CN108949702A - 超大孔径层析介质在纯化病毒颗粒的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了超大孔径层析介质在纯化病毒颗粒的应用，所述超大孔径层析介质带有离子交换功能基团，所述超大孔径层析介质的粒径≥40μm。超大孔径微球的离子交换层析树脂比现有技术的类似层析介质具有显著提高的病毒颗粒结合载量和结合速度，从而能提高吸附一洗脱层析模式病毒颗粒纯化效率，同样也可以提高流穿层析模式时病毒去除效率。

Description

超大孔径层析介质在纯化病毒颗粒的应用
技术领域
本发明属于纯化领域，具体涉及一种超大孔径层析介质在纯化病毒颗粒的应用。
背景技术
病毒颗粒纯化在基因治疗以及疫苗开发和生产领域不可缺少的环节。除病毒纯化外，病毒和病毒样颗粒的去除是治疗性蛋白质下游加工中的重要问题。尽管有多种分离技术应用于病毒纯化与去除，层析分离法已被证明为潜在的比传统的密度梯度超速离心法更为有效的手段。吸附-洗脱(bind-elute)模式的层析分离在病毒载体及疫苗纯化工艺中得到广泛应用，而流穿模式(flow-through)的层析方法则成为治疗性蛋白质(包括单克隆抗体和融合重组蛋白)下游生产工艺中去除病毒的普遍选择。
纯化用层析介质一般由多孔微球树脂组成，主要有水凝胶类树脂(比如琼脂糖类)或者合成聚合物类树脂(比如聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯等)。
多糖类微球类层析填料，是目前国内外最常用的生化分离介质。琼脂糖分子不带电荷，具有良好的亲水性，能够提供生物兼容的界面环境；分子中丰富的羟基可被继续修饰，形成离子交换、疏水、亲和等多种不同类型的介质。但是，琼脂糖介质作为一种软凝胶微球，介质孔径一般小于50nm，介质球含水量通常在90％以上，在高压、高流速下会发生变形，严重影响分离效率。
多孔的聚合物微球，可以以单体为原料合成，通常由悬浮聚合形成刚性的微球结构，能够承受较高的流速与压力。通过调控聚合单体和聚合工艺，可有效控制聚合物微球的孔道结构与界面特征。孔径范围一般为10-30nm。用于层析分离时，由于孔径较小，流动相在孔道内的传质过程主要依靠分子扩散完成，传质速度慢；不利于分离大分子的生化技术产品。现有技术的纯化用层析介质通常孔径在以下。例如，目前市场上层析介质知名品牌的Sepharose Fast-Flow(GE Healthcare)树脂的平均孔径一般远小于(参考文献：Yao Y，LenhoffAM.J Chromatogr A.2004 May 28；1037(1-2)：273-82)。现有技术制备的大孔径层析树脂如POROS微球(ThermoFisher)以及UNOsphere微球(Bio-Rad)，平均孔径也只有将近(参考文献：Trilisky EI.Stationary and mobile phase selectionfor ion-exchange chromatography of viruses[Ph.D.]University of Delaware；Newark，DE：2009)。
伴随着生物技术的发展，层析介质及分离纯化工艺也面临许多新的挑战。当面临超大分子纯化，常规琼脂糖凝胶和聚合物微球介质由于孔径尺寸较小，无法满足分离的需要。例如纯化多亚基疫苗分子、病毒颗粒、类病毒颗粒等，目标物粒径通常为几十到几百纳米，因此需要开发超大孔径层析树脂(大于)来纯化或者去除病毒颗粒。
发明内容
本发明应用超大孔径(大于)层析树脂来纯化或者去除病毒颗粒，本发明所述方法中病毒回收率高达65％左右，工艺稳定，易于放大。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是，超大孔径层析介质在纯化病毒颗粒的应用，所述超大孔径层析介质带有离子交换功能基团，所述粒径≥40um。
优选的，所述超大孔径层析介质的孔径在之间。
优选的，所述超大孔径层析介质的粒径在50～80μm之间。
优选的，所述超大孔径层析介质的基材是聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物或者聚甲基丙烯酸酯共聚物。
优选的，所述超大孔径层析介质带有的离子交换功能基团为DEAE。
优选的，所述超大孔径层析介质型号为NanoGel-50DEAE Macro系列。
优选的，使用所述超大孔径层析介质对病毒颗粒的纯化收率≥60％。
优选的，所述超大孔径层析介质表面具有亲水层修饰。
本发明选用平均孔径显著大于常规现有技术中层析介质孔径的超大孔径微球，发现用这些超大孔径微球做成的离子交换层析树脂比现有技术的类似层析介质具有显著提高的病毒颗粒结合载量和结合速度，从而能提高吸附-洗脱层析模式病毒颗粒纯化效率，同样也可以提高流穿层析模式时病毒去除效率。这些病毒分离效率的提高是由于超大孔径增加了病毒颗粒可以扩散结合的表面积以及病毒颗粒在介质内的扩散传质速度。
超大孔径层析介质微球选用苏州纳微科技股份有限公司NanoGel-50DEAE Macro系列层析介质。微球基材是聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物或者聚甲基丙烯酸酯共聚物，微球表面修饰有DEAE(N，N-二乙基氨基乙基)离子交换基团。微球粒径大于40微米，最好是50-80微米范围。微球的平均孔径大于最好是聚合物微球做成层析介质之前先进行亲水表面化学改性来提高介质材料的亲水性和生物相容性。表面亲水改性既可以是亲水包覆(参考文献：FournierC.Langmuir 1995，11(7)，p2344-2347)也可以是表面衍生亲水改性(参考文献：US5503933A)。表面亲水改性后的聚合物微球通过常规化学方法转化成各种能用于病毒纯化的离子交换层析树脂，包括带磺酸基功能团(S)的强阳离子交换树脂，带季胺功能团(Q)的强阴离子交换树脂，以及带叔胺基团(比如DEAE)的弱阴离子交换树脂。这些具有超大孔径的离子交换树脂在用于离子交换层析方法纯化病毒时，展现出比现有技术层析树脂无法比拟的病毒结合载量和结合速度。
本发明方法中病毒回收率高达65％左右，工艺稳定，易于放大，而现有技术中病毒回收率一般为25％左右，因此相对于现有技术本发明的方法具有相当显著的技术效果。
附图说明
图1是DEAE离子交换树脂病毒纯化色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例，对本发明的技术方案进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
实施例1，采用超大孔径DEAE离子交换层析介质用于病毒纯化
将超大孔径DEAE离子交换层析树脂(苏州纳微科技股份有限公司生产，填料型号：NanoGel-50DEAE Macro)装柱(Tricorn5/50，H＝5cm，CV＝1ml)柱子经过5CV平衡液后，上样～19毫升病毒料液(鸡胚来源的H5N2流感病毒收获液，0.45um过滤。)上样完成后，用2CV平衡液清洗柱子，然后在10CV内，0-1M NaCl缓冲液做梯度洗脱，并将10CV的梯度淋洗分成两部分收集，前面5CV为E1洗脱，后5CV为E2洗脱。图1为DEAE离子交换树脂纯化病毒色谱图。
表1用超大孔径聚苯乙烯微球制备的DEAE层析介质纯化病毒测试结果
其中，S：上样样品
FT：流穿收集液
E1：前半洗脱收集液
E2：后半洗脱收集液
从表1中可以看出，用超大孔径DEAE层析树脂纯化病毒时，流穿收集组分没有病毒成分，说明病毒与超大孔径DEAE层析树脂的结合速度很快，结合载量高。
实施例2
与实施例1过程完全相同，不同之处在于所装填的DEAE离子交换层析树脂孔径为(苏州纳微科技股份有限公司生产，填料型号：UniGel 80DEAE)。
表2用大孔径聚苯乙烯微球制备的DEAE层析介质纯化病毒测试结果表
实施例3
与实施例1过程完全相同，不同之处在于所装填的DEAE离子交换层析树脂孔径为的琼脂糖凝胶(填料型号：DEAE SepharoseFF)。
表3.孔径的DEAE SepharoseFF
从实施例2、3和实施例1的对比可见，采用超大孔径DEAE层析介质纯化病毒比小孔径DEAE层析介质纯化病毒的收率显著地高。
本发明方法中病毒回收率高达65％左右，工艺稳定，易于放大，而现有技术中病毒回收率一般为25％左右，相对于现有技术本发明的方法具有相当显著的技术效果。因此，超大孔径微球的离子交换层析树脂比现有技术的类似层析介质具有显著提高的病毒颗粒结合载量和结合速度，从而能提高吸附-洗脱层析模式病毒颗粒纯化效率，同样也可以提高流穿层析模式时病毒去除效率。
除上述实施例以外，本发明还可以有其他方式实现，在不脱离本发明内容的前提下，任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.超大孔径层析介质在纯化病毒颗粒上的应用，其特征在于，所述超大孔径层析介质带有离子交换功能基团，所述超大孔径层析介质的孔径≥3000Å，粒径≥40µm。
2.如权利要求1所述的超大孔径层析介质在纯化病毒颗粒的应用，其特征在于，所述超大孔径层析介质的孔径在3500Å~5500Å之间。
3.如权利要求1所述的超大孔径层析介质在纯化病毒颗粒的应用，其特征在于，所述超大孔径层析介质的粒径在50~80µm之间。
4.如权利要求1所述的超大孔径层析介质在纯化病毒颗粒的应用，其特征在于，所述超大孔径层析介质带有的离子交换功能基团为DEAE。
5.如权利要求4所述的超大孔径层析介质在纯化病毒颗粒的应用，其特征在于，所述超大孔径层析介质型号为NanoGel-50DEAE Macro系列。
6.如权利要求1所述的超大孔径层析介质在纯化病毒颗粒的应用，其特征在于，使用所述超大孔径层析介质对病毒颗粒的纯化收率≥60%。
7.如权利要求1所述的超大孔径层析介质在纯化病毒颗粒的应用，其特征在于，所述超大孔径层析介质表面具有亲水层修饰。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111394321A (zh) * 2020-03-30 2020-07-10 无锡加莱克色谱科技有限公司 病毒颗粒纯化用超大孔径层析介质及其应用方法
CN112546672A (zh) * 2019-09-26 2021-03-26 苏州纳微科技股份有限公司 无孔层析介质在病毒纯化上的应用
CN116768985A (zh) * 2022-12-07 2023-09-19 华北制药金坦生物技术股份有限公司 一种有效纯化病毒样颗粒的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1332796A (zh) * 1998-12-31 2002-01-23 阿文蒂斯药物股份有限公司 分离病毒颗粒的方法
CN102443088A (zh) * 2011-09-22 2012-05-09 中国科学院过程工程研究所 一种尺寸均一的小粒径超大孔聚合物微球及其制备方法
CN103113626A (zh) * 2013-01-23 2013-05-22 中国科学院过程工程研究所 一种超大孔多糖微球及其制备方法
CN103374143A (zh) * 2012-04-28 2013-10-30 中国科学院过程工程研究所 一种超大孔聚合物微球及其制备方法
US8940172B2 (en) * 2006-12-01 2015-01-27 Institute Of Process Engineering, Chinese Academy Of Sciences Super-macroporous polymeric microspheres and preparation method thereof

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1332796A (zh) * 1998-12-31 2002-01-23 阿文蒂斯药物股份有限公司 分离病毒颗粒的方法
US8940172B2 (en) * 2006-12-01 2015-01-27 Institute Of Process Engineering, Chinese Academy Of Sciences Super-macroporous polymeric microspheres and preparation method thereof
CN102443088A (zh) * 2011-09-22 2012-05-09 中国科学院过程工程研究所 一种尺寸均一的小粒径超大孔聚合物微球及其制备方法
CN103374143A (zh) * 2012-04-28 2013-10-30 中国科学院过程工程研究所 一种超大孔聚合物微球及其制备方法
CN103113626A (zh) * 2013-01-23 2013-05-22 中国科学院过程工程研究所 一种超大孔多糖微球及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
超大孔色谱纯化类病毒颗粒的过程研究: "超大孔色谱纯化类病毒颗粒的过程研究", 《中国博士学位论文全文库》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112546672A (zh) * 2019-09-26 2021-03-26 苏州纳微科技股份有限公司 无孔层析介质在病毒纯化上的应用
WO2021056788A1 (zh) * 2019-09-26 2021-04-01 苏州纳微科技股份有限公司 无孔层析介质在病毒纯化上的应用
CN111394321A (zh) * 2020-03-30 2020-07-10 无锡加莱克色谱科技有限公司 病毒颗粒纯化用超大孔径层析介质及其应用方法
CN116768985A (zh) * 2022-12-07 2023-09-19 华北制药金坦生物技术股份有限公司 一种有效纯化病毒样颗粒的方法
CN116768985B (zh) * 2022-12-07 2024-03-22 华北制药金坦生物技术股份有限公司 一种有效纯化病毒样颗粒的方法

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