MXPA00010338A - Purificacion eficiente de adenovirus. - Google Patents

Purificacion eficiente de adenovirus.

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Abstract

Un metodo de enriquecimiento de una solucion de un adenovirus el cual comprende la aplicacion la aplicacion de una solucion mezclada que comprende adenovirus y por lo menos un tipo indeseado de biomolecula a una resina de cromatografia de intercambio anionico que comprende una porcion de enlaces seleccionada del grupo consistente de dimetilaminopropilo, dimetilaminobutilo, dimetilaminoisobutilo, y dimetilaminopentilo, y eluyendo el adenovirus de la resina de cromatografia. Tambien se proporciona un metodo de purificacion del adenovirus a partir de celulas infectadas con el adenovirus el cual comprende el lisado de dichas celulas, la aplicacion del elisado a una cromatografia simple, eluyendo el adenovirus de la resina de cromatografia, y recolectando una porcion que contiene el adenovirus que es substancialmente tan puro como un adenovirus triple purificado por gradiente de densidad de CsCI. Este metodo proporciona adicionalmente un metodo para la cuantificacion exacta del numero de particulas adenovirales en una solucion de adenovirus el cual comprende la aplicacion a y al elucion de una solucion de muestra de adenovirus de una resina de cromatografia de intercambio anionico, y la comparacion de la absorbencia de la solucion de muestra de adenovirus y la absorbencia de una solucion de adenovirus estandar, y la cuantificacion del numero de particulas adenovirales en la solucion de la muestra.

Description

PURIFICACION EFICIENTE DE ADENOVIRUS Campo del Invento. La presente invención se refiere a la purificación eficiente de 5 adenovirus.
Antecedentes del Invento Tradicionalmente, las partículas adenovirales han sido aisladas a través del uso de protocolos de purificación de gradiente ? de densidad, tal como a través del uso de gradientes de cloruro de cesio (CsCI). Aunque las preparaciones estén adecuadas para la purificación de baja escala , la purificación por gradiente de densidad es tediosa, se lleva mucho tiempo y no puede ser escalada fácilmente. Por consiguiente, el proceso con frecuencia es 5 considerado comercialmente indeseable. Un método alternativo para la purificación del adenovirus es usar cromatografía de columna o lote. Los primeros intentos para aislar las partículas virales con técnicas cromatográficas y utilizando resina cromatográfica de dietilaminoetilo (DEAE) fueron reportadas 0 primero de 1959 a 1961 . Haruna y asociados (Virology 1 3 páginas 264 a 267 (1961 )) reportó el uso de la cromatrografía de intercambio de ion DEAE para la purificación de los tipos 1 , 3 y 8 de adenoviruses, mientras Klemperar y Pereira ((Virology 9 páginas 536 a 545 (1 959)) y Philipson (Virology 1 0 páginas 459 a 465 (1 960)) 5 . reportaron dificultades utilizando el mismo método con otros tipos de adenovirus. Estas técnicas no fueron usadas ampliamente después de aproximadamente 1 965, más probablemente como un resultado de la tendencia de la matriz cromatográfica para colapsarse durante el uso. Además, la selectividad de las resinas de cromatrografía disponibles en el momento hicieron la purificación cromatrográfica de los víruses inferior a la técnicas de purificación de gradiente de densidad . Recientemente, se ha renovado el interés de la purificación de los víruses por medio de la cromatrografía. Por ejemplo, Shabram y asociados (WO 96/27677) y Huyghe y asociados (Terapia Genética Humana 6 páginas 1403 a 1416 (1995)) describen los métodos para usar resinas de cromatrografía para purificar los víruses. Los materiales de empaque más nuevos para la cromatografía también han sido desarrollados en la última década y media . Estos materiales de empaque pueden ser clasificados en cuatro grupos: (i), polisacáridas homogéneas de enlace cruzado, las cuales incluyen geles suaves (por ejemplo, agarosa) que tienen buena capacidad, pero una resolución deficiente y una tendencia a comprimirse; (ii) polímeros de macroporous basados en polímeros sintéticos los cuales incluyen resinas de cromatografía de perfusión con "poros interiores" grandes, permitiendo la mejor difusívidad y conduciendo a una eficiencia mejorada de la columna, velocidad y resolución ; (iii) sorbentes "tentaculares", los cuales tiene tentáculos que fueron diseñados para las interacciones más rápidas con las proteínas (por ejemplo, fractogel); y (iv) materiales basados en gel suave en una caparazón rígida, la cual explota la alta capacidad de los geles suaves, y la rigidez de los materiales del compuesto (por ejemplo, Ceramic HyperD™ F) (ver Boschetti, J . Chromatogr. 658 página 207 (1994); Rodríguez, j. Chromatogr. 699 páginas 47 a 61 ( 1 997)). Es deseable aumentar la velocidad, la facilidad de uso, y eficiencia de la purificación , particularmente la purificación comercial de gran escala, de estas técnicas del arte previo. La presente invención proporciona dicho proceso para la purificación de adenovirus. Estas y otras ventajas de la presente invención, así como las características inventivas adicionales, podrán ser apreciadas a partir de la descripción de la presente invención que se proporciona a continuación .
Sumario del I nvento La presente invención proporciona un método para enriquecer una solución de un adenovirus. El método comprende: (i) la obtención de una solución mezclada que comprende el adenovirus y por lo menos un tipo no deseado de biomolécula; (ii) la aplicación de la solución mezclada a una resina de cromatografía por intercambio aniónico que contiene un porción enlazadora seleccionada por el grupo consistente de dimetilaminopropil , dimetilaminobutilo, dimetilaminoisobutilo, y dimetilaminopentilo; y (iii) la elución del adenovirus a partir de la resina de purificación de cromatografía con un eluyente, el método puede comprender además la aplicación de la solución mezclada que comprende el adenovirus y por lo menos un tipo indeseado de biomolécula a una pre-resina de intercambio aniónico antes de aplicar al adenovirus la resina cromatográfia de intercambio aniónico. La presente invención también proporciona un método de purificación de un adenovirus a partir de las células infectadas con el adenovirus. El método comprende el lisado de celdas infectadas con el adenovirus, la aplicación del lisado a una resina de cromatografía simple, la elución del adenovirus a partir de la resina de cromatografía, y la recolección de una fracción que contiene el adenovirus, en donde el adenovirus es substancialmente tan puro como un adenovirus triple CsCI de gradiente de densidad-purificado.
La presente invención proporciona adicionalmente un método para cuantificar de manera exacta el número de partículas adenovirales en una solución de adenovirus, tal como una solución obtenida a partir de un lisado crudo de las células infectadas con el adenovirus, el cual comprende (i) la aplicación a y la elución de una resina de cromatografía de intercambio aniónico que contiene una porción de enlace seleccionada del grupo consistente de demitilaminopropilo, dimetilaminobutilo, demetilaminoisobutilo, y dimetilaminopentilo como solución de muestra del adenovirus, (ii) la determinación de la absorbencia de la solución de muestra del adenovirus eluída a partir de resina de cromatografía y la absorbencia de una solución estándar del adenovirus, (iii) la comparación de la absorbencia de la solución de muestra del adenovirus eluída a partir de la resina de cromatografía con la absorbencia de la solución estándar del adenovirus, y la cuantificación del número de partículas adenovirales en la solución de muestra. La presente invención puede ser comprendida mejor haciendo referencia a los dibujos adjuntos y a la siguiente descripción detallada del invento.
Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es una cromatografía de un lisado de célula infectada por adenovirus eluída a partir de una resina de amina de cromatografía cuaternaria (Q Ceramic HyperC™F), en la cual el eje-y ilustra la absorbencia (de 260 a 280 nm), el eje-x indica el tiempo de elución (minutos), y el eje-y paralelo (a la derecha) indica el agente de elución en la columna medido por la conductividad (linea de guiones; ms). La Figura 2 es una cromatografía de un lísato de célula infectada por adenovirus clarificada por filtración de flujo tangencial , tratado con una DNasa/RNasa (Benzonase®), y eluída a partir de una resina de cromatografía amina cuaternaria (Q Ceramic HyperD™F), en la cual el eje-y ilustra la absorbencia (260 y 280 nm), el eje-x indica el tiempo de elución (minuto), y el eje-x paralelo (a la derecha) indica el agente de elución en la columna medido por la conductividad (línea punteada; ms). La Figura 3 es una cromatografía de un lisato de una célula infectada por adenovirus eluída a partir de resina de cromatografía de absorción de cama expandida (Streamiine QXL®), en la cual el eje-y ilustra la absorbencia (260 & 280 nm), el eje-x indica el tiempo de elución (minuto), y el eje-y paralelo (a la derecha) indica el agente de elución en la columna medido por la contabilidad (línea punteada) en milisiemmens (ms). La Figura 4 es una cromatografía de un lisato de célula infectada por adenovirus purificada por centrifugación triple de gradiente de CsCI, y cuantificada utilizando una columna de escala analítica (POROS® 50D) perfusiva de dimetiiaminopropilo, en la cual el eje-y ilustra la absorbencia ( 260 & 280 nm) y el eje-x ilustra el tiempo de elución (minuto). La Figura 5 es una cromatografía de un lisato de célula infectada por adenovirus elu ída a partir de una resina de cromatografía de absorción de cama expandida (Streamiine QXL®) y dos veces a partir de una resina de cromatografía perfusiva de dimetiiaminopropilo (POROS® 50D), en la cual el eje-y indica la absorbencia (260 & 280 nm) y el eje-x indica el tiempo de elución (minuto). La Figura 6 es una cromatografía de un lisato de célula infectada por adenovirus eluída a partir de una resina de cromatografía perfusiva de dimetiiaminopropilo (POROS® 50D) en la cual el eje-y indica la absorbencia (260 y 280 nm) y el eje-x indica el tiempo de elución (minuto).
Descripción Detallada del Invento.
La presente invención se refiere a un método para enriquecer una solución que comprende el adenovirus. El témino "adenovirus", significa un adenovirus que ocurre de manera natural y un adenovirus recombinante, en donde el adenovirus recombinante puede ser infeccioso o no infeccioso. El método comprende la obtención de una solución mezclada que comprende el adenovirus y por lo menos un tipo indeseado de biomolécula. El término "biomolécula" significa cualquier macromolécula, por ejemplo, cualquier proteína, carbohidrato, lípido o ácido nucléico (por ejemplo ADN y ARN) y similares, asi como fragmentos de los mismos, tal y como se utiliza en la presente invención, "solución" tiene el significado que normalmente se le ha dado, en el arte se entiende que también comprenda un lisato cel ular. Cualquier solución que comprende adenovirus, puede ser enriquecido de acuerdo con el método de la presente invención . Una solución mezclada de adenovirus será obtenida generalmente, infectando las células eucarióticas con un adenovirus tal y como se define en la presente descripción, manteniendo las células por un periodo de tiempo suficiente para criticar el número de partículas adenovirales, recolectando las células infectadas, y Usando (rompiendo la abiertas) en una solución regulada . Los términos "enriqueciendo" y "purificando" así como "enriquecidos" y "purificado" son utilizadas de manera intercambiable para indicar que la concentración de adenovirus en un volumen de solución determinado está aumentando o ha aumentado, respectivamente. De un modo deseable, la solución enriquecida purificada de adenovirus es substancialmente tan pura como un adenovirus triple purificado por densidad de gradiente de CsCI . Cuando se está purificando el virus a partir de células infectadas, por ejemplo, células eucarióticas, es preferible no dejar que proceda la infección hasta el punto en donde el virus mismo causa la lísis de las células, debido a que bajo estas condiciones el lisado de las células individuales en tiempos substancialmente diferentes y las encimas de degradación liberadas por las células lisadas comenzarán a atacar al virus liberado. Adicionalmente, las deformaciones en el metabolismo celular justamente antes de la lísis celular mediada por el adenovirus puede causar una reducción en la exactitud de la replicación viral . Por lo tanto, es preferible Usar las células antes de la lísis mediada por el adenovirus. Cualquier método adecuado para la lísis puede ser usado. Por ejemplo, las células y el medio de cultivo pueden ser centrifugados, y el medio reemplazado por una solución de detergentes fuertes u otros aditivos (por ejemplo, Triton™X-100, Tween 20, Tween 80, o deoxicolato) y, después de la incubación durante un periodo de tiempo adecuado, la muestra puede ser recolectada para el procesamiento adicional . Alternativamente, las células pueden ser recolectadas por medio de una centrifugación suave para formar una pildora de células, y lisada congelando y descongelándola tres veces. Una técnica alternativa preferida es usar una prensa francesa, y aún más preferentemente, un microfluidizador. Las prensas francesas o los microfluidizadores, lisan de manera eficiente las células eucarióticas aplicando fuerzas de corte para la ruptura de las membranas celulares. El proceso de fuerzas de corte es más rápido, y reproducible que otros métodos adecuados para la obtención de una solución que comprende un adenovirus a partir de una población de células infectadas, por ejemplo células eucarióticas. Por consiguiente, una solución mezclada comprende una adenovirus y por lo menos un tipo no deseado de biomolécula para la purificación o enriquecimiento de acuerdo con los métodos de la presente invención puede ser obtenido por medio de la microfluidización de una población de células infectadas por adenovirus. Una vez que se ha obtenido la solución de la cual va a ser purificado el adenovirus, ésta puede ser clarificada opcionalmente. Si se desea, dicha clarificación se puede llevar a cabo mediante un paso de centrifugación moderadamente suave para remover las piezas muy grandes de los desechos celulares, y las organelas grandes no rotas (si están presentes), el lisado celular también puede ser clarificado por medio de filtración. Particularmente, el lisado celular puede ser clarificado concentrado por filtración de flujo tangencial (TFF) de acuerdo con los métodos conocidos en el arte. La solución puede ser tratada entonces opcionalmente como una enzima con capacidad para digerir el ADN y el ARN (una "DNasa/RNasa") para remover cualquier ADN y ARN en el lisato clarificado no contenido dentro de las partículas adenovirales. Después de que es clarificado el Usado celular, éste puede ser cromatografiado opcionalmente en una pre-resina de intercambio aniónico antes de la purificación . Cualquier resina de cromatografía de intercambio aniónico puede ser usada en una pre-resina. Preferentemente, la resina de cromatografía de intercambio aniónico que va a ser usada en la pre-resina tiene grupo de superficie derivado con una amina terciaria o cuaternaria (por ejemplo, diatilaminoetilo, trimetilaminoetilo, o trimetilaminopropilo). El grupo de la superficie puede ser enlazado a un soporte de matriz a través de cualquier grupo enlazadora adecuado tal y como es conocido en el arte. Los enlazadores de polímeros acrílicos se encuentran entre los adecuados para usarse en el contexto de la presente invención. La matriz de soporte puede estar compuesta por cualquier material adecuado; sin embargo, es preferible que la matriz de soporte esté basada en un material en el concepto de "gel suave en una caparazón rígida". Esta resina de cromatografía "llena de gel" permite que se pueda aprovechar la alta capacidad de los gels suaves, por ejemplo, agarosa, y la rigidez de los materiales de compuesto para índices altos de flujo, y una tolerancia aumentada a la compresión o contracción e hinchazón del medio, una característica común de los gels suaves. Estas resinas de cromatografía "Menas de gel" son bien conocidas en el arte, y se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,268,097 y 5,672,276. Una resina de cromatografía de intercambio aniónico con pre-resina deseable en el contexto de la presente invención , es una Q Ceramic HyperD™F, comercializada por BioSepra, Veilleneuve-La-Garenne, Francia . La Q Ceramic HyperD™ F está compuesta de un material de cuentas ceramizado altamente poroso llenado con un hidrogel hidrofílico flexible funcionalizado, con un tamaño de cuenta promedio de 50µ (con un rango de partícula desde 25 a 75µ). La Q Ceramic HyperD™ tiene una capacidad dinámica de por lo menos 85 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) en 200 cm/hr con un 50% de ruptura, y de por lo menos 80 mg/ml BSA en 600 cm/hr con 50% de ruptura. Debido a que la naturaleza del gel relleno de la Q Ceramic HyperD™F, existe un área de superficie externa mayor disponible para el enlace, comparados con los medios por esos clásicos, para los cuales generalmente el 50% del exterior de las partículas está compuesta por la entrada de los poros, en donde no ocurre el enlace. Como resultado, el 100% del área de superficie externa total de la Q Ceramic HyperD™ F contribuye al enlace. Esta característica hace que esta resina de cromatografía sea un material preferido para la pre-resina. Alternativamente, el lisado celular puede ser cromatografíado opcionalmente en una pre-resina de intercambio aniónico de absorción de cama extendida. Por ejemplo, se puede utilizar una resina de cromatografía de intercambio aniónico de absorción de cama expandida con porciones enlazadoras derivadas con amina cuaternaria (por ejemplo, trimetilaminometilo o DEAE). Las resinas de cromatografía de intercambio aniónico de cama expandida se caracterizan por tamaños de cuentas más grandes, por ejemplo con diámetros mayores de 30µp? pero generalmente no exceden de 500µG? de diámetro. Debido al tamaño grande de las cuentas, los fragmentos grandes de desechos celulares y las células totales (sin lisar) tienen la capacidad de fluir libremente a través de la resina de cromatografía (y su sinterizado de tamaño apropiado). Las resinas de cromatografía de absorción de cama expandida adecuada incluyen, pero no están limitadas a Streamline QXL® (Pharmacia, Uppsala, Sweden) y DEAE Cellthru-Blg Beads™ (Sterogene, Carisbad, CA, o el equivalente de UpFront Chromatography, Copenague, Dinamarca). El lisado de célula es eluído a partir de una resina de cromatografía de pre-resína de intercambio aniónico en cualquier eluyente adecuado (por ejemplo, 600 mM de NaCI). La solución es diluida de manera adecuada si es necesario, para disminuir la concentración del agente de elución u otros agentes en el regulador de elución. La solución de lisato de célula semi-purificada y concentrada entonces puede ser aplicada a una resina de cromatografía de intercambio aniónico adecuada para la purificación.
En vista de lo anterior, la presente invención proporciona un método para el enriquecimiento de una solución de un adenovirus.
El método comprende los pasos de: (i) obtención de una solución mezclada que comprende adenovirus y por lo menos un tipo indeseado de biomolécula; (ii) aplicación de la solución mezclada a una resina de cromatografía de intercambio aniónico, y (Ni) elución de adenovirus a partir de la resina cromatográfica en un eluyente, de modo que se obtiene una solución de adenovirus enriquecida. Además, la solución mezclada de adenovirus puede ser clarificada opcionalmente por medio de filtración del flujo tangencial . Además, la solución mezclada y clarificada de adenovirus puede ser cromatografiada opcionalmente utilizando un pre-resina de intercambio aniónico. Al respecto, la presente invención también proporciona un método para la purificación de un adenovirus de células infectadas con el adenovirus. El método comprende el lisado de las células infectadas con adenovirus, aplicando el lisado a una resina de cromatografía sencilla de modo que el adenovirus se enlaza a la resina de cromatografía, eluyendo el adenovirus de la resina de cromatografía y colectando una fracción que contiene el adenovirus. El adenovirus que se encuentra en la fracción es substancialmente puro como un adenovirus triple purificado por gradiente de densidad de CsCI. Para purificar el adenovirus de la célula Usada se puede utilizar cualquier resina de cromatografía simple adecuada. Cualquier resina de cromatografía dé intercambio aniónico adecuado que tenga un grupo de superficie seleccionada a partir del grupo consistente de dimetilaminopropilo, dimetilaminobutilo, dimetilaminoisobutilo, y dimetilaminopentilo puede ser usada para purificar el adenovirus de la solución mezclada que comprende el adenovirus y por lo menos un tipo indeseado de biomolécula. El grupo de la superficie es preferentemente dimetilaminopropilo. El grupo de la superficie puede ser enlazado a un soporte de matriz a través de cualquier grupo de enlace adecuado tal como los conocidos en el arte. Los eniazadores de sulfonamida y acrilato se encuentran entre aquellos eniazadores adecuados en el contexto de la presente invención. El soporte de matriz puede estar compuesto por cualquier material adecuado; sin embargo, es preferente que el soporte de la matriz sea una resina de cromatografía de intercambio aniónico perfusiva, de modo que se pueda optimizar el transporte de masa intrapartículas. La resinas de cromatografía perfusivas generalmente tienen poros grandes que cortan transversamente las partículas. A una red de poros más pequeños, limitando de este modo las trayectorias de difusión aumenta el área de superficie de los diámetros de los poros grandes. En parte debido a la distribución de dos modos de tamaños de partículas, la fase móvil y el adenovirus entran y fluyen a través de las partículas de la resina de cromatografía, utilizando tanto el transporte de convección como de difusión . Dichas resinas de cromatografía perfusivas son bien conocidas por el arte, y por ejemplo, son descritas de una manera más detallada por Afeyan y asociados (J. Chromatogr. 519 páginas 1 a 29 (1990), y las Patentes Norteamericanas 5,384,042; 5,228,989; 5,552 ,041 ; 5,605,623; y 5,01 9,270). La resina de cromatografía de intercambio iónico perfusivo 5 adecuada en el contexto de la presente invención es la POROS® 50D, comercializada por perSeptive Biosystems, Framingham, Massachusetts , la POROS® 50D es una resina de cromatografía de copolímero de estireno-divinilbenceno, que tiene una capacidad dinámica de por lo menos 100 mg/ml de albúmina de suero bovino o (BSA) en 100 cm/hr con ruptura al 50%, y de por lo menos 80 mg/ml de BSA en 1000 cm/hr con ruptura al 5% . La POROS® 50D exhibe una caída de presión menor de 3 bars en 1000 cm/hr en un lecho de resina cromatográfica y el tamaño de partícula nominal de la resina de cromatografía es de aproximadamente 50µ?t? (por ejemplo, el 5 tamaño de partícula promedio es de entre 25 y 100pm). Las resinas de cromatografía de intercambio aniónico pueden ser usadas ya sean como resinas de cromatografía de "lote" o preferentemente como, preparaciones "de flujo", preferentemente la forma de una columna, especialmente para resinas de cromatografía 0 perfusivas. Además, la presente invención tiene un contraste distinto con los métodos del arte previo, proporciona u na cromatografía que utiliza la purificación rápida, sencilla y completamente escalable del adenovirus.
Un adenovirus purificado de acuerdo con los métodos de la presente invención , no tiene una proporción de partícula pfu substancialmente inferior (pu/pfu) que un adenovirus purificado por gradiente de densidad de CsCI. Es decir, la proporción pu/pfu del adenovirus purificado es de por lo menos 50% el adenovirus purificado por gradiente de densidad de Cs.CI preferentemente de por lo menos aproximadamente el 85% del adenovirus purificado por gradiente de densidad de CsCI, y más preferentemente, de por lo menos aproximadamente el 96% del adenovirus purificado por gradiente de densidad de CsCI. Además, la pureza del adenovirus cromatografiado excede preferentemente a la de una solución idéntica a la del adenovirus que analíticamente no se puede distinguir a partir del adenovirus purificado a través del arte previo estándar de purificación triple de gradiente de densidad CsCI (por ejemplo, es tan puro substancialmente como el adenovirus triple purificado de gradiente de densidad CsCI, por ejemplo es por lo menos 90% tan puro, preferentemente 97% tan puro, y más preferentemente por lo menos 99% tan puro como el adenovirus triple purificado por gradiente de CsCI). El adenovirus es substancialmente y adecuadamente enriquecido con una solución eluyéndola a partir de la resina de cromatografía de intercambio aniónico en un eluyente adecuado. Los eluyentes típicos son de carácter iónico de modo que compiten con el adenovirus para el enlace a la resina de cromatografía . El eluyente es aplicado preferentemente a la resina de cromatografía en un gradiente discontinuo, por ejemplo, en dos o más pasos, o en una gradiente continua. Dichas gradientes pueden ser lineales, cóncavas o convexas. Un eluyente adecuado es el cloruro de sodio en una solución regulada. Por ejemplo, el adenovirus se eluye a partir de 5 resina de cromatografía Q Ceramic Hyper D® F en aproximadamente 360 y aproximadamente 475 mM de NaCI , más particularmente en 41 5 mM de NaCI, y la resina de cromatografía POROS® 50D en entre aproximadamente 360 y aproximadamente 450 mM de NaCI, más particularmente de o aproximadamente de 400 mM de NaCI. La resina de cromatografía de intercambio aniónico puede ser cargada de manera provechosa en concentraciones altas de agentes de elución (por ejemplo, de por lo menos el 75% de la concentración que es necesaria para eluir el adenovirus de la resina de 5 cromatografía, preferentemente de entre aproximadamente el 85% hasta aproximadamente el 90% de la concentración que es necesaria para eluir el virus de la resina de cromatografía). Cargando la resina de cromatografía de intercambio aniónico en altas concentraciones de agente eluyente, ciertas impuresas no se enlazan a la resina. 0 La elución del adenovirus enriquecido puede ocurrir en cualquier rango de flujo adecuado. Los rangos de flujo típicos para la resina de cromatografía de intercambio aniónico utilizado en la resina son de aproximadamente 100 cm/hr hasta aproximadamente 1 ,000 cm/hr, preferentemente de aproximadamente 200 cm/hr hasta 5 aproximadamente 500 cm/hr. Los rangos de flujo de ejemplo para la resina de cromatografía de intercambio aniónico que contienen una porción de enlace seleccionada del grupo consistente de dimetilaminopropilo, dimetilaminobutilo, dimetilaminoisobutilo, y ^ dimetilaminopentilo son desde aproximadamente 100 cm/hr hasta 5 aproximadamente 1 500 cm/hr, preferentemente desde aproximadamente 500 cm/hr hasta aproximadamente 1250 cm/hr. Con el objeto de cuantificar de manera exacta el número de partículas adenovirales ya sea en la solución de muestra del adenovirus tal y como una solución obtenida a partir del lisado crudo )10 de las células infectadas con el adenovirus, una solución de muestra de un adenovirus puede ser preparada tal y como se describió anteriormente. La solución de muestra del adenovirus entonces puede ser enriquecida y purificada aplicándola a y eluyéndola la solución de muestra de una resina de cromatografía de intercambio 15 aniónico tal y como se describió anteriormente. La absorvencia de la muestra de adenovirus eluída de la resina de cromatografía es determinada después. Como comparación, la absorbencia de una solución de adenovirus estándar, por ejemplo, una solución de adenovirus se determina una solución de adenovirus de una 20 concentración conocida. A través de una comparación de la absorbencia de la solución de muestra, y la absorbencia de la solución estándar, se puede determinar la concentración de las partículas adenovirales, por ejemplo, el número de partículas adenovirales en un volumen determinado en la solución de muestra.
La absorbencia estándar puede ser una absorbencia estándar sola, o una serie o un grupo de absorbencias estándar que indican el rango de concentraciones del adenovirus. La absorbencia de la muestra y la absorbencia estándar pueden ser presentadas en formatos, mediciones o unidades similares o diferentes (aunque preferentemente similares) siempre y cuando se realice una comparación útil . Por ejemplo, una absorbencia estándar adecuada puede ser una absorbencia que es determinada a partir de una solución estándar de adenovirus que ha sido tratada de la misma manera que la solución de adenovirus de muestra ha sido tratada de acuerdo con los métodos de la presente invención. La cuantificación del número de partículas adenovirales es realizada comparando la absorbencia de la muestra con la absorbencia estándar o cualquier método adecuado. Por ejemplo, la absorbencia de la muestra y la absorbencia estándar pueden ser comparadas calculando una curva estándar del área abajo del pico que corresponde a la elución del virus de la resina de cromatografía en una absorbencia contra el tiempo de la cromatografía. La absorbencia de concentraciones conocidas diferentes del adenovirus puede ser traza en una gráfica, creando una curva estándar. Usando un análisis de regresión lineal, puede ser determinada la concentración de la muestra . Puede obtener el adenovirus enriquecido en una solución o purificada a partir de la células infectadas con el adenovirus utilizando cromatografía de intercambio aniónico en soluciones que pueden contener concentraciones altas de un agente de elución, por ejemplo, NaCI . La composición regulada puede ser cambiada fácilmente mediante cualquier técnica adecuada a cualquier regulador deseado, por ejemplo, un regulador estéril isotónico para inyección de mamíferos (por ejemplo una solución de Ringer lactada) que contiene los excipientes adecuadas (estabilizadores y crioconservadores) para un almacenamiento a largo plazo del adenovirus purificado. Las técnicas adecuadas para el cambio de la composición del regulador incluyen , pero no están limitadas a, la diálisis, y la filtración, y cromatografía de exclusión de tamaño. Las matrices de cromatografía por exclusión de tamaño adecuadas incluyen Toyopearl HW-40C y Toyopearl HW-40F (TosoHaas, Montgomeryville, PA); Uniflow™, Superflow™, y U ltraflow™ (Sterogene , Carlsbad, CA); Shodex1^ (Thomson Instruments, Chantilly, VA); y Bio-Síl™ y Bio-Gel™ (Bio-Rad, Hercules, CA) cada una de estas resinas cromatográficas tienen un potencial bajo de enlace de proteína de una manera adecuada. La presente invención se describe de manera adicional en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos sirven solamente para ilustrar la invención y no intentan limitar el alcance de la misma de manera alguna.
EJ EM PLOS Ejemplo 1 Este Ejemplo demuestra la purificación del adenovirus a partir de un lisado crudo de célula. La purificación fue lograda clarificando primero el lisado de célula, y aplicando el lisado de célula a y ^ eluyéndolo desde una pre-resina de intercambio aniónico, y 5 finalmente, aplicando el lisado de célula a eluyéndola desde la resina de intercambio aniónico que contiene una porción de enlaces seleccionada del grupo consistente de dimetilaminopropil, dimetilaminopentilo, dimetilaminoisobutilo y dimetilaminopentilo. El AdSEAP y el AdVEGFi2i son vectores adenovirales con )10 retiro en las regiones E 1 y E3 del genoma adenoviral que contiene el cassette de expresión del gen, en este caso, un promotor tipo citomegaloviral (CMV) enlazado de manera operable a un gen extraño (transgen), por ejemplo fosfato secretorio alcalino (AdSEAP) o un factor de crecimiento vascular endotelial 121 (AdVEGFi2i ), en la 15 región E 1 del genoma adenoviral. El AdSEAP y el AdVEGFi2i fueron propagados, en matraces giratorios, botellas giratorias, botellas de agitador o bioreactores que contenían aproximadamente células 293 1 05- 106 por mililitro en la presencia o ausencia dé suero en el medio de crecimiento. Las células y el medio fueron procesados por 20 cualquiera de los dos métodos siguientes de cromatografía del arte previo: (a) las células fueron concentradas por centrifugación, y se volvieron a suspender en un regulador adecuado (25m Tris, pH 7.8, 75 mM NaCI , 10mM gC ) para la actividad óptima de la DNasa/RNasa, lisada en un microfluidisador (Microfluidics, Newton, 25 Massachusetts) de acuerdo con las instrucciones del fabricante clarificadas mediante filtración; o (b) las células fueron lisadas directamente en un microfluidizador de acuerdo con las instrucciones del fabricante, clarificadas por filtración y concentradas y diafiltradas dentro del regulador adecuado descrito anteriormente para la filtración del flujo tangencial (TFF). En ambos métodos, el lisado de células clarificado fue tratado posteriormente con una DNasa/RNasa, tal como Benzonase® (Nycomed Pharma A/S, Denmark), de acuerdo con las instrucciones del fabricante; y diluida dentro de un regulador adecuado para la resina de intercambio aniónico. El lisato de las células fue aplicado entonces a una columna Q Ceramic HyperD™F y eluída con un gradiente de paso de 360 a 475 mM de NaCI. La Figura 1 , la cual es una cromatografía de un lisado de célula infectada adenoviralmente eluída a partir de resina de cromatografía de amina cuaternaria (columna Q Ceramic HyperD™F), muestra la elución del adenovirus a partir desde la pre-columna de intercambio aniónico Q Ceramic HyperD™F, cuando no se llevó acabo el paso de DNasa/RNasa. El pico viral purificado parcialmente y concentrado, el cual eluye en aproximadamente 415 mM de NaCI cuando es eluído con gradientes de paso de 360, 450 y 1000 mM de NaCI , fue contenido en una fracción de alrededor de 51 minutos. La Figura 2 la cual es una cromatografía de un lisado de células infectadas adenoviralmente clarificadas por medio de filtración de flujo tangencial , tratadas con DNasa/RNasa , y eluída de la resina de cromatografía de amina cuaternaria, muestra la elución del adenovirus de la pre-columna de intercambio aniónico Q Ceramic HyperD™F, cuando se utilizó DNasa/RNasa (Benzonase®). Se observó una disminución significativa en la magnitud del pico de ácido nucleico de elución después del pico del virus. El eluyente de la pre-columna de intercambio aniónico entonces fue diluido por aproximadamente él 30% que es necesario para diluir el agente de elución , en este caso NaCI a una concentración menor qué contra de los de la concentración de elución para la cromatografía de dimetilaminopropilo perfusiva columna (POROS® 50D), la cual fue usada para terminar la purificación del adenovirus del lisado de cél ula crudo. La columna POROS® 50D fue cargada en una concentración de 300mM de NaCI. Luego la columna fue eluída con un paso gradiente de cloruro de sodio (360 mM a 450 mM). Una cromatografía de lisado de células infectado adenoviralmente y clarificado por filtración de flujo tangencial, tratada con DNasa/RNasa eluída de la columna de cromatografía de amina cuaternaria . y la columna de cromatografía de dimetilaminopropilo profusiva muestra la elución del adenovirus de la columna POROS® 50D. Substancialmente, solamente se obtuvo un pico agudo en aproximadamente 35 minutos. La caracterización analítica del adenovirus purificado indicó que la pureza del adenovirus substancialmente no se pudo distinguir del adenovirus purificado en donde el adenovirus triple purificado por gradiente de densidad de CsCI.
Por lo tanto, el adenovirus fue purificado a partir del lisado de célula crudo mediante la filtración de lisado de célula, aplicando el lisado de célula a y eluyéndolo de una pre-columna de intercambio aniónico de columna de amina cuaternaria, y finalmente aplicando el lisado de célula y eluyéndolo de la columna de intercambio aniónico que contiene una porción de enlace dimetilaminopropilo.
Ejemplo 2. Este ejemplo demuestra la purificación del adenovirus a partir del lisado de célula crudo. La purificación se llevó acabo clarificando primero el estado de célula , aplicando el lisado de célula y eluyéndola de una pre-columna de intercambio aniónica de absorción de lecho expandido, y finalmente, aplicando el lisado de célula a y eluyéndolo de la columna de intercambio aniónico que contiene una porción de enlaces seleccionada del grupo consistente dimetilaminopropilo, dimetilaminopentilo, dimetilaminoisobutilo y dimetilaminopentilo. El AdSEAP (el vector adenoviral tal y como se describió en el Ejemplo 1 ) fue propagado en matraces giratorios con un contenido de aproximadamente 293 105-106 células por mi. Las células y el medio fueron lisados en un microfluidizador de acuerdo con las intrucciones del fabricante. El lisado de células fue aplicado a una pre-columna de intercambio aniónico de absorción de cuenta expandido Streamline QXL® (Pharmacia, Uppsala, Suecia) (para eliminar los desechos grandes de las células no lisadas). La columna Streamline QXL® sirvió también parcialmente para purificar y concentrar el adenovirus. La Figura 3, la cual es una cromatografía de un lisado de células infectadas adenoviralmente de una resina de cromatografía de absorción de lecho expandido. Muestra la elución del adenovirus de la columna Streamline QXL®. El pico viral fue contenido en la fracción 14 (una fracción por minuto) la cual se eluyó en aproximadamente 600 mM de NaCI. El eluyente de la columna Streamline QXL® fué eluído en aproximadamente 1 :2. La delución fue necesaria para deluir el agente de elución , en este caso NaCI, a una concentración menor que la concentración de elución para la columna POROS® 50D, la cual se utilizó posteriormente. Una columna POROS® 50D fue utilizada para terminar la purificación del adenovirus. La columna POROS® 50D fue cargada en una concentración de 300 mM de NaCI. Entonces la columna fue eluída con un gradiente lineal de cloruro de sodio (360 mM a 450 mM), en donde el adenovirus fue elu ído de la columna POROS® 50D. Una cromatografía del lisado de células infectadas adenoviralmente eluído de la resina de cromatografía de absorción de cama expandida y una resina de cromatografía de dimetilaminopropilo perfusiva, muestra substancialmente solamente un pico agudo en aproximadamente 15 minutos cuando es elu ída con un gradiente lineal de NaCI desde 360 a 450 mM, de modo que el virus es eluído en aproximadamente 400mM de NaCI . La caracterización analítica del adenovirus purificado indicó que la pureza del adenovirus substancialmente no era distinguible del adenovirus triple purificado por gradiente de densidad de CsCI (ver Figura 4). Por lo tanto, el adenovirus fue purificado a partir del lisado de ^ célula crudo por medio de la filtración de lisado de célula, aplicando 5 el lisado de célula a y eluyéndola de una pre-columna de intercambio aniónico del lecho expandido, y finalmente, aplicando el lisado de célula a y eluyéndolo de una columna de intercambio aniónico con un contenido de una porción de enlace de dimetilaminopropilo. ?10 Ejemplo 3 Este ejemplo demuestra, un contraste diferente a los métodos anteriores, la purificación de una denovirus por medio de una columna de cromatografía sencilla a partir del lisado de célula crudo, en donde la purificación fue por lo menos del 95% tan pura como el 15 adenovirus purificado por gradiente de densidad de CsCI. Adicionalmente, esta técnica proporciona un método rápido y exacto para cuantificar el número total de partículas virales en un lisado crudo. El AdSEAP (el vector adenoviral de acuerdo con el Ejemplo 1 ) 20 fue cultivado y lisado de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 1 , método (a). El lisado de célula completo fue aplicado a una columna POROS® 50D en 360 mM de NaCI. La columna fue eluída tal y como se indicó en el Ejemplo 1 , dando como resu ltado la cromatografía de absorbencia (260 nm y 280 nm) contra el tiempo (minutos) ilustrado 25 en la Figura 6. El análisis analítico de la fracción del pico indicó que la purificación no era distinguible del adenovirus triple purificado por gradiente de densidad de CsCI (Figuras 5 & 6) en las cuales la l ínea superior horizontal es una medición en línea de la conductividad indicada de la concentración real de NaCI. El traslape substancial y la proporción de la absorbencia pico en 260 nm (la traza más alta en la cromatografía) a 280 nm, (el trazo más bajo en la cromatografía) el cual fue 1 .27 (1 .25 ± 0.08 fue la proporción determinada empíricamente del virus puro), indicó que el virus era substancialmente puro. La falta de picos no superimpuestos (o picos secundarios), también indicó que el virus era substancialmente puro.
Varias soluciones de adenovirus con concetraciones conocidas fueron aplicadas a una columna POROS® 50D en 360 mM de NaCI. La columna fue eluída tal y como se indica en el Ejemplo 1 , y la absorbencia (260 nm y 280 nm) contra el tiempo de elución (minuto) fue cromatografiada. El área abajo del pico correspondiente a la elución adenoviral fue determinada por cada concentración diferente y trazada en la forma de una gráfica del área contra la concentración del adenovirus. El área debajo de la curva de la cromatografía del AdSEAP en la Figura 5 correspondiente a la elución adenoviral fue calculada y comparada con la curva estándar utilizando la regresión lineal y determinó que el Usado crudo contenía 4.64 x 1 01 0 pu/mL. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método de un solo paso para la purifiación del adenovirus de un Usado de célula total. Por lo que el adenovirus el cual fue por lo menos el 95% tan puro como el adenovirus triple purificado por el gradiente de densidad CsCI, fue purificada a partir del lisado de célula crudo por una columna de cromatografía simple. Además, el número total de adenovirus en un lisado de célula crudo fue cuantificado rápida y exactamente.
Ejemplo 4 Este ejemplo demuestra, que la composición reguladora del adenovirus aislado de las columnas de intercambio aniónico pueden ser cargadas fácilmente ( por ejemplo, de u na concentración alta de sal a una concentración baja de sal). Aproximadamente volúmenes de columna de 0.1 (volúmenes de columna de 0.01 hasta aproximadamente volúmenes de columna de 0.25) de solución con contenido de adenovirus aislado en el Ejemplo 1 , fue aplicada a una columna Toyopearl HW-40C o una columna Uniflow 4 equilibrada con un regulador isotónico estéril adecuado para inyección a mamíferos (por ejemplo, solución Ringer lactada) y con un contenido de excipientes adecuados (estabilizadores y crioconservadores) para almacenamiento de largo plazo del adenovirus purificado. La fracción de la columna que contiene el adenovirus fue identificada por espectroscopia en línea y retenida. El virus purificado fue contenido en un regulador que contiene aproximadamente 10 mM Tris, pH 7.8, 75 mM de NaCI y diferentes estabilizadores.
Todas las referencias citadas en la presente invención, incluyendo las Patentes, solicitudes de Patente y publicaciones están adecuadas en su totalidad a la presente descripción como referencia.
Aunque la presente invención ha sido descrita haciendo un énfasis en las modalidades preferidas, será obvio para los expertos en el arte, que se pueden usar variaciones de las modalidades preferidas, y que se tiene la intención de que la presente invención pueda ser practicada de un modo diferente al descrito específicamente en la presente descripción. Por consiguiente, la presente invención incluye todas las modificaciones comprendidas dentro del espíritu y alcance de la misma tal y como se define en las Reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

R E I V I N D I C A C I O N E S ^ Habiendo descrito la presente invención, se considera 5 como novedad y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES:
1. Un método para el enriquecimiento de una solución Mo de un adenovirus el cual comprende: (i) La obtención de una solución mezclada que comprende el adenovirus y por lo menos un tipo indeseado de biomolécula; (ii) La aplicación de dicha solución mezclada a una 15 resina de cromatografía de intercambio aniónico que contiene una porción de enlace seleccionada del grupo consistente de dimetilaminopropilo, dimetilaminobutilo, dimetilaminoisobutilo y dimetilaminopentilo, de modo que el adenovirus se enlaza a dicha resina de cromatografía; y 20 (iii) La elución de dicho adenovirus de dicha resina de cromatografía con un eluyente, de modo que se obtiene una solución de adenovirus enriquecida.
2. El método tal y como se describe en la Reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha porción de enlace es dimetilaminopropilo.
3. El método tal y como se describe en cualquiera de la Reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado además porque dicho eluyente es un eluyente de gradiente continuo o discontinuo.
4. El método tal y como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones del 1 al 3, caracterizado además porque dicho eluyente es un eluyente de gradiente que comprende un gradiente de solución de cloruro de sodio.
5. El método tal y como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones del 1 al 4, caracterizado además porque dicha resina de cromatografía de intercambio aniónico es una resina de cromatografía de intercambio aniónico perfusiva.
6. El método tal y como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones del 1 al 5, caracterizado además porque dicha solución mezclada comprende el adenovirus y por lo menos un tipo indeseable de biomolécula y es obtenida por medio de la microfluidización de una población de células infectadas con el adenovirus.
7. El método tal y como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones del 1 al 6, caracterizado además porque dicho método comprende adicionalmente: (i) la aplicación de dicha solución mezclada que comprende el adenovirus y por lo menos un tipo indeseable de biomolécula a una pre-resina de intercambio aniónico y dicho adenovirus se eluye de dicha pre-resina y luego, en el paso (ii), en vez de aplicar dicha solución mezclada, se aplica dicho adenovirus eluído de dicha pre-resina a dicha resina de cromatografía de intercambio aniónico,
8. El método tal y como se describe en la Reivindicación7, caracterizado además porque dicha pre-resina de intercambio aniónico es una resina amina cuaternaria.
9. El método tal y como se describe en la Reivindicación 8, caracterizado además porque dicha pre-resina de intercambio aniónico, es una resina de lecho plano o de absorción de lecho expandido.
10. El método tal y como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones del 1 al 9, caracterizado además porque el paso (ii) es realizado en una solución que contiene por lo menos aproximadamente el 75% por concentración de un agente de elución requerido para eluir dicho adenovirus de dicha resina de cromatografía de intercambio aniónico. 1 1 . El método tal y como se describe en cualquiera de las Reivindicaciones del 1 al 10 , caracterizado además porque dicho contacto de dicha resina es mezclada con una resina de cromatografía de intercambio aniónico que es realizado en una solución que contiene desde aproximadamente el 85% hasta aproximadamente el 90% por concentración de un agente de elución requerido para eluir dicho adenovirus de dichas resinas de cromatografía de intercambio aniónico. O 12. Un método para cuantificar de manera exacta el número de partículas adenovirales en una solución de muestra el cual comprende: (i) El enriquecimiento de dicha solución de adenovirus 5 de muestra , tal y como se describe en el método de cualquier de las Reivindicaciones del 1 al 1 1 ; (ii) Determinación de la absorbencia de la solución de muestra que ha sido enriquecida de acuerdo con el método tal y como se describe en cualquiera de las reivindicaciones del 1 al 1 1 y 0 una solución de adenovirus estándar; (iii) La comparación de la absorbencia de la solución de muestra y la solución estándar; y (iv) La cuantificación del número de partículas adenovirales en dicha solución de muestra. 5 1 3. El método tal y como se describe en la Reivindicación 12, caracterizado además porque la solución de muestra es preparada a partir de un listado de célula cruda de células infectadas ^ adenoviralmente. 5 14. Un método de purificación de un adenovirus a partir de células infectadas con el adenovirus cuyo método comprende el lisado de dichas células, la aplicación del lisado a una resina de cromatografía simple, de modo que dicho adenovirus se enlaza a Mu dicha resina de cromatografía, eluyendo dicho adenovirus y dicha resina de cromatografía y recolectando una fracción que contiene dicho adenovirus, en donde dicho adenovirus es substancialmente tan puro como un adenovirus triple purificado con gradiente de densidad CsCI. 15 1 5. Un método para la cuantificación exacta de un número de partículas adenovirales en una solución de muestra el cual comprende: (i) La purificación de la solución del adenovirus muestra 20 de acuerdo con el método tal y como se describe en la Reivindicación 14; (ii) La determinación de la absorbencia de la solución de muestra que ha sido purificada de acuerdo con el método tal y como se describe en la reivindicación 14 y una solución estándar del 25 adenovirus; (i¡¡) Comparación de la absorbencia de la solución de muestra y la solución estándar; y (iv) La cuantificación del número de partículas adenovirales en dicha solución de muestra. RESU M EN Un método de enriquecimiento de una solución de u n adenovirus el cual comprende la aplicación la apl icación de u na solución mezclada que comprende adenovirus y por lo menos un tipo indeseado de biomolécu la a u na resina de cromatografía de intercambio a n ión ico que comprende una porción de enlaces seleccionada del gru po consistente de dimeti lami nopropilo, dimetilam i nobutilo, dimetilaminoisobutilo, y d imetilaminopentilo, y eluyéndo el adenovirus de la resina de cromatografía. También se proporciona un método de purificación del adenovi rus a partir de células i nfectadas con el adenovirus el cual com prende el lisado de dichas célu las, la aplicación del elisado a una cromatografía simple, eluyendo el adenovirus de la resina de cromatografía, y recolectando una porción que contiene el adenovirus que es substancialmente tan puro como un adenovirus triple purificado por gradiente de densidad de CsCI . Este método proporciona adicionalmente un método para la cuantificación exacta del número de partículas adenovirales en una solución de adenovi rus el cual comprende la aplicación a y al elución de u na sol ución de muestra de adenovirus de una resina de cromatografía de intercambio anión ico , y la comparación de la absorbencia de la solución de muestra de adenovirus y la absorbencia de una sol ución de adenovirus estándar, y la cuantificación del nú mero de partículas adenovirales en la solución de la muestra .
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