CN1462636A - 预防和治疗人丙型肝炎病毒感染的重组蛋白疫苗及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组蛋白疫苗，它是由卡介苗热休克蛋白65和多表位丙型肝炎病毒核心抗原融合而形成的融合蛋白；这种蛋白的氨基酸序列和编码这种重组蛋白疫苗的核苷酸序列；含有该核苷酸序列的表达载体；含有该表达载体的宿主细胞；该重组蛋白疫苗的制备方法；含有该重组蛋白的预防和治疗丙型肝炎病毒感染的疫苗制品。本发明还提供了一种用于检测丙型肝炎病毒疫苗诱导丙型肝炎特异性杀伤性T淋巴细胞活性的方法及其细胞模型。

Description

预防和治疗人丙型肝炎病毒感染的重组蛋白疫苗及其用途

发明领域

本发明涉及一种基因工程领域，具体地涉及基因工程重组蛋白疫苗(下文有时也称为“基因工程重组蛋白”)，特别是涉及一种预防和治疗人丙型肝炎病毒感染的重组蛋白疫苗；这种重组蛋白的氨基酸序列；编码这种重组蛋白疫苗的核苷酸序列(下文有时也称为“基因”)；含有该核苷酸序列的表达载体；含有该表达载体的宿主细胞，以及该重组蛋白疫苗的制备方法；本发明还涉及该基因工程重组蛋白在制备用于预防和治疗人丙型肝炎病毒感染的疫苗制品中的用途以及含有该基因工程重组蛋白的疫苗制品；用装载丙型肝炎病毒特异性多肽的肿瘤细胞检测丙型肝炎病毒特异性杀伤性T淋巴细胞的方法。

发明背景

目前，在全世界，大约有1亿七千万人感染了丙型肝炎病毒(HCV)，其感染者是人类免疫缺陷病病毒(HIV)感染者的4倍。在今后几年中，每年死于由HCV感染引起的肝癌，肝硬化等肝脏损害的人数有可能超过因HIV感染而死于AIDS的人数。

在世界范围内，采用α-干扰素和病毒唑对病人进行联合药物是治疗丙型肝炎病毒感染的唯一方法，其有效率最高只有40％[Jon Cohen.丙型肝炎的科学挑战(The Scientific Challenge of Hepatitis C).科学(Science)，1999，285：26-30]。

采用有效的疫苗控制和治疗丙型肝炎病毒感染是预防和治疗丙型肝炎病毒感染的理想途径，在这方面，科学家一直在进行不懈的探索。迄今为止，在世界上尚未研制出有效的丙型肝炎丙型肝炎病毒疫苗。

对于一些病毒，例如A型流感病毒(influenza A)，乙型肝炎病毒(HBV)等，诱导中和抗体似乎足以抵御感染；但对另外许多病毒，必须产生有效的特异性杀伤性T淋巴细胞(CTL)反应才能清除病原体[IsabelleP.Hunziker，Rinaldo Zurbriggen，Reinhard Glueck et.al.展望：对于一种针对丙型肝炎病毒的多肽疫苗(Perspectives：towards apeptide-based vaccine against hepatitis C virus)分子免疫(Molecular Immunology)2001 38，475-484]。近年的研究表明，CD8+杀伤性T淋巴细胞(CTL)也能有效地预防和清除HCV感染[Cooper S；EricksonAL；Adams EJ等，成功的抗丙型肝炎病毒的免疫反应的分析(Analysis ofa successful immune response against hepatitis C virus).免疫(Immunity)1999 Apr；10(4)：439-449]。Cerny等的工作表明，HCV保守区域的HLA-A2.1结合表位可诱导丙型肝炎病毒特异性的CTL反应[Cerny A，McHutchison JG，Pasquinelli C等，对丙型肝炎病毒来源的含有结合基序的多肽的细胞毒性T淋巴细胞反应(Cytotoxic T lymphocyteresponse to hepatitis C virus-derived peptides containing thebinding motif.)临床研究杂志(J Clin Invest)，1995，95：521-530]。作为HCV保守区域的蛋白成分，核心蛋白含有若干不同MHC-I类分子限制的T细胞表位，根据这些表位的序列可能研制出对丙型肝炎病毒感染有预防和治疗作用的疫苗，在研制的此类疫苗中有DNA疫苗、病毒载体疫苗和合成肽疫苗等。

研究表明，外源性的蛋白类抗原在免疫人体后，通常被抗原提呈细胞摄取、加工，进入MHC II类提呈途径，能激发体液免疫反应(Heikema A，Agsteribbe E，Wilschut J，Huckriede A.通过胞内装载gp96抗原肽产生基于热休克蛋白的疫苗(Generation of heat shock protein-basedvaccines by intracellular loading of gp96 with antigenic peptides).免疫学通讯(Immunol Lett)1997 Jun 1；57(1-3)：69-74)，但不能有效激活特异性的CTL的产生。因此，赋予HCV核心抗原以能特异性激活CTL的性质就成为研究以HCV核心抗原疫苗的一个技术关键。

热休克蛋白(heat shock protein，下文有时简称为“HSP”)是存在于多种生物体内的一个分子伴侣蛋白质家族。在免疫应答的过程中，热休克蛋白可表现如下三种基本的功能：1、协助抗原性物质进入包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞；2、在抗原提呈细胞中和加工处理的抗原物质相互作用使之进入MHC I类抗原提呈途径，进而激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)；3、刺激树突状细胞表达协同刺激分子(如B7等)和分泌细胞因子(Suzue K，Zhou X，Eisen HN，Young RA.热休克蛋白融合蛋白作为载体将抗原带入主要组织相容性复合体I类分子提呈途径(Heat shock fusion proteins as vehicles forantigen delivery into the major histocompatibility complex classI presentation pathway).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1997 Nov25；94(24)：13146-13151)。

发明内容

本发明的一方面是提供一种重组蛋白疫苗，它是将卡介苗热休克蛋白65(HSP65)和多表位HCV核心抗原融合在一起而生产的、对丙型肝炎有预防和治疗作用的基因工程重组蛋白疫苗。

本发明的另一方面是提供这种重组蛋白的氨基酸序列。

本发明的另一方面是提供一种编码这种重组蛋白的核苷酸序列。

本发明的另一方面是提供一种含有该核苷酸序列的表达载体。

本发明的另一方面是提供一种含有含有该表达载体的宿主细胞。

本发明的另一方面是提供一种制备该重组蛋白疫苗的方法。

本发明的另一方面涉及该基因工程重组蛋白在制备用于预防和治疗丙型肝炎的疫苗制品中的用途。

本发明的另一方面涉及用装载丙型肝炎病毒特异性多肽的肿瘤细胞检测丙型肝炎病毒特异性杀伤性T淋巴细胞的方法。

本发明的又一方面涉及含有该基因工程重组蛋白的疫苗制品。

因此，正是本发明人经过长期的大量的研究，解决了现有技术中的技术难题，首次开拓性地将卡介苗热休克蛋白65与多表位HCV核心抗原相连形成了全新的基因工程重组蛋白，从而赋予HCV核心抗原以能特异性激活CTL的性质，实现了对丙型肝炎的有效的预防和治疗。

另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其它具有实质性特点的方面及其创造性的有益效果对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。

附图简要说明

图1是描述本发明的重组蛋白疫苗的制备过程流程图解。

图2是以卡介苗基因组为模板用热休克蛋白65(HSP65)特异性引物进行PCR所得到的PCR产物的电泳图，其中泳道1为DNA marker，泳道2箭头所示为PCR产物。

图3所示的是为合成单拷贝多表位HCV核心抗原基因而进行的第一轮PCR产物的琼脂糖凝胶电泳照片，其中箭头所示为PCR产物。

图4所示的是为合成单拷贝多表位HCV核心抗原基因而进行的第二轮PCR产物的琼脂糖凝胶电泳照片，其中箭头所示为PCR产物。

图5所示的是酶切鉴定pMD-18T-多表位HCV核心抗原重组质粒的琼脂糖凝胶电泳照片，其中：泳道1为DNA marker，泳道2为未经酶切的pMD-18T-多表位HCV核心抗原重组质粒，泳道3为EcoRI和HindIII双酶切后的pMD-18T-多表位HCV核心抗原重组质粒。

图6所示的是PET28a-Hsp65重组质粒酶切鉴定电泳照片，其中：泳道1为DNA marker，泳道2为经NcoI和EcoRI双酶切后的PET28a-Hsp65重组质粒，箭头所示为释放的DNA片段。

图7所示的是PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重组质粒酶切鉴定电泳照片，其中：泳道1为DNA marker，泳道2为经EcoRI和HindIII双酶切后的PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重组质粒，箭头所示为释放的DNA片段(多表位HCV核心抗原)。

图8所示的是PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重组质粒结构示意图。

图9为纯化后的含有PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重组质粒的大肠杆菌表达产物(卡介苗HSP-65和多表位HCV核心抗原基因融合蛋白)的SDS-PAGE分析，其中：泳道1为纯化后的表达产物，泳道2为纯化后经过除盐的表达产物，泳道3为蛋白质分子量标志。可以看到目的蛋白分子量为80kDal左右，与理论计算值相符。

图10所示的是酶切鉴定PET26b-8R-多拷贝多表位HCV核心蛋白重组质粒的电泳照片，其中：泳道1和2是经BamH I和Xho I双酶切后的PET26b-8R-多拷贝多表位HCV核心蛋白重组质粒，箭头所示为释放出的DNA片段(多拷贝多表位HCV核心抗原)，泳道3是DNA marker。

图11所示的是大肠杆菌中表达的8R-多拷贝多表位HCV核心蛋白融合蛋白纯化后的SDS-PAGE分析，其中：泳道1为纯化的8R-多拷贝多表位HCV核心蛋白融合蛋白，泳道3为纯化后经过除盐的8R-多拷贝多表位HCV核心蛋白融合蛋白，泳道4为蛋白质分子量标志，可以看到目的蛋白分子量为35kDal左右，与理论计算值相符。

图12所示为疫苗组和对照组小鼠肿瘤形成状况的对比照片。

图13所示为表达HCV核心抗原表位的B16细胞的体外特异性杀伤实验结果。

具体实施方式

在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。特别地，下列术语具有如下的含义：

“重组蛋白疫苗”：利用基因工程技术，将具有较强免疫原性的一个或多个基因片段以克隆到原核或真核细胞的表达载体上，将表达载体转入细菌或真核细胞(酵母细胞或哺乳动物细胞)，利用此细菌或真核细胞生产的由具有较强免疫原性的一个或多个基因片段编码的蛋白质为重组蛋白疫苗。这种疫苗在应用于机体后可诱导机体产生抗原特异性的记忆性淋巴细胞(T淋巴细胞和B淋巴细胞)，这些记忆性的淋巴细胞在接触到相应的病原体后可迅速增殖、反应，通过产生抗体的方式或特异性杀伤细胞的方式抑制或该杀伤病原体或杀伤病毒感染细胞。

“卡介苗热休克蛋白65”是指来源于卡介苗的分子量为65kDal的热休克蛋白，其氨基酸序列优选地如实施例1中所示。

“多表位HCV核心抗原”是指来源于丙型肝炎病毒核心蛋白的5个表位相连接而形成的多肽，其氨基酸序列优选地如SEQ ID NO：9所示，其编码核苷酸序列优选地如SEQ ID NO：8所示。

“人丙型肝炎病毒感染”是指丙型肝炎病毒通过某种途径进入人体并感染肝细胞的状态，包括急性感染和慢性感染以及无症状携带状态，包括，但不限于表现出肝病临床症状或有生化指标改变的状态。

“严紧的杂交条件”是指为避免反应体系中非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物而采用的杂交条件，如较高的反应温度和低离子强度。

″治疗″或″预防″包括：

(1)预防疾病，也就是使疾病的临床症状不会在哺乳动物中发展，所述的哺乳动物可能与该疾病的病原体接触或易患有该疾病但不曾经历或显现出疾病的该症状，

(2)抑制疾病，也就是阻止或减轻该疾病或其临床症状的发展，或

(3)缓解疾病，也就是引起疾病或其临床症状的退化。

丙型肝炎病毒的基因型和我们采用的丙型肝炎病毒基因序列：

丙型肝炎病毒基因组具有显著异源性，而且具有一定的地域和人群分布特征。目前将已发现的100多种丙肝毒株分为6种主要基因型[Simmonds P.丙型肝炎病毒的异源性(Viral heterogeneity of the hepatitis C virus).1999 J.肝脏病学(Hepatology)31：54-60]。欧美国家主要流行株为I型，亚洲及我国流行株属于II型。本发明中所依据的基因序列来自HCV typeIb，即为II型中的一株。

本发明提供了一种重组蛋白疫苗，它是由卡介苗热休克蛋白65和多表位HCV核心抗原融合而形成的融合蛋白，其中，所述的单拷贝多表位HCV核心抗原由如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的序列的多肽相互连接形成(按照1-5的顺序连接)：Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Glu Ile Asp Asp(SEQ ID NO：1)；Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Glu AspSer Glu(SEQ ID NO：2)；Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg AlaGlu Asn Asp Glu Ile Glu(SEQ ID NO：3)；Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Asn AspGlu(SEQ ID NO：4)；Leu Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Glu IleAsp Asn Glu(SEQ ID NO：5)。该单拷贝多表位HCV核心抗原的序列优选地如SEQ ID NO：9所示或其功能等价物，而所述的单拷贝HCV核心抗原多表位的表达基因的序列优选地具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

本发明的重组蛋白疫苗中，卡介苗热休克蛋白65可以位于该融合蛋白的氨基端，单拷贝多表位HCV核心抗原位于该融合蛋白的羧基端。

将单拷贝多表位HCV核心抗原和卡介苗热休克蛋白65的基因融合可表达出多表位HCV核心抗原和卡介苗热休克蛋白65融合蛋白(序列优选地如SEQ ID NO：7所示)。此蛋白在应用于人体后可在包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞内进入MHC I类途径加工提呈，诱生丙型肝炎病毒特异性CTL。此CTL可杀伤丙型肝炎病毒感染的细胞并失活丙型肝炎病毒因而对丙型肝炎病毒感染有预防和治疗的作用。

因此，本发明的重组蛋白疫苗具有选自如下的任一氨基酸序列：

1)SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；和

2)由在严紧的杂交条件下与编码1)的氨基酸序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

本发明还提供了编码本发明的重组蛋白疫苗的核苷酸序列，该核苷酸序列可以具有选自如下的任一序列：

1)SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；和

2)由在严紧的杂交条件下与1)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

我们将这五个肽段的编码基因相连在一起，合成了一种新的基因，这一基因编码的多肽即为单拷贝多表位HCV核心抗原。将单拷贝多表位HCV核心抗原和卡介苗热休克蛋白65融合形成的融合蛋白，可刺激人体的细胞毒性T细胞(CTL)攻击和杀伤表达HCV核心抗原的靶细胞，因而对丙型肝炎预防和治疗的作用。将单拷贝多表位HCV核心抗原相连接获得的2-5个拷贝的多拷贝单拷贝多表位HCV核心抗原和卡介苗热休克蛋白65融合形成的融合蛋白也可刺激人体的细胞毒性T细胞(CTL)攻击和杀伤表达HCV核心抗原的靶细胞，因而对丙型肝炎预防和治疗的作用。

卡介苗热休克蛋白65是一种来源于卡介苗的蛋白质，它在和多表位HCV核心抗原形成融合蛋白后，可以协助多表位HCV核心抗原进入包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞，并进入MHC I类途径加工提呈，进而激活抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)对表达HCV核心抗原的细胞进行攻击和杀伤。此外，卡介苗热休克蛋白65还可刺激包括树突状细胞在内的抗原提呈细胞表达协同刺激分子(如B7等)和分泌细胞因子，这些协同刺激分子(如B7等)和细胞因子可激活细胞毒性T淋巴细胞的肿瘤细胞杀伤能力。

本发明的重组蛋白疫苗可通过本领域已知的方法，例如按照文献(Brennan，W.A.and Lin，S.H.蛋白质纯化策略及实验规程(“Strategiesfor Protein Purification and Characterization，A LaboratoryManual”)，冷泉港实验室出版，1996 Cold Spring Harbor LaboratoryPress.)所述进行生产，以下的实施例详细地例举了一种生产本发明的重组蛋白疫苗的方法。

因此，本发明还提供了含有上述编码本发明的重组蛋白疫苗的核苷酸序列的表达载体；含有该表达载体的宿主细胞，其可以为本领域常规的各种原核细胞，真核细胞或哺乳动物细胞；以及该重组蛋白疫苗的基因工程制备方法。

另外，本发明还涉及该基因工程重组蛋白在制备用于预防和治疗人丙型肝炎的疫苗制品中的用途以及含有该基因工程重组蛋白的疫苗制品。本领域技术人员可以理解的是，这些疫苗制品可用本领域周知的各种常规方法制备。

本发明的重组蛋白疫苗可通过皮下注射的方式给人接种，接种的剂量为100-500μg。为了加强效果，可进行2-3次的加强免疫。时间间隔可为2周-2月。

为了弥补因无丙型肝炎病毒细胞模型和动物模型的不足，本发明创立了一种研究丙型肝炎病毒疫苗激发特异性CTL并产生保护作用的新方法，即提供了一种检测丙型肝炎病毒疫苗活性的一种方法。动物模型构建原理：八聚精氨酸(8R)能有效地将其C末端的融合蛋白带入细胞内并进入MHC-I类途径[Park J，Ryu J，Kim KA，et al.携带外源性蛋白进入哺乳动物细胞所必须的I型人免疫缺陷病毒Tat蛋白转导区域的变异分析(Mutational analysis of a human immunodeficiency virustype 1 Tat protein transduction domain which is required fordelivery of an exogenous protein into mammalian cells)普通病毒学杂志(J Gen Virol)2002 May；83(Pt5)：1173-81]。我们利用8R的这一特性，构建8R-多拷贝多表位HCV核心抗原融合蛋白，并将其转染来源于C57小鼠的黑色素瘤细胞B16。这样的B16细胞表面将表达HCV核心抗原表位，可以被HCV核心抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤。将这种B16细胞注射入接种HCV疫苗的C57小鼠体内，观察肿瘤生长状况，并与未接种疫苗的小鼠进行对比，可作为一种检测丙型肝炎病毒疫苗活性的方法。

下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例

在如下实施例中，如附图1所示制备本发明的重组蛋白疫苗。其中未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，例如Molecular Cloning一书(J.Sambrook，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Molecular cloning，1989)所述的方法。

实施例1获取卡介苗65KD热休克蛋白(HSP65)的编码基因

卡介苗来源于长春生物制品研究所。采用苏通马铃薯培养基(StarchPotato Code No：C250-1，Sigma分装北京鼎国生物)培养的温度为37-39℃，生长出的卡介苗呈现干皱浅黄色的菌膜。收集菌膜，从中提取卡介苗基因组DNA。

提取卡介苗基因组DNA的方法参照Molecular Cloning一书(J.Sambrook，从哺乳动物分离高分子量DNA(Isolation of high-molecular-weight DNA from mammalian cells)，9.16-9.22，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。

采用PCR方法自卡介苗分离热休克蛋白65(HSP65)结构基因。采用的5′端引物序列为5′CCATG GCC AAG ACA ATT GCG3′ (SEQ ID NO：21)，3′端引物序列为5′ACC GAA TTC GCT AGC CAT ATG GAA ATC CATGCC ACC CAT 3′ (SEQ ID NO：22)。

所述PCR操作程序是：在一500μl微量离心管中加入下列试剂：

模板cDNA 5μl(10mmol/L)

10×PCR缓冲液(67mmol/L Tris-Cl pH8.8，50mmol/L KCl，15mmol/L MgCl，10mmol/L DMSO)5μl

dNTPs(10mmol/L)1μl

5′端和3′端引物(0.01mmol/L)各0.5μl

Taq DNA聚合酶(5u/μl)0.25μl

加去离子水至终体积50μl

混合后加入矿物油3滴

反应条件：94℃，30″；55℃，1′；72℃，2′，30个循环周期后，72℃延伸10分钟。

采用TA克隆方法克隆PCR产物，方法见文献(于永利，麻彤辉，杨贵贞。TA克隆及双链DNA测序：介绍一种快速克隆及分析PCR产物的方法。中国免疫学杂志，1994，10(1)：5)。

按常规方法(J.Sambrook，聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamidegel electrophoresis)1.21-1.32，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)提取质粒，DNA序列分析仪测序。所获PCR产物的序列是cc atg gcc aag aca att gcg tac gac gaa gag gcc cgt cgc ggc ctc gagcgg ggc ttg aac gcc ctc gcc gat gcg gta aag gtg aca ttg ggc ccc aagggc cgc aac gtc gtc ctg gaa aag aag tgg ggt gcc ccc acg atc acc aacgat ggt gtg tcc atc gcc aag gag atc gag ctg gag gat ccg tac gag aagatc ggc gcc gag ctg gtc aaa gag gta gcc aag aag acc gat gac gtc gccggt gac ggc acc acg acg gcc acc gtg ctg gcc cag gcg ttg gtt cgc gagggc ctg cgc aac gtc gcg gcc ggc gcc aac ccg ctc ggt ctc aaa cgc ggcatc gaa aag gcc gtg gag aag gtc acc gag acc ctg ctc aag ggc gcc aaggag gtc gag acc aag gag cag att gcg gcc acc gca gcg att tcg gcg ggtgac cag tcc atc ggt gac ctg atc gcc gag gcg atg gac aag gtg ggc aacgag ggc gtc atc acc gtc gag gag tcc aac acc ttt ggg ctg cag ctc gagctc acc gag ggt atg cgg cag gag gcg gtc ctg gag gac ccc tac atc ctgctg gtc agc tcc aag ctg tcc acc ctg gtc gtc aac aag atc cgc ggc accttc aag tcg gtg gcg gtc aag gct ccc ggc ttc ggc gac cgc cgc aag gcgatg ctg cag gat atg gcc att ctc acc ggt ggt cag gtg atc agc gaa gaggtc ggc ctg acg ctg gag aac gcc gac ctg tcg ctg cta ggc aag gcc cgcaag gtc gtg gtc acc aag gac gag acc acc atc gtc gag ggc gcc ggt gacacc gac gcc atc gcc gga cga gtg gcc cag atc cgc cag gag atc gag aacagc gac tcc gac tac gac cgt gag aag ctg cag gag cgg ctg gcc aag ctggcc ggt ggt gtc gcg gtc atc aag gcc ggt gcc gcc acc gac gtc gaa ctcaag gag cgc aag cac cgc atc gag gat gcg gtt cgc aat gcc aag gcc gccgtc gag gag ggc atc gtc gcc ggt ggg ggt gtg acg ctg ttg caa gcg gccccg acc ctg gac gag ctg aag ctc gaa ggc gac gag gcg acc ggc gcc aacatc gtg aag gtg gcg ctg gag gcc ccg ctg aag cag atc gcc ttc aac tccggg ctg gag ccg ggc gtg gtg gcc gag aag gtg cgc aac ctg ccg gct ggccac gga ctg aac gct cag acc ggt gtc tac gag gat ctg ctc gct gcc ggcgtt gct gac ccg gtc aag gtg acc cgt tcg gcg ctg cag aat gcg gcg tccatc gcg ggg ctg ttc ctg acc acc gag gcc gtc gtt gcc gac aag ccg gaaaag gag aag gct tcc gtt ccc ggt ggc ggc gac atg ggt ggc atg gat ttccat atg gct agc gaa ttc

另外，图2给出了以卡介苗基因组为模板用热休克蛋白65(HSP65)特异性引物进行PCR所得到的PCR产物的电泳图。

实施例2.合成单拷贝多表位HCV核心抗原基因

采用两轮PCR合成合成单拷贝多表位HCV核心抗原基因。1)第一轮PCR(两条引物互为模板进行扩增)引物1的序列为：5′ATGGGTTACATCCCGCTGGTTGGTGCTCCGCTGGAAGACTCTGAAGGTGTTTACCTGCTGCCGCGTCGTGGG CCGCGCCTGGGCGTTCGC 3′ (SEQ ID NO：10)引物1’的序列为：5′GTCGTTACGTTCAGAAGTTTTACGAGTAGCACGAACACCCAGACGCGGACCTTCGATTTCGTCGTTTTCAGC GCGAACGCCCAGGCGCGG 3′ (SEQ ID NO：11)

所述PCR操作程序是：在一500μl微量离心管中加入下列试剂：

引物1和引物1’各2μl

10×PCR缓冲液(北京鼎国公司成分见产品说明)5μl

dNTPs(10mmol/L)1μl

Taq DNA聚合酶(2u/μl)1μl

加去离子水至终体积50μl

混合后加入矿物油2滴

PCR的反应条件为：94℃，1’；60℃，1′；72℃，2′，3个循环周期后，72℃延伸10分钟第一轮PCR合成的产物的序列是：5′ATGGGTTACA TCCCGCTGGT TGGTGCTCCG CTGGAAGACT CTGAAGGTGTTTACCTGCTG CCGCGTCGTG GCCCGCGCCT GGGCGTTCGC GCTGAAAACGACGAAATCGA AGGTCCGCGT CTGGGTGTTC GTGCTACTCG TAAAACTTCT GAACGTAACGAC 3′ (SEQ ID NO：12)，其电泳图如图3所示。2)以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR引物2的序列是：5′GAATTCATGTCTACTAACCCGAAACCGCAGCGTAAAACTAAAGAAATCGACGACTTCGCTGACCTG ATGGGTTACATCCCGCTG 3′ (SEQ ID NO：13)引物2′的序列是5′AAGCTTTTCGTTGTCGATTTCCTGACGACGACCACGCGGCTGAGAACGTTCGGAGGTTTTACGCAGTTC GTCGTTACGTTCAGAA GT 3′(SEQ ID NO：14)

所述PCR操作程序是：在一500μl微量离心管中加入下列试剂：

引物2和引物2’各1μl

10×PCR缓冲液(北京鼎国公司成分见产品说明)5μl

dNTPs(10mmol/L)1μl

Taq DNA聚合酶(2u/μl)1μl

加去离子水至终体积50μl

混合后加入矿物油2滴PCR的反应条件为：94℃，1’；60℃，1′；72℃，2′，30个循环周期后，72℃延伸10分钟。产物的序列是：5′ATGTCTACTA ACCCGAAACC GCAGCGTAAA ACTAAAGAAA TCGACGACTTCGCTGACCTG ATGGGTTACA TCCCGCTGGT TGGTGCTCCG CTGGAAGACT CTGAAGGTGTTTACCTGCTG CCGCGTCGTG GCCCGCGCCT GGGCGTTCGC GCTGAAAACGACGAAATCGA AGGTCCGCGT CTGGGTGTTC GTGCTACTCG TAAAACTTCT GAACGTAACGACGAACTGCG TAAAACCTCC GAACGTTCTC AGCCGCGTGG TCGTCGTCAG GAAATCGACAACGAA3′(SEQ ID NO：15)，其电泳图如图4所示。3)将PCR产物克隆入载体质粒pMD-18T(Takara)。

操作过程：

1回收PCR产物：将目的DNA区带的琼脂糖凝胶切下，置1.5ml Ep管中，用DNA快速回收试剂盒(北京鼎国公司)回收目的DNA片段(操作步骤见产品说明)

2连接反应：载体质粒pMD-18T(50ng/μl)0.5μl

           PCR产物(10ng/μl)4.5μl

           Ligation Solution I(Takara，成分见产品说明)5μl

           16℃反应2小时

3转化大肠杆菌JM109：

感受态细胞的制备：

a、将大肠杆菌JM109(本室保存)在LB琼脂培养基上划线，37℃培养12-16小时；

b、次日从琼脂平板上取一单菌落于2ml LB培养基中，37℃以225rpm速度震荡培养12-16小时；

c、取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中，37℃以225rpm的速度震荡培养直至OD值为0.5左右(大约3小时)；

d、将菌液冰浴2小时，然后2,500Xg，4℃离心20分钟收集菌体；

e、加入100ml冰冷的Trituration缓冲液(100mmol/LCaCl₂，70mmol/L MgCl₂，40mmol/L醋酸钠，pH5.5)，混匀，置冰上45分钟；

f、1,800Xg，4℃离心10分钟，弃上清，加入10ml冰冷的Trituration缓冲液悬浮细胞；

g.按每份200ul分装，4℃可保存1-2周。若需长期保存，可加甘油至终浓度为15％，置-70℃备用。

转化方法：

a、将200ul感受态细胞置冰上融化，然后加入3ul DMSO或β-巯基乙醇，混合后，加入3-5μl连接反应液(含重组质粒)，温和混匀，置冰上30分钟；

b、42℃45秒，然后迅速放回冰中1-2分钟；

c、加入2ml LB培养液，37℃以225rpm的速度摇荡培养1小时；

d、4,000Xg离心10秒钟，弃上清，用200ul LB培养液重悬菌体；

e、将菌液铺于含有Ampicillin(100ug/ml)的LB琼脂培养板上，涂匀，室温放置20-30分钟，倒置于37℃孵箱中培养12-16小时。用限制性内切酶消化的方法鉴定重组克隆。

f、质粒和菌株的保存：质粒冰冻保存于-20℃。菌株在含20-50％甘油培养液中保存于-20℃或-70℃。图5所示的是酶切鉴定pMD-18T-多表位HCV核心抗原重组质粒的琼脂糖凝胶电泳照片，其中：泳道1为DNAmarker，泳道2为未经酶切的pMD-18T-多表位HCV核心抗原重组质粒，泳道3为EcoRI和HindIII双酶切后的pMD-18T-多表位HCV核心抗原重组质粒。

实施例3.

卡介苗HSP-65基因的克隆

用NcoI(Takara)和EcoRI(Takara)在37℃消化得自实施例1的质粒，时间为2小时。消化产物琼经脂糖凝胶电泳分离。电泳的条件是：1％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，150-200mA，电泳0.5-1小时。20×TAE缓冲液：0.8mol/L Tris base，0.4mol/L NaOAc，0.04mol/L Na₂EDTA，用冰醋酸调pH8.3。

在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的DNA电泳带。将含DNA区带的琼脂糖凝胶切下，置-70℃冷冻15分钟；室温融化后，12,000rpm离心5分钟，将上层液相移至另一管中，用2-2.5倍乙醇沉淀、洗涤和干燥DNA。

将回收的DNA片段克隆入经限制性内切酶NcoI(Takara)和EcoRI(Takara)消化的原核细胞表达载体pET-28a(+)质粒(美国Novagen公司)的6聚组氨酸(histidine)密码子的上游。

质粒DNA的消化反应：

1μg质粒DNA

1μl 10×缓冲液(见Promega Corporation产品说明书)。

1μl限制性内切酶NcoI(10单位/μl)

1μl限制性内切酶EcoRI(10单位/μl)

用双蒸水补齐至10μl

混合后37℃温育30-120分钟。

连接反应：

质粒DNA(0.5μg/μl)2μl

DNA插入片段(即卡介苗HSP-65基因)(300ng/μl)5μl

10×连接缓冲液(见Protocols and Applications Guide，p57，Promega Corporation，Second Edition，1991)1μl

T4 DNA连接酶1μl

用双蒸水补齐至10μl

混合后置14-16℃水浴6-12小时。

将含卡介苗HSP-65基因的重组pET-28a(+)质粒转化大肠杆菌。转化方法同上。酶切鉴定阳性重组质粒。图6所示的是PET28a-Hsp65重组质粒酶切鉴定电泳照片，其中：泳道1为DNA marker，泳道2为经NcoI和EcoRI双酶切后的PET28a-Hsp65重组质粒，箭头所示为释放的DNA片段。

实施例4

构建卡介苗HSP-65和多表位HCV核心抗原基因融合基因

将卡介苗65KD热休克蛋白(HSP65)的编码基因的重组PET28a质粒以及含有多表位HCV核心抗原基因的重组PMD18-T质粒分别用EcoRI和HindIII(Takara)消化，37℃，2小时。采用琼脂糖凝胶电泳分离消化产物。电泳的条件是：1％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，150-200mA，电泳0.5-1小时。

20×TAE缓冲液：0.8mol/L Tris base

0.4mol/L NaOAc

0.04mol/L Na₂ EDTA

用冰醋酸调pH8.3。

在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的DNA电泳带。将含目的DNA区带的琼脂糖凝胶切下，置Ep管中，用DNA快速回收试剂盒(北京鼎国公司)回收目的DNA片段及线性化质粒。

将经EcoRI/HindIII消化的PET28a-HSP65重组质粒和多表位HCV核心抗原基因用T4 DNA连接酶(Takara)连接。连接物转化感受态细胞JM109，用限制性内切酶消化的方法鉴定重组克隆。(具体序列参见SEQ ID No：6)。重组质粒冰冻保存于-20℃。菌株在含20-50％甘油培养液中保存于-20℃或-70℃。图7所示的是PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重组质粒酶切鉴定电泳，其中：泳道1为DNA marker，泳道2为经EcoRI和HindIII双酶切后的PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重组质粒，箭头所示为释放的DNA片段(多表位HCV核心抗原)。图8所示的是PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重组质粒结构示意图。

实施例5卡介苗HSP-65和多表位HCV核心抗原基因融合基因的表达

将单菌落接种于1000ml LB培养基中。37℃水浴震荡培养至OD600为0.6。加入IPTG使其终浓度为1mM，37℃水浴震荡培养2-3小时。三角烧瓶于冰上5分钟，4℃离心5分钟(5000xg)。吸弃上清，收集细菌，立即使用或冻存。

实施例6

卡介苗HSP-65和多表位HCV核心抗原融合蛋白的纯化

将大肠杆菌细胞于室温下解冻。每克菌(湿重)重悬于10ml裂解缓冲液。

裂解缓冲液：

20mM Tris.HCL(pH7.9)

5mM imidazole

0.5M NaCl

0.1mM PMSF

每毫升裂解缓冲液加1M MgSO₄ 10ul，10ug/ml DNase I 10ul。冰上放置30min。12,000rpm，4℃离心15min。弃上清。每克菌加1.5ml结合缓冲液。

结合缓冲液：

20mM Tris.HCL(pH7.9)

5mM imidazole

0.5M NaCl

6M urea

冰上放置2h。12,000rpm，4℃离心15min。留取上清，做Ni²⁺-Saphrose-4-B层析(层析介质购自Pharmacia公司)，分离HSP-65和多表位HCV核心抗原融合蛋白。

洗脱的目的蛋白进行苯基Sepharose疏水层析(层析介质购自Pharmacia公司)去除内毒素。

采用葡聚糖凝胶Sephadex-G-25离子交换层析(层析介质购自Pharmacia公司)去除目的蛋白中的盐类。

采用常规的SDS-PAGE方法(J.Sambrook，聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis)6.36-6.49，Cold Spring HarborLaboratory Press，Molecular cloning，1989)。鉴定HSP-65和HCV核心抗原多表位基因融合蛋白纯度为：95％。图9为纯化后的含有PET28a-Hsp65-多表位HCV核心抗原重组质粒的大肠杆菌表达产物(卡介苗HSP-65和多表位HCV核心抗原基因融合蛋白)的SDS-PAGE分析，其中：泳道1为纯化后的表达产物，泳道2为纯化后经过除盐的表达产物，泳道3为蛋白质分子量标志。可以看到目的蛋白分子量为80kDal左右，与理论计算值相符。实施例7：八聚精氨酸(8R)-多拷贝多表位HCV核心抗原融合蛋白的表达和纯化

8R即八聚精氨酸，是一段由8个精氨酸残基连接而成短肽，它能有效地将其C末端的融合蛋白带入细胞内并进入MHC-I类途径。我们利用8R的这一特性，构建8R-多拷贝多表位HCV核心抗原融合蛋白，用于转染细胞。

实验过程：

(a)PCR获取HCV core multiple epitopes DNA

为构建多拷贝多表位HCV核心抗原，设计一对引物：

primer 3  AAG CTT A  CCA TGG TT  GGA TCC ATGTCTACTA ACCCGAAACC(SEQ ID NO：18)primer 3’ GAA TTC  TTA  CTC GAG  AGA TCT TTCGTTGTCG ATTTCCTGAC(SEQ ID NO：19)。为构建多聚体，引物两端分别设计BamH I、Bgl II酶切位点，以序列正确的pMD-18T-HCVcore multiple epitope重组质粒为模板进行PCR：primer3、primer3’各1μl(0.01mM)，模板质粒1μl，10mM dNTP2μl，10×Taq DNA聚合酶缓冲液10μl(北京鼎国公司，成分见产品说明)，Taq DNA聚合酶(20u/μl)1μl，84μl ddH₂O。混匀后加一滴矿物油。按下列程序在PCR仪中扩增：94℃ 30sec，55℃ 60sec，72℃ 90sec，共30个循环。循环结束后，72℃延伸10分钟。反应结束后取PCR产物10μl做2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察结果。特异性DNA片段(HCVcoremultiple epitope)的回收及TA克隆方法同前。(b)pMD-18T-poly3 HCVcore multiple epitope重组质粒的构建

取2个0.5ml Ep管(1和2)，每管加入pMD-18T-HCV’重组质粒16μl。管1中加10xBuffer K(Takara)2μl，限制酶BamH I、Pst I(Takara)各1μl；管2中加10xBuffer H(Takara)2μl，限制酶Bgl II、Pst I(Takara)各1μl。37℃孵育2小时，2％琼脂糖凝胶电泳。回收管1中释放出的特异性片段(multiple HCVcoreepitope)和管2中的线性化质粒(pMD-18T-multiple HCVcoreepitope)。连接，转化，酶切鉴定(方法同前)。得到的阳性重组质粒为pMD-18T-poly2 multiple HCVcore epitope。

取pMD-18T-poly2 multiple HCVcore epitope重组质粒16μl，加10xBuffer H 2μl，限制酶Bgl II、Pst I各1μl。37℃孵育2小时，2％琼脂糖凝胶电泳。回收线性化质粒，与上述HCVcore multipleepitope连接，转化JM109感受态细胞。提取质粒酶切鉴定，所得阳性重组质粒为pMD-18T-poly3 multiple HCVcore epitope。(c)PET26b-8R-poly3 HCVcore multiple epitope表达质粒的构建

质粒PET26b-8R用BamH I和Xho I(Takara)消化，回收线性化载体；pMD-18T-poly3 multiple HCVcore epitope重组质粒同样用BamH I和Xho I消化，回收DNA片段poly3 multiple HCVcoreepitope。将二者连接，转化感受态菌JM109。提取阳性重组质粒备用。

(方法同前)

(d)PET26b-8R-poly3 HCVcore multiple epitope的表达和纯化(方法同前)。

图10所示的是酶切鉴定PET26b-8R-多拷贝多表位HCV核心蛋白重组质粒的电泳照片，其中：泳道1和2是经BamH I和Xho I双酶切后的PET26b-8R-多拷贝多表位HCV核心蛋白重组质粒，箭头所示为释放出的DNA片段(多拷贝多表位HCV核心抗原)，泳道3是DNA marker。图11所示的是大肠杆菌中表达的8R-多拷贝多表位HCV核心蛋白融合蛋白纯化后的SDS-PAGE分析，其中：泳道1为纯化的8R-多拷贝多表位HCV核心蛋白融合蛋白，泳道3为纯化后经过除盐的8R-多拷贝多表位HCV核心蛋白融合蛋白，泳道4为蛋白质分子量标志，可以看到目的蛋白分子量为35kDal左右，与理论计算值相符。

实施例8表达HCV核心抗原表位的B16细胞在小鼠体内的生长抑制实验

为了弥补因无丙型肝炎病毒细胞模型和动物模型的不足，创立了一种研究丙型肝炎病毒疫苗激发特异性CTL并产生保护作用的新方法：1、材料

8R-多拷贝多表位丙型肝炎病毒核心抗原融合蛋白(8R-polyHCVcoremultiple epitope)：

8R即八聚精氨酸，是由8个精氨酸残基连接而成的氨基酸序列，它能有效地将其C末端的融合蛋白带入细胞内并进入MHC-I类途径。用8R-多拷贝多表位HCV核心抗原融合蛋白转染细胞，将使被转染细胞表面表达HCV核心抗原表位，可用来作实验中的靶细胞。

B16细胞：

B16细胞是来源于C57小鼠的黑色素瘤细胞，其MHC的型为H-2^b。可在小鼠形成原位实体肿瘤。将8R-多拷贝多表位HCV核心抗原融合蛋白转染B16细胞。这样的B16细胞表面将表达HCV核心抗原表位。将这种B16细胞注射入接种HCV疫苗的C57小鼠体内，观察其生长状况，并与未接种疫苗的小鼠进行对比，可作为一种检测丙型肝炎病毒疫苗活性的方法。2、实验动物：7周的雄性C57小鼠(购自中国军事医学科学院)，疫苗组11只；对照组4只。3、实验方法接种疫苗

在试验的第1天，14天和21天：即接种肿瘤前的第28天，14天和7天，疫苗组分别四肢皮下注射20μg卡介苗热休克蛋白65和多表位HCV核心抗原融合蛋白重组蛋白疫苗；对照组分别四肢皮下注射同疫苗组同体积生理盐水。培养B-16细胞

采用含10％的灭活胎牛血清的IMDM培养基培养(购自GIBCO公司)B16细胞。在注射之前，在培养基中加入10％条件培养基培养24小时。

条件培养基制备方法：

1.将C57小鼠脱颈处死后，在75％乙醇中浸泡1-2分钟。

2.无菌状态下取小鼠脾脏，置于装有2ml 10％FBS IMDM的无菌平皿里。

3.用无菌毛玻璃片将脾脏磨碎，用1ml加样器反复吹打将毛玻璃片上的残余细胞冲洗至平皿中。

4.将细胞悬液经200目尼龙网滤至10ml玻璃试管内。

5.加入2ml 0.83％NH₄Cl，室温放置10分钟以破裂红细胞。

6.1000rpm离心5分钟，弃上清。

7.用2ml 10％FBS IMDM重悬细胞，将细胞移入一50ml细胞培养瓶中，补加4ml 10％FBS IMDM。

8.加入ConA至终浓度5mg/ml。37℃，5％CO₂培养24小时。

9.培养12-24h期间观察脾细胞的变化，高倍镜下可观察到部分细胞变大，变圆，并可见核分裂相。

10.将细胞悬液移至一个无菌10ml管，2000rpm离心5-10分钟，将上清分装至1.5ml管中。装载8R-polyHCV核心抗原多表位蛋白

将200ug 8R-polyHCV核心抗原多表位蛋白与10ul Lipotectin混均后加入细胞培养基中孵育4小时。接种肿瘤

取7只免疫鼠每只小鼠注射1×10⁵个转染8R-polyHCV核心多表位的B16细胞；对照组4只，每只小鼠注射1×10⁵个转染转染8R-polyHCV核心多表位的B16细胞。注射部位是小鼠右后肢腹侧皮下。在接种肿瘤后的第15天，杀鼠取瘤，测量小鼠肿瘤块大小及重量。4、实验结果及结论

动物肿瘤重量平均值：注射转染8R-polyHCV核心多表位的B16细胞的疫苗组为1.59g，对照组为3.28g，对照组与疫苗组差异明显(p＜0.01)。图12所示为疫苗组和对照组小鼠肿瘤形成状况的对比照片。

由于疫苗组和对照组小鼠接种的肿瘤细胞来源及数量完全相同，疫苗组小鼠肿瘤重量明显低于对照组，说明疫苗组小鼠接种的肿瘤细胞受到一定程度的特异性杀伤。造成这一现象的原因是疫苗组小鼠体内存在针对HCV核心抗原表位的CTL，能特异性杀伤表达HCV核心抗原表位的靶细胞。结论是此卡介苗热休克蛋白65和多表位HCV核心抗原融合蛋白重组蛋白疫苗能激活丙型肝炎病毒特异性CTL，这种CTL能以MHC限制的方式杀伤和抑制表达HCV核心抗原表位的靶细胞。

实施例9体外特异性CTL杀伤试验1材料：8R-polyHCV核心抗原多表位蛋白、B16细胞。2、实验动物：7周的雄性C57小鼠(购自中国军事医学科学院)，疫苗组4只；对照组4只。3、实验方法接种疫苗

在试验的第1天，14天和21天，疫苗组分别四肢皮下注射20μg卡介苗热休克蛋白65和多表位HCV核心抗原融合蛋白重组蛋白疫苗；对照组分别四肢皮下注射同疫苗组同体积生理盐水。实验步骤：a.靶细胞的制备：

1.B16细胞培养至覆盖100ml细胞培养瓶底30-40％(约1×10⁶个细胞)，弃培养液，加入8ml无血清IMDM和1ml条件培养基。37℃，5％CO₂培养12-24小时。

2.弃掉培养液，用0.25％胰酶消化细胞3分钟，吸弃胰酶，用4ml 10％FBS IMDM重悬细胞。

3.将100-200pmol的8R-多表位HCV核心抗原多聚体蛋白(8R-polyHCV)与5-7ul的Lipofectin混合，室温放置10分钟后加入细胞悬液，轻轻混匀，37℃，5％CO₂培养3-4小时。

4.用吸管吹吸、重悬细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清。用110ul 10％FBS IMDM重悬细胞，置于同位素标记管中。取10ul稀释100倍计数，记录。

5.加入100ul⁵¹Cr(0.2mCi)，37℃，5％CO₂培养1小时。

6.用含10％FBS的IMDM冲洗细胞四次，每次2ml。

7.用5ml含10％FBS及10％条件培养基的IMDM重悬细胞，均匀铺于96孔板，每孔加入100ul细胞悬液，含1×10⁴个细胞。

b.效应细胞的制备：

1.将免疫三次后的C57小鼠脱颈处死，在75％乙醇里浸泡1-2分钟。

2.在超净台中无菌取小鼠脾脏，置于装有2ml 10％FBS IMDM的无菌平皿里。

3.用无菌毛玻璃片将脾脏磨碎，用1ml加样器反复吹洗毛玻璃片上的细胞。

4.将细胞悬液经200目尼龙网滤至10ml试管内。

5加入2ml 0.83％氯化氨(NH₄Cl)，室温放置10分钟。

6. 1000rpm离心5分钟，弃掉上清。

7.用2ml 10％FBS IMDM重悬细胞，将细胞移入一50ml培养瓶中，补加4ml 10％FBS IMDM。

8.加入10％条件培养基及200ug的疫苗(卡介苗Hsp65-单拷贝多表位HCV核心抗原融合蛋白)。37℃，5％CO₂培养三天后，补加10％条件培养基及200ug的疫苗。继续培养四天。

9.取同一只小鼠的淋巴结共9个，置于一无菌平皿中，加入2ml 10％FBSIMDM，，用无菌毛玻璃片将淋巴结研碎，用1ml加样器反复吹洗毛玻璃片上的细胞至培养液中。

10.将细胞悬液经200目无菌尼龙网滤至50ml培养瓶中，加入3ml 10％FBSIMDM。

11.加入10％条件培养基及200ug的疫苗(卡介苗Hsp65-单拷贝多表位HCV核心抗原融合蛋白)。37℃，5％CO₂培养三天后，补加10％条件培养基及200ug的疫苗。继续培养四天。

12.将培养了7天的脾细胞及淋巴结细胞取出，计数，调整细胞浓度。按不同效靶比(200∶1，100∶1 50∶1)将效应细胞加入已铺好靶细胞的96孔板，每孔加100ul，每个效靶比设三复孔。

13.轻轻敲击96孔板板的四周以使细胞更好的混匀，置于平板离心机200rpm离心1-2分钟。37℃，5％CO₂培养12小时。

14.离心96孔板，3000rpm，5分钟。每孔吸出100ul上清，测放射性。

特异杀伤率(％)＝实验孔rpm—自发释放rpm/最大释放rpm—自发释放rpm实验结果如表1和图13所示：对照组特异杀伤率在三种效靶比中无明显差别，为0％-1.1％

    疫苗组特异杀伤率：效靶比50∶1为-10％

                      效靶比100∶1为-24％

                      效靶比200∶1为-56％

结论是经卡介苗热休克蛋白65-多表位HCV核心抗原融合蛋白重组蛋白疫苗免疫的小鼠体内分离的淋巴细胞能特异性地杀伤表达HCV核心抗原表位的B16细胞。说明此卡介苗热休克蛋白65和多表位HCV核心抗原融合蛋白重组蛋白疫苗能激活丙型肝炎病毒特异性CTL，这种CTL能以MHC限制的方式杀伤表达HCV核心抗原表位的靶细胞。

   表1

                   特异性杀伤率(％)

                             效靶比   50∶1

    效应细胞来源   鼠1       鼠2      鼠3       鼠4       平均值PBS组   脾             -1.1      0.6      1.2       -0.8      -0.025

       淋巴结      -0.4      0.3      1.6       0.4       0.45疫苗组  脾             8.2       7.8      6.4       7.4       4.45

       淋巴结      9.3       11.4     8.6       9.7       9.75

                             效靶比   100∶1PBS组   脾             0.5       1.1      -0.2      -0.6      0.2

       淋巴结      0.8       1.3      0.7       1.2       1疫苗组  脾             18.6      19.4     23.8      23.6      21.35

       淋巴结      23.3      26.7     25.9      29.2      26.13

                             效靶比   200∶1PBS组   脾             0.6       1.3      -0.1      0.9       0.65

       淋巴结      -0.2      1.8      0.9       1.7       1.05疫苗组  脾             48.9      51.2     53.4      46.3      49.95

       淋巴结      59.4      63.8     62.7      57.6      60.85

                   序列表<110>北京迪威华宇生物技术有限公司<120>预防和治疗人丙型肝炎病毒感染的重组疫苗及其用途<130>I020106<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>16<212>PRT<213>Hepatitis C virus<400>1Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Glu Ile Asp Asp1               5                   10                  15<210>2<211>18<212>PRT<213>Hepatitis C virus<400>2Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Glu1               5                   10                  15Asp Ser<210>3<211>22<212>PRT<213>Hepatitis C virus<400>3Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala1               5                   10                  15Glu Asn Asp Glu Ile Glu

        20<210>4<211>18<212>PRT<213>Hepatitis C virus<400>4Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Asn1               5                   10                  15Asp Glu<210>5<211>20<212>PRT<213>Hepatitis C virus<400>5Leu Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Glu1               5                   10                  15Ile Asp Asn Glu

        20<210>6<211>1965<212>DNA<213>Artificial<220><221>CDS<222>(1)..(1965)<223><400>6atg gcc aag aca att gcg tac gac gaa gag gcc cgt cgc ggc ctc gag    48Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu1               5                   10                  15cgg ggc ttg aac gcc ctc gcc gat gcg gta aag gtg aca ttg ggc ccc       96Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro

        20                  25                  30aag ggc cgc aac gtc gtc ctg gaa aag aag tgg ggt gcc ccc acg atc      144Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile

    35                  40                  45acc aac gat ggt gtg tcc atc gcc aag gag atc gag ctg gag gat ccg      192Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro

50                  55                  60tac gag aag atc ggc gcc gag ctg gtc aaa gag gta gcc aag aag acc      240Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr65                  70                  75                  80gat gac gtc gcc ggt gac ggc acc acg acg gcc acc gtg ctg gcc cag      288Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln

            85                  90                  95gcg ttg gtt cgc gag ggc ctg cgc aac gtc gcg gcc ggc gcc aac ccg      336Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro

        100                 105                 110ctc ggt ctc aaa cgc ggc atc gaa aag gcc gtg gag aag gtc acc gag      384Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu

    115                 120                 125acc ctg ctc aag ggc gcc aag gag gtc gag acc aag gag cag att gcg      432Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala

130                 135                 140gcc acc gca gcg att tcg gcg ggt gac cag tcc atc ggt gac ctg atc      480Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser lle Gly Asp Leu Ile145                 150                 155                 160gcc gag gcg atg gac aag gtg ggc aac gag ggc gtc atc acc gtc gag      528Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu

            165                 170                 175gag tcc aac acc ttt ggg ctg cag ctc gag ctc acc gag ggt atg cgg      576Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg

        180                 185                 190ttc gac aag ggc tac atc tcg ggg tac ttc gtg acc gac ccg gag cgt      624Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg

    195                 200                 205cag gag gcg gtc ctg gag gac ccc tac atc ctg ctg gtc agc tcc aag     672Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys

210                 215                 220gtg tcc act gtc aag gat ctg ctg ccg ctg ctc gag aag gtc atc gga     720Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly225                 230                 235                 240gcc ggt aag ccg ctg ctg atc atc gcc gag gac gtc gag ggc gag gcg     768Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala

            245                 250                 255ctg tcc acc ctg gtc gtc aac aag atc cgc ggc acc ttc aag tcg gtg     816Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val

        260                 265                 270gcg gtc aag gct ccc ggc ttc ggc gac cgc cgc aag gcg atg ctg cag     864Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln

    275                 280                 285gat atg gcc att ctc acc ggt ggt cag gtg atc agc gaa gag gtc ggc     912Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Val Gly

290                 295                 300ctg acg ctg gag aac gcc gac ctg tcg ctg cta ggc aag gcc cgc aag     960Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys305                 310                 315                 320gtc gtg gtc acc aag gac gag acc acc atc gtc gag ggc gcc ggt gac    1008Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ala Gly Asp

            325                 330                 335acc gac gcc atc gcc gga cga gtg gcc cag atc cgc cag gag atc gag    1056Thr Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu

        340                 345                 350aac agc gac tcc gac tac gac cgt gag aag ctg cag gag cgg ctg gcc    1104Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala

    355                 360                 365aag ctg gcc ggt ggt gtc gcg gtc atc aag gcc ggt gcc gcc acc gac    1152Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Asp

370                 375                 380gtc gaa ctc aag gag cgc aag cac cgc atc gag gat gcg gtt cgc aat    1200Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn385                 390                 395                 400gcc aag gcc gcc gtc gag gag ggc atc gtc gcc ggt ggg ggt gtg acg    1248Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr

            405                 410                 415ctg ttg caa gcg gcc ccg acc ctg gac gag ctg aag ctc gaa ggc gac    1296Leu Leu Gln Ala Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp

        420                 425                 430gag gcg acc ggc gcc aac atc gtg aag gtg gcg ctg gag gcc ccg ctg    1344Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu

    435                 440                 445aag cag atc gcc ttc aac tcc ggg ctg gag ccg ggc gtg gtg gcc gag    1392Lys Gln Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu

450                 455                 460aag gtg cgc aac ctg ccg gct ggc cac gga ctg aac gct cag acc ggt    1440Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly465                 470                 475                 480gtc tac gag gat ctg ctc gct gcc ggc gtt gct gac ccg gtc aag gtg    1488Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val

            485                 490                 495acc cgt tcg gcg ctg cag aat gcg gcg tcc atc gcg ggg ctg ttc ctg    1536Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu

        500                 505                 510acc acc gag gcc gtc gtt gcc gac aag ccg gaa aag gag aag gct tcc    1584Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser

    515                 520                 525gtt ccc ggt ggc ggc gac atg ggt ggc atg gat ttc cat atg gct agc    1632Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe His Met Ala Ser

530                 535                 540gaa ttc atg tct act aac ccg aaa ccg cag cgt aaa act aaa gaa atc    1680Glu Phe Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Glu Ile545                 550                 555                 560gac gac ttc gct gac ctg atg ggt tac atc ccg ctg gtt ggt gct ccg    1728Asp Asp Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro

            565                 570                 575ctg gaa gac tct gaa ggt gtt tac ctg ctg ccg cgt cgt ggc ccg cgc    1776Leu Glu Asp Ser Glu Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg

        580                 585                 590ctg ggc gtt cgc gct gaa aac gac gaa atc gaa ggt ccg cgt ctg ggt    1824Leu Gly Val Arg Ala Glu Asn Asp Glu Ile Glu Gly Pro Arg Leu Gly

    595                 600                 605gtt cgt gct act cgt aaa act tct gaa cgt aac gac gaa ctg cgt aaa     1872Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Asn Asp Glu Leu Arg Lys

610                 615                 620acc tcc gaa cgt tct cag ccg cgt ggt cgt cgt cag gaa atc gac aac     1920Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Glu Ile Asp Asn625                 630                 635                 640gaa aag ctt gcg gcc gca ctc gag cac cac cac cac cac cac tga         1965Glu Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His

            645                 650<210>7<211>654<212>PRT<213>Artificial<400>7Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu1               5                   10                  15Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro

        20                  25                  30Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile

    35                  40                  45Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro

50                  55                  60Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr65                  70                  75                  80Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln

            85                  90                  95Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro

        100                 105                 110Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu

    115                 120                 125Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala

130                 135                 140Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile145                 150                 155                 160Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu

            165                 170                 175Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg

        180                 185                 190Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg

    195                 200                 205Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys

210                 215                 220Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly225                 230                 235                 240Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala

            245                 250                 255Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val

        260                 265                 270Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln

    275                 280                 285Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Val Gly

290                 295                 300Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys305                 310                 315                 320Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ala Gly Asp

            325                 330                 335Thr Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Gln Glu Ile Glu

        340                 345                 350Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala

    355                 360                 365Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Asp

370                 375                 380Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn385                 390                 395                 400Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr

            405                 410                 415Leu Leu Gln Ala Ala Pro Thr Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp

        420                 425                 430Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu

    435                 440                 445Lys Gln Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu

450                 455                 460Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly465                 470                 475                 480Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val

            485                 490                 495Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu

        500                 505                 510Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser

    515                 520                 525Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe His Met Ala Ser

530                 535                 540Glu Phe Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Glu Ile545                 550                 555                 560Asp Asp Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro

            565                 570                 575Leu Glu Asp Ser Glu Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg

        580                 585                 590Leu Gly Val Arg Ala Glu Asn Asp Glu Ile Glu Gly Pro Arg Leu Gly

    595                 600                 605Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Asn Asp Glu Leu Arg Lys

610                 615                 620Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Glu Ile Asp Asn625                 630                 635                 640Glu Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His

            645                 650<210>8<211>285<212>DNA<213>Artificial<220><221>CDS<222>(1)..(285)<223><400>8atg tct act aac ccg aaa ccg cag cgt aaa act aaa gaa atc gac gac        48Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Glu Ile Asp Asp1               5                   10                  15ttc gct gac ctg atg ggt tac atc ccg ctg gtt ggt gct ccg ctg gaa        96Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Glu

        20                  25                  30gac tct gaa ggt gtt tac ctg ctg ccg cgt cgt ggc ccg cgc ctg ggc       144Asp Ser Glu Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly

    35                  40                  45gtt cgc gct gaa aac gac gaa atc gaa ggt ccg cgt ctg ggt gtt cgt       192Val Arg Ala Glu Asn Asp Glu Ile Glu Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg

50                  55                  60gct act cgt aaa act tct gaa cgt aac gac gaa ctg cgt aaa acc tcc       240Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Asn Asp Glu Leu Arg Lys Thr Ser65                  70                  75                  80gaa cgt tct cag ccg cgt ggt cgt cgt cag gaa atc gac aac gaa           285Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Glu Ile Asp Asn Glu

            85                  90                  95<210>9<211>95<212>PRT<213>Artificial<400>9Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Glu Ile Asp Asp1               5                   10                  15Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Glu

        20                  25                  30Asp Ser Glu Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly

    35                  40                  45Val Arg Ala Glu Asn Asp Glu Ile Glu Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg

50                  55                  60Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Asn Asp Glu Leu Arg Lys Thr Ser65                  70                  75                  80Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Glu Ile Asp Asn Glu

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Claims (20)

1.一种重组蛋白疫苗，它是由卡介苗热休克蛋白65和多表位丙型肝炎病毒核心抗原融合而形成的融合蛋白。

2.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其中所述的多表位丙型肝炎病毒核心抗原由如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5所示的序列的肽段相互连接形成。

3.  按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其中所述的多表位丙型肝炎病毒核心抗原可以是1-5个拷贝。

4.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其具有选自如下的任一氨基酸序列：

1)SEQ ID No：7所示的氨基酸序列；和

2)由在严紧的杂交条件下与编码1)的氨基酸序列的核苷酸序列杂交的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

5.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其中所述的单拷贝多表位丙型肝炎病毒核心抗原具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。

6.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，其中卡介苗热休克蛋白65位于该融合蛋白的氨基端，多表位丙型肝炎病毒核心抗原位于该融合蛋白的羧基端。

7.按照权利要求1所述的重组蛋白疫苗，它具有SEQ ID No：7所示的氨基酸序列。

8.编码权利要求1至6中任意一项所述的重组蛋白疫苗的核苷酸序列。

9.按照权利要求8所述的核苷酸序列，其具有选自如下的任一序列：

1)SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；和

2)由在严紧的杂交条件下与1)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

10.按照权利要求7所述的基因，它具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

11.含有权利要求8-10中任一项的核苷酸序列的表达载体。

12.含有权利要求11的表达载体的宿主细胞。

13.按照权利要求12所述的宿主细胞，其为原核细胞，真核细胞或哺乳动物细胞。

14.一种制备权利要求1-6中任一项的重组蛋白疫苗的方法，包括培养如权利要求12或13所述的宿主细胞。

15.权利要求1-6中任一项所述的重组蛋白在制备用于预防和治疗丙型肝炎病毒感染的疫苗制品中的用途。

16.按照权利要求15所述的用途，其中所述的丙型肝炎病毒感染是丙型肝炎。

17.一种用于预防丙型肝炎病毒感染的疫苗制品，含有权利要求1-6中任一项所述的重组蛋白和载体或赋形剂。

18.按照权利要求17所述的疫苗制品，其中所述的丙型肝炎病毒感染是丙型肝炎。

19.一种用于研究丙型肝炎病毒疫苗的免疫效果的细胞模型，包括B-16细胞装载的多表位丙型肝炎病毒核心抗原。

20.一种用于研究丙型肝炎病毒疫苗的免疫效果的方法，包括使用如权利要求19所述的细胞模型以研究丙型肝炎病毒疫苗是否激发特异性CTL并产生保护作用。

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