JP2024004020A - Ａ型肝炎ウイルスのクロマトグラフィー精製方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、従来技術と比較して効率的に不純物を除去できるクロマト工程が組み込まれたＡ型肝炎ウイルスの精製方法を提供することを目的とする。【解決手段】Ａ型肝炎ウイルスの精製方法であって、ａ）Ａ型肝炎ウイルスに感染した細胞を培養し、培養した細胞を回収する工程；ｂ）回収した細胞を可溶化して可溶化液を得る工程；ｃ）得られた可溶化液を、ジエチルアミノプロピルを有する架橋アガロースを含むクロマトグラフィー担体を有する陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してＡ型肝炎ウイルスを分離し、その後溶出液を得る工程；およびｄ）得られた溶出液をゲルろ過クロマトグラフィーに供する工程、を含む、Ａ型肝炎ウイルスの精製方法。【選択図】なし
Description
本発明は、Ａ型肝炎ワクチン製造における、陰イオン交換クロマトグラフィーによるＡ型肝炎ウイルスの精製方法に関する。具体的には、陰イオン交換体官能基としてジエチルアミノプロピルを有する架橋アガロースを含むクロマトグラフィー担体を使用するＡ型肝炎ウイルスの精製方法に関する。
Ａ型肝炎ウイルスは、直径２７ｎｍの正２０面体のピコルナウイルス科のＲＮＡウイルスである。遺伝子型は７種類あり、世界の各地域で流行型に差が存在するが、血清型は１種類であるため、遺伝子型による免疫抗原性に違いは見られない。
Ａ型肝炎ウイルスは、培養細胞において増殖性があるが、その速度は遅く、２～３週間かけてゆっくり増殖する。一般的に細胞変性効果（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）を示さず、細胞内に貯留する。
Ａ型肝炎ウイルスが人に感染した場合は、２～６週間の潜伏期間を経て、発熱、倦怠感などに続いて血清トランスアミラーゼが上昇する。また、食欲不振、嘔吐などの症状の他、黄疸、肝腫大、濃色尿、灰白色便などの症例が見られる。一般的には慢性化することはなく、１～２ヶ月経過後に回復するが、まれに劇症肝炎を発症する場合もある。近年、海外渡航者の増加により、Ａ型肝炎ウイルスへの感染リスクが増加しており、Ａ型肝炎ワクチンの需要が増している。
従来技術としてのＡ型肝炎ワクチンの製造方法は次の通りである。（特許文献１）
［１］ ワクチン製造用のＡ型肝炎ウイルスを、アフリカミドリザル腎臓由来の株化細胞であるＧＬ３７細胞に接種して感染させる；
［２］ ３週間のローラーボトル培養を行うことによって、感染したＡ型肝炎ウイルスをＧＬ３７細胞内で増殖させる；
［３］ 培養終了後、細胞を界面活性剤により溶解してＡ型肝炎ウイルスを回収し、細胞溶解液を得る；
［４］ 細胞溶解液をろ過にて清澄化し、塩析及び遠心で濃縮後、クロロホルム、酵素及び有機溶媒で処理し、精製ウイルス液とする；
［５］ 精製ウイルス液をホルマリンで不活化し、ワクチン原液とする。
［１］ ワクチン製造用のＡ型肝炎ウイルスを、アフリカミドリザル腎臓由来の株化細胞であるＧＬ３７細胞に接種して感染させる；
［２］ ３週間のローラーボトル培養を行うことによって、感染したＡ型肝炎ウイルスをＧＬ３７細胞内で増殖させる；
［３］ 培養終了後、細胞を界面活性剤により溶解してＡ型肝炎ウイルスを回収し、細胞溶解液を得る；
［４］ 細胞溶解液をろ過にて清澄化し、塩析及び遠心で濃縮後、クロロホルム、酵素及び有機溶媒で処理し、精製ウイルス液とする；
［５］ 精製ウイルス液をホルマリンで不活化し、ワクチン原液とする。
Ａ型肝炎ワクチンの製造方法の改良として、陰イオン交換体及びゲル濾過のクロマトグラフィー操作を界面活性剤の存在下で行う精製方法が開示されている（特許文献２）。特許文献２における陰イオン交換クロマトグラフィーでは、Ａ型肝炎ウイルス粒子が担体に一旦保持され、それを後に溶出させる条件が設定されている。しかしながら、先行特許文献で実際に検討された陰イオン交換体はＤＥＡＥ系の特定の担体のみである。
また、株化細胞で増殖後に回収されたＡ型肝炎ウイルス調製物をプロテアーゼで処理し、Ａ型肝炎ウイルスをプロテアーゼ消化タンパク質から分離し、そして当該ウイルスを失活させる工程を含むＡ型肝炎ウイルスの製法が開示されている（特許文献３）。ここで、プロテアーゼ消化後の精製工程として、イオン交換のステップを行うことも示されている。
上記のような先行技術は存在していたが、陰イオン交換体による不純物の除去については、更なる改善が求められていた。
また、株化細胞で増殖後に回収されたＡ型肝炎ウイルス調製物をプロテアーゼで処理し、Ａ型肝炎ウイルスをプロテアーゼ消化タンパク質から分離し、そして当該ウイルスを失活させる工程を含むＡ型肝炎ウイルスの製法が開示されている（特許文献３）。ここで、プロテアーゼ消化後の精製工程として、イオン交換のステップを行うことも示されている。
上記のような先行技術は存在していたが、陰イオン交換体による不純物の除去については、更なる改善が求められていた。
従来のＡ型肝炎ワクチン製造方法におけるウイルスの精製方法は、ウイルス培養後のハーベスト液（可溶化液）を出発原料とし、遠心分離、抽出等の人手を介した開放系での作業が多く、スケールアップに限界があった。生産能力の向上や工程短縮等を目的に改良精製法が検討されてきたが、従来製法と同等の品質の精製ウイルス液を得るには、クロマト工程での効率的な不純物除去という課題が存在する。
したがって、本発明は、従来技術と比較して効率的に不純物を除去できるクロマト工程が組み込まれたＡ型肝炎ウイルスの精製方法を提供することを目的とする。
本発明者等は、上記の目的を達成するために検討を重ねた結果、クロマト工程の陰イオン交換クロマトグラフィー担体として官能基にジエチルアミノプロピルを有する架橋アガロースを含む担体を使用することで、効率的に不純物を除去し、Ａ型肝炎ウイルスを精製できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
したがって、本発明には以下の発明が含まれる；
［項１］
Ａ型肝炎ウイルスの精製方法であって、
ａ）Ａ型肝炎ウイルスに感染した細胞を培養し、培養した細胞を回収する工程；
ｂ）回収した細胞を可溶化して可溶化液を得る工程；
ｃ）得られた可溶化液を、ジエチルアミノプロピルを有する架橋アガロースを含むクロマトグラフィー担体を有する陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してＡ型肝炎ウイルスを分離し、その後溶出液を得る工程；および
ｄ）得られた溶出液をゲルろ過クロマトグラフィーに供する工程、
を含む、Ａ型肝炎ウイルスの精製方法；
［項２］
工程ｃ）において、分離されたＡ型肝炎ウイルスを高塩濃度緩衝液により溶出させる、項１に記載の方法；
［項３］
工程ｃ）において、平衡化緩衝液が０．２Ｍ ＮａＣｌ以下及び０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）であり、溶出緩衝液が１．０～２．０Ｍ ＮａＣｌ及び０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である、項２に記載の方法；
［項４］
細胞が、アフリカミドリザル腎細胞由来の株化細胞である、項１－３のいずれか一項に記載の方法；
［項５］
アフリカミドリザル腎細胞由来の株化細胞が、Ｖｅｒｏ細胞またはＧＬ３７細胞である、項４に記載の方法；
［項６］
工程ｃ）で得られた溶出液のタンパク質当たりの抗原量（比活性）が０．５ｍｇ抗原／ｍｇ以上である、項１－５のいずれか一項に記載の方法；
［項７］
工程ｄ）のゲルろ過後に、Ａ型肝炎ウイルスを不活化する工程を含む、項１－６のいずれか一項に記載の方法；
［項８］
項１－７いずれか一項に記載の方法によってＡ型肝炎ウイルスを精製し、得られたＡ型肝炎ウイルスを用いることを特徴とする、免疫原性組成物の製造方法；
［項９］
項１－７いずれか一項に記載の方法によってＡ型肝炎ウイルスを精製し、得られたＡ型肝炎ウイルスを用いることを特徴とする、Ａ型肝炎ワクチンの製造方法；
［項１０］
項１－７いずれか一項に記載の方法によってＡ型肝炎ウイルスを精製する工程を含む、Ａ型肝炎ウイルスの製造方法。
［項１］
Ａ型肝炎ウイルスの精製方法であって、
ａ）Ａ型肝炎ウイルスに感染した細胞を培養し、培養した細胞を回収する工程；
ｂ）回収した細胞を可溶化して可溶化液を得る工程；
ｃ）得られた可溶化液を、ジエチルアミノプロピルを有する架橋アガロースを含むクロマトグラフィー担体を有する陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してＡ型肝炎ウイルスを分離し、その後溶出液を得る工程；および
ｄ）得られた溶出液をゲルろ過クロマトグラフィーに供する工程、
を含む、Ａ型肝炎ウイルスの精製方法；
［項２］
工程ｃ）において、分離されたＡ型肝炎ウイルスを高塩濃度緩衝液により溶出させる、項１に記載の方法；
［項３］
工程ｃ）において、平衡化緩衝液が０．２Ｍ ＮａＣｌ以下及び０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）であり、溶出緩衝液が１．０～２．０Ｍ ＮａＣｌ及び０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である、項２に記載の方法；
［項４］
細胞が、アフリカミドリザル腎細胞由来の株化細胞である、項１－３のいずれか一項に記載の方法；
［項５］
アフリカミドリザル腎細胞由来の株化細胞が、Ｖｅｒｏ細胞またはＧＬ３７細胞である、項４に記載の方法；
［項６］
工程ｃ）で得られた溶出液のタンパク質当たりの抗原量（比活性）が０．５ｍｇ抗原／ｍｇ以上である、項１－５のいずれか一項に記載の方法；
［項７］
工程ｄ）のゲルろ過後に、Ａ型肝炎ウイルスを不活化する工程を含む、項１－６のいずれか一項に記載の方法；
［項８］
項１－７いずれか一項に記載の方法によってＡ型肝炎ウイルスを精製し、得られたＡ型肝炎ウイルスを用いることを特徴とする、免疫原性組成物の製造方法；
［項９］
項１－７いずれか一項に記載の方法によってＡ型肝炎ウイルスを精製し、得られたＡ型肝炎ウイルスを用いることを特徴とする、Ａ型肝炎ワクチンの製造方法；
［項１０］
項１－７いずれか一項に記載の方法によってＡ型肝炎ウイルスを精製する工程を含む、Ａ型肝炎ウイルスの製造方法。
本発明においては、官能基としてジエチルアミノプロピルを有する架橋アガロースを含むクロマトグラフィー担体を使用することにより精製されたＡ型肝炎ウイルス液を提供する。当該精製ウイルス液は、Ａ型肝炎ワクチンの製造に用いてもよい。
本発明は、Ａ型肝炎ワクチン製造におけるＡ型肝炎ウイルスの精製に用いられる。具体的には、クロマト工程として官能基としてジエチルアミノプロピルを有する架橋アガロースを含むクロマトグラフィー担体が組み込まれたＡ型肝炎ウイルスの精製方法によって特徴付けられる。
Ａ型肝炎ウイルスの増殖に用いられる細胞としては、Ａ型肝炎ウイルスを増殖できる細胞であれば特に限定されないが、アフリカミドリザル腎細胞由来の株化細胞であることが好ましい。アフリカミドリザル腎細胞由来の株化細胞としてＶｅｒｏ細胞やＧＬ３７細胞などが挙げられる。
培地は、通常細胞培養に用いられる培地、例えば、ＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、特注品）、イーグルＭＥＭ（日水製薬）、ダルベッコ変法ＭＥＭ（日水製薬）、ＶＰ－ＳＦＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等が挙げられるが、いずれを使用してもよい。ウイルス培養時には、ウシ胎児血清を添加した培地を用いることもできる。
Ａ型肝炎ウイルスを増殖させた細胞は、例えば、界面活性剤を含有する細胞溶解用液で可溶化される。このＡ型肝炎ウイルス精製の可溶化された試料が、限外ろ過、核酸分解及びタンパク質分解を目的とした酵素処理、陰イオン交換クロマト及びゲルろ過クロマト等の工程に供されてもよい。同一の工程が２回以上行われてもよく、例えば最初の酵素処理を行うと同時に、連続して、または最初の酵素処理の後に続く他の工程の後に２回目の酵素処理が行われてもよい。同一の工程が２回以上行われる場合、同じ態様で行われてもよいし、異なる態様で行われてもよい。例えば、酵素処理が２回行われる場合は最初の工程で核酸分解酵素で処理され、そして２回目の工程でタンパク質分解酵素で処理される。
これらの工程のいずれかを、任意の他の工程の前に、単独で、または組み合わせて行うことができ、サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーに供して精製されたＡ型肝炎ウイルスの調製物を生成する前に、行ってもよい。
Ａ型肝炎ウイルスを増殖させた細胞は、例えば、界面活性剤を含有する細胞溶解用液で可溶化される。界面活性剤は例えば、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０（ＮＰ－４０）である。界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００などが使用されてもよい。
酵素処理の酵素としては、例えば、プロテアーゼ（例えば、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、トリプシン）、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅＡ、ベンゾナーゼ（商標））、または他の酵素が挙げられる。
当業者が入手可能な陰イオン交換クロマトグラフィー担体として、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体では、Ｑセファロース（商標）ファスト・フロー、ＤＥＡＥセファロース（商標）ファスト・フロー、およびＡＮＸセファロース（商標）４ファスト・フローなどが一例として挙げられる。当業者が入手可能な陰イオン交換体は、例えば強陰イオン交換体または弱陰イオン交換体である。強陰イオン交換体は４級アンモニウム基を担体として有する陰イオン交換体が挙げられ、弱陰イオン交換体として、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはジエチルアミノプロピルを担体として有する陰イオン交換体が挙げられる。４級アンモニウム基を担体として有する強陰イオン交換体としてＱセファロース（商標）ファスト・フローが挙げられ、弱陰イオン交換体として、ＤＥＡＥセファロース（商標）ファスト・フロー、およびＡＮＸセファロース（商標）４ファスト・フローなどが挙げられる。
陰イオン交換クロマトグラフィー工程において、平衡化緩衝液が使用されてもよい。当業者は使用する試料、担体を考慮してウイルスを精製できる平衡化緩衝液を選択することができる。平衡化緩衝液には任意の適切な塩が含まれていてもよい。塩としては、好適には、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が使用される。平衡化緩衝液は、典型的には、およそ０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ以下の塩（例えば、ＮａＣｌ）を含み、より好ましくは平衡化緩衝液は０．２Ｍ以下のＮａＣｌを含む。平衡化緩衝液にはリン酸（例えば、５、１０、２０または５０ｍＭ）緩衝液などの任意の適切な緩衝液が用いられてもよい。実施形態の例として、平衡化緩衝液には、およそ７．０、７．２又は７．５のｐＨのリン酸緩衝液を使用して行われることが好ましい。他の平衡化緩衝液の使用も本技術分野で周知であり、本開示の方法の実施に使用し得る。
クロマトでは、溶出は、担体に結合するＡ型肝炎ウイルスを、溶出緩衝液と接触させることによって行われる。例えば、混入物質を除去して担体への結合物の大部分がＡ型肝炎ウイルスの成分になるように、洗浄工程を使用してもよい。そのような場合には、単一の溶出工程を用いて、結合したＡ型肝炎ウイルスの粒子を担体から溶出してもよい。溶出では、塩溶液が溶出緩衝液として用いられてもよい。溶出緩衝液には、任意の適切な塩を使用してもよい。塩として塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が使用されていなくてもよい。好適には、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が使用される。高塩濃度緩衝液は、典型的には、およそ３００ｍＭ、５００ｍＭ、１Ｍ又は２Ｍの塩（例えば、ＮａＣｌ）である。例えば、溶出は、およそ３００ｍＭ、５００ｍＭ、１Ｍ又は２ＭのＮａＣｌを含む、適切な緩衝液中で行ってもよい。一例として、リン酸（例えば、５、１０、２０または５０ｍＭ）緩衝液などの任意の適切な緩衝液が用いられうる。実施形態の例として、溶出は、高濃度の塩（例えば、３００ｍＭ、５００ｍＭ、１Ｍ又は２Ｍ）を含む、およそ７．０、７．２又は７．５のｐＨのリン酸緩衝液を使用して行われることが好ましい。他の溶出緩衝液の使用も本技術分野で周知であり、本発明の方法の実施に使用し得る。
使用される緩衝液には界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ８０などの非イオン性界面活性剤が挙げられ、好ましくはＴｗｅｅｎ８０である。界面活性剤の濃度は特に限定されないが、およそ０．０００５、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５％以下である。好ましくは界面活性剤の濃度はおよそ０．００２％である。
クロマトグラフィー後の溶出液は、好ましくは限外ろ過により濃縮される。限外ろ過の方法は当業者が目的に応じて適宜設定できる。
溶出液、好ましくは濃縮した溶出液は、ゲルろ過に供される。好適なゲルろ過担体としては、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－４００ＨＲ（Ｃｙｔｉｖａ製）及びＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ（Ｃｙｔｉｖａ製）などが挙げられる。
精製されたＡ型肝炎ウイルスを含む溶出溶液において、タンパク質当たりの抗原量（比活性）が測定されてもよい。抗原量は酵素免疫測定法によりＨＡＶ抗原を定量することにより測定することができる（生物学的製剤基準「乾燥組織培養不活化Ａ型肝炎ワクチン」）。例えば精製されたＡ型肝炎ウイルスを含む溶液における抗原量は、およそ０．１ｍｇ抗原／ｍｇ、０．２ｍｇ抗原／ｍｇ、０．３ｍｇ抗原／ｍｇ、０．４ｍｇ抗原／ｍｇ、０．５ｍｇ抗原／ｍｇ、０．６ｍｇ抗原／ｍｇ、０．７ｍｇ抗原／ｍｇ、０．８ｍｇ抗原／ｍｇ、０．９ｍｇ抗原／ｍｇ以上である。精製されたＡ型肝炎ウイルスを含む溶液における抗原量は、好ましくはおよそ０．５ｍｇ抗原／ｍｇ以上である。
本開示において、クロマトグラフィーの抗原収率は、処理後の抗原量／処理前の抗原量＊１００により計算されてもよい。本開示においてクロマトグラフィーの抗原収率は、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上であることが好ましい。本開示において、不純物として、ＤＮＡ及び／または宿主細胞由来のタンパク質（ＨＣＰ）が挙げられる。クロマトグラフィーの不純物除去は処理前のＤＮＡ含量及び／またはＨＣＰ含量を処理後のＤＮＡ含量及び／またはＨＣＰ含量と比較して検討されてもよい。本開示のクロマトグラフィー工程により、当該工程後の不純物の量は当該工程の前の不純物の量と比較して９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、２．５、１％以下である。本開示のクロマトグラフィー工程により、当該工程後の不純物の量が検出限界以下であってもよい。本開示において、クロマトグラフィーによる精製の程度は、（ｉ）担体への抗原の吸着が認められるか、（ｉｉ）溶出時にクロマトグラム上で抗原ピークが認められるか、および（ｉｉｉ）不純物ピークと十分に分離できているかをもとに総合的に判断されてもよい。本開示の好ましい態様では、クロマトグラフィーにより、（ｉ）担体への抗原の吸着が認められ、（ｉｉ）溶出時にクロマトグラム上で抗原ピークが認められ、かつ（ｉｉｉ）不純物ピークと十分に分離されている場合に精製されていると判断される。
当業者は、本開示に含まれるＡ型肝炎ウイルスの精製方法を用いることにより、Ａ型肝炎ウイルスを製造できる。また、Ａ型肝炎ウイルスを不活化する方法は当業者が目的に応じて適宜設定できる。精製Ａ型肝炎ウイルス液は、例えば、０．０２５ｖｏｌ％ホルマリン存在下にて不活化処理を受け、製剤化工程を経て、Ａ型肝炎ワクチンが調製される。
当業者は、本開示に含まれる精製したＡ型肝炎ウイルス液由来の成分を含むことを特徴とする免疫原性組成物を製造できる。免疫原性組成物には、例えば、安定剤、界面活性剤、塩類、ｐＨ調節剤、および賦形剤などが含まれてもよい。
当業者は、本開示に含まれる精製したＡ型肝炎ウイルス液由来の成分を含むことを特徴とするＡ型肝炎ワクチンを製造できる。Ａ型肝炎ワクチンには、例えば、安定剤、界面活性剤、塩類、ｐＨ調節剤、および賦形剤などが含まれてもよい。
本明細書において「およそ」とは示した数値の±１０％、好ましくは±５％の範囲を意味する。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１：Ａ型肝炎ウイルスの培養
以下に、本発明の例示的な実施形態として、アフリカミドリザル腎臓由来細胞であるＧＬ３７細胞を用いて増殖させたＡ型肝炎ウイルス（ＫＲＭ００３株由来）を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの方法により限定されるものではない。
以下に、本発明の例示的な実施形態として、アフリカミドリザル腎臓由来細胞であるＧＬ３７細胞を用いて増殖させたＡ型肝炎ウイルス（ＫＲＭ００３株由来）を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの方法により限定されるものではない。
ＶＰ－ＳＦＭ培地で接着培養したＧＬ３７細胞を、初期細胞数１．２×１０９ ｃｅｌｌｓとなるようにウシ胎児血清加ＭＥＭ培地１６００ｍＬに懸濁し、これにＡ型肝炎ウイルス（ｍ．ｏ．ｉ． ０．１）を接種した。
繊維材質支持体（商品名：ＢｉｏＮＯＣＩＩ（登録商標）、ＣＥＳＣＯ社）を充填した高密度培養容器（商品名：ＢｅｌｌｏＣｅｌｌ５００Ａ（登録商標）、ＣＥＳＣＯ社）に、当該ＭＥＭ培地を投入し、一昼夜、当該培養容器の１割分の容量の培地を出し入れすることで細胞を支持体に接着させた。その後、培地のほぼ全量を出し入れすることで接着を確実なものとした。３７℃、５％ＣＯ２の環境下で３週間の培養を行い、培養期間中、古い培地の排出と新しい培地の投入を毎日繰り返し、培養を維持した。
高密度培養装置の稼働を停止し、培地を除去してＰＢＳで洗浄した。１Ｖ／Ｖ％ＮＰ－４０を含有する細胞溶解用液で細胞を可溶化し、当該可溶化液をＡ型肝炎ウイルス精製の出発材料とした。
繊維材質支持体（商品名：ＢｉｏＮＯＣＩＩ（登録商標）、ＣＥＳＣＯ社）を充填した高密度培養容器（商品名：ＢｅｌｌｏＣｅｌｌ５００Ａ（登録商標）、ＣＥＳＣＯ社）に、当該ＭＥＭ培地を投入し、一昼夜、当該培養容器の１割分の容量の培地を出し入れすることで細胞を支持体に接着させた。その後、培地のほぼ全量を出し入れすることで接着を確実なものとした。３７℃、５％ＣＯ２の環境下で３週間の培養を行い、培養期間中、古い培地の排出と新しい培地の投入を毎日繰り返し、培養を維持した。
高密度培養装置の稼働を停止し、培地を除去してＰＢＳで洗浄した。１Ｖ／Ｖ％ＮＰ－４０を含有する細胞溶解用液で細胞を可溶化し、当該可溶化液をＡ型肝炎ウイルス精製の出発材料とした。
実施例２：Ａ型肝炎ウイルスの精製（陰イオン交換クロマト前まで）
限外ろ過１
可溶化後のＡ型肝炎ウイルス液を膜間差圧０．０４～０．０６ＭＰａで限外ろ過し、緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液）への置換及び濃縮を行った。
可溶化後のＡ型肝炎ウイルス液を膜間差圧０．０４～０．０６ＭＰａで限外ろ過し、緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液）への置換及び濃縮を行った。
酵素処理（核酸分解）
限外ろ過１後のＡ型肝炎ウイルス液に、塩化マグネシウムを最終濃度が５ｍＭとなるように加え混和し、次いで核酸分解酵素（商品名：Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）を最終濃度が１００Ｕ／ｍＬとなるように加え混和し、３７℃で１６時間の酵素処理を行った。
限外ろ過１後のＡ型肝炎ウイルス液に、塩化マグネシウムを最終濃度が５ｍＭとなるように加え混和し、次いで核酸分解酵素（商品名：Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）を最終濃度が１００Ｕ／ｍＬとなるように加え混和し、３７℃で１６時間の酵素処理を行った。
酵素処理（タンパク質分解）
さらに、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを最終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるように加え混和し、３７℃で１．５時間の酵素処理を行った。
さらに、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを最終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるように加え混和し、３７℃で１．５時間の酵素処理を行った。
限外ろ過２
タンパク質分解酵素処理後のＡ型肝炎ウイルス液を膜間差圧０．０４～０．０６ＭＰａで限外ろ過し、緩衝液（０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液）への置換及び濃縮を行った。
タンパク質分解酵素処理後のＡ型肝炎ウイルス液を膜間差圧０．０４～０．０６ＭＰａで限外ろ過し、緩衝液（０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液）への置換及び濃縮を行った。
実施例３：Ａ型肝炎ウイルスの精製（陰イオン交換クロマト担体の選択）
Ａ型肝炎ウイルスの精製における陰イオン交換クロマト工程について、不純物除去と収率の観点からクロマト担体のスクリーニングを行い、好適な担体を選択した。
陰イオン交換樹脂として、ＤＥＡＥ－６５０Ｍ（東ソー）、ＱＡＥ－５５０Ｃ（東ソー）、ＮＨ２－７５０Ｆ（東ソー）、ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（Ｃｙｔｉｖａ）、疎水性担体としてＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＦＦ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（Ｃｙｔｉｖａ）、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標） Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ（東ソー）、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ－６００Ｍ（東ソー）、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ（東ソー）、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ－６５０Ｍ（東ソー）、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＰＰＧ－６００Ｍ（東ソー）及びＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｅｔｈｅｒ－６５０Ｍ（東ソー）を評価した。
陰イオン交換樹脂のスクリーニングでは、０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化後、限外ろ過２工程後の溶液をアプライ液とし、５００ｍＭ～５Ｍ ＮａＣｌ及び０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）によりグラジエント溶出することにより陰イオン交換クロマトを行った。また、疎水性担体のスクリーニングでは、２Ｍ ＮａＣｌ及び０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化後、精製後のＡ型肝炎ウイルス液をアプライ液とし、０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）によりリニアグラジエント溶出することにより疎水クロマトを行った。その結果、ＤＥＡＥ－６５０Ｍ、ＱＡＥ－５５０Ｃ、ＮＨ２－７５０Ｆ及びＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦについて、Ａ型肝炎ウイルスの抗原収率は、それぞれ、７７％、未測定、６１％及び８５％以上であり、不純物との分離は、△、△、△及び◎であった。ここで、△は「担体への抗原の吸着が認められ、溶出時にクロマトグラム上で抗原ピークが認められたが、不純物ピークと十分に分離できていなかったもの」であり、◎は「担体への抗原の吸着が認められ、溶出時にクロマトグラム上で明瞭な抗原ピークが認められ、不純物ピークと十分に分離できていたもの」である。
なお、ＤＥＡＥ－６５０Ｍ、ＮＨ２－７５０Ｆ及びＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦについては比活性（タンパク質当たりの抗原量）を評価し、分離が良好であったＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦは相対的に比活性が高いことを確認した。
一方、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＦＦ、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ－６００Ｍ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ－６５０Ｍ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＰＰＧ－６００Ｍ及びＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｅｔｈｅｒ－６５０Ｍについては、いずれも、「担体への抗原の吸着が認められないもの」又は「担体への抗原の吸着が認められたが溶出時に抗原ピークが確認できない又は素通り画分に抗原が含まれ分離精製ができないもの」であった。
以上より、Ａ型肝炎ウイルスを精製し不純物を除去するとともに高い抗原収率を達成するという目的には、ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦが最適であることが分かった。
上記の結果をまとめて下表に示すとともに、ＤＥＡＥ－６５０ＭおよびＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦのクロマトグラムを、それぞれ図１および図２として示す。ＤＥＡＥ－６５０Ｍ（図１）では、不純物ピークとの重なりが大きく、目的物であるＡ型肝炎ウイルスと不純物との分離が不十分であった。
Ａ型肝炎ウイルスの精製における陰イオン交換クロマト工程について、不純物除去と収率の観点からクロマト担体のスクリーニングを行い、好適な担体を選択した。
陰イオン交換樹脂として、ＤＥＡＥ－６５０Ｍ（東ソー）、ＱＡＥ－５５０Ｃ（東ソー）、ＮＨ２－７５０Ｆ（東ソー）、ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（Ｃｙｔｉｖａ）、疎水性担体としてＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＦＦ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（Ｃｙｔｉｖａ）、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（Ｃｙｔｉｖａ）、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標） Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ（東ソー）、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ－６００Ｍ（東ソー）、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ（東ソー）、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ－６５０Ｍ（東ソー）、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＰＰＧ－６００Ｍ（東ソー）及びＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｅｔｈｅｒ－６５０Ｍ（東ソー）を評価した。
陰イオン交換樹脂のスクリーニングでは、０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化後、限外ろ過２工程後の溶液をアプライ液とし、５００ｍＭ～５Ｍ ＮａＣｌ及び０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）によりグラジエント溶出することにより陰イオン交換クロマトを行った。また、疎水性担体のスクリーニングでは、２Ｍ ＮａＣｌ及び０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化後、精製後のＡ型肝炎ウイルス液をアプライ液とし、０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）によりリニアグラジエント溶出することにより疎水クロマトを行った。その結果、ＤＥＡＥ－６５０Ｍ、ＱＡＥ－５５０Ｃ、ＮＨ２－７５０Ｆ及びＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦについて、Ａ型肝炎ウイルスの抗原収率は、それぞれ、７７％、未測定、６１％及び８５％以上であり、不純物との分離は、△、△、△及び◎であった。ここで、△は「担体への抗原の吸着が認められ、溶出時にクロマトグラム上で抗原ピークが認められたが、不純物ピークと十分に分離できていなかったもの」であり、◎は「担体への抗原の吸着が認められ、溶出時にクロマトグラム上で明瞭な抗原ピークが認められ、不純物ピークと十分に分離できていたもの」である。
なお、ＤＥＡＥ－６５０Ｍ、ＮＨ２－７５０Ｆ及びＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦについては比活性（タンパク質当たりの抗原量）を評価し、分離が良好であったＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦは相対的に比活性が高いことを確認した。
一方、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＦＦ、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｈｅｘｙｌ－６５０Ｃ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ－６００Ｍ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ－６５０Ｍ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ－６５０Ｍ、ＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）ＰＰＧ－６００Ｍ及びＴｏｙｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｅｔｈｅｒ－６５０Ｍについては、いずれも、「担体への抗原の吸着が認められないもの」又は「担体への抗原の吸着が認められたが溶出時に抗原ピークが確認できない又は素通り画分に抗原が含まれ分離精製ができないもの」であった。
以上より、Ａ型肝炎ウイルスを精製し不純物を除去するとともに高い抗原収率を達成するという目的には、ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦが最適であることが分かった。
上記の結果をまとめて下表に示すとともに、ＤＥＡＥ－６５０ＭおよびＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦのクロマトグラムを、それぞれ図１および図２として示す。ＤＥＡＥ－６５０Ｍ（図１）では、不純物ピークとの重なりが大きく、目的物であるＡ型肝炎ウイルスと不純物との分離が不十分であった。
実施例４：Ａ型肝炎ウイルスの精製（陰イオン交換クロマトの条件至適化）
選択したＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦについて、緩衝液（組成、ｐＨ）等のクロマト条件（グラジエント溶出）の至適化検討を行った。
抗原収率、タンパク質当たりの抗原量及びＡ型肝炎ウイルス抗原ピークの不純物との良好な分離を指標として、下記の至適条件を決定した（図３）。
選択したＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦについて、緩衝液（組成、ｐＨ）等のクロマト条件（グラジエント溶出）の至適化検討を行った。
抗原収率、タンパク質当たりの抗原量及びＡ型肝炎ウイルス抗原ピークの不純物との良好な分離を指標として、下記の至適条件を決定した（図３）。
選択したＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦについて、緩衝液（組成、ｐＨ）等のクロマト条件（ステップワイズ溶出）の至適化検討を行った。
抗原収率、タンパク質当たりの抗原量及びＡ型肝炎ウイルス抗原ピークの不純物との良好な分離を指標として、下記の至適条件を決定した（図４）。
抗原収率、タンパク質当たりの抗原量及びＡ型肝炎ウイルス抗原ピークの不純物との良好な分離を指標として、下記の至適条件を決定した（図４）。
実施例５：Ａ型肝炎ウイルスの精製（陰イオン交換クロマト後）
限外ろ過３
実施例４の至適条件でＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦを用いて得られた陰イオン交換クロマト後のＡ型肝炎ウイルス液を膜間差圧０．０４～０．０６ＭＰａで限外ろ過し、濃縮を行った。
実施例４の至適条件でＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦを用いて得られた陰イオン交換クロマト後のＡ型肝炎ウイルス液を膜間差圧０．０４～０．０６ＭＰａで限外ろ過し、濃縮を行った。
ゲルろ過
限外ろ過３後のＡ型肝炎ウイルス液をデキストラン系ゲルろ過カラムに展開し、Ａ型肝炎ウイルスのピーク部分を採取した。
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－４００ＨＲ（Ｃｙｔｉｖａ製）をカラムユニットに充填し、クロマトは室温下で、０．００２％ポリソルベート８０含有リン酸緩衝液を線速９ｃｍ／ｈｏｕｒで流して行った。
得られたＡ型肝炎ウイルスのピーク画分を、精製Ａ型肝炎ウイルス液とした。
Ａ型肝炎ウイルスの精製に係る実施形態の概要を次に示す：
限外ろ過３後のＡ型肝炎ウイルス液をデキストラン系ゲルろ過カラムに展開し、Ａ型肝炎ウイルスのピーク部分を採取した。
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－４００ＨＲ（Ｃｙｔｉｖａ製）をカラムユニットに充填し、クロマトは室温下で、０．００２％ポリソルベート８０含有リン酸緩衝液を線速９ｃｍ／ｈｏｕｒで流して行った。
得られたＡ型肝炎ウイルスのピーク画分を、精製Ａ型肝炎ウイルス液とした。
Ａ型肝炎ウイルスの精製に係る実施形態の概要を次に示す：
実施例６：ＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦを導入したＡ型肝炎ウイルスの精製フローの評価
陰イオン交換クロマト工程の担体としてＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦを導入したＡ型肝炎ウイルスの精製フローにより、各工程及び得られた精製ウイルス液の品質を評価した。
精製ウイルス液においては、限外ろ過２後までに残存した不純物がＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦにより効率的に除去できており、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで不純物バンドを認めず、ＤＮＡ含量及びＨＣＰ（宿主細胞由来のタンパク質）含量が検出下限未満となっており、高純度の精製Ａ型肝炎ウイルス液が得られることが確認された。
Ａ型肝炎ウイルスの精製度の指標として、タンパク質当たりのＡ型肝炎ウイルス抗原量（比活性）の精製工程での推移を下表に示す。
陰イオン交換クロマト工程の担体としてＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦを導入したＡ型肝炎ウイルスの精製フローにより、各工程及び得られた精製ウイルス液の品質を評価した。
精製ウイルス液においては、限外ろ過２後までに残存した不純物がＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦにより効率的に除去できており、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで不純物バンドを認めず、ＤＮＡ含量及びＨＣＰ（宿主細胞由来のタンパク質）含量が検出下限未満となっており、高純度の精製Ａ型肝炎ウイルス液が得られることが確認された。
Ａ型肝炎ウイルスの精製度の指標として、タンパク質当たりのＡ型肝炎ウイルス抗原量（比活性）の精製工程での推移を下表に示す。
実施例７：Ａ型肝炎ウイルスの不活化及びワクチン調製
実施例５で得られた精製Ａ型肝炎ウイルス液を、０．０２５ｖｏｌ％ホルマリン存在下に３７℃で１２日間の不活化処理し、最終バルク調製、充填及び凍結乾燥を経て、Ａ型肝炎ワクチンを調製した。
実施例５で得られた精製Ａ型肝炎ウイルス液を、０．０２５ｖｏｌ％ホルマリン存在下に３７℃で１２日間の不活化処理し、最終バルク調製、充填及び凍結乾燥を経て、Ａ型肝炎ワクチンを調製した。
本発明によれば、Ａ型肝炎ワクチン製造における、陰イオン交換クロマトグラフィーによるＡ型肝炎ウイルスの精製方法を提供できる。
Claims (10)
- Ａ型肝炎ウイルスの精製方法であって、
ａ）Ａ型肝炎ウイルスに感染した細胞を培養し、培養した細胞を回収する工程；
ｂ）回収した細胞を可溶化して可溶化液を得る工程；
ｃ）得られた可溶化液を、ジエチルアミノプロピルを有する架橋アガロースを含むクロマトグラフィー担体を有する陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してＡ型肝炎ウイルスを分離し、その後溶出液を得る工程；および
ｄ）得られた溶出液をゲルろ過クロマトグラフィーに供する工程、
を含む、Ａ型肝炎ウイルスの精製方法。 - 工程ｃ）において、分離されたＡ型肝炎ウイルスを高塩濃度緩衝液により溶出させる、請求項１に記載の方法。
- 工程ｃ）において、平衡化緩衝液が０．２Ｍ ＮａＣｌ以下及び０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）であり、溶出緩衝液が１．０～２．０Ｍ ＮａＣｌ及び０．００２％Ｔｗｅｅｎ８０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）である、請求項２に記載の方法。
- 細胞が、アフリカミドリザル腎細胞由来の株化細胞である、請求項１－３のいずれか一項に記載の方法。
- アフリカミドリザル腎細胞由来の株化細胞が、Ｖｅｒｏ細胞またはＧＬ３７細胞である、請求項４に記載の方法。
- 工程ｃ）で得られた溶出液のタンパク質当たりの抗原量（比活性）が０．５ｍｇ抗原／ｍｇ以上である、請求項１－５のいずれか一項に記載の方法。
- 工程ｄ）のゲルろ過後に、Ａ型肝炎ウイルスを不活化する工程を含む、請求項１－６のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１－７いずれか一項に記載の方法によってＡ型肝炎ウイルスを精製し、得られたＡ型肝炎ウイルスを用いることを特徴とする、免疫原性組成物の製造方法。
- 請求項１－７いずれか一項に記載の方法によってＡ型肝炎ウイルスを精製し、得られたＡ型肝炎ウイルスを用いることを特徴とする、Ａ型肝炎ワクチンの製造方法。
- 請求項１－７いずれか一項に記載の方法によってＡ型肝炎ウイルスを精製する工程を含む、Ａ型肝炎ウイルスの製造方法。
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| JP2022103447A JP2024004020A (ja) | 2022-06-28 | 2022-06-28 | Ａ型肝炎ウイルスのクロマトグラフィー精製方法 |
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