SK15682000A3 - Účinné čistenie adenovírusu - Google Patents

Účinné čistenie adenovírusu Download PDF

Info

Publication number
SK15682000A3
SK15682000A3 SK1568-2000A SK15682000A SK15682000A3 SK 15682000 A3 SK15682000 A3 SK 15682000A3 SK 15682000 A SK15682000 A SK 15682000A SK 15682000 A3 SK15682000 A3 SK 15682000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
adenovirus
solution
resin
anion exchange
sample solution
Prior art date
Application number
SK1568-2000A
Other languages
English (en)
Inventor
Miguel E. Carri�N
Marilyn Menger
Imre Kovesdi
Original Assignee
Genvec, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genvec, Inc. filed Critical Genvec, Inc.
Publication of SK15682000A3 publication Critical patent/SK15682000A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
    • B01J41/20—Anion exchangers for chromatographic processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/96—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation using ion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/34—Size selective separation, e.g. size exclusion chromatography, gel filtration, permeation
    • B01D15/345—Perfusive chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N2030/621—Detectors specially adapted therefor signal-to-noise ratio
    • G01N2030/625—Detectors specially adapted therefor signal-to-noise ratio by measuring reference material, e.g. carrier without sample
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/075—Adenoviridae
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Water Treatment By Electricity Or Magnetism (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Dry Shavers And Clippers (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Vynález sa týka účinnej purifikácie adenovírusu.
Doterajší stav techniky
Častice adenovírusov boli obvykle izolované s využitím protokolov na purifikáciu v hustotnom gradiente, napríklad s využitím gradientu chloridu cézneho (CsCl). Purifikácia v hustotnom gradiente je vhodná na preparácie v malom množstve, ale je časovo náročná a ťažko použiteľná vo väčšom meradle. Komerčne je preto využitie tohto spôsobu často nežiaduce.
Alternatívnou metódou purifikácie adenovírusov je kolónová alebo vsádzková chromatografia. Prvé pokusy o izoláciu vírusových častíc pomocou chromatografických techník využívajúcich náplne na báze dietylaminoetylovaných (DEAE) chromatografických živíc sú uvedené v rokoch 1959 až 1961. Haruna a spol. (Virology 13: 246-267 (1961)) uvádzali využitie DEAE chromatografie na meničoch iónov na purifikáciu adenovírusov typov 1, 3 a 8, zatiaľ čo Klemperer a Pereira (Virology 9: 536-545 (1959)) a Philipson (Virology 10: 459-465 (1960) uvádzali ťažkosti pri použití rovnakej metódy pre iné typy adenovírusov Použitie týchto techník nebolo do obdobia asi po roku 1965 príliš rozšírené, predovšetkým kvôli tomu, že chromatografické matrice mali tendenciu sa pri separáciách rúcať. Vzhľadom na selektivitu vtedy dostupných chromatografických živíc boli chromatografické purifikácie vírusov menej účinné než purifikačné techniky v hustotnom gradiente. Bigwood a spol. (EP 0213719) opisuje chromatografícké živice s funkčnými skupinami polyamínov s 2 až 4 aminoskupinami, oddelenými 2 až 4 metylénovými skupinami. Bigwood a spol. však neopisujú použitie takýchto živíc na čistenie vírusov alebo iného biologického materiálu.
V poslednej dobe sa obnovil záujem o purifikáciu vírusov pomocou chromatografie. Použitie chromatografických živíc na purifikáciu vírusov ukázali napríklad Guillaume a spol. (WO 98/00524), Shabram a spol. (WO 96/27677) a Huyghe a spol. (Human Gene Therapy 6: 1403-1416 (1995)). V posledných pätnástich rokoch boli tiež vyvinuté novšie chromatografické náplne. Tieto náplne môžu byť rozdelené do štyroch skupín: (i) homogénne prekrížené polysacharidy zahrnujúce mäkké gély (napríklad agarózu), ktoré majú dobrú kapacitu, ale zlé rozlíšenie a tendenciu stláčať sa, (ii) makroporézne polyméry na báze syntetických polymérov, ku ktorým sa radia živice pre perfúznu chromatografiu umožňujúce lepšiu difuzivitu a vyššiu účinnosť, rýchlosť a rozlíšenie, (iii) tykadlové (tentakulárne) sorbenty, majúce tykadlá, ktoré boli navrhnuté na rýchlejšiu interakciu s proteínmi (napríklad fraktogél) a (iv) materiály, kde je mäkký gél uzavretý v rigidnej schránke a tak využívajú vysokú kapacitu mäkkých gélov aj rigiditu pevných materiálov (napríklad Ceramic Hyper D™F) (viď Boschetti, J. Chromatogr. 658: 207 (1994), Rodriguez, J. Chromatogr. 699: 47-61 (1997)).
Je žiaduce zvýšiť rýchlosť, jednoduchosť a účinnosť purifikácii, a to predovšetkým v prípade komerčných purifikácii vykonávaných vo veľkom meradle pomocou týchto techník. Vynález poskytuje taký proces na purifikáciu adenovírusu. Tieto a iné výhody predkladaného vynálezu a tiež ďalšie nové prvky budú zrejmé z opisu vynálezu, ktorý je tu predložený.
Podstata vynálezu
Vynález poskytuje spôsob obohatenia roztoku adenovírusom. Tento spôsob zahrnuje: (i) získanie zmesového roztoku obsahujúceho adenovírus a prinajmenšom jeden nežiaduci typ biomolekuly, (ii) nanesenie takého zmesového roztoku na chromatografickú živicu schopnú meniť anióny (menič aniónov) obsahujúce väzobnú časť vybranú zo skupiny zahrnujúcej dimetylaminopropyl, dimetylaminobutyl, dimetylaminoizobutyl a dimetylaminopentyl, a (iii) eluovanie adenovírusu z purifikačnej chromatografickej živice pomocou elučného roztoku Spôsob môže ďalej zahrnovať predseparáciu zmesového roztoku obsahujúceho adenovírus a najmenej jeden typ nežiaducej biomolekuly na chromatografickej živici meniacej anióny pred nanesením adenovírusu na chromatografickú živicu meniacu anióny.
Vynález poskytuje tiež spôsob purifikácie adenovírusu z buniek, ktoré sú adenovírusom infikované. Táto metóda zahrnuje lýzu buniek infikovaných adenovírusom, nanesenie lyzátu na jeden typ chromatografickej živice, eluovanie adenovírusu z chromatografickej živice' a zbieranie frakcií obsahujúcich adenovírus, kde adenovírus je preukázateľne tak čistý ako po trojnásobnej purifikácii adenovírusu pomocou hustotného gradientu CsCl.
Vynález tiež poskytuje spôsob presnej kvantifikácie množstva častíc adenovírusu v roztoku adenovírusu, ako je roztok získaný zo surového lyzátu buniek infikovaných adenovírusom, zahrnujúci (i) nanesenie vzorky roztoku adenovírusu na chromatografíckú živicu meniacu anióny a obsahujúcu väzobnú časť vybranú zo skupiny zahrnujúcej dimetylaminopropyl, dimetylaminobutyl, dimetylaminoizobutyl a dimetylaminopentyl a elúciu z tejto chromatografickej živice, (ii) stanovenie absorbancie roztoku vzorky adenovírusu eluovaného z chromatografickej živice a absorbancie štandardného roztoku adenovírusu, (iii) porovnanie absorbancie vzorkového roztoku adenovírusu eluovaného z chromatografickej živice s absorbanciou štandardného roztoku adenovírusu a kvantifikáciu počtu častíc adenovírusu v roztoku vzorky.
Vynález môže byť najlepšie pochopený s odkazom na pripojené výkresy a nasledujúci podrobný opis výhodných uskutočnení.
Vynález je zameraný na spôsob obohatenia roztoku obsahujúceho adenovírus. Adenovírusom je myslený prirodzene sa vyskytujúci adenovírus a rekombinantný adenovírus. Pritom rekombinantný adenovírus môže byť infekčný i neinfekčný. Metóda zahrnuje získavanie zmesového roztoku obsahujúceho adenovírusy a prinajmenšom jeden nežiaduci typ biomolekuly Biomolekulou je myslená akákoľvek makromolekula, napríklad akýkoľvek protein, uhľovodík, lipid alebo nukleová kyselina (napríklad DNA a RNA) apod. a tiež fragmenty takých molekúl. Používané slovo roztok je tu vo význame, v akom je v odbore bežne používané a navyše je ním myslený i bunkový lyzát. Akýkoľvek roztok obsahujúci adenovírus môže byť obohatený metódou predloženou týmto vynálezom. Zmesový roztok adenovírusu sa obvykle získa infikovaním eukaryotických buniek adenovírusom, ako je tu definovaný, udržovaním buniek po dostatočne dlhé časové obdobie, aby mohlo dôjsť k amplifikácii počtu adenovírusových častíc, zhromaždením infikovaných buniek a ich lýz (rozbitím) v pufrovanom roztoku.
# z ' Výrazy obohacovanie a purifíkovanie 'a tak isto obohatený a purifikovaný sú tu použité zameniteľné a znamenajú, že koncentrácia adenovírusu sa v danom objeme zvyšuje alebo zvýšila. Je žiaduce, aby obohatený alebo purifikovaný roztok adenovírusu bol tak čistý ako adenovírus purifikovaný trikrát v hustotnom gradiente (CsCl).
Pokiaľ sa purifikujú vírusy z infikovaných buniek (napríklad z eukaryotických buniek), je výhodné nenechať infekciu prebiehať až do štádia, kedy samotné vírusy spôsobia lýzu buniek, pretože za týchto podmienok prebieha lýza jednotlivých buniek v podstatne odlišných časoch a degradatívne enzýmy uvoľnené lýzovanými bunkami začnú napádať uvoľnené vírusy. Navyše tesne pred bunkovou lýzou spôsobenou adenovírusmi môžu dispozície bunkového metabolizmu zapríčiniť zníženie presnosti vírusovej replikácie. Preto sa odporúča lýzovať bunky predtým, než dôjde k ich lýze pôsobením adenovírusov
Na lýzu môže byť použitá akákoľvek vhodná metóda. Napríklad môžu byť bunky aj s živným médiom odstredené a médium nahradené roztokom silných detergentov a ďalších aditív (napríklad Triton™X-100, Tween 20, Tween 80 alebo deoxycholát) a po vhodne dlhej inkubácii môže byť vzorka zhromaždená na ďalšie spracovanie Alebo môžu byť bunky zhromaždené šetrnou centrifugáciou, tak aby sa sformovali do bunkovej pelety, a lýzované trojnásobným zmrazením a rozmrazením. Preferovanou alternatívnou technikou je použitie francúzskeho lisu alebo ešte lepšie mikrofluidizéru. Francúzske lisy a mikrofluidizéry účinne lýzujú eukaryotické bunky pomocou strižných síl, ktoré rozrušujú bunkové membrány Postup využívajúci strižné sily je rýchlejší a reprodukovateľnejší než iné vhodné metódy na získanie roztoku obsahujúceho adenovírus z infekčnej bunkovej populácie (napríklad eukaryotických buniek) V súlade s tým môže byť zmesový roztok obsahujúci adenovírus a prinajmenšom jeden nežiaduci typ biomolekuly na purifikáciu alebo obohatenie podľa metód opísaných v tomto vynáleze získaný mikrofluidizáciou bunkovej populácie infikovanej adenovírusmi.
Roztok, z ktorého má byť purifikovaný adenovírus, môže byť prípadne predčistený. Pokiaľ je požadované, môže byť také predčistenie uskutočnené stredne šetrnou centrifugáciou, aby boli odstránené veľké kusy zvyškov buniek a väčšie nerózrušené organely (pokiaľ sú prítomné). Bunkový lyzát môže byť tiež predčistený filtráciou. Predovšetkým môže byť použitá filtrácia s tangenciálnym tokom (TFF) v súlade so známymi metódami. Roztok môže byť prípadne inkubovaný s enzýmami schopnými rozkladať DNA a RNA (DNáza/RNáza), aby boli odstránené všetky DNA a RNA obsiahnuté v predčisťovaných bunkách, ktoré nie sú obsiahnuté v časticiach adenovírusov.
Potom, ako je bunkový lyzát predčistený, môže byť prípadne predseparovaný na chromatografíckej živici meniacej anióny pred vlastnou purifikáciou. Na predseparáciu môže byť použitá akákoľvek vhodná chromatografická živica meniaca anióny. Prednostne sa na predseparáciu používa chromatografická živica meniaca anióny, ktorá má povrchové skupiny derivatizované terciárnym alebo kvartérnym amínom (napríklad dietylaminoetyl, trimetylaminoetyl alebo trimetylaminopropyl). Povrchová skupina môže byť spojená s nosnou matricou (nosičom) pomocou akejkoľvek v odbore používanej spojovacej skupiny. Medzi vhodné spojovacie skupiny v kontexte tohto vynálezu patria tie, ktoré sú na báze akrylových polymérov. Nosná matrica môže byť tvorená akýmkoľvek vhodným materiálom. Prednostne sa na nosné matrice používa materiál založený na koncepte mäkký gél v rigidnej schránke. Táto gélom plnená chromatografická živica spojuje výhodu vysokej kapacity mäkkých gélov, napríklad agarózy, a rigidity pevných materiálov pri vysokých prietokových rýchlostiach a ich zvýšenej odolnosti proti stlačovaniu, zmršťovaniu a nadúvaniu sa, čo sú vlastnosti bežné u mäkkých gélov. Tieto gélom plnené chromatografické živice sú veľmi rozšírené a sú opísané napríklad v patentoch U. S. č. 5,268,097 a 5,672,276.
V kontexte tohto vynálezu je na predseparáciu žiaduca chromatografická živica meniaca anióny Q Ceramic HyperD1MF, ktorá je komerčne dostupná od
ΤΜ
BioSepra, Villeneuve-La-Garenne, Francie. Q Ceramic HyperD F je zložená z vysoko poréznych keramických guliek naplnených flexibilným hydrofílným gélom s funkčnými skupinami. Priemerná veľkosť guľky je 50 pm (rozmedzie veľkosti častíc je 25 až 75 pm). Q Ceramic HyperD™F má dynamickú kapacitu prinajmenšom 85 mg/ml hovädzieho sérového albumínu (BSA) pri 200 cm/h s 50% prierazom (breakthrough) a prinajmenšom 80 mg/ml hovädzieho sérového albumínu (BSA) pri 600 cm/h s 50% prierazom(prielomom). Kvôli gélom-plnenej povahe vykazuje náplň Q Ceramic HyperD™F väčšiu povrchovú plochu dostupnú na viazanie v porovnaní s klasickými poréznymi médiami, v ktorých je obvykle najmenej 50% vonkajšku častice tvorených vstupmi do pórov, kde nedochádza k naviazaniu. V dôsledku toho 100 % celkovej vonkajšej plochy Q Ceramic HyperD™F prispieva k viazaniu. Vďaka tomuto rysu je táto chromatografická živica na predčisťovanie uprednostňovaná.
Alternatívou je predčistenie bunkového lyzátu na expandovaných guľkách adsorpčného meniča aniónov. Napríklad môže byť použitá chromatografická živica meniaca anióny na expandovaných adsorpčných guľkách s väzbovými časťami derivatizovanými kvartérnym amínom (napríklad trimetylaminometyl alebo DEAE). Pre expandované chromatografické náplne s živicami meniacimi anióny je charakteristický väčší priemer guliek, napríklad väčší než 30 pm, ale obvykle neprekračujúci 500 pm. Vďaka značnej veľkosti guliek môžu veľké fragmenty bunkových zvyškov a celé (nelýzované) bunky pretekať voľne chromatografickou živicou (a fritou jej prispôsobenej veľkosti). Medzi vhodné adsorpčné chromatografícké živice s expandovanou náplňou patrí Streamline QXL® (Pharmacia, Uppsala, Švédsko) a DEAE Cellthru-Big Beads1M (Sterogene, Carlsbad, CA, alebo ekvivalent od UpFront Chromatography, Kodaň, Dánsko).
Bunkový lyzát je eluovaný z chromatografickej živice meniacej anióny akýmkoľvek vhodným eluentom (napríklad 600 mM NaCl). Pokiaľ je to potrebné, je roztok vhodne zriedený na nižšiu koncentráciu elučného činidla, alebo iných činidiel v elučnom pufri. Potom môže byť polopreČistený a koncentrovaný bunkový lyzát nanesený na vhodnú chromatografickú živicu meniacu anióny a purifikovaný.
Ako vyplýva z vyššie uvedeného, ponúka tento vynález metódu umožňujúcu zvýšiť koncentráciu adenovírusu v roztoku. Metóda zahrnuje (i) získanie zmesového roztoku obsahujúceho adenovírus a najmenej jeden nežiaduci typ biomolekuly; (ii) nanesenie tohto zmesového roztoku na chromatografickú živicu meniacu anióny; a (iii) eluovanie adenovírusu z chromatografickej živice pomocou takého eluentu, aby bol získaný roztok obohatený o adenovírus. Navyše môže byť zmesový roztok adenovjrusu prípadne klarifikovaný (vyčírený) pomocou filtrácie s tangenciálnym tokom. Ďalej môže byť vyčírený roztok prípadne predseparovaný pomocou chromatografie na meničoch aniónov.
V tomto ohľade ponúka tento vynález tiež metódu umožňujúcu purifikovať adenovírus z buniek adenovírusom infikovaných. Táto metóda zahrnuje lýzu buniek infikovaných adenovírusom, aplikáciu lyzátu na jedinú chromatografickú živicu, ktorá naviaže adenovírus, elúciu adenovírusu z chromatografickej živice a zbieranie frakcie obsahujúcej adenovírus. Adenovírus vo frakcii je v podstate tak čistý, ako adenovírus po trojnásobnej purifikácii v hustotnom gradiente CsCI.
Akákoľvek vhodná chromatografícká živica môže byť použitá na purifikáciu adenovírusu z bunkového lyzátu. Akákoľvek vhodná chromatografícká živica meniaca anióny a majúca povrchové skupiny vybrané zo skupiny zahrnujúcej dimetylaminopropyl, dimetylaminobutyl, dimetylaminoizobutyl a dimetylaminopentyl môže byť použitá na purifikáciu adenovírusu zo zmesového roztoku obsahujúceho adenovírus a najmenej jeden nežiaduci typ biomolekuly. Ako povrchová skupina býva prednostne používaný dimetylaminopropyl. Povrchová skupina môže byť pripojená k nosiču pomocou akejkoľvek používanej vhodnej spojovacej skupiny. V kontexte tohto vynálezu patrí medzi vhodné sulfónamidové a akrylátové spojovacie skupiny. Nosič matrice môže byť tvorený akýmkoľvek vhodným materiálom; je však výhodné pokiaľ je tvorený takou perfúznou chromatografickou živicou meniacou anióny, aby bol optimalizovaný transport do vnútra častíc náplne.
Typické perfúzne chromatografické živice majú na povrchu častíc veľké (napríklad 6000 až 8000 Ä) póry. Sieť menších pórov, obmedzujúca dĺžku difúz8 nych dráh, zväčšuje povrchovú plochu pórov s veľkými priemermi. Vďaka tejto bimodálnej distribúcii veľkostí pórov využíva mobilnú fázu s adenovírusom, ktorá vstupuje a preteká časticami chromatografickej živice, ako konvektívneho, tak difúzneho transportu. Takáto perfúzna chromatografická živica je dobre známa a podrobnejšie ju opisuje Afeyan a spol. (J. Chromatogr. 519: 1-29 (1990)) a U.S. patenty 5,384,042; 5,228,989; 5,605,623; a 5,019,270).
I
V kontexte tohto vynálezu je vhodnou perfúznou chromatografickou živicou meniacou anióny POROS® 50D, ktorá je komerčne dostupná od PerSeptive Biosystems, Framingham, Massachusetts. POROS® 50D je chromatografická živica na báze kopolyméru styrén-divinylbenzén, ktorá má dynamickú kapacitu prinajmenšom 100 mg/ml hovädzieho sérového albumínu (BSA) pri 100 cm/h s 50% prierazom (breakthrough) a prinajmenšom 80mg/ml BSA pri 1000 cm/h s 5% prierazom. POROS 50D vykazuje zníženie tlaku menej než 3 bary pri 1000 cm/h v 10 cm vrstve chromatografickej živice a pri menovitej veľkosti častice chromatografickej živice okolo 50 pm (t. j. priemerná veľkosť častice sa pohybuje v rozmedzí (25 až 100 pm)).
Chromatografická živica meniaca anióny môže byť použitá buď vsádzkovo (batch), alebo výhodnejšie v prietokovom (flow-through) usporiadaní, prednostne na kolóne (kolóna naplnená chromatografickou živicou), predovšetkým pokiaľ ide o perfúzne chromatografické živice. Okrem toho ponúka predkladaný vynález v kontraste k skôr používaným metódam jednoduchú a rýchlu chromatografickú purifikáciu adenovírusu ľahko uskutočniteľnú do iného meradla
Adenovírus purifikovaný podľa vynájdenej metódy nemá nižší pomer častice vzhľadom na pfu (pu/pfu) než adenovírus purifikovaný v hustotnom gradiente (CsCl). Takže pu/pfu purifikovaného adenovírusu je prinajmenšom 50 % v porovnaní s adenovírusom purifikovaným v hustotnom gradiente CsCl, výhodne prinajmenšom 85 % v porovnaní s adenovírusom purifikovaným v hustotnom gradiente CsCl a predovšetkým prinajmenšom 96 % v porovnaní s adenovírusom purifikovaným trojnásobne v hustotnom gradiente CsCl. Okrem toho čistota adenovírusu po chromatografii prevyšuje čistotu rovnakého roztoku adenovírusu, ktorý je analyticky nerozlíšíteľný od adenovírusu purifikovaného štandardným spôsobom v hustotnom gradiente CsCl (to je v podstate tak čistý ako adenovírus purifikovaný trojnásobne v hustotnom gradiente CsCl, napríklad prinajmenšom z 90 % tak čistý, výhodne prinajmenšom z 97 % tak čistý a výhodnejšie z 99 % tak čistý ako adenovírus purifikovaný trojnásobne v gradiene CsCl).
Podstatné a vhodné obohatenie adenovírusu v roztoku je dosiahnuté jeho eluovaním pomocou vhodného eluentu z chromatografickej živice meniacej anióny. Typické vhodné eluenty sú roztoky s veľkou kóncentráciou iónov, takže ióny súťažia s adenovírusom o väzbu na chromatografíckú živicu. Prednostne je na kolónu privádzaný gradient eluentu. Gradient eluentu je buď diskontinuálny, t. j. vo dvoch alebo viac krokoch, alebo kontinuálny. Také gradienty môžu byť lineárne, konkávne alebo konvexné. Vhodným eluentom je chlorid sodný v pufrovanom roztoku. Napríklad adenovírus je eluovaný z chromatografickej živice Q Ceramic Hyper D®F v rozmedzí koncentrácií chloridu sodného okolo 360 mM až okolo 475 mM, presnejšie pri zhruba 415 mM NaCl a z chromatografickej živice POROS® 50D v rozmedzí koncentrácií chloridu sodného okolo 360 mM až okolo 450 mM, presnejšie pri zhruba 410 mM NaCl.
Vzorky môžu byť výhodne dávkované na chromatografíckú živicu meniacu anióny pri vysokých koncentráciách elučných činidiel (napr. najmenej pri 75 % koncentrácii nevyhnutnej na eluovanie adenovírusu z chromatografickej živice, výhodnejšie okolo 85 % až okolo 90 % koncentrácie nevyhnutnej na eluovanie adenovírusu z chromatografickej živice). Dávkovaním vzorky pri vysokých koncentráciách elučného činidla na chromatografíckú živicu meniacu anióny sa docieli to, že sa určité nečistoty nenaviažu na živicu.
Elúcia obohateného adenovírusu môže byť vykonávaná pri akomkoľvek vhodnom prietoku. Typické prietoky pre predseparácie na chromatografickej živici meniacej anióny sa pohybujú od zhruba 100 cm/h až do zhruba 1000 cm/h, prednostne od asi 200 cm/h do asi 500 cm/h. Typické prietoky pre chromatografické živice meniace anióny s väzbovými skupinami, ako je demetylaminopropyl, dimetylaminobutyl, dimetylaminoizobutyl a dimetylaminopentyl, sú zhruba 100 cm/h až zhruba 1500 cm/h, prednostne od zhruba 500 cm/h do zhruba 1250 cm/h
S cieľom správne kvantifikovať počet adenovírusových častíc vo vzorke roztoku adenovírusu, takom ako je roztok získaný zo surového lyzátu buniek infikovaných adenovírusom, môže byť roztok vzorky adenovírusu pripravený vyššie opísaným spôsobom. Vzorka roztoku adenovírusu môže byť potom obohatená a purifikovaná aplikáciou na chromatografickú živicu meniacu anióny a následnou elúciou roztoku adenovírusu z tejto živice vyššie opísaným spôsobom. Potom je stanovená absorbancia vzorky adenovírusu eluovanéh.o z chromatografiei ' kej živice. Na porovnanie je určovaná absorbancia štandardného roztoku adenovírusu, t. j. roztoku známej koncentrácie. Z porovnania absorbancie roztoku vzorky a absorbancie štandardného roztoku sa určí koncentrácia adenovírusových častíc, t. j. počet adenovírusových častíc v danom objeme v roztoku vzorky.
Štandardnou absorbanciou môže byť jediná štandardná absorbancia alebo séria či skupina štandardných absorbancií určitého koncentračného rozsahu adenovírusu. Absorbancia vzorky a Štandardná absorbancia môžu byť prezentované v podobných, alebo rôznych (prednostne podobných) formátoch, meraniach, alebo jednotkách, pokiaľ však môže byť dosiahnuté užitočné porovnanie. Napríklad vhodná štandardná absorbancia môže byť absorbancia, ktorá bola stanovená v štandardnom roztoku adenovírusu, ktorý bol získaný rovnakým spôsobom, ako vzorka roztoku adenovírusu podľa metód opísaných v tomto vynáleze.
Kvantifikácia počtu adenovírusových častíc je vykonávaná porovnávaním absorbancie vzorky so štandardom akýmkoľvek vhodným spôsobom. Napríklad môžu byť absorbancie vzorky a absorbancie štandardu porovnávané vypočítaním štandardnej krivky plochy pod vrcholom zodpovedajúcej elúcii vírusu z chromatografickej živice; v chromatograme je vynesená absorbancia proti času. Absorbancia rôznych známych koncentrácií adenovírusu môže byť zakreslená do grafu a tak vznikne štandardná (kalibračná) krivka. Koncentrácia vzorky môže byť potom určená pomocou lineárnej regresie
Adenovirus obohatený v roztoku alebo purifikovaný z buniek infikovaných adenovírusom pomocou chromatografických živíc meniacich anióny môže byť získaný v roztokoch obsahujúcich vysoké koncentrácie elučného činidla, naprí11 klad NaCI. Zloženie pufru môže byť ľahko zmenené akoukoľvek vhodnou technikou na akýkoľvek požadovaný pufer, napríklad sterilný izotonický pufer na injekcie cicavcom (napríklad Ringerov roztok) obsahujúci vhodné stabilizátory a kryo konzervačné látky na dlhodobé skladovanie purifikovaného adenovírusu Vhodné techniky na zmenu zloženia pufru zahrnujúce dialýzu, diafiltráciu a chromatografiu na molekulových sitách (niekedy tzv. gélová permeačná chromatografia) a ďalšie techniky. Medzi vhodné matrice pre chromatografiu na moi t lekulových sitách patrí Toyopearl HW-40C a Toyopearl HW40F (TosoHaas, Montgomeryville, PA); Uniflow™, Superflow™ a Ultraflow™ (Sterogene, Carlsbad, CA); Shodex™ ( Thomson Instruments, Chantilly, VA); a Bio-Sil™ a Bio-Gel™ (Bio-Rad, Hercules, CA). Každá z týchto chromatografických živíc má dostatočne nízky potenciál viazať proteíny.
Predkladaný vynález je detailnejšie opísaný na nasledujúcich príkladoch. Tieto príklady slúžia len na objasnenie vynálezu, ale v žiadnom prípade nemajú obmedzovať rozsah vynálezu.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 predstavuje chromatogram bunkového lyzátu infikovaného adenovírusom, eluovaného z chromatografickej živice so skupinou kvartérneho amínu (Q Ceramic HyperD™F), kde os y predstavuje absorbanciu (pri 260 a 280 nm), os x znázorňuje elučný čas (min) a paralelná os y (napravo) znázorňuje vodivosť elučného činidla na kolóne (čiarkovaná čiara, mS).
Obr. 2 predstavuje chromatogram lyzátu buniek infikovaných adenovírusom, prečisteného pomocou filtrácie s tangenciálnym tokom a inkubáciou s DNázou/RNázou (Benzonase”1) a eluovaného z chromatografickej živice so skupinou kvartérneho amínu (Q Ceramic HyperD™F), kde os y predstavuje absorbanciu (pri 260 a 280 nm), os x znázorňuje elučný čas (min) a paralelná os y (napravo) znázorňuje vodivosť elučného činidla na kolóne (čiarkovaná čiara, mS).
Obr. 3 predstavuje chromatogram lyzátu buniek infikovaných adenovírusom, eluovaného z adsorpčnej chromatografickej živice s expandovanými časticami (Streamline QXL®), kde os y predstavuje absorbanciu (pri 260 a 280 nm), os x znázorňuje elučný čas (min) a paralelná os y (napravo) znázorňuje vodivosť elučného činidla na kolóne (čiarkovaná čiara, mS).
Obr. 4 predstavuje chromatogram lyzátu buniek infikovaných adenovírusom, purifikovaného trojnásobnou' centrifugáciou v gradiente CsCl a kvantifikovaného na dimetylaminopropyl perfúznej (POROS®50D) analytickej kolóne, kde os y predstavuje absorbanciu (pri 260 a 280 nm), os x znázorňuje elučný čas (min).
Obr. 5 predstavuje chromatogram lyzátu buniek infikovaných adenovírusom, eluovaného z adsorpčnej chromatografickej živice s expandovanými časticami (Streamline QXL®) a dvakrát z dimetylaminopropyl perfúznej (POROSr50D) chromatografíckej živice, kde os y predstavuje absorbanciu (pri 260 a 280 nm), os x znázorňuje elučný čas (min).
Obr. 6 predstavuje chromatogram lyzátu buniek infikovaných adenovírusom, eluovaného z dimetylaminopropyl perfúznej (POROSm50D) chromatografickej živice, kde os y predstavuje absorbanciu (pri 260 a 280 nm), os x znázorňuje elučný čas (min).
Príklady uskutočnení vynálezu
Príklad 1
Tento príklad demonštruje purifikáciu adenovírusu zo surového bunkového lyzátu. Purifikácia bola uskutočnená predčistením, t j vyčírením bunkového lyzátu, nanesením lyzátu na živicu meniacu anióny a následnou elúciou a nakoniec nanesením bunkového lyzátu na chromatografickú živicu meniacu anióny s väzbovými skupinami vybranými zo súboru zahrnujúceho dimetylaminopropyl.
dimetylaminopentyl, dimetylaminoizobutyl a dimetylaminopentyl a následnou elúciou
AdSEAP a AdVEGFni sú vektory adenovírusu s deléciou v EI a E3 regiónoch adenovírusového genómu obsahujúceho kazetu génovej expresie, v tomto prípade cytomegalovírusový (CMV) promótor operabilne pripojený k cudziemu génu (transgénu), napríklad sekrečnej alkalickej fosfatázy (AdSEAP) alebo vaskulárneho endoteliálneho rastového faktoru Ϊ21 (AdVEGFm), v EI regióne adenovírusového genómu. AdSEAP a AdVEGFm boli propagované v odstreďovacích bankách, valcových fľašiach, trepacích fľašiach alebo bioreaktoroch obsahujúcich okolo 10s až 106 293 buniek na ml v prítomnosti alebo v neprítomnosti séra v rastovom médiu.
Pred chromatografickou separáciou boli bunky a média spracovávané jednou z nasledujúcich metód: (a) bunky boli zakoncentrované centrifugáciou a resuspendované vo vhodnom pufre (25 mM Tris, pH 7.8, 75 mM NaCl, 10 mM MgCb) pre optimálnu aktivitu DNázy/RNázy, lýzované v mikrofluidizére (Microfluidics, Newton, Massachusetts) podľa pokynov výrobcu a klarifikované filtráciou; alebo (b) bunky boli lýzované priamo v mikrofluidizére podľa pokynov výrobcu, klarifikované filtráciou, koncentrované a diafiltrované do vhodného vyššie opísaného pufru pomocou filtrácie s tangenciálnym tokom (TFF). Pri použití oboch metód bol klarifikovaný bunkový lyzát inkubovaný s DNázou/RNázou ako je Benzonase® (Nycomed Pharma A/S, Denmark) podľa pokynov výrobcu a rozpustený vo vhodnom pufre na chromatografickú predseparáciu na meničoch aniónov
Bunkový lyzát bol potom nanesený na kolónu Q Ceramic HyperD1MF a eluovaný krokovým gradientom 360 až 460 mM NaCl. Obr. 1, ktorý je chromatografiou bunkového lyzátu infikovaného adenovírusom a eluovaného z chromatografickej živice modifikovanej kvartérnym amínom (kolóna Q Ceramic HyperD™F), znázorňuje elúciu adenovírusu z predseparačnej kolóny meniacej anióny (Q Ceramic HyperD1MF) v prípade, keď nebola uskutočnená inkubácia s DNázou/RNázou. Koncentrovaný a čiastočne purifikovaný vírusový pík, ktorý sa eluuje okolo 415 mM NaCl, keď je na elúciu použitý krokový gradient 360, 450 a
1000 mM NaCl, bol obsiahnutý v jednej frakcii okolo 51 minút. Obr. 2, ktorý je chromatografiou bunkového lyzátu infikovaného adenovírusom, klarifikovaného pomocou filtrácie s tangenciálnym tokom a inkubovaného s DNázou/RNázou a eluovaného z chromatografickej živice modifikovanej kvartérnym amínom, znázorňuje elúciu adenovírusu pri predseparácii z kolóny meniacej anióny, Q Ceramic HyperD™F, keď bola použitá DNáza/RNáza (Benzonase®). Bolo pozorované významné zníženie veľkosti piku nukleovej kyseliny'eluujúcej sa po víruse.
Eluent z predchromatografie na meničoch aniónov bol potom zriedený asi o 30 %, čo je nevyhnutné zriedenie elučného činidla, v tomto prípade NaCl, na koncentráciu menšiu, než je elučná koncentrácia na perfúznu chromatografíckú kolónu so skupinami dimetylaminopropylu (POROS® 50D), ktorá bola použitá na dokončenie purifikácie adenovírusu zo surového bunkového lyzátu. Dávkovanie na kolónu POROS® 50D bolo vykonávané pri koncentrácii 300 mM NaCl. Elúcia z kolóny bola vykonávaná krokovým gradientom chloridu sodného (od 360 mM do 450 mM).
Chromatogram bunkového lyzátu infikovaného adenovírusom klarifikovaného filtráciou s tangenciálnym tokom, inkubovaného s DNázou/RNázou a eluovaného z chromatografickej kolóny s kvartérnym amínom a perfúznej chromatografickej kolóny s dimetylaminopropylom, znázorňuje elúciu adenovírusu z kolóny POROS® 50D. V podstate bol získaný len jediný ostrý pík s retenčným časom zhruba 35 minút. Analytická charakterizácia purifikovaného adenovírusu ukázala, že čistota adenovírusu bola v podstate nerozlíšiteľná od adenovírusu purifikovaného trojnásobne v hustotnom gradiente CsCl.
Preto bol adenovírus purifikovaný zo surového bunkového lyzátu filtráciou bunkového lyzátu, predseparáciou bunkového lyzátu na kolóne s kvartérnym amínom meniacej anióny a nakoniec nástrekom bunkového lyzátu na kolónu so skupinami dimetylaminopropylu meniacu anióny a následnou elúciou z tejto kolóny.
Príklad 2
Tento príklad demonštruje purifikáciu adenovírusu zo surového bunkového lyzátu. Purifikácia bola uskutočnená klarifikáciou bunkového lyzátu, predseparáciou bunkového lyzátu na kolóne s expandovanou adsorpčnou náplňou meniacej anióny a nakoniec separáciou bunkového lyzátu na kolóne meniacej anióny s väzbovými skupinami vybranými zo súboru zahrnujúceho demetylaminopropyl, ; ΐ dimetylaminopentyl a dimetylaminoizobutyl.
AdSEAP (adenovírusový vektor opísaný v príklade 1) bol propagovaný v odstred’ovacích bankách obsahujúcich 105 - 106 293 buniek na ml. Bunky a médium boli lýzované v mikrofluidizére podľa pokynov výrobcu. Bunkový lyzát bol dávkovaný na predkolónu s expandovanou adsorpčnou náplňou meniča aniónov Streamline QXL® (Pharmacia, Uppsala, Švédsko) (aby boli odstránené veľké zvyšky buniek a nelýzované bunky). Kolóna Streamline QXL® tiež slúžila na čiastočnú purifikáciu a zakoncentrovnie adenovírusu. Obr. 3, ktorý je chromatogramom bunkového lyzátu infikovaného adenovírusom, eluovaného z expandovanej adsorpčnej chromatografíckej náplne, ukazuje elúciu adenovírusu z kolóny Streamline QXL®. Pík zodpovedajúci vírusu bol obsiahnutý vo frakcii 14 (jedna frakcia za minútu), ktorá sa eluovala pri 600 mM NaCl. Eluent z kolóny Streamline QXL® bol nariedený asi 1.2. Toto nariedenie bolo nevyhnutné, aby bolo zriedené elučné činidlo, v tomto prípade NaCl, na koncentráciu nižšiu než je elučná koncentrácia z kolóny POROS® 50 D, ktorá bola následne použitá.
Kolóna POROS® 50 D bola použitá na dokončenie purifikácie adenovírusu. Dávkovanie na POROS® 50 D bolo vykonávané pri koncentrácii 300 mM NaCl. Elúcia z kolóny bola potom vykonávaná lineárnym gradientom chloridu sodného (od 360 mM do 450 mM), v ktorom sa adenovírus eluuje z kolóny POROS® 50 D Chromatogram bunkového lyzátu infikovaného adenovírusom, eluovaného z adsorpčnej chromatografíckej živice s expandovanou náplňou a dimetylaminopropyl-perfúznej chromatografíckej živice ukazuje v podstate len jeden ostrý pík v približne 15 minútach, keď sa eluuje lineárnym gradientom NaCl od 360 do 450 mM tak, že vírus je eluovaný pri zhruba 400 mM NaCl Analytická charakterizácia purifíkovaného adenovírusu preukázala, že čistota adenovíru16 su bola v podstate nerozlíšiteľná od adenovírusu purifikovaného trojnásobne v hustotnom gradiente CsCl (viď obr. 4).
Z toho dôvodu bol adenovírus purifíkovaný zo surového bunkového lyzátu filtráciou bunkového lyzátu, nástrekom bunkového lyzátu na predkolónu s expandovanou náplňou meniacu anióny a následnou elúciou z tejto kolóny a nakoniec aplikáciou bunkovéo lyzátu na kolónu obsahujúcu skupiny dimetylaminop! t ropylu meniacu anióny a následnou elúciou z tejto kolóny.
Príklad 3
Tento príklad demonštruje - v zreteľnom protiklade k doterajším metódam - purifikáciu adenovírusu na jedinej chromatografickej kolóne zo surového bunkového lyzátu, pri ktorej bola purifikáciou dosiahnutá prinajmenšom 95% čistota adenovírusu purifikovaného v trojnásobnom hustotnom gradiente CsCl. Navyše táto technika ponúka rýchlu a presnú metódu kvantifikácie celkového počtu vírusových častíc v surovom lyzáte.
Nárast a lýza AdSEAP (adenovírusový vektor z príkladu 1) boli vykonávané ako v príklade 1, metóda (a). Bunkový lyzát bol dávkovaný na POROS® 50 D v 360 mM NaCl. Elúcia z kolóny bola uskutočnená tak, ako je uvedené v príklade 1 a bol získaný chromatogram absorbancie (260 nm a 280 nm) proti času (min), znázornený na obr. 6. Analytická skúška frakcie zodpovedajúca piku preukázala, že purifikácia bola nerozlíšiteľná od adenovírusu purufikovaného trojnásobne v hustotnom gradiente CsCl (obr. 5 a 6), kde horná horizontálna čiara predstavuje meranie vodivosti, ktoré indikuje aktuálnu koncentráciu NaCl. Podstatné prekrytie absorbancie piku pri 260 nm (vyššia čiara v chromatograme) a pri 280 nm (nižšia čiara v chromatograme), čo bolo 1,27 (1,25 ± 0,08 bol empiricky stanovený pomer čistého vírusu), ukazujúce, že vírus bol v podstate čistý.
Rôzne roztoky adenovírusu známej koncentrácie boli dávkované na kolónu POROS® 50D v 360 mM NaCl Elúcia z kolóny bola uskutočnená tak, ako je uvedené v príklade 1 a na chromatograme bola zaznamenaná absorbancia (260 a
280 nm) proti elučnému (retenčnému) času. Plocha piku (pod píkom) zodpovedajúca elúcii adenovírusu bola určená pre rôzne koncentrácie a zakreslená (vynesená) do grafu ako plocha proti koncentrácii adenovírusu. Plocha pod krivkou AdSEAP v chromatograme na obr. 5 zodpovedajúca elúcii adenovírusu bola vypočítaná a porovnaná so štandardnou krivkou pomocou lineárnej regresie a bolo určené, že surový lyzát obsahuje 4,64 x 1O10 pu/ml.
z
Takto predstavuje predkladaný vynález jednokrokovú metódu na purifikáciu adenovírusu z lyzátu celých buniek. Preto bol adenovirus, ktorý bol prinajmenšom z 95% tak čistý ako adenovirus po trojnásobnej purifikácii v hustotnom gradiente CsCl, purifikovaný zo surového bunkového lyzátu na jedinej chromatografickej kolóne. Navyše bol rýchlo a presne kvantifikovaný celkový počet adenovírusov v surovom bunkovom lyzáte.
Príklad 4
Tento príklad demonštruje, že zloženie pufru s adenovírusom izolovaným z kolón meniacich anióny môže byť ľahko zmenené (napríklad z vysokej koncentrácie soli na nízku koncentráciu soli).
Zhruba 0,1 objemu kolóny (0,01 až asi 0,25 objemu kolóny) roztoku obsahujúceho adenovirus z príkladu 1 bolo dávkované na kolónu Toyopearl HW40C, alebo na kolónu Uniflow 4 ekvilibrovanú vhodným sterilným izotonickým roztokom na injekcie cicavcom (napr. Ringerov roztok) a obsahujúce vhodné stabilizátory a kryo konzervačné látky pre dlhodobé skladovanie purifikovaného adenovírusu. Chromatografická frakcia obsahujúca adenovirus bola identifikovaná spektroskopiou (in-line) a zbieraná. Purifikovaný vírus bol obsiahnutý v pufre obsahujúcom asi 10 mM Tris, pH 7,8, 75 mM NaCI a rôzne stabilizátory.
Všetky odkazy, ktoré sú tu citované, vrátane prihlášok vynálezov a publikácií sú zahrnuté v celom ich rozsahu odkazom.
Zatiaľ čo tento vynález bol opísaný s dôrazom na preferované uskutočnenia, bude kvalifikovaným v odbore zrejmé, že môžu byť použité varianty prefe18 rovaných uskutočnení, a že je zamýšľané, aby vynález mohol byť vykonávaný aj inak, než je tu špecificky opísané. Teda tento vynález zahrnuje všetky modifikácie zahrnuté v duchu a rámci tohto vynálezu, tak ako je definované nasledujúcimi patentovými nárokmi.

Claims (6)

1. Spôsob obohacovania roztoku adenovírusom, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:
(i) získavanie zmesového roztoku obsahujúceho adenovírus a najmenej jeden nežiaduci typ biomolekuly, (ii) dávkovanie uvedenej zmesi na chromatografíckú živicu meniacu anióny obsahujúcu väzbovú skupinu vybranú zo súboru zahrnujúceho dimetylaminopropyl, dimetylaminobutyl, dimetylaminoizobutyl a dimetylaminopentyl, tak, že sa adenovírus na uvedenú chromatografíckú živicu viaže; a (iii) eluovanie uvedeného adenovírusu z uvedenej chromatografickej živice eluentom tak, že je získaný roztok obohatený adenovírusom.
2/6
Vírus
Vodivosť (mS) (uiu 08Z Ή 092) BpuBqjosqy
Čas (min)
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedenou väzbovou skupinou je dimetylaminopropyl
3/6
Vodivosť (mS) >p θ'*
Čas (min) (UIU 087 Ή 097) BiouBqjosqv
Μ(>
(uju 08Ζ # 093) BiouBquosqv
Čas (min)
3. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že uvedeným eluentom je eluent s kontinuálnym alebo diskontinuálnym gradientom
4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že uvedeným eluentom je gradientový eluent zahrnujúci gradient chloridu sodného.
5/6 (mu 082 Y 092) BiouBqjosqy
Čas (min)
Obr. 5
5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že uvedenou chromatografickou živicou meniacou anióny je perfúzna chromatografická živica meniaca anióny
6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že uvedený zmesový roztok zahrnujúci adenovírus a prinajmenšom 'jeden nežiaduci typ biomolekuly je získaný mikrofluidizáciou populácie buniek infikovaných adenovírusom.
7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že uvedený spôsob ďalej zahrnuje: (i1) aplikáciu uvedenej zmesi obsahujúcej adenovírus a prinajmenšom jeden nežiaduci typ biomolekuly na pred-živicu meniacu anióny a elúciu uvedeného adenovírusu z uvedenej pred-živice a potom v kroku (ii) namiesto aplikácie uvedeného zmesového roztoku, aplikáciu adenovírusu eluovaného z uvedenej pred-živice na uvedenú chromatografickú živicu meniacu anióny.
8 Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že uvedenou pred-živicou meniacou anióny je živica s kvartérnym amínom.
9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že uvedenou pred-živicou meniacou anióny je adsorpčná živica s plochou alebo expandovanou náplňou.
10. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že krok (ii) sa uskutočňuje v roztoku obsahujúcom prinajmenšom 75 % kon21 centrácie elučného činidla požadovaného na elúciu uvedeného adenovírusu z uvedenej chromatografickej živice meniacej anióny.
11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že uvedený styk uvedeného zmesového roztoku s chromatografickou živicou meniacou anióny sa uskutočňuje v roztoku obsahujúcom od asi 85 % do asi 90 % koncentrácie elučného činidla požadovaného na elúciu uvedeného adenovírusu z uvedenej chromatografickej živice meniacej anióny.
12. Spôsob presnej kvantifikácie počtu adenovírusových častíc v roztoku vzorky, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:
(i) obohacovanie roztoku vzorky adenovírusom spôsobom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11;
(ii) určovanie absorbancie roztoku vzorky, ktorý bol obohatený spôsobom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 11 a štandardného roztoku adenovírusu;
(iii) porovnávanie absorbancie roztoku vzorky a štandardného roztoku; a (iv) kvantifikáciu počtu adenovírusových častíc v uvedenom roztoku vzorky.
13 Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že roztok vzorky je pripravený zo surového bunkového lyzátu adenovírusom infikovaných buniek.
14 Spôsob purifikácie adenovírusu z buniek infikovaných adenovírusom, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje lýzovanie uvedených buniek, aplikáciu lyzátu na jedinú chromatografickú živicu tak, že sa uvedený adenovírus via22 že na uvedenú chromatografickú živicu, elúciu uvedeného adenovírusu z uvedenej chromatografíckej živice a zbieranie frakcie obsahujúcej uvedený adenovírus, pričom uvedený adenovírus je v podstate tak čistý, ako adenovírus purifikovaný trojnásobne v hustotnom gradiente CsCI.
, 15. Spôsob presnej kvantifikácie počtu adenovírusových častíc v roztoku vzorky, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:
(i) purifikáciu roztoku vzorky adenovírusu spôsobom podľa nároku 14;
(ii) určovanie absorbancie roztoku vzorky, ktorý bol purifikovaný spôsobom podľa nároku 14 a štandardného roztoku adenovírusu;
(iii) porovnávanie absorbancie roztoku vzorky a štandardného roztoku a (iv) kvantifikáciu počtu adenovírusových častíc v uvedenom roztoku vzorky1/6
Vírus
Vodivosť (mS) (iuu 082 9 092) BiouBqjosqy
Čas (min)
6/6 (tuu 082 092) Biounqjosqv
Čas (min)
Obr. 6
SK1568-2000A 1998-04-22 1999-04-22 Účinné čistenie adenovírusu SK15682000A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8262898P 1998-04-22 1998-04-22
PCT/US1999/008843 WO1999054441A1 (en) 1998-04-22 1999-04-22 Efficient purification of adenovirus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK15682000A3 true SK15682000A3 (sk) 2001-05-10

Family

ID=22172352

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1568-2000A SK15682000A3 (sk) 1998-04-22 1999-04-22 Účinné čistenie adenovírusu

Country Status (20)

Country Link
US (3) US6383795B1 (sk)
EP (1) EP1073721B1 (sk)
JP (1) JP2002512361A (sk)
AT (1) ATE303434T1 (sk)
AU (1) AU756889B2 (sk)
BG (1) BG104928A (sk)
BR (1) BR9909789A (sk)
CA (1) CA2328462C (sk)
DE (1) DE69927013T2 (sk)
EA (1) EA200001096A1 (sk)
EE (1) EE200000605A (sk)
HU (1) HUP0102209A2 (sk)
IL (1) IL139040A0 (sk)
IS (1) IS5673A (sk)
MX (1) MXPA00010338A (sk)
NO (1) NO20005295L (sk)
PL (1) PL343630A1 (sk)
SK (1) SK15682000A3 (sk)
WO (1) WO1999054441A1 (sk)
ZA (1) ZA200005363B (sk)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE550429T1 (de) * 1996-11-20 2012-04-15 Crucell Holland Bv Adenovirus-zusammensetzungen erhältlich durch ein verbessertes produktions- und reinigungsverfahren
US7732129B1 (en) 1998-12-01 2010-06-08 Crucell Holland B.V. Method for the production and purification of adenoviral vectors
US6689600B1 (en) 1998-11-16 2004-02-10 Introgen Therapeutics, Inc. Formulation of adenovirus for gene therapy
WO2000050573A1 (fr) 1999-02-22 2000-08-31 Transgene S.A. Procede d'obtention d'une preparation virale purifiee
GB9915413D0 (en) * 1999-07-01 1999-09-01 Glaxo Group Ltd Propagation method
US6447995B1 (en) 2000-10-04 2002-09-10 Genvec, Inc. Utilizing intrinsic fluorescence to detect adenovirus
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
JP3547715B2 (ja) * 2001-03-06 2004-07-28 榮 新垣 ベクター精製用装置及び方法
US7319002B2 (en) * 2001-08-08 2008-01-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for purification of viral vectors having proteins which bind sialic acid
EP1371723A1 (en) * 2002-06-12 2003-12-17 Procorde GmbH Process for preparing an adenovirus-containing preparation
WO2004073624A2 (en) 2003-02-14 2004-09-02 The Curators Of The University Of Missouri Contraceptive methods and compositions related to proteasomal interference
US20040166091A1 (en) 2003-02-24 2004-08-26 Genvec, Inc. Materials and methods for treating disorders of the ear
GB0304576D0 (en) * 2003-02-28 2003-04-02 Lonza Biologics Plc Protein a chromatography
EP1633321A4 (en) * 2003-06-18 2006-11-02 Onyx Pharma Inc METHOD FOR CLEANING VIRUS
WO2005012537A2 (en) * 2003-07-25 2005-02-10 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based vaccines
TWI228272B (en) * 2003-09-19 2005-02-21 Tinggi Technologies Pte Ltd Fabrication of semiconductor devices
ES2340038T3 (es) 2003-11-14 2010-05-28 Genvec, Inc. Composicion farmaceutica para tratar cancer de pancreas localmente avanzado (cpla) no extirpable.
EP1718738A2 (en) * 2004-02-23 2006-11-08 Crucell Holland B.V. Virus purification methods
JP2007532656A (ja) 2004-04-12 2007-11-15 アメリカ合衆国 アデノウイルスベクターを用いて免疫応答を誘導するための方法
GB0411081D0 (en) * 2004-05-18 2004-06-23 Glaxo Group Ltd Novel apparatus
WO2006039045A2 (en) * 2004-09-01 2006-04-13 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Adenoviral vectors able to transduce apcs, potential use in immune response generation
AU2005305347A1 (en) 2004-11-03 2006-05-18 Introgen Therapeutics Inc. Method of producing and purifying of adenoviral vectors
JP4626350B2 (ja) * 2005-03-22 2011-02-09 ソニー株式会社 ハイブリダイゼーション検出に適する反応部などを有する流路系、該流路系を用いるハイブリダイゼーション検出装置
CN107033243B (zh) 2005-03-23 2020-12-15 根马布股份公司 用于治疗多发性骨髓瘤的cd38抗体
ATE412737T1 (de) * 2005-04-11 2008-11-15 Crucell Holland Bv Virusreinigung mit ultrafiltration
SI1912675T1 (sl) 2005-07-25 2014-07-31 Emergent Product Development Seattle, Llc zmanjšanje števila celic B z uporabo molekul, ki se specifično vežejo na CD37 in CD20
CA2629163C (en) 2005-11-10 2017-03-21 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based foot-and-mouth disease vaccine
EP1808697A1 (en) * 2006-01-13 2007-07-18 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Use of an ion exchange matrix for determining the concentration of virus particles and/or virus antigens
CA2654317A1 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Single-chain multivalent binding proteins with effector function
AU2008287195A1 (en) * 2007-07-06 2009-02-19 Emergent Product Development Seattle, Llc Binding peptides having a C-terminally disposed specific binding domain
KR101383476B1 (ko) 2007-11-01 2014-04-11 아스테라스 세이야쿠 가부시키가이샤 면역억제 폴리펩티드 및 핵산
PT2132228E (pt) * 2008-04-11 2011-10-11 Emergent Product Dev Seattle Imunoterapia de cd37 e sua combinação com um quimioterápico bifuncional
CA2742474C (en) * 2008-11-03 2016-05-31 Crucell Holland B.V. Method for the production of adenoviral vectors
US9605844B2 (en) * 2009-09-01 2017-03-28 Cree, Inc. Lighting device with heat dissipation elements
AU2011214262B2 (en) 2010-02-15 2015-05-21 Crucell Holland B.V. Method for the production of Ad26 adenoviral vectors
WO2011119773A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Roeth Jeremiah F Vectors conditionally expressing therapeutic proteins, host cells comprising the vectors, and uses thereof
CN103534355A (zh) 2011-03-04 2014-01-22 英特瑞克斯顿股份有限公司 条件性表达蛋白质的载体
CN102590431B (zh) * 2012-02-10 2014-04-02 济南康众医药科技开发有限公司 一种治疗咳嗽的中药药物组合物检测方法
MX2017002931A (es) 2014-09-07 2017-05-30 Selecta Biosciences Inc Metodos y composiciones para atenuar respuestas inmunes anti-vector de transferencia viral.
TWI710635B (zh) 2014-10-09 2020-11-21 美商珍維克公司 編碼人類無調同源物-1(hath1)之腺病毒載體
EP3352760A4 (en) 2015-09-21 2019-03-06 Aptevo Research and Development LLC CD3 BINDING POLYPEPTIDES
JP2020506890A (ja) 2017-01-07 2020-03-05 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッドＳｅｌｅｃｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ． 合成ナノキャリアにカップリングした免疫抑制剤のパターン化された投与
WO2019075360A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Selecta Biosciences, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MITIGATING ANTI-VECTOR VIRAL TRANSFER IGM RESPONSES
GB201806736D0 (en) * 2018-04-25 2018-06-06 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Method for virus purification
JP2022521268A (ja) 2019-02-21 2022-04-06 アンリーシュ イミュノ オンカリティクス，インコーポレイテッド 腫瘍溶解性アデノウイルスベクター及び使用法
BR112021021566A2 (pt) 2019-04-28 2022-04-19 Selecta Biosciences Inc Métodos para tratamento de indivíduos com imunidade preexistente a vetores de transferência viral
CA3141863A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuated anti-viral transfer vector immune response
US11725192B2 (en) * 2019-07-12 2023-08-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Separation and quantification of empty and full viral capsid particles
EP4073102A4 (en) 2019-12-12 2024-05-08 Ting Therapeutics LLC COMPOSITIONS AND METHODS FOR PREVENTION AND TREATMENT OF HEARING LOSS
US20230141563A1 (en) 2021-10-12 2023-05-11 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses
US20230357437A1 (en) 2022-03-09 2023-11-09 Selecta Biosciences, Inc. Immunosuppressants in combination with anti-igm agents and related dosing

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4788223A (en) * 1985-07-26 1988-11-29 Rohm And Haas Company Low-rinse, high-capacity, weakly basic acrylic ion exchange resin
US5225989A (en) * 1988-05-19 1993-07-06 Fanuc Ltd. Apparatus and method for performing simultaneous control of control axes of a machine tool
US5019270A (en) 1989-07-06 1991-05-28 Perseptive Biosystems, Inc. Perfusive chromatography
US5228989A (en) 1989-07-06 1993-07-20 Perseptive Biosystems, Inc. Perfusive chromatography
WO1992011933A1 (en) * 1991-01-04 1992-07-23 Perseptive Biosystems, Inc. Sulfonamide bonded hydrophilic coatings
US5268097A (en) 1992-06-19 1993-12-07 Sepracor Inc. Passivated and stabilized porous mineral oxide supports and method for the preparation and use of same
US5445732A (en) 1992-06-19 1995-08-29 Sepracor Inc. Passivated porous polymer supports and methods for the preparation and use of same
US5837520A (en) 1995-03-07 1998-11-17 Canji, Inc. Method of purification of viral vectors
WO1997008298A1 (en) * 1995-08-30 1997-03-06 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adenovirus and aav
CA2184132C (en) * 1995-09-21 2011-03-15 Kristina J. Hennessy An adjuvanted vaccine which is substantially free of non-host albumin
AU3447097A (en) * 1996-07-01 1998-01-21 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Method for producing recombinant adenovirus
ATE550429T1 (de) * 1996-11-20 2012-04-15 Crucell Holland Bv Adenovirus-zusammensetzungen erhältlich durch ein verbessertes produktions- und reinigungsverfahren
CA2356373A1 (fr) 1998-12-31 2000-07-13 Aventis Pharma S.A. Methode de separation de particules virales
WO2000050573A1 (fr) 1999-02-22 2000-08-31 Transgene S.A. Procede d'obtention d'une preparation virale purifiee

Also Published As

Publication number Publication date
US6586226B2 (en) 2003-07-01
HUP0102209A2 (hu) 2001-09-28
BG104928A (en) 2001-09-28
EP1073721A1 (en) 2001-02-07
ZA200005363B (en) 2001-09-25
US7141406B2 (en) 2006-11-28
MXPA00010338A (es) 2005-06-17
US6383795B1 (en) 2002-05-07
WO1999054441A8 (en) 2000-02-24
NO20005295L (no) 2000-11-30
BR9909789A (pt) 2000-12-26
JP2002512361A (ja) 2002-04-23
PL343630A1 (en) 2001-08-27
EA200001096A1 (ru) 2001-04-23
EE200000605A (et) 2002-04-15
CA2328462C (en) 2010-11-09
US20020034735A1 (en) 2002-03-21
ATE303434T1 (de) 2005-09-15
IS5673A (is) 2000-10-20
WO1999054441A1 (en) 1999-10-28
US20030203469A1 (en) 2003-10-30
CA2328462A1 (en) 1999-10-28
EP1073721B1 (en) 2005-08-31
AU3662099A (en) 1999-11-08
DE69927013T2 (de) 2006-06-29
DE69927013D1 (de) 2005-10-06
AU756889B2 (en) 2003-01-23
IL139040A0 (en) 2001-11-25
NO20005295D0 (no) 2000-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK15682000A3 (sk) Účinné čistenie adenovírusu
AU779267B2 (en) Method for separating viral particles
US20220267796A1 (en) Adeno-associated virus purification methods
JP2021508484A (ja) アデノ随伴ウイルス精製方法
Strauss et al. Understanding the mechanism of virus removal by Q sepharose fast flow chromatography during the purification of CHO‐cell derived biotherapeutics
JP7540667B2 (ja) アデノウイルス精製の方法
EP4387750A1 (en) Anion-exchange chromatography methods for purification of recombinant adeno-associated viruses
TWI803725B (zh) 使用親和層析法之用於疫苗病毒的純化方法
CZ20003829A3 (cs) Účinné čištění adenoviru
Forcic et al. Chromatographic detection of residual cellular DNA on short monolithic columns
AU2023262534A1 (en) A pre-screening method and a method for separating adeno-associated virus capsids
AU778287B2 (en) Method for producing recombinant adenovirus
MXPA01006607A (es) Método de separacion de particulas virales
FR2788064A1 (fr) Methode de separation de particules virales