KR20150099846A - 백신 및 바이러스를 정제하기 위한 크로마토그래피 매질 - Google Patents

백신 및 바이러스를 정제하기 위한 크로마토그래피 매질 Download PDF

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KR20150099846A
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데이비드 야보르스키
존 보일
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이엠디 밀리포어 코포레이션
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Abstract

크로마토그래피, 특히 이온 교환 크로마토그래피용 흡착 매질은 성형 섬유로부터 유도되고, 바이러스를 정제하는데 유용하다. 특정 실시양태에서, 상기 작용화된 성형 섬유는 통상의 섬유와 비교할 때 현저히 섬유의 표면적을 증가시키는 피브릴형 또는 릿지형(ridged) 구조를 나타낸다. 이온 교환 작용기를 고 표면적 섬유에 제공하는 표면 현수(pendant) 작용기가 부가될 수 있다. 이러한 현수 작용기는 인플루엔자와 같은 바이러스의 이온 교환 크로마토그래피 정제에 유용하다.

Description

백신 및 바이러스를 정제하기 위한 크로마토그래피 매질{CHROMATOGRAPHY MEDIA FOR PURIFYING VACCINES AND VIRUSES}
본 출원은 2013년 1월 31일 출원된 미국 가출원 번호 61/758,926호를 우선권 주장하며, 그 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
분야
본 명세서에 개시된 실시양태는 백신 및 바이러스의 정제 및 모노클로날 항체 공급 스트림(monoclonal antibody feed stream)의 정제를 위한 바이러스 제거용으로 적합한 크로마토그래피 매질에 관한 것이다.
최근의 유행병 발병에 대한 대응으로서 뿐만 아니라 신생 치료 적용을 위해 백신 제조를 위한 새로운 정제 기술의 개발은 아주 관심을 끄는 것이다. 수율을 개선하고, 제품 순도를 증가시키며 또 생산 속도를 증진시키기 위하여 이러한 새로운 기술에 대한 일반적 필요가 존재한다. 현재 이용되는 백신 정제 기술은 염화세슘 밀도구배 원심분리, 접선 유동 여과(tangential flow filtration), 및 크로마토그래피를 포함한다. 이들 기술의 각각은 분명한 이점과 결점을 제공하며 또 백신 제조자들은 이들의 생산 규모, 순도 및 제조 비용 요건에 따라서 특정 정제 기술을 선택해야 한다. 전통적인 백신 정제 공정은 도 1에 도시된 바와 같은 공정 흐름 다이아그램에 기재되어 있다.
접선(tangential) 유동 여과 및 구배적 원심분리 공정은 백신 생산에 널리 이용되고 있지만, 이들 단위 작업들은 고가이고 또 시간 소모적 배치(batch)식 작업이며, 측량이 어렵고, 특수한 장비와 인력을 필요로 하며, 또 낮은 수율과 감염 손실을 제공한다. 이러한 작업에 사용된 장치는 폐기하기가 어렵고 또 다음 배치의 정제 장치를 제조하기 위하여 값비싼 재생, 세정 및 확인 공정이 수행되어야 한다.
대조적으로, 백신을 결합/용리(bind/elute) 크로마토그래피 정제하기 위하여 비드를 기본으로 한 수지를 사용하는 것은 그러한 정제 공정이 훨씬 대규모로 실시될 수 있기 때문에 관심을 끈다. 불행히도, 이러한 용도로 상업적으로 시판되는 수지는 전형적으로 너무 작은 기공 크기를 가져서 대형 바이러스 입자에 의해서는 접근될 수 없다. 그 결과, 이러한 매질은 바이러스가 비드의 외부 표면에만 접근할 수 있기 때문에 낮은 결합능을 나타낸다. 이러한 적용에 적합한 크로미토그래피 수지와 관련된 고 비용과 결부된 이러한 낮은 결합능은 이러한 공정을 비용 효과적인 것으로 만들기 위하여 제조자들이 크로마토그래피 매질을 사용하여 다수의 결합/용리 및 컬럼 재생을 실시하는 것을 필요로 한다. 상기 재생 공정은 생성물 처리량(throughput) 감소, 완충액 및 세정액의 소비 증가, 확인 비용 및 중요한 장치 요건 증가로 인하여 생산 비용을 또한 증가시킨다. 바이러스에 대한 결합능 증가를 제공할 수 있는 유망 기술들이 현재 개발되고 있고 또 이들은 막 흡수제, 모노리쓰(monoliths), 및 시판되는 수지 시스템을 사용하는 플로우 쓰루(flow-through) 흡착제 정제 방법을 포함한다. 막 흡수제 및 모노리쓰는 이들 적용에 대해 증가된 결합능을 가능하게 하는 반면에, 이들 기술들은 전형적으로 자신의 고유한 규모 제한을 갖고 또 이러한 정제 매질의 극히 높은 비용은 이들 생성물을 일회용 장치로 사용하는 것을 배제시키며 또 전통적으로 가격에 민감한 백신 산업에 대한 이들의 적용을 더욱 제한시킨다.
당해 분야에 현재 공지된 정제 기술의 대다수의 제한을 해결하기 위하여, 아주 저비용의 열가소성 섬유 및 상기 섬유의 표면 상에 리간드 작용기를 포함하는 새로운 유형의 크로마토그래피 매질이 개발되었다. 상기 리간드는 이온 교환과 같은 세포 배양 공급 스트림으로부터의 바이러스를 선택적으로 결합시킬 수 있다. 상기 결합된 바이러스는 이후에 예컨대 고도의 이온 세기를 갖는 용리 완충액을 사용하는 것을 통하여 용액 조건에서의 변화시 크로마토그래피 매질로부터 방출될 수 있다. 상기 섬유-계 정지상은 비다공성이고 또 높은 바이러스 결합능을 위해 충분한 표면적을 제공하는 나선형의 표면 구조를 나타낸다. 상기 바이러스 결합은 섬유의 표면 위에서만 생기기 때문에, 다공성 비드계 결합/용리 시스템의 경우에서 볼 수 있는 것과 같은 바이러스 결합에 의한 크기 배제 문제가 존재하지 않는다. 또한, 바이러스 입자는 대류(convection)에 의해 상기 리간드 부위로 직접 수송될 수 있기 때문에, 상기 시스템에서 확산 문제가 없고 또 백신 공급 스트림은, 예컨대, 훨씬 높은 유동속도 또는 더 짧은 체류 시간에서 처리될 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, 크로마토그래피 매질은 성형된 섬유(shaped fiber)로부터 유도된다. 특정 실시양태에서, 상기 성형된 섬유는 피브릴형(fibrillated) 또는 릿지형(ridged) 구조(예컨대, 도 1b)를 제시한다. 이들 릿지(ridge: 이랑)는 보통 섬유와 비교하여 섬유의 표면적을 현저히 증가시킬 수 있다(예컨대, 도 1a). 따라서, 섬유 직경을 감소시키지 않고도 고 표면적이 얻어지고, 이는 전형적으로 층(bed) 투과도에서 현격한 감소와 그에 상응한 유량(flow rate) 감소를 초래한다. 특정 실시양태에 따른 고 표면적 섬유의 일례는 "윙형(winged)" 섬유로서, 이들은 알라쏘 인더스트리스 인코포레이티드(미국 노쓰캐롤라이나 랄리 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다. 알라쏘사의 윙형 섬유의 단면 SEM 영상은 도 1d에 도시되어 있다. 이들 섬유는 그램당 약 1 내지 14 m2 범위의 표면적을 제공한다. 상기 섬유 매질의 표면적 측정은 크립톤 또는 질소 가스를 이용하여 BET(Brunauer, Emmett, and Teller)의 방법과 같은 통상의 가스 흡착 수법에 의해 결정된다.
본 명세서에는 예를 들어 음이온 교환(AEX) 작용성을 상기 고 표면적 섬유에 제공하는 표면의 현수(pendant) 작용기를 부가하는 방법이 또한 개시되어 있다. 상기 현수 작용기는 백신 및 인플루엔자와 같은 바이러스의 이온 교환 크로마토그래피 정제에 유용하다.
본 명세서에 개시된 실시양태는 또한 고 표면적 작용화된 섬유를 포함하는 매질을 사용하여 백신 및 바이러스를 정제하는 방법에 관한 것이다. 이들 방법은 플로우 쓰루 모드(flow through mode) 또는 결합/용리 모드로 실시될 수 있다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명에 개시된 매질은 높은 층 투과도(예컨대, 300-900 mDarcy), 비드계 크로마토그래피 매질에 비교하여 낮은 재료 비용, 20-60 mg/mL BSA 동적 결합, 높은 분리 효율(예컨대, HETP < 0.1 cm), 50-200 mg/g IgG 정적 결합능, 및 흡착질을 리간드 결합 부위로 대류적 지배되는 신속한 수송을 갖는다.
특정 실시양태에 따르면, 독특한 고 표면적의 압출 섬유(예컨대 열가소성 섬유)의 사용은, 0.5 내지 6 mm 사이의 길이를 갖는 불규칙 배향된 절단섬유(cut fiber)의 충전층으로서 구성될 때 높은 유동 투과도(액체) 및 균일한 유동 분포를 허용한다. 흡착적 상호작용을 기본으로 한 분리를 가능하게 하기 위하여 상기 섬유 표면을 작용화하기 위한 화학적 처리 방법이 제공된다. 화학적 처리 방법은 이온성, 친화성, 소수성 상호작용 또는 상호작용의 조합 등을 기본으로 하여 이러한 섬유에 다양한 표면 화학 작용성을 부여할 수 있다. 상기 섬유 제조 및 간단한 표면 화학 처리 공정의 조합된 경제로 생물약제에서 정제 작업뿐만 아니라 백신 제조 및 바이러스 정제를 위한 경제적이고 용이하게 측정가능한 기술을 얻는다.
특정 실시양태에 따르면, 신속한 처리 속도를 허용하는 흡착적 분리 물질이 제공되며, 이는 섬유 표면으로 또 섬유 표면에서부터 물질 수송은 확산성 수송이 접촉 시간을 길게 하여 처리 시간을 더 느리게 하는 비드계 매질과 대조적으로 매질을 통한 유체 대류에 의해 크게 제어되기 때문이다. 바이러스와 같은 대형 생물학적 종을 포획하거나 제거하는 능력이 제공되며, 이는 비드 기공의 입체적 제한으로 인하여 통상의 비드계 매질을 사용하여서는 효과적으로 분리될 수 없는 것이다.
도 1a는 종래 기술에 따른 섬유의 개략도이다;
도 1b는 특정 실시양태에 따라 사용될 수 있는 릿지형 섬유의 개략도이다;
도 1c는 특정 실시양태에 따라 부착된 현수 기를 갖는 도 1b의 섬유의 개략도이다;
도 1d는 특정 실시양태에 따라 사용될 수 있는 릿지형 섬유의 SEM 영상이다;
도 1e는 특정 실시양태에 따른 섬유의 작용화의 개략도이다;
도 2는 특정 실시양태에 따라 선택된 흡착제에 대한 BSA-라텍스 입자의 정적 결합능의 플럿이다;
도 3a 내지 도 3d는 다양한 섬유의 SEM 영상이다;
도 4는 AEX 섬유 매질뿐만 아니라 선택된 시판되는 막 흡수제 및 비드계 AEX 매질에 대해 수집된 플로우 쓰루 분획에 대한 φ6 LRV의 플럿이다;
도 5는 Φ6 역가의 용리 풀(elution pool)의 플럿이다;
도 6은 바이러스 제거 대조 플럿이다;
도 7은 인플루엔자 파괴 플럿이다;
도 8은 인플루엔자 파괴 플럿이다;
도 9는 플로우 쓰루 MVM 제거 LRV 값의 플럿이다;
도 10은 특정 실시양태에 따른 눈가루 형상의 섬유의 단면도이다;
도 11은 특정 실시양태에 따른 태양 형상의 섬유의 단면도이다;
도 12는 특정 실시양태에 따른 데이지 형상의 섬유의 단면도이다;
도 13a 내지 도 13e는 특정 실시양태에 따른 돌출부(projection) 및 분기된(branched) 하위돌출부(sub-projection)를 갖는 섬유의 단면도이다;
도 14a 내지 도 14d는 특정 실시양태에 따른 증가된 표면을 갖는 성형 섬유의 단면도이다.
상세한 설명
본 명세서에 개시된 실시양태에 따른 성형된 섬유 매질은 섬유 자체의 표면에만 의존한다. 상기 성형된 섬유는 높은 표면적 뿐만 아니라 유동에 대한 높은 투과도를 제공하기 때문에, 수용능력 및 효율에 관한 성능 목적을 달성하도록 섬유 지지체 상의 입수가능한 표면적을 증대시키기 위하여 아가로오스 히드로겔 또는 다공성 미립자를 부가할 필요는 없다. 또한, 히드로겔 또는 다공성 미립자의 부가에 의해 표면적을 향상시킬 필요가 없으므로, 본 명세서에 기재된 매질의 제조 비용은 최소로 유지된다.
섬유는 임의 길이 및 직경일 수 있고 또 바람직하게는 절단 또는 스테이플 섬유 또는 부직포(non-woven fabric)이다. 이들은 일체 구조로서 함께 결합될 필요가 없지만 개별적 성분으로 효과적으로 작용할 수 있다. 이들은 임의 길이의 실(thread) 또는 모노필라멘트와 같은 연속 길이 형태일 수 있거나 또는 이들은 부직포 또는 직물포와 같은 섬유 물질(예컨대 스테이플 섬유)를 잘게 자르거나(chopping), 결정 성장법 등에 의해 형성된 연속 길이의 섬유를 개별 조각으로 절단하는 것에 의해 더 짧은 개별 섬유로 형성될 수 있다. 바람직하게는 상기 섬유는 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 열가소성 우레탄, 코폴리에스테르, 또는 액체 결정성 중합체와 같은 열가소성 중합체로 제조된다. 약 1-3 데니어를 갖는 섬유가 바람직하다. 특정 실시양태에서, 상기 섬유는 약 1 μm 내지 약 100 μm의 단면 길이 및 약 1 μm 내지 약 100 μm의 단면 폭을 갖는다. 1개의 적합한 섬유는 약 20 μm의 단면 길이 및 약 10 μm의 단면 폭, 및 약 1.5의 데니어를 갖는다. 약 10,000 cm2/g 내지 약 1,000,000 cm2/g 범위의 표면적을 갖는 섬유가 적합하다. 바람직하게는 상기 섬유는 약 10-20 μm의 섬유 길이를 갖는다.
특정 실시양태에서, 상기 섬유는 개시된 작용에 맞는 적절한 포트와 치수를 갖는 장치 또는 용기에 압축하에 용이하게 충전될 수 있다. 상기 섬유는 또한 부직포 산업에서 일반적인 스펀본드(spunbond)(연속 필라멘트) 또는 웨트-레이드(wet-laid)(절단 섬유)에 의해 생성된 부직 시트스톡 물질과 같은 예비형성된 층 포맷에 사용될 수 있다. 적절한 예비형성된 섬유 포맷은 시트, 매트, 웹, 모노리쓰 등을 포함한다.
특정 실시양태에서, 섬유 단면은 일반적으로 본체 영역과 그 본체 영역으로부터 외방으로 방사상으로 연장되는 복수의 돌출부를 갖는 윙 형상이다. 상기 돌출부는 섬유 길이를 따라 연장되는, 동일 직선상(co-linear) 채널의 어레이를 형성하며, 섬유당 전형적으로 20 내지 30개 채널이다. 특정 실시양태에서, 돌출부의 길이는 본체 영역의 길이보다 더 짧다. 특정 실시양태에서, 섬유 단면은 일반적으로 섬유의 중심 아래로 지나는 종축을 포함하는 중간 영역 및 상기 중간 영역으로부터 연장되는 복수의 돌출부를 갖는 윙 형상(도 1d)이다. 특정 실시양태에서, 복수의 돌출부는 상기 중간 영역으로부터 방사상으로 일반적으로 연장된다. 이러한 구조의 결과로서, 상기 돌출부에 의해 복수의 채널이 규정된다. 돌출부 사이의 적합한 채널 폭은 약 200 내지 약 1000 나노미터 범위이다. 적합한 섬유는 미국 특허 공개 번호 2008/0105612호에 개시되어 있고, 그 개시내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 특정 실시양태에서, 상기 섬유는 본체 영역 및 상기 본체 영역으로부터 연장되는 하나 이상의 돌출부를 포함한다. 상기 돌출부는 또한 그들로부터 연장되는 돌출부를 가질 수 있다. 상기 돌출부는 직선 또는 곡선일 수 있다. 상기 돌출부는 실질적으로 동일 길이이거나 또는 상이한 길이일 수 있다. 상기 본체 영역은 상기 돌출부의 두께보다 더 두꺼운 두께의 영역을 가질 수 있다. 예시적 형상은 도 10에 도시된 바와 같은 눈가루 형상, 도 11에 도시된 태양 형상, 및 도 12에 도시된 바와 같은 데이지 형상을 포함한다. 더욱 자세하게는, 도 10에 도시된 눈가루 형상은 중앙 본체부와 그로부터 외방으로 연장되는 복수의 돌출부를 포함한다. 이들 돌출부 각각은 그의 길이를 따라서 그로부터 외방으로 연장되는 다양한 길이의 복수의 더 짧은 이차 돌출부 또는 하위돌출부를 갖는다. 도 11에 도시된 태양 형상은 또한 중앙 본체부를 포함하고, 또 그로부터 외방으로 연장되는 복수의 곡선 돌출부를 갖는다. 도 12에 도시된 데이지 형상은 중앙의 고형 본체부와 그로부터 외방으로 돌출하는 복수의 돌출부를 포함하고, 이들 돌출부는 부가적 돌출부를 갖지 않는다.
상기 본체 영역은 고형(예컨대 도 12) 또는 중공(예컨대 도 10 및 도 11)일 수 있고, 실질적으로 선형 또는 비선형이다. 다른 예시적 형상은 도 13a 내지 도 13e에 도시된 바와 같은 분기된 구조를 포함하는 성형 섬유를 포함한다. 따라서, 도 13a는 별 형상으로서, 고형의 중앙 본체 영역 및 그로부터 대칭적 패턴으로 외방으로 연장되는 6개의 직선상의 동일 보폭의 돌출부를 갖는다. 도 13b에 도시된 섬유는 고형의 중앙 본체 영역과 그로부터 외방으로 연장되는 직선 돌출부 세트를 갖고 있고, 세트 내의 각 돌출부는 동일 방향으로 연장된다. 도 13c에 도시된 섬유는 중앙 본체 영역과 그로부터 상이한 방향으로 연장되는 3개의 직선상의 동일 보폭의 돌출부를 갖는다. 각 돌출부는 중앙 본체 영역을 향하는 각도에서 그로부터 연장되는 말단 자유 단부 이차돌출부 또는 하위돌출부를 갖는다. 도 13d에 도시된 섬유는, 이차돌출부 또는 하위돌출부가 상기 중앙 본체 영역으로부터 멀어진 각도에서 연장되는 이외는, 도 13c에 도시된 것과 유사하다. 도 13d에 도시된 섬유는 각 이차돌출부 또는 하위돌출부가 그의 말단 자유 단부에서 부가적 돌출부를 갖는 것을 제외하고는 도 13d에 도시된 섬유와 유사하다.
다른 예시적 형상은 도 14a 내지 도 14d에 도시된 바와 같은중공 코어를 갖는 섬유, 번들형 마이크로필라멘트, 웨이브 리본 형상의 섬유를 포함한다. 도 14a 및 도 14b는 중공 코어 및 교대하는 고점과 저점(peaks and valleys)을 규정하는 복수의 돌출부를 갖는 폐쇄 다각형을 도시한다. 도 14c는 클러스터(cluster)로 함께 결합되어 각 섬유 사이의 사이 공간에서 접근가능한 표면적을 갖는 단일 필라멘트를 형성하는 섬유 번들을 도시한다. 도 14d는 지그-재그 패턴을 갖는 성형 섬유를 도시한다.
섬유 형상은 힐스 인코포레이티드(미국 플로리다 웨스트 멜번 소재)로부터 입수가능한 이성분 섬유 방사 기기를 이용하여 제조될 수 있다. 성형된 이성분 섬유는 시판되는 섬유 방사 장치 및 미국 특허 번호 5,162,074호에 기재된 바와 같은 주문 설계된 섬유 다이 스택(die stacks)를 이용하여 제조될 수 있고, 상기 기재내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 2개의 압출기는 용융 가공가능한 물질을 공통 스핀 헤드에 공급한다. 상기 스핀 헤드는 용융 유동물을, 방적돌출부를 통하여 나온 후 수집되는, 별개의 필라멘트로 분리하여 다시 지시하는 다이 스택을 함유한다. 각 필라멘트의 단면은 일차 물질 및 소망하는 섬유 형상에 대하여 네가티브로 작용하는 이차 물질에서 소망하는 섬유 형상을 갖는다. 상기 이차 물질의 존재는 피처 크기 및 근접성 측면에서만 압출되면 불가능할 수 있는 섬유 단면에서 섬유 피처를 허용한다. 압출 후, 이차 물질을 보통 용해에 의해 제거하여, 소망하는 다면을 갖는 고 표면적 섬유를 남긴다. 섬유의 최종 단면의 상세한 내용은 다이 스택, 처리 조건, 방사돌출부 형상 및 일차 및 이차 중합체의 선택의 조합에 의해 결정된다.
상기 다이 스택은 다양한 매우 난해하고 복잡한 다면을 생성하도록 제조될 수 있다. 일차 물질은 용융 방사될 수 있는 물질일 수 있다: 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리에틸렌, 등. 상기 이차 물질은 임의의 용융 방사가능한 물질일 수 있다; 그러나, 상기 이차 물질은 용이하게 제거되는 것이 바람직하므로, 바람직한 물질은 폴리락트산, 폴리비닐 알코올, 적합한 코폴리에스테르 등과 같은 용해성 중합체이다.
특정 실시양태에 따르면, 표면 현수 작용기는 음이온 교환작용성을 고 표면적 섬유에 제공하도록 배치된다. 상기 현수 작용기는 백신 및 인플루엔자와 같은 바이러스의 음이온 교환 크로마토그래피 정제에 유용하다.
고표면적 섬유의 표면 작용화는 2단계 공정에 의해 달성될 수 있다. 적합한 작용화 공정은 그라프팅 중합화이고, 또 도 1e에 도시된 도식 1에 예시된다. 이 실시양태에서, 상기 고 표면적 섬유는 글리시딜 메타크릴레이트 단량체, 암모늄 세륨(IV) 니트레이트, 및 HNO3의 수용액과 공기 중 35℃에서 1시간 동안 반응한다. 이들 조건하에서, 나일론 섬유 표면의 세륨 산화는 자유 라디칼을 생성하여 글리시딜 메타크릴레이트 중합체의 표면 그라프팅 중합화반응을 개시한다. 이러한 조건하에서, 표면 개시된 중합화 공정은 중합화된 글리시딜 메타크릴레이트 단량체의 중합체의 중합체성 "촉수(tentacle)"를 생성한다. 이렇게 하여, 상기 글리시딜 메타크릴레이트 중합체는 섬유 표면에 공유적으로 부착된다. 이러한 공정은 그라프팅 중합반응으로 공지되어 있다.
이차 합성 단계에서, 특정 실시양태에서 상기 폴리(글리시딜 메타크릴레이트) 변형된 섬유 물질은 물에 의해 신속하게 세정되고 또 트리메틸아민(25 wt%)의 수용액으로 실온에서 18시간 동안 처리된다. 이들 조건하에서,
폴리(글리시딜 메타크릴레이트) 촉수 상의 잔류하는 에폭시 기는 트리메틸아민과 반응하여 현수 양이온성 트리메틸알키람모늄(Q) 작용기를 얻을 수 있으며, 이는 백신 정제 적용에 대한 소망하는 음이온 교환 작용기를 제공할 수 있다.
1 내지 5 cm의 층 높이에서 약 0.1-0.4 g/ml, 바람직하게는 약 0.32 g/ml의 적합한 컬럼 충전 밀도는 크로마토그래피 평가에서 허용가능한 성능을 위해 충분한 유동 균일성을 제공할 것이다.
특정 실시양태에서, 상기 매질(작용화되고 충전된 섬유)은 비드계 매질과는 달리 건조하고, 미리충전된 포맷으로 사용자에게 전달될 수 있다. 상기 섬유는 열적 또는 화학적 수단에 의해 융합되어 압력 용기 내에 수용될 수 있는 반 강성(semi-rigid) 구조를 형성할 수 있다. 이러한 구성에 의하여, 상기 매질 및 그를 부착하는 장치는 즉시 사용가능하게 제조될 수 있다. 크로마토그래피 비드계 매질은 일반적으로 느슨한 물질(습윤)로 전달되며, 사용자는 압력 용기(컬럼)을 부하하도록 하는 것이 요구되며 또 다양한 수단에 의해 공극이나 채널없이 잘 충전된 층을 생성한다. 충전의 균일성을 확인하기 위하여 후속 시험이 일반적으로 필요하다. 대조적으로, 특정 실시양태에 따르면, 제품이 사용할 준비에 이르면 사용자에 의한 충전이 필요 없다.
상기 성형된 섬유 매질은 그의 형태 성질로 인하여 다공성 크로마토그래피 비드에 비하여 특정의 이점을 제공한다. 전형적으로 비드계 크로마토그래피에서, 분리 공정에서 속도 제한 단계는 확산에 의해 제어되는 다공성 비드의 심층으로 흡착질(용질)을 침투시키는 것이다; 단백질과 같은 거대분자의 경우, 이러한 확산 수송은 비교적 느릴 수 있다. 본 명세서에 개시된 고 표면적 섬유의 경우, 결합 부위는 섬유의 외부 상에서 노출되므로 유동 스트림 중의 흡착질 분자에 의해 용이하게 접근될 수 있다. 이러한 접근법에 의해 제공된 신속한 수송이 짧은 체류 시간(높은 유량)을 허용하므로, 모의(simulated) 이동 층 시스템과 같은 수법에 의해 매질의 신속한 순환을 가능하게 한다. 처리 속도는 생물학적 약제(biologics)의 제조에서 중요한 변수이기 때문에, 본 명세서에 개시된 바와 같은 섬유계 크로마토그래피 매질은 통상의 비드계 매질에 비하여 특별한 공정 이점을 갖는다.
통상의 크로마토그래피 수지는 전형적으로 아가로오스, 합성 중합체, 및 실리카 또는 글래스로 된 다공성 비드로 시작한다. 이들 물질은 일반적으로 고가이다: 작용화되지 않은 아가로오스 비드는 리터당 $300-$350 소요되고 또 제어된 기공 글래스는 리터당 $600-$1000 소요된다. 대조적으로, 양호한 크로마토그래피 특성을 달성하기 위하여 적절한 밀도와 두께 범위에 있는 본 명세서에 기재된 바와 같은 고 표면적 섬유의 부직 층은 리터당 $20-$50 소요될 것으로 추정된다. 이러한 비용 이점은 이러한 새로운 크로마토그래피 매질이 단일 사용 후 또는 대부분의 경우 1회의 제조 캠페인 내에서 다수 주기 이후 사용하고 처리되기에 적절한 가격을 갖는 "1회성" 기술(예컨대 단일 사용)로서 시판될 수 있을 것이라는 가능성을 증가시킬 것이다.
그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 공개 번호 2012/0029176호에 기재된 실시양태의 상기 표면 작용화된 섬유 매질(예컨대, SP 작용화된 알라쏘 섬유, SPF1)은 충전층 포맷에서 높은 투과도를 나타낸다. 충전된 밀도에 따라서, 층 투과도는 >14000 mDarcy 내지 1000 mDarcy 미만의 범위일 수 있다. 0.1 g/mL(1 g 매질/9.3 mL 컬럼 부피)의 낮은 충전 밀도에서, 900 cm/hr의 선형밀도에서 14200 mDarcy의 층 투과도가 측정되었다. 이 값은 넓은 속도 범위(400 -1300 cm/hr)에 걸쳐 변하지 않는다. 이러한 특징은 충전된 섬유 층이 높은 선속도에서는 압축되지 않음을 나타낸다. 이어 상기 표면 작용화된 섬유 매질(SP 작용화된 알라쏘 섬유, SPF1)을 0.33 g/mL(1 g 매질/ 2.85 mL 컬럼 부피)의 더 높은 충전 밀도로 압축하여 900 cm/hr의 선속도에서 1000 mDarcy의 층 투과도를 얻었다. 마찬가지로, 1000 mDarcy의 상기 값은 400-1300 cm/hr의 선속도 범위에 걸쳐 변하지 않았다. 적합한 충전 밀도는 약 0.1 내지 약 0.5 g/ml 사이를 포함한다.
ProRes-S(밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠 빌레리카 소재)와 같이 생물분해용에 이용된 통상의 충전층, 이온 교환 크로마토그래피 매질의 경우, 상기 케이스(3 cm 층 깊이, 11 mm ID Vantage 컬럼, 2.85 mL 컬럼 부피)와 유사한 치수의 충전층에 대해 1900 mDarcy의 투과도 값이 측정되었다. 막 흡수제의 경우, 전형적인 투과도 값은 1-10 mDarcy 범위이다. ProRes-S의 경우, 400-1300 cm/hr의 속도 범위에 걸쳐 층 투과도에서 아무런 유의한 변화도 측정되지 않았다.
ProRes-S 와 같은 반강성 비드에 대해서는 상기와 같은 거동이 예상되었다; 더욱 압축성인 매질(예컨대 아가로오스 비드)은 충전층의 유의한 압축으로 인하여 높은 선속도(> 200 cm/hr)에서 층 투과도의 현저한 감소를 나타낼 것으로 예상된다.
고 표면적 섬유 표면 작용화 및 트리메틸아민에폭시 개환 과정의 예는 이하에 제공된다(실시예 1 및 2).
트리메틸알킬암모늄 (Q) 촉수 작용화된 고 표면적 섬유( AEX 섬유 매질)의 제조
실시예 1. 비변형 나일론 섬유의 그라프트 중합반응. 500 mL 병에 10 g의 알라쏘(Allasso) 나일론 섬유 및 물(466 mL)을 부가하였다. 1M HNO3 용액(14.4 mL, 14.4 mmol)을 상기 반응 혼합물에 부가한 다음, 1M HNO3 중의 암모늄 세륨(IV) 니트레이트의 0.4 M 용액(1.20 mL, 0.480 mmol)을 부가하였다. 이 반응 혼합물을 15분간 교반하였다. 글리시딜 메타크릴레이트(GMA, 3.39 g, 24 mmol)를 부가하고 또 상기 반응 혼합물을 1시간 동안 35℃로 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 고형분을 DI수(3x 300mL)로 세정하고 또 습윤 물질을 다음 단계에 즉시 사용하였다.
실시예 2. 에폭시- 작용화된 섬유( AEX 섬유 매질)의 Q- 작용화
2L 병에 상기 실시예 1로부터 얻은 습윤 GMA 작용화된 섬유, 물(500 mL) 및 메탄올(500 mL) 중의 50 wt% 트리메틸아민(aq.) 용액을 부가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 섬유 고형분을 0.5 M 황산(3 x 400 mL) 중의 0.2 M 아스코르브산 용액, DI수(3 x 400 mL), 1M 수산화 나트륨 용액(3 x 400 mL), DI수(3 x 400 mL) 및 에탄올(1 x 400 mL)으로 세정하였다. 얻어진 물질을 오븐에 넣고 40℃에서 48시간 동안 건조시켰다. 11.74 g의 백색의 섬유상 고체를 수득하였다.
AEX 섬유 매질의 작용 성능. 실시예 2에 기재된 AEX 섬유 매질의 성능은 이하의 실시예에 기재된 바와 같은 다양한 바이러스 제거 및 백신 정제 적용에 대해 평가하였다.
실시예 3. AEX 섬유 매질 컬럼 충전. 11 mm ID Vantage 컬럼에 100 mL의 25 mM 트리스 완충액(pH 8) 중의 실시예 2에 기재된 1.0 g의 AEX 섬유 매질의 슬러리를 부가하였다. 상기 섬유 매질을 3.0 cm의 층 깊이(2.85 mL 컬럼 부피, 0.35 g/mL 섬유 충전 밀도)로 압축하였다. 섬유 층 투과도는 25 mM 트리스 pH 8 완충액을 2.0 mL/min의 유량으로 상기 컬럼에 흘려주고 또 컬럼 압력 강하를 전자압력변환기에 의해 측정하는 것에 의해 평가하였다. 섬유 층 투과도 값은 이하의 표 1에 제공된다.
표 1: 섬유 매질 컬럼 충전
Figure pct00001
실시예 4. BSA-코팅된 라텍스 비드를 사용한 AEX 섬유 매질로의 바이러스 결합의 모의실험. 포스트 아날리틱스 인코포레이션으로부터 입수한 BSA-코팅된 폴리스티렌 라텍스 입자(100 nm 입경)를 인플루엔자 바이러스의 크기와 충전 특징을 모방하기 위한 모델로서 사용하였다. 상기 BSA-라텍스 입자 2 mg/mL 용액은 25 mM 트리스 완충액, pH 8 중에 제조하였고 또 상기 AEX 섬유 매질의 정적 결합능을 결정한 다음 시판되는 Q-형 수지(Q-Sepharose Fast Flow, GE 헬쓰케이 라이프 사이언스 인코포레이션 제조) 뿐만 아니라 시판되는 Q-형 막 흡착제(막-Q)의 정적 결합능과 비교하였다. 이들 결과를 하기 표 2 및 도 2에 요약한다. 상기 AEX 섬유 매질은 작용화되지 않은 알라쏘 섬유 매질 또는 시판되는 Q-Sepharose Fast Flow 크로마토그래피 수지보다는 BSA 코팅된 라텍스 입자에 대하여 현저하게 더 큰 정적 결합능을 갖는다. 상기 Q-Sepharose 수지의 낮은 결합능은 대형 BSA-라텍스 입자가 접근할 수 있는 유용한 표면적이 제한되는 것에 의해 설명될 수 있다. 또한, 상기 AEX 섬유 매질의 결합능은 시판되는 막-Q 막 흡착제의 결합능에 필적한다. 도 3은 BSA-라텍스 입자를 사용한 정적 결합 실험 이후의 AEX 섬유 매질 및 비변형 알라쏘 윙형 섬유의 SEM 영상을 제공한다. AEX 섬유 매질의 경우, 상기 입자의 대다수 양이 상기 섬유 표면을 거의 완전하게 덮는 것으로 관찰된다. 작용화되지 않은 알라쏘 섬유를 사용한 대조 실험의 경우에서, 매우 적은 입자가 상기 미처리 알라쏘 섬유의 표면에 흡착된다. 이 경우에서, 결합은 상기 BSA-라텍스 입자와 상기 미처리 알라쏘 섬유 사이의 비특이적 결합 상호작용에 기인할 수 있다.
표 2: 선택된 매질에 대한 BSA-라텍스 SBC
Figure pct00002
실시예 5. 바이러스를 결합/ 용리 정제하기 위한 섬유 매질능 . 박테리오파지 Φ6에 대한 정적 결합능 및 용리 회수 측정 결과는 하기 표 3에 제공된다. 5개의 플라스틱 원심분리관에 실시예 2의 AEX 섬유 매질 및 작용화되지 않은 알라쏘 섬유 샘플을 하기 표에 기재된 양으로 부가하였다. 각 섬유 샘플 및 대조 관을 10분간 교반하면서 5 mL의 25 mM 트리스 완충액(pH 8, 0.18 mg/mL HSA)으로 평형화시켰다. 상기 관들을 테이블 탑(table top) 원심분리기 내, 실온에서 4000 rpm으로 10분간 휘저어서 섬유 매질을 펠릿화하였다. 상기 상청액 2.5 mL를 제거하고 또 25 mM 트리스 완충액(pH 8, 0.18 mg/mL HSA) 중의 1.7x107 pfu/mL Φ6 용액 2.5 mL를 각 관에 부가하였다. 상기 샘플들을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 관들을 테이블 탑 원심분리기 내, 실온에서 4000 rpm으로 15분간 휘저어서 섬유 매질을 펠릿화하였다. 상기 상청액 2.5 mL를 제거하고 또 이들 샘플을 플라크 형성 에세이(plaque-forming assay)에 의해 미결합 Φ6에 대해 분석하였다. 상기 관들을 25 mM 트리스 완충액(pH 8, with 0.18 mg/mL HSA)을 사용한 2.5 mL 세정을 3회 실시하고 원심분리하여 상기 섬유 매질을 각 세정과 2.5 mL의 상청액 제거 사이에서 펠릿화하였다. 세정 후, 25 mM 트리스 완충액(pH 8, 0.18 mg/mL HSA) 중의 1.0M NaCl 용액 2.5 mL를 각 관(5 mL 총 부피, 최종 NaCl 농도는 0.5 M임)에 부가하였다. 상기 샘플을 실온에서 10분간 교반하였다. 그 후, 상기 관들을 테이블 탑 원심분리기 내 실온에서 4000 rpm으로 10분간 휘저어서 섬유 매질을 펠릿화하였다. 상기 상청액 2.5 mL를 제거하고 또 이들 용리 샘플을 용리된 Φ6 에 대해 플라크 형성 에세이에 의해 평가하였다. 실시예 2의 Q-작용화된 촉수 섬유 매질은 유의한 박테리오파지 Φ6 로그 감소값(LRV: Log Reduction Value) 3.1 및 40%의 용리 회수 수율을 나타낸다. 이러한 성능은 상업적 바이러스 크로마토그래피 적용에서 이용된 막-계 음이온 교환 매질에 필적한다. 본 발명의 상기 Q-작용화된 섬유 매질은 플로우 쓰루 바이러스 제거 또는 결합/용리 바이러스 정제 적용을 위한 예비충전된 장치 포맷 또는 크로마토그래피 컬럼에 일체화될 수 있다. 대조적으로, 작용화되지 않은 알라쏘 섬유 샘플은 Φ6 박테리오파지(Φ6 LRV = 0)에 대해 눈에 띄는 결합능을 나타내지 않는다.
표 3. 정적 결합능 관리. 시험: 0.18 mg/mL HSA를 갖는 25 mM 트리스 (pH 8) 중의 2.5 mL의 1.7E7 pfu /mL 박테리오파지 Phi6 . 용리 완충액: 0.18 mg/ml HSA를 갖는 25 mM 트리스 (pH 8) 중의 0.5 M NaCl.
Figure pct00003
실시예 6. Φ6 LRV , Φ6 결합능 , 및 용리 풀 Φ6 회수율의 결정. 2개의 11 mm ID Vantage 컬럼을 실시예 3에 기재된 방법에 따라서 실시예 2로부터 얻은 AEX 섬유 매질을 사용하여 충전하였다. 상기 AEX 섬유 매질 컬럼을 BioCAD 크로마토그래피 워크스테이션에 부착하고 또 2% 아세톤 용액 및 25 mM 트리스(pH 8) 완충액의 30 μl 주사액을 3.2 mL/min(선속도 200 cm/hr)의 유량으로 용리액으로서 사용하여 HETP 및 피크 비대칭 값을 측정하였다. 상기 HETP 및 피크 비대칭은 각각 0.08 cm 및 2.8로 측정되었다. 슈모모나스(Pseudomonas) 박테리오파지 Φ6 공급 스트림(1.0 x 109 pfu/mL 0.0625% HSA를 갖는 25 mM 트리스 pH 8)을 사용하여 AEX 섬유 매질 컬럼을 동적 결합능, 바이러스 로그 감소값(LRV), 및 Φ6 회수율에 대해 시험하고 또 그 성능을 2개의 시판되는 음이온 교환 막 흡수제 및 시판되는 비드계 음이온 교환체의 성능과 비교하였다. 상기 AEX 섬유 매질 컬럼을 0.0625% HSA를 갖는 35 CV의 25 mM 트리스 pH 8에 의해 평형화시켰다. 그 후, 각 컬럼에 140 CV의 슈도모나스 박테리오파지 Φ6 공급스트림 용액(약 9.3 x 108 pfu/ mL 0.0625% HSA를 갖는 25 mM 트리스 pH 8)을 로딩하고 또 20 x 7 CV 플로우 쓰루 분획을 수집하였다. 로딩 후, 상기 컬럼들을 0.0625% HSA를 갖는 30 CV의 25 mM 트리스 pH 8에 의해 세정하였다. 결합된 Φ6를 0.0625% HSA를 갖는 25 mM 트리스 pH 8 중의 15 CV의 1.0 M NaCl 용액을 사용하여 용리시켰다. 플로우 쓰루, 세정 및 용리 샘플을 플라크 형성 에세이에 의해 Φ6 역가를 분석하였다. 막 흡착제 장치 및 Q-Sepharose Fast Flow 컬럼은 유사한 과정에 따라 평가하였다. 이들 장치는 0.0625% HSA를 갖는 15 CV의 25 mM 트리스 pH 8를 사용하여 평형화시켰다. 그후, 각 컬럼에 140 CV의 슈도모나스 박테리오파지 Φ6 공급스트림 용액(0.0625% HSA를 갖는 25 mM 트리스 pH 8 중의 약 1.4 x 109 pfu/mL)을 로딩하고 또 5x28 CV 플로우 쓰루 분획을 수집하였다. 로딩 후, 상기 컬럼들을 0.0625% HSA를 갖는 15 mL의 25 mM 트리스 pH 8를 사용하여 세정하였다. 결합된 Φ6은 0.0625% HSA를 갖는 25 mM 트리스 pH 8 중의 15 CV의 1.0 M NaCl 용액을 사용하여 용리시켰다. 플로우 쓰루, 세정 및 용리 샘플을 플라크 형성 에세이에 의해 Φ6 역가를 분석하였다. 성능 데이터를 하기 표 4 및 도 4 및 5에 요약한다. 막 흡수제(Sartobind-Q and ChromaSorb) 뿐만 아니라 Q-Sepharose Fast Flow 수지 모두는 Φ6에 대해 매우 낮은 결합능을 나타내었다. 이는 Φ6의 조기 돌파(early breakthrough) 및 최초의 28 CV 플로우 쓰루 시점에 대하여 표에 보고된 상응하는 낮은 Φ6 LRV 값에 의해 표시된다. 막 흡착제 장치 및 Q-Sepharose 수지 컬럼에 대해 보고된 용리 풀 Φ6 역가 또한 매우 낮았고, 또한 이는 Φ6 박테리오파지에 대한 이들 물질의 낮은 결합능을 반영한다. 대조적으로, AEX 섬유 매질 컬럼의 경우, 본 발명자들은 Φ6에 대한 훨씬 높은 결합능을 발견하였는데, 동일 28 CV 플로우 쓰루 시점에서 약 3의 Φ6 LRV를 가졌다. 용리 풀 Φ6 역가는 비교 샘플보다 훨씬 더 높고 또 최종 Φ6 역가는 Φ6 로딩 역가보다 더 높다. 이는 AEX 섬유 매질 컬럼에 대한 Φ6 결합능이 실질적이고 또 상기 매질은 출발 공급물에 비하여 더 높은 값으로 Φ6 박테리오파지를 농축할 수 있음을 나타낸다.
표 4. Φ6 LRV의 결정 및 AEX 섬유 매질뿐만 아니라 선택된 시판되는 막 흡착제 및 비드계 AEX 매질에 대한 Φ6 결합능 및 용리 회수율의 측정
Figure pct00004
실시예 7. 박테리오파지 ΦX174 LRV 결정. 2개의 11 mm ID Vantage 컬럼에 실시예 2로부터의 AEX 섬유 매질을 사용하고 실시예 3에 기재된 방법에 따라 충전시켰다. 상기 AEX 섬유 매질 컬럼들을 BioCAD 크로마토그래피 워크스테이션에 부착하고 또 HETP 및 피크 비대칭 값은 용리액으로서 2% 아세톤 용액 및 25 mM 트리스(pH 8) 완충액 30 μl 주입물을 3.2 mL/min(선속도 200 cm/hr) 유량으로 사용하여 측정하였다. 상기 HETP 및 피크 비대칭은 각각 0.10 cm 및 2.0으로 측정되었다. AEX 섬유 매질 컬럼들은 ΦX174 공급스트림(25 mM 트리스 pH 8 중의 1.28 x 107 pfu/mL)을 사용하여 바이러스 로그 감소값(LRV)에 대해 시험하였고 또 상기 성능은 2개의 시판되는 ChromaSorb™ 음이온 교환 막 흡수제의 성능과 비교하였다. 상기 AEX 섬유 매질 컬럼은 35 CV(100 mL)의 25 mM 트리스 pH 8을 사용하여 평형화시켰다. 그후, 각 컬럼에 380 CV(1080 mL)의 박테리오파지 ΦX174 공급스트림(25 mM 트리스 pH 8 중의 1.28 x 107 pfu/mL) 용액을 로딩하고 또 4 x 1 mL 플로우 쓰루 그랩 분획을 100, 200, 300, 및 370 CV 시점에서 수집하였다. ChromaSorb™ 막 흡착제 장치는 유사한 과정에 따라 평가하였다. 이들 장치들을 30 mL(375 CV)의 25 mM 트리스 pH 8을 사용하여 평형화시켰다. 그후, 각 장치에 750 CV(60 mL)의 박테리오파지 ΦX174 공급스트림(25 mM 트리스 pH 8 중의 약 1.28 x 107 pfu/mL) 용액을 로딩하고 또 3 x 1 mL 플로우 쓰루 그랩 분획을 25, 375 및 750 CV 시점에서 수집하였다. 플로우 쓰루 그랩 샘플을 플라크 형성 에세이에 의해 ΦX174 역가에 대해 분석하였다. 성능 데이터는 하기 표 5 및 도 6에 요약한다. 이들 조건하에서, AEX 섬유 매질 컬럼 및 ChromaSorb™ 막 흡착제 장치는 양호한 ΦX174 바이러스 제거 성능을 나타내며 ΦX174 LRV 값은 약 4와 동일하거나 그 이상이다.
표 5. AEX 섬유 매질 및 Chromasorb ™ 장치에 대한 플로우 쓰루 ΦX174 제거 LRV
Figure pct00005
실시예 8. 정화된 MDCK 세포 배양액으로부터 인플루엔자 바이러스의 결합 및 용리 정제
실시예 2로부터의 AEX 섬유 매질을 실시예 3에 기재된 과정에 따라서 11 mm Vantage 컬럼에 충전하였다. 상기 AEX 섬유 매질의 성능을 시판되는 AEX 비드 및 인플루엔자 바이러스의 결합/용리 정제의 막 흡착제와 비교하였다. 시판되는 예비충전된 Q-형 수지 HiTrap™ Q FF(GE Healthcare Life Sciences Inc. PN:17-5053-01) 뿐만 아니라 시판되는, 강한 염기성의, AEX 막 흡착제 장치(Sartobind®-Q, Sartorius AG PN:Q5F)를 대조용으로 선택하였다. 인플루엔자 바이러스 세포 배양액은 불용성 오염물을 제거하기 위하여 침강 마이크로캐리어(microcarrier), 따르기 및 이어서 Stericup®-GP 필터 유닛(EMD Millipore PN:SCGPU11RE)을 통한 여과에 의해 수집하였다. 혈구응집(HA) 에세이에 의해, 상기 인플루엔자 농도는 출발 공급물의 경우 9131 HAU/mL인 것으로 측정되었다. 모든 장치는 0.1M NaCl을 갖는 적어도 5 컬럼 부피(CV)의 소렌센 인산 나트륨 완충액 pH 7.2 을 사용하여 평형화시켰다. 상기와 동일 완충액을 세정 단계에 사용하였다. 1.5M NaCl을 갖는 소렌센 인산 나트륨 완충액 pH 7.2 을 용리 완충액으로 사용하였다. 상기 AEX 섬유 매질 및 상기 HiTrap Q FF 장치의 경우 시험은 이중 장치에서 실시하였다. 컬럼은 소형 연동 펌프를 이용하여 충전되었고 또 상기 막 장치에는 느리고 안정적인 압력을 이용한 10 mL 주사위를 이용하여 충전되었다. 플로우 쓰루, 로딩, 및 용리 샘플을 수집하고 또 HA 에세이에 의해 시험하였다. 작업 변수 및 결과는 하기 표 6 및 7 그리고 도 7에 요약한다. 이 평가로부터, 비드계 HiTrap™ Q FF 음이온 교환물질에 대해 낮은 인플루엔자 결합능이 검출된다. 이는 Sartobind®-Q 막 흡착제(Q5F)와 비교할 때 이른 인플루엔자 돌파에 의해 증명된다. 상기 Sartobind®-Q 막 흡착제는 인플루엔자에 대한 더 높은 결합능을 나타내며, 또 용리시, 상기 결합된 인플루엔자는 57% 수율로 회수된다. 공급 제한으로 인하여, 상기 AEX 섬유 매질 장치는 인플루엔자에 의해 7.6 x 105 HAU/mL로 로딩되었고 또 상기 물질은 34 내지 67% 수율로 회수되었다. 비드계 HiTrap™ Q FF 음이온 교환 매질과 비교하여, 상기 AEX 섬유 매질 컬럼은 인플루엔자에 대하여 훨씬 더 높은 결합능을 나타내며 또 이들 장치는 적어도 Sartobind®-Q(Q5F) 막 흡착제만큼 높은 인플루엔자 결합능을 나타낼 수 있다.
표 6. B/E 인플루엔자 정제를 위한 작업 조건
Figure pct00006
표 7. B/E 인플루엔자 정제에 대한 결과 요약
Figure pct00007
실시예 9. 정화된 MDCK 세포 배양액으로부터 인플루엔자 바이러스의 결합 및 용리 정제. 실시예 2로부터의 AEX 섬유 매질을 실시예 3에 기재된 과정에 따라서 11 mm Vantage 컬럼에 충전하였다. 상기 AEX 섬유 매질의 성능을 인플루엔자 바이러스의 결합/용리 정제에서 시판되는 AEX 비드와 비교하였다. 시판되는 예비충전된 Q-형 수지 HiTrap™ Q FF(GE Healthcare Life Sciences Inc. PN:17-5053-01)를 대조를 위해 선택하였다. 인플루엔자 바이러스 세포 배양액은 불용성 오염물을 제거하기 위하여 침강 마이크로캐리어(microcarrier), 따르기 및 이어서 Stericup®-GP 필터 유닛(EMD Millipore PN:SCGPU11RE)를 통한 여과에 의해 수집하였다. 혈구응집(HA) 에세이에 의해, 상기 인플루엔자 농도는 출발 공급물의 경우 4389 HAU/mL인 것으로 측정되었다. 모든 장치는 0.1M NaCl을 갖는 적어도 5 컬럼 부피(CV)의 소렌센 인산 나트륨 완충액 pH 7.2 을 사용하여 평형화시켰다. 상기와 동일 완충액을 세정 단계에 사용하였다. 1.5M NaCl을 갖는 소렌센 인산 나트륨 완충액 pH 7.2 을 용리 완충액으로 사용하였다. 시험은 이중 장치에서 실시하였다. 컬럼은 소형 연동 펌프를 이용하여 충전되었다. 플로우 쓰루, 로딩, 및 용리 샘플을 수집하고 또 HA 에세이에 의해 시험하였다. 작업 변수 및 결과는 하기 표 8 및 9 그리고 도 8에 요약한다. 이 평가로부터 비드계 HiTrap™ Q FF 음이온 교환물질에 대해 낮은 인플루엔자 결합능이 검출된다. 이는 AEX 섬유 매질 컬럼과 비교할 때 이른 인플루엔자 돌파에 의해 증명된다. 상기 AEX 섬유 매질은 인플루엔자에 대한 더 높은 결합능을 나타내며, 또 용리시, 상기 결합된 인플루엔자는 42% 수율로 회수된다. 공급 제한으로 인하여, 상기 AEX 섬유 매질 장치는 인플루엔자에 의해 1.05 x 106 HAU/mL로 로딩되었고 또 이 로딩 수준까지는 어떠한 인플루엔자 돌파도 관찰되지 않았다.
표 8. B/E 인플루엔자 정제용 작업 조건
Figure pct00008
표 9. B /E 인플루엔자 정제에 대한 결과 요약
Figure pct00009
실시예 10. MVM LRV 결정. 2개의 6.6 mm ID Omnifit 컬럼은 실시예 2로부터의 AEX 섬유 매질을 사용하여 실시예 3에 기재된 과정에 따라서 충전되었다. 각 컬럼의 경우, 0.35 g의 AEX 섬유 매질을 층 깊이 3.0 cm 및 컬럼 부피 1 mL로 충전하였다. 상기 AEX 섬유 매질 컬럼의 바이러스 제거능은 마우스의 미세 바이러스(MVM)(2.0 x 106 TCID50/mL)에 의해 감염된 17.6 g/L mAb 공급스트림을 사용하여 평가하였고 또 그 성능을 2개의 시판되는 ChromaSorb™ 장치 및 1개의 Sartobind-Q 음이온 교환 막 흡착제의 성능과 비교하였다. 관련 mAb 공급스트림을 더욱 잘 모방하기 위하여 상기 공급물은 약 84 ppm의 숙주 세포 단백질(HCP) 오염물을 함유하였다. 상기 AEX 섬유 매질 컬럼은 100 CV(100 mL)의 25 mM 트리스 pH 7에 의해 평형화시켰다. 그 후, 각 컬럼에는 411 CV(411 mL)의 MVM-감염된 mAb 공급스트림을 로딩하였고 또 5 x 1 mL 플로우 쓰루 그랩 분획을 0.2, 1.8, 3.5, 5.2, 및 7.0 kg/L mAb 통과 시점에서 수집하였다. ChromaSorb™ 및 Sartobind®-Q 막 흡착제 장치는 유사한 과정에 따라서 평가하였다. 이들 장치는 10 mL(125 CV)의 25 mM 트리스 pH 7에 의해 평형화시켰다. 그 후, ChromaSorb™ 및 Sartobind®-Q 장치에는 400 CV(ChromaSorb™의 경우 32 mL, Sartobind®-Q 장치의 경우 56 mL)의 MVM-감염된 mAb 공급스트림을 로딩하였고 또 5 x 1 mL 플로우 쓰루 그랩 분획을 0.2, 1.8, 3.5, 5.2, 및 7.0 kg/L mAb 통과 시점에서 수집하였다. 주: Sartobind®-Q 막 흡착제 장치의 경우 5.2 and 7.0 kg/L mAb 통과 시점은 수집하지 않았다. 플로우 쓰루 그랩 샘플은 TCID50 에세이를 이용하여 MVM 감염에 대해 분석하였다. 성능 데이터는 하기 표 10 및 도 9에 요약한다. 이들 조건하에서, AEX 섬유 매질 컬럼 및 ChromaSorb™ 막 흡착제 장치는 모두 7 kg/L 만큼 높은 mAb 처리 레벨에서 ≥ 4의 MVM LRV 값을 갖는 양호한 MVM 바이러스 제거능을 나타낸다. 대조적으로, 시판되는 Sartobind®-Q 막 흡착제 장치는 낮은 mAb 처리 레벨에서도 3 미만의 불량한 MVM LRV 값을 나타낸다.
표 10. AEX 섬유 매질, Chromasorb ™ 및 Sartobind ®-Q 장치에 대한 플로우 쓰루 MVM 제거 LRV.
Figure pct00010

Claims (9)

  1. 샘플 중의 바이러스를 정제하는 방법으로서,
    상기 방법은 샘플을 섬유 매질 층(bed of fiber media)과 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 매질 중의 섬유는 본체 영역 및 본체 영역으로부터 연장되는 복수의 돌출부를 포함하며, 상기 섬유는 크로마토그래피가 가능하게 하는 부여된 작용기를 갖는,
    샘플 중의 바이러스를 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 작용기는 상기 섬유에 그라프팅(grafted)되어 있는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 작용기는 정제를 플로우 쓰루 모드(flow through mode)로 가능하게 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 작용기는 정제를 결합/용리 모드(bind/elute mode)로 가능하게 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 이온 교환 작용기는 양이온 교환 작용기이고, 또 상기 정제는 pH 5 내지 8에서 실시되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 작용기는 음이온 교환 작용기이고, 또 상기 정제는 pH 7 내지 9에서 실시되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 섬유는 트리메틸아민에 의해 작용화되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 바이러스가 인플루엔자인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 섬유가 데이지, 눈가루 및 태양 형상으로 이루어진 군으로부터 선택된 형상을 갖는 방법.
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