CN1259051A

CN1259051A - 稳定化后的人乳头瘤病毒制剂

Info

Publication number: CN1259051A
Application number: CN98805728A
Authority: CN
Inventors: G·桑亚尔; D·B·沃尔金; 史力
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1997-04-08
Filing date: 1998-04-07
Publication date: 2000-07-05
Also published as: JP4598201B2; AU6953398A; DE69822452T2; JP2001519814A; IL132201A0; NO994879L; NZ500028A; AU739829B2; PL336715A1; EE9900612A; KR20010006169A; SK138199A3; ATE261734T1; WO1998044944A3; DK0973546T3; NO994879D0; CA2286294A1; WO1998044944A2; EP0973546A2; DE69822452D1

Abstract

本发明公开了一种人乳头瘤病毒(HPV)抗原制剂,该制剂能防止蛋白凝聚,并作为水溶液显示出更强的稳定性。这些制剂包括以生理上可接受的浓度存在的一种盐(例如氯化钠)和一种非离子型表面活性剂(多乙氧基醚80例如Tween80^)。

Description

稳定化后的人乳头瘤病毒制剂

相关申请的交叉参考

本申请是1997年4月8日提交的序列号为60/042,808的美国临时申请的部分延续。联邦资助研究的声明不适用缩微平片附录的参考不适用

发明领域

本发明涉及人乳头瘤病毒抗原制剂，该制剂表现出增强了的抗原稳定性和减弱了的抗原凝聚和沉淀性。本发明还涉及用此处公开的人乳头瘤病毒抗原制剂制备佐剂化HPV疫苗的方法。本发明还涉及由这些人乳头瘤病毒抗原制剂制备而成的佐剂化人乳头瘤病毒疫苗。

发明背景

乳头瘤病毒的感染发生在各种动物中，包括人、绵羊、狗、猫、兔、猴、蛇以及奶牛。乳头瘤病毒感染上皮细胞，通常在感染部位形成良性上皮瘤和纤维上皮瘤。乳头瘤病毒是种特异性感染源。

根据所感染宿主的不同，乳头瘤病毒可以分为不同的组。根据DNA杂交研究，可以进一步将人乳头瘤病毒分为70多个型。PV的型之间表现出型特异性的免疫原，也就是说，对乳头瘤病毒的一个型引起的感染具有中和活性的免疫性不能赋予抵抗乳头瘤病毒另一个型的免疫力。

就人而言，不同的HPV类型引起的疾病不同。HPV的1、2、3、4、7、10以及26～29型在正常和免疫受损的个体中都能引起良性疣。HPV的5、8、9、12、14、15、17、19～25、36和46-50型在免疫受损的个体中能引起扁平损伤。HPV的6、11、34、39、41～44和51～55型引起生殖道和呼吸道黏膜非恶性湿疣。HPV的16、18、31、33、35、45和58型引起生殖道黏膜上皮发育异常，而且与大部分子宫颈、阴道、外阴、以及肛管的原位或侵袭性癌有关。

乳头瘤病毒是小的(50～60nm)、无囊膜、二十面体DNA病毒，由8个早期基因和2个晚期基因编码。病毒基因组的阅读框被命名为E1～E8以及L1和L2，此处的“E”代表早期而“L”代表晚期。L1和L2编码病毒的核衣壳蛋白。早期(E)基因与病毒的复制、翻译调节以及细胞转化有关。

L1蛋白是主要的衣壳蛋白，分子量为55～60kDa。L2是次要的衣壳蛋白，其预期分子量为55～60kDa，而通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的表观分子量为75～100kDa。免疫学资料显示在病毒衣壳中，大部分的L2蛋白在L1蛋白的内层。L1的ORF在不同的乳头瘤病毒之间高度保守。L2蛋白在不同的乳头瘤病毒之间的保守性较低。

现在已经鉴定出L1和L2基因可以作为免疫预防的好的目标。另外还发现早期基因中的几个也可以作为发展疫苗的潜在目标。美洲产白尾棕色兔乳头瘤病毒(CRPV)和牛乳头瘤病毒(BPV)的研究表明，用重组L1和/或L2蛋白(用细菌或痘病毒载体生产的)免疫可以保护动物不受病毒的感染。用杆状病毒表达系统或痘病毒载体表达乳头瘤病毒L1基因可以导致病毒样颗粒(VLP)的组装，VLP能诱导产生高滴度的病毒中和抗体，这与保护个体不受病毒的攻击有关。而且，已经用L1和L2基因生产疫苗从而预防和治疗动物中的乳头瘤病毒感染。

现已在昆虫和哺乳动物细胞系统中表达了含HPV11L1蛋白的病毒样颗粒。酵母细胞中表达的VLPs具有成本划算和易于调节发酵罐中的大规模生长的优点。然而，酵母细胞中的HPV11L1蛋白的表达量低。观察到这种现象是由于HPV11L1 mRNA的截短导致的。相反，HPV6L1蛋白基因是全长mRNA翻译成的，其表达水平高。通过修饰HPV6L1DNA让其编码HPV11L1蛋白，这样就能促进全长mRNA的翻译导致HPV11L1蛋白表达量的增加。

现已用L1和L2基因来生产疫苗，预防和治疗动物中的乳头瘤病毒的感染。

把第16型的HPV的L1基因和L2基因克隆到痘病毒载体中，用重组后的载体感染CV-1哺乳动物细胞生产病毒样颗粒(VLP)。

已经生产出了细菌来源的重组牛乳头瘤病毒L1和L2。重组细菌蛋白的中和血清可以和天然的病毒之间低水平地交叉中和反应，这可能是由于天然蛋白和细菌来源的蛋白之间的构象不同。

现已用表达HPV16L1或HPV16L2 ORFs的重组杆状病毒感染SF9细胞，生产L1和L2蛋白。Western印迹分析表明，杆状病毒来源的L1蛋白和L2蛋白能与HPV16的抗体交叉反应。该杆状病毒来源的L1可以形成VLPs。

Jansen等人(1995，Vaccine 13(16)：1509～1514)在从美洲产白尾棕色兔乳头瘤病毒纯化L1和L1+L2 VLPs的过程中，使用了含有氯化钠和Tween80^的电泳缓冲液。

目前，纯化的重组HPV VLP制剂必须在高NaCl浓度的条件下保存，以防止溶液中凝聚。在低离子强度的条件下，HPV VLPs的凝聚能达到从溶液中沉淀出来的程度。基于这些以及其他相关的观察结果，目前采取将HPV本体溶液在高浓度NaCl(1.25～2.5M)下冻存。经RIA、EIA或BIA核心实验测定，高度凝聚后的HPV11 VLP样品表现出很低的体内抗原性。因此，需要制备一种含水的HPV VLP制剂，使它能在生理盐浓度的条件和其他可接受的长期保存条件下保持稳定。本发明致力于并满足了这种需要。

发明概述

本发明涉及人乳头瘤病毒(HPV)抗原制剂，该制剂在表面活性剂存在和生理盐浓度的条件下能够防止抗原凝聚并增强抗原稳定性。

本发明还涉及一种佐剂化HPV疫苗的生产，该方法是用本发明的HPV抗原制剂和生理有效量的一种佐剂混合从而形成一种佐剂化HPV疫苗。

本发明的HPV抗原制剂和佐剂化疫苗包括但不只限于，作为抗原成分的病毒样颗粒，该病毒样颗粒作为重组HPV亚单位疫苗生产，这种亚单位疫苗中含有来自HPV6a、6b、11、16和18型的L1或L1与L2蛋白的组合。使该重组疫苗的单价形式以及二价(例如但决不限于重组HPV11L1、HPV16L1和HPV6aL1)和多价形式(例如但决不限于重组HPV11L1、HPV6aL1、HPV16L1和HPV18L1)保持稳定都在本发明的范围之内。

本发明还涉及HPV抗原制剂，其中包括一种生理盐浓度和一种表面活性剂用来提供增强该制剂中疫苗成分0℃以上时的稳定性。本发明的HPV制剂应该经得起长期保存，在约2℃～约8℃的温度范围内能至少保存1个月到2年。

本发明的一个实施方案涉及HPV抗原制剂，其中该制剂包括一种生理上可接受的盐，该盐包括但未必限于氯化钠、硫酸钠和硫酸铵。在该制剂中加入盐的目的在于保持期望的离子强度。共同形成离子强度的离子可能来自缓冲成分以及非缓冲性的盐，该缓冲成分包括但不限于，磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、Tris-HCl、MOPS等，。

本发明的另一个实施方案涉及HPV抗原制剂，其中该制剂包括一种非离子型表面活性剂，包括但未必限于，聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯(多乙氧基醚)，例如多乙氧基醚80(例如Tween80^)、多乙氧基醚60(例如Tween60^)和多乙氧基醚20(例如Tween20^)；聚氧乙烯烷基醚(例如Brij58^、Brij35^)以及其他包括但不限于TritonX-100^、Triton X-114^、NP40^、Span85和Pluronic系列的非离子型表面活性剂(例如Pluronic121)。

本发明的另一个实施方案涉及一种HPV抗原制剂，其中该制剂包括一种上述公开的浓度范围达到约0.2％w/v的非离子型表面活性剂，生理上可接受的盐是存在于一种生理上可接受的缓冲液中浓度范围为约10mM～约500mM的氯化钠。

本发明的另一个实施方案涉及一种HPV抗原制剂，其中该制剂包括一种上述公开的浓度范围达到约0.2％w/v的非离子型表面活性剂，生理上可接受的盐是存在于一种生理上可接受的缓冲液中浓度范围为约50mM～约400mM的氯化钠。

本发明还有另一个实施方案涉及一种HPV抗原制剂，其中该制剂包括一种上述公开的浓度范围达到约0.2％w/v的非离子型表面活性剂，生理上可接受的盐是存在于一种生理上可接受的缓冲液中浓度范围为约150mM～约300mM的氯化钠。

本发明的另一个实施方案涉及一种HPV抗原制剂，其中生理上可接受的盐是浓度范围为约10mM～约500mM的氯化钠，非离子型表面活性剂是存在于一种生理上可接受的缓冲液中浓度范围达到约0.2％w/v的多乙氧基醚80(包括但不限于Tween80^)。

本发明的一个特定的实施方案涉及一种HPV抗原制剂，其中生理上可接受的盐是浓度范围为约10mM～约500mM的氯化钠，非离子型表面活性剂是存在于一种生理上可接受的缓冲液中浓度范围为约0.01％～0.1％w/v的多乙氧基醚80(包括但不限于Tween80^)。

本发明的一个优选实施方案涉及一种HPV抗原制剂，其中氯化钠的浓度范围为约50mM～约400mM的氯化钠，多乙氧基醚80(包括但不限于Tween80^)，在一种生理上可接受的缓冲液中的百分比范围为约0.01％～约0.1％w/v。

本发明的一个特别优选实施方案涉及一种HPV抗原制剂，其中生理上可接受的盐是浓度范围为约150mM～约300mM的氯化钠，多乙氧基醚80(包括但不限于Tween80^)存在于一种生理上可接受的缓冲液中用量的百分比范围为约0.01％～约0.1％w/v。

本领域技术人员应该知道的是，本发明提供的存在于生理上可接受的缓冲液中的抗原制剂优选但未必限于由磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、Tris-HCl或MOPS缓冲形成的制剂，pH值范围优选但不限于约pH5.0～9.0，特别优选约pH6.0～约8.0。

本发明还涉及制备HPV疫苗制剂的方法，其中包括使用本发明的HPV抗原制剂。此处描述了这些经改进后的生产以铝盐或非铝盐为基础的HPV疫苗。

本发明还涉及佐剂化HPV疫苗，其中一种生物学有效量的佐剂与一种生物学有效量的此处公开的含抗原制剂结合在一起。

此处使用的“PV”一词是“乳头瘤病毒”的缩写。

此处使用的“HPV”一词是“人乳头瘤病毒”的缩写。

此处使用的“VLP”一词是“病毒样颗粒”的缩写。

此处使用的“生理上可接受的”一词意思是，一种缓冲液、赋形剂或盐的浓度或离子强度使得制剂与所免疫的目标宿主，例如人之间生物学上相容。

附图简述

图1给出的是4℃下2个月的时间段内，HPV11L1 VLP(50mM MOPS，pH7.0，1.25M NaCl)蛋白稀释度对水力学大小(hydrodynamic size)影响随时间变化的情况。(□)470mcg/mL；(■)18mcg/mL。

图2给出的是室温下保存过程中，盐浓度对HPV11和HPV16L1 VLP水力学大小的影响。将样品稀释在一种缓冲液中，保存1小时后进行分析。对于HPV11而言，然后再将其用同样的缓冲液透析过夜。用含有不同浓度NaCl的50mM MOPS缓冲液(pH7.0)将HPV11L1 VLP配成制剂。(○)未透析；(□)透析。用含有不同浓度NaCl的50mM MOPS缓冲液(pH7.0)将HPV16L1 VLP配成制剂，(●)未透析。

图3给出的是，室温下96小时的时间段内，以50mcg/mL浓度溶解在置于聚丙烯管中的含180mM NaCl、pH7.0的50mM MOPS中形成HPV11L1 VLP溶液，在一种透析膜上所发生的蛋白吸附对HPV11L1VLP的水力学大小(●)和蛋白浓度(剩余的HPV11L1所占的百分比)(■)的影响。

图4给出的是室温下24小时的时间段内，聚苯乙烯(○)、聚丙烯(●)和玻璃(◇)对溶解在含1.25M NaCl、pH7.0的50mM MOPS中的HPV11L1 VLP的吸附程度的影响。

图5给出的是表面和容积之比的增大对溶解在含0.25M NaCl、pH7.0的50mM MOPS中的HPV11L1 VLP(18mcg/mL)在聚丙烯上吸附的影响。(□)表面/容积＝4cm^-1；(●)表面/容积＝6cm^-1。

图6A和图6B给出的是各种表面活性剂(0.01％)对以下两种不同情况下的HPV11L1 VLP(18mcg/mL)稳定性的影响：溶解于含150mMNaCl、pH7.0的50mM MOPS中，在室温下温育20小时(图幅A)；以及溶解于含40mM NaCl、pH7.0的50mM MOPS中，50℃下温育30min，接着在动力光散射(dynamic light scattering)(DLS)之前再在用室温下温育48小时(图幅B)。

图7A和7B给出的是室温下多乙氧基醚80(例如Tween80^)对溶解在不同离子强度的pH7.0的50mM MOPS中的HPV11L1 VLP(16mcg/mL)在聚丙烯表面上的表面吸附(图幅A)和凝聚(图幅B)的影响：(●)0.4M(NH₄)₂SO₄+0.01％Tween80^(○)0.1M(NH₄)₂SO₄；(◇)0.5M(NH₄)₂SO₄；(X)0.1M Na₂SO₄；(|)0.5M Na₂SO₄；(△)0.1M NaCl以及(■)0.5M NaCl。

图8给出的是室温下随着时间的变化，多乙氧基醚80(例如Tween80^)对溶解在含250mM NaCl、pH7.0的50mM MOPS中的HPV11L1 VLP(18mcg/mL)在聚丙烯表面上的水力学直径和HPV11L1 VLP的浓度的影响。测定的蛋白浓度是指占初始蛋白浓度的百分比。反过来蛋白浓度的减小与表面吸附有关。(X)0.01％Tween80^，蛋白浓度；(△)不含Tween80^，蛋白浓度；(■)0.01％Tween80^，水力学直径；以及(◆)不含Tween80^，水力学直径。

图9给出的是NaCl浓度和多乙氧基醚80(例如Tween80^)的联合作用对具有以下几种离子强度、pH7.0的50mM MOPS中的HPV11L1VLP(18mcg/mL)的水力学大小的影响：(●)40mM NaCl和0.01％Tween80^；(◇)100mM NaCl和0.01％Tween80^；以及(○)40mMNaCl，不含Tween80^。

图10A和图10B给出的是在4℃(图幅A)和室温(图幅B)两种情况下，随着时间的变化不同浓度的多乙氧基醚80(例如Tween80^)浓度[(●)0.000％w/v；(○)0.001％w/v；(■)0.005％w/v；(□)0.010％w/v]对溶解在含250mM NaCl、pH7.0的50mM MOPS中的HPV11L1VLP(18mcg/mL)水力学大小(Dh(nm))的影响。

图11给出的是各种表面活性剂(0.01％)对在动力光散射(DLS)测试前室温下保存了50天的溶解在150mM NaCl的pH7.0的50mM MOPS中的HPV16L1 VLP(20mcg/mL)的稳定性的影响。

发明详述

本发明的HPV抗原制剂和佐剂化疫苗包括但不只限于，作为抗原成分的病毒样颗粒，该病毒样颗粒作为重组HPV亚单位疫苗生产，这种亚单位疫苗中含有来自HPV6a、6b、11、16和18型的L1或L1与L2蛋白的组合。使该重组疫苗的单价形式以及二价(例如但决不限于重组HPV11L1、HPV16L1和HPV6aL1)和多价形式(例如但决不限于重组HPV11L1、HPV6aL1、HPV16L1和HPV18L1)保持稳定都在本发明的范围之内。所以，虽然在本发明的范例中使用的是重组HPV11L1VLPs，但这决不对本发明抗原制剂中用到的HPV的类型构成限制。实际上，从该说明书中可以明显地看出此处公开的疫苗制剂可以用于稳定其他的疫苗制剂，包括但不只限于其他以HPV为基础的VLPs。例如，本发明HPV疫苗制剂包括但不只限于作为重组HPV亚单位疫苗生产的病毒样颗粒，其中含有来自第6a、6b、11、16和18型HPV的L1或L1与L2蛋白的联合体。因此，如上所述，也显然的是本发明的制剂可以用于稳定各种二价和多价制剂，包括但不限于二价(例如重组的HPV11L1和HPV6aL1)和多价(例如，重组HPV11L1、HPV6aL1、HPV16L1和HPV18L1)HPV制剂。

因此，本发明涉及含有一种非离子型表面活性剂的抗原制剂，该抗原制剂包含在一系列有效蛋白浓度和优选保存温度下用于在生理活性盐和缓冲液条件下稳定HPV VLPs的非离子型表面活性剂。本发明的HPV制剂应该经得起长期保存，在约2℃～约8℃的温度范围内能至少保存1个月到2年。这些制剂可以与一种佐剂混合，该佐剂包括已知的含铝盐佐剂，例如磷酸铝、碱式磷酸铝(aluminumhydroxyphosphate)和氢氧化铝。本发明的抗原制剂还可以与非铝盐佐剂一起使用，尤其是不受已知能用于HPV VLPs的高离子强度制剂影响的非铝盐佐剂。

在低离子强度的条件下，HPV VLPs凝聚能达到从溶液中沉淀出来的程度。高度凝聚后的HPV11L1 VLP样品表现出很低的体外抗原性(例如RIA、EIA或BIA核心实验)。实施例部分3中的数据表明，解冻一种HPV11 VLPL1(在50mM MOPS/1.25M NaCl中浓度为470mcg/mL)，并用同种缓冲液将其中的一部分稀释到18mcg/mL。即使NaCl浓度维持在1.25M，低蛋白浓度的溶液也会在一段时间后发生凝聚。因此，单纯的高浓度的盐不能防止HPV VLP的凝聚。测试各种NaCl浓度范围(本体溶液经过保存或一小段时间的透析后)的实施例部分4中出现的数据表明，NaCl浓度降低到低水平(约150mMNaCl及更低)可以导致蛋白凝聚(随后发生沉淀)。为了解决这个问题，可以在高浓度NaCl(1.25～2.5M)存在的条件下冷冻保存含有HPV11L1 VLP的溶液。此处公开的本发明的一部分涉及各种含HPVVLPs制剂，所述制剂在有效温度范围内以及生理盐浓度的条件下不发生凝聚。本发明的制剂有利于稳定的HPV VLPs溶液在4℃下长期保存，并可用于单独或者有铝盐佐剂或非铝盐佐剂存在的条件下对HPV的免疫学研究。

另外，实施例部分5中公开了，HPV VLPs和各种不同的表面接触也会影响凝聚。此处表明，与HPV VLPs接触的表面积(例如，透析膜或保存管)的增大可以增大VLP的水力学大小。凝聚的增加导致HPVVLP中蛋白浓度相应地减小，这表明HPV VLPs在膜表面上的吸附，并说明在表面吸附和凝聚之间存在着相关的关系。因此，让疫苗和一种优选的容器表面的接触也属于本发明的范围之内。这些数据表明室温下温育24小时后的HPV11L1 VLPs(50mM MOPS/1.25M NaCl，pH7.0)表现出对硼硅酸盐玻璃的明显吸附，但未发现对聚苯乙烯的吸附。

实施例部分6包括的数据表明了加入到本发明的制剂中的优选的赋形剂和盐。

因此，本发明的本质涉及包括生理浓度的盐的HPV抗原制剂，其中加入了一种非离子型表面活性剂使得该制剂中的抗原成分在0～40℃的温度范围内能保持长期稳定，并且不发生现有的HPV制剂经常出现的凝聚现象。所以，本发明涉及含有一种盐的HPV疫苗制剂，该盐包括但未必限于，以宿主能接受的离子强度存在的氯化钠、硫酸钠和硫酸铵。在该制剂中加入盐的目的是维持所需要的离子强度。缓冲成分生成的离子以及来自非缓冲成分的离子共同作用形成离子强度。

本发明一个特别优选的方面涉及含有一种生理上可接受水平的盐的HPV抗原制剂，其中加入一种最低量的非离子型表面活性剂的目的是增强该制剂中疫苗成分的稳定性。用于该抗原制剂中的非离子型表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚以及其他的非离子型表面活性剂，所述的聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯包括但不限于多乙氧基醚80(Tween80^)、多乙氧基醚60(Tween60^)和多乙氧基醚20(Tween20^)，所述的聚氧乙烯烷基醚包括但不限于Brij58^、Brij35^，所述的其他的非离子型表面活性剂包括但不限于Triton X-100^、Triton X-114^、NP40^、Span85以及Pluronic系列的非离子型表面活性剂(例如Pluronic121)。

本发明的另一个实施方案涉及一种HPV抗原制剂，其中该制剂包括一种上述公开的浓度范围达到约0.2％w/v的非离子型表面活性剂、生理上可接受的盐是存在于一种生理上可接受的缓冲液中浓度范围为约10mM～约500mM的氯化钠。

本发明的另一个实施方案涉及一种HPV抗原制剂，其中该制剂包括一种上述公开的浓度范围达到约0.2％w/v的非离子型表面活性剂、生理上可接受的盐是存在于一种生理上可接受的缓冲液中浓度范围为约50mM～约400mM的氯化钠。

本发明还有另一个实施方案涉及一种HPV抗原制剂，其中该制剂包括一种上述公开的浓度范围达到约0.2％w/v的非离子型表面活性剂、生理上可接受的盐是存在于一种生理上可接受的缓冲液中浓度范围为约150mM～约300 mM的氯化钠。

本发明的另一个实施方案涉及一种HPV抗原制剂，其中生理上可接受的盐是浓度范围为约10mM～约500mM的氯化钠，非离子型表面活性剂是存在于一种生理上可接受的缓冲液中浓度范围达到约0.2％w/v的多乙氧基醚80。

本发明的一个特定的实施方案涉及一种HPV抗原制剂，其中生理上可接受的盐是浓度范围为约10mM～约500mM的氯化钠，非离子型表面活性剂是存在于一种生理上可接受的缓冲液中浓度范围达到约0.01％～0.1％w/v的多乙氧基醚80。

本发明的一个优选实施方案涉及一种HPV抗原制剂，其中氯化钠的浓度范围为约50mM～约400mM，多乙氧基醚80(包括但不限于Tween80^)，存在于一种生理上可接受的缓冲液中用量的百分比范围为约0.01％～约0.1％w/v。

本发明的一个特别优选实施方案涉及一种HPV抗原制剂，其中氯化钠的浓度范围为约150mM～约300mM，多乙氧基醚80(包括但不限于Tween80^)存在于一种生理上可接受的缓冲液中用量的百分比范围为约0.01％～约0.1％w/v。

本发明所述的制剂可以将HPV溶液以非冷冻的状态保存在一种近似生理浓度的盐溶液中。因此，可以省去冷冻和解冻的步骤，并能在近似生理离子强度的条件下通过HPV和铝盐佐剂吸附或者用非铝盐佐剂制备来将HPV VLP溶液和佐剂直接配制成试剂。

因此，本发明公开了一种改进后的用于制备佐剂化HPV疫苗的方法，该方法在与含铝盐的佐剂混合前不需要如此严格的温度梯度和盐浓度。例如，在与铝盐佐剂混合前，本发明的抗原制剂可以在4℃下制备和保存。然后将该无铝盐(pre-alum)抗原制剂与磷酸铝、碱式磷酸铝和氢氧化铝等铝盐佐剂混合在一起。如果需要还可加入硫柳汞等防腐剂。本发明的方法可以使该独创的(original)抗原制剂在2～8℃的温度范围内长期保存到2年以上。

从本发明可以明显地看出，本发明的HPV抗原制剂的优点是它们能够与一种生理上可接受浓度的铝盐或非铝盐直接结合。从本发明还可以明显地看出，另一个优点是在冰点以上的0～40℃，特别是2～8℃的温度范围内的稳定性增强，使得可以将这些制剂直接加入到含铝盐或非铝盐的佐剂中。换句话说，此处描述的HPV溶液也经得起在生理盐浓度的条件下与非铝盐佐剂直接配置。

虽然上述的制剂实例是优选的，但是从说明书的教导中可以明显地得知各种另外的制剂也在本发明的范围之内。由此还可以理解出，本发明中的上述实例和另外的抗原制剂都包括一种以宿主生理上可接受离子强度存在的盐、一种生理上可接受的缓冲液以及一种以生理上可接受浓度存在的表面活性剂，从而增强了该疫苗成分的稳定性，减弱了其从溶液中凝聚或沉淀出的趋势，而且还能在更方便的温度下长期保存。

本发明HPV疫苗制剂的给药方案可以根据下列因素来选择：包括类型(type)、人种、年龄、体重、性别以及健康状况等在内的患者的各种因素；治疗条件的严格程度；患者的肾功能和肝功能；以及因此所用的具体成分。一个普通的医疗技术人员能够很容易地确定并处方给出预防、逆转或控制病情发展所需的HPV疫苗的有效剂量。

以下提供的实施例是用来说明，而非用来限制本发明的。

实施例1重组HPV11L1 VLP的过量表达

合成的L1基因的构建-HPV11L1 VLP的过量表达和纯化在1995年3月30日提交的两份系列号为08/413,571和08/413,572的美国专利申请中已有描述，在本发明的实施例部分中提及仅仅是为了举例，而绝非用于限制可用于生产重组的HPV VLPs的方法。为了举出本发明制剂的实例，本说明书还公开了重组HPV11L1和HPV16L1的用途。对于一个本领域的普通技术人员应该知道的是，已知重组DNA方法可以用于生产本说明书中列举出的重组HPV VLPs。还应该知道的是，除酵母以外的其他宿主都能用于过量表达本发明的抗原制剂中使用的HPV VLPs。

用从Midland试剂公司订购的合成DNA寡聚体构建了HPV11L1的1.5kbp的开放阅读框。这些寡聚体含有5’端磷酸基。下面列出了所需要的全部24个寡聚体：#241-15′-GAAGATCTCACAAAACAAAATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGGATGCTTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATT-3′(SEQ ID NO：1)#24125′-ATTCCATAAAAAAGGTTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGTCAGGATATCAATACAGAGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCCTAACAAATTTGCATTGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATCCCACAACACAACGTTTGGTATGGGCATGCATGT-3′(SEQ ID NO：2)#241-35′-ACATGCATGCACAGGCCTAGAGGTGGGCCGGGGACAGCCATTAGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTTTACTAAATAAATATGATGATGTTGAAAATTCAGGGGGTTACGGTGGTAACCCTGGACAGGATAACAGG-3′(SEQ ID NO：3)#241-45′-GTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATGGTTGGATGTGCCCCCCCTTTGGGCGAGCATTGGGGTAAAGGTACACAGTGTAGTAATACATCTGTACAGAATGGTGACTGCCCGC-3′(SEQ ID NO：4)#241-55′-CCTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGGTTGACACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACCAATAAATCAGATGTTCCTCTTGACATATGTGGCACTGTA-3′(SEQ IDNO：5)#241-65′-TGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCATATGGTGATAGATTATTTTTTTATCTACGGAAGGAACAAATGTTTGCCAGACATTTTTTTAACAGGGCTGGTACCCC-3′(SEQ ID NO：6)#241-75′-GGGGTACCGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGATCTTTTAGTTAAGGGTGGTAACAATCGCTCGTCTGTAGCGAGTAGTATATATGTTCACACCCCAAGCGGCTCTTTGGTGTCCTCTGAGGCACA-3′(SEQ IDNO：7)#241-85′-ATTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACATAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCATCTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGA-3′(SEQ ID NO：8)#241-95′-CATTATGTGCATCCGTATCTAAATCTGCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTTTGATTTACAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATT-3′(SEQ ID NO：9)#241-105′-ACATTGTCTGCTGAAGTAATGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTCTCGAGGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACACTCGAGCGG-3′(SEQ ID NO：10)#241-115′-CCGCTCGAGGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGGAAAAGCAAGATCCCTATAAGGACATGAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTAGTGAATTGGATCAGTTTCCTTT-3′(SEQ ID NO：11)#241-125′-GGGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGACCTCTGCTCGTACCGGTATTAAGCGCCCTGCTGTTTCCAAACCCTCTACTGCCCCTAAACGTAAGCGCACCAAAACTAAAAAGTAAGATCTTC-3′(SEQ ID NO：12)#241-135′-GAAGATCTTACTTTTTAGTTTTGGTGCGCTTACGTTTAGGGGCAGTAGAGGGTTTGGAAACAGCAGGGCGCTTAATACCGGTACGAGCAGAGGTCCGTCCCCTATATCCACTTTGTAACAAAAACTTGCGTCCCAAAGGAAACTGATCCAATTC-3′(SEQ ID NO：13)#241-145′-ACTAGAAAACTTTTCTTTTAAATTAACCTCCCAAAAACTCATGTCCTTATAGGGATCTTGCTTTTCCTTTTCAGGAGTGGGCTTTTGACAGGTAATGGCCTGTGACTGCACATACCTATAGGTATCCTCGAGCGG-3′(SEQ ID NO：14)#241-155′-CCGCTCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAGTCCTCGAGAACAGAGGGATTCATTGTGTGAATATAGGCCATTACTTCAGCAGACAATGTAATGCTACATAATTGAAAAA-3′(SEQ ID NO：15)#241-165′-TAAATTGTAAATCAAACTCTTCCACATGACGCATGTACTCTTTATAATCAGAATTGGTGTATGTGGCAGATTTAGATACGGATGCACATAATGTCATGTTGGTACTGCGTGTG-3′(SEQ ID NO：16)#241-175′-GTATCTACCACAGTAACAAACAGATGATTACCCCAACAAATACCATTGTTATGTCCCTGGGCTTTTTGTAGCCAATATGGCTTATTAAACAATTGTGCCTCAGAGGACACCAA-3′(SEQ ID NO：17)#241-185′-AGAGCCGCTTGGGGTGTGAACATATATACTACTCGCTACAGACGAGCGATTGTTACCACCCTTAACTAAAAGATCATCAGGCACAGGTTCCCCCACGGTACCCC-3′(SEQ ID NO：18)#241-195′-GGGGTACCAGCCCTGTTAAAAAAATGTCTGGCAAACATTTGTTCCTTCCGTAGATAAAAAAATAATCTATCACCATATGGGTCTGCAGCCATTTGTAAATAATCTGGATATTTACATACAGTGCCACATATGTCAA-3′(SEQ ID NO：19)#241-205′-GAGGAACATCTGATTTATTGGTCTGCAAATCAGCAAAATTCATAGCACCAAAGCCTGTGTCAACCATATCGCCATCCTGTATAACACTGGTAATAAGTTCTAAGGGCGGGCAGTCACCATTCTGT-3′(SEQ ID NO：20)#241-215′-ACAGATGTATTACTACACTGTGTACCTTTACCCCAATGCTCGCCCAAAGGGGGGGCACATCCAACCATGCATAATTGTGTTTGTTTATAATCCATACCTACATTAACCCTGTTATCCTGTCCAGGGT-3′(SEQ ID NO：21)#241-225′-TACCACCGTAACCCCCTGAATTTTCAACATCATCATATTTATTTAGTAAAGGATGTCCACTTACACCCACACCTAATGGCTGTCCCCGGCCCACCTCTAGGCCTGTGCATGCATGT-3′(SEQ ID NO：22)#241-235′-ACATGCATGCCCATACCAAACGTTGTGTTGTGGGATCAAAAAGAGACGAGTCAGGCAATGCAAATTTGTTAGGATCTGGTAACACCACCTTAAATACTCTGTATTGATATCCTGACACCTTTGGCACAACAGTTTTGTTAACCTTTTTTATGGAATAATAAGGATGACCC-3′(SEQ ID NO：23)#241-245′-ACTGCAAGAAGTCTAGAACTGCTGGCATGATAAAATATGTTGGTGCGTTTAACATAAGCATCCGTGGCAACAACTTTGGATACAGGGTTAGGAGGAGGCACATATACTGTGCTGTCGCTAGGCCGCCACATTTTGTTTTGTGAGATCTTC-3′(SEQ ID NO：24)

把互补的寡聚体对(#241-1和241-24，#241-2和241-23，#241-3和241-22，#241-4和241-21，#241-5和241-20，#241-6和241-19，#241-7和241-18，#241-8和241-17，#241-9和241-16，#241-10和241-15，#241-11和241-14，#241-12和241-13)分别置于装有含2.5mM Tris，pH7.5，0.25mMEDTA的管中，进行退火。将管在98℃下加热4分钟，然后置于一个装有200ml 98℃热水的250ml烧杯中慢慢冷却。当水冷却至室温时，按照指定的那样将上述退火后的寡聚体对加入到试管中：片段A(寡聚体对#241-1 &24和-2 &23)；片段B(#241-3 &22，-4 &21，-5 &20和-6 &19)；片段C(#241-7 &18，-8 &17，-9 &16和-10 &15)和片段D(#241-11 &14和-12 &13)。把这些寡聚体对混合物62℃加热2min，然后象以前那样慢慢地冷却。将每管中的内容物用T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim，Inc.)和厂商提供的试剂在23℃下连接过夜。

连接后，为了增加全长产物的量需要对片段B进行PCR扩增。使用Boehringer Mannheim Taq聚合酶和下列寡聚体引物对在应用生物系统(Applied Biosystems)热循环仪上扩增10个循环：94℃，1min；48℃，1min；72℃，1min；然后72℃延长10min。5′-GGAATTCACATGCATGCACAGGCCTAG-3′(SEQ ID NO：25)和5′-GGAATTCGGGGTACCAGCCCTGTTAA-3′(SEQ ID NO：26).

然后按照下列方法用限制性内切酶(Boehringer Mannheim，Inc.)消化上述连接产物和片段B的PCR扩增产物：用Bgl II和SphI消化片段A；用Sph I和Kpn I消化片段B；用Kpn I和Xho I消化片段C；用Xho I和Bgl II消化片段D。按照厂商推荐的方法，用低熔点琼脂糖(FMC BioProducts)凝胶电泳分离消化后的片段，切割凝胶条分离出大小正确的片段，琼脂糖酶消化琼脂糖(Boehringer Mannheim，Inc.)。乙醇沉淀回收片段A、B和D，然后将这些片段分别连接到载体pSP72(Promega，Inc)，为了与每个所连接的片段匹配该载体已经事先用限制性内切酶做了相应地切割。

首先把用Kpn I和Xho I消化得到的片段C与退火后的寡聚体连接5′-TCGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACAC-3′；(SEQ ID NO：27)和5′-TCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAGTCT-3′(SEQ ID NO：28).

然后用Xho I再切割片段C，接着把长为450bp的Kpn I Xho I片段和事先用Kpn I和Xho I消化过的载体pSP72连接在一起。用连接的混合产物转化大肠杆菌DH5株的感受态细胞(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。通过克隆杂交从转化体中筛选出含有插入片段的克隆(J.Sambrook et al.，分子克隆：实验指南，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)。用Wizard miniprep试剂盒(Promega Corp.)从阳性克隆中提取出质粒DNA，然后用AppliedBiosystems 373A DNA测序仪测序。象上述方法一样，消化含有上述4个片段之一的正确DNA序列的克隆使所插入片段从中释放出来。用三方连接(three-way ligation)把用Kpn I和Xho I消化得到的片段C与Xho I、Bgl II消化得到的片段D以及Kpn I、Bgl II-切割过的pSP72连接起来。然后用连接产物转化大肠杆菌。对得到的转化体进行测序，得到序列正确的克隆(命名为CD)。再切割载体pSP72切出长750bp的Bgl II Kpn I插入片段CD，并将其与Bgl II、Sph I-消化得到的片段A以及Sph I、Kpn I-消化得到的片断B按照上述方法三方连接在一起，不同之处是加入Bgl II以减小不需要的连接产物的量。琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，分离出长1.5kbp的片段，命名为D361-1。

HPV6/11 L1、HPV11 L1和HPV6 L1酵母表达载体的构建-用从PUC18/双向GAL启动子载体分离出的一个1.4kbp的Sph I片段构建pGAL1-10酵母表达载体，该片段中含有来自质粒pBM272(MarkJohnston提供，Washington University，St.Louis，MO)啤酒糖酵母分歧(divergent)启动子GAL1-GAL10。该分歧启动子的两侧各有一个拷贝的酵母ADH1翻译终止子(Bennetzen和Hall，1982，J.Biol.Chem.257：3018-3025)，启动子GAL-1和第一个拷贝的ADH1翻译终止子之间有一个BamH I克隆位点，启动子GAL-10和第二个拷贝的ADH1翻译终止子之间有一个SmaI克隆位点。用Sph I消化一个由pBR322、酵母基因LEU2d和酵母质粒2μ组成的一个穿梭载体，并将其与上述含分歧启动子GAL的1.4kbp的Sph I片段连接生成pGAL1-10。

编码HPV11L1蛋白(实施例1中的实例D361-1)的HPV6/11杂合体L1 DNA含有一个酵母非翻译前导序列(Kmiskern，et al.，1986，Gene 46：135-141)，该序列紧靠地位于HPV6/11 L1起始甲硫氨酸密码子的上游。用BamH I在GAL1启动子和ADH1翻译终止子之间切割使pGAL1-10线性化，并将其与1.5kbp的HPV6/11 L1基因片段(样品361-1)连接。筛选大肠杆菌DH5(Gibco BRL，Inc)转化体，分离出一个含有HPV6/11 L1基因的质粒pGAL1-10，命名为D362-1。

从尖锐湿疣病灶(condyloma acuminatum)处克隆出野生型HPV11(wt-HPV11)DNA(由Darron Brown博士惠赠)。抽提出总人基因组DNA，用限制性内切酶消化。把含有wt-HPV11 DNA的部分连接到大肠杆菌克隆载体中，用来作为PCR扩增的模板。采用vent多聚酶(NewEngland Biolabs，Inc.)，10个扩增循环(94℃ 1min，48℃ 1min，72℃ 1min 45sec)以及下列含有侧翼Bgl II位点(下划线部分)的引物，PCR扩增wt-HPV11L1基因。有义引物：5′-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC

GGC CTA GCG ACA GCA CAG-3′(SEQ ID NO：29)反义引物：5′-GAG AGA TCT TAC TTT TTG GTT TTG GTA

CGT TTT CG-3′(SEQ ID NO：30)

该有义引物引导一个紧靠wt-HPV11L1起始甲硫氨酸密码子(粗印刷体高亮显示)的酵母非翻译序列。用Bgl II消化长1.5kbp的wt-HPV11 L1PCR 扩增产物，凝胶纯化并将其与用BamH I消化过的质粒pGAL1-10生成质粒p329-1连接。

从HPV6a阳性的尖锐湿疣病灶处抽提出总基因组DNA(Dr.DarronBrown惠赠)。活组织检查样品DNA作模板，Vent多聚酶(New EnglandBiolabs，Inc.)PCR扩增HPV6a L1基因，共进行10个扩增循环(94℃ 1min，48℃ 1min，72℃ 1min 45sec)，其中所用引物为上面列出的用于PCR扩增wt-HPV11 L1的有义引物和具有下列序列的反义引物：5’-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3’(SEQID NO：31)。用Bgl II消化长1.5kbp的HPV6a L1PCR扩增产物，凝胶纯化并将其连接到用BamH I消化过的质粒pGAL1-10生成质粒D-128。

菌株1558的制备

a.酵母菌株U9的制备

啤酒糖酵母菌株2150-2-3(MATalpha，leu2-04，adel，cir°)由Dr.leland Hartwell(University Of Washington，Seattle，WA)提供。在5mL YEHD培养基中30℃下繁殖菌株2150-2-3的细胞过夜(Carty et al.，1987，J.Ind Micro 2：117-121)。上述细胞用灭菌的蒸馏水冲洗3遍，然后用灭菌的蒸馏水2mL重悬，接着将该细胞重悬液在6个5-氟代乳清酸(FOA)平板上划线培养，其中每个平板上涂布0.1mL，以此来筛选ura3突变体(Cold Spring HarborLaboratory manual for yeast genetics)。30℃下温育平板。培养基中的组成为每250mL蒸馏水中含：不含氨基酸和硫酸铵的Difco氮碱3.5g，5-氟代乳清酸0.5g，尿嘧啶25mg以及葡聚糖(dextrose)10.0g。

上述培养基用02.μm的膜过滤除菌，然后与保存在50℃的4％的细菌培养用琼脂250mL、1.2mg/mL的腺嘌呤溶液10mL以及L-亮氨酸溶液(180mg/50mL)5mL混合。将制得的培养基以每个佩氏培养皿中各20mL的量分装。

培养5天后，长出大量的克隆。用再划线的方法将单个的克隆从初始的FOA平板上转移到新鲜的FOA平板上，然后在30℃下培养。通过在YEHD平板和无尿嘧啶(uracil-minus)平板上复制铺板，对来自第2套FOA平板的大量克隆进行测试以确定是否存在ura3突变体。期望的结果是在YEHD上生长良好，且在无尿嘧啶培养基上不生长。得到一株表现上述这些特征的分离株(U9)。-70℃甘油冻存备用。

b.制备一个破坏(disruption)MNN9基因的载体-为了制备一个破坏MNN9基因的载体，首先需要从啤酒糖酵母基因组DNA中分离出MNN9。通过标准的聚合酶链反应(PCR)技术完成这一点。根据发表的酵母MNN9基因的全长序列(zymogenetics：申请号为88117834、公开号为0-314-096-A2的EPO专利申请)设计出用于PCR扩增MNN9全长编码序列的5’有义引物和3’反义引物。使用的就是下列含有侧翼Hind III位点(下划线部分)的寡聚脱氧核苷酸引物

有义引物：5’-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGTATC G-3’(SEQ ID NO：32)；

反义引物：5’-TGA TAA GQT TGC TCA ATG GTT CTC TTC

CTC-3’(SEQ ID NO：33).

用粗的印刷体高亮显示出的是MNN9基因的起始甲硫氨酸密码子。PCR扩增反应中：用来自啤酒糖酵母菌株JRY188的基因组DNA作为模板，Taq聚合酶(Perkin Elmer)和25个扩增循环(94℃，1min；37，2min；72，3min)。

用Hind III消化1.2kbp的PCR片段，凝胶纯化，然后与用Hind III消化、碱性磷酸酶处理过的质粒pUC13连接。得到的质粒命名为p1183。

为了用酵母URA3基因破坏MNN9基因，用Hind III消化质粒pBR322-URA3(将含有啤酒糖酵母URA3基因的1.1kbp的Hind III片段亚克隆到pBR322中的Hind III位点装配而成)，得到一个承载着功能性URA3基因的1.1kbp的DNA片段，用T4 DNA聚合酶制成平端，然后将其与Pml I消化过的质粒p1183(在MNN编码基因之间用Pml I切割)连接。得到含有一个被功能性URA3基因破坏了的MNN9基因的质粒p1199。

c.构建含有MNN9基因破坏的U9-衍生菌株1372-为了破坏菌株U9(#325)中的MNN9基因，取30μg质粒p1199，用Hind III消化得到一个线性mnn9：：URA3破坏序列盒。用原生质球方法(Hinnen，et al.，1978，Proc，Natl.Acad.Sci.USA 75：1929-1933)将Hind III消化过的p1199 DNA转化菌株325的细胞，用一种不含尿嘧啶但含有1.0M山梨糖醇的合成琼脂糖培养基上对转化体进行筛选。该合成培养基的组成为每升蒸馏水：琼脂糖20g；酵母氮碱w/o氨基酸6.7g；腺嘌呤0.04g；L-酪氨酸0.05g；山梨糖醇182g；葡萄糖20g以及亮氨酸减少溶液#2 10ml。亮氨酸减少溶液#2的组成为每升蒸馏水：L-精氨酸2g；L-组氨酸1g；L-亮氨酸6g；L-异亮氨酸6g；L-赖氨酸4g；L-甲硫氨酸1g；L-苯丙氨酸6g；L-苏氨酸6g；L-色氨酸4g。

培养基平板在30℃下培养5天，此时出现大量克隆。取其中的10个克隆制备染色体DNA，然后用EcoR I加Hind III消化。然后用承载着MNN9基因(分离自质粒p1199)的1.2kbp Hind III片段作探针通过Southern印迹(J.Sambrook et al.，1989，分子克隆：实验指南，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)测试DNA消化产物。鉴定出了一个分离株(菌株#1372)，该菌株在Southern印迹中表现出预期的DNA带迁移，表现出mnn9突变体所表现的典型的大团块。

d.构建含有酵母HIS3基因破坏的载体-为了构建一个其中的啤酒糖酵母HIS3基因被URA3基因破坏了的破坏序列盒，用BamH I消化质粒YEp6(Struhl，et al.，1978，Proc，Natl.Acad.Sci.USA76：1035)，凝胶纯化得到一个承载着HIS3基因的1.7kbp的BamHI片段，用T4 DNA聚合酶制成平端，然后与事先用BamH I消化和T4DNA聚合酶处理过的质粒pUC18连接。用Nhe I(切割HIS3编码序列)消化以上得到的质粒(命名为p1501或pUC18-HIS3)，凝胶纯化得到的载体片段，用T4 DNA聚合酶制成平端，然后用小牛肠碱性磷酸酶处理。通过用Hind III消化从质粒pBRR322-URA3中分离出URA3基因，然后凝胶纯化得到一个承载着URA3基因的1.1kbp的片段，用T4 DNA聚合酶制成平端，然后与上述pUC18-HIS3 Nhe I片段连接。得到的基因含有一个破坏序列盒，其中的酵母HIS3基因被功能性URA基因破坏。

e.构建用HIS3基因破坏酵母PRB1基因的载体-承载啤酒糖酵母PRB1基因的质粒FP8△H由carnegie-mellon大学的Dr.E.Jones提供(Moehle et al.，1987，Genetics 115：255-263)。用HindIII加Xho I消化该质粒，凝胶纯化得到一个承载着PRB1基因的长3.2kbp的DNA片段，用T4 DNA聚合酶制成平端，用BamH I消化质粒pUC18，凝胶纯化，用T4 DNA聚合酶处理制成平端，然后将得到的该载体片段与上述PRB1基因连接生成质粒pUC18-PRB1。用BamH I消化含有HIS3基因的质粒YEp6。凝胶纯化得到一个承载着HIS3基因的1.7kbp的BamH I片段，然后用T4 DNA聚合酶制成平端。然后与事先用BamH I消化和T4 DNA聚合酶处理过的质粒pUC18连接。用切割部位在PRB1编码序列上的内切酶EcoRV加NcoI消化质粒pUC18-PRB1，切去蛋白酶B活性位点和侧翼序列。凝胶纯化得到一个承载着PRB1编码序列5’端残基和3’端部分的5.7kbp的EcoRV-NcoI片段，然后用T4 DNA聚合酶处理制成平端，用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化，与上述平端化后的HIS3片段连接。得到的质粒(命名为pUC18-prb1：：HIS3，保存号#1245)在上述切去PRB1基因的部位由功能性HIS3基因取而代之。

f.同时含有MNN9基因破坏和PBR1基因破坏的U9-相关酵母菌株的构建-此处的U9-相关菌株1372中含有MNN基因破坏。用FOA平板对菌株1372的克隆分离株进行传代，以此来筛选ura3突变体。从菌株1372中得到大量的ura3分离株，从中筛选出-个具体的分离株(菌株12930-190-S1-1)用于随后HIS3的插入。用XbaI加EcoRI消化pUC18-his3：：URA3破坏载体得到一个线性his3：：URA3破坏序列盒，并采用乙酸锂法转化(Methods in Enzymology，1992，194：290)菌株12930-190-S1-1。用不含尿嘧啶的合成琼脂糖培养基筛选Ura⁺转化体，在同样的培养基上再划线培养克隆过的菌株，然后在不含尿嘧啶或组氨酸的培养基上复制铺板，筛选同时表现出Ura⁺和His^-特性的分离株。筛选出一个分离株(菌株12930-230-1)用于随后的PBR1基因的破坏，用Sac I加Xba I消化PBR1基因破坏载体(pUC18-prb1：：HIS3，保存号#1245)得到一个线性prb1：：HIS3破坏序列盒，并采用乙酸锂法转化菌株12930-190-S1-1。用不含组氨酸的琼脂糖培养基筛选His⁺突变体，在同样的培养基上再划线培养克隆过的菌株。从大量得到的His⁺分离株中提取基因组DNA，用EcoR I消化，然后用0.8％的琼脂糖电泳。接着用放射性标记的617bp的探针对用下列寡聚脱氧核苷酸引物通过PCR制备的PBR1基因进行Southern印迹分析：5′-TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA-3′(SEQ ID NO：34)；和5′-CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA-3′(SEQ ID NO：35)

探针与2.44kbp prb1：：HIS3片段杂交，得到11个分离株，这些分离株探针与2.44kbp prb1：：HTS3片段之间均表现出期望的杂交结果。这与用探针与野生型PRB1基因的1.59kbp片段之间的杂交结果相反。从上述含有期望的prb1：：HIS3破坏的分离株中取一株做进一步的使用，并将其命名为菌株#1558

实施例2

在酵母中表达HPV11L1和HPV6L1-通过原生质球方法(Hinnen，et al.，1978，Proc，Natl.Acad.Sci.USA 75，1929-1933)，用质粒D362-1(pGAL1-10+HPV6/11L1)、p329-1(pGAL1-10+wt-HPV11L1)、D128(pGAL1-10+HPV6L1)和pGAL1-10转化啤酒糖酵母菌株#1558.(MATa，leu2-04，prb1：：HIS3，mnn9：：URA3，adel，cir°)。用质粒D362-1转化的#1558酵母菌株命名为菌株1782。为了进行RNA研究，将酵母克隆分离株在含有0.1M山梨糖醇以及2％葡萄糖或半乳糖的YEH复合培养基(Carty et al.，1987，J.Ind.Micro.2，117-121)中30℃下培养26小时。收获细胞后，用热酸性酚方法(Current Protocols In Molicular Biology，vol.2，Current Protocols，1993)提取酵母RNA。为了进行蛋白分析，将同样的分离株在含有0.1M山梨糖醇、2％葡萄糖和2％半乳糖的YEH复合物培养基中30℃下培养70小时。收获细胞后，用玻璃珠破碎细胞沉淀，通过免疫转印分析细胞裂解物中HPV11L1或HPV6L1蛋白的表达状况。

HPV6/11L1(菌株#1782)的发酵-将生长在平板培养物表面的菌株1782无菌转移到不含亮氨酸的液体培养基中，该培养基的组成为(每升)：不含氨基酸和硫酸铵的Difco酵母氮源8.5g、腺嘌呤0.2g、尿嘧啶0.2g、琥珀酸10g、硫酸铵5g以及L-酪氨酸0.25g；在灭菌前用NaOH将培养基调至pH5.0-5.3。28℃生长25hr后，加入灭菌甘油至终浓度17％(W/V)，分装冷冻(每个冷冻小瓶中各1mL)，置于-70℃保存。用同样的培养基制备用于菌株1782发酵的接种体，将两个冷冻小瓶中的融化的内容物转移到转移到2L的烧瓶中，28℃下250rpm振荡培养25小时。培养后，菌株1782的发酵使用Chemap23L发酵罐，其工作体积为18L。所使用的生产培养基(productionmedium)含有(每L)：Difco酵母浸出物20g；Sheffied HySoy蛋白胨10g；葡萄糖20g；半乳糖20g；灭菌前将培养基调至pH5.3。将2-L接种烧瓶中的全部内容物(500mL)转移到发酵罐中进行温育，具体条件为：28℃，每分钟9L空气，500rpm，压力为3.5psi。加快搅拌，以满足把溶解的氧保持在大于饱和度40％的水平的需要。利用离线葡萄糖测量(Beckman葡萄糖2分析仪)和在线质谱分析(Perking-Elmer)监测发酵的进展情况。培养66小时后，细胞密度达到9.32g干细胞重/L。合并两个上述这样的发酵中的内容物(总体积为17.5L的培养物)，然后收获细胞。用空心纤维滤器(AmiconH5MP01-43柱，在Amicon DC-10过滤系统中)将该培养物浓缩到约2L的体积，用2L磷酸盐缓冲的盐溶液进行渗滤，进一步浓缩(至大约1L)，然后分装到500mL的离心瓶中。4℃、8000rpm(Sorval GS3转子)离心20min，收集细胞沉淀。倾去上清，把沉淀(共358g湿细胞)保存于-70℃备用。

重组HPV11型L1衣壳蛋白的纯化-除另有说明外，所有步骤均在4℃下进行。在-70℃冻存细胞。20-23℃融化冻存的细胞(湿细胞＝180g)，然后重悬到900mL的“破碎缓冲液”(MOPS 50mM，pH7.2，NaCl500mM，CaCl₂ 1mM)中。加入蛋白酶抑制剂AEBSF和抑胃肽A至终浓度分别为1mM和1.7mM。用M110-Y微型匀浆器(Microfluidics Corp.，Newton，MA)在大约16,000psi的压力下破碎细胞浆4次。向破碎后的细胞浆中加入足够量的清洁剂10％Triton X100^使TX100的浓度达到0.5％。将该浆液搅拌20小时。将Triton X100处理过的裂解液12,000Xg离心40min，去除细胞碎片。收获含有L1蛋白的上清液。

在300K切向流动膜盒(tangential flow member cassette)(Filtron，Nerthborough，MA)中，用5倍体积的含0.5M NaCl、pH7.2的20mM的磷酸钠对上述上清液进行渗滤。放射免疫测定和western印迹分析的结果显示，保留在膜上的物质中含有L1蛋白。

用经含0.5M NaCl的pH7.2的20mM的磷酸钠平衡过的SPSpherodex(M)^树脂(IBF，Villeneuve-la-Garenne，France)的高分辨亲和层析柱(11.0cmID×5.3cm)对上述保留物进行亲和层析。接着用平衡缓冲液洗涤，用含有1.0M NaCl的pH7.2的20mM的磷酸钠分步洗涤，用含有2.5M NaCl的pH7.2的20mM的磷酸钠分步洗涤洗脱出L1蛋白。在洗涤和洗脱的过程中收集各级分。用Brandford方法对层析级分进行总蛋白分析。然后用western印迹和SDS-PAGE加胶体考马氏蓝染色对级分进行分析。还用放射免疫测定法对级分进行了测定。

把表现出相当纯度和富集的L1蛋白的SP Spherodex级分合并起来，经western印迹和SDS-PAGE加胶体考马氏蓝染色检测分析终产物。估计L1蛋白具有大于90％的均一性。用western印迹对上述L1蛋白的鉴定结果进行确证。用0.22mm的滤膜无菌过滤终产物，并将其在-70℃下保存于含50mM MOPS和1.25M NaCl的溶液中。

用结构探针(Structural Probe)(West Chester，PA)进行电子显微镜分析。将一等份样品放于一个200目的碳包被铜丝网上。将一滴pH7.0的2％磷钨酸在网上放置20秒。待网上空气干燥后进行TEM测试。所有显微观察均用JEOL100CX透射电子显微镜在100kV的加速电压下进行。得到的显微照片的最终放大倍数为100,000X。

总蛋白的Brandford分析-总蛋白的分析采用商品化的Coomassie Plus^试剂盒(Pierce，Rockford，IL)。用Milli-Q-水适当稀释样品。在标准分析和显微分析的操作中所需的体积分别为0.1mL和1.0mL。这两种方法中都用BSA(Pierce，Rockford，IL)产生标准曲线。具体操作按照厂商推荐的方法进行。在MacintoshIIci电脑上用CricketGraph^软件绘制出标准曲线。

SDS-PAGE和Western印迹分析-所有凝胶、缓冲液以及电泳设备都购自Novex(San Diego，CA)，按照厂商推荐的方法进行电泳。简而言之，用Milli-Q-水将样品稀释到等蛋白浓度，并与含有200mM DTT的样品温育缓冲液等量混合。样品在100℃温育15min，加入到预制的12％的Tris-甘氨酸凝胶上。样品在125V电泳1hr45min。用购得的试剂盒(Integrated Separation System，Natick，MA)通过胶体考马氏蓝染色对凝胶进行显色。

为了进行Western印迹，25V电压下转印40min将蛋白转移到PVDF膜上。用Milli-Q-水洗膜，空气干燥。一抗采用多克隆的兔抗TrpE-HPV11L1融合蛋白的抗血清(Dr.D.Brown惠赠)。通过在印迹缓冲液(含5％脱脂奶的6.25mM磷酸钠，pH7.2，150mM NaCl，0.02％NaN₃)中稀释抗血清制备抗体溶液。在20～23℃温育至少1小时。更换PBS(6.25mM磷酸钠，pH7.2，150mM NaCl)洗涤3次印迹膜，每次1min。通过用印迹缓冲液稀释羊抗兔IgG碱性磷酸酶偶连的共轭抗血清(Pierce，Rockford，IL)制备二抗溶液。在与上述相同的条件下温育至少1小时。按照上述方法洗涤转印膜，用1步NBT/BCIP底物进行检测(Pierce，Rockford，IL)。

实施例3

凝聚对蛋白浓度的依赖性

用上述方法制备一批HPV11 VLP，并将其以0.47mg/mL的浓度保存在含1.25M NaCl的50mM MOPS中。融化这批保存物，并用同样的缓冲液将其中的一部分稀释到18mcg/mL。4℃下2个月内，高蛋白浓度保存溶液中的水力学直径(Dh)在107～115nm的范围内保持不变(通过动力光散射测量得到)，而低蛋白浓度溶液即使在盐浓度保持在1.25M NaCl的条件下，一段时间后仍发生了凝聚(图1)。图1表明，在低蛋白浓度时即使高的盐浓度也无法在4℃下的保存过程中防止HPV的凝聚。

实施例4

凝聚对盐浓度的依赖性

制备一批HPV11和HPV16 VLP，用其来测试保存过程中水力学直径的盐类依赖性。将重组的HPV11和HPV16 VLP从保存溶液(在50mM MOPS，1.25M NaCl，pH7.0)稀释到50mM的MOPS缓冲液中，以使最终的蛋白浓度恒定地保持为约20mcg/mL，但NaCl的浓度发生了如图2所示的变化。上述稀释在聚丙烯eppendorf管中进行，室温保存。就象前一个实施例(图1)中所述的那样即使溶液中含有高浓度的盐，在这种蛋白浓度下仍会发生缓慢的凝聚，所以测试实验在制备稀释液后1小时内完成。在NaCl浓度降低至0.15M(HPV11)和0.5M(HPV16)之前，Dh值近乎保持恒定(图2)。另一方面，透析过的HPV11样品在所有的盐浓度下都表现出较大的水力学直径，在盐浓度低于0.5MNaCl时，这种现象尤其明显。

用不同批次的HPV11分别进行的实验(数据未在图表中显示)表明，重组HPV11L1 VLP(透析进含不同NaCl浓度的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)中)的Dh值从0.5M NaCl时的大约113nm增大到0.15MNaCl时的133nm。在头-头比较实验(head-to-head comparision)中，将样品透析到1.0、2.0和3.0M的NaCl溶液中时表现出的Dh值分别为114、113和108nm，而将样品透析到0.025M浓度的氯化钠溶液中时生成了肉眼可见的沉淀。除浓度为0.025M的氯化钠中的样品在溶液中的剩余的蛋白浓度仅为16mcg/mL以外，这些样品的蛋白浓度均在130～179mcg/mL的范围之内。保存在含2.5M NaCl的20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.2)中但未透析的对照样品产生的Dh值为82nm。

该实施例的结果表明，低的盐浓度或低的离子强度有助于HPVVLP’s的颗粒间凝聚，低的蛋白浓度和HPV溶液的物理操作(physicalmanipulation)(例如蛋白透析)也是形成HPV VLP凝聚的主要因素。

实施例5

HPV11 VLPs的表面吸附

透析膜表面-为了测定透析膜对HPV11凝聚的直接影响，用以50mcg/mL的浓度溶解在含0.18M NaCl、pH7.0的50mM MOPS缓冲液中的的蛋白溶液与不同表面面积的透析膜温育。室温下温育96小时后发现，Dh随着膜表面积的增大而增大(图3)。同时还发现，溶液的蛋白浓度随着膜表面积的增大而减小(图3)。这些观察结果表明，HPV11吸附在膜的表面上，说明表面吸附和凝聚之间存在相关关系。这些数据表明低浓度HPV长期暴露于聚丙烯表面和透析膜表面时会导致吸附和凝聚。这两种过程都是温度依赖性的。两种过程中4℃下温育的样品与25℃下温育的样品相比，都表现出较低的动力学特性。

HPV在不同容器表面吸附的比较-各种HPV浓度下，用表面和容积之比相同的硼硅酸盐玻璃、聚丙烯和聚苯乙烯试管(相同尺寸12×75mm²)来比较HPV的吸附程度。将样品置于含1.25M NaCl、pH7.0的50mM MOPS缓冲液中，室温下温育24小时。图4显示在浓度低于100mcg/mL时，硼硅酸盐玻璃上出现明显的表面吸附。当低于30mcg/mL时，聚丙烯容器吸附更好成为明显的问题，但是这些条件下较高的浓度时未出现。聚苯乙烯呈现出最好的结果，浓度下降到10mcg/mL时也无明显吸附。

将HPV11(以18mcg/mL存在于含0.25M NaCl的50mM MOPS)置于聚丙烯试管中，在两种表面和容积之比不同的条件下，对HPV的表面吸附进行进一步的测定(图5)。室温放置1天后，表面和容积之比为6.0cm^-1聚丙烯试管中HPV基本上全部吸附到表面上，而在表面和容积之比为4.0cm^-1聚丙烯试管中仅有15％的吸附(图5)。

实施例6

能抑制HPV 11VLP表面吸附和凝聚的赋形剂

用加速稳定实验筛选表面活性剂-在初步筛选实验中，将含0.01％的几种表面活性剂HPV11样品和不含表面活性剂的HPV11样品在室温下温育20小时。HPV的浓度为18mcg/mL，pH7.0的缓冲液中含有50mM MOPS和0.15M NaCl。用动力光散射测定结果表明：与未经表面活性剂处理过的HPV样品相比，几种表面活性剂在这些条件下都部分防止了凝聚的发生(图6A)。

在更严格的条件下进行表面活性剂的筛选实验。将含有0.01％的各种表面活性剂的HPV11样品和不含表面活性剂的HPV11样品在50℃下温育30分钟，然后在室温下温育2天。HPV的浓度为18mcg/mL，pH7.0的缓冲液中含有50mM MOPS和0.04M NaCl。在这些条件下，与上述实验相比，未经表面活性剂处理过的HPV对照样品发生凝聚的程度更大。图6B显示：在这些测试的表面活性剂中，聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(Tween80^)和聚氧乙烯烷基醚(Brij58^)抵抗HPV11VLP凝聚的活性最强。

盐和多乙氧基醚80的联合保护效应-图7A和图7B显示：在较低的HPV浓度下，单纯的高浓度盐，如氯化钠、硫酸钠和硫酸铵中的每一种在0.1M和0.5M两种浓度下都不能防止HPV VLP的表面吸附或凝聚。相反，图7A和图7B显示也表明：在含有0.4M硫酸铵的缓冲液中加入非离子型表面活性剂Tween80^后，即使在室温下放置6天以后也能几乎完全抑制吸附和凝聚的发生。

分开的实验再次确证了多乙氧基醚80(例如Tween80^)和NaCl对表面吸附和凝聚的影响。将HPV11L1 VLP以18mcg/mL的浓度在置于聚丙烯管中的含250mM NaCl，pH7，含0.01％Tween80^或不含Tween80^的50mM MOPS中温育。图8显示出室温下吸附蛋白的百分比和Dh值对温育时间的函数。在不含Tween80^的溶液中，吸附损失和凝聚都非常显著，而加入0.01％Tween80^时吸附损失和凝聚都得到有效的防止。

图9给出的是，除多乙氧基醚80以外，为防止低浓度(100mcg/mL)的HPV11L1 VLPs发生凝聚和吸附所需的最佳盐浓度。另外，还可以看出：在低离子强度的制剂中，Tween80^的增加仅能提供部分而非完全的保护。图9表明：通过在含有50mM MOPS和0.04M NaCl的缓冲液中加入0.01％Tween80^只能部分控制HPV11(18mcg/mL)的凝聚，但是当NaCl的浓度增加到0.10M时，室温下48小时内能近乎完全地防止凝聚的发生。

图10给出的是在含0.15M NaCl、pH7.0的50mM MOPS缓冲液中，滴定多乙氧基醚80对HPV11L1 VLP凝聚的影响。将样品与浓度为0～0.01％的Tween80^分别在4℃和室温下温育。在4℃下，含有0.01％Tween的样品中直到20天时也未观察到明显的凝聚，而在室温下观察到仅能部分地防止凝聚的发生。

图11显示出非离子型表面活性剂防止HPV16 VLP凝聚的能力。所测试的表面活性剂中包括多乙氧基醚80(例如Tween80)、多乙氧基醚20(例如Tween20)、NP-40、Triton X100、Triton X114以及聚氧乙烯烷基醚(例如Brij35^、Brij58^)。将蛋白浓度为20mcg/mL的HPV16样品与0.01％的各种表面活性剂分别地在室温(环境温度)下温育50天。pH7的温育缓冲液中含有50mM MOPS和0.15M NaCl。DLS测定发现：与不含表面活性剂的对照用HPV16样品相比，所有的表面活性剂在保存过程中都能防止HPV16发生凝聚(图11)。这一表面活性剂浓度(0.01％)下的保护程度因表面活性剂的不同而略有不同。为了测试非离子型表面活性剂的保护能力对盐类的依赖性，将蛋白浓度为30～60mcg/mL的HPV16样品与0.01～0.02％的Tween80和0.15～0.5M NaCl在4℃下温育24小时。浓度为0.2M或更高的NaCl与非离子型表面活性剂结合能对HPV16VLP的凝聚提供显著的保护。

在总离子强度下测定在含有非离子型表面活性剂时，盐浓度对抑制HPV凝聚所起到的稳定作用。图2和图9显示出在含有或不含非离子型表面活性剂的条件下，稳定HPV VLP所需的最小NaCl浓度。下面的实验测定了在恒定的离子强度下，不同盐类稳定HPV16VLP的能力。60mcg/mL的HPV16在22℃下温育24小时，然后4℃保存直至以下分析：动力光散射测量水力学大小(Dh)和EIA和BIA核心分析测定体外抗原活性(抗体结合能力)。表1显示：当用各种盐来代替NaCl时，相同的离子强度下更低的盐浓度能提供相同的HPV稳定性。作为对照，较低离子强度的溶液引起HPV凝聚和抗原性的部分丧失。这些结果表明：在这些条件下，对盐类稳定效应发挥决定性作用的是离子强度而非盐的类型。当在更严格的条件下对同种盐类的稳定效应进行测试时，通过体外抗原性分析和凝聚分析观察到在不同的盐之间的稳定能力有些不同。例如，恒定的离子强度下，CaCl₂和MgCl₂以及磷酸盐缓冲液稳定HPV VLPs的效果较差。

表1

	MOPS(M)	加入的盐(M)	Tween80的终浓度	总离子强度(M)	Biacore*/蛋白	EIA*/蛋白	Dh(nm)
	MOPS(M)	加入的盐(M)	Tween80的终浓度	总离子强度(M)	Biacore*/蛋白	EIA*/蛋白	Dh(nm)	NaCl	0.05	0.02	0.01％	0.12	0.4	0.2	180
NaCl	0.05	0.12	0.01％	0.22	1.0	1.0	72	NaCl	0.05	0.02	0.01％	0.12	0.4	0.2	180
NaCl	0.05	0.12	0.01％	0.22	1.0	1.0	72	柠檬酸钠	0.05	0.02	0.01％	0.22	1.2	0.9	74
磷酸钠	0.05	0.02	0.01％	0.22	0.8	1.2	74	柠檬酸钠	0.05	0.02	0.01％	0.22	1.2	0.9	74
磷酸钠	0.05	0.02	0.01％	0.22	0.8	1.2	74	乙酸钠	0.05	0.12	0.01％	0.22	1.0	1.0	74
Na₂SO₄	0.05	0.04	0.01％	0.22	0.8	1.1	73	乙酸钠	0.05	0.12	0.01％	0.22	1.0	1.0	74
Na₂SO₄	0.05	0.04	0.01％	0.22	0.8	1.1	73	MgCl₂	0.05	0.04	0.01％	0.22	1.0	1.1	74
CaCl₂	0.05	0.04	0.01％	0.22	0.8	1.2	93	MgCl₂	0.05	0.04	0.01％	0.22	1.0	1.1	74

*体外抗体结合效应的相对值相对于-70℃冻存的HPV16对照样品标准化。对照样品在融化后立即进行测试。动力光散射测定的对照样品的水动力学直径(Dh)为73nm。

因此，即使多乙氧基醚80的浓度低至0.01％，在4℃以及近似生理离子强度的条件下也能保护HPV11和HPV16数周内不发生容器表面吸附和颗粒间凝聚。这些结果还表明：(1)HPV的表面吸附和凝聚之间相关；(2)静电机制和疏水机制两者都可能发挥了作用，因为清洁剂独自或盐独自对吸附或凝聚都不能提供完全的保护。序列表(1)一般信息：(i)申请人：MERCK & CO.，INC.(ii)发明名称：稳定化后的人乳头瘤病毒制剂(iii)序列数：35(iv)通讯地址：

(A)收信人：Merck & Co..Inc.

(B)街道：P.O.Box 2000 RY60-30

(C)城市：Rahway

(D)州：新泽西

(E)国家：美国

(F)邮编：07065-0907(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30(vi)当前申请资料：

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(A) 姓名：Hand，J.Mark

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(C) 参考/摘要号：19933Y(ix)电讯信息：

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(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：CCGCTCGAGG ATACCTATAG GTATGTGCAG TCACAGGCCA TTACCTGTCA AAAGCCCACT 60CCTGAAAAGG AAAAGCAAGA TCCCTATAAG GACATGAGTT TTTGGGAGGT TAATTTAAAA 120GAAAAGTTTT CTAGTGAATT GGATCAGTTT CCTTT 155(2)SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征：

(A)长度：134个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型 (ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：GGGACGCAAG TTTTTGTTAC AAAGTGGATA TAGGGGACGG ACCTCTGCTC GTACCGGTAT 60TAAGCGCCCT GCTGTTTCCA AACCCTCTAC TGCCCCTAAA CGTAAGCGCA CCAAAACTAA 120AAAGTAAGAT CTTC 134(2)SEQ ID NO：13的信息：(i)序列特征：

(A)长度：154个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：GAAGATCTTA CTTTTTAGTT TTGGTGCGCT TACGTTTAGG GGCAGTAGAG GGTTTGGAAA 60CAGCAGGGCG CTTAATACCG GTACGAGCAG AGGTCCGTCC CCTATATCCA CTTTGTAACA 120AAAACTTGCG TCCCAAAGGA AACTGATCCA ATTC 154(2)SEQ ID NO：14的信息：(i)序列特征：

(A)长度：135个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：ACTAGAAAAC TTTTCTTTTA AATTAACCTC CCAAAAACTC ATGTCCTTAT AGGGATCTTG 60CTTTTCCTTT TCAGGAGTGG GCTTTTGACA GGTAATGGCC TGTGACTGCA CATACCTATA 120GGTATCCTCG AGCGG 135(2)SEQ ID NO：15的信息：(i)序列特征：

(A)长度：125个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：CCGCTCGAGT GTACCATTTG GGGGAGGCGA TAACCCAAAG TTCCAGTCCT CGAGAACAGA 60GGGATTCATT GTGTGAATAT AGGCCATTAC TTCAGCAGAC AATGTAATGC TACATAATTG 120AAAAA 125(2)SEQ ID NO：16的信息：(i)序列特征：

(A)长度：113个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：TAAATTGTAA ATCAAACTCT TCCACATGAC GCATGTACTC TTTATAATCA GAATTGGTGT 60ATGTGGCAGA TTTAGATACG GATGCACATA ATGTCATGTT GGTACTGCGT GTG 113(2)SEQ ID NO：17的信息：(i)序列特征：

(A)长度：113个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：GTATCTACCA CAGTAACAAA CAGATGATTA CCCCAACAAA TACCATTGTT ATGTCCCTGG 60GCTTTTTGTA GCCAATATGG CTTATTAAAC AATTGTGCCT CAGAGGACAC CAA 113(2)SEQ ID NO：18的信息：(i)序列特征：

(A)长度：104个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：AGAGCCGCTT GGGGTGTGAA CATATATACT ACTCGCTACA GACGAGCGAT TGTTACCACC 60CTTAACTAAA AGATCATCAG GCACAGGTTC CCCCACGGTA CCCC 104(2)SEQ ID NO：19的信息：(i)序列特征：

(A)长度：136个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：GGGGTACCAG CCCTGTTAAA AAAATGTCTG GCAAACATTT GTTCCTTCCG TAGATAAAAA 60AATAATCTAT CACCATATGG GTCTGCAGCC ATTTGTAAAT AATCTGGATA TTTACATACA 120GTGCCACATA TGTCAA 136(2)SEQ ID NO：20的信息：(i)序列特征：

(A)长度：125个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：GAGGAACATC TGATTTATTG GTCTGCAAAT CAGCAAAATT CATAGCACCA AAGCCTGTGT 60CAACCATATC GCCATCCTGT ATAACACTGG TAATAAGTTC TAAGGGCGGG CAGTCACCAT 120TCTGT 125(2)SEQ ID NO：21的信息：(i)序列特征：

(A)长度：127个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型 (ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：ACAGATGTAT TACTACACTG TGTACCTTTA CCCCAATGCT CGCCCAAAGG GGGGGCACAT 60CCAACCATGC ATAATTGTGT TTGTTTATAA TCCATACCTA CATTAACCCT GTTATCCTGT 120CCAGGGT 127(2)SEQ ID NO：22的信息：(i)序列特征：

(A)长度：116个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：TACCACCGTA ACCCCCTGAA TTTTCAACAT CATCATATTT ATTTAGTAAA GGATGTCCAC 60TTACACCCAC ACCTAATGGC TGTCCCCGGC CCACCTCTAG GCCTGTGCAT GCATGT 116(2)SEQ ID NO：23的信息：(i)序列特征：

(A)长度：170个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：ACATGCATGC CCATACCAAA CGTTGTGTTG TGGGATCAAA AAGAGACGAG TCAGGCAATG 60CAAATTTGTT AGGATCTGGT AACACCACCT TAAATACTCT GTATTGATAT CCTGACACCT 120TTGGCACAAC AGTTTTGTTA ACCTTTTTTA TGGAATAATA AGGATGACCC 170(2)SEQ ID NO：24的信息：(i)序列特征：

(A)长度：150个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：ACTGCAAGAA GTCTAGAACT GCTGGCATGA TAAAATATGT TGGTGCGTTT AACATAAGCA 60TCCGTGGCAA CAACTTTGGA TACAGGGTTA GGAGGAGGCA CATATACTGT GCTGTCGCTA 120GGCCGCCACA TTTTGTTTTG TGAGATCTTC 150(2)SEQ ID NO：25的信息：(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：GGAATTCACA TGCATGCACA GGCCTAG 27(2)SEQ ID NO：26的信息：(i)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：GGAATTCGGG GTACCAGCCC TGTTAA 26(2)SEQ ID NO：27的信息：(i)序列特征：

(A)长度：45个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：TCGAAGACTG GAACTTTGGG TTATCGCCTC CCCCAAATGG TACAC 45(2)SEQ ID NO：28的信息：(i)序列特征：

(A)长度：45个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：TCGAGTGTAC CATTTGGGGG AGGCGATAAC CCAAAGTTCC AGTCT 45(2)SEQ ID NO：29的信息：(i)序列特征：

(A)长度：45个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：CTCAGATCTC ACAAAACAAA ATGTGGCGGC CTAGCGACAG CACAG 45(2)SEQ ID NO：30的信息：(i)序列特征：

(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：GAGAGATCTT ACTTTTTGGT TTTGGTACGT TTTCG 35(2)SEQ ID NO：31的信息：(i)序列特征：

(A)长度：34个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：GAGAGATCTT ACCTTTTAGT TTTGGCGCGC TTAC 34(2)SEQ ID NO：32的信息：(i)序列特征：(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：CTTAAAGCTT ATGTCACTTT CTCTTGTATC G 31(2)SEQ ID NO：33的信息：(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：TGATAAGCTT GCTCAATGGT TCTCTTCCTC 30(2)SEQ ID NO：34的信息：(i)序列特征：

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：TGGTCATCCC AAATCTTGAA A 21(2)SEQ ID NO：35的信息：(i)序列特征：

(A)长度：21个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ii)分子类型：其他核酸

(A)说明：/desc＝“合成的DNA寡聚体”(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：CACCGTAGTG TTTGGAAGCG A 27

Claims

1.一种人乳头瘤病毒抗原制剂，其中包括：

(a)一种疫苗成分；

(b)一种以生理上可接受的浓度存在的盐；以及

(c)一种以生理上可接受的浓度存在的非离子型表面活性剂。

2.权利要求1中的抗原制剂，其中所述的人乳头瘤病毒疫苗成分包括病毒样颗粒。

3.权利要求2中的抗原制剂，其中所述的人乳头瘤病毒病毒样颗粒包括L1蛋白或L1和L2蛋白。

4.权利要求3中的抗原制剂，其中所述的人乳头瘤病毒病毒样颗粒选自人乳头瘤病毒6a、6b、11、16、18型及其任意结合。

5.权利要求4中的抗原制剂，其中所述的盐选自氯化钠、硫酸钠、硫酸铵、乙酸钠、柠檬酸钠和磷酸钠，或者其他能使溶液具有足够离子强度的生理上可接受的缓冲离子。

6.权利要求5中的抗原制剂，其中所述的盐是氯化钠。

7.权利要求6中的抗原制剂，其中所述氯化钠的浓度为约50mM～约500mM。

8.权利要求6中的抗原制剂，其中所述氯化钠的浓度为约150mM～约300mM。

9.权利要求8中的抗原制剂，其中所述的非离子型表面活性剂选自多乙氧基醚、聚氧乙烯烷基醚、Triton X-100^、Triton114^、NP40^、Span85以及Pluronic121的非离子型表面活性剂。

10.权利要求9中的抗原制剂，其中所述的多乙氧基醚是多乙氧基醚80。

11.权利要求10中的抗原制剂，其中所述的多乙氧基醚80的浓度为约0.2％。

12.权利要求10中的抗原制剂，其中所述的多乙氧基醚80例如Tween80^的浓度为约0.01％。

15.一种人乳头瘤病毒抗原制剂，其中包括：

(a)由选自6a、6b、11、16和18型的人乳头瘤病毒L1蛋白组成的人乳头瘤病毒病毒样颗粒群体；

(b)以浓度为约150mM～约300mM存在的氯化钠；以及

(c)以达到约0.1％的浓度存在的多乙氧基醚80。

16.一种使纯化的由人乳头瘤病毒的L1蛋白或L1和L2蛋白产生的病毒样颗粒在温度高于0℃以及时间至少为1个月的期间内保持稳定的方法，该方法包括把所述的纯化的病毒样颗粒置于一种制剂中，该制剂中含有浓度为约50mM～约500mM的氯化钠以及浓度达到至少0.2％w/v的多乙氧基醚80。

17.权利要求16的方法，其中所述的疫苗制剂包括浓度范围为约150mM～约300mM的氯化钠。

18.权利要求17的方法，其中多乙氧基醚80的浓度达到至少0.1％w/v。

19.权利要求16的方法，其中所述的疫苗制剂可以在约2℃～约8℃的温度范围内稳定至少1个月。