JPH08170958A

JPH08170958A - 分離剤

Info

Publication number: JPH08170958A
Application number: JP6315211A
Authority: JP
Inventors: Makoto Kawabata; 信河端; Kozo Otsuki; 耕三大槻; Kenji Sato; 健司佐藤
Original assignee: MARUDAI SHOKUHIN KK; Marudai Food Co Ltd
Current assignee: MARUDAI SHOKUHIN KK; Marudai Food Co Ltd
Priority date: 1994-12-19
Filing date: 1994-12-19
Publication date: 1996-07-02

Abstract

(57)【要約】【構成】長さ１〜２０ｍｍの繊維性濾過物質に吸着性構
成単位を結合してなるクロマトグラフ用分離剤。【効果】生物由来あるいは合成高分子などの粘性物質を
分離を、目詰まりを起こさず行うことができ、粘性試料
の分離あるいは前処理に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、混合物の分離剤に関
し、特に粘性物質の分離剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】多糖類や蛋白質などを含む粘度の高い試
料は、目詰まりを起こしやすいため、カラムクロマトグ
ラフなどで分離を行うことが困難であった。例えば電気
泳動であれば、粘性試料の分離は可能であるが、電気泳
動では処理できる試料の量が限られるため、大量の試料
を扱うことができない。

【０００３】近年、イオン交換繊維からなる粘性試料用
のクロマトグラフ用充填剤も市販されているが、例えば
コラーゲンなどの粘性の高い物質の分離では、目詰まり
を起こし、回収率が低下し、分離に長時間を要するなど
の問題があった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、粘性試料を
短時間且つ高回収率で分離ないし前処理を行うためのク
ロマトグラフ用の分離剤を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
鑑み検討を重ねた結果、例えばカラムに充填ないし濾過
する際に、一定の長さを有する繊維性充填剤を用いる
と、適度の空隙が形成されるため濾過速度が大きくな
り、粘度の大きい試料であっても目詰まりせず、容易に
濾過ができることを見出した。

【０００６】本発明は、以下の分離剤を提供するもので
ある。

【０００７】項１．長さ１〜２０ｍｍの繊維性濾過物
質に吸着性構成単位を結合してなるクロマトグラフ用分
離剤。

【０００８】項２．繊維性濾過物質が繊維性セルロー
スである項１に記載のクロマトグラフ用分離剤。

【０００９】本発明のクロマトグラフ用分離剤は、通常
カラムに充填して用いるが、バッチ式で被処理物の分離
を行ってもよい。

【００１０】本発明において、繊維性濾過物質は、１本
ずつが独立した繊維であっても良く、複数の繊維が絡み
合っていてもよい。該繊維性濾過物質は、好ましくは繊
維であるが、カラムに充填可能であるか、バッチ式で用
いることができる限り織物、編物、不織布などの布状物
の断片であってもよい。

【００１１】繊維性濾過物質の長さは、繊維形状の場合
平均で１〜２０ｍｍ程度、好ましくは１〜１０ｍｍ程度
であり、より好ましくは１〜３ｍｍである。繊維性濾過
物質の長さがこの範囲にあると、繊維が絡み合うため、
濾過が迅速に行えることになり好ましい。該繊維は、上
記の平均長さの範囲内にある限り、長さは揃っていて
も、不揃いであってもよい。

【００１２】繊維状濾過物質の材質は、吸着性構成単位
を共有結合などにより結合できるものであれば特に限定
されないが、繊維性セルロースなどの天然繊維、ポリビ
ニルアルコール、ポリアクリロニトリルなどの合成繊維
が挙げられ、好ましくは繊維性セルロースが挙げられ
る。繊維性セルロースとして、綿、麻、木材パルプ等が
例示される。

【００１３】吸着性構成単位としては、アニオン性（カ
ルボキシメチル(CM)、ホスフェート(P)、ホスホノメチ
ル(PPM)、スルホエチル(SE)、スルホメチル(SM)など）
又はカチオン性（ジエチルアミノエチル(DEAE)、トリエ
チルアミノエチル(TEAE)、アミノエチル(AE)、グアニド
エチル（GE）、エクテオラ(ECTEOLA)、パラアミノベン
ジル(PAB)など）のイオン交換基、アフィニティークロ
マトグラフィーに用いられる物質（酵素に対する基質、
阻害剤、補酵素など；ホルモンに対する受容体、ＤＮＡ
に対するＲＮＡなど；抗原に対する抗体など）等が挙げ
られ、好ましい吸着性構成単位としてアニオン性又はカ
チオン性のイオン交換基が挙げられる。

【００１４】本発明の分離剤は、繊維性濾過物質に、常
法に従いアニオン又はカチオン性イオン交換基、アフィ
ニティークロマトグラフィーに用いられる物質などの吸
着性構成単位を共有結合により結合させる。繊維性濾過
物質に対する吸着性構成単位の比率は、各々の組み合わ
せにより異なり、当業者であれば容易に決定でき、特に
限定されないが、例えば繊維性セルロースの膨潤時容量
１dlあたりアニオン又はカチオン交換基は０．１〜３０
ｍ当量程度である。

【００１５】本発明の充填剤は、常圧下にカラムに充填
した場合、１ｇ当たり１０〜３０ｍｌ程度、特に２０〜
３０ｍｌ程度の容積を有する。

【００１６】本発明の分離剤は、例えば公知のイオン交
換繊維やアフィニティークロマトグラフィー用充填剤な
どと同様の条件で使用することができる。

【００１７】

【発明の効果】本発明の分離剤は、生物由来の蛋白質、
糖蛋白、核酸、多糖類等、あるいは合成高分子などの粘
性物質を分離する際に、目詰まりを起こさずに物質の分
離を行うことができ、粘性試料の分離あるいは前処理に
有用である。該分離剤は、カラムの充填剤として用いて
も良く、バッチ式で粘性試料を含む溶液に、該分離剤を
加え、濾過することによっても粘性試料の精製ないし前
処理を行うことができる。該分離剤を用いて前処理を行
えば、次の精製ステップでは目詰まりはしないか大幅に
軽減され、全体として粘性試料の精製が容易に行える。

【００１８】

【実施例】以下、本発明を実施例及び比較例を用いてよ
り詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定され
ない。

【００１９】実施例１本発明の分離剤の調製一辺が１ｃｍ程度になるようにちぎった濾紙（No.1、ワ
ットマン社製）に水を加えホモジナイザーで３分間処理
し、乾燥して濾紙の細片６０ｇを得た。得られた濾紙細
片６０ｇを２０％水酸化ナトリウム中、ジエチルアミノ
エチルクロライド塩酸塩３５ｇの存在下に１００℃（還
流下）で３〜４時間撹拌した。反応液を濾過し、溶媒で
洗浄して、ＤＥＡＥ−濾紙片を６０ｇ得た。

【００２０】得られたＤＥＡＥ−濾紙片は、以下の性質
を有する。

【００２１】１．総イオン交換容量：５ｍｅｑ／ｄｌ２．ＢＳＡ吸着容量：６１ｍｇ−ＢＳＡ／ｍｌ−ｇｅ
ｌ３．繊維の長さ：１〜３ｍｍ４．１ｇ当たりの容積２７．７ｍｌ実施例２Ｆ−ＤＥＡＥと市販の高流速タイプのイオン交換充填剤
との高粘度試料適用時の流速の変化を調べた。

【００２２】１）サンプルの調製牛腸の非コラーゲン部分をナイフで切除し、０．１Ｎ−
ＮａＯＨで１晩撹拌抽出し、遠心分離（３０００ｇ、１
０分間）で沈殿物を分離する操作を６回繰り返し、次い
で、組織湿重量の1/100〜1/200のペプシンを加えて４℃
で１晩抽出、遠心分離（３０００ｇ、１０分間）を行
い、上清としてペプシン可溶性コラーゲンを得た。

【００２３】得られた牛腸のペプシン可溶性コラーゲン
（ＰＳＣ）に、１／４量の10M 尿素，250mM塩化ナトリ
ウム溶液を加えて混合後、2M TrisでpH8.2に調整した。

【００２４】２）充填剤のカラムへの充填以下の６種類の市販の充填剤及び実施例１で得られた本
発明の充填剤を使用した。

【００２５】・DEAE-トヨハ゜ール(TOSOH TSKgel DEAE-TOYOPEARL650C) ・DEAE-セルロファイン(生化学工業(株)DEAE-Cellulofine AM) ・DEAE-セファロース(Pharmacia Biotech DEAE-Sepharose Fas
t Flow) ・Q-セファロース(Pharmacia Biotech Q-Sepharose Fast Flo
w) ・DE-52(Whatman PRE-SWOLLEN MICROGLANULAR ANIONEXC
HANGER Diethylaminoethyl Cellulose) ・Ex-イオン交換体D(Whatman HIGH FLOW RATE ION EXCHANG
ER D) カラムへの充填及び流量の測定は、以下のようにして行
った。

【００２６】(1)各々の充填剤を緩衝液（2M 尿素，50mM
NaClを含む Tris-HCl緩衝液(pH8.2)）に懸濁後（Ｆ−
ＤＥＡＥのみ、10000ｒｐｍで１分間ホモジネート）、
ムロマックのカラムに６ｃｍの高さまでに常圧で充填し
た（充填量：約２．５ｍｌ）。

【００２７】(2)上記のＰＳＣサンプルを１０ｍｌカラ
ムにかけた。

【００２８】(3)５分おきに１０ｍｌのメスシリンダー
を用いて、流量を測定した。

【００２９】(4)また、それぞれのサンプルの粘度をリ
オン（株）製ビスコテーターVT-03（ローターNo.4；回
転数６２．５ｒｐｍ）にて測定した。

【００３０】結果を図１に示す。

【００３１】試験例１実施例１で得た分離剤を用いて、以下のプロトコール
（１）〜（１１）に従い、原料であるブタ腸（小腸及び
大腸）１０００ｇから精製Ｉ型コラーゲン５．１ｇを得
た。

【００３２】（１）ブタの小腸および大腸から、脂肪組
織などの非コラーゲン画分をナイフでできる限り取り除
く。

【００３３】（２）残りを細切し、０．１Ｎ−ＮａＯＨ
に懸濁し、一晩撹拌抽出し、遠心分離（３０００ｇ、１
０分間）して沈殿を得る操作を６回繰り返す。

【００３４】（３）冷蒸留水で洗浄を繰り返す。

【００３５】（４）湿重量の５−１０倍量の０．５Ｍ酢
酸に懸濁し、一晩撹拌抽出の後に遠心分離（３０００
ｇ、１０分間）し、再度０．５Ｍ酢酸に懸濁し、一晩撹
拌抽出の後に遠心分離（３０００ｇ、１０分間）を行
う。

【００３６】（５）沈殿物に０．５Ｍ酢酸を加え、塩酸
でｐＨを２．５に調整し、組織湿重量の１／１００〜１
／２００のペプシンを加えて４℃で一晩抽出する。

【００３７】（６）遠心分離（３０００ｇ、１０分間）
により上清（ペプシン可溶性コラーゲン）を得る。

【００３８】（７）このペプシン処理および遠心分離操
作を３回繰り返す。

【００３９】（８）ペプシン可溶性コラーゲン２００部
に、１０Ｍ尿素と２５０ｍＭＮａＣｌの混合溶液５０
部を加え、２ＭＴｒｉｓ緩衝液でｐＨを８．２に調整
する。

【００４０】（９）４０ｍＭＴｒｉｓ、２Ｍ尿素、５
０ｍＭＮａＣｌを含む溶液を２ＮＨＣｌを用いてコラ
ーゲン溶液と同じｐＨに調整する。

【００４１】（１０）実施例１で得られたＤＥＡＥ−濾
紙細片を充填したカラムを工程（９）で調製した緩衝液
で平衡化する。

【００４２】（１１）ペプシン可溶性コラーゲン溶液３
０部をカラムに注入し、工程（９）で用いた緩衝液２０
部で溶出後に水で透析し、凍結乾燥し、［α１（Ｉ）］
₂α２（Ｉ）のサブユニット構造を有するＩ型コラーゲ
ンを得る。カラムの目詰まりはなかった。

【００４３】＊サブユニットの分離上記で得られたＩ型コラーゲン凍結乾燥物１ｍｇに、２
Ｍ尿素および５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ４．８）を１ｍｇ／ｍＬの割合で加え、５０℃
で５分間加熱してサブユニットを解離させた。この溶液
を、上記酢酸緩衝液で平衡化したBAKERBOND CSX強カチ
オン交換カラム（Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒＵ．Ｓ．Ａ製）に
注入し、流速１ｍＬ／分で３０分間、０〜３００ｍＭ
ＮａＣｌの直線勾配により、蛋白質を溶離した。各サブ
ユニットを含む画分を集め、凍結乾燥により濃縮した。
２Ｍ尿素、１５０ｍＭＮａＣｌを含むリン酸緩衝液
（ｐＨ６．５）により平衡化したＴＳＫＧＥＬＳＷ
３０００ＸＬに注入し、β鎖以上の重合物を除去した。

【００４４】さらに、塩および緩衝液を除くため、BAKE
RBOND C4逆相カラム（Ｊ．Ｔ．ＢａｋｅｒＵ．Ｓ．
Ａ．製）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸存在下で１
０−８０％のアセトニトリルの直線勾配溶出を行った。

【００４５】BAKERBOND C4逆相カラムの溶出パターンを
図２に示す。

【００４６】試験例２ニワトリの卵白６０ｇに水３０ｍｌを加え、濾紙で濾過
した。

【００４７】実施例１で得た分離剤２．５ｍｌまたはＥ
ｘ−イオン交換体Ｄ２．５ｍｌを高さ６ｃｍのカラムに
詰め、上記の１．５倍希釈の卵白のサンプル１０ｍｌ
を、各カラムに通した。結果を図３に示す。

【図面の簡単な説明】

【図１】各種カラム充填剤の流量の測定結果を示す。

【図２】BAKERBOND C4逆相カラムの溶出パターンを示
す。

【図３】卵白の希釈試料のカラムクロマトグラフィーの
流量変化を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 591105801 丸大食品株式会社大阪府高槻市緑町21−３ (72)発明者河端信京都府京都市左京区大原野村町208−２ (72)発明者大槻耕三京都府向日市上植野町南開34−２ (72)発明者佐藤健司京都府京都市左京区浄土寺石橋町16 リバーサイドマンション302号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】長さ１〜２０ｍｍの繊維性濾過物質に吸着
性構成単位を結合してなるクロマトグラフ用分離剤。
【請求項２】繊維性濾過物質が繊維性セルロースである
請求項１に記載のクロマトグラフ用分離剤。