CZ356799A3

CZ356799A3 - Prostředek obsahující antigen lidského papilomaviru

Info

Publication number: CZ356799A3
Application number: CZ19993567A
Authority: CZ
Inventors: Gautum Sanyal; David B. Volkin; Li Shi
Original assignee: Merck & Co., Inc.
Priority date: 1998-04-07
Filing date: 1998-04-07
Publication date: 2000-04-12

Abstract

Prostředky obsahující antigen lidského papilomaviru (HPV), ve kterých nedochází k agregaci proteinu a které mají ve formě vodných roztoků prodlouženou stabilitu. Tyto prostředky obsahují sůl (například chlorid sodný) aneiontový surfaktant (Polysorbat 80 jakoje například Tween 80R) ve fyziologicky přijatelných koncentracích.

Description

Předkládaný vynález se týká prostředků obsahujících antigen lidského papilomaviru, které mají zvýšenou stabilitu antigenu a redukovanou agregaci a srážení antigenu. Předkládaný vynález se také týká způsobů přípravy HPV vakcin obsahujících adjuvans využívajících prostředky obsahující antigen lidského papilomaviru, které jsou zde popsány. Předkládaný vynález se také týká vakcin obsahujících adjuvans proti lidskému papilomaviru vyrobených z těchto prostředků obsahujících antigen lidského papilomaviru.

Dosavadní stav techniky

Infekce papilomaviry (PV) se vyskytuje u mnoha zvířat, včetně lidí, ovcí, psů, koček, králíků, opic, hadů a krav. Papilomaviry infikují epitelové buňky a obyčejně indukují benigní epitelové nebo fibroepitělové nádory v místě infekce. Papilomaviry jsou druhově specifickými infekčními agens.

Papilomaviry jsou klasifikovány do různých skupin podle hostitele, kterého infikují. Lidské papilomaviry (HPV) jsou dále klasifikovány do více než 70 typů podle studií založených na hybridizaci DNA. PV typy se zdají být typově specifickými imunogeny v tom, že neutralizační imunita k infekci jedním typem papilomaviru nezpůsobuje imunitu proti infekci jiným typem papilomaviru.

U lidí způsobují různé typy HPV různá onemocnění. HPV typu 1,

2, 3, 4, 7, 10 a 26-29 způsobují benigní bradavice jak u normálních, tak u imunokompromitovaných jedinců. HPV typů 5, 8, • · · · ·

9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 a 46-50 způsobují plošné léze u ímunokompromitovaných jedinců. HPV typů 6, 11, 34, 39, 41-44 a 51-55 jsou příčinou nemaligních kondylomat genitální nebo respirační sliznice. HPV typů 16, 18, 31, 33, 35, 45 a 58 jsou příčinou epitelové dysplasie genitální sliznice a jsou spojeny s většinou karcinomů in šitu a invazivních karcinomů čípku děložního, pochvy, vulvy a análního kanálu.

Papilomaviry jsou malé (50-60 nm) , neobalené, icosahedrální DNA viry, které kódují až osm časných a dva pozdní geny. Otevřené čtecí rámce (ORF) virových genomů jsou označeny El až E8 a LI a L2, kde E znamená časné a a L pozdní. Časné (E) geny jsou spojeny s funkcemi jako je replikace viru, regulace transkripce a buněčná transformace.

LI protein je hlavní protein kapsidy a má molekulovou hmotnost 55-60 kDa. L2 je vedlejší protein kapsidy a má předpokládanou molekulovou hmotnost 55-60 kDa a zjevnou molekulovou hmotnost 75-100 kDa, jak je stanovena pólyakry1amidovou gelovou elektroforesou. Imunologická data naznačují, že většina L2 proteinů je umístěna uvnitř vzhledem k LI proteinu ve virové kapsomeře. LI ORF je značně konzervován mezi různými papilomaviry. L2 proteiny jsou mezi různými papilomaviry konzervovány méně.

LI a L2 geny byly identifikovány jako dobré cíle pro imunoprofylaxi. Bylo také zjištěno, že některé časné geny jsou potenciálními cíly pro vývoj vakcin. Studie provedené s papilomaviry na cottontail králících (CRPV) a hovězích papilomavirech (BVP) prokázaly, že imunizace rekombinantními LI a/nebo L2 proteiny (produkovanými v bakteriích nebo za použití vakciniových vektorů) chránily zvířata před virovou infekcí. Exprese LI genů papilomaviru v bakulovirových expresních systémech nebo za použití vakciniových vektorů vedla k přípravě viru-podobných částic (VLP), které byly použity pro indukci produkce vysokého titru virus-neutralizujících protilátek, které korelují s ochranou před infekcí. Dále byly LI a L2 geny použity pro přípravu vakcin pro prevenci a léčbu papilomavirových infekcí u zvířat.

Viru-podobné částice obsahující HPVll LI protein byly exprimovány jak ve hmyzích, tak v savčích buněčných systémech. Exprese VLP v kvasinkách je také výhodná, jelikož je levná a snadno se adaptuje na průmyslovou výrobu ve fermentorech.

Nicméně, HPV11 LI protein je v kvasinkách exprimován s nízkým výtěžkem. Bylo zjištěno, že to je způsobeno zkrácením HPVll LI mRNA. Naopak, HPV6 LI gen je transkribován jako kompletní mRNA a je exprimován ve vysokých hladinách. Modifikováním HPV6 LI DNA tak, aby kódovala HPVll LI protein, je možné dosáhnout usnadnění transkripce kompletní mRNA, což povede k vyšší expresi HPVll LI proteinu.

LI a L2 geny byly použity pro výrobu vakcin pro prevenci a léčbu papilomavirových infekcí u zvířat. LI a L2 geny HPV typu 16 byly klonovány do vektoru vakcinia viru a savčí buňky CV-1 byly infikovány rekombinantním vektorem za zisku viru-podobných částic (VLP) .

Byly připraveny rekombinantní LI a L2 hovězího papilomaviru získané z bakterií. Neutralizační sérum k rekombinantním bakteriálním proteinům zkříženě reagovalo s nativním virem při nízkých koncentracích, pravděpodobně z důvodů odlišností v konformaci nativních a bakteriálních proteinů.

Rekombinantní bakuloviry exprimující HPV16 LI nebo HPV16 L2 ORF byly použity pro infekci hmyzích SF9 buněk a produkci LI a L2 • · • · ► · · · ‘ · · · ··· ··· proteinů. Western blot analýzy ukázaly, že LI a L2 proteiny připravené za použití bakuloviru reagují s protilátkou k HPV16.

LI připravený v bakuloviru tvoří VLP.

Jansen et al. (1995, Vaccine 13(16): 1509-1514) použil pracovní pufr obsahující chlorid sodný a Tween 80®· při přečištění LI a L1+L2 VLP z cottontail králičích papilomavirů.

V současnosti musí být přípravky obsahující přečištěné rekombinantní VLP skladovány za přítomnosti vysokých koncentrací NaCl pro prevenci agregace v roztoku. Při nízkých koncentracích iontů agreguje HPV VLP tak, že se vysráží z roztoku. Na základě těchto a podobných pozorování byly zásobní roztoky HPV skladovány v lyofilizovaném stavu za přítomnosti vysokých koncentrací NaCl (1,25 - 2,5 M) . Vysoce agregované vzorky HPV li VLP mají špatnou antigenicitu in vitro, jak je měřena RIA, EIA nebo BIA core testy. Proto existuje potřeba vodného HPV VLP prostředku, který je stabilní při fyziologických koncentrací solí i při přijatelně dlouhodobém skladování. Předkládaný vynález se týká této potřeby a splňuje tuto potřebu.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká prostředků obsahujících antigen lidského papilomavirů (HVP), ve kterých nedochází k agregaci antigenu a které mají vyšší stabilitu antigenu při fyziologických koncentracích solí za přítomnosti surfaktantu.

Předkládaný vynález se také týká přípravy HPV vakciny obsahující adjuvans, která je připravena smísením prostředku obsahujícího HPV antigen podle předkládaného vynálezu s biologicky účinným množstvím adjuvans, čímž vznikne HPV vakcina obsahující adjuvans.

* · ♦ * · ♦ • · · · · • · ·· · « « « • · · ·♦··· · « ·· • ·

Prostředky obsahující HPV antigen a vakciny obsahující adjuvans podle předkládaného vynálezu obsahují, bez omezení, jako antigenní složku viru-podobné částice vyrobené jako rekombinantní HPV podjednotková vakcina obsahující bud' LI, nebo kombinaci LI a L2 proteinů z HPV typů 6a, 6b, 11, 16 a 18. Předkládaný vynález zahrnuje stabilizaci monovalentních forem této rekombinantní vakciny, stejně jako divalentních forem (jako jsou například rekombinantní HPV11 LI, HPV16 LI a HPV6a LI) a multivalentních forem (jako je například HPV11 LI, HPV6a LI, HPV16 LI a HPV18 LI) .

Předkládaný vynález se také týká prostředků obsahujících HPV antigen, které obsahují fyziologické koncentrace solí a surfaktant, což umožňuje dosažení vyšší stability vakcinační složky prostředku při teplotách vyšších než je 0 °C. HPV prostředky podle předkládaného vynálezu by měly být vhodné pro dlouhodobé skladování po dobu od nejméně 1 měsíce do přibližně 2 let při přibližně 2 °C až přibližně 8 °C.

V jednom provedení se předkládaný vynález týká prostředků obsahujících HPV antigen, které obsahují fyziologicky přijatelnou sůl, jako je například chlorid sodný, síran sodný a síran amonný. Důvodem použití soli v prostředku je dosažení požadované iontové koncentrace. Koncentrace iontů může být tvořena ionty pufrovacích sloučenin, jako jsou fosfát, citrát, acetat, jantaran, Tris-HCl, MOPS atd., stejně jako ionty nepufrovacích sloučenin.

V jiném provedení se předkládaný vynález týká rostředků obsahujících HPV antigen, které obsahují neiontový surfaktant, jako jsou například polyoxyethylensorbitanové estery mastných kyselin (Polysorbaty) jako je Polysorbate 80 (například Tween 80^R), Polysorbate 60 (například Tween 60^R) a Polysorbate 20 (například Tween 20^R), polyoxyethylenalkylethery (například Brij • · · ·

58^R, Brij 35^R), stejně jako další sloučeniny, jako je například Triton X-100^R, Triton X-114^R, NP40^R, Spán 85 a Pluronic serie neiontových surfaktantů (například Plurionic 121).

V dalším provedení se předkládaný vynález týká prostředku obsahujícího HPV antigen v přítomnosti fyziologicky přijatelného pufru, který obsahuje neiontový surfaktant uvedený výše, který je obsažen v koncentraci až do přibližně 0,2 % (hmot./objem) a fyziologicky přijatelnou sůl, kterou je chlorid sodný v koncentraci od 10 mM do 500 mM.

V jiném provedení se předkládaný vynález týká prostředků obsahujících HPV antigen v přítomnosti fyziologicky přijatelného pufru, který obsahuje neiontový surfaktant uvedený výše, který je obsažen v koncentraci až do přibližně 0,2 % (hmot./objem) a fyziologicky přijatelnou sůl, kterou je chlorid sodný v koncentraci od 50 mM do 400 mM.

V ještě jiném provedení se předkládaný vynález týká prostředků obsahujících HPV antigen v přítomnosti fyziologicky přijatelného pufru, který obsahuje neiontový surfaktant uvedený výše, který je obsažen v koncentraci až do přibližně 0,2 % (hmot./objem) a fyziologicky přijatelnou sůl, kterou je chlorid sodný v koncentraci od 150 mM do 300 mM.

V dalším provedení se předkládaný vynález týká prostředků obsahujících HPV antigen v přítomnosti fyziologicky přijatelného pufru, ve kterých je fyziologicky přijatelnou solí chlorid sodný v koncentraci od přibližně 10 mM do přibližně 500 mM a neiontovým surfaktantem je Polysorbát 80 (včetně například Tween 80^R), který je přítomen až v koncentraci 0,2% (hmot./obj.).

V dalším provedení se předkládaný vynález týká prostředků • · · · · ·· frfr * · · fr ► · · · • frfr frfrfr • · • · c · obsahujících HPV antigen v přítomnosti fyziologicky přijatelného pufru, ve kterých je fyziologicky přijatelnou solí chlorid sodný v koncentraci od přibližně 10 mM do přibližně 500 mM a neiontovým surfaktantem je Polysorbat 80 (včetně například Tween 80^R), který je přítomen až v koncentraci od přibližně 0,01% do přibližně 0,1% (hmot./obj.).

Výhodným provedením předkládaného vynálezu jsou prostředky obsahující HPV antigen v přítomnosti fyziologicky přijatelného pufru, ve kterých je chlorid sodný přítomen v koncentraci od přibližně 50 mM do přibližně 400 mM, Polysorbat 80 (včetně například Tween 80^R) je přítomen v koncentraci od přibližně 0,01% do přibližně 0,1% (hmot./obj.).

Zejména výhodným provedením předkládaného vynálezu jsou prostředky obsahující HPV antigen v přítomnosti fyziologicky přijatelného pufru, ve kterých je chlorid sodný přítomen v koncentraci od přibližně 150 mM do přibližně 300 mM, Polysorbat 80 (včetně například Tween 80^R) je přítomen v koncentraci od přibližně 0,01% do přibližně 0,1% (hmot./obj.

Odborníkům v oboru je dobře známo, že prostředky obsahující HPV antigen podle předkládaného vynálezu ve fyziologicky přijatelném pufru jsou výhodně, ale ne nezbytně omezeny na prostředky pufrované fosfátem, citrátem, acetatem, sukcinatem, Tris-HCL nebo MOPS, výhodně při pH v rozmezí od 5,0 do 9,0, lépe při pH v rozmezí d 6,0 do 8,0.

Předkládaný vynález se také týká způsob pro přípravu HPV vakcinačních prostředků, které obsahují použití prostředků obsahujících HPV antigen podle předkládaného vynálezu. Tyto vylepšené techniky přípravy jak HPV vakcin obsahujících kamenec, tak HPV vakcin neobsahujících kamenec, jsou zde popsány.

φ φ

Předkládaný vynález se také týká HPV vakcin obsahujících adjuvans, ve kterých je biologicky účinné množství adjuvans smíseno s biologicky účinným množstvím prostředku obsahujícího antigen podle předkládaného vynálezu.

Termín PV, jak je zde použit, je zkratkou pro papilomavirus.

Termín HPV, jak je zde použit, papilomavirus.

Termín VLP, jak je zde použit, částici.

je zkratkou pro lidský je zkratkou pro viru podobnou

Termín fyziologicky přijatelný, jak je zde použit, označuje pufr, přísadu nebo sůl, jejíž koncentrace nebo iontová síla je taková, že prostředek je biologicky kompatibilní s imunizovaným hostitelem, jako je člověk.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 ukazuje vliv ředění proteinu na závislost hydrodynamické velikosti na čase pro HPV11 LI VLP (50 mM MOPS, pH 7,0, 1,25 M NaCl) během 2 měsíců při 4 °C. (□) 470 mcg/ml; () mcg/ml.

Obr. 2 ukazuje vliv koncentrace solí na HPV11 a HPV16 LI VLP hydrodynamickoou velikost v průběhu skladování při pokojové teplotě. Vzorky byly ředěny do pufru a po jedné hodině byly analyzovány. V případě HPV11 byly vzorky také dialyzovány přes noc proti stejnému pufru. HPV11 LI VLP byl připraven v 50 mM MOPS pufru (pH 7,0) obsahujícím různé koncentrace NaCl, (o) bez dialýzy; (□) dialýza. HPV16 LI VLP byl připraven v 50 mM MOPS pufru (pH 7,0) obsahujícím různé koncentrace NaCl, (·) bez • · dialýzy.

Obr. 3 ukazuje vliv adsorpce proteinu na dialyzační membránu na hydrodynamickou velikost (O a koncentraci proteinu () (jako procento zbývajícího HPV11 LI) pro 50 mcg/ml HPV11 LI VLP v 50 mM MOPS, pH 7,0 při 180 mM NaCl v polypropylenové zkumavce při pokojové teplotě pro 96 hodin.

Obr. 4 ukazuje vliv polystyrenu (o), polypropylenu (·) a skla (Φ) na HPV11 LI VLP adsorpci v 50 mM MOPS, pH 7,0 při 1,25 M NaCl při pokojové teplotě pro 24 hodin.

Obr. 5 ukazuje vliv zvyšujícího se poměru povrch/objem na HPV LI VLP (18 mcg/ml) adsorpci na polypropylen v 50 mM MOPS, pH 7,0, 0,25 M NaCl. (D) povrch/objem=4 cm'¹;!·) povrch/objem=6 cm^-1

Obr. 6A a Obr. 6B ukazuje vliv různých surfaktantů (při 0,01%) na stabilitu HPV11 LI VLP (18 mcg/ml) v 50 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl při pokojové teplotě během 20 hodin (panel A) a v 50 mM MOPS, pH 7,0, 40 mM NaCl při 50 °C během 30 minut a potom při pokojové teplotě během 48 hodin (panel B) před analýzou dynamickým rozptylem světla (DLS).

Obr. 7A a 7B ukazují vliv polysorbatu 80 (například Tween 80^R) na adsorpci na povrch (panel A) a agregaci (panel B) HPV11 LI VLP (16 mcg/ml) na polypropylenový povrch při pokojové teplotě v 50 mM MOPS, pH 7,0, při různých iontových sílách: (·) 0,4 M (NH ) SO + 0,01% Tween 80 ^R; (o) 0,1 M (NH ) SO ; (0) 0,5 M

4í ·4 2 4b (NH ) SO ; (x) 0,1 M Na SO ; (I) 0,5 M Na SO ; (Δ.) 0,1 M NaCl; a

() 0,5 M NaCl.

Obr. 8 ukazuje vliv Polysorbatu 80 (například Tween 80^R na hydrodynamický průměr a HPV11 LI VLP koncentraci HPV11 LI VLP ·*·· (18 mcg/ml) proti polypropylenovému povrchu v 50 mM MOPS, pH 7,0,

250 mM NaCl při teplotě okolí za čas. Koncentrace proteinu je měřena jako procento počáteční koncentrace proteinu. Snížení koncentrace proteinu je nepřímo úměrné adsorpci na povrch, (x) 0,

01% Tween 80^R, koncentrace proteinu; (A) bez Tween 80^R, koncentrace proteinu; () 0,01% Tween 80^R, hydrodynamický průměr; (♦) bez Tween 80^R, hydrodynamický průměr.

Obr. 9 ukazuje kombinovaný vliv koncentrací NaCl a Polysorbatu 80 (například Tween 80^R) na hydrodynamickou velikost pro HPV11 LI VLP (18 mcg/ml) v 50 mM MOPS, pH 7,0, s (·) 40 mM NaCl a 0,

01% Tween 80^R; (ty 100 mM NaCl a 0,01% Tween 80^R; a (o) 40 mM NaCl a bez Tween 80^R.

Obr. 10A a 10B ukazují vliv koncentrace Polysorbatu 80 (například Tween 80^R) ((·) 0,000% hmot./obj.; (o) 0,001% hmot./obj.; () 0,005% hmot./obj.; (O) 0,010% hmot./obj.) na hydrodynamickou velikost pro HPV11 LI VLP (18 mcg/ml) v 50 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl při 4 °C (panel A) a při pokojové teplotě (panel B) v závislosti na čase.

Obr. 11 ukazuje vliv různých surfaktantů (při 0,01%) na stabilitu HPV16 LI VLP (20 mcg/ml) v 50 mM MOPS, pH 7,0, 150 mM NaCl při pokojové teplotě po dobu 50 dnů před analýzou dynamickým rozptylem světla (DLS).

Předkládaný vynález se týká prostředků obsahujících antigen lidského papilomaviru (HVP), ve kterých nedochází k agregaci antigenů a které mají vyšší stabilitu antigenů při fyziologických koncentracích solí za přítomnosti surfaktantu.

Předkládaný vynález se také týká přípravy HPV vakciny • 9 · ·9 ·

- »· 9 * · · . , “ · · · · • · ··· ... * · · • ·♦·· ..

obsahující adjuvans, která je připravena smísením prostředku obsahujícího HPV antigen podle předkládaného vynálezu s biologicky účinným množstvím adjuvans, čímž vznikne HPV vakcina obsahující adjuvans.

Prostředky obsahující HPV antigen a vakciny obsahující adjuvans podle předkládaného vynálezu obsahují, bez omezení, jako antigenní složku viru-podobné částice vyrobené jako rekombinantní HPV podjednotková vakcina obsahující buď LI, nebo kombinaci LI a L2 proteinů z HPV typů 6a, 6b, 11, 16 a 18. Předkládaný vynález zahrnuje stabilizaci monovalentních forem této rekombinantní vakciny, stejně jako divalentních forem (jako jsou například rekombinantní HPV11 LI, HPV16 LI a HPV6a LI) a multřvalentnich forem (jako je například HPV11 LI, HPV6a LI, HPV16 LI a HPV18 LI). Ačkoliv je rekombinantní HPV11 LI VLP použit v předkládaném vynálezu jako příklad, neznamená omezení typů HPV, které mohou být připraveny pro stabilizaci prostředků obsahujících antigen podle předkládaného vynálezu. Ve skutečnosti je po prostudování této přihlášky zřejmé, že zde popsané vakcinační prostředky mohou být použity pro stabilizaci jiných vakcinačních prostředků, včetně například jiných VLP odvozených od HPV. Například, HPV vakcinační prostředky podle předkládaného vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny pouze na tyto prostředky, virové částice generované jako rekombinantní HPV podjednotkové vakciny obsahující buď LI, nebo kombinaci LI a L2 proteinů z HPV typů 6a, 6b, 11, 16 a 18. Proto, jak bylo uvedeno výše, je také zřejmé, že prostředky podle předkládaného vynálezu budou užitečné pro stabilizaci různých divalentních a multivalentnich prostředků, včetně divalentních (jako jsou například rekombinantní HPV11 LI a HPVGa LI) a multivalentních (jako je například HPV11 LI, HPV6a LI, HPV16 LI a HPV18 LI) HPV prostředků.

Proto se předkládaný vynález týká antigenních prostředků obsahujících neiontový surfaktant, který stabilizuje HPV VLP za fyziologicky aktivních koncentrací solí a pufrů při různých použitelných koncentracích proteinu a výhodných skladovacích teplotách. HPV prostředky podle předkládaného vynálezu by měly být vhodné pro dlouhodobé skladování podobu alespoň jednoho měsíce až přibližně 2 let při teplotách od přibližně 2 °C do přibližně 8 °C. Tyto prostředky mohou být smíseny s adjuvans, včetně známých adjuvans obsahujících kamenec, jako je fosforečnan hlinitý, hydroxyfosforečnan hlinitý a oxyhydroxid hlinitý. Také je možné použití antigenních prostředků podle předkládaného vynálezu s nekamencovými adjuvans, zejména s nekamencovými adjuvans, které jsou prostředky s negativním nábojem s vysokou iontovou koncentrací, které jsou použity pro HPV VLP.

Je známo, že při nízkých iontových koncentracích HPV11 LI VLP agreguje až je vysrážen z roztoku. Je známo, že vysoce agregované vzorky HPV11 LI VLP mají slabou antigenicitu in vitro (například v RIA, EIA nebo BIA core testech). Data uvedená v příkladu 3 ukazují, že HPV11 LI VLP (470 mcg/ml v 50 mM MOPS/1,25 M NaCl) se nechal roztát a část roztoku byla ředěna ana 18 mcg/ml ve stejném pufru. V roztoku s nižší koncentrací proteinu docházelo za čas k agregaci, i když byla koncentrace NaCl udržována na 1,25 M NaCl. Proto samotná vysoká koncentrace soli nebrání agregaci HPV VLP. Data uvedená v příkladu 4 testujícím různé koncentrace NaCl (buď při skladování nebo při dialýze zásobního roztoku během krátkého časového období) ukazují, že snížení koncentrace NaCl na nižší úroveň (přibližně 150 mM a nižší) vede k agregaci proteinu (po které následuje srážení). Pro překonání tohoto problému může být roztok obsahující HPV11 LI VLP skladován zmrazený za přítomnosti vysokých koncentrací NaCl (od přibližně 1,25 M do 2,5 M) . Část předkláldaného vynálezu se týká různých prostředků obsahujících HPV VLP, ve kterých nedochází k agregaci při fyziologických koncentracích solí při použitelných teplotách. Prostředky podle » ·· • · · • » 4 ► · · « · * · ·· předkládaného vynálezu usnadňují dlouhodobé skladování stabilních roztoků HPV VLP při 4 °C a umožňují provedení studií imunogenicity jak HPV samotného, tak HPV spolu s adjuvans tvořeným hlinitou solí nebo tvořeným jiným než hlinitým adjuvans.

Dále, v příkladu 5 je popsáno, že kontaktování HPV VLP s různými povrchy také způsobí agregaci. Je zde uvedeno, že zvyšující se kontaktní plocha pro HVP VLP (například dialyzační membrána nebo skladovací nádobka) zvyšuje hydrodynamickou velikost VLP. Toto zvýšení agregace vede k současnému snížení proteinové koncentrace HPV VLP roztoku, což ukazuje na adsorpci HPV VLP na povrch membrány a naznačuje vztah mezi adsorpci na povrch a agregací. Proto se také předkládaný vynález týká kontaktu vakciny s výhodným povrchem zásobníku. Data naznačují, že HPV11 LI VLP (50 mM MOPS/1,25 M NaCl, pH 7,0) inkubovaný při pokojové teplotě po dobu 24 hodin vykazuje signifikantní adsorpci na borosilikátové sklo, zatímco v případě polystyrenu není pozorována žádná signifikantní adsorpce.

Příklad 6 obsahuje data ukazující výhodné přísady a soli pro prostředky podle předkládaného vynálezu.

Tak se základ předkládaného vynálezu týká prostředků obsahujících HPV antigen, které obsahují fyziologické koncentrace solí, do kterých je přidán neiontový surfaktant, takže je dosaženo toho, že antigenní složka má dlouhodobější stabilitu při teplotách od přibližně 0 °C do přibližně 40 °C, stejně jako toho, že prostředek je odolný vůči agregaci, která je často pozorována u známých prostředků obsahujících HPV. V tomto ohledu se předkládaný vynález týká HPV vakcinačního prostředku, který obsahuje sůl, kterou je například chlorid sodný, síran sodný a síran amonný, která je přítomna v takové iontové síle, která je fyziologicky přijatelná pro hostitele. Důvodem obsažení soli v prostředku je dosažení požadované iontové síly. Iontová síla může být tvořena jak pufrovacími sloučeninami, tak ionty nepufrovacích solí.

Zejména výhodný aspekt předkládaného vynálezu se týká prostředků obsahujících HPV antigen, které obsahují sůl ve fyziologicky přijatelné koncentraci, do kterých je přidáno minimální množství neiontového surfaktantu, který zvýší stabilitu vakcinační složky prostředku. Mezi neiontové surfaktanty pro použití v antigenních patří - bez omezení

- polyoxyethylensorbitanové estery mastných kyselin jako je například Polysorbate 80 (Tween 80¹*) , Polysorbate 60 (Tween 60^R) a Polysorbate 20 {Tween 20^R), polyoxyethylenalkylethery (například Brij 58^R, Brij 35^R), stejně jako další sloučeniny, jako je například Triton X-100^R, Triton X-114^R·, NP40^R, Spán 85 a Pluronic serie neiontových surfaktantů (například Plurionic 121) .

V ještě jiném provedení se předkládaný vynález týká prostředků ♦ * · · · · obsahujících HPV antigen v přítomnosti fyziologicky přijatelného pufru, který obsahuje neiontový surfaktant uvedený výše, který je obsažen v koncentraci až do přibližně 0,2 % (hmot./objem) a fyziologicky přijatelnou sůl, kterou je chlorid sodný v koncentraci od 150 mM do 300 mM.

V dalším provedení se předkládaný vynález týká prostředků obsahujících HPV antigen v přítomnosti fyziologicky přijatelného pufru, ve kterých je fyziologicky přijatelnou solí chlorid sodný v koncentraci od přibližně 10 mM do přibližně 500 mM a neiontovým surfaktantem je Polysorbat 80 (včetně například Tween 80^R), který je přítomen až v koncentraci 0,2% (hmot./obj.).

V dalším provedení se předkládaný vynález týká prostředků obsahujících HPV antigen v přítomnosti fyziologicky přijatelného pufru, ve kterých je fyziologicky přijatelnou solí chlorid sodný v koncentraci od přibližně 10 mM do přibližně 500 mM a neiontovým surfaktantem je Polysorbat 80 (včetně například Tween.80^R), který je přítomen až v koncentraci od přibližně 0,01% do přibližně

0,1% (hmot./obj.).

Výhodným provedením předkládaného vynálezu jsou prostředky obsahující HPV antigen v přítomnosti fyziologicky přijatelného pufru, ve kterých je chlorid sodný přítomen v koncentraci od přibližně 50 mM do přibližně 400 mM a Polysorbat 80 (včetně například Tween 80^R) je přítomen v koncentraci od přibližně 0,01% do přibližně 0,1% (hmot./obj.).

Zejména výhodným provedením předkládaného vynálezu jsou prostředky obsahující HPV antigen v přítomnosti fyziologicky přijatelného pufru, ve kterých je chlorid sodný přítomen v koncentraci od přibližně 150 mM do přibližně 300 mM a Polysorbat 80 (včetně například Tween 80^R) je přítomen

• · · · • · · 9 • 9 ·* ♦· v koncentraci od přibližně 0,01% do přibližně 0,1% (hmot./obj.).

Odborníkům v oboru je dobře známo, že prostředky obsahující HPV antigen podle předkládaného vynálezu ve fyziologicky přijatelném pufru jsou výhodně, ale ne nezbytně, omezeny na prostředky pufrované fosfátem, citrátem, acetatem, sukcinatem, Tris-HCL nebo MOPS, výhodně při pH v rozmezí od 5,0 do 9,0, lépe při pH v rozmezí d 6,0 do 8,0.

Prostředky podle předkládaného vynálezu umožňují skladování HPV roztoků při téměř fyziologických koncentracích solí v nezmraženém stavu. Proto umožní eliminaci kroků zmrazení a rozpuštění a umožní přímou přípravu roztoků HPV VLP s adjuvans buď adsorpcí na hlinité adjuvans, nebo přípravou s jiným než hlinitým adjuvans, při vhodné iontové síle.

Proto předkládaný vynález popisuje zepšené způsoby pro přípravu HPV vakcin obsahujících adjuvans, které nevyžadují také výrazné změny teplot a koncentrací solí před smísením s hlinitým adjuvans. Například mohou být antigenní prostředky podle předkládaného vynálezu připraveny a skladovány při 4 °C před smísením s hlinitým adjuvans. Takový antigenní prostředek je smísen s hlinitým adjuvans jako je fosforečnan hlinitý, hydroxyfosforečnan hlinitý a oxyhydroxid hlinitý. Pokud je to žádoucí, může být přidáno konzervační činidlo jako je thimersol. Způsob podle předkládaného vynálezu umožní dlohodobé skladování původního antigenního prostředku při teplotách od přibližně 2 °C do přibližně 8 °C po dobu až dvou let.

Po prostudování této přihlášky je jasné, že jednou výhodou prostředků obsahujících HPV antigen podle předkládaného vynálezu je možnost jejich přímého míšení s hlinitými nebo jinými než hlinitými adjuvans při fyziologicky přijatelných koncentracích.

5.· ·: · :

55:··· ·· · ...····

• · ·· ·>

Po prostudování této přihlášky je také jasné, že jinou výhodou je zvýšená stabilita při teplotách vyšších než je bod mrazu, t.j. od 0 °C do 40 °C, a zejména při teplotách od 2 °C do 8 °C, takže mohou být tyto prostředky přímo přidány do vhodných adjuvans obsahujících hliník nebo neobsahujících hliník. Jinými slovy, prostředky podle předkládaného vynálezu jsou také vhodné pro přímou přípravu HPV roztoků s adjuvans neobsahujícími hliník při fyziologických koncentracích solí.

Je třeba si uvědomit, že ačkoliv byly uvedeny výhodné prostředky, vynález také zahrnuje jiná provedení. Vynález zahrnuje uvedené a další antigenní prostředky podle předkládaného vynálezu obsahující soli ve fyziologicky přijatelných iontových koncentracích, fyziologicky přijatelný pufr a surfaktant v biologicky přijatelných koncentracích, u kterých je dosaženo vyšší stability vakcinační složky,, redukce tendence k agregaci nebo vysrážení z roztoku, a kde tyto prostředky jsou vhodné pro skladování při výhodnějších teplotách po delší dobu.

Dávkový režim použitý pro HPV vakcinační prostředky podle předkládaného vynálezu může být vybrán po zvážení různých faktorů jako je typ, druh, věk, hmotnost, pohlaví a zdravotní stav pacienta; závažnost léčeného onemocnění; způsob podání; jaterní a ledvinné funkce pacienta; a typ konkrétního použitého prostředku. Odborník v oboru snadno určí a předepíše účinné množství HPV vakciny nutné pro prevenci, léčbě nebo zastavení progrese stavu.

Následující příklady jsou ilustrativní a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

*· ····

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Nadměrná exprese rekombinantního HPV11 LI VLP

Konstrukce syntetického LI genu

Nadměrná exprese a přečištění HPV11 LI VLP je popsáno v U.S. přihláškách pořadové č. 08/413571 a 08/413572, podaných 30.3.1995, a tento postup je také popsán v tomto příkladu pouze pro ilustraci, nikoliv jako omezení způsobů, které mohou být použity pro výrobu rekombinantních HPV VLP. Tento vynález popisuje použití rekombinantních HPV11 LI a HPV16 LI jako příkladů prostředků podle předkládaného vynálezu. Odborníkům v oboru bude známo, že technologie rekombinantní DNA může být použita pro přípravu rekombinantních HPV VLP uvedených v předkládaném vynálezu. Je také známo, že pro nadměrnou expresi HPV VLP, které mohou být použity v antigenních prostředcích podle předkládaného vynálezu, může být použito jiných hostitelů než kvasinek.

Byl připraven 1,5 kb otevřený čtecí rámec HPV11 LI za použití syntetických DNA oligomerů získaných od Midland Reagent Company. Tyto oligomery byly dodány s 5¹-koncovými fosfáty. Bylo potřeba celkem 24 oligomerů, které jsou uvedeny dále.

#241-1

5’-GAAGATCTCACAAAACAAAATGTGGCGGCCTAGCGACAGCAC AGTATATGTGCCTCCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCAC GGATGCTTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAG TTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATT-3' (SEQ ID NO:1) #2412

5’-ATTCCATAAAAAAGGTTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGTC AGGATATCAATACAGAGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCCTA ACAAATTTGCATTGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATCCCACAACAC AACGTTTGGTATGGGCATGCATGT-3’ (SEQ ID NO:2) • 9 · ·

9 • · #241-3

5’-ACATGCATGCACAGGCCTAGAGGTGGGCCGGGGACAGCCATT AGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTTTACTAAATAAATATGATG ATGTTGAAAATTCAGGGGGTTACGGTGGTAACCCTGGACAGGAT AACAGG-3' (SEQ ID N0;3) #241-4

5’-GTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATGG

TTGGATGTGCCCCCCCTTTGGGCGAGCATTGGGGTAAAGGTACA

CAGTGTAGTAATACATCTGTACAGAATGGTGACTGCCCGC-3' (SEQ ID N0:4) #241-5

5'-CCTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGGT TGACACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACCAA TAAATCAGATGTTCCTCTTGACATATGTGGCACTGTA-3' (SEQ ID N0:5) #241-6

5'-TGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCATATG GTGATAGATTATTTTTTTATCTACGGAAGGAACAAATGTTTGCCA GACATTTTTTTAACAGGGCTGGTACCCC-3'(SEQ ID N0:6) #241-7

5'-GGGGTACCGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGATCTTTTAGTTAA GGGTGGTAACAATCGCTCGTCTGTAGCGAGTAGTATATATGTTCA CACCCCAAGCGGCTCTTTGGTGTCCTCTGAGGCACA-3' (SEQ ID N0;7) #241-8

5'-ATTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACAT AACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCATCTGTTTGTTACTGTGGTA GATACCACACGCAGTACCAACATGA-3'(SEQ ID N0:8) ·· ·· • · · 9 9 9

999 999 #241-9

5'-CATTATGTGCATCCGTATCTAAATCTGCCACATACACCAATTCT GATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTTTGATTTACA ATTTATTTTTCAATTATGTAGCATT-3'(SEQ ID NO:9) #241-10

5'-ACATTGTCTGCTGAAGTAATGGCCTATATTCACACAATGAATC CCTCTGTTCTCGAGGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAA ATGGTACACTCGAGCGG-3’(SEQ ID NO:10) #241-11

5’-CCGCTCGAGGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATTA .CCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGGAAAAGCAAGATCCCTAT AAGGACATGAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTC TAGTGAATTGGATCAGTTTCCTTT-3' (SEQ ID NO;11) #241-12

5’-GGGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGAC CTCTGCTCGTACCGGTATTAAGCGCCCTGCTGTTTCCAAACCCTCT ACTGCCCCTAAACGTAAGCGCACCAAAACTAAAAAGTAAGATCT TC-3’ (SEQ ID NO; 12) #241-13

5’-GAAGATCTTACTTTTTAGTTTTGGTGCGCTTACGTTTAGGGGCA GTAGAGGGTTTGGAAACAGCAGGGCGCTTAATACCGGTACGAG CAGAGGTCCGTCCCCTATATCCACTTTGTAACAAAAACTTGCGTC CCAAAGGAAACTGATCCAATTC-3’ (SEQ ID NO: 13) • ·

• frfrfr • · · · · fr • · · · · • fr frfrfr frfrfr • frfr • frfrfr frfr- frfr ;#241-14

5ACT AG AAAACTTTTCTTTTAAATTAAC CTC C C AAAAACTC ATGT CCTTATAGGGATCTTGCTTTTCCTTTTCAGGAGTGGGCTTTTGACA GGTAATGGCCTGTGACTGCACATACCTATAGGTATCCTCGAGCG G-3’ (SEQ ID N0:14) #241-15

5’-CCGCTCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTC

CAGTCCTCGAGAACAGAGGGATTCATTGTGTGAATATAGGCCAT

TACTTCAGCAGACAATGTAATGCTACATAATTGAAAAA-3' (SEQ ID NO; 15) #241-16

5’-TAAATTGTAAATCAAACTCTTCCACATGACGCATGTACTCTTTA TAATCAGAATTGGTGTATGTGGCAGATTTAGATACGGATGCACA TAATGTCATGTTGGTACTGCGTGTG-3’ (SEQ ID NO:16) #241-17

5'-GTATCTACCACAGTAACAAACAGATGATTACCCCAACAAATA CCATTGTTATGTCCCTGGGCTTTTTGTAGCCAATATGGCTTATTAA ACAATTGTGCCTCAGAGGACACCAA-3’ (SEQ ID NO:17) #241-18

5’-AGAGCCGCTTGGGGTGTGAACATATATACTACTCGCTACAGAC gagcgattgttaccacccttaactaaaagatcatcaggcacagg TTCCCCCACGGTACCCC-3' (SEQ ID NO:18) #241-19

5’-GGGGTACCAGCCCTGTTAAAAAAATGTCTGGCAAACATTTGTT CCTTCCGTAGATAAAAAAATAATCTATCACCATATGGGTCTGCA gccatttgtaaataatctggatatttacatacagtgccacatatg TCAA-3’ (SEQ ID NO:19) • · · · · · #241-20

5'-GAGGAACATCTGATTTATTGGTCTGCAAATCAGCAAAATTCAT

AGCACCAAAGCCTGTGTCAACCATATCGCCATCCTGTATÁACACT

GGTAATAAGTTCTAAGGGCGGGCAGTCACCATTCTGT-3' (SEQ ID NO:20) #241-21

5'-ACAGATGTATTACTACACTGTGTACCTTTACCCCAATGCTCGCC

CAAAGGGGGGGCACATCCAACCATGCATAATTGTGTTTGTTTAT

AATCCATACCTACATTAACCCTGTTATCCTGTCCAGGGT-3’ (SEQ ID NO.-21) #241-22

5’-TACCACCGTAACCCCCTGAATTTTCAACATCATCATATTTATTT AGTAAAGGATGTCCACTTACACCCACACCTAATGGCTGTCCCCG GCCCACCTCTAGGCCTGTGCATGCATGT-3’(SEQ ID NO:22) #241-23

5'-ACATGCATGCCCATACCAAACGTTGTGTTGTGGGATCAAAAAG

AGACGAGTCAGGCAATGCAAATTTGTTAGGATCTGGTAACACCA

CCTTAAATACTCTGTATTGATATCCTGACACCTTTGGCACAACAG

TTTTGTTAACCTTTTTTATGGAATAATAAGGATGACCC-3’ (SEQ ID NO:23) #241-24

5'-ACTGCAAGAAGTCTAGAACTGCTGGCATGATAAAATATGTTG

GTGCGTTTAACATAAGCATCCGTGGCAACAACTTTGGATACAGG GTTAGGAGGAGGCACATATACTGTGCTGTCGCTAGGCCGCCACA TTTTGTTTTGTGAGATCTTC-3' (SEQ ID NO:24) • · • · · · • · · · · ·

Oligomery tvořící komplementární páry (#241-1 a #241-24, #241-2 a #241-23, #241-3 a #241-22, #241-4 a #241-21, #241-5 a #241-20, #241-6 a #241-19, #241-7 a #241-18, #241-8 a #241-17, #241-9 a #241-16, #241-10 a #241-15, #241-11 a #241-14, #241-12 a #241-13) byly tepelně zpracovány v separátních zkumavkách obsahujících 2,5 mM Tris, pH 7,5, 0,25 mM EDTA. Zkumavky se zahřívaly při 98 °C po dobu 4 minut a potom se umístily v 200 ml vody o teplotě 98 °C ve 250 ml kádince pro pomalé ochlazení. Po ochlazení vody na pokojovou teplotu se tepelně zpracované páry přidaly do zkumavek podle plánu: fragment A (oligomerové páry

#241-1	a	24	a	#241-2 a 23) ;	fragment B	(#241-3 a	22,	#241-4	a 21,
#241-5	a	20	a	#241-6 a 19);	fragment C	(#241-7 a	18,	#241-8	a 17,
#241-9	a	16	a	#241-10 a 15)	a fragment	D (#241-11	a	#241-12	a

13). Tyto směsi oligomerových párů se zahřívaly při 62 °C po dobu 2 minut a potom se pomalu nechaly vychladnou, jak je uvedeno výše. Obsah každé zkumavky byl ligován přes noc při 23 °C za použití T4 DNA ligasy (Boehringer Mannheim, lne.) a činidel dodaných výrobcem.

Po ligaci vyžadoval fragment B PCR amplifikaci pro zvýšení množství kompletního produktu. Tato amplifikace obsahovala 10 cyklů 94 °C, 1 minuta; 48 °C, 1 minuta; 72 °C, 1 minuta a potom 10 minut při 72 °C v termocyklizačním přístroji od Applied Biosystems za použití Taq polymerasy (Boehringer Mannheim) a oligomerových primerů:

5'-GGAATTCACATGCATGCACAGGCCTAG-3' (SEQ ID NO:25) a 5’-GGAATTCGGGGTACCAGCCCTGTTAA-3' (SEQ ID NO:26).

Ligované produkty a produkt PCR fragmentu B byly tráveny restrikčními enzymy (Boehringer Mannheim) následujícím způsobem: fragment A byl tráven Bgl II a Sph I; fragment B Sph I a Κρη I; fragment C Κρη I a Xho I; a fragment D Xho I a Bgl II. Trávené fragmenty byly separovány na agarosových gelech s nízkou teplotouo tání (FMC BioProducts) a fragmenty správné velikosti byly izolovány excisí proužku a trávením agarosy za použití Agarase™ (Bohringer Mannheim, lne.) podle návodu výrobce. Fragmenty A, B a D byly získány srážením v ethanolu a byly jednotlivě ligovány do vektoru pSP72 (Promega, lne.), který byl podobně tráven restrikčními enzymy, aby odpovídal každému ligovanému fragmentu.

Fragment C trávený KpnI a Xhol byl nejprve ligován do tepelně zpracovaných oligomerů:

5’-TCGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTAC AC-3'; (SEQ ID NO:27) and

5’-TCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAGT CT-3'(SEQ ID NO:28).

Fragment C byl potom znovu štěpen Xhol a 450 bp KpnI Xhol fragment byl ligován do pSP72 vektoru tráveného KpnI a Xhol. Ligační směsi byly použity pro transformaci kompetentních buněk Escherichia coli kmene DH5 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Transformanty byly vyšetřovány na klony obsahující insert hybridizací kolonií (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Plasmidová DNA byla izolována z pozitivních klonů za použití Wizard miniprep kitu (promega Corp.) a potom byla • a • · Λ Λ

sekvencována za použití 3 73A DNA sekvenátoru (Applied

Biosystems). Klony obsahující správnou DNA sekvenci pro každý ze čtyř fragmentů byly tráveny stejným způsobem za uvolnění fragmentů z pSP72 vektoru. Fragment C trávený KpnI a Xhol byl ligován s fragmentem D tráveným Xhol, BglII a pSP72 tráveným KpnI, BglII v trojcestné ligaci. Produkty ligace byly potom použity pro transformaci E. coli. Výsledné transformanty byly sekvencovány a byl získán klon se správnou sekvencí (označený CD). 750 bp BglII KpnI insert CD byl znovu vystřižen z pSP72 vektoru a byl ligován s BglII, Sphl tráveným fragmentem A a Sphl, KpnI tráveným fragmentem B v trojcestné ligaci, jak byla uvedena výše, s tou výjimkou, že pro snížení množství nežádoucích produktů ligace byl přidán BglII. Produkty ligace byly separovány na agarosových gelech, byl izolován 1,5 kb fragment, který byl označen D361-1.

Konstrukce HPV6/11 LI, HPV11 LI a HPV6 LI kvasinových expresních vektorů pGALl-10 kvasinkový expresní vektor byl připraven izolací 1,4 kb Sphl fragmentu z pUCl8/dvojsměrný GAL promotor plasmidu, který obsahuje Saccharomyces cerevisiae divergentní GAL1-GAL10 promotory z plasmidu pBM272 (získán od Mark Johnston, Washington University, St. Louis, MO). Divergentní promotory na každé straně sousedí s kopií kvasinkového ADH1 transkripčního terminátoru (Bennetzen and Halí, 1982, J. Biol. Chem. 257: 3018-3025), mají BamHI klonovací místo umístěné mezi GAL1 promotorem a první kopií ADH1 transkripčního terminátoru a Smál klonovací místo umístěné mezi GAL10 promotorem a druhou kopií ADH1 transkripčního terminátoru. Kvasinkový kyvadlový vektor skládající se z pBR322, kvasinkového LEU2d genu (Erhart and Hollenberg, 1983, J.

Bacteriol. 156: 625-635) a kvasinkového 2u plasmidu (dar od Benjamin Halí, University of Washington, Seattle, WA) (Broach and ·· ··

9 9 • · ·

999 999

Volkert, 1991, Circular DNA Plasmids of Yeasts), Cold Spring Harbor Labratory Press, Cold Spring Harbor, New York) byly tráveny Sphl a byly ligovány s 1,4 kb Sphl fragmentem divergentního GAL promotoru, za vzniku pGALl-10.

HPV6/11 hybridní LI DNA kódující HPV11 LI protein (vzorek D361-1 z příkladu 1) obsahuje kvasinkovou netranslatovanou vedoucí sekvenci (Kniskern et al., 1986, Gene 46: 135-141) bezprostředně před HPV6/11 LI iniciačním methiononovým kodonem. pGALl-10 plasmid byl linearizován BamHI, který jej rozstřihne mezi GAL1 promotorem a ADH1 transkripčním terminátorem a byl ligován s 1,5 kb HPV6/11 LI genovým fragmentem (vzorek D361-1). E. coli DH5 (Gibco BRL, lne.) transformanty byly vyšetřovány a byl izolován pGALl-10 plasmid obsahující HPV6/11 gen, který byl označen D362-1.

Přirozená HPV11 (wt-HPVll) DNA byla klonována z condyloma accuminatum (dar od Dr. Darron Brown). Byla extrahována celková lidská genomová DNA a byla trávena restrikčními endonukleasami. Frakce obsahující wt-HPVll DNA byla ligována do E. coli klonovacího vektoru a byla užita jako templát pro PCR. Wt-HPVll LI gen byl amplifikován PCR za použití Vent polymerasy (New England Biolabs, lne.), při 10 cyklech amplifikace (94 °C, 1 minuta; 48 °C, 1 minuta; 72 °C, 45 sekund) a za použití následujících oligonukleotidových primerů, které obsahují sousední BglII místa (podtržená):

kódující primer: 5'- CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC

GGC CTA GCG ACA GCA CAG - 3' (SEQ ID NO: 29) protismyslný primer: 5'- GAG AGA TCT TAC TTT TTG GTT TTG GTA CGT TTT CG - 3' (SEQ ID NO: 30)

Kódující primer vkládá kvasinkovou netranslatovanou vedoucí • ·* · sekvenci (Kniskern et al., 1986, Gene 46: 135-141) bezprostředně před wt-HPVll LI iniciační methiononový kodon (tučná písmena).

1,5 kb wt-HPVll LI PCR produkt byl tráven BglII, přečištěn na gelu a ligován s pGALl-10 tráveným BamHI za zisku plasmidu p329-l.

Celková genomová DNA byla extrahována z HPV6a-pozitivního condyloma accuminatum (dar od Dr. Darron Brown). HPV6a LI gen byl amplifikován PCR za použití vzorku DNA z biopsie jako templátu, Vent polymerasy (New England Biolabs, lne.), 35 cyklů amplifikace (94 °C, 1 minuta; 48 °C, 1 minuta; 72 °C, 45 sekund) a za použití kódujícího primerů uvedeného výše pro PCR wt-HPTll Ll a protismyslného primerů uvedeného níže:

5'- GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3' (SEQ ID NO: 31)

1,5 kb HPV6a Ll PCR produkt byl tráven BglII, přečištěn na gelu a ligován s pGALl-10 tráveným BamHI za zisku plasmidu D128.

Příprava kmene 1558

a. Příprava kvasinkového kmene U9

Saccharomyces cerevisiae kmen 2150-2-3 (MAT alpha, leu2-04, adel, cir°) byl získán od Dr. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA). Buňky kmene 2150-2-3 byly propagovány přes noc při 30 °C v 5 ml YEHD media (Carty et al., 1987, J. Ind. Micro. 2: 117-121). Buňky byly třikrát promyty ve sterilní, destilované vodě, byly resuspendovány ve 2 ml sterilní destilované vody a 0,1 ml buněčné suspenze byl umístěn každou ze šesti ploten obsahujících kyselinu 5-fluor-orotovou (FOA) pro selekci ura3 mutantů (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for

• · · · · • · ** • ♦ · · • ♦ · · ··· ·*·

9

Yeast Genetics). Plotny byly inkubovány při 30 °C. Medium obsahovalo na 250 ml destilované vody 3,5 g Difco Yeast Nitrogen Base bez aminokyselin a síranu amonného; 0,5 g kyseliny 5-fluor-orotové; 25 mg uracilu; a 10,0 g dextrosy.

Medium bylo sterilizováno filtrací přes 0,2 grn membrány a potom bylo smíseno s 250 ml 4% Bacto-Agaru (Difco) o teplotě 50 °C, 10 ml 1,2 mg/ml roztoku adeninu a 5 ml roztoku L-leucinu (180 mg/50 ml). Vzniklé medium bylo umístěno ve 20 ml Petriho miskách.

Po 5 dnech inkubace se objevilo mnoho kolonií. Jednotlivé kolonie byly izolovány přenesením kolonií z počátečních FOA ploten na čerstvé FOA plotny, které byly potom inkubovány při 30 °C. Mnoho kolonií z druhé sady FOA ploten bylo testováno na přítomnost ura3 mutace opakovanou kultivací na YEHD plotnách nebo uráčil-minus plotnách. Požadovaným -výsledkem byl uspokojivý růst na YEHD a žádný růst na mediu bez uracilu. Byl získán jeden izolát (U9), který měl tyto vlastnosti. Byl uskladněn ve zmrazeném stavu v glycerolu (kmen #325) při -70 °C pro pozdější použití.

b. Příprava vektoru pro narušení kvasinkového MNN9 genu

Pro přípravu vektoru pro narušení kvasinkového MNN9 genu bylo nutné nejprve klonovat MNN9 gen z genomové DNA Saccharomyces cerevisiae. Toto klonování bylo provedeno standardní technikou polymerasové řetězové reakce (PCR). 5'-kódující primer a 3'-protismyslný primer pro PCR kompletní MNN9 kódující sekvence byly navrženy podle publikované sekvence pro kvasinkový MNN9 gen (Zymogenetics: EPO patentová přihláška č. 88117834.7, publikace č. 0-314-096-A2). Byly použity následující oligodeoxynukleotidové primery obsahující sousední HindlII místa (podtržená):

• · ··· ·

Kódující primer: 5'-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3' (SEQ ID NO: 32);

Protismyslný primer: 5'-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3' (SEQ ID NO: 33).

Iniciační methioninový kodon pro MNN9 gen je uveden tučnými písmeny. PCR byla provedena za použití genomové DNA z S. cerevisiae kmene JRY188 jako templátu, Taq DNA polymerasy (Perkin Elmer) a 25 cyklů amplifikace (94 °C, 1 minuta; 37 °C, 2 minuty; 72 °C, 3 minuty). Výsledný 1,2 kb PCR fragment byl tráven HindlII, přečištěn na gelu a ligován s pUC13 (Pharmacia) zpracovaným alkalickou fosfatasou a tráveným HindlII. Výsledný plasmid byl označen pll83.

Pro narušení MNN9 genu kvasinkovým URA3 genem byl plasmid pBR322-URA3 (který obsahoval 1,1 kb HindlII fragment kódující S. cerevisiae URA3 gen subklonovaný do HindlII místa pBR322) tráven HindlII a 1,1 kb DNA fragment obsahující funkční URA3 gen byl přečištěn na gelu, opatřen tupými konci za použití T4 DNA polymerasy a potom byl ligován s PmlI-tráveným plasmidem pll83 (PmlI působí uvnitř MNN9 kódující sekvence). Výsledný plasmid pll99 obsahoval narušení MNN9 genu funkčním URA3 genem.

c. Konstrukce kmene 1372 odvozeného od U9 obsahujícího narušený MNN9 gen

Pro narušení MNN9 genu v kmenu U9 (#325) bylo 30 gg plasmidu pll99 tráveno HindlII za vzniku lineární mnn9::URA3 kazety. Buňky kmene 325 byly transformovány HindlII-trávenou pll99 DNA za použití sferoplastové techniky (Hinnen et al., 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933) a transformanty byly selektovány na syntetickém agarovém mediu bez uracilu, které obsahovalo 1,0 M

9999

99 * 9 · · · 9 9

999 99 9 ·

99 sorbitol. Syntetické medium obsahovalo na litr destilované vody: agar, 20 g; kvasinkovou dusíkovou bázi w/o aminokyseliny, 6,7 g; adenin, 0,04 g; L-tyrosin, 0,05 g; sorbitol, 182 g; glukosu, 20 g; a Leucine Minus Solution #2, 10 ml. Leucine Minus Solution #2 obsahoval na litr destilované vody: L-arginin, 2 g; L-histidin, 1 g; L-leucin, 6 g; L-isoleucin, 6 g; L-lysin, 4 g; L-methionin, 1 g; L-fenylalanin, 6 g; L-threonin, 6 g; L-tryptofan, 4 g.

Plotny byly inkubovány při 30 °C po dobu 5 dnů, během kterých se objevilo mnoho kolonií. Přípravky chromosomální DNA byly připraveny z 10 kolonií a tato DNA byla trávena EcoRI a HindlII. Trávená DNA byla potom vyhodnocována za použití Southern blot metody (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) za použití 1,2 kb HindlII fragmentu nesoucího MNN9 gen (izolovaný z plasmidu pll99) jako sondy. Byl identifikován izolát (kmen #1372), který měl předpokládaný posun DNA proužku v Southern blotu, stejně jako extremní shluky buněk, což je typické pro mnn9 mutanty.

d. Konstrukce vektoru pro narušení kvasinkového HIS3 genu

Pro konstrukci inserční kazety, ve které je HIS3 gen S. cerevisiae narušen URA3 genem, byl plasmid YEp6 (Struhl et al., 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 1035) tráven BamHI a 1,7 kb BamHI fragment nesoucí HIS3 gen byl přečištěn na gelu, opatřen tupými konci za použití T4 DNA polymerasy a byl ligován s pUC18, který byl předem trávenBamHI a ošetřen T4 DNA polymerasou. Výsledný plasmid (označený pl501 nebo pUC18-HIS3) byl tráven Nhel (který působí v kódující sekvenci HIS3) a vektorový fragment byl přečištěn na gelu, opatřen tupými konci za použití T4 DNA polymerasy a byl ošetřen telecí střevní alkalickou fosfatasou. URA3 gen byl izolován z plasmidu pBR322-URA3 trávením HindlII

a 1,1 kb fragment nesoucí URA3 gen byl přečištěn na gelu, opatřen tupými konci za použití T4 DNA polymerasy a byl ligován s výše uvedeným pUC18-HIS3 Hnel fragmentem. Výsledný plasmid (označený pUC18-his3::URA3 nebo pl505) obsahoval inserční kazetu, ve které byl kvasinkový HIS3 gen narušen funkčním URA3 genem.

e. Konstrukce vektoru pro narušení kvasinkového PRBl genu HIS3 genem

Plasmid FP8 H nesoucí PRB1 gen S. cerevisiae byl získán od Dr. E. Jones, Carnegie-Mellon Univ. (Moehle et al., 1987, Genetics 115: 255-263) . Tento plasmid byl tráven HindlII plus Xhol a 3,2 kb DNA fragment nesoucí PRB1 gen byl přečištěn na gelu a byl opatřen tupými konci za použití T4 DNA polymerasy. Plasmid pUC18 byl tráven BamHI, byl přečištěn na gelu a byl opatřen tupými konci za použití T4 DNA polymerasy. Výsledný vektorový fragment byl ligován s výše uvedeným fragmentem PRB1 genu za vzniku plasmidu pUC18-PRBl.plasmid YEp6, který obsahuje HIS3 gen, byl tráven BamHI. Vzniklý 1,7 kb fragment nesoucí funkční HIS3 gen byl přečištěn na gelu a byl opatřen tupými konci za použití T4 DNA polymerasy. Plasmid pUC18-PRBl byl tráven EcoRV plus Ncol, který tráví PRB1 kódující sekvenci a odstraňuje proteasa B aktivní místo a sousední sekvence. 5,7 kb EcoRV-NcoI fragment nesoucí residuální 5' a 3'-části PRB1 kódující sekvence v pUC18 byl přečištěn na gelu, byl opatřen tupými konci za použití T4 DNA polymerasy, byl defosforylován za použití telecí střevní alkalické fosfatasy a byl ligován s tupě zakončeným HIS3 fragmentem popsaným výše. Výsledný plasmid (označený pUC18-prbl::HIS3, šarže #1245) obsahoval funkční HIS3 gen na místě části PRB1 genu, která byla deletována.

f. Konstrukce kvasinkového kmene odvozeného od U9 obsahujícího porušení MNN9 i PRBl genů.

·· ·♦·· ,

*· ·· 99 • * · · · · • · · · · • · ····<» • ♦ · • ···· «· ··

U9-příbuzný kmen 1372, který obsahuje porušení MNN9 genu již byl k dispozici. Klonální izoláty kmenu 1372 byly pasážovány na FOA plotnách pro selektování ura3 mutantů. Bylo získáno více ura3 izolátů kmene 1372 a byl vybrán jeden izolát (kmen

12930-190-S1-1) pro následující narušení HIS3 genu.

pUC18-his3::URA3 genový inserční vektor (pl505) byl tráven Xbal plus EcoRI pro vytvoření lineární his3::URA3 inserční kazety a byl použit pro transformaci kmene 12930-190-S1-1 za použití techniky využívající octanu lithného (Methods in Enzymology,

1992, 194:290). Ura+ transformanty byly selektovány na syntetickém agarovém mediu bez uracilu, byly přeočkovány na stejném mediu pro získání klonálních izolátů a potom byly dvojmo umístěny buď na mediu bez uracilu, nebo bez histidinu pro vyhledání těch izolátů, které byly jak Ura+, tak His+. Jeden izolát (kmen 12930-230-1) byl vybrán pro následující narušení PRB1 genu. Vektor pro narušení PRB1 genu (pUC18-prbl::HIS3, skladovaný materiál #1245) byl tráven Sací plus Xbal pro vytvoření lineární prbl::HIS3 inserční kazety a byl použit pro transformaci kmene 12930-230-1 technikou využívající octan lithný. His+ transformanty byly selektovány na agarovém mediu bez histidinu a byly přeočkovány na stejném mediu pro získání klonálních izolátů. Z mnoha získaných His+ izolátů byla připravena genomová DNA, byla trávena EcoRI a potom byla podrobena elektroforese na 0,8% agarosových gelech. Potom byly provedeny Southern blot analýzy za použití radioaktivně značené 617 bp sondy pro PRB1 gen, která byla připravena PCR za použití následujících oligonukleotidových primerů:

5’- TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA - 3' (SEQ ID NO: 34); a

5'- CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA - 3' (SEQ ID NO: 35).

Bylo získáno 11 izolátů, u kterých došlo k očekávané ·· ·♦·· ·· hybridizací sondy s 2,44 kb prbl::HIS3 DNA fragmentem. Toto bylo v protikladu s hybridizací sondy s 1,59 kb fragmentem pro přirozený PRB1 gen. Jeden z těchto izolátů obsahujících požadované prbl::HIS3 narušení byl vybrán pro další použití a byl označen jako kmen #1558.

Příklad 2

Exprese HPVll LI a HPV6 LI v kvasinkách

Plasmidy D362-1 (pGALl-10 + HPV6/11 LI), p329-l (pGALl-10 + wt-HPVll LI), D128 (pGALl-10 + HPV6 LI) a pGALl-10 byly použity pro transformaci S. cerevisiae kmene #1558 (MATa, leu2-04, prbl::HIS3, mnn9::URA3, adel, cir°) za použití sferoplastové techniky (Hinnen et al., 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933). Kvasinkový kmen #1558 transformovaný plasmidem D362-1 byl označen jako kmen #1782. Pro studie RNA byly kvasinkové klonální izoláty kultivovány po dobu 26 hodin při 30 °C v YEH komplexním mediu (Carty et al., 1987, J. Ind. Micro. 2: 117-121) obsahujícím 0,1 M sorbitol a buď 2% glukosu, nebo galaktosu. Po sklízení buněk byla kvasinková RNA extrahována za použití techniky horkého kyselého fenolu, jak je popsána v Current Protocols in Molecular Biology, svazek 2, Current Protocols,

1993). Pro analýzu proteinů byly identické izoláty kultivovány po dobu 70 hodin při 30 °C v YEH komplexním mediu obsahujícím 0,1 M sorbitol, 2% glukosu a 2% galaktosu. Po sklízení buněk byly buněčné pelety rozdrceny se skleněnými korálky a buněčné lyzáty byly analyzovány na expresi HPVll LI nebo HPV6 LI proteinu imunoblotovou analýzou.

Fermentace HPV6/11 LI (kmen #1782)

Povrchově rostoucí kultura kmene 1782 byla asepticky přenesena

9 Λ 99 9

9» do bezleucinového kapalného media obsahujícího (na 1): 8,5 g Difco kvasinkové dusíkové baze bez aminokyselin a síranu amonného; 0,2 g adeninu; 0,2 g uracilu; 10 g kyseliny jantarové;

g síranu amonného; a 0,25 g L-tyrosinu.; pH tohoto media bylo upraveno před sterilizací na pH 5,0-5,3 pomocí NaOH. Po kultivaci po dobu 25 hodin při 28 °C a 250 rpm na rotační třepačce byly připraveny zkumavky obsahující zmrazenou kulturu, za přidání sterilního glycerolu v konečné koncentraci 17% (hmot./obj.) před uskladněním při -70 °C (1 ml na kryozkumavku). Inokulum pro fermentaci kmene 1782 bylo vyvíjeno ve stejném mediu (750 ml na 2 nádobu) a fermentace byla zahájena přenesením roztátého obsahu dvou zkumavek se zmrazenou kulturou do 2 1 nádob a inkubací při 28 °C, při 250 rpm na rotační třepačce po dobu 25 hodin. Při fermentaci kmene 1782 byl použit Chemap 23 1 fermentor s pracovním objemem 18 1 po inokulaci. Použité produkční medium obsahovalo (na 1): 20 g Difco kvasinkového extraktu; 10 g Sheffied HySoy peptonu; 20 g glukosy; 20 g galaktosy; před sterilizací bylo pH media upraveno na pH 5,3. Celý obsah (500 ml)

1 inokulační nádoby byl přenesen do fermentoru, ve kterém proběhla inkubace při 28 °C, 9 1 vzduchu za minutu, 500 rpm, tlaku 3,5 psi. Třepání bylo zvyšováno tak, aby byla udržována více než 40% saturace rozpuštěným kyslíkem. Průběh fermentace byl sledován off-line měřením glukosy (Beckman Glucose 2 Analyzer) a on-line hmotnostní spektrometrií (Perkin-Elmer 1200). Po 66 hodinách inkubace bylo dosaženo hustoty buněk 9,32 g suchých buněk na 1. Obsah dvou takových fermentaci (celkem 17,5 1 media) byl smísen před odběrem buněk. Kultura byla koncentrována filtrací přes dutá vlákna (Amicon H5MP01-43 patrona v Amicon DC-10 filtračnírn~systému) na objem přibližně 2 1, byla diafiltrována s 2 1 fosfátem pufrovaného salinického roztoku a byladále koncentrována (přibližně na objem 11) před umístěním do 500 ml centrifugačních nádob. Buněčné pelety byly získány centrifugací při 8000 rpm (Sorval GS3 centrifuga)po dobu 20 minut * 4 4 *4 · • 4 «··· ·· 44 ¹ 4 4 4 > 4 4 4 •44 444 při 4 °C. Po odstranění supernatantu byly pelety (celkem 358 g vlhkých buněk) uskladněny při -70 °C do použití.

Přečištění LI kapsidových proteinů rekombinantního HPV typu 11

Všechny kroky byly provedeny při 4 °C, pokud není uvedeno jinak. Buňky byly skladovány ve zmrazeném stavu při -70 °C. Zmrazené buňky (vlhká hmotnost = 180 g) se nechaly roztát při 20-23 °C a resuspendovaly se v 900 ml Breaking Buffer (50 mM MOPS, pH 7,2, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl₂). Inhibitory proteas AEBSF a pepstatin A byly přidány do konečné koncentrace 1 mM a 1,7 mM, v příslušném pořadí. Buněčné kaše byla připravena při tlaku přibližně 16000 psi 4 průchody přes M110-Y Microfluidizer (Microfluidics Corp., Newton, ΜΑ). K buněčné kaši byl přidán dostatečný objem 10% Triton X100^R detergentu (Pierce, Rockford,

IL) pro dosažení konečné koncentrace TX100 0,5%. Kaše se mísila po dobu 20 hodin. Tritonem X100 zpracovaný lyzát se centrifugoval při 12000 x g po dobu 40 minut pro odstranění buněčné drti. Odebral se kapalný supernatant obsahující LI protein.

Kapalný supernatant se diafiltroval proti pěti objemům 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2, 0,5 M NaCl, za použití 300 K membránové kazety s tangenciálním tokem (Filtron, Northborough, MA). Radioimunotestem a Wester blottingem bylo prokázáno, že materiál zachycený na membráně obsahuje LI protein.

Zachycený materiál se vložil do afinitní kolony s vysokou účinností (11,0 cm ID x 5,3 cm) SP Spherodex (M)^R pryskyřice (IBF, Vilenueve-la-Garenne, France) uvedené do rovnováhy ve 20 mM fosforečnanu sodném, pH 7,2, 0,5 M NaCl. Po promytí ekvilibračním pufrem a stupni promytí 20 mM fosforečnanem sodným, pH 7,2, 1,0 M NaCl, byl LI protein eluován ve výplachu 20 mM fosforečnanem sodným, pH 7,2, 2,5 M NaCl. Frakce byly odebírány během promývání • · • · • · • · «

• ···· ·· • ·

• · ·· *♦ a eluce. Frakce z kolony byly testovány na celkový obsah proteinu Bradfordovou technikou. Frakce byly potom analyzovány western blottingem a SDS-PAGE s detekcí koloidní Coomassie modři. Frakce byly také analyzovány v radioimunotestu.

SP Spherodex frakce vykazující srovnatelnou čistotu a obsah Ll proteinu byly smíseny. Konečný materiál byl analyzován western blottingem a SDS-PAGE s detekcí koloidní Coomassie modři, bylo stanoveno, že Ll protein má více než 90% homogenitu. Identita Ll proteinu byla potvrzena western blottingem. Výsledný materiál byl nakonec asepticky filtrován přes 0,22 mm membránu a byl uskladněn při -70 °C v 50 mM MOPS a 1,25 M NaCl.

Analýza elektronovou mikroskopií byla provedena za použití Structure Probe (West Chester, PA). Alikvota vzorku byla umístěna do 200 mesh měděné mřížky potažené uhlíkem. Na mřížku byla na 20 sekund umístěna kapka 2% kyseliny fosfowolfrámové, pH 7,0. Mřížka se sušila vzduchem před TEM vyšetřením. Všechna mikroskopická vyšetření byla provedena na JEOL 100 CX transmisním elektronovém mikroskopu (JEOL USA, lne.) při urychlovacím napětí 100 kV. Získané fotografie mají konečné zvětšení 100000X.

Bradfordův test na celkový protein

Celkový protein byl testován za použití komerčně dostupného Coomassie Plus^R kitu (Pierce, Rockford, IL). Vzorky byly ředěny na vhodné koncentrace v Milli-Q-H O. Požadované objemy byly 0,1 ml a 1,0 ml pro standardní a mikrotestový protokol, v příslušném pořadí. Pro oba protokoly byl pro získání standardní křivky použit BSA (Pierce, Rockford, USA). Testy byly provedeny podle návodu výrobce. Standardní křivky byly zaneseny do grafu za použití CricketGraph^R softwaru na Macintosh líci počítači.

·· · · · · • · • · · ·

SDS-PAGE a Western blot testy

Všechny gely, pufry a elektroforetický přístroj byly získány od Novex (San Diego, CA) a byly použity podle návodu výrobce. Stručně, vzorky byly ředěny na stejné koncentrace proteinu v Milli-Q-H₂O a byly smíseny v poměru 1:1 s pufrem pro inkubaci vzorku obsahujícím 200 mM DTT. Vzorky byly inkubovány po dobu 15 minut při 100 °C a potom byly přeneseny na pre-cast 12%

Trys-glycínových gelů. Byla provedena elektroforesa při 125 V po dobu 1 hod. 45 minut. Gely se vyvíjely barvením koloidním Coomassie barvivém za použití komerčně dostupného kitu (Integrated Separation Systems, Natick, MA) .

Pro Western bloty byly proteiny přeneseny na PVDF membrány při 25 V během 40 minut. Membrány byly promyty Milli-Q-H₂O a byly sušeny vzduchem. Primární protilátkou bylo polyklonální králičí antisérum proti TrpE-HPVllLl fúsnímu proteinu (dar od Dr. D. Browna). Roztok protilátky byl připraven ředěním antiséra v blotovacím pufru (5% odtučněné mléko v 6,25 mM fosforečnanu sodném, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02% NaN₃). Inkubace trvala alespoň jednu hodinu při 20-23 °C. Blot byl vypláchnut třikrát během 1 minuty v PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 150 mM NaCl). Roztok sekundární protilátky byl připraven ředěním kozího antiséra proti králičímu IgG konjugovaného s alkalickou fosfatasou (Pierce, Rocford) v blotovacím pufru. Inkubace probíhala za stejných podmínek po dobu alespoň jedné hodiny.

Bloty byly promyty způsobem uvedeným výše a detekce byla provedena za použití 1 stupňového NBT/BCIP substrátu (Pierce, Rocford, IL).

Příklad 3: Závislost agregace na proteinové koncentraci

Způsobem uvedeným výše byla připravena šarže HPV11 VLP a byla • · · ·

•»· · · · ·· uskladněna při koncentraci 0,47 mg/ml v 50 mM MOPS obsahujícím 1,25 M NaCl. Tato Šarže se nechala rozmrznout a část tohoto roztoku se ředila ve stejném pufru na koncentraci 18 mcg/ml. Zatímco zásobní roztoky s vyšší koncentrací proteinu si udržovaly stejný hydrodynamický průměr (D_h) v rozmezí 107-115 nm (podle měření dynamickým rozptylem světla) po dobu 2 měsíců při 4 °C, roztoky s nižší koncentrací proteinu během času agregovaly, i když byla koncentrace solí udržována při 1,25 M NaCl (obr. 1). Obr. 1 ukazuje, že při nižší koncentraci HPV proteinu nebrání ani vyšší koncentrace solí agregaci HPV během skladování při 4 °C.

Příklad 4: Závislost agregace na koncentrací solí

Byly připraveny šarže HPV11 a HPV16 VLP a byly testovány na závislost hydrodynamické velikosti na koncentraci solí během skladování. Rekombinantní HPV11 a HPV16 byly ředěny ze zásobního roztoku (v 50 mM MOPS, 1,25 M NaCl, pH 7,0) v 50 mM MOPS pufru tak, že konečná koncentrace proteinu zůstavala konstantní při hodnotě asi 20 mcg/ml, ale lišila se koncentrace NaCl, jak je uvedeno na obr. 2. Byla připravena různá ředění v polypropylenových eppendorfových zkumavkách a tyto zkumavky byly uskladněny při pokojové teplotě. Během jedné hodiny od přípravy ředění byla provedena měření, protože - jak je uvedeno v předešlém příkladu (obr. 1) - pomalá agregace probíhá při této koncentraci proteinu i tehdy, obsahuje-li roztok vysoké koncentrace solí. Hodnota D_h byla téměř neměnná pod 0,15 M NaCl (HPV11) a 0,5 M NaCl (HPV16), ale zvyšovala se při nižších koncentracích solí (obr. 2). Na druhé straně, dialyzované vzorky HPV11 měly vyšší hydrodynamickou velikost při všech koncentracích solí a tento efekt byl zejména zvýrazněn při koncentraci solí nižší než 0,5 M NaCl.

Jiný samostatný pokus s jinou šarží HPV11 (data nejsou uvedena • · • · • · · ·····«·· • · · · · ···· ve formě obrázku) ukázal, že pro rekombinantní HPV11 LI VLP (dialyzovaný proti 20 mM pufru fosforečnanu sodného (pH 7,2) obsahujícímu různé koncentrace NaCl) se zvyšuje D_h z přibližně 113 nm při 0,5 M NaCl na 133 nm při 0,15 M NaCl. Vzorky dialyzované do 1,0, 2,0 a 3,0 M NaCl měly hodnoty D_h 114, 113 a 108 nm při vzájemném srovnání, zatímco vzorky dialyzované proti koncentraci NaCl 0,025 M tvořily viditelnou sraženinu.

Koncentrace proteinu v těchto vzorkách byly v rozmezí 130-179 mcg/ml (jak bylo stanoveno Lowryho proteinovým testem) s výjimkou vzorku v 0,025 M NaCl, ve kterém byl protein v roztoku v koncemtraci pouze 16 mcg/ml. Kontrolní vzorek, který byl skladován v 20 mM pufru fosforečnanu sodného (pH 7,2) obsahujícím 2,5 M NaCl, ale který nebyl dialyzován, měl D_h = 82 nm.

Data tohoto příkladu ukazují, že ačkoliv nizká koncentrace solí nebo nízká koncentrace iontů přispívá k agregaci mezi částicemi HPV VLP, jsou nízké koncentrace proteinu a fyzikální zpracování roztoků HPV (jako je například dialýza proteinu) také hlavní příčinou agregace HPV VLP.

Příklad 5: Adsorpce HPV11 VLP na povrch

Povrch dialyzační membrány mcg/ml roztok proteinu v 50 mM MOPS pufru, pH 7,0, obsahujícím 0,18 M NaCl byl inkubován s různými plochami povrchu dialyzační membrány pro stanovení přímého vlivu dialyzační membrány na agregaci HPV11. bylo zjištěno, že D_h se zvyšuje se zvyšujícím se povrchem membrány po 96 hodinové inkubaci při teplotě okolí (obr. 3). Současně bylo zjištěno, že koncentrace proteinu v roztoku se snižuje se zvětšujícím se povrchem (obr.

3) . Tato pozorování ukazují na adsorpci HPV11 na povrch membrány a naznačují korelaci mezi adsorpci na povrch a agregací. Tato • · · · · · « · data ukazují, že dlouhodobý kontakt nízkých koncetrací HPV s polypropylenovým povrchem a povrchem dialyzační membrány může způsobit adsorpci na povrch a agregaci. Oba tyto jevy jsou závislé na teplotě. U vzorků inkubovaných při 4 °C byly zjištěny pomalejší kinetiky obou těchto procesů než při 25 °C.

Srovnání adsorpce HPV na různé povrchy zásobníků

Adsorpce HPV byla srovnávána, při stejných poměrech plocha:objem, pro zkumavky z borosilikatového skla, polypropylenu a polystyrenu (které měly stejné rozměry 12x75 mm²) při různých koncentracích HPV. Vzorky byly inkubovány v 50 mM MOPS pufru obsahujícím 1,25 M NaCl při pH 7,0 a byly ponechány při pokojové teplotě po dobu 24 hodin. Obr. 4 ukazuje, že adsorpce na povrch je významná ve zkumavkách z borosilikátového skla při koncentracích pod 100 mcg/ml. Polypropylen je lepší v tom, že adsorpce je významným problémem při koncentracích nižších než 30 mcg/ml, ale ne při vyšších koncentracích za těchto podmínek. Polystyren je nej lepší a nedochází v něm k žádné významné adsorpci proteinu při koncentracích do 10 mcg/ml.

Adsorpce HPV na povrch byla dále vyšetřována v pokusu, ve kterém byl HPV11 (18 mcg/ml v 50 mM MOPS pufru obsahujícím 0,25 M NaCl) umístěn do polypropylenových zkumavek ve dvou různých poměrech povrch:objem (obr. 5). Po jednom dnu při pokojové teplotě byl v podstatě všechen HPV adsorbován na povrch při poměru povrch: objem 6,0 cm'¹, zatímco při poměru povrch .-objem 4,0 cm'¹ byla pozorována přibližně 15% adsorpce (obr. 5).

Příklad 6: Přísady inhibující adsorpci HPVll VLP na povrch a agregaci

Vyhledávání surfaktantů v rychlých testech stability • · · ·

V předběžných vyhledávacích pokusech byly vzorky HPVll, za přítomnosti nebo za absence 0,01% několika surfaktantů, inkubovány při teplotě okolí po dobu 20 hodin. Koncentrace HPV byla 18 mcg/ml a pufr obsahoval 50 mM MOPS, 0,15 M NaCl při pH 7,0. Několik surfaktantů způsobilo za těchto podmínek částečnou ochranu před agregací ve srovnání se vzorky HPV bez surfaktantů, jak bylo stanoveno dynamickým rozptylem světla (obr. 6A).

Vyhledávací test pro surfaktant byl proveden za přísnějších podmínek. HPVll byl inkubován za přítomnosti nebo za absence 0,01% každého surfaktantů při 50 °C po dobu 30 minut a potom při pokojové teplotě po dobu 2 dnů. Koncentrace HPV byla 18 mcg/ml a pufr obsahoval 50 mM MOPS, 0,04 M NaCl při pH 7,0. Za těchto podmínek agregoval vzorek HPV bez surfaktantů mnohem více než v předešlém pokusu. Na obr. 6B je uvedeno, že z testovaných surfaktantů bylo dosaženo nej lepší prevence agregace HPVll VLP při použití polyoxyethylensorbitanových esterů mastných kyselin (Tween 80^R) a polyoxyethylenalkyletherů (Brij 58^R).

Ochranný účinek kombinace soli a Polysorbatu 80

Obr. 7A a 7B ukazují, že při nižší koncentraci HPV nebrání samotná vysoká koncentrace soli adsorpci HPV VLP na povrch nebo agregaci HPV VLP při použití chloridu sodného, síranu sodného a síranu amonného, vždy v koncentraci 0,1 M a 0,5 M. naopak, obr. 7A a 7B také ukazují, že přidání neiontového surfaktantů Tween 80^R k pufru obsahujícímu 0,4 M síran amonný vede k téměř kompletní prevenci adsorpce a agregace i po 6 dnech při pokojové teplotě.

Vliv Polysorbatu 80 (například Tween 80^R) a NaCl na adsorpci na povrch a agregaci byl potvrzen v odděleném pokusu. HPVll LI

VLP v koncentraci 18 mcg/ml byl inkubován v polypropylenových

• · · • · zkumavkách v 50 mM MOPS pufru obsahujícím 250 mM NaCl při pH 7 s nebo bez Tween 80^R. Obr. 8 ukazuje procento adsorbovaného proteinu a hodnoty D_h v závislosti na době inkubace při pokojové teplotě. Za absence Tween 80^R je ztráta způsobená adsorpci a gregací velmi významná, zatímco 0,01% Tween 80^R poskytuje ochranu před oběma problémy.

Obr. 9 ukazuje, že pro chránění nízkých koncentrací HPVll VLP (100 mcg/ml) před agregací a adsorpci je kromě Polysorbatu 80 nutná optimální koncentrace solí. Také je možno pozorovat, že zvýšení Tween 80^R v prostředcích s nízkou iontovou koncentrací zpsobí částečnou, nikoliv úplnou, ochranu. Obr. 9 ukazuje, že agregace HPVll (18 mcg/ml) je pouze částečně kontrolována 0,01% Tween 80^R v pufru obsahujícím 50 mM MOPS a 0,04 M NaCl, ale pokud je koncentrace NaCl zvýšena na 0,10 M, tak je dosaženo téměř úplné ochrany VLP před agregací po dobu 48 hodin při pokojové teplotě.

Obr. 10 ukazuje vliv titrace Polysrobatu 80 na agregaci HPVll VLP (18 mcg/ml) v 50 mM MOPS pufru obsahujícím 0,15 M NaCl při pH 7,0. Vzorky byly inkubovány s Tween 80^R v koncentraci v rozmezí od 0 do 0,01% při 4 °C a pokojové teplotě. Při 4 °C nebyla pozorována žádná významná agregace až do 20 dnů pro vzorek obsahující 0,01% Tween a částečná prevence agregace byla pozorována při pokojové teplotě.

Obr. 11 ukazuje schopnost neiontových surfaktantů bránit agregaci HPV16 VLP. vyšetřovanými surfaktanty byly Polysorbat 80 (například Tween 80), Polysorbat 20 (například Tween 20), NP-40, Triton X100, Triton X114, stejně jako polyoxyethylenalkylethery (například Brij 35 a Brij 85). Vzorky HPV16 s proteinovou koncentrací 20 mcg/ml byly inkubovány s různými surfaktanty v koncentraci 0,01% při pokojové (okolní) teplotě po dobu 50 dnů.

• · ·

Inkubační pufr obsahoval 50 mM MOPS, 0,15 M NaCl při pH 7.

Všechny surfaktanty chránily HPV16 před agregací během skladování ve srovnání s kontrolními vzorky HPV16 bez surfaktantu, jak bylo stanoveno DLS (obr. 11). Stupeň ochrany při této koncentraci surfaktantů (0,01%) se mezi surfaktanty mírně lišil. Pro testování závislosti ochranné schopnosti neionotovych surfaktantů na koncentraci solí byly vzorky HPV16 s koncentrací proteinu 30-60 mcg/ml inkubovány po dobu 24 hodin při 4 °C s 0,01% Tween 80 a NaCl v koncentracích 0,15 - 0,5 M. Bylo zjištěno, že koncentrace NaCl 0,2 nebo vyšší v kombinaci s neiontovými surfaktanty umožňují významnou ochranu před agregací HPV16 VLP.

Stabilizační vliv solí různých koncentrací na agregaci HPV v přítomnosti neiontových surfaktantů byl testován z hlediska celkové iontové síly. Obr. 2 a Obr. 9 ukazují, že minimální koncentrace NaCl je nutná pro stabilizaci HPV VLP v přítomnosti nebo za absence neiontových surfaktantů. V následujících pokusech byly testovány různé soli na svou schopnost stabilizovat HPV16 VLP při konstantní iontové síle. HPV16 v koncentraci 60 mcg/ml byl inkubován při 22 °C po dobu 24 hodin a potom byl uskladněn při 4 °C do testu na hydrodynamickou velikost (Dh), který byl proveden za použití dynamického rozptylu světla a na in vitro antigenicitu (vazbu protilátky), která byla stanovena EIA nebo BIA core testy. Tabulka 1 ukazuje, že při použití různých solí místo NaCl byla pozorována podobná stabilita HPV při nižších koncentracích solí, ale při stejných iontových silách. Pro kontrolu byl použit roztok s nižší iontovou silou, u které došlo k agregaci HPV a k částečné ztrátě antigenicity. Tyto výsledky naznačují, že stabilizační účinek soli je za těchto podmínek způsoben především koncentrací iontů, nikoli typem soli. Když byly stejné stabilizační účinky soli testovány za přísnějších podmínek (37 °C), tak byly pozorovány určité variace stabilizační aktivity různých solí, jak byla stanovena v testu in vitro • ·

antigenicity a v analýze agregace. Například CaCl₂ a MgCl₂, stejně jako fosfátový pufr, byly při konstantní iontové síle méně účinné ve stabilizaci HPV VLP.

Tabulka 1

	MOPS Přidaná	Konečný Celková	Biacore* EIA*/	Dh (nm)
(M)	sůl (M)	Tween80	konc. iontů (M)	protein	protein
NaCl	0,05	0,02	0,01%	0,12	0,4	0,2	180
NaCl	0,05	0,12	0,01%	0,22	1,0	1,0	72
citrát	0,05	0,02	0,01%	0,22	1,2	0,9	74
sodný
fosforečnan	0,05	0,02	0,01%	0,22	0,8	1,2	74
sodný
octan	0,05	0,12	0,01%	0,22	1,0	1,0	74
sodný
Na SO	0,05	0,04	0,01%	0,22	0,8	1,1	73
2 4
MgCl₂	0,05	0,04	0,01%	0,22	1,0	1,1	74
CaCl 2	0,05	0,04	0,01%	0,22	0,8	1,2	93

* Relativní in vitro vazba protilátky byla normalizována vzhledem ke kontrolnímu vzorku HPV16 zmrazenému na -70 °C. Hydrodynamický průměr (Dh) kontrolní vzorku měřený dynamickým rozptylem světla byl 73 nm.

Proto chrání přítomnost Polysorbatu 80 v koncentraci 0,01% HPV11 a HPV16 před adsorpcí na povrch zásobníku a před agregací částic při téměř fyziologické koncentraci iontů při 4 °C po dobu více týdnů. Tato data také ukazují, že (1) adsorpce HPV na povrchy a agregace spolu souvisejí a že (2) těchto dějů se mohou • · • · · * φ · · • · · · · »····· • · » · · • ······· · · ·· účastnit jak elektrostatické, tak hydrofobní mechanismy, protože při použití detergentu nebo soli samotných se nedosáhne plné ochrany před adsorpcí nebo agregací.

• · 4 · 4 4 4 4 4 4 4 4φ * · ♦ 4 · · 4 <444

4 4 4 4 44 4 >ιζ- 444 · 4 4*444444 ^έΟ 444 44 44

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel: Merck & Co., INC.

(ii) Název vynálezu: Prostředek obsahující antigen lidského papilomaviru (iii) Počet sekvencí: 35 (iv) Adresa pro korespondenci (A) Adresa: Merck & Co., Inc.

(B) Ulice: P.O. Box 2000-RY60-30 (C) Město: Rahway (D) Stát: NJ (E) Země: USA (F) ZIP: 07065-0907 (v) Počítačová čtecí forma:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30 (vi) Údaje o současné přihlášce:

(A) Číslo přihlášky:

(B) Datum podání:

(C) Klasifikace:

(viii) Zástupce/agent informace (A) Jméno: Hand, J. Mark (B) Registrační číslo: 36545 (C) Reference/číslo rejstříku: 19933Y (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: 732/594-3905 (B) Telefax: 732/594-4720 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 164 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer ···« · · · ·· ·· • · · ·· * 9 · « « · • * 9 9 · · · · · • · * · · · 9 999999

9 9 9 9 9 9

9 9 999 999 9 9 9 9 9 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 1:

GAAGATCTCA CAAAAGAAAA TGTGGCGGCC TAGCGACAGC ACAGTATATG TGCCTCCTCC 60

TAACCCTGTA TCCAAAGTTG TTGCCACGGA TGCTTATGTT AAACGCACCA ACATATTTTA 120

TCATGCCAGC AGTTCTAGAC TTCTTGCAGT GGGTCATCCT TATT 164 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 156 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 2:

ATTCCATAAA	AAAGGTTAAC	AAAACTC-TTG	TGCCAAAGGT	GTCAGGATAT	CAATACAGAG	60
TATTTAAGGT	GGTGTTACCA	GATCCTAACA	AATTTGCATT	GCCTGACTCG	TCTCTTTTTG	120
ATCGCACAAC	ACAACGTTTG	GTATGGGCAT	GCATGT			15 6

(2) Informace pro SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 136 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 3:

ACATGCATGC ACAGGCCTAG AGGTGGGGCG GGGACAGCCA TTAGGTGTGG GTGTAAGTGG 60

ACATCCTTTA CTAAATAAAT ATGATGATGT TGAAAATTCA GGGGGTTACG GTGGTAACCC 120

TGGACAGGAT AACAGG 136 • 9 ·· 9·

9 9 9 · • 9 9 9 9 * 999 ·99

9 9

9 9 9 « 9 9 (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 127 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 4:

GTTAATGTAG GTATGGATTA TAAACAAACA CAATTATGCA TGGTTGGATG TGCCCCCCCT 60

TTGGGCGAGC ATTGGGGTAA AGGTACACAG TGTAGTAATA CATCTGTACA GAATGGTGAC 12 C

TGCCCGC ¹²⁷ (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 125 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 5:

CCTTAGAACT? TATTACCAGT GTTATACAGG ATGGCGATAT GGTTGACACA GGCTTTGGTG 60

CTATGAATTT TGCTGATTTG CAGACCAATA AATCAGATGT TCCTCTTGAC ATATGTGGCA 120

CTGTA ¹²⁵ (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 116 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární

♦ ♦ ·

(ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 6:

TGTAAATATC CAGATTATTT ACAAATGGCT GCAGACCCAT ATGGTGATAG ATTATTTTTT 60

TATCTACGGA AGGAACAAAT GTTTGCCAGA CATTTTTTTA ACAGGGCTGG TACCCC 116 (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 124 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 7:

GGGGTACCGT GGGGGAACCT GTGCCTGATG ATCTTTTAGT TAAGGGTGGT AACAATCGCT 60

CGTCTGTAGC GAGTAGTATA TATGTTCACA CCCCAAGCGG CTCTTTGGTG TCCTCTGAGG 120

CACA 124.

(2) Informace pro SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 113 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 8:

ATTGTTTAAT AAGCCATATT GGCTACAAAA AGCCCAGGGA CATAACAATG GTATTTGTTG GGGTAATCAT CTGTTTGTTA CTGTGGTAGA TACCACACGC AGTACCAACA TGA ·· · ··· • 0

0 00 0 (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 113 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 9:

CATTATGTGC ATCCGTATCT AAATCTGCCA CATACACCAA TTCTGATTAT AAAGAGTACA

TGCGTCATGT GGAAGAGTTT GATTTACAAT TTATTTTTCA ATTATGTAGC ATT (2) Informace pro SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 105 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 10:

ACATTGTCTG CTGAAGTAAT GGCCTATATT CACACAATGA ATCCCTCTGT TCTCGAGGAC 60

TGGAACTTTG GGTTATCGCC TCCCCCAAAT GGTACACTCG AGCGG 105 (2) Informace pro SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 155 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 11:

φφ φφφ* • φ φ φ · · • φ φ φ φ • φ φφφ φφφ • φ φ φφφφφ φ · *·

CCGCTCGAGG	ATACCTATAG	GTATGTGCAG	TCACAGGCCA	TTACCTGTCA AAAGCGCACT	60
CCTGAAAAGG	AAAAGCAAGA	TCCCTATAAG	GACATGAGTT	TTTGGGAGGT TAATTTAAAA	120
GAAAAGTTTT’	CTAGTGAATT	GGATCAGTTT	CCTTT		155

(2) Informace pro SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 134 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 12:

GGGACGCAAG TTTTTGTTAC AAAGTGGATA TAGGGGACGG ACCTCTGCTC GTACCGGTAT TAAGCGCCCT GCTGTTTCCA AACCCTCTAC TGCCCCTAAA CGTAAGCGCA CCAAAACTAA

AAAGTAAGAT CTTC (2) Informace pro SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 154 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 13:

GAAGATCTTA	CTTTTTAGTT	TTGGTGCGCT	TACGTTTAGG	GGCAGTAGAG	GGTTTGGAAA	60
CAGCAGGGCG	CTTAATACCG	GTACGAGCAG	AGGTCCGTCC	CCTATATCCA	CTTTGTAACA	120
AAAACTTGCG	TCCCAAAGGA	AACTGATCCA	ATTC			154

(2) Informace pro SEQ ID NO: 14:

(i) Charakteristiky sekvence: (A) Délka: 135 párů basí

4444 • · 4 • 44

4 4

4«

4

44

4 4 • 4 4

444 444 » 4 ·4 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 14:

ACTAGAAAAC	TTTTCTTTTA	AATTAACCTC	CCAAAAACTC	ATGTCCTTAT	AGGGATCTTG	60
CTTTTCCTTT	TCAGGAGTGG	GCTTTTGACA	GGTAATGGCC	TGTGACTGCA	CATACCTATA	120
GGTATCCTCG	AGCGG					135

(2) Informace pro SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 125 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 15:

CCGCTCGAGT	GTACCATTTG	GGcjGAGGCG A.	TAACCtAAAG	TTCCAGTCCT	GGAGAACAGA	60
GGGATTCATT	GTGTGAATAT	AGGCCATTAC	TTCAGCAGAC	AATGTAATGC	TACATAATTG	120
AAAAA						125

(2) Informace pro SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 113 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 16:

TAAATTGTAA ATCAAACTCT TCCACATGAC GCATGTACTC TTTATAATCA GAATTGGTGT 6 0

ATGTGGCAGA TTTAGATACG GATGCACATA ATGTCATGTT GGTACTGCGT GTG

113 ······ · »· 00 ·· • 0 0 00·0 0000 • 00 0 00000 0 ·0 0 · 0 0 000000 0 0 0 0 0 0 0 (2) Informace pro SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 113 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 17:

GTATCTACCA CAGTAACAAA CAGATGATTA CCCCAACAAA TACCATTGTT ATGTCCCTGG 60

GCTTTTTGTA GCCAATATGG CTTATTAAAC AATTGTGCCT CAGAGGACAC CAA 113 (2) Informace pro SEQ ID NO: 18:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 104 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 18:

AGAGCCGCTT GGGGTGTGAA CATATATACT ACTCGCTACA GACGAGCGAT TGTTACCACC 60

CTTAACTAAA AGATCATCAG GCACAGGTTC CCCCACGGTA CCCC 104 (2) Informace pro SEQ ID NO: 19:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 136 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 19:

··

(C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 22:

TACCACCGTA ACCCCCTGAA TTTTCAACAT CATCATATTT ATTTAGTAAA GGATGTCCAC

TTACACCCAC ACCTAATGGC TGTCCCCGGC CCACCTCTAG GCCTGTGCAT GCATGT (2) Informace pro SEQ ID NO: 23:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 170 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 23:

ACATGCATGC CCATACCAAA CGTTGTGTTG TGGGATCAAA AAGAGACGAG TCAGGCAATG

CAAATTTGTT AGGATCTGGT AACACCACCT TAAATACTCT GTATTGATAT CCTGACACCT

TTGGCACAAC AGTTTTGTTA ACCTTTTTTA TGGAATAATA AGGATGACCC

116

120

C (2) Informace pro SEQ ID NO: 24:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 150 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 24:

TCCGTGGCAA CAACTTTGGA

ACTGCAAGAA GTCTAGAACT <

150

GGCCGCCACA TTTTGTTTTG TGAGATCTTC ♦· ♦»·· (2) Informace pro SEQ ID NO: 25:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 27 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 25:

ggaattcaca tgcatgcaca ggcctag (2) Informace pro SEQ ID NO: 26:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 26 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligonukleotid (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 26:

GGAATTCGGG GTACCAGCCC TGTTAA 26 (2) Informace pro SEQ ID NO: 27:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 45 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 27:

TCGAAGACTG GAACTTTGGG TTATCGCCTC CCCCAAATGG TACAC (2) Informace pro SEQ ID NO: 28:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 45 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina ·· *· ♦ * · 9 « · • « · · · • · ·· · ·99 ···· • · » * • · · • · · · • · · »· · t (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 28:

TCGAGTGTAC CATTTGGGGG AGGCGATAAC CCAAAGTTCC AGTCT 45 (2) Informace pro SEQ ID NO: 29:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 45 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 29:

CTCAGATCTC ACAAAACAAA ATGTGGCGGC CTAGCGACAG CACAG 45 (2) Informace pro SEQ ID NO: 30:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 35 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 30:

GAGAGATCTT ACTTTTTGGT TTTGGTACGT TTTCG (2) Informace pro SEQ ID NO: 31:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 34 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární ·· ···· • · · φ • · · * · · ·· · ·

Φ· • · ···· ·♦ • · • 999

9

999 9 (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 31:

GAGAGATCTT ACCTTTTAGT TTTGGCGCGC TTAC (2) Informace pro SEQ ID NO: 32:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 31 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 32:

CTTAAAGCTT ATGTCACTTT CTCTTGTATC G (2) Informace pro SEQ ID NO: 33:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 30 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 33:

TGATAAGCTT GCTCAATGGT TCTCTTCCTC (2) Informace pro SEQ ID NO: 34:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer • · (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 34:

TGGTCATCCC AAATCTTGAA A 21 (2) Informace pro SEQ ID NO: 35:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický DNA oligomer (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 35:

CACCGTAGTG TTTGGAAGCG A

Claims

1. Prostředek obsahující antigen lidského papilomaviru vyznačující se tím, že obsahuje (a) vakcinační složku;

(b) sůl ve fyziologicky přijatelné koncentrací;

(c) neiontový surfaktant ve fyziologicky přijatelné koncentraci.

2. Prostředek obsahující antigen podle nároku 1 vyznačující se tím, že uvedená vakcinační složka lidského papilomaviru obsahuje viru-podobné částice.

3. Prostředek obsahující antigen podle nároku 2 vyznačující se tím, že uvedenými částicemi podobnými lidskému papilomaviru jsou Ll protein nebo LI a L2 protein.

4. Prostředek obsahující antigen podle nároku 3 vyznačující se tím, že uvedené částice podobné lidskému papilomaviru jsou vybrány ze skupiny tvořené lidskými papilomaviry typů 6a, 6b, 11, 16, 18 a jakýmikoliv jejich kombinacemi.

5. Prostředek obsahující antigen podle nároku 4 vyznačující se tím, že uvedená sůl je vybrána ze skupiny skládající se z chloridu sodného, síranu sodného, síranu amonného, octanu sodného, citrátu sodného a fosforečnanu sodného, nebo jiných fyziologicky přijatelných iontů pufru vzniklých v roztoku v dostatečné iontové síle.

6. Prostředek obsahující antigen podle nároku 5 vyznačující se tím, že uvedenou solí je chlorid • · · · sodný.

7. Prostředek obsahující antigen podle nároku 6 vyznačuj ícísetím, že chlorid sodný je přítomen v koncentraci od přibližně 50 mM do přibližně 500 mM.

8. Prostředek obsahující antigen podle nároku 6 vyznačuj ícísetím, že chlorid sodný je přítomen v koncentraci od přibližně 150 mM do přibližně 300 mM.

9. Prostředek obsahující antigen podle nároku 8 vyznačující se tím, že uvedený neiontový surfaktant je vybrán ze skupiny neiontových surfaktantů zahrnující polysorbaty, polyoxyethylenalkylestery, Triton X-100¹¹, Triton 114^R, NP40^R, Spán 85 a Pluronic 121.

10. Prostředek obsahující antigen podle nároku 9 vyznačující se tím, že uvedeným polysorbatem je Polysorbat 80.

11. Prostředek obsahující antigen podle nároku 10 vyznačující se tím, že Polysorbat 80 je přítomen v koncentraci do přibližně 0,2%.

12. Prostředek obsahující antigen podle nároku 10 vyznačující se tím, že Polysorbat 80 je přítomen v koncentraci do přibližně 0,01%.

15. Prostředek obsahující antigen lidského papilomaviru vyznačující se tím, že obsahuje (a) populaci lidskému papilomaviru-podobných částic složenou z

Ll proteinu lidského papilomaviru vybraného ze skupiny skládající se z 6a, 6b, ll, 16 a 18;

• · • · · · (b) chlorid sodný v koncentraci od přibližně 150 mM do přibližně 300 mM; a (c) Polysorbat 80 v koncentraci až přibližně 0,1%.

16. Způsob stabilizace populace přečištěných viru-podobných částic odvozených od LI nebo LI a L2 proteinu lidského papilomaviru při teplotách vyšších než 0 °C na dobu delší než alespoň jeden měsíc vyznačuj ící se tím, že obsahuje přípravu uvedených přečištěných viru-podobných částic v prostředku obsahujícím chlorid sodný v koncentraci od přibližně 50 mM do přibližně 500 mM a Polysorbat 80 v koncentraci až 0,2% (hmot./obj.).

17. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že vakcinační prostředek obsahuje chlorid sodný v koncentraci v rozmezí od přibližně 150 mM do přibližně 300 mM.

18. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že Polysorbat 80 je přítomen v koncentraci do 0,1% (hmot.obj.).

19. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedený prostředek je stabilní při teplotách od přibližně 2 °C do přibližně 8 °C po dobu alespoň jednoho měsíce.