KR100514589B1

KR100514589B1 - 재조합아데노바이러스의제조방법

Info

Publication number: KR100514589B1
Application number: KR10-1998-0710930A
Authority: KR
Inventors: 프랑시스 블랑쉐; 쟝-마르 길로메
Original assignee: 아방티 파르마 소시에테 아노님
Priority date: 1996-07-01
Filing date: 1997-06-20
Publication date: 2005-12-16
Also published as: KR20000022489A

Abstract

본 발명은 바이러스 DNA가 패키징 세포 배양액에 도입되는 생성된 바이러스가 상등액에서의 방출 후에 수거되는 재조합 아데노바이러스의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 생성된 바이러스 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

재조합 아데노바이러스의 제조방법

본 발명은 재조합 아데노바이러스의 신규 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 공정에 따라 생성된 정제 바이러스 제제에 관한 것이다.

아데노바이러스는 유전자 요법에 있어 유전자 전달용 벡터로서 사용하기에 특히 유리한 특성을 보인다. 특히, 이들은 상당히 광범위한 범위의 숙주를 보유하고, 휴지기 세포를 감염시킬 수 있으며, 감염 세포의 게놈에 통합되지 않으며, 현재까지로는 인간에 있어 주요 병리와 연관되어 있지 않다. 아데노바이러스는 따라서 해당 유전자를 근육[참조문헌: Ragot et al. m Nature 361 (1993) 647], 간[참조문헌: Jaffe et al., Nature genetics 1 (1992) 372], 신경계[참조문헌: Akli et al., Nature genetics 3 (1993) 224] 등으로 전달하는 데에 사용되어 왔다.

아데노바이러스는 약 36(킬로 베이스)kb 크기의 선형 이본쇄 DNA이다. 이들의 게놈은 특히 각각의 말단에 역 반복서열(ITR), 캡시드화 서열(Psi), 초기 유전자 및 후기 유전자를 포함한다. 주된 초기 유전자는 E1, E2, E3 및 E4 영역에 들어있다. 이들 가운데서, 특히 E1 영역에 들어있는 유전자는 바이러스 증식에 필수이다. 주된 후기 유전자는 L1 내지 L5 영역에 들어있다. Ad5 아데노바이러스의 게놈은 완전히 서열분석되었으며 데이터베이스상에서 입수가능하다(특히 Genebank M73260). 이와 마찬가지로, 다른 아데노바이러스(Ad2, Ad7, Ad12 등) 게놈의 일부 또는 심지어는 전부도 서열분석되었다.

이들을 유전자 요법에 사용하기 위해, 각종 치료 유전자가 이입되어 있는 아데노바이러스로부터 유도된 각종 벡터가 제조되었다. 이러한 작제물 각각에 있어서, 아데노바이러스는 감염세포에서 복제할 수 없게 되도록 변형된다. 따라서, 선행기술에 기술된 작제물은 바이러스 복제에 필수인 E1 영역이 결실되고 이의 수준에서 이종 DNA 서열이 삽입되는 아데노바이러스이다[참조문헌: Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161] 더욱이, 벡터의 특성을 증진시키기 위하여, 아데노바이러스 게놈에 다른 결실이나 변형을 생성시키는 것이 제안되었다. 따라서, 열-민감성 돌연변이가 ts125 돌연변이체에 도입하여 72 kDa DNA 결합 단백질(DBP)을 불활성화시킬 수 있다. [참조문헌: Van der Vlist et al., 1975]. 다른 벡터는 바이러스 복제 및/또는 증식에 필수인 다른 영역, E4 영역의 결실을 포함한다. E4 영역은 사실 후기 유전자의 발현 조절, 후기 핵 RNA의 안정성, 숙주 세포 단백질의 발현 폐지 및 바이러스 DNA 복제의 효능에 관여된다. 따라서, E1 및 E4 영역이 결실되어 있는 아데노바이러스 벡터는 전사 백그라운드 노이즈 및 매우 감소된 바이러스 유전자의 발현을 보유한다. 이러한 벡터는 예를 들면, 출원 WO 94/28152, WO 95/02697, PCT/FR96/00088에 기술되어 있다. 또한, IVa2 유전자 수준에서 변형을 운반하는 벡터 또한 기술되어 있다(WO 96/10088).

문헌에 기술되어 있는 재조합 아데노바이러스는 상이한 아데노바이러스 혈청형으로부터 생성된다. 사실상, 구조와 특성이 다소 다양한 각종 아데노바이러스 혈청형이 존재하지만, 이들은 필적할 만한 유전자 구성을 보인다. 더욱 구체적으로 말하면, 재조합 아데노바이러스는 인간 또는 동물 기원일 수 있다. 인간 기원의 아데노바이러스와 관련하여, 바람직하게는 C 그룹으로 분류된 것들, 특히 유형 2(Ad2), 5(Ad5), 7(Ad7) 또는 12(Ad12)의 아데노바이러스를 들 수 있다. 동물기원의 각종 아데노바이러스 가운데는, 바람직하게는 개 기원 및 특히 CAV2 아데노바이러스의 모든 균주를 들 수 있다(예를 들면, 맨해튼 균주 또는 A26/61 (ATCC VR-800). 동물기원의 기타 아데노바이러스는 본원에서 참조로 인용되는 출원 WO 94/26914에 실려 있다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 재조합 아데노바이러스는 C 그룹 인간 아데노바이러스이다. 더욱 바람직하게는, Ad2 또는 Ad5 아데노바이러스이다.

재조합 아데노바이러스는 캡시드화주, 즉 재조합 아데노바이러스 게놈에 결힙된 하나 이상의 기능을 트랜스로 보완할 수 있는 세포주에서 생성된다. 이러한 세포주 중 하나는 예를 들면, 아데노바이러스 게놈의 일부가 통합되어 있는 세포주 293이다. 더욱 정확하게 말하면, 세포주 293은 좌측 ITR, 캡시드화 영역, E1a 및 E1b 영역을 포함한 E1 영역, pIX 단백질을 암호화하는 영역 및 pIVa2 단백질을 암호화하는 영역의 일부를 포함하는 혈청형 5 아데노바이러스(Ad5) 게놈의 좌측 말단(약 11 내지 12%)을 함유하는 인간 배아 신장 세포주이다. 이 세포주는 E1 영역이 결손된, 즉 E1 영역의 전부 또는 일부가 결힙된 재조합 아데노바이러스를 트랜스 상보화할 수 있고, 고역가의 바이러스 스톡을 생성할 수 있다. 이 세포주는 또한 허용되는 온도(32℃)에서, 추가로 열-민감성 E2 돌연변이를 포함하는 바이러스 스톡을 생성할 수 있다. E1 영역을 상보화할 수 있는 기타 세포주가 특히 인간 폐암 세포 A549(WO 94/28152) 또는 인간 망막아세포[참조문헌: Hum. Gen. Ther. (1996) 215]를 토대로 기술되었다. 더욱이, 아데노바이러스의 수종의 기능을 상보화할 수 있는 세포주도 기술되었다. 특히, E1 및 E4 영역을 상보화할 수 있는 세포주[참조문헌: Yeh et al., J. Virol. 70 (1996) 559: Cancer Gen. Ther. 2 (1995) 322; Krougliak et al, Hum. Gen. Ther. 6 (1995) 1575] 및 E1 및 E2 영역을 상보화할 수 있는 세포주(WO 94/28152, WO 95/02697, WO/27071)를 들 수 있다.

재조합 아데노바이러스는 바이러스 DNA를 캡시드화주로 도입한 다음, 약 2일 또는 3일 후에 세포를 용해시킴으로써 생성된다(아데노바이러스 사이클의 동역학은 24 내지 36 시간이다). 세포 용해후, 재조합 바이러스 입자는 세슘 클로라이드 구배 원심분리로 분리해낸다.

이러한 공정을 수행하기 위해, 도입된 바이러스 DNA는 임의로 세균(WO 96/25506) 또는 효모(WO 95/03400)에서 작제한, 세포 중으로 형질감염된 완전한 재조합 바이러스 게놈일 수 있다. 이는 또한 캡시드화 세포주를 감염시키기 위해 사용된 재조합 바이러스일 수 있다. 바이러스 DNA는 또한, 각각이 재조합 바이러스 게놈의 일부 및 캡시드화 세포 중으로의 도입 후, 바이러스 게놈을 다양한 단편 간의 상동성 재조합에 의해 재구성되도록 허용하는 상동지역을 운반하는 단편 형태로 도입될 수 있다. 따라서 아데노바이러스의 생산을 위한 통상적인 방법은 다음과 같은 단계를 포함한다: 세포(예를 들면, 세포 293)를 배양 접시에서 세포당 3 내지 5 개의 바이러스 입자의 양으로 바이러스 프리스톡으로 감염시키거나(감염 중복도(MOI) = 3 내지 5), 바이러스 DNA로 감염시킨다. 이어서 배양을 40 내지 72 시간 지속한다. 이어서, 바이러스를 일반적으로 수차례의 연속적인 해동 사이클에 의한 세포 용해에 의해 핵으로부터 방출시킨다. 이어서 수득된 세포 용해물을 저속(2000 내지 4000 rpm)으로 원심분리하고 상등액(투명해진 세포 용해물)을 세슘 클로라이드의 존재하에 두 단계로 원심분리한다:

- 배지내 단백질로부터 바이러스를 분리하기 위해 바이러스 밀도(1.34)를 플랭킹하는 밀도 1.25 내지 1.40의 두 세슘 클로라이드 층에서 1.5 시간 동안 제 1 고속 원심분리;

- 실질적이고 단독의 바이러스 정제 단계를 구성하는 제 2 장기 구배 원심분리(사용된 회전자에 따라 10 내지 40 시간).

일반적으로, 제 2 원심분리 단계 후, 바이러스 밴드가 우세하다. 그럼에도 불구하고 두 개의 미세하고 덜 짙은 밴드가 관찰되고, 전자 현미경에 의한 검사는 좀더 짙은 밴드가 속이 비어있거나 부서진 바이러스 입자이고, 좀더 덜 짙은 밴드가 바이러스 서브 단위(펩톤, 헥손)임을 예시한다. 이 단계 후, 바이러스는 니들을 사용하여 투공에 의해 원심분리관에서 수거하고 투석이나 탈염에 의해 세슘을 제거한다.

수득된 순도수준이 만족스럽지만, 이러한 유형의 공정은 그럼에도 불구하고 특정한 단점이 있다. 특히, 이러한 공저인 인간에 있어 치료용도와 부합하지 않는 반응성인 세슘 클로라이드의 사용에 기초한다. 이러한 이유로 해서, 정제 말미에 세슘 클로라이드를 제거하는 것이 불가피하다. 이러한 공정은 또한 뒤에 언급되는 다른 단점을 지니고 있어 산업적 규모로의 사용이 제한된다.

이러한 문제점을 극복하기 위해, 용해 후, 세슘 클로라이드 구배를 이용하지 않고, 크로마토그래피를 이용하여 바이러스를 정제하는 것이 제안되어 왔다. 따라서, Huyghe 등에 의한 논문[참조: Hum. Gen. Ther. 6 (1996) 1403]은 재조합 아데노바이러스의 정제에 도입된 크로마토그래피의 상이한 유형의 연구에 대하여 기술하고 있다. 이 논문은 특히, 약 음이온-교환 크로마토그래피(DEAE)를 이용한 재조합 아데노바이러스의 정제 연구에 대하여 기술하고 있다. 이전의 연구는 이미 이러한 목적에 이러한 유형의 크로마토그래피의 사용에 대하여 기술하고 있다[참조문헌: Klemperer et al., Virology 9 (1959) 536; Philipson L, Virology 10 (1960) 459: Haruna et al, virology 13 (1961) 264]. Huyghe 등에 의한 논문에 제시된 결과는 권장된 이온 교환 크로마토그래피 절차의 매우 평범한 효능을 보여준다. 따라서, 수득된 분석력은 평균적이며, 저자들은 바이러스 입자가 여러개의 크로마토그래피 피크에 존재하고; 수율이 낮으며(바이러스 입자 수율: 67%; 감염입자 수율; 49%); 및 이러한 크로마토그래피 단계를 따라 수행된 바이러스 제제가 순수하지 않음을 시사하고 있다. 추가로, 다양한 효소/단백질로 바이러스를 예비처리하는 것이 필수이다. 이 동일 논문은 또한, 매우 불량한 분석 및 매우 낮은 수율(15 내지 20%)을 실증하는 겔 투과 크로마토그래피의 사용에 대한 연구도 기술하고 있다.

도 1: 실시예 4에 따라서 정제된 아데노바이러스의 안정성 연구,

도 2: 실시예 4에 따라서 정제된 아데노바이러스의 HPLC (역상) 분석. 실시예 3의 아데노바이러스와 비교.

도 3: 반정량적 PCR 및 플라크 분석에 의해서 측정된 세포 293 상등맥내 아데노바이러스 Ad-β Gal의 방출 카이네틱스.

도 4: 한외여과된 아데노바이러스 상등액의 Source Q15에 대한 용출 프로필 (실시예 5.1).

도 5: 한외여과된 아데노바이러스 상등액의 Source Q15 수지에 대한 크로마토그래피에 의해서 수득된 바이러스 피크의 Ressource Q HPLC 분석 (실시예 5.1).

도 6: (A) 한외여과된 Ad-APOA1 아데노바이러스 상등액의 Source Q15 수지에 대한 용출 프로필 (실시예 5.3); 및 (B) 수득된 바이러스 피크의 HPLC (Resource Q) 분석.

도 7: (A) 한외여과된 Ad-TK 아데노바이러스 상등액의 Source Q15에 대한 용출 프로필 (실시예 5.3). 수득된 다양한 바이러스 분획(피크의 시작 및 끝)의 HPLC (Resource Q) 분석; (B) 분획 F2, 피크의 중간; (C) 분획 F3, 피크의 한계; (D) 분획 F4, 피크의 끝.

도 8: 아데노바이러스 생성 세포 배양액의 농축된 상등액의 Mono Q 수지에 대한 용출 프로필 (실시예 5.4). BG25F1: 세슘에서 농축되고 정제된 바이러스 상등액. BG25C: 농축 감염된 상등액.

도 9: 아데노바이러스 생성 세포 배양액의 농축된 상등액의 POROS HQ 겔에 대한 용출 프로필 (실시예 5.4). BG25F1: 세슘에서 농축되고 정제된 바이러스 상등액. BG25C: 농축 감염된 상등액.

도 10A 및 B: 한외여과된 아데노바이러스 상등액의 S1000HR/Superdex 200HR에 대한 겔 투과 정제 프로필 (실시예 6).

도 11: 본 발명에 따라서 정제된 아데노바이러스 스톡의 전자 현미경에 의한 분석.

도 12: 밀도 1.28 바이러스 밴드의 전자 현미경에 의한 분석.

일반적인 분자 생물학 기술

통상적으로 분자 생물학에 사용되는 방법, 예를 들면, 플라스미드 DNA의 예비 추출, 세슘 클로라이드 구배에서 플라스미드 DNA의 원심분리, 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동, 전기용출에 의한 DNA 단편의 정제, 단백질의 페놀 또는 페놀-클로로포름 추출, 염수 매질에서 DNA의 에탄올 또는 이소프로판올 침전, 에세리히아 콜라이에서의 형질전환 등이 당해분야 기술자들에게 익히 공지되어 있고 문헌[참조: Maniatis T. et al., "Molecular Cloning. a Laboratory Manual", Cold Spring Haebor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al., (eds), "current Protocols in Molecular Biology", John Wiley ＆ Sons, New York, 1987]에 광범위하게 기재되어 있다.

pBR322 및 PUC 유형 플라스미드 및 M13 시리즈의 파지가 시판 기원의 것이다 (Bethesda Research Laboratories). 라이게이션을 위해서, DNA 단편을 아가로스 또는 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해서 크기에 따라 분리하고 페놀 또는 페놀/클로로포름 혼합물로 추출하며, 에탄올로 침전시킨 다음 공급자의 권장에 따라 파지 T4 DNA 리카제 (Biolabs)의 존재하에 공급자의 사양서에 따라서 배양한다. 뻗어 나오는 5' 말단을 채움은 공급자의 사양서에 따라서 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I(Biolabs)의 클레노브 단편으로 수행할 수 있다. 뻗어 나오는 3' 말단의 파괴는 제조자의 권고에 따라서 사용된 파지 T4 DNA 폴리머라제(Biolabs)의 존재하에 수행된다. 뻗어 나오는 5' 말단의 파괴는 S1 뉴클레아제로의 통제된 처리에 의해서 수행된다.

합성 올리고디옥시뉴클레오티드에 의한 시험관내 부위-인도 돌연변이현상이 Taylor 등 [참조문헌: Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764]에 의해서 기재된 방법에 따라서 Amersham에 의해서 기여된 키트를 사용하여 수행될 수 있다. 소위 PCR 기술[참조문헌: Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. and Faloona F.A. Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350]에 의한 DNA 단편의 효소 증폭이 제조자의 사양서에 따라서 DNA 열 순환기(Perkin Elmer)를 사용하여 수행될 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 다양화는 Sanger 등[참조문헌: Proc. natl. Acad. Sci. USA. 74 (1977) 5463-5467]에 의해서 개발된 방법에 의해서 Amersham에 의해 반포된 키트를 사용하여 수행될 수 있다.

실시예

실시예 1: 세포주의 캡시드화

본 발명의 프레임워크 내에서 사용되는 캡시드화 세포는 아데노바이러스에 의해서 감염될 수 있고 치료 목적 용도와 양립할 수 있는 세포주로부터 수득될 수 있다. 이들은 좀더 바람직하게는 하기의 세포주 중에서 선택된다:

-293 세포주:

293 세포주는 좌측 ITR, 캡시드화 영역, E1a와 E1b를 포함하는 E1 영역, PIX 단백질을 암호화하는 영역 및 pIVa2 단백질을 암호화하는 영역의 일부를 포함하는 혈청형 5 아데노바이러스 (Ad5) 게놈의 좌측 말단 (약 11 내지 12%)를 함유하는 인간 배아 신장 세포주이다 [참조문헌: J. Gen. virol. 36 (1977) 59)]. 이러한 세포주는 E1 영역에 대해 결손이 있는 즉, E1 영역 모두 또는 일부가 부족한 재조합 아데노바이러스를 트랜스상보화할 수 있고, 고 역가의 바이러스 스톡을 생성할 수 있다.

-A459 세포주

아데노바이러스 E1 영역을 보완하는 세포가 A549 세포로부터 작제된다 (Imler et al., gene Ther. (1996) 75). 이들 세포는 좌측 ITr이 부족하고 유도성 프로모터의 조절하에 배치된 E1 영역의 제한된 단편을 함유한다.

-HER 세포주

인간 배 망막 (HER) 세포를 아데노바이러스로 감염시킨다 (참조문헌: Byrd et al., Oncogene 2 (1998) 477). 이러한 세포로부터 제조된 아데노바이러스 캡슐화 세포가 예를 들면, 출원 WO 94/28152 또는 Fallaux 등에 의한 논문(Hum. Gene Ther. (1996) 215)에 기재되었다. 좀더 상세하게는 Ad5 아데노바이러스 게놈의 E1 영역을 포함하는 세포주 911, HER 세포의 게놈으로 통합된 뉴클레오티드 79에서 뉴클레오티드 5789를 언급할 수 있다. 이러한 세포주는 E1 영역에 대해 결손이 있는 바이러스 생성을 허용한다.

-IGRP2 세포

IGRP2 세포는 세포 293으로부터 E4 영역의 작용성 단위의 통합에 의해서 유도성 프로모터의 조절하에 수득된 세포이다. 이러한 세포는 E1 및 E4 영역에 대해 결손이 있는 바이러스의 생성을 허용한다 (Yeh et al., J. Virol (1996) 70).

-VK 세포

VK 세포 (VK2-20 및 VK10-9)는 세포 293으로부터 유도성 프로모터의 조절하에 전체 E4 영역 및 pIX 단백질을 암호화하는 영역의 통합에 의해 수득되는 세포이다. 이러한 세포는 E1 및 E4 영역에 대해 결손이 있는 바이러스의 생성을 허용한다 (Krougliak et al., Hum. Gene ther. 6 (1995) 1575).

-293E4 세포

293E4 세포는 세포 293으로부터 전체 E4 영역의 통합에 의해서 수득된 세포이다. 이러한 세포는 E1 및 E4 영역에 대해 결손이 있는 바이러스의 생성을 허용한다 (WO 95/02597; Cancer Gene Ther. (1995) 322).

실시예 2: 사용된 바이러스

하기의 실시예 상황에서 생성되는 바이러스는 이. 콜라이 LacZ 마커 유전자 (Ad-β Gal). 허프스 바이러스 티미딘 키나제 (Ad-TK)를 암호화하는 유전자를 함유하는 아데노바이러스, 인간 p53 종양 억제제 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 아데노바이러스 및 아포리포프로테인 A1을 암호화하는 바이러스 (Ad-apoAI)이다. 이러한 바이러스는 Ad5 혈청형으로부터 유도되고 하기의 구조를 지닌다:

-예를 들면, 뉴클레오티드 382 (Hinf 부위)에서 3446 (Sau3a 부위)를 포함하는 E1 영역에서의 결실.

-결실의 수준으로 삽입된, RSV 또는 CMV 프로모터의 조절하에서의 유전자 발현을 위한 카세트.

-E3 영역에서의 결실.

이러한 바이러스의 작제가 참조문헌 (WO 94/25073, WO 95/14102, FR 95/01632, Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest (1992) p626)에 기재되어 있다. 기타 작제물, 특히 기타 이종 유전자 및/또는 기타 결실 (예를 들면, E1/E4 또는 E1/E2)을 운반하는 바이러스가 본 발명의 방법에 따라서 생성될 수 있음이 이해된다.

실시예 3: 세포 용해에 의한 바이러스의 생성

본 실시예는 생성된 바이러스를 회수하기 위해서 캡시드화 세포를 용해함에 있어서 바이러스 생성을 위한 이전의 기술을 재생한다.

세포 293을 세포당 3 내지 5 바이러스의 양으로 (감염의 중복도 MOI = 3 내지 5) Ad-β Gal 또는 Ad-TK 바이러스 (실시예 2)의 프리스톡을 갖는 배양 디쉬에서 80 내지 90% 합류로 감염시킨다. 배양을 40 내지 72 시간 동안 지속하고, 수득 시기를 현미경 하에서 둥글게 되고, 좀더 굴절성이고 배양 지지체에 점점 더 약하게 접착하는 세포를 관찰함으로써 결정한다. 문헌에서, 바이러스 사이클의 동력학은 24 내지 36 시간 동안 지속한다.

실험실 생산의 수준에서, 세포를 손실하지 않으면서 수득 시기에 감염 배지를 제거한 다음 이들을 최소 용적으로(농도 인자는 배양물 크기에 따라 약 10 내지 100 배) 수득하기 위해서 분리하기 전에 세포를 수득함이 중요하다.

이어서 바이러스를 3 내지 6 연속 해동 사이클(-70℃에서 에탄올-건조, 37℃에서 수조)에 의해서 핵으로부터 방출시킨다.

이어서 수득된 세포 용해물을 저속(2000 내지 4000 rpm)에서 원심분리한 다음 상등액(맑아진 세포 용해물)을 하기의 두 단계로 세슘 클로라이드 구배 상에서 한외여과에 의해서 정제한다:

-바이러스를 배지 중의 단백질로부터 제거하기 위해서 바이러스 밀도 (1.34)를 플랭킹하는 두 세슘 층 1.25 및 1.40에서 1.5 시간, 35000 rpm, 로터 sw 41의 제 1 신속 한외여과; 로터는 처리될 용적에 따라서 "스윙잉" 로터 (Sw28, Sw41 Beckman)이거나 고정각 로터 (Ti 45, Ti70, Ti 70.1 Beckman)일 수 있다.

-제 2의 더욱 장시간의 구배 한외여과 (사용되는 로터에 따라 10 내지 40 시간), 예를 들면, 실질적인 단독의 바이러스 정제를 구성하는 sw 41 로터에서 35000 rpm으로 18 시간 동안 바이러스는 1.34의 밀도에서 평형으로 선형 구배로 존재한다.

일반적으로 이 단계에서, 바이러스 밴드가 우세하다. 그럼에도 불구하고, 두 개의 미세하고 덜 짙은 밴드가 종종 관찰되고 전자 현미경에 의한 검사는 이것이 비어 있거나 부서진 바이러스이고 가장 덜 짙은 밴드에 대해서는 바이러스 서브단위(펜톤, 헥손)임을 예시하였다. 이러한 단계 후, 바이러스는 바늘로 관통함으로써 튜므내에서 수득되고 세슘은 G25 상의 투석 또는 탈염에 의해서 제거된다.

실시예 4: 상등액에서 바이러스의 생성

본 실시예는 하기 자연 방출물의 회수에 의한 바이러스 생성 실험에 관해 기술하고 있다. 한외여과로 바이러스를 수거한 다음 세슘 클로라이드로 정제한다.

4.1. 과정

본 방법에서는, 실시예 3과는 달리, 감염 후 40 내지 72시간 만에 세포가 수거되지 않지만, 동결-해동 사이클을 수행할 필요없이 8 내지 12일간 배양되어 전체 세포 용해물을 얻게 된다. 바이러스는 상등액에 존재한다.

점감 다공성(10 ㎛/1.0 ㎛/0.8-0.2 ㎛)의 깊이 필터상에서의 여과를 통해 상등액을 정화시킨다.

바이러스는 0.1 ㎛의 크기를 가지며 이 단계에서, 최하 다공성(0.22 ㎛)에서 필터상의 보유력에 의한 바이러스의 손실을 관찰되지 않는다.

일단 정화되면, 상등액을 300 kDa의 컷-오프를 지닌 밀리포어 나선막상의 접선 한외여과를 통해 농축한다.

본 발명에서 보고된 실험에서, 농축 인자는 100 ㎖인 시스템의 경계 부피로 표시된다. 이 시스템을 이용하여 4 내지 20 리터의 상등액 부피를 농축하여, 어려움없이 20 내지 100배의 농축 인자에 상응하는 100 ㎖ 내지 200 ㎖의 농축물 부피를 얻을 수 있다.

농축물을 0.22 ㎖상에서 여과한 다음 실시예 3에 기재된 세슘 클로라이드상의 원심분리에 의해 정제하고, 이후 투석 단계를 진행한다.

4.2. 결과

순도

세포내 바이러스 튜브(실시예 3)가 때때로 바이러스 밴드를 띤 응괴(지질, 단백질)와 함께 흐린 형태를 갖지만, 본 발명 공정에 의해 세슘 클로라이드상의 제 1 원심분리 단계 이후에 수득된 바이러스 제조물은 상층상을 지속시키는 매질 중의 불순물로부터 이미 잘 분리된 바이러스 밴드를 지닌다. Resource Q 칼럼상의 고-해상 액체 크로마토그래피 분석(비교 실시예 5)은 또한 감염된 상등액의 한외 여과에 의해 수득된 개시 물질의 순도는 증가하고 핵산 불순물(1.8보다 크거나 동일한 OD 260/280비) 및 단백질 불순물(1보다 작은 OD 260/280비)이 감소되는 결과를 보여준다.

37℃의 상등액에서 바이러스의 안정성

플라크 분석법에 의해, 37℃에서 감염 후 다양한 배양 시간때에 수집된 감염성 배양 상등액의 분취량을 적정하여 바이러스의 안정성을 관찰한다. 결과는 하기에 나타나 있다:

Ad-TK 바이러스:

·감염 10일 후 적정량 = 3.5× 10³ pfu/㎖

·감염 20일 후 적정량 = 3.3× 103 pfu/㎖ Ad-β Gal 바이러스

·감염 8일 후 적정량 = 5.8× 10⁸ pfu/㎖

·감염 9일 후 적정량 = 3.6× 10⁸ pfu/㎖

·감염 10일 후 적정량 = 3.5× 10⁸ pfu/㎖

·감염 13일 후 적정량 = 4.1× 10⁸ pfu/㎖

·감염 16일 후 적정량 = 5.5× 10⁸ pfu/㎖

얻어진 결과는 감염 후 적어도 20일 이하에서, 상등액의 적정량이 분석의 정밀도의 범위내에서 안정함을 보여준다. 또한, 도 1은 용출 완충액에서, 바이러스가 -80℃ 및 -20℃에서 적어도 8개월간 안정함을 보여준다.

제조물의 특정 감염성

HPLC로 측정된 바이러스 입자수 : pfu수의 비에 상응하는 이러한 파라미터는 바이러스 제조물의 감염성에 관한 정보를 제공한다. FDA의 추천에 따르면, 이는 100 이하여야 한다. 이러한 파라미터는 하기와 같이 측정된다: 세포 293을 함유한 두가지 부류의 배양 플라스크를 동일한 조건하에 동일한 바이러스 사전 저장물과 동시에 나란히 감염시킨다. 재조합 Ad-β gal 아데노바이러스에 대해 본 실험을 수행한 다음, Ad-TK 아데노바이러스에 대해 이 실험을 반복한다. 각 아데노바이러스의 경우, 일련의 플라스크는 감염 후 48시간만에 수거되고 이는 동결-해동 후 세슘 구배상에서 정제된 세포내 바이러스의 생성으로 간주된다. 나머지 플라스크를 감염 후 10일간 배양하고 상등액에서 바이러스를 수거한다. 수득된 정제 제조물을 플라크 분석으로 적정하고 6.4 M 구아니딘에서 샘플을 변성시킨 후 C4 Vydac 4.6× 50 ㎜ 칼럼상의 역상 HPLC에 의해 PVII 단백질의 농도를 측정함으로써 바이러스 입자 총 수의 정량을 측정한다. PVII 단백질의 양은 720 PVII 사본/바이러스를 고려하면 바이러스 입자 수와 상관 관계가 있다(Horwitz, Virology, Second edition (1990)). 흡광도의 특정 사멸 계수 1.0 유닛이 1.1× 10¹² 입자/㎖ 임을 고려할 때, 본 방법은 260 ㎚에서 농도계법에 의해 정제된 제조물상의 바이러스 입자의 측정값과 상관 관계가 있다.

얻어진 결과는 Ad-β gal 바이러스의 경우, 이 비율이 상등액 바이러스의 경우 16이고 세포내 바이러스의 경우 45임을 보여준다. Ad-TK 바이러스의 경우, 이 비율은 상등액법에서 바이러스 수거의 경우 78이고, 세포내법에 의해 수거된 바이러스의 경우 80이다.

전자 현미경에 의한 분석:

본 방법은 빈 입자의 존재 또는 함께 정제된 바이러스 서브유닛의 부재를 검출하고, 정제된 바이러스 제조물의 단백질 오염 또는 바이러스 입자의 비-분리성 집합체의 존재를 평가할 수 있다.

과정: 20 ㎕의 샘플을 탄소 그리드상에 침착시킨 다음 실험을 위해 1.5%의 우라닐 아세테이트를 이용한 음성 염색으로 처리한다. 실험을 위해, 50 kV 내지 100 kV Jeol 1010 전자 현미경을 사용한다.

결과: 상등액에서 수거된 바이러스상에서 수행된 분석은 불순물, 집합체 및 빈 바이러스 입자없이, 맑은 제조물을 보여준다. 이는 또한 바이러스 섬유 및 일정한 기하 구조와 구별될 수 있다. 이러한 결과는 본 발명에 따라 수득된 양질의 바이러스 입자를 확인시킨다.

단백질 프로필의 HPLC 및 SDS-PAGE 분석

SDS-PAGE 분석:

20 ㎕의 샘플을 Laemmli 완충액(Nature 227 (1970) 680-685)에서 희석하고, 95℃에서 5분간 분해시킨 다음 Novex 겔 1 ㎜× 10 웰 구배 4 내지 20%상으로 로딩한다. 이동 후, 겔을 쿠마시 블루로 염색하고, Pharmacia VDS Image Master상에서 분석한다. 분석은 문헌 자료(Lennart Philipson, 1984 H.S. Ginsberg editors, Plenum press, 310-338)에 따라 상등액에서 수거된 바이러스에 대한 전기 영동 프로필을 보여준다.

역상 HPLC 분석:

도 2는 세포내적으로 수거된 두가지 바이러스 샘플과 상등액법으로 정제된 바이러스 샘플로부터 수득된 3 크로마토그램의 겹침을 보여준다. 실험 조건은 하기와 같다: Vydac 칼럼 참조 번호 254 Tp 5405, RPC4 4.6× 50 ㎜, 용매\A: H20+TFA 0.07%; 용매 B: CH3CN+TFA 0.07%, 직선 구배: T = 0분 %B=25; T-50분 %B=50%; 유동율 = 1 ㎖/분, 검출기=215 ㎚. 크로마토그램은 각 피크의 상대적인 강도에서 차이없이, 샘플간의 완벽한 확인을 보여준다. 각 피크의 성질은 서열에 의해 결정되고 단백질 존재가 모든 바이러스 기원임을 보여준다(하기 표 참조).

시험관 내에서 형질도입 및 세포독성의 효율 분석

MOI를 증가시키기 위해 24-웰 플레이트에 HCT116 세포를 감염시키고 크리스탈 바이올렛 염색 기법을 사용하여, 감염 후 2 및 5일만에, 비-감염된 대조군과 비교하여 생존 세포의 퍼센티지를 측정함으로써 독성 분석을 행한다.

결과는 하기 표에 나타나 있다:

형질 도입 효율의 분석

AD-β Gal 아데노바이러스의 경우, 바이러스 입자의 농도를 증가시킴에 따라, 24-웰 플레이트에서 배양된 복제 비-허용성 W162 세포를 감염시켜 제조물의 형질 도입 효율을 측정한다. 침착된 동량의 바이러스 입자의 경우, X-gal을 기질로 배양한 후 감염 48시간만에 베타-갈락토시다제 활성을 발현시키는 세포를 헤아린다. 각 청색 세포를 하나의 형질 도입 단위(TDU)로 계산하고, 여기서 나온 결과에 샘플의 형질도입 단위로서의 농도를 얻기위해 샘플의 희석배수를 곱한다. 바이러스 입자의 농도 : TDU 농도비를 계산하여 형질 도입 효율로 표현한다. 얻어진 결과는 정제된 바이러스가 시험관 내에서 우수한 형질도입 효율을 가짐을 보여준다.

생체 내에서 뇌내 발현의 분석

생체내에서 유전자 전달 및 발현을 위한 본 발명에 따른 아데노바이러스의 효율을 평가하기 위해, 아데노바이러스를 정위 경로를 통해 OF1 면역컴피턴트 마우스의 스트리애텀에 주입한다. 이를 위해, 10⁷ pfu의 바이러스 중 부피 1 ㎕를 하기의 정위 참조 지점(0 ㎜에서 절개선의 경우)에 주입한다: 전후 방향: +0.5; 메디오래터럴: 2; 깊이: -3.5.

주입 후 7일만에 뇌를 분석한다. 얻어진 결과는 형질도입 효율이 높음을 보여준다: 수천개의 형질도입 세포, 핵에서의 매우 강한 발현 및 원형질에서의 빈번한 강한 분산.

4.3. 바이러스 방출의 동역학

본 실시예는 캡시드화 세포 배양 상등액에서 아데노바이러스 방출의 동역학에 관한 연구를 기술하고 있다.

본 연구는 아데노바이러스 게놈 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드에 의한 반정량적 PCR에 의해 수행된다. 이러한 효과를 위해, dXTP(2 ㎕, 10 mM), 한쌍의 특정 올리고뉴클레오티드 및 10배 PCR 완충액에서 Taq 폴리머라제(Cetus)의 존재하에 선형 바이러스 DNA(1-10 ng)를 배양하고, 하기 조건하에 30회 증폭을 행한다: 91℃에서 2분, 30회(91℃에서 1분, 어닐링 온도에서 2분, 72℃에서 3분). 72℃에서 5분에 이어, 4℃에서 행함. 하기 서열의 올리고뉴클레오티드 쌍을 이용하여 PCR 실험을 수행한다:

- 쌍 1:

TAATTACCTGGGCGGCGAGCACGAT(6368) - 서열번호 1

ACCTTGGATGGGACCGCTGGGAACA(6369) - 서열번호 2

- 쌍 2:

TTTTTGATGCGTTTCTTACCTCTGG (6362) - 서열번호 3

CAGACAGCGATGCGGAAGAGAGTGA (6363) - 서열번호 4

- 쌍 3:

TGTTCCCAGCGGTCCCATCCAAGGT (6364) - 서열번호 5

AAGGACAAGCAGCCGAAGTAGAAGA (6365) - 서열번호 6

- 쌍 4:

GGATGATATGGTTGGACGCTGGAAG (6366) - 서열번호 7

AGGGCGGATGCGACGACACTGACTT (6367) - 서열번호 8

감염 후 다양한 시간 때에, Ad-β Gal로 감염된 세포 293의 상등액상에서 상등액 중의 유리 아데노바이러스의 양을 측정한다. 얻어진 결과는 도 3에 나타나 있다. 이는 세포 방출이 감염 후 5 또는 6일부터 시작됨을 보여준다.

기타 바이러스 측정 기법은 기타 캡시드화 주상에서, 동일한 목적, 및 아데노바이러스 유형에 이용될 수 있음이 이해된다.

실시예 5; 한외여과 및 이온 교환에 의한 바이러스의 정제

본 실시예는 농축물에 함유된 아데노바이러스가 직접 및 단일 이온-교환 크로마토크래피 단계에서 매우 높은 수율로 정제될 수 있는 방법에 관해 기술하고 있다.

5.1. 과정

본 실험에서, 개시 물질은 따라서 실시예 4에서 기술된 농축물(또는 한외여과 리텐테이트)로 구성된다. 이 리텐테이트는 PBS 완충액(10 mM 포스페이트, 150 mM NaCl을 함유한 pH 7.2)에서 5 내지 50 ㎎/㎖, 바람직하게는 10 내지 30 ㎎/㎖의 총 단백질 함량을 가진다.

바이러스 제조물로부터 수득된 한외여과 상등액을 250 mM NaCl, 1.0 mM MgCl₂ 및 10% 글리세롤(완충액 A)을 함유한 50 mM Tris-HCl 완충액 pH 8.0에서 평형이 이루어진 Source Q 15(Pharmacia)를 함유한 칼럼중에 주입한다. 완충액 A의 10 칼럼 부피로 세정한 후, 흡착된 부류를 25 칼럼 부피상에서 직선 NaCl 구배(250 mM - 1 M)를 이용하여, 60 내지 300 ㎝/시간, 바람직하게는 12 ㎝/시간의 직선 유동율로 용출시킨다. 260 ㎚에서 수득된 전형적인 용출 프로필은 도 4에 나타나 있다. 바이러스 입자를 함유한 분획을 수집한다. 이는 보유 시간이 초원심분리에 의해 정제된 바이러스 입자의 제조물을 이용하여 수득된 보유 시간과 일치하는 미세한 대칭 피크에 상응한다. 상술된 조건하에, 바이러스 입자 피크의 우수한 해상도를 보유하면서 Source Q 15 1 ㎖당 최소 30 ㎎의 총 단백질을 주입할 수 있다.

β-gal¹ 아데노바이러스 제조물을 이용하여 수행된 대표적인 실험(실시예 2)에서, 총 12.6 ㎎의 단백질을 Source Q 칼럼(1 β), 즉 5× 10¹⁰ PFU 및 1.6× 10¹⁰ TDU 중에 주입한다. 크로마토크래피(3.2 ㎖; 도 5) 후 수집된 바이러스 입자 피크는 173 ㎍의 단백질 및 3.2× 10¹⁰ PFU 및 2.3× 10¹⁰ TDU를 함유한다. 따라서 바이러스 입자를 70배(단백질의 양) 정제하면 정제 수율은 PFU가 64%이고 TDU가 142%(하기 표 참조)이다.

5.2. 순도

정제 단계 후, 수집된 분획은 하기 크로마토그래피 시스템에서 Source Q 칼럼(1 ㎖)상에서 고-해상 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석할 경우, 순도≥98% 바이러스 입자(260 ㎚에서 UV 검출)를 가진다: (실시예 5.1에 기재된 크로마토그래피에 의해 정제된 10 ㎕ 분획을 50 mM Tris/HCl 완충액 pH 8.0(완충액 B)에서 평형이 이루어진 Source Q15 칼럼(겔 1 ㎖; Pharmacia) 중에 주입함). 5 ㎖의 완충액 B로 세정한 후, 흡착된 부류를 B 완충액에서 30 ㎖의 NaCl(0 - 1 M)의 직선 구배를 이용하여 1 ㎖/분의 유동율로 용출시킨다. 용출된 부류는 260 ㎚에서 검출된다. 이 HPLC 분석(도 5)은 또한, 한외여과 리텐테이트에 존재하는 잔류 소혈청 알부민이 예비 크로마토그래핑 동안 완전히 제거됨을 보여준다. 정제된 분획내의 함량은 0.1%보다 작을 것으로 추정된다. 항-BSA 폴리클로날 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석(ECL 노출; Amersham)은 크로마토그래피 제조물에서 BSA의 함량이 바이러스 1 ㎎당 100 ng 이하임을 나타낸다.

크로마토그래피에 의해 정제된 아데노바이러스 분획의 전기영동 분석은 변형(SDS) 조건하에 폴리아크릴아미드 겔(4-20%)상에서 수행된다. 단백질 밴드는 은 나이트레이트에 의해 나타난다. 이러한 분석은 크로마토그래피에 의해 수득된 아데노바이러스 제조물이 기존의 초원심분리에 의해 수득된 제조물의 것과 적어도 동일한 순도 수준을 가짐을 보여주는데 이는 비-아데노바이러스 단백질에 의한 제조물의 오염원을 나타내는 추가 단백질 밴드를 가지지 않기 때문이다.

크로마토그래피에 의해 수득된 아데노바이러스 제조물은 1.30±0.05에 일치하는 흡광비 A_260㎚/A_280㎚를 가진다. 초원심분리에 의해 수득된 최상의 제조물의 경우에 얻어진 것과 일치하는 이 값은 제조물이 단백질을 오염시키거나 핵산을 오염시키지 않음을 나타낸다.

크로마토그래피-정제 Ad-β gal 바이러스상에서 실시예 4.2에 기재된 조건하에 수행된 전자 현미경에 의한 분석은 오염원, 집합체 및 빈 바이러스 입자가 없는(도 11) 맑은 제조물을 보여준다. 또한, 본 제조물의 세슘 클로라이드 구배 원심분리는 밀도 1.30의 단일 밴드를 보이는데, 이는 잠재적인 빈 입자 또는 캡시드 분획에 의한 크로마토그래피 제조물 오염원의 부재를 확인시킨다. 정제 동안, 바이러스에 대한 크로마토그래피 피크 다음에 맨 뒷부분에 쇼울더(또는 제 2 피크)가 있는데, 이는 주된 피크와 함께 수집되지는 않는다. 이러한 분획의 세슘 클로라이드 구배 초원심분리는 밀도 1.27의 밴드를 나타내고, 이러한 분획 조성물의 분석은 이것이 핵산을 함유하지 않음을 보여준다. 전자 현미경에 의한 분석은 이러한 분획이 표면에 구멍을 나타내는 비균일 형상의 입자를 함유함을 보여준다(도 12). 따라서 이는 속이 빈(DNA 결여) 불완전한 입자이다. 이는 따라서 크로마토그래피에 의한 아데노바이러스의 정제가 정제 이전에 소량의 제조물에 존재하는 빈 입자를 제거하였음을 입증한다.

5.3. ApoA1 또는 티미딘 키나제 단백질을 암호화하는 유전자와 같은 치료 유전자를 포함하는 아데노바이러스의 정제

본 실시예는 게놈 중에, 치료 단백질을 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스가 직접 및 단일 이온-교환 크로마토그래피 단계에서 정제되는 방법에 관해 기재하고 있다. 이는 또한 아데노바이러스의 크로마토그래피 행위가 다양한 이종 핵산 서열을 우난하는 상이한 아데노바이러스의 경우에 동일한 정제 공정이 이용될 수 있도록, 이것이 운반하는 이종 핵산 서열과 일치함을 보여준다.

전형적인 정제 실험에서, 게놈 중에, ApoA1 단백질을 암호화하는 이종 핵산 서열(실시예 2, WO 94/25073)은 실시예 5.1에 기재된 시스템에서 감염 10일 후 수거된 세포 배양의 농축된 상등액 18 ㎖(단백질 72 ㎎; 1.08× 10¹³ 입자)를 크로마토그래핑시켜 정제된다(도 6A). 크로마토그래피 후 수집된 바이러스 입자 피크(14 ㎖; 단배질 1.4 ㎎)는 92%의 입자 수율 및 51의 정제 인자를 나타내는 9.98× 10¹² 입자를 함유한다. 이러한 정제 단계 후, 수집된 분획은 5.2에 기재된 조건하에 크로마토그래피 분석 동안 바이러스 입자의 경우 98%보다 높은 순도(도 6B)를 가진다. 실시예 5.2에 기재된 조건하에 수행된 크로마토그래피에 의해 정제된 아데노바이러스 분획의 전기 영동 분석은 이러한 제조물이 기존의 초원심분리에 의해 수득된 제조물의 것과 적어도 일치하는 순도 수준을 가지고, 단백질을 오염시키거나 핵산을 오염시키지 않음을 보여준다.

또다른 전형적인 정제 실험에서, 게놈 중에, 유형 1의 허프스 심플렉스 티미딘 키나제 단백질(실시예 2, WO 95/14102)을 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스가 실시예 5.1에 기재된 시스템에서, 세포 배양의 농축된 상등액 36 ㎖(단백질 180 ㎎; 4.69× 10¹³ 입자)을 크로마토그래핑시켜 정제된다(도 7A). 크로마토그래피 후 수집된 바이러스 입자 피크(20 ㎖; 단백질 5.6 ㎎)는 91%의 입자 수율 및 32의 정제 인자를 나타내는 4.28× 10¹³ 입자를 함유한다. 이러한 정제 단계 후, 수집된 분획은 실시예 5.2에 기재된 조건 및 1.29의 흡광비하에 크로마토그래피 분석 동안 바이러스 입자의 경우 99%보다 큰 순도를 가진다(도 7B-D). 실시예 5.2에 기재된 조건하에 수행된 크로마토그래피에 의해 정제된 아데노바이러스 분획의 전기 영동 분석은 이러한 제조물이 기존의 초원심분리에 의해 수득된 제조물의 것과 적어도 일치하는 순도 수준을 가지고, 단백질을 오염시키거나 핵산을 오염시키지 않음을 보여준다.

5.4. 강 음이온 교환에 의한 세포내 아데노바이러스의 정제

본 실시예는 게놈 중에 단일 이온-교환 크로마토그래피 단계에서 직접 정제될 수 있는 이종 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스가 바이러스를 생성하는 캡시드화 세포의 용해액으로부터 가지는 방법에 관해 기술하고 있다.

전형적인 정제 실험에서, 게놈중에 β-gal 단백질을 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스는 실시예 5.1에 기재된 시스템(FineLine Pilot 35 칼럼, Pharmacia, source 15Q 수지 100 ㎖)에서 화학적 용해(1% Tween-20)에 의해 감염 후 3일만에 수거된 세포 배양의 농축 용해물 450 ㎖(즉 2.5× 10¹⁴ 입자)를 크로마토그래핑시켜 정제된다. 크로마토그래피 후 수집된 바이러스 입자 피크(110 ㎖)는 86%의 수율을 나타내는 2.15× 10¹⁴ 입자를 함유한다. 이러한 정제 단계 후, 수집된 분획은 5.2에 기재된 조건하에 크로마토그래피 분석 동안 98%보다 큰 바이러스 입자 순도를 가진다. 실시예 5.2에 기재된 조건하에 수행된 크로마토그래피에 의해 정제된 아데노바이러스 분획의 전기 영동 분석은 이러한 제조물이 기존의 초원심분리에 의해 수득된 제조물의 것과 적어도 일치하는 순도 수준을 가지고, 단백질을 오염시키거나 핵산을 오염시키지 않음을 보여준다.

5.5. 다양한 칼럼상에서 한외여과 및 이온-교환 크로마토그래피에 의한 바이러스의 정제

본 실시예는 동일한 분리 원리, 매트릭스의 4급 아민 그룹과 상호작용에 의한 음이온 교환으로 작업하는 동안, Source 15Q 지지체와 상이한 겔을 이용한 단일 이온-교환 크로마토그래피 단게에서 농축물에 함유된 아데노바이러스가 직접 정제될 수 있는 방법에 관해 기술하고 있다.

아데노바이러스의 정제를 위한 전형적인 실험에서, 다양한 재조합 아데노바이러스(β Gal, 아포리포단백질 AI 및 TK 암호)는 Source Q30 겔 칼럼상의 크로마토그래피에 이어 실시예 5.1에 기재된 프로토콜에 의해 정제된다. 얻어진 결과는 Source Q30 겔이 70 내지 100%의 수율과 함께, 85% 순도의 바이러스 제조물을 수득할 수 있게끔 해줌을 보여준다. 또한, 얻어진 결과는 Q30이 아데노바이러스 정제의 경우, 1000의 효율(이론상 플레이트 수로 표현됨) 및 0.5 내지 1× 10¹² vp/㎖(피크의 변형없이 크로마토그래핑이 가능한 바이러스의 최대량)를 보유하고 있음을 보여준다. 이러한 결과는 Source Q30 겔이 재조합 아데노바이러스의 정제에 적당할 수 있지만, 이의 특성은 Source Q15의 것(99%의 순도, 8000의 효율 및 2.5 내지 5× 10¹² vp/㎖의 수용능력)보다 우수하지 못함을 보여준다.

또다른 전형적인 아데노바이러스 정제 실험에서, β -Gal 아데노바이러스는 실시예 5.1에 기술된 과정을 이용하여 MonoQ HR 5/5 칼럼상에서의 크로마토그래피에 의해 정제된다. 이렇게 수득된 한외여과 리텐테이트 및 정제된 바이러스 제조물에 상응하는 크로마토그래피 상은 도 8에 기술되어 있다.

또다른 전형적인 아데노바이러스 정제 실험에서, β-Gal 아데노바이러스는 실시예 5.1에 기술된 과정을 이용하여 poros HQ/M 칼럼상에서의 크로마토그래피에 의해 정제된다. 이렇게 수득된 한외여과 리텐테이트 및 정제된 바이러스 제조물에 상응하는 크로마토그래피 상은 도 9에 기술되어 있다.

실시예 6: 한외여과 및 겔 투과에 의한 바이러스의 정제

본 실시예는 농축물(한외여과 리텐테이트)에 함유된 아데노바이러스가 매우 높은 수율로, 겔투과 크로마토그래피에 의해 직접 정제될 수 있는 방법에 관해 기술하고 있다.

6.1. 과정

실시예 4에서 수득된 한외여과 리텐테이트 200 ㎕(즉 단백질 1.3 ㎎)를 예를 들면 150 mM NaCl을 함유한 pH 7.2의 PBS 완충액(완충액 C)에서 평형화된 Sephacryl S-1000SF(Pharmacia)로 충진된 HR 10/30 칼럼(Pharmacia) 중으로 주입한다. 부류를 분획화하고 0.5 ㎖/분의 유동율로 완충액 C를 이용하여 용출시킨 다음 260 ㎚에서 UV에 의한 칼럼의 아울렛에서 검출된다. 다르게는, 동일한 작업 조건하에, 100 ㎚ 내지 1000 ㎚의 입자에 대한 카럼 Sephacryl S-1000HR보다 우수한 해상도를 나타내는 Sephacryl S-2000으로 충진된 칼럼을 이용할 수 있다.

상술된 두가지 겔 투과 크로마토그래피 시스템의 해상도는 완충액 C로 평형화된 부류(Sephacryl S-1000HR 또는 S-2000 칼럼에 이은 Superdex 200 HR 칼럼)로 커플링된 2 HR 10/30 칼럼(Pharmacia) 시스템상에서 한외여과 상등액(200 ㎕)을 크로마토그래핑시켜 유리하게 증진될 수 있다. 본 부류는 완충액 C를 이용하여 0.5 ㎖/분의 유동율로 용출되고 260 ㎚에서 UV로 검출된다. 이 시스템에서, 바이러스 입자 피크는 Sephacryl S-1000 HR 또는 Sephacryl S-2000 칼럼만으로 구성된 시스템에서보다 낮은-분자량 부류로부터 매우 명확하게 잘 분리된다.

대표적인 실험에서, 한외여과 리텐테이트(200 ㎕, 단백질 1.3 ㎎)는 2 Sephacryl S-1000HR-Superdex 200 HR 10/30 칼럼 시스템상에서 크로마토그래핑된다(도 10). 바이러스 입자를 함유한 크로마토그래피 피크가 수집된다. 유지 시간은 초원심분리에 의해 정제된 바이러스 입자 제조물의 경우 얻어진 보유 시간과 일치한다. 크로마토그래피 후 수집된 바이러스 입자 피크(7 ㎖)는 28 ㎍의 단백질과 3.5× 10⁹ PFU를 함유한다. 실시예 5.2에 기재된 조건하에 분석용 이온-교환 크로마토그래피에 의한 분석은 분석용 칼럼상에 좀더 강하게 남아있는 오염화 피크의 존재를 보여주고, 이의 표면적은 바이러스 피크 표면적의 약 25%를 나타낸다. 1.86 값을 가진 260 ㎚/280 ㎚ 흡광도 비는 이러한 오염화 피크가 핵산에 상응함을 나타낸다. 따라서 바이러스 입자는 약 50배(단백질 량)로 정제되고 정제 수율은 PFU의 경우 85%이다.

다르게는, 완충액 C로 평형화된 TSK G6000 PW 칼럼(7.5× 300 ㎜; TosoHaas) 상에서 바이러스 입자의 제조물(음이온-교환 크로마토그래피의 아울렛에서의 한외여과물 또는 분획)을 크로마토그래핑할 수 있다. 부류는 완충액 C를 이용하여 0.5 ㎖/분의 유동율로 용출되고 260 ㎚에서 UV로 검출된다. 또한, 완충액 C로 평형화된 부류[TSK G6000 PW 칼럼(7.5× 300 mm)에 이은 Superdex 200 HR 칼럼]로 커플링된 2 칼럼 시스템상에서 한외여과 상등액(50 내지 200 ㎕)을 크로마토그래핑시켜, 크로마토그래피 시스템의 해상도, 특히 지-분자량의 부류로부터 바이러스 입자 피크의 분리를 증가시키는 것이 유리할 수 있다. 이 부류는 완충액 C를 이용하여 0.5 ㎖/분의 유동율로 용출되고 260 ㎚에서 UV로 검출된다.

실시예 7: 한외여과, 이온 교환 및 겔 투과에 의한 바이러스의 정제

음이온-교환 크로마토그래피로부터 유도된 바이러스 입자 분획(실시예 5)을 예를 들면 바이러스 입자의 순도 수준을 추가로 개선시킴과 동시에, 주로 바이러스 제조물과 친화적이거나 이의 차후 용도(주입, 등)에 적합한 배지에 바이러스 입자를 패킹시키기 위해 상술된 겔 투과 크로마토그래피 시스템 중 하나에서 유리하게 크로마토그래핑될 수 있다.

본 발명은 재조합 아데노바이러스의 새로운 생산방법에 대하여 설명한다. 본 발명에 따른 공정은 생산 단계 수준 및/또는 정제 단계 수준에서 기존 공정의 변형에서 유도된다. 본 발명에 따른 공정에 의해 바이러스 스톡을 매우 높은 양과 품질로써 매우 신속하고 양산화 가능한 방식으로 수득할 수 있다.

본 발명의 제 1 면 중 하나는 특히, 바이러스가 배양 상등액으로부터 수거되는 재조합 아데노바이러스의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 다른 일면은 한외여과 단계를 포함하는 아데노바이러스 제조방법에 관한 것이다. 다른 일면에 따라, 본 발명은 또한, 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 정제 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 임의로 음이온 교환 크로마토그래피와 커플링된 겔 투과 크로마토그래피를 이용하는 개선된 정제방법에 대해서도 설명한다. 본 발명에 따른 공정에 따르면, 순도, 안정성, 형태 및 감염력에 있어서, 매우 높은 수율과함께 양산화 요구조건과 치료 분자의 생산과 관련된 법제에 완전히 부합될 수 있는 생산조건하에 양질의 바이러스를 수득할 수 있다.

특히, 산업화면에서, 본 발명의 공정은 마이크로 여과 또는 깊이 여과, 및 접선 한외여과와 같은, 재조합 단백질에 대해 대규모상에서 입증된 배양상등액의 처리방법을 이용한다. 더욱이, 37℃에서 바이러스의 안정성으로 해서, 본 공정은 내세포법과는 대조적으로, 수거 시간이 반나절내에서는 정확해야 할 필요가 없기 때문에 공업적 단계의 더 양호한 구성을 허용한다. 더욱이 몇몇 영역이 결손된 바이러스의 경우 특히 중요한 바이러스의 최대 수확을 보장한다. 또한, 본 발명의 공정은 예비처리 없이 상등액의 균질 샘플로부터 직접적으로 생산 동역학을 더욱 용이하고 더욱 정확하게 모니터링할 수 있게 하여 생산의 재현성이 더 양호해진다. 본 발명에 따른 공정은 또한 세포 용해 단계를 필요없게 할 수 있다. 따라서, 공업적 수준에서 동결-해동 사이클에 의한 세포 파괴를 구상하는 것이 곤란해질 수도 있다. 더욱이, 대안의 용해방법(Dounce, X-프레스, 음파처리, 기계적 전단 등)은 단점을 안고 있으며; 이들은 L2 또는 L3 바이러스를 속박하기 곤란한 에어로졸의 잠정적인 생성자이며(병원성 또는 전파 양식에 따라 바이러스의 속박 수준), 이들 바이러스는 또한, 공기를 통한 경로에 의해 감염되는 경향이 있으며; 이들은 통제하기가 어렵고 제제의 활성을 감소시키는 전단력 및/또는 열 방출을 생성한다. 세포 용해를 위한 세제 사용 용액은 유효하도록 요구될 것이며 또한 세제 제거의 유효함을 요할 것이다. 최종적으로, 세포 용해는 정제를 더 복잡하게 만드는 수많은 세포 파편을 배지에 존재하게 한다. 바이러스 품질면에서, 본 발명의 공정은 잠정적으로 바이러스의 더 양호한 성숙을 허용하여 더 균질한 집단을 생성한다. 특히, 바이러스 DNA 패키징이 바이러스 사이클의 최종 단계이므로, 세포의 때이른 용해는 비록 비-복제성이지만, 감염성이고 바이러스에 특이적인 독성 효과에 참여할 수 있고 수득된 제제의 특정 활성비를 증가시킬 수 있는 속이 빈 입자를 잠정적으로 방출한다. 제제의 특정 감염력 비는 생화학적 방법(OD260nm, CLHP, PCR, 면역효소법 등)으로 측정한 바이러스 입자의 총수 : 생물학적 효과(고체 배지내 배양시 세포상 용해 파지의 형성, 세포의 형질도입)를 생성하는 바이러스 입자의 수의 비로서 정의된다. 실질적으로, 정제된 제제의 경우 이러한 비는 260nm에서 OD에 의해 측정된 입자의 농도 : 제제의 플라크 형성 단위의 농도 비를 게산해냄으로써 측정한다. 이러한 비는 100 이하이어야 한다.

수득된 결과로서 본 발명의 과정에 의해 농축 바이러스 상등액을 출발물질로 하여, 선행 처리 없이 일단계로, 세슘 클로라이드 구배 농도에 의해 정제된 상동체와 적어도 동등한 순도를 갖는 바이러스를 수득할 수 있음을 알 수 있다.

따라서 본 발명의 제 1 목적은 바이러스 DNA를 캡시드화 세포 배양액 중으로 도입하고, 생성된 바이러스를 배양 상등액 중으로 방출한 뒤에 수거함을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스 제조 방법에 관한 것이다. 바이러스가 기계적으로 또는 화학적으로 수행된 때이른 세포 용해 뒤에 수거되는 선행기술 방법과는 대조적으로, 본 발명의 방법의 경우에는 세포가 외부요인에 의해 용해되지 않는다. 더 긴 기간 동안 배양을 지속하고, 캡시드화 세포에 의한 동시 방출 후에 바이러스를 상등액에서 직접 수거한다. 본 발명에 따른 바이러스는 따라서 세포 상등액에서 회수되는 반면에, 선행기술 방법의 경우, 이는 내세포성, 특히 핵간 바이러스이다.

본 출원인은, 배양 지속기간을 연장시키며 대 용적 사용함에도 불구하고, 본 발명에 따른 방법에 의해 바이러스 입자를 다량으로 및 더 우수한 품질로 생성 할 수 있음을 밝혀내었다. 또한, 전술한 바와 같이, 이러한 공정은 산업수준에서 번거럽고 다수의 불순물을 생성하는 용해 단계를 피할 수 있게 해준다.

따라서, 방법의 원리는 상등액 중으로 방출된 바이러스의 수거에 기초한다. 이러한 방법은 세포 용해에 기초한 선행기술에 대한 것보다 배양시간을 더 길게 할 수 있다. 전술한 바와 같이, 수거 시간은 반나절내에서 정확하여야 할 필요는 없다. 이는 본질적으로 세포 상등액 중으로의 바이러스 방출 동역학에 의해 결정된다.

바이러스 방출의 동역학은 다양한 방법으로 모니터링될 수 있다. 특히, RP-HPLC, IE-HPLC, 반정량적 PCR(실시예4.3), 트립판 블루에 의한 사멸세포의 염색, LDH형 내세포 효소의 방출 측정, 쿨터형 장치 또는 광산란에 의한 상등액내 입자의 측정, 면역학적 방법(ELISA, RIA 등) 또는 현탁액내 세균 계량법, 항체 존재하 응집에 의한 적정과 같은 분석방법을 이용하는 것이 가능하다.

바람직하게는, 수거는 바이러스의 적어도 50%가 상등액 중으로 방출될 때 수행된다. 바이러스의 50%가 방출될 때의 시간은 전술한 방법에 따른 동역학을 도출하여 용이하게 측정할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 수거는 바이러스의 적어도 70%가 상등액 중으로 방출될 때 수행된다. 바이러스의 적어도 90%가 상등액 중으로 방출될 때, 즉 동역학이 안정수준기에 도달할 때 수거를 수행하는 것이 특히 바람직하다. 바이러스 방출의 동역학은 본질적으로 아데노바이러스 복제 사이클에 기초하며 특정 요인에 의해 영향받을 수 있다. 특히, 사용된 바이러스 유형, 및 특히 재조합 바이러스 게놈에 생긴 결실 유형에 따라 변할 수 있다. 특히, E3 영역의 결실은 바이러스의 방출을 지연시키는 것으로 보인다. 따라서, E3 영역의 존재하에, 바이러스는 24 내지 48 시간 후-감염으로부터 수거될 수 있다. 이와는 대조적으로, E3 영역의 부재하에, 더 긴 배양시간이 필요한 것으로 보인다. 이와 관련하여, 본 출원인은 세포 상등액내 E1 및 E3 영역이 결핍된 아데노바이러스의 방출 동역학에 대해 실험을 수행하였으며, 방출이 감염 약 4 내지 5일 후 개시되어 대략 14일째까지 지속함을 알아내었다. 방출은 일반적으로 8일째 내지 14일째 사이에 안정상태에 도달하고, 역가는 적어도 20일 후-감염 동안 안정하게 남는다.

바람직하게는, 본 발명의 공정에서, 세포는 2 내지 14일간 동안 배양된다. 더욱이, 바이러스의 방출은 캡시드화 세포에서, 바이러스의 방출에 연루된, 단백질, 예를 들면, 바이러스 단백질의 발현에 의해 유도될 수 있다. 따라서, 아데노바이러스의 경우, 방출은 임의로 유도성 프로모터의 조절하에 발현된, 아데노바이러스의 E3 영역에 의해 암호화된 사멸 단백질(단백질 E3-11.6K)의 발현에 의해 조정될 수 있다. 이러한 이유로 해서, 바이러스 방출 시간을 조절하고 배양 상등액에서 24 내지 48 시간 감염후 바이러스의 50% 이상을 수거할 수 있다.

바이러스 입자를 회수하기 위하여, 배양 상등액을 유리하게는 사전에 여과하는 것이 유리하다. 약 0.1 ㎛(120 nm) 크기의 아데노바이러스에서, 여과는 바이러스를 통과시키기에 충분히 크지만, 오염물을 보유시키기에는 충분히 미세한 다공성을 갖는 막에 의해 수행한다. 바람직하게는, 여과는 0.2 ㎛ 이상의 다공성을 갖는 막에 의해 수행된다. 특히 유리한 양태에 따라, 여과는 감소하는 다공성 막에서 연속적인 여과에 의해 수행한다. 특히 우수한 결과는 감소하는 다공성 10 ㎛, 1.0 ㎛ 및 0.8 내지 0.2 ㎛의 깊이 필터상에서 여과를 수행함으로써 수득된다. 바람직한 별법에 따라, 여과는 편평막 또는 중공 섬유상에서의 접선 미세여과에 의해 수행된다. 특히 다공성이 0.2 내지 0.6 ㎛인 편평한 밀리포어 막 또는 중공 섬유를 사용하는 것이 가능하다. 실시예에 제시된 결과는 이러한 여과 단계로 100% 수율(최저 다공성을 갖는 필터상에 보유시킴으로써 바이러스의 어떠한 손실도 관찰되지 않았다)이 달성됨을 보여준다.

본 발명의 다른 일면에 따라, 본 출원인은 상등액으로부터 바이러스를 수거 및 정제할 수 있게 하는 방법을 개발하였다. 이런 취지로, 여과된(또는 청정화된) 상등액을 한외여과시킨다. 이러한 한외여과에 의해 (i) 상등액을 농축(수반된 용적이 커짐)할 수 있고, (ii) 바이러스를 1차 정제할 수 있으며 (iii) 후속 제조단계에 대해 완충제를 조정할 수 있다. 바람직한 양태에 따라, 상등액은 접선 한외여과에 투입된다. 접선 한외여과는 측정된 컷-오프를 갖는 막에 의해 분리된 두 구획, 보유물과 여액간의 용액 농축 및 분획화, 장치의 보유물 구획내 유동 생성 및 이러한 구획과 여액 구획 간의 수송막 압력을 적용함에 있다. 유동은 일반적으로 장치의 보유물 구획내 펌프에 의해 생성되고 수송막 압력은 보유물 회로의 액체 스트림에 대한 밸브 또는 여액 회로의 액체 스트림에 대한 가변용량 펌프에 의해 조절될 수 있다. 유속과 수송막 압력은 막의 차단을 피하면서, 낮은 전단력(5000 sec^-1, 바람직하게는 3000 sec^-1 이하의 레이놀즈 수, 1.0 바 이하의 압력)을 발생시키도록 선택된다. 예를 들면, 나선형 막 (Millipore, Amicon), 편평막 또는 중공 섬유(Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF, Sepracor)과 같은 다양한 시스템이 한외여과 수행에 사용될 수 있다. 약 1000 kDa 질량을 갖는 아데노바이러스, 컷-오프가 1000, 바람직하게는 100 kDa 내지 1000 kDa 막이 본 발명의 프레임워크내에서 유리하게 사용된다. 컷-오프가 1000 kDa 이상인 막을 사용함으로써 본 단계에서 바이러스가 상당히 소실된다. 바람직하게는 컷-오프가 200 내지 600 kDa, 더욱 바람직하게는 300 내지 500 kDa인 막이 사용된다. 실시예에 제시된 실험은 컷-오프가 300 kDa인 막을 사용하면 배지로부터 오염물(DNA, 배지내 단백질, 세포 단백질 등)을 제거하면서 바이러스 입자를 90% 이상 보유할 수 있게 함을 보여준다. 500 kDa의 컷-오프 사용은 동일 이점을 제공한다.

실시예에 제시된 결과는 이러한 한외여과 단계에 의해 바이러스의 손실없이(90%의 수율) 상등액의 대 용적을 농축시킬 수 있으며, 더 양호한 품질의 바이러스를 생성함을 예시한다.

따라서, 이러한 한외여과는 컷-오프(300 또는 500 kDa)보다 작은 질량을 갖는 오염물이 적어도 부분적으로 제거되므로 통상적인 전략에 비해 추가적인 정제를 구성한다. 두 공정에 따른 제 1 한외 여과 단계 후에 분리 양태를 비교하였을 때 바이러스 제제 품질이 증진된다는 것은 자명하다. 용해를 수반하는 통상적인 공정의 경우에는 바이러스 제제의 튜브는 종종 바이러스 밴드를 띤 응괴(지질, 단백질)와 함께 흐릿한 형태를 갖지만, 본 발명의 공정에 경우에는, 방출 및 한외여과 후 제제는 상부상에 지속되는 배지내 오염물로부터 이미 잘 분리된 밴드를 갖는다. 본 발명에 설명된 바와 같이 한외여과에 의해 수득된 바이러스에 대해 세포 용해에 의해 수득한 바이러스의 이온 교환 크로마토그래피 프로필을 비교하였을 때 품질의 증진이 또한 입증된다. 더욱이, 농축물을 투석여과에 의해 한외여과 함으로써 품질을 더욱 증진시킬 수 있다. 이러한 투석여과는 접선 한외여과에서와 동일한 원리로 수행되고, 그로써 정제 완충제에서 농축물을 평형시키면서, 막 컷-오프 이상의 크기를 갖는 오염물을 완전히 제거할 수 있다.

더욱이, 본 출원인은 또한, 이러한 한외여과가 이온 교환 칼럼상에서의 크로마토그래피에 의해 또는 겔 투과 크로마토그래피에 의해 직접 바이러스를 정제하여 크로마토그래피에 앞서 제제를 처리할 필요없이 바이러스 입자 피크의 탁월한 분해를 수득할 수 있게 됨을 알아내었다. 이는 특별히 예상되지 않은 것으로서, 이점이 있는 것이다. 사실상, 상기에서 인용된 Hyughe 등에 의한 문헌에 적시된 바와 같이 바이러스 제제의 크로마토그래피 정제는 평범한 결과를 부여하고 추가로 벤조나제 및 사이클로덱스트린으로 바이러스 현탁액을 예비처리할 것을 요한다.

구체적으로 말해서, 본 발명에 따른 공정은 따라서 바이러스가 한외여과에 의해 수거됨을 특징으로 한다.

전술한 바와 같이, 생성되는 농축물은 바이러스 정제에 직접 사용될 수 있다. 이러한 정제과정은 크기, 밀도 또는 침강계수에 따라 입자가 분리되도록 허용하는 세슘 클로라이드 또는 다른 한외여과 매질상에서의 원심분리와 같은 기존의 기술에 의해 수행될 수 있다. 실시예 4에 제시된 결과는 사실, 수득된 바이러스가 현저한 특성을 지니고 있음을 보여준다. 특히, 본 발명에 따라, 세슘 클로라이드를 아이오딕사놀, 5,5'-[(2-하이드록시-1,3-프로판디일)비스(아세틸이미노)]-비스[N,N'-비스(2,3-디하이드록시프로필)-2,4-트리아이오도-1,3-벤젠디카복사미드]의 용액으로 대치가능하고, 이 용액에서 바이러스는 1.16 내지 1.24의 상대밀도에서 평형상태에서 침강한다. 이러한 용액의 사용은 세슘 클로라이드와는 달리 무독하기 때문에 유리하다. 더욱이, 출원인은 또한, 유리하게는 수득된 농축물이 또한 이온 교환 메커니즘에 의해 또는 겔 투과에 의해 직접 바이러스를 정제하고, 예비처리의 필요없이 바이러스 입자 크로마토그래피 피크의 탁월한 분해를 수득할 수 있게 해준다.

바람직한 양태에 따라, 바이러스는 따라서 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 수거되고 정제된다.

음이온 교환 크로마토그래피의 경우, 셀룰로스, 아가로스(세파로스 겔), 덱스트란(세파덱스 겔), 아크릴아미드(세파크릴 겔, 트리스아크릴 겔), 실리카(TSK 겔-SW 겔), 폴리(스티렌-디비닐벤젠)(Source 또는 Poros 겔), 에틸렌글리콜-메타크릴레이트 공중합체(Toyopearl HW 겔 및 TSK 겔-PW 겔), 또는 혼합물(아가로스-덱스트란: 슈퍼덱스 겔)과 같은 다양한 유형의 지지체가 사용될 수 있다. 더욱이, 크로마토그래피의 분해를 증진시키기 위해, 본 발명의 프레임워크내에서, 다음과 같은 특징을 지닌 비드 형태의 지지체를 사용하는 것이 바람직하다:

-가능한 한 구형,

-보정된 직경(모두 동일하거나 가능한 한 균질인 비드), 결함이나 파괴 없음,

-최소 가능 직경: 10 ㎛의 비드가 기술됨(예를 들면, Pharmacia로부터의 MonoBeads 또는 OosoHaas로부터의 TSK). 이러한 값은 또한 물체가 비드 내측에 크로마토그래피되도록 하기 위해 다공성이 매우 높아야하는 비드의 직영에 대한 하한선을 구성하는 것으로 보인다.

-압력에 견디기 위해 경질성 유지.

더욱이, 초대형 크기(직경 100 nm 이상)의 물체를 구성하는 아데노바이러스를 크로마토그래피하기 위해서는, 바이러스 입자가 관심의 대상이 되는 작용 그룹에 접근될 수 있도록 높은 다공성 상한선을 갖는, 또는 심지어 가능한 한 다공성이 높은 겔을 사용하는 것이 중요하다.

유리하게도, 지지체를 아가로스, 덱스트란, 아크릴아미드, 실리카, 폴리[스티렌-디비닐벤젠], 에틸렌글리콜-메타크릴레이트 공중합체 중에서 단독으로 또는 혼합체로서 선택한다.

음이온 교환 크로마토그래피의 경우에, 사용된 지지체는 음이온성 분자와 상호작용할 수 있는 그룹을 이식함으로써 작용화되어야 한다. 좀더 일반적으로, 그룹은 3급 또는 4급일 수 있는 아민으로 이루어진다. 예를 들면, DEAE와 같은 3급 아민을 사용함으로써, 약 음이온성 교환제가 수득된다. 4급 아민을 사용함으로써 강 음이온 교환제가 수득된다.

본 발명의 프레임워크 내에서, 강 음이온성 교환제를 사용함이 특히 유리하다. 따라서, 상기에 지적된 바와 같은 4급 아민에 의해서 작용화된 크로마토그래피 지지체는 바람직하게 본 발명에 따라서 사용된다. 4급 아민에 의해서 작용화된 지지체 중에서, 예로서 수지 Source Q, Mono Q, Q Sepharose, Poros HQ 및 Poros QE, Fractogel TMAE 유형의 수지 및 Toyopearl Super Q 수지가 언급될 수 있다.

본 발명의 프레임워크 내에서 사용될 수 있는 수지의 바람직한 예는 Source, 특히 Source Q, 예를 들면, 15 Q (Pharmacia), MonoBeads, 예를 들면, Q (Pharmacia), Poros HQ 및 Poros OE 유형 수지이다. MonoBeads 지지체 (비드 직경 10 ± 0.5 ㎛)가 10 년 이상, Source (15 ㎛) 또는 Poros (10 ㎛ 또는 20 ㎛) 유형의 수지가 약 5 년 동안 시판되어 왔다. Source 또는 Poros 지지체는 매우 광범위한 내부 포어 분포 (이들은 20 nm 내지 1 ㎛ 범위임)를 갖는 장점을 나타내고, 이렇게 하여 비드를 통한 매우 큰 물체의 통과를 허용한다. 또한, 이들은 순환에 대한 매우 적은 내성 또는 겔을 통한 액체(그러므로 매우 적은 압력)를 제공하고 매우 경질이다. 그러므로, 상호작용할 작용 그룹을 향한 용질의 수송은 매우 신속하다. 본 출원인은 분산이 그 크기로 인하여 느린 아데노바이러스의 경우에 특히 중요하다는 것을 밝혀냈다.

실시예에 제시된 결과는 아데노바이러스가 정제 수율이 우수하고(tdu의 경지에서, Huyghes 등에 의해 보고된 49%의 값과 비교하여) 분해력이 우수한 단일 음이온-교환 크로마토그래피 단계에서 농축물로부터 정제될 수 있다. 또한, 제시된 결과는 수득된 아데노바이러스가 높은 감염성을 지니고, 따라서 치료 용도를 위해서 요구되는 특성을 지님을 예시한다. 특히 유리한 결과가 강 음이온 교환제로 수득되고, 즉, 특히 수지 Source Q로 4급 아민에 의해서 작용화된다. 수지 Source Q15가 특히 바람직하다.

이에 관하여, 본 발명의 다른 요지는 강 음이온-교환 크로마토그래피에 의한 정제단계를 포함함을 특징으로 하는 생물학적 배지로부터의 재조합 아데노바이러스의 정제방법에 관한 것이다.

이러한 변형에 있어서, 생물학적 배지는 바이러스를 생성하는 캡시드화 세포의 현탁액, 바이러스를 생성하는 캡시드화 세포의 용해물 또는 바이러스 정제 용액일 수 있다.

바람직하게는, 크로마토그래피는 4급 아민으로 작용화된 지지체에서 수행된다. 또한 바람직한 양식에 있어서, 지지체가 아가로스, 덱스트란, 아크릴아미드, 실리카, 폴리[스티렌-디비닐벤젠], 에틸렌글리콜-메타크릴레이트 공중합체 중에서 단독 또는 혼합물로서 선택된다.

특히 유리한 양태는 크로마토그래피가 Source Q 수지, 바람직하게는 Q15에서 수행됨을 특징으로 한다.

또한, 상술된 방법은 유리하게는 생성 세포의 현택액을 사용하여 수행되고 예비 한외여과 단계를 포함한다. 이 단계는 유리하게는 상술된 조건 하에서 수행되고 특히 이것은 300 내지 500 kDa의 컷-오프를 지닌 막에서의 접선 한외여과이다.

본 발명 방법의 다른 양태에 있어서, 바이러스가 수득되고 겔 투과 크로마토그래피에 의해서 정제된다.

겔 투과는 상등액, 농축물, 또는 음이온-교환 크로마토그래피로부터 유도된 바이러스 상에서 직접 실행될 수 있다. 음이온-교환 크로마토그래피에 대해서 언급된 지지체가 작용화되지 않으면서 이 단계에서 사용될 수 있다.

이에 관하여, 바람직한 지지체는 아가로스 (Sepharose 겔), 덱스트란 (Sephadex 겔), 아크릴아미드 (Sephacryl 겔, Trisacryl 겔), 실리카 (TSK 겔-SW 겔), 에틸렌글리콜-메타크릴레이트 공중합체 (Toyopearl HW 겔 및 TSK 겔-PW 겔), 또는 혼합물 (아가로스-덱스트란: Superdex 겔)이다. 특히 바람직한 지지체는

-Superdex 200HR (Pharmacia)

-Sephacryl S-500HR, S-1000HR 또는 S-2000 (Pharmacia)

-TSK G6000 PW (TosoHaas)이다.

그러므로, 본 발명에 따른 바람직한 방법은 한외여과에 이은 음이온-교환 크로마토그래피를 포함한다.

바람직한 방법은 한외여과에 이은 음이온-크로마토그래피, 이어서 겔 투과 크로마토그래피를 포함한다.

본 발명의 변형은 제 1 단계의 한외여과, 제 2 단계의 희석 또는 투석 및 제 3 단계의 음이온-교환 크로마토그래피를 포함하는 생물학적 배지로부터 아데노바이러스 정제방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 변형에 있어서, 제 1 단계는 세슘 클로라이드 구배의 신속한 한외여과에 의해서 수행된다. 용어 신속한이란 약 0.5 내지 4 시간 범위의 한외여과를 의미한다. 제 2 단계 동안, 크로마토그래피 겔에의 주입 및 한외여과 매질의 제거를 촉진하기 위해서 완충제에 대해서 바이러스를 희석하거나 투석한다. 제 3 단계를 상술된 바와 같이, 음이온, 바람직하게는 강 음이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 수행한다. 전형적인 실험에서, 상등액(또는 임의로 세포내)에서 수득된 바이러스로 시작하여 세슘 클로라이드로써 제 1 한외여과를 실행한다 (실시예 3에서와 같이). 다음, 완충제내 샘플의 단순 희석 (예를 들면, 완충제 10 용적으로) 후 또는 단순 투석 후, 샘플을 이온-교환 크로마토그래피에 투입한다 (실시예 5.1 에서와 같이). 본 발명 방법의 이러한 변형의 장점은 총 2가지의 상이한 바이러스 분리 양식 (밀도 및 표면 저하)를 사용한다는 사실로부터 유래하고, 이는 아마도 바이러스로 하여금 2가지 방법의 성능을 결합시키는 품질의 수준을 갖게할 수 있다. 또한, 크로마토그래피 단계에 의해 한외여과(예를 들면, 세슘 클로라이드 또는 상술된 바와 같은 다른 동등한 매질)에 사용되는 매질을 동시에 제거할 수 있다.

본 발명의 다른 요지는 아데노바이러스 정제를 위한 아이오딕사놀, 5,5'-[2-하이드록시-1,3-프로판디일)비스(아세틸이미노)]비스[N,N'-비스(2,3-디하이드록시프로필)-2,4,6-트리아이오도-1,3-벤젠디카복사미드]의 사용에 관한 것이다.

본 발명 방법을 수행하기 위해서, 다양한 아데노바이러스 캡시드화 세포가 사용될 수 있다. 특히, 캡시드화 세포는 다양한 약학적으로 유용한 세포, 즉, 산업적으로 허용되는 조건하에서 배양할 수 있지만 인식되는 병리학적 특성을 지니지 않는 세포로부터 제조될 수 있다. 이들은 세포주 또는 제 1 배양물 및 특히 인간 망막아종, 인간 폐암 세포, 또는 배아 신장세포를 성립할 수 있다. 이들은 유리하게는 아데노바이러스에 의해서 감염될 수 있는 인간 기원의 세포일 수 있다. 이에 관하여, KB, Hela, 293, Vero, gmDBP6, HER, A549, HER 세포 등이 언급될 수 있다.

KB의 세포주는 인간 상피 암종으로부터 유도된다. 이것은 ATCC (ref. CCL17) 및 이의 배양을 허용하는 조건에서 입수가능하다. 인간 세포주 Hela는 인간 상피 암종으로부터 유도된다. 이것은 또한 ATCC (ref. CCL2) 및 이의 배양을 허용하는 조건에서 입수가능하다. 세포주 293은 인간 배아 신장세포이다 [참조문헌: Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59]. 이러한 세포주는 특히 이의 게놈에 통합된 인간 아데노바이러스 Ad5 (12%) 게놈의 좌측부를 함유한다. 세포주 gm DBP6 [참조문헌: Brough et al., Virology 190 (1992) 624]는 MMTV LTR의 조절 하에서 아데노바이러스 E2 유전자를 운반하는 Hela 세포로 이루어진다.

이들은 또한 개 기원 (BHK, MDCK 등)의 세포일 수 있다. 이에 관하여, 고양이의 MDCK 세포주가 바람직하다. MDCK 배양을 위한 조건은 특히 문헌[참조: Macatney et al., Science 44 (1988) 9.]에 기재되어 있다.

다양한 캡시드화 세포주가 문헌에 기재되어 있고 실시예에 언급되어 있다. 이들은 유리하게는 아데노바이러스 E1 기능을 트랜스상보화하는 세포이다. 좀더 바람직하게는, 이들은 아데노바이러스 E1 및 E4 또는 E1 및 E2a 기능을 트랜스상보화하는 세포이다. 이러한 세포는 바람직하게는 신장 또는 망막 세포, 또는 인간 폐 암종으로부터 유도된다.

따라서, 본 발명은 특히 유리한 재조합 아데노바이러스의 생성방법을 제공한다. 이러한 방법은 하나 이상의 영역에 결손이 있는 재조합 바이러스, 특히 E1 영역에 대해 또는 E1 및 E4 영역에 대해 결손이 있는 바이러스의 생성에 적합하다. 또한, 상기에 지적된 바와 같이 이것을 다양한 혈청형의 아데노바이러스 생성에 적용할 수 있다.

특히 유리한 양식에 따라서, 본 발명의 방법은 E1 영역이 Ad5 아데노바이러스 서열에서 뉴클레오티드 454에서 뉴클레오티드 3328을 스트렛칭하는 PvuII-Bg1II 단편의 결실에 의해서 불활성화되는 재조합 아데노바이러스의 생성에 사용된다. 이러한 서열은 문헌 및 데이터베이스에서 입수가능하다(특히 Genebank 제 M73260 참조). 다른 바람직한 양태에서, E1 영역은 뉴클레오티드 382에서 뉴클레오티드 3446을 스트렛칭하는 HindfII-Sau3A 단편의 결실에 의해서 불활성화된다. 특정 양식에서, 방법은 E4 영역 전체의 결실을 포함하는 벡터의 생성을 허용한다. 이것은 뉴클레오티드 35935에서 32720에 상응하는 MaeII-MscI 단편의 절제에 의해서 수행될 수 있다. 다른 양식에서, E4의 작용부만이 결실된다. 이러한 부분은 적어도 ORF3 및 ORF6 프레임을 포함한다. 실시예에 의해서, 이러한 판독 프레임이 뉴클레오티드 34801에서 34329 및 34115에서 33126 각각에 상응하는 pvuII-AluI 및 BgIII-PvuII 단편 각각의 형태로 게놈으로부터 결실될 수 있다. 바이러스 Ad2 이 808 또는 바이러스 Ad5 dl1004, Ad5 dl1007, Ad5 dl1011 또는 Ad5 dl1014의 E4 영역의 결실이 또한 본 발명 프레임워크 내에 사용될 수 있다. 이에 관하여, 본 발명의 세포는 불활성 E1 영역과 Ad5 dl1014의 게놈에 존재하는 유형의 E4 영역에 결실을 포함하는 바이러스, 즉, 판독 프레임 ORF4를 전환하는 E4^- 바이러스 생성에 특히 유리하다.

상기에 지적된 바와 같이, E1 영역의 결실은 유리하게는 모두 또는 일부의 E1A 및 E1B 영역을 포함한다. 이러한 결실은 바이러스가 세포내 자발적으로 복제될 수 없게 하기에 충분해야 한다. 본 발명에 따른 아데노바이러스에서 결실된 일부의 E1 영역은 유리하게는 뉴클레오티드 454에서 3328 또는 382에서 3446을 포함한다.

상기에 해당하는 위치는 데이터베이스 상에서 공개되고 입수가능한 야생형 Ad5 아데노바이러스 서열을 의미한다. 소수 변형이 다양한 아데노바이러스 혈청형 사이에 존재할 수 있지만, 이러한 위치는 일반적으로 혈청형으로부터 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스, 및 특히 아데노바이러스 Ad2 및 Ad7의 작제에 적용할 수 있다.

또한, 생성된 아데노바이러스는 이러한 게놈에 기타 변형을 지닐 수 있다. 특히, 기타 영역이 바이러스의 능력을 증가시키고 바이러스 유전자의 발현에 연결된 부작용을 감소시키기 위해서 결실될 수 있다. 따라서, 모든 또는 일부의 E3 또는 Iva2 영역이 특히 결실될 수 있다. 그러나, E3 영역에 관하여, gp19K 단백질을 암호화하는 부분을 전환함이 특히 유리할 수 있다. 사실상 이러한 단백질에 의해 아데노바이러스 벡터는 (i) 이의 작용을 제한하고 (ii) 바람직하지 못한 부작용을 지닐 수 있는 면역 반응의 주체가 되지 못할 수 있다. 특정 양식에 따라서, E3 영역이 결실되고 gp19K 단백질을 암호화하는 서열이 이종 프로모터의 조절 하에서 재도입된다.

상기에 지적된 바와 같이, 아데노바이러스는 유전자 및 세포 치료 적용에 매우 효율적인 유전자 전달용 벡터를 구성한다. 이를 위해서, 세포, 기관 또는 유기체로의 전달 및/또는 발현이 목적인 이종 핵산이 이의 게놈으로 삽입될 수 있다. 이러한 서열은 하나 이상의 치료 유전자, 예를 들면, 표적 세포에서의 전사 및 가능한 해독이 치료 효과를 갖는 산물을 생성하는 하나 이상의 치료 유전자를 함유할 수 있다. 치료 산물 중에서, 좀더 상세하게 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인: 인터류킨, 인터페론, TNF 등 (FR 9203120), 생장 인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 등; 아포리포프로테인: ApoAI, ApoAIV, ApoE 등 (WO 94/25073), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀 (WO 93/06223), 종양 억제 유전자: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등 (WO 94/24297), 응고에 수반되는 유전자 암호화 인자: 인자 VII, VIII, IX등, 자살 유전자: 티미딘 키나제, 시오신 디아미나제 등, 또는 모든 또는 일부의 천연 또는 인공 이뮤노글로불린(Fab, ScFv 등, WO94/29446) 등이 언급될 수 있다. 치료 유전자는 또한 표적 세포에서의 발현이 유전자 발현 또는 세포 mRNA 전사의 조절을 가능하게 하는 안티센스 유전자 또는 서열일 수 있다. 이러한 서열은 예를 들면, 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사될 수 있고, 따라서 특허 EP 140 308에 기재된 기술에 따라서 단백질로의 해독을 억제할 수 있다. 치료 유전자는 또한 백신 생성을 위해 인간에게 면역 반응을 생성할 수 있는 항원 펩티드를 암호화하는 유전자일 수 있다. 이들은 특히 Epstein-Barr 바이러스, HIV 바이러스, 헤파티티스 B 바이러스 (EP 185 573), 슈도-라비즈 바이러스에 특이하거나 종양 (EP 259 212)에 특이한 항원 펩티드일 수 있다.

일반적으로, 이종 핵산 서열은 또한 감염된 세포 및 해당 유전자 3'에 위치하는 영역에 작용성이고 전사 말단 시그널 및 폴리아데닐화 부위를 특화하는 전사 프로모터 영역을 포함한다. 이들 요소 모두가 발현 카세트를 구성한다. 프로모터 영역에 관하여, 이것은 프로모터가 감염된 세포에서 작용화할 수 있는 경우 고려되는 유전자의 발현을 자연적으로 책임지는 프로모터 영역일 수 있다. 이것은 또한 (기타 단밸질의 발현을 책임지는, 또는 심지어 합성인) 상이한 기원의 영역일 수 있다. 특히, 이들은 특정한 방식으로 또는 이와 달리 또는 유도성 방식으로 또는 이와 달리 유전자의 전사를 자극하거나 억제하는 진핵 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열 또는 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 예로서, 감염시키기를 원하는 세포의 게놈 또는 바이러스의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열, 특히 아데노바이러스 MEP, E1A 유전자, RSV-LTR, CMV 프로모터 등일 수 있다. 진핵세포 프로모터 중에서, 편재성 프로모터 (HPRT, 비멘틴, α-액틴, 튜불린 등), 중간체 필라멘트의 프로모터(데스민, 뉴로필라멘트, 케라틴, GFAP 등), 치료 유전자의 프로모터 (MDR, CFTR, 인자 VIII 유형 등), 조직-특이 프로모터 (피루베이트 키나제, 빌린, 내장 지방산-결합 단백질을 위한 프로모터, 평활근 세포의 α-액틴을 위한 프로모터, 간에 대해 특이한 프로모터; Apo AI, Apo AII, 인간 알부민 등) 또는 이와 달리 자극에 반응하는 프로모터 (스테로이드 호르몬 수용체, 레티노산 수용체 등)가 또한 언급될 수 있다. 또한 이러한 발현 서열은 활성화 또는 조절 서열 또는 조직-특이적이거나 우세한 발현을 허용하는 서열의 첨가에 의해서 변형될 수 있다. 또한, 삽입된 핵산이 발현 서열을 함유하지 않을 경우, 이것은 이러한 서열의 결손 바이러스 하류의 게놈으로 삽입될 수 있다.

또한, 이종 핵산 서열이 특히 치료 유전자의 사율에 표적 세포의 분비 경로에 합성된 치료 산물을 인도하는 시그널 서열을 함유할 수 있다. 이러한 시그널 서열은 치료 산물을 위한 천연 시그널 서열일 수 있지만, 이것은 또한 기타 작용성 시그널 서열 또는 인공적인 시그널 서열일 수 있다.

치료 유전자를 위한 발현 카세트는 선행 기술에 기재된 기술에 따라서, 재조합 아데노바이러스 게놈의 다양한 부위로 삽입될 수 있다. 이것은 무엇보다도 E1 결실의 수준에서 삽입될 수 있다. 이것은 또한 서열의 첨가 또는 치환으로서 E3 영역의 수준에서 삽입될 수 있다. 이것은 또한 결실된 E4 영역의 수준에서 위치될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명 방법에 따라 수득된 정제된 바이러스 제조 및 본 발명에 따라서 제조된 하나 이상의 결손 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 국부, 경구, 비경구, 비내, 전맥내, 근육내, 피하, 안내 또는 경피 투여 등을 위해 제형될 수 있다.

바람직하게는, 약학 조성물은 주사 제형을 위해 약학적으로 허용되는 비히클을 함유한다. 이들은 특히 염수 (일나트륨 또는 이나트륨 포스페이트, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 클로라이드 등, 또는 이러한 염의 혼합물), 멸균 또는 등장 용액, 또는 멸균수 또는 생리학적 식염수를 경우에 따라 첨가시, 주사액의 구성을 허용하는 건조, 특히 동결-건조 조성물일 수 있다. 예를 들면, 하이드로겔과 같은 기타 부형제가 사용될 수 있다. 이러한 하이드로겔이 생물호환성 및 비세포독성 중합체로부터 제조될 수 있다 (호모 또는 헤테로). 이러한 중합체가 예를 들면, WO 93/08845에 기재되어 있다. 이들 중에서 일부, 예를 들면, 특히 에틸렌 및/또는 프로필렌 옥사이드로부터 수득된 것들이 시판된다. 주사용으로 사용되는 바이러스 용량은 다양한 파라미터, 특히 사용되는 투여 양식, 관련 경로, 발현될 유전자 또는 바람직한 처리 기간에 따라서 조정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스가 제형되고 10⁴ 내지 10¹⁴ pfu, 바람직하게는 10⁶ 내지 10¹⁰ pfu의 용량 형태로 투여된다. 용어 pfu (플라크 형성 단위)는 아데노바이러스 용액의 감염도에 상응하고, 적합한 세포 배양물을 감염시키고, 일반적으로 15 일 후 감염된 세포 플라크 수를 측정함으로써 측정된다. 바이러스 용액의 pfu 적정 측정기술이 문헌에 잘 기재되어 있다.

치료 유전자에 따라서, 이렇게 하여 생성된 바이러스가 유전적 질병(영양실조, 담낭 섬유증 등), 신경 퇴행성 질병(알츠하이머, 파킨슨, ALS 등), 암, 혈액응고 장애 또는 리포프로테인 장해에 연관된 병, 바이러스 감염 (헤파티티스, AIDS 등)에 연관된 병 등을 포함하여 다수의 병의 치료 또는 예방을 위해서 사용될 수 있다.

본 발명은 설명적이고 제한적이지 않은 것으로서 고려되어야 하는 하기의 실시예의 도움으로 좀더 완전히 기재될 것이다.

Claims

바이러스 DNA가 캡시드화 세포 배양액 중으로 도입되고 생성된 바이러스가 외부 요소에 의한 캡시드화 세포의 용해(lysis)없이 상등액 중으로의 방출된 후 수거됨을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 수거가 바이러스의 적어도 50%가 상등액 중으로 방출되었을 때 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 수거가 바이러스의 적어도 70%가 상등액 중으로 방출되었을 때 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 수거가 바이러스의 적어도 90%가 상등액 중으로 방출되었을 때 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 바이러스가 한외여과(ultrafiltration)에 의해 수거됨을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 한외여과가 접선 한외여과(tangential ultrafiltration)임을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 한외여과가 1000 kDa 이하의 컷 오프를 갖는 막에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 바이러스가 음이온 교환 크로마토그래피로 수거됨을 특징으로 하는 방법.
제 8 항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피가 강 음이온 교환 크로마토그래피임을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 강 음이온 교환 크로마토그래피가 수지 Source Q, Mono Q, Q 세파로스, Poros HQ 및 Poros QE, Fractogel TMAE 유형의 수지 및 Toyopearl 슈퍼 Q 중에서 선택된 지지체상에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 바이러스가 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography)에 의해 수거됨을 특징으로 하는 방법.
겔 투과 크로마토그래피가 겔 세파크릴 S-500 HR, 세파크릴 S-1000 SF, 세파크릴 S-1000 HR, 세파크릴 S-2000, 슈퍼덱스 200 HR, 세파로스 2B, 4B 또는 6B 및 TSK G6000 PW 중에서 선택된 지지체상에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 바이러스가 한외여과에 의해 수거된 뒤에 음이온 교환 크로마토그래피에 투입됨을 특징으로 하는 방법.
제 13 항에 있어서, 바이러스가 한외여과에 의해 수거한 뒤에 음이온 교환 크로마토그래피에 투입된 다음 겔 투과 크로마토그래피에 투입됨을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 캡시드화 세포가 아데노바이러스 E1 기능을 트랜스상보화하는 세포임을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 캡시드화 세포가 아데노바이러스 E1 및 E4 기능을 트랜스상보화함을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 캡시드화 세포가 아데노바이러스 E1 및 E2a 기능을 트랜스상보화함을 특징으로 하는 방법.