WO2000040702A1 - Methode de separation de particules virales - Google Patents

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WO2000040702A1
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Anne Barbot
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    • G01N30/02—Column chromatography

Definitions

  • the invention relates to a new method for the purification and quantification of viral particles. More particularly the invention relates to a method of purification and quantification of adenovirus by ion exchange chromatography. The invention also relates to a method for identifying the various adenovirus serotypes.
  • adenovirus vectors in gene therapy requires access to two types of technology which are currently limiting for the production of viral stocks: the first is to have a rapid method, with high sensitivity and very selective for the quantification of the viral particles in the samples coming from the stages of construction and amplification of the virus considered, this point is particularly important for the optimization of the production process of the viral stocks: the second is to have a purification process reliable, reproducible, simple and easily extrapolated on an industrial scale for the purification of viral particles.
  • adenovirus The production of clinical batches of adenovirus remains a long process due to the number of transfection and amplification steps whose productivity is not optimized.
  • Recombinant adenoviruses are usually produced by introducing viral DNA into an encapsidation line. followed by a mechanical or chemical lysis of the cells after about two or three days of culture (the kinetics of the adenoviral cycle being 24 to 36 hours).
  • the culture is continued for a longer period (8 to 12 days), and the viruses are harvested directly in the supernatant, after spontaneous release by a phenomenon of autolysis of the packaging cells (WO98 / 00524) .
  • the quantification method for viral particles must satisfy several conditions. First, it must be sensitive enough to ensure the determination of viral particles in diluted preparations or with a low titer (typically ⁇ 1 x 10 ° viral particles per ml (w / ml)) without resorting to an enrichment step prior.
  • the dosage of viral particles must be carried out directly in lysates or crude preparations, without it being necessary to perform a step of purification or pretreatment.
  • this method must ensure high selectivity to overcome possible interference with the many compounds present in the lysates or crude cell extracts, the proportions of which can vary depending on the culture conditions.
  • the detection limit is estimated at 2 to 5 x 10 ° pvml in such samples and this method does not make it possible to quantify the adenoviral particles in very diluted and unpurified preparations such as lysates of infected cells during the transfection steps and amplification of the virus for which the Adenoviral titer is typically of the order of 1 x 10 s pv / ml to 1 x 10 ° pv / ml.
  • this method also does not make it possible to quantify the adenoviral particles from preparations obtained in certain production media devoid of animal proteins. Indeed, such media contain, at the end of culture, compounds of the type, sugars, amino acids, vitamins, or phenol red, etc.
  • Application WO98 / 00524 describes in particular a purification method using the strong anion exchange resin Source 150 and which makes it possible to obtain, in a single chromatographic step.
  • adenovirus preparations whose purity is at least equivalent to that obtained from preparations purified by ultracentrifugation in cesium chloride gradient. This degree of purity is very high and reaches the standards required for clinical studies in humans (WHO Expert Committee on Biological Standardization, Forty-ninth Report. WHO Technical Report Series, WHO Geneva, in press).
  • the limited performances of the chromatographic techniques described above do not allow either of quantify, nor purify adenoviral particles in a single step from such starting material.
  • the problem therefore arises of being able to have a method for titrating viral particles from crude preparations which is at the same time rapid, sensitive and highly selective.
  • the problem also arises of having a reliable, reproducible purification method making it possible to obtain, from these same crude preparations, and preferably in a single step, viral preparations of pharmaceutical quality.
  • chromatography supports have su ⁇ renantly quite exceptional properties for the separation of viral particles and in particular of adenoviruses. These properties allow the titration and / or purification of viral particles from crude preparations, without prior treatment, with very high sensitivity and selectivity.
  • the use of these supports also provides, unexpectedly, a simple and rapid analysis method for separating and identifying by chromatography, adenoviruses of different serotypes or adenoviruses modified at the fiber or hexon level.
  • the present invention relates to a method of separating viral particles from a biological medium characterized in that it comprises at least one chromatography step carried out on a support comprising a matrix, groups of ion exchangers, said groups being grafted onto said matrix by means of a flexible arm.
  • the matrix can be chosen from agarose. dextran, acrylamide, silica, poly [styrene-divinylbenzene], alone or in admixture.
  • the matrix consists of agarose. More preferably, it is about 6% crosslinked agarose.
  • the supports consisting of crosslinked agarose beads onto which flexible functionalized ion exchange arms are grafted have been developed for the preparative and industrial chromatography of biomolecules. These materials have especially been developed for the capture step (that is, the initial step of the purification process) biomolecules from crude mixtures simply released, that is to say, cleared of suspended solids constituents . Their performances have been optimized in the sense of a very high capacity for fixing the solutes on the support, a very low back pressure at high linear flow rate of liquid, a low cost as well as a very high chemical resistance cleaning agents used for regeneration.
  • the flexible arm is hydrophilic in nature and consists of a polymer of synthetic or natural origin.
  • polymers of synthetic origin mention may be made of polymers consisting of monomers of polyvinyl alcohols, of polyacrylamides, of polymethacrylamides or of polyvinyl ethers.
  • polymers of polysaccharide nature chosen from starch, cellulose, dextran and agarose.
  • the degree of polymerization of the flexible arm is approximately 30 monomeric units, more preferably, the flexible arm is a dextran with an average molecular weight of approximately 5000 Da.
  • the flexible arm is functionalized by grafting a group capable of interacting with an anionic molecule.
  • the group consists of an amine which can be ternary or quaternary.
  • a strong anion exchanger preferably used according to the invention a chromatography support as indicated above, functionalized with quaternary amines.
  • Q Sepharose® XL As a particularly preferred support for the implementation of the invention, mention may be made of Q Sepharose® XL (Amersham Pharmacia Biotech). The use of this support is mentioned in one of the examples of application WO98 / 39467.
  • Purified adenoviruses are modified by treatment with polyethylene glycol (PEG). After reaction, the modified adenoviruses, the unmodified adenoviruses and the PEG are separated by passage through a column of Q Sepharose® XL. It is therefore a simple separation between starting products and end products of a chemical reaction. Those skilled in the art could not assume that this column could be successfully used for the separation of adenovirus from a complex biological medium containing various contaminating species (host DNA.
  • PEG polyethylene glycol
  • RNAs, proteins, lipids, lipoproteins, endotoxins such as a cell lysate of packaging.
  • Q Sepharose® XL can be used for preparatory purposes because it is known that the majority of supports lose their effectiveness when large quantities of products are injected.
  • the matrix consists of agarose crosslinked at 6%, it is grafted with flexible arms made of dextran and functionalized with strong anion exchange groups.
  • the support has a particle size preferably between 40 and 200 ⁇ m approximately;
  • the term "approximately” referring to the grain size signifies that the value to be taken into consideration is within a range of between +/- 20% relative to the value expressed. Preferably, this difference is between +/- 10% and more preferably it is between +/- 5% relative to the value expressed.
  • the particle size is between
  • the matrix has a dispersion such that 95% of the particles have a diameter between 0.1 and 10 times the average diameter of the particles, and preferably between 0.3 and 3 times the average diameter of the particles.
  • the Q Sepharose® XL has a size distribution of beads ranging from 45 to 165 ⁇ m, centered on 90 ⁇ m. These characteristics of size and distribution of the beads make this support a preparative type chromatographic exchanger. The theory as well as the chromatographic practice indicate that such a support has very modest performances for the separation of compounds exhibiting similar chromatographic behaviors as for the interaction of ion exchange. Similarly, such a support generates wide chromatographic peaks poorly resolved, in particular due to the large size and the very wide distribution of the beads which constitute it. These expected chromatographic characteristics are verified for biomolecules in general such as proteins, which are eluted in the form of large poorly separated peaks (see Data File Pharmacia Biotech N ° 18-1 123-82).
  • the adenovirus particles are eluted from this type of support in the form of an extremely fine peak. very symmetrical.
  • the efficiency of a column filled with Q Sepharose® XL measured by the Height Equivalent to a Theoretical Tray (HEPT) or the number of theoretical trays per unit of column length (N / m). is 50 to 100 times higher for adenovirus (N / m: 35,000) than for proteins like bovine serum albumin (N / m: 600). See for example FIG. 1.
  • this type of gel and in particular Q Sepharose® XL gel gives a chromatographic peak for the adenovirus of a fineness unmatched by the supports.
  • this type of gel and in particular Q Sepharose® XL gel gives a chromatographic peak for the adenovirus of a fineness unmatched by the supports.
  • the supports recommended for the separation of biomolecules mention may be made of supports whose base matrix is of the divinylbenzene polystyrene type (such as, for example, the resins Source 15Q and Source 30Q, or the resins of the type Poros HQ, Poros DE2, or Poros D ).
  • supports whose base matrix is of the ethylene glycol methacrylate copolymer type, such as, for example, Toyopearl DEAE, QAE resins. and Super Q, or the Fractogel TMAE, TMAE HiCap, DMAE, or DEAE type resins, the ion exchange functional groups of which are located on linear polymer chains of polyacrylamide type grafted onto the matrix.
  • supports whose base matrix is of the ethylene glycol methacrylate copolymer type, such as, for example, Toyopearl DEAE, QAE resins. and Super Q, or the Fractogel TMAE, TMAE HiCap, DMAE, or DEAE type resins, the ion exchange functional groups of which are located on linear polymer chains of polyacrylamide type grafted onto the matrix.
  • the effectiveness of the supports used in the context of the present invention for the separation of adenovirus particles leads to a very high sensitivity of detection of the particles.
  • the unexpected chromatographic behavior of the viral particles makes it possible to quantify the adenovirus with a detection limit much lower than the detection limit of the methods described previously.
  • This detection limit is at least ten times lower, which makes it possible to reach a detection limit of the order of 1 ⁇ 10 s pv / ml in crude cell lysate type preparations and a detection limit of the order of 1 x 10 'pv / ml for purified viral preparations.
  • This type of support also ensures a very high selectivity with respect to contaminants present in the samples to be analyzed such as proteins and nucleic acids.
  • the proteins are in the form of very broad peaks which elute well before the viral peak.
  • Nucleic acids are eluted from the column with a salt concentration much higher than the concentration necessary for the elution of the virus.
  • This characteristic very different from that obtained with the chromatographic method previously described (Huygue et al., Human Gene Ther. 6: 1403-1416, 1995) makes it possible to overcome the interference of this type of compound with the viral peak.
  • the preparations to be analyzed contain species co-eluted with the viral particles, the very specific form of the viral peak easily makes it possible to identify it and to carry out its quantification.
  • the supports used in the context of the invention make it possible to identify and quantify very easily and with great precision the peak of the adenovirus when it is analyzed from preparations containing a large quantity of proteins and d 'nucleic acids.
  • the quantitative analysis of the particles as well as the purification is also possible from preparations obtained with very varied viral production media, or media devoid of constituents of animal origin, such as albumin, whether it is d bovine, human or another origin ( Figure 2). It is also important to note that the method described in the present invention is applicable to the analysis of samples containing nucleic acids without prior treatment with a nuclease without affecting either the sensitivity or the selectivity of the method.
  • another subject of the invention relates to the use of this type of support and of Q Sepharose® XL in particular, for the preparative separation or the purification of viral particles, in particular of adenovirus, from media. biological.
  • a separation process can optionally comprise a prior stage of chromatography on another support such as those used in the process which is the subject of application WO98 / 00524, and in particular the Source 15Q resin.
  • Such a preliminary step may prove to be advantageous in particular cases, for example if an excessive quantity of contaminants is present in the biological medium.
  • Another object of the invention relates to the use of this type of support and of Q Sepharose® XL in particular, for the quantitative analysis or the titration of viral particles, in particular of adenovirus, from biological media.
  • the biological medium from which is made the purification or titration of virus may be a cell supernatant of producing encapsidation of the virus or a cell lysate of encapsidation. or a prepurified solution of said virus.
  • a preliminary step of ultrafiltration preferably this step is carried out by ultrafiltration tangential on membrane having a cutoff threshold between 300 and 500 kDa.
  • the purification process according to the invention makes it possible to obtain viral preparations of high quality in terms of purity with high yields of particles (of the order of 75 to 80%) in one step, from a diluted stock. or / and very rich in contaminants and this, under production conditions fully compatible with industrial requirements and with the regulations concerning the production of therapeutic molecules.
  • Another object of the invention relates to a method for quantifying adenovirus, characterized in that the viral particles are separated by chromatography on a support of Q Sepharose® XL type and the amount of adenovirus is determined by measuring the absorbance of the chromatography fractions.
  • the method of the invention allows easier and more precise monitoring of the production kinetics, directly on homogeneous samples of supernatant, without pretreatment, which allows better reproducibility and better control of the production processes of stocks of viral particles. .
  • the subject of the invention is also the use of a Sepharose® XL type Q chromatography support for the identification of different adenovirus serotypes. Indeed, and su ⁇ renantly, it has been observed that this type of support makes it possible to separate and identify in a simple and rapid manner a large variety of adenoviruses of different serotypes directly from a sample of viral production medium. by determining the retention time and the absorbance ratio at 260 nm and 280 nm from the chromatographic peak.
  • the separation of viral particles for analytical or preparative purposes may be carried out by applying to the chromatography column a gradient salt elution or according to a mode isocratic, ie at constant salt concentration.
  • the chromatographic support can be used in a chromatography column of conventional type or in a column suitable for high performance chromatography systems, using for example the Q Sepharose® XL support, or even in a so-called system. with "fluidized bed” or expanded, using for example the Streamline® Q XL support.
  • the size of the chromatographic column is determined according to the amount of virus present in the starting material.
  • the viral preparation to be purified can be applied to the support in a buffer whose conductivity is such that the virus is not retained on the support while the nucleic acids are fixed.
  • the conductivity is adjusted to 45 mS / cm.
  • the assay and purification and characterization methods of the different serotypes described in the present invention can be applied to different types of virus, and of adenovirus in particular, whether they are wild virus or recombinant viruses carrying a transgene of interest.
  • Figure 1 elution profile of purified adenovirus and bovine albumin on Q Sepharose® XL.
  • Figure 2 elution profile on Q Sepharose® XL of a viral culture supernatant obtained on a medium devoid of serum.
  • Figure 3 elution profile on Q Sepharose® XL of a preparation of purified adenovirus (2 x 10 l0 pv injected).
  • Figure 4 elution profile on 0 Sepharose® Fast Flow of a preparation of purified adenovirus (2 x 10 l0 pv injected).
  • Figure 5 Comparison of the elution profiles of a preparation of adenovirus purified on Q Sepharose® XL and Q Sepharose® Fast Flow.
  • Figure 6 elution profile on Q Sepharose® HP of a preparation of purified adenovirus (2 x 10 l0 pv injected).
  • Adenoviruses are linear double-stranded DNA viruses about 36 kilobases in size. Their genome includes in particular a repeated inverted sequence (ITR) at each end, an encapsidation sequence (Psi), early genes and late genes.
  • ITR inverted sequence
  • Psi encapsidation sequence
  • the main early genes are contained in the El. E2, E3 and E4 regions. Among these, the genes contained in the El region in particular are necessary for viral propagation.
  • the main late genes are contained in regions L1 to L5.
  • the genome of the Ad5 adenovirus has been fully sequenced and is accessible on the database (see in particular Genebank M73260). Likewise, parts or even all of other adenoviral genomes (Ad2, Ad7, Ad 12, etc.) have also been sequenced.
  • adenovirus For their use in gene therapy, different vectors derived from adenoviruses have been prepared, incorporating different therapeutic genes. In each of these constructions, the adenovirus was modified so as to render it incapable of replication in the infected cell.
  • the constructions described in the prior art are adenoviruses deleted from the E1 region essential for viral replication, at the level of which heterologous DNA sequences are inserted (Levrero et al. Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al. Gene 50 (1986) 161). Furthermore, to improve the properties of the vector, it has been proposed to create other deletions or modifications in the genome of the adenovirus.
  • thermosensitive point mutation was introduced into the mutant ts125, making it possible to inactivate the 72 kDa DNA binding protein (DBP) (Van der Vliet et al., 1975).
  • Other vectors include a deletion of another region essential for viral replication and / or spread, the E4 region.
  • the E4 region is indeed involved in the regulation of the expression of late genes, in the stability of late nuclear RNA, in the extinction of the expression of cell proteins host and in the efficiency of viral DNA replication.
  • Adenoviral vectors in which the E l and E4 regions are deleted therefore have very limited transcription background noise and expression of viral genes.
  • Such vectors have been described by example in applications WO94 / 28152, WO95 / 02697, WO96 / 22378).
  • vectors carrying a modification at the level of the IVa2 gene have also been described (WO96 / 10088).
  • the recombinant adenoviruses described in the literature are produced from different serotypes of adenoviruses. There are in fact different serotypes of adenoviruses, the structure and properties of which vary somewhat, but which have a comparable genetic organization. More particularly, the recombinant adenoviruses can be of human or animal origin. As regards adenoviruses of human origin, mention may preferably be made of those classified in group C, in particular adenoviruses of type 2 (Ad2), 5 (Ad5); in group B, adenovirus type 7 (Ad7); or in group A, adenovirus type 12 (Ad 12).
  • adenoviruses of animal origin mention may preferably be made of adenoviruses of canine origin, and in particular all the strains of adenoviruses CAV2 [manhattan or A26 / 61 strain (ATCC VR-800) for example].
  • Other adenoviruses of animal origin are cited in particular in application WO94 26914, which is incorporated herein by reference.
  • the recombinant adenovirus is a human adenovirus of group C. More preferably, it is an adenovirus Ad2 or Ad5.
  • Recombinant adenoviruses are usually produced by introducing viral DNA into the packaging line, followed by lysis of the cells after approximately 2 or 3 days (the kinetics of the adenoviral cycle being 24 to 36 hours), depending on to another variant, the culture is continued until 8 to 12 days and the viral particles are released spontaneously into the culture medium by autolysis of packaging cells.
  • viruses used in the context of the following examples are adenoviruses containing the lacZ marker gene from E.coli (AV, 0 CMV.lacZ). These viruses are derived from the Ad5 serotype and have the following structure:
  • the culture media can vary according to the transcomplementing lines used or according to the quantities used. These environments can be the MEM, DMEM ... whether or not supplemented with calf serum and contain different concentrations of inorganic salts, sugar, amino acids, vitamins, hepes or phenol red.
  • Transcomplementing cells of the E1 region such as 293 or PER.C6 cells are transfected at 60-80% confluence in a culture dish with viral DNA obtained by digestion of a plasmid carrying the adenoviral genome of interest.
  • the incubation lasts from 8 to 15 days, the harvest time is judged by the observation under the microscope of the cells which round off, become more refractive and adhere more and more weakly to the culture support.
  • the virus is then released from the nucleus by 3 to 6 successive thawing cycles (dry ice ethanol at -70 ° C, water bath at 37 ° C).
  • the virus thus obtained is used to re-infect transcomplementing cells at a given Multiplicity of Infection (MOI) which can vary between 10 and 500 viral particles per cell, the amplified virus is obtained as previously by continuing the incubation from 40 to 72 h.
  • MOI Multiplicity of Infection
  • the cells are not harvested 40 to 72 hours post-infection, but the incubation is prolonged between 8 to 12 days so as to obtain total lysis of the cells without the need for proceed to freeze-thaw cycles.
  • the virus is then spontaneously released into the supernatant.
  • the supernatant is then clarified by filtration on filters with decreasing porosity depth (10 ⁇ m / 1.0 ⁇ m / 0.8-0.2 ⁇ m).
  • the clarified supernatant is then concentrated by tangential ultrafiltration on a Millipore spiral membrane having a cutoff threshold of 300 kDa.
  • the concentration factor is of the order of 20 to 100 times.
  • the clarified supernatant can be used as it is for the purification of adenoviral particles by chromatography on a column of Q Sepharose® XL.
  • This column is mounted on a Waters HPLC system type 626 fitted with a detection system UV / visible diode array 996 operating in the range of 200-300 nm absorbance.
  • This anion exchange column is used for the separation and quantification of the viral particles.
  • the column Before each analysis, the column is equilibrated at 30 ° C in a 20 mM Tris / HCl buffer, pH 7.5 at a flow rate of 1.5 ml / min.
  • the sample to be analyzed containing the viral particles is injected onto the column.
  • the quantity of particles injected must be less than or equal to 2x l0 12 particles / ml of support.
  • the volume injected has no appreciable influence on the separation of the species, at least for an injected volume less than or equal to 50 ml per ml of gel.
  • the column is rinsed with 5 volumes of the same buffer, and the fixed species are eluted with a linear gradient from 0 to 1 M NaCl in the 20 mM Tris / HCl buffer, pH 7.5 over 30 column volumes .
  • the column is washed with 2 volumes of 0.5 N sodium hydroxide column before rebalancing for the next analysis.
  • a standard curve at 260 nm is constructed with a preparation of adenovirus particles purified either by a CsCl gradient or by chromatography. This standard preparation was previously titrated into particles by its absorbance at 260 nm in a 0.1% SDS solution using the conversion factor of 1 ⁇ 10 10 particles per unit of absorbance at 260 nm.
  • the adenovirus is eluted at the retention time of approximately 18 min and has an absorbance ratio at 260 nm compared to 280 nm of 1.30 ⁇ 0.02 (see FIG. 3).
  • the suitability software of the Millennium Waters chromatographic signal acquisition and processing station automatically determines after each analysis the value of N m (calculated at mid-height) and the asymmetry (calculated at 10% of the height) of the peak.
  • the value of N m on the peak adenoviral is typically 35,000 ⁇ 3,000 and the peak asymmetry factor is 1.05 ⁇ 0.05.
  • the adenovirus is purified from cultures of packaging cells 293 or
  • PER.C6 (WO97 / 00326).
  • the virus is produced and harvested in supernatants after autolysis as described above. It is then filtered through a 0.45 ⁇ m membrane (HT Tuffryn or polysulfone) just before purification.
  • the purification protocol is identical to the protocol used for the analytical separation of viral particles described above, but with a gradient of different elution. Elution is carried out with a gradient of 0.25 to 1 M NaCl over 30 column volumes. The volume of the column is adapted to the quantities of virus to be purified by considering a capacity of 1 ⁇ 10 12 particles per ml of chromatographic support. Similarly, the linear flow rate of the eluents is fixed at 300 cm / h.
  • Example 1 comparison of Q type Sepharose® XL supports with Q Sepharose® Fast Flow support.
  • This example illustrates the specific properties of Sepharose® XL type Q media with respect to Sepharose® Fast Flow 0 support.
  • the two supports consist of balls of identical basic structure
  • a purified adenovirus preparation (2 x 10 10 pv) is injected onto a column of Q Sepharose® XL (1 ml of support) and eluted with a NaCl gradient as defined in paragraph 2 of the Materials and Methods section.
  • the elution profile is presented in FIG. 3.
  • an identical analysis is carried out on a similar column filled with Q Sepharose® Fast Flow (FF) support.
  • the elution profile is presented in FIG. 4.
  • the comparison of the chromatographic performances is presented in the table below.
  • Example 2 comparison of Q-type Sepharose® XL supports with Q-type Sepharose® HP support.
  • This example illustrates the specific properties of Sepharose® XL type Q media with respect to Sepharose® HP 0 support.
  • the two supports consist of beads of identical basic structure (cross-linked agarose at 6%).
  • the Q Sepharose® XL support has a size distribution of beads ranging from 45 to 165 ⁇ m centered on 90 ⁇ m.
  • the particle size of the support Q Sepharose® HP is 34 ⁇ 10 ⁇ m.
  • the particle size of the Q Sepharose® HP support is finer and much less dispersed than that of the Q Sepharose® XL support.
  • the Q Sepharose® HP support should therefore have chromatographic performances far superior to the performances of the Q Sepharose® XL.
  • a purified adenovirus preparation (2 x 10 10 pv) is injected onto a column of Q Sepharose® XL (1 ml of support) and eluted with a NaCl gradient as defined in paragraph 2 of the Materials and Methods section.
  • the elution profile is presented in FIG. 3.
  • an identical analysis is carried out on a similar column filled with Q Sepharose® HP support.
  • the elution profile obtained with support 0 Sepharose® HP is presented in Figure 6.
  • the results presented in FIG. 6 show that the Q Sepharose® HP support has an efficiency (N / m, 15,000) substantially lower than the Q Sepharose XL support.
  • the viral peak has a sensitive lag on the Q Sepharose® HP support (asymmetry, 1.6), whereas it is rigorously symmetrical on the Q Sepharose® XL support.
  • the Q Sepharose® HP support does not achieve the performance of the Q Sepharose® XL support for the separation of viral particles.
  • it has much higher performance for the separation of proteins, as indicated by the supplier (Amersham-Pharmacia Biotech) and as it is confirmed in our experimental conditions with bovine albumin separation experiments (table below). below).
  • Example 3 comparison of Sepharose® XL type Q supports with Fractogel® TMAE (S) and Source 15Q supports.
  • This example illustrates the specific properties of Sepharose® XL type Q media with respect to the Fractogel® TMAE (S) support and Source 15Q support.
  • the three supports consist of balls of different structure and composition.
  • Q Sepharose® XL consists of 6% cross-linked agarose.
  • the Fractogel® TMAE support is a crosslinked polymethacrylate resin and the Source 15Q support consists of resin beads of the polystyrene-divinylbenzene type.
  • the particle size of the Fractogel® TMAE (S) (20-40 ⁇ m) and Source 15Q (15 ⁇ m) supports is much lower and much less dispersed than that of the Q Sepharose® XL support (45-165 ⁇ m).
  • the three supports present the strong exchanger groups. These are located on flexible arms fixed to the matrix in the case of Fractogel® TMAE (S) and Q Sepharose® XL, unlike Source 150 whose exchanger groups are grafted directly onto the matrix.
  • a preparation of purified adenovirus (2 x 10 i0 vp) is injected onto a column of Q Sepharose XL (1 ml support) and eluted with a NaCl gradient as defined in paragraph 2 of the section Materials and Methods.
  • the elution profile obtained is presented in Figure 3. Under the same conditions, an identical analysis is carried out on a similar column filled with Source 15Q support and and another analysis is carried out on a column filled with Fractogel® TMAE (S) support.
  • Fractogel® TMAE does not reach the performance of the Q Sepharose® XL support for the separation of adenoviruses. On the other hand, it has much higher performance for the separation of proteins. Similarly, despite its very fine particle size and its almost monodispersed particle size distribution. Source 15Q support n 'reaches not, either, Q Sepharose XL support performance for the separation of adenoviruses.
  • Table 3 comparison of chromatographic performance with Source 15Q, Q Sepharose® XL and Fractogel® TMAE (S) supports.
  • Example 4 detection and quantification of wild adenovirus particles of various serotypes.
  • This example illustrates a method of detection and identification of wild adenovirus particles of various serotypes based on the use of the Sepharose® XL type Q chromatographic support.
  • the various wild adenoviruses were produced by infection of A549 cells cultured on DMEM medium and harvested after 3 cycles of freezing-thawing of the cells. The preparations were then filtered through an Acrodisc membrane (type HT Tuffryn 0.45 ⁇ m; GelmanSciences) before analysis.
  • Acrodisc membrane type HT Tuffryn 0.45 ⁇ m; GelmanSciences
  • Adenovirus 5 retention is greater (25.3 min) than the reference retention time (18 min) indicated in the Materials and Methods section.
  • Table 5 correlation between the retention time of the virus and the sequence identity of the hexon.
  • Example 5 detection and quantification of the recombinant adenovirus particles during the stages of production of a viral stock.
  • This example illustrates the use of Sepharose® XL type Q supports for the detection and quantification of the AV, 0 CMV.lacZ recombinant adenovirus particles produced during the transfection and amplification steps with different packaging cell lines ( cells 293 or PER.C6).
  • This extremely rapid analysis method provides, in a few minutes, and from a culture supernatant, the title of the adenovirus solution resulting from each step.
  • This fast and sensitive method makes it possible to optimize the amplification conditions of the next step which can therefore be carried out under conditions of determined and controlled MOI.
  • This analysis method was tested to control the production of recombinant adenoviruses of type AV 1 0 CMV.lacZ during the steps of transfection and amplification on 293 or PER.C6 cells.
  • the adenovirus AV 1 0 CMV.lacZ was produced after transfection of 293 or PER.C6 cells with the plasmid pXL2822 digested with Pacl (Crouzet et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 1414-1419, 1997) then infection of cells respectively 293 or PER.C6 at a determined multiplicity of infection (MOI).
  • the initial transfection is carried out with 5 to 10 micrograms of viral DNA obtained by digestion of the plasmid.
  • the virus was harvested by 3 freeze-thaw cycles of the cells. The preparations were then filtered through an Acrodisc membrane (of the HT Tuffryn type) of 0.45 ⁇ m before analysis.
  • the various preparations are then analyzed by chromatography according to the protocol described in paragraph 2 of the Materials and Methods section.
  • the titer of the adenovirus solution is determined by reference to a standard curve produced under the conditions described in paragraph 2 of the Materials and Methods section.
  • Table 6 Detection and quantification of particles of recombinant adenovirus AV, 0 CMV.lacZ obtained during the production of viral stocks in two transcomplementing lines (293 or PER.C6).
  • the total viral particles obtained were assayed to determine the concentration of infectious particles (pfu) and particles having the activity of the transgene (tdu).
  • pfu plaque forming unit
  • plaque forming unit corresponds to the infectious power of an adenovirus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 15 days, the number of plaques of infected cells.
  • Table 7 relationship between the concentration of infectious particles (pfu) and particles with the activity of the transgene (tdu).
  • Example 6 detection and quantification of the recombinant adenovirus particles produced during the transfection and amplification steps on an IGRP2 cell.
  • This example illustrates the use of Sepharose® XL type Q supports for the detection and quantification of recombinant adenovirus particles.
  • AV 30 CMV.lacZ produced during the transfection and amplification steps on an IGRP2 cell.
  • the adenovirus AV 30 CMV.lacZ was produced after transfection of IGRP2 packaging cells with the plasmid pXL3005 digested with Pacl (the plasmid pXL3005 derives from the plasmid pXL281 1 described in (Crouzet et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 1414-1419, 1997) by exchange of the RSV promoter with the CMV promoter) then infection of IGRP2 cells (WO96 / 22378) at a determined multiplicity of infection (MOI). During cell lysis, the virus was harvested by 3 freeze-thaw cycles of the cells. The preparations were then filtered through an Acrodisc membrane (of the HT Tuffryn type) of 0.45 ⁇ m before analysis.
  • Acrodisc membrane of the HT Tuffryn type
  • Table 8 Detection and quantification of particles of recombinant adenovirus AV? 0 CMV.lacZ obtained during the production of viral stocks.
  • the total viral particles obtained were assayed to determine the concentration of particles having the transgene activity (tdu 3.2 x 10s / ml).
  • a ratio vp / tdu of 43 is comparable to the ratio vp / tdu 43 and 55 obtained in Example 5 and used to correlate the physical measurement 1, 39 x 10 '° vp / ml of viral particles in biological measuring 3.2 x 10 tdu / ml of transduction units.
  • Example 7 purification of the virus by chromatography on Q Sepharose® XL resin.
  • the starting material consists either of the culture lysate obtained by freeze-thaw cell for producing packaging of the virus or the supernatant obtained after lysis of the cells spontaneously.
  • the collected fraction is analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) on a Resource Q column (1 ml) in a following chromatographic system: 10 ⁇ l of the fraction purified by chromatography as described above are injected onto a Resource Q15 column ( 1 ml of gel; Pharmacia) equilibrated in 100 mM Tris / HCl buffer pH 8.0 containing 0.5 mM MgC12, (buffer B). After rinsing with 5 ml of buffer B, the adsorbed species are eluted with a linear gradient of 30 ml of NaCl (0 to 1 M) in buffer B at a flow rate of 1 ml / min. The eluted species are detected at 260 nm. After the purification step on a column of Q Sepharose XL. the fraction collected has a purity> 99% in viral particles (UV detection at 260 nm). The purification yield in viral particles is 82%.
  • the electrophoresis analysis of the purified adenoviral fraction by chromatography is carried out on polyacrylamide gel (4-20%) under denaturing conditions (SDS). The protein bands are then revealed with silver nitrate. This analysis shows that the adenoviral preparation obtained by chromatography has a level of purity at least equal to that of the preparation obtained conventionally by ultracentrifugation and that it does not have any additional protein band which would indicate contamination of the preparation with non-adenoviral proteins.
  • the adenoviral preparation obtained by chromatography has an absorbance ratio A 260 nm / 280 nm equal to 1.30 ⁇ 0.05. This value, which is identical to that obtained for the best preparations obtained by ultracentrifugation. indicates that the preparation is free of contaminating proteins or contaminating nucleic acids.
  • the titration of the virus clearly shows the presence of infectious viral particles with a very satisfactory pv / pfu ratio (see table below) and the purified viral particles effectively have the expected infectious activity.
  • Table 9 purification of AV adenovirus, 0 CMV.LacZ on Q Sepharose® XL support.
  • the method described in this example therefore makes it possible to purify the adenoviral particles without affecting their infectious power, directly from a lysate of packaging cells, without prior treatment (ultrafiltration for example or treatment with a nuclease) of the material to be purified.

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Abstract

L'invention concerne une nouvelle méthode pour la purification et la quantification de particules virales. Plus particulièrement l'invention concerne une méthode de purification et de quantification d'adénovirus par chromatographie d'échange d'ions. L'invention concerne également une méthode d'identification des différents sérotypes d'adénovirus.

Description

METHODE DE SEPARATION DE PARTICULES VIRALES
L'invention concerne une nouvelle méthode pour la purification et la quantification de particules virales. Plus particulièrement l'invention concerne une méthode de purification et de quantification d'adénovirus par chromatographie d'échange d'ions. L'invention concerne également une méthode d'identification des différents serotypes d'adénovirus.
La thérapie génique connaît actuellement un développement remarquable et diverses études cliniques chez l'homme sont en cours depuis les premiers essais conduits en 1990. Parmi les méthodes couramment employées pour le transfert de gènes, les vecteurs viraux s'avèrent particulièrement prometteurs, et parmi ceux-ci, les adenovirus occupent une place de premier plan.
Le développement des vecteurs adenovirus en thérapie génique nécessite d'avoir accès à deux types de technologies qui sont aujourd'hui limitantes pour la production des stocks viraux : la première est de disposer d'une méthode rapide, d'une grande sensibilité et très sélective pour la quantification des particules virales dans les échantillons provenant des étapes de construction et d'amplification du virus considéré, ce point est particulièrement important pour l'optimisation du procédé de production des stocks viraux : la seconde est de disposer d'un procédé de purification fiable, reproductible, simple et facilement extrapolable à l'échelle industrielle pour la purification des particules virales.
La production de lots cliniques d'adénovirus reste un processus long en raison du nombre d'étapes de transfection et d'amplification dont la productivité n'est pas optimisée. Les adenovirus recombinants sont habituellement produits par introduction de l'ADN viral dans une lignée d'encapsidation. suivie d'une lyse mécanique ou chimique des cellules après environ deux ou trois jours de culture (la cinétique du cycle adénoviral étant de 24 à 36 heures). Selon une autre variante, la culture est poursuivie pendant une durée plus longue (8 à 12 jours), et les virus sont récoltés directement dans le surnageant, après libération spontanée par un phénomène d'autolyse des cellules d'encapsidation (WO98/00524).
Généralement entre 2 et 7 cycles d'amplifications sont nécessaires pour constituer les stocks viraux. Une limitation importante à l'optimisation du procédé de production des stocks viraux réside dans les méthodes de titration des particules virales. En effet, les méthodes biologiques sont des méthodes relativement sensibles et précises mais particulièrement longues à mettre en oeuvre( environ 4 à 15 jours selon le dosage utilisé i.e. activité du transgène (tdu) ou obtention de plage (pfu) ). Des méthodes analytiques plus rapides ont été développées mais celles-ci ne présentent pas un degré de précision et de sensibilité suffisant lorsque les titrations de particules virales doivent être effectuées, sans purification préalable, dans des lysats, des extraits cellulaires bruts ou des surnageants de culture. C'est la raison pour laquelle les cycles d'amplification successifs sont réalisés avec des multiplicités d'infection (MOI) estimées de manière approximative. Il en résulte que les étapes d'amplification sont peu reproductibles, voire parfois plus longues et/ou plus nombreuses qu'il ne serait nécessaire avec un procédé optimisé. La détermination rapide et précise des titres de solutions d'adénovirus permettrait d'ajuster la multiplicité d'infection de chaque étape de manière à optimiser l'ensemble du procédé production des stocks d'adénovirus.
La méthode quantification des particules virales doit satisfaire plusieurs conditions. En premier lieu, elle doit être suffisamment sensible pour assurer le dosage de particules virales dans des préparations diluées ou présentant un faible titre (typiquement < 1 x 10° particules virales par ml (pv/ml)) sans recourir à une étape d'enrichissement préalable. Le dosage des particules virales doit pouvoir être effectué directement dans des lysats ou des préparations brutes, sans qu'il soit nécessaire d'effectuer une étape de purification ou un traitement préalable. De plus, cette méthode doit assurer une sélectivité élevée pour s'affranchir des interférences possibles avec les nombreux composés présents dans les lysats ou extraits cellulaires bruts et dont les proportions peuvent varier en fonction des conditions de culture.
Une méthode analytique quantitative basée sur la chromatographie d'échange d'anions a été décrite dans la littérature (Huygue et al., Human Gène Ther. 6: 1403- 1416, 1995; P. W. Shabram et al., Human Gène Ther. 8:453-465. 1997). Cette méthode, qui présente une limite de détection de l'ordre 1 x 10s pv/ml, est applicable à la titration de préparations virales purifiées. Cependant, la sensibilité de cette méthode décroît dès lors que l'analyse est réalisée sur des lysats ou des extrait cellulaires bruts. La limite de détection est estimée à 2 à 5 x 10° pvml dans de tels échantillons et cette méthode ne permet pas de quantifier les particules adénovirales dans les préparations très diluées et non purifiées telles que les lysats de cellules infectées lors des étapes de transfection et d'amplification du virus pour lesquelles le titre adénoviral est typiquement de l'ordre de 1 x 10s pv/ml à 1 x 10° pv/ml. De plus cette méthode ne permet pas non plus de quantifier les particules adénovirales à partir de préparations obtenues dans certains milieux de production dépourvus de protéines animales. En effet, de tels milieux contiennent en fin de culture des composés de type, sucres, acides aminés, vitamines, ou rouge de phénol, etc. parmi lesquels certains d'entre eux peuvent interférer avec les particules adénovirales lors de la quantification du virus et qui conduisent à surestimer très largement le titre de la préparation. Enfin, la méthode chromatographique rapportée par Shabram et al. nécessite un pré-traitement de l'échantillon avec une nucléase à large spectre d'activité (Benzonase®) pour éliminer les acides nucléiques qui interfèrent avec la détection et la mesure des particules.
Concernant les méthodes de séparation préparatives des adenovirus, la chromatographie a été utilisé depuis de nombreuses années pour la purification des particules adénovirales [Haruna, I., Yaosi, H., Kono. R. and Watanabe, I. Virology ( 1961 ) 13. 264-267; Klemperer, H. G. and Pereira, H. G. Virology ( 1959) 9, 536-545; Philipson, L., Virology- (1960) 10, 459-465]. Plus récemment des méthodes décrivant la purification à large échelle d'adénovirus recombinants ont été décrites (demandes de brevet internationales WO96/27677, WO97/08298, WO98/00524, W098/22588).
La demande WO98/00524 décrit notamment une méthode de purification mettant en oeuvre la résine échangeuse d'anions fort Source 150 et Qui permet d'obtenir, en une seule étape chromatographique. des préparations d'adénovirus dont la pureté est au moins équivalente à celle obtenue à partir de préparations purifiées par ultracentrifugation en gradient de chlorure de césium. Ce degré de pureté est très élevé et atteint les standards requis pour des études cliniques chez l'homme (WHO Expert Committee on Biological Standardization, Forty-ninth Report. WHO Technical Report Séries, WHO Geneva, in press).
Cependant lorsque le titre viral des préparations à purifier est faible (par exemple dans le cas d'un adenovirus présentant une productivité faible, ou lorsque la purification doit être effectuée à partir d'un stock obtenu lors d'une étape d'amplification précoce), ou encore lorsque le milieu de production du virus conduit à la présence de composés co-élués avec l 'adenovirus (comme par exemple dans le cas de milieux dépourvus de sérum de veau), les performances limitées des techniques chromatographiques décrites précédemment ne permettent ni de quantifier, ni de purifier les particules adénovirales en une seule étape à partir d'un tel matériel de départ.
Le problème se pose par conséquent de pouvoir disposer d'une méthode de titration de particules virales à partir de préparations brutes qui soit tout à la fois rapide, sensible et hautement sélective. Le problème se pose également de disposer d'une méthode de purification fiable, reproductible permettant d'obtenir, à partir de ces mêmes préparations brutes, et de préférence en une seule étape, des préparations virales de qualité pharmaceutique.
Il a maintenant été trouvé et c'est que qui fait l'objet de la présente invention, que certains supports de chromatographie présentent de manière suφrenante des propriétés tout à fait exceptionnelles pour la séparation des particules virales et en particulier des adenovirus. Ces propriétés permettent la titration et/ou la purification de particules virales à partir de préparations brutes, sans traitement préalable, avec une sensibilité et une sélectivité très élevée. L'utilisation de ces supports fournit en outre et de manière inattendue une méthode d'analyse simple et rapide pour séparer et identifier par chromatographie, des adenovirus de différents serotypes ou des adenovirus modifiés au niveau de la fibre ou de l'hexon.
La présente invention a pour objet un procédé séparation de particules virales à partir d'un milieu biologique caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape de chromatographie réalisée sur un support comportant une matrice, des groupements échangeurs d'ions, lesdits groupements étant greffés sur ladite matrice au moyen d'un bras flexible.
La matrice peut être choisie parmi l'agarose. le dextran, l'acrylamide, la silice, le poly[styrene-divinylbenzene], seuls ou en mélange. De préférence la matrice est constituée d'agarose. de préférence encore, il s'agit d'agarose réticulé à 6 % environ.
Les supports constitués de billes d'agarose réticulé sur lequel sont greffés des bras flexibles échangeurs d'ions fonctionnalisés ont été développés pour la chromatographie préparative et industrielle de biomolécules. Ces supports ont plus particulièrement été conçus pour l'étape de capture (c'est à dire l'étape initiale du procédé de purification) des biomolécules à partir de mélanges bruts simplement clarifiés, c'est à dire débarrassés de leurs constituants solides en suspension. Leurs performances ont été optimisées dans le sens d'une très grande capacité de fixation des solutés sur le support, d'une très faible contre-pression à fort débit linéaire de liquide, d'un faible coût ainsi que d'une très grande résistance chimique aux agents de nettoyage utilisés pour la régénération.
De manière avantageuse, le bras flexible est de nature hydrophile et il est constitué d'un polymère d'origine synthétique ou naturelle. Parmi les polymères d'origine synthétique, on peut citer les polymères constitués de monomères d'alcools polyvinyliques, de polyacrylamides, de polyméthacrylamides ou de polyvinyl éthers. A titre de polymère d'origine naturelle, on peut citer notamment des polymères de nature polysaccharidique choisis parmi l'amidon, la cellulose, le dextran et l'agarose. De préférence le degré de polymérisation du bras flexible est d'environ 30 unités monomériques, de préférence encore, le bras flexible est un dextran de poids moléculaire moyen de 5000 Da environ.
De préférence, le bras flexible est fonctionnalisé par greffage d'un groupement susceptible d'interagir avec une molécule anionique. Le plus généralement, le groupement est constitué d'une aminé qui peut être ternaire ou quaternaire. Dans le cadre de la présente invention, il est particulièrement avantageux d'utiliser un échangeur d'anions fort. Ainsi, on utilise préférentiellement selon l'invention un support de chromatographie tel qu'indiqué ci-dessus, fonctionnalisé par des aminés quaternaires.
A titre de support particulièrement préféré pour la mise en oeuvre de l'invention, on peut citer le Q Sepharose® XL (Amersham Pharmacia Biotech). L'utilisation de ce support est mentionnée dans un des exemples de la demande WO98/39467 . Des adenovirus purifiés sont modifiés par traitement par du polyéthylèneglycol (PEG). Après réaction, les adenovirus modifiés, les adenovirus non modifiés et le PEG sont séparés par passage sur une colonne de Q Sepharose® XL. Il s'agit donc d'une simple séparation entre des produits de départ et les produits finaux d'une réaction chimique. L'homme du métier ne pouvait supposer que cette colonne puisse être utilisée avec succès pour la séparation d'adénovirus à partir d'un milieu biologique complexe contenant diverses espèces contaminantes(ADN de l'hôte. ARNs, protéines, lipides, lipoprotéines, endotoxines...). tel qu'un lysat de cellules d'encapsidation. Il n'apparaissait pas non plus à la lecture de ce document que le Q Sepharose® XL puisse être utilisé à des fins préparatives car il est connu que la majorité des supports perdent leur efficacité dès lors que l'on injecte des quantités importantes de produits.
D'autres supports échangeurs d'anions forts présentant des caractéristiques similaires de composition de matrice, de distribution de taille de particules, de porosité, de nature chimique du bras fiexible, de densité de greffage peuvent être utilisés pour la séparation préparative ou analytique des particules adénovirales. De manière avantageuse, la matrice est constituée d'agarose réticulé à 6 %, elle est greffée avec des bras flexibles constitués de dextran et fonctionnalisés avec des groupements échangeurs d'anions forts. Le support présente une granulométrie comprise de préférence entre 40 et 200 μm environ ; Le terme "environ" se rapportant à la granulométrie signifie que la valeur à prendre en considération se situe dans un écart compris entre +/- 20 % par rapport à la valeur exprimée. De préférence, cet écart est compris entre +/- 10 % et de préférence encore il est compris entre +/- 5 % par rapport à la valeur exprimée.
De manière plus particulèrement préférée, la granulométrie est comprise entre
45 et 165 μm et centrée sur 90 μm.
De manière avantageuse également, la matrice présente une dispersion telle que 95 % des particules ont un diamètre compris entre 0.1 et 10 fois le diamètre moyen des particules, et de préférence entre 0.3 et 3 fois le diamètre moyen des particules.
Le Q Sepharose® XL, utilisé dans les exemples qui suivent, illustre de façon non exhaustive les performances des supports utilisables dans le cadre de l'invention.
Le Q Sepharose® XL présente une distribution de taille des billes allant de 45 à 165 μm, centrée sur 90 μm. Ces caractéristiques de taille et de distribution des billes font de ce support un échangeur chromatographique de type préparatif. La théorie ainsi que la pratique chromatographique indiquent qu'un tel support a des performances très modestes pour la séparation de composés présentant des comportements chromatographiques similaires quant à l'interaction d'échange d'ions. De même, un tel support génère des pics chromatographiques larges mal résolus, en particulier en raison de la grande taille et de la distribution très large des billes qui le constituent. Ces caractéristiques chromatographiques attendues sont vérifiées pour les biomolécules en général comme les protéines, qui sont éluées sous forme de larges pics mal séparés (voir Data File Pharmacia Biotech N° 18- 1 123-82). Par contre, et de façon totalement inattendue, les particules d'adénovirus sont éluées de ce type de support sous forme d'un pic extrêmement fin. très symétrique. Par comparaison aux protéines, comme par exemple l'albumine, l'efficacité d'une colonne remplie de Q Sepharose® XL , mesurée par la Hauteur Equivalente à un Plateau Théorique (HEPT) ou le nombre de plateaux théoriques par unité de longueur de colonne (N/m). est 50 à 100 fois plus élevée pour l'adénovirus (N/m : 35,000) que pour les protéines comme l'albumine sérique bovine (N/m : 600). Voir par exemple figure 1. Ainsi, lorsqu'il est mis en oeuvre dans des conditions chromatographiques optimisées, ce type de gel et notamment le gel Q Sepharose® XL, donne un pic chromatographique pour l'adénovirus d'une finesse inégalée par les supports généralement préconisés pour la séparation des biomolécules. Parmi les supports préconisés pour la séparation des biomolécules on peut citer les supports dont la matrice de base est de type polystyrène divinylbenzene (comme par exemple les résines Source 15Q et Source 30Q, ou les résines de type Poros HQ, Poros DE2, ou Poros D). On peut également citer des supports dont la matrice de base est de type copolymère méthacrylate éthylene glycol comme par exemple les résines Toyopearl DEAE, QAE. et Super Q, ou les résines de type Fractogel TMAE, TMAE HiCap, DMAE, ou DEAE dont les groupements fonctionnels échangeurs d'ions sont situés sur des chaines polymériques linéaires de type polyacrylamide greffées sur la matrice.
L'efficacité des supports utilisés dans le cadre de la présente invention pour la séparation des particules d'adénovirus conduit à une très grande sensibilité de détection des particules. Ainsi lorsque ces supports sont mis en oeuvre dans des colonnes chromatographiques analytiques, le comportement chromatographique inattendu des particules virales permet de quantifier l'adénovirus avec une limite de détection très inférieure à la limite de détection des méthodes décrites antérieurement. Cette limite de détection est au moins dix fois inférieure ce qui permet d'atteindre une limite de détection de l'ordre de 1 x 10s pv/ml dans des préparations de type lysat cellulaire brut et une limite de détection de l'ordre de 1 x 10' pv/ml pour des préparations virales purifiées.
Ce type de support permet également d'assurer une sélectivité très élevée vis à vis des contaminants présents dans les échantillons à analyser comme par exemple les protéines et les acides nucléiques. Les protéines se présentent sous forme de pics très larges et élues bien avant le pic viral. Les acides nucléiques sont élues de la colonne avec une concentration saline très supérieure à la concentration nécessaire à l'élution du virus. Cette caractéristique, très différente de celle obtenue avec la méthode chromatographique précédemment décrite (Huygue et al., Human Gène Ther. 6: 1403-1416, 1995) permet de s'affranchir des interférences de ce type de composés avec le pic viral. Enfin, même lorsque les préparations à analyser contiennent des espèces co-éluées avec les particules virales, la forme très spécifique du pic viral permet aisément de l'identifier et de procéder à sa quantification.
Ainsi, les supports utilisés dans le cadre de l'invention permettent d'identifier et de quantifier très facilement et avec une grande précision le pic de l'adénovirus lorsque celui-ci est analysé à partir de préparations contenant une grande quantité de protéines et d'acides nucléiques. L'analyse quantitative des particules ainsi que la purification est également réalisable à partir de préparations obtenues avec des milieux de production virale très variés, ou des milieux dépourvus de constituants d'origine animale, comme par exemple l'albumine, qu'elle soit d'origine bovine, humaine ou d'une autre origine encore (figure 2). Il est également important de constater que la méthode décrite dans la présente invention est applicable à l'analyse des échantillons contenant des acides nucléiques sans traitement préalable avec une nucléase sans affecter ni la sensibilité ni la sélectivité de la méthode.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de ce type de support et du Q Sepharose® XL en particulier, pour la séparation préparative ou la purification de particules virales, en particulier d'adénovirus, à partir de milieux biologiques. Un tel procédé de séparation peut éventuellement comprendre une étape préalable de chromatographie sur un autre support tel que ceux utilisés dans le procédé objet de la demande WO98/00524, et en particulier la résine Source 15Q. Une telle étape préalable peut se révéler avantageuse dans des cas particuliers, par exemple si une quantité de contaminants trop importante est présente dans le milieu biologique.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de ce type de support et du Q Sepharose® XL en particulier, pour l'analyse quantitative ou la titration de particules virales, en particulier d'adénovirus, à partir de milieux biologiques.
Le milieu biologique à partir duquel est effectué la purification ou la titration du virus peut être un surnageant de cellules d'encapsidation productrices du virus ou un lysat de cellules d'encapsidation. ou une solution prépurifiée dudit virus. Lorsque la séparation préparative ou la purification des particules virales est effectuée à partir d'un surnageant de cellules d'encapsidation productrices ou d'un lysat, il peut être avantageux de réaliser une étape préalable d'ultrafiltration, de préférence cette étape est réalisée par ultrafiltration tangentielle sur membrane ayant un seuil de coupure compris entre 300 et 500 kDa.
Le procédé de purification selon l'invention permet d'obtenir des préparations virales de qualité élevée en terme de pureté avec des rendements en particules élevés (de l'ordre de 75 à 80 % ) en une étape, à partir d'un stock dilué ou/et très riche en contaminants et ce, dans des conditions production entièrement compatibles avec les exigences industrielles et avec la réglementation concernant la production de molécules thérapeutiques.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de quantification d'adénovirus caractérisé en ce que les particules virales sont séparées par chromatographie sur un support de type Q Sepharose® XL et la quantité d'adénovirus est déterminée par mesure de l'absorbance des fractions de chromatographie. Le procédé de l'invention permet un suivi plus facile et plus précis de la cinétique de production, directement sur des échantillons homogènes de surnageant, sans prétraitement, ce qui permet une meilleure reproductibilité et un meilleur contrôle des procédés de production des stocks de particules virales.
L'invention a également pour objet l'utilisation de support de chromatographie de type Q Sepharose® XL pour l'identification de différents serotypes d'adénovirus. En effet, et de façon suφrenante, il a été observé que ce type de support permet de séparer et d'identifier de manière simple et rapide une grande variété d'adénovirus de différents serotypes directement à partir d'un échantillon de milieu de production viral par la détermination du temps de rétention et du ratio des absorbances à 260 nm et à 280 nm du pic chromatographique.
Concernant la mise en oeuvre des supports de chromatographie dans le cadre de la présente invention, la séparation des particules virales à des fins analytiques ou préparatives peut être effectuée en appliquant sur la colonne de chromatographie un gradient d'élution de sel ou encore selon un mode isocratique c'est à dire à concentration saline constante. Pour les méthodes préparatives, le support chromatographique peut être utilisé dans une colonne de chromatographie de type classique ou dans une colonne adaptée aux systèmes de chromatographie haute performance, en mettant en oeuvre par exemple le support Q Sepharose® XL, ou encore dans un système dit à "lit fluidisé" ou expansé, en mettant en oeuvre par exemple le support Streamline® Q XL. La taille de la colonne chromatographique est déterminée en fonction de la quantité de virus présent dans le matériel de départ.
La préparation virale à purifier peut être appliquée sur le support dans un tampon dont la conductivité est telle que le virus ne soit pas retenu sur le support alors que les acides nucléiques sont fixés. De manière avantageuse, la conductivité est ajustée à 45 mS/cm. Ce mode particulier de mise en oeuvre permet alors de séparer par une simple filtration à travers le support Q Sepharose® XL le virus des acides nucléiques provenant de la cellule hôte contaminant la préparation virale.
Les méthodes de dosage et de purification et de caractérisation des différents serotypes décrites dans la présente invention peuvent s'appliquer à différents types de virus, et d'adénovirus en particulier, qu'il s'agisse de virus sauvage ou de virus recombinants portant un transgène d'intérêt.
Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples suivants, donnés à titre illustratif et non limitatif.
LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 : profil d'élution d'adénovirus purifié et d'albumine bovine sur Q Sepharose® XL.
Figure 2 : profil d'élution sur Q Sepharose® XL d'un surnageant de culture virale obtenue sur un milieu dépourvu de sérum.
Figure 3 : profil d'élution sur Q Sepharose® XL d'une préparation d'adénovirus purifié (2 x 10l0pv injectées ).
Figure 4 : profil d'élution sur 0 Sepharose® Fast Flow d'une préparation d'adénovirus purifié (2 x 10l0pv injectées). Figure 5 : Comparaison des profils d'élution d'une préparation d'adénovirus purifié sur Q Sepharose® XL et Q Sepharose® Fast Flow .
Figure 6 : profil d'élution sur Q Sepharose® HP d'une préparation d'adénovirus purifié (2 x 10l0pv injectées).
MATERIEL ET METHODES
1 - Adenovirus et production des adenovirus recombinants défectifs pour la réplication.
Les adenovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 kilobases environ. Leur génome comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs. Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions El. E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région El notamment sont nécessaires à la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions Ll à L5. Le génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement séquence et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité d'autres génomes adénoviraux (Ad2, Ad7, Ad 12, etc) ont également été séquencées.
Pour leur utilisation en thérapie génique, différents vecteurs dérivés des adenovirus ont été préparés, incoφorant différents gènes thérapeutiques. Dans chacune de ces constructions, l'adénovirus a été modifié de manière à le rendre incapable de réplication dans la cellule infectée. Ainsi, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adenovirus délétés de la région El. essentielle à la réplication virale, au niveau de laquelle sont insérées les séquences d'ADN hétérologue (Levrero et al.. Gène 101 ( 1991) 195 ; Gosh-Choudhury et al. Gène 50 (1986) 161). Par ailleurs, pour améliorer les propriétés du vecteur, il a été proposé de créer d'autres délétions ou modifications dans le génome de l'adénovirus. Ainsi, une mutation ponctuelle thermosensible a été introduite dans le mutant tsl25, permettant d'inactiver la protéine de 72 kDa de liaison à l'ADN (DBP) (Van der Vliet et al., 1975). D'autres vecteurs comprennent une délétion d'une autre région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale, la région E4. La région E4 est en effet impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des vecteurs adénoviraux dans lesquels les régions E l et E4 sont délétées possèdent donc un bruit de fond de transcription et une expression de gènes viraux très réduits. De tels vecteurs ont été décrits pas exemple dans les demandes W094/28152, WO95/02697, WO96/22378). En outre, des vecteurs portant une modification au niveau du gène IVa2 ont également été décrits (WO96/ 10088).
Les adenovirus recombinants décrits dans la littérature sont produits à partir de différents serotypes d'adénovirus. Il existe en effet différents serotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable. Plus particulièrement, les adenovirus recombinants peuvent être d'origine humaine ou animale. Concernant les adenovirus d'origine humaine, on peut citer préférentiellement ceux classés dans le groupe C, en particulier les adenovirus de type 2 (Ad2), 5 (Ad5) ; dans le groupe B, les adenovirus de type 7 (Ad7) ; ou dans le groupe A, les adenovirus de type 12 (Ad 12). Parmi les différents adenovirus d'origine animale, on peut citer préférentiellement les adenovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adenovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. D'autres adenovirus d'origine animale sont cités notamment dans la demande WO94 26914 incoφorée à la présente par référence.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, l'adénovirus recombinant est un adenovirus humain du groupe C. De manière plus préférentielle, il s'agit d'un adenovirus Ad2 ou Ad5.
Plusieurs méthodes ont été décrites pour la génération d'adénovirus recombinants (C. Chartier et al., J. Virol. 70:4805-4810, 1996 ; WO96/25506 ; J. Crouzet et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94 : 1414- 1419, 1997 ; T-C. He et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95 :2509-2514, 1998). Ces méthodes permettent de construire chez E. coli des plasmides portant le génome adénoviral d'intérêt, ces plasmides sont ensuite digérés par une enzyme de restriction pour exciser le génome adénoviral du plasmide. Le génome adénoviral est alors transfecté dans une lignée d'encapsidation puis amplifié.
Les adenovirus recombinants sont habituellement produits par introduction de l'ADN viral dans la lignée d'encapsidation, suivie d'une lyse des cellules après environ 2 ou 3 jours (la cinétique du cycle adénoviral étant de 24 à 36 heures), selon une autre variante, la culture est poursuivie jusqu'à 8 à 12 jours et les particules virales sont libérées spontanément dans le milieu de culture par autolyse des cellules d'encapsidation.
Les virus utilisés dans le cadre des exemples qui suivent sont des adenovirus contenant le gène marqueur lacZ de E.coli (AV, 0CMV.lacZ). Ces virus sont dérivés du sérotype Ad5 et possèdent la structure suivante :
- Une délétion dans la région El recouvrant par exemple les nucleotides 386 (site Hinfl) à 3446 (site Sau3a).
- Une cassette d'expression du gène lacZ, sous contrôle du promoteur CMV, insérée au niveau de ladite délétion.
- Une délétion de la région E3.
La construction de ces virus a été décrite dans la littérature (WO94/25073,
WO95/14102, WO96/25506, J. Crouzet et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94 : 1414-
1419, 1997). Il est entendu que toute autre construction peut être utilisée dans le procédé selon l'invention, et notamment des virus portant d'autres gènes heterologues et/ou d'autres délétions (E1/E4 ou E1/E2 par exemple).
Les techniques de transfection des cellules, d'amplification et de titration des adenovirus ont été décrites précédemment (F.L. Graham et al., Molecular Biotechnology 3:207-220, 1995; Crouzet et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94 : 1414- 1419, 1997 ; WO96/25506).
La technique de dosage en tdu de l'activité β-galactosidase codée par le gène lacZ contenu dans les virus AV, 0CMV.lacZ est réalisée comme décrite par P. Yeh et al. (J. Virol. 70:559-565, 1996).
- Production des adenovirus AV, 0CMV.lacZ
La récolte du virus à partir des cultures de lignées productrices a été faite soit par un procédé classique faisant appel à une série de cycles de congélation- décongélation, soit par lyse chimique en présence de 1% Tween-20, soit en poursuivant la culture jusqu'à l'autolyse selon le procédé décrit dans WO98/00524.
Les milieux de culture peuvent varier selon les lignées transcomplémentantes utilisées ou selon les quantités mises en œuvre . Ces milieux peuvent être le MEM, DMEM... complémenté ou non de sérum de veau et contiennent différentes concentrations de sels inorganiques, sucre, acides aminés, vitamines, hepes ou rouge de phénol.
Les cellules transcomplémentantes de la région El telles que les cellules 293 ou PER.C6 sont transfectées à 60-80% de confluence en boite de culture avec un ADN viral obtenu par digestion d'un plasmide portant le génome adénoviral d'intérêt. L'incubation dure de 8 à 15 jours, le moment de récolte est jugé par l'observation au microscope des cellules qui s'arrondissent, deviennent plus réfringentes et adhèrent de plus en plus faiblement au support de culture. Le virus est ensuite libéré du noyau par 3 à 6 cycles de décongélation successifs (éthanol carboglace à -70°C, bain-marie à 37°C). Le virus ainsi obtenu est utilisé pour infecter de nouveau les cellules transcomplémentantes à une Multiplicité d'Infection (MOI) donnée pouvant varier entre 10 et 500 particules virales par cellule, le virus amplifié est obtenu comme précédemment en poursuivant l'incubation de 40 à 72 h.
Selon une autre variante décrite dans la demande WO98/00524, les cellules ne sont pas récoltées 40 à 72 heures post-infection, mais l'incubation est prolongée entre 8 à 12 jours de façon à obtenir une lyse totale des cellules sans avoir besoin de procéder aux cycles de congélation-décongélation. Le virus est alors libéré spontanément dans le surnageant. Le surnageant est ensuite clarifié par filtration sur des filtres profondeur de porosité décroissante ( 10μm/1.0μm/0.8-0.2μm). Le surnageant clarifié est ensuite concentré par ultrafiltration tangentielle sur membrane spirale Millipore ayant un seuil de coupure de 300 kDa. Le facteur de concentration est de l'ordre de 20 à 100 fois. Selon une autre variante, le surnageant clarifié peut être utilisé tel quel pour la purification des particules adénovirales par chromatographie sur une colonne de Q Sepharose® XL.
- Analyse des préparations d'adénovirus.
Les différentes techniques analytiques utilisées pour déterminer la qualité des préparations virales obtenues (SDS-PAGE, analyse en Western blot, IE-HPLC sur colonne Resource 15Q, etc.) ont été décrites précédemment (WO98/00524).
2 - Méthodes analytiques mettant en oeuvre le support de chromatographie Q Sepharose® XL. Les conditions opératoires pour la détection, l'identification et la quantification des particules d'adénovirus à partir d'une culture de cellules d'encapsidation infectées sont réalisées comme décrit ci-après.
Une colonne de chromatographie remplie avec environ 1 ml de Q Sepharose® XL (45-165 μm; Amersham-Pharmacia Biotech) est préparée dans une colonne de type HR 5/5 (Amersham-Pharmacia Biotech). Cette colonne est montée sur un système CLHP de type Waters 626 équipé d'un système de détection UV/visible à barrette de diodes 996 opérant dans la plage d'absorbance 200-300 nm. Cette colonne d'échange d'anions est utilisée pour la séparation et la quantification des particules virales.
Avant chaque analyse, la colonne est équilibrée à 30°C dans un tampon 20 mM Tris/HCl, pH 7.5 à un débit de 1 ,5 ml/min. L'échantillon à analyser contenant les particules virales est injecté sur la colonne. Pour obtenir une résolution maximale, la quantité de particules injectée doit être inférieure ou égale à 2x l012 particules / ml de support. Le volume injecté n'a pas d'influence sensible sur la séparation des espèces, au moins pour un volume injecté inférieur ou égal à 50 ml par ml de gel. Après l'injection, la colonne est rincée avec 5 volumes du même tampon, et les espèces fixées sont éluées avec un gradient linéaire de 0 à 1 M NaCl dans le tampon 20 mM Tris/HCl, pH 7,5 sur 30 volumes de colonne. En fin de gradient, la colonne est lavée avec 2 volumes de colonne de soude 0,5 N avant rééquilibration en vue de l'analyse suivante.
Une courbe étalon à 260 nm est construite avec une préparation de particules d'adénovirus purifiée soit en gradient de CsCl, soit par chromatographie. Cette préparation étalon a été titrée au préalable en particules par son absorbance à 260 nm dans une solution de SDS à 0.1 % en utilisant le facteur de conversion de 1 x 1010 particules par unité d'absorbance à 260 nm.
Dans ces conditions, l'adénovirus est élue au temps de rétention de 18 min environ et présente un ratio d' absorbance à 260 nm par rapport à 280 nm de 1.30 ± 0.02 (voir figure 3). Le logiciel « Suitability » de la station d'acquisition et de traitement du signal chromatographique Millennium Waters détermine après chaque analyse de façon automatique la valeur de N m (calculée à mi-hauteur) et de l'asymétrie (calculée à 10 % de la hauteur) du pic. La valeur de N m sur le pic adénoviral est typiquement de 35.000 ± 3,000 et le facteur d'asymétrie du pic est de 1.05 ± 0,05.
3 - Méthode préparative pour la purification d'adénovirus par chromatographie d'échange d'anions.
L'adénovirus est purifié à partir de cultures de cellules d'encapsidation 293 ou
PER.C6 (WO97/00326). Le virus est produit et récolté dans des surnageants après autolyse comme décrit précédemment. Il est ensuite filtré à travers une membrane 0.45 μm (HT Tuffryn ou polysulfone) juste avant purification. En l'absence d'indication contraire, le protocole de purification est identique au protocole mis en oeuvre pour la séparation analytique des particules virales décrit ci-dessus, mais avec un gradient d'élution différent. L'élution est effectuée avec un gradient de 0.25 à 1 M NaCl sur 30 volumes de colonne. Le volume de la colonne est adapté aux quantités de virus à purifier en considérant une capacité de 1 x 1012 particules par ml de support chromatographique. De même, le débit linéaire des éluants est fixé à 300 cm/h.
EXEMPLES
Exemple 1 : comparaison des supports de type Q Sepharose® XL avec le support Q Sepharose® Fast Flow.
Cet exemple illustre les propriétés spécifiques des supports de type Q Sepharose® XL vis à vis du support 0 Sepharose® Fast Flow.
Les deux supports sont constitués de billes de structure de base identique
(agarose réticulé à 6 %), de même répartition granulométrique (45-165 μm). Ils diffèrent par la présence de bras flexibles en dextran portant les groupements échangeurs de type Q pour le Q Sepharose® XL, alors que les mêmes groupements de type Q sont fixés directement sur la matrice d'agarose dans le cas du Q Sepharose® FF.
Une préparation d'adénovirus purifiée (2 x 1010 pv) est injectée sur une colonne de Q Sepharose® XL ( 1 ml de support) et éluée avec un gradient de NaCl tel que défini au paragraphe 2 de la Section Matériel et Méthodes. Le profil d'élution est présenté dans la figure 3. Dans les mêmes conditions, une analyse identique est effectuée sur une colonne similaire remplie de support Q Sepharose® Fast Flow (FF). Le profil d'élution est présenté dans la figure 4. La comparaison des performances chromatographiques est présentée dans le tableau ci-dessous.
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Tableau 1 : comparaison des performances chromatographiques avec les supports Q Sepharose® XL et Q Sepharose® FF
Comme le montrent les figures 3 et 4, le temps de rétention du virus est similaire dans les deux cas (t = 18 min pour Q Sepharose® XL et t = 20 min pour Q Sepharose® FF), mais le support Q Sepharose® XL présente une efficacité très supérieure au support Q Sepharose® FF.
De la même façon, l'analyse d'un extrait cellulaire brut contenant 2 x 109 particules virales d'adénovirus sur les deux supports (figure 5) montre que seul le support Q Sepharose® XL présente un pic de virus identifié et quantifiable. Par contre, les protéines présentes dans la préparation sont séparées avec une efficacité identique pour les deux supports étudiés (figure 5).
Ces résultats indiquent que la présence des bras flexibles portant les groupements échangeurs est un élément essentiel de ce type de support. La présence de ces bras flexibles contribue de manière importante aux performances chromatographiques avantageuses du Q Sepharose® XL pour la séparation des adenovirus.
Exemple 2 : comparaison des supports de type Q Sepharose® XL avec le support Q Sepharose® HP.
Cet exemple illustre les propriétés spécifiques des supports de type Q Sepharose® XL vis à vis du support 0 Sepharose® HP.
Les deux supports sont constitués de billes de structure de base identique (agarose réticulé à 6 %). Le support Q Sepharose® XL présente une distribution de taille des billes allant de 45 à 165 μm centrée sur 90 μm. La granulométrie du support Q Sepharose® HP est de 34 ± 10 μm. La granulométrie du support Q Sepharose® HP est plus fine et beaucoup moins dispersée que celle du support Q Sepharose® XL. Le support Q Sepharose® HP devrait donc présenter des performances chromatographiques très supérieures aux performances du Q Sepharose® XL.
Une préparation d'adénovirus purifiée (2 x 1010 pv) est injectée sur une colonne de Q Sepharose® XL ( 1 ml de support) et éluée avec un gradient de NaCl tel que défini au paragraphe 2 de la Section Matériel et Méthodes. Le profil d'élution est présenté dans la figure 3. Dans les mêmes conditions, une analyse identique est effectuée sur une colonne similaire remplie de support Q Sepharose® HP. Le profil d'élution obtenu avec le support 0 Sepharose® HP est présenté dans la figure 6.
Les résultats présentés dans la figure 6 montrent que le support Q Sepharose® HP présente une efficacité (N/m, 15 000) sensiblement inférieure au support Q Sepharose XL. De plus le pic viral présente une traîne sensible sur le support Q Sepharose® HP (asymétrie, 1,6), alors qu'il est rigoureusement symétrique sur le support Q Sepharose® XL.
De façon inattendue, malgré sa granulométrie plus fine et sa répartition granulométrique moins dispersée, le support Q Sepharose® HP n'atteint pas les performances du support Q Sepharose® XL pour la séparation des particules virales. Il présente par contre des performances bien supérieures pour la séparation des protéines, comme il est indiqué par le fournisseur (Amersham-Pharmacia Biotech) et comme il est confirmé dans nos conditions expérimentales avec des expériences de séparation de l'albumine bovine (tableau ci-dessous).
Figure imgf000020_0001
Tableau 2 : comparaison des performances chromatographiques avec les supports Q Sepharose® XL et Q Sepharose® HP Ces résultats confirment que la présence des bras flexibles portant les groupement échangeurs d'anions forts est un élément essentiel dans la performance chromatographique de ce type de support pour la séparation des particules virales. Ces résultats indiquent également qu'un autre paramètre important à prendre en compte dans la définition du choix du support est la granulométrie et en particulier la dispersion de taille.
Exemple 3 : comparaison des supports de type Q Sepharose® XL avec les supports Fractogel® TMAE(S) et Source 15Q.
Cet exemple illustre les propriétés spécifiques des supports de type Q Sepharose® XL vis à vis du support Fractogel® TMAE(S) et du support Source 15Q.
Les trois supports sont constitués de billes de structure et de composition différentes. Le Q Sepharose® XL est constitué d'agarose réticulé à 6%. Le support Fractogel® TMAE est une résine de polyméthacrylate réticulé et le support Source 15Q est constitué de billes de résine de type polystyrene-divinylbenzene. La granulométrie des supports Fractogel® TMAE(S) (20-40 μm) et Source 15Q ( 15 μm) est très inférieure et bien moins dispersée que celle du support Q Sepharose® XL (45-165 μm). Par ailleurs, les trois supports présentent les groupements échangeurs forts. Ces derniers sont situés sur des bras flexibles fixés sur la matrice dans le cas du Fractogel® TMAE(S) et du Q Sepharose® XL, contrairement au Source 150 dont les groupements échangeurs sont greffés directement sur la matrice.
Une préparation d'adénovirus purifiée (2 x 10i0 pv) est injectée sur une colonne de Q Sepharose® XL (1 ml de support) et éluée avec un gradient de NaCl tel que défini au paragraphe 2 de la Section Matériel et Méthodes. Le profil d'élution obtenu est présenté dans la figure 3 . Dans les mêmes conditions, une analyse identique est effectuée sur une colonne similaire remplie de support Source 15Q et et une autre analyse est effectuée sur une colonne remplie de support Fractogel® TMAE(S).
De façon inattendue, malgré sa granulométrie bien plus fine, le support
Fractogel® TMAE(S) n'atteint pas les performances du support Q Sepharose® XL pour la séparation des adenovirus. Il présente par contre des performances bien supérieures pour la séparation des protéines. De même, malgré sa granulométrie très fine et sa distribution granulométrique quasi monodispersée. le support Source 15Q n'atteint pas, lui non plus, les performances du support Q Sepharose® XL pour la séparation des adenovirus.
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Tableau 3 : comparaison des performances chromatographiques avec les supports Source 15Q, Q Sepharose® XL et Fractogel® TMAE(S).
Ces résultats indiquent que la présence de bras flexibles portant les groupements échangeurs n'est pas seule responsable des performances chromatographiques spécifiques du support Q Sepharose® XL pour la séparation des adenovirus. La composition chimique de ces bras, leur densité de greffage, la nature et la porosité de la matrice sur laquelle sont greffés les bras flexibles sont autant de paramètres qui peuvent influer sur les performances chromatographiques du support pour la séparation des particules virales.
Exemple 4 : détection et quantification des particules d'adénovirus sauvages de divers serotypes.
Cet exemple illustre une méthode de détection et d'identification des particules d'adénovirus sauvages de divers serotypes basée sur l'utilisation du support chromatographique de type Q Sepharose® XL.
Les divers adenovirus sauvages ont été produits par infection de cellules A549 cultivées sur milieu DMEM et récoltés après 3 cycles de congélation-décongélation des cellules. Les préparation ont ensuite été filtrées à travers une membrane Acrodisc (de type HT Tuffryn 0.45 μm; GelmanSciences) avant analyse.
Les diverses préparations sont ensuite analysées par chromatographie selon le protocole décrit dans le paragraphe 2 de la section Matériel et Méthodes. Cependant, dans l'exemple présenté, les analyses ont été effectuées avec une colonne ayant un volume légèrement supérieur à 1 ml (≈ 1.35 ml), ce qui explique que le temps de 21
rétention de l'adénovirus 5 soit supérieur (25,3 min) au temps de rétention de référence ( 18 min) indiqué dans la section Matériel et Méthodes.
Figure imgf000023_0001
Tableau 4 : caractérisation chromatographique de divers adenovirus sauvages
Cet exemple montre que les divers adenovirus ont non seulement un temps de rétention variable suivant les serotypes considérés mais aussi un ratio d'absorbance 260 nm/280 nm caractéristique du sérotype en question. La combinaison de ces deux critères qui peuvent être mesurés simultanément durant une seule et même analyse chromatographique constitue donc un moyen d'identification rapide et fiable du sérotype de l'adénovirus présent dans la préparation chromatographiée.
Une corrélation a été recherchée entre le temps de rétention du virus sur la colonne et les caractéristiques de la fibre et de l'hexon des adenovirus de type 7, 3, 4, 5 et 2, pour lesquels les séquences sont publiées ( 1998 J, Virol. (1998) 72 p. 7909 et Arch, Virol ( 1997) 142 p. 1307 ). Aucune corrélation n'est mise en évidence à partir des données d'identité de séquences de la tête de la fibre, ni même à partir des différences du nombre de répétitions de feuillets β dans la tige de la fibre (voir tableau ci-dessous). Par contre, et de façon suφrenante. une corrélation a été mise en évidence entre le temps de rétention du virus et l'identité de séquences de l'hexon (voir tableau ci-dessous). Cette corrélation est en parfait accord avec la charge globale de l'hexon à pH 7 ; cette corrélation montre que l'élévation de la charge de l'hexon à pH 7 correspond à une augmentation de la rétention du virus sur la colonne. Des nuances peuvent exister en fonction de la charge à pH 7 de la partie L l exposée de l'hexon, tel qu'indiqué par les données obtenues avec le virus de type 3.
Figure imgf000024_0001
Tableau 5 : corrélation entre le temps de rétention du virus et l'identité de séquences de l'hexon.
Exemple 5 : détection et quantification des particules d'adénovirus recombinants au cours des étapes de production d'un stock viral.
Cet exemple illustre l'utilisation des supports de type Q Sepharose® XL pour la détection et la quantification des particules d'adénovirus recombinant AV, 0CMV.lacZ produites lors des étapes de transfection et d'amplification avec différentes lignées cellulaires d'encapsidation (cellules 293 ou PER.C6).
Cette méthode d'analyse extrêmement rapide fournit en quelques minutes, et à partir d'un surnageant de culture, le titre de la solution d'adénovirus résultant de chaque étape. Cette méthode rapide et sensible permet d'optimiser les conditions d'amplification de l'étape suivante qui peut dès lors être réalisée dans des conditions de MOI déterminée et contrôlée. Cette méthode d'analyse a été testée pour contrôler la production d'adénovirus recombinants de type AV1 0CMV.lacZ lors des étapes de transfection et d'amplification sur cellules 293 ou PER.C6.
L' adenovirus AV1 0CMV.lacZ a été produit après transfection de cellules 293 ou PER.C6 avec le plasmide pXL2822 digéré par Pacl (Crouzet et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94 : 1414-1419, 1997 ) puis infection de cellules respectivement 293 ou PER.C6 à une multiplicité d'infection (MOI) déterminée. La transfection initiale est réalisée avec 5 à 10 microgrammes d'ADN viral obtenu par digestion du plasmide.
Lors de la lyse des cellules, le virus a été récolté par 3 cycles de congélation- décongélation des cellules. Les préparations ont ensuite été filtrées à travers une membrane Acrodisc (de type HT Tuffryn) de 0.45 μm avant analyse.
Les diverses préparations sont ensuite analysées par chromatographie selon le protocole décrit dans le paragraphe 2 de la section Matériel et Méthodes. Le titre de la solution d'adénovirus est déterminé par référence une courbe étalon réalisée dans les conditions décrites au paragraphe 2 de la Section Matériel et Méthodes.
Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous.
Figure imgf000025_0001
Tableau 6 : détection et quantification des particules d'adénovirus recombinant AV, 0CMV.lacZ obtenues lors de la production de stocks viraux dans deux lignées transcomplémentantes (293 ou PER.C6).
Les particules virales totales obtenues ont été dosées pour déterminer la concentration en particules infectieuses (pfu) et particules possédant l'activité du transgène (tdu). Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution d'adénovirus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Ces dosages reposent sur des méthodes biologiques et les valeurs obtenues peuvent apparaître différentes selon les conditions utilisées (J. Virol. ( 1996) 70 p. 7498). En fait, la formation d'une plage dans une lignée transcomplémentante ne décrit pas nécessairement l'infectivité du virus dans d'autres cellules cibles (Biotechniques (1997) 22 p. 447). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-dessous et les valeurs obtenues sont en parfait accord avec les données de la littérature (P. Yeh et al. J. Virol. ( 1996) 70 p. 559). En effet, P. Yeh et al. décrivent des virus AdRSVβGal purifiés par gradient de chlorure de césium ayant des rapport tdu/pfu de 0,49 à 0,68 ce qui est très proche des résultats obtenus ci-dessous.
Figure imgf000026_0001
Tableau 7 : relation entre la concentration en particules infectieuses (pfu) et particules possédant l'activité du transgène (tdu).
Exemple 6 : détection et quantification des particules d'adénovirus recombinant produites lors des étapes de transfection et d'amplification sur cellule IGRP2.
Cet exemple illustre l'utilisation des supports de type Q Sepharose® XL pour la détection et la quantification des particules d'adénovirus recombinant AV30CMV.lacZ produites lors des étapes de transfection et d'amplification sur cellule IGRP2.
L'adénovirus AV3 0CMV.lacZ a été produit après transfection de cellules d'encapsidation IGRP2 avec le plasmide pXL3005 digéré par Pacl (le plasmide pXL3005 dérive du plasmide pXL281 1 décrit dans (Crouzet et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94 : 1414-1419, 1997) par échange du promoteur RSV par le promoteur CMV ) puis infection de cellules IGRP2 (WO96/22378) à une multiplicité d'infection (MOI) déterminée. Lors de la lyse des cellules, le virus a été récolté par 3 cycles de congélation-décongélation des cellules. Les préparations ont ensuite été filtrées à travers une membrane Acrodisc (de type HT Tuffryn) de 0.45 μm avant analyse.
Les diverses préparations sont ensuite analysées par chromatographie selon le protocole décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous.
Figure imgf000027_0001
Tableau 8 : détection et quantification des particules d'adénovirus recombinant AV? 0CMV.lacZ obtenues lors de la production de stocks viraux.
Les particules virales totales obtenues ont été dosées pour déterminer la concentration en particules possédant l'activité du transgène ( 3,2 x 10s tdu/ml). Un rapport pv/tdu de 43 est comparable au rapport pv/tdu de 43 et 55 obtenu dans l'exemple 5 et permet de corréler la mesure physique 1 ,39 x 10'° pv/ml de particules virales à la mesure biologique de 3.2 x lO tdu/ml d'unités de transduction. Exemple 7 : purification du virus par chromatographie sur résine Q Sepharose® XL.
Le matériel de départ est constitué soit du lysat de culture obtenu par congélation-décongélation des cellules d'encapsidation productrices du virus, soit du surnageant obtenu après lyse spontanée des cellules.
Dans l'expérience rapportée dans cet exemple, 153 ml d'un autolysat de culture de cellules PER.C6 infectées par le virus AV, 0CMV.LacZ contenant 4.9 x 10ι particules ont été injectés sur une colonne de 5,8 ml de Q Sepharose® XL. L'équilibration de la colonne et l'élution du virus ont été effectuées à un débit de 300 cm/h avec un gradient de 0,25 à 1 M NaCl sur 30 volumes de colonne comme décrit pour la séparation analytique du virus dans le paragraphe 2 de la section Matériel et Méthodes. Le pic viral (7,1 ml) a été collecté puis analysé par diverses techniques ( EI-CLHP, SDS-PAGE) comme décrit ci-dessous. La fraction collectée est analysée par chromatographie liquide haute performance (CLHP) sur une colonne de Resource Q (1 ml) dans un système chromatographique suivant : 10 μl de la fraction purifiée par chromatographie comme décrit ci-dessus sont injectés sur une colonne Resource Q15 (1ml de gel; Pharmacia) équilibrée dans du tampon Tris/HCl 100 mM pH 8,0 contenant 0,5 mM MgC12, (tampon B). Après rinçage avec 5 ml de tampon B, les espèces adsorbées sont éluées avec un gradient linéaire de 30 ml de NaCl (0 à 1 M) dans le tampon B à un débit de 1 ml/min. Les espèces éluées sont détectées à 260 nm. Après l' étape de purification sur colonne de Q Sepharose® XL . la fraction collectée présente une pureté > 99 % en particules virales (détection UV à 260 nm). Le rendement de purification en particules virales est de 82 %.
Cette analyse par CLHP montre de plus que l'albumine sérique bovine résiduelle présente dans le lysat de départ est totalement éliminée au cours de la chromatographie préparative.
L'analyse en électrophorèse de la fraction adénovirale purifiée par chromatographie est effectuée en gel de polyacrylamide (4-20 %) en conditions dénaturantes (SDS). Les bandes de protéines sont ensuite révélées au nitrate d'argent. Cette analyse montre que la préparation adénovirale obtenue par chromatographie a un niveau de pureté au moins égal à celui de la préparation obtenue classiquement par ultracentrifugation et qu'elle ne présente pas de bande de protéines supplémentaire qui indiquerait une contamination de la préparation par des protéines non adénovirales.
La préparation adénovirale obtenue par chromatographie présente un ratio d'absorbance A 260 nm / 280 nm égal à 1,30 ± 0.05. Cette valeur, qui est identique à celle obtenue pour les meilleures préparation obtenues par ultracentrifugation. indique que la préparation est dépourvue de protéines contaminantes ou d'acides nucléiques contaminants.
La titration du virus montre bien la présence de particules virales infectieuses avec un rapport pv/pfu très satisfaisant, (voir tableau ci-dessous) et les particules virales purifiées ont effectivement l'activité infectieuse attendue.
Figure imgf000029_0001
Tableau 9 : purification d'adénovirus AV, 0CMV.LacZ sur support Q Sepharose® XL.
Le procédé décrit dans cet exemple permet donc de purifier les particules adénovirales sans affecter leur pouvoir infectieux , directement à partir d'un lysat de cellules d'encapsidation, sans traitement préalable (ultrafiltration par exemple ou traitement avec une nucléase) du matériel à purifier.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de séparation de particules virales à partir d'un milieu biologique caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape de chromatographie réalisée sur un support comportant une matrice, des groupements échangeurs d'ions, lesdits groupements étant greffés sur ladite matrice au moyen d'un bras flexible.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la matrice est choisie parmi l'agarose. le dextran, l'acrylamide, la silice, le poly[styrene-divinylbenzene], seuls ou en mélange.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la matrice est constituée d'agarose réticulé et de préférence d'agarose réticulé à 6 %.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la matrice présente une granulométrie comprise entre 40 et 200 μm environ.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la matrice présente une granulométrie comprise entre 45 et 165 μm et centrée sur 90 μm.
6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que la matrice présente une dispersion telle que 95 % des particules ont un diamètre compris entre 0.1 et 10 fois le diamètre moyen des particules, et de préférence entre 0.3 et 3 fois le diamètre moyen des particules.
7. Procédé selon la revendication 1. caractérisé en ce que le bras fiexible est un bras hydrophile constitué d'un polymère d'origine synthétique ou naturelle.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le bras fiexible est un polymère d'origine synthétique choisi parmi les alcools polyvinyliques, les polyacrylamides. les polyméthacrylamides ou les polyvinyl éthers.
9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le bras fiexible est un polymère d'origine naturelle de nature polysaccharridique choisi parmi l'amidon, la cellulose, le dextran et l'agarose.
10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que le degré de polymérisation du bras flexible est d'environ 30 unités monomériques
1 1. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le bras flexible est un dextran de poids moléculaire moyen de 5000 Da environ.
12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le groupement échangeur d'ions est un groupement échangeur d'anions fort.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le groupement échangeur d'anions fort est une aminé quaternaire.
14. Procédé selon l'une des revendications 7 à 13 ou selon la revendication 5, caractérisé en ce que la chromatographie est effectuée sur un support de type Q Sepharose® XL.
15. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu biologique est un surnageant de cellules d'encapsidation productrices dudit virus.
16. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu biologique est un lysat de cellules d'encapsidation productrices dudit virus.
17. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu biologique est une solution prépurifiée dudit virus.
18. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable d'ultrafiltration.
19. Procédé selon la revendication 18 caractérisé en ce que l'ultrafiltration est une ultrafiltration tangentielle sur membrane ayant un seuil de coupure compris entre 300 et 500 kDa.
20. Utilisation de support de chromatographie de type Q Sepharose® XL pour la séparation analytique et/ou préparative de particules virales.
21. Utilisation selon la revendication 20, caractérisée en ce que les particules virales sont des adenovirus.
22. Utilisation de support de chromatographie de type Q Sepharose® XL pour l'identification de différents serotypes d'adénovirus.
23. Utilisation de support de chromatographie de type Q Sepharose® XL pour la titration d'adénovirus.
24. Procédé de quantification d'adénovirus caractérisé en ce que les particules virales sont séparées par chromatographie sur un support de type Q Sepharose® XL et la quantité d'adénovirus est mesurée par absorbance des fractions de chromatographie.
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