SK281878B6 - Kapsidové proteíny papilomavírusu, spôsob ich prípravy a čistenia, farmaceutické prostriedky s ich obsahom a ich použitie - Google Patents

Abstract

Sú opísané kapsidové proteíny papilomavírusu typu HPV 6a, HPV 11 alebo HPV 16, ktoré sú pripravené spôsobom, pri ktorom sa transformuje kvasinková bunka rekombinantnou DNA kódujúcou uvedené proteíny a následnou kultiváciou, izoláciou a čistením sú získané rekombinantné proteíny s najmenej 70 %-nou čistotou. Takto získané proteíny sa používajú na prípravu vakcín a farmaceutických prostriedkov na liečbu infekcie, prípadne na výrobu činidla na detekciu papilomavírusu alebo protilátok proti nemu a tiež na výrobu liečiva na vyvolanie imunitnej odozvy stavovcov.ŕ

Description

Vynález sa týka čistených rekombinantných papilomavírusových (PV) proteínov a spôsobu prípravy, hodnotenia, použitia a formulácie týchto proteínov a farmaceutických prostriedkov s ich obsahom.

Doterajší stav techniky

Infekcia papilomavírusmi (PV) sa vyskytuje u rôznych živočíchov, medzi ktoré patria ľudia, ovce, psy, mačky, králiky, opice, hady a kravy. Papilomavírusy infikujú epiteliálne bunky, zvyčajne vyvolávajú benígne epiteliálne alebo fibroepiteliálne nádory v mieste infekcie. Papilomavírusy sú druhovo špecifické infekčné agensy; ľudské papilomavírusy infikujú len človeka.

Papilomavírusy sa na základe hostiteľa, ktorého infikujú, môžu zaraďovať do odlišných skupin. Ľudské papilomavírusy (HPV) sa ďalej rozdeľujú na viac než 70 typov v závislosti od homológie DNA sekvencie. Papilomavírusy sa javia byť typovo špecifickými imunogénmi. Imunita neutralizujúca infekciu jedným typom papilomavírusu nezaručuje imunitu proti iným typom papilomavírusov.

U ľudí rôzne typy ľudských papilomavírusov (HPV) spôsobujú rôzne ochorenia. Ľudské papilomavírusy (HPV) typu 1, 2, 3, 4, 7, 10 a 26 až 29 spôsobujú u ľudí s normálnou a narušenou imunitou benígne bradavice. Ľudské papilomavírusy (HPV) typu 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19 až 25, 36 a 46 až 50 spôsobujú u ľudí s narušenou imunitou plytké lézie. Ľudské papilomavírusy (HPV) typu 6, 11, 34, 39, 41 až 44 a 51 až 55 spôsobujú benígne kondylomaty na slizniciach pohlavných orgánov a dýchacieho ústrojenstva. Ľudské papilomavírusy (HPV) typu 16 a 18 spôsobujú epiteliálne dysplazie genitálnych slizníc a sú spájané s väčšinou karcinómov in situ a invazívnych karcinómov maternicového čapíka, pošvy, vulvy a análnej trubice.

Papilomavírusy sú malé (50 až 60 nm), ikosaedrické, DNA vírusy, bez vírusového obalu. Nesú až osem včasných a dva neskoré gény. Otvorené čítacie reťazce (ORF) vírusového genómu sú označené El až E7 a L1 a L2, kde „E“ znamená včasný (early) a „L“ znamená neskorý (late). L1 a L2 otvorené čítacie rámce kódujú vírusové kapsidové proteíny. Včasné gény (značené E) zodpovedajú za funkcie ako sú replikácia vírusu a transformácia bunky.

Proteín označený L1 je hlavný kapsidový protein a jeho molekulová hmotnosť je 55 až 60 kDa. Proteín označený L2 je menej významný kapsidový proteín, ktorého predpokladaná molekulová hmotnosť je 55 až 60 kDa, elektroforéza na polyakrylovom géli stanovila hodnotu jeho molekulovej hmotnosti na 75 až 100 kDa. Imunologické údaje naznačujú, že väčšina L2 proteínu leží vo vnútri proteínu Ll. Otvorený čítací rámec L1 je medzi rôznymi papilomavírusmi vysoko stály. Proteín L2 je medzi rôznymi papilomavírusmi menej stály.

Gény označené ako Ll a L2 sú vhodnými cieľmi pre imunoprofylaxiu. Tiež niektoré včasné gény sa javia ako potenciálne ciele na vývoj vakcíny. Štúdie na systémoch králičích papilomavírusov (cottontail rabbit papilomavirus; CRPV) a hovädzích papilomavírusov (BPV) ukázali, že zvieratá imunizované týmito proteínmi, ktoré boli exprimované v baktériách, alebo použitím vektorov vakcinácie, boli chránené proti vírusovej infekcii. Expresia papilomavirusových génov Ll v expresných systémoch bakulírov alebo použitím vektorov vakcínie vedie k vytvoreniu partikúl, ktoré sú podobné vírusovým partikulám (virus-like particles; VLP). Tieto partikuly sa používajú na vyvolanie imu nologickej odozvy, vzniká vysoký titer protilátok neutralizujúci vírus, čo spôsobuje ochranu proti vírusu. Gény Ll a L2 sa používajú na vytvorenie vakcíny na prevenciu a liečenie papilomavírusových infekcií u zvierat. Gény Ll a L2 ľudského papilomavírusu typu 16 sa klonovali do vektora vírusu vakcínie. Výsledný vektor sa použil na liečenie cicavčích buniek CV-1 s cieľom tvoriť partikuly podobné vírusovým partikulám (VLP).

Vývoju a komercializácii profylaktických a liečebných vakcín papilomavírusovej infekcie a ochorení, ktoré obsahujú proteín Ll, proteiny Ll a L2 alebo modifikované Ll alebo Ll a L2 proteiny, bráni to, že nie je prístupné veľké množstvo čisteného vírusu a proteínu. Vzhľadom na to, že nie je ľahké kultivovať papilomavírusy in vitro, je tiež ťažké pripraviť rozmnožením papilomavírusov in vitro požadované množstvo proteínu Ll a L2. Preto je problematická charakterizácia papilomavírusuov a ich proteínov. Z týchto dôvodov je užitočné vyvinúť ľahko obnoviteľný zdroj surových papilomavírusových proteínov, zvlášť papilomavírusových proteínov Ll a L2 alebo modifikovaných proteínov Ll a L2. Je tiež užitočné vyvinúť spôsob čistenia veľkého množstva surových papilomavírusových proteínov na úroveň čistoty, ktorá je vhodná pre imunologické štúdie a vývoj vakcíny. Vhodná sa javí aj príprava veľkého množstva papilomavírusových proteínov, ktoré majú imunitu prepožičiavajúcu vlastnosti prírodných proteínov, ako je konformácia prírodného proteínu. Ďalej je vhodné vytvoriť spôsob analýzy papilomavírusových proteínov a spôsob určenia relatívnej čistoty a zloženia týchto proteínov. Také vysoko čisté proteiny sa môžu použiť na prípravu rôznych činidiel na štúdium papilomavírusovej infekcie; takéto činidlá zahrnujú napríklad polyklonálne protilátky, monoklonálne protilátky a analytické štandardy.

Vynález opisuje vysoko čistené papilomavírusové proteíny Ll a L2. Vynález ďalej zahrnuje spôsob prípravy a čistenia rekombinantných papilomavírusových proteinov, ktoré vykazujú imunitu prepožičiavajúcu vlastnosti prírodných papilomavírusových proteínov. Vynález sa týka prípravy profylaktických a liečebných vakcín pre papilomavírusovú infekciu. Rekombinantné proteiny podľa vynálezu sú schopné tvoriť partikuly podobné vírusovým partikulám (VLP). Tieto partikuly sú imunogénické a bránia tvorbe bradavíc u zvieracieho modelu. Vynález je doložený príkladom modelových systémov rekombinantných z kvasiniek odvodených proteínov Ll, Ll a L2 králičieho papilomavírusu (CRPV), ľudského papilomavírusu typu 6 (subtypu 6a) a ľudského papilomavírusu typu 16. Spôsob čistenia a analýzy podľa vynálezu sa môže upraviť pre iné typy ľudských papilomavírusov, iné proteiny ľudských papilomavírusov a iné rekombinantné expresné systémy.

Podstata vynálezu

Vynález sa týka čistených rekombinantných papilomavírusových (PV) proteínov a spôsobu prípravy, hodnotenia, použitia a formulácie týchto proteínov.

Konkrétne vynález poskytuje kapsidový proteín papilomavírusu typu HPV6a, HPV11 alebo HPV16 izolovaný a čistený, vybraný zo skupiny, ktorá zahŕňa proteiny Ll, L2, L1+L2 a ich funkčné deriváty, pripravené v umelom systéme obsahujúcom rekombinantnú kvasinkovú bunku, pričom proteiny sú najmenej 70 %-nej čistoty, čo sa dosahuje čistením surového proteínu chromatografickou kolónou obsahujúcou živicu na báze poly(styrén-divinylbenzénu).

SK 281878 Β6

Ďalšie uskutočnenia vynálezu zahrnujú napríklad rekombinantné molekuly DNA ľudského papilomavírusu, RNA komplementárnu k molekulám rekombinantnej DNA papilomavírusu, proteíny kódované molekulami rekombinantnej DNA, protilátky proti molekulám rekombinantnej DNA a proteínom, ktoré sa k ním vzťahujú, kompozície obsahujúce DNA, RNA, proteíny alebo protilátky, spôsoby použitia DNA, RNA, proteínov alebo protilátok a ich derivátov. Takéto deriváty napríklad zahrnujú peptidy a proteíny kódovanej DNA, protilátky proti DNA alebo protilátky proti proteínom kódovaným DNA, vakcíny obsahujúce DNA alebo proteíny kódované DNA, imunologické kompozície zahrnujúce DNA alebo proteíny kódované DNA, súpravy obsahujúce DNA alebo RNA odvodené od DNA alebo proteínov kódovaných DNA.

Vznikol rekombinantný L1 a L2 hovädzieho papilomavírusu pochádzajúceho z baktérií. Séra neutralizujúce rekombinantné bakteriálne proteíny vykazujú slabú kríženú reakciu s prirodzeným vírusom, čo je pravdepodobne spôsobené rozdielmi v konformácii prirodzených a z baktérií pochádzajúcich proteínov.

Rekombinantné bakulovírusy exprimujú otvorené čítacie rámce (ORF) proteínov L1 alebo L2 ľudského papilomavírusu typu 16 (HPV 16) sa používajú na infekciu buniek hmyzu SF9 a na prípravu proteínov L1 a L2. Analýza spôsobom Westem blot ukazuje, že proteíny L1 a L2 produkované bakulovírusmi reagujú s protilátkami proti ľudskému papilomavírusu typu 16 (HPV 16). Proteín L1 odvodený z bakulovírusu tvorí partikuly podobné vírusovým partikulám (VLP).

Spomína sa produkcia surových proteínov L1 a L2 ľudského papilomavírusu typu 16 (HPV 16) rekombinantnými kmeňmi Saccharomyces cerevisiae. Rekombinantné proteíny sa produkujú vo forme vnútrobunkových a vylučovacích produktov. V prípade, že sa proteíny exprimujú vnútrobunkovo a bunky sa lyžujú bez účasti denaturačného činidla, väčšina proteínov sa nachádza v nerozpustnej forme. Čistota proteínu sa neudáva.

Rekombinantné proteíny vylučované kvasinkami obsahujú sacharidy pochádzajúce z kvasiniek. Prítomnosť týchto cez dusík viazaných oligosacharidov môže prekryť prirodzené epitópy. Ďalej vylučované rekombinantné proteíny môžu obsahovať iné modifikácie ako retenciu sekrečnej vedúcej sekvencie. Sekrečný proces môže byť tiež menej účinný.

Vývoju a komercializácii profylaktických a liečebných vakcín papilomavírusovej infekcie a ochorenia, ktoré obsahujú proteín L1 a proteíny L1 a L2 alebo modifikované L1 alebo L1 a L2 proteíny, bráni to, že nie je prístupné veľké množstvo čisteného vírusu a proteínu. Vzhľadom na to, že nie je ľahké kultivovať papilomavírusy in vitro, je tiež ťažké pripraviť rozmnožením papilomavírusov in vitro požadované množstvo proteínu L1 a L2. Preto je problematická chemická, imunologická a biologická charakterizácia papilomavírusov a ich proteínov. Z týchto dôvodov je užitočné vyvinúť ľahko obnoviteľný zdroj surových papilomavírusových proteínov, zvlášť papilomavírusových proteínov L1 a L2 alebo modifikovaných proteínov LÍ a 12. Je tiež užitočné vyvinúť spôsoby čistenia veľkého množstva surových papilomavírusových proteínov na úroveň čistoty, ktorá je vhodná pre imunologické štúdie a vývoj vakcíny. Vhodná sa zdá tiež príprava veľkého množstva papilomavírusových proteínov, ktoré majú imunitu prepožičiavajúcu vlastnosti prirodzených proteínov, ako je konformácia prirodzeného proteínu. Ďalej je vhodné vytvoriť spôsob analýzy papilomavírusových proteínov a spôsob určenia relatívnej čistoty a zloženia týchto proteínov. Takéto vysoko čisté proteíny sa môžu použiť na prípravu rôznych činidiel na štúdium papilomavírusovej infekcie; takéto činidlá zahrnujú napríklad polyklonálne protilátky, monoklonálne protilátky a analytické štandardy.

Farmaceutický využiteľné kompozície, obsahujúce DNA alebo proteíny, kódované DNA sa môžu tvoriť podľa známych metód, ako je pridanie farmaceutický prijateľných nosičov. Príklady takýchto nosičov a metód tvorenia kompozícií sa nachádzajú v Remington's Pharmaceutical Sciences. S cieľom vytvoriť farmaceutický prijateľnú kompozíciu vhodnú na účinnú aplikáciu, tieto kompozície obsahujú účinné množstvo proteínu alebo partikúl podobných vírusovým partikulám (virus-like particles; VLP). Takéto kompozície môžu obsahovať proteíny alebo partikuly podobné vírusovým partikulám (virus-like particles; VLP), odvodené z viacerých než jedného typu ľudského papilomavírusu.

Liečebné alebo diagnostické kompozície podľa vynálezu sa podávajú osobe v množstve, ktoré je dostatočné na liečenie alebo na diagnostiku papilomavírusových infekcií. Účinné množstvo môže kolísať podľa radu faktorov takých, ako sú individuálna kondícia, váha, pohlavie a vek. Iné faktory zahrnujú spôsob podania. Väčšinou sa kompozícia podáva v dávkach v rozmedzí približne od 1 pg do 1 mg.

Existujú rôzne spôsoby podávania farmaceutických kompozícií, ako sú podkožné, lokálne, ústne, mukozálne, intravenózne a intramuskuláme.

Vakcíny podľa vynálezu obsahujú DNA, RNA alebo proteíny kódované DNA, ktoré obsahujú antogénne determinanty nevyhnutné na vyvolanie tvorenia neutralizujúcich protilátok v hostiteľovi. Takéto vakcíny sú dostatočne bezpečné, aby sa mohli podávať bez nebezpečenstva klinickej infekcie; nemajú toxické vedľajšie účinky; môžu sa podávať účinným spôsobom, ako stabilné a kompatibilné s vakcínovými nosičmi.

Vakcíny sa môžu podávať rozličnými spôsobmi: ústne, parenterálne, podkožné, mukozálne, intravenózne alebo intramuskuláme. Dávka kolíše v závislosti od kondície, pohlavia, váhy a veku osoby; od spôsobu podania; a typu papilomavírusu, ktorý sa vo vakcíne použil. Vakcína sa môže podávať vo forme kapsúl, suspenzií, elixírov alebo kvapalných roztokov. Vakcína sa môže tvoriť s imunologický prijateľným nosičom.

Vakcíny sa podávajú v množstve, ktoré je účinné na liečbu, čo znamená v množstve dostatočnom na vyvolanie imunologický ochrannej odozvy. Účinné množstvo na liečbu môže kolísať podľa typu papilomavírusu. Vakcína sa môže podávať v jednej alebo viacerých dávkach.

Čistené proteíny podľa vynálezu sa môžu používať pri tvorení imunogénnych kompozícií. Takéto kompozície, po ich zavedení do vhodného hostiteľa, sú schopné vyvolať v hostiteľovi imunitnú odozvu.

Čistené proteíny podľa vynálezu alebo ich deriváty sa môžu používať na tvorbu protilátok. Tu použitý termín „protilátka“ zahrnuje polyklonálne protilátky rovnako ako ich fragmenty také, ako sú F v, Fab a F(ab)2 fragmenty, ktoré sú schopné väzby na antigén alebo haptén.

Proteíny alebo ich deriváty podľa vynálezu sa môžu použiť na serotypovanie infekcie spôsobenej ľudskými papilomavírusmi alebo na ich skríning. Čistené proteíny, partikuly podobné vírusovým partikulám a protilátky sa dajú použiť v súprave, ktorá je vhodná na detekciu a serotypovanie ľudských papilomavírusov. Takáto súprava by mala obsahovať najmenej jeden oddelený kontajner, v ktorom bude tesne uzavretý nosič. Nosič zahrnuje reagencie, ktorými sú rekombinantné proteíny L1 alebo L2 ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) alebo partikuly podobné ví3 rusovým partikulám (virus-like particles; VLP) alebo protilátky, vhodné na detekciu rozličných typov ľudských papilomavírusov. Ďalšou súčasťou nosiča, na účely detekcie, môže byť značený antigén alebo enzýmové substráty a podobne.

Čistené proteíny sa tiež používajú ako imunologické štandardy, markery na určenie molekulárnej váhy a veľkosti molekúl.

Vzhľadom na to, že genetický kód je degenerovaný, môže sa používať viac než jeden kodón na kódovanie jednotlivej aminokyseliny, a preto aminokyselinová sekvencia môže byť kódovaná ľubovoľnou súpravou podobných oligonuklcotidov DNA. Len jeden člen tejto sady bude zhodný so sekvenciou ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) alebo typu 16 (HPV16), ale bude schopný za vhodných podmienok hybridizovať s DNA ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) alebo typu 16 (HPV16) dokonca aj v prítomnosti oligonukleotidov DNA s chybným párovaním. Pri alternatívnych podmienkach oligonukleotidy DNA s chybným párovaním môžu stále hybridizovať s DNA ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) alebo typu 16 (HPV16), a tak umožňujú detekciu a izoláciu DNA, ktorá kóduje ľudský papilomavírus typu 6a (HPV6a) alebo typu 16 (HPV16).

Čistená DNA ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) alebo typu 16 (HPV16) podľa vynálezu alebo jej fragmenty sa môžu používať na izoláciu a čistenie homológov a fragmentov ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) z iných zdrojov. S týmto cieľom sa najskôr DNA ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) zmieša za vhodných hybridizačných podmienok so vzorkou, ktorá obsahuje DNA kódujúce homológy ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a). Ďalej sa môže izolovať komplex hybridizovanej DNA, z ktorého sa môže získať DNA, kódujúca homológnu DNA.

Je známe, že rôzne kodóny, ktoré kódujú špecifické aminokyseliny, obsahujú podstatné množstvo nadbytočnej informácie. Preto sa tento vynález týka aj tých sekvencií DNA, ktoré obsahujú alternatívne kodóny kódujúce konečnú transláciu zhodnej aminokyseliny. Na účely tejto špecifikácie sekvencia nesúca jeden alebo viac zameniteľných kodónov sa bude definovať ako degenerovaný variant. Predmetom vynálezu sú tiež mutácie. Ide o mutácie sekvencie DNA alebo translačného proteínu, ktorý v podstate nemení konečné fyzikálne vlastnosti exprimovaného proteínu. Napríklad náhrada valínu leucínom, arginínu lyzínom alebo asparagínu glutamínom nemôže zmeniť funkčnosť polypeptidu.

Je známe, že sekvencie DNA, kódujúce peptid sa môžu zmeniť tak, aby kódovali peptid, majúci odlišné vlastnosti od tých, ktoré charakterizujú prirodzene sa vyskytujúci peptid. Metódy pozmeňujúce sekvencie DNA zahrnujú, ale nie sú obmedzené na miestne cielenú mutagenézu.

Tu používaný termín „funkčný derivát“ ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) znamená látku, ktorá má biologickú aktivitu (buď funkčnú alebo štruktúrnu), ktorá sa podstatne podobá biologickej aktivite ľudského papilomavirusu typu 6a (HPV6a). Termín „funkčné deriváty“ zahrnuje „fragmenty“, „varianty“, „degenerované varianty“, „analógy“ a „homológy“ alebo „chemické deriváty“ ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a). Termín „fragment“ sa vzťahuje na ľubovoľný polypeptid ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a),. Termín „variant“ znamená molekulu podstatne podobnú štruktúre a funkcii buď celej molekuly ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) alebo jej fragmentu. Molekula je „podstatne podobná“ ľudskému papilomavírusu typu 6a (HPV6a), ak obe molekuly majú podstatne podobnú štruktúru alebo ak obe molekuly majú podobnú biologickú aktivitu. Preto, ak dve molekuly majú podstatne podobnú aktivitu, sú považované za varianty dokonca, ak štruktúra jednej z molekúl sa nenachádza u tej druhej alebo dokonca, ak dve aminokyselinové sekvencie nie sú identické. Termín „funkčný derivát“ nezahrnuje ľudský papilomavírus typu 6a (HPVóa).

Termín „analóg“ znamená molekulu podstatne funkčne podobnú buď celej molekule ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) alebo jej fragmentu.

Na klonovanie DNA ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) sa môžu používať rôzne metódy. Tieto metódy zahrnujú, ale nie sú obmedzené na priamu funkčnú expresiu génov ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a), po ktorej nasleduje konštrukcia cDNA ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) alebo knižnice genómovej DNA vo vhodnom expresnom vektorovom systéme. Ďalšou metódou je skríning cDNA ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) alebo knižnice genómovej DNA, vytvorenej v bakteriofágu alebo plazmidovom vektore, pomocou značenej oligonukleotidovej sondy, odvodenej z aminokyselinovej sekvencie ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a). Ďalšie metódy zahrnujú skríning cDNA ľudského papilomavírusu typu 6a (HPVóa) alebo knižnice genómovej DNA, vytvorenej v bakteriofágu alebo v plazmidovom vektore, neúplnou DNA, ktorá kóduje ľudský papilomavírus typu 6a (HPVóa). Táto parciálna DNA sa získa amplifikáciou DNA fragmentu ľudského papilomavírusu typu 6a (HPVóa) pomocou špecifickej polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), pre ktorú je potrebné vytvoriť degenerované primery z aminokyselinovej sekvencie čisteného ľudského papilomavírusu typu 6a (HPVóa). Ďalšia metóda je izolácia RNA z buniek produkujúcich ľudský papilomavírus typ 6a (HPVóa) a translácia RNA na proteín pomocou in vitro alebo in vivo translačného systému. Translácia RNA na peptid alebo proteín povedie k produkcii najmenej časti proteínu HPVóa, ktorý sa môže určiť napríklad aktivitou tohto proteínu alebo imunologickou reaktivitou s antiHPVóa protilátkami. Pri tejto metóde sa môže skúmať celková RNA izolovaná z buniek, produkujúcich ľudský papilomavírus typu 6a (HPVóa) na prítomnosť RNA, kódujúci prinajmenšom časť ľudského papilomavírusu typu 6a (HPVóa). Ďalšia frakcionácia celkovej RNA prebehne oddelením RNA ľudského papilomavírusu typu 6a od ostatnej RNA. Peptid alebo proteín produkovaný touto metódou sa môže skúmať za účelom poskytnutia aminokyselinových sekvencií, ktoré sa používajú na vytvorenie primerov na produkciu cDNA ľudského papilomavírusu typu 6a. Ďalej RNA používaná na transláciu sa môže skúmať s cieľom poskytnúť nukleotidové sekvencie, kódujúce ľudský papilomavírus typu 6a (HPVóa) a sondy, vhodné na skining knižnice cDNA ľudského papilomavírusu typu 6a (HPVóa). Tieto metódy sú v danej oblasti techniky známe a sú uvedené napríklad v publikácii Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. in Molecular Cloning: A Laboratory Manuál, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Je zrejmé, že ďalšie typy knižníc rovnako ako knižnice, vytvorené z iných buniek alebo bunkových typov sa môžu použiť na izoláciu DNA, kódujúcej ľudský papilomavírus typu 6a (HPVóa). Ďalšie typy knižníc zahrnujú, ale nie sú obmedzené na knižnice cĎNA, odvodené z iných buniek alebo bunkových línií, ktoré obsahujú ľudský papilomavírus typ 6a alebo knižnice genómovej DNA.

Rad spôsobov je vhodný na prípravu knižníc cDNA. Tieto metódy sa uvádzajú napríklad v publikácii Sambrook, J. a ďalší, ako je uvedené. Je zrejmé, že DNA, kódujúca

SK 281878 Β6 ľudský papilomavírus typu 6a sa môže tiež izolovať z vhodnej knižnice genómovej DNA. Na vytvorenie knižníc genómovej DNA sa môže použiť rad metód, ktoré sa opisujú v publikácii Sambrook, J., a ďalší, ako je uvedené.

Klonovaná DNA ľudského papilomavírusu typu 6a alebo jej fragmenty, ktoré je možné získať tu opísanými metódami, sa môžu po molekulárnom klonovaní do expresných vektorov, obsahujúcich vhodný promótor a ďalšie vhodné transkripčné regulačné elementy rekombinantne exprimovať. Tieto vektory sa vnášajú do prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských buniek kvôli produkcii rekombinantného ľudského papilomavírusu typu 6a. Metódy na uvedené manipulácie sa plne opisujú v publikácii Sambrook, J. a ďalší, ako je uvedené a sú v danej oblasti techniky známe.

Expresné vektory sa tu definujú ako sekvencie DNA, ktoré sa vyžadujú na transkripciu klonovaných kópii génov a transláciu ich mRNA vo vhodnom hostiteľovi. Takéto vektory sa môžu používať na expresiu eukaryotických génov v rôznych hostiteľoch ako sú baktérie, sinice, rastlinné bunky, hmyzie bunky, bunky húb a živočíšne bunky. Špecificky vytvorené vektory umožňujú prenos DNA medzi hostiteľmi takými, ako sú baktéria-kvasinka alebo baktéria-živočišna bunka, alebo baktéria-bunky húb, alebo baktériabunky stavovcov. Vhodne konštruovaný expresný vektor by mal obsahovať začiatok replikácie pre autonómnu replikáciu v hostiteľských bunkách, selekčné markery, obmedzený počet reštrikčných miest, potenciál pre vysoký počet kópií a aktívne promótoiy. Promótor sa definuje ako sekvencia DNA, ktorá riadi RNA polymerázu, aby naviazala na DNA, a tak iniciovala syntézu RNA. Silný promótor sa vyznačuje vysokou frekvenciou iniciácie transkripcie. Expresné vektory zahrnujú, ale nie sú obmedzené na klonovacie vektoty, modifikované klonovacie vektory, špecificky vytvorené plazmidy alebo vírusy.

Rôzne cicavčie expresné vektory sa môžu používať na expresiu DNA ľudského papilomavírusu typu 6a alebo ich fragmentov v cicavčích bunkách. Bežne dostupné cicavčie expresné vektory, ktoré môžu byť vhodné na rekombinantnú expresiu ľudského papilomavírusu typu 6a, zahrnujú, ale nie sú obmedzené na pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBV-l(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVNEO (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) a ZD35 (ATCC 37565).

Rôzne bakteriálne expresné vektory sa môžu používať na expresiu DNA ľudského papilomavírusu typu 6a alebo ich fragmentov v bakteriálnych bunkách. Bežne dostupné bakteriálne expresné vektory zahrnujú, ale nie sú obmedzené na pETIIa (Novagen), lambda gtll (Invitrogen), pcDNA -II (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).

Rôzne expresné vektory húb sa môžu používať na expresiu DNA ľudského papilomavírusu typu 6a alebo ich fragmentov v bunkách húb. Bežne dostupné expresné vektory húb zahrnujú, ale nie sú obmedzené na pYES2 (Introgen) a Pichia expresný vektor (Invitrogen).

Rôzne expresné vektory buniek hmyzu sa môžu používať na expresiu DNA ľudského papilomavírusu typu 6a alebo ich fragmentov v bunkách hmyzu. Bežne dostupné expresné vektory hmyzích buniek zahrnujú, ale nie sú na pBlue BacIII (Invitrogen) obmedzené.

Expresný vektor, obsahujúci DNA, kódujúci ľudský papilomavírus typu 6a (HPV6a) alebo jej fragmenty sa môže použiť na expresiu HPV6a proteínov alebo fragmentov HPV6a proteínov v bunke, tkanivách, orgánoch alebo v ži vočíchoch (zahrnujú sa aj ľudia). Hostiteľské bunky môžu byť prokaryotické alebo eukaryotické, zahrnujú, ale nie sú obmedzené na baktérie, ako je E. coli, bunky húb, ako je kvasinka, cicavčie bunky zahrnujúce, ale nie sú obmedzené na bunkové línie ľudského, hovädzieho, prasacieho, opičieho pôvodu a línie pochádzajúce z hlodavcov, ďalej hmyzie bunky zahrnujúce, ale nie sú obmedzené na bunkové línie získané z drozofily a z húseníc priadky morušovej. Vhodné a dostupné bunkové línie, získané z cicavčích druhov zahrnujú, ale nie sú obmedzené na L bunky L-M(TK') (ATCC CCL 1.3), L bunky L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CRL 1651), CHOK-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) a MRC-5 (ATCC CCL 171).

Expresné vektory sa môžu vniesť do hostiteľských buniek s použitím jednej alebo radu metód, medzi ktoré patrí transformácia, transfekcia, lipofekcia, fúzia protoplastov a elektroporácia. Bunky, obsahujúce expresné vektory sa klonálne rozmnožujú a skúma sa ich schopnosť produkovať HPV6a proteín. Na určenie klonu hostiteľských buniek exprimujúcich ľudský papilomavírus typu 6a sa môže použiť niekoľko spôsobov, ktoré zahrnujú, ale nie sú obmedzené na imunologickú reaktivitu s protilátkami proti ľudskému papilomavírusu typu 6a a preukázanie istej aktivity hostiteľských buniek, ktorá je spätá s výskytom ľudského papilomavírusu typu 6a. Ide o naviazanie ligandov špecifických pre ľudský papilomavírus typu 6a (HPV6a) alebo o signálnu transdukciu, ktorá sa definuje ako odozva, sprostredkovaná interakciou HPV6a špecifických ligandov s ľudským papilomavírusom typu 6a.

Na expresiu fragmentov DNA ľudského papilomavírusu sa tiež používa in vitro produkovaná syntetická mRNA alebo prirodzená mRNA. Syntetická mRNA alebo mRNA izolovaná z buniek produkujúcich ľudský papilomavírus typu 6a sa môže účinne prekladať v rôznych bezbunkových systémoch, ktoré zahrnujú, ale nie sú obmedzené na extrakty múčnych červov a extrakty retikulocytov, rovnako ako v bunkových systémoch, ktoré zahrnujú, ale nie sú obmedzené na preferovanú mikroinjektáž do žabích oocytov.

Nasleduje expresia HPV6a proteínov v hostiteľskej bunke. HPV6a proteín sa izoluje s cieľom získať jeho čistú formu. Existuje niekoľko vhodných a dostupných metód na čistenie HPV6a proteínu. Ako sa tu opisuje, rekombinantný HPV6a protein sa môže čistiť z bunkového lyzátu samostatnou aplikáciou alebo rôznymi kombináciami metód, medzi ktoré patrí frakcionácia pomocou soli, ionomeničová chromatografia, vylučovacia chromatografia, adsorpčná chromatografia na hydroxylapatite, chromatografia založená na hydrofóbnych interakciách.

Ďalej rekombinantný HPV6a proteín môže byť oddelený od iných bunkových proteínov použitím imunoafinitných kolón obsahujúcich monoklonálne alebo polyklonálne protilátky, ktoré sú špecifické pre plnú dĺžku vznikajúceho HPV6a proteínu alebo jeho polypeptidového fragmentu. Existuje celý rad metód na prípravu monoklonálnych a polygonálnych protilátok. Monoklonálne a monošpecifické protilátky tu používané sú definované ako jediný druh protilátok alebo viacnásobný protilátkový druh s homogénnou väzbovou charakteristikou vzhľadom na HPV6a proteínu. Homogénna väzbovosť je tu definovaná ako schopnosť určitého druhu protilátok viazať sa na špecifický epitóp alebo antigén.

Je zrejmé, že metódy na produkciu monošpecifických protilátok sa môžu využiť na prípravu protilátok, ktoré sú

SK 281878 Β6 špecifické proti fragmentom HPV6a polypeptidu alebo proti celej dĺžke nascentného HPV6a polypeptidu. Môžu sa teda vytvoriť protilátky, ktoré sú špecifické pre celkom funkčný HPVóa proteín alebo jeho fragmenty.

Tento vynález sa týka metód vhodných na vyhľadávanie zlúčenín, ktoré modulujú expresiu DNA alebo RNA kódujúcich HPVóa proteín rovnako ako ftmkciu(ie) HPVóa proteínu(ov) in vivo. Zlúčeniny, ktoré modulujú tieto aktivity môžu byť DNA, RNA, peptidy, proteíny alebo neproteínové organické molekuly. Tieto látky môžu zvýšiť alebo utlmiť expresiu DNA alebo RNA kódujúce HPVóa proteín alebo môžu ovplyvniť funkciu tohto proteínu. Na detekciu uvedených látok existuje rad testov. Jeden druh testov sú takzvané „áno/nie“ testy, ktoré sa používajú na určenie zmien v expresii alebo vo funkcii. Test sa môže hodnotiť kvantitatívne porovnaním expresie alebo funkcie testovanej vzorky so štandardnou vzorkou.

Ak súprava obsahuje DNA ľudského papilomavírusu typu 6a, fragmenty DNA ľudského papilomavírusu typu 6a, protilátky proti DNA ľudského papilomavírusu typu 6a alebo proti HPVóa proteínu, môže sa pripraviť RNA ľudského papilomavírusu typu 6a alebo HPVóa proteín. Takéto súpravy sa používajú na detekciu DNA, ktorá hybridizuje s DNA ľudského papilomavírusu typu 6a, alebo na detekciu prítomnosti HPVóa proteínu(ov) alebo peptidových fragmentov vo vzorke. Takáto charakterizácia je využiteľná na rôzne účely medzi ktoré patrí, ale nie je obmedzená na súdne analýzy a epidemiologické štúdie.

Nukleotidové sekvencie, ktoré sú komplementárne k DNA sekvencii, kódujúcej ľudský papilomavírus typu 6a, sa môžu syntetizovať s cieľom tzv. „antisense“ terapie (bráni transkripcii DNA). Medzi molekuly s uvedenou schopnosťou patria DNA, stabilné deriváty DNA, ako sú fosforotioáty a alebo metylfosfonáty, RNA, stabilné deriváty RNA také, ako 2'-O-alkyl-RNA alebo iné antioligonukleotidové napodobeniny ľudského papilomavírusu typu 6a. Anti-molekuly ľudského papilomavírusu typu 6a sa vnášajú do buniek mikroinjektážou, lipozómovou kapsuláciou alebo pomocou v bunke exprimovaného vektora, ktorý nesie anti-sekvenciu. HPVóa „antisense“ terapia sa môže zvlášť využiť pri liečení ochorenia, kde je nutné redukovať aktivitu ľudského papilomavírusu typu 6a.

Termín „chemický derivát“ opisuje molekulu, ktorá obsahuje ďalšie chemické časti, ktoré normálne nie sú súčasťou molekuly. Takéto chemické časti môžu zlepšiť napríklad rozpustnosť, polčas rozpadu, absorpciu základnej molekuly. Naopak chemické časti môžu aj utlmiť nežiaduce vedľajšie účinky základnej molekuly alebo jej toxicitu. Príklady takýchto chemických častí sú opísané v rôznych publikáciách ako je Remington’s Pharmaceutical Sciences.

Látky, ktoré sa určujú metódami tu uvedenými, sa môžu používať samostatne vo vhodných dávkach stanovených rutinnými testami s cieľom dosiahnuť optimálnu inhibiciu ľudského papilomavírusu typu 6a alebo jeho aktivity, pričom sa minimalizuje potenciálna toxicita. Navyše sa môže vyžadovať súčasné alebo následné podávanie ďalších činidiel.

Výhodné je podávať látky podľa vynálezu raz denne alebo rozdeliť celkovú dennú dávku do viacerých dávok. Látky sa môžu podávať rôznymi spôsobmi, napríklad: intranazálne, transdermálne, formou čapíkov, ústne a podobne.

Pri kombinovanej liečbe s viacerými než jedným aktívnym činidlom, kde aktívne látky existujú v oddelených dávkových formách, sa môžu tieto látky podávať súčasne alebo rozložené v inom čase.

Dávkový režim látok podľa vynálezu je závislý od mnohých faktorov, napríklad typu, species, veku, váhy, po hlavia a zdravotného stavu pacienta; pacientovej funkcie obličiek a pečene a zvlášť od použitej aktívnej látky. Lekár môže ľahko určiť a predpísať účinné množstvo lieku, ktoré je nutné na prevenciu, kontrolu alebo zastavenie postupu príznakov. Určenie rozmedzia koncentrácie lieku, v ktorom je látka účinná a nie toxická, vyžaduje optimálnu presnosť. Účinná koncentrácia aktívnej látky je závislá od kinetiky jej dostupnosti v cieľových miestach, čo zahrnuje distribúciu, rovnováhu a vylučovanie lieku.

Pri metódach podľa vynálezu tu opísané látky môžu tvoriť aktívne prísady a sú väčšinou podávané v zmesi s vhodne vybranými farmaceutický prijateľnými riedidlami alebo nosičmi (tu sú zhrnuté pod názvom „nosné materiály“) s ohľadom na zamýšľanú formu podávania, t j. orálne tablety, kapsuly, elixíry, sirupy, čapíky, gély a podobne, v súlade s bežnou farmaceutickou praxou.

Napríklad s cieľom ústne podať tabletové alebo kapsulové formy sa môže aktívna látka kombinovať s orálnym, netoxickým, farmaceutický prijateľným, inertným nosičom, ako je etanol, glycerol, voda a podobne. Pokiaľ je to nutné, do zmesi sa ďalej môžu začleniť spojivá, mazadlá, dezintegračné a farbiace činidlá. Vhodné spojivá sú škrob, želatína, prírodné cukry, ako sú glukóza alebo beta-laktóza, kukuričné sladidlá, prirodzené alebo syntetické gumy, ako sú akácie, tragakant alebo alginát sodný, karboxymetylcelulóza, polyetylénglykol, vosky a podobne. Mastivá, ktoré sa používajú v týchto dávkovacích formách zahrnujú oleát sodný, stearát sodný, stearát horečnatý, benzoát sodný, acetát sodný, chlorid sodný a podobne. Dezintegračné činidlá zahrnujú škrob, metylcelulózu, agar, bentonit, xantánovú gumu a podobne.

V prípade kvapalných foriem aktívnej zložky sa môžu kombinovať s aromatickými suspendujúcimi alebo dispergačnými činidlami, ako sú syntetické a prírodné gumy, napríklad tragakant, akácia, metylcelulóza a podobne. Ďalším dispergačným činidlom, ktoré sa môže použiť, je glycerín a podobne. V prípade parenterálneho podávania sa vyžaduje sterilná suspenzia a roztoky. Izotonické prípravky, ktoré spravidla obsahujú vhodné konzervačné činidlá, sa používajú na intravenózne podávanie.

Lokálne prípravky obsahujú aktívnu zložku, ktorá môže byť v zmesi s rôznymi nosičovými materiálmi dobre známymi v danej oblasti techniky, sú to alkoholy, gél aloe vera, alantoín, glycerín, oleje s vitamínom A a E, minerálny olej, PPG2 myristylpropionát a podobne, tvoria napríklad alkoholické roztoky, lokálne čističe, čistiace krémy, kožné gély, pleťové vody alebo krémové alebo gélové šampóny.

Látky podľa vynálezu sa môžu tiež podávať pomocou lipozomálnych zavádzacích systémov, ako sú malé unilameláme vačky, veľké unilameláme vačky a multilameláme vačky. Lipozómy sa môžu tvoriť z rôznych fosfolipidov, ako sú cholesterol, stearylamín alebo fosfotidylcholíny.

Látky podľa vynálezu sa môžu tiež zavádzať pomocou monoklonálnych protilátok, ktoré slúžia ako jednotlivé nosiče, s ktorými je molekula látky spojená. Látky podľa vynálezu sa môžu tiež spájať s rozpustnými polymérmi, ktoré slúžia ako cielené nosiče. Takéto polyméry zahrnujú polyvinylpyrolidón, kopolymér pyránu, polyhydroxypropylmetakrylamid-fenol, poly-hydroxyetylaspartamid-fenol, alebo polyetylénoxid-polylyzín substituovaný palmitoylovým zvyškom. Ďalej sa látky podľa vynálezu môžu viazať na biologicky rozložiteľné polyméry, ktoré sa používajú na riadené uvoľňovanie liekov, sú to napríklad polymér kyseliny mliečnej, polyepsilón kaprolaktónu, kyselina polyhydroxykaprolaktónová, kyselina polyhydroxybutánová, polyortoestery, polyacetály, polydihydropyrány, polykyanoak

SK 281878 Β6 ryláty a zosieťované alebo amfipatické blokové kopolyméry hydrogélov.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje dvojsmerný kvasinkový expresný vektor, ktorý sa používa na expresiu kapsidových proteínov L1 a/alebo L2.

Na obr. 2 je elektrónový mikrograf partikúl podobných vírusovým partikulám (virus-like particles; VLP), ktoré obsahujú protcín L1 ľudského papilomavírusu typu 6a exprimovaných v kvasinkách.

Na obr. 3 je elektrónový mikrograf partikúl podobných partikulám (virus-like particles; VLP), ktoré obsahujú proteíny L1/L2 ľudského papilomavírusu typu 6a exprimovaných v kvasinkách.

Na obr. 4 je znázornená schéma konštrukcie kmeňa číslo 1558 5. cerevisiae.

Na obr. 5 je znázornená schéma konštrukcie kmeňa číslo 1569 S. cerevisiae.

Na obr. 6 sa opisujú základné kroky postupu čistenia.

Na obr. 7 je zoznam kmeňov.

Obr. 8 ukazuje analýzu spôsobom SDS-PAGE proteínu L1 + L2 ľudského papilomavírusu typu 16 (HPV16) získaného z kvasiniek. Vedľa konečných čistených partikúl podobných vírusovým partikulám (VLP) sa použili aj vzorky odobrané z jednotlivých krokov čistenia. Je zahrnutý gél sfarbený koloidnou Coomassie a Westem bloty testované antisérom proti proteínom L1 a L2.

Na obr. 9 sú alternatívne postupy čistenia proteínu L1 králičieho papilomavírusu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava kvasinkového kmeňa U9

Kmeň 2150-2-3 Saccharomyces cerevisiae (MATalpha, leu2-04, adel, cir ) sa získal od Dr. Lelanda Hartwella (University of Washington, Seattle, W. A). Bunky kmeňa 2150-2-3 sa rozmnožujú cez noc pri teplote 37 °C v 5 ml média YEHD (Carty a ďalší, J. Ind. Micro. 2 (1987) 117 až 121). Bunky sa trikrát premývajú sterilnou destilovanou vodou a resuspendujú sa 2 ml sterilnej destilovanej vody. 0,1 ml bunkovej suspenzie sa dá na každú zo šiestich platní s 5-fluór-orotovou kyselinou (FOA) kvôli selekcii ura3 mutantov (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Platne sa inkubujú pri teplote 30 °C. 250 ml média obsahuje: 3,5 g Difco kvasinkovú dusíkatú bázu bez aminokyselín a síranu amónneho; 0,5 g 5-fluór-orotovej kyseliny; 25 mg uracilu a 10 g dextrózy.

Médium sa sterilizuje filtráciou cez membránu s pórmi s veľkosťou 0,2 pm a potom sa zmieša s 250 ml 4 % Bactoagaru (Difco) udržovanom pri teplote 50 °C, s 10 ml roztoku adenínu s koncentráciou 1,2 mg/ml a s 5 ml roztoku L-leucínu (180 mg/ml). 20 ml takto získaného média sa naliali do každej Petriho misky.

Po piatich dňoch inkubácie sa objavil rad kolónií. Jednotlivé kolónie sa izolujú rozotrením na čerstvé FOA platne, ktoré sa inkubujú pri teplote 30 °C. Rad kolónií z druhej sady FOA platní sa testuje na prítomnosť ura3 mutantov vytvorením dvoch odtlačkov na YEHD platne bez uracilu. Požadovaný výsledok je dobrý rast na YEHD médiu a kolónie nerastú na médiu bez uracilu. Získal sa jeden izolát (U9), ktorý vykazuje tieto vlastnosti. Kmeň sa uchováva zmrazený v glycerole (kmeň číslo #325) pri teplote -70 °C.

Príklad 2

Príprava vektora na prerušenie kvasinkového génu MNN9

S cieľom pripraviť vektor na prerušenie kvasinkového génu MNN9, je nevyhnutné najskôr klonovať tento gén z genómovej DNA S. cerevisiae. To umožňuje štandardný spôsob polymerizačnej reťazovej reakcie (PCR). Vytvorili sa primery 5'-konca a 3'-konca vhodné na amplifikáciu celej dĺžky sekvencie kódujúcej MNN9 gén. (Zymogenetics: prihláška EPO č. 88117834.7, publikácie č. 0-314-096-A2). Použili sa tieto oligonukleotidové primery s lemovacou sekvenciou (podčiarknuté), ktorú rozoznáva reštrikčná endonukleáza HindlII·.

sense primer: 5’-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCTTGTATGG-3' antisense primer: 5-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3'

Iniciačný metionínový kodón pre gén MNN9 je zvýraznený tučným písmom. Polymerázová reťazová reakcia (PCR) prebieha s použitím genómovej DNA z kmeňa JRY 188 S. cerevisiae (Rine a ďalší) ako templátu, Tag DNA polymerázy (Perkin Elmer) a 25 cyklov amplifikácie (94 °C 1 minúta, 37 °C 2 minúty, 72 °C 3 minúty). Výsledný 1,2 kbp veľký fragment PCR sa štiepi restriktázou HindlII, čistí sa na géli a liguje sa vektorom pUC13 (Pharmacia), ktorý sa štiepil restriktázou HindlII a upravoval sa alkalickou fosfatázou. Výsledný plazmid sa označil pl 183.

Za účelom prerušenia génu MNN9 kvasinkovým génom URA3 sa plazmid pBR322-URA3 (obsahujúci 1,1 kbp veľký HindlII fragment kódujúci gén URA3 z S. cerevisiae subklonovaný do HindlII miesta plazmidu pBR322) štiepi restriktázou HindlII a 1,1 kbp veľký fragment DNA nesúci funkčný gén URA3 sa čistil na géli, T4 DNA polymerázou sa vytvoria tupé konce fragmentu a ten sa potom liguje s plazmidom pl 183, ktorý sa štiepil restriktázou PmlI (PmlI štiepi sekvenciu kódujúcu gén MNN9). Výsledný plazmid pl 199 obsahuje prerušenie génu MNN9 funkčným génom URA3.

Príklad 3

Konštrukcia kmeňa 1372 obsahujúceho prerušenie génu MNN9 a odvodeného z kmeňa U9.

S cieľom prerušiť gén MNN9 v kmeni U9 (#325) 30 pg plazmidu sa štiepilo restriktázou HindlII, aby vznikla kazeta mnn9::URA3. Bunky kmeňa č. 325 sa transformujú DNA plazmidu pl 199 štiepenou restriktázou HindlII pomocou sferoplastovej metódy (Hinnen a ďalší, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75::1929 až 1933) a transformanty sa selektujú na syntetickom agarovom médiu bez uracilu obsahujúci IM sorbitol. Syntetické médium obsahuje na jeden liter destilovanej vody: 20 g agaru, 6,7 g kvasinkovej dusíkatej bázy bez aminokyselín, 0,04 g adenínu, 0,05 g L-tyrozínu, 182 g sorbitolu, 20 g glukózy, 10 ml roztoku #2 bez leucínu. Roztok #2 bez leucinu obsahuje na 1 liter destilovanej vody: 2 g L-arginínu, 1 g histidínu, 6 g L-leucínu, 6 g L-izoleucínu, 4 g L-lyzínu, 1 g L-metionínu, 6 g L-fenylalanínu, 6 g L-treonínu a 4 g L-tryptofánu.

Pri inkubácii pri teplote 30 “C počas piatich dní sa objaví rad kolónií. Z desiatich kolónií sa pripravila chromozomálna DNA a štiepi sa restriktázami HindlII a EcoRI. Štiepená DNA sa hodnotí metódou Southem blot (Sambrook ďalší, Molecular Cloning: Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Ako sonda sa použije 1,2 kbp veľký HindlII fragment nesúci gén MNN9 (izolovaný z plazmidu pl 199). Určil sa izolát (kmeň #1372), ktorý vykazuje očaΊ

SK 281878 Β6 kávaný posun pruhu DNA na blote a extrémnu tvorbu zhlukov kolónií, čo je typické pre mnn9 mutanty.

Príklad 4

Konštrukcia vektor na prerušenie kvasinkového génu HIS3

Kvôli konštrukcii kazety, v ktorej gén HIS3 S. cerevisiae je prerušený génom URA3 sa plazmid YEp6 (K. Struhl a ďalší, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76: 1035) štiepi restriktázou BamHI a výsledný 1,7 kbp veľký BamHI fragment nesúci gén HIS3 sa čisti na géli, T4 DNA polymerázou sa upravia tupé konce a liguje sa s plazmidom pUC18, ktorý sa štiepil restriktázou BamHI a ošetril sa T4 DNA polymerázou. Vzniknutý plazmid (označený pl501 alebo pUC18-HIS3) sa štiepi restriktázou NheI (NheI štiepi sekvenciu kódujúcu gén HIS3) a fragment vektora sa čistí na géli, T4 DNA polymerázou sa upravia tupé konce a potom sa ošetril teľacou alkalickou fosfatázou (CIP). Gén URA3 sa izoluje štiepením plazmidu pBR-322-URA3 restriktázou HlndlII a 1,1 kbp veľký fragment nesúci gén URA3 sa čistí na géli, T4 DNA polymerázou sa upravia tupé konce a liguje sa s NheI fragmentom pUC18-HIS3. Výsledný plazmid (označený pUC18-his3::URA3 alebo pl505) obsahuje kazetu, v ktorej kvasinkový gén HIS3 je prerušený funkčným génom URA3.

Príklad 5

Konštrukcia vektora prerušenia kvasinkového génu PRB1 pomocou génu H1S3

Plazmid FP8 H nesúci gén PBRI z S. cerevisiae poskytol Dr. Jones z Camegie-Mellon University (C. M. Moehle a ďalší, 1987, Genetics 115: 255 až 263). Plazmid sa štiepil restriktázami HindlII a Xhol. 3,2 kbp veľký fragment DNA nesúci gén PBRI sa čistí na géli a T4 DNA polymerázou sa upravia tupé konce. Výsledný fragment vektora sa liguje s fragmentom, ktorý nesie gén PRB1. Vznikol plazmid pUC18-PRBl. Plazmid YEp6, ktorý obsahuje gén HIS3, sa štiepi restriktázou BamHI. Výsledný 1,7 kbp veľký BamHI fragment nesúci funkčný gén HIS3 sa čistil na géli a T4 DNA polymerázou sa upravili tupé konce. Plazmid pUC18-PRBl sa štiepil restriktázami EcoRV a Ncol, ktorý štiepi sekvenciu kódujúcu gén PRB1 a odstraňuje aktívne miesto proteázy B a lemovaciu sekvenciu. 5,7 kpb veľký EcoRV-Ncol fragment nesúci reziduálne 5' a 3'-časti kódujúce sekvenciu PRB1 génu v plazmide pUC18 sa čistil na géli, T4 DNA polymerázou sa upravili tupé konce, defosforyloval sa teľacou alkalickou fosfatázou a ligoval sa s fragmentom nesúcim gén HIS3, ktorý je zakončený tupými koncami. Výsledný plazmid (označený pCU18-prbl::HIS3, uchované pod číslom #1245) obsahuje funkčný gén HIS3 v mieste, kde sa odstránila časť génu PRB1.

Príklad 6

Konštrukcia kvasinkového od U9 kmeňa odvodeného kmeňa obsahujúceho prerušenie génov MNN9 a PRB1

Kmeň 1372, ktorý je odvodený od kmeňa U9 obsahuje prerušenie génu MNN9, sa opisuje v príklade 3. Klonálne izoláty kmeňa 1372 sa pasážujú na platniach s 5-fluórorotovou kyselinou (FOA) (ako opisuje príklad 1) kvôli selekcii ura3 mutantov. Získal sa rad izolátov kmeňa 1372 nesúci gén URA3 a jeden izolát (kmeň 12930-190-S1-1) sa vybral s cieľom prerušiť gén HIS3. Vektor nesúci prerušený gén HIS3 pUC18-his3::URA3 (p 1505) sa štiepil restriktázami Xbal a EcoRI s cieľom vytvoriť lineárnu kazetu his3::URA3, ktorá sa použije na transformáciu kmeňa 12930-190-S1-1 lítium acetátovým spôsobom. (Methods in Enzymology, 194: 290(1991)). Transformanty Ura⁺ sa selektujú na syntetickom agarovom médiu bez uracilu. S cie ľom nájsť klonálne izoláty sa jednotlivé kolónie prenášajú na uvedené médium a potom sa vytvorí replika platní na médiu, kde chýba buď uracil alebo histidín, a tak sa identifikujú izoláty, ktoré sú Ura⁺ a His’. Jeden izolát (kmeň 12930-230-1) sa vybral s cieľom vytvoriť podstatné prerušenie génu PRB1. Vektor nesúci prerušený gén PRB1 (pUC18-prbl::HIS3, #1245) sa štiepi restriktázami Sací a Xbal, aby sa vytvorila lineárna kazeta prbl::HIS3, ktorá sa použije na transformáciu kmeňa 129030-230-1 lítium acetátovým spôsobom. Transformanty HIs⁺ sa selektujú na agarovom médiu bez histidínu a jednotlivé izoláty sa rozotierajú na rovnakom médiu s cieľom získať klonálne izolátov. Genómová DNA sa pripravuje z radu výsledných His⁺ izolátov, ktoré sa štiepia restriktázou EcoRI a potom sa elektroforezujú na 0,8 % agarózovom géli. Potom nasleduje Southem blot analýza s použitím rádioaktívne značenej 617 bp veľkej sondy reagujúcej s génom PRB1, ktorá sa pripravuje polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s použitím oligonukleotidových primerov:

5' TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3'

5' CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3’

Získalo sa jedenásť izolátov, kde sonda hybridizuje s 2,44 kbp veľkým prbl::HIS3 fragmentom DNA. Čo je v kontraste s hybridizáciou sondy s 1,59 kbp veľkým fragmentom génu PRB1 divokého typu. Jeden z týchto izolátov obsahujúci požadované prbl::HIS3 prerušenie sa vybral na ďalšie použitie a označil sa ako kmeň #1558.

Príklad 7

Konštrukcia vektora na prerušenie kvasinkového génu PEP4

Gén PEP4 z S. cerevisiae sa klonuje z kvasinkovej genómovej knižnice nasledujúcim spôsobom. Bunky E. coli obsahujúce kvasinkovú genómovú knižnicu pLSIOl (Shultz and Friesen, 1983, J. Bacteriol. 155: 8 - 14) sa cez noc rozmnožil v 5 ml LB média, ktoré obsahuje 100 pg/ml ampicilínu. Riedenie 10‘⁴ a 10'⁵ tejto kultúry sa nanesú na platňu s LB médiom a ampicilínom. Pripraví sa otlačenie platne s kolóniami na nitrocelulózovú membránu. Polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s použitím Taq DNA polymerázy, celej plazmidovej DNA z kvasinkovej knižnice pLSIOl a nasledujúcich oligonukleotidových primerov pripravených na základe publikovanej DNA sekvencie pre gén PEP4 (C. A. Woolford a ďalší, Mol. Celí. Biol. 6: 2500 (1986) sa získa 600 bp veľká sonda pre kvasinkový gén PEP4.

sense primer: 5'-GAG GCT ACC AGC GAG CCG GGC-3' antisense primer: 5'-GGC CAG TGG GCC AAC AGG TTC-3'

Polymerázová reťazová reakcia prebieha v 25 cykloch (94 °C 1 min.; 37 °C 2 min.; 72 “C 3 min.). Sonda vytvorená polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) sa čistí na géli, rádioaktívne sa značí a používa sa na hybridizáciu s kolóniami na membráne, ktorá sa opisuje zhora. Pri niekoľkých kolóniách je hybridizácia s PEP4 sondou pozitívna. Tieto kolónie sa prenesú na LB médium s ampicilínom. Plazmidová DNA z niekoľkých týchto izolátov sa pripravuje alkalickou-SDS lýziou (Sambroock a ďalší, uvedené) a štiepi sa restriktázou BamHI. Zistili sa očakávané pruhy zodpovedajúce veľkosti 14 kbp veľkému vektoru a 6,9 kbp veľkému inzertu PEP4. Po štiepení s restriktázami EcoRI a Λ7;ο/ sa získa 1,5 kbp veľký pruh, zodpovedajúci génu PEP4. Jeden izolát (kmeň #860 E. cotí) vykazujúci očakávané výsledky sa vybral na ďalšie použitie. Plazmidová DNA z kmeňa #860 sa štiepi restriktázou BamHI a vzniknutý 6,9 kbp veľký BamHI fragment DNA nesúci chromozomálny gén PEP4 sa subklonuje do BamHI miesta plazmidu pUC13, vzniká plazmid

SK 281878 Β6 p890. Plazmid p890 sa potom štiepi restriktázou Ncol (ktorá štiepi kódujúcu sekvenciu génu PEP4), čistí sa na géli, T4 DNA polymerázou sa upravujú tupé konce a liguje sa s 1,1 kbp fragmentom s tupými koncami, ktorý nesie funkčný gén URA3 (pripravený podľa príkladu 2). Výsledný plazmid obsahuje gén PEP4 prerušený génom URA3 a označil sa ako pUC13-pep4::URA3 (kmeň #906).

Príklad 8

Konštrukcie kmeňov číslo 1569, 1538 a 1592, ktoré sú odvodené od kmeňa U9 a obsahujú mutanty prbl a pep4

S cieľom prerušiť gén HIS3 v kmeni U9 sa štiepi vektor pUC18-his3::URA3 restriktázami EcoRI a Xbal a potom sa použije na transformáciu kmeňa U9 lítium acetátovou metódou. Transformanty Ura⁺ sa selektujú na agarovom médiu bez uracilu. S cieľom nájsť klonálne izoláty sa jednotlivé kolónie prenášajú na uvedené médium a potom sa vytvorí replika platní na médiu, kde chýba buď uracil alebo histidín, a tak sa identifikujú izoláty, ktoré sú Ura⁺ a His. Jeden izolát (kmeň číslo 1524) sa vybral s cieľom vytvoriť podstatné prerušenie génu PRBl. Vektor nesúci prerušený gén PRB1 pUC18-pbrl: HIS3 sa štiepi restriktázami Sací a XCbal a potom sa používa na transformáciu kmeňa číslo 1524 lítium acetátovou metódou. Transformanty His⁺ sa selektujú na agarovom médiu bez histidínu. S cieľom nájsť klonálne izoláty sa jednotlivé kolónie prenášajú na uvedené médium. Genómová DNA sa pripravuje z radu výsledných His⁺ izolátov a hodnotí sa Southem blot hybridizáciou s rádioaktívne značenou sondou PRB1. Jeden z izolátov (kmeň číslo 1537), ktorý vykazuje požadované prerušenie génu PRB1 génom HIS3 (to je prbl:;HIS3), sa vybral na prerušenie génu PEP4. Kmeň číslo 1537 sa pasážuje na platniach s 5-fluórorotovou kyselinou (FOA) za účelom selekcie izolátov a jeden izolát (kmeň číslo 1541) sa vybral na ďalšie použitie.

S cieľom prerušiť gén PEP4 v kmeni číslo 1541 sa vektor nesúci prerušený gén PEP4 pUC13-pep4::URA3 štiepil restriktázou Xhol, aby sa vytvorila lineárna kazeta pep4::URA3, ktorá sa použije na transformáciu kmeňa číslo 1541 lítium acetátovým spôsobom. Transformanty Ura⁺ sa selektujú na agarovom médiu bez uracilu. S cieľom nájsť klonálne izoláty sa jednotlivé kolónie prenášajú na uvedené médium. Genómová DNA sa pripravuje z radu výsledných Ura⁺ transformantov a hodnotí sa metódou Southem blot s použitím rádioaktívne značenej sondy pre gén PEP4. Jeden izolát (kmeň číslo 1569) vykazujúci požadované prerušenie génu PEP4 génom URA3 sa vybral na ďalšie použitie. Kmeň číslo 1538 bol vytvorený v nezávislom pokuse rovnakou selekciou jednotlivých krokov. Kmeň číslo 1538 sa odvodil od kmeňa U9. Kmeň číslo 1538 obsahuje prbl a pep4 mutanty. Ďalej ura3 derivát kmeňa číslo 1569 sa získal pasážovaním na platniach s 5-fluórorotovou kyselinou (FOA). Výsledný ura3 derivát kmeňa číslo 1569 sa označil ako kmeň číslo 1592.

Príklad 9 Extrakcia nukleovej kyseliny z biopsie

Od 25-ročnej pacientky po pôrode sa získala veľká vulváma lézia condyloma acuminatum. Fragment tejto lézie sa zamrazil v kvapalnom dusíku, potom sa spracoval Braunovým mikrodismembrátorom II (B. Braun Instruments, Melsungen, Germany). Výsledný materiál sa rozpustil v 0,6 % (hmotnosť/objem) dodecylsulfáte sodnom (SDS), natravil sa proteinázou K v množstve 50 pg/ml a extrahoval sa zmesou fenol/chloroform/izoamylalkohol. DNA sa vyzrážala etanolom a jej množstvo sa určilo UV spektrofotometricky. Prítomnosť DNA s vysokou molekulovou hmotnosťou sa dokázala elektroforézou na agarózovom géli s následným zafarbením etídium bromidom.

Príklad 10

Typovanie DNA ľudského papilomavírusu

DNA ľudského papilomavírusu (HPV) sa určila použitím hybridného záchytového testu, ktorý sa nazýva Vira Type Plus (Digene Diagnostistics, Beltsville, MD). Používané HPV sondy sa rozdelili na dve časti, ktorých zloženie je dané vzťahom každého typu k malígnym nádorom genitálneho traktu. Skupina sond označená ako skupina A obsahuje málo rizikové typy ľudského papilomavírusu (HPV), sú to typ 6, 11, 42, 43 a 44. Sonda B obsahuje vysoko rizikové typy 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51 a 56. S cieľom určiť subtyp ľudského papilomavírusu (HPV) sa celková DNA štiepila reštrikčnými endonukleázami PstI, BamHI a Hindlll a nasledujúci Southemov prenos prebehol za vysoko prísnych podmienok, teplota topenia bola 15 °C.

Príklad 11

Klonovanie genómu ľudského papilomavírusu typu 6a

Celková DNA, ktorá extrahovala zo vzorky HPV6apozitívnej biopsie, sa štiepila endonukleázou HindlII. Ďalej nasleduje delenie na základe veľkosti na 0,8 % preparačnom géli vyhotovenom z agarózy topiacej sa za nízkej teploty. Z gélu sa vyrezala oblasť obsahujúca DNA s veľkosťou približne 8000 párov báz (bp) a agaróza sa štiepila s enzýmom Gelase™ (Epicentre Technologies, Inc., Madison, WI), vzorka sa ligovala do vektorov pUC18 (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ), štiepeným enzýmom HindlII a potom defosforylovaným. Nasledovala transformácia kompetentných DH5 buniek E. coli (Gibco, BRL, Gaithersburg, MD). Z plazmidovej knižnice sa vybrali klony pozitívne na HPV6a pomocou hybridizácie kolónií s oligonukleotidom odvodeným z pozitívneho reťazca DNA značeným ³²P. Oligonukleotid je komplementárny k 3'-koncu L1 génu ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) (5'-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3'; SEQ ID NO:1). Izoloval sa plazmid pUC18 obsahujúci 8,1 kbp veľký genóm ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) a charakterizoval sa pomocou štiepenia reštrikčným enzýmom a Southemovým prenosom. Tento plazmid sa označil ako pUC18-HPV6a. Plazmidová DNA sa pripravila použitím Quigen™ Plazmid Maxi kit (Quigen Inc., Chatsworth, CA).

Príklad 12

Sekvenčná analýza plazmidu pUC18-HPV6a

S cieľom určiť celú sekvenciu ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) sa na základe uverejnenej sekvencie ľudského papilomavírusu typu 6b (HPV6b) syntetizoval sekvenčný primer. Sekvenovali sa oba reťazce celého 8,1 kbp veľkého genómu ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) pomocou dideoxy reťazovej terminačnej metódy s použitím súpravy PR1SM™ a automatizovaného sekventátora Applied Biosystems (ABI) (č. 373A). Pri sekvenovaní sa postupovalo podľa inštrukcií výrobcu (ABI, Inc., Foster City, CA). V prípadoch, kde antikódujúca a kódujúca sekvencia nesúhlasí, syntetizovali sa ďalšie HPV6a špecifické primery s cieľom znova sekvenovať spornú oblasť v oboch smeroch.

Sekvencie DNA HPV6a a HPV6b sú na 97 % rovnaké, obsahujú z celkového počtu 8010 párov báz 229 párov báz odlišných V porovnaní so sekvenciou ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) sa našli najpodstatnejšie rozdiely v dlhej regulačnej oblasti (LCR; v polohe nukleotid 7205 až nukleotid 106). Nezávisle na niekoľkých jednotlivých zme9

SK 281878 Β6 nách nukleotidov v dlhej regulačnej oblasti ľudského papilomavírusu typu 6a, sa našli dve inzercie. Jedna je 94 párov báz veľká a je umiestnená v polohe nukleotid 7804. V porovnaní s genómom ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a) sa našla v polohe nukleotid 7 615 delécia s veľkosťou 6 párov báz.

Príklad 13

Konštrukcia kvasinkového expresného vektora pre proteín L1 ľudského papilomavírusu typu 6a (HPV6a Ll)

DNA ľudského papilomavírusu typu 6a sa použila ako templát na polymerázovú reťazovú reakciu (PCR). Gén HPB6a Ll sa amplifikuje polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s použitím Vent polymerázy (New England Biolabs, Inc.) v 35 cykloch (94 °C 1 min., 48 °C 1 min., 72 °C 1 min. 45 sekúnd) a nasledujúcich oligonukleotidových primerov, ktoré obsahujú lemovacie miesto rozoznateľné rcstriktázou Bglll (podčiarknuté):

sense primer: 5' -CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC GGC CTA GCG ACA GCA CAG-3' antisenseprimer: 5-GAG AGA TCT TAC CTTTTA GTT TTGGCG

CGC TTA C-3'

Sense primer zavádza kvasinkovú neprekladanú vedúcu sekvenciu bezprostredne k iniciačnému metionínovému kodónu (zvýraznené tučným písmom) proti smeru transkripcie génu HPV6a Ll. 1,5 kbp veľký produkt PCR sa štiepi restriktázou Bglll a čistí sa na géli. Konštrukcia expresného vektora pGALlO prebieha izoláciou 1,4 kbp veľkého Sphl fragmentu pochádzajúceho z vektora pUC18-GALlp-GALlOp obsahujúceho dvojsmerný promótor GAL. Vektor zahrnuje divergentoý promótor GAL1/GAL10 z plazmidu pBM272 (poskytol Dr. Mark Johnston, Washington Univcrsity, St. Luis), ktorý je na každej strane olemovaný kópiou kvasinkového transkripčného terminátora ADH1 (Bennetzen, J. L. and Halí, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257: 3018 až 3025). Ďalej zahrnuje BamHI klonovacie miesto nachádzajúce sa medzi GALI promótorom a prvou kópiou transkripčného terminátora ADH1 a Smal klonovacie miesto lokalizované medzi divergentným promótorom GAL 10 a druhou kópiou transkripčného terminátora ADH1. Kvasinkový pendlujúci vektor pozostávajúci z plazmidu pBR322, kvasinkového génu LEU2-d a kvasinkového 2 pm veľkého kruhu s reštrikčným miestom Sphl je ligovaný s 1,4 kbp veľkým Sphl fragmentom promótora GAL. Výsledný vektor pGALlO sa linearizuje restriktázou BamHI, ktorá rozoznáva reštrikčné miesto medzi promótorom GALI a transkripčným terminátorom ADH1. Vektor pGALlO štiepcný restriktázou BamHI a PCR fragment génu HPVóa Ll štiepený restriktázou Bglll sa ligujú a vzniknutý plazmid sa používa na transformáciu DH5 buniek E. coli (BRL). Izoloval sa plazmid pCl/l-GAL obsahujúci gén HPVóa Ll a označil sa ako pl3173-357-6. Gén Ll v plazmide pl3173-357-6 sa sekvenoval (ABI sekventátor číslo 3731) a ukazuje sa, že je identický ako gén Ll v klone pUC18-HPV6a.

Príklad 14

Konštrukcia kvasinkového expresného vektora génov HPVóa Ll a L2

Plazmid pl3173-357-6 (pGALlO a HPVóa Ll) sa štiepi restriktázou Smal, ktorý rozoznáva reštrikčné miesto medzi promótorom GAL 10 a transkripčným terminátorom ADH1.

1,4 kbp veľký gén HPVóa L2 sa amplifikuje polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s použitím DNA plazmidu pUC18-HPV6a ako templátu, Vent polymerázy (New En gland Biolabs, Inc.), amplifikácia prebieha v 10 cykloch (94 °C 1 min., 48 °C 1 min., 72 °C 1 min. 45 sekúnd) a používajú sa nasledujúce oligonukleotidové primery, ktoré obsahujú lemovaciu sekvenciu s Smal reštrikčným miestom (zvýraznené podčiarknutím):

sense primer: 5'-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGCCAGATA

GTA GGG CCC GAC GAC-3' antisenseprimer: 5-TCC CCC GGG CTA GGC CGCCAC ATC TGA

AAA AAA TAA GG-3'

Sense primer zavádza kvasinkovú neprekladanú vedúcu sekvenciu bezprostredne k iniciačnému metionínovému kodónu (zvýraznené tučným písmom) proti smeru transkripcie génu HPVóa L2. Produkt PCR sa štiepi restriktázou Smal, čistí sa na géli a liguje sa s plazmidom pl 3173-357-6 štiepeným restriktázou Smal. Izoloval sa plazmid pGALlO, ktorý obsahuje gény HPVóa Ll a L2, a označil sa ako p 14049-7-2. Gén L2 sa sekvenoval (ABI sekventátor #373A) a zistilo sa, že je zhodný s génom L2 z klonu pUC18-HP6a.

Príklad 15

Expresia HPVóa Lla koexpresia HPVóa Ll a L2 v kvasinkách Plazmidy pl 3173-357-6 (pGAL+HPVóa Ll) a pl4049-7-2 (pGALlO+HPVóa Ll a L2) sa používali na transformáciu kmeňov číslo 1569 (MATa, leu2-04, prbl, odel, pep4, cir³) a 1558 (MATa, leu2-04, prbl, odel, mnn9, cir³). Výsledné rekombinantné kmene získané použitím hostiteľského kmeňa číslo 1558 sú kmene číslo 1644 (HPVóa Ll) a kmeň číslo 1670 (HPVóa Ll + L2), ako sa uvádza v tabuľke. Klonálne izoláty sa kultivujú v YEHD médiu obsahujúcom 2 % galaktózy, pri teplote 30 “C a počas 68 až 78 hodín. Po získaní buniek, sa peleta buniek rozbije sklenenými guľôčkami a bunkový lyzát sa testuje imunoblotom, či dochádza k expresii proteínu HPVóa Ll alebo HPVóa L2. Vzorky obsahujúce 40 pg celkového bunkového proteínu sa elektroforezujú na 10 % Tris-glycínovom géli za redukujúcich a denaturujúcich podmienok a elektroblotujú sa na nitrocelulózové membrány. Proteín Ll sa imunodeteguje použitím králičieho séra proti íuznemu proteínu trpE-HPV11 (Brown, D. R. a ďalší, Virology 201: 46 - 54), ktorý slúži ako primáme protilátky a oslích anti-králičieho IgG celých protilátok (Amersham, Inc.) viazaných na chrenovú peroxidázu (HRP), ktoré sa používajú ako sekundárne protilátky. Na membrány sa použila chemoluminiscenčná ECL™ detekčná súprava (Amersham, Inc.). Vo všetkých vzorkách s výnimkou negatívnej kontroly) vektor bez génov Ll alebo L2) sa detegoval 50 až 55 kDa veľký pruh zodpovedajúci proteínu Ll.

Proteín L2 sa detegoval ako 70 kDa veľký pruh Westemovým testom s použitím séra z myší ako primárnych protilátok s riedením 1 : 250. Sérum sa pripravilo trojnásobnou imunizáciou myší fuznym proteínom trp-E-HPV6a L2, ktorý sa pripravil spôsobom podľa Carter a ďalší. Ako sekundárne protilátky sa použili ovčie anti-myšacie IgG (Amersham, Inc.) viazané na chrenovú peroxidázu (HRP) v riedení 1 :1000.

Kvôli EM testu (elektrónová mikroskopia (Structure Próbe, West Chester, PA) sa alikvotná časť každej vzorky umiestnila na medenú mriežku s 200 okami potiahnutú uhlíkom. Na mriežku sa kvapla na 20 sekúnd kvapka 2 % kyseliny fosforečnato-12-volfrámovej (PTA), pH 7,0. Pred použitím mikroskopu sa mriežka nechala vyschnúť na vzduchu. Mikroskopické pozorovanie sa uskutočnilo použitím JEOL 100CX transmisného elektrónového mikrosko10

SK 281878 Β6 pu (JEOL USA? Inc.) pri akceleračnom napätí 100 kV. Vzniknutý mikrograf má konečné zväčšenie 100 000 x,

Partikuly podobné vírusovým partikulám (VLP) sa pozorovali vo všetkých vzorkách kvasiniek. Ich priemer je v rozmedzí 50 až 55 nm. Kvasinky nesú buď HPV6a L1 alebo HPV6a L1 a L2 koexpresné plazmidy. V kontrolnej vzorke kvasiniek sa nepozorovali žiadne partikuly podobné vírusovým partikulám (VLP).

Príklad 16

Fermentácia HPV6a L1 + L2 (kmeň číslo 1670)

Kmeň číslo 1670 rastúci na povrchu platne sa prenesie do kvapalného média bez leucínu, ktoré obsahuje na jeden liter 8,5 g kvasinkovej dusíkatej bázy (Difco) bez aminokyselín a síranu amónneho, 0,2 g adeninu, 0,2 g uracilu, 10 g kyseliny jantárovej, 5 g síranu amónneho a 0,25 g L-tyrozínu, pH tohto média sa pred sterilizáciou upraví hydroxidom sodným na hodnotu 5,0 až 5,3. Kultúra sa kultivovala pri teplote 28 °C, počas 25 hodín na rotačnej miešačke pri otáčkach 250 otáčok/minútu. Zmrazená kultúra sa pripravila pridaním sterilného glycerolu v konečnej koncentrácii 17 % (v/o). Kultúra sa uchováva pri teplote -70 °C v alikvótach s objemom 1 ml v kryo-skúmavkách. Inokulum pre fermentáciu kmeňa číslo 1670 sa pripraví do rovnakého média (500 ml do dvojlitrovej nádoby) a prenosom rozmrazeného obsahu kryo-skúmaviek do dvojlitrových nádob a inkubuje sa pri teplote 28 °C, počas 25 hodín a mieša sa na rotačnej miešačke pri 250 otáčkach/minútu. Po inokulácii sa pre ďalšiu inkubáciu kmeňa číslo 1670 používa fermentor New Brunswick SF-116 s pracovným obsahom 101. Používané médium obsahuje na jeden liter 20 g kvasinkového extraktu (Difco), 10 g Sheffieldovho HySoy peptónu, 20 g glukózy, 20 g galaktózy, pH média pred sterilizáciou sa upraví na hodnotu 5,3. Celkový obsah (500 ml) dvojlitrovej inokulačnej nádoby sa prenesie do fermentora, kde sa kultúra inkubuje pri teplote 28 °C, prevzdušňuje sa 5 1 vzduchu za minútu, mieša sa pri 400 otáčkach/minútu a za tlaku 0,0245 MPa. Miešanie sa môže zintenzívniť, ak je nutné udržať hodnotu rozpusteného kyslíka vyššiu než 40 % saturácie. Priebeh fermentácie sa pozoruje meraním obsahu glukózy spôsobom off-linc (Bcckman Glokose 2 Analyzer) a hmotnostnou spektroskopiou (Perkin-Elmer 1200) spôsobom on-line. Po 69 hodinách inkubácie je hustota buniek 9,9 suchej bunkovej hmoty na jeden liter. Kultúra sa koncentruje filtráciou cez duté vlákna (náplň Amicon H5MPO1-43, filtračný systém Amicon DC-10) na objem približne 2 litre, diafiltruje sa s 2 1 fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanmi a pred preliatím do centrifúgačných fliaš s objemom 500 ml sa ďalej koncentruje (na objem približne 1 1). Bunková peleta sa získa centrifugáciou pri 8000 otáčkach/minútu (rotor Sorval GS3), počas 20 minút a pri teplote 4 °C. Po vyliatí supernatantu sa peleta (celkové množstvo 225 g mokrej váhy buniek) uchováva pri teplote -70 °C.

Príklad 17

Čistenie rekombinantných kapsidových proteínov HPV6a L1 + L2

Všetky kroky sa vykonávajú pri teplote 4 °C pokiaľ nie je uvedené inak.

Bunky kmeňa číslo 1670 sa uchovávajú v zmrazenej forme pri teplote -70 °C. Zmrazené bunky (mokrá váha 38 g) sa rozmrazujú pri teplote 20 až 23 °C a resuspendujú sa v 50 ml „pufra Ll“ (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Do pufra sa pridajú inhibítory proteázy PMSF a pepstatín A s konečnou koncentráciou 2 mM, respektíve 1,7 μΜ. Bunková suspenzia sa rozbije pri tlaku približne 56 MPa v troch cykloch v mikrofluidizéri Ml 10 (Microfluidics Corp., Newton, MA). Rozbité bunky sa centrifugujú pri 5000xg počas 10 minút, s cieľom odstrániť bunkový odpad. Odoberá sa supematant, ktorý obsahuje Ll + L2 antigén.

Supematant sa nariedi 1 : 5 pridaním pufra A (20 mM MOPS, pH 7,0) a aplikuje sa na anexovú záchytnú kolónu (5 cm v priemere x 4 cm). Náplňou kolóny je živica Fractogel^R EMD TMAE-650 (S) (EM Separation, Gibbstown, NJ) ekvilibrovaná pufŕom A. Nasleduje premytie pufrom A a antigén je vymytý gradientom 0 až 1,0 M NaCl v pufri A. Určenie, ktorá frakcia obsahuje proteín Ll sa uskutoční imuno-dot blotom.

Frakcie obsahujúce proteín Ll, ktoré sa určili imunodot blotom sa testujú s cieľom zistiť celkové množstvo proteínu pomocou Bradfordovej metódy nasledovanej SDS-PAGE s použitím farbenia striebrom a Westem blotu.

Zhromažďujú sa frakcie vykazujúce porovnateľnú čistotu a porovnateľné množstvo proteínu Ll. Antigén sa koncentruje frakcionalizáciou so síranom sodným. Roztok sa upravi na hodnotu 63 % saturovaného síranu sodného pridaním tuhého činidla, zatiaľ čo je jemne miešaný počas 30 minút. Vzorka sa umiestni na ľad a nechá sa precipitovať počas 30 minút, potom sa centrifuguje pri 12 OOOxg. Peleta sa resuspenduje v 20 ml PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH 7,2,150 mM NaCl).

Resuspendovaná peleta sa delí na vylučovacej chromatografickej kolóne s veľkosťou (priemer kolóny 2,6 cm x 89 cm) na základe veľkosti. Náplň kolóny je živica Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ), pufer je PBS. Chromatografia prebieha za teploty 20 až 23 °C. Frakcie sa testujú metódou SDS-AGE s použitím farbenia striebrom a detegujú sa Westem blotom. Zhromažďujú sa najčistejšie frakcie, ktoré sa potom koncentrujú.

Konečný produkt sa testuje metódou SDS-PAGE s použitím farbenia koloidnou Coomassie. Odhaduje sa, že proteíny Ll a L2 sú na 85 % homogénne. Či ide určite o proteíny Ll a L2 sa dokáže použitím príslušného antiséra. Konečný produkt sa rozdelí na alikvotné časti a uchováva sa pri teplote -70 °C. Týmto spôsobom sa získalo celkom 3 mg proteínu.

Pomocou štruktúrnej sondy (West Chester, PA) prebieha analýza elektrónovou mikroskopiou. Alikvotná časť každej vzorky sa umiestni na medenú mriežku s 200 okami potiahnutú uhlíkom. Na mriežku sa kvapla na čas 20 sekúnd kvapka 2 % kyseliny fosforečnano-12-volfrámovej (PTA), pH 7,0. Pred použitím mikroskopu sa mriežka nechala vyschnúť na vzduchu. Mikroskopické pozorovanie sa uskutočnilo použitím JEOL 100CX transmisného elektrónového mikroskopu (JEOL USA? Inc.) pri akceleračnom napätí 100 kV. Vzniknutý mikrograf má konečné zväčšenie 100 OOOx. Potvrdila sa prítomnosť partikúl podobných vírusovým partikulám (VLP) s veľkosťou 50 až 55 nm.

Príklad 18

Konštrukcia vektora na expresiu génu CRPV Ll

Gén CRPV Ll sa amplifikuje polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) z plazmidu pLAII, ktorý obsahuje celý CRPV vírusový genóm (Dr. Peter Howley, NCI), s použitím Vent polymerázy (New England Biolabs, Inc.) a nasledujúcich oligonukleotidových primerov obsahujúcich lemovaciu sekvenciu s Bglll reštrikčným miestom (zvýraznené podčiarknutým písmom). Amplifikácia prebieha v 35 cykloch (94 °C 1 min., 50 °C 1 min., 72 °C 2 min.).

sense primer: 5-GAA GAT CTT CAA AAC AAA ATGGCA GTG TGG CTG

TCTAC-3' antisense primer: 5-GAA GAT CTT TAT TAA GTA CGT CTCTTGCGT

TTA G-3'

Sense primer zavádza kvasinkovú neprekladanú vedúcu sekvenciu bezprostredne k iniciačnému metionínovému kodónu (zvýraznené tučným písmom) proti smeru transkripcie génu CRPV L1. 1,6 kbp veľký produkt PCR sa štiepi restriktázou Bglll, čistí sa na géli a subklonuje sa do Bglll reštrikčného miesta vektora pSP72 (Promega). Vzniká plazmid pSP72-CRPV-Ll (pl2930-314-4-1).

Jeden subklon sa celý sekvenoval a zistilo sa, že sa v 4 nukleotidoch líši od publikovanej sekvencie CRPV Ll. Tieto odlišnosti nespôsobili zmeny v aminokyselinách. Gén Ll sa získal z plazmidu pSP72-CRPV-Ll ako BgUI fragment a subklonuje sa do jediného BamHI reštrikčného miesta, ktoré sa nachádza medzi kvasinkovým promótorom GAL10 a transkripčným terminátorom ADH1 v kvasinkovom expresnom vektore, ktorý obsahuje GAL10 promótor z plazmidu YEp52 (Broach a ďalší, Exp. Manipulation of gene expression, 1983, 83: 81-116) a transkripčný terminátor ADH1 z kostry rovnakého vektora. Vzniknutý plazmid sa označil pl2930-323-6-l.

Príklad 19

Konštrukcia vektora na expresiu génu CRPV L2

Gén CRPV L2 sa amplifikuje polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s použitím Vent polymerázy (New England Biolabs, Inc.) z plazmidu pLAII štiepeného restriktázou Sali, čistenie 7,9 kbp veľkého fragmentu na géli a ligáciu so sebou samým. Používajú sa nasledujúce oligonukleotidové primery obsahujúce lemovaciu sekvenciu s EcoRI reštrikčným miestom (zvýraznené podčiarknutým písmom). Amplifikácia prebieha v 35 cykloch (90 °C 1 min., 50 °C 1 min., 72 °C 2 min.).

sense primer: 5'-GGA ATT CAC AAA ACA AAA TGG TTG CAC GGT CAC

GAAAAC-3' antisense primer: 5'-GGA ATT CTT ATT CTG CGT AGA CAG CCA CAC

TG-3'

Sense primer zavádza kvasinkovú neprekladanú vedúcu sekvenciu bezprostredne k iniciačnému metionínovému kodónu (zvýraznené tučným písmom) proti smeru transkripcie génu CRPV Ll. 1,5 kbp veľký produkt PCR sa štiepi restriktázou EcoRI, čistí sa na géli a subklonuje sa do EcoRI reštrikčného miesta vektora pUC18-GALlp-GAL10p s dvojsmerným promótorom. Vektor obsahuje divergentný kvasinkový promótor GAL1/GAL10. Tento vektor obsahuje jediné BamHI reštrikčné miesto medzi promótorom GALI a prvou kópiou transkripčného terminátora ADH1, ďalej obsahuje jediná EcoRI a Smal reštrikčné miesta ležiace medzi promótorom GALI a druhou kópiou transkripčného terminátora ADH1. Výsledná expresná kazeta je nesená na 1,4 kb veľkom Sphl fragmente. Jeden kloň (pl2930-295-2-2) obsahujúci požadovaný L2 inzert, ktorý prilieha k promótora GAL10, sa celý sekvenoval. Zistilo sa, že sa líši šiestimi nukleotidmi od publikovanej sekvencie, 4 nukleotidy spôsobujú zmeny v aminokyselinách. Sekvenčná analýza pôvodnej templátovej DNA potvrdila, že tieto zmeny boli prítomné aj v plazmide pLAII a neboli teda vnesené PCR. Vektor pUC18-GALlp-GAL10p obsahujúci gén L2 sa štiepi restriktázou Sphl a 2,9 kb veľký fragment nesúci ADHltGALlp-GAL10p-L2-ADHl expresnú kazetu sa liguje s veľkým Sphl fragmentom kvasinkového pendlujúceho vektora. Výsledný plazmid sa označil ako pl2930-323-2-3.

Príklad 20

Expresia kapsidových proteínov CRPV Ll a L2 v kvasinkách

Plazmidy pl2930-323-6-l a pl2930-323-2-3 sa použili na transformáciu kmeňov číslo 1569, 1538, BJ5462 (E. W. Jones, Methods in Enzymology 194 (1991) 428 - 453) a kmene číslo BJ1995 (Jones v rovnakej publikácii) S. cerevisiae. Klonálne izoláty sa kultivujú v YEHD médiu obsahujúcom 2 % galaktózy, pri teplote 30 °C a počas 48 až 72 hodín. Po získaní buniek, sa peleta rozbije sklenenými guľôčkami, pridá sa TritonX-100 v množstve, aby jeho konečná koncentrácia bola 0,5 % a bunkový lyzát sa testuje imunoblotom, či dochádza k expresii proteínu CRPV Ll a L2. Vzorky obsahujúce 40 pg celkového bunkového proteínu sa elektroforezujú na 12 % Tris-glycínovom géli (Novex) za redukujúcich podmienok a elektroblotujú sa na PVDF membrány (Novex). Proteíny CRPV Ll a L2 sa detegujú použitím polyklonálneho anti-Ll a anti-L2 králičieho antiséra (darček od Dr. John Kreider, Hershey Medical Center), ktoré slúži ako primáme protilátky a proteínu A viazaného na chrenovú peroxidáza (HRP), ktorý sa používa ako sekundárne protilátky. Na membránu sa použila chemoluminiscenčná ECL™ detekčná súprava (Amersham, Inc.). Vo všetkých vzorkách nesúcich Ll expresný plazmid sa detegoval 55 až 61 kDa veľký pruh zodpovedajúci proteínu Ll. Vo všetkých vzorkách kvasinkových klonov nesúcich L2 expresný plazmid sa detegoval približne 90 kDa veľký prah zodpovedajúci proteínu L2.

Žiadny signál sa nedetegoval vo vzorkách odvodených z kvasinkových klonov nesúcich Ll expresný plazmid pomocou anti-L2 antiséra alebo obrátene (obrázok 6).

Na základe týchto výsledkov expresie sa vybrali na ďalšie štúdie tieto rekombinantné kvasinkové kmene: kmeň číslo 1582, ktoiý je hostiteľským kmeňom číslo 1569 obsahujúci plazmid pl2930-323-6-l a kmeň číslo 1583, ktorý je hostiteľským kmeňom číslo 1538 obsahujúci plazmid pl2930-323-2-3.

Príklad 21

A. Čistenie rekombinantného kapsidového proteínu CRPV Ll

Bunky kmeňa číslo 1582 uchovávané v -70 °C sa rozmrazia a suspendujú sa v rovnakom objeme lyžujúceho pufra (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 100 mM NaCl,

1,7 mM EDTA). K suspenzii buniek sa pridajú proteázové inhibítory PMSF a pepstatín A v množstve, aby ich konečná koncentrácia bola 2 mM respektíve 1,7 mM. Bunky sa lyžujú v 10-tich cykloch v mikrofluidizéri. Lyzát sa čistí centrifugáciou pri 5000xg počas 10 minút. Supematant sa prevrství cez 5 centimetrový vankúš 45 % sacharózy (v/o) v jednom litri pufra a Ll sa získa centrifugáciou pri 100 OOOxg počas 4 hodín. Peleta sa resuspenduje v 1/10 objeme Ll pufra. Resuspendovaná peleta sa čisti centrifugáciou pri 5000xg počas 10 minút. K supematantu sa pridá Tween-80 v množstve, aby jeho konečná koncentrácia bola 0,01 % a supematant sa fŕakcionalizuje pri teplote miestnosti podľa veľkosti vylučovacou chromatografiou na kolóne s objemom 1700 ml (priemer kolóny 5 cm) so živicovou náplňou Sephacryl S-1000 (Pharmacia). Použitý pufer pre túto kolónu má zloženie 10 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,01 % Tween-80. Frakcie obsahujúce imunoreaktívny materiál sa určia imunodot blotovacim testom, spoja sa a koncentrujú sa na 1/6 objemu ultrafiltráciou s použitím miešaných jamôk (Amicon) s YM-100 membránou (100 000 MWCO) s priemerom 76 mm. Produkt sa sterilizuje filtráciou cez membránu Millex-GV s pórmi s veľkosťou 0,22 pm (Millipore).

SK 281878 Β6

B. Charakterizácia rekombinantného kapsidového proteínu L1

Identita konečného produktu sa overuje Westem blotom a N-terminálnou sekvenčnou analýzou. Čistota sa určuje metódou SDS-PAGE s Coomassie a farbením striebrom a roztoky deliacou kapilárnou elektroforézou (SSCE) s optickou detekciou pri vlnovej dĺžke 215 nm. Metóda SSCE určila, že proteín L1 je zo 75 % čistý. Elektrónová mikroskopia vykazuje prítomnosť partikúl podobných vírusovým partikulám (VLP), priemer partikúl je 50 až 55 nm.

C. Analytická podľa veľkosti vylučovacia kvapalinová chromatografia (HPLC)

S cieľom zistiť prítomnosť partikúl podobných vírusovým partikulám (VLP) sa vzorky delia na frakcie podľa veľkosti vylučovacou chromatografiou. Chromatografia prebieha na Perkin-Elmer Šerieš 410 Biopump HPLC s autoinjektorom ISS 100, ktorý obsahuje 200 mikrolitrovú injekčnú slučku. Použila sa G5000 PW kolóna s rozmermi

7,5 x 600 mm (TOSOHAAS, Montgomeryville, PA) naplnená s TSK gélom. S cieľom monitorovať vymývanie proteínu z kolóny sa použila optická detekcia pri vlnovej dĺžke 280 nm pomocou diódového detektora Perkin-Elmer LC-235. Zloženie mobilnej fázy je 0,5 mM NaCl v 10 mM pufra fosforečnanu sodného, pH 7,2. Rýchlosť prietoku je 0,5 ml/min. Zbierajú sa frakcie s objemom 1 ml. Kalibrácia kolóny sa uskutočnila proteínovým štandardom (Sigma) a rekombinantným povrchovým antigénom hepatitídy B (Recombivax™, Merck & Co., Wcst Point, PA). Detekcia antigénu vo frakciách získaných počas vymývania kolóny prebehla imunodot blotom.

D. Imunodot blot mikrolitrov vzorky každej frakcie sa aplikuje na pruh membrány PVDF (imunobilon-P, Millipore Corp., Bedford, MA), ktorá je navlhčená a umiestnená na vlhký blotovací papier. Vzorky sa nechajú nasať do membrány a membrána sa umiestni do blokujúceho roztoku (5 % (v/o) netučné sušené mlieko rozpustené v 0,15 M NaCl, 0,02 % (v/o) azid sodný a 0,01 M fosforečnan sodný, pH 7,2) a tá sa inkubuje pri teplote miestnosti za jemného miešania v priebehu minimálneho času tri hodiny. Blokujúci roztok sa nahradí roztokom primárnych protilátok.

Primáme protilátky sa vyberajú v závislosti od antigénu, ktorý sa má určiť.

Proteín CRPV L1 sa testuje pomocou králičieho antiCRPV séra „neskorá odozva“ (Biodesigne Intemational, Kennebunk, ME). Proteín CRPV L2 sa testuje pomocou králičieho anti-CRPV L2 séra. Proteín HPV6a L1 sa testuje pomocou monoklonálnych protilátok MAB 837 (Chemicon Intemational, Inc., Temecula, CA). Proteín HPV6a sa testuje pomocou myšacieho anti-HPV6a L2-trpE fuzneho séra.

Zviditeľnenie imunokomplexov prebieha použitím štandardných metód pomocou druhých protilátok spojených s alkalickou fosfatázou a chromogénneho substrátu NBT-BCIP.

E. Príprava vakcíny z rekombinantného kapsidového proteínu CRPV L1

Čistený rekombinantný kapsidový proteín sa absorbuje do A1(OH)₃ v koncentrácii 100 pg/ml.

Príklad 22

A. Čistenie rekombinantného kapsidového proteínu CRPV L1 - schéma 2

Všetky kroky prebiehajú pri teplote 4 “C, ak nie je uvedené inak.

Bunky kmeňa číslo 1582 uchovávané v -70 °C sa rozmrazia a suspendujú v rovnakom objeme lyžujúceho pufra (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 100 mM NaCl,

1,7 mM EDTA). K suspenzii buniek sa pridajú proteázové inhibítory PMSF a pepstatín A v množstve, aby ich konečná koncentrácia bola 2 mM respektíve 1,7 mM. Bunky sa lyžujú použitím BioNeb systémom (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lyzát sa čistí centrifugáciou pri 5000xg počas 10 minút. Supematant sa prevrství cez 5 centimetrový vankúš 45 % sacharózy (v/o) v jednom litri pufra a L1 sa získa centrifugáciou pri 100 OOOxg počas hodín. Peleta sa resuspenduje v 1/10 objemu L1 pufra. Resuspendovaná peleta sa čistí centrifugáciou pri 5000xg počas 10 minút.

Supematant sa nariedi 1 : 5 pufrom PBS, prečistí sa centrifiigáciou s použitím rotora Sorvall SA-600 pri 6500 otáčkach/minútu počas 10 minút pri teplote 4 °C. Supematant sa filtruje cez filter s pórmi s veľkosťou 0,22 pm a delí sa anexovou chromatografiou.

Anexová chromatografia prebieha na Perkin-Elmer Šerieš 410 Biopump HPLC s 5 mililitrovou injekčnou slučkou. Používa sa kolóna s rozmermi 150 mm x 10 mm v priemere so živicovou náplňou Fractogel EMF TMA-650 (S) s pórmi s veľkosťou 25 až 40 mikrónov (EM Separations, Gibbstown, NJ). S cieľom monitorovať vymývanie proteínu z kolóny sa použila optická detekcia pri vlnovej dĺžke 280 nm pomocou diódového detektora Perkin-Elmer LC-235. Kolóna bola ekvilibrovaná pufrom A so zložením 0,15 M NaCl v 0,01 M pufri fosforečnanu sodného, pH 7,2. Rýchlosť prietoku je 0,75 ml/minútu. Vzorka sa nanesie na kolónu a kolóna sa premýva pufrom A, s cieľom odstrániť nenaviazaný materiál. Viazaný materiál sa vymýva počas minút. NaCl s lineárnym koncentračným gradientom 0,15 až 0,65 M, potom nasleduje vymývanie s koncentračným gradientom 0,65 M až 1,15 M počas 30 minút. Detekcia antigénu vo frakciách, ktoré sa zozbierali počas vymývania, sa uskutočňuje imunodot blotom. Spojili sa frakcie obsahujúce imunoreakčný materiál (t. j. frakcie vymyté hodnotou gradientu medzi 0,81 M až 1,05 M NaCl).

Frakcie sa koncentrujú centrifugačným koncentračným prístrojom Macrosep (Filtron Technology Cor., Northborough, MA) na 1/5 objemu.

Koncentrát sa delí vylučovacou chromatografiou použitím živice Sephacryl S-1000 SF (Pharmacia, Piscataway, NJ) na kolóne s rozmermi 87 mm x 27 mm v priemere. Prietoková rýchlosť v kolóne je 2,5 ml/min. Vymývanie sa monitoruje pri vlnovej dĺžke 280 nm. Antigén sa deteguje imunoblotom.

Frakcie obsahujúce imunoreaktívny materiál sa spoja a koncentrujú sa ultrafiltráciou s použitím miešaných jamôk (Amicon, Inc., Beverly, MA) s membránou YM-100 (Amicon, Inc., Beverly, MA) s priemerom 43 mm v atmosfére dusíka pri tlaku 0,07 MPa.

Konečný produkt sa charakterizuje metódou SDS-PAGE s Coomassie farbením a roztokmi deliacou kapilárnou elektroforézou (SSCE). Konečný produkt podľa schémy 2 je na 88 % čistý, ako sa stanovil pomocou metódy SSCE.

Príklad 23

Čistenie rekombinantného kapsidového proteínu CRPV L1 - schéma 3, obr. 17

Všetky kroky prebiehajú pri teplote 4 “C, ak nie je uvedené inak.

Bunky kmeňa číslo 1582 uchovávané v -70 °C sa rozmrazia a suspendujú v rovnakom objeme lyžujúceho pufra (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 100 mM NaCl,

SK 281878 Β6

1,7 mM EDTA). K suspenzii buniek sa pridajú proteázové inhibítoiy PMSF a pepstatín A v množstve, aby ich konečná koncentrácia bola 2 mM respektíve 1,7 mM. Bunky sa lyžujú použitím BioNeb systémom (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN). Lyzát sa čistí centrifugáciou pri 5000xg počas 10 minút. Supematant sa prevrství cez 5 centimetrový vankúš 45 % sacharózy (v/o) v jednom litri pufra a L1 sa získa centrifugáciou pri 100 OOOxg počas 4 hodín. Peleta sa resuspenduje v 1/10 objemu L1 pufra. Resuspendovaná peleta sa čistí centrifugáciou pri 5000xg počas 10 minút.

Supematant sa extrahuje 1/2 objemu chloroformu. Odoberie sa vodná fáza a čistí sa centrifugáciou pri 12 000 otáčkach/minútu na mikrocentrifúge Beckman počas 5 minút pri teplote miestnosti.

Supematant sa riedi 1 : 5 pufrom PBS, prečistí sa centrifugáciou s použitím rotora Sorvall SA-600 pri 6500 otáčkach/minútu počas 10 minút pri teplote 4 °C. Supematant sa filtruje cez filter s pórmi s veľkosťou 0,22 pm a delí sa anexovou chromatografiou.

Anexová chromatografia prebieha na Perkin-Elmer Šerieš 410 Biopump HPLC s 5 mililitrovou injekčnou slučkou. Používa sa kolóna s rozmermi 150 mm x 10 mm v priemere so živicovou náplňou Fractogel EMF TMA-650 (S) s pórmi s veľkosťou 25 až 40 mikrónov (EM Separations, Gibbstown, NJ). S cieľom monitorovať vymývanie proteínu z kolóny sa použila optická detekcia pri vlnovej dĺžke 280 nm pomocou diódového detektora Perkin-Elmer LC-235. Kolóna bola ekvilibrovaná pufrom A s ložením 0,15 M NaCl v 0,01 M pufri fosforečnanu sodného, pH 7,2. Rýchlosť prietoku je 0,75 ml/minútu. Vzorka sa nanesie na kolónu a kolóna sa premýva pufrom A, s cieľom odstrániť nenaviazaný materiál. Viazaný materiál sa vymýva počas 5 minút NaCl s lineárnym koncentračným gradicntom 0,15 až 0,65 M, potom nasleduje vymývanie s koncentračným gradientom 0,65 M až 1,15 M počas 30 minút. Detekcia antigénu vo frakciách, ktoré sa zozbierali počas vymývania, sa uskutočňuje imunodot blotom. Spojili sa frakcie obsahujúce imunoreakčný materiál (t. j. frakcie vymyté hodnotou gradientu medzi 0,81 M až 1,05 M NaCl).

Frakcie sa koncentrujú centrifúgačným koncentračným prístrojom Macrosep (Filtron Technology Cor., Northborough, MA) na 1/5 objemu.

Koncentrát sa delí vylučovacou chromatografiou použitím živice Sephacryl S-1000 SF (Pharmacia, Piscataway, NJ) na kolóne s rozmermi 87 mm x 27 mm v priemere. Prietoková rýchlosť v kolóne je 2,5 ml/min. Vymývanie sa monitoruje pri vlnovej dĺžke 280 nm. Antigén sa deteguje imunoblotom.

Frakcie obsahujúce imunoreaktívny materiál sa spoja a koncentrujú ultrafiltráciou s použitím miešaných jamôk (Amicon, Inc., Beverly, MA) s membránou YM-100 (Amicon, Inc., Beverly, MA) s priemerom 43 mm v atmosfére dusíka pri tlaku 0,07 MPa.

Konečný produkt sa charakterizuje metódou SDS-PAGE s Coomassie farbením a roztokmi deliacou kapilárnou elektroforézou (SSCE). Konečný produkt podľa schémy 2 je na 88 % čistý, ako sa stanovil pomocou metódy SSCE.

Roztok deliacej kapilárnej elektroforézy (SSCE)

Vzorky partikúl podobných vírusovým partikulám (VLP) CRPV (približne 0,2 mg/ml) sa zahrievajú počas 15 minút pri teplote 100 °C v 1 % 2-merkaptoetanolu a v 1 % SDS (v/o). Vzorka sa elektrokineticky nanesie do kapiláry z taveného kremeňa s rozmermi 42 cm (22 cm k detektoru) x 0,05 mm v priemere, ekvilibrovanú 10 lumen objemami 0,1 N NaOH, vody a deliaceho činidla ProSort (Applied Biosystems, Foster City, CA) vedľa referenčného markera, ktorým je kyselina melitová. Aplikuje sa separačné napätie 300 V/cm použitím prístroja Applied Biosystems Model 270A-HT CE. Vymývanie vzorky sa monitoruje absorbanciou pri vlnovej dĺžke 215 nm a dáta sa zaznamenávajú pomocou softvéru Nelson Turbochrom 3.

Príklad 24

Ochrana proti tvoreniu papilomom spôsobených králičím papilomavírusom (CRPV) pomocou vakcinácie partikulami podobnými vírusovým partikulám (VLP) obsahujúcich proteín CRPV L1 pochádzajúci z kvasiniek

Päť novozélandských bielych králikov sa intramuskuláme imunizuje buď 135 pg L1 VLP (čistota 75 %) absorbovanými na kamenec alebo 100 μ g rekombinantného povrchového antigénu hepatitídy B (čistota 99 %) absorbovanom na hydroxide hlinitom. Tento antigén sa používa ako negatívna kontrola. Zvieratá dostali 2 ďalšie dávky po 8 týždňoch pred tým, než boli testované králičím vírusom (CRPV), čo sa stalo 10 dní po poslednej dávke. Séra odobrané pred imunizáciou, pri každej dávke a pred testovaním králičím vírusom sa analyzujú k proteínu L1 špecifickou ELISOU. Doska s 96 jamkami sa pokryje s 5 pg surového lyzátu proteínu CRPV-L1 alebo CRPV L2 pochádzajúceho z kvasiniek. Proteín sa odstráni a dosky sa blokujú v roztoku 10 % suchého mlieka (Camation) a TTBS (20 mM TRIS pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,1 % Tween) počas 2 hodín a teplote 4 °C. Potom, čo sa doska premyje roztokom TTBS, sa do roztoku 1 % mlieka a TTBS pridá riedené králičie sérum a inkubuje sa počas 2 hodín pri teplote 4 °C. Dosky sa premyjú roztokom TTBS a do roztoku 1 % mlieka a TTBS sa pridá anti-králičí IgG viazané na alkalickú fosfatázu (Kirkegaard and Peny Labs., Inc.) v riedení 1 : 1000 a dosky sa inkubujú počas 2 hodin pri teplote 4 “C. Dosky sa premyjú roztokom TTBS a detekčná reakcia sa vyvolá pridaním p-nitrilfenylfosforečnanu (Kirkegaard and Perry Labs., Inc.). Reakcia sa zastaví pridaním 5 % EDTA. Absorbancia sa meria pri vlnovej dĺžke 405 nm, je pozitívna, ak pomer absorbancie L1/L2 je 2:1.

Titer protilátok anti-Ll sa objavuje 4 týždne po prvej injekcii a rastie s každou ďalšou dávkou. Kontrolné zvieratá sú negatívne. Šesť týždňov po testovaní s CRPV sú vakcinované zvieratá bez bradavíc na 15 miestach z 15 (vírus je riedený 1 : 2 alebo 1 : 12). Zatiaľ čo kontrolné zvieratá vykazujú tvorbu bradavíc na 12 miestach z 15-tich (riedenie vírusu je 1 :2) alebo na 9 miestach z 15 (pri riedení 1 :12). Po 15 týždňoch sú vakcinované zvieratá bez bradavíc.

Vírus neutralizujúci test prebieha (v podstate podľa metódy Christensen a ďalší, 1991, Virology 181: 572 až 579) zmiešaním králičieho séra s králičím papilomavírusom (CRPV) a následným testovaním králikov s králičím papilomavírusom (CRPV). Štandard na stanovenie neutralizujúcich protilátok sa uskutočnil neutralizáciou vírusu (na 3 miestach z 3 sa netvoria bradavice). Analyzujú sa séra z 5 vakcinovaných a z 5 kontrolných zvierat. Séra získané po 1 dávke VLP s proteínom CRPV L1 obsahujú protilátky, ktoré celkom neutralizujú neriedený vírus z 80 % (u 4 králikov z 5). Po 2 alebo 3 dávkach VLP s proteínom CRPV L1 má 100 % králikov protilátky, ktoré neutralizujú vírus. Kontrolné séra nevykazujú žiadnu vírus neutralizujúcu aktivitu. V závislosti od konečného titri séra vybraných vakcinovaných zvierat sa môže sérum zriediť 10 až 1000-krát a stále je stopercentne neutralizujúci.

Príklad 25

Konštrukcia vektora na koexpresiu génu CRPV L1/L2 z jedného plazmidu

SK 281878 Β6

Plazmid pSP72-CRPV-Ll (p 12930-314-4-1) sa štiepi restriktázami Bglll a 1,5 kbp veľký Bglll fragment nesúci otvorený čítací rámec CRPV Ll (CRPV Ll ORF) s kvasinkovou 5'-neprekladanou vedúcou sekvenciou sa čistí na géIi. Plazmid pl2930-323-2-3 sa štiepi restriktázou BamHI, ktorá rozoznáva reštrikčné miesto medzi promótorom GALI a terminátorom transkripcie ADHI. Fragment lineárneho vektora sa čistí na géli a potom sa liguje so spomínaným Bglllfragmentom CRPV Ll. Vzniká plazmid pl2930-366-1-2. Tento výsledný plazmid obsahuje otvorený čítací rámec CRPV-L1, ktorý sa riadi promótorom GALI a otvorený čítací rámec CRPV-L2, ktorý sa riadi promótorom GAL10.

Príklad 26

Konštrukcia vektora na koexpresiu génu CRPV L1/L2 z dvoch plazmidov

Vektor pUC18-GALlp-GAL10p obsahujúci gén L2 sa štiepi restriktázou Sphl. 2,9 kb veľký fragment nesúci expresnú kazetu ADHlt-GALlp-GAL10p-L2-ADHlt sa čistí na géli a T4 DNA polymerázou sa upravia tupé konce. Kvasinkový pendlujúci vektor YEp24 (Botstein a ďalší, Gene 8: 17 (1979) sa štiepi restriktázou BamHI, T4 DNA polymerázou sa upravia tupé konce, defosforyluje sa teľacou alkalickou fosfatázou a potom sa liguje s L2 expresnou kazetou s tupými koncami. Vzniká plazmid p 1594.

Príklad 27

Koexpresia génu CRPV Ll a L2 v kvasinkách

Plazmid pl2930-366-l -2 (pCl/l-GALl/10p-CRPV/Ll+L2) sa použil na transformáciu kmeňov číslo 1569 a BJ5462 S. cerevisiae (systém s jedným plazmidom). Výsledné transformanty sa selektujú na syntetickom agarovom médiu bez leucínu. V paralelnom experimente sa kmeň číslo 1592 kotransformuje s CRPV Ll expresným vektorom p 1594 (systém dvoch plazmidov) a výsledné transformanty obsahujúce oba vektory sa selektujú na syntetickom agarovom médiu bez leucínu a uracilu. Klonálne izoláty oboch systémov sa kultivujú v YEHD médiu obsahujúcom 2 % galaktózu, pri teplote 30 °C a počas 48 až 72 hodín. Po získaní buniek, sa peleta buniek rozbije sklenenými guľôčkami, pridá sa TritonX-100 v množstve, aby jeho konečná koncentrácia bola 0,5 %, a bunkový lyzát sa testuje imunoblotom, či dochádza k expresii proteínu CRPV Ll a L2. Vzorky obsahujúce 50 pg celkového bunkového proteínu sa elektroforezujú na Tris-glycínovom géli (Novex) s gradientom 8 až 16 % za redukujúcich a denaturačných podmienok a elektroblotujú sa na PVDF membrány (Novex). Proteiny CRPV Ll a L2 sa detegujú použitím polygonálneho anti-Ll a anti-L2 králičieho antiséra (darček od Dr. John Kreider, Hershey Medical Center), ktoré slúži ako primárna protilátky, a proteínu viazaného na chrenovú peroxidázu (HRP), ktorý sa používa ako sekundárna protilátka. Na membrány sa použila chemoluminiscenčná ECL™ detekčná súprava (Amersham, Inc.). Vo všetkých vzorkách nesúcich Ll expresný plazmid sa detegoval 55 až 61 kDA veľký pruh zodpovedajúci proteínu Ll. Vo všetkých vzorkách kvasinkových klonov, nesúcich L1+L2 expresný plazmid sa detegoval približne 90 kDa veľký pruh zodpovedajúci proteínu L2. Žiadny signál sa nedetegoval vo vzorkách odvodených z kvasinkových klonov, nesúcich Ll expresný plazmid (obr. 6). Žiadny signál sa nedetegoval vo vzorkách z buniek, obsahujúcich len L2 expresný vektor.

Príklad 28

Čistenie partikúl podobných vírusovým partikulám (VLP) nesúcich proteiny CRPV Lla CRPV L1+L2 pre štúdiu uskutočnenú elektrónovou mikroskopiou (EM)

Kvasinkami exprimované proteiny CRPV Lla CRPV L1+L2 sa čiastočne čistia a koncentrujú kvôli štúdiu elektrónovou mikroskopiou (EM). Jeden až 1,5 1 média EYHD, obsahujúceho 1 % galaktózu sa inokuluje kmeňom číslo 1569 alebo BJ5462 S. cerevisiae, ktoré sú transformované L1+L2 koexpresným vektorom pl2930-366-1-2 a kultivuje sa pri teplote 30 °C a počas 48 až 72 hodín. V paralelnom experimente sa bunky kmeňa číslo 1569 kotransformujú CRPV-L1 expresným vektorom pl2930-323-6-l a YEp24-GAL10p-L2 plazmidom pl594 a kultivujú sa za rovnakých podmienok. Peleta získaných buniek sa zamrazí pri teplote 4 °C. Všetky nasledujúce kroky prebiehajú pri teplote 4 °C. Peleta buniek sa rozmrazí a suspenduje sa v rovnakom objeme Ll pufra (20 mM fosforečnan sodný pH 7,2, 100 mM NaCl,

1,7 mM EDTA). Do bunkovej suspenzie sa pridajú inhibítory proteázy PMSF a pepstatín A s konečnou koncentráciou 2 mM, respektíve 1,7 μΜ. Bunky sa lyžujú 3 až 5 pasážami v mikrofluidezéri. Lyzát sa čistí centrifúgáciou pri 5000xg počas 10 minút. Supematant sa prevrstvi cez 5 centimetrový vankúš 45 % sacharózy (v/v) v jednom litri pufra a proteiny Ll, L2 alebo L1+L2 sa získajú centrifitgáciou pri 100 OOOxg počas 4 hodín. Pelet sa resuspenduje v 1/10 objemu Ll pufra. Resuspendovaná peleta sa čistí centrifugáciou pri 5000xg počas 10 minút.

Kvôli EM testu (elektrónová mikroskopia) (Structure Próbe, West Chester, PA) sa alikvot každej vzorky umiestni na medenú mriežku s 20 okami potiahnutú uhlíkom. Na mriežku sa kvapla na 20 sekúnd kvapka 2 % kyseliny fosforečnano-12-volfrámovej (PTA), pH 7,0. Pred použitím mikroskopu sa mriežka nechala vyschnúť na vzduchu. Mikroskopické pozorovanie sa uskutočnilo použitím JOEL 100CX transmisného elektrónového mikroskopu (JEOL USA, Inc.) pri akceleračnom napätí 100 kV. Vzniknutý mikrograf má konečné zväčšenie 100 OOOx.

Vo všetkých kvasinkových vzorkách nesúcich buď CRPV Ll expresný plazmid alebo plazmid pre koexpresiu CRPV Ll a L2 sú prítomné partikuly podobné vírusovým partikulám (VLP), ktorých priemer je menší alebo rovný 25 nm. Žiadne partikuly podobné vírusovým partikulám (VLP) nie sú pozorované v kvasinkových kontrolných vzorkách, ktoré nesú samotný L2 expresný plazmid.

Príklad 29

Expresia génu CRPV Ll (kmeň číslo 1582) a génu HPV6a Ll (kmeň číslo 1644) v obohatenom komplexnom a chemicky definovanom médiu.

Inokulum týchto kmeňov sa pripraví v syntetickom médiu bez leucínu, ako je opísané, a to sa prenesie do miešaných kultivačných nádob. Použité miešané nádoby majú vysokú prevzdušňovaciu kapacitu (70 ml kvapaliny do 300 ml nádoby, Tunair Labware). Do média sa pridá približne 0,5 ml/1 protipenivého činidla (UCON LB-625, Union Carbide). Obohatené komplexné médium obsahuje na jeden liter: 40 g kvasinkového extraktu Difco; 20 g Sheffieldovho HySoy peptónu; 30 g glukózy; 50 g galaktózy; pH média sa upravilo pred sterilizáciou na hodnotu 5,3. Použité chemicky definované médium je rovnaké ako médium, ktoré opisuje Oura (Biotechnol. Bioengineer., 16: 1197 až 1212, 1974), ale obohatené s (na jeden liter): 0,1 g cholinchloridu; 0,4 g adenínu; 30 g glutamatu sodného, ktoré slúži ako zdroj dusíka; 0,2 g uracilu; 20 g glukózy; 40 g galaktózy. Nádoby sa inokulujú s 3 ml inokula, in15 kubujú sa počas 66 hodín pri teplote 28 °C a miešajú sa na rotačnej miešačke pri 250 otáčkach/minútu. S cieľom overiť expresiu proteínov pomocou imunoblotu použitím antiCRPV L1 a anti-HPV6a L1 antisér sa z nádob odoberajú vzorky.

Príklad 30

Klonovanie génov HPV 16 L1 a L2

Z Caski buniek (ATCC #CRL 1550) sa štandardným postupom (Sambrook a ďalší, opísané) extrahuje celková genómová DNA. DNA sa štiepi endonukleázami Bstl 1071 a Sphl a elektroforezuje sa na 0,8 % agarózovom preparatívnom géli topiacom sa za nízkej teploty. Oblasť zodpovedajúca DNA s veľkosťou približne 3,5 kbp sa z gélu vyreže a agaróza sa štiepi enzýmom Gelase™ (Epicentre Technologies, Inc.). Na géli čistená DNA s tupými koncami, ktoré sa upravia T4 DNA polymerázou, sa liguje s fosforylovanými oligodeoxynukleotidovými spojovníkmi s tupými koncami, ktoré obsahujú skryté HindlII reštrikčné miesto. Ligačná zmes sa štiepi restriktázou HindlII s cieľom doplniť a približne 3,5 kbp veľká DNA sa delí podľa veľkosti na agarózovom géli, ako sa opisuje. Na géli čistená DNA sa liguje s DNA plazmidu pUC18, ktorá sa štiepila s restriktázou HindlII a defosforylovala sa. Nasleduje transformácia kompetentných buniek DH5 E. coli (BRL). Plazmidová knižnica sa testuje s cieľom zistiť klony pozitívne na HPV 16 pomocou hybridizácie kolónií. Ako sonda sa použije antisense oligodeoxynukleotid značený ³²P, ktorý je komplementárny s 3'-koncu génu HPV6a L1 (5'-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC-3'). Izoluje sa plazmid pUC18 obsahujúci 3,3 kbp veľký genómový fragment ľudského papilomavírusu typu 16 (HPV 16) a charakterizuje sa štiepením reštrikčnými enzýmami a analýzou Southemovým prenosom. Tento plazmid sa označil ako pUC18-HPV16Ll/L2 a obsahuje celé L1 a L2 kódujúce sekvencie DNA. Plazmidová DNA sa pripravila použitím súpravy Qiagen™ Plazmid Maxi kit (Qiagen, Inc.).

Príklad 31

Konštrukcia kvasinkového expresného vektora pre gén HPV16L1

Kloň pUC18-HPV16Ll/L2 sa použil ako templát na polymerázovú reťazovú reakciu (PCR). Gén HPV16 L1 sa amplifikuje polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s použitím Vent polymerázy (New England Biolabs, Inc.) v 10 cykloch (94 °C 1 minúta, 48 °C 1 minúta, 72 °C 1 minúta 45 sekúnd) a nasledujúcich oligonukleotidových printerov, ktoré obsahujú lemovacie miesto rozoznateľné restriktázou Bglll (podčiarknuté):

sense primer: 5-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT CTC TTT

GGC TGC CTA TGT AGC CC-3’ antisense primer: 5'-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG

CGT TTA GC-3'

Sense primer zavádza kvasinkovú neprekladanú vedúcu sekvenciu bezprostredne k iniciačnému metionínovému kodónu (zvýraznené tučným písmom) proti smeru transkripcie génu HPV 16 Ll. 1,5 kbp veľký produkt PCR sa štiepi restriktázou Bglll, čistí sa na géli a liguje sa s vektorom pGALlO štiepeným restriktázou BamHI. Izoloval sa plazmid obsahujúci gén HPV16 Ll a označil sa pl4049-37-1. Gén Ll obsiahnutý v plazmide p 14049-37-1 sa sekvenuje použitím súpravy PRISM™ (ABI, Inc.) a ABI sekventátora modelu číslo 373A podľa inštrukcií výrobcu. Gén

Ll v tomto izoláte obsahuje 3 zmeny nukleotidov v porovnaní s upravenou publikovanou sekvenciou prototypu (Kirnbauer, R a ďalší, (1993) J. Virol. 67: 6929 až 6936). Tieto zmeny vedú ku zmenám dvoch aminokyselín: His-202 na Asp; Thr-266 na Ala. Sekvenčná analýza pôvodnej templátovej DNA potvrdila, že tieto zmeny sú tiež prítomné v genómovom klone pUC18-HPV16Ll/L2 a neboli teda spôsobené PCR.

Príklad 32

Konštrukcia kvasinkového expresného vektora pre gén HPV16 Ll a L2.

Plazmid p 14049-37-1 sa štiepi restriktázou Smal, ktorá rozoznáva reštrikčné miesto medzi promótorom GAL10 a terminátorom transkripcie ADH1. 1,4 kbp veľký gén HPV 16 L2 sa amplifikuje polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) s použitím DNA pUC16-HPV16Ll/L2 ako templátu a Vent polymerázy (New England Biolabs, Inc.). Amplifikácia prebieha v 10 cykloch (94 °C 1 minútu, 48 °C 1 minútu, 72 °C 1 minútu a 45 sekúnd) a používajú sa nasledujúce oligonukleotidové primery, ktoré obsahujú lemovacie miesto rozoznateľné restriktázou Bglll (podčiarknuté):

sense primer: 5’-TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC GAC ACA

AAC GTT CTG CAA AAC-3’ antisense primer: 5-TCC CCC GGG CTA GGC AGC CAA AGA GAC

ATC TGA-3'

Sense primer zavádza kvasinkovú neprekladanú vedúcu sekvenciu bezprostredne k iniciačnému metionínovému kodónu (zvýraznené tučným písmom) proti smeru transkripcie génu HPV16 L2. 1,5 kbp veľký L2 produkt PCR sa štiepi restriktázou Smal, čistí sa na géli a liguje sa s vektorom pl4049-37-l štiepeným restriktázou Smal. Izoloval sa plazmid pLSllO, obsahujúci gény HPV 16 Ll a L2 a označil sa pl4049-42-2. Gén L2 obsiahnutý v plazmide pl4049-42-2 sa sekvenuje použitím súpravy PRISM™ (ABI, Inc.) a ABI sekventátora modelu číslo 373A podľa inštrukcií výrobcu. Gén L2 v tomto izoláte obsahuje 5 zmien nukleotidov v porovnaní s upravenou publikovanou sekvenciou prototypu (Kimbauer, R a ďalší, (1993) J. Virol. 67: 6929 až 6936). Tieto zmeny vedú k zmene jednej aminokyseliny: Ser-269 na Pro. Sekvenčná analýza genómového klonu pUC18-HPV16Ll/L2 potvrdila, že tieto zmeny sú tiež prítomné v pôvodnej templátovej DNA a neboli teda spôsobené PCR.

Príklad 33

A. Expresia génu HPV16 Ll a koexpresie génov HPV16 Ll 19. 8.1997 L2 v kvasinkách

Plazmidy pl4049-37-l a pl4049-42-2 sa použijú na transformáciu kmeňa číslo 1558 S. cerevisiae. Ako je ukázané v tabuľke výslednými kmeňmi sú kmeň číslo 1678 (HPV16 Ll) a kmeň číslo 1679 (HPV16 L1+L2). Klonálne izoláty oboch systémov sa kultivujú v YEHD médiu obsahujúcom 2 % galaktózu, pri teplote 30 °C a počas 68 až 78 hodín. Po získaní buniek, sa peleta buniek rozbije sklenenými guľôčkami a bunkový lyzát sa testuje imunoblotom, či dochádza k expresii proteínu HPV6a Ll alebo HPV6a L2. Vzorky obsahujúce 40 pg celkového bunkového proteínu sa elektroforezujú na 10 % Tris-glycínovom géli za redukujúcich a denaturačných podmienok a elektroblotujú sa na nitrocelulózové membrány. Proteín HPV 16 Ll sa imunodeteguje použitím králičieho polyklonálneho antiséra proti fúznemu proteínu trpE-HPVll Ll (Brown, D. R. a ďalší, Virology 201: 46 až 54), ktoré slúži ako primárna

SK 281878 Β6 protilátka, a oslích anti-králičieho IgG protilátok (Amersham, Inc.) viazaných na chrenovú peroxidázu (HRP), ktoré sa používajú ako sekundárne protilátky. Na membrány sa použila chemoluminiscenčná ECL™ detekčná súprava (Amersham, Inc.). Vo všetkých vzorkách s výnimkou negatívnej kontroly (vektor bez génov Ll alebo L2) sa detegoval 55 až 61 kDA veľký pruh zodpovedajúci proteínu Ll. Proteín L2 sa detegoval ako 70 kDA veľký pruh imunoblotom s použitím myšacieho anti-HPV16 L2 séra vytvoreného proti fúznym proteínom trpE-L2, ktoré exprimujú v E. coli. Toto sérum sa používa ako primárna protilátka. Ako sekundárne protilátky sa používa kozí anti-myšací UgG viazaný na chrenovú peroxidázu (HRP) (Amersham, Inc.). Membrány sa detegovali opísaným spôsobom.

B. Čistenie rekombinantných kapsidových proteínov Ll+L2HPVtypu 16

Všetky kroky sa uskutočňujú pri teplote 4 “C pokiaľ nie je uvedené inak.

Bunky sa uchovávajú v zmrazenej forme pri teplote -70 °C. Zmrazené bunky (mokrá váha 27,6 g) sa rozmrazujú pri teplote 20 až 23 °C a resuspendujú sa v 40 ml „pufra Ll“ (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 100 mM NaCl,

1,7 mM EDTA). Do pufra sa pridajú inhibítory proteázy PMSF a pepstatín A s konečnou koncentráciou 2 mM, respektíve 1,7 μΜ. Bunková suspenzia sa rozbije pri tlaku približne 56 MPa v troch cykloch v mikrofluidizéri Ml 10 (Microfluidics Corp., Newton, MA). Rozbité bunky sa centrifúgujú pri 5000xg počas 10 minút, s cieľom odstrániť bunkový odpad. Odoberá sa supematant, ktorý obsahuje L1+L2 antigén.

Supematant sa nariedi 1 : 5 pridaním pufra A (20 mM MOPS, pH 7,0) a aplikuje sa na anexovú záchytnú kolónu (5 cm v priemere x 4,8 cm). Náplňou kolóny je živica Fractogel^R EMD TMAE-650 (S) (EM Separation, Gibbstown, NJ) ekvilibrovaná pufrom A. Nasleduje premytie pufrom A a antigén je vymytý gradientom 0 až 1,0 M NaCl v pufri A. Určenie, ktorá frakcia obsahuje proteín Ll sa uskutoční imuno-dot blotom.

Frakcie obsahujúce proteín Ll, ktoré sa určili imuno-dot blotom sa testujú s cieľom zistiť celkové množstvo proteínu pomocou Bradfordovej metódy nasledovanej SDS-PAGE s použitím farbenia striebrom a Westem blotu.

Zhromažďujú sa TMAE frakcie vykazujúce porovnateľnú čistotu a porovnateľné množstvo proteínu Ll. Antigén sa koncentruje frakcionalizáciou so síranom sodným. Roztok sa upraví na hodnotu 48 % saturovaného síranu sodného pridaním tuhého činidla, zatiaľ čo je jemne miešaný počas 30 minút. Vzorky sa umiestnia na ľad a nechajú sa precipitovať cez noc, potom sa centrifúgujú pri 12 OOOxg. Peleta sa resuspenduje v 20 ml PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH 7,2,150 mM NaCl).

Resuspendované pelety sa delia na vylučovacej chromatografickej kolóne s veľkosťou (priemer kolóny 2,6 cm x 89 cm) na základe veľkosti. Náplň kolóny je živica Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ), pufer je PBS. Frakcie sa testujú metódou SDS-AGE s použitím farbenia striebrom a detegujú sa Westem blotom. Zhromažďujú sa najčistejšie frakcie. Výsledná vzorka sa koncentruje v miešanej jamke s objemom 50 ml s použitím 43 mililitrových membrán YM-100 (Amicon, Beverly, MA) v atmosfére dusíka za tlaku 0,028 až 0,042 MPa.

Konečný produkt sa testuje metódou SDS-PAGE s použitím farbenia koloidnou Coomassie. Odhaduje sa, že proteíny Ll a L2 sú na 70 % homogénne. Či ide určite o proteíny Ll a L2 sa dokáže Westem blotom použitím príslušného antiséra. Konečný produkt sa rozdelí na alikvotné časti a uchováva sa pri teplote -70 °C. Týmto spôsobom sa získalo celkom 0,53 mg proteínu.

Pomocou štruktúrnej sondy (West Chester, PA) prebieha analýza elektrónovou mikroskopiou. Alikvotná časť každej vzorky sa umiestni na medenú mriežku s 200 okami potiahnutú uhlíkom. Na mriežku sa kvapla počas 20 sekúnd kvapka 2 % kyseliny fosforečnano-12-volfrámovej (PTA), pH 7,0. Pred použitím mikroskopu sa mriežka nechala vyschnúť na vzduchu. Mikroskopické pozorovanie sa uskutočnilo použitím JEOL 100CX transmisného elektrónového mikroskopu (JEOL USA, Inc.) pri akceleračnom napätí 100 kV. Vzniknutý mikrograf má konečné zväčšenie 100 OOOx. Potvrdila sa prítomnosť partikúl podobných vírusovým partikulám (VLP) s veľkosťou menšou alebo rovnou 25 nm.

C. Čistenie rekombinantných kapsidových proteínov L1+L2 HPV typu 16

Všetky kroky sa uskutočňujú pri teplote 4 °C pokiaľ nie je uvedené inak.

Bunky sa uchovávajú v zmrazenej forme pri teplote -70 °C. Zmrazené bunky (mokrá váha 92,8 g) sa rozmrazujú pri teplote 20 až 23 °C a resuspendujú sa v 105 ml „pufra Ll“ (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 100 mM NaCl, 1,7 mM EDTA). Do pufra sa pridajú inhibítory proteázy PMSF a pepstatín A s konečnou koncentráciou 2 mM, respektíve 1,7 μΜ. Bunková suspenzia sa rozbije pri tlaku približne 112 MPa v troch cykloch v mikrofluidizéri Ml 10 (Microfluidics Corp., Newton, MA). Rozbité bunky sa centrifúgujú pri 6100xg počas 15 minúť s cieľom odstrániť bunkový odpad. Odoberá sa supematant, ktorý obsahuje L1+L2 antigén.

Supematant sa nariedi 1 : 5 pridaním pu&a A (20 mM MOPS, pH 7,0) a aplikuje sa na anexovú záchytnú kolónu (5 cm v priemere x 4,2 cm). Náplňou kolóny je živica Fractogel* EMD TMAE-650 (S) (EM Separation, Gibbstown, NJ) ekvilibrovaná pufrom A. Nasleduje premytie pufrom A a antigén je vymytý gradientom 0 až 1,0 M NaCl v pufri A. Určenie, ktorá frakcia obsahuje proteín Ll sa uskutoční imuno-dot blotom.

Frakcie obsahujúce proteín Ll, ktoré sa určili imunodot blotom sa testujú s cieľom zistiť celkové množstvo proteínu pomocou Bradfordovej metódy nasledovanej SDS-PAGE s použitím farbenia striebrom a Westem blotu.

Zhromažďujú sa TMAE frakcie vykazujúce porovnateľnú čistotu a porovnateľné množstvo proteínu Ll. Antigén sa koncentruje frakcionalizáciou so síranom sodným. Roztok sa upraví na hodnotu 35 % saturovaného síranu sodného pridaním tuhého činidla, zatiaľ čo je jemne miešaný počas 10 minút. Vzorky sa umiestnia na ľad a nechajú sa precipitovať počas 4 hodín, potom sa centrifúgujú pri 12 OOOxg. Peleta sa resuspenduje v 20 ml PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH 7,2,150 mM NaCl).

Resuspendované pelety sa delia na vylučovacej chromatografickej kolóne s veľkosťou (priemer kolóny

2,6 cm x 89 cm) na základe veľkosti. Náplň kolóny je živica Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ), pufer je PBS a 1 mM EDTA. Frakcie sa testujú metódou SDS-AGE s použitím farbenia striebrom a detegujú sa Western blotom. Zhromažďujú sa najčistejšie frakcie. Výsledná vzorka sa koncentruje v miešanej jamke s objemom 50 ml s použitím 43 mililitrových membrán YM100 (Amicon, Beverly, MA) v atmosfére dusíka za tlaku 0,028 až 0,042 MPa.

Konečný produkt sa testuje metódou SDS-PAGE s použitím farbenia koloidnou Coomassie. Odhaduje sa, že proteíny Ll a L2 sú na 70 % homogénne. Či ide určite o proteíny Ll a L2 sa dokáže Westem blotom použitím pri

SK 281878 Β6 slušného antiséra. Konečný produkt sa rozdelí na alikvotné časti a uchováva sa pri teplote -70 °C. Týmto spôsobom sa získalo celkom 3,8 mg proteínu.

Príklad 34

A. Fermentácia kmeňa číslo 1679 (HPV typ 16 L1+L2)

Spôsob prípravy zmrazených kultúr s cieľom uchovávať, príprava inokula, fermentácia a získanie buniek kmeňa číslo 1679 je v podstate uvedený. Po 67 hodinách inkubácie sa dosiahne hustota buniek s hodnotou 4,2 g surovej váhy na jeden liter a celkové množstvo buniek je 93 g (vlhká váha).

B. Fermentácia kmeňa číslo 1678 (HPV typ 16 Ll)

Spôsob prípravy zmrazených kultúr s cieľom uchovávať, príprava inokula, fermentácia a získanie buniek kmeňa číslo 1678 je v podstate uvedený. Po 10,5 hodinách inkubácie sa spoja obsahy dvoch 10 litrových fermentácií (dosiahne hustota buniek s hodnotou 8,7 g surovej váhy na jeden liter). Celkové množstvo buniek je 258 g (vlhká váha).

C. Čistenie rekombinantného kapsidového proteínu Ll HPV typu 16

Všetky kroky sa uskutočňujú pri teplote 4 °C pokiaľ nie je uvedené inak.

Bunky kmeňa číslo 1678 sa uchovávajú v zmrazenej forme pri teplote -70 °C. Zmrazené bunky (mokrá váha 128 g) sa rozmrazujú pri teplote 20 až 23 °C a resuspendujú sa v 140 ml „pufra Ll“ (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 100 mM NaCl). Do pufra sa pridajú inhibitory proteázy PMSF a pepstatín A s konečnou koncentráciou 2 mM, respektíve

1,7 μΜ. Bunková suspenzia sa rozbije pri tlaku približne 112 MPa v troch cykloch v mikrofluidizéri Ml 10 (Microfluidics Corp., Newton, MA). Rozbité bunky sa centrifugujú pri 11 OOOxg počas 40 minút, s cieľom odstrániť bunkový odpad. Odoberá sa supematant, ktorý obsahuje Ll antigén.

Supematant sa nariedi 1 : 5 pridaním pufra A (20 mM MOPS, pH 7,0) a aplikuje sa na anexovú záchytnú kolónu (5 cm v priemere x 6,4 cm). Náplňou kolóny je živica Fractogel^R EMD TMAE-650 (S) (EM Separation, Gibbstown, NJ) ekvilibrovaná pufrom A. Nasleduje premytie pufrom A a antigén je vymytý gradientom 0 až 1,0 M NaCl v pufri A. Určenie, ktorá frakcia obsahuje proteín Ll sa uskutoční imuno-dot blotom.

Frakcie obsahujúce proteín Ll, ktoré sa určili imunodot blotom sa testujú s cieľom zistiť celkové množstvo proteínu pomocou Bradfordovej metódy nasledovanej SDS-PAGE s použitím farbenia striebrom a Westem blotu.

Zhromažďujú sa TMAE frakcie vykazujúce porovnateľnú čistotu a porovnateľné množstvo proteínu Ll. Antigén sa koncentruje frakcionalizáciou so síranom sodným. Roztok sa upraví na hodnotu 35 % saturovaného síranu sodného pridaním tuhého činidla, zatiaľ čo je jemne miešaný počas 10 minút. Vzorky sa umiestnia na ľad a nechajú sa precipitovať počas 5 hodín, potom sa centrifugujú pri 12 OOOxg. Peleta sa resuspenduje v 20 ml PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH 7,2,150 mM NaCl).

Resuspendované pelety sa delia na vylučovacej chromatografickej kolóne s veľkosťou (priemer kolóny 2,6 cm x 89 cm) na základe veľkosti. Náplň kolóny je živica Sephacryl 500 HR (Pharmacia, Piscataway, NJ), pufer je PBS. Frakcie sa testujú metódou SDS-AGE s použitím farbenia striebrom a detegujú sa Westem blotom. Zhromažďujú sa najčistejšie frakcie. Výsledná vzorka sa koncentruje v miešanej jamke s objemom 50 ml s použitím 43 mililitrových membrán YM-100 (Amicon, Beverly, MA) v atmosfére dusíka za tlaku 0,028 až 0,042 MPa.

Konečný produkt sa testuje metódou SDS-PAGE s použitím farbenia koloidnou Coomassie. Odhaduje sa, že proteín Ll je na 70 % homogénny. Či ide určite o proteín Ll sa dokáže Westem blotom použitím príslušného antiséra. Konečný produkt sa rozdelí na alikvotné časti a uchováva sa pri teplote -70 °C. Týmto spôsobom sa získalo celkom 7,4 mg proteínu.

D. Analytické postupy Imuno-dot blot

Vzorky sa riedia (ak je to nevyhnutné) 1 : 10 Milli-Q-vodou a 10 μΐ vzorky sa kvapne na membrány PolyScreen™ PVDF (NEN Research Products, Boston, MA). PO vysušení sa membrány premyjú vodou a nechajú sa uschnúť. Roztok primárnych protilátok sa pripraví riedením príslušného antiséra blotovacím roztokom (5 % netučné mlieko rozpustené v 6,25 mM fosforečnane sodnom, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN₃). Inkubácia prebieha počas najmenej 1 hodiny pri teplote 20 až 23 C. Blot sa 3x premýva vždy počas 1 minúty v pufri PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 150 mM NaCl). Roztok sekundárnych protilátok sa pripraví riedením príslušného antiséra viazaného na alkalickú fosfatázu blotujúcim pufrom. Inkubácia prebieha za rovnakých podmienok počas najmenej jednej hodiny. Bloty sa premývajú spôsobom skôr opísaným a detegujú sa použitím substrátu NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL).

Na detekciu sa použili nasledujúce protilátky:

Proteín HPVóa Ll sa deteguje pomocou MAB 837 (Chemicon Intemational, Inc., Temecula, CA). Proteín HPVóa L2 sa deteguje spojením myšacích anti-HPVóa L2-trpE fúznych sér číslo 641 a 647 (pripravil M. Rosolowski, v našom ústave). Proteín HPV16 L2 sa deteguje spojeným myšacím anti-HPVló L2-trpE fuznym sérom číslo 611 (pripravil K. Jansen, v našom ústave).

Bradfordov test na stanovenie celkového množstva proteínu

Stanovenie celkového množstva proteínu prebieha s použitím bežne dostupného kitu Milli-Q-vodou. Podľa štandardného protokoluje potrebný objem vzorky 1 ml, pre mikrometódu je to objem 0,1 ml. V oboch prípadoch sa na prípravu štandardnej krivky používa BSA (Pierce, Rockford, IL). Test prebieha podľa inštrukcií výrobcu. Štandardná krivka sa vynáša s použitím softvéru ČricketGraph^R na počítači Macintosh líci.

Test SDS-PAGE a Westem blot

Všetky prístroje, gély a pufŕe sa získali od firmy Novex (San Diego, CA) a prevádzkovali sa a pripravovali podľa inštrukcií výrobcu. Vzorky sa riedia na rovnakú koncentráciu proteínu Milli-Q-vodou a zmiešajú sa v pomere 1 : 1 s inkubačným pufrom, ktorý obsahuje 200 mM DTT. Vzorky sa inkubujú počas 15 minút pri teplote 100 “C a nanesú sa na vopred naliaty 12 % Tris-glycínový gél. Vzorky sa elektroforezujú pri napätí 125 V počas 1 hodiny a 45 minút. Gély sa vizualizujú s použitím buď farbenia striebrom pod, ľa rôznych metód publikovaných Heukeshovenom a Dernickom (Electrophoresis, 6 (1985) 103 až 112) alebo Coomassie farbenie použitím bežne dostupnej súpravy (Inetgrated Separation Systems, Natick, MA). V prípade spôsobu Wester blot sa proteínu nanášajú na membrány PVDF pri napätí 25 V počas 40 minút. Membrány sa sušia a inkubujú s roztokom protilátok rovnakým spôsobom ako sa uvádza v prípade imuno-dot blotu.

Príklad 35

Príprava imunogénnych kompozícií

Čistené partikuly podobné vírusovým partikulám (VLP) sa podľa známeho spôsobu zmiešajú s farmaceutický prijateľnými nosičmi, stabilizátormi alebo adjuvansami, ktoré sa používajú pri príprave vakcín. Kvôli príprave vakcíny sa imunogénne partikuly podobné vírusovým partikulám (VLP) podľa vynálezu zlučujú s fyziologicky prijateľnými roztokmi, ako sú pufer PBS, fyziologický roztok alebo destilovaná voda. Imunogénne partikuly podobné vírusovým partikulám (VLP) sa podávajú v dávkach v rozmedzí od 0,1 do 100 pg, prednosť sa dáva dávke od 1 do 20 pg, s cieľom dosiahnuť požadovaný imunogénny účinok. Množstvo partikúl podobných vírusovým partikulám (VLP) v prípravku môže kolísať v závislosti od rôznych faktorov, ktoré zahrnujú celkový stav indivídua, váhu, pohlavie a vek. Prípravky s VLP sa môžu podávať rôznymi spôsobmi, ktoré zahrnujú orálne, lokálne, mukozálne, intramuskuláme a subkutánne podanie. Tieto prípravky s VLP môžu obsahovať jediný typ partikúl podobných vírusovým partikulám (VLP) (t. j. z ľudského papilomavírusu typu 6a) alebo zmes partikúl podobných vírusovým partikulám (VLP) (t. j. VLP z ľudských papilomavírusov typu 6a, 11,16 a 18).

Môžu byť prítomné antimikrobiálne prípravky, napríklad timerosal. Ak je nutné, môžu sa použiť imunogénne antigény podľa vynálezu v kombinácii so stabilizátormi a adjuvansami, ktoré sa používajú pri príprave vakcín. Typickými stabilizátormi sú špecifické látky, napríklad polyanióny, ako sú heparín, inositol, haxasulfát, sulfónovaný beta-cyklodextrín, menej špecifické excipienty, napríklad aminokyseliny, sorbitol, manitol, xylitol, glycerol, sacharóza, dextróza, trehalóza alebo rôzne podmienky, ktoré nastávajú v roztoku, napríklad neutrálne pH, vysoká iónová sila (asi 0,5 až 2 M soli), obsah dvojvalentných katiónov (Ca²⁺, Mg^24-). Príkladmi adjuvasov sú A1(OH)₃ a A1(PO₄). Vakcíny podľa vynálezu sa uchovávajú v chladničkách v lyofilizovanej forme.

Príklad 36 Príprava protilátok proti partikulám podobným vírusovým partikulám (VLP)

Čistené partikuly podobné vírusovým partikulám (VLP) sa používajú na vyvolanie tvorby protilátok. Termín „protilátky“ tu zahrnuje polyklonálne a monoklonálne protilátky a ich fragmenty, ako sú Fv, Fab a F(ab)2 fragmenty, ktoré sú schopné sa viazať na antigén alebo haptén. Protilátky sa používajú rôznymi spôsobmi, napríklad na čistenie rekombinantných prirodzených proteínov L1 a L2 a v rôznych súpravách. Súpravy by mali obsahovať najmenej jeden oddelený kontajner, v ktorom bude tesne uzavretý nosič. Nosič zahrnuje reagencie, ako anti-VLP protilátky alebo partikuly podobné vírusovým partikulám (VLP) vhodné na detekciu ľudských papilomavírusov, fragmentov ľudských papilomavírusov alebo protilátok proti ľudským papilomavírusom. Ďalšou súčasťou nosiča na účely detekcie, môže byť značený antigén alebo enzýmové substráty a podobne. Protilátky, partikuly podobné vírusovým partikulám (VLP) alebo súpravy sa využívajú na rôzne účely, ako sú súdne analýzy a epidemiologické štúdie.

Príklad 37

Čistenie rekombinantného kapsidového proteínu HPV typu 11 Ll

Všetky kroky sa uskutočňujú pri teplote 4 °C pokiaľ nie je uvedené inak.

Bunky sa uchovávajú v zmrazenej forme pri teplote -70 °C. Zmrazené bunky (mokrá váha 180 g) sa rozmrazujú pri teplote 20 až 23 °C a resuspendujú sa v 900 ml „lyžujú ceho pufra“ (50 mM MOPS, pH 7,2, 500 mM NaCl, 1 mM CaClj). Do pufra sa pridajú inhibítory proteázy AEBSF a pepstatín A s konečnou koncentráciou 1 mM, respektíve

1,7 μΜ. Bunková suspenzia sa rozbije pri tlaku približne 112 MPa v štyroch cykloch v mikrofluidizéri M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). S cieľom rozbiť bunkovú suspenziu sa pridá dostatočné množstvo detergentu Triton X10O^R (Pierce, Rockford, IL), jeho konečná koncentrácia je 0,5 %. Bunková suspenzia sa mieša 20 hodín. Lyzát ošetrený Tritonom X100 sa centrifuguje pri 12 OOOxg počas 40 minút, s cieľom odstrániť bunkový odpad. Odoberá sa supematant, ktorý obsahuje L1 proteín.

Supematant sa diafiltruje proti piatim objemom 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2, 0,5 M NaCl s použitím membránovej kazety s tangenciálnym prietokom 300K (Filtron, Northborough, MA). Rádioimunotestom a Westem blotom sa dokázalo, že materiál zadržaný na membráne obsahuje proteín L1.

Dialyzovaný roztok sa aplikoval na afinitnú kolónu z vysokým rozlíšením (11 cm v priemere x 5,3 cm). Ako náplň sa použila živica SP Spherodex (M)^R (IFB, Villeneuvela-Garenne, France) ekvilibrovaná 20 mM fosforečnanom sodným, pH 7,2, 0,5 NaCl. Nasleduje premytie s ekvilibračným pufrom a ďalšie premytie 20 mM fosforečnanom sodným, pH 7,2, 1 M NaCl. Proteín L1 sa vymyje 20 mM fosforečnanom sodným, pH 7,2, 2,5 M NaČl. Počas premývania a vymývania sa zbierajú jednotlivé frakcie. Použitím Bradfordovej metódy sa frakcie testujú s cieľom stanoviť celkové množstvo proteínu. Frakcie sa potom analyzujú metódou Westem blot a SDS-PAGE použitím detekcie koloidnou Coomassie.

Frakcie sa tiež analyzujú rádioimunotestom.

Spoja sa frakcie, ktoré vykazujú porovnateľnú čistotu a obsah proteínu Ll.

Konečný produkt sa testuje metódou SDS-PAGE s použitím farbenia koloidnou Coomassie. Odhaduje sa, že proteín L1 je na 90 % homogénny. Či ide určite o proteiny Ll a L2 sa dokáže Westem blotom použitím príslušného antiséra. Konečný produkt sa filtruje cez membránu s pórmi s veľkosťou 0,22 pm a uchováva sa pri teplote 4 °C. Týmto spôsobom sa získalo celkom 100 mg proteínu.

Pomocou štruktúrnej sondy (West Chester, PA) prebieha analýza elektrónovou mikroskopiou. Alikvotná časť každej vzorky sa umiestni na medenú mriežku s 200 okami potiahnutú uhlíkom. Na mriežku sa kvapla na čas 20 sekúnd kvapka 2 % kyseliny fosforečnano-12-volfrámovej (PTA), pH 7,0. Pred použitím mikroskopu sa mriežka nechala vyschnúť na vzduchu. Mikroskopické pozorovanie sa uskutočnilo použitím JEOL 100CX transmisného elektrónového mikroskopu (JEOL USA, Inc.) pri akceleračnom napätí 100 kV. Vzniknutý mikrograf má konečné zväčšenie lOOOOOx.

Bradfordov test na stanovenie celkového množstva proteínu Stanovenie celkového množstva proteínu prebieha s použitím bežne dostupného kitu Coomassie Plus^R (Pierce, Rockford, IL). Vzorky sa riedia Milli-Q-vodou. Podľa štandardného protokolu je potrebný objem vzorky 1 ml, pre mikrometódu je to objem 0,1 ml. V oboch prípadoch sa na prípravu štandardnej krivky používa BSA (Pierce, Rockford, IL). Test prebieha podľa inštrukcií výrobcu. Štandardná krivka sa vynáša s použitím softvéru CricketGraph^R na počítači Macintosh líci.

Test SDS-PAGE a Westem blot

Všetky prístroje, gély a pufre sa získali od firmy Novex (San Diego, CA) a prevádzkovali sa a pripravovali podľa inštrukcií výrobcu. Vzorky sa riedia na rovnakú koncentráciu proteínu Milli-Q-vodou a zmiešajú sa v pomere 1 : 1 s inkubačným pufrom, ktorý obsahuje 200 mM DTT. Vzorky sa inkubujú počas 15 minút pri teplote 100 °C a nanesú sa na vopred naliaty 12 % Tris-glycínový gél. Vzorky sa elektroforezujú pri napätí 125 V počas 1 hodiny a 45 minút. Gély sa vizualizujú s použitím buď farbenia striebrom podľa rôznych metód publikovaných Heukeshovenom a Dernickom (Electrophoresis, 6 (1985) 103 až 112) alebo Coomassie farbenie použitím bežne dostupnej súpravy (Inetgrated Separation Systems, Natick, MA). V prípade spôsobu Wester blot sa proteínu nanášajú na membrány PVDF pri napätí 25 V počas 40 minút. Membrány sa premývajú Milli-Q-vodou a sušia sa na vzduchu. Ako primáme protilátky slúži polyklonálne králičie antisérum vzniknuté proti fúznemu proteinu TrpE-HPVllLl (darček od Dr. D. Brown). Roztok protilátok sa pripraví riedením antiséra blotovacím roztokom (5 % netučné mlieko rozpustené v 6,25 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2, 150 mM NaCl, 0,02 % NaN₃). Inkubácia prebieha počas najmenej 1 hodiny pri teplote 20 až 23 °C. Blot sa 3x premýva vždy počas 1 minúty v pufri PBS (6,25 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 150 mM NaCl). Roztok sekundárnych protilátok sa pripraví riedením príslušného kozieho anti-králičieho IgG viazaného na chrenovú peroxidázu (HRP) konjugačného antiséra (Pierca, Rockford, IL) blotujucim pufrom. Inkubácia prebieha za rovnakých podmienok počas najmenej jednej hodiny. Bloty sa premývajú spôsobom skôr opísaným a detegujú sa použitím substrátu NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL).

Príklad 38

Čistenie rekombinantného kapsidového proteínu HPV typu 6a L1

Všetky kroky sa uskutočňujú pri teplote 4 °C pokiaľ nie je uvedené inak.

Bunky sa uchovávajú v zmrazenej forme pri teplote -70 °C. Zmrazené bunky (mokrá váha 60 g) sa rozmrazujú pri teplote 45 °C a resuspendujú sa v 300 ml „lyžujúceho pufra“ (50 mM MOPS, pH 7,2, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl₂). Do pufra sa pridajú inhibítory proteázy AEBSF a pepstatín A s konečnou koncentráciou 1 mM, respektíve

1,7 μΜ. Bunková suspenzia sa rozbije pri tlaku približne 112 MPa v piatich cykloch v miläofluidizéri M110-Y (Microfluidics Corp., Newton, MA). S cieľom rozbiť bunkovú suspenziu sa pridá dostatočné množstvo detergentu Triton X1OO^R (Pierce, Rockford, IL), jeho konečná koncentrácia je 0,5 %. Bunková suspenzia sa mieša 18 hodín. Lyzát ošetrený Tritonom X100 sa centrifuguje pri 12 OOOxg počas 40 minút, s cieľom odstrániť bunkový odpad. Odoberá sa supematant, ktorý obsahuje L1 proteín.

Supematant sa diafiltruje proti piatim objemom 20 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2, 0,5 M NaCl s použitím membránovej kazety s tangenciálnym prietokom 300K (Filtron, Northborough, MA). Rádioimunotestom a Westem blotom sa dokázalo, že materiál zadržaný na membráne obsahuje proteín Ll.

Dialyzovaný roztok sa aplikoval na afinitnú kolónu s vysokým rozlíšením (5 cm v priemere x 10 cm). Ako náplň sa použila živica POROS^R 50HS (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA) ekvilibrovaná 20 mM fosforečnanom sodným, pH 7,2, 0,5 NaCl. Nasleduje premytie s ekvilibračným pufrom. Proteín Ll sa vymyje NaCl s lineárnym gradientom 0,5 až 1,5 mM, v 20 mM fosforečnane sodnom, pH 7,2. Počas premývania a vymývania sa zbierajú jednotlivé frakcie. Použitím Bradfordovej metódy sa frakcie testujú s cieľom stanoviť celkové množstvo proteínu. Frakcie sa potom analyzujú metódou Westem blot a SDS-PAGE použitím detekcie koloidnou Coomassie. Frakcie sa tiež analyzujú rádioimunotestom.

Spoja sa frakcie, ktoré vykazujú porovnateľnú čistotu a obsah proteínu Ll. Spojené frakcie sa aseptický filtrujú cez membránu s pórmi s veľkosťou 0,22 pm. Produkt sa koncentruje v miešaných jamkách s objemom 50 ml s použitím membrán YM-100 (Amicon, Inc., Beverly, MA) s priemerom 43 mm v atmosfére dusíka pri tlaku 0,028 až 0,042 MPa. Produkt sa uchováva pri teplote 4 °C. Týmto spôsobom sa pripravilo celkom 2,7 mg proteínu.

Vzorka konečného produktu sa ďalej koncentruje pomocou TCA zrážaním a testuje sa metódou SDS-PAGE s použitím farbenia koloidnou Coomassie. Denzitometria farebných gélov koloidnej Coomassie dokázala, že proteín Ll je na 90 % a viac homogénny. Či ide určite o proteín Ll sa dokáže Westem blotom.

Pomocou štruktúrnej sondy (West Chester, PA) prebieha analýza elektrónovou mikroskopiou. Alikvotná časť každej vzorky sa umiestni na medenú mriežku s 200 okami potiahnutú uhlíkom. Na mriežku sa kvapla na čas 20 sekúnd kvapka 2 % kyseliny fosforečnano-12-volfrámovej (PTA), pH 7,0. Pred použitím mikroskopu sa mriežka nechala vyschnúť na vzduchu. Mikroskopické pozorovanie sa uskutočnilo použitím JEOL 100CX transmisného elektrónového mikroskopu (JEOL USA, Inc.) pri akceleračnom napätí 100 kV. Vzniknutý mikrograf má konečné zväčšenie lOOOOOx.

Bradfordov test na stanovenie celkového množstva proteínu

Stanovenie celkového množstva proteínu prebieha s použitím bežne dostupného kitu Coomassie Plus^R (Pierce, Rockford, IL). Vzorky sa riedia Milli-Q-vodou. Podľa štandardného protokoluje potrebný objem vzorky 1 ml, pre mikrometódu je to objem 0,1 ml. V oboch prípadoch sa na prípravu štandardnej krivky používa BSA (Pierce, Rockford, IL). Test prebieha podľa inštrukcií výrobcu. Štandardná krivka sa vynáša s použitím softvéru ČricketGraph^R na počítači Macintosh líci.

Test SDS-PAGE a Westem blot

Všetky prístroje, gély a pufre sa získali od firmy Novex (San Diego, CA) a prevádzkovali sa a pripravovali podľa inštrukcií výrobcu. Vzorky sa riedia na rovnakú koncentráciu proteínu Milli-Q-vodou a zmiešajú sa v pomere 1 : 1 s inkubačným pufrom, ktorý obsahuje 200 mM DTT. Vzorky sa inkubujú počas 15 minút pri teplote 100 “C a nanesú sa na vopred naliaty 12 % Tris-glycinový gél. Vzorky sa elektroforezujú pri napätí 125 V počas 1 hodiny a 45 minút. Gély sa vizualizujú s použitím buď farbenia striebrom podľa rôznych metód publikovaných Heukeshovenom a Dernickom (Electrophoresis, 6 (1985) 103 až 112) alebo Coomassie farbenia použitím bežne dostupnej súpravy (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

V prípade spôsobu Wester blot sa proteínu nanášajú na membrány PVDF pri napätí 25 V počas 40 minút Membrány sa premývajú Milli-Q-vodou a sušia sa na vzduchu. Ako primáme protilátky slúži MAB 837 (Chemicon Intemational, Inc., Temecula, C A), ktoré sú kovalentne viazané enzým alkalickou fosfatázou (J. Cook, MRL). Roztok protilátok sa pripraví riedením antiséra blotovacím roztokom (5 % netučné mlieko rozpustené v 6,25 mM fosforečnanu sodného, pH 7,2,150 mM NaCl, 0,02 % NaN₃). Inkubácia prebieha počas najmenej 1 hodiny pri teplote 20 až 23 “C. Blot sa 3x premýva vždy počas 1 minúty v pufri PBS (6,25 mM fosforečnan

SK 281878 Β6 sodný, pH 7, 2, 150 mM NaCl). Bloty sa detegujú použitím substrátu NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL).

Zoznam sekvencii

Informácie o sekvencii SEQID č. 1:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 30 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č. 1:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 2:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 30 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č.2:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 3:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 21 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č.3:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 4:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 21 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č.4:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 5:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 21 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č.5:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 6:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 21 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č.6:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 7:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 34 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č.7:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 8:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 45 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov Jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č.8:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 9:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 34 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č.9:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 10:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 45 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č. 10:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 11:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 38 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č.l 1:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 12:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 38 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov:jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č. 12:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 13:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 34 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č. 13:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 14:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 39 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č. 14:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 15:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 32 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

SK 281878 Β6

C. počet reťazcov Jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQID č. 15:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 16:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 35 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č. 16:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 17:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 47 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č. 17:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 18:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 35 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č. 18:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 19:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 45 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č. 19:

Informácie o sekvencii SEQ ID č. 20:

i) charakteristiky sekvencie:

A. dĺžka: 33 párov báz

B. typ: nukleová kyselina

C. počet reťazcov: jednoreťazová

D. topológia: lineárna ii) typ molekuly: cDNA iii) znázornenie sekvencie: SEQ ID č.20:

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (13)

1. Kapsidový proteín papilomavírusu typu HPV6a, HPV11 alebo HPV16, izolovaný a čistený, vybraný zo skupiny, ktorá zahŕňa proteíny Ll, L2, L1+L2 a ich funkčné deriváty, pripravené v umelom systéme obsahujúcom rekombinantnú kvasinkovú bunku, pričom proteíny sú najmenej 70 %-nej čistoty.

2. Kapsidy, vyznačujúce sa tým, že obsahujú proteín podľa nároku 1.

3. Kapsidy podľa nároku 3, vyznačujúce sa tým, že sú najmenej 70 %-nej čistoty.

4. Partikuly podobné vírusovým partikulám, vyznačujúce sa tým, že obsahujú proteín podľa nároku 1.

5. Partikuly podobné vírusovým partikulám, podľa nároku 4, vyznačujúce sa tým, že sú najmenej 70 %-nej čistoty.

6. Spôsob prípravy čisteného proteínu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že

a) kvasinková bunka sa transformuje molekulou rekombinantnej DNA kódujúcou proteín vybraný zo skupiny, ktorá zahrnuje proteíny Ll, L2, L1+L2 papilomavírusov typu HPV6a, HPV11 alebo HPV16 a ich funkčné deriváty,

b) transformovaná kvasinková bunka sa kultivuje za podmienok, ktoré dovoľujú expresiu molekuly rekombinantnej DNA, a tak sa produkuje surový rekombinantný papilomavírusový proteín a

c) surový rekombinantný papilomavírusový proteín sa čistí použitím chromatografickej kolóny na báze poly(styrén-divinylbenzénu) a vzniká čistený proteín.

7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že kvasinkovou bunkou je Saccharomyces cerevisiae.

8. Vakcína na liečbu alebo prevenciu papilomavírusovej infekcie, vyznačujúca sa tým, že obsahuj e proteín podľa nároku 1.

9. Farmaceutické prostriedky, vyznačujúce sa tým, že obsahujú proteín podľa nároku 1.

10. Farmaceutické prostriedky, vyznačujúce sa tým, že obsahujú kapsidy podľa nárokov 2 alebo 3.

11. Farmaceutické prostriedky, vyznačujúce sa tým, že obsahujú partikuly podobné vírusovým partikulám podľa nárokov 4 alebo 5.

12. Súprava na detekciu papilomavírusu alebo protilátok vzniknutých proti papilomavírusom, vyznačujúca sa tým, že obsahuje činidlo, vybrané zo skupiny zahrnujúcej molekulu rekombinantnej DNA, kódujúcej papilomavírusový proteín, čistený papilomavírusový proteín podľa nároku 1, partikuly podobné vírusovým partikulám obsahujúce papilomavírusový proteín podľa nároku 4, protilátky vytvorené proti papilomavírusovému proteínu podľa nároku 1 a protilátky vytvorené proti partikulám podobným vírusovým partikulám podľa nároku 4.

13. Použitie proteínu podľa nároku 1 na výrobu liečiva na vyvolanie imunitnej odozvy u stavovcov.

10 výkresov t/IO

OBR. 1

2/10

OBR. 2

SK 281878 Β6

3/10

SK 281878 Β6

4/10

2150-2-3 (MATa, Ieu2, adeľ)

Selekcia ura na platniach FOA

U9 (MATa, Ieu2, ade1, ura3)

Transformácia pomocou kazety mnn9::URA3

1372 (mnnS, Ieu2, adel)

Selekcia ura“ na platniach FOA

1372-ura3 (mnn9, Ieu2, ura3, ade!)

I Transformácia pomocou | kazety his3::URA3

1372-hís3 (mnn9, Ieu2, his3, ade1)

Transformácia pomocou kazety prbl::URA3 kmeň 1558 (MATa, Ieu2, mnn9, prbl, ade1)

OBR. 4

SK 281878 Β6

5/10

2150-2-3 (MATa, /eu2, adeí) í Selekcia ura na platniach FOA

U9 (MATa, Ieu2, adeí, ura3) | Transformácia pomocou Y kazety his3::URA3

1524 (leu2_t adeí, his3) | Transformácia pomocou J kazety prbl::HIS3

1537 (Ieu2_rprb1, adeí) y Selekcia ura na platniach FOA

1541 (Ieu2, prb 1, ade 1, ura3)

Transformácia pomocou * kazety pep4::URA3

1569 (MATa, Ieu2, prb1, pep4, adeí)

OBR. 5

SK 281878 Β6

6/10

OBR. 6

SK 281878 Β6

7/10

Rekombinantný kmeň PV kódový reťazec (reťazce) Hostiteľský kmeň kvasiniek^a 1582 CRPV Ll 15Ô9 1583 CRPV L2 1538 1603 CRPV Ll + L2 (dvojplazmidový systém) 1592 1606 CRPV ϋ τ 12 1569 1609 CRPV Ll r 12 BJ5462 1644 HFV 6a L1 1558 1670 HFV 6a Ll 4 L2 1558 1678 HP/ 16 Ll 1558 1679 HFV 16 Ll Ť 12 1558

OBR. 7

SK 281878 Β6

8/10

SK 281878 Β6

9/10

12 3 4 5 6 7 8 9 10

OBR. 8B

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

OBR. 8C

SK 281878 Β6

10/10

Rozrušenie buniek f

Vyčerenie lyzátu odstredením pri malej rýchlosti t

Sedimentácia cez 45% sacharózu

Resuspenzia usadeniny a vyčerenie odstredením malou rýchlosťou

Extrakcia chloroformom (tento stupeň bol v schéme 2 vynechaný)

I

Chromatografia na anionomeniči

I

Ultrafiltrácia (polyétersulfónová membrána)

Chromatografia s oddelením podľa mol. hmotnosti

I

Ultrafiltrácia (membrána YM-100)

OBR. 9