940；人杯状病毒株Mc37，GenBank登录号AY237415；水貂肠杯状病毒株Canada151A，GenBank登录号AY144337；人杯状病毒SLV/Hou7-1181，GenBank登录号AF435814；人杯状病毒SLV/Mex14917/2000，GenBank登录号AF435813；人杯状病毒SLV/Mex340/1990，GenBank登录号AF435812；猪肠杯状病毒，GenBank登录号AF182760；Sapporo病毒-London/29845，GenBank登录号U95645；Sapporo病毒-Manchester，GenBank登录号X86560；Sapporo病毒-Houston/86，GenBank登录号U95643；Sapporo病毒-Houston/90，GenBank登录号U95644；以及人杯状病毒株HuCV/Potsdam/2000/DEU，GenBank登录号AF294739；所有这些的序列(如本申请的提交日时登入的)通过提述并入本文。还参见Schuffenecker等(2001)Arch Virol.,Vol.146(11):2115-2132；Zintz等(2005)Infect.Genet.Evol.,Vol.5:281-290；Farkas等(2004)Arch.Virol.,Vol.149:1309-1323；以供序列比较以及札幌病毒的遗传多样性的讨论和系统进化分析。
所述复合和共有氨基酸序列可源自至少两个诺如病毒基因型组I或基因型组II株的衣壳序列。在一个实施方案中，所述VLP包含具有复合序列的多肽，所述复合序列源自来自两种或更多种基因型组II，基因型4诺如病毒株的衣壳蛋白的共有序列。基因型组II，基因型4诺如病毒株的非限定性实例包括Houston株、Minerva株、Laurens株、Bristol株、Lordsdale株、Farmington Hills株、Hunter株、Carlow株以及US95/96-US、2006a和2006b株。
在本发明的另一个实施方案中，所述病毒样颗粒包含至少一种复合多肽，其中所述复合多肽的序列源自Houston、Minerva和Laurens的VP1序列。在另一个实施方案中，所述复合序列是SEQ ID NO:1。还在另一个实施方案中，基于Houston、Minerva和Laurens的复合序列可源自SEQ IDNO:2定义的共有序列。
在一些实施方案中，所述共有序列可根据来自至少两个不同的基因型或至少两个不同的基因型组的诺如病毒株确定。在本发明的一个实施方案中，所述病毒样颗粒包含至少一个具有复合氨基酸序列的多肽，其中所述复合氨基酸序列源自来自一个基因型组内至少两个不同的基因型的诺如病毒株衣壳蛋白的共有序列。试举一例，所述共有序列可源自基因型组II，基因型2和基因型组II，基因型4诺如病毒株的衣壳序列。在另一个实施方案中，所述共有序列可源自一个基因型组内三个或更多个基因型的衣壳序列。
在其他实施方案中，所述共有序列可根据来自至少两个不同的基因型组的诺如病毒株确定。上述实施方案之一，可为包含具有复合氨基酸序列的多肽的VLP，其中所述复合氨基酸序列源自基因型组I，基因型1和基因型组II，基因型4诺如病毒株的衣壳蛋白的共有序列。
本发明还提供包含复合多肽的病毒样颗粒(VLP)，所述复合多肽源自来自诺如病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列以及来自第二诺如病毒的衣壳蛋白。所述来自第二诺如病毒的衣壳蛋白可为主要衣壳蛋白VP1，其由ORF2编码，或次要衣壳蛋白VP2，其由ORF3编码，或VP1和VP2的组合。在一个实施方案中，所述来自第二诺如病毒的衣壳蛋白是来自基因型组I诺如病毒的VP1蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供包含复合多肽和第二多肽的VLP，前一多肽源自代表杯状病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列，所述第二多肽具有第二复合氨基酸序列，其中所述第二复合氨基酸序列源自代表第二杯状病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列。优选地，所述病毒样颗粒具有所述第一杯状病毒两种或更多种流行株和所述第二杯状病毒两种或更多种流行株的抗原性质。
所述第二多肽与第二杯状病毒所述两种或更多种流行株的每一个衣壳序列相比含有至少一个不同的、至少三个不同的、至少五个不同的、至少十个不同的、至少十五个不同的、至少二十个不同的、至少二十五个不同的、至少三十个不同的、至少三十五个不同的、至少四十个不同的、至少四十五个不同的或至少五十个不同的氨基酸。在一些实施方案中，所述第二多肽当在宿主细胞中表达时形成病毒样颗粒。在另一个实施方案中，所述第二杯状病毒是诺如病毒。在另一个实施方案中，所述诺如病毒是基因型组I诺如病毒。所述基因型组I诺如病毒可为本文中公开的任何基因型组I株。在一个实施方案中，所述基因型组I诺如病毒选自下组：诺沃克病毒、Southampton病毒、Hesse病毒和Chiba病毒。
本发明还涵盖分离的多肽或其片段，其具有本文中定义的复合氨基酸序列，以及编码它们的核酸或载体。在一个实施方案中，所述分离的多肽或其片段具有复合氨基酸序列，其中所述复合氨基酸序列源自代表无包膜病毒两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列，且其中所述多肽与所述两种或更多种流行株的每一个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸。在另一个实施方案中，所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行株的衣壳序列相比含有至少3个不同的氨基酸。在另一个实施方案中，所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行株的衣壳序列相比含有5-50个不同的氨基酸。还在另一个实施方案中，所述共有序列是SEQ IDNO:2。
所述复合多肽可具有源自本文中公开的任何无包膜病毒两种或更多种流行株的序列。在一个实施方案中，所述无包膜病毒是杯状病毒。在另一个实施方案中，所述杯状病毒是诺如病毒或札幌病毒。在另一个实施方案中，所述诺如病毒是基因型组I或基因型组II诺如病毒，或其组合。还在另一个实施方案中，所述分离的多肽具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明提供编码具有复合氨基酸序列的多肽的分离的核酸，其中所述复合氨基酸序列源自代表无包膜病毒两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列，且其中所述多肽与所述两种或更多种流行株的每一个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸。在另一个实施方案中，所述核酸具有SEQ ID NO:3的序列。在另一个实施方案中，本发明提供包含编码复合多肽的分离的核酸的载体。还在另一个实施方案中，本发明提供包含编码复合多肽的载体的宿主细胞。
本发明的抗原性分子(例如，VLP、多肽及其片段)可通过从其天然存在的生物分离并纯化来制备，或其可通过重组技术来制备。一旦分离或合成了所需的颗粒形成多肽的编码序列，可将其克隆入任何合适的载体或复制子以供表达。多种克隆载体对本领域技术人员是已知的，且本领域一般技术人员有能力选择适当的克隆载体。然后将载体用于转化适当的宿主细胞。合适的重组表达系统包括但不仅限于细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链球菌(Streptococcus))，杆状病毒/昆虫、牛痘、Semliki Forest病毒(SVF)、甲病毒(如辛德比斯病毒(Sindbis)、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒(Venezuelan Equine Encephalitis))、哺乳动物(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK-293细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、小鼠骨髓瘤(SB20)细胞和猴肾细胞(COS))、酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastori)和其他毕赤酵母表达系统)、植物和非洲蟾蜍(Xenopus)表达系统，以及其他本领域已知的表达系统。特别优选的表达系统是哺乳动物细胞系、细菌、昆虫细胞和酵母表达系统。
每一种前述抗原(例如VLP、多肽或其片段)优选以基本上纯的状态使用。取决于选定的表达系统和宿主，VLP是通过在颗粒形成多肽表达且VLP可形成的条件下培养由表达载体转化的宿主细胞来产生的。适当生长条件的选择属于本领域的技术。
优选地，VLP抗原是从昆虫细胞如Sf9、High Five、TiniPro、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、家蚕(Bombyxmori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)制备的。用于在昆虫细胞培养中产生VLP的方法在本领域是众所周知的(参见例如美国专利6,942,865号，其通过全文提述并入本文)。简言之，携带所述复合衣壳序列的重组杆状病毒是从合成cDNA构建的。然后将重组杆状病毒用于感染昆虫细胞培养物(例如Sf9、High Five和TniPro细胞)，而复合VLP可从细胞培养物分离。“复合VLP”是包含至少一种具有复合氨基酸序列的多肽的VLP，所述复合氨基酸序列源自代表无包膜病毒两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列。
如果VLP是在胞内形成的，则可使用化学、物理或机械手段破坏细胞，其裂解细胞但使得VLP基本上保持完好。上述方法对本领域技术人员是已知的，且公开于例如Protein Purification Applications:A PracticalApproach,(E.L.V.Harris和S.Angal,Eds.,1990)。
然后使用保持颗粒完整性的方法分离(或基本上纯化)所述颗粒，如通过密度梯度离心(例如蔗糖梯度)、PEG沉淀、成粒(pelleting)等(参见例如Kirnbauer等,J.Virol.(1993)67:6929-6936)以及标准纯化技术，包括例如离子交换和凝胶过滤层析。
适用于本发明的描述分子生物学技术如克隆、突变等的一般性文献，包括Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods inEnzymology volume 152Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(Berger)；Sambrook等,Molecular Cloning--A Laboratory Manual(3rd Ed.),Vol.1-3,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,2000(“Sambrook”)以及Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等,eds.,CurrentProtocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and JohnWiley&Sons,Inc.,(“Ausubel”)。这些文献描述了诱变，载体的使用，启动子和许多其他涉及例如无包膜病毒(如杯状病毒)衣壳蛋白的克隆和表达相关的主题。
在一些实施方案中，本发明的抗原性分子(例如VLP、多肽及其片段)在体内通过施用包含编码复合多肽的分离的核酸来产生。合适的载体包括但不仅限于病毒载体如水泡性口炎病毒(VSV)载体、马脑炎病毒(EEV)载体、痘病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒载体，以及表达质粒如pFastBac1、pWINEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其他合适的载体对于本领域技术人员而言是显而易见的。
本发明还涵盖包含本发明中描述的VLP、多肽或核酸的疫苗制剂。在一个实施方案中，所述疫苗制剂包含复合VLP和第二病毒样颗粒，其中所述第二病毒样颗粒包含来自诺如病毒的衣壳蛋白。所述第二VLP可包含来自基因型组I或基因型组II诺如病毒的天然衣壳蛋白。所述第二VLP可包含全长诺如病毒衣壳蛋白如VP1和/或VP2蛋白或某些VP1或VP2衍生物。或者，所述第二VLP包含截短的衣壳蛋白，如截短的VP1蛋白。所述截短可为N或C端截短。适合地，截短的衣壳蛋白为功能性衣壳蛋白衍生物。功能性衣壳蛋白衍生物能够以与由全长衣壳蛋白组成的VLP引发免疫应答相同的方式引发免疫应答。包含VLP混合物的疫苗制剂描述于WO2008/042789，其通过全文提述并入本文。纯系试举一例，所述疫苗制剂可含有来自一种或多种诺如病毒基因型组I株的VLP，以及包含来自一种或多种诺如病毒基因型组II株的复合蛋白的VLP。优选地，所述诺如病毒VLP混合物由诺沃克和基因型组II，基因型4诺如病毒的株组成。在另一个实施方案中，所述疫苗制剂包含复合VLP和诺沃克VLP，其中所述复合VLP包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。还在另一个实施方案中，所述疫苗制剂包含第一复合VLP和第二复合VLP，其中所述第一和第二复合VLP包含至少一种源自不同共有序列的多肽。例如，第一复合VLP包含来自一种或多种诺如病毒基因型组I株的复合蛋白，而第二复合VLP包含来自一种或多种诺如病毒基因型组II株的复合蛋白。在一个实施方案中，所述第一复合VLP包含来自诺如病毒基因型组I，基因型1(GI.1)的一种或多种株的复合蛋白，而第二复合VLP包含来自诺如病毒基因型组II，基因型4(GII.4)的一种或多种株的复合蛋白。
在一些实施方案中，所述疫苗制剂进一步包含佐剂。大部分佐剂含有设计为保护抗原免受快速代谢的物质如氢氧化铝或矿物油，以及免疫应答的刺激剂如百日咳博德特氏菌(Bordatella pertussis)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)来源的蛋白。合适的佐剂是商业上可获得的，例如弗氏不完全和完全佐剂(Pifco Laboratories,Detroit,Mich.)；Merck佐剂65(Merck and Company,Inc.,Rahway,N.J.)；矿物盐，包括铝盐如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝和钙盐、铁盐或锌盐；酰化酪氨酸酰化糖的不可溶悬液；阳离子或阴离子衍生化多糖；聚磷腈；生物降解性微球；以及QuilA。
合适的佐剂还包括但不仅限于toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰基脂质A(MPL)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、铝盐、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体(virosome)、蜗状佐剂(cochleate)、聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、水包油乳剂、MF59和鲨烯。在一些实施方案中，所述佐剂为细菌来源的外毒素。在其他实施方案中，可使用刺激Th1型应答的佐剂如3DMPL或QS21。在某些实施方案中，所述佐剂是MPL和氢氧化铝的组合。
在一些实施方案中，所述佐剂是单磷酰基脂质A(MPL)。MPL是来自沙门氏菌(Salmonella)的脂质A的无毒衍生物，其为强力的TLR-4激动剂，其已作为疫苗佐剂得到了开发(Evans等(2003)Expert Rev Vaccines,Vol.2:219-229)。在鼠类前临床研究中，已显示鼻内MPL给药增强分泌以及全身性体液应答(Baldridge等(2000)Vaccine,Vol.18:2416-2425；Yang等(2002)Infect Immun.,Vol.70:3557-3565)。还已在超过120,000位患者的临床研究中证明其作为疫苗佐剂是安全和有效的(Baldrick等(2002)Regul ToxicolPharmacol,Vol.35:398-413)。MPL通过TLR-4受体刺激对先天免疫的诱导，并因此能够引发针对广泛范围的感染性病原体包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、病毒和寄生物的非特异性免疫应答(Persing等(2002)TrendsMicrobiol,Vol.10:S32-37)。在鼻内制剂中包含MPL应提供了对先天应答的快速诱导，引发了来自病毒攻击的非特异性免疫应答，同时增强了由疫苗的抗原性组分生成的特异性应答。在一些实施方案中，MPL可与一种或多种附加的佐剂组合。例如，MLP可与氢氧化铝合并构成合适的佐剂以供疫苗制剂的肌肉内给药。
在其他实施方案中，所述佐剂是天然存在的油如鲨烯。鲨烯是由植物产生的三萜烃类油(C30H50)，且存在于多种食物中。人类也产生大量的鲨烯，因为其充当胆固醇和甾类激素的前体。其在肝和皮肤中合成，由极低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)在血液中转运，并由皮脂腺大量分泌。
因为鲨烯为人体的天然组分，且是生物可降解的，其已用作疫苗佐剂的组分。这些鲨烯佐剂之一为MF59，由Chiron开发的水包油乳剂。已在多种前临床和临床研究中显示MF59显著地增强针对广泛种类的疫苗抗原的免疫应答。MF59构成1997年以来在多个欧洲国家批准的流感亚单位疫苗的一部分。该疫苗已给出了超过2千万次给药，且已显示其具有良好的安全记录(safety profile)。还已通过使用来自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、尿路病原性(uropathogenic)大肠杆菌等的重组抗原在多个年龄组包括1至3日龄新生儿的多种调查性临床研究显示了具有MF59佐剂的疫苗的安全性。
术语“有效佐剂量”或“有效量的佐剂”可为本领域技术人员充分理解，且包括能够刺激针对施用的抗原的免疫应答的一种或多种佐剂的量，即以鼻洗出物(nasal washing)中IgA水平、血清IgG或IgM水平或B和T细胞增殖的方式测量增加对施用的抗原组合物的免疫应答的量。免疫球蛋白水平合适有效的增加包括与不含任何佐剂的相同抗原组合物相比超过5％，优选超过25％，特别是超过50％的增加。
在本发明的另一个实施方案中，所述免疫制剂还可包含递送剂，其基于但并不限于因为宿主粘多糖部分脱水、递送剂的物理性质或通过递送剂和在暴露位点的宿主组织之间的离子相互作用(其提供储备(depot)作用)的单一或组合作用所致的液体粘性上升而起增强抗原摄入的作用。或者，所述递送剂能够增加抗原在递送位点的停留时间(例如，延迟抗原的排出)。上述递送剂可为生物粘着剂。在一些实施方案中，所述生物粘着剂可为选自下组的粘膜粘着剂：糖胺聚糖(例如硫酸软骨素、硫酸皮肤素软骨素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸)、糖聚合物(例如果胶、藻酸盐、糖原、直连淀粉(amylase)、支链淀粉、纤维素、壳多糖、水苏糖、unulin、糊精、葡聚糖)、聚(丙烯酸)的交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖(包括粘蛋白、其他粘多糖和，一种从芦荟植物提取的天然酸性多糖)、聚离子化合物(polyion)、纤维素衍生物(例如，羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素)、蛋白质(例如凝集素、菌毛蛋白(fimbrial protein))和脱氧核糖核酸。在一个实施方案中，所述疫苗制剂包含多糖如壳聚糖、壳聚糖盐、壳聚糖碱或天然多糖(例如)。
壳聚糖，一种源自甲壳类外壳中的壳多糖的荷正电的直链多糖，对于上皮细胞及覆于其上的粘液层具有生物粘着性。用壳聚糖配制抗原增加了其与鼻膜(nasal membrane)的接触时间，从而通过储备作用增加了摄入(Illum等(2001)Adv Drug Deliv Rev,Vol.51:81-96；Illum等(2003)J ControlRelease,Vol.87:187-198；Davis等(1999)Pharm Sci Technol Today,Vol.2:450-456；Bacon等(2000)Infect Immun.,Vol.68:5764-5770；van der Lubben等(2001)Adv Drug Deliv Rev,Vol.52:139-144；van der Lubben等(2001)EurJ Pharm Sci,Vol.14:201-207；Lim等(2001)AAPS Pharm Sci Tech,Vol.2:20)。已对壳聚糖作为鼻递送系统对于几种疫苗包括流感、百日咳和白喉在动物模型和人中进行了测试(Illum等(2001)Adv Drug Deliv Rev,Vol.51:81-96；Illum等(2003)J Control Release,Vol.87:187-198；Bacon等(2000)InfectImmun.,Vol.68:5764-5770；Jabbal-Gill等(1998)Vaccine,Vol.16:2039-2046；Mills等(2003)A Infect Immun,Vol.71:726-732；McNeela等(2004)Vaccine,Vol.22:909-914)。在这些试验中，显示壳聚糖将系统性免疫应答增强至等同于胃肠外接种的水平。此外，还在粘膜分泌中测量到显著的抗原特异性IgA水平。因此，壳聚糖能够极大地增强鼻疫苗的有效性。而且，由于其物理特征，壳聚糖极其适于配制为粉末的鼻内疫苗(van der Lubben等(2001)Eur J Pharm Sci,Vol.14:201-207；Mikszta等(2005)J Infect Dis,Vol.191:278-288；Huang等(2004)Vaccine,Vol.23:794-801)。
在本发明的另一个实施方案中，所述疫苗制剂可进一步包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体，包括任何合适的稀释剂或赋形剂，包括任何其自身不诱导对接受该疫苗制剂的受试者有害的免疫应答产生并可在没有异常毒性情况下给药的药剂。如本文中使用的术语“药学上可接受的”意指经联邦或州政府的管理机构批准，或列于美国药典、欧洲药典或其他通常接受的药典以供在哺乳动物中(且更特别地，在人类中)使用。药学上可接受的载体包括但不仅限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、灭菌的等渗水性缓冲液及其组合。对于药学上可接受的载体、稀释剂和其他赋形剂的透彻讨论在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.N.J.当前版本)中给出。所述制剂应适应给药模式。在一个优选实施方案中，所述制剂适于施与人类，优选地所述制剂是无菌的、非颗粒的和/或无热原的。所述疫苗制剂，若需要，还可含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。
在本发明的一些实施方案中，疫苗制剂包含壳聚糖、壳聚糖盐或壳聚糖碱，等等。所述壳聚糖的分子量可为10kDa至800kDa，优选100kDa至700kDa，且更优选200kDa至600kDa。组合物中壳聚糖的浓度通常会为高达约80％(w/w)，例如5％、10％、30％、50％、70％或80％。壳聚糖优选至少为75％脱乙酰化的，例如80-90％，更优选82-88％脱乙酰化的，具体实例为83％、84％、85％、86％和87％脱乙酰化。
本发明的组合物可配制为用于作为疫苗或抗原性制剂给药。如本文中使用的术语“疫苗”指含有VLP或如上所述本发明的其他抗原的制剂，其为能够给予脊椎动物，并诱导足以诱导免疫以阻止和/或缓解感染和/或减少至少一种感染症状和/或增强另一剂VLP或抗原的效力的保护性免疫应答的形式。如本文中使用的术语“抗原性制剂”或“抗原性组合物”指当给予脊椎动物例如哺乳动物时，会诱导免疫应答的制备物。如本文中使用的术语“免疫应答”指体液免疫应答和细胞介导免疫应答两者。所述体液免疫应答涉及刺激B淋巴细胞产生抗体，其例如中和传染原、阻断传染原进入细胞、阻断所述传染原的复制和/或保护宿主细胞免受感染和破坏。所述细胞介导的免疫应答指脊椎动物(例如人)呈现的，由T淋巴细胞和/或其他细胞如巨噬细胞介导的，针对传染原的免疫应答，其阻止或缓解感染或减少其至少一种症状。具体而言，“保护性免疫”或“保护性免疫应答”指脊椎动物(例如人)呈现的，针对传染原的免疫，或免疫应答的引发，其阻止或缓解感染或减少其至少一种症状。具体而言，所述疫苗给药对保护性免疫应答的诱导彰显为胃肠炎一种或多种症状存在的消除或减少，或上述症状的持续时间的减少或严重性的降低。因诺如病毒而起的胃肠炎的临床症状包括恶心、腹泻、稀粪、呕吐、发热和一般性不适。减少或消除疾病症状的保护性免疫应答会减少或停止诺如病毒爆发在人群中的扩散。疫苗制备一般地描述于Vaccine Design("The subunit and adjuvant approach"(edsPowell M.F.&Newman M.J.)(1995)Plenum Press New York)。本发明的组合物可配制为例如通过粘膜或胃肠外(例如肌肉内、静脉内、表皮下、真皮内、真皮下或经皮)给药途径给予受试者。上述粘膜给药可为，但不仅限于通过胃肠、鼻内、经口或阴道递送。在一个实施方案中，所述疫苗制剂为鼻喷剂、滴鼻剂或干粉形式。在另一个实施方案中，所述疫苗制剂为适于肌肉内给药的形式。
本发明的疫苗制剂可为液体制剂或干粉制剂。当所述组合物意欲递送于呼吸道(例如鼻)粘膜时，通常将其配制为水溶液以供作为气雾剂或滴鼻剂给药，或者，作为干粉例如用于快速沉积于鼻道中。用于作为滴鼻剂给药的组合物可含有一种或多种通常包括在该组合物中的类型的赋形剂，例如防腐剂、粘性调整剂、张度调整剂、缓冲剂等。粘性剂可为微晶纤维素、壳聚糖、淀粉、多糖等。用于作为干粉给药的组合物还可含有一种或多种通常包括在该组合物中的赋形剂，例如粘膜粘着剂、填充剂和用于递送适当粉末流动和大小特征的试剂。填充剂和粉末流动和大小试剂可包括甘露醇、蔗糖、海藻糖和木糖醇。
在一个实施方案中，所述疫苗制剂含有一种或多种复合VLP作为免疫原，佐剂如、鲨烯或，生物聚合物如壳聚糖或以促进对粘膜表面的粘着，以及填充剂如甘露醇和蔗糖。
例如，疫苗可配制为含有一种或多种如本文中讨论的复合VPL如GII.4复合VPL、佐剂、壳聚糖粘膜粘着剂以及作为填充剂并提供适当流动特征的甘露醇和蔗糖的10mg的干粉。所述制剂可包含约7.0mg(25至90％w/w范围)的壳聚糖，约1.5mg甘露醇(0至50％w/w范围)，约1.5mg蔗糖(0至50％w/w范围)，约25μg(0.1至5％w/w范围)，以及约100μg复合VLP抗原(0.05至5％w/w范围)。
复合VLP/抗原可以以约0.01％(w/w)至约80％(w/w)的浓度存在。在一个实施方案中，VLP可配制为约5μg、约15μg、约25μg、约50μg、约100μg、约200μg、约500μg以及约1mg每10mg干粉制剂(0.05、0.15、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0％w/w)的剂量以供给药至两个鼻孔中(每个鼻孔10mg)或约10μg、约30μg、约50μg、约100μg、约200μg、约400μg、约1mg和约2mg(0.1、0.3、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0和20.0％w/w)每20mg干粉制剂以供给药至一个鼻孔。在每次给药过程中，所述制剂可给予一个或两个鼻孔。可在第一次给药之后1至12周进行增强给药以促进免疫应答。疫苗和抗原性制剂中每种VLP/抗原的含量可为1μg至100mg的范围，优选为1-1000μg的范围，更优选5-500μg，最通常为10-200μg范围中。在每个剂量中给药的总VLP/抗原可为约10μg、约30μg、约200μg、约250μg、约400μg、约500μg或约1000μg。总疫苗剂量可给药至一个鼻孔或分为两半以供给药至两个鼻孔。干粉特征为少于10％的颗粒直径小于10μm。平均颗粒大小为直径范围是10至500μm。
在本发明的另一个实施方案中，所述干粉制剂可与一种或多种装置组合以供给予一剂或多剂所述制剂。上述装置可为一次性使用的鼻给药装置。在另一个实施方案中，所述一剂或多剂为单位剂量。
在一些实施方案中，所述抗原性和疫苗制剂为液体制剂以供后续给予受试者。意欲用于鼻内给药的液体制剂应包含复合VLP/抗原、佐剂和递送剂如壳聚糖。用于胃肠外(例如表皮下、真皮内或肌肉内(i.m.))给药的液体制剂应包含复合VLP/抗原、佐剂和缓冲液，而不含递送剂(例如壳聚糖)。
优选地，本文中上述抗原性和疫苗制剂经冻干，并以无水形式储藏直至其将被使用，在此时间点将其用稀释剂重构。或者，组合物的不同组分可分别储藏于试剂盒中(任何或全部组分被冻干)。所述组分可保持冻干形式用于干制剂或经重构用于液体制剂，并或者在使用前混合或者分别给予患者。对于干粉给药，所述疫苗或抗原性制剂可预加载入鼻内递送装置并储藏直至使用。优选地，上述鼻内递送装置应保护并确保其成分的稳定性。
本发明还涵盖包含一种或多种本文中所述的免疫原性核酸、多肽和/或VLP的组合物。不同的多肽，包括复合多肽和衣壳多肽或其片段可一同混合于单一制剂。在上述组合中，免疫原性组合物的抗原可以超过一种多肽或多表位多肽的形式存在。
所述免疫原性组合物可包含复合多肽和编码复合多肽的核酸的混合物，其还可使用相同或不同的媒介递送。抗原可于例如预防性(即，为了预防感染)或治疗性(为了治疗感染)免疫原性组合物中单独给药或组合给药。可超过一次地给予所述免疫原性组合物(例如，“引发(prime)”给药继以一次或多次“增强(boost)”给药)以达成所需的效果。相同的组合物可以以一次或多次引发步骤以及一次或多次增强步骤给药。或者，可使用不同的组合物以供引发和增强。
本发明还涵盖针对受试者中的病毒感染诱导保护性免疫的方法，包括给予本文中所述的任何疫苗制剂。在一个实施方案中，所述病毒感染是诺如病毒感染。在另一个实施方案中，所述疫苗制剂赋予针对诺如病毒感染的一种或多种症状的保护。
本发明还提供用于制备包含复合多肽的VLP的方法。在一个实施方案中，所述方法包括比对来自无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的氨基酸序列；从所述比对的氨基酸序列确定共有序列；基于所述共有序列制备复合序列，所述复合序列与所述两种或更多种流行株的每一个衣壳序列相比具有至少一个不同的氨基酸；和将所述复合序列在宿主细胞中表达，由此产生病毒样颗粒。在另一个实施方案中，所述复合序列与所述两种或更多种流行株的每一个衣壳序列相比含有至少三个不同的氨基酸。在另一个实施方案中，所述复合序列与所述两种或更多种流行株的每一个衣壳序列相比含有至少五个不同的氨基酸。还在另一个实施方案中，所述复合序列与所述两种或更多种流行株的每一个衣壳序列相比含有至少九个不同的氨基酸。在一些实施方案中，所述共有序列可通过比对来自无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的核苷酸序列来确定；并基于所述共有序列制备复合核苷酸序列。适用于该方法的无包膜病毒的非限定性实例为杯状病毒、小RNA病毒、星状病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、乳头瘤病毒、细小病毒和戊型肝炎病毒。在一些实施方案中，所述无包膜病毒是杯状病毒。所述杯状病毒可为诺如病毒或札幌病毒。在另一个实施方案中，所述诺如病毒是基因型组I或基因型组II诺如病毒。
本发明现可更详细地通过参照下述实施例中所述的具体实施方案来阐明。所述实施例意欲纯系对本发明的说明，并不意欲以任何方式限制其范围。
实施例
实施例1.诺如病毒GII.4共有基因的设计
通过两种近来流行GII.4株Minerva，即2006-a；以及Laurens，即2006-b，与2002年获得的GII.4Houston株的同源性比较确定了基因型组II，基因型4(GII.4)诺如病毒的主要衣壳蛋白(VP1)的共有氨基酸序列。所述三种不同的诺如病毒GII.4分离株的比对如下所示。从所述三种GII.4株的同源性比较确定的共有序列(SEQ ID NO:2)示于图1。
通过从Minerva序列选择在共有序列中所有三个菌株均不同的可变位置的氨基酸来从共有序列衍生复合序列。所选的氨基酸存在于抗原性区，靠近但不包含推定的糖结合域。将所述复合GII.4序列用于产生编码复合GII.4诺如病毒VP1蛋白(SEQ ID NO:1)的合成基因。GII.4复合VP1氨基酸序列(GII.4Comp)作为SEQ ID NO:1示于下述与来自Houston、Minerva和Laurens病毒(分别为SEQ ID NO:4、5和6)的VP1蛋白的氨基酸序列的比对。编码GII.4复合VP1的DNA序列示于图2。
实施例2.复合VLP的纯化
将实施例1所述的衣壳域的诺如病毒GII.4复合序列的合成基因构建物克隆入重组杆状病毒。对昆虫细胞的感染显示了高产量的VLP产生。将40mL针对所述复合VLP VP1基因的P2pFastBac重组杆状病毒储备等分试样用蔗糖梯度处理以验证复合VLP的表达和装配。首先将条件培养基铺于30％蔗糖垫上，然后以140K x g离心以沉淀VLP。将沉淀重悬，铺于蔗糖梯度，然后以140K x g离心。在离心之后在梯度内观察到可见的白色层。从梯度收集500μL的级分，然后通过SDS-PAGE/考马斯凝胶分析(图3)。在蔗糖梯度级分内观察到了对于复合VLP在～56kDa的预测的条带样式。
使用高压液相色谱系统，用20mM Tris 150mM NaCl pH 7的运行缓冲液，以0.5mL/分钟的流速，将复合表达细胞培养上清的50μL等分试样上样于Superose-6尺寸排阻柱上。在～15.3分钟在280nm和220nm观察到完好的VLP峰，确证了复合VLP的完整性(图4)。
还从条件培养基使用柱层析纯化了复合VLP。通过阳离子交换层析处理条件培养基。进一步通过疏水相互作用层析(HIC)纯化阳离子交换洗脱级分。通过切线流过滤浓缩HIC洗脱级分并进行缓冲液交换。将终产物过滤除菌并储藏于4℃。将500ng纯化的复合VLP(CM3批次)通过银染SDS-PAGE进行分析(图5)。
使用高压液相色谱系统，用20mM Tris 150mM NaCl pH 7的运行缓冲液，以1.0mL/分钟的流速，将纯化的CM3复合VLP的50μL等分试样上样于Superose-6尺寸排阻柱上。在～7.5分钟在280nm观察到完好的VLP峰，确证了复合VLP的完整性(图6)。
实施例3.复合免疫原性
将大约8-10周龄的雌性C57BL/6小鼠用浓度顺次减少的复合VLP(CVLP)进行腹膜内免疫，起始为50μg，2倍减少至0.19μg。所述CVLP含有具有如实施例所述的SEQ ID NO:1的序列的多肽。包括了一组仅用PBS免疫的动物作为阴性对照。收集了血清样品，并通过ELISA就CVLP特异性IgG的存在对其进行分析(图7)。该实验的结果表明剂量曲线的线性范围是在大约6μg至0.2μg。超过6.25μg CVLP的剂量似不以剂量依存性形式增强免疫应答。使用Softmax Pro软件(Molecular DevicesCorporation,Sunnyvale,CA)，EC50值(定义为产生50％应答的有效剂量)计算为大约1.0μg/mL。
实施例4.复合VLP的多重抗原作用
将雌性C57BL/6小鼠(8-10周龄)用多种剂量的诺沃克VLP本身(NVLP)、复合VLP(CVLP)本身或其组合进行腹膜内免疫。包括了一组仅用PBS免疫的动物作为阴性对照。收集了血清样品，并通过ELISA对其就抗原特异性IgG进行了分析(图8和9)。该结果表明用CVLP和NVLP的组合免疫增强了免疫应答从而使得用较低剂量的抗原获得了较高的IgG水平。例如，用NVLP和CVLP各1μg进行的免疫比给药任一种VLP本身引发了更强烈而稳定的免疫应答。来自用CVLP免疫的动物的抗体不与NVLP交叉反应，反之亦然(数据未显示)。
实施例5.复合VLP引发交叉反应性抗体
将大约10-12周龄的雌性C57/BL6小鼠用与作为佐剂的MPL(20μg)一起配制的30μg Houston VLP或复合VLP进行腹膜内免疫。所述复合VLP含有具有如实施例1中所述的SEQ ID NO:1的序列的多肽。在免疫之后第21日对小鼠进行放血，并在抗原特异性ELISA中测定血清以确定复合型、Houston、Laurens和诺沃克VLP的抗体效价。数据示于图10。用复合VLP的免疫在更多血清型中诱发了更广泛的应答，如针对Laurens株更大的应答而保持对Houston株的应答所彰显。用Houston VLP的免疫还诱导了针对复合型和Laurens的交叉反应性抗体，但应答的程度不如用复合VLP免疫所观察到的大。对诺沃克VLP(其为GI.1诺如病毒)并无可检测的应答。
实施例6.二价疫苗在家兔中的效力
进行了评估包含如实施例2中所述的诺如病毒GII.4复合VLP(CVLP)和诺沃克VLP(NVLP，GI.1)的二价诺如病毒疫苗的效力的研究。用该二价疫苗在第0和第21日对家兔进行肌肉内免疫。VLP剂量的范围为每种类型的VLP 20μg至0.002μg，且每个疫苗制剂含有25μg MPL和250μgAlOH。在第28日从每只家兔收集血清，并评估VLP特异性IgG。在第75日收集脾和肠系膜淋巴结，并就抗原特异性细胞免疫的存在进行评估。
通过ELISA使用包被以NVLP或CVLP作为捕捉剂的微滴定板测量血清IgG效价。效价表示为稀释程度的倒数(图11)。抗原特异性T细胞应答性是在用5μg NVLP或CVLP体外刺激5日之后通过氚化胸苷掺入来评估的(图12)。记忆B细胞是通过VLP特异性ELIPOT评估的，且结果表示为每百万细胞中的抗体分泌细胞(图13)。
该研究的结果阐明了用佐剂MPL和AlOH配制的IM二价诺如病毒疫苗引发了高VLP特异性IgG应答、应答性T细胞和记忆B细胞，其能够响应NVLP和CVLP二者的刺激。
实施例7.家兔中的高剂量二价疫苗接种
本实施例概述了设计为确定二价疫苗中高剂量的复合和诺沃克VLP会否导致任何不利事件的实验。将家兔用二价疫苗(参见实施例6)在第0、14和21日进行肌肉内免疫。VLP剂量的范围为150μg至5μg每种VLP(诺沃克和复合型)，且每种制剂含有50μg MPL和500μg AlOH。在最初72小时中每12小时监视经免疫的家兔的一般性健康、皮毛状况(coat condition)和注射位点，之后每日进行监视。从每只家兔在第21日和第35日收集血清，并评估诺沃克VLP(NVLP)特异性(图14)和复合VLP(CVLP)特异性(图15)IgG和IgA。还在第35日收获脾，并就抗原特异性细胞免疫的存在对其进行评估(图16)。
通过ELISA使用包被以NVLP或CVLP作为捕捉剂的微滴定板测量血清IgG效价。效价表示为稀释程度的倒数。抗原特异性T细胞应答性是在用所示抗原(例如，复合VLP，GII.4(2002)VLP，GII.4(2006)VLP和诺沃克VLP)体外刺激5日之后通过氚化胸苷掺入来评估的。
该研究的结果显示诺如病毒二价疫苗在测试的剂量是安全的，如通过下述事实所彰显：所有的家兔在研究期限内显得健康，且未观察到注射位点反应。从经疫苗接种的家兔测量的免疫应答确证了二价诺如病毒疫苗对引发VLP特异性抗体以及VLP应答性T细胞均为有效的。
实施例8.对于诺如病毒疫苗效力的小鼠效力测定
该实施例概述了开发小鼠效力测定以评估二价诺如病毒疫苗的效力。将小鼠在第0和7日用相同浓度(范围为0.002μg至30μg)的诺沃克VLP(NVLP)和复合VLP(CVLP)进行IP免疫。在第14日从每只小鼠收集血清，并评估VLP特异性IgG(图17)。该抗体的中和活性还通过血凝抑制测定(HAI)使用O型阳性人红细胞测量(图18)。仅可评价诺沃克HAI特异性效价，因为GII.4基因型并不凝集红细胞。
通过ELISA使用包被以NVLP或CVLP作为捕捉剂的微滴定板测量血清IgG效价。效价表示为稀释程度的倒数。HAI效价通过使用标准血凝测定来测量。
此研究的结果表明用二价诺如病毒疫苗接种引发了强力和功能性IgG效价，从而使得其能够抑制人红细胞的血凝。这些结果特别重要，因为其阐明了响应疫苗接种引发的抗体具有功能性，其可在感染过程中导致实际病毒的中和。
实施例9.诺如病毒二价疫苗的壳聚糖制剂
在家兔中进行了用二价诺如病毒VLP疫苗评估壳聚糖在该疫苗制剂中作用的研究。该制剂含有等量的诺沃克VP1VLP和复合GII.4VLP(参见实施例2)。在第0和21日用干粉制剂对家兔进行鼻内免疫。VLP剂量的范围为每种类型的VLP 150μg至5μg，且每种制剂含有50μg MPL。对于每种剂量范围变动壳聚糖浓度(7mg、0.7mg和0mg)以确定其在免疫原性中的作用。从每只家兔收集血清，并评估了VLP特异性IgG(图19)。
通过ELISA使用包被以VLP作为捕捉剂的微滴定板测量血清IgG效价。将专属的内部家兔抗VLP血清的系列稀释用于生成标准曲线。效价表示为单位抗VLP/mL(一单位大约等于1μg)。
来自这些实验的结果表明需要最高剂量的壳聚糖(7mg)以达到最大的免疫原性。对于50μg剂量的IgG数据示于图19，且结果表示为U/ml。IgA抗体应答显示于下面的表1。
实施例10.诺如病毒GII共有基因的设计
本发明的方法还可用于生成来自不同GII基因型GII.1、GII.2、GII.3的诺如病毒GII分离株之间的衣壳共有序列。下述比对是从来自三种不同的诺如病毒GII分离株的VP1序列生成的。根据该三种GII株的同源性比较确定的共有序列(SEQ ID NO:7)示于图20。
通过从一种株的序列选择在共有序列中两种或多种菌株有所不同的可变位置处的氨基酸来从共有序列衍生复合序列。优选地，氨基酸所选自的序列是近来的流行株，或更通常与疾病相关或更通常出现于受评估的株中。在本实施例中，从Snow Mountain序列选择在共有序列中所有三个株均有差异的可变位置处的氨基酸以生成复合VP1GII序列。所述复合GII序列用于生成编码复合GII VP1蛋白的合成基因以供在GII诺如病毒分离株中诱导交叉免疫性。
所述复合GII VP1氨基酸序列(复合型(Composite))作为SEQ ID NO:11示于下述与来自GII.1(登录号：AAL13001)、GII.2Snow Mountain(登录号：AAB61685)和GII.3病毒(登录号：AAL12998)的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:8、9和10)进行的比对中。
实施例11.诺如病毒GI共有基因的设计
本发明的方法还可用于生成诺如病毒GI分离株之间的衣壳共有序列。下述比对是从来自三种不同的诺如病毒GI分离株的VP1序列生成的。根据该三种GI株的同源性比较确定的共有GI序列(SEQ ID NO:12)示于图21。
通过从一种株的序列选择在共有序列中两种或更多种株有所差异的位置处的氨基酸来从共有序列衍生复合序列。优选地，氨基酸所选自的序列是近来的流行株，或更通常与疾病相关或更通常出现于受评估的株中。在本实施例中，从Southampton序列在共有序列中所有三个株均有差异的可变位置选择氨基酸以生成复合VP1GI序列。所述复合GI序列用于生成编码复合GI VP1蛋白的合成基因以供在GI诺如病毒分离株中诱导交叉免疫性。
所述复合GI VP1氨基酸序列(复合型(Composite))作为SEQ ID NO:16示于下述与来自诺沃克病毒(登录号：M87661)、Southampton(登录号：Q04542)和Chiba病毒(登录号：BAB18267)的氨基酸序列(分别为SEQ IDNO:13、14和15)进行的比对中。
实施例12.人乳头瘤病毒L1共有基因的设计
本发明的方法还可用于生成其他无包膜病毒之间的共有序列。下述比对是从三种人乳头瘤病毒(HPV)生成的：HPV-11、HPV-16和HPV-18。根据该三种HPV株的同源性比较确定的共同L1衣壳蛋白序列(SEQ ID NO:17)示于图22。
通过从一种株的序列选择在共有序列中两种或更多种株有所差异的位置处的氨基酸来从共有序列衍生复合序列。优选地，氨基酸所选自的序列是近来的流行株，或更通常与疾病相关或更通常出现于受评估的株中。在本实施例中，从HPV-18序列在共有序列中所有三个株均有差异的可变位置选择氨基酸以生成复合L1HPV序列。所述复合HPV序列用于生成编码复合L1多肽的合成基因以供在多种HPV株中诱导交叉免疫性。
所述复合HPV L1氨基酸序列(复合型(Composite))作为SEQ ID NO:21示于下述与来自HPV-11、HPV-16和HPV-18病毒的L1蛋白的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:18、19和20)进行的比对中。
实施例13.复合VLP疫苗制剂在人中的剂量放大安全性研究
进行了诺如病毒疫苗的一项双盲、有对照的、剂量放大1期安全性和免疫原性研究。所述疫苗由设计用于鼻内施用的干粉基质中的复合诺如病毒病毒样颗粒(VLP)组成。所述复合VLP含有具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。疫苗接种者包括属于H型1抗原分泌者的健康成人志愿者。选择H型1抗原分泌者的理由是H型1抗原分泌者对诺如病毒感染易感而非分泌者有抵抗力。作为对照，每种剂量水平的另外2名志愿者只接受基质。所述干粉基质包括25μg佐剂、7mg壳聚糖、1.5mg甘露醇和1.5mg蔗糖。在第0和第21日向志愿者给药，并要求其在每次给药后记录7天症状日记。收集血液以供血清学、抗体分泌细胞(ASC)评估并收集粪便和唾液样品以供粘膜抗体评估用。
表2中列出了疫苗的成分。将疫苗包装到鼻内递送装置中。将单次施用的复合VLP疫苗包装到单剂Bespak(Milton Keynes,UK)UniDose DP干粉鼻内递送装置中。每个装置递送10mg干粉疫苗制剂。每剂疫苗由两个递送装置组成，每个鼻孔中一个。总疫苗剂量是20mg干粉。佐剂/赋形剂的制剂与复合VLP疫苗相同，只是制剂中不包括复合VLP抗原。佐剂/赋形剂的制剂(也称作干粉基质)总结于表3中。
表2：复合VLP疫苗组合物
表3：佐剂/赋形剂(干粉基质)
成分 分子类别 每10mg干粉的量 占最终制剂的％
单磷酰基脂质A 磷脂 25μg 0.25％
壳聚糖 多糖 7.0mg 70％
甘露醇 糖 1.5mg 15％
蔗糖 糖 1.5mg 15％
具体而言，如下进行疫苗的剂量放大：适当筛选健康优良后，使一组3名志愿者随机接受通过鼻内途径的5μg复合VLP疫苗加干粉基质(n＝2)或单独的干粉基质(n＝1)。对这3名志愿者跟踪安全性21天，并由独立安全监视人(Independent Safety Monitor,ISM)审查他们的安全性数据。在ISM批准之后，这些个体在第21天接受他们的第二剂疫苗或基质，并使另外4名志愿者随机接受通过鼻内途径的5μg VLP蛋白加干粉基质(n＝3)或单独的基质(n＝1)。ISM审查来自这第二组的安全性数据，并且在ISM批准后，在第一剂后21天给予鼻内第二剂。志愿者在每次给药后记录7天症状日记。在ISM决定放大至下一个更高剂量是可接受的之后，使另一组7名志愿者随机接受在第0天和第21天通过鼻内途径的含有15μg VLP蛋白的复合VLP疫苗(n＝5)或单独的干粉基质(n＝2)。再次，记录7天症状日记，并在第21天第二剂之前由ISM审查。最后，审查来自前两个剂量分组的安全性数据后，ISM决定剂量放大是否可接受，并且对最后一组7名志愿者随机指派以在第0天和第21天通过鼻内途径接受含有50μg VLP蛋白的复合VLP疫苗(n＝5)或单独的干粉基质(n＝2)。第21天第二剂之前ISM再次审查七天症状日记和其它安全性数据。
志愿者在接受复合VLP疫苗或单独的干粉基质后7天里记症状日记(包括局部症状：诸如鼻涕、鼻疼痛/不适、鼻充血、鼻漏、鼻痒、鼻出血、头痛；和系统症状：诸如每日口腔温度、肌痛、恶心、呕吐、腹部绞痛、腹泻和食欲不振)。在每次随访(第7±1天、第21±2天、第28±2天、第56±2天和第180±14天)时获得期中(interim)医学史；对志愿者询问期中的疾病、药疗和医生出诊。要求志愿者报告所有严重的或重度的不良事件，包括在随访期间未请求的(solicited)事件。在第7天和第28天(每次免疫后7天)对志愿者评估CBC和血清肌酸酐、葡萄糖、AST和ALT，而且如果异常，那么跟踪异常实验室测试直至所述测试变成正常或稳定。
在免疫前及在第7±1天、第21±2天、第28±2天、第56±2天和第180±14天收集血液以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量针对复合VLP疫苗的血清抗体。在施用每剂疫苗或单独的干粉基质之前及之后第7天收集外周血淋巴细胞以通过ELISPOT测定法检测抗体分泌细胞。在疫苗接种之前及之后第21±2天、第56±2天和第180±14天获得全血以分离细胞并冷冻，供未来研究由细胞介导的免疫用，包括响应复合VLP抗原而发生的细胞因子生成，和淋巴增殖。在免疫前及在第7±1天、第21±2天、第28±2天、第56±2天和第180±14天收集全便样品，供抗复合VLP sIgA筛选用。在免疫前及在第7±1天、第21±2天、第28±2天、第56±2天用商品化装置(Salivette,Sarstedt,Newton,NC)收集唾液，而且如果第56天粘膜抗体呈阳性，那么收集第180±14天样品并筛选抗复合VLP sIgA。最后，在第0天、第21天、第56天和第180天对来自接受最高剂量的复合VLP(50μg，上文所述第三分组)的志愿者的血液筛选记忆B细胞。
使用下列方法来分析自经免疫个体或接受单独的干粉基质的个体收集的血液、粪便和唾液样品：
A.通过ELISA测量血清抗体
在疫苗接种之前及在疫苗接种之后多个时间点收集20mL血液以供通过ELISA测量针对复合VLP的抗体，其中使用纯化的重组复合VLP作为靶抗原来筛选有编码的标本。简言之，使用碳酸盐包被缓冲液pH9.6中的复合VLP包被微滴定板。将经包被的板清洗，封闭，并与连续两倍稀释的测试血清一起温育，接着清洗，并与酶偶联的对人IgG、IgM和IgA特异性的二抗试剂一起温育。添加适宜的底物溶液，显色，读板，并测定IgG、IgM和IgA终点效价，与参照标准曲线比较每种抗体类别。阳性响应定义为疫苗接种后的效价升高4倍。
B.抗体分泌细胞测定法
自30mL肝素化血液收集外周血单核细胞(PBMC)以供ASC测定以检测分泌针对复合VLP的抗体的细胞。在施用所述复合VLP疫苗或单独的干粉基质后在第0日、第7±1日、第21±2日和第28±2日实施这些测定。阳性应答定义为疫苗接种后每106个PBMC的ASC计数超出所有受试者疫苗接种前计数的均值至少3个标准偏差(SD)(以对数计量计)和至少8个ASC斑点，这对应于用介质刺激的阴性对照孔的均值(2个斑点)加3个SD，如相似测定法中所测定的。
C.测量复合VLP病毒特异性记忆B细胞
疫苗接种后在第0、21、56和180天自分组3(30mL第0天和第21天，50mL第56天和第180天)收集肝素化血液以使用ELISpot测定法测量记忆B细胞，之前有体外抗原刺激。相似的测定法成功地用于测量家兔中由诺沃克VLP制剂引发的记忆B细胞的频率(参见WO 2008/042789，通过提述并入本文)。将外周血单核细胞(5x106细胞/mL，1mL/孔，24孔板中)与复合VLP抗原(2-10μg/mL)一起温育4日以使得抗原特异性记忆B细胞克隆能够扩增并分化成抗体分泌细胞。对照包括在相同条件中在没有抗原的情况中温育的细胞和/或与无关抗原一起温育的细胞。刺激后，清洗细胞，计数并转移至经复合VLP包被的ELISpot板。为了测定VLP特异性记忆B细胞/总Ig分泌B淋巴细胞的频率，还将扩增的B细胞添加至经抗人IgG和抗人IgA抗体包被的孔。用HRP标记的抗人IgG或抗人IgA，接着用True Blue底物揭示结合的抗体。也可以使用针对IgA和IgG亚类(IgA1、IgA2和IgG1-4)的偶联物来测定抗原特异性亚类应答，这可能与不同效应器机制和免疫引发位置有关。用ELISpot读数器对斑点计数。通过流式细胞术为每名志愿者检查扩增细胞群以确认他们的记忆B细胞表型，即CD19+、CD27+、IgG+、IgM+、CD38+、IgD-。
D.细胞免疫应答
作为有编码的标本收集肝素化血液(50mL分组1和2，25mL分组3)，分离PBMC，并在液氮中冷冻保存，以供未来可能评估针对复合VLP抗原的细胞介导免疫(CMI)应答。可以实施的测定法包括针对复合VLP抗原的PBMC增殖和细胞因子应答，而且可以通过依照已建立的技术测量干扰素(IFN)-γ和白介素(IL)-4水平来测定。
E.收集粪便和唾液以供抗复合VLP sIgA
在粪便和唾液样品中测量抗复合VLP IgA。将唾液标本用蛋白酶抑制剂(即AEBSF、亮抑酶肽(leupeptin)、苯丁抑制素(bestatin)和抑酶肽(aprotinin))(Sigma,St.Louis,MO)处理，保存于-70℃，并使用一种先前记载的测定法的改良形式测定(Mills et al.(2003)Infect.Immun.71:726-732)。在疫苗接种后的多个日子收集粪便，并将标本保存于-70℃直至分析。融化标本，并添加蛋白酶抑制剂缓冲液以制备10％w/v粪便悬液。如下所述，通过ELISA对粪便上清测定复合VLP特异性粘膜IgA。
在疫苗接种之前及在疫苗接种之后多个时间点收集大约2-3mL的全唾液。通过商品化装置(Salivette,Sarstedt,Newton,NC)收集唾液，其中咀嚼Salivette拭子或将Salivette拭子在舌下放置30-45秒，直至拭子被唾液饱和。通过离心自拭子收集唾液。
F.测量粪便和唾液中的抗复合VLP
利用用抗人IgA抗体试剂或靶复合VLP抗原涂层包被的板实施ELISA以对每份标本测定总IgA和滴定特异性抗VLP IgA应答。如上所述，用HRP标记的抗人IgA揭示总的或特异性的IgA。包括一条内部总IgA标准曲线来对IgA含量定量。应答定义为特异性抗体升高4倍。
实施例14.两种剂量的鼻内复合VLP疫苗在人中的安全性和免疫原性 研究
在健康成人中进行了一项随机化、双盲研究以与佐剂/赋形剂和安慰剂对照(空装置)比较两种剂量水平的复合诺如病毒病毒样颗粒(VLP)疫苗的安全性和免疫原性。所述疫苗由实施例13中所述设计用于鼻内施用的干粉基质中的复合诺如病毒病毒样颗粒(VLP)组成。疫苗接种者包括属于H型1抗原分泌者的健康成人志愿者。将人志愿者随机指派四个小组之一，而且每个小组接受下列处理之一：一剂50μg复合VLP疫苗，一剂100μg复合VLP疫苗，佐剂/赋形剂，或安慰剂。志愿者在第0和第21日给药，并被要求在每次给药后记录7天症状日记。收集血液以供血清学、抗体分泌细胞(ASC)评估并收集粪便和唾液样品以供粘膜抗体评估用。
实施例13表2中列出了疫苗的成分。将疫苗包装到鼻内递送装置中。将单次施用的复合VLP疫苗包装到单剂Bespak(Milton Keynes,UK)UniDose DP干粉鼻内递送装置中。每个装置递送10mg干粉疫苗制剂。每剂疫苗由两个递送装置组成，每个鼻孔中一个。总疫苗剂量是20mg干粉。因此，50μg疫苗剂量由两个装置组成，每个递送10mg干粉制剂，其中每10mg干粉制剂由25μg复合VLP、25μg佐剂、7mg壳聚糖、1.5mg甘露醇和1.5mg蔗糖组成。类似地，100μg疫苗剂量由两个装置组成，每个递送10mg干粉制剂，其中每10mg干粉制剂由50μg复合VLP、25μg佐剂、7mg壳聚糖、1.5mg甘露醇和1.5mg蔗糖组成。佐剂/赋形剂的制剂与复合VLP疫苗相同，只是制剂中不包括复合VLP抗原。佐剂/赋形剂的制剂(也称作干粉基质)总结于实施例13表3中。安慰剂组接受两个空装置。
志愿者在接受两剂复合VLP疫苗、单独的干粉基质或安慰剂任一剂后7天里每天记症状日记(包括局部症状诸如：鼻涕、鼻疼痛/不适、鼻充血、鼻漏、鼻痒、鼻出血、头痛；和系统症状诸如：每日口腔温度、肌痛、恶心、呕吐、腹部绞痛、腹泻和食欲不振)。在每次随访(第7+1日、第21+2日、第28+2日、第56+2日和第180+14日)时获得期中医学史；对志愿者询问期中的疾病、药疗和医生出诊。要求志愿者报告所有严重的或重度的不良事件，包括在随访期间未请求的事件。在第7和第28日(每次免疫后7日)对志愿者评估CBC和血清肌酸酐、葡萄糖、AST和ALT，而且如果异常，那么跟踪异常实验室测试直至所述测试变成正常或稳定。
在免疫前及在第7+1日、第21+2日、第28+2日、第56+2日和第180+14日收集血液以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量针对复合VLP疫苗的血清抗体。在施用每剂疫苗、单独的干粉基质或安慰剂前及在施用每剂疫苗、单独的干粉基质或安慰剂后第7日，收集外周血淋巴细胞以通过ELISPOT测定法检测抗体分泌细胞。在疫苗接种之前及在疫苗接种后第21+2日、第56+2日和第180+14日，获得全血以分离细胞并冷冻，供未来研究由细胞介导的免疫用，包括响应复合VLP抗原而发生的细胞因子生成，和淋巴增殖。在免疫前及在第7+1日、第21+2日、第28+2日、第56+2日和第180+14日收集全便样品，供抗复合VLP sIgA筛选用。在免疫前及在第7+1日、第21+2日、第28+2日、第56+2日用商品化装置(Salivette,Sarstedt,Newton,NC)收集唾液，而且如果第56日粘膜抗体呈阳性，那么收集第180+14日样品并筛选抗复合VLP sIgA。还在第0、21、56和180日对血液筛选记忆B细胞。
用于分析自经免疫个体或接受单独的干粉基质或安慰剂的个体收集的血液、粪便和唾液样品的方法详细记载于实施例13中。
实施例15.用感染性诺如病毒在用复合诺如病毒VLP疫苗接种之后进 行的实验性对人攻击研究
在80名用所述复合诺如病毒VLP疫苗免疫的人志愿者中进行了一项多部位、随机化、双盲、有安慰剂对照的1-2期攻击研究。合格的受试者包括那些年龄为18-50岁的，健康状况良好的，表达H型-寡糖1的(通过阳性唾液分泌者状态来测量)且不属于B型或AB型血的。属于非H型-1分泌者的或具有B或AB型血的受试者据报告对诺沃克病毒感染更有抵抗力，被排除在研究之外。基于这两条标准，预期至少80％的志愿者是合格的。
筛选后，将达到所有接受标准的合格志愿者随机(1:1)分入两个同等大小的分组之一，每个分组中有约40名志愿者。分组1用复合VLP免疫而分组2接受安慰剂。在每个鼻孔中用10mg复合VLP疫苗(总共20mg干粉)或安慰剂免疫志愿者。每10mg复合VLP疫苗含有50μg复合VLP、7mg壳聚糖、25μg、1.5mg蔗糖和约1.5mg甘露醇。如此，分组1中的每名志愿者在每次免疫时接受100μg复合VLP抗原的总剂量。志愿者在第0和第21日接受疫苗或安慰剂。
评估了复合病毒VLP疫苗与安慰剂相比的安全性。志愿者在每次用疫苗或安慰剂免疫后7日里记日记以记录不良事件的严重程度和持续时间。最后一剂疫苗或安慰剂后6个月里和用感染性病毒考验后的4个月里跟踪严重的不良事件(SAE)和任何重大新医学状况的发生。
在第二剂疫苗或安慰剂后21-42日之间(研究第42-56日之间)用感染性诺如病毒考验所有志愿者。每名志愿者接受大于或等于50％人感染剂量(HID 50)，即预期在安慰剂组的至少50％的志愿者中引起疾病的感染性病毒量。HID 50介于约48和约480病毒当量的攻击病毒株之间。将攻击诺如病毒与无菌水混合，并口服给药。接种之前摄取水中的500mg碳酸氢钠，以防止病毒被胃酸和胃蛋白酶分解。在口服接种感染性病毒后5分钟进行第二次碳酸氢钠溶液(水中的500mg碳酸氢钠)摄取。志愿者在考验机构逗留至少4天且在急性胃肠炎的症状/体征(呕吐、腹泻、稀粪、腹痛、恶心和发烧)消失后至少18小时。
监测数项度量来测定复合VLP疫苗在预防或减轻由病毒考验诱发的急性胃肠炎的症状/体征方面的效能。记录所有志愿者的急性胃肠炎临床症状，而且研究人员在研究场所将这些症状记入文件。将来自接受疫苗的分组1的疾病症状/体征与分组2安慰剂接受者比较。
在用疫苗或安慰剂免疫前和在考验后例行地自所有志愿者收集血清和粪便样品。通过ELISA分析血清样品的IgA和IgG，针对攻击VLP的效价。分别通过ELISA和PCR在粪便样品中测试攻击病毒抗原和攻击病毒RNA，其指示病毒的存在、自肠脱落的病毒的量和病毒脱落的持续时间。对在考验后生病的受试者进行别的实验室研究，包括血清化学、BUN、肌酸酐和肝功能测试，直至症状/体征得到解决。
比较来自疫苗组(分组1)和安慰剂组(分组2)的结果以评估疫苗针对诺如病毒疾病总体的保护效能(主要终点)和/或其在改善症状/体征(疾病的严重程度和天数)和/或病毒脱落的存在、量和/或持续时间的降低中的效能(次要终点)。
本发明在范围上不受所描述的具体实施方案的限制，所描述的具体实施方案意欲作为本发明各方面的单一例示，而且功能上等同的方法和成分在本发明的范围内。实际上，根据上述描述和附图，仅使用例行实验，在本文所显示的和所描述的那些之外，对本发明的各种修饰对于本领域技术人员而言即会变得显而易见。上述修饰和等同方案意欲落在所附权利要求的范围内。
通过提述将本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请并入本说明书，其程度有如具体并单独指明通过提述将每一篇单独的出版物、专利或专利申请并入本文一样。
本文中对参考文献的引用或讨论不应解释为承认其为本发明的现有技术。

Claims (10)

1.一种病毒样颗粒，其包含至少一种具有复合氨基酸序列的多肽，其中所述复合氨基酸序列源自代表无包膜病毒的两种或更多种流行株的衣壳蛋白的共有序列，且其中所述至少一种多肽当在宿主细胞中表达时形成病毒样颗粒并且与所述两种或更多种流行株的各个衣壳序列相比含有至少一个不同的氨基酸。
2.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒具有所述无包膜病毒的两种或更多种流行株的抗原性质。
3.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒在与所述无包膜病毒的一种或多种流行株的抗血清交叉反应性方面与通过用仅含有来自所述一种或多种流行株的蛋白质的病毒样颗粒免疫而获得的抗血清交叉反应性相比增加至少两倍。
4.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行株的衣壳序列相比含有至少3个不同的氨基酸。
5.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行株的衣壳序列相比含有至少5个不同的氨基酸。
6.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述复合序列与所述无包膜病毒的一种或多种流行株的衣壳序列相比含有至少9个不同的氨基酸。
7.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述共有序列是SEQ ID NO:2。
8.权利要求1的病毒样颗粒，其中所述无包膜病毒选自下组：杯状病毒(Calicivirus)、小RNA病毒(Picornavirus)、星状病毒(Astrovirus)、腺病毒(Adenovirus)、呼肠孤病毒(Reovirus)、多瘤病毒(Polyomavirus)、乳头瘤病毒(Papillomavirus)、细小病毒(Parvovirus)和戊型肝炎病毒(Hepatitis Evirus)。
9.权利要求8的病毒样颗粒，其中所述无包膜病毒是杯状病毒。
10.权利要求9的病毒样颗粒，其中所述杯状病毒是诺如病毒(Norovirus)或札幌病毒(Sapovirus)。
CN201510127943.5A 2008-08-08 2009-08-10 交叉反应性增强的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒 Pending CN104911154A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8750408P 2008-08-08 2008-08-08
US61/087,504 2008-08-08
US21860309P 2009-06-19 2009-06-19
US61/218,603 2009-06-19
CN200980139886.5A CN102177233B (zh) 2008-08-08 2009-08-10 用于增强交叉反应性的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980139886.5A Division CN102177233B (zh) 2008-08-08 2009-08-10 用于增强交叉反应性的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104911154A true CN104911154A (zh) 2015-09-16

Family

ID=41664003

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980139886.5A Active CN102177233B (zh) 2008-08-08 2009-08-10 用于增强交叉反应性的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒
CN201510127943.5A Pending CN104911154A (zh) 2008-08-08 2009-08-10 交叉反应性增强的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980139886.5A Active CN102177233B (zh) 2008-08-08 2009-08-10 用于增强交叉反应性的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒

Country Status (14)

Country Link
US (2) US8841120B2 (zh)
EP (2) EP2324113B8 (zh)
JP (3) JP5852883B2 (zh)
KR (2) KR101793161B1 (zh)
CN (2) CN102177233B (zh)
AU (1) AU2009279456B2 (zh)
CA (1) CA2733589C (zh)
DK (1) DK2324113T3 (zh)
ES (1) ES2668836T3 (zh)
HK (1) HK1215051A1 (zh)
NO (1) NO2324113T3 (zh)
PL (1) PL2324113T3 (zh)
SG (1) SG2013057732A (zh)
WO (1) WO2010017542A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109776657A (zh) * 2017-11-14 2019-05-21 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 重组诺如病毒vlp颗粒和制备方法及其用途
WO2022143282A1 (zh) * 2020-12-30 2022-07-07 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 诺如病毒病毒样颗粒、免疫组合物或试剂盒及其用途

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008094197A2 (en) * 2006-07-27 2008-08-07 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Chimeric influenza virus-like particles
AU2008302276B2 (en) 2006-09-29 2013-10-10 Takeda Vaccines, Inc. Method of conferring a protective immune response to norovirus
SG174845A1 (en) 2006-09-29 2011-10-28 Ligocyte Pharmaceuticals Inc Norovirus vaccine formulations
KR20150098681A (ko) * 2007-03-14 2015-08-28 다케다 백신즈 인코포레이티드 바이러스 유사 입자 정제
US20100266636A1 (en) 2007-09-18 2010-10-21 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Method of conferring a protective immune response to norovirus
DK2324113T3 (en) 2008-08-08 2018-04-16 Takeda Vaccines Inc VIRUS-LIKE PARTICLES INCLUDING COMPOSITE CAPSID AMINO ACID SEQUENCES FOR INCREASED CRYSTAL REACTIVITY
US10130697B2 (en) 2010-03-23 2018-11-20 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Vaccines comprising mutant attenuated influenza viruses
US20130171185A1 (en) * 2010-07-06 2013-07-04 Ethan Settembre Norovirus derived immunogenic compositions and methods
WO2013009849A1 (en) * 2011-07-11 2013-01-17 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Parenteral norovirus vaccine formulations
EP2747778B1 (en) 2011-08-26 2017-12-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Influenza viruses with mutant pb2 gene segment as live attenuated vaccines
JP6567824B2 (ja) * 2011-10-12 2019-08-28 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア ヒトパピローマウイルスのワクチンおよびその使用方法
JOP20130186B1 (ar) 2012-06-22 2021-08-17 Takeda Vaccines Montana Inc تنقية الجزيئات الشبيهة بالفيروسات
CN105307678A (zh) 2013-03-12 2016-02-03 宾夕法尼亚大学理事会 用于人乳头状瘤病毒的改进疫苗及其使用方法
JP2015015931A (ja) 2013-07-12 2015-01-29 株式会社Ｕｍｎファーマ ウイルス様粒子を含む培養物の製造方法
JP6479305B2 (ja) 2013-07-12 2019-03-06 株式会社Ｕｍｎファーマ ウイルス様粒子の精製方法
US10524493B2 (en) * 2013-09-16 2020-01-07 The Johns Hopkins University Compositions and methods for preventing or relieving symptoms of infections
SG11201602585XA (en) 2013-10-03 2016-05-30 Takeda Vaccines Inc Methods of detection and removal of rhabdoviruses from cell lines
EP3074051A4 (en) * 2013-11-29 2017-04-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mers-cov vaccine
US10053671B2 (en) 2014-06-20 2018-08-21 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Mutations that confer genetic stability to additional genes in influenza viruses
CN108430502A (zh) 2015-08-28 2018-08-21 科学生物技术公司 诺瓦克病毒疫苗
WO2017040203A1 (en) * 2015-08-28 2017-03-09 Yoshihiro Kawaoka Generation of infectious influenza viruses from virus-like particles
BR112018011331A2 (pt) * 2015-12-04 2019-04-30 Xiamen Innovax Biotech Co., Ltd. mutante de proteìna l1 de papillomavirus humano tipo 11
CA3025675A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Quest Diagnostics Investments Llc Methods for detecting norovirus
WO2018170603A1 (en) * 2017-03-23 2018-09-27 Medicago Inc. Norovirus fusion proteins and vlps comprising norovirus fusion proteins
TWI743346B (zh) 2017-03-31 2021-10-21 國立大學法人東京大學 諾羅病毒抗體
JP6795468B2 (ja) * 2017-07-14 2020-12-02 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア ヒトパピローマウイルスのワクチンおよびその使用方法
WO2019079594A1 (en) * 2017-10-18 2019-04-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill METHODS AND COMPOSITIONS FOR VACCINES AGAINST NOVOVIRUS AND DIAGNOSIS OF NOVOVIRUS
MX2020005530A (es) 2017-11-30 2021-01-15 Medicago Inc Proteinas vp1 de norovirus modificadas y psv que comprenden proteinas vp1 de norovirus modificadas.
US11918646B2 (en) 2017-12-11 2024-03-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Dry adjuvanted immune stimulating compositions and use thereof for mucosal administration
US11427618B2 (en) * 2018-06-04 2022-08-30 Xiamen Universitry Mutant of L1 protein of human papillomavirus type 39
KR102075393B1 (ko) * 2018-06-28 2020-02-11 한국과학기술원 중증 열성 혈소판 감소 증후군(sfts) 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물
WO2020010428A1 (en) * 2018-07-13 2020-01-16 Medicago Inc. Modified norovirus vp1 proteins and vlps comprising modified norovirus vp1 proteins
JP2021534074A (ja) 2018-08-20 2021-12-09 タケダ ワクチン, インコーポレイテッドTakeda Vaccines, Inc. Ｖｌｐ製剤
EP3921413A1 (en) 2019-02-08 2021-12-15 Wisconsin Alumni Research Foundation (WARF) Humanized cell line
US11807872B2 (en) 2019-08-27 2023-11-07 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Recombinant influenza viruses with stabilized HA for replication in eggs
JP7075130B2 (ja) * 2019-10-25 2022-05-25 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア ヒトパピローマウイルスのワクチンおよびその使用方法
CN114316033A (zh) * 2020-09-29 2022-04-12 香港理工大学深圳研究院 一种特异性识别诺如病毒的单克隆抗体及制备方法与应用
TW202306977A (zh) * 2021-05-20 2023-02-16 日商電化股份有限公司 抗諾羅病毒抗體
JP2024519800A (ja) 2021-05-21 2024-05-21 タケダ ワクチン，インコーポレイテッド 固体組成物、フリーズドライ方法およびガラスバイアル
WO2023060086A1 (en) 2021-10-04 2023-04-13 Takeda Vaccines, Inc. Methods for determining norovirus-reactive antibodies
WO2023183458A1 (en) * 2022-03-25 2023-09-28 Merck Sharp & Dohme Llc Controlled release vaccine formulations

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5953727A (en) * 1996-10-10 1999-09-14 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Project-based full-length biomolecular sequence database
US7067638B1 (en) * 1999-06-22 2006-06-27 Japan As Represented By Director-General National Institute Of Infectious Diseases Small round structured virus (SRSV) detection kit
US20070207526A1 (en) * 2005-11-22 2007-09-06 Doris Coit Norovirus and sapovirus antigens

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6572862B1 (en) 1989-11-08 2003-06-03 Baylor College Of Medicine Methods and reagents to detect and characterize Norwalk and related viruses
WO1992016543A1 (en) 1991-03-25 1992-10-01 Genelabs Incorporated NORWALK VIRUS HUMAN GASTROENTERITIS AGENT AND MOLECULAR CLONING OF CORRESPONDING cDNAs
WO1993021325A1 (en) * 1992-04-08 1993-10-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Wild-type measles virus glycoproteins: vaccine and detection method therefor
JPH08500250A (ja) 1992-09-07 1996-01-16 ベイラー・カレッジ・オブ・メディシン ノーウォークおよび関連ウイルスを検出し、かつ特徴付けるための方法並びに試薬
US5788970A (en) * 1994-03-29 1998-08-04 The University Of Maryland College Park Chimeric infectious bursal disease virus CDNA clones, expression products and vaccines based thereon
CN1152935A (zh) * 1994-05-16 1997-06-25 麦克公司 乳头状瘤病毒疫苗
US5645051A (en) * 1995-04-21 1997-07-08 Dura Pharmaceuticals, Inc. Unit dose dry powder inhaler
US5861241A (en) * 1995-08-16 1999-01-19 University Of Massachusetts Monoclonal antibodies for detecting Norwalk virus
GB9525083D0 (en) * 1995-12-07 1996-02-07 Danbiosyst Uk Vaccine compositions
US6491919B2 (en) * 1997-04-01 2002-12-10 Corixa Corporation Aqueous immunologic adjuvant compostions of monophosphoryl lipid A
WO1998050071A1 (en) * 1997-05-01 1998-11-12 Chiron Corporation Use of virus-like particles as adjuvants
US20040265377A1 (en) * 1997-10-27 2004-12-30 Harry Seager Solid dispersing vaccine composition for oral delivery
SI1105466T1 (sl) * 1998-08-14 2006-08-31 Merck & Co Inc Postopek za ciscenje virusu podobnih delcev humanega papilomskega virusa
AU770809B2 (en) * 1998-12-17 2004-03-04 Merck Sharp & Dohme Corp. Synthetic virus-like particles with heterologous epitopes
JP2002020399A (ja) 2000-07-10 2002-01-23 Osaka Prefecture ノルウォークウイルス（ｎｖ）を認識するモノクローナル抗体
US20040063188A1 (en) * 2002-02-14 2004-04-01 Novavax, Inc. Kit for treating gastrointestinal tract
EP1513552B1 (en) * 2002-06-20 2010-12-01 Cytos Biotechnology AG Packaged virus-like particles in combination with cpg for use as adjuvants with allergens : method of preparation and use
WO2005032457A2 (en) 2003-07-21 2005-04-14 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Vectors and methods for immunization against norwalk virus using transgenic plants
WO2005030806A2 (en) 2003-09-24 2005-04-07 Montana State University Norovirus monoclonal antibodies and peptides
US7795242B2 (en) * 2003-10-15 2010-09-14 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and compositions for immunomodulation
US20050215501A1 (en) * 2003-10-24 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods and products for enhancing epitope spreading
FR2863890B1 (fr) 2003-12-19 2006-03-24 Aventis Pasteur Composition immunostimulante
US7481997B1 (en) * 2004-02-12 2009-01-27 Montana State University Snow mountain virus genome sequence, virus-like particles and methods of use
US20050260225A1 (en) * 2004-05-18 2005-11-24 Goldberg Joanna B Intranasal recombinant Salmonella vaccine encoding heterologous polysaccharide antigens
CU23496A1 (es) * 2004-09-03 2010-02-23 Ct Ingenieria Genetica Biotech Composición vacunal contra el virus de la hepatitis c
JP4993301B2 (ja) 2004-10-20 2012-08-08 サノフィ パスツール バイオロジクス リミテッド ライアビリティ カンパニー 日本脳炎ウイルスおよび西ナイルウイルスに対するワクチン
GB0428394D0 (en) 2004-12-24 2005-02-02 Chiron Srl Saccharide conjugate vaccines
WO2006086188A2 (en) * 2005-01-31 2006-08-17 The Johns Hopkins University Use of consensus sequence as vaccine antigen to enhance recognition of virulent viral variants
ES2385045T3 (es) 2005-02-18 2012-07-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Inmunógenos de Escherichia coli uropatogénica
US7767212B2 (en) 2005-03-18 2010-08-03 Cytos Biotechnology Ag CAT allergen conjugates and uses thereof
EP1736538A1 (en) 2005-06-21 2006-12-27 Cytos Biotechnology AG Process for the preparative purification of virus-like-particles (VLPs)
JP4825958B2 (ja) * 2005-08-10 2011-11-30 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 高リスク群ヒトパピローマウイルスの中和抗体を誘導する抗原
JP2007145775A (ja) * 2005-11-29 2007-06-14 Falco Life Science:Kk ノロウイルスｇｉの高感度検出方法
SG174845A1 (en) * 2006-09-29 2011-10-28 Ligocyte Pharmaceuticals Inc Norovirus vaccine formulations
AU2008302276B2 (en) 2006-09-29 2013-10-10 Takeda Vaccines, Inc. Method of conferring a protective immune response to norovirus
US20100266636A1 (en) * 2007-09-18 2010-10-21 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Method of conferring a protective immune response to norovirus
DK2324113T3 (en) 2008-08-08 2018-04-16 Takeda Vaccines Inc VIRUS-LIKE PARTICLES INCLUDING COMPOSITE CAPSID AMINO ACID SEQUENCES FOR INCREASED CRYSTAL REACTIVITY
CN102791286B (zh) * 2010-01-21 2017-08-08 莱戈赛特医药股份有限公司 杯状病毒病毒样颗粒上靶定异源抗原的呈递

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5953727A (en) * 1996-10-10 1999-09-14 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Project-based full-length biomolecular sequence database
US7067638B1 (en) * 1999-06-22 2006-06-27 Japan As Represented By Director-General National Institute Of Infectious Diseases Small round structured virus (SRSV) detection kit
US20070207526A1 (en) * 2005-11-22 2007-09-06 Doris Coit Norovirus and sapovirus antigens

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SEAN P.MCBURNEY ET AL: "Developing Broadly Reactive HIV-1/AIDS Vaccine:A review of Polyvalent and Centralized HIV-1 Vaccine,", 《 CURRENT PHARMACEUTICAL DESIGN》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109776657A (zh) * 2017-11-14 2019-05-21 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 重组诺如病毒vlp颗粒和制备方法及其用途
CN109776657B (zh) * 2017-11-14 2021-11-26 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 重组诺如病毒vlp颗粒和制备方法及其用途
WO2022143282A1 (zh) * 2020-12-30 2022-07-07 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 诺如病毒病毒样颗粒、免疫组合物或试剂盒及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
JP6448445B2 (ja) 2019-01-09
AU2009279456A1 (en) 2010-02-11
NO2324113T3 (zh) 2018-07-28
AU2009279456A2 (en) 2011-03-31
EP2324113B1 (en) 2018-02-28
KR20170122848A (ko) 2017-11-06
EP2324113A4 (en) 2012-01-04
JP2017153484A (ja) 2017-09-07
US20150023995A1 (en) 2015-01-22
SG2013057732A (en) 2015-02-27
ES2668836T3 (es) 2018-05-22
JP2011530295A (ja) 2011-12-22
KR20110053994A (ko) 2011-05-24
EP2324113A1 (en) 2011-05-25
AU2009279456B2 (en) 2015-02-05
JP2015171363A (ja) 2015-10-01
WO2010017542A1 (en) 2010-02-11
EP3382011A1 (en) 2018-10-03
HK1215051A1 (zh) 2016-08-12
US20110195113A1 (en) 2011-08-11
CN102177233A (zh) 2011-09-07
JP5852883B2 (ja) 2016-02-03
KR101793161B1 (ko) 2017-11-03
CA2733589A1 (en) 2010-02-11
US9518096B2 (en) 2016-12-13
PL2324113T3 (pl) 2018-08-31
US8841120B2 (en) 2014-09-23
EP2324113B8 (en) 2018-04-04
KR102118458B1 (ko) 2020-06-03
CA2733589C (en) 2021-07-13
CN102177233B (zh) 2015-04-15
DK2324113T3 (en) 2018-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102177233B (zh) 用于增强交叉反应性的包含复合衣壳氨基酸序列的病毒样颗粒
US11701420B2 (en) Parenteral norovirus vaccine formulations
CN104740624B (zh) 赋予针对诺如病毒的保护性免疫应答的疫苗
US20100266636A1 (en) Method of conferring a protective immune response to norovirus
US20220054621A1 (en) Norovirus vaccine formulations and methods

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1215051

Country of ref document: HK

CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: Massachusetts, USA

Applicant after: TAKEDA VACCINES, INC.

Address before: Montana

Applicant before: TAKEDA VACCINES, INC.