SK138199A3 - Human papillomavirus antigen formulation and method for stabilizing a population of virus-like purified particles, derived from protein l1 or protein l1 and l2 of human papillomavirus - Google Patents

Description

Tento vynález sa týka formulácií antigénu ľudského papilomavírusu, ktoré majú zvýšenú stabilitu antigénu a zníženú agregáciu a precipitáciu antigénu. Súčasný vynález sa tiež. týka spôsobov prípravy adjuvantných HPV vakcín s použitím formulácií antigénu ľudského papilomavírusu opisovaných v tomto vynáleze. Súčasný vynález sa tiež týka adjuvantných vakcín z ľudských papilomavírusov, ktoré boli generované z týchto formulácií antigénu ľudského papilomavírusu.

Táto prihláška je čiastočne pokračovaním predbežnej prihlášky číslo 60/042,808 prijatej 8. apríla 1997.

Doterajší stav techniky

Infekcie papilomavírusmi (PV) sa vyskytujú u mnohých živočíchov včítane ľudí, oviec, psov, mačiek, králikov, opíc, hadov a kráv. Papilomavírusy infikujú epitelové bunky, všeobecne spôsobujúce benígne epitelové alebo fibroepitelové nádory na mieste infekcie. Papilomavírusy sú druhovo špecifické infekčné činidlá.

Papilomavírusy sa podľa hostiteľa, ktorého infikujú, rozdeľujú do niekoľkých

I . I · skupín. Ľudské papilomavírusy (HPV) sa podľa štúdií s hybridizáciou, DNÄ ďalej delia na viac ako 70 typov. Zdá sa, že typy PV sú typovo špecifickými imunogénmi, pretože neutralizujúca imunita voči infekcii jedným typom papilomavírusu nezabezpečuje imunitu voči inému typu papilomavírusu.

U ľudí rôzne typy HPV spôsobujú odlišné ochorenia. HPV typ 1, 2, 3, 4, 7, 10 a 26 až 29 spôsobuje u jedincov s normálnou aj oslabenou imunitou benígne bradavice. HPV typ 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19 až 25, 36 a 46 až 50 spôsobuje u jedincov s oslabenou imunitou ploché lézie. HPV typ 6, 11, 34, 39, 41 až 44 a 51 až

-255 spôsobuje nemalígne kondylómy sliznice pohlavných alebo dýchacích orgánov. HPV typ 16, 18, 31, 33, 35, 45 a 58 spôsobuje epitelovú dyspláziu sliznice pohlavných orgánov a tieto typy sú spojené s väčšinou in situ karcinómov a invazívnych karcinómov krčka maternice, pošvy, vonkajších ženských pohlavných orgánov a análneho kanálu.

Papilomavírusy sú malé (50 až 60 nm), neobalené DNA vírusy ikosahedrického tvaru, ktoré kódujú až osem skorých a dva neskoré gény. Otvorené čítacie rámce vírusových genómov sú označené E1 až E8 a L1 a L2, kde „E“ znamená skorý a „L“ znamená neskorý. L1 a L2 kóduje proteíny vírusového kapsidu. Skoré (E) gény sú spojené s takými funkciami ako je napríklad replikácia vírusu, kontrola transkripcie a bunková transformácia.

Proteín L1 je hlavný proteín kapsidu, ktorého molekulová hmotnosť je 55 až 60 kDa. Proteín L2 je vedľajší proteín kapsidu s predpokladanou molekulovou hmotnosťou 55 až 60 kDa a podľa určenia polyakrylamidovou gélovou elektroforézou zrejme s molekulovou hmotnosťou 75 až 100 kDa. Imunologické údaje naznačujú, že väčšina proteínu L2 je v rámci vírusového kapsoméru uložená pod proteínom Ľl. Otvorený čítací rámec proteínu L1 je u rôznych papilomavírusov veľmi konzervatívny. Proteíny L2 sú u rôznych papilomavírusov menej konzervatívne.

Zistilo sa, že gény L1 a L2 sú pre imunoprofylaxiu dobrým cieľom. Zistilo sa tiež, že niektoré gény sú potenciálnym cieľom pre vyvíjané vakcíny. V štúdiách papilomavírusu amerického králika (CRPV) a hovädzí papilomavírus (BPV) bolo zistené, že imunizovanie rekombinantným proteínom L1 a/alebo L2 (produkovaný baktériami alebo s použitím vakcínových vektorov) ochránil zvieratá pred vírusovou infekciou. Expresia papilomavírusových génov L1 v bakulovírusových expresných systémoch alebo s použitím vakcínových vektorov viedla k vzniku častíc podobných vírusom (VLP), ktoré sa použili na vyvolanie vysokých koncentrácií protilátok na neutralizáciu vírusov, ktoré boli v korelácii s ochranou proti vírusovej infekcii. Okrem toho gény Ľ1 a L2 sa použili na generovanie vakcín na prevenciu a liečbu papilomavírusových infekcií u zvierat.

-3Vírusom podobné častice obsahujúce proteín HPV11 L1 sa exprimovali v hmyzích aj cicavčích bunkových systémoch. Expresia VLP v bunkách kvasiniek ponúka efektívne a lacné podmienky, ktoré sa dajú ľahko prispôsobiť podmienkam masovej kultivácie vo fermentačných nádobách, avšak proteín HPV1.1 L1 sa v bunkách kvasiniek exprímuje len na nízkej úrovni. Zistilo sa, že je to dôsledok okyptenia HPV11 L1 mRNA. Naopak, gén HPV6 L1 sa prepisuje ako mRNA s plnou dĺžkou a exprimuje sa na vysokej úrovni. Modifikovaním HPV6 L1 DNA tak, aby kódovala proteín HPV11 L1, sa umožní transkripcia celej mRNA vedúca ku zvýšenej expresii proteínu HPV11 L1.

Gény L1 a L2 sa použili na generovanie vakcín na prevenciu a liečbu papilomavírusových infekcií u zvierat. L1 a L2 gény typu HPV16 boli klonované do vakcínového vírusového vektora a cicavčie bunky CV-1 sa infikovali rekombinantným vektorom, aby sa získali vírusom podobné častice (VLP).

Vygeneroval sa rekombinantný hovädzí papilomavírusový proteín L1 a L2 odvodený pomocou baktérií. Neutralizačné séra voči rekombinantným bakteriálnym proteínom reagovali krížovo pri nízkych hladinách s natívnym vírusom, pravdepodobne kvôli rozdielom v konformácii natívnych a bakteriálne odvodených proteínov.

Rekombinantné bakulovírusy exprimujúce otvorené čítacie rámce HPV16 L1 alebo HPV16 L2 sa použili na infikovanie hmyzích buniek SF9 a na produkciu proteínov L1 a L2. Analýzy pomocou Western blotovania ukázali, že L1 a L2 proteín odvodený od bakulovírusu reagoval s protilátkou proti HPV16. L1 odvodený od bakulovírusu tvorí VLP.

· , '

Jansen a spol. (1995, Vaccine 13(16): 1509 áž 1514) použili dynamický tlmivý roztok obsahujúci chlorid sodný a Tween 80® počas čistenia VLP L1, a L1 a L2 z papilomavírusov amerických králikov.

V súčasnosti formulácie s vyčistenými rekombinantnými HPV VLP sa musia skladovať pri vysokých koncentráciách NaCI, aby sa v roztoku predišlo agregácii. Pri nízkych iónových silách HPV VLP agregujú až do tej miery, že sa z roztoku vyzrážajú. Na základe týchto a podobných pozorovaní sa väčšie objemy roztokov HPV uskladňovali v zmrazenom stave v prítomnosti vysokých koncentrácií NaCI

-4(1,25 až 2,5 M). Vysoko agregované vzorky HPV11 VLP mali podľa testov RIA, EIA alebo BIA nízku in vitro antigenitu. Je preto potrebné pripraviť vodnú HPV VLP formuláciu, ktorá je stabilná vo fyziologických podmienkach soli a tiež počas prijateľne dlhého skladovania. Súčasný vynález týmto požiadavkám vyhovuje.

Podstata vynálezu

Súčasný vynález sa týka formulácií antigénu ľudského papilomavírusu (HPV), ktoré zabraňujú agregácii antigénu a zvyšujú stabilitu antigénu vo fýziologických koncentráciách soli v prítomnosti povrchovo aktívneho činidla.

Súčasný vynález sa tiež týka generovania pomocnej HPV vakcíny, ktorá sa vytvorí zmiešaním formulácie HPV antigénu podľa súčasného vynálezu s biologicky účinným množstvom pomocnej látky, čím vznikne pomocná HPV vakcína.

Formulácie HPV antigénu a pomocnej vakcíny podľa súčasného vynálezu zahŕňajú, avšak sa neobmedzujú, ako antigénovú zložku, na častice podobné vírusom generované ako rekombinantná vakcína s HPV podjednotkou zahŕňajúca buď L1 alebo kombináciu proteínu L1 a L2 z HPV typov 6a, 6b, 11, 16 a 18. Obsahom tohto vynálezu je stabilizovanie jednomocných foriem tejto rekombinantnej vakcíny, a tiež jej dvojmocných foriem (napríklad, avšak nie výlučne, rekombinantného HPV 11 L1, HPV 16 L1 a HPV 6a L1) a viacmocných foriem (napríklad, avšak nie výlučne, rekombinantného HPV 11 L1, HPV 6a L1, HPV 16 L1 a HPV 18 L1).

Súčasný vynález sa tiež týka formulácií HPV antigénu, ktoré zähŕňajú fyziologickú koncentráciu soli a povrchovo aktívne činidlo na poskytnutie zvýšenej stabilizácie vakcínovej zložky formulácie pri teplotách nad 0 °C. HPV formulácie podľa súčasného vynálezu by mali umožniť skladovanie po dlhšiu dobu, aspoň jeden mesiac až približne dva roky pri teplote približne 2 až 8 °C.

Uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácií HPV antigénu, kde formulácia zahŕňa fyziologicky prijateľnú soľ včítane, avšak nie výlučne, chloridu sodného, síranu sodného a síranu amónneho. Účelom zahrnutia soli do formulácie

-5je dosiahnuť požadovanú iónovú silu. K iónovej sile môžu prispievať ióny produkované tlmivou zlúčeninou, včítane, avšak nie výlučne, fosforečnanom, citronanom, octanom, jantaranom, Tris-HCI, MOPS, atď., ako aj ióny netlmivých solí.

Ďalšie uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácií HPV antigénu, kde formulácia zahŕňa neiónové povrchovo aktívne činidlo včítane, avšak nie výlučne, estery mastných kyselín polyoxyetylénsorbitanu (polysorbáty), napríklad Polysorbate 80 (napríklad Tween 80®), Polysorbate 60 (napríklad Tween 60®) a Polysorbate 20 (napríklad Tween 20®), polyoxyetylén alkylétery (napríklad Brij 58®, Brij 35®), a iné, včítane, avšak nie výlučne, Triton X-100®, Triton X-114®, NP40®, Span 85 a série Pluronic neiónových povrchovo aktívnych činidiel (napríklad Pluronic 121).

Ďalšie uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácie HPV antigénu, kde formulácia zahŕňa uvedené neiónové povrchovo aktívne činidlo a prítomné v rozpätí približne až 0,2 % hmotnosť/objem, pričom fyziologicky prijateľná soľ je chlorid sodný v koncentrácii približne medzi 10 mM až 500 mM v prítomnosti fyziologicky prijateľného tlmivého roztoku.

Ďalšie uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácie HPV antigénu, kde formulácia zahŕňa uvedené neiónové povrchovo aktívne činidlo a prítomné v rozpätí približne až 0,2 % hmotnosť/objem, pričom fýziologicky prijateľná soľ je chlorid sodný v koncentrácii približne medzi 50 mM až 400 mM v prítomnosti fyziologicky prijateľného tlmivého roztoku.

Ďalšie uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácie HPV antigénu, kde formulácia zahŕňa uvedené neiónové povrchovo aktívne činidlo a prítomné v rozpätí približne až 0,2 % hmotnosť/objem, pričom fyziologicky prijateľná soľ je chlorid sodný v koncentrácii približne medzi 150 mM až 300 mM v prítomnosti fyziologicky prijateľného tlmivého roztoku.

Ďalšie uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácie HPV antigénu, kde fýziologicky prijateľná soľ je chlorid sodný v koncentrácii približne medzi 10 mM až 500 mM a neiónové povrchovo aktívne činidlo, Polysorbate 80 (včítane, avšak

-6nie výlučne, Tween 80®), je prítomné v rozpätí približne až 0,2 % hmotnostných, v prítomnosti fyziologicky prijateľného tlmivého roztoku.

Špecifické uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácie HPV antigénu, kde fýziologicky prijateľná soľ je chlorid sodný v koncentrácii približne medzi 10 mM až 500 mM, a neiónové povrchovo aktívne činidlo, Polysorbate 80 (včítane, avšak nie výlučne, Tween 80®), je prítomné v rozpätí približne od 0,01 až približne do 0,1 % hmotnosť/objem, v prítomnosti fyziologicky prijateľného tlmivého roztoku.

Výhodné uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácie antigénu HPV, kde chlorid sodný je prítomný v koncentrácii približne medzi 50 mM až 400 mM, Polysorbate 80 (včítane, avšak nie výlučne, Tween 80®), je prítomný v množstvách približne medzi 0,01 až 0,1 % hmotnosť/objem, v prítomnosti fyziologicky prijateľného tlmivého roztoku.

Zvlášť výhodné uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácie HPV antigénu, kde chlorid sodný je prítomný v koncentrácii približne medzi 150 mM až 300 mM, Polysorbate 80 (včítane, avšak nie výlučne, Tween 80®), je prítomný v množstvách približne medzi 0,01 až 0,1 % hmotnosť/objem, v prítomnosti fýziologic-ky prijateľného tlmivého roztoku.

Osoby oboznámené s problematikou budú vedieť poskytnúť formulácie HPV antigénu podľa súčasného vynálezu vo fyziologicky prijateľnom tlmivom roztoku, výhodne, avšak nie nevyhnutne výlučne formulácie tlmené fosforečnanom, citronanom, octanom, jantaranom, Tris-HCI alebo MOPS, výhodne, avšak nie výlučne v rozpätí pH približne medzi pH 5,0 až 9,0, a najmä v rozpätí medzi pH 6,0 až8,0. ' ’

Súčasný vynález sa tiež týka spôsobov generovania formulácií HPV vakcín, ktoré zahŕňajú použitie formulácie HPV antigénu podľa súčasného vynálezu. Opisujú sa tu tieto upravené spôsoby generovania HPV vakcíny buď s kamencom alebo bez neho.

Súčasný vynález sa tiež týka pomocných HPV vakcín, kde biologicky účinné množstvo pomocnej látky sa skombinuje s biologicky účinným množstvom formulácie obsahujúcej antigén podľa uvedeného opisu.

-7Použitý výraz „PV je skratka pre „papilomavírus“.

Použitý výraz „HPV“ je skratka pre „ľudský papilomavírus“.

Použitý výraz „VLP“ je skratka pre „vírusom podobné častice“.

Použitý výraz „fýziologicky prijateľný“ znamená tlmivý roztok, excipient alebo soľ, kde buď koncentrácia alebo iónová sila je taká, že formulácia je biologicky kompatibilná s imunizovaným cieľovým hostiteľom, napríklad človekom.

Súčasný vynález sa týka formulácií antigénu ľudského papilomavírusu (HPV), ktoré zabraňujú agregácii antigénu a zvyšujú stabilitu antigénu pri fyziologických koncentráciách soli v prítomnosti povrchovo aktívneho činidla.

Súčasný vynález sa tiež týka generovania pomocnej HPV vakcíny, ktorá vzniká zmiešaním formulácie HPV antigénu podľa súčasného vynálezu s biologicky účinným množstvom pomocnej látky, čím vznikne pomocná HPV vakcína.

Formulácie HPV antigénu a pomocnej vakcíny podľa súčasného vynálezu zahŕňajú, avšak nie sú obmedzené, ako antigénovú zložku, na častice podobné vírusom generované ako rekombinantná vakcína s HPV podjednotkou zahŕňajúca buď L1 alebo kombináciu proteínu Ľ1 a L2, z HPV typu 6a, 6b, 11, -16 a 18. Obsahom tohto vynálezu je stabilizovanie jednomocných foriem tejto rekombinantnej vakcíny, a tiež jej dvojmocných foriem (napríklad, avšak nie výlučne, rekombinantného HPV 11 L1, HPV 16 L1 a HPV 6a L1) a viacmocných foriem (napríklad, avšak nie výlučne, rekombinantného HPV 11 L1, HPV 6a L1, HPV 16 L1 a HPV 18 L1). Kým rekombinantný HPV 11 L1 VLP sa používa pri objasňovaní vynálezu, toto nijako neobmedzuje HPV typy, ktoré možno generovať na stabilizovanie v antigénových formuláciách podľa tohto vynálezu. V skutočnosti, po prezretí tohto opisu je zrejmé, že vakcínové formulácie opisované v tomto vynáleze možno použiť na stabilizovanie iných vakcínových formulácií včítane, avšak nie výlučne, iných VLP založených na HPV. Napríklad formulácie HPV vakcíny podľa súčasného vynálezu zahŕňajú, avšak nie sú výlučne obmedzené na častice podobné vírusom generované ako vakcína rekombinantnej HPV podjednotky zahŕňajúca buď L1 alebo kombináciu proteínov L1 a L2, z HPV typov 6a, 6b, 11,16 a 18. Je preto zrejmé, že formulácie podľa súčasného vynálezu budú užitočné na stabilizovanie rôznych dvojmocných a viacmocných formulácií včítane, avšak nie

-8výlučne dvojmocných (napríklad rekombinantného HPV 11 L1 a HPV 6a L1) a viacmocných (napríklad rekombinantného HPV 11 L1, HPV 6a L1, HPV 16 L1 a HPV 18 L1) formulácií HPV.

Preto súčasný vynález sa týka antigénových formulácií zahŕňajúcich neiónové povrchovo aktívne činidlo, ktoré stabilizujú HPV VLP vo fyziologicky aktívnych podmienkach soli a tlmivého roztoku v celom rozsahu užitočných koncentrácií proteínov a výhodných skladovacích teplôt. Formulácie HPV podľa súčasného vynálezu by sa mali dať skladovať aspoň jeden mesiac až približne dva roky pri teplotách 2 až 8 °C. Tieto formulácie možno zmiešať s pomocnou látkou včítane známych pomocných látok s obsahom kamenca ako je napríklad fosforečnan hlinitý, hydroxyfosforečnan hlinitý a oxyhydroxid hlinitý. Je tiež užitočné použiť antigénové formulácie podľa súčasného vynálezu s pomocnými látkami bez obsahu kamenca, najmä s takými, ktoré sú negatívne ovplyvnené formuláciami s vysokou iónovou silou, o ktorých je známe, že sa používajú na HPV VLP.

Je známe, že pri nízkej iónovej sile HPV 11 L1 VLP agreguje až do takej miery, že sa z roztoku vyzráža. Je známe, že vysoko agregované vzorky HPV 11 L1 VLP vykazujú nízku in vitm antigenitu (napríklad testy RIA, EIA alebo BIA). Údaje v príklade 3 ukazujú, že HPV 11 VLP L1 (470 pg/ml v 50mM MOPS/1.25M NaCI) sa rozmrazil a časť roztoku sa zriedil na 18 pg/ml v tom istom tlmivom roztoku. Roztok s nižšou koncentráciou proteínov v priebehu času agregoval, hoci koncentrácia NaCi sa udržiavala na 1,25 M NaCI. Preto vysoké koncentrácie soli samy o sebe nezabránia agregácii HPV VLP. V príklade 4 sa uvádzajú údaje o testovaní rôznych NaCi koncentrácií (buď skladovaním alebo dialýzou väčšieho objemu roztoku počas > I krátkej doby), ktoré ukazujú, že pokles koncentrácie NaCi na nízku úroveň (približne ’ 150 mM NaCi a nižšie) vedie k agregácii proteínov (po ktorej nasleduje vyzrážanie). Aby sa tento problém obišiel, roztoky obsahujúce HPV 11 L1 VLP možno skladovať v zmrazenom stave v prítomnosti vysokých koncentrácií NaCi (približne 1,25 M až

2,5 M). Časť uvádzaného vynálezu sa týka rôznych formulácií zahŕňajúcich HPV VLP, ktoré odolávajú agregácii pri fyziologických koncentráciách soli v rámci užitočného rozpätia teploty. Formulácie podľa súčasného vynálezu uľahčujú

-9dlhodobé skladovanie stabilných HPV VLP roztokov pri 4 °C a umožňujú užitočné štúdie imunogenity samotného HPV alebo HPV v prítomnosti buď pomocných látok s obsahom hliníka alebo bez neho.

Navyše, v príklade 5 sa opisuje, že kontakt HPV VLP s rôznymi povrchmi tiež ovplyvňuje agregáciu. V tomto vynáleze sa ukazuje, že zväčšenie povrchu kontaktnej oblasti pomocou HPV VLP (napríklad dialyzačná membrána alebo skladovacia skúmavka) zvyšuje hydrodynamický priemer VLP. Tento vzostup agregácie vedie k súčasnému zníženiu koncentrácie proteínov roztoku HPV VLP, čo svedčí o adsorpcii HPV VLP na povrchu membrány a naznačuje koreláciu medzi povrchovou adsorpciou a agregáciou. Preto obsahom vynálezu je aj kontaktovanie vakcíny s povrchom výhodnej nádoby. Údaje ukazujú, že HPV 11 L1 VLP (50mM MOPS/1.25M NaCI, pH 7,0) inkubované 24 hodín pri izbovej teplote vykazuje výraznú adsorpciu k borokremičitému sklu, kým v prípade polystyrénu sa nezistila žiadna výraznejšia adsorpcia.

V príklade 6 sa uvádzajú údaje o výhodných excipientoch a soliach, ktoré môžu byť zahrnuté do formulácií podľa súčasného vynálezu.

Preto sa podstata súčasného vynálezu týka formulácií HPV antigénu, ktoré obsahujú fyziologické koncentrácie soli, kde sa pridalo neiónové povrchovo aktívne činidlo tak, aby antigénová zložka formulácie mala predĺženú stabilitu pri teplotách v rozpätí približne medzi 0 °C až 40 °C a tiež aby odolávala agregácii, ktorá sa u známych HPV formulácií často vyskytuje. Súčasný vynález sa týka formulácií HPV vakcíny, ktoré zahŕňajú soľ, včítane, avšak nie výlučne, chloridu sodného, síranu sodného a síranu amónneho prítomného pri iónovej sile, ktorá je pre hostiteľa fyziologičky prijateľná. Účelom zahrnutia sóli do formulácie je dosiahnuť požädo- , vanú iónovú silu. K iónovej sile môžu prispievať ióny produkovaných tlmivou zlúčeninou a tiež ióny netlmivých solí.

Zvlášť výhodný aspekt súčasného vynálezu sa týka formulácií HPV antigénu, ktoré zahŕňajú soľ na fyziologicky prijateľnej úrovni, kde sa pridáva minimálne množstvo neiónového povrchovo aktívneho činidla, ktoré poskytuje zvýšenú stabilizáciu vakcínovej zložky formulácie. Neiónové povrchovo aktívne činidlá, ktoré na použitie v antigénových formuláciách podľa súčasného vynálezu zahŕňajú, avšak

-10sa neobmedzujú na estery mastných kyselín polyoxyetylén sorbitanu, včítane, avšak nie výlučne Polysorbate 80 (Tweenu 80®), Polysorbate 60 (Tweenu 60®) a

Polysorbate 20 (Tweenu 20®), polyoxyetylén alkyléterov, včítane, avšak nie výlučne

Brij 58®, Brij 35®, a iných, napríklad Tritonu X-100®, Tritonu X-114®, NP40®, Span 85 a série Pluronic neiónových povrchovo aktívnych činidiel (napríklad Pluronic 121).

Ďalšie uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácie HPV antigénu, kde formulácia zahŕňa uvedené neiónové povrchovo aktívne činidlo a prítomné v rozpätí približne až 0,2 % hmotnosť/objem, pričom fyziologicky prijateľná soľ je chlorid sodný v koncentrácii približne medzi 10 mM až 500 mM v prítomnosti fyziologicky prijateľného tlmivého roztoku.

Ďalšie uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácie HPV antigénu, kde formulácia zahŕňa uvedené neiónové povrchovo aktívne činidlo a prítomné v rozpätí približne až 0,2 % hmotnosť/obejm, pričom fyziologicky prijateľná soľ je chlorid sodný v koncentrácii približne medzi 50 mM až 400 mM v prítomnosti fyziologicky prijateľného tlmivého roztoku.

Ďalšie uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácie HPV antigénu, kde formulácia zahŕňa uvedené neiónové povrchovo aktívne činidlo a prítomné v rozpätí až približne 0,2 % hmotnosť/objem, pričom fýziologicky prijateľná soľ je chlorid sodný v koncentrácii približne medzi 150 mM až 300 mM v prítomnosti fyziologicky prijateľného tlmivého roztoku.

Ďalšie uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácie HPV antigénu, kde fýziologicky prijateľná soľ je chlorid sodný v koncentrácii približne medzi 10 mM až 500 mM a neiónové povrchovo aktívne činidlo, Polysorbate 80 (včítane, avšak nie výlučne Tweenu 80®), je prítomné v rozpätí približne až 0,2 % hmotnosť/objem, v prítomnosti fyziologicky prijateľného tlmivého roztoku.

Špecifické uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácie HPV antigénu, kde fyziologicky prijateľná soľ je chlorid sodný v koncentrácii približne medzi 10 mM až 500 mM, a neiónové povrchovo aktívne činidlo, Polysorbate 80 (včítane, avšak nie výlučne Tweenu 80®), je prítomné v rozpätí približne medzi 0,01 až 0,1 % hmotnosť/objem, v prítomnosti fyziologicky prijateľného tlmivého roztoku.

-11 Výhodné uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácie antigénu HPV, kde chlorid sodný je prítomný v koncentrácii približne medzi 50 mM až 400 mM, Polysorbate 80 (včítane, avšak nie výlučne Tweenu 80®), je prítomný v množstvách približne medzi 0,01 až 0,1 % hmotnosť/objem, v prítomnosti fyzioloI gicky prijateľného tlmivého roztoku.

Zvlášť výhodné uskutočnenie súčasného vynálezu sa týka formulácie HPV antigénu, kde chlorid sodný je prítomný v koncentrácii približne medzi 150 mM až 300 mM, Polysorbate 80 (včítane, avšak nie výlučne Tweenu 80®), je prítomný v množstvách približne medzi 0,01 až 0,1 % hmotnosť/objem, v prítomnosti fyziologicky prijateľného tlmivého roztoku.

Osoby oboznámené s problematikou budú vedieť poskytnúť formulácie HPV antigénu podľa súčasného vynálezu vo fyziologicky prijateľnom tlmivom roztoku, výhodne, avšak nie nevyhnutne výlučne formulácie tlmené fosforečnanom, citronanom, octanom, jantaranom, Tris-HCI alebo MOPS, výhodne, avšak nie výlučne v rozpätí približne medzi pH 5,0 až 9,0, a najmä v rozpätí medzi pH 6,0 až 8,0.

Formulácia opísaná v súčasnom vynáleze umožňuje skladovanie nezmrazených HPV roztokov s koncentráciami soli, ktoré sú blízko fyziologickým podmienkam. Výsledkom je preto vylúčenie zmrazovania a rozmrazovania a umožní priame formulovanie HPV VLP roztokov s pomocnými látkami, a to buď adsorpciou HPV k pomocnej látke obsahujúcej hliník alebo prípravou s použitím pomocných látok bez obsahu hliníka vo fyziologických podmienkach s vhodnou iónovou silou.

i ·

Preto súčasný vynález opisuje upravené spôsoby prípravy adjuvantných HPV vakcín, ktoré pred zmiešaním s pomocnou látkou obsahujúcou kamenec nevyžadujú také prudké gradienty v teplote a koncentrácii soli. Napríklad antigénovú formuláciu podľa súčasného vynálezu možno pripraviť a skladovať pri 4 °C skôr než sa zmieša s pomocnou látkou obsahujúcou hliník. Táto predbežná antigénová formulácia sa zmieša s pomocnou látkou obsahujúcou hliník, napríklad s fosforečnanom hlinitým, hydroxyfosforečnanom hlinitým a oxyhydroxidom hlinitým. V prípade potreby možno pridať aj ochrannú látky, napríklad thimersol. Spôsob

-12podľa súčasného vynálezu by mal umožniť predĺžené skladovanie pôvodnej antigénovej formulácie pri teplotách približne medzi 2 až 8 ’C aspoň po dobu dvoch rokov.

Po prezretí tohto opisu je zrejmé, že jednou z výhod formulácií HPV antigénu podľa súčasného vynálezu je ich schopnosť, že sa vo fyziologicky prijateľných koncentráciách môžu priamo skombinovať s pomocnou látkou buď obsahujúcou alebo neobsahujúcou kamenec. Po prezretí opisu je tiež zrejmé, že ďalšou výhodou je stabilita pri teplotách vyšších ako je bod mrazu, približne medzi 0 až 40 °C, a najmä medzi 2 až 8 °C, takže tieto formulácie možno pridať priamo do pomocnej látky buď s obsahom kamenca alebo bez neho. Inými slovami, formulácie opisované v tomto vynáleze sú tiež vhodné na priame formulovanie HPV roztokov s pomocnými látkami neobsahujúcimi kamenec pri fyziologických koncentráciách soli.

Hoci uvedené príklady formulácií sú výhodné, zo záverov tejto špecifikácie je zrejmé, že sa uvažuje aj o rôznych ďalších formuláciách. Uvádza sa tu, že opisované a tiež aj ďalšie formulácie antigénu podľa súčasného vynálezu zahŕňajú soľ s fyziologicky prijateľnou iónovou silou, fyziologicky prijateľný tlmivý roztok a povrchovo aktívne činidlo v biologicky prijateľných koncentráciách tak, aby vakcínová zložka vykazovala zvýšenú stabilitu, zníženú tendenciu agregovať alebo vyzrážať sa z roztoku, a tiež schopnosť vydržať skladovanie počas dlhších období pri výhodnejších teplotách.

Režim dávkovania s použitím formulácií HPV vakcíny podľa súčasného vynálezu sa môže voliť podľa mnohých faktorov včítane typu, druhu, veku, hmotnosti, pohlavia a zdravotného stavu pacienta'; závažnosti stavu, ktorý sa má liečiť; spôsobu podávania; obličkových a pečeňových funkcií pacienta; a použitej zlúčeniny. Riadne zaškolený lekár vie bez problémov určiť a predpísať účinné množstvo HPV vakcíny potrebnej na prevenciu, zvrátenie alebo zastavenie postupu ochorenia.

Nasledujúce príklady sa poskytujú na ilustrovanie súčasného vynálezu, avšak bez jeho obmedzovania.

-13Prehfad obrázkov na výkresoch

Na obrázku 1 je účinok riedenia proteínov na hydrodynamický priemer v priebehu času u HPV 11 L1 VLP (50 mM MOPS, pH 7,0, 1,25 M NaCI) počas 2 mesiacov pri 4 °C. (□) 470 μ/ml; () 18 pg/ml.

Na obrázku 2 je účinok koncentrácie soli na hydrodynamický priemer HPV 11 a HPV 16 Ľ1 VLP počas skladovania pri izbovej teplote. Vzorky sa zriedili do tlmivého roztoku, skladovali sa jednu hodinu a potom boli analyzované. V prípade HPV 11 boli potom vzorky tiež dialyzované cez noc proti rovnakému tlmivému roztoku. HPV 11 L1 VLP bol formulovaný v 50mM tlmivom roztoku MOPS (pH 7,0) obsahujúcom rôzne koncentrácie NaCI, (o) bez dialýzy; (□) dialýza. HPV 16 L1 VLP bol formulovaný v 50mM tlmivom roztoku MOPS (pH 7,0) obsahujúcom rôzne koncentrácie NaCI, (·) bez dialýzy.

Na obrázku 3 je účinok adsorpcie proteínov k dialyzačnej membráne na hydrodynamický priemer (·) a koncentráciu proteínov () [ako percento zostávajúceho HPV 11 L1] v 50 pg/ml HPV 11 L1 VLP v 50mM MOPS, pH 7,0 pri 180 mM NaCI v polypropylénovej skúmavke 96 hodín pri izbovej teplote.

Na obrázku 4 je účinok polystyrénu (o), polypropylénu (·) a skla (0) na adsorpciu HPV 11 L1 VLP v 50mM MOPS, pH 7,0 pri 1,25 M NaCI 24 hodín pri izbovej teplote.

Na obrázku 5 je účinok stúpajúceho pomeru medzi povrchom a objemom na adsorpciu HPV L1 VLP (18 pg/ml) k polypropylénu v 50mM MOPS, pH 7,0, 0,25 M NaCI. (□) pomer povrchu k objemu je 4 cm^_1;(·) pomer povrchu k objemu je 6 cm¹.

' I l

Na obrázku 6A a 6B je účinok rôznych povrchovo aktívnych činidiel (pri 0,01%) na stabilitu HPV 11 L1 VLP (18 pg/ml) v 50mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCI 20 hodín pri izbovej teplote (panel A) a v 50mM MOPS, pH 7,0, 40 mM NaCI 30 minút pri 50 °C a potom 48 hodín pri izbovej teplote (panel B) pred stanovením dynamického rozptylu svetla (DLS).

Na obrázku 7A a 7B je účinok Polysorbate 80 (napríklad Tweenu 80®) na povrchovú adsorpciu (panel A) a agregáciu (panel B) HPV 11 L1 VLP (16 pg/ml)

-14proti polypropylénovému povrchu pri izbovej teplote v 50mM MOPS, pH 7,0, pri rôznych iónových silách: (·) 0,4M (NH₄)₂SO₄ + 0,01% Tween 80®; (o) 0,1 M (NH₄)₂SO₄; (0) 0,5M (NH₄)₂SO₄; (x) 0,1M Na₂SO₄; (|) 0,5M Na₂SO₄; (Δ) 0,1M NaCI; a () 0,5M NaCI.

Na obrázku 8 je znázornený účinok Polysorbate 80 (napríklad Tweenu 80®) na hydrodynamický priemer a koncentráciu HPV 11 L1 VLP (18 pg/ml) voči polypropylénovému povrchu v 50mM MOPS, pH 7,0, 250mM NaCI v priebehu času pri izbovej teplote. Koncentrácia proteínov sa meria ako percento počiatočnej koncentrácie proteínov. Pokles v koncentrácii proteínov je nepriamo úmerný povrchovej adsorpcii. (x) 0,01% Tween 80®, koncentrácia proteínov; (Δ) bez Tweenu 80®, koncentrácia proteínov; () 0,01% Tween 80®, hydrodynamický priemer; a (♦) bez Tweenu 80®, hydrodynamický priemer.

Na obrázku 9 je kombinovaný účinok koncentrácie NaCI a Polysorbate 80 (napríklad Tweenu 80®) na hydrodynamický priemer u HPV 11 L1 VLP (18 pg/ml) v 50mM MOPS, pH 7,0, so (·) 40mM NaCI a 0,01% Tween 80®; (0) 100mM NaCI a 0,01% Tween 80®; a (o) 40mM NaCI, bez Tweenu 80®.

Na obrázku 10A a 10B je účinok koncentrácie Polysorbate 80 (napríklad Tweenu 80®) [(·) 0,000% hmotnosť/objem; (o) 0,001% hmotnosť/objem; () 0,005% hmotnosť/objem; (□) 0,010% hmotnosť/objem] na hydrodynamický priemer (Dh (nm)) pre HPV 11 L1 VLP (18 pg/ml) v 50mM MOPS, pH 7,0, 150mM NaCI pri 4 °C (panel A) a izbovej teplote (panel B) v priebehu času.

Na obrázku 11 je účinok rôznych povrchovo aktívnych činidiel (pri 0,01%) na stabilitu HPV 16 L1 VLP (20 pg/ml) skladovanom v 50mM MOPS, pH 7,0, .150mM NaCI 50 dní pri izbovej teplote pred stanovením dynamického rozptylu svetla (DLS).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Nadmerná expresia rekombinantných HPV 11 L1 VLP

-15Konštrukcia syntetického L1 génu

Nadmerná expresia a čistenie HPV11 L1 VLP je opísané v US prihláškach so sériovým číslom 08/413,571 a 08/413,572, ktoré bol prijaté 30. marca 1995, a uvádza sa aj v tomto príklade výlučne ako príklad, a v žiadnom prípade nie na obmedzovanie spôsobov, ktoré možno použiť na generovanie rekombinantných HPV VLP. Táto špecifikácia opisuje použitie rekombinantného HPV11 L1 a HPV16 L1 na osvetlenie formulácií podľa súčasného vynálezu. Osobám oboznámeným s problematikou bude známe, že na generovanie rekombinantných HPV VLP uvedených v tejto špecifikácii možno použiť známe spôsoby používané v problematike rekombinantnej DNA. Je tiež známe, že na nadmerné exprimovanie HPV VLS možno použiť hostiteľov aj iných než sú kvasinky, čo sa využíva v antigénových formuláciách podľa súčasného vynálezu.

Skonštruoval sa otvorený čítací rámec HPV11 L1 dlhý 1,5 kbp s použitím syntetických DNA oligomérov objednaných od firmy Midland Reagent Company. Tieto oligoméry boli dodané s 5’ terminálnymi fosfátmi. Celkom bolo potrebných 24 oligomérov a uvádzajú sa nižšie:

Číslo 241-1

5-AAGATCTCACAAAACAAAATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTG CCTCCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGGATGCTTATGTTAAACGC ACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCT TATT-3’ (SEQ ID NO:1)

Číslo 241-2

5’-TTCCATAAAAAAGGTTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGTCAGGATATCAA

TACAGAGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCCTAACAAATTTGCATTGCCTGAC

TCGTCTCTTTTTGATCCCACAACACAACGTTTGGTATGGGCATGCATGT-3’ (SEQ ID NO:2)

-16Číslo 241-3

5‘-CATGCATGCACAGGCCTAGAGGTGGGCCGGGGACAGCCATTAGGTGTGGG TGTAAGTGGACATCCTTTACTAAATAAATATGATGATGTTGAAAATTCAGGGGG TTACGGTGGTAACCCTGGACAGGATAACAGG-3’ (SEQ ID NO:3)

Číslo 241-4

5’-GTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATGGTTGGATGTGC CCCCCCTTTGGGCGAGCATTGGGGTAAAGGTACACAGTGTAGTAATACATCTG TACAGAATGGTGACTGCCCGC-3’ (SEQ ID NO:4)

Číslo 241-5

5’-CTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGGTTGACACAGGC TTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACCAATAAATCAGATGTTCCTCTTG ACATATGTGGCACTGTA-3’ (SED ID NO:5)

Číslo 241-6

5’-GTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCATATGGTGATAGATTA TTTTTTTATCTACGGAAGGAACAAATGTTTGCCAGACATTTľTTTAACAGGGCTG GTACCCC-3’ (SEQ ID NO:6)

Číslo 241-7

5’-GGGTACCGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGATCTTTTAGTTAAGGGTGGTAA

CAATCGCTCGTCTGTAGCGAGTAGTATATATGTTCACACCCCAAGCGGCTCTTT ' I

GGTGTCCTCTGAGGCACA-3’(SEQ ID NO:7)

Číslo 241-8

5’-TTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACATAACAATGGTA TTTGTTGGGGTAATCATCTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCA ACATGA-3’ (SEQ ID NO:8)

-17Číslo 241-9

5'-ATTATGTGCATCCGTATCTAAATCTGCCACATACACCAATTCTGATTATAAAG AGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTTTGATTTACAATTTATTTTTCAATTATGTAG CATT-3’ (SEQ ID NO:9)

Číslo 241-10

5'-ACATTGTCTGCTGAAGTAATGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTCT CGAGGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACACTCGAGCGG3’ (SEQ IDNO:10)

Číslo 241-11

5’-CCGCTCGAGGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATTACCTGTCAAA

AGCCCACTCCTGAAAAGGAAAAGCAAGATCCCTATAAGGACATGAGTTTTTGG

GAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTAGTGAATTGGATCAGTTTCCTTT-3’ (SEQ ID NO:11)

Číslo 241-12

5’-GGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGACCTCTGCTCGT ACCGGTATTAAGCGCCCTGCTGTTTCCAAACCCTCTACTGCCCCTAAACGTAA GCGCACCAAAACTAAAAAGTAAGATCTTC-3’ (SEQ ID ΝΟ.Ί2)

Číslo 241-13

5’-AAGATCTTACTTTTTAGTTTTGGTGCGCTTACGTTTAGGGGCAGTAGAGGGT TTGGAAACAGCAGGGCGCTTAATAÓCGGTACGAGCAGAGGTČCGTCCCCTATA TCCACTTTGTAACAAAAACTTGCGTCCCAAAGGAAACTGATCCAATTC-3’ (SEQ ID NO:13)

Číslo 241-14

5’-CTAGAAAACTTTTCTTTTAAATTAACCTCCCAAAAACTCATGTCCTTATAGGG ATCTTGCTTTTCCTTTTCAGGAGTGGGCTTTTGACAGGTAATGGCCTGTGACTG CACATACCTATAGGTATCCTCGAGCGG-3’ (SEQ ID NO: 14)

-18Číslo 241-15

5’-CGCTCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAGTCCTCG

AGAACAGAGGGATTCATTGTGTGAATATAGGCCATTACTTCAGCAGACAATGTA

ATGCTACATAATTGAAAAA-3’ (SEQ ID ΝΟ.Ί5)

Číslo 241-16

5’-TAAATTGTAAATCAAACTCTTCCACATGACGCATGTACTCTTTATAATCAGAAT TGGTGTATGTGGCAGATTTAGATACGGATGCACATAATGTCATGTTGGTACTGC GTGTG-3* (SEQ ID NO:16)

Číslo 241-17

5’-GTATCTACCACAGTAACAAACAGATGATTACCCCAACAAATACCATTGTTATG TCCCTGGGCTTTTTGTAGCCAATATGGCTTATTAAACAATTGTGCCTCAGAGGA CACCAA-3’ (SEQ ID NO: 17)

Číslo 241-18

5-GAGCCGCTTGGGGTGTGAACATATATACTACTCGCTACAGACGAGCGATTG TTACCACCCTTAACTAAAAGATCATCAGGCACAGGTTCCCCCACGGTACCCC-3’ (SEQ ID NO:18)

Číslo 241-19

5’-GGGTACCAGCCCTGTTAAAAAAATGTCTGGCAAACATTTGTTCCTTCCGTAG

ATAAAAAAATAATCTATCACCATATGGGTCTGCAGCCATTTGTAAATAATCTGGA

I ,

TATTTACATACAGTGCCACATATGTCAA-3’ (SEQ ID NO: 19)

Číslo 241-20

5’-AGGAACATCTGATTTATTGGTCTGCAAATCAGCAAAATTCATAGCACCAAAG CCTGTGTCAACCATATCGCCATCCTGTATAACACTGGTAATAAGTTCTAAGGGC GGGCAGTCACCATTCTGT-3’ (SEQ ID NO:21)

-19Číslo 241-21

5’-ACAGATGTATTACTACACTGTGTACCTTTACCCCAATGCTCGCCCAAAGGGG GGGCACATCCAACCATGCATAATTGTGTTTGTTTATAATCCATACCTACATTAAC CCTGTTATCCTGTCCAGGGT-3’ (SEQ ID NO:21)

Číslo 241-22

5’-ACCACCGTAACCCCCTGAATTTTCAACATCATCATATTTATTTAGTAAAGGAT GTCCACTTACACCCACACCTAATGGCTGTCCCCGGCCCACCTCTAGGCCTGTG CATGCATGT-3’ (SEQ ID NO:22)

Číslo 241-23

5’-ACATGCATGCCCATACCAAACGTTGTGTTGTGGGATCAAAAAGAGACGAGTC AGGCAATGCAAATTTGTTAGGATCTGGTAACACCACCTTAAATACTCTGTATTG ATATCCTGACACCTTTGGCACAACAGTTTTGTTAACCTTTTTTATGGAATAATAA GGATGACCC-3’ (SEQ ID NO:23)

Číslo 241-24

5’-CTGCAAGAAGTCTAGAACTGCTGGCATGATAAAATATGTTGGTGCGTTTAAC ATAAGCATCCGTGGCAACAACTTTGGATACAGGGTTAGGAGGAGGCACATATA CTGTGCTGTCGCTAGGCCGCCACATTTTGTTTTGTGAGATCTTC-3’ (SEQ ID NO:24)

Oligoméry tvoriace komplementárne páry (čísla 241-1 a 241 ;24, 241-2 a 24123, 241-3 241-22, 241-4 a 241-21, 241-5 a 241-20, ,241-6 a 241-19, 241,-7 a 24118, 241-8 a 241-17, 241-9 a 241-16, 241-10 a 241-15, 241-11 a 241-14, 241-12 a 241-13) sa žíhali v oddelených skúmavkách obsahujúcich 2,5 mM Tris, pH 7,5, a 0,25 mM EDTA. Skúmavky sa ohrievali 4 minúty na 98 °C a potom sa umiestnili do 200 ml 98 °C vody v 250ml kadičke a pomaly sa ochladili. Keď sa voda ochladila na izbovú teplotu, do skúmaviek sa pridali žíhané páry podľa označenia: fragment A (oligomérové páry 241-1 a 24 a 241-2 a 23); fragment B (241-3 a 22, 241-4 a 21, 241-5 a 20 a 241-6 a 19); fragment C (241-7 a 18, 241-8 a 17, 241-9 a 16 a 241-10

-20a 15) a fragment D (241-11 a 14 a 241-12 a 13). Tieto zmesi oligomérových párov sa ohrievali 2 minúty na 62 °C a potom sa opäť pomaly ochladili. Obsah každej skúmavky bol spojený pri 23 °C cez noc T4 DNA ligázou (Boehringer Mannheim,

Inc.) a reagenciami dodanými uvedeným výrobcom.

Po ukončení ligácie fragment B vyžadoval PCR amplifikáciu, aby sa zvýšilo množstvo produktu s plnou dĺžkou. K tomu bolo potrebných 10 cyklov pri 94 °C, 1 min; 48 °C, 1 min; 72 °C, 1 min, a potom 10 min pri 72 °C v termocyklovači firmy Applied Biosystems s použitím Taq polymerázy firmy Boehringer Mannheim a nasledovných oligomérových primerov:

5’-GGAATTCACATGCATGCACAGGCCTAG-3’ (SEQ ID NO:25) a

5’-GGAATTCGGGGTACCAGCCCTGTTAA-3’ (SED ID NO:26).

Pospájané produkty a fragment B PCR boli štiepené reštrikčnými enzýmami (Boehringer Mannheim, Inc.) nasledovným spôsobom: fragment A sa štiepil enzýmom Bgl II a Sph I; fragment B enzýmom Sph I a Κρη I; fragment C enzýmom Κρη I a Xho I; a fragment D enzýmom Xho I a Bgl II. Naštiepené fragmenty sa oddelili na agarózových géloch s nízkou teplotou topenia (FMC BioProducts) a fragmenty so správnou veľkosťou boli vyizolované vykrojením prúžku a naštiepením agarózy s použitím agarázy (Agarase™, Boehringer Mannheim, Inc.) podľa odporúčania dodávateľa. Fragmenty A, B a D sa získali vyzrážaním etanolom a potom boli oddelene včlenené do vektora pSP72 (Promega, Inc.), ktorý sa podobným spôsobom naštiepil reštrikčnými enzýmami, aby zodpovedali jednotlivým t . · ¹ pospájaným fragmentom.

Fragment C naštiepený enzýmami Κρη I a Xho I sa najprv začlenil do vyžíhaných oligomérov

5’-TCGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACAC-3’ (SEQ ID NO:27) a

5’-TCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAGTCR-3’ (SEQ ID NO:28).

-21 Fragment C sa potom opäť naštiepil enzýmom Xho I a fragment Kpnl Xhol, 450 bp dlhý, sa spojil s vektorom pSP72, naštiepeným enzýmom Κρη I a Xho I. Ligačné zmesi sa použili na transformovanie kompetentných buniek kmeňa DH5 Escherichia coli (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Transformanty sa testovali hybridizáciou kolónií na klony obsahujúce inzerty (J. Sambrook a s pol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Z pozitívnych klonov sa vyizolovala plazmidová DNA s použitím súpravy Wizard miniprep (Promega Corp.), a potom sa sekvenovala v sekvenátore 373A DNA Sequencer firmy Applied Biosystems. Klony obsahujúce správnu sekvenciu DNA pre každý zo štyroch uvedených fragmentov sa naštiepili uvedeným spôsobom, aby sa z vektoru pSP72 uvoľnili fragmenty. Fragment C naštiepený enzýmom Κρη I a Xho I sa spojil s fragmentom D, naštiepeným enzýmom Xho I a Bgl II, a s vektorom pSP72 naštiepeným enzýmom Κρη I a Bg II, do trojitého spojenia. Produkty ligácie sa potom použili na transformáciu E. coli. Výsledné transformanty boli sekvenované a získal sa kloň so správnou sekvenciou (označené CD). Inzert Bgl II Κρη I z CD, 750 bp dlhý, sa opäť naštiepil z vektora pSP72 a spojil sa s fragmentom A, naštiepeným enzýmom Bgl II, Sph I, a s fragmentom B, naštiepeným enzýmom Sph I, Κρη I, do uvedenej trojnásobnej ligácie stým rozdielom, že Bgl II sa pridal preto, aby sa znížilo množstvo nežiadúcich produktov ligácie. Produkty ligácie sa oddelili na agarózových géloch, vyizoloval sa 1,5 kbp dlhý fragment a označil sa D361-1.

Skonštruovanie kvasinkových expresných vektorov HPV6/11 L1, HPV11 L1 a HPV6 L1 .

Kvasinkový expresný vektor pGAL1-10 sa skonštruoval vyizolovaním 1,4 kbp dlhého fragmentu Sphl z GAL promótorového plazmidu pUC18/obojsmerne, ktorý obsahuje divergentné promótory GAL1 až GAL10 kvasinky Saccharomyces cerevisiae z plazmidu pBM272 (poskytol ho Mark Johnston, Washington University, St. Louis, MO). Divergentné promótory sú na oboch stranách ohraničené jednou kópiou kvasinkového transkripčného terminátora ADH1 (Bennetzen a Halí, 1982, J. Biol. Chem. 257: 3018 až 3025). Klonovacie miesto BamHI umiestnené medzi

-22promótorom GAL1 a prvou kópiou transkripčného terminátora ADH1 a klonovacie miesto Smal umiestnené medzi promótorom GAL10 a druhou kópiou transkripčného terminátora ADH1. Kvasinkový vektor pozostávajúci zpBR322, kvasinkový gén LEU2d (Erhart a Hollenberg, 1983, J. Bacteriol. 156: 625 až 635) a kvasinkový plazmid 2u (dar od Benjamína Halia, University of Washington, Seattle, WA) (Broach a Volkert, 1991, Circulator DNA Plasmids of Yeasts, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) sa naštiepil enzýmom Sphl a spojil sa s 1,4 kbp Sphl fragmentom divergentného promótoru GAL, čím vznikli pGAL1 až 10.

Hybridná L1 DNA HPV6/11 kódujúca HPV11 L1 proteín (vzorka D361-1 z príkladu 1) obsahuje uvedený kvasinkový netranslatovaný primer na PCR zwtHPV11 L1 a antisense primer obsahujúci sekvenciu

5'-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3’ (SEQ ID NO:31).

1,5 kbp dlhý PCR produkt HPV6a L1 sa naštiepil enzýmom Bglli, vyčistil sa na géle a spojil sa s piazmidom pGAL-10 naštiepeným enzýmom BamHI, čím sa získal plazmid D128.

Príprava kmeňa 1558

a. Príprava kvasinkového kmeňa U9

Sacchamrnyces cerevisiae kmeň 2150-2-3 (MATalpha, Ieu2-O4, ade1, cir°) * , í I sa získal od Dr. Lelanda Hartwella (University of Washington, Seattle, WA). Bunky kmeňa 2150-2-3 sa množili cez noc pri 30 °C v 5 ml média YEHD (Carty a spol., 1987, J. Ind. Micro. 2: 117 až 121). Bunky sa trikrát premyli sterilnou destilovanou vodou, resuspendovali sa v 2 ml sterilnej destilovanej vody, a 0,1 ml bunkovej suspenzie sa vysialo na každú zo šiestich FOA (kyselina 5-fluoro-orotická) platničiek, aby sa vyselektovali ura3 mutanty (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Platničky sa inkubovali pri 30 °C. Médium na 250 ml destilovanej vody obsahovalo: 3,5 g Difco Yeast Nitrogen Base bez aminokyselín a

-23síranu amónneho; 0,5 g kyseliny 5-fluoro-orotickej; 25 mg uracilu; a 10,0 g dextrózy.

Médium sa sterilizovalo prefiltrovaním cez 0,2 μπη membrány a potom sa zmiešalo s 250 ml 4% Bacto-Agaru (Difco) udržiavaného pri 50 °C, 10 ml roztoku

1,2 mg/ml adenínu a 5 ml roztoku L-leucínu (180 mg/50 ml). Výsledné médium sa rozdelilo po 20 ml do Petriho misiek.

Po 5 dňoch inkubácie sa objavil veľký počet kolónií. Jednotlivé kolónie sa vyizolovali preočkovaním z počiatočných FOA platničiek na čerstvé FOA platničky, ktoré sa potom inkubovali pri 30 °C. Mnohé kolónie z druhej sady FOA platničiek sa testovali na prítomnosť mutácie ura3 spôsobom vytvárania replík ako na YEHD platničkách, tak aj na platničkách bez uracilu. Požadovaný výsledok bol dobrý rast v médiu YEHD a nijaký rast v médiu bez uracilu. Získal sa jeden izolát (U9), s takýmito vlastnosťami. Uskladnil sa zmrazený s glycerolom (kmeň číslo 325) pri -70 °C na neskoršie použitie.

b. Príprava vektora na rozbitie kvasinkového génu MNN9

Na prípravu vektora na rozbitie génu MNN9 bolo potrebné najprv vyklonovať gén MNN9 z genómovej DNA zo S. cerevisiae. Toto sa uskutočnilo štandardným spôsobom PCR (polymerázovou reťazovou reakciou). Sense primer 5’ a antisense primer 3' na PCR kódujúcej sekvencie MNN9 s plnou dĺžkou sa označili na základe publikovanej sekvencie kvasinkového génu MNN9 (Zymogenetics: Patentová prihláška EPO číslo 88117834.7, publikácia číslo 0-314-096-A2). Použili sa nasledujúce oligodeoxynukleotidové primery obsahujúce priľahlé Hindlll miesta (podčiarknuté): , ¹ sense primer: 5’-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3’ (SEQ ID NO:32);

antisense primer: 5’-TGA TAAGCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3' (SEQ ID NO:33).

-24Iniciačný metionínový kodón génu MNN9 je zvýraznený polotučné. PCR sa urobila s použitím genómovej DNA z kmeňa JRY188 S. cerevisiae ako templátu, Taq DNA polymerázy (Perkin Elmer) a 25 cyklov amplifikácie (1 minútu pri 94 °C, 2 minúty pri 37 °C, 3 minúty pri 72 ’C). Výsledný PCR fragment dlhý 1,2 kbp sa naštiepil enzýmom Hindlll, vyčistil sa na géle a spojil sa spUC13 (Pharmacia) naštiepeným enzýmom Hindlll a ošetreným alkalickou fosfatázou. Výsledný plazmid sa označil p1183.

Na rozbitie génu MNN9 kvasinkovým génom URA3 sa plazmid pBR322URA3 (ktorý obsahuje 1,1 kbp dlhý fragment Hindlll kódujúci gén URA3 zo S. cerevisiae naklonovaný na miesto Hindlll plazmidu pBR322) naštiepil enzýmom Hindlll a 1,1 kbp DNA fragment nesúci funkčný URA3 gén sa vyčistil na géle, jeho konce sa otupili T4 DNA polymerázou a potom sa spojil s plazmidom p1183 naštiepeným enzýmom Pmll (Pmll štiepi v medziach kódujúcej sekvencie génu MNN9). Výsledný plazmid p1199 obsahuje časť génu MNN9 odštiepenú funkčným génom URA3.

c. Skonštruovanie kmeňa 1372 odvodeného od U9, ktorý obsahuje rozbitý gén MNN9

Na rozbitie génu MNN9 u kmeňa U9 (číslo 325) sa 30 pg plazmidu p1199 naštiepilo enzýmom Hindlll, aby sa vytvorila lineárna disrupčná kazeta mnn9::URA3. Bunky kmeňa 325 sa pretransformovali s DNA z plazmidu p1199 naštiepeného enzýmom Hindlll s použitím sféroplastového spôsobu (Hinnen a spol., 1978, Prac. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929 až 1933) a transformanty boli vyselektované na syntetickom agárovom médiu bez uracilu s obsahom 1,0 M sorbitolu. Syntetické médium obsahovalo na liter destilovanej vody: 20 g agaru; 6,7 g Yeast nitrogen base, 0,04 g adenínu; 0.05 g L-tyrozínu; 182 g sorbitolu; 20 g glukózy a 10 ml roztoku bez leucínu číslo 2. Roztok bez leucínu číslo 2 obsahuje na liter destilovanej vody: 2 g L-arginínu; 1 g L-histidínu; 6 g L-leucínu; 6 g Lizoleucínu; 4 g L-lyzínu; 1 g L-metionínu; 6 g L-fenylalanínu; 6 g L-treonínu; 4 g Ltryptofánu.

-25Platničky sa inkubovali pri 30 °C päť dní, počas ktorých sa objavil veľký počet kolónií. Z 10 kolónií sa pripravila chromozómová DNA, ktorá sa potom naštiepila enzýmom EcoRI a Hindlll. Výsledné naštiepené DNA sa potom analyzovali pomocou Southern blotovania (Sambrook a spol., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press) s použitím 1,2 kbp dlhého Hindlll fragmentu nesúceho gén MNN9 (vyizolovaného z plazmidu p1199) ako sondu. Našiel sa izolát (kmeň číslo 1372), ktorý mal podľa Southern blotovania očakávané posuny v DNA prúžkoch a tiež aj mimoriadnu schopnosť zhlukovať sa, čo je pre mnn9 mutanty typické.

d. Skonštruovanie vektora na rozbitie kvasinkového génu HIS3

Na skonštruovanie disrupčnej kazety, v ktorej sa gén HIS3 zo S. cerevisiae rozbije génom URA3, sa plazmid YEp6 (Struhl a spol., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 76: 1035) naštiepil enzýmom BamHI a 1,7 kbp dlhý fragment BamHI nesúci gén HIS3 sa vyčistil na géle, jeho konce sa otupili T4 DNA polymerázou a spojil sa s plazmidom pUC18, ktorý bol predtým naštiepený enzýmom BamHI a ošetril saT4

DNA polymerázou. Výsledný plazmid (označený p1501 alebo pUC18-HIS3) sa naštiepil enzýmom Nhel (ktorý štiepi kódujúcu sekvenciu génu HIS3) a vektorový fragment sa vyčistil na géle, jeho konce sa otupili T4 DNA polymerázou a potom sa vystavil účinkom alkalickej fosfatázy z teľacieho čreva. Gén URA3 sa vyizoloval z plazmidu pBR322-URA3 naštiepením enzýmom Hindlll a 1,1 kbp dlhý fragment nesúci gén URA3 sa vyčistil na géle, jeho konce sa otupili T4 DNA polymerázou a spojil sa s uvedeným fragmentom pUC18-HIS3 Nhel. Výsledný plazmid (označený * » . ‘ * · « pUC18-his::URA3 alebo p1505) obsahuje disrupčnú kazetu, v ktorej kvasinkový gén HIS3 sa rozbije funkčným génom URA3.

e. Skonštruovanie vektora na rozbitie kvasinkového génu PRB1 génom HIS3

Plazmid FP8AH nesúci gén PRB1 zo S. cerevisiae poskytol Dr. E. Jones z Carnegie-Mellon University (Moehle a spol., 1987, Genetics 115: 255 až 263). Naštiepil sa enzýmom Hindlll a Xhol, a 3,2 kbp dlhý DNA fragment nesúci gén PRB1 sa vyčistil na géle a jeho konce sa otupili vplyvom T4 DNA polymerázy.

-26Plazmid pUC18 sa naštiepil enzýmom BamHI, vyčistil sa na géle a jeho konce sa otupili vplyvom T4 DNA polymerázy. Výsledný fragment vektoru sa spojil s fragmentom uvedeného PRB1 génu, čím sa získal plazmid pUC18-PRB1. Plazmid YEp6, ktorý obsahuje gén HIS3, sa naštiepil enzýmom BamHI. Výsledný

1,7 kbp dlhý fragment BamHI nesúci funkčný gén HIS3 sa vyčistil na géle a jeho konce sa otupili vplyvom T4 DNA polymerázy. Plazmid pUC18-PRB1 sa naštiepil enzýmom EcoRV a Ncol, ktorý štiepi v medziach kódujúcej sekvencie génu PRB1 a odstraňuje aktívne miesto proteázy B a priľahlú sekvenciu. 5,7 kbp dlhý EcoRVNcol fragment nesúci zvyškové 5’ a 3’-časti kódujúcej sekvencie PRB1 v plazmide pUC18 sa vyčistil, jeho konce sa otupili vplyvom T4 DNA polymerázy, defosforyloval sa alkalickou fosfatázou z teľacieho čreva a spojil sa s uvedeným HIS fragmentom s otupenými koncami. Výsledný plazmid (označený pUC18-prb1:.HIS3, zásobný č. 1245) obsahuje funkčný gén HIS3 namiesto časti génu PRB1, ktorý bol vynechaný.

f. Skonštruovanie kvasinkového kmeňa príbuzného s U9 obsahujúceho rozbité časti génu MNN9 aj PRB1

Ide o kmeň 1372 príbuzný s U9, ktorý obsahuje rozbitú časť génu MNN9. Klonové izoláty kmeňa 1372 boli pasážované na FOA platničkách, aby sa vyselektovali mutanty ura3. Získalo sa veľké množstvo ura3 izolátov kmeňa 1372, a jeden konkrétny izolát (kmeň 12930-190-S1-1) sa vyselektoval pre následné rozbitie génu HIS3. Disrupčný vektor (p1505) génu pUC18-his3::URA3 sa naštiepil enzýmom Xbal a EcoRI, aby sa vygenerovala lineárna disrupčná kazeta his3::URA3 a použil sa na transformáciu kmeňa 12930-190-S1-1 spôsobom octanu lítneho (Methods in Enzymology, 1992, 194: 290). Ura⁺ transformarity sa vyselektovali na syntetickom agarovom médiu bez uracilu, preočkovali sa na rovnaké médium, aby sa získali klonové izoláty, a s použitím spôsobu repliky sa vysiali na médium buď bez uracilu alebo histidínu a hľadali sa tie izoláty, ktoré boli Ura⁺ a His”. Jeden izolát (kmeň 12930-230-1) sa vyselektoval kvôli následnému rozbitiu génu PRB1. Disrupčný vektor génu PRB1 (pl)C18-prb1::HIS3, zásobný č. 1245) sa naštiepil enzýmom Sací a Xbal, čím sa vygenerovala lineárna disrupčná kazeta prb1::HIS3 a použila sa na transformovanie kmeňa 12930-230-1 spôsobom

-27octanu lítneho. His* transformanty sa vyselektovali na agarovom médiu bez histidínu a preočkovali sa na rovnaké médium, aby sa získali klonové izoláty. Genómová DNA sa pripravila z veľkého počtu výsledných His⁺ izolátov, naštiepila sa enzýmom EcoRI, a potom sa urobila elektroforéza na 0,8% agarózových géloch. Vykonala sa potom analýza Southern blotovaním s použitím značenej 617 bp sondy pre gén PRB1, ktorý sa predtým pripravil spôsobom PCR s použitím nasledujúcich oligodezoxynukleotidových primerov:

5’-TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA-3’ (SED ID NO:34); a

5-CAC CGT AGT GTTTGG AAG CGA-3'(SED ID NO:35).

Získalo sa jedenásť izolátov, u ktorých sa našla očakávaná hybridizácia sondy s 2,44 kbp dlhým DNA fragmentom prb1::HIS3. Toto sa líšilo od hybridizácie sondy s 1,59 kbp dlhým fragmentom pre gén PRB1 divého typu. Na ďalšie požitie sa vybral jeden z týchto izolátov, ktorý obsahoval požadovanú rozbitú časť prb1::HIS3, a označil sa ako kmeň číslo 1558.

Príklad 2

Expresia HPV11 L1 a HPV6 L1 v kvasinkách

Plazmidy D362-1 (pGAL1 až 10 + HPV6/11 L1), p329-1 (pGAL1 až 10 + wtHPV11 L1), D128 (pGAL1 až 10 + HPV6 L1) a pGAL1 až 10 sa použili sa transformovanie S. cerevisiae kmeň 1558 (MATa, Ieu2-O4, prb1::HIS3, mnn9::URA3, áde1, cir°) š použitím sféroplastového spôsobu'(Hinnen a spol., 1978, Proc. NatL Acad. Sci. USA 75: 1929 až 1933). Kvasinkový kmeň číslo 1558 transformovaný plazmidom D362-1 sa označil ako kmeň číslo 1782. Na RNA štúdie sa kvasinkové klonové izoláty kultivovali 26 hodín pri 30 °C v kompletnom médiu YEH (Carty a spol., 1987, J. Ind. Micro. 2, 117 až 121) obsahujúcom 0,1 M sorbitol a buď 2% glukózu alebo galaktózu. Po pozbieraní buniek sa vyextrahovala kvasinková RNA s použitím spôsobu horúceho kyslého fenolu (Current Protocols in Molecular Biology, ročník. 2, Current Protocols, 1993). Na analýzy proteínov sa rovnaké

-28izoláty kultivovali 70 hodín pri 30 °C v kompletnom médiu YEH obsahujúcom 0,1 M sorbitol, 2% glukózu a 2% galaktózu. Po pozbieraní buniek sa pelety buniek rozdrvili sklenými guličkami a bunkové lyzáty sa s použitím imunoblotovania analyzovali na expresiu HPV11 L1 alebo HPV6 L1 proteinu.

Fermentovanie HPV6/11 L1 (kmeň číslo 1782)

Povrchový rast platničkovej kultúry kmeňa 1782 sa aseptický preniesol do tekutého média bez leucínu obsahujúceho na 1 liter 8,5 g Difco Yeast Nitrogen Base bez aminokyselín a síranu amónneho; 0,2 g adenínu; 0,2 g uracilu; 10 g kyseliny jantárovej; 5 g síranu amónneho a 0,25 g L-tyrozínu; pH tohto média sa ešte pred vysterilizovaním upravilo pomocou NaOH na 5,0 až 5,3.

Po 25-hodinovej kultivácii pri 28 °C a 250 rpm na rotačnej trepačke sa zmrazené kultivačné fľaštičky pripravili pridaním sterilného glycerolu do konečnej koncentrácie 17 % hmotnosť/objem ešte pred uskladnením pri -70 °C (1 ml na 1 zmrazovaciu nádobku). Fermentačné inokulum kmeňa 1782 sa vyvinulo v rovnakom médiu (750 ml na 2-litrovú kultivačnú fľašu) a bolo začaté prenesením rozmrazeného obsahu dvoch zmrazených kultivačných nádob do 2-litrových fliaš a inkubovaním 25 hodín pri 28 °C a 250 ot./minútu na rotačnej trepačke. Pri fermentácii kmeňa 1782 sa použil 23-litrový fermentátor Chemap s pracovným objemom 18 litrov po inokulácii. Použité výrobné médium obsahovalo (na 1 liter): 20 g kvasinkového extraktu Difco; 10 g peptónu Sheffield HySoy; 20 g glukózy; 20 g galaktózy; pH média sa pred vysterilizovaním upravilo na 5,3. Celý obsah (500 ml) dvojlitrovej inkubačnej fľaše sa preniesol do fermentátora a inkuboval sa pri 28 °C, 9 I vzduchu za minútu, 500 ot./minútu, tlak 24 kPa (3,5 psi). Miešanie sa zvyšovalo podľa potreby na udržanie hladiny rozpusteného kyslíka vyššej ako je 40% nasýtenia. Postup fermentovania sa monitoroval mimo fermentačnej nádoby meraním glukózy (Beckman Glucose 2 Analyzer) a v nádobe hmotnostnou spektrometriou (Perkin-Elmer 1200). Po 66 hodinách inkubácie sa dosiahla bunková hustota 9,32 g sušiny na liter. Obsah dvoch takých fermentácii (celkom

17,5 I bujónu) sa ešte pred získaním buniek zlúčil. Kultúra sa skoncentrovala prefiltrovaním cez duté vlákna (Amicon H5MP01-43 kartridž vo filtračnom systéme

-29Amicon DC-10) približne na 2 I, diafiltrovala sa s 2 I fosfátmi tlmeným fyziologickým roztokom, ďalej sa skoncentrovala (približne na 1 I) a naplnila sa do 500 ml centrifugačných nádob. Bunkové pelety sa získali centrifugovanim pri 8000 ot./minútu (rotor Sorval GS3) 20 minút pri 4 °C. Po vyliatí supernatantu sa pelety (celkom 358 g mokrých buniek) skladovali pri -70 °C až do použitia.

Čistenie rekombinantných kapsidových proteínov HPV typu 11 Ľ1

Všetky kroky sa urobili pri 4 °C, pokiaľ to nie je uvedené inak. Bunky boli skladované v zmrazenom stave pri -70 °C. Zmrazené bunky (mokrá hmotnosť =180

g) sa rozmrazili pri 20 až 23 °C a resuspendovali sa v 900 ml „rozbíjacieho tlmivého roztoku“ (50 mM MOPS, pH 7,2, 500 mM NaCi, 1 mM CaCI₂). Inhibítory proteáz AEBSF a pepstatín A sa pridali v konečnej koncentrácii 1 mM a 1,7 mM. Bunková kaša sa rozdrvila pri tlaku približne 110 MPa (16 000 psi) v štyroch cykloch v homogenizátore M110-Y Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA). Ku kaši rozbitých buniek sa pridal dostatočný objem 10% detergentu Triton X100® (Pierce, Rockford, IL), aby sa koncentrácia TX100 upravila na 0,5%. Kaša sa miešala 20 hodín. Lyzát vystavený účinku Tritonu X100 sa centrifugoval 40 minút pri 12000xg, aby sa odstránil bunkový odpad. Získal sa tekutý supernatant obsahujúci proteín L1.

Supernatant sa prefiltroval proti piatim objemom 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2, 0,5 M NaCi s použitím 300K tangenciálnej kazety s prietokovou membránou (Filtron, Northborough, MA). Rádioimunoanalýzou a Western blotovaním sa zistilo, že materiál zachytený membránou obsahuje proteín L1.

I . · ¹

Zachytený materiál sa naniesol do afinitnej kolóny s vysokým 'rozlíšením (11,0 cm ID x 5,3 cm) so živicou SP Spherodex (M)® (IBF, Villeneuve-la-Garenne, Francúzsko) vyvážený v 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2, 0,5 M NaCi. Po premytí vyrovnávacím tlmivým roztokom a premytí 20 mM roztokom fosforečnanu sodného, pH 7,2, 1,0 M NaCi, proteín L1 bol eluovaný premytím s 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2, 2,5 M NaCi. Frakcie sa získavali počas premývania a eluovania. Frakcie z kolóny sa testovali na celkové proteíny spôsobom podľa

-30Bradfordovej. Frakcie sa potom analyzovali Western blotovaním a SDS-PAGE, pričom detekčným činidlom bolo koloidálne farbivo Coomassie. Frakcie boli analyzované aj rádioimunoanalýzou.

Frakcie zo živice SP Spherodex, ktoré mali porovnateľnú čistotu a koncentráciu proteínu L1, sa spojili. Konečný produkt sa analyzoval Western blotovaním a s použitím SDS-PAGE s detekciou pomocou koloidálneho farbiva Coomassie. Odhadlo sa, že homogenita proteínu L1 je vyššia ako 90%. Totožnosť L1 proteínu bola potvrdená Western blotovaním. Konečný produkt sa aseptický prefiltroval cez 0,22 mm membránu a skladoval sa pri -70 °C v 50 mM MOPS a 1,25 M NaCI.

Elektrónmikroskopická analýza sa robila pomocou Structure Próbe (West Chester, PA). Alikvotná časť vzorky sa umiestni na uhlíkom povlečenú medenú mriežku s veľkosťou otvorov 200. Na mriežku sa na 20 sekúnd umiestni kvapka 2% kyseliny fosfowolfrámovej, pH 7,0. Mriežka sa pred elektrónmikroskopickým vyšetrením (TEM) nechala na vzduchu usušiť. Všetky mikroskopické vyšetrenia sa robili s mikroskopom JEOL 100 CX (JEOL USA, Inc.) pri akceleračnom napätí 100 kV. Konečné zväčšenie získaných fotografií je 100 000 x.

Stanovenie celkových proteínov podľa Bradfordovej

Celkové proteíny sa stanovili s použitím komerčne dostupnej súpravy Coomassie Plus® (Pierce, Rockford, IL). Vzorky sa zriedili na jednotlivé hladiny v Milli-Q-HjO. Požadované objemy na štandardy a mikrotestové protokoly boli 0,1 ml a 1,0 ml. Pre obidva protokoly sa na vygenerovanie štandardnej krivky použilo BSA (Pierce, Rockford, IL). Test sa uskutočnil podľa odporúčaní výrobcu.

* I i * ¹

Štandardné krivky sa zostrojili s použitím softvéru CricketGraph® a počítača Macintosh líci.

SDS-PAGE a Western blotovanie

Všetky gély, tlmivé roztoky a zariadenia na elektroforézu boli získané od firmy Novex (San Diego, CA) a boli používané v súlade s odporúčaniami výrobcu. V krátkosti, vzorky sa zriedili tak, aby sa vyrovnali s koncentráciami proteínov v MilliQ-H₂O a zmiešali sa v pomere 1:1 stlmivým roztokom na inkubáciu vzoriek

-31 obsahujúcim 200 mM DTT. Vzorky sa inkubovali 15 minút pri 100 °C a naniesli sa na pripravené 12% Tris-glycínové gély. Vzorky sa vyšetrovali elektroforeticky pri 125 V a 1 h 45 min. Gély sa vyvolávali farbením koloidálnym farbivom Coomassie s použitím komerčne dostupnej súpravy (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

Na Western blotovanie sa proteíny preniesli na membrány PVDF pri 25 V počas 40 min. Membrány sa premyli s Milli-Q-H₂O a vysušili sa na vzduchu. Primárnou protilátkou bolo polyklonálne králičie antisérum vyvolané proti fúzovanému proteínu TrpE-HPV11L1 (dar Dr. D. Browna). Roztok protilátky sa pripravil zriedením antiséra v blotovacom tlmivom roztoku (5% nízkotučného mlieka v 6,25 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2, 150 mM NaCI, 0,02% NaN₃). Inkubácia trvala aspoň 1 hodinu pri 20 až 23 °C. Každá škvrna sa premývala 1 minútu v troch várkach PBS (6,25 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2, 150 mM NaCI). Roztok sekundárnej protilátky sa pripravil zriedením kozieho protikráličieho IgG konjugovaného antiséra spojeného s alkalickou fosfatázou (Pierce, Rockford, IL) v blotovacom tlmivom roztoku. Inkubácia prebiehala za rovnakých podmienok aspoň 1 hodinu. Škvrny sa premyli uvedeným spôsobom a zisťovali sa s použitím jednokrokového substrátu NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL)

Príklad 3

Závislosť agregácie od koncentrácie proteínov

Uvedeným spôsobom sa pripravila šarža HPV11 VLP a skladovala sa v koncentrácii 0,47 mg/ml v 50 mM MOPS obsahujúcom 1,25 M NaCI. Táto šarža sa rozmrazila a časť tohto roztoku sa zriedila na 18 pg/ml v rovnakom tlmivom roztoku. Kým zásobný roztok pri vyšších koncentráciách proteínov si udržal rovnaký hydrodynamický priemer (D_h) v rozpätí 107 až 115 nm (merané pódia dynamického rozptylu svetla) počas 2 mesiacov pri 4 °C, roztok s nižšou koncentráciou proteínov sa v priebehu času agregoval aj vtedy, ak koncentrácia soli sa udržiavala pri 1,25 M NaCI (obrázok 1). Podľa obrázku 1 pri nižších koncentráciách HPV proteínov ani vyššie koncentrácie soli nezabránia agregácii HPV počas skladovania pri 4 °C.

-32Príklad 4

Závislosť agregácie od koncentrácie soli

Pripravila sa šarža HPV11 a HPV 16 VLP a otestovala sa na závislosť hydrodynamického priemeru od soli počas skladovania. Rekombinantný HPV 11 a 16 VLP sa zriedil zo zásobného roztoku (v 50mM MOPS, 1,25 M NaCI, pH 7,0) do 50mM tlmivého roztoku MOPS tak, aby konečná koncentrácia proteínov ostala konštantná približne okolo 20 pg/ml, avšak koncentrácia NaCI bola rôzna (obrázok

2). Riedenia sa uskutočnili v polypropylénových skúmavkách eppendorf a skladovali sa pri izbovej teplote. Merania sa uskutočnili do jednej hodiny po zriedení, pretože v predchádzajúcom príklade (obrázok 1) sa pozorovala pomalá agregácia pri tejto koncentrácii proteínov dokonca aj v roztoku s vysokou koncentráciou soli. Hodnota D_h bola takmer nemenná až po koncentráciu 0,15 M NaCI (HPV 11) a 0,5 M NaCI (HPV 16), avšak sa zvýšila pri nižších koncentráciách soli (obrázok 2). Na druhej strane u dialyzovaných vzoriek HPV 11 sa zistili väčšie hydrodynamické priemery pri všetkých koncentráciách soli, a tento účinok bol obzvlášť výrazný pri koncentrácii soli pod 0,5 M NaCI.

Samostatný pokus sinou šaržou HPV11 (výsledky nie sú graficky znázornené) ukázal, že rekombinantný HPV 11 L1 VLP (dialyzovaný do 20 mM tlmivého roztoku fosforečnanu sodného (pH 7,2) obsahujúceho rôzne koncentrácie NaCI) vykazoval vzostup hodnoty D_h približne z 113 nm v 0,5 M NaCI na 133 nm v 0,15 M NaCI. Vzorky dialyzované do 1,0, 2,0 a 3,0 M NaCI mali hodnoty D_h po porovnaní 114,113 a 108 nm, kým vzorka dialyzovaná do koncentrácie NaCI 0,025 M vytvorila viditeľnú zrazeninu. Koncentrácie proteínov týchto vzoriek boli v rozpätí 130 až 179 pg/ml (merané podľa Lowryho spôsobu stanovenia proteínov) okre vzorky v 0,025 M NaCI, v ktorej ostalo v roztoku iba 16 pg/ml proteínu. V kontrolnej vzorke, ktorá sa skladovala v 20 mM tlmivom roztoku fosforečnanu sodného (pH 7,2) obsahujúceho 2,5 M NaCI, avšak nebola dialyzovaná, bola hodnota D_h 82 nm.

Údaje tohto príkladu ukazujú, že kým nízke koncentrácie soli alebo nízke iónové sily prispievajú k agregácii medzi čiastočkami HPV VLP, nízke koncentrácie

-33proteínov a fyzické manipulácie s roztokom HPV (napríklad dialýza proteínov) sú tak isto významnými faktormi agregácie HPV VLP.

Príklad 5

Povrchová adsorpcia HPV 11 VLP

Povrch dialyzačnej membrány pg/ml roztok proteínov v 50 mM tlmivom roztoku MOPS pri pH 7,0 obsahujúci 0,18 M NaCI sa inkuboval s rôzne veľkými plochami dialyzačnej membrány, aby sa zistil účinok dialyzačnej membrány priamo na agregáciu HPV

11. Zistilo sa, že hodnota D_h stúpa so stúpajúcou veľkosťou plochy membrány po 96 hodinách inkubácie pri izbovej teplote (obrázok 3). Zároveň sa zistilo, že koncentrácia proteínov v roztoku klesá so stúpajúcou veľkosťou plochy membrány (obrázok 3). Tieto pozorovania svedčia o adsorpcii HPV 11 na povrch membrány a naznačujú koreláciu medzi povrchovou adsorpciou a agregáciou. Tieto údaje ukazujú, že predĺžené vystavenie nízkych koncentrácií HPV polypropylénovému povrchu a povrchu dialyzačnej membrány spôsobuje povrchovú adsorpciu a agregáciu. Oba tieto procesy sú závislé od teploty. Vzorky inkubované pri 4 °C mali pomalšiu kinetiku v oboch procesoch ako vzorky pri 25 °C.

Porovnanie adsorpcie HPV k povrchu rôznych nádob

Porovnala sa adsorpcia HPV pri rovnakých pomeroch povrchu k objemu v borokremičitom skle, polypropylénových a polystyrénových skúmavkách (s 'l rovnakými rozmermi 12 x 75 mm²) pri rôznych koncentráciách HPV. Vzorky sa inkubovali v 50 mM tlmivom roztoku MOPS obsahujúcom 1,25 M NaCI pri pH 7,0 a nechali sa 24 hodín pri izbovej teplote. Obrázok 4 ukazuje, že povrchová adsorpcia je v borokremičitom skle pod 100 pg/ml značná. Polypropylén dopadol lepšie, pretože adsorpcia sa stáva vážnym problémom pri koncentrácii pod 30 μg/ml, avšak pri vyšších koncentráciách a za týchto podmienok nie. Polystyrén dopadol najlepšie a nevykazoval nijakú výraznejšiu adsorpciu proteínov až po koncentráciu 10 pg/ml.

-34Povrchová adsorpcia HPV sa ďalej skúmala v prípadoch, kde HPV 11 (18 pg/ml v 50 mM tlmivom roztoku MOPS obsahujúcom 0,25 M NaCI) sa umiestnil do polypropylénových skúmaviek pri dvoch rôznych pomeroch povrchu k objemu (obrázok 5). Po jednom dni pri izbovej teplote v podstate celý HPV bol adsorbovaný na povrchu pri pomere povrchu k objemu 6,0 cm¹, kým na druhej strane sa pozorovala iba 15% adsorpcia, ak pomer povrchu k objemu bol 4,0 cm“¹ (obrázok 5).

Príklad 6

Excipienty potláčajúce povrchovú adsorpciu a agregáciu HPV11 VLP

Testovanie povrchovo aktívnych činidiel v pokuse na urýchlenie stability

V predbežnom pokuse sa vzorky HPV 11, buď v prítomnosti alebo v neprítomnosti 0,01% niekoľkých povrchovo aktívnych činidiel, inkubovali 20 hodín pri izbovej teplote. Koncentrácia HPV bola 18 pg/ml a tlmivý roztok obsahoval 50 mM MOPS, 0,15 M NaCI pri pH 7,0. Podľa dynamického rozptylu svetla (obrázok 6A), niekoľko povrchovo aktívnych činidiel za týchto podmienok poskytlo čiastočnú ochranu proti agregácii v porovnaní so vzorkou HPV, ktorá nebola ošetrená povrchovo aktívnym činidlom.

Pokus na testovanie povrchovo aktívnych činidiel sa vykonal za prísnejších podmienok. HPV 11 sa inkuboval 30 minút v neprítomnosti alebo v prítomnosti 0,01% každého povrchovo aktívneho činidla pri 50 °C, a potom 2 dni pri izbovej teplote. Koncentrácia HPV bola 18 pg/ml a tlmivý roztok obsahoval 50 mM MOPS a 0,04 M NaCI pri pH 7,0. Za týchto podmienok sa kontrolná vzorka HPV neošetrená povrchovo aktívnym činidlom v porovnaní s vyššie opísaným pokusom agregovala oveľa viac. Z testovaných povrchovo aktívnych činidiel (obrázok 6B) estery mastných kyselín polyoxyetylénsorbitanu (Tween 80®) a polyoxyetylén alkylétery (Brij 58®) poskytli najlepšiu ochranu pred agregáciou HPV11 VLP.

-35Kombinovaný ochranný účinok soli a Polysorbate 80

Zistilo sa, že pri nižších koncentráciách HPV vysoké koncentrácie soli chloridu sodného, síranu sodného a síranu amónneho v koncentrácii 0,1 M a 0,5 M - samy o sebe nezabránia povrchovej adsorpcii alebo agregácii HPV VLP (Obrázok 7A a 7B). Na druhej strane, obrázok 7A a 7B tiež ukazuje, že pridanie neiónového povrchovo aktívneho činidla Tween 80® k tlmivému roztoku obsahujúcemu 0,4 M síranu amónneho vedie k takmer úplnej ochrane proti adsorpcii a agregácii dokonca aj po 6 dňoch pri izbovej teplote.

Účinok činidla Polysorbate 80 (napríklad Tween 80®) a NaCI na povrchovú adsorpciu a agregáciu sa opäť potvrdil v samostatnom pokuse. HPV 11 L1 VLP, v koncentrácii 18 pg/ml, sa inkuboval v polypropylénových skúmavkách v 50mM tlmivom roztoku MOPS obsahujú 250 mM NaCI pri pH 7 s 0,01% Tweenu 80® alebo bez neho. Na obrázku 8 je percento adsorbovaných proteínov a hodnoty D_h ako funkcia inkubačného času pri izbovej teplote. V neprítomnosti Tweenu 80® bola adsorpčná strata a agregácia veľmi výrazná, kým 0,01% Tweenu 80® poskytuje ochranu proti obom problémom.

Podľa obrázku 9 je okrem Polysorbate 80 je na ochranu nízkych koncentrácií HPV 11 VLP (100 pg/ml) pred agregáciou a adsorpciou potrebná aj optimálna koncentrácia soli. Obrázok tiež ukazuje, že vzostup v koncentrácii Tweenu 80® vo formuláciách s nízkou iónovou silou poskytuje iba čiastočnú, nie plnú ochranu. Obrázok 9 ukazuje, že agregáciu HPV 11 (18 pg/ml) kontroloval 0,01% Tween 80® v tlmivom roztoku obsahujúcom 50 mM MOPS a 0,04 NaCI iba čiastočne, avšak ochrana bola takmer úplná proti agregácii VLP počas 48 hodín pri izbovej teplote, t ₄ ak sa koncentrácia NaCI zvýšila na 0,10 M.

Na obrázku 10 je účinok titrácie Polysorbate 80 na agregáciu HPV 11 VLP (18 pg/ml) v 50mM tlmivom roztoku MOPS, ktorý obsahuje 0,15 M NaCI pri pH 7,0. Vzorky sa inkubovali s rôznymi koncentráciami Tweenu 80® v rozpätí od 0 až 0,01% pri 4 °C. Pri 4 °C sa vo vzorke obsahujúcej 0,01% Tweenu nepozorovala nijaká výraznejšia agregácia ani po 20 dňoch, kým pri izbovej teplote sa proti agregácii pozorovala čiastočná ochrana.

-36Na obrázku 11 je znázornená schopnosť neiónových povrchovo aktívnych činidiel chrániť HPV 16 VLP proti agregácii. Skúmané povrchovo aktívne činidlá zahŕňajú Polysorbate 80 (napríklad Tween 80), Polysorbate 20 (napríklad Tween

20), NP-40, Triton X-100, Triton X-114 a tiež polyoxyetylén alkylétery (napríklad Brij 35 a Brij 58). Vzorky HPV 16 pri koncentrácii proteínov 20 pg/ml sa inkubovali 50 dní s 0,01% rôznych povrchovo aktívnych činidiel pri izbovej (okolitej) teplote. Inkubačný tlmivý roztok obsahoval 50 mM MOPS, 0,15 M NaCI pri pH 7. Dynamickým rozptylom svetla (DLS) sa zistilo, že všetky povrchovo aktívne činidlá ochraňovali počas doby skladovania HPV 16 proti agregácii v porovnaní s kontrolnou vzorkou HPV 16, ktorá nebola vystavená účinku povrchovo aktívneho činidla (obrázok 11). Stupeň ochrany pri tejto koncentrácii povrchovo aktívneho činidla (0,01%) sa medzi jednotlivými činidlami mierne líši. Na otestovanie ochrannej schopnosti neiónových povrchovo aktívnych činidiel v závislosti od soli sa vzorky HPV 16 s koncentráciou proteínov 30 až 60 pg/ml inkubovali 24 hodín pri 4 °C s 0,01 až 0,02% Tweenu 80 a koncentráciou NaCI 0,15 až 0,5 M. Zistilo sa, že koncentrácie NaCI 0,2 M a vyššie poskytujú výraznú ochranu proti agregácii HPV16 VLP v kombinácii s neiónovými povrchovo aktívnymi činidlami.

Stabilizujúci účinok koncentrácie soli proti agregácii HPV v prítomnosti neiónových povrchovo aktívnych činidiel sa skúmal v zmysle celkovej iónovej sily. Obrázok 2 a 9 ukazuje, že na stabilizovanie HPV VLP v prítomnosti alebo neprítomnosti neiónových povrchovo aktívnych činidiel je potrebná minimálna koncentrácia NaCI. V ďalšom pokuse sa skúmala schopnosť rôznych solí stabilizovať HPV 16 VLP pri konštantnej iónovej ?ile. 60 μg/ml HPV sa inkubovalo * ' I hodín pri 22 °C, potom sá skladovalo pri 4 °C až do odmerania ‘ hydrodynamického priemeru (D_h) dynamickým rozptylom svetla a stanovením in vitro antigenity (väzbou protilátky) analýzou EIA a BIA. Tabuľka 1 ukazuje, že ak sa namiesto NaCI použili aj iné soli, pri nižších koncentráciách solí, avšak pri rovnakej iónovej sile, sa pozorovala podobná HPC stabilita. Ako kontrola, roztok s nižšou iónovou silou viedol k agregácii HPV a čiastočnej strate antigenity. Tieto výsledky naznačujú, že stabilizujúci účinok soli za týchto podmienok závisí skôr od iónovej

-37sily než od druhu soli. Ak sa za prísnejšíčh podmienok (37 °C) testovali podobné stabilizujúce účinky, v schopnosti stabilizovať sa medzi jednotlivými soľami pozorovali určité odchýlky, ako to ukazujú výsledky in vitro testu antigenity a analýzy agregácie. Napríklad CaCI₂ a MgCI₂ a tiež fosfátmi tlmený fyziologický roztok bol pri konštantnej iónovej sile menej účinný pri stabilizovaní HPV VLP.

Tabuľka 1

	MOP S (M)	Pridaná soľ (M)	Konečný Tween 80	Celková iónová sila (M)	Biacore*/ proteín	EIA7 proteín	Dh (nm)
NaCI	0,05	0,02	0,01%	0,12	0,4	0,2	180
NaCI	0,05	0,12	0,01%	0,22	1,0	1,0	72
Citrónan sodný	0,05	0,02	0,01%	0,22	1,2	0,9	74
Fosforečnan sodný	0,05	0,02	0,01%	0,22	0,8	1,2	74
Octan sodný	0,05	0,12	0,01%	0,22	1,0	1,0	74
Na2SO4	0,05	0,04	0,01%	0,22	0,8	1,1	73
MgCI2	0,05	0,04	0,01%	0,22	1,0	1,1	74
CaCI2	0,05	0,04	0,01%	0,22	0,8	1,2	93

‘Relatívna odpoveď väzby protilátky in vitro sa normalizovala na kontrolnej vzorke HPV 16 zmrazenej na -70 °C. Kontrola sa rozmrazila tesne pred urobením testu.

i I ’ i

Nameraná hodnota hydrodynamického priemeru (D_h) kontrolnej vzorky prostredníctvom dynamického rozptylu svetla bola 73 nm.

-38Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:

(i) Prihlasovateľ: Merck & co., Inc.

(ii) Názov vynálezu: Stabilizované formulácie ľudského papilomavírusu (iii) Počet sekvencií: 35 (iv) Adresa pre korešpondenciu:

(A) Adresát: Merck & co., Inc.

(B) Ulica: P. O. Box 2000 RY60-30 (C) Mesto: Rahway (D) Štát: NJ (E) Krajina: USA (F) PSČ: 07065-0907 (v) Forma čitateľná pre počítač:

(A) Typ média: disketa (B) Počítač: PC IBM kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Softvér: Patentln Release 1.0, verzia 1.30 (vi) Údaje súčasnej prihlášky:

(A) Číslo prihlášky:

(B) Dátum registrácie:

(C) Zatriedenie:

(viii) Informácie o agentovi/zástupcovi:

t

I · (A) .Meno: Hand, J.'Mark (B) číslo registrácie: 36,545 (C) Referenčné/spisové číslo: 19933Y (ix) Telekomunikačné informácie:

(A) Telefón: 732/594-3905 (B) Fax: 732/594-4720

-39(2) Informácie pre SEQ ID NO:1:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 164 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:1:

GAAGATCTCA CAAAACAAAA TGTGGCGGCC TAGCGACAGC TGCCTCCTCC TAACCCTGTA TCCAAAGTTG TTGCCACGGA AAACGCACCA ACATATTTTA TCATGCCAGC AGTTCTAGAC GGGTCATCCT TATT (2) Informácie o SEQ ID NO:2:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 156 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér' (xi) Opis sekvencie: SEÔ ID NO:2;

ATTCCATAAA AAAGGTTAAC AAAACTGTTG TGCCAAAGGT CAATACAGAG TATTTAAGGT GGTGTTACCA GATCCTAACA GCCTGACTCG TCTCTTTTTG ATCCCACAAC ACAACGTTTG GCATGT

ACAGTATATG

TGCTTATGTT

TTCTTGCAGT

GTCAGGATAT

AATTTGCATT

GTATGGGCAT

-40(2) Informácie o SEQ ID NO:3:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 136 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér'* (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:3:

ACATGCATGC ACAGGCCTAG AGGTGGGCCG GGGACAGCCA TTAGGTGTGG GTGTAAGTGG ACATCCTTTA CTAAATAAAT ATGATGATGT TGAAAATTCA GGGGGTTACG GTGGTAACCC TGGACAGGAT AACAGG (2) Informácie o SEQ ID NO:4:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 127 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:4:

t * I « » · , I ¹ * ,

GTTAATGTAG GTATGGATTA TAAACAAACA CAATTATGCA TGGTTGGATG TGCCCCCCCT TTGGGCGAGC ATTGGGGTAA AGGTACACAG TGTAGTAATA CATCTGTACA GAATGGTGAC TGCCCGC (2) Informácie o SEQ ID NO:5:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 125 bázových párov

-41 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:5:

CCTTAGAACT TATTACCAGT GTTATACAGG ATGGCGATAT GGTTGACACA GGCTTTGGTG CTATGAATTT TGCTGATTTG CAGACCAATA AATCAGATGT TCCTCTTGAC ATATGTGGCA CTGTA (2) Informácie o SEQ ID NO:6:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 116 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:6:

TGTAAATATC CAGATTATTT ACAAATGGCT GCAGACCCAT ATGGTGATAG

ATTATTTTTT TATCTACGGA AGGAACAAAT GTTTGCCAGA CAI I I I ľlTA . »

ÁCAGGGCTGG TÁCCCC (2) Informácie o SEQ ID NO:7:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 124 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna

-42(ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:7:

GGGGTACCGT GGGGGAACCT GTGCCTGATG ATCTTTTAGT TAAGGGTGGT AACAATCGCT CGTCTGTAGC GAGTAGTATA TATGTTCACA CCCCAAGCGG CTCTTTGGTG TCCTCTGAGG CACA (2) Informácie o SEQ ID NO:8:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 113 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér' (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:8:

ATTGTTTAAT AAGCCATATT GGCTACAAAA AGCCCAGGGA CATAACAATG GTATTTGTTG GGGTAATCAT CTGTTTGTTA CTGTGGTAGA TACCACACGC AGTACCAACA TGA (2) Informácie o SEQ ID NO:9:

I , (i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 113 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:9:

-43CATTATGTGC ATCCGTATCT AAATCTGCCA CATACACCAA TTCTGATTAT AAAGAGTACA TGCGTCATGT GGAAGAGTTT GATTTACAAT TTAI I I I ICA ATTATGTAGC ATT (2) Informácie o SEQ ID NO: 10:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 105 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 10:

ACATTGTCTG CTGAAGTAAT GGCCTATATT CACACAATGA ATCCCTCTGT TCTCGAGGAC TGGAACTTTG GGTTATCGCC TCCCCCAAAT GGTACACTCG AGCGG (2) Informácie o SEQ ID NO:11:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 155 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ IS NO:11:

CCGCTCGAGG ATACCTATAG GTATGTGCAG TCACAGGCCA TTACCTGTCA AAAGCCCACT CCTGAAAAGG AAAAGCAAGA TCCCTATAAG GACATGAGTT

-44TTTGGGAGGT TAATTTAAAA GAAAAGTTTT CTAGTGAATT GGATCAGTTT CCTTT (2) Informácie o SEQ ID NO: 12:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 134 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligoméľ¹ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:12:

GGGACGCAAG TTTTTGTTAC AAAGTGGATA TAGGGGACGG ACCTCTGCTC GTACCGGTAT TAAGCGCCCT GCTGTTTCCA AACCCTCTAC TGCCCCTAAA CGTAAGCGCA CCAAAACTAA AAAGTAAGAT CTTC (2) Informácie o SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 154 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligoméľ* (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 13:

GAAGATCTTA Cl I I I IAGTT TTGGTGCGCT TACGTTTAGG GGCAGTAGAG GGTTTGGAAA CAGCAGGGCG CTTAATACCG GTACGAGCAG AGGTCCGTCC CCTATATCCA CTTTGTAACA AAAACTTGCG TCCCAAAGGA AACTGATCCA ATTC

-45(2) Informácie o SEQ ID NO: 14:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 135 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:14:

ACTAGAAAAC TTTTCTTTTA AATTAACCTC CCAAAAACTC ATGTCCTTAT AGGGATCTTG CTTTTCCTTT TCAGGAGTGG GCTTTTGACA GGTAATGGCC TGTGACTGCA CATACCTATA GGTATCCTCG AGCGG (2) Informácie o SEQ ID NO: 15:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 125 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:15:

' · ' ’ ·

CCGCTCGAGT GTACCATTTG GGGGAGGCGA TAACCCAAAG TTCCAGTCCT CGAGAACAGA GGGATTCATT GTGTGAATAT AGGCCATTAC TTCAGCAGAC AATGTAATGC TACATAATTG AAAAA (2) Informácie o SEQ ID NO:16:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 113 bázových párov

-46I (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 16:

TAAATTGTAA ATCAAACTCT TCCACATGAC GCATGTACTC GAATTGGTGT ATGTGGCAGA TTTAGATACG GATGCACATA GGTACTGCGT GTG (2) Informácie o SEQ ID NO:17:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 113 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:17:

GTATCTACCA CAGTAACAAA CAGATGATTA CCCCAACAAA ATGTCCCTGG GCTTTTTGTA GCCAATATGG CTTATTAAAC CAGAGGACAC CAA (2) Informácie o SEQ ID NO: 18:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 104 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna

TTTATAATCA

ATGTCATGTT

TACCATTGTT

AATTGTGCCT t

-47(ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 18:

AGAGCCGCTT GGGGTGTGAA CATATATACT ACTCGCTACA GACGAGCGAT TGTTACCACC CTTAACTAAA AGATCATCAG GCACAGGTTC CCCCACGGTA CCCC (2) Informácie o SEQ ID NO: 19:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 136 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligoméľ' (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 19:

GGGGTACCAG CCCTGTTAAA AAAATGTCTG GCAAACATTT GTTCCTTCCG TAGATAAAAA AATAATCTAT CACCATATGG GTCTGCAGCC ATTTGTAAAT AATCTGGATA TTTACATACA GTGCCACATA TGTCAA (2) Informácie o SEQ ID NO:20:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 125 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér

-48(xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:20:

GAGGAACATC TGATTTATTG GTCTGCAAAT CAGCAAAATT CATAGCACCA AAGCCTGTGT CAACCATATC GCCATCCTGT ATAACACTGG TAATAAGTTC TAAGGGCGGG CAGTCACCAT TCTGT (2) Informácie o SEQ ID NO:21:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 127 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:21:

ACAGATGTAT TACTACACTG TGTACCTTTA CCCCAATGCT CGCCCAAAGG GGGGGCACAT CCAACCATGC ATAATTGTGT TTGTTTATAA TCCATACCTA CATTAACCCT GTTATCCTGT CCAGGGT (2) Informácie o SEQ ID NO:22:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 116 bázových párov

I * (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:22:

-49TACCACCGTA ACCCCCTGAA TTTTCAACAT CATCATATTT ATTTAGTAAA GGATGTCCAC TTACACCCAC ACCTAATGGC TGTCCCCGGC CCACCTCTAG GCCTGTGCAT GCATGT (2) Informácie o SEQ ID NO:23:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 170 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:23:

ACATGCATGC CCATACCAAA CGTTGTGTTG TGGGATCAAA AAGAGACGAG TCAGGCAATG CAAATTTGTT AGGATCTGGT AACACCACCT TAAATACTCT GTATTGATAT CCTGACACCT TTGGCACAAC AGTTTTGTTA ACCI I I I ITA TGGAATAATA AGGATGACCC (2) Informácie o SEQ ID NO:24:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 150 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:24:

-50ACTGCAAGAA GTCTAGAACT GCTGGCATGA TAAAATATGT TGGTGCGTTT AACATAAGCA TCCGTGGCAA CAACTTTGGA TACAGGGTTA GGAGGAGGCA CATATACTGT GCTGTCGCTA GGCCGCCACA TTTTGTTTTG TGAGATCTTC (2) Informácie o SEQ ID NO:25:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 27 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:25:

GGAATTCACA TGCATGCACA GGCCTAG (2) Informácie o SEQ ID NO:26:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 26 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligonukleotid“ ' (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:26:

GGAATTCGGG GTACCAGCCC TGTTAA (2) Informácie o SEQ ID NO:27:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 45 bázových párov

-51 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:27:

TCGAAGACTG GAACTTTGGG TTATCGCCTC CCCCAAATGG TACAC (2) Informácie o SEQ ID NO:28:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 45 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:28:

TCGAGTGTAC CATTTGGGGG AGGCGATAAC CCAAAGTTCC AGTCT (2) Informácie o SEQ ID NO.29:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 45 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetická DNA molekula“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:29:

-52CTCAGATCTC ACAAAACAAA ATGTGGCGGC CTAGCGACAG CACAG (2) Informácie o SEQ ID NO:30:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 35 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:30:

GAGAGATCTT ACTTTTTGGT TTTGGTACGT TTTCG (2) Informácie o SEQ ID NO:31:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 34 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:31:

GAGAGATCTT ACCTTTTAGT TTTGGCGCGC TTAC (2) Informácie o SEQ ID NO:32:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 31 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno

-53(D)Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:32:

CTTAAAGCTT ATGTCACTTT CTCTTGTATC G (2) Informácie o SEQ ID NO:33:

(1) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 30 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:33:

TGATAAGCTT GCTCAATGGT TCTCTTCCTC (2) Informácie o SEQ ID NO:34:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 21 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina * l (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér“ (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:34:

TGGTCATCCC AAATCTTGAA A

-54(2) Informácie o SEQ ID NO:35:

(i) Charakteristika sekvencie:

(A) Dĺžka: 21 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: jedno (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: iná nukleová kyselina (A) Opis: /dese = „syntetický DNA oligomér (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO:35:

CACCGTAGTG TTTGGAAGCG A

Claims (16)

1. Formulácia antigénu ľudského papilomavírusu, vyznačujúca sa t ý m, že zahŕňa (a) vakcínovú zložku;

(b) soľ prítomnú vo fyziologicky prijateľnej koncentrácii; a (c) neiónové povrchovo aktívne činidlo prítomné vo fyziologicky prijateľnej koncentrácii.

2. Formulácia antigénu podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že vakcínová zložka ľudského papilomavírusu zahŕňa častice podobné vírusom.

3. Formulácia antigénu podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že častice podobné ľudskému papilomavírusu zahŕňajú buď proteín L1 alebo proteín L1 a L2.

4. Formulácia antigénu podľa nároku 3, vyznačujúca sa tým, že častice podobné ľudskému papilomavírusu sa volia zo skupiny ľudského papilomavírusu typu 6a, 6b, 11,16,18 a akejkoľvek ich kombinácie.

5. Formulácia antigénu podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že soľ sa volí zo skupiny pozostávajúcej z chloridu sodného, síranu sodného, síranu amónneho, octanu sodného, citronanu sodného a fosforečnanu sodného, alebo iných prijateľných tlmivých iónov, výsledkom ktorých je roztok s dostatočnou iónovou silou.

6. Formulácia antigénu podľa nároku 5, vyznačujúca sa tým, že soľ je chlorid sodný.

7. Formulácia antigénu podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že chlorid sodný je prítomný v koncentrácii približne 50 mM až 500 mM.

-568. Formulácia antigénu podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že chlorid sodný je prítomný v koncentrácii približne 150 mM až 300 mM.

9. Formulácia antigénu podľa nároku 8, vyznačujúca sa tým, že neiónové povrchovo aktívne činidlo sa volí zo skupiny neiónových povrchovo aktívnych činidiel, ktoré sú polysorbáty, polyoxyetylén alkylétery, Triton X-100®, Triton 114®, NP40®, Span 85 a Pluronic 121.

10. Formulácia antigénu podľa nároku 9, v y z n a č u j ú c a sa tým, že polysorbát je Polysorbate 80.

11. Formulácia antigénu podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že Polysorbate 80 je prítomný v koncentrácii približne až 0,2 % hmotnosť/objem.

12. Formuláciaantigénu podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že polysorbát, napríklad Polysorbate 80, je prítomný v koncentrácii približne až 0,01 % hmotnosť/objem.

13. Formulácia antigénu vírusu ľudského papilomavírusu, vyznačujúca sa t ý m, že zahŕňa:

(a) populáciu častíc podobných ľudskému papilomavírusu zahŕňajúcu proteín L1 ľudského papilomavírusu volený zo skupiny pozostávajúcej z typu 6a, 6b, 11, 16 a 18;

(b) chlorid sodný v koncentrácii približne 150 mM až 300 mM; a (c) Polysorbate 80 v koncentrácii približne až 0,1 % hmotnosť/objem.

14. Spôsob stabilizácie populácie vyčistených častíc podobných vírusu odvodených od proteínu L1 alebo od proteínu L1 a L2 ľudského papilomavírusu pri teplote približne nad 0 °C počas aspoň jedného mesiaca, vyznačujúci sa t ý m, že zahŕňa umiestnenie uvedených vyčistených častíc podobných vírusu vo

-57formulácii obsahujúcej chlorid sodný v koncentrácii približne 50 mM až 500 mM a Polysorbate 80 v koncentrácii aspoň 0,2 % hmotnosť/objem.

15. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že vakcínová formulácia zahŕňa chlorid sodný v koncentrácii približne 150 mM až 300 mM.

16. Spôsob podľa nároku 17, vy z n a č u j ú c i sa t ý m, že Polysorbate 80 je prítomný v koncentrácii aspoň 0,1 % hmotnosť/objem.

17. Spôsob podľa nároku 16, vy z n a č u j ú c i sa t ý m, že formulácia je stabilná pri teplote približne 2 až 8 °C aspoň jeden mesiac.