HRP950557A2 - Purified papillomavirus proteins - Google Patents

Description

Ovo je djelomičan nastavak S.A.D. patentne prijave br. 08/339,668 podnijete 14. studenog 1994., čije je rješavanje u tijeku.

Područje tehnike

Predmet ovog izuma su pročišćeni rekombinantni proteini papilomavirusa (PV) i postupci za njihovo dobivanje, mjerenje, uporabu i formuliranje.

Kratak opis crteža

Slika 1 prikazuje dvosmjerni ekspresijski vektor kvasca upotrijebljen za ekspresiju kapsidnih proteina L1 i/ili L2 papilomavirusa.

Slika 2 je elektronski mikrograf HPV6a L1 VLP-a koje su eksprimirane u kvascu.

Slika 3 je elektronski mikrograf HPV6a L1/L2 VLP-a koje su eksprimirane u kvascu.

Slika 4 je shematski pregled oblikovanja soja 1558 S. cerevisiae.

Slika 5 je shematski pregled oblikovanja soja 1569 S. cerevisiae.

Slika 6 prikazuje najvažnije korake u postupku pročišćavanja.

Slika 7 je popis sojeva.

Slika 8 prikazuje niz SDS-PAGE analiza L1 + L2 HPV16 pročišćenih iz kvasca. Osim konačno pročišćenog VLP, uključeni su i ostaci iz intermedijarnih stupnjeva u postupku pročišćavanja. Tablica omogućuje identifikaciju uzoraka u svakom stupcu. Uključeni su i gel obojan koloidalnim Coomassie kao i Western blotovi ispitivani protuserumima na proteine L1 i L2.

Slika 9 je shema alternativnih postupaka pročišćavanja L1 papilomavirusa cottontail kunića.

Stanje tehnike

Infekcije papilomavirusom nastaju u brojnih životinjskih vrsta, uključujući ovce, pse, mačke, kuniće, majmune, zmije i krave, kao i u čovjeka. Papilomavirusi inficiraju stanice epitela, potičući nastajanje epitelnih ili fibroepitelnih tumora na mjestu infekcije. PV su infektivni agensi specifični za vrstu; humani papilomavirus ne može inficirati životinje.

Papilomavirusi se mogu podijeliti u različite skupine prema vrsti domaćina kojeg inficiraju. Humani papilomavirusi (HPV) dijele se na više od 70 tipova prema homologiji slijeda DNA. Izgleda da je imunogeničnost papilomavirusa tipnospecifična, jer neutralizirajuća imunost na infekciju jednim tipom papilomavirusa na znači imunost na drugi tip.

U čovjeka, različiti tipovi HPV uzrokuju različite bolesti. HPV tipovi 1,2,3,4,7,10 i 26-29 uzrokuju dobroćudne bradavice i u normalnih i u imunokompromitiranih pojedinaca. HPV tipovi 5,8,9,12,14,15,17,19-25,36 i 46-50 uzrokuju pločaste lezije u imunokompromitiranih pojedinaca. HPV tipovi 6,11,34,39,41-44 i 51-55 uzrokuju nemaligne kondilome na sluznicama genitalnog i dišnog sustava. HPV tipovi 16,18,31,33,35,45 i 58 uzrokuju displaziju epitela sluznice genitalnog sustava i povezani su s većinom in situ i invazivnih karcinoma cerviksa, vagine, vulve i analnog kanala.

Papilomavirusi su mali (50-60 nm), ikozaedarski DNA virusi bez omotača koji sadrže do osam ranih i dva kasna gena. Otvoreni okviri čitanja (engl. open reading frames), (ORF-ovi) virusnih genoma označeni su s E1 do E7 i L1 do L2, pri čemu se “E” označuje rani, a “L” označuje kasni. L1 i L2 kodiraju proteine virusne kapside. Rani (E) geni povezani su s funkcijama kao što su replikacija virusa i stanična transformacija.

L1 veći protein kapside čija je molekularna težina 55-60 kDa. L2 je manji protein kapsule čija je očekivana molekularna težina 55-60 kDa, a točna molekularna težina 75-100 kDa što je ustanovljeno elektroforezom na poliakrilamidnom gelu. Imunološki podaci ukazuju da se najveći dio L2 proteina nalazi unutar L1 proteina. L1 ORF je znatno održan među različitim papilomavirusima. L2 proteini su manje održani među različitim papilomavirusima.

Geni L1 i L2 ustanovljeni su kao pogodni ciljevi za imunoprofilaksu. Za neke od ranih gena također je pokazano da su potencijalni ciljevi za razvoj cjepiva. Pokusi sa sustavima papilomavirusa cottontail kunića (CRPV) i goveđeg papilomavirusa (BPV) pokazali su da imunizacija ovim proteinima dobivenim bakterijskom ekspresijom ili korištenjem vakcinija vektora štite životinje od infekcije virusom. Ekspresijom gena L1 papilomavirusa u ekspresijskim sustavima bakulovirusa ili korištenjem vakcinija vektora došlo je do nakupljanja čestica sličnih virusu (VLP) koje su korištene da se postigne imunosni odgovor visokog titra virus-neutralizirajućih protutijela koji korelira sa stupnjem zaštite od infekcije virusom. Pored toga, geni L1 i L2 korišteni su za tvorbu cjepiva za sprečavanje i liječenje infekcija papilomavirusom u životinja. Geni L1 i L2 HPV tipa 16 klonirani su u vakcinija virusnom vektoru; dobiveni vektor upotrijebljen je za inficiranje CV-1 stanica sisavaca u svrhu proizvodnje čestica sličnih virusu (VLP).

Razvoj i komercijalizacija profilaktičkih i terapijskih cjepiva protiv PV infekcija i bolesti, koja sadrže protein L1, proteine L1+L2 ili modificirane proteine L1 ili L1+L2, bili su ometeni manjkom velikih količina pročišćenih virusa i pročišćenih proteina. Kako HPV do sada nije uspješno kultiviran in vitro, teško je proizvesti potrebne količine proteina L1 i L2 razmnožavanjem PV iv vitro. Posljedični problemi dobave otežavaju opisivanje PV i PV proteina. Shodno tome, bilo bi korisno razviti lako obnovljiv izvor sirovih PV proteina, osobito proteina PV L1 i L2 ili modificiranih proteina L1 i L2. Također bi bilo korisno razviti postupke pročišćavanja velikih količina proteina papilomavirusa stupnja čistoće podobnog za imunološka proučavanja i razvoj cjepiva. Također bi bilo korisno proizvesti velike količine proteina papilomavirusa koji imaju imunogenična svojstva nativnih proteina, na primjer konformaciju nativnih proteina. Pored toga, bilo bi korisno razviti postupke za ispitivanje PV proteina i postupke za određivanje relativne čistoće proteina kao i spojeva koji ih sadrže. Takvi visoko pročišćeni proteini također bi bili korisni u pripravljanju različitih reagensa potrebnih za proučavanje PV infekcija; takvi reagensi uključuju, ali nisu ograničeni na poliklonalna protutijela, monoklonalna protutijela i analitičke standarde.

Predmet ovog izuma su visoko pročišćeni proteini L1 i L2 PV. Izum također donosi postupke za proizvodnju i pročišćavanje rekombinantnih proteina papilomavirusa koji imaju imunogenična svojstva nativnih proteina papilomavirusa. Predmet ovog izuma je proizvodnja profilaktičkih i terapijskih cjepiva protiv infekcija papilomavirusom. Rekombinantni proteini ovog izuma mogu tvoriti čestice slične virusu (VLP). Ove VLP su imunogenične i sprečavaju razvoj bradavica u životinjskom modelu. Izum je opisan rekombinantnim proteinimaL1 i L1 + L2 papilomavirusa cottontail kunića (CRPV) dobivenim iz kvasca, HPV tipa 6 (podtipa 6a) i HPV tipa 16 kao modelima. Postupci pročišćavanja i analize koji su ovdje primijenjeni mogu se prilagoditi i drugim tipovima HPV, drugim proteinima HPV kao i drugim ekspresijskim sustavima.

Sažetak izuma

Predmet ovog izuma su pročišćeni proteini papilomavirusa (PV) i postupci njihove pripreme, mjerenja, korištenja i formuliranja.

Opsežan opis izuma

Predmet ovog izuma su pročišćeni rekombinantni proteini papilomavirusa i postupci njihove pripreme, mjerenja, korištenja i formuliranja. Izum je opisan, ali ne i ograničen na rekombinantne proteine CRPV dobivene iz kvasca, HPV6a i HPV16. Različite realizacije ovog izuma uključuju, ali nisu ograničene na rekombinantne HPV molekule DNA, molekule RNA kompolementarne rekombinantnim HPV molekulama DNA, proteine kodirane rekombinantnim molekulama DNA, protutijela na rekombinantne molekule DNA i odgovarajuće proteine, spojeve koji sadrže DNA, RNA, proteine ili protutijela, postupke za korištenje DNA, RNA, proteina ili protutijela kao i njihovih derivata. Ti derivati uključuju, ali nisu ograničeni na peptide i proteine koje kodira DNA, protutijela na DNA ili protutijela na proteine koje kodira DNA, cjepiva koja sadrže DNA ili cjepiva koja sadrže proteine koje kodira DNA, imunološke spojeve koji sadrže DNA ili proteine koje kodira DNA, tvari koje sadrže DNA ili RNA izvedene iz DNA ili proteine koje kodira DNA.

Pripravljeni su L1 i L2 rekombinantnog goveđeg papilomavirusa dobivenog od bakterija. Neutralizirajući serumi na rekombinantne bakterijske proteine križno su reagirali s nativnim virusom pri niskim koncentracijama, vjerojatno zbog razlika u konformaciji između nativnih i bakterijski dobivenih proteina.

Rekombinantni bakulovirusi sa ekspresijom L1 HPV16 ili L2 HPV16 ORF upotrijebljeni su da bi se inficirale SF9 stanice kukca i dobili proteini L1 i L2. Western blot analize pokazale su da proteini L1 i L2 dobiveni od bakulovirusa reagiraju s protutijelima na HPV16. L1 dobiven iz bakulovirusa tvori VLP.

Objavljena je priprava sirovih L1 HPV16 i L2 HPV16 proteina pomoću rekombinantnih sojeva Saccharomyces cerevisiae. Rekombinantni su proteini nastali kao unutarstanični odnosno kao sekretorni produkti. U slučaju kad je ekspresija proteina bila unutarstanična, uz najveći dio proteina bila je ustanovljena netopljivost nakon lize stanice bez prisutnosti denaturirajućih tvari. Čistoća ovih proteina nije objavljena.

Za rekombinantne proteine izlučene iz kvasca pokazano je da sadrže ugljikohidrate porijeklom iz kvasca. Prisutnost ovih N-vezanih oligosaharida može prikriti nativne epitope. Pored toga, izlučeni rekombinantni proteini mogu posjedovati druge modifikacije, kao što je zadržavanje sekretornog inicijalnog slijeda. Postupak izlučivanja također može biti manje učinkovit.

Razvoj i komercijalizacija profilaktičkih i terapijskih cjepiva protiv PV infekcija i bolesti koja sadrže protein L1, proteine L1 + L2 ili modificirane proteine L1 ili L1 + L2 ometeni su manjkom velikih količina pročišćenog virusa i pročišćenih proteina. Kako HPV do sada nije uspješno kultiviran in vitro, teško je pripraviti potrebne količine proteina L1 i L2 umnožavanjem PV in vitro. Teškoće povezane s in vitro kultivacijom PV također imaju za posljedicu teškoće u kemijskom, imunološkom i biološkom opisivanju PV i PV proteina. Shodno tome, bilo bi korisno razviti lako obnovljiv izvor sirovih PV proteina, osobito L1 i L2 PV ili modificiranih proteina L1 i L2. Također bi bilo korisno razviti postupke pročišćavanja velikih količina proteina papilomavirusa stupnja čistoće podobnog za imunološka proučavanja i razvoj cjepiva. Također bi bilo korisno proizvesti velike količine proteina papilomavirusa koji imaju imunogenična svojstva nativnih proteina, na primjer komformaciju nativnih proteina. Pored toga, bilo bi korisno razviti postupke za ispitivanje PV proteina i postupke za određivanje relativne čistoće proteina kao i spojeva koji ih sadrže. Takvi visoko pročišćeni proteini također bi bili korisni u pripravljanju različitih reagensa potrebnih za proučavanje PV infekcija; takvi reagensi uključuju, ali nisu ograničeni na poliklonalna protutijela, monoklonalna protutijela i analitičke standarde.

Farmaceutski korisni spojevi koji sadrže DNA ili proteine koje kodira DNA mogu se formulirati poznatim postupcima, kao na primjer dodavanjem farmaceutski prikladnog nosača. Primjeri takvih nosača i postupci za pripravu mogu se pronaći u Remington’s Pharmaceutical Sciences. Da bi se dobili farmaceutski prikladni spojevi pogodni za učinkovitu primjenu, takvi pripravci moraju sadržavati učinkovitu količinu proteina ili VLP. Takvi spojevi mogu sadržavati proteine ili VLP dobivene iz više tipova HPV.

Terapijski ili dijagnostički pripravci izuma primjenjuju se na pojedince u količinama dostatnim za liječenje ili dijagnosticiranje PV infekcija. Učinkovita količina ovisi o nizu činitelja kao što su tjelesna kondicija, težina, spol i dob pojedinca. Ostali činitelji uključuju i način primjene. Općenito, pripravci se primjenjuju u rasponu doza od oko 1µg do oko 1mg.

Farmaceutski pripravci mogu se primjenjivati na pojedince različitim putevima, kao što su supkutani, topički, peroralni, mukozalni, intravenski i intramuskularni.

Cjepiva ovog izuma sadrže DNA, RNA ili proteine koje kodira DNA koja sadrži antigenske determinante potrebne za pobuđivanje stvaranja neutralizirajućih protutijela u domaćinu. Takva su cjepiva dovoljno sigurna za primjenu bez opasnosti od kliničke infekcije; nemaju toksične nuspojave; mogu se primjenjivati učinkovitim putem; stabilna su, te kompatibilna s nosačem cjepiva.

Cjepiva se mogu primjenjivati različitim putevima, kao što su peroralni, parenteralni, supkutani, mukozalni, intravenski ili intramuskularni. Doza propisivanja mijenja se ovisno o kondiciji, spolu, težini i dobi pojedinca, putu primjene i tipu PV cjepiva. Cjepiva se mogu primjenjivati u različitim oblicima, kao što su kapsule, suspenzije, eliksiri ili otopine. Cjepivo se može pripraviti s imunološki prikladnim nosačem.

Cjepiva se primjenjuju u terapijski učinkovitim količinama, to jest u količinama dostatnim da pobude imunološki zaštitni odgovor. Terapijski učinkovite količine mijenjaju se ovisno o tipu PV. Cjepivo se može primijeniti u jednoj ili više doza.

Pročišćeni proteini ovog izuma mogu se koristiti za pripravu imunogeničnih pripravaka. Takvi pripravci, nakon uvođenja u prikladnog domaćina, mogu pobuditi imunosni odgovor u domaćinu.

Pročišćeni proteini izuma ili njihovi derivati mogu se koristiti za dobivanje protutijela. Izraz “protutijelo” ovdje upotrijebljen uključuje i poliklonalna i monoklonalna protutijela, kao i njihove fragmente, kao što su Fv, Fab i F(ab)2 fragmenti koji mogu vezati antigen ili hapten.

Proteini i proteinski derivati ovog izuma mogu se koristiti za serotipiziranje HPV infekcija i za HPV pretraživanje (skrining). Pročišćeni proteini, VLP i protutijela dovode se do oblika koji su pogodni za otkrivanje i serotipizaciju HPV. Jedan od takvih oblika sadrži razdijeljen nosač pogodan za održavanje barem jednog spremnika (kontejnera) u bliskom dodiru. Nosač može sadržavati i reagense kao što su rekombinantni proteini L1 ili L2 HPV6a ili VLP ili protu-HPV6a protutijela ili rekombinantne proteine L1 ili L2 HPV6a ili VLP ili protu-HPV16 protutijela pogodna za otkrivanje različitih tipova HPV. Nosač također može sadržavati sredstva za otkrivanje kao što su obilježeni antigen ili enzimski supstrati i slično.

Pročišćeni proteini također se mogu koristiti kao imunološki standardi, markeri molekularne težine i markeri veličine molekule.

Kako je genetički zapis neprecizan, pojedinu aminokiselinu može kodirati više od jednog kodona, pa se slijed aminokiselina može kodirati bilo kojim nizom sličnih oligonukleotida DNA. Samo će jedan iz tog niza biti istovjetan slijedu u HPV6a ili HPV16, no bit će, u odgovarajućim uvjetima, podložan hibridizaciji s HPV6a ili HPV16 čak i u prisutnosti DNA oligonukleotida s pogreškama. U promijenjenim uvjetima, i DNA oligonukleotidi s pogreškom mogu se hibridizirati s HPV6a ili HPV16 čime omogućuju otkrivanje i izdvajanje DNA koja kodira HPV6a i HPV16.

Pročišćena HPV6a i HPV16 DNA ovog izuma ili njeni fragmenti mogu se koristiti za izdvajanje i pročišćavanje homologa i fragmenata HPV6a iz drugih izvora. Da bi se to postiglo, prva DNA HPV6a treba se izmiješati s uzorkom koji sadrži DNA koja kodira homologe HPV6a u odgovarajućim uvjetima za hibridizaciju. Sklop hibridizirane DNA se izdvoji i iz njega se pročišćavanjem dobije DNA koja kodira homologe DNA.

Poznato je da postoji izvjesna količina suviška u različitim kodonima koji kodiraju pojedine aminokiseline. Zbog toga, predmet ovog izuma su i oni DNA slijedovi koji sadrže alternativne kodone koji kodiraju moguće translacije istovjetnih aminokiselina. U svrhu ovog izlaganja, slijedovi koji nose jedan ili više zamijenjenih kodona bit će nazvani degeneriranim varijacijama. Ovaj se izum bavi i mutacijama bilo u slijedu DNA ili u proteinima nastalima translacijom koji ne mijenjaju značajno konačna fizikalna svojstva proteina dobivenog ekspresijom. Na primjer, supstitucija valina za leucin, arginina za lizin ili asparagina za glutamin ne mora izazvati promjenu u djelovanju polipeptida.

Poznato je da se slijedovi DNA koji kodiraju peptide mogu promijeniti tako da kodiraju peptide koji imaju svojstva različita od onih koji se prirodno javljaju. Postupci promjene slijeda DNA uključuju, ali nisu ograničeni na mutagenezu usmjerenu na položaj.

U značenju u kojem se ovdje koristi, “funkcionalni derivat” HPV6a je spoj koji posjeduje biološku aktivnost (bilo funkcionalnu, bilo strukturalnu) koja je u temelju slična biološkoj aktivnosti HPV6a. Izraz “funkcionalni derivati” obuhvaća “fragmente”, “degenerirane varijante”, “analoge” i “homologe” ili “kemijske derivate” HPV6a. Izraz “fragment” odnosi se na bilo koju polipeptidnu podjedinicu HPV6a. Izraz “varijanta” odnosi se na molekulu koja je u temelju slična strukturom ili funkcijom bilo čitavoj molekuli HPV6a, bilo njenim fragmentima. Molekula je “u temelju slična” HPV6a ako obje molekule imaju u temelju slične strukture ili ako obje molekule posjeduju sličnu biološku aktivnost. Prema tome, ako dvije molekule posjeduju u temelju sličnu aktivnost, smatraju se varijantama čak i ako se struktura jedne od molekula ne nalazi i u drugoj, ili čak ako dva slijeda aminokiselina nisu istovjetna. Izraz “funkcionalni derivat” ne uključuje HPV6b.

Izraz “analog” odnosi se na molekulu u temelju sličnu po funkciji bilo čitavoj molekuli HPV6a, bilo njenom fragmentu.

Za molekularno kloniranje DNA HPV6a koristi se niz postupaka poznatih u struci. Ovi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na izravnu funkcionalnu ekspresiju gena HPV6a nakon oblikovanja cDNA ili genomske DNA knjižnice koja sadrži HPV6a, u odgovarajućem vektorskom sustavu za ekspresiju. Drugi postupak je probir cDNA koje sadrže HPV6a ili genomičnih DNA knjižnica oblikovanih u shuttle vektorima bakteriofaga ili plazmida s označenom oligonukleotidnom probom pripravljenom iz aminokiselinskog slijeda HPV6a. Dodatni se postupak sastoji od probira cDNA koje sadrže HPV6a ili genomičnih DNA knjižnica oblikovanih u plazmidskim shuttle vektorima ili bakteriofagima koji sadrže dio DNA koji kodira HPV6a.

Ova nepotpuna DNA dobije se specifičnom reakcijom lančane polimeraze (PCR) umnožavanjem DNA fragmenata HPV6a putem oblikovanja degeneriranih oligonukleotidnih klica iz aminokiselinskog slijeda pročišćenog HPV6a.

Drugi je postupak izdvajanje RNA iz stanica koje proizvode HPV6a i prevođenje RNA u protein in vitro i in vivo putem sustava za prevođenje. Prevođenje RNA u peptide ili u protein imat će za posljedicu stvaranje barem dijela proteina HPV6a koji se može otkriti, na primjer, prema aktivnosti proteina HPV6a ili imunološkom reaktivnošću s anti-HPV6a protutijelom. U ovom postupku, poolovi RNA izolirani iz stanica koje proizvode HPV6a mogu se ispitati na prisutnost RNA koja kodira barem dio HPV6a. Može se provesti daljnje razdvajanje poola RNA da bi se pročistila HPV6a RNA od ne-HPV6a RNA. Tako dobiven peptid ili protein se analizira da se ustanove slijedovi aminokiselina koji se potom koriste za dobivanje klica (primera) za stvaranje cDNA HPV6a, ili se RNA korištena za prevođenje analizira da se dobiju uzorci za probir cDNA knjižnice HPV6a. Ovi su postupci poznati u struci i mogu se naći u, na primjer, Sambrook, J.,Fritsch, E.F., Maniatis, T. u Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. 1989.

Poznavateljima struke očito je da i drugi tipovi knjižnica, kao i knjižnice sastavljene od drugih stanica ili tipova stanica, mogu poslužiti za izdvajanje DNA koja kodira HPV6a. Drugi tipovi knjižnica uključuju, ali nisu ograničeni na cDNA knjižnice izvedene na drugim stanicama ili staničnih linija koje sadrže HPV6a i genomske DNA knjižnice.

Priprava cDNA knjižnica može se provesti standardnim tehnikama dobro poznatim u struci. Tehnike priprave cDNA knjižnica mogu se naći u, na primjer, Sambrook, J., et al. vidjeti gore. Poznavateljima struke jasno je da se DNA koja kodira HPV6a može izdvojiti i iz pogodne genomske DNA knjižnice. Izrada genomskih DNA knjižnica može se provesti standardnim tehnikama poznatim u struci. Tehnike izrade genomske DNA knjižnice može se naći u Sambrook, J., et al. vidjeti gore.

Klonirana DNA HPV6a ili njezini fragmenti dobiveni ovdje opisanim postupcima mogu se podvrgnuti rekombinantnoj ekspresiji pomoću molekularnog kloniranja u ekspresijski vektor koji sadrži pogodan promotor i druge odgovarajuće elemente regulacije prevođenja, a koji se prenosi u prokariotsku ili eukariotsku stanicu domaćina u svrhu stvaranja rekombinantnog HPV6a. Tehnike takve manipulacije cjelovito su opisane u Sambrook, J., et al., vidjeti gore, i poznate u struci.

Ekspresijski vektori definirani su ovdje kao slijedovi DNA potrebni za prepisivanje kloniranih kopija gena i prevođenje njihovih mRNA u odgovarajućem domaćinu. Takvi se vektori mogu koristiti za ekspresiju eukariotskih gena u različitim domaćinima kao što su bakterije, modrozelene alge, stanice biljaka, stanice kukaca, stanice gljiva i stanice životinja.

Specifično oblikovani vektori omogućuju vezu (shuttling) između domaćina kao što su bakterija-kvasac ili bakterija-stanice životinja ili bakterija-stanice gljiva ili bakterija-stanice beskralješnjaka. Dobro oblikovan ekspresijski vektor trebao bi sadržavati: izvor replikacije za samostalnu replikaciju u stanicama domaćina, merkere koji se mogu selekcionirati, ograničen broj korisnih mjesta restrikcijskih enzima, sposobnost postizanja velikog broja kopija i aktivne promotore. Promotor je definiran kao slijed DNA koji nalaže vezanje RNA polimeraze na DNA i time započinje sintezu RNA. Moćan promotor je onaj koji uzrokuje visoku frekvenciju iniciranja mRNA. Ekspresijski vektori uključuju, ali nisu ograničeni na klonirajuće vektore, modificirane klonirajuće vektore i specifično oblikovane plazmide ili viruse.

Brojni se ekspresijski vektori sisavaca mogu koristiti za ekspresiju DNA HPV6a ili njenih fragmenata u stanicama sisavaca. Ekspresijski vektori sisavaca dostupni na tržištu koji su pogodni za ekspresiju rekombinantnog HPV6a uključuju, ali nisu ograničeni na pcDNA3 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagen), pSG5 (Stratagen), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) i λZD35 (ATCC 37565).

Brojni se bakterijski ekspresijski vektori mogu koristiti za ekspresiju DNA HPV6a ili njenih fragmenata u bakterijskim stanica. Bakterijski ekspresijski vektori dostupni na tržištu koji su pogodni za ekspresiju rekombinantnog HPV6a uključuju, ali nisu ograničeni na pET11a (Novagen), λgt11 (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).

Brojni se gljivični ekspresijski vektori mogu koristiti za ekspresiju DNA HPV6a ili njenih fragmenata u gljivičnim stanicama. Gljivični ekspresijski vektori dostupni na tržištu koji su pogodni za ekspresiju rekombinantnog HPV6a uključuju, ali nisu ograničeni na pYES2 (Invitrogen), Pichia ekspresijski vektor (Invitrogen).

Brojni se ekspresijski vektori stanica insekata mogu koristiti za ekspresiju DNA HPV6a ili njenih fragmenata u stanicama insekata. Ekspresijski vektori stanica insekata dostupni na tržištu koji su pogodni za ekspresiju rekombinantnog HPV6a uključuju, ali nisu ograničeni na pBlue BacIII (Invitrogen).

Ekspresijski vektor koji sadrži DNA koja kodira HPV6a ili njegove fragmente može se koristiti za ekspresiju proteina HPV6a ili fragmenata proteina HPV6a u stanici, tkivu, organu ili životinji. Izraz životinja, u smislu u kojem je ovdje upotrijebljen, uključuje i čovjeka. Stanice domaćina mogu biti prokariotske ili eukariotske, što uključuje, ali nije ograničeno na bakterije, kao što je E. coli, stanice gljiva, kao što su kvasci, stanice sisavaca koje uključuju, ali nisu ograničene na stanične linije ljudskog, goveđeg, svinjskog, majmunskog porijekla, te porijeklom od glodavaca, kao i stanice kukaca, što uključuje, ali nije ograničeno na stanične linije porijeklom od Drosophilae i svilca. Stanične linije dobivene od majmunskih vrsta koje su pogodne i dostupne na tržištu uključuju, ali nisu ograničene na L staniceL-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), L stanice L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86),CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61),3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BC-C-1 (ATCC CCL 26) i MRC-5 (ATCC CCL 171).

Ekspresijski vektori mogu se uvesti u stanice domaćina putem bilo koje od brojnih tehnika koje uključuju, ali nisu ograničene na transformaciju, lipofekciju, fuziju protoplasta i elektroporaciju. Stanice koje sadrže ekspresijski vektor se klonalno umnožavaju i pojedinačno ispituju da bi se ustanovilo stvaraju li protein HPV6a. Otkrivanje klonova stanica domaćina koji vrše ekspresiju HPV6a može se provesti na nekoliko načina, koji uključuju, ali nisu ograničeni na imunološku reaktivnost s protu-HPV6a protutijelima i postojanje HPV6a aktivnosti povezane sa stanicom domaćina, kao što je vezanje HPV6a-specifičnih liganada ili provođenje signala definirano kao odgovor posredovan međudjelovanjem HPV6a-specifičnih liganada i HPV6a.

Ekspresija fragmenata DNA HPV također se može provesti pomoću in vitro stvorene sintetičke mRNA ili nativne mRNA. Prevođenjem sintetičke mRNA ili mRNA izdvojene iz stanica koje proizvode HPV6a može se uspješno izvesti u različitim nestaničnim sustavima, koji uključuju, ali nisu ograničeni na ekstrakte pšeničnog kvasca i ekstrakte retikulocita, kao i u sustavima temeljnim na stanicama, koji uključuju, ali nisu ograničeni na mikroinjekcije u oocitu žabe, s time da se preporuča upravo taj sustav.

Nakon ekspresije proteina HPV6a u stanicama domaćina, protein HPV6a se može doraditi tako da se dobije HPV6a u pročišćenom obliku. Nekoliko je postupaka za pročišćavanje dostupno i pogodno za uporabu. Kao što se ovdje opisuje, rekombinantni protein HPV6a se može pročistiti iz staničnih lizata i ekstrakata različitim kombinacijama ili pojedinačnom primjenom frakcioniranja soli, ionske izmjenjivačke kromatografije, kromatografije koja razdvaja prema veličini, hidroksilapatit adsorpcijske kromatografije i hidrofobne interakcijske kromatografije.

Osim toga, rekombinantni HPV6a može se izdvojiti od ostalih staničnih proteina uporabom imunoafinitetnog stupca sastavljenog od monoklonalnih ili poliklonalnih protutijela specifičnih za nascentni HPV6a pune duljine ili polipeptidne fragmente HPV6a. Monoklonalna i poliklonalna protutijela mogu se pripraviti brojnim postupcima poznatim u struci. Monoklonalna ili monospecifična protutijela, u značenju u kojem se ovdje spominju, definirana su kao pojedinačne ili višestruke vrste protutijela s istovjetnim osobinama vezanja za HPV6a. Homogeno vezanje, u značenju u kojem se ovdje spominje, odnosi se na sposobnost protutijela određene vrste da se vežu na specifični antigen ili epitop.

Poznavatelji struke uočit će da se postupci za dobivanje monospecifičnih protutijela mogu provoditi tako da donose protutijela specifična za polipeptidne fragmente HPV ili za nascentni HPV pune duljine. Posebice će poznavatelji struke uvidjeti da se mogu dobivati monospecifična protutijela koja su specifična za cjelovite funkcionalne proteine HPV ili njihove fragmente.

Predmet ovog izuma su i postupci za probir spojeva koji moduliraju ekspresiju DNA ili RNA koje kodiraju HPV kao i funkcije proteina HPV6a in vivo. Spojevi koji moduliraju te aktivnosti mogu biti DNA; RNA, peptidi, proteini ili neproteinske organske molekule. Takvi spojevi mogu djelovati pojačavajući ili smanjujući ekspresiju DNA ili RNA koje kodiraju HPV6a ili funkciju samih proteina HPV6a. Spojevi koji moduliraju ekspresiju DNA ili RNA koje kodira HPV6a ili funkciju proteina HPV6a mogu se otkriti različitim testovima. Takav test može biti jednostavan “da/ne” test kojim se ustanovi postoji li promjena u ekspresiji ili funkciji. Testovi se mogu izvoditi i kvantitativno pri čemu se uspoređuju ekspresija ili funkcija ispitivanog uzorka s vrijednostima ekspresije ili funkcije u standardnom uzorku.

Također se mogu sastaviti pripravci koji sadrže DNA HPV6a, fragmente DNA HPV6a, protutijela na DNA HPV6a ili na protein HPV6a. Takvi se pripravci koriste za otkrivanje DNA koja hibridizira s DNA HPV6a ili za otkrivanje prisutnosti proteina ili peptidnih fragmenata HPV6a u uzorku. Takva su svojstva korisna za brojne namjene, koje uključuju, ali nisu ograničene na forenzička ispitivanja i epidemiološke studije.

Slijedovi nukleotida koji su komplementarni slijedu DNA koja kodira HPV6a mogu se sintetizirati za potrebe antisense terapije. Kao antisense molekule mogu služiti DNA, stabilni derivati DNA kao što su 2’-O-alkilRNA ili drugi oligonukleotidni HPV6a antisense mimetici. HPV6a antisense molekule mogu se uvesti u stanice mikroinjiciranjem, inkapsulacijom u liposome ili ekspresijom putem vektora koji nose antisense slijed. HPV6a antisense terapija je od osobite koristi u liječenju bolesti kod kojih je poželjno smanjiti aktivnost HPV6a.

Izraz “kemijski derivat” opisuje molekulu koja sadrži dodatne kemijske dijelove koji nisu uobičajeni dio osnove molekule. Takvi dijelovi mogu poboljšati topljivost, poluživot, apsorpciju i druga svojstva osnove molekule. S druge strane, ti dijelovi mogu ublažiti nepoželjne nuspojave osnove molekule ili ublažiti njenu toksičnost. Primjeri takvih dijelova opisani su u različitim tekstovima, na pr. u Remington’ s Pharmaceutical Sciences.

Spojevi otkriveni ovdje opisanim postupcima mogu se koristiti samostalno u prikladnim dozama koje se određuju rutinskim ispitivanjem, u svrhu postizanja optimalne inhibicije HPV6a ili njegove aktivnosti uz što manju potencijalnu toksičnost. Pored toga, može koristiti i istodobna zajednička primjena ili primjena u slijedu ostalih agensa.

Povoljna je mogućnost primjene spojeva ovog izuma u jednoj dnevnoj dozi, ili se ukupna dnevna doza može raspodijeliti u nekoliko pojedinačnih obroka. Osim toga, spojevi ovog izuma mogu se primijeniti različitim putovima, koji uključuju, ali nisu ograničeni na intranazalni, transdermalni, putem supozitorija, peroralni i slično.

U kombiniranom liječenju više od jednom aktivnom tvari, gdje su aktivne tvari u pojedinačnim pripravcima, one se mogu primjenjivati istodobno ili se svaka može primijeniti u različito vrijeme.

Režim primjene spojeva ovog izuma odabire se prema različitim činiteljima kao što su tip, vrsta, dob, težina, spoj i medicinska kondicija pacijenta; težina stanja koje se liječi; put primjene; funkcija jetre i bubrega pacijenta; kao i osobitosti primijenjenog spoja. Liječnik uobičajene stručnosti moći će lako odrediti i propisati učinkovitu količinu lijeka u svrhu sprečavanja, zaustavljanja napredovanja ili promjene tijeka bolesnog stanja. Optimalna preciznost u postizanju koncentracije lijeka unutar raspona koji omogućava učinkovitost bez toksičnosti zahtijeva režim primjene koji se temelji na kinetici dostupnosti lijeka ciljnim mjestima.

Ovo obuhvaća poznavanje raspodjele, ravnoteže i izlučivanje lijeka.

U postupcima ovog izuma, spojevi koji su ovdje opsežno opisani mogu tvoriti aktivne sastojke i uglavnom se primijenjuju u smjesama s prikladnim farmaceutskim razrjeđivačima, ekscipijensima ili nosačima (koji se zajednički nazivaju tvarima-nosačima) koji su pravilno izabrani obzirom na planirani oblik primjene, kao što su peroralne tablete, kapsule, eliksiri, sirupi, supozitoriji, gelovi i sl., i u skladu s uobičajenim farmaceutskim postupcima priprave.

Na primjer, za peroralnu primjenu u obliku tableta ili kapsula, aktivna tvar lijeka može se kombinirati s peroralnim, netoksičnim, farmaceutski prikladnim inertnim nosačem kao što je etanol, glicerol, voda i slično. Štoviše, kada je potrebno ili poželjno, u smjesu se mogu dodati i prikladna sredstva za vezanje, lubrikansi, sredstva za razgradnju i boje. Pogodna sredstva za vezanje uključuju, ali nisu ograničena na škrob, želatinu, prirodne šećere kao što su glukoza ili beta-laktoza, sladila iz kukuruza, prirodne i sintetičke gume kao što su akacija, tragakant ili natrijev aglinat, karboksimetilceluloza, polietilenglikol, voskovi i slično. Lubrikansi koji su korišteni u ovim oblicima za doziranje uključuju, bez ograničenja, natrijev oleat, natrijev stearat, magnezijev stearat, natrijev benzoat, natrijev acetat, natrijev klorid i slično. Sredstva za razgradnju uključuju, bez ograničenja, škrob, metilcelulozu, agar, bentonit, ksantan gumu i slično.

Za dobivanje tekućih oblika, aktivna tvar lijeka može se kombinirati s pogodno aromatiziranom tvari u suspenziji ili disperzijskom sustavu, a takve tvari mogu biti sintetičke i prirodne gume, kao što su, na pr., tragakant, akacija, metilceluloza i slično. Druge disperzijske tvari koje se mogu koristiti uključuju glicerol i slične. Za parenteralnu primjenu, potrebne su sterilne suspenzije i otopine. Kad se traži intravenska primjena, korisne su izotonični preparati koji uglavnom sadrže prikladne prezervative.

Topički pripravci koji sadrže aktivnu ljekovitu tvar mogu se miješati s različitim tvarima-nosačima koje su dobro poznate u struci, kao što su, na pr., alkoholi, gel aloe vera, alantoin, glicerin, ulja s vitaminom A i E, mineralna ulja, PPG2 miristil-propionat, i drugi, da bi se dobile, npr., alkoholne otopine, topička sredstva za čišćenje, krema za čišćenje, gelovi za kožu, losioni za kožu i šamponi u obliku gela ili kreme.

Spojevi ovog izuma također se mogu primijenjivati u obliku liposomskih dostavnih sustava, kao što su mali unilamelarni mjehurići, veliki unilamelarni mjehurići i multilamelarni mjehurići. Liposomi se mogu pripraviti od različitih fosfolipida, kao što su kolesterol, stearilamin ili fosfatidilkolini.

Spojevi ovog izuma također se mogu koristiti pomoću monoklonalnih protutijela kao individualnih nosača na koje su vezane molekule spoja. Spojevi ovog izuma također se mogu vezati s topivim polimerima kao ciljnim nosačima lijeka. Takvi polimeri obuhvaćaju polivinil-pirolidon, piran, kopolimer, polihidroksipropilmetakril-amidofenol, polihidroksietilaspartamidfenol ili polietil-enoksipolilizin supstituiran s palmitoilskim ostacima. Nadalje, spojevi ovog izuma mogu se vezati na klasu biorazgradivih polimera korisnih u postizanju kontroliranog oslobađanja lijeka, na pr., poliaktinska kiselina, poliepsilon-kaprolakton, polihidroksimaslačna kiselina, poliortoesteri, poliacetali, polihidropirani, policijanoakrilati i križno vezani ili amfipatički blokovi kopolimera hidrogelova.

Slijedeći primjeri ilustriraju ovaj izum ne ograničavajući ga.

Primjer 1

Priprava soja U9 kvasca

Saccharomyces cerevisiae soj 2150-2-3 (Matalpha, leu2-04, adel, ciro) dobiven je od dr. Lelanda Hartwella (University of Washington, Seattle, WA). Stanice soja 2150-2-3 razmnožavaju se tijekom noći na 30ºC u 5 ml YEHD medija (Carty et al., J.Ind Micro 2 (1987) 117-121). Stanice se ispiru tri puta u sterilnoj destiliranoj vodi, ponovo se suspendiraju u 2 ml sterilne destilirane vode i po 0,1 ml suspenzije stavi se na svaku od šest pločica s 5-fluoroorotičnom kiselinom (FOA) da bi se izdvojili ura3 mutanti (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Pločice se inkubiraju na 30ºC. Medij sadrži na 250ml destilirane vode: 3,5 g Difco dušične baze kvasca bez aminokiselina i amonij-sulfata; 0.5 g 5-fluoroorotične kiseline; 25 mg uracila; i 10.0 g dekstroze.

Medij se sterilizira filtracijom kroz membrane od 0.2 μm i potom miješa s 250 ml 4%-tnog Bakto-agara (Difco) pri50ºC, 10ml 1.2 mg/ml otopine adenina i 5 ml otopine L-leucina (170 mg/50ml). Dobiveni medij razdijeli se po 20 ml na Petrijeve pločice.

Nakon 5 dana inkubacije pojave se brojne kolonije. Pojedinačne kolonije izdvajaju se razdijeljivanjem kolonija s početne FOA ploče na svježe FOA ploče koje se potom inkubiraju na 30ºC. Određen broj kolonija sa drugog seta FOA ploča ispita se na prisutnost ura3 mutacije ponovnim nanošenjem (replica-plating) na YEHD ploče i na ploče bez uracila. Željeni ishod je dobar rast na YEHD i odsutnost rasta na mediju bez uracila. Dobije se jedan izolat (U9) koji pokazuje ova svojstva. Taj se izolat pohrani u smrznutom glicerolu (soj #325) na -70ºC za kasniju uporabu.

Primjer 2

Priprava vektora za rascjep MNN9 gena kvasca

Da bi se dobio vektor za rascjep MNN9 gena kvasca, najprije je potrebno klonirati gen MNN9 iz genomske DNAS. cerevisiae. To se postiže standardnom tehnikom polimerazne lančane reakcije (PCR). 5’ sense klica (primer) i3’ antisense klica za PCR pune duljine slijeda koji kodira MNN9 oblikovane su na temelju objavljenog slijeda MNN9 gena kvasca (Zymogenetics: EPO Patent Application No 88117834.7, Publication No. 0-314-096-A2). Korištene su slijedeće oligodeoksinukleotidne klice koje sadrže bočna HindIII mjesta (potcrtano):

sense klica: 5’-CTT AAA GCT TAT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3’

antisense klica 5’-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3’

Početni metioninski kodon za gen MNN9 označen je podebljano. PCR je izvedena korištenjem genomske DNA soja JRY188 S. cerevisiae (Rine et al.) kao kalupa, Taq DNA polimeraze (Perkin Elmer) i 25 ciklusa umnožavanja (94ºC 1 min., 37ºC 2 min., 72ºC 3 min.). Nastali 1.2 kbp PCR fragment razgrađen je pomoæu HindIII, pročišćen u gelu i vezan s pUC13 (Pharmacia) koji je prethodno razgrađen s HindIII i izložen alkalnoj fosfatazi. Dobiveni plazmid nazvan je p1183.

Da bi se rascijepio gen MNN9 genom URA3 kvasca, plazmid pBR322-URA3 (koji sadrži 1.1 kbp HindIII fragment koji kodira URA3 gen S cerevisiae supkloniran u HindIII mjesto pBR322) je razgrađen s HindIII i 1.1 kbp DNA fragment koji nosi funkcionalni URA3 gen je pročišćen u gelu, kraj mu je otupljen T4 DNA polimerazom i potom je vezan s plazmidom koji je razrađen pomoću PM1I (PM1I cijepa unutar kodirajućeg slijeda za MNN9). Dobiveni plazmid p1199 sadrži rascjep MNN9 gena funkcionalnim URA3 genom.

Primjer 3

Oblikovanje soja 1372 izvedenog iz U9 koji sadrži rascjep gena MNN9

Za rascjep gena MNN9 u soju U9 (#325), 30μg plazmida p1199 razgrađeno je pomoću HindIII da bi se dobila linearna mnn9::URA3 rascjepna kazeta. Stanice soja 325 izmijenjene su sferoplastičnom metodom pomoću p1199 DNA probavljene s HindIII (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933) i promijenjeni oblici su izdvojeni u mediju od sintetičkog agara bez uracila koji sadrži 1.0 M sorbitola. Sintetički medij po litri destilirane vode sadrži: agar, 20 g; dušičnu bazu kvasca w/o aminokiseline, 6.7 g; adenin, 0.04 g; L-tirozin, 0.05 g; sorbitol, 182 g; glukoza, 20 g; Leucin Minus otopina #2, 10 ml. Leucin Minus otopina #2 po litri destilirane vode sadrži: L-arginin, 2 g; L-histidin, 1 g; L-leucin, 6 g; L-izoleucin, 6 g; L-lizin, 4 g; L-metionin, 1 g; L-fenilalanin, 6 g; L-treonin, 6 g; L-triptofan, 4 g.

Pločice se inkubiraju na 30ºC tijekom pet dana, za vrijeme kojih nastanu brojne kolonije. Preparati kromosomalne DNA dobiju se iz 10 kolonija i razgrade pomoću EcoRi plus HindIII. Dobiveni segmenti DNA se ispituju Southern blot tehnikom (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) uz 1.2 kbp HindIII fragmente koji nose gen MNN9 (izoliran iz plazmida p1199) kao probu. Dobije se izolat (soj #1372) koji pokazuje očekivane pomake DNA vrpce na Southern blotu kao i izrazito grudanje tipično za mnn9 mutante.

Primjer 4

Oblikovanje vektora za rascjep HIS3 gena kvasca

Da bi se oblikovala kazeta za rascjep u kojoj se u HIS3 gen S. cerevisiae ucijepljuje gen URA3, plazmid YEp6 (K. Struhl et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76:1035) se razgradi pomoću BamHI, 1.7 kbp BamHI fragmenti koji nose gen HIS3 se pročiste u gelu, T4 DNA polimerazom im se otupe krajevi i potom se vežu s pUC18 koji je prethodno bio razgrađen pomoću BamHI i izložen T4 DNA polimerazi. Dobiveni plazmid (nazvan p1501 ili pUC18-HIS3) se razgradi pomoću NheI (koji cijepa u kodirajućem slijedu HIS3), vektorski fragment s pročisti u gelu, otupe mu se krajevi T4 DNA polimerazom i potom se izloži telećoj crijevnoj alkalnoj fosfatazi. Gen URA3 se izdvoji iz plazmida pBR322-URA3 razgradnjom s HindIII, 1.1 kbp fragment koji nosi gen URA3 se pročisti u gelu, otupe mu se krajevi T4 DNA polimerazom i veže se s prije spomenutim pUC18-HIS3 NheI fragmentom. Dobiveni plazmid (nazvan pUC18-his3::URA3 ili p1505) sadrži rascjepnu kazetu u kojoj je HIS3 gen kvasca rascijepljen funkcionalnim URA3 genom.

Primjer 5

Oblikovanje vektora za rascjep PRB1 gena kvasca genom HIS3

Plazmid FP8ΔH koji nosi gen PRB1 S. cerevisiae dobiven je od dr. E. Jonesa iz Carnegie-Mellon sveuč. (C. M. Moehle et al., 1987, Genetics 115:255-263). Razgrađen je pomoću HindIII plus XhoI i 3.2 kbp DNA fragment koji nosi gen PRB1 je pročišćen u gelu i krajevi su mu otupljeni izlaganjem T4 DNA polimerazi. Plazmid pUC18 se razgradi pomoću BamHI, pročisti se u gelu i krajevi se otupe izlaganjem T4 DNA polimerazi. Dobiveni vektorski fragment se veže s prije spomenutim PRB1 fragmentom gena čime se dobije plazmid pUC18-PRB1. Plazmid YEp6, koji sadrži gen HIS3, razgradi se pomoću BamHI. Dobiveni 1.7 kbp BamHI fragment koji sadrži funkcionalni gen HIS3 se pročisti u gelu i otupe mu se krajevi izlaganjem T4 DNA polimerazi. Plazmid pUC18-PRB1 se razgradi pomoću EcoRV plus NcoI koji cijepaju unutar slijeda koji kodira gen PRB1 i uklanjaju aktivno mjesto i bočni slijed proteaze B. Dobiveni 5.7 kbp EcoRV-NcoI fragment koji sadrži ostatne 5’ i 3’dijelove slijeda koji kodira PRB1 u pUC18 se pročisti u gelu, otupe mu se krajevi izlaganjem T4 DNA polimerazi, defosforilira telećom crijevnom alkalnom fosfatazom i veže se s gore opisanim HIS3 fragmentom otupljenih krajeva. Dobiveni plazmid (nazvan pUC18-prbl::HIS3, uskladišten kao #1245) sadrži funkcionalni gen HIS3 na mjestu dijela gena PRB1 koji je prethodno izbrisan.

Primjer 6

Oblikovanje soja kvasca povezanog s U9 koji sadrži rascjepe gena MNN9 i PRB1

Soj 1372 povezan s U9 koji sadrži rascjep gena MNN9 opisan je u Primjeru 3. Klonalni izolati soja 1372 nanose se na FOA ploče (kao što je opisano u Primjeru 1) da bi se izdvojili ura3 mutanti. Dobije se određen broj ura3 izolata soja 1372 i jedan izolat (soj 12930-190-S1-1) se izdvoji za posljedični rascjep gena HIS3. Genski vektor rascjepapUC18-his3::URA3 (p1505) razgradi se pomoću XbaI plus Eco RI da se dobije linearna his3::URA3 disrupcijska kazeta koja se koristi za transformaciju soja 12930-190-S1-1 litij-acetatnim postupkom (Metods in Enzymology, 194:290 (1991). Ura+ transformanti izdvojeni su u sintetičkom agar mediju bez uracila, razdijeljeni u svrhu klonalnog izdvajanja na istom mediju i potom ponovno nanešeni na medij bez uracila odnosno bez histidina u svrhu probira izolata koji su istovremeno Ura+ i His-. Jedan izolat (soj 12930-230-1) izdvojen je za rascjep gena PRB1. Vektor rascjepa gena PRB1 (pUC18-prb1::HIS3, punjenje #1245) razgrađen je pomoću SacI plus XbaI da bi se dobila linearna prb1::HIS3 disrupcijska kazeta koja se koristi za transformaciju soja 12930-230-1 litij-acetatnim postupkom. His+ transformanti se izdvoje na agar mediju bez histidina i razdijele na istom mediju u svrhu klonalne izolacije. Genomska DNA pripravi se od izvjesnog broja dobivenih His+ izolata koji su razgrađeni pomoću EcoRI i potom podvrgnuti elekroforezi na0.8%-tnom agaroza gelu. Potom se provede Southern blot ispitivanje korištenjem radioobilježene 617 bp probe za gen PRB1 koji je pripravljen pomoću PCR uz uporabu slijedećih oligodeoksinukleotidnih klica (primera):

5’ TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA 3’

5’ CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA 3’

Dobiveno je jadanaest izolata koji su pokazali očekivanu hibridizaciju probe s 2.44 kbp prbl::HIS3 DNA fragmentom. To je bilo u suprotnosti s hibridizacijom probe s 1.59 kbp fragmentom za divlji tip gena prb1. Jedan od ovih izolata koji sadrži prbl::HIS3 rascjep izdvojen je za daljnju uporabu i nazvan soj #1558.

Primjer 7

Oblikovanje vektora za rascjep PEP4 gena kvasca

PEP4 gen S. cerevisiae klonira se iz genomske knjižnice kvasca na slijedeći način. Stanice E. coli koje sadrže genomsku knjižnicu kvasca pLS101 (Schultz i Friesen, 1983, J. Bacteriol. 155:8-14) razmnožavaju se preko noći u 5 ml LB medija koji sadrži 100 µg/ml ampicilina. Iz te kulture, razrijeđenja 10-4 i 10-5 nanesena su na LB plus ampicilin ploče. Skidanje kolonija s ploča izvodi se korištenjem nitroceluloznih filtera. 600 bp proba za PEP4 gen kvasca pripravi se pomoću PCR uz uporabu Taq DNA polimeraze, ukupne plazmidske DNA iz pLS101 knjižnice kvasca i slijedećih oligodeoksinukleotidnih klica oblikovanih prema objavljenom slijedu DNA za PEP4 (C.A. Woolford et al., Mol. Cell. Biol. 6:2500 (1986)).

sense klica: 5’ –GAG GCT ACC AGC GAG CCG GGC- 3’

antisense klica 5’ –GGC CAG TGG GCC AAC AGG TTC- 3’

PCR se provodi 25 ciklusa umnožavanja (94ºC 1 min., 37ºC 2 min., 72ºC 3 min.). PCR uzorak se pročisti u gelu, radioobilježi i hibridizira s prije spomenutim filterima za kolonije. Nekoliko kolonija pozitivnih na hibridizaciju s PEP4 uzorkom razdijeljeno je na LB plus ampicilin ploče za pojedinačne kolonije. Plazmidska DNA se pripravialkalnom-SDS lizom (Sambrook et al, vidjeti gore) iz nekoliko izolata te razgradnjom pomoću BamHI. Uočene su očekivana 14 kbp vrpca vektora i 6.9 kbp PEP4 vrpca inserta. Nakon dvostruke razgradnje pomoću EcoRI plus XhoI, uočena je očekivana 1.5 kbp vrpca za PEP4. Jedan izolat (E.coli soj #860) koji je pokazao očekivane rezultate izdvojen je za daljnju uporabu. Plazmidska DNA iz soja #860 razgradi se pomoću BamHI i 6.9 kbp fragmenti koji sadrže kromosomski gen PEP4 se supkloniraju na BamHI mjestu pUC13 da se dobije plazmid p860. Plazmid p860 se potom razgradi pomoću NcoI (koja cijepa unutar slijeda koji kodira PEP4), pročisti u gelu, otupe mu se krajevi izlaganjem T4 DNA polimerazi i veže se s 1.1 kbp fragmentom otupljenih krajeva koji nosi funkcionalni URA3 gen (pripravljen kao u Primjeru 2). Dobiveni plazmid koji sadrži rascjep gena PEP4 URA3 genom naziva se pUC13-pep4::URA3 (soj #906).

Primjer 8

Oblikovanje sojeva kvasca #1569, #1538, #1592, koji su derivati soja U9 koji sadrži i prb1 i pep4 mutacije

Da bi se rascijepio gen HIS3 soja U9, vektor rascjepa pUC18-his3::URA3 se razgradi pomoću EcoRI plus XbaI i potom se koristi za transformiranje soja U9 litij-acetatnim postupkom. Ura+ transformanti izdvoje se na agar mediju bez uracila i razdijele na isti medij da se dobiju klonalni izolati. Određen broj Ura+ izolata se potom ponovno nanese na agar medij kojem nedostaje ili uracil ili histidin ili pretražuje na one izolate koji su istodobno Ura+ i His-. Jedan se izolat(soj #1524) izdvoji za kasniji rascjep gena PRB1. Vektor rascjepa PRB1 gena pUC18-prbl::HIS3 se razgradi pomoću SacI plus XbaI i koristi za transformaciju soja #1524 litij-acetatnim postupkom. His+ transformanti izdvoje se na agar mediju bez histidina i razdijele na isti medij radi klonalne izolacije. Genomska DNA se pripravi iz nekoliko His+ izolata i ispita Southern blot hibridizacijom s radioobilježenom PRB1 probom. Jedan od izolata (soj #1537) koji pokazuje željeni rascjep PRB1 gena sa HIS3 (to jest, prlb::HIS3) se izdvoji za kasniji rascjep gena PEP4. Soj #1537 se prenosi na FOA ploče u svrhu dobivanja ura3 izolata i jedan se izolat (soj #1541) izdvoji za daljnju uporabu.

Da bi se rascijepio gen PEP4 u soju #1541, vektor rascjepa gena PEP4 pUC13-pep4::URA3 se razgradi pomoću XhoI da se dobije linearna pep4::URA3 rascjepna kazeta i koristi za transformaciju soja #1541 litij-acetatnim postupkom. Ura+ transformanti se izdvoje na agar mediju bez uracila i razdijele na isti medij u svrhu klonalne izolacije. Genomska DNA se dobije iz određenog broja Ura+ transformanata i ispita Southern blot tehnikom uz korištenje radioobilježene probe za gen PEP4. Jedan izolat (soj #1569) koji pokazuje željeni rascjep gena PEP4 genom URA3 izdvoji se za daljnju uporabu.

U neovisnom pokusu, ponavljanjem gotovo istog redoslijeda postupaka, dobiven je soj #1538. Soj #1538 je derivat soja U9. Soj #1538 sadrži i prb1 i pep4 mutaciju. Pored toga, ura3 derivat soja #1569 dobiven je prijenosom na FOA ploče. Dobiveni ura3 derivat soja #1569 nazvan je #1592.

Primjer 9

Izdvajanje nukleinske kiseline iz bioptičkog materijala

Veliki condyloma accuminatum vulve dobiven je od 25-godišnje bolesnice nakon porođaja. Dio tvorbe zamrznut je u tekućem dušiku i obrađen Braun mikro-dismembratorom II (B. Braun Instruments, Melsungen, Germany). Dobiveni materijal otopljen je 0.6%-tnim (mas/vol) natrij-dodecilsulfatom, izložen proteinazi K (50 µg/ml) i ekstrahiran fenol/kloroform/izoamilalkoholom. DNA je precipitirana etanolom i kvantitativno određena UV spektrofotometrijski. Prisutnost DNA visoke molekularne težine potvrđena je elektroforezom na agaroza gelu i, zatim, bojanjemetidij-bromidom.

Primjer 10

Tipiziranje DNA HPV

Tip DNA HPV određen je korištenjem testa vezanja hibrida koji je na tržištu pod imenom ViraType Plus (Digene Diagnostics, Beltsville, MD). Korišteni uzorci HPV podijeljeni su u dva poola čiji je sastav temeljen na povezanosti svakog tipa s malignomima genitalnog trakta. Skupina uzoraka A sadržavala je tipove HPV “niskog rizika”-6,11,42,43 i 44, dok je uzorak B sadržavao tipove “visokog rizika”-16,18,31,33,35,45,51, 52 i 56. Ukupna DNA razgrađena je pomoću PstI, BamHI i HindIII, i potom je provedena Southern blot analiza u vrlo strogim uvjetima (mT-15°C) da bi se odredio podtip HPV.

Primjer 11

Kloniranje genoma HPV6a

Ukupna DNA ekstrahirana iz biopsijskog uzorka pozitivnog na HPV6a razgrađena je HindIII endonukleazom. Nakon frakcioniranja prema veličini kroz 0.8%-tni agarozni preparativni gel niskog tališta, regija koja odgovara DNA od približno 8 kbp izrezana je iz gela i agaroza je razgrađena GelaseN enzimom (Epicentre Technologies, Inc., Madison, WI). Uzorak je vezan s pUC18 (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) koji je prethodno razgrađen pomoću HindIII i defosforiliran. Nakon transformiranja kompetentnih stanica E. coli DH5 (Gipco, BRL, Gaithersburg, MD), plazmidska knjižnica je ispitana na postojanje HPV6a-pozitivnih klonova hibridizacijom kolonija uz korištenje antisense oligonukleotida obilježenoga pomoću32 P koji je komplementaran s 3’-krajem gena L1 HPV6b (5’-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3’). PUC18 plazmid koji sadrži 8.1 kbp genom HPV6a izdvojen je i ispitan restrikcijskim enzimom i Southern blot analizom. Ovaj je plazmid nazvan pUC18-HPV6a. Plazmid DNA pripravljen je korištenjem QiagenN Plasmid Maxi sustava (Qiagen inc., Chatsworth, CA).

Primjer 12

Analiza slijeda pUC18-HPV6a

Da bi se odredio cjelokupan slijed HPV6a, sintetizirane su sekvencijske klice na temelju objavljenog slijeda HPV6b. Oba se lanca cjelokupnog 8.1 kbp genoma HPV6a sekvencioniraju dideoksi lančanim terminacijskim postupkom uz pomoć PRISMN sustava i Applied Biosytems (ABI) automatskog uređaja za sekvencioniranje (#373A) prema uputama proizvođača (ABI, Inc., Foster City, CA). Tamo gdje se sense i antisense slijedovi nisu poklapali, sintetizirane su dodatne specifične HPV6a klice u svrhu ponovnog sekvencioniranja u oba smjera preko upitnog područja da bi se postigao sklad.

Slijedovi DNA HPV6a i HPV6b pokazuju preko 97% istovjetnosti s ukupnom razlikom od 229 bp od 8010 bp. najznačajnije razlike prema slijedu HPV6b nađene su u dugom kontrolnom području (long control region, LCR;nt 7205 - nt 106). Pored nekoliko razlika u pojedinim nukleotidima (nt) u LCR HPV6a, nađen je umetak od 94 bp pri nt 7350 i drugi, od 19 bp, pri nt 7804. Pri nt 7615, iz genoma HPV6a izbrisano je šest parova baza.

Primjer 13

Oblikovanje ekspresijskog vektora iz kvasca za L1 HPV6a

DNA HPV tipa 6a korištena je kao kalup za PCR. Gen L1 HPV6a umnožen je pomoću PCR korištenjem Vent polimeraze (New England Biolabs, Inc.) u 35 ciklusa umnažanja (94°C 1 min, 48ºC 1 min, 72°C 1 min 45 sec) i slijedećih oligonukeotidnih klica koje sadrže bočna Bg1II mjesta (potcrtano):

sense klica 5’ –CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC GGC CTA GGC CTA GCG ACA GCA CAG - 3’

antisense klica 5’ –GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C- 3’

Sense klica uvodi neprevedeni vodeći slijed kvasca protusmjerno do početnog kodona metionina (podebljano) L1 HPV6a. L1 HPV6a proizvod dobiven pomoću PCR razgradi se pomoću Bg1II i pročisti u gelu. Ekspresijski vektor pGAL10 oblikuje se izdvajanjem 1.4 kbp SphI fragmenta iz dvosmjernog GAL promotor vektora pUC18-GAL1p-GAL10p koji sadrži različite GAL1/GAL10 promotore iz plazmida pBM272 (dobiven od dr. Marka Johnstona, Washington University, St. Louis) bočno na svakom položaju kao kopiju ADH1 transkripcijskog terminatora kvasca (Bennetzen, J.L. i Hall, B.D. (1982) J.Biol.Chem. 257:3018-3025), kloniranjem BamHI mjesta smještenog između Gal1 promotora i prve kopije ADH1 transkripcijskog terminatora, i SmaI mjesta kloniranja smještenog između različitih GAL10 promotora i druge kopije ADH1 transkripcijskog terminatora. Shuttle vektor kvasca koji se sastoji od pBR322, gena LEU2-d kvasca i 2 µm prstena sa SphI i spojen s 1.4-kbp SphI GAL promotor fragmentom. Dobiveni vektor, pGAL10, izravna se pomoću BamHI koji cijepa između GAL1 promotora i ADH1 transkripcijskog terminatora. pGAL10 vektor razgrađen pomoću BamHI i PCR fragment L1 HPV6a razgrađen pomoću Bg1II spoje se i koriste za transformaciju stanica E. coli DH5 (BRL). Izolira se pC1/1-GAL plazmid koji sadrži L1 gen HPV6a i označi kao p13173-357-6. Gen L1 u p13173-357-6 se sekvencionira (ABI Sequencer #373A) i pokaže se da je istovjetan genu L1 u pUC18-HPV6a klonu.

Primjer 14

Oblikovanje ekspresijskog vektora iz kvasca za L1 i L2 HPV6a

Plazmid p13173-357-6 (pGAL10 + L1 HPV6a) razgradi se pomoću SmaI koji cijepa između GAL10 promotora i ADH1 transkripcijskog terminatora. 1.4 kbp gen L1 HPV6a se umnoži pomoću PCR korištenjem pUC18- HPV6a kao kalupa, Vent polimeraze (New England Biolabs, Inc), u 10 ciklusa PCR umnažanja (94°C 1 min, 48°C 1 min, 72°C 1 min 45 sec) i slijedećih oligonukleotidnih klica koji sadrže bočna SmaI mjesta (potcrtano):

sense klica 5’–TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGG CAC ATA GTA GGG CCC GAC GAC- 3’

antisense klica: 5’-TCC CCC GGG CTA GGC CGC CAC ATC TGA AAA AAA TAA GG- 3’

Sense klica uvodi neprevedeni vodeći slijed kvasca izravno protusmjerno do početnog kodona metionina L2 HPV (podebljano). PCR fragment se razgradi pomoću SmaI, pročisti se u gelu i veže s plazmidom p13173-357-6 koji je razgrađen pomoću SmaI. Plazmid pGAL10 koji sadrži i L1 i L2 gen HPV6a izdvoji se i označi kao p14049-7-2. Gen L2 se sekvencionira (ABI Sequencer #373A) čime se pokaže da je istovjetan genu L2 u klonu pUC18- HPV6a.

Primjer 15

Ekspresija L1 HPV6a i koekspresija L1 i L2 HPV6a u kvascu

Plazmidi 13173-357-6 (pGAL10 + HPV6a L1) i p14049-7-2 (pGAL10 + HPV6a L1 i L2) korišteni su za transformiranje sojeva #1569 (MATa, leu2-04, prbl, ade1, pep4, cir°) i (#1558 (MATa, leu2-04, prbl, mnn9, adel, cir°) S. cerevisiae. Nastali sojevi dobiveni od soja-domaćina #1558 su sojevi #1644 (L1 HPV6a) i #1670 (L1 i L2 HPV6a), kao što je prikazano u tablici. Klonalni izolati se razvijaju na 30°C u YEHD mediju koji sadrži 2% galaktoze tijekom 68-78 sati. Nakon prikupljanja stanica, stanične pelete se razbiju staklenim kuglicama i stanični lizat se ispituje na ekspresiju I1 HPV6a ili L2 HPV6a proteina pomoću imunoblot postupka. Uzorci koji sadrže 40 µg ukupnog staničnog proteina podvrgnu se elektroforezi na 10%-tnom Tris-glicin gelu u reducirajućim i denaturirajućim uvjetima, te elektroblotingu na nitrocelulozne filtere. Protein L1 otkrije se imunodetekcijom pomoću protuseruma kunića usmjerenih na fuzijski protein trpE-HPV11 (Brown, D.R. et al., Virology 201:46-54) kao primarno protutijelo i magarećih potpunih igG protutijela protiv kunića vezanih s peroksidazom hrena (Amersham, Inc.) kao sekundarnih protutijela. Filteri se obrade pomoću kemiluminescentnog ECLN pribora za otkrivanje (Amersham, Inc.). 50-55 kDa proteinska vrpca L1 otkrije se u svim uzorcima osim u negativnoj kontroli (kontrolni vektor bez gena L1 i L2).

Protein L2 se otkrije kao 70 kDa proteinska vrpca pomoću Western blot analize korištenjem seruma u razrijeđenju 1:250 dobivenom od miševa koji su bili 3 puta imunizirani trpE-HPV6a L2 fuzijskim proteinom pripravljenim prema postupku Cartera et al. kao primarnim protutijelom, i ovčijim IgG protiv miša vezanima s HRP (Amersham, Inc.) kao sekundarnim protutijelom (razrijeđenje 1:1000).

Za EM analizu (Structure Probe, West Chester, PA), alikvot svakog uzorka se stavi na bakrene rešetke s 200 šupljina obložene ugljikom. Kapljica 2%-tne fosfovolframove kiseline (PTA) čiji je pH 7.0 stavi se na rešetke i ostavi stajati 20 sekundi. Rešetke se osuše na zraku prije ispitivanja TEM. Za mikroskopiranje je korišten JEOL 100CX transmisijski elektronski mikroskop (JEOL USA, Inc.) uz napon ubrzavanja od 100 kV. Izgrađeni mikrogrami bili su povećanja 100000x.

VLP se ispitivao u rasponu promjera od 50-55 nm u svim uzorcima kvasca koji nose ili L1 HPV6a ili L1 i L2 HPV6a koekspresijski plazmid. VLP nije nađen u kontrolnom uzorku kvasca.

Primjer 16

Fermentacija L1 + L2 HPV6a (soj #1670)

Površinski prirast kulture soja 1670 na ploči aseptički je prenešen na tekući medij bez leucina koji sadrži (po L): 8.5 g Difco dušične baze kvasca bez aminokiselina i amonijevog sulfata; 0.2 g adenina; 0.2 g uracila; 10 g sukcinilne kiseline; 5 g amonijevog sulfata; i 0.25 g L-tirozina; pH medija podešen je prije sterilizacije na 5.0-5.3 pomoću NaOH. Nakon razvijanja tijekom 25 sati na 28°C, na kružnoj mućkalici pri 250 okretaja u minuti, priprave se bočice sa smrznutom kulturom dodavanjem sterilnog glicerola do konačne koncentracije od 17% (mas/vol) nakon čega slijedi pohranana -70°C (1 ml po kriobočici). Inokulum za fermentaciju soja 1670 razvije se u istom mediju (500 ml po boci od 2 L) i počne se s prijenosom otopljenog sadržaja zamrznutih bočica s kulturom u dvolitrene boce, nakon čega slijedi inkubacija na 28°C, na kružnoj mućkalici pri 250 okr/min tijekom 25 sati. Fermentacija soja 1670 zahtijeva New Brunswick SF-116 uređaj za fermentaciju radnog obujma od 10 L nakon inokulacije. Proizvodni medij sadržavao je (po L): 20 g Difco ekstrakta kvasca; 10 g Sheffield HySoy peptona; 20 g glukoze; 20 g galaktoze. pH medija podešen je prije sterilizacije na 5.3. Cjelokupan sadržaj (500 ml) dvolitrene boce za inokulum prenijet je u fermentor koji je inkubiran na 28°C, 5 L zraka u minuti, 400 okr/min, tlak od 3.5 psi. Miješanje se ubrza ako je potrebno održati razinu oslobođenog kisika na više od 40%-tne zasićenosti. Razvoj fermentacije prati se offline mjerenjima glukoze (Beckmann Glucose 2 Analyzer) i online masenom spektrometrijom (Perkin-Elmer 1200). Nakon 69 sati inkubacije dobije se gustoća stanica od 9.9 g stanične mase po litri. Kultura se koncentrira filtriranjem kroz šuplja vlakna (Amicon H5MPO1-43 punjenjem u Amicon DC-10 filtracijskom sustavu) do oko 2 L, dijafiltrira s 2 L otopine soli puferirane fosfatom, i dalje koncentrira (do oko 1 L) prije razdijeljivanja u bočice za centrifugiranje od 500ml: Stanične pelete se prikupe centrifugiranjem pri 8000 okr/min (Sorval GS3 rotor) tijekom 20 min na 4°C. Nakon odstranjivanja nadtaloga, pelete (ukupna težina 225 g mokrih stanica) se pohrane na -70°C do korištenja.

Primjer 17

Pročišćavanje rekombinantnih kapsidnih proteina L1 + L2 HPV6a

Svi se postupci odvijaju na 4°C ako nije drugačije označeno.

Stanice soja #1670 pohranjene su zamrznute na -70°C. Zamrznute stanice (mokra težina = 38.0 g) se otope na 20-23°C i ponovno suspendiraju u 50 ml “L1 pufera” (20 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA). Dodaju se inhibitori proteaza PMSF i pepstatin A do konačne koncentracije od 2 mM odnosno 1.7 μM. Stanične veze se prekidaju pod tlakom od oko 8000 psi tijekom 3 prolaza u M110 mikrofluidizatoru (Microfluidics Corp., Newton, MA). Dobivena se masa centrifugira pri 5000 g tijekom 10 min da se ukloni stanični debris. Tekući nadtalog koji sadrži antigene L1 + L2 se prikuplja.

Nadtalog se razrijedi u omjeru 1:5 puferom A (20 mM MOPS, pH 7.0) i nanese u vezivni stupac za izmjenu aniona (5.0 cm ID x 4.0 cm) od Fractogel® EMD TMAE-650 (S) smole (EM Separations, Gibbstown, NJ) uravnotežen u puferu A. Nakon ispiranja puferom A, antigen se ispire gradijentom od 0-1.0 M NaCl u puferu A. Provede se imunodot bloting postupak da bi se ustanovilo koje frakcije iz stupca sadrže protein L1.

U frakcijama koje sadrže protein L1, što je ustanovljeno imunodot blotingom, odrede se ukupni proteini pomoću Bradford postupka, nakon čega se vrši SDS-PAGE uz bojanje srebrom te Western bloting.

TMAE frakcije sličnih čistoća i sadržaja proteina L1 se puliraju. Antigen se koncentrira frakcioniranjem amonijevim sulfatom. Otopina se podesi na 63%-tnu zasićenost amonijevim sulfatom dodavanjem krutog reagensa uz oprezno miješanje tijekom 30 min. Uzorak se stavi na led i ostavi precipitirati tijekom 30 min. Uzorak se potom centrifugira pri 12000 g. Peleta se ponovno suspendira u 20.0 ml PBS (6.25 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 150 mM NaCl).

Ponovno suspendirane pelete se podvrgnu kromatografiji na stupcu za razdvajanje prema veličini (2.6 cm ID x 89 cm) od Sephacryl 500 HR smole (Pharmacia, Piscataway, NJ). Korišten je PBS pufer. Kromatografija se izvodi na 20-23°C. Frakcije se ispituju pomoću SDS-PAGE uz bojanje srebrom i Western blot postupkom. Dobiveni se pool koncentrira.

Konačni proizvod se ispituje SDS-PAGE uz koloidalno Coomassie bojanje. Procijenjeno je da su proteini L1 i L2 85%-tne homogenosti. Prisutnost proteina L1 i L2 potvrđuje se Western blotingom uz uporabu odgovarajućih protuseruma. Konačni se proizvod podijeli u alikvote i pohrani na -70°C. Ovim se postupcima dobije ukupno 3.0 mg proteina.

Ispitivanje elektronskom mikroskopijom provedeno je pomoću Structure Probe (West Chester, PA). Alikvot uzorka nanese se na bakrenu rešetku s 200 šupljina obloženu ugljikom. Na rešetku se kapne kap 2%-tne fosfovolframove kiseline čiji je pH 7.0, i ostavi stajati 20 sekundi. Rešetka se osuši na zraku prije TEM ispitivanja. Za mikroskopiranje je korišten JEOL 100 CX transmisijski elektronski mikroskom (JEOL USA, Inc.) uz napon ubrzavanja od 100 kV. Dobiveni mikrografi bili su povećanja 100000x. Potvrđena je prisutnost čestica sličnih virusu veličine u rasponu od50-55 nm.

Primjer 18

Oblikovanje ekspresijskog vektora za gen L1 CRPV

Gen CRPV L1 umnožen je pomoću PCR iz plazmida pLAII koji sadrži potpuni virusni genom CRPV (dr. Peter Howley, NCI) korištenjem Vent polimeraze (New England Biolabs, Inc.); korišteno je 35 ciklusa umnožavanja (94°C, 1 min; 50°C, 1 min; 72°C, 2 min) i slijedeće oligonukleotidne klice koje sadrže bočna Bg1II mjesta (potcrtano):

sense klica 5’ GAA GAT CTT CAA AAC AAA ATG GCA GTG TGG CTG TCT AC- 3’

antisense klica 5’ –GAA GAT CTT TAT TAA GTA CGT CTC TTG CGT TTAG- 3’

Sense klica uvodi neprevedeni vodeći slijed kvasca izravno protusmjerno CRPV L1 početnom kodonu metionina (podebljano). 1.6 kb proizvod dobiven pomoću PCR razgradi se pomoću Bg1II, pročisti u gelu i subklonira u mjestu Bg1II vektora pSP72 (Promega) čime se dobije plazmid pSP72-CRPV-L1 (p12930-314-4-1).

Jedan se subklon potpuno sekvencionira čime se pokaže razlika u 4 nukleotida od objavljenog slijeda CRPV L1. Razlike ne dovode do promjene redoslijeda aminokiselina. Gen L1 se izreže iz pSP72-CRPV-L1 kao Bg1II fragment i subklonira unutar BamHI položaja smještenog između GAL10 promotora kvasca i ADH1 terminatora transkripcije u ekspresijskom vektoru kvasca koji sadrži promotor GAL10 iz YEp52 (Broach et al., Exp. Manipulation of Gene Expression, 1983, 83:81’116) i ADH1 transkripcijskog terminatora u istoj vektorskoj osnovi. Dobiveni plazmid je označen kao p12930-323-6-1.

Primjer 19

Oblikovanje ekspresijskog vektora za L2 CRPV

Gen L2 CRPV umnožen je korištenjem PCR uz Vent polimerazu (New England Biolabs, Inc.) iz plazmida pLAII nakon razgradnje plazmida pomoću SaII, pročišćavanja u gelu 7.9 kb fragmenta, te vezanja sa samim sobom. Korišteno je 35 ciklusa umnožavanja (90°C, 1 min; 72°C, 2 min) i slijedeće oligonukleotidne klice koje sadrže bočna EcoRI mjesta:

sense klica 5’ –GGA ATT CAC AAA ACA AAA TGG TTG CAC CGT CAC GAA AAC- 3’

antisense klica 5’ –GGA ATT CTT ATT CTG CGT AGA CAG CCA CAC TG- 3’

Sense klica uvodi neprevedeni vodeći slijed kvasca izravno protusmjerno CRPV L2 početnom kodonu metionina (podebljano). 1.5 kb proizvod dobiven pomoću PCR razgrađen je EcoRI, pročišćen u gelu i subkloniran unutar EcoRI položaja dvosmjernog promotorskog vektora pUC18-GAL1p-GAL10p koji sadrži različite GAL1/GAL10 promotore kvasca. Ovaj vektor ima BamHI položaj između GAL1 promotora i prve kopije ADH1 transkripcijskog terminatora, EcoRI i SmaI položaje smještene između GAL10 promotora i druge kopije ADH1 transkripcijskog terminatora. Tako nastalu kazetu ekspresije nosi 1.4 kb SphI fragment. Jedan klon (p12930-295-2-2) koji sadrži željeni L2 insert blizak GAL10 promotoru potpuno je sekvencioniran i pokazano je da sadrži 6 nukleotida različitih od objavljenog slijeda, od kojih 4 imaju kao posljedicu promjenu aminokiseline. Analiza slijeda izvornog kalupa DNA potvrdila je da su promjene također prisutne i na pLAII i nisu uvedene PCR-om. Vektor pUC18-GAL1p-GAL10p koji sadrži gen L2 presječen je pomoću SphI i 2.9 kb fragment koji nosi ADH1t-GAL1p-GAL10p-L2-ADH1t kazetu ekspresije se veže s velikim Sph1 fragmentom shuttle vektora kvasca. Dobiveni plazmid se označi kao p12930-323-2-3.

Primjer 20

Ekspresija kapsidnih proteina L1 i L2 CRPV u kvascu

Plazmidi p12930-323-6-1 i p12930-323-2-3 korišteni su za transformaciju sojeva S. cerevisiae #1569, #1538, BJ5462 (E.W. Jones, Methods in Enzymology 194 (1991) 428-453) i BJ1995 (Jones, isto. Klonalni izolati uzgajaju se na 30°C u YEHD mediju koji sadrži 2% galaktoze tijekom 48-72 sata. Nakon prikupljanja stanica, stanične pelete se razbiju staklenim kuglicama, doda se Triton X-100 do konačne koncentracije od 0.5% i dobiveni stanični lizati se ispitaju na postojanje ekspresije L1 i L2 CRPV imunoblot analizama. Uzorci koji sadrže 40 µg ukupnih staničnih proteina podvrgnu se elektroforezi na 12%-tnim Tris-glicin gelovima (Novex) u reducirajućim i denaturirajućim uvjetima, te elektroblotu na PVDF membranama (Novex). Proteini L1 i L2 CRPV se otkrivaju pomoću poliklonilnih kunićjihprotu–L1 ili protu-L2 protuseruma (poklon dr. Johna Kreidera, Hershey Medical Center) kao primarnih protutijela i proteina A vezanog na peroksidazu hrena (Amersham, Inc.) kao sekundarnih protutijela. Membrane se obrade uporabom kemiluminescentnog ECLN pribora za otkrivanje (Amersham, Inc.). 55-61 kDa vrpca proteina L1 otkrivena je u svim uzorcima koji nose L1 ekspresijski plazmid, dok je proteinska vrpca od približno 90 kDa otkrivena u svim uzorcima klonova kvasca koji nose L2 ekspresijski plazmid.

Nije otkriven signal u uzorcima dobivenim od klonova kvasca koji nose L1 ekspresijski plazmid s protu-L2 protuserumom ili obrnuto (Slika 6).

Prema ovim ispitivanjima ekspresije, za daljnja su proučavanja izdvojeni slijedeći sojevi kvasca: soj #1582, koji je soj-domaćin soja #1569 koji sadži plazmid p12930-323-6-1; kao i soj #1583, koji je soj-domaćin soja #1538 koji sadrži plazmid p12930-323-2-3.

Primjer 21

A. Pročišćavanje rekombinantnog kapsidnog proteina L1 CRPV

Stanice soja #1582, pohranjene na temperaturi od -70ºC, se otope i suspendiraju u jednakom volumenu Breaking pufera (20 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA).

Inhibitori proteaza PMSF i Pepstatin A se dodaje smjesi do ukupne koncentracije od 2 mM odnosno 1.7 μM. Stanice se liziraju putem 10 prolaza u mikrofluidizatoru. Lizat se proθisti centrifugiranjem pri 5000 g tijekom 10 minuta. Nadtalog se nanese na vrh jastučića od 45%-tne (mas/vol) saharoze u L1 puferu koji ima 5 cm, i L1 se peletira centrifugiranjem pri 100000 g tijekom 4 sata. Peleta se ponovno suspendira u desetini volumena L1 pufera. Tako suspendirana peleta se razbistri centrifugiranjem pri 5000 g tijekom 10 minuta. Nadtalogu se doda Tween 80 do konačne koncentracije od 0.01% i nadtalog se frakcionira na sobnoj temperaturi kromatografijom koja razdvaja prema veličini na stupcu Sephacryl S-1000 smole (Pharmacia) od 1700 ml (5 cm ID). Pufer korišten za ovaj stupac ima slijedeći sastav: 10 mM natrijev-fosfata, pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.01% Tween-80. Frakcije koje sadrže imunoreaktivni materijal, što se potvrdi imunodot blot testom, se puliraju i koncentriraju do 1/6 volumena ultrafiltacijom korištenjem Amicon mješala za stanice s YM-100 ravnoslojnom membranom promjera 76 mm (100000 MWCO). Dobiveni se proizvod sterilno filtrira kroz Millex-GV 0.22 μm membranu (Millipore).

B. Dokazivanje rekombinantnog kapsidnog proteina L1 CRPV

Prisutnost konačnog proizvoda potvrđena je Western blot analizom, kao i ispitivanjem N-terminalnog slijeda. Čistoća je određena pomoću SDS/PAGE uz Coomassie i bojanje srebrom, te kapilarnom elektroforezom prosijavanja otopine (engl. solution sieving capillary electrohoresis, SSCE) s optičkim ispitivanjem pri 215 nm. SSCE je pokazao 75%-tnu čistoću L1. Elektronska mikroskopija pokazala je prisutnost VLP u rasponu veličine od 50-55 nm.

C. Analitička HPLC koja razdvaja prema veličini

Da bi se ispitale VLP, uzorci su frakcionirani prema veličini kromatografijom koja razdvaja prema veličini. Kromatografija je provedena Perkin-Elmer Series 410 Biopunks HPLC s ISS 100 autoinjektorom opremljenim 200-mikrolitarskom injekcijskom petljom. Kao stupac je korišten TSK-gel G5000PW, 7.5 x 600 mm (TOSOHAAS, Mongomeryville, PA). Za praćenje ispiranja proteina sa stupca, korištena je optička detekcija pri 280 nm pomoću Perkin-Elmer LC-235 diodnog detektora. Kao mobilna faza korišteno je 0.5 M NaCl u 10 mM natrij-fosfatnog pufera, pH 7.2. Brzina protoka bila je 0.5 ml/min, i prikupljane su frakcije od jednog mililitra. Kalibracija stupaca izvedena je proteinskim standardima Sigma kao i rekombinantnim površinskim antigenom hepatitisa B (RecombivaxN, Merck&Co., West Point, PA). Ispitivanje antigena u frakcijama prikupljenim tijekom ispiranja vršeno je imunodot blot testom.

D. Imunodot blot test

Uzorak od 10 mikrolitara svake frakcije nanese se na traku PVDF membrane (Immobilon-P, Millipore Corp., Bedford, MA) koja je prethodno ovlažena i nanesena na vlažni papir za bloting. Uzorak se ostavi da se upije u membranu i membrana se stavi u blokirajuću otopinu (5% (mas/vol) nemasnog mlijeka u prahu otopljenog u 0.15 M NaCl, 0.02% (mas/vol) natrijevog azida i 0.01 M natrijevog fosfata, pH 7.2) i inkubira se na sobnoj temperaturi uz blago miješanje tijekom najmanje tri sata. Potom se blokirajuća otopina odlije i zamijeni otopinom primarnih protutijela.

Korištena su različita protutijela, ovisno o ispitivanom antigenu: L1 CRPV je ispitivan kunićjim protu-CRPV serumom “kasnog odgovora” (Biodesign International, Kennebunk, ME). L2 CRPV je ispitivan kunićjim protu-CRPV L2 serumom. L1 HPV6a je ispitivan monoklonskim protutijelima MAB 837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). L2HPV6a je ispitivan mišjim protu-HPV6a L2-trpE fuzijskim serumom.

Imunosni kompleksi su vizualizirani standardnim postupcima, korištenjem drugog protijela vezanu za alkalnu fosfatazu i kromogeni supstrat NBT/BCIP.

E. Priprava cjepiva protiv rekombinantnog kapsidnog proteina L1 CRPV

Pročišćeni kapsidni protein L1 CRPV adsorbira se na Al(O3H) u koncentraciji od 100 µg/ml.

Primjer 22

Pročišćavanje rekombinantnog kapsidnog proteina L1 CRPV - Shema 2

Svi se postupci odvijaju na 4ºC ako nije drugačije navedeno.

Stanice soja #1582, pohranjene na -70ºC, otope se i suspendiraju u istom volumenu Breaking pufera (20 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA). Inhibitori proteaza PMSF i Pepstatin A se dodaju smjesi do konačne koncentracije od 2 mM odnosno 1.7 µM. Stanice se liziraju pomoæu BioNeb sustava za razaranje stanica (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN) lizat se razbistri centrifugiranjem pri 5000 g tijekom 10 min.

Nadtalog se nanese na vrh jastučića od 45%-tne (mas/vol) saharoze u L1 puferu koji ima 5 cm, i L1 se peletira centrifugiranjem pri 100000 g tijekom 4 sata. Peleta se ponovno suspendira u desetini volumena L1 pufera. Tako suspendirana peleta se razbistri centrifugiranjem pri 5000 g tijekom 10 minuta.

Nadtalog se razrijedi s PBS u omjeru 1:5, ponovno razbistri centrifugiranjem u Sorvall SA rotoru pri 6500 okr/min tijekom 10 minuta na 4ºC. Nadtalog se filtrira kroz štrcajuæi (syringe) filtar i frakcionira anionskom izmjenjivačkom kromatografijom.

Anionska izmjenjivačka kromatografija izvodi se na Perkin-Elmer Series 410 Biopump HPLC s 5-milimetarskom injekcijskom petljom. Medij za kromatografiju bila je Fractogel EMF TMAE-650 (S) smola od 25-40 mikrona (EM Separations, Gibbstown, NJ) u ID staklenom stupcu od 150 mm x 10 mm. Ispiranje proteina sa stupaca praćeno je optičkom detekcijom pri 280 nm provedenom Perkin-Elmer LC-235 diodnim detektorom. Stupac je prethodno uravnotežen pomoću 0.15 M NaCl u 0.01 M natrij-fosfatnog pufera, pH 7.2 (pufer A). Brzina protoka u stupcu bila je 0.75 ml/min. Uzorak je nanesen na stupac i stupac je ispran puferom A da se ukloni nevezani materijal. Vezani materijal je ispran linijskim koncentracijskim gradijentom natrij-klorida, 0.15 M do 0.65 M tijekom 5 minuta, pa zatim 0.65 M do 1.15 M linijskim gradijentom tijekom 30 minuta. Otkrivanje antigena u frakcijama koje su prikupljene ispiranjem provedeno je imunodot blot postupkom. Frakcije koje su sadržavale imunoreaktivni materijal (tj. frakcije isprane između 0.81 M i 1.05 M NaCl ) su pulirane.

Pulirane frakcije se koncentriraju u Macrosep centrifugalnom uređaju za koncentriranje (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) do 1/5 volumena.

Koncentrat se frakcionira kromatografijom koja razdvaja prema veličini pomoću Sephacryl S-1000 SF smola (Pharmacia, Piscataway NJ) u ID stupcima od 87 cm x 27 cm. Brzina protoka u stupcu bila je 2.5 ml/min. Ispiranje proteina se prati pri A280 nm. Antigen se otkriva imunoblot postupkom.

Frakcije koje sadrže imunoreaktivni materijal puliraju se i koncentriraju ultrafiltriranjem uporabom miješanih stanica (Amicon, Inc., Beverly, MA) i YM-100 ravnoslojne membrane promjera 43 mm (Amicon, Inc, Beverly, MA) u dušiku pod tlakom od 10. psi.

Konačni proizvod se ispita pomoću SDS/PAGE i Coomassie bojanja, te kapilarnom elektroforezom prosijavanja otopine (SSCE). SSCE je pokazala 88%-tnu čistoću konačnog proizvoda Sheme 2.

Primjer 23

A. Pročišćavanje rekombinantnog kapsidnog proteina CRPV L1 - Shema 3 (Slika 17)

Svi se postupci odvijaju na 4ºC ako nije drugačije navedeno.

Stanice soja #1582, pohranjene na -70ºC, otope se i suspendiraju u istom volumenu Breaking pufera (20 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA). Inhibitori proteaza PMSF i Pepstatin A se dodaju smjesi do konačne koncentracije od 2 mM odnosno 1.7 µm. Stanice se liziraju pomoću BioNeb sustava za razaranje stanica (Glas-Col Apparatus Co., Terra Haute, IN) lizat se razbistri centrifugiranjem pri 5000 g tijekom 10 min.

Nadtalog se nanese na vrh jastučića od 45%-tne (mas/vol) saharoze u L1 puferu koji ima 5 cm, i L1 se peletira centrifugiranjem pri 100000 g tijekom 4 sata. Peleta se ponovno suspendira u desetini volumena L1 pufera. Tako suspendirana peleta se razbistri centrifugiranjem pri 5000 g tijekom 10 minuta.

Nadtalog se ekstrahira sa 1/2 volumena kloroforma. Vodeni sloj se izdvoji i razbistri centrifugiranjem pri 12000 okr/min u Beckmann mikrofugi tijekom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Nadtalog se razrijedi s PBS u omjeru 1:5, ponovno razbistri centrifugiranjem u Sorvall SA rotoru pri 6500 okr/min tijekom 10 minuta na 4ºC. Nadtalog se filtrira kroz štrcajući (syringe) filtar i frakcionira anionskom izmjenjivačkom kromatografijom.

Anionska izmjenjivačka kromatografija izvodi se na Perkin-Elmer Series 410 Biopump HPLC s 5-milimetarskom injekcijskom petljom. Medij za kromatografiju bila je Fractogel EMF TMAE-650 (S) smola od 25-40 mikrona (EM Separations, Gibbstown, NJ) u ID staklenom stupcu od 150 mm x 10 mm. Ispiranje proteina sa stupaca praćeno je optičkom detekcijom pri 280 nm koja je provedena Perkin-Elmer LC-235 diodnim detektorom. Stupac je prethodno uravnotežen pomoću 0.15 M NaCl u 0.01 M natrij-fosfatnog pufera, pH 7.2 (pufer A). Brzina protoka u stupcu bila je 0.75 ml/min. Uzorak je nanešen na stupac i stupac je ispran puferom A da se ukloni nevezani materijal. Vezani materijal ispran je linijskim koncentracijskim gradijentom natrij-klorida, 0.15 M do 0.65 M tijekom 5 minuta, pa zatim 0.65 M do 1.15 M linijskim gradijentom tijekom 30 minuta. Otkrivanje antigena u frakcijama koje su prikupljene ispiranjem provedeno je imunodot blot postupkom. Frakcije koje su sadržavale imunoreaktivni materijal (tj. frakcije isprane između 0.81 M i 1.05 M NaCl) su pulirane.

Pulirane frakcije se koncentriraju u Macrosep centrifugalnom uređaju za koncentriranje (Filtron Technology Corp., Northborough, MA) do 1/5 volumena.

Koncentrat se frakcionira kromatografijom koja razdvaja prema veličini pomoću Sephacryl S-1000 SF smole (Pharmacia, Piscataway NJ) u ID stupcima od 87 cm x 27 cm. Brzina protoka u stupcu bila je 2.5 ml/min. Ispiranje proteina se prati pri A=280 nm. Antigen se otkriva imunoblot postupkom.

Frakcije koje sadrže imunoreaktivni materijal puliraju se i koncentriraju ultrafiltriranjem uporabom miješanih stanica (Amicon, Inc., Beverly, MA) i YM-100 ravnoslojne membrane promjera 43 mm (Amicon, Inc, Beverly, MA) u dušiku pod tlakom od 10. psi.

Konačni proizvod se ispita pomoću SDS/PAGE i Coomassie bojanja, te kapilarnom elektroforezom prosijavanja otopine (SSCE). SSCE je pokazala 95%-tnu čistoću konačnog proizvoda Sheme 3.

Kapilarna elektroforeza prosijavanja otopine (SSCE)

Uzorci VLP CRPV (oko 0.2 mg/ml) se griju tijekom 15 minuta na 100ºC u 1%-tnom 2-merkaptoetanolu i 1%-tnom (mas/vol) SDS. Uzorak se, zajedno sa melitičnom kiselinom kao referentnim markerom, elektrokinetički unese u silikom zatvorenu kapilaru, 42 cm (22 cm od detektora) x 0.05 mm I.D., prethodno uravnoteženu 10-lumenskim volumenom 0.1 N NaOH, vode i ProSort reagensa za prosijavanje (Applied Biosystems, Foster City, CA). Primjeni se separacijski napon od 300 V/cm pomoću Applied Biosystems Model 270A-HT CE uređaja. Ispiranje uzorka prati se kao apsorbancija pri 215 nm i podaci se prikupljaju korištenjem Nelson Turbochrom 3 softvera.

Primjer 24

Zaštita protiv razvoja papiloma uzrokovanih CRPV cijepljenjem s L1 VLP CRPV dobivenim iz kvasca

Pet novozelandskih bijelih kunića intramuskularno se imunizira ili sa 135 µg L1 VLP (75%-tne čistoće) adsorbiranih na alaun ili sa 100 µg rekombinantnog površinskog antigena hepatitisa B (99%-tne čistoće) adsorbiranog na aluminijev hidroksid što služi kao negativna kontrola. Životinje prime još dvije doze tijekom 8 tjedana prije izlaganja CRPV, koje se provede 10 dana nakon posljednje doze. Serumi uzeti prije imunizacije, pri svakoj dodatnoj dozi i prije izlaganja antigenu ispitaju se putem L1-specifičnog ELISA testa. Ploče 96 bunarića oblože se s 5 µg sirovog lizata CRPV-L1 ili CRPV-L2 dobivenog iz kvasca. Protein se ukloni i ploče se blokiraju u 10%-tnom mlijeku u prahu (Carnatium) + TTBS (20 mM tris pH 7.4, 500 mM NaCl, 0.1 % Tween) tijekom 2 sata na 4ºC. Nakon ispiranja ploča TTBS-om dodaju se razrijeđeni kunićji serumi u 1%-tnom mlijeku + TTBS i inkubiraju tijekom 2 sata na 4ºC. Ploče se potom ispiru TTBS-om i inkubiraju protu-kunićjom IgG alkalnom fosfatazom (Kirkegaard and Perry Labs., Inc) u 1%-tnom mlijeku + TTBS tijekom 2 sata na 4ºC. Ploče se ispiru TTBS-om i razvijaju dodavanjem p-nitrofenilfosfata (Kirkegaard and Perry Labs., Inc). Reakcija se zaustavi dodavanjem 5%-tnog EDTA. Apsorbancija se mjeri pri 405 nm. Titar se smatra pozitivnim ako omjer apsorbancija L1/L2 iznosi 2:1.

Titrovi protutijela protiv L1 bili su prisutni 4 tjedna nakon prve injekcije i rasli su sa svakom dodatnom dozom. Kontrolne su životinje ostale negativne. Šest tjedana nakon izlaganja CRPV cijepljene su životinje bile bez bradavica na svih 15 izloženih mjesta (virus u razrijeđenju 1:2 ili 1:12), dok je u kontrolnoj skupini došlo do pojave bradavica na 12 do 15 mjesta (virus u razrijeđenju 1:2) odnosno 9 od 15 mjesta (virus u razrijeđenju 1:12). Nakon 15 tjedana, cijepljene su životinje i dalje bile bez bradavica.

Testovi neutralizacije virusa izvedeni su (u osnovi prema postupku Christensena et al., 1991, Virology 181:572-579) miješanjem kunićjih seruma s CRPV i potom izlaganja kunića tako obrađenom CRPV. Standard za dokazivanje neutralizacijskih protutijela bila je potpuna neutralizacija virusa (sva tri mjesta negativna na stvaranje bradavica). Ispitani su serumi 5 cijepljenih i 5 kontrolnih životinja. Serumi prikupljeni nakon 1 doze L1 VLP CRPV sadržavali su protutijela koja su potpuno neutralizirala nerazrijeđeni virus u 80% (4/5) kunića. Nakon 2 ili 3 doze L1 VLP CRPV 100% kunića (5/5) je razvilo protutijela koja neutraliziraju virus. Kontrolni serumi nisu pokazivali neutralizirajuće djelovanje na virus. Ovisno o konačnim titrovima serumi odabranih cijepljenih životinja mogu se razrijediti 10-1000 puta nakon čega i dalje pokazuju 100%-tni neutralizirajući učinak.

Primjer 25

Oblikovanje vektora koekspresije L1/L2 CRPV iz jednog plazmida

Plazmid pSP72-CRPV-L1 (p12930-314-4-1) se razgradi pomoću Bg1II i 1.5 kbp fragment Bg1II koji nosi CRPV L1 ORF s 5’-neprevedenim vodećim slijedom kvasca se pročisti u gelu. Plazmid p12930-323-2-3 se probavi pomoću BamHI koji cijepa između GAL1 promotora i ADH1 transkripcijskog terminatora. Linijski vektorski fragment se pročisti u gelu i potom veže s prije spomenutim fragmentom CRPV-L1 Bg1II čime se dobije plazmid p12930-336-1-2. Tako dobiven plazmid sadrži CRPV L1 ORF pod kontrolom GAL1 promotora i CRPV-L2 ORF pod kontrolom GAL10 promotora.

Primjer 26

Oblikovanje vektora koekspresije CRPV L1/L2 iz dva plazmida

Vektor pUC18-GAL1p-GAL10p koji sadrži gen L2 se izreže pomoću SphI i 2.9 kb fragment koji sadržiADH1t-GAL1p-GAL10p-L2-ADH1t kazetu ekspresije se pročisti u gelu i krajevi mu se otupe izlaganjem T4 DNA polimerazi. Shuttle vektor kvasca YEp24 (Botstein et al., Gene 8:17 (1979)) se razgradi pomoću BamHI, otupe mu se krajevi izlaganjem T4 DNA polimerazi, defosforilira se telećom crijevnom alkalnom fosfatazom i potom veže s gore opisanom L2 kazetom ekspresije otupljenih krajeva čime se dobije plazmid p1594.

Primjer 27

Koekspresija L1 i L2 CRPV u kvascu

Plazmid p12930-366-1-2 (pC1/1-GAL1/10p-CRPV/L1 + L2) upotrijebljen je za transformaciju sojeva #1569 i BJ5462 (jednoplazmidski sustav) S. cerevisiae i dobiveni transformanti su izdvojeni na sintetičkom agar mediju bez leucina. U usporednom pokusu, soj #1592 je kotransformiran s CRPV-L1 vektorom ekspresije p12930-323-6-1 plus YEp24-GAL10p-L2 vektorom ekspresije p1594 (dvoplazmidski sustav) i dobiveni transformanti koji sadrže oba vektora su izdvojeni na sintetičkom agar mediju bez leucina i uracila. Klonalni izolati oba sustava, jednoplazmidskog i dvoplazmidskog, ostavljeni su da se razviju na 30ºC u YEHD sliženom mediju koji sadrži 2% galaktoze tijekom 48-72 sata. Nakon prikupljanja stanica, stanične pelete su razbijene staklenim zrncima. Dodan je TritonX-100 do konačne koncentracije od 0.5% i stanični lizati su imunoblot postupkom ispitani na postojanje ekspresije L1 i L2 CRPV. Uzorci koji sadrže 50 µg ukupnih staničnih proteina podvrgnu se elektroforezi na 8-16% Tris-glicin gelovima s gradijentom (Novex) u reducirajućim i denaturirajućim uvjetima, te se elektroblotiraju na PVDF membrane (Novex). Proteini L1 i L2 CRPV se ispituju korištenjem poliklonalnih protu-L1 i protu-L2 protuseruma kunića (dar dr. Johna Kreidera, Hershey Medical Center) kao primarnih protutijela i proteina vezanog s peroksidazom hrena (Amersham, Inc.) kao sekundarnih protutijela. Membrane se obrade korištenjem kemiluminescentne ECLN opreme za otkrivanje (Amersham, Inc.). 55-61 kDa vrpca proteina L1 i približno 90 kDa vrpca proteina L2 otkrivene su u svim uzorcima klonova kvasca koji su sadržavali L1 + L2 ekspresijske plazmide. Nisu otkriveni znaci L2 u uzorcima dobivenim od klonova kvasca koji su nosili ekspresijski plazmid za L1 (Slika 6). Nisu otkriveni znaci L1 u uzorcima dobivenim od stanica koje su sadržavale samo L2 ekspresijski vektor.

Primjer 28

Pročišćavanje L1 CRPV i L1 + L2 CRPV VLP za EM proučavanja

Proteini L1, kao i L1 i L2 CRPV su djelomično pročišćeni i koncentrirani za ispitivanje elektronskim mikroskopom (EM). 1 do 1.5 litra YEHD medija koji sadrži 2% galaktoze inokulira se sa sojevima #1569 ili BJ5462 S. cerevisiae transformiranima s L1 + L2 vektorom koekspresije p12930-366-1-2 i ostane se razvijati na 30ºC tijekom 48-72 sata. U usporednom pokusu, stanice soja #1569 se kotransformirane s CRPV-L1 vektorom ekspresije p1293032361 plus YEp24-GAL10p-L2 plazmidom p1594 razvijaju se u sličnim uvjetima. Stanice se prikupe iz stanične pelete smrznu na -70ºC. Svi se slijedeći postupci odvijaju na 4ºC. Stanične pelete se otope i suspendiraju u istom volumenu “L1 pufera” (20 mM natrijevog-fosfata, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA). Inhibitori proteaza PMSF i pepstatin A se dodaju smjesi do konačne koncentracije od 2 mM odnosno 1.7 µM. Stanice se liziraju putem 3-5 prolaza u mikrofluidizatoru. Lizati se razbistre centrifugiranjem pri 5000 g tijekom 10 min. Nadtalog se nanese na vrh jastučića od 45%-tne (mas/vol) saharoze u L1 puferu koji ima 5 cm, i L1, L2 ili L1 i L2 proteini se peletiraju centrifugiranjem pri 100000 g tijekom 4 sata. Peleta se ponovno suspendira u desetini volumena L1 pufera. Tako suspendirana peleta se razbistri centrifugiranjem pri 5000 g tijekom 10 minuta.

Za ispitivanje elektronskom mikroskopijom (Structure Probe, West Chester, PA), alikvot svakog uzorka nanese se na bakrenu rešetku s 200 šupljina obloženu ugljikom. Na rešetku se kapne kap 2%-tne fosfovolframove kiseline čiji je pH 7.0, i ostavi stajati 20 sekundi. Rešetka se osuši na zraku prije TEM ispitivanja. Za mikroskopiranje je korišten JEOL 100 CX transmisijski elektronski mikroskop (JEOL USA Inc.) uz napon ubrzavanja od 100 kV. Dobiveni mikrografi bili su povećanja 100000x.

U svim uzorcima kvasca koji nose ili L1 CRPV plazmid ekspresije ili plazmide koekspresije L1 i L2 CRPV, opažane su VLP promjera ≤ 25 nm. Nisu opažene VLP u kontrolnim uzorcima kvasca, kao ni u uzorcima kvasca koji nose samo plazmid ekspresije L2.

Primjer 29

Ekspresija L1 CRPV (soj 1582) i L1 HPV tipa 6a ( soj 1644) u obogaćenom spoju i kemijski definiranom mediju

Inokulumi za ove sojeve razvijeni su u sintetičkom mediju bez leucina, kao što je prije opisano, za prijenos kultura u boce za mućkalice. U korištenim bocama za mućkalice zapriječen je visoki kapacitet aeracije (70 ml tekućine po boci od 300 ml, Tunair Labware) i medij je obogaćen s oko 0.5 ml/l sredstva protiv pjenjenja (UCON LB-625, Union Carbide). Obogaćeni složeni medij sadržavao je (po l): 40 g Difco ekstrakta kvasca,; 20 g Sheffield HySoy peptona; 30 g glukoze; 50 g galaktoze; pH medija podešen je na 5.3 prije sterilizacije. Kemijski definiran medij koji je korišten sličan je onom koji je opisao Oura (Biotechnol. Bioengineer. 16:1197-1212; 1974), ali je obogaćen s (po L): 0.1 g kolin-klorida; 0.2 g uracila; 20 g glukoze; 40 g galaktoze. Boce su inokulirane sa po 3 ml inokuluma i inkubirane tijekom 66 sati na 28ºC, pri 250 okr/min na kružnoj mućkalici. Iz boca su povremeno uzimani uzorci za dokazivanje ekspresije pomoću imunoblot postupka uz protu-CRPV L1 i protu-HPV 6a L1 protuseruma.

Primjer 30

Kloniranje L1 i L2 gena HPV16

Ukupna genomička DNA ekstrahira se iz Caski stanica (ATCC #CRL 1550) standardnim postupcima (Sambrook et al.,vidjeti gore). DNA se razgradi BstI1071 i SphI endonukleazama i podvrgne elektroforezi na 0.8%-tnom agaroznom preparacijskom gelu niskog tališta. Regija koja odgovara DNA od približno 3.5 kbp se izreže s gela i agaroza se probavi GelaseN enzimom (Epicentre Technologies, Inc.). DNA pročišćenoj u gelu se okupe krajevi T4 DNA polimerazom i takva se veže s fosforiliranim oligonukleotidnim spojevima otopljenih krajeva koji sadrže prikrivena HindIII mjesta. Smjesa se potpuno razgradi pomoću HindIII i DNA od približno 3.5 kbp se frakcionira prema veličini u agaroza gelu kao što je opisano. DNA pročišćena u gelu se veže s pUC18 plazmidom DNA koji je prethodno razgrađen pomoću HindIII i defosforiliran. Nakon transformacije kompetentnih stanica E. coli DH5 (BRL), plazmidska knjižnica se pretraži na HPV16-pozitivne klonove hibridizacijom kolonija pomoću antisense oligodeoksinukleotida označenog pomoću 32P koji je komplementaran 3’-kraju L1 gena HPV16 (5’-GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC -3’). Plazmid pUC18 koji sadrži 3.3 kbp genomski fragment HPV16 se izdvoji i ispita restrikcijskim enzimima i Southern blot postupkom. Ovaj se plazmid označi kao pUC18-HPV16 L1/L2 i sadrži sve slijedove DNA koji kodiraju L1 i L2. Plazmidska DNA je pripravljena pomoću QiagenN Plasmid Maxi opreme. (Qiagen, Inc.).

Primjer 31

Oblikovanje ekspresijskog vektora iz kvasca za L1 HPV16

Klon pUC18-HPV16 L1/L2 korišten je kao kalup za PCR. Gen L1 HPV16 je umnožen PCR-om pomoću Vent polimeraze (New England Biolabs, Inc.), 10 ciklusa umnožavanja (94ºC, 1 min; 48ºC, 1 min; 72ºC, 1 min 45 sec) i slijedeæih oligodeoksinukleotidnih klica koje sadrže bočna Bg1II mjesta (podcrtano):

sense klica: 5’-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT CTC TTT GGC TGC CTA TGT AGG CC- 3’

antisense klica: 5’ –GAG AGA TCT TAC AGC TTA CGT TTT TTG CGT TTA GC- 3’

Sense klica uvodi neprevedeni vodeći slijed kvasca izravno protusmjerno početnom metioninskom kodonu HPV16 L1 (podebljano). 1.5 kbp L1 dobiven PCR-om razgradi se pomoću Bg1II, pročisti u gelu i veže s pGAL10 vektorom koji je prethodno razgrađen pomoću BamHI. Plazmid pGAL10 koji sadrži gen L1 HPV16 se izolira i označi kao p14049-37-1. Gen L1 u p14049-37-1 se sekvencionira korištenjem PRISMN opreme (ABI, Inc.) i ABI Sequencer Model #373A prema uputama proizvođača. Pokazalo se da gen L1 iz ovog izolata sadrži 3 nukleotidne promjene u odnosu na prepravljeni i objavljeni slijed prototipa (Kirnbauer, R. et al. (1993) J. Virol. 67:6929-6936), koji imaju za posljedicu promjene dvije aminokiseline: His-202 u Asp; Thr-266 u Ala. Analiza slijeda izvornog kalupa dena potvrdila je da su ove promjene bile također prisutne i u genomskom klonu pUC18-HPV16 L1/L2 i nisu unijete PCR-om.

Primjer 32

Oblikovanje ekspresijskog vektora iz kvasca za L1 i L2 HPV16

Plazmid p14049-37-1 se razgradi pomoću SmaI, koji cijepa između promotora GAL10 i transkripcijskog terminatora ADH1. 1.4 kbp L2 gen HPV16 se umnoži PCR-om pomoću pUC18-HPV16 L1/L2 DNA kao kalupa. Vent polimeraze (New England Biolabs, Inc), 10 ciklusa PCR umnožavanja (94ºC, 1 min; 48ºC, 1 min; 72ºC, 1 min 45 sec) i slijedeæih oligodeoksinukleotidnih klica koje sadrže prikrivena SmaI mjesta (potcrtano):

sense klica: 5’ –TCC CCC GGG CAC AAA ACA AAA TGC GAC ACA AAC GTT CTG CAA AAC -3’

antisense klica: 5’ –TCC CCC GGG CTA GGC AGC CAA AGA GAC ATC TGA -3’

Sense klica uvode neprevedeni vodeći slijed kvasca izravno protusmjerno početnom metioninskom kodonu L2 HPV16 (podebljano). 1.4 kbp proizvod PCR L2 razgradi se pomoću SmaI, pročisti u gelu i veže s vektorom p14049-37-1 koji je prethodno razgrađen pomoću SmaI. Plazmid pLS110 koji sadrži i L1 i L2 gene HPV16 izdvoji se i označi kaop14049-42-2. Gen L2 u p14049-42-2 se sekvencionira korištenjem PRISMN opreme (ABI, Inc.) i ABI SequencerModel #373A prema uputama proizvođača. Gen L2 ovog izolata sadržavao je 5 nukleotidnih razlika u odnosu na ispravljeni i objavljeni slijed (Kirnbauer, R. et al. (1993), vidjeti gore), što je za posljedicu imalo razliku u jednoj aminokiselini: Ser-269 mijenja se u Pro. Ispitivanje slijeda genomskog klona pUC18-HPV16 L1/L2 potvrdilo je prisutnost ove promjene u izvornom kalupu DNA, to jest da nije uvedena PCR-om.

Primjer 33

A. Ekspresija L1 HPV16 i koekspresija L1 i L2 HPV16 u kvascu

Plazmidi p14049-37-1 i p14049-42-2 korišteni su za transformaciju soja #1558 S.cerevisiae. Dobiveni su rekombinantni sojevi #1678 (HPV16-L1) i #1679 (HPV16 L1 + L2) što je prikazano u tablici. Klonalni izolati uzgajaju se na 30ºC u YEHD mediju koji sadrži 2% galaktoze tijekom 68-78 sati. Nakon prikupljanja stanica, stanične pelete se razbiju staklenim kuglicama i stanični se lizati imunoblot postupkom ispituju na prisutnost ekspresije proteina L1 HPV16 ili L2 HPV16. Uzorci koji sadrže 40 µg ukupnih staničnih proteina podvrgnu se elektroforezi na 10%-tnim Tris-glicin gelovima u reducirajućim i denaturirajućim uvjetima i elektroblotiraju na nitrocelulozne filtere. Protein L1 HPV16 se otkriva imunodetekcijom pomoću kunićjih poliklonalnih protuseruma usmjerenih na trpE HPV11 L1 fuzijski protein ( D.Brown et al., Virology 201:46-54) kao primarni antigen, te protu-kunićje IgG protutijelo magarca vezano na HRP (Amersham, Inc.) kao sekundarno protutijelo. Filteri se obrade korištenjem kemiluminescentne ECLN opreme za otkrivanje (Amersham, Inc.). U svim je uzorcima osim u negativnoj kontroli (vektorska kontrola bez gena L1 i L2) otkrivena 50-55 kDa vrpca proteina L1. Protein L2 otkriven je kao 70 kDa proteinska vrpca imunoblot postupkom korištenjem mišjih protu-HPV16L2 seruma usmjerenih na trpE-L2 fuzijske proteine dobivene ekspresijom u E. coli kao primarnim protutijelom. Kozji protu-mišji IgG vezan na HRP (Amesham, Inc.) korišten je kao sekundarno protutijelo, a filteri su obrađeni kao što je ranije opisano.

B. Pročišćavanje rekombinantnih kapsidnih proteina L1 + L2 HPV tipa 16

Svi se postupci odvijaju na 4ºC ako nije drugačije označeno. Stanice su pohranjene zamrznute na -70ºC. Zamrznute stanice (mokra težina=27.6 g) se otope na 20-23ºC i ponovno suspendiraju u 40 ml “L1 pufera” (20 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA). Dodaju se inhibitori proteaza PMSF i pepstatin A do konačne koncentracije od 2 mM odnosno 1.7 µM. Stanične veze se prekidaju pod tlakom od oko 8000 psi tijekom 3 prolaza u M110 mikrofluidizatoru (Microfluidics Corp., Newton, MA). Dobivena se masa centrifugira pri 5000 g tijekom 10 min da se ukloni stanični debris. Tekući nadtalog koji sadrži antigene L1 + L2 se prikuplja.

Nadtalog se razrijedi u omjeru 1:5 puferom A (20 mM MOPS, pH 7.0) i nanese u vezivni stupac za izmjenu aniona(5.0 cm ID x 4.8 cm) od Fractogel® EMD TMAE-650 (S) smole (EM Separations, Gibbstown, NJ) uravnotežen u puferu A. Nakon ispiranja puferom A, antigen se ispire gradijentom od 0-1.0 M NaCl u puferu A. Provede se imunodot bloting postupak da bi se ustanovilo koje frakcije iz stupca sadrže protein L1.

U frakcijama koje sadrže protein L1, što je ustanovljeno imunodot blotingom, odrede se ukupni proteini pomoću Bradford postupka, nakon čega se vrši SDS-PAGE uz bojanje srebrom te Western bloting.

TMAE frakcije sličnih čistoća i sadržaja proteina L1 se puliraju. Antigen se koncentrira frakcioniranjem amonijevim sulfatom. Otopina se podesi na 48%-tnu zasićenost amonijevim sulfatom dodavanjem krutog reagensa uz oprezno miješanje tijekom 30 min. Uzorak se stavi na led i ostavi precipitirati preko noći. Uzorak se potom centrifugira pri 12000 g. Peleta se ponovno suspendira u 20.0 ml PBS (6.25 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 150 mM NaCl).

Ponovno suspendirane pelete se podvrgnu kromatografiji na stupcu za razdvajanje prema veličini (2.6 cm ID x 89 cm) od Sephacryl 500 HR smole (Pharmacia, Piscataway, NJ). Korišten je PBS pufer. Kromatografija se izvodi na 20-23ºC. Frakcije se ispituju pomoću SDS-PAGE uz bojanje srebrom i Western blot postupkom. Najčišće se frakcije puliraju. Dobiveni se poolovi koncentriraju u 50 ml miješanih stanica korištenjem YM-100 ravnoslojnih membrana od 43 mm (Amicon, Beverly , MA) u atmosferi dušika pod tlakom od 4-6 psi.

Konačni proizvod se ispituje SDS-PAGE uz koloidalno Coomassie bojanje. Procijenjeno je da su proteini L1 i L2 70%-tne homogenosti. Prisutnost proteina L1 i L2 potvrđuje se Western blotingom uz uporabu odgovarajućih protuseruma. Konačni se proizvod podijeli u alikvote i pohrani na -70ºC. Ovim se postupcima dobije ukupno 0.53 mg proteina.

Ispitivanje elektronskom mikroskopijom provedeno je pomoću Structure Probe (West Chester, PA). Alikvot uzorka nanese se na bakrenu rešetku s 200 šupljina obloženu ugljikom. Na rešetku se kapne kap 2%-tne fosfovolframove kiseline čiji je pH 7.0, i ostavi stajati 20 sekundi. Rešetka se osuši na zraku prije TEM ispitivanja. Za mikroskopiranje je korišten JEOL 100 CX transmisijski elektronski mikroskop (JEOL USA, Inc.) uz napon ubrzavanja od 100 kV. Dobiveni mikrografi bili su povećanja 100000x. Potvrđena je prisutnost čestica sličnih virusu veličine ≤25 nm.

C. Pročišćavanje rekombinantnih kapsidnih proteina L1 + L2 HPV tipa 16

Svi se postupci odvijaju na 4ºC ako nije drugačije određeno.

Stanice su pohranjene zamrznute na -70ºC. Zamrznute stanice (mokra težina=92.8 g) se otope na 20-23ºC i ponovno suspendiraju u 105 ml “L1 pufera” (20 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA). Dodaju se inhibitori proteaza PMSF i pepstatin A do konačne koncentracije od 2 mM odnosno 1.7 µM. Stanične veze se prekidaju pod tlakom od oko 16000 psi tijekom 3 prolaza u M110 mikrofluidizatoru (Microfluidics Corp., Newton, MA). Dobivena se masa centrifugira pri 6100 g tijekom 15 min da se ukloni stanični debris. Tekući nadtalog koji sadrži antigene L1 + L2 se prikuplja. Nadtalog se razrijedi u omjeru 1:5 puferom A (20 mM MOPS, pH 7.0) i nanese u vezivni stupac za izmjenu aniona (5.0 cm ID x 4.2 cm) od Fractogel® EMD TMAE-650 (S) smole (EM Separations, Gibbstown, NJ) uravnotežen u puferu A. Nakon ispiranja puferom A. antigen se ispire gradijentom od 0-1.0 M NaCl u puferu A. Provede se imunodot bloting postupak da bi se ustanovilo koje frakcije iz stupca sadrže proteine L1.

U frakcijama koje sadrže proteine L1, što je ustanovljeno imunodot blotingom, odrede se ukupni proteini pomoću Bradford postupka, nakon čega se vrši SDS-PAGE uz bojanje srebrom te Western bloting.

TMAE frakcije sličnih čistoća i sadržaja proteina L1 se puliraju. Antigen se koncentrira frakcioniranjem amonijevim sulfatom. Otopina se podesi na 35%-tnu zasićenost amonijevim sulfatom dodavanjem krutog reagensa uz oprezno miješanje tijekom 10 min. Uzorak se stavi na led i ostavi se precipitirati tijekom 4 sata. Uzorak se potom centrifugira pri 12000 g. Peleta se ponovno suspendira u 20.0 ml PBS (6.25 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 150 mM NaCl) koji sadrži 1 mM EDTA.

Ponovno suspendirane pelete se podvrgnu kromatografiji na stupcu za razdvajanje prema veličini (2.6 cm ID x 89 cm) od Sephacryl 500 HR smole (Pharmacia, Piscataway, NJ). Korišten je PBS pufer + 1mM EDTA. Kromatografija se izvodi na 20-23°C. Frakcije se ispituju pomoću SDS-PAGE uz bojanje srebrom i Western blot postupkom. Najčišće se frakcije puliraju. Dobiveni se poolovi koncentriraju na 50 ml miješanih stanica korištenjem YM-100 ravnih membrana od 43 mm (Amicon, Beverly, MA) u atmosferi dušika pod tlakom od 4-6 psi.

Konačni proizvod se ispituje SDS-PAGE uz koloidalno Coomassie bojanje. Procijenjeno je da su proteini L1 iL2 70%-tne homogenosti. Prisutnost proteina L1 i L2 potvrđuje se Western blotingom uz uporabu odgovarajućih protuseruma. Konačni se proizvod podijeli u alikvote i pohrani na -70°C. Ovim se postupkom dobije ukupno 3.8 mg proteina.

Primjer 34

A. Fermentacija soja 1679 (L1 + L2 HPV tipa 16)

Postupci korišteni za pripravu zamrzavanjem uskladištenih kultura, razvoj inokuluma, fermentacija i dobivanje stanica soja 1679 u osnovi su jednaki ranije opisanima. Nakon 67 sati inkubacije, postignuta je gustoća stanica od 4.2 g suhe stanične težine na L čime se, nakon umnožavanja, dobilo ukupno 93 g mokre težine stanične pelete.

B. Fermentacija soja 1678 (L1 HPV tipa 16)

Postupci korišteni za pripravu zamrzavanjem uskladištenih kultura, razvoj inokuluma, fermentacija i dobivanje stanica soja 1678 u osnovi su jednaki ranije opisanima. Nakon 70.5 sati inkubacije, sadržaji dva fermentatora od po 10 l su pulirani (pri gustoći stanica od 8.7 g suhe stanične težine po l) čime se, nakon umnožavanja, dobilo ukupno 258 g mokre težine stanične pelete.

C. Pročišćavanje rekombinantnih kapsidnih proteina L1 + L2 HPV tipa 16

Svi se postupci odvijaju na 4°C ako nije drugačije označeno.

Stanice soja #1678 pohranjene su zamrznute na -70°C. Zamrznute stanice (mokra težina=128 g) se otope na 20-23°C i ponovno suspendiraju u 140 ml “modificiranog L1 pufera” (20 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 100 mM NaCl). Dodaju se inhibitori proteaza PMSF i pepstatin A do konačne koncentracije od 2 mM odnosno 1.7 μM. Stanične veze se prekidaju pod tlakom od oko 16000 psi tijekom 3 prolaza u M110 mikrofluidizatoru (Microfluidics Corp., Newton, MA). Dobivena se masa centrifugira pri 11000 g tijekom 40 min da se ukloni stanični debris. Tekući nadtalog koji sadrži antigen L1 se prikuplja.

Tekući se nadtalog razrijedi u omjeru 1:5 puferom A (20 mM MOPS, pH 7.0) i nanese u vezivni stupac za izmjenu aniona (5.0 cm ID x 6.4 cm) od Fractogel® EMD TMAE-650 (S) smole (EM Separations, Gibbstown, NJ) uravnotežen u puferu A. Nakon ispiranja puferom A. antigen se ispire gradijentom od 0-1.0 M NaCl u puferu A. Provede se imunodot bloting postupak da bi se ustanovilo koje frakcije iz stupca sadrže protein L1.

U frakcijama koje sadrže protein L1, što je ustanovljeno imunodot blotingom, odrede se ukupni proteini pomoću Bradfordovog postupka, nakon čega se vrši SDS-PAGE uz korištenje bojanja srebrom te Western bloting.

TMAE frakcije sličnih čistoća i sadržaja proteina L1 se puliraju. Antigen se koncentrira frakcioniranjem amonijevim sulfatom. Otopina se podesi na 35%-tnu zasićenost amonijevim sulfatom dodavanjem krutog reagensa uz oprezno miješanje tijekom 10 min. Uzorak se stavi na led i ostavi se precipitirati tijekom 5 sati. Uzorak se potom centrifugira pri 12000 g. Peleta se ponovno suspendira u 20.0 ml PBS (6.25 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 150 mM NaCl).

Ponovno suspendirane pelete se podvrgnu kromatografiji na stupcu za razdvajanje prema veličini (2.6 cm ID x 89 cm) od Sephacryl 500 HR smole (Pharmacia, Piscataway, NJ). Korišten je PBS pufer. Kromatografija se izvodi na 20-23°C. Frakcije se ispituju pomoću SDS-PAGE uz bojanje srebrom i Western blot postupkom. Najčišće se frakcije puliraju. Dobiveni se poolovi koncentriraju u 50 ml miješanih stanica korištenjem YM-100 ravnoslojnih membrana od 43 mm (Amicon, Beverly, MA) u atmosferi dušika pod tlakom od 4-6 psi.

Konačni proizvod se ispituje SDS-PAGE uz koloidalno Coomassie bojanje. Procijenjeno je da je protein L1 70%-tne homogenosti. Prisutnost proteina L1 potvrđuje se Western blotingom uz uporabu odgovarajućih protuseruma. Konačni se proizvod podijeli u alikvote i pohrani na -70°C. Ovim se postupcima dobije ukupno 7.4 mg proteina.

Analitički postupci

Imunodot blot postupak

Uzorci se (ako je potrebno) razrijede u Milli-Q-H2O u omjeru 1:10 i 10 µl uzorka se nanese na PolyScreenN PVDF membrane (NEN Research Products, Boston, MA). Nakon što se naneseni uzorci osuše, membrane se ispiru u vodi i ostave se da se osuše. Otopina primarnih protutijela pripravi se razrijeđivanjem odgovarajućeg protuseruma u blotting puferu (5% nemasnog mlijeka u 6.25 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 150 mM natrij-klorida, 0.02% NaN3). Inkubacija se provodi barem 1 sat na 20-23ºC. Mrlje se ispiru u PBS (6.25 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 150 mM natrij-klorida) tri puta po 1 min. Otopina sekundarnih protutijela se pripravi razrijeđivanjem odgovarajuæeg konjugiranog protuseruma vezanog s alkalnom fosfatazom u blotting puferu. Inkubacija se provodi barem 1 sat u istim uvjetima. Mrlje se ispiru na opisani način i ispituju pomoću 1 stupnja NBT/BCIP supstrata (Pierce, Rockford, IL).

Upotrijebljena su slijedeća protutijela:

L1 HPV6a ispitan je pomoću MAB 837 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). L2 HPV6a ispitan je mišjim protu-HPV6a L2-trpE fuzijskim serumom pool #641 i 647 (vlastite proizvodnje, M. Rosolowski). L1 HPV16 ispitan je pomoću MAB 885 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA). L2 HPV16 ispitan je mišjim protu-HPV16 L2-trpE fuzijskim serumom pool #611 (vlastite proizvodnje, K. Jansen).

Bradford postupak za određivanje ukupnih proteina

Ukupni se proteini određuju Coomassie Plus® opremom (Pierce, Rockford, IL) dostupnom na tržištu. Uzorci se razrijede do odgovarajućih vrijednosti u Milli-Q-H2O. Potrebni volumeni su 0.1 ml za standardni odnosno 1.0 ml za mikro protokol. Za oba protokola upotrijebljen BSA (Pierce, Rockford, IL) u svrhu dobivanja standardnih krivulja. Test je izveden prema preporukama proizvođača. Standardne krivulje izrađene su pomoću CricketGraph® softvera na Macintosh IIci računalu.

SDS-PAGE i Western blot testovi

Svi gelovi, puferi i elektroforetski uređaji dobiveni su od tvrtke Novex (San Diego, CA) i korišteni su prema preporukama proizvođača. Ukratko, uzorci su razrijeđivani do jednakih koncentracija proteina u Milli-Q-H2O i miješanje u omjeru 1:1 s puferom za inkubaciju uzoraka koji sadrži 200 mM DTT. Uzorci su inkubirani 15 min na 100°C i nanošeni na prethodno pripravljene 12%-tne Tris-glicin gelove. Uzorci su podvrgnuti elektroforezi pri 125 V tijekom 1 sat 45 min. Gelovi su razvijani ili bojanjem srebrom varijacijom postupka po Heukeshovenu i Dernicku (Electrophoresis, 6 (1985) 103-112) ili koloidalnim Coomassie bojanjem pomoću opreme dostupne na tržištu (Integrated Separation Systems, Natick, MA). Za Western blot, proteini su prenošeni na PVDF membrane pri 25 V tijekom 40 min. Membrane su sušene i inkubirane s otopinama protutijela kao za imunodot-blot testove.

Primjer 35

Priprava imunogeničnih spojeva

Pročišćene VLP formuliraju se prema poznatim postupcima, kao što su dodavanje primjesa farmaceutski prihvatljivih nosača, stabilizatora ili adjuvansa cjepiva. Imunogenične VLP ovog izuma mogu se pripraviti za korištenje u obliku cjepiva kombiniranjem s fiziološki prihvatljivim spojevima, kao što su PBS, otopine soli ili destilirana voda. Imunogenične VLP primjenjuju se u rasponu doza od oko 0.1 do 100 µM, najbolje oko 1 do 20 µg, u svrhu postizanja željeznog imunološkog učinka. Količina VLP po pripravku mijenja se ovisno o različitim činiteljima koji uključuju, ali nisu ograničeni na kondiciju, težinu, dob i spol pojedinca. VLP pripravci mogu se primijeniti različitim putevima koji uključuju, ali nisu ograničeni na peroralni, supkutani, topički, mukozalni i intramuskularni. Takvi VLP pripravci mogu sadržavati jedan tip VLP (na pr. VLP iz HPV6a) ili mješavinu VLP (na pr. VLP iz HPV6a, HPV11, HPV16 i HPV18).

Također može biti prisutan i prezervativ protumikrobnog djelovanja, na pr. timerozal. Imunogenični antigeni ovog izuma mogu se, ako je potrebno, kombinirati sa stabilizatorima cjepiva i adjuvansima cjepiva. Tipični stabilizatori su specifični spojevi, na pr. polianioni kao što je heparin, inozitol, heksasulfat, sulfatirani betaciklodekstrin, kao i manje specifični ekscipijensi, na pr. aminokiseline, sorbitol, manitol, ksilitol, glicerol, saharoza, dekstroza, trehaloza te promjene uvjeta u otopini, na pr. neutralni pH, visoka ionska jakost (oko 0.5-2.0 M soli), dvovaljani kationi (Ca2+, Mg2+). Primjeri adjuvanata su Al (O3H) i Al4 (PO). Cjepivo ovog izuma pohranjuje se u hladioniku ili u liofiliziranom obliku.

Primjer 36

Priprava protutijela na VLP

Pročišćene VLP koriste se za dobivanje protutijela. Izraz “protutijelo” u značenju u kojem je ovdje upotrijebljeno uključuje i poliklonalna i monoklonalna protutijela, kao i njihove fragmente, na pr. Fv, Fab i F(ab)2 fragmente koji mogu vezati antigen ili hapten. Protutijela se koriste na različite načine, uključujući bez ograničenja pročišćavanje rekombinantnih VLP, pročišćavanje nativnih proteina L1 ili L2 i opreme. Opreme sadrže razdijeljeni nosač koji može držati u bliskom dodiru najmanje jedan spremnik (kontejner). Nadalje, nosač sadrži reagense kao što su protu-VLP protutijela ili VLP pogodne za otkrivanje HPV ili fragmenata HPV ili protutijela na HPV. Nosač može također sadržavati sredstva sa otkrivanje kao što su označeni antigeni ili enzimski supstrati i slično. Protutijela, VLP ili opreme korisni su u različite svrhe, uključujući bez ograničenja forenzička ispitivanja i epidemiološka proučavanja.

Primjer 37

Pročišćavanje rekombinantnih kapsidnih proteina L1 HPV tipa 11

Svi se postupci odvijaju na 4°C ako nije drugačije označeno.

Stanice su pohranjene zamrznute na -70°C. Zamrznute stanice (mokra težina =180 g) se otope na 20-23°C i ponovno suspendiraju u 900 ml “Breaking pufera” (50 mM MOPS, pH 7.2, 500 mM NaCl, 1 mM kalcij-klorida). Dodaju se inhibitori proteaza AEBSF i pepstatin A do konačne koncentracije od 1mM odnosno 1.7 µM. Stanične veze se prekidaju pod tlakom od oko 16000 psi tijekom 4 prolaza u M110-Y mikrofluidizatoru (Microfluidics. Corp., Newton, MA). Doda se dovoljan volumen 10%-tnog Triton X100® detergenta (Pierce, Rockford, IL) da se postigne koncentracija TX100 od 0.5%. Smjesa se miješa tijekom 20 sati. Dobiveni lizat se centrifugira pri 12000 g tijekom 40 min da se ukloni stanični debris. Tekući nadtalog koji sadrži protein L1 se prikuplja.

Tekući se nadtalog dijafiltrira protiv pet volumena od po 20 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 0.5 M NaCl pomoću membranske kazete tangencijalnog protoka od 300K (Filtron, Nortborough, MA). U tvari koja se zadrži na membrani prikaže se radioimunotestom i Western blotingom prisutnost proteina L1. Ostatna tvar se potom nanese afinitetni stupac visoke rezolucije (11.0 cm ID x 5.3 cm) od Spherodex (M)® smole (IBF, Villeneuvela-Garenne, France) uravnotežen u 20 mM natrij-fosfata., pH 7.2, 0.5 M NaCl. Nakon ispiranja puferom za uravnotežavanje i postupnog ispiranja s 20 mM natrij fosfata, pH 7.2, 2.5 M NaCl. Za vrijeme ispiranja prikupljaju se frakcije. Frakcije sa stupca ispituju se na ukupne proteine Bradford postupkom. Frakcije se potom ispituju Western blotingom i SDS-PAGE uz koloidalno Coomassie bojanje. Frakcije se također ispituju radioimunotestom. SP Spherodex frakcije sličnih čistoća i sadržaja proteina L1 se puliraju. Konačni proizvod se ispituje Western blotingom i SDS-PAGE uz koloidalno Coomassie bojanje. Procijenjeno je da je protein L1 ≥90%-tne homogenosti. Prisutnost proteina L1 potvrđuje se Western blotingom. Konačni se proizvod aseptički filtrira kroz membranu od 0.22 µm i pohrani na 4°C. Ovim se postupcima dobije ukupno 100 mg proteina.

Ispitivanje elektronskom mikroskopijom provedeno je pomoću Structure Probe (West Chester, PA). Alikvot uzorka nanese se na bakrenu rešetku s 200 šupljina obloženu ugljikom. Na rešetku se kapne kap 2%-tne fosfovolframove kiseline čiji pH 7.0 i ostavi stajati 20 sekundi. Rešetka se osuši na zraku prije TEM ispitivanja. Za mikroskopiranje je korišten JEOL 100 CX transmisijski elektronski mikroskop (JEOL USA, Inc.) uz napon ubrzavanja od 100 kV. Dobiveni mikrografi bili su povećanja 100000x.

Bradford test za ukupne proteine

Ukupni proteini određeni su Coomassie Plus® opremom dostupnom na tržištu (Pierce, Rockford, IL). Uzorci se razrijede do odgovarajuće razine u Milli-Q-H2O. Potrebni volumeni su 0.1 ml i 1.0 ml za standardni odnosno mikro protokol. Za oba protokola, korišten je BSA (Pierce, Rockford, IL) za dobivanje standardne krivulje. Test je izvođen prema preporukama proizvođača. Standardne su krivulje izrađene pomoću CricketGraph®softvera na Macintosh IIci računala.

SDS-PAGE i Western blot testovi

Svi gelovi, puferi i elektroforetski uređaji dobiveni su od tvrtke Novex (San Diego, CA) i korišteni su prema preporukama proizvođača. Ukratko, uzorci su razrijeđivani do jednakih koncentracija proteina u Milli-Q-H2O i miješani u omjeru 1:1 s puferom za inkubaciju uzoraka koji sadrži 200 mM DTT. Uzorci su inkubirani 15 min na 100°C i nanošeni na prethodno pripravljene 12%-tne Tris-glicin gelove. Uzorci su podvrgnuti elektroforezi pri 125 V tijekom 1 sat 45 min. Gelovi su razvijani koloidalnim Coomassie bojanjem pomoću opreme dostupne na tržištu (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

Za Western blot, proteini su prenošeni na PVDF membrane pri 25 V tijekom 40 min. Membrane su isprane Milli-Q-H2O i osušene na zraku. Kao primarno protutijelo služio je poliklonalni protuserum kunića usmjeren protiv TrpE-HPV11L1 fuzijskog proteina (poklon dr. D. Browna). Otopina protutijela pripravljena je razrijeđivanjem protuseruma u blotting puferu (5% nemasnog mlijeka u 6.25 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 150 mM natrij-klorida, 0.02% NaN3). Inkubacija se prevodi barem 1 sat na 20-30°C. Mrlja se ispire u PBS (6.25 mM natrij-fosfata, pH 7.2 150 mM natrij-klorida) tri puta po 1 min. Otopina sekundarnih protutijela se pripravi razrijeđivanjem kozjeg protu-kunićjeg IgG konjugiranog protuseruma vezanog s alkalnom fosfatazom (Pierce, Rockford, IL) u blotting puferu. Inkubacija se provodi barem 1 sat u istim uvjetima. Mrlje se ispiru na opisani način i ispituju pomoću 1 stupnja NBT/BCIP supstrata (Pierce, Rockford, IL).

Primjer 38

Pročišćavanje rekombinantnih kapsidnih proteina L1 HPV tipa 6a

Svi se postupci odvijaju na 4°C ako nije drugačije označeno.

Stanice su pohranjene zamrznute na -70°C. Zamrznute stanice (mokra težina =60 g) se otope na 45°C i ponovno suspendiraju u 300 ml “Breaking pufera” (50 mM MOPS, pH 7.2, 500 mM NaCl, 1 mM kalcij-klorida). Dodaju se inhibitori proteaza AEBSF i pepstatin A do konačne koncentracije od 1 mM odnosno 1.7 µM. Stanične veze se prekidaju pod tlakom od oko 16000 psi tijekom 5 prolaza u M110-Y mikrofluidizatoru (Microfluidics Corp., Newton, MA). Doda se dovoljan volumen 10%-tnog Triton X100® detergenta (Pierce, Rockford, IL) da se postigne koncentracija TX100 od 0.5%. Smjesa se miješa tijekom 18 sati. Dobiveni lizat se centrifugira pri 12000 g tijekom 40 min da se ukloni stanični debris. Tekući nadtalog koji sadrži protein L1 se prikuplja. Tekući se nadtalog dijafiltrira protiv pet volumena od po 20 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 0.5 M NaCl pomoću membranske kazete tangencijalnog protoka od 300K (Filtron, Northborough, MA). U tvari koja se zadrži na membrani prikaže se radioimunotestom i Western blotingom sadržaj proteina L1 ≥90% izvorne količine.

Ostatna tvar se potom nanese na afinitetni stupac visoke rezolucije (5.0 cm ID x 10 cm) od POROS® 50HS smole (Perspective Biosystems, Cambridge, MA) uravnotežen u 20 mM natrij-fosfata., pH 7.2, 0.5 M NaCl. Nakon ispiranja puferom za uravnotežavanje, protein L1 se ispire linijskim gradijentom od 0.5-1.5 M NaCl u 20 mM natrij-fosfata, pH 7.2. Za vrijeme ispiranja prikupljaju se frakcije. Frakcije sa stupca ispituju se na ukupne proteine Bratford postupkom. Frakcije se potom ispituju Western blotingom i SDS-PAGE uz koloidalno Coomassie bojanje. Frakcije se također ispituju radioimunotestom.

Frakcije sa stupaca koje su sličnih čistoća i sadržaja proteina L1 se puliraju. Pulirane se frakcije aseptički filtriraju kroz membrane od 0.22 μM. Proizvod se koncentrira u 50 ml miješanih stanica korištenjem YM-100 ravnoslojnih membrana od 43 mm (Amicon, Beverly, MA) u atmosferi dušika od 4-6 psi. Dobiveni se proizvod pohrani na 4°C. Ovim se postupkom dobije ukupno 2.7 mg proteina.

Uzorak konačnog proizvoda ponovno se koncentrira TCA precipitacijom i ispituje Western blotingom i SDS-PAGE uz koloidalno Coomassie bojanje. Denzitometrijom koloidalnih Coomassie obojanih gelova pokaže se homogenost proteina L1 ≥90%. Prisutnost proteina L1 se potvrdi Western blotingom.

Ispitivanje elektronskom mikroskopijom provedeno je pomoću Structure Probe (West Chester, PA). Alikvot uzorka nanese se na bakrenu rešetku s 200 šupljina obloženu ugljikom. Na rešetku se kapne kap 2%-tne fosfovolframove kiseline čiji je pH 7.0, i ostavi stajati 20 sekundi. Rešetka se osuši na zraku prije TEM ispitivanja. Za mikroskopiranje je korišten JEOL 100 CX transmisijski elektronski mikroskop (JEOL USA, Inc) uz napon ubrzavanja od 100 kV. Dobiveni mikrografi bili su povećanja 100000x.

Bradford test za ukupne proteine

Ukupni proteini određeni su Coomassie Plus® opremom dostupnom na tržištu (Pierce, Rockford, IL). Uzorci se razrijede do odgovarajuće razine u Milli-Q-H2O. Potrebni volumeni su 0.1 ml i 1.0 ml za standarni odnosno mikro protokol. Za oba protoka, korišten je BSA (Pierce, Rockford, IL) za dobivanje standardne krivulje. Test je izvođen prema preporukama proizvođača. Standardne su krivulje izgrađene pomoću CricketGraph softvera na Macintosh IIci računala.

SDS-PAGE i Western blot testovi

Svi gelovi, puferi i elektroforetski uređaji dobiveni su od tvrtke Novex (San Diego, CA) i korišteni su prema preporukama proizvođača. Ukratko, uzorci su razrijeđivani do jednakih koncentracija proteina Milli-Q-H2O i miješani u omjeru 1:1 s puferom za inkubaciju uzoraka koji sadrži 200 mM DTT. Uzorci su inkubirani 15 min na 100°C i nanošeni na prethodno pripravljene 12%-tne Tris-glicin gelove. Uzorci su podvrgnuti elektroforezi pri 125 V tijekom 1 sat 45 min. Gelovi su razvijani koloidalnim Coomassie bojanjem pomoću opreme dostupne na tržištu (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

Za Western blot, proteini su prenošeni na PVDF membrane pri 25 V tijekom 40 min. Membrane su isprane Milli-Q-H2O i osušene na zraku. Kao primarno protutijelo služio je MAB 87 (Chemicon International, Inc., Temecula, CA) koji je kovalentno vezan s alkalnom fosfatazom (J: Cook, MRL). Otopina protutijela pripravljena je razrijeđivanjem protuseruma u blotting puferu (5% nemasnog mlijeka u 6.25 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 150 mM natrij-klorida, 0.02% NaN3). Inkubacija se provodi barem 1 sat na 20-23°C. Mrlja se ispire u PBS (6.25 mM natrij-fosfata, pH 7.2, 150 mM natrij-klorida) tri puta po 1 min. Mrlje se ispituju pomoću 1 stupnja NBT/BCIP supstrata (Pierce, Rockford, IL).

SEQUENCE LISTING

[image] [image] [image] [image]

Claims (26)

1. Izdvojen i pročišćen kapsidni protein papilomavirusa, naznačen time, što je kapsidni protein izabran između proteina L1, proteina L2, proteina L1 + L2 i njihovih funkcionalnih derivata, gdje je čistoća proteina najmanje 70%.

2. Pročišćeni protein iz Zahtjeva 1, naznačen time, što je papilomavirus izabran iz skupine koja se sastoji od papilomavirusa čovjeka i papilomavirusa cottontail kunića.

3. Pročišćeni protein iz Zahtjeva 2, naznačen time, što je papilomavirus čovjek izabran iz skupine koja se sastoji od HPV6a, HPV6b, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV41, HPV45, i HPV58.

4. Pročišćeni protein iz Zahtjeva 1, naznačen time, što je protein proizveden sintetičkim sustavom koji sadrži rekombinantnog domaćina.

5. Kapside, naznačene time, što sadrže protein iz Zahtjeva 1.

6. Čestice slične virusu, naznačen time, što sadrže protein iz Zahtjeva 1.

7. Postupak za proizvodnju pročišćenog proteina iz Zahtjeva 1, naznačen time, što obuhvaća: a) transformiranje domaćina rekombinantnom molekulom DNA koja kodira protein izabran iz proteina L1 papilomavirusa, proteina L2 papilomavirusa, proteina L1 + L2 papilomavirusa njihovih funkcionalnih derivata; b) kultiviranje transformiranog domaćina u uvjetima koji omogućuju ekspresiju rekombinantne molekule DNA u svrhu proizvodnje sirovog rekombinantnog proteina papilomavirusa; i c) pročišćavanje sirovog rekombinantnog proteina papilomavirusa da bi se dobio pročišćeni protein.

8. Rekombinantni protein papilomavirusa, naznačen time, što je proizveden postupkom iz Zahtjeva 7.

9. Kapside, naznačene time, što sadrže protein iz Zahtjeva 7.

10. Čestice slične virusu, naznačen time, što sadrže protein iz Zahtjeva 7.

11. Cjepivo, naznačeno time, što sadrži protein iz Zahtjeva 1.

12. Farmaceutski pripravci, naznačeni time, što sadrže protein iz Zahtjeva 1.

13. Postupak za liječenje ili sprečavanje infekcija papilomavirusom, naznačen time, što obuhvaća primjenu cjepiva iz Zahtjeva 11 na domaćina.

14. Opremu za otkrivanje papilomavirusa ili protutijela na papilomavirus, naznačenu time, što sadrži reagens izabran iz skupine koja se sastoji od rekombinantne molekule DNA koja kodira protein papilomavirusa, pročišćeni protein papilomavirusa, čestice slične virusu sastavljene od pročišćenog proteina papilomavirusa, protutijela na protein papilomavirusa i protutijela na čestice slične virusu.

15. Postupak za proizvodnju rekombinantnog kapsidnog proteina papilomavirusa ugrađenog u kapsidu, naznačen time, što obuhvaća: a. kloniranje gena papilomavirusa koji kodira najmanje jedan kapsidni protein papilomavirusa u vektor; b. prijenos vektora u stanicu domaćina u svrhu dobivanja rekombinantne stanice domaćina; c. kultiviranje rekombinantne stanice domaćina u uvjetima koji omogućuju proizvodnju kapsidnog proteina papilomavirusa ; i d. pročišćavanje kapsidnog proteina papilomavirusa u uvjetima koji omogućuju stvaranje kapside.

16. Kapside, naznačene time, što su proizvedene postupkom iz Zahtjeva 15.

17. Čestice slične virusu, naznačen time, što sadrže kapside iz Zahtjeva 16.

18. Postupak za pobuđivanje imunosnog odgovora u životinje kralješnjaka, naznačen time, što obuhvaća primjenu kapsida iz Zahtjeva 16 na životinju.

19. Postupak za pobuđivanje imunosnog odgovora u životinje, naznačen time, što obuhvaća primjenu proteina iz Zahtjeva 1 na životinju.

20. Farmaceutski pripravci, naznačeni time, što sadrže čestice slične virusu iz Zahtjeva 6.

21. Farmaceutski pripravci, naznačeni time, što sadrže kapside iz Zahtjeva 5.

22. Sintetički sustav iz Zahtjeva 4, naznačen time, što je sustav izabran iz transformiranih stanica insekata, transformiranih stanica kvasca, transformiranih bakterijskih stanica, transformiranih stanica gljiva, transformiranih biljnih stanica i transformiranih životinjskih stanica.

23. Postupak pročišćavanja čestica sličnih virusu koje sadrže najmanje jedan pročišćeni protein papilomavirusa, naznačen time, što obuhvaća a. obradu otopine koja sadrži najmanje jedan sirovi protein papilomavirusa ionskom izmjenjivačkom kromatografijom u svrhu dobivanja djelomično pročišćenog proteina papilomavirusa; b. izlaganje obrađenog djelomično pročišćenog proteina papilomavirusa precipitaciji amonij-sulfatom; i c. daljnje pročišćavanje proteina kromatografijom koja razdvaja prema veličini.

24. Čestice slične virusu papilomavirusa, naznačen time, što sadrže rekombinantni protein papilomavirusa i koje su najmanje 70%-tne čistoće.

25. Postupak pročišćavanja kapsida koje sadrže najmanje jedan pročišćeni protein papilomavirusa, naznačen time, što obuhvaća: a. obradu otopine koja sadrži najmanje jedan sirovi protein papilomavirusa ionskom izmjenjivaču kromatografijom u svrhu dobivanja djelomično pročišćenog proteina papilomavirusa; b. izlaganje obrađenog djelomično pročišćenog proteina papilomavirusa precipitaciji amonij-sulfatom; i c. daljnje pročišćavanje proteina kromatografijom koja razdvaja prema veličini.

26. Kapside papilomavirusa, čestice slične virusu koje sadrže rekombinantni protein papilomavirusa, naznačene time, što je čistoća kapsida najmanje 70%.