CN1173203A - 纯化的乳头状瘤病毒蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及纯化的重组乳头状瘤病毒(PV)蛋白和其制备,测定,使用及配制成制剂的方法。
Description
相关申请
本申请是1994年11月14日申请的,现在未决的,美国系列编号为No.08/339 668的专利申请的部分延续申请。发明领域
本发明涉及纯化的重组乳头状瘤病毒(PV)蛋白,以及其制备,测定和制剂方法。
附图简要说明
图1是用来表达乳头状瘤病毒L1和/或L2病毒衣壳蛋白的双向酵母表达载体。
图2是在酵母中表达的HPV 6aL1 VLPs的电子显微图。
图3是在酵母中表达的HPV 6aL1/L2 VLPs的电子显微图。
图4是啤酒糖酵母菌株1558构建图示。
图5是啤酒糖酵母菌株1569构建图示。
图6是纯化过程的概要步骤。
图7是菌株表。
图8是从酵母中纯化的HPV 16 L1+L2的一系列SDS-PAGE分析。除最终纯化的VLP外还包括纯化过程中间步骤的保留物。表提供了各泳道中样品的鉴定。包括用胶体考马斯蓝的凝胶染色以及用L1和L2蛋白的抗血清的Western印迹。
图9是另一种美洲产白尾棕色兔乳头状瘤病毒L1纯化过程示意图。
发明背景
乳头状瘤病毒(PV)感染发生于多种动物,包括人、绵羊、狗、猫、兔、猴、蛇和牛。乳头状瘤病毒感染上皮细胞,一般在感染部位引起良性上皮或纤维上皮肿瘤。PV是特异感染剂物种;人乳头状瘤病毒不能感染非人动物。
乳头状瘤病毒可以以它们所感染的宿主为基础分类为性质不同的组。人乳头状瘤病毒(HPV)以DNA序列同源性为基础进一步分类为70多种类型。PV类型显示为特异型免疫原,因为对于由一种类型乳头状瘤病毒引起的感染的中和免疫性不使其具有抗另一种类型乳头状瘤病毒的免疫性。
在人体内,不同HPV类型引起不同疾病HPV1、2、3、4、7、10和26-29型在正常的和免疫妥协个体体内引起良性瘤(wart)。HPV5、8、9、12、14、15、17、19-25、36和46-50型在免疫妥协个体体内引起浅度损害(flat lesion)。HPV6、11、34、39、41-44和51-55型引起生殖器或呼吸道粘膜非恶性湿疣。HPV16、18、31、33、35、45和58型引起生殖器粘膜上皮发育不良,并且与子宫颈、阴道、阴门和肛门管的多数原位及侵袭性癌相关。
乳头状瘤病毒是小的(50-60nm),无被膜的,二十面体DNA病毒,其编码至多8个早期基因和两个晚期基因。病毒基因组的开放读框(ORFs)以E1至E7和L1和L2表示,其中“E”表示早期和“L”表示晚期。L1和L2编码病毒衣壳蛋白。早期(E)基因与例如病毒复制和细胞转化功能相关。
L1蛋白是主要的衣壳蛋白,分子量是55-60kDa。L2蛋白是少量衣壳蛋白,预计其分子量是55-60kDa,且根据聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,其表观分子量是75-100kDa。免疫学数据表明大多数L2蛋白对于L1蛋白是内化的。L1 ORF在不同乳头状瘤病毒之间是高度保守的。L2蛋白在不同乳头状瘤病毒之间较少保守性。
L1和L2已被鉴定为用于免疫预防的良好靶物。一些早期基因也已被证明是开发疫苗的潜在的靶物。有关美洲产白尾棕色兔乳头状瘤病毒(CRPV)和牛乳头状瘤病毒(BPV)系统的研究表明用细菌中表达的这些蛋白质免疫或通过使用痘苗载体保护动物免受病毒感染。乳头状瘤病毒L1基因在杆状病毒表达系统中表达或使用痘苗载体集合产生病毒样颗粒(VLP),其已被用来诱导与保护而免受病毒攻击相关的高滴定度病毒中和抗体应答。而且L1和L2基因已被用来产生用于预防和治疗动物乳头状瘤病毒感染的疫苗。HPV 16型L1和L2基因已被克隆到痘苗载体中;所得载体用来感染CV-1哺乳动物细胞,以产生病毒样颗粒(VLP)。
用于PV感染和疾病,包含L1蛋白,L1+L2蛋白,或修饰的L1或L1+L2蛋白的预防和治疗疫苗的开发和商业化由于缺乏大量纯化的病毒和纯化的蛋白质而受到阻碍。因为PV不易体外培养,因此通过体外PV增殖难以生产所需量的L1和L2蛋白。引起的供应问题使之难以表征PV和PV蛋白。因此开发一种粗PV蛋白,尤其是PVL1和L2蛋白或修饰的L1和L2蛋白的易再生源是有用的。开发将粗乳头状瘤病毒蛋白大量纯化到适于免疫学研究和疫苗开发的纯度水平的方法也是有用的。大量生产具有天然蛋白免疫给予(immunity-conferring)性质,如天然蛋白构象的乳头状瘤病毒蛋白也将是有用的。另外开发分析PV蛋白的方法和测定蛋白质的相对纯度以及含蛋白组合物的方法也将是有用的。如此高度纯化的蛋白在制备各种用于PV感染研究的试剂中也是有用的;这些试剂包括但不限于多克隆抗体,单克隆抗体,和分析标准物。
本发明涉及高度纯化的PV的L1和L2蛋白。本发明也涉及用于生产和纯化具有天然乳头状瘤病毒蛋白的免疫给予(immunity-conferring)性质的重组乳头状瘤病毒蛋白的方法。本发明涉及用于乳头状瘤病毒感染预防和治疗疫苗的生产。本发明重组蛋白能生成病毒样颗粒。这些VLP是免疫原性的,并且防止动物模型中形成瘤。本发明以美洲产白尾棕色兔乳头状瘤病毒(CRPV),HPV 6型(6a亚型)和HPV 16型的重组的酵母产生的L1和L1+L2蛋白为模型系统进行了例示。本发明纯化和分析方法适用于其它HPV型,其它HPV蛋白和其它重组体表达系统。
发明概要
本发明涉及纯化的乳头状瘤病毒(PV)重组蛋白以及其制备、测定、应用和制剂方法。发明的详述
本发明涉及纯化的乳头状瘤病毒(PV)重组蛋白以及其制备、测定、应用和制剂方法。本发明以CRPV、HPV 6a和HPV 16重组的酵母衍生的蛋白质进行例示,但本发明不限于此。本发明各种实施方案包括但不限于重组HPV DNA分子,与重组HPV DNA分子互补的RNA,重组DNA分子编码的蛋白质,重组DNA分子和相关蛋白质的抗体,包含DNA,RNA,蛋白质或抗体的组合物,使用DNA,RNA,蛋白质或抗体以及其衍生物的方法。这些衍生物包括但不限于DNA编码的肽和蛋白质,DNA的抗体,或DNA编码的蛋白质的抗体,包含DNA的疫苗或者包含DNA编码的蛋白质的疫苗,包含DNA或DNA编码蛋白的免疫学组合物,包含DNA或DNA衍生的RNA或DNA编码蛋白的药盒。
已产生出细菌衍生的重组牛乳头状瘤病毒L1和L2。重组细菌蛋白的中和血清与天然病毒以低水平交叉反应,假设是由于天然和细菌产生的蛋白之间的构象不同。
表达HPV 16 L1或HPV 16 L2 ORFs的重组杆状病毒已被用来感染昆虫SF9细胞并产生L1和L2蛋白。Western印迹分析表明杆状病毒衍生的L1和L2蛋白与抗HPV 16的抗体反应。杆状病毒衍生的L1形成VLPs。
已经报道过用啤酒酵母的重组菌株生产粗HPV 16 L1和HPV 16 L2蛋白。重组蛋白作为细胞内和分泌的产物生产。当胞内表达蛋白质时,发现主要蛋白质当细胞在不存在变性剂情况下裂解时是不可溶的。这些蛋白质的纯度未加报道。
酵母分泌的重组蛋白显示含有酵母衍生的碳水化合物。这些N-键连的寡糖的存在可以掩蔽天然表位。另外,分泌的蛋白可以包含其它修饰,如分泌性前导序列的保留,分泌过程也可能是低效率的。
用于PV感染和疾病,包含L1蛋白,L1+L2蛋白,或修饰的L1或L1+L2蛋白的预防和治疗疫苗的开发和商业化由于缺少大量纯化的病毒和纯化的蛋白而受到阻碍。因为PV不容易体外培养,所以通过PV体外增殖难以生产所需量的L1和L2。与体外培养PV相关的困难导致了PV和PV蛋白化学,生物学和生理学表征方面的困难。因此开发一种粗PV蛋白,尤其是PVL1和L2蛋白或修饰的L1和L2蛋白的容易再生源是有用的。开发将粗乳头状瘤病毒蛋白大量纯化到适于免疫学研究和疫苗开发的纯度水平的方法也是有用的。大量生产具有天然蛋白免疫给予性质,如天然蛋白构象的乳头状瘤病毒蛋白也将是有用的。另外开发分析PV蛋白的方法和测定蛋白质的相对纯度以及含蛋白组合物的方法也将是有用的。如此高度纯化的蛋白在制备各种用于PV感染研究的试剂中也是有用的;这些试剂包括但不限于多克隆抗体,单克隆抗体,和分析标准物。
包含DNA或DNA编码蛋白的药用组合物可以根据已知技术如通过与药学可接受载体混合而配制。载体和配制方法的例子可以参见《Remington药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Science)。为制成适于有效给药的药学可接受组合物,这些组合物要含有有效量的所述蛋白或VLP。这些组合物可以含有从多于一种类型的HPV衍生出来的蛋白质或VLP。
本发明治疗或诊断组合物以足以治疗或诊断PV感染的量给与个体。有效量根据多种因素而不同,如个体的症状、体重、性别和年龄。其它因素包括给药方式,一般情况下,以大约1mcg至大约1mg剂量范围给与本发明组合物。
本发明药物组合物可以通过多种途径提供给个体,如皮下,局部,口服,粘膜,静脉内和肌内给药。
本发明疫苗包含DNA,RNA或DNA编码蛋白,其含有在宿主体内诱导中和抗体生成所必需的抗原决定簇。这些疫苗有足够的安全性,给与时不会有临床感染的危险;没有毒付作用;可以通过有效途径给与;稳定;并且与疫苗载体相容。
可以通过多种途径给与疫苗,如口服,肠胃外,皮下,粘膜,静脉内或肌内。给与剂量根据个体症状,性别,体重和年龄,给药途径;和疫苗的PV类型而不同。疫苗可以以如胶囊,悬浮剂,酏剂或液体溶液的剂量形式使用。本发明疫苗可以与免疫学可接受载体一起配制。
以治疗有效量,即足以产生免疫保护应答的量给与疫苗。治疗有效量可以根据PV类型不同而不同。可以以单剂或多剂给与疫苗。
本发明纯化的蛋白质可以用于免疫原性组合物制剂。当引入到合适的宿主时这些组合物能在宿主体内诱导免疫应答。
本发明纯化的蛋白质或其衍生物可以用来产生抗体。这里使用的术语“抗体”包括多克隆和单克隆抗体两者,以及其能结合抗原或半抗原的片段,如Fv,Fab和F(ab)2
本发明蛋白和蛋白衍生物可以用于血清型HPV感染和HPV筛选。纯化的蛋白质,VLP和抗体使其自身配制成HPV检测和血清型鉴定的药盒。这样一种药盒包含一种适于在至少一个容器中密封保持的隔室化载体。该载体可以进一步包含适于检测各种HPV类型的试剂,如重组HPV 6a L1或L2蛋白或VLP或抗HPV 6a抗体或重组HPV 16 L1或L2蛋白或VLP或HPV 16抗体。该载体也可以包含检测方法如标记的抗原或酶底物等等。
纯化的蛋白质也用作免疫学标准物,分子量标准参照物和分子大小标准参照物。
因为基因密码是简并的,可以用多于一种的密码子来编码特定的氨基酸,因此氨基酸序列可以被任何一套相似DNA寡核苷酸编码。只有一套将是与HPV 6a或HPV 16序列相同的,但即使存在在合适的条件下失配的DNA寡核苷酸的情况下也能与HPV 6a或HPV 16 DNA杂交。在改变的条件下,失配的DNA寡核苷酸仍可以与HPV 6a或HPV 16 DNA杂交,以允许鉴定和分离HPV 6a或HPV 16编码DNA。
本发明纯化的HPV 6a或HPV 16 DNA或其片段可以用来分离和纯化其它来源的同系物和HPV 6a片段。为此,在合适的杂交条件下将第一种HPV 6a DNA与含有编码HPV 6a同系物的DNA的样品混合。可以分离杂交的DNA复合体,并且可以从中纯化编码同源DNA的DNA。
已知在各种编码特异氨基酸的密码子中存在大量冗余。因此本发明也涉及那些包含改变的编码相同氨基酸最后的翻译的密码子的DNA序列。为此说明书的目的,具有一个或几个取代密码子的序列定义为简并变异。本发明范围也包括DNA序列或翻译的蛋白质基本上不改变被表达蛋白的最终物理性质的突变。例如,用缬氨酸取代亮氨酸,精氨酸取代赖氨酸,或者天冬酰胺取代谷氨酰胺可以不引起多肽的功能变化。
已知编码一种肽的DNA序列可以改变,以编码与那些天然存在的肽不同性质的肽。改变DNA序列的方法包括但不限于定点诱变。
这里所使用的HPV 6a的“功能衍生物”是具有基本上与HPV 6a生物活性相似的生物活性(功能上的或是结构上的)的化合物。术语“功能衍生物”试图包括HPV 6a的“片段”,“变体”,“简并变体”,“类似物”,“同系物”或“化学衍生物”。术语“片段”指HPV 6a的任何多肽亚组。术语“变体”指结构和功能与整个HPV 6a分子或与其片段基本上相同的分子。如果两个分子具有基本上相同的结构,或者两个分子具有相同的生物活性,则是一个分子与HPV 6a“基本上相同”。因此,如果两个分子具有基本上相同的活性,则即使其中一个分子的结构并没有在另一个分子中发现,或者即使两个氨基酸序列是不相同的,这两个分子也被认为是变体。术语“功能衍生物”不包括HPV 6b。
术语“类似物”指一个分子其功能与整个HPV 6a分子或与其片段基本上相同。
可以用本领域已知的多种方法来分子克隆HPV 6a DNA。这些方法包括但不限于在构建包含HPV 6a的cDNA或基因组DNA库之后在合适的表达载体系统中直接功能化表达HPV 6a基因。另一种方法是筛选用自HPV 6a氨基酸序列设计的标记的寡核苷酸探针在噬菌体或质粒穿梭载体中构建的包含HPV 6a的cDNA或基因组DNA库。另外一个方法包括用编码HPV 6a的部分DNA筛选在噬菌体或质粒穿梭载体中构建的包含HPV 6a的cDNA或基因组DNA库。所述部分DNA是通过由纯化的HPV6a的氨基酸序列设计简并的寡核苷酸引物而进行HPV 6a DNA片段的特异聚合酶链反应(PCR)扩增而获得的。另一种方法是从生产HPV 6a的细胞中分离RNA,并通过体外或体内翻译系统将RNA翻译成蛋白质,将RNA翻译成肽或蛋白质会导致生产至少一部分HPV 6a蛋白质,其可以用例如HPV 6a蛋白活性或用抗HPV 6a抗体免疫学活性而鉴定。在该方法中,由生产HPV 6a的细胞中分离的RNA样品可被分析编码至少一部分HPV 6a的RNA的存在。可以对RNA样品的进一步级分以从非HPV6a RNA中纯化HPV 6a RNA。可以分析用该方法生产的肽或蛋白以提供氨基酸序列,这些氨基酸序列接着用来提供生产HPV 6a cDNA的引物,或者可以分析用于翻译的RNA以提供编码HPV 6a的核苷酸序列,并产生用于筛选HPV 6a cDNA文库的探针。这些方法是本领域公知的,并且公开于例如,Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第二版,CddSpring Harbor Laboratory Press,Cold Sping Harbor,NY.1989。
对于本领域技术人员来说,其它类型文库,以及从其它细胞或细胞型构建的文库可以用来分离HPV 6a编码DNA这一点是显而易见的。其它类型文库包括但不限于从其它包含HPV 6a型的细胞和细胞系中衍生的cDNA文库和基因组DNA文库。
制备cDNA文库可以通过本领域公知的标准技术而进行。cDNA文库构建技术可以参见例如Sambrook,J.,等,上文。对于本领域技术人员来说也可以从合适的基因组DNA文库中分离编码HPV 6a的DNA这一点是显而易见的。构建基因组DNA文库可以用本领域标准技术进行。基因组DNA文库构建技术可以参见上文Sambrook,J.,等人的文献。
通过本说明书描述的方法获得的克隆HPV 6a DNA或其片段可以通过将分子克隆到包含合适的启动子和其它合适的转录调节元件的表达载体中而重组表达,并转移到原核或真核宿主细胞中生产重组HPV 6a。这些操作技术全部公开于上文Sambrook,J.,等的文献中,是本领域公知的。
表达载体在本说明书中定义为在合适的宿主中转录基因的克隆拷贝和翻译它们的mRNA所需要的DNA序列。这些载体可用来在各种宿主中,如细菌、蓝绿藻、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞和动物细胞,表达真核生物基因。具体设计的载体使DNA穿梭于宿主之间,如细菌-酵母或细菌-动物细胞或细菌-真菌细胞或细菌-无脊椎动物细胞。合适地构建的表达载体包含:宿主细胞中自主复制的复制原点,选择性标记,一定数目的有用的限制性酶切位点,高拷贝数的能力,和活性启动子。一个启动子定义为引导DNA聚合酶结合DNA并引发RNA合成的一个DNA序列。强的启动子是以高频率引发mRNA的启动子。表达载体可以包括但不限于克隆载体,修饰的克隆载体,具体设计的质粒或病毒。
各种哺乳动物表达载体可以用来在哺乳动物细胞内表达HPV 6a DNA或其片段。适于重组HPV 6a表达的商售哺乳动物表达载体包括但不限于pcDNA3(Invitrogen),pMClneo(Stratagene),pXT1(Stratagene),pSG5(Stratagene),EBO-pSV2-neo(ATCC 37593),pBPV-1(8-2)(ATCC 37110),pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC37224),pRSVgpt(ATCC 37199),pRSVneo(ATCC 37198),pSV2-dhfr(ATCC 37146),pUCTag(ATCC 37460),和λZD35(ATCC 37565)。
各种细菌表达载体可以用来在细菌细胞内表达HPV 6a DNA或其片段。适于重组HPV 6a表达的商售细菌表达载体包括但不限于pET 11a(Novagen),λgt11(InVitrogen),pcDNAII(InVitrogen),pKK223-3(Pharmacia)。
各种真菌细胞表达载体可以用来在真菌细胞内表达HPV 6a或其片段。适于重组HPV 6a表达的商售真菌细胞表达载体包括但不限于pYES2(Invitrogen),毕赤酵母表达载体(Invitrogen)。
各种昆虫表达载体可以用来在昆虫细胞内表达HPV 6a DNA或其片段。适于重组HPV 6a表达的商售昆虫细胞表达载体包括但不限于pBlue BacIII(InVitrogen)。
包含编码HPV 6a或其片段的DNA的表达载体可以用来在细胞、组织、器官或动物体内表达HPV 6a蛋白或HPV 6a蛋白片段。这里使用的动物包括人。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞,包括但不限于细菌,如大肠杆菌,真菌细胞如酵母,哺乳动物细胞,包括但不限于人、牛、猪、猴和啮齿动物源的细胞系,和昆虫细胞系,包括但不限于果蝇和蚕衍生的细胞系。合适的并可商购的由哺乳动物物种衍生的细胞系包括但不限于L细胞L-M(TK-)(ATCC 1.3),L细胞L-M(ATCCCCL 1.2),293(ATCC CRL 1573),Raji(ATCC CCL 86),CV1(ATCC CCL 70),COS-1(ATCC CRL 1650),COS-7(ATCC CRL 1651),CHO-K1(ATCC CCL 61),3T3(ATCC CCL 92),NIH/3T3(ATCC CRL 1658),Hela(ATCC CCL 2),C1271(ATCC CRL 1616),BS-C-1(ATCC CCL 26)和MRC-5(ATCC CCL 171)。
表达载体可以通过任何一项技术引入到宿主细胞中,包括但不限于转化,转染,脂质转染法(lipofection),原生质体融合,和电穿孔。这些包含表达载体的细胞被克隆繁殖并各个分析以测定它们是否产生HPV 6a蛋白。HPV 6a表达宿主细胞的克隆的鉴定可以通过几种方法进行,包括但不限于与抗-HPV 6a抗体的免疫学反应,和宿主细胞相关的HPV 6a活性的存在,如HPV 6a特异配体结合,或定义为HPV 6a特异配体在HPV 6a的相互作用介导的应答的信号转导。
HPV DNA片段的表达也可以用体外合成制备的mRNA或天然mRNA来进行。合成的mRNA或从产生HPV 6a的细胞中分离的mRNA可以在多种无细胞体系内有效翻译,所述系统包括但不限于麦胚提取物和网织细胞提取物,以及在以细胞为基础的系统中有效翻译,包括但不限于微注射到蛙卵母细胞中,优选微注射到蛙卵母细胞中。
HPV 6a蛋白在宿主细胞中表达以后,可以回收HPV 6a蛋白以提供纯化形式的HPV 6a。可以获得几种HPV 6a的纯化方法并适于应用。正如本说明书所描述的,重组HPV 6a蛋白可以从细胞裂解物中纯化,并通过盐分级分离,离子交换层析,大小排阻层析,羟基磷灰石吸附层析和疏水作用层析单独应用或各种组合来提取。
另外,重组HPV 6a可以从其它细胞蛋白中通过使用用特异于全长新生HPV 6a或HPV 6a多肽片段的单克隆或多克隆抗体制备的免疫亲和柱来分离。 多克隆和单克隆抗体可以根据本领域多种方法来制备。这里所使用的单克隆或单特异性抗体定义为单一抗体种类或具有HPV 6a同源结合特征的多抗体种类。这里所说的同源结合指抗体种类结合一个特异抗原或表位的能力。
可以使用生产单特异性抗体的方法来制备对HPV多肽片段或全长新生HPV多肽有特异性的抗体,这一点对于本领域技术人员是显而易见的。具体地说,可以产生对全部功能HPV蛋白或其片段有特异性的单特异性抗体这一点对本领域技术人员是显而易见的。
本发明也涉及筛选体内调控DNA表达或RNA编码HPV以及HPV 6a蛋白功能的化合物的方法。调控这些活性的化合物可以是DNA,RNA,肽,蛋白质或非蛋白类有机分子。化合物可以通过增强或减弱DNA,或编码HPV 6a RNA的表达,或HPV 6a蛋白的功能而进行调控。调控DNA表达,或RNA编码HPV 6a或HPV 6a蛋白功能的化合物可以通过各种检验而测定。检验可以简单的“是/不是”检测来测定表达或功能是否有变化。检测可以通过将试验样品的表达或功能与标准样品的表达或功能的水平相比较而定量进行。
可以制备包含HPV 6a DNA,HPV 6a DNA片段,抗HPV 6a DNA或HPV 6a蛋白的抗体,HPV 6a RNA或HPV 6a蛋白的药盒。这种药盒可用来检测与HPV 6a DNA杂交的DNA,或检测样品中HPV 6a蛋白或肽片段的存在。这一特征对于多种目的是有用的,包括但不限于法医分析和流行病学研究。
可以合成与HPV 6a编码DNA序列互补的核苷酸序列以用于反义治疗。这些反义分子可以是DNA,DNA稳定的衍生物,如硫代磷酸酯或甲基膦酸酯,RNA,RNA的稳定衍生物,如2′-O-烷基RNA,或其它HPV 6a反义寡核苷酸拟态物。HPV 6a反义分子可以通过微注射,脂质体包被作用,或通过从载有反义序列的载体中表达而引入细胞中。HPV 6a反义疗法可能特别适用于治疗其中降低HPV 6a活性是有益的那些疾病。
术语“化学衍生物”指包含另外的通常不是基础分子的一部分的化学部分的分子。这些部分可以改善基础分子的溶解性,半寿期,吸收性等。或者这些部分可以减弱基础分子的副作用或者降低基础分子的毒性。这些部分的例子在多种文献中有所描述,例如《Remington’s药物科学》。
可以以合适的剂量单独使用根据本文所公开的方法鉴定的化合物,所述合适的剂量通过常规试验确定以获得HPV 6a或其活性的最佳抑制使用,同时减少任何潜在的毒性。另外与其它药剂一起给药或顺序给药也是所希望的。
有利的是,本发明化合物可以以每日单剂给药,或者每日总剂量可以分成几次剂量给药。而且,本发明化合物可以通过多种途径给药,包括但不限于鼻内,经皮,通过栓剂,口服等给药。
对于使用多于一种的活性试剂的结合治疗,其中活性试剂以不同制剂形式存在,活性试剂可以同期给药,或者每种药剂可以以不同交错时间给药。
使用本发明化合物的剂量用法根据多种因素选择,包括患者的类型,种类,年龄,体重,性别和医疗条件;所要治疗的疾病的严重程度;给药途径;患者的肝肾功能;所使用的其具体化合物。普通医生容易确定和对防止,阻扰或停止病状进展所需药物的有效量开处方。在获得药效力而又没有毒性的范围内实现药物浓度的最佳精确度需要以药物适于靶位点的动力学为基础的给药法,包括考虑药物的分布,平衡和减少。
本发明方法中,详细描述的化合物可以形成活性成分,而且一般情况下以与根据所要给药的形式而适当选取的合适的药物稀释剂、赋形剂或载体(本说明书中称为“载体”物质)的混合物的形式给药,并且结合常规制药实践。所述给药形式是口服片剂、胶囊、酏剂、糖浆、栓剂、凝胶体等。
例如,对于以片剂或胶囊形式口服给药,活性药物成分可以与口服非毒性药物可接受惰性载体如乙醇、甘油、水等相混合。而且,如果期望或需要,也可以向混合物中掺入合适的结合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂。合适的结合剂包括但不限于淀粉、明胶、天然的糖如蔗糖、或β-乳糖、玉米甜剂,天然或合成的胶如金合欢、西黄蓍胶或藻酸钠、羧甲基素、聚乙二醇、蜡或类似物。这些剂量形式中使用的润滑剂包括但不限于油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等等。
对于液体形式,活性药物成分可以适当地混合于调味悬浮剂或分散剂中,如合成的或天然胶,例如西黄蓍胶、金合欢、甲基纤维素等。其它可以使用的分散剂包括甘油等。对于肠胃外给药,需要灭菌的悬浮液如溶液。当需要静脉内给药时要使用一般含有合适防腐剂的等张制剂。
含有活性药物成分的局部制剂可以与多种本领域公知的载体材料混合,例如醇、芦荟凝胶、尿囊素、甘油、维生素A和E油、矿物油、PPG2丙酸肉豆蔻酯等,生成例如醇溶液、局部清洁剂、清洁霜、皮肤凝胶、皮肤洗剂,和乳膏或凝胶制剂中的洗发剂。
本发明化合物也可以以脂质体运送系统的形式给药,例如小单层囊泡,大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可以由各种磷脂,如胆甾醇、硬脂基胺或卵磷脂生成。
本发明化合物也可以通过使用单克隆抗体作为化合物分子与之偶联的各载体来运送。本发明化合物也可以与作为靶向性药物载体的可溶聚合物偶联,这样的聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基异丁烯酰基-酰胺苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚、或被十六烷酰残基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。而且,本发明化合物可以与一类用于实现药物缓释中的生物可降解聚合物偶联,所述聚合物是例如聚乳酸、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯,和水凝胶交联或两亲性共聚物。
下面实施例详细说明本发明而不是限制本发明。实施例1制备酵母菌株U9
从Leland Hartwell博士(华盛顿大学,Seattle,WA)处得到啤酒酵母菌株2150-2-3(MA Talpha,Leu 2-04,adel,cri°)。菌株2150-2-3细胞在30℃在5mL YEHD培养基(Carty等,J.IndMicro 2(1987)117-121)中繁殖过夜。细胞用无菌蒸馏水冲洗3次,再悬浮于2mL无菌蒸馏水中,0.1mL细胞悬液铺到六个5-氟-乳清酸(FOA)板的每一板上,以挑选ura3突变株(Cold Spring HarborLaboratory Manual for Yeast Genetics)。平板在30℃孵育。每250mL蒸馏水所含的培养基:3.5g,没有氨基酸和硫酸铵盐的DifcoYeast Nitrogen Base;0.5g,5-氟-乳清酸;25mg尿嘧啶;和10.0g葡萄糖。
通过0.2μm膜过滤将培养基灭菌,然后与保持50℃的250mL 5%Bacto-Agar(Difco),10mL 1.2mg/mL腺嘌呤溶液,和5mL L-亮氨酸溶液(180mg/50mL)混合。所得培养基以每个培养皿20mL分配。
培养5天后,出现多个菌落,通过将菌落再划线而将单一菌落从最初的FOA板分离到新鲜的FOA板,然后在30℃培养。来自第二批FOA板的几个菌落通过复制平板置于YEHD平板和减少尿嘧啶的平板两个平板上而测定ura 3突变株的存在。所期结果是在YEHD板上生长良好,而在无尿嘧啶的培养基中不生长。得到了一个分离物(U9),其显示了这些性质。其以冷冻的甘油贮备液在-70℃下贮存(菌株#325)备用。实施例2制备用于断裂酵母MNN9基因的载体
为了制备用于断裂酵母MNN9基因的载体,需要首先从啤酒酵母基因组DNA中克隆MNN9基因。这通过标准聚合酶链反应(PCR)技术进行。以公开的酵母MNN9基因的序列(Zymogenetica:欧洲专利申请No.88117834.7,公开号No.0-314-096-A2)为基础设计用于全长MNN9编码序列PCR的5′正义引物和3′反义引物。使用了下面的含有旁侧Hind III位点(下划线)的寡脱氧核苷酸引物:正义引物:5′-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3′反义引物:5′-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3′
MNN9基因的初始蛋白酶密码子是粗印体中的强调部分。使用来自啤酒酵母菌株JRY 188(Rine等)的基因组DNA为模板,使用TaqDNA聚合醚(Perkin Elmer),并进行25个循环扩增(94℃1分钟,37℃2分钟,72℃3分钟),来进行PCR。所得的1.2kbp PCR片段用Hind III消化,凝胶纯化,并与Hind III消化的碱性磷酸酶处理的pUC13(Pharmacia)连接。所得质粒以p1183表示。
为了用酵母URA3基因断裂MNN9基因,质粒pBR322-URA3(其包含亚克隆到pBR322 Hind III位点的1.1kbp Hind III片段编码S.cerevisiae URA3基因)用Hind III消化,并且具有功能URA3基因的1.1kbp DNA片段被凝胶纯化,用T4 DNA聚合酶平整末端,然后与PmII消化的质粒p1183(在MNN9编码序列内PmII切割)连接。所得质粒中p1199包含被功能URA3基因分裂的MNN9基因。实施例3构建包含MNN9基因断裂的U9-衍生的菌株1372
为断裂菌株U9(#325)中的MNN9基因,用Hind III消化30μg质粒p1199,产生线性mnn9∷URA3断裂盒(cassette)。菌株325细胞用原生质球方法(Hinnen等,1978,《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),75:1929-1933)用Hind III消化过的p1199DNA转化,转化产物在没有尿嘧啶但含有1.0M山梨糖醇的合成琼脂培养基上挑选。合成培养基每升蒸馏水含有:琼脂,20g;酵母氮碱(Yeastnitrogen base)和/或氨基酸,6.7g;腺嘌呤,0.04g;L-酪氨酸,0.05g;山梨糖醇,182g;葡萄糖,20g;和减少亮氨酸的溶液#2,10ml。减少亮氨酸的溶液#2每升蒸馏水含有:L-精氨酸,2g;L-组氨酸,1g;L-亮氨酸,6g;L-异亮氨酸,6g;L-赖氨酸,4g;L-蛋白酶,1g;L-苯丙氨酸,6g;L-苏氨酸,6g;L-色氨酸,4g。
平板在30℃孵育5天,此时出现一些菌落。从10个菌落中制得染色体DNA制剂,然后用EcoRI加Hind III消化。然后用具有MNN9基因(自质粒p1199分离的)的1.2kbp Hind III片段为探针,通过Southern印迹(J.Sambrook等,《分子克隆:实验手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第二版,Cold Spring Harbro Labroatory出版社,1989)评价DNA消化产物。鉴定了一个分离物(菌株#1372),其显示了Southern印迹上所期望的DNA带位移以及mnn9突变体典型显示的极端聚集。实施例4构建用于酵母HIS3基因断裂的载体
为了构建其中啤酒酵母HIS3基因被URA3基因断裂的断裂盒,质粒YEP6(K.Strubl等,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:1035)用BamHI消化,具有HIS3基因的1.7kbp BamHI片段被凝胶纯化,用T4DNA聚合酶平整末端,并与事先已用BamHI消化并用T4 DNA聚合酶处理的pUC 18连接。所得质粒(以p1501或pUC 18-HIS3表示)用NheI(其在HIS3编码序列中切割)消化,载体片段被凝胶纯化,用T4DNA聚合酶平整末端,然后用牛肠碱性磷酸酶处理。通过用Hind III消化从质粒pBR322-URA3中分离URA3基因,具有URA3基因的1.1kbp片段被凝胶纯化,并用T4 DNA聚合酶平整末端,并与上述pUC 18-HIS3 NheI片段连接。所得质粒(指定为pUC 18-his3∷URA3或p1505)包含其中酵母HIS3基因被功能URA3基因断裂的断裂盒。实施例5构建用于通过HIS3基因断裂酵母PRB1基因的载体
具有啤酒酵母PRB1基因的质粒FP8ΔH由Carneyie-Mellon大学的E.Jones博士提供(C.M.Moehle等,1987,《遗传学》(Genetics)115∶255-263)。其用Hind III加XhoI消化,具有PRB1基因的3.2kbpDNA片段被凝胶纯化,并通过用T4 DNA聚合酶处理平整末端。质粒pUC 18用BamHI消化,凝胶纯化,并通过用T4 DNA聚合酶处理平整末端。所得载体片段与上述PRB1基因片段连接,得到质粒pUC 18-PRB1。包含HIS3基因的质粒YEp6用BamHI消化。所得具有功能HIS3基因的1.7kbp BamHI片段被凝胶纯化,然后通过用T4 DNA聚合酶处理平整末端。质粒pUC18-PRB1用EcoRV加在PRB1编码序列中切割的NcoI消化,并去除蛋白酶B活性位点的旁侧序列。具有pUC 18中PRB1编码序列的残基5′和3′一部分的5.7kbp EcoRV-NcoI片段被凝胶纯化,通过用T4 DNA聚合酶处理平整末端,用牛肠碱性磷酸酶脱磷酸化,并与上述末端整平的HIS3连接。所得质粒(指定为pUC 18-prb1 ::HIS3,原种#1245)在已被如上缺失的PRB1基因部位的位置包含功能HIS3基因。实施例6构建包含MNN9和PRB1基因两者断裂的U9相关的酵母菌株
包含MNN9基因断裂的U9相关菌株1372在实施例3中已描述过。菌株1372的克隆分离物在FOA板(如实施例1所述)上传代,以选择ura3突变体。得到了几种菌株1372的ura3分离物,并且一特别分离(菌株12930-190-S1-1)被挑选用于下面的HIS3基因断裂。pUC 18-his3∷URA3基因断裂载体(p1505)用XbaI加EcoRI消化,产生线性his3∷URA3断裂盒,并用于通过乙酸锂方法(《酶学方法)》Meehodsin Enzymology,194:290(1991))的菌株12930-190-S1-1的转化。在没有尿嘧啶的合成琼脂培养基上挑选Ura+转化物,在相同培养基上对克隆分离物再划线,然后复制平板置于没有尿嘧啶或者没有组氨酸的培养基上以筛选哪些既是Ura+又是His-的分离物。挑选一个分离物(菌株12930-230-1)用于下面的PRB1基因的断裂。PRB1基因断裂载体(pUC 18-prb1∷HIS3,原种#1245)用SacI加XbaI消化,产生线性prb1∷HIS3断裂盒,并用于通过乙酸锂方法转化菌株12930-230-1。在没有组氨酸的琼脂培养基上挑选His+转化物,在相同培养基上对克隆分离物重新划线。从几种所得His+分离物制备基因组DNA,用EcoRI消化,然后在0.8%琼脂糖凝胶上电泳。然后用通过PCR使用下面寡脱氧核苷酸引物已经制备的PRB1基因的放射标记617bp探针进行Southern印迹分析:
5′TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3′
5′CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3′
获得11种分离物,其显示所期望的探针与2.44kbp prb1∷HIS3DNA片段的杂交作用。这与该探针与野生型PRB1基因1.59kbp片段的杂交作用相矛盾。挑选这些包含所述prb1∷HIS3分裂的分离物中的一个用于进一步的应用并指定为菌株#1558。实施例7构建用于酵母PEP4基因断裂的载体
用下面的方法从酵母基因组库中克隆啤酒酵母PEP4基因。包含酵母基因组库pLS 101(Schultz和Friesen,1983,《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)155:8-14)的大肠杆菌细胞在5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中繁殖过夜。从该培养物中10-4和10-5稀释物被铺于LB加氨苄青霉素的平板上。使用硝基纤维素滤纸制备菌落平板lift。通过PCR技术,使用Taq DNA聚合酶,制备对于酵母PEP4基因的探针,来自pLS 101酵母库的全部质粒DNA,接着以公开的PEP4的DNA序列(C.A.,Woolford等,《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)6:2500(1986))为基础设计寡脱氧核苷酸引物。有义引物:5′-GAG GCT ACC AGC GAG CCG GGC-3′反义引物:5′-GGC GAG TGG GCC AAC AGG TTC-3′
用25次循环扩增(94℃1分钟,37℃2分钟,72℃3分钟)进行PCR。PCR探针被凝胶纯化,放射标记,并与上述菌落滤纸杂交。几个菌落对与PEP4探针的杂交呈阳性,对于单一菌落在LB加氨苄青霉素平板上划线。质粒DNA通过碱性-SDS裂解(Sambrook等,上文)人几种分离物中制备,并用BamHI消化。发现所期望的14kbp载体带和6.9kbp PEP4插入带。用EcoRI加XhoI进行两次消化,发现所期望的PEP4的1.5kbp带。挑选显示出所期望结果的一个分离物(大肠杆菌菌株#860)用于进一步的应用。来自菌株#860的质粒DNA用BamHI消化,携带染色体PEP4基因的6.9kbp BamHI DNA片段克亚隆到pUC 13的BamHI位点,得到质粒p890。然后质粒p890用NcoI(在PEP4编码序列中切割)消化,凝胶纯化,通过用T4 DNA聚合酶处理平整末端,与具有功能URA3基因的1.1kbp末端已平整的片段(如实施例2所制备)连接,所得的包含被URA3基因分裂的PEP4基因的质粒指定为pUC 13-pep4∷URA3(菌株#906)。实施例8构建酵母菌株#1569,#1538和#1592,它们是包含prb1和pep4突变型两者的菌株U9的衍生物
为了断裂菌株U9中的HIS3基因,用EcoHI加XbaI消化断裂载体pUC 18-his3∷URA3,然后用来通过乙酸锂方法转化菌株U9。在没有尿嘧啶的琼脂培养基上挑选Ura+转化物,并对于克隆分离物在相同培养上划线。然后几种所得Ura+分离物复制平板置于没有尿嘧啶或组氨酸的琼脂培养基上,并筛选即Ura+又His-的那些。挑选一个分离物(菌株#1524)用于下面的PRB1断裂。PRB1断裂载体pUC 18-prb1∷HIS3用SacI加XbaI消化后用于通过乙酸锂方法对菌株#1524的转化。在没有组氨酸的琼脂培养上挑选His+转化物,并对于克隆分离物在相同培养基上划线。由一些His+分离物制备基因组DNA,通过与放射标记的PRB1探针的Southern印迹杂交进行评价。挑选显示出所期望的PRB1基因被HIS3断裂(即prb1∷HIS3)的一种分离物用于下面的PEP4基因的断裂。为了获得ura3分离物而在FOA板上将菌株#1537传代,并且挑选一个分离物(菌株#1541)用于进一步的应用。
为了断裂菌株#1541中的PEP4基因,PEP4基因断裂载体pUC13-pep4∷URA3用XhoI消化,产生线性pep4∷URA3断裂盒,并用于通过乙酸锂方法的菌株#1541的转化。在尿嘧啶缺少的琼脂培养基上挑选Ura+转化物,并对于克隆分离物在相同培养基上划线。由几个Ura+转化物制备基因组DNA,并用放射标记的PEP4基因探针进行Southern印迹评价。挑选显示出所期望的PEP4基因被URA3基因断裂的一个分离物(菌株#1569)用于进一步的应用。根据实质上相同的步骤顺序,在一独立的实验中构建了菌株#1538。菌株#1538是菌株U9的一个衍生物。菌株#1538包含prb1和pep4突变型两者。另外,菌株#1569的ura3衍生物通过在FOA板上传代而获得。所得的菌株#1569的ura3衍生物指定为菌株#1592。实施例9从活检组织中提取核酸
从25岁分娩后女性患者获得大的外阴湿疣尖锐损害。在液氮中冷冻损害碎片,然后用Braun mikrodismembrator II(B.BraunInstruments,Melsungen,德国)处理。所得物质用0.6%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)溶解,用蛋白酶K(50mcg/ml)处理,并用苯酚/氯仿/异戊醇提取。DNA是乙醇沉淀的,并用UV分光光度测定定量。通过琼脂糖凝胶电泳,接着用溴化乙锭染色来证明存在高分子量的DNA。实施例10HPV DNA分型
HPV DNA分型使用标记为Vira Type Plus(DigeneDiagnostics,Beltsville,MD)的杂交捕获分析来测定。使用的HPV探针被分成两个库,其组成以每一类型与生殖恶性肿瘤的相关性为基础。探针组A含有“低危险性”类型HPV 6,11,42,43和44,而探针B含有“高危险性”类型16,18,31,33,35,45,51,52和56。全部DNA用PstI,BamHI和Hind III消化,并且在高度严格的条件下(Tm-15℃)进行Southern印迹以测定HPV亚型。实施例11克隆HPV 6a基因组
从HPV 6a阳性生物活组织样品中提取的全部DNA用Hind III核酸内切酶消化。通过0.8%低熔点温度琼脂糖制备凝胶大小分级后,从凝胶上切下相当于~8kbp的DNA的区,并用GelaseTM酶消化琼脂糖(GelaseTM酶购自Epicentre Technologyies,Inc.,Madison,WI)。样品与已用HindIII消化并脱磷酸化的pUC 18(Pharmacia,Inc.,Piscataway,NJ)连接。活性大肠杆菌DH5细胞(Gibco,BRL,Gaithersburg,MD)转化后,通过菌落杂交,用与HPV 6b L1基因(5′-GAG AGA TCT TAC CTT TTAGTT TTG GCG CGC TTA C-3′)的3′端互补的反义32P-标记的寡脱氧核苷酸从质粒库中筛选HPV 6a阳性克隆。分离包含8.1kbp HPV 6a基因组的pUC 18质粒并用限制性酶表征并进行Southern印迹分析。该质粒用pUC 18-HPV 6a消化。用QiagenTM Plasmid Maxi药盒(QiagenInc.,Chatsworth,CA)制备质粒DNA。实施例12pUC 18-HPV 6a的序列分析
为了测定完全的HPV 6a序列,以公开的HPV 6b序列为基础合成序列测定引物。完全的8.1-kbp HPV 6a基因组的两股链通过双脱氧链终止法用PRISMTM药盒和Applied Biosystems(ABI)自动测序仪(#373A)根据厂商说明(ABI,Inc.,Foster City,CA)进行序列测定。有义和反义序列不匹配的情况下,合成另外的HPV 6a特异性引物以从两个方向对有问题的区再进行序列测定以得到共有序列。
HPV 6a和HPV 6b的DNA序列具有超过97%的相同性,在8010bp之中,总共有229bp被鉴定有变化。与HPV 6b序列相比最明显的区别发现于长调控区(LCR;nt7205-nt106)。除了在HPV 6a LCR中几个单个核苷酸(nt)变化外,发现在nt7350处一个94-bp插入和另一个在nt7804处19-bp插入。在nt7615处,六个碱基对从HPV 6a基因组中缺失。实施例13构建HPV 6a L1酵母表达载体
HPV型6a DNA用作PCR模板。通过PCR使HPV 6a L1基因扩增,使用Vent聚合酶(New England Biolabs,Inc.)35次扩增循环(94℃,1分钟;48℃,1分钟;72℃,1分钟45秒),使用包含旁侧BglII位点(下划线)的下面的寡脱氧核苷酸引物:有义引物:5′-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC GGC
CTA GCG ACA GCA CAG-3′反义引物:5′-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA
C-3′
有义引物引入酵母非翻译前导序列紧接着的HPV 6a L1起始蛋白酶密码子(粗印体强调部分)上游。1.5-kbp L1 PCR产物用BglII消化并凝胶纯化。通过从包含来自质粒pBM272(由华盛顿大学,St.Louis的Mark Johnston提供)的通过酵母ADH1转录终止子(Bennetzen,J.L.和Hall,B.D.(1982)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)257:3018-3025)而位于每一面旁侧的趋异进化GAL1/GAL 10启动子的双向GAL启动子载体pUC 18-GAL 1p-GAL 10p中分离1.4kbp Sph I片段,克隆位于GAL 1启动子和ADH 1转录终止子第一拷贝之间的BamHI位点,而构建pGAL 10表达载体,Sma I克隆位点位于趋异性化GAL 10启动子和ASH 1转录终止子的第二个拷贝之间。由pBR322,酵母LEU2-d基因和酵母2μm组成的酵母穿梭载体与Sph I成环并与1.4-kbpSphI GAL启动子片段连接。所得启动子pGAL 10用在GAL 1启动子和ADH 1转录终止子之间切割的BamHI线性化。BamHI消化过的pGAL 10载体和BglII消化过的HPV 6a L1 PCR片段连接,并用来转化大肠杆菌DH5细胞(BRL)。分离包含HPV 6a L1基因的pC 1/1-GAL质粒并指定为p13173-357-6。对p13173-357-6中的L1基因进行序列测定(ABI Sequencer #373A)并显出与pUC 18-HPV 6a克隆中的L1基因相同。实施例14构建HPV 6a L1和L2酵母表达载体
质粒p13173-357-6(pGAL 10+HPV 6a L1)用SamHI消化,Sam I在GAL 10启动子和ADH 1转录终止子之间切割。1.4-kbp HPV6a L2基因通过PCR扩增,使用pUC 18-HPV 6a DNA为模板,使用Vent聚合酶(New England Biolads,Inc.),进行10个循环PCR扩增(94℃,1分钟;48℃,1分钟;72℃,1分钟45秒),并使用下面的含旁侧Sma I位点(下划线)的寡脱氧核苷酸引物:有义引物:5′-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGG CAC ATA
GTA GGG CCC GAC GAC-3′反义引物:5′-TCC CCC GGG CTA GGC CGC CAC ATC TGA AAA
AAA TAA GG-3′
有义引物引入酵母非翻译前导序列紧接着的HPV 6a L2起始蛋氨酸密码子(粗印体强调部分)上游。PCR片段用Bma I消化,,凝胶纯化,并与Sma I消化过的p13173-357-6质粒连接。分离既包含HPV 6a L1又包含L2基因的pGAL 10质粒并指定为p14049-7-2。对L2基因测序(ABI Sequencer #373A),发现与pUC 18-HPV 6a克隆中的L2基因相同。实施例15在酵母中表达HPV 6a L1并共表达HPV 6a L1和L2
质粒p13173-357-6(pGAL 10+HPV 6a L1)和p14049-7-2(pGAL 10+HPV 6a L1和L2)用来转化啤酒酵母菌株#1569(MATa,Leu 2-04,prb 1,ade 1,pep 4,cir°)和#1558(MATa,Leu 2-04,prb 1,mnn 9,ade 1,cir°)。用宿主菌株#1558获得的结果重组菌株是菌株#1644(HPV 6a L1)和#1670(HPV 6a L1+L2),如表中所示。克隆分离物在30℃在含有2%半乳糖的YEHD培养基中生长68-78小时。收获细胞后,用玻璃珠破碎细胞沉淀物。通过免疫印迹分析分析细胞溶质中HPV 6a L1或HPV 6a L2蛋白的表达。含有40μg总细胞蛋白的样品在还原和变性条件下在10%Tris-甘氨酸凝胶上进行电泳,并电印迹到硝基纤维素滤纸上。使用用来抗trp E-HPV 11融合蛋白的兔抗血清(Brown,D.R等,Virology201:46-54)为第一抗体,猴抗兔IgG辣根过氧化物酶连接的(HRP)整个抗体(Amersham,Inc.)作为第二抗体对L1蛋白进行免疫测定。用化学发光ECLTM检测药盒(Amersham,Inc.)处理滤纸。在除阴性对照物(没有L1或L2基因的载体对照物)外的所有样品中检测到了50-55kDaL1蛋白带。
使用来自小鼠的1∶250稀释的血清通过Western分析测定L2蛋白是70kDa蛋白带,其中所述小鼠已用基本上根据Carter等的方法制备的trpE-HPV 6a L2融合蛋白为第一抗体,HRP连接的,绵羊抗小鼠IgG(Amersham,Inc.)为第二抗体(1∶1000稀释)进行了三次免疫。
对于EM分析(Structure Probe,West Chester,PA),每一样品一份置于200目碳包被的铜载网上。一滴2%磷钨酸(PTA),pH7.0置于载网20秒。在TEM检验之前使载网空气风干。所有电微学技术用JEOL 100 CX透射电子显微镜(JEOL USA,Inc.)以加速电压100KV进行。产生的显微图最终放大倍数为100000X。
在具有HPV 6a L1或HPV 6a L1和L2共表达质粒的所有酵母样品中在50-55nm直径大小范围发现VLP。在酵母对照样品中没有发现VLP。实施例16HPV 6a L1+L2(菌株#1670)的发酵
将平板培养的菌株的1670的表面生长无菌转移到无亮氨酸的液体培养基中,所述的液体培养基含有(每升):8.5g没有氨基酸和硫酸铵的Difco酵母氮碱;0.2g尿嘧啶;10g琥珀酸;5g硫酸铵;和0.25g L-酪氨酸,在灭菌前用NaOH将该培养基调至pH 5.0-53。在28℃在旋转振荡器上以250rpm生长25小时后,在-70℃贮存之前通过将无菌甘油加入至终浓度17%(w/v)(每冷冻管1mL)而制备冷冻培养物小管。用于菌株1670发酵的接种物在相同培养基(每2L烧瓶中500mL)中培养,并将两个冷冻培养物小管的解冻的内容物转移至2-L烧瓶中而开始,并在28℃,在旋转振荡器上以250rpm培养25小时。酵菌株1670使用New Brunswidk SF-116发酵罐,接种后工作体积为10L。使用的生产培养基含有(每L):20g Difco酵母提取液;10gSheffield HySoy胨;20g葡萄糖;20g半乳糖;在灭菌前将培养基调至pH 5.3。将2L种菌烧瓶中的全部内容物(500mL)转移到发酵罐中,在28℃。每分钟通5L空气,400rpm,3.5psi压力条件下培养。根据需要增强搅拌以保持溶解的氧的水平高于40%饱和。发酵过程用脱机葡萄糖测量器(Beckman Gluvose 2 Analyzer)和联机质谱(Perkin-Elmer 1200)监测。孵育69个小时后,达到每升9.9g干细胞重量的细胞密度。培养物用中空纤维过滤(Amicon DC-10过滤系统中的Amicon H5MPO1-43柱体)浓缩至大约2L,用2升磷酸缓冲盐水渗滤,在分散于500mL离心管之前进一步浓缩(至大约1升)。以8000rpm(Sorval GS3回转器)在4℃离心20分钟收集细胞沉淀。倾析出上清液后,将沉淀物(共225g湿细胞)在-70℃贮存备用。实施例17纯化重组HPV 6a L1+L2衣壳蛋白除有注明外所有步骤都在4℃下进行
菌株#1670细胞在-70℃下冷冻贮存。冷冻细胞(湿重=3.80g)在20-23℃下解冻,并再悬浮于50mL“L1缓冲液”(20mM磷酸钠,pH 7.2,100mM NaCl,1.7mM EDTA)中。加入蛋白酶抑制剂PMSF和胃酶抑制剂A,分别达到终浓度2mM和1.7mcM。通过M 110微液化器(Microfluidics Corp.,Newton,MA)的三个通道以大约8000psi的压力将细胞浆液破碎。破碎的细胞浆液以5000×g离心10分钟去除细胞残渣碎片。回收含有L1+L2抗原的上清液。
加入缓冲液A(20mM MOPS,pH 7.0)以1∶5稀释上清液,加到用缓冲液A平衡过的FractogelEMD TMAE-650(S)树脂(EMSeparatiohs,Gibbstown,NJ)阴离子捕获柱(5.0cmID×4.0cm)上。用缓冲液A冲洗后,以缓冲液A中0~1.0M NaCl的梯度洗脱抗原。进行免疫打点印迹检测哪一柱级分中含有L1蛋白。
通过Bradford方法,接着是使用银染的SDS-PAGE和Western印迹对免疫打点印迹检测含有L1蛋白的级分的所有蛋白质。
集中那些显示相差不大纯度旦富含L1蛋白的TMAE级分。通过硫酸铵分级浓缩抗原。加入固体试剂同时温和搅拌30分钟将溶液调至63%饱和的硫酸铵。样品置于冰上,让沉淀进行30分钟,以12000×g离心样品,沉淀重新悬浮于20.0mL PBS(6.25mM磷酸钠,pH7.2,150mM NaCl)。
重新悬浮的沉淀在Sephacryl 500HR树脂(Pharmacia,Piscataway,NJ)大小排阻柱(2.6cm ID×89cm)上层析,洗脱缓冲液是PBS。层析在20-23℃下进行。通过银染SDS-PAGE和Western印迹检测分析级分。收集最纯的级分,浓缩所得的集中样品。
用胶体考马斯染色SDS-PAGE分析最终样品。L1和L2蛋白估计是85%同源性。使用合适的抗血清通过western印迹证明L1和L2蛋白的特征。最终样品分成小份在-70℃贮存。这一过程得到共3.0mg蛋白质。
通过结构探针(Structure Probe)(West Chester,PA)进行电子显微分析。一小份样品置于200目碳包被铜载网上。一滴2%磷钨酸,pH 7.0置于载网20秒钟。在TEM检验前使载网空气风干。所有显微技术用JEOL 100 CX透射电子显微镜(JEOL USA,Inc.)以100kV的加速电压进行。产生的显微图最终放大倍数100000X。证明存在50-55nm大小范围的病毒样颗粒。实施例18构建CRPVL1表达载体
通过PCR技术,从包含完全的CRPV病毒基因组(Peter Howley博士,NCI)的质粒pLA II中扩增CRPV L1基因,使用Vent聚合酶(NewEngland Biolabs,Inc.);35次循环扩增(94℃,1分钟;50℃,1分钟;72℃,2分钟),并且使用下面的包含旁侧BglII位点(下划线)的寡核苷酸引物:有义引物:5′-GAA GAT CTT CAA AAC AAA ATG GCA GTG TGG
CTG TCT AC-3′反义引物:5′-GAA GAT CTT TAT TAA GTA CGT CTC TTG CGT TTA
G-3′
有义引物将酵母非翻译前导序列紧接着的CRPV L1起始蛋白酸密码子(粗印体强调)上游引入。1.6kb L1 PCR产物用Bgl II消化,凝胶纯化并亚克隆克载体pSP72(Promega)的BglII位点,得到质粒pBP72-CRPV-L1(p12930-314-4-1)。
对一个亚克隆进行完全的序列测定,发现与公开的CRPV L1序列有4个核苷酸不同。这一变化不导致氨基酸的变化。从pSP72-CRPV-L1中切割L1基因作为Bgl II片段并亚克隆到位于酵母表达载体中酵母GAL 10启动子和ADH 1转录终止子之间的独特的BamHI位点,所述酵母表达载体包含来自YEp52(Broach等,Exp.Manipulation ofGene Expression(基因表达的实验操作),1983,83:81-116)的GAL 10启动子和相同载体骨架中的转录终止子。所得质粒指定为p12930-323-6-1。实施例19构建CRPV L2表达载体
质粒pLA II用Sal I消化,凝胶纯化7.9kb片段并与其自身连接后,通过PCR技术,使用Vent聚合酶(New England Biolabs,Inc.)从质粒pLA II扩增CRPV L2基因。进行35次循环扩增(90℃,1分钟;50℃,1分钟;72℃,2分钟),并使用包含旁侧EcoRI位点(下划线)的寡核苷酸引物:有义引物:5′-GGA ATT CAC AAA ACA AAA TGG TTG CAC GGT
CAC GAA AAC-3′反义引物:5′-GGA ATT CTT ATT CTG CGT AGA CAG CCA CAC TG
-3′
有义引物引入酵母非翻译前导序列紧接着的CRPV L2起始蛋氨酸密码子(粗印体强调)的上游。1.5kb PCR产物用EcoRI消化,凝胶纯化,并亚克隆到包含趋异进化酵母GAL 1/GAL 10启动子的双向启动子载体pUC 18-GAL 1p-GAL 10p的EcoRI位点。该载体包含位于GAL 1启动子和ADH 1转录终止子第一拷贝之间的独特的BamHI位点,独特的EcoRI和Sma I位点位于GAL 10启动子和ADH 1转录终止子的第二拷贝之间。所得表达弹夹载于1.4kb Sph I片段上。包含紧邻GAL 10启动子的所期望的L1插入物的一个克隆(p12930-295-2-2)进行完全序列测定,并显示出包含与公开的序列不同的6个核苷酸变化,其中4个导致氨基酸变化。起点模板DNA的序列分析证明这些变化也存在于pLA II,且不是由PCR引入的。用Sph I切割包含L2基因的pUC 18-GAL 1p-GAL 10p载体,具有ADH 1t-GAL 1p-GAL 10p-L2-ADH 1t表达弹夹的2.9kb片段与酵母穿梭载体的大Sph I片段连接。所得质粒指定为p12930-323-2-3。实施例20在酵母中表达CRPV L1和L2衣壳蛋白
质粒p12930-323-6-1和p12930-323-2-3用来转化啤酒酵母菌株#1569、#1538、BJ5462〔EW.Jones,《(酶学方法》(Methods in Enzymology 194(1991)428-453〕和BJ 1995〔Jones,出处同上〕。克隆分离物在30℃在含有2%半乳糖的YEHD培养基中生长48-72小时。收获细胞后,用玻璃珠破碎细胞沉淀,加入Triton X-100至0.5%终浓度,通过免疫印迹分析对所得细胞溶质评估CRPV L1和L2表达。含有40μg总细胞蛋白的样品在还原和变性的条件下在12%Tris-Glycin凝胶(Novex)上进行电泳,并在PVDF膜(Novex)上电印迹。用多克隆兔抗-L1或抗-L2抗血清(由Hershey医药中心的John Kreider博士馈赠)作为第一抗体,与辣根过氧化物酶偶联的蛋白质A(Amersham,Inc.)作为第二抗体,检测CRPV L1和L2蛋白。用化学发光ECLTM检测药盒(Amersham,Inc.)处理膜。在所有具有L1表达质粒的样品中检测到了一条55-61kDa L1蛋白带,而在所有来自具有L2表达质粒的酵母克隆的样品中检测到了一条~90kDaL2蛋白带。
用抗L2抗血清在来自具有L1表达质粒的酵母克隆的样品中检测不到信号,反之亦然(图6)。
以这些表达结果为基础,挑选下面的重组酵母菌株进一步研究:菌株#1582,其是包含质粒p12930-323-6-1的宿主菌株#1569;和菌株#1583,其是包含p12930-323-2-3质粒的宿主菌株#1538。实施例21A.纯化重组CRPV L1衣壳蛋白
将在-70℃下贮存的菌株#1582细胞解冻,悬浮于等体积的Breaking缓冲液(20mM磷酸钠,pH 7.2,100mM NaCl,1.7mMEDTA)。向浆液中加入蛋白酶抑制剂PMSF和胃酶抑制剂A,分别达到2mM和1.7μM终浓度。通过微液化器中的10个通道裂解细胞。通过以5000×g离心10分钟澄清裂解液。上清液加到L1缓冲液45%蔗糖(w/v)的5cm垫层的顶端,以100000×g离心4小时沉淀L1。沉淀小丸再悬浮于1/10th体积的L1缓冲液中。再悬浮的沉淀通过以5000×g离心10分钟而澄清。向上清液中加入Tween-80至0.01%终浓度。室温下通过大小排阻层析在Sephacryl S-1000树脂(Pharmacia)的1700ml柱(5cm ID)上将上清分级。用于该柱的洗脱缓冲液是10mM磷酸钠,pH 7.2,150mM NaCl,0.01%Tween-80。集中经免疫打点印迹分析含有免疫反应性物质的级分,用带有76mm直径的YM-100平片膜(100000MW CO)的Amicon搅拌池通过超滤将集中样品浓缩1/6th体积。产物通过Millex-GV 0.22μm膜(Millipore)无菌过滤。B.重组CRPV L1衣壳蛋白的表征
通过Westem印迹并通过N-末端序列分析证明终产物的特征。通过考马斯和银染SDS/PAGE,并通过溶液筛分毛细管电泳(SSCE),在215nm处光学检测测定纯度。L1经SSCE测定纯度是75%。电子显微分析表明存在50-55nm直径大小范围的VLP。C.进行分子排阻HPLC分析
为测定VLP’s,样品根据大小通过分子排阻层析分级。用带有装备有200微升注射针头的ISS 100自动注射器的Perkin-Elmer Series410 Biopump HPLC进行层析。柱子是TSK-凝胶G 5000 PW,7.5×600mm(TOSOHAA S,Montyonmeryville,PA)。为了监测蛋白质自柱上洗脱,用Perkin-Elmer LC-235二极阵列检测器在280nm进行光学检测。流动相是10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)中的0.5MNaCl。流速是0.5mL/分钟,收集1毫升级分。用来自Sigma的蛋白标准物以及重组乙肝表达抗原(RecombivaxTM,Merck & Co.,WestPoint,PA)进行柱校正。通过免疫打点印迹分析进行对洗脱过程中收集的级分中的抗原的检测。D.免疫打点印迹分析
将每一级分中的10微升样品应用到PCDF膜(Immobilon-P,Millipore Corp.,Bedford,MA)的横带上,所述膜被预先润湿并置于弄湿的印迹纸上。使样品吸收到膜中,将该膜置于溶解于阻断溶液(0.15MNaCl,0.02%(w/v)叠氮化钠,和0.01M磷酸钠,pH7.2的5%(w/v)脱脂奶粉溶液),室温下柔和搅拌孵育至少3小时。倾析出阻断溶液并代之以第一抗体溶液。
所使用的第一抗体根据要检测的抗原而不同:
用兔抗-CRPV血清“晚期应答”(Biodesign International,Kennebunk,ME)探测CRPV L1。用兔抗-CRPV L2血清探测CRPVL2。用单克隆抗体MAB 837(Chemicon International,Inc.,Temecula,CA)探测HPV 6a L1。用小鼠抗-HPV 6a L2-trp E融合血清探测HPV6a L2。
通过标准方法使用与碱性磷酸酶缀合的第二抗体和显色底物NBT/BCIP使免疫配合物显色。E.自重组CRPV L1衣壳蛋白制备疫苗
以100μg/ml的浓度将纯化的CRPV L1衣壳蛋白吸附到Al(OH)3。实施例22纯化重组CRPV L1衣壳蛋白-方案2
除特别说明外,所有步骤在4℃下进行。
将在-70℃下贮存的菌株#1582细胞解冻悬浮于等体积的破碎缓冲液(20mM磷酸钠,pH7.2,100mM NaCl,1.7mM EDTA)。向浆液中加入蛋白酶抑制剂PMSF和胃酶抑制剂A,分别达2mM和1.7μM终浓度。用BioNeb细胞破裂系统(Glas-Col Apparatus Co.,Terra Haute,IN)裂解细胞。裂解液以5000×g离心10分钟以澄清。
上清液加到L1缓冲液中45%蔗糖(w/v)的5cm垫层上端,L1以100000×g离心4小时而沉淀。沉淀物再悬浮于1/10th体积的L1缓冲液中。重悬浮的沉淀以5000×g离心10分钟澄清。
上清液用PBS稀释1∶5。通过在Sorvall SA-600转子上以6500rpm在4℃离心10分钟而再澄清。上清通过0.22微米针筒式滤器过滤,并通过阴离子交换层析分级。
用带有ml注射针头的Perkin-Elmer系列410 Biopump HPLC进行阴离子交换层析。层析基质是150mm×10mm ID玻璃柱中的Fractoeel EMF TMAE-650(S)25-40微米树脂(EMSeparations,Gibbstown,NJ)。为监测蛋白质自柱洗脱,用Perkin-ElmerLC-235二极阵列检测器在280nm进行光学检测。柱子用0.15M、0.01M磷酸钠缓冲液(pH7.2)(缓冲液A)中的NaCl预平衡。柱子流速0.75ml/分钟。将样品装上柱,柱子用缓冲液A冲洗以去除未结合物质。结合物质用氯化钠线性浓度梯度自0.15M至0.65M洗脱5分钟,接着用0.65M至1.15M线性梯度洗脱30分钟。通过免疫打点印迹分析进行对洗脱过程中收集的级分中的抗原的检测。集中含有免疫反应性物质的级分(即在0.81M和1.05M NaCl之间洗脱的级分)。
在Macrosep离心浓缩装置(Filtron Technology Corp.,Northborugh,MA)中将集中的级分浓缩至1/5th体积。
通过分子排阻层析用87cm×27cm ID柱中的Sephacryl S-1000SF树脂(Pharmacia,Piscataeay,NJ)将浓缩物分级。以2.5ml/分钟流速洗脱柱子。用280nm监测蛋白质的洗脱。用免疫印迹检测抗原。
集中含有免疫反应性物质的级分,并用带有43mm直径YM-100平片膜(Amicon,Inc.,Beverly,MA)的搅拌池(Amicon,Inc.,Beverly,MA)在10psi压力氮气下超滤浓缩。
通过用考马斯染色的SDS/PAGE,并通过溶液筛分毛细管电泳(SSCE)表征终产物。通过SSCE分析由方案2得到的终产物纯度88%。实施例23A.纯化重组CRPV L1衣壳蛋白-方案3(图17)
除具体说明外所有步骤在4℃下进行。
将于-70℃下贮存的菌株#1582细胞解冻,并悬浮于等体积的破碎缓冲液(20mM磷酸钠,pH7.2,100mM NaCl,1.7mM EDTA)中。向浆液中加入蛋白酶抑制剂PMSF和胃酶抑制剂A,分别达到2mM和1.7mM终浓度。用BioNeb细胞破碎系统(Glas-Col Apparatus Co.,Terra Haute,IN)裂解细胞。裂解液以5000×g离心10分钟澄清。
上清液加到L1缓冲液中45%蔗糖(w/v)的5cm垫层之上,以100000×g离心4小时使L1沉淀。沉淀小丸再悬浮于1/10th体积的L1缓冲液中。再悬浮的沉淀以5000×g离心10分钟而澄清。
上清用1/2体积氯仿提取,取出含水层并以12000rpm在Beckman微管中在室温下离心5分钟而澄清。
用PBS将上清稀释至1∶5。在Sorvall SA-600转子中以6500rpm在4℃离心10分钟而再澄清。上清通过0.22微米针筒式滤器过滤,并通过阴离子交换层析分离。
用带有5ml注射针头的Perkin-Elmer系列410 Biopump HPLC进行阴离子交换层析。层析基质是150mm×10mm ID玻璃柱中的Fractogel EMF TMAE-650(S)25-40微米树脂(EMSeparations,Gibbstown,NJ)。为了监测蛋白质自柱上洗脱,用Perkin-Elmer LC-235二极阵列检测器在280nm进行光学检测。柱子用0.01M磷酸钠缓冲液,pH 7.2(缓冲液A)中的0.15M NaCl预平衡。柱子以0.75ml/分钟的流速洗脱。将样品装载上柱,用缓冲液A冲洗柱子以去除未结合的物质。结合的物质用NaCl线性浓度梯度自0.15M至0.65M洗脱5分钟,接着以0.65M至1.15M线性梯度洗脱30分钟。通过免疫打点印迹分析进行对洗脱过程中收集的级分中抗原的检测,集中包含免疫反应性物质(即在0.01和1.05M NaCl之间洗脱的级分)的级分。
集中的级分在Macrosep离心浓缩装置中(Filtron TechnologyCorp.,Northborough,MA)浓缩至1/5th体积。
通过离子排阻层析用87cm×27mm ID柱中的Sephacryl S-1000SF树脂(Pharmacia,Pisvataway,NJ)将浓缩物分级。柱子以2.5ml/分钟的流速洗脱。用A280nm监测蛋白质的洗脱。免疫印迹检测抗原。
集中含有免疫反应性的物质的级分,并用带有43mm直径YM-100平片膜(Amicon,Inc.,Beverly,MA)的搅拌池(Amicon,Inc.,Beverly,MA)在10psi压力氮气下超滤浓缩。
通过考马斯染色SDS/PAGE,并通过溶液筛分毛细管电泳(SSCE)表征终产物。SSCE测定方案3的终产物纯度为95%。溶液筛分毛细管电泳(SSCE)
在100℃在1%2-巯基乙醇和1%(w/v)SDS中将样品CRPVVLP(~0.2mg/ml)加热15分钟。样品与参照标记,苯六甲酸一起电动加入到用10腔体积0.1N NaOH,水和Prosort筛分试剂(ApplideBiosystems,Foster City,CA)预平衡的硅石融合毛细管,42cm(22cm至监测器)×0.05mm I.D.中。使用Applied Biosystems Model 270A-HT CE仪器施加300伏/cm分离电压。以在215nm的吸收值监测洗脱样品,用Nelson Turbochrom3软件采集数据。实施例24通过用酵母衍生物CRPV L1 VLPS接种引起的保护免受乳头状瘤发展的作用
5只新西兰白兔用吸附于矾的135μg L1 VLPs(75%纯)的肌内免疫,或者用吸附于氢氧化铝的100μg重组乙肝表面抗原(99%纯)肌内免疫作为阴性对照。在最后一次加强免疫后十天用CRPV攻击之前,动物在8周内得到了两次以上的加强免疫。在免疫前,每一次加强时,和在攻击之前采取血清用L1特异性ELISA分析。用酵母衍生的CRPV-L1或CRPV-L2的裂解粗产物5μg包被96孔平板。去除蛋白质,平板在4℃在10%干乳(Carnation)+TTBS(20mM Tris-HCl pH7.4,50mM NaCl,0.1%Tween)中阻断2小时。用TTBS冲洗平板后,在1%乳+TTBS中加入稀释的兔血清并在4℃孵育2小时。平板用TTBS冲洗并和以1%乳+TTBS中1∶1000稀释的抗兔IgG-碱性磷酸酶(Kirbegaard和Perry Lads,Inc,)一起在4℃孵育2小时。平板用TTBS冲洗并通过加入磷酸对硝基苯酯(Krikegaard和Perry Lads.,Inc.)发展。通过加入5%EDTA使反应停止,在405nm测定吸收值。如果L1/L2吸收值之比是2∶1的话则效价被认为是阳性的。
第一次注射后-L搞抗体滴度存在4星期,每次附加的加强免疫其滴度都增加。对照动物是阴性的。CRPV攻击后六周接种动物15处都没有疣(1∶2稀释的或1∶12稀释的病毒原种),而对照动物显示15处中的12处(1∶2稀释的病毒)或15处的9处(1∶12稀释的病毒)生成疣。15星期后,接种的动物仍未长疣。
基本上根据Christensen等,1991年《病毒学》(Virology)181:572-579的方法,通过将兔血清与CRPV混合,并接着用处理的CRPV攻击兔而进行病毒中和测定。测定中和抗体的标准是完全的病毒中和作用(处于疣生成来说3/3处显阴性)。分析了来自5个接种动物和5个对照动物的血清。1剂量CRPV L1 VLPs后采集的血清在80%的兔子中(4/5)含有其完全中和了未稀释病毒的抗体。2或3剂量CRPV L1VLPs后,100%的兔子(5/5)具有病毒中和抗体。对照血清不显示任何病毒中和活性。根据滴度,所选择接种动物的血清应稀释10-1000倍之间,且仍100%中和。实施例25构建用于来自单一质粒的CRPV L1/L2共表达的载体
质粒pSP72-CRPV-L1(p12930-314-4-1)用Bgl II消化,具有带酵母5′-非翻译前导序列的CRPV L1 ORF的1.5kbp BglII片段被凝胶纯化。质粒p12930-323-2-3用在GAL 1启动子与ADH 1转录终止子之间切割的BamHI消化。线性载体片段被凝胶纯化,然后与上面提到的CRPV-L1 BglII片段连接,得到质粒p12930-366-1-2。所得质粒包含GAL 1启动子调控下的CRPV-L1 ORF和GAL 10启动子调控下的CRPV-L2 ORF。实施例26构建用于来自两个质粒的CRPV L1/L2共表达的载体
包含L2基因的pUC 18-GAL 1p-GAL 10p载体用Sph I切割,具有ADH 1t-GAL 1p-GAL 10p-L2-ADH 1t表达盒的2.9kb片段被凝胶纯化并用T4 DNA聚合酶处理平整末端。酵母穿梭载体YEp24〕Botstein等,《基因》(Gene)8∶17(1979)〕用BamHI消化,用T4 DNA聚合酶处理平整末端,用牛肠碱性磷酸酶去磷酸化后与上述末端平整过的L2表达盒连接,得到质粒p1594。实施例27CRPV L1和L2在酵母中共表达
质粒p12930-366-1-2(pC1/1-GAL 1/10p-CRPV/L1+L2)用来转化啤酒酵母菌株#1569和BJ5462(一个质粒体系)。在亮氨酸减少合成琼脂培养基上挑选所得的转化物。在一平行实验中,菌株#1 592用CRPV-L1表达载体p12930-323-6-1;加YEp24-GAL 10p-L2表达载体p1594(两个质粒体系)共转化,在没有亮氨酸和尿嘧啶的合成琼脂培养基上挑选包含两个载体的所得转化物。一个质粒体系和两个质粒体系的克隆分离物在30℃在含有2%半乳糖的YEHD复合培养基中生成48-72小时。收获细胞后,用玻璃珠破碎细胞沉淀。加入Triton X-100达0.5%终浓度,并通过免疫印迹分析分析细胞裂解物的CRPV L1和L2的表达。含有50μg总细胞蛋白质的样品在还原和变性条件下在8-16%Tris-Glycin梯度凝胶(Novex)上电泳,并电印迹到PVDF膜(Novex)上。用多克隆兔抗-L1或抗-L2抗血清(由Hershey Medical Center的John Kreider博士惠赠)作为第一抗体,与辣根过氧化物酶偶联的蛋白质A(Amersham,Inc.)作为第二抗体来检测CRPV L1和L2蛋白。膜用化学发光ECLTM检测药盒(Amersham,Inc.)处理。在所有来自拥有L1+L2表达质粒的酵母克隆的所有样品中检测到了一条55-61kDa L1蛋白质带和一条~90kDaL2蛋白质带。在自拥有L1表达质粒的酵母克隆衍生的样品中没有到L2信号(图6)在来自只包含L2表达载体的细胞的样品中没有检测到L1信号。实施例28纯化CRPV L1和CRPV L1+L2 VLPs用于EM研究
酵母表达的CRPV L1和CRPV L1和L2蛋白被部分纯化并浓缩用于电子显微镜研究(EM)。用被L1+L2共表达载体p12930-366-1-2转化的S.cerevisiae菌株#1569或BJ5462接种含有2%半乳糖的1至1.5升YEHD培养基,并在30℃生长48-72小时。在一平行实验中,和CRPV-L1表达载体p12930-323-6-1加YEp24-GAL10p-L2质粒p1594共转化的菌株#1569细胞在相同方式下生长。收获细胞,且细胞沉淀物在-70℃下冷冻。所有下面的步骤在4℃下进行。将细胞沉淀物解冻,并悬浮于等体积的“L1缓冲液”(20mM磷酸钠,pH7.2,100mM NaCl,1.7mM EDTA)。向浆液中加入蛋白抑制剂PMSF和胃酶抑制剂A,分别达到2μM和1.7μM终浓度。细胞通过微液化器中3-5道裂解。裂解液以5000×g离心10分钟而澄清。将上清液加到L1缓冲液中45%(v/v)蔗糖的5cm垫层的上部,L1,L2或L1和L2蛋白以100000×g离心4小时沉淀。将沉淀物重悬浮于1/10th体积的L1缓冲液中。重悬浮的沉淀以5000×g离心10分钟澄清。
对于EM分析(Structure Probe,West Chester,PA),每一样品的一小份被置于200目碳包被的铜载网上。一滴2%磷钨酸(PTA),pH 7.0加到载网上20秒钟。在TEM检验之前使载网空气风干。所有显微镜检查法用JEOL 100CX透射电子显微镜(JEOL USA,Inc.)以100KV加速电压进行。产生的显微图最终放大倍数是100000X。
在包含CRPV L1表达质粒或用于CRPV L1和L2共表达质粒的所有酵母样品中,发现VLPs≤25nm直径大小范围。在酵母对照样品中或在只拥有L2表达质粒的酵母样品中没有发现VLP。实施例29在滋养复合且化学确定的培养基中表达CRPV L1(菌株1582)和HPV型6a L1(菌株1644)
这些菌株的种苗在如上所述的无亮氨酸的合成培养基上生长,以转移到摇荡烧瓶培养物中。所用摇荡烧瓶有隔板以获得高通气容量(每300ml烧瓶有70mL液体,Tunair Labware),且培养基补加有大约0.5mL/L的消泡剂(UCON LB-625,Union Carbide)。滋养复合培养基含有(每升):40g Difco酵母提取液;20g Sheffield HySoy胨;30g葡萄糖;50g半乳糖;灭菌前将培养基调至pH 5.3。所用的化学确定的培养基与Oura(《生物技术与生物工程》(BiotechnolBioenyineer)16:1197-1212,1974)所描述的相同,但补加有(每升):0.1g胆碱Cl;0.4g腺嘌呤;30g谷氨酸-钠盐为氮源;0.2g尿嘧啶;20g葡萄糖;40g半乳糖。用3mL种菌接种烧瓶,并以250rpm在旋转摇荡器上在28℃孵育66小时。在不同时间间隔从烧瓶中取样通过免疫印迹用抗-CRPV L1和抗HPV 6a L1抗血清来证实表达作用。实施例30克隆HPV6 L1和L2基因
通过标准技术(Sambrook等,上文)从Caski细胞(ATCC #CRL1550)中提取总基因组DNA。DNA用Bstl 107I和SphI核酸内切酶消化,并通过0.8%低熔点温度琼脂糖制备凝胶电泳。从凝胶上切下对应于~3.5kbp DNA的区,琼脂糖用GelaseTM酶(Epicentre Technologies,Inc.)消化。凝胶纯化的DNA用T4 DNA聚合酶平整末端,并包含包埋的Hind III位点的末端平整的,磷酸化的寡脱氧核苷酸接头连接。连接的混合物用Hind III消化至完全,~3.5kbp DNA通过如上所述的琼脂糖凝胶进行大小分级。凝胶纯化的DNA与已被被Hind III消化并去磷酸化的pUC 18质粒DNA连接。活性大肠杆菌DH5细胞(BRL)转化后,通过菌落杂交用与HPV-16 L1基因(5′-GAG AGA TCT TAC AGCTTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3′)的3′终端互补的反义32P标记的寡脱氧核苷酸从质粒库中筛选HPV 16-阳性克隆。分离包含3.3-kbpHPV 16基因组片段的pUC 18质粒并通过限制酶和Southern印迹分析表征。该质粒指定为pUC 18-HPV 16 L1/L2,且包含所有L1和L2编码DNA序列,用QiagenTM Plasmid Maxi药盒(Qiagen,Inc.)制备质粒DNA。实施例31构建HPV 16 L1酵母表达载体
用克隆pUC18-HPV 16 L1/L2作为PCR模板。通过PCR扩增HPV16 L1基因,使用Vent聚合酶(New England Biolads,Inc.),10次循环扩增(94℃,1分钟;48℃,1分钟;72℃,1分钟45秒),且使用包含旁侧BglII位点(下划线)的如下的寡脱氧核苷酸引物:有义引物:5′-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT CTC TTT
GGC TGC CTA TGT AGG CC-3′反义引物:5′-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA
GC-3′
有义引物引入酵母非翻译前导序列紧接着的HPV 16 L1起始蛋氨酸密码子(粗印体强调部分)的上游。1.5kbp L1 PCR产物用Bgl II消化,凝胶纯化,并与BamHI消化的pGAL 10载体连接。分离包含HPV 16L1基因的pGAL 10并指定为p14049-37-1。用PRISMTM药盒(ABI,Inc.)和ABI序列测定仪#373A型,根据厂商说明,对p14049-37-1中的L1基因测序。分离物中的L1基因显示包含3个相对于正确的公开的原型序列(Kirbbauer,R.等(1 993)J.Virol.67:6929-6936)的核苷酸变化,导致两个氨基酸变化:His-202变为Asp;Thr-266变为Ala。原始模板DNA的序列分析证明这些变化也存在于基因组克隆pUC 18-HPV 16 L1/L2,且不是由PCR引入的。实施例32构建HPV 16 L1和L2酵母表达载体
质粒p14049-37-1用Sma I消化,Sma I在GAL 10启动子和ADH1转录终止子之间切割。通过PCR扩增1.4-kbp HPV 16 L2基因,使用pUC 18-HPV 16 L1/L2 DNA为模板,使用Vent聚合酶(NewEngland Biolads,Inc.),进行10次循环扩增(94℃,1分钟;48℃,1分钟;72℃,1分钟45秒),并使用下面的包含旁侧SmaI位点(下划线)的寡脱氧核苷酸引物:有义引物:5′-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC GAC ACA
AAC GTT CTG CAA AAC-3′反义引物:5′-TCC CCC GGG CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC
TGA-3′
有义引物引入酵母非翻译前导序列紧接着的HPV 16 L2起始蛋氨酸密码子(粗印体强调部分)的上游。1.4-kbp L2 PCR产物用Sma I消化,凝胶纯化,并与Sma I消化的p14049-37~1载体连接。分离包含HPV 16 L1和L2基因两者的pLS 110质粒并指定为p14049-42-2。p1 4049-42-2中的L2基因用PRISMTM药盒(ABI,Inc)和ABI测序仪#373A型,根据厂商说明进行序列测定。分离物中L2基因显示包含5个相对于正确的,公开的原型序列(Kirnbauer,R.等(1993)上文)的核苷酸变化,导致一个氨基酸变化:Ser-269变为Pro。基因组克隆pUC 18-HPV 16 L1/L2序列分析证明该变化也存在于原始模板DNA中,且不是由PCR引入的。实施例33A.酵母中HPV 16 L1的表达和HPV 16 L1和L2的共表达
质粒p14049-37-1和p14049-42-2用来转化啤酒酵母菌株#1558。所得重组菌株是表中所示的#1678(HPV 16-L1)和#1679(HPV 16 L1+L2)。克隆分离物在30℃在含有2%牛乳糖的YEHD培养基中生长68-78小时。收获细胞后,用玻璃珠破碎细胞沉淀物,且通过免疫印迹分析分析细胞裂解物的HPV 16 L1或HPV 16 L2蛋白的表达。含有40mcg总细胞蛋白的样品在还原和变性条件下在10%Tris-Glycine凝胶上电泳,并电印迹到硝基纤维素滤膜上。用抗trp E-HPV11 L1融合蛋白的兔多克隆抗血清(D.Brown等,Virology 201:46-54)作为第一抗体,HRP连接的猴抗兔IgG抗体(Amersham,Inc.)为第二抗体免疫检测HPV 16 L1蛋白。滤膜用化学发光ECLTM检测药盒(Amersham,Inc.)处理。除阴性对照外(没有L1或L2基因的载体对照物)在所有样品中检测到了一条50-55kDa L1蛋白质带。通过免疫印迹用抗在大肠杆菌中表达的trp E-L2融合蛋白的小鼠抗HPV 16 L2血清作为第一抗体检测到L2蛋白质是一条70kDa蛋白质带。山羊抗小鼠HRP连接的IgG(Amersham,Inc.)用作第二抗体,滤膜如上进行处理。B.纯化重组HPV 16型L1+L2衣壳蛋白
除指明的外所有步骤在4℃下进行。
细胞在-70℃下冷冻贮存。冷冻细胞(湿重=27.6g)在20-23℃下解冻,并重新悬浮于40mL“L1缓冲液”(20mM磷酸钠,pH7.2,100mM NaCl,1.7mM EDTA)。加入蛋白酶抑制剂PMSF和胃酶抑制剂A,分别达2mM和1.7mcM终浓度。所有细胞浆液在M110微液化器(Microfluidics Corp.,Newton,MA)通过三个通道以大约8000psi的压力破碎。破碎的细胞浆液以5000×g离心10分钟去除细胞渣片。回收含L1+L2抗原的上清液。
加入缓冲液A(20mM MOPS,pH7.0),以1∶5稀释上清,并施加到在缓冲液A中平衡的FractogelEMD TMAE-650(S)树脂的阴离子交换捕获柱(5.0cm ID×4.8cm)上。用缓冲液A冲洗后,用缓冲液A中0-1.0M NaCl的梯度洗脱抗原。进行免疫打点印迹测定自柱中流出的哪个级分含有L1蛋白。
经免疫打点印迹测定的含有L1蛋白质的级分通过Bradford方法接着是用银染的SDS-PAGE和Westem印迹测定全部的蛋白质。
集中哪些显示出类似纯度且富含L1蛋白的TMAE级分。通过硫酸铵分级浓缩抗原。通过加入固体试剂同时柔和搅拌30分钟将样品调节至48%饱和硫酸铵。将样品置于冰上,沉淀过夜。样品以12000×g离心。沉淀重新悬浮于20.0mL PBS(6.25mM磷酸钠,pH 7.2,150mMNaCl)。
重悬浮的沉淀物在20-23℃下在Sephacryl 500HR树脂的大小排阻柱(2.6cm ID×89cm)上分别进行层析。洗脱液是PBS。用银染SDS-PAGE和Nestern印迹检测分析级分,集中最纯的级分。所得集中液在50mL搅拌池中用43mm YM-100平片膜(Amicon Beverly,MA)以N2压力为4-6psi的压力浓缩。
终产物通过用胶体考马斯染色的SDS-PAGE分析。通过使用合适抗血清的Western印迹分析证明了L1和L2蛋白的同一性。终产物分成小份并在-70℃下贮存。该过程产生总量0.53mg蛋白质。
用Structure Probe(West Chester,PA)进行电子显微镜分析。一小份样品置于200目碳包被铜载网。一滴2%磷钨酸,pH7.0置于载网上20秒。TEM检验之前使载网空气风干。所有显微技术用JEOL 100CX透射电子显微镜(JEOL USA,Inc.)以100kV加速电压进行。产生的显微图具有100000X最终放大倍数。证明存在≤25大小范围内的病毒样颗粒。C.纯化重组HPV 16型L1+L2衣壳蛋白
除标明的外所有步骤在4℃下进行。
细胞在-70℃下冷冻贮存。在20-23℃解冻冷冻的细胞(湿重=92.8g),并再悬浮于105mL“L1缓冲液”(20mM磷酸钠,pH7.2,100mM NaCl,1.7mM EDTA)中。加入蛋白酶抑制剂PMSF和胃酶抑制剂A,分别达2mM和1.7mcM终浓度。通过在M110-Y微液化器(Microfluidics Corp.,Newton,MA)中的三个通道以大约16000psi压力破碎细胞浆液。破碎的细胞浆液以6100×g离心15分钟以去除细胞残渣片。回收含有L1+L2抗原的上清液。
加入缓冲液A(20mM MOPS,pH7.0),以1∶5稀释上清液,并加入到在缓冲液A中平衡的FractogelEMD TMAE-650(S)树脂(EM Separations,Gibbstown,NJ)的阴离子交换捕获柱(5.0cm ID×4.2cm)。用缓冲液A冲洗后,用缓冲液A中0-1.0M NaCl的梯度洗脱抗原。进行免疫打点印迹检测自柱中流出的哪一级分含有L1蛋白。
通过Bradford方法,接着是用银染SDS-PAGE和western印迹对免疫打点印迹确定的含有L1蛋白的级分测定其全部蛋白质。
集中那些显示类似纯度且富含L1蛋白的TMAE级分。通过硫酸铵分级浓缩抗原。通过加入固体试剂并同时柔和搅拌10分钟将样品调至35%饱和硫酸铵。将样品置于冰上,让其沉淀进行4小时。样品以12000×g离心。沉淀再悬浮于20.0mL PBS(6.25mM磷酸钠,pH 7.2,150mMNaCl)中,所述PBS中含有1mM EDTA。
重新悬浮的沉淀物分开地在Sephacryl 500HR树脂(Pharmacia,Piscatanay,NJ)的大小排阻柱(2.6cm ID×89cm)上层析。洗脱液是PBS+1mM EDTA。通过用银染SDS-PAGE和蛋白质印迹检测分析级分,集中最纯的级分。所得集中液用43mm YM-100平片膜(Amicon Beverly,MA)以4-6psi N2压力在50mL搅拌的小池中浓缩。
终产物用胶体考马斯染色SDS-PAGE进行分析。估计L1和L2蛋白质有70%同源性。通过使用合适的抗血清证明了L1和L2蛋白质的同一性。将终产物分成小份并在-70℃下贮存。该过程产生了总量38mg蛋白质。实施例34A.发酵菌株1679(HPV 16型L1+L2)
基本上如上所述进行用于制备冷冻原种培养基,接种,发酵,和菌株1679的细胞回收的过程。培养67小时后,达到每升4.2g干细胞重的细胞密度,回收后得到总量93g湿细胞沉淀物。B.发酵菌株1678(HPV 16型L1)
基本上根据如上所述进行用于制备冷冻原种培养基,接种,发酵,和菌株1678的细胞回收过程。培养70.5小时后,集中两个10升发酵的内容物(每升8.7g干细胞重的细胞密度),其回收后得到总共258g湿细胞沉淀物。C.纯化重组HPV 16型L1衣壳蛋白
除标明的外所有步骤在4℃下进行。
菌株#1678细胞在-70℃下冷冻贮存。冷冻细胞(湿重=128g)在20-23℃解冻,并再悬浮于140mL“改良的L1缓冲液”(20mM磷酸钠,pH7.2,100mM NaCl)中。加入蛋白酶抑制剂和胃酶抑制剂,分别达2mM和1.7mcM终浓度。通过在M110-Y微液化器(Microfluidics Corp.,Newton,MA)中的3个通道以大约16000psi压力将细胞浆液破碎。破碎的浆液以11000×g离心40分钟以去除细胞残渣。回收含有L1抗原的上清液。
加入缓冲液A(20mM MOPS,pH7.0),以1∶5稀释上清液,并加到在缓冲液A中平衡的FractogelEMD TMAE-650(S)树脂的阴离子捕获柱(5.0cm ID×6.4cm)上。用缓冲液A冲洗后,用缓冲液A中0-1.0M NaCl的梯度洗脱抗原。进行免疫打点印迹检测自柱中流出的哪一级分含有L1蛋白。
通过Bradford方法,接着是用银染SDS-PAGE和蛋白质印迹分析免疫打点印迹所确定的含L1蛋白的级的总蛋白。
集中那些显示类似纯度且富含L1蛋白的TMAE级分。通过硫酸铵分级来浓缩抗原。通过加入固体试剂同时柔和搅拌10分钟,将样品调至35%饱和硫酸铵。样品置于冰上使沉淀进行5小时。样品以12000×g离心。沉淀重悬浮于20.0mL PBS(6.25mM磷酸钠,pH7.2,150mMNaCl)中。
重悬浮的沉淀物分开地在Sephacryl 500HR树脂(Pharmacia,Piscatanay,NJ)的大小排阻柱(2.6cm ID×89cm)上层析。洗脱液是PBS。通过用银染SDS-PAGE和蛋白质印迹检测分析级分,收集最纯的级分。所得集中液用43mm YM-100平片膜(Amicon Beverly,MA)以4-6psi N2压力在50mL搅拌的小池中浓缩。
终产物通过使用胶体考马斯染色的SDS-PAGE分析。估计L1蛋白质有70%同源性。通过使用合适的抗血清蛋白质印迹证明了L1的同一性。将终产物分成小份并在-70℃下贮存。该过程产生总共7.4mg蛋白。D.分析方法免疫打点印迹方法
样品以1∶10稀释(如果需要)于Milli-Q-H2O中,并将10mcL样品点滴到Poly ScreenTM PVDF膜(NEN Research Products,Boston,MA)上。斑点干燥后,膜在水中冲洗并使其干燥。第一抗体溶液通过将合适的抗血清稀释于印迹缓冲液(6.25mM磷酸钠,pH7.2,5%脱脂乳,150mM NaCl,0.02%NaN3)中而制备。在20-23℃孵育至少1小时。印迹在三个变化的PBS(6.25mM磷酸钠,pH 7.2,150mMNaCl)中各冲洗1分钟。第二抗体溶液通过将合适的碱性磷酸酶连接的缀合物抗血清于印迹缓冲液中而制备。相同条件下孵育进行至少1小时。象前面一样冲洗印迹,并用1步NBT/BCIP底物(Pierce,Rockford,IL)检测。
抗体如下用于检测:
通过MAB 837(Chemicon Intemational,Inc.,Temecula,CA)测定HPV 6a L1。HPV 6a L2通过小鼠抗-HPVA L2-trp E融合血清集中液#641和647(由M.Rosolowski室内制备)检测。HPV 16 L1通过MAB885(Chemicon International,Inc.,Temecula,CA)检测。HPV 16 L2通过小鼠抗-HPV 16 L2-trp E融合血清集中液#611(由K.Jansen室内制备)检测。用于总蛋白的Bradford测定
由商购Coomassie Plus药盒(Pierce,Rockford,IL)测定总蛋白。样品在Milli-Q-H2O中稀释至合适的水平。标准和微测定方法所需体积分别为0.1mL和1.0mL。对于两种方法,使用BSA(Pierce,Rockford,IL)制备标准曲线。根据厂商说明进行测定。用Cricket Graph软件在Macintosh IIci计算机上描绘标准曲线。SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
所有凝胶,缓冲液,和电泳仪器由Novex(San Diego,CA)获得,并根据厂商说明进行。简要地说,样品在Milli-Q-H2O中稀释至相等蛋白浓度并以1∶1与含有200mM DTT的样品孵育缓冲液混合。样品在100℃孵育15分钟,并加到预制凝胶12%Tris-甘氨酸凝胶上。样品以125V电泳1小时45分钟。通过各种Heukeshoven和Dernick〔《电泳》(Electrophoresis),6(1985)103-112〕或使用商购药盒(Integrated Separation System S,Natick,MA)的胶体考马斯染色的方法的银染法使凝胶展开。对于蛋白质印迹,蛋白质以25V45分钟转移到LVDF膜上。将膜干燥并如免疫打点印迹一样和抗体溶液一起孵育。实施例35制备免疫原组合物
根据已知方法,如通过与药物可接受载体,稳定剂,或疫苗助剂混合而将纯化的VLP’s配制成制剂,本发明免疫原性VLP’s可以通过与生理可接受组合物如,例如PBS,盐水或蒸馏水混合而制备,用于疫苗应用。为了获得所期望的免疫原性效果,免疫原性VLP’s以大约0.1至100mcg,优选大约1至大约20mcg的剂量范围给予。每制剂中的VLP量可以根据多种因素而不同,包括但不限于个体症状,体重,年龄和性别。VLP制剂可以通过各种途径给药,包括但不限于口服,皮下,局部,粘膜和肌内。这种VLP制剂可以由单一类型VLP(即来自HPV 6a的VLP)或VLP的混合物(即来自HPV 6a,HPV 11,HPV 16和HPV 18的VLP)组成。
任意选择地可以含有抗微生物保鲜剂,例如邻乙汞硫基苯酸钠。如果需要,本发明免疫原性抗原可以结合疫苗稳定剂和疫苗助剂使用。典型的稳定剂是特别的化合物,例如聚阴离子如肝素,肌醇六硫酸酯,硫酸化的β-环糊精,少的特别的赋形剂,例如氨基酸,山梨糖醇,甘露糖醇,木糖醇,甘油,蔗糖,葡萄糖,海藻糖,和改变溶液条件,例如中性pH,高离子强度(大约0.5~2.0M的盐),二价阳离子(Ca2+,Mg2+)。助剂的例子是Al(OH)3和Al(PO4)。本发明疫苗可以以冷冻或冻干形式下贮存。实施例36制备VLP的抗体
纯化的VLP被用来产生抗体。这里所用的术语“抗体”包括单克隆和多克隆抗体两者以及其片段,如Fv,Fab和F(ab)2片段,这些片段能结合抗原或半抗原。抗体以多种方式被使用,包括但不限于重组VLP的纯化,天然L1或L2蛋白的纯化,和药盒。药盒应该包含适于至少在一个容器中保持密封的间隔化的载体。该载体应该进一步包括适于检测HPV或HPV片段或HPV抗体的试剂如抗VLP抗体或VLP。载体也可以含有检测的手段如标记的抗原和酶底物等等。抗体,或VLP或药盒用于各种目的,包括但不限于荧光分析和流行病学研究。实施例37纯化重组HPV 11型L1衣壳蛋白
除标明的外所有步骤在4℃下进行。
细胞在-70℃冷冻贮存。冷冻细胞(湿重=180g)在20-23℃解冻,并再悬浮于900mL“破碎缓冲液”(50mM MOPS,pH7.2,500mM NaCl,1mM CaCl2)中。加入蛋白酶抑制剂AEBSF和胃酶抑制剂A,分别达1mM和1.7μM终浓度。细胞浆液通过在M110-Y微液化器(Microfluidics Corp.,Newton,MA)中的4个通道以大约16000psi压力破碎。向破碎的细胞浆液中加入足够体积的10%TritonX100去污剂(Pierce,Rockford,IL)使TX 100浓度达0.5%。将浆液搅拌20小时。用Triton X100处理过的裂解液以12000×g离心40分钟以去除细胞残渣。回收含有L1蛋白质的上清液。
用300K弦切流动膜盒(Filtron,Northborough,MA)将上清液用5体积20mM磷酸钠,pH7.2,0.5M NaCl透析。由膜截留的物质经放射免疫测定和蛋白质印迹分析表明含有L1蛋白。
将保留物加到在20mM磷酸钠,pH7.2,0.5M NaCl中平衡的SPSpherodex(M)树脂(IBF,Villeneuve-la-Garenne,法国)的高分辨亲和柱(11.0cm ID×5.3cm)上。用平衡缓冲液冲洗后,用20mM磷酸钠,pH7.2,1.0M NaCl冲洗,用20mM磷酸钠,pH7.2,2.5MNaCl冲洗步骤洗脱出L1蛋白。在冲洗和洗脱过程中收集级分。用Bradford法测定柱级分的总蛋白。然后用蛋白质印迹和用胶体考马斯检测SDS-PAGE分析级分,也用放射免疫分析分析级分。
集中显示类似纯度且富含L1蛋白的SP Spherodex级分。
终产物用蛋白质印迹和用胶体考马斯检测的SDS-PAGE分析。估计L1蛋白质有≥90%同源性。蛋白质印迹证明了L1蛋白的同一性。终产物通过0.22μm膜灭菌过滤,并4℃下贮存。该过程得到总共100mg蛋白。
用结构探针(Structure Probe)(West Chester,PA)进行电子显微分析。一小份样品置于200目碳包被铜载网上,一滴20%磷钨酸, pH7.0置于载网上20秒。在TEM检测前空气风干载网。所有显微技术用JEOL 100Q透射电子显微镜(JEOL USA,Inc.)以加速电压100kV进行。得到的显微图最终放大倍数是100 000X。用于总蛋白的Bradford测定
用商购Coomassie Plus药盒(Pierce,Rockford,IL)检测总蛋白。样品在Milli-Q-H2O中稀释到适当水平。标准和微测定方法分别需要0.1mL和1.0mL体积。在两种方案中,用BSA(Pierce,Rockford,IL)制备标准曲线。根据厂商说明进行测定。用CricketGraph软件在Macintosh IIci计算机上绘制标准曲线。SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
所有凝胶,缓冲液,和电泳仪器由Novex(San Diego,CA)获得,并根据厂商说明进行。简要地说,样品在Milli-Q-H2O中稀释至相等蛋白浓度并以1∶1与含有200mM DTT的样品孵育缓冲液混合。样品在100℃孵育15分钟,并加到预制凝胶12%Tris-甘氨酸凝胶上。样品以125V电泳1小时45分钟。通过使用商购药盒(IntegratedSepcaration Systems,Natock,MA)的胶体考马斯染色显色凝胶。
对于蛋白质印迹,以25V40分钟将蛋白质转移到PVDF膜上。膜用Milli-Q-H2O冲洗并空气风干。第一抗体是抗Trp E HPV 11 L1融合蛋白的多克隆兔抗血清(由D.Brown博士惠赠)。抗体溶液通过将抗血清稀释于印迹缓冲液(6.25mM磷酸钠,pH 7.2中的5%脱脂乳,150mM NaCl,0.02%NaN3)而制备。孵育在20-23℃至少进行1小时。印迹在三个变化的PBS(6.25mM磷酸钠,pH7.2,150mMNaCl)中各冲洗1分钟。第二抗体溶液通过将山羊抗-兔IgG碱性磷酸酶连接的缀合物抗血清(Pierce,Rockford,IL)稀释在印迹缓冲液中而制备。在相同条件下孵育至少1小时。如前所述冲洗印迹并用一步NBT/BCIP底物(Pierce,Rockford,IL)检测。实施例38纯化重组HPV 6a型L1衣壳蛋白
除标明的外所有步骤在4℃下进行。
细胞在-70℃冷冻贮存。冷冻细胞(湿重=60g)在45℃水浴中解冻,并再悬浮于300mL“破碎”缓冲液(50mM MOPS,pH 7.2,500mM NaCl,1mM CaCl2)中。加入蛋白酶抑制剂AEBSF和胃酶抑制剂A,分别至1mM和1.7μM终浓度。细胞浆液通过在M110-Y微液化器(Microfluidics Corp.,Newton,MA)中的5个通道以大约16000psi压力破碎。向破碎的细胞浆液中加入足够体积的10%TritonX100去污剂(Pierce,Rockford,IL)使TX 100浓度达0.5%。将浆液搅拌20小时。用Triton X100处理过的裂解液以12000×g离心40分钟以去除细胞残渣。回收含有L1蛋白质的上清液。
用300K切向流膜盒(Filtron,Northborough,MA)将上清液用5体积20mM磷酸钠,pH7.2,0.5M NaCl透析。由膜截留的物质经放射免疫测定和蛋白质印迹分析表明含有≥90%L1蛋白原量。
将保留物加到在20mM磷酸钠,pH7.2,0.5M NaCl中平衡的POROS5OHS树脂(PerseptiVe Biosystems,Cambridge,MA)的高分辨亲和柱(5.0cm ID×10.0cm)上。用平衡缓冲液冲洗后,用20mM磷酸钠,pH7.2,中的0.5-1.5M NaCl线性梯度冲洗L1蛋白,在冲洗和洗脱过程中收集级分。用Bradford法测定柱级分的总蛋白。然后用蛋白质印迹和用胶体考马斯检测SDS-PAGE分析级分,也用放射免疫分析分析级分。
集中显示类似纯度且富含L1蛋白的柱级分。集中的级分通过0.22μm膜灭菌过滤。产物用43mm YM-100平片膜(Amicon Beverly,MA)以4-6psi N2压力在50mL搅拌池中浓缩。产物在4℃下贮存。该过程产生总共2.7mg蛋白。
终产物样品通过TCA沉淀进一步浓缩,通过蛋白质印迹和用胶体考马斯检测SDS-PAGE分析,通过胶体考马斯染色凝胶的光密度显示L1蛋白质为≥90%同源性。通过蛋白质印迹证明L1蛋白的同一性。
用结构探针(Structure Probe)(West Chester,PA)进行电子显微分析。一小份样品置于200目碳包被铜载网上,一滴20%磷钨酸,pH7.0置于载网上20秒。在TEM检测前空气风干载网。所有显微技术用JEOL 100CX透射电子显微镜(JEOL USA,Inc.)以加速电压100kV进行。得到的显微图最终放大倍数是100000X。用于总蛋白的Bradford测定
用商购Coomassie Plus药盒(Pierce,Rockford,IL)检测总蛋白。样品在Milli-Q-H2O中稀释到适当水平。标准和微测定方法分别需要0.1mL和1.0mL体积。在两种方案中,用BSA(Pierce,Rockford,IL)制备标准曲线。根据厂商说明进行测定。用CricketGraph软件在Macintosh IIci计算机上绘制标准曲线。SDS-PAGE和蛋白质印迹分析
所有凝胶,缓冲液,和电泳仪器由Novex(San Diego,CA)获得,并根据厂商说明进行。简要地说,样品在Milli-Q-H2O中稀释至相等蛋白浓度并以1∶1与含有200mM DTT的样品孵育缓冲液混合。样品在100℃孵育15分钟,并加到预制凝胶12%Tris-甘氨酸凝胶上。样品以125V电泳1小时45分钟。通过使用商购药盒(IntegratedSepcaration Systems,Natock,MA)的胶体考马斯染色展开凝胶。
对于蛋白质印迹,以25V40分钟将蛋白质转移到PVDF膜上。膜用Milli-Q-H2O冲洗并空气风干。第一抗体是抗MAB 837(ChemiconInternational,Inc.,Temecula,CA)其已与碱性磷酸酶(J.Cook,MRL)共价连接。抗体溶液通过将抗血清稀释于印迹缓冲液(6.25mM磷酸钠,pH7.2中的5%脱脂乳,150mM NaCl,0.02%NaN3)而制备。孵育在20-23℃至少进行1小时。印迹在三个变化的PBS(6.25mM磷酸钠,pH7.2,150mM NaCl)中各冲洗1分钟。洗印迹用一步NBT/BCIP底物(Pierce,Rockford,IL)检测。
序列表(1)一般信息:
(i)申请人:Lehman,Ernest D.
Cook,III James C.
George,Hugh A.
Hofmann,Kathryn J.
Jansen,Kathrin U.
Joyce,Joseph G.
Markus,Henry Z.
Schultz,Loren D.
(ii)发明题目:纯化的乳头状瘤病毒蛋白
(iii)序列数目:20
(iv)联系地址:
(A)住址:Christine E.Carty
(B)街道:126 E.Lincoln Avenue,P.O.Box 2000
(C)市:Rahway
(D)州:New Jersey
(E)国家:USA
(F)邮编:07065-0907
(v)计算机可读方式:
(A)媒介类型:Floppy盘
(B)计算机:IBM PC兼容
(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS
(D)软件:PatentIn Release #1.0,版本#1.25
(vi)当前申请数据:
(A)申请号:US 08/339,368
(B)申请日:14-NOV-1994
(C)分类:
(viii)代理人/事务所情报:
(A)名称:Carty,Christine E.
(B)登记号:36,099
(C)参考/档案号:19341Y
(ix)电讯情报:
(A)电话:(908)594-6734
(B)电传:(908)594-4720(2)SEQ ID NO:1的信息:
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Claims (26)
1.分离和纯化的乳头状瘤病毒衣壳蛋白,所述衣壳蛋白选自L1蛋白、L2蛋白、L1+L2蛋白,和其官能衍生物,所述蛋白至少70%纯度。
2.权利要求1的纯化的蛋白,其中乳头状瘤病毒选自人乳头状瘤病毒和美洲产白尾棕色兔乳头状瘤病毒。
3.权利要求2纯化的蛋白,其中人乳头状瘤病毒选自HPV 6a,HPV6b,HPV 11,HPV 16,HPV 18,HPV 31,HPV 33,HPV 35,HPV 41,HPV 45,和HPV 58。
4.权利要求1纯化的蛋白,其中蛋白质由一合成系统产生,该合成系统包括重组宿主。
5.由权利要求1蛋白组成的病毒衣壳。
6.由权利要求1蛋白组成的病毒样(virus-like)颗粒。
7.一种生产权利要求1纯化的蛋白质的方法,包括:
(a)用重组DNA分子转化宿主,重组DNA分子编码选自乳头状瘤病毒L1蛋白,乳头状瘤病毒L2蛋白,乳头状瘤病毒L1+L2蛋白,和其官能衍生物的蛋白;
(b)在允许重组DNA表达,产生粗产物重组乳头状瘤病毒蛋白的条件下培养转化的宿主;和
(c)纯化粗产物重组乳头状瘤病毒蛋白以产生纯化的蛋白质。
8.用权利要求7的方法产生的重组乳头状瘤病毒蛋白。
9.由权利要求7蛋白质组成的病毒衣壳。
10.由权利要求7蛋白质组成的病毒样颗粒。
11.一种包含权利要求1蛋白质的疫苗。
12.含有权利要求1蛋白质的药物组合物。
13.一种治疗或预防乳头状瘤病毒感染的方法,包括给宿主施用权利要求11的疫苗。
14.一种检测乳头状瘤病毒或抗乳头状瘤病毒抗体的药盒,包括一种选自下面的试剂:编码乳头状瘤病毒蛋白的重组DNA分子,纯化的乳头状瘤病毒蛋白,由纯化的乳头状瘤病毒蛋白组成的病毒样颗粒,抗乳头状瘤病毒蛋白的抗体,和抗病毒样颗粒抗体。
15.一种产生装配到病毒衣壳中的重组乳头状瘤病毒衣壳蛋白的方法,包括:
(a)将编码至少一种乳头状瘤病毒衣壳蛋白的乳头状瘤病毒基因克隆到载体中;
(b)将载体转移到宿主细胞中产生重组宿主细胞;
(c)在允许产生乳头状瘤病毒衣壳蛋白的条件下培养重组宿主细胞;和
(d)在允许形成病毒衣壳的条件下纯化乳头状瘤病毒衣壳蛋白。
16.用权利要求15的方法产生的病毒衣壳。
17.由权利要求16的衣壳组成的病毒样颗粒。
18.一种诱导脊椎动物免疫应答的方法,包括给动物施用权利要求16的衣壳。
19.一种诱导动物免疫应答的方法,包括给动物施用权利要求1的蛋白质。
20.含有权利要求6病毒样颗粒的药物组合物。
21.含有权利要求5的衣壳的药物组合物。
22.权利要求4的合成系统,其中系统选自转化的昆虫细胞,转化的酵母细胞,转化的细菌细胞、转化的真菌细胞,转化的植物细胞和转化的动物细胞。
23.一种制备纯化的由至少一种纯化的乳头状瘤病毒蛋白组成的病毒样颗粒的方法,该方法包括:
(a)用阴离子交换层析处理含有至少一种粗乳头状瘤病毒蛋白的溶液,产生部分纯化的乳头状瘤病毒蛋白;
(b)将处理过的部分纯化的乳头状瘤病毒蛋白进行硫酸铵沉淀;和
(c)用大小排阻层析进一步纯化蛋白质。
24.乳头状瘤病毒的病毒样颗粒,该病毒样颗粒包括重组乳头状瘤病毒蛋白,且病毒样颗粒为至少70%纯度。
25.一种制备纯化的由至少一种纯化的乳头状瘤病毒蛋白组成的衣壳的方法,该方法包括:
(a)用阴离子交换处理含有至少一种粗乳头状瘤病毒蛋白的溶液,产生部分纯化的乳头状瘤病毒蛋白;
(b)将处理过的部分纯化的乳头状瘤病毒蛋白进行硫酸铵沉淀;和
(c)用大小排阻层析进一步纯化蛋白质。
26.乳头状瘤病毒衣壳,该病毒样颗粒包括重组乳头状瘤病毒蛋白,且该衣壳至少70%纯度。
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