KR20010006169A - 안정화된 사람 파필로마바이러스 제형물 - Google Patents
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Abstract
본원에는, 단백질의 응집을 방지하고, 수용액으로서 장기간의 안정성을 보여주는 사람 파필로마바이러스(HPV) 항원 제형물이 기술되어 있다. 이러한 제형물은 생리학적으로 허용되는 농도의 염(예: 염화나트륨) 및 비이온성 계면활성제(Tween 80R과 같은 폴리소르베이트 80)를 포함한다.
Description
파필로마바이러스(PV) 감염은 각종 동물, 예를 들면 사람, 양, 개, 고양이, 토끼, 원숭이, 뱀 및 소에서 발생한다. 파필로마바이러스는 상피 세포를 감염시켜, 일반적으로 감염 부위에 양성 상피 또는 섬유상피 종양을 유발한다. 파필로마바이러스는 종-특이적 감염제이다.
파필로마바이러스는 이들이 감염시키는 숙주를 기초로 특정 그룹으로 분류된다. 또한, 사람 파필로마바이러스(HPV)는 DNA 하이브리드화 연구를 기초로 70개 이상의 유형으로 분류된다. PV 유형은, 하나의 파필로마바이러스 유형에 의한 감염에 대한 중화 면역성이 다른 유형의 파필로마바이러스에 대해 면역성을 부여하지 않는 것으로 여겨진다.
사람에서, 상이한 HPV 유형은 별개의 질환을 유발한다. HPV 유형 1, 2, 3, 4, 7, 10 및 26 내지 29는 정상 개체 및 면역타협된(immunocompromised) 개체에서 양성 우췌를 유발한다. HPV 유형 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19 내지 25, 36 및 46 내지 50은 면역타협화된 개체에서 평편 병변을 유발한다. HPV 유형 6, 11, 34, 39, 41 내지 44 및 51 내지 55는 생식기 또는 호흡기 점막의 비악성 습우를 유발한다. HPV 유형은 16, 18, 31, 33, 35, 45 및 58은 생식기 점막의 상피 이형성을을 유발하고, 경관, 질, 음문 및 항문 관의 잠재암 및 침입암의 대부분과 관련이 있다.
파필로마바이러스는 작고(50 내지 60nm), 외막이 없는, 8개 이하의 초기 유전자 및 2개 이하의 후기 유전자를 암호화하는 이십면체 DNA 바이러스이다. 바이러스 게놈의 개방형 판독 프레임(ORF)은 E1 내지 E8 및 L1 내지 L2로 명명되며, 여기서 "E"는 초기를 의미하고, "L"은 후기를 의미한다. L1 및 L2는 바이러스 캡시드 단백질을 암호화한다. 초기(E) 유전자는 바이러스 복제, 전사 조절 및 세포 형질전환과 같은 기능과 관련이 있다.
L1 단백질은 다수의 캡시드 단백질이며, 이의 분자량은 55 내지 60kDa이다. L2 단백질은 소수의 캡시드 단백질이며, 이의 예상 분자량은 55 내지 60kDa이며, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 측정에 따른 겉보기 분자량은 75 내지 100kDa이다. 면역학적 데이타에 의하면, L2 단백질의 대부분은 바이러스 캡소미어(capsomere)내의 L1 단백질 내부에 존재한다는 것이 제시된다. L1 ORF는 상이한 파필로마바이러스중에서 고도로 보존되어 있다. L2 단백질은 상이한 파필로마바이러스중에서 덜 보존되어 있다.
L1 및 L2 유전자는 면역예방을 위한 적당한 표적으로서 인식되어 왔다. 초기 유전자의 일부는 또한 백신 개발의 잠재적인 표적인 것으로 입증되었다. 흰꼬리 토끼 파필로마바이러스(CRPV) 및 소 파필로마바이러스(BPV) 시스템에 관한 연구로 부터, 재조합 L1 및/또는 L2 단백질(박테리아에서 생성되거나 왁지니아 벡터를 사용함으로써 생성됨)를 사용한 면역화에 의해 동물이 바이러스 감염으로 부터 보호된다는 것이 밝혀졌다. 바쿨로바이러스 발현 시스템내에서의, 또는 왁지니아 벡터를 사용한 파필로마바이러스 L1 유전자의 발현에 의해, 바이러스-유사 입자(VLP)가 조립되어 지며, 이는 바이러스 챌린지(challenge)로 부터의 보호와 관계가 있는 고역가 바이러스 중화 항체 반응을 유도하는데 사용되어진다. 게다가, L1 및 L2 유전자를 사용하여 동물에서의 파필로마바이러스 감염의 예방 및 치료를 위한 백신을 제조한다.
HPV11 L1 단백질을 포함하는 바이러스-유사 입자는 곤충 및 포유류 세포 시스템 모두에서 발현된다. 효모 세포내에서의 VLP의 발현은, 비용면에서 효율적이고, 발효기내의 대규모 성장에 용이하게 적용시킬 수 있다는 점에서 이점을 제공한다. 그러나, HPV11 L1 단백질은 효모 세포내에서 저수준으로 발현된다. 이는 HPV11 L1 mRNA의 절두(truncation)의 결과인 것으로 관찰되었다. 대조적으로, HPV6 L1 유전자는 완전한 길이의 mRNA로서 전사되고, 고수준으로 발현된다. HPV11 L1 단백질을 암호화하도록 HPV6 L1 DNA를 변형시킴으로써, 완전한 길이의 mRNA의 전사를 용이하게 하여 HPV11 L1 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다.
L1 및 L2 유전자를 사용하여 동물에서의 파필로마바이러스 감염을 예방 및 치료하기 위한 백신을 제조할 수 있다. HPV 유형 16 L1 및 L2 유전자를 왁시니아 바이러스 벡터내로 클로닝시키고, 재조합 벡터로 CV-1 포유류 세포를 감염시켜 바이러스-유사 압자(VLP)를 생성시킨다.
박테리아-유래된 재조합 소 파필로마바이러스 L1 및 L2가 제조되었다. 재조합 박테리아 단백질에 대한 중화 혈청은 고유 바이러스와 저수준으로 교차-반응하는데, 이는 아마도 고유 단백질과 박테리아-유래된 단백질이 형태면에서 상이하기 때문일 것이다.
HPV16 L1 또는 HPV16 L2 ORF를 발현하는 재조합 바쿨로바이러스를 사용하여 곤충 SF9 세포를 감염시키고, L1 및 L2 단백질을 생성시킨다. 웨스턴 블롯 분석에 따르면, 바쿨로바이러스-유래된 L1 및 L2 단백질이 HPV16에 대한 항체와 반응한다는 것이 밝혀졌다. 바쿨로바이러스-유래된 L1은 VLP를 형성한다.
문헌[Jansen et al., 1995, Vaccine 13(16): 1509-1514]에 따르면, 흰꼬리 토끼 파필로마바이러스로 부터 L1 및 L1+L2 VLP를 정제하는 동안에, 염화나트륨 및 Tween 80R을 포함하는 흐르는 완충액이 사용된다.
현재, 정제된 재조합 HPV VLP 제형물은, 용액내에서의 응집이 방지되도록 고농도의 NaCl에서 보관하여야 한다. 낮은 이온 농도에서, HPV VLP는 용액으로 부터 침전될 정도로 응집된다. 상기 관찰 및 기타 관련된 관찰을 토대로, HPV 벌크 용액을 고농도의 NaCl(1.25 내지 2.5M)의 존재하에서 냉동 보관한다. HPV11 VLP의 고도로 응집된 샘플은, RIA, EIA 또는 BIA 코어 분석에 의해 측정된 바와 같이 불량한 시험관내 항원성을 나타낸다. 따라서, 생리학적 염 상태 및 허용가능한 장기간의 보관 조건하에서 안정한 수성 HPV11 VLP 제형물을 제조할 필요성이 존재한다. 본 발명은 이러한 필요성에 중점을 두어 이를 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은, 항원 응집을 방지하고, 계면활성제의 존재하, 생리학적 염 농도에서 항원 안정성을 증가시키는 사람 파필로마바이러스(HPV) 항원 제형물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 생물학적 유효량의 보조제와 본 발명의 HPV 항원 제형물을 혼합하여 보조 HPV 백신을 형성시킴으로써 생성되는 보조 HPV 백신의 제조에 관한 것이다.
본 발명의 HPV 항원 제형물 및 보조 백신은, 이에 제한되지는 않으나 항원 성분으로서, HPV 유형 6a, 6b, 11, 16 및 18로 부터의 L1 또는 L1과 L2 단백질의 조합체를 포함하는 재조합 HPV 서브유니트 백신으로서 생성된 바이러스-유사 입자를 포함한다. 이러한 재조합 백신의 일가 형은 물론 이가형(재조합 HPV11 L1, HPV16 L1 및 HPV6a L1이 예시되나, 이에 제한되는 것은 아니다) 및 다가형(HPV11 L1, HPV6a L1, HPV16 L1 및 HPV18 L1이 예시되나, 이에 제한되는 것은 아니다)을 안정화시키는 것은 본 발명의 범위에 속한다.
또한, 본 발명은, 0℃ 이상의 온도에서 제형물의 백신 성분의 안정성이 증가되도록 생리학적 염 농도 및 계면활성제를 포함하는 HPV 항원 제형물에 관한 것이다. 본 발명의 HPV 제형물을, 약 2℃ 내지 약 8℃에서 약 1개월 내지 약 2년의 기간 동안 장기간 보과하기 위하여는 변형시켜야 한다.
본 발명의 태양은, 염화나트륨, 황산나트륨 및 황산암모늄이 포함되지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아닌 생리학적으로 허용되는 염을 포함하는 HPV 항원 제형물에 관한 것이다. 제형물중에 염을 포함시키는 목적은 원하는 이온 농도를 얻기 위한 것이다. 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트, 석시네이트, 트리스-HCl, MOPS, 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는 완충성 화합물에 의해 생성된 이온, 및 비-완충성 염의 이온에 의해 이온 농도가 영향받을 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(폴리소르베이트), 예를 들면 폴리소르베이트 80(예: Tween 80R), 폴리소르베이트 60(예: Tween 60R) 및 폴리소르베이트 20(예: Tween 20R), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(예: Brij 58R, Brij35R)이 포함되지만 이에 제한되지 않는 비이온성 계면활성제, 및 트리톤 X-100R,트리톤 X-114R,NP40R, Span 85 및 비이온성 계면활성제의 Pluronic 시리즈(예: Pluronic 121)이 포함되지만 이에 제한되지 않는 기타의 것을 포함하는 HPV 항원 제형물에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 태양은, 생리학적으로 허용되는 완충액의 존재하에서, 약 0.2% w/v 이하의 양으로 존재하는 상기한 바와 같은 비이온성 계면활성제를 포함하고, 생리학적으로 허용되는 염이 약 10mM 내지 약 500mM 농도의 염화나트륨인 HPV 항원 제형물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 태양은, 생리학적으로 허용되는 완충액의 존재하에서, 약 0.2% w/v 이하의 양으로 존재하는 상기한 바와 같은 비이온성 계면활성제를 포함하고, 생리학적으로 허용되는 염이 약 50mM 내지 약 400mM 농도의 염화나트륨인 HPV 항원 제형물에 관한 것이다.
본 발명의 구체적인 태양은, 생리학적으로 허용되는 완충액의 존재하에서, 약 0.2% w/v 이하의 양으로 존재하는 상기한 바와 같은 비이온성 계면활성제를 포함하고, 생리학적으로 허용되는 염이 약 150mM 내지 약 300mM 농도의 염화나트륨인 HPV 항원 제형물에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 태양은, 생리학적으로 허용되는 완충액의 존재하에서, 생리학적으로 허용되는 염이 약 10mM 내지 약 500mM 농도의 염화나트륨이고, 비이온성 계면활성제인 폴리소르베이트 80(Tween 80R이 포함되나 이에 제한되지 않음)가 약 0.2% w/v 이하의 양으로 존재하는 HPV 항원 제형물에 관한 것이다.
본 발명의 구체적인 태양은, 생리학적으로 허용되는 완충액의 존재하에서, 생리학적으로 허용되는 염이 약 10mM 내지 약 500mM 농도의 염화나트륨이고, 비이온성 계면활성제인 폴리소르베이트 80(Tween 80R이 포함되나 이에 제한되지 않음)가 약 0.01% 내지 약 0.1% w/v의 양으로 존재하는 HPV 항원 제형물에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 태양은, 생리학적으로 허용되는 완충액의 존재하에서, 염화나트륨이 약 50mM 내지 약 400mM 농도로 존재하고, 폴리소르베이트 80(Tween 80R이 포함되나 이에 제한되지 않음)가 약 0.01% 내지 약 0.1% w/v의 양으로 존재하는 HPV 항원 제형물에 관한 것이다.
본 발명의 특히 바람직한 태양은, 생리학적으로 허용되는 완충액의 존재하에서, 염화나트륨이 약 150mM 내지 약 300mM 농도로 존재하고, 폴리소르베이트 80(Tween 80R이 포함되나 이에 제한되지 않음)가 약 0.01% 내지 약 0.1% w/v의 양으로 존재하는 HPV 항원 제형물에 관한 것이다.
생리학적으로 허용되는 완충액중의 HPV 항원 제형물, 바람직하게는 이에 제한되는 것은 아니나 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트, 석시네이트, 트리스-HCl, 또는 MOPS에 의해 완충되고, 이에 제한되는 것은 아니나 바람직하게는 pH 범위가 약 5.0 내지 9.0, 특히 약 6.0 내지 약 8.0인 제형물을 제공하는 것이 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 HPV 항원 제형물을 사용하여 HPV 백신 제형물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 알루미늄- 또는 비-알루미늄 계 HPV 백신을 제조하는 개선된 방법이 본원에 기술되어 있다.
또한, 본 발명은, 생리학적 유효량의 보조제와 생리학적 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 항원-함유 제형물이 배합된 보조 HPV 백신에 관한 것이다.
본원에 사용된 "PV"란 용어는 "파필로마바이러스"에 대한 약어이다.
본원에 사용된 "HPV"란 용어는 "사람 파필로마바이러스"에 대한 약어이다.
본원에 사용된 "VLP"란 용어는 "바이러스-유사 입자"에 대한 약어이다.
본원에 사용된 "생리학적으로 허용"이란 용어는 농도 또는 이온 농도가, 당해 제형물이 면역화 표적 숙주, 예를 들면 사람에서 생물학적으로 적합할 정도인 완충액, 부형제 또는 염을 의미한다.
본 발명은 항원의 안정성이 증가되고 항원의 응집 및 침전이 감소된, 사람 파필로마바이러스(papillomavirus) 항원 제형물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본원에 기술된 사람 파필로마바이러스 항원 제형물을 사용하여, 보조 HPV를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 사람 파필로마바이러스 항원 제형물로 부터 제조된 보조 사람 파필로마바이러스 백신에 관한 것이다.
도 1은 4℃에서 2개월간에 걸친, HPV11 L1 VLP(50mM MOPS, pH 7.0, 1.25M NaCl)에 대한 시간 경과에 따른 유체역학 크기에 미치는 단백질 희석의 효과를 도시한다. (□) 470mcg/mL; (■) 18mcg/mL.
도 2는 실온에서 보관하는 동안의 HPV11 및 HPV16 L1 VLP 유체역학 크기에 미치는 염 농도의 효과를 도시한다. 샘플을 완충액으로 희석시키고, 1 시간 동안 보관한 후, 분석한다. HPV11의 경우에, 샘플을 동일한 완충액에 대해 밤새 투석시킨다. HPV11 L1 VLP를 상이한 NaCl 농도를 포함하는 50mM MOPS 완충액(pH 7.0)중에서 제형물화시키다; (○) 투석하지 않음, (□) 투석함. HPV16 L1 VLP를, 상이한 NaCl 농도를 포함하는 50mM MOPS 완충액(pH 7.0)중에 제형화시킨다; (●) 투석하지 않음.
도 3은, 실온에서 96시간 동안 폴리프로필렌 튜브내에서 HPV11 L1 VLP(50mM MOPS, pH 7.0, 180mM NaCl) 50mcg/ml의 단백질 농도(■)[HPV11 L1의 잔류물 %] 및 유체역학 크기(●)에 미치는 투석막에 대한 단맥질 흡착의 효과를 도시한다.
도 4는 실온에서 24시간 동안 50mM MOPS, pH 7.0, 1.25M NaCl중에서 HPV11 L1 VLP 흡착에 미치는 폴리스티렌(○), 폴리프로필렌(●) 및 유리(◇)의 효과를 도시한다.
도 5는 50mM MOPS, pH 7.0, 0.25M NaCl중에서 폴리프로필렌에 대한 HPV L1 VLP(18mcg/mL) 흡착에 미치는 표면/용적 비의 증가 효과를 도시한다. (□) 표면/용적=4cm-1; (●) 표면/용적=6cm-1.
도 6a 및 6b는, 동적 광 산란(DLS: Dynamic Light Scattering)에 적용하기전에, 실온에서 20시간 동안 50mM MOPS, pH 7.0, 150mM NaCl중(패널 A)에서, 및 50℃에서 30분간에 이어 실온에서 48시간 동안 50mM MOPS, pH 7.0, 40mM NaCl중(패널 B)에서 HPV11 L1 VLP(18mcg/mL)의 안정성에 미치는 각종 계면활성제(0.01%)의 효과를 도시한다.
도 7a 및 7b는, 실온에서 50mM MOPS, pH 7.0, 각종 이온 농도: (●) 0.4M (NH4)2SO4+0.01% Tween80R; (○) 0.1M (NH4)2SO4; (◇) 0.5M (NH4)2SO4; (×) 0.1M Na2SO4; (l) 0.5M Na2SO4; (△) 0.1M NaCl; 및 (■) 0.5M NaCl에서 폴리프로필렌 표면에 대한 HPV11 L1 VLP(16mcg/mL)의 표면 흡착(패널 A) 및 응집(패널 B)에 미치는 폴리소르베이트 80(예: Tween 80R)의 효과를 도시한다.
도 8은 실온에서 50mM MOPS, pH 7.0, 250mM NaCl중에서, 시간 경과에 따라 폴리프로필렌 표면에 대한 HPV11 L1 VLP(18mcg/mL)의 HPV11 L1 VLP 농도 및 유체역학적 직경 모두에 미치는 폴리소르베이트 80(예: Tween 80R)의 효과를 도시한다. 단백질 농도를 초기 단백질 농도의 %로서 측정한다. 단백질 농도의 감소는 표면 흡착과 반비례 관계에 있다. (×) 0.01% Tween 80R, 단백질 농도; (△) Tween 80R부존재, 단백질 농도; (■) 0.01% Tween 80R, 유체역학적 직경; 및 (◆) Tween 80R부존재음, 유체역학적 직경.
도 9는 50mM MOPS, pH 7.0중에서, (●) 40mM NaCl 및 0.01% Tween 80R; (◇) 100mM NaCl 및 0.01% Tween 80R; 및 (○) 40mM NaCl 및 Tween 80R부존재인 경우에 HPV11 L1 VLP(18mcg/mL)에 대한 유체역학 크기에 미치는 NaCl 농도 및 폴리소르베이트 80(예: Tween 80R)의 병합 효과를 도시한다.
도 10a 및 10b는, 4℃(패널 A) 및 실온(패널 B)에서 50mM MOPS, pH 7.0, 150mM NaCl중에서, 시간 경과에 따라 HPV11 L1 VLP(18mcg/mL)에 대한 유체역학 크기(Dh(nm))에 미치는 폴리소르베이트 80(예: Tween 80R) 농도[(●) 0.000% w/v; (○) 0.001% w/v; (■) 0.005% w/v; (□) 0.010% w/v]의 효과를 도시한다.
도 11은, 동적 광 산란(DLS)에 적용하기 전에, 실온에서 50일간 50mM MOPS, pH 7.0, 150mM NaCl중에서 보관된 HPV16 L1 VLP(20mcg/mL)의 안정성에 미치는 각종 계면활성제(0.01%)의 효과를 도시한다.
본 발명은, 계면활성제의 존재하, 생리학적 염 농도에서 항원 응집을 방지하고, 항원 안정성을 증가시키는 사람 파필로마바이러스(HPV) 항원 제형물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, 생물학적 유효량의 보조제와 본 발명의 HPV 항원 제형물을 혼합하여 보조 HPV 백신을 형성시킴으로써 생성되는 보조 HPV 백신의 제조에 관한 것이다.
본 발명의 HPV 항원 제형물 및 보조 백신은, 이에 제한되지는 않으나 항원 성분으로서, HPV 유형 6a, 6b, 11, 16 및 18로 부터의 L1 또는 L1과 L2 단백질의 조합체를 포함하는 재조합 HPV 서브유니트 백신으로서 생성된 바이러스-유사 입자를 포함한다. 이러한 재조합 백신의 일가형은 물론 이가형(재조합 HPV11 L1, HPV16 L1 및 HPV6a L1이 예시되나, 이에 제한되는 것은 아니다) 및 다가형(HPV11 L1, HPV6a L1, HPV16 L1 및 HPV18 L1이 예시되나, 이에 제한되는 것은 아니다)을 안정화시키는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 이러한 목적을 위해, 재조합 HPV11 L1 VLP를 본 발명의 예를 위해 사용하지만, 이것이 본 발명의 항원 제형물의 안정화를 위해 사용될 수 있는 HPV 유형을 제한하는 것은 아니다. 사실, 본원의 검토로부터 명백하듯이, 본원에 기술된 백신 제형물을 사용하여, 다른 HPV-계 VLP가 포함되지만 이에 제한되지 않는 다른 백신 제형물을 안정화시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 HPV 백신 제형물에는, HPV 유형 6a, 6b, 11, 16, 및 18로 부터의, L1 또는 L1과 L2 단백질의 조합체를 포함하는 재조합 HPV 서브유니트 백신으로서 생성된 바이러스-유사 입자가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 상기한 바와 같이, 본 발명의 제형물이, 이가형(예: 재조합 HPV1 L1 및 HPV6a L1) 및 다가형(예: 재조합 HPV11 L1, HPV6a L1, HPV16 L1 및 HPV18 L1)을 포함하나 이에 제한되지 않는 각종 이가 및 다가 제형물을 안정화시키는데 유용할 것이라는 것이 명백하다.
따라서, 본 발명은, 생리학적 활성 염, 및 유용한 단백질 농도 및 바림직한 보관 농도의 범위내 완충액 조건에서, HPV VLP를 안정화시키는 비이온성 계면활성제를 포함하는 항원 제형물에 관한 것이다. 본 발명의 HPV 항원 제형물은 약 2℃ 내지 약 8℃에서 1개월 내지 약 2년동안 장기간 보관하기 위하여는 변형될 수 있어야 한다. 이들 제형물은 보조제, 예를 들면 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록시포스페이트 및 알루미늄 옥시하이드록시드와 같은 알루미늄-함유 보조제와 혼합될 수 있다. 본 발명의 항원 제형물을 비-알루미늄 보조제, 특히 HPV VLP에 이용되는 것으로 공지된 높은 이온 농도의 제형물에 의해 음성적으로 작용받는 비-알루미늄 보조제와 함께 사용하는 것이 유용할 것이다.
낮은 이온 농도에서, HPV11 L1 VLP는 용액으로 부터 침전될 정도까지 응집되는 것으로 공지되어 있다. 고도로 응집된 HPV11 L1 VLP의 응집된 샘플은 시험관내 항원성이 불량하게 나타내는 것으로 알려져 있다(RIA, EIA 또는 BIA 코어 분석시). 실시예 3의 데이타로 부터, HPV11 VLP L1(50mM MOPS/1.25M NaCl중의 470mcg/mL)을 해동되고, 용액 일부를 동일한 완충액중에서 18mcg/mL로 희석시킨다는 것을 알 수 있다. 저농도의 단백질 용액은, NaCl 농도가 1.25M NaCl에서 유지되더라도, 시간이 경과됨에 따라 응집된다. 따라서, 높은 염 농도 단독으로는 HPV VLP 응집을 방지하지 못한다. 여러 NaCl 농도 범위(단시간에 걸친 벌크 용액의 보관 또는 투석을 경유)에서 시험한 실시예 4에 제시된 데이타로 부터, 저수준(약 150mM NaCl 및 그 미만)으로의 NaCl 농도의 감소가 단백질 응집(이후 침전)을 초래한다는 것을 알 수 있다. 이러한 문제점을 피하기 위해, HPV11 L1 VLP를 함유하는 용액을 고농도의 NaCl(약 1.25M 내지 2.5M)의 존재하에서 냉동 보관할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 일부는, 유용한 온도 범위내, 생리학적 염 농도에서 응집에 견딜 수 있는 HPV VLP를 포함하는 다양한 제형물에 관한 것이다. 본 발명의 제형물은 안정한 HPV VLP 용액을 4℃에서 장기간 보관하는 것을 용이하게 하고, HPV 단독의 면역원성 연구, 또는 알루미늄 염 보조제 또는 비-알루미늄 보조제 존재하의 HPV의 면역원성 연구에 유용할 것이다.
또한, HPV VLP가 다양한 표면과 접촉하면, 응집에 영향을 줄 것이라는 것이 실시예 5에 기술되어 있다. HPV VLP와의 접촉 표면적(예: 투석막 또는 보관 튜브)이 증가하면, VLP의 유체역학 크기도 증가한다. 이러한 응집의 증가에 따라 HPV VLP 용액의 단백질 농도가 동시에 감소되는데, 이는 막 표면상에 HPV VLP가 흡착됨을 나타내고, 표면 흡착과 응집간의 상관관계를 제시해준다. 따라서, 바람직한 용기의 표면에 백신을 접촉시키는 것도 또한 본 발명의 범위에 속한다. 실온에서 24시간 동안 항온처리한 HPV11 L1 VLP(50mM MOPS/1.25M NaCl, pH 7.0)이 보로실리케이트 유리에서는 상당한 흡착을 나타내는 반면, 폴리스티렌에서는 상당한 흡착이 나타내지 않는다는 것이 데이타에 제시된다.
실시예 6은 본 발명의 제형물중에 포함시키기 위한 바람직한 부형제 및 염을 제시하는 데이타를 포함한다.
따라서, 본 발명의 요지는, 제형물의 항원 성분이 약 0℃ 내지 약 40℃의 온도에서 장기간 안정성을 갖음은 물론, 공지된 HPV 백신 제형물의 경우 종종 보이는 응집에 견딜 수 있도록 비이온성 계면활성제가 가해진, 생리학적 염 농도를 포함하는 HPV 항원 제형물에 관한 것이다. 이러한 목적을 위하여, 본 발명은, 염화나트륨, 황산나트륨 및 황산암모늄을 포함하나 이에 반드시 제한되지 않는 염이 숙주에 생리학적으로 허용되는 이온 농도로 존재하는 HPV 백신 제형물에 관한 것이다. 제형물중에 염을 포함시키는 목적은 원하는 이온 농도를 얻는데 있다. 이온의 농도는 완충성 화합물에 의해 생성된 이온 및 비-완충성 염의 이온에 의해 영향받을 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 면은, 제형물의 백신 성분의 안정성을 증가시키기 위해 최소량의 비이온성 계면활성제를 가한, 생리학적으로 허용되는 수준의 염을 포함하는 HPV 항원 제형물에 관한 것이다. 본 발명의 항원 제형물에 사용하기 위한 비이온성 계면활성제에는, 예를 들면 폴리소르베이트 80(예: Tween 80R), 폴리소르베이트 60(예: Tween 60R) 및 폴리소르베이트 20(예: Tween 20R)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르; Brij 58R및 Brij35R을 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르; 및 트리톤 X-100R,트리톤 X-114R,NP40R, Span 85, 및 비이온성 계면활성제의 Pluronic 시리즈(예: Pluronic 121)와 같은 기타의 것이 포함된다.
본 발명의 추가적 태양은, 생리학적으로 허용되는 완충액의 존재하에서, 약 0.2% w/v 이하의 양으로 존재하는 상기한 바와 같은 비이온성 계면활성제를 포함하고, 생리학적으로 허용되는 염이 약 10mM 내지 약 500mM 농도의 염화나트륨인 HPV 항원 제형물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 태양은, 생리학적으로 허용되는 완충액의 존재하에서, 약 0.2% w/v 이하의 양으로 존재하는 상기한 바와 같은 비이온성 계면활성제를 포함하고, 생리학적으로 허용되는 염이 약 50mM 내지 약 400mM 농도의 염화나트륨인 HPV 항원 제형물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 태양은, 생리학적으로 허용되는 완충액의 존재하에서, 약 0.2% w/v 이하의 양으로 존재하는 상기한 바와 같은 비이온성 계면활성제를 포함하고, 생리학적으로 허용되는 염이 약 150mM 내지 약 300mM 농도의 염화나트륨인 HPV 항원 제형물에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 태양은, 생리학적으로 허용되는 완충액의 존재하에서, 생리학적으로 허용되는 염이 약 10mM 내지 약 500mM 농도의 염화나트륨이고 비이온성 계면활성제인 폴리소르베이트 80(Tween 80R이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다)이 약 0.2% w/v 이하의 양으로 존재하는 HPV 항원 제형물에 관한 것이다.
본 발명의 특정한 태양은, 생리학적으로 허용되는 완충액의 존재하에서, 생리학적으로 허용되는 염이 약 10mM 내지 약 500mM 농도의 염화나트륨이고 비이온성 계면활성제인 폴리소르베이트 80(Tween 80R이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다)이 약 0.01% 내지 약 0.1% w/v 양으로 존재하는 HPV 항원 제형물에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 태양은, 생리학적으로 허용되는 완충액의 존재하에서, 염화나트륨이 약 50mM 내지 약 400mM의 농도로 존재하고 폴리소르베이트 80(Tween 80R이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다)이 약 0.01% 내지 약 0.1% w/v의 양으로 존재하는 HPV 항원 제형물에 관한 것이다.
본 발명의 특히 바람직한 태양은, 생리학적으로 허용되는 완충액의 존재하에서, 염화나트륨이 약 150mM 내지 약 300mM의 농도로 존재하고 폴리소르베이트 80(Tween 80R이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다)이 약 0.01% 내지 약 0.1% w/v의 양으로 존재하는 HPV 항원 제형물에 관한 것이다.
pH 범위가 약 0.5 내지 약 9.0(이에 제한되는 것은 아니다), 바람직하게는 약 6.0 내지 약 8.0인 생리학적으로 허용되는 완충액중의 본 발명의 HPV 항원 제형물, 바람직하게는 이에 제한되는 것은 아니지만, 포스페이트, 시트레이트, 석시네이트, 아세테이트, Tris-HCl, 또는 MOPS에 의해 완충된 제형물을 제공하는 것은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명에 기술된 제형물은 동결되지 않은 상태로 거의 생리학적 염 농도에서 HPV를 보관할 수 있게 한다. 따라서, 동결 및 해동 단계를 생략할 수 있으므로, 적합한 생리학적 이온 농도 조건에서 알루미늄 보조제에 HPV를 흡착시키거나 비-알루미늄 보조제를 이용하여 제조함으로써 보조제를 수반한 HPV VLP 용액을 직접 제형물화할 수 있다.
따라서, 본 발명은 알루미늄-함유 보조제와의 혼합전에 온도 및 염 농도에서 상기와 같은 심한 변화를 요구하지 않는 보조 HPV 백신의 개선된 제조 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 항원 제형물을 제조하여, 알루미늄 보조제와의 혼합전에 4℃에서 보관할 수 있다. 이러한 예비-알루미늄 항원 제형물을 알루미늄 보조제, 예를 들어 인산알루미늄, 알루미늄 하이드록시포스페이트 및 알루미늄 옥시하이드록사이드와 혼합한다. 티머졸과 같은 방부제를 경우에 따라 첨가할 수 있다. 본 발명의 방법은 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 적어도 2년 이하의 기간 동안 본래의 항원 제형물을 장기간 보관시킬 수 있다.
본원의 검토시 명백하듯이, 본 발명의 HPV 항원 제형물은 생리학적으로 허용되는 농도에서 알루미늄 또는 비-알루미늄 보조제와 직접 배합될 수 있다는 이점이 있다. 또한, 본원의 검토시 명백하듯이, 또다른 이점은 이들 제형물이 적절한 알루미늄- 또는 비-알루미늄 함유 보조제에 직접 첨가될 수 있도록, 약 0℃ 내지 약 40℃, 및 특히 약 2℃ 내지 약 8℃의 빙점 이상의 온도에서 안정성이 증가된다는 것이다. 즉, 본원에 기술된 제형물은 또한 생리학적 염 농도에서 비-알루미늄 보조제를 포함하는 HPV 용액의 직접적인 제형물화를 위해 변형될 수 있다.
상기 예시된 제형물이 바람직하지만, 본 명세서의 교시에 비추어 각종 추가의 제형물이 고려될 수 있다. 본원에 교시된 바와 같이, 본 발명의 예시된 제형물은 물론 추가의 항원 제형물은 백신 성분이 장기간 동안 보다 편리한 온도에서 보관될 수 있을 뿐만 아니라 안정성이 증가되고 용액으로부터 응집 또는 침전하려는 경향이 감소될 수 있도록, 숙주에 대해 생리학적으로 허용되는 이온 농도의 염, 생리학적으로 허용되는 완충액 및 생리학적으로 허용되는 농도의 계면활성제를 포함할 수 있다.
본 발명의 HPV 백신 제형물을 사용하는 투여법은 환자의 유형, 종류, 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태; 치료될 증상의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 사용된 특정 화합물을 포함하는 각종 요인에 따라 선택될 것이다. 통상의 지식을 가진 주치의는 상태의 진행을 예방, 회복, 억제하는데 요구되는 HPV 백신의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된 것이며, 본 발명이 이에 제한하는 것은 아니다.
실시예 1
재조합 HPV11 L1 VLP의 과발현
합성 L1 유전자의 작제-HPV11 L1 VLP의 과발현 및 정제는 1995년 3월 30일자로 출원된 미국 특허원 제08/413,571호 및 08/413,572호에 기술되어 있으며, 단지 예시를 위해 본 실시예에서 제시되어 있으나, 재조합 HPV VLP를 제조하는데 사용될 수 있는 방법을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에는 본 발명의 제형물을 예시하기 위한 재조합 HPV11 L1 및 HPV16 L1의 용도가 기술되어 있다. 공지된 재조합 DNA 방법을 사용하여 본 명세서에 언급된 재조합 HPV VLP를 제조할 수 있음은 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 효모 이외의 숙주를 사용하여, 본 발명의 항원 제형물에 사용될 수 있는 HPV VLP를 과발현시킬 수 있음도 공지되어 있다.
HPV11 L1의 1.5kbp 개방형 판독 프레임은 미들랜드 리전트 컴파니(Midland Reagent Company)로부터 주문한 합성 DNA 올리고머를 사용하여 작제한다. 5' 말단 포스페이트를 함유하는 이들 올리고머가 공급된다. 총 24개의 올리고머가 요구되며, 다음과 같다:
상보성 쌍을 형성하는 올리고머(#241-1과 #241-24, #241-2와 #241-23, #241-3과 #241-22, #241-4와 #241-21, #241-5와 #241-20, #241-6과 #241-19, #241-7과 #241-18, #241-8과 #241-17, #241-9와 #241-16, #241-10과 #241-15, #241-11과 #241-14, #241-12와 #241-13)을 2.5mM Tris(pH 7.5), 0.25mM EDTA를 함유하는 별도의 튜브에서 어닐링시킨다. 튜브를 98℃에서 4분 동안 가열한 다음 250ml 비이커내의 98℃ 물 200ml에 넣어 서서히 냉각시킨다. 물이 실온으로 냉각되면, 어닐링된 쌍을 지시된 바와 같이 튜브에 첨가한다: 단편 A(올리고머쌍 #241-1 ＆ 24, 및 -2 ＆ 23); 단편 B(#241-3 ＆ 22, -4 ＆ 21, -5 ＆ 20, 및 -6 ＆ 19); 단편 C(#241-7 ＆ 18, -8 ＆17, -9 ＆ 16 및 -10 ＆ 15) 및 단편 D(#241-11 ＆ 14 및 -12 ＆ 13). 이들 올리고머쌍 혼합물을 62℃로 2분 동안 가열한 다음 앞서와 같이 서서히 냉각시킨다. 각 튜브의 내용물을 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim, Inc.) 및 제조업자에 의해 제공된 시약을 사용하여 23℃에서 밤새 연결시킨다.
연결시킨 후, 완전한 길이의 생성물의 양을 증가시키기 위해 단편 B를 PCR 증폭시킬 필요가 있다. 이것은 Boehringer Mannheim Taq 폴리머라제 및 하기 올리고머 프라이머(서열 25 및 26)를 사용하여 Applied Biosystems 열순환기에서 94℃에서 1분; 48℃에서 1분; 72℃에서 1분에 이은 72℃에서 10분의 10 사이클을 필요로 한다:
5'-GGAATTCACATGCATGCACAGGCCTAG-3'(서열 25) 및
5'-GGAATTCGGGGTACCAGCCCTGTTAA-3'(서열 26).
연결된 생성물 및 단편 B PCR 생성물을 제한 효소(Boehringer Mannheim, Inc.)로 다음과 같이 분해한다: 단편 A를 Bgl II 및 Sph I으로 분해하고; 단편 B를 Sph I 및 Kpn I으로 분해하며; 단편 C를 Kpn I 및 Xho I으로 분해하고; 단편 D를 Xho I 및 Bgl II로 분해한다. 분해된 단편을 융점이 낮은 아가로즈(FMC BioProducts) 겔상에서 분리하고, 정확한 크기의 단편을 공급자가 권장한 바에 따라 AgaraseTM(Boehringer Mannheim, Inc.)를 사용하여, 밴드를 절제하고 아가로즈를 분해하여 분리한다. 단편 A, B 및 D를 에탄올 침전법으로 회수한 다음 벡터 pSP72(Promega, Inc.)에 별도로 연결하는데, 이때 벡터 pSP72를 제한효소로 유사하게 분해하여 연결하고자 하는 각 단편과 일치시킨다.
Kpn I Xho I로 분해된 단편 C를, 우선 하기의 어닐링된 올리고머에 연결시킨다:
5'-TCGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACAC-3'(서열 27) 및
5'-TCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAGTCT-3'(서열 28).
이어서, 단편 C를 Xho I으로 다시 절단하고, 450bp KpnI XhoI 단편을 Kpn I, Xho I-분해된 pSP72 벡터에 연결시킨다. 연결 혼합물을 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주 DH5 수용적격(competent) 세포(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)를 형질전환시킨다. 형질전환체를, 콜로니 하이브리드화[참조: J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]로 삽입체-함유 클론에 대해 스크리닝한다. 플라스미드 DNA를 Wizard 미니프렙 키트(Promega Corp.)를 사용하여 포지티브 클론으로부터 분리한 다음 Applied Biosystems 373A DNA 서열분석기를 사용하여 서열분석한다. 4개의 각 단편에 대한 정확한 DNA 서열을 함유하는 클론을, pSP72 벡터로부터 단편을 분리하기 위해 앞서와 같이 분해한다. Kpn I, Xho I-분해된 단편 C를 Xho I, Bgl II-분해된 단편 D 및 Kpn I, Bgl II-절단된 pSP72에 3가지 연결 방식으로 연결한다. 이어서, 연결 생성물을 사용하여 이. 콜라이(E. coli)를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 서열분석하고, 정확한 서열의 클론을 수득한다(CD로 명명함). CD의 750bp Bgl II Kpn I 삽입체를 pSP72 벡터로부터 다시 절단하고, Bgl II, Sph I-분해된 단편 A 및 Sph I, Kpn I-분해된 단편 B에 상기와 같은 3가지 연결 방식으로 연결하는데, 단 Bgl II를 가하여 목적하지 않는 연결 생성물을 감소시킨다. 연결 생성물을 아가로즈 겔상에서 분리하고, 1.5kbp 단편을 분리하여 D361-1로 명명한다.
HPV6/11 L1, HPV11 L1 및 HPV6 L1 효모 발현 벡터의 작제-
플라스미드 pBM272[참조: Mark Johnston사 제공, Washington University, St. Louis, MO]로부터의 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 분기성(divergent) GAL1-GAL10 프로모터를 함유하는 pUC18/이방향성 GAL 프로모터 플라스미드로부터 1.4kbp SphI 단편을 분리하여 pGAL1-10 효모 발현 벡터를 작제한다. 분기성 프로모터를 효모 ADH1 전사 터미네이터의 복사체[참조: Bennetzen and Hall, 1982, J. Biol. Chem. 257: 3018-3025]로 각 측면에 플랭킹시키고, BamHI 클로닝 부위를 GAL1 프로모터와 ADH1 전사 터미네이터 제1 복사체 사이에 위치시키며, SmaI 클로닝 부위를 GAL10 프로모터와 ADH1 전사 터미네이터 제2 복사체 사이에 위치시킨다. pBR322, 효모 LEU2d 유전자[참조: Erhart and Hollenberg, 1983, J. Bacteriol. 156: 625-635] 및 효모 2μ 플라스미드[참조: Benjamin Hall, University of Washington, Seattle, WA]로 이루어진 효모 왕복 벡터[참조: Broach and Volkert, 1991, Circular DNA Plasmids of Yeasts, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York]를 SphI으로 분해하고, 1.4kbp SphI 분기성 GAL 프로모터 단편에 연결시키면, pGAL1-10이 생성된다.
HPV11 L1 단백질을 암호화하는 HPV6/11 하이브리드 L1 DNA(실시예 1의 샘플 D361-1)는 메티오닌 코돈에서 개시되는 HPV6/11 L1의 인접 상부에 효모 비-해독된 리더 서열[참조: Kniskern, et al., 1986, Gene 46: 135-141]을 포함한다. pGAL1-10 플라스미드를, GAL1 프로모터와 ADH1 전사 터미네이터 사이를 절단하는 BamHI으로 선형화시키고, 1.5kbp의 HPV6/11 L1 유전자 단편(샘플 D361-1)에 연결시킨다. 이. 콜라이 DH5(Gibco BRL, Inc.) 형질전환체를 스크리닝하고, HPV6/11 L1 유전자를 함유하는 pGAL1-10 플라스미드를 분리하여 D362-1로 명명한다.
야생형 HPV11(wt-HPV11) DNA를 첨규습우 병변(Dr. Darron Brown이 발견함)으로부터 클로닝한다. 전체 사람 게놈 DNA를 추출하고, 제한 엔도뉴클레아제로 분해한다. wt-HPV11 DNA를 함유하는 분획을, PCR의 주형으로 사용되는 이. 콜라이 클로닝 벡터에 연결한다. Vent 폴리머라제(New England Biolabs, Inc.), 10 사이클의 증폭(94℃에서 1분, 48℃에서 1분, 72℃에서 1분 45초), 및 플랭킹 Bgl II 부위(밑줄로 표시되어 있음)를 포함하는 하기 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 wt-HPV11 L1 유전자를 증폭시킨다:
센스 프라이머: 5'-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC GGC CTA GCG ACA GCA CAG-3'(서열 29)
안티센스 프라이머: 5'-GAG AGA TCT TAC TTT TTG GTT TTG GTA CGT TTT CG-3'(서열 30)
센스 프라이머는 메티오닌 코돈(강조된 굵은 활자체 부분)에서 개시되는 wt-HPV11 L1의 인접 상부에 효모 비-해독된 리더 서열[참조: Kniskern, et al., 1986, Gene 46: 135-141]를 도입한다. 1.5kbp의 wt-HPV11 L1 PCR 생성물을 BglII로 분해하고, 겔로 정제한 다음 BamHI-분해된 pGAL1-10 플라스미드에 연결하여 플라스미드 p329-1을 수득한다.
전체 게놈 DNA를 HPV6a-포지티브 첨규습우(Dr. Darron Brown이 발견함)으로부터 추출한다. 주형으로서 생검 샘플 DNA, Vent 폴리머라제(New England Biolabs, Inc.), 35 사이클의 증폭(94℃에서 1분, 48℃에서 1분, 72℃에서 1분 45초), wt-HPV11 L1의 PCR을 위한 상기 수록된 센스 프라이머 및 하기 서열을 갖는 안티센스 프라이머를 사용하여 HPV6a L1 유전자를 PCR에 의해 증폭시킨다:
5'-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3'(서열 31)
1.5kbp의 HPV6a L1 PCR 생성물을 BglII로 분해하고, 겔로 정제한 다음 BamHI-분해된 pGAL1-10 플라스미드에 연결시켜 플라스미드 D128을 수득한다.
균주 1558의 제조
a. 효모 균주 U9의 제조
사카로마이세스 세레비지애 균주 2150-2-3(MATalpha, leu2-04, ade 1,cir0)을 Dr. Leland Hartwell(University of Washington, Seattle, WA)로부터 수득한다. 균주 2150-2-3의 세포를 YEHD 배지[참조: Carty et al., 1987, J. Ind Micro 2: 117-121] 5ml에서 30℃로 밤새 증식시킨다. 세포를 멸균 증류수로 3회 세척하고, 멸균 증류수 2ml에 재현탁시키며, 세포 현탁액 0.1ml를 6개의 5-플루오로-오로트산(FOA) 플레이트상에 각각 도말하여 ura3 돌연변이체를 선별한다[참조: Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics]. 플레이트를 30℃에서 배양한다. 배지는 중류수 250ml당, 아미노산과 황산암모늄이 배제된 Difco 효모 질소 염기 3.5g; 5-플루오로-오로트산 0.5g 및 덱스트로즈 10.0g을 함유한다.
0.2㎛ 막을 통해 여과하여 배지를 멸균시키고, 이어서 50℃로 유지된 4% Bacto-아가(Difco) 250ml, 1.2mg/ml의 아데닌 용액 10ml 및 L-루이신 용액 5ml(180mg/50ml)과 혼합한다. 생성된 배지를 페트리 접시당 20ml씩 분배한다.
배양후 5일 경과하여, 다수의 콜로니가 나타난다. 초기 FOA 플레이트의 콜로니를 신선한 FOA 플레이트에 재스트리킹하여 단일 콜로니를 분리한 다음 30℃에서 배양한다. FOA 플레이트의 제2 세트로부터의 다수의 콜로니를 YEHD 플레이트 및 우라실-비함유 플레이트상에 복제-도말(replica-plating)하여, ura3 돌연변이의 존재를 시험한다. 목적하는 결과는 YEHD상에서의 성장이 우수하고 우라실-비함유 배지상에서의 성장이 없는 것이었다. 이러한 특성을 나타낸 하나의 분리물(U9)가 수득되었다. 이것을 나중에 사용하기 위해 -70℃에서 동결된 글리세롤 스톡(균주 #325)로서 보관한다.
b. 효모 MNN9 유전자의 단절(disruption)을 위한 벡터의 제조
MNN9 유전자의 단절을 위한 벡터를 제조하기 위해서는, 에스. 세레비지애 게놈 DNA로부터 MNN9 유전자를 먼저 클로닝할 필요가 있다. 이는 표준 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술에 의해 달성된다. 완전한 길이의 MNN9 암호화 서열의 PCR을 위한 5' 센스 프라이머 및 3' 안티센스 프라이머를, 효모 MNN9 유전자의 공개된 서열[참조: Zymogenetics: EPO 특허원 제88117834.7, 공개 번호 제0-314-096-A2]에 기초하여 고안한다. 플랭킹 HindIII 부위(밑줄로 표시되어 있음)을 함유하는 하기 올리고데옥시뉴클레오타이드 프라이머가 사용된다:
센스 프라이머: 5'-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3'(서열 32);
안티센스 프라이머: 5'-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3'(서열 33)
MNN9 유전자에 대한 개시 메티오닌 코돈은 굵은 활자체로 강조되어 있다. 주형으로서 에스. 세레비지애 균주 JRY188의 게놈 DNA, Taq 폴리머라제(Perkin Elmer) 및 25 사이클의 증폭(94℃에서 1분, 37℃에서 2분, 72℃에서 3분)을 사용하여 PCR을 수행한다. 생성된 1.2kbp PCR 단편을 HindIII로 분해하고, 겔로 정제하며, HindIII로 분해하여 알칼린-포스파타제로 처리한 pUC13(Pharmacia)에 연결시킨다. 생성된 플라스미드를 p1183으로 명명한다.
효모 URA3 유전자로 MNN9를 단절시키기 위해, 플라스미드 pBR322-URA3(이는 pBR322의 HindIII 부위내로 서브클로닝된 에스. 세레비지애 URA3 유전자를 암호화하는 1.1kbp의 HindIII 단편을 함유한다)을 HindIII으로 분해하고, 작용성 URA3 유전자를 포함하는 1.1Kbp의 DNA 단편을 겔-정제하며, T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 평활-말단화시키고, 이어서 PmlI-분해된 플라스미드 p1183(MNN9 암호 서열내의 PmlI 절단물)에 연결시킨다. 생성된 플라스미드 p1199는 작용성 URA3 유전자에 의해 단절된 MNN9 유전자를 함유한다.
c. 단절된 MNN9 유전자를 함유하는 U9-유도체 균주 1372의 작제
균주 U9(#325)내의 MNN9 유전자를 단절시키기 위해, 30㎍의 플라스미드 p1199를 HindIII으로 분해하여 선형 mnn9::URA3 단절 카셋트를 제조한다. 균주 325의 세포를 스페로플라스트 방법[참조: Hinnen, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933]에 의해 HindIII-분해된 p1199 DNA로 형질전환시키고, 형질전환체를 우라실이 결핍된 1.0M 소브비톨을 함유하는 합성 아가 배지상에서 선별한다. 합성 배지는 증류수 L당, 아가 20g; 효모 질소 염기 w/o 아미노산 6.7g; 아데닌 0.04g; L-티로신 0.05g; 소르비톨 182g; 글루코즈 20g; 및 루이신 비함유 용액 #2 10ml를 포함한다. 루이신 비함유 용액 #2는 증류수 L당, L-아르기닌 2g; L-히스티딘 1g; L-루이신 6g; L-이소루이신 6g; L-리신 4g; L-메티오닌 1g; L-페닐알라닌 6g; L-트레오닌 6g; L-트립토판 4g을 포함한다.
플레이트를 5일 동안 30℃에서 항온처리하면, 다수의 콜로니가 나타난다. 염색체 DNA 제제를 10개의 콜로니로부터 제조한 다음 EcoRI + HindIII로 분해한다. 이어서, DNA 분해물을, 프로브로서 MNN9 유전자(플라스미드 p1199로부터 분리됨)을 포함하는 1.2kbp의 HindIII 단편을 사용하여 서던 블롯[참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press)으로 평가한다. 확인한 결과, mnn9 돌연변이체에 의해 전형적으로 나타나는 고도의 응괴 뿐만 아니라 서던 블롯상에서 예상된 DNA 밴드 이동을 나타내는 분리물(균주 #1372)이 동정된다.
d. 효모 HIS3 유전자의 단절을 위한 벡터의 작제
에스. 세레비지애 HIS3 유전자가 URA3 유전자에 의해 단절된 단절 카셋트를 작제하기 위해, 플라스미드 YEp6[참조: Struhl et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035]를 BamHI으로 분해하고, HIS3 유전자를 포함하는 1.7kbp의 BamHI 단편을 겔-정제하며, T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 평활-말단화시키고, BamHI으로 미리 분해하여 T4 DNA 폴리머라제로 처리한 pUC18에 연결시킨다. 생성된 플라스미드(p1501 또는 pUC18-HIS3으로 명명함)를 NheI(이는 HIS3 암호화 서열내를 절단한다)으로 분해하고, 벡터 단편을 겔-정제하며, T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 평활-말단화시키고, 송아지 장 알칼리 포스파타제로 처리한다. URA3 유전자를 HindIII으로 분해하여 플라스미드 pBR322-URA3으로부터 분리하고, URA3 유전자를 포함하는 1.1kbp 단편을 겔-정제하며, T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 평활-말단화시키고, 상기 pUC18-HIS3 NheI 단편에 연결시킨다. 생성된 플라스미드(pUC18-his3::URA3 또는 p1505로 명명함)는 효모 HIS3 유전자가 작용성 URA3 유전자에 의해 단절된 단절 카셋트를 포함한다.
e. HIS3 유전자로 효모 PRB1 유전자를 단절시키기 위한 벡터의 작제
에스. 세레비지애 PRB1 유전자를 포함하는 플라스미드 FP8△H는 카네기-멜론 유니버시티(Carnegie-Mellon Univ.)의 Dr. E. Jones에 의해 제공된다[참조: Moehle et al., 1987, Genetics 115:255-263]. 이를 HindIII + XhoI로 분해하고, PRB1 유전자를 포함하는 3.2kbp의 DNA 단편을 겔-정제하며, T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 평활-말단화시킨다. 플라스미드 pUC18을 BamHI으로 분해하고, 겔-정제한 다음 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 평활-말단화시킨다. 생성된 벡터 단편을 상기 PRB1 유전자 단편에 연결하여 플라스미드 pUC18-PRB1을 수득한다. HIS3 유전자를 포함하는 플라스미드 YEp6을 BamHI으로 분해한다. 작용성 HIS3 유전자를 포함하는 생성된 1.7kbp의 BamHI 단편을 겔-정제한 다음 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 평활-말단화시킨다. 플라스미드 pUC18-PRB1을 EcoRV + NcoI로 분해하는데, EcoRV + NcoI는 PRB1 암호화 서열내를 절단하여 프로테아제 B 활성 부위 및 플랭킹 서열을 제거한다. pUC18내에 PRB1 암호 서열의 잔존하는 5' 및 3'-부분을 포함하는 5.7kbp의 EcoRV-NcoI 단편을 겔-정제하고, T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 평활-말단화시키며, 송아지 장 알칼리 포스파타제로 탈인산화시키고, 상기 평활-말단화된 HIS3 단편에 연결시킨다. 생성되는 플라스미드(pUC18-prb1::HIS3, 스톡 #1245)는 상기 결실된 PRB1 유전자 부분 대신에 작용성 HIS3 유전자를 함유한다.
f. 단절된 MNN9 및 PRB1 유전자를 포함하는 U9-관련된 효모 균주의 작제
단절된 MNN9 유전자를 포함하는 U9-관련 균주 1372는 본원에 기술되어 있다. 균주 1372의 클론 분리물을 FOA 플레이트상에서 계대하여 ura3 돌연변이체를 선별한다. 균주 1372의 다수 ura3 분리물이 수득되었고, 하나의 특정한 분리물(균주 12930-190-S1-1)을 HIS3 유전자의 후속적인 단절을 위해 선별한다. pUC18-his3::URA3 유전자 단절 벡터(p1505)를 XbaI + EcoRI으로 분해하여 선형 his3::URA3 단절 카셋트를 형성시키고, 리튬 아세테이트 방법[참조: Methods in Enzymology, 1992, 194:290]에 의한 균주 12930-190-S1-1의 형질전환에 사용한다. Ura+형질전환체를 우라실이 결핍된 합성 아가 배지상에서 선별하고, 동일한 배지상에 클론 분리물을 위해 재스트리킹한 후, 우라실 또는 히스티딘이 결핍된 배지상에 복제-도말하여 Ura+및 His-양자의 분리물을 스크리닝한다. 특정한 분리물(균주 12930-230-1)을 PRB1 유전자의 후속적인 단절을 위해 선별한다. PRB1 유전자 단절 벡터(pUC18-prb1::HIS3, 스톡 #1245)를 SacI + XbalI으로 분해하여 선형 prb1::HIS3 단절 카셋트를 제조하고, 리튬 아세테이트 방법에 의한 균주 12930-230-1의 형질전환에 사용한다. His+형질전환체를 히스티딘이 결핍된 아가 배지상에서 선별하고, 클론 분리물을 위해 동일한 배지상에서 재스트리킹한다. 게놈 DNA를 생성된 다수의 His+분리물로부터 제조하고, EcoRI으로 분해한 다음 0.8% 아가로즈 겔상에서 전기영동한다. 이어서, 하기 올리고데옥시뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 제조된 PRB1 유전자에 대한 방사선-표지된 617bp 프로브를 사용하여 서던 블롯 분석을 수행한다:
5'-TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA-3'(서열 34) 및
5'-CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA-3'(서열 35)
2.44kbp의 prb1::HIS3 DNA 단편과 프로브의 예상된 하이브리드화를 나타내는 11개의 분리물이 수득된다. 이는 야생형 PRB1 유전자 경우의 1.59kbp 단편과 프로브의 하이브리드화와는 대조적이다. 목적하는 prb1::HIS3 단절을 포함하는 이들 분리물중 하나를 추가로 사용하기 위해 선별하고, 균주 #1558로 명명하였다.
실시예 2
효모에서 HPV11 L1 및 HPV6 L1의 발현
플라스미드 D362-1(pGAL1-10 + HPV6/11 L1), p329-1(pGAL1-10 + wt-HPV11 L1), D128(pGAL1-10 + HPV6 L1) 및 pGAL1-10을 사용하여 스페로플라스트 방법[참조: Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929-1933]으로 에. 세레비지애 균주 #1558(MATα, ler2-04, prb1::HIS3, mnn9::URA3, ade1, ciro)를 형질전환시킨다. 플라스미드 D362-1로 형질전환된 #1558 효모 균주를 #1782 균주라 명명한다. RNA 연구를 위해, 효모 클론 분리물을 0.1M 소르비톨 및 2% 글루코즈 또는 갈락토즈를 함유하는 YEH 복합 배지[참조: Carty et al., 1987, J. Ind. Micro. 2.117-121]중 30℃에서 26시간 동안 성장시킨다. 세포를 회수한 후, 효모 RNA를 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols, 1993]에 기술된 바와 같은 열 산성 페놀 방법으로 추출한다. 단백질 분석을 위해, 동일한 분리물을 0.1M 소르비톨, 2% 글루코즈 및 2% 갈락토즈를 함유하는 YEH 복합 배지중 30℃에서 70시간 동안 성장시킨다. 세포를 회수한 후, 세포 펠렛을 유리 비드로 부수고, 세포 용해물을 면역블롯 분석으로 HPV11 L1 또는 HPV6 L1 단백질의 발현에 대해 분석한다.
HPV6/11 L1 (균주 #1782)의 발효
균주 1782의 평판 배양의 표면 성장물을 루이신-비함유 액체 배지[L당 아미노산 및 황산암모늄을 포함하지 않는 Difco 효모 질소 염기 8.5g, 아데닌 0.2g, 우라실 0.2g, 석신산 10g, 황산암모늄 5g 및 L-타로신 0.25g을 함유하고, 멸균전에 NaOH로 pH 5.0 내지 5.3으로 조절된다]에 무균적으로 옮긴다. 250rpm의 회전 진탕기상에서 28℃로 25시간 동안 성장시킨 후, -70℃에서 보관(냉동 바이알당 1mL)하기 전에 멸균 글리세롤을 17%(w/v)의 최종 농도에 이르기까지 가하여 냉동 배양물 바이알을 제조한다. 균주 1782의 발효용 접종을 동일한 배지(2L 플라스크당 750mL)에서 전개시키며, 이는 2개의 냉동 배양물의 해동 내용물을 2L 플라스크에 옮기고 250rpm의 회전 진탕기상에서 28℃로 25시간 동안 배양함으로써 개시된다. 균주 1782의 발효에는 접종 후 작업 용적이 18L인 Chemap 23L 발효기가 사용된다. 사용된 생산 배지는 Difco 효모 추출물 20g, Sheffield HySoy 펩톤 10g, 글루코즈 20g 및 갈락토즈 20g을 포함하고, 멸균 전에 pH 5.3으로 조절된다. 2L 접종 플라스크의 내용물 전부(500ml)를 발효기에 옮기고, 28℃, 분당 9L 공기, 500rpm, 3.5psi 압력에서 배양한다. 필요하면, 용존 산소량이 포화량의 40%를 넘게 유지되도록 교반을 증가시킨다. 발효 공정을 오프라인(offline) 글루코즈 측정(Beckman Glucose 2 Analyzer) 및 온라인(online) 질량 분광법(Perkin-Elmer 1200)으로 모니터링한다. 66시간 동안 배양한 후, L당 9.32g의 건조 세포 중량의 세포 밀도에 도달한다. 세포를 회수하기 전, 2개의 상기 발효의 내용물(총 17.5L 브로쓰)을 모은다. 배양액을 공동(hollow) 섬유 여과(Amicon DC-10 여과 시스템내 Amicon H5MP01-43 카트리지)로 약 2L로 농축시키고, 2L 인산염-완충 염수로 투석여과시킨 후, 추가로 농축(약 1L)시키고, 이어서 500ml 원심분리병에 분배시킨다. 세포 펠렛을 4℃에서 20분 동안 8000rpm으로 원심분리(Sorval GS3 로타)시켜 회수한다. 상등액을 경사분리시킨 후, 사용할 때까지 펠렛(총 358g 습윤 세포)을 -70℃에서 보관한다.
재조합 HPV 유형 11 L1 캡시드 단백질의 정제
모든 단계는 달리 언급이 없는 한 4℃에서 수행한다. 세포를 -70℃에서 냉동 보관한다. 냉동 세포(습윤 중량=180g)를 20 내지 23℃에서 해동시키고, "파괴 완충액(Breaking Buffer)"(50mM MOPS, pH 7.2, 500mM NaCl, 1mM CaCl2) 900mL에 재현탁시킨다. 프로테아제 억제제 AEBSF 및 펩스타틴 A를 각각 1mM 및 1.7mM의 최종 농도에 이르기까지 가한다. 세포 슬러리를 약 16,000psi의 압력에서, M110-Y Microfluidizer(Microfluidics Corp., Newton, MA)에 4회 통과시켜 파괴시킨다. 파괴된 세포 슬러리에 충분한 용량의 10% Triton X100R세제(Pierce, Rockford, IL)를 가하여 TX100의 농도를 0.5%로 만든다. 슬러리를 20시간 동안 교반한다. Triton X100-처리된 용해물을 40분 동안 12,000xg로 원심분리시켜 세포 파편을 제거시킨다. L1 단백질을 함유하는 상등액을 회수한다.
상등액을 300K 접선 유동 막 카셋트(Filtron, Northborough, MA)를 사용하여 20mM 인산나트륨(pH 7.2) 및 0.5M NaCl의 5 용량에 대해 투석여과시킨다. 방사선면역검정 및 웨스턴 블롯팅에 의해, 막에 보유된 물질이 L1 단백질을 함유하는 것으로 나타났다.
보유물을 20mM 인산나트륨(pH 7.2) 및 0.5M NaCl로 평형을 맞춘 SP Spherodex(M)R수지(IBF, Villeneuve-la-Garenne, France)의 고분해능 친화성 컬럼에 적용시킨다. 평형 완충액으로 세척하고, 20mM 인산나트륨(pH 7.2) 및 1.0M NaCl로 단계적으로 세척한 후, L1 단백질을 20mM 인산나트륨(pH 7.2) 및 2.5M NaCl으로 세척하여 용출시킨다. 세척 및 용출하는 동안 분획을 수집한다. 컬럼 분획물을 Bradford 방법으로 전체 단백질에 대해 검정한다. 이어서, 분획물을 웨스턴 블롯팅, 및 콜로이드성 Coomassie 검출을 이용하는 SDS-PAGE로 분석한다. 또한, 분획물을 방사성면역검정으로도 분석한다.
상당한 순도와 L1 단백질의 농후도를 나타내는 SP Spherodex 분획물을 모은다. 최종 생성물을 웨스턴 블롯팅, 및 콜로이드성 Coomassie 검출을 이용하는 SDS-PAGE로 분석한다. L1 단백질은 90%를 초과하는 균질성을 갖는 것으로 평가되었다. L1 단백질의 동정은 웨스턴 블롯으로 확인된다. 최종 생성물을 0.22mm 막을 통해 무균적으로 여과시키고, 50mM MOPS 및 1.25M NaCl중에 -70℃로 보관한다.
전자현미경 분석을 Structure Probe(West Chester, PA)로 수행한다. 분취량의 샘플을 200 메쉬 탄소-피복된 구리 그리드(grid)에 놓는다. 소량의 2% 포스포텅스트산(pH 7.0)을 20초 동안 그리드에 놓고, TEM 조사 전에 그리드를 공기 건조시킨다. 모든 현미경 검사는 100kV의 가속 전압에서 JEOL 100 CX 투과 전자 현미경(JEOL USA, Inc.)을 사용하여 수행한다. 현미경 사진은 최종 배율이 100,000 x이다.
전체 단백질의 Bradford 검정
전체 단백질을 시판되는 Coomassie PlusR키트(Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 분석한다. 샘플을 Milli-Q-H2O중에 적합한 수준으로 희석시킨다. 필요 용량은 표준 프로토콜 및 미세검정 프로토콜에 있어 각각 0.1ml 및 1.0ml이다. 2가지의 프로토콜을 위해, BSA(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 표준 곡선을 그린다. 검정은 제조자의 지시에 따라 수행한다. 표준 곡선은 Macintosh IIci 컴퓨터의 CricketGraphR소프트웨어를 사용하여 플로팅한다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 검정
모든 겔, 완충액 및 전기영동 기구는 Novex(San Diego, CA)로 부터 구입하고, 제조자의 지시에 따라 사용한다. 간단히 설명하면, 샘플을 Mili-Q-H2O중에 동일 단백질 농도로 희석시키고, 200mM DTT를 함유하는 샘플 인큐베이션 완충액과 1:1로 혼합한다. 샘플을 100℃에서 15분 동안 항온처리한 후, 프레-캐스트(pre-cast) 12% Tris-글리신 겔에 로딩시킨다. 샘플을 1시간 45분 동안 125V에서 전기영동시킨다. 겔을 시판되는 키트(Integrated Separation Systems, Natick, MA)를 사용하여 콜로이드성 Coomassie 염색으로 전개시킨다.
웨스틴 블롯을 위해, 단백질을 40분 동안 25V에서 PVDF 막으로 이동시킨다. 막을 Milli-Q-H2O로 세척하고, 공기 건조시킨다. 제1 항체는 TrpE-HPV11L1 융합 단백질(Dr. D. Brown으로 부터 기증 받음)에 대해 발생된 폴리클로날 래빗 항혈청이다. 항체 용액은, 블롯팅 완충액(6.25mM Na 포스페이트, pH 7.2, 150mM NaCl, 0.02% NaN3중의 5% 지방-비함유 우유)중에 항혈청을 희석시켜 제조한다. 1시간 이상 동안 20 내지 23℃의 온도로 항온처리 한다. 블롯을 각각 1분 동안 PBS(6.25mM Na 포스페이트, pH 7.2, 150mM NaCl)로 3회 세척한다. 제2 항체 용액은, 염소 항-래빗 IgG 알칼리 포스파타제-결합된 결합체 항혈청(Pierce, Rockford, Il)을 블롯팅 완충액중에 희석시켜 제조한다. 1시간 이상 동안 동일한 조건하에 항온처리 한다. 앞에서와 같이 블롯을 세척한 후, 1 단계 NBT/BCIP 기질(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 검출한다.
실시예 3
응집에 대한 단백질 농도 의존성
다량의 HPV11 VLP를 전술한 바와 같이 제조하고, 1.25M NaCl을 함유하는 50mM MOPS중에 0.47mg/mL로 보관한다. 이를 해동시킨 후, 이 용액의 일부를 동일 완충액중에 18mcg/mL로 희석시킨다. 높은 단백질 농도의 저장 용액은 4℃에서 2개월 동안 107 내지 115nm 범위(동적 광 산란으로 측정)에서 동일한 유체역학적 직경(Dh)을 유지하는 반면, 낮은 단백질 농도의 용액은 염 농도가 1.25M NaCl로 유지되더라도 시간이 경과함에 따라 응집되었다(도 1). 도 1은, 낮은 HPV 단백질 농도에서는 염 농도가 높더라도 4℃에서 보관하는 동안 응집으로 부터 HPV를 보호하지 못한다는 것을 보여준다.
실시예 4
응집에 대한 염 농도 의존성
다량의 HPV11 및 HPV16 VLP를 제조하고, 보관하는 동안 유체역학적 크기에 대한 염 의존성을 시험한다. 재조합 HPV11 및 16 VLP를 저장 용액(50mM MOPS, 1.25M NaCl, pH 7.0)으로 부터 50mM MOPS 완충액중에 희석시켜, 최종 단백질의 농도를 약 20mcg/mL로 일정하게 유지시키고, NaCl 농도를 도 2에 나타난 바와 같이 변화시킨다. 희석액을 폴리프로필렌 에펜도르프 튜브에서 제조하여 실온에서 보관한다. 앞의 실시예(도 1)에서 나타난 바와 같이, 높은 염 농도를 함유하는 용액의 경우에도 이러한 단백질의 농도에서는 서서히 응집이 일어나므로, 희석물을 제조하는 1시간내에 측정해야 한다. Dh 값은 0.15M NaCl(HPV11) 및 0.5M NaCl(HPV16) 경우에는 거의 불변하였으나, 보다 낮은 농도에서는 증가하였다(도 2). 다른 한편, HPV11의 투석된 샘플은 모든 염 농도에서 보다 큰 유체역학적 크기를 나타내었고, 그 효과는 특히 0.5M NaCl 미만의 염 농도에서 두드러졌다.
상이한 다량의 HPV11을 사용한 별도의 실험(자료가 도면 형태로는 나타나 있지 않음)은, 재조합 HPV11 L1 VLP[상이한 농도의 NaCl을 포함하는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)으로 투석시킴]는 0.5M NaCl에서의 약 113nm으로부터 0.15M NaCl에서의 133nm으로 Dh 증가를 나타낸다. 1.0, 2.0 및 3.0M NaCl로 투석된 샘플은 헤드-대-헤드 비교에서 114, 113 및 108의 Dh 값을 나타내었으며, 한편 0.025M NaCl 농도로 투석된 샘플은 가시적 침전물을 형성한다. 이러한 샘플의 단백질 농도는, 용액중에 잔존하는 단지 16mcg/mL 단백질을 갖는 0.025M NaCl중의 샘플을 제외하고는, 130 내지 179mcg/mL(Lowry 단백질 검정으로 측정) 범위내이다. 2.5M NaCl을 함유하는 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)에 보관하고 투석하지 않은 대조군 샘플은 82nm의 Dh를 나타낸다.
이 실시예의 데이타는, 낮은 염 농도 또는 낮은 이온 농도가 HPV VLP의 입자간 응집을 유도하고, 낮은 단백질 농도 및 HPV 용액의 물리적 조작(단백질이 투석과 같은 조작)이 HPV VLP 응집에 크게 기여한다는 것을 보여준다.
실시예 5
HPV11 VLP의 표면 흡착
투석 막 표면
0.18M NaCl을 함유하는 50mM MOPS 완충액(pH 7.0)중의 단백질 용액 50mc g/mL을 상이한 표면적의 투석 막과 항온처리하여, HPV11 응집에 대한 직접적인 투석 막의 효과를 조사한다. Dh는 실온에서 96시간 동안 항온처리한 후 막의 표면적이 증가함에 따라 증가하는 것으로 밝혀졌다(도 3). 동시에, 용액중 단백질 농도는 막 표면적이 증가함에 따라 감소하는 것으로 밝혀졌다(도 3). 이러한 관측은, 막 표면상에 HPV11가 흡착을 나타내며, 표면 흡착과 응집간의 연관성을 제시한다. 이러한 데이타는, 폴리프로필렌 표면 및 투석 막 표면에 낮은 농도의 HPV가 장기간 노출되면 표면 흡착 및 응집이 야기된다는 것을 보여준다. 이러한 공정 모두 온도 의존적이다. 4℃에서 항온처리된 샘플은, 양 공정 모두에 있어 25℃의 경우 보다 느린 카이네틱을 나타낸다.
상이한 용기 표면에서의 HPV 흡착의 비교
다양한 HPV 농도에서 보로실리케이트 유리, 폴리프로필렌 및 폴리스티렌 튜브(12 x 75mm2의 동일 크기)에서, 동일한 표면대 용적 비의 HPV 흡착을 비교한다. 샘플을 1.25M NaCl(pH 7.0)을 함유하는 50mM MOPS 완충액중에서 항온처리하고, 24시간 동안 실온에서 정치시킨다. 도 4는 표면 흡착이 보로실리케이트 유리에서 100mcg/mL 미만으로 상당하다는 것을 보여준다. 폴리프로필렌에서도 흡착이 잘 진행되어, 30mcg/mL 미만일때, 상당한 문제가 되었으나, 보다 높은 농도에서는 이러한 조건하에서도 문제가 되지 않았다. 폴리스티렌이 가장 잘 진행되어 10mcg/mL 미만으로의 상당한 단백질 흡착이 없었다.
HPV11(0.25M NaCl을 함유하는 50mM MOPS 완충액중 18mcg/mL)을 2개의 상이한 표면대 용적 비를 갖는 폴리프로필렌 튜브에 놓고, HPV의 표면 흡착을 추가로 조사한다(도 5). 실온에서 1일 후, 4.0cm-1의 표면대 용적 비에서는 약 15%의 흡착을 보이는 반면, 6.0cm-1의 표면대 용적 비에서는 실질적으로 모든 HPV가 표면 흡착되었다(도 5)
실시예 6
HPV11 VLP 표면 흡착 및 응집을 억제하는 부형제
촉진된 안정화 실험에서 계면활성제의 스크리닝
예비 스크리닝 실험에서, HPV11 샘플을 0.01%의 수개의 계면활성제의 존재 또는 부재하에 실온에서 20시간 동안 항온처리 한다. HPV 농도는 18mcg/mL이고, 완충액은 50mM MOPS 및 0.15M NaCl(pH 7.0)을 포함한다. 수개의 계면활성제는, 동적 광 산란으로 측정되는 바와 같이, 계면활성제로 처리되지 않은 HPV와 비교하여, 상기 조건하에서 응집에 대해 부분적인 보호를 제공한다(도 6a).
계면활성제 스크리닝 실험을 보다 강화된 조건하에서 수행한다. HPV11를 30분 동안 50℃에서 0.01%의 각각의 계면활성제의 존재 또는 부재하에서 항온처리한 후, 2일 동안 실온에서 항온처리 한다. HPV 농도는 18mcg/mL이고, 완충액은 50mM MOPS 및 0.04M NaCl(pH 7.0)을 포함한다. 이러한 조건하에서, 계면활성제-비처리된 대조군 HPV 샘플은 상술한 실험과 비교하여 보다 높은 정도로 응집된다. 도 6b는, 시험된 계면활성제중에서 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(Tween 80R) 및 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(Brij 58R)가 응집으로 부터 HPV11 VLP를 가장 잘 보호한다는 것을 보여준다.
염과 폴리소르베이트 80의 배합에 따른 보호 효과
도 7a 및 도7b는, 낮은 HPV 농도에서 높은 염 농도(각각 0.1M 및 0.5M의 염화나트륨, 황산나트륨 및 황산암모늄) 단독으로 HPV VLP 표면 흡착 또는 응집을 억제하지 못한다는 것을 보여준다. 역으로, 도 7a 및 도7b는 또한, 비이온성 계면활성제 Tween 80R을 0.4M 황산암모늄 함유 완충액에 가하는 경우 실온에서 6일 후 조차 흡착 및 응집으로 부터 거의 완전히 보호된다는 것을 보여준다.
표면 흡착 및 응집에 미치는 폴리소르베이트 80(예: Tween 80R) 및 NaCl의 효과가 별도의 실험에서 재확인되었다. 18mcg/mL 농도의 HPV11 L1 VLP를, 폴리프로필렌 튜브내, 0.01% Tween 80R의 존재 또는 부재하에 250mM NaCl을 함유하는 50mM MOPS 완충액(pH 7)중에서 항온처리 한다. 도 8은 실온에서의 항온처리 시간의 함수로써 흡착된 단백질의 % 및 Dh 값을 나타낸다. Tween 80R의 부재하에서, 흡착 손실 및 응집 모두 상당했으며, 0.01% Tween 80R는 상기한 문제 모두로 부터 보호를 제공한다.
도 9는 응집 및 흡착으로 부터 낮은 농도의 HPV11 VLP(100mcg/mL)를 보호하기 위해 폴리소르베이트 80 이외에 최적 염 농도가 필요하다는 것을 보여준다. 또한, 낮은 이온 농도의 제형물에서 Tween 80R의 증가는 완전한 보호는 아니나 부분적인 보호를 제공한다는 것을 알 수 있다. 도 9는 HPV11(18mcg/mL)의 응집이 50mM MOPS 및 0.04M NaCl을 함유하는 완충액중의 0.01% Tween 80R에 의해서는 단지 부분적으로 조절되나, NaCl 농도를 0.10M로 증가시켰을 때 실온에서 48시간 동안 VLP 응집에 대해 거의 완전한 보호를 제공한다는 것을 보여준다.
도 10은 0.15M NaCl을 함유하는 50mM MOPS 완충액(pH 7.0)중에서 HPV11 VLP (18mcg/mL) 응집에 미치는 적정 폴리소르베이트 80의 효과를 보여준다. 샘플을 4℃ 및 실온에서 0 내지 0.01%의 Tween 80R와 항온처리 한다. 4℃에서는 0.01% Tween 80R함유 샘플에서 20일까지 상당한 응집이 관측되지 않았으나, 실온에서는 응집에 대해 부분적인 보호가 관측되었다.
도 11은 응집에 대해 HPV16 VLP를 보호하기 위한 비이온성 계면활성제의 능력을 보여준다. 조사된 계면활성제에는 폴리소르베이트 80(예: Tween 80), 폴리소르베이트 20(예: Tween 20), NP-40, Triton X100, Triton X114 및 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(예:Brij35 및 Brij58)이 포함된다. 20mcg/mL 단백질의 HPV16 샘플을 50일 동안 실온(주위 온도)에서 0.01%의 다양한 계면활성제 각각과 항온처리 한다. 항온처리 완충액은 50mM MOPS 및 0.15M NaCl(pH 7)을 함유한다. DLS로 측정시, 계면활성제를 포함하지 않는 대조군과 비교하여, 모든 계면활성제가 보관 동안 HPV16을 응집으로 부터 보호한다(도 11). 이러한 계면활성제 농도(0.01%)에서 보호 정도는 계면활성제마다 다소 다양하다. 비이온성 계면활성제의 보호 능력에 대한 염 의존성을 시험하기 위해, 30 내지 60mcg/mL 단백질의 HPV16 샘플을 0.01% 내지 0.02% Tween 80 및 0.15 내지 0.5M NaCl과 4℃에서 24시간 동안 항온처리 한다. 0.2M 농도 이상의 NaCl이 비이온성 계면활성제와 배합되어 HPV16 VLP 응집에 대해 상당한 보호를 제공한다는 것을 알 수 있었다.
비이온성 계면활성제의 존재하에 HPV 응집에 대한 염 농도의 안정화 효과를 총 이온 농도의 측면에서 조사한다. 도 2 및 도 9는 비이온성 계면활성제의 존재 또는 부재하에 HPV VLP를 안정화시키기 위해 최소의 NaCl 농도가 필요하다는 것을 보여준다. 다음의 실험에서, 상이한 염이 일정한 이온 농도에서 HPV16 VLP를 안정화시키는 능력을 갖는지를 조사한다. 60mcg/mL HPV16을 24시간 동안 22℃에서 항온처리하고, 이어서 동적 광 산란, 및 EIA 및 BIA 코어 분석에 의한 시험관내 항원성(항체 결합)에 의해 유체역학적 크기(Dh)가 검정될 때 까지 4℃에서 보관한다. 표 1은 NaCl 대신 다양한 염을 사용하는 경우, 염 농도는 보다 낮으나 이온 농도는 동일한 조건에서 유사한 HPV 안정성이 나타난다는 것을 보여준다. 대조군으로서, 보다 낮은 이온 농도 용액은 HPV 응집 및 부분적인 항원성 상실 보여준다. 이러한 결과는 염 안정화 효과가 이러한 조건하에서 염의 유형 대신에 이온 농도에 의해 통제된다는 것을 제시한다. 유사한 염 안정화 효과를 보다 강화된 조건(37℃)에서 시험하는 경우, 시험관내 항원성 검정 및 응집 분석에 의해 보여지는 바와 같이 상이한 염간의 안정화 능력에 있어 다소 차이가 나타났다. 예를들어, CaCl2및 MgCl2뿐만 아니라 인산염 완충액은 일정한 이온 농도에서 HPV VLP를 안정화시키는데 덜 효과적이다.
| MOPS(M) | 첨가 염(M) | 최종 Tween80 | 총 이온농도(M) | Biocore＊/단백질 | EIA＊/단백질 | Dh(nm) | |
| NaCl | 0.05 | 0.02 | 0.01% | 0.12 | 0.4 | 0.2 | 180 |
| NaCl | 0.05 | 0.12 | 0.01% | 0.22 | 1.0 | 1.0 | 72 |
| Na시트레이트 | 0.05 | 0.02 | 0.01% | 0.22 | 1.2 | 0.9 | 74 |
| Na포스페이트 | 0.05 | 0.02 | 0.01% | 0.22 | 0.8 | 1.2 | 74 |
| Na아세테이트 | 0.05 | 0.12 | 0.01% | 0.22 | 1.0 | 1.0 | 74 |
| Na2SO4 | 0.05 | 0.04 | 0.01% | 0.22 | 0.8 | 1.1 | 73 |
| MgCl2 | 0.05 | 0.04 | 0.01% | 0.22 | 1.0 | 1.1 | 74 |
| CaCl2 | 0.05 | 0.04 | 0.01% | 0.22 | 0.8 | 1.2 | 93 |
＊상대적인 시험관내 항체 결합 반응은 -70℃ 냉동 대조군 HPV16 샘플에 대해 표준화된 것이다. 대조군은 검정직전에 해동된다. 동적 광 산란에 의한 대조군 샘플의 유체역학적 직경(Dh)은 73nm로 측정되었다.
따라서, 0.01%와 같은 낮은 농도의 폴리소르베이트 80이 존재하면, 4℃에서 수주일 동안, 약 생리학적 이온 농도에서 HPV11 및 HPV16이 용기 표면에 흡착되고 입자간 응집되는 것으로 부터 보호된다. 이러한 데이타는 또한, (1) HPV의 표면에 대한 흡착과 응집이 서로 관련이 있고 (2) 세제 그 자체 또는 염 그 자체에 의해서는 흡착 또는 응집에 대해 완전한 보호를 제공할 수 없으므로, 정전기 및 소수성 기전 모두가 수반될 것이라는 것을 보여준다.
Claims (19)
- (a) 백신 성분;(b) 생리학적으로 허용되는 농도로 존재하는 염; 및(c) 생리학적으로 허용되는 농도로 존재하는 비이온성 계면활성제를 포함하는 사람 파필로마바이러스 항원 제형물.
- 제1항에 있어서, 사람 파필로마바이러스 백신 성분이 바이러스-유사 입자를 포함하는 항원 제형물.
- 제2항에 있어서, 사람 파필로마바이러스 바이러스-유사 입자가 L1 단백질 또는 L1과 L2 단백질을 포함하는 항원 제형물.
- 제3항에 있어서, 사람 파필로마바이러스 바이러스-유사 입자가 6a, 6b, 11, 16, 18 및 이의 조합으로 이루어진 사람 파필로마바이러스 유형의 그룹중에서 선택되는 항원 제형물.
- 제4항에 있어서, 염이 염화나트륨, 황산나트륨, 황산암모늄, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨 및 인산나트륨으로 이루어진 그룹중에서 선택되거나, 또는 기타 생리학적으로 허용되는 완충액 이온에 의해 충분한 이온 농도를 지닌 용액이 생성되는 항원 제형물.
- 제5항에 있어서, 염이 염화나트륨인 항원 제형물.
- 제6항에 있어서, 염화나트륨이 약 50mM 내지 약 500mM의 농도로 존재하는 항원 제형물.
- 제6항에 있어서, 염화나트륨이 약 150mM 내지 약 300mM의 농도로 존재하는 항원 제형물.
- 제8항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 트리톤 X-100R, 트리톤 114R, NP40R, Span 85 및 Pluronic 121로 이루어진 비이온성 계면활성제의 그룹중에서 선택되는 항원 제형물.
- 제9항에 있어서, 폴리소르베이트가 폴리소르베이트 80인 항원 제형물.
- 제10항에 있어서, 폴리소르베이트 80이 약 0.2%의 농도로 존재하는 항원 제형물.
- 제10항에 있어서, 폴리소르베이트 80이 약 0.01%의 농도로 존재하는 항원 제형물.
- 내용 없음
- 내용 없음
- (a) 6a, 6b, 11, 16 및 18 유형으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 사람 파필로마바이러스 L1 단백질을 포함하는 사람 파필로마바이러스 바이러스-유사 입자의 집단;(b) 약 150mM 내지 약 300mM 농도의 염화나트륨; 및(c) 약 0.1% 이하 농도의 폴리소르베이트 80을 포함하는 사람 파필로마바이러스 항원 제형물.
- 사람 파필로마바이러스의 L1 또는 L1과 L2 단백질로 부터 유래된 정제된 바이러스-유사 입자를 약 50mM 내지 약 500mM 농도의 염화나트륨 및 적어도 0.2% w/v 이하 농도의 폴리소르베이트 80을 포함하는 제형물중에 방치시킴을 특징으로 하여, 상기 정제된 바이러스-유사 입자의 집단을 약 0℃ 이상의 온도에서 1개월 이상의 기간 동안 안정화시키는 방법.
- 제16항에 있어서, 백신 제형물이 약 150mM 내지 약 300mM 농도의 염화나트륨을 포함하는 방법.
- 제17항에 있어서, 폴리소르베이트 80이 적어도 0.1%w/v 이하의 농도로 존재하는 방법.
- 제16항에 있어서, 제형물을 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 1개월 이상의 기간 동안 안정하게 유지시키는 방법.
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