KR20170001720A - 바이러스 유사 입자 정제 - Google Patents
바이러스 유사 입자 정제 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20170001720A KR20170001720A KR1020167036031A KR20167036031A KR20170001720A KR 20170001720 A KR20170001720 A KR 20170001720A KR 1020167036031 A KR1020167036031 A KR 1020167036031A KR 20167036031 A KR20167036031 A KR 20167036031A KR 20170001720 A KR20170001720 A KR 20170001720A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- vlps
- chromatography
- chromatographic
- vlp
- hydroxyapatite
- Prior art date
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims description 25
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 71
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 121
- 241001263478 Norovirus Species 0.000 claims abstract description 50
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 140
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 83
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 68
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 66
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 53
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 53
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 44
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 37
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 29
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 29
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 22
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 19
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 16
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 3
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 claims description 3
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 claims 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 claims 1
- 241001617329 Norovirus isolates Species 0.000 abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 54
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 50
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 50
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 45
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 27
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 26
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 26
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 25
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 24
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 24
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 24
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 24
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 24
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical group [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 24
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 21
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 16
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 16
- 241000056533 Houston virus Species 0.000 description 15
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 15
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 15
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 14
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 14
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 150000001450 anions Chemical group 0.000 description 12
- 150000001768 cations Chemical group 0.000 description 12
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 12
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 11
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 11
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 11
- 241000369757 Sapovirus Species 0.000 description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 8
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 8
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 8
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 8
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 7
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 241000532183 Norovirus GI Species 0.000 description 5
- 241000532184 Norovirus GII Species 0.000 description 5
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 5
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 5
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 5
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 5
- -1 carboxylate salt Chemical class 0.000 description 5
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 5
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011358 absorbing material Substances 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 4
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 4
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEVGGTGPGPKZHF-UHFFFAOYSA-N Epilaurene Natural products CC1C(=C)CCC1(C)C1=CC=C(C)C=C1 HEVGGTGPGPKZHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 3
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 101100282617 Bovine herpesvirus 1.1 (strain Cooper) gC gene Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 2
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001734 carboxylic acid salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 229940116441 divinylbenzene Drugs 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 239000012616 hydrophobic interaction chromatography medium Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150029062 15 gene Chemical class 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710170920 62 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241000256173 Aedes albopictus Species 0.000 description 1
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 1
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 1
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 1
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 1
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 1
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 1
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 1
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000149420 Bothrometopus brevis Species 0.000 description 1
- YCSMVPSDJIOXGN-UHFFFAOYSA-N CCCCCCCCCCCC[Na] Chemical class CCCCCCCCCCCC[Na] YCSMVPSDJIOXGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910014497 Ca10(PO4)6(OH)2 Inorganic materials 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006339 Caliciviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001466947 Desert Shield virus Species 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 206010061166 Gastroenteritis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 1
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 1
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 1
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 1
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000555303 Mamestra brassicae Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 1
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 1
- 241001534230 Nereididae Species 0.000 description 1
- 241000714209 Norwalk virus Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 1
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 241001635203 Sapporo virus-Manchester Species 0.000 description 1
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 1
- 101710146343 Scaffold protein D13 Proteins 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 1
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001467 acupuncture Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 208000012873 acute gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012615 aggregate Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000002801 charged material Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000000551 dentifrice Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 description 1
- 229940021223 hypertonic solution Drugs 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- VMPHSYLJUKZBJJ-UHFFFAOYSA-N lauric acid triglyceride Natural products CCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCC VMPHSYLJUKZBJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000016379 mucosal immune response Effects 0.000 description 1
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- SYUHGPGVQRZVTB-UHFFFAOYSA-N radon atom Chemical compound [Rn] SYUHGPGVQRZVTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001467 sodium calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/02—Recovery or purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/16011—Caliciviridae
- C12N2770/16023—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/16011—Caliciviridae
- C12N2770/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/16011—Caliciviridae
- C12N2770/16051—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 노로바이러스 및 사포바이러스를 포함하는 인간 칼시바이러스를 정제하기 위한 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 생물학적 원료들로부터 바이러스 유사 입자(VLPs)를 추출하고 정제하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 대용량으로 상업용 등급의 VLPs를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 정제된 VLPs를 생산하는 복수의 정제 단계를 사용한다.
인간 칼리시바이러스군, 노로바이러스와 사포바이러스는 급성, 비-박테리아성 위장염의 주요 원인이다. 노로바이러스와 반대로, 사포바이러스는 주로 유아와 어린이를 감염시키는 것으로 알려졌으나, 사포바이러스는 성인 인구에도 많이 발견된다(Johansson et al., 2005, A nosocomial sapovirus-associated outbreak of gastroenteritis in adults. Scand J Infect Dis. 37(3):200-4). 노로바이러스는 비박테리아성 위장염의 유행병 발생의 하나의 가장 중요한 원인으로 출현한 배양할 수 없는 인간 칼리바이러스이다(Hardy, 1999, Clin Lab Med. 19(3):675-90). 노로바이러스의 임상적 중요성은 고감도 분자 진단 측정법이 개발되기 이전에는 과소평가되었다. 원형 유전자군 I 놀워크 바이러스(NV) 게놈의 복제와 재조합 바큘로바이러스 발현 시스템으로부터 바이러스 유사 입자(VLPs)의 생산이 널리 퍼진 노로바이러스 감염을 밝힌 측정법의 개발로 유도하였다(Jiang et al. Norwalk Virus Genome Cloning and Characterization. Science 1990; 250: 1580-1583; Jiang et al. 1992, J. Virol. 66(11):6527-32).
노로바이러스 및 사포바이러스는 비절편화 RNA 게놈을 함유하는 단일 가닥, 양성 센스 RNA 바이러스이다. 바이러스 게놈은 3개의 오픈 리딩 프레임을 암호화하고, 나중 2개는 각각 중요한 캡시드 단백질 및 중요하지 않은 구조 단백질의 생산을 지정한다(Glass et al., The Epidemiology of Enteric Caliciviruses from Human: A Reassessment Using New Diagnostics. J Infect Dis 2000; 181 (Sup 2): S254-S261). 진핵 발현 시스템에서 높은 수준으로 발현될 때, NV의 캡시드 단백질 및 특정 다른 노로바이러스와 사포바이러스는 고유 노로바이러스 비리온을 구조적으로 모방한 VLPs 속으로 자가결합한다. 투과전자현미경으로 관찰할 때, VLPs는 인간 대변 샘플로부터 분리한 감염성 비리온과 형태학적으로 분간할 수 없다.
비록 노로바이러스 및 사포바이러스는, VLPs의 이용가능성과 다량으로 생산되는 이들의 능력 때문에, 인비트로로 배양될 수 없지만, 노로바이러스 캡시드의 항원적 및 구조적 토포그래피를 정의하는데 상당한 진전이 이루어졌다. VLPs는 감염성 유전 물질을 결핍시키는 반면 바이러스 캡시드 단백질의 진짜 형태를 보존시킨다. 결과적으로, VLPs는 바이러스와 세포 수용체의 기능적 상호작용을 모방하여, 감염을 재생하거나 일으키는 능력을 결핍시키는 반면 강한 숙주 면역 반응을 유도한다. NIH와 공동으로, 베일러 의과 대학은 학문적인, 연구자-후원 I 단계 임상 실험에서 인간 지원자들에서 노로바이러스 VLPs에 대한 체액, 점막 및 세로 면역 반응을 연구하였다. 경구 투여된 VLPs는 건강한 성인들에서 안전했고 면역반응을 일으켰다(Ball et al. 1999; Tacket et al. 2003). 다른 연구 센터에서, 동물 모델들에서 임상전 실험은 박테리아성 외독소 보조제와 비강으로 투여될 때 VLPs에 대한 면역 반응의 증가를 나타내었다(Guerrero et al. 2001, Recombinant Norwalk Virus-like Particles Administered Intranasally to Mice Induce Systemic and Mucosal (Fecal and Vaginal) Immune Responses. J Virol 2001; 75: 9713; Nicollier-Jamot et al. 2004, Recombinant Virus-like Particles of a Noroviras (Genogroup II Strain) Administered Intranasally and Orally with Mucosal Adjuvants LT and LT(Rl 92G) in BALB/c Mice Induce Specific Humoral and Cellular Thl/Th2-like Immune Responses. Vaccine 2004; 22: 1079- 1086; Periwal et al. 2003, Enhances Systemic and Mucosal Immune Responses to Recombinant Norwalk Virus- like Particle Vaccine. Vaccine 2003; 21 : 376-385).
노로바이러스 VLPs를 정제하는 소용량 방법은 문헌에 기술되었다. 예를 들어, 초원심분리에 의한 놀워크 바이러스 VLP 정제가 기술되었고(Jiang et al. 1990; 1992) 이 분야의 노로바이러스 연구자들에 의해 통상적으로 사용된다. 그러나, 초원심분리에 의해 정제된 VLPs는 인간 임상 실험에 사용된 반면, 이 방법은 칼시바이러스 VLPs의 상업적 용량을 생산하는데 적절하지 않다. 결과적으로, 다양한 생물학적 원료로부터 VLPs를 정제할 수 있는 정량할 수 있고 효과적인 정제 시스템을 제공할 필요가 존재한다.
본 발명은 상기한 과제를 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
출원인들은 칼시바이러스 VLPs의 효과적인 정제를 위한 적절한 크로마토그래프법을 개발함으로써 칼시바이러스 VLPs에 대한 계량가능한 정제 시스템에 대한 요구를 해결하였다. 본 발명의 방법은 정제된 VLPs의 상업용 생산을 위한 스케일링에 잘 따른다. 따라서, 본 발명은 크로마토그래피 공정을 사용하여 칼시바이러스 유사 입자(VLPs)를 정제하는 방법에 관한 것이다. 크로마토그래피 공정은 하나 이상의 크로마토그래피 물질과 하나 이상의 유동상 조건을 사용할 수 있다. 크로마토그래피 물질과 유동상 조건은 다른 물리적 또는 화학적 특성일 수 있어서, 크로마토그래피 공정을 오쏘거널(orthogonal) 되게 한다.
일부 실시예들에서, 크로마토그래피 물질과 유동상 조건은 VLPs를 보유할 수 있도록 선택된다. 다른 실시예들에서, 크로마토그래피 물질과 유동상 조건은 VLPs를 통과시키도록 선택된다. 또 다른 실시예에서, 크로마토그래피 물질과 유동상 조건은 VLP 제제 속의 오염물들을 보유하도록 선택된다. 또 다른 실시예에서, 크로마토그래피 물질과 유동상 조건은 VLP 제제 속의 오염물들을 통과하도록 선택된다.
일부 실시예에서, 다른 것들 중에서, 본 발명의 크로마토그래피 공정은 둘 이상의 크로마토그래피 단계를 사용하는 다단계 크로마토그래피 공정이다. 본 발명의 다단계 크로마토그래피 공정의 순서는 소정의 품질을 충족하는 VLPs를 생산하기 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 정제 방법은 약 70%, 80%, 90%, 95% 초과 또는 99%초과의 순도로 VLPs를 정제하는데 사용될 수 있다.
한 실시예에서, 다단계 크로마토그래피 공정의 순서는 VLPs의 최종 조성물을 제어하도록 설계된다. 다른 실시예에서, 다단계 크로마토그래피 공정의 순서는 약학적 등급의 의약 물질을 위한 규제 기관들이 허용가능한 수준으로 오염물 수준을 감소시키도록 설계된다. 예를 들어, 숙주 세포 DNA 함량의 오염 수준은 1% 미만으로 감소될 수 있다. 숙주 세포 단백질 함량의 오염 수준은 5% 미만으로 감소될 수 있다. 다단계 크로마토그래피 공정의 순서는 cGMP 규제와 일치하고 인간에서 약학적 검사에 적합한 VLPs를 제조하도록 설계된다.
또한 본 발명은 VLPs를 함유하는 용액을 크로마토그래피 물질과 접촉하는 방법을 포함한다. 이와 관련해서, VLPs를 함유하는 세포 용해물은 크로마토그래피 물질과 접촉될 수 있고 여기서 세포 용해물은 크로마토그래피 물질과 접촉하기 이전에 침전화에 의해 여과 또는 정제된다. 용액 또는 세포 용해물은 수크로스 기울기 없이 원심분리될 수 있다. 한 실시예에서, VLPs를 함유하는 정제된 용액은 크로마토그래피 물질과 접촉된다. 선택적으로, 한 크로마토그래피 단계로부터의 VLP를 함유하는 용액은 다른 크로마토그래피 물질과 접촉된다.
용액을 함유하는 VLP는 재조합 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, VLPs 및 VLP 단백질은 박테리아 세포, 곤충 세포, 효모 세포 또는 포유류 세포에서 생산될 수 있다.
한 실시예에서, 본 발명은 용액 속의 크로마토그래피 수지, 컬럼 속의 크로마토그래피 수지 또는 막 속에 또는 표면 위에 부여된 크로마토그래피 기능성을 포함하는 크로마토그래피 물질을 제공한다. 크로마토그래피 물질은 단백질 또는 핵산의 정제를 위해 설계될 수 있다. 크로마토그래피 물질은 이온 교환, 친화성, 소수성 상호작용, 혼합 모드, 역상, 크기 배제 및 흡수 물질을 더 포함할 수 있다. 흡수 물질은 수지 또는 막일 수 있다.
한 실시예에서, 크로마토그래피 물질은 인산칼슘계 물질을 포함한다. 인산칼슘계 물질은 수산화인회석일 수 있다.
다른 실시예에서, 크로마토그래피 물질은 이온 교환체를 포함한다. 이온 교환제는 양이온 교환체이며 양이온 교환체는 황산염, 인산염 및 카복실산염 유도 크로마토그래피 물질을 포함한다. 다른 실시예에서, 이온 교환체는 음이온 교환체이고, 이온 교환체는 양으로 대전된 크로마토그래피 물질을 포함한다. 양으로 대전된 크로마토그래피 물질은 4차 아민(Q) 또는 다이에틸아미노에테인(DEAE)일 수 있다.
또 다른 실시예에서, 크로마토그래피 물질은 소수성 상호작용 물질을 포함한다. 소수성 상호작용 물질은 메틸, 에틸, t-뷰틸 및 페닐로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 한 실시예에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질은 메틸 HIC 수지이다.
또 다른 실시예에서, 크로마토그래피 물질은 역상 물질을 포함한다. 역상 물질은 C2, C4, C8 또는 C18 기능성을 포함한다. 다른 실시예에서, 크로마토그래피 물질은 친화성 크로마토그래피 물질을 포함한다. 친화성 크로마토그래피 물질은 항체, 염료 수지 및 금속을 포함한다. 염료 수지는 시바크롬 블루 또는 폴리믹신일 수 있다.
한 실시예에서, 크로마토그래피 물질은 크기 배제 물질을 포함하며 크기 배제 물질은 수지 또는 막이다. 수지 또는 막은 동일하거나 다른 크기의 구멍들을 포함한다.
본 발명은 또한 VLPs를 정제하는 방법을 제공하며 VLP-함유 용액은 VLPs를 보유하도록 조절되어, 오염 물질들은 크로마토그래피 물질을 통과한다. 일부 실시예에서, VLP-함유 용액의 pH는 버퍼에 의해 더욱 산성 값(예를 들어, 7 미만)으로 조절될 수 있다. 다른 실시예에서, VLP-함유 용액의 pH는 더욱 염기성 값(예를 들어, 7 초과)으로 조절될 수 있다. 버퍼는 인산염, 카복실산염, 황산염, 아세트산염, 시트르산염, 트리스 또는 비스 트리스를 포함할 수 있다. 버퍼 농도는 약 10 내지 1000mM의 범위일 수 있다.
한 실시예에서, VLP를 함유하는 용액의 이온 강도는 조절된다. 이온 강도는 황산암모늄과 같은 호프메이스터 시리즈(Hofmeister series)로부터 음이온과 양이온에 의해 조절될 수 있다. 황산암모늄 농도는 약 100밀리 몰 또는 약 1, 2 또는 2.4 몰보다 클 수 있다.
다른 실시예에서, 이온 강도는 인산염의 첨가에 의해 조절된다. 일부 실시예에서, 인산염은 인산나트륨이다. 인산나트륨 농도는 약 10 내지 500mM의 범위일 수 있다. 한 실시예에서, 인산나트륨 농도는 약 100mM이다.
본 발명의 한 실시예에서, 크로마토그래피 물질의 pH는 VLPs를 보유하도록 버퍼에 의한 평형화에 의해 VLP 사용 이전에 조절된다. pH는 산성 값(예를 들어, 7 미만), 염기성 값(예를 들어, 7 초과) 또는 중성 값(예를 들어, 7)으로 조절될 수 있다. 평형 버퍼는 인산염, 카복실산염, 황산염, 아세트산염, 시트르산염, 트리스 또는 비스 트리스를 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 크로마토그래피 물질의 이온 강도는 VLPs를 보유하도록 조절된다. 조절은 염의 첨가에 의해 이루어질 수 있다. 염은 황산암모늄과 같은 호프메이스트 시리즈로부터의 양이온 및 음이온을 포함한다. 황산암모늄의 농도는 약 1, 2 또는 2.4 몰보다 클 수 있다.
다른 실시예에서, 크로마토그래피 물질의 이온 강도는 인산염의 첨가에 의해 조절된다. 일부 실시예에서, 인산염은 인산나트륨일 수 있다. 인산나트륨 농도는 약 10 내지 500mM의 범위일 수 있다. 한 실시예에서, 인산나트륨 농도는 약 100mM이다.
또 다른 실시예에서, VLP를 함유하는 용액의 유기 용매 농도는 VLPs를 보유하도록 조절된다.
본 발명은 VLP 함유 용액과 오염 물질을 보유하는 크로마토그래피 물질을 선택함으로써 VLPs가 크로마토그래피 수지를 통과하는 VLPs의 정제 방법을 추가로 제공한다. 이렇게 함으로써, VLP 함유 용액의 pH는 버퍼로 조절될 수 있는데, 예를 들어, pH는 7 미만 또는 7 초과 또는 7로 조절된다. 인산염, 카복실산염, 황산염, 아세트산염, 시트르산염, 트리스 또는 비스 트리스를 포함할 수 있다. 한 실시예에서, 버퍼 농도는 약 10 내지 1000mM의 범위이다.
한 실시예에서, VLP를 함유하는 용액의 이온 강도는 오염 물질을 보유하도록 조절되어 VLPs는 크로마토그래피 물질을 통과한다. 이것은 염의 첨가에 의해 이루어질 수 있으며 염은 인산나트륨과 같은 호프메이스터 시리즈로부터의 양이온 및 음이온을 포함할 수 있다. 인산나트륨 농도는 약 10 내지 500mM의 범위일 수 있다. 한 실시예에서, 인산나트륨 농도는 약 100mM이다.
다른 실시예에서, 크로마토그래피 물질의 pH는 오염 물질을 보유하도록 버퍼에 의한 평형화에 의해 VLP 사용 이전에 조절되며 VLPs는 크로마토그래피 수지를 통과한다. pH는 인산염, 카복실산염 또는 황산염을 포함할 수 있는 버퍼로 7 미만 또는 7 초과 또는 7로 조절될 수 있다.
다른 실시예에서, 크로마토그래피 물질의 이온 강도는 오염 물질을 보유하도록 버퍼에 의한 평형화에 의해 VLP 사용 이전에 조절되며 VLPs는 크로마토그래피 수지를 통과한다. 이온 강도는 염의 첨가에 의해 이루어질 수 있다. 염은 인산나트륨과 같은 호프메이스터 시리즈로부터의 양이온 및 음이온을 포함할 수 있다. 한 실시예에서, 인산나트륨 농도는 약 10mM 보다 크다.
또 다른 실시예에서, VLPs의 결합과 용출은 유동상에 존재하는 유기 용매의 양에 의해 제어된다. VLP 함유 용액의 유기 용매 농도는 오염 물질을 보유하도록 조절될 수 있다. 유기 용매는 메탄올, 에탄올 또는 프로판올과 같은 알콜 또는 아세토나이트릴과 같은 다른 수용성 유기 용매일 수 있다.
본 발명은 노로바이러스 및 사포바이러스 VLPs와 같은 칼시바이러스 바이러스-유사 입자(VLPs)로부터 VLPs를 정제하는 방법을 추가로 제공한다. 노로바이러스는 유전자군 I, 유전자군 II, 유전자군 III 및 유전자군 IV 노로바이러스를 포함한다. 사포바이러스는 5개 유전자군(I-V)을 포함하며, 이들 중 단지 유전자군 I, II, IV 및 V만 인간을 감염시키는 것으로 알려져 있다(Farkas et al. 2004, Genetic diversity among sapoviruses. Arch Virol. 2004;149:1309-23).
본 발명은 다단계 크로마토그래피 공정에 의해 제조된 약학적 물질을 추가로 제공한다. 약학적 물질은 노로바이러스 백신과 같은 백신일 수 있다.
*본 발명은 본 명세서에 개시된 다단계 크로마토그래피 공정에 의해 제조된 약학적 물질을 추가로 제공한다. 분석 시약은 원하는 정제 수준까지 정제될 수 있어서, 진단 방법 또는 키트에서 사용될 수 있다.
본 발명의 이런 및 다른 실시예들은 아래 제공된 본 발명을 완전히 이해하면 명백해질 것이다.
개관
이 특허 전체에서 인용된 모든 공개공보와 특허출원은 각 공개공보 또는 특허/특허 출원이 전문이 참조로 포함되는 것을 구체적이고 개별적으로 나타내는 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다.
본 발명의 변형과 변화는 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명에서 개시된 구체적 실시예들은 단지 예로 제공되며 본 발명은 이에 제한되는 것으로 해석되지 않는다.
본 발명은 노로바이러스 VLPs 및 사포바이러스 VLPs를 포함하는 칼시바이러스 유사 입자(VLPs)의 정제 방법에 관한 것이다. "노로바이러스", "노로바이러스(NOR)", "노로바이러스"는 칼시바이러스과의 노로바이러스속의 일원을 의미한다. 일부 실시예에서, 노로바이러스는 인간 또는 비인간 포유류 종들에 감염될 수 있는 관련, 포지티브-센스 단일 가닥 RNA, 외피비보유 바이러스의 그룹을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 노로바이러스는 인간에서 급성 위장염을 일으킬 수 있다. 또한 노로바이러스는 전자현미경으로 볼 때 정교한 표면 구조 또는 울퉁불퉁한 모서리를 가진 작은 원형 구조 바이러스(SRSVs)로 불릴 수 있다. 핵산과 15개 유전자 클러스터를 포함하는 아미노산 서열로 정의된 적어도 4개 유전자군(GI-IV)이 노로바이러스에 포함된다. 주요 유전자군은 GI 및 GII이다. GIII 및 GIV가 제안되었으나 일반적으로 받아들여진다. GIII의 대표적인 것은 소, 예나 균주이다. GIV는 바이러스, 알파트론을 함유한다. 노로바이러스의 추가 설명은 Vinje et al. J. Clin. Micro. 41 : 1423-1433 (2003)를 참조. "노로바이러스"는 재조합 노로바이러스 유사 바이러스(rNOR VLPs)를 의미한다. 일부 실시예에서, 예를 들어, Sf9 세포들의 바큘로바이러스 벡터로부터 얻은, 세포들의 ORF2에 의해 암호화된 적어도 노로바이러스 캡시드 단백질의 재조합 발현은 VLPs 속으로 캡시드 단백질의 연속적 자기 결합을 일으킬 수 있다. 일부 실시예에서, 예를 들어, Sf9 세포들의 바큘로바이러스 벡터로부터 얻은, 세포들의 ORF2 및 ORF3에 의해 암호화된 적어도 노로바이러스 캡시드 단백질의 재조합 발현은 VLPs 속으로 캡시드 단백질의 연속적 자기 결합을 일으킬 수 있다. VLPs는 노로바이러스와 구조적으로 유사하나 바이러스 RNA 게놈이 부족하고 따라서 감염성이지 않다. 따라서, "노로바이러스"는 결함 및 결함-방해 입자를 포함하는 감염성 또는 비감염성 입자들일 수 있는 비리온을 포함한다.
노로바이러스의 비제한적인 예들은 놀워크 바이러스(NV, GenBank M87661, NP056821), 사우스앰톤 바이러스(SHV, GenBank L07418), 사막방패바이러스(DSV, U04469), 헤세 바이러스(HSV), 치바 바이러스(CHV, GenBank AB042808), 하와이 바이이러스(HV, GenBank U07611), 설산 바이러스(SMV, GenBank U70059), 토론토 바이러스(TV, Leite et al, Arch. Virol. 141 :865-875), 브리스톨 바이러스(BV), 제나 바이러스(JV, AJ01099), 메릴랜드 바이러스(MV, AY032605), 세토 바이러스(SV, GenBank AB031013), 켑버웰 바이러스(CV, AF145896), 로드스달 바이러스(LV, GenBank X86557), 그림스비 바이러스(GrV, AJ004864), 멕시코 바이러스(MXV, GenBank U22498), 박서(AF538679), C59(AF435807), VA115(AY038598), BUDS (AY660568), 휴스턴 바이러스(HoV), MOH(AF397156), 패리스 아일랜드(PiV; AY652979), VA387(AY038600), VA207(AY038599), 및 오퍼레이션 이라키 프리덤(OIF, AY675554)을 포함한다. 사포바이러스의 비제한적인 예들은 비제한적인 예들은 사포로바이러스(SV), 휴스톤/86[U95643](Hu/SLV/Hou/1986/US), 휴스톤/90[u95644](Hu/SLV/Hou 27/1990/US), 런던 29845[U95645](Hu/SLV/Lon 29845/1992/UK), 맨체스터 바이러스[X86560](Hu/SLV/Man/1993/UL), 파크빌레 바이러스[U73124](Hu/SLV/Park/1994/US), 사포로 바이러스[U65427](Hu/SLV/SV/1982/JP)를 포함한다. 칼시바이러스의 추가 바이러스 균주는 연속적으로 동정되고 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 고려된다(ICTVdB - The Universal Virus Database, version 4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/). 핵산과 각각의 상응하는 아미노산 서열은 전문이 참조로 포함된다. 일부 실시예에서, 암호문은 동정을 위해서 사용될 수 있고 준비되었다: 숙주 종들로부터 바이러스가 속 약어/종 약어/균주 이름/발생연도/발생국가로 분리되었다(Green et ah, Human Caliciviruses, in Fields Virology Vol. 1 841-874 (Knipe and Howley, editors-in-chief, 4th ed., Lippincott Williams & Wilkins 2001)). 놀워크 바이러스 VLPs 및 휴스톤 바이러스 VLPs를 정제하는 대표적인 예는 본 발명에서 논의된다.
"VLP 제제"는 VLPs 및 정제되어야 하는 다른 물질들을 함유하는 임의의 용액이다. VLP 제제는 배치, 살포 또는 세포 공장 방법 중 임의의 하나를 포함하는 인비트로로 숙주 세포에서의 배양 또는 적절한 동물 숙주에서 인비보 배양을 포함하는 여러 방법에 의해 생산될 수 있다. 전자의 경우에, 바이러스 감염 세포들은 채취되고, 성장 매질로부터 분리될 수 있고, VLP 단백질은 출아 공정(budding process)을 통해 매질 속에 배출될 수 있거나 세포들의 용해 및 세포 조각으로부터의 분리에 의해 유리되었다. 후자의 경우에, 바이러스가 살고 있는 조직 또는 기관은 제거될 수 있고 VLP 단백질은 조직 또는 기관을 포함하는 세포들의 용해에 의해 유리되고 세포/조직 조각으로부터 분리된다.
본 발명에 사용된 대로, "바이러스 유사 입자(들) 또는 VLPs"는 칼시바이러스의 캡시드 단백질 암호화 서열로부터 생산되고 감염성 칼시바이러스 입자들의 항원 특성들과 유사한 항원 특성(들)을 포함하는 바이러스 유사 입자(들), 이의 단편(들) 또는 부분(들)을 의미한다. VLPs는 임의의 구조 단백질일 수 있고 구조 단백질은 하나 이상의 핵산 서열에 의해 암호화된다. VLPs는 재조합 구조 단백질, 즉, 자가-결합 또는 손상되지 않은 VLPs 또는 응집된 VLPs의 정제에 의해 자발적으로 형성된 개개의 구조 단백질, 즉, 단백질 모노머 또는 다이머 또는 단백질 착물을 포함할 수 있다. VLPs는 VLPs의 캡시드 모노머, 단백질 또는 펩타이드 단편 또는 이의 캡시드 모노머 또는 응집체 또는 혼합물의 형태일 수 있다. 이들은 구조 단백질 단편 또는 이의 돌연변이 형태, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산의 첨가, 치환 또는 결실에 의해 변형된 구조 단백질을 사용하여 생산될 수 있다. VLPs는 진짜 비리온과 형태학적으로 항원적으로 유사하다. VLPs는 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 포유류, 효모, 박테리아 및 곤충 숙주 세포에서 인비보로 생산될 수 있다.
본 발명은 생산된 재조합 VLPs의 대용량 정제 방법을 제공한다. 이 방법은 숙주 세포주로부터의 용액, 세포 용해물 또는 배양 상청액을 제조하고 용해물 또는 배양 상청액을 크로마토그래피 물질 또는 매질의 여러 조합 위로 통과시키는 단계를 포함한다. 숙주 세포주는 페트리 접시, 롤러 병, 생체반응기에서 또는 대용량 세포 배양에 적합한 다른 기술을 사용하여 배양될 수 있다.
당업자는 다른 바이러스 유사 입자는 정제될 VLP에 적합한 약간의 이의 특징을 채택함으로써 본 발명의 공정을 사용하여 정제될 수 있다. 적절한 VLPs는 정제 공정에서 다단계 크로마토그래피 단계, 수산화인회석과 같은 크로마토그래피 물질, 소수성 상호작용, 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피 물질을 사용하여 쉽게 정제될 수 있는 것들이다.
"박테리아 세포"는 배양액에서 번식될 수 있는 원핵세포를 포함하는 것으로 정의된다. 박테리아 세포는 이형 단백질의 재조합 발현을 위한 숙주 세포로서 작용할 수 있다. 박테리아 세포는 벡터 속에 삽입된 단백질 서열의 발현을 위해 벡터로 변형(transform), 이입(transfect) 또는 감염(infect)될 수 있다. 적절한 박테리아 세포들의 예는 E. coli, B. megaterium, B. subtilis 및 B. brevis 및 카울로 바이러스, 스타필로코코스 및 스트렙토마이스의 다양한 종을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"효모 세포"는 출아 또는 직접 분열(분체)을 통해 또는 단순 불규칙 필라멘트(균사체)로서 성장에 의해 성장과 재생할 수 있는 작은, 단세포 유기체로 이루어진 그룹을 포함하는 것으로 정의된다. 효모 세포는 이형 벡터 속에 삽입된 핵산 서열의 발현을 위해 이형 벡터로 변형 또는 이입될 수 있다. 효모 세포의 예는 이형 단백질의 이입과 발현을 위해 통상적으로 사용되는 효모균(Saccharomyces cerevisiae)을 포함한다.
"포유류 세포 배양액"은 세포 배양 배지에서 엑스 비보로 생존할 수 있는 포유류 원료로부터 유도된 세포들의 그룹을 포함하는 것으로 정의된다. 포유류 세포는 포유류 세포 원료로부터 직접 유도된 초대 세포일 수 있다. 보다 통상적으로, 포유류 세포 배양액에서 포유류 세포는 불멸화될 것인데, 즉, 확정되지 않은 수의 배양 또는 분할을 통해 성장 및 분할할 수 있다.
"곤충 세포"는 곤충 숙주로부터 엑스 비보로 생존할 수 있는 곤충 원료로부터 유도된 세포들의 그룹을 포함하는 것으로 정의된다. 곤충 세포는 이형 벡터 속에 삽입된 단백질 서열의 발현을 위해 이형 벡터로 변형, 이입 또는 감염될 수 있다. 곤충 세포들의 예는 하이 파이브TM 세포, 흰줄숲모기(Aedes albopictus) 세포, 노랑초파리(Drosophila melanogaster) 세포, Sf9 곤충 세포 및 도둑나방 (Mamestra brassicae) 세포를 포함한다.
"세포 용해"는 화학적 또는 물리적 수단 또는 바이러스 수명 사이클의 일부로서 바이러스 감염된 세포들의 개방시켜 VLPsf를 수집하는 공정을 의미한다.
"다공성 크로마토그래피 물질"은 크기, 소수성 및 전하를 주로 기초로 한 분자들의 분리에 통상적으로 사용된 물질의 실제로 임의의 형태의 물질을 의미한다.본 발명에서 예시한 대로, "다공성 크로마토그래피 물질"은 덱스트란(예를 들어, SephadexTM 수지) 또는 다양하게 표면 유도화(예를 들어, 친수성, 이온성, 소수성 등)된 아가로스, 폴리스티렌 다이바이닐-벤젠, 폴리메타아크릴레이트, 실리카, 지방족 아크릴 폴리머(예를 들어, AmberliteTM 수지)를 포함하는 다양한 물질들로 구성될 수 있는 다른 다공성 물질을 포함한다.
본 발명에서 사용된 대로, "침전화"는 염의 첨가 또는 제거, 유기 용매의 첨가, 단백질 함유 용액의 농축 또는 분자들(VLPs 또는 오염원)의 선택적 침전화를 일으키는 pH의 조절을 통한 용액 상태의 조절을 의미한다. 불용성 또는 침전 물질은 원심분리 또는 여과와 같은 여러 기술을 사용하여 가용성 물질로부터 분리된다.
"수산화인회석 크로마토그래피"는 기질과 리간드를 모두를 형성하는 불용성 수산화 인산칼슘 Ca10(PO4)6(OH)2를 사용하는 단백질 정제 방법을 의미한다. 작용기들은 양전하 칼슘 이온(C-부위)의 쌍 및 음전하 인산기(P-부위)의 집단으로 이루어진다. 수산화인회석과 단백질의 상호작용은 복잡하고 여러 형태이다. 그러나, 상호작용의 한 방법에서, 단백질들 상의 양전하 아미노기들은 음전하 P-부위와 결합하고 단백질 카복실기는 배위 착물화에 의해 C-부위와 상호작용한다. 쉐퍼드, 제이. Chromatography 891 :93-98 (2000). 결정 수산화인회석은 크로마토그래피에서 사용된 첫 번째 형태의 수산화인회석이나, 구조적 어려움들 때문에 제한되었다. 세라믹 수산화인회석(cHA) 크로마토그래피는 제한된 유속과 같은 결정 수산화인회석과 관련된 어려움들 중 일부를 극복하기 위해 개발되었다. 세라믹 수산화인회석은 높은 내구성, 우수한 단백질 결합 능력을 가지며 결정 수산화인회석보다 더 높은 유속과 압력에서 사용될 수 있다. 볼라 등, Bio Techniques 14:650-655(1993).
"크기 배제 크로마토그래피"는 다공성 크로마토그래피 물질을 사용하여 분자들을 분리하는 방법을 의미한다. 크기 배제 크로마토그래피는 단일 단계에서 사용된 하나 이상의 독특한 형태의 다공성 크로마토그래피 물질 또는 다중 분리 단계에서 사용된 하나 이상의 독특한 형태의 다공성 크로마토그래피 물질로 구성될 수 있다. 본 발명에서 사용된 대로, 하나 이상의 다공성 크로마토그래피 물질이 사용되는 "크기 배제 크로마토그래피"의 한 예는 암베르라이트TM XAD7HP 및 세파덱스TM G-50이다.
"친화성 물질"은 기질 또는 리간드에 결합된 고체상태 물질이고, 관심 단백질 또는 친화성 태그에 부착된 단백질에 선택적으로 결합한다. 결합하자마자, 관심 단백질은 컬럼 또는 다른 정제 장치 내에 유지되며, 따라서 VLP 제제에 존재하는 임의의 불순물들로부터 분리될 수 있다. 친화성 매트릭스를 세척한 후, 관심 단백질은 컬럼 또는 다른 장치로부터 실질적으로 정제된 형태로 용출될 수 있다. 친화성 매트릭스의 예들은 아가로스, 셀룰로스, 세파로스, 세파덱스와 같은 크로마토그래피 매질 및 다른 크로마토그래피 매질, 폴리스티렌 비드, 자성 비드, 필터, 막 및 다른 선택한 친화성 태그에 결합하는 리간드 또는 기질에 결합된 고체상 물질들을 포함한다.
본 발명에서 사용된 대로, 단백질을 "정제한다"는 외래 또는 불쾌한 요소들, 특히 단백질 또는 단백질의 한 샘플에 존재할 수 있는 DNA와 같은 생물학적 거대분자의 양을 소정의 수준의 순도로 감소시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 VLPs를 약 70%, 80%, 90%, 95% 초과 또는 99% 초과 순도로 정제하는데 사용될 수 있다. 외래 단백질들의 존재는 겔 전기영동 및 염색 또는 웨스턴 블롯 분석, HPLC 및/또는 ELISA 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 방법에 의해 분석될 수 있다. DNA의 존재는 겔 전기영동 및 염색, DNA 결합 단백질 및/또는 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하는 분석을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 분석될 수 있다.
본 발명에서 사용된 대로, "크로마토그래피 물질", "크로마토그래피 매질", "크로마토그래피 매트릭스" 및 "크로마토그래피 수지" 및 이들의 유사한 표현은 명세서 전체에서 상호교환해서 사용된다.
정제 절차의 설명
본 발명은 생물학적 원료 물질들로부터 바이러스 유사 입자(VLP)의 정제에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 재조합 VLP 무결성 또는 이의 후속 사용에 해로울 수 있는 불순물들과 오염물들을 제거하기 위한 수단으로서 크로마토그래피 방법의 사용에 관한 것이다.
개시된 본 발명은 생물학적 원료로부터 VLPs를 정제하기 위해서 단일 또는 복수의 크로마토그래피 단계(들)를 사용하는 것을 고려한다. 다양한 순서와 조합으로 사용된 다른 크로마토그래피 물질들이 본 발명에 의해 고려된다. 크로마토그래피 단계(들)는 하나 이상의 크로마토그래피 물질 및 하나 이상의 유동상 조건들을 사용할 수 있다. 크로마토그래피 물질들과 유동상 조건들은 다른 물리적 또는 화학적 특성일 수 있어서 오쏘거널이다.
크로마토그래피 물질들은 이온-교환, 친화성, 소수성 상호작용, 혼합 모드, 역상, 크기 배제 및 흡수 물질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 또한 아가로스, 셀룰로스, 실리카 및 폴리(스티렌-다이바이닐벤젠)(PSDVB)을 포함하는 많은 지지 매질을 고려한다. 또한, 통상적인 크로마토그래피, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피 또는 고압 액체 크로마토그래피) 또는 관류 크로마토그래피를 포함하는 여러 크로마토그래피 방법이 사용될 수 있다. 당업자는 컬럼의 크기(즉, 지름과 길이)는 적재될 물질의 부피, 정제될 VLPs의 농도 및 원하는 해상도 또는 순도와 같은 여러 인자에 의존할 것이라는 알 것이다.
세포
용해물
제제
본 발명의 실시는 당업계의 실시자의 기술 내에 있는 분자 생물학, 단백질 분석 및 미생물학의 기술을 사용한다. 이런 기술들은 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et ciL, eds., John Wiley & Sons, New York, 1995에 상세하게 설명된다.
VLPs는 세포주, 조직 등을 포함하는 여러 생물학적 원료로부터 제조된 세포 용해물로부터 정제될 수 있다. 종종 VLPs는 바이러스 감염 세포들로부터 제조된 세포 용해물 제제로부터 정제될 것이고, 세포들은 세포 배양법을 사용하여 성장되었다. VLP 함유 세포 용해물은 재조합 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, VLPs 및 VLP 단백질은 박테리아 세포, 곤충 세포, 효모 세포 또는 포유류 세포에 생산될 수 있다. 예를 들어, 노로바이러스 VLPs는 바큘로바이러스-감염 Sf9 세포 등으로부터 분리될 수 있다. 세포들은 효율을 최적화하기 위해서 높은 다양성의 감염으로 감염될 수 있다.
감염된 세포들로부터 VLP 단백질을 배출하는데 적합한 임의의 방법은 세포 용해물 함유 VLP를 제조하기 위해 사용될 수 있다. VLP 단백질은 발아 공정을 통해 성장 매질 속으로 배출될 수 있다. VLPs는 매질 및 세포 조각으로부터 분리를 통해 회수될 수 있거나 당업계에 공지된 기술들을 사용하여 감염된 세포들로부터 배출될 수 있다. 바이러스 감염 세포들을 용해하는 방법은 저장성 용액, 고장성 용액, 초음파 처리, 압력 또는 분해제를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시예에서, 기술은 분해제를 사용하는 것이다. 다른 실시예에서, 샘플에서 DNA와 RNA의 양에 따라, 기술은 분해제와 조합해서 핵산 가수분해효소를 사용하는 것이다.
비-이온성 또는 이온성 분해제를 포함하는 여러 분해제가 세포들을 용해하기 위해 사용된다. 효소 물질은 통상의 당업자에게 공지된 것과 같이 하나 이상의 효소, 바람직하게는 RNAse 및/또는 DNAse 또는 엔도뉴클레아제의 혼합물로 이루어진 세포 용해물을 처리하는데 사용될 수 있다. 핵산들은 세포 또는 바이러스 응집을 일으킴으로써 본 발명의 크로마토그래피 정제법을 방해할 수 있는 세포 물질에 부착될 수 있어서, 약간의 VLPs가 회수되게 한다는 것은 주지되어 있다.
정제
정제 단계 이전에, 분해제 또는 바람직하게는 분해제와 핵산 가수분해효소에 의한 처리 후 세포 용해물 제제는 다량의 미립자 물질을 제거하도록 처리될 수 있다. 이것은 저속 원심분리 또는 여과를 포함하는 여러 절차에 의해 완성될 수 있다. 사용된 필터 또는 막의 형태(즉, 조성물 및 구멍 크기)는 특정 VLPs를 정제하기 위해 당업계의 숙련된 실시자의 지식 내에 있다.
본 발명의 한 실시예는 침전화에 의한 정제를 포함한다. 원하는 VLP 단백질은, PEG, 황산나트륨, 황산암모늄, 글리신 또는 온도를 포함하나 이에 제한되지 않는 단백질 침전화제의 사용과 같은 당업계에 주지된 침전화 기술을 사용하여 세포 용해물 또는 배양 상청액으로부터 회수될 수 있다. 침전화는 화학 물질의 조심스럽게 선택된 농도로 수행되는 것이 바람직한데 이는 이것이 오염 단백질들의 공동 침전화를 감소시키기 때문이다. 침전된 단백질들은 여과 또는 원심분리에 의해 가용성 물질들로부터 분리된다. 본 발명의 한 실시예에서, VLPs는 탈이온수의 첨가를 통해 용액의 이온 강도를 감소시킴으로써 침전된다. 다른 실시예에서, VLPs는 황산암모늄의 첨가에 의해 침전된다. 침전된 VLPs는 저속 원심분리를 사용하여 수집되고 버퍼에서 재현탁된다.
본 발명의 다른 실시예는 다공성 크로마토그래피 물질을 사용하는 정제를 포함할 수 있다. 존재하는 세포 덩어리의 양에 따라 특정 세포 용해물로부터 VLP를 정제하는데, 크기 배제 크로마토그래피를 수행하기 위해 단일 다공성 크로마토그래피 물질을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이런 예들에서 선-정제(즉, 여과)단계를 사용하고, 뒤이어 바람직하게는 덱스트란, 더욱 바람직하게는 특정 세파덱스TM 수지로 제조한 단일 다공성 크로마토그래피 물질을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 것이 충분할 것이다. 일반적으로, 당업계에 주지된 수단에 의해 얻은 세포 용해물 또는 세포 배양 상청액은 정제되기 쉽다.
한 실시예에서, 본 발명은 용액 속의 크로마토그래피 수지, 컬럼 속의 크로마토그래피 수지 또는 막 속에 또는 표면 위에 부여된 크로마토그래피 기능성을 포함하는 크로마토그래피 물질을 제공한다. "막"은 주로 크기를 기초로 한 분자의 분리에 통상적으로 사용되는 거의 임의의 형태의 물질을 의미한다. 예로서, "막"은 필터 또는 분자 분리를 위해 사용될 수 있는 다른 다공성 물질을 포함한다.
크로마토그래피 물질은 단백질 또는 핵산의 정제를 위해 설계될 수 있다. 크로마토그래피 물질은 이온 교환, 친화성, 소수성 상호작용, 혼합 모드, 역상, 크기 배제 및 흡수 물질을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 예시적 크로마토그래피 물질은 이하에서 상세하게 기술된다. 크로마토그래피 물질은 단지 설명을 위해서 제공되며 본 발명은 이런 크로마토그래피 물질 또는 단계에 제한되는 것으로 해석해서는 안 되며 일반적으로 단백질 또는 핵산 정제 및 특히 VLP 정제를 위해 사용될 수 있는 임의의 및 모든 크로마토그래피 물질 또는 단계를 포함하는 것으로 해석해야된다.
아래 논의된 크로마토그래피 방법은 단일 단계 또는 연속적으로 또는 동시에 수행될 수 있다. "동시에(in tandem)"는 한 크로마토그래피로부터의 용출액이 중간 용출액 수집 단계 없이 다음 크로마토그래피로 직접 사용되는 것을 의미한다. 선택적으로, 용출액의 일부는 합쳐질 수 있고 다음 크로마토그래피에 사용되기 이전에 수집될 수 있다.
*수산화인회석 크로마토그래피 물질
일부 실시예들에서, 크로마토그래피 물질은 인산칼슘계 물질을 포함한다. 인산칼슘계 물질은 수산화인회석일 수 있다. 다양한 수산화인회석 크로마토그래피 물질 또는 수지는 구입할 수 있고 임의의 구입할 수 있는 형태의 물질은 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시예에서, 수산화인회석은 결정 형태이다. 본 발명에서 사용하기 위한 수산화인회석은 입자들을 형성하기 위해 응집되고 안정한 다공성 세라믹 덩어리 속으로 고온에서 소결된 것들일 수 있다.
수산화인회석의 입자 크기는 매우 다양할 수 있으나, 통상적인 입자 크기는 지름이 1㎛ 내지 1,000㎛ 및 10㎛ 내지 100㎛일 수 있다. 본 발명의 한 실시예에서, 입자 크기는 20㎛이다. 본 발명의 다른 실시예에서, 입자 크기는 40㎛이다. 본 발명의 다른 실시예에서, 입자 크기는 80㎛이다.
본 발명은 부드럽고, 컬럼 또는 연속된 고리 모양 크로마토그래피에 채워진 수산화인회석 수지에 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시예에서, 세라믹 수산화인회석 수지는 컬럼에 채워진다. 컬럼 크기의 선택은 당업자에 의해 결정된다. 본 발명의 한 실시예에서, 적어도 0.5cm의 지름과 약 20cm의 층 높이를 가진 컬럼이 소용량 정제를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 한 다른 실시예에서, 약 35cm 내지 약 60cm의 컬럼 지름이 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 60cm 내지 85cm의 컬럼 지름이 사용될 수 있다.
VLPs를 함유하는 수산화인회석 컬럼으로부터의 용출액은 합쳐질 수 있고 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지와 같은 다른 크로마토그래피 수지에 사용될 수 있다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 물질
일부 실시예들에서, 크로마토그래피 물질은 소수성 상호작용 물질을 포함한다. 소수성 상호작용 물질은 메틸, 에틸, t-뷰틸 및 페닐로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다.
소수성 상호작용 크로마토그래피("HIC")는 고염 조건하에서 단백질의 분리를 위한 유용한 기술이다(HPLC of Biological Macromolecules. Methods and Applications, Gooding, K. M. et ah, Eds., Marcel Dekker, Inc. (1990) 참조). 단백질에 대해서, HIC 분리는 단백질의 소수성 아미노산 잔기와 크로마토그래피 지지체에 고정된 고정 소수성 모이이터의 상호작용을 기초로 한다. 고정 소수성 모이어티는 다양한 알킬기 및 아릴기로부터 선택될 수 있다. PEG는 HIC 크로마토그래피에 통상적으로 사용된 고정 모이어티이다. 모이어티의 소수성은 알킬 길이가 증가함에 따라 증가한다. 단백질은 고염(1-3M NH4(SO4)2)의 컬럼에 흡수되며 이온 강도를 낮춤으로써 용출된다. HIC를 전도하는 방법은 전문이 참조로 본 발명에 포함된 Cameron, G. W. et a (Meth. Molec. Cell. Biol. 4:184-188 (1993)), Raymond, J. et a (J. Chromatog. 212:199-209 (1981)), Ochoa, J. I. (Biochimie 60:1-15 (1978)), Roggenbuck, D. et a (J. Immunol. Meth. 167:207-218 (1994)), Michaelson, S. et a (Pol. J. FoodNutr. Sci. 3/44:5-44 (1994), Rippel, G. et a (J. Chromatog. 668:301-312 (1994)), Szepesy, L. et a (J. Chromatog. 668:337-344 (1994)), Huddleston, J. G. et a (Biotechnol. Bioeng. 44:626-635 (1994)), Watanabe, E. et a (Annl. NY Acad. Sci. 721 :348-364 (1994))에 개시된다.
넓은 범위의 소수성에 미치는 다양한 구입할 수 있는 HIC 컬럼 화학은 크로마토그래피 분리를 허용하는 적절한 리간드를 찾을 수 있게 한다. 예를 들어, HIC 컬럼은 다양한 구입할 수 있는 알킬 및 방향족 리간드를 다루는 신크롬 및 바이오-라드(허큘러스 칼리프)로부터 구입할 수 있다. 한 실시예에서, 본 발명에서 사용된 HIC 컬럼은 메틸 HIC이다.
크기 배제 크로마토그래피 물질
일부 실시예에서, 크로마토그래피 물질은 크기 배제 물질을 포함하며 크기 배제 물질은 수지 또는 막이다. 본 발명에서 의도한 대로, 크기 배제 크로마토그래피는 주로 이들의 크기를 기초로 분자들을 분리하는 것을 포함한다. 크기 배제에 사용된 매트릭스는 가교 폴리사카라이드의 복합물, 예를 들어, 구형 비드의 형태인 가교 아가로스 및/또는 덱스트란일 수 있는 불활성 겔 매질이 바람직하다. 가교의 등급은 팽창된 겔 비드에 존재하는 구멍들의 크기를 결정한다. 특정 크기보다 큰 분자들은 겔 비드에 들어가지 않고 크로마토그래피 층을 통해 더 빠르게 이동한다. 크기와 모양에 따라 다양한 정도로 겔 비드를 통과하는 분해제, 단백질, DNA 등과 같은 더 작은 분자들은 층을 통해 이들의 통로에서 지연된다. 따라서 분자들 감소하는 분자 크기 순서로 일반적으로 용출된다.
바이러스들의 크기 배제 크로마토그래피에 적합한 다공성 크로마토그래피 수지는 덱스트란 및 가교 덱스트란으로 제조될 수 있다. 가장 통상적으로 사용되는 것은 아머샴 바이오사이언스로부터 구입할 수 있는 상표명 "SEPHADEX"이다. 사용된 SEPHADEX의 형태 또는 다른 크기 배제 크로마토그래피 수지는 정제될 VLP의 형태 및 VLP를 함유하는 세포 배양 용해물의 성질의 함수이다. 다른 물질로 제조된 다른 크기 배제 지지체는, 예를 들어, 적절한 Toyopearl 55F(polymethacrylate, from Tosoh Bioscience, Montgomery Pa.) 및 Bio-Gel P-30 Fine(BioRad Laboratories, Hercules, Calif.)이다.
크기 배제 크로마토그래피를 위해서, 부분 정제된 VLPs의 농축 풀(pool)은 적절한 버퍼(예를 들어, 인산염 버퍼)에서 평형화된 적절한 제조용 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(세파덱스 G200 또는 수퍼포즈 6 수지와 같은)을 함유하는 컬럼 위에 적재된다.
본 발명은 이온 교환체를 포함하는 크로마토그래피 물질을 추가로 제공한다. 이온 교환체는 양이온 교환체일 수 있고, 양이온 교환체는 황산염, 인산염 및 카복실산염 유도 크로마토그래피 물질을 포함한다. 이온 교환체는 음이온 교환체일 수 있고, 음이온 교환체는 양으로 대전된 크로마토그래피 물질을 포함한다. 양으로 대전된 크로마토그래피 물질은 4차 아민(Q) 또는 다이에틸아미노에테인(DEAE)일 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피 물질
음이온 교환 크로마토그래피는 불활성 폴리머 주쇄에 공유 결합된 양으로 대전된 유기 모이어티를 사용한다. 불활성 폴리머 주쇄는 수지의 지지체로서 사용된다. 대표적 유기 모이어티는 트라이메틸아미노에틸(TMAE), 다이에틸아미노에틸(DEAE), 다이메틸아미노에틸(DMAE)과 같은 1차, 2차, 3차 및 4차 아미노기, 및 대략 5 내지 대략 9의 pH 범위 내에 있는 형식 양전하를 이미 갖거나 갖게 될 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 다른 기들로부터 유도된다.
한 실시예에서, DMAE, TMAE, DEAE 또는 4차 암모늄기로 이루어진 음이온 교환 수지가 사용된다. 상표명 프락토겔(노바겐)로 판매된 여러 음이온 교환 수지는 양으로 대전된 모이이터로 TMAE, DEAE, DMAE 및 메타크릴레이트 코-폴리머 백그라운드를 사용한다. 4차 암모늄 수지 및 상표명 Q SOURCE-30(아머샴 바이오사이언스)으로 판매된 형태의 4차 암모늄 수지를 사용하는 수지들이 사용될 수 있다. Q SOURCE-30은 다이바이닐벤젠과 가교된 폴리스티렌으로 제조된 지지체를 가진다.
POROS 50 PITM, Q SEPHAROSETM, 임의의 DEAE, TMAE, 3차 또는 4차 아민 또는 PEI-계 수지와 같은 N-대전 아미노 또는 이미노 수지를 포함하는 이런 컬럼에 사용될 수 있는 여러 가능한 음이온 교환 매질이 공지되어 있다. 당업자는 재조합 VLPs는 정제 이전 또는 이후 음이온 교환 컬럼 또는 다른 컬럼들 상에서 정제될 수 있다는 것을 알 것이다.
음이온 교환 크로마토그래피 수지는 반경류 또는 축류, 유체층 컬럼 또는 슬러리, 즉 배치 방법을 사용하는 중력 컬럼크로마토그래피 또는 고압 액체크로마토그래피 장치에 사용될 수 있다. 후자 방법의 경우에, 수지는 디켄팅 또는 원심분리 또는 여과 또는 방법들의 조합에 의해 샘플로부터 분리된다.
이온 교환 크로마토그래피의 원리는 대전된 분자들이 비가역적으로 이온 교환체에 흡수되어 이온 환경을 변화시킴으로써 분자들이 결합되거나 용출될 수 있다는 것이다. 이온 교환체들 상에서 분리는 주로 두 단계로 성취된다: 먼저, 분리될 물질은 안정하고 단단한 결합을 제공하는 조건들을 사용하여 교환체에 결합되며; 그 후 물질은 정제될 물질의 특성들에 따라 다른 pH 또는 이온 강도의 버퍼로 용출된다.
더욱 구체적으로, 본 발명에 사용된 대로, 이온 교환 크로마토그래피의 기본 원리는 교환체를 위한 VLP의 친화성은 단백질의 전기적 특성들 및 용매에서 다른 대전된 물질들의 상대적 친화성에 의존한다는 것이다. 한편, 결합된 단백질은 pH를 변화시켜, 단백질의 전하를 변화시키거나 한 예로서 결합된 단백질의 염인 경쟁 물질들을 첨가함으로써 용출될 수 있다. 다른 물질들은 다른 전기적 특성을 갖기 때문에, 배출을 위한 조건들은 각각의 결합된 분자 종들에 따라 다르다. 일반적으로, 분리를 잘 시키기 위해서, 선택 방법은 연속적인 이온 강도 기울기 용출 또는 단계적 용출이다. 음이온 교환체의 경우, pH는 감소하고 이온 강도는 증가하거나 이온 강도만 증가한다. 양이온 교환체의 경우, pH와 이온 강도 모두가 증가할 수 있다. 용출 절차의 실제 선택은 주로 실행과 실수 및 정제될 VLPs의 안정성 고려의 결과이다.
당업자는 음이온 교환체, 버퍼, 및 VLP를 결합하고 용출하는데 사용된 염들의 형태는 정제될 VLP의 형태의 함수가 될 것을 알 것이다.
양이온 교환 크로마토그래피 물질
양이온 교환 크로마토그래피의 경우, 음이온 작용기는 불용성 지지 매질에 결합한다. 따라서, 양이온 교환 크로마토그래피 매질은 배양기간이 양으로 대전된 작용기가 음으로 대전된 양이온 교환체 매질에 결합하여 이와 평형을 이루도록 하기에 충분한 시간인 경우 양의 반대 이온과 결합한다. 중성 분자와 음이온은 양이온 교환 매질과 결합하지 않는다. 전체 양의 전하를 처리하는 종들의 정전기 결합 이후, 양이온 매질은 세척되어, 결합하지 않은 분자들을 매질로부터 제거한다. 그런 후에 결합된 이온들은 양의 이온들의 농도를 증가시켜 매질을 세척하거나 매질의 pH를 변화시킴으로써 용출된다. 개시된 발명은 당업계에 주지된 여러 지지 매질에 결합된 임의의 황-, 인 카복시- 또는 카복시-메틸계 양이온 교환 수지와 같은 다양한 양이온 교환 매질을 사용하는 것을 고려한다.
본 발명의 한 실시예에서, 이온 교환 크로마토그래피는 이하에서 논의될 바인딩 모드(binding mode) 또는 플로우-스루 모드(flow-through mode)에 사용될 수 있다.
친화성 크로마토그래피 물질
일부 실시예들에서, 크로마토그래피 물질은 친화성 크로마토그래피 물질을 포함한다. 친화성 크로마토그래피 물질은 항체, 염료 수지 및 금속을 포함할 수 있다. 염료 수지는 시바크롬 블루 또는 폴리믹신일 수 있다.
친화성 크로마토그래피는 표적 화합물의 리간드 특이적 정제를 위해 제공되는 기술이다. 이와 같이, 기술은 특정 조건하에서 특이적 특성들을 기초로 분자들을 결합시킴으로써 거대분자들의 구조적 및 기능적 특성을 사용한다.
다양한 다른 친화성 컬럼 매트릭스는 개시된 발명과 사용하는 것이 고려된다. 예를 들어, VLPs에 대항하는 항체들은 VLPs를 정제하는데 사용될 수 있는 친화성 컬럼 매질을 발생시키는데 사용될 수 있다. 또한, 친화성 크로마토그래피 물질은 염료 수지 및 금속을 포함할 수 있다. 염료 수지는 시바크롬 블루 또는 폴리믹신일 수 있다.
개시된 발명의 한 실시예는 흡착성 그룹으로서 헤파린의 사용을 고려한다. 헤파린을 함유하는 친화성 크로마토그래피 매질은 다양한 소스로부터 구입할 수 있다. 예를 들어, PerSeptive Biosystems사(Framingham, Mass.)는 헤파린계 매질(POROS 20HETM)을 판매한다. POROS 20HETM이 친화성 크로마토그래피 매질로 사용될 때, VLPs 함유 용액은 친화성 매질에 사용되고 뒤이어 적절한 염 농도로 용출된다.
상기한 크로마토그래피 물질은 단일 단계 또는 연속적으로 또는 동시에 사용될 수 있다. 본 발명의 다단계 크로마토그래피 공정의 순서는 소정 필요조건을 충족하는 VLPs를 생산하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 정제 방법은 약 70%, 80%, 90% 95% 또는 99% 초과 순도로 VLPs를 정제하는데 사용될 수 있다.
한 실시예에서, 다단계 크로마토그래피 공정의 순서는 VLPs의 최종 조성물을 제어하도록 설계된다. 다른 실시예에서, 다단계 크로마토그래피 공정의 순서는 오염물 수준을 약학적 등급의 약물을 위해 규제 기관이 수용할 수 있는 것으로 생각되는 수준으로 감소시키도록 설계된다. 예를 들어, 숙주 세포 DNA 함량의 오염물 수준은 1% 미만으로 감소될 수 있다. 숙주 세포 단백질 함량의 오염물 수준은 5% 미만으로 감소될 수 있다. 다단계 크로마토그래피 공정의 순서는 cGMP 규제와 일치하고 인간에서 약학적 검사에 적합한 VLPs를 제조하도록 설계된다.
본 발명은 VLPs를 함유하는 용액을 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 방법을 추가로 제공한다. 이와 관련해서, 배지 또는 VLPs를 함유하는 세포 용해물은 크로마토그래피 물질과 접촉될 수 있고 배지 또는 세포 용해물은 여과되거나 크로마토그래피 물질과 접촉하기 이전에 침전화로 정제된다. 용액 또는 세포 용해물은 수크로스 기울기 없이 원심분리될 수 있다. 한 실시예에서, VLPs를 함유하는 정제 용액은 크로마토그래피 물질과 접촉된다. 선택적으로, 한 크로마토그래피 단계로부터 얻은 VLP 함유 용액은 다른 크로마토그래피 물질과 접촉된다.
개시된 발명의 특정 실시예들은 세포 용해 공정 동안 배출된 세포 환경으로부터 VLPs 입자들을 정제하기 위해 소수성 상호작용 크로마토그래피 매질과 함께 수산화인회석 매질의 사용을 고려한다. 한 실시예에서, 세포 용해물은 수산화인회석 컬럼(Bio-Rad, CHT)에 적재된다. 이런 컬럼은 다양한 크기로 구입할 수 있다. 수산화인회석 컬럼 위에서 정제한 후, VLPs-함유 물질은 소수성 상호작용(HIC) 컬럼 위를 통과한다. 그런 후에 컬럼은 세척되고 용출된다. VLPs의 정제된 샘플은 정제를 위해, 예를 들어, 은-염색 SDS-PAGE 또는 크리 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석될 수 있다.
본 발명의 한 실시예에서, 수산화인회석 매질은 약리학적 용도를 위해 소수성 상호작용 크로마토그래피 매질과 함께 및 음이온 교환 크로마토그래피 매질과 함께 사용된다. 본 발명자들은 이 조합이 상업적 용량 수준으로 유전자형 I 놀워크 바이러스를 정제하는데 특히 적합하다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 양이온 교환 크로마토그래피 후 메틸 HIC가 휴스톤 바이러스를 정제하는데 특히 적합하다는 것을 발견하였다.
각 단계에서 크로마토그래피 물질을 VLP 제제와 접촉시키기 전에, pH, 이온 강도 및 온도와 같은 변수들을 조절하는 것이 필요할 수 있고 일부 경우에 다른 종류의 물질들의 첨가가 필요할 수 있다. 이런 변수들의 조절은 당업자가 알고 있고 VLP 함유 용액 또는 크로마토그래피 매질에서 성취될 수 있다. 예를 들어, VLP 함유 용액의 pH는 버퍼로 조절될 수 있다. pH는 산성 값(예를 들어, 7 미만) 또는 염기성 값(예를 들어, 7 초과)으로 조절될 수 있다. 일부 실시예들에서, 용액 또는 크로마토그래피 물질의 pH는 중성 값(예를 들어, 7)으로 조절되는 것이 바람직할 수 있다. pH 값을 조절하는데 사용된 버퍼는 인산염, 카복실산염, 황산염, 아세트산염, 시트르산염, 트리스 또는 비스 트리스를 포함할 수 있고 버퍼 용액은 약 10 내지 1000mM일 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 VLP 함유 용액의 이온 강도의 조절을 포함한다. 이온 강도는 호프메이스트 시리즈로부터의 양이온 및 음이온을 포함하는 염의 첨가에 의해 조절될 수 있다. 염은 인산나트륨, 인산칼슘 및 인산칼륨과 같은 인산염일 수 있다. 일부 실시예들에서, 인산염은 인산나트륨이다. 염의 농도는 약 10 내지 500mM일 수 있다. 한 실시예에서, 인산나트륨 농도는 약 100mM이다.
선택적으로, 임의적 단계는 VLP 제제의 정제를 위해 필수적인 특성들을 가져오기 위해 용액(예를 들어, pH, 이온 강도 등을 조절하거나 분해제의 주입을 위한 버퍼)으로 세척함으로써 크로마토그래피 물질에 수행될 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래피 물질의 pH는 버퍼에 의한 평형화에 의해 VLP 사용 이전에 조절될 수 있다. pH는 인산염, 카복실산염 또는 황산염을 포함하는 버퍼에 의해 7 미만 또는 7 초과 또는 7로 조절될 수 있다.
다른 실시예에서, 크로마토그래피의 이온 강도는 염의 첨가에 의해 조절될 수 있다. 염은 황산암모늄과 같은 호프메이스터 시리즈로부터의 양이온과 음이온을 포함한다. 황산암모늄의 농도는 약 1, 2 또는 2.4 몰 보다 클 수 있다.
다른 실시예에서, 크로마토그래피의 이온 강도는 인산염의 첨가에 의해 조절될 수 있다. 일부 실시예에서, 인산염은 인산나트륨이다. 인산염 농도는 약 10 내지 500mM일 수 있다. 한 실시예에서, 인산나트륨 농도는 약 100mM이다. 또 다른 실시예에서, VLP 함유 용액의 유기 용액 농도는 역상 공정 동안 조절될 수 있다.
VLP 함유 용액 또는 크로마토그래피 물질의 변수들을 조절하면 VLPs 및 오염물의 보유 또는 통과를 일으킬 수 있다. 한 실시예에서, VLP 함유 용액 또는 크로마토그래피 물질은 VLPs를 보유하고 오염 물질들이 크로마토그래피 물질을 통과하도록 선택될 수 있다. 다른 실시예에서, VLP 함유 용액 또는 크로마토그래피 물질은 오염 물질들을 보유하고 VLPs가 크로마토그래피 물질을 통과하도록 선택될 수 있다. 이런 특징들은 "플로우-스루 모드" 또는 "바인딩 모드" 또는 이의 혼합에서 크로마토그래피 단계를 작동하기 위해 사용될 수 있다. "플로우-스루 모드"라는 용어는 VLP 제제 분리 기술을 의미하며 제제에 함유된 적어도 하나의 VLP는 크로마토그래피 수지 지지체를 통과하는 반면, 적어도 하나의 잠재적인 오염물 또는 불순물은 크로마토그래피 수지 또는 지지체에 결합한다. 플로우-스루 모드는, 예를 들어, 수산화인회석 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 사용될 수 있다.
"바인딩 모드"는 VLP 제제 분리 기술을 의미하며 제제에 함유된 적어도 하나의 VLP는 크로마토그래피 수지 지지체에 결합하는 반면, 적어도 하나의 오염물 또는 불순물은 통과한다. 바인딩 모드는, 예를 들어, 수산화인회석 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 사용될 수 있다.
특정 실시예들에서, 본 발명은 바인딩 모드, 플로우-스루 모드 또는 이의 조합으로 수산화인회석 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하여 VLP 제제로부터 오염 물질들을 제거하는 방법을 제공한다. 이런 실행은 VLP 제제의 대용량 정제에 사용된다.
바인딩 모드 수산화인회석 크로마토그래피에서, 방법은 VLPs를 결합하기 위해 중성 pH와 낮은 이온 강도에서 인산염으로 채워진 수산화인회석 지지체를 사용한다. 그런 후에 컬럼은 느슨하게 결합된 불순물들을 제거하기 위해 인산염 버퍼로 세척된다. 다음으로, VLPs는 100 내지 200mM 인산염을 함유하는 고이온 강도 인산염 버퍼를 사용하여 선택적으로 용출된다. 마지막으로, 수지는 수산화나트륨 및 인산칼륨 용액을 사용하여 선택적으로 재생된다.
플로우-스루 모드 수산화인회석 크로마토그래피에서, VLP 제제는 적절한 pH에서 로드 버퍼(load buffer) 속으로 버퍼-교환된다. 그런 후에 VLP 제제는 수산화인회석 컬럼을 통과하는 반면, 불순물들은 컬럼에 결합한다. 컬럼은 선택적으로 뒤이어 세척되고 정제되어 추가의 VLPs를 컬럼을 통과시키고 정제되게 한다. 마지막으로, 컬럼은 수산화나트륨 및 인산칼륨 용액과 같은 버퍼를 사용하여 선택적으로 벗겨지고 재생될 수 있다.
결합/플로우-스루 모드 수산화인회석 크로마토그래피 조합에서, 수산화인회석 매질은 용액으로 평형화되고 세척되어, VLP 제제의 정제를 위해 필수적인 특성을 가져온다.
평형화 및 크로마토그래피 이전에, 수산화인회석 크로마토그래피 매질은 선택된 용액, 예를 들어, 염 및/또는 버퍼 용액에서 선-평형화될 수 있다. 선-평형화는 크로마토그래피 매질을 재생 및/또는 저장하는데 사용된 용액을 대체하는 기능을 한다. 당업자는 선-평형 용액의 조성물은 저장 용액 및 후속 크로마토그래피를 위해 사용될 용액의 조성물에 의존한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 적절한 선-평형 용액은, 선택적으로, 크로마토그래피를 수행하는데 사용된 높은 농도에서, 크로마토그래피를 수행하기 위해 사용된 동일한 버퍼 또는 염을 포함할 수 있다.
샘플이 컬럼에 사용되기 전에, 수산화인회석 크로마토그래피 매질은 VLP를 크로마토그래피하는데 사용될 버퍼 또는 염에서 평형화될 수 있다. 크로마토그래피(및 정제된 단백질의 하중)는 나트륨, 칼슘, 암모늄, 마그네슘, 칼슘, 염화물, 불화물, 아세트산염, 인산염 및/또는 시트르산염 및/또는 트리스 버퍼를 포함하는 여러 버퍼 또는 염에서 일어날 수 있다. 이런 버퍼 또는 염은 약 2 내지 약 10의 pH를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, 평형은 트리스 또는 인산나트륨 버퍼를 포함하는 용액에서 발생할 수 있다. 선택적으로, 인산나트륨 버퍼는 약 0.5 밀리몰 내지 약 50 밀리몰의 농도, 더욱 바람직하게는 약 15 밀리몰 내지 35 밀리몰의 농도이다. 바람직하게는, 평형은 적어도 약 5.5의 pH에서 발생한다. 평형은 약 6.0 내지 약 8.6, 바람직하게는 6.5 내지 7.5의 pH에서 일어난다. 가장 바람직하게는, 용액은 약 25 밀리몰의 농도 및 약 6.8의 pH로 인산나트륨 버퍼를 포함한다.
VLP 제제를 바인딩 모드, 플로우-스루 모드 또는 이의 조합에서 수산화인회석 수지에 접촉하는 것은 고체상 매트릭스를 함유하는 충전된 층 컬럼, 유동화된/팽창된 층 컬럼 및/또는 고체상 매트릭스는 특정 시간 동안 용액과 혼합되는 단순한 배치 작업에서 수행될 수 있다.
수산화인회석 수지를 VLP 제제와 접촉한 후에 선택적으로 세척 절차가 수행된다. 그러나, 일부 경우에, 세척 절차가 생략될 수 있어서, 세척 용액뿐만 아니라 공정 단계를 절약한다. 사용된 세척 버퍼들은 수산화인회석 수지의 특성, 사용된 수산화인회석 크로마토그래피의 모드에 의존할 것이고 따라서 당업자들 중 하나에 의해 결정될 수 있다. 플로우-스루 모드 및 결합/플로우-스루 모드 조합에서, 컬럼의 선택적 세척 후 플로루-스루로 얻은 정제된 VLP는 다른 정제된 VLP 분획들과 합쳐질 수 있다.
바인딩 모드에서, VLP는 선택적 냉각 절차 후 컬럼으로부터 용출될 수 있다. 컬럼으로부터 VLP의 용출을 위해, 본 발명은 높은 이온 강도 인산염 버퍼를 사용한다. 예를 들어, 용출 버퍼는 1 내지 300mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, 다른 실시예에서 용출 버퍼는 50 내지 250mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, 다른 실시예에서, 용출 버퍼는 100 내지 200mM 인산나트륨을 함유할 수 있고, 다른 실시예에서, 용출 버퍼는 150mM 인산나트륨을 함유할 수 있다. 용출 버퍼의 pH는 6.4 내지 7.6일 수 있다. 한 실시예에서, pH는 6.5 내지 7.3일 수 있고, 다른 실시예에서 pH는 7.2일 수 있고 다른 실시예에서 pH는 6.8일 수 있다. 용출 버퍼는 연속적 또는 단계적 기울기로 컬럼으로부터 VLP를 용출하기 위해 변할 수 있다. 버퍼 구성요소는 당업자의 지식에 따라 조절될 수 있다.
*결합, 플로우-스루 모드 모두 및 이의 조합에서, 고체상 매트릭스는 VLP의 용출 또는 통과 후, 선택적으로 정제, 즉, 벗겨지고 재생될 수 있을 것이다. 이 절차는 고체상의 표면상에 불순물들의 성장을 최소화 및/또는 미생물에 의한 제품의 오염을 피하기 위해 매트릭스를 안정화하기 위해 통상 규칙적으로 수행된다.
특정 실시예에서, 수산화인회석 크로마토그래피 단계는 먼저 수행되고, 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계는 두 번째로 수행되고, 음이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계는 세 번째로 수행된다.
VLPs는 일반적으로 결합, 플로우-스루 또는 이의 조합의 분획에서 수산화인회석 단계로부터 회수된다. 이런 분획의 염 농도 및 pH는, 실시예 1에 개시된 대로, 소수성 상호작용 컬럼 위에서 정제 또는 임의의 다른 적절한 친화성 컬럼 위에서 정제를 위해 조절될 수 있다. 이 방법에 따라, 황산암모늄은 합쳐진 VLPs에 8% w/v의 최종 농도로 첨가되었고 샘플은 황산암모늄이 용해될 때까지 교반된다. 250mL의 HIC 수지를 함유하는 컬럼은 100mM 인산나트륨, 2.4M 황산암모늄 pH 6.8 및 VLP 현탁액이 적재된 5 CV로 평형화된다. 컬럼은 대략 안정한 기준선이 관찰될 때까지 버퍼 C의 대략 3 CV로 세척되고 70% 100mM 인산염, pH 6.8의 10 CV로 세척된다. VLPs는 150mM 인산염을 가진 컬럼으로부터 용출될 수 있다.
크로마토그래피 매질의 등급은 VLPs 입자들의 최종 정제에 중요한 것으로 고려되지 않는다는 것을 알아야 한다. 또한, 크기 배제 컬럼은 샘플을 더 정제하기 위해 선택적으로 사용될 수 있다. 이런 조합들을 사용하여 얻은 수율은 단일 컬럼 정제 단계를 사용하여 얻은 수율을 기초로 하여 예상할 수 있다.
HIC 컬럼으로부터 용출된 VLPs는 필요에 따라 추가의 크기 배제 정제 단계를 거칠 수 있다. 본 발명의 한 실시예에서, 수산화인회석 크로마토그래피 및 HIC 크로마토그래피 조합에 의해 정제된 용출물은 DEAE 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제되었다.
본 발명의 임의의 또는 모든 크로마토그래피 단계는 임의의 기계적 수단에 의해 수행될 수 있다. 크로마토그래피는 컬럼에서 수행될 수 있다. 컬럼은 압력으로 또는 압력 없이 및 위에서 아래로 또는 아래서 위로 작동될 수 있다. 컬럼에서 유체의 흐름 방향은 크로마토그래피 공정 동안 뒤바뀔 수 있다. 크로마토그래피는 배치 공정을 사용하여 수행될 수 있고 고체 지지체는 중력, 원심분리 또는 여과를 포함하는 임의의 적절한 수단에 의해 샘플을 채우고, 세척하고 용출하는데 사용된 액체로부터 분리된다. 크로마토그래피는 샘플을 다른 것보다 더욱 강하게 샘플에서 일부 분자들을 흡착 또는 보유하는 필터와 접촉시킴으로써 수행될 수 있다.
마지막으로, 음이온 교환 컬럼으로부터의 용출물은 여과물을 농축하기 위해 다이어필터 또는 접선방향 흐름 필터를 통해 여과될 수 있다.
추가 선택적 단계
비록 수산화인회석 및 소수성 상호작용 크로마토그래피가, 상기한 대로, VLP를 분리하는데 함께 사용될 수 있다는 것을 발견하였으나, 본 발명의 정제 방법은 다른 단백질 정제 기술들과 조합해서 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시예에서, 수산화인회석 단계 이전의 하나 이상의 단계는 오염물 또는 불순물의 적재 문제를 감소시키는데 바람직할 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서, 소수성 상호작용 단계 이후의 하나 이상의 정제 단계는 추가 오염물 또는 불순물을 제거하는데 바람직할 수 있다.
개시된 수산화인회석 정제 절차는 단백질 A 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정 금속 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 정용여과, 초여과, 바이러스 제거 여과 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 정제 단계들과 선택적으로 조합될 수 있다.
다른 정제 방법들은 여과, 침전화, 증발, 증류, 건조, 가스 흡수, 용매 추출, 압축 추출, 흡착, 결정화 및 원심분리를 포함할 수 있다. 다른 정제 방법들은 배치 또는 컬럼 크로마토그래피를 사용하는 본 발명에 따른 다른 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 또한, 추가 정제는, 예를 들어, 다른 방법들의 크로마토그래피의 조합, 크로마토그래피와 여과의 조합, 크로마토그래피와 침전화의 조합 또는 건조에 의한 막 처리의 조합과 같은 상기한 것들의 임의의 것의 조합을 포함할 수 있다.
VLPs의 용출은 광 밀도, 저자 현미경의 전도 또는 광 스캐닝을 포함하는 당업계에 공지된 기술들에 의해 관찰될 수 있다. 또한, 정제 이전 및 이후의 VLPs의 생화학적 특성들은 잘 정립된 측정법을 사용하여 측정될 수 있다. 더욱 구체적으로, VLP 순도 및 정체는 환원된 및 환원되지 않은 황산도데실나트륨 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 크기 배제 크로마토그래피, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피), 모세관 전기영동, MALDI(매트릭스 지원 레이저 탈착 이온화) 질량 분광측정계, ELISA(효소결합면역흡수법) 또는 원편광 이색성을 포함하는 다양한 분석방법을 사용하여 측정될 수 있다.
다음 예들은 본 발명의 바람직한 실시예들을 증명하기 위해 포함된다. 당업자는, 본 발명의 상세한 설명의 관점에서, 많은 변화가 특정 실시예에 가해질 수 있고 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않고 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것을 알 것이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1은 크로마토그래피 단계의 함수로서 VLP 순도의 변화를 나타내는 예시적 겔이다.
도 2는 수산화인회석 크로마토그래피 컬럼 분획물의 SDS-PAGE 겔/쿠마시 염색이다.
도 3은 HIC 크로마토그래피 컬럼 분획물의 SDS-PAGE 겔/쿠마시 염색이다.
도 4는 DEAE 크로마토그래피 컬럼 분획물의 SDS-PAGE 겔/쿠마시 염색이다.
도 5는 투석여과 분획물의 SDS-PAGE 겔/쿠마시 염색이다.
도 6은 크로마토그래피로 정제된 놀워크 바이러스 VLPs의 투과 현미경 미세그리프의 이미지이다.
도 7은 초원심분리로 정제된 놀워크 바이러스 VLPs의 투과 현미경 미세그리프의 이미지이다. 이런 입자들은 크기가 34 내지 38nM이다.
도 8은 pH의 함수로서 10℃(점선) 및 90℃(굵은 선)에서 컬럼 정제 VLPs의 CD 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 9는 온도와 pH의 함수로서 205nm에서 관찰된 컬럼 정제 VLPs의 CD 신호를 나타내는 그래프이다.
도 10은 온도와 pH의 함수로서 222nm에서 관찰된 컬럼 정제 VLPs의 CD 신호를 나타내는 그래프이다.
도 11은 초원심분리로 정제된 VLPs의 pH의 함수로서 10℃(점선) 및 90℃(굵은 선)에서 CD 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 12는 초원심분리에 의해 정제된 VLPs의 온도와 pH의 함수로서 205nm에서 CD 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 13은 초원심분리에 의해 정제된 VLPs의 온도와 pH의 함수로서 222nm에서 CD 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 14는 휴스톤 바이러스 VLPs를 위해 사용된 양이온 교환 정제 단계에 의한 크로마토그램이다.
도 15는 휴스톤 바이러스 VLPs의 양이온 교환 분획물의 SDS-PAGE 겔/쿠마시 염색이다.
도 16은 휴스톤 바이러스 VLPs를 위해 사용된 메틸 HIC 크로마토그래피 정제 단계에 의한 크로마토그램이다.
도 17은 휴스톤 바이러스 VLPs의 메틸 HIC 분획물의 SDS-PAGE 겔/쿠마시 염색이다.
도 18은 정제된 휴스톤 바이러스 단백질의 SDS-PAGE 겔/쿠마시 염색이다.
도 19는 정제된 휴스톤 바이러스 단백질의 HPLC-SEC 크로마토그램이다.
도 20은 20% 황산암모늄 침전화에 의한 휴스톤 VLP 제제의 정제를 나타내는 은 염색 SDS-PAGE 겔이다. "Amm 현탁액"은 최초 황산암모늄 현탁액이다. "Amm 상청액"은 황산암모늄 현탁액이 원심분리될 때 생기는 상청액이다. "시트르산염 상청액"은 용해된 침전 물질이다. 비-침전된 오염 물질의 양을 강조하는 "amm 상청액" 레인이 중요하다.
도 21은 최초 휴스톤 VLP 제제의 성분들과 침전되고 재용해된 황산암모늄 물질을 비교하는 그래프이다. VLP에 대한 숙주 세포 단백질 백분율(HCP/VLP%) 감소에 의해 20% 황산암모늄 제제에서 순도의 현저한 개선을 나타낸다.
도 22는 침전화 및 뒤이어 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 휴스톤 VLPs의 정제 공정을 나타내는 은 염색 SDS-PAGE 겔이다. 레인 2와 레인 5 및 6을 비교하여 나타낸 것과 같이, pH 조절에 의한 VLP 침전화는 순도를 증가시킨다. 레인 8은 VLPs를 농축하는 컬럼 크로마토그래피의 능력을 나타낸다.
도 23은 침전화 및 뒤이어 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 라우렌 VLPs의 정제 공정을 나타내는 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔이다. 레인 5 내지 8 대 레인 11의 비교는 캡쳐 크로마토그래피에 의해 얻은 라우렌 VLP 샘플들의 순도 증가를 나타낸다.
도 24는 다양한 pH 값에서 GI 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석이다. 패널 A. pH 2에서 GI 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석. 약 17분에서 흡수 피크는 손상되지 않은 단분산 VLPs의 용출에 해당한다. 패널 B. pH 8에서 GI 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석. 약 16분에서 흡수 피크는 손상되지 않은 단분산 VLPs의 용출에 해당한다. 패널 C. pH 8.5에서 GI 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석. 약 33분에서 흡수 피크는 VLP의 안정한 중간 단편의 용출에 해당한다. 크로마토그램은 230nm(상부) 및 280nm(하부)에서 흡수 단면도를 나타낸다.
도 25는 다양한 pH 수준에서 GII 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석이다. 패널 A. pH 2에서 GII 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석. 약 17분에서 흡수 피크는 손상되지 않은 단분산 VLPs의 용출에 해당한다. 패널 B. pH 9.5에서 GII 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석. 약 17분에서 흡수 피크는 손상되지 않은 단분산 VLPs의 용출에 해당한다. 패널 C. pH 10에서 GII 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석. 약 34분에서 흡수 피크는 VLP의 안정한 중간 단편의 용출에 해당한다. 크로마토그램은 230nm(상부) 및 280nm(하부)에서 흡수 단면도를 나타낸다.
도 2는 수산화인회석 크로마토그래피 컬럼 분획물의 SDS-PAGE 겔/쿠마시 염색이다.
도 3은 HIC 크로마토그래피 컬럼 분획물의 SDS-PAGE 겔/쿠마시 염색이다.
도 4는 DEAE 크로마토그래피 컬럼 분획물의 SDS-PAGE 겔/쿠마시 염색이다.
도 5는 투석여과 분획물의 SDS-PAGE 겔/쿠마시 염색이다.
도 6은 크로마토그래피로 정제된 놀워크 바이러스 VLPs의 투과 현미경 미세그리프의 이미지이다.
도 7은 초원심분리로 정제된 놀워크 바이러스 VLPs의 투과 현미경 미세그리프의 이미지이다. 이런 입자들은 크기가 34 내지 38nM이다.
도 8은 pH의 함수로서 10℃(점선) 및 90℃(굵은 선)에서 컬럼 정제 VLPs의 CD 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 9는 온도와 pH의 함수로서 205nm에서 관찰된 컬럼 정제 VLPs의 CD 신호를 나타내는 그래프이다.
도 10은 온도와 pH의 함수로서 222nm에서 관찰된 컬럼 정제 VLPs의 CD 신호를 나타내는 그래프이다.
도 11은 초원심분리로 정제된 VLPs의 pH의 함수로서 10℃(점선) 및 90℃(굵은 선)에서 CD 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 12는 초원심분리에 의해 정제된 VLPs의 온도와 pH의 함수로서 205nm에서 CD 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 13은 초원심분리에 의해 정제된 VLPs의 온도와 pH의 함수로서 222nm에서 CD 스펙트럼을 나타내는 그래프이다.
도 14는 휴스톤 바이러스 VLPs를 위해 사용된 양이온 교환 정제 단계에 의한 크로마토그램이다.
도 15는 휴스톤 바이러스 VLPs의 양이온 교환 분획물의 SDS-PAGE 겔/쿠마시 염색이다.
도 16은 휴스톤 바이러스 VLPs를 위해 사용된 메틸 HIC 크로마토그래피 정제 단계에 의한 크로마토그램이다.
도 17은 휴스톤 바이러스 VLPs의 메틸 HIC 분획물의 SDS-PAGE 겔/쿠마시 염색이다.
도 18은 정제된 휴스톤 바이러스 단백질의 SDS-PAGE 겔/쿠마시 염색이다.
도 19는 정제된 휴스톤 바이러스 단백질의 HPLC-SEC 크로마토그램이다.
도 20은 20% 황산암모늄 침전화에 의한 휴스톤 VLP 제제의 정제를 나타내는 은 염색 SDS-PAGE 겔이다. "Amm 현탁액"은 최초 황산암모늄 현탁액이다. "Amm 상청액"은 황산암모늄 현탁액이 원심분리될 때 생기는 상청액이다. "시트르산염 상청액"은 용해된 침전 물질이다. 비-침전된 오염 물질의 양을 강조하는 "amm 상청액" 레인이 중요하다.
도 21은 최초 휴스톤 VLP 제제의 성분들과 침전되고 재용해된 황산암모늄 물질을 비교하는 그래프이다. VLP에 대한 숙주 세포 단백질 백분율(HCP/VLP%) 감소에 의해 20% 황산암모늄 제제에서 순도의 현저한 개선을 나타낸다.
도 22는 침전화 및 뒤이어 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 휴스톤 VLPs의 정제 공정을 나타내는 은 염색 SDS-PAGE 겔이다. 레인 2와 레인 5 및 6을 비교하여 나타낸 것과 같이, pH 조절에 의한 VLP 침전화는 순도를 증가시킨다. 레인 8은 VLPs를 농축하는 컬럼 크로마토그래피의 능력을 나타낸다.
도 23은 침전화 및 뒤이어 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 라우렌 VLPs의 정제 공정을 나타내는 쿠마시 염색 SDS-PAGE 겔이다. 레인 5 내지 8 대 레인 11의 비교는 캡쳐 크로마토그래피에 의해 얻은 라우렌 VLP 샘플들의 순도 증가를 나타낸다.
도 24는 다양한 pH 값에서 GI 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석이다. 패널 A. pH 2에서 GI 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석. 약 17분에서 흡수 피크는 손상되지 않은 단분산 VLPs의 용출에 해당한다. 패널 B. pH 8에서 GI 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석. 약 16분에서 흡수 피크는 손상되지 않은 단분산 VLPs의 용출에 해당한다. 패널 C. pH 8.5에서 GI 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석. 약 33분에서 흡수 피크는 VLP의 안정한 중간 단편의 용출에 해당한다. 크로마토그램은 230nm(상부) 및 280nm(하부)에서 흡수 단면도를 나타낸다.
도 25는 다양한 pH 수준에서 GII 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석이다. 패널 A. pH 2에서 GII 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석. 약 17분에서 흡수 피크는 손상되지 않은 단분산 VLPs의 용출에 해당한다. 패널 B. pH 9.5에서 GII 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석. 약 17분에서 흡수 피크는 손상되지 않은 단분산 VLPs의 용출에 해당한다. 패널 C. pH 10에서 GII 노로바이러스 VLPs의 SE-HPLC 분석. 약 34분에서 흡수 피크는 VLP의 안정한 중간 단편의 용출에 해당한다. 크로마토그램은 230nm(상부) 및 280nm(하부)에서 흡수 단면도를 나타낸다.
실시예
1.
노로바이러스
유전자군 I 바이러스의 정제
방법의 일반적 설명
이 정제 공정은 3개의 크로마토그래피 단계로 이루어진다. 단계들은 오쏘거널 매커니즘(orthogonal mechanisms)을 사용하여 고순도 VLPs를 생산하는 계량가능한 공정이 된다. 정제의 제 1 단계는 바이오-라드 수산화인회석(CHT) 수지를 사용하는 캡쳐 단계이다. CHT 단계는 놀워크 VLPs를 농축하고, 매질 성분들을 제거하고 생성물을 인산 버퍼로 교환한다. 황산암모늄을 첨가한 후, 메틸 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 도 1에 도시된 대부분의 정제를 제공한다. 제 3 크로마토그래피 단계는 인-플로우 모드에서 작동하는 DEAE 이온 교환 크로마토그래피이다. 사용된 조건하에서, 놀워크 VLPs는 컬럼에 결합하지 않고 잔류 오염물들(엔도톡신, 핵산 및 단백질)은 보유된다. 정제 공정의 최종 단계는 초여과이고 인산염 버퍼는 주입을 위해 물로 대체된다. 대형 약물(놀워크 VLPs)은 2-8℃에서 0.5 내지 1.5mg/mL 현탁액으로 저장된다.
크로마토그래피-정제 VLPs에 대한 검사 횟수는 크로마토그래피-정제 VLPs와 초원심분리-정제 VLPs 사이에 어떠한 차이가 있는 지를 측정하기 위해 수행될 수 있다. 이런 방법들은 투과전자현미경 및 원평광 이색성 스펙트럼, 동적 광 산란, 크기 배제 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 용융점을 포함하는 물리적/화학적 특징화를 포함한다. 이런 크로마토그래피 정제 절차는 아래 개략적으로 설명된다. 정제 공정은 임의의 용량을 위해 정상화될 수 있다. 나열된 선형 유속은 컬럼 지름에 무관하다.
VLPs
의 정제
15L 정제는 10L의 조절된 매질을 생산한다. 아래 개시된 정제 공정은 5L를 처리하도록 설계된다. 전체 10L를 정제하기 위해서, 5L를 사용하는 2개의 캠페인은 2주 동안 수행된다.
HA 컬럼 크로마토그래피: 5리터의 배지 상청액은 80mL/min의 유속으로 5mM 인산나트륨 버퍼(버퍼 A)의 10 컬럼 부피를 통과시킴으로써 평형화된 500mL의 수산화인회석(Bio-Rad, CHT) 수지로 충전된 컬럼 위에 적재된다. 배양 상청액을 컬럼 위에 적재하고 버퍼의 2 컬럼 부피(CV)로 세척한다. 150mM 인산염(버퍼 B)는 CHT 컬럼으로부터 놀워크 VLPs를 용출하기 위해 사용된다. 놀워크 VLPs는 버퍼 B에서 분리된 단일 피크로 용출된다. 분획(각각 1 CV)들을 크로마토그래피를 수행하는 동안 수집하고 SDS-PAGE로 분석하였다. VLPs를 함유하는 분획들은 정제의 다음 단계를 위해 합쳐진다. 수산화인회석 크로마토그래피 분획들의 쿠마시 염색에 의한 SDS-PAGE는 도 2에 도시된다. 대다수의 놀워크 VLPs는 100% 버퍼를 가진 4개 용출물 컬럼 부피 분획에서 용출된다. 이런 합쳐진 분획들은 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 정제 단계 2를 위해 사용되었다.
HIC 컬럼 크로마토그래피: CHT 크로마토그래피 단계로부터 합쳐진 VLP 분획들에, 고체 황산암모늄을 8% w/v의 최종 농도로 첨가하고 모든 황산암모늄이 용해될 때까지 샘플을 교반하였다. 황산암모늄의 첨가는 BioRad 메틸 HIC 수지 위에 단백질의 흡착을 용이하게 한다. 250mL의 HIC 수지를 함유하는 컬럼은 100mM 황산나트륨, 2.4M 황산암모늄 pH 6.8(버퍼 C) 및 VLP 현탁액이 적재된 5 CV로 평형화되었다. 컬럼은 안정한 기준선이 관찰될 때까지 버퍼 C의 대략 3 CV로 세척되고 70% 100mM 인산염, pH 6.8(버퍼 D)의 10 CV로 세척된다. HIC 컬럼으로부터의 VLPs는 100% 버퍼 B의 3 내지 4 CV에서 용출된다. 용출하는 동안 250mL(1 CV) 분획을 수집하고 SDS-PAGE로 분석하였다. VLPs를 함유하는 분획들은 합쳐지고 DEAE 크로마토그래피 단계에 사용된다. HIC 컬럼 분획의 SDS-PAGE/쿠마시 염색은 도 3에 도시된다.
DEAE 컬럼 크로마토그래피: 메틸 HIC 컬럼으로부터 부분적으로 정제된 VLPs를 함유하는 합쳐진 분획들은 270mL DEAE 세파덱스 수지로 충전된 컬럼 위에 직접 적재된다. 인산염 pH 6.5는 40mL/min의 유속에서 펌프되어 VLPs가 공극 부피에 용출되게 한다(통과하게 한다). 오염 단백질들은 나중에 크로마토그래피에서 수지와 용출물과 상호작용한다. 분획들(각각 1/4 CV)은 샘플을 채울 때 및 UV 탐지기 신호가 기준선 위로 올라가자마자 수집된다. 분획들은 SDS-PAGE 및 정용 여과에 의한 버퍼 교환을 위해 합쳐진 VLPs를 함유하는 분획들에 의해 분석된다. DEAE 컬럼 ㅂ분획들의 S-PAGE/쿠마시 염색은 도 4에 도시된다.
정용여과: 최종 정제 단계에서 DEAE 컬럼으로부터 용출된 놀워크 VLPs는 정용여과되고 농축된다. 이 절차는 살균된 교반된 세포 정용여과 장치에 VLPs를 놓는 것을 포함한다. 액체의 부피는 50% 만큼 감소하며 주사용 물은 최초 부피에 다시 첨가된다. 이 공정은 전체 10회 반복되었다. 농축액은 정용여과된 놀워크 VLPs를 함유한다. 이 물질은 최종 살균 여과 공정을 통과한다. 분취액은 QC 검사 및 방출을 위해 채취된다. 정용여과 분획들로부터 SDS-PAGE/쿠마시 염색은 도 5에 도시된다.
VLP 함량: 정제를 통해, 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 겔들은 VLPs를 함유하는 분획들을 동정하기 위해 사용된다. 정제하는 동안, 분획은 동일한 겔에서 작동하는 VLP 참조 물질과 유사한 분자량으로 이동하는 밴드가 관찰되면 VLPs를 함유하는 것으로 생각된다. VLP 밴드가 VLP 표준의 강도와 동일하거나 더 큰 강도를 갖는 분획들만 합쳐진다.
단백질 농도: 공정에서 단백질 농도(초여과 단계)는 단백질과의 비친코닉산(bicinchonic acid) 반응을 기초로 한 발색법에 의해 측정된다.
개시된 방법에 의해 크로마토그래피적으로 정제된 놀워크 바이러스 VLPs의 품질은 표 1에 나타내어진다. 크로마토그래피적으로 정제된 놀워크 바이러스 VLPs는 투과전자현미경(TEM) 및 CD 스펙트럼을 사용하는 초원심분리 방법에 의해 정제된 VLPs와 비교되었다. 결과들은 도 6-13에 도시된다.
| 검사 | 품질 | 결과 |
| 정체 | a. 49 내지 62 KDa 사이의 SDS-PAGE 단백질 밴드에 의한 분자량 b. 웨스턴 블럿에 의해 탐지된 49 내지 62kDa 단백질에 대해 확인 |
컴파일 컴파일 |
| 단백질 농도 | 0.5mg/mL 내지 1.5mg/mL | 1.40mg/mL |
| 순도 | 90% 크기 배제 크로마토그래피 보다 크다 | >99% |
| 숙주 세포 DNA | <100pg/mL | <100pg/mL |
| 바큘로스바이러스 DNA | <100pg/mL | >31 & <62pg/mL |
| 숙주 세포 단백질 | 640EU/mL 미만 | <0.3% |
| 엔도톡신 | >320 & <640 EU/mL |
|
| pH | ≤7.0 | 5.4 |
실시예
2.
노로바이러스
유전자군 II 바이러스의 정제
방법의 일반적 설명
휴스톤 정제 공정은 오쏘거널 매커니즘을 사용하여 고순도 VLPs를 생산하는 계량가능한 공정이 된다. HA, HIC 및 음이온 교환과 같은 놀워크 정제 공정과 반대로, 2 컬럼 공정은 유전자군 II.4 휴스톤 바이러스 VLP에 잘 작동한다는 것을 발견한다.
휴스톤 VLPs를 정제하기 위해, VLPs를 함유하는 조절된 매질은 여과 또는 원심분리에 의해 정제되며 20mM 인산시트르산 버퍼, pH 4.0으로 평형화된 양이온 교환 SP FF 수지 위에 적재된다. 20% 용출 버퍼(20mM 인산 시트르산, 1M 염화나트륨) 후, VLPs는 단계 기울기 및 100% 용출 버퍼를 사용하여 용출된다.
휴스톤 VLPs를 함유하는 양이온 교환 컬럼으로부터의 분획들은 합쳐지고 이온 강도는 15%(w/v) 황산암모늄의 첨가를 통해 조절된다. 이 합쳐진 물질은 2.4M 황산암모늄(버퍼 A)을 함유하는 pH 6.8의 인산염 버퍼를 가진 메틸 HIC 수지를 함유하는 컬럼 위에 적재된다. 적재 후에, 3 단계 기울기 용출은 HIC 수지로부터 VLPs를 용출하는데 사용된다. 제 1 단계에서, 40% 용출 버퍼(100mM 인산나트륨)는 오염물들을 용출하는데 사용된다. 다음으로, 기울기는 VLPs를 용출시키는 70% 용출 버퍼까지 증가되고 최종적으로 기울기는 용출이 완료되는 것을 확보하고 임의의 잔존하는 오염물들을 용출하기 위해 100% 용출 버퍼로 조절된다. 70% 용출 버퍼 속의 메틸 HIC 크로마토그래피로부터의 VLPs를 함유하는 용출 피크는 20mM 인산 시트르산 버퍼 및 150mM 염산나트륨 속으로 pH 6.0까지 투석된다.
소량 생산 작업을 기초로, 공정은 200 내지 500mL 스피너 플라스크로부터 5 내지 15mg의 정제 VLPs를 얻고 SDS-PAGE에 의해 90% 보다 큰 VLP 순도를 얻는다.
표 2는 유전자군 II 노로바이러스, 휴스톤 바이러스에 대한 정제 공정을 요약한다. 도 14 및 15는 양이온 교환 단계의 결과를 제공하는 반면에, 도 16 및 17은 메틸 HIC 크로마토그래피 단계로부터의 결과를 제공한다. 도 18 및 19는 정제된 휴스톤 바이러스 단백질의 SDS-PAGE 및 HPLC-SEC를 제공한다.
| 배양 조건 | MOI = 1 3 x 106cells/mL 7일에 NaCl을 150mM 첨가 상청액을 수집 |
|
| 정제 프로토콜 |
1단계: 양이온 교환 SP FF 수지 |
평형 버퍼: 2mM 인산 시트르산 pH 6.0 용출 버퍼: 20mM 인산 시트르산, 1M 염화 나트륨 pH 4.0 단계 기울기: 1단계 - 20% 용출 버퍼로 세척; 2단계 - 100% 용출 버퍼로 용출 |
| 2단계: 메틸 HIC 수지 - 출발 물질은 15% 황산암모늄을 함유한다. | 평형 버퍼: 100mM 인산나트륨, 2.4M 황산암모늄 pH 6.8 용출 버퍼:100mM 인산나트륨 pH 6.8 15%(w/v)까지 황산암모늄의 첨가로 채워진 샘플. 단계 기울기: 1단계 - 40% 용출 버퍼로 세척; 2단계 - 70% 용출 버퍼로 용출; 3단계 - 100% 용출 버퍼로 세척. |
|
| 3단계: 버퍼로 투석 | 70% 용출 버퍼를 가진 메틸 HIC 크로마토그래피로부터 얻은 용출 피크를 20mM 인산 시트르산 버퍼, 150mM 염화나트륨 속에 pH 6.0으로 투석된다. | |
| 최종 수율 | 20-30mg 정제 단백질/L |
표 2에 약술된 공정 이외에, 탈이온수의 첨가를 통해 조절된 매질의 이온 강도를 감소시킴으로써 휴스톤 VLPs를 선택적으로 침전시킬 수 있다. 이것은 침전 공정에 의해 발생한 부피의 빠른 감소 때문에 상당한 장점을 제공한다. 일단 침전화되면, VLPs는 원심분리 또는 여과를 사용하여 분리될 수 있다. 침전된 VLPs는 적절한 버퍼에 재현탁되고 상기한 크로마토그래피 방법을 추가로 사용하여 정제된다. 본 발명자들은 이런 크로마토그래피 기술의 적어도 둘 및 모두 셋을 사용하여 계량가능한 정제 방법을 개발하는 것을 고려한다. 본 정제법 개발의 목적은 초원심분리를 통해 정상적으로 생산된 VLPs와 품질이 동일하고 휴스톤 VLPs의 상업적 제조를 위해 대용량으로 생산될 수 있는 기능성 VLPs를 제공할 수 있는 정제법을 얻는 것이다.
상기에 제공된 사전 데이터는 크로마토그래피 방법은 휴스톤 바이러스 VLPs의 정제에 효과적일 것이라는 것을 증명한다. VLPs는 여러 수지에 결합되고 적절한 버퍼들로 용출될 수 있다. 개발의 다음 단계는 이런 크로마토그래피는 더 순수한 생성물을 생산하기 위해 사용되어 질 조합과 순서를 결정하는 것이다. 또한, 추가 실험들이 최대 수율의 VLPs를 얻기 위해 이런 크로마토그래피 기술들에 필요한 변형들을 결정하기 위해 행해질 것이다. 완성된 방법은 휴스톤 바이러스 VLPs의 대용량 생산과 정제에 사용될 것이다.
실시예
3.
황산암모늄
침전화에
의한 유전자군 II
VLPs
의 정제
휴스톤 VLPs의 부분적으로 정제된 제제를 1mL 분취량으로 나누었다. 황산암모늄은 10% 내지 35%(w/v)의 최종 농도를 얻기 위해 각 분취량에 첨가되었다. 샘플들을 회전기에 놓고 4℃에서 밤새 혼합하였다. 샘플들을 눈으로 검사하여 침전이 생겼는지 확인하였다. 20㎕의 분취량을 제거하고 "Amm 현탁액"으로 표시했다. 황산암모늄 현탁액을 10분 동안, 실온에서 14,000 x g에서 원심분리하였다. 결과로 얻은 상청액을 모아서 "시트르산 상청액"으로 표시했다. 도 20은 정제 공정 전체의 다른 지점에서 채취한 샘플들의 은 염색 SDS-PAGE 겔을 도시한다. "시트르산 염 상청액"에서 두 밴드는 정제된 휴스톤 VLPs를 나타낸다.
황산암모늄 침전화 단계는 도 21에 도시된 대로 VLPs의 순도를 현저하게 향상시켰다. 숙주 세포 단백질(HCP) 대 VLP 단백질의 비율은 황산 암모늄 침전화의 결과와 같이 대략 절반으로 감소하였다.
실시예 4. 침전화에 의한 노로바이러스 유전자군 II VLPs 의 정제 후 4차 아민(Q) 크로마토그래피
휴스톤
VLP
정제 공정
SF9 세포들의 1 리터 현탁 배양액을 1.7 x 107 cells/mL의 밀도까지 성장시키고 휴스톤 VP1 서열을 암호화하는 재조합 바큘로바이러스 원료로 0.5pfu/cell의 MOI(감염 다중도)로 감염시켰다. 감염은 20% 미만의 생존력이 되도록 허용된다(도 22, 레인 2). 휴스톤 VLPs를 다음 방식으로 채취하고, 정제하고 농축하였다. 배양액의 pH는 VLPs를 침전시키기 위해 HCl(레인 3)을 사용하여 5.5로 낮추었다. pH 5.5의 배양액을 실온에서 5분 동안 1,000 x g에서 원심분리하였다. 상청액(레인 4)을 기울여 따라서 버렸다. 다음으로, 잔존하는 펠렛을 pH 8(레인 5)에서, 20mM 트리스, 50mM NaCl, 10mM EDTA에 재현탁하였다. 재현탁된 펠렛을 5분 동안 1,000 x g에서 원심분리하였다. 상청액은 기울여 따르고 "휴스톤 VLP 추출물"로 표시했다(레인 6). 침전화 공정은 레인 2의 출발 물질에서 관찰된 여러 밴드와 비교한 것과 같이 레인 6의 하나의 밴드에 의해 도시된 대로 순도를 상당히 개선시켰다(도 22).
채취한 후, 휴스톤 VLP 추출물을 물로 1:2로 희석하고 Q100 막 위에 적재했다. 유동상 버퍼는 20mM 트리스 pH 6.5이었고 용출 버퍼는 20mM 트리스, 1M NaCl pH 6.5이었다. 적재 후에, 컬럼을 20% 용출 버퍼(도 22, 레인 7)로 세척하고 50% 용출 버퍼(레인 8)로 세척하였다. 도 22에 도시된 은 염색 SDS-PAGE 겔은 휴스톤 VLPs는 이 캡쳐 크로마토그래피 단계에 의해 농축된다는 것을 보여준다(레인 8과 레인 2 비교).
라우렌
VLP
정제 공정
휴스톤 VLPs에 대해 상기한 VLP 채취 공정을 GII.4 라우렌 바이러스로부터의 VP1 서열을 암호화하는 재조합 바큘로바이러스 원료로 감염된 SF9 배양액에 사용하여, 라우렌 VLP 추출물을 얻었다(도 23, 레인 11). 재현탁된 펠렛을 물로 1:2로 희석하고 Q100 막 위에 적재했다. 유동상 버퍼는 20mM 트리스 pH 6.8이었고 용출 버퍼는 20mM 트리스, 1M NaCl pH 6.8이었다. 도 23의 레인 2 내지 10은 Q100 막으로부터의 단계 기울기 용출에 의해 수집된 분획들을 나타낸다. VLPs는 40% 용출 버퍼 분획에 용출되었다(레인 5-8). 휴스톤으로 관찰된 것과 같이, 라우렌 VLPs는 pH 조절 및 포획 크로마토그래피를 사용하여 정제되고 농축될 수 있다.
실시예
5.
노로바이러스
GI 및 GII
VLP
구조에서 pH-의존성 변화
VLP 정제 절차를 더 최적화하기 위해서, 노로바이러스 GI 및 GII 군주로부터의 VLPs의 안정성은 약 pH 2 내지 약 pH 10의 pH 범위에 노출되었다.
손상되지 않은 VLPs는 대략 10MDa 질량이다. 특정 pH 조건에 노출되고 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)에 의해 분석된 손상되지 않은 VLPs는 구형 단백질 크기 표준에 비해 약 220 kDa의 질량을 가진 안정한 중간 단편으로의 전이를 보여준다. 완전한 변성 조건은 중간 단편을 약 60kDa의 모노머로 추가로 분해시킨다. 노로바이러스 VLPs가 손상되지 않고 존재하는 pH 범위를 추가로 경험하기 위해서, 노로바이러스 GI VLPs 또는 노로바이러스 GII VLPs를 함유하는 용액의 pH는 SE-HPLC로 분석하기 이전에 약 2로부터 약 10으로 증가하도록 조절되었다. 또한, SE-HPLC 컬럼 버퍼는 분석을 위한 동일한 pH로 조절되었다.
pH 2(도 24a) 내지 pH 8(도 24b)의 pH 조건에 노출된 노로바이러스 GI VLPs는 약 17분에 손상되지 않은 단분산 VLPs를 나타내는 하나의 흡수 피크를 나타낸다. pH 8.5(도 24c)에 노출된 VLPs는 약 33분에서 흡수 피크를 나타내어, 더 낮은 등급의 안정한 중간 VLP 단편을 나타낸다. 이런 결과는 노로바이러스 GI VLPs는 pH 2 내지 8에 손상되지 않으며 pH 8 내지 8.5에서 안정한 중간 단편으로 분해된다는 것을 나타낸다.
pH 2(도 25a) 내지 pH 9.5(도 25b)의 pH 조건에 노출된 노로바이러스 GII VLPs는 약 17분에 손상되지 않은 단분산 VLPs를 나타내는 하나의 흡수 피크를 나타내는 반면에, pH 10(도 25c)에 노출된 VLPs는 약 34분에서 흡수 피크를 나타낸다. 따라서, 이런 결과는 노로바이러스 GII VLPs는 pH 2 내지 9.5에 손상되지 않으며 pH 9.5 내지 10에서 안정한 중간 단편으로 분해된다는 것을 나타낸다.
이런 실험들의 결과는 VLPs를 함유하는 용액의 pH를 조절함으로써 손상되지 않은 VLPs 또는 단편을 얻는 조건을 선택할 수 있게 한다. 이런 조건들은 정제 공정을 용이하게 할 수 있다.
실시예
6. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하는
VLP
단백질의
침전화
염의 첨가에 의해 VLPs의 침전화를 위해 관찰된 것과 유사한 방식으로, 유사한 결과들이 VLPs의 선택적 침전 및 용해를 일으키도록, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 다른 첨가제들을 사용하여 나타날 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG) 질량과 농도의 최적 농도를 측정하기 위해서, 200 내지 20,000의 분자 질량을 가진 PEG가 5% 증가하여 0 내지 50% PEG의 최종 PEG 농도가 되는 양으로 VLPs를 함유하는 용액에 첨가된다. 각 5% PEG 첨가 이후, VLP 함유 용액을 10,000g에서 원심분리하고 상청액의 샘플들을 얻었다. 상청액 샘플들을 SDS-PAGE, ELISA 및/또는 HPLC 분석하여 VLPs의 순도와 전체 농도를 측정하였다.
VLPs는 상청액에서 최초로 발견될 것이다. PEG 농도가 증가함에 따라, VLPs 및 오염 단백질은 여러 등급으로 침전될 것이다. 펠렛이 관찰되는 경우, 펠렛은 상청액을 기울여 따르고 수집한다. 펠렛은 버퍼에 재현탁되고 VLPs의 순도는 SDS-PAGE에 의해 분석된다. 재현탁된 펠렛에서 전체 VLP 함량은 ELISA 또는 HPLC에 의해 측정된다. 상청액 및 펠렛 대 PEG 질량 및 농도의 상대 순도의 표 또는 그래프가 만들어진다. 최적 PEG 질량 및 PEG 농도 조합은 허용가능한 수율 또는 생성물 재생으로 최고의 순도를 나타내는 조건을 기초로 선택된다.
Claims (13)
- 크로마토그래피 공정을 사용하여 노로바이러스 바이러스 유사 입자(VLPs)를 정제하는 방법으로, 방법은 상기 VLPs를 함유하는 용액을 수산화인회석 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 단계를 포함하며, VLPs는 인산염 버퍼를 사용하여 수산화인회석 물질로부터 용출되며, 수산화인회석 물질로부터의 용출 이후 여과 단계를 추가로 포함하는 것인 노로바이러스 바이러스 유사 입자(VLPs)를 정제하는 방법.
- 제 1 항에 있어서,
크로마토그래피 공정이 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 및 이온 교환 크로마토그래피 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. - 제 2 항에 있어서,
크로마토그래피 공정은
(a) 상기 VLPs를 함유하는 용액을 수산화인회석 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 단계;
(b) 인산염 버퍼를 사용하여 수산화인회석 크로마토그래피 물질로부터 상기 VLPs를 용출하는 단계;
(c) 단계(b)로부터의 용출액을 HIC 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 단계;
(d) 상기 HIC 크로마토그래피 물질로부터 상기 VLPs를 용출하는 단계;
(e) 단계(d)로부터의 용출액을 이온 교환 크로마토그래피 물질과 접촉시키는 단계; 및
(f) 상기 이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 상기 VLPs를 용출하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 제 2 항에 있어서,
이온 교환 크로마토그래피 물질은 DEAE 이온 교환 크로마토그래피 물질인 방법. - 제 1 항에 있어서,
여과 단계는 초여과 단계, 정용여과 단계 또는 이들의 조합인 방법. - 제 1 항에 있어서,
노로바이러스 VLPs는 노로바이러스 유전자군 I VLPs인 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 VLPs를 함유하는 용액은 세포 용해물 또는 배지 상청액이며, 세포 용해물 또는 배지 상청액은 재조합 방법을 사용하여 생산되는 것인 방법. - 제 7 항에 있어서,
VLPs는 박테리아 세포, 곤충 세포, 효모 세포 또는 포유류 세포에서 생산되는 것인 방법. - 제 7 항에 있어서,
숙주 세포 DNA 함량의 오염 수준은 100pg/mL 미만인 방법. - 제 7 항에 있어서,
숙주 세포 단백질의 오염 수준은 1중량% 미만인 방법. - 제 10 항에 있어서,
숙주 세포 단백질의 오염 수준은 0.5중량% 미만인 방법. - 제 1 항의 방법에 의해 제조된 VLPs를 포함하는 백신.
- 제 1 항에 있어서,
방법이 황산암모늄 또는 PEG 침전화 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US90682107P | 2007-03-14 | 2007-03-14 | |
| US60/906,821 | 2007-03-14 | ||
| PCT/US2008/057072 WO2008113011A2 (en) | 2007-03-14 | 2008-03-14 | Virus like particle purification |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020157020558A Division KR20150098681A (ko) | 2007-03-14 | 2008-03-14 | 바이러스 유사 입자 정제 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20170001720A true KR20170001720A (ko) | 2017-01-04 |
Family
ID=39760420
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020097021421A KR101576219B1 (ko) | 2007-03-14 | 2008-03-14 | 바이러스 유사 입자 정제 |
| KR1020157020558A KR20150098681A (ko) | 2007-03-14 | 2008-03-14 | 바이러스 유사 입자 정제 |
| KR1020167036031A KR20170001720A (ko) | 2007-03-14 | 2008-03-14 | 바이러스 유사 입자 정제 |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020097021421A KR101576219B1 (ko) | 2007-03-14 | 2008-03-14 | 바이러스 유사 입자 정제 |
| KR1020157020558A KR20150098681A (ko) | 2007-03-14 | 2008-03-14 | 바이러스 유사 입자 정제 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US8481693B2 (ko) |
| EP (1) | EP2134360B1 (ko) |
| JP (4) | JP5284290B2 (ko) |
| KR (3) | KR101576219B1 (ko) |
| AU (1) | AU2008224877B2 (ko) |
| CA (1) | CA2683977C (ko) |
| DK (1) | DK2134360T3 (ko) |
| ES (1) | ES2559421T3 (ko) |
| HK (1) | HK1138795A1 (ko) |
| HU (1) | HUE028605T2 (ko) |
| PL (1) | PL2134360T3 (ko) |
| SG (2) | SG179488A1 (ko) |
| WO (1) | WO2008113011A2 (ko) |
Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG174845A1 (en) | 2006-09-29 | 2011-10-28 | Ligocyte Pharmaceuticals Inc | Norovirus vaccine formulations |
| KR101576219B1 (ko) | 2007-03-14 | 2015-12-10 | 다케다 백신즈 인코포레이티드 | 바이러스 유사 입자 정제 |
| EP2190471A4 (en) | 2007-09-18 | 2012-05-09 | Ligocyte Pharmaceuticals Inc | METHOD FOR TRANSFERRING A PROTECTIVE REACTION ON NOROVIRES |
| US20100266636A1 (en) | 2007-09-18 | 2010-10-21 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Method of conferring a protective immune response to norovirus |
| SG176283A1 (en) | 2009-06-16 | 2012-01-30 | Genzyme Corp | Improved methods for purification of recombinant aav vectors |
| EP2449096A4 (en) * | 2009-07-03 | 2014-01-08 | Univ Queensland | METHOD FOR PRODUCING A BIOLOGICAL PARTICLE STRUCTURE |
| US20110142863A1 (en) * | 2009-12-16 | 2011-06-16 | Millipore Corporation | Flow through purification processes for large biomolecules |
| WO2011088225A1 (en) | 2010-01-15 | 2011-07-21 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Surface neutralization of apatite |
| BR112012026095A2 (pt) * | 2010-04-14 | 2015-09-15 | Emd Millipore Corp | métodos de produção de estoques de vírus de alta pureza e altos títulos e métodos de uso dos mesmos. |
| DE102010046817A1 (de) * | 2010-09-28 | 2012-03-29 | Sartorius Stedim Biotech Gmbh | Verfahren zur Abtrennung von Viren aus einem Kontaminanten enthaltenden flüssigen Medium |
| FI122520B (fi) * | 2010-10-15 | 2012-03-15 | Vesna Blazevic | Noroviruksen kapsidi ja rotaviruksen VP6-proteiini käytettäväksi yhdistelmärokotteena |
| EP2670704B1 (en) | 2011-02-02 | 2018-12-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Apatite surface neutralization with alkali solutions |
| MY170746A (en) | 2011-07-11 | 2019-08-27 | Takeda Vaccines Inc | Parenteral norovirus vaccine formulations |
| EP2554664A1 (de) * | 2011-08-02 | 2013-02-06 | Life Science Inkubator | Verfahren zur Aufreinigung von Virus-ähnlichen Partikeln (VLP) |
| ES2748039T3 (es) * | 2011-12-30 | 2020-03-12 | Deutsches Krebsforsch | Partículas similares a virus (VLP) de segunda generación a partir de virus de Epstein-Barr para fines de vacunación |
| WO2013180933A1 (en) | 2012-05-30 | 2013-12-05 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | In situ restoration of apatite-based chromatography resins |
| JOP20130186B1 (ar) | 2012-06-22 | 2021-08-17 | Takeda Vaccines Montana Inc | تنقية الجزيئات الشبيهة بالفيروسات |
| SG11201505190VA (en) * | 2013-02-22 | 2015-08-28 | Agency Science Tech & Res | Chromatographic purification of virus preparations with negatively charged particles |
| JP6479305B2 (ja) | 2013-07-12 | 2019-03-06 | 株式会社Ｕｍｎファーマ | ウイルス様粒子の精製方法 |
| JP2015017065A (ja) * | 2013-07-12 | 2015-01-29 | 株式会社Ｕｍｎファーマ | ノロウイルスのウイルス様粒子を含む医薬組成物 |
| JP2015015931A (ja) * | 2013-07-12 | 2015-01-29 | 株式会社Ｕｍｎファーマ | ウイルス様粒子を含む培養物の製造方法 |
| EP3052631B1 (en) | 2013-10-03 | 2019-08-07 | Takeda Vaccines, Inc. | Methods of detection and removal of rhabdoviruses from cell lines |
| WO2015200278A1 (en) | 2014-06-23 | 2015-12-30 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Apatite in-situ restoration |
| EP3157689B1 (en) | 2014-06-23 | 2021-04-28 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Apatite pretreatment |
| CN107603959A (zh) * | 2017-08-30 | 2018-01-19 | 四川大学 | 提高缓冲液盐离子浓度纯化病毒的方法 |
| CN114008067A (zh) * | 2019-07-04 | 2022-02-01 | 株式会社钟化 | 病毒或病毒样颗粒的纯化方法 |
| EP4206329A4 (en) * | 2020-08-28 | 2024-11-20 | Kaneka Corporation | Method for purifying useful substance |
| WO2022246323A1 (en) | 2021-05-21 | 2022-11-24 | Takeda Vaccines, Inc. | Solid composition, freeze-drying method and glass vial |
Family Cites Families (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2833106B2 (ja) | 1990-02-21 | 1998-12-09 | 株式会社島津製作所 | 液体クロマトグラフ |
| WO1994026087A2 (en) | 1993-05-14 | 1994-11-24 | Connor Kim C O | Recombinant protein production and insect cell culture and process |
| PL183781B1 (pl) * | 1994-05-16 | 2002-07-31 | Merck & Co Inc | Sposób wytwarzania szczepionki przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaków |
| AR004464A1 (es) * | 1994-11-14 | 1998-12-16 | Merck Sharp & Dohme | Un metodo para producir una proteina de capside de papilomavirus |
| JP3316325B2 (ja) | 1994-12-20 | 2002-08-19 | 富士シリシア化学株式会社 | ビール安定化処理用シリカゲル及びその製造方法並びにビールの安定化処理方法 |
| US5641870A (en) | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
| WO1998021338A1 (en) | 1996-11-08 | 1998-05-22 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Synthesis and purification of hepatitis c virus-like particles |
| DK1015561T3 (da) | 1997-09-05 | 2006-11-13 | Medimmune Inc | In vitro-fremgangsmåde til adskillelse/gensamling af papillomavirus-lignende partikler (VLP'er) |
| DE19823814A1 (de) | 1998-05-27 | 1999-12-02 | Octapharma Ag Ziegelbruecke | Verfahren zur Trennung und/oder Isolierung von Plasmaproteinen mit annularer Chromatographie |
| CZ2001570A3 (cs) | 1998-08-14 | 2001-09-12 | Merck & Co., Inc. | Způsob čištění částic, podobných lidskému papillomaviru |
| US6349843B1 (en) | 1999-04-01 | 2002-02-26 | The Vollrath Company Llc | Pan removal ramp |
| KR100762092B1 (ko) * | 1999-06-22 | 2007-10-04 | 국립감염증연구소장이 대표하는 일본국 | Ｓｒｓｖ 검출 킷트 |
| DE10012732A1 (de) | 2000-03-18 | 2001-09-20 | Aventis Behring Gmbh | Thrombin-Zubereitungen und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| JP2003066021A (ja) | 2001-08-28 | 2003-03-05 | Hiroshi Shionoya | 連続分取液体クロマトグラフィー装置とそれを用いる方法 |
| US7041500B2 (en) * | 2002-02-14 | 2006-05-09 | Novavax, Inc. | Insect cell line |
| WO2003102132A2 (en) | 2002-04-26 | 2003-12-11 | Genetech, Inc. | Non-affinity purification of proteins |
| WO2004020971A2 (en) | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Introgen Therapeutics Inc. | Chromatographic methods for adenovirus purification |
| US7879338B2 (en) * | 2003-07-21 | 2011-02-01 | Boyce Thompson Institute For Plant Research | Vectors and methods for immunization against norovirus using transgenic plants |
| US7481997B1 (en) * | 2004-02-12 | 2009-01-27 | Montana State University | Snow mountain virus genome sequence, virus-like particles and methods of use |
| WO2006138514A2 (en) * | 2005-06-16 | 2006-12-28 | Children's Hospital Medical Center | Novel norovirus particle for use as an antiviral or vaccine |
| EP1736538A1 (en) * | 2005-06-21 | 2006-12-27 | Cytos Biotechnology AG | Process for the preparative purification of virus-like-particles (VLPs) |
| CA2630220C (en) | 2005-11-22 | 2020-10-13 | Doris Coit | Norovirus and sapovirus antigens |
| CN103536914B (zh) | 2005-12-29 | 2015-11-11 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | 多价pcv2免疫原性组合物和制备此类组合物的方法 |
| AU2007345768B2 (en) | 2006-07-27 | 2013-08-01 | Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric influenza virus-like particles |
| SG174845A1 (en) | 2006-09-29 | 2011-10-28 | Ligocyte Pharmaceuticals Inc | Norovirus vaccine formulations |
| US8202967B2 (en) | 2006-10-27 | 2012-06-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | H5 proteins, nucleic acid molecules and vectors encoding for those, and their medicinal use |
| KR101576219B1 (ko) | 2007-03-14 | 2015-12-10 | 다케다 백신즈 인코포레이티드 | 바이러스 유사 입자 정제 |
| EP2027875A1 (en) | 2007-08-23 | 2009-02-25 | Octapharma AG | A Process for Isolation and Purification of a Target Protein free of Prion Protein (PrPSC) |
| EP2190471A4 (en) | 2007-09-18 | 2012-05-09 | Ligocyte Pharmaceuticals Inc | METHOD FOR TRANSFERRING A PROTECTIVE REACTION ON NOROVIRES |
| WO2009080781A1 (en) | 2007-12-21 | 2009-07-02 | Cytos Biotechnology Ag | Process for clarifying cell homogenates |
| KR101793161B1 (ko) * | 2008-08-08 | 2017-11-03 | 다케다 백신즈 인코포레이티드 | 강화된 교차 반응성을 가진 복합체 캡시드 아미노산 서열들을 포함하는 바이러스-유사 입자들 |
| AU2009319979B2 (en) | 2008-11-03 | 2016-10-20 | Takeda Vaccines, Inc. | Improved methods for isolating enveloped virus-based VLPs free of infectious agents |
| US8945895B2 (en) | 2009-07-31 | 2015-02-03 | Baxter International Inc. | Methods of purifying recombinant ADAMTS13 and other proteins and compositions thereof |
| SG182636A1 (en) * | 2010-01-21 | 2012-08-30 | Ligocyte Pharmaceuticals Inc | Targeted heterologous antigen presentation on calicivirus virus-like particles |
| EP2619217B1 (en) | 2010-09-20 | 2016-11-09 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Dissociation of product-complexed contaminants in chromatography |
| FI122520B (fi) | 2010-10-15 | 2012-03-15 | Vesna Blazevic | Noroviruksen kapsidi ja rotaviruksen VP6-proteiini käytettäväksi yhdistelmärokotteena |
| CN102260651A (zh) | 2011-06-24 | 2011-11-30 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 一种纯化病毒样颗粒蛋白的方法及其应用 |
| JOP20130186B1 (ar) | 2012-06-22 | 2021-08-17 | Takeda Vaccines Montana Inc | تنقية الجزيئات الشبيهة بالفيروسات |
| JP2015015931A (ja) | 2013-07-12 | 2015-01-29 | 株式会社Ｕｍｎファーマ | ウイルス様粒子を含む培養物の製造方法 |
-
2008
- 2008-03-14 KR KR1020097021421A patent/KR101576219B1/ko active IP Right Grant
- 2008-03-14 EP EP08782762.2A patent/EP2134360B1/en active Active
- 2008-03-14 PL PL08782762T patent/PL2134360T3/pl unknown
- 2008-03-14 SG SG2012018131A patent/SG179488A1/en unknown
- 2008-03-14 CA CA2683977A patent/CA2683977C/en active Active
- 2008-03-14 AU AU2008224877A patent/AU2008224877B2/en active Active
- 2008-03-14 DK DK08782762.2T patent/DK2134360T3/en active
- 2008-03-14 ES ES08782762.2T patent/ES2559421T3/es active Active
- 2008-03-14 KR KR1020157020558A patent/KR20150098681A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-03-14 US US12/531,248 patent/US8481693B2/en active Active
- 2008-03-14 KR KR1020167036031A patent/KR20170001720A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-03-14 JP JP2009553820A patent/JP5284290B2/ja active Active
- 2008-03-14 HU HUE08782762A patent/HUE028605T2/en unknown
- 2008-03-14 WO PCT/US2008/057072 patent/WO2008113011A2/en active Application Filing
- 2008-03-14 SG SG10201701988TA patent/SG10201701988TA/en unknown
-
2010
- 2010-06-09 HK HK10105749.1A patent/HK1138795A1/zh unknown
-
2013
- 2013-05-29 JP JP2013112580A patent/JP2013176392A/ja active Pending
- 2013-06-10 US US13/914,331 patent/US9359410B2/en active Active
-
2016
- 2016-05-02 US US15/144,265 patent/US10172930B2/en active Active
-
2017
- 2017-02-23 JP JP2017032171A patent/JP2017086090A/ja active Pending
-
2018
- 2018-12-07 US US16/213,297 patent/US10792353B2/en active Active
-
2019
- 2019-01-07 JP JP2019000688A patent/JP2019068846A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2008113011A3 (en) | 2008-12-24 |
| JP2010530734A (ja) | 2010-09-16 |
| EP2134360A2 (en) | 2009-12-23 |
| KR101576219B1 (ko) | 2015-12-10 |
| US10792353B2 (en) | 2020-10-06 |
| KR20100015562A (ko) | 2010-02-12 |
| HUE028605T2 (en) | 2016-12-28 |
| US8481693B2 (en) | 2013-07-09 |
| JP2017086090A (ja) | 2017-05-25 |
| CA2683977A1 (en) | 2008-09-18 |
| US20100150961A1 (en) | 2010-06-17 |
| ES2559421T3 (es) | 2016-02-12 |
| US9359410B2 (en) | 2016-06-07 |
| CA2683977C (en) | 2017-04-25 |
| SG179488A1 (en) | 2012-04-27 |
| JP5284290B2 (ja) | 2013-09-11 |
| KR20150098681A (ko) | 2015-08-28 |
| PL2134360T3 (pl) | 2016-05-31 |
| EP2134360A4 (en) | 2011-08-24 |
| DK2134360T3 (en) | 2016-02-22 |
| AU2008224877A1 (en) | 2008-09-18 |
| US10172930B2 (en) | 2019-01-08 |
| JP2013176392A (ja) | 2013-09-09 |
| HK1138795A1 (zh) | 2010-09-03 |
| AU2008224877B2 (en) | 2013-07-11 |
| JP2019068846A (ja) | 2019-05-09 |
| US20130344107A1 (en) | 2013-12-26 |
| US20190282686A1 (en) | 2019-09-19 |
| EP2134360B1 (en) | 2015-11-18 |
| SG10201701988TA (en) | 2017-04-27 |
| WO2008113011A2 (en) | 2008-09-18 |
| US20160317645A1 (en) | 2016-11-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101576219B1 (ko) | 바이러스 유사 입자 정제 | |
| CN101490248B (zh) | 纯化流感病毒的方法 | |
| Li et al. | A hydrophobic interaction chromatography strategy for purification of inactivated foot-and-mouth disease virus | |
| Tseng et al. | A fast and efficient purification platform for cell-based influenza viruses by flow-through chromatography | |
| KR20010072470A (ko) | 사람 유두종바이러스 바이러스-유사 입자의 정제방법 | |
| JP6385374B2 (ja) | タンパク質製剤からエンドトキシンを除去するための物質および方法 | |
| US20250034593A1 (en) | Method for Adenovirus Purification | |
| JP2016530271A (ja) | 細胞の破砕及び／又は生体分子の回収のための微粒子 | |
| JP2024527602A (ja) | アデノ随伴ウイルスカプシドを分離するための方法、前記方法によって得られる組成物及びその使用 | |
| AU2013242822B2 (en) | Virus like particle purification | |
| AU2016269506A1 (en) | Virus like particle purification | |
| JP2024004020A (ja) | Ａ型肝炎ウイルスのクロマトグラフィー精製方法 | |
| Alves | Production, concentration and purification strategies for Bluetongue virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A107 | Divisional application of patent | ||
| PA0104 | Divisional application for international application |
Comment text: Divisional Application for International Patent Patent event code: PA01041R01D Patent event date: 20161222 Application number text: 1020157020558 Filing date: 20150728 |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| A201 | Request for examination | ||
| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 20170117 Comment text: Request for Examination of Application |
|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20170213 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E601 | Decision to refuse application | ||
| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20181026 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20170213 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |