CN108404453B - 层析介质和方法 - Google Patents

Abstract

用于层析，特别是离子交换层析的吸附介质，衍生自成型的纤维。在某些实施方案中，官能化的成型纤维呈现纤化或隆脊状结构，当与普通纤维相比时，极大地提高纤维的表面积。在此还公开了一种添加表面侧挂官能团的方法，为高表面积纤维提供阳离子交换或阴离子交换官能团。这种侧挂官能团可用于例如单克隆抗体(mAb)的生物分子的离子交换层析纯化。

Description

层析介质和方法

本申请为一项发明专利申请的分案申请，其母案的申请日为2011年7月27日、申请号为201180037517.2(PCT/US2011/045519)、发明名称为“层析介质和方法”。

本申请要求2010年7月30日提交的美国临时申请序列号61/369,331的优先权，在此将其公开内容引入作为参考。

技术领域

在此公开的实施方案涉及适用于例如借助于离子交换层析纯化生物分子的层析介质。

背景技术

目前使用基于珠粒的层析树脂实现各种治疗生物分子，例如单克隆抗体的商业规模纯化。单克隆抗体作为治疗和诊断试剂持续受到重视。为候选的mAB筛选杂交瘤库的工艺既耗时又是劳动密集的。一旦确定表达合适的mAB的杂交瘤细胞系，则必须研发纯化方法来产生足够的mAB用于进一步表征。传统的纯化方法包括使用蛋白A或蛋白G亲合层析，以及离子交换层析。纯化的抗体被脱盐并使用渗析交换进入生物缓冲剂中。整个方法通常需要若干天来完成，并且如果同时评价多个mAB，则可能特别烦琐。

层析树脂目前制备有各种配体结构，其能够以亲合、阳离子交换或阴离子交换方式使珠粒起作用。这些树脂显示高孔隙率和大表面积，提供具有足以用于以生产规模(例如10,000升)成批处理生物分子的吸附容量的材料。层析树脂通常呈现球形结构，使得有效的柱填充剂能够具有最小流量不均匀性。珠粒之间的间隙空间为对流输送通过层析柱提供流道。这样使层析柱能够在高线速率和最小压降下以大床深工作。这些因素的组合使层析树脂能够呈现所需的效率、高渗透性和生物分子大规模纯化所需的充足结合容量。在基于珠粒的层析中，大部分可用的吸附表面积在珠粒内部。因此，由于质量输送速率通常由孔隙扩散控制，所以分离过程固有地缓慢。为将这种扩散阻力减到最小和附带地使动态结合容量最佳化，可以使用小直径珠粒。但是，使用小直径珠粒以柱压降升高为代价。因此，制备层析分离的优化经常涉及效率/动态容量(小珠粒有利)和柱压降(大珠粒有利)之间的折中。

层析介质通常具有很高的成本(＞$1000/L)，以及大规模生产柱需要很大的数量。因此，生物制药生产商将层析树脂循环使用数百次。这些再生循环每次消耗大量的介质，并且各个步骤产生与检验各个清洁、杀菌和柱填充剂操作有关的额外费用。

一些技术在专利文献中描述，并且商业销售这些技术来用于基于官能化纤维介质和/或复合材料的生物制药分离。大多数依赖于将多孔凝胶插入纤维基质，该凝胶提供所需的表面积以获得适当的结合容量。但是，在这种构造中，凝胶位置和质量中的差的均匀性通常产生差的效率(浅表穿透(shallow breakthrough)和洗脱锋面(elution fronts))。另外，即使对于浅的床深度，流动阻力也可能较高，问题经常由于适度压力载荷下的凝胶压缩而加重。采用的另一种方法已经在纤维基质内引入颗粒，该颗粒经常是多孔的并且具有天然的吸附性官能团，其实例为活性碳和硅胶。

理想的将是在不牺牲床渗透性和可达到的流速的基础上，为生物分子层析应用提供具有侧挂吸附性官能团的高表面积纤维的组合。

发明内容

现有技术的缺陷已由在此公开的实施方案解决，所述实施方案涉及用于层析，特别是离子交换层析的吸附性介质。公开的层析介质衍生自成型的纤维。在某些实施方案中，成型的纤维呈现纤化或隆脊状结构。当与普通的纤维相比时，这些隆脊可以极大地提高纤维的表面积。因此，在不降低纤维直径的基础上获得高表面积，纤维直径降低通常导致床渗透性显著降低和相应的流动速率减小。根据某些实施方案的高表面积纤维的实例为由Allasso Industries，Inc. (Raleigh，NC)市售的“翼状（winged）”纤维。Allasso翼状纤维的截面SEM图像在图1d中提供。这些纤维呈现大约14米²/克的表面积。在此还公开了一种添加表面侧挂官能团的方法，例如为高表面积纤维提供阳离子交换或阴离子交换官能团。这种侧挂官能团可用于生物分子例如单克隆抗体(mAb)的离子交换层析纯化。

在此公开的实施方案还涉及用包括高表面积官能化纤维的离析、纯化或分离生物分子的方法。这些方法可以以流过方式或结合/洗脱方式进行。例如，在mAb纯化中，通常实施阳离子交换层析，其中在低于抗体蛋白质的等电位点的pH下和少量降低的溶液传导率下工作，抗体蛋白质将通过离子交换配体以离子键方式结合至载体，同时未结合的污染物(宿主细胞蛋白质、核酸等)自由地通过层析床。在用足以屏蔽珠粒树脂和蛋白之间的离子相互作用的高导电性缓冲剂剥离结合的mAb产物之前，通过用适当的缓冲剂溶液吹洗填充的珠粒床进一步清除这些污染物。相反，经常在单克隆抗体制造下游使用阴离子交换层析，以进一步清除残余的细胞培养污染物，其中该操作在使得mAb蛋白将不与珠粒树脂的阳离子表面结合，而是代之以自由通过层析柱的pH和传导率的溶液条件下进行。另一方面，带有纯负电荷的蛋白质和核酸将有效地与阴离子交换树脂结合并由此被从产物中清除。

根据某些实施方案，在此公开的介质具有高床渗透性(例如500-900 mDarcy)，相对于基于珠粒的层析介质的低材料成本，20-60 mg/mL IgG动态结合，高分离效率(例如HETP＜0.1 cm)，50-160 mg/g IgG静态结合容量，和快速的吸附物至配体结合位置的对流支配的输送。

根据某些实施方案，使用独特的高表面积，当配置为长度在2-6 mm之间的随机取向的短切纤维的填充床时，挤出的纤维(例如热塑性纤维)允许高流动渗透性(液体)和均匀流动分布。提供使这种纤维表面官能化的化学处理方法，以使生物分子和生物分离能够基于吸附性相互作用。化学处理方法可以基于离子、亲合性、疏水性等相互作用或相互作用组合来赋予这种纤维各种表面化学官能团（functionalities）。纤维制造和简单的表面化学处理法的组合经济性产生用于生物制药和疫苗制造中的纯化操作的经济的和容易扩展的技术。

根据某些实施方案，提供吸附分离材料，以允许快速的处理速率，因为溶质往返于纤维表面的质量输送基本上由通过介质的流体对流来控制，这与基于珠粒的介质相反，其中扩散输送要求更长的接触时间和因此更慢的处理速率。提供了捕获或清除大生物物质，例如病毒的能力，由于珠粒孔隙的空间限制，所述大生物物质不能使用常规的基于珠粒的介质来有效分离。

附图简述

图1a为根据现有技术的纤维的示意性视图；

图1b为根据某些实施方案的可以使用的隆脊状纤维的示意性视图；

图1c为根据某些实施方案的具有连接侧基的图1b纤维的示意性视图；

图1d为根据某些实施方案的可以使用的隆脊状纤维的SEM图像；

图1e为根据某些实施方案的纤维的官能化的示意性视图；

图1f为根据某些实施方案的纤维的官能化的另一个示意性视图；

图2为根据某些实施方案的SP-官能化介质的IgG穿透曲线和洗脱峰；

图3为根据某些实施方案的改变速率下的SP-官能化介质的IgG穿透曲线的图示；

图4为根据某些实施方案的改变线速率下的IgG动态结合容量的图示；

图5为根据某些实施方案的mAb激发测试的层析谱；

图6为根据某些实施方案的官能化介质的mAb洗脱峰；

图7a、b和c显示根据某些实施方案的借助于蛋白A HPLC的IgG量化；

图8a、b和c显示根据某些实施方案的CHO-HCP的ELISA数据；

图9为显示根据某些实施方案的单克隆抗体进料的流过合计清除率(flowthrough aggregate clearance)的曲线；

图10为根据某些实施方案的SP-触角(tentacle)官能化介质的IgG穿透曲线的图示；

图11为根据某些实施方案的改变速率下的SP-触角官能化阳离子交换介质的IgG穿透曲线的图示；和

图12为根据某些实施方案的改变速率下的SP-触角官能化阳离子交换介质的IgG动态结合容量的图示。

详细说明

根据在此公开的实施方案，成型的纤维介质仅释放在纤维本身的表面上。因为成型的纤维提供高表面积和高流动渗透性，所以对于满足相对于容量和效率的性能目标而言，例如添加水凝胶或多孔颗粒的修饰并非必需。另外，不需要通过添加水凝胶或多孔颗粒来增加表面积，在此描述的介质的制造成本保持在最小限度。

纤维可以具有任何长度和直径，并且优选为短切或短纤维或无纺织物。它们不必粘合在一起作为一个集成结构，而是可以有效地作为单独的离散本体。它们可以为连续长度的形式，例如不定长度的细丝或单丝，或者它们可以例如通过切断纤维状材料(例如短纤维)，例如非织造或织造织物，将连续长度纤维切割成为单独的碎片形成更短的单根纤维，它们可以通过晶体生长方法等形成。优选纤维由热塑性聚合物，例如聚丙烯、聚酯、聚乙烯、聚酰胺、热塑性氨基甲酸酯、共聚酯或液晶聚合物制成。具有约1-3的旦尼尔的纤维是优选的。在某些实施方案中，纤维具有约1 μm至约100 μm的截面长度和约1 μm至约100 μm的截面宽度。一种合适的纤维具有约20 μm的截面长度和约10 μm的截面宽度，产生约1.5的旦尼尔。表面积为约100,000 cm²/g至约1,000,000 cm²/g的纤维是合适的。优选纤维具有约10 –20 μm的截面长度。

在某些实施方案，纤维可以在压缩下容易地填充进入具有适合所述应用的适当阀口和尺寸的装置或容器中。纤维也可以以预形成的床形式使用，例如由非织造工业中常用的纺粘(连续长丝)或湿法(短切纤维)工艺产生的非织造片料。合适的预形成的纤维形式包括片材、毡片、网片、整料等。

在某些实施方案中，纤维截面通常是翼形的，具有划定基本纵轴的主体区域和多个从主体区域向外径向延伸的突出部。突出部形成一排沿着纤维长度延伸的共线通道（co-linear channels），通常每根纤维20-30个这种通道。在某些实施方案中，突出部的长度比主体区域的长度短。在某些实施方案中，纤维截面通常是翼形的，具有包括纤维中心向下延伸的纵轴的中部区域，以及具有多个从中部区域中延伸的突出部(图1d)。在某些实施方案中，多个突出部通常从中部区域径向延伸。由于这种构造，多个通道由突出部划定。突出部之间合适的通道宽度为约200至约1000纳米。合适的纤维在美国专利公开号2008/0105612中公开，在此将其公开内容引入作为参考。

高表面积纤维的表面官能化可以由两步法实现。一种合适的官能化方法为接枝聚合，并且在图1e中所示的方案1中说明。通过在50°下，在氢氧化钠水溶液存在下用烯丙基缩水甘油醚处理纤维12小时，官能化以侧挂烯丙基连接至尼龙6纤维表面为起点。侧挂烯丙基用作纤维表面上的锚固位置，作为侧挂丙烯酰胺聚合物官能团的连接点。提供丙烯酰胺单体进行溶液聚合的条件，和将纤维表面上的侧挂烯丙基连接至溶液中生长的聚合物链上。因此，烯丙基-官能化的纤维随后用2-丙烯酰亚胺-2-甲基-1-丙烷磺酸、N,N-二甲基丙烯酰亚胺和过硫酸铵的水溶液在80℃处理4小时。当加热至80℃时，过硫酸盐分解引发丙烯酸单体的自由基聚合。在这些条件下，纤维表面上的侧挂烯丙基用作侧挂丙烯酸聚合物官能团的连接点。以这种方法，丙烯酸聚合物以共价键方式连接至纤维表面。

在某些实施方案中，丙烯酰胺聚合物可以单独地制备，随后以表面涂层的形式施涂于尼龙纤维。所得表面涂布的纤维显示与烯丙基接枝材料类似的IgG结合容量。

根据某些实施方案，官能化以丙烯酸羟基丙酯(HPA)和N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)(MBAm)的交联涂层沉积到高表面积纤维的表面上为起点，如图1f中说明的。这一步骤为随后的丙烯酰胺单体的高铈离子引发的氧化还原聚合提供反应性羟基烷基官能团。

HPS/MBAm处理的纤维与2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸钠盐，硝酸铵铈(IV)和HNO₃的水溶液在35℃下在氮气气氛中反应。在这些条件下，纤维表面上的交联的羟基烷基(丙烯酸羟基丙酯)官能团的铈氧化在纤维表面上产生游离自由基，并且引发2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸单体的表面接枝聚合。在这种条件下，表面引发的聚合工艺产生聚合的(2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸)单体的聚合物“触角”。以这种方法，丙烯酰胺聚合物以共价键方式连接至纤维表面。这种方法被称为接枝聚合。

在1-5 cm的床高度下，在约0.1-0.4 g/ml之间的、优选约0.32 g/ml的适当柱填充剂密度将为层析评价中的可接受特性提供充足的流动均匀性。

在某些实施方案中，该介质(官能化的填充纤维)可以以干燥的、预先填充的形式输送至使用者，这不同于基于珠粒的介质。纤维可以借助于热或化学方法熔凝形成可以放置在压力容器中的半刚性结构。借助于这种构造，介质和相应的装置可以随时可用地制造。基于珠粒的层析介质通常以松散料(潮湿)的形式提供，其中使用者需要装载压力容器(柱)和借助于各种装置产生没有空穴或通道的良好填充的床。通常需要后续测试以确保填充剂的均匀性。相反，根据某些实施方案，随着产物到达准备投入使用，使用者不需要进行填充。

由于其形态特性，成型的纤维介质提供某些优于多孔层析珠粒的优点。典型地在基于珠粒的层析中，分离方法中的速率限制步骤为当受到扩散控制时吸附物(溶质)渗入多孔珠粒的深度；对于例如蛋白质的大分子而言，这种扩散输送可能较慢。对于在此公开的高表面积纤维而言，结合部位暴露在纤维外部上，并因此容易被流动流中的吸附物分子接触。由这一方法提供的快速输送允许停留时间短(流速高)，由此能够借助于例如模拟移动床系统的装置使介质迅速循环。因为处理速率为生物制剂制造中的临界参数，所以如在此描述的基于纤维的层析介质具有优于常规基于珠粒的介质的特殊工艺优点。

常规的层析树脂源自通常为琼脂糖、合成聚合物和二氧化硅或玻璃的多孔珠粒。这些材料通常具有高成本：未官能化的琼脂糖珠粒可能成本在每升$300-$350之间，而受控孔隙玻璃可能成本在每升$600-$1000之间。相反，在获得优良层析性能的适当密度和厚度下，如在此描述的高表面积纤维的非织造床成本估计在每升$20-$50之间。这种成本优点将提高这种新型层析介质可以以适当定价的“一次性”技术销售用于应用和在一次生产活动内在单次使用之后或者很可能在多次循环之后任意处理的可能性。

在此公开的实施方案的表面官能化纤维介质(例如SP官能化Allasso纤维，SPF1)在填充床形式下显示高渗透性。根据填充密度，床渗透性可以为＞14000 mDarcy至低于1000 mDarcy。在0.1 g/mL (1 g介质/9.3 mL柱体积)的低填充密度下，测定900 cm/hr的线速率下的床渗透性为14200 mDarcy。在宽的速率范围(400-1300 cm/hr)内，该值并不变化。这种性能表示填充的纤维床在高线速率下并未压缩。表面官能化纤维介质(SP官能化Allasso纤维，SPF1)随后压缩至0.33 g/mL (1 g介质/ 2.85 mL柱体积)的更高的填充密度，在900 cm/hr的线速率下提供1000 mDarcy的床渗透性。同样，1000 mDarcy的该值在400-1300 cm/hr的线速率范围内无变化。合适的填充密度包括约0.1至约0.5 g/ml。

对于常规的填充床，用于生物分离的离子交换层析介质，例如ProRes-S(Millipore Corp，Billerica，MA)，根据与以上情况类似的尺寸的填充床(3 cm床深度，11mm ID Vantage柱，2.85 mL柱体积)测量，渗透性值为1900 mDarcy。对于膜吸附剂，典型的渗透性值为1-10 mDarcy。对于ProRes-S，在400-1300 cm/hr的速率范围内所测量的床渗透性无显著变化。同时对于半刚性珠粒，例如ProRes-S而言，预期这一性能；更可压缩介质(例如琼脂糖珠粒)预期在高线速率(＞200 cm/hr)下显示床渗透性显著减少，原因是填充床的显著压缩。

在表2中，对于在此公开的实施方案的表面官能化纤维介质(SPF1)，给出IgG动态结合容量数据。在200 cm/hr至1500 cm/hr的线速率范围内，在1、5、10、50%穿透下所测量的IgG DBC值无显著变化，并且图3中给出的IgG穿透曲线形状没有显著的变化。

在以下表格A中，对于ProRes-S给出在很宽的线速率范围内测量的IgG动态结合容量数据。对于这种传统的填充床基于珠粒的离子交换层析介质(ProRes-S)，建议60 cm/hr的线速率，以使DBC对于结合和洗脱捕获层析应用而言达到最佳化。在更高速率(＞60 cm/hr)下，IgG动态结合容量存在显著降低。在测定的最高线速率(1200 cm/hr)下，IgG DBC仅是按照60 cm/hr情况测定的几分之一。当ProRes-S在大于60 cm/hr的速率下工作时，观察到IgG穿透曲线显著变宽。

对于在大于60 cm/hr和特别是大于200 cm/hr的线速率下需要极短停留时间或柱操作的应用，SP-官能化纤维介质(SPF1)比传统的基于珠粒的层析树脂，例如ProRes-S，更适合于那些应用。

表A。在不同线速率下在1、5、10和50%穿透下的ProRes-S介质的IgG DBC值。

以下提供高表面积纤维表面官能化和自由基聚合接枝方法的实例。

实施例1。利用侧挂烯丙基的高表面积纤维的表面改性。

利用烯丙基缩水甘油醚的尼龙纤维表面改性。在玻璃瓶中添加烯丙基缩水甘油醚(28.9 g，250 mmol)，硫酸钠(6.0 g，42 mmol)和4 N氢氧化钠溶液(60 mL)。向混合物中添加4 g松散尼龙纤维(供应商，批ID)。将潮湿固体加热至50℃持续12小时。

在冷却到室温之后，将固体转移至布氏漏斗并用蒸馏水(400 mL)洗涤。在真空下使材料干燥30分钟。

获得9.4 g潮湿固体。

立刻在以下步骤中使用该材料。

实施例2。利用侧挂磺丙基阳离子交换官能团的烯丙基-改性的高表面积纤维的自由基接枝聚合。

烯丙基-改性尼龙(AMPS/DMAM 55/45)的接枝聚合。在玻璃瓶中添加2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS，5.02 g，24 mmol)，N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAM，1.96 g，20mmol)，过硫酸铵(0.49 g，2 mmol)和水(72.8 mL)。向混合物中添加9.4 g松散尼龙纤维(实施例1)。将潮湿固体加热至80℃持续4小时。

在冷却到室温之后，将固体转移至布氏漏斗并用蒸馏水(450 mL)和甲醇(250 mL)洗涤。将材料放入烘箱中在70℃下干燥12小时。

获得4.0 g白色纤维固体。

实施例3。所得介质的功能特性。

在阳离子交换层析应用中对于多克隆人类γ免疫球蛋白(IgG)的纯化评价来自实 施例2的磺丙基-官能化高表面积纤维。IgG的静态结合容量测量结果在以下表1中提供。在 该研究中，将来自Allasso Industries (批ID 090602PA6C)的未官能化“翼状纤维”的试样 的静态结合容量与由以上实施例1和2中描述的UV-引发聚合方法和热引发聚合物接枝方法 制备的磺丙基-官能化纤维的试样进行比较。热引发自由基接枝方法提供静态结合容量 (50-80 mg IgG/g纤维试样)比UV-引发方法(10-30 mg IgG/g纤维试样)和单独的未官能化 纤维(20 mg IgG/g纤维试样)显著更高的SP-官能化纤维介质。也利用1 M NaCl溶液对这些 试样进行IgG洗脱研究。在这些洗脱条件下测定来自SP-官能化材料的结合IgG的50-70%回 收率。基于这些结果，对于生物分子层析应用中的功能特性测试而言，SP-官能化纤维介质 显示充足的静态结合容量和盐洗脱性能。

试样ID	方法	Amt (g)	IgG结合 (mg)	SBC (mg/g)	IgG洗脱 (mg)	%回收率
							未官能化Allasso	--	0.1 g	1.8	18	0.7	41%
未官能化Allasso	--	0.1 g	2.1	21	0.2	10%
							SP-官能化Allasso	UV	0.1 g	2.7	27	2.3	85%
SP-官能化Allasso	UV	0.1 g	1.2	12	2.3	190%
							SP-官能化Allasso (实施例2)	接枝	0.1 g	7.9	79	3.8	47%
SP-官能化Allasso (实施例2)	接枝	0.1 g	7.0	70	3.3	47%
							SP-官能化Allasso (实施例2)	接枝	0.1 g	6.2	53	4.3	69%
SP-官能化Allasso (实施例2)	接枝	0.1 g	5.6	48	2.6	46%

表1。静态结合容量测量。激发：2 g/L多克隆人类IgG (SeraCare LifeSciences，Milford，MA)，在50 mM乙酸钠(pH 5)中。洗涤缓冲剂50 mM乙酸钠(pH 5)。洗脱缓冲剂50 mM乙酸钠中的1 M氯化钠(pH 5)。

实施例4。

将大约0.3 g的松散SP-官能化Allasso翼状纤维装入6.6 mm的ID Omnifit层析柱中。通过压缩顶部溶剂分配顶盖(header)，产生0.68 mL的柱体积，将床体积调节至2 cm。根据以下步骤进行IgG动态结合容量测量：

10 CV 50 mM NaOAc 缓冲剂 (pH 5) (平衡)

60 CV 2 mg/mL IgG (SeraCare)，在50 mM NaOAc 缓冲剂中 (pH 5) (IgG激发)

80 CV 50 mM NaOAc 缓冲剂 (pH 5) (洗涤)

50 CV 1 M NaCl，在50 mM NaOAc 缓冲剂中 (pH 5) (洗脱)

20 CV 0.5 M NaOH (清洗)

60 CV 50 mM NaOAc 缓冲剂 (pH 5) (洗涤)。

图2提供根据某些实施方案的实施例2中所述SPF1纤维的典型IgG穿透曲线的实例。存在一个尖锐的穿透曲线，并且测定IgG动态结合容量为20至30 mg/mL (表2)。当用50mM NaOAc缓冲剂(pH 5)中的1 M氯化钠洗脱时，获得结合IgG的定量回收率。

表2。在不同线速率下在1、5、10和50%穿透下的实施例2的SP官能化介质(SPF1)的IgG DBC值。

图3提供在200 cm/hr至1500 cm/hr的不同线速率下SPF1纤维介质柱的叠加IgG穿透曲线。随着线性流速升高，穿透曲线形状没有变化。

图4显示即使在很高速率(1500 cm/hr)下，测定的IgG动态结合容量的最小变化。该性能是通过将IgG分子对流输送至离子配体结合位置所支配的系统的指示。

相反，随着速率升高，传统的基于珠粒的离子交换层析树脂将显示动态结合容量显著减少和更加扩散的穿透曲线。在很高的速率下，床压缩可能牺牲珠粒的完整性，导致流动均匀性较差和层析性能降低。

实施例5。利用丙烯酰胺共聚物涂层的尼龙表面改性。

AMPS/DMAM 55/45的溶液聚合。在250 mL三颈圆底烧瓶中添加2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS，10.04 g，48 mmol)，N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAM，3.92 g，40 mmol)，过硫酸铵(0.98 g，4 mmol)和水(146 mL)。将溶液加热至80℃持续4小时。在冷却到室温之后，立刻在以下步骤中使用该聚合物溶液。

利用AMPS/DMAM聚合物涂层的尼龙纤维表面改性。在玻璃瓶中添加19 g的以上制备的AMPS/DMAM 55/45共聚物溶液和1 g的松散尼龙纤维(Allasso Industries，#090602PA6C)。将潮湿固体在80℃加热24小时。在冷却到室温之后，将固体转移至布氏漏斗并用蒸馏水(3×50 mL)和甲醇(1×50 mL)洗涤。在真空下使材料干燥10分钟。将材料放入烘箱中在40℃下干燥24小时。

获得0.9 g白色纤维固体。

静态结合容量测量。IgG的静态结合容量测量结果在以下表3中提供。在该研究中， 将来自Allasso(批ID 090602PA6C)的未官能化“翼状纤维”的一个试样的静态结合容量与 由该实施例(实施例5)的溶液聚合物涂层方法制备的磺丙基-官能化纤维的一个试样进行 比较。在该研究中，溶液聚合物涂层方法提供静态结合容量(30-40 mg IgG/g纤维试样)比 单独的未官能化纤维(1 mg IgG/g纤维试样)更高的SP-官能化纤维介质。基于这些结果，通 过简单涂布和AMPS/DMAM共聚物溶液的热退火，可以建立SP-官能聚合物纤维涂层。

试样ID	方法	量 (g)	IgG结合 (mg)	SBC (mg/g)
					未官能化Allasso #090602PA6C	--	0.1 g	0.1	1
SP-官能化Allasso (实施例5)	涂布	0.1 g	4.8	42
					SP-官能化Allasso (实施例5)	涂布	0.1 g	3.4	32

表3。静态结合容量测量。激发：2 g/L多克隆人类IgG(SeraCare LifeSciences，Milford，MA)，在50 mM乙酸钠(pH 5)中。

实施例6。利用侧挂烯丙基的高表面积纤维的表面改性。

利用烯丙基缩水甘油醚的尼龙纤维表面改性。在0.5 L烧瓶中添加烯丙基缩水甘油醚(70.7 g，620 mmol)，硫酸钠(14.9 g，105 mmol)和4 N氢氧化钠溶液(350 mL)。向混合物中添加10 g松散尼龙纤维(Allasso Industries，#090602PA6C)。将潮湿固体加热至50℃持续12小时。在冷却到室温之后，将固体转移至布氏漏斗并用蒸馏水(1.5 L)和甲醇(0.5L)洗涤。在真空下使材料干燥30分钟。将材料放入烘箱中在50℃下干燥18小时。

获得8.8 g白色纤维固体。

实施例7。具有侧挂磺丙基阳离子交换官能团的烯丙基-改性的高表面积纤维的自由基接枝聚合。

烯丙基-改性尼龙(AMPS/DMAM 55/45)的接枝聚合。根据以下表4中提供的比率，在玻璃管瓶中添加2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS)，N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAM)，过硫酸铵和水。向各混合物中添加松散的烯丙基缩水甘油醚-改性尼龙纤维(实施例6)。将潮湿固体加热至80℃持续4小时。在冷却到室温之后，将潮湿固体各自转移至布氏漏斗并用蒸馏水(3×50 mL)和甲醇(1×50 mL)洗涤。将材料放入烘箱中在40℃下干燥12小时。

干燥的表面-改性纤维试样为利用IgG激发溶液进行静态结合容量测量作准备。

静态结合容量测量。IgG的静态结合容量测量结果也在以下表4中提供。在该研究中，将来自Allasso(批ID 090602PA6C)的未官能化“翼状纤维”的一个试样的静态结合容量与由热引发聚合物接枝方法制备的磺丙基-官能化纤维的试样(试样A-G)进行比较。在该研究中，SP-官能化纤维介质的IgG静态结合容量可能受AMPS/DMAM聚合物组合物和反应溶液浓度的影响。例如，试样E和G提供显著高于单独的未官能化尼龙纤维(6 mg IgG/g纤维试样)以及用更高AMPS含量制备的A和C试样的IgG静态结合容量。

表4。接枝聚合组合物和IgG静态结合容量测量数据。激发：2 g/L多克隆人类IgG(SeraCare LifeSciences，Milford，MA)，在50 mM乙酸钠(pH 5)中。

介质的功能特性。对于借助于阳离子交换层析的单克隆抗体(mAb)的结合和洗脱纯化，在以下实施例中评价来自实施例2的磺丙基-官能化高表面积纤维的特性。mAb以浓度为6.7 mg/mL的来自蛋白A柱的洗脱液形式提供。

实施例8。单克隆抗体的结合和洗脱纯化。

柱填充剂。在100 g异丙醇中将0.9 g的来自实施例2的磺丙基-官能化高表面积纤维料浆化30分钟。添加400 mL的去离子水，将料浆搅拌一夜。将纤维料浆转移进11 mm的IDvantage柱中，使用真空将过量的液体吸引通过柱并促进短纤维压缩。在将料浆转移至柱中之后，安装柱的顶盖，并将顶盖压缩产生2.76 mL的最终柱体积(床压缩至目标特性)。使用2wt%丙酮溶液进行HETP和峰不对称性测量。HETP测定为低于0.1 cm，峰不对称性测定为低于2.0。

借助于阳离子交换层析的mAb纯化。在图5和6中，提供来自使用实施例2的阳离子交换介质的mAb的结合/洗脱纯化的层析谱实例。在该实例中，将0.79 CV (2.18 mL)的含有6.7 mg/mL mAb (14.7 mg mAb)的蛋白A洗出物施加于柱，并用100 mM MES缓冲剂(pH 6)中的250 mM NaCl洗脱。在20个0.5 CV级分(每个级分= 1.38 mL)中收集mAb洗脱峰。借助于280 nm下每个级分的UV吸光率测量值量化mAb洗脱级分提供13.8 mg的回收(94%产率)。也借助于图7中的蛋白A HPLC来分析IgG洗脱级分。该分析也提供每个洗脱级分的IgG浓度。借助于该分析，mAb洗脱主要在级分#5-9中，mAb回收率为90%。

在图8中，提供每个mAb洗脱级分的中国仓鼠卵巢-宿主细胞蛋白浓度(CHO-HCP)的ELISA数据。HCP主要在级分#5-9中洗脱，平均浓度为479 ng/mL。因为mAb激发溶液具有6944ng/mL的HCP浓度，所以计算HCP清除(clearance) log减少值(LRV)为1.1。

实施例9。利用侧挂烯丙基的高表面积纤维的表面改性。

利用烯丙基缩水甘油醚的尼龙纤维表面改性。在玻璃管瓶中添加烯丙基缩水甘油醚(28.8 g，252 mmol)，硫酸钠(6.0 g，43 mmol)和4 N氢氧化钠溶液(60 mL)。向混合物中添加4 g松散尼龙纤维(Allasso Industries，#090602PA6C)。将潮湿固体加热至50℃持续12小时。

在冷却到室温之后，将固体转移至布氏漏斗并用蒸馏水(0.5 L)洗涤。在真空下使材料干燥30分钟。立刻在以下步骤中使用该潮湿材料。

实施例10。具有侧挂三甲基铵阴离子交换官能团的烯丙基-改性的高表面积纤维的自由基接枝聚合。

烯丙基-改性尼龙(APTAC 100)的接枝聚合。在玻璃管瓶中添加(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基氯化铵(APTAC，9.1 g，44 mmol)，过硫酸铵(0.64 g，3 mmol)，水(27 mL)和10 g来自以上实施例9的潮湿烯丙基缩水甘油醚改性纤维。将溶液加热至80℃持续4小时。

在冷却到室温之后，将潮湿固体各自转移至布氏漏斗并用蒸馏水(100 mL)和甲醇(30 mL)洗涤。在真空下使材料干燥120分钟。将材料放入烘箱中在50℃下干燥12小时。

获得6.1 g浅黄色纤维固体。

干燥的表面-改性纤维试样为利用牛血清白蛋白(BSA)激发溶液进行静态结合容量测量作准备。

实施例11。

静态结合容量测量。为了测试三甲基铵-官能化纤维在阴离子交换应用中的特性， 进行BSA静态结合容量测量。BSA的静态结合容量测量结果在以下表5中提供。在该研究中， 记录借助于实施例10的热引发聚合物接枝方法制备的三甲基铵-官能化纤维试样的静态结 合容量。来自实施例10的三甲基铵-官能化纤维介质的BSA静态结合容量为1至19 mg/g。

试样 ID	方法	量 (g)	BSA结合 (mg)	SBC (mg/g)
					Q-官能化纤维实施例10	接枝	0.1 g	0.1	1
Q-官能化纤维实施例10	接枝	0.1 g	2.0	19

表5。静态结合容量测量。激发：0.5 g/L牛血清白蛋白(BSA)，在25 mM TRIS缓冲剂(pH 8)中。

实施例12。

未改性尼龙纤维的接枝聚合。在6×200 mL瓶子中添加3-磺丙基甲基丙烯酸酯钾盐(3-SPMA)，水，尼龙纤维(Allasso industries)和1 M HNO₃溶液(下表中描述的量)。向各瓶中添加1 M HNO₃中的0.4 M的硝酸铵铈(IV)(CAN)的溶液。封闭反应瓶并将混合物加热至35℃持续18小时。

在冷却到室温之后，用0.5 M硫酸中的0.2 M抗坏血酸溶液(3×50 mL)，去离子水(3×50 mL)，1 M氢氧化钠溶液(3×50 mL)，去离子水(3×50 mL)和丙酮(1×50 mL)洗涤各瓶中的纤维固体。将材料放入烘箱中在40℃下干燥12小时。

获得白色纤维固体试样(回收率和重量添加数据参见表6)。

反应 #

Allasso 纤维 (g)

3-SPMA单体，g (mmol)

CAN (mM)

HNO<sub>3</sub> (mM)

水 (mL)

产物重量，g (%添加)

实施例 12-1

1.5 g

7.39 g (30 mmol)

8 mM

240 mM

55.5 mL

1.72 g, (+15 %)

实施例 12-2

1.5 g

9.24 g (38 mmol)

6 mM

180 mM

60.4 mL

1.64 g (+9%)

实施例 12-3

1.5 g

7.39 g (30 mmol)

4 mM

120 mM

65.3 mL

1.54 g (+3%)

实施例 12-4

1.5 g

5.54 g (23 mmol)

6 mM

180 mM

60.4 mL

1.74 g (+16%)

实施例 12-5

1.5 g

7.39 g (30 mmol)

8 mM

80 mM

67.5 mL

1.56 g (+4%)

实施例 12-6

1.5 g

9.24 g (38 mmol)

6 mM

60 mM

69.4 mL

1.52 g (+1%)

表6。铈氧化还原接枝聚合组合物和回收率数据。

静态结合容量测量。IgG的静态结合容量测量结果在以下表7中提供。SP-官能化触 角纤维介质显示可与商业生物分子层析应用中使用的基于珠粒的阳离子交换介质比较的 IgG静态结合容量。

试样	量(g)	IgG结合 (mg)	SBC (mg/g)	SBC (mg/mL)<sup>1</sup>
					实施例 12-1	0.111	14.6	131	43
实施例 12-2	0.102	16.4	160	52
					实施例 12-3	0.104	10.9	105	34
实施例 12-4	0.100	14.9	149	49
					实施例 12-5	0.108	12.6	116	38
实施例 12-6	0.103	14.2	138	45

¹基于0.33 g/mL纤维填充密度

表7。静态结合容量测量。激发：2 g/L多克隆人类IgG (SeraCare Life Sciences，Milford，MA)，在50 mM乙酸钠(pH 5)中。

动态结合容量测量。以下表8中提供实施例12-6的SP-官能化纤维介质的IgG动态结合容量测量结果。将1.0 g的介质填充进11 mm内径的Vantage柱中并压缩至2.9 cm的床深度(2.75 mL柱体积，0.36 g/mL纤维填充密度)。在60 cm/hr至1200 cm/hr的线速率范围内进行动态结合容量测量。这些速率对应于9秒至180秒的停留时间。实施例12-6的纤维介质显示IgG动态结合容量为30-40 mg/mL。

表8。在不同线速率下在1、5、10和50%穿透下的SP-触角官能化Allasso翼状纤维阳离子交换介质的IgG DBC值(RT =停留时间)。激发：2.0 g/L多克隆人类IgG (SeraCareLife Sciences，Milford，MA)，在50 mM乙酸盐中，pH 5。

实施例13。

未改性尼龙纤维的接枝聚合。在6×200 mL瓶子中添加甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，水，尼龙纤维(Allasso industries)和1 M HNO₃溶液(下表中描述的量)。向各瓶中添加1 M HNO₃中的0.4 M的硝酸铵铈(IV)(CAN)的溶液。封闭反应瓶并将混合物加热至35℃持续18小时。

在冷却到室温之后，用0.5 M硫酸中的0.2 M抗坏血酸溶液(3×50 mL)，去离子水(3×50 mL)，1 M氢氧化钠溶液(3×50 mL)，去离子水(3×50 mL)和丙酮(1×50 mL)洗涤各瓶中的纤维固体。将材料放入烘箱中在40℃下干燥12小时。

获得白色纤维固体试样(回收率和重量添加数据参见表9)。

反应#

Allasso 纤维 (g)

GMA单体，g (mmol)

CAN (mM)

HNO<sub>3</sub> (mM)

水 (mL)

产物重量，g (%添加)<sup>1</sup>

实施例 13-1

1.5 g

0.53 g (4 mmol)

5 mmol

150 mmol

62.8 mL

1.62 g (+8%)

实施例 13-2

1.5 g

1.07 g (8 mmol)

3 mmol

75 mmol

68.9 mL

2.13 g (+42%)

实施例 13-3

1.5 g

0.53 g (4 mmol)

1 mmol

30 mmol

72.6 mL

1.62 g (+8%)

实施例 13-4

1.5 g

0.11 g (1 mmol)

3 mmol

75 mmol

68.9 mL

1.62 g (+8%)

实施例 13-5

1.5 g

0.53 g (4 mmol)

5 mmol

50 mmol

70.3 mL

1.35 g (不适用，溢出)

实施例 13-6

1.5 g

1.07 g (8 mmol)

3 mmol

25 mmol

72.7 mL

2.01 g (+34%)

¹基于1/3分离级分计算

表9。铈氧化还原接枝聚合组合物和回收率数据。

环氧官能化纤维的二乙胺-官能化。在6×250 mL瓶子中分批添加来自以上实施例的潮湿GMA-官能化纤维以及25 wt%二乙胺(水)溶液(下表中描述的量)。在室温下将混合物搅拌3小时。

将纤维固体随后用去离子水(3×50 mL)和乙醇(1×50 mL)洗涤。将材料放入烘箱中在40℃下干燥12小时。

获得白色纤维固体试样(回收率和重量添加数据参见表10)。

反应 #	潮湿 GMA-纤维(g)	25% Et<sub>2</sub>N，水溶液(mL)	产物重量，g (%添加)<sup>1</sup>
				实施例13-1B	3.24	100 mL	1.08 g (+8%)
实施例13-2B	4.88	100 mL	1.32 g (+32%)
				实施例13-3B	1.93	100 mL	1.08 g (+8%)
实施例13-4B	3.00	100 mL	1.00 g (+0%)
				实施例13-5B	3.51	100 mL	1.22 g (+22%)
实施例13-6B	4.34	100 mL	1.34 g (+34%)

¹基于初始1.5 g纤维进料的2/3级分计算

表10。用二乙胺改性的环氧官能化纤维的组合物和回收率数据。

静态结合容量测量。BSA的静态结合容量测量结果在以下表11中提供。根据GMA-触 角接枝密度，二乙胺-官能化触角纤维介质可以显示很宽范围值的BSA静态结合容量。在该 系列中，我们发现实施例13-2B和实施例13-3B组合物产生可与商业生物分子层析应用中使 用的基于珠粒的阴离子交换介质比较的BSA SBC值。

试样	量 (g)	BSA结合(mg)	SBC (mg/g)	SBC (mg/mL)<sup>1</sup>
					实施例13-1B	0.099	2.76	28	9
实施例13-2B	0.096	14.60	152	50
					实施例 13-3B	0.102	18.80	184	60
实施例 13-4B	0.109	1.41	13	4
					实施例 13-5B	0.102	4.26	42	14
实施例 13-6B	0.112	6.36	57	19
					Allasso 3 kg批次	0.086	0.21	2	1

¹基于0.33 g/mL纤维填充密度

表11。静态结合容量测量。激发：2 g/L牛血清白蛋白(BSA)，在25 mM TRIS缓冲剂(pH 8)中。

动态结合容量测量。以下表12中提供实施例13-3B的二乙胺-官能化纤维介质的 BSA动态结合容量测量结果。将0.5 g的介质填充进11 mm内径的Vantage柱中并压缩至1.5 cm的床深度(1.42 mL柱体积，0.35 g/mL纤维填充密度)。在200 cm/hr的线速率下进行动态 结合容量测量。该速率对应于27秒的停留时间。实施例13-3B的纤维介质在10%穿透下显示 30 mg/mL的BSA动态结合容量。

实施例13-3B	DBC (mg/mL)
		% 穿透	200 cm/hr (RT 27秒)
1	25
		5	29
10	31
		50	39

表12。在200 cm/hr下在1、5、10和50%穿透下的二乙胺-触角官能化Allasso翼状纤维阴离子交换介质的BSA DBC值(RT =停留时间)。激发：2 g/L牛血清白蛋白(BSA)，在25 mMTRIS缓冲剂(pH 8)中。

实施例14。

未改性尼龙纤维的接枝聚合。在500 mL瓶子中添加甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA，1.70 g，12 mmol)和水(232.8 mL)。向溶液中添加5 g的Allasso尼龙纤维。向反应混合物中添加1 M HNO₃溶液(7.22 mL，7.2 mmol)，随后添加1 M HNO₃中的0.4 M硝酸铵铈(IV)溶液(0.602 mL，0.240 mmol)。

将反应混合物加热至35℃持续1小时。

在冷却到室温之后，将固体用去离子水(3×100 mL)洗涤，以及在以下步骤中立刻使用潮湿材料(12.21 g)。

环氧官能化纤维的Q-官能化。在4×250 mL瓶子中分批添加来自以上实施例的潮湿GMA-官能化纤维以及甲醇中的50 wt%三甲胺(水)溶液(下表13中描述的量)。在室温下将混合物搅拌18小时。

随后用0.5 M硫酸中的0.2 M抗坏血酸溶液(3×50 mL)，去离子水(3×50 mL)，1 M氢氧化钠溶液(3×50 mL)，去离子水(3×50 mL)和乙醇(1×50 mL)洗涤纤维固体。将材料放入烘箱中在40℃下干燥12小时。

获得白色纤维固体试样(回收率和重量添加数据参见表13)。

反应#	潮湿 GMA-纤维(g)	50% Me<sub>3</sub>N，水溶液(mL)	甲醇 (mL)	产物重量，g (%添加)
					实施例14B	2.44 g	100 mL	0 mL	1.09 g (+9%)
实施例14C	2.44 g	80 mL	20 mL	1.02 g (+2%)
					实施例14D	2.44 g	50 mL	50 mL	1.04 g (+4%)
实施例14E	2.44 g	20 mL	80 mL	0.97 g (-3%)
					实施例 14	2.44 g	--	--	1.09 g (+9%)

表13。用三甲胺改性的环氧官能化纤维的组合物和回收率数据。

静态结合容量测量。BSA的静态结合容量测量结果在以下表14中提供。Q-官能化触 角纤维介质提供30 mg/mL的BSA静态结合容量。在该系列中，我们发现实施例14C和实施例 14D组合物产生可与商业生物分子层析应用中使用的基于珠粒的阴离子交换介质比较的最 高BSA SBC值。

试样	量 (g)	BSA结合 (mg)	SBC (mg/g)	SBC (mg/mL)<sup>1</sup>
					实施例14 (未改性的GMA接枝纤维)	0.097	-0.09	-1	0
实施例14B	0.100	8.76	88	29
					实施例14C	0.097	10.10	104	34
实施例14D	0.099	10.40	105	34
					实施例14E	0.104	9.66	93	30

¹基于0.33 g/mL纤维填充密度

表14。静态结合容量测量。激发：2 g/L牛血清白蛋白(BSA)，在25 mM TRIS缓冲剂(pH 8)中。

动态结合容量测量。以下表15中提供根据实施例14C制备的Q-官能化纤维介质的BSA动态结合容量测量结果。将1.0 g的介质填充进11 mm内径的Vantage柱中并压缩至3.0cm的床深度(2.85 mL柱体积，0.35 g/mL纤维填充密度)。在60 cm/hr至1200 cm/hr的线速率范围内进行动态结合容量测量。这些速率对应于9秒至180秒的停留时间。实施例14C的纤维介质显示BSA动态结合容量为30-40 mg/mL。

表15。在不同线速率下在1、5、10和50%穿透下的Q-触角官能化Allasso翼状纤维阴离子交换介质的BSA DBC值(RT =停留时间)。激发：2 g/L牛血清白蛋白(BSA)，在25 mMTRIS缓冲剂(pH 8)中。

实施例15。

未改性尼龙纤维的接枝聚合。在500 mL瓶子中添加甲基丙烯酸羟乙基酯(HEMA，1.69 g，13 mmol)和水(232.5 mL)。向溶液中添加5.00 g的Allasso尼龙纤维。向反应混合物中添加1 M HNO₃溶液(7.21 mL，7.2 mmol)，随后添加1 M HNO₃中的0.4 M硝酸铵铈(IV)溶液(0.601 mL，0.240 mmol)。

将反应混合物加热至35℃持续1小时。

在冷却到室温之后，用0.5 M硫酸中的0.2 M抗坏血酸溶液(3×100 mL)，去离子水(3×100 mL)，1 M氢氧化钠溶液(3×100 mL)，去离子水(3×100 mL)和乙醇(1×100 mL)洗涤固体。将材料放入烘箱中在40℃下干燥12小时。

获得5.58 g白色纤维固体。

实施例16。

聚(HEMA)-官能化纤维的硫酸盐化（Sulfation）。在氩气下向具有磁性搅拌棒和3N NaOH氢氧化钠鼓泡器的500 mL 3颈烧瓶中添加乙酸，并冷却至0℃。添加氯磺酸(5.0 g，43 mmol)。向反应混合物中添加2.5 g来自以上实施例的聚(HEMA)-官能化纤维。将反应加热到室温并搅拌1小时。

随后通过添加5 mL水和300 mL 1 M碳酸钠溶液中和纤维固体。分批向反应混合物中添加固体碳酸钠，直到pH＞7。随后用1 M碳酸钠溶液(3×100 mL)，去离子水(3×100 mL)和乙醇(1×100 mL)洗涤纤维固体。将材料放入烘箱中在40℃下干燥12小时。

获得3.64 g白色胶状固体。

对比例1

未改性EVOH纤维的接枝聚合。在4×30 mL瓶子中添加2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸钠盐溶液(AmPS-Na，50%水溶液)，水，和EVOH纤维(Engineered Fiber Technologies，S030-0.5 d×5 mm)。在真空下吹扫反应混合物，并用氮气再充气三次。向各瓶子中添加1 MHNO₃溶液和1 M HNO₃中的0.4 M硝酸铵铈(IV)(CAN)溶液(下表16中描述的量)。封闭反应瓶并将混合物加热至40℃持续12小时。

在冷却到室温之后，用去离子水(2×30 mL)，0.5 M硫酸中的0.2 M抗坏血酸溶液(3×30 mL)，去离子水(3×30 mL)，1 M氢氧化钠溶液(2×30 mL)，去离子水(3×30 mL)和甲醇(2×30 mL)洗涤各瓶中的纤维固体。将材料放入烘箱中在40℃下干燥8小时。

获得白色纤维固体试样(回收率和%产率数据参见表16)。

反应#

EVOH 纤维 (g)

AmPS-Na 单体，g (mmol)

CAN (mM)

HNO<sub>3</sub> (mM)

水 (mL)

产物重量，g (%产率)

对比例 1-1

0.5 g

4.58 g (20 mmol)

2.5 mmol

25 mmol

10.2 mL

0.42 g (84%)

对比例1-2

0.5 g

2.29 g (10 mmol)

5.0 mmol

25 mmol

14.7 mL

0.45 g (90%)

对比例1-3

0.5 g

1.15 g (5 mmol)

1.0 mmol

25 mmol

17.2 mL

0.45 g (90%)

对比例1-4

0.5 g

0.46 g (2 mmol)

2.5 mmol

25 mmol

18.5 mL

0.43 g (86%)

表16。铈氧化还原接枝聚合组合物和回收率数据。

对比例2。

未改性PVA纤维的接枝聚合。在4×30 mL瓶子中添加2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸钠盐溶液(AmPS-Na，50%水溶液)，水，和PVA纤维(Engineered Fiber Technologies，VPB 052×3 mm)。在真空下吹扫反应混合物，并用氮气再充气三次。向各瓶子中添加1 MHNO₃溶液和1 M HNO₃中的0.4 M硝酸铵铈(IV)(CAN)溶液(下表17中描述的量)。封闭反应瓶并将混合物加热至40℃持续12小时。

在冷却到室温之后，用去离子水(3×30 mL)，0.5 M硫酸中的0.2 M抗坏血酸溶液(3×30 mL)，去离子水(3×30 mL)，1 M氢氧化钠溶液(2×30 mL)，去离子水(3×30 mL)和甲醇(2×30 mL)洗涤各瓶中的纤维固体。将材料放入烘箱中在40℃下干燥8小时。

获得白色纤维固体试样(回收率和%产率数据参见表17)。

反应#

PVA 纤维 (g)

AmPS-Na单体，g (mmol)

CAN (mM)

HNO<sub>3</sub> (mM)

水 (mL)

产物重量，g (%产率)

对比例2-1

0.5 g

4.58 g (20 mmol)

2.5 mmol

25 mmol

10.2 mL

0.45 g (90%)

对比例2-2

0.5 g

2.29 g (10 mmol)

5.0 mmol

25 mmol

14.7 mL

0.53 g (106%)

对比例2-3

0.5 g

1.15 g (5 mmol)

1.0 mmol

25 mmol

17.2 mL

0.44 g (88%)

对比例2-4

0.5 g

0.46 g (2 mmol)

2.5 mmol

25 mmol

18.5 mL

0.42 g (84%)

表17。铈氧化还原接枝聚合组合物和回收率数据。

静态结合容量测量。IgG的静态结合容量测量结果在以下表18中提供。基于EVOH纤维基础基质的SP-官能化触角介质(对比例1)仅显示低IgG静态结合容量。基于PVA纤维基础基质的SP-官能化触角介质(对比例2)对于某些组合物仅显示略高的IgG静态结合容量(对比例2-1)。在所有情况下，IgG SBC值比商业生物分子层析应用中使用的基于珠粒的阳离子交换介质低得多。这些实施例用来说明由来自Allasso industries的翼状纤维介质显示的表面积增强作用的好处。如果对PVA或EVOH类型基础基质实施类似的表面积增强作用，则在使用在此描述的高铈离子氧化还原接枝方法进行直接表面官能化之后，可以获得高IgG结合容量。

¹基于0.33 g/mL纤维填充密度

表18。静态结合容量测量。激发：2 g/L多克隆人类IgG (SeraCare LifeSciences，Milford，MA)，在50 mM乙酸钠(pH 5)中。

实施例16。

利用HPA/MBAm 95/5的尼龙纤维表面改性。在具有机械搅拌器、回流冷凝器和温度控制器的2000 mL 3颈圆底烧瓶中添加丙烯酸羟基丙酯(HPA，13.7 g，95 mmol)，N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺) (MBAm，0.77 g，5 mmol)和水(710 mL)。向混合物中添加16.8 g松散尼龙纤维(Allasso industries，#090602PA6C)。添加过硫酸铵(1.60 g，7 mmol)。将潮湿固体加热至80℃持续4小时。

在冷却到室温之后，将固体转移至布氏漏斗并用热水(3×500 mL)和甲醇(1×500mL)洗涤。在真空下使材料干燥20分钟。将材料转移进烘箱中并在40℃下干燥18小时。

获得17.6 g白色纤维。

实施例17。

HPA/MBAm改性尼龙纤维的接枝聚合。在4×200 mL瓶子中添加甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，水，HPA/MBAm改性尼龙纤维(实施例16)和1 M HNO₃溶液(下表19中描述的量)。向各瓶中添加1 M HNO₃中的0.4 M的硝酸铵铈(IV)(CAN)的溶液。封闭反应瓶并将混合物加热至35℃持续12小时。

在冷却到室温之后，将来自各个瓶的纤维固体用去离子水(3×150 mL)和甲醇(1×150 mL)洗涤。将材料放入烘箱中在40℃下干燥12小时。

获得白色纤维固体试样(回收率和重量添加数据参见表19)。

反应#

HPA/MBAm 纤维 (g)

GMA单体，g (mmol)

CAN (mM)

HNO<sub>3</sub> (mM)

水 (mL)

产物重量，g (%添加)

实施例17-1

1.5 g

5.69 g (40 mmol)

5 mM

50 mM

150 mL

3.87 g, (+158)

实施例17-2

1.5 g

3.41 g (24 mmol)

5 mM

50 mM

150 mL

2.90 g (+93%)

实施例17-3

1.5 g

1.14 g (8 mmol)

5 mM

50 mM

150 mL

2.21 g (+47%)

实施例17-4

1.5 g

0.57 g (4 mmol)

5 mM

50 mM

150 mL

1.82 g (+21%)

表19。铈氧化还原接枝聚合组合物和回收率数据。

实施例18。

利用重组体蛋白A亲合性配体，rSPA的尼龙纤维表面改性。在250 mL瓶子中添加1M碳酸氢钠(100 mL)，重组体蛋白A (rSPA #RN091139，150 mg，水中47.5 mg/mL溶液形式)和水(90 mL)。向反应混合物中添加来自以上实施例17-4的GMA-接枝纤维(350 mg)。将混合物在37℃加热2.5小时。

在冷却到室温之后，将固体转移至布氏漏斗并用0.1 M碳酸氢钠(3×100 mL)洗涤。将潮湿纤维固体悬浮于0.2 M碳酸氢钠/ 0.5 M氯化钠溶液中的100 mL的10 wt%硫甘油溶液中。反应混合物在室温下搅拌一夜。

将固体转移至布氏漏斗，并用0.1 M TRIZMA碱和0.15 M氯化钠的溶液 (1×75mL)，0.05 M乙酸溶液(1×75 mL)洗涤。将TRIZMA碱和乙酸洗涤循环另外重复两次。将纤维固体最终用去离子水(1×75 mL)和20 wt%乙醇(1×75 mL)洗涤。将纤维固体保存在20 wt%乙醇溶液中。

静态结合容量测量。以下表20中提供根据实施例18制备的蛋白A-官能化纤维介质 的IgG静态结合容量测量结果。蛋白A-官能化触角纤维介质提供4 mg/mL的IgG静态结合容 量。蛋白A配体偶合方法的进一步优化将为低成本生物分子亲合层析应用提供增强的IgG静 态结合容量。

试样	量 (g)	IgG结合 (mg)	SBC (mg/g)	SBC (mg/mL)<sup>1</sup>
					实施例18A	0.500	4.22	8	3
实施例18B	0.500	5.67	11	4

¹基于0.33 g/mL纤维填充密度

表20。静态结合容量测量。激发：2 g/L多克隆人类IgG (SeraCare LifeSciences，Milford，MA)，在磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中。

动态结合容量测量。以下表21中提供实施例18的蛋白A-官能化纤维介质的IgG动态结合容量测量结果。将0.35 g的介质填充进11 mm内径的Vantage柱中并压缩至1.1 cm的床深度(1.04 mL柱体积，0.34 g/mL纤维填充密度)。在60 cm/hr至800 cm/hr的线速率范围内进行动态结合容量测量。这些速率对应于5秒至60秒的停留时间。实施例18的纤维介质显示IgG动态结合容量为5 mg/mL。蛋白A配体偶合方法的进一步优化将为低成本生物分子亲合层析应用提供增强的IgG动态结合容量。

表21。在不同线速率下在1、5、10和50%穿透下的蛋白A-官能化Allasso翼状纤维亲合层析介质的IgG DBC值(RT =停留时间)。激发：2 g/L多克隆人类IgG (SeraCare LifeSciences，Milford，MA)，在磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)中。

实施例19。

HPA/MBAm改性尼龙纤维的流过接枝聚合。在22 mm内径的Vantage层析柱中添加来自以上实施例16的HPA/MBAm改性尼龙纤维的料浆(100 mL去离子水中的1.52 g纤维)。使用真空来吸引过量液体通过柱并促进短纤维压缩。在将料浆转移至柱中之后，安装柱的顶盖，并将顶盖压缩产生4.54 mL的最终柱体积(1.2 cm床深度)。在具有磁性搅拌棒、回流冷凝器、温度控制器和加热罩的250 mL 3颈烧瓶中添加2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸钠盐溶液(AmPS-Na，50%水溶液，23.0 g，100 mmol)和水(53.5 mL)。用氩气吹洗单体溶液10分钟。向反应混合物中添加1 M HNO₃中的0.4 M硝酸铵铈(IV)(CAN)溶液(0.62 mL，0.250 mmol)和1 M HNO₃溶液(2.5 mL，2.5 mmol)，并将反应混合物加热至35℃。将单体溶液以3.5 mL/min的速率泵送通过Vantage柱12小时。发现在反应过程中单体溶液的粘度升高；这样导致三个小时之后某时单体溶液通过柱的流动速率显著降低。

在冷却到室温之后，移出来自vantage柱的纤维固体并用0.5 M硫酸中的0.2 M抗坏血酸溶液(3×150 mL)，去离子水(3×150 mL)，1 M氢氧化钠溶液(3×150 mL)，去离子水(3×150 mL)和甲醇(1×150 mL)洗涤。将材料放入烘箱中在40℃下干燥12小时。

获得1.52 g白色纤维固体。

静态结合容量测量。IgG的静态结合容量测量结果在以下表22中提供。经由流过接 枝聚合方法制备的SP-官能化触角纤维介质显示可与商业生物分子层析应用中使用的基于 珠粒的阳离子交换介质比较的IgG静态结合容量。HPA/MBAm改性纤维前体(实施例16)仅显 示最小的IgG SBC。

试样	量 (g)	IgG结合 (mg)	SBC (mg/g)	SBC (mg/mL)<sup>1</sup>
					实施例19	0.094	16.41	175	57
实施例16 (HPA/MBAm改性纤维)	0.100	0.54	5	2

¹基于0.33 g/mL纤维填充密度

表22。静态结合容量测量。激发：2 g/L多克隆人类IgG (SeraCare LifeSciences，Milford，MA)，在50 mM乙酸钠(pH 5)中。

动态结合容量测量。以下表23中提供实施例19的SP-官能化纤维介质的IgG动态结合容量测量结果。将0.64 g的介质填充进11 mm内径的Vantage柱中并压缩至2.0 cm的床深度(1.90 mL柱体积，0.32 g/mL纤维填充密度)。在200 cm/hr的线速率下进行动态结合容量测量。该速率对应于36秒的停留时间。实施例19的纤维介质显示IgG动态结合容量为40 mg/mL。

表23。在不同线速率下在1、5、10和50%穿透下的SP-触角官能化Allasso翼状纤维阳离子交换介质的IgG DBC值(RT =停留时间，nd =无数据)。激发：2.0 g/L多克隆人类IgG(SeraCare Life Sciences，Milford，MA)，在50 mM乙酸盐中，pH 5。

实施例20。

未改性尼龙纤维的接枝共聚合。在4×250 mL瓶子中添加甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基氯化铵溶液(APTAC，75 wt%水溶液)，水，翼状尼龙纤维(Allasso industries)和1 M HNO3溶液(下表中描述的量)。向各瓶中添加1 M HNO₃中的0.4 M的硝酸铵铈(IV)(CAN)的溶液。封闭反应瓶并将混合物加热至35℃持续3小时。

在冷却到室温之后，用丙酮(3×100 mL)洗涤来自各个瓶的纤维固体。将潮湿材料放入烘箱中在40℃下干燥12小时。

获得白色纤维固体试样(回收率和重量添加数据参见表24)。

表24。铈氧化还原接枝聚合组合物和回收率数据。

实施例21。

环氧官能化纤维的聚(烯丙胺)改性。在30 mL瓶子中添加来自以上实施例20-2的GMA/APTAC接枝纤维(0.5 g)，水(10 mL)，40 wt%聚(烯丙胺)氢氯化物溶液(1.25 g的40wt%溶液)和1.0 M氢氧化钠(10 mL)。将反应混合物加热至35℃持续18小时。

在冷却到室温之后，将固体用去离子水(3×50 mL)和丙酮(1×50 mL)洗涤。

将潮湿材料放入烘箱中在40℃下干燥12小时。

获得0.48 g浅黄色纤维固体。

实施例22。

磺丙基官能化纤维的聚(烯丙胺)改性。在装有磁性搅拌棒的500 mL烧杯中添加1.0 g实施例2的磺丙基-官能化纤维和聚烯丙胺水溶液(PAA MW = 15 kDa，20% (w/w)，75mL)。添加聚(乙二醇)二缩水甘油醚(750 μL，Aldrich #475696)，在室温下将混合物快速搅拌5分钟，然后用250 mL水骤冷。经由中等玻璃熔结料过滤器过滤混合物，用水(3×250 mL)洗涤。将纤维在40℃干燥一夜。(实施例22)。

实施例23。

磺丙基官能化纤维的聚(烯丙胺)改性。在装有磁性搅拌棒的500 mL烧杯中添加1.0 g实施例2的磺丙基-官能化纤维和聚烯丙胺水溶液(PAA MW = 15 kDa，20% (w/w)，75mL)。添加聚(乙二醇)二缩水甘油醚(750 μL，Aldrich #475696)，在室温下将混合物快速搅拌10分钟，然后用250 mL水骤冷。经由中等玻璃熔结料过滤器过滤混合物，用水(3×250mL)洗涤。将纤维在40℃干燥一夜。(实施例23)。

实施例24。

磺丙基官能化纤维的聚(烯丙胺)改性。在装有磁性搅拌棒的500 mL烧杯中添加1.0 g实施例23的聚(烯丙胺)-官能化纤维和聚烯丙胺水溶液(PAA MW = 15 kDa，20% (w/w)，75 mL)。添加聚(乙二醇)二缩水甘油醚(750 μL，Aldrich #475696)，在室温下将混合物快速搅拌10分钟，然后用250 mL水骤冷。经由中等玻璃熔结料过滤器过滤混合物，用水(3×250 mL)洗涤。将纤维在40℃干燥一夜。(实施例24)。

静态结合容量测量。BSA的静态结合容量测量结果在以下表25中提供。聚(烯丙 胺)-官能化纤维介质提供20-60 mg/mL的BSA静态结合容量。在该系列中，我们发现来自实 施例24的组合物产生可与商业生物分子层析应用中使用的基于珠粒的阴离子交换介质比 较的最高BSA SBC值。

试样	量 (g)	BSA结合 (mg)	SBC (mg/g)	SBC (mg/mL)<sup>1</sup>
					实施例22	0.01	0.60	60	20
实施例23	0.01	0.89	89	29
					实施例24	0.01	1.72	172	57
实施例2	0.01	-0.03	-3	-1

¹基于0.33 g/mL纤维填充密度

表25。静态结合容量测量。激发：2 g/L牛血清白蛋白(BSA)，在50 mM TRIS缓冲剂(pH 8)中。

动态结合容量测量。以下表26中提供实施例24的聚(烯丙胺)-官能化纤维介质的 BSA动态结合容量测量结果。将1.0 g的介质填充进11 mm内径Vantage柱中并压缩至3.0 cm 的床深度(2.85 mL柱体积，0.35 g/mL纤维填充密度)。在200 cm/hr的线速率下进行动态结 合容量测量。该速率对应于54秒的停留时间。实施例24的纤维介质在10%穿透下显示50 mg/ mL的BSA动态结合容量。

实施例 24	DBC (mg/mL)
		%穿透	200 cm/hr (RT 54 秒)
1	44
		5	47
10	49
		50	62

表26。在200 cm/hr下的1、5、10和50%穿透下聚(烯丙胺)-官能化Allasso翼状纤维阴离子交换介质的BSA DBC值(RT =停留时间)。激发：0.5 g/L BSA，在25 mM Tris中，pH 8。

实施例25。

利用HPA/MBAm 95/5的尼龙纤维表面改性。在具有机械搅拌器、回流冷凝器和温度控制器的1000 mL 3颈圆底烧瓶中添加丙烯酸羟基丙酯(HPA，13.7 g，95 mmol)，N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺) (MBAm，0.77 g，5 mmol)和水(710 mL)。向混合物中添加16.8 g松散尼龙纤维(Allasso industries，#090602PA6C)。添加过硫酸铵(1.60 g，7 mmol)。将潮湿固体加热至80℃持续4小时。

在冷却到室温之后，将固体转移至布氏漏斗并用热水(3×500 mL)和甲醇(1×500mL)洗涤。在真空下使材料干燥30分钟。将材料转移进烘箱中并在40℃下干燥12小时。

获得17.3 g白色纤维。

实施例26。具有侧挂磺丙基阳离子交换官能团的HPA/MBAm改性高表面积纤维的高铈离子氧化还原接枝聚合。

HPA/MBAm改性尼龙纤维的接枝聚合。在具有机械搅拌器、回流冷凝器和温度控制器的200 mL 3颈圆底烧瓶中添加2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸钠盐(AMPS-Na，23.1 g，100 mmol)和水(76.3 mL)。向溶液中添加2.50 g的HPA/MBAm改性尼龙纤维(实施例25)。在真空下吹扫反应混合物，用氮气再充气三次。

向反应混合物中添加1 M HNO₃中的0.4 M硝酸铵铈(IV)溶液(0.620 mL，0.250mmol)和1 M HNO₃溶液(2.46 mL，2.46 mmol)。

将反应混合物加热至35℃持续18小时。

在冷却到室温之后，用0.5 M硫酸中的0.2 M抗坏血酸溶液(3×150 mL)，去离子水(3×150 mL)，1 M氢氧化钠溶液(3×150 mL)，去离子水(3×150 mL)和丙酮(3×150 mL)洗涤固体。将材料放入烘箱中在40℃下干燥12小时。

获得2.52 g白色纤维固体。

介质的功能特性。在阳离子交换层析介质中对于多克隆人类γ免疫球蛋白(IgG)的纯化评价来自实施例26的磺丙基-官能化高表面积纤维。

IgG的静态结合容量测量结果在以下表27中提供。在该研究中，将来自Allaso(批ID“3kg batch-no manuf. lot ID”)的未官能化“翼状纤维”的试样的静态结合容量与由实施例26的高铈离子氧化还原聚合方法和实施例2中描述的热引发聚合物接枝方法制备的磺丙基-触角官能化纤维的试样进行比较。人们发现高铈离子氧化还原接枝方法提供的静态结合容量(150 mg IgG/g纤维试样)比热-引发方法(50 mg IgG/g纤维试样)和单独的未官能化纤维(10 mg IgG/g纤维试样)显著更高的SP-官能化触角纤维介质。SP-官能化触角纤维介质显示可与商业生物分子层析应用中使用的基于珠粒的树脂介质比较的IgG静态结合容量。

表27。静态结合容量测量。激发：2 g/L多克隆人类IgG (SeraCare LifeSciences，Milford，MA)，在50 mM乙酸钠(pH 5)中。

使用对用1.00 g的来自实施例26的SP-触角改性尼龙纤维填充的11 mm IDVantage柱注入丙酮，以及将纤维床压缩至3.0 cm的床深度(柱体积2.85 ml)，测量HETP值。得到HETP的容许值(0.08 cm)和峰不对称性(1.8-2.0)。基于这些结果，人们相信0.35 g/mL的SP-触角改性纤维填充密度将为层析评价中的可接受特性提供充足的流动均匀性。

也根据以下步骤，用相同的柱进行IgG动态结合容量测量：

5 CV (柱体积) 50 mM NaOAc 缓冲剂 (pH 5) (平衡)

60 CV 1.7 mg/mL IgG (SeraCare)，在50 mM NaOAc 缓冲剂中 (pH 5) (IgG激发)

30 CV 50 mM NaOAc 缓冲剂 (pH 5) (洗涤)

15 CV 1 M NaCl，在50 mM NaOAc 缓冲剂中 (pH 5) (洗脱)

10 CV 0.5 M NaOH (清洗)

10 CV 50 mM NaOAc 缓冲剂 (pH 5) (洗涤)。

图10提供根据某些实施方案的SP-触角改性纤维的典型IgG穿透曲线的实例。在10% IgG穿透下存在尖锐的穿透曲线和40 mg/mL的IgG动态结合容量(表28)。

表28。在不同线速率下在1、5、10和50%穿透下的SP-触角官能化Allasso翼状纤维阳离子交换介质的IgG动态结合容量(RT =停留时间)。

图11提供在200 cm/hr至1200 cm/hr的不同线速率下SP-触角纤维柱的叠加IgG穿透曲线。随着线性流速率升高，IgG穿透曲线的斜率略微降低。根据在此公开的实施方案，对纤维介质的动态IgG结合容量的速率影响比典型在基于珠粒的系统中观察到的明显小得多。在图12中，仅看到在所测最高速率(1200 cm/hr，9秒停留时间)下所测IgG动态结合容量少量减少。该性能是主要通过将IgG分子对流输送至离子配体结合位置所支配的系统的指示。

相反，随着速率升高，传统的基于珠粒的离子交换层析树脂将显示动态结合容量显著减少和更加扩散的穿透曲线。在很高的速率下，床压缩可能牺牲珠粒的完整性，导致流动均匀性较差和层析性能降低。

实施例27。

流过宿主细胞蛋白清除。以流过抛光(flow through polishing)方式评价根据实施例26制备的磺丙基-官能化纤维介质的HCP清除活性。将0.3 g的磺丙基-官能化纤维介质填充进14.5 mm内径柱中，并压缩至0.6 cm的床深度(1.00 mL柱体积，0.30 g/mL纤维填充密度)。独立地和与商业膜吸附剂(ChromaSorb™，Millipore Corp，膜体积0.2 mL)结合来测试柱。

澄清含有单克隆抗体的细胞培养介质，然后使用蛋白A柱层析分离并将溶液的pH调节至pH 5。随后用TRIS将蛋白A洗脱的pH调节至pH 7，然后经由0.2微米膜过滤。

用缓冲剂溶液(25 mM Tris，pH 7)平衡柱和Chromasorb™膜装置。

如表29中所述分别和连续评价磺丙基-官能化纤维介质和Chromasorb™膜吸附剂。使72 mL的7.3 g/L单克隆抗体蛋白A洗脱(pH 7)以0.25 mL/min的流速通过装置。收集六个12 mL级分。分别由HCP-ELISA和蛋白A HPLC分析八个流过级分和合并的试样，以确定HCP清除水平和单克隆抗体回收率。

虽然SP-纤维(0.38 LRV)不如ChromaSorb™膜吸附剂(1.42 LRV)那样能清除更多的HCP，但是我们发现在pH 7下两个流过吸附剂连续排列(2.13 LRV)在HCP清除方面比单独的吸附剂更加有效。因为这些吸附剂介质在该应用中没有容量限制，这些结果表明两个吸附剂清除分别的和不同群体(population)的HCP。我们怀疑SP-纤维将在更低pH下清除更多的HCP，其中HCP将具有更大的有效正电荷，但是，SP-纤维的单克隆抗体的亲合性也将升高并可能降低产物回收率。

¹流过级分体积的合计总和

表29。单克隆抗体进料的流过纯化。三个流过抛光组的评价。SP-纤维(实施例26)(顶部)，ChromaSorb™ (中部)，SP-纤维(实施例26)/ChromaSorb™连续排列(底部)。5个流过和1个合并级分的单克隆抗体回收率(蛋白A HPLC)和HCP清除(HCP-ELISA)。激发：7.3 g/L的单克隆抗体蛋白A洗脱(pH 7)，流速0.25 mL/min。

实施例28。

流过宿主细胞蛋白清除。以流过抛光方式评价根据实施例14(引入实施例14C）制备的Q-官能化纤维介质的HCP清除活性。将0.34 g的Q-官能化纤维介质填充进14.5 mm内径柱中，并压缩至0.6 cm的床深度(1.00 mL柱体积，0.34 g/mL纤维填充密度)。

澄清含有单克隆抗体的细胞培养介质，然后使用蛋白A柱层析分离并将溶液的pH调节至pH 5。随后用TRIS碱将蛋白A洗脱的pH调节至pH 8，然后经由0.2微米膜过滤。

用缓冲剂溶液(25 mM Tris，pH 8)平衡Q-官能化纤维介质柱。

表30中提供来自Q-官能化纤维介质评价的数据。使100 mL的8.2 g/L单克隆抗体蛋白A洗脱(pH 8)以1.0 mL/min的流速通过装置。收集十个10 mL级分。使用25 mM Tris pH8中的1 M氯化钠溶液作为洗脱缓冲剂来洗脱结合的HCP。同样收集两个10 mL洗脱级分。分别由HCP-ELISA和蛋白A HPLC分析十个流过级分和两个洗脱级分，以确定HCP清除的水平和单克隆抗体回收率。

Q-官能化纤维在流过方式的HCP清除中是有效的。用高mAb回收率(94%)获得0.3的HCP LRV。在此公开的实施方案的Q-官能化纤维介质可以用作单克隆抗体制造中的流过抛光应用的基于珠粒的树脂介质和膜吸附剂体系的适宜的低成本替代方案。Q-官能化纤维介质的高渗透性(对于根据实施例14C制备的Q-官能化纤维介质而言，700 mDa)能够以使用膜吸附剂不能达到的流速高速处理mAb进料流。

¹流过和洗脱级分体积的合计总和

表30。单克隆抗体进料的流过纯化。包括填充床形式(1.0 mL柱体积，0.34 g/mL填充密度)的Q-官能化纤维介质的流过抛光方法的评价。5个流过和2个洗脱级分的单克隆抗体回收率(蛋白A HPLC)和HCP清除(HCP-ELISA)。合并级分数据为计算值。激发：8.2 g/L的单克隆抗体蛋白A洗脱(pH 8)，流速1.0 mL/min (停留时间= 60秒)。

实施例29。

流过单克隆抗体合计清除。以流过抛光方式评价根据实施例26制备的磺丙基-官能化纤维介质的单克隆抗体合计清除活性。将1.0 g的磺丙基-官能化纤维介质填充进11mm内径的Vantage柱中，并压缩至3.0 cm的床深度(2.85 mL柱体积，0.35 g/mL纤维填充密度)。

用50 mM乙酸盐缓冲剂(pH 5)中的0.5 M氯化钠溶液和50 mM乙酸盐缓冲剂(pH 5)稀释含有20 g/L单克隆抗体的蛋白A洗脱合并物，以提供pH为5的6.9 g/L溶液和19 mS/cm的传导率。选择19 mS/cm的传导率值，以削弱单体单克隆抗体的结合和促进聚集的单克隆抗体物质在蛋白A料液中结合。

用缓冲剂溶液(50 mM 乙酸盐，pH 5)平衡磺丙基-官能化纤维介质柱。

表31和图9中提供来自磺丙基-官能化纤维介质评价的数据。285 mL的6.9 g/L单克隆抗体蛋白A洗脱(pH 5，19 mS/cm)以3.2 mL/min (200 cm/hr)的流速通过柱。收集三十三个8.6 mL (3柱体积)级分。使用50 mM乙酸盐中的0.5 M氯化钠溶液（pH为5）作为洗脱缓冲剂洗脱结合单体和聚集单克隆抗体。同样收集五个8.6 mL (3柱体积)洗脱级分。分别由尺寸排除层析(SEC)和蛋白A HPLC来分析三十三个流过级分和五个洗脱级分，以确定合计清除水平和单克隆抗体回收率。

在流过工作方式下，在单体单克隆抗体物质存在下，磺丙基官能化-纤维显示结合聚集的单克隆抗体的能力。从蛋白A HPLC数据我们发现92%的高mAb回收率。SEC数据的分析显示流过级分#2中单体mAb物质完全穿透，而聚集的mAb并不与0.6%的初始进料浓度(100%穿透)匹配，直到流过级分#5。洗脱级分#35、36和37的SEC分析显示聚集的高分子量(HMW)物质中富集的和单体mAb中消耗的mAb群体。根据在此公开的实施方案的磺丙基-官能化纤维介质可以用作根据本实施例中描述的方法的聚集清除的手段。磺丙基-官能化纤维介质的高渗透性(对于根据实施例26制备的磺丙基-官能化纤维介质而言，520 mDa)能够以适合于模拟移动床操作的高流速来高速、迅速地循环mAb进料流。

¹流过和洗脱级分体积的合计总和

表31。单克隆抗体进料的流过合计清除。包括填充床形式(2.85 mL柱体积，0.35g/mL填充密度)的磺丙基-官能化纤维介质的流过合计清除方法的评价。31个流过和3个洗脱级分的单克隆抗体回收率(蛋白A HPLC)和%单体，% HMW合计(SEC)。合并级分数据为计算值。激发：6.9 g/L的单克隆抗体蛋白A洗脱(pH 5，19 mS)，流速3.2 mL/min (停留时间= 54秒)。

实施例32。

对可压缩床的直接捕获。评价实施例19的磺丙基-官能化纤维介质从流过工作方式的未澄清细胞培养流体中直接捕获单克隆抗体。将0.49 g的磺丙基-官能化纤维介质填充进14.5 mm的内径柱中，并压缩至3.0 cm的床深度(5.0 mL柱体积，0.10 g/mL纤维填充密度)。用缓冲剂溶液(50 mM 乙酸盐，pH 5)平衡磺丙基-官能化纤维介质柱。提供含有0.8 g/L单克隆抗体的未澄清的中国Hampster卵巢细胞培养流体(pH 6.5，5.7 mS/cm)。

使含有0.8 g/L单克隆抗体的100 mL未澄清的细胞培养流体以12.5 mL/min (460cm/hr)流速经过柱。收集九个10 mL (2柱体积)的流过级分。通过反复压缩和展开纤维床，用50 mM乙酸盐缓冲剂(pH 5)洗涤低密度纤维床。这种压缩和展开通过调节柱流动分布顶盖来实现。收集十三个10 mL (2柱体积) 50 mM乙酸盐缓冲剂(pH 5)洗涤级分。使用50 mM乙酸盐中的1.0 M氯化钠溶液（pH为5）作为洗脱缓冲剂来洗脱结合的单克隆抗体。优选以压缩床形式(床深度1.0 cm，1.65 mL柱体积，0.30 g/mL纤维填充密度)实现洗脱步骤，以进一步浓缩单克隆抗体洗脱。收集三个10 mL (2柱体积)洗脱级分。通过蛋白A HPLC来分析九个流过级分，十三个洗涤级分和三个洗脱级分，测定单克隆抗体回收率。表32中提供来自磺丙基-官能化纤维介质评价的数据。

在未澄清的中国仓鼠卵巢细胞培养介质存在下，磺丙基-官能化纤维显示结合单克隆抗体(mAb)的能力。根据蛋白A HPLC数据，我们发现在mAb捕获操作期间，级分#7完成mAb穿透。50 mM乙酸盐(pH 5)洗涤阶段借助于洗涤级分#6从柱和系统中清除任何未结合的mAb。用50 mM乙酸盐中的1.0 M氯化钠洗脱液(pH 5)来洗脱来自磺丙基-官能化纤维介质柱中所结合的mAb。本领域技术人员将认识到通过任何数目的工艺变化可以获得单克隆IgG结合容量方面的显著提高。这些可以包括细胞培养进料传导率减小，未澄清的细胞培养进料稀释，或使用蛋白A亲合性配体结构，而不是本实施例的磺丙基-基阳离子交换配体官能团。本领域技术人员将认识到对于这种直接捕获应用而言，实施例18的蛋白A官能化纤维介质或其衍生物会是优选的。在低填充密度形式下，表面官能化纤维介质能够从未澄清的进料流中直接捕获IgG。随后的床压缩能够以压缩床形式浓缩mAb洗脱。这种方法可以省去在处理例如单克隆抗体的治疗生物制药的下游使用一级(离心)和二级澄清(深度过滤)方法。

¹流过、洗涤和洗脱级分体积的合计总和

表32。从未澄清的细胞培养直接捕获单克隆抗体。包括填充床形式(5.00 mL柱体积，0.10 g/mL填充密度)的磺丙基-官能化纤维介质的直接mAb捕获方法的评价。4个流过、4个洗涤和3个氯化钠洗脱级分的单克隆抗体浓缩和回收率(蛋白A HPLC)。激发：含有0.87g/L的单克隆抗体的100 mL的未澄清的中国hampster卵巢细胞培养流体(pH 6.5，5.7 mS)，流速12.5 mL/min (停留时间= 24秒)。

实施例33。

纤维介质结合/洗脱纯化病毒的能力。以下表31中提供噬菌体φ6的静态结合容量和洗脱回收率测量结果。以表33中描述的量在5个塑料离心管中添加实施例14C的Q-官能化触角纤维介质和未官能化Allasso纤维试样。伴随搅拌10分钟，用5 mL的25 mM Tris缓冲剂(pH 8，0.18 mg/mL HSA)平衡各纤维试样和对照管。在室温下在台式离心机中以4000 rpm旋转管10分钟，使纤维介质成丸粒。移除2.5 mL上清液，向各管中添加25 mM Tris缓冲剂中的2.5 mL的1.7×10⁷ pfu/mL φ6溶液(pH 8，0.18 mg/mL HSA)。在室温下将试样搅拌1小时。然后，在室温下在台式离心机中以4000 rpm旋转管15分钟，使纤维介质成丸粒。移除2.5mL上清液，通过评价所形成的样片来对这些试样的未结合φ6进行评价。在各洗涤和移除2.5 mL上清液之间，用25 mM Tris缓冲剂的2.5 mL洗涤液(pH 8，0.18 mg/mL HSA)将管洗涤3次，伴随离心使纤维介质成丸粒。洗涤之后，向各管中添加25 mM Tris缓冲剂中的2.5mL的1.0 M NaCl溶液(pH 8，0.18 mg/mL HSA)(5 mL总体积，最终的NaCl浓度为0.5 M)。在室温下将试样搅拌10分钟。然后，在室温下在台式离心机中以4000 rpm旋转管10分钟，使纤维介质成丸粒。移除2.5 mL上清液，通过评价所形成的样片来对这些洗脱试样的洗脱φ6进行评价。实施例14C的Q-官能化触角纤维介质显示3.1的显著噬菌体φ6 log减少值(LRV)和40%的洗脱回收率产率。该特性可与商业病毒层析应用中使用的基于膜的阴离子交换介质相比。本发明的Q-官能化纤维介质可以集成进入预填充装置形式或层析柱中，用于流过病毒清除或结合/洗脱病毒纯化应用。

表33。静态结合容量测量。激发：25 mM Tris (pH 8)中的2.5 mL的1.7x10⁷ pfu/mL噬菌体φ6，具有0.18 mg/mL HSA。洗脱缓冲剂：25 mM Tris (pH 8)中的0.5 M NaCl，具有0.18 mg/mL HSA。

Claims (10)

1.高表面积轴向压缩的短尼龙纤维的非织造床，该纤维具有包括划定基本纵轴的体区域和多个从所述体区域向外径向延伸的突出部的横截面，所述短尼龙纤维具有其上赋予的阳离子交换或阴离子交换官能团，其中所述短尼龙纤维为随机取向的纤维。

2.根据权利要求1所述的高表面积轴向压缩的短尼龙纤维的非织造床，其中所述短尼龙纤维的长度为2-6 mm。

3.包括松散或熔凝的轴向压缩的短尼龙纤维的填充床的外壳，所述纤维具有包括划定基本纵轴的体区域和多个从所述体区域向外径向延伸的突出部的横截面，所述短尼龙纤维具有其上赋予的阳离子交换或阴离子交换官能团，其中所述短尼龙纤维为随机取向的纤维。

4. 根据权利要求3所述的包括松散或熔凝的轴向压缩的短尼龙纤维的填充床的外壳，其中所述短尼龙纤维的长度为2-6 mm。

5.纯化包括有益的生物分子和杂质的试样的方法，包括使所述试样与轴向压缩的短尼龙纤维介质床接触，所述纤维具有包括划定基本纵轴的体区域和多个从所述体区域向外径向延伸的突出部的横截面，所述短尼龙纤维具有其上赋予的阳离子交换或阴离子交换官能团，其中所述短尼龙纤维为随机取向的纤维；并回收有益的生物分子。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述短尼龙纤维的长度为2-6 mm。

7.权利要求5的方法，其中所述官能团使得能够以流过方式进行纯化。

8.权利要求5的方法，其中所述官能团使得能够以结合/洗脱方式进行纯化。

9.权利要求5的方法，其中所述纤维具有其上赋予的阳离子交换官能团，和其中所述纯化在5至8的pH下进行。

10.纯化蛋白混合物中的蛋白质的方法，包括：

使所述蛋白混合物与低密度短尼龙纤维介质床接触，所述纤维具有包括划定基本纵轴的体区域和多个从所述体区域向外径向延伸的突出部的横截面，所述纤维具有其上赋予的阳离子交换官能团、阴离子交换官能团、疏水作用官能团或亲合性官能团，其中所述短尼龙纤维为随机取向的纤维，

洗涤所述短尼龙纤维介质以清除未结合的物质，

轴向压缩所述纤维介质，和

洗涤所述压缩的纤维介质以提取结合蛋白。

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