JP2022540478A - 空のおよび完全なウイルスキャプシド粒子の分離および定量化 - Google Patents
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Abstract
本開示は、ウイルス医薬組成物または医薬産生物などのウイルス調製物内の空のおよび完全なウイルスキャプシド（例えば、ＡＡＶキャプシド）の分離および定量化のための方法を提供する。【選択図】図２０
Description
関連出願への相互参照
この出願は、２０１９年７月１２日に出願された米国出願６２／８７３，６１９からの優先権を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
この出願は、２０１９年７月１２日に出願された米国出願６２／８７３，６１９からの優先権を主張し、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、遺伝子治療において最も人気のあるウイルスベクター送達システムの１つとして浮上している。ＡＡＶベースの遺伝子送達ベクター（組換えＡＡＶまたはｒＡＡＶ）は、治療的導入遺伝子を含むＡＡＶキャプシドを含む。細胞培養におけるＡＡＶベクター産生の特徴は、過剰な「空の」キャプシドの形成であり、これはベクターゲノムを欠いているため、治療的利益を提供できない。空のキャプシドが臨床転帰に及ぼす影響は不明であるが、ベクターに対する自然免疫応答または獲得免疫応答が増加する可能性が大きな懸念事項である。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、遺伝子治療において最も人気のあるウイルスベクター送達システムの１つとして浮上している。ＡＡＶベースの遺伝子送達ベクター（組換えＡＡＶまたはｒＡＡＶ）は、治療的導入遺伝子を含むＡＡＶキャプシドを含む。細胞培養におけるＡＡＶベクター産生の特徴は、過剰な「空の」キャプシドの形成であり、これはベクターゲノムを欠いているため、治療的利益を提供できない。空のキャプシドが臨床転帰に及ぼす影響は不明であるが、ベクターに対する自然免疫応答または獲得免疫応答が増加する可能性が大きな懸念事項である。
不純物として空のベクター粒子を定量化するための分析方法の開発は、ウイルス調製物、医薬組成物、および医薬産生物の特徴付けのために特別な注目を集めている。空のウイルス粒子のパーセント（または空と完全との比）を決定するために現在利用可能な方法は、面倒で、煩雑で、スループットが低く、および／または分解能が低い。空のＡＡＶ粒子およびｒＡＡＶ（「完全な」）粒子を分離し、製造プロセス中にクロマトグラフィー法によってｒＡＡＶ粒子を精製する試みがなされている；しかしながら、空の粒子に対応するピークおよび標的ゲノムを含有するＡＡＶベクターに対応するピーク間のベースラインピーク分解能の成功は、まだ達成されていない。
したがって、製造プロセス中のスクリーニング、ベクター産生物の放出、および／または現在の良好な製造慣行およびＵＳＰ基準などの高品質基準の厳しい要求によく適した医薬産生物分析のための新しいＡＡＶ特異的アッセイの必要性が残っている。
本開示は、ウイルス調製物（例えば、ＡＡＶ調製物）中の空のおよび完全なキャプシド（例えば、空のおよび完全なＡＡＶキャプシド）を分離する方法を提供する。この方法は、ウイルス調製物および移動相をイオン（例えば、陰イオンまたは陽イオン）交換カラムを通して実行することを含み、移動相は、不連続な溶出勾配および少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの）アイソクラティックホールドを含む。
別の態様において、本開示は、ウイルス調製物（例えば、ＡＡＶ調製物）中の空のおよび完全なキャプシド（例えば、空のおよび完全なＡＡＶキャプシド）を定量化する方法を提供する。この方法は、ウイルス調製物および移動相を陰イオンまたは陽イオン交換カラムを通して実行することを含み、移動相は、不連続な溶出勾配および少なくとも１つの（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの）アイソクラティックホールドを含む条件下で実行される。
本発明の方法のいくつかの実施形態において、ウイルス調製物および移動相は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム上で実行される。
いくつかの実施形態において、空のおよび完全なキャプシドは、２．０より大きいベースライン分解能などのベースライン分解能により分離される。
いくつかの実施形態において、方法で使用される陰イオン交換カラムは、第四級アミン（Ｑ－アミン）カラムなどの強陰イオン交換（ＳＡＸ）カラムである。いくつかの実施形態において、陰イオン交換カラムはモノリスカラムである。
いくつかの実施形態において、方法で使用される陽イオン交換カラムは、ベンゼンスルホン酸カラムなどの強陽イオン交換（ＳＣＸ）カラムである。いくつかの実施形態において、陽イオン交換カラムはモノリスカラムである。
いくつかの実施形態において、本発明の方法で使用される移動相は、塩を含む。さらなる実施形態において、塩は、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）または酢酸ナトリウムである。特定の実施形態において、移動相の最終勾配は、０．１から１０Ｍ（例えば、１、１．５、または２Ｍなどの０．５から５Ｍ）の塩を含む。特定の実施形態において、塩は、０．５から５Ｍ（例えば、１Ｍ）のＴＡＭＣまたは酢酸ナトリウムである。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのアイソクラティックホールドは、移動相が最終勾配の５０％に達する前に、例えば、移動相が最終勾配の２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４０％、または４５％に達する前に導入される。
いくつかの実施形態において、移動相のｐＨは、約８から約１０、例えば約９である。
いくつかの実施形態において、カラムは、０℃から５０℃の間、例えば２０℃から２５℃の間の温度を有する。
本発明の方法により調製される高度に精製された組換えウイルス組成物（例えば、ＡＡＶ組成物）も、提供される。いくつかの実施形態において、ウイルス組成物は、１００％空のキャプシドまたは１００％未満（例えば、９５％未満、９０％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満）空のキャプシドを含む。特定の実施形態において、本開示は、空のウイルスキャプシドについて濃縮されるウイルス調製物を提供し、該調製物は、本明細書に記載の方法により得られるものであり、所望により、調製物中のウイルスキャプシドの２０％以下（例えば、１５％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下）は完全なウイルスキャプシドである。特定の実施形態において、本開示は、完全なウイルスキャプシドについて濃縮されるウイルス調製物を提供し、該調製物は、本明細書に記載の方法により得られるものであり、所望により、調製物中のウイルスキャプシドの２０％以下（例えば、１５％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下）は空のウイルスキャプシドである。
いくつかの実施形態において、本明細書におけるＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９などの１つまたは複数の血清型に由来してもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書における組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、約２０から９，０００塩基のサイズを有する組換えゲノムを有する。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明において明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示しているが、限定ではなく、例示としてのみ与えられることを理解されたい。本発明の範囲内の種々の変化および修正は、詳細な説明から当業者に明らかになる。
図１Ａおよび図１Ｂは、空のＡＡＶ（ピーク１）および完全なＡＡＶ（ピーク２）粒子についてのピークポジショニングを示す３つの異なる試料（積層された）の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムである。ＦＦＢ：最終処方緩衝液。ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３：アルファ－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）導入遺伝子を保持する組換えＡＡＶ６。ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ２：組換えＡＡＶ６－ＧＬＡウイルスの異なる産生バッチ。ＡＡＶ６空：空のＡＡＶ６キャプシド試料。
図２は、ＨＰＬＣにより計算される完全なキャプシドのパーセント対キャプシド粒子に対するベクターゲノム（ＶＧ／キャプシド）比の比較および相関を示すグラフである。
図３は、同じ試料についての完全なキャプシドのピーク面積およびさまざまな注入容量の線形性を示す積層ＨＰＬＣクロマトグラムである。
図４は、ＨＰＬＣにより分析される同じ試料についての完全なキャプシドのピーク面積およびさまざまな注入容量の線形性を示すグラフである。
図５は、一定の注入容量での同じ試料についての完全なキャプシドのピーク面積およびさまざまなキャプシド濃度の線形性を示す積層ＨＰＬＣクロマトグラムである。
図６は、一定の注入容量でのＨＰＬＣ分析により測定される同じ試料についての完全なキャプシドのピーク面積および可変キャプシド濃度の線形性を示すグラフである。
図７は、正規化されたキャプシド濃度を有する異なるｒＡＡＶ試料およびＡＡＶ空の試料のピーク分離を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。ｒＡＡＶ６－３７５－１：アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）導入遺伝子を保持する組換えＡＡＶ６。ｒＡＡＶ６－３７５－２：ＩＤＵＡ導入遺伝子を保持する組換えＡＡＶ６の異なる産生バッチ。ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ１：ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ２または３とは異なるＧＬＡ発現カセットを保持する組換えＡＡＶ６。
図８は、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ２（「ＧＬＡ２」）キャプシド試料についてのピーク分離およびリテンションタイムに対するカラム温度の影響を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図９Ａおよび９Ｂは、異なる商業的ベンダーからのＡＡＶおよびｒＡＡＶ試料の空のおよび完全なピーク分離およびリテンションタイムを比較するＨＰＬＣクロマトグラムである。試料は、Ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ６ Ｌｏｔ１、Ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ６ Ｌｏｔ２、およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６ Ｌｏｔ３を含む。
図１０は、４つの異なる溶出緩衝液を使用する、試料ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＡＡＶ６－０３０［空のＡＡＶ６ Ｌｏｔ ０３０］のリテンションタイムを比較するＨＰＬＣクロマトグラムである。
図１１Ａは、約０～１００％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を用いる、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料の連続注入のＨＰＬＣ結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図１１Ｂは、約１５～３０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を用いる、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料の連続注入のＨＰＬＣ結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図１１Ｃは、約１５～３０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を用いる、Ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料の連続注入の結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図１２Ａは、種々のｐＨレベルのＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、モノリスＨＰＬＣカラムで実行されるＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図１２Ｂは、種々のｐＨレベルのＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、弱陰イオン交換（ＷＡＸ）ＨＰＬＣカラムで実行されるＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図１３は、種々のｐＨレベルのＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、タンデム構成のＡＡＶモノリスおよび弱陰イオン交換（ＷＡＸ）ＨＰＬＣカラム上で実行されるＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図１４は、約１０分および１５分の緩い勾配（より長いＨＰＬＣ実行時間）を使用する、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図１５は、約５分の溶出緩衝液実行時間勾配を使用するＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についての結果と比較される、約１０、１５、２０、２５、および３０分の溶出緩衝液の緩い勾配を使用する、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図１６は、約１、２、３、４、および５分の溶出緩衝液の分析時間勾配を使用する、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図１７は、約１７％または１８％のアイソクラティックホールドを用いて約１５％～３０％または１５％～３５％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３を含む試料のピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図１８は、約１８％または１９％のアイソクラティックホールドを用いて約１５％～３０％または１５％～３５％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図１９は、約１９％のアイソクラティックホールドを用いて約０％～４０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図２０は、約１９％のアイソクラティックホールドを用いて約０％～４０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図２１は、約１９％のアイソクラティックホールドおよび約０．０３１ｓ／０．１３ｓ／０．５ｓの応答時間を用いて約０％～４０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図２２は、約１９％のアイソクラティックホールドを用いて約０％～４０％、５％～４０％、または１０％～４０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図２３は、約１９％のアイソクラティックホールドを用いて約２０℃、２５℃、３０℃、または３５℃のカラム温度を用いて約５％～４０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク分離およびリテンションタイムについての結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図２４は、約１９％のアイソクラティックホールドを用いて約２５℃または３５℃のカラム温度を用いて約５％～５０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図２５は、約１９％のアイソクラティックホールドを用いて２８０ｎｍの励起および３４８／３５０／３５５ｎｍの発光に設定される検出波長を用いて約０％～４０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図２６は、約１９％のアイソクラティックホールドを用いて３４８ｎｍの励起および２８０／３５０／３５５ｎｍの発光に設定される検出波長を用いて約０％～４０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図２７は、約１９％のアイソクラティックホールドを用いて約５％～４０％または約５％～５０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、処方緩衝液（ＦＢ）、Ｅｍｐｔｙ（Ｅ）、Ｆｕｌｌ（Ｆ）、およびＥｍｐｔｙ＋Ｆｕｌｌキャプシド混合組成試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果の比較を示すＨＰＬＣクロマトグラムのパネルである。
図２８Ａおよび２８Ｂは、約２、４、６、８、１０、および２０μｌでのＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３試料についてのピーク面積の負荷線形性を示すＨＰＬＣクロマトグラムおよびグラフである。
図２９Ａおよび２９Ｂは、約２、４、６、８、および１０μｌの注入容量でのＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク面積の負荷線形性を示すＨＰＬＣクロマトグラムおよびグラフである。
図３０Ａおよび３０Ｂは、両方のＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料についてのピーク面積の希釈線形性を示すグラフである。
図３１は、空のおよび完全なＡＡＶピークのピーク高さで従来の２６０／２８０切り替えを示す混合試料のＵＶ２６０および２８０ｎｍトレースを示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
図３２は、ピーク面積およびキャプシド濃度間の線形関係を示す、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料の異なる混合物の較正プロットを示すグラフである。
図３３は、種々のｐＨ値で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料のピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムのパネルである。
図３４は、種々のカラム温度で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、混合されたＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料のピーク分離およびリテンションタイムの結果を示すＨＰＬＣクロマトグラムのパネルである。
図３５Ａおよび３５Ｂは、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料のＣｒｙｏＴＥＭ分析の代表的なグラフである。
図３６Ａおよび３６Ｂは、ＣｒｙｏＴＥＭとの比較に使用されるＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３、Ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０、およびその他の試料についてのピーク分離およびリテンションタイムの結果を示す代表的なＨＰＬＣクロマトグラムである。
図３７Ａおよび３７Ｂは、ＡＵＣ、ＨＰＬＣ、およびＣｒｙｏＴＥＭ法により試験された異なるｒＡＡＶ６試料からの空の（Ａ）および完全なＡＡＶキャプシド（Ｂ）のパーセント定量化の比較を示すグラフである。
図３８Ａおよび３８Ｂは、ＪＭＰソフトウェアを使用するＨＰＬＣおよびＣｒｙｏＴＥＭを使用して計算される異なるウイルス試料中の空の（Ａ）および完全な（Ｂ）ＡＡＶ粒子のパーセンテージの相関を示すグラフである。
図３９は、約２０％のアイソクラティックホールドを用いて約０％～３０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、ＡＡＶ１ Ｅｍｐｔｙ Ｌｏｔおよび組換えＡＡＶ１試料（ＡＡＶ１－ＣＭＶ－ＧＦＰ、１７－ＡＡＶ－３２１、および１７－ＡＡＶ－０３７）のピーク分離、リテンションタイム、およびパーセント定量化結果を示す一連のＨＰＬＣクロマトグラムである。
図４０は、約１２％のアイソクラティックホールドを用いて約０％～３０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、ＡＡＶ２ Ｅｍｐｔｙ Ｌｏｔおよび組換えＡＡＶ２試料（１７－ＡＡＶ－０７７および１７－ＡＡＶ－１５５）の空のおよび完全なＡＡＶキャプシドのピーク分離、リテンションタイム、およびパーセント定量化結果を示す一連のＨＰＬＣクロマトグラムである。
図４１は、約１５％のアイソクラティックホールドを用いて約０％～３０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、ＡＡＶ３ Ｅｍｐｔｙ Ｌｏｔおよび組換えＡＡＶ３試料（ＡＡＶ３－ＣＭＶ－ＧＦＰ、１７－ＡＡＶ－１２４、および１７－ＡＡＶ－３２４）についての空のおよび完全なＡＡＶキャプシドのピーク分離、リテンションタイム、およびパーセント定量化結果を示す一連のＨＰＬＣクロマトグラムである。
図４２Ａおよび４２Ｂは、約１４％のアイソクラティックホールドを用いて約０％～３０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、ＡＡＶ８ Ｅｍｐｔｙ Ｌｏｔ（１７－ＡＡＶ－０８２）および組換えＡＡＶ８試料（１８－ＡＡＶ－０７０、１７－ＡＡＶ－３３９、１７－ＡＡＶ－３４０、１７－ＡＡＶ－３４１、およびＡＡＶ８ ＲＳＭ））についての空のおよび完全なＡＡＶキャプシドのピーク分離、リテンションタイム、およびパーセント定量化結果を示す一連のＨＰＬＣクロマトグラムである。
図４３は、約５％のアイソクラティックホールドを用いて約０％～４０％の勾配で実行されるＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する、試料ＰＤ Ｌｏｔ ０７６、ＰＤ７０ Ｌｏｔ １９－ＢＡＶ－４８４ＰＤ、ＰＤ７６ Ｌｏｔ ２０－ＢＡＶ－０２７ＰＤ、およびＲｕｎ２４ Ｌｏｔ １９－ＢＡＶ－４７０についての空のおよび完全なＡＡＶ９キャプシドのピーク分離、リテンションタイム、およびパーセント定量化結果を示す一連のＨＰＬＣクロマトグラムである。
発明の詳細な説明
本明細書に記載の方法は、カラムクロマトグラフィーを使用して、ＡＡＶ医薬組成物および医薬産生物などのＡＡＶ調製物中の空のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドおよび完全なＡＡＶ（例えば、組換えＡＡＶまたはｒＡＡＶ）キャプシドを分離および定量化するために使用されてもよい。例えば、高圧液体クロマトグラフィーとも呼ばれる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、各ピークの面積または高さが正確に測定されてもよい程度までウイルス調製物、医薬組成物、および医薬産生物中の空のＡＡＶキャプシドおよび完全なＡＡＶ（ｒＡＡＶ）キャプシドをベースライン分離するために使用できる。
本明細書に記載の方法は、カラムクロマトグラフィーを使用して、ＡＡＶ医薬組成物および医薬産生物などのＡＡＶ調製物中の空のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドおよび完全なＡＡＶ（例えば、組換えＡＡＶまたはｒＡＡＶ）キャプシドを分離および定量化するために使用されてもよい。例えば、高圧液体クロマトグラフィーとも呼ばれる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、各ピークの面積または高さが正確に測定されてもよい程度までウイルス調製物、医薬組成物、および医薬産生物中の空のＡＡＶキャプシドおよび完全なＡＡＶ（ｒＡＡＶ）キャプシドをベースライン分離するために使用できる。
ＡＡＶは、標的細胞にＤＮＡ（例えば、治療的遺伝子またはレポーター遺伝子）を送達するように操作することができる、エンベロープを有さない一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶベクターの製造中、ＤＮＡはＡＡＶレプリカーゼ（Ｒｅｐ）タンパク質の作用により自己組織化ウイルス粒子にパッケージされる。しかしながら、このＤＮＡパッケージングプロセスは非効率的であることが多く、ベクターゲノムを欠く空の粒子が大量に発生する。使用する製造プロセスによっては、トランスフェクションベースの手順において、空の粒子の汚染が完全な粒子の２０～３０倍になることができる（Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２０１０ｂ）２１：１２７３－１２８５）。空の粒子の存在は、治療中に与えられるＡＡＶキャプシドタンパク質の用量を効果的に増加させ、したがって、ベクターキャプシドに対する望ましくない免疫結果の可能性を増加させる。したがって、本明細書に記載の方法はまた、ウイルス調製物、医薬組成物、および医薬産生物の大規模産生バッチを精製するために使用されてもよい。
「空のキャプシド」、「空のバイアル粒子」、および「空のＡＡＶ」なる語は、所望の産生物のものと本質的に同様であるが、中にパッケージされた核酸分子を欠くＡＡＶタンパク質キャプシドシェルを含むＡＡＶビリオンを指す。
「完全なキャプシド」、「完全なウイルス粒子」、「ｒＡＡＶ」、および「完全なｒＡＡＶ」なる語は、目的のヌクレオチド配列をキャプシド化するＡＡＶタンパク質キャプシドシェルを含むＡＡＶビリオンを指す。
本発明者らは、改善されたＨＰＬＣパラメータを使用して、試料内の空のＡＡＶキャプシドおよび完全なＡＡＶキャプシドに対応するクロマトグラムピーク間のベースライン分解能を達成できるという予想外の発見をしている。ピーク分解能は、クロマトグラム上の２つのピーク間の距離である。「ベースライン分離」または「ベースライン分解能」は、少なくとも１．５の分解能係数を意味する。分解能が１．５を超える時、次いで２つのピーク間に約１％未満の相互干渉がある。いくつかの実施形態において、空のおよび完全なバイアル粒子（キャプシド）に対応するクロマトグラフィーピークは、２．０を超えるベースライン分解能により分離される。いくつかの実施形態において、ピーク分解能は２．０より大きい。
本明細書に記載のＨＰＬＣシステムは、固定相および移動相を含む。例えば、ポリ（グリシジルメタクリレート－ｃｏ－エチレングリコール）支持マトリックスを含むモノリス強陰イオン交換（ＳＡＸ）カラムは、ベクターと比較して空の粒子のわずかに少ない陰イオン特性に基づいて、空のおよび完全なＡＡＶキャプシドを分離するための固定相として使用されてもよい。状況によっては、クロマトグラムのピークベースライン分離を達成するために、試料の結合条件が許す場合、弱陰イオン交換（ＷＡＸ）カラムを利用することが有益であってもよい。状況によっては、クロマトグラムのピークベースライン分離を達成するために、試料結合条件が許す場合、強陽イオン交換（ＳＣＸ）カラムまたは弱陽イオン交換（ＷＣＸ）カラムを利用することが有益であってもよい。リテンションタイム（ＲＴ）は、ピークの分離を改善し、容量係数を上げるのに十分な長さであることが望ましい。したがって、移動相のｐＨが調整され、ベースライン分離が達成されてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＡＸ、ＷＡＸ、ＳＣＸ、またはＷＣＸカラム、または複数の強力なＡＥＸ、ＣＥＸ、ＳＡＸ、ＷＡＸ、ＳＣＸ、またはＷＣＸカラムは、タンデム配置で、カラム長が増加するように接続されて使用されてもよい。
いくつかの実施形態において、移動相は、例えば、ビス－トリスプロパン（ＢＴＰ）などの緩衝液組成物を含む。移動相緩衝液の濃度は変化されてもよい。例えば、約１ｍＭから約１００ｍＭ（例えば、１から５０ｍＭ）の濃度が使用されてもよい。いくつかの実施形態において、移動相中の溶出緩衝液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、および／または酢酸アンモニウム（ＮＨ４ＯＡｃ）を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の塩を含んでもよい。いくつかの実施形態において、塩は、約０．１Ｍから約１０Ｍ、または約０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１．０Ｍ、１．５Ｍ、２．０Ｍ、３．０Ｍ、３．５Ｍ、４Ｍ、４．５Ｍ、５．０Ｍ、５．５Ｍ、６．０Ｍ、６．５Ｍ、７Ｍ、７．５Ｍ、８．０Ｍ、８．５Ｍ、９．０Ｍ、または９．５Ｍの濃度であってもよい。実施形態において、緩衝液組成物のｐＨは約９．０である。いくつかの実施形態において、移動相緩衝液のｐＨは、約８．０から約９．５の範囲である。
移動相は、勾配として実行することができる（すなわち、勾配溶出クロマトグラフィー）。クロマトグラフィー分析中の移動相組成の安定した変化は、勾配溶出と呼ばれる。例えば、溶出溶媒は特定のパーセンテージで開始でき、時間の経過とともに着実に増加することができる。グラデーションは０％から始まり、約１００％まで増加する。いくつかの実施形態において、勾配は、約２％～１５％で始まり、約３０％～１００％に増加し、ここで移動相は１Ｍの塩溶出溶媒を含む。他の実施形態において、勾配は約１０％で始まり、約３０％に増加する。さらに他の実施形態において、勾配は約１５％で始まり、約３０％に増加する。さらに他の実施形態において、勾配は約１５％で始まり、約３５％に増加する。他の実施形態において、勾配は約１５％で始まり、約４０％に増加する。他の実施形態において、勾配は約１５％で始まり、約４５％または約５０％に増加する。
移動相は、緩い勾配（より長い実行時間または溶出溶媒強度のより遅い増加）または急な勾配（より短い実行時間または溶出溶媒強度のより速い増加）または２つの組み合わせとして実行されてもよい。さらに、アイソクラティックホールドは、勾配移動相中に組み込まれてもよい。アイソクラティックホールドまたは流れにおいて、移動相組成は一定に保たれる。本発明者らは、勾配溶出中にアイソクラティックホールドを組み込むことは、空のおよび完全なウイルス粒子に対応するクロマトグラフィーピークの分解能を大幅に向上させ、ピークのベースライン分離をもたらすという重要な発見をしている。このことは順に、試料内の空のおよび完全なウイルス粒子の量が測定されてもよい精度を増加させる。
特定の実施形態において、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、または約３０％でのアイソクラティックホールドは、クロマトグラフィー分析の勾配溶出中に組み込まれてもよい。いくつかの実施形態において、ピーク対称性はまた、方法内の２つの勾配に隣接するアイソクラティックホールドの追加により改善される。他の実施形態において、ピーク非対称性およびテーリングは２．０未満である。
いくつかの実施形態において、移動相の実行時間は、勾配として実行されるかどうかにかかわらず、約１分から６０分の間である。他の実施形態において、移動相の実行時間は、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分、約２１分、約２２分、約２３分、約２４分、約２５分、約２６分、約２７分、約２８分、約２９分、約３０分、約３１分、約３２分、約３３分、約３４分、約３５分、約３６分、約３７分、約３８分、約３９分、約４０分、約４１分、約４２分、約４３分、約４４分、または約４５分である。
本明細書に記載のＨＰＬＣ方法は、ＵＶまたは蛍光検出と共に使用されてもよい。いくつかの実施形態において、励起および発光の波長は、それぞれ２８０ｎｍ±２０ｎｍおよび３４８ｎｍ±２０ｎｍに設定される。
いくつかの実施形態において、検出器の応答時間は０．５秒に設定される。いくつかの実施形態において、応答時間は、クロマトグラフィーピーク全体で少なくとも２０個のデータポイントを生成するように設定される。いくつかの実施形態において、応答時間は、約０．１～１．０秒の間に設定される。
ウイルス調製物は、哺乳動物細胞ＡＡＶ産生システム（例えば、２９３ＴまたはＨＥＫ２９３細胞に基づくもの）および昆虫細胞ＡＡＶ産生システム（例えば、ｓｆ９昆虫細胞に基づくものおよび／またはバキュロウイルスヘルパーベクターを使用しているもの）などの任意の既知の産生システムにより得られてもよい。ウイルス調製物は、不連続な塩化セシウム密度勾配などの周知の技術を使用することにより細胞培養物から精製されてもよい（例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ． （２０１６） ３：１６００２を参照）。
本発明の方法は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１０、およびＡＡＶ１１、ならびにそれらの変異体、ハイブリッド、キメラまたは疑似型などの様々なＡＡＶ血清型のウイルス調製物を精製および分析するために使用することができる。「疑似型」または「クロスパッケージ」とは、ｒＡＡＶは、キャプシドが別のＡＡＶ血清型のキャプシドに置き換えられた組換えＡＡＶを意味し、例えば、ウイルスの形質導入効率または向性プロファイルを変更する（例えば、Ｂａｌａｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ． １８４（１）：６９１－８（２０１３））。「キメラ」または「ハイブリッド」ｒＡＡＶは、キャプシドが異なる血清型に由来するキャプシドタンパク質から組み立てられる、および／またはキャプシドタンパク質が異なる血清型（例えば、血清型１および２；Ｈａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ７（３）：４１９－２５（２００３）参照）に由来する配列を有するキメラタンパク質である組換えＡＡＶを意味する。例えば、本発明の方法が使用され、ＩＴＲなどのゲノムがＡＡＶ２などのある血清型に由来し、キャプシドが別の血清型；例えばＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／９、またはＡＡＶ２／６／９に由来する組換えＡＡＶを精製および分析してもよい。例えば、米国特許第７，１９８，９５１号および９，５８５，９７１号を参照されたい。
本明細書で他に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料を以下に記載するが、本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料もまた、本開示の実施または試験において使用することができる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先される。一般に、本明細書に記載の心臓病学、医学、医薬品化学、および細胞生物学に関連して使用される命名法、およびそれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造業者の仕様に従って実施される。さらに、文脈上他に必要でない限り、単数形は複数形を含む、複数形は単数形を含むものとする。この明細書および実施形態を通して、「有する(have)」および「含む(comprise)」なる語、または「有する(has)」、「有する(having)」、「含む(comprises)」、または「含む(comprising)」などの変形は、述べられた整数または整数の群を含むことを意味すると理解されるが、任意の他の整数または整数の群を除外することは意味されない。本明細書に記載されるすべての刊行物および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書において多くの文書が引用されるが、この引用は、これらの文書のいずれかが当技術分野の一般的な知識の一部を形成することを認めるものではない。本明細書で使用される場合、目的の１つまたは複数の値に適用される「およそ」または「約」なる語は、記載された参照値と同様の値を指す。特定の実施形態において、この語は、他に記載されない限り、または文脈から明らかでない限り、記載される参照値の（より大きいかまたは小さい）いずれかの方向で１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の範囲内にある値の範囲を指す。本明細書で使用される場合、２つの数値の「間」の値は、２つの数値のうちの１つであってもよい。
本発明がよりよく理解されてもよいように、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示のみを目的としており、いかなる方法でも本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例
実施例１：空のおよび完全なウイルス粒子を分離するための陰イオン交換ＨＰＬＣ
陰イオン交換ＨＰＬＣを、ウイルス調製物内の空のＡＡＶ粒子および組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）（完全な）粒子を分離するその能力について評価した。空のＡＡＶキャプシドおよび完全なＡＡＶキャプシド（ｒＡＡＶ試料）のクロマトグラフィーピーク分離およびピークポジショニングを評価するために、４つの異なるＡＡＶ試料を実行した。含まれる試料：最終処方緩衝液（ＦＦＢ）；ベンダーにより製造された完全なＡＡＶキャプシド（Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３）で主に構成される参照試料；完全なＡＡＶキャプシド（ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３）で主に構成されるＳａｎｇａｍｏで調製された試料；および空のＡＡＶキャプシド（Ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０）で主に構成されるＳａｎｇａｍｏで調製された試料。
実施例１：空のおよび完全なウイルス粒子を分離するための陰イオン交換ＨＰＬＣ
陰イオン交換ＨＰＬＣを、ウイルス調製物内の空のＡＡＶ粒子および組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）（完全な）粒子を分離するその能力について評価した。空のＡＡＶキャプシドおよび完全なＡＡＶキャプシド（ｒＡＡＶ試料）のクロマトグラフィーピーク分離およびピークポジショニングを評価するために、４つの異なるＡＡＶ試料を実行した。含まれる試料：最終処方緩衝液（ＦＦＢ）；ベンダーにより製造された完全なＡＡＶキャプシド（Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３）で主に構成される参照試料；完全なＡＡＶキャプシド（ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３）で主に構成されるＳａｎｇａｍｏで調製された試料；および空のＡＡＶキャプシド（Ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０）で主に構成されるＳａｎｇａｍｏで調製された試料。
Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムを使用した。液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）グレードまたはＨＰＬＣグレードの試薬を使用して、バックグラウンドを低減できる。この実施例において、ＬＣ－ＭＳグレードの試薬を使用して、ビス－トリスプロパンおよび塩化ナトリウムで構成される移動相を調製した。ＨＰＬＣ緩衝液を、ＨＰＬＣグレードまたは高純度の化合物をＬＣ－ＭＳグレードの水に溶解することにより調製した。緩衝液を適切なｐＨに調整し、０．２μｍフィルターでろ過した。次いで、溶液をＨＰＬＣボトルに移した。この実施例のＨＰＬＣシステムのラインＡを、より低い量の塩を含有する緩衝液のために選択し、ラインＢを、塩濃度の高い緩衝液のために選択した。ラインＣをＨＰＬＣグレードの水に選択し、ラインＤをイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に使用した。ラインＣおよびＤを、溶媒の交換またはシステムの洗浄に必要な場合にのみ使用した。分離には、モノリスＡＡＶ分析カラムを使用した。実験を開始する前に、溶媒ラインを適切なボトルに入れ、３ｍＬ／分で（１ラインあたり）少なくとも５分間フラッシュした。
ＣＩＭａｃ（登録商標）ＡＡＶ完全／空－０．１Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｌｕｍｎ（１．３μｍ）陰イオン交換カラム（ＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｓｌｏｖｅｎｉａ）を、（通常はカラム仕様より少ない）圧力をモニターしながら１ｍＬ／分で１０～１５分間高塩緩衝液で洗浄した。次いで、カラムを方法の初期条件で平衡化した。緩衝液を切り替える必要がある場合は、最初に溶媒ラインを水でフラッシュし、続いて次の緩衝液でフラッシュした。長期保管の場合、システムをシャットダウンする前に、溶媒ラインおよびシステムをＩＰＡでフラッシュする。緩衝剤として、ビス－トリスプロパン（ＢＴＰ）を使用し、これは２つのｐＫａ値を有し、ｐＨ値の範囲（約６．５～９．５）をカバーするためである。イオン強度を大幅に増加させることなく十分な緩衝能力を可能にするために、緩衝液濃度を約２０ｍＭとして選択した。しかしながら、他の適切な濃度を使用してもよい。
図１Ａおよび図１Ｂは、空のＡＡＶ（ピーク１）および完全なＡＡＶ（ピーク２）粒子についてのピークポジショニングを示す３つの異なる試料（積層された）の代表的なクロマトグラムである。図１Ａ（３０分）および図１Ｂ（１５分）に示すように、すべての試料が明確なピーク分離パターンを実証した。主に完全なキャプシドを含む試料は、空のキャプシドに対応する小さなピークを示し、これは完全なキャプシドに対応する大きなピークが続き、それらの間にベースラインの分離はなかった。空のＡＡＶ試料は、空のキャプシドに対応するより大きなピークを示し、これは空の対完全なＡＡＶ粒子のピーク位置を示す。
感度がより高いため、蛍光（Ｔｒｐ）モードからのデータを示すが、ＵＶを使用して同様のパターンのピークを観察する。
３つ全ての試料は、空のＡＡＶおよび完全なＡＡＶ粒子について一貫したピーク位置（保持時間）を示す。ベースライン分解能はなかったが、ピーク積分を使用してピーク面積を計算した。ピーク面積の比を使用して、空のＡＡＶと完全なＡＡＶとの比を計算できる。ＵＳＰ規制に従って検証可能なアッセイを達成するには、ピーク間のベースライン分解能が必要であるが、この方法を使用して、ＡＡＶ医薬産生物中の空の粒子のおおよそのパーセンテージを推定できる。
実施例２：ウイルス試料中の空のおよび完全なウイルス粒子のパーセンテージの計算のための陰イオン交換ＨＰＬＣ
複数の試料からのピーク面積を使用して、各試料中の完全なＡＡＶ粒子のパーセンテージを計算した。さらに、ＶＧ力価を、ＡＡＶカセットのＢＧＨポリＡ領域を標的とするプライマー／プローブ配列を使用して測定し、キャプシド力価を、ＡＡＶ６ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。ＶＧおよびキャプシドの両方のデータに基づいて、比を計算し、完全なＡＡＶ粒子のパーセンテージを得た。表１は、実施例１（２回の実行）に記載されるＨＰＬＣ方法、ＶＧ、およびキャプシド力価により決定されるピーク面積を示す。
複数の試料からのピーク面積を使用して、各試料中の完全なＡＡＶ粒子のパーセンテージを計算した。さらに、ＶＧ力価を、ＡＡＶカセットのＢＧＨポリＡ領域を標的とするプライマー／プローブ配列を使用して測定し、キャプシド力価を、ＡＡＶ６ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。ＶＧおよびキャプシドの両方のデータに基づいて、比を計算し、完全なＡＡＶ粒子のパーセンテージを得た。表１は、実施例１（２回の実行）に記載されるＨＰＬＣ方法、ＶＧ、およびキャプシド力価により決定されるピーク面積を示す。
Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－３８１は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）導入遺伝子についての発現カセットを含み、２，６２９塩基のサイズを有するゲノムを含有する。Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－３７５は、ＩＤＵＡ導入遺伝子についての発現カセットを含み、３，０７７塩基のサイズを有するゲノムを含有する。Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－３８は、ＩＤＳ導入遺伝子についての発現カセットを含み、２，７８０塩基のサイズを有するゲノムを含有する。Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３は、ＧＬＡ導入遺伝子のカセットの発現を含み、２，７７２塩基のサイズを有するゲノムを含有する。Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ１およびＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ２はそれぞれ、ＧＬＡ遺伝子についての発現カセットを含み、それぞれ２，７２９塩基および３，３２１塩基のサイズを有するゲノムを含有する。本願明細書で使用される試料は全て、調査のみの試料である。
全ての試料について、ＨＰＬＣおよびＶＧ／キャプシドにより測定される完全なウイルス粒子のパーセンテージをプロットして比較した。ＧＬＡ１試料およびＧＬＡ２試料を除く全ての試料についての比は同様であり、このことはＨＰＬＣからの結果および他の受け入れられる方法間に相関関係があることを示す。方法の比較を図２に示す。
実施例３：ウイルス試料中の空および／または完全なウイルス粒子のパーセンテージ（％）の計算のための陰イオン交換ＨＰＬＣの精度
実施例１に記載されるＨＰＬＣ方法の精度を試験するために、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－３７５およびＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－３８１の同じ試料を５回実行し、ピーク面積を完全なＡＡＶ粒子について計算した。試料Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－３７５およびＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－３８１は、試料内のウイルス粒子が異なる導入遺伝子を含有するという点で異なる。ＵＳＰガイドラインに基づくと、精度は２％未満である必要がある。表２および表３に示すように、測定されたピーク面積は２％未満の注入精度を実証した。パーセント回収も１００％に近かった（最初の試料注入に基づいて計算された）。ＵＶ２６０および２８０のピーク面積も得て、２６０／２８０比の計算に使用した。しかしながら、蛍光シグナルは、より高いシグナル対ノイズ比を実証した。
実施例１に記載されるＨＰＬＣ方法の精度を試験するために、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－３７５およびＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－３８１の同じ試料を５回実行し、ピーク面積を完全なＡＡＶ粒子について計算した。試料Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－３７５およびＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－３８１は、試料内のウイルス粒子が異なる導入遺伝子を含有するという点で異なる。ＵＳＰガイドラインに基づくと、精度は２％未満である必要がある。表２および表３に示すように、測定されたピーク面積は２％未満の注入精度を実証した。パーセント回収も１００％に近かった（最初の試料注入に基づいて計算された）。ＵＶ２６０および２８０のピーク面積も得て、２６０／２８０比の計算に使用した。しかしながら、蛍光シグナルは、より高いシグナル対ノイズ比を実証した。
実施例４：注入容量、キャプシド濃度、およびキャプシド含有量を変化させるための陰イオン交換ＨＰＬＣの線形性
注入容量ならびにキャプシド濃度の線形性を分析した。ＨＰＬＣ手順は、上記の方法に従って実施された。図３および図４に示すように、完全なＡＡＶ粒子についてのピーク面積の結果は同じ試料の容量を変化させる時に線形であることを見出した。
注入容量ならびにキャプシド濃度の線形性を分析した。ＨＰＬＣ手順は、上記の方法に従って実施された。図３および図４に示すように、完全なＡＡＶ粒子についてのピーク面積の結果は同じ試料の容量を変化させる時に線形であることを見出した。
試料をまた、異なるキャプシド力価にＦＦＢで希釈し、次いで、同じ容量を、希釈された試料ごとにＨＰＬＣシステムに注入した。同様に、キャプシドの濃度を一定の試料容量で変化させた場合、完全なＡＡＶ粒子についてのピーク面積の結果は線形であることを見出した。図５および図６は、一定の容量での異なる注入されたキャプシド濃度間の線形性を示す。
同様のキャプシド力価を有する異なるウイルス組成物試料を、記載される方法に従って分析した。試料をＦＦＢで同じキャプシド力価に希釈し、希釈した各試料に同じ容量を注入した。これらの結果は、試料の種類に関係なく、注入されるキャプシドの量がおよそ同じになることを示す。図７に示すように、正規化された試料の一貫したピーク面積も実証した。
ＧＬＡを含有するＡＡＶ６キャプシドの試料を使用して、異なる温度下でのピーク分離を決定した。図８は、約２０℃から約３５℃の間の範囲の温度について一貫したピーク分離があったことを示す。
ＧＦＰ導入遺伝子または空の調製物のいずれかを含有する異なる商業的ベンダーからのＡＡＶ試料は、全ての試料が完全なおよび空のＡＡＶ粒子の不均一な混合物を含むことを示した。図９Ａに示すように、試料のＦｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３は、完全なＡＡＶ粒子の最も高いパーセンテージを有していた。
実施例５：Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ＨＰＬＣシステムでの溶離液の変動
以前の実施例からの試料は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣシステムで分析され、同様の結果およびピーク分離パターンを実証した（データは示さず）。
以前の実施例からの試料は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣシステムで分析され、同様の結果およびピーク分離パターンを実証した（データは示さず）。
４つの溶離液塩（ＮａＣｌ、ＴＡＭＣ、酢酸ナトリウムおよび酢酸アンモニウムの１Ｍ溶液）を、空のキャプシドおよび完全なキャプシドに対応するクロマトグラムピーク間のベースライン分離について分析した。完全なキャプシド試料（Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３）および空のキャプシド試料（ＡＡＶ６－０３０）の溶出プロファイルを得た。示される場合を除き、前述の方法を使用した。溶離液のイオン強度と溶出強度が異なるため、溶離液緩衝液の勾配を０～１００％に維持して、完全な溶出プロファイルを得た。Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０の主要なピークのリテンションタイム（ＲＴ）を比較し、正味のＲＴの計算に使用した。最大の正味の差は、最も明確なベースラインの分離をもたらす。
４つの溶出塩の溶出プロファイルを図１０に示し、４つの溶離液塩の正味のＲＴ差を表４に提示する。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は最高の溶出強度（したがって最低のＲＴ）を実証し、一方で酢酸アンモニウム（ＮＨ４ＯＡｃ）は最低の溶出強度（したがってより高いＲＴ）を実証した。最も高い正味のＲＴ差を、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、続いて酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）を使用して実証したが、ＮａＣｌおよびＮＨ４ＯＡｃは、２つの試料間でより低い正味のＲＴ差をもたらした。
実施例６：種々の勾配でのＴＭＡＣを含む移動相
完全なおよび空のウイルス粒子に対応するピーク間のベースライン分離を改善するために、ＴＭＡＣの種々の勾配を分析した。示される場合を除き、この方法を前述のように実行した。緩衝液ＡはｐＨ９．０で２０ｍＭ ＢＴＰを含み、一方緩衝液ＢはｐＨ９．０で１Ｍ ＴＭＡＣを含む２０ｍＭＢＴＰを含んだ。以前は、勾配を０～１００％で実行した。しかしながら、ピーク分離を改善するために、より緩く、より狭い勾配を評価した。各勾配を、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３試料、Ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料、および両方の試料の混合で実行した。再現性を評価するために５回の注入を使用した。
完全なおよび空のウイルス粒子に対応するピーク間のベースライン分離を改善するために、ＴＭＡＣの種々の勾配を分析した。示される場合を除き、この方法を前述のように実行した。緩衝液ＡはｐＨ９．０で２０ｍＭ ＢＴＰを含み、一方緩衝液ＢはｐＨ９．０で１Ｍ ＴＭＡＣを含む２０ｍＭＢＴＰを含んだ。以前は、勾配を０～１００％で実行した。しかしながら、ピーク分離を改善するために、より緩く、より狭い勾配を評価した。各勾配を、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３試料、Ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料、および両方の試料の混合で実行した。再現性を評価するために５回の注入を使用した。
Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３、Ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０および混合試料についてのＴＭＡＣを含む溶出緩衝液を使用する勾配分離を示すクロマトグラムが、図１１Ａから図１１Ｃまでに提示される。完全なキャプシド混合試料および空のキャプシド混合試料を連続して注入すると、一貫したピークＲＴとピーク面積が得られ、このことは方法の高い精度を実証した。さらに、混合試料の空のピークは、Ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料の主要なピークと一致した（図１１Ａ～図１１Ｃ）。空のおよび完全なキャプシドのピーク分離をさらに改善するために、勾配を０～１００％から約１５～３０％に狭め、再現性を決定するために複数のアッセイを実行した。勾配が狭いほどピーク分離は良好であったが、ピークも広くなった。空のおよび完全なキャプシド混合試料の両方のピークは、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３試料およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料の同様のピークに対応し、２つの試料を混合してもピークＲＴに不要なシフトが発生しないことを示す。これらの結果は、異なるペイロードを含む異なる方法により産生されるウイルス試料は、識別および区別できる空のおよび完全な粒子の両方の妥当な量を含んでもよいことを示す。
実施例７：弱陰イオン交換カラムおよびタンデムクロマトグラフィーによる勾配法
実施例１～６において、ＡＡＶ強陰イオン交換（ＡＥＸ）モノリスカラムを使用した。この研究では、弱陰イオン交換（ＷＡＸ）カラム（例えば、ＢｉｏＷＡＸ ＮＰ３（非多孔質、４．５ｘ５０ｍｍ、３μｍＨＰＬＣカラム））を分析して、空のおよび完全なウイルス粒子のピーク分離への影響を調べた。タンデムカラムまた、カラム長の増加または２つのマトリックス（弱いＡＥＸおよび強いＡＥＸの）の組み合わせが、空のおよび完全なウイルス粒子のピーク分離に影響を与えるかどうかを判断するために分析した。モノリスカラムおよびＷＡＸカラムを、コネクタを使用するタンデムクロマトグラフィーのために背中合わせに取り付けた。ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ０３９（ＧＬＡ導入遺伝子Ｌｏｔ ０３９を保持する組換えＡＡＶ６；Ｓａｎｇａｍｏ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０を含む試料を使用した。示される場合を除き、以前の実施例において記載される方法を使用した。ＷＡＸカラムおよびモノリスカラムについて、異なる移動相ｐＨレベルを分析して、空のおよび完全なウイルス粒子クロマトグラムのピークベースライン分離への影響も調べた。
実施例１～６において、ＡＡＶ強陰イオン交換（ＡＥＸ）モノリスカラムを使用した。この研究では、弱陰イオン交換（ＷＡＸ）カラム（例えば、ＢｉｏＷＡＸ ＮＰ３（非多孔質、４．５ｘ５０ｍｍ、３μｍＨＰＬＣカラム））を分析して、空のおよび完全なウイルス粒子のピーク分離への影響を調べた。タンデムカラムまた、カラム長の増加または２つのマトリックス（弱いＡＥＸおよび強いＡＥＸの）の組み合わせが、空のおよび完全なウイルス粒子のピーク分離に影響を与えるかどうかを判断するために分析した。モノリスカラムおよびＷＡＸカラムを、コネクタを使用するタンデムクロマトグラフィーのために背中合わせに取り付けた。ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ０３９（ＧＬＡ導入遺伝子Ｌｏｔ ０３９を保持する組換えＡＡＶ６；Ｓａｎｇａｍｏ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０を含む試料を使用した。示される場合を除き、以前の実施例において記載される方法を使用した。ＷＡＸカラムおよびモノリスカラムについて、異なる移動相ｐＨレベルを分析して、空のおよび完全なウイルス粒子クロマトグラムのピークベースライン分離への影響も調べた。
モノリスカラムは、ｐＨ９．０で移動相との強い結合を実証した。より低いｐＨレベルでは、ＲＴは左にシフトし、結合の喪失または結合の減少およびより速い溶出を示す。ＲＴは、ピークの分離を改善し、容量係数を高めるのに十分な高さであることが望ましい。しかしながら、特定のｐＨレベルを含む移動相はピーク分離を実証しなかった。ＷＡＸカラムは、モノリスカラムと比較して、同じｐＨレベルで試料のより強い結合（高ＲＴ）を示した。モノリスカラムと比較して、ＷＡＸカラムで見られるピーク分離は少なかった。さらに、ピーク非対称性が大きくなった（より広いピーク）。より低い移動相ｐＨレベルでは、両方のカラムがＡＡＶのより低い結合を示し、ウイルス組成物の一部または大部分が空隙容量（０～１．５ｍＬの間）で溶出した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。
カラムをタンデムで使用した場合、ピーク分離は、モノリスのみの場合と同様であった。さらに、ｐＨを下げると、結合が減少し（より低いＲＴ）、完全なキャプシドおよび空のキャプシドのピーク間の分離が少なくなった。同様に、図１３に示すように、タンデムクロマトグラフィーのために２つのモノリスカラムを取り付けた時、ピーク分離は同じままだった。
記載される方法および試料と併せて、（Ｑ－アミンを有する）モノリスカラムは、（ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）を有する）ＷＡＸカラムより良好なピーク分離をもたらした。
実施例８：モノリスカラムを用いた緩い勾配
より緩い勾配（より長い実行時間）を分析して、完全なおよび空のウイルス粒子クロマトグラフィーピーク間の改善されたピーク分解能を決定した。モノリスＡＡＶカラムを使用し、勾配を緩衝液Ｂの１５～３０％に設定した。実行時間を変化させた。元の方法において、勾配を５分を超えて実行した。さらに５つの勾配を分析した（１０、１５、２０、２５、および３０分）。その結果、各実験についての実行時間が長くなった。Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０の混合物を、ウイルス組成物試験試料として使用した。より速い勾配（１、２、３、および４分）も分析した。
より緩い勾配（より長い実行時間）を分析して、完全なおよび空のウイルス粒子クロマトグラフィーピーク間の改善されたピーク分解能を決定した。モノリスＡＡＶカラムを使用し、勾配を緩衝液Ｂの１５～３０％に設定した。実行時間を変化させた。元の方法において、勾配を５分を超えて実行した。さらに５つの勾配を分析した（１０、１５、２０、２５、および３０分）。その結果、各実験についての実行時間が長くなった。Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０の混合物を、ウイルス組成物試験試料として使用した。より速い勾配（１、２、３、および４分）も分析した。
図１４に目を向けると、より緩い勾配は、ピークがより広く、分解されるため、ピーク分解能を改善しなかった。しかしながら、５分の勾配時間で個々の試料と混合試料を比較すると、ピークベースライン分解能が実証されなくても、非対称でより鋭いピークが見られた。一方、より速い勾配（１～４分）を使用した場合、分離は改善せず、ピークはよりシャープになった。（図１５および図１６）。高速な方法が望ましいが、実行時間は、効率的なＨＰＬＣピーク分離を可能にするのに十分な長さである必要がある。
実施例９：勾配移動相内のアイソクラティックホールドは、空のおよび完全なウイルス粒子に対応するピーク間のベースライン分離を産生する
アイソクラティックホールドを勾配法に組み込んで、ウイルス組成物内の空のウイルス粒子および完全なウイルス粒子に対応するクロマトグラムピーク間のベースライン分離に対するその効果を決定した。ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ０３９を、完全な試料として使用した。約１７％、１８％、１９％、または２０％のアイソクラティックホールドを、１０分の勾配時間（同じ実行時間、異なる勾配）でテストした。好ましい条件を決定すると、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０を含む混合試料を分析した。
アイソクラティックホールドを勾配法に組み込んで、ウイルス組成物内の空のウイルス粒子および完全なウイルス粒子に対応するクロマトグラムピーク間のベースライン分離に対するその効果を決定した。ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ０３９を、完全な試料として使用した。約１７％、１８％、１９％、または２０％のアイソクラティックホールドを、１０分の勾配時間（同じ実行時間、異なる勾配）でテストした。好ましい条件を決定すると、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０を含む混合試料を分析した。
実験の開始前に、試料を氷上で新たに解凍した。各試料を、直接分析するか、必要に応じてＦＦＢで希釈して分析した。試料をＨＰＬＣバイアルに移し、スリット付きの適切なキャップで蓋をした。次いで、バイアルを希望の位置でＨＰＬＣマルチサンプラーに移し、配列内の位置を特定した。
図１７から図１９までに示すように、勾配移動相の一部としてアイソクラティックホールドを含むことは、同じ試料の空のおよび完全なキャプシドに対応するピーク間にベースライン分離をもたらした。約１７％または１８％を含むアイソクラティックホールドは、Ｆａｂｒｙ試料の明確な分離をもたらした（図１７）。混合試料を分析すると、明確なピークベースライン分離とともに、同様のパターンが示された（図１８）。ピーク分離は、より高いパーセンテージのアイソクラティックホールド（約１９％または２０％）で実証されたが、試料は完全には結合せず、試料の一部は空隙容量で溶出された。
完全な結合を得るために、約０～４０％の勾配をアイソクラティックホールドと組み合わせて使用した。この勾配は、試料を最低のイオン強度で結合させ、アイソクラティックホールドを使用してピーク分離を維持させた。これらの条件は、空のおよび完全なピーク間の明確なベースライン分解能での試料組成物の全てまたはほとんどの結合をもたらした（図１９）。
勾配移動相へのアイソクラティックホールドの追加は、空のウイルス粒子および完全なウイルス粒子に対応するピーク間のベースライン分解能をもたらした。本明細書に記載の方法を使用する試料内の成分の定量化について、試料がカラム上で勾配分離を受け、試料産生物が空隙容量でほとんどまたはまったく溶出しないことを保証するために、試料全体の結合を可能にする条件が、好ましい。
実施例１０：空のおよび完全なウイルス粒子に対応するピーク間の強化された試料結合、ピーク対称性およびベースライン分離についての条件
初期勾配パーセンテージおよびアイソクラティックホールドパーセンテージなどの方法条件を分析して、試料結合およびピーク対称性を強化し、ピークテーリングを減少させた。さらに、蛍光検出の上限波長を得た。示される場合を除き、実施例５に記載される方法を使用した。Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０の試料の混合物を使用して、勾配法をさらに改善した。１９％のアイソクラティックホールドを選択し、勾配開始および終了パーセンテージを変化させた。さらに、励起および発光波長を変化させて、好ましい波長を得た。
初期勾配パーセンテージおよびアイソクラティックホールドパーセンテージなどの方法条件を分析して、試料結合およびピーク対称性を強化し、ピークテーリングを減少させた。さらに、蛍光検出の上限波長を得た。示される場合を除き、実施例５に記載される方法を使用した。Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０の試料の混合物を使用して、勾配法をさらに改善した。１９％のアイソクラティックホールドを選択し、勾配開始および終了パーセンテージを変化させた。さらに、励起および発光波長を変化させて、好ましい波長を得た。
図２０に示すように、１９％のアイソクラティックホールドは、完全なウイルス粒子および空のウイルスピークの両方のベースライン分離をもたらした。初期勾配は０％で、これは約１５％まで線形的に増加し、その後約１９％まで徐々に増加し、ここでアイソクラティックホールドは空のＡＡＶ６粒子の分離を実証した。約４０％または５０％へのさらなる勾配増加は、完全なウイルス粒子に対応するピークの溶出をもたらした。方法中にカラムを洗浄するために、約１００％へのさらなる勾配増加を使用した。空のＡＡＶ６粒子に対応するピークの形状および幅を狭めるために、勾配開始時に低い％の緩衝液Ｂを使用することが好まれることができる。したがって、５％の開始勾配を初期勾配として選択した。結果は、５％の初期勾配が空のＡＡＶ６のピーク非対称性を改善することを示した。さらに、約５０％の最終勾配により、完全なＡＡＶ６ピーク対称性が改善した。約５～１５～５０％の勾配の使用は、２．０を超える分解能および２．０未満の非対称性およびテーリングをもたらし、これはＨＰＬＣ分析のためのＵＳＰ方法についての要件に適合する。
好ましい励起／発光波長を確認するために、一方のパラメータを固定し、他方を変化させることにより実験を行った。それぞれ２８０ｎｍおよび３４８ｎｍの励起および発光についての波長は、好ましいピーク特性、検出、およびシグナル対ノイズ比を実証した。
試料収集についての応答時間も、変化させた。ＵＳＰ下のもう１つの要件である、ピーク全体で少なくとも２０のデータポイントを生成するには、約０．５秒の応答時間で十分であることを見出した。より短い応答時間は、データポイントの数も増加させることができるが、ファイルが十分に大きくなると分析を遅くすることができる。
温度の影響も調べた。より高い温度は、高ＲＴでの小さなピークの追加をもたらすことを実証した。これらの結果は、この方法が粒子の他のバリアントをさらに区別できることを示す。ＡＡＶ６カラムは、５０℃までの許容可能な性能で４０℃以下、例えば、約１５～２５℃の好ましい温度を実証した。
実施例１１：注入容量の線形性、注入されたキャプシド濃度、および複数の注入の精度
Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料を使用して、注入容量、注入されたキャプシド濃度、および複数の注入の精度の線形性を決定した。さらに、異なる比率で調製される異なる混合試料の線形性を、調査した。
Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０試料を使用して、注入容量、注入されたキャプシド濃度、および複数の注入の精度の線形性を決定した。さらに、異なる比率で調製される異なる混合試料の線形性を、調査した。
約１～１００μＬの間の注入容量を分析して、負荷線形性を決定した。Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０の試料を、混合して独立して使用した。完全なおよび空のウイルス粒子に対応するピークのピーク面積を、比較した。最大約１０μＬの容量では、キャプシド力価が大きく異なるにもかかわらず、両方の試料は高い線形性を示した。より高い容量では、試料の一部が結合しないことが、ピーク面積の非線形な増加をもたらした。
注入可能なウイルス粒子濃度（例えば、キャプシド）の線形性を決定した。Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０の両方の試料を、最終処方緩衝液で２倍に希釈し、各溶液１０μＬを注入した。Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３のキャプシド力価は６．１１Ｅ＋１２キャプシド／ｍＬであり、Ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０のキャプシド力価は３．２Ｅ＋１３キャプシド／ｍＬであった。面積応答を、両方のピークで両方の試料について測定し、線形であることを見出した。各試料の主要なピークは、高い線形性範囲（Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３について６．１１Ｅ＋１０－９．５５Ｅ＋８キャプシド／注入、Ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０について３．２Ｅ＋１１－５Ｅ９）をもたらし、最低点は１００を超える試料対ノイズ比を示した。したがって、検出限界（ＬＯＤ）および定量化限界（ＬＯＱ）ははるかに低くなってもよい。これらの結果は、この方法が非常に感度が高く、これらの量より少ないキャプシドも主要なピークについて分析できることを示す。
空のＡＡＶキャプシドは、より高い検出ＵＶ２８０対２６０ｎｍを有するべきであり、一方完全なＡＡＶは、２８０ｎｍを超えるより高い検出ＵＶ２６０を有するべきである（キャプシド内のＤＮＡのため）。同じことが一貫して観察され、このことは空のおよび完全なＡＡＶの想定されるピーク位置が正しいことを示す。
各クロマトグラムについての％空および完全分析を、全てのピークの総ピーク面積の関連するピークの％を計算することにより得た。Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０における％空のおよび完全なキャプシドを計算するために、負荷線形性（上記を参照）データを使用した。注入される複数の容量のデータは、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３の空および完全のパーセントがそれぞれ８％および９２％であることを示した。一方、Ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０中の空のおよび完全なＡＡＶ粒子のパーセントは、それぞれ６％および９４％であり、妥当な変動があった（＜１０％）。これらの値を使用して、異なる比率で混合し、それらの混合物における理論上％空および完全を計算することにより、カスタム標準曲線を作成できる。得られたクロマトグラムのピーク面積を使用して、単純な曲線（線形または二次）を作成できる。逆算を使用して、各混合物の％回収を得ることができる。
試料が空のおよび完全なＡＡＶピークの両方を有し、ピーク面積応答が線形であることを確認するために、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０の混合物からなる標準曲線を調製し、図３２に提示する。混合物から、１０μＬを注入し、各ピークについてのピーク面積を得た。ピーク面積を、％ＥｍｐｔｙまたはＦｕｌｌ注入されたキャプシド量に対してプロットした。線形関係を使用して％回収を逆算し、±２０％以内であることを実証した。この実験は、両方のＡＡＶピークを含有する試料の混合物の範囲および回収が非常に線形的であることも示した（ｒ２＞０．９９）。曲線近似をさらに洗練するために、ソフトウェアを使用して線形または二次曲線を近似した。二次曲線は、残余標準偏差が低くても適切に近似できることを見出した。しかしながら、線形曲線近似および２次曲線近似の両方を使用してもよい。
両方の移動相の約８．８～９．２のｐＨ範囲内で、ピーク分離が依然として高分解能で存在することも実証した。しかしながら、いくらかのピークテーリングをｐＨ９．２で観察し、ピークＲＴは極端なｐＨ条件でシフトした（図３３）。
ｐＨに加えて、カラム温度の影響も分析した。カラムコンパートメントの温度を約１５～５０℃の間で変化させ、空のおよび完全なＡＡＶのピーク分離を分析した。図３４に示すように、ピーク分離は低温では影響を受けなかった（多少のテーリングはある）一方、３０℃を超える温度ではクロマトグラムに余分なピークが現れてもよい。
クロマトグラフィーに対する試料温度の影響もまた、試料を異なる温度に加熱することにより調査した。より高い温度（例えば、約９０℃）では、試料は分解し、勾配溶出中にピークを示さなかった（データは示さず）。したがって、この方法を使用して、試料の安定性を分析し得る。
実施例１２：ＡＵＣおよびＣｒｙｏＴＥＭと比較されるＨＰＬＣにより定量化される％空のおよび完全な粒子の比較
合計１０個の試料（Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－３８４、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ４（ＧＬＡ導入遺伝子を保持する組換えＡＡＶ６）、およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０を含む）を、実施例１０に記載されるＨＰＬＣ方法を使用して分析し、空のおよび完全なキャプシドのパーセントを計算した。試料のうち５つを、ＣｒｙｏＴＥＭ分析に送り、完全なおよび空のキャプシドのパーセントを得た。
合計１０個の試料（Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ３、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－３８４、Ｆｕｌｌ ｒＡＡＶ６－ＧＬＡ４（ＧＬＡ導入遺伝子を保持する組換えＡＡＶ６）、およびＥｍｐｔｙ ＡＡＶ６－０３０を含む）を、実施例１０に記載されるＨＰＬＣ方法を使用して分析し、空のおよび完全なキャプシドのパーセントを計算した。試料のうち５つを、ＣｒｙｏＴＥＭ分析に送り、完全なおよび空のキャプシドのパーセントを得た。
ＨＰＬＣ方法およびＣｒｙｏＴＥＭ法間の比較分析は、表６および表７に示すように、強い相関を実証した。表において、ｒＡＡＶ６－３７８は、左ＺＦＮ導入遺伝子についての発現カセットを含有するゲノムを有し；ｒＡＡＶ６－４４７は、Ｆ８（因子ＶＩＩＩ）導入遺伝子についての発現カセットを含有するゲノムを有し；ｒＡＡＶ６－０００４９０および１８－ｒＡＡＶ６－５５０はそれぞれ、ＣＤ１９導入遺伝子についての発現カセットを含有するゲノムを有するが、それぞれＳｆ９細胞およびＨＥＫ２９３細胞中で産生された。
方法間の相関関係も、図４３（％空のキャプシド）および図４４（％完全なキャプシド）に示す。９５％カバレッジでのＨＰＬＣ対ＴＥＭ相関のピアソン相関係数（ｒ）は０．９９９であった。これらの結果は、試料内の空のおよび完全なキャプシド定量化のＴＥＭ法と比較した場合、本明細書に記載のＨＰＬＣ方法が正確であることを示す。
好ましい実施形態によれば、以下のパラメータを利用してもよい。ラインＡ（緩衝液Ａ）について２０ｍＭのビス－トリスプロパン（ＢＴＰ）ｐＨ９．０；ラインＢ（緩衝液Ｂ）について２０ｍＭビス－トリスプロパン（ＢＴＰ）、１Ｍ塩（ＴＭＡＣ）ｐＨ９．０；ラインＣ－ＬＣ－ＭＳ（または同等の）グレードの水;ラインＤイソプロピルアルコール；シールウォッシュ（ＳＷ）についてＬＣ－ＭＳ（または同等の）グレードの水中の１０％ＩＰＡ；ニードルウォッシュ（ＮＷ）について５０％メタノール；ＵＶ検出セットアップ－２６０±２０ｎｍ、２８０±２０ｎｍ；蛍光検出セットアップ－励起／発光＝２８０ｎｍ／３４８ｎｍ；試料注入容量について１０μＬ；マルチサンプラーパラメーター：ニードルウォッシュ－標準；ドロー速度について１００μＬ／分；排出速度について４００μＬ／分；ドロー後の待ち時間について１．２秒；試料フラッシュアウト係数－５；カラム温度について２０℃；ＤＡＤ設定：シグナルＡ－２６０±２０ｎｍ、リファレンス４００±１００ｎｍ、応答時間＞０．２５秒；シグナルＢ－２８０±２０ｎｍ、リファレンス４００±１００ｎｍ、応答時間＞０．２５秒；スリットについて４ｎｍ；ＦＬＤ設定：励起－２８０ｎｍ、発光－３４８ｎｍ、応答時間について０．２５秒。
特定の実施形態によれば、表８に提示される移動相勾配プログラムを利用してもよい。
実施例１３：空のおよび完全な粒子の分離および定量化のためのアイソクラティックホールドＨＰＬＣ方法の幅広い有用性
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９を含む追加の５つの異なるＡＡＶ血清型のウイルス調製物を、実施例１０に記載されるＨＰＬＣ方法を使用して分析し、空および完全なキャプシドのパーセントを計算した。各血清型について、異なる試料を実行して、空のＡＡＶキャプシドおよび完全なＡＡＶキャプシドについてのクロマトグラフィーピーク分離およびピークポジショニングを評価した。さらに、各血清型について、効率的な結合、アイソクラティックホールド、およびアイソクラティックホールドの各側の両方の線形勾配のための１Ｍ ＴＭＡＣの濃度に関して方法を変更した。
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９を含む追加の５つの異なるＡＡＶ血清型のウイルス調製物を、実施例１０に記載されるＨＰＬＣ方法を使用して分析し、空および完全なキャプシドのパーセントを計算した。各血清型について、異なる試料を実行して、空のＡＡＶキャプシドおよび完全なＡＡＶキャプシドについてのクロマトグラフィーピーク分離およびピークポジショニングを評価した。さらに、各血清型について、効率的な結合、アイソクラティックホールド、およびアイソクラティックホールドの各側の両方の線形勾配のための１Ｍ ＴＭＡＣの濃度に関して方法を変更した。
ＡＡＶ１血清型について、試料は、Ｖｉｒｏｖｅｋから購入されたＡＡＶ１ Ｅｍｐｔｙ ＬｏｔおよびＡＡＶ１ ＣＭＶ－ＧＦＰを含み；ＨＥＫ２９３細胞中でトリプルトランスフェクションプロセスを使用するＳＧＭＯ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅにより製造され、ＣｓＣｌ密度勾配法により精製されたロット１７－ＡＡＶ－３２１および１７－ＡＡＶ－０３７を含んだ。トリプルトランスフェクション法について、ｒＡＡＶは、プラットフォーム法を使用してＳａｎｇａｍｏのベクターコアグループにより産生された。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を１０層のＣｅｌｌＳＴＡＣＫチャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）中に播種し、密度が８０％になるまで３日間増殖させた。３つのプラスミドである、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を含有するＡＡＶヘルパープラスミド、アデノウイルスヘルパー遺伝子を含有するアデノウイルスヘルパープラスミド、およびＡＡＶ２逆末端リピートが隣接するパッケージ化される配列を含有する導入遺伝子プラスミドを、リン酸カルシウムを使用して細胞中にトランスフェクトした（Ｘｉａｏ ｅｔ．ａｌ．１９９８）。３日後、細胞を回収した。細胞を３ラウンドの凍結／解凍により溶解し、細胞破片を遠心分離により除去した。ｒＡＡＶを、ポリエチレングリコールを使用して沈殿させた。再懸濁後、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配で一晩超遠心分離することによりウイルスを精製した。ウイルスを、透析により処方し、次いでフィルター滅菌した。Ｓａｎｇａｍｏ試料を分離して、精製された主に完全なＡＡＶ１粒子を分離した。データは、図３９に示すように、２０％のアイソクラティックホールドが、完全なウイルス粒子および空のウイルスピークの両方のベースライン分離をもたらしたことを示す。初期勾配は０％で、これは約８％まで線形的に増加し、その後約２０％まで徐々に増加し、ここでアイソクラティックホールドは空のＡＡＶ粒子の分離を実証した。約３０％へのさらなる勾配増加は、完全なウイルス粒子に対応するピークの溶出をもたらした。方法中にカラムを洗浄するために、約９５％へのさらなる勾配増加を使用した。データは、Ｅｍｐｔｙ ＡＡＶ１中の空および完全のパーセントがそれぞれ８５．２％および９．３％であることを示す。ＡＡＶ１ ＣＭＶ－ＧＦＰ中の空および完全のパーセントは、それぞれ１３．８％および８４．１％であった。１７－ＡＡＶ－３２１中の空および完全のパーセントは、それぞれ２０．６％および７９．４％であった。１９－ＡＡＶ－０３７中の空および完全のパーセントは、それぞれ６．４％および９０．０％であった。
ＡＡＶ２血清型について、試料は、Ｖｉｒｏｖｅｋから購入されたＡＡＶ２ Ｅｍｐｔｙ Ｌｏｔを含み；ＨＥＫ２９３細胞中でトリプルトランスフェクションプロセスを使用するＳＧＭＯ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅにより製造され、ＣｓＣｌ密度勾配法により精製されたロット１７－ＡＡＶ－０７７および１７－ＡＡＶ－１５５を含んだ。Ｓａｎｇａｍｏ試料を分離して、主に完全なＡＡＶ２粒子を濃縮した。データは、図４０に示すように、１２％のアイソクラティックホールドが、完全なウイルス粒子および空のウイルスピークの両方のベースライン分離をもたらしたことを示す。初期勾配は０％で、これは約８％まで線形的に増加し、その後約１２％まで徐々に増加し、ここでアイソクラティックホールドは空のＡＡＶ粒子の分離を実証した。約３０％へのさらなる勾配増加は、完全なウイルス粒子に対応するピークの溶出をもたらした。方法中にカラムを洗浄するために、約１００％へのさらなる勾配増加を使用した。データは、ＡＡＶ２ Ｅｍｐｔｙ中の空および完全のパーセントがそれぞれ７２．３％および２１．４％であることを示す。１７－ＡＡＶ－０７７中の空および完全のパーセントは、それぞれ５．９％および７９．６％であった。１７－ＡＡＶ－１５５中の空および完全のパーセントは、それぞれ７８．５％および８．９％であった。
ＡＡＶ３血清型について、試料は、Ｖｉｒｏｖｅｋから購入されたＡＡＶ３ Ｅｍｐｔｙ ＬｏｔおよびＡＡＶ３ ＣＭＶ－ＧＦＰを含み；ＨＥＫ２９３細胞中でトリプルトランスフェクションプロセスを使用するＳＧＭＯ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅにより製造され、ＣｓＣｌ密度勾配法により精製されたロット１７－ＡＡＶ－１２４および１７－ＡＡＶ－３２４を含んだ。Ｓａｎｇａｍｏ試料を分離して、精製された主に完全なＡＡＶ３粒子を分離した。データは、図４１に示すように、１５％のアイソクラティックホールドが、完全なウイルス粒子および空のウイルスピークの両方のベースライン分離をもたらしたことを示す。初期勾配は０％で、これは約８％まで線形的に増加し、その後約１５％まで徐々に増加し、ここでアイソクラティックホールドは空のＡＡＶ粒子の分離を実証した。約３０％へのさらなる勾配増加は、完全なウイルス粒子に対応するピークの溶出をもたらした。方法中にカラムを洗浄するために、約１００％へのさらなる勾配増加を使用した。データは、ＡＡＶ３ Ｅｍｐｔｙ中の空および完全のパーセントがそれぞれ７４．１％および１７．９％であることを示す。ＡＡＶ３ ＣＭＶ－ＧＦＰ中の空および完全のパーセントは、それぞれ５５．２％および４１．５％であった。１７－ＡＡＶ－１２４中の空および完全のパーセントは、それぞれ５５．４％および４４．６％であった。１７－ＡＡＶ－３２４中の空および完全のパーセントは、それぞれ７２．９％および２７．２％であった。
ＡＡＶ８血清型について、試料は、ＨＥＫ２９３細胞中でトリプルトランスフェクションプロセスを使用するＳＧＭＯ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅにより製造され、ＣｓＣｌ密度勾配法により精製されたＡＡＶ８ Ｅｍｐｔｙ（１７－ＡＡＶ－０８２）およびロット１８－ＡＡＶ－０７０、１７－ＡＡＶ－３３９、１７－ＡＡＶ－３４０、および１７－ＡＡＶ－３４１を含んだ。ＡＡＶ８ Ｅｍｐｔｙロットを分離して空のＡＡＶ８粒子を濃縮し、一方で他の全てのロットを分離して精製された完全なＡＡＶ８粒子を分離した。ＡＴＣＣから購入され、ナント（フランス）のＡｔｌａｎｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ－ＵＭＲ １０８９および、バルセロナ自治大学（スペイン）の動物バイオテクノロジーおよび遺伝子治療センター（ＣＢＡＴＥＧ）により製造されたＡＡＶ８ ＲＳＭ（完全なＡＡＶ８キャプシドで主に構成される）も、テストした。データは、図４２Ａおよび４２Ｂに示すように、１４％のアイソクラティックホールドが、完全なウイルス粒子および空のウイルスピークの両方のベースライン分離をもたらしたことを示す。初期勾配は０％で、これは約８％まで線形的に増加し、その後約１４％まで徐々に増加し、ここでアイソクラティックホールドは空のＡＡＶ粒子の分離を実証した。約３０％へのさらなる勾配増加は、完全なウイルス粒子に対応するピークの溶出をもたらした。方法中にカラムを洗浄するために、約９５％へのさらなる勾配増加を使用した。データは、ＡＡＶ８ Ｅｍｐｔｙ中の空および完全のパーセントがそれぞれ７６．６％および２２．２％であることを示す。ＡＡＶ８ Ｌｏｔ １８－０７０中の空および完全のパーセントは、それぞれ１５．２％および８１．５％であった。ＡＡＶ８ Ｌｏｔ １７－３３９中の空および完全のパーセントは、それぞれ１．８％および９５．５％であった。ＡＡＶ８ Ｌｏｔ １７－３４０の空および完全のパーセントは、それぞれ２８％と７０．４％であった。ＡＡＶ８ Ｌｏｔ １７－３４１の空および完全のパーセントは、それぞれ４．３％および９３．３％であった。ＡＡＶ８ ＲＳＭ中の空および完全のパーセントは、それぞれ０％（検出されなかった）および１００％であった。ＡＡＶ８ ＲＳＭの濃度が低いと、空のピークが検出可能な限界を下回る可能性がある。
ＡＡＶ９血清型について、試料は、Ｓｆ９細胞プロセスにおいてバキュロウイルスベースの感染を使用して製造され、アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたＡＡＶ９ Ｌｏｔ ０７０および０７６を含み；ＨＥＫ２９３細胞中でトリプルトランスフェクションプロセスを使用するＳＧＭＯ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅにより製造され、ＣｓＣｌ密度勾配法により精製されたＬｏｔ ２４を含んだ。これらのロットを分離して、精製された主に完全なＡＡＶ９粒子を分離した。データは、５％のアイソクラティックホールドであるＡＡＶ９血清型が、図４３に示すように、完全なウイルス粒子および空のウイルスピークの両方のベースライン分離をもたらしたことを示す。初期勾配は０％で、これは約３％まで線形的に増加し、その後約５％まで徐々に増加し、ここでアイソクラティックホールドは空のＡＡＶ粒子の分離を実証した。約４０％へのさらなる勾配増加は、完全なウイルス粒子に対応するピークの溶出をもたらした。方法中にカラムを洗浄するために、約１００％へのさらなる勾配増加を使用した。データは、ＰＤ Ｌｏｔ ０７６中の空および完全のパーセントがそれぞれ５３．６％および４３．３％であることを示す。ＰＤ７０ Ｌｏｔ １９－ＢＡＶ－４８４ＰＤ中の空および完全のパーセントは、それぞれ５．８％および８７．８％であった。ＰＤ７６ Ｌｏｔ ２０－ＢＡＶ－０２７ＰＤ中の空および完全のパーセントは、それぞれ５４．２％および４１．１％であった。Ｒｕｎ２４ Ｌｏｔ １９－ＢＡＶ－４７０中の空および完全のパーセントは、それぞれ２．７％および９７．３％であった。
Claims (21)
- ウイルス調製物中の空のおよび完全なキャプシドを分離する方法であって、該方法は、ウイルス調製物および移動相を陰イオン交換カラムを通して実行することを含み、ここで移動相が、不連続な溶出勾配および少なくとも１つのアイソクラティックホールドを含む条件下で実行される、方法。
- ウイルス調製物中の空のおよび完全なキャプシドを定量化する方法であって、該方法は、ウイルス調製物および移動相を陰イオン交換カラムを通して実行することを含み、ここで移動相が、不連続な溶出勾配および少なくとも１つのアイソクラティックホールドを含む条件下で実行される、方法。
- ウイルス調製物および移動相が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム上で実行される、請求項１または２に記載の方法。
- 空のおよび完全なキャプシドが、ベースライン分解能により分離される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ベースライン分解能が２．０より大きい、請求項４に記載の方法。
- キャプシドがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドを含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 陰イオンカラムが強陰イオン交換（ＳＡＸ）カラムである、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ＳＡＸカラムが第四級アミン（Ｑ－アミン）カラムである、請求項７に記載の方法。
- 陰イオン交換カラムがモノリスカラムである、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 移動相が塩を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 塩が塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）または酢酸ナトリウムである、請求項１０に記載の方法。
- 移動相の最終勾配が０．５から５Ｍ、所望により１Ｍの塩を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
- 移動相が最終勾配の５０％に達する前に、少なくとも１つのアイソクラティックホールドが導入される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 移動相のｐＨが約８から約１０である、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 移動相のｐＨが約９である、請求項１４に記載の方法。
- カラムが０℃から５０℃の間の温度を有する、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- カラムが２０℃から２５℃の間の温度を有する、請求項１６に記載の方法。
- ＡＡＶが、１つまたは複数の血清型に由来し、所望によりＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９から選択される、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ウイルス調製物中の完全なキャプシドが、約２０塩基対から約９，０００塩基対の間の核酸導入遺伝子構築物を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 空のウイルスキャプシドについて濃縮されるウイルス調製物であって、該調製物は、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法により得られるものであり、ここで所望により、調製物中のウイルスキャプシドの２０％以下が完全なウイルスキャプシドである、ウイルス調製物。
- 完全なウイルスキャプシドについて濃縮されるウイルス調製物であって、該調製物は、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法により得られるものであり、ここで所望により、調製物中のウイルスキャプシドの２０％以下が空のウイルスキャプシドである、ウイルス調製物。
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