CN105307743A - 用于纯化疫苗和病毒的色谱介质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及吸附介质，其用于色谱法、特别是离子交换色谱法，由成型纤维衍生，可用于纯化病毒。在某些实施方案中，所述官能化成型纤维提供纤化或隆起结构，其当与普通纤维相比较时大大增加纤维的表面积。可加入表面悬垂官能基团，为高表面积纤维提供离子交换官能团。该悬垂官能团可用于诸如流感病毒等病毒的离子交换色谱纯化。

Description

用于纯化疫苗和病毒的色谱介质
本申请要求2013年1月31日提交的美国临时申请61/758,926号的优先权，其公开内容通过引用结合到本文中来。
领域
本文公开的实施方案涉及适合纯化疫苗和病毒并适合用于纯化单克隆抗体进料流的病毒清除应用的色谱介质。
背景
用于制备疫苗的新纯化技术的发展在作为对近来大流行病爆发的响应以及用于新兴治疗应用两方面而言具有重大意义。通常需要这样的新技术来改进收率、增加产品纯度和加速生产率。目前采用的疫苗纯化技术包括氯化铯密度梯度离心、切向流过滤及色谱法。这些技术中的每一种提供独特的优势和劣势，且疫苗生产商必须基于他们的生产规模、纯度及产品成本需要选择特定的纯化技术。典型的疫苗纯化工艺描述在图1中列出的工艺流程图中。
切向流过滤和梯度离心方法两者广泛用于疫苗生产中，但这些单元操作是价格昂贵且耗时的批量操作，可规模化差，需要专用设备及人员，并提供低收率和感染性损失。用于这样的操作的设备几乎没有一次性的，且必须进行昂贵的再生、清洁和验证过程以准备用于下一批的纯化设备。
相比之下，将基于珠粒的树脂用于疫苗的结合/洗脱色谱纯化令人感兴趣，因为这些纯化方法可以大得多的规模进行。遗憾的是，用于这些应用的市售可得的树脂通常提供太小以致于较大病毒颗粒无法到达的孔径。因此，这样的介质展现出弱结合容量，因为病毒仅可到达珠粒的外表面。低结合容量同与适合于该应用的色谱树脂相关的高成本结合在一起，要求生产商使用该色谱介质进行多次结合/洗脱和柱再生循环以使得这样的过程成本有效。再生过程由于产品通过量、缓冲剂和清洁剂的消耗量增加、验证成本和资本设备需要增加而进一步增加生产成本。目前，新兴技术处于发展之中，其可提供增加的病毒结合容量且这些包括使用商业树脂体系的膜吸附器、整体料和流通吸附器纯化方法。虽然膜吸附器和整体料可以使得这些应用的结合容量增加称为可能，但是这些技术通常具有它们自己的规模局限性且这样的纯化介质的极高成本排除将这些产品用作一次性装置并且可进一步限制其在传统上价格敏感的疫苗工业中被采用。
概述
为了解决本领域目前已知的纯化技术的许多局限性，已经开发了一种新型色谱介质，其包含极低成本的热塑性纤维和在所述纤维的表面上的配体官能团。所述配体能够自细胞培养物进料流选择性地结合病毒，例如通过离子交换。所结合的病毒可随后在例如通过使用具有较高离子强度的洗脱缓冲剂改变溶液条件时从所述色谱介质释放。基于纤维的固定相是无孔的且展示提供回旋状表面结构，其对于高病毒结合容量而言足够的表面积。因为病毒结合仅在纤维的表面上发生，所以不存在如在基于多孔珠粒的结合/洗脱体系的情况下见到的关于病毒结合的尺寸排阻问题。此外，因为病毒颗粒可通过对流直接输送到配体位点，所以在体系和疫苗进料流方面没有扩散限制，例如可在高得多的流速或短得多的驻留时间下处理。
根据某些实施方案，所述色谱介质来源于成型纤维。在某些实施方案中，所述成型纤维提供纤化或隆起结构(例如，图1(b))。当与普通纤维(例如，图1(a))相比较时，这些隆起可大大增加纤维的表面积。因此，在不减小纤维直径的情况下获得高表面积，所述减小纤维直径通常引起床渗透率显著减小且流速相应降低。根据某些实施方案的高表面积纤维的实例为“有翼”纤维，其自Allasso Industries, Inc. (Raleigh, NC)商售可得。Allasso有翼纤维的截面SEM图像提供在图1(d)中。这些纤维提供在约1-14平方米/克范围内的表面积。该纤维介质的表面积测量通过常规气体吸附技术确定，例如使用氪或氮气的Brunauer、Emmett和Teller (BET)的方法。
本文还公开了将例如提供阴离子交换(AEX)官能团的表面悬垂官能基团到高表面积纤维的方法。该悬垂官能团可用于疫苗和例如流感病毒的病毒的离子交换色谱纯化。
本文公开的实施方案还涉及用包含高表面积官能化纤维的介质纯化疫苗和病毒的方法。这些方法可以流通模式或结合/洗脱模式进行。
根据某些实施方案，本文公开的介质具有高床渗透率(例如，300-900毫达西)、相对于基于珠粒的色谱介质而言的低材料成本、20-60mg/mL BSA动态结合、高分离效率(例如，HETP < 0.1cm)、50-200mg/g IgG静态结合容量和吸附物至配体结合位点的快速对流主导输送。
根据某些实施方案，使用独特的高表面积压纺纤维(例如，热塑性纤维)在构造成0.5-6mm长的随机定向切断纤维的填充床时允许高流动渗透率(液体)和均匀流动分布。提供使所述纤维表面官能化的化学处理方法以使得基于一种或多种吸附相互作用的分离可行。化学处理方法可基于离子、亲和性、疏水等相互作用或相互作用的组合将多种表面化学官能团赋予所述纤维。纤维生产和简单表面化学处理方法的组合经济产生用于在生物医药以及疫苗生产和病毒纯化中的纯化操作的经济且可容易地规模化的技术。
根据某些实施方案，提供允许快处理速率的吸附分离材料，因为，与基于珠粒的介质形成相比，溶质向纤维表面和自纤维表面的质量输送主要通过穿过介质的流体对流来控制，在基于珠粒的介质中，扩散输送要求接触时间较长且因此处理速率较慢。提供捕集或除去诸如病毒等大生物物种的能力，这些生物物种由于珠粒孔的空间局限而不能使用常规基于珠粒的介质有效地分离。
附图简述
图1(a)为根据现有技术的纤维的示意图；
图1(b)为可根据某些实施方案使用的隆起纤维的示意图；
图1(c)为根据某些实施方案具有连接的悬垂基团的图1b的纤维的示意图；
图1(d)为可根据某些实施方案使用的隆起纤维的SEM图像；
图1(e)为根据某些实施方案的纤维的官能化的示意图；
图2为根据某些实施方案BSA-胶乳颗粒对于所选的吸附物的静态结合容量的绘图；
图3(a)-(d)为各种纤维的SEM图像；
图4为AEX纤维介质以及所选的商业膜吸附器和基于珠粒的AEX介质收集的流通级分的Φ6 LRV的绘图；
图5为洗脱池Φ6滴度的绘图；
图6为病毒清除比较的绘图；
图7为流感病毒突破的绘图；
图8为流感病毒突破的绘图；
图9为流通MVM清除LRV值的绘图；
图10为根据某些实施方案呈雪花形状的纤维的横截面图；
图11为根据某些实施方案呈太阳形状的纤维的横截面图；
图12为根据某些实施方案呈雏菊形状的纤维的横截面图；
图13(a)-(e)为根据某些实施方案具有突出和分支亚突出的纤维的横截面图；和
图14(a)-(d)为根据某些实施方案具有增加的表面积的成型纤维的横截面图。
发明详述
根据本文公开的实施方案的成型纤维介质仅依赖于纤维本身的表面。因为所述成型纤维提供高表面积以及高流动渗透率，所以不必加入琼脂糖水凝胶或多孔微粒来加强在纤维载体上的可用表面积以满足关于容量和效率的性能目标。此外，不需要通过加入水凝胶或多孔微粒增强表面积，本文所述的介质的生产成本被保持到最低。
纤维可具有任何长度和直径且优选为切断纤维或短纤维或非机织织物。它们不必结合在一起成为集成结构，而可有效地充当单个离散实体。它们可以呈连续长度的形式，例如不确定长度的线或单丝，或者它们可例如通过切割诸如非机织或机织织物的纤维材料(例如，短纤维)、将连续长度纤维切成单个碎片，通过结晶生长方法等形成而形成较短的单个纤维。优选所述纤维由热塑性聚合物制成，所述热塑性聚合物，例如聚丙烯、聚酯、聚乙烯、聚酰胺、热塑性氨基甲酸乙酯、共聚酯或液晶聚合物。优选具有约1-3的旦尼尔的纤维。在某些实施方案中，所述纤维具有约1μm-约100μm的截面长度和约1μm-约100μm的截面宽度。一种合适的纤维具有约20μm的截面长度和约10μm的截面宽度及约1.5的旦尼尔。具有约10,000cm2/g-约1,000,000cm2/g的表面积的纤维为合适的。优选所述纤维具有约10-20μm的截面长度。
在某些实施方案中，所述纤维可在压缩下容易地填充到具有适当的开口和尺寸的装置或容器中以适应所述应用。所述纤维也可以预成形床格式使用，例如在非织造织物工业中常见的通过纺粘 (长丝)或湿法成网(切断纤维) 产生的非织造片料。合适的预成形纤维格式包括片材、垫子、网格、整体料等。
在某些实施方案中，所述纤维截面通常为翼形的，具有本体区域和从所述本体区域向外径向延伸的多个突出。所述突出形成沿所述纤维的长延伸的一阵列共线通道，通常每根纤维20-30个这样的通道。在某些实施方案中，所述突出的长度与所述本体区域的长度相比较短。在某些实施方案中，所述纤维截面通常为翼形的，其具有包括向下行进到所述纤维的中心的纵轴的中间区域且具有从所述中间区域延伸的多个突出(图1(d))。在某些实施方案中，多个所述突出通常从所述中间区域径向延伸。由于该构造，多个通道由所述突出限定。在突出之间的合适通道宽度的范围为约200-约1000纳米。合适的纤维公开在美国专利公告2008/0105612号中，其公开内容通过引用结合到本文中来。在某些实施方案中，所述纤维包括本体区域和从所述本体区域延伸的一个或多个突出。所述突出还可具有从它们延伸的突出。所述突出可为径直或弯曲的。所述突出可具有基本相同的长度或不同长度。所述本体区域可具有厚度大于所述突出的厚度的区域。例示性形状包括如在图10中所示的雪花形状、如在图11中所示的太阳形状和如在图12中所示的雏菊形状。更具体地讲，在图10中的雪花形状包括中心本体部分，其具有自此向外延伸的多个突出。这些突出中的每一个具有沿其长自其向外延伸的不同长度的多个较短第二级或亚突出。在图11中所示的太阳形状还包括中心本体部分且具有自此向外延伸的多个弯曲突出。在图12中的雏菊形状包括中心实心本体部分，其具有自此向外延伸的多个突出，这些突出没有另外的突出。
所述本体区域可为实心的(例如，图12)或中空的(例如，图10和图11)，基本上为线性或非线性的。其它例示性形状包括包含如在图13(a)-(e)中所示的分支结构的成型纤维。因此，图13(a)为星形形状，其具有实心中心本体区域和呈对称图案的自此向外延伸的6个径直相同步幅的突出。在图13(b)中所示的纤维具有实心中心本体区域，具有自此向外延伸的成组的径直突出，在组内的各个突出沿相同方向延伸。在图13(c)中所示的纤维具有中心本体区域，其具有自此朝不同方向延伸的三个径直等间距的突出。各个突出具有自此以一定角度朝向所述中心本体区域延伸的其末端自由端第二级或亚突出。除了第二级或亚突出以一定角度远离所述中心本体区域延伸之外，在图13(d)中的纤维与图13(c)中的纤维类似。除了各个第二级或亚突出在其未端自由端具有另外的突出之外，在图13(d)中的纤维与图13(d)中的纤维类似。
其它例示性形状包括具有中空芯的纤维、成束微丝的纤维或呈波浪带形状的纤维，如在图14(a)-(d)中所示。图14(a)和图14(b)图示封闭多角形，其具有中空芯的和限定交替的峰和谷的多个突出。图14(c)图示一束纤维，其呈簇地连接在一起以形成单丝，所述单丝具有在各纤维之间的空隙空间中的可到达的表面积。图14(d)图示具有锯齿形图案的成型纤维。
所述纤维形状可使用来自Hills, Inc. (West Melbourne, FL)的双组分纤维纺织机生产。成型双组分纤维可使用市售可得的纤维纺丝设备和如在美国专利5,162,074号中所述的专门设计的纤维模具叠层（die stack）制备，该专利的公开内容通过引用结合到本文中来。两个挤出机将熔融可加工的材料进料到共用的纺丝头中。该纺丝头含有模具叠层，该模具叠层将熔体流分开并重新定向以分离细丝，所述细丝在经由喷丝板离开之后收集。各个细丝的横截面具有呈主要材料的所需纤维形状，且次要材料充当该所需纤维形状的底版（negative）。次要材料的存在允许在纤维横截面方面的纤维特征，这在如果主要材料单独挤出的情况下在特征大小和近似性方面将是不可能的。在挤出之后，次要材料通常通过溶解除去，留下具有所需横截面的高表面积纤维。纤维的最终横截面的细节由模具叠层、加工条件、喷丝板形状和主要聚合物及次要聚合物的选择的组合来决定。
可将该模具叠层制造以产生各种非常纷繁复杂的截面。主要材料可为可熔纺的任何材料：聚丙烯、聚酯、聚酰胺、聚乙烯等。次要材料也可为任何可熔纺的材料，然而，优选次要材料易于除去，因此，优选的材料为可溶性聚合物，例如：聚乳酸、聚乙烯醇、可溶性共聚酯等。
根据某些实施方案，装配表面悬垂官能团以将阴离子交换官能团提供给高表面积纤维。该悬垂官能团可用于疫苗和病毒例如流感病毒的阴离子交换色谱纯化。
高表面积纤维的表面官能化可通过两步法完成。合适的官能化方法为接枝聚合，且在图1(e)中所示的方案1中举例说明。在该实施方案中，使高表面积纤维与甲基丙烯酸缩水甘油酯单体、硝酸铵铈(IV)和HNO3的水溶液在35℃下在空气中反应1小时。在这些条件下，尼龙纤维表面的铈氧化产生自由基并引发甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物的表面接枝聚合。在这样的条件下，表面引发的聚合过程产生聚合的甲基丙烯酸缩水甘油酯单体的聚合“触手”。以此方式，甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合物共价连接到纤维表面。这样的过程被称为接枝聚合。
在第二合成步骤中，在某些实施方案中，迅速地用水洗涤聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)改性纤维材料并将其在室温下用三甲胺水溶液(25重量%)处理18小时。在这些条件下，在聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)触手上的任何残留环氧基团都可与三甲胺反应，提供可提供用于疫苗纯化应用的所需阴离子交换官能团的悬垂的阳离子三甲基烷基铵(Q)官能团。
在1-5cm的床高下约0.1-0.4g/ml、优选约0.32g/ml的合适柱填充密度会提供针对在色谱评价中的可接受性能而言足够的流动均匀性。
在某些实施方案中，与基于珠粒的介质不同，该介质(官能化填充纤维)可以干燥的预填充格式递送给使用者。纤维可通过热或化学方法熔合以形成可安放在压力容器中的半刚性结构。通过这一构造，介质和伴随装置可制作为即用的。基于色谱珠粒的介质通常作为松散材料(湿)递送，其中需要使用者将其装载到压力容器(柱)中并通过各种方法产生没有空隙或通道的良好填充的床。通常需要跟踪试验以确保填充的均匀性。相比之下，根据某些实施方案，不需要使用者填充，因为产品到达时就已准备好使用了。
成型纤维介质在其形态性质方面提供优于多孔色谱珠粒的某些优势。通常，在基于珠粒的色谱法中，在分离过程中的速度限制步骤为吸附物(溶质)进入多孔珠粒的深度的渗透，其受扩散的控制；对于例如蛋白质的大分子，该扩散输送可相对缓慢。对于本文公开的高表面积纤维，结合部位暴露在纤维的外部且因此易于被在流动物流中的吸附物分子到达。由该方法提供的迅速输送允许短驻留时间(高流速)，由此通过例如模拟移动床系统的方式使得介质的迅速循环可行。因为加工速度是生物制剂生产中的关键参数，所以如本文所述的基于纤维的色谱介质具有优于常规基于珠粒的介质的特定工艺优势。
常规色谱树脂以通常为琼脂糖、合成聚合物和氧化硅或玻璃的多孔珠粒开始。这些材料通常为高成本：未官能化的琼脂糖珠粒的成本可为$300-$350/升，且受控孔玻璃的成本可为$600-$1000/升。相反，估计以适当密度和厚度实现良好色谱性质的的如本文所述的高表面积纤维的无纺床的成本为$20-$50/升。该成本优势会产生如下可能性，该新色谱介质可作为“一次性”技术(例如，单次使用)出售，所述“一次性”技术针对使用适当定价并在单次使用之后或最可能在一次生产活动内的多个循环之后可任意处置。
在美国专利公告2012/0029176号中公开的实施方案的表面官能化的纤维介质(例如，SP官能化Allasso纤维，SPF1)以填充床格式展示了高渗透性，所述公告的公开内容通过引用结合到本文中来。根据填充密度，床渗透率范围可为从>14000毫达西至<1000毫达西。在0.1g/ml(1克介质/9.3毫升柱体积)的低填充密度下，测量到在900cm/hr的线速度下14200毫达西的床渗透率。该值在广泛的速度范围(400-1300cm/hr)内不会改变。这类性能指示填充的纤维床在高线速度下不会被压缩。随后将表面官能化的纤维介质(SP官能化Allasso纤维，SPF1)压缩到0.33g/ml(1g介质/2.85mL柱体积)的较高填充密度提供在900cm/hr的线速度下1000毫达西的床渗透率。同样地，1000毫达西的这个值在400-1300cm/hr的线速度范围内没有变化。合适的填充密度包括在约0.1g/ml和约0.5g/ml之间。
就用于生物分离的常规填充床，颗粒交换色谱介质，例如ProRes-S (Millipore Corp, Billerica, MA)而言，对于与上述情况的类似大小的填充床(3cm床深、11mM ID Vantage柱，2.85mL柱体积)，测量到1900毫达西的渗透率值。对于膜吸附器，典型的渗透率值在1-10毫达西范围内。对于ProRes-S，在400-1300cm/hr的速度范围内没有测量到床渗透率的显著改变。虽然该性能对于半刚性珠粒例如ProRes-S而言是预期的，但是期望更可压缩的介质(例如，琼脂糖珠粒)因填充床的显著压缩所致在高线性速度(> 200cm/hr)下展现出床渗透率的显著减小。
高表面积纤维表面官能化和三甲胺环氧开环方法的实例提供在下文中(实施例1和2)。
三甲基烷基铵 (Q) 触手官能化高表面积纤维 (AEX 纤维介质 ) 的制备。
实施例 1. 未改性的尼龙纤维的接枝聚合。
向500mL瓶子中加入10g Allasso尼龙纤维和水(466mL)。将1M HNO3溶液(14.4mL，14.4mmol)加入反应混合物中，接着加入硝酸铵铈(IV)在1M HNO3 (1.20mL，0.480mmol)中的0.4M溶液。将反应混合物搅拌15分钟。加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA，3.39g，24mmol)并将反应混合物加热至35℃维持1小时。在冷却至室温之后，将固体用DI水(3 x 300mL)洗涤并在以下步骤中立即使用该潮湿的材料。
实施例 2. 环氧官能化纤维 (AEX 纤维介质 ) 的 Q- 官能化。
向2L瓶子中加入来自上文实施例1的潮湿的GMA官能化纤维、水(500mL)和在甲醇(500mL)中的50重量%三甲胺(水性)溶液。将混合物在室温下搅拌18小时。将纤维固体接着用0.2M抗坏血酸在0.5M硫酸中的溶液(3 x 400mL)、DI水(3 x 400mL)、1M氢氧化钠溶液(3 x 400mL)、DI水(3 x 400mL)和乙醇(1 x 400mL)洗涤。将该材料置于烘箱中以在40℃下干燥48小时。得到11.74g白色纤维质固体。
AEX 纤维介质的功能性能。对于如在下面示出的实施例中所述的各种病毒清除和疫苗纯化应用评价在实施例2中描述的AEX纤维介质的性能。
实施例 3. AEX 纤维介质柱填充。
向11mM ID Vantage柱中加入1.0g在上文实施例2中描述的AEX纤维介质在100mL 25mM tris缓冲液(pH 8)中的浆液。将纤维介质压缩到3.0cm的床深(2.85mL柱体积，0.35g/ml纤维填充密度)。纤维床渗透率通过使25mM Tris pH 8缓冲剂以2.0mL/min的流速流过柱并借助于电子压力传感器测量柱压降来评定。纤维床渗透率值提供在下表1中。
表1. 纤维介质柱填充
柱类型 介质类型 ( 量 ) 床深， cm (CV ， mL) 压力， PSI ( 流速， mL/min) 渗透率，毫达西 ( 速度， cm/hr)
11mM Vantage AEX纤维，实施例2(1.0g) 3.0cm (2.85mL) 6.5 PSI (6.1mL/min) 724mDa (384cm/hr)
11mM Vantage AEX纤维，实施例2(1.0g) 3.0cm (2.85mL) 13 PSI (12mL/min) 722mDa (778cm/hr)
实施例 4. 使用 BSA 包衣的胶乳珠粒模拟病毒结合到 AEX 纤维介质
将来自Postnova Analytics Inc.的BSA包衣的聚苯乙烯胶乳颗粒(100nm粒径)用作模型以模拟流感病毒的大小和带电特性。BSA胶乳颗粒的2mg/mL溶液在pH 8的25mM Tris缓冲液中制备且确定AEX纤维介质的静态结合容量并将其与商业Q型树脂(Q-S琼脂糖速流（epharose Fast Flow），GE Healthcare Life Sciences Inc.)的静态结合容量以及商业Q型膜吸附器(Membrane-Q)的静态结合容量相比较。这些结果汇总在下表2和图2中。与未官能化的Allasso纤维介质或商业Q-琼脂糖速流色谱树脂相比，AEX纤维介质对于BSA包衣的胶乳颗粒具有显著更大的静态结合容量。Q-琼脂糖树脂的弱结合容量可解释为大BSA胶乳颗粒可到达的可用表面积解释有限。此外，AEX纤维介质的结合容量与商业Membrane-Q膜吸附器的结合容量是可比较的。图3提供在使用BSA胶乳颗粒进行静态结合实验之后AEX纤维介质和未改性的Allasso有翼纤维的SEM图像。对于AEX纤维介质，观察到相当大数量的颗粒，几乎完全地覆盖纤维表面。在使用未官能化的Allasso纤维的对照实验的情况下，仅少数颗粒吸附到未处理的Allasso纤维的表面。在此情况下，所有结合都可归因于在BSA胶乳颗粒和未处理的Allasso纤维之间的非特异性结合相互作用。
表2. 用于选择的介质的BSA-胶乳SBC
样品编号 介质量，mL BSA胶乳溶液体积，mL (颗粒数) 最终的BSA胶乳溶液浓度(颗粒/mL) 静态结合容量(BSA颗粒/mL介质)
AEX纤维介质 0.10mL1 1.0mL (4.09x1012) 1.40 x1012 2.6 x1013
AEX纤维介质 0.11mL 1.0mL (4.09x1012) 1.26 x1012 2.7 x1013
AEX纤维介质 0.10mL 1.0mL (3.85x1012) 1.36 x1012 2.4 x1013
AEX纤维介质 0.11mL 1.0mL (3.85x1012) 1.33 x1012 2.5 x1013
Allasso纤维 0.10mL 1.0mL (4.09x1012) 3.80 x1012 2.9 x1012
Allasso纤维 0.10mL 1.0mL (4.09x1012) 3.78 x1012 3.2 x1012
Q-Sepharose FF 1.0mL 1.0mL (4.09x1012) 2.30 x1012 1.8 x1012
Q-Sepharose FF 1.0mL 1.0mL (4.09x1012) 2.32 x1012 1.8 x1012
Membrane-Q 0.14mL 1.0mL (3.85x1012) 8.96 x1011 2.1 x1013
Membrane-Q 0.14mL 1.0mL (3.85x1012) 9.36 x1011 2.1 x1013
1基于0.35g/ml纤维填充密度的纤维介质体积
实施例 5. 对于病毒的结合 / 洗脱纯化而言的纤维介质容量。
噬菌体Φ6的静态结合容量和洗脱回收测量的结果提供在下表3中。向5个塑料离心管中以在下表中描述的量加入实施例2的AEX纤维介质和未官能化的Allasso纤维样品。将各纤维样品和对照管在搅拌下用5mL的25mM Tris缓冲液(pH 8，具有0.18mg/mL HSA)平衡10分钟。将管在室温下在台面离心机中以4000rpm旋转10分钟以粒化纤维介质。除去2.5mL上清液并将2.5mL的在25mM Tris缓冲液(pH 8，具有0.18mg/mL HSA)中的1.7x107 pfu/mLΦ6溶液加入各管中。将样品在室温下搅拌1小时。然后，将管在室温下在台面离心机中以4000rpm旋转15分钟以粒化纤维介质。除去2.5mL上清液并通过菌斑形成测定来对测定这些样品中未结合的Φ6。将管用2.5mL的25mM Tris缓冲液(pH 8，具有0.18mg/mL HSA)的洗涤液洗涤3次，在每次洗涤之间离心将纤维介质球粒化并除去2.5mL上清液。在洗涤之后，将2.5mL的在25mM Tris缓冲液中的1.0M NaCl溶液(pH 8，具有0.18mg/mL HSA)加入各管(5毫升总体积，终NaCl浓度为0.5M)中。将样品在室温下搅拌10分钟。然后，将管在室温下在台面离心机中以4000rpm旋转10分钟以使纤维介质球粒化。除去2.5mL上清液并通过菌斑形成测定来测定这些洗脱样品中洗脱的Φ6。实施例2的Q官能化触手纤维介质展示3.1的显著的噬菌体Φ6对数降低值(LRV)和40%的洗脱回收收率。该性能与在商业病毒色谱应用中所采用的基于膜的阴离子交换介质是可比较的。本发明的Q官能化纤维介质可集成入预填充装置格式或色谱柱中以便用于流通病毒清除或结合/洗脱病毒纯化应用。相比之下，未官能化的Allasso纤维样品没有显示出对于Φ6噬菌体的可测到的结合容量(Φ6 LRV = 0)。
表3. 静态结合容量测量。挑战：2.5mL的在具有0.18mg/mL HSA的25mM Tris (pH 8)中的1.7E7 pfu/mL噬菌体Phi6。洗脱缓冲液：在具有0.18mg/mL HSA的25mM Tris (pH 8)中的0.5M NaCl。
样品 量(g) Φ6滴度(pfu/mL) Φ6结合(LRV) 洗脱Φ6滴度 (pfu/mL) %回收率，Φ6
对照管 -- 2.10 x 107 -- 2.15 x 106 --
实施例2 0.051g 1.39 x 104 3.18 8.45 x 106 40.3%
实施例2 0.052g 1.65 x 104 3.10 8.15 x 106 38.8%
Allasso未官能化的纤维 0.051g 2.09 x 107 0.00 8.65 x 105 --
Allasso未官能化的纤维 0.050g 2.32 x 107 -0.04 7.10 x 105 --
实施例 6. 确定Φ 6 LRV 、Φ 6 结合容量和洗脱池Φ 6 回收率。
两个11mM ID Vantage柱根据在实施例3中描述的方法使用来自实施例2的AEX纤维介质填充。将AEX纤维介质柱连接到BioCAD色谱工作站并使用30μl的2%丙酮溶液和25mM Tris (pH 8)缓冲液的注射液作为洗脱剂以3.2mL/min的流速(线速度200cm/hr)测量HETP和峰不对称值。HETP和峰不对称性分别测量为0.08cm和2.8。使用假单胞菌属噬菌体Φ6进料流(1.0 x109 pfu/mL，在具有0.0625% HSA的25mM Tris pH 8中) 测试AEX纤维介质柱的动态结合容量、病毒对数降低值(LRV)和Φ6回收率，且将性能与两种商业阴离子交换膜吸附器和商业基于珠粒的阴离子交换剂的性能相比较。将AEX纤维介质柱用35CV的具有0.0625% HSA的25mM Tris pH 8平衡。然后，用140CV的假单胞菌属噬菌体Φ6进料流溶液（大约9.3×108 pfu/ml，在具有0.0625% HSA的25mM Tris pH 8中）装载每个柱，并收集20×7CV流通级分。在装载之后，将柱用30CV的具有0.0625% HSA的25mM Tris pH 8洗涤。将结合的Φ6用15CV的在具有0.0625% HSA的25mM Tris pH 8中的1.0M NaCl溶液洗脱。通过菌斑形成测定分析流通、洗涤和洗脱样品的Φ6滴度。根据类似程序评价膜吸附器装置和Q-琼脂糖速流柱。将这些装置用15CV的具有0.0625% HSA的25mM Tris pH 8平衡。然后，用140CV的假单胞菌属噬菌体Φ6进料流溶液(约1.4 x 109pfu/mL，在具有0.0625% HSA的25mM Tris pH 8中)装载各柱，并收集5 x 28CV的流通级分。在装载之后，将柱用15mL的具有0.0625% HSA的25mM Tris pH 8洗涤。将结合的Φ6用15CV的在具有0.0625% HSA的25mM Tris pH 8中的1.0M NaCl溶液洗脱。通过菌斑形成测定分析流通、洗涤和洗脱样品的Φ6滴度。性能数据汇总于下表4和图4及图5中。所有膜吸附器(Sartobind-Q和ChromaSorb)以及Q-琼脂糖速流树脂都展现了Φ6的极低结合容量。这通过Φ6的早期突破和在该表中针对第一28CV流通时间点报告的相应低Φ6 LRV值示出。对于膜吸附器装置和Q-琼脂糖树脂柱记录的洗脱池Φ6滴度也相当低，且进一步反映了这些材料对于Φ6噬菌体的弱结合容量。相比之下，对于AEX纤维介质柱，我们发现高得多的对Φ6的结合容量，在相同的28CV流通时间点下Φ6 LRV约为3。洗脱池Φ6滴度与比较样品相比高得多且最终Φ6滴度与Φ6装载滴度相比更高。这表明AEX纤维介质柱的Φ6结合容量是相当大的且该介质能够将Φ6噬菌体浓缩到与起始进料相比更高的值。
表4. 确定Φ6 LRV并评价AEX纤维介质以及所选商业膜吸附器和基于珠粒的AEX介质的Φ6结合容量和洗脱回收率。
样品 柱体积(mL) 流速，mL/min (驻留时间，分钟) 装载体积，CV (mL) Φ6进料滴度 洗脱池体积，CV Φ6 LRV流通 (28CV) 洗脱池Φ6滴度 (pfu/mL)
AEX纤维介质 2.85mL 2.9mL/min (1min) 140CV (400mL) 9.3 x108 15CV 3.44 2.5 x109
AEX纤维介质 2.85mL 3.1mL/min (54sec) 140CV (400mL) 9.3 x108 15CV 2.88 1.7 x109
Sartobind-Q 0.14mL 1mL/min (8sec) 140CV (19.6mL) 1.4 x109 15CV 0.18 2.4 x106
Sartobind-Q 0.14mL 1mL/min (8sec) 140CV (19.6mL) 1.4 x109 15CV 0.02 3.0 x106
Q-Sepharose FF 1.00mL 1mL/min (1min) 140CV (140mL) 1.4 x109 15CV 0.20 7.1 x106
Q-Sepharose FF 1.00mL 1mL/min (1min) 140CV (140mL) 1.4 x109 15CV 0.25 8.6 x106
Chromasorb 0.08mL 1mL/min (5sec) 140CV (11.2mL) 1.4 x109 15CV 0.21 9.8 x106
Chromasorb 0.08mL 1mL/min (5sec) 140CV (11.2mL) 1.4 x109 15CV 0.31 1.6 x107
实施例 7. 噬菌体Φ X174 LRV 确定。
两个11mM ID Vantage柱根据在实施例3中描述的方法使用来自实施例2的AEX纤维介质填充。将AEX纤维介质柱连接到BioCAD色谱工作站并将30μl的2%丙酮溶液和25mM Tris (pH 8)缓冲液的注射液用作洗脱剂以3.2 mL/min的流速(线速度200cm/hr)测量HETP和峰不对称值。HETP和峰不对称性分别测量为0.10cm和2.0。使用ΦX174进料流(1.28 x107 pfu/mL，在25mM Tris pH 8中)测试AEX纤维介质柱的病毒对数降低值(LRV)，且将性能与两种商业ChromaSorbTM阴离子交换膜吸附器的性能相比较。将AEX纤维介质柱用35CV(100mL)的25mM Tris pH 8平衡。然后，将各柱装载380CV(1080mL)的噬菌体ΦX174进料流溶液(1.28 x 107 pfu/mL，在25mM Tris pH 8中)，并在100、200、300和370CV时间点收集4 x 1mL流通捕获级分。根据类似程序评价ChromaSorb™膜吸附器装置。这些装置用30mL (375CV)的25mM Tris pH 8平衡。然后，将各装置装载750CV(60mL)的噬菌体ΦX174进料流溶液(约1.28 x 107 pfu/mL，在25mM Tris pH 8中)且在25、375和750CV时间点收集3 x 1mL流通捕获级分。通过菌斑形成测定分析流通捕获级分的ΦX174滴度。性能数据汇总于下表5和图6中。在这些条件下，AEX纤维介质柱和ChromaSorb™膜吸附器装置两者都展现出具有大于或近似等于4的ΦX174 LRV值的良好ΦX174病毒清除性能。
表5. AEX纤维介质和Chromasorb™装置的流通ΦX174清除LRV
样品编号 柱体积(mL) 装载体积，CV (mL) ΦX174装载滴度(pfu/mL) ΦX174 LRV (平均)
AEX纤维介质 2.85mL 379CV (1080mL) 1.28 x 107 3.8
AEX纤维介质 2.85mL 379CV (1080mL) 1.28 x 107 3.9
ChromaSorb™ 0.08mL 750CV (60mL) 1.28 x 107 6.2
ChromaSorb™ 0.08mL 750CV (60mL) 1.28 x 107 6.2
实施例 8. 自澄清的 MDCK 细胞培养物结合和洗脱纯化流感病毒。
根据在实施例3中描述的程序将来自实施例2的AEX纤维介质填充到11 mM Vantage柱中。在流感病毒的结合/洗脱纯化中，将AEX纤维介质的性能与市售可得的AEX珠粒和膜吸附器相比较。选择商业预填充Q型树脂HiTrap™ Q FF (GE Healthcare Life Sciences Inc. PN:17-5053-01）以及商业强碱性AEX膜吸附器装置(Sartobind®-Q, Sartorius AG PN:Q5F)用于比较。流感病毒细胞培养物通过沉降微载体、倾析且随后经过Stericup®-GP过滤装置(EMD Millipore PN:SCGPU11RE)后续过滤以除去不溶性污染物来收获。通过血细胞凝集(HA)测定，对于起始进料而言，流感病毒浓度确定为9131 HAU/mL。所有装置都用至少5柱体积(CV)的具有0.1M NaCl的Sorensen磷酸钠缓冲液pH 7.2平衡。同一缓冲液被用于洗涤步骤。将具有1.5M NaCl的Sorensen磷酸钠缓冲液pH 7.2用作洗脱缓冲液。对于AEX纤维介质和HiTrap Q FF装置，对重复的装置进行测试。柱使用小蠕动泵进料且膜装置用10mL注射器使用缓慢且稳定的压力进料。收集流通、装载和洗脱样品并通过HA测定测试。操作参数和结果汇总于下表6和7及图7中。根据该评价，检测到基于珠粒的HiTrap™ Q FF阴离子交换剂的低流感病毒结合容量。这通过与Sartobind®-Q膜吸附器(Q5F)相比较其早期流感病毒突破来证实。Sartobind®-Q膜吸附器证明对于流感病毒的较高结合容量，且在洗脱时，以57%的收率回收结合的流感病毒。由于进料局限性，AEX纤维介质装置仅装载流感病毒至7.6 x 105 HAU/mL且该材料被以34-67%的收率回收。与基于珠粒的HiTrap™ Q FF阴离子交换介质相比较，AEX纤维介质柱展现对于流感病毒的高得多的结合容量，且这些装置可证明至少与Sartobind®-Q (Q5F)膜吸附器一样高的流感病毒结合容量。
表6. B/E流感病毒纯化的操作条件。
流速(mL/min) 装载量(收集的流通样品的编号和体积) 洗涤 洗脱
AEX纤维介质 3.0 5 x 50mL 15mL 15mL
HiTrap Q FF 1.0 5 x 15-20mL 4.5mL 10mL
Q5F (Sartobind®-Q) NA* 20 x 1.5mL 2mL 2mL
表7. B/E流感病毒纯化的结果汇总。
装载量 (HAU/mL) 回收率(%)
AEX纤维介质 7.6E+05 34-67
HiTrap Q FF 1.8E+05 37-61
Q5F 1.8E+06 57
实施例 9. 自澄清的 MDCK 细胞培养物结合和洗脱纯化流感病毒。
根据在实施例3中描述的程序将来自实施例2的AEX纤维介质填充到11mM Vantage柱中。在流感病毒的结合/洗脱纯化中，将AEX纤维介质的性能与市售可得的AEX珠粒相比较。选择商业预填充Q-型树脂：HiTrap™ Q FF (GE Healthcare Life Sciences Inc. PN:17-5053-01)用于比较。流感病毒细胞培养物通过沉降微载体、倾析且随后通过Stericup®-GP过滤装置(EMD Millipore PN:SCGPU11RE)的后续过滤以除去不溶性污染物来收获。通过血细胞凝集测定，对于起始进料而言，流感病毒浓度确定为4389HAU/mL。所有装置都用至少5柱体积(CV)的具有0.1M NaCl的Sorensen磷酸钠缓冲液pH 7.2平衡。同一缓冲液被用于洗涤步骤。将具有1.5M NaCl的Sorensen磷酸钠缓冲液pH 7.2用作洗脱缓冲液。对重复装置进行测试。柱使用小蠕动泵进料。收集流通、装载和洗脱样品并将其通过HA测定测试。操作参数和结果汇总于下表8和9及图8中。根据此评价，检测到基于珠粒的HiTrap™ Q FF阴离子交换剂的低流感病毒结合容量。这通过与AEX纤维介质柱相比较的其早期流感病毒突破所证实。AEX纤维介质展现出对于流感病毒明显更大的结合容量，且在洗脱时，结合的流感病毒被以42%收率回收。由于进料局限性，AEX纤维介质装置仅装载流感病毒至1.05 x 106HAU/mL且多至此装载水平，也没有观察到流感病毒突破。
表8. B/E流感病毒纯化的操作条件。
流速(mL/min) 装载量(收集的流通样品的数量和体积) 洗涤 洗脱
AEX纤维介质 3.0 16 x 45mL 30mL 15mL
HiTrap Q FF 1.0 10 x 10mL 10mL 10mL
表9. B/E流感病毒纯化的结果汇总。
装载量(HAU/mL) 回收率(%)
AEX纤维介质 1.1E+06 42
HiTrap Q FF 8.8E+04 60-100
实施例 10. MVM LRV 确定。
两个6.6mM ID Omnifit柱根据在实施例3中描述的方法使用来自实施例2的AEX纤维介质填充。对于各柱，将0.35g AEX纤维介质填充至3.0cm的床深和1mL的柱体积。AEX纤维介质柱的病毒清除容量使用被小鼠的细小病毒(MVM)(2.0 x 106 TCID50/mL)感染的17.6g/L mAb进料流评价且将性能与两种商业ChromaSorb™装置和一种Sartobind-Q阴离子交换膜吸附器的性能相比较。为了更好地模拟相关mAb进料流，该进料还含有约84ppm的宿主细胞蛋白质(HCP)污染物。将AEX纤维介质柱用100CV(100mL)的25mM Tris pH 7平衡。然后，各柱装载411CV (411mL)的MVM感染的mAb进料流，且在0.2、1.8、3.5、5.2和7.0kg/L mAb通过量时间点收集5 x 1mL流通捕获级分。根据类似程序评价ChromaSorb™和Sartobind®-Q膜吸附器装置。这些装置用10mL (125CV)的25mM Tris pH 7平衡。然后，ChromaSorb™和Sartobind®-Q装置装载400CV (对于ChromaSorb™，32mL；对于Sartobind™-Q装置，56mL)的MVM感染的mAb进料流，且在0.2、1.8、3.5、5.2和7.0kg/L mAb通过量时间点收集5 x 1mL流通捕获级分。注：对于Sartobind®-Q膜吸附器装置而言，不收集5.2和7.0kg/L mAb通过量时间点。经由TCID50测定分析流通捕获样品的MVM感染。性能数据汇总于下表10和图9中。在这些条件下，AEX纤维介质柱和ChromaSorb™膜吸附器装置两者都展现出良好的MVM病毒清除性能，在高达7kg/L的mAb通过量水平下，MVM LRV值≥4。相比之下，商业Sartobind®-Q膜吸附器装置展现出即使在低mAb通过量水平下也小于3的不良MVM LRV值。
表10. AEX纤维介质、Chromasorb™和Sartobind®-Q装置的流通MVM间隙LRV
。

Claims (9)

1. 一种纯化在样品中的病毒的方法，其包括使所述样品与纤维介质的床接触，在所述介质中的纤维包括本体区域和从所述本体区域延伸的多个突出，所述纤维其上赋予有使得色谱法可行的官能团。
2. 权利要求1的方法，其中所述官能团接枝到所述纤维上。
3. 权利要求1的方法，其中所述官能团以流通模式使得纯化可行。
4. 权利要求1的方法，其中所述官能团以结合/洗脱模式使得纯化可行。
5. 权利要求1的方法，其中所述离子交换官能团为阳离子交换官能团，且其中所述纯化在5-8的pH范围内进行。
6. 权利要求1的方法，其中所述官能团为阴离子交换官能团，且其中所述纯化在7-9的pH范围内进行。
7. 权利要求1的方法，其中所述纤维用三甲胺官能化。
8. 权利要求1的方法，其中所述病毒为流感病毒。
9. 权利要求1的方法，其中纤维具有选自雏菊、雪花和太阳形状的形状。
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