MXPA01006607A - Método de separacion de particulas virales - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un nuevo método para la purificación de partículas virales. Más particularmente, la invención concierne a un método de purificación y de cuantificación de adenovirus por cromatografía de intercambio de iones. La invención concierne igualmente a un método de identificación de los diferentes serotipos de adenovirus.

Description

MÉTODO DE SEPARACIÓN DE PARTÍCULAS VIRALES DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención concierne a un nuevo método para la purificación y la cuantificación de partículas virales. Más particularmente, la invención concierne a un método de purificación y de cuantificación de adenovirus por cromatografía de intercambio iónico. La invención concierne igualmente, a un método de identificación de los diferentes serotipos de adenovirus. Se tiene actualmente un desarrollo notable, en la terapia genética y están en curso diversos estudios clínicos en el hombre, desde los primeros ensayos realizados en 1990. Entre los métodos empleados comúnmente para la transferencia de genes, los vectores virales, se manifiestan particularmente prometedores, y entre éstos los adenovirus ocupan un lugar de primer plano. El desarrollo de los vectores adenovirus en terapia genética, necesita tener acceso a dos tipos de tecnologías que son actualmente limitantes para la producción de existencias o inventarios virales: la primera es disponer de un método rápido, de una gran sensibilidad y muy selectivo para la cuantificación de las partículas virales en las muestras que provengan de las etapas de construcción y de amplificación del virus considerado, este punto es particularmente importante para la optimización del Ref: 129360 procedimiento de producción de las existencias vírales; la segunda es disponer de un procedimiento de purificación confiable, reproducible, simple y fácilmente extrapolable a escala industrial, para la purificación de las partículas virales. La producción de lotes clínicos de adenovirus es aún un proceso largo a causa del número de etapas de transfección y de amplificación, cuya productividad no está optimizada. Los adenovirus recombinantes son producidos habitualmente por introducción del ADN viral en una linea de encapsulación o de empacamiento, seguida de una lisis mecánica o química de las células después de aproximadamente dos o tres dias de cultivo (siendo la cinética del ciclo adenoviral de 24 a 36 horas) . Según otra variante, el cultivo se prosigue durante un período más largo (8 a 12 días), y se recolectan los virus directamente en el sobrenadante, después de liberación espontánea, por un fenómeno de autólisis de las células de encapsulación ( O98/00524) . Generalmente, son necesarios entre 2 y 7 ciclos de amplificación para constituir las existencias virales. Una limitación importante para la optimización del procedimiento de producción de las existencias virales reside en los métodos de titulación de las partículas virales. En efecto, los métodos biológicos son métodos relativamente sensibles y precisos pero particularmente largos de aplicar (aproximadamente 4 a 15 dias según las dosis utilizadas, es decir, 'actividad del transgen (tdu) u obtención de fago (pfu) ) . Se han desarrollado métodos analíticos más rápidos, pero éstos no presentan un grado de precisión y de sensibilidad suficiente cuando las titulaciones de las partículas virales deben ser efectuadas, sin purificación previa, en Usados, extractos celulares brutos o sobrenadantes de cultivo. Es la razón por la cual los ciclos de amplificación sucesivos se realizan con multiplicidades de infección (MOI), estimadas de manera aproximada. De lo que resulta que las etapas de amplificación son poco reproducibles, hasta a veces más largas y/o más numerosas de lo que seria necesario con un procedimiento optimizado. La determinación rápida y precisa de los títulos de soluciones de adenovirus, permitiría ajustar la multiplicidad de infección de cada etapa a manera de optimizar el conjunto del procedimiento de producción de las existencias o inventarios de adenovirus. El método de cuantificación de las partículas virales debe satisfacer varias condiciones. En primer lugar, debe ser suficientemente sensible para asegurar la dosificación de las partículas virales en preparaciones diluidas o que presentan un leve título (típicamente < 1 X 109 partículas virales por ml (pv/ml)) sin recurrir a una etapa de enriquecimiento previo. La dosificación de las partículas virales debe poder efectuarse directamente en Usados o preparaciones brutas, sin que sea necesario efectuar una etapa de purificación o un tratamiento previo. Además. Este método debe asegurar una selectividad elevada para librarse de las interferencias posibles con los numerosos compuestos presentes en los Usados o extractos celulares brutos y cuyas proporciones pueden variar en función de las condiciones de cultivo. Un método analítico cuantitativo basado en la cromatografía de intercambio anionico se ha descrito en la literatura (Huygue y colaboradores, Human Gene Ther. 6:1403-1416, 1995; P. W. Shabran y colaboradores, Human Gene Ther. 8:453-465, 1997) . Este método, que presenta un limite de detección del orden de 1 X 108 pv/ml, es aplicable a la titulación de preparaciones virales purificadas. No obstante, la sensibilidad de este método decrece desde que el análisis es realizado sobre usados o extractos celulares brutos. El limite de detección se estima que es de 2 a 5 X 109 pv/ml en tales muestras y este método no permite cuantificar las partículas adenovirales en las preparaciones muy diluidas y no purificadas tales como los usados de células infectadas en etapas de transfección y de amplificación del virus para las cuales el titulo adenoviral es típicamente del orden de 1 X 108 pv/ml a 1 X 109 pv/ml. Además, este método no permite tampoco cuantificar las partículas adenovirales a partir de preparaciones obtenidas en ciertos medios de producción desprovistos de proteínas animales. En efecto, tales medios contienen al final del cultivo, compuestos de tipo, azúcares, aminoácidos, vitaminas, o rojo de fenol, etc. Entre los cuales algunos de ellos pueden interferir con las partículas adenovirales en la cuantificación de los virus y que conducen a sobreestimar muy ampliamente el titulo de la preparación. Finalmente, el método cromatográfico reportado por Shabram y colaboradores necesita un pre-tratamiento de la muestra con una nucleasa de amplio espectro de actividad (Benzonase®) para eliminar los ácidos nucleicos que interfieren con la detección y la medida de las partículas. En lo que concierne a los métodos de separación preparativos de los adenovirus, la cromatografía se ha utilizado desde hace años para la purificación de las partículas adenovirales [Haruna, I., Yaosi, H., Kono, R. Y Watanabe, I. Virology (1961) 13, 264-267; Klemperer, H. G. y Pereira H. G. Virology (1959) 9, 536-545; Philipson, L., Virology (1960) 10, 459-465]. Más recientemente se han descrito métodos que describen la purificación en gran escala de adenovirus recombinantes ( solicitudes de patentes internacionales W096/27677, WO97/08298, WO98/00524, W098/22588) .

La solicitud WO98/00524, describe particularmente un método de purificación que aplica la resina intercambiadora de aniones fuerte Source 15Q y que permite obtener en una sola etapa cromatográfica, preparaciones de adenovirus cuya pureza es al menos equivalente a la obtenida a partir de preparaciones purificadas por ultracentrigufación en gradiente de cloruro de cesio. Este grado de pureza es muy elevado y alcanza los estándares requeridos para estudios clínicos en el hombre (WHO Expert Committee on Biological Standardization, Forty-ninth Report. WHO Technical Report Series, WHO Geneva, in press) . No obstante, cuando el titulo viral de las preparaciones a purificar es leve (por ejemplo en el caso de un adenovirus que presenta una productividad leve, o cuando la purificación debe efectuarse a partir de una existencia obtenida en una etapa de amplificación precoz), o aún cuando el medio de producción del virus conduce a la presencia de compuestos co-eluídos con el adenovirus (como por ejemplo en el caso de medios desprovistos de suero de ternera), los resultados limitados de las técnicas cromatográficas descritas precedentemente no permiten ni cuantificar, ni purificar las partículas adenovirales en una sola etapa, a partir de dicho material inicial. En consecuencia, se plantea el problema de poder disponer de un método de titulación de partículas virales a partir de preparaciones brutas, que sea a la vez rápido, sensible y altamente selectivo. Igualmente se plantea el problema de disponer de un método de purificación confiable, reproducible que permita obtener, a partir de estas mismas preparaciones brutas, y de preferencia en una sola etapa, preparaciones virales de calidad farmacéutica. Actualmente se ha encontrado, y es el objeto de la presente invención, que ciertos soportes de cromatografía presentan de manera sorprendente, propiedades totalmente excepcionales para la separación de las partículas virales y en particular de los adenovirus. Estas propiedades permiten la titulación y/o la purificación de partículas virales a partir de preparaciones brutas, sin tratamiento previo, con una sensibilidad y una selectividad muy elevada. La utilización de estos soportes proporciona además y de manera inesperada un método de análisis simple y rápido para separar e identificar por cromatografía, adenovirus de diferentes serotipos o de los adenovirus modificados al nivel de la fibra o del hexon. La presente invención tiene por objeto un procedimiento de separación de partículas virales a partir de un medio biológico caracterizado, porque contiene al menos una etapa de cromatografía realizada sobre un soporte que contiene una matriz, grupos intercambiadores de iones, dichos grupos que están injertados o fijados sobre la mencionada matriz por medio de un brazo flexible. La matriz puede ser seleccionada entre la agarosa, el dextrano, la acrilamida, el silicio, el poli (estiren-divinilbenceno), solos o en mezcla. De preferencia la matriz está constituida por agarosa, de preferencia aún, de agarosa reticulada al 6 % aproximadamente. Se han desarrollado los soportes constituidos por perlas de agarosa reticulada sobre las cuales están injertados brazos flexibles intercambiadores de iones activados o funcionalizados, para la cromatografía preparativa e industrial de biomoléculas. Estos soportes han sido, más particularmente concebidos para la etapa de captura (es decir, la etapa inicial del procedimiento de purificación) de las biomoléculas a partir de mezclas brutas simplemente clarificadas, es decir sin sus constituyentes sólidos en suspensión. Sus resultados han sido optimizados en el sentido de una muy grande capacidad de fijación de los solutos sobre el soporte, de una muy leve contra-presión de fuerte gasto lineal de líquido, de un leve costo así como una muy grande resistencia química a los agentes de limpieza utilizados para la regeneración. De manera ventajosa, el brazo flexible es de naturaleza hidrófila y está constituido por un polímero de origen sintético o natural. Entre los polímeros de origen sintético, se puede citar ios polímeros constituidos por monomeros de alcoholes polivinílicos, de poliacrilamidas, de polimetacrilamidas o de polivinil éteres. Como ejemplo de polímero de origen natural, se puede citar particularmente polímeros de naturaleza polisacarídica seleccionados entre el almidón, la celulosa, el dextrano y la agarosa. De preferencia el grado de polimerización del brazo flexible es de aproximadamente 30 unidades monoméricas, de preferencia aún, el brazo flexible es un dextrano de peso molecular medio de 5000 Da aproximadamente. De preferencia, el brazo flexible está activado o funcionalizado por injerto de un grupo susceptible de interactuar con una molécula anionica. Más generalmente, el grupo está constituido por una amina que puede ser ternaria o cuaternaria. En el marco de la presente invención, es particularmente ventajoso utilizar un intercambiador de iones fuerte. Asi, se utiliza preferentemente, según la invención un soporte de cromatografía tal como el indicado anteriormente, activado por aminas cuaternarias. Como ejemplo de soporte particularmente preferido para la aplicación de la invención, se puede citar el Q Sepharose® XL (Amersham Pharmacia Biotech) . La utilización de este soporte es mencionado en uno de los ejemplos de la solicitud W098/39467. Adenovirus purificados son modificados por tratamiento por medio del polietilenglicol (PEG) .

Después de la reacción, los adenovirus modificados, los adenovirus no modificados y el PEG se separan por paso sobre una columna de Q Sepharose® XL. Se trata pues de una simple separación entre productos iniciales y los productos finales de una reacción química. El experto en la materia no podía suponer que esta columna pudiera ser utilizada con éxito para la separación de adenovirus a partir de un medio biológico complejo, que contenga diversas especies contaminantes (ADN del huésped, ARNs, proteínas, lípidos, lipoproteinas, endotoxinas ... ) , tal como un lisado de células de encapsulación. No parece tampoco con la lectura de este documento que el Q Sepharose® XL, pueda ser utilizado para fines preparativos ya que es sabido que la mayoría de los soportes pierden su eficacia desde que se les inyecta cantidades importantes de productos. Otros soportes intercambiadores de aniones fuertes que presentan características similares de composición de matriz, de distribución de tamaño de partículas, de porosidad, de naturaleza química del brazo flexible, de densidad de injerto pueden ser utilizados para la separación preparativa o analítica de las partículas adenovirales. De manera ventajosa, la matriz está constituida por agarosa reticulada al 6 %,es injertada con brazos flexibles constituidos por dextrano y activados o funcionalizados con grupos intercambiadores de aniones fuertes . El soporte presenta una granulometría comprendida, de preferencia entre 40 y 200 µm aproximadamente; El término "aproximadamente" que se refiere a la granulometría, significa que el valor a tomar en consideración se sitúa en una desviación comprendida entre +/- 20 % en relación al valor expresado. De preferencia, esta desviación está comprendida entre +/-10 % y de preferencia aún, está comprendida entre +/- 5 % en relación al valor expresado. De manera más particularmente preferida, la granulometria está comprendida entre 45 y 165 µm y centrada sobre 90 µm. Igualmente, de manera ventajosa la matriz presenta una dispersión tal, que 95 % de las partículas tienen un diámetro comprendido entre 0.1 y 10 veces el diámetro medio de las partículas, y de preferencia entre 0.3 y 3 veces el diámetro medio de las partículas. El Q Sepharose® XL, utilizado en los ejemplos que siguen, ilustra de forma no exhaustiva los resultados de los soportes utilizables en el marco de la invención. El Q Sepharose® XL presenta una distribución de tamaño de perlas o bolas que va de 45 a 165 µm, centrado sobre 90 µm. Estas características de tamaño y de distribución de las perlas hacen de este soporte un intercambiador cromatográfico de tipo preparativo. La teoría, asi como la práctica cromatográfica indican que un soporte tal tiene resultados muy modestos para la separación de compuestos que presentan comportamientos cromatográficos similares, en cuanto a la interacción de intercambio de iones. Asimismo, un soporte tal genera amplios picos cromatográficos mal resueltos, en particular debido al gran tamaño y de la distribución muy amplia de las perlas o bolas que lo constituyen. Estas características cromatográficas esperadas son verificadas para las biomoléculas en general como las proteinas, que son eluídas bajo la forma de grandes picos mal separados (ver Data File Pharmacia Biotech No. 18-1123-82) . Por el contrario, y de forma totalmente inesperada, las partículas de adenovirus son eluidas de este tipo de soporte bajo la forma de un pico extremadamente fino, y muy simétrico. En comparación con las proteinas, como por ejemplo la albúmina, la eficacia de una columna llena de Q Sepharose® XL, medida por la Altura Equivalente de un Plato Teórico (HEPT por sus siglas en francés) o el número de platos teóricos equivalentes por unidad de longitud de columna (N/m) , es 50 a 100 veces más elevado para el adenovirus (N/m: 35,000), que para las proteinas como la albúmina sérica bovina (N/m: 600). Ver por ejemplo la figura 1. Así, cuando se aplica en condiciones cromatográficas optimizadas, el tipo de gel y particularmente el gel Q Sepharose® XL, dá un pico cromatográfico para el adenovirus de una fineza inigualable por los soportes generalmente previstos para la separación de las biomoléculas. Entre los soportes previstos para la separación de las biomoléculas se pueden citar los soportes cuya matriz de base es de tipo poliestireno divinilbenceno (como por ejemplo las resinas Source 15Q y Source 30Q, o las resinas de tipo Poros HQ, Poros DE2, o Poros D) . Se puede igualmente citar soportes cuya matriz de base es del tipo copolímero de metacrilato de etilen glicol como por ejemplo, las resinas Toyopearl DEAE, QAE, y Super Q, o las resinas de tipo Fractogel TMAE, TMAE HiCap, DMAE, o DEAE cuyos grupos funcionales intercambiadores de iones están situados sobre cadenas poliméricas lineales de tipo poliacrilamida injertadas sobre la matriz. La eficacia de los soportes utilizados en el marco de la presente invención para la separación de partículas de adenovirus, conduce a una gran sensibilidad de detección de partículas. Así, cuando estos soportes son aplicados en columnas cromatográficas analíticas, el comportamiento cromatográfico inesperado de las partículas virales, permite cuantificar el adenovirus con un limite de detección muy inferior al límite de detección de los métodos descritos anteriormente. Este límite de detección es al menos diez veces inferior, lo que permite alcanzar un limite de detección del orden de 1 x 108 pv/ml en preparaciones de tipo lisado celular bruto y un límite de detección del orden de 1 x 107 pv/ml para preparaciones virales purificadas. Este tipo de soporte permite igualmente asegurar una selectividad muy elevada frente a contaminantes presentes en las muestras a analizar como por ejemplo las proteínas y los ácidos nucleicos. Las proteinas se presentan bajo la forma de picos muy amplios y eluídos mucho antes del pico viral. Los ácidos nucleicos son eluidos de la columna con una concentración salina muy superior a la concentración necesaria para la elución del virus. Esta característica, muy diferente de la obtenida con el método cromatográfico descrito precedentemente (Huygue y colaboradores, Human Gene Ther. 6:1403-1416, 1995), permite liberarse de las interferencias de este tipo de compuestos con el pico viral. Finalmente, también cuando las preparaciones a analizar contienen especies co-eluidas con las partículas virales, la forma muy específica del pico viral, permite fácilmente identificarlas y proceder a su cuantificación. Así, los soportes utilizados en el marco de la invención permiten identificar y cuantificar muy fácilmente y con una gran precisión el pico del adenovirus cuando éste es analizado a partir de preparaciones que contienen una gran cantidad de proteínas y de ácidos nucleicos. El análisis cuantitativo de las partículas así como la purificación son particularmente realizables a partir de preparaciones obtenidas con medios de producción viral muy variados, o medios desprovistos de constituyentes de origen animal, como por ejemplo la albúmina, que sea de origen bovino, humano o aún de otro origen (figura 2) . Es igualmente importante constatar que el método descrito en la presente invención es aplicable al análisis de las muestras que contienen ácidos nucleicos sin tratamiento previo con una nucleasa, sin afectar ni la sensibilidad ni la selectividad del método. Con respecto a esto, otro objeto de la invención concierne a la utilización de este tipo de soporte y del Q Sepharose® XL en particular, para la separación preparativa o la purificación de partículas virales, en particular de adenovirus, a partir de medios biológicos. Dicho procedimiento de separación puede comprender finalmente una etapa previa de cromatografía sobre otro soporte tal como los utilizados en el procedimiento objeto de la solicitud WO98/00524, y en particular la resina Source 15Q. Dicha etapa previa puede revelarse ventajosa en casos particulares, por ejemplo si una cantidad de contaminante demasiado importante está presente en el medio biológico. Otro objeto de la invención concierne a la utilización de este tipo de soporte y del Q Sepharose® XL en particular, para el análisis cuantitativo o para la titulación de partículas virales, en particular de adenovirus, a partir de medios biológicos. El medio biológico, a partir del cual se efectúa la purificación o la titulación del virus puede ser un sobrenadante de células de encapsulación productoras del virus o un lisado de células de encapsulación, o una solución purificada de dicho virus. Cuando la separación preparativa o la purificación de las partículas virales se efectúa a partir de un sobrenadante de células de encapsulación productoras o de un lisado, puede ser conveniente realizar una etapa previa de ultrafiltración, de preferencia esta etapa se realiza por ultrafiltración tangencial sobre la membrana que tenga un umbral de corte comprendido entre 300 y 500 kDa. El procedimiento de purificación según la invención permite obtener preparaciones virales de calidad elevada en términos de pureza, con rendimientos de partículas elevados (del orden de 75 a 80 %) en una etapa, a partir de una existencia diluida o/y muy rica en contaminantes y esto, en condiciones de producción enteramente compatibles con las exigencias industriales y con la reglamentación concerniente a la producción de moléculas terapéuticas. Otro objeto de la invención concierne a un procedimiento de cuantificación de adenovirus caracterizado, porque las partículas virales son separadas por cromatografía sobre un soporte de tipo Q Sepharose® XL y la cantidad de adenovirus, es determinada por medida de la absorbancia de las fracciones de cromatografía. El procedimiento de la invención permite un seguimiento más fácil y más preciso de la cinética de producción, directamente sobre muestras homogéneas de sobrenadante, sin pretratamiento, lo que permite una mejor reproducibilidad y un mejor control de los procedimientos de producción de las existencias de partículas virales. La invención tiene igualmente por objeto la utilización de soporte de cromatografía de tipo Q Sepharose® XL para la identificación de diferentes serotipos de adenovirus. En efecto, y de forma sorprendente, se ha observado que este tipo de soporte permite separar e identificar de manera simple y rápida una gran variedad de adenovirus de diferentes serotipos directamente a partir de una muestra de medio de producción viral por la determinación del tiempo de retención y de la proporción entre las absorbancias a 260 nm y a 280 nm del pico cromatográfico. En lo que concierne a la aplicación de los soportes de cromatografía en el marco de la presente invención, la separación de las partículas virales para fines analíticos o preparativos, puede efectuarse aplicando sobre la columna de cromatografía un gradiente de elución de sal o aún según una modalidad isocrática, es decir, a concentración salina constante. Para los métodos preparativos, el soporte cromatográfico puede utilizarse en una columna de cromatografía de tipo clásico o en una columna adaptada a los sistemas de cromatografía de alta resolución, aplicando por ejemplo el soporte Q Sepharose® XL, o aún en un sistema llamado en "lecho fluidizado" o expandido, aplicando por ejemplo el soporte Streamline® Q XL. El tamaño de la columna cromatográfica es determinado en función de la cantidad de virus presente en el material inicial. La preparación viral a purificar puede aplicarse sobre el soporte en un tampón cuya conductividad sea tal, que el virus no sea retenido sobre el soporte cuando sean fijados los ácidos nucleicos. De manera conveniente, la conductividad se ajusta a 45 MS/cm. Esta modalidad particular de aplicación permite entonces separar por una simple fltración a través del soporte Q Sepharose® XL el virus de los ácidos nucleicos que provienen de la célula huésped que contamina la preparación viral. Los métodos de dosificación y de purificación y de caracterización de los diferentes serotipos descritos en la presente invención, pueden aplicarse a diferentes tipos de virus, y de adenovirus en particular, ya sea que se trate de virus salvajes o de virus recombinantes que contengan un transgen de interés. Además de las disposiciones precedentes, la presente invención comprende igualmente otras características y ventajas que resaltarán, de los ejemplos siguientes, dados de modo ilustrativo y no limitativo. SUBTÍTULOS Y FIGURAS Figura 1: perfil de elución de adenovirus purificado y de albúmina bovina sobre Q Sepharose® XL . Figura 2: perfil de elución sobre Q Sepharose® XL de un sobrenadante de cultivo viral obtenido sobre un medio desprovisto de suero. Figura 3 : perfil de elución sobre Q Sepharose® XL de una preparación de adenovirus purificado (2 X 1010 pv inyectados ) . Figura 4 : perfil de elución sobre Q Sepharose® Fast Flow de una preparación de adenovirus purificado (2 X 1010 pv inyectadas) . Figura 5: Comparación de los perfiles de elución de una preparación de adenovirus, sobre Q Sepharose XL y Q Sepharose® Fast Flow. Figura 6: perfil de elución sobre Q Sepharose® HP de una preparación de adenovirus purificada (2 X 1010 pv inyectados) .

MATERIALES Y MÉTODOS 1. Adenovirus y producción de los adenovirus recombinantes defectuosos para la replicación. Los adenovirus son virus de ADN de doble filamento lineal de un tamaño de 36 kilobases aproximadamente. Su genoma comprende particularmente una secuencia invertida repetida (ITR) en cada extremo, una secuencia de encapsulación (Psi), genes precoces y de los genes tardíos. Los principales genes precoces están contenidos en las regiones El, E2, E3 y E4. entre éstos, los genes contenidos en la región El son particularmente necesarios para la propagación viral. Los principales genes tardíos están contenidos en las regiones Ll a L5. El genoma del adenovirus Ad5 ha sido totalmente ordenado en secuencia y está accesible en la base de datos (ver particularmente Genebank M73260) . Asimismo, desde las partes, hasta la totalidad de otros genomas adenovirales (Ad2, Ad7 , Adl2, etc) han sido igualmente ordenados en secuencia. Para su utilización en terapia genética, se ha preparado diferentes vectores derivados de los adenovirus , incorporando diferentes genes terapéuticos. En cada una de estas construcciones, el adenovirus ha sido modificado de manera que se vuelva incapaz de replicacion en la célula infectada. Asi, las construcciones descritas en el arte anterior son adenovirus eliminados de la región El, esencial para la replicacion viral, al nivel de la cual son insertadas las secuencias de ADN heterólogas (Levrero y colaboradores, Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury y colaboradores, Gene 50 (1986) 161). Por otra parte, para mejorar las propiedades del vector, se ha propuesto crear otras eliminaciones o modificaciones en el genoma del adenovirus. Así, se ha introducido una mutación puntual termosensible en el mutante tsl25, lo que permite inactivar la proteína de 72 kDa de unión con el ADN (DBP) (Van der Vliet y colaboradores, 1975). Otros vectores comprenden una eliminación de otra región esencial para la replicacion y/o para la propagación viral, la región E4. La región E4 está en efecto, implicada en la regulación de la expresión de los genes tardíos, en la estabilidad de los ARN nucleares tardíos, en la extinción de la expresión de las proteinas de la célula huésped y en la eficacia de la replicacion del ADN viral. Vectores adenovirales en los cuales las regiones El y E4 son eliminadas poseen pues una interferencia de transcripción y una expresión de genes virales muy reducida. Dichos vectores han sido descritos por ejemplo en las solicitudes W094/28152, WO95/02697, W096/22378) . Además, han sido descritos igualmente, vectores que contienen una modificación al nivel del gen IVa2 (WO 96/10088) . Los adenovirus recombinantes descritos en la literatura son producidos a partir de diferentes serotipos de adenovirus. Existe, en efecto diferentes serotipos de adenovirus, cuya estructura y las propiedades varian un poco, pero que presentan una organización genética comparable. Más particularmente, los adenovirus recombinantes pueden ser de origen humano o animal . En lo que concierne a los virus de origen humano, se puede citar preferentemente aquellas clases en el grupo C, en particular los adenovirus de tipo 2 (Ad2), 5 (Ad5); en el grupo B, los adenovirus de tipo 7 (Ad7); o en el grupo A, los adenovirus de tipo 12 (Adl2) . Entre los diferentes adenovirus de origen animal, se puede citar preferentemente a los adenovirus de origen canino, y particularmente todas las cepas de los adenovirus CAV2 [cepa manhattan o A26/61 (ATCC VR-800) por ejemplo]. Otros adenovirus de origen animal son citados particularmente en la solicitud W094/26914 incorporada a la presente como referencia. En una modalidad preferida de aplicación de la invención, el adenovirus recombinante es un adenovirus humano del grupo C. de manera más preferencial, se trata de un adenovirus Ad2 o Ad5. Se han descrito varios métodos para la generación de adenovirus recombinantes (C. Chartier y colaboradores, J. Virol. 70:4805-4810, 1996; WO96/25506; J. Crouzet y colaboradores, Procc . Nati. Acad. Sci USA 94: 1414-1419, 1997; T-C. He y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:2509-2514, 1998). Estos métodos permiten construir en E. coli plásmidos que contengan el genoma adenoviral de interés, estos plásmidos son a continuación digeridos por una enzima de restricción para excisar el genoma adenoviral del plásmido. El genoma adenoviral es entonces transfectado en una línea de encapsulación, luego amplificado. Los adenovirus recombinantes son habitualmente producidos por introducción del ADN viral en la línea de encapsulación, seguido de una lisis de las células después de aproximadamente 2 o 3 días (siendo la cinética del ciclo adenoviral de 24 a 36 horas), según otra variante, se continúa con el cultivo desde 8 hasta 12 dias y las partículas virales son liberadas espontáneamente en el medio de cultivo por autólisis de las células de encapsulación. Los virus utilizados en el marco de los ejemplos que siguen son adenovirus que contienen el gen marcador lacZ de E. coli (AVi.oCMV. lacZ) Estos virus se derivan del serotipo Ad5 y poseen la estructura siguiente: -Una eliminación en la región El que recubre por ejemplo, los nucleótidos 386 (sitio Hinfl) a 3446 (sitio Sau3a) . -Un cartucho de expresión del gen lacZ, bajo el control del promotor CMV insertado al nivel de la eliminación mencionada . -Una eliminación de la región E3.

La construcción de estos virus se ha descrito en la literatura (WO94/2507-3, WO95/14102, WO96/25506, J. Crouzet y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94: 1414-1419, 1997). Se comprende que cualquier otra construcción, puede utilizarse en el procedimiento según la invención, y particularmente virus que contienen otros genes heterólogos y/u otras eliminaciones (E1/E4 o E1/E2 por ejemplo) . Las técnicas de transfección de las células, de amplificación y de titulación de los adenovirus se han descrito precedentemente (F. L. Graham y colaboradores, Molecular Biotechnology 3: 207-220, 1995; Crouzet y colaboradores, Procc . Nati. Acad. Sci. USA 94: 1414-1419, 1997; WO96/25506) . La técnica de dosificación en tdu de la actividad ß-galactosidasa codificada por el gen lacZ contenido en el virus AVOi.oCMV. lacZ se realiza como describió P. Eh y colaboradores (J. Virol. 70:559-565, 1996). -Producción de los adenovirus AVi.pCMV. lacZ La recolección del virus a partir de los cultivos de líneas productoras se ha hecho ya sea por el procedimiento clásico, recurriendo a una serie de ciclos de congelación-descongelación, ya sea por lisis química en presencia de 1 % de Tween-20, ya sea prosiguiendo el cultivo hasta la autólisis según el procedimiento descrito en WO98/00524.

Los medios de cultivo pueden variar según las líneas transcomplementantes utilizadas o según las cantidades aplicadas. Estos medios pueden ser el MEM, DMEN ... complementado o no de suero de ternera y contienen diferentes concentraciones de sales inorgánicas, azúcar, aminoácidos, vitaminas, hepes o rojo de fenol. Las células transcomplementantes de la región El tales como las células 293 o PER.C6 son transfectadas al 60-80 % de confluencia en caja de cultivo con un ADN viral obtenido por digestión de un plásmido que contiene el genoma adenoviral de interés. La incubación dura de 8 a 15 días, el momento de la recolección es juzgado por la observación al microscopio de las células que se redondean, se vuelven más refringentes y se adhieren cada vez más débilmente al soporte de cultivo. A continuación se libera el virus del núcleo por 3 a 4 ciclos de descongelación sucesivos (etanol, anhídrido carbónico a -70 °C, baño maría a 37 °C) . el virus así obtenido se utiliza para infectar de nuevo las células transcomplementantes en una Multiplicidad de Infección (MOI) dada, pudiendo variar entre 10 y 500 partículas virales por célula, el virus amplificado es obtenido como precedentemente, prosiguiendo la incubación de 40 a 72 horas . Según otra variante descrita en la solicitud WO98/00524, las células no se recolectan 40 a 72 horas después de la infección, sino la incubación se prolonga entre 8 a 12 días a manera de obtener una lisis total de las células sin tener necesidad de proceder a los ciclos de congelación-descongelación. El virus es entonces liberado espontáneamente en el sobrenadante. El sobrenadante es a continuación clarificado por filtración sobre filtros de profundidad de porosidad decreciente (10 µm/1. Oµm/0.8-0.2µm) . El sobrenadante clarificado es concentrado a continuación por ultrafiltración tangencial sobre la membrana espiral Millipore que tenga un umbral de corte de 300 kDa. El factor de concentración es del orden de 20 a 100 veces. Según otra variante, el sobrenadante clarificado puede ser utilizado como tal para la purificación de las partículas adenovirales por cromatografía sobre una columna de Q Sepharose® XL . -Análisis de las preparaciones de adenovirus Las diferentes técnicas analíticas utilizadas para determinar la calidad de las preparaciones virales obtenidas (SDS-PAGE, análisis en manchado Western, IE-HPLC sobre columna Resource 15Q, etc) han sido descritas precedentemente (WO98/00524 ) . 2 - Métodos analíticos que aplican el soporte de cromatografía Q Sepharose® XL. Las condiciones de operación para la detección, identificación y la cuantificación de las partículas de adenovirus a partir de un cultivo de células de encapsulación infectadas son realizadas como se describe a continuación . Una columna de cromatografía llena con aproximadamente 1 ml de Q Sepharose® XL (45-165 µm; Amersham-Pharmacia Biotech) se prepara en una columna de tipo HR 5/5 (Amersham-Pharmacia Biotech) . Esta columna se monta sobre un sistema de CLHP de tipo Waters 626 equipado con un sistema de detección UV/visible de pasador de diodos 996 que opera en el intervalo de absorbancia de 200-300 nm. Esta columna de intercambio de aniones es utilizada para la separación y la cuantificacíón de las partículas virales. Antes de cada análisis, la columna se equilibra a 30 °C en un tampón de 20 mM de Tris/HCl, pH de 7.5 a un gasto de 1.5 ml/min. La muestra a analizar que contenga las partículas virales es inyectada sobre la columna. Para obtener una resolución máxima, la cantidad de partículas inyectada debe ser inferior o igual a 2 X 1012 partículas/ml de soporte. El volumen inyectado no tiene influencia significativa en la separación de las especies, al menos para un volumen inyectado inferior a 50 ml por ml de gel. Después de la inyección, la columna es enjuagada con 5 volúmenes del mismo tampón, y las especies fijadas son eluídas con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 1 M en el tampón de 20 mM de Tris/HCl, pH 7.5 sobre 30 volúmenes de columna. Al final del gradiente, la columna se lava con 2 volúmenes de columna de soda 0.5 N antes del reequilibrio previendo el análisis siguiente. Se construye una curva de calibración a 260 nm con una preparación de partículas de adenovirus purificada ya sea en gradiente de CsCl, o bien por cromatografía. Esta preparación para calibración o patrón ha sido titulada previamente en partículas por su absorbancia a 260 nm en una solución de SDS a 0.1 % utilizando el factor de conversión de 1 X 1010 partículas por unidad de absorbancia a 260 nm. En estas condiciones, el adenovirus es eluído al tiempo de retención de 18 min aproximadamente y presenta una proporción de absorbancia a 260 nm en relación a 280 nm de 1.30 ± 0.02 (ver la figura 3). El logicial " Suitability" de la estación de adquisición y de tratamiento de la señal cromatográfica Millenium Waters determina después de cada análisis de forma automática el valor N/m (calculado a altura-media) y de la asimetría (calculada a 10 % de la altura) del pico. El valor de N/m sobre el pico adenoviral es típicamente de 35,000 ± 3,000 y el factor de asimetría del pico es de 1.05 ± 0.05. 3-Método preparativo para la purificación de adenovirus por cromatografía de intercambio de aniones. El adenovirus es purificado a partir de cultivos de células de encapsulación 293 o PER.C6 (WO97/00326) . El virus es producido y recolectado en sobrenadantes después de autólisis como se describe precedentemente. Es a continuación filtrado a través de una membrana de 0.45 µm (HT Tuffryn o polisulfonas ) , justo antes de purificación. En ausencia de indicación contraria, el protocolo de purificación es idéntico al protocolo aplicado para la separación analítica de las partículas virales descrito anteriormente, pero con un gradiente de elución diferente. La elución se efectúa con un gradiente de NaCl 0.25 a ÍM sobre 30 volúmenes de columna. El volumen de la columna se adapta a las cantidades de virus a purificar considerando una capacidad de 1 X 1012 partículas por ml de soporte cromatográfico. Asimismo, el gasto lineal de los eluyentes se fija a 300 cm/h. EJEMPLOS Ejemplo 1: comparación de los soportes de tipo Q Sepharose® XL con el soporte Q Sepharose® Fast Flow.

Este ejemplo ilustra las propiedades específicas de los soportes de tipo Q Sepharose ® en comparación con las del soporte Q Sepharose® Fast Flow. Los dos soportes están constituidos por perlas o bolas de estructura de base idéntica (agarosa reticulada al 6 %), de igual distribución granulométrica (45-165 µm) . Éstos difieren por la presencia de brazos flexibles en dextrano que contienen los grupos intercambiadores de tipo Q para la Q Sepharose® XL, mientras que los mismos grupos de tipo Q están fijados directamente sobre la matriz de agarosa en el caso del Q Sepharose® FF. Una preparación de adenovirus purificada (2 X 1010 pv) es inyectada sobre una columna de Q Sepharose® XL ( 1 ml de soporte) y eluida con un gradiente de NaCl tal como el definido en el párrafo 2 de la sección Material y Métodos. El perfil de elución se presenta en la figura 3. En las mismas condiciones, un análisis idéntico se efectúa sobre una columna similar llena de soporte Q Sepharose® Fast Flow (FF) . El perfil de elución se presenta en la figura 4. La comparación de los resultados cromatográficos se presenta en la tabla siguiente. Soporte Eficacia (N/m) Asimetría Q Sepharose® XL 30 000 1.0 Q Sepharose® FF 5 000 1.0 Tabla 1: comparación de los resultados cromatográficos con los soportes Q Sepharose® XL y Q Sepharose® FF. Como lo muestran las figuras 3 y 4, el tiempo de retención del virus es similar en los dos casos (t = 18 minutos para Q Sepharose® XL y t= 20 minutos para Q Sepharose FF) , pero el soporte Q Sepharose® XL presenta una eficacia muy superior a la del soporte Q Sepharose® FF. De la misma forma el análisis de un extracto celular bruto que contiene 2 X 109 partículas virales de adenovirus sobre los dos soportes (figura 5) muestra que sólo el soporte Q Sepharose® XL presenta un pico de virus identificado y cuantificable . Por el contrario, las proteínas presentes en la preparación, son separadas con una eficacia idéntica para los dos soportes estudiados (figura 5) . Estos resultados indican que la presencia de los brazos flexibles que contienen los grupos intercambiadores es un elemento esencial de este tipo de soporte. La presencia de estos brazos flexibles contribuye, de manera importante a los resultados cromatográficos ventajosos del Q Sepharose® XL para la separación de los adenovirus. Ejemplo 2 : comparación de los soportes de tipo Sepharose® XL con el soporte Q Sepharose® HP. Este ejemplo ilustra las propiedades específicas de los soportes de tipo Q Sepharose® XL en comparación con las del soporte Q Sepharose® HP. Los dos soportes están constituidos por perlas o bolas de base idéntica (agarosa reticulada al 6 %) . El soporte Q Sepharose® XL presenta una distribución de tamaño de perlas que van de 45 a 165 µm centrada sobre 90 µm. La granulometría del soporte Q Sepharose® HP es de 34 ± 10 µm. La granulometría del soporte Q Sepharose® HP es más fina y mucho menos dispersa que la del soporte Q Sepharose® XL . El soporte Q Sepharose® HP debería pues, presentar resultados cromatográficos muy superiores a los resultados del Q Sepharose® XL . Una preparación de adenovirus purificada (2 X 10 pv) es inyectada sobre una' columna de Q Sepharose® XL (1 ml de soporte) y eluída con un gradiente de NaCl tal como el definido en el párrafo 2 de la sección Material y Métodos. El perfil de elución se presenta en la figura 3. En las mismas condiciones, un análisis idéntico se efectúa sobre una columna similar llena de soporte Q Sepharose HP. El perfil de elución obtenido con el soporte Q Sepharose® HP se presenta en la figura 6. Los resultados presentados en la figura 6 muestran que el soporte Q Sepharose® HP presenta una eficacia (N/m, 15 000) notablemente inferior a la del soporte Q Sepharose XL. Además el pico viral presenta una constante, importante sobre el soporte Q Sepharose® HP (asimetría, 1.6), mientras que es rigurosamente simétrico sobre el soporte Q Sepharose® XL. De forma inesperada, a pesar de su granulometría más fina y su distribución granulométrica menos dispersa, el soporte Q sepharose® HP no alcanza los resultados del soporte Q Sepharose® XL para la separación de las partículas virales. Presenta por el contrario resultados muy superiores para la separación de las proteínas, como lo indica el fabricante (Amersham-Pharmacia Biotech) y como se confirma en nuestras condiciones experimentales con experiencias de separación de la albúmina bovina, (tabla siguiente) Soporte Adenovirus Albúmina Eficacia Asimetría Eficacia (N/m) (N/m) Q Sepharose® XL 30 000 1.0 600 Q Sepharose® HP 15 000 1.6 4 000 Tabla 2: comparación de los resultados cromatográficos con los soportes Q Sepharose® XL y Q Sepharose® HP. Estos resultados confirman que la presencia de los brazos flexibles que contienen los grupos intercambiadores de aniones fuertes, es un elemento esencial en los resultados cromatográficos de este tipo de soporte, para la separación de las partículas virales. Estos resultados indican igualmente que otro parámetro importante a tomar en cuenta en la definición de la selección del soporte, es la granulometría y en particular la dispersión de tamaño. Ejemplo 3: comparación de los soportes de tipo Q Sepharose® XL con los soportes Fractogel® TMAE(S) y Source 15Q. Este ejemplo ilustra las propiedades específicas de los soportes de tipo Q Sepharose® XL en comparación con el soporte Fractogel® TMAE(S) y con el soporte Source 15Q. Los tres soportes están constituidos por perlas de estructura y de composición diferentes. El Q Sepharose® XL está constituido por agarosa reticulada al 6 %. El soporte Fractogel® TMAE es una resina de polimetacrilato reticulado y el soporte Source 15Q está constituido de perlas de resina de tipo poliestiren-divinilbenceno . La granulometría de los soportes Fractogel® TMAE(S) (20- 40 µm) y Source 15Q (15 µm) es muy inferior y mucho menos dispersa que la del soporte Q Sepharose® XL (45-165 µm) . Por otra parte, los tres soportes presentan los grupos intercambiadores fuertes. Estos últimos están situados sobre brazos flexibles fijados sobre la matriz, en el caso del Fractogel® TMAE(S) y del Q Sepharose® XL, contrariamente al Source 15Q cuyos grupos intercambiadores están injertados directamente sobre la matriz . Una preparación de adenovirus purificada (2 X 1010 pv) , se inyecta sobre una columna Q Sepharose® XL ( 1 ml de soporte) y se eluye con un gradiente de NaCl tal como el definido en el párrafo 2 de la sección Material y Métodos. El perfil de elución obtenido se presenta en la figura 3. En las mismas condiciones, un análisis idéntico se efectúa sobre una columna similar llena de soporte Source 15Q y se efectúa otro análisis sobre una columna llena de soporte Fractogel® TMAE(S) . De manera inesperada, a pesar de su granulometría más fina, el soporte Fractogel® TMAE(S) no alcanza los resultados del soporte Q Sepharose® XL para la separación de los adenovirus. Presenta por el contrario resultados muy superiores para la separación de las proteínas. Asimismo, a pesar de su granulometría muy fina y su distribución granulométrica casi monodispersa, el soporte Source 15Q, no alcanza, el tampoco, los resultados del soporte Q Sepharose® XL para la separación de los adenovirus. Soporte Eficacia (N/m) Asimetría Source 15Q 20 000 1.2 Q Sepharose® XL 30 000 1.0 Fractogel® TMAE(S). 20 000 1.5 Tabla 3: comparación de los resultados cromatográficos con los soportes Source 15Q, Q Sepharose® XL y Fractogel® TMAE ( S ) . Estos resultados indican que la presencia de brazos flexibles que contienen los grupos intercambiadores no es la única responsable de los resultados cromatográficos específicos del soporte Q Sepharose® XL, para la separación de los adenovirus. La composición química de estos brazos, su densidad de injerto, la naturaleza y la porosidad de la matriz sobre la cual son injertados los brazos flexibles son por lo tanto, parámetros que pueden influir sobre los resultados cromatográficos del soporte para la separación de las partículas virales. Ejemplo 4: detección y cuantificación de las partículas de adenov±rus salvajes de diversos serotipos.

Este ejemplo ilustra un método de detección y de identificación de las partículas de adenovirus salvajes de diversos serotipos con base en la utilización del soporte cromatográfico de tipo Q Sepharose® XL . Los diversos adenovirus salvajes han sido producidos por infección de células A549 cultivadas sobre medio DMEM y recolectadas después de 3 ciclos de congelación-descongelación de las células. A continuación, las preparaciones se filtraron a través de una membrana Acrodisc (de tipo HT Tuffryn de 0.45 µm; GelmanSciences ) antes de análisis . A continuación, las diversas preparaciones se analizan por cromatografía según el protocolo descrito en el párrafo 2 de la sección Material y Métodos. No obstante, en el ejemplo presentado, los análisis se efectuaron con una columna que tenía un volumen ligeramente superior a 1 ml (« 1.35 ml ) , lo que implica que el tiempo de retención del adenovirus 5 sea superior (25.3 min) al tiempo de retención de referencia (18 minutos) indicado en la sección Material y Métodos. Adenovirus Sub- Título Proporción T (Serotipo) Grupo (pv/ml) 260/280 (min) 18 B 2.3 X 109 1.18 15.0 3 B 4.8 X 1010 1.35 20.1 7 B 4.4 X 1010 1.33 18.3 11 B 3.8 X 1010 1.30 22.7 14 B 1.1 X 1010 1.31 27.0 21 B 2.7 X 1010 1.36 22.8 34 B 4.7 X 1010 1.30 21.5 1 C 1.2 X 1010 1.32 26.9 2 C 2.3 X 1010 1.33 26.9 5 C 6.6 X 1010 1.33 25.3 Adenovirus Sub- Título Proporción T (Serotipo) Grupo (pv> /ml) 260/280 (min 6 C 6.6 X 1010 1.38 22.3 13 D 4.6 X 1010 1.55 17.0 20 D 8.5 X 1010 1.32 22.1 4 E 3.9 X 1010 1.31 20.1 36 2.9 X 1010 1.37 22.4 Tabla 4: caracterización cromatográfica de diversos adenovirus salvajes. Este ejemplo muestra que los diversos adenovirus tienen, no solamente un tiempo de retención variable según los serotipos considerados sino también una proporción entre las absorbancias a 260nm/280 nm, característica del serotipo en cuestión. La combinación de estos dos criterios, que pueden ser medidos simultáneamente durante un solo y mismo análisis cromatográfico, constituye pues un medio de identificación rápida y confiable del serotipo del adenovirus presente en la preparación cromatografiada .

Se investigo una correlación entre el tiempo de retención del virus sobre la columna y las características de la fibra y del hexon de los adenovirus de tipo 7, 3, 4, 5 y 2, para los cuales" las secuencias se han publicado (1998 J. Virol. (1998) 72 p. 7909 y Arch. Virol. (1997) 142 p. 1307) . Ninguna correlación se puso en evidencia a partir de los datos de identidad de las secuencias de la cabeza de la fibra, ni tampoco a partir de las diferencias del número de repeticiones de hojillas ß en el vastago de la fibra (ver la tabla siguiente) . Por el contrario, y de forma sorprendente, se puso en evidencia una correlación entre el tiempo de retención del virus y la identidad de secuencias del hexon (ver la tabla siguiente). Esta correlación concuerda perfectamente con la carga global del hexon a pH 7; esta correlación muestra que la elevación de la carga del hexon a pH 7 corresponde a un aumento de la retención del virus sobre la columna. Pueden existir matices en función de la carga a pH 7, de la parte Ll expuesta del hexon, tal como se indico por los datos obtenidos con el virus de tipo 3.

Tabla 5: correlación entre el tiempo de retención del virus y la identidad de secuencias del hexon. Ejemplo 5: detección y cuantificación de las partículas de adenovirus recombinantes en el transcurso de las etapas de producción de un inventario o existencia viral. Este ejemplo ilustra la utilización de los soportes de tipo Q Sepharose® XL para la detección y la cuantificación de las partículas de adenovirus recombinante AVi.oCMV. lacZ producidas en las etapas de transfección y de amplificación con diferentes líneas celulares de encapsulación (células 293 o PER.C6) . Este método de análisis extremadamente rápido proporciona en algunos minutos, y a partir de un sobrendante de cultivo, el título de la solución de adenovirus que resultan de cada etapa. Este método rápido e importante permite optimizar las condiciones de amplificación de la etapa siguiente, que puede desde entonces ser realizada en condiciones de MOI determinadas y controladas.

Este método de análisis ha sido verificado para controlar la producción de adenovirus recombinantes de tipo AVi.oCMV. lacZ en etapas de transfección y de amplificación sobre células 293 o PER.C6. El adenovirus AV?.0CMV. lacZ se ha producido después de transfección de células 293 o PER.C6 con el plásmido pXL2822 digerido por Pací (Crouzet y colaboradores, Proc. Nati.

Acad. Sci USA 94: 1414-1419, 1997) luego, infección de células respectivamente 293 o PER.C6 a una multiplicidad de infección (MOI) determinada. La transfección inicial se realiza con 5 a 10 microgramos de ADN viral obtenido por digestión del plásmido. En la lisis de las células, el virus se recolecto por 3 ciclos de congelación-descongelación de las células. A continuación, las preparaciones se filtraron a través de una membrana Acrodisc (de tipo HT Tuffryn) de 0.45 µm antes de análisis. A continuación se analizaron las diversas preparaciones por cromatografía según el protocolo descrito en el párrafo 2 de la sección Material y Métodos . El título de la solución de adenovirus se determino por referencia con una curva de calibración realizada en las condiciones descritas en el párrafo 2 de la sección Material y Métodos. Los resultados se presentan en la tabla siguiente.

Tabla 6: detección y cuantificación de las partículas de adenovirus recombinante AVi.oCMVlacZ obtenidas en la producción de inventarios virales en dos líneas transcomplentarias (293 o PER.C6). Las partículas virales totales obtenidas, se dosificaron para determinar la concentración de partículas infecciosas (pfu) y partículas que posean la actividad del transgen (tdu). El término pfu ("unidad formadora de placa"), corresponde al poder infeccioso de una solución de adenovirus, y se mide por infección de un cultivo celular apropiado, y determinación, generalmente después de 15 días, el número de zonas de células infectadas. Estas dosificaciones se apoyan en métodos biológicos, y los valores obtenidos pueden parecer diferentes según las condiciones utilizadas (J. Virol. (1996) 70 p. 7498). De hecho, la formación de una zona en una línea transcomplementaria, no describe necesariamente la infecciosidad del virus en otras células objetivo (Biotechniques (1997) 22 p. 447). Los resultados obtenidos se presentan en la tabla siguiente y los valores obtenidos están perfectamente de acuerdo con los datos de ia literatura (P. Yeh y colaboradores J. Virol. (1996) 70 p. 559) . En efecto, P. Yeh y colaboradores, describen virus AdRSVßGal purificados por gradiente de cloruro de cesio, que tienen relaciones tdu/tfu de 0.49 a 0.68, lo que es muy próximo a los resultados siguientes obtenidos.

Tabla 7: relación entre la concentración de partículas infecciosas (pfu) y partículas que poseen la actividad del transgen (tdu) .

Ejemplo 6: detección y cuantificación de las partículas de adenovirus recombinantes , producidas en etapas de transfección y de amplificación sobre célula IGRP2. Este ejemplo ilustra la utilización de los soportes de tipo Q Sepharose® XL para la detección y la cuantificación de las partículas de adenovirus recombinantes AV3.0CMV. lacZ producidas en etapas de transfección y de amplificación sobre célula IGRP2. El adenovirus AV3.0CMV.lacZ ha sido producido después de transfección de células de encapsulación IGRP2 con el plásmido pXL3005 digerido por Pací (el plásmido pXL3005 se deriva del plásmido pXL2811 descrito en (Crouzet y colaboradores, Procc. Nati. Acad. Sci USA 94: 1414-1419, 1997), por intercambio del promotor RSV por el promotor CMV) luego, infección de células IGRP2 (W096/22378) a una multiplicidad de infección (MOI ) determinada . En la lisis de las células, el virus ha sido recolectado por 3 ciclos de congelación-descongelación de las células. A continuación, las preparaciones se filtraron a través de una membrana Acrodisc (de tipo HT Tuffryn) de 0.45 µm antes de análisis. A continuación se analizaron las diversas preparaciones por cromatografía, según el protocolo descrito en la sección Material y Métodos. Los resultados se presentan en la tabla siguiente .

Tabla 8:deteccion y cuantificación de las partículas de adenovirus recombinantes AV3.0CMV. lacZ obtenidas en la producción de inventarios o existencias virales. Las partículas virales totales obtenidas, se dosificaron para determinar la concentración en partículas que posean la actividad del transgen (3.2 X 108 tdu/ml). Una relación de pv/tdu de 43 es comparable a la relación de pv/tdu de 43 y 55 obtenida en el ejemplo 5 y permite correlacionar la medida física 1.39 X 1010 pv/ml de partículas virales a la medida biológica de 3.2 X 108 tdu/ml de unidades de transducción. Ejemplo 7 :purificación del virus por cromatografía sobre resina Q Sepharose® XL. El material inicial está constituido ya sea del lisado de cultivo obtenido por congelación-descongelación de las células de encapsulación productoras del virus, o bien del sobrenadante obtenido después de lisis espontánea de las células . En la experiencia reportada en este ejemplo, 153 ml de un autolisado de cultivo de células PER.C6 infectadas por el virus AVi.oCMVLacZ que contiene 4.9 X 1012 partículas se han inyectado sobre una columna de 5.8 ml de Q Sepharose® XL . El equilibrio de la columna y la elución del virus se efectuaron a un gasto de 300 cm/h con un gradiente de 0.25 a 1 M de NaCl sobre 30 volúmenes de columna como se describe para la preparación analítica del virus en el párrafo 2 de la sección Material y Métodos. El pico viral (7.1 ml ) se ha colectado después analizado por diversas técnicas (EI-CLHP, SDS-PAGE) como se describe a continuación. La fracción colectada es analizada por cromatografía líquida de alta resolución (CLHP) sobre una columna de Resource Q (1 ml ) en un sistema cromatográfico conforme a: 10 µl de la fracción purificada por cromatografía como se describe anteriormente se inyectaron sobre una columna Resource Q15 (1 ml de gel; Pharmacia) equilibrada en el tampón Tris/HCl 100 mM pH 8.0 que contenía 0.5 mM de MgCl2, (tampón B) . Después de enjuague con 5 ml de tampón B, las especies absorbidas son eluídas con un gradiente lineal de 30 ml de NaCl (0 a 1 M) en el tampón B a un gasto de 1 ml/min. Las especies eluídas se detectaron a 260 nm. Después de la etapa de purificación sobre columna de Q Sepharose® XL, la fracción colectada presenta una pureza > 99 % de partículas virales (detección UV a 260 nm) . El rendimiento de purificación en partículas virales es de 82 %. Este análisis por CLHP muestra además que la albúmina sérica bovina residual, presente en el lisado inicial es totalmente eliminada en el transcurso de la cromatografía preparativa . El análisis por electroforesis, de la fracción adenoviral purificada por cromatografía se efectúa en gel de poliacrilamida (4-20 %) en condiciones desnaturalizadoras (SDS) . A continuación, las bandas de proteínas se revelan al nitrato de plata. Este análisis muestra que la preparación adenoviral obtenida por cromatografía, tiene un nivel de pureza al menos igual al de la preparación obtenida clásicamente por ultracentrigufación y que no presenta banda de proteínas suplementaria que indicara una contaminación de la preparación por proteínas no adenovirales.

La preparación adenoviral obtenida por cromatografía presenta una proporción entre las absorbancias A260 nm/ 28o nm, igual a 1.30 ± 0.05. Este valor, que es idéntico al obtenido para las mejores preparaciones obtenidas por ultracentrigufación, indica que la preparación está desprovista de proteínas contaminantes o de ácidos nucleicos contaminantes.

La titulación del virus muestra bien la presencia de partículas virales infecciosas con una relación de pv/pfu muy satisfactorio (ver la tabla siguiente) y las partículas virales purificadas tienen efectivamente la actividad infecciosa esperada.

Tabla 9 :purificacion de adenovirus AVI .0CMV. LacZ sobre soporte Q Sepharose® XL .

El procedimiento descrito en este ejemplo permite pues purificar las partículas adenovirales sin afectar su poder infeccioso, directamente a partir de un lisado de células de encapsulación, sin tratamiento previo (ultrafiltracion por ejemplo o tratamiento con una nucleasa) del material a purificar . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Procedimiento de separación de partículas virales a partir de un medio biológico, caracterizado porque contiene al menos una etapa de cromatografía realizada sobre un soporte que contiene una matriz, grupos intercambiadores de iones, dichos grupos que están injertados sobre la mencionada matriz por medio de un brazo flexible.
2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, que está caracterizado porque la matriz es seleccionada entre la agarosa, el dextrano, la acrilamida, el silicio, el poli (estiren-divinilbenceno) , solos o en mezcla.
3. 3. Procedimiento según la reivindicación 2, que está caracterizado porque la matriz está constituida por agarosa reticulada y, de preferencia de agarosa reticulada al 6 % .
4. 4. Procedimiento según alguna de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la matriz presenta una granulometría comprendida entre 40 y 200 µm aproximadamente.
5. 5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la matriz presenta una granulometría comprendida entre 45 y 165 µm y centrada sobre 90 µm.
6. 6. Procedimiento según la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque la matriz presenta una dispersión tal, que 95 % de las partículas tienen un diámetro comprendido entre 0.1 y 10 veces el diámetro medio de las partículas, y de preferencia entre 0.3 y 3 veces el diámetro medio de las partículas .
7. 7. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el brazo flexible es un brazo hidrófilo, constituido por un polímero de origen sintético o natural .
8. 8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el brazo flexible es un polímero de origen sintético seleccionado entre los alcoholes polivinílicos, las poliacrilamidas, las polimetacrilamidas o los polivinil éteres.
9. 9. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque el brazo flexible es un polímero de origen natural de naturaleza polisacarídica seleccionado entre el almidón, la celulosa, el dextrano y la agarosa.
10. 10. Procedimiento según la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque el grado de polimerización del brazo flexible es de aproximadamente 30 unidades monoméricas.
11. 11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el brazo flexible es un dextrano de peso molecular medio de 5000 Da aproximadamente.
12. 12. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el grupo intercambiador de iones es un grupo intercambiador de aniones fuerte.
13. 13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque el grupo intercambiador de aniones fuerte es una amina cuaternaria.
14. 14. Procedimiento según alguna de las reivindicaciones 7 a 13 o según la reivindicación 5, caracterizado porque la cromatografía se efectúa sobre un soporte de tipo Q Sepharose® XL .
15. 15. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el medio biológico es un sobrenadante de células de encapsulación productoras del virus mencionado .
16. 16. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el medio biológico es un lisado de células de encapsulación productoras del virus mencionado.
17. 17. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el medio biológico es una solución pre-purificada del virus mencionado.
18. 18. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una etapa previa de ultrafiltracion.
19. 19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque la ultrafiltracion es una ultrafiltracion tangencial sobre membrana, que tenga un umbral de corte comprendido entre 300 y 500 kDa.
20. 20. Utilización del soporte de cromatografía de tipo Q Sepharose® XL para la separación analítica y/o preparativa de partículas virales.
21. 21. Utilización según la reivindicación 20, caracterizada porque las partículas virales son de adenovirus .
22. 22. Utilización del soporte de cromatografía de tipo Sepharose® XL para la identificación de diferentes serotipos de adenovirus.
23. 23. Utilización del soporte de cromatografía de tipo Q Sepharose® XL para la titulación de adenovirus.
24. 24. Procedimiento de cuantificación de adenovirus, caracterizado porque las partículas virales son separadas por cromatografía sobre un soporte de tipo Q Sepharose® XL y la cantidad de adenovirus es medida por absorbancia de las fracciones de cromatografía.