KR100762033B1 - 바이러스 입자의 분리방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바이러스 입자를 정제하고 정량하는 신규 방법에 관한 것임. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 이온-교환 크로마토그래피에 의해 아데노바이러스를 정제하고 정량하는 방법에 관한 것임. 본 발명은 또한 여러 아데노바이러스 혈청타입을 동정하는 방법에 관한 것임.
바이러스 입자 분리방법, Q SepharoseR XL 타입 크로마토그래피 지지체

Description

바이러스 입자의 분리방법{METHOD FOR SEPARATING VIRAL PARTICLES}
본 발명은 바이러스 입자의 정제 및 정량을 위한 신규 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 이온-교환 크로마토그래피에 의해 아데노바이러스를 정제하고 정량하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 각종 아데노바이러스 혈청타입을 동정하는 방법에 관한 것이다.
유전자 요법은 현재 놀랄만한 발전을 거듭하고 있으며 1990년대에 수행된 최초의 시험 이래로 인간에 대한 각종 임상 연구가 진행중이다. 유전자 전달에 보통 사용되는 방법 중, 바이러스 벡터가 특히 전망이 좋은 것으로 밝혀졌고, 이들 중 아데노바이러스가 중요한 위치를 차지한다.
유전자 요법에서 아데노바이러스 벡터의 개발은 현재 바이러스 스톡의 생성을 제한하는 두 종류 기술로의 접근을 요구한다:첫번째는 해당 바이러스를 작제하고 증폭시키는 단계로부터 얻어진 샘플에서 바이러스 입자의 빠르고도, 매우 감도가 좋으면서 매우 선택적인 정량방법을 가지는 것임; 이러한 점은 바이러스 스톡을 생성하는 방법을 최적화하는데 특히 중요함; 두번째는 신뢰할 만하고, 재현가능하고도 간단하면서 바이러스 입자의 정제를 위해 산업적 규모로 쉽게 추정될 수 있는 정제 방법을 가지는 것임.
생산성이 최적화되지 않은 형질감염 및 증폭 단계 수로 인해 아데노바이러스의 임상학적 뱃치 생산은 장기 과정이다. 재조합 아데노바이러스는 보통 바이러스 DNA를 캡시드화 계통에 도입시킨데 이어, 배양한지 약 2 또는 3일 후에 세포를 기계적 또는 화학적으로 용해시켜 생성된다(아데노바이러스 사이클의 활동은 24 내지 36시간임). 또다른 양태에 따르면, 장기간 동안(8 내지 12일) 연속 배양된 다음, 바이러스는 캡시드화 세포의 자가용해 현상에 의해 자연적인 방출 후 상등액에서 직접 수거된다(WO 98/00524).
일반적으로, 바이러스 스톡을 구성하는데 2 내지 7회 증폭 사이클이 필요하다. 바이러스 스톡을 생산하는 방법의 최적화에 대한 주된 제한은 바이러스 입자를 적정하는 방법에 있다. 실제로, 생물학적 방법은 비교적 감도가 좋고 정확하지만, 특히 수행이 장기적인(사용된 분석, 즉 트랜스진 활성(tdu) 또는 플라크 생성(pfu)에 따라 약 4 내지 15일) 방법이다. 좀더 빠른 분석 방법이 개발되었지만 이들은 사전 정제없이 용해물, 조 세포 추출물 또는 배양 상등액에서 바이러스입자의 적정을 수행할 때 충분한 정도의 정밀도와 감도를 가지지 않는다. 그 이유는 대략적으로 추정되는 감염 중복도(MOI)로 연속 증폭 사이클을 수행하기 때문이다. 결과는 증폭 단계가 매우 재현적이지 않거나, 심지어 최적화된 방법이 필요로하는 것보다 다소 길고/길거나 다소 많다. 아데노바이러스 용액의 역가의 빠르고도 정밀한 측정은 각 단계에 대한 감염 중복도를 조절할 수 있어 아데노바이러스 스톡의 전체 생산 방법을 최적화할 수 있다.
바이러스 입자를 정량하는 방법은 다수 조건을 충족시켜야 한다. 우선, 사전 농축 단계에 의존함이없이 희석되거나 낮은 역가(전형적으로 < 1 x 109 바이러스 입자/㎖(vp/㎖))를 가진 제조물에서 바이러스 입자를 분석할 정도로 충분히 감도가 좋아야 한다. 정제 단계 또는 사전 처리를 수행할 필요없이 용해물 또는 조 제조물에서 직접 바이러스 입자를 분석할 수 있어야 한다. 또한, 이러한 방법은 조 세포 용해물 또는 추출물에 존재하는 다수 화합물들(이들의 비율은 배양 조건에 따라 달라질 수 있음)의 가능한 방해를 제거하도록 높은 선택성을 가져야 한다.
음이온-교환 크로마토그래피에 기초한 정량 분석법이 문헌에 기재되어 있다(Huygue et al., Human Gene Ther. 6: 1403-1416, 1995; P.W. Shabram et al., Human Gene Ther. 8: 453-465, 1997). 1 x 108 vp/㎖의 검출 한계를 가지는 이러한 방법은 정제된 바이러스 입자의 적정에 적용가능하다. 그러나, 일단 분석이 용해물 또는 조 세포 추출물에서 수행되면 이러한 방법의 감도는 감소한다. 검출 한계는 이러한 샘플에서 2 내지 5 x 109 vp/㎖로 추정되며 이러한 방법에 의해서 바이러스 형질감염 및 증폭 단계동안 감염된 세포 용해물과 같이 매우 희석된 비정제된 제조물에서 아데노바이러스 역가가 전형적으로 1 x 108 vp/㎖ 내지 1 x 109 vp/㎖인 아데노바이러스 입자를 정량할 수 없다. 또한, 이러한 방법은 동물 단백질이 없는 특정 생산 배지에서 얻어진 제조물로부터 아데노바이러스 입자를 정량할 수 없다. 실제로, 이러한 배지는 배양의 마지막에 당, 아미노산, 비타민 또는 페놀 레드 타입 등의 화합물을 함유하며, 이 중에서 몇몇은 바이러스 정량동안 아데노바이러스 입 자를 방해할 수 있고 제조물의 역가를 매우 넓게 과대평가한다. 마지막으로, Shabram 등이 보고한 크로마토그래피법은 입자 검출 및 측정을 방해하는 핵산을 제거하기 위해 광범위한 활성을 지닌 뉴클레아제(BenzonaseR)를 이용한 샘플의 전처리 단계를 요구한다.
아데노바이러스를 분리하는 예비 방법의 경우, 아데노바이러스 입자의 정제를 위해 수년간 크로마토그래피를 사용해 왔다[Haruna, I., Yaosi, H., Kono, R. and Watanabe, I. Virology (1961) 13. 264-267; Klemperer, H.G. and Pereira, H.G. Virology (1959) 9, 536-545; Philipson, L., Virology (1960) 10, 459-465]. 재조합 아데노바이러스의 대규모 정제에 관해 기술하고 있는 방법이 좀더 최근에 보고되고 있다(국제 특허 출원 WO 96/27677, WO 97/08298, WO 98/00524, WO 98/22588).
출원 WO 98/00524는 특히 강한 음이온-교환 수지 공급원 15Q를 이용하여 일단계 크로마토그래피에서 세슘 클로라이드 구배 초원심분리에 의해 정제된 제조물로부터 얻어진 것과 순도면에서 적어도 대등한 아데노바이러스 제조물을 얻을 수 있는 정제방법에 관해 기술하고 있다. 이러한 순도 정도는 매우 높고 인간에게서 임상 연구에 필요한 표준에 이른다(생물학적 표준화에 관한 WHO 전문가 위원회, 49 보고서. WHO 기술 보고서 시리즈, WHO 제네바, 간행).
그러나, 정제되는 제조물의 바이러스 역가가 낮거나(예를 들어 낮은 생산성을 가진 아데노바이러스의 경우, 또는 초기 증폭 단계동안 얻어진 스톡을 이용하여 정제를 수행해야 할 경우), 바이러스 생산 배지가 아데노바이러스와 함께 용출되는 화합물의 존재를 야기할 경우(예를 들면 송아지 혈청이 없는 배지의 경우), 앞서 기재된 크로마토그래피 기술의 제한된 성능은 이러한 출발 물질로부터 일 단계로 아데노바이러스 입자를 정량하거나 정제할 수 없다.
조 제조물로부터 바이러스 입자를 적정하는 방법이 빠르고, 감도가 좋으면서 선택성이 높지만 문제점이 잔존한다. 신뢰할 만하고, 재현가능하며 동일한 조 제조물로부터 얻어질 수 있고, 바람직하게는 일 단계로 약학적 성질의 바이러스 제조물을 얻을 수 있는 정제 방법도 문제점이 잔존한다.
특정 크로마토그래피 지지체가 놀랍게도 바이러스 입자, 특히 아데노바이러스의 분리를 위해 매우 놀랄만한 성질을 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 이것이 본 발명의 주제를 구성한다. 이러한 성질로 인해 사전 처리없이 매우 높은 감도와 선택성으로 조 제조물로부터 바이러스 입자를 적정하고/적정하거나 정제할 수 있다. 이러한 지지체의 사용은 부수적으로 뜻밖에도 크로마토그래피에 의해 여러 혈청타입의 아데노바이러스 또는 섬유 또는 헥손 수준에서 변형된 아데노바이러스를 분리하여 동정하는 단순하고도 빠른 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 주제는 매트릭스와 이온-교환 그룹을 포함하는 지지체상에서 수행되는 적어도 일 크로마토그래피 단계를 포함하고, 상기 그룹이 유연성 아암에 의해 매트릭스상에 그래프팅됨을 특징으로 하는, 생물학적 배지로부터 바이러스 입자를 분리하는 방법이다.
매트릭스는 아가로스, 덱스트란, 아크릴아미드, 실리카 및 폴리[스티렌-디비닐벤젠], 단독 또는 혼합 형태 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 매트릭스는 아가로스로 구성되고; 좀더 바람직하게는, 이는 대략 6% 가교 결합된 아가로스이다.
작용화된, 유연성 이온-교환 아암이 그래프팅된 가교 결합된 아가로스 비드로 이루어진 지지체가 생물분자의 예비용 및 산업용 크로마토그래피를 위해 개발되었다. 이들 지지체는 좀더 구체적으로는 단순히 정화된, 즉 현탁액에 고형 구성물이 없는 조 혼합물로부터 생물분자를 포획하는 단계(즉 정제 방법의 초기 단계)를 위해 고안되었다. 이의 성능은 지지체상으로 용질의 매우 높은 부착능력, 높은 직선 액체 유동 속도에서 매우 낮은 역압, 낮은 비용 및 재생에 이용된 세정제에 대한 매우 높은 내약품성 측면에서 최적화되었다.
유리하게는, 유연성 아암은 친수성이고 합성 또는 천연 기원의 중합체로 이루어진다. 합성 기원의 중합체 중에서, 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 또는 폴리비닐 에테르 단량체로 이루어진 중합체가 언급될 수 있다.
천연 기원의 중합체의 경우, 특히 전분, 셀룰로스, 덱스트란 및 아가로스 중에서 선택된 다당류 성질의 중합체가 언급될 수 있다. 바람직하게는, 유연성 아암의 중합 정도는 약 30 단량체 단위이고, 좀더 바람직하게는, 유연성 아암은 약 5000 Da의 평균 분자량을 가진 덱스트란이다.
바람직하게는, 유연성 아암은 음이온 분자와 상호작용할 수 있는 그룹을 그래프팅시켜 작용화된다. 가장 일반적으로, 이러한 그룹은 3급 또는 4급 아민으로 구성된다. 본 발명의 구성상, 강한 음이온 교환기를 이용함이 특히 유리하다. 이에 따라, 바람직하게는 앞서 지적된 4급 아민에 의해 작용화되는 크로마토그래피 지지체가 본 발명에 이용된다.
본 발명을 수행하기에 특히 바람직한 지지체의 경우, Q SepharoseR XL(Amersham Pharmacia Biotech)이 언급될 수 있다. 출원 WO 98/39467의 실시예 중 하나에 이러한 지지체의 사용이 언급되고 있다. 정제된 아데노바이러스는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 처리하여 변형시킨다. 반응 후, 변형된 아데노바이러스, 변형되지 않은 아데노바이러스 및 PEG는 Q SepharoseR XL 컬럼을 통과하여 분리된다. 이는 출발 물질과 화학 반응의 최종 산물간의 단순한 분리이다. 업계의 숙련인은 이러한 컬럼이 캡시드화 세포 용해물과 같은 각종 오염물질 종류(숙주에서 나온 DNA, RNA, 단백질, 지질, 리포프로테인, 엔도톡신 등)를 함유한 복합 생물 배지로부터 아데노바이러스를 성공적으로 분리하는데 사용될 수 없음을 숙지하고 있다. 일단 다량의 산물이 주입되면 대부분의 지지체가 능력을 상실하는 것으로 알려져 있기 때문에 이러한 문헌 어디에도 예비용으로 Q SepharoseR XL을 사용할 수 있다는 문구를 발견할 수 없다.
매트릭스 조성, 입자 크기 분포, 다공성, 유연성 아암의 화학적 성질 및 그래프팅 밀도를 포함한 유사한 특성을 가진 기타 강한 음이온 교환 지지체가 아데노바이러스 입자의 예비용 또는 분석용 분리에 이용될 수 있다. 유리하게도, 매트릭스는 6% 가교 결합된 아가로스로 구성되며; 여기에 덱스트란으로 구성되고 강한 음 이온-교환 그룹에 의해 작용화되는 유연성 아암이 그래프팅된다. 지지체는 바람직하게는 약 40 내지 200 ㎛의 입자 크기를 가지며; 입자 크기와 관련된 용어 "약"은 표시된 값에 대해 +/- 20%의 편차 이내를 의미한다. 바람직하게는, 이러한 편차는 표시된 값에 대해 +/-10%이고 좀더 바람직하게는 +/- 5% 이다.
가장 특히 바람직한 방법에서, 입자 크기는 45 내지 165 ㎛이고 평균 90㎛이다.
유리하게도, 매트릭스는 입자의 95%가 입자 평균 직경의 0.1 내지 10배의 직경을 가지고, 바람직하게는 입자 평균 직경의 0.3 내지 3배의 직경을 가지게끔 분산된다.
하기의 실시예에 사용된 Q SepharoseR XL은 본 발명 구성에 이용될 수 있는 지지체의 성능을 대략적으로 설명해 준다.
Q SepharoseR XL은 45 내지 165㎛ 범위의 비드 크기 분포를 나타내며, 평균 90㎛이다. 이들 크기 및 비드 분포 특성으로 인해 지지체가 예비-형 크로마토그래피 교환체가 된다. 크로마토그래피 이론과 실제는 이러한 지지체가 이온-교환 상호작용 측면에서 유사한 크로마토그래피 행동을 나타내는 화합물의 분리에 대해 매우 적절한 성능을 가짐을 보여준다. 게다가, 이러한 지지체는 불량한 해상도의 광범위 크로마토그래피 피크를 나타내는데, 그 이유는 특히 이를 구성하는 비드의 큰 크기와 매우 폭넓은 분포에 의해서이다. 이러한 예상된 크로마토그래피 특성은 생물분자, 일반적으로 큰, 불량하게 분리된 피크 형태로 용출되는 단백질의 경우에 입증 된다(데이터 파일 Pharmacia Biotech No. 18-1123-82 참조). 한편, 충분히 예상치 못한 방법에서, 아데노바이러스 입자는 매우 대칭의 극도로 좁은 피크 형태로 이러한 종류의 지지체로부터 용출된다. 예를 들어 알부민과 같은 단백질과 비교해서, Q SepharoseR XL로 채워진 컬럼의 효능은 이론적 플레이트에 해당되는 높이(HETP) 또는 컬럼 길이 단위당 이론적 플레이트 수(N/m)를 측정하면 소 혈청 알부민과 같은 단백질의 경우(N/m: 600)보다 아데노바이러스의 경우(N/m: 35,000) 50 내지 100배 높다. 예를 들어 도 1을 참조하라. 이에 따라, 최적화된 크로마토그래피 조건하에 사용할 경우, 이러한 종류의 겔, 특히 Q SepharoseR XL 겔은 생물분자 분리에 일반적으로 추천되는 지지체에 의해 폭이 동일하지 않은 아데노바이러스 크로마토그래피 피크를 제공한다. 생물분자 분리를 위해 추천되는 지지체 중에서, 기본 매트릭스가 폴리[스티렌-디비닐벤젠] 타입(예를 들면 수지 공급원 15 Q 및 공급원 30Q, 또는 Poros HQ, Poros DE2 또는 Poros D 타입 수지)이 언급될 수 있다. 또한 기본 매트릭스가 메타크릴레이트-에틸렌 글리콜 공중합체 타입, 예를 들면 수지 Toyopearl DEAE, QAE 및 Super Q, 또는 작용성 이온-교환 그룹이 매트릭스상에 그래프팅된 폴리아크릴아미드-형 직쇄 중합체상에 위치된 Fractoge TMAE, TMAE HiCap, DMAE 또는 DEAE 타입의 수지도 언급될 수 있다.
아데노바이러스 입자 분리를 위해 본 발명의 구성상 이용되는 지지체의 능력은 입자의 검출에 있어 매우 높은 감도를 야기한다. 이에 따라, 이들 지지체가 분석용 크로마토그래피 컬럼에 사용되면, 바이러스 입자의 예상치 못한 크로마토그래 피 행동은 앞서 기재된 방법의 검출 한계 이하인 검출 한계를 이용하여 아데노바이러스를 정량할 수 있다. 이러한 검출 한계는 조 세포 용해물 타입의 제조물에서 1 x 108 vp/㎖의 검출 한계 및 정제된 바이러스 제조물의 경우 1 x 107 vp/㎖의 검출 한계를 달성할 수 있는 것보다 적어도 10배 이하이다.
이러한 타입의 지지체는 또한 분석될 샘플에 존재하는 오염물질, 예를 들어 단백질과 핵산에 대해 매우 높은 선택성을 제공할 수 있다. 단백질은 매우 폭넓고 바이러스 피크에 앞서 용출되는 피크 형태로 존재한다. 핵산은 바이러스의 용출에 필요한 농도보다 상당히 높은 식염 농도를 지닌 컬럼으로부터 용출된다. 앞서 기재된 크로마토그래피 방법으로 얻어진 것과 매우 다른 이러한 특성(Huygue et al., Human Gene Ther. 6: 1403-1416, 1995)으로 인해 바이러스 피크에 대한 이러한 타입의 화합물로부터의 간섭을 없앨 수 있다. 결국, 분석될 제조물이 바이러스 입자와 함께 용출되는 종을 함유하더라도, 매우 특이적인 바이러스 피크 형태로 인해 이를 쉽게 동정하여 정량할 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 구성에 사용된 지지체는 다량의 단백질과 핵산을 함유한 제조물을 이용하여 분석할 경우 아데노바이러스에 대한 피크를 매우 쉽고도 굉장한 정확도로 동정하여 정량할 수 있다. 입자의 정량 분석 및 정제는 광범위한 바이러스 생산 배지를 이용하거나 동물 기원의 구성분, 예를 들면 알부민(소 기원, 인간 기원 또는 여타 기원에 상관없이)이 없는 배지를 이용하여 얻어진 제조물을 이용하여 수행될 수도 있다(도 2). 본 발명에 기재된 방법이 방법의 감도 또는 선 택성에 영향을 미치지 않고 뉴클레아제를 이용한 사전 처리없이 핵산을 함유한 샘플의 분석에 적용가능하다는 사실도 중요하다.
이러한 관점에서, 본 발명의 또다른 주제는 생물 배지로부터 바이러스 입자, 특히 아데노바이러스를 예비 분리 또는 정제를 위해 이러한 종류의 지지체, 특히 Q SepharoseR XL의 사용에 관한 것이다. 이러한 분리 방법은 출원 WO 98/00524의 주제인 방법에 사용된 것과 같은 또다른 지지체, 특히 수지 공급원 15Q상에서 예비 크로마토그래피 단계를 임의로 포함할 수 있다. 이러한 예비 단계는 특정 경우, 예를 들어 과도한 다량의 오염물질이 생물 배지에 존재하는 경우에 유리한 것으로 입증된다.
본 발명의 또다른 주제는 생물 배지로부터 바이러스 입자, 특히 아데노바이러스의 정량 분석 또는 적정에 있어, 이러한 종류의 지지체, 특히 Q SepharoseR XL의 사용에 관한 것이다.
바이러스 정제 또는 적정이 수행되는 생물 배지는 바이러스를 생산하는 캡시드화 세포의 상등액 또는 캡시드화 세포의 용해물, 또는 상기 바이러스의 예비정제용액일 수 있다. 바이러스 입자의 예비 분리 또는 정제가 캡시드화 세포를 생산하는 상등액 또는 용해물을 사용하여 수행될 경우, 예비 한외여과 단계를 수행함이 유리할 수 있으며; 바람직하게는 이러한 단계는 300 내지 500 kDa의 절단물을 지닌 막상에서 접선 한외여과에 의해 수행된다.
본 발명에 따른 정제 방법에 의해 일 단계로 희석되고/희석되거나, 오염물질 이 매우 풍부한 스톡을 이용하여, 산업상 요구사항과 치료 분자의 생산과 관련한 규제에 충분히 부합하는 생산 조건하에 순도면에서 높은 입자 수율(75 내지 80%)을 지닌 양질의 바이러스 제조물을 얻을 수 있다.
본 발명의 또다른 주제는 바이러스 입자가 Q SepharoseR XL 타입 지지체상에서 크로마토그래피에 의해 분리되고 아데노바이러스의 양이 크로마토그래피 분획의 흡광도를 측정하여 결정됨을 특징으로 하는, 아데노바이러스의 정량법에 관한 것이다. 본 발명 방법에 의해 전처리없이 균질한 상등액 샘플에 대해 직접 생산 동역학을 좀더 쉽고도 정확히 모니터링할 수 있으며, 바이러스 입자 스톡을 생산하는 방법의 보다 우수한 재생능력과 보다 우수한 조절을 가능케한다.
본 발명의 주제는 또한 각종 아데노바이러스 혈청타입의 동정을 위해 Q SepharoseR XL 타입 크로마토그래피 지지체의 사용이다. 실제로, 놀랍게도, 이러한 종류의 지지체에 의해 크로마토그래피 피크에 있어 260 nm와 280 nm에서 보유시간 및 흡광도 값의 비를 측정하여 바이러스 생산 배지 샘플로부터 직접 각종 혈청타입의 광범위한 아데노바이러스를 간단하고도 빠르게 분리하고 동정할 수 있음이 밝혀졌다.
본 발명의 구성상 크로마토그래피 지지체의 사용과 관련하여, 분석용 또는 예비용 바이러스 입자의 분리는 크로마토그래피 컬럼에 염 용출 구배를 적용하거나 대등한 방식에 따라, 즉 일정한 식염 농도로 수행될 수 있다.
예비용 방법의 경우, 크로마토그래피 지지체는 예를 들어 Q SepharoseR XL 지지체를 사용하여 통상적인 종류의 크로마토그래피 컬럼 또는 고-해상 크로마토그래피 시스템에 적당한 컬럼에 사용되거나, 예를 들어 StreamlineR XL 지지체를 이용하여 확장 또는 소위 "유동층" 시스템에 이용될 수 있다. 크로마토그래피 컬럼의 크기는 출발 물질에 존재하는 바이러스 양의 함수로써 결정된다.
정제될 바이러스 제조물은 완충액 중의 지지체에 적용될 수 있으며 완충액의 전도성은 바이러스가 지지체상에 보유되지 않고 핵산이 결합되도록 하는 정도이다. 유리하게도, 전도성은 45 mS/cm로 조절된다. 이러한 특정 양태에 따라 Q SepharoseR XL 지지체를 통한 단순한 여과에 의해 바이러스 제조물을 오염시키는 숙주 세포에서 얻어진 핵산으로부터 바이러스를 분리할 수 있다.
본 발명에 기재된 각종 혈청타입을 분석하고 정제한 다음 특징 분석하는 방법은 야생형 바이러스이든 해당 트랜스진을 운반하는 재조합 바이러스이든 상관없이, 각종 타입의 바이러스, 특히 아데노바이러스에 적용될 수 있다.
상기 특성 이외에, 본 발명은 하기 실시예에서 도출되는 기타 특성 및 이점을 포함하며 이는 설명을 위해 주어지고 제한의 목적은 아니다.
도 1: Q SepharoseR XL상에서 정제된 아데노바이러스와 소 알부민에 대한 용출 프로필.
도 2: 무혈청 배지에서 얻어진 바이러스 배양액의 상등액에 대한 Q SepharoseR XL상에서의 용출 프로필.
도 3: 정제된 아데노바이러스 제조물(2x1010 vp 주입)에 대한 Q SepharoseR XL상에서의 용출 프로필.
도 4: 정제된 아데노바이러스 제조물(2 x 1010 vp 주입)에 대한 Q SepharoseR Fast Flow상에서의 용출 프로필.
도 5: Q SepharoseR XL과 Q SepharoseR Fast Flow상에서 정제된 아데노바이러스 제조물에 대한 용출 프로필 비교.
도 6: 정제된 아데노바이러스 제조물(2x1010 vp 주입)에 대한 Q SepharoseR HP상에서의 용출 프로필.
재료 및 방법
1 - 아데노바이러스 및 복제-결손 재조합 아데노바이러스의 생성
아데노바이러스는 크기가 약 36 kb인 선형, 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 이의 게놈은 특히 각 말단에 역 말단 반복부(ITR), 캡시드화 서열(Psi), 초기 유전자 및 후기 유전자를 포함한다. 주된 초기 유전자는 E1, E2, E3 및 E4 영역에 포함된다. 이들 중, E1 영역에 포함된 유전자가 특히 바이러스 증식에 필수적이다. 주된 후기 유전자는 L1에서 L5 영역에 포함되다. Ad5 아데노바이러스 게놈이 완전히 서열 분석되었고 데이터베이스로 입수가능하다(특히 Genebank M73260 참조). 또한, 기타 아데노바이러스 게놈(Ad2, Ad7, Ad12 등)의 일부 또는 심지어 전체가 서열 분 석되었다.
유전자 요법에 사용시, 아데노바이러스에서 유도된 각종 벡터는 각종 치료 유전자를 도입시켜 제조되었다. 이들 작제물 각각에서, 아데노바이러스는 감염된 세포에서 복제할 수 없도록 변형되었다. 이에 따라, 종래 기술 문헌에 기재된 작제물은 바이러스 복제에 필수적인 E1 영역이 결실된 아데노바이러스이며, 여기에 이종 DNA 서열이 삽입된다(Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50(1986) 161). 또한, 벡터의 성질을 개선하기 위해, 아데노바이러스 게놈에 기타 결실 또는 변형을 만들 것을 제안해 왔다. 이에 따라, 열-감성 점 돌연변이가 ts125 돌연변이체에 도입되어, 72 kDa DNA 결합 단백질(DBP)를 불활성화시켰다(Van der Vliet et al., 1975). 기타 벡터는 바이러스 복제 및/또는 증식에 필수적인 또다른 영역, E4 영역의 결실을 포함한다. E4 영역은 실제로 후기 유전자의 발현 조절, 후기 핵 RNA의 안정성, 숙주 세포의 단백질 발현 소멸 및 바이러스 DNA의 복제 능력과 관련된다. E1과 E4 영역이 결실된 아데노바이러스 벡터는 전사 백그라운드 노이즈 및 매우 감소된 바이러스 유전자 발현을 보유한다. 이러한 벡터는 예를 들면 출원 WO 94/28152, WO 95/02697, WO 96/22378에 기재되고 있다. 부가적으로, IVa2 유전자에 변형을 운반하는 벡터도 기재되고 있다(WO 96/10088).
문헌에 기재된 재조합 아데노바이러스는 각종 아데노바이러스 혈청타입으로부터 생산된다. 각종 아데노바이러스 혈청타입은 실제로 구조 및 성질이 다소 차이가 있지만, 상당한 유전적 체계를 나타낸다. 좀더 구체적으로 말해, 재조합 아데노바이러스는 인간 또는 동물 기원일 수 있다. 인간 기원의 아데노바이러스의 경우, 바람직하게는 그룹 C에 분류되는 것들, 특히 타입 2(Ad2), 5(Ad5) 아데노바이러스; 그룹 B의 타입 7(Ad7) 아데노바이러스; 또는 그룹 A의 타입 12(Ad12) 아데노바이러스가 언급될 수 있다. 동물 기원의 각종 아데노바이러스 중, 바람직하게는 개 기원의 아데노바이러스, 특히 모든 CAV2 아데노바이러스 균주[Manhattan 또는 A26/61 균주 (ATCC VR-800)]가 언급될 수 있다. 동물 기원의 기타 아데노바이러스는 특히 본 출원에 참조되는 출원 WO 94/26914에서 인용된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 재조합 아데노바이러스는 그룹 C 인간 아데노바이러스이다. 좀더 바람직하게는, 이는 Ad2 또는 Ad5 아데노바이러스이다.
재조합 아데노바이러스를 생산하는 다수 방법이 기재되어 있다(C. Chartier et al., J. Virol. 70: 4805-4810, 1996; WO 96/25506; J. Crouzet et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 1414-1419, 1997; T-C. He et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2509-2514, 1998). 이들 방법에 의해 이. 콜라이(E. coli)에서 해당 아데노바이러스 게놈을 운반하는 플라스미드를 작제할 수 있으며; 이들 플라스미드는 제한 효소에 의해 절단되어 플라스미드로부터 아데노바이러스 게놈을 절개한다. 아데노바이러스 게놈은 캡시드화 계통으로 형질감염된 다음 증폭된다.
재조합 아데노바이러스는 보통 바이러스 DNA를 캡시드화 계통에 도입시킨 다음 약 2 또는 3일 후 세포를 용해시켜 생성되거나(아데노바이러스 사이클의 활동은 24 내지 36시간임); 또다른 양태에 따르면, 8 내지 12일간 연속 배양한 다음 바이러스 입자가 캡시드화 세포의 자가용해에 의해 배양 배지중으로 자발적으로 방출된다.
하기 실시예에 사용된 바이러스는 이.콜라이의 lacZ 마커 유전자를 함유한 아데노바이러스이다(AV1.0CMV.lacZ). 이들 바이러스는 Ad5 혈청타입에서 유도되고 하기 구조를 보유한다:
- 예를 들어 뉴클레오티드 386(HinfI 부위)에서 3446(Sau3a 부위)에 해당하는 E1 영역의 결실.
- 상기 결실 수준에 삽입된 CMV 프로모터의 통제하에 놓인 lacZ 유전자의 발현 카세트.
- E3 영역의 결실.
이들 바이러스의 구조는 문헌에 기재되어 있다(WO 94/25073, WO 95/14102, WO 96/25506, J. Crouzet et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 1414-1419, 1997). 본 발명에 따른 방법에서는 임의 기타 작제물, 특히 기타 이종 유전자 및/또는 기타 결실(예를 들어 E1/E4 또는 E1/E2)을 운반하는 바이러스가 이용될 수 있는 것으로 이해한다.
세포의 형질감염, 아데노바이러스의 증폭 및 적정 기술은 이미 공지되어 있다(F.L. Graham et al., Molecular Biotechnology 3: 207-220, 1995; Crouzet et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 1414-1419, 1997; WO 96/25506).
AV1.0CMV.lacZ 바이러스에 함유된 lacZ 유전자에 의해 암호화된 β-갈락토시다제 활성을 분석하는 tdu 기술은 문헌[참조: P. Yeh et al, J. Virol. 70: 559-565, 1996]에 기재된 바와 같이 수행된다.
- AV 1.0 CMV.lacZ 아데노바이러스의 생산
동결-해동 사이클을 반복하는 통상적인 방법에 의하거나, 1% Tween-20의 존재하에 화학적 용해에 의하거나, WO 98/00524에 기재된 방법에 따라 자가용해가 얻어질 때까지 연속 배양하여 생성된 계통의 배양액으로부터 바이러스를 수거했다.
배양 배지는 사용된 트랜스상보 계통에 좌우되거나 사용된 양에 따라 달라질 수 있다. 이러한 배지는 송아지 혈청이 보충되거나 보충되지 않은 MEM, DMEM 등일 수 있고, 각종 농도의 무기 염, 당, 아미노산, 비타민, 허프스 또는 페놀 레드를 함유한다.
세포 293 또는 PER.C6와 같은 E1 영역 트랜스상보 세포는 해당 아데노바이러스 게놈을 운반하는 플라스미드를 절단하여 얻어진 바이러스 DNA를 지닌 배양 접시에서 60-80%의 융합으로 형질감염된다. 8 내지 15일간 배양을 지속시키고, 원형의, 좀더 굴절되고 배양 지지체에 점차 약하게 부착하는 세포의 현미경 관찰에 의해 수거 시간을 결정한다. 바이러스는 3 내지 6회 연속 해동 사이클에 의해 핵에서부터 방출된다(-70℃에서 에탄올-드라이 아이스, 37℃ 수조). 이렇게 얻어진 바이러스를 이용하여 정해진 감염 중복도(MOI)(이는 세포당 10 내지 500 바이러스 입자 범위에서 달라질 수 있음)에서 새로운 트랜스상보 세포를 감염시키고, 증폭된 바이러스는 상기와 같이 40 내지 72시간의 연속 배양에 의해 얻어진다.
출원 WO 98/00524에 기재된 또다른 양태에 따르면, 세포를 감염시킨 후 40 내지 72시간째 수거하지 않고, 8 내지 12일간 연장 배양시켜 동결-해동 사이클을 수행할 필요없이 세포의 완전한 용해를 얻는다. 바이러스는 상등액중으로 자발적으로 방출된다. 상등액은 감소 다공성(10 ㎛/1.0 ㎛/0.8-0.2㎛)의 깊이 필터상에서 여과시켜 정화된다. 정화된 상등액은 300 kDa에서 컷 오프하는 Millipore 나선형 막상에서 접선 한외여과에 의해 농축된다. 농축율은 20 내지 100배이다. 또다른 양태에 따르면, 정화된 상등액은 그 자체로 Q SepharoseR XL 컬럼상의 크로마토그래피에 의해 아데노바이러스 입자의 정제를 위해 사용될 수 있다.
- 아데노바이러스 제조물의 분석
얻어진 바이러스 제조물의 양을 측정하는데 이용된 각종 분석 기술(SDS-PAGE, 웨스턴 블랏 분석, Resource 15Q 컬럼상의 IE-HPLC 등)은 이미 공지되어 있다(WO 98/00524).
2 - Q Sepharose R XL 크로마토그래피 지지체를 이용한 분석법
감염된 캡시드화 세포 배양액으로부터 아데노바이러스 입자의 검출, 동정 및 정량을 위한 작업 조건은 하기에 기재되고 있다.
약 1 ㎖의 Q SepharoseR XL (45-165 ㎛; Amersham-Pharmacia Biotech)가 채워진 크로마토그래피 컬럼을 타입 HR 5/5 컬럼(Amersham-Pharmacia Biotech)에서 제조한다. 이 컬럼을 200-300 nm 흡광도 범위에서 작동하는 다이오드 어레이 996을 이용하는 UV/가시광 검출 시스템이 장착된 Waters 626 타입 HPLC 시스템상에 고정시킨다. 이러한 음이온-교환 컬럼을 바이러스 입자의 분리 및 정량에 이용한다.
각각의 분석 이전에, 컬럼을 30℃에서 20 mM Tri/HCl 완충액, pH 7.5에서 1.5 ㎖/분의 유동율로 평형화시킨다. 바이러스 입자를 함유하는 분석용 샘플을 컬럼에 주입한다. 최대 해상도를 얻기 위해, 주입된 입자의 양은 지지체 1 ㎖당 2 x 1012 입자 이하여야 한다. 주입되는 용량은 종의 분리에 실질적인 영향을 미치지 않고, 주입되는 용량은 적어도 겔 1 ㎖당 50 ㎖ 이하이다. 주입 후, 컬럼을 동일한 완충액 5 용적으로 세정하고, 결합된 종을 20 mM Tris/HCl 완충액에서, pH 7.5에서, 30 컬럼 용적에 걸쳐 0 내지 1 M NaCl의 직선 구배를 이용하여 용출한다. 구배 마지막에, 컬럼을 0.5 N 나트륨 히드록사이드 2 컬럼 용적으로 세척한 다음 다음 분석을 위해 재평형화시킨다.
260 nm에서 표준 곡선은 CsCl 구배에서, 또는 크로마토그래피에 의해 정제된 아데노바이러스 입자 제조물로 구성된다. 입자에 대한 이러한 표준 제조물을 260 nm에서의 흡광도 단위당 1 x 1010 입자의 전환 계수를 이용하여 0.1% SDS 용액에서 260 nm의 흡광도에 의해 미리 적정했다.
이들 조건하에, 아데노바이러스는 약 18분의 보유 시간에 용출되었고 260 nm/ 280 nm의 흡광도 비(1.30 ± 0.02)를 가진다(도 3 참조). 크로마토그래피 시그널 획득을 위한 "적합성" 소프트웨어 및 공정 처리 단위 밀레니엄 워터즈는 각 분석 후 자동적으로 피크의 N/m값(1/2 높이에서 계산)과 비대칭값(높이의 10%에서 계산)을 측정한다. 아데노바이러스 피크에 대한 N/m 값은 전형적으로 35,000±3000이고 피크 비대칭 계수는 1.05±0.05이다.
3 - 음이온-교환 크로마토그래피에 의한 아데노바이러스 정제를 위한 예비적 방법
캡시드화 세포 293 또는 PER.C6(WO 97/00326) 배양액으로부터 아데노바이러스를 정제한다. 바이러스를 생산하고 이를 앞서 기재된 자가용해 후 상등액에서 수거한다. 이를 정제 직전에 0.45 ㎛ 막(HT Tuffryn 또는 폴리술폰)을 통해 여과한다. 달리 언급이 없으면, 정제 프로토콜은 앞서 기재된 바이러스 입자의 분석용 분리에 사용된 프로토콜과 일치하지만, 상이한 용출 구배가 이용된다. 30 컬럼 용적에 걸쳐 0.25 내지 1 M NaCl 구배를 이용하여 용출을 수행한다. 크로마토그래피 지지체 1 ㎖당 1 x 1012 입자의 용량을 고려하여, 컬럼 용적을 정제될 바이러스의 양으로 조절한다. 또한, 용출제의 직선 유동율을 300 cm/시간으로 세팅한다.
실시예 1: Q Sepharose R Fast Flow 지지체와 Q Sepharose R XL 타입 지지체의 비교
본 실시예는 Q SepharoseR Fast Flow 지지체와 비교된 Q SepharoseR XL 타입 지지체의 특정 성질을 구체적으로 설명해 준다.
두 지지체는 동일한 기본 구조(6% 가교-결합된 아가로스)를 가지고, 동일한 입자 크기 분포(45-165 ㎛)를 가진 비드로 구성된다. 이는 Q SepharoseR XL 에 대한 Q 타입 교환 그룹을 운반하는 유연성 덱스트란 아암의 존재에 있어 상이하지만 Q SepharoseR FF의 경우 동일한 Q 타입 그룹이 직접 아가로스 매트릭스에 직접 고정된다.
정제된 아데노바이러스 제조물(2 x 1010 vp)을 Q SepharoseR XL 컬럼(지지체 1 ㎖)상에 주입하고 재료 및 방법 섹션의 단락 2에 규정된 NaCl 구배를 이용하여 용출한다. 용출 프로필은 도 3에 나타나 있다. 동일한 조건하에, Q SepharoseR Fast Flow(FF) 지지체로 채워진 유사 컬럼상에서 동일한 분석을 수행한다. 용출 프로필은 도 4에 주어진다. 크로마토그래피 성능의 비교는 하기 표에 주어진다.
Q SepharoseR XL과 Q SepharoseR FF 지지체를 이용한 크로마토그래피 성능 비교
지지체 능력(N/m) 비대칭
Q SepharoseR XL 30,000 1.0
Q SepharoseR FF 5,000 1.0
도 3과 4에서 알 수 있듯이, 바이러스 보유 시간은 두 경우에 유사하지만(Q SepharoseR XL의 경우 t=18분이고 Q SepharoseR FF의 경우 t=20분), Q SepharoseR XL 지지체는 Q SepharoseR FF 지지체보다 높은 능력을 가진다.
동일한 방법으로, 두 지지체상에서 2 x 109 아데노바이러스 입자를 함유한 조 세포 추출물의 분석(도 5)은 오직 Q SepharoseR XL 지지체만이 동정되고 정량가 능한 바이러스 피크를 가짐을 보여준다. 한편, 제조물에 존재하는 단백질은 두 지지체의 경우 동일한 능력으로 분리된다(도 5).
이러한 결과는 교환 그룹을 운반하는 유연성 아암의 존재가 이러한 종류의 지지체의 중요한 성분임을 보여준다. 이러한 유연성 아암의 존재는 실질적으로 아데노바이러스 분리를 위해 Q SepharoseR XL의 유리한 크로마토그래피 성능에 기여한다.
실시예 2: Q Sepharose R XL 타입 지지체와 Q Sepharose R HP 지지체의 비교
본 실시예는 Q SepharoseR HP 지지체와 비교하여 Q SepharoseR XL 타입 지지체의 특정 성질을 구체적으로 설명해 준다.
두 지지체는 동일한 기본 구조(6% 가교 결합된 아가로스)를 가진 비드로 구성된다. Q SepharoseR XL 지지체는 45 내지 165 ㎛ 범위(평균 90 ㎛)의 비드 크기 분포를 가진다. Q SepharoseR HP 지지체의 입자 크기는 34 ±10 ㎛이다. Q SepharoseR HP 지지체의 입자 크기는 보다 더 미세하고 Q SepharoseR XL 지지체보다 다소 덜 분산된다. Q SepharoseR HP 지지체는 Q SepharoseR XL의 성능보다 높은 크로마토그래피 성능을 가져야 한다.
정제된 아데노바이러스 제조물(2 x 1010 vp)을 Q SepharoseR XL 컬럼(지지체 1 ㎖)상에 주입하고 섹션 재료 및 방법의 단락 2에서 규정된 NaCl 구배를 이용하여 용출시킨다. 용출 프로필은 도 3에 주어진다. 동일한 조건하에, Q SepharoseR HP 지지체로 채워진 유사 컬럼상에서 동일한 분석을 수행한다. Q SepharoseR HP 지지체를 이용하여 얻어진 용출 프로필은 도 6에 주어진다.
도 6에 주어진 결과는 Q SepharoseR HP 지지체가 Q SepharoseR XL 지지체보다 실질적으로 낮은 능력(N/m, 15,000)을 가짐을 보여준다. 또한, 바이러스 피크는 Q SepharoseR HP 지지체상에 상당한 테일링을 보이지만(비대칭, 1.6), Q SepharoseR XL 지지체상에서는 정확하게 대칭이다.
뜻밖에도, 보다 미세한 입자 크기 및 덜 분산된 입자 크기 분포에도 불구하고, Q SepharoseR HP 지지체는 바이러스 입자의 분리시 Q SepharoseR XL 지지체의 성능을 달성하지 못한다. 한편, 이는 공급자가 지적하고(Amersham-Pharmacia Biotech) 소 알부민의 분리 실험시 실험 조건하에 확인되듯이, 단백질 분리를 위해 상당힌 우수한 성능을 가진다(하기 표).
Q SepharoseR XL과 Q SepharoseR HP 지지체의 크로마토그래피 성능 비교
지지체 아데노바이러스 알부민
능력 (N/m) 비대칭 능력(N/m)
Q SepharoseR XL 30,000 1.0 600
Q SepharoseR HP 15,000 1.6 4000
이러한 결과는 강한 음이온 교환 그룹을 운반하는 유연성 아암의 존재가 바이러스 입자 분리시 이러한 종류의 지지체의 크로마토그래피 성능에 필수적인 성분 임을 확인시킨다. 이러한 결과는 또한 지지체의 선택을 규정짓는데 고려되는 또다른 중요한 파라미터가 입자 크기, 특히 크기 분산임을 보여준다.
실시예 3: Q Sepharose R XL 타입 지지체와 Fractogel R TMAE(S) 및 Source 15Q 지지체의 비교
본 실시예는 FractogelR TMAE(S) 지지체와 Source 15Q 지지체와 비교하여 Q SepharoseR XL 타입 지지체의 특정 성질을 설명해 준다.
세 지지체는 상이한 구조 및 조성의 비드로 구성된다. Q SepharoseR XL은 6% 가교-결합된 아가로스로 구성된다. FractogelR TMAE 지지체는 가교 결합된 폴리메타크릴레이트 수지이고 Source 15Q 지지체는 폴리스티렌-디비닐벤젠 타입 수지 비드로 구성된다. FractogelR TMAE(S)(20-40 ㎛)와 Source 15Q(15 ㎛) 지지체의 입자 크기는 Q SepharoseR XL 지지체(45-165 ㎛)보다 상당히 작고 덜 분산된다. 또한, 세 지지체는 강한 교환 그룹을 가진다. 교환 그룹이 매트릭스상에 직접 그래프팅된 Source 15Q와는 달리, 후자는 FractogelR TMAE(S) 및 Q SepharoseR XL의 경우 매트릭스에 부착된 유연성 아암상에 위치한다.
정제된 아데노바이러스 제조물(2 x 1010vp)을 Q SepharoseR XL 컬럼(지지체 1 ㎖)상에 주입하고 재료 및 방법 섹션의 단락 2에 규정된 NaCl 구배를 이용하여 용 출시킨다. 얻어진 용출 프로필은 도 3에 제시된다. 동일한 조건하에, 동일한 분석을 Source 15Q 지지체로 채워진 유사 컬럼에서 수행하고 또다른 분석을 FractogelR TMAE(S) 지지체로 채워진 컬럼에서 수행한다.
뜻밖에도, 좀더 미세한 입자 크기에도 불구하고, FractogelR TMAE(S) 지지체는 아데노바이러스 분리의 경우 Q SepharoseR XL 지지체의 성능을 달성하지 못한다. 한편 이는 단백질 분리의 경우 보다 높은 성능을 나타낸다. 또한, 매우 미세한 입자 크기 및 실제 단분산 입자 크기 분포에도 불구하고, Source 15Q 지지체는 아데노바이러스 분리의 경우 Q SepharoseR XL의 성능을 달성하지 못한다.
Source 15Q, Q SepharoseR XL 및 FractogelR TMAE(S) 지지체들의 크로마토그래피 성능 비교
지지체 능력 (N/m) 비대칭
Source 15Q 20,000 1.2
Q SepharoseR XL 30,000 1.0
FractogelR TMAE(S) 20,000 1.5
이러한 결과는 교환 그룹을 운반하는 유연성 아암의 존재가 아데노바이러스 분리를 위해 Q SepharoseR XL 지지체의 특정 크로마토그래피 성능을 담당하는 유일한 인자가 아님을 보여준다. 이들 아암의 화학 조성, 그래프팅 밀도, 유연성 암이 그래프팅된 매트릭스의 성질 및 다공성 모두 바이러스 입자의 분리를 위한 지지체의 크로마토그래피 성능에 영향을 미칠 수 있는 파라미터들이다.
실시예 4: 각종 혈청타입의 야생형 아데노바이러스 입자의 검출 및 정량
본 실시예는 Q SepharoseR XL 타입 크로마토그래피 지지체의 사용에 기초한 각종 혈청타입의 야생형 아데노바이러스 입자를 검출하여 동정하는 방법을 구체적으로 설명한다.
세포를 3회 동결-해동 사이클을 거친 후 DMEM 배지상에서 배양된 A549 세포를 감염시켜 각종 야생형 아데노바이러스를 생산한 다음 수거했다. 제조물을 분석 이전에 Acrodisc 막(타입 HT Tuffryn 0.45 ㎛; Gelman Sciences)을 통해 여과했다.
재료 및 방법 섹션의 단락 2에 기재된 프로토콜에 따른 크로마토그래피에 의해 각종 제조물을 분석했다. 그러나, 기재된 실시예에서, 1 ㎖보다 약간 큰 용적(대략 1.35 ㎖)을 가진 컬럼을 이용하여 분석을 수행했는데, 그 이유는 아데노바이러스 5의 보유 시간이 재료 및 방법 섹션에 기재된 기준 보유 시간(18 분)보다 크기 때문이다(25.3분).






표 4: 각종 야생형 아데노바이러스의 크로마토그래피 특성
아데노바이러스 (혈청타입) 하부그룹 역가 (vp/㎖) 비 (260/280) Tr (분)
18 2.3 x 109 1.18 15.0
3 B 4.8 x 1010 1.35 20.1
7 4.4 x 1010 1.33 18.3
11 3.8 x 1010 1.30 22.7
14 1.1 x 1010 1.31 27.0
21 2.7 x 1010 1.36 22.8
34 4.7 x 1010 1.30 21.5
1 C 1.2 x 1010 1.32 26.9
2 2.3 x 1010 1.33 26.9
5 6.6 x 1010 1.33 25.3
6 6.6 x 1010 1.38 22.3
13 D 4.6 x 1010 1.55 17.0
20 8.5 x 1010 1.32 22.1
4 E 3.9 x 1010 1.31 20.1
36 2.9 x 1010 1.37 22.4
본 실시예는 각종 아데노바이러스가 해당 혈청타입에 따라 각종 보유 시간을 가짐과 동시에, 관련 혈청타입의 특징적인 260 nm/280 nm 흡광도 비를 가짐을 보여준다. 일 및 동일 크로마토그래피 분석동안 동시에 측정될 수 있는 이들 두 기준의 조합은 크로마토그래피 제조물에 존재하는 아데노바이러스 혈청타입을 동정하는 빠르고도 신뢰할만한 수단을 구성한다.
컬럼상에서 바이러스의 보유 시간과, 서열이 공개된 아데노바이러스 타입 7, 3, 4, 5 및 2의 섬유와 헥손의 특성간의 상관관계를 찾았다(1998 J. Virol. (1998) 72 p. 7909 and Arch, Virol (1997) 142 p. 1307). 섬유 헤드에 대한 서열 확인 데이터, 또는 심지어 섬유 줄기에 β시이트의 반복 회수의 차이로부터 상관관계를 발 견할 수 없다(하기 표 참조). 한편, 놀랍게도, 바이러스에 대한 보유 시간과 헥손에 대한 서열 존재 사이에 상관관계가 발견되었다(하기 표 참조). 이러한 상관관계는 pH 7에서 헥손의 전체 전하와 완전히 일치하고; 이러한 상관관계는 pH 7에서 헥손의 전하 상승이 컬럼상의 바이러스의 보유 증가에 상응함을 보여준다. 타입 3 바이러스를 이용하여 얻어진 데이터가 나타내는 바에 따르면, pH 7에서 노출된 헥손의 L1 부위의 전하에 따라 약간의 차이가 존재할 수 있다.
바이러스 보유 시간과 헥손 서열 존재간의 상관관계
섬유 헥손
아데노바이러스 혈청타입 하부 그룹 Tr (분) % 존재 헤드 pH 7에서 전하 반복 수 줄기 % 존재 헥손 pH 7에서 헥손 pI 전하 pH 7에서 헥손 L1 전하
7 B 18.3 100 6 100 5.31 -16.83 -12.03
3 B 20.1 52 -2.91 6 93.9 5.23 -18.66 -10.03
4 E 20.1 32 12 73.9 5.30 -17.55 -12.06
5 C 25.3 27 -3.61 22 67.8 5.15 -22.57 -20.94
2 C 26.9 33 -2.80 22 67.3 4.96 -26.73 -20.02
실시예 5: 바이러스 스톡의 생산 단계동안 재조합 아데노바이러스 입자의 검출 및 정량
본 실시예는 각종 캡시드화 세포 계통(세포 293 또는 PER.C6)의 형질감염 및 증폭 단계 동안 생성된 재조합 아데노바이러스 AV1.0CMV.lacZ 입자의 검출 및 정량을 위한 Q SepharoseR XL 타입 지지체의 사용을 구체적으로 설명한다.
이러한 극도로 빠른 분석 방법은 수분 이내에 배양 상등액을 사용하여 각 단계로부터 생산된 아데노바이러스 용액의 역가를 제공한다. 이러한 빠르고 감도가 좋은 방법은 정해진 조절된 MOI 조건하에 수행될 수 있는 다음 단계의 증폭 조건을 최적화할 수 있다.
이러한 분석 방법은 세포 293 또는 PER.C6상에서 형질감염 및 증폭 단계 동안 AV1.0CMV.lacZ 재조합 아데노바이러스의 생성을 입증하기 위해 시험되었다.
AV1.0CMV.lacZ 아데노바이러스는 세포 293 또는 PER.C6를 PacI로 절단된 플라스미드 pXL2822로 형질감염시킨데 이어(Crouzet et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 1414-1419, 1997) 정해진 감염 중복도(MOI)로 세포 293 또는 PER.C6를 각각 감염시킨 후 생성되었다. 플라스미드 절단에 의해 얻어진 바이러스 DNA 5 내지 10 마이크로그램을 이용하여 초기 형질감염을 수행했다.
세포 용해 동안, 세포를 3회 동결-해동 사이클을 반복하여 바이러스를 수거했다. 제조물을 분석 이전에 0.45 ㎛ Acrodisc 막(타입 HT Tuffryn)을 통해 여과시켰다.
재료 및 방법 섹션의 단락 2에 기재된 프로토콜에 따라 크로마토그래핑하여 각종 제조물을 분석했다. 아데노바이러스 용액의 역가를 재료 및 방법 섹션의 단락 2에 기재된 조건하에 제조된 표준 곡선과 대조하면서 결정한다.
하기 표에 결과가 주어진다.



두 트랜스상보 계통(293 또는 PER.C6)에서 바이러스 스톡의 생성동안 얻어진 AV1.0CMV.lacZ 재조합 아데노바이러스 입자의 검출 및 정량
세포 바이러스 단계 역가(vp/㎖) 총량 (vp)
293 AV1.0CMV.lacZ 형질감염 3.8 x 108 7.6 x 109
증폭 I MOI 50 3.5 x 1010 1.0 x 1012
증폭 II MOI 30 4.2 x 1010 3.1 x 1013
PER.C6 AV1.0CMV.lacZ 형질감염 2.4 x 108 9.6 x 109
증폭 I MOI 30 2.1 x 1010 6.3 x 1011
증폭 II MOI 60 3.2 x 1010 1.9 x 1013
얻어진 총 바이러스 입자를 분석하여 감염 입자(pfu) 및 트랜스진 활성을 가진 입자(tdu)의 농도를 측정한다. 용어 pfu("플라크 형성 단위")는 아데노바이러스 용액의 감염력에 상응하고, 적절한 세포 배양액을 감염시킨 다음 일반적으로 15일 후 감염된 세포 플라크 수를 측정하여 결정된다. 이러한 분석은 생물학적 방법에 기초하며 얻어진 바이러스는 사용된 조건에 따라 상이할 수 있다(J. Virol. (1996) 70 p. 7498). 실제로, 트랜스상보 계통에서 플라크 형성은 기타 표적 세포에서 바이러스 감염성을 반드시 기재하고 있지는 않다(Biotechniques (1997) 22 p. 447). 얻어진 결과는 하기 표에 주어지며 얻어진 값은 문헌(P. Yeh et al. J. Virol. (1996) 79 p. 559)의 데이터와 완전히 일치한다. 실제로, P. Yeh 등은 0.49:0.68의 tdu/pfu 비를 가진 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제된 AdRSVβGal 바이러스에 관해 기재하고 있으며, 이는 하기에서 얻어진 결과와 매우 가깝다.
감염 입자(pfu)와 트랜스진 활성을 가진 입자(tdu) 농도 간의 상관관계
세포 바이러스 역가 (vp/㎖) 역가 (pfu/㎖) vp/pfu 역가 (tdu/㎖) vp/tdu tdu/pfu
293 AV1.0CMVlacZ 4.2 x 1010 1.7 x 109 24 7.6 x 108 55 0.45
PER.C6 AV1.0CMV.lacZ 3.2 x 1010 1.3 x 109 26 7.4 x 108 43 0.57
실시예 6: IGRP2 세포에서 형질감염 및 증폭 단계 동안 생성된 재조합 아데노바이러스 입자의 검출 및 정량
본 실시예는 세포 IGRP2에서 형질감염 및 증폭 단계 동안 생성된 AV3.0CMV.lacZ 재조합 아데노바이러스 입자의 검출 및 정량을 위해 Q SepharoseR XL 타입 지지체의 사용에 관해 설명하고 있다.
AV3.0CMV.lacZ 아데노바이러스는 IGRP2 캡시드화 세포를 PacI로 절단된 플라스미드 pXL3005로 형질감염시킨데 이어(플라스미드 pXL3005는 RSV 프로모터를 CMV 프로모터와 교환하여 문헌(Crouzet et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 1414-1419, 1997)에 기재된 플라스미드 pXL2811에서 유도됨) 정해진 감염 중복도(MOI)로 IGRP2 세포(WO 96/22378)를 감염시킨 후 생성되었다. 세포 용해 동안, 세포를 3회 동결-해동 사이클을 반복하여 바이러스를 수거했다. 제조물을 분석 이전에 0.45 ㎛ Acrodisc 막(타입 HT Tuffryn)을 통해 여과시켰다.
재료 및 방법 섹션에 기재된 프로토콜에 따라 크로마토그래핑하여 각종 제조물을 분석한다. 결과는 하기 표에 주어진다.
바이러스 스톡의 생성동안 얻어진 AV3.0CMV.lacZ 재조합 아데노바이러스 입자의 검출 및 정량
바이러스 단계 역가 (vp/㎖) 총량(vp)
AV3.0CMV.lacZ 형질감염 0.1 x 1010 2.0 x 1010
증폭 I, MOI 100 1.54 x 1010 1.4 x 1012
증폭 II, MOI 50 1.39 x 1010 1.0 x 1013
얻어진 총 바이러스 입자를 분석하여 트랜스진 활성을 가진 입자의 농도를 측정한다(3.2 x 108 tdu/㎖). vp/tdu비 43은 실시예 5에서 얻어진 vp/tdu 비 43과 55에 필적할 만하며 이는 물리적 측정값 1.39 x 1010 vp/㎖의 바이러스 입자와 생물학적 측정값 3.2 x 108 tdu/㎖의 형질도입 단위를 서로 상관지울 수 있다.
실시예 7: Q Sepharose R XL 수지상 크로마토그래피에 의한 바이러스 정제
출발 물질은 캡시드화 세포를 생산하는 바이러스를 동결-해동시켜 얻어진 배양 용해물, 또는 세포의 자연 용해 후 얻어진 상등액으로 구성된다.
본 실시예에서 보고된 실험에서, 4.9 x 1012 입자를 함유한 AV1.0CMV.lacZ 바이러스로 감염된 PER.C6 세포 배양액의 자가용해물 153 ㎖를 Q SepharoseR XL 5.8 ㎖ 컬럼상에 주입했다. 컬럼의 평형 및 바이러스 용출을 재료 및 방법 섹션의 단락 2에서 바이러스의 분석용 분리에 기재된 바와 같이 30 컬럼 용적상에 0.25 내지 1 M NaCl 구배를 이용하여 300 cm/시간의 유동율로 달성했다. 바이러스 피크(7.1 ㎖)를 모은 다음 하기에 기재된 각종 기술(IE-HPLC, SDS-PAGE)로 분석했다. 모아진 분획을 하기 크로마토그래피 시스템에서 Resource Q 컬럼(1 ㎖)상에서 고해상 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분석한다: 앞서 기재된 크로마토그래피에 의해 정제된 분획 10 ㎕를 pH 8.0의, 0.5 mM MgCl2를 함유한 100 mM Tris/HCl 완충액 (완충액 B)에서 평형화된 Resource Q15 컬럼(겔 1 ㎖; Pharmacia)상에 주입한다. 완충액 B 5 ㎖로 세정한 후, 흡착된 종을 완충액 B에서 NaCl(0 내지 1 M) 30 ㎖의 직선 구배를 이용하여 1 ㎖/분의 유동율로 용출시킨다. 용출된 종을 260 nm에서 검출한다. Q SepharoseR XL 컬럼상에서 정제 단계 후, 모아진 분획은 바이러스 입자로서 순도 ≥99%를 가진다(260 nm에서 UV 검출). 바이러스 입자의 정제 수율은 82%이다.
이러한 HPLC 분석은 또한 출발 용해물에 존재하는 남은 소 혈청 알부민이 예비용 크로마토그래피 동안 완전히 제거됨을 보여준다.
크로마토그래피에 의해 정제된 아데노바이러스 분획의 전기영동 분석을 변형 조건(SDS)하에 폴리아크릴아미드 겔(4-20%)에서 수행한다. 단백질 밴드를 은 나이트레이트에서 염색시킨다. 이러한 분석은 크로마토그래피에 의해 얻어진 아데노바이러스 제조물이 통상적으로 초원심분리에 의해 얻어진 제조물과 최소한 동일한 수준의 순도를 가지고 비아데노바이러스 단백질에 의한 제조물의 오염을 야기할 수 있는 부가적인 단백질 밴드가 없음을 보여준다.
크로마토그래피에 의해 얻어진 아데노바이러스 제조물은 1.30 ±0.05에 해당 하는 A260 nm/A280 nm 흡광도 비를 가진다. 초원심분리에 의해 얻어진 최상의 제조물의 경우에 얻어진 것과 동일한 이러한 값은 제조물에 오염 단백질 또는 오염 핵산이 존재하지 않음을 말해준다.
바이러스 적정은 실제로 매우 만족스러운 vp/pfu비를 지닌 감염성 바이러스 입자의 존재를 보여주고(하기 표 참조) 정제된 바이러스 입자는 실제로 예상된 감염 활성을 가진다.
Q SepharoseR XL 지지체상에서 AV1.0CMV.LacZ 아데노바이러스의 정제
단계 역가 (vp/㎖) 역가(pfu/㎖) vp/pfu vp에서 누적수율(%)
정제 이전 3.2 x 1010 0.13 x 1010 25 -
크로마토그래피 분획 56 x 1010 1.6 x 1010 34 81
제형된 산물 93 x 1010 3.7 x 1010 25 74
본 실시예에 기재된 방법은 감염력에 영향을 미침이 없이 정제될 물질의 사전 처리(예를 들어 초원심분리 또는 뉴클레아제로 처리)없이 캡시드화 세포 용해물로부터 직접 아데노바이러스 입자를 정제할 수 있다.

Claims (24)

  1. 생물학적 배지로부터 바이러스 입자를 분리하는 방법에 있어서,
    매트릭스와 이온-교환 그룹을 포함한 지지체 상에서 수행되는 적어도 하나의 크로마토그래피 단계를 포함하고,
    상기 이온-교환 그룹은 유연성 아암에 의해 매트릭스 상에 그래프팅되며,
    생물학적 배지는 바이러스를 생산하는 캡시드화 세포의 상등액이거나 바이러스를 생산하는 캡시드화 세포의 용해물임을 특징으로 하는,
    생물학적 배지로부터 바이러스 입자를 분리하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 매트릭스가 아가로스, 덱스트란, 아크릴아미드, 실리카 및 폴리[스티렌-디비닐벤젠], 단독 또는 혼합물 형태 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 매트릭스가 가교 결합된 아가로스로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 매트릭스가 6% 가교 결합된 아가로스로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 매트릭스가 40 내지 200㎛의 입자 크기를 가짐을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 매트릭스가 45 내지 165 ㎛의 입자 크기를 가지고 평균 90 ㎛임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 입자의 95%가 입자의 평균 직경의 0.1 내지 10배의 직경을 가지도록 매트릭스가 분산됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 입자의 95%가 입자의 평균 직경의 0.3 내지 3배의 직경을 가지도록 매트릭스가 분산됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 유연성 아암이 합성 또는 천연 기원의 중합체로 이루어진 친수성 아암임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 유연성 아암이 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 또는 폴리비닐 에테르 중에서 선택된 합성 기원의 중합체임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 유연성 아암이 전분, 셀룰로스, 덱스트란 및 아가로스 중에서 선택된 다당류 성질의 천연 기원의 중합체임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 유연성 아암의 중합 정도가 30 단량체 단위임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 유연성 아암이 5000 Da의 평균 분자량을 가진 덱스트란임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 이온-교환 그룹이 강한 음이온-교환 그룹임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 강한 음이온-교환 그룹이 4급 아민임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 6 항 또는 제 9 항에 있어서, 크로마토그래피를 Q SepharoseR XL 타입 지지체상에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
  17. 삭제
  18. 제 1 항에 있어서, 예비 한외여과 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 한외여과가 300 내지 500 kDa의 컷 오프를 가진 막상에서의 접선 한외여과임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 크로마토그래피가 Q SepharoseR XL 타입 크로마토그래피 지지체 상에서 수행되고, 상기 방법은 바이러스 입자의 분석 또는 예비 분리를 위해 수행되는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 바이러스 입자가 아데노바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 크로마토그래피가 Q SepharoseR XL 타입 크로마토그래피 지지체 상에서 수행되고, 상기 방법은 아데노바이러스 혈청타입의 동정을 위해 수행되는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서, 크로마토그래피가 Q SepharoseR XL 타입 크로마토그래피 지지체 상에서 수행되고, 상기 방법은 아데노바이러스 적정(titration)을 위해 수행되는 방법.
  24. 바이러스 입자를 Q SepharoseR XL 타입 지지체상에서 크로마토그래피시켜 생물학적 배지로부터 분리하는 단계, 및
    아데노바이러스 양을 크로마토그래피 분획의 흡광도에 의해 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 생물학적 배지는 상기 바이러스를 생산하는 캡시드화 세포의 상등액 또는 상기 바이러스를 생산하는 캡시드화 세포의 용해물임을 특징으로 하는,
    아데노바이러스 정량 방법.
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